(57)【要約】  チロシナーゼの阻害活性を有し、皮膚美白に有効な素材の提供。Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤を提供する。また下記式（I）〜（III）のいずれかで表される化合物、およびそれを有効成分とするチロシナーゼ阻害剤を提供する。2019516777.tif 000034
2019516777.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
【請求項２】
Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効成分とするメラニン生成阻害剤。
【請求項３】
Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効成分とする皮膚美白剤。
【請求項４】
チロシナーゼ阻害剤の製造のための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物の使用。
【請求項５】
メラニン生成阻害剤の製造のための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物の使用。
【請求項６】
皮膚美白剤の製造のための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物の使用。
【請求項７】
チロシナーゼ阻害に使用するための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物。
【請求項８】
メラニン生成阻害に使用するための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物。
【請求項９】
皮膚美白に使用するための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物。
【請求項１０】
チロシナーゼ阻害のための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物の使用。
【請求項１１】
メラニン生成阻害のための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物の使用。
【請求項１２】
皮膚美白のための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物の使用。
【請求項１３】
対象に、Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効量で投与することを含む、対象におけるチロシナーゼ阻害方法。
【請求項１４】
対象に、Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効量で投与することを含む、対象におけるメラニン生成阻害方法。
【請求項１５】
対象に、Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効量で投与することを含む、対象における皮膚美白方法。
【請求項１６】
下記式（I）〜（III）のいずれかで表される化合物。
【化１】
2019516777.tif 000017
【請求項１７】
下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
【化２】
2019516777.tif 000018
【請求項１８】
下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするメラニン生成阻害剤。
【化３】
2019516777.tif 000019
【請求項１９】
下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする皮膚美白剤。
【化４】
2019516777.tif 000020
【請求項２０】
チロシナーゼ阻害剤の製造のための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
【化５】
2019516777.tif 000021
【請求項２１】
メラニン生成阻害剤の製造のための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
【化６】
2019516777.tif 000022
【請求項２２】
皮膚美白剤の製造のための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
【化７】
2019516777.tif 000023
【請求項２３】
チロシナーゼ阻害に使用するための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種。
【化８】
2019516777.tif 000024
【請求項２４】
メラニン生成阻害に使用するための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種。
【化９】
2019516777.tif 000025
【請求項２５】
皮膚美白に使用するための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種。
【化１０】
2019516777.tif 000026
【請求項２６】
チロシナーゼ阻害のための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
【化１１】
2019516777.tif 000027
【請求項２７】
メラニン生成阻害のための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
【化１２】
2019516777.tif 000028
【請求項２８】
皮膚美白のための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
【化１３】
2019516777.tif 000029
【請求項２９】
対象に、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効量で投与することを含む、対象におけるチロシナーゼ阻害方法。
【化１４】
2019516777.tif 000030
【請求項３０】
対象に、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効量で投与することを含む、対象におけるメラニン生成阻害方法。
【化１５】
2019516777.tif 000031
【請求項３１】
対象に、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効量で投与することを含む、対象における皮膚美白方法。
【化１６】
2019516777.tif 000032
【請求項３２】
Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効成分として最低0.01質量％かつ最高95質量％の濃度で含有する皮膚美白用製品。
【請求項３３】
チロシナーゼ阻害活性を有する、請求項３２記載の皮膚美白用製品。
【請求項３４】
メラニン生成阻害活性を有する、請求項３２記載の皮膚美白用製品。
【請求項３５】
水および／またはアルコール溶媒を用いて抽出されたSyzygium polyanthumの抽出物からなる、請求項３２記載の皮膚美白用製品。
【請求項３６】
前記水および／またはアルコール溶媒の抽出物が葉に由来する、請求項３５記載の皮膚美白用製品。
【請求項３７】
下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を、有効成分として、成人１人１日当たり最低0.0001mgかつ最高10gの濃度で含有する皮膚美白用製品。
【化１７】
2019516777.tif 000033
【請求項３８】
チロシナーゼ阻害活性を有する、請求項３７記載の皮膚美白用製品。
【請求項３９】
メラニン生成阻害活性を有する、請求項３７記載の皮膚美白用製品。
【請求項４０】
水および／またはアルコール溶媒を用いて抽出されたSyzygium polyanthumの抽出物からなる、請求項３７記載の皮膚美白用製品。
【請求項４１】
前記水および／またはアルコール溶媒の抽出物が葉に由来する、請求項４０記載の皮膚美白用製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚美白に有効な素材に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の色素沈着やシミ、ソバカス等は、一般に皮膚の紫外線暴露による刺激やホルモンの異常または遺伝的要素等によって皮膚内に存在する色素細胞（メラノサイト）が活性化されメラニン生成が亢進した結果生じるものと考えられている。このメラニン生成亢進のメカニズムは複雑であるが、メラニンは酵素チロシナーゼの作用により生合成されること、チロシナーゼのドーパオキシダーゼ活性はメラニン生成のメカニズムに深く関与していることが知られている（非特許文献１）。
【０００３】
メラニン生成のメカニズムを標的とした美白剤が開発されている。例えば、酵素チロシナーゼの活性を抑制してメラニン産生を抑制する作用を有する皮膚美白剤として、アスコルビン酸、アルブチン、コウジ酸等（非特許文献２）、ならびに多様な植物エキスが報告されている。また、ドーパオキシダーゼ活性を抑制し、美白作用を有する植物エキスに関する多数の報告がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Biochimica et Biophysica Acta, 1247, 1-11 (1995)
【非特許文献２】Advanced Cosmetic Dermatology, IV. Clinical pharmacology of skin whitening agent (“Bihaku senryaku, IV. Bihakuzaino yakuri to rinsho” in Japanese,) NANKODO Co., Ltd., p. 95-116
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤を提供する。
本発明は、Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効成分とするメラニン生成阻害剤を提供する。
また本発明は、Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効成分とする皮膚美白剤を提供する。
【０００６】
さらに本発明は、下記式（I）〜（III）のいずれかで表される化合物を提供する。
さらに本発明は、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤を提供する。
さらに本発明は、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするメラニン生成阻害剤を提供する。
さらに本発明は、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする皮膚美白剤を提供する。
【０００７】
【化１】
2019516777.tif 000003
【発明の詳細な説明】
【０００８】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、およびその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【０００９】
本発明は、チロシナーゼの阻害活性およびメラニン生成阻害活性を有し、皮膚美白に有効な素材を提供することに関する。
【００１０】
本発明者らは、多くの研究を行った結果、チロシナーゼ活性を阻害し、皮膚メラノサイトにおけるメラニン生成を抑制する植物を見出した。また本発明者らは、当該植物から、チロシナーゼ活性を阻害し、または皮膚メラノサイトにおけるメラニン生成を抑制する活性を有する新規化合物を見出した。
【００１１】
本発明は、チロシナーゼ阻害活性およびメラニン生成阻害活性を有する植物由来素材を提供する。これらの素材は、皮膚美白に有効である。
【００１２】
本明細書において、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療または診断する方法を含まない概念、より具体的には医師または医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療または診断を実施する方法を含まない概念である。
【００１３】
本明細書において、「予防」とは、個体における疾患もしくは状態の発症の防止、抑制または遅延、あるいは個体の疾患もしくは状態の発症の危険性を低下させることをいう。本明細書において、「改善」とは、疾患もしくは状態の好転、疾患もしくは状態の悪化の防止、抑制または遅延、あるいは疾患もしくは状態の進行の逆転、防止、抑制または遅延をいう。
【００１４】
本発明で使用されるSyzygium polyanthumは、Myrtaceae科に属する植物であり、インドネシアではSalamとも称される。Syzygium polyanthumは、従来、下痢、腹痛、糖尿病、二日酔い、乾癬、痒みなどに適用されており、またその葉は色味や香りづけとして米料理に混ぜて食されている。一方、Salamは従来、皮膚美白には用いられていなかった。
【００１５】
本発明において、Syzygium polyanthumは、任意の部位、例えば該植物の全木、葉（葉身、葉柄を含む）、樹皮、木質部、枝、果実、果皮、種子、花（花弁、子房を含む）、根、またはそれらの組み合わせを使用することができる。好ましくは、葉が使用される。
【００１６】
本発明において、Syzygium polyanthumは、上述したその植物体の任意の部位をそのまま、または切断、破砕、粉砕もしくは搾取して使用されてもよく、またはそれらの乾燥物が使用されてもよい。好適には乾燥物が用いられる。該乾燥物は、切断、破砕、粉砕もしくは粉末化されていてもよい。
【００１７】
本発明で使用されるSyzygium polyanthumの抽出物は、上述したSyzygium polyanthumの植物体の任意の部位をそのまま抽出した抽出物であってもよく、または当該植物体の部位を乾燥、切断、破砕、粉砕もしくは搾取したものから抽出した抽出物であってもよい。好適には、Syzygium polyanthumの葉の乾燥物からの抽出物、または該乾燥物を切断、破砕、粉砕もしくは粉末化したものからの抽出物である。
【００１８】
当該抽出物を得るための抽出手段としては、例えば、固液抽出、圧搾抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、ソックスレー抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の通常の手段を用いることができる。これらの抽出手段は組み合わせてもよい。例えば、浸漬や固液抽出と液液抽出を組み合わせてもよく、または抽出時間を短縮する場合には、攪拌を伴う固液抽出をおこなってもよい。
【００１９】
当該抽出物の抽出のための溶媒としては、極性溶媒、非極性溶媒のいずれをも使用することができ、またはこれらを混合して用いることもできる。該抽出溶媒の例としては、水；１価もしくは多価のアルコール類；アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類；酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなどの鎖状および環状エーテル類；ポリエチレングリコールなどのポリエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素などのハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテルなどの炭化水素類；ベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素類；ピリジン類；超臨界二酸化炭素；油脂、ワックス、その他オイルなどが挙げられる。上記に列挙した溶媒は、単独でまたは２種以上を組み合わせて使用することができる。溶媒の組み合わせの例としては、一価アルコールもしくは多価アルコールと水との混合溶媒が挙げられる。
【００２０】
あるいは、植物抽出物は、異なる溶媒を用いた繰り返し抽出により調製されてもよい。
【００２１】
一価アルコールの例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アミルアルコール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール等が挙げられる。多価アルコールの例としては、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、１，４−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール等の２価アルコール、およびグリセリン等の３価以上のアルコールが挙げられる。このうち、炭素数１〜４の一価または多価アルコールが好ましく、または汎用性の点で１価アルコールおよび２価アルコールが好ましい。より好ましい例としては、メタノール、エタノール、１，３−ブチレングリコール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノールおよびｔ−ブタノールが挙げられ、メタノールおよびエタノールがさらに好ましい。
【００２２】
一価アルコールもしくは多価アルコールと水との混合溶媒の例としては、上記に列挙した一価アルコールと水との混合溶媒、および上記に列挙した多価アルコールと水との混合溶媒が挙げられ、好ましくは、メタノール、エタノール、１，３−ブチレングリコール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ−ブタノールおよびｔ−ブタノールから選択されるアルコールと水との混合溶媒が挙げられ、より好ましくは、メタノールもしくはエタノールと水との混合溶媒が挙げられる。
【００２３】
一価アルコールもしくは多価アルコールと水との混合溶媒におけるアルコールの濃度は、好ましくは１０容量％以上、より好ましくは２０容量％以上、さらに好ましくは３０容量％以上であり、かつ好ましくは９０容量％以下、より好ましくは８０容量％以下、さらに好ましくは７０容量％以下である。あるいは、当該水／アルコール混合溶媒におけるアルコールの濃度の例としては、１０〜９０容量％、１０〜８０容量％、１０〜７０容量％、２０〜９０容量％、２０〜８０容量％、２０〜７０容量％、３０〜９０容量％、３０〜８０容量％、および３０〜７０容量％が挙げられる。
【００２４】
好ましい実施形態において、植物抽出物の抽出に使用される溶媒は、水、一価アルコール、多価アルコール、および一価アルコールもしくは多価アルコールと水との混合溶媒から選択され、より好ましくは水、メタノール、エタノール、またはメタノールもしくはエタノールと水との混合溶媒であり、さらに好ましくは水、メタノール、またはエタノールと水との混合溶媒である。
【００２５】
当該メタノールもしくはエタノールと水との混合溶媒における、メタノールもしくはエタノールの濃度の例としては、１０〜９０容量％、１０〜８０容量％、１０〜７０容量％、２０〜９０容量％、２０〜８０容量％、２０〜７０容量％、３０〜９０容量％、３０〜８０容量％、および３０〜７０容量％が挙げられ、より好ましくは４０〜６０容量％、さらに好ましくは５０容量％が挙げられる。
【００２６】
抽出における溶媒の使用量としては、植物（乾燥質量換算）１ｇに対して１〜１００ｍＬが好ましい。抽出条件は、十分な抽出が行える条件であれば特に限定されない。通常、溶媒がより低温であればより長時間、溶媒がより高温であればより短時間の抽出を行う。例えば、抽出時間は１時間以上が好ましく、４時間以上がより好ましく、他方、２ヶ月以下が好ましく、４週間以下がより好ましい。また例えば、抽出温度は、好ましくは０℃以上、より好ましくは５℃以上であり、かつ好ましくは溶媒沸点以下であり、１０〜８０℃程度がさらに好ましいが、室温程度であってもよい。好ましい抽出条件の例としては、１５〜４０℃で３日〜４週間、５０〜７０℃で１〜１０時間、などが挙げられるが、これらに限定されず、当業者によって適宜選択され得る。
【００２７】
上述の手順で得られた抽出物に対して、必要に応じて、植物抽出物の製造に一般的に用いられる精製処理、例えば、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフ、カラムクロマトグラフ、液液分配、ゲルろ過分離、活性炭等を用いた処理を行うこともできる。
【００２８】
上述の手順で得られた抽出物は、抽出液やその画分を単独でまたは混合してそのまま用いてもよく、または適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、または濃縮エキス、乾燥粉末もしくはペースト状に調製して用いてもよい。
【００２９】
後述の実施例に示すとおり、Syzygium polyanthumの抽出物は、チロシナーゼ阻害活性、皮膚メラノサイトにおけるメラニン生成阻害活性を有し、皮膚のメラニン生成を抑制する（実施例１〜２参照）。したがって、Syzygium polyanthumまたはその抽出物は、チロシナーゼ阻害、メラニン生成阻害のための有効成分として使用することができる。あるいは、Syzygium polyanthumまたはその抽出物は、皮膚におけるメラニン生成の抑制、皮膚美白などのための有効成分として使用することができる。
【００３０】
本発明によれば、Syzygium polyanthumおよびその抽出物は、いずれかが単独で使用されても、または組み合わせで使用されてもよい。好ましい実施形態においては、Syzygium polyanthumの抽出物が使用される。
【００３１】
さらに本発明者らは、Syzygium polyanthumの活性成分として、下記式（I）〜（III）で表される新規化合物を見出した。
【００３２】
【化２】
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【００３３】
式（I）〜（III）で表される化合物は、チロシナーゼ阻害、メラニン生成阻害のための有効成分として使用することができる。さらに、これらの化合物は、皮膚におけるメラニン生成の抑制、皮膚美白などのための有効成分として使用することができる。本発明において、式（I）〜（III）で表される化合物は、いずれか１種で使用されても、またはいずれか２種、もしくは３種を組み合わせて使用されてもよい。さらに本発明によれば、式（I）〜（III）で表される化合物のいずれか１種、２種または３種を、Syzygium polyanthumおよび／またはその抽出物と組み合わせて使用してもよい。
【００３４】
好ましくは、本発明で用いられるSyzygium polyanthumの抽出物は、Syzygium polyanthumの葉からの抽出物を含有する。
【００３５】
したがって、一態様において、本発明は、Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効成分とする、チロシナーゼ阻害剤を提供する。また本発明は、Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効成分とする、メラニン生成阻害剤を提供する。さらに本発明は、Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効成分とする、皮膚美白剤を提供する。
【００３６】
別の態様において、本発明は、チロシナーゼ阻害剤、メラニン生成阻害剤、または皮膚美白剤の製造のための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物の使用を提供する。
【００３７】
一実施形態において、当該剤は、Syzygium polyanthumまたはその抽出物から本質的に構成され得る。
【００３８】
別の態様において、本発明は、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、チロシナーゼ阻害剤を提供する。また本発明は、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、メラニン生成阻害剤を提供する。さらに本発明は、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする、皮膚美白剤を提供する。
【００３９】
別の態様において、本発明は、チロシナーゼ阻害剤、メラニン生成阻害剤、または皮膚美白剤の製造のための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種の使用を提供する。
【００４０】
一実施形態において、当該剤は、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種から本質的に構成され得る。
【００４１】
一実施形態において、当該チロシナーゼ阻害剤、メラニン生成阻害剤または皮膚美白剤は、Syzygium polyanthum、その抽出物および式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される１種以上を有効成分として含有し得る。
【００４２】
また別の態様において、本発明は、チロシナーゼ阻害、メラニン生成阻害、または皮膚美白のための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物の使用を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、チロシナーゼ阻害、メラニン生成阻害、または皮膚美白に使用するための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物を提供する。
また別の態様において、本発明は、チロシナーゼ阻害、メラニン生成阻害、または皮膚美白のための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種の使用を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、チロシナーゼ阻害、メラニン生成阻害、または皮膚美白に使用するための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を提供する。
【００４３】
一実施形態において、当該チロシナーゼ阻害、メラニン生成阻害または皮膚美白には、Syzygium polyanthum、その抽出物および式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される１種以上が使用され得る。
【００４４】
本発明による当該使用は、治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。治療的使用の例としては、メラニンの過剰生成に起因する疾患（例えば肝斑、後天性真皮メラノサイトーシスなど）を罹患した者に対する使用が挙げられる。非治療使用の例としては、美容目的での皮膚メラニン生成阻害または皮膚美白のための使用が挙げられる。また例えば、非治療的使用は、他者に、医療行為としてではなくSyzygium polyanthum、その抽出物および式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される１種以上を投与または摂取させるために、皮膚メラニン生成阻害または皮膚美白効果を謳ってそれらを提供することを含む。
【００４５】
本発明において、Syzygium polyanthum、その抽出物、および式（I）〜（III）で表される化合物は、ヒトおよび非ヒト動物のいずれに対しても使用することができる。非ヒト動物としては、非ヒト哺乳動物、鳥類などが挙げられ、非ヒト哺乳動物としては、例えば、類人猿、その他霊長類、マウス、ラット、ハムスター、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、およびコンパニオン動物などが挙げられる。
【００４６】
本発明において、Syzygium polyanthum、その抽出物、および式（I）〜（III）で表される化合物は、医薬品、医薬部外品、化粧料または食品等に対して、チロシナーゼ阻害、メラニン生成阻害、または皮膚美白の機能を付与するための有効成分として使用することができる。
【００４７】
当該医薬品（医薬部外品も含む）は、チロシナーゼ阻害またはメラニン生成阻害のための医薬品であり、Syzygium polyanthum、その抽出物および式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される１種以上を、当該機能のための有効成分として含有する。さらに、該医薬品は、該有効成分の機能が失われない限りにおいて、必要に応じて薬学的に許容される担体、または他の有効成分、薬理成分等を含有していてもよい。
【００４８】
当該医薬品（医薬部外品も含む）の投与形態は、経口投与および非経口投与の何れであってもよい。該医薬品の剤形は、経口または非経口的に投与可能な剤形であれば特に限定されず、例えば注射剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、各種外用剤、局所製剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤、シロップ剤等の何れでもよい。これらの種々の剤形の製剤は、Syzygium polyanthum、その抽出物および式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される１種以上を、薬学的に許容される担体（例えば賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、嬌味剤、香料、被膜剤、希釈剤等）、他の薬効成分等と適宜組み合わせて、定法に従って調製することができる。
【００４９】
当該医薬品（医薬部外品も含む）におけるSyzygium polyanthumまたはその抽出物の含有量（乾燥物換算）は、特に限定されないが、好ましくは全質量中０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、さらに好ましくは１．０質量％以上、さらにより好ましくは１０質量％以上、なお好ましくは１５質量％以上であり、かつ好ましくは９５質量％以下、より好ましくは８０質量％以下、さらに好ましくは６０質量％以下である。さらに、当該含有量の例として、０．０１〜９５質量％、０．０１〜８０質量％、０．０１〜６０質量％、０．１〜９５質量％、０．１〜８０質量％、０．１〜６０質量％、１．０〜９５質量％、１．０〜８０質量％、１．０〜６０質量％、１０〜９５質量％、１０〜８０質量％、１０〜６０質量％、１５〜９５質量％、１５〜８０質量％、および１５〜６０質量％が挙げられる。
【００５０】
当該医薬品（医薬部外品も含む）における式(I)〜(III)で表される化合物の合計含有量は、特に限定されないが、好ましくは全質量中０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、さらに好ましくは１．０質量％以上、さらにより好ましくは１０質量％以上、なお好ましくは１５質量％以上であり、かつ好ましくは９５質量％以下、より好ましくは８０質量％以下、さらに好ましくは６０質量％以下である。さらに、当該含有量の例として、０．０１〜９５質量％、０．０１〜８０質量％、０．０１〜６０質量％、０．１〜９５質量％、０．１〜８０質量％、０．１〜６０質量％、１．０〜９５質量％、１．０〜８０質量％、１．０〜６０質量％、１０〜９５質量％、１０〜８０質量％、１０〜６０質量％、１５〜９５質量％、１５〜８０質量％、および１５〜６０質量％が挙げられる。
【００５１】
当該化粧料は、チロシナーゼ阻害、メラニン生成阻害、または皮膚美白のための化粧料であり、Syzygium polyanthum、その抽出物および式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される１種以上を、当該機能のための有効成分として含有する。さらに、該化粧料は、該有効成分の機能が失われない限りにおいて、必要に応じて化粧料に許容される担体、または他の有効成分もしくは化粧成分、例えば、保湿剤、他の美白剤、紫外線保護剤、細胞賦活剤、洗浄剤、角質溶解剤、メークアップ成分（例えば、化粧下地、ファンデーション、おしろい、パウダー、チーク、口紅、アイメーク、アイブロウ、マスカラ、その他）などを含有していてもよい。該化粧料の形態としては、皮膚外用投与、局所投与、または経口投与のための形態が挙げられる。
【００５２】
当該化粧料は、Syzygium polyanthum、その抽出物および式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される１種以上を、必要に応じて当該化粧料に許容される担体、他の有効成分、化粧成分などと組みあわせて、常法により製造することができる。
【００５３】
当該化粧料におけるSyzygium polyanthumまたはその抽出物の含有量（乾燥物換算）は、特に限定されないが、好ましくは全質量中０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上、さらに好ましくは０．０１質量％以上、さらにより好ましくは０．１質量％以上、なお好ましくは１．０質量％以上であり、かつ好ましくは６０質量％以下、より好ましくは４０質量％以下、さらに好ましくは２０質量％以下、なお好ましくは１０質量％以下である。さらに、当該含有量の例として、０．０００１〜６０質量％、０．０００１〜４０質量％、０．０００１〜２０質量％、０．０００１〜１０質量％、０．００１〜６０質量％、０．００１〜４０質量％、０．００１〜２０質量％、０．００１〜１０質量％、０．０１〜６０質量％、０．０１〜４０質量％、０．０１〜２０質量％、０．０１〜１０質量％、０．１〜６０質量％、０．１〜４０質量％、０．１〜２０質量％、０．１〜１０質量％、１．０〜６０質量％、１．０〜４０質量％、１．０〜２０質量％、および１．０〜１０質量％が挙げられる。
【００５４】
当該化粧料における式（I）〜（III）で表される化合物の合計含有量は、特に限定されないが、好ましくは全質量中０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上、さらに好ましくは０．０１質量％以上、さらにより好ましくは０．１質量％以上、なお好ましくは１．０質量％以上であり、かつ好ましくは６０質量％以下、より好ましくは４０質量％以下、さらに好ましくは２０質量％以下、なお好ましくは１０質量％以下である。さらに、当該含有量の例として、０．０００１〜６０質量％、０．０００１〜４０質量％、０．０００１〜２０質量％、０．０００１〜１０質量％、０．００１〜６０質量％、０．００１〜４０質量％、０．００１〜２０質量％、０．００１〜１０質量％、０．０１〜６０質量％、０．０１〜４０質量％、０．０１〜２０質量％、０．０１〜１０質量％、０．１〜６０質量％、０．１〜４０質量％、０．１〜２０質量％、０．１〜１０質量％、１．０〜６０質量％、１．０〜４０質量％、１．０〜２０質量％、および１．０〜１０質量％が挙げられる。
【００５５】
当該食品は、チロシナーゼ阻害、メラニン生成阻害、または皮膚美白の機能を提供するための食品であり、Syzygium polyanthum、その抽出物および式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される１種以上を、当該機能のための有効成分として含有する。該食品には、チロシナーゼ阻害、メラニン生成阻害、または皮膚美白をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した病者用食品、および栄養機能食品、特定保健用食品、機能性表示食品等の保健機能食品が包含される。
【００５６】
当該食品の形態は、固形、半固形または液状（例えば飲料）であり得る。食品の例としては、パン類、麺類、飯類、クッキー等の菓子類、ゼリー類、乳製品、スープ類、冷凍食品、インスタント食品、でんぷん加工製品、加工魚肉製品、その他加工食品、調味料、栄養補助食品、およびお茶やコーヒー飲料、果実飲料、炭酸飲料、ゼリー状飲料等の飲料、ならびにそれらの原料が挙げられる。あるいは、該食品は、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、液剤、シロップなどの経口投与製剤の形態を有するサプリメントであってもよい。
【００５７】
当該食品は、Syzygium polyanthum、その抽出物および式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される１種以上を、任意の食品材料または食品に許容される添加物（例えば溶剤、軟化剤、油、乳化剤、防腐剤、香科、甘味料、安定剤、着色剤、紫外線吸収剤、酸化防止剤、保湿剤、増粘剤、固着剤、分散剤、湿潤剤等）と適宜組み合わせて、定法に従って調製することができる。
【００５８】
当該食品中における、Syzygium polyanthumまたはその抽出物の含有量（乾燥物換算）は、特に限定されないが、好ましくは全質量の０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上、さらに好ましくは０．０１質量％以上であり、かつ好ましくは５０質量％以下、より好ましくは２０質量％以下、さらに好ましくは１０質量％以下である。さらに、当該含有量の例として、０．０００１〜５０質量％、０．０００１〜２０質量％、０．０００１〜１０質量％、０．００１〜５０質量％、０．００１〜２０質量％、０．００１〜１０質量％、０．０１〜５０質量％、０．０１〜２０質量％、および０．０１〜１０質量％が挙げられる。
【００５９】
当該食品中における式（I）〜（III）で表される化合物の合計含有量は、特に限定されないが、好ましくは全質量の０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上、さらに好ましくは０．０１質量％以上であり、かつ好ましくは５０質量％以下、より好ましくは２０質量％以下、さらに好ましくは１０質量％以下である。さらに、当該含有量の例として、０．０００１〜５０質量％、０．０００１〜２０質量％、０．０００１〜１０質量％、０．００１〜５０質量％、０．００１〜２０質量％、０．００１〜１０質量％、０．０１〜５０質量％、０．０１〜２０質量％、および０．０１〜１０質量％が挙げられる。
【００６０】
なお別の態様において、本発明は、対象におけるチロシナーゼ阻害方法を提供する。また本発明は、対象におけるメラニン生成阻害方法を提供する。また本発明は、対象における皮膚美白方法を提供する。当該方法は、対象に、Syzygium polyanthum、その抽出物および式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される１種以上を有効量で投与することを含む。当該方法は、治療的方法であっても非治療的方法であってもよい。
【００６１】
当該方法における対象としては、チロシナーゼ阻害、メラニン生成阻害、または皮膚美白が所望されるか、またはそれを必要とする動物が挙げられる。動物としては、上述したヒトおよび非ヒト動物が挙げられ、より好ましくはヒトである。あるいは、当該方法における対象としては、上述したヒトおよび非ヒト動物における、美白が所望されるか、またはそれを必要とする皮膚の部位（例えば、色素沈着、シミ、老人性色素班等を有する皮膚の部位、および皮膚の露光部）が挙げられる。
【００６２】
本発明はさらに、インビトロでのチロシナーゼ阻害またはメラニン生成阻害方法を提供する。当該インビトロ方法は、上述したヒトまたは非ヒト動物由来の組織もしくは細胞、例えば皮膚組織、３Ｄ培養皮膚、培養メラノサイト等の皮膚細胞、またはそれらの抽出液、あるいはチロシナーゼとその基質であるチロシンまたはＬ−ドーパを含有する反応液などを対象として行うことができる。
【００６３】
当該本発明の方法における投与の有効量は、対象におけるチロシナーゼ活性またはメラニン生成を抑制できる量であり得る。好ましくは、有効量とは、投与群におけるチロシナーゼ活性を、未投与群と比べて統計学的に有意に低下させることができる量である。また好ましくは、有効量とは、投与群における皮膚細胞（例えば、皮膚組織由来細胞、３Ｄ培養皮膚、培養メラノサイト）のメラニン量を、未投与群と比べて統計学的に有意に低下させることができる量である。また好ましくは、有効量とは、投与群におけるチロシナーゼ活性を、未投与群の５０％以下、好ましくは７０％以下に低下させることができる量である。また好ましくは、有効量とは、投与群におけるメラニン量を、未投与群の５０％以下、好ましくは７０％以下に低下させることができる量である。チロシナーゼ活性は、チロシナーゼと基質との反応生成物による反応液の色の変化を吸光度に基づき測定することで、決定することができる。メラニン量は、皮膚細胞から抽出したメラニンを含む溶液の色の濃さを吸光度に基づいて測定することで、決定することができる。しかしながら、上記の測定法は例示であり、チロシナーゼ活性や細胞のメラニン量の測定の手順は当業者に周知である。
【００６４】
本発明において、Syzygium polyanthum、その抽出物、および式（I）〜（III）で表される化合物の投与量および投与計画は、対象の種、体重、性別、年齢、状態、またはその他の要因に従って、当業者により適宜決定されればよい。限定ではないが、Syzygium polyanthumまたはその抽出物（乾燥物換算）の投与量は、例えば成人１人１日当たり、好ましくは０．０００１ｍｇ以上、より好ましくは０．００１ｍｇ以上、さらに好ましくは０．０１ｍｇ以上であり、さらにより好ましくは０．１ｍｇ以上であり、なお好ましくは１ｍｇ以上であり、なお好ましくは０．１ｇ以上であり、なお好ましくは１ｇ以上であり、かつ好ましくは１０ｇ以下、より好ましくは５ｇ以下、さらに好ましくは１ｇ以下である。あるいは、本発明によるSyzygium polyanthumまたはその抽出物（乾燥物換算）の投与量（成人１人１日当たり）は、例えば０．０００１ｍｇ〜１０ｇ、０．０００１ｍｇ〜５ｇ、０．０００１ｍｇ〜１ｇ、０．００１ｍｇ〜１０ｇ、０．００１ｍｇ〜５ｇ、０．００１ｍｇ〜１ｇ、０．０１ｍｇ〜１０ｇ、０．０１ｍｇ〜５ｇ、０．０１ｍｇ〜１ｇ、０．１ｍｇ〜１０ｇ、０．１ｍｇ〜５ｇ、０．１ｍｇ〜１ｇ、１ｍｇ〜１０ｇ、１ｍｇ〜５ｇ、１ｍｇ〜１ｇ、０．１ｇ〜１０ｇ、０．１ｇ〜５ｇ、０．１ｇ〜１ｇ、１ｇ〜１０ｇ、または１ｇ〜５ｇの範囲で選択され得る。上記の量を、例えば、１日に１回、２回または３回以上に分け、数週間〜数ヶ月間継続して投与することが好ましい。
【００６５】
あるいは、本発明による式（I）〜（III）で表される化合物の合計投与量は、限定ではないが、例えば成人１人１日当たり、好ましくは０．０００１ｍｇ以上、より好ましくは０．００１ｍｇ以上、さらに好ましくは０．０１ｍｇ以上であり、さらにより好ましくは０．１ｍｇ以上であり、なお好ましくは１ｍｇ以上であり、なお好ましくは０．１ｇ以上であり、なお好ましくは１ｇ以上であり、かつ好ましくは１０ｇ以下、より好ましくは５ｇ以下、さらに好ましくは１ｇ以下である。あるいは、式（I）〜（III）で表される化合物の合計投与量（成人１人１日当たり）は、例えば０．０００１ｍｇ〜１０ｇ、０．０００１ｍｇ〜５ｇ、０．０００１ｍｇ〜１ｇ、０．００１ｍｇ〜１０ｇ、０．００１ｍｇ〜５ｇ、０．００１ｍｇ〜１ｇ、０．０１ｍｇ〜１０ｇ、０．０１ｍｇ〜５ｇ、０．０１ｍｇ〜１ｇ、０．１ｍｇ〜１０ｇ、０．１ｍｇ〜５ｇ、０．１ｍｇ〜１ｇ、１ｍｇ〜１０ｇ、１ｍｇ〜５ｇ、１ｍｇ〜１ｇ、０．１ｇ〜１０ｇ、０．１ｇ〜５ｇ、０．１ｇ〜１ｇ、１ｇ〜１０ｇ、または１ｇ〜５ｇの範囲で選択され得る。上記の量を、例えば、１日に１回、２回または３回以上に分け、数週間〜数ヶ月間継続して投与することが好ましい。
【００６６】
本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途または方法を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない
【００６７】
〔１〕Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
〔２〕Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効成分とするメラニン生成阻害剤。
〔３〕Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効成分とする皮膚美白剤。
〔４〕チロシナーゼ阻害剤の製造のための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物の使用。
〔５〕メラニン生成阻害剤の製造のための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物の使用。
〔６〕皮膚美白剤の製造のための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物の使用。
〔７〕チロシナーゼ阻害に使用するための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物。
〔８〕メラニン生成阻害に使用するための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物。
〔９〕皮膚美白に使用するための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物。
〔１０〕チロシナーゼ阻害のための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物の使用。
〔１１〕メラニン生成阻害のための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物の使用。
〔１２〕皮膚美白のための、Syzygium polyanthumまたはその抽出物の使用。
〔１３〕対象に、Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効量で投与することを含む、対象におけるチロシナーゼ阻害方法。
〔１４〕対象に、Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効量で投与することを含む、対象におけるメラニン生成阻害方法。
〔１５〕対象に、Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効量で投与することを含む、対象における皮膚美白方法。
〔１６〕前記〔１０〕〜〔１２〕において、好ましくは、前記使用は非治療的使用である。
〔１７〕前記〔１〕〜〔１６〕において、前記抽出物は、
好ましくは水、メタノール、エタノール、またはメタノールもしくはエタノールと水との混合溶媒による抽出物であり、
より好ましくは、水、メタノール、またはエタノールと水との混合溶媒による抽出物である。
〔１８〕前記〔１７〕において、前記メタノールもしくはエタノールと水との混合溶媒は、好ましくは３０〜７０容量％エタノール水溶液または３０〜７０容量％メタノール水溶液である。
〔１９〕前記〔１〕〜〔１８〕において、前記Syzygium polyanthumは、好ましくはSyzygium polyanthumの葉である。
【００６８】
〔２０〕下記式（I）〜（III）のいずれかで表される化合物（ただし、Syzygium polyanthumまたはその抽出物に含有された形態ではない）。
〔２１〕下記式（I）〜（III）のいずれかで表される化合物と、薬学的に許容される担体、化粧料に許容される担体、化粧成分および食品に許容される添加物からなる群より選択されるいずれか１種以上とを含有する（ただし、該式（I）〜（III）のいずれかで表される化合物はSyzygium polyanthumまたはその抽出物に含有された形態ではない）組成物。
〔２２〕下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
〔２３〕下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とするメラニン生成阻害剤。
〔２４〕下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分とする皮膚美白剤。
〔２５〕チロシナーゼ阻害剤の製造のための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
〔２６〕メラニン生成阻害剤の製造のための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
〔２７〕皮膚美白剤の製造のための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
〔２８〕チロシナーゼ阻害に使用するための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種。
〔２９〕メラニン生成阻害に使用するための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種。
〔３０〕皮膚美白に使用するための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種。
〔３１〕チロシナーゼ阻害のための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
〔３２〕メラニン生成阻害のための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
〔３３〕皮膚美白のための、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種の使用。
〔３４〕対象に、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効量で投与することを含む、対象におけるチロシナーゼ阻害方法。
〔３５〕対象に、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効量で投与することを含む、対象におけるメラニン生成阻害方法。
〔３６〕対象に、下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効量で投与することを含む、対象における皮膚美白方法。
【００６９】
【化３】
2019516777.tif 000005
【００７０】
〔３７〕前記〔１〕〜〔１９〕において、好ましくは、前記Syzygium polyanthumの抽出物は、Syzygium polyanthumの葉からの抽出物を含有する。
〔３８〕Syzygium polyanthumまたはその抽出物を有効成分として最低0.01質量％かつ最高95質量％の濃度で含有する皮膚美白用製品。
〔３９〕チロシナーゼ阻害活性を有する、〔３８〕記載の皮膚美白用製品。
〔４０〕メラニン生成阻害活性を有する、〔３８〕記載の皮膚美白用製品。
〔４１〕水および／またはアルコール溶媒を用いて抽出されたSyzygium polyanthumの抽出物からなる、〔３８〕記載の皮膚美白用製品。
〔４２〕前記水および／またはアルコール溶媒の抽出物が葉に由来する、〔４１〕記載の皮膚美白用製品。
〔４３〕下記式（I）〜（III）で表される化合物からなる群より選択される少なくとも１種を有効成分として、成人１人１日当たり最低0.0001mgかつ最高10gの濃度で含有する皮膚美白用製品。
【化４】
2019516777.tif 000006
〔４４〕チロシナーゼ阻害活性を有する、〔４３〕記載の皮膚美白用製品。
〔４５〕メラニン生成阻害活性を有する、〔４３〕記載の皮膚美白用製品。
〔４６〕水および／またはアルコール溶媒を用いて抽出されたSyzygium polyanthumの抽出物からなる、〔４３〕記載の皮膚美白用製品。
〔４７〕前記水および／またはアルコール溶媒の抽出物が葉に由来する、〔４６〕記載の皮膚美白用製品。
【実施例】
【００７１】
（製造例１）Syzygium polyanthum水抽出物の調製
Syzygium polyanthumの葉（UD. Sari Alam社、Tawangmangu, Karanganyar, Central Java, Indonesia）５０ｇに水５００ｍＬを加え、６０℃で４時間抽出し、濾過して粗抽出液を得た後、濃縮乾固して抽出固形分１０ｇを得た。この抽出固形分を固形分濃度が６２．５−１００００ｐｐｍ（ｗ／ｖ）になるようＤＭＳＯに溶解し、異なる濃度のSyzygium polyanthumの水抽出物溶液を調製した。
【００７２】
（製造例２）Syzygium polyanthum５０％エタノール抽出物の調製
Syzygium polyanthumの葉（UD. Sari Alam社、Tawangmangu, Karanganyar, Central Java, Indonesia）５０ｇに５０％（ｖ／ｖ）エタノール５００ｍＬを加え、室温で７日間抽出し、濾過して粗抽出液を得た後、濃縮乾固して抽出固形分１０ｇを得た。この抽出固形分を固形分濃度が６２．５−１００００ｐｐｍ（ｗ／ｖ）になるようＤＭＳＯに溶解し、異なる濃度のSyzygium polyanthumの５０％エタノール抽出物溶液を調製した。
【００７３】
（製造例３）Syzygium polyanthumメタノール抽出物の調製
Syzygium polyanthumの葉（UD. Sari Alam社、Tawangmangu, Karanganyar, Central Java, Indonesia）５００ｇにメタノール２．５Ｌを加え、室温で１日間抽出し、濾過して粗抽出液を得た後、濃縮乾固する過程を３日間行い、抽出固形分７０ｇを得た。
【００７４】
実施例１  チロシナーゼ活性アッセイ
Syzygium polyanthum抽出物のチロシナーゼ阻害活性を調べるためチロシナーゼ活性アッセイを行った。
【００７５】
（１）Syzygium polyanthum水および５０％エタノール抽出物のチロシナーゼ阻害活性
製造例１−２で調製した抽出物溶液７０μＬを９６ウェルプレートに入れ、チロシナーゼ溶液３０μＬ（３３３ｕｎｉｔ／ｍＬ  マッシュルームチロシナーゼ（ＳＩＧＭＡ）の５０ｍＭリン酸バッファー溶液、ｐＨ６．５）と基質溶液（２ｍＭ  Ｌ−チロシンまたは１２ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡ）１１０μＬを加えた。ポジティブコントロールとして抽出物の代わりにコウジ酸を使用した。反応液を３７℃で３０分間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーを用いて４９２ｎｍ吸光度を測定し、さらにＩＣ５０値（５０％阻害を示す最終濃度（乾燥物換算））を算出した。
【００７６】
（２）メタノール抽出物のチロシナーゼ阻害活性
製造例３で調製したSyzygium polyanthumのメタノール抽出物１ｍｇを５０μＬのＤＭＳＯと５５０μＬのｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭリン酸水素二ナトリウム溶液、ｐＨ６．５）に溶解させた。この抽出物溶液を、抽出物の最終濃度が５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６２５、７．８１２５、および０μｇ／ｍＬとなるように９６ウェルプレートに入れ、ｂｕｆｆｅｒを用いて６０μＬまで希釈した。当該９６ウェルプレートの各ウェルにチロシナーゼ溶液３０μＬ（１ｍｇ／１６ｍＬ  マッシュルームチロシナーゼ（ＳＩＧＭＡ）のｂｕｆｆｅｒ溶液、ｐＨ６．５）と基質溶液（２ｍＭ  Ｌ−チロシンまたは１２ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡ）１１０μＬを加えた。ポジティブコントロールとして抽出物の代わりにコウジ酸を用いた。反応液を３７℃で３０分間反応させた後、マイクロプレートリーダーを用いて５１０ｎｍ吸光度を測定し、さらにＩＣ５０値を算出した。
【００７７】
チロシナーゼ活性アッセイの結果を表１、２に示す。Syzygium polyanthumの水抽出物、５０％エタノール抽出物、およびメタノール抽出物は、いずれもチロシナーゼ活性を阻害した。
【００７８】
【表１】
2019516777.tif 000007
【００７９】
【表２】
2019516777.tif 000008
【００８０】
実施例２  皮膚メラノサイトにおけるメラニン生成阻害
（１）皮膚メラノサイトの培養
皮膚メラノサイトとしてＢ１６メラノーマ細胞（ＤＳ  ｐｈａｒｍａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用した。Ｂ１６メラノーマ細胞は、１０％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を入れた１０ｃｍディッシュを用いて、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）において培養した。培養後の細胞から５．０×１０4ｃｅｌｌ／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。当該細胞懸濁液を９９８μＬずつ２４ウェルプレートに播種し、一晩ＣＯ2インキュベーター（３７℃，５％ＣＯ2）において培養した後、製造例３で調製したSyzygium polyanthumのメタノール抽出物のＤＭＳＯ溶液を２μＬずつ添加して（抽出物の最終濃度：２５および５０μｇ／ｍＬ）さらに７２時間培養した。ポジティブコントロールとして抽出物の代わりにアルブチン（７３０μＭ）を用いた。コントロールとしてＤＭＳＯを用いた。
【００８１】
（２）メラニン量の算出
（１）で調製した培養物の上澄みを回収し、９６ウェルプレートに２００μＬずつ移した後、５１０ｎｍで吸光度を測定した。コントロールに対する相対値を求めることで、細胞外相対メラニン量を算出した。
【００８２】
（３）細胞毒性試験（ＭＴＴ法）
ＭＴＴ試験薬は、Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ  Ｂｌｕｅ  Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ（ＳＩＧＭＡ）５０ｍｇをＰＢＳ（−）１０ｍＬに溶解させて調製した。（１）で調製した培養物に当該ＭＴＴ試験薬を５０μＬずつ添加し、４時間反応させた。次に、ＭＴＴ用イソプロパノールを１ｍＬずつ添加し、アルミ箔をまいて室温で２時間反応した。反応後、全量を回収し、遠心分離（１．４５×１０3ｒｐｍ，１ｍｉｎ）した後、上澄みを９６ウェルプレートに１５０μＬずつ移し、５９０ｎｍで吸光度を測定した。コントロールに対する相対値を求めることで、相対細胞生存率（細胞毒性）を算出した。
【００８３】
メラノサイトにおける細胞外相対メラニン量、および相対細胞生存率の結果を表３に示す。Syzygium polyanthum抽出物は、メラノサイトの細胞外メラニン量を濃度依存的に減少させた。一方、メラノサイトの細胞生存率は、高濃度のSyzygium polyanthum抽出物の存在下でも充分に高かった。
【００８４】
【表３】
2019516777.tif 000009
【００８５】
実施例３  Syzygium polyanthum葉からの活性化合物の分離
Syzygium polyanthum葉を小片に切断した後、黒い布で覆い、日光下で乾燥させ粉末にした。この粉末５００ｇを２．５Ｌのメタノールで２４時間静置抽出した。抽出は３回繰り返した。得られた抽出液を濾過し、エバポレーターで溶媒除去し、自然乾燥した。得られたメタノール抽出物に蒸留水を適量加え、スターラーで撹拌した後、等量の酢酸エチルを加え、分液漏斗を用いて酢酸エチル層と水層を得た。酢酸エチル層をエバポレーターで溶媒除去して乾燥後、ガラスカラム（８０ｍｍ径×５２０ｍｍ長）にｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１（ｖ／ｖ）で湿潤したシリカグルを充填し、酢酸エチルに溶解してアプライした。溶離液はｎ−ヘキサン：酢酸エチル＝２：１（ｖ／ｖ）、１：１（ｖ／ｖ）、酢酸エチル、メタノールの順に変化させ、８画分（Ｆｒ．１〜８）を得た。下記に分画のスキームを示す。
【００８６】
【化５】
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【００８７】
得られた８画分をサンプルとして、実施例１（３）と同様の手順でチロシナーゼ活性アッセイを行った。各画分はそれぞれＤＭＳＯ６００μＬに溶解し、終濃度が５０、２５、１２．５μｇ／ｍＬとなるように９６ウェルプレートに添加した。結果を表４に示す。Ｆｒ．４〜５から強い活性が検出された。
【００８８】
【表４】
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【００８９】
さらに８つの画分をＨＰＬＣで分析した結果、Ｆｒ．５からの化合物単離が有望であると考えられた。そこでＦｒ．５を分取ＨＰＬＣにかけた結果、ＨＰＬＣ分析で単一ピークを示す画分が単離された。これらの画分をＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析により構造解析した結果、以下の化合物１〜３であることが明らかになった。
（分取ＨＰＬＣ条件）
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ：Ｊａｓｃｏ
Ｃｏｌｕｍｎ：Ｉｎｅｒｔ  Ｓｕｓｔａｉｎ  Ｃ１８．５μｍ（４．６×２５０ｍｍ）
Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：３６０ｎｍ
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：５．０ｍＬ／ｍｉｎ
Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｐｒｏｇｒａｍ：ＭｅＯＨ：０．０５％ＴＥＡａｑ．＝６０％：４０％→１００％：０％
（ＮＭＲ）
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ：ＪＥＯＬ  ＥＣＡ６００ＮＭＲ
Ｓｏｌｖｅｎｔ：ＣＤ3ＯＤ，Ｃ3Ｄ6Ｏ
Ｓｃａｎ：1Ｈ−ＮＭＲ  ８，13Ｃ−ＮＭＲ  １０００
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ：ＳＩＭＡＤＺＵ  ＢＩＯＴＥＣＨ  ＡＸＩＭＡ  ＲＥＳＯＮＡＮＣＥ
Ｉｏｎ  ｍｏｄｅ：ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎ  ｍｏｄｅ
Ｌｏｗ：１００＋
Ｐｏｗｅｒ：１２０
【００９０】
【化６】
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【００９１】
【化７】
2019516777.tif 000013
【００９２】
【化８】
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【００９３】
実施例４  化合物１〜３によるチロシナーゼ阻害およびメラニン生成阻害
化合物１〜３をサンプルとして、実施例１（３）と同様の手順でチロシナーゼ活性アッセイを行った。チロシナーゼ活性アッセイでは各化合物の終濃度を１００、５０、２５、１２．５μＭに調整し、ＩＣ５０値を算出した。また実施例２と同様の手順でメラニン生成阻害活性試験および細胞毒性試験を行い、化合物１〜３を添加した皮膚メラノサイトの細胞外相対メラニン量、および相対細胞生存率を測定した。チロシナーゼ活性アッセイの結果を表５に、細胞外相対メラニン量および相対細胞生存率の測定結果を表６に示す。
【００９４】
【表５】
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【００９５】
【表６】
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【国際調査報告】
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