(57)【要約】【課題】本明細書では、広範囲の食品用途のために高機能性を有する緑豆タンパク質単離物を製造するための方法が提供される。【解決手段】いくつかの実施形態では、単離物を製造するための方法は、（ａ）例えば、約６．５〜１０．０のｐＨの水溶液中で緑豆タンパク質供給源から１つまたは複数の緑豆タンパク質を抽出することと、（ｂ）２つの方法：（ｉ）グロブリンリッチな画分の等電点に近いｐＨ、例えば約５．０〜６．０のｐＨにおいて抽出物からタンパク質を沈殿させること、および／または（ｉｉ）精密ろ過、限外ろ過もしくはイオン交換クロマトグラフィなどのろ過を用いて抽出物からタンパク質を分画および濃縮することのうち少なくとも１つを用いて抽出物からタンパク質を精製することと、（ｃ）精製タンパク質単離物を回収することとから選択される１つまたは複数のステップを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも６０重量％の緑豆タンパク質含量と、
植物タンパク質の少なくとも５０重量％のグロブリン型タンパク質含量と、
前記植物タンパク質の本来未修飾の供給源と比べて低減された酸化酵素活性と、
前記緑豆タンパク質の前記本来未修飾の供給源と異なる１つまたは複数の調節された官能特性と
を含む、精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項２】
等電点が、約ｐＨ５．２〜約ｐＨ６．０の範囲であることを特徴とする、請求項１に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項３】
等電点が、約ｐＨ５．４〜約ｐＨ６．０の範囲であることを特徴とする、請求項１に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項４】
等電点が、約ｐＨ５．６〜約ｐＨ６．０の範囲であることを特徴とする、請求項１に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項５】
等電点が、ｐＨ５．６、５．７、５．８、５．９または６．０であることを特徴とする、請求項１に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項６】
前記調節された官能特性が：渋い、豆っぽい、苦い、焦げた、バターのような、ナッツのような、甘い、酸っぱい、フルーティな、フローラルな、ウッディな、土のような、豆っぽい、スパイシーな、メタリックな、甘い、かび臭い、草のような、グリーンな、油っぽい、酢のような、ニュートラルなおよび淡白な風味または芳香の１つまたは複数の低減または不在を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項７】
前記低減された酸化酵素活性が、前記緑豆タンパク質の本来未修飾の供給源と比べて脂質または残留脂質の酸化の低減を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項８】
前記低減された酸化酵素活性が、前記緑豆タンパク質の本来未修飾の供給源中の脂質の量と比べて前記単離物中の脂質または残留脂質の量の低減を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項９】
前記低減された酸化酵素活性が、前記緑豆タンパク質の本来未修飾の供給源と比べてリポキシゲナーゼ（ＥＣ１．１３．１１．−）の量の低減を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項１０】
乳化、水結合性、発泡性、ゲル化、クラム密度、構造形成、テクスチャ構築、粘着／接着性、弾性／スプリング性、溶解度、粘度、脂肪吸収、風味結合、凝固、膨化、通気、クリーミーさ、フィルム形成特性、光沢／輝きの付加、凍結／解凍安定性および色から選択される１つまたは複数の機能特性を示す、請求項１〜９のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項１１】
９０℃未満のゲル化開始温度を示す、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項１２】
２％よりも大きい振動歪のゲル強度を示す、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の精製タンパク質単離物。
【請求項１３】
３００Ｐａよりも大きいゲル弾性を示す、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物を含む食用組成物であって、ゲル、フォーム、エマルションおよび水溶液からなる群から選択される食用組成物。
【請求項１５】
７５％よりも多い緑豆タンパク質を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項１６】
前記緑豆タンパク質が、少なくとも６０％のグロブリン型タンパク質を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項１７】
前記グロブリン型タンパク質が、８Ｓグロブリン／ベータコングリシニンを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項１８】
前記グロブリン型タンパク質が、配列番号１に対して少なくとも５０％の同一性を有するタンパク質である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項１９】
前記グロブリン型タンパク質が、前記単離物の植物供給源中で見られるタンパク質の量に対して前記単離物中で強化されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項２０】
前記強化が、前記単離物の前記植物供給源中で見られる前記タンパク質の量に対して少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２０％超である、請求項１９に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項２１】
アレルゲン、抗栄養因子および環境汚染物質からなる群から選択される１つまたは複数の化合物が、前記単離物の前記植物供給源中で見られる前記１つまたは複数の化合物の量に対して前記単離物中で低減されている、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項２２】
親水コロイド、ガム、リン酸塩およびトランスグルタミナーゼからなる群から選択される１つまたは複数の副成分と接触されている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項２３】
前記リン酸塩が、リン酸二ナトリウムである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物を含む卵代用品であって、卵に類似する１つまたは複数の官能特性を有することを特徴とする卵代用品。
【請求項２５】
卵の対応する機能特性に類似するかまたはそれと均等である少なくとも１つの機能特性を示す、請求項２４に記載の卵代用品。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの機能特性は、乳化、水結合能、発泡性、ゲル化、クラム密度、構造形成、テクスチャ構築、粘着、接着性、弾性、スプリング性、溶解度、粘度、脂肪吸収、風味結合、凝固、膨化、通気、クリーミーさ、フィルム形成特性、光沢の付加、輝きの付加、凍結安定性、解凍安定性または色を含む、請求項２５に記載の卵代用品。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物を含む脂肪低減ショートニング系。
【請求項２８】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物を含む食品または飲料組成物。
【請求項２９】
卵を含まない食用エマルション、卵類似品、卵を含まないスクランブルエッグ、卵を含まないパティ、卵を含まないパウンドケーキ、卵を含まないエンゼルフードケーキ、卵を含まないイエローケーキ、卵および乳製品を含まないクリームチーズ、卵を含まないパスタ生地、卵を含まないカスタード、卵を含まないアイスクリーム、ならびに乳製品を含まない乳、クリームチーズ、パスタ生地、パスタ、乳または乳様飲料、前記乳または乳様飲料を含む食品、カスタード、アイスクリーム、冷凍デザート、食肉レプリカ、デリミートレプリカ、乳化押出肉、ソーセージ、フィッシュケーキレプリカ、ディップ、フィリング、スプレッド、チップスおよびクラッカーからなる群から選択される、請求項２８に記載の食品または飲料組成物。
【請求項３０】
（ａ）約６．５〜１０．０のｐＨの水溶液中で緑豆タンパク質の供給源から１つまたは複数の緑豆タンパク質を抽出することと、
（ｂ）ｐＨ５．２〜ｐＨ６．０の範囲のｐＨにおいて前記抽出された緑豆タンパク質を沈殿させることと
を含む方法によって製造される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項３１】
精製緑豆タンパク質単離物の製造方法であって、
（ａ）約６．５〜１０．０のｐＨの水溶液中で緑豆タンパク質の供給源から１つまたは複数の緑豆タンパク質を抽出することと、
（ｂ）グロブリンリッチな画分の等電点に近いｐＨもしくは約５．０〜６．０のｐＨにおいて前記緑豆タンパク質を沈殿させること、または、精密ろ過もしくは限外ろ過を用いて前記植物タンパク質を分画および濃縮することと、
（ｃ）精製緑豆タンパク質単離物を回収することであって、前記精製緑豆タンパク質単離物は、
少なくとも６０重量％の緑豆タンパク質含量と、
前記緑豆タンパク質の少なくとも５０重量％のグロブリン型タンパク質含量と、
前記緑豆タンパク質の本来未修飾の供給源と比べて低減された酸化酵素活性と、
前記緑豆タンパク質の前記本来未修飾の供給源と異なる１つまたは複数の調節された官能特性と
を含む、ことと
を含む方法。
【請求項３２】
前記抽出ステップが、約６．５〜８．０のｐＨ範囲内で実施される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記沈殿ステップが、約ｐＨ５．２〜ｐＨ６．０のｐＨ範囲内で実施される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記沈殿ステップが、約ｐＨ５．４〜ｐＨ６．０のｐＨ範囲内で実施される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記沈殿ステップが、約ｐＨ５．６〜ｐＨ６．０のｐＨ範囲内で実施される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記沈殿ステップが、ｐＨ５．６、５．７、５．８、５．９または６．０で実施される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記植物タンパク質を活性炭、木炭または粘土で処理するステップをさらに含む、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
約１〜４℃の温度で低温沈殿させるステップをさらに含む、請求項３１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
遠心分離による前記精製タンパク質単離物の回収をさらに含む、請求項３１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記精製タンパク質単離物を８０％の水分含量まで再水和させること、および約ｐＨ６．０に調整することをさらに含む、請求項３１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
カルシウム塩溶液中に水性タンパク質を希釈すること、
タンパク質を熱処理によってろ過すること、
選択膜によって透析ろ過すること、
緩衝液中にタンパク質を希釈して標的用途ごとにｐＨを調整すること、
用途に応じてタンパク質を濃縮すること、および
用途に応じてタンパク質を乾燥させること、
からなる群から選択される１つまたは複数の付加的なステップをさらに含む、請求項３１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
親油性の異臭、基質または補助因子を低減することを含む、請求項３１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
異臭または芳香を調節するか、所望の風味を調節するか、または基準食品に類似するかもしくはそれと均等である感覚印象を提供する、請求項３１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
食品または飲料組成物中に前記精製緑豆タンパク質単離物を配合するステップをさらに含む、請求項３１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
請求項３１〜５０のいずれか一項に記載の方法によって製造された精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項５２】
請求項３１〜５０のいずれか一項に記載の方法を含む方法によって製造された食品または飲料組成物。
【請求項５３】
請求項３１〜５０のいずれか一項に記載の方法によって製造された卵代用品。
【請求項５４】
少なくとも６０重量％のトランスグルタミナーゼ修飾緑豆タンパク質含量と、
植物タンパク質の少なくとも５０重量％のグロブリン型タンパク質含量と、
前記植物タンパク質の本来未修飾の供給源と比べて低減された酸化酵素活性と、
前記植物タンパク質の前記本来未修飾の供給源と異なる１つまたは複数の調節された官能特性と
を含む精製緑豆タンパク質単離物。
【請求項５６】
０．０００１％〜０．０１２５％のトランスグルタミナーゼによって修飾されている、請求項５５に記載の精製タンパク質単離物。
【請求項５７】
精製タンパク質単離物の製造方法であって、
ａ．約６．５〜１０．０のｐＨの水溶液中で供給源から１つまたは複数の植物タンパク質を抽出することと、
ｂ．グロブリンリッチな画分の等電点に近いｐＨもしくは約５．２〜６．０のｐＨにおいて前記植物タンパク質を沈殿させること、または、精密ろ過もしくは限外ろ過を用いて前記植物タンパク質を分画および濃縮することと、
ｃ．前記精製タンパク質単離物を回収することであって、前記精製タンパク質単離物は、
少なくとも６０重量％の植物タンパク質含量と、
前記植物タンパク質の少なくとも５０重量％のグロブリン型タンパク質含量と、
前記植物タンパク質の本来未修飾の供給源と比べて低減された酸化酵素活性と、
前記緑豆タンパク質の前記本来未修飾の供給源と異なる１つまたは複数の調節された官能特性と
を含む、ことと
ｄ．前記抽出ステップａ．または前記回収ステップｂ．において前記緑豆タンパク質をトランスグルタミナーゼで修飾することと
を含む方法。
【請求項５８】
前記抽出ステップａ．または前記回収ステップｂにおいて前記植物タンパク質をトランスグルタミナーゼで修飾する前記ステップｄ．が、前記緑豆タンパク質を０．０００１％〜０．０１２５％のトランスグルタミナーゼと接触させることを含む、請求項５７に記載の精製タンパク質単離物の製造方法。
【請求項５９】
前記精製タンパク質単離物が、安定的に架橋されている、請求項５７または５８に記載の精製タンパク質単離物の製造方法。
【請求項６０】
前記精製タンパク質単離物が、リポキシゲナーゼまたは脂質を酸化し得る酵素を本質的に含まない、請求項５７〜５９のいずれか一項に記載の精製タンパク質単離物の製造方法。
【請求項６１】
前記トランスグルタミナーゼが、カプセル化されているか、または固体基質上に固定化されている、請求項５７〜６０のいずれか一項に記載の精製タンパク質単離物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本開示は、緑豆(mung bean)由来の組成物、このような組成物を製造するための方法、およびこのような組成物から得ることができる食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
２．背景
マメ科植物タンパク質単離物および濃縮物を抽出するために使用される従来の方法およびプロセスは、アルカリ抽出および酸沈殿または限外ろ過（湿式プロセス）、ならびに空気分級（乾式プロセス）を含む。これらの方法によって製造されるマメ科植物タンパク質組成物の品質は、これらを調製するために使用される操作条件に直接依存する。酸性、アルカリ性または中性の抽出プロセスの適用は、得られるタンパク質組成物の機能特性、例えばゲル化、発泡または乳化特性に直接影響を与え、これにより、結果として生じるタンパク質組成物は、特定の用途に適さなくなる。従って、食品用途に関連して所望の特性を付与するようにタンパク質組成物を修飾することが必要であり得る。
【０００３】
動物タンパク質代用品として大豆およびエンドウ豆などの植物ベースのタンパク質を使用することは、消費者が従来の動物ベースの製品の代替品を探し求めるにつれて一層大きく注目を集めているが、異臭を除去しながら機能特性を再現することは、依然として対処する必要のある課題である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、必要とされるのは、種々の用途に適した１つまたは複数の所望の官能特性(organoleptic property)を再現することを含む、１つまたは複数の所望の機能特性を示す精製植物タンパク質単離物を製造するための方法および組成物である。本明細書には、現在の技術の限界に対処する方法が開示される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
３．発明の概要
本明細書には、精製緑豆タンパク質単離物を製造するための方法および組成物が記載される。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、少なくとも６０重量％の緑豆タンパク質含量を含む。いくつかの実施形態では、グロブリン型タンパク質含量は、単離物中の緑豆タンパク質の少なくとも５０重量％に相当する。いくつかの実施形態では、グロブリン型タンパク質は、ビグナ・ラディアタ（Vigna radiata）の８ｓグロブリン／ベータ−コングリシニンに対して少なくとも５０％の同一性を有するタンパク質である。
【０００６】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、緑豆タンパク質の本来未修飾の供給源(otherwise unmodified source)と比べて低減された酸化酵素活性を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、緑豆タンパク質の本来未修飾の供給源と異なる１つまたは複数の調節された官能特性を含む。
【０００７】
本明細書では、広範囲の食品用途のために高機能性を有する緑豆タンパク質単離物を製造するための方法も提供される。いくつかの実施形態では、単離物を製造するための方法は、
（ａ）水溶液中で緑豆タンパク質供給源から１つまたは複数の緑豆タンパク質を抽出すること（いくつかの実施形態では、抽出は、約６．５〜１０．０のｐＨで実施される）と、
（ｂ）２つの方法：
（ｉ）グロブリンリッチな画分の等電点に近いｐＨ、例えば約５．０〜６．０のｐＨにおいて抽出物からタンパク質を沈殿させること、および／または
（ｉｉ）精密ろ過、限外ろ過もしくはイオン交換クロマトグラフィなどのろ過を用いて抽出物からタンパク質を分画および濃縮すること
の少なくとも１つを用いて抽出物からタンパク質を精製することと、
（ｃ）精製タンパク質単離物を回収することと
から選択される１つまたは複数のステップを含む。
【０００８】
特定の実施形態では、抽出は、約７．０＋／−０．２のｐＨで実施される。特定の実施形態では、緑豆タンパク質の等電沈殿は、ｐＨ５．６＋／−０．２で実施される。他の特定の実施形態では、緑豆タンパク質の等電沈殿は、ｐＨ６．０＋／−０．２で実施される。
【０００９】
緑豆タンパク質の供給源から食用緑豆タンパク質単離物を製造するためのプロセスも開示され、本プロセスは：、タンパク質リッチな画分を得るために緑豆タンパク質の供給源を分画プロセスに供することであって、タンパク質リッチな画分の少なくとも５０重量％は、１つまたは複数のグロブリン型タンパク質を含むかまたはそれからなる、こと；少なくとも１つの不純物を低減することであって、少なくとも１つの不純物は、食用緑豆タンパク質単離物における悪臭または異臭に関連する、こと；および食用緑豆タンパク質単離物を得るために、タンパク質リッチな画分を精製すること；を含み、食用タンパク質単離物の少なくとも６０重量％は、緑豆タンパク質であり、食用タンパク質単離物の酸化酵素活性は、緑豆タンパク質の供給源の対応する酸化酵素活性よりも低く、および食用タンパク質単離物の官能特性は、緑豆タンパク質の供給源の対応する官能特性と異なる。
【００１０】
本発明の好ましい態様によると、卵の置換のための方法および組成物が提供され、前記組成物は、トランスグルタミナーゼによって修飾された植物ベースのタンパク質単離物を含み、前記組成物は、卵を本質的に含まず、前記組成物は、天然の卵の１つまたは複数の機能特性を含む。好ましくは、組成物は、天然の卵の乳化特性を含む。より好ましくは、組成物は、０．０００１％〜０．０１２５％のトランスグルタミナーゼによって修飾された緑豆タンパク質単離物を提供し、かつリポキシゲナーゼまたは脂質を酸化し得る他の酵素の著しく低減された活性を示す。
【００１１】
特定の態様では、本明細書に記載される方法および組成物は、以下の特徴：渋い、豆っぽい、苦い、焦げた、バターのような、ナッツのような、甘い、酸っぱい、フルーティな、フローラルな、ウッディな、土のような、豆っぽい、スパイシーな、メタリックな、甘い、かび臭い、草のような、グリーンな、油っぽい、酢のような、ニュートラルなおよび淡白な風味または芳香(bland flavor or aromas)の１つまたは複数の調節された官能特性を有する精製タンパク質単離物を提供する。好ましくは、精製タンパク質単離物は、以下：渋い、豆っぽい、苦い、焦げた、バターのような、ナッツのような、甘い、酸っぱい、フルーティな、フローラルな、ウッディな、土のような、豆っぽい、スパイシーな、メタリックな、甘い、かび臭い、草のような、グリーンな、油っぽい、酢のような、ニュートラルなおよび淡白な風味または芳香の１つまたは複数の低減または不在などの調節された官能特性を示す。
【００１２】
精製タンパク質単離物は、種々の食品用途に適しており、例えば、卵を含まない食用エマルション、卵類似品、卵を含まないスクランブルエッグ、卵を含まないパティ、卵を含まないパウンドケーキ、卵を含まないエンゼルフードケーキ、卵を含まないイエローケーキ、卵および乳製品を含まないクリームチーズ、卵を含まないパスタ生地、卵を含まないカスタード、卵を含まないアイスクリーム、ならびに乳製品を含まない乳中に取り込まれている。精製タンパク質単離物は、クリームチーズ、パスタ生地、パスタ、乳または乳様飲料、前記乳または乳様飲料を含む食品、カスタード、アイスクリーム、冷凍デザート、食肉レプリカ（例えば、デリミートレプリカ）；乳化押出肉（emulsified extruded meat）（例えば、ソーセージ、フィッシュケーキレプリカ）；ディップ、フィリングおよびスプレッド、チップス、ならびにクラッカーの植物ベースの類似品としての使用にも適している。他の用途も本明細書に記載される機能性緑豆タンパク質単離物に適しており、上記のリストは非限定的である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】本明細書に記載される方法に従って緑豆タンパク質を単離するための一般的なプロセス図を示す。
【図１Ｂ】水抽出ステップにおいてトランスグルタミナーゼを用いてタンパク質を単離するため一般的なプロセス図を示す。
【図１Ｃ】精製ステップにおいてトランスグルタミナーゼを用いてタンパク質を単離するための一般的なプロセス図を示す。
【図１Ｄ】精製ステップにおいてトランスグルタミナーゼを用いて乾式分画によってタンパク質を単離するための一般的なプロセス図を示す。
【図２】本明細書で提供される方法に従ってタンパク質単離物を調製するためのプロセスの一実施形態を提供する。
【図３】パイロット規模のタンパク質単離のための一般的なプロセスのブロック流れ図を示す。
【図４】限外ろ過の原理を図示する。斜線は、半透膜を表し、水およびより低分子量の溶質は、それを通過して透過液中に入るが、より高分子量の溶質は、保持液中に保持される。
【図５Ａ】それぞれｐＨ４．９、５．２、５．６および６で酸沈殿を経た緑豆単離物のタンパク質純度を図示する。
【図５Ｂ】それぞれｐＨ４．９、５．２、５．６および６で酸沈殿を経た緑豆単離物のタンパク質収率を図示する。
【図６Ａ】それぞれｐＨ４．９、５．２、５．６および６で酸沈殿を経た緑豆単離物のサイズ排除クロマトグラフを示す。
【図６Ｂ】それぞれｐＨ４．９、５．２、５．６および６で酸沈殿を経た緑豆単離物のタンパク質および非タンパク質種の量を図示する。
【図７】それぞれｐＨ４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０および６．２で酸沈殿を経た緑豆単離物における全タンパク質の回収を図示する。ｙ軸は、タンパク質を含む１００．７グラムの抽出物から回収されたタンパク質のグラム数を表す。
【図８Ａ】ｐＨ４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０および６．２で酸沈殿を経た緑豆タンパク質単離物において回収された全油を図示する。ｙ軸は、サンプル（抽出物または単離物）１グラムにつき回収された粗脂肪のミリグラム数を表す。上記のｐＨ値のそれぞれで沈殿された単離物について回収された粗脂肪の量の図を提供し、沈殿前の緑豆タンパク質抽出物（左端）も含む。
【図８Ｂ】ｐＨ４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０および６．２で酸沈殿を経た緑豆タンパク質単離物において回収された全油を図示する。ｙ軸は、サンプル（抽出物または単離物）１グラムにつき回収された粗脂肪のミリグラム数を表す。ｐＨ４．４、４．６、４．８、５、５．２、５．４、５．６、５．８および６．０で沈殿された単離物について回収された粗脂肪の量のより詳細な図を提供する。
【図９Ａ】ｐＨ４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０および６．２で酸沈殿を経た緑豆タンパク質単離物において回収された脂肪酸（脂肪酸メチルエステルとして測定される）の量を図示する。測定された特定の脂肪酸は（左から右へ向かって）、Ｃ１４：０（ミリスチン酸メチル）；Ｃ１５：０（ペンタデカン酸メチル）；Ｃ１６：０（パルミチン酸メチル；Ｃ１６：１  パルミトレイン酸メチル；Ｃ１７：０  ヘプタデカン酸メチル；Ｃ１８：０  ステアリン酸メチル；Ｃ１８：１  オレイン酸メチル；Ｃ１８：２  リノール酸メチル；Ｃ１８：３  アルファリノール酸メチル；Ｃ２０：０  エイコサン酸メチル；およびＣ２２：０  ベヘン酸メチルである。上記のｐＨ値のそれぞれにおいて沈殿された単離物について回収されたこれらの脂肪酸のそれぞれの量の図を提供する。
【図９Ｂ】ｐＨ４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０および６．２で酸沈殿を経た緑豆タンパク質単離物において回収された脂肪酸（脂肪酸メチルエステルとして測定される）の量を図示する。測定された特定の脂肪酸は（左から右へ向かって）、Ｃ１４：０（ミリスチン酸メチル）；Ｃ１５：０（ペンタデカン酸メチル）；Ｃ１６：０（パルミチン酸メチル；Ｃ１６：１  パルミトレイン酸メチル；Ｃ１７：０  ヘプタデカン酸メチル；Ｃ１８：０  ステアリン酸メチル；Ｃ１８：１  オレイン酸メチル；Ｃ１８：２  リノール酸メチル；Ｃ１８：３  アルファリノール酸メチル；Ｃ２０：０  エイコサン酸メチル；およびＣ２２：０  ベヘン酸メチルである。マイナーな脂質タイプの量のより詳細な図を提供する。
【図１０】それぞれｐＨ４．４、５．０、５．６および６．０で酸沈殿を経た緑豆タンパク質単離物のゲル化開始温度を図示する。
【図１１】それぞれｐＨ４．４、５．０、５．６および６．０で酸沈殿を経た緑豆タンパク質単離物のゲル強度を図示する。
【図１２】それぞれｐＨ４．４、５．０、５．６および６．０で酸沈殿を経た緑豆タンパク質単離物のゲル弾性を図示する。
【図１３】それぞれｐＨ５．２および５．６で酸沈殿を経た緑豆タンパク質単離物から作られた卵類似品パティの硬度、粘着性(cohesiveness)、スプリング性および弾力性(resilience)を図示する。
【図１４Ａ】緑豆タンパク質抽出物のサイズ排除クロマトグラフを示す。タンパク質（８ｓグロブリンおよび１１ｓグロブリンを含む）および非タンパク質の相対的割合は表示される通りである。
【図１４Ｂ】抽出、等電沈殿および洗浄ステップによって得られた緑豆タンパク質沈殿物のサイズ排除クロマトグラフを示す。タンパク質（８ｓグロブリンおよび１１ｓグロブリンを含む）および非タンパク質の相対的割合は表示される通りである。
【図１４Ｃ】抽出および等電沈殿によって得られた緑豆タンパク質沈殿物のサイズ排除クロマトグラフを示す。タンパク質（８ｓグロブリンおよび１１ｓグロブリンを含む）および非タンパク質の相対的割合は表示される通りである。
【図１４Ｄ】抽出および等電沈殿によって得られた緑豆タンパク質沈殿物の上清のサイズ排除クロマトグラフを示す。タンパク質（８ｓグロブリンおよび１１ｓグロブリンを含む）および非タンパク質の相対的割合は表示される通りである。
【図１４Ｅ】抽出、等電沈殿および洗浄ステップによって得られた緑豆タンパク質沈殿物のサイズ排除クロマトグラフを示す。タンパク質（８ｓグロブリンおよび１１ｓグロブリンを含む）および非タンパク質の相対的割合は表示される通りである。
【図１４Ｆ】抽出、等電沈殿および洗浄ステップによって得られた緑豆タンパク質沈殿物の上清のサイズ排除クロマトグラフを示す。タンパク質（８ｓグロブリンおよび１１ｓグロブリンを含む）および非タンパク質の相対的割合は表示される通りである。
【図１５】表形式およびグラフ形式の両方で配列番号１〜１２のアミノ酸配列アライメントを提供する。
【図１６】異なる精製タンパク質単離物の変性温度プロファイルを図示する。
【図１７】異なる供給源から精製されたタンパク質単離物のアンフォールディング熱力学を研究するために使用される固体示差走査熱量測定からのプロットを表す。
【図１８】種々の精製タンパク質単離物の（Ａ）融解温度および（Ｂ）材料によって吸収される熱をグラフで表す。
【図１９】遠心分離による破壊後、加熱ゲル化後のサンプルが液体（水）を保持する能力を評価するために使用される水結合能試験からの結果を示す。
【図２０】種々の供給源からの精製タンパク質単離物のゲル化温度を示す。
【図２１】（Ａ）卵；（Ｂ）塩沈殿から得られた精製緑豆タンパク質単離物；および（Ｃ）等電沈殿から得られた精製緑豆タンパク質単離物を用いて作られた卵パティ代用品の断面を視覚的に示す。
【図２２】（◆）塩沈殿タンパク質単離物；（△）タンパク質単離物の等電沈殿を（□）全卵と比較する振動温度勾配(0scillatory temperature ramp)を図示する。
【図２３】（◆）塩沈殿タンパク質単離物；（△）タンパク質単離物の等電沈殿を（□）全卵と比較する振動振幅掃引を図示する。
【図２４】主成分分析の２次元視覚化を用いて、異なるプロセス下で配合された緑豆単離物のテクスチャ特徴を種々の卵対照のテクスチャ特徴と比較する。
【図２５】特定の精製緑豆タンパク質濃度を有するサンプルの発泡能試験からの結果を示す。
【図２６】いくつかの基準材料と比較した種々の緑豆タンパク質単離物配合物の溶解度を図示する。
【図２７】いくつかの基準材料と比較した種々の緑豆タンパク質単離物配合物の泡安定性を図示する。
【図２８】いくつかの基準材料と比較した種々の緑豆タンパク質単離物配合物のエマルション安定性を図示する。
【図２９】（Ａ）精製緑豆単離物；（Ｂ）イオタ−カラギナン＆アラビアゴムを伴う精製緑豆単離物；（Ｃ）コンニャク＆キサンタンガムを伴う精製緑豆単離物；および（Ｄ）ゲラン（gellan）を伴う精製緑豆単離物を用いて作られた４つの液体スクランブル配合物からの卵パティ代用品の断面を視覚的に示す。
【図３０】（□）市販の液体卵製品；（◇）均質化した殻を除いた全卵；および（▲）ゲランが配合された液体スクランブルにおける粘度対せん断速度の比較を示す。
【図３１】トランスグルタミナーゼで処理した抽出物および処理しない抽出物の濁度を視覚的に示す。
【図３２】種々の濃度のトランスグルタミナーゼと反応された緑豆タンパク質単離物を視覚的に示す。図１６は、種々の形式の緑豆精製タンパク質単離物を視覚的に示す。
【図３３】調理プロセス中にトランスグルタミナーゼと反応された緑豆を用いて調製されたスクランブルエッグ類似品を視覚的に示す。
【図３４】トランスグルタミナーゼによる前処理を受けた及び受けなかった、緑豆タンパク質単離物を用いたスクランブルエッグ類似品を視覚的に示す。
【図３５】等電沈殿後、様々なレベルのトランスグルタミナーゼで処理した緑豆を用いて調製された上清およびペレットのウエスタンブロットの画像を示す。
【図３６】等電沈殿後、様々なレベルのトランスグルタミナーゼで処理した緑豆を用いて調製された上清およびペレットのポンソーレッド（Ponceau red）染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ膜の画像を示す。
【図３７】等電沈殿後、様々なレベルのトランスグルタミナーゼと反応された緑豆を用いて調製された溶液の上清中の全タンパク質を図示する。
【図３８】最終タンパク質単離物のおおよその乾燥収率％を図示する。
【図３９】緑豆単離物のゲルテクスチャに対するリン酸二ナトリウム（ＤＳＰ）二水和物濃度の効果を図示する。
【図４０】緑豆単離物の分散安定性に対するＤＳＰの濃度の効果を示す。
【図４１】緑豆タンパク質単離物を用いた液体卵類似品における長鎖ヘキサメタリン酸ナトリウムの用量反応曲線を示す。
【図４２】緑豆タンパク質単離物を用いた液体卵類似品の粘度に対するヘキサメタリン酸ナトリウム鎖長の効果を示す（破線は市販の液体全卵サンプルの粘度を示す）。
【図４３】冷蔵庫内で１５日間貯蔵した後の、緑豆タンパク質単離物を用いた液体卵類似品のエマルション安定性に対する長鎖ＳＨＭＰ濃度の効果を示す。
【図４４】緑豆タンパク質単離物を用いた液体卵類似品におけるピロリン酸四ナトリウムの用量反応曲線を示す（破線は市販の液体全卵サンプルの粘度を示す）。
【図４５】本明細書で提供される緑豆タンパク質単離物組成物を用いて調製された緑豆パティのテクスチャプロファイル分析（硬度、噛み応え、スプリング性、弾力性および粘着性）の結果を図示する。
【図４６】アーモンド乳、半々の混合物および乳と比べた緑豆タンパク質飲料系の粒径を図示する。
【図４７】ココナッツ乳および豆乳と比べた緑豆タンパク質飲料系のエマルション安定性を図示する。
【図４８】緑豆タンパク質ベースのバター系を視覚的に示す。
【図４９】種々の形式の緑豆精製タンパク質単離物を視覚的に示す。
【図５０】（Ａ）卵および（Ｂ）緑豆からのタンパク質抽出物（１９％）を用いるパウンドケーキの断面を視覚的に示す。
【図５１】卵（左側）、タンパク質抽出物（中央）および再可溶化単離物（右側）を用いて作られたパウンドケーキの平面図を視覚的に示す。
【図５２】精製タンパク質単離物を用いて作られたパウンドケーキ（右側）と比較した、卵を用いて作られたパウンドケーキ（左側）の断面を視覚的に示す。
【図５３】精製タンパク質単離物を用いて作られたエンゼルフードケーキ（右側）と比較した、卵白（左側）を用いて作られたエンゼルフードケーキの側面図を視覚的に示す。
【図５４】図５３のエンゼルフードケーキの一部の断面を視覚的に示す。
【図５５】緑豆タンパク質食肉類似品、市販のチキンナゲット／ストリップおよび市販のチキンナゲット類似品を比較するテクスチャプロファイル分析を図示する。
【図５６】緑豆タンパク質食肉類似品、市販のチキンナゲット／ストリップおよび市販のチキンナゲット類似品の写真を視覚的に示す。
【図５７】４つの液体スクランブル配合物、（Ａ）塩沈殿による精製緑豆単離物；（Ｂ）等電沈殿による精製緑豆単離物；（Ｃ）精製緑豆＆小麦タンパク質単離物（５０：５０）；および（Ｄ）精製緑豆＆エンドウ豆タンパク質単離物（５０：５０）からの卵パティ代用品を視覚的に示す。
【図５８】図５７に示される４つの液体スクランブル配合物を比較する振動温度勾配を図示する。
【図５９】図５７に示される４つの液体スクランブル配合物を比較する振動振幅掃引を図示する。
【図６０】（Ａ）卵；（Ｂ）精製ゴールデンレンティルタンパク質単離物および（Ｃ）精製キマメタンパク質単離物を用いるパウンドケーキの断面を視覚的に示す。
【図６１Ａ】緑豆タンパク質単離物ベースの脂肪低減ショートニングモデルを視覚的に示す。
【図６１Ｂ】いずれも緑豆タンパク質単離物ベースの脂肪低減ショートニングモデルを用いて製造された完成ケーキおよびフロスティング類似品を示す。
【図６２Ａ】培養ステップの直前のTheromomix内の未完成の非乳製品の類似品を示す。
【図６２Ｂ】完成した非乳製品の類似品を示す。左側のサンプルは、仕上げステップを行わずに培養させたものであり、右側のサンプルは、完成品として滑らかな一貫性のために均質化されており、培養プロセスはｐＨ５で停止された。
【図６２Ｃ】完成された非乳製品の加圧クリームチーズ類似品を示す。
【図６３Ａ】緑豆タンパク質ベースのパスタ類似品の押出のために使用されるダイ＃１４３示す。
【図６３Ｂ】乾燥させた後の緑豆タンパク質ベースの完成したパスタ類似品を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
５．実施形態の詳細な説明
５．１  用語
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈が他に明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。
【００１５】
「約」という用語は、指示値およびその値の上下の範囲を示し、これらを包含する。特定の実施形態では、「約」という用語は、指定値±１０％、±５％または±１％を示す。特定の実施形態では、「約」という用語は、指定値±その値の１標準偏差を示す。
【００１６】
「低減する」という用語は、基準値と比べた指示値の減少または低下を示す。いくつかの実施形態では、「低減する」（「低減」を含む）という用語は、基準値と比べて約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％の指示値の減少または低下を指す。いくつかの実施形態では、「低減する」（「低減」を含む）という用語は、基準値と比べて少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％の指示値の減少または低下を指す。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「卵」という用語は、鶏卵、他の鳥の卵（例えば、ウズラ卵、アヒル卵、ダチョウ卵、シチメンチョウ卵、チャボ卵、ガチョウ卵など）および魚の卵、例えば魚卵を含むがこれらに限定されない。典型的な食品用途比較は、鶏卵に関して行われる。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「強化」という用語は、基準サンプル中のその分子のパーセント量と比べて１つのサンプル中の分子、例えばタンパク質のパーセント量の増大を指す。例えば、全緑豆と比べて特定のタイプのグロブリンタンパク質において強化された単離物は、単離物中の全タンパク質の量の割合として表される単離物中のグロブリンタンパク質の量が、全緑豆中の全タンパク質の量の割合として表される全緑豆中のグロブリンタンパク質の量よりも高いことを意味する。いくつかの実施形態では、強化は重量対重量に基づく。いくつかの実施形態では、強化は、基準値または量と比べて約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％の増大を指す。いくつかの実施形態では、強化は、基準値または量と比べて少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％の増大を指す。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「単離物の植物供給源」は、全緑豆などの全植物材料、または植物から作られた中間材料、例えば脱皮豆、粉、粉末、ミール、粉砕穀物、ケーキ（例えば、脱脂または脱油ケーキなど）、または精製タンパク質単離物を製造するための本明細書で開示される加工技術に適した任意の他の中間材料を指す。
【００２０】
「トランスグルタミナーゼ」という用語は、ＥＣ２．３．２．１３として分類されている、γ−カルボキシアミド基と種々の第１級アミンとの間のアシル転移を触媒する酵素（Ｒ−グルタミル−ペプチド：アミングルタミルトランスフェラーゼ）を指す。トランスグルタミナーゼは、食品産業において、乳製品、食肉および穀物製品などのいくつかの食品のテクスチャを改善するために使用される。トランスグルタミナーゼは、細菌源、真菌、かび、魚、哺乳類および植物から単離することができる。
【００２１】
特定の成分、例えばタンパク質含量に関連して「大部分」または「主に」という用語は、参照されるバッチ、プロセスストリーム、食品配合物または組成物の少なくとも５０重量％を有する成分を指す。
【００２２】
他に記載されない限り、成分の割合（％）は、他に記載されない限り、通常、乾燥重量に基づく全重量％を指す。
【００２３】
「精製タンパク質単離物」、「タンパク質単離物」、「単離物」、「沈殿物」、「タンパク質抽出物」、「単離タンパク質」または「単離ポリペプチド」という用語は、タンパク質画分、タンパク質またはポリペプチドを指し、その起源または由来源により、（１）その天然状態で付随される天然関連成分と関連しないか、（２）天然に見られない純度で存在する（ここで、純度は、他の細胞物質の存在に関して調整することができる（例えば、同じ種からの他のタンパク質を含まない））か、（３）異なる種からの細胞によって発現されるか、または（４）天然に存在しない（例えば、それは、天然に見られるポリペプチドの断片であるか、あるいは天然に見られないアミノ酸類似品もしくは誘導体または標準ペプチド結合以外の連結を含む）。１つまたは複数のタンパク質または画分は、残留している原料物質および／または非固体タンパク質材料から部分的に除去または分離され得、従って天然に存在せず、天然において通常見られない。ポリペプチドまたはタンパク質は、当該技術分野で知られておりかつ本明細書に記載されるようなタンパク質精製技術を用いる単離により、天然関連成分を実質的に含まないものとされてもよい。化学的に合成されるか、またはそれが天然に由来する細胞と異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、その天然関連成分から「単離される」であろう。このように定義されるため、「単離」は、そのように記載されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドがその天然環境から物理的に除去されていることを必ずしも必要としない。
【００２４】
配列同一性パーセントとも呼ばれるポリペプチドの配列相同性は、通常、配列分析ソフトウェアを用いて測定される。例えば、Genetics Computer Group (GCG), University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wis. 53705のSequence Analysis Software Packageを参照されたい。タンパク質分析ソフトウェアは、種々の置換、欠失および他の修飾（保存的アミノ酸置換を含む）に割り当てられた相同性の尺度を使用して類似配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧは、密接に関連したポリペプチド（例えば、異なる種の生物からの相同ポリペプチドなど）間または野生型タンパク質とその突然変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を決定するためにデフォルトパラメータと共に使用され得る「Gap」および「Bestfit」などのプログラムを含有する。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。
【００２５】
特定のポリペプチド配列を、異なる生物からの多数の配列を含有するデータベースと比較する場合に好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)；Gish and States, Nature Genet. 3:266-272 (1993)；Madden et al., Meth. Enzymol. 266:131-141 (1996)；Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)；Zhang and Madden, Genome Res. 7:649-656 (1997)）、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)）である。
【００２６】
ＢＬＡＳＴｐのための好ましいパラメータは、予測値：１０（デフォルト）；フィルタ：seg（デフォルト）；コスト対オープンギャップ：１１（デフォルト）；コスト対エクステンドギャップ：１（デフォルト）；最大アライメント：１００（デフォルト）；ワードサイズ：１１（デフォルト）；記述の数：１００（デフォルト）；ペナルティマトリックス：BLOWSUM62である。
【００２７】
相同性について比較されるポリペプチド配列の長さは、一般的に、少なくとも約１６のアミノ酸残基、通例、少なくとも約２０の残基、より通例には少なくとも約２４の残基、通常、少なくとも約２８の残基、好ましくは約３５超の残基であろう。多数の異なる生物からの配列を含有するデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較するのが好ましい。アミノ酸配列を用いて検索するデータベースは、当該技術分野で既知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって測定することができる。例えば、ポリペプチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１中のプログラムであるＦＡＳＴＡを用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリー配列と検索配列との間の最良のオーバーラップ領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する。Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990)（参照により本明細書に援用される）。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性パーセントは、ＧＣＧバージョン６．１（参照により本明細書に援用される）において提供されるように、そのデフォルトパラメータ（ワードサイズ２およびＰＡＭ２５０スコアリングマトリックス）を用いるＦＡＳＴＡを使用して決定することができる。
【００２８】
５．２  緑豆タンパク質単離物組成物
本明細書には、高タンパク質含量、高タンパク質純度、低分子量の非タンパク質種（単糖および二糖を含む）の保持の低下、油および脂質の保持の低下、高いゲル強度およびゲル弾性などの優れた構造構築特性、優れた感覚特性、ならびに高機能性８ｓグロブリン／ベータコングリシニンタンパク質の選択的強化を含むが、これらに限定されない１つまたは複数の望ましい食品品質を含む、１つまたは複数の食用緑豆タンパク質単離物が提供される。
【００２９】
好ましい実施形態では、本明細書で提供されるタンパク質単離物は、緑豆に由来する。いくつかの実施形態では、緑豆は、ビグナ・ラディアタ（Vigna radiata）である。本発明の種々の態様では、本明細書に記載される精製緑豆タンパク質単離物は、Ｖ．ラディアタ（V. radiata）の任意の変種または栽培種を含む緑豆タンパク質の任意の供給源から製造することができる。例えば、タンパク質単離物は、全緑豆などの全植物材料から、または植物から作られる中間材料、例えば脱皮豆、粉、粉末、ミール、粉砕穀物、ケーキ（例えば、脱脂または脱油ケーキなど）、または精製タンパク質単離物を製造するための本明細書で開示される加工技術に適した任意の他の中間材料から直接調製することができる。いくつかの実施形態では、植物タンパク質の供給源は、２つ以上の中間材料の混合物であり得る。本明細書で提供される候補中間材料の例は、限定を意図されない。
【００３０】
好ましい実施形態では、本明細書で提供されるのは、主にタンパク質ベースの画分を含む緑豆タンパク質単離物組成物である。好ましい実施形態では、タンパク質画分は、緑豆単離物の５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらに１００％である。好ましい実施形態では、精製単離物の少なくとも６０重量％は、タンパク質画分である。好ましい実施形態では、精製単離物の少なくとも６５重量％は、タンパク質画分である。好ましい実施形態では、精製単離物の少なくとも７０重量％は、タンパク質画分である。いくつかの実施形態では、精製単離物の少なくとも７５重量％は、タンパク質画分である。いくつかの実施形態では、精製単離物の少なくとも８０重量％は、タンパク質画分である。いくつかの実施形態では、精製単離物の約９５重量％は、タンパク質画分である。
【００３１】
好ましい実施形態は、少なくとも１つのグロブリン型タンパク質からなるかまたはそれを含む少なくとも５０重量％のタンパク質を含む、緑豆からの高純度のタンパク質単離物を含む。特定の理論により拘束されることは望まないが、グロブリン画分は、機能性の基礎を提供すると考えられる。従って、精製タンパク質単離物は、全緑豆と比べてグロブリンタンパク質が強化されている。いくつかの実施形態では、グロブリン様タンパク質は、緑豆８ｓグロブリン／ベータ−コングリシニンである。いくつかの実施形態では、単離物のタンパク質画分の少なくとも約１０重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％または８５重量％超は、緑豆８ｓグロブリン／ベータ−コングリシニンからなるかまたはそれを含む。他の実施形態では、タンパク質画分の約６０重量％〜８０重量％、６５重量％〜８５重量％、７０重量％〜９０重量％または７５重量％〜９５重量％は、緑豆８ｓグロブリン／ベータ−コングリシニンからなるかまたはそれを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、精製タンパク質単離物は、１００〜２００ｇ／Ｌ以上で濃縮される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、緑豆単離物組成物は、全緑豆または緑豆粉と比べて１１ｓグロブリンの量が低減される。いくつかの実施形態では、１１ｓグロブリンの量は、単離物のタンパク質画分の１０％、８％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％未満である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、組成物中のタンパク質は、非変性タンパク質を含む。他の実施形態では、組成物中のタンパク質は、変性タンパク質を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源に由来する約１％〜１０％、２％〜９％、３％〜８％または４％〜６％の炭水化物（例えば、デンプン、多糖、繊維）を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源に由来する約１０％、９％、８％、７％、６％または５％未満の炭水化物を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源に由来する約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または約１％の炭水化物を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法の実施は、緑豆タンパク質供給源中で本来見られる炭水化物の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％が低減された緑豆タンパク質単離物の製造をもたらす。
【００３６】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源に由来する約１％〜１０％、２％〜９％、３％〜８％または４％〜６％の灰分を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源に由来する約１０％、９％、８％、７％、６％または５％未満の灰分を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源に由来する約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または約１％の灰分を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法の実施は、緑豆タンパク質供給源中で本来見られる灰分の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％が低減された緑豆タンパク質単離物の製造をもたらす。
【００３７】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源に由来する約１％〜１０％、２％〜９％、３％〜８％または４％〜６％の脂肪を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源に由来する約１０％、９％、８％、７％、６％または５％未満の脂肪を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源に由来する約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または約１％の脂肪を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法の実施は、緑豆タンパク質供給源中で本来見られる脂肪の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％が低減された緑豆タンパク質単離物の製造をもたらす。
【００３８】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源に由来する約１％〜１０％の水分を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源に由来する約１０％、９％、８％、７％、６％または５％未満の水分を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源に由来する約９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または約１％の水分を含む。
【００３９】
特定の実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源に由来する１０％未満の炭水化物、８％未満の灰分、５％未満の脂肪および７％未満の水分を含む。
【００４０】
５．２．１  単離物組成物の緑豆タンパク質
マメ科の植物は、多数のタイプのタンパク質を含有し、そのうちの２つは、グロブリンおよびアルブミンである。グロブリンおよびアルブミンは、可溶性タンパク質であり、緑豆中の全タンパク質の大部分を構成する。グロブリンは、レグミン、ビシリンおよびコンビシリンにさらに分類され得る。既知の５，０００程度のＶ．ラディアタ（V. radiata）変種間において、タンパク質レベルは、約２０〜３０％の範囲である。
【００４１】
本明細書で提供される単離物のタンパク質画分の重量による大部分を構成するグロブリン型タンパク質は、全て同じタイプのグロブリン型タンパク質を有し得るか、または２つ以上のタイプのグロブリン型タンパク質を含み得る。例えば、グロブリン型タンパク質は、７Ｓグロブリン、８Ｓグロブリンおよび／または１１Ｓグロブリンを含み得る。いくつかの実施形態では、グロブリン型タンパク質は、主に８Ｓグロブリンであり、これは、グロブリン型タンパク質の重量による大部分が８Ｓグロブリンであることを意味する。グロブリン型タンパク質は、同様にまたは代替的に、７Ｓ、８Ｓおよび／または１１Ｓグロブリンと相同のタンパク質を含み得る。
【００４２】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される緑豆タンパク質単離物のグロブリン型タンパク質は、ベータ−コングリシニンタンパク質である。いくつかの実施形態では、ベータ−コングリシニンタンパク質は、配列番号１と少なくとも５０％同一である。いくつかの実施形態では、ベータ−コングリシニンタンパク質は、配列番号１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９０％を超えて、または９５％を超えて同一である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、緑豆からの１つまたは複数のグロブリン型タンパク質（例えば、７Ｓ、８Ｓ、１１Ｓ）と少なくとも７５％同一の配列を有するタンパク質を含み、このタンパク質は、単離物の植物供給源中で見られるタンパク質の量に対して単離物中で強化されている。いくつかの実施形態では、強化タンパク質は、緑豆からの１つまたは複数のグロブリン型タンパク質（例えば、７Ｓ、８Ｓ、１１Ｓ）と少なくとも５０％、６０、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％またはさらにより高い同一性を有する。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される強化緑豆タンパク質単離物は、以下のＮＣＢＩ受入番号：ＸＰ＿０１４５２４３５４（配列番号１）、ＮＰ＿００１３０４２２９（配列番号２）、ＸＰ＿０１４５２３９３８（配列番号３）、ＮＰ＿００１３０４２０２（配列番号４）、ＮＰ＿００１３０４２３１（配列番号５）、ＸＰ＿０１４５２３９２３（配列番号６）、ＸＰ＿０１４５０７３６３（配列番号７）、ＸＰ＿０１４４９２５３６（配列番号８）、ＸＰ＿０１４５２１７５８（配列番号９）、ＸＰ＿０１４５１５６６９（配列番号１０）、ＸＰ＿０１４５２３９３６（配列番号１１）およびＸＰ＿０１４５２４３５３（配列番号１２）に対応する配列の群から選択される配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、以下のＮＣＢＩ受入番号：ＸＰ＿０１４５２４３５４（配列番号１）、ＮＰ＿００１３０４２２９（配列番号２）、ＸＰ＿０１４５２３９３８（配列番号３）、ＮＰ＿００１３０４２０２（配列番号４）、ＮＰ＿００１３０４２３１（配列番号５）、ＸＰ＿０１４５２３９２３（配列番号６）、ＸＰ＿０１４５０７３６３（配列番号７）、ＸＰ＿０１４４９２５３６（配列番号８）、ＸＰ＿０１４５２１７５８（配列番号９）、ＸＰ＿０１４５１５６６９（配列番号１０）、ＸＰ＿０１４５２３９３６（配列番号１１）およびＸＰ＿０１４５２４３５３（配列番号１２）に対応する配列の群から選択される配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列を含む、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれを超える強化タンパク質を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の全タンパク質の少なくとも１％である量において、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質の量は、単離物の少なくとも５、１０、１５または２０％である。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源中で見られるタンパク質の量に対して、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質について強化されている。いくつかの実施形態では、強化タンパク質は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２０％を超えて強化されている。前述の実施形態のいずれかにおいて、緑豆タンパク質単離物は、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を含むことができる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の全タンパク質の少なくとも１％である量において、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質の量は、単離物の少なくとも５、１０、１５または２０％である。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源中で見られるタンパク質の量に対して、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質について強化されている。いくつかの実施形態では、強化タンパク質は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２０％を超えて強化されている。前述の実施形態のいずれかにおいて、緑豆タンパク質単離物は、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を含むことができる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の全タンパク質の少なくとも１％である量において、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質の量は、単離物の少なくとも５、１０、１５または２０％である。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源中で見られるタンパク質の量に対して、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質について強化されている。いくつかの実施形態では、強化タンパク質は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２０％を超えて強化されている。前述の実施形態のいずれかにおいて、緑豆タンパク質単離物は、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を含むことができる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の全タンパク質の少なくとも１％である量において、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質の量は、単離物の少なくとも５、１０、１５または２０％である。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源中で見られるタンパク質の量に対して、配列番号４と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質について強化されている。いくつかの実施形態では、強化タンパク質は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２０％を超えて強化されている。前述の実施形態のいずれかにおいて、緑豆タンパク質単離物は、配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を含むことができる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の全タンパク質の少なくとも１％である量において、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質の量は、単離物の少なくとも５、１０、１５または２０％である。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源中で見られるタンパク質の量に対して、配列番号５と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質について強化されている。いくつかの実施形態では、強化タンパク質は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２０％を超えて強化されている。前述の実施形態のいずれかにおいて、緑豆タンパク質単離物は、配列番号５と少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を含むことができる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の全タンパク質の少なくとも１％である量において、配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質の量は、単離物の少なくとも５、１０、１５または２０％である。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源中で見られるタンパク質の量に対して、配列番号６と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質について強化されている。いくつかの実施形態では、強化タンパク質は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２０％を超えて強化されている。前述の実施形態のいずれかにおいて、緑豆タンパク質単離物は、配列番号６と少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を含むことができる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、配列番号７と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の全タンパク質の少なくとも１％である量において、配列番号７と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、配列番号７と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質の量は、単離物の少なくとも５、１０、１５または２０％である。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源中で見られるタンパク質の量に対して、配列番号７と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質について強化されている。いくつかの実施形態では、強化タンパク質は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２０％を超えて強化されている。前述の実施形態のいずれかにおいて、緑豆タンパク質単離物は、配列番号７と少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を含むことができる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、配列番号８と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の全タンパク質の少なくとも１％である量において、配列番号８と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、配列番号８と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質の量は、単離物の少なくとも５、１０、１５または２０％である。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源中で見られるタンパク質の量に対して、配列番号８と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質について強化されている。いくつかの実施形態では、強化タンパク質は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２０％を超えて強化されている。前述の実施形態のいずれかにおいて、緑豆タンパク質単離物は、配列番号８と少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を含むことができる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、配列番号９と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の全タンパク質の少なくとも１％である量において、配列番号９と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、配列番号９と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質の量は、単離物の少なくとも５、１０、１５または２０％である。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源中で見られるタンパク質の量に対して、配列番号９と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質について強化されている。いくつかの実施形態では、強化タンパク質は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２０％を超えて強化されている。前述の実施形態のいずれかにおいて、緑豆タンパク質単離物は、配列番号９と少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を含むことができる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、配列番号１０と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の全タンパク質の少なくとも１％である量において、配列番号１０と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１０と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質の量は、単離物の少なくとも５、１０、１５または２０％である。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源中で見られるタンパク質の量に対して、配列番号１０と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質について強化されている。いくつかの実施形態では、強化タンパク質は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２０％を超えて強化されている。前述の実施形態のいずれかにおいて、緑豆タンパク質単離物は、配列番号１０と少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を含むことができる。
【００５５】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、配列番号１１と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の全タンパク質の少なくとも１％である量において、配列番号１１と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１１と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質の量は、単離物の少なくとも５、１０、１５または２０％である。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源中で見られるタンパク質の量に対して、配列番号１１と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質について強化されている。いくつかの実施形態では、強化タンパク質は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２０％を超えて強化されている。前述の実施形態のいずれかにおいて、緑豆タンパク質単離物は、配列番号１１と少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を含むことができる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、配列番号１２と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の全タンパク質の少なくとも１％である量において、配列番号１２と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１２と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質の量は、単離物の少なくとも５、１０、１５または２０％である。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源中で見られるタンパク質の量に対して、配列番号１２と少なくとも９０％の同一性を有するタンパク質について強化されている。いくつかの実施形態では、強化タンパク質は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％または２０％を超えて強化されている。前述の実施形態のいずれかにおいて、緑豆タンパク質単離物は、配列番号１２と少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質を含むことができる。
【００５７】
他の実施形態によると、上記のタンパク質の断片を含む精製タンパク質単離物が提供される。これらの断片は、好ましくは、少なくとも２０の隣接アミノ酸を含み、より好ましくは少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれを超える隣接アミノ酸を含む。
【００５８】
５．２．２  低減されたアレルゲン含量
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される緑豆タンパク質単離物は、低減されたアレルゲン含量を有する。いくつかの実施形態では、低減されたアレルゲン含量は、単離物の植物供給源のアレルゲン含量に対するものである。緑豆タンパク質単離物またはタンパク質単離物を含む組成物は、動物質を含まず、乳製品を含まず、大豆を含まず、かつグルテンを含まないものであり得る。卵に対して通常アレルギーがある対象で提示される、じんま疹または発疹、腫れ、喘鳴、胃痛、筋痙攣、下痢、嘔吐、眩暈およびさらにはアナフィラキシーなどの有害な免疫応答が回避され得る。さらに、タンパク質単離物を含む精製タンパク質単離物または組成物は、乳、卵、大豆および小麦アレルゲンに基づいて、対象でアレルギー反応を誘発し得ない。従って、いくつかの実施形態では、タンパク質単離物は、実質的にアレルゲンフリーである。いくつかの実施形態では、Ｖｉｇ  ｒ１、Ｖｉｇ  ｒ２、Ｖｉｇ  ｒ４およびＶｉｇ  ｒ６などのタンパク質も回避される。特定の実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、受入番号ＡＡＸ１９８８９．１（配列番号１３）に対応する病原性関連タンパク質（ＰＲ−１０）に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を、低減された（単離物の植物供給源と比べて）または非検出可能な量で有する。
【００５９】
５．２．３  低減された抗栄養因子
食事性の抗栄養因子は、タンパク質の消化率、アミノ酸の生物学的利用能および食品のタンパク質品質に悪影響を与え得る化学物質である（Gilani et al., 2012）。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される緑豆タンパク質単離物は、抗栄養因子の量が低減されている。いくつかの実施形態では、低減された抗栄養因子の量は、単離物の植物供給源のアレルゲン含量に対するものである。いくつかの実施形態では、低減された抗栄養因子は、タンニン、フィチン酸、ヘマグルチニン（レクチン）、ポリフェノール、トリプシン阻害剤、α−アミラーゼ阻害剤、レクチンおよびプロテアーゼ阻害剤からなる群から選択される。特定の実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、受入番号ＸＰ＿０１４５１２５６５（配列番号１４）に対応するレクチンタンパク質に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を、低減された（単離物の植物供給源と比べて）または非検出可能な量で有する。別の特定の実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、受入番号ＸＰ＿０１４５０５１８１（配列番号１５）に対応するプロテアーゼに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％またはより高い同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を、低減された（単離物の植物供給源と比べて）または非検出可能な量で有する。
【００６０】
５．２．４  低減された環境汚染物質
有利には、本明細書で提供される緑豆タンパク質単離物を製造するための方法は、１つまたは複数の低減された環境汚染物質（単離物の植物供給源と比べて）を有する食品安全性の組成物を製造する。好ましい実施形態では、環境汚染物質は、緑豆タンパク質単離物から０．１ｐｐｍの検出レベル未満に除去されているか、または毒物学的な有意性を示さないレベルで存在する。いくつかの実施形態では、低減された環境汚染物質は、残留農薬である。いくつかの実施形態では、残留農薬は、アラクロル、アルドリン、アルファ−ＢＨＣ、アルファ−クロルデン、ベータ−ＢＨＣ、ＤＤＤ、ＤＤＥ、ＤＤＴ、デルタ−ＢＨＣ、ジエルドリン、エンドスルファンＩ、エンドスルファンＩＩ、エンドスルファンスルファート、エンドリン、エンドリンアルデヒド、ガンマ−ＢＨＣ、ガンマ−クロルデン、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキシド、メトキシクロルおよびペルメトリンを含む塩素系農薬；ならびにアジノホスメチル、カルボフェノチオン、クロルフェンビンホス、クロルピリホスメチル、ジアジノン、ジクロルボス、ダーズバン、ジホナート、エチオン、フェニトロチオン、マラチオン、メチダチオン、メチルパラチオン、パラチオン、ホサロンおよびピリミホスメチルを含む有機リン系農薬からなる群から選択される。
【００６１】
他の実施形態では、低減された環境汚染物質は、ダイオキシンおよびポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）の残留物から選択される。さらに他の実施形態では、低減された環境汚染物質は、マイコトキシンである。いくつかの実施形態では、マイコトキシンは、アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２およびオクラトキシンＡからなる群から選択される。
【００６２】
５．３  緑豆タンパク質単離物を製造するための方法
本明細書では、広範囲の食品用途のために高機能性を有する緑豆タンパク質単離物を製造するための方法も提供される。いくつかの実施形態では、単離物を製造するための方法は、
（ａ）水溶液中で緑豆タンパク質供給源から１つまたは複数の緑豆タンパク質を抽出すること（いくつかの実施形態では、抽出は、約６．５〜１０．０のｐＨで実施される）と、
（ｂ）２つの方法：
（ｉ）グロブリンリッチな画分の等電点に近いｐＨ、例えば約５．０〜６．０のｐＨにおいて抽出物からタンパク質を沈殿させること、および／または
（ｉｉ）精密ろ過、限外ろ過またはイオン交換クロマトグラフィなどのろ過を用いて抽出物からタンパク質を分画および濃縮すること
の少なくとも１つを用いて抽出物からタンパク質を精製することと、
（ｃ）精製タンパク質単離物を回収することと
から選択される１つまたは複数のステップを含む。
【００６３】
好ましい実施形態では、本明細書で提供される方法は、以下の特徴：少なくとも６０重量％のタンパク質含量；タンパク質含量の少なくとも５０重量％のグロブリン型タンパク質含量；緑豆タンパク質の本来未修飾の供給源と比べて低減された酸化酵素活性；および緑豆タンパク質の本来未修飾の供給源と異なる１つまたは複数の調節された官能特性；の１つまたは複数を含む緑豆タンパク質単離物を生じさせる。
【００６４】
好ましい実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、一連の機械的プロセスを用いて製造され、使用される化学物質は、水酸化ナトリウムおよびクエン酸などのｐＨ調整剤、ならびに単離物の風味に影響を与え得る脂質酸化活性を防止するためのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のみである。
【００６５】
５．３．１  脱皮および製粉
本明細書で提供される緑豆タンパク質単離物は、緑豆タンパク質の任意の適切な供給源から調製され得るが、出発材料が全緑豆などの全植物材料である場合、本明細書で提供される方法の第１のステップは、原材料を脱皮することを含む。いくつかのこのような実施形態では、原料緑豆は、種皮（穀皮）および果皮（ブラン）を除去するために穴あけ（pitting）、浸漬および乾燥の１つまたは複数のステップで脱皮され得る。脱皮緑豆は、次に製粉されて、明確に定義された粒子分布サイズを有する粉が生じる。いくつかの実施形態では、粒子分布サイズは、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００または１００μｍ未満である。特定の実施形態では、抽出ステップ中にタンパク質の割合および収率を増大させるために、粒子分布サイズは、３００μｍ未満である。使用されるミルのタイプは、ハンマーミル、ピンミル、ナイフミル、バリミルおよび空気分級ミルの１つまたは組み合わせを含み得る。
【００６６】
実行可能な場合、得られた粉の空気分級は、タンパク質抽出プロセスを促進し、プロセス全体の効率を高めるために必要であると考えられる。使用される方法は、空気分級ミルなどの微粉砕ミルを用いて、通常４５μｍ未満である粒径まで緑豆が製粉されることを保証し得る。得られる粉は、次に、空気分級機を通過され、これにより、粉は、粗粒画分および細粒画分の両方に分離される。粉に空気分級機を通過させる行為は、粉中の利用可能なタンパク質の大部分を粉の全質量のより小さい部分に濃縮することが意図される。典型的な細粒画分（高タンパク質）の収率は、１０〜５０％であり得る。細粒画分は、２０μｍ未満の粒径を有する傾向があるが、これは、最初の緑豆生育シーズンおよび地域によって影響され得る。高タンパク質画分は、通常、最初のサンプル中のタンパク質の１５０〜２２０％を含有する。結果として得られるデンプンリッチな副産物ストリームも付加価値となり、同様に実行可能で販売可能な利益を有する。
【００６７】
５．３．２  抽出
好ましい実施形態では、方法は、抽出ステップを含む。抽出ステップのいくつかの実施形態では、中間出発材料、例えば緑豆粉は、水溶液と混合されてスラリーを形成する。いくつかの実施形態では、水溶液は、水、例えば軟水である。水抽出は、例えば、約３〜１５部の水抽出溶液に対して１部の植物タンパク質の供給源（例えば、粉）を含む水溶液を作ることを含み得る。他の実施形態では、１部の植物タンパク質の供給源につき５〜１０体積の水抽出溶液が使用される。水抽出溶液対粉のさらなる有用な比率は、１：１、２：１、４：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１または１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５を含む。
【００６８】
好ましくは、水抽出は、冷却した混合タンク内において、所望の温度、例えば約２〜１０℃で実施されてスラリーを形成する。いくつかの実施形態では、混合は、中程度〜高度のせん断下で実施される。いくつかの実施形態では、混合プロセス中の発泡を低減するために食品グレードの消泡剤（例えば、ＫＦＯ ４０２ポリグリコール）がスラリーに添加される。他の実施形態では、抽出中に消泡剤は利用されない。
【００６９】
スラリーのｐＨは、標的タンパク質の水溶液中への可溶化のために所望の抽出ｐＨに達するように、食品グレードの５０％水酸化ナトリウム溶液を用いて調整され得る。いくつかの実施形態では、抽出は、約６．５〜１０．０のｐＨで実施される。他の実施形態では、抽出は、中性または中性に近いｐＨで実施される。いくつかの実施形態では、抽出は、約ｐＨ５．５〜ｐＨ９、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．５またはより好ましくはｐＨ６．５〜ｐＨ８のｐＨで実施される。特定の実施形態では、抽出は、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９または１０．０のｐＨで実施される。特定の実施形態では、抽出は、約７．０のｐＨで実施される。
【００７０】
抽出に続いて、可溶化されたタンパク質抽出物は、例えば、デカンタおよびディスクスタック遠心分離機からなる固体／液体分離ユニットにおいてスラリーから分離される。抽出物は、低温、好ましくは３〜１０℃の温度で遠心分離される。抽出物は、捕集され、ペレットは、好ましくは水対粉３：１で再懸濁される。ｐＨが再度調整され、遠心分離される。両方の抽出物を合わせ、ナイロンメッシュを用いてろ過する。
【００７１】
５．３．３  木炭処理
任意選択的に、タンパク質抽出物は、タンパク質抽出から非タンパク質、異臭成分および付加的な繊維状固体を除去するために炭素吸着ステップが行われ得る。この炭素吸着ステップは、清澄化タンパク質抽出物をもたらす。炭素吸着ステップの一実施形態では、タンパク質抽出物は、次に、４〜８℃において、食品グレードの顆粒状木炭が充填された環状バスケットカラム（＜５％ｗ／ｗの木炭対タンパク質抽出物比）へ送られる。実例となる炭素吸着プロトコルは、以下の実施例１でも提供される。
【００７２】
５．３．４  酸沈殿
いくつかの実施形態では、抽出と、任意選択的に炭素吸着とに続いて、清澄化タンパク質抽出物は、冷却条件（例えば、２〜８℃）下において、その等電点に達するまで食品安全性の酸性溶液によって酸性化される。この条件下において、標的タンパク質は、沈殿し、水溶液から分離可能になる。いくつかの実施形態では、水溶液のｐＨは、タンパク質リッチな画分中の１つまたは複数のグロブリン型タンパク質の少なくとも１つ、例えば緑豆８ｓ／ベータコングリシニンの等電点付近に調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、調整ステップ前に約６．５〜１０．０の初期ｐＨを有するタンパク質抽出物を含む水溶液から調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約５．０〜６．５に調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約５．２〜６．５、５．３〜６．５、５．４〜６．５、５．５〜６．５または５．６〜６．５に調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約５．２〜６．０、５．３〜６．０、５．４〜６．０、５．５〜６．０または５．６〜６．０に調整される。特定の実施形態では、ｐＨは、約ｐＨ５．４〜５．８に調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１または６．２に調整される。
【００７３】
本明細書で提供される方法の好ましい実施形態では、約ｐＨ５．６〜ｐＨ６．０の範囲にｐＨが調整され、所望の緑豆タンパク質の沈殿が達成される。理論により拘束されないが、約ｐＨ５．６〜ｐＨ６．０の範囲の等電沈殿は、タンパク質収率、タンパク質純度、低分子量の非タンパク質種（単糖および二糖を含む）の保持の低下、油および脂質の保持の低下、高いゲル強度およびゲル弾性などの構造構築特性、優れた感覚特性、ならびに高機能性８ｓグロブリン／ベータコングリシニンタンパク質の選択的強化から選択される１つまたは複数の品質に関して優れた緑豆タンパク質単離物をもたらすと考えられる。本明細書で提供される方法によって調製される緑豆タンパク質単離物のこれらの予想外に優れた特徴は、例えば、実施例６および８において記載される。以下の実施例６に記載される結果によって実証されるように、約ｐＨ５．６〜ｐＨ６．０のｐＨ範囲で酸沈殿を経た緑豆タンパク質単離物は、ｐＨ５．６未満のｐＨで酸沈殿を経た緑豆タンパク質単離物と比較して、タンパク質の回収（小分子の回収と比較して）、ゲル化開始温度、ゲル強度、ゲル弾性および感覚特性に関して優れた品質を実証した。約ｐＨ５．２〜ｐＨ５．８のｐＨ範囲で酸沈殿を経た緑豆タンパク質単離物は、この範囲外で酸沈殿を経た緑豆タンパク質単離物と比較したときに実質的により低い脂質保持も実証した。
【００７４】
タンパク質沈殿を誘導するのに適した食品グレードの酸には、リンゴ酸、乳酸、塩酸およびクエン酸が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、沈殿は、２０％の食品グレードのクエン酸溶液によって実施される。他の実施形態では、沈殿は、４０％の食品グレードのクエン酸溶液によって実施される。
【００７５】
いくつかの実施形態では、異臭化合物を生じ得る脂質の酸化を阻害するために、ｐＨ調整に加えて、ＥＤＴＡ、例えば２ｍＭの食品グレードのＥＤＴＡが沈殿溶液に添加され得る。
【００７６】
代替実施形態では、沈殿ステップは、低温沈殿（１〜４℃）と組み合わせたｐＨ５．６における等電沈殿を含み、ここで、ｐＨは、５．４〜５．８に調整される。
【００７７】
別の代替実施形態では、高流速における低イオン強度沈殿が低温沈殿（１〜４℃）と組み合わせられる。いくつかのこのような実施形態では、ろ液の急速希釈は、３体積の冷却０．３％ＮａＣｌに対して１体積の上清の比率において冷（１〜４℃）０．３％ＮａＣｌ中で実施される。付加的な再懸濁および均質化ステップは、所望のタンパク質単離物の生成を保証する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、沈殿したタンパク質スラリーは、次に、ｐＨ調整された水溶液から除去され、固体／液体分離ユニット（例えば、１つのディスクスタック遠心分離機）に送られる。本方法のいくつかの実施形態では、０．３％（ｗ／ｗ）食品グレード塩化ナトリウムの添加によって分離が起こり、重い相中にタンパク質凝固物が回収される。好ましい実施形態では、タンパク質凝固物は、冷却条件（２〜８℃）下で４体積の軟水で洗浄され、繊維状固体、塩および炭水化物などの最終残留不純物が除去される。
【００７９】
５．３．５  ろ過
本方法のいくつかの実施形態では、ろ過は、酸沈殿の代替としてまたは酸沈殿に加えて使用される。理論により拘束されないが、タンパク質の酸沈殿は、小分子の除去を促進するが、沈殿／タンパク質の強凝集事象を回避するために限界ろ過（ＵＦ）などの代替方法が使用され得ると考えられる。従って、いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物を得るためのタンパク質リッチな画分の精製は、少なくとも１つの選択膜を利用してろ過、精密ろ過または限外ろ過手順を実施することを含む。実例となるプロトコルは、以下の実施例３４において提供される。
【００８０】
５．３．６  殺菌
いくつかの実施形態では、酸沈殿および分離から得られた、洗浄されたタンパク質凝固物溶液は、溶液中に存在し得るあらゆる病原性細菌を死滅させるために高温／短時間の殺菌ステップで殺菌される。特定の実施形態では、殺菌は、７４℃で２０〜２３秒間実施される。乾燥単離物が所望される特定の実施形態では、殺菌した溶液は、あらゆる残留含水量を除去するためにスプレー乾燥機を通過される。典型的なスプレー乾燥条件は、入口温度１７０℃および出口温度７０℃を含む。最終乾燥タンパク質単離物粉末は、通常、５％未満の水分含量を有する。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、タンパク質単離物のより広い機能性を保持するために殺菌は省略される。
【００８１】
５．３．７  単離方法の特定の実施形態
本明細書で提供される緑豆タンパク質単離物を製造するための本方法の例示的な実施形態は、次の通りである：
１）一段階または複数段階でのｐＨ＞６．５における軟水による抽出。抽出は、１：３〜１：１５（粉：水）の比率で緑豆粉を水溶液と中程度〜高いせん断下で接触させた後、固体−液体分離ステップを行うことを含む；
２）任意選択的な活性炭による処理；
３）低温沈殿法（１〜４℃）と組み合わせた等電沈殿（ｐＨ５．６〜ｐＨ６．０）または低温沈殿法（１〜４℃）と組み合わせた超高流速における低イオン強度沈殿；
４）その後の固体−液体分離ステップ。
【００８２】
通常、分離ステップは、低濃度のＮａＣｌ溶液、０．１％〜０．９％のＮａＣｌ、好ましくは０．３％〜０．５％のＮａＣｌによる洗浄を含む。
【００８３】
以下の実施例で実証されるように、本明細書で提供される方法は、タンパク質の濃度を増大させ、豆っぽい味および風味、ならびに得られた緑豆タンパク質単離物中のメイラード反応物の濃度を著しく低下させた。
【００８４】
５．３．８  ステップの順序および付加的なステップ
上記の方法のステップは、代替的な順序で実施され得ると理解すべきである。例えば、いくつかの実施形態では、植物タンパク質の供給源を分画プロセスに供することは、少なくとも１つの不純物を低減することの前およびタンパク質リッチな画分を精製して精製タンパク質単離物を得ることの前に起こる。このような実施形態では、少なくとも１つの不純物を低減することは、タンパク質リッチな画分を精製して精製タンパク質単離物を得ることの前または後に行うことができる。いくつかの実施形態では、不純物を低減することは、植物タンパク質の供給源を分画プロセスに供することの前およびタンパク質リッチな画分を精製して精製タンパク質単離物を得ることの前に行われ、植物タンパク質の供給源を分画プロセスに供することは、タンパク質リッチな画分を精製して精製タンパク質単離物を得ることの前に起こる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、プロセスは、精製タンパク質単離物を回収すること（例えば、遠心分離を用いる）、精製タンパク質単離物を洗浄すること、精製タンパク質単離物を用いてペーストを作ること、または精製タンパク質単離物を用いて粉末を作ることから選択される１つまたは複数を含む付加的なステップを含む。いくつかの実施形態では、精製タンパク質単離物は、再水和（例えば、約８０％の水分含量まで）され、再水和された精製タンパク質単離物のｐＨは、約６．０のｐＨに調整される。
【００８６】
他の態様では、本明細書で提供される組成物および方法は、抽出後、炭水化物（例えば、デンプン）を含む画分または炭水化物リッチなタンパク質単離物を低減または除去し、これらのストリームを、麺類および多数のベーカリー用途を含む多数の食品用途のための生成物ストリームとして利用する機会を提供する。従って、本明細書に記載される抽出方法によって製造される緑豆由来の炭水化物（例えば、デンプン）画分または炭水化物リッチなタンパク質単離物も本明細書で提供される。
【００８７】
５．４  トランスグルタミナーゼを用いるスクランブルエッグ類似品
別の態様では、本明細書において、本明細書に記載される方法によって製造された緑豆タンパク質単離物を含む植物ベースのスクランブルエッグ類似品が提供され、緑豆タンパク質は、有利なテクスチャ特性、機能特性および官能特性を提供するためにトランスグルタミナーゼと接触されている。
【００８８】
トランスグルタミナーゼを用いる食品加工法は、例えば、特開昭５９−０５９１５１号において記載されており、それは、タンパク質、油または脂肪および水を含有するエマルションをトランスグルタミナーゼで処理して、ゼラチン質の架橋ゲルを生じさせることを開示する。米国特許第第６，０９３，４２４号などの多数の特許が乳またはチーズと共にトランスグルタミナーゼの使用を開示しており、他の参考文献、例えば中国特許１０１７０３１４７Ａ号は、エンドウ豆タンパク質単離物と共にトランスグルタミナーゼを開示している。
【００８９】
これらの努力を考慮しても、卵代用品またはスクランブルエッグ類似品などの食用エマルションを製造するための方法および組成物が依然として必要とされている。
【００９０】
従って、本明細書で提供される方法および組成物のいくつかの実施形態では、エマルションの加熱時、より堅くかつより滑らかなゲルテクスチャを達成するために、緑豆タンパク質単離物を含む植物ベースの卵模倣品エマルションにトランスグルタミナーゼが添加される。
【００９１】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される植物ベースの卵類似品において使用される場合、トランスグルタミナーゼは、マイクロカプセル化される。植物ベースの卵模倣品エマルション中のトランスグルタミナーゼ酵素のマイクロカプセル化は、タンパク質基質とトランスグルタミナーゼ酵素との接触を防止することにより、安定したエマルションを保持する。架橋反応は、マイクロカプセル化組成物を加熱して溶融させると開始される。トランスグルタミナーゼを含む卵模倣品エマルションは、トランスグルタミナーゼ酵素がエマルションに添加されると架橋反応が始まるという点で本質的に不安定である。
【００９２】
緑豆タンパク質単離物から植物ベースの卵類似品を調製することに加えて、このアプローチは、同様の機能性を示すマメ科植物の他の豆類近縁種に適用することができる。
【００９３】
トランスグルタミナーゼの１つの利点は、調理した卵もしくはスクランブルエッグまたは焼き製品、例えばケーキおよびクッキー（通常、卵を含有する）の特徴の多くを示す高品質の調理済み食品を製造するために使用することができる冷蔵温度または室温貯蔵可能な卵模倣品エマルションを向上させることである。付加的な利点は、完成食品において様々なテクスチャを作り出す、可変の分子量およびサイズを有するタンパク質リッチな成分を生じさせることを含む。従って、種々の態様において、トランスグルタミナーゼは、最終製品の機能性およびテクスチャに役立つ。
【００９４】
本発明の特定の態様では、卵代用品組成物を製造するための方法は、マメ科植物タンパク質を好ましくは０．０００１％〜０．１％の量のトランスグルタミナーゼと接触させて、所望の植物タンパク質単離物を生じさせることを含む。いくつかの好ましい実施形態では、本方法は、０．００１％〜０．０５％の量のトランスグルタミナーゼを提供する。より好ましい実施形態では、本方法は、０．００１％〜０．０１２５％の量のトランスグルタミナーゼを提供する。他の実施形態において、好ましい範囲外で製造したタンパク質単離物は、より濃厚であるか、または配合物中に容易に均質化されないスクランブル類似品を生じさせた。タンパク質に対して増大された量のトランスグルタミナーゼは、タンパク質抽出物をトランスグルタミナーゼで処理する際、ｐＨ５．６で沈殿しないと思われる。従って、タンパク質を好ましい量のトランスグルタミナーゼと接触させる付加的なステップは、望ましいスクランブル類似品を生じさせた。
【００９５】
従って、種々の態様において、本明細書に記載されるタンパク質単離物を含む緑豆由来のスクランブル類似品が本明細書で提供され、スクランブル類似品は、以下の成分：水、リン酸二ナトリウムおよび油の少なくとも１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、スクランブル類似品は、ＮａＣｌをさらに含む。いくつかの実施形態では、スクランブル類似品は、トランスグルタミナーゼと接触されている。特定の実施形態では、スクランブル類似品は、以下の配合物：タンパク質固体：１１．３ｇ、水：８１．７９ｇ、リン酸二ナトリウム：０．４ｇ、油：６．２ｇ、ＮａＣｌ：０．３１ｇ（全重量１００ｇに基づく）から構成され、タンパク質固体は、０．００１％〜０．０１２５％のトランスグルタミナーゼと接触される。
【００９６】
付加的な実施形態では、方法および組成物は、リポキシゲナーゼを欠いている。
【００９７】
従って、本発明は、卵の置換のための組成物を提供し、前記組成物は、トランスグルタミナーゼによって修飾された植物ベースのタンパク質単離物を含み、前記組成物は、卵を本質的に含まず、前記組成物は、天然の卵の１つまたは複数の機能特性を含む。好ましくは、組成物は、天然の卵の乳化特性を含む。より好ましくは、組成物は、０．０００１％〜０．０１２５％のトランスグルタミナーゼによって修飾された植物ベースのタンパク質単離物を提供し、この単離物は、全植物抽出物に対する体積基準で表される場合に低減されたまたはさらに著しく低減されたリポキシゲナーゼ活性または脂質を酸化し得る他の酵素の活性を示す。より好ましくは、組成物は、リポキシゲナーゼまたは脂質を酸化し得る酵素を本質的に含まない。さらなる実施形態では、植物ベースのタンパク質単離物は、安定的に架橋される。
【００９８】
いくつかの態様では、トランスグルタミナーゼは、リポキシゲナーゼまたは脂質を酸化し得る酵素を低減するかまたはそれに架橋しない。付加的な実施形態は、トランスグルタミナーゼをマイクロカプセル内にカプセル化することを含む。植物ベースのタンパク質単離物を含む組成物は、冷蔵または室温での貯蔵に適しており、エマルション中で常温保存可能である。さらなる態様では、トランスグルタミナーゼは、遊離している、架橋されている、および／または固定化されている。
【００９９】
本発明の付加的な態様は、少なくとも６０重量％のトランスグルタミナーゼ修飾植物タンパク質含量と、植物タンパク質の少なくとも５０重量％のグロブリン型タンパク質含量と、植物タンパク質の本来未修飾の供給源と比べて低減された酸化酵素活性と、植物タンパク質の本来未修飾の供給源と異なる１つまたは複数の調節された官能特性とを含む精製タンパク質単離物を含む。好ましい実施形態は、０．０００１％〜０．０１２５％のトランスグルタミナーゼによって修飾された精製タンパク質単離物を含む。
【０１００】
本発明の好ましい方法によると、精製タンパク質単離物を製造するための方法であって、ａ．約６．５〜１０．０のｐＨの水溶液中で供給源から１つまたは複数の植物タンパク質を抽出することと、ｂ．グロブリンリッチな画分の等電点に近いｐＨもしくは約５．０〜６．０のｐＨにおいて植物タンパク質を沈殿させること、またはろ過、精密ろ過もしくは限外ろ過またはイオン交換クロマトグラフィを用いて植物タンパク質を分画および濃縮することと、ｃ．精製タンパク質単離物を回収することであって、精製タンパク質単離物は、少なくとも６０重量％の植物タンパク質含量と、植物タンパク質の少なくとも５０重量％のグロブリン型タンパク質含量と、植物タンパク質の本来未修飾の供給源と比べて低減された酸化酵素活性と、植物タンパク質の本来未修飾の供給源と異なる１つまたは複数の調節された官能特性とを含む、ことと、ｄ．抽出ステップａ．または回収ステップｂ．において植物タンパク質をトランスグルタミナーゼで修飾することとを含む方法が提供される。
【０１０１】
精製タンパク質単離物を製造するための方法の好ましい実施形態は、抽出ステップａ．または回収ステップｂ．において植物タンパク質をトランスグルタミナーゼで修飾するステップｄ．が、０．０００１％〜０．０１２５％トランスグルタミナーゼを含むことを含む。さらなる実施形態は、安定的に架橋されており、リポキシゲナーゼまたは脂質を酸化し得る酵素を本質的に含まない精製タンパク質単離物を含む組成物を提供する。付加的な実施形態は、トランスグルタミナーゼをカプセル化および／または固定化することを含む。
【０１０２】
本発明の好ましい組成物によると、植物タンパク質固体、水、リン酸二ナトリウム、油およびＮａＣｌなどの塩を含む卵代用品組成物が提供され、前記植物タンパク質固体は、トランスグルタミナーゼによって修飾された植物ベースのタンパク質単離物を含む。好ましくは、卵代用品組成物の植物ベースのタンパク質単離物は、０．０００１％〜０．０１２５％のトランスグルタミナーゼで修飾される。トランスグルタミナーゼは、リポキシゲナーゼまたは脂質を酸化し得る酵素を低減するかまたはそれに架橋しない。このような実施形態では、卵代用品組成物は、低減されたまたはさらに著しく低減されたリポキシゲナーゼ活性または脂質を酸化し得る他の酵素の活性を示す。トランスグルタミナーゼは、リポキシゲナーゼ以外のタンパク質を架橋し、リポキシゲナーゼを遊離させておくことにより、等電沈殿および遠心分離ステップにおいて、リポキシゲナーゼが、架橋したタンパク質から離れて上清中にとどまることができる。より好ましくは、卵代用品組成物は、リポキシゲナーゼまたは脂質を酸化し得る酵素を本質的に含まない。付加的な実施形態は、植物ベースのタンパク質単離物を、マイクロカプセル中にカプセル化されたトランスグルタミナーゼと接触させることを含む。得られた卵代用品組成物は、冷蔵または室温での貯蔵に適しており、エマルション中で常温保存可能である。エマルションを加熱すると、卵代用品組成物は、ゲル、例えばスクランブルエッグ類似品を形成する。本発明の卵代用品組成物は、天然の卵に類似する１つまたは複数の官能特性を示す。組成物は、増大または低減された、柔らかさ（fluffiness）、ふんわり性（airiness）およびパサパサ感などの調節された官能特性を有する。
【０１０３】
５．４．１  卵様テクスチャを調製するための架橋
卵様テクスチャを製造するのに適した緑豆タンパク質単離物は、本明細書で提供される緑豆単離物を製造するための方法に架橋ステップを追加することによって調製することができる。１つの例では、架橋ステップは、図１Ｂに示されるように手順の抽出ステップに追加することができる。例えば、１部の緑豆粉を３〜１５部の水と混ぜ合わせる均質な水溶液が調製され、適切な無機もしくは有機酸または塩基により、ｐＨは６．５〜８に調整される。この混合物は、遠心分離され、タンパク質リッチな上清は、炭水化物リッチな重い相からデカントされる。トランスグルタミナーゼ粉末は、０．００１〜０．５％（ｗ／ｗ）の濃度でタンパク質リッチな溶液に添加され、約５０Ｃ（トランスグルタミナーゼのための最適反応温度）まで加熱され、１５〜９０分間インキュベートされる。反応混合物は、トランスグルタミナーゼ酵素を不活性化するために＞７０Ｃまで１〜５分間にわたり急速に加熱される。溶液のｐＨは、タンパク質混合物のグロブリンリッチな成分の等電点またはその付近に調整され（ｐＨ約５．４〜５．８）、５０Ｃ未満まで急速に冷却され、＞３，０００ｘｇで遠心分離される。上清は、デカントされ、白色〜淡褐色の外観のタンパク質リッチな粉末が残され、これは、次に、一般的に利用可能な方法により、さらに乾燥粉末に加工することができる。タンパク質リッチな粉末は、植物ベースの卵模倣品エマルション中に取り込むことができ、これは、オーブン、パン、スキレットまたは湯浴中で加熱されると卵様テクスチャを生じさせる。
【０１０４】
別の例では、１部の緑豆粉を３〜１５部の水と混ぜ合わせる均質な水溶液が調製され、適切な無機もしくは有機酸または塩基により、ｐＨは６．５〜８に調整される。溶液は、＞３０００ｘｇで遠心分離され、タンパク質リッチな上清は、炭水化物リッチな重い相から分離される。トランスグルタミナーゼ粉末は、０．００１〜０．５％（ｗ／ｗ）の濃度で溶液に添加され、約５０Ｃ（トランスグルタミナーゼのための最適反応温度）まで加熱され、１５〜９０分間インキュベートされる。インキュベーション後、０．０１〜０．１％（ｗ／ｗ）の最終濃度になるまで過酸化水素溶液が溶液に添加される。これは、トランスグルタミナーゼ上のシステイン残基を酸化し、活性を停止させる。溶液は、次にタンパク質または対象のタンパク質画分のＰＩ点まで導かれる（約５．４〜５．８ｐＨ）。溶液は、次に冷却され、遠心分離される。上清は、次にデカントされ、グロブリンリッチな重い画分が残される。グロブリンリッチな画分は、約５〜２０％固体（ｗ／ｗ）の固体濃度まで水で希釈され、次にスプレー乾燥される。これは、次にスプレー乾燥のために水と混合される。水酸化ナトリウムは、このプロセスにおける加工助剤である。これは、抗菌剤および漂白剤であるという付加利益を有する。スプレー乾燥後、酸化剤の全ての残存物は、完全に崩壊されている。
【０１０５】
別の例では、緑豆抽出物は、トランスグルタミナーゼと接触されるが、プロセスは、トランスグルタミナーゼ活性を停止させるためのステップを含まない。１部の緑豆粉を３〜１５部の水と混ぜ合わせる均質な水溶液が調製され、適切な無機もしくは有機酸または塩基により、ｐＨは６．５〜８に調整される。これは、＞３０００ｘｇで遠心分離され、タンパク質リッチな上清は、炭水化物リッチな重い相から分離される。トランスグルタミナーゼ粉末は、０．００１〜０．５％（ｗ／ｗ）の濃度で溶液に添加される。トランスグルタミナーゼ濃度は、完成品のために所望のテクスチャを作り出すように選択され得る。溶液は、次に約５０℃（トランスグルタミナーゼのための最適反応温度）まで加熱され、１５〜９０分間インキュベートされる。溶液は、次にタンパク質または対象のタンパク質画分のＰＩ点まで導かれる（約５．４〜５．８ｐＨ）。溶液は、次に冷却され、遠心分離される。上清は、次にデカントされ、グロブリンリッチな重い画分が残される。得られた重い画分は、トランスグルタミナーゼ酵素を不活性化するために＞７０℃まで１〜５分間にわたり急速に加熱される。重い画分は、水と混合され、スプレー乾燥される。
【０１０６】
卵様テクスチャを製造するのに適した緑豆タンパク質単離物は、図１Ｃに示されるように、タンパク質の酸沈殿後に架橋を実施することによって調製することもできる。１つの例では、１部の緑豆粉を３〜１５部の水と混ぜ合わせる均質な水溶液が調製され、適切な無機もしくは有機酸または塩基により、ｐＨは６．５〜８に調整される。溶液は、次に＞３，０００ｘｇで遠心分離される。タンパク質リッチな上清は、デカントされ、炭水化物リッチな重い相が残される。タンパク質リッチな溶液のｐＨは、タンパク質混合物のグロブリンリッチな成分の等電点またはその付近に調整され（ｐＨ約５．４〜５．８）、結果としてグロブリンリッチなタンパク質の沈殿が生じる。溶液は、＞３，０００ｘｇで遠心分離される。上清は、デカントされ、グロブリンリッチなタンパク質画分が残される。このグロブリンリッチなタンパク質画分は、５〜２５％のタンパク質濃度を達成するように水中に再稀釈される。トランスグルタミナーゼ粉末は、０．００１〜０．５％（ｗ／ｗ）の濃度で溶液に添加され、約５０℃（トランスグルタミナーゼのための最適反応温度）まで加熱され、１５〜９０分間インキュベートされる。反応混合物は、トランスグルタミナーゼ酵素を不活性化するために＞７０Ｃまで１〜５分間にわたり急速に加熱される。混合物は、次に５０Ｃ未満まで急速に冷却され、＞３，０００ｘｇで遠心分離される。上清は、デカントされ、白色〜淡褐色の外観のタンパク質リッチな粉末が残され、これは、次に、一般的に利用可能な方法により、さらに乾燥粉末に加工することができる。タンパク質リッチな粉末は、植物ベースの卵模倣品エマルション中に取り込むことができ、これは、オーブン、パン、スキレットまたは湯浴中で加熱されると卵様テクスチャを生じさせる。
【０１０７】
架橋がタンパク質の酸沈殿後に適用される別の実施形態では、図１Ｄに示されるように、水抽出の代わりに乾式分画が使用され、濃縮物を生じさせる。脱皮緑豆は、連続ミル（例えば、ローラーミルおよびその後のピンミル）を通過され、微細な粒径を有する粉を発生させる。粉は、次に高速サイクロンを通過され、より大きい粒子をより小さい粒子から分離する。タンパク質リッチな粒子（５５〜６０％タンパク質）は、次に、約５〜２５％固体の溶液を達成するように水中に希釈される。溶液のｐＨは、タンパク質混合物のグロブリンリッチな成分の等電点またはその付近に調整され（ｐＨ約５．４〜５．８）、結果としてグロブリンリッチなタンパク質の沈殿が生じる。溶液は、＞３，０００ｘｇで遠心分離される。上清は、デカントされ、グロブリンリッチなタンパク質画分が残される。このグロブリンリッチなタンパク質画分は、５〜２５％のタンパク質濃度を達成するように水中に再稀釈される。トランスグルタミナーゼ粉末は、０．００１〜０．５％（ｗ／ｗ）の濃度で溶液に添加され、約５０℃（トランスグルタミナーゼのための最適反応温度）まで加熱され、１５〜９０分間インキュベートされる。反応混合物は、トランスグルタミナーゼ酵素を不活性化するために＞７０℃まで１〜５分間にわたり急速に加熱される。混合物は、次に５０℃未満まで急速に冷却され、＞３，０００ｘｇで遠心分離される。上清は、デカントされ、白色〜淡褐色の外観のタンパク質リッチな粉末が残され、これは、次に、一般的に利用可能な方法により、さらに乾燥粉末に加工することができる。タンパク質リッチな粉末は、植物ベースの卵模倣品エマルション中に取り込むことができ、これは、オーブン、パン、スキレットまたは湯浴中で加熱されると卵様テクスチャを生じさせる。
【０１０８】
５．４．２  固定化したトランスグルタミナーゼによる架橋
バルクのシングルユースのトランスグルタミナーゼ酵素を使用する代替として、反応器内で平坦または渦巻形状で使用され得る、不活性の多孔質ビーズまたはポリマーシート上に固定化したトランスグルタミナーゼ酵素を用いてプロセスストリームを処理することもできる。ビーズのための典型的な固定化酵素の担体は、二酸化ケイ素（パーライト）またはアルギン酸カルシウムを含む。固定化トランスグルタミナーゼは、トランスグルタミナーゼ水溶液を、ビーズ材料および酵素を固体基質に固定するグルタルアルデヒドなどの架橋剤と接触させることによって調製される。酵素含有担体は、次に乾燥され、使用前に条件付けされる。固定化酵素反応器の利点は、１）バッチ間でより均一な結果をもたらす酵素反応の暴露および温度条件の制御の改善、および２）トランスグルタミナーゼ酵素の再使用によって可能になる経済性の改善を含む。固体基質は、トランスグルタミナーゼ酵素の変性の可能性および割合を低減する。
【０１０９】
５．４．３  マイクロカプセル化したトランスグルタミナーゼによる架橋
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、植物ベースの液体卵様エマルションを調製するためにマイクロカプセル化したトランスグルタミナーゼ酵素が使用される。例えば、脂肪、水および乳化剤を含有するエマルションは、５０℃〜８０℃の融点を有する脂肪と共に調製される。代表的な脂肪には、ステアリン酸、パームおよびココナッツショートニングが含まれる。次に、トランスグルタミナーゼ酵素は、約５〜２０％固体の流動性溶液を達成するために高せん断ミキサーまたはホモジナイザーを用いてエマルション中に分散される。次に、エマルションは、典型的な条件（１５０〜１７５℃）下において短い滞留時間でスプレー乾燥される。トランスグルタミナーゼ酵素含有スプレー乾燥粉末は、次に、本明細書に記載される植物ベースの卵模倣品エマルション中に取り込むことができる。
【０１１０】
５．５  修飾された官能特性を有する緑豆単離物
緑豆タンパク質の供給源から食用緑豆タンパク質単離物を製造するためのプロセスも本明細書において提供され、本プロセスは、タンパク質リッチな画分を得るために、緑豆タンパク質の供給源を分画プロセスに供することであって、タンパク質リッチな画分の少なくとも５０重量％は、１つまたは複数のグロブリン型タンパク質を含むかまたはそれからなる、こと；、少なくとも１つの不純物を低減することであって、少なくとも１つの不純物は、食用緑豆タンパク質単離物における悪臭または異臭に関連する、こと；食用緑豆タンパク質単離物を得るためにタンパク質リッチな画分を精製すること；を含む。いくつかの実施形態では、食用緑豆タンパク質単離物の少なくとも６０重量％は、植物タンパク質である。いくつかの実施形態では、食用タンパク質単離物の酸化酵素活性は、植物タンパク質の供給源の対応する酸化酵素活性よりも低い。いくつかの実施形態では、食用緑豆タンパク質単離物の官能特性は、緑豆タンパク質の供給源の対応する官能特性と異なる。
【０１１１】
特定の態様では、方法および組成物は、以下の特徴：渋い、豆っぽい、苦い、焦げた、バターのような、ナッツのような、甘い、酸っぱい、フルーティな、フローラルな、ウッディな、土のような、豆っぽい、スパイシーな、メタリックな、甘い、かび臭い、草のような、グリーンな、油っぽい、酢のような、ニュートラルなおよび淡白な風味または芳香の１つまたは複数の調節された官能特性を有する精製タンパク質単離物の製造を提供する。好ましくは、精製タンパク質単離物は、以下：渋い、豆っぽい、苦い、焦げた、バターのような、ナッツのような、甘い、酸っぱい、フルーティな、フローラルな、ウッディな、土のような、豆っぽい、スパイシーな、メタリックな、甘い、かび臭い、草のような、グリーンな、油っぽい、酢のような、ニュートラルなおよび淡白な風味または芳香の１つまたは複数の低減または不在などの調節された官能特性を示す。
【０１１２】
５．５．１  官能特性を修飾するための方法
好ましくは、本明細書で提供される方法は、精製タンパク質単離物における異臭もしくは悪臭を付与するかまたはそれらに関連する可能性のある少なくとも１つの不純物を低減または除去する。１つまたは複数の不純物は、揮発性または不揮発性化合物であり得、例えば、脂肪酸の酸化を触媒することが知られているリポキシゲナーゼ（ＥＣ１．１３．１１．−）を含み得る。他の例として、少なくとも１つの不純物は、フェノール、アルコール、アルデヒド、硫化物、過酸化物またはテルペンを含み得る。レクチンおよびプロテアーゼ阻害剤、例えばセリンプロテアーゼ阻害剤およびトリプシン阻害剤などを含む、アルブミンとして分類される他の生物学的に活性なタンパク質も除去される。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの不純物は、酸化酵素活性に対する１つまたは複数の基質、例えば１つまたは複数の脂肪酸を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、Ｃ１４：０（ミリスチン酸メチル）；Ｃ１５：０（ペンタデカン酸メチル）；Ｃ１６：０（パルミチン酸メチル；Ｃ１６：１  パルミトレイン酸メチル；Ｃ１７：０  ヘプタデカン酸メチル；Ｃ１８：０  ステアリン酸メチル；Ｃ１８：１  オレイン酸メチル；Ｃ１８：２  リノール酸メチル；Ｃ１８：３  アルファリノール酸メチル；Ｃ２０：０  エイコサン酸メチル；およびＣ２２：０  ベヘン酸メチルから選択される１つまたは複数の脂肪酸を低減または除去する。理論により拘束されないが、１つもしくは複数の脂肪酸または酸化酵素活性に対する他の脂質基質の低減または除去は、緑豆タンパク質単離物の経時的な酸敗も低減すると考えられる。さらに、利点は、単離物中のタンパク質対非タンパク質分子の比率の増大に起因することもあり、下流の食品用途においてより一貫性がありかつ均質な性能および機能性が可能になる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、不純物の低減は、脂質基質と反応する少なくとも１つの酵素の低減を含む。このような実施形態では、このような不純物の低減は、少なくとも１つの親油性の異臭、親油性の基質または補助因子を低減する。いくつかの実施形態では、不純物は、例えば、木炭、ベントナイト粘土または活性炭を用いる固体吸収手順によって低減される。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、精製緑豆タンパク質単離物は、緑豆タンパク質の供給源と比べて低減された酸化酵素活性を有する。例えば、精製緑豆単離物は、緑豆タンパク質の供給源と比べて約５％、１０％、１５％、２０％または２５％の酸化酵素活性の低減を有することができる。いくつかの実施形態では、酸化酵素活性は、リポキシゲナーゼ活性である。いくつかの実施形態では、精製タンパク質単離物は、リポキシゲナーゼ活性の低減に起因して、植物タンパク質の供給源と比べて脂質または残留脂質のより低い酸化を有する。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物中のリポキシゲナーゼ活性の低減は、緑豆タンパク質抽出物または単離物をトランスグルタミナーゼ活性と接触させることでもたらされる。従って、トランスグルタミナーゼによって修飾された緑豆タンパク質単離物も本明細書において提供され、単離物は、単離物の植物供給源と比べて低減されたまたはさらに著しく低減されたリポキシゲナーゼ活性（または脂質を酸化し得る他の酵素）を示す。例えば、トランスグルタミナーゼによって修飾された緑豆タンパク質単離物は、単離物の植物供給源と比べて少なくとも約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％または７５％のリポキシゲナーゼ活性（または脂質を酸化し得る酵素の活性）の低減を有することができる。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物を修飾するために使用されるトランスグルタミナーゼの量は、修飾される単離物または抽出物の量に対する体積基準で表して約０．０００１％〜０．０１２５％である。
【０１１７】
付加的な実施形態では、少なくとも１つの不純物の低減は、繊維状固体、塩または炭水化物の除去を含む。このような不純物の低減は、異臭または悪臭を付与するかまたはそれらに関連し得る少なくとも１つの化合物の低減を含む。このような化合物は、例えば、活性炭、炭素または粘土を用いて除去され得る。別の例として、少なくとも１つの化合物は、脂質または残留脂質を酸化する少なくとも１つの酵素阻害するために、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、クエン酸またはリン酸塩）を用いて除去され得る。特定の例では、残留脂質を酸化して、異臭をさせることが知られている化合物（例えば、ヘキサナール）にし得る酵素のリポキシゲナーゼの補助因子に結合するためにＥＤＴＡが使用され得る。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、残留している原料物質からタンパク質を分離すると、タンパク質に関連する望ましくない官能特性、例えば豆っぽい風味または以下の表１からの化合物に関連する不適切な風味プロファイルのいずれも除去される。
【０１１９】
本明細書に開示される方法および組成物は、例えば、「豆っぽい」芳香および味などの望ましくない特徴を低減することにより、良好な官能特性を示すその能力を特徴とするタンパク質単離物を提供する。好ましい実施形態では、異臭に関連する成分は、除去されるかまたは実質的に低減される。望ましくない化合物の除去は、芳香、風味もしくは味またはこれらの組み合わせを改善し得る。いくつかの実施形態では、異臭が低減されたタンパク質単離物を製造するための方法は、以下の方法：
１）任意の残留脂質を酸化して、異臭をさせることが知られている化合物（例えば、ヘキサナール）にし得るリポキシゲナーゼのレベルを著しく低減するための等電点（ｐＨ約５．６〜ｐＨ６．０）沈殿；
２）リポキシゲナーゼの補助因子に結合するためのキレート剤、例えばＥＤＴＡの使用；および／または
３）異臭に寄与し得る化合物を除去するための抽出後の固定化活性炭の使用
の１つまたは複数を含む。脂質基質が大量である場合、脂質は、上清中に捕集され、かつ除去または低減され得る。開示される方法は、ある種類のタンパク質の強化と、主として不飽和脂肪酸または不飽和脂肪の酸化を触媒するリポキシゲナーゼなどの酵素の低減とにより、タンパク質単離物の改善された機能性を提供し得る。従って、いくつかの実施形態では、異臭を低減するためにタンパク質画分を精製するか、またはある種類のタンパク質を低減する方法は、タンパク質単離物組成物が１つまたは複数の所望の機能特性を保持する能力に最小限に影響を与える。
【０１２０】
従って、特定の態様では、本明細書に開示される方法および組成物は、タンパク質単離物の風味プロファイルを調節または改善し、これは、次に、タンパク質単離物を含む食品の風味プロファイルを調節または改善する。特定の実施形態では、植物タンパク質の供給源の特定の非タンパク質画分、例えば多糖など、特にマメ科植物中の消化されにくいものを除去または低減すると、より望ましい風味が付与され得る。非タンパク質画分の除去または低減は、架橋ポリフェノール、揮発性物質および重金属イオンを含む望ましくない小分子の除去または低減をもたらし得る。開示される方法および組成物は、望ましくない風味または芳香に起因する種々の化合物に加えて、架橋ポリフェノール、揮発性物質、重金属イオン、ｐ−クマル酸（４−ヒドロキシケイ皮酸）、フェルラ酸（４−ヒドロキシ−３−メトキシケイ皮酸）および４−ヒドロキシ安息香酸（既知のポリフェノール）を含むが、これらに限定されない標的化合物の除去または低減を提供し得る。従って、方法および組成物は、ニュートラルな風味および／または芳香を有することを特徴とする可溶化植物タンパク質を提供し得る。さらに他の実施形態では、方法および組成物は、風味または芳香の調節を提供し、選択された化合物は、除去されるか、低減されるか、またはさらに取り込まれる。
【０１２１】
従って、１つまたは複数の所望の風味または芳香は、特定の風味に起因する１つまたは複数の小分子を調節することにより、除去、低減または付加され得る。１つのこのような方法は、一般的に望ましくない風味の付与に関連する小分子を除去するためにタンパク質の沈殿を含む。
【０１２２】
食品サンプルの芳香を特徴付ける１つの方法は、GC SNFR Olfactory Port（PerkinElmer）の使用を含む。サンプルから揮発された化合物は、ＧＣカラムに注入され、得られた化合物は、分離され、マススペクトルを用いて同定される。表１は、化合物および感覚特性に対するその効果の例示的なリストを提供する。付加的な化合物は、その感覚特性を関連付けるために分離および同定することができる。
【０１２３】
【表１】
2019509036.tif 000002
【０１２４】
従って、いくつかの実施形態では、本方法は、これらおよび／または他の化合物の１つまたは複数の除去または低減を提供する。例えば、表１に示されるように、ヘキサナールの存在は、刈ったばかりの草に似た芳香を有する食品をもたらし得る。いくつかの実施形態では、このような臭気は除去または低減される。同様に、本方法は、配合物中の特定の化合物を同定し、１つまたは複数の化合物を嗅覚に関連付け、かつその化合物を除去または低減することにより、配合を繰り返すか、修飾するか、または改善することを提供する。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、精製タンパク質単離物は、植物タンパク質の供給源の対応する官能特性と異なる１つまたは複数の官能特性を有する。官能特性の例としては、渋い風味もしくは芳香、豆っぽい風味もしくは芳香、苦い風味もしくは芳香、焦げた風味もしくは芳香、バターのような風味もしくは芳香、ナッツのような風味もしくは芳香、甘い風味もしくは芳香、酸っぱい風味もしくは芳香、フルーティな風味もしくは芳香、フローラルな風味もしくは芳香、ウッディな風味もしくは芳香、土のような風味もしくは芳香、豆っぽい風味もしくは芳香、スパイシーな風味もしくは芳香、メタリックな風味もしくは芳香、甘い風味もしくは芳香、かび臭い風味もしくは芳香、草のような風味もしくは芳香、グリーンな風味もしくは芳香、油っぽい風味もしくは芳香、酢のような風味もしくは芳香、ニュートラルな風味もしくは芳香、または淡白な風味もしくは芳香が挙げられるが、これらに限定されない。植物タンパク質の供給源は、風味、芳香または感覚印象（例えば、豆っぽい風味または匂い）を有することがあり、これにより、植物タンパク質の供給源は、例えば、卵などの基準食品の代わりに使用するのに望ましくないまたは不適切であるとされる。植物タンパク質の供給源と比べて、精製タンパク質単離物は、修飾された官能特性を有し、この修飾された官能特性により、精製タンパク質単離物は、基準食品においてまたは基準食品の代用品として使用するのにより適しているとされ得る。換言すると、精製タンパク質単離物は、精製タンパク質単離物または精製タンパク質単離物を取り込んだ組成物に、基準食品の風味、芳香または感覚印象に類似するかまたはそれと均等な風味、芳香または感覚印象を与える官能特性を有し得る。例えば、精製タンパク質単離物は、植物タンパク質の供給源の官能特性を低減または排除し得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、精製タンパク質単離物の官能特性は、卵の対応する官能特性に類似するかまたはそれと均等であり得る。いくつかの実施形態では、精製タンパク質単離物は、例えば、卵（液体、スクランブルまたはパティ形態）、ケーキ（例えば、パウンドケーキ、イエローケーキまたはエンゼルフードケーキ）、クリームチーズ、パスタ、エマルション、糖菓、アイスクリーム、カスタード、乳、デリミート、チキン（例えば、チキンナゲット）またはコーティングなどの基準食品の風味、芳香または感覚印象に類似するかまたはそれと均等である風味、芳香または感覚印象を提供する。
【０１２７】
５．６  緑豆タンパク質単離物の食品機能性
特定の態様では、本明細書で提供される高純度の緑豆タンパク質単離物は、産業界での標準的な方法で測定したときに乳化、水結合、発泡性およびゲル化特性などの望ましい機能性特徴を示す。卵の特徴と比較して、測定される精製タンパク質単離物のこのような特性は、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える値に相当する。本明細書で提供される方法は、卵などの食品と一致する機能特性、例えば乳化およびゲル化を示す、高純度、好ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれを超える緑豆タンパク質単離物を生じさせる。好ましい実施形態では、タンパク質含量は、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える。
【０１２８】
以下の実施例で実証されるように、１つまたは複数の機能特性を示す精製緑豆タンパク質単離物を取り込んだいくつかの食品用途を調製した。機能特性は、卵などの食品のクラム密度、構造／テクスチャ、弾性／スプリング性、凝固、結合、保湿、口あたり、膨化、通気／発泡性、クリーミーさおよび乳化を含み得るが、これらに限定されない。口あたりは、食品の試験および説明において使用される概念である。例示的なタンパク質単離物を用いて作られた製品は、口あたりについて評価することができる。いくつかの実施形態では、例示的なタンパク質単離物を用いて作られた製品、例えば焼き食品は、天然の卵で作られた製に類似する口あたりを有する。いくつかの実施形態では、例示的なタンパク質単離物を用いて作られた製品の口あたりは、これまでに知られているまたは試みられた卵代用品、例えばバナナ、修飾乳清タンパク質またはEgg BeatersＴＭの口あたりよりも優れている。
【０１２９】
口あたりの尺度に含まれ得る特性の例としては、粘着性：大臼歯で噛んだときに、破裂する前にサンプルが変形する度合；密度：大臼歯で完全に噛んだ後のサンプル断面の緻密さ；乾燥度：口中でサンプルが乾いていると感じる度合；もろさ（Fracturability）：サンプルを崩壊、亀裂または粉砕させる力（もろさは、砕けやすさ、クリスピーさ、サクサク感および脆性を包含する）；粒状性：サンプルが小さい粒状粒子を含有する度合いであり、滑らかさの反対であると考えることができる；ガム性（Gumminess）：半固体の食物を嚥下の準備ができた状態まで崩壊させるのに必要とされるエネルギー；硬度：食品を所与の距離まで変形させるのに必要とされる力、すなわち大臼歯間で圧縮し、切歯で噛み、舌と口蓋との間で圧縮するための力；重さ：最初に舌の上に置かれたときに感じられる食品の重量；吸湿性：食品によって吸収される唾液の量；水分放出性：サンプルから放出される水分／汁の量；マウスコーティング（Mouthcoating）：咀嚼後の口中のコーティング（例えば、脂肪／油）のタイプおよび度合い；粗さ：舌で感じられる食品の表面の摩損性の度合い；滑りやすさ：食品が舌の上でスライドする度合い；滑らかさ：食品中に任意の粒子、塊、隆起などが存在しないこと；均一性：サンプルが全体に平らである度合い；均質性；噛み口の均一性：噛み口全体にわたる力の均一性；噛み応えの均一性：食品の噛み応えの特徴が咀嚼全体を通して均一である度合い；粘度：液体をスプーンから舌の上に取り出すのに必要とされる力；および濡れ性：食品の表面で感じられる水分の量が挙げられる。
【０１３０】
精製タンパク質単離物はまた、それ自体でまたは組成物中に取り込まれたときに１つまたは複数の機能特性を有し得る。このような機能特性は、乳化、水結合能、発泡性、ゲル化、クラム密度、構造形成、テクスチャ構築、粘着、接着性、弾性、スプリング性、溶解度、粘度、脂肪吸収、風味結合、凝固、膨化、通気、クリーミーさ、フィルム形成特性、光沢の付加、輝きの付加、凍結安定性、解凍安定性または色の１つまたは複数を含み得るが、これらに限定されない。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、精製タンパク質単離物の少なくとも１つの機能特性は、植物タンパク質の供給源の対応する機能特性と異なる。いくつかの実施形態では、精製タンパク質単離物の少なくとも１つの機能特性は、例えば、卵（液体、スクランブルまたはパティ形態）、ケーキ（例えば、パウンドケーキ、イエローケーキまたはエンゼルフードケーキ）、クリームチーズ、パスタ、エマルション、糖菓、アイスクリーム、カスタード、乳、デリミート、チキン（例えば、チキンナゲット）またはコーティングなどの基準食品の対応する機能特性に類似するかまたはそれと均等である。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、精製タンパク質単離物が食品組成物中に含まれる場合、食品組成物は、例えば、卵、液体卵、スクランブルエッグ、卵パティ、ケーキ（例えば、パウンドケーキ、イエローケーキまたはエンゼルフードケーキ）、クリームチーズ、パスタ、エマルション、糖菓、アイスクリーム、カスタード、乳、デリミート、チキン（例えば、チキンナゲット）またはコーティングなどの基準食品の対応する機能特性に類似するかまたはそれと均等である少なくとも１つの機能特性を有する。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、精製タンパク質単離物は、単独でまたは組成物中に取り込まれたときに加熱下または室温でゲルを形成することができる。
【０１３４】
５．６．１  レオロジー特性
ハイブリッドレオメーター（TA Instruments Discovery HR-1）を用いると、時間および温度の関数としてのタンパク質単離調製物の粘弾性挙動（例えば、ゲル化温度、弾性、粘度）の測定が可能になる。これらのタイプの物理的測定値は、製品性能と相関し得る。いくつかの実施形態では、タンパク質単離物およびタンパク質単離物を含有する配合物の特定の物理的測定値は、最適な原材料供給源を予測し（これらが著しい違いを実証する範囲で）、製品開発努力を導くために使用される。
【０１３５】
実施例６．３で実証されるように、約５．６〜６．０の範囲内の沈殿ｐＨを利用する、本明細書に記載される単離方法から調製される緑豆タンパク質単離物は、アルカリ金属イオン（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ）、親水コロイドまたは他の増粘もしくはゲル化剤などの付加的な成分を添加することなく、ゲル化温度、ゲル強度およびゲル弾性を含む優れた構造構築特性を実証する。従って、別の態様では、本明細書において、９０℃未満のゲル化開始温度を有する緑豆タンパク質単離物が提供される。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物のゲル化開始温度は、８９℃、８８℃または８７℃未満である。別の態様では、本明細書において、２％よりも大きい振動歪（oscillation strain）のゲル強度を有する緑豆タンパク質単離物が提供される。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物のゲル強度は、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％の振動歪よりも大きい。別の態様では、本明細書において、３００Ｐａよりも大きいゲル弾性を有する緑豆タンパク質単離物が提供される。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物のゲル弾性は、３００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００Ｐａよりも大きく、または８０００Ｐａよりも大きい。
【０１３６】
本明細書に記載される緑豆タンパク質単離物を用いて配合された卵および卵を含まない製品の、広い範囲の実験パラメータ（Ｎａ２ＨＰＯ４濃度および水分含量を含む）にわたる粘度も開示される。この方法は、製品開発および品質管理を案内するために使用され得る。図３０は、（□）市販の液体卵製品；（◇）均質化した殻を除いた全卵；および（▲）ゲランが配合された液体スクランブルにおける粘度対せん断速度の比較を示す。粘度（Ｐａ．ｓ）を示すｙ軸は、０．０３Ｐａ．ｓという低い粘度（卵）および０．２７Ｐａ．ｓという高い粘度を有するサンプルによって示される極端な範囲のために対数的である。６２％の水分、０．５％のＮａ２ＨＰＯ４。
【０１３７】
５．６．２  水分含量
いくつかの実施形態は、所望の水分含量を有する精製タンパク質単離物を提供する。種々の実施形態では、水分含量％は、約５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、８０％、８５％、９０％またはさらにそれよりも高い。
【０１３８】
５．６．３  粒径
エンドウ豆タンパク質単離物は、様々な用途に適合するように１５０〜４００ミクロンの範囲の粒径で市販されている。より小さい粒径は、飲料、栄養バー、および滑らかな口あたりが所望される任意の用途によく適している。より大きい粒径は、調理損失を低減する優れた水分保持を示し、収率を改善し、しっとりとした口あたりを提供する。中型の粒径は、両方の属性を少しずつ必要とする用途のために利用可能である。小型、中型および大型の粒径は、異なる用途および口あたりを有する。より大きい粒径は、焼くためによりよく適している。
【０１３９】
緑豆タンパク質濃縮物は、通常、他のタンパク質単離物よりも粒径が大きい。微細な粉末でも、タンパク質濃縮物は、そのより大きい粒径により、吸水性用途のために、かつ焼き食品およびパスタにおけるテクスチャを向上させるためによく適するようになる。特定の実施形態では、精製タンパク質単離物は、調理損失を低減する所望のまたは優れた水分保持を示し、収率を改善し、しっとりとした口あたりを提供する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、粒径分布は、約８．９〜２２３．０μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、タンパク質組成物の粒径は、１０マイクロメートル以下である。より好ましくは、タンパク質組成物の粒径は、１マイクロメートル以下である。より好ましい実施形態では、タンパク質組成物の粒径は、１００マイクロメートル以下を含む。代替の実施形態では、タンパク質組成物の粒径は、約３０ｎｍである。他の実施形態では、タンパク質組成物の粒径は、１０〜１００ｎｍを含む。
【０１４１】
５．７  緑豆単離物の食品用途
いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、多数のカテゴリーにわたる様々な従来の食品および飲料製品における動物ベースまたは植物ベースのタンパク質の直接的なタンパク質置換品として使用される。いくつかの実施形態では、使用レベルは、最終製品の３〜９０％ｗ／ｗの範囲である。本明細書で提供される緑豆タンパク質単離物が用途を見出す例示的な食品カテゴリーおよび使用レベルは、表２に要約される。いくつかの実施形態では、緑豆タンパク質単離物は、食品中の現存のタンパク質に対するサプリメントとしても使用される。
【０１４２】
【表２−１】
2019509036.tif 000003
【０１４３】
【表２−２】
2019509036.tif 000004
【０１４４】
本明細書で提供される精製緑豆タンパク質単離物は、種々の食品用途に適しており、例えば、卵を含まない食用エマルション、卵類似品、卵を含まないスクランブルエッグ、卵を含まないパティ、卵を含まないパウンドケーキ、卵を含まないエンゼルフードケーキ、卵を含まないイエローケーキ、卵を含まないクリームチーズ、卵を含まないパスタ生地、卵を含まないカスタード、卵を含まないアイスクリーム、および乳製品を含まない乳中に取り込まれる。
【０１４５】
種々の態様では、組成物および方法は、液体およびパティのスクランブルエッグ代用品を含む多数の食品用途において、所望される乳化、水結合性およびゲル化のレベルまで１つまたは複数の精製タンパク質単離物を取り込む。好ましい実施形態では、機能性卵置換製品は、精製タンパク質単離物または抽出物（１０〜１５％）と、油（１０％）、親水コロイド、保存料および任意選択的に風味料、水、レシチン、キサンタン、炭酸ナトリウム、黒塩の１つまたは複数とを含む。
【０１４６】
従って、本方法および組成物は、食肉代用品、卵代用品、焼き食品および強化ドリンクを含むがこれらに限定されない種々の食品用途において、置換成分として適切である１つまたは複数の精製タンパク質単離物から、成分が所望の官能性を有することを可能にする。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、精製タンパク質単離物は、卵代用品に取り込まれる。いくつかのこのような実施形態では、精製タンパク質単離物の官能特性（例えば、風味または芳香）は、卵の対応する官能特性に類似するかまたはそれと均等である。卵代用品は、卵の対応する機能特性に類似するかまたはそれと均等である少なくとも１つの機能特性（例えば、乳化、水結合能、発泡性、ゲル化、クラム密度、構造形成、テクスチャ構築、粘着、接着性、弾性、スプリング性、溶解度、粘度、脂肪吸収、風味結合、凝固、膨化、通気、クリーミーさ、フィルム形成特性、光沢の付加、輝きの付加、凍結安定性、解凍安定性または色）を示し得る。精製タンパク質単離物に加えて、卵代用品は、イオタ−カラギナン、アラビアゴム、コンニャク、キサンタンガムまたはゲランの１つまたは複数を含み得るが、これらに限定されない。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、精製タンパク質単離物は、パウンドケーキ、イエローケーキまたはエンゼルフードケーキなどの卵を含まないケーキ中に取り込まれる。いくつかのこのような実施形態では、卵を含まないケーキの少なくとも１つの官能特性（例えば、風味または芳香）は、卵を含有するケーキの対応する官能特性に類似するかまたはそれと均等である。卵を含まないケーキは、卵を含有するケーキの対応する機能特性に類似するかまたはそれと均等である少なくとも１つの機能特性を示し得る。少なくとも１つの機能特性は、例えば、乳化、水結合能、発泡性、ゲル化、クラム密度、構造形成、テクスチャ構築、粘着、接着性、弾性、スプリング性、溶解度、粘度、脂肪吸収、風味結合、凝固、膨化、通気、クリーミーさ、フィルム形成特性、光沢の付加、輝きの付加、凍結安定性、解凍安定性または色の１つまたは複数であり得る。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、精製タンパク質単離物は、卵を含まないケーキミックスまたは卵を含まないケーキ生地中に取り込まれる。いくつかのこのような実施形態では、卵を含まないケーキミックスまたは生地は、卵を含有するケーキミックスまたは生地の対応する官能特性に類似するかまたはそれと均等である、卵を含まないケーキ生地の少なくとも１つの官能特性（例えば、風味または芳香）を有する。卵を含まないケーキミックスまたは生地は、卵を含有するケーキ生地の対応する機能特性に類似するかまたはそれと均等である少なくとも１つの機能特性を示し得る。少なくとも１つの機能特性は、例えば、乳化、水結合能、発泡性、ゲル化、クラム密度、構造形成、テクスチャ構築、粘着、接着性、弾性、スプリング性、溶解度、粘度、脂肪吸収、風味結合、凝固、膨化、通気、クリーミーさ、フィルム形成特性、光沢の付加、輝きの付加、凍結安定性、解凍安定性または色の１つまたは複数であり得る。
【０１５０】
卵を含まないパウンドケーキ中に精製タンパク質単離物が含まれるいくつかの実施形態では、卵を含まないパウンドケーキのピーク高さは、卵を含有するパウンドケーキのピーク高さの少なくとも９０％である。卵を含まないパウンドケーキ生地中に精製タンパク質単離物が含まれるいくつかの実施形態では、卵を含まないパウンドケーキ生地の比重は、０．９５〜０．９９である。
【０１５１】
幾つかの態様では、食品用途において、増大された機能性は、精製タンパク質単離物に関連する。例えば、精製タンパク質単離物を含む食品は、ドームまたはクラック、ケーキの弾力性、ケーキの粘着性、ケーキのスプリング性、ケーキのピーク高さ、生地の比重、中央のドーム形成、中央のクラック、褐色化、口あたり、スプリングバック（spring-back）、異臭または風味において増大された機能性を示し得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、精製タンパク質単離物は、クリームチーズ、パスタ生地、パスタ、乳、カスタード、冷凍デザート（例えば、アイスクリームを含む冷凍デザート）、デリミートまたはチキン（例えば、チキンナゲット）中に含まれる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、精製タンパク質単離物は、例えば、卵代用品、ケーキ（例えば、パウンドケーキ、イエローケーキまたはエンゼルフードケーキ）、ケーキ生地、ケーキミックス、クリームチーズ、パスタ生地、パスタ、カスタード、アイスクリーム、乳、デリミートまたは糖菓などの食品または飲料組成物中に取り込まれる。食品または飲料組成物は、基準食品または飲料組成物を再現するテクスチャおよび口あたりに類似するかまたはそれと均等である感覚印象を提供し得る。いくつかの実施形態では、食品または飲料組成物中に包含される前に、精製タンパク質単離物は、精製タンパク質単離物の標的用途に依存する方法でさらに加工される。例えば、精製タンパク質単離物は、ｐＨを標的用途に適したｐＨに調整するために緩衝液中に希釈され得る。別の例として、精製タンパク質単離物は、標的用途で使用するために濃縮され得る。さらに別の例として、精製タンパク質単離物は、標的用途で使用するために乾燥され得る。
【０１５４】
卵を含まないエマルション（例えば、スクランブルエッグに類似するかまたはそれと均等である卵を含まない食品用）、パウンドケーキ、イエローケーキ、エンゼルフードケーキ、クリームチーズ、パスタ生地、パスタ、カスタード、アイスクリーム、乳、デリミートまたは糖菓を含む、緑豆からの高純度のタンパク質単離物を主要な機能性成分として取り込んだ種々の食品用途を作成した。実施例８〜１２、２０および２１は、種々の食品用途に取り込まれたタンパク質単離物の例を提供する。
【０１５５】
５．７．１  完全ベジタリアン(vegan)パティ
種々の実験は、緑豆タンパク質単離物が、配合された完全ベジタリアンパティ中の単独のゲル化剤としての使用に適しているという証拠を提供する。いくつかの実施形態では、イオタ−カラギナンおよびアラビアゴムから構成される親水コロイド系が配合パティ中の緑豆単離物の天然ゲル化特性を高める。他の実施形態では、１．５：１の比率の高アシルおよび低アシルゲランから構成される親水コロイド系が配合パティ中の緑豆単離物の天然ゲル化特性を高める。さらなる実施形態では、コンニャクおよびキサンタンガムから構成される親水コロイド系が配合パティ中の緑豆単離物の天然ゲル化特性を高める。
【０１５６】
５．７．２  卵を含まないエマルション
別の態様では、本明細書において、本明細書に記載される緑豆タンパク質単離物を含む、卵を含まない食用エマルションが提供される。いくつかの実施形態では、エマルションは、水、油、脂肪、親水コロイドおよびデンプンから選択される１つまたは複数の付加的な成分を含む。いくつかの実施形態では、卵を含まない食用エマルションの少なくともまたは約６０〜８５％は、水である。いくつかの実施形態では、卵を含まない食用エマルションの少なくともまたは約１０〜２０％は、タンパク質単離物である。いくつかの実施形態では、卵を含まない食用エマルションの少なくともまたは約５〜１５％は、油または脂肪である。いくつかの実施形態では、卵を含まない食用エマルションの少なくともまたは約０．０１〜６％は、親水コロイド画分またはデンプンである。いくつかの実施形態では、親水コロイド画分は、高アシルゲランガム、低アシルゲランガム、イオタ−カラギナン、アラビアゴム、コンニャク、ローカストビーンガム、グァーガム、キサンタンガムまたはこれらの１つもしくは複数のガムの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、エマルションは、風味料、着色剤、抗菌剤、膨張剤および塩の１つまたは複数をさらに含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、エマルションは、リン酸塩をさらに含む。いくつかの実施形態では、リン酸塩は、リン酸二ナトリウム（ＤＳＰ）、ヘキサメタリン酸ナトリウム（ＳＨＭＰ）、ピロリン酸四ナトリウム（ＴＳＰＰ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、エマルションは、ＤＳＰを含む。別の特定の実施形態では、エマルションは、ＤＳＰを含む。いくつかの実施形態では、エマルション中のＤＳＰの量は、少なくともまたは約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１１％、０．１２％、０．１３％、０．１４％もしくは０．１５％であり、または０．１５％よりも多い。別の特定の実施形態では、エマルションは、ＳＨＭＰを含む。いくつかの実施形態では、ＳＨＭＰは、短鎖ＳＨＭＣ、通常鎖のＳＨＭＰまたは長鎖ＳＨＭＰである。いくつかの実施形態では、エマルション中のＳＨＭＰの量は、少なくともまたは約０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％であり、または１％よりも多い。
【０１５８】
特定の実施形態では、本明細書において、約５．６〜６．８のｐＨを有する卵を含まない食用エマルションが提供される。いくつかの実施形態では、卵を含まない食用エマルションは、水、本明細書に記載される緑豆タンパク質単離物、タンパク質単離物の構造を修飾する酵素および油または脂肪を含む。いくつかの実施形態では、酵素は、トランスグルタミナーゼまたはタンパク質分解酵素を含む。いくつかの実施形態では、卵を含まない食用エマルションの少なくともまたは約７０〜８５％は、水である。いくつかの実施形態では、卵を含まない食用エマルションの少なくともまたは約７〜１５％は、タンパク質単離物である。いくつかの実施形態では、卵を含まない食用エマルションの少なくともまたは約０．０００５〜０．００２５％（５〜２５百万分率）は、タンパク質単離物の構造を修飾する酵素である。いくつかの実施形態では、卵を含まない食用エマルションの少なくともまたは約５〜１５％は、油または脂肪である。
【０１５９】
本明細書において、上記の卵を含まないエマルションのいずれかを用いて作られたパティも提供される。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載されるタンパク質単離物を用いて調製された、卵を含まないエマルションを提供し、卵を含まないエマルションは、例えば、卵を用いて調製されたスクランブルエッグ、オムレツまたはキッシュに類似するかまたはそれと均等である卵を含まない食品を作るために使用され得る。従って、いくつかの実施形態では、卵を含まないエマルションは、本明細書で開示される例示的なタンパク質単離物の１つまたは複数を含む。卵を含まないエマルションは、例えば、脂質、１つまたは複数の炭水化物および任意選択的にタンパク質修飾酵素、塩、風味料および／または色をさらに含み得る。これらの成分の割合は、結果として得られる卵を含まない食品のテクスチャ、風味および／または色を調節するように選択され得る。結果として得られる卵を含まない食品は、卵を再現するテクスチャおよび口あたりに類似するかまたはそれと均等である感覚印象を提供し得る。液体スクランブルおよびパティの感覚品質パラメータは、卵と同様のきれいな噛み口および適度な噛み応えを有する軟性の緻密なゲルとして特徴付けられる。
【０１６１】
いくつかの実施形態は、タンパク質を卵代用品として調製するための方法を提供する。例えば、実施例８で調製されるタンパク質単離物を２％のＮａ２ＨＰＯ４と混ぜ合わせ、成分を以下の液体組成：全固体２１％およびＮａ２ＨＰＯ４  ０．２５％にすることにより、タンパク質は、植物ベースの卵代用品、適切な置換成分として容易に使用される。
【０１６２】
５．７．３  焼いたケーキ
別の態様では、本明細書において、１つまたは複数の卵を含まないケーキ生地を調製するのに適した１つまたは複数の卵を含まないケーキミックスが提供され、このケーキミックスから１つまたは複数の卵を含まないケーキを作ることができる。いくつかの実施形態では、卵を含まないケーキミックスは、粉、糖および本明細書に記載される緑豆タンパク質単離物を含む。いくつかの実施形態では、卵を含まないケーキミックスは、クリームターター（cream of tartar）、リン酸二ナトリウム、ベーキングソーダおよびｐＨ安定剤から選択される１つまたは複数の付加的な成分をさらに含む。いくつかの実施形態では、粉は、ケーキ粉を含む。
【０１６３】
本明細書において、上記の卵を含まないケーキミックスおよび水を含む、卵を含まないケーキ生地も提供される。いくつかの実施形態では、卵を含まないケーキ生地は、卵を含まないパウンドケーキ生地、卵を含まないエンゼルフードケーキ生地または卵を含まないイエローケーキ生地である。いくつかの実施形態では、卵を含まないケーキ生地は、０．９５〜０．９９の比重を有する。
【０１６４】
本明細書において、上記の卵を含まないケーキ生地から作られた卵を含まないケーキも提供される。いくつかの実施形態では、卵を含まないケーキのピーク高さは、卵を含有するパウンドケーキのピーク高さの少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、卵を含まないケーキの１つまたは複数の特徴は、卵を含有するケーキの１つまたは複数の対応する特徴に類似するかまたはそれと均等である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の特徴は、弾力性、粘着性、スプリング性、ピーク高さ、中央のドーム形成、中央のクラック、褐色化、口あたり、スプリングバックまたは風味を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の特徴は、硬度、弾力性、粘着性、スプリング性または噛み応えを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の特徴は、機能特性または官能特性を含む。いくつかの実施形態では、機能特性は、乳化、水結合能、発泡性、ゲル化、クラム密度、構造形成、テクスチャ構築、粘着、接着性、弾性、スプリング性、溶解度、粘度、脂肪吸収、風味結合、凝固、膨化、通気、クリーミーさ、フィルム形成特性、光沢の付加、輝きの付加、凍結安定性、解凍安定性または色の１つまたは複数を含む。
【０１６５】
特定の実施形態では、本明細書において、粉、糖および本明細書に記載される緑豆タンパク質単離物を含む、卵を含まないパウンドケーキミックスが提供される。いくつかの実施形態では、粉は、ケーキ粉を含む。いくつかの実施形態では、卵を含まないパウンドケーキミックスは、油または脂肪をさらに含む。いくつかの実施形態では、油または脂肪は、バターまたはショートニングを含む。いくつかの実施形態では、卵を含まないパウンドケーキ生地の少なくともまたは約２５〜３１％は、粉である。いくつかの実施形態では、卵を含まないパウンドケーキ生地の少なくともまたは約２５〜３１％は、油または脂肪である。いくつかの実施形態では、卵を含まないパウンドケーキ生地の少なくともまたは約２５〜３１％は、糖である。いくつかの実施形態では、卵を含まないパウンドケーキ生地の少なくともまたは約６〜１２％は、タンパク質単離物である。いくつかの実施形態では、生地は、リン酸二ナトリウムまたはベーキングソーダをさらに含む。
【０１６６】
本明細書において、上記の卵を含まないパウンドケーキミックスを含み、かつ水をさらに含む、卵を含まないパウンドケーキ生地も提供される。いくつかの実施形態では、卵を含まないパウンドケーキ生地は、約４部の卵を含まないパウンドケーキミックス；および約１部の水を含む。いくつかの実施形態では、卵を含まないパウンドケーキ生地の少なくともまたは約２０〜２５％は、粉である。いくつかの実施形態では、卵を含まないパウンドケーキ生地の少なくともまたは約２０〜２５％は、油または脂肪である。いくつかの実施形態では、卵を含まないパウンドケーキ生地の少なくともまたは約２０〜２５％は、糖である。いくつかの実施形態では、卵を含まないパウンドケーキ生地の少なくともまたは約５〜８％は、タンパク質単離物である。いくつかの実施形態では、卵を含まないパウンドケーキ生地の少なくともまたは約１８〜２０％は、水である。
【０１６７】
別の特定の実施形態では、本明細書において、粉、糖および本明細書に記載される緑豆タンパク質単離物を含む、卵を含まないエンゼルフードケーキミックスが提供される。いくつかの実施形態では、卵を含まないエンゼルフードケーキミックスの少なくともまたは約８〜１６％は、粉である。いくつかの実施形態では、卵を含まないエンゼルフードケーキミックスの少なくともまたは約２９〜４２％は、糖である。いくつかの実施形態では、卵を含まないエンゼルフードケーキミックスの少なくともまたは約７〜１０％は、タンパク質単離物である。いくつかの実施形態では、卵を含まないエンゼルフードケーキミックスは、クリームターター、リン酸二ナトリウム、ベーキングソーダまたはｐＨ安定剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、粉は、ケーキ粉を含む。本明細書において、上記の卵を含まないエンゼルフードケーキミックスおよび水を含む、卵を含まないエンゼルフードケーキ生地も提供される。
【０１６８】
別の特定の実施形態では、本明細書において、粉、糖および本明細書に記載される緑豆タンパク質単離物を含む、卵を含まないイエローケーキミックスが提供される。いくつかの実施形態では、卵を含まないイエローケーキミックスの少なくともまたは約２０〜３３％は、粉である。いくつかの実施形態では、卵を含まないイエローケーキミックスの少なくともまたは約１９〜３９％は、糖である。いくつかの実施形態では、卵を含まないイエローケーキミックスの少なくともまたは約４〜７％は、タンパク質単離物である。いくつかの実施形態では、卵を含まないイエローケーキミックスは、ベーキングパウダー、塩、ドライミルクおよびショートニングの１つまたは複数をさらに含む。本明細書において、上記の卵を含まないイエローケーキミックスおよび水を含む、卵を含まないイエローケーキ生地も提供される。
【０１６９】
いくつかの実施形態は、タンパク質単離物を用いて卵を含まないパウンドケーキを製造するための方法を提供する。例えば、生地は、１７℃〜２０℃において、緑豆タンパク質単離物を含む液体溶液と、糖、ケーキ粉およびバターとを１：１：１：１ｗ／ｗの比率で混合することによって作られる。成分は、Hobartミキサーにおける一段階混合を用いて２２℃で６分間混ぜ合わせられる。生地は、パウンドケーキパン内で１５０℃において４５分間焼かれ、パン中で２２℃において２時間冷却される。
【０１７０】
タンパク質単離物を用いて作られたケーキの感覚品質パラメータは、柔らかく軟性のふんわりしたテクスチャとして特徴付けられる。ピーク高さは、卵を含有するパウンドケーキの９０〜１１０％であると測定された。精製緑豆タンパク質単離物を含むケーキ生地の比重は、０．９５〜０．９９であり、これは、全卵を含むケーキ生地の比重０．９５〜０．９６と同様であった。
【０１７１】
５．７．４  クリームチーズ類似品
別の態様では、本明細書において、本明細書に記載される緑豆タンパク質単離物を含む、卵を含まないクリームチーズが提供される。いくつかの実施形態では、卵を含まないクリームチーズは、水、油または脂肪および親水コロイドから選択される１つまたは複数の付加的な成分を含む。いくつかの実施形態では、卵を含まないクリームチーズの少なくともまたは約７５〜８５％は、水である。いくつかの実施形態では、卵を含まないクリームチーズの少なくともまたは約１０〜１５％は、タンパク質単離物である。いくつかの実施形態では、卵を含まないクリームチーズの少なくともまたは約５〜１０％は、油または脂肪である。いくつかの実施形態では、卵を含まないクリームチーズの少なくともまたは約０．１〜３％は、親水コロイドである。いくつかの実施形態では、親水コロイドは、キサンタンガムまたは低メトキシペクチンおよび塩化カルシウム系を含む。いくつかの実施形態では、卵を含まないクリームチーズは、風味料または塩をさらに含む。いくつかの実施形態では、卵を含まないクリームチーズの１つまたは複数の特徴は、卵を含有するクリームチーズの１つまたは複数の対応する特徴に類似するかまたはそれと均等である。いくつかの実施形態では、特徴は、味、粘度、クリーミーさ、稠度、匂い、延展性、色、熱安定性または融解特性である。いくつかの実施形態では、特徴は、機能特性または官能特性を含む。いくつかの実施形態では、機能特性は、乳化、水結合能、発泡性、ゲル化、クラム密度、構造形成、テクスチャ構築、粘着、接着性、弾性、スプリング性、溶解度、粘度、脂肪吸収、風味結合、凝固、膨化、通気、クリーミーさ、フィルム形成特性、光沢の付加、輝きの付加、凍結安定性、解凍安定性または色を含む。いくつかの実施形態では、官能特性は、風味または臭気を含む。
【０１７２】
実施例３１は、ＣａＣｌ２を含む低メトキシペクチンから構成される親水コロイド系を用いる例示的なクリームチーズ類似品を提供し、これは、クリームチーズを連想させるテクスチャ官能特性を有する連続的な軟性ゲルを形成する。付加的な結果は、キサンタンガムから形成される親水コロイド系を提供し、これは、クリームチーズを連想させるテクスチャ官能特性を有する連続的な軟性ゲルを形成する。
【０１７３】
５．７．５  卵を含まないパスタ生地
別の態様では、本明細書において、本明細書に記載される緑豆タンパク質単離物を含む、卵を含まないパスタ生地が提供される。いくつかの実施形態では、卵を含まないパスタ生地は、粉、油または脂肪および水から選択される１つまたは複数の付加的な成分を含む。いくつかの実施形態では、粉は、セモリナ粉を含む。いくつかの実施形態では、油または脂肪は、エクストラバージンオイルを含む。いくつかの実施形態では、卵を含まないパスタ生地は、塩をさらに含む。本明細書において、上記の卵を含まないパスタ生地から作られた卵を含まないパスタも提供される。いくつかの実施形態では、卵を含まないパスタは、生である。いくつかの実施形態では、卵を含まないパスタは、乾燥される。いくつかの実施形態では、卵を含まないパスタの１つまたは複数の特徴は、卵を含有するパスタの１つまたは複数の対応する特徴に類似するかまたはそれと均等である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の特徴は、噛み応え、密度、味、調理時間、貯蔵期間、粘着性または粘性を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の特徴は、機能特性または官能特性を含む。いくつかの実施形態では、機能特性は、乳化、水結合能、発泡性、ゲル化、クラム密度、構造形成、テクスチャ構築、粘着、接着性、弾性、スプリング性、溶解度、粘度、脂肪吸収、風味結合、凝固、膨化、通気、クリーミーさ、フィルム形成特性、光沢の付加、輝きの付加、凍結安定性、解凍安定性または色を含む。いくつかの実施形態では、官能特性は、風味または臭気を含む。
【０１７４】
５．７．６  植物ベースの乳
別の態様では、本明細書において、本明細書に記載される緑豆タンパク質単離物を含む、植物ベースの乳が提供される。いくつかの実施形態では、植物ベースの乳は、水、油または脂肪および糖から選択される１つまたは複数の付加的な成分を含む。いくつかの実施形態では、植物ベースの乳の少なくともまたは約５％は、タンパク質単離物である。いくつかの実施形態では、植物ベースの乳の少なくともまたは約７０％は、水である。いくつかの実施形態では、植物ベースの乳の少なくともまたは約２％は、油または脂肪である。いくつかの実施形態では、植物ベースの乳は、リン酸二ナトリウム、大豆レシチンおよび微量のミネラルの１つまたは複数をさらに含む。特定の実施形態では、植物ベースの乳は、ラクトースを含まない。他の特定の実施形態では、植物ベースの乳は、ガムまたは安定剤を含まない。
【０１７５】
５．７．７  卵を含まないカスタード
別の態様では、本明細書において、本明細書に記載される緑豆タンパク質単離物を含む、卵を含まないカスタードが提供される。いくつかの実施形態では、卵を含まないカスタードは、クリームおよび糖から選択される１つまたは複数の付加的な成分を含む。いくつかの実施形態では、卵を含まないカスタードの少なくともまたは約５％は、タンパク質単離物である。いくつかの実施形態では、卵を含まないカスタードの少なくともまたは約８１％は、クリームである。いくつかの実施形態では、卵を含まないカスタードの少なくともまたは約１３％は、糖である。いくつかの実施形態では、卵を含まないカスタードは、イオタ−カラギナン、カッパ−カラギナン、バニラおよび塩の１つまたは複数をさらに含む。いくつかの実施形態では、クリームは、ヘビークリームである。
【０１７６】
５．７．８  卵を含まないアイスクリーム
別の態様では、本明細書において、本明細書に記載される緑豆タンパク質単離物を含む、卵を含まないアイスクリームが提供される。いくつかの実施形態では、卵を含まないアイスクリームは、ソフトクリームまたは通常のアイスクリームである。いくつかの実施形態では、卵を含まないアイスクリームは、クリーム、乳および糖から選択される１つまたは複数の付加的な成分を含む。いくつかの実施形態では、卵を含まないアイスクリームの少なくともまたは約５％は、タンパク質単離物である。いくつかの実施形態では、卵を含まないアイスクリームの少なくともまたは約４１％は、クリームである。いくつかの実施形態では、卵を含まないアイスクリームの少なくともまたは約４０％は、乳である。いくつかの実施形態では、卵を含まないアイスクリームの少なくともまたは約１３％は、糖である。いくつかの実施形態では、卵を含まないアイスクリームは、イオタカラギナン、カッパカラギナン、バニラおよび塩の１つまたは複数をさらに含む。いくつかの実施形態では、クリームは、ヘビークリームである。いくつかの実施形態では、乳は、全乳である。特定の実施形態では、卵を含まないアイスクリームは、ラクトースを含まない。他の特定の実施形態では、卵を含まないアイスクリームは、ガムまたは安定剤を含まない。他の実施形態では、卵を含まないアイスは、卵ベースのアイスクリームの従来の口あたりおよびテクスチャを提供するが、卵ベースのアイスクリームと比べてより遅い速度で溶ける。
【０１７７】
５．７．９  脂肪低減ショートニング系（ＦＲＳＳ）
別の態様では、本明細書において、本明細書に記載される緑豆タンパク質単離物を含む、脂肪低減ショートニング系が提供される。いくつかの実施形態では、ＦＲＳＳは、水、油または脂肪から選択される１つまたは複数の付加的な成分を含む。いくつかの実施形態では、ＦＲＳＳは、クエン酸ナトリウムをさらに含む。さらにいくつかの実施形態では、ＦＲＳＳは、シトラス繊維をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＦＲＳＳの少なくともまたは約５％は、タンパク質単離物である。好ましい実施形態では、動物および／または乳製品ベースのショートニングを利用する同じ食品用途と比較すると、緑豆ベースのＦＲＳＳは、ＦＲＳＳを利用する食品用途（例えば、ベーキング用途）において脂肪含量の低減を可能にする。いくつかの実施形態では、動物および／または乳製品ベースのショートニングを利用する同じ食品用途と比較すると、脂肪の低減は、少なくとも１０％、２０％、３０％または４０％である。
【０１７８】
ＦＲＳＳの特定の実施形態では、ＦＲＳＳは、本明細書に記載される単離プロセスによって調製され、酸沈殿ステップは、約６．０のｐＨで実行される。いくつかのこのような実施形態では、結果として得られる緑豆タンパク質単離物は、ボックス乾燥機で乾燥される。
【０１７９】
５．７．１０  食肉類似品
別の態様では、本明細書において、本明細書に記載される緑豆タンパク質単離物を含む食肉類似品が提供される。いくつかの実施形態では、食肉類似品は、水、油、リン酸二ナトリウム、トランスグルタミナーゼ、デンプンおよび塩から選択される１つまたは複数の付加的な成分を含む。いくつかの実施形態では、食肉類似品の少なくともまたは約１０％は、タンパク質単離物である。いくつかの実施形態では、食肉類似品の調製は、食肉類似品の成分をエマルション中に混合し、チャブ内に結合させることができるケーシング内にエマルションを注ぐことを含む。いくつかの実施形態では、食肉類似品を含有するチャブは、水浴中、５０Ｃで２時間インキュベートされる。さらなる実施形態では、インキュベートされたチャブは、加圧調理される。いくつかの実施形態では、加圧調理は、１５ｐｓｉにおいて約１２１℃で３０分間行われる。
【０１８０】
５．７．１１  食品用途：補助成分
５．７．１１．１  ガム
本明細書に記載される１つまたは複数の緑豆ベースの食品を配合するために有用な種々のガムには、例えば、コンニャク、アカシアガム、Versawhip、グァーガム＋キサンタンガム、Q-extract、CMC6000（カルボキシメチルセルロース）、Citri-Fi200（シトラス繊維）、アップル繊維、フェヌグリーク繊維が含まれる。
【０１８１】
５．７．１１．２  リン酸塩
本明細書に記載される１つまたは複数の緑豆ベースの食品を配合するために有用な種々のリン酸塩は、リン酸二ナトリウム（ＤＳＰ）、ヘキサメタリン酸ナトリウム（ＳＨＭＰ）およびピロリン酸四ナトリウム（ＴＳＰＰ）を含む。特定の実施形態では、緑豆ベースの食品は、ＤＳＰを含む。いくつかの実施形態では、エマルション中のＤＳＰの量は、少なくともまたは約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．１１％、０．１２％、０．１３％、０．１４％もしくは０．１５％であり、または０．１５％よりも多い。別の特定の実施形態では、緑豆ベースの食品は、ＳＨＭＰを含む。いくつかの実施形態では、ＳＨＭＰは、短鎖ＳＨＭＣ、通常鎖のＳＨＭＰまたは長鎖ＳＨＭＰである。いくつかの実施形態では、エマルション中のＳＨＭＰの量は、少なくともまたは約０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％もしくは１％であり、または１％よりも多い。
【０１８２】
５．７．１１．３  デンプン
デンプンは、最も普及している食品成分の１つであり、有用な乳化特性を有することが示されている。デンプンおよびデンプン粒は、エマルションを安定化することが知られている。従って、１つまたは複数のデンプンは、例えば、クズウコンデンプン、コーンスターチ、タピオカデンプン、緑豆デンプン、ジャガイモデンプン、サツマイモデンプン、米デンプン、サゴデンプン、小麦デンプンなどの植物組成物から製造される。疎水性により、デンプンは、油−水界面で吸着されるようになり、再合体、従って液滴の安定性が防止される。
【０１８３】
５．７．１１．４  保存料
特定の実施形態では、方法および組成物は、タンパク質単離物と組み合わせて有効量の保存料の添加を含む。
【０１８４】
保存料は、細菌、カビ、真菌または酵母からの食品の損傷を防止し（抗菌剤）；色、風味またはテクスチャの変化を遅くするかまたは防止し、酸敗を遅延させ（酸化防止剤）；鮮度を保持する。保存料には、以下：アスコルビン酸、クエン酸、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸カルシウム、エリトルビン酸ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、ソルビン酸カルシウム、ソルビン酸カリウム、ＢＨＡ、ＢＨＴ、ＥＤＴＡ、トコフェロール（ビタミンＥ）および酸化防止剤（脂肪および油ならびにこれらを含有する食品が酸敗するかまたは異臭を発生することを防止する）が含まれるが、これらに限定されない。表３を参照されたい。
【０１８５】
【表３】
2019509036.tif 000005
【０１８６】
５．８  組成物の貯蔵および貯蔵期間
いくつかの実施形態では、タンパク質単離物またはタンパク質単離物を含む組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０週間まで室温での貯蔵において安定であり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質単離物またはタンパク質単離物を含む組成物は、数か月間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３か月を超えて室温での貯蔵に対して安定であり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質単離物またはタンパク質単離物を含む組成物は、数か月間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３か月を超えて冷蔵または冷凍貯蔵に対して安定であり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質単離物またはタンパク質単離物を含む組成物は、数年間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３年を超えて冷蔵または冷凍貯蔵に対して安定であり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質単離物またはタンパク質単離物を含む組成物は、数か月間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３か月を超えて室温での貯蔵に対して安定であり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質単離物またはタンパク質単離物を含む組成物は、数年間、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３年を超えて室温での貯蔵に対して安定であり得る。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、乾燥材料としての貯蔵は、タンパク質単離物またはタンパク質単離物を含む組成物の貯蔵期間を延ばすことができる。いくつかの実施形態では、タンパク質単離物またはタンパク質単離物を含む組成物は、液体、例えば水を用いて後に再構成するための乾燥材料として貯蔵される。いくつかの実施形態では、精製タンパク質単離物は、粉末形態であり、これにより、より安価で輸送することができ、損傷のリスクがより少なくなり、貯蔵期間が延長される（大幅に減少した含水量および水分活性による）。
【０１８８】
他の実施形態では、精製タンパク質単離物またはタンパク質単離物を含む組成物は、液体、例えば水、乳または消費に適した他の液体によって再構成される。１つの例では、液体スクランブルを製造するために３６〜４５グラムの液体を１２〜１５グラムの乾燥重量の組成物に添加することができる。液体の量は、再構成された組成物の特定の目的に適合するように変化され得る。
【０１８９】
付加的な実施形態では、食品組成物は、加熱下において、冷蔵またはより冷たい条件下または非周囲条件下で精製タンパク質単離物またはそのエマルション中の配合物を含む。
【実施例】
【０１９０】
６．実施例
６．１  実施例１：粒径のキャラクタリゼーション
種子の製粉の効率は、粉の粒径分布に反映され、単離された材料の組成およびその機能性に影響を与える。Mastersizer AeroS（Malvern）を用いて緑豆粉の粒径を特徴付け、表４に示した。単離のために使用した材料は、８〜２２０μｍの範囲の粒径分布を示した。
【０１９１】
【表４】
2019509036.tif 000006
【０１９２】
６．２  実施例２：タンパク質単離物の精製プロトコル
この実施例は、本明細書に記載される緑豆タンパク質単離物を調製するための例示的なプロトコルを提供する。
【０１９３】
Ａ．多段階抽出。５：１の水道水対粉の比率で水を緑豆粉と混合する。混合物のｐＨをＮａＯＨによってｐＨ６．５〜ｐＨ８に調整する。４℃において混合物を６０００ｘｇで１５分間遠心分離する。抽出物を捕集し、ペレットを水対粉３：１で再懸濁させる。ｐＨをＮａＯＨによってｐＨ６．５〜ｐＨ８に調整し、４℃において６０００ｘｇで１５分間再度遠心分離する。両方の抽出物を合わせ、１００ｕｍのナイロンメッシュによってろ過する。
【０１９４】
Ｂ．木炭ろ過または異臭除去（任意選択）。木炭の規格：粒径約５００ｕｍ〜１５００ｕｍ、メッシュサイズ１２ｘ３０、酸洗浄済。木炭の調製：１００ｇの木炭を３ｋｇの水中に混合し、フィルタに流し込み、木炭を捕集する。次に、１ｇの木炭を１０ｇの抽出物に添加し、約１５分間インキュベートする。次に、４℃において混合物を１００００ｘｇで１５分間遠心分離する。混合物は、キレート剤、例えば２ｍＭのＣａＮａ２ＥＤＴＡによって処理することもできる。
【０１９５】
Ｃ．酸沈殿。ｐＨ５．６＋／−０．２における等電沈殿を１〜４℃における低温沈殿法と組み合わせる。ｐＨを２０％クエン酸によってｐＨ５．４〜５．８まで下げる。氷上で１時間冷却する。代替的に、低イオン強度沈殿を低温沈殿法（１〜４℃）と組み合わせて超高流速で実施することができる。冷（４℃）０．３％ＮａＣｌ中、１体積の上清対３体積の冷０．３％ＮａＣｌの比率でろ液の急速希釈を実施する。次に、４℃においてろ液を１０，０００ｘｇで１５分間遠心分離する。
【０１９６】
Ｄ．回収。ペレットを捕集し、０．３％ＮａＣｌ（４℃）によって１：４（ｗ／ｗ）で再懸濁し、均質化する。ｐＨをクエン酸によって５．６＋／−０．１に保持する。４℃において懸濁液を１０，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、最終ペレットを均質化する。
【０１９７】
最終ペレットを均質化し、水分含量を記録する。
【０１９８】
６．３  実施例３：タンパク質抽出物の木炭処理
この実施例は、タンパク質抽出プロセスにおける非タンパク質、異臭成分（例えば、豆っぽい風味など）を除去するために炭素吸着ステップを実施するための例示的なプロトコルを提供する。入力マメ科植物粉または材料の典型的な出発重量は１〜１２ｋｇの範囲であり、典型的な収率は約２５％であり、水分含量は約７８％である。
【０１９９】
木炭の規格：粒径約５００ｕｍ〜１５００ｕｍ、メッシュサイズ１２ｘ３０、酸洗浄済。
【０２００】
木炭の調製：１００ｇの木炭を３ｋｇの水中に混合し、フィルタに流し込み、捕集する。この洗浄ステップを全部で２回洗浄するために繰り返す。
【０２０１】
抽出物の調製：３：１の水対粉の比率で水を粉と混ぜ合わせ、次に４℃において６０００ｘｇで２０分間遠心分離する。上清を捕集し、１００ｕｍのナイロンメッシュによってろ過する。
【０２０２】
木炭処理：調製した木炭を１Ｌの抽出物と混合し、１５分間攪拌する。次に、抽出物−木炭混合物を１００ｕｍフィルタによってろ過して大きい木炭粒子を除去し、４℃において１０，０００ｘｇで１５分間遠心分離して、残りの灰分を除去する。５００ｍＭのＣａＮａ２ＥＤＴＡを最終濃度が２ｍＭのＣａＮａ２ＥＤＴＡになるまで抽出物に添加し、混合してから、４℃で６０分間インキュベートする。冷（４℃）０．３％ＮａＣｌ中、１体積の上清対３体積の冷０．３％ＮａＣｌの比率でろ液の急速希釈を実施する。次に、４℃においてろ液を１０，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、ペレットを捕集する。
【０２０３】
０．３％ＮａＣｌ＋０．７ｍＭのＣａＮａ２ＥＤＴＡ（４℃）によって１：４（ｗ／ｗ）でペレットを懸濁および均質化し、４℃において１０，０００ｘｇで１５分間遠心分離する。得られたペレットを０．３％ＮａＣｌ（４℃）によって１：４（ｗ／ｗ）で洗浄してから、４℃において１０，０００ｘｇで１５分間遠心分離する。
【０２０４】
最終ペレットを均質化し、水分含量を記録する。
【０２０５】
６．４  実施例４：パイロット規模のタンパク質単離法
この実施例は、緑豆タンパク質単離物のパイロット規模の調製のための例示的なプロトコルを提供する。一般的なプロセスのブロック流れ図は、図３に示される。プロセスは、タンパク質の抽出段階から始まり、製粉された緑豆粉が５〜１０体積の軟水と冷却した混合タンク（２〜８℃）内で混合されて、スラリーを形成する。スラリーのｐＨは、標的タンパク質の水溶液中への可溶化のためにｐＨ７に達するまで、食品グレードの５０％ＮａＯＨ溶液によって調整される。次に、スラリーは、固体／液体分離ユニット操作（通常、１つのデカンタおよび１つのディスクスタック遠心分離機の組み合わせ）まで送られ、可溶化タンパク質抽出物は、粉の繊維状デンプン画分から分離される。
【０２０６】
任意選択的に、タンパク質抽出物は、４℃において食品グレードの木炭充填環状バスケットカラム（＜５％の木炭対タンパク質抽出物比、ｗ／ｗ）を通過するように送り出される。この炭素吸着ステップの主要な機能は、タンパク質抽出における非タンパク質、異臭成分（例えば、豆っぽい風味など）を除去することである。いくらかの繊維状固体も除去し、従って清澄化されたタンパク質抽出物をもたらす。
【０２０７】
清澄化タンパク質抽出物は、低温条件（２℃）下でその等電点（ｐＨ５．６）に達するまで２０％の食品グレードのクエン酸溶液によって酸性化される。この条件下において、標的タンパク質は、沈殿し、水溶液から分離可能になる。ｐＨ調整に加えて、異臭化合物の生成を招き得るリポキシゲナーゼ活性を阻害するために、このステップ中に２ｍＭの食品グレードのＥＤＴＡが添加される。沈殿したタンパク質スラリーは、次に固体／液体分離ユニット操作（通常、１つのディスクスタック遠心分離機）に送られ、遠心分離ステップの重い相中にタンパク質凝固物が回収される。
【０２０８】
次に、タンパク質凝固物は、低温条件（２℃）下の洗浄ステップ中、４体積の軟水によって洗浄される。洗浄は、タンパク質凝固物中の不純物（例えば、繊維状固体、塩、炭水化物）を除去するための仕上げ精製（polishing）ステップとみなされる。このステップでは、遠心分離中の固体／液体分離を促進するために０．３％（ｗ／ｗ）食品グレードの塩化ナトリウムが通常添加される。
【０２０９】
洗浄したタンパク質凝固物溶液は、次に高温／短時間（ＨＴＳＴ）殺菌ステップによって殺菌される。乳の殺菌と同様に、このステップの主要な機能は、洗浄したタンパク質凝固物溶液中に存在し得るあらゆる病原性細菌を死滅させることである。例示的なＨＴＳＴ条件は、７４℃で２０〜２３秒間である。
【０２１０】
加工の最終ステップは、スプレー乾燥であり、殺菌されたタンパク質溶液は、含水量を除去するためにスプレー乾燥機を通過される。典型的なスプレー乾燥条件は、乾燥機入口温度１７０℃および乾燥機出口温度７２℃を有する。乾燥したタンパク質単離物粉末は、通常、５％未満の水分含量を有する。
【０２１１】
６．５  実施例５：限外ろ過研究
限外ろ過研究は、緑豆タンパク質単離物から、残留している原料物質、例えば多糖を含む汚染分子を除去することの有効性を評価するために行った。限外ろ過（ＵＦ）は、様々な膜ろ過であり、圧力または濃度勾配のような力が半透膜を通して分離をもたらす。懸濁された高分子量の固体および溶質は、いわゆる保持液中に保持されるが、水および低分子量の溶質は、透過液中で膜を通過する（図４）。
【０２１２】
１つの実験では、粒径の決定に基づいて１００ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用した。流速は、膜間差圧が低くてもこれまで観察されたものよりもはるかに速く、最終的に種々の画分（約４Ｘ濃度）を得た。透過液画分は、著しく黄色であり、特徴的な生の豆の臭いを有していた。約７５０ｍｌの材料を２００ｍｌまで濃縮してから、２６０ｍｌの新たな１００ｍＭのＮａ＋／Ｋ＋リン酸緩衝液、ｐＨ６．８を添加して、洗浄または透析ろ過した。主要な画分および透析ろ過ステップからの透過液画分の２つの透過液画分が得られた。最終的に、保持液体積を２００ｍｌまで濃縮し、膜をすすいで残留タンパク質を得た。
【０２１３】
全体的に見て、粒径の決定に基づいてＵＦユニットにおける巨大分子構造の分配を実証することにより、本方法は、嗅覚検知により、かつ物理的にも判断されるように、スクランブルエッグのために使用されるタンパク質単離物における望ましくない臭気に関連する小分子を問題なく除去した。付加的なＵＦトライアルは、せん断された親水コロイドを含有する微小流体化材料が直接ＵＦを受けることができるかどうかを決定することができる。従って、本方法は、限外ろ過を用いて、望ましくない臭気に関連する小分子の除去を提供する。
【０２１４】
６．６  実施例６：等電沈殿のｐＨ値の効果
６．６．１  タンパク質収率、純度および小分子の保持に対する効果
得られる緑豆タンパク質単離物のタンパク質収率、純度および非タンパク質の保持に対する効果を決定するために等電沈殿中のｐＨ値の効果を調べた。ｐＨ４．９、ｐＨ５．２、ｐＨ５．６またはｐＨ６のいずれかで等電沈殿ステップを実施したことを除いて、実施例２に記載されるように緑豆単離物を調製した。タンパク質純度（ｍｇ／タンパク質／ｍｇ乾燥重量）およびタンパク質収率（ｇ／ｇ粉）を決定し、その結果は、それぞれ図５Ａおよび５Ｂに示される。これらの結果は、等電沈殿をｐＨ５．６で実施したときにタンパク質純度およびタンパク質収率が最高であったことを示す。
【０２１５】
単離物においてサイズ排除クロマトグラフィ分析も実施し、その結果は、図６Ａに示され、図６Ｂに要約される。これらの結果は、より低いｐＨ（すなわちｐＨ４．９および５．２）において、より小さい分子（例えば、単糖および二糖などの炭水化物）が単離物中にタンパク質と共に回収されるが、より高いｐＨ値（すなわちｐＨ５．６および６．０）では、小分子の回収と比べて実質的により高い割合のタンパク質が回収されることを実証する。従って、約ｐＨ５．６〜約ｐＨ６．０の範囲における緑豆タンパク質の沈殿は、望ましくない臭気に関連する小分子のより良い除去を提供し、得られる単離物においてより高い割合のタンパク質の回収を可能にする。
【０２１６】
６．６．２  粗脂質および脂肪酸の保持に対する効果
得られる緑豆タンパク質単離物の油および脂質に対する効果を決定するために等電沈殿中のｐＨ値の効果をさらに調べた。緑豆単離物は、以下のように調製した。緑豆粉を１：５の比率で蒸留水と混合し、オーバーヘッドミキサーを用いて５分間混合した。次に、混合を起こしながら、１０ＭのＮａＯＨを用いて溶液のｐＨを７．０に調整した。次に、４℃において溶液を６，０００ｇで１０分間遠心分離した。次に、上清をボトルからデカントして保存し、ペレットを廃棄した。上清を同量の１０個のバッチに分けた。各バッチをオーバーヘッドミキサーで混合し、２０％（ｗ／ｗ）クエン酸溶液を用いて、十（１０）個の所望のｐＨ値：ｐＨ４．４、４．６、４．８、５、５．２、５．４、５．６、５．８、６および６．２の１つにｐＨを調整した。各バッチにおいて所望のｐＨが達成されたら、溶液をさらに１分攪拌させ、ｐＨを安定化させた。次に、各バッチを遠心機に移動し、４℃において１０，０００ｇで１５分間回転するように設定した。次に、上清を廃棄し、（１）全タンパク質の回収、（２）粗脂質および（３）脂肪酸分析を定量化するためにペレットを捕集した。
【０２１７】
粗脂質の抽出は、Dionex ASE 350システムを使用し、加圧流体抽出によって実施した。ケイ藻土を用いて約１：１の比率（ｗ：ｗ）でサンプルを混合した。石油エーテル（BD Analytical）を用いてサンプルを１００℃で５分間抽出した。抽出物を蒸発させ、残渣の重量を粗脂質％として記録した。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（BD Analytical）を用いて約１００ｍｇの各粗抽出物を１０ｍＬに希釈した。５００μＬの各抽出物をアンバーＨＰＬＣバイアルに移した。２５０μＬの水酸化トリメチルスルホニウム溶液（TCI Organics、メタノール中０．２Ｍ）の添加により、遊離脂肪酸を誘導体化した。バイアルを１００℃で１０分間加熱し、冷却し、分析のためにＧＣへ移した。NuChek Prepから購入した遊離脂肪酸混合物７４ｘを用いてＦＡＭＥを同定した。FAMEWAXカラム（３０ｍｘ０．２５ｍｍｘ０．２５μｍ、Restek）を用いるAgilent 7890B GC-FIDシステムにおいてサンプルを分離した。
【０２１８】
図７に示されるように、全タンパク質の回収は、緑豆タンパク質をｐＨ５．４〜５．６で酸沈殿させたときに最高であり、上記の観察と一致した。ｙ軸は、タンパク質を含む１００．７グラムの抽出物から回収されたタンパク質のグラム数を表す。
【０２１９】
図８に示されるように、ｐＨ５．４〜５．６で酸沈殿を経た緑豆タンパク質単離物はまた、試験した沈殿ｐＨの範囲の中で最小量の粗脂質を保持した。図８Ａに示されるように、単離物がｐＨ４．４、４．６、４．８および５．０、６．０および６．２で沈殿を経ると、粗脂質の全量は、沈殿前の抽出物中の粗脂質の量（左端）と比べて強化されているようである。図９Ａおよび９Ｂは、ｐＨ４．４〜６．２から沈殿された緑豆タンパク質単離物のそれぞれの中の特定の脂肪酸（ＦＡＭＥＳ）の量を示す。測定した特定の脂肪酸は（左から右へ向かって）、Ｃ１４：０（ミリスチン酸メチル）；Ｃ１５：０（ペンタデカン酸メチル）；Ｃ１６：０（パルミチン酸メチル；Ｃ１６：１  パルミトレイン酸メチル；Ｃ１７：０  ヘプタデカン酸メチル；Ｃ１８：０  ステアリン酸メチル；Ｃ１８：１  オレイン酸メチル；Ｃ１８：２  リノール酸メチル；Ｃ１８：３  アルファリノール酸メチル；Ｃ２０：０  エイコサン酸メチル；およびＣ２２：０  ベヘン酸メチルである。図９Ａは、上記のｐＨ値のそれぞれにおいて沈殿された単離物について回収されたこれらの脂肪酸のそれぞれの量の図を提供し、図９Ｂは、マイナーな脂質タイプの量のより詳細な図を提供する。測定したそれぞれの特定の脂肪酸について、ｐＨ５．４〜５．６で酸沈殿を経た緑豆タンパク質単離物はまた、最小量のＦＡＭＥＳを保持した。
【０２２０】
６．６．３  ゲル化に対する効果
構造構築特性、特に得られた緑豆タンパク質単離物からゲルを形成する能力に対する効果を決定するために等電沈殿中のｐＨ値の効果をさらに調べた。
【０２２１】
動的振動レオロジーにより、ｐＨ４．４、５．０、５．６および６．０でそれぞれ沈殿された緑豆タンパク質単離物のゲル化を特徴付けた。平坦な平行プレート形状（直径４０ｍｍ）を備えたレオメーター（MCR502、Anton Paar）を使用し、温度の上昇の結果として各単離物の粘弾性特性をモニターした。各沈殿ｐＨ値について、１３．３％のタンパク質濃度で単離物のサンプルを調製した。約１．５ｍＬのサンプルをレオメーターの下側プレートにロードし、標準手順に従ってトリミングした。測定中の温度上昇の結果としてサンプル内の水が蒸発するのを防止するために溶媒トラップに２ｍＬの蒸留Ｈ２Ｏを入れた。
【０２２２】
１０ラジアン／秒の一定の角振動数において変形の小さい条件（０．１％歪）下において、５℃／分の加熱速度で３０℃から９５℃までの温度勾配中、貯蔵弾性率（Ｇ’）および損失弾性率（Ｇ”）を連続的に記録し、その後、５分間９５℃に保持した。この保持後、ゲル化材料の線形粘弾性領域を特徴付けるために材料の温度を５０℃まで低下させ、１０ラジアン／秒の一定の振動数において０．０１〜１００％歪の振幅掃引試験を実行した。各サンプルは、トリプリケートで試験した。
【０２２３】
レオロジーデータを分析して、上記で定義された条件下で単離物によって製造されたゲルの挙動のキャラクタリゼーションに関連する特定の特徴を抽出した。
【０２２４】
ゲル化開始温度は、生データから抽出され、調査した範囲全体の温度に対する位相角の変曲点として解釈された。ゲル化事象において、位相角は、温度の関数として著しく低下し、材料がその内部構造において明確な遷移を受けた温度の正確な尺度として使用され得る。図１０に示されるように、ｐＨ５．６（８７．４℃）〜ｐＨ６．０（８５．４℃）で沈殿された単離物のゲル化開始温度は、ｐＨ４．４〜５．０（いずれも９０．７℃）で沈殿された単離物と比較して実質的により低い。
【０２２５】
ゲル強度も生データから抽出され、貯蔵弾性率が振動歪の関数として直線の粘弾性範囲を超えた振動歪（％）として定義された。図１１に示されるように、ｐＨ４．４および５．０で沈殿された単離物（いずれも１．４０％未満）と比較して、ｐＨ５．６で沈殿された単離物（７．００％）およびｐＨ６．０で沈殿された単離物（１１．８３％）のゲル強度は、実質的により高かった。特にｐＨ４．４〜５．０で沈殿された単離物と比較して、単離物をｐＨ５．６〜６．０で沈殿させたときのゲル強度の増大の大きさは約５〜９倍であり、これは、予想外に優れたゲル強度を表した。
ゲル弾性も同様に貯蔵弾性率対振動歪の生データから抽出され、貯蔵弾性率が振動歪の関数として直線の粘弾性範囲を超えた応力（Ｐａ）として定義された。図１２に示されるように、ｐＨ４．４（１９４．４０Ｐａ）〜ｐＨ５．０．（２０７Ｐａ）で沈殿された単離物と比較して、ｐＨ５．６（１１４５．０８Ｐａ）〜ｐＨ６．０（８２０９．９４Ｐａ）で沈殿された単離物のゲル弾性は、実質的により高かった。特にｐＨ４．４〜５．０で沈殿された単離物と比較して、単離物をｐＨ５．６〜６．０で沈殿させたときのゲル弾性の増大の大きさは約５〜４０倍であり、これは、予想外に優れたゲル弾性を表した。
【０２２６】
６．６．４  感覚特性に対する効果
ｐＨ５．２および５．６でそれぞれ沈殿された単離物から調製された卵様パティの感覚特性に対する効果を決定するために等電沈殿中のｐＨ値の効果をさらに調べた。ｐＨ５．２で沈殿されたタンパク質単離物を含むパティ配合物は、水（７８％）、タンパク質単離物（１４．７２％）、油（６．２％）、ＤＳＰ（０．４２％）、乳化剤（０．４％）、塩（０．３１％）および酵素（０．００２％）を含んだ。ｐＨ５．６で沈殿されたタンパク質単離物を含むパティ配合物は、水（７９％）、タンパク質単離物（１４．０２％）、油（６．２％）；ＤＳＰ（０．４２％）、乳化剤（０．４％）、塩（０．３１％）および酵素（０．００２％）を含んだ。各サンプルについて、緑豆タンパク質単離物を、中〜高せん断混合下で均質な混合物を作るような配合で水、油、リン酸二ナトリウム、乳化剤および塩とブレンドした。次に、混合物を５０Ｃの温度まで加熱した後、酵素を添加した。次に、この材料をシリコーン型に充填し、パティを形成した。シリコーン型を２３分間５５℃に保持した後、インピンジメントオーブンに移し、２５０Ｆで１０分間調理した。シリコーン型を冷却し、型から外し、丸いパティが得られた。
【０２２７】
ｐＨ５．２で沈殿された緑豆タンパク質単離物を用いて調製されたパティ配合物は、完全には「調理」されず、すなわち、パティは、固いゲルを形成しなかったが、ｐＨ５．６で沈殿された単離物を用いて調製されたパティ配合物は、完全なままのパティを形成した。この結果は、２つのパティの直接的な感覚比較を実行する能力を限定した。それでも１０人の被験者が製品を試食し、以下の表５に要約される感覚コメントを提供した。ほとんど全ての被験者は、ｐＨ５．２で沈殿された単離物で作られたパティがｐＨ５．６のものと異なることに気付いた。ｐＨ５．２で沈殿された単離物で作られたパティを説明するために最も一般的に使用される属性は、「酸っぱい」であった。
【０２２８】
【表５】
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【０２２９】
さらに、各単離物から作られたパティにおいてテクスチャプロファイル分析（ＴＰＡ）を実施した。３８ｍｍプローブを備えたBrookfield Texture Analyzerを用いて、手段となるテクスチャプロファイルパラメータを記録した。最初に５ｇの負荷によって引き起こされる１ｍｍ／ｓの試験速度における２回の一軸圧縮サイクルをサンプルに行った。標的圧縮距離は、７０％の変形に対応して７ｍｍに設定した。硬度、粘着性、スプリング性および弾力性を決定し、その結果を図１３に提供する。ｐＨ５．２で沈殿された単離物で作られたサンプルは、ｐＨ５．６で沈殿された単離物で作られたサンプルよりも堅さ、粘着性、スプリング性および弾力性が低かった。
【０２３０】
６．６．５  結論
まとめると、約ｐＨ５．６〜ｐＨ６．０のｐＨ範囲で酸沈殿を経た緑豆タンパク質単離物は、ｐＨ５．６未満のｐＨで酸沈殿を経た緑豆タンパク質単離物と比較してタンパク質の回収に優れ（小分子の回収と比較して）、ゲル化開始温度、ゲル強度、ゲル弾性および感覚特性に関して優れた品質を実証した。約ｐＨ５．２〜ｐＨ５．８のｐＨ範囲で酸沈殿を経た緑豆タンパク質単離物は、この範囲外で酸沈殿を経た緑豆タンパク質単離物と比較したときに実質的により低い脂質保持も実証した。
【０２３１】
６．７  実施例７：低収量の代替プロセス
代替プロセスは、非常に低いタンパク質量をもたらした。沈殿前に抽出物を６５℃で２時間加熱し、その後、２５℃において１０，０００ｘｇで１時間遠心分離を行った。ペレットを廃棄し、上清を捕集し、低温沈殿法と組み合わせた超高流速の低イオン強度沈殿によって沈殿させた。
【０２３２】
６．８  実施例８：緑豆タンパク質単離物のタンパク質組成
その組成的構成と、単離プロセスによる何らかの組成変化、例えばタンパク質の強化とを決定するために、実施例２に従って調製された緑豆タンパク質単離物の生化学的分析を行った。緑豆タンパク質単離物の４つの不連続バッチ。
【０２３３】
表６は、出発材料の脱皮緑豆と比較した、本明細書に記載される方法に従って調製された緑豆タンパク質単離物中のタンパク質、炭水化物、脂肪、水分および灰分含量の近似分析を提供する。
【０２３４】
【表６】
2019509036.tif 000008
【０２３５】
緑豆タンパク質は、大部分（約９０％）が、８ｓ、１１ｓおよび７ｓグロブリンによって表されるグロブリンを含む。通常、緑豆中の全グロブリンの約９０％に相当する８ｓグロブリンは、約１５０ｋＤａの分子量を有するヘテロ三量体タンパク質であり、各モノマーは、約４９ｋＤａの分子量を有する。通常、緑豆中の全グロブリンの１０％未満に相当する１１ｓグロブリンは、約６４ｋＤａの分子量を有する。通常、緑豆中の全グロブリンの５％未満に相当する７ｓグロブリンは、約４４〜４５ｋＤａの分子量を有する。タンパク質の単離プロセスを通してタンパク質分布の変化を調べるために、単離プロセスの進行段階を通して得られたサンプルにおいてサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）分析を行った。
【０２３６】
図１４Ａおよび１４Ｂは、（Ａ）緑豆粉からのタンパク質抽出の直後であるが、等電沈殿（ＩＥＰ）前に得られたサンプルからのタンパク質分子量分布と、（Ｂ）ＩＥＰおよび洗浄後に得られたサンプルからのタンパク質分子量分布との比較を提供する。抽出物のＩＥＰおよび洗浄は、６２．４％（＋／−５．３４％）から７０％（＋／−１１．７％）への全タンパク質の強化、３７．５５％（＋／−５．３５％）から３０％（＋／−１１．７％）への非タンパク質種の低減をもたらす。８ｓタンパク質の量の増大（全非凝集タンパク質の％として）および１１ｓタンパク質の量の低減（全非凝集タンパク質の％として）も見られる。
【０２３７】
単離プロセスを通した８ｓグロブリンの強化および１１ｓグロブリンの低減を確認するために、ＩＥＰステップおよび洗浄ステップからそれぞれ得られた上清およびペレット画分中のタンパク質プロファイルの評価を実施した。図１４Ｃおよび１４Ｄは、ＩＥＰが沈殿物（ペレット）画分中の８ｓグロブリンの大部分の保持をもたらし、上清中にごく少量の８ｓが存在するが、１１ｓグロブリンの大部分は上清中に保持され、ごく少量のが沈殿物中に存在することを示す。図１４Ｅおよび１４Ｆは、ＩＥＰ後の洗浄ステップが沈殿物中の８ｓグロブリン集団をさらに強化し、上清中にはごく少量が残され、一方、１１ｓグロブリンが沈殿物中にほとんど検出できず、上清中のタンパク質のかなりの部分を構成することを示す。ＳＥＣ分析における全タンパク質のかなりの部分は、非常に高分子量の凝集体として現れ、その同一性は不明であり、８ｓおよび／または１１ｓグロブリンの凝集体を表し得る。しかしながら、単離プロセスを通した８ｓおよび１１ｓに対応する分子量種の分布のパターンは、単離プロセスによって８ｓグロブリンが強化されているが、１１ｓグロブリンは低減されていることを強く示唆する。
【０２３８】
タンパク質同一性のレベルにおいて、８ｓグロブリンが単離プロセスによって強化されているかどうかを決定するために、２次元−液体クロマトグラフィ−タンデム質量分析（２Ｄ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により、抽出物および単離物からのタンパク質の同一性を調べた。ビグナ・ラディアタ（Vigna radiata）ゲノムおよびデコイ配列データベースに対して生ＭＳ／ＭＳスペクトルを検索した。スペクトルカウンティングを使用して、全タンパク質量に関して各タンパク質の相対量を計算した。表７は、その存在量がサンプル中の全タンパク質の１％よりも多いタンパク質の予測同一性および代表的な量（平均値％として表される）を提供する。値は、抽出プロセスのみから得られたサンプル（「抽出物」）およびＩＥＰを含む単離プロセス全体を通して得られたサンプル（「単離物」）について提供される。抽出物に対する単離物中のタンパク質の存在量の増大パーセントは、「強化％」として表される。
【０２３９】
【表７】
2019509036.tif 000009
【０２４０】
図１５は、表形式およびグラフ形式の両方において、上記の配列（配列番号１〜１２）のアミノ酸配列アライメントを提供する。アライメントは、ベータ−コングリシニンタンパク質であると予測される配列番号１に対して、配列番号２〜９および１２が少なくとも５０％以内の同一性であることを示す。これらの結果は、緑豆抽出物の等電沈殿が緑豆単離物組成物中の全タンパク質と比べてベータ−コングリシニンを強化する（３０％まで）ことを実証する。
【０２４１】
６．９  実施例９：タンパク質単離物の分析
単離プロセスが一貫した産物を生じることを検証するために緑豆タンパク質単離物（実施例２に従って調製）の４つの不連続バッチを分析した。バッチ分析の結果は、表８に提供される。結果は、単離プロセスが一貫した産物を生じることを示す。
【０２４２】
【表８】
2019509036.tif 000010
【０２４３】
６．１０  実施例１０：アミノ酸プロファイル
実施例９に記載される４つの代表的なバッチの緑豆タンパク質単離物のアミノ酸組成における分析を実施し、その結果を以下の表９に提供する。結果は、タンパク質単離物のアミノ酸プロファイルがバッチ間で一貫しており、緑豆タンパク質単離物がバランスの取れたアミノ酸プロファイルを含有することを示す。
【０２４４】
【表９】
2019509036.tif 000011
【０２４５】
６．１１  実施例１１：ビタミン、ミネラル、炭水化物および脂質
３つの不連続バッチのタンパク質単離物（実施例２に従って調製）においてビタミン、ミネラル、炭水化物および脂質ついての分析を行い、その結果を以下の表１０に提供する。
【０２４６】
【表１０−１】
2019509036.tif 000012
【０２４７】
【表１０−２】
2019509036.tif 000013
【０２４８】
６．１２  実施例１２：環境汚染物質
６．１２．１  残留農薬
緑豆タンパク質単離物が天然の供給源に由来することを考慮して、３つの不連続バッチのタンパク質単離物において、いくつかの塩素系および有機リン系農薬残留物についての分析を行った。試験した塩素系農薬には、アラクロル、アルドリン、アルファ−ＢＨＣ、アルファ−クロルデン、ベータ−ＢＨＣ、ＤＤＤ、ＤＤＥ、ＤＤＴ、デルタ−ＢＨＣ、ジエルドリン、エンドスルファンＩ、エンドスルファンＩＩ、エンドスルファンスルファート、エンドリン、エンドリンアルデヒド、ガンマ−ＢＨＣ、ガンマ−クロルデン、ヘプタクロル、ヘプタクロルエポキシド、メトキシクロルおよびペルメトリンが含まれた。試験した有機リン系農薬には、アジノホスメチル、カルボフェノチオン、クロルフェンビンホス、クロルピリホスメチル、ジアジノン、ジクロルボス、ダーズバン、ジホナート、エチオン、フェニトロチオン、マラチオン、メチダチオン、メチルパラチオン、パラチオン、ホサロンおよびピリミホスメチルが含まれた。バッチ分析の結果は、表１１に提供され、緑豆タンパク質単離物（実施例２に従って調製）の塩素系および有機リン系農薬残留物のレベルが０．１ｐｐｍの検出レベルよりも低いことを示す。
【０２４９】
【表１１】
2019509036.tif 000014
【０２５０】
６．１２．２  ダイオキシンおよびポリ塩化ビフェニル
残留農薬に加えて、３つの不連続バッチの緑豆タンパク質単離物（実施例２に従って調製）は、ダイオキシンおよびポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）の残留物についても分析した。分析の結果は、表１２において提供される。これらの化合物は、試験材料に存在しないか、または毒物学的有意性のないレベルで存在すると決定された。
【０２５１】
【表１２】
2019509036.tif 000015
【０２５２】
６．１２．３  マイコトキシン
アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２およびオクラトキシンＡを含むマイコトキシンの存在について、不連続バッチの緑豆タンパク質単離物（実施例２に従って調製）を液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって分析した。表１３に提供される分析結果は、タンパク質単離物が任意の残留マイコトキシンを含まないことを示す。
【０２５３】
【表１３】
2019509036.tif 000016
【０２５４】
６．１３  実施例１３：抗栄養因子
食事性の抗栄養因子は、タンパク質の消化率、アミノ酸の生物学的利用能および食品のタンパク質品質に悪影響を与え得る化学物質である（Gilani et al., 2012）。緑豆において報告されている抗栄養因子は、タンニン、フィチン酸、ヘマグルチニン（レクチン）、ポリフェノール、トリプシン阻害剤、α−アミラーゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤であり（Dahiya et al., 2015）、これらは、脱皮、発芽、浸漬および加熱などの特定の加工ステップ中、部分的または完全に除去または分解されることが報告されている（Mubarak, 2005）。
【０２５５】
代表的なバッチの緑豆タンパク質単離物（実施例２に従って調製）および緑豆粉におけるタンパク質ベースの抗栄養因子の存在は、プロテオミクス解析と組み合わせた２次元ナノ液体クロマトグラフィ−質量分析／質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）法を用いて分析した。表１４に提供される結果は、タンパク質単離プロセスが、緑豆粉サンプルと比較してレクチンおよびプロテアーゼ阻害剤タンパク質の相対存在量の低下をもたらすことを示した。プロテオミクス解析後、既知の□−アミラーゼ阻害剤とのマッチは同定されなかった。別の分析では、タンパク質単離物および緑豆粉のそれぞれの３つの代表的なバッチにおいてレクチンのレベルを分析し、結果は、これらのサンプル中の低レベルのレクチン（＜０．０５ｍｇ／ｇ）を示した。
【０２５６】
【表１４】
2019509036.tif 000017
【０２５７】
タンパク質ベースの抗栄養因子（すなわちプロテアーゼ阻害剤、アルファ−アミラーゼ阻害剤およびレクチン）に加えて、いくつかの代表的なバッチの緑豆タンパク質および緑豆粉では、非タンパク質ベースの抗栄養因子（すなわちポリフェノールおよびフィチン酸）のレベルも測定した。一般に、緑豆粉のレベル（１１７〜３４４ｍｇのＧＡＥ／１００ｇ）と比較して、タンパク質単離物（９８〜２０３ｍｇの没食子酸当量（ＧＡＥ）／１００ｇ）では、低レベルの全ポリフェノールが同定された。緑豆粉では６８５〜７１６ｍｇ／１００ｇであるフィチン酸範囲と比較して、タンパク質単離物におけるフィチン酸のレベルは、７５９〜９１８ｍｇ／１００ｇの範囲であった。
【０２５８】
６．１４  実施例１４：アレルゲン性
AllergenOnlineデータベース（http://www.allergenonline.org/）に従う緑豆関連の５つの推定タンパク質アレルゲンと、５つのバッチの緑豆粉およびその対応するタンパク質単離物の全体にわたって同定された１，８６７のタンパク質のユニオンセットとの比較タンパク質分析を行った（FARRP, 2016）。全体で、粉およびタンパク質単離物中の１８の配列が推定緑豆アレルゲンの４つとマッチした。マッチは、１ｅ−７未満のＥ値で全長アライメントについて計算された５０％よりも大きい配列同一性を有した。推定アレルゲンは、種子アルブミン（ＣＡＡ５０００８．１、４ヒット）、病原性関連タンパク質−１０（ＰＲ−１０）（ＡＡＸ１９８８９．１、２ヒット）、８Ｓグロブリンベータ−アイソフォーム前駆体（ＡＢＧ０２２６２．１、１２ヒット）および８ｓグロブリンアルファ−アイソフォーム前駆体（ＡＢＷ２３５７４．１、１２ヒット）であった。代表的なバッチのタンパク質単離物および緑豆粉における推定アレルゲンマッチの相対存在量は、表１５に示される。タンパク質単離プロセスは、ＰＲ−１０タンパク質アレルゲンのレベルを無視できるほどほとんどないレベルまで実質的に除去または低減する。より具体的には、ＰＲ−１０タンパク質アレルゲンは、緑豆粉中に０．００２〜０．００３％のレベルで検出され、これらのアレルゲンのレベルをタンパク質単離物中で測定すると、１つのバッチ（ロット番号１５−６８６−０３１９−１２０．１）で微量レベル（０．００１％）が検出されたが、他の４つのバッチではＰＲ−１０タンパク質アレルゲンは検出されなかった。タンパク質単離プロセスは、推定アルブミンおよびグロブリンアレルゲンの相対存在量を緑豆粉と比較して有意な程度まで変化させないようであった。認められる差異は、恐らく実験誤差の範囲内である。
【０２５９】
【表１５】
2019509036.tif 000018
【０２６０】
スプレー乾燥タンパク質単離物（完成品；ロット番号１２３．１）、ならびにスプレー乾燥タンパク質単離物から調製された未調理および調理済サンプルにおいて同定された１，０８３のタンパク質のユニオンセットについて同様の分析を実施した（表１６）。より具体的には、スプレー乾燥サンプルを１００ｍＭのHepes（ｐＨ８．６）中に再懸濁させ、１０ｍＭのリン化ナトリウム（ＮａＰ）ｐＨ８．０緩衝液中、０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈した。次に、未調理サンプルを調製するために、スプレー乾燥材料を水中に可溶化させて１２％ｗ／ｗのタンパク質溶液を作り、１０ｍＭのＮａＰ（ｐＨ８）緩衝液中、０．５ｍｇ／ｍＬまで希釈した。調理済サンプルは、ＮａＰ緩衝液の添加前に付加的な調理ステップ（２５０°Ｆで１０分間）を行い、同様にして調製した。病原性関連タンパク質１０（ＡＡＸ１９８８９．１）マッチは検出されなかった。以下の表１６に示されるように、タンパク質単離プロセスおよび調理は、推定アレルゲンの相対存在量を有意に変更しない（全ての変化は各サンプルの初期値の３％以内であった）。しかしながら、タンパク質単離プロセス中、推定８ｓグロブリン□−アイソフォーム前駆体およびアルファサブユニット（これらはいずれも、緑豆種子中の主要なタンパク質の貯蔵源および機能タンパク質である）のレベルはわずかに強化または消耗された。
【０２６１】
【表１６】
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【０２６２】
６．１５  実施例１５：緑豆タンパク質単離物の安定性
２４か月の安定性研究は現在進行中であり、４つの不連続バッチの緑豆タンパク質単離物（実施例２に従って調製）が室温において気密容器内で貯蔵される。タンパク質単離物の組成（すなわち水分、タンパク質、油、灰分および炭水化物）は、研究期間を通して種々の時点（すなわち４、６、９、１２、１８および２４か月）で測定される。安定性研究の中間結果は、以下の表１７に示される。緑豆タンパク質単離物の水分、タンパク質含量、油含量、灰分および炭水化物は、確立された製品規格から有意に変化せず、タンパク質単離物が６か月まで貯蔵されたときに安定していることが示唆される。タンパク質単離物の油／脂質含量の値は以下に示され、これらの値は、６か月までの貯蔵後に有意に変化しない。
【０２６３】
【表１７】
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【０２６４】
６．１６  実施例１６：緑豆タンパク質単離物のタンパク質消化率および補正アミノ酸スコア
１９８９年に国連食糧農業機関（ＦＡＯ）によって提唱されたＰＤＣＡＡＳ評定は、タンパク質品質を評価するための「好ましい最良の」方法として１９９３年にＦＤＡによって採用された（ＦＡＯ／ＷＨＯ，１９９１；Ｕ．Ｓ．ＦＤＡ，１９９３）。この方法は、タンパク質の栄養価が、人間の（必須）アミノ酸の必要量を満たすのに適切な量の窒素およびアミノ酸を提供するその能力に依存するという原理に基づく。いくつかのタンパク質の品質は、アミノ酸スコア値を用いて直接評価され得るが、他のタンパク質の品質は、消化率および／または生物学的利用能が低いために評価することができない。従って、アミノ酸の組成および消化率の尺度は、いずれも人間の食事のための食物のタンパク質品質を正確に予測するために必要であると考えられる（ＦＡＯ／ＷＨＯ，１９９１）。実際には、ＰＤＣＡＡＳは、ラットバランスアッセイを用いて測定されることが多い糞便消化率（fecal digestibility）を補正して、試験タンパク質の第１制限必須アミノ酸の含量を必須アミノ酸の基準パターン（すなわちアミノ酸スコア）中の同じアミノ酸の含量に関連付ける（ＦＡＯ／ＷＨＯ，１９９１）。
【０２６５】
緑豆タンパク質単離物（実施例２に従って調製）のＰＤＣＡＡＳは、以下の式を用いて計算され、ここで、必須アミノ酸の基準パターンは、１９８５年にＦＡＯ／ＷＨＯ／ＵＮＵによって決定された２〜５歳の未就学児のアミノ酸の必要量に基づく（表１８を参照されたい）。
【数１】
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【０２６６】
【表１８】
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【０２６７】
表１８に示されるように、タンパク質単離物中の制限アミノ酸は、最低のアミノ酸スコア０．６５を有する硫黄含有アミノ酸のメチオニンおよびシステインである。０．６５というアミノ酸スコアを考慮に入れ、かつ緑豆について報告された真の糞便消化率８４％（Khan et al., 1979）に基づいて、緑豆タンパク質単離物のＰＤＣＡＡＳ％は、０．５５（すなわち０．６５ｘ８４％）として計算される。インビボの糞便消化率研究は、２つのバッチの緑豆タンパク質単離物を用いてラットにおいて行った。未調理単離物と、加熱プロセスによって調製および調理した単離物との両方の食事において各単離物の消化率を評価した。試験グループは、ラットの生存に必要な他のビタミン、ミネラルおよびカロリーと共に配合されたおよそ１０％のタンパク質からなる１５ｇ／日の食事をそれぞれ与えらえた４匹の雄シロネズミから構成された。試験グループにこの食事を連続して９日間与え、５〜９日目に糞便の捕集を行った。次に、タンパク質供給源の真の消化率（ＴＤ）を評価するためにケルダール法を用いて、窒素含量によるタンパク質濃度について糞便材料を分析した。表１９に示されるように、インビボのＰＤＣＡＡＳ値は、上記のインビトロの値と一致し、調理プロセスによる影響は受けない。緑豆タンパク質単離物について測定された真の消化率スコア平均９６．４は、カゼイン対照について測定された真の消化率スコア９７．１に好ましく匹敵する。
【０２６８】
【表１９】
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【０２６９】
６．１７  実施例１７：緑豆および他の植物供給源からの単離物の熱的キャラクタリゼーション
熱安定性の指標として、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により、緑豆タンパク質単離物（実施例２に従って調製）の変性を決定した。固体示差走査熱量計（Q20、TA Instruments）を使用して変性温度を決定した。吸熱ピークの温度は、タンパク質の変性と関連され得る。低イオン強度における低温沈殿によって種々の植物供給源からの単離物を作った。蒸留水での希釈によって１３％の固体に調整された単離物溶液をＤＳＣ分析のために使用した。４０℃における平衡後、密封アルミニウムパン内に封入されたサンプルおよび空の基準パンを４０℃から１２０℃まで３℃／分で上昇させて加熱した。緑豆からの単離物は、全卵と同様に、他の植物供給源からの材料（８４℃〜１０１℃）よりも著しく低い熱安定性（７０℃〜７８℃）を示した。タンパク質単離物の変性温度は、図１６に示され、以下の表２０に要約される。
【０２７０】
【表２０】
2019509036.tif 000024
【０２７１】
固体示差走査熱量測定を使用して、異なる緑豆供給源から精製されたタンパク質単離物のアンフォールディング熱力学を研究した。低温沈殿法と組み合わせた超高流速の低イオン強度沈殿によってタンパク質を単離した。温度走査は、４℃／分の速度で４０℃〜１００℃の範囲であった。融解温度は、図１７に示されるように７７℃〜８５℃で様々である。
【０２７２】
固体示差走査熱量測定を使用して、ｐＨ．５．６における等電沈殿によって調製されたタンパク質のアンフォールディング熱力学を研究した。殺菌前の単離物（６２．１）、殺菌後の単離物（６２．２）、スプレー乾燥単離物（６２．３）を異なる固体パーセントで可溶化し、比較した。融解温度および材料に吸収された熱（エンタルピー）は、図１８Ａおよび１８Ｂにそれぞれ示される。温度走査は、５℃／分の速度で４０℃〜１００℃の範囲であった。スプレー乾燥単離物の変性温度は、より高く（２℃〜５℃のシフトアップ）、変性のために吸収されるエネルギーは、全ての単離物について同じであり、固体％と共に上昇する。
【０２７３】
６．１８  実施例１８：ゲル化：水結合能および構造構築特性
表２１は、遠心分離による破壊後、加熱ゲル化後の植物単離物サンプルが液体（水）を保持する能力を評価するために使用される水結合能を示す。ＷＢＣ％が高いほど、保持される水の量も多くなる。蒸留水によって植物単離物を１３％の固体に基準化し、６５℃および８５℃で６０分間加熱し、４７００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。遠心分離中にゲルによって放出されたセラム（serum）の重量からＷＢＣ％を計算した。
【０２７４】
【表２１】
2019509036.tif 000025
【０２７５】
図１９は、熱で誘導された緑豆単離物ゲルが、両方の温度（６５℃および８５℃）で他の植物供給源からの単離物ゲルよりも高い水結合能を示すことを示し、これにより、緑豆単離物のより強力なゲルネットワークおよび増大された機能性が示される。
【０２７６】
ゲル構造の強度は、６５℃で１０〜９０分間の加熱ゲル化後に決定した。冷却した後、サンプルをVortexによって激しく攪拌した。緑豆および他の植物供給源からの単離物から熱で誘導されたゲルの構造を視覚的に評価し、以下の判断基準に基づいて分類し、表２２に示す。
【０２７７】
【表２２】
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【０２７８】
これらの結果は、緑豆タンパク質単離物が、試験した他の植物単離物と比べて加熱時により高いゲル化およびゲルネットワーク構築特性を示すことを実証する。
【０２７９】
６．１９  実施例１９：動的振動レオロジーを用いた緑豆単離物および他の植物供給源のレオロジー的キャラクタリゼーション
緑豆の高純度タンパク質単離物、他の植物供給源および対象の食品用途のゲル化を、動的振動レオロジーを用いて特徴付けした。平行プレート形状（直径４０ｍｍ）を備えたディスカバリーハイブリッドレオメーター（TA Instruments）を使用し、１０ラジアン／秒の一定の角振動数における変形の小さい条件（０．５％歪）下において、４５℃から９５℃までの温度勾配中、材料の貯蔵弾性率（Ｇ’）および損失弾性率（Ｇ”）をモニターした。ゲル化温度を、Ｇ’が最高の相対的増加を受けるときの温度として記録した。全ての振動温度勾配後、ゲル化材料の線形粘弾性領域を記録するために材料の温度を５０℃まで下げ、０．０１％〜１０％歪の振幅掃引試験を行った。
【０２８０】
図２０は、種々の緑豆供給源からの単離物のゲル化温度を示す。ＨＣＦ−２１３、ＨＣＦ−２３４およびＨＣＦ−２０８は、全卵のゲル化温度に匹敵するゲル化温度を有する。
【０２８１】
図２１は、単一の供給源から得られるが、異なる条件下で沈殿されたゲル化緑豆単離物を卵と比較して視覚的に示す。配合された緑豆単離物は、均質化し殻を除いた全卵と同じ温度でゲル化しない（図２２を参照されたい）が、これら、特に塩沈殿によって得られる単離物は、振幅掃引において全卵と同様の粘弾性のプロファイルを示す（図２３を参照されたい）。
【０２８２】
６．２０  実施例２０：テクスチャプロファイル分析（ＴＰＡ）を用いたゲル化緑豆単離物のテクスチャのキャラクタリゼーション
３８ｍｍプローブを備えたBrookfield Texture Analyzerを用いて、手段となるテクスチャプロファイルパラメータを記録した。最初に５ｇの負荷によって引き起こされる１ｍｍ／ｓの試験速度における２回の一軸圧縮サイクルをサンプルに行った。標的圧縮距離は、７０％の変形に対応して７ｍｍに設定した。硬度、粘着性、スプリング性、噛み応えおよび弾力性を決定し、対象の食品用途と比較した。図２４は、主成分分析の２次元視覚化を用いて、異なるプロセス下で配合された緑豆単離物のテクスチャ特徴を種々の卵対照のテクスチャ特徴と比較する。異なるプロセス１〜４を用いて配合されたいくつかの精製タンパク質単離物（すなわちＪＰ１−６９、ＪＰ１−７０、ＪＰ１−７１）のテクスチャは、硬度、粘着性、スプリング性、噛み応えおよび弾力性に関して卵対照のテクスチャに匹敵することが示された。配合物は、タンパク質修飾酵素、親水コロイドで使用される成分および塩レベルにおいて様々であった。精製パラメータは、ｐＨ、塩、酸、温度および時間において様々であった。
【０２８３】
６．２１  実施例２１：発泡能試験
Cuisinartハンドヘルドミキサーを用いてサンプルをホイップし過ぎないように注意しながら速度４において室温で４〜６分間タンパク質溶液の泡を（特定の濃度で）作った後、オーバーラン％を測定することにより、緑豆単離物（実施例２に従って調製）において発泡能試験を実施した。オーバーラン％は、初期の液体体積に対する泡体積の比率として測定した。次に、泡を３０分間静置し、ドレナージ％を測定した。泡安定性の指標であるドレナージ％は、初期の泡体積に対する３０分後の泡体積の比率として測定した。より高いドレナージ％は、低い泡安定性を示唆する。図２５は、卵白対照と比較した、２つの緑豆タンパク質単離物によるオーバーラン％およびドレナージ％の結果を示す。
【０２８４】
６．２２  実施例２２：緑豆からの単離物の溶解度のキャラクタリゼーション
比濁法の技術を用いて緑豆単離物（実施例２に従って調製）の溶解度を測定した。比濁法は、液体サンプル内で散乱された光の量を測定し、濁度を高感度で定量化する。NEPHELOstar Plusプレートリーダー（BMG Labtech）を使用して、９６ウェルプレートベースの形式で溶解度測定を実施した。NEPHELOstarは、６３２．８ｎｍの偏光ヘリウム−ネオンレーザーを使用する。使用した比濁計の設定は、ビーム焦点２．５ｍｍおよび強度１０％を含む。直径３ｍｍで軌道平均化を使用した。位置決め遅延（セトリングタイム）０．１秒で、１ウェル当たりの測定時間は０．２６秒であった。測定前に各プレートに５００ｒｐｍで１０秒のダブルオービタル振とうを行い、ウェル内のサンプル溶液を均質化した。溶解度測定は室温で実施した。透明な平底９６ウェルGreinerマイクロプレートを使用した。ｐＨ３、５および７、ならびに０、０．４、０．８および１ｗｔ％ＮａＣｌの存在下を含む種々の溶媒条件下で緑豆単離物の溶解度を研究した。クエン酸塩およびリン酸二ナトリウム緩衝液を使用して水性画分のｐＨを制御した。０〜８．９ｗｔ％タンパク質の範囲の単離物の濃度勾配を使用して、１２の溶媒条件（３つのｐＨ×４つのＮａＣｌ濃度）の全てでタンパク質の溶解度を決定した。各測定は、再現性を保証するためにトリプリケートで行った。
【０２８５】
相対比濁計単位（Relative Nephelometer Unit）（ＲＮＵ）対タンパク質濃度のデータの線形適合を実施することにより、溶解度を決定した。２本のラインを適合させ、線形回帰を最適化して、タンパク質濃度の増大として起こるＲＮＵの増大に対して最良適合の２本のラインを得た。溶解度値は、これらの２本のラインが互いに交差するタンパク質濃度であると決定された。図２６に提供されるデータは、これらの溶解度値に対応する。試験したほぼ全ての条件において、緑豆タンパク質単離物を含む水溶液は、乳、均質化した全卵、チア、ソルガム粉および有機乳と比較して優れた溶解度を示した。
【０２８６】
６．２３  実施例２３：緑豆からの単離物の泡安定性のキャラクタリゼーション
KruessからのDynamic Foam Analyzer（DFA100）機器において泡安定性測定を実施した。３つの測定モードを使用して、泡安定性についての最大量の情報を収集した：泡および液体レベルの高さ（光散乱によって測定）、構造（泡のタイムラプス画像の画像分析によって測定）、ならびに液体含量（サンプルを通して異なる高さに配置される一連の電極に沿って測定された伝導率によって測定）。データ分析のために最新ソフトウェアを使用した。以下の機器設定を使用した：気流速度０．２Ｌ／分、高さ測定について４０％の光照射および構造測定について７５％の光照射。４５ｍＬの水性タンパク質溶液を使用し、その体積の２倍（９０ｍＬ）の空気を液体全体に機械的にパージした。DFA100内の１６〜４０ｕｍ焼結ガラスフリットに空気を通過させた。泡の安定性は、１０分間にわたって（サンプル中に空気をパージした直後に開始）評価した。６フレーム／分（ｆｐｍ）のデータサンプリング間隔によって６０の画像が得られ、これを泡構造について分析した。カメラを測定容器の底から５５ｍｍの高さに配置した。
【０２８７】
ｐＨ３、５および７、ならびに４．２および８．９ｗｔ％タンパク質のタンパク質濃度を含む種々の溶媒条件下で水性タンパク質サンプルを調製した。クエン酸塩およびリン酸二ナトリウム緩衝液を使用して水性画分のｐＨを制御した。各サンプルは、トリプリケートで試験した。
【０２８８】
泡の安定性は、泡指標として計算した。これは、最大泡高さおよび泡高さの経時的な崩壊の尺度である。泡および溶液の全高さを空気のパージの終了から実験の終了までの時間（１０分間）において積分した。この積分は、最大発泡能（最大高さによって表される）および安定性（泡および溶液の高さの損失によって決定される）の両方の効果を取り込む。高い泡指標は、発泡性について十分な性能のある材料を示す。図２７のデータは、緑豆単離物およびいくつかの基準材料の泡品質を報告する。
【０２８９】
６．２４  実施例２４：緑豆からの単離物のエマルション安定性のキャラクタリゼーション
単離物の乳化特性を研究するために、緑豆タンパク質単離物を含有する水中油エマルションにおいてエマルション安定性の測定を実施した。まず、種々の溶媒条件下の単離物の水溶液を調製した。エマルション中の最終タンパク質濃度は４．２および８．９ｗｔ％タンパク質であり、水性画分は、ｐＨ３、５および７において、ＮａＣｌ（１ｗｔ％）の非存在下および存在下で調製した。クエン酸塩およびリン酸二ナトリウム緩衝液を使用して水性画分のｐＨを制御した。高速で約１０秒間のボルテックスによって水溶液を混合した。セロロジカルピペットによってキャノーラ油を全体積の１／３の質量比で添加し、高速で１０秒間ボルテックスした。Pro Scientific PRO25Dホモジナイザーによって２０ｍｍの鋸歯プローブを用いて４分間、全体積（約１５ｍＬ）を５０００ｒｐｍで均質化した。次に、ポジティブディスプレイスメント式ピペットを用いてエマルションを４ｍＬのガラスバイアル内に分配し、１ガラスバイアル当たり３ｍＬのサンプルを分注した。各サンプルは、トリプリケートで試験した。測定の直前に、Pro Scientific PRO25Dホモジナイザーによって直径７ｍｍの鋸歯プローブを用いてサンプルを５０００ｒｐｍで４分間均質化した。
【０２９０】
Formulaction Turbiscan Lab機器を使用してエマルション安定性を研究した。この機器は、エマルション内の相分離を特徴付けるために光散乱を使用する。機器によって捕集された生データは、サンプルの高さおよび時間の関数として透過率および後方散乱の値を含む。各サンプルを１０分間にわたって測定し、サンプルにおける入射光の後方散乱を２５秒の間隔で測定した。
【０２９１】
全体的なエマルション安定性を時間の関数として評価するためにTurbiscan測定からの後方散乱データを処理した。０分の時点で測定された後方散乱のベースラインを差し引いた後の最終の１０分の時点における後方散乱（ＢＳ）を調べた（式１）。サンプルの全高さにわたる１０分での後方散乱のこの変化（ΔＢＳ）を使用して、安定性指標（ＳＩ）と称されるエマルション安定性の指標を抽出した（式２、図２８）。安定性指標は、本質的に、ΔＢＳ対高さの曲線下の面積であり、以下に示される式によって定義される。
ΔＢＳｈ，ｔ＝ＢＳｈ，ｔ−ＢＳｈ，０  （１）
【数２】
2019509036.tif 000027
【０２９２】
安定性指標が高いほど、エマルションの安定性は低い。より低い安定性指標は、より高いエマルション安定性を示す。
【０２９３】
６．２５  実施例２５：液体卵代用品
図２９（Ａ〜Ｄ）は、緑豆タンパク質単離物を含む４つの液体卵代用品配合物を視覚的に示す。
Ａ  −−−  緑豆単離物
Ｂ  −−−  イオタ−カラギナン＆アラビアゴムを伴う緑豆単離物
Ｃ  −−−  コンニャク＆キサンタンガムを伴う緑豆単離物
Ｄ  −−−  ゲランを伴う緑豆単離物
【０２９４】
図３０は、液体スクランブル配合物における粘度対せん断速度の比較を示す。緑豆タンパク質単離物およびゲランを用いる卵様パティ配合物は、通常の卵と同様の粘度プロファイルを示す。そのニュートン挙動により、これらは注入可能になり、液体スクランブル卵代用品製品として使用するのに適格とされる。
【０２９５】
卵様パティの代表的な配合物は、水（７５〜８５％）；緑豆タンパク質単離物（１０〜１５％）；油（５〜１０％）；親水コロイド（０．１〜３％）（以下の組み合わせ：（１）高アシル＆低アシルゲランガム；（２）イオタ−カラギナン＆アラビアゴム；（３）コンニャク＆キサンタンガムのいずれか１つを含む）；デンプン（０．１〜６％）；風味料（１〜２％）；および塩（＜１％）を含む。エマルション混合物はｐＨ５．６〜６．８である。
【０２９６】
緑豆からの高純度の単離物を８０％の水分含量まで再水和させ、１ＭのＮａＯＨによってｐＨ６．０に調整する。室温において５０００ｒｐｍで４分間操作されるPro Scientificせん断ミキサーを用いて植物タンパク質単離物、油、親水コロイド、塩および他の成分のエマルションを調製した。エマルションを円形の型（直径３インチ）内に堆積させ、堆積させる量は１つの型につき５０ｇである。対流式オーブンを２２０°Ｆで５５分に設定する。
【０２９７】
６．２６  実施例２６：トランスグルタミナーゼを用いるスクランブル製品の調製
緑豆タンパク質濃縮物または単離物の調製および使用は、加工中、トランスグルタミナーゼを予め反応させた。緑豆タンパク質を含む水性中間プロセスストリームにトランスグルタミナーゼを添加し、規定の温度で規定の期間インキュベートした後、短期間適用される熱により、または過酸化水素などの酸化剤の添加により酵素の不活性化を行った。トランスグルタミナーゼ酵素は、タンパク質濃縮物または単離物の調製プロセスの複数の時点で適用した。このプロセスの結果は、精製され、安定的に架橋された、高機能性の緑豆タンパク質リッチな産物であり、これは、冷蔵または室温貯蔵安定性の植物ベースの液体食品エマルションにおいて使用することができる。
【０２９８】
タンパク質をトランスグルタミナーゼ粉末と接触させた後、０．２％のトランスグルタミナーゼ処理した抽出物は、０％のトランスグルタミナーゼよりも濁っていることが認識された。これは、トランスグルタミナーゼ処理した抽出物中のタンパク質の強凝集を示す。図３１は、５０℃で１５分のインキュベーション後であるが、等電沈殿前の抽出物を示す。トランスグルタミナーゼで処理した全ての抽出物が、より多くのトランスグルタミナーゼの添加につれてより濁ることは明らかであった。これもトランスグルタミナーゼ処理した抽出物中のタンパク質の強凝集を示す。プロセスの冷却部分後、より多量のトランスグルタミナーゼ抽出物が凝固物を形成し始めることも認識された。
【０２９９】
スクランブル配合において９００ｇの抽出物に添加された種々の量のトランスグルタミナーゼ粉末が最終単離物にどのように影響し得るかを決定するために、付加的な試験を実施した。図３２は、様々な量のトランスグルタミナーゼ粉末を（抽出物重量の割合として）示す。トランスグルタミナーゼの量の増大は、ゴム状ペレットまたは凝固物をもたらすようであった。
【０３００】
トランスグルタミナーゼと反応されたタンパク質の好ましい実施形態をスクランブル類似品に取り込むと、より柔らかい、よりふんわりしている、および／または、あまりパサパサでない特徴が得られた。調理プロセス中に見られる、０．０１２５％トランスグルタミナーゼによって改善されたスクランブル配合物を示す図３３と、特徴的により柔らかく、よりふんわりしており、かつあまりパサパサでない所望のスクランブルを、トランスグルタミナーゼを用いずに作られたスクランブルと比較する図３４とを参照されたい。
【０３０１】
６．２７  実施例２７：トランスグルタミナーゼと反応した緑豆タンパク質の分析
調製した緑豆単離物中の対象のタンパク質グロブリンに、トランスグルタミナーゼがリポキシゲナーゼを架橋させている可能性があるかどうか、およびそれがどの程度であるかを決定するために、図１Ｂに示されるように単離物を調製した。すなわち、等電沈殿前に様々な量のトランスグルタミナーゼと反応させた。上清およびペレット（グロブリンリッチな重い画分を含有する）を沈殿後に捕集し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥを行い、１サンプル当たりのリポキシゲナーゼの量をウエスタンブロッティングによって決定した。
【０３０２】
図３５は、リポキシゲナーゼについて染色されたウエスタンブロットを示し、全てのレーンは、以下のように、上清（レーン４〜９）またはペレット（レーン１０〜１２）からの約５ｕｇのタンパク質サンプル（ここで、サンプルは様々な量のトランスグルタミナーゼと反応されている）を含有する：
レーンキー（上清およびペレットは、全てＩＥＰ後である）：
１．抽出物
２．０％ＴＧ上清
３．ラダー
４．０．０１２５％ＴＧ上清
５．０．０２５％ＴＧ上清
６．０．０５％ＴＧ上清
７．０．１％ＴＧ上清
８．０．１５％ＴＧ上清
９．０．２％上清
１０．０％ＴＧペレット
１１．０．０１２５％ＴＧペレット
１２．０．０２５％％ＴＧペレット
【０３０３】
レーン１０〜１２において明らかなように、リポキシゲナーゼは、グロブリンリッチなペレットに持ち越されておらず、レーン２および４〜９は、リポキシゲナーゼが明白に上清中に残存することを示した。理論により拘束されることなく、トランスグルタミナーゼは、リポキシゲナーゼを所望のタンパク質に架橋させ得ることが予想されたが、この結果は、トランスグルタミナーゼがリポキシゲナーゼを架橋させていないか、または対象のタンパク質グロブリンに架橋していないかのいずれかであることを暗示しており、これは予想外であった。
【０３０４】
トランスグルタミナーゼで処理されたペレットにおいて任意の高分子量タンパク質複合体が形成されるかどうかを決定するために、膜をポンソーレッド染色した。図３６に示されるように、約１００〜１５０ｋｄａの高分子量タンパク質が存在するようである（楕円で示される）。さらに、これらのペレット中の５０Ｋｄａのグロブリンバンドの量は、０％トランスグルタミナーゼと比較して低下される。これは、グロブリンの結合によって形成された複合体を示し得る。複合体をさらに識別するために付加的な試験が企図される。
【０３０５】
単離手順から得られるタンパク質の収率に対するトランスグルタミナーゼ処理の効果を決定するために、様々な量のトランスグルタミナーゼと反応させたサンプルからの上清およびペレットの両方においてタンパク質量を評価した。図３７に示されるように、トランスグルタミナーゼの量の増大と共に上清のタンパク質濃度が低下した。図３８に示されるように、抽出物中０．０５％のトランスグルタミナーゼ後、最終タンパク質単離物の乾燥収率％（ペレット中の固体ｇ／使用した粉ｇ）は増大した。まとめると、これらの結果は、より多くのタンパク質がグロブリンリッチなペレット画分中に保持され、単離プロセス中のトランスグルタミナーゼ処理の量の増大と共に全タンパク質収率が増大することを示唆する。
【０３０６】
まとめると、これらの結果は、より多くのタンパク質がグロブリンリッチなペレット画分中に保持され、単離プロセス中のトランスグルタミナーゼ処理の量の増大と共に全タンパク質収率が増大することを示唆する。
【０３０７】
６．２８  実施例２８：緑豆由来の卵類似品組成物に対するリン酸塩の効果
リン酸塩は、乳製品および食肉タンパク質系において緩衝および乳化塩として一般的に使用される。タンパク質系において使用されるリン酸塩のタイプおよびその濃度は、タンパク質のテクスチャおよび機能特性影響を与えることが示されている。この実施例は、リン酸塩の３つのタイプ（（１）リン酸二ナトリウム；（２）ヘキサメタリン酸ナトリウム；および（３）ピロリン酸四ナトリウム）、およびその濃度が、卵パティ類似品および液体卵類似品製品中の緑豆タンパク質単離物の機能性に与える影響を説明する。
【０３０８】
６．２８．１  緑豆タンパク質単離物を用いて作られた卵パティ類似品のテクスチャ特性に対するリン酸二ナトリウム濃度の影響
表２３に記載されるように様々なレベルのリン酸二ナトリウム、水、キャノーラ油、酵素と共に緑豆タンパク質単離物を用いて卵パティ類似品を調製した。全ての成分をブレンドして均質な混合物を作った。この混合物を４０〜５５℃に加熱し、円形シリコーン型に流し込み、各キャビティに５０ｇを保持する。型を４０〜５０℃で２０〜６０分間インキュベートし、その後、対流式オーブン内で２５０〜２７５°Ｆにおいて４５〜６０分間焼いてパティを作った。焼いた後、パティを室温まで冷やし、型から取り出し、テクスチャプロファイル分析のために使用した。
【０３０９】
直径３８ｍｍの円筒プローブを備えたBrookfield Texture Analyzerを用いて、緑豆タンパク質パティのテクスチャプロファイル分析を行った。緑豆パティサンプルを直径２．５４ｃｍおよび高さ１ｃｍの円筒に切断した。５ｇの負荷によって引き起こされる２回の一軸圧縮サイクルを用いてサンプルを分析した。標的圧縮距離は、１ｍｍ／ｓの速度で実施される７０％の変形に対応して０．７ｃｍに設定した。緑豆タンパク質パティの硬度、粘着性、スプリング性および弾力性を決定し、市販の卵パティ製品と比較した。
【０３１０】
【表２３】
2019509036.tif 000028
【０３１１】
０．０１〜０．５％のリン酸二ナトリウムを配合物に添加すると、緑豆パティの全体的な官能特性が改善され、卵パティのテクスチャが緊密に模倣された（図３９）。ＤＳＰが存在しない（０％）と、緑豆パティは、卵パティと比較して著しく低い硬度、粘着性、スプリング性および弾力性を有した。ＤＳＰを添加すると、緑豆パティの硬度、粘着性、スプリング性および弾力性が増大し、卵パティに匹敵した。０．０６〜０．５％でテクスチャパラメータの有意な変化はなく、この濃度範囲ではＤＳＰ用量と無関係であった。これらの結果は、ＤＳＰが卵パティ類似品配合物中の緑豆タンパク質単離物の機能性に影響を与え、改善されたテクスチャ性能を提供することを示唆する。０．０６％という低いリン酸二ナトリウム用量を用いる緑豆パティは、配合物において卵パティタイプのテクスチャを達成するのに役立ち得る。
【０３１２】
６．２８．２  緑豆タンパク質単離物の分散性に対するリン酸二ナトリウムの濃度の影響
表２４に示される配合物を用いて緑豆単離物の分散体を調製した。まず、リン酸二ナトリウムを蒸留水と混合し、完全に溶けるまでボルテックスした。次に、緑豆タンパク質単離物を溶液に添加し、Pro Scientific Inc.のホモジナイザーを用いて６０００〜７０００ｒｐｍで３〜５分間均質化した。サンプルを冷蔵庫（約４℃）に２４時間放置し、その後、写真を記録し、ｐＨ測定を行った。
【０３１３】
【表２４】
2019509036.tif 000029
【０３１４】
ＤＳＰ濃度の増大は、緑豆タンパク質単離物の水中での分散安定性を改善した。ＤＳＰを含まない（０％のＤＳＰ）サンプルは、２４時間にわたる放置において最大の分離を定性的に示し（図４０）、ここで、緑豆タンパク質単離物は管の底に向かって沈降し、比較的透明な液体の上部層が形成される。０．４３％および１％のＤＳＰの濃度では、２４時間の放置後、分離は観察されなかった。加えて、緑豆タンパク質単離物の分散体のｐＨは、ＤＳＰの濃度の増大と共に上昇した。これらの結果は、リン酸二ナトリウムの添加が緑豆タンパク質単離物の分散性および分散安定性を増大させることを示唆する。ｐＨは混合物のイオン強度の変化と共に変化し、分散安定性を駆動するメカニズムであり得る。
【０３１５】
６．２８．３  緑豆タンパク質単離物を用いて作られた液体卵類似品の粘度およびエマルション安定性に対するヘキサメタリン酸ナトリウムの濃度および鎖長の影響
【０３１６】
【表２５】
2019509036.tif 000030
【０３１７】
表２６に示される配合物を用いて液体卵類似品を調製した。全ての成分をブレンドして均一かつ均質な混合物を作った。混合物を１０〜２０分間５０〜５５℃に保持した後、７０〜７５℃で５〜１５分間で殺菌した。殺菌機から出てくる最終混合物をボトルに入れ、さらなる試験まで冷蔵下で貯蔵した。
【０３１８】
０．１ｓ−１〜５０ｓ−１の様々なせん断速度にわたって、４℃でせん断レオメーター（Discovery HR-1、TA Instruments）を用いてこれらのサンプルで粘度を測定した。エマルションにおける分離の視覚的な評価により、エマルション安定性を定性的に測定した。
【０３１９】
【表２６】
2019509036.tif 000031
【０３２０】
長鎖ヘキサメタリン酸ナトリウムの添加は、緑豆タンパク質単離物を用いる液体卵類似品配合物の粘度を大きく低下させた（図４１）。配合物中のＳＨＭＰ２２の濃度が０．１〜１．１％で増大すると共に、配合物の粘度が低下した。ＳＨＭＰ２２が１．０３％の配合物は、ＳＨＭＰを含まない配合物（一桁より粘性である（４．１±０．３５Ｐａ−ｓ））と比較して、０．１４±０．０２（Ｐａ−ｓ）である液体全卵の粘度により近い粘度（０．６２±０．０１Ｐａ−ｓ）を有した。
【０３２１】
短鎖ヘキサメタリン酸ナトリウムは、長鎖ヘキサメタリン酸ナトリウムと比較して緑豆タンパク質液体卵類似品の粘度に対してより大きい影響を有した。配合物中１．０３％のＳＨＭＰ６は、ＳＨＭＰ２２およびＳＨＭＰ１１よりも粘度をさらに低下させ、液体全卵の粘度により匹敵した（図４２）。さらに、所与のタイプのヘキサメタリン酸ナトリウム鎖長について、配合物の粘度は、ＳＨＭＰの濃度（０．１〜１．１％）が高いほど低かった。
【０３２２】
１３日間の冷蔵貯蔵にわたって試験したときにより高いＳＨＭＰ２２の濃度は、より安定したエマルションを作った（図４３）。１．０３％のＳＨＭＰ２２で調製した配合物は、１３日間の冷蔵貯蔵にわたって分離しなかった。しかしながら、０．１３５％のＳＨＭＰ２２による配合物は安定性が低く、１３日間の貯蔵後に分離を示した。
【０３２３】
６．２８．４  緑豆タンパク質単離物を用いた液体卵類似品の粘度に対するピロリン酸四ナトリウム（ＴＳＰＰ）の濃度の影響
ＴＳＰＰの添加は、ヘキサメタリン酸ナトリウムが粘度を低下させた様式と同様に、緑豆タンパク質単離物を用いる液体卵類似品配合物の粘度を大きく低下させた（図４４）。配合物中のＴＳＰＰの濃度が０．２〜１％で増大すると共に粘度が低下した。
【０３２４】
６．２９  実施例２９：緑豆パティの安定性
６．２９．１  水分およびｐＨ
冷凍貯蔵条件（−２０および−８０℃）下での緑豆パティの安定性を１２週間にわたって評価した。１５．５％のスプレー乾燥緑豆タンパク質単離物（ロット番号１２２．１）、水、塩、脂肪および微量の食品添加物（製品の＜３％）から緑豆パティを調製した。成分をブレンドし、１２１．１℃で１０分間予備調理し、ポリエチレンバッグに入れ、研究中、フリーザー内で貯蔵した。０、２、４、８および１２週間でｐＨおよび水分の変化を測定した。各時点で、対流式オーブンにおいて１２１．１℃で２０〜２４分間、内部温度が７４℃になるまで冷凍パティを解凍した。標準ｐＨメーターを用いてｐＨを測定し、乾燥減量（loss-on-drying）アナライザーを用いて重量測定法でパティの水分含量を測定した。全体的に見て、ｐＨおよび水分は研究期間を通して有意に変化せず、−２０および−８０℃における１２週間の貯蔵にわたって緑豆パティが安定していることが示唆された（表２７）。
【０３２５】
【表２７】
2019509036.tif 000032
【０３２６】
６．２９．２  テクスチャプロファイル
セクション６．２９．１において上記のように調製された緑豆パティのテクスチャプロファイル（硬度、噛み応え、スプリング性、弾力性および粘着性）を０日目、ならびに２週目、４週目、８週目および１２週目に評価した。貯蔵条件（−２０および−８０℃）は、セクション６．２９．１において既に示されたものと同様であった。７０％変形、トリガー負荷５．０ｇおよび試験速度１ｍｍ／ｓに対して設定された円筒プローブ（直径３８ｍｍ）を用いるBrookfield CT3アナライザーにおいてテクスチャプロファイル分析を実施した。分析の結果は、図４５に提供される。全体的に見て、緑豆パティの硬度、噛み応えおよび粘着性は、研究の最初の４週間に増大し、８週目と１２週目との間で有意な違いはなかった。これらの特性は、研究の前半を通して変化されたが、感覚パネルメンバーによって有意な差異は報告されなかった。
【０３２７】
６．３０  実施例３０：酸沈殿法を用いて調製された他の植物タンパク質単離物の感覚結果
上記の酸沈殿法を用いて調製された大豆タンパク質単離物を使用して卵様スクランブル製品を調製した。得られた製品は、かなり悪い臭気および風味を有し、エマルションは粘液性であった。製品はワッフル生地と酷似しているようであり、流動的に動かず、その混合を試みるとドロドロであった。完成品のテクスチャは不十分であり、ほとんどの配合物は中まで十分に調理もされなかった。調理した製品は、極めて絹のような上部を有し、内部は調理の際に少し分離し、パサパサした内部テクスチャが生じた。
【０３２８】
上記の酸沈殿法を用いて調製されたソラマメタンパク質単離物を使用して卵様スクランブル製品を調製した。得られた製品は、最初に臭気がなかったが、混合が始まるとエマルションが形成され、非常に強い「サワーチーズ」臭が明らかになった。この臭気は、製品の味まで伝えられた。製品の色は、極めて黄色であり、小さい凝固物の塊のようなテクスチャになるまで調理された。製品は、１つの固体単位を形成せず、調理後に壊れるようであった。
【０３２９】
上記の酸沈殿法を用いて調製されたヒヨコマメタンパク質単離物を使用して卵様スクランブル製品を調製した。得られた製品は、良好に機能せず、この実験において最悪の性能のタンパク質単離物であった。８つのうちの６つのパックは、タンパク質中の大量の水分のために破裂した。室温になると、タンパク質は容器内に水を流しており、タンパク質は本質的に破壊された。風味は、ハマスまたはタヒニの苦みに似ており、大量では非常に不快であった。テクスチャも不十分であった（特に破裂したもの）。
【０３３０】
６．３１  実施例３１：クリームチーズ類似品
代表的なクリームチーズ類似品配合物は、以下を含む：
水（７５〜８５％）
タンパク質単離物（１０〜１５％）
油（５〜１０％）
１）低メトキシペクチンおよび塩化カルシウム系；２）キサンタンガムのいずれかを含む親水コロイド（０．１〜３％）
風味料（１〜２％）
塩（＜１％）。
【０３３１】
室温において５０００ｒｐｍで４分間操作されるPro Scientificせん断ミキサーを用いて、植物タンパク質単離物、油、親水コロイド、塩および他の成分のエマルションを調製した。エマルションを円形の型（直径３インチ）内に堆積させる。堆積させる量は１つの型につき５０ｇである。対流式オーブンを２２０°Ｆで５５分に設定する。
【０３３２】
６．３２  実施例３２：代替ヨーグルト系
代表的な代替ヨーグルト配合物は、水、緑豆タンパク質単離物、糖、油および細菌培養物を含む。
【０３３３】
緑豆ヨーグルトプロトタイプにおいて以下の試験を行い、DannonのAll Natural Plain YogurtおよびLucerneのGreek Plain Yogurtに対して評価した。
【０３３４】
６．３２．１  ゲル系のレオロジー特性
レオメーターDHR-1を用いてプロトタイプのレオロジー特性を測定した（ここで、１ｍｌのサンプルは、コーン−イン−プレート形状によって１０℃で１Ｈｚの一定の振動数で、０．０３〜５００Ｐａの振動振幅掃引を受ける）。ゲルの粘弾性特性を同定するのに役立ち得る貯蔵弾性率および損失弾性率を測定した。ＬＶＥ領域のＧ’のプラトー値は、静止しているサンプルの剛性を表し、プラトー値Ｇ”は、非せん断サンプルの粘度の尺度である。降伏応力はまた、貯蔵弾性率および損失弾性率関数の交差点から得られ、材料が粘弾性固体から粘弾性液体に変わる点を示す。
【０３３５】
【表２８】
2019509036.tif 000033
【０３３６】
上記の結果は、緑豆タンパク質単離物を用いて作られたヨーグルトプロトタイプが、Dannonヨーグルトにはるかによく類似するテクスチャを示すことを示唆する。それは、より硬化されたゲル様テクスチャを有するLucerne Greekヨーグルトと比較して滑らかでクリーミーなテクスチャを有する。プロトタイプは、ココナッツ油、タンパク質および水のみを使用して作った。安定剤およびガムの添加は、潜在的にテクスチャスペクトルの他端により近い製品をもたらすことができる。
【０３３７】
６．３２．２  エマルションゲルのテクスチャ分析
Brookfield TA機器を用いて、これらの３つのサンプルにおいてテクスチャプロファイル分析を実施した。ＴＰＡは、サンプルがサイクルで２回圧縮される試験である。円筒プローブＴＡ−１１（Ｄ２５．４ｍｍ、Ｌ３５ｍｍ）を用いて、６ウェルプレートウェルにおいて１６ｍｌのサンプルを圧縮した。試験速度を１ｍｍ／ｓに設定し、１０ｍｍの圧縮を標的とした。３回のサンプル再現において３回の圧縮を行い、以下のデータを得た（表２９）。
【０３３８】
【表２９】
2019509036.tif 000034
【０３３９】
上記の結果は、緑豆タンパク質単離物で作られたプロトタイプが、２倍の差異でDannonにはるかによく類似する口あたりおよびテクスチャを有することを示唆する。
【０３４０】
６．３３  実施例３３：緑豆由来のタンパク質飲料系
代表的なタンパク質飲料系配合物は、水、緑豆タンパク質単離物、糖および油を含む。
【０３４１】
緑豆由来のタンパク質飲料プロトタイプにおいて粒径分析を実施し、Organic Valleyの全脂肪乳およびハーフ＆ハーフ、365 Everyday Valueのアーモンド乳に対して評価した。エマルション安定性はまた、Silkのココナッツ乳および365 Everyday Valueの豆乳に対して評価した。
【０３４２】
６．３３．１  脂肪滴の粒径
Mastersizer 3000を用いて脂肪滴の粒径分布を測定した。機器は、レーザー回折を利用して、分散粒子によって回折された散乱光の強度の角度変化を測定した。次に、角度散乱強度データを分析し、光散乱のミー理論を用いて、散乱パターンを作り出す粒子のサイズを計算する。
【０３４３】
エマルションサンプルをまず蒸留水中に希釈し、レーザーのオブスキュレーション限界が測定の範囲になるまでチャンバーに加えた。
【０３４４】
以下の表３０および図４６のデータは、飲料製品中の粒子の平均サイズクラスを示す。プロットは、３回の測定から得られた３つの分布の平均を取ることで作成される。図４６に示されるように、乳製品代替飲料製品では２つのピークが観察されたが、乳製品飲料では１つのピークのみが見られた。
【０３４５】
【表３０】
2019509036.tif 000035
【０３４６】
６．３３．２  液体エマルション系のエマルション安定性
光源がエマルションサンプルを通過するときに経時的に後方散乱および透過の変化を検出することにより、エマルション安定性を測定した。３ｍｌのエマルションサンプルをガラスバイアルに移し、室温下で１分ごとに６０分間走査した。
【０３４７】
研究されるエマルションサンプルのエマルション安定性を反映するためにTurbiscan安定性指標（ＴＳＩ）を使用した。これは、第１のスキャンに対する累積デルタ−後方散乱差として計算される。ＴＳＩの値が大きいほど、検出される後方散乱間の差が大きく、より安定性の低いサンプルを示す。
【０３４８】
【表３１】
2019509036.tif 000036
【０３４９】
ＴＳＩ値は、同じプロトコル下でのサンプル間の比較を可能にする。表３１および図４７に示されるデータによって表示されるように、緑豆タンパク質単離物で作られたプロトタイプは、豆乳飲料と比較して同様の安定性挙動を示す。それは、ココナッツ乳よりも６倍低いＴＳＩ値を有し、緑豆タンパク質ベースの飲料がココナッツ乳飲料よりも優れた保存安定性を有し得ることを示す。
【０３５０】
６．３４  実施例３４：緑豆タンパク質由来のバター系
代表的な緑豆由来のバター系は、リン酸二ナトリウム、水、緑豆タンパク質単離物、細菌培養物および油を含む。プロトタイプの非乳製品の緑豆由来のバター系は、図４８に示される。
【０３５１】
６．３５  実施例３５：パウンドケーキ
図４９は、緑豆抽出物からのタンパク質の単離の種々の段階における視覚的な描写を提供し、ここで、メイラード反応物の濃度および豆っぽい風味は著しく低減される。焼き食品に緑豆単離物を適用すると、より優れた製品の外観（より薄い色）および感覚特性（苦くて豆っぽい風味の低減）が得られる。図５０は、卵で作られたパウンドケーキと比較した緑豆（moong dal）タンパク質抽出物１９％のパウンドケーキの断面を提供する。図５１は、パウンドケーキのドームの平面図を提供し、ここで、元のタンパク質抽出物（中央）とは対照的に、卵ベースのケーキ（左側）および再可溶化沈殿物（右側）は同様のドームおよびクラッキングを有する。
【０３５２】
タンパク質抽出物を使用する代表的なパウンドケーキ配合物は、ケーキ粉（２５％）、バター（２５％）、糖（２５％）、タンパク質抽出物（全固体３４％およびタンパク質１９％）を含む。
【０３５３】
Hobart N90ミキサーにおける一段階混合プロセスを用いて、フラットパドルによる低速でケーキ生地を調製した。粉、糖およびバターをミキサーに添加した。緑豆抽出物は、１：１（ｗ／ｗ）比で緑豆粉を水と混合し、室温において６０００ｘｇで３０分間遠心分離することによって調製した。タンパク質抽出物をストリームに添加し、低速で少しの間にわたり混合した。混合を中速でさらに５分間続けた。２１オンスの矩形アルミニウムパンに生地を注ぎ、３００°Ｆで４５分間焼いた。図４９に示される緑豆抽出物パウンドケーキおよび卵ベースのパウンドケーキの比較は、以下の表３２に示される。
【０３５４】
【表３２】
2019509036.tif 000037
【０３５５】
タンパク質単離物を使用する代表的なパウンドケーキ配合物は、ケーキ粉（２５％）、バター（２５％）、糖（２５％）、（＞８０％タンパク質）を含有するタンパク質単離物固体（５〜６．２５％）、リン酸二ナトリウムまたはベーキングソーダおよび水を含む。
【０３５６】
表３３は、精製緑豆タンパク質単離物で作られた代表的なパウンドケーキの機能特性を卵ベースのパウンドケーキと比較する結果を提供する。
【０３５７】
【表３３】
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【０３５８】
Hobart N90ミキサーにおける一段階混合プロセスを用いて、フラットパドルによる低速でケーキ生地を調製した。粉、糖およびバターをHobart N50ミキサーに添加する。タンパク質単離物および水を混合する。タンパク質単離物をストリームに添加し、低速で少しの間にわたり混合する。混合を中速でさらに５分間続ける。１０オンスの矩形アルミニウムパンに生地を注ぐ。３００°Ｆで４５分間焼く。精製タンパク質単離物で作られた代表的なパウンドケーキは、図５２に示される。
【０３５９】
６．３６  実施例３６：エンゼルフードケーキ
精製緑豆タンパク質単離物を用いる代表的なエンゼルケーキ配合物は、ケーキ粉（１５．２％）、クリームターター（０．６％）、糖（４２％）塩（０．２％）、タンパク質単離物固体（７．５６〜１０．５％）、リン酸二ナトリウム（ｐＨ安定剤）（０〜０．２１％）、添加水（３１〜３４．２３）を含む。
【０３６０】
添加水およびリン酸二ナトリウムによってタンパク質を可溶化した。タンパク質単離物、添加水、リン酸二ナトリウムおよびクリームターターを、バルーンウィスクを有するHobart N50ミキサーにおいて中速で混合した。次に、糖をゆっくり添加し、泡立てを続けた。Hobartミキサーにおいて低速で混合しながら糖および粉を添加した。１４０ｇの生地を４”×５”のケーキ型に充填し、３５０°Ｆで１７分間焼いた。結果は、図５３および図５４に示される。
【０３６１】
表３４は、緑豆タンパク質単離物で作られた代表的なエンゼルフードケーキの機能特性を卵白エンゼルフードケーキと比較する結果を提供する。
【０３６２】
【表３４】
2019509036.tif 000039
【０３６３】
６．３７  実施例３７：パスタ生地
精製タンパク質単離物を用いる代表的なパスタ生地配合物は、１／２カップのセモリナ粉、ティースプーン１／２の塩および３５ｍＬのエキストラバージンオリーブ油とパルスブレンドしてから３０ｍＬの水と混合された、１００ｇの緑豆タンパク質単離物を含む。得られたパスタは、構造を維持し、調理中のより長い期間、望ましいアルデンテのテクスチャを保持する能力を示した。さらに、得られたパスタ生地は、レトルト処理中、構造を保持し、パスタベースのスープを含む缶詰用途での使用が示唆される。得られたパスタは、滑らかなテクスチャおよび白色の外観を有した。
【０３６４】
６．３８  実施例３８：食肉類似品
緑豆タンパク質単離物を利用して卵を含まないエマルションを調製し、これから、（ｉ）朝食用サンドイッチのパティとしておよびスクランブルとして使用するための卵類似品と、（ｉｉ）デリミートまたはチキンナゲットとして使用するための食肉類似品とを作った。
【０３６５】
卵類似品として使用するために、（ａ）緩衝塩、（ｂ）２０℃〜９５℃の温度への加熱および（ｃ）低せん断〜高せん断均質化を用いておよびこれらを用いずにタンパク質単離物を利用した。単離物を２５〜５５℃でトランスグルタミナーゼ酵素とブレンドした後、２５〜５５℃で０〜６０分間インキュベーションし、最後に１２１〜２００℃で５〜１５分間オーブンで焼くと、単離物は、調理された卵に類似する種々のタイプのテクスチャを生じた。上記のプロセスを用いて製造された卵を含まないパティのテクスチャは、高熱パンで調製された十分に調理したスクランブルエッグに類似する、堅く、きれいな切り口、粘着性、弾性テクスチャを含む。卵を含まないスクランブルのテクスチャは、低〜中程度に調理されたスクランブルエッグに類似して、軟性、スプリング性、ふんわり性、弾性、クリーミー、粘着性および弾力性であった。
【０３６６】
代表的な配合物：
ａ．８０％の水
ｂ．１１．８％のタンパク質単離物（約８５％の植物タンパク質を含む）
ｃ．０．４３％のリン酸二ナトリウム
ｃ．０．００１０％（１０ｐｐｍ）のトランスグルタミナーゼ
ｄ．６．２％のキャノーラ油
ｅ．１．１５％の卵タイプおよび乳製品タイプの風味量
ｆ．０．１５％のナチュラルイエロー着色剤
ｇ．０．３％の塩（ここで、混合物は、ｐＨが約６．５である）
【０３６７】
タンパク質単離物粉末および残りの全ての乾燥物を、熱的被覆ミキサー（Thermomix）において低せん断で８分間、水および油と混合した（設定２がＲＰＭ範囲を提供し得る）。温度が８３℃に達するまで混合を継続しながら、この混合物を加熱した。次に、混合物を５０℃まで冷却し、１０ｐｐｍのトランスグルタミナーゼ酵素を添加し、さらに３０秒間混合した。混合後、丸い形状のシリコーン型（直径３インチ）において５０℃で６０分間エマルションのインキュベーションを行なった。インキュベーション後、インピンジメントオーブンにおいて１２１Ｃで１０分間サンプルを焼いた。得られた丸いパティは、マイルドな卵および乳製品風味、ならびにニュートラルな植物風味を有した。パティテクスチャは、卵パティに類似して、軟性、スプリング性、ふんわり性、弾性、クリーミー、粘着性および弾力性であった。
【０３６８】
代替的に、酵素添加後のエマルション混合物の同じ配合物は、ケーシング内に注ぎ、端部を縛って管形状のチャブを作り、水浴中、５０℃で２時間インキュベートすると、強力なゲルが作られた。チャブをほどき、ゲルを丸いパティにスライスして、１２１℃において１０分間オーブンで焼いた。得られた丸いパティは、卵および乳製品風味、ならびにニュートラルな植物風味を有した。パティのテクスチャは、卵パティに類似して、軟性、スプリング性、ふんわり性、弾性、クリーミー、粘着性および弾力性であった。
【０３６９】
６．３９  実施例３９：食肉類似品
緑豆タンパク質単離物を利用して卵を含まないエマルションを調製し、これから食肉類似品を作った。（ａ）緩衝塩、（ｂ）５０℃〜９５℃の温度への加熱および（ｃ）低せん断〜中せん断均質化を用いておよびこれらを用いずにタンパク質単離物を利用した。トランスグルタミナーゼ酵素と２５〜５５℃でブレンドした後、２５〜５５℃で６０〜１２０分間インキュベーションし、最後に１５〜２９ｐｓｉで２０〜６０分間加圧調理すると、調理済製品はデリミート様のテクスチャを有した。
【０３７０】
代表的な配合物：
ａ．８０％の水；
ｂ．１３％のタンパク質単離物（約８５％の植物タンパク質を含む）
ｃ．０．４３％のリン酸二ナトリウム
ｃ．０．００１０％（１０ｐｐｍ）のトランスグルタミナーゼ
ｄ．６．２％のキャノーラ油
ｇ．０．３％の塩（ここで、混合物は、ｐＨが約６．５である）
【０３７１】
タンパク質単離物粉末および残りの全ての乾燥物を、熱的被覆ミキサー（Thermomix）（設定２）において低せん断で８分間、水および油と混合した。温度が８３℃に達するまで混合を継続しながら、この混合物を加熱した。次に、混合物を５０℃まで冷却し、１０ｐｐｍのトランスグルタミナーゼ酵素を添加し、さらに３０秒間混合した。エマルション混合物をケーシング内に注ぎ、端部を縛って管形状のチャブを作り、水浴中、５０℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、１５ｐｓｉにおいて約１２１℃で３０分間サンプルを加圧調理した。チャブを室温まで冷却し、ほどき、得られたゲルは、チキンナゲットに類似するテクスチャを有した。ゲルテクスチャは、チキンナゲットと同様に、軟性、中程度の噛み応え、繊維状、スプリング性、弾性、粘着性および弾力性であった。
【０３７２】
６．４０  実施例４０：食肉類似品の比較分析
表３５に示される配合に従って緑豆タンパク質単離物を用いて食肉類似品を調製した。緑豆タンパク質単離物を、中〜高せん断混合下で均質な混合物を作るような配合で水、油、リン酸二ナトリウム、塩およびデンプンとブレンドした。次に、混合物を２５〜９５Ｃの温度まで加熱した後、酵素を添加した。次に、この材料をケーシングに充填し、円筒チャブを形成した。チャブを６０〜１２０分間４０〜５５℃に保持した後、押出し、８〜１５ｐｓｉｇで３０〜１２０分間の加圧調理を行なった。チャブを冷却し、ナゲットにスライスした。
【０３７３】
【表３５】
2019509036.tif 000040
【０３７４】
食肉類似品サンプルをそのテクスチャ特性について分析した。Brookfield CT3テクスチャアナライザーを使用してテクスチャプロファイル分析を実行した。この分析のために２５．４ｍｍの円筒プローブを使用した。緑豆ナゲットサンプルを直径２．５４ｃｍおよび高さ１ｃｍの円筒に切断した。５ｇの負荷によって引き起こされる２回の一軸圧縮サイクルを用いてサンプルを分析した。標的圧縮距離は、１ｍｍ／ｓの速度で実施される７０％の変形に対応して０．７ｃｍに設定した。
【０３７５】
酵素処理前に加熱を受けたサンプルを「予熱トライアル」と名付け、酵素処理前に加熱されなかったサンプルを「非加熱トライアル」と名付けた。
【０３７６】
緑豆タンパク質単離物を用いる「予熱」および「非加熱」トライアルにより、市販のチキンナゲット、ならびに大豆タンパク質単離物およびエンドウ豆タンパク質単離物を用いて作られた市販の食肉類似品に匹敵する硬度、粘着性、噛み応えおよび弾力性のテクスチャ特性を示す食肉類似品が作られた（図５５）。緑豆タンパク質食肉類似品は、テクスチャプロファイル分析によって記録されるテクスチャにおいて、市販の食肉類似品のいくつかよりも性能が優れていた。ゲルテクスチャは、チキンナゲットと同様に、軟性、中程度の噛み応え、繊維状、スプリング性、弾性、粘着性および弾力性であった。さらに、緑豆タンパク質食肉類似品においてチキンの筋繊維に類似する繊維状の外観も観察された（図５６）。
【０３７７】
６．４１  実施例４１：他のタンパク質単離物で作られた食品用途
他のタンパク質単離物は、多様な食品用途において緑豆ほど機能しなかった。４つの液体スクランブル配合物：（Ａ）塩沈殿による精製緑豆単離物、（Ｂ）等電沈殿による精製緑豆単離物、（Ｃ）精製緑豆＆小麦タンパク質単離物（５０：５０）および（Ｄ）精製緑豆＆エンドウ豆タンパク質単離物（５０：５０）からの卵パティ代用品を視覚的に示す図５７を参照されたい。（Ｃ）および（Ｄ）において実証されるように、緑豆タンパク質単離物を小麦またはエンドウ豆などの他のタンパク質と組み合わせると、機能性が損失される。これは、緑豆タンパク質単離物のみで作られた配合物と比較して振幅掃引試験後の極めて低い貯蔵弾性率によって実証される。図６１〜６３を参照されたい。
【０３７８】
６．４２  実施例４２：脂肪低減ショートニング系（ＦＲＳＳ）のためのプロセスおよび組成物
本明細書において、一般的なベーキング用途で利用される必要な脂肪を低減することができる代表的なショートニングモデル系も提供される。本明細書で提供される特定の緑豆タンパク質単離物を利用することにより、この系は、等量の均等な現行のベーカリーショートニングと比較して、モデル系において４０％までかつそれを超える脂肪低減を可能にする能力を有し、テクスチャ、水分および構造に対する負の利益は最小限〜ゼロである。
【０３７９】
６．４２．１  ＦＲＳＳ用途のための代表的な緑豆タンパク質の単離プロセス
ステップ１：８００ｋｇの脱皮、製粉した緑豆粉（１００メッシュスクリーンサイズ）を４０００ＬのＲＯ水（５部の水に対して１部の粉の比率）で抽出し、抽出スラリーのｐＨは約ｐＨ６．７であった。粉中のタンパク質を可溶化するために、ＮａＯＨの添加によって抽出のｐＨをｐＨ７に調整した。抽出の温度は約１５Ｃであった。
【０３８０】
ステップ２：約２１００Ｌ／時の供給速度、３２７２ｒｐｍのボウル速度で抽出スラリーをパイロット規模のデカンタ遠心機（Alfa Laval Foodec 360）に供給し、繊維およびデンプンリッチな固体相からタンパク質抽出物を液相中に分離した。
【０３８１】
ステップ３：次に、デカンタからの液相を高速ボウル遠心機（Alfa Laval Clara 80）に送り、液体中に存在する微粒子を分離した。これは、１６９５Ｌ／時の供給速度および８１４２ｒｐｍの遠心機速度で行った。微粒子の画分は、高速ボウル遠心機分離後に除去された。
【０３８２】
ステップ４：ステップ３からの清澄化液体抽出物をクエン酸の添加によってｐＨ６．０にｐＨ調整し、標的ｐＨで対象のタンパク質が沈殿する。外部熱交換器によって沈殿槽を１０Ｃに冷却した。
【０３８３】
ステップ５：ステップ４からの沈殿したタンパク質スラリーを３５０〜５００Ｌ／時の供給速度で高速ボウル遠心機（Alfa Laval Clara 80）に送り、タンパク質は、約１７％の全固体（ＴＳ）で遠心機の固体排出部分において回収される。回収されたタンパク質の純度は、８３〜８７％である（乾燥質量によるケルダール法を用いてサンプル中の窒素含量を定量化した）。
【０３８４】
ステップ６：回収スラリー（１７％ＴＳ）をパイロット規模のボックス乾燥機でスプレー乾燥し、２つの入口空気温度条件を使用し（１８０および２１０Ｃ）、スラリーを４５〜５５ｋｇ／時の供給速度で乾燥機へ供給し、５％未満の水分含量のスプレー乾燥粉末（薄黄色）を捕集した。
【０３８５】
６．４２．２  代表的なＦＲＳＳ配合物
緑豆タンパク質単離物（上記のプロセスに従って調製）を含む代表的な脂肪低減ショートニング系（ＦＲＳＳ）配合物は、水（３４．５５％）、精製ココナッツ油（４４．４％）、エキスペラ圧搾キャノーラ油（１４．８％）、緑豆単離物（４．９３％）、クエン酸ナトリウム（．９８％）、オレンジからのシトラス繊維（．２９％）を含む。
【０３８６】
Vorwerk Thermomixを用いてタンパク質をクエン酸ナトリウムおよび都市用水によって可溶化した。安定したエマルション混合物を作るために熱および特定のせん断を適用して、緑豆単離物をクエン酸ナトリウムおよび水と混ぜ合わせた。付加的な水、最終重量の油の一部およびシトラス繊維を混ぜ合わせ、加熱およびせん断を特定の時間にわたって用いてタンパク質混合物に添加する。最終混合物を（４０〜５０Ｃ）の範囲まで冷却し、さらなる加工のために清浄なThermomix容器に移す。
【０３８７】
油の乳化時間（１０分）中、混合物を穏やかな渦で回転させる。残りの油は、いずれも少しずつ加えて混ぜ合わせる。残りの油の全重量を通して一貫した流れで油を流す。最終製品全体を通して一貫性を保持するために、油およびタンパク質の混合物が混ぜ合わせられるにつれてせん断を徐々に増大させる。最終製品を真空バッグに入れ、圧縮して、ＦＲＳＳ塊を強固にする。完成した袋詰め製品を１２時間以上冷蔵し、最終テクスチャを凝固させる。
【０３８８】
図６１Ａは、ベーキング用途に適用する準備ができた完成した緑豆単離物ショートニングモデルを示す。
【０３８９】
６．４２．３  緑豆由来のＦＲＳＳを利用するベーキング用途
タンパク質由来の系のバイアビリティを１対１の比較で実証する目的で、現行の破砕（fractured）パーム油ショートニングの場合に通常使用される量と等しい量でＦＲＳＳを多数のベーキング用途に適用した。スポンジケーキ（卵および乳製品を含まない）のパイロット配合物を、ショートニング、卵および乳製品（バターおよび乳）を使用する既知の市販のスポンジケーキと比較した。
【０３９０】
上記の精製緑豆単離物を利用する代表的なホワイトスポンジケーキ配合物は、糖（４２．４０１％）、中力粉（All Purpose Flour）（２３．７７％）、ケーキ粉（２２．６３％）、Ventura、パームショートニング（８．４０１％）、ダブルアクティングベーキングパウダー（１．０８７％）、塩（．９８８％）、天然風味料（．２８７％）、炭酸水素ナトリウム（Sodium Bicarb）（．２４７％）、クエン酸（．０９９％）、バニラ（．０４９％）を含む。付加的な水を使用してケーキモデルを完成させた。
【０３９１】
組み合わせて、精製緑豆単離物に基づくＦＲＳＳを用いる表示されたケーキフロスティングモデル配合物は、粉砂糖１０ｘ（７１．８８％）、ＦＲＳＳ（２３．８９％）、都市用水（３．１７％）、塩（１．０６％）を含む。
【０３９２】
フロスティング類似品を水素化パーム油で作られた商業的に既知のフロスティングと比較した。
【０３９３】
バニラおよび天然風味料と組み合わせて糖およびＦＲＳＳをプレーティングすることにより、ケーキミックスを調製した。乾燥成分を混ぜ合わせてふるいにかけ（＃１６）てから、プレーティングされたショートニング／糖混合物に添加する。バッチ全体を１０分間にわたりまたは十分に取り込まれるまで混ぜ合わせ、材料の一貫性のために最後にふるいにかけた（＃１６）。ケーキ生地は、付加的な都市用水およびパドルの付いたHobartスタンドミキサーを用いて調製した。水およびミックスを低速で３０秒間混ぜ合わせる。ボウルおよびパドルをこそげ取り、次にミックスを中速で１分間回転させて、混合物を完全に乳化し、系中に空気を取り込む。混合物を９”×９”パンに注ぎ、３５０度で１８〜２４分間焼いた。完成したケーキをラック上で周囲温度まで冷却させる。
【０３９４】
Hobartミキサーおよびパドルアタッチメントを用いて、１／２の全粉糖および全ＦＲＳＳを取り込まれるまで低速で混ぜ合わせることによってフロスティング類似品を調製する。ボウルおよびパドルをこそげ落とし、他方の１／２の糖を少量ずつ導入して十分にブレンドする。水および塩を添加し、混合物を滑らかな一貫性までブレンドする。
【０３９５】
図６１Ｂは、完成したケーキおよびフロスティング類似品を示す。
【０３９６】
６．４２．４  他の用途：緑豆由来の非乳製品クリームチーズ類似品
上記の緑豆タンパク質単離物の水結合性および乳化特性を利用して非乳製品クリームチーズ類似品サンプルを製造した。加熱およびせん断によって操作し、カルシウムによってコンディショニングし、最終的に培養することにより、従来の乳製品クリームチーズのテクスチャおよび風味を達成することができる。
【０３９７】
精製緑豆タンパク質単離物を用いる代表的な配合物は、都市用水（６５．０１％）、エキスペラ圧搾キャノーラ油（２７．９５％）、精製緑豆タンパク質単離物（９．７５〜１１．２５％）、糖（１．５〜５％）、塩化カルシウム（１．３０％）、塩（．６５％）、乳酸（．２６％）を含む。
【０３９８】
Vorwerk Thermomixを用いて水、糖および塩と共にタンパク質を可溶化した。加熱および中程度のせん断を３０分間適用する。最終温度は８５Ｃを超えるであろう。混合物に中程度のせん断をさらに７〜１０分間行い、わずかに（５０〜６０Ｃ）冷却して一貫性を保持する。
【０３９９】
Thermomix速度を中高速に上昇させ、キャノーラ油の７５％を混合物中に流し入れる。２５ｇの残りの油中に希釈させた塩化カルシウムを添加し、５分間せん断させる。カルシウムが完全に取り込まれてから、残りの油の全重量を通して一貫した流れで残りの油を流す。
【０４００】
ベースが均質化されたら、氷浴に移して冷却する（４０Ｃ）。４０Ｃに加熱したThermomixを用いて冷却混合物を中速でせん断し、混合物を滑らかに保持し、培養に適した温度に設定する。培養ペレット−ＣＨ（．０２２〜．２５％）を５ｇの都市用水で希釈して混合物の培養を準備する。培養物が導入されたら、バッチを５分間回転させ、培養物を完全に取り込む。完成した混合物を１クォート（ｑｔ．）の容器に移し、ＰＨ値を取った後にsous vide水浴（４０Ｃ）に入れる。
【０４０１】
最終混合物ｐＨは、水浴中の類似品の開始点として必要である。製品は３時間以上にわたりまたはｐＨ値が４．６〜５．１に降下するまで「培養される」。
【０４０２】
最終培養ブレンドは、製品を滑らかにかつ均質化し、培養プロセスを設定するために、Thermomixにおいて８５Ｃで７分間、中速でせん断される。最終混合物は、成形および最終テクスチャのために型内に加圧される。
【０４０３】
図６２Ａは、培養ステップの直前のTheromomix内の未完成の非乳製品の類似品を示す。図６２Ｂは、完成した非乳製品の類似品を示す。左側のサンプルは、仕上げステップを行わずに培養させたものであり、右側のサンプルは、完成品として滑らかな一貫性のために均質化されており、培養プロセスは、ｐＨ５で停止された。図６２Ｃは、完成された非乳製品の加圧クリームチーズ類似品を示す。
【０４０４】
６．４２．５  他の用途：緑豆由来のパスタ生地およびパスタ
上記の精製緑豆単離物の結合および構造構築能を利用してサンプルパスタ生地を製造した。パスタ類似品は、従来の小麦粉のテクスチャを模倣するタンパク質単離物の構造構築能力に応じて、グルテンフリーである。
【０４０５】
上記の緑豆タンパク質単離物を用いる代表的な配合物は、緑豆粉−未加工（４１％）、精製緑豆単離物（９％）、ロンググレイン白米粉（３０％）、コーン粉（２０％）を含む。付加的な都市用水（配合の全重量の３２．５％）を使用して生地を完成させる。水の量は、周囲条件（湿度）に基づいて＋／−２％異なるであろう。
【０４０６】
Roma Pamパスタ押出機を用いて乾燥成分および精製緑豆単離物（スプレー乾燥）をＲＰホッパーに添加し、完全な取り込みのために最低２分間ブレンドする。成分がブレンドされたら、混合物に都市用水を流し込み、ＲＰが生地を形成し始める。ブレンドは、湿った砂の稠度を有するであろう。生地が最適条件になるまでパスタ生地をＲＰホッパー内で９〜１１分間回転させる。
【０４０７】
ＲＰの＃１４３パスタダイを用いて、ホッパーが空になるまで、滑らかで連続した動きで生地を押し出す。生地が押出されるにつれて、それを穴の開いた乾燥バスケットに捕集し、乾燥ラックに入れる。押し出されたパスタは、パスタを硬化および固化させるために最低２時間必要である。
【０４０８】
図６３Ａは、パスタ類似品の押出のために使用されるダイ＃１４３を示す。図６３Ｂは、乾燥された後の完成パスタ類似品を示す。本明細書において引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物または特許出願がそれぞれ具体的にかつ個別に参照により援用されると示されたかのように、参照により本明細書に援用される。上記の本発明は、理解を明白にするために図および例によっていくらか詳細に説明されたが、本発明の教示を考慮して、特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、本発明に対する特定の変化形態および修正形態がなされ得ることは当業者に容易に明らかであろう。
【０４０９】
本明細書において引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物または特許出願がそれぞれ具体的にかつ個別に参照により援用されると示されたかのように、参照により本明細書に援用される。上記の本発明は、理解を明白にするために図および例によっていくらか詳細に説明されたが、本発明の教示を考慮して、特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、本発明に対する特定の変化形態および修正形態がなされ得ることは当業者に容易に明らかであろう。
【図１Ａ】
2019509036.tif 000041
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５−１】
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【図５５−２】
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【図５６】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５７Ｃ】
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【図５７Ｄ】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２Ａ】
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【図６２Ｂ】
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【図６２Ｃ】
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【図６３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019509036.tif 000128
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