(57)【要約】  低減されたＬ−グルタミナーゼ活性および増強されたin vivo循環を有するエルウィニア・クリサンセミ（Erwinia chrysanthemi）のＬ−アスパラギナーゼ変異体が、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病などのがんの処置における使用のための、Ｌ−アスパラギナーゼおよびＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインを含有する融合タンパク質として記載されている。
2019509041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の３１、６３および２５４位の１以上でのアミノ酸置換を含む、エルウィニア・クリサンセミ（Erwinia chrysanthemi）のＬ−アスパラギナーゼ（ＥｒＡ）変異体。
【請求項２】
３１位でのアミノ酸置換が、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはトレオニンを含む、請求項１に記載のＥｒＡ変異体。
【請求項３】
６３位でのアミノ酸置換が、グルタミン、アスパラギン、またはアスパラギン酸を含む、請求項１に記載のＥｒＡ変異体。
【請求項４】
２５４位でのアミノ酸置換が、アスパラギンまたはグルタミンを含む、請求項１に記載のＥｒＡ変異体。
【請求項５】
配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７に示されたアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＥｒＡ変異体。
【請求項６】
最小で野生型ＥｒＡ酵素の７５％のアスパラギナーゼ反応速度（ｋｃａｔ）を示す、請求項１に記載のＥｒＡ変異体。
【請求項７】
Ｌ−アスパラギンについて２５０μＭ未満のＫｍを示す、請求項１に記載のＥｒＡ変異体。
【請求項８】
野生型ＥｒＡ酵素の６０％未満のグルタミナーゼ反応速度（ｋｃａｔ）を示す、請求項１に記載のＥｒＡ変異体。
【請求項９】
Ｌ−グルタミンについて３ｍＭより大きいＫｍを示す、請求項１に記載のＥｒＡ変異体。
【請求項１０】
ヒスチジンタグ、ＳＵＭＯタグ、アルブミン結合ドメイン、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項１に記載のＥｒＡ変異体。
【請求項１１】
ＰＥＧ化されている、請求項１に記載のＥｒＡ変異体。
【請求項１２】
７２、７６、７９、８４、８５、２０６、２１０、２１５、２１６、２３５、２３９、２４０、２６１、２６４、２６５、２６８、２６９、３１８、３２２位またはそれらの組み合わせの位置でシステイン残基をさらに含む、請求項１１に記載のＥｒＡ変異体。
【請求項１３】
ＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインをさらに含む、請求項１に記載のＥｒＡ変異体。
【請求項１４】
ＴＲＡＩＬの可溶性ドメインが、ヒトＴＲＡＩＬの残基１１５〜２８１を含む、請求項１３に記載のＥｒＡ変異体。
【請求項１５】
ＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインが、１〜８個のアミノ酸残基を含むペプチド結合基を介して互いに結合されている、請求項１３に記載のＥｒＡ変異体。
【請求項１６】
アミノ酸残基がグリシンおよびセリンから選択される、請求項１５に記載のＥｒＡ変異体。
【請求項１７】
ＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインが、１〜２０個のアミノ酸残基を含むペプチド結合基を介してＥｒＡ変異体に結合されている、請求項１３に記載のＥｒＡ変異体。
【請求項１８】
アミノ酸残基がグリシンおよびセリンから選択される、請求項１７に記載のＥｒＡ変異体。
【請求項１９】
請求項１に記載のＥｒＡ変異体をコードする、核酸分子。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項２１】
請求項１９に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１に記載のＥｒＡ変異体および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２３】
ＴＲＡＩＬの安定な形態をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ＴＲＡＩＬの安定な形態が、ＦＯＬＤＯＮ配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号３１）を含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
処置を必要とする対象に請求項１に記載のＥｒＡ変異体の有効量を投与し、それによって対象のがんを処置することを含む、がんを処置する方法。
【請求項２６】
がんが、非ホジキンリンパ腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、およびヘアリー細胞白血病から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＴＲＡＩＬの安定な形態を投与することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
ＴＲＡＩＬの安定な形態が、ＦＯＬＤＯＮ配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号３１）を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインに結合されているＬ−アスパラギナーゼを含む、融合タンパク質。
【請求項３０】
ＴＲＡＩＬの可溶性ドメインが、ヒトＴＲＡＩＬの残基１１５〜２８１を含む、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
ＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインが、１〜８個のアミノ酸残基を含むペプチド結合基を介して互いに結合されている、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
アミノ酸残基がグリシンおよびセリンから選択される、請求項３１に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
ＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインが、１〜２０個のアミノ酸残基を含むペプチド結合基を介してＬ−アスパラギナーゼに結合されている、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
アミノ酸残基がグリシンおよびセリンから選択される、請求項３３に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
Ｌ−アスパラギナーゼが、エルウィニア・クリサンセミまたは大腸菌由来のＬ−アスパラギナーゼである、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
エルウィニア・クリサンセミのＬ−アスパラギナーゼが、配列番号１の３１、６３および２５４位の１以上でアミノ酸置換を含む変異体である、請求項３５に記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
ヒスチジンタグ、ＳＵＭＯタグ、アルブミン結合ドメイン、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
ＰＥＧ化されている、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
Ｌ−アスパラギナーゼが、７２、７６、７９、８４、８５、２０６、２１０、２１５、２１６、２３５、２３９、２４０、２６１、２６４、２６５、２６８、２６９、３１８、３２２位またはそれらの組み合わせの位置でシステイン残基を含むエルウィニア・クリサンセミ由来のＬ−アスパラギナーゼである、請求項３８に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
請求項２９に記載の融合タンパク質をコードする、核酸分子。
【請求項４１】
請求項４０に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項４２】
請求項４０に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項４３】
請求項２９に記載の融合タンパク質および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項４４】
処置を必要とする対象に請求項２９に記載の融合タンパク質の有効量を投与し、それによって対象のがんを処置することを含む、がんを処置する方法。
【請求項４５】
がんが、非ホジキンリンパ腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、およびヘアリー細胞白血病から選択される、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
緒言
本願は、２０１６年３月１日に出願された米国仮出願第62/301,806号、２０１６年６月８日に出願された第62/347,376号、および２０１７年１月１３日に出願された第62/446,026号の優先権の利益を主張し、その内容はその全体が参照によりここに組み込まれる。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号RO1 EB013685および復員軍人援護局によって授与された助成金番号I01BX001919の下での政府の支援によってなされた。政府は、発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
背景
急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）などの一定のがんは、かかるがんにおけるアスパラギン合成酵素の欠如／低発現に最も一般的に起因する因子である、Ａｓｎの血液からのスカベンジングに依存する。したがって、Ｌ−アスパラギナーゼは、これらのがんの処置において重要な成分として同定されている。Ｌ−アスパラギナーゼは、二重の活性を有する酵素である。主たる活性であるＬ−アスパラギナーゼ活性は、アミノ酸であるＬ−アスパラギン（Ａｓｎ）をＬ−アスパラギン酸（Ａｓｐ）およびアンモニアに加水分解する。第２の活性は、Ｌ−グルタミナーゼ活性であり、これはＬ−グルタミン（Ｇｌｎ）をＬ−グルタミン酸（Ｇｌｕ）およびアンモニアに加水分解する。例えば、ELSPAR（登録商標）（大腸菌（Escherichia coli）から得られる酵素）およびERWINAZE（登録商標）（エルウィニア・クリサンセミ（Erwinia chrysanthemi）から得られる酵素）などの、ＦＤＡに認可された酵素については、Ｌ−グルタミナーゼ活性は、第１のＬ−アスパラギナーゼ活性の２〜１０％の範囲に及ぶ。これらの薬のＬ−アスパラギナーゼ活性の重要性が受け入れられる一方、白血病細胞を殺す際のＬ−グルタミナーゼ活性の重要性について相反する報告がある。さらに、Ｌ−グルタミナーゼ活性は、Ｌ−アスパラギナーゼの臨床的な毒性の多くに関連している。事実、Ｌ−アスパラギナーゼ処置の有毒な副作用は、この抗がん薬の使用を厳しく限定する。
【０００４】
ＡＬＬの処置においてＬ−アスパラギナーゼを使用する治療上の利点があれば、これらの酵素のより有効な変異体（variant）が探求される。この目的のために、ＡｓｐまたはＧｌｕとの複合体中におけるエルウィニア・クリサンセミのＬ−アスパラギナーゼの結晶構造が解明された。この分析は、最も活性な部位の残基（Ｇｌｕ６３、Ｔｈｒ９５、Ａｓｐ９６、およびＬｙｓ１６８）の位置がリガンドの性質に感受性でないことを示す（Ａｓｐ対Ｇｌｕ）。対照的に、Ｔｈｒ１５の立体配置はリガンドの種類に感受性である（Nguyen, et al. (2016) Biochemistry 55(8):1246-53）。以前の研究では、エルウィニア・クリサンセミ（ＥｒＡ）の２つの活性部位の残基Ｇｌｕ６３およびＳｅｒ２５４が、グルタミナーゼ活性と相関すると仮定されており、ここで、ＧｌｎおよびＡｓｎによるそれらの置換は、それぞれ最小のＬ−グルタミナーゼ活性をもたらすと示唆された（Aghaiypour, et al. (2001) Biochemistry 40(19):5655-5664）。
【０００５】
突然変異分析は、Ａｓｐ１３３のバリンまたはロイシンによる置換が、ＥｒＡのＬ−アスパラギナーゼに対する熱安定性を付与することを示す（Kotzia & Labrou (2009) FEBS J. 276(6):1750-61）。バシラス・サブティリス（Bacillus subtilis）のＬ−アスパラギナーゼのＡｓｎ１３３およびＶａｌ１４３の変異もまた、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を増加させることが示されている（CN104371993）。さらに、大腸菌のＬ−アスパラギナーゼのアスパラギンエンドペプチダーゼ耐性変異体（Ａｓｎ２４Ａｌａ）は、界面変異（Ｔｙｒ２５０Ｌｅｕ）と組み合わされると、最小のＬ−グルタミナーゼ活性、低減された細胞毒性、および野生型酵素と比較して２４３％の全ＩＣ５０を有する酵素を提供する（Offman, et al. (2011) Blood 117:1614-21）。さらに、Parmentier, et al. ((2015) Leuk. Res. 39(7):757-62は、野生型Ｌ−アスパラギナーゼ活性および減少したＬ−グルタミナーゼ活性を有するヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）のＬ−アスパラギナーゼ二重変異体（Ｍｅｔ１２１Ｃｙｓ／Ｔｈｒ１６９Ｍｅｔ）を記載し、これはヒト白血病細胞株に対して低減された活性を示した。さらに、WO 2015/038639は、５８および５９位で置換を有する大腸菌由来の改変されたＬ−アスパラギナーゼ酵素を開示し、これは低減されたＬ−グルタミナーゼ活性を示した。US 2013/0330316は、パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）由来のＬ−アスパラギナーゼの変異体を記載し、これは、Ｌｙｓ２７４Ｇｌｕ、Ｔｈｒ５３Ｇｌｎ、およびＴｈｒ５３Ｇｌｎ／Ｌｙｓ２７４Ｇｌｕの置換を含み、高い熱安定性、ｐＨ安定性を有し、Ｌ−グルタミナーゼ活性を有さない。
【０００６】
Ｌ−アスパラギナーゼの翻訳後改変バージョンもまた記載されている。例えば、Ｌ−アスパラギナーゼは、Ｌ−アスパラギナーゼ処置の免疫副作用を低減し、治療中の酵素の半減期を延長するために、ポリエチレングリコールに結合されている（ＰＥＧ−アスパラギナーゼ）。US 2010/0143324およびUS 2012/0100121を参照されたい。Ｌ−アスパラギナーゼへのアルブミン結合ペプチドの融合もまた、この酵素の半減期の増加における使用について示唆されている。US 2012/0009123およびUS 2016/0213759を参照されたい。
【０００７】
Ｌ−アスパラギナーゼを使用してがんを処置するための他のアプローチは、Ｌ−アスパラギナーゼの、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）アゴニストまたはＴＲＡＩＬ受容体アゴニスト、例えば３つの可溶性ＴＲＡＩＬドメインおよび抗体フラグメントなどの追加の機能ドメインとの、共投与を含む。US 2015/0337027、US 2009/0131317およびWO 2012/170640を参照されたい。この点において、Ｌ−アスパラギナーゼは、Ｂｃｌ−２／Ｂｃｌ−ｘＬ阻害剤ＡＢＴ２６３によって誘導された内因性アポトーシスおよびＬ−アスパラギナーゼ単一処置に対して耐性であるグリオーマ細胞におけるＴＲＡＩＬによって媒介された外因性アポトーシスの両方に対する耐性を克服することが示されている（Karpel-Massler, et al. (2016) Onco標的化 7(23):33512-28）。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
この発明は、配列番号１の３１、６３および２５４位の１以上でアミノ酸置換を有するエルウィニア・クリサンセミのＬ−アスパラギナーゼ（ＥｒＡ）変異体を提供する。いくつかの態様において、３１位でのアミノ酸置換は、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはトレオニンを含み、６３位でのアミノ酸置換は、グルタミン、アスパラギン、またはアスパラギン酸を含み、２５４位でのアミノ酸置換は、アスパラギンまたはグルタミンを含む。一定の態様において、ＥｒＡ変異体は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７に示されたアミノ酸配列を有する。理想的には、ＥｒＡ変異体は、最小で野生型ＥｒＡ酵素の７５％のＬ−アスパラギナーゼ反応速度（ｋｃａｔ）を、Ａｓｎについて２５０μＭ未満のＫｍを、野生型ＥｒＡ酵素の６０％未満のＬ−グルタミナーゼ反応速度（ｋｃａｔ）を、および／または、Ｇｌｎについて３ｍＭより大きいＫｍを示す。さらなる態様において、ＥｒＡ変異体は、ヒスチジンタグ、ＳＵＭＯタグ、アルブミン結合ドメイン、ＰＥＧ化、および／またはＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインをさらに含む。特定の態様において、ＴＲＡＩＬの可溶性ドメインは、ヒトＴＲＡＩＬの残基１１５〜２８１、例えばグリシンおよびセリンから選択される１〜８個のアミノ酸残基を含むペプチド結合基を介して互いに結合されているＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメイン、および／または、例えばグリシンおよびセリンから選択される１〜２０個のアミノ酸残基を含むペプチド結合基を介してＥｒＡ変異体に結合されているＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインを含む。いくつかの態様において、ＰＥＧ化は、７２、７６、７９、８４、８５、２０６、２１０、２１５、２１６、２３５、２３９、２４０、２６１、２６４、２６５、２６８、２６９、３１８、３２２位またはそれらの組み合わせの位置でシステイン残基を有するＥｒＡ変異体によって達成される。
【０００９】
発明は、ＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインに結合されたＬ−アスパラギナーゼから構成される融合タンパク質も提供する。いくつかの態様において、ＴＲＡＩＬの可溶性ドメインは、ヒトＴＲＡＩＬの残基１１５〜２８１を、例えばグリシンおよびセリンから選択される１〜８個のアミノ酸残基を含むペプチド結合基を介して互いに結合されているＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインを、および／または、例えばグリシンおよびセリンから選択される１〜２０個のアミノ酸残基を含むペプチド結合基を介してＥｒＡ変異体に結合されているＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインを含む。他の態様において、融合タンパク質のＬ−アスパラギナーゼは、エルウィニア・クリサンセミまたは大腸菌由来のＬ−アスパラギナーゼである。一定の態様において、Ｅ．クリサンセミのＬ−アスパラギナーゼ（ＥｒＡ）は、配列番号１の３１、６３および２５４位の１以上にアミノ酸置換を有する変異体である。さらに、融合タンパク質は、ヒスチジンタグ、ＳＵＭＯタグ、アルブミン結合ドメイン、および／またはＰＥＧ化をさらに含む。いくつかの態様において、ＰＥＧ化Ｌ−アスパラギナーゼは、７２、７６、７９、８４、８５、２０６、２１０、２１５、２１６、２３５、２３９、２４０、２６１、２６４、２６５、２６８、２６９、３１８、３２２位またはそれらの組み合わせの位置でシステイン残基を有するエルウィニア・クリサンセミ由来のＬ−アスパラギナーゼである。
【００１０】
ＥｒＡ変異体または融合タンパク質を含有する核酸分子、発現ベクター、宿主細胞および医薬組成物もまた提供され、処置を必要とする対象にＥｒＡ変異体または融合タンパク質の有効量を、任意にＴＲＡＩＬの安定な形態と組み合わせて投与することによって、がんを処置する方法もまた提供される。
図面の簡潔な説明
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ルシフェラーゼを発現するＬＯＵＣＹ（ヒトＴ−ＡＬＬ；図１Ａ）およびＳＵＰ−Ｂ１５（ヒトＢ−ＡＬＬ；図１Ｂ）細胞株を使用することにより、低減されたＬ−グルタミナーゼ活性を有するＬ−アスパラギナーゼがＡＬＬ動物のがん細胞の数を急速に減少させることを示す。
【００１２】
【図２】図２は、ＬＯＵＣＹ（ヒトＴ−ＡＬＬ）細胞を接種し、野生型およびＥｒＡ変異体（ＥｒＡ−Ｅ６３ＱおよびＥｒＡ−Ｅ６３Ｑ−Ｓ２５４Ｎ（ＥｒＡ−ＤＭ１））を投与した動物の体重減少が、Ｌ−グルタミナーゼ活性と相関し、ここで、より高いＬ−グルタミナーゼ活性は、より多くの体重減少をもたらしたことを示す。ＳＵＰ−Ｂ１５（ヒトＢ−ＡＬＬ）細胞を接種した動物についても同様な結果が得られた。体重減少は毒性の指標であるため、低Ｌ−グルタミナーゼＥｒＡ変異体で処置した動物の低減された体重減少は、これらの酵素が低減された毒性をもつことを示す。
【００１３】
【図３】図３は、エルウィニア・クリサンセミ（Ａ；UniProtエントリP06608；配列番号１）、Ｅ．カロトボーラ（E. carotovora）（Ｂ；UniProtエントリQ6Q4F4；配列番号８）、大腸菌（Ｃ；UniProtエントリP00805；配列番号９）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｄ；UniProtエントリO25424；配列番号１０）、ウォリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）（Ｅ；UniProtエントリP50286；配列番号１１）、およびキャビア・ポルセルス（Cavia porcellus）（モルモット）（Ｆ；UniProtエントリH0W0T5；配列番号１２）由来のＬ−アスパラギナーゼの配列アラインメントを示す。厳密に保存された残基は下線で示される。Ｌ−グルタミナーゼ活性を低減させる目的で変異誘発のために選択された４つの部位が示される。Ｅ．クリサンセミ、Ｅ．カロトボーラおよび大腸菌の酵素は、アラインメントに含まれていないＮ末端シグナルペプチドを含有する。モルモットの酵素については、そのＮ末端Ｌ−アスパラギナーゼドメイン中の残基のみが示される。
【００１４】
【図４】図４は、超低Ｌ−グルタミナーゼＥｒＡ−ＴＭ２変異体が、高Ｌ−グルタミナーゼＥｒＡ−ＷＴと同様に効果的にＴ−ＡＬＬ ＬＯＵＣＹ細胞を排除することを示す。４週間前にルシフェラーゼを発現するＬＯＵＣＹ細胞を尾静脈注射した雌マウスを、ビヒクル（ｎ＝３）、ＥｒＡ−ＷＴ（ｎ＝４）、およびＥｒＡ−ＴＭ（ｎ＝４）で１４日間毎日処置した（薬用量５０ＩＵ／マウス／日、腹腔内）。各群について、示された代表的な動物は、処置の０日目に最高の生物発光イメージングシグナルを有した。
【００１５】
【図５】図５は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）マウスモデルにおけるＴＲＡＩＬ三量体−ＥｒＡ−ＴＭ２融合タンパク質の抗がん活性を示す。
【００１６】
発明の詳細な説明
エルウィニア・クリサンセミのＬ−アスパラギナーゼ（ＥｒＡ）のＬ−グルタミナーゼ活性に起因する有毒な副作用は、ＥｒＡ酵素のアミノ酸残基３１、６３および２５４の１以上の変異によって減少され得ることが現在見出されている。さらに、Ｌ−アスパラギナーゼのin vivo循環時間は、ヒスチジンタグ、ＳＵＭＯタグ、および／またはアルブミン結合ドメインのＮまたはＣ末端付加によって増加され得る。さらに、Ｌ−アスパラギナーゼのＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインとの融合は、アポトーシスに必要なシグナルを提供すること（Ｌ−アスパラギナーゼ）、および、アポトーシスのプロセスを誘導すること（ＴＲＡＩＬ）の両方によって細胞死を促進することが現在実証されている。したがって、この発明は、Ａｓｎの外部供給の存在に依存するリンパ腫および白血病などのがんの処置における使用のための、Ｌ−アスパラギナーゼ変異体およびＬ−アスパラギナーゼを含有する融合タンパク質ならびにそれらの組み合わせを提供する。本Ｌ−アスパラギナーゼの改善された安全性は、現在の患者集団（例えば、小児ＡＬＬを有する患者）および他の患者集団（例えば、成人ＡＬＬ、ＡＭＬ、および他のがん）における長期にわたる使用に利益をもたらす。
【００１７】
当該技術分野で知られているように、Ｌ−アスパラギナーゼ（Ｌ−アスパラギンアミノヒドロラーゼ、E.C.3.5.1.1）は、Ａｓｎにおけるアミド結合をＡｓｐおよびアンモニアに加水分解するアミダーゼである（Kumar & Verma (2012) Asian J. Biochem. Pharma Res. 3:197-205）。この発明における使用のＬ−アスパラギナーゼは、動物、微生物または植物を含む任意の適切な生物から得ることができる。理想的には、Ｌ−アスパラギナーゼは、細菌、真菌、酵母、放線菌または藻類などの微生物から得られる。本Ｌ−アスパラギナーゼを得ることができる細菌種は、大腸菌（Cedar & Schwartz (1968) J. Bacteriol. 96:2043-8；UniProtエントリ P00805も参照されたい）、エルウィニア・カロトボーラ（Erwinia carotovora）（Kotzia & Labrou (2005) J. Bacteriol. 119:309-323）、シュードモナス・スツッツェリ（Pseudomonas stutzeri）（Manna, et al. (1995) Curr. Microbiol. 30:291-8）、シュードモナス・アシドボラス（Pseudomonas acidovoras）（Davis, et al. (1977) J. Bacteriol. 129:1379-86）、エルウィニア・アロイデ（Erwinia aroideae）（Peterson & Ciegler (1969) Appl. Microbiol. 18:64-7）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）（Pritsa, et al. (2001) Anticancer Drugs 12:137-42)、サーマス・アクアチカス（Thermus aquaticus）（Curran, et al. (1985) Arch. Biochem. Biophys. 241:571-6）、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）（Rozalska & Mikucki (1992) Acta Microbiol. Pol. 41:145-50)、ビブリオ・サクシノゲネス（Vibrio succinogenes）（Kafkewitz & Goodman (1974) Appl. Microbiol. 27:206-9）、シトロバクター・フリーディー（Citrobacter freundi）(Davison, et al. (1977) Biochim. Biophys. Acta 480:282-94)、プロテウス・ブルガリ（Proteus vulgaris）(Tosa, et al. (1972) J. Biochem. 11:217-22）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）（Pinheiro, et al. (2001) Biomater. Diagn. 6:243-4)、バシラス・サブティリス(Fisher & Wray (2002) J. Bacteriol. 184:2148-54)、バシラス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）（Golden & Bernlohr (1985) J. Bacteriol. 164:938-40)、バシラス・サーキュランス（Bacillus circulans）MTCC 8574（Hymavathi, et al. (2009) Appl. Biochem. Biotechnol. 159:191-98)、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）（Mukherjee, et al. (2000) Appl. Microbiol. Biotechnol. 53:180-4）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）(Khan, et al. (1970) Biochem. Biophys. Res. Commun. 41:525-33)、ウォリネラ・サクシノゲネス（UniProtエントリP50286を参照されたい）、ヘリコバクター・ピロリ（UniProtエントリO25424を参照されたい）、およびキャビア・ポルセルス（モルモット）（UniProtエントリH0W0T5を参照されたい）を含むが、これらに限定されない。アスペルギルス・タマリ（Aspergillus tamari）、アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、シロンドロカルポン・オブツシスポラム（Cylindrocarpon obtusisporum）、フザリウム・ローズム（Fusarium roseum）、フザリウム・サロニ（Fusarium saloni）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisae）、カンジダ・ユティリス（Candida utilis）、カンジダ・ギリエルモンディ（Candida guilliermondii）およびロドスポリジウム・トルロイド（Rhodosporodium toruloids）などの真菌および酵母種もまた、本L-アスパラギナーゼの供給源になり得る。
【００１８】
最も広く使用され、市販されているＬ−アスパラギナーゼは、大腸菌またはエルウィニア種に由来する。エルウィニア種のうち、Ｅ．クリサンセミおよびＥ．カロトボーラに由来する酵素が知られており、Ｅ．クリサンセミNCPPB 1066（UniProtKBアクセッション番号P06608を参照されたい）、Ｅ．クリサンセミ3937（GENBANKアクセッション番号AAS67028を参照されたい）、Ｅ．クリサンセミNCPPB 1125（GENBANKアクセッション番号CAA31239を参照されたい）、Ｅ．カロトボーラ亜種アトロセプチカ（atroseptica）（GENBANKアクセッション番号AAS67027またはUniProtKBアクセッション番号Q6Q4F4を参照されたい）およびＥ．カロトボーラ（GENBANKアクセッション番号AAP92666を参照されたい）から単離された酵素を含むが、これらに限定されない。したがって、ここで使用されるＬ−アスパラギナーゼは、大腸菌、Ｅ．クリサンセミまたはＥ．カロトボーラに由来することが好ましい。特に、Ｌ−アスパラギナーゼはＥ．クリサンセミから得られることが好ましい。一定の態様において、ここで使用されるＬ−アスパラギナーゼは、Ｎ末端のリーダー配列を欠き、Ｎ末端メチオニン残基を有する。例示的なＥ．クリサンセミのＬ−アスパラギナーゼは、配列番号１に示されたアミノ酸配列を有する。
【００１９】
「ＥｒＡ変異体」は、Ｌ−アスパラギナーゼ活性を示し、Ｌ−グルタミナーゼ活性を低減または減少させ、安定性を増加させ、および／または野生型ＥｒＡ酵素と比較したＥｒＡのin vivo循環時間を増加させる、少なくとも１つの変異または改変を含む、ＥｒＡ酵素の任意の天然に存在しない形態を指す。これと比較して、「野生型」Ｌ−アスパラギナーゼは、天然に存在する供給源から単離されたときの典型的なＬ−アスパラギナーゼの形態を指す。野生型は、天然の集団において最も頻繁に観察されるものであり、したがって、任意に正常または野生型の形態と呼ばれる。
【００２０】
ここで実証されるように、Ｅ．クリサンセミのＬ−アスパラギナーゼ（ＥｒＡ；配列番号１）の３１、６３および２５４位の１以上の変異は、低減または減少したＬ−グルタミナーゼ活性を有する酵素を提供する（表７を参照されたい）。特に、ＥｒＡ変異体のＬ−グルタミナーゼ活性は、野生型ＥｒＡ活性の、０％と６５％との間、０％と５０％との間、０％と３５％との間、０％と２５％との間、０％と２０％との間、０％と１５％との間、または０％と１０％との間まで低減される。理想的には、発明のＥｒＡ変異体は、野生型ＥｒＡ酵素のＬ−グルタミナーゼ反応速度（ｋｃａｔ）の６０％、５０％、４０％、３０％または２０％未満のＬ−グルタミナーゼｋｃａｔを示す。さらに、ＥｒＡ変異体は、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０ｍＭより大きい、ＧｌｎのＫｍを示すことが好ましい。特に、発明は、２〜１００ｍＭ、３〜１００ｍＭ、１０〜１００ｍＭ、または２０〜１００ｍＭの範囲でＧｌｎのＫｍを示すＥｒＡ変異体を含む。
【００２１】
ＥｒＡ変異体は、配列番号１の３１、６３および／または２５４位で変異を有するタンパク質を含む。したがって、ＥｒＡ変異体は、配列番号１の３１位、６３位、２５４位、３１および６３位、３１および２５４位、６３および２５４位、および３１、６３および２５４位で変異を含む。ＥｒＡ変異体タンパク質における変異は、Ａｌａ３１のイソロイシン、バリン、ロイシン、またはトレオニンによる置換、Ｇｌｕ６３のグルタミン、アスパラギン、またはアスパラギン酸による置換、および／またはＳｅｒ２５４のアスパラギンまたはグルタミンによる置換を含む。配列番号１の３１、６３および２５４位の１以上で変異を有する例示的なＥｒＡ変異体タンパク質は、配列番号２（Ｅ６３Ｑ）、配列番号３（Ｅ６３Ｑ−Ｓ２５４Ｎ）、配列番号４（Ａ３１Ｉ−Ｅ６３Ｑ）、配列番号５（Ｅ６３Ｑ−Ｓ２５４Ｑ）、配列番号６（Ａ３１Ｉ−Ｅ６３Ｑ−Ｓ２５４Ｑ）および配列番号７（Ａ３１Ｉ−Ｅ６３Ｑ−Ｓ２５４Ｎ）の下で提供される。
【００２２】
ＥｒＡに加えて、他のＬ−アスパラギナーゼにおける対応する位置での変異もまた作製され得る。用語「対応する」は、あるポリペプチド配列中の同等のアミノ酸を他のポリペプチド配列と比較、アラインメントまたは同定する文脈で使用されるとき、他のポリペプチド配列とアラインメントしたときに最も高いパーセントの同一性を生じる比較またはアラインメントを指す。例えば、Ｅ．カロトボーラ（UniProtエントリQ6Q4F4）由来のＬ−アスパラギナーゼにおけるＥｒＡの残基３１、６３および２５４の対応する位置は、配列番号８の２９、６１および２５２位に位置する。
【００２３】
有利なことに、この発明のＥｒＡ変異体は、野生型ＥｒＡのものに匹敵するＬ−アスパラギナーゼ活性を有する。特に、ＥｒＡ変異体は、野生型ＥｒＡ酵素の最小で７０％のＬ−アスパラギナーゼ反応速度（ｋｃａｔ）を示す。理想的には、ＥｒＡ変異体は、野生型ＥｒＡ酵素のｋｃａｔの５０〜１５０％、６０〜１４０％、７０〜１３０％、または８０〜１２５％の範囲でＬ−アスパラギナーゼｋｃａｔを示す。さらに、ＥｒＡ変異体は、２５０、２００、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０または４０μＭ未満のＡｓｎに対するＫｍを示すことが好ましい。特に、発明は、１０〜２５０μＭ、２０〜２００μＭ、３０〜１９０μＭ、または５０〜１５０μＭの範囲でＡｓｎに対するＫｍを示すＥｒＡ変異体を含む。
【００２４】
ここで開示されるＬ−アスパラギナーゼ（野生型アスパラギナーゼおよび融合タンパク質を含む）のin vivo循環時間を増加させるために、この発明は、変異体、特に、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ）、ＳＵＭＯタグ（ＳＵＭＯ）、アルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）、またはそれらの組み合わせを有するＥｒＡ変異体も提供する。Ｌ−アスパラギナーゼ変異体は、そのＣ末端および／またはＮ末端にヒスチジンタグ、ＳＵＭＯタグおよび／またはアルブミン結合ドメインを含み得る。例として、Ｌ−アスパラギナーゼ変異体は、ＳＵＭＯ−アスパラギナーゼ−ＡＢＤ、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−ＡＢＤ−アスパラギナーゼ、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−アスパラギナーゼ−ＡＢＤ、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−アスパラギナーゼ、Ｈｉｓ−ＡＢＤ−アスパラギナーゼ、ＡＢＤ−アスパラギナーゼ、ＡＢＤ−ＳＵＭＯ−アスパラギナーゼなどのＮ→Ｃ末端構造を有し得る。Ｈｉｓ、ＳＵＭＯまたはＡＢＤをコードする核酸は、Ｌ−アスパラギナーゼをコードする核酸の５’または３’のいずれかにインフレームで挿入され得、それにより融合タンパク質を作製することができる。
【００２５】
理想的には、ヒスチジンタグ、ＳＵＭＯタグ、アルブミン結合ドメイン、またはそれらの組み合わせの１以上の包含は、Ｌ−アスパラギナーゼのin vivo循環時間を著しく増加させる。代替的に言えば、変異体は、同等のタンパク質用量で投与される野生型Ｌ−アスパラギナーゼよりも長いｔ１／２を有する。ここで使用される場合、用語「ｔ１／２」または「半減期」は、Ｌ−アスパラギナーゼまたはその変異体または融合タンパク質の濃度がin vitroまたはin vivoで（例えば哺乳動物における注射後に）半減するのに必要な時間を指す。特に、変異体は、約５０μｇ／ｋｇの用量（タンパク質含量基準）で、少なくとも約５０、５２、５４、５６、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４または６５時間のｔ１／２を有する。代替的には、変異体は、約１０μｇ／ｋｇの用量で（タンパク質含量基準）、少なくとも約３０、３２、３４、３６、３７、３８、３９、または４０時間のｔ１／２を有する。他の態様において、変異体は、約１０，０００〜約１５，０００ＩＵ／ｍ２（約２０〜３０ｍｇタンパク質／ｍ２）の範囲に及ぶ用量で、少なくとも約１００〜約２００時間のｔ１／２を有する。Ｌ−アスパラギナーゼの有効性が薬のin vivo半減期に関連することを考えると、この発明の変異体は、白血病およびリンパ腫などのがんの処置に特に有用である。
【００２６】
ここで使用される場合、「ヒスチジンタグ」は、少なくとも６つのヒスチジン（Ｈｉｓ）残基から構成されるアミノ酸モチーフを指す。ヒスチジンタグは、６（ヘキサヒスチジンタグ、６×Ｈｉｓタグ、またはＨｉｓ６タグ）、７、８、９、１０、または２０のヒスチジン残基までのポリヒスチジンを含む。
【００２７】
「ＳＵＭＯタグ」は、目的のタンパク質の溶解性／安定性を増強するための、ＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）タンパク質の目的のタンパク質との融合を指す。ＳＵＭＯタグの包含は、CHAMPION pET SUMO expression system（Invitrogen）、EXPRESSO T7 SUMO cloning and expression system（Lucigen）、またはpET His6 SUMO TEV LIC cloning vector（Addgene）などの既知の発現系を使用して達成され得る。ＳＵＭＯタグに加えて、Ｕｂ、Ｒｕｂ１、Ｈｕｂ１、ＩＳＧ１５、Ｕｂｉ−Ｌ（ＭＮＳＦ）、ＦＡＴ１０、Ａｐｇ１２、Ａｐｇ８およびＵｒｍ１を含むが、これらに限定されない、他のＵｂｌタンパク質が使用され得ることが企図される（Larsen & Wang (2002) J. Proteome Res. 1(5):411-9）。US 7,655,413（参照によりその全体がここに組み込まれる）も参照されたい。
【００２８】
「アルブミン結合ドメイン」は、in vivoまたはin vitroでアルブミンに結合し、治療剤の血清半減期および生体内分布を増強するポリペプチドを指す。アルブミンは、任意の動物種、例えばヒト、サル、またはげっ歯類に由来し得る。アルブミン結合ドメインは、例えば、US 6,267,964、WO 1991/19741、WO 2005/097202、WO 2001/45746、WO 2013/043071およびUS 2004/0001827に記載されている。さらに、US 9,156,887は、この発明で使用され得る非天然のアルブミン結合ドメインを開示している。いくつかの態様において、アルブミン結合ドメインは、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５に示されたアミノ酸配列を有する。
【００２９】
ここで開示されるＬ−アスパラギナーゼ（野生型Ｌ−アスパラギナーゼ、ＥｒＡ変異体および融合タンパク質を含む）のＰＥＧ化もまた、in vivo循環時間を増加させるために使用され得る。用語「ＰＥＧ化され」または「ＰＥＧ化」は、Ｌ−アスパラギナーゼのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とのコンジュゲーションを指す。ＰＥＧは、化学的方法を介してＰＥＧ鎖の末端のヒドロキシ基を通じて活性剤に結合（例えば、共有結合）され得る。発明のＬ−アスパラギナーゼをＰＥＧ化するために使用され得るＰＥＧ化の方法は、例えば、US 4,179,337、US 5,766,897、US 2002/0065397、およびUS 2009/0054590に提供されている。代替的に、ここに開示されるように、Ｌ−アスパラギナーゼは、アミノ酸置換によってＬ−アスパラギナーゼのアミノ酸配列中に導入される１個と５個との間のシステイン残基の部位特異的なＰＥＧ化によってＰＥＧ化され得る。例６を参照されたい。いくつかの態様において、Ｌ−アスパラギナーゼは、７２、７６、７９、８４、８５、２０６、２１０、２１５、２１６、２３５、２３９、２４０、２６１、２６４、２６５、２６８、２６９、３１８、３２２位またはそれらの組み合わせの位置でシステイン残基を有するＥ．クリサンセミ由来のＬ−アスパラギナーゼ（野生型、変異体または融合タンパク質）である。特定の態様において、この発明のＬ−アスパラギナーゼのＰＥＧ化は、野生型Ｌ−アスパラギナーゼ（例えば、配列番号１のＥｒＡ）、Ｌ−アスパラギナーゼ変異体（例えば、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６または配列番号７の変異体）、またはその融合タンパク質のＡｓｐ８４のシステインによる置換によって達成され、それによって、マレイミドベースのＬ−アスパラギナーゼのＰＥＧ化に特異的な部位を提供する。
【００３０】
ここに開示されるＬ−アスパラギナーゼ（すなわち、野生型およびＥｒａ変異体）の増強された細胞傷害活性は、Ｌ−アスパラギナーゼをＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインにコンジュゲートまたは融合させることによって、またはＬ−アスパラギナーゼをＴＲＡＩＬの安定な形態とともに共投与することによって達成され得る。ここで実証されるように、得られた融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインを欠くＬ−アスパラギナーゼと比較して、ＩＣ５０値の少なくとも２５倍の減少を提供することが見出された。したがって、ここに開示される融合タンパク質は、がん、特にＬ−アスパラギナーゼに非感受性のがんの処置に特に有用である。
【００３１】
「融合タンパク質」は、非天然の様式で作動可能に結合されたタンパク質またはタンパク質フラグメント（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼまたはその変異体）を含有するキメラタンパク質を指す。この発明の融合タンパク質によれば、ＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメイン（ＴＲＡＩＬ三量体）は、Ｌ−アスパラギナーゼ（例えば、エルウィニア・クリサンセミまたは大腸菌のＬ−アスパラギナーゼ）またはその変異体（例えば、ＥｒＡ変異体）とインフレームで融合される。融合タンパク質は、そのＣ末端またはＮ末端でＴＲＡＩＬを含み得る。例として、融合タンパク質は、ＴＲＡＩＬ−アスパラギナーゼまたはアスパラギナーゼ−ＴＲＡＩＬのＮ→Ｃ末端構造を有し得る。タグまたは改変と組み合わせて使用されるとき、融合タンパク質は、ＳＵＭＯ−ＴＲＡＩＬ−アスパラギナーゼ−ＡＢＤ、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−ＡＢＤ−ＴＲＡＩＬ−アスパラギナーゼ、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−ＴＲＡＩＬ−アスパラギナーゼ−ＡＢＤ、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯアスパラギナーゼ−ＴＲＡＩＬ、Ｈｉｓ−ＡＢＤ−ＴＲＡＩＬ−アスパラギナーゼ、ＡＢＤ−アスパラギナーゼ−ＴＲＡＩＬ、ＡＢＤ−ＳＵＭＯ−ＴＲＡＩＬ−アスパラギナーゼなどの構造を有し得る。ＴＲＡＩＬ、特にＴＲＡＩＬ三量体をコードする核酸は、Ｌ−アスパラギナーゼをコードする核酸の５’または３’のいずれかにインフレームで挿入され得、それによって融合タンパク質を作製する。
【００３２】
好ましくは、ＴＲＡＩＬの可溶性ドメインは、哺乳動物、特に、対立遺伝子変異体および／またはその誘導体を含むヒトＴＲＡＩＬに由来する。可溶性ドメインは、膜局在化ドメインなしの受容体結合ドメインを含むＴＲＡＩＬの細胞外部分を含む。ＴＮＦスーパーファミリーの他のタンパク質と同様に、ＴＲＡＩＬは、１５〜３０アミノ酸のＮ末端部分、いわゆるストーク領域を介して膜に固定される。ストーク領域は、三量体化に寄与し、細胞膜に対して一定の距離を提供する。しかしながら、ストーク領域は受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）の部分ではない。したがって、可溶性ＴＲＡＩＬドメインは、ストーク領域由来の任意のアミノ酸を欠くＴＲＡＩＬの受容体結合ドメインを含むことが好ましい（US 2015/0337027を参照されたい）。
【００３３】
可溶性ＴＲＡＩＬドメインは、配列番号１６に示されたヒトＴＲＡＩＬに由来し得る。好ましくは、可溶性ＴＲＡＩＬドメインは、特にアミノ酸１１５〜１２２から出発するヒトＴＲＡＩＬに由来し、配列番号１６のアミノ酸残基１１５〜２８１、１２０〜２８１、１２１〜２８１または１２２〜２８１を含む。一定の態様において、各々のＴＲＡＩＬの可溶性ドメイン三量体は、ヒトＴＲＡＩＬ（配列番号１６）の残基１１５〜２８１から構成される。ヒトＴＲＡＩＬの残基１１５〜２８１は、ここで配列番号１７に示されている。
【００３４】
細胞死受容体結合ＴＲＡＩＬドメインの誘導体および変異体はすべて企図されており、それらのアミノ酸配列を置換、付加および／または欠失／切断によって変更することによって、または、機能的に同等のポリペプチドをもたらす化学的改変を導入することによって作製され得る。任意のポリペプチドの配列中の一定のアミノ酸が、ポリペプチドの活性に悪影響を及ぼすことなく他のアミノ酸に置換され得ることは、当業者に理解されるであろう。
【００３５】
ここで開示されるＴＲＡＩＬドメインは、開示される配列中の１以上のアミノ酸の置換を含む。当業者は、周知の技術を使用して、ここに示されるペプチドの好適な配列変異体を決定し得るであろう。一定の態様において、当業者は、活性にとって重要でないと考えられる領域を標的化することによって、活性を破壊することなく変化し得る分子の好適な領域を同定し得る。他の態様において、当業者は、同様なポリペプチド間で保存されている分子の残基および部分を同定し得る。さらなる態様において、生物学的活性または構造にとって重要なアミノ酸残基さえも、その生物学的活性を破壊することなく、またはペプチド構造に悪影響を及ぼさずに、保存的アミノ酸置換を受け得る。
【００３６】
３つのＴＲＡＩＬの可溶性ドメインは、好ましくは、１〜８個のアミノ酸残基から構成されるペプチド結合基を介して互いに連結される。同様に、ＴＲＡＩＬ三量体は、１〜２０個のアミノ酸残基から構成されるペプチド結合基を介してＬ−アスパラギナーゼに結合されていることが好ましい。用語「ペプチド結合基」または「リンカー」は、２つの異なる分子を一緒に作動可能に結合する分子架橋として作用するペプチド部分を指すことを意味する。望ましくは、この発明のリンカーは、グリシンまたはセリン、またはそれらの組み合わせから構成される。特定の態様において、各々のＴＲＡＩＬの可溶性ドメイン三量体は、好ましくは、単一のグリシンまたは単一のセリン残基によって互いに結合される。３つの可溶性ＴＲＡＩＬドメインの間の単一のグリシン残基を含む、例示的なＴＲＡＩＬ三量体は、ここで配列番号１８に示される。ＴＲＡＩＬ三量体とＬ−アスパラギナーゼとの間に位置するペプチド結合基に関して、このリンカーは柔軟なリンカーであることが望ましい。柔軟なリンカーは、好ましくは、１〜２０のアミノ酸残基の長さ、特に６、９、１２、１５または１８のアミノ酸残基の長さを有する。柔軟なリンカーは、好ましくは、グリシン／セリンリンカー、すなわち主にグリシンおよびセリンのアミノ酸から構成されるペプチドリンカーである。特定の態様において、ＴＲＡＩＬ三量体とＬ−アスパラギナーゼとの間のリンカーは、（ＧＧＧＳ）ｎリンカー（配列番号１９）であり、ここで、ｎは１〜４である、または、例えばＧＧＧＳ（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２０）、ここで、ｎは１〜４である、を含むその順列である。一定の態様において、ＴＲＡＩＬ三量体とＬ−アスパラギナーゼとの間のリンカーは、配列番号２１に示されたアミノ酸配列を有する。３つの可溶性ＴＲＡＩＬドメインの間に単一のグリシン残基を、ＴＲＡＩＬ三量体とＬ−アスパラギナーゼとの間にグリシン／セリンリンカーを含むＴＲＡＩＬ三量体を有する例示的なＴＲＡＩＬ三量体−ＥｒＡ変異体（ＴＭ２）融合タンパク質は、ここで配列番号２２に示される。
【００３７】
ＴＲＡＩＬの安定な形態は、三量体化を促進するＴＲＡＩＬの形態を指すことが意図される。特に、ＴＲＡＩＬの三量体化を促進するために、小さな三量体化ドメインであるＦＯＬＤＯＮ配列（ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ；配列番号３１）は、ＴＲＡＩＬの安定性および生物学的活性を３７℃で少なくとも４８時間維持することが示されている（Kouno, et al. (2013) J. Invest. Dermatol. 133(9):2212-2220）。したがって、ＦＯＬＤＯＮペプチドは、Ｈｉｓ−ＳＵＭＯタグとＴＲＡＩＬのＮ末端との間に挿入されてＨｉｓ−ＳＵＭＯ−ＦＯＬＤＯＮ−ＴＲＡＩＬ融合タンパク質をもたらす。融合タンパク質は発現させ、細菌培養において＞１０ｍｇ／Ｌの融合タンパク質の収量が得られた。タンパク質は極めて安定しており、ＦＯＬＤＯＮの包含が、ＴＲＡＩＬの安定な形態をもたらすことを示した。したがって、Ｌ−アスパラギナーゼの細胞傷害活性を増強するために、ＴＲＡＩＬの安定な形態は、Ｌ−アスパラギナーゼとともに医薬組成物中に共投与および／または組み合わせられ得る。
【００３８】
ＴＲＡＩＬおよびＴＲＡＩＬ−アスパラギナーゼ融合タンパク質の安定な形態は、ヒスチジンタグ、ＳＵＭＯタグ、アルブミン結合ドメイン、ＰＥＧ化、またはそれらの組み合わせを含むようにさらに改変され得る。Ｎ末端にポリヒスチジンタグおよびＳＵＭＯタグをさらに含む例示的なＴＲＡＩＬ−ＥｒＡ変異体（ＴＭ２）融合タンパク質は、ここで配列番号２３に示される。さらに、例示的なＴＲＡＩＬの安定な形態は、構造：Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ−ＦＯＬＤＯＮ−ＴＲＡＩＬを有し得る。
【００３９】
ここで開示される変異体および融合タンパク質は、従来の組み換えタンパク質技術によって容易に調製され得、ここで、組み換え宿主細胞は、変異体または融合タンパク質をコードする核酸分子を含む発現コンストラクトまたはベクターによって形質転換または形質導入され、組み換え宿主細胞は、好適な条件下で増殖させて変異体または融合タンパク質の発現を提供し、続いて変異体または融合タンパク質は単離され、任意には精製されてもよい。したがって、この発明は、ＥｒＡ変異体（すなわち、配列番号１の３１、６３および２５４位の１以上にアミノ酸置換を有し、および／または、ヒスチジンタグ、ＳＵＭＯタグ、アルブミン結合ドメイン、またはそれらの組み合わせを含むＥｒＡ）、または融合タンパク質（すなわち、ＴＲＡＩＬの３つのタンデム可溶性ドメインに結合されたＬ−アスパラギナーゼ）、ならびにそれらを含有する発現カセットおよび／または発現ベクターをコードする核酸分子も提供する。理想的には、発現カセットおよび発現ベクターは、目的の宿主細胞における発現を促進するために必要な調節配列（例えば、プロモーター、ターミネーターなど）を含有する。ＥｒＡ変異体または融合タンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞もまた、この発明の範囲内に含まれる。宿主細胞は、真核細胞（例えば、哺乳動物、真菌または酵母細胞）または原核細胞（例えば、大腸菌）を含み得る。
【００４０】
発明のＥｒＡ変異体および／または融合タンパク質は、生産および単離／精製後、薬学的に許容可能な賦形剤を含有する医薬組成物としてそのまま使用され得、または処方され得る。ここで提供される医薬組成物は、固体または液体の形態での静脈内投与用または静脈内注射用に特別に処方され得る。最適な医薬組成物は、例えば、意図される投与経路、送達形態、および所望の投与量に依存して、当業者によって決定され得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（第19版、1995）を参照されたい。
【００４１】
ＥｒＡ変異体および／または融合タンパク質は、注射可能な処方などの従来の全身投与形態に組み込まれ得る。投与形態は、必要な生理学的に許容可能な担体材料、賦形剤、潤滑剤、バッファー、界面活性剤、抗菌剤、（マンニトールなどの）増量剤、抗酸化剤（アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）なども含み得る。
【００４２】
医薬組成物中の主な担体または賦形剤は、性質上水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、好適な担体または賦形剤は、注射用水、生理食塩水または人工脳脊髄液であり得、場合によっては、非経口投与のための組成物に一般的な他の材料で補充され得る。中性緩衝食塩水または血清アルブミンと混合された食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓバッファー、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸バッファーを含み得、ソルビトールまたはそのための好適な代替物をさらに含み得る。発明の医薬組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥された固体（cake）または水溶液の形態の任意の処方剤と混合することによって、保存用に調製され得る（Remington's Pharmaceutical Sciences, Id.）。さらに、発明のＥｒＡ変異体または融合タンパク質は、スクロースまたはグリシンなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として処方され得る。
【００４３】
発明のＥｒＡ変異体、融合タンパク質、または医薬組成物の投与経路は、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内の経路による注射；徐放性システムまたは移植デバイスによるものを含む。組成物は、ボーラス注射によって投与され得、または、注入または移植デバイスによって連続的に投与され得る。組成物はまた、所望の分子が吸収または封入された膜、スポンジまたは別の適切な材料の移植を介して局所的に投与され得る。移植デバイスが使用される場合、デバイスは、任意の好適な組織または器官に移植され得、所望の分子の送達は、放散、徐放ボーラス、または連続投与を介するものであり得る。
【００４４】
発明の組成物は、非経口的に送達され得る。非経口投与が企図されるとき、この発明における使用のための治療上の組成物は、薬学的に許容可能なビヒクル中で発明のスクリーニング方法で同定された所望の化合物を含む発熱物質を含まない非経口的に許容可能な水溶液の形態であり得る。非経口注射のための特に好適なビヒクルは、発明のスクリーニング方法で同定された化合物が適切に保存された滅菌等張溶液として処方される滅菌蒸留水である。調製には、注射可能なマイクロスフィア、生体分解可能な粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸など）、ビーズまたはリポソームなどの剤との、所望の分子の処方が関与し得、これは、産物の制御または徐放を提供し得、次いでデポー注射を介して送達され得る。ヒアルロン酸による処方は、循環における持続期間を促進する効果を有する。移植可能な薬送達デバイスを使用して、所望の分子を導入し得る。
【００４５】
組成物はまた、吸入のために処方され得る。これらの態様において、ＥｒＡ変異体または融合タンパク質は、吸入のための乾燥粉末として処方されるか、または吸入溶液はまた、噴霧などによるエアロゾル送達のための噴射剤とともに処方され得る。肺投与は、化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載するWO 1994/020069にさらに記載されている。
【００４６】
発明の組成物は、経口などの消化管を通じて送達され得る。かかる薬学的に許容可能な組成物の調製は、当業者の知識の範囲内である。この様式で投与される発明のＥｒＡ変異体または融合タンパク質は、錠剤およびカプセルなどの固体剤形の調合において慣用的に使用される担体を用いて、または用いずに処方され得る。カプセルは、バイオアベイラビリティが最大化され、全身の（pre-systemic）分解が最小化されるときに、胃腸管中の点で処方の活性部分を放出するように設計され得る。ここで開示される発明のペプチドの吸収を促進するために、追加の剤が含まれ得る。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤が用いられ得る。
【００４７】
これらの組成物はまた、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの様々な抗菌剤および抗真菌剤の包含によって確実にされ得る。また、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことは望ましいものであり得る。注射可能な医薬形態の延長された吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅らせる剤の包含によってもたらされ得る。
【００４８】
発明のＥｒＡ変異体および／または融合タンパク質は、アスパラギンの枯渇によって処置可能な疾患または状態の処置に特に有用である。したがって、この発明はまた、処置を必要とする対象にＥｒＡ変異体または融合タンパク質の有効量を投与することによって、疾患、特にがんを処置するための方法を提供する。ここで使用される「有効量」は、（ａ）障害の重篤度を低減すること；（ｂ）処置される障害（単数または複数）に特徴的な症状の発症を限定または防止すること；（ｃ）処置される障害（単数または複数）に特徴的な症状の悪化を阻害すること；（ｄ）障害を以前に有していた患者における障害（単数または複数）の再発を限定または防止すること；（ｅ）以前に障害（単数または複数）の徴候があった患者の症状の再発を限定または防止すること；（ｆ）疾患または障害の発生後の死亡率の低減；（ｇ）治癒；および（ｈ）疾患の予防という意図された目的を達成するのに十分な活性成分の量を指す。各々の個々の場合における有効量は、当該技術分野において確立された方法にしたがって当業者によって経験的に決定され得る。発明の文脈で使用される場合、「投与する」は、個体へのin vivo投与、ならびに細胞または組織へのin vitroまたはex vivo直接投与を含む。ＥｒＡ変異体または融合タンパク質の有効量は、一般に、アポトーシスを誘導し、対象のがん細胞または腫瘍において循環するＬ−アスパラギンを低減させ得るものである。臨床医は、最適な治療上の効果を得るために投与量または投与経路を力価測定し得る。
【００４９】
一定の態様において、ＥｒＡ変異体または融合タンパク質は、成人および小児の両方における急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）ならびにアスパラギン枯渇が有用な効果を有することが期待される他の状態の処置における使用のための医薬品の処置または製造において有用である。かかる状態は、血液悪性腫瘍、非ホジキンリンパ腫、ＮＫリンパ腫、膵臓がん、ホジキン病、急性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、慢性リンパ性白血病、リンパ肉腫、細網肉腫、および黒色肉腫を含むが、これらに限定されない、悪性腫瘍またはがんを含むが、これらに限定されない。アスパラギン枯渇に応答する代表的な非悪性血液疾患は、免疫システムに媒介される血液疾患（例えば、ＨＩＶ感染によって引き起こされるもの（すなわち、ＡＩＤＳ）などの感染疾患）を含む。アスパラギン依存症に関連する非血液疾患は、自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ、ＳＬＥ、自己免疫、コラーゲン血管疾患、ＡＩＤＳなど）を含む。他の自己免疫疾患は、骨関節炎、アイザックス症候群、乾癬、インスリン依存性真性糖尿病、多発性硬化症、硬化性全脳炎、全身性エリテマトーデス、リウマチ熱、炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎およびクローン病）、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、糸球体腎炎、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、およびグレーブス病を含む。特定の態様において、ＥｒＡ変異体または融合タンパク質は、非ホジキンリンパ腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、およびヘアリー細胞白血病の処置において使用される。
【００５０】
疾患を引き起こすことが疑われる細胞は、任意の好適なin vitroまたはin vivoアッセイ（例えば、増殖培地がアスパラギンを欠いているin vitroアッセイ）においてアスパラギン依存性について試験され得る。したがって、一側面において、発明は、発明のコンジュゲートの有効量を患者に投与することを含む、患者において処置可能な疾患を処置する方法に関する。特定の態様において、疾患はＡＬＬである。特定の態様において、アスパラギン枯渇により処置可能な疾患の処置において使用されるＥｒＡ変異体または融合タンパク質は、エルウィニア種、より具体的にはエルウィニア・クリサンセミに由来するＬ−アスパラギナーゼを含む。
【００５１】
ＥｒＡ変異体または融合タンパク質は、１週間に約３回から１ヶ月に約一度までの範囲に及ぶスケジュール、典型的には、１週間に一度または隔週に一度、単一剤（例えば、単剤治療）として、または、グルココルチコイド、コルチコステロイド、抗がん化合物、または他の剤（メトトレキサート、デキサメタゾン、プレドニゾン、プレドニゾロン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、およびアントラサイクリンを含むが、これらに限定されない）を含むがこれらに限定されない化学治療薬の組み合わせの部分として、投与され得る。一例として、ＡＬＬを有する患者は、誘導、強化または増強、および維持を含む３つの化学治療の段階の間に、多剤化学治療の成分として、発明のＥｒＡ変異体または融合タンパク質を投与されるであろう。特定の例において、ＥｒＡ変異体または融合タンパク質は、アスパラギン合成酵素阻害剤と共に投与されない（例えば、WO 2007/103290を参照されたい）。別の特定の例において、ＥｒＡ変異体または融合タンパク質は、アスパラギン合成酵素阻害剤と共に投与されないが、他の化学治療薬と共に投与される。ＥｒＡ変異体または融合タンパク質は、多剤化学治療レジメンの部分として、他の化合物の前、後、または同時に投与され得る。
【００５２】
特定の態様において、方法には、約１Ｕ／ｋｇ〜約１０００Ｕ／ｋｇの量で発明のＥｒＡ変異体または融合タンパク質を投与することが関与する。より特定の態様において、ＥｒＡ変異体または融合タンパク質は、約２０、５０、６０、７０、１００、２００、３００、４００、５００および６００Ｕ／ｋｇからなる群から選択される量で投与される。別の特定の態様において、ＥｒＡ変異体または融合タンパク質は、約１０００ＩＵ／ｍ２〜約２００００ＩＵ／ｍ２の範囲に及ぶ用量（例えば、１０００ＩＵ／ｍ２、２０００ＩＵ／ｍ２、３０００ＩＵ／ｍ２、４０００ＩＵ／ｍ２、５０００ＩＵ／ｍ２、６０００ＩＵ／ｍ２、７０００ＩＵ／ｍ２、８０００ＩＵ／ｍ２、９０００ＩＵ／ｍ２、１００００ＩＵ／ｍ２、１１０００ＩＵ／ｍ２、１２０００ＩＵ／ｍ２、１３０００ＩＵ／ｍ２、１４０００ＩＵ／ｍ２、１５０００ＩＵ／ｍ２、１６０００ＩＵ／ｍ２、１７０００ＩＵ／ｍ２、１８０００ＩＵ／ｍ２、１９０００ＩＵ／ｍ２、または２００００ＩＵ／ｍ２）で投与される。別の特定の態様において、ＥｒＡ変異体または融合タンパク質は、約３日〜約１０日（例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０日）の期間、単一投与で、検出不能なレベルまでＡｓｎを枯渇させる用量で投与される。別の態様において、方法には、野生型Ｌ−アスパラギナーゼと比較して単一投与後により長いin vivo循環半減期を有する発明のＥｒＡ変異体または融合タンパク質を投与することが関与する。
【００５３】
以下の非限定的な例は、本発明をさらに説明するために提供される。
【００５４】
例１：材料および方法
ＥｒＡ遺伝子クローニングおよび変異誘発。最初の２１アミノ酸残基のシグナルペプチドを欠いているＥｒＡ（UniProtエントリP06608）のアミノ酸配列に対応するコドン最適化合成遺伝子を、以前に記載されたようにGenscriptにより合成した（Schalk, et al. (2014) J. Biol. Chem. 289:33175-33186）。合成遺伝子をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ−ＨＦ制限酵素で消化し、ゲル精製し、Instant Sticky End DNA ligase（New England Biolabs）を使用してＨｉｓ６−ＳＵＭＯ−ｐＥＴ１４ｂベクター（ここで、Ｈｉｓ６タグの後に酵母タンパク質ＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子、Ｓｍｔ３ｐ）がある）に連結し、Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯ−ＥｒＡ−ＷＴプラスミドを生成した。このプラスミドを、その後、以下の１３種のＥｒＡ単一変異体を作製するためのテンプレートとして使用した：Ａｌａ３１Ｓｅｒ（Ａ３１Ｓ）、Ａｌａ３１Ｉｌｅ（Ａ３１Ｉ）、Ａｌａ３１Ｌｅｕ（Ａ３１Ｌ）、Ａｌａ３１Ｍｅｔ（Ａ３１Ｍ）、Ａｌａ３１Ａｓｎ（Ａ３１Ｎ）、Ａｌａ３１Ｔｈｒ（Ａ３１Ｔ）、Ａｌａ３１Ｖａｌ（Ａ３１Ｖ）、Ｇｌｕ６３Ｌｅｕ（Ｅ６３Ｌ）、Ｇｌｕ６３Ｇｌｎ（Ｅ６３Ｑ）、Ｐｒｏ１２３Ｓｅｒ（Ｐ１２３Ｓ）、Ｐｒｏ１２３Ａｓｎ（Ｐ１２３Ｎ）、Ｓｅｒ２５４Ａｓｎ（Ｓ２５４Ｎ）、Ｓｅｒ２５４Ｐｒｏ（Ｓ２５４Ｐ）。次いで変異体Ｅ６３Ｑを有するプラスミドをテンプレートとして使用してＥｒＡ二重変異体（Ａ３１Ｔ−Ｅ６３Ｑ、Ａ３１Ｉ−Ｅ６３Ｑ、Ｓ２５４Ｎ−Ｅ６３ＱおよびＳ２５４Ｑ−Ｅ６３Ｑ）を作製し、他方で変異体Ｓ２５４Ｎを使用して２つの他の二重変異体（Ａ３１Ｉ−Ｓ２５４ＮおよびＡ３１Ｔ−Ｓ２５４Ｎ）を生成した。二重変異体Ａ３１Ｉ−Ｅ６３Ｑを有するプラスミドをテンプレートとして使用して２つの三重変異体（Ａ３１Ｉ−Ｅ６３Ｑ−Ｓ２５４ＮおよびＡ３１Ｉ−Ｅ６３Ｑ−Ｓ２５４Ｑ）を作製した。
【００５５】
ＥｒＡタンパク質の発現および精製。タンパク質の発現および精製は以前に記載されたように行った（Schalk, et al. (2014) J. Biol. Chem. 289:33175-33186）。簡潔には、野生型ＥｒＡ（ＥｒＡ−ＷＴ）または変異挿入（シーケンシングにより確認された）に対応するプラスミドを発現のために大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃ４１細胞に形質転換した。単一のコロニーを拾い、２ｘＹＴ培地で３７℃で増殖させた。培養物が０．６〜０．８の光学密度（６００ｎｍ）に達したときに、０．３ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）でタンパク質発現を誘導した。次いで、インキュベーション温度を低減し、１８℃で次の１２時間維持した。細胞を超音波処理により破壊し、破片を４℃で２０，０００ｇで３０分間遠心分離することによって除去した。上清を５ｍＬのHISTRAP nickel affinity column（GE Healthcare）に充填した。その後、カラムを２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、および２５、５０および７５ｍＭのイミダゾールからなるバッファーで洗浄した。結合したタンパク質を同じバッファー（ただし５００ｍＭのイミダゾールを含有）で溶出した。Ｎ末端Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯタグをＳＵＭＯプロテアーゼで切断し、タンパク質溶液をニッケルアフィニティーカラムに戻してタグを分離した。精製された酵素を含有するフロースルー画分を２５ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５、１００ｍＭのＮａＣｌに透析し、２０〜８０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、分注し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。
【００５６】
ＴＲＡＩＬ遺伝子のクローニングおよび変異誘発。ヒトＴＲＡＩＬ（UniProtエントリP50591）の３つの反復を含有する（大腸菌におけるタンパク質発現のためにコドン最適化された）合成遺伝子をGenscriptにより合成した。各反復は、ＴＲＡＩＬ（配列番号１７）のアミノ酸残基１１５〜２８１を含んでいた。単一のグリシンまたは単一のセリン残基を、第１および第２の反復と第２および第３の反復の間に挿入した。さらに、ＧＧＧＳ（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（配列番号２１）をコードする５７ｂｐのオリゴヌクレオチド（５’−ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＣＴ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＡＧＣ ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＧＡ ＧＧＧ ＴＣＧ−３’；配列番号２４）を、制限部位ＢｇｌＩＩＩとＮｄｅＩとの間の第３の反復の末端に付加した。得られた遺伝子をｐＵＣ５７ベクターに挿入した。
【００５７】
部位特異的な変異誘発およびプライマーＨａｎｏ−２０３：５’−ＣＧＡ ＡＴＧ ＣＡＴ ＣＴＡ ＧＡＴ ＣＴＣ ＧＡＧ ｃｇｔ ｇａｇ ｃｇｔ ｇ−３’（配列番号２５）およびＨａｎｏ−２０４：５’−ｃａｃ ｇｃｔ ｃａｃ ｇＣＴ ＣＧＡ ＧＡＴ ＣＴＡ ＧＡＴ ＧＣＡ ＴＴＣ Ｇ−３’（配列番号２６）を使用して、ＢｇｌＩＩＩ−ＴＲＡＩＬ１−Ｇ−ＴＲＡＩＬ２−Ｇ−ＴＲＡＩＬ３−リンカー−ＮｄｅＩを含有するベクターｐＵＣ５７のユニークなＢｇｌＩＩＩ部位をＸｈｏＩ部位に改変してサブクローニングを促進した。次いで、得られたプラスミドをＸｈｏＩおよびＮｄｅＩ制限酵素で消化し、ゲル精製して二重消化し精製した挿入物ＸｈｏＩ−ＴＲＡＩＬ１−Ｇ／Ｓ−ＴＲＡＩＬ２−Ｇ／Ｓ−ＴＲＡＩ１３−リンカー−ＮｄｅＩを生成した。
【００５８】
ＥｒＡのＡ３１Ｉ−Ｅ６３Ｑ−Ｓ２５４Ｑ三重変異体（ＴＭ２）をコードするベクターＨｉｓ６−ＳＵＭＯ−ＮｄｅＩ−ＥｒＡ−ＴＭ２−ｐＥＴ１４ｂを、プライマーＨａｎｏ−２０１：５’−ｇａａ ｃａｇ ａｔｔ ｇｇｔ ｇｇｔ ＣＴＣ ＧＡＧ ｇｇａ ｇｇａ ａｔｔ ｃＣＡ ＴＡＴ Ｇｇａ ｔａａ ａｃｔ ｇ−３’（配列番号２７）およびＨａｎｏ−２０２：５’−ｃａｇ ｔｔｔ ａｔｃ ＣＡＴ ＡＴＧ ｇａａ ｔｔｃ ｃｔｃ ｃＣＴ ＣＧＡ Ｇａｃ ｃａｃ ｃａａ ｔｃｔ ｇｔｔ ｃ−３’（配列番号２８）を使用して増幅し、それにより、ＸｈｏＩ部位を作製した。Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯ−ＸｈｏＩ−ＮｄｅＩ−ＥｒＡ−ＴＭ２を含有する得られたｐＥＴ１４ｂプラスミドをＸｈｏＩおよびＮｄｅＩ制限酵素で消化し、ゲル精製して、二重消化かつ精製したベクターｐＥＴ１４ｂ−Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯ−ＸｈｏＩ−ＮｄｅＩ−ＥｒＡ−ＴＭ２を生成した。
【００５９】
二重消化かつ精製した挿入物ＸｈｏＩ−ＴＲＡＩＬ１−Ｇ／Ｓ−ＴＲＡＩＬ２−Ｇ／Ｓ−ＴＲＡＩＬ３−リンカー−ＮｄｅＩを、Instant Sticky End DNA ligase（New England BioLabs）と使用して、二重消化かつ精製したベクターｐＥＴ１４ｂ−Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯ−ＸｈｏＩ−ＮｄｅＩ−ＥｒＡ−ＴＭ２に連結し、ｐＥＴ１４ｂ−Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯ−ＸｈｏＩ−ＴＲＡＩＬ１−Ｇ／Ｓ−ＴＲＡＩＬ２−Ｇ／Ｓ−ＴＲＡＩＬ３−リンカー−ＮｄｅＩ−ＥｒＡ−ＴＭ２プラスミドを生成した。正確な配列をＤＮＡ配列分析によって確認した。プライマーＨａｎｏ−２１１：５’−ｇｃａ ｃｇｃ ｔａｔ ａｔｃ ａｃｃ ａｔｇ ａｃｇ ａａｃ ｇｃｔ ｔｃｇ ａｃｃ−３’（配列番号２９）およびＨａｎｏ−２１２：５’−ｇｇｔ ｃｇａ ａｇｃ ｇｔｔ ｃｇｔ ｃａｔ ｇｇｔ ｇａｔ ａｔａ ｇｃｇ ｔｇｃ−３’（配列番号３０）を使用して、このプラスミドをテンプレートとして使用して、不活性な変異体ｐＥＴ１４ｂ−Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯ−ＸｈｏＩ−ＴＲＡＩＬ１−Ｇ−ＴＲＡＩＬ２−Ｇ−ＴＲＡＩＬ３−リンカー−ＮｄｅＩ−ＥｒＡ−ＴＭ２−Ｋ１６８Ｍを生成させた。
【００６０】
融合タンパク質の発現および精製。ｐＥＴ１４ｂ−Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯ−ＸｈｏＩ−ＴＲＡＩＬ１−Ｇ／Ｓ−ＴＲＡＩＬ２−Ｇ／Ｓ−ＴＲＡＩＬ３−リンカー−ＮｄｅＩ−ＥｒＡ−ＴＭ２およびｐＥＴ１４ｂ−Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯ−ＸｈｏＩ−ＴＲＡＩＬ１−Ｇ／Ｓ−ＴＲＡＩＬ２−Ｇ／Ｓ−ＴＲＡＩＬ３−リンカー−ＮｄｅＩ−ＥｒＡ−ＴＭ２−Ｋ１６８Ｍプラスミドを、発現のために大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃ４１細胞に別々に形質転換した。得られたタンパク質はここではそれぞれＴＲＡＩＬ三量体−ＥｒＡ−ＴＭ２およびＴＲＡＩＬ三量体−ＥｒＡ−ＴＭ２−Ｋ１６８Ｍを指す。単一のコロニーを拾い、２ＹＴ培地で３７℃で終夜増殖させた。同様な高い産物収量に向けてタンパク質を発現させるために２つのプロトコルを確立した。
【００６１】
第１のプロトコルにおいて、終夜の培養物を新鮮な２ＹＴ培地に移し、培養物が０．６〜０．８の光学密度（６００ｎｍ）に達するまで３７℃で増殖させた。タンパク質の発現を、細胞を収穫する前に、３７℃で４〜５時間、０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。
【００６２】
第２のプロトコルにおいて、終夜の培養物を、１ＬのＺＹ当たり、２０ｍＬの滅菌した５０ｘＭ（１．２５ＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．２５ＭのＫＨ２ＰＯ４、２．５ＭのＮＨ４Ｃｌおよび０．２５ＭのＮａ２ＳＯ４）、２０ｍＬの滅菌した５０ｘ５０５２（２５％のグリセロール、２．５％のグルコースおよび１０％のα−ラクトース一水和物）、１ｍＬの滅菌した２ＭのＭｇＳＯ４、および０．１〜１ｍＬの滅菌した１０００ｘ金属混合物（５０ｍＭのＦｅＣｌ３ｘ６Ｈ２Ｏ；２０ｍＭのＣａＣｌ２ｘ２Ｈ２Ｏ；１０ｍＭのＭｎＣｌ２；１０ｍＭのＺｎＳＯ４ｘ７Ｈ２Ｏ；２ｍＭのＣｏＣｌ２ｘ６Ｈ２Ｏ；２ｍＭのＣｕＣｌ２；２ｍＭのＮｉＣｌ２ｘ６Ｈ２Ｏ；２ｍＭのＮａ２ＭｏＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ；２ｍＭのＮａ２ＳｅＯ３；２ｍＭのＨ２ＢＯ３）で補充した新鮮なＺＹ培地（１％のＮ−Ｚ−アミンまたはトリプトン＋０．５％の酵母抽出物）に移した。次いで、インキュベーション温度を低減させ、細胞を収穫する前に、２０℃で終夜維持した。
【００６３】
第１または第２のプロトコルによって得られた細胞を超音波処理により破壊し、破片を４℃で２０，０００ｇで３０分間遠心分離することによって除去した。上清を、５ｍｌのHISTRAP nickel affinity column（GE Healthcare）に充填した。その後、カラムを、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、および２５、５０、または７５ｍＭのイミダゾールのいずれかからなるバッファーで洗浄した。結合したタンパク質を同じバッファー（ただし５００ｍＭのイミダゾールを含有）で溶出した。Ｎ末端Ｈｉｓ６−ＳＵＭＯタグを、Ｈｉｓ６タグＳＵＭＯプロテアーゼにより切断した。精製された酵素を含有するフロースルー画分をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS, Mediatech）に透析した。９７ｋＤａの融合タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
【００６４】
反応速度アッセイ。Ｌ−アスパラギナーゼ活性を、以前に記載されたように連続分光酵素結合アッセイ（continuous spectroscopic enzyme-coupled assay）（Schalk, et al. (2014) J. Biol. Chem. 289:33175-33186）を使用して決定した。簡潔には、アッセイは、還元されたＮＡＤＨの１：１酸化を通じてＬ−アスパラギン酸の生産を測定する。ＮＡＤＨのＮＡＤ＋への変換は、３７℃で３４０ｎｍにおける吸光度の減少として分光光度的に測定した。すべての測定を三重に行った。SIGMAPLOT software（Systat Software Inc）を使用して、ミカエリス−メンテン式に速度をフィッティングさせた。特に、融合タンパク質ＴＲＡＩＬ三量体−ＥｒＡ−ＴＭ２は、１ｍｇ当たり約１０国際単位（ＩＵ）の比活性を有した；一方、不活性な融合タンパク質ＴＲＡＩＬ三量体−ＥｒＡ−ＴＭ２−Ｋ１６８Ｍは、１ｍｇ当たり０．２ＩＵしか有さなかった。
【００６５】
Ｌ−グルタミナーゼ活性を決定するための従来のアッセイ（Gella & Pascual (1982) Anal. Biochem. 127:322-5）をいくつかの改変を加えて使用した。精製した酵素を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、７ＵのＧＤＨ（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、Sigma-Aldrich）、３ｍＭのＩＮＴ（塩化ヨードニトロテトラゾリウム、Sigma-Aldrich）、１００ｍＭのＰＭＳ（フェナジンメト硫酸塩、Sigma-Aldrich）、および１００ｍＭのＮＡＤ＋を含有する溶液に混合した。異なる濃度のＬ−グルタミンを添加することにより、アンモニアおよびＬ−グルタミン酸を生産する最初の反応が引き起こされた。後者は、ＮＡＤ＋の存在下、ＧＤＨの触媒下で、α-ケトグルタル酸およびアンモニアにさらに分解される。この第２の反応によって生産されたＮＡＤＨは、ＩＮＴとともに、第３の反応へのインプットとして役立ち、ＰＭＳの触媒下でのＩＮＴ−ホルマザンの形成は、５００ｎｍでの吸光度の増加として分光光度的に追跡することができる。すべての反応を３７℃で行った。１ＩＵの酵素は、３７℃で１分間に１マイクロモルの産物を生産するために使用される酵素の量として定義される。
【００６６】
細胞の培養。ＬＯＵＣＹ細胞株は、マイコプラズマフリーであることが確認され、Global Bioresource Center ATCCからの対応するＳＴＲ（Short Tandem Repeat）プロファイルデータと１００％一致することを確認した。細胞を、１０％のＦＢＳ（Hyclone）および１ｘペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Invitrogen）で補充したＲＰＭＩ １６４０培地を使用して、湿潤雰囲気（５％ＣＯ２、３７℃）で培養した。Ｌ−グルタミンを細胞培養物に直接２ｍＭの最終濃度まで添加した。
【００６７】
細胞生存率−増殖アッセイ。ＤＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、Mediatech）またはＬ−アスパラギナーゼのいずれかの１０μＬの存在下で、細胞懸濁液の９０μＬの分量（１ｍＬ当たり２．５×１０５個の細胞）を、丸底９６ウェルマイクロタイタープレート中で、０．０００１〜１ＩＵ／ｍＬの範囲に及ぶ最終濃度まで、三重で培養した。５％のＣＯ２を含有する加湿空気中でプレートを３７℃で４日間インキュベートした後、Alamar Blue（Invitrogen）を１０％ｖ／ｖの最終濃度まで加え、プレートをさらに４時間インキュベートし、続いて、蛍光シグナルを読んだ。白血病細胞の生存率は、Ｌ−アスパラギナーゼの存在下での蛍光カウントの、ＤＰＢＳ対照における蛍光カウントに対するパーセンテージとして計算した。
【００６８】
結晶化、Ｘ線データ収集、および精密化。ハンガードロップ蒸気拡散法を使用してＥｒＡ変異体の結晶を２８５Ｋで成長させた。２．５〜１０ｍｇ／ｍＬの酵素の２μＬを１〜４μＬのリザーバー緩衝液と混合した。リザーバー溶液は、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５および２４％のＰＥＧ ＭＭＥ２０００から構成された。
【００６９】
データ収集の前に、結晶を、０．１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５および２４％のＰＥＧ ＭＭＥ２０００において、１０ｍＭのＬ−アスパラギン酸（Sigma-Aldrich）または２５ｍＭのＬ−グルタミン酸（Sigma-Aldrich）とともに５分間浸漬した。次いで浸漬した結晶をそれぞれ同じ溶液に移したが、凍結保護のために２５％のグリセロールを補充した。
【００７０】
回折データは、アルゴンヌ国立研究所に位置するライフサイエンス共同アクセスチーム（LS-CAT）ビームライン21-ID-Fで収集した。データをXDSパッケージ（Kabsch (2010) Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66:133-144）で処理した。構造は、原子分解構造（PDBエントリ1O7J）を検索モデルとして使用して、MOLREP（Roberts (1976) J. Biol. Chem. 251:2119-2123）による分子置換によって決定した。精密化はREFMAC（Steckel, et al. (1983) Biochem. Pharmacol. 32:971-977）を使用して行い、モデル構築はCoot（Steckel, et al. (1983) Biochem. Pharmacol. 32:971-977）を使用して行った。データ収集および精密統計を表１に示す。構造は、PyMOL Molecular Graphics System（バージョン1.6.0、Schrodinger）を用いて調製した。
【００７１】
電子密度の検査は、活性部位における浸漬したＡｓｐの存在を示した。対照的に、浸漬したＧｌｕの電子密度は観察されなかった。
【表１】
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【００７２】
例２：高Ｌ−グルタミナーゼ共活性は、Ｌ−アスパラギナーゼのin vivo有効性に必要ではない
高Ｌ−アスパラギナーゼおよび低Ｌ−グルタミナーゼ活性を有するＥｒＡ変異体の設計および特性評価。Ｌ−アスパラギナーゼがＡＬＬの処置に成功するには、酵素が、可能な限り高いＬ−アスパラギナーゼ活性（がん細胞を殺すため）であり、可能な限り低いＬ−グルタミナーゼ活性（有毒な副作用を最小化するため）であることが必要であると仮定された。２つのＦＤＡに認可された細菌のＬ−アスパラギナーゼのうち、Ｅ．クリサンセミ（ＥｒＡ）由来のものは、大腸菌（ＥｃＡ）由来のものよりも高いＬ−アスパラギナーゼ活性を有する。表２を参照されたい。
【表２】
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【００７３】
かかる酵素薬のアスパラギン枯渇力を定義するパラメータは重要である。反応の速度（ｋｃａｔ）は重要であるが（遅い酵素はＡｓｎを枯渇させるには非効率的である）、おそらくＫｍ値はより重要である。必要とされる低マイクロモル濃度の血液Ａｓｎを達成するために、酵素はこの範囲のＫｍ値を有さなければならない。酵素学者は、しばしば、これらの２つのパラメータを、酵素の効率を表すと考えられる単一の値（ｋｃａｔ／Ｋｍ）に組み合わせる。ヒト血液は約５０μＭのＡｓｎを含有するため、この正確な基質濃度での酵素によるＡｓｎ加水分解の速度もまた、Ｌ−アスパラギナーゼの臨床的適合性を知らせるパラメータである。表２は、ＦＤＡに認可された野生型ＥｒＡおよびＥｃＡ（すなわち、ＥｒＡ−ＷＴおよびＥｃＡ−ＷＴ）についてのこれらの値を示す。これらの数値は、Ａｓｎの生理学的濃度の下でＡｓｎを加水分解する際に、ＥｒＡ−ＷＴがＥｃＡ−ＷＴより約２倍良好であることを示す。したがって、ＥｒＡ酵素を低Ｌ−グルタミナーゼ活性を有する変異体を開発するために選択した。
【００７４】
ＥｒＡ−ＷＴは、優れたＬ−アスパラギナーゼ活性に加えて、より高いＬ−グルタミナーゼ活性をも有する（表３）。
【表３】
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【００７５】
野生型ＥｒＡは、０．５ｍＭのＧｌｎの生理学的濃度で、ＥｃＡ−ＷＴと比較して＞７０倍高いＬ−グルタミナーゼ活性を有する。その高いＬ−アスパラギナーゼ活性を維持しながら内因性Ｌ−グルタミナーゼ活性を低下させるＥｒＡ工学の努力の結果は、表３に列挙される上位２つの変異体とともに、これらの基準を満たすいくつかの変異体をもたらした。
【００７６】
Ｇｌｕ６３のグルタミンへの単一の変異は、Ｌ−グルタミナーゼ活性を＞２１倍低減させた。Ｅ６３Ｑに加えて、Ｓｅｒ２５４のアスパラギンへの変異は、Ｌ−グルタミナーゼ活性のさらに７倍の低減を伴う二重変異体（ＥｒＡ−ＤＭ１）をもたらした。両方のＥｒＡ変異体がＥｒＡ−ＷＴと比較してＬ−グルタミナーゼ活性を著しく低減させただけでなく、ＥｒＡ−ＤＭ１はＥｃＡ−ＷＴのそれに比べてさらに低かった（表３）。しかしながら、ＥｒＡ−ＤＭ１のＬ−アスパラギナーゼ活性は、ＥｃＡ−ＷＴのレベルと同様のレベルまで低減した（表２のｋｏｂｓ＠５０μＭ Ａｓｎを参照されたい）。
【００７７】
臨床的有用性のために、Ｌ−アスパラギナーゼ対Ｌ−グルタミナーゼの相対的な比が重要である。したがって、生理学的な基質濃度（Ａｓｎについて５０μＭ、Ｇｌｎについて５００μＭ）およびＩＵ（臨床的に、Ｌ−アスパラギナーゼは国際単位に基づいて投与される）で観察された速度に基づいて、この比を計算した。両方の比は、ＥｒＡ−ＤＭ２がＥｒＡ−ＷＴに対して優れた酵素であることを示す（表４）。注目すべきことに、ＥｒＡ−ＤＭ１は、内因的に低いＬ−グルタミナーゼ活性を有する酵素であるＥｃＡ−ＷＴと比較しても、より低いＬ−グルタミナーゼ活性を示した。この点は、表４に列挙される酵素のＬ−グルタミナーゼ速度を理解するために使用したＮＭＲ分光法を使用して確認した。
【表４】
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【００７８】
これらの実験は、設計されたＥｒＡ変異体についての低減されたＬ−グルタミナーゼ速度およびＥｒＡ−ＤＭ１の非常に低いＬ−グルタミナーゼ活性を実証する。
【００７９】
Ｌ−アスパラギナーゼのin vitro試験。マウス白血病Ｌ５１７８Ｙ細胞の増殖のための外因性Ａｓｎへの依存性により（Haley, et al. (1961) Cancer Res. 21:532-536）、この細胞株はＬ−アスパラギナーゼ活性を評価するための有用なモデルとなった。したがって、この細胞株を使用して、ＥｒＡ−ＷＴおよびＥｃＡ−ＷＴと比較したＥｒＡ−Ｅ６３Ｑ変異体の活性を評価した。従来の細胞培養条件下では、これらの細胞の増殖を防止するのに３つの酵素すべてが効率的であることが観察された（表５）。
【表５】
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【００８０】
酵素の細胞を殺す力の指標としてＩＣ５０値を使用すると、ＥｒＡ−ＷＴは、ＥｃＡ−ＷＴまたはＥｒＡ−６３Ｑよりも効率的（すなわち、より低いＩＣ５０値）であった。この順序は、これらの酵素の相対的なＬ−グルタミナーゼ活性を反映しているため（ＥｒＡ−ＷＴ＞ＥｃＡ−ＷＴ＞ＥｒＡ−６３Ｑ）、このＩＣ５０の差異は主としてこの酵素の副活性（side activity）によるものであると推測された。これを試験するために、用量応答実験を繰り返したが、今回は細胞培養培地にＧｌｎを補充した。実際、ＩＣ５０値は増加した（表５）。観察されたＩＣ５０値に対するＧｌｎ補充の効果は、約１５〜２５倍の範囲の増加に及び劇的であった（表５）。最も低いＬ−グルタミナーゼの副活性を有する酵素がＧｌｎ補充によって最も良好に保護されていることが注目された。言い換えれば、高いＬ−グルタミナーゼ活性を有する酵素（例えば、ＥｒＡ−ＷＴ）は、減少したＬ−グルタミナーゼ活性を有する酵素（例えば、ＥｒＡ−ｅ６３Ｑ）と比較してＧｌｎ補充を大幅に克服する。これはおそらく、追加のＧｌｎを加水分解する高Ｌ−グルタミナーゼ活性の酵素によるものである。
【００８１】
Ｌ−アスパラギナーゼのＬ−グルタミナーゼ副活性の役割に取り組む以前の研究は、実験モデルとしての細胞培養に依存していた。培養で増殖した細胞株はいずれもＧｌｎを必要とするため、高いＬ−グルタミナーゼ活性を有する酵素がより良好な殺作用を示すことは明らかである。しかしながら、これはＬ−アスパラギナーゼ薬のこの副活性が臨床的有効性に必要であることを必ずしも意味しない。実際、極端な場合、低Ｌ−アスパラギナーゼ活性であるが高Ｌ−グルタミナーゼ活性である酵素は、細胞培養において極めて有効であるように見えるが、外因性Ａｓｎに依存するＡＬＬなどのがんの処置に臨床的に関連性はないであろう。したがって、Ｌ−アスパラギナーゼ中に存在するＬ−グルタミナーゼ副活性の重要性を試験するために、好ましくはin vivoモデルを使用する。
【００８２】
Ｌ−アスパラギナーゼ変異体の評価のためのＡＬＬのヒト異種移植モデルの開発。過去の研究者は、Ｌ−アスパラギナーゼのin vivo評価のためにＬ５１７８Ｙマウス細胞株を使用した（例えば、Abuchowski, et al. (1984) Cancer Biochem. Biophys. 7:175-186；Kwon, et al. (2009) J. Control Rel. 139:182-189）。ヒト起源ではないこの細胞株を別として、この同系ＡＬＬマウスモデルの追加の欠点は、動物の疾患負担を定量的に追跡不能であることである。これは、異なるＬ−アスパラギナーゼ調製物を正確に評価することを困難にする。したがって、ルシフェラーゼを発現するＬＯＵＣＹ（ヒトＴ−ＡＬＬ）およびＳＵＰ−Ｂ１５（ヒトＢ−ＡＬＬ）細胞株を使用してＡＬＬの定量的in vivoモデルを開発した。これらのシステムの利点は、移植されたルシフェラーゼ発現細胞によって産生される生物発光シグナルが疾患負荷の定量的尺度として作用するin vivoイメージングを使用可能であることである。
【００８３】
最初に、ＥｒＡおよびＥｃＡの野生型バージョンおよび低Ｌ−グルタミナーゼＥｒＡ変異体に対するこれらのヒトＡＬＬ細胞株のin vitroでの感受性を決定した。この分析は、両方の細胞株がＬ−アスパラギナーゼ投与に感受性であることを示した。それらのより高いＬ−グルタミナーゼ活性から予想されるように、ＥｒＡ−ＷＴおよびＥｃＡ−ＷＴについての培養で決定されたＩＣ５０値は、低Ｌ−グルタミナーゼＥｒＡ変異体（表６）と比較して５０〜１００％低いと決定された。
【表６】
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【００８４】
ヒトＡＬＬ細胞株のＬ−アスパラギナーゼ感受性を確認した後、これらの細胞をマウスに移植することができることを確認した。経時的な生物発光シグナルの増加に基づいて、細胞の増殖および疾患負担の増加を実証する。
【００８５】
Ｔ−ＡＬＬおよびＢ−ＡＬＬマウスモデルにおけるＥｒＡ−ＷＴおよびＥｒＡ変異体のin vivo試験。ＥｒＡ−ＷＴ中に存在する極めて高い内因性Ｌ−グルタミナーゼ活性が臨床的有効性に必要であるかどうかを試験するために、ＬＯＵＣＹまたはＳＵＰ−Ｂ１５細胞を移植したマウスをＦＤＡに認可されたＬ−アスパラギナーゼで処置し、活性をここに記載の低Ｌ−グルタミナーゼ変異体と比較した。酵素の酵素パラメータに加えて、他の変数がin vivo応答に影響を与え得ることに注目することが重要である。例えば、長いin vivo安定性を有する酵素は、短い半減期を有するものと比較して、血液Ａｓｎを枯渇させる上でより効率的であろう。ヒトでは、ＥｒＡ−ＷＴは、ＥｃＡ−ＷＴよりもはるかに短い半減期を有することが知られている（０．６５日対１．２４日；Asselin, et al. (1993) J. Clin. Oncol. 11:1780-1786）。ＥｒＡ−ＷＴを用いた最初の実験の間、腫瘍細胞の増殖の減少は観察されなかった。これは、マウスにおけるＥｒＡ−ＷＴの低い安定性によるものと仮定され、ヒトにおける観察を反映した。これを試験するために、ＥｒＡ−ＷＴのＮ末端にＳＵＭＯタグを付加して、酵素特性に悪影響を及ぼすことなく安定性を増加させた。実際、ＳＵＭＯ−ＥｒＡ−ＷＴで処置したマウスは、腫瘍負荷の顕著な減少を示した。したがって、以下のin vivo研究において使用されるすべてのＥｒＡ酵素は、この安定性タグを含んでいた。
【００８６】
ＬＯＵＣＹ Ｔ−ＡＬＬ細胞を移植したマウスを５０ＩＵ／マウスの用量で腹腔内注射（ｉ．ｐ．）により１４日間毎日Ｌ−アスパラギナーゼで処置した。この用量は、ヒトに与えられるＥｒＡ−ＷＴ用量の約１／３と同等であるが、ヒトにおいては、週に３回投与され、筋肉内または静脈内で与えられる。動物モデルにおける有効性は、それを循環させる薬の量によって影響され得るため、投与様式におけるこの差異が注目される。換言すれば、目的はin vivoでのがんの増殖を制限するＬ−グルタミナーゼＥｒＡ変異体の能力を試験することであるが、in vivo有効性を決定する他の因子が存在し得る。しかしながら、比較がほぼ同一の酵素（ＥｒＡ−ＷＴおよびＥｒＡ変異体）の間であったため、これらの酵素は極めて類似した薬物動態特性を有するであろうと推定された。
【００８７】
高Ｌ−グルタミナーゼＥｒＡ−ＷＴ、低Ｌ−グルタミナーゼＥｒＡ−Ｅ６３Ｑおよび極低Ｌ−グルタミナーゼＥｒＡ−ＤＭ２は、動物におけるがん細胞の数を急速に減少させた（図１Ａ）。ＥｒＡ−ＤＭ１で観察されたルシフェラーゼシグナルのわずかに遅い減少は、この変異体のより高いＡｓｎ Ｋｍに起因し得る。それにもかかわらず、処置終了までに、すべてのＥｒＡ変異体に由来するルシフェラーゼシグナルのレベルは背景に近く、これらの細胞の極めて強力な殺作用を実証した。
【００８８】
これらの実験をＢ−ＡＬＬ ＳＵＰ−Ｂ１５細胞株で繰り返した。これらの酵素はＬ−グルタミナーゼ活性の点で極端であるため（ＥｒＡ−ＷＴで最も高く、ＥｒＡ−ＤＭ２で最も低い）、今回は、ＥｒＡ−ＷＴおよびＥｒＡ−ＤＭ１のみを比較した。Ｔ−ＡＬＬ ＬＯＵＣＹ細胞株で見られるように、ＥｒＡ−ＷＴおよびＥｒＡ−ＤＭ１の両方は、マウスのがん細胞の数を劇的に低減させた（図１Ｂ）。
【００８９】
低Ｌ−グルタミナーゼＥｒＡ変異体の低減した毒性の兆候。ここに示されるデータは、極めて低いＬ−グルタミナーゼ活性のみを含有するＬ−アスパラギナーゼがin vivoでのＡＬＬ増殖の強力な阻害剤であることを実証する。さらに、動物の体重は薬の投与によって劇的に影響を受け、これは相対的なＬ−グルタミナーゼ活性と相関する効果であることが注目された。薬のＬ−グルタミナーゼ活性が高ければ高いほど、体重減少はより大きくなる（図２）。注目すべきは、体重減少は疾患負担と相関がなかったことである。実際、ビヒクルで処置したマウス（最も病弱なコホート）は、最小の体重減少を受けた。これは、観察された体重減少が、（ＥｒＡ−ＷＴについて予想されるように）より大きな枯渇をもたらす酵素によるＧｌｎ枯渇によるものであり、最も大きな体重減少をもたらすことを示す。逆に、最小のＧｌｎ枯渇をもたらすと予想される酵素、すなわちＥｒＡ−ＤＭ２で処置したマウスは、最も少ない量の体重減少を与えた。
【００９０】
ＥｒＡ−ＷＴ、ＥｒＡ−ＤＭ１、およびＥｃＡ−ＷＴの活性の間の差異をさらに調べるために、ＮＭＲを使用して、３７℃で溶液中の時間の関数としてアスパラギンおよびグルタミンのレベルを追跡した。これらの実験のために、細胞培養実験に存在する濃度を、これらのアミノ酸の出発濃度として選択した（すなわち、２．０５ｍＭのＧｌｎおよび０．３７５ｍＭのＡｓｎ）。注目すべきことに、ヒト血液は約０．６ｍＭのＧｌｎおよび約０．０５ｍＭのＡｓｎを含有する。０．５ＩＵ／ｍｌの用量で添加されたすべての酵素について、最初の時点がとられた時間までに、ＡｓｎのすべてがＡｓｐに加水分解されていた。これは、試験した酵素がＡｓｎを枯渇させる能力の点で極めて類似していたことを示す。
【００９１】
これと比較して、Ｇｌｎ枯渇を評価するとき、酵素は極めて異なる特性を示した。その反応速度特性から予想されるように、ＥｒＡ−ＷＴはＧｌｎを枯渇させるのに非常に効率的であった；４８時間の時点で、ＧｌｎのすべてがＧｌｕに加水分解されていた。２４時間後でさえ、Ｇｌｎレベルは、ＥｒＡ−ＷＴによって約２ｍＭ〜約０．１ｍＭに低減していた。Ｌ−アスパラギナーゼを評価する細胞培養研究では、しばしば細胞を７２時間または９６時間でさえ、薬とともにインキュベートするため、細胞は必須のＧｌｎを極めて長い時間奪われるであろうから、ＥｒＡ−ＷＴが極めて強力な細胞殺作用を実証したことは驚くべきことではなかった。ＥｃＡ−ＷＴは、内因的に低いＬ−グルタミナーゼ活性を有するが、２４時間および４８時間の時点でＥｒＡ−ＷＴと同じＧｌｎ枯渇を示した（その遅いＬ−グルタミナーゼ活性は５時間の時点で顕著であった）。
【００９２】
最も重要なことに、ＥｒＡ−ＤＭ１変異体はＧｌｎ枯渇を著しく低減させた。２４時間の時点で、この酵素とともにインキュベートした溶液のＧｌｎレベルは依然として約０．４ｍＭであり、４８時間で約０．１ｍＭであった。７２時間の時点でのみ、ＧｌｎはＥｒＡ−ＤＭ１によって完全に枯渇した。注目すべきことに、Ｇｌｎは自発的な加水分解を受け、使用した実験条件下で、著しいＧｌｎが実験の４日間のインキュベーション期間中に加水分解された。したがって、後の時間でのＧｌｎ枯渇の量は、Ｌ−アスパラギナーゼによって触媒された加水分解および自発的な加水分解の組み合わせである。したがって、無視できる自発的なＧｌｎ加水分解が発生している２４時間の時点に分析を限定する場合、ＥｒＡ−ＤＭ１がＥｒＡ−ＷＴまたはＥｃＡ−ＷＴと比較してはるかに少ないＧｌｎ枯渇を引き起こすことは極めて明らかである。
【００９３】
高Ｌ−アスパラギナーゼ活性および付随するＬ−グルタミナーゼ活性の減少に照らして、ここに記載のＥｒＡ変異体は、特に、ＰＥＧ化された融合タンパク質の形態において、ＡＬＬなどのがんの処置においてin vivo半減期を増加させるために容易に使用され得る。
【００９４】
例３：操作されたＥｒＡの低Ｌ−グルタミナーゼ活性の構造的な根拠
変異誘発のための残基の選択。４つの残基Ａｌａ３１、Ｇｌｕ６３、Ｐｒｏ１２３、およびＳｅｒ２５４を、Ｌ−グルタミナーゼ／Ｌ−アスパラギナーゼ比に影響を及ぼし得る候補部位として同定した。触媒作用におけるそれらの役割のために、Ｌ−アスパラギナーゼ／Ｌ−グルタミナーゼスーパーファミリー（図３のアスタリスクで示され、Ｔ１２ＧＧＴ１５、Ｈ９３ＧＴＤＴ９７、Ｓ６２、Ｋ１６８を含む）間のコンセンサスモチーフに存在する残基を、変異の検討から除外した。代わりに、活性部位を取り囲み、必ずしも基質と相互作用しない非保存残基を標的化した。多重配列アラインメント（図３）に基づき、産物ＡｓｐおよびＧｌｕとの複合体中のＥｒＡの結晶構造の分析と組み合わせて、Ａｌａ３１、Ｇｌｕ６３、Ｐｒｏ１２３およびＳｅｒ２５４を変異誘発のための４つの潜在的な候補部位として同定した。興味深いことに、これらの４つの残基のうち、ただ１つのＧｌｕ６３のみが基質と直接相互作用する。
【００９５】
部位１、Ａｌａ３１は、活性部位のリガンドの存在下で閉鎖し、整えられる柔軟なＮ末端ループの部分である。整えられるとき、Ａｌａ３１は基質結合ポケットの入口に位置する。好ましい基質Ａｓｎと直接相互作用しないが、それはアミノ酸のＣα原子の４Å以内である。より大きな基質Ｇｌｎを有するＥｒＡ構造において、このアミノ酸に存在する余分なメチレン原子はＡｌａ３１の方向にねじれていることが観察された。Ａｓｎの収容を維持するがＧｌｎを排除するために、小さいアラニン側鎖をよりかさ張ったものに置換することによって、空洞を立体的に拘束することが目的であった。すなわち、この設計は、余分なＧｌｎメチレン基を立体的に排除するためになされた。モデリング研究に基づいて、バリン、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニンに存在する側鎖が最も適切であると同定された。さらに、配列アラインメント（図３）に示すように、Ａｌａ３１は、大腸菌およびヘリコバクター・ピロリＬ−アスパラギナーゼの場合、それぞれバリンまたはセリンで置換されている。ＥｒＡと比較して、これらの酵素は、Ｌ−グルタミナーゼ活性がより低いかまたは無視できる程度であると報告されている（Parmentier, et al. (2015) Leuk. Res. 39:757-762; Cappelletti, et al. (2008) Biochem. Biophys. Res. Commun. 377:1222-1226）。したがって、Ａｌａ３１を、セリンまたはトレオニン（後者はバリンを模倣するがセリンのヒドロキシル基は保持する）のいずれかと置換した。
【００９６】
部位２、Ｇｌｕ６３は、アミノ酸基質のα−アミノ基と直接相互作用する残基である。ＡｓｐおよびＧｌｕとの複合体におけるＥｒＡの構造分析は、より大きなＧｌｕを収容するために、基質が、小さなＡｓｐによって採用された結合位置に対してＧｌｕ６３の方向にシフトすることを示した。このＧｌｎの再配置を不利にするために、Ｇｌｕ６３をグルタミンに置換した。この変異の選択は、低Ｌ−グルタミナーゼのヘリコバクター・ピロリおよび大腸菌のＬ−アスパラギナーゼのＧｌｕ６３の対応部分がグルタミンであるという事実によって補強された。グルタミン酸およびグルタミンの両方の側鎖は、ＡｓｎまたはＧｌｎのいずれかのα−アミノ基の結合に関与し得る酸素原子を含有する。しかしながら、グルタミン側鎖中に存在するアミノ基は、（グルタミン酸中の第２の酸素原子とは対照的に）Ｇｌｎの収容にあまり好ましくないものであり得ると仮定された。Ｅ６３Ｑ変異体に加えて、Ｅ６３Ｌ変異もまた、高Ｌ−アスパラギナーゼ活性を示すＱ５９Ｌ ＥｒＡ変異体の同定にしたがって作製した（Chan, et al. (2014) Blood 123:3596-3606）。
【００９７】
変異誘発のために選択された第３の部位はＰｒｏ１２３であった。この残基は、いずれも低Ｌ−グルタミナーゼ活性を示すウォリネラ・サクシノゲネスのＬ−アスパラギナーゼおよびヘリコバクター・ピロリのＬ−アスパラギナーゼのそれぞれのセリンまたはアスパラギンのいずれかであるため（図３）、この部位を選択した。Ｐｒｏ１２３の位置に基づいて、この残基はＧｌｎに対するＡｓｎの選好を増加させる間接的な役割を果たし得ることが予想された。これを実証するために、Ｐ１２３ＳおよびＰ１２３Ｎ ＥｒＡ変異体を調製した。
【００９８】
改変のための部位４、残基Ｓｅｒ２５４は、基質結合ポケットの入口に位置し、隣接するプロトマーに由来する。したがって、Ａｌａ３１について上記で合理化されたように、このセリンをより大きな側鎖を有する残基で置換することはＧｌｎを排除すると仮定された。多重配列アラインメント（図３）は、大腸菌およびモルモット酵素（Ｌ−グルタミナーゼ活性が低いものから同活性がないものまで）におけるこの残基の対応部分がそれぞれアスパラギンおよびプロリンであることを明らかにした。したがって、変異体Ｓ２５４ＮおよびＳ２５４Ｐを作製して、Ｌ−グルタミナーゼ／Ｌ−アスパラギナーゼ選好に対するこの部位の効果を調べた。
【００９９】
ＥｒＡ変異体の反応速度の特性評価。ＥｒＡ−ＷＴに加えて、表７に挙げた１８種のＥｒＡ変異体を発現させ、精製した。
【表７】
2019509041.tif 000009
【０１００】
比色酵素結合アッセイを使用して、酵素のＬ−アスパラギナーゼおよびＬ−グルタミナーゼ活性を決定した。飽和基質濃度での速度を測定したことを保証するために、１０ｍＭのＧｌｎおよび２ｍＭのＡｓｎを、それぞれＬ−グルタミナーゼアッセイおよびＬ−アスパラギナーゼアッセイの基質として使用した。１８種の変異体のうち１７種がＬ−グルタミナーゼ活性を低減させた（表７）。しかしながら、ほとんどの変異体について、この減少はＬ−アスパラギナーゼ活性の低下と付随していた。（ｉ）≧６０％の保持されたＬ−アスパラギナーゼ活性（Ｅｒｗ−ＷＴに対して）および（ｉｉ）≦５％のＬ−グルタミナーゼ対Ｌ−アスパラギナーゼ活性の基準を使用して、変異体ＥｒＡ−Ｅ６３Ｑ、ＥｒＡ−Ｓ２５４Ｐ、ＥｒＡ−Ａ３１Ｉ＋Ｅ６３ＱおよびＥｒＡ−Ｓ２５４Ｎ＋Ｅ６３Ｑをさらなる研究のために選択した。
【０１０１】
飽和基質濃度での最初の変異体スクリーニングから、単一変異体ＥｒＡ−Ｓ２４５Ｐは、最も望ましい特性を有するようであった：Ｌ−グルタミナーゼ活性はアッセイ条件の検出感度未満であったが、Ｌ−アスパラギナーゼ活性は野生型酵素に対して１２０％であった（表７）。変異体のＬ−アスパラギナーゼ活性のさらなる反応速度の特性評価により、Ａｓｎによる高い代謝回転速度を確認した。しかしながら、それはＡｓｎのＫｍ値において（ＥｒＡ−ＷＴに対して）２５倍の増加も明らかにした（表８）。
【表８】
2019509041.tif 000010
【０１０２】
Ｌ−アスパラギナーゼの臨床的な使用は、血液Ａｓｎレベルの完全な枯渇を必要とするため、有効であるためには酵素のＫｍは低いマイクロモル範囲でなければならない。したがって、Ｌ−グルタミナーゼ活性を大部分排除するという目標が達成されたが、ＥｒＡ−Ｓ２４５Ｐ変異体は、Ｌ−アスパラギナーゼ反応におけるＡｓｎのＫｍ値の許容できない増加を考慮して、さらなる分析のために選択しなかった。
【０１０３】
最初のスクリーニング（表７）からの変異体の特性をさらに調べたところ、３つの次に最も有望な変異体はＥ６３Ｑ（ＥｒＡ−Ｅ６３Ｑ）単一変異体およびＡ３１Ｉ−Ｅ６３Ｑ（ＥｒＡ−ＤＭ２）およびＥ６３Ｑ−Ｓ２５４Ｎ（ＥｒＡ−ＤＭ１）二重変異体であることが示された。これらの変異体のさらなる反応速度の特性評価により、基質Ａｓｎの臨界（critical）Ｋｍ値はＥｒＡ−ＷＴのＫｍ値に匹敵することが明らかになった（表８および９）。実際、ＥｒＡ−ＤＭ２は、ＥｒＡ−ＷＴよりも低いＡｓｎ Ｋｍを獲得した（３７対４８μＭ）。対照的に、ＥｒＡ−ＤＭ１変異体は、Ａｓｎ Ｋｍにおいて４倍の増加を示した。野生型ｋｃａｔに近いもの（ＥｒＡ−ＷＴの６０〜９０％の範囲）とともに、これらの変異体は、Ａｓｎを血液から効率的に枯渇させるのに必要な基準を満たす。
【表９】
2019509041.tif 000011
【０１０４】
その後、望ましくないＬ−グルタミナーゼ活性の正確な反応速度パラメータを決定した。この研究は、これらの変異体の低減したＬ−グルタミナーゼ活性が、ＥｒＡ−ＷＴと比較して、低減したｋｃａｔ（３〜９倍低い）および非常に増加したＫｍ（８〜４４倍高い）のためであることを確立した（表１０および１１）。
【表１０】
2019509041.tif 000012
【表１１】
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【０１０５】
ｋｃａｔ／Ｋｍパラメータによって示されるように、変異体のＬ−グルタミナーゼ効率は約２０〜４００倍低減した。同様に、０．５ｍＭの生理学的な血液濃度で観察したＬ−グルタミナーゼ速度は、ＥｒＡ−ＷＴに対して９５〜９９％低減した。この分析は、これらの３つの変異体が、Ｌ−グルタミナーゼ活性が著しく損なわれているがＥｒＡ−ＷＴのＬ−アスパラギナーゼ活性に近い設計基準を大いに満たすことを実証する。
【０１０６】
改善されたＬ−アスパラギナーゼ選択性の分子的な根拠。上記で論じた変異体の設計に構造上の考慮が組み込まれたが、増加したＡｓｎ選択性のメカニズムが確認された。したがって、ＥｒＡ−Ｅ６３Ｑ、ＥｒＡ−ＤＭ１、およびＥｒＡ−ＤＭ２酵素の変異体は、ＡｓｐまたはＧｌｕのいずれかを用いて結晶化した（それぞれ、Ｌ−アスパラギナーゼおよびＬ−グルタミナーゼ反応の産物）。高分解能回折データをＡｓｐおよびＧｌｕの両方の浸漬した結晶で収集した。Ａｓｐの浸漬した結晶について（データ収集および精密統計については表１を参照）、酵素の活性部位での電子密度の調査は、明らかにリガンドの存在を示した。しかしながら、異なる浸漬条件（例えば、浸漬時間の増加、Ｇｌｕ濃度の増加）下でのいくつかの試みにもかかわらず、浸漬したＧｌｕの電子密度は観察されなかった。代わりに、Ｇｌｕの浸漬した結晶の活性部位は、結晶化溶液の成分であるＨＥＰＥＳバッファーの電子密度を有していた。ＨＥＰＥＳの分子は、同じ条件を使用して結晶化されたアポＥｒＡ−ＷＴの活性部位に結合していることが以前に観察された。注目すべきことに、ＥｒＡ−ＷＴについては、浸漬したＡｓｐおよびＧｌｕの両方が、活性部位からバッファー分子を置換することができる。対照的に、ここで論じた３つのＥｒＡ変異体については、結合したＨＥＰＥＳ分子を完全に置換するのに成功したのはＡｓｐ（しかしＧｌｕではない）のみであった。浸漬したＧｌｕがＥｒＡ変異体の結晶中のバッファー分子を置換することができないことは、野生型酵素と比較してＧｌｎ Ｋｍ値が非常に増加したことと相関する。
【０１０７】
ＥｒＡ変異体の全体構造。ＥｒＡ−ＷＴは、活性部位におけるＡｓｐ／Ｇｌｕの存在または非存在にかかわらず、二量体−二量体から構成される四量体を構築する。しかしながら、Ａｓｐ／Ｇｌｕの非存在下では、Ｎ末端領域（残基１８〜３４）は明確な電子密度を欠いている。このいわゆる柔軟なＮ末端ループは、ＡｓｐまたはＧｌｕのいずれかがＥｒＡ−ＷＴに結合すると、整えられ、活性部位に接近することが観察された。ここで解析された３種類のＥｒＡ変異体（ＥｒＡ−Ｅ６３Ｑ、ＥｒＡ−ＤＭ１、ＥｒＡ−ＤＭ２）について、四量体構成が維持され、柔軟なＮ末端ループが電子密度を明確に示し、閉鎖された立体配置を採用した。ＥｒＡ−Ｅ６３Ｑ−Ａｓｐ、ＥｒＡ−ＤＭ１−Ａｓｐ、およびＥｒＡ−ＤＭ２−Ａｓｐ構造は、それぞれ２．０５Å、１．５０Åおよび１．６０Åの分解能で解明され（表１）、すべてＥｒＡ−ＷＴ−ＡＳＰ構造（PDB ID 5F52；０．０９〜０．１３５Åのｒｍｓｄ）に極めて同様である。
【０１０８】
ＥｒＡ−Ｅ６３ＱへのＡＳＰの結合。示されるように、野生型酵素において、Ｇｌｕ６３は、アミノ酸リガンド（ＡｓｐまたはＧｌｕ）のα−アミノ基と直接相互作用する。ＥｒＡ−ＷＴ−Ａｓｐの特定の場合、その相互作用距離は２．８Åである。Ｇｌｕ６３をグルタミンで置換することは、Ｇｌｕ６３が基質のα−アミノ基と塩橋を形成するのに対し、Ｇｌｎ６３はＨ結合を形成するため、より距離感受性である相互作用をもたらすであろうと仮定された。この相互作用の距離感受性の増加は、Ｇｌｎの結合に影響を与えるがＡｓｎの結合には影響しないことが予測された。Ｇｌｎ６３側鎖の配向（カルボニル酸素原子対アミド窒素原子）の割り当ては、Ｇｌｎ６３（Ｈ結合供与体）のアミド窒素原子がリガンド（これもまたＨ結合供与体）のα−アミノ基からさらに遠い側にあるであろうという化学的推論に基づいてなされた。
【０１０９】
分析は、ＥｒＡ−Ｅ６３Ｑ−Ａｓｐ構造において、リガンド（Ａｓｐ）のα−アミノ基とＧｌｎ６３のグルタミン側鎖のカルボニル部分との間の相互作用距離が３．０Åに増加したことを示した。重要なことに、Ｇｌｎ６３のアミド窒素原子とＡＳＰリガンドのα−アミノ基との間の距離は、３．９Åで許容できるほど長いものであった。換言すれば、Ｌ−アスパラギナーゼ反応に悪影響を及ぼさないように、ＡＳＰの場合（そして基質Ａｓｎについても当てはまる）、これらのＨ結合供与体部分の間に十分な分離が存在した。これは、なぜこの変異体が高いＬ−アスパラギナーゼ活性を維持するのかを説明する。
【０１１０】
ＡｓｐのＥｒＡ−ＤＭ１への結合。その後、Ａｓｐ（ＥｒＡ−ＤＭ２−Ａｓｐ）との複合体中のＡ３１Ｉ−Ｅ６３Ｑ二重変異体（ＥｒＡ−ＤＭ２）の結晶構造を決定した。ＥｒＡ−ＤＭ２に対するＥ６３Ｑ変異の最小の効果は、ＥｒＡ−Ｅ６３Ｑについて見られたものと同様であった。対照的に、Ａ３１Ｉ変異の効果は、より重要であり、柔軟なＮ末端ループの立体配置に影響を与えた。依然として閉鎖しているが、このループは、ＥｒＡ−ＷＴ−Ａｓｐ複合体構造に見られるものとは異なる立体配置を採用した。より小さなアラニンを置換した３１位のイソロイシンは、Ｎ末端の柔軟なループのこの部分が基質結合部位に近づくのを妨げた。ＥｒＡ−ＷＴ−Ａｓｐにおいて、３１位のアラニンは、それぞれ、結合したＡｓｐのＣαおよびＣβ原子から４．１Åおよび５．３Å離れていた。Ａｌａ３１がより大きなイソロイシンに置き換えられたとき、ＥｒＡ−ＤＭ２−Ａｓｐ中のイソロイシンの先端がＡＳＰからほぼ同じ距離になるように（４．２および５．３Å）、柔軟なＮ末端ループの位置が調整された。したがって、この構造は、変異体がそのＬ−アスパラギナーゼ活性を維持するためにどのように適合するかを明らかにした。
【０１１１】
ＡｓｐのＥｒＡ−ＤＭ１への結合。Ｓｅｒ２５４のアスパラギンへの単一置換は、Ｌ−アスパラギナーゼおよびＬ−グルタミナーゼ活性の同等の減少を伴う変異体をもたらした（表７）。興味深いことに、Ｓ２５４Ｎ変異をＥ６３Ｑ変異と組み合わせると（ＥｒＡ−ＤＭ１）、Ａｓｎに対して高度に選択的な変異体が得られた（表８および表１０）。この現象を理解するために、Ａｓｐとの複合体中のＥｒＡ−ＤＭ１（ＥｒＡ−ＤＭ１−Ａｓｐ）の結晶構造を解明した。再び、Ｅ６３Ｑ変異のわずかな効果は、以前に論じたものと同様であった。第２の変異の部位である残基２５４は、四量体酵素の隣接するプロトマーに由来した（数字の後にプライムで示される）。ＥｒＡ−ＷＴにおいて、Ｓｅｒ２５４’は、結合したＡＳＰと直接相互作用しなかったが（Ａｓｐのα−アミノ基に対して４．０Åの距離）、保存されたＡｓｐ９６の側鎖を位置付けるように機能した（Ｓｅｒ２５４’ヒドロキシルとＡｓｐ９６の側鎖との間の２．７Åの距離）。Ｓｅｒ２５４’がアスパラギンに変異した場合、より大きな側鎖は結合したＡＳＰに近づき（Ａｓｐのα−アミノ基に対して３．５Å）、Ａｓｐ９６との位置的相互作用（positioning interaction）を維持した（３．１Å）。Ａｓｎ２５４’側鎖アミド窒素原子（Ｈ結合供与体）がＡｓｐ９６（Ｈ結合受容体）のカルボン酸部分に面するように、Ａｓｎ２５４’の配向はＡｓｐ９６によって指示された。これは重要な点であり、なぜなら、Ａｓｐ２５４’の側鎖アミド窒素原子は、Ａｓｐ９６によって配置されているため、ＡｓｎまたはＧｌｎのα−アミノ基に対する反発を生じるからである。これは、なぜＥｒＡ−Ｓ２５４Ｎの単一変異体がＡｓｎおよびＧｌｎの両方で活性を減少させたのかを説明する（表７）。
【０１１２】
Ｓ２５４Ｎ変異がＥ６３Ｑ変異と組み合わされたとき（すなわちＥｒＡ−ＤＭ１）、酵素の反応速度特性は著しく異なった。以前のＥ６３Ｑ含有変異体と同様に、６３位の側鎖とＡｓｐとの間のＥｒＡ−ＤＭ１−Ａｓｐ構造中の距離は３．０Åに増加した。この距離の増加は小さいが、Ａｓｎ２５４’と基質Ａｓｎとの分離を３．５Åに増加させた。Ａｓｐの位置のこのシフト（Ｅ６３Ｑ変異による）は、Ａｓｎ２５４’の側鎖との反発相互作用を軽減することを可能にした。換言すれば、Ｅ６３Ｑ変異は、リガンドα−アミノ基（Ｈ結合供与体）とＡｓｎ２５４’アミド窒素原子（これもまたＨ結合供与体）との間の反発相互作用を制限するように、リガンドを十分に置換した。これにより、ＥｒＡ−ＤＭ１は高いＬ−アスパラギナーゼ活性を維持することができる。
【０１１３】
ＥｒＡ変異体へのＧｌｕ結合様式のモデル化。前述の構造分析は、変異とＡｓｎとの酵素活性の適合性を実証する。したがって、変異とＧｌｎの加水分解との不適合性の根拠が探求された。しかしながら、Ｇｌｕが浸漬した変異体酵素の結晶がアミノ酸に結合できなかったため、変異体がどのようにしてＧｌｎに結合するかについての直接的な実験的見解は不可能であった。したがって、ＥｒＡ−ＷＴ−Ｇｌｕを変異体構造と重ね合わせた。理論に縛られるわけではないが、この種類の分析では、ＧｌｕがＥｒＡ−ＷＴに観察されたものと同じように変異体酵素に結合すると仮定された。この分析は、変異体に対する潜在的なＧｌｕ結合様式の洞察を提供する。
【０１１４】
Ｅ６３Ｑ変異は、高Ｌ−アスパラギナーゼ／低Ｌ−グルタミナーゼ特性を有する、これまでに論じた３つの変異体すべてに存在するため、ＡｓｎとＧｌｎとの間の差別化において重要な役割を果たすに違いない。ＥｒＡ−ＷＴ−ＧｌｕとＥｒＡ−Ｅ６３Ｑの構造の重ね合わせは、ＥｒＡ−Ｅ６３Ｑへの推定されるＧｌｕ結合様式を提供し、Ｇｌｕα−アミノ基とＧｌｎ６３アミド窒素原子との間の短い距離（３．５Å）を明らかにした。これらの部分の両方がＨ結合供与体であるため、かかる近接性はこのアミノ酸の結合に有害であろう。論じたように、より小さいサイズでＧｌｎ６３から離れて位置を変えることができるＡＳＰの場合、類似のＨ結合：Ｈ結合距離は３．９Åであり、したがってあまり有害ではなかった。野生型酵素では、アミド窒素の代わりに、Ｈ結合受容体であるＧｌｕ６３側鎖カルボキシレートの第２の酸素原子が存在し、これはなぜＧｌｎがＥｒＡ−ＷＴの比較的良好な基質であるのかを説明する。Ｇｌｕ側鎖カルボキシレート（およびＡｓｐのそれ）がＴｈｒ９５によって固定されているため、ＡＳＰはＧｌｎ６３のアミド窒素原子との距離を増加させるため、Ｇｌｕは再配置しない。このトレオニンは、Ｔｈｒ１５と組み合わせて、ＡｓｎおよびＧｌｎの酵素的加水分解にとって重要である。したがって、Ｅ６３Ｑ変異は、この大きなアミノ酸がＧｌｕ６３／Ｇｌｎ６３の方向にシフトすることによって活性部位に収まるという要件を利用することによってＧｌｎを区別し、次に、Ｇｌｎα−アミノ基をＧｌｎ６３アミド窒素原子に好ましくない近接度で設置する（ただし、野生型Ｇｌｕ６３と適合する）。
【０１１５】
Ａ３１Ｉ（ＥｒＡ−ＤＭ２に存在する）は、Ｇｌｎに対する差異を増加させるように働くのではなく、むしろＡｓｎのＫｍを低減させる（ＥｒＡ−Ｅ６３Ｑの５１μＭからＥｒＡ−ＤＭ２の３７μＭまで）。この変異はＧｌｎのＫｍをも低減させる。ＥｒＡ−ＤＭ１−ＡＳＰ構造により、この変異が柔軟なＮ末端ループを野生型酵素によって採用されたものとは異なる閉鎖した立体配置を強制的にとらせることを明らかにした。これがどのようにしてＡｓｎ Ｋｍ値を低減させるかは構造からは明らかではない。この変異はループの閉鎖のダイナミクスに影響を及ぼし、最終的に基質Ｋｍ値に影響を及ぼすことが推測された。
【０１１６】
Ｓ２５４Ｎ変異（ＥｒＡ−ＤＭ１に存在する）は、ＡｓｎとＧｌｎとの間の選択性を増加させ、Ｅ６３Ｑ変異と同様の様式でそれを行う。すなわち、この変異は、Ｇｌｎα−アミノ基に近接したＨ−結合供与体を導入する。ＥｒＡ−ＷＴ−ＧｌｕおよびＥｒＡ−ＤＭ１−Ａｓｐの重ね合わせは、変異体酵素に結合したときにＧｌｕが採用するであろう位置を明らかにした。この重ね合わせにより、Ａｓｎ２５４’に向かって移動することにより、より大きなＧｌｕが、Ｈ−結合基間の好ましくない短い（３．２Å）分離をもたらすであろうことが明らかになった。より小さい基質Ａｓｎがこの変異によって著しい程度まで影響を受けない理由は（そのＫｍもまたＥｒＡ−Ｅ６３Ｑの５１μＭからＥｒＡ−ＤＭ１の１８５まで増加したが）、これらのＨ結合供与基間のより大きな分離（３．５Å）によるものであった。
【０１１７】
改善された第２世代の変異体を開発するための構造分析の利用。以前の研究は、６３位および２５４位をＡｓｎ／Ｇｌｎ選択性のための「ホットスポット」として同定し、基質Ｋｍ値を低減させるための３１位を同定した。したがって、３つすべてのホットスポットにおける置換を有する変異体が改善された特性を有するか否かを決定した。三重変異体ＥｒＡ−Ａ３１Ｉ−Ｅ６３Ｑ−Ｓ２５４Ｎ（ＥｒＡ−ＴＭ１）は実際にＡｓｎに対してより低いＫｍを有したが（ＥｒＡ−ＤＭ１については１１０対１７０μＭ、表９）、そのＬ−グルタミナーゼ速度は増加した（表１１）。ＥｒＡ−ＴＭ１は、以前の最も良好な変異体であるＥｒＡ−ＤＭ１よりもわずかに良好であった。
【０１１８】
ＥｒＡ−ＤＭ１−Ａｓｐの構造は、２５４位のグルタミンがＧｌｎに対してより良好に識別し得ることを示した。実際に、ＥｒＡ−Ｅ６３Ｑ−Ｓ２５４Ｑ（ＥｒＡ−ＤＭ３）変異体は、ＥｒＡ−ＤＭ１と比較してさらに高いＧｌｎ Ｋｍを与えられた（８４対１５．８ｍＭ）（表８）。重要なことに、ＥｒＡ−ＤＭ３のＬ−アスパラギナーゼ活性は、Ｓｅｒ２５４をアスパラギン（ＥｒＡ−ＤＭ１の場合）からグルタミンに変えることによって悪影響を受けなかった（表８）。
【０１１９】
非常に高いＧｌｎ Ｋｍ値を有する変異体（ＥｒＡ−ＤＭ３）を同定したため、この変異体にＡ３１Ａ変異を加えた。この変異体にＡ３１Ａ変異を加える利点は、Ａｓｎ Ｋｍ値の低減を含んだ。実際に、ＥｒＡ−Ａ３１Ｉ−Ｅ６３Ｑ−Ｓ２５４Ｑ（ＥｒＡ−ＴＭ２）は、ＥｒＡ−ＤＭ３のＡｓｎ Ｋｍ値の約半分であるＡｓｎ Ｋｍ値を有していた（９５対１７９μＭ、表８）。ＧｌｎのＫｍ値もまた低減したが（４７．５対８４ｍＭ）、この低減にもかかわらず、生理学的血液Ｇｌｎ濃度よりも１００倍高いままであった。したがって、ＥｒＡ三重変異体Ａ３１Ｉ−Ｅ６３Ｑ−Ｓ２５４Ｑ（ＥｒＡ−ＴＭ２）は、高Ｌ−アスパラギナーゼ／低Ｌ−グルタミナーゼ特性の最も良好な組合せを有していた（表１２）。
【表１２】
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【０１２０】
超低Ｌ−グルタミナーゼＥｒＡ−ＴＭ２変異体は、細胞殺作用特性を維持する。この研究は、高Ｌ−アスパラギナーゼおよび低Ｌ−グルタミナーゼ活性を有するいくつかのＥｒＡ変異体を、超低Ｌ−グルタミナーゼ特性を有する２つの変異体（ＥｒＡ−ＤＭ３およびＥｒＡ−ＴＭ２）で設計および特性評価した。超低Ｌ−グルタミナーゼ活性を有する変異体がＡＬＬ細胞を殺す能力を維持しているかどうかを試験するために、ヒトＴ−ＡＬＬ ＬＯＵＣＹ細胞株を漸増濃度のＥｒＡ−ＴＭ２に暴露し、この酵素のＩＣ５０値を決定した。この分析は、ＥｒＡ−ＴＭ２がＥｒＡ−ＷＴのＩＣ５０値（０．０００３３ＩＵ／ｍＬ）に匹敵するＩＣ５０値（０．０００６１ＩＵ／ｍＬ）を有することを示した。
【０１２１】
マウスにおける超低Ｌ−グルタミナーゼＥｒＡ−ＴＭ２の有効性。雌マウスに、ルシフェラーゼ発現ＬＯＵＣＹ細胞を尾静脈注射した。４週間後、マウスをビヒクル（ｎ＝３）、ＥｒＡ−ＷＴ（ｎ＝４）、またはＥｒＡ−ＴＭ２（ｎ＝４）で１４日間毎日処置した（薬用量５０ＩＵ／マウス／日；腹腔内）。生物発光シグナルを０日目、７日目および１４日目に測定した。１４日目の相対的な生物発光イメージング（ＢＬＩ）フラックスを評価し、ビヒクル処置マウスの０日目に対して１０倍増加することが見出された。両方の処置群（ＥｒＡ−ＷＴおよびＥｒＡ−ＴＭ２）について、ビヒクル対照と比較してフラックスは劇的に減少し（ｐ値＜０．０００１）、１４日目までに背景レベルに戻り、処置群間に有意差はなかった。末梢血％ｈｕＣＤ４５＋レベルは、処置開始の１週間前（−７日目）、処置開始（０日目）、および処置の終了（１４日目）に決定した。％ｈｕＣＤ４５＋＞８％で示されるように、０日目にすべての動物に高度に生着した。１４日目までに、ビヒクル処置マウスでは、％ｈｕＣＤ４５＋は４０〜６０％に増加したが、両方の処置群では、％ｈｕＣＤ４５＋は検出できなかった（ビヒクル処置群と酵素処置群との間のｐ値＜０．０００１）。０日目に、処置に使用されたものと同様なＢＬＩフラックスを有する３匹のマウスにおける骨髄％ｈｕＣＤ４５＋の評価は、高い生着を示した。１４日目に、骨髄％ｈｕＣＤ４５＋はビヒクル処置マウスでは高いままであったが、両方の酵素処置群では検出できなかった（ビヒクル処置群と酵素処置群との間のｐ値＜０．０００１）。ビヒクル処置マウスの脾臓は非常に拡大していたが、ＥｒＡ−ＷＴおよびＥｒＡ−ＴＭ２群の脾臓は正常なマウス脾臓と大きさが似ていた。ビヒクル処置マウス、ＥｒＡ−ＷＴ処置マウスおよびＥｒＡ−ＴＭ２処置マウスからの肝臓のＨ＆Ｅ染色されたパラフィン切片は、ビヒクル処置動物がリンパ芽球性白血病細胞の沈着物で満たされた肝臓を有することを示した。対照的に、ＥｒＡ−ＷＴまたはＥｒＡ−ＴＭ２で処置したマウスの肝臓には、検出可能な白血病細胞は存在しなかった。殺作用活性に関して、この分析の結果は、ＥｒＡ−ＴＭ２によるＡＬＬ細胞の著しい殺作用効果を示した（図４）。特に、超低Ｌ−グルタミナーゼＥｒＡ−ＴＭ２は、高Ｌ−グルタミナーゼＥｒＡ−ＷＴと同様に効果的にＴ−ＡＬＬ ＬＯＵＣＹ細胞を排除する。さらに、毒性の指標として体重減少（グラム、０日目に対して）を使用すると、ＥｒＡ−ＷＴ処置マウスは顕著な毎日の体重減少を示したが、体重減少はＥｒＡ−ＴＭ２処置群で０．２９ｇ／日改善したことを観察した（ｐ値＜０．０００１）。
【０１２２】
Ｌ−グルタミナーゼ活性および毒性をさらに相関させるために、ＣＤ−１マウスに急性の単一用量の漸増毒性試験を行った。各群は、ＥｒＡ−ＴＭ２の不足のために４匹の動物（３匹の雌、１匹の雄）のみを有する群６を除いて、３匹の雄および３匹の雌を有していた。ＥｒＡ−ＷＴを投与した動物は有意な身体的および行動的症状を示したが、ＥｒＡ−ＴＭ２を投与した動物はかかる症状がほとんどなかった（表１３）。
【表１３】
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【０１２３】
例４：ＴＲＡＩＬ−ＥｒＡ融合タンパク質
ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）は、アポトーシスによって細胞死を誘導するタンパク質である。したがって、ＴＲＡＩＬ−アスパラギナーゼ融合タンパク質は、これら２つのタンパク質の活性を組み合わせるために作製した。この融合タンパク質を使用して、Ｌ−アスパラギナーゼ成分は細胞にアポトーシスを起こさせ、ＴＲＡＩＬ成分は細胞死を誘導する。
【０１２４】
ヒトＡＭＬ細胞に対する融合タンパク質ＴＲＡＩＬ三量体−ＥｒＡ−ＴＭ２の有効性。１０％ＦＢＳ（Hyclone）および１×ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Invitrogen）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌ−グルタミンを含む）を使用して、ヒト急性骨髄性白血病ＭＶ４；１１細胞を湿潤雰囲気（５％ＣＯ２、３７℃）で培養した。０．０００１〜２．５ＩＵ／ｍｌの範囲の最終濃度までのＤＰＢＳまたはＴＲＡＩＬ三量体−ＥｒＡ−ＴＭ２のいずれかの１０μＬの存在下、細胞懸濁液の９０μＬアリコート（１ｍＬあたり２．５×１０５細胞）を丸底９６ウェルマイクロタイタープレートで三重に培養した。プレートを５％ＣＯ２を含有する加湿空気中３７℃で４日間インキュベートした後、Alamar Blue（Invitrogen）を１０％ｖ／ｖの最終濃度まで加え、プレートをさらに４時間インキュベートした後、蛍光シグナルの読み出しを行った。白血病細胞の生存率は、ＤＰＢＳ対照における蛍光カウントに対するＬ−アスパラギナーゼの存在下での蛍光カウントのパーセンテージとして計算した。この分析は、Ｌ−アスパラギナーゼＥｒＡ−ＴＭ２単独（ＩＣ５０＝１．６３１ＩＵ／ｍＬ）と比較して、活性ＴＲＡＩＬ三量体−ＥｒＡ−ＴＭ２融合タンパク質がＭＶ４；１１細胞株に対して著しく良好な殺作用特性をもつことを示した（ＩＣ５０＝０．０６４ＩＵ／ｍＬ）。
【０１２５】
ＴＲＡＩＬ三量体−ＥｒＡ−ＴＭ２のより良好な抗がん効果が、ＴＲＡＩＬ三量体とＬ−アスパラギナーゼの両方の同調に由来し、ＴＲＡＩＬ三量体単独の活性に由来しないことを確認するために、ＴＲＡＩＬ三量体−ＥｒＡ−ＴＭ２を、同量の不活性な変異体ＴＲＡＩＬ三量体−ＥｒＡ−ＴＭ２−Ｋ１６８Ｍで置換した。この分析の結果、Ｌ−アスパラギナーゼ活性が損なわれると、融合ＴＲＡＩＬ三量体−ＥｒＡ−ＴＭ２−Ｋ１６８Ｍタンパク質はそのＭＶ４；１１細胞の殺作用効果を失うことが実証された。
【０１２６】
マウスにおけるヒトＡＭＬ細胞に対する融合タンパク質ＴＲＡＩＬ三量体−ＥｒＡ−ＴＭ２の有効性。４匹の非肥満糖尿病／重症複合免疫不全γ（ＮＳＧ）マウス（The Jackson Laboratory）に６週齢で５×１０６ルシフェラーゼ陽性ＭＶ４；１１細胞を含有する１５０μＬのＤＰＢＳを静脈内注射した。定期的な時点で、IVIS Lumina II imaging system（PerkinElmer）を使用して生物発光を測定した。生着後（０日目）、マウスをＴＲＡＩＬ三量体−ＥｒＡ−ＴＭ２の１５ＩＵ／マウスの腹腔内注射で１週間毎日処置した。生物発光シグナルを０日目および７日目に測定した。この分析の結果は、ＴＲＡＩＬ三量体−ＥｒＡ−ＴＭ２によるＭＶ４；１１細胞の著しい殺作用効果を示した（図５）。
【０１２７】
例５：in vivo半減期を増加させるためのタグ
Ｌ−アスパラギナーゼの有効性は、薬のin vivo半減期に関連する；半減期が長ければ長いほど、酵素は血液アスパラギンを加水分解するようにより長く作用する。したがって、Ｌ−アスパラギナーゼならびにここに開示される変異体および融合タンパク質のin vivo半減期を増加させるために、タグをＬ−アスパラギナーゼのＮ末端に融合させた。タグは、Ｈｉｓ６−酵母ＳＵＭＯタグ、Ｈｉｓ６−ヒトＳＵＭＯタグおよびアルブミン結合ペプチドＳＡ２１タグを含んでいた。各タグは、Ｌ−アスパラギナーゼ酵素の循環時間を増加させた。さらに、タグの組み合わせを試験した。特に、ＳＡ２１および酵母ＳＵＭＯタグを組み合わせて、さらに長期にわたる半減期を有する変異体を得た。
【０１２８】
ヒスチジンタグ。一連の６〜９個のヒスチジン残基を特定するＤＮＡ配列は、組み換えタンパク質の生産のためのベクターにおいて頻繁に使用される。結果は、そのＮ末端またはＣ末端に融合された６ｘＨｉｓまたはポリ−Ｈｉｓタグを有する組み換えタンパク質の発現である。
【０１２９】
発現されたＨｉｓタグ化タンパク質は、容易に精製および検出され得、タンパク質特異的抗体またはプローブなしで組み換えタンパク質を特異的に精製または検出する手段を提供する。キットはＨｉｓタグタンパク質について市販されている。
【０１３０】
ＳＵＭＯ改変。Ｎ末端融合パートナーとしてのＳＵＭＯは、著しく改善されたタンパク質安定性および溶解性に基づいて、原核および真核の発現系における機能的タンパク質の生産を増強することが見出されている。
【０１３１】
融合タンパク質の発現および精製に続いて、ＳＵＭＯタグは、in vitroでエンドペプチダーゼ活性を介して特異的（ＳＵＭＯ）プロテアーゼによって切断されて、放出されたタンパク質パートナーの所望のＮ末端を生成することができる。ＳＵＭＯタグ発現系は市販されている。いくつかの態様では、ＳＵＭＯタグは、酵母ＳＵＭＯタグ（例えば、Ｓｍｔ３）である。他の態様では、ＳＵＭＯタグは、ヒトＳＵＭＯタグ（例えば、ＳＵＭＯ−１、ＳＵＭＯ−２またはＳＵＭＯ−３）である。
【０１３２】
Ｈｉｓ−ＳＵＭＯ改変。ポリヒスチジン（例えば、６ｘＨｉｓ）タグとＳＵＭＯ改変を組み合わせることにより、効率的な精製、増加した発現および溶解性、ならびにＬ−アスパラギナーゼの増加した半減期が提供される。目的のタンパク質にＨｉｓ−ＳＵＭＯ改変を提供するための発現系は市販されている。例えば、CHAMPION pET SUMO protein expression system（Invitrogen）を参照されたい。
【０１３３】
アルブミン結合ドメイン。アルブミン結合ドメインは、グラム陽性細菌によって発現される様々な表面タンパク質に見られる小さな３ヘリックスのタンパク質ドメインである。かかるアルブミン結合領域は、タンパク質精製または固定化に使用されている。例示的なアルブミン結合ドメインには、ＳＡ２０（ＱＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦ；配列番号１３）、ＳＡ２１（ＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤ；配列番号１４）およびＳＡ３１（ＲＬＩＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ；配列番号１５）を含むが、これらに限定されない。
【０１３４】
さらに、かかるドメインを治療上のタンパク質に融合させることによって、アルブミンとの非共有結合による薬物動態の改善に成功したことが示されている。Dennis, et al. (2002) J. Biol. Chem. 277(38):35035-35043；US 2016/0185874；およびUS 2004/0001827を参照されたい。
【０１３５】
例６：部位特異的なＰＥＧ化
ＰＥＧの機能は、Ｌ−アスパラギナーゼをタンパク質分解および宿主免疫システムから保護することである。Ｌ−アスパラギナーゼのマレイミドベースのＰＥＧ化を可能にするために、様々なアミノ酸残基をシステイン残基に変異させて、酵素活性にほとんどまたはまったく影響を及ぼさない好適な位置を同定した。注目すべきことに、ＥｒＡ−ＷＴおよびＥｒＡ−ＴＭ２はシステイン残基を含有しない。したがって、このアミノ酸残基の導入は、折りたたみまたは活性を破壊しないように、酵素の適切な位置になければならなかった。したがって、ＥｒＡ−ＴＭ２の構造を分析して、システインに変異し得る残基の領域を同定した。（１）表面に位置し、（２）オリゴマー化界面から適切な距離にあり（ＥｒＡ−ＴＭ２は四量体であるため、界面付近の残基をＰＥＧ化することは酵素の活性に有害であり得る）、（３）外側を指している残基を含む、５つのかかる領域を同定した（表１４）。
【表１４】
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【０１３６】
部位特異的なＰＥＧ化のための部位としての表１４のアミノ酸残基の使用を実証するために、ＥｒＡ−ＴＭ２の残基Ａｓｐ８４をシステインに変異させた。得られたＥｒＡ−ＴＭ２−Ｄ８４Ｃタンパク質を発現させ、精製し、ｍＰＥＧ−１０ＫでＰＥＧ化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいて、ＥｒＡ−ＴＭ２−Ｄ８４Ｃタンパク質の分子量の測定可能な増加によって証明されるように、ＥｒＡ−ＴＭ２−Ｄ８４ＣをＰＥＧ化した。
【０１３７】
続いて、Ｄ８４Ｃ変異およびそのＰＥＧ化バージョンが酵素活性に負の影響を及ぼさないことを確認した。ＥｒＡ−ＴＭ２、ＥｒＡ−ＴＭ２−Ｄ８４Ｃ、およびＰＥＧ化−ＥｒＡ−ＴＭ２−Ｄ８４Ｃの活性を比較すると、各酵素の計算した速度は同等であることを観察した。ここで、ＥｒＡ−ＴＭ２−Ｄ８４ＣのＰＥＧ化により、ＥｒＡ−ＴＭ２と比較して活性は１０％未満低減した（表１５）。
【表１５】
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【０１３８】
これらのデータに照らせば、ＰＥＧ化のためのシステイン残基の組み込みを含むように標的化することができるここに開示されるＬ−アスパラギナーゼの５つの領域（表１４）が存在する。本発明によれば、ＰＥＧ５Ｋ、ＰＥＧ１０Ｋ、ＰＥＧ２０Ｋ、ＰＥＧ４０Ｋなどの大きな分子量のＰＥＧ分子とのシステイン残基のマレイミドベースのコンジュゲーションにより、直鎖または分枝ＰＥＧ分子のいずれかとして、ＰＥＧ化を達成することができる。１、２、３、４または５個のシステイン残基が表１４に示される位置に組み込まれ、それにより１〜５個のＰＥＧ付着部位が提供され得ることが企図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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