(57)【要約】  記載した発明は、大脳内出血および脳微小出血のゼブラフィッシュ並びにマウスモデルを用いて識別される大脳内出血および脳微小出血の発生を減少させることができる小分子治療化合物に関し、前記小分子治療化合物は、アルテムエーテルおよびその誘導体（例えばジヒドロアルテミシニン、アルテミシニン、アルテスネート）、ベニジピン、ラシジピン、エチニルエストラジオール並びにトリプトリドから成る群から選択される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管漏出の発生を減少させる方法であって、前記方法が、小分子治療化合物を含む医薬組成物を投与する工程を含み、当該化合物の治療量が、脳内の出血の発生をコントロールと比較して少なくとも30％減少させるために有効である、前記方法。
【請求項２】
当該小分子治療化合物がアルテムエーテルまたはアルテムエーテル誘導体から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
当該アルテムエーテル誘導体がジヒドロアルテミシニン、アルテミシニンまたはアルテスネートである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
当該小分子治療化合物が、ベニジピン、ラシジピン、エチニルエストラジオールまたはトリプトリドから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
当該血管漏出が、スタチンによって、リポ多糖類によって、または両者によって誘発される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
当該スタチンがアトルバスタチンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
当該血管漏出が偶発的大脳内出血である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
当該偶発的大脳内出血が、ベータ-pix、Pak2a、cdh5、ccm1、ccm2、ccm3、Rap1b、Pggt1b、Hmgcrb、およびインテグリンベータ3から選択される１つ以上の遺伝子の変異と関連して発生する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
当該血管漏出が脳微小出血を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
当該脳微小出血がスタチンの投与に関連して発生する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
当該血管漏出が脳血管の奇形を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
当該脳血管の奇形が大脳海綿状奇形である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互引用）本出願は、米国仮特許出願No.62/370,077（2016年8月2日出願）（発明の名称：SMALL MOLECULE THERAPEUTIC COMPOUNDS THAT REDUCE THE INCIDENCE OF INTRACEREBRAL HEMORRHAGE AND BRAIN MICROHEMORRHAGES（大脳内出血および脳微小出血の発生を軽減する小分子治療化合物））に関し優先権を主張する（前記出願は参照によってその全体が本明細書に含まれる）。
（技術分野）
記載の発明は、大脳内出血および脳微小出血の発生を軽減することができる小分子治療化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの病的状態が血管ネットワークの脱安定化を引き起こし、内皮の高透過性、過剰な血管出芽、および血管新生をもたらす（Smith MCP, Li, DY, Whitehead, KJ (2010) “Mechanisms of vascular stability and the relationship to human disease,” Curr.Opin.Hematol.17(30), 237-44）。
血管透過性
血管透過性は、種々の状況下で、明瞭に異なる血管タイプを巻き込み、異なる解剖学的および分子的経路を利用する極めて複雑なプロセスである。
高等生物の血管系はしばしば“閉鎖されている”と記載されるが、前記は、組織との小分子（気体、栄養物、老廃物）の容易な交換を可能にするために十分に“開放されている”ことを必要とする（Nagy, J.A., Benjamin, L., Zeng, H., Dvorak, A.M., Dvorak, H.F.(2008) “Vascular permeability, vascular hyperpermeability and angiogenesis,” Angiogenesis 11(2):  109-119）。
透過性（血管透過性亢進作用因子（vascular permeabilizing agent）に応答してまたは病的な血管新生部位で、血管床を横切って間質に蓄積した溶質（典型的には巨大分子）の正味量を意味する）は極めて複雑なプロセスであり、前記は多くの種々の変数の影響を受ける（上掲書）。これら変数には、関与する種々のタイプの微小血管（毛細血管、細静脈、母血管（mother vessel, MV））の固有の特性；血管外漏出分子のサイズ、形状および荷電；分子が内皮細胞障壁の通過に利用する解剖学的経路；透過性が測定されるタイムコース；並びに究明しようとしている動物および血管床が含まれる（上掲書）。
【０００３】
基礎血管透過性（BVP）
正常組織の分子交換は主として毛細血管で多くが拡散によって生じる。交換される分子は多くが気体（O2およびCO2）、水、小分子（例えば塩および糖類）、およびほんの少量の血漿タンパク質から成る（上掲書）。BVPの程度は種々の正常組織で顕著に変動し、静水圧の変化、閉鎖管の開口、交換に利用できる表面積、血流などに応答して実質的な変化を受ける（上掲書）。
【０００４】
水および親油性溶質（例えば気体、例えばO2およびCO2）は内皮細胞を通って拡散することができ、それらはまた容易に内皮細胞間接合部および内皮窓を通過する（上掲書）。親油性小分子はまた内皮細胞膜に溶解することができ、したがって血管腔を通過して間質へ入ることができる（上掲書）。毛細血管内皮細胞は多数の小さな（直径約70nm）小胞（カベオラ）を含み、その大半は、薄い隔膜によって一般的には閉じられている小孔という手段によって管腔側および反管腔側の形質膜とつながっているのが認められる。前記隔膜は、形質膜小胞結合タンパク質（PV-1）、カベオラの小孔隔膜、内皮貫通チャネル、小胞液胞小器官および内皮窓の隔膜と結合する内皮特異的統合膜糖タンパク質を含んでいる（Stan, RV, Tkachenko, E., Niesman, IR, (2004), “PV1 is a key structural component for the formation of the stomatal and fenestral diaphragms,” Mol.Biol.Cell 15(8):  3615-30）。他のものは細胞質に存在する。
【０００５】
急性血管高透過性（AVH）
血管透過性の急速な増加は、微小血管構造が、多数の血管透過性亢進作用因子のいずれか（例えばVEGF-A、ヒスタミン、セロトニン、PAFなど）に急激に暴露されるときに生じる。これらの作用因子のいくつか（例えばヒスタミン、セロトニン、VEGF-A）は普段は組織の肥満細胞に貯蔵され（Nagy, J.A., Benjamin, L., Zeng, H., Dvorak, A.M., Dvorak, H.F.(2008)“Vascular permeability, vascular hyperpermeability and angiogenesis,” Angiogenesis 11(2):109-119（以下を引用している：Boesiger J, Tsai M, Maurer M et al (1998) Mast cells can secrete vascular permeability factor/vascular endothelial cell growth factor and exhibit enhanced release after immunoglobulin E-dependent upregulation of fc epsilon receptor I expression.J Exp Med 188:1135-1145）；Galli SJ (2000) Mast cells and basophils.Curr Opin Hematol 7:32-39；Galli SJ (1997) The Paul Kallos Memorial Lecture.The mast cell: a versatile effector cell for a challenging world.Int Arch Allergy Immunol 113:14-22）、したがって肥満細胞の脱顆粒を引き起こす作用因子（例えばアレルギー、昆虫咬傷など）によって放出され得る。これらの透過性因子のいずれかの単一暴露は、組織への血漿の急速であるが自己限定的（20−30分までに完結）な流入をもたらす。
【０００６】
AVHにおける血管外漏出液の量はBVPで見出されるものより大きく増加し、その組成も大きく変化する。AVHで血管外に漏出する液は血漿タンパク質に富み、血漿で見出されるレベルに近づき、滲出液と称される（上掲書）。血管外に漏出する血漿タンパク質ではとりわけフィブリノゲンおよび血液凝固カスケードの多様なメンバーが存在する（上掲書）。これらが組織因子（多くの間質細胞によって普段に発現されるタンパク質）と接触するとき、凝固系が活性化され、滲出液を凝固させてフィブリンが堆積される（上掲書、以下を引用している：Dvorak HF, Quay SC, Orenstein NS et al (1981) Tumor shedding and coagulation.Science 212:923-924；VanDeWater L, Tracy PB, Aronson D et al (1985) Tumor cell generation of thrombin via functional prothrombinase assembly.Cancer Res 45:5521-5525）。フィブリンは水および他の溶質を閉じ込めるゲルを形成し、リンパ管または毛細血管によるそれらの除去を抑制して組織の腫脹（浮腫）を生じる（上掲書）。透過性刺激が持続的でないかぎり、堆積されたフィブリンは更なる結果をもたらすことなく急速に分解される（上掲書）。
【０００７】
AVHはまた、血管外漏出が後毛細血管細静脈（毛細血管のすぐ下流の高度に特異的な血管）から生じるという点でBVPと相違する（上掲書、以下を引用している：Majno G, Palade GE, Schoefl GI (1961) Studies on inflammation.II.The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study.J Biophys Biochem Cytol 11:607-626；Majno G, Shea SM, Leventhal M (1969) Endothelial contraction induced by histamine-type mediators: an electron microscopic study.J Cell Biol 42:647-672）。ヒスタミンおよび他の血管透過性亢進作用因子は、内皮細胞の収縮および引離しを誘発して、十分なサイズの細胞間（傍細胞）ギャップを形成させ血漿タンパク質の漏出を可能にすると提唱された（上掲書）。加えて、細静脈の内皮は構造物、小胞液胞小器官（VVO）を含み、前記は、透過性因子に応答して血漿を漏出させるまた別の内皮細胞貫通ルートを提供する（上掲書、以下を引用している：Kohn S, Nagy JA, Dvorak HF et al (1992) Pathways of macromolecular tracer transport across venules and small veins.Structural basis for the hyperpermeability of tumor blood vessels.Lab Invest 67:596-607；Dvorak AM, Kohn S, Morgan ES et al (1996) The vesiculo-vacuolar organelle (VVO): a distinct endothelial cell structure that provides a transcellular pathway for macromolecular extravasation.J Leukoc Biol 59:100-115；Feng D, Nagy J, Dvorak A et al (2000) Different pathways of macromolecule extravasation from hyperpermeable tumor vessels.Microvascular Research 59:24-37；Feng D, Nagy JA, Hipp J et al (1996) Vesiculo-vacuolar organelles and the regulation of venule permeability to macromolecules by vascular permeability factor, histamine, and serotonin.J Exp Med 183:1981-1986；Feng D, Nagy JA, Hipp J et al (1997) Reinterpretation of endothelial cell gaps induced by vasoactive mediators in guinea-pig, mouse and rat: many are transcellular pores.J Physiol 504(Pt 3):747-761）。VVO（数百の被覆されていない細胞質小胞および液胞で構成され一緒になって、細静脈の内皮細胞質を横切る小器官を形成するブドウ様クラスターである）は、しばしば内皮細胞間の境界に達し、それらの個々の液胞は（カベオラとは異なり）、通常は内皮細胞間の裂け目に向かって開いている（上掲書）。小胞および液胞を含むVVOのサイズはカベオラのそれらサイズから10倍大きい体積を有する液胞まで変動する（Feng D, Nagy JA, Pyne K et al (1999) Pathways of macromolecular extravasation across microvascular endothelium in response to VPF/VEGF and other vasoactive mediators.Microcirculation 6:23-44）。これらの小胞および液胞は、互いにさらに管腔側および反管腔側の形質膜に小孔によって接続される。前記小孔は、薄い隔膜によって普段は閉じられカベオラで見出されるものと類似しているように見える（上掲書）。血管透過性を誘発する作用因子は小胞および液胞の相互接続を引き起こして開放させ、それによって血漿および血漿タンパク質の血管外漏出のための細胞貫通経路を提供すると提唱されている（上掲書）。
【０００８】
慢性血管高透過性（CVH）
透過性因子への慢性的暴露は細静脈の構造および機能に深刻な変化を生じ、前記は、腫瘍、治癒中創傷および慢性炎症疾患（例えば関節リウマチ、乾癬、細胞性免疫など）で見いだされる病的な血管新生の慢性高透過性をもたらす（上掲書、以下を引用している：Dvorak HF (2003) Rous-Whipple award lecture.How tumors make bad blood vessels and stroma.Am J Pathol 162:1747-1757；Nagy JA, Masse EM, Herzberg KT et al (1995) Pathogenesis of ascites tumor growth: vascular permeability factor, vascular hyperpermeability, and ascites fluid accumulation.Cancer Res 55:360-368）。AVHのように、血管外漏出液は血漿の全体的組成に近い滲出液である。腫瘍では、液の蓄積は概して間質圧の増加と関係し（上掲書、以下を引用している：Jain RK (1988) Determinants of tumor blood flow: a review.Cancer Res 48:2641-2658）、この圧の増加は、持続的な血管高透過性、液体が閉じ込めたフィブリンゲルの蓄積による滲出液の凝固、不適切なリンパ液の排出、および一緒になって液の消散を制限する周囲組織による強制的拘束からもたらされる（上掲書）。これらの拘束は、腫瘍が体腔（例えば腹腔）内またはその周辺で増殖するときにはほとんど存在せず、このような場合には大量の腹水が蓄積する（上掲書）。
【０００９】
BPVおよびAVHとは対照的に、CVHでは液体漏出はいずれのタイプの正常な血管からも生じない。その代わり、腫瘍でも創傷でも漏出を生じる血管は新しく形成され（新生血管）、これらは主として母血管（MV）および規模は小さいがMVから生じる類糸球体状微小血管増殖（GMP）である（上掲書、以下を引用している：Nagy JA, Feng D, Vasile E et al (2006) Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A.Lab Invest 86:767-780；Pettersson A, Nagy JA, Brown LF et al (2000) Heterogeneity of the angiogenic response induced in different normal adult tissues by vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor.Lab Invest 80:99-115；Sundberg C, Nagy JA, Brown LF et al (2001) Glomeruloid microvascular proliferation follows adenoviral vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor-164 gene delivery.Am J Pathol 158:1145-1160；Brown LF, Detmar M, Claffey K et al (1997) Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor: a multifunctional angiogenic cytokine.Exs 79:233-269；Brown LF, Yeo KT, Berse B et al (1992) Expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) by epidermal keratinocytes during wound healing.J Exp Med 176:1375-1379；Ren G, Michael LH, Entman ML et al (2002) Morphological characteristics of the microvasculature in healing myocardial infarcts.J Histochem Cytochem 50:71-79）。母血管は大きく拡張した洞様毛細血管であり、前記は、周皮細胞の剥離、血管基底膜の劣化、および管腔サイズの4−5倍の増加（広範囲の内皮細胞薄痩化に付随する）を含むプロセスによって既存の正常な細静脈から生じる（上掲書）。血流（流速）は血管半径の4乗に比例することをポアズイユの法則が示しているにもかかわらず、MVは血漿に対するその高透過性（ヘマトクリットの顕著な増加をもたらす）のためにゆっくりとした血流を示す（上掲書）。CVHの高タンパク質滲出液は組織因子と相互反応し、凝固系を作動させてフィブリンを堆積させる（上掲書、以下を引用している：Dvorak HF, Quay SC, Orenstein NS et al (1981) Tumor shedding and coagulation.Science 212:923-924；VanDeWater L, Tracy PB, Aronson D et al (1985) Tumor cell generation of thrombin via functional prothrombinase assembly.Cancer Res 45:5521-5525）。
【００１０】
組織因子は宿主間質細胞と同様に多くの腫瘍細胞上で発現され、さらに前記因子はVEGF-Aによって内皮細胞中で誘発される（上掲書）。その液体閉じ込め特性に加えて、フィブリンはまた、時間をかけて存続するとき腫瘍及び治癒中創傷の場合のように多くの他の特性を示し、血管新生を促進する暫定的間質を提供する。前記暫定的間質は、新しい血管および線維芽細胞の内方増殖並びに成熟線維血管間質の敷設を誘発し後にはこれらに置き換えられる（前掲書、以下を引用している：Dvorak HF (2003) Rous-Whipple award lecture.How tumors make bad blood vessels and stroma.Am J Pathol 162:1747-1757；Dvorak HF, Orenstein NS, Carvalho AC et al (1979) Induction of a fibrin-gel investment: an early event in line 10 hepatocarcinoma growth mediated by tumor-secreted products.J Immunol 122:166-174；Dvorak HF, Dvorak AM, Manseau EJ et al (1979) Fibrin gel investment associated with line 1 and line 10 solid tumor growth, angiogenesis, and fibroplasia in guinea pigs.Role of cellular immunity, myofibroblasts, microvascular damage, and infarction in line 1 tumor regression.J Natl Cancer Inst 62:1459-1472）。フィブリンは多数の細胞タイプによって発現されるインテグリンと相互反応し、それによって腫瘍細胞とともに宿主間葉系細胞（内皮細胞、周皮細胞、線維芽細胞）および炎症性細胞（好中球、単球）の遊走を助ける（上掲書）。フィブリンはまた増殖因子を隔離してそれらを分解から保護し、さらに血管新生促進分子、例えばIL-8および組織因子の発現を誘発する（上掲書）。フラグメントE（フィブリン分解生成物）は直接的に血管新生を促進する（上掲書）。巨大分子は多くが細胞貫通ルートを介してMVおよびGMPから血管外に漏出する（上掲書、以下を引用している：Nagy JA, Feng D, Vasile E et al (2006) Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A.Lab Invest 86:767-78）。
【００１１】
要するに、VEGF-Aのような作用因子は長い間AVHおよびCVHを誘発することが知られていたが、血流力学因子を別とすれば、BPVの正常な透過性のために必要とされる分子的事象についてははるかに少ししか知られてなく、透過性の調節に関係する分子について判明していることはさらに少なく、前記種々のタイプの透過性の各々を支配する分子的メカニズムは大いに相違する可能性がある。血管透過性の誘発に作用する良く研究されているNOSおよびカベオリン-1のような分子ですらそのシグナリング経路はほとんど理解されていない（上掲書）。重要な事象、例えばカベオラのシャトリング、VVOの隔膜の開口、窓の形成、内皮細胞接合部の変化などを調節する分子メカニズムについてはほとんど分かっていない（上掲書、以下を引用している：Dejana E (2004) Endothelial cell-cell junctions: happy together.Nat Rev Mol Cell Biol 5:261-270；Oh P, Borgstrom P, Witkiewicz H et al (2007) Live dynamic imaging of caveolae pumping targeted antibody rapidly and specifically across endothelium in the lung.Nat Biotechnol 25:327-337；Ioannidou S, Deinhardt K, Miotla J et al (2006) An in vitro assay reveals a role for the diaphragm protein PV-1 in endothelial fenestra morphogenesis.Proc Natl Acad Sci U S A 103:16770-16775）。
【００１２】
血管新生
血管新生は、胚形成、成人組織の恒常性および発癌時に既存の血管から新血管が形成されるプロセスである（Katoh, M., (2013) “Therapeutics targeting angiogenesis:  genetics and epigenetics, extracellular miRNAs and signaling networks,” Intl J.Mol.Med.32(4):  763-67, citing Carmeliet P.(2005) Angiogenesis in life, disease and medicine.Nature.438:932-936；Ferrara N, Kerbel RS.(2005) Angiogenesis as a therapeutic target.Nature.438:967-974；Folkman J.(2007) Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery？ Nat Rev Drug Discov.6:273-286；Carmeliet P, Jain RK.(2011) Molecular mechanisms and clinical applications of angiogenesis.Nature.473:298-307）。血管新生は血管形成とは全く異なり、後者は、中胚葉由来の血管芽細胞の発生中のin situ分化および血管成長である。
血管新生は以下のように複数の工程で生じる：i）基底膜の分解および内皮細胞の接着低下によって誘発される血管の脱安定化；ii）内皮先端細胞の遊走および内皮茎細胞の増殖から生じる血管新生出芽；iii）内皮細胞による管腔形成および内皮管腔の周辺領域への周皮細胞の補充；vi）密な接合部および基底膜次第の血管安定化（Katoh, M., (2013) “Therapeutics targeting angiogenesis - genetics and epigenetics, extracellular miRNAs and signaling networks,” Intl J.Mol.Med.32(4): 763-67, citing Carmeliet P.(2005) Angiogenesis in life, disease and medicine.Nature.438:932-936).
【００１３】
血管内皮増殖因子（VEGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF2）、アンギオポイエチン（ANGPT1およびANGPT2）、ノッチリガンド（ジャグド1（JAG1）およびデルタ様リガンド4（DLL4））および形質転換増殖因子-β（TGF-β）は、血管内皮細胞上のそれらの受容体を介して血管新生を調節する。VEGFは、内皮細胞上のVEGRF2受容体を介して、内皮硝酸酸化物シンターゼ（eNOS）、SRC、RAS-ERKおよびPI3K-AKTシグナリングカスケードを活性化する（前記はそれぞれ血管透過性、内皮の遊走、増殖および生存を誘発する）（上掲書、以下を引用している：Coultas L, Chawengsaksophak K, Rossant J.(2005) “Endothelial cells and VEGF in vascular development.” Nature.438:937-945；Olsson AK, Dimberg A, Kreuger J, Claesson-Welsh L.(2006) “VEGF receptor signaling-in control of vascular function.” Nat Rev Mol Cell Biol.7:359-371）。FGF2は、内皮細胞上のFGFR1受容体を介してVEGFと同様にシグナリングカスケードにより直接的に、または内皮細胞、心筋細胞および間質細胞のVEGF分泌により間接的に血管新生を促進する（上掲書、以下を引用している：Presta M, Dell’Era P, Mitola S, et al.(2005) “Fibroblast growth factor/fibroblast growth factor receptor system in angiogenesis.” Cytokine Growth Factor Rev.16:159-178）。ANGPT1（周皮細胞から分泌される）は、TEK/TIE2受容体を活性化して内皮の活動停止または安定化を維持し、一方、ANGPT2（VEGFまたは低酸素症シグナリングによって内皮細胞それ自体から分泌される）は、TEKを抑制して内皮活性化または出芽を促進する（上掲書、以下を引用している：Fagiani E, Christofori G.(2013) “Angiopoietins in angiogenesis.” Cancer Lett.328:18-26）。JAG1-ノッチシグナリングは血管新生出芽を促進し、一方、DLL4-ノッチシグナリングは血管新生出芽を抑制する（上掲書、以下を引用している：Bridges E, Oon CE, Harris A.(2011) “Notch regulation of tumor angiogenesis.” Future Oncol.7:569-588）。TGFBR1/ALK5受容体からSmad2/3カスケードを介するTGF-βシグナリングは、内皮細胞活性化を抑制して内皮の活動停止を維持し、一方、ACVRL1/ALK1受容体からSmad1/5カスケードを介するTGF-βシグナリングは、内皮細胞の遊走および増殖を促進する（上掲書、以下を引用している：Gaengel K, Genove G, Armulik A, Betsholtz C.(2009) “Endothelial-mural cell signaling in vascular development and angiogenesis.” Arterioscler Thromb Vasc Biol.29:630-638）。VEGF、FGF、ノッチおよびTGF-βシグナリングカスケードは、内皮細胞の血管新生シグナリングに直接関与する（上掲書）。
【００１４】
VEGF、FGF、ノッチおよびTGF-βシグナリングカスケードは、WNTおよびヘッジホッグシグナリングカスケードとクロストークして、幹細胞シグナリングネットワークを構成する（上掲書、以下を引用している：Katoh M, Katoh M.(2007) “WNT signaling pathway and stem cell signaling network.” Clin Cancer Res.13:4042-4045；Katoh Y, Katoh M.(2008) “Hedgehog signaling, epithelial-to-mesenchymal transition and miRNA,” Int J Mol Med.22:271-275）。DVL2結合デユビキチナーゼFAM105Bは、WNTシグナリングおよび血管新生を調節し（上掲書、以下を引用している：Rivkin E, Almeida SM, Ceccarelli DF, et al.(2013) “The linear ubiquitin-specific deubiquitinase gumby regulates angiogenesis.” Nature 498:318-324）、一方、ヘッジホッグシグナリングは、肝洞様毛細血管内皮細胞の調節に関与する（上掲書、以下を引用している：Diehl AM.(2012) “Neighborhood watch orchestrates liver regeneration.” Nat Med.18:497-499）。FGF、ノッチおよび正規のWNTシグナリングは、相互の転写調節に基づいて細胞の運命の決定に関与し、一方、FGF、ノッチ、TGF-β、ヘッジホッグおよび非正規のWNTシグナリングは、SNAI1（カタツムリ）、SNAI2（ナメクジ）、ZEB1、ZEB2およびTWISTのアップレギュレーションにより上皮間葉転換（EMT）に関与する（Katoh, M., Nakagama, H., (2014) “FGF receptors: cancer biology and therapeutics,” Med.Res.Rev.34(2): 280-300）。EMTは内皮間葉転換（EndMT）と類似する細胞プロセスである。低酸素症は、VEGFアップレギュレーションの結果として血管新生を誘発する（Dewhirst MW, Cao Y, Moeller B.(2008) “Cycling hypoxia and free radicals regulate angiogenesis and radiotherapy response.” Nat Rev Cancer.8:425-437）。血管新生は、VEGF、FGF、ノッチ、TGF-β、ヘッジホッグおよびWNTシグナリングカスケード（前記は内皮細胞の活動停止、遊走および増殖を直接または間接的に調節する）によって統合される。
【００１５】
血管新生のもっとも初期段階で、例えば創傷および虚血によって誘発される血管新生サイトカインVEGFに応答して血管基底膜が分解する（Senger, DR, and David, GE, (2011) “Angiogenesis,” Cold Spring Harb.Perspect.Biol.Aug.3(8):  a005090、以下を引用している：Sundberg, C.et al.(2001) “Glomeruloid microvascular proliferation follows adenoviral vascular permeability factor/VEGF-164 gene delivery,” Am J Pathol 158: 1145-1160；Rowe, RG and Weiss, SJ (2008) “Breaching the basement membrane: Who, when and how？” Trends Cell Biol 18: 560-574；Chang SH et al.(2009) “VEGF-A induces angiogenesis by perturbing the cathepsin-cysteine protease inhibitor balance in venules, causing basement membrane degradation and mother vessel formation,” Cancer Res 69: 4537-4544）。基底膜の分解に続き、さらに血管出芽として知られている後続段階によって（上掲書、以下を引用している：Nicosia, RF and Madri, JA (1987) “The microvascular extracellular matrix.Developmental changes during angiogenesis in the aortic ring-plasma clot model.” Am J Pathol 128: 78-90）、血管は漏出し易くなりさらに血漿タンパク質に対して高透過性になる（上掲書、以下を引用している：Sundberg, C.et al.(2001) “Glomeruloid microvascular proliferation follows adenoviral vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor-164 gene delivery.” Am J Pathol 158: 1145-1160）。この血管高透過性は、血漿タンパク質（フィブリノゲン、ビトロネクチンおよびフィブロネクチン）の血液からの漏出を引き起こす（上掲書、以下を引用している：Senger, DR (1996) “Cell migration promoted by a potent GRGDS-containing thrombin-cleavage fragment of osteopontin.” Biochim Biophys Acta 1314: 13-24；Sundberg, C.et al.(2001) “Glomeruloid microvascular proliferation follows adenoviral vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor-164 gene delivery.” Am J Pathol 158: 1145-1160）。フィブリノゲンは続いて酵素性凝固によりフィブリンに変換され、血管外漏出ビトロネクチンおよびフィブロネクチンと一緒になって直ちに間質コラーゲンマトリックスを変換して、新しい暫定的なECMを形成する。したがって、初期段階の血管新生出芽は、血漿に由来するフィブリン、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンと一緒に既存の間質コラーゲンに富む環境で進行すると一般的に考えられている。血管の形態発生が進行し、血管出芽が管腔を獲得するにつれ、成熟した新しい管は再び結合周皮細胞を有する血管基底膜で覆い隠され、それによって安定性が達成される（上掲書、以下を引用している：Grant, DS and Kleinman, HK (1997) “Regulation of capillary formation by laminin and other components of the extracellular matrix.” EXS 79: 317-333；Benjamin, LE et al.(1999) “Selective ablation of immature blood vessels in established human tumors follows vascular endothelial growth factor withdrawal.” J Clin Invest 103: 159-165）。血液チューブ（vascular tube）への周皮細胞の補充は、この基底膜の組み立て工程をin vitroおよびin vivoで直接制御する（上掲書、以下を引用している：Stratman, AN et al.(2009) “Pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly stimulates endothelial basement membrane matrix formation.” Blood 114: 5091-5101；Stratman, AN et al.(2010) “Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization.” Blood 116: 4720-4730）。したがって、血管新生サイトカインによる刺激に応答して、成人の血管新生は、一般的には以下の基礎的段階により進行すると考えられる：（1）血管基底膜の分解および活動停止内皮細胞（EC）の活性化；（2）暫定的なECM内でのECの出芽および増殖；（3）血管出芽内の管腔形成、それによる血液チューブの作出；および（4）支持周皮細胞と結合した成熟血管基底膜による血液チューブの被覆。
【００１６】
新血管形成
血管新生（現存の血管から新しい血管が形成される）としばしば同義語と考えられているが、新血管形成は、血管新生で始まり新しい機能的循環ネットワークの形成をもたらす多数のフェーズを経て進行する、はるかに広範囲の一連の時間的に制御された血管プロセスを含む（LeBlanc, AJ et al, (2012) “Microvascular repair - post-angiogenesis vascular dynamics,” Microcirculation 19(8): 10.1111/j.1549-8719.2012.00207.x）。新血管形成の開始時に、対応する微小血管断片はそれらの安定的な血管構造を弛緩させ、新しい血管断片の形成をもたらす血管出芽を開始する（上掲書）。続いて、当該新しく形成された新血管は、血管細胞分化および新しく形成された血管壁への周皮細胞の取り込みを介して再構築され、適切な密度及び分布の細動脈、細静脈および毛細血管を生じる（上掲書）。最後に、新しく形成された血管ネットワークは成熟し、再構築されてより効率的な灌流を生じ、前記は組織の灌流の要求および機能に適合する（上掲書）。
有効な成人組織の新血管形成は（自然に生じるか治療的手段によるかにかかわらず）、血管ネットワークの拡張および血液灌流経路長の増加をもたらし、前記はより多くの血液の組織への適切なデリバリーを生じる（上掲書）。
【００１７】
型どおりの血管構造物は存在しないが、一般的には微小血管ネットワークは、遠位の毛細血管に血液をデリバリーする、口径がだんだん小さくなる小動脈/細動脈の分岐ネットワークを流入側に含み、前記は続いて口径が増加する流出細静脈/小静脈の分岐ネットワークに排出されるが、ただしこの基本的なネットワーク機構の変型が存在し、しばしば組織および/または器官に特異的な機能を反映する（上掲書）。3つの大まかな血管区画の各々（細動脈、毛細血管および細静脈）は、それらの構造的および機能的特徴並びに血管構造内のそれらの配置のためにその微小循環内で異なる機能を演じる（上掲書）。細動脈はその血管回路内で血流に対してもっとも強い抵抗を提供し、この抵抗の大半は分岐順位1番目及び2番目の細動脈に帰される（上掲書、以下を引用している：Mayrovitz HN, Wiedeman MP, Noordergraaf A.(1975) “Microvascular hemodynamic variations accompanying microvessel dimensional changes.” Microvasc Res.10:322-29 Box 1）。これは主として、栄養動脈とより小さな細動脈との間に相対的に大きな直径差があることおよびこれらの近位細動脈の数が相対的に少ないことによる。より優勢な下流及び末端細動脈は組織全体に血液を広範囲に行きわたらせるために働き、さらに血管緊張動力学を介して、もっとも遠位の毛細血管への血流を制御する。毛細血管の非常に小さな直径及び大きな数は、効果的な酸素並びに他の血中栄養物および分子の血液-組織交換を支援するためにそれら毛細血管を理想的にする。最後に、細静脈は、部分的には比較的抵抗性の少ない壁のために、高性能排水系として機能する。重要なことには、優れた微小循環床では、血管の直径は血管区画内で減少するので、当該区画内の血管の数は分岐により増加する。これは、十分に大きな横断面積をもたらし、たとえ単一血管断片内の抵抗が高くても、当該区画全体の比較的低い血流に対して抵抗を維持するために十分である（抵抗と直径の4乗との間の反比例関係による）。したがって、微小血管構造全体の適切な抵抗を維持するために、したがって効果的な灌流を維持するために、適切に分岐順位を付けることが重要である。加えて、組織内の血流分布は、対数態様で分岐の程度に左右される（Mayrovitz HN, Tuma RF, Wiedeman MP.(1977) “Relationship between microvascular blood velocity and pressure distribution.” Am J Physiol.;232:H400-5）。血管口径と血管数（すなわち分岐）との間の正規化関係は、機能的な微小血管ネットワーク構造の重要な特性である。この関係のミスマッチは、典型的には組織内の低灌流および/または低酸素症として観察される貧弱な血液動力学機能を招く。血液灌流不足（例えば虚血、低酸素症）は、多数の病的状態（組織の梗塞、壊死、創傷治癒、組織移植および器官不全を含む）の原因および/または前記と関連する合併症の原因である。
【００１８】
微小血管安定性：Rho GTPアーゼCdc42は内皮障壁機能の媒介に関与している
内皮接着結合（AJ）は、膜貫通血管内皮（VE）カドヘリンタンパク質のトランスオリゴマーから成り、前記はそれらの細胞質ドメインを介してβ-カテニンと結合する（Broman, MT et al (2006) “Cdc42 regulates adherens junction stability and endothelial permeability by inducing alpha-catenin interaction with the vascular endothelial cadherin complex,” Cir.Res.98:  73-80）。β-カテニンは順繰りにα-カテニンと結合し、アクチン細胞骨格によりAJ複合体とつながる（上掲書）。Rho GTPアーゼCdc42は、α-カテニンとβ-カテニンとの結合を制御し、その結果、VEカドヘリン/カテニン複合体のアクチン細胞骨格との相互反応を制御することによってAJ透過性を調節する（上掲書）。β-カテニンおよび結合したα-カテニンは続いてアクチン重合化のための支持部位として機能することができ、長い内皮形質膜突出の形成をもたらす（Kouklis, P.et al (2003) VE-cadherin-induced Cdc42 signaling regulates formation of membrane protrusions in endothelial cells,” J.Biol.Chem.278:  16230-36）。非接合VEカドヘリンはしたがって形質膜でインサイドアウトシグナリングに能動的に参加し、内皮膜突出の発達をもたらす（上掲書）。
炎症時には、炎症媒介物質は、主として後毛細血管細静脈の内皮細胞間の細胞間ギャップの形成によって血管透過性を増加させる（Spindler, V.et al (2010) “Role of GTPases in control of microvascular permeability,” Cardiovasc.Res.87(2):  243-53）。内皮細胞の接着結合は、内皮結合が一過性に開いて血液から組織へ白血球を通過させるときには動的でなければならない。Rac1およびCdc42は、障壁の維持および安定化に必要な主要なGTPアーゼである。RhoAは、休止状態および炎症状態の両方で、障壁特性を負の態様で調節する（すなわち障壁をより透過性にする）（上掲書）。Rho GTPアーゼ（RhoA、Rac1およびCdc42）またはRap1は、接着結合皮質アクチン細胞骨格の再組織化によって部分的に細胞接着を調節することが知られている（上掲書）。活性化されたCdc42は、内皮高透過性の正規RhoA媒介メカニズムに対抗することによって機能するが（Ramchandran, R.et al (2008) “Critical role of Cdc42 in mediating endothelial barrier protection in vivo,” Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.295:  363-69）、一方、微小血管内皮におけるRac1媒介障壁脱安定化は、強化された内皮細胞遊走状態に大きく拘束され、したがって炎症よりもむしろ血管新生により密接に関係するように思われる（Spindler, V.et al (2010) “Role of GTPases in control of microvascular permeability,” Cardiovasc.Res.87(2):  243-53）。最近の研究は、cAMPシグナリング（前記が障壁防御性であることはよく知られている）は、RhoAの阻害と同様にRac1およびCdc42のRap1媒介活性化を介して部分的に障壁機能を強化することを明らかにした。のみならず、障壁安定化媒介物質は直接Rac1およびCdc42を活性化するか、またはcAMPレベルを増加させる（上掲書）。他方、いくつかの障壁破壊性成分は、cAMPの生成減少（Rac1の不活化およびRhoAの活性化の両方をもたらす）によって透過性を増加させる（上掲書）。
【００１９】
コレステロール生合成経路
コレステロール生合成経路のメバロネートアーム（ミトコンドリア、ペルオキシソームおよび小胞体における酵素活性を含む）は、アセチルCoAの消費（3つの細胞区画（ミトコンドリア、細胞質およびペルオキシソーム）で並行して生じる）で開始し、小胞体でのスクァレンの生成で終了する（Mazein, A.et al.(2013) “A comprehensive machine-readable view of the mammalian cholesterol biosynthesis pathway,” Biochemical Pharmacol.86:  56-66）。以下はメバロネートアームの酵素である：
アセチル-CoAアセチルトランスフェラーゼ（ACAT1；ACAT2；アセトアセチル-CoAチオラーゼ；EC 2.3.1.9）は、アセチルCoAの2分子の可逆的縮合を触媒し、アセトアシル-CoAを形成する（上掲書）。
ヒドロキシメチルグルタリル-CoAシンターゼ（HMGCS1（細胞質）；HMGCS2（ミトコンドリアおよびペルオキシソーム）；EC 2.3.3.10）は、アセチルCoAおよびアセトアセチルCoAから3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリルCoA（3HMG-CoA）の生成を触媒する（上掲書）。
ヒドロキシメチルグルタリル-CoAリザーゼ（ミトコンドリア、HMGCL；EC 4.1.3.4）は、HMG-CoAをアセチル-CoAおよびアセトアセテートに転換する。
3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-コエンザイムAレダクターゼ（HMGCR；EC 1.1.34）は、3HMG-CoAのメバロン酸への変換を触媒する。この工程はコレステロール生成の初発工程である。HMGCRはシグナリング経路（SREBP経路を含む）によって高度に調節される（上掲書）。
【００２０】
メバロネートキナーゼ（MVK；ATP：メバロネート5-ホスホトランスフェラーゼ； EC 2.7.1.36）は、メバロネートのホスホメバロネートへの変換を触媒する（上掲書）。
ホスホメバロネートキナーゼ（PMVK；EC 2.7.4.2）は、メバロネート5-ホスフェートからメバロネート5-ジホスフェートの生成を触媒する（上掲書）。
ジホスホメバロネートデカルボキシラーゼ（MVD；メバロネート(ジホスホ)デカルボキシラーゼ；EC 4.1.1.33）は、メバロネート5-ジホスフェートを脱カルボキシル化してイソペンテニルジホスフェートを形成し、一方、ATPを加水分解する（上掲書）。
イソペンテニル-ジホスフェートデルタイソメラーゼ（ID11；ID12；EC 5.3.3.2）は、イソペンテニルジホスフェートをジメチルアリルジホスフェート（イソプレノイドの基本的構築ブロック）に異性化する（上掲書）。
ファルネシルジホスフェートシンターゼ（FDPS；EC2.5.1.10；EC 2.5.1.1；ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ）は、ファルネシルジホスフェート生成に至る2つの反応を触媒する。最初の反応では（EC 2.5.1.1活性）、イソペンテニルジホスフェートおよびジメチルアリルジホスフェートを縮合させてゲラニルジホスフェートを生成する。次に、ゲラニルジホスフェートおよびイソペンテニルジホスフェートを縮合させてファルネシルジホスフェートを生成する（EC 2.5.1.10活性）（上掲書）。
【００２１】
ゲラニルゲラニルピロホスフェートシンターゼ（GGPS1；EC 1.5.1.29；EC 2.5.1.10；ファルネシルジホスフェートシンターゼ；EC 2.5.1.1；ジメチルアリルトランストランスフェラーゼ）は、ファルネシルジホスフェート生成の2つの反応およびジメチルアリルジホスフェートへのイソペンテニルジホスフェートの3分子の付加を触媒してゲラニルゲラニルジホスフェートを生成する（上掲書）。
ファルネシルジホスフェートファルネシルトランスフェラーゼ1（FDFT1；EC 2.5.1.21；スクァレンシンターゼ）は、2つのファルネシルジホスフェート分子（C15）の二工程還元性ダイマー化を触媒してスクァレン（C30）を生成する。FDFT1発現レベルはコレステロールの状況によって調節され、ヒトFDFT1遺伝子は、SREBP-1aおよびSREBP-2のための複数の結合部位を有する複雑なプロモーターを有する（上掲書）。
【００２２】
当該経路のステロールアームはスクァレンで開始し、BlochとKandutsch-Russell経路ではコレステロールの生成で終了し、シャント経路では24 (S),25-エポキシコレステロールにより終了する（上掲書）。以下はステロールアームの酵素である：
スクァレンエポキシダーゼ（SQLE；EC 1.14.13.132、スクァレンモノオキシゲナーゼ）は、スクァレンのスクァレン-2,3-エポキシドへの変換およびスクァレン-2,3-エポキシド（2,3-オキシドスクァレン）の2,3:22,23-ジエポキシスクァレン（2,3:22,23-ジオキシドスクァレン）への変換を触媒する。第一の反応は、コレステロール生合成経路の最初の酸素化工程である。第二の反応は、スクァレン2,3-エポキシドから24(S),25-エポキシコレステロールを生成する最初の工程である（上掲書）。
ラノステロールシンターゼ（LSS；OLC；OSC；2,3-オキシドスクァレン:ラノステロールシンターゼ；EC 5.4.99.7）は、スクァレン-2,3-エポキシドのラノステロールへの環化および2,3:22,23-デポキシスクァレンの24(S),25-エポキシラノステロールへの環化を触媒する（上掲書）。
【００２３】
Δ(24)-ステロールレダクターゼ（DHCR24；24-デヒドロコレステロールレダクターゼ；EC 1.3.1.72）は、中間代謝物質のΔ-24二重結合の還元を触媒する。特に、前記はラノステロールを24,25-ジヒドロラノステロール（Kandutsch-Russel経路の最初の代謝物質）に変換し、さらにまたデスモステロールをコレステロールに変換するBloch経路の最後の工程を提供する。Bloch経路の中間体はDHCR24によってKandutsch-Russell経路の中間体に変換される（上掲書）。
ラノステロール14-αデメチラーゼ（CYP51A1；チトクロームP450、ファミリー51、サブファミリーA、ポリペプチド1；EC 1.14.13.70）は、ラノステロールを4,4-ジメチル-5α-コレスタ-8,14,24-トリエン-3β-オールに、および24,25-ジヒドロラノステロールを4,4-ジメチル-5α-コレスタ-8,14-ジエン-3β-オールへ三工程で変換する（上掲書）。
デルタ(14)-ステロールレダクターゼ（TM7F2；トランスメンブレン７スーパーファミリーメンバー2、EC 1.3.1.70）は、コレステロールおよび24(S),25-エポキシコレステロール経路の3分岐での反応を触媒する（上掲書）。
メチルステロールモノオキシゲナーゼ1（MSM01；SC4MOL；C-4メチルステロールオキシダーゼ；EC 1.14.13.72）は、C4メチルステロールの脱メチル化を触媒する（上掲書）。
ステロール-4-アルファ-カルボキシレート3-デヒドロゲナーゼ、脱カルボキシル化（NSDHL；NAD(P)依存ステロイドデヒドロゲナーゼ様；EC 1.1.1.170）は、ポストスクァレンコレステロールおよび24(S),25-エポキシコレステロール合成のいくつかの工程に参加する（上掲書）。
【００２４】
3-ケト-ステロイドレダクターゼ（HSD17B7；17-ベータ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ7；EC 1.1.1.270）は、Bloch経路でザイモステロンをザイモステロールに変換する（上掲書）。
3-β-ヒドロキシステロイド-Δ(8),Δ(7)-イソメラーゼ（EBP；エモパミル-結合タンパク質；EC5.3.3.5）は、Δ(8)-ステロールのΔ(7)-ステロールへの変換を触媒する（上掲書）。
ラトステロールオキシダーゼ（SC5DL；ステロール-C5-デサチュラーゼ（ERG3Δ-5-デサチュラーゼホモログ、S.セレビシアエ（S.cerevisiae）様；EC 1.14.21.6）は、7-デヒドロコレステロール、7-デヒドロデスモステロールおよび24(S),25-エポキシ-7-デヒドロコレステロールの生成を触媒する（上掲書）。
7-デヒドロコレステロールレダクターゼ（DHCR7；EC 1.3.1.21）は、7-デヒドロコレステロールのC7-C8二重結合の還元およびコレステロールの生成を触媒し、7-デヒドロデスモステロールからデスモステロールを、および24(S),25-エポキシ-7-デヒドロコレステロールから24(S),25-エポキシコレステロールを生成する（上掲書）。
チトクロームP450、ファミリー3、サブファミリーA、ポリペプチド4（CYP3A4；1,8-シネオール2-エキソ-モノオキシゲナーゼ；タウロケノデオキシコレート6α-ヒドロキシラーゼ；EC 1.14.13.97）は、25-ヒドロキシコレステロールおよび4β-ヒドロキシコレステロールに至るコレステロールのヒドロキシル化を触媒する（上掲書）。
コレステロール25-ヒドロキシラーゼ（CH25H；コレステロール25-モノオキシゲナーゼ；EC 1.14.99.38）は、二鉄コファクターを用いコレステロールのヒドロキシル化を触媒して25-ヒドロキシコレステロールを生成し、さらに24-ヒドロキシコレステロールの24, 25-ジヒドロキシコレステロールへの遷移を触媒する（上掲書）。
【００２５】
チトクロームP450、ファミリー7、サブファミリーA、ポリペプチド1（CYP7A1；コレステロール7-アルファ-ヒドロキシラーゼ；EC 1.14.13.17）は、コレステロールの7位に親水性部分を導入して7α-ヒドロキシコレステロールを生成するために必要である（上掲書）。
チトクロームP450、ファミリー27、サブファミリーA、ポリペプチド1（CYP27A1；ステロール27-ヒドロキシラーゼ；EC 1.14.13.15）は、ミトコンドリアコレステロールの27-ヒドロキシコレステロールおよび25-ヒドロキシコレステロールへの遷移を触媒する（上掲書）。
チトクロームP450 46A1（CYP46A1、コレステロール24-ヒドロキシラーゼ；EC 1.14.13.98）は、コレステロールの24(S)-ヒドロキシコレステロールへの転換を触媒する（上掲書）。
【００２６】
スタチン
本明細書で用いられる“スタチン”という用語は、コレステロール生合成経路のメバロネートアームにおけるHMG-CoAレダクターゼの競合性阻害物質を指す。例示的スタチンには、メバスタチン、ロバスタチン、シムバスタチンおよびプラバスタチン（前記は真菌代謝物質である）、並びにフルバスタチン、アトルバスタチンおよびベリバスタチン（前記は合成化合物である）が含まれる（ただしこれらに限定されない）。スタチンは、それらの主要な作用（低密度リポタンパク質コレステロールレベルを減少させる）を、メバロン酸様成分（生成物阻害によってHMGCRを競合的に阻害する）を介して表出する。より強力なスタチン（例えばアトルバスタチンおよびシムバスタチン）のより高用量はまた、超低密度リポタンパク質レベルの上昇によって引き起こされるトリグリセリドレベルを減少させることができる（Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ed.Joel G.Hardman, Lee E.Limbird, Eds., 10th Ed., McGraw Hill, New York (2001), p.984）。
【００２７】
スタチン（セリバスタチンおよびアトルバスタチン）によるHMG-CoAレダクターゼ阻害は、脂質非依存性でありかつ内皮アポトーシスおよびVEGFシグナリングの変化と関係する血管新生に対して二相性用量依存作用を有することが示された（Weis, M.et al (2002) “Statins have biphasic effects on angiogenesis,” Cir.Res.105:  739-45）。不死化ヒト皮膚微小血管内皮細胞株のin vitro内皮細胞増殖、遊走および分化は低スタチン濃度（0.005から0.01μmol/L）で強化されたが、高スタチン濃度（0.05から1μmol/L）では顕著に阻害された。高濃度での抗血管新生作用は、VEGFの内皮放出の低下および内皮アポトーシスの増加と関係し、前記作用はゲラニルゲラニルピロホスフェート（GGP）によって逆転された。GGPはRhoファミリーメンバーの膜局在に要求される。スタチンの他の抗血管新生作用には、単球化学誘因タンパク質1、メタロプロテイナーゼおよびアンギオテンシン-2、プレプロエンドセリン遺伝子、およびアクチンフィラメントの発現および活性の阻害、並びに巣状接着（focal adhesion）形成が含まれ得る。ゼブラフィッシュ抗血管新生薬スクリーニングで、多数のスタチン（シムバスタチン、メバスタチン、ロバスタチンおよびロスバスタチン）が、発生中のゼブラフィッシュ胚で血管新生を阻害することが確認された。ロスバスタチンの抗血管新生作用は、マウスの異種移植前立腺癌モデルで確認された（Wang, C.et al, (2010) “Rossuvastatin, identified from a zebrafish chemical genetic screen for anti-angiogenic compounds, suppresses the growth of prostate cancer,” Eur.Urol.58:  418-26）。他のネズミモデルでは、炎症誘発血管新生は低用量スタチン療法（0.5mg/kg/d）を用いて強化されたが、セリバスタチンまたはアトルバスタチンの高濃度（2.5mg/kg/d）では顕著に阻害された。高用量スタチン処置が高脂血症アポリポタンパク質E欠損マウスにおける脂質レベルの減少に有効であるという事実にもかからず、前記処置は血管新生を強化するのではなく障害した。
【００２８】
プレニル化
プレニル化は、タンパク質のC-末端またはC-末端近くの保存されたシステインへのファルネシル（15炭素）またはゲラニルゲラニル（20炭素）イソプレノイドの二重結合付加を含む脂質改変の類いである（Zhang, F.L.and Casey, PJ (1996)“Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences,”Ann.Rev.Biochem. 65:241-69）。プレニル化は、プレニル化されたタンパク質の膜相互反応を促進し、それら膜相互反応を必要とするいくつかのタンパク質-タンパク質相互反応で主要な役割を果たす。
15炭素イソプレノイドFPPおよび20炭素イソプレノイドGGPはMVA代謝経路の生成物であり、当然の結果としてHMGCR、FTアーゼおよびGGTアーゼ-I（メバロネート経路の重要酵素）はタンパク質のプレニル化に顕著な影響を与えることができる（Zhang, F.L.and Casey, PJ (1996) “Protein Prenylation:  Molecular Mechanisms and Functional Consequences,” Ann.Rev.Biochem.65:  241-69）。
【００２９】
プレニル化タンパク質は2つの主要なクラス、CAAXモチーフを含むものおよびいわゆるCC-またはCxC-含有タンパク質に分類できる。CAAXタンパク質は、それらの翻訳後修飾を指令する特異的なアミノ酸配列をC-末端に有するタンパク質グループと定義される（Gao, J.et al (2009) “CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis,” Am.J.Trans.Res.1(3): 312-25）。Cはシステイン残基であり、AAは2つの脂肪族残基であり、Xは種々の基質特異性に依存する任意のC-末端アミノ酸を表す。CAAXタンパク質は多様な分子を包含し、前記分子には、核ラミン（中間体フィラメント）、Rasおよび多数のGTP結合タンパク質（Gタンパク質）、並びにいくつかのタンパク質キナーゼおよびホスファターゼが含まれる。ほとんどのCAAXタンパク質は、主として細胞膜の細胞質表面に見いだされ、細胞の生物学的機能で多様な役割を果たすきわめて多くの細胞シグナリングプロセスおよび調節事象で必要とされる。これらの活性には細胞増殖、分化、核安定性、胚形成、精子形成、代謝、およびアポトーシスが含まれる。C-末端にCAAXボックスを有するタンパク質は、当該タンパク質が形質膜または核膜に移送されしたがってそれらの種々の機能を表出する前に、常にプレニル化プロセスを要求する。
【００３０】
CAAXタンパク質のプレニル化は、ポリイソプレニル化、タンパク質分解、およびカルボキシルメチル化の3工程を含む（Zhang, F.L.and Casey, PJ (1996) “Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences,” Ann.Rev.Biochem.65: 241-69）。最初に、イソプレノイド脂質が、プレニルトランスフェラーゼ（例えばFTアーゼまたはGGTアーゼ-1）によってCAAXボックスに付加される。C末端アミノ酸“Ｘ”がセリン、メチオニン、またはグルタミンであるときは、タンパク質はFTアーゼによって認識されるが、この位置にロイシンがあるときはGGTアーゼ-1によって改変される。FTアーゼおよびGGTアーゼ-Iはタンパク質内のCAAXボックスを認識し、続いて、CAAXボックスのシステイン残基にFTアーゼによって15炭素イソプレノイドファルネシルピロホスフェートを、またはGGTアーゼ-Iによって20炭素イソプレノイド付加する。第二に、プレニル化に続いて、aaX残基がエンドプロテアーゼによって除去される。第三に、修飾されたシステインのカルボキシル基が特異的なメチルトランスフェラーゼによってメチル化される。
GGTアーゼIIは、CAAXタンパク質のプロセスとは機構的に異なるプロセスで、ゲラニルゲラニル基をGGPPからCC-またはCxC-含有タンパク質の両システイン残基へ移す。加えて、CxCモチーフを含むタンパク質はC-末端プレニルシステインでメチル化されるが、CC含有タンパク質はメチル化されない。
HMGCR媒介GGPP生合成はCdc42プレニル化を調節する（Eisa-Beygi S, Hatch G, Noble S, Ekker M, Moon TW (2013) “The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR) pathway regulates developmental cerebral-vascular stability via prenylation-dependent signaling pathway,” Dev Biol 373:258-266）。Cdc42は接着結合安定性および内皮障壁機能を調節する。
【００３１】
大脳内出血（ICH）
偶発的な大脳内出血（ICH）は卒中の重篤で消耗性の形態であり、前記は、もっとも一般的は高血圧、アミロイド血管症、脳血管奇形に起因し、または薬物治療（抗血小板薬および抗凝固薬を含む）に続発する。偶発的ICHは卒中の10％を構成し、北アメリカで1年間に罹患する約90,000人の患者の50％を超える者の死亡または身体障害に関係する（Roger VL, Go AS, Lloyd-Jones DM, Adams RJ, Berry JD, Brown TM, et al (2011) “Heart disease and stroke statistics-2011 update: a report from the American Heart Association,”Circulation 123:el8-e209）。臨床研究はまた、コレステロール低下HMGCR阻害物質（スタチン）とICHのリスクの増加との間の連関を明らかにした（Collins R, Armitage J, Parish S, Sleight P, Peto R: (2004)“Effects of cholesterol-lowering with simvastatin on stroke and other major vascular events in 20536 people with cerebrovascular disease or other high-risk conditions,” Lancet 363:757-767；Flaster M, Morales-Vidal S, Schneck MJ, Biller J (2011) “Statins in hemorrhagic stroke,”Expert Rev Neurother 11:1141-1149；Goldstein LB, Amarenco P, Szarek M, Callahan A, III, Hennerici M, Sillesen H, et al (2008)“Hemorrhagic stroke in the Stroke Prevention by Aggressive Reduction in Cholesterol Levels study,”Neurology 70:2364-2370）。脳出血の別のタイプは脳微小出血（BMH）であり、前記は、小さな、通常は複数のICHである。系統的な再調査によって、健康な成人の5％、虚血性卒中を有する患者の34％、および非外傷性ICHを有する患者の60％がBMHを有することが見出された（Cordonnier C, Klijn CJ, van BJ, Al-Shahi SR (2010)“Radiological investigation of spontaneous intracerebral hemorrhage: systematic review and trinational survey,”Stroke 41:685-690）。それらは、高血圧および真性糖尿病を有する患者でより一般的である。高血圧の処置以外に、ICHまたはBMHを防ぐ予防的処置は存在しない。
【００３２】
1．大脳内出血、脳微小出血および大脳内出血の他の原因
偶発的ICHは卒中の10％を占める。米国およびカナダでは、毎年約90,000人が発症する。死亡率は30−50％である。もっとも一般的な原因は高血圧であり、高血圧が原因のICHは高血圧治療によって部分的に減少させることができる。しかしながら、他の要因（例えば低血清コレステロール）が高血圧によるICHに寄与する（Sutherland GR, Auer RN (2006) “Primary intracerebral hemorrhage,”J Clin Neurosci 13:511-517）。ICHの第二の主要な原因はアミロイド血管症であり、前記に対しては特定の治療はない。アミロイド血管に起因するICHの病理生理学は不明であるが、ただし前記は脳動脈および細動脈のアミロイド沈着と密接に関係する。
脳微小出血（BMH）はICHの別の形態である（Fisher MJ (2013)“Brain regulation of thrombosis and hemostasis: from theory to practice,” Stroke 44:3275-3285）。それらは、加齢、アミロイド血管症、高血圧、虚血性/出血性卒中（混合型大脳血管性疾患）、およびアルツハイマー病と関係する。通常それらは細い細動脈の裂傷の局在化出血に起因するとされるが、Fisherはそれらは年齢依存性で炎症媒介性の細い脳血管からの漏出であり得ると提唱している（上掲書）。この仮説は、ゼブラフィッシュおよびマウスのリポ多糖類（LPS）誘発BMHによって支持される（図5、6および9）（Liu S, Vasilevko V, Cribbs DH, Fisher M (2013) “A mouse model of cerebral microhemorrhages,” Stroke 44:AWP297 (Abstract)）。さらにまた、BMHの患者はICHのリスクが増加し、当該リスクは彼らが抗血小板薬または抗凝固薬を服用している場合にさらに増加する（Cordonnier C, Klijn CJ, van BJ, Al-Shahi SR (2010)“Radiological investigation of spontaneous intracerebral hemorrhage: systematic review and trinational survey,” Stroke 41:685-690；Greenberg SM, Eng JA, Ning M, Smith EE, Rosand J (2004)“Hemorrhage burden predicts recurrent intracerebral hemorrhage after lobar hemorrhage,”Stroke 35:1415-1420；Imaizumi T, Horita Y, Hashimoto Y, Niwa J (2004)“Dotlike hemosiderin spots on T2*-weighted magnetic resonance imaging as a predictor of stroke recurrence: a prospective study,”J Neurosurg 101:915-920）。BMHはまた認知障害と関係する（Yakushiji Y, Noguchi T, Hara M, Nishihara M, Eriguchi M, Nanri Y, et al (2012)“Distributional impact of brain microhemorrhages on global cognitive function in adults without neurological disorder,”Stroke 43:1800-1805）。
【００３３】
スタチンは心筋梗塞および虚血性卒中の長期的リスクを軽減するが、それらはICHのリスクを増加させる（Collins R, Armitage J, Parish S, Sleight P, Peto R (2004)“Effects of cholesterol-lowering with simvastatin on stroke and other major vascular events in 20536 people with cerebrovascular disease or other high-risk conditions,” Lancet 363:757-767；Flaster M, Morales-Vidal S, Schneck MJ, Biller J (2011)“Statins in hemorrhagic stroke,” Expert Rev Neurother 11:1141-1149；Goldstein LB, Amarenco P, Szarek M, Callahan A, III, Hennerici M, Sillesen H, et al (2008)“Hemorrhagic stroke in the Stroke Prevention by Aggressive Reduction in Cholesterol Levels study,”Neurology 70:2364-2370；Haussen DC, Henninger N, Kumar S, Selim M (2012)“Statin use and microhemorrhages in patients with spontaneous intracerebral hemorrhage,”Stroke 43:2677-2681；Eisa-Beygi S, Wen XY, Macdonald RL.(2014)“A Call for Rigorous Study of Statins in Resolution of Cerebral Cavernous Malformation Pathology.”Stroke 45(6):1859-61）。米国心臓協会（American Heart Association）の指針にしたがえば、スタチンはこれらの患者では指示されるべきではない（Morgenstem LB, Hemphill JC, III, Anderson C, Becker K, Broderick JP, Connolly ES, Jr., et al (2010)“Guidelines for the management of spontaneous intracerebral hemorrhage: a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association,”Stroke 41:2108-2129）。スタチンはコレステロール合成を阻害し、低血清コレステロールもまたICHの独立したリスク因子である（Sutherland GR, Auer RN (2006)“Primary intracerebral hemorrhage,”J Clin Neurosci 13:511-517）。
【００３４】
大脳海綿状奇形（CCM）はもっとも一般的な脳血管奇形である。それらは集団の0.5％で見出され、偶発的ICHの原因である（Richardson BT, Dibble CF, Borikova AL, Johnson GL (2013)“Cerebral cavernous malformation is a vascular disease associated with activated RhoA signaling,”Biol Chem 394:35-42）。出血は時間が経つとクラスターを形成する傾向があり、したがって、出血リスク上昇時にこのリスクを軽減する薬剤が積極的に探索されかつ希求されている（Barker FG, Amin-Hanjani S, Butler WE, Lyons S, Ojemann RG, Chapman PH, et al (2001)“Temporal clustering of hemorrhages from untreated cavernous malformations of the central nervous system,”Neurosurgery 49:15-24；Li Q, Mattingly RR (2008)“Restoration of E-cadherin cell-cell junctions requires both expression of E- cadherin and suppression of ERK MAP kinase activation in Ras-transformed breast epithelial cells,”Neoplasia 10:1444-1458）。CCMは散発性であることもまたは遺伝性であることもあり、後者では下記の3つの構造的に別個のタンパク質をコードする遺伝子の機能喪失変異が関係する：CCM1（KRIT1）、CCM2（MEKK3若しくはOSM、MALCAVERIN、またはMGC4607のためのオスモセンシング足場）およびCCM3（プログラム細胞死10（PDCD10））（Li DY, Whitehead KJ (2010) “Evaluating strategies for the treatment of cerebral cavernous malformations,” Stroke 41:S92-S94）。3つのCCMタンパク質の全てが細胞骨格およびAJに必要とされ、さらにCCMが生じるためには変異が内皮細胞に存在しなければならない。CCM1およびCCM2の変異はRhoA活性の増加をもたらし、前記は、RhoA活性の増加は細胞の細胞骨格に影響を与え、血管の不安定性、CCMおよびおそらくICH/BMHを人間で引き起こすという仮説が導き出される。RhoA活性を阻害する薬剤、例えばスタチンおよびファスジルは、CCMのマウスモデルのデーターに基づいてICHのリスクを軽減すると理論づけられている（Li DY, Whitehead KJ (2010) “Evaluating strategies for the treatment of cerebral cavernous malformations,” Stroke 41:S92-S94; Richardson BT, Dibble CF, Borikova AL, Johnson GL (2013) “Cerebral cavernous malformation is a vascular disease associated with activated RhoA signaling,” Biol Chem 394:35-42）。この仮説はゼブラフィッシュの研究とは対照的である。前記研究では、スタチンは血管安定性を障害しICH/BMHを生じる（Eisa-Beygi S, Hatch G, Noble S, Ekker M, Moon TW (2013) “The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR) pathway regulates developmental cerebral-vascular stability via prenylation-dependent signaling pathway,” Dev Biol 373:258-266）。これらの作用は、Rho GTPアーゼ、特にCdc42（血管の安定性の調節に必要とされるRho GTPアーゼ）の不完全なプレニル化に起因することが示され、ゼブラフィッシュとマウスモデルとの間の矛盾の原因に関し疑問が生じた。実際、ゼブラフィッシュのスタチン処理は、ゆっくりした血流を有する漏出性で拡張した頭側血管を特色とする大脳血管不全（CCMと類似する）を誘発する。理論に拘束されないが、この相違は、本明細書ではRhoAとCdc42の阻害の相対的程度に起因すると仮説が立てられる。なぜならば、血管脱安定化RhoAと血管安定化Cdc42のバランスは用量及び種に依存して相違し得るからである。
【００３５】
2．ICHおよびBMHのモデル
ゼブラフィッシュは、大規模で表現型に基づく化学物質および遺伝的スクリーニングのために有用なモデル生物として出現した。ゼブラフィッシュは遺伝的にヒトと非常に類似し、大量処理スクリーニングのために繁殖が容易で速く、容易な画像化のために早い段階で透明であり、さらに遺伝的改変が比較的容易である。ゼブラフィッシュで発見されたいくつかの化合物は哺乳動物でおよび人間の研究ですでに有効である（Peterson RT, Fishman MC (2011)“Designing zebrafish chemical screens,”Methods Cell Biol 105:525- 541）。スクリーニングはin vivoで実施され、一般的な薬剤毒性は薬剤有効性と同じ時に評価することができるので、培養細胞でのin vitro薬剤スクリーニングと比較してより高い成功率が許容される（Miscevic F, Rotstein O, Wen XY (2012)“Advances in zebrafish high content and high throughput technologies,”Comb Chem High Throughput Screen 15:515-521, 2012）。さらにまた、in vivoスクリーニング系（例えばゼブラフィッシュ）は、薬剤有効性をその代謝物質と同様に測定できる。ゼブラフィッシュで化合物ライブラリーの大量処理スクリーニングを実施する能力は、大量処理スクリーニングが不可能なげっ歯類での化合物試験より有利である。
ICH/BMHのいくつかのモデルがゼブラフィッシュで識別されている。第一に、スタチンはゼブラフィッシュでICH/BMHを引き起こす（図7、9）（Eisa-Beygi S, Hatch G, Noble S, Ekker M, Moon TW (2013)“The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR) pathway regulates developmental cerebral-vascular stability via prenylation-dependent signaling pathway,”Dev Biol 373:258-266）。そのメカニズムはタンパク質のプレニル化の阻害による。なぜならば、ICH/BMHはまた、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ1のβサブユニット（GGTアーゼ1、pggtlβ）のMO-誘発枯渇によって誘発され、さらにHMGCRの生成物、ゲラニルゲラニルピロホスフェート（GGPP、図3、4および8）を用いて下流の代謝性レスキューによって予防することができるからである。GGPPは、Rho GTPアーゼタンパク質の翻訳後プレニル化のために要求される20炭素脂質分子である。当該BMHの時間的および空間的分布は、ゼブラフィッシュバブルヘッド（bbhm292）およびレッドヘッド（rhdmi149）変異体で観察されるICH/BMHと類似する（Buchner DA, Su F, Yamaoka JS, Kamei M, Shavit JA, Barthel LK, et al (2007)“pak2a mutations cause cerebral hemorrhage in redhead zebrafish,”Proc Natl Acad Sci USA 104:13996-14001；Butler MG, Gore AV, Weinstein BM (2011)“Zebrafish as a model for hemorrhagic stroke,”Methods Cell Biol 105:137-161；Liu J, Fraser SD, Faloon PW, Rollins EL, Vom BJ, Starovic-Subota O, et al (2007)“A betaPix Pak2a signaling pathway regulates cerebral vascular stability in zebrafish,”Proc Natl Acad Sci U S A 104:13990-13995）。
【００３６】
バブルヘッド（bbhm292）は受精後（hpf）36から52時間でICHおよび脳浮腫を発生させ、一方、レッドヘッド（rhdmi149）は受精後2から3日でICHを発生させる。bbhm292変異はβpix（pak-interacting exchange factor β（pak-相互反応交換因子β））遺伝子に存在し、一方、rhdmi149変異はpak2a（p21 protein [Cdc42/Rac]-activated kinase 2a（p21タンパク質[Cdc42/Rac]-活性化キナーゼ2a））遺伝子に存在する。これらの遺伝子は、Rho GTPアーゼ、RacおよびCdc42の活性を調節するタンパク質をコードする。これらの変化の両方がICH/BMHと関係することは、RacおよびCdc42がGGTアーゼ1媒介プレニル化を必要とすることと一致する。GGTアーゼ1は、メバロネート誘導GGPPを添加することによってRacおよびCdc42を翻訳後改変する（メバロネート誘導GGPPはこれらGTPアーゼを活性化するために必要である）（Peterson YK, Kelly P, Weinbaum CA, Casey PJ (2006)“A novel protein geranylgeranyltransferase-I inhibitor with high potency, selectivity, and cellular activity,”J Biol Chem 281:12445-12450）。オルトログヒトCCM1、CCM2およびCCM3遺伝子に対応するゼブラフィッシュ変異体もまた存在する（Butler MG, Gore AV, Weinstein BM (2011) “Zebrafish as a model for hemorrhagic stroke,” Methods Cell Biol 105:137-161）。これらは、心臓拡張および血管の進行性拡大拡張を発生させ、さらにこれら遺伝子は両方の種で類似機能を有すると言われている。これらのゼブラフィッシュ変異体ではICHは報告されていないが、Ras GTPアーゼエフェクタータンパク質のMO誘発減少と一体となってrap lbおよびゼブラフィッシュccmlは確かにICHを引き起こした（Gore AV, Lampugnani MG, Dye L, Dejana E, Weinstein BM (2008) “Combinatorial interaction between CCM pathway genes precipitates hemorrhagic stroke,” Dis Model Mech 1:275-281）。マウスでは、奇形の発生のために、CCMのための遺伝子欠損が内皮細胞で必要であると言われている（Chan AC, Li DY, Berg MJ, Whitehead KJ (2010)“Recent insights into cerebral cavernous malformations: animal models of CCM and the human phenotype,”FEBS J 277:1076-1083）。
【００３７】
ICHのマウスモデルは、脳への血液の直接注射またはエラスターゼの注射（血管コラーゲンを劣化させ出血を引き起こす）を含む。これらのモデルは、血管構造を安定化させる治療作用因子の検出には有用ではないだろう。マウス偶発性ICHには2つのモデルが存在する。1つは、アンギオテンシン2およびマウスNOS阻害の組合せによって誘発される急性および慢性高血圧のモデルである（Wakisaka Y, Chu Y, Miller JD, Rosenberg GA, Heistad DD (2010) “Spontaneous intracerebral hemorrhage during acute and chronic hypertension in mice,”.J Cereb Blood Flow Metab 30:56- 69）。しかしながら、高血圧におけるICHのメカニズムは、スタチンおよびCCM遺伝子を用いて我々が解明しようとしているメカニズムとは異なる可能性がある。
BMHの第二のモデルはトランスジェニックマウス（例えばTg2576）を含み、前記マウスは偶発的にP-アミロイドを過剰に発現し、大脳のアミロイド血管症を模倣する（Herzig MC, Winkler DT, Burgermeister P, Pfeifer M, Kohler E, Schmidt SD, et al.Abeta is targeted to the vasculature in a mouse model of hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis.Nat Neurosci.2004;7(9):954-60；Fisher M, Vasilevko V, Passos GF, Ventura C, Quiring D, Cribbs DH.Therapeutic modulation of cerebral microhemorrhage in a mouse model of cerebral amyloid angiopathy.Stroke.2011;42(11):3300-3）。類似する他のモデルが存在する（Alharbi BM, Tso MK, Macdonald RL.(2016) Animal models of spontaneous intracerebral hemorrhage.Neurol Res  38:448-455）。限界は、動物がBMHを発症するには2年を要するということである。
LPSがマウスでBMHを誘発するために用いられている（Tang, AT, et al, “Endothelial TLR4 and the microbiome drive cerebral cavernous malformations,” Nature (2017) 545 (7654):  305-310.Doi:  10.1038/nature22075；Liu S, Vasilevko V, Cribbs DH, Fisher M (2013) “A mouse model of cerebral,” Stroke 44:AWP297 [Abstract])；Liu S, Grigoryan MM, Vasilevko V, Sumbria RK, Paganini-Hill A, Cribbs DH, et al.(2014)“Comparative analysis of H & E and prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds.”J Histochem Cytochem.62:767-773）。LPSまたは小胞（リン酸緩衝食塩水（PBS））が基準時および再度24時間で注射され、このマウスは最初の注射から2日後にサクリファイスされた（図6および9）。脳を調べたとき、脳血管障壁透過性が増加するので、多数の小さな新しい出血がLPS処理マウスで見出された。このモデルはBMHのメカニズムおよびBMHのための介入の研究に有用であり得ると提案された。
【００３８】
大脳内出血（ICH）の抗β3インテグリンマウスモデル
インテグリンαIIbβ3は血小板で最も豊富な糖タンパク質である。β3サブユニットはまた、血管新生時の増殖中内皮細胞でαVサブユニット（すなわちαVβ3）と同時発現される（Yougbare, I.et al.,“Maternal anti-platelet β3 integrins impair angiogenesis and cause intracranial hemorrhage,”(2015) J.Clin.Invest.125(4):  1545-56、以下を引用している：Brooks, PC et al,“ Requirement of vascular integrin alpha v beta 3  for angiogenesis,” Science (1994) 264 (5158):  569-71；Brooks, PC et al,“Integrin αvβ3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels,”(1994) Cell 79(7):1157-64；Di Q, et al, “Impaired cross-activation of β3 integrin and VEGFR-2 on endothelial progenitor cells with aging decrases angiogenesis in response to hypoxia,”Intl J.Cardiol.(2013) 168(3):2167-76；Stupack, DC, Cheresh, DA,“Integrins and angiogenesis,”Curr.Top.Dev.Bio.(2004) 64:  207-38）。いくつかの研究が、β3は血管新生で重要な役割を果たしていることを示した。例えば、αVb3は血管新生に必要であること（上掲書、以下を引用している：Brooks, PC et al,“ Requirement of vascular integrin alpha v beta 3  for angiogenesis,”Science (1994) 264 (5158):569-71）、およびαVb3アンタゴニストは血管新生血管のアポトーシスを誘発することによって腫瘍の縮退を促進することが示された（上掲書、以下を引用している：Brooks, PC et al, “Integrin αvβ3 antagonists promote tumor regression by inducing apoptosis of angiogenic blood vessels,”(1994) Cell 79(7):1157-64）。インテグリンαVβ3は血管新生促進シグナリングでVEGFR2と協調するという証拠（上掲書、以下を引用している：Robinson, SD, et al, “αvβ3 integrin limits the contribution of neuropilin-1 to vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis,” J.Biol.Chem.(2009) 284(49):33966-81; Soldi, R.et all, “Role of αvβ3 integrin in the activation of vascular endothelial growth factor receptor-2,” EMBO J.(1999) 18(4):882-92）、およびAKTホスホリル化はVEGF媒介出生後血管新生で必須であるという証拠もまた示された（上掲書、以下を引用している：Kitamura, T et al, “Regulation of VEGF-mediated angiogenesis by the Akt/PKB substrate Girdin,” Nat.Cell Biol.(2008): 10(3):329-337）。
【００３９】
胎児および新生児自己免疫性血小板減少症（FNAIT）の確立されたネズミモデルを用いて、罹患胎児および新生児のICHメカニズムを解明した（上掲書、以下を引用している：Chen, P.et al., “Animal model of fetal and neonatal immune thrombocytopenia: role of neonatal Fc receptor in the pathogenesis and therapy,”Blood (2010) 116 (18): 3660-68；Li, C.et al,”The maternal immune response to fetal platelet GpIbα causes frequent miscarriage in mice that can be prevented by intravenous IgG and anti-FcRn therapies,”J.Clin.Invest.(2011) 121(11):4537-47; Ni H, et al,“A novel murine model of fetal and neonatal alloimmune thrombocytopenia:  respons to intravenous IgG therapy,”Blood (2006) 107(7):2976-83）。妊娠時のβ3またはGPIbαへの暴露を模倣するために、Itgb3-/-およびGp1ba-/-マウス（以下ではβ3-/-およびGPIbα-/-と称される）にWT血小板が輸血された（上掲書）。抗β3または抗GPIbα抗体が検出された。これらの免疫マウスを続いてWT雄と交配させた（上掲書）。免疫されたβ3-/-およびGPIBα-/-マウスに由来するヘテロ接合（-/+）新生児で同じように重度の血小板減少症が見いだされた（上掲書）。ICHは、EC15.5で始まってβ3-/-胎児とともに新生児で見出された（妊娠マウスの子宮内ICHの検出には高周波超音波画像系が用いられ、脳切片のH&E染色が実施された）（上掲書）。出血は脳の種々の領域で観察され、ICHの頻度は母体の免疫回数にしたがって胎児で増加した（上掲書）。ICHは、抗GPIbα媒介FNAIT胎児または新生児では全く見られなかった（上掲書）。
【００４０】
以下の実験は、抗β3抗体は（抗GPIbα抗体でもなくまたは血小板減少症単独でもなく）ICHの原因であることを示した。ICHが実際に抗体によって媒介されたことを確認するために、ナイーブなマウスから生まれたβ3-/-およびGPIBα-/-新生児に抗血清をP2で受動的に注射した。β3-/-新生児への抗β3血清の出生後注射はICHを誘発したが、抗GPIbα血清はGPIBα-/-新生児でICHを全く誘発しなかった（P＜0.01）（上掲書）。血小板媒介細胞傷害性（上掲書、以下を引用している：Nieswandt, B.et al., “Identification of critical antigen-specific mechanisms in the development of immune thrombocytopenic purpura in mice,” Blood (2000) 96(7):  2520-27; Nieswandt, B.et al, “Targeting of platelet integrin αIIbβ3 determines systemic reaction and bleeding in murine thrombocytopenia regulated by activating and inhibitory FcγR,” Intl Immunol.(2003) 15(3):  341-49）がICHのメカニズムに関与している可能性をさらに決定するために、抗β3血清をαIIbインテグリン欠損仔（血小板にαIIbβ3インテグリンを発現しない）に注射した（上掲書）。ICHは正常な血小板数を有するItga2b-/-仔で観察され、抗β3血清のβ3-/-新生児への出生後注射は、これらの抗原陰性仔でICHを誘発せず網膜血管発生を障害しなかった（上掲書）。
ミスマッチ修復複合タンパク質Msh2のホモ接合性欠損のバックグラウンドでCcmヘテロ接合体を合体させるマウスモデル（＜Ccm1+/-Msh-/-およびCcm2+/'Msh-/-）はCCMを発生させる（McDonald DA, Shi C, Shenkar R, Stockton RA, Liu F, Ginsberg MH, et al, (2012) “Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease,” Stroke 43:571- 574）。別の重要な遺伝子はRap1bであり、そのマウス変異体は胚の12.5日目までは正常に発生し、この時点で50％が出血のために死亡する（上掲書、Chrzanowska-Wodnicka M (2013)“Distinct functions for Rapl signaling in vascular morphogenesis and dysfunction,”Exp Cell Res 319:2350-2359）。ゼブラフィッシュでは、ccmlおよびrap lbのサブ表現型レベルの減少が脳出血を引き起こす。
【００４１】
3．ICHおよびBMHのメカニズム
高血圧の患者では、ICHの原因は、大きな誘導大脳血管から生じる傾向がある小さな貫入血管の細動脈硬化である（Auer, RN, Sutherland, GR (2005) “Primary intracerebral hemorrhage:  pathophysiology,” Can.J.Neurol.Sci.32 Suppl.2:3-12）。これまで利用可能な唯一の治療は高血圧の予防的処置である。高血圧性ICHをいったん発した患者の管理のための指針が公表され、占拠性小脳ICHの外科的除去および一般的な医療ケアが推奨されている（Hemphill JC, 3rd, Greenberg SM, Anderson CS, Becker K, Bendok BR, Cushman M, et al.Guidelines for the management of spontaneous intracerebral hemorrhage: A guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association.Stroke.2015;46:2032-2060）。
なぜスタチンがICHのリスクを増加させるかに関しては種々の理論が存在する。例えば、スタチン結合ICHおよび他のタイプのICH/BMHはHMGCR経路の欠損によるかもしれない（Eisa-Beygi S, Hatch G, Noble S, Ekker M, Moon TW (2013) “The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR) pathway regulates developmental cerebral-vascular stability via prenylation-dependent signaling pathway,”Dev Biol 373:258-266）。HMGCRまたは他の下流分子（例えばゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ1（GGTアーゼ1））の阻害は、ゼブラフィッシュの胚でICH/BMHを引き起こす（上掲書）。Flasterと共同研究者は、スタチンは、血小板でまたは凝固およびフィブリン溶解カスケード間の相互反応でICHを刺激し得る変化を引き起こす可能性があると述べたが、ただしこれについてはこれまでのところ証拠はない（Flaster M, Morales-Vidal S, Schneck MJ, Biller J (2011) “Statins in hemorrhagic stroke,” Expert Rev Neurother 11:1141-1149）。
【００４２】
ゼブラフィッシュでICHを引き起こす少なくとも2つの変異が存在する。バブルヘッドはβpixの機能喪失変異である（前記はp21活性化キナーゼ（Pak）相互反応交換因子のpアイソフォームである）（Liu J, Zeng L, Kennedy RM, Gruenig NM, Childs SJ (2012) “betaPix plays a dual role in cerebral vascular stability and angiogenesis, and interacts with integrin alphavbeta8,” Dev Biol 363:95-105）。βpixは、血管安定性を調節し、βpix変異は、bbhm292 変異体の血管脆弱性およびICHの原因である（Liu J, Fraser SD, Faloon PW, Rollins EL, Vom BJ, Starovic-Subota O, et al (2007) “A betaPix Pak2a signaling pathway regulates cerebral vascular stability in zebrafish,” Proc Natl Acad Sci USA 104:13990-13995）。βpixはまた巣状接着複合体に必要とされ、前記はインテグリンおよびカドヘリンを含む（Frank SR, Hansen SH (2008) “The PIX-GIT complex: a G protein signaling cassette in control of cell shape,” Semin Cell Dev Biol 19:234-244）。別のゼブラフィッシュ変異体（レッドヘッド）は、変異pak2a（p21タンパク質[Cdc42/Rac]活性化キナーゼ2a）を有するrhdmi149である（Liu J, Fraser SD, Faloon PW, Rollins EL, Vom BJ, Starovic-Subota O, et al (2007) “A betaPix Pak2a signaling pathway regulates cerebral vascular stability in zebrafish,”Proc Natl Acad Sci USA 104:13990-13995）。pak2aはCdc42およびRacの下流を活性化するキナーゼであり、βPix、パキシリンおよびGIT1との複合体に含まれる。Cdc42はまたVEカドヘリンおよびアクチン細胞骨格の相互反応に要求されるので、bbhm292変異体の欠陥はこの後者の相互反応の欠損による可能性がある。マウスでは、生殖細胞系列または内皮細胞特異的Pak2ノックアウトは、おそらく血管形成障害のために胚で致死性である（Radu M, Semenova G, Kosoff R, Chemoff J (2014) “PAK signalling during the development and progression of cancer,” Nat Rev Cancer 14:13-25）。両者は、細胞内細胞骨格を細胞外マトリックスと接続するトランスメンブレンタンパク質である（Frank SR, Hansen SH (2008) “The PIX-GIT complex: a G protein signaling cassette in control of cell shape,” Semin Cell Dev Biol 19:234-244; van der Flier A, Sonnenberg A (2001) “Function and interactions of integrins,” Cell Tissue Res 305:285-298）。それらは血管新生および血管安定性で重要である。例えば、ホモ接合性インテグリンαvまたはβ8ヌルマウスはICHのために周産期または周産期前に死亡する（Zhu J, Motejlek K, Wang D, Zang K, Schmidt A, Reichardt LF (2002)“β8 integrins are required for vascular morphogenesis in mouse embryos,”Development 129:2891-2903）。マウスでのVEカドヘリンを標的とする不活化およびVEカドヘリンのβ-カテニン結合細胞質ドメインの切り詰めは、血管構造の不完全再構築および成熟並びに初期致死性に加えて、内皮細胞特異的アポトーシスを誘発する（Carmeliet P, Lampugnani MG, Moons L, Breviario F, Compemolle V, Bono F, et al (1999) “Targeted deficiency or cytosolic truncation of the VE-cadherin gene in mice impairs VEGF-mediated endothelial survival and angiogenesis,” Cell 98:147-157）。つい最近、我々は、抗β3インテグリン抗体を妊娠マウスにデリバリーすることによって、マウス胚および新生児マウスにICHを誘発できることを示した（Yougbare I, Lang S, Yang H, Chen P, Zhao X, Tai WS, Zdravic D, Vadasz B, Li C, Piran S, Marshall A, Zhu G, Tiller H, Killie MK, Boyd S, Leong-Poi H, Wen XY, Skogen B, Adamson SL, Freedman J and Ni H (2015)“Maternal anti-platelet β3 integrin antibodies impair angiogenesis and cause intracranial hemorrhage in fetal and neonatal alloimmune thrombocytopenia,”J.Clinical Investigation (JCI), 125:1545-56）。cdh5のモルホリノ誘発減少（cdh5はヒトVEカドヘリン遺伝子のゼブラフィッシュホモログである）は、血管不安定性、不完全な管腔形成およびICHを48hpfまでに引き起こす（Montero-Balaguer M, Swirsding K, Orsenigo F, Cotelli F, Mione M, Dejana E (2009)“Stable vascular connections and remodeling require full expression of VE-cadherin in zebrafish embryos,”PLoS ONE 4:e5772）。インテグリンは、βPixと巣状接着で複数のタンパク質（標的（GIT1）（ArfGTPアーゼ活性化タンパク質（GAP）である）と相互反応するGタンパク質結合受容体キナーゼを含む）によって連結されることが知られている（Liu J, Zeng L, Kennedy RM, Gruenig NM, Childs SJ (2012) “betaPix plays a dual role in cerebral vascular stability and angiogenesis, and interacts with integrin alphavbeta8,” Dev Biol 363:95- 105）。GIT1のないマウスは肺血管密度及び肺出血が増加する。ゼブラフィッシュではGIT1は初期には普遍的に発現されるが、48hpfまでに頭部に制限されるようになる。MOによるGIT1発現のノックダウンはICHの増加を引き起こす（Liu, et al., conducted a series of experiments in zebrafish that suggest that βPix interacts with αv and β8 integrins and GIT1 to stabilize the cerebral vasculature, and inhibiting expression of any of the components causes ICH (Liu J, Zeng L, Kennedy RM, Gruenig NM, Childs SJ (2012) “betaPix plays a dual role in cerebral vascular stability and angiogenesis, and interacts with integrin alphavbeta8,”Dev Biol 363:95- 105）。
【００４３】
CCM1、2および3はマルチタンパク質複合体を形成することができ、前記複合体はまた、インテグリンβ1-結合タンパク質（ICAP-1）、GTPアーゼRacおよびRapl並びにMAPKキナーゼキナーゼMEKX3を含む（Chrzanowska-Wodnicka M (2013)“Distinct functions for Rap1 signaling in vascular morphogenesis and dysfunction,” Exp Cell Res 319:2350-2359；Liu J, Fraser SD, Faloon PW, Rollins EL, Vom BJ, Starovic-Subota O, et al (2007) “A betaPix Pak2a signaling pathway regulates cerebral vascular stability in zebrafish.Proc Natl Acad Sci U S A 104:13990-13995）。この複合体は、内皮細胞で（ただしおそらくは他の周皮細胞を除く）主としてβカテニンおよびVEカドヘリンと相互反応することによって接着結合を調節し、血管安定性を達成する。ゼブラフィッシュおよびマウスでのccm遺伝子のノックアウトの作用は完全には解明されていないが、胚の生殖細胞系列ノックアウトはヒトの表現型とは類似しない傾向を示す（ただし、いくつかの事例では、条件付き内皮細胞特異的ノックアウトはヒト表現型と類似する）。ゼブラフィッシュでは、rap1bのノックダウンはICHをもたらすが、ccm1と組み合わされたrap1bのサブ表現型レベルの減少もまたICHをもたらす。
細胞内局在および他の要件が、血管安定性およびICH/BMHに対するGTPアーゼシグナリングの作用に影響を与えるということはありそうなことである。なぜならば、生殖細胞系列に変異を有するかまたはCCM2に内皮特異的変異を有するマウスでは、HMGCRのスタチン阻害（Rho GTPアーゼのプレニル化を減少させる）は、内皮の完全性を改善し血管透過性の増加を防ぐからである。しかしながら、ゼブラフィッシュでは、スタチンまたは変異によるHMGCRの阻害およびRho GTPアーゼシグナリング活性化タンパク質のMO誘発機能低下は血管透過性を増加させる（Liu J, Fraser SD, Faloon PW, Rollins EL, Vom BJ, Starovic-Subota O, et al (2007)“A betaPix Pak2a signaling pathway regulates cerebral vascular stability in zebrafish,”Proc Natl Acad Sci USA 104:13990-13995）。この矛盾は、細胞特異的作用、生物の年齢、種の違い、RhoAおよびcdc42の弁別的作用（反対の作用を有する傾向がある（RhoAは脱安定化、cdc2は安定化））または野生型とCCM2動物との間の相違によるということはありそうである。
【００４４】
問題の明示
大脳内出血、BMHおよび海綿状奇形は、頭蓋内出血、脳損傷並びに死亡および身体障害をもたらす血管における血管不安定性の一般的要素を共有する。大脳内出血は、卒中の最も致死性で破壊的な型である。前記を軽減させるために利用可能な薬理学的処置は存在せず、対処されていない高い医療ニーズが存在する。したがって、治療量の血管安定化剤を含み、いくつかの実施態様では徐放性調製物として処方される医薬組成物が希求され、前記は投与されたとき、ICH、BMHおよび多様な原因（脳海綿状奇形を含む）によるICHの発生を予防または軽減するために有効である。
【発明の概要】
【００４５】
ある特徴にしたがえば、記載の発明は血管漏出の発生を減少させる方法を提供し、前記方法は、小分子治療化合物を含む医薬組成物を投与する工程を含み、当該化合物の治療量は、脳内出血の発生率をコントロールと比較して少なくとも30％減少させるために有効である。
ある特徴にしたがえば、当該小分子治療化合物は、アルテムエーテルまたはアルテムエーテル誘導体から成る群から選択される。別の実施態様にしたがえば、アルテミシニンの誘導体はジヒドロアルテミシニン、アルテミシニンまたはアルテスネートである。別の実施態様にしたがえば、小分子治療化合物は、ベニジピン、ラシジピン、エチニルエストラジオールまたはトリプトリドから成る群から選択される。
ある実施態様にしたがえば、血管漏出は、スタチンによって、リポ多糖類によって、または両者によって誘発される。別の実施態様にしたがえば、スタチンはアトルバスタチンである。
ある実施態様にしたがえば、血管漏出は偶発的な大脳内出血である。別の実施態様にしたがえば、偶発的大脳内出血は、ベータ-pix、Pak2a、cdh5、ccm1、ccm2、ccm3、Rap1b、Pggt1b、Hmgcrb、およびベータ3インテグリンから選択される1つ以上の遺伝子の変異と関連して発生する。
ある実施態様にしたがえば、血管漏出は脳微小出血を含む。別の実施態様にしたがえば、脳微小出血はスタチンの投与と関連して発生する。
ある実施態様にしたがえば、血管漏出は脳血管奇形を含む。別の実施態様にしたがえば、脳血管奇形は大脳の海綿状奇形である。
【００４６】
本特許または出願ファイルは彩色された少なくとも1枚の図面を含む。本特許または特許出願公開のカラー図面を含むコピーは、申請及び必要な料金の支支払いに際して当局によって提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図1は、ゼブラフィッシュのアトルバスタチン誘発大脳内出血（ICH）モデルを化学物質スクリーニングのために用いた実験の結果を示す。パネル（A）は、スタチンが働く分子経路を示す模式図である。パネルB−G：ICHは、成熟した野生型またはTg(flk-1:eGFP)およびTg(gata-1:DsRed)ゼブラフィッシュの胚に受精後2時間で1μMのアトルバスタチンを適用することによって誘発され、薬剤化合物を含む96ウェルプレートに並べられた。パネルB、DおよびF（DMSOコントロール処理胚）；パネルC、EおよびG（アトルバスタチン処理胚）。パネルB、DおよびFは、ベヒクルDMSO処理コントロール胚では赤血球の血管外漏出がないことを示す。アトルバスタチン処理胚は脳の出血（約80％パネルCおよびG）および内皮細胞間の接合の増加（パネルEをDと比較）を示す。パネルHはスクリーニングプロセスの案を示す模式図である。パネルIからLは、ARTファミリーの4つの化合物のためのEC50実験を示す（前記のうちの2つはNCCライブラリーから識別された）。データは3から4実験の平均±SEMとして表される。ARM、アルテムエーテル；DHA、ジヒドロ-アルテミシニン；ARS、アルテミシニン；ART、アルテスネート。
【図２】図2は、ゼブラフィッシュの1μMアトルバスタチン誘発脳出血のNCCライブラリーから識別された4つの活性化合物による阻害を示す。図表は、％出血（y軸）対薬剤濃度（Ig nmol/L）（x軸）である。EC50は、有効性50％時の薬剤濃度である。データは3から4実験の平均±SEMとして表される。Bはベニジピン、Eはエチニルエストラジオール、Lはラシジピン、Tはトリプトリドである。
【図３】図3は、ゼブラフィッシュのHMGCR-媒介代謝経路、Rho GTPアーゼ(Cdc42)-カドヘリンシグナリング経路、および大脳海綿状奇形（Ccm）経路の間の関係を示す。HMG-CoAを阻害することによって、スタチン処理は、CDC42-カドヘリン経路を介して、血管不安定性及びゼブラフィッシュの脳出血をもたらし得る。ARTファミリー化合物は、この経路（例えばpak2、βpix）のいくつかの重要な分子の遺伝的ノックアウトによって引き起こされる脳出血のレスキューに有効であることが示される。これは、ART化合物が、脳内の血管安定性に必須である下流の標的で働くことを示唆する。
【図４】図4は、ゼブラフィッシュbbhモデルで、2つの化合物（ART（アルテスネート）およびARM（アルテムエーテル））について薬剤有効性アッセイから得られた結果例を示す。結果はパーセント出血（y軸）対log(薬剤nmol/L)としてプロットされる。n＝30幼生/条件。
【図５】図5は、アルテスネート（ART）およびアルテムエーテル（ARM）を用いたゼブラフィッシュhmgcrbモルファントにおける薬剤有効性アッセイの結果例を示す。結果はパーセント出血（y軸）対log(薬剤nmol/L)としてプロットされる。n＝15−20幼生/条件。
【図６】図6は、アトルバスタチン（ATV）およびアトルバスタチン+アルテムエーテル（ATV＋ARM）で処理したときのmRNAの変化を示す。qRT-PCR分析を用い、表示のように1μMのアトルバスタチン（ATV）、ATV+500nmol/Lのアルテムエーテル（ARM）で処理したゼブラフィッシュでVEカドヘリン（パネルA）。β3インテグリン（パネルB）およびCCM3（パネルC）の遺伝子発現をmRNAレベルで評価した（n＝3）。
【図７】図7は、心拍、血流および心臓浮腫に対するアルテムエーテル（ARM（GMP））の毒性アッセイの結果を示す。心拍及び血流は3（正常心拍および血流）から0（心拍及び血流無し）にランク付けされた。心臓浮腫は、0（浮腫無しの正常な心臓）から-3（重度の心臓浮腫）にランク付けされた。TC50は、最大毒性の50％時の薬剤濃度である。データは3実験の平均±SEMとして表される。
【図８】図8は、アルテムエーテル（ARM）は、マウスのLPS誘発脳微小出血をレスキューすることを示す。パネルAは、LPS処理マウス（n＝8）またはLPS+アルテムエーテル処理マウス（n＝8）の脳における表面微小出血の立体顕微鏡による計測のデータを示す。左パネルは、2つのグループの各々の代表的な画像を示す（矢印は微小出血を示す）。右パネルは統計分析を示す（*P＜0.05、ウェルチ補正実施両側ｔ検定）。データは平均±SDとして表される。LPS処理動物と比較して、ARM処理マウスの脳は、総表面微小出血で劇的な減少を示した。パネルBは、ヘマトキシリンエオシンによって染色された脳スライスの微小出血の定量化のデータを示す。左パネルは、2つのグループの各々の染色脳スライスの代表的画像を示す（矢印はスライスの微小出血を示す）。右のパネル図は、微小出血計測の統計分析を示す（**P＜0.01、ウェルチ補正実施独立両側ｔ検定）。データは平均±SDとして表される。LPS処理およびLPS+ARM処理の両グループについてn＝8。表面微小出血計測と同様に、ARM処理は、マウス脳内の微小出血の総数を有意に減少させた。
【図９】図9は、アルテムエーテル（ARM）はリポ多糖類（LPS）によって誘発されたマウスの微小出血をレスキューすることを示す。パネル（A）は、LPS注射またはLPS+ARM処理脳の2日後のマウス大脳皮質における、高解像検出のT2*-強調グラディエントエコー（GRE）MRIシーケンスの代表的な3D再構成画像を示す。矢印は微小出血を示す。（B）は、ベヒクルコントロールグループおよびアルテムエーテル（ARM）処理グループにおける各脳当たりの微小出血の数を示す棒グラフである。総微小出血体積の定量化を半自動ソフト（Display）を用いて実施し、総脳体積に対して標準化し、10000カウントにおける総ボクセルとして表した。データは平均±SDとして表され（*P＜0.05、ウェルチ補正実施両側ｔ検定）、LPS処理およびLPS+ARM処理の両グループについてn＝8で、ナイーブコントロールについては2である。
【図１０】図10は、アルテムエーテル（ARM）は大脳内出血の抗β3インテグリンマウスモデルでICHを軽減することを示す。パネルAは、出生後2日目に抗β3インテグリン血清を単独注射された（左）またはARM処理された（右）マウスの脳の代表的な未加工T2*-強調グラディエントエコー（GRE）MRI画像を示す。パネルBは、それぞれARM処理無し（左）または処理有り（右）の抗β3血清注射マウスの冠状切断全脳のパラフィン包埋ブロックを示す。パネルCは、抗β3インテグリン血清単独注射またARM処理されたマウスの大脳内出血の頻度の定量化を示す。データは平均±SDとして表される（**P＜0.01、ウェルチ補正実施両側ｔ検定）。ARM処理無しまたは処理有りの抗β3インテグリン血清注射マウスについてはそれぞれn＝29、および24である。
【図１１】図11は、コントロールおよびアルテムエーテル（ARM）（処理用量および4X処理用量）で処理されたマウスの血液ヘモグロビン（g/dL）（y軸）の図表を示す。3日間のARM処理はマウスで貧血を引き起こさない。ARM処理後に血液を血液ヘモグロビン濃度について検査した。血液ヘモグロビン濃度をドラブキンの方法（Drabkin’s method）で査定した。分光光度計データを標準シアンメトヘモグロビン濃度の標準曲線と比較した。コントロールグループには薬剤を投与しなかった。処理用量グループは低用量ARM（25mg/kg）の3日間注射を受け、4X処理用量グループは高用量ARM（100mg/kg）の3日間注射を受けた。データは平均±SDとして表される（nsP＞0.05、一元配置ANOVA、n＝4）。
【図１２】図12は、発生中ゼブラフィッシュにおける大脳血管安定化喪失の薬理学的および遺伝的誘発を示す。（A）大脳血管安定化に関与する遺伝的経路の模式図。（B）Cdc42によって部分的に調節されるVEカドヘリン媒介細胞対細胞接着の模式図。（C）非プレニル化Cdc42は不活性（GDP結合）を維持し、グアニンヌクレオチド解離阻害因子（GDI）と結合したままであることを示す模式図。（D）注射されていない胚を示す写真。（E）hmgcrbを標的とするMOを注射された胚を示す写真。（F）pggtlbを標的とするMOを注射された胚を示す写真。（G）βpixを標的とするMOを注射された胚を示す写真。（H）pak2aを標的とするMOを注射された胚を示す写真。矢印は血液の異常な蓄積部位を示す。（I、K）は、DMSO中でインキュベートされたTg(fli1:EGFP);(gata-1:DsRed)胚の代表的な顕微鏡写真である。（J、L）は、アトルバスタチン中でインキュベートされたTg(fli1:EGFP);(gata-1:DsRed)胚の代表的顕微鏡写真である。（J）の矢印は、停滞したDsRed陽性赤血球蓄積が観察される領域を示す。（L）の矢印は、同じゼブラフィッシュの膨張した大脳血管を示す。（M、P）は、基礎血管構造の断片化と関連する出血を示す写真である。（N、O）は、DMSO中でインキュベートされたTg (fli1:EGFP);(gata-1:DsRed)胚の代表的な明視野顕微鏡写真を示す。（Q、R）は、アトルバスタチンでインキュベートされたTg (fli1:EGFP);(gata-1:DsRed)胚の代表的な明視野顕微鏡写真を示す。星印は出血を示し、黒い点線領域は問題の視野を示す。同じTg(fli1:EGFP);(gata-1:DsRed)胚の黒い点線領域のZ-スタックプロジェクション。白い星印はDsRed陽性赤血球を示し、白い矢印は、血管崩壊が観察される領域を示す。頭側は（I−R）で示される左側である。
【図１３】図13は、ゼブラフィッシュで血管安定性をもたらすHMGCR分子経路を示す。パネルA＆B：安定なEC接合は、Cdc42依存性およびVEカドヘリン媒介性細胞対細胞接着によって維持されることを示す模式図。パネルCは、cdh5に向けて設計されたスプライス誘発モリフォリノは36−48hpfでゼブラフィッシュの大脳内出血を誘発すること示す（側面画像が示されている）。
【図１４】図14パネル（A−B）は、アルテスネートは、ゼブラフィッシュの脳血管の膜安定性を標的にするモルフォリノによって誘発される出血表現型を用量依存的にレスキューすることを示す。（A）試験した3つのモルフォリノの標的部位を示す模式図。（B）アルテスネートは、3つのモルフォリノによって誘発される出血の全てを用量依存的にゼブラフィッシュでレスキューする。パネル（C−D）アルテスネートはbbhm292変異によるICH表現型をレスキューする。（C）上段パネル、bPix遺伝子のスプライシングに影響する点変異を示すbPix遺伝子の部分的なエクソン-イントロン構成。下段パネル、エクソン14にフランキングするプライマーを用いた野生型およびbbhm292変異体cDNAのRT-PCR分析。（D）上段パネル、DMSOまたはアルテスネートで処理し、48hpfで画像化したbbhm292変異体の表現型。矢印は出血部位を示す。下段パネル、アルテスネートでレスキューされる脳出血を有するbbhm292胚のパーセンテージ。
【図１５】図15は、LPSは発生中のゼブラフィッシュ胚で脳出血を誘発し、アルテムエーテルはLPS-誘発死亡率に対して防御作用を有することを示す。（A）LPSが魚水に受精後24時間（hpf）でデリバーされたときの発生中ゼブラフィッシュ胚の生存曲線。（B）は、魚水中のアルテムエーテルは魚の生存に対して防御作用を有することを示す。（C）は、24hpf胚のLPS処理は52％の脳出血を有する胚を生じることを示す（n＝120）（矢印は出血を指す）。（D）（C）のパーセント（％）大脳出血を示す棒グラフ。
【図１６】図16は、スタチンはマウスのLPS誘発大脳内出血を悪化させることを示す。（A）LPS（5mg/kg）に加えてアトルバスタチン（50mg/kg）の処理は処理後24時間で100％の死亡率をもたらしたが、LPS単独処理は同じ試験時間で単に25％死亡率を生じ、スタチン単独では死亡率は全く生じなかった（n＝5）。（B）アトルバスタチン処理は、LPSによって引き起こされる大出血の数を有意に増加させた。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
用語集
本明細書で用いられる“活性を有する”という用語は、意図される治療作用を果たすことができる本記載発明の組成物の要素、成分または構成物質を指す。本明細書で用いられる“投与する”という用語は与えることまたは適用することを意味する。本明細書で用いられる“投与”は、ex vivoで細胞または組織に直接投与することと同様にin vivoで投与することを含む。
本明細書で用いられる“アゴニスト”という用語は、完全なまたは部分的な薬理学的応答を誘発するために受容体を活性化できる化学物質を指す。受容体は、内因性または外因性アゴニストおよびアンタゴニストによって活性化または不活化され、生物学的応答の刺激または阻害を生じることができる。生理学的アゴニストは、同じ身体的応答を生じるが同じ受容体と結合しない物質である。特定の受容体に対する内因性アゴニストは、当該身体によって天然に生成される化合物で、前記は当該受容体と結合しこれを活性化する。スーパーアゴニストは、標的受容体に対する内因性アゴニストよりも強い最大応答を生じることができ、したがって有効性は100％より高い。このことは、必ずしもスーパーアゴニストが内因性アゴニストよりも強力であることを意味せず、むしろ受容体結合後に細胞内部で生じ得る可能な最大応答の比較である。完全なアゴニストは受容体と結合しこれを活性化し、当該受容体で完全な有効性を示す。部分的アゴニストもまた与えられた受容体と結合しこれを活性化するが、ただし完全なアゴニストと比較して当該受容体で単に部分的な有効性を有する。逆アゴニストは、受容体についてあるアゴニストと同じ受容体結合部位に結合し、受容体の構成的活性を逆転させる作用因子である。逆アゴニストは受容体アゴニストの反対の薬理学的作用を発揮する。不可逆的アゴニストは、受容体が永続的に活性化される態様で受容体に永続的に結合するアゴニストのタイプである。前記は、アゴニストと受容体との関係が可逆的であるという点で単なるアゴニストとは別個であり、一方、不可逆的アゴニストと受容体との結合は不可逆的であると考えられる。これは、化合物に短時間に急激に活性を発生させ、その後に受容体の脱感作および内在化が続き、これは長期的処置によりアンタゴニストにより類似する作用をもたらす。選択的アゴニストはある一定のタイプの受容体に特異的である。
本明細書で用いられる“増幅”という用語は、遺伝的物質のコピー数の増加をもたらす当該遺伝的物質の複製を指す。
【００４９】
解剖学的用語：
動物（典型的には頭および口を有する一方の末端を有し、反対側の末端はしばしば肛門および尾を有する）を指すときは、当該頭の末端は頭側末端と称され、一方、尾の末端は尾側末端と称される。頭自体の内部では、吻側は鼻の末端に向かう方向を指し、尾側は尾の方向を指すために用いられる。常態で上向き方向にある（重力と反対の）動物体の表面または面は背側であり、反対側（全脚で歩行し遊泳または飛行するときに典型的には地面に最も近い面）は腹側である。四肢または他の付加物で、本体に近い点は“近位”であり、離れた点は“遠位”である。3つの基本的参照平面が動物解剖学で用いられる。“矢状面”は身体を左部分および右部分に分かつ。“正中矢状面”は中央に存在し、すなわちそれは正中線上構造物（例えば脊髄）を通り、全ての他の矢状面は前記に対して平行である。“前頭”面は身体を背側部分及び腹側部分に分かつ。“横断”面は身体を頭側部分および腹側部分に分かつ。
人間を指すときは、身体およびその部分は、身体が直立していると仮定して常に記述される。頭の末端に近い身体部分は“上方”（動物の頭側と一致する）であり、一方、遠い身体部分は“下方”（動物の尾側と一致する）である。身体の前面に近い対象物は“前方”（動物の腹側に一致する）と称され、身体の背面に近い対象物は“後方”（動物の背側に一致する）と称される。横断平面、軸平面または水平面はX-Y平面であり地面に平行で、前記は上方/頭と下方/脚を分離する。前頭面（coronal plane, frontal plane）はY-Z平面であり地面に対して垂直で、前記は前方と後方を分離する。矢状面はX-Z平面で地面および前頭面に対して垂直であり、前記は左と右を分離する。正中矢状面は特別な矢状面で、前記は正確に身体の中央に存在する。
正中線に近い構造物は内側と称され、動物の側面に近い構造物は外側と称される。したがって、内側構造物は正中矢状面に近く、外側構造物は正中矢状面から遠い。身体の正中線内の構造物は正中に存在する。例えば人間の鼻の先端は正中線内に存在する。
同側は同じ側を意味し、対側は他方の側を意味し、両側は両方の側面を意味する。身体の中心に近い構造物は近位または中枢であり、一方、中心から遠いものは遠位または抹消である。例えば、手は腕の遠位端にあり、一方、肩は近位端に存在する。
【００５０】
本明細書で用いられる“アンタゴニスト”という用語は、別の物質の作用を妨げる物質を指す。
“アポトーシス”または“プログラムされた細胞死”という用語は、生物を損傷しない、以下を含む多様な形態学的変化をもたらす一連の生化学的事象で構成される、生物学的恒常性に寄与する高度に調節された能動的プロセスを指す：ブレッビング、細胞膜の変化、例えば膜の非対称性および接着の消失、細胞収縮、核断片化、クロマチン凝縮および染色体DNAの断片化。
アポトーシスによる細胞死は多くの種々の要因によって誘発され、多数のシグナリング経路が関与し、いくつかはカスパーゼプロテアーゼ（システインプロテアーゼの類い）に依存し、他のものはカスパーゼ非依存性である。前記細胞死は、アポトーシスシグナリング経路の活性化を生じる、多くの種々の細胞刺激（細胞表面受容体、ストレスへのミトコンドリア応答、および細胞傷害性T細胞を含む）によって惹起され得る。
アポトーシスに関与するカスパーゼは、タンパク分解カスケードでアポトーシスシグナルを伝達する。カスパーゼは他のカスパーゼを切断および活性化し、切断および活性化されたカスパーゼは続いて細胞死をもたらす他の細胞標的を分解する。カスケードの上方端のカスパーゼにはカスパーゼ8およびカスパーゼ9が含まれる。カスパーゼ8は、死亡ドメイン（DD）様Fasによる受容体との応答に関与する最初のカスパーゼである。
腫瘍壊死因子受容体ファミリーの受容体は、炎症シグナリングと同様に、アポトーシス誘発と関係する。Fas受容体（CD95）は、他の細胞の表面で発現されるFasリガンドによってアポトーシスシグナルを媒介する。Fas-FasL相互反応は免疫系で重要な役割を果たし、この系の欠如は自己免疫をもたらす。このことは、Fas媒介アポトーシスは自己反応性リンパ球を除去することを示している。Fasシグナリングはまた、形質転換細胞およびウイルス感染細胞を除去するために、免疫監視に関与する。Fasと別の細胞上のオリゴマー化されたFasLとの結合は、死亡ドメイン（DD）と名付けられた細胞質ドメインを介してアポトーシスシグナリングを活性化する（DDはシグナリングアダプター（FAF、FADDおよびDAXを含む）と相互反応してカスパーゼタンパク分解カスケードを活性化する）。カスパーゼ8およびカスパーゼ10は最初に活性化され、続いて下流のカスパーゼおよび多様な細胞基質（細胞死をもたらす）を切断および活性化する。
【００５１】
ミトコンドリアは、ミトコンドリアタンパク質を細胞質に放出することによってアポトーシスシグナリング経路に参加する。チトクロームc（電子伝達における重要タンパク質）はアポトーシスシグナルに応答してミトコンドリアから放出され、Apaf-1（ミトコンドリアから放出されるプロテアーゼ）を活性化する。活性化Apaf-1は、カスパーゼ9およびカスパーゼ経路の残りのものを活性化する。Smac/DIABLOがミトコンドリアから放出され、常態ではカスパーゼ9と相互反応してアポトーシスを阻害するIAPタンパク質を阻害する。Bcl-2ファミリータンパク質によるアポトーシス調節は、ミトコンドリア膜から侵入するファミリーメンバー形複合体として生じ、チトクロームcおよび他のタンパク質の放出を調節する。アポトーシスを引き起こす腫瘍壊死因子ファミリー受容体は、カスパーゼカスケードを直接活性化するが、前記はまたBid（Bcl-2ファミリーメンバー（ミトコンドリア媒介アポトーシスを活性化する））を活性化できる。Bax（別のBcl-2ファミリーメンバー）は、この経路によって活性化されてミトコンドリア膜に局在化し、その透過性、チトクロームcおよび他のミトコンドリアタンパク質放出を増加させる。Bcl-2およびBcl-xLは孔形成を防ぎアポトーシスを阻止する。チトクロームcと同様に、AIF（アポトーシス誘発因子）はミトコンドリアで見出されるタンパク質であり、前記はアポトーシス刺激によってミトコンドリアから放出される。チトクロームCがカスパーゼ依存アポトーシスシグナリングと連結されるとき、AIF放出は、カスパーゼ非依存アポトーシスを刺激して核に移動し、そこで前記はDNAと結合する。AIFによるDNA結合は、クロマチン凝縮およびDNA断片化（おそらくヌクレアーゼの補充による）を刺激する。
【００５２】
ミトコンドリアストレス経路はミトコンドリアからチトクロームcの放出で開始し、前記は続いてApaf-1と相互反応して自己切断およびカスパーゼ9の活性化を引き起こす。カスパーゼ3、6、および7は下流のカスパーゼであり、それらは上流のプロテアーゼによって活性化され、細胞標的を切断するために働く。
細胞傷害性T細胞によって放出されるグランザイムBおよびパーフォリンは標的細胞でアポトーシスを誘発して膜貫通孔を形成し、アポトーシスを惹起する。前記はおそらくはカスパーゼの切断によるが、ただしグランザイムB媒介アポトーシスのカスパーゼ非依存メカニズムが示唆されている。
ヌクレオソームラダーを生じるアポトーシス経路によって活性化される多数のヌクレアーゼによる核ゲノムの断片化は、アポトーシスに特徴的な細胞応答である。アポトーシスに関与する1つのヌクレアーゼは、DNA断片化因子（DFF）（カスパーゼ活性化DNアーゼ（CAD））である。DFF/CADは、その結合阻害因子ICADのカスパーゼプロテアーゼによるアポトーシス時の切断を介して活性化される。DFF/CADは、クロマチン成分、例えばトポイソメラーゼIIおよびヒストンH1と相互反応して、クロマチン構造を凝縮し、おそらくCADをクロマチンに補充する。別のアポトーシス活性化プロテアーゼはエンドヌクレアーゼG（EndoG）である。EndoGは核ゲノムでコードされるが、正常細胞ではミトコンドリアに局在する。EndoGは、アポトーシスと同様に、ミトコンドリアゲノムの複製で重要な役割を果たす可能性がある。アポトーシスシグナリングはミトコンドリアからEndoGの放出を引き起こす。EndoGおよびDFF/CAD経路は、EndoG経路がDFFを欠く細胞でなお発生するので独立性である。
【００５３】
低酸素症は、その後に再酸素供給が続く低酸素症と同様にチトクロームc放出およびアポトーシスを作動させることができる。グリコゲンシンターゼキナーゼ（GSK-3）（ほとんどの細胞タイプで普遍的に発現されるセリン-スレオニンキナーゼ）は、ミトコンドリア細胞死経路を活性化する多くの刺激によりアポトーシスを媒介または増強するように思われる（Loberg, RD, et al.(2002) J.Biol.Chem.277 (44):41667-673）。前記は、カスパーゼ3活性化を誘発し、アポトーシス促進腫瘍抑制遺伝子p53を活性化することが示された。GSK-3は、アポトーシス促進Bcl-2ファミリーメンバー、Baxの活性化および移転を促進することもまた示唆されている（Baxは凝集およびミトコンドリアへの局在時にチトクロームc放出を誘発する）。Aktは重要なGSK調節因子であり、GSK-3のリン酸化及び不活化はAktの抗アポトーシス作用のいくつかを媒介し得る。
本明細書で用いられる“外観”はそのもの自体の外側の特徴または提示を指す。
本明細書で用いられる“適用”という用語は、接触常態に置くことまたはその上に置くか若しくは広げることを指す。
“アッセイマーカー”または“レポーター遺伝子”（または“レポーター”）という用語は、検出され、または容易に識別され測定され得る遺伝子を指す。レポーター遺伝子の発現はRNAレベルまたはタンパク質レベルで測定できる。遺伝子生成物（実験的アッセイプロトコルで検出できる）には、マーカー酵素、抗原、アミノ酸配列マーカー、細胞表現型マーカー、核酸配列マーカーなどが含まれるが、ただしこれらに限定されない。研究者らは、あるレポーター遺伝子を細胞培養、細菌、動物又は植物中の関心がある別の遺伝子に結合させることができる。例えば、いくつかのレポーターは、選別可能なマーカーであるか、またはそれらを発現する生物の容易な識別およびアッセイを可能にする特徴を当該生物に付与する。レポーター遺伝子を生物に導入するために、研究者らは、細胞または生物に挿入されるべき同じDNA構築物にレポーター遺伝子および関心のある遺伝子を置く。培養中の細菌または真核細胞のために、前記はプラスミドの形態であり得る。一般的に用いられるレポーター遺伝子には、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、および選別可能マーカー（例えばクロラムフェニコールまたはカナマイシン）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００５４】
本明細書で用いられる“結合する（associate）”という用語およびその種々の文法形は、直接的に、間接的に、能動的に、非能動的に、不活性に、活性に、完全にまたは不完全に結合すること（joining）、接続すること（connecting）または組合わされること（combining to）を指す。
本明細書で用いられる“結合して（in association with）”という用語は、ある物質と別の物質とが接続、結合または連結されている2つの物質の間の関係を指す。
本明細書で用いられる“バイオマーカー”（または“バイオシグナチャー”）という用語は、ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、遺伝子、代謝物、または生物学的状態の指標として用いられる任意の他の物質を指す。客観的に測定され、正常な生物学的プロセス、病理学的プロセス、または治療的介入に対する薬理学的応答の細胞性または分子性指標として評価されることを特徴とする。本明細書で用いられる“指標”という用語は以下を指す：時間の関数としての相対的変化を示すことができる一連の観察事実に由来する任意の物質、数または比率；またはその存在若しくは提示を目で見ることができるかまたは証拠とするシグナル、徴候、マーク、出来事または症状。提唱されたバイオマーカーがいったん検証されたら、前記バイオマーカーを用いて、疾患のリスク、個々の疾患の存在を診断するか、または当該疾患について個々に治療を調整（薬剤治療または投与レジメンを選択）することができる。可能な薬剤療法の評価で、バイオマーカーは天然のエンドポイント（例えば生存率または不可逆的罹患率）の代用物として用いることができる。治療がバイオマーカーに変化を生じ当該変化が健康の改善に直結するならば、当該バイオマーカーは臨床有益性を評価するための代用エンドポイントとして役立ち得る。臨床エンドポイントは、患者がどのように感じ機能しまたは生存するかを測定するために用いることができる変数である。代用エンドポイントは、臨床エンドポイントのために代用することが意図されるバイオマーカーである。これらのバイオマーカーは、規制機関および臨床コミュニティーにとって受け入れ可能な信頼レベルを有する臨床エンドポイントを予測するために提示される。
【００５５】
“cDNA”という用語は成熟mRNA鋳型から合成されるDNAを指す。cDNAはもっとも頻繁には逆転写酵素を用いて成熟mRNAから合成される。この酵素はmRNAの一本鎖上で作動し、それらのDNA相補物（T、A、C、G）に対してRNA塩基対（AU、G、C、）を形成して相補性DNAを生成する。例えば真核細胞cDNA（そのイントロンはスプライスされている）を得るためにcDNAを作製するいくつかの公知の方法が存在する。一般的には、これらの方法は以下の工程を取り入れる：a）真核細胞がDNA（遺伝子由来）をRNA（前mRNA）に転写する；b）同じ細胞が、イントロンをスプライスアウトしさらにポリAテールおよび5'メチル-グアニンキャプを付加することによって、前mRNA鎖をプロセッシングする；c）この成熟mRNA混合物を細胞から抽出する；d）ポリTオリゴヌクレオチドプライマーを当該成熟mRNA鋳型のポリAテールにハイブリダイズさせる（逆転写酵素はその作動の開始のためにプライマーとしてこの二本鎖セグメントを要求する）；e）逆転写酵素をデオキシヌクレオチドトリホスフェート（A、T、G、C）と一緒に添加し、逆転写酵素は成熟mRNA上をスキャンして、当該mRNA鋳型を相補するDNAの配列を合成する。このDNA鎖が相補性DNAである（以下もまた参照されたい：Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons（参照によってその全体が本明細書に含まれる））。
本明細書で用いられる“細胞”という用語は生きている有機体の構造的および機能的単位を指し、前記は、生物と分類される有機体の最小単位である。
本明細書で用いられる“細胞培養”という用語は、最初の組織、初代培養から採取された分散細胞に由来する、または細胞株若しくは細胞亜株（cell strain）に由来する培養の樹立または維持を指す。
本明細書で用いられる“細胞株”という用語は不死化細胞を指し、前記は形質転換されてあり培養で無限に継代することができる。
【００５６】
本明細書で用いられる“適合できる”という用語は、組成物の成分が、通常の使用条件下で当該組成物の有効性を実質的に減少させる相互反応が存在しない態様で互いに組み合わせることができることを意味する。
“組成物”および“処方物”という用語は互換的に用いられ、全ての活性および不活性成分を含む本記載の発明の製品を指す。本明細書で用いられる“医薬組成物”または“医薬処方物”という用語は、標的症状または疾患を予防し、重篤度を軽減し、治癒させ或いは治療するために用いられる組成物または処方物を指す。
本明細書で用いられる“接触させる”という用語は、接触状態に持ち込むことまたは接触状態に置くこと（bring in contact, put in contact）、接触していることまたは接触することになること（be in contact, come into contact）を指す。本明細書で用いられる“接触”という用語は、直に（immediate proximity）または近くで（local proximity）触れる状況または状態を指す。組成物と標的場所（例えば器官、組織または細胞であるが、ただしこれらに限定されない）との接触は、当業者に公知の任意の投与手段によって生じ得る。
“欠失”または“欠失変異”という用語は本明細書では互換的に用いられ、塩基または塩基対がDNAから失われることを指す。
【００５７】
本明細書で用いられる“誘導体”という用語は、同様な構造の別の化合物から1つ以上の工程で生成され得る化合物を意味する。あるペプチドまたは化合物の1つの“誘導体”または“複数の誘導体”が、当該ペプチドまたは化合物の所望の機能を少なくともある程度保持する。したがって、“誘導体”のまた別の用語は“機能的誘導体”であり得る。誘導体はペプチドの化学的改変を含むことができ、前記改変は例えばアルキル化、アシル化、カルバミル化、ヨード化、または当該ペプチドを誘導する任意の改変である。そのような誘導分子には、例えば、アミンヒドロクロリド、p-トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、t-ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基、またはフォルマル基を形成するために遊離アミノ基が誘導されてある分子が含まれる。遊離カルボキシル基は誘導されて塩、エステル、アミド、またはヒドラジドを形成できる。遊離ヒドロキシル基は誘導されてO-アシルまたはO-アルキル誘導体を形成できる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は誘導されてN-im-ベンジルヒスチジンを形成できる。さらにまた誘導体またはアナログとして含まれるものは、20の標準アミノ酸の1つ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体（例えば4-ヒドロキシプロリン、5-ヒドロキシリジン、3-メチルヒスチジン、ホモセリン、オルニチンまたはカルボキシグルタミン）を含むペプチドであり、さらにペプチド結合によって連結されないアミノ酸を含むことができる。そのようなペプチド誘導体をペプチド合成時に取り込むことができ、或いはペプチドは周知の化学的改変方法によって改変できる（例えば以下を参照されたい：Glazer et al.(1975), Chemical Modification of Proteins, Selected Methods and Analytical Procedures, Elsevier Biomedical Press, New York）。
【００５８】
“検出可能マーカー”は選別可能マーカーおよびアッセイマーカーの両方を包含する。“選別可能マーカー”という用語は、発現構築物で形質転換された細胞をそれに対して選別またはスクリーニングすることができる多様な遺伝子生成物を指し、前記には、薬剤耐性マーカー、蛍光活性化細胞選別で有用な抗原性マーカー、接着マーカー（例えば選択的接着を可能にする接着リガンドに対する受容体）などが含まれる。核酸が合成により調製または改変されるとき、意図される宿主（当該核酸が発現される）の公知のコドン優先性を利用することができる。
“検出可能な応答”という用語は、アッセイ（検出試薬を用いてまたは用いないで実施できる）で検出できる任意のシグナルまたは応答を指す。検出可能な応答には、放射性崩壊およびエネルギー（例えば蛍光、紫外線、赤外線、可視線）放射、吸収、極性化、蛍光、燐光、伝達、反射、共鳴伝達が含まれるが、ただしこれらに限定されない。検出可能な応答にはまた、クロマトグラフィー移動度、濁度、電気泳動移動度、質量分析、紫外線スペクトル、赤外線スペクトル、核磁気共鳴スペクトル、およびｘ線回折が含まれる。また別に、検出可能な応答は、生物学的材料の1つ以上の特性を測定するアッセイの結果、例えば融点、密度、伝導率、表面弾性波、触媒活性、元素組成であってもよい。“検出試薬”は、問題の物質の有無の指標となる検出可能な応答を生じる任意の分子である。検出試薬には、任意の多様な分子（例えば抗体、核酸配列および酵素）が含まれる。
本明細書で用いられる“分化”という用語は、培養で組織特異的弁別特性を示す細胞の特性を指す。
“有効量”という用語は、所望される生物学的作用を認識するために必要なまたは十分な量を指す。
本明細書で用いられる“EC50”という用語は、薬剤の最大可能効果の50％を生じる当該薬剤の濃度（モル単位またはg/Lで表される）を指す。
【００５９】
“発現系”という用語は遺伝的配列を指し、前記は、あるタンパク質コード領域の発現を達成するために必要な遺伝的シグナルの全てに作動できるように連結される当該タンパク質コード領域を含む。慣例的に、発現系は、調節エレメント（例えばプロモーターまたはエンハンサー）を含み、タンパク質コード領域の転写および/または翻訳を増強させるか、または過剰発現制御を提供する。調節エレメントは、タンパク質コード領域の上流または下流に位置するか、またはタンパク質コード領域を中断するイントロン（非コード領域）に配置され得る。また別には、タンパク質コード領域そのものの配列が調節能力を含むこともまた可能である。
本明細書で用いられる“hpf”という用語は受精後の時間を指す。
“ハイブリダイゼーション”という用語は、相補的な一本鎖核酸の単一分子への結合のプロセスを指す。ヌクレオチドは通常状態下でそれらの相補物と結合し、したがって2本の完全に相補的な鎖はたやすく互いに結合（または‘アニール’）するであろう。しかしながら、ヌクレオチドの種々の分子幾何学のために、2本の鎖の間のただ1つの不一致が当該2つの鎖の結合をエネルギー的に不利にする。2本の鎖がアニールする速度を定量することによる塩基不適合の影響の測定は、アニールされる2本の鎖における塩基配列の類似性に関する情報を提供することができる。本明細書で用いられる“特異的にハイブリダイズする”という用語は、ある核酸が、当該核酸と本来対を形成しなかったDNAの少なくとも一方の鎖の相補的領域と特徴的にまたは確実に塩基対を形成するプロセスを指す。選択的にハイブリダイズする核酸は、当該核酸配列の指定された核酸標的配列との（ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での）ハイブリダイゼーションを実行し、そのハイブリダイゼーションの程度は、非標的核酸配列とのハイブリダイゼーションよりも検出可能なほど強く（例えばバックグラウンドを少なくとも2倍超える）、さらに非標的核酸を実質的に排除するほどである。選択的にハイブリダイズする配列は、典型的にはおよそ少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％配列同一性、または100％配列同一性（すなわち相補性）を有する。
【００６０】
本明細書で用いられる“ヒポモルフィック変異”という用語は変異の一タイプを指し、前記変異では変化遺伝子の生成物は減少レベルの活性を有するか、または野生型遺伝子の生成物は減少レベルで発現される。
本明細書で用いられる“阻害する（inhibiting, inhibit, inhibition）”は、量またはプロセスの速度の減少、プロセスの完全な停止、またはその作用若しくは機能の低下、制限または遮断を指す。阻害は、ある物質の量、割合、作用機能、またはプロセスの少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、または少なくとも99％の減少または低下を含むことができる。
本明細書で用いられる“阻害因子”という用語は、酵素と結合し、それによって酵素活性を低下させる分子を指す。酵素阻害因子は、酵素に結合し、それによって酵素活性を低下させる分子を指す。阻害因子の結合は、基質が酵素の活性部位へ侵入するのを停止させるか、および/または酵素がその反応を触媒するのを妨害することができる。阻害因子の結合は可逆性または不可逆性である。通常、不可逆性阻害因子は酵素と反応し、例えば酵素活性に要求される重要なアミノ酸残基を改変することによって当該酵素を化学的に変化させる。対照的に、可逆性阻害因子は非共有結合で結合し、これらの阻害因子が酵素、酵素基質複合体またはその両方に結合するか否かに応じて種々のタイプの阻害を生じる。酵素阻害因子はしばしばそれらの特異性および効力によって評価される。
【００６１】
“単離された分子”は、実質的に純粋であり、当該分子が天然にまたはin vivo系で通常的に一緒に見出される他の物質を当該物質の意図される使用のために実際的および適切な程度に含まない分子である。特に、組成物は、十分に純粋であり宿主細胞の他の生物学的構成物をほとんど含まず、例えば医薬調製物の製造で有用であるか、または当該組成物が核酸、ペプチドまたは多糖類である場合には配列決定で有用である。組成物は医薬調製物で医薬的に許容できる担体と混合できるので、当該組成物は、調製物の重量でほんのわずかなパーセンテージを含むことができる。当該組成物は、それにもかかわらず、当該組成物が生きている系でまたは合成時に関係し得る物質から実質的に分離されてあるという点で実質的に純粋である。本明細書で用いられるように、“実質的に純粋”という用語は、分析プロトコルによって決定したとき少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％純粋を指す。そのようなプロトコルには、例えば蛍光活性化細胞選別、高速度液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、クロマトグラフィーなどが含まれ得るが、ただしこれらに限定されない。
本明細書で用いられる“漸進的最小化”は、一続き若しくは一連の事象の進展の量、範囲、サイズ、または程度の減少を指す。
本明細書で用いられる“調整する”は、一定の尺度または割合に調節すること、変化させること、順応させること、または調整することを意味する。
【００６２】
本明細書で用いられる“モルフォリノオリゴヌクレオチド（MO）”という用語は、ホスホロジアミデート分子骨格を有する非イオン性DNAアナログを指し、前記はアンチセンス核酸配列内の特異的配列への他の分子のアクセスを遮断する。それらはDNAまたはRNAと比較して変化した骨格結合を有するが、モルフォリノはワトソン-クリック塩基対形成によって相補性核酸配列と結合する。この結合は類似するDNAおよびRNAオリゴマーの結合よりも強くなく、アンチセンス遺伝子阻害のためには比較的長い25塩基モルフォリノの使用を必要とする。当該骨格はヌクレアーゼによる消化に対してモルフォリノを耐性にさせる。さらにまた、当該骨格は負の電荷を欠くので、モルフォリノは細胞タンパク質と非選択的に相互作用する可能性が低いと考えられる（そのような相互作用はしばしば情報に富む表現型の観察をあいまいにする）（Corey, D.R.and J.M.Abrams (2001)“Morpholino antisense oligonucleotides:tools for investigating vertebrate development,”Genome Biol.2(5): 1015.1-1015.3）。MOとmRNAとの間の二重鎖形性はmRNA翻訳開始コドン近くのMOハイブリダイゼーションにより翻訳を妨げ、さらにスプライスドナー部位を標的とすることによって正確なスプライシングを混乱させる（Wada, T.et al (2012)“Antisense morpholino targeting just upstream from a poly(A) tail junction of material mRNA remoes the tail and inhibits translation,”Nucleic Acids Res.40 (22):e173）。
本明細書で用いられる“変異”という用語は、生物の遺伝子または染色体内のDNA配列の変化（親型では見出されない新しい特徴または特性の発生を生じる）、およびそのような変化が染色体内で生じるプロセス（遺伝子をコードするDNAのヌクレオチド配列の変化または染色体の物理的配置の変更による）を指す。3つの変異メカニズムには、置換（ある塩基対を別の塩基対に交換）、付加（1つ以上の塩基の配列内への挿入）、および欠失（1つ以上の塩基対の消失）が含まれる。
【００６３】
“核酸”という用語は、本明細書では一本鎖または二本鎖形のDNAまたはRNAポリマーを指し、前記は特段に限定されなければ公知のアナログを包含し、前記アナログは、それらが天然に存在するヌクレオチドと同様な態様で一本鎖核酸とハイブリダイズするという点で天然のヌクレオチドの本質的な性質を有する（例えばMOオリゴヌクレオチド）。
“ヌクレオチド”という用語は、複素環式塩基、糖および1つ以上のリン酸基から成る化学的化合物を指すために用いられる。もっとも一般的なヌクレオチドでは、塩基はプリンまたはピリミジンの誘導体であり、糖はペントースデオキシリボースまたはリボースである。ヌクレオチドは核酸のモノマーであり、核酸を形成するためには3つ以上が一緒に結合する。ヌクレオチドはRNA、DNA、およびいくつかの補因子（CoA、FAD、DMN、NAD、およびNADPを含むが、ただしこれらに限定されない）の構造的単位である。プリンはアデニン（A）およびグアニン（G）を含み、ピリミジンはシトシン（C）、チミン（T）およびウラシル（U）を含む。
【００６４】
“作動できるように連結される”という語句は、第二の配列またはドメインと十分に近位に位置する第一の配列またはドメインを指し、したがって第一の配列またはドメインは、当該第二の配列またはドメインの制御下で当該第二の配列またはドメインに対して影響を発揮できる。
“ポリヌクレオチド”という用語はDNA、RNAまたはそのアナログを指し、前記アナログは、それらが天然に存在するヌクレオチドと実質的に同じヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか、および/または天然に存在するヌクレオチドと同じアミノ酸への翻訳を可能にするという点で天然のリボヌクレオチドの本質的な性質を有する。特段に指定されなければ、当該用語は指定の配列とともにその相補性配列の言及を含む。したがって、安定化のためにまたは他の理由のために改変された骨格を有するDNAおよびRNAは、当該用語が本明細書で意図されるように“ポリヌクレオチド”である。さらに、ほんの2例を挙げれば、通常でない塩基（例えばイノシン）または改変塩基（例えばトリチル化塩基）を含むDNAまたはRNAもまた、当該用語が本明細書で用いられるポリヌクレオチドである。きわめて多様な改変がDNAおよびRNAに対して実施され、当該DNAおよびRNAは当業者に公知の有用な多くの目的に役立つ。本明細書で用いられるように、ポリヌクレオチドという用語は、そのような化学的、酵素的または代謝的に改変されたポリヌクレオチド形とともにウイルスおよび細胞（とりわけ単純な細胞および複雑な細胞を含む）に特徴的なDNAおよびRNAの化学的形態を包含する。
【００６５】
本明細書で用いられる“医薬組成物”という用語は、標的症状、症候群、異常または疾患を予防、重篤度の軽減、治癒或いは治療のために用いられる組成物を指す。
本明細書で用いられる“医薬的に許容できる担体”という用語は、医薬の投与に通常的に用いることができる任意の実質的に非毒性の担体を指す（当該医薬中で本発明の単離ポリペプチドは安定かつ生物利用可能な状態を保持するであろう）。医薬的に許容できる担体は、十分に高純度および十分に低毒性であり、治療される哺乳動物への投与のために当該医薬を適切にさせる必要がある。担体はさらに、活性な作用因子の安定性および生物利用性を維持するべきである。医薬的に許容できる担体は液体でも固体でもよく、計画的な投与態様を考慮して選択され、活性な作用因子および与えられた組成物の他の成分と一緒にしたときに所望される嵩、一貫性などを提供する。
【００６６】
本明細書で用いられる“医薬的に許容できる塩”という用語は、適切な医学的判断の範囲内で、人間およびより下等な動物の組織に接触させて使用するために適切であり、不適切な毒性、刺激、アレルギー反応などをもたず、さらに合理的な利益/リスク比に見合う塩を指す。医薬として用いられるとき、当該塩は医薬的に許容できるはずであるが、医薬的に許容できない塩を用いてその医薬的に許容できる塩を都合よく調製することができる。そのような塩には以下の酸から調製されるものが含まれる（ただしそれらに限定されない）：塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、p-トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン-2-スルホン酸、およびベンゼンスルホン酸。そのような塩はまたアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩として、例えばカルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩として調製できる。“医薬的に許容できる塩”とは、適切な医学的判断の範囲内で、人間およびより下等な動物の組織に接触させて使用するために適切であり、不適切な毒性、刺激、アレルギー反応などをもたず、さらに合理的な利益/リスク比に見合う塩を意味する。医薬的に許容できる塩は当業界で周知である。たとえば、P.H.Stahlらは以下で詳細に医薬的に許容できる塩を記載している："Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use"（Wiley VCH, Zurich, Switzerland:2002）。塩は、本発明に記載の化合物の最終的な単離および精製時にin situで調製するか、または遊離塩基官能基を適切な有機酸と反応させることによって分離することができる。代表的な酸付加塩には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、およびウンデカン酸塩。塩基性窒素含有基もまた以下のような薬剤を用いて四級化することができる：ハロゲン化低級アルキル、例えば塩化、臭化、ヨウ化メチル、エチル、プロピルおよびブチル；硫酸ジアルキル、例えば硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチルおよびジアミル；長鎖ハロゲン化物、例えば塩化、臭化、ヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリル；ハロゲン化アリールアルキル、例えば臭化ベンジルおよびフェネチル並びに他のもの。水溶性、油溶性または分散性生成物がそれによって得られる。医薬的に許容できる酸付加塩を生成するために用いることができる酸の例には、塩酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸のような無機酸、並びにシュウ酸、マレイン酸、コハク酸およびクエン酸のような有機酸が含まれる。塩基付加塩は、本発明に記載の化合物の最終的な単離および精製時に、カルボン酸含有部分を適切な塩基（例えば医薬的に許容できる金属陽イオンの水酸化物、炭酸化物または重炭酸化物）またはアンモニアまたは有機一級、二級若しくは三級アミンと反応させることによってin situで調製することができる。医薬的に許容できる塩には、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を土台とする陽イオン（例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム塩など）、並びに非毒性四級アンモニアおよびアミン陽イオン（アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、エチルアミンなどを含む）が含まれる（ただしこれらに限定されない）。塩基付加塩の生成に有用な他の代表的な有機アミンにはエチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン、ピペラジンなどが含まれる。医薬的に許容できる塩はまた、当業界で周知の標準的な手順を用いて、例えば十分に塩基性の化合物（例えばアミン）を生理学的に許容できる陰イオンを与える適切な酸と反応させることによって入手できる。カルボン酸のアルカリ金属（例えばナトリウム、カリウムまたはリチウム）またはアルカリ土類金属（例えばカルシウムまたはマグネシウム）塩もまた生成され得る。
【００６７】
“プライマー”という用語は、DNA鎖とハイブリダイズするとき、適切な重合化剤の存在下で伸長生成物の合成を開始することができる核酸を指す。プライマーは、DNA鎖の特異的領域との固有のハイブリダイゼーションのために十分に長い。プライマーはまた、cDNAの第一鎖の合成のためにRNAで用いることができる。
“プロモーター”という用語は、転写開始からDNA上流、下流または遠位にあり、RNAポリメラーゼおよび転写開始のための他のタンパク質の認識および結合に必要とされる領域を指す。例えばT7、T3およびSp6はRNAポリメラーゼプロモーター配列である。RNA合成では、プロモーターは、どの遺伝子がメッセンジャーRNA生成に用いられるべきか、さらに伸長によって、細胞が製造するどのタンパク質を制御するべきかの範囲を示すための手段である。プロモーターは、他の調節領域（エンハンサー、サイレンサー、境界エレメント/隔離因子）と協調して働き、与えられた遺伝子の転写レベルを指令することができる重要なエレメントである。
【００６８】
本明細書で用いられる“減少”または“減少させる”という用語は、程度、強度、範囲、サイズ、量、密度または数の縮小、低下、減弱または減退を指す。
本明細書で用いられる“難治性”という用語は、影響を受けない、非応答性、抵抗性または完全に応答しない状態を指す。
“制限消化”という用語は、分析または他のプロセッシングのためにDNAの調製に用いられる手順を指す。DNA断片化としてもまた知られているように、制限消化は、DNAの鎖を短いセグメントに選択的に切断するために制限酵素を用いる。
“制限酵素”（または制限エンドヌクレアーゼ）という用語は、二本鎖DNAを切断する酵素を指す。
“制限部位”または“制限認識部位”という用語は、DNA分子を切断する部位として制限酵素によって認識されるヌクレオチドの固有の配列を指す。当該部位は、概して（ただし必ずしもというわけではない）パリンドロームであり（なぜならば制限酵素は通常ホモダイマーとして結合する）、さらに固有の酵素は、その認識部位内でまたは近くのどこかで2つのヌクレオチド間を切断することができる。
本明細書で用いられる“Rho”は、細胞形質転換および形態の調節および樹状細胞の機能に関与すると考えられるRASサブグループに関係するタンパク質のサブファミリーを指す。Rhoタンパク質の非限定的な例には、RhoA、RhoBおよびRhoC、RhoG、RhoH、RhoQ、RhoU、RhoV、Rnd1、2および3（例えばRhoE）、並びにRAC1、2、3および4が含まれる。
【００６９】
配列：
以下の用語は、2つ以上の核酸またはポリヌクレオチド間の配列の関係を記述するために本明細書で用いられる：（a）“参照配列”、（b）“比較ウィンドウ”、（c）“配列同一性”、（d）“配列同一性パーセンテージ”、および（e）“実質的同一性”。
“参照配列”という用語は、配列比較のための基礎として用いられる配列を指す。参照配列は、指定された配列のサブセットまたは全体（例えば完全長cDNAまたは遺伝子配列のセグメント、または完全なcDNA若しくは遺伝子配列として）であり得る。
“比較ウィンドウ”という用語は、ポリヌクレオチド配列の連続する指定セグメントを指し、ここで、当該ポリヌクレオチド配列を参照配列と比較することができ、比較ウィンドウ内の当該ポリヌクレオチド配列の部分は、2つの配列の最適なアラインメントのために参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわちギャップ）を含むことができる。一般的には、比較ウィンドウは長さが連続する少なくとも20ヌクレオチドであり得る。場合によって長さは連続する少なくとも30ヌクレオチド、長さは連続する少なくとも40ヌクレオチド、長さは連続する少なくとも50ヌクレオチド、長さは連続する少なくとも100ヌクレオチド、またはそれより長くてもよい。当該ポリヌクレオチド配列にギャップを加えることによる参照配列との高類似性を回避するために、典型的にはギャップペナルティーが導入され、マッチ数から差し引かれることは当業者には理解される。
【００７０】
比較のための配列アラインメントの方法は当業界で周知である。比較のための最適な配列アラインメントは以下によって実施できる：局所相同性アルゴリズム（Smith and Waterman (1981), Adv.Appl.Math.2:482）、相同性アラインメントアルゴリズム（Needleman and Wunsch (1970), J.Mol.Biol.48:443）類似性検索方法（Pearson and Lipman (1988), Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444）、前記アルゴリズムのコンピュータによる実行。コンピュータによる実行には以下が含まれる（ただしそれらに限定されない）：インテリジェネティクス（Intelligenetics, Mountain View, Calif.）によるPC/GeneプログラムにおけるCLUSTAL；GAP、BESTFIT、BLAST、FASTAおよびTFASTA（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wis., USA）。CLUSTALは以下に詳しく記載されている：Higgins and Sharp (1988), Gene 73:237-244；Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-153；Corpet, et al.(1988) Nucleic Acids Research 16:10881-90；Huang, et al.(1992) Computer Applications in the Biosciences 8:155-65；およびPearson, et al.(1994) Methods in Molecular Biology 24:307-331。BLASTファミリープログラム（データベース類似性検索ために用いることができる）は以下を含む：ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド審問配列のためのBLASTN；タンパク質データベース配列に対するヌクレオチド審問配列のためのBLASTX；タンパク質データベース配列に対するタンパク質審問配列のためのBLASTP；ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質審問配列のためのTBLASTN；およびヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド審問配列のためのTBLASTX。以下を参照されたい：Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1995。
【００７１】
特段の記載がなければ、本明細書で提供される配列同一性/類似性値は、デフォルトパラメータを用いるプログラムのBLAST 2.0一式を用いて得られる値を指す（Altschul et al.(1997) Nucleic Acids Res.25:3389-3402）。BLAST分析を実施するためのソフトは、例えば以下で一般に公開されている：National Center for Biotechnology-Information (http://www.hcbi.nlm.nih.gov/)。このアルゴリズムは、審問配列中の長さWの短いワードを識別することによって、まず初めに高スコアの配列ペア（HSP）を識別することを必要とし、前記は、データベース配列で同じ長さのワードを用いてアラインメントされるときいくつかの正の値を有する閾値スコアTに適合するかまたはそれを満足させる。Tは近隣ワードスコア閾値と称される（Altschul et al.,上掲書）。これらの最初の近隣ワードヒットはそれらを含むより長いHSPを見つけるために検索を開始する種として機能する。続いて、累積アラインメントスコアが増加する限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸長させる。ヌクレオチド配列のためには、累積スコアは、パラメータM（マッチ残基のための褒章スコア；常に＞0）およびN（ミスマッチ残基のためのペナルティスコア；常に＜0）を用いて計算される。アミノ酸配列については、累積スコアを計算するためにスコア化マトリックスが用いられる。各方向のワードヒットの伸長は以下の場合に停止される：累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Xに落ちるとき；累積スコアが、1つ以上の負のスコアを生じる残基アラインメントのために0以下に達するとき；またはどちらかの配列の末端に達するとき。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXがアラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワード長（W）11、期待（E）10、カットオフ100、M＝5、N＝4、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列のために、BLASTPプログラムは、デフォルトとしてワード長（W）3、期待（E）10、およびBLOSUM62スコア化マトリックスを用いる（以下を参照されたい：Henikoff & Henikoff (1989) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915）。
【００７２】
パーセント配列同一性を計算することに加えて、BLASTアルゴリズムはまた、2つの配列間の類似性の統計的分析を実施する（例えば以下を参照されたい：Karlin & Altschul (1993) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は、最小合計確率（P(N)）であり、前記は、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然によって生じる確率の指標を提供する。BLAST検索は、タンパク質はランダム配列として形作られ得ると仮定する。しかしながら、多くの実際のタンパク質は非ランダム配列の領域を含む（前記領域はホモポリマー鎖、短期リピート、または1つ以上のアミノ酸に富む領域であり得る）。そのような低複雑性領域は、他のタンパク質領域が完全に類似しない無関係のタンパク質間でもアラインメントすることがある。多数の低複雑性フィルタープログラムを利用して、そのような低複雑性アラインメントを軽減させることができる。例えば、SEG（Wooten and Federhen (1993), Comput.Chem., 17:149-163）およびXNU（Claverie and States (1993) Comput.Chem., 17:191-201）低複雑性フィルターを単独でまたは組合わせて利用することができる。
【００７３】
2つの核酸またはポリペプチド配列の関係で“配列同一性”または“同一性”という用語は、本明細書では、2つの配列が指定された比較ウィンドウで最大一致のためにアラインメントされたとき同じである当該2つの配列の残基を指す。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に関して用いられるとき、同一でない残基の位置は保存的アミノ酸置換により相違する（すなわち、保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基は同様な化学的特性（例えば電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換され、したがって当該分子の機能的特性を変化させない）。配列が保存的置換で相違する場合、パーセント配列同一性は、上方調整して置換の保存的性質のために修正することができる。そのような保存的置換によって相違する配列は、“配列類似性”または“類似性”を有すると称される。この調整を実施する手段は当業者には周知である。典型的には、これは、完全なミスマッチではなく部分的ミスマッチとして保存的置換をスコアし、それによってパーセンテージ配列同一性を増加させることを必要とする。したがって、例えば、同一アミノ酸がスコア1を与えられ、非保存的置換がスコア0を与えられる場合、保存的置換は0と1の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコア化は、例えばプログラムPC/GENE（Intelligenetics, Mountain View, Calif., USA）で実施されているように、例えばMeyers & Millerのアルゴリズムにしたがって計算される（Meyers and Miller (1988) Computer Applic.Biol.Sci., 4:11-17）。
【００７４】
本明細書で用いられる“配列同一性のパーセンテージ”という用語は、2つの最適にアラインメントされた配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって決定される値を意味し、ここで、当該比較ウィンドウのポリヌクレオチド配列の部分は、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較したとき、2つの配列の最適なアラインメントのために付加または欠失（すなわちギャップ）を含むことができる。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列で生じる位置の数を決定してマッチ位置の数を入手し、当該マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数によって割り、結果に100を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
ポリヌクレオチド配列の“実質的同一性”という用語は、ポリヌクレオチドが、標準的パラメーターを用いて記載のアラインメントプログラムの1つにより参照配列と比較して、少なくとも70％配列同一性、少なくとも80％配列同一性、少なくとも90％配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、これらの値を適切に調整し、2つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム配置を考慮することによって決定できることを理解しているであろう。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的同一性は、通常、少なくとも60％、または少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％の配列同一性を意味する。ヌクレオチド配列が実質的に同一であるという別の指標は、2つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするかどうかということである。しかしながら、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であるならばなお実質的に同一である。これは、例えば、核酸コピーが遺伝暗号によって許容される最大のコドン縮重を用いて生成されるとき生じ得る。2つの核酸配列が実質的に同一であるという1つの指標は、第一の核酸がコードするポリペプチドが第二の核酸によってコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応するということである。
【００７５】
ペプチドの関係では、“実質的同一性”という用語は、ペプチドが、参照配列に対して少なくとも70％配列同一性、参照配列に対して少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または95％配列同一性を指定の比較ウィンドウにわたって有する配列を含むことを示す。場合によって、最適アラインメントは、Needleman & Wunschの相同性アラインメントアルゴリズムを用いて実施される（Needleman and Wunsch (1970) J.Mol.Biol.48:443）。2つのペプチド配列が実質的に同一であるという指摘は、一方のペプチドが第二のペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に反応するということである、したがって、2つのペプチドが保存的置換によってのみ相違する場合には、ペプチドは第二のペプチドと実質的に同一である。“実質的に類似”するペプチドは、上記に記載したように、同一でない残基位置は保存的アミノ酸変更によって相違し得るという点を除いて配列を共有する。
【００７６】
“対象動物”または“個体”または“患者”という用語は互換的に用いられ、脊椎動物起源の動物種のメンバー（例えばゼブラフィッシュ）、哺乳動物起源を指す。後者には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：マウス、ラット、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ハムスター、イタチ、ブタ、イヌ、カモノハシ、モルモット、ウサギ、および霊長動物（例えば、サル、類人猿、またはヒト）。
本明細書で用いられる“その必要がある対象動物”という語句は、当該語句の関係及び使用の仕方がそうではないことを示していないかぎり、以下の患者を指す：（i）ICH、BMHまたはCCMに感受性であり、本記載発明の治療薬剤をICH、BMHまたはCCMの治療のために将来投与される、（ii）ICH/BMHまたはCCMの治療のために、本記載発明の治療薬剤を現在投与されている；またはICH/BMHまたはCCMの治療のために、本記載発明の治療薬剤を投与された患者。
【００７７】
“置換”という用語は、本明細書では、1つの塩基または複数の塩基がDNAで別の1つの塩基または複数の塩基に交換されることを指すために用いられる。置換は同義置換または非同義置換であり得る。本明細書で用いられるように、“同義置換”は、生じるアミノ酸配列が改変されないような、タンパク質をコードする遺伝子のエクソンにおける1つの塩基の別のものへの置換を指す。本明細書で用いられる“非同義置換”という用語は、生じるアミノ酸配列が改変されるような、タンパク質をコードする遺伝子のエクソンにおける1つの塩基の別のものへの置換を指す。
本明細書で用いられる“感受性を有する”という用語はリスクを有する集団のメンバーを指す。
本明細書で用いられる“治療薬剤”という用語は、治療効果を提供する医薬、分子、核酸、タンパク質、組成物または他の物質を指す。本明細書で用いられる“活性な”という用語は、意図される治療効果のために必要な本発明の組成物の成分、構成成分または構成要素を指す。“治療薬剤”または“活性薬剤”という用語は本明細書では互換的に用いられる。活性薬剤は、治療的に有効な量の活性薬剤それ自体、当該活性薬剤の模倣物、誘導体、アゴニスト、または医薬的に許容できるその塩であり得る。
【００７８】
本明細書で用いられる“治療的構成成分”という用語は、集団のパーセンテージにおける特定疾患の表出の進行を排除、軽減または予防する治療的に有効な投薬量（すなわち投与用量及び頻度）を指す。一般的に用いられる治療的構成成分の例はED50であり、前記は、集団の50％における特定疾患の表出に治療的に有効な特定の投薬量の用量を示す。
本明細書で用いられる“治療効果”という用語は治療の成果を指す（その結果は所望されかつ有益であると判断される）。治療効果には、疾患の表出の直接的または間接的停止、軽減または排除が含まれ得る。治療効果にはまた、疾患表出進行の直接的または間接的停止、軽減若しくは排除が含まれ得る。
1つ以上の活性薬剤の“治療量”、“有効量”または“医薬量”は互換的に用いられ、意図される治療利益を提供するために十分な量を指す。
薬剤の効果の強さ（y軸）は投与される薬剤の用量（x軸）の関数としてプロットできる（Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ed.Joel G.Hardman, Lee E.Limbird, Eds., 10th Ed., McGraw Hill, New York (2001), p.25, 50）。これらの図表は用量-作用曲線と称される。そのような曲線はその各々の成分のためのより単純な曲線に分解することができる。これらの濃度-作用関係は、4つの特徴的な変数（効能、傾き、最大有効性、および個体の変動性を有すると考えることができる。
濃度軸に沿う用量-作用曲線の位置は薬剤の効能を表す（上掲書）。
用量-作用曲線の傾きは薬剤の作用メカニズムを反映する。曲線の険しさは、臨床効果の達成に有用な用量の範囲を示す。
【００７９】
本明細書で互換的に用いられる“最大有効性”または“臨床有効性”という用語は、薬剤によって生じ得る最大の効果を指す。最大有効性は、基本的には薬剤およびその受容体-エフェクター系の特性によって決定され、当該曲線のプラトーで反映される。臨床における使用では、薬剤の投薬量は望ましくない作用によって制限され得る。
本明細書で用いられる“生物学的変動性”という用語は、薬剤の指定濃度で異なる個体で生じ得る強度変動の作用を指す。全ての対象動物で指定された強度の効果を生じるためには、ある範囲の濃度が要求される。
最後に、異なる個体は、効能、最大有効性および傾きの相違について適切な修正が実施されたとき、同じ濃度の薬剤に対して彼らの応答の強さに変動を生じ得る。
薬剤の作用期間は、濃度が最大有効濃度（MEC）を超える期間によって決定される。一用量の薬剤の投与の後、通常その効果は特徴的な時間的パターンを示す。薬剤効果対時間の図表は、薬剤効果の時間的特徴および治療ウィンドウに対するその関係を示す。ラグ期間は薬剤濃度が所望の効果のためのMECを超える前に存在する。応答の開始の後、効果の強度は薬剤が吸収され分布し続けるとき増加する。効果の強度はピークに達し、その後、薬剤の排除は効果の強度の下降をもたらし、薬剤濃度がMEC以下に降下するとき消滅する。治療ウィンドウは、許容不能な毒性をもたらすことなく有効性を提供する濃度範囲を反映する。したがって、治療ウィンドウ内の濃度を維持するためにもう一用量の薬剤が与えられるべきである。
【００８０】
“転写終了シグナル”という用語は、転写用ゲノムDNA上の遺伝子またはオペロンの末端に印をつける遺伝的配列の断片を指す。原核細胞では、2つのクラスの転写終了シグナルが知られている：1）内在的転写終了シグナル（このシグナルでは、mRNA-DNA-RNAポリメラーゼ三元複合体を破壊する発生期の転写物内にヘアピン構造が生じる）；および2）Rho-依存転写終了シグナル（前記は、発生期mRNA-DNA-RNAポリメラーゼ三元複合体を破壊するためにRho因子、RNAヘリカーゼタンパク質複合体を要求する）。真核細胞では、転写終了シグナルは、ポリアデニル化シグナル（すなわち、“ポリ-Aシグナル”または“ポリ-Aテール”）で発生期RNAを同時転写的に切断し、RNAポリメラーゼによる転写の更なる伸長を停止させるタンパク質因子によって認識される。この部位へのポリ-Aテールのその後の付加はmRNAを安定化させ、mRNAの核の外への移送を可能にする。終了配列は、mRNA中に存在し翻訳のための停止シグナルである終了コドン（前記はまたナンセンスコドンと呼ばれ得る）とは別個である。
“治療する”または“治療”という用語は、疾患、症状または異常の進行の停止、実質的阻害、速度緩慢化または逆転、症状の臨床的または審美的症候の実質的緩和、疾患、症状または異常の臨床的または審美的症候の出現の実質的予防、および有害または不快な症候からの防御を含む。治療はさらに以下の1つ以上の達成を指す：（a）異常の重篤度の軽減；（b）治療される異常に特徴的な症候の発達の制限；（c）治療される異常に特徴的な症候の悪化の制限；（d）以前に異常を有した患者における当該異常の再発の制限；および（e）異常について以前に無症状であった患者における当該症状の再発の制限。
【００８１】
“変種”、“変異体”および“誘導体”は、本明細書では、参照ヌクレオチド配列と実質的な同一性を有するヌクレオチド配列を指すために用いられる。配列の相違は、配列または構造における（天然のまたは故意による）変化の結果であり得る。天然の変化は、個々の核酸配列の天然の正常な複製（replication or duplication）の過程で生じ得る。故意による変化は特異的に設計され特定の目的のために配列に導入され得る。そのような特異的な変化はin vitroで多様な変異誘導技術を用いて達成され得る。特異的に作出されたそのような変種は、本来の配列の“変異体”または“誘導体”と称することができる。
【００８２】
本明細書で用いられる“血管漏出”という用語は血管透過性の病理学的増加を指す。
本明細書で用いられる“血管透過性”という用語は、血管透過性亢進因子に応答してまたは病理学的血管新生部位で、血管床を通過し間質に蓄積する溶質（典型的には巨大分子）の正味の量を指す。
本明細書で用いられる“血管安定性”という用語は、内皮細胞の細胞骨格および接合タンパク質の制御並びに内皮細胞と壁細胞の相互作用を含む。
本明細書で用いられる“野生型”という用語は、ある生物、株、遺伝子、タンパク質、核酸または天然にあるがままの特徴の典型的な型を指す。野生型は天然の集団中のもっとも一般的な表現型を指す。“野生型”および“天然に出現する”という用語は互換的に用いられる。
ある特徴にしたがえば、本記載の発明は、小分子の治療化合物を含む医薬組成物を投与することによって脳の出血の発生を軽減する方法を提供し、前記化合物の治療量は、コントロールと比較して少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、60％以下、55％以下、50％以下、45％以下、49％以下、35％以下、30％以下に脳の出血の発生を軽減するために有効である。
【００８３】
いくつかの実施態様にしたがえば、小分子の治療化合物は、アルテムエーテルまたはアルテムエーテルの誘導体から成る群から選択される。いくつかの実施態様にしたがえば、アルテムエーテルの誘導体はジヒドロアルテミシニン、アルテミシニンまたはアルテスネートである。
いくつかの実施態様にしたがえば、小分子治療化合物は、ベニジピン、ラシジピン、エチニルエストラジオールまたはトリプトリドから成る群から選択される。
いくつかの実施態様にしたがえば、脳の出血は、スタチンによって、リポ多糖類によって、または両方によって誘発される。
いくつかの実施態様にしたがえば、スタチンはアトルバスタチンである。
いくつかの実施態様にしたがえば、脳の出血は偶発的な大脳内出血である。
いくつかの実施態様にしたがえば、偶発的大脳内出血はスタチンの投与に関連して発生する。
いくつかの実施態様にしたがえば、脳の出血は脳微小出血である。
いくつかの実施態様にしたがえば、脳微小出血はスタチンの投与に関連して発生する。
いくつかの実施態様にしたがえば、脳の出血は脳の血管奇形を含む。
いくつかの実施態様にしたがえば、脳の血管奇形は大脳海綿状奇形である。
【００８４】
ある範囲の値が提供される場合に、当該範囲の上限と下限の間に挟まれる各値（文脈が明らかにそうでないことを示さないかぎり当該下限の構成単位の10番目まで）、および任意の他の明示された値または当該明示範囲中の介在値は本発明内に包含される。これらのより小さな範囲の上限および下限（前記は独立して当該より小さな範囲に含まれ得る）もまた本発明内に包含されるが、当該明示範囲で特に除外された任意の限界にしたがう。明治の範囲が一方のまたは両方の限界を含む場合、含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた本発明に含まれる。
特段の規定がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語または学術用語は、本発明が属する業界の業者が一般的に理解する同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または等価のいずれの方法および材料も本発明の実施または試験で用いることができるが、例示的な方法および材料が記載されている。本明細書で述べた全ての刊行物が参照により本明細書に含まれ、当該刊行物の引用に関係する方法および/または材料を開示及び記載する。
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるように、単数形、“a”、“an”および“the”は、文脈が明確にそうでないことを示さないかぎり複数の対応語を含む。
本明細書で考察する刊行物は、本出願の出願日前のそれら刊行物の開示を単に提供するだけであり、各々は参照によってその全体が本明細書に含まれる。本明細書のいずれのものも、本発明が先行発明のためにそのような刊行物に先行する資格がないことを容認していると解釈されてはならない。さらにまた、提供した出版日は実際の出版日と相違し得る（出版日は別個に確認されるべきである）。
【実施例】
【００８５】
以下の実施例は、当業者に本発明の実施および使用の仕方を完全に開示および説明するために示され、本発明者らがその発明に関して意図するものの範囲をそれら実施例が制限することは意図されず、下記の実施例が実施される実験の全てまたは唯一のものであるということも意図されない。使用する数値（例えば量、温度など）に関しては正確さを担保するために努力したが、いくらかの実験誤差および偏差は存在するはずである。特段の指定がなければ、割合は重量割合であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は℃であり、圧力は大気または大気に近い。
【００８６】
材料および方法
ゼブラフィッシュの飼育
全てのゼブラフィッシュ（Danio rerio）実験は聖マイケル病院の動物管理委員会（St.Michael's Hospital Animal Care Committee, Toronto, Ontario, Canada）の承認プロトコル（ACC403）の下に実施された。ゼブラフィッシュは下記施設（Li Ka Shing Knowledge Institute, St.Michael's Hospital, Toronto, Ontario, Canada）の研究用飼養場に収容して維持し、以前に記載したように生育期飼育（staged）した（Avdesh A, Chen M, Martin-Iverson MT et al.Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.J Vis Exp 2012;e4196）。略記すれば、魚を28℃で14時間明：10時間暗サイクルで収容した。胚を対交配によって生産し、1xのE3胚培養液（5mM NaCl、0.17mM KCl、0.33mM CaCl2、0.33mM MgSO4）で成長させた。この試験で用いられた株は、Tg(Flk:GFP;Gata:dsRed)およびbbh(m292);kdrl:mCherry -/-)を含んでいた。受精卵収集物は、以前に記載した（上掲書）標準的な方法にしたがいペア毎の交配により入手された。
【００８７】
ゼブラフィッシュのスタチン誘発脳出血
出血性卒中のモデルとしてのゼブラフィッシュは以前に提唱された（Butler MG, Gore AV, Weinstein BM.Zebrafish as a model for hemorrhagic stroke.Methods Cell Biol 2011;105:137-161）。脳出血の遺伝子モデルに加えて、脳出血をゼブラフィッシュで誘発するためにスタチンを用いた（Gjini E, Hekking LH, Kuchler A et al.Zebrafish Tie-2 shares a redundant role with Tie-1 in heart development and regulates vessel integrity.Dis Model Mech 2011;4:57-66；Eisa-Beygi S, Hatch G, Noble S, Ekker M, Moon TW.The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase (HMGCR) pathway regulates developmental cerebral-vascular stability via prenylation-dependent signalling pathway.Dev Biol 2013;373:258-266）。スタチン誘発モデルは、我々のNIH薬剤ライブラリースクリーニングプロジェクトのために採用された。
ゼブラフィッシュは実験日の前の晩に用意した。実験日の朝に、我々は交尾および受精のためにブリーダーを集めた。受精後6時間（hpf）で、各ウェルに7から8個の魚卵とともに100μLの水を保持する96ウェルプレートにスタチンを添加した（前記は連続パイロット実験で最適化された）。スタチンをDMSOに溶解し、0.5％DMSO水で希釈し作業溶液にした。DMSO 0.5％を含む100μLの水は最終査定で全ウェルの媒体であった。
【００８８】
最初に、我々は、シムバスタチンおよびアトルバスタチンの両方を脳出血の誘発について試験した。シムバスタチンは、最終濃度10．25、50、100および200 nmol/Lで試験され、アトルバスタチン（ATV）は濃度50、150、300、500 nmol/Lおよび1μMで試験された。数バッチの実験後、我々は、1μMのATVが、もっとも再現性が高い出血を幼魚の80％を超えるものでもたらすことを見出した。したがって、その後の全てのスクリーニング作業では1μMのATVを用いて、幼生ゼブラフィッシュの脳出血誘発を実施した。シムバスタチン（MW 558.6）は以下から購入し（Cayman Chemical, Ann Arbor, MI）、アトルバスタチンカルシウム塩（MW 604.69）はシグマ（Sigma, St Louis, MO）から購入した。
NIH化合物ライブラリーのスクリーニングのために、ライブラリーの薬剤の各々の5μMを24hpにウェルに添加した。前記ウェルは6hpf以来1μMのATVで処理された魚卵を含んでいた。出血陽性コントロールのウェルはATVで処理されたが薬剤では全く処理されなかった。陰性コントロールはいずれの化合物でも処理されなかった（魚は0.5％のDMSO水を有する）。ゲラニルゲラニルピロホスフェート（GGPP、4mg/L）を陽性レスキューコントロールとして用いた。
【００８９】
脳出血は、2人の観察者によって立体顕微鏡を用いて72hpf（スタチン添加後66時間）に査定した。脳出血のパーセンテージを最終リードアウトとして用いた。初回試験で70％を超える脳出血レスキューを示した化合物を再試験し、ライブラリーの最終ヒットリストを作成した。
4つの他の化合物＋アルテスネートおよびアルテムエーテルがライブラリーの陽性ヒットとして別個に識別された。それらの誘導体（アルテミシニンおよびジヒドロアルテミシニン）を入手し（Sequoia Research Products, Pangbourne, UK）、同じATVゼブラフィッシュモデルで陽性か否かを試験した。スクリーニング中に確立し最適化プロトコルを用いて、陽性化合物のその後のEC50アッセイを全て実施した。
【００９０】
モルホリノ注射
モルホリノオリゴヌクレオチド（MO）はジーンツールズ（Gene Tools, Carvalis, OR）によってカスタム合成された。前記の配列は表1に示されている。
【００９１】
表1：モルホリノ配列
2019527735.tif 000002
【００９２】
ダニュー（Danieau）緩衝液（58mM NaCl、0.7mM KCl、0.4mM MgSO4、0.6mM Ca(NO3)2、5.0mM HEPES（pH7.6））をMO溶液の希釈に用いた（最終濃度0.2mM）。個々のウェルは1.0％アガロースプレート上に置かれ、前記アガロースプレートに胚が位置する。その後、MO溶液を細胞卵黄を通って1から4細胞期の胚に注入した。注入量は0.5から15ngまで変動した。
bbhm292ゼブラフィッシュ変異体はヒポモルフィック変異をβPixに有し、ICH/BMHおよび水頭症をもたらす。MOはβPixexon6-MOであり、前記はエクソン6のスプライシングを遮断し、未熟なタンパク質終了をもたらす。0.2ngのβPixexon6-MOの注射は61％の胚でICHをもたらした。より高用量のβPixexon6-MO（8ngまで）は血液循環の欠如を生じ、したがってICH/BMHは検出されなかった。8ngの注射はβPixの完全なミススプライシング、したがってヌル表現型を生じ、一方、低用量はいくらかの正常にスプライスされたβPixを維持する。βPixexon6-MO配列は5'-GCGCATCTCTCTTACCACATTATAG-3'（配列番号:1）である。βPixexon6-MOを1−2細胞期で胚に注射し、化合物を12hpfに添加した。アルテスネート（5μmol/L）はICHを予防した（図14）。
【００９３】
別のMOを設計して、pak2aのエクソン8の後ろのスプライスドナー部位を遮断した。pak2aは、ICH/BMHを発生させるrhdmi149ゼブラフィッシュ変異体の変異遺伝子である。pak2a-MO配列は5'-AATAGAGTACAACATACCTCTTGGC-3'（配列番号:2）である。8pgのpak2a-MOを胚毎に注射して、低死亡率のICH/BMHを有する−80％の胚を生じた（図12および14）。
【００９４】
図12は、発生中ゼブラフィッシュにおける大脳血管安定化の消失の薬理学的および遺伝的誘発を示す。（A）ゼブラフィッシュのHMGCR（hmgcrb）媒介代謝経路とRho GTPアーゼ（CDC42）シグナリングとの間の推定関係が示される。ゲラニルゲラニル化プロセス（GGTアーゼI（pggt1b）によって触媒される）は、CDC42の形質膜への移転を促進する。膜結合CDC42は、GDP結合（不活性）状態とGTP結合（活性）状態との間で変化することによって分子スイッチとして機能する。βPixは、GDP放出を促進しGTPに対する酵素親和性を増加させることによってCDC42を活性化するので、グアニン交換因子（GFP）である。p21活性化キナーゼ2a（pak2a）はβPixのための結合パートナーである。pak2aは、Rho GTPアーゼシグナリングの下流で作用するセリン/スレオニンキナーゼであり、この経路の変換に関与する。HMGCR機能は、スプライス誘発アンチセンスモルホリノオリゴヌクレオチド（MO）またはスタチン（0.5mg/L）への胚の水媒介暴露を用いて阻害された。pggt1b、βpix、またはpak2aの機能は、遺伝子特異的MOを用いて軽減された。（B）VEカドヘリン媒介細胞対細胞接着は部分的にCDC42によって調節される。CDC42がプレニル化されそのGTP結合活性型であるとき、前記はαおよびβカテニンと相互作用して、VEカドヘリンカテニン複合体を維持し、したがって安定性を付与する。（C）対照的に、非プレニル化CDC42は不活性（GDP結合）でグアニンヌクレオチド解離阻害因子（GDI）と結合したままである。この状態は弱い接着活性を付与し、したがって細胞対細胞安定性を破壊する。（D−H）hmgcrb、pggt1b、βpixまたはpak2a遺伝子の喪失は大脳出血を早める。非注射胚（D）と比較して、hmgcrb（E）、pggt1b（F）、βpix（G）またはpak2a（H）を標的とするMOを注射された胚は、36−52hpfでICH表現型を示す。矢印は異常な血液蓄積部位を示す。代表的な画像が示されている。前方は左側である。（I−L）出血が脳の血管欠損のために生じる。（IおよびJ）2hpfでDMSOまたは0.5mg/Lアトルバスタチンでインキュベートされ、36hpfで画像化されたTg(fli1:EGFP);(gata-1:DsRed)胚の代表的な顕微鏡写真である。（J）の矢印は、停滞したDsRed陽性赤血球蓄積が観察される領域を示す。（L）の矢印は同じ魚の異常に膨張した大脳血管を示す。前方は左側である。（M−R）出血は基本的血管構造の断片化と関連する。（MおよびP）2hpfでDMSOまたは0.5mg/Lアトルバスタチンでインキュベートされ、48−52hpfで画像化されたTg(fli1:EGFP);(gata-1:DsRed)胚の代表的な明視野顕微鏡写真である。星印は出血を指し、黒い点線領域は問題の視野を示す。前方は左側で背側は上方である。（N−R）同じTg(fli1:EGFP);(gata-1:DsRed)胚の黒い点線領域の代表的な合成共焦点Z-スタックプロジェクション。白い星印はDsRed陽性赤血球を示し、白い矢印は、血管崩壊が観察される領域を示す。
【００９５】
細胞接合タンパク質の発現の測定
ハウスキーピング遺伝子コントロールとしてβ-アクチンを用いqRT-PCRにより選択遺伝子の相対的発現を査定した（2つの生物学的試験および3つの技術的複製の平均、各試験は処理当たり60幼生のプール）。RNA抽出およびcDNA合成のために、3dpfのTg(Flk:GFP; Gata:dsRed)ゼブラフィッシュ幼生を用いた。アトルバスタチンおよび薬剤の処理は薬剤スクリーニングで以前に述べたように実施した。RNeasy抽出キット（Qiagen, Mississauga, ON, CAN）を用いてこれらの幼生（1プールは50−60幼生/処理）から全RNAを抽出し、DNaseで処理した。全RNA濃度は、NanoDropTM分光光度計を用い260/280nmで分光光度計的に決定した。ランダムヘキサマープライマーを用いて、第一鎖cDNAを1μgの全RNAから合成した。
【００９６】
PCR条件：
用いられる問題の遺伝子およびプライマー対は表2に示される。各事例でフォワードプライマーは上にリバースプライマーは下に示される。
【００９７】
表2：qPCRの実施ために選択された遺伝子のためのプライマー配列
2019527735.tif 000003
【００９８】
cDNAの増幅は、94℃で2分の最初の変性、続いて40サイクルの変性（94℃30秒）、アニーリング（60℃30秒）および伸長（72℃1分）、続いて終了前の最終伸長時間10分（72℃）を用いて達成された。PCRは全体積20μLで実施され、以下を含んでいた：1ｘのPCR緩衝液、1.25mM MgCl2、0.25mM dNTP、1U Taqポリメラーゼ、0.5μmol/Lのフォワードおよびリバースプライマー、並びに1μLのcDNA。
【００９９】
毒性アッセイ
胚を収集し、有効性アッセイと同様に0.5％DMSOの96ウェルプレートに分配した。薬剤を24hpfに50nmol/Lから100μmol/Lの範囲で添加した。受精後3日（dpf）に、幼生を心拍、血流および心臓浮腫について観察した。薬剤処理幼生を0.5％DMSO中の非処理サンプルと比較した。心拍及び血流を3（正常心拍または血流）から0（無心拍または無血流）にランク付けした。心臓浮腫は0（浮腫のない正常な心臓）から-3（重度の心臓浮腫）にランク付けした。TC50は最大毒性の50％の薬剤濃度である。TC50/EC50の比を各事例で計算した。
【０１００】
マウスモデルワーク
動物および動物飼育
聖マイケル病院の飼養場施設の換気付きマイクロアイソレーターケージに全てのマウスを個々に収容した。部屋を21℃の周囲温度で維持し、12時間明/暗サイクルに付した。湿度を30−50％に維持した。全てのマウスがオートクレーブ飼料および水に自由にアクセスした。消毒剤としてバイロックスを用いた。環境エンリッチメントが各ケージのマウスに提供された。聖マイケル病院の動物管理委員会が本実験の全てのプロトコルおよび手順を承認した。
【０１０１】
リポ多糖類（LPS）誘発微小出血モデル
LPS媒介微小出血モデルをLuiらが記載しモデルと同様に作製した（Liu S, Grigoryan MM, Vasilevko V et al.Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds.J Histochem Cytochem 2014;62:767-773）。9−10週齢の雌雄C57BL/6マウスをチャールズリバーから購入し、コントロールまたは処理グループに同じ数で無作為に割り当てた。サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）のLPS（Sigma Aldrich, St Louis, MO）をPBSで最終濃度5mg/mLに再構成した。コントロール（n＝16）および薬剤処理（n＝16）の両方に5mg/mLのLPSを0および24時間に注射した。薬剤処理グループをさらに高用量（n＝4）および低用量（n＝12）に分け、アルテムエーテル（ARM）（低用量のために25mg/mLおよび高用量のために100mg/mL）をLPS処理の-72、-48、-24、0および24時間の時点で腹腔内注射した。最初のLPS注射から48時間後に全てのマウスをサクリファイスした。
組織学的試験またはMRI試験のために脳を用いた。
【０１０２】
大脳内出血（ICH）の抗β3インテグリンモデル
我々が以前に報告した方法にしたがって大脳内出血（ICH）の抗β3インテグリンモデルを作出した（Yougbare I, Lang S, Yang H et al.Maternal anti-platelet beta3 integrins impair angiogenesis and cause intracranial hemorrhage.J Clin Invest 2015;125:1545-1556）。簡単に記せば、ゲルろ過野生型血小板を用い週に2回の尾静脈注射によりβ3-/-の雌マウスを免疫することによって、抗β3抗体を含む血清を作製した。抗β3抗体を検出するために、免疫雌マウスの伏在静脈から血液を収集し、凝血させた。血液を9600gで5分間遠心分離することによって血清を抽出し、FITC結合抗マウスIgGとともにインキュベートし、フローサイトメーター（FACSCalibur, BD Biosciences, Mississauga, ON）によってアッセイした。
β3+/-マウスを作出するために、6−8週齢のβ3-/-雌マウスを野生型雄BALB/cと交配した。得られた仔動物を無作為にコントロール（n＝29、無処理）または薬剤処理グループ（n＝24）に割り当てた。仔動物にICHを誘発するために、各マウスの腹腔内に50μLの抗β3血清（コントロールグループ）または50μLの抗β3血清＋25mg/kgのARM（薬剤処理グループ）を出生後2日目に（P2）に注射した。P3に全ての新生仔を断頭によってサクリファイスした。
【０１０３】
マウス脳の組織学的試験
全ての組織学的試験は、我々が確立したプロトコルにしたがって実施される（D'Abbondanza JA, Ai J, Lass E et al.Robust effects of genetic background on responses to subarachnoid hemorrhage in mice.J Cereb Blood Flow Metab 2016;36:1942-19547-13；Sabri M, Kawashima A, Ai J, Macdonald RL.Neuronal and astrocytic apoptosis after subarachnoid hemorrhage: a possible cause for poor prognosis.Brain Res 2008;1238:163-171；Sabri M, Jeon H, Ai J et al.Anterior circulation mouse model of subarachnoid hemorrhage.Brain Res 2009;1295:179-185；Sabri M, Ai J, Macdonald RL.Dissociation of vasospasm and secondary effects of experimental subarachnoid hemorrhage by clazosentan.Stroke 2011;42:1454-1460；Sabri M, Ai J, Marsden PA, Macdonald RL.Simvastatin re-couples dysfunctional endothelial nitric oxide synthase in experimental subarachnoid hemorrhage.PLoS One 2011;6:e17062；Sabri M, Ai J, Lakovic K, D'Abbondanza J, Ilodigwe D, Macdonald RL.Mechanisms of microthrombi formation after experimental subarachnoid hemorrhage.Neuroscience 2012;224:26-37；Sabri M, Ai J, Lass E, D'Abbondanza J, Macdonald RL.Genetic elimination of eNOS reduces secondary complications of experimental subarachnoid hemorrhage.J Cereb Blood Flow Metab 2013;33:1008-1014）。
【０１０４】
LPS誘発微小出血モデル：LPS試験の全てのマウスをケタミンおよびキシラジンで深麻酔して、左心室から以下を灌流させた: NaCl（0.9％）、続いて1ｘPBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）および2mMガドテリドール造影剤を24時間。各脳を1ｘPBS＋0.02％アジ化ナトリウムおよび2mMガドテリドール造影剤に移した。画像化前にこの浸漬溶液に脳を14日間維持し、磁気共鳴画像化（MRI）スキャンのために脳内の適切な脳内造影剤拡散を担保した。非MRIスキャン脳については、肉眼試験の後で、1ｘPBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で脳を24時間固定し、続いて組織学のための処理の前に1ｘPBS＋0.02％アジ化ナトリウムに貯蔵のために移した。組織学のために、脳をマウス脳マトリックス（Zivic Instruments, Pittsburgh, PA）で切断した。3つの冠状切断物を前頭から-6mm（小脳正中線）、続いて4mm前方（前頭から-2mm）、続いて第二の切断から3mm前方（前頭から+1mm）で作製した。ブロックをパラフィンに包埋し、7μm切片をミクロトームで切り出した。
【０１０５】
抗β3 ICHモデル：MRIが意図されたマウス（n＝16）のサブセットのために、全頭を首から切断し、直ちに1ｘPBS緩衝液中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）および2mMガドテリドール造影剤で24時間固定した。各脳を1ｘPBS＋0.02％アジ化ナトリウムおよび2mMガドテリドール造影剤に移した。画像化前にこの浸漬溶液に頭を14日間維持し、脳内の適切な脳内造影剤拡散を担保した。非MRI脳のためには、肉眼試験の後で、1ｘPBS緩衝液中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で脳を24時間固定し、続いて組織学のための処理の前に1ｘPBS＋0.02％アジ化ナトリウムに貯蔵のために移した。
【０１０６】
ヘマトキシリンエオシン染色
脳ブロックを処理し、パラフィンに包埋した。7ミクロンの切片をミクロトームを用いて切り出した。切片をキシレン中で脱パラフィン化し、エタノールの低下勾配溶液により再水和した。スライドをヘマトキシリンエオシンで染色し、キシレン系マウンティング媒体（Permount, Sigma Chemical Company, St.Louis, MO）でカバースリップ被覆して明視野顕微鏡下で観察した。
【０１０７】
蛍光緑染色
蛍光緑B（Fluoro-jade B）（Histo-Chem Inc., Jefferson, AR）を用いてニューロン変性を査定した。脳切片を脱パラフィン化し再水和した。脱イオン水とのインキュベーションに続いて、スライドを0.06％の過マンガン酸カリウム（Sigma-Aldrich）中で15分間インキュベートした。続いてスライドを脱イオン水でリンスし、0.001％蛍光緑B作業溶液（0.1％酢酸）中に30分間浸漬した。スライドを洗浄して15分間乾燥させ（60℃）、続いてキシレンで清澄化して非水性低蛍光のスチレン系マウンティング媒体（DPX, Sigma-Aldrich）でカバースリップ被覆した。スライドを蛍光明視野顕微鏡（Olympus BX50, Olympus, Richmond Hill, ON, Canada）下で観察し、定常パラメーター（露光時間およびコントラスト値）を用いて画像を撮影した。
【０１０８】
肉眼検査
インテグリンICHモデルのために、脳を頭蓋骨から取り出し、正中-冠状位で切断し、ICHの何らかの証拠があるか否かを二元的態様で査定した。査定に続いて脳を直ちに固定した。LPSモデルのためには、脳を灌流固定後に摘出し、画像を全脳について撮影し、微小出血斑の出現を調べた。
【０１０９】
コントラスト強化磁気共鳴画像化
16チャネルのソレノイドコイルを有する7Tバーカー（Burker）MRIを用いて脳をスキャンする。利用したパルスシーケンスは、以下のパラメーターを有するFLASH T2*グラディエントエコー（GRE）シーケンスであった：TR＝30.2msおよびTE＝12 ms。マトリックス＝250ｘ200ｘ200。FOV＝FOV＝2.5ｘ2.0ｘ2.0 gcrush＝6 tcrush＝0.002。FAは11°（Liu S, Grigoryan MM, Vasilevko V et al.Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds.J Histochem Cytochem 2014;62:767-773）。ボクセルサイズは100*100*100μm。画像の再構成の後、画像ねじれ修正アルゴリズムを適用して、全ての脳を処理し、脳の全体積および出血の全体積について分析した。定量は、出血（各脳のサイズに対して標準化）のパーセンテージを用いて実施した。盲検的実験を実施して、調製および分析の全レベルにおいて偏向のない作業を担保した。第一に、サンプルを調製し、それらが属するグループを知ることなくコード化した。第二に、グループについて知らされていない別の技術者が脳をスキャンした。最後に、定量化は盲検態様で実施された。全ての定量化および3D再構成は、ディスプレー（Display）およびアミラ（Amira）プロセッシングソフトの組合せを用いて実施された。
【０１１０】
ヘモグロビン濃度の分光光度計分析
ヘモグロビン濃度の540nmにおける熱量定量のためにドラブキン試薬（Drabkin’s reagent, Sigma Aldrich）を用いた。C57BL/6マウスをコントロール、低用量ARMおよび高用量ARMの3グループに無作為に割り当てた（各々n＝4）。ARMグループのために、25mg/kg/日および100mg/kg/日のARMがそれぞれ3日間、低および高用量のために投与された。4日目に伏在静脈から血液を収集し、UV3600シマズ分光光度計を用いてヘモグロビン濃度について検査した。シアンメトヘモグロビンの既知標準溶液を用いて標準曲線を作製し、Hbの血液濃度を標準曲線と比較した。
【０１１１】
データ分析および統計
アプリオリ検出力分析を実施して、検出力0.8およびα0.05を用いる両側独立二サンプルｔ検定のための各グループのサンプル数を概算し、出血体積で1標準偏差相違を検出した。P値は、ウェルチ補正による独立両側ｔ検定、分散分析（ANOVA）によって決定した。全ての棒グラフおよび用量応答曲線は平均±SEMまたはSDとして表される。
化学物質
全てのマウスモデル実験のために、アルテムエーテル（80mg/mL）を業者（Dafra Pharma）から入手し、分画ココナッツ油中で1：15に希釈し、腹腔内投与した。ゼブラフィッシュ実験のためには、アルテスネートを業者（Guilin Pharmaceutical, Guangxi, China）から購入し、前記をアルテムエーテル（Dafra）と一緒にGMP薬剤と称する。両ART化合物はまた、GMP薬剤との比較実験のためにシグマアルドリッチ（Sigma Aldrich（Sigma））から購入した。
【実施例１】
【０１１２】
先導化合物の識別のためのゼブラフィッシュスクリーニング
ゼブラフィッシュのICH/BMHのいくつかのモデル（スタチン、bbhm292およびrhdmi149変異体並びにMOを含む）を用い、pak2a、βPix、Rap1bおよびcdh5の発現を減少させた。加えて、マウスBMHモデルと一致する、ゼブラフィッシュのICH誘発のための低用量LPSを決定した。LPSは血管構造を脱安定化させ、魚の体全体（脳を含む）で血管漏出を引き起こす。
図1は、ゼブラフィッシュのアトルバスタチン誘発大脳内出血（ICH）モデルを用いて実施した化学物質スクリーニングの実験結果を示す。パネル（A）は、スタチンが機能する分子経路を示す模式図である。パネル（B）−（G）：ICHは、野生型またはTg(flk-1:eGFP)およびTg(gata-1:DsRed)ゼブラフィッシュの成魚に由来する胚の受精後2時間で1μmol/アトルバスタチンを適用することによって誘発され、当該薬剤化合物を含む96ウェルプレートに並べられた。ICH表現型レスキューを測定した。ベヒクルのDMSOで処理されたコントロールの胚では赤血球の血管外漏出は観察されなかった（パネルB、DおよびF）。アトルバスタチ処理胚は、脳の出血（約80％、パネルCおよびG）および内皮細胞間の接合増加（パネルDと比較してパネルE）を示した。パネルHは、スクリーニングプロセスの案を示す模式図である。パネルIからLは、ARTファミリーの4つの化合物のためのEC50実験を示す（前記化合物のうち2つはNCCライブラリーから識別された）。データは、3−4実験の平均±SEMとして表される。ARM、アルテムエーテル；DHA、ジヒドロアルテミシニン；ARS、アルテミシニン；ART、アルテスネート。
【０１１３】
NCCライブラリーのスクリーニング。米国立衛生研究所臨床コレクション1および2は727化合物から成り、薬剤再利用のために米国食品医薬局承認薬を含む（www.nihclinicalcollection.com）。これらの化合物は、ほとんどがフェース1から3の臨床試験で用いられている薬剤であり、他の並列コレクションでは提示されていない。それらは好ましい特性、例えば純度、可溶性および市場での入手可能性を有する。多くが既知の安全性プロフィールを有する。
1μmol/Lのアトルバスタチンを用いて脳出血モデルを最適化した後、NIH化合物ライブラリー1および2（http://nihsmr.evotec.com/evotec/sets/ncc）の727化合物を記載の条件（96ウェルプレートに7胚/ウェルおよび1μmol/Lのアトルバスタチン）を用いてスクリーニングした。4ファミリーから6つの活性化合物（2つのジヒドロピリジンカルシウムチャネルブロッカー（ベニジピンおよびラシジピン）、エチニルエストラジオール、トリプトリド、2つの抗マラリア薬（アルテスネートおよびアルテムエーテル）が当該ライブラリーからそれぞれ別個に識別された。これら6つの活性化合物＋ARTファミリー化合物の2つの誘導体の化学構造及び特性は表3並びに図1および2に要約されている。
【０１１４】
図2は、NCCライブラリーの4つの活性化合物による、ゼブラフィッシュのE 1μmol/Lアトルバスタチン誘発脳出血の阻害を示し、ここで、EC50は薬剤の50％有効性の濃度である。データは、3から4つの実験の平均±SEMとして表される。データをベヒクル処理コントロールのデータに対して標準化し、GraphPad Prism4ソフトの様々な傾きによるS字状フィットを用いて適合させた。Bはベニジピン、Eはエチニルエストラジオール、Lはラシジピン、Tはトリプトリドである。
【０１１５】
表3：NIH臨床コレクション（NGP-104ライブラリー）から識別された活性化合物。ATVモデルは1μmol/Lアトルバスタチンによって誘発された。1つの＋記号は、1μmol/LのATVまたはβ-Pix MO誘発出血の20％阻害を表す。
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4つのART化合物のうち3つが100nmol/L未満のEC50を有し高い効能を示した。他の4つの化合物の軽い効能（EC50は19から290nmol/Lの範囲）のために、我々はそれらをそれ以上精査しなかった。
【実施例２】
【０１１６】
ゼブラフィッシュにおけるART化合物の作用メカニズムに関する研究
臨床試験は、コレステロール低下3-ヒドロキシ-メチルグルタリル-コエンザイムAレダクターゼ（HMGCR）阻害剤（スタチン）とICHのリスク増加との間の連関を示した。HMGCR経路は、Rhoグアノシントリホスファターゼ（GTPアーゼ）シグナリング経路の成分とCdc42/Racのプレニル化で関係をもつ（図3）。この経路の多くのタンパク質が血管安定性に必要である。我々は、いくつかのICH/BMHはタンパク質のプレニル化の障害によって媒介される血管の不安定性に続発し、タンパク質に誘発されたいずれの欠陥も（例えば変異または発現の変化も）出血を引き起こす可能性があると仮説をたてた。関与する経路およびタンパク質に注意を向け、薬剤が出血をレスキューするメカニズムをより良く理解するために、我々は、遺伝的改変によって出血を誘発し、出血がART薬剤によってレスキューされ得るか否か試験しようとした。
【０１１７】
1．ART化合物は脳出血のbbh遺伝子モデルをレスキューした
バブルヘッド（bbh）と呼ばれる遺伝子変異を有する特別なゼブラフィッシュ系統を用いた。この系統は偶発的ICHを有する。バブルヘッド表現型はβPixにおける変異によって引き起こされる。ホモ接合のゼブラフィッシュ成魚は生存能力および繁殖能力を有する。バブルヘッド胚は受精後（hpf）36から52時間でICHおよび脳浮腫を発達させる（Liu J, Zeng L, Kennedy RM, Gruenig NM, Childs SJ.betaPix plays a dual role in cerebral vascular stability and angiogenesis, and interacts with integrin alphavbeta8.Dev Biol 2012;363:95-105；Liu J, Fraser SD, Faloon PW et al.A betaPix Pak2a signaling pathway regulates cerebral vascular stability in zebrafish.Proc Natl Acad Sci U S A 2007;104:13990-13995）。85％を超えるゼブラフィッシュ幼生がICH表現型を示す。興味深いことに、我々は、ART薬剤による処理はbbh変異体で出血を完全にレスキューできることを見出した。図4は、bbhモデルにおける2つの化合物（アルテスネート（ART）およびアルテムエーテル（ARM））の薬剤有効性アッセイの結果を示す。表4は多様な薬剤について測定されたEC50値を示す。
【０１１８】
表4：スタチンおよびbbhモデルにおける種々の薬剤の脳出血レスキューのための有効性（EC50値）の比較。スタチンモデルについては、n＝15−20幼生/条件；実験は化合物毎に3回実施された。bbh変異体モデルについては、n＝15−20幼生/条件；実験は化合物毎に1−3回実施された。
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bbh変異体モデルおよびアトルバスタチン誘発ICHモデルから得られたART薬剤のEC50値は類似した。これは、最初のスクリーニングに用いられたスタチンモデルの正当性を確認する（表3）。
【０１１９】
2．ART化合物はHMBCR/Rhoキナーゼ経路の重要タンパク質の遺伝子ノックアウトによって誘発されるICHをレスキューした
bbhの使用の他に、ゼブラフィッシュでICHを誘発する他の方法は遺伝的な遺伝子ノックアウトである。我々は、特異的モルホリノを用いて、HMGCRおよびRhoグアノシントリホスファターゼ（GTPアーゼ）シグナリング経路の両方でいくつかの重要な遺伝子をノックアウトした（図3）。以下の遺伝子に対するモルホリノを用いた。
1）Pak2a：p21タンパク質（Cdc42/Rac）-活性化キナーゼ2aはRho GTPアーゼ、RacおよびCdc42の活性を調節し、βPixとの複合体に含まれ得る。
2）βPix：Pak-相互作用交換因子βはGDP-Rho GTPアーゼ（RacおよびCdc42）のGTP-RhoGTPアーゼへの変換を促進する。
3）HMGCR：3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-コエンザイムAレダクターゼはHMG-CoAのメバロネートへの変換を触媒する。
4）VEカドヘリン：血管内皮カドヘリンは、細胞内の細胞骨格を細胞外マトリックスにつなぐトランスメンブレンタンパク質である。
5）Rap1b：Ras GTPアーゼエフェクタータンパク質は細胞膜へのCCMタンパク質の補充を促進する。
6）GGTアーゼ1：ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ1は、メバロネート誘導GGPPを付加することによってRacおよびCdc42を翻訳後改変する（メバロネート誘導GGPPはこれらGTPアーゼの活性化に要求される）。
【０１２０】
図14（A−B）は、ゼブラフィッシュの脳血管の膜安定性を標的とするモルホリノによって誘発される出血表現型をアルテスネートが用量依存的にレスキューすることを示す。
（A）試験した3つのモルホリノの標的部位を示す模式図。（B）アルテスネートは3つ全てのモルホリノ誘発脳出血をゼブラフィッシュで用量依存的にレスキューする。（C−D）アルテスネートはbbhm292 変異の内在的ICH表現型をレスキューする。（C）上段パネル、bPix遺伝子のスプライシングに影響する点変異を示すbPix遺伝子の部分的なエクソン-イントロン構成。下段パネル、エクソン14にフランキングするプライマーを用いた野生型およびbbhm292変異体cDNAのRT-PCR分析。（D）上段パネル、DMSOまたはアルテスネートで処理し、48hpfで画像化したbbhm292変異体の表現型。矢印は出血部位を示す。下段パネル、アルテスネートでレスキューされる脳出血を有するbbhm292胚のパーセンテージ。
アルテスネートは、pak2a-MOによる処理後にICH/BMHを用量依存的に軽減した（図12および14）。hmgcrb（スタチンによって阻害されるゼブラフィッシュの酵素）のMO媒介阻害は、胚のICH/BMH（アルテスネートによってもまた予防された）を引き起こした（図14）。
【０１２１】
最後に、ゼブラフィッシュのVEカドヘリンホモローグ、cdh5の役割は、cdh5のMOノックダウンはゼブラフィッシュでICHを誘発することで明示された。（図13）。図13は、ゼブラフィッシュで血管安定性をもたらすHMGCR分子経路を示す。パネルA＆B：安定なEC接合は、Cdc42依存性およびVEカドヘリン媒介性細胞対細胞接着によって維持される。VEカドヘリンはEC細胞対細胞接合の表面で見出される。VEカドヘリンは、β-およびα-カテニンとそれらの細胞質ドメインで結合する（前記ドメインはそれらをアクチンを土台とする細胞骨格（青丸）に接続する）。CDc42は小グアノシントリホスファターゼ（GTPアーゼ）のRhoファミリーに属する（GTPアーゼはVEカドヘリン系細胞対細胞接着の主要な調節因子である）。ゼブラフィッシの接合安定性の調節におけるhmgcrb、βPixおよびpak2aの機能が示されている。HMGCR媒介GGPP生合成はCdc42のプレニル化を調節する。βPixはGTPに対するCDC42親和性を増加させるGEFである。pak2はCdc42のエフェクターであり、、前記はアクチンフィラメントの組織化を調節する。パネルCは、cdh5（VEカドヘリン遺伝子のゼブラフィッシュオルトログ）に向けて設計されたスプライス誘発モリフォリノは、36−48hpfでゼブラフィッシュの大脳内出血を誘発すること示す（側面画像が示されている）。
我々は、上記モルホリノのいずれかの注射は3dpfのゼブラフィッシュ幼生で出血を引き起こすことを見出した。このことは血管安定性でこれら遺伝子が果たす重要な役割を示す。次に、各モルホリノの最適な量を決定した。目標は、モルフォリノ注射による毒性を生じることなく許容し得るパーセンテージで出血を誘発することであった（理想的には40−80％の間）。結果は表5に要約される。
【０１２２】
表5：モルフォリノ注射量の最適化（n＝150−250幼生/条件）；実験は少なくとも2回実施された。
2019527735.tif 000006
【０１２３】
最初の3つのモルホリノが有効性試験で良好であった。有効性アッセイは、アルテムエーテル（ARM、Sigma）およびアルテスネート（ART、GMP）を用いて実施した。結果は、Pak2a、βPixおよびHMGCRモルホリノによって誘発される欠陥はそれぞれ別個の実験で出血を誘発できることを示した。これらのモルファントの当該薬剤による処理はICH表現型をレスキューした。図5は、アルテスネート（ART）およびアルテムエーテル（ARM）を用いたhmgcrbモルファントにおける薬剤有効性試験の例を示す（n＝150−250幼生/条件）。実験は化合物につき2回実施された。上述の最初の3つのモルファントについて計算したEC50値が表6に示されている。
【０１２４】
表6：種々のモルホリノによって誘発される出血をレスキューするARM（Sigma）およびART（GMP）の有効性比較（EC50）（n＝150−250幼生/条件）；実験は少なくとも2回実施された。
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【０１２５】
VFカドヘリンの抑制は出血を誘発する。しかしながら、心臓浮腫がいくつかのモルファントで観察された。有効性アッセイは、ARMおよびARTを用いて実施され、両事例でレスキューは観察された。
アトルバスタチン誘発ICHモデルおよびbbh変異体モデルで見出されたものと一致して、ARMは最高の有効性を示し、モルファントの出血をレスキューした（表4および表6）。
【０１２６】
ゼブラフィッシュにおけるART化合物の毒性に関する研究
毒性アッセイを実施して、3つのパラメーター（心拍、血流および心臓浮腫）を考慮しながらTC50を測定した。例として、図7はART（GMP）の毒性アッセイの結果を示す。心拍及び血流は3（正常心拍または血流）から0（無心拍または血流）にランク付けされた。心臓浮腫は、0（浮腫のない正常な心臓）から-3（重度の心臓浮腫）にランク付けされた。TC50は、最大毒性の50％の薬剤濃度である。データは3実験の平均±SEMとして表される。全ての薬剤のTC50値はTC50/EC50比と同様に表7に要約される。
【０１２７】
表7：種々の薬剤の毒性（TC50値）の比較。TC50/EC50比は括弧内に示され（n＝15−25幼生/条件）、実験は化合物につき3回実施された。
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【０１２８】
我々、ARMは安全な薬剤であることを見いだした。なぜならば、ARMのEC50はゼブラフィッシュの胚でTC50よりもはるかに低いからである(表7)。
【０１２９】
3）ART化合物は血管安定性に肝要な重要タンパク質をアップレギュレートする
我々は、ICHメカニズムに潜在的に関与する20遺伝子リストを考慮し、アトルバスタチン誘発脳出血モデルでART薬剤処理後のそれら遺伝子のうちの5つの転写における変化を評価した。これの遺伝子は以下のとおりである：VEカドヘリン（Cdh5）、インテグリン（Itgb3a）および3つの大脳海綿状奇形遺伝子（ccm1、ccm2およびccm3）。
図6は、スタチン（ATV）およびアルテムエーテル（ARM）を500nmol/Lで添加したときの遺伝子転写の変化を示す。qRT-PCRを用い、1μmol/Lのアトルバスタチン（ATV）および500nmol/Lのアルテムエーテル（ARM）で処理したゼブラフィッシュで遺伝子発現のRNAレベルを評価した：A、VEカドヘリン；B、β3-インテグリン；C、CCM3（n＝3）。この濃度では、出血は観察されなかった。各図は、50−60の3dpf胚の実験結果を示す。
結果は、スタチン誘発ICHモデルでは、転写レベルのアップレギュレーションが、インテグリンβ3およびVEカドヘリンについてARM処理に際して生じることを示した。CCM3はアトルバスタチンによる出血誘発後の低下を示した。ARMによる処理に際して、転写レベルは、ゼブラフィッシュ幼生における出血のレスキューと並行して正常に戻った。
【実施例３】
【０１３０】
スタチン誘導胚スクリーニングで識別された化合物の抗ICH有効性を評価するための他のゼブラフィッシュモデル
実験1：ゼブラフィッシュ胚のLPS誘発ICH/BMH
先導化合物をICH/BMHのLPSモデルで試験して、ICH/BMH表現型のレスキューがこれらの化合物の一般的特性であるかまたはそれはスタチン誘発ICH/BMHに特異的であるかが決定されるであろう。予備的データは、アルテムエーテルはLPSによる死亡率を軽減することを示唆した（図15）。図15は、LPSが発生中ゼブラフィッシュ胚で脳出血を誘発し、アルテムエーテルはLPS誘発死亡率に対して防御的効果を有することを示す。パネルAは、LPSが魚水に受精後24時間（hpf）でデリバーされるときの発生中ゼブラフィッシュ胚の生存曲線を示す。パネルBは、魚水中のアルテムエーテル（1μmol/L）は魚の生存に対して防御作用を有することを示す。用いられたLPS濃度は200mg/mLであった。パネルCは、24hpf胚の25mg/mL LPS処理は死亡率を生じなかったが、52％の胚が脳出血を生じたことを示す（n＝120）。LPS誘発脳出血におけるアルテムエーテルのレスキュー効果の範囲を明確にするために実験は進行中である。緑色蛍光血管を有し、赤色蛍光赤血球を有する二重トランスジェニックゼブラフィッシュ（Gata1:DsRed/Flk1:GFP）が用いられている。矢印は出血を示す。
【実施例４】
【０１３１】
ICHのマウスモデルにおける実験
我々は脳出血の2つのモデルを利用した。我々の結果は、ICHのLPSモデルおよびインテグリンモデルの両方で、ARMは出血を有効に予防するかまたは緩和することを示す。
LPS誘発微小出血マウスモデル
1．ARM（GMP）はLPSによって誘発される表面および深部脳微小出血を軽減する
LPSおよびその主要な受容体が徹底的に調べられ、最近の文献は、表面の皮質領域および深部葉性領域の両方に存在する脳微小血管のモデルの特徴を示した（Liu S, Grigoryan MM, Vasilevko V et al.Comparative analysis of H&E and Prussian blue staining in a mouse model of cerebral microbleeds.J Histochem Cytochem 2014;62:767-773;  Sumbria RK, Grigoryan MM, Vasilevko V et al.A murine model of inflammation-induced cerebral microbleeds.J Neuroinflammation 2016;13:218）。各脳の表面微小出血の数を立体顕微鏡で数え、LPSコントロールおよびLPS＋ARM処置グループについて平均を決定した。図8は、アルテムエーテル（ARM）は、マウスのLPS誘発脳微小出血をレスキューすることを示す。パネルAは、LPS処理マウス（n＝8）またはLPS+アルテムエーテル処理マウス（n＝8）の脳における表面微小出血の立体顕微鏡による計測のデータを示す。左パネルは、2つのグループの各々の代表的な画像を示す（矢印は微小出血を示す）。右パネルは統計分析を示す（*P＜0.05、ウェルチ補正実施両側ｔ検定）。データは平均±SDとして表される。LPS処理動物と比較して、ARM処理マウスの脳は、総表面微小出血で劇的な減少を示した。
脳内の微小出血をさらに査定するために、我々は、H&E染色脳スライドで微小出血の数を定量化した。パネルBは、ヘマトキシリンエオシンによって染色された脳スライスの微小出血の定量化のデータを示す。左パネルは、2つのグループの各々の微小出血を有する染色脳スライスの代表的画像を示す（矢印はスライスの微小出血を示す）。右のパネル図は、微小出血計測の統計分析を示す（**P＜0.01、ウェルチ補正実施独立両側ｔ検定）。データは平均±SDとして表される。LPS処理およびLPS+ARM処理の両グループについてn＝8。
表面微小出血計測と同様に、ARM処理は、マウス脳内部の微小出血の総数を有意に減少させた。
【０１３２】
2．マウス脳内の総LPS誘発微小出血のARM（GMP）による減少はMRIによって検証される
肉眼解剖学および組織学の結果を確認するために、我々は、3D FLASH GREによりMRIを用いてその後の実験で脳を精査した。出血の総体積を定量化し、各脳についてパーセント出血を計算した。図9は、アルテムエーテル（ARM）はリポ多糖類（LPS）によって誘発されたマウスの微小出血をレスキューすることを示す。パネルAは、高解像検出のT2*-強調グラディエントエコー（GRE）MRIシーケンスの代表的な3D再構成画像を示し、LPSまたはLPS+ARM処理マウス脳の微小出血を示している。
矢印は微小出血を示す。パネルBは、ベヒクルコントロールグループおよびアルテムエーテル（ARM）処理グループにおける各脳当たりの微小出血の数を示す棒グラフである。総微小出血体積の定量化を半自動ソフト（Display）を用いて実施し、総脳体積に対して標準化し、10000カウントにおける総ボクセルとして表した。データは平均±SDとして表され（+P＜0.05、ウェルチ補正実施両側ｔ検定）、LPS処理およびLPS+ARM処理の両グループについてn＝8で、ナイーブコントロールについては2である。
このデータは、モデルのコントロールグループと比較して、ARM処理グループで出血の有意な減少（約2/3の減少）が存在することを確認する（図9）。
【０１３３】
3．LPSは有意なニューロン細胞死またはヘモシデリン沈着を誘発しなかった
我々は、蛍光緑Cおよびパール（Perl’s）染色を実施して、それぞれニューロン変性およびヘモシデリン沈着を検出した。これらアッセイの両方の結果がコントロールおよび処理グループについて陰性で、LPSによって誘発される観察された微小出血は急性であること、および（少なくともこのモデルについて我々が試験した時間尺度では）微小出血はニューロン細胞死を引き起こさなかったことを示唆した。
【０１３４】
インテグリンICHマウスモデル
1．ARM（GMP）はICHの発生率を減少させる
以前の研究は、インテグリンのαVサブユニットとヘテロダイマーを形成することによって、β3インテグリンは、（特に血管新生中の）内皮の増殖で役割を果たすことを示唆した（Yougbare I, Lang S, Yang H et al., Maternal anti-platelet beta3 integrins impair angiogenesis and cause intracranial hemorrhage., J Clin Invest 2015;125:1545-1556）。抗体を特に発生期の間に使用することによって、血管の不安定性および不適切な血管新生、したがって急速なICHの発生が生じることが既に示されていた（上掲書）。
我々は、大脳内出血の抗β3インテグリンモデルの治療効果の試験のために2つのエンドポイントを利用した。図10は、アルテムエーテル（ARM）は大脳内出血の抗β3インテグリンマウスモデルでICHを軽減することを示す。パネルAは、出生後2日目に抗β3インテグリン血清を単独注射された（左）またはARM処理された（右）マウスの脳の代表的な未加工T2*-強調グラディエントエコー（GRE）MRI画像を示す。パネルBは、それぞれARM処理無し（左）または処理有り（右）の抗β3血清注射マウスの冠状切断全脳のパラフィン包埋ブロックを示す。パネルCは、抗β3インテグリン血清単独注射またARM処理されたマウスの大脳内出血の頻度の定量化を示す。77％の新生仔がICHモデルのコントロールグループでICHを示した。対照的に、ARMはICH発生を47％に減少させた。データは平均±SDとして表される（**P＜0.01、ウェルチ補正実施両側ｔ検定）。ARM処理無しまたは処理有りの抗β3インテグリン血清注射マウスについてはそれぞれn＝29および24である。
【０１３５】
2．ARM（GMP）はMRIによって検証されるICHの総体積を減少させる
予備的データは、ARMはコントロールと比較してICHの総体積を減少させることを示す（データは示されていない）。
以前のいくつかの研究が推測したARM処理による貧血作用の可能性を査定するために、ARM処理後にヘモグロビン濃度について血液サンプルを試験した。血液ヘモグロビン濃度をドラブキンの方法を用いて査定した。分光光度計データを標準シアンメトヘモグロビン濃度の標準曲線と比較した。コントロールグループには薬剤を投与されなかった。処理用量グループは低用量ARM（25mg/kg）の3日間注射を受け、4X処理用量グループは高用量ARM（100mg/kg）の3日間注射を受けた。
図11は、3日間のARM処理はマウスで貧血を引き起こさなかったことを示している。前記は、コントロールおよびアルテムエーテル（ARM）（処理用量および4X処理用量）で処理されたマウスの血液ヘモグロビン（g/dL）（y軸）の図である。ARM処理後に血液をヘモグロビン濃度について検査した。血液ヘモグロビン濃度をドラブキンの方法（Drabkin’s method）で査定した。分光光度計データを標準シアンメトヘモグロビン濃度の標準曲線と比較した。コントロールグループには薬剤は投与されなかった。処理用量グループは低用量ARM（25mg/kg）の3日間注射を受け、4X処理用量グループは高用量ARM（100mg/kg）の3日間注射を受けた。データは平均±SDとして表される（nsP＞0.05、一元配置ANOVA、n＝4）。我々はグループ間に統計的差異を全く見いださなかった（図11）。
図16は、スタチンはマウスのLPS誘発大脳内出血を悪化させることを示す。（A）LPS（5mg/kg）に加えてアトルバスタチン（50mg/kg）の処理は処理後24時間で100％の死亡率をもたらしたが、LPS単独処理は同じ試験時間で単に25％死亡率を生じ、スタチン単独では死亡を全く引き起こさなかった（n＝5）。（B）アトルバスタチン処理は、LPSによって引き起こされる大出血の数を有意に増加させた。本発明をその特別な実施態様を参照しながら説明してきたが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく多様な変更を実施できること、および等価物で置き換えることができることは当業者には理解されるべきである。加えて、多くの改変を実施して、個別の状況、材料、物質の組成、1つまたは複数の処理工程を本発明の目的とする趣旨および範囲のために採用することができる。そのような改変はいずれもここに添付した特許請求の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
2019527735000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月4日(2019.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
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【国際調査報告】
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