(57)【要約】  本技術は、植物代謝を改変するための転写因子およびそのような転写因子をコードしている核酸分子を提供する。植物におけるアルカロイド産生を調節するため、およびアルカロイド含量が変化した植物および細胞を産生するためにこれらの核酸を使用する方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であると共に、ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしているヌクレオチド配列
からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含んでなり、
該ヌクレオチド配列が異種核酸に作動可能に結合されている
単離されたｃＤＮＡ分子。
【請求項２】
タバコ属宿主細胞における発現を導くのに適した１または２以上の制御配列に作動可能に結合されている、請求項１に記載のｃＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項１に記載の単離されたｃＤＮＡ分子を含むキメラ核酸構築物を含む細胞を含む、遺伝子操作されたニコチン性アルカロイド産生性タバコ属植物。
【請求項４】
植物がタバコ属タバコ植物である、請求項３に記載の遺伝子操作されたタバコ属植物。
【請求項５】
種子がキメラ核酸構築物を含む、請求項３に記載の遺伝子操作されたタバコ属植物由来の種子。
【請求項６】
請求項３に記載の遺伝子操作されたタバコ属植物を含むタバコ生成物。
【請求項７】
ヌクレオチド配列が配列番号２に記載されている、請求項１に記載の単離されたｃＤＮＡ分子。
【請求項８】
ヌクレオチド配列が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている、請求項１に記載の単離されたｃＤＮＡ分子。
【請求項９】
ヌクレオチド配列が、配列番号２に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であると共に、ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしている、請求項１に記載の単離されたｃＤＮＡ分子。
【請求項１０】
ヌクレオチド配列が、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であると共に、ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしている、請求項１に記載の単離されたｃＤＮＡ分子。
【請求項１１】
タバコ属植物中のニコチン性アルカロイドを増加させる方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、および
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であると共に、ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしているヌクレオチド配列
からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む発現ベクターをタバコ属植物中に導入すること、および
（ｂ）ヌクレオチド配列からのニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子の発現を可能にする条件下で植物を成長させること
を含んでなり、
転写因子の発現により、同様の条件下で生育した対照植物と比較してニコチン性アルカロイド含量が増加した植物が得られる、方法。
【請求項１２】
ＮＢＢ１、Ａ６２２、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、プトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）またはＮ−メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）のうちの少なくとも１つをタバコ属植物中で過剰発現させることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する少なくとも１つの追加の転写因子をタバコ属植物中で過剰発現させることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する前記追加の転写因子が、ＮｔＭＹＣｌａ、ＮｔＭＹＣｌｂ、ＮｔＭＹＣ２ａまたはＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベクターが配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ベクターが、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）（ｉ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列と、または、（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列と、少なくとも約９０％同一であると共に
（ｂ）ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしている
ヌクレオチド配列を、前記ベクターが含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
対照植物と比較して、ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子の発現が上昇していると共にアルカロイド含量が増加している、請求項１１に記載の方法によって産生された遺伝子操作されたタバコ属植物。
【請求項１９】
対照植物から産生された生成物と比較してニコチン性アルカロイド含量が増加している、請求項１８に記載の遺伝子操作された植物またはその一部を含む生成物。
【請求項２０】
請求項１８に記載の遺伝子操作された植物からの種子。
【請求項２１】
アルカロイド生合成を正に制御する転写因子を下方制御することを含んでなる、タバコ属植物中のニコチン性アルカロイドを減少させる方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、および
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であると共に、アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしているヌクレオチド配列
からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ分子の少なくとも約１５個のセンス方向、アンチセンス方向またはその両方の連続ヌクレオチドを含む核酸をタバコ属植物細胞に導入すること、
（ｂ）植物細胞を含む植物を産生すること、および
（ｃ）同様の条件下で生育した対照植物と比較して、ヌクレオチド配列が植物中の転写因子のレベルを減少させる条件下で植物を生長させること
により転写因子を下方制御する方法。
【請求項２２】
植物中で、ＮＢＢ１、Ａ６２２、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、プトレシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）またはＮ−メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）のうちの少なくとも１つを抑制することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
アルカロイド生合成を正に制御する転写因子を下方制御することを含んでなる、タバコ属植物中のニコチン性アルカロイドを減少させる方法であって、
（ａ）（ｉ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列、
（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、および
（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であると共に、アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしているヌクレオチド配列
からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ分子の少なくとも約１５個の連続したヌクレオチドを含む標的の部位特異的突然変異誘発試薬を植物細胞の集団に導入すること、および
（ｂ）対照植物と比較して、アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしている遺伝子において突然変異を引き起こしていると共にアルカロイド含量が減少している標的突然変異植物細胞またはそのような細胞に由来する植物を検出および選択すること、
により転写因子を下方制御する方法。
【請求項２４】
前記試薬が組換え型オリゴ核酸塩基である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記試薬が標的ヌクレアーゼである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
対照植物と比較して、ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子の発現が低下していると共にアルカロイド含量が減少している、請求項２３に記載の方法により産生された突然変異植物。
【請求項２７】
対照植物から産生された生成物と比較してニコチン性アルカロイドのレベルが低下している、請求項２６に記載の突然変異植物またはその一部を含む生成物。
【請求項２８】
請求項２６に記載の突然変異植物からの種子。
【請求項２９】
タバコ属植物の集団中のニコチン性アルカロイドレベルを低下させる方法であって、
（ａ）突然変異タバコ属植物の集団を提供することを含み；
（ｂ）該集団中の標的突然変異植物を検出および選択することを含み；
（ｉ）前記標的突然変異植物は、対照植物と比較して、アルカロイド生合成を正に制御する転写因子の発現が低下しており、
（ｉｉ）前記検出は、プライマーまたはプローブとしてｃＤＮＡ分子を使用することを含み、および
（ｉｉｉ）前記ｃＤＮＡ分子は、
（１）配列番号２に記載のヌクレオチド配列、
（２）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、および
（３）（１）または（２）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であると共にアルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしているヌクレオチド配列
からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含んでおり；および
（ｃ）対照植物の集団と比較して、アルカロイド生合成を正に制御する転写因子の発現が低下している植物の集団を産生するように前記標的突然変異植物を選択的に育種することを含む方法。
【請求項３０】
対照植物と比較して、アルカロイド生合成を正に制御する転写因子の発現が低下していると共にアルカロイド含量が減少している、請求項２９に記載の方法により産生された突然変異アルカロイド産生性タバコ属植物。
【請求項３１】
タバコ属タバコ植物である、請求項３０に記載の突然変異植物。
【請求項３２】
対照植物から産生された生成物と比較して、ニコチン性アルカロイドのレベルが低下している、請求項３０に記載の突然変異植物またはその一部を含むタバコ生成物。
【請求項３３】
請求項３０に記載の突然変異植物からの種子。
【請求項３４】
対照と比較して遺伝子生成物の発現の増加を示すと共に、
（ａ）植物細胞中で作動可能なプロモーター、および
（ｂ）該プロモーターと作動可能に結合している、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む異種ヌクレオチド配列
を5’→3’方向に含む核酸構築物を含んでいる細胞を含む、
配列番号２によってコードされる遺伝子生成物を過剰発現している遺伝子操作タバコ植物。
【請求項３５】
配列番号２によってコードされる遺伝子生成物を過剰発現している、請求項３４に記載の遺伝子操作植物の子孫。
【請求項３６】
配列番号２によってコードされる遺伝子生成物が過剰発現している遺伝子操作されたニコチン増加タバコ細胞を作製する方法であって、請求項１に記載のｃＤＮＡ分子を細胞内に導入して配列番号２によってコードされる遺伝子生成物を遺伝子操作して過剰発現させることを含む方法。
【請求項３７】
ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する少なくとも１つの追加の転写因子を遺伝子操作してタバコ細胞内で過剰発現させることをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する追加の転写因子が、NtMYCla、NtMYClb、NtMYC2aまたはNtMYC2bのうちの少なくとも1つである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＮＢＢ１、Ａ６２２、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、プトレシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）またはＮ−メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）からなる群より選ばれる１または２以上のニコチン性アルカロイド生合成酵素を遺伝子操作してタバコ細胞内で過剰発現させることをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３６に記載の方法によって産生されたタバコ植物細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１６年９月２日に出願された米国仮特許出願第６２／３８２，８９５号の優先権を主張し、その内容が参照により全体として本明細書に援用される。
【０００２】
本技術は、概して、植物代謝を改変するための転写因子、そのような転写因子をコードしている核酸分子、ならびにこれらの核酸を使用して植物におけるアルカロイド産生を調節する方法およびアルカロイド含量が変化した植物および植物細胞を産生する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
以下の説明は、読者の理解を助けるために提供されている。提供された情報または引用された参考文献のいずれも先行技術であると認められない。
【０００４】
植物天然産物は長い間、人間の健康と社会生活を向上させるために使用されてきた。そのような生物活性のある天然植物生成物の中にはアルカロイドがあり、これはあるクラスの窒素含有二次代謝産物を含む。アルカロイドの例としては、モルヒネ、スコポラミン、カンプトテシン、コカインおよびニコチンがある。ピロリジンアルカロイドであるニコチンは、タバコ種で産生される最も豊富なアルカロイドの1つで、根で合成され、その後植物維管束を通って葉や他の空中組織に移動し、そこで草食動物に対する防御化合物として機能する。前駆体であるポリアミンプトレシンからのニコチン産生は、植物における2つの経路を介して達成することができる。プトレシンは、脱カルボキシル化酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）またはアルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）の活性を介して、それぞれ、オルニチンまたはアルギニンから直接合成することができる。ニコチン生合成における最初の重要なステップは、プトレシンN-メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）による、プトレシンのN-メチルプトレシンへの変換である。N-メチルプトレシンは、続いてジアミンオキシダーゼ（ＤＡＯ）によって酸化され、環化されて1-メチル-Δ1-ピロリウムカチオンを産生し、続いてこれはニコチン酸と縮合されてニコチンを産生する。
【０００５】
転写レベルでの遺伝子発現の調節は、植物代謝およびニコチン生合成を含む多くの生物学的プロセスにおける主要な制御点である。したがって、ニコチン生合成経路のさらなるモジュレーターを同定すること、ならびに、トランスジェニック植物、トランスジェニックタバコ植物、組換え安定細胞株、組換え安定タバコ細胞株およびそれらの誘導体を含む植物中におけるニコチンおよび他のアルカロイドの産生レベルを遺伝的に調節するための組成物および改良された方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
植物におけるアルカロイド生合成を調節するための方法および組成物が本明細書で開示される。
【０００７】
一つの局面において、本開示は、（ａ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であると共に、ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしているヌクレオチド配列からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含んでなり、該ヌクレオチド配列が異種核酸に作動可能に結合されている、単離されたｃＤＮＡ分子を提供する。
【０００８】
もう一つの局面において、本開示は、（ａ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であると共に、ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしているヌクレオチド配列からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む単離ｃＤＮＡ分子を含んでなり、該ヌクレオチド配列が、タバコ属宿主細胞において発現を導くのに適した１または２以上の対照配列に作動可能に結合されている、発現ベクターを提供する。
【０００９】
もう一つの局面において、本開示は、（ａ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であると共に、ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしているヌクレオチド配列からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む単離されたcDNA分子を含むキメラ核酸構築物を含む細胞を含んでなり、該ヌクレオチド配列が異種核酸に作動可能に結合されている、遺伝子操作されたニコチン性アルカロイド産生性タバコ属植物を提供する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたタバコ属植物はタバコ属タバコ植物である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子操作されたタバコ属植物由来の、キメラ核酸構築物を含む種子を提供する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本開示は、遺伝子操作されたタバコ属植物またはその一部を含むタバコ生成物を提供する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、単離されたｃＤＮＡ分子は、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、単離されたｃＤＮＡ分子は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、単離されたｃＤＮＡ分子は、配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であると共にニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしているヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、単離されたｃＤＮＡ分子は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であると共にニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしているヌクレオチド配列を含む。
【００１７】
一つの局面において、本開示は、タバコ属植物中のニコチン性アルカロイドを増加させる方法であって、（ａ）（ｉ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であると共に、ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしているヌクレオチド配列からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む発現ベクターをタバコ属植物中に導入すること、および（ｂ）ヌクレオチド配列からのニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子の発現を可能にする条件下で植物を成長させることを含んでなり、転写因子の発現により、同様の条件下で生育した対照植物と比較してニコチン性アルカロイド含量が増加した植物が得られる方法を提供する。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本方法は、ＮＢＢ１、Ａ６２２、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、プトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）またはＮ−メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）のうちの少なくとも１つをタバコ属植物中で過剰発現させることをさらに含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、本方法は、ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する少なくとも1つの追加の転写因子をタバコ属植物中で過剰発現させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する追加の転写因子は、ＮｔＭＹＣｌａ、ＮｔＭＹＣｌｂ、ＮｔＭＹＣ２ａまたはＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つである。
【００２０】
本方法のいくつかの実施形態において、発現ベクターは配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
本方法のいくつかの実施形態において、発現ベクターは、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
本方法のいくつかの実施形態において、発現ベクターは、（ａ）（ｉ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列とまたは（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であると共に（ｂ）ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしているヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
本方法のいくつかの実施形態において、対照植物と比較して、ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子の発現が上昇していると共にアルカロイド含量が増加している、遺伝子操作されたタバコ属植物が提供される。
【００２４】
本方法のいくつかの実施形態において、対照植物から産生された生成物と比較してニコチン性アルカロイド含量が増加している、遺伝子操作された植物またはその一部を含む生成物が提供される。この方法のいくつかの実施形態では、遺伝子操作植物由来の種子が提供される。
【００２５】
一つの局面において、本開示は、アルカロイド生合成を正に制御する転写因子を下方制御することを含んでなる、タバコ属植物中のニコチン性アルカロイドを減少させる方法であって、（ａ）（ｉ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であると共に、アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしているヌクレオチド配列からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ分子の少なくとも約１５個のセンス方向、アンチセンス方向またはその両方の連続ヌクレオチドを含む核酸をタバコ属植物細胞に導入すること、（ｂ）植物細胞を含む植物を産生すること、および（ｃ）同様の条件下で生育した対照植物と比較して、ヌクレオチド配列が植物中の転写因子のレベルを減少させる条件下で植物を生長させることにより転写因子を下方制御する方法を提供する。
【００２６】
いくつかの実施形態において、本方法は、植物中で、ＮＢＢ１、Ａ６２２、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、プトレシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）またはＮ−メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）のうちの少なくとも１つを抑制することをさらに含む。
【００２７】
一つの局面において、本開示は、アルカロイド生合成を正に制御する転写因子を下方制御することを含んでなる、タバコ属植物中のニコチン性アルカロイドを減少させる方法であって、（ａ）（ｉ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列、（ｉｉ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、および（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であると共に、アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしているヌクレオチド配列からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ分子の少なくとも約１５個の連続したヌクレオチドを含む標的の部位特異的突然変異誘発試薬を植物細胞の集団に導入すること、および（ｂ）対照植物と比較して、アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしている遺伝子において突然変異を引き起こしていると共にアルカロイド含量が減少している標的突然変異植物細胞またはそのような細胞に由来する植物を検出および選択することにより転写因子を下方制御する方法を提供する。
【００２８】
本方法のいくつかの実施形態において、試薬は組換え型オリゴ核酸塩基である。いくつかの実施形態では、試薬は標的ヌクレアーゼである。
【００２９】
本方法のいくつかの実施形態において、対照植物と比較して、ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子の発現が低下していると共にアルカロイド含量が減少している突然変異植物が提供される。
【００３０】
本方法のいくつかの実施形態において、対照植物から産生された生成物と比較してニコチン性アルカロイドのレベルが低下している、突然変異植物またはその一部を含む生成物が提供される。本方法のいくつかの実施形態では、突然変異植物からの種子が提供される。
【００３１】
一つの局面において、本開示は、タバコ属植物の集団中のニコチン性アルカロイドレベルを低下させる方法であって、（ａ）突然変異タバコ属植物の集団を提供することを含み；（ｂ）該集団中の標的突然変異植物を検出および選択することを含み；（ｉ）前記標的突然変異植物は、対照植物と比較して、アルカロイド生合成を正に制御する転写因子の発現が低下しており、（ｉｉ）前記検出は、プライマーまたはプローブとしてｃＤＮＡ分子を使用することを含み、および（ｉｉｉ）前記ｃＤＮＡ分子は、（１）配列番号２に記載のヌクレオチド配列、（２）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、および（３）（１）または（２）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であると共にアルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしているヌクレオチド配列からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含んでおり；および（ｃ）対照植物の集団と比較して、アルカロイド生合成を正に制御する転写因子の発現が低下している植物の集団を産生するように前記標的突然変異植物を選択的に育種することを含む方法を提供する。
【００３２】
本方法のいつかの実施形態において、対照植物と比較して、アルカロイド生合成を正に制御する転写因子の発現が低下していると共にアルカロイド含量が減少している、突然変異アルカロイド産生性タバコ属植物が提供される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、突然変異植物はタバコ属タバコ植物である。
【００３４】
本方法のいくつかの実施形態において、対照植物から産生された生成物と比較して、ニコチン性アルカロイドのレベルが低下している、突然変異植物またはその一部を含むタバコ生成物が提供される。本方法のいくつかの実施形態では、突然変異植物からの種子が提供される。
【００３５】
一つの局面において、本開示は、対照と比較して遺伝子生成物の発現が増加していると共に、（ａ）植物細胞中で作動可能なプロモーター、および（ｂ）該プロモーターと作動可能に結合している、配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含む異種ヌクレオチド配列を5’→3’方向に含む核酸構築物を含んでいる細胞を含む、配列番号２によってコードされる遺伝子生成物を過剰発現している遺伝子操作タバコ植物を提供する。
【００３６】
いくつかの実施形態において、配列番号２によってコードされる遺伝子生成物を過剰発現している、遺伝子操作植物の子孫が提供される。
【００３７】
一つの局面において、本開示は、配列番号２によってコードされる遺伝子生成物が過剰発現している遺伝子操作されたニコチン増加タバコ細胞を作製する方法であって、（ａ）配列番号２に記載のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列、および（ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列と少なくとも約９０％同一であると共に、ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する転写因子をコードしているヌクレオチド配列からなる群より選ばれるヌクレオチド配列を含む単離されたcDNA分子を細胞内に導入することを含んでなり、該ヌクレオチド配列が異種核酸に作動可能に結合されて、配列番号２によってコードされる遺伝子生成物を遺伝子操作して過剰発現させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、この方法によって産生されるタバコ植物細胞が提供される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、本方法は、ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する少なくとも１つの追加の転写因子を遺伝子操作してタバコ細胞内で過剰発現させることをさらに含む。いくつかの実施形態において、ニコチン性アルカロイド生合成を正に制御する追加の転写因子は、ＮｔＭＹＣｌａ、ＮｔＭＹＣｌｂ、ＮｔＭＹＣ２ａまたはＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つである。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本方法は、ＮＢＢ１、Ａ６２２、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、プトレシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）またはＮ−メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）からなる群より選ばれる１または２以上のニコチン性アルカロイド生合成酵素を遺伝子操作してタバコ細胞内で過剰発現させることをさらに含む。
【００４０】
本明細書に記載および特許請求されている発明は、限定されないが、この簡単な概要に提示または記載または参照されているものを含む多くの属性および実施形態を有する。包括的であることを意図するものではなく、本明細書に記載され特許請求される本発明は、例示のみを目的として含まれ制限を目的としないこの簡単な概要において特定される特徴または実施形態によって制限されない。さらなる実施形態が以下の詳細な説明において開示される。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
Ｉ．導入
本技術は、ニコチン性アルカロイド生合成経路を調節する転写因子をコードしていると予測される遺伝子ＮｔＥＲＦ２４１の発見に関する。この遺伝子の核酸配列は決定されている。コード領域ならびにその５’および３’上流および下流調節配列を含むＮｔＥＲＦ２４１の全長配列が配列番号１に示されている。配列番号２に記載の配列番号１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号３に記載のポリペプチド配列をコードしていると予測される。
【００４２】
エチレン応答性要素結合因子（ＥＲＦ）は、植物に特異的な転写因子のファミリーの一員である。ERFドメインとして知られる高度に保存されたDNA結合ドメインは、このタンパク質ファミリーの固有の特徴である。いくつかの公知のＥＲＦは、ＧＣＣボックス特異的結合活性を示し、そして、植物において転写を調節することが示されている。例えば、ＮｔＥＲＦ１、ＮｔＥＲＦ３２およびＮｔＥＲＦ１２１を含むＥＲＦ転写因子は、ニコチンピロリジン環の合成における最初の重要な段階であるプトレシンN-メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）をコードしているＮ．タバカム遺伝子の１つであるＮｔＰＭＴｌａのジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）誘導転写に必要なＧＡＧモチーフのＧＣＣボックス様要素を特異的に結合することが示されている。Searsら著, Plant Mol. Biol, 84: 49-66 (2014)。ＰＭＴプロモーターのＧＡＧモチーフは、ＥＲＦおよびＭｙｃ転写因子の動員を与える。インビトロおよびインビボ研究は、ＮｔＥＲＦ３２がＮｔＰＭＴ遺伝子の転写活性化因子として機能することを示した。ＮｔＥＲＦ３２の過剰発現は、ＮｔＰＭＴｌａのインビボ発現および総アルカロイド含量を増加させることが示されており、一方、ＮｔＥＲＦ３２のＲＮＡｉ媒介ノックダウンは、ＮｔＰＭＴｌａおよびキノリネートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮｔＱＰＴ２）を含むニコチン生合成経路におけるいくつかの遺伝子のｍＲＮＡレベルを低下させ、ニコチンおよび総アルカロイドレベルを低下させる。Searsら（2014）。ＤＮＡレベルでは、ＮｔＥＲＦ３２とこれまでに知られていなかった遺伝子ＮｔＥＲＦ２４１は約９０％同一である。したがって、ＮｔＥＲＦ２４１はタバコアルカロイドの生合成に関与する遺伝子を正に制御するＥＲＦ転写因子をコードしていると予測される。
【００４３】
すなわち、いくつかの実施形態において、本技術は、アルカロイドを天然に産生する植物におけるアルカロイド（例えば、ニコチンアルカロイド）の合成を遺伝子操作するために使用され得る、これまでに発見されていない遺伝子（ＮｔＥＲＦ２４１）またはその生物活性断片を提供する。例えば、タバコ種（例えば、Ｎ．タバカム、Ｎ．ルスティカおよびＮ．ベンサミアナ）は、天然にニコチン性アルカロイドを産生する。N.タバカムは農作物であり、この植物のバイオテクノロジー用途は増え続けている。ＮｔＥＲＦ２４１遺伝子またはその生物学的に活性な断片は、治療用途を有し得るニコチン性アルカロイドおよび関連化合物の合成を増加させるために植物または植物細胞において使用され得る。いくつかの実施形態において、本技術は、ＮｔＥＲＦ２４１の過剰発現を遺伝子操作することによって植物および植物細胞におけるニコチンアルカロイド産生を増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、本技術は、ＮｔＥＲＦ２４１、ならびにＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａおよびＮｔＭＹＣ２ｂからなる群より選ばれる少なくとも１つのＭＹＣ転写因子遺伝子の過剰発現を遺伝子操作することによって植物および植物細胞中のニコチンアルカロイド産生を増加させる方法を提供する。配列番号４に記載のＮｔＭＹＣｌａ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号５に記載のポリペプチド配列をコードしている。配列番号６に記載のＮｔＭＹＣ１ｂ遺伝子のＯＲＦは配列番号７に記載のポリペプチド配列をコードしている。ＮｔＭＹＣ２ａ遺伝子の全長配列は、配列番号８に記載されている。ＮｔＭＹＣ２ａポリペプチド配列は、配列番号９に記載されている。ＮｔＭＹＣ２ｂ遺伝子の全長配列は、配列番号１０に記載されている。ＮｔＭＹＣ２ｂポリペプチド配列は、配列番号１１に記載されている。いくつかの実施形態において、ニコチン性アルカロイドの産生に対する相乗効果は、ＮｔＥＲＦ２４１ならびに、ｏｉＮｔＭＹＣｌａ、ＮｔＭＹＣｌｂ、ＮｔＭＹＣ２ａおよびＮｔＭＹＣ２ｂからなる群より選ばれる少なくとも１つのＭＹＣ転写因子遺伝子の組み合わせ過剰発現によって生じる。ＭＥＲＦ２４１またはその生物学的に活性な断片は、また、ニコチン性アルカロイド合成の抑制を遺伝的に操作して、植物製医薬品（例えば、組換えタンパク質および抗体）の産生のための低毒性産生プラットフォームとしてまたは産業用の食品およびバイオマス作物として使用するためのゼロまたは低いニコチンレベルを含むタバコ品種を作り出すために使用され得る。
【００４４】
ＩＩ．定義
本明細書で使用されるすべての技術用語は、生化学、分子生物学および農業において一般的に使用されており、したがって、それらは本技術が属する分野の当業者によって理解される。これらの技術用語は、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第３版, 第1-3巻, Sambrook and Russel著(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001); Current Protocols In Molecular Biology, Ausubelら著(Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 1988)(定期的アップデートを含む); Short Protocols In Molecular Biology: A Compendium Of Methods From Current Protocols In Molecular Biology 第5版, 第1-2巻, Ausubelら著(John Wiley & Sons, Inc., 2002); Genome Analysis: A Laboratory Manual, 第1-2巻, Greenら著(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997)に見ることができる。植物生物学技術を含む方法論は、本明細書に記載されており、また、Methods In Plant Molecular Biology: A Laboratory Course Manual, Maligaら著(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1995)のような論文に詳細に記載されている。
【００４５】
「アルカロイド」は、植物に見られ、二次代謝によって産生される窒素含有塩基性化合物である。「ピロリジンアルカロイド」は、その分子構造の一部としてピロリジン環を含むアルカロイド、例えば、ニコチンである。ニコチンおよび関連アルカロイドは、公開された文献においてピリジンアルカロイドとも呼ばれている。「ピリジンアルカロイド」は、その分子構造の一部としてピリジン環を含むアルカロイド、例えば、ニコチンである。「ニコチン性アルカロイド」は、ニコチンまたは、ニコチンに構造的に関連し、ニコチン生合成経路において産生される化合物から合成されるアルカロイドである。例示的なニコチン性アルカロイドとしては、ニコチン、ノルニコチン、アナタビン、アナバシン、アナタリン、Ｎ−メチルアナタビン、Ｎ−メチルアナバシン、ミオスミン、アナバセイン、ホルミルノルニコチン、ニコチリンおよびコチニンが挙げられるが、これらに限定されない。タバコ葉中の他の非常に少量のニコチン性アルカロイドが、例えば、Hechtら著, Accounts of Chemical Research 12: 92-98 (1979); Tso, T.G., Production, Physiology and Biochemistry of Tobacco Plant. Ideals Inc., Beltsville, MO (1990)に報告されている。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、「アルカロイド含量」とは、植物中に見出されるアルカロイドの総量を意味し、例えば、乾燥重量（ＤＷ）に基づく（pg/g）または生重量（ＦＷ）に基づく（ng/mg）と表される。
「ニコチン含量」は、植物中に見出されるニコチンの総量を意味し、例えば、ＤＷまたはＦＷに基づくｍｇ／ｇと表される。
【００４７】
「キメラ核酸」は、コード配列が天然に存在する細胞においてそれが関連するヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列に結合されたコード配列またはその断片を含む。
【００４８】
「コードしている」という用語は、転写および翻訳のメカニズムを通して遺伝子が細胞に情報を提供し、それから一連のアミノ酸を特定のアミノ酸配列に組み立てて活性酵素を産生することができるプロセスを指す。遺伝暗号の縮重のために、ＤＮＡ配列における特定の塩基変化はタンパク質のアミノ酸配列を変化させない。
【００４９】
「内因性核酸」または「内因性配列」は、遺伝子操作されるべき植物または生物にとって「天然」、すなわち固有のものである。それは、遺伝子操作されるべき植物または生物のゲノム中に存在する核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ分子を指す。
【００５０】
「外因性核酸」とは、ヒトの努力によって細胞（または細胞の祖先）に導入された核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。そのような外因性核酸は、それが導入された細胞中に天然に見出される配列のコピー、またはその断片であり得る。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、「発現」とは、遺伝子の転写によるＲＮＡ生成物の産生またはヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチド生成物の産生を意味する。「過剰発現」または「上方制御」は、細胞または植物（それらに由来する全ての子孫植物を含む）における特定の遺伝子配列またはその変異体の発現が、対照細胞または植物と比較して遺伝子操作によって増加したことを示すために用いられる（例えば、「ＮｔＥＲＦ２４１過剰発現」）。
【００５２】
「遺伝子操作」は、宿主生物に核酸または特定の突然変異を導入するための任意の方法論を包含する。例えば、植物は、それが遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチド配列で形質転換されるときに遺伝子操作され、その結果、標的遺伝子の発現は対照植物と比較して減少する。植物は、ポリヌクレオチド配列が導入されるときに遺伝子操作されて、植物において新規遺伝子の発現、または植物に天然に見出される遺伝子生成物のレベルの増加をもたらす。この状況において、「遺伝子操作された」は、トランスジェニック植物および植物細胞、ならびに例えば、Beethamら著, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 8774-8778 (1999)およびZhuら著, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96: 8768-8773 (1999)により記載されているようにキメラRNA/DNAオリゴヌクレオチドの使用を通して行われる標的突然変異誘発によって産生される植物および植物細胞、または国際特許公開ＷＯ２００３／０１３２２６に記載されているようないわゆる「組換え型オリゴ核酸塩基」を包含する。同様に、遺伝子操作された植物または植物細胞は、改変ウイルスの導入によって産生され得、それは次に宿主において遺伝子改変を引き起こし、トランスジェニック植物において産生されるものと同様の結果をもたらす。例えば、米国特許第４，４０７，９５６号を参照のこと。さらに、遺伝子操作された植物または植物細胞は、宿主植物種または性的に互換性のある植物種に由来する核酸配列のみを導入することによって実施される任意の天然アプローチ（すなわち、外来ヌクレオチド配列を含まない）の生成物であり得る。例えば、米国特許出願第２００４／０１０７４５５号を参照のこと。
【００５３】
「異種核酸」とは、細胞（または細胞の祖先）に導入されており、それが導入される細胞に天然に見られる配列のコピーではない、核酸、ＤＮＡ、またはＲＮＡを指す。そのような異種核酸は、それが導入された細胞中に天然に見出される配列のコピーであるセグメント、またはその断片を含み得る。
【００５４】
「単離された核酸分子」とは、その天然の環境から取り出された核酸分子、DNA、またはRNAを意味する。例えば、ＤＮＡ構築物中に含まれる組換えＤＮＡ分子は本技術の目的のために単離されると考えられる。単離されたＤＮＡ分子のさらなる例には、異種宿主細胞中に維持されている組換えＤＮＡ分子、または部分的もしくは実質的に溶液中で精製されているＤＮＡ分子が含まれる。単離されたＲＮＡ分子は、本技術のＤＮＡ分子のインビトロＲＮＡ転写物を含む。本技術によれば、単離された核酸分子は、さらに、合成的に製造されたそのような分子を含む。
【００５５】
「植物」は、植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、分化または未分化植物細胞、およびそれらの子孫を包含する用語である。
植物材料は、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織部位、カルス組織、葉、根、新芽、茎、果実、配偶体、胞子体、花粉および小胞子を含むがこれらに限定されない。
【００５６】
「植物細胞培養物」とは、例えばプロトプラスト、細胞培養細胞、植物組織中の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、接合子、および様々な発達段階における胚のような植物単位の培養物を意味する。本技術のいくつかの実施形態では、トランスジェニック組織培養物またはトランスジェニック植物細胞培養物が提供され、トランスジェニック組織または細胞培養物は本技術の核酸分子を含む。
【００５７】
「低下アルカロイド植物」または「減少アルカロイド植物」は、アルカロイド含量が、同じ種または品種の対照植物のアルカロイド含量の50％未満、好ましくは10％、5％または1％未満まで減少した遺伝子組み換え植物を包含する。
【００５８】
「増加アルカロイド植物」は、アルカロイド含量が、同じ種または品種の対照植物のアルカロイド含量の10％を超えて、好ましくは50％、100％または200％を超えて増加している遺伝子組み換え植物を包含する。
【００５９】
「プロモーター」は、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合に関与する転写の開始から上流のＤＮＡの領域を意味する。「構成的プロモーター」は、植物の寿命を通してそしてほとんどの環境条件下で活性であるものである。組織特異的、組織選択的、細胞型特異的および誘導性プロモーターは、「非構成的プロモーター」のクラスを構成する。「作動可能に結合された」とは、プロモーターと第二の配列との間の機能的結合をいい、ここでプロモーター配列は第二の配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始し媒介する。一般に、「作動可能に結合された」とは、結合される核酸配列が隣接していることを意味する。
【００６０】
２つのポリヌクレオチド（核酸）またはポリペプチド配列の関係における「配列同一性」または「同一性」は、特定の領域にわたって最大対応するように整列した場合に同一である２つの配列中の残基への言及を含む。タンパク質に関して配列同一性のパーセンテージが使用される場合、同一ではない残基位置は保存的アミノ酸置換によって異なることが多いと解され、アミノ酸残基が電荷および疎水性などの類似の化学的性質を有する他のアミノ酸残基に置換され、それ故、分子の機能的性質は変わらない。配列が保存的置換において異なる場合、置換の保存的性質を補正するためにパーセント配列同一性を上方に調整することができる。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整をするための手段は当業者にはよく知られている。典型的には、これは、完全なミスマッチではなく部分的ミスマッチとして保存的置換を採点することを含み、それによって配列同一性パーセントを増加させる。したがって、例えば、同一のアミノ酸に1のスコアが与えられ、非保存的置換にゼロのスコアが与えられる場合、保存的置換には0と1の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、Meyers & Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4: 11-17 (1988)のアルゴリズムに従って、プログラムPC/GENE(Intelligenetics, Mountain View, California, USA)で実行することにより計算される。
【００６１】
配列同一性のパーセンテージのこの説明における使用は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列した配列を比較することによって決定される値を意味し、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比べて、付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。パーセンテージは、一致した位置の数を得るために両方の配列中の同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割ることによって計算され、結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを得る。
【００６２】
「抑制」または「下方制御」という用語は、それに由来するすべての子孫植物を含む細胞または植物におけるその特定の遺伝子配列変異体の発現が、対照の細胞または植物と比較して遺伝子操作によって低減されていることを示すための同義語として用いられる（例えば、「ＮｔＥＲＦ２４１下方制御」）。
【００６３】
本明細書中で使用される場合、「相乗効果」とは、少なくとも２つの化合物の組み合わせによって生じる相加効果（例えば、ＮｔＥＲＦ２４１と、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａおよびＮｔＭＹＣ２ｂからなる群から好ましく選ばれる少なくとも一つのＭＹＣ転写因子遺伝子とのような、少なくとも２つの転写因子の組み合わせた過剰発現によって生じる効果）を超え、さもなければ個々の化合物から生じるであろうもの（例えば、ＮｔＥＲＦ２４１単独などの単一転写因子の過剰発現によって生じる効果）を超える効果を意味する。
【００６４】
「タバコ」または「タバコ植物」とは、ニコチン性アルカロイドを産生するタバコ属の任意の種をいい、ニコチアナアカウリス、ニコチアナアクミナータ、ニコチアナアクミナータ変異ムルトジュラ、ニコチアナアフリカーナ、ニコチアナアラタ、ニコチアナアンプレクシカウリス、ニコチアナアレントシイ、ニコチアナアテニュアータ、ニコチアナベナビデシイ、ニコチアナベンサミアナ、ニコチアナビゲロビイ、ニコチアナボナリエンシス、ニコチアナカビコラ、ニコチアナクレベランディイ、ニコチアナコルディフォリア、ニコチアナコリンボサ、ニコチアナデブネイイ、ニコチアナエクセルシオール、ニコチアナホルゲチアーナ、ニコチアナフラグランス、ニコチアナグラウカ、ニコチアナグルチノサ、ニコチアナグッドスピーディー、ニコチアナゴッセイ、ニコチアナハイブリッド、ニコチアナイングルバ、ニコチアナカワカミイ、ニコチアナナイチアナ、ニコチアナラングスドルフ、ニコチアナリニアリス、ニコチアナロンギフロラ、ニコチアナマリチマ、ニコチアナメガロシフォン、ニコチアナミエルシイ、ニコチアナノクチフロラ、ニコチアナヌディカウリス、ニコチアナオブツシフォリア、ニコチアナオクシデンタリス、ニコチアナオクシデンタリス亜種ヘスペリス、ニコチアナオトフォラ、ニコチアナパニキュラータ、ニコチアナパウジロラ、ニコチアナペチュニオイデス、ニコチアナプルムバギニフォリア、ニコチアナグアドリバルビス、ニコチアナライモンディイ、ニコチアナレパンダ、ニコチアナロスラータ、ニコチアナロスラータ亜種イングルバ、ニコチアナロツンディフォリア、ニコチアナルスチカ、ニコチアナセットチェルリイ、ニコチアナシムランス、ニコチアナソラニフォリア、ニコチアナスペガウイニイ、ニコチアナストックトニイ、ニコチアナスアベオレンス、ニコチアナシルベストリス、ニコチアナタバクム、ニコチアナチルシフローラ、ニコチアナトメントサ、ニコチアナトメントシフォミス、ニコチアナトリゴノフィラ、ニコチアナウンブラチカ、ニコチアナウンデュラータ、ニコチアナベルチナ、ニコチアナヴィガンジオイデスおよび上記の種間雑種が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６５】
「タバコ生成物」とは、タバコ属植物によって産生される材料を含む生成物を指し、例えば、カットタバコ、刻みタバコ、ニコチンガムおよび禁煙用のパッチ；膨張（パフ）および再構成タバコを含む紙巻タバコ；葉巻タバコ、パイプタバコ、シガレット、葉巻、ならびに；噛みタバコ、嗅ぎタバコ、スヌースおよびロゼンジなどのあらゆる形態の無煙タバコを含む。
【００６６】
「転写因子」は、ＤＮＡ結合ドメインを用いてＤＮＡ領域、典型的にはプロモーター領域に結合し、そして特定の遺伝子の転写を増加または減少させるタンパク質である。転写因子の発現が、アルカロイド生合成酵素をコードしている1つまたは複数の遺伝子の転写を増加させ、アルカロイド産生を増加させる場合、転写因子はアルカロイド生合成を「正に調節する」。転写因子の発現が、アルカロイド生合成酵素をコードしている1つまたは複数の遺伝子の転写を減少させ、アルカロイド産生を低下させる場合、転写因子はアルカロイド生合成を「負に調節する」。転写因子はそれらのＤＮＡ結合ドメインの類似性に基づいて分類される（例えば、Stegmaierら著、Genome Inform. 15(2): 276-86（（2004））を参照されたい）。植物転写因子のクラスには、ERF転写因子；Myc塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックス転写因子；ホメオドメインロイシンジッパー転写因子；ＡＰ２エチレン応答因子転写因子；およびＢ３ドメインオーキシン応答因子転写因子が含まれる。
【００６７】
「変異体」は、特定の遺伝子またはポリペプチドの標準または所定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列から逸脱するヌクレオチドまたはアミノ酸配列である。「アイソフォーム」、「アイソタイプ」および「アナログ」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「変異体」形態も意味する。１または２以上のアミノ酸の付加、除去もしくは置換、またはヌクレオチド配列の変化によって改変されているアミノ酸配列は、変異体配列と見なすことができる。ポリペプチド変異体は、「保存的」変化を有してもよく、ここで、置換アミノ酸は、類似の構造的または化学的特性、例えば、ロイシンのイソロイシンへの置換を有する。ポリペプチド変異体は、「非保存的」変化、例えばグリシンのトリプトファンによる置換を有することがある。類似の小さな変動は、アミノ酸の欠失もしくは挿入、またはその両方を含むこともある。どのアミノ酸残基を置換、挿入または削除できるかを決定する際の手引きは、Vector NTI Suite（InforMax, MD）ソフトウェアなどの当技術分野で周知のコンピュータプログラムを使用して見出すことができる。変異体は、Ｍａｘｙｇｅｎに譲渡された特許（例えば、米国特許第６，６０２，９８６号を参照のこと）に記載されているものなどの「シャッフルされた遺伝子」を指すこともある。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、「約」という用語は当業者によって理解され、それが使用される状況に応じてある程度変動するであろう。使用される状況を考慮して当業者には明らかではない用語の使用がある場合、「約」は特定の用語の±１０％までを意味するであろう。
【００６９】
「生物学的に活性な断片」という用語は、例えば全長ＮｔＥＲＦ２４１も結合する抗体に結合することができるＮｔＥＲＦ２４１の断片を意味する。「生物学的に活性な断片」という用語は、例えば植物における遺伝子サイレンシングの誘導において有用であり得るＮｔＥＲＦ２４１の断片も意味し得る。いくつかの実施形態において、ＮｔＥＲＦ２４１の生物学的に活性な断片は、全長配列（アミノ酸または核酸のいずれか）の約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％であり得る。ＮｔＥＲＦ２４１の全長アミノ酸配列を示す配列番号３は、246個のアミノ酸である。他の実施形態では、ＮｔＥＲＦ２４１の生物学的に活性なペプチド断片は、例えば少なくとも約５個の連続したアミノ酸であり得る。さらに他の実施形態において、ＮｔＥＲＦ２４１の生物学的に活性なペプチド断片は、約５個の連続アミノ酸から約２４５個までの連続アミノ酸、またはこれら２つの量の間の任意の値の連続アミノ酸であり得、例えば、約７、約８、約９、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０または約２４５の連続アミノ酸であるが、これらに限定されない。配列番号２は、コード領域ならびにその５'および３'上流および下流調節配列を含むＮｔＥＲＦ２４１の全長配列を表す配列番号１のＯＲＦを表す。配列番号２は７４１塩基対の長さである。いくつかの実施形態では、ＮｔＥＲＦ２４１の生物学的に活性な核酸断片は、例えば少なくとも約１５の連続した核酸であり得る。さらに他の実施形態では、ＮｔＥＲＦ２４１の生物学的に活性な核酸断片は、約１５個の連続核酸から約７４０個までの連続核酸、またはこれら２つの量の間の任意の値の連続核酸であり得、例えば、約２０、約３０、約４０、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５または約７４０個の連続核酸であるが、これらに限定されない。
【００７０】
ＩＩＩ．植物におけるアルカロイド産生の調節
本技術の開示は、植物におけるアルカロイド産生を調節するための組成物および方法におけるＮｔＥＲＦ２４１またはその生物学的に活性な断片の使用に関する。
【００７１】
Ａ．アルカロイド産生量の増加
いくつかの実施形態において、本技術は、アルカロイド産生に対して正の制御効果を有する転写因子を過剰発現させることによって植物中のアルカロイドを増加させることに関する。ＮｔＥＲＦ２４１遺伝子またはそのオープンリーディングフレームは、植物または植物細胞におけるアルカロイド、例えば、ニコチン性アルカロイド（例えば、ニコチン）の過剰産生を操作するために使用され得る。
【００７２】
ニコチンなどのアルカロイドは、アルカロイド生合成経路における酵素をコードしている1つまたは２以上の遺伝子を過剰発現させることによって増加させることができる。例えば、Satoら著, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(l): 367-72 (2001)を参照されたい。根におけるPMT転写生成物レベルの4〜8倍の増加にもかかわらず、葉のニコチン含量に対するPMT単独の過剰発現の効果はわずか40％の増加であるので、経路の他の段階での制限がより大きな効果を妨げることを示唆している。したがって、本技術は、アルカロイド産生に対する正の制御効果が予測される転写因子（例えば、ＮｔＥＲＦ２４１）およびＡ６２２、ＮＢＢ１、ＱＰＴ、ＰＭＴおよび／またはＭＰＯのような少なくとも１つのアルカロイド生合成遺伝子の過剰発現が、アルカロイド生合成遺伝子のみを上方制御することよりも、アルカロイド産生量が多いと考える。
【００７３】
本技術のこの態様によれば、ＮｔＥＲＦ２４１、そのオープンリーディングフレーム、またはその生物学的に活性な断片、およびＡ６２２、ＮＢＢ１、ＱＰＴ、ＰＭＴまたはＭＰＯのうちの少なくとも１つを含む核酸構築物を植物細胞に導入する。例示的な核酸構築物は、例えば、ＮｔＥＲＦ２４１またはその生物学的に活性な断片とQPTの両方を含み得る。同様に、例えば、ＮｔＥＲＦ２４１およびＱＰＴを過剰発現している遺伝子操作植物は、ＮｔＥＲＦ２４１を過剰発現しているトランスジェニック植物と、ＱＰＴを過剰発現しているトランスジェニック植物とを交配することによって作製することができる。
交配および選択の連続ラウンドに続いて、ＮｔＥＲＦ２４１およびＱＰＴを過剰発現している遺伝子操作植物を選択することができる。
【００７４】
Ｂ．アルカロイド産生の減少
例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術、人工マイクロＲＮＡ技術、ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）技術、アンチセンス技術、センス共抑制技術および標的突然変異誘発技術のような当分野で一般に知られている多くの方法において、本技術のＮｔＥＲＦ２４１転写因子遺伝子配列を用いてアルカロイド産生を正に制御する転写因子をコードしている内因性遺伝子の抑制によってアルカロイド産生を減少させることができる。したがって、本技術は、ＮｔＥＲＦ２４１を抑制することによって植物中のアルカロイド含量を減少させるための方法論および構築物を提供する。アルカロイド産生を正に制御する転写因子（例えば、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａおよび／またはＮｔＭＹＣ２ｂ）をコードしている２つ以上の遺伝子を抑制することは、植物中のアルカロイドレベルをさらに減少させることがある。
【００７５】
以前の報告は、タバコ属におけるアルカロイド生合成遺伝子の抑制がニコチン性アルカロイド含量を減少させることを示している。例えば、QPTを抑制すると、ニコチンレベルが低下する（例えば、米国特許第６，５８６，６６１号を参照）。PMTを抑制するのと同様に（例えば、Chintapakorn ＆ Hamill, Plant Mol. Biol. 53: 87-105 (2003）を参照）、またはMPOを抑制するのと同様に（例えば、WO2008/020333およびWO2008/008844；Katohら著, Plant Cell Physiol. 48（3）：550-4 (2007）を参照）、A622またはNBB1を抑制すると、ニコチンレベルも減少する（例えば、WO2006/109197を参照）。したがって、本技術は、Ａ６２２、ＮＢＢ１、ＱＰＴ、ＰＭＴおよびＭＰＯのうちの１つ以上を抑制し、そしてＮｔＥＲＦ２４１を抑制することによって、ニコチン性アルカロイド含量をさらに減少させることを企図する。本技術のこの態様によれば、少なくともＮｔＥＲＦ２４１の生物学的に活性な断片と、Ａ６２２、ＮＢＢ１、ＱＰＴ、ＰＭＴおよびＭＰＯのうちの少なくとも１つの生物学的に活性な断片とを含む核酸構築物を細胞または植物に導入する。例示的な核酸構築物は、ＮｔＥＲＦ２４１の生物学的に活性な断片およびＱＰＴの両方を含み得る。
【００７６】
Ｃ．アルカロイド産生を調節する転写因子配列を用いた植物および細胞の遺伝子操作
転写因子配列
本技術の転写因子遺伝子には、少なくとも約15個の連続核酸から約740個までの連続核酸、またはこれら２つの量の間にある任意の値、例えば限定はされないが約２０、約３０、約４０、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５または約７４０個の連続核酸の生物学的に活性な断片を含む配列番号1および配列番号2に記載の配列が含まれる。いくつかの実施形態において、本技術の転写因子遺伝子は、植物における遺伝子サイレンシングの誘導に有用な充分な長さである少なくとも約２１連続ヌクレオチドの生物学的に活性なその断片を含む配列番号１および配列番号２に示される配列を含む（Hamilton ＆ Baulcombe, Science, 286: 950-952 (1999））。
【００７７】
本技術は、アルカロイド生合成活性を調節するポリペプチドをコードしている１以上の塩基が欠失、置換、挿入または付加された、配列番号１および配列番号２の「変異体」も含む。したがって、「１以上の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列」を有する配列は、コードされたアミノ酸配列が１以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加された場合でも生理活性を保持する。さらに、遺伝子生成物の翻訳後修飾、または複数の形態の転写因子遺伝子に起因し得る、複数の形態のＮｔＥＲＦ２４１が存在し得る。そのような修飾を有し、アルカロイド生合成を調節するＮｔＥＲＦ２４１転写因子をコードしているヌクレオチド配列は、本技術の範囲内に含まれる。
【００７８】
例えば、ポリＡテールまたは５'または３'末端の非翻訳領域を欠失させることができ、塩基を、アミノ酸が欠失される程度まで欠失させることができる。フレームシフトが生じない限り、塩基を置換することもできる。塩基は、アミノ酸が付加される程度まで「付加」することもできる。しかしながら、そのような修飾がアルカロイド生合成を調節する転写因子活性の喪失をもたらさないことが重要である。この状況における修飾ＤＮＡは、例えば、部位特異的突然変異誘発によってコード化ポリペプチドの特定部位のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されるように本技術のＤＮＡ塩基配列を修飾することによって得ることができる｛Zoller & Smith, Nucleic Acid Res. 10: 6487-500 (1982)を参照）。
【００７９】
転写因子配列は、例えば、天然のＤＮＡ配列とは異なるが同一または類似のアミノ酸配列を有するタンパク質の産生をもたらすＤＮＡ分子を作製するためのガイドとして本明細書に開示された適切なタンパク質配列を使用することによって、適切な塩基から最初から合成することができる。
【００８０】
特記しない限り、ここでＤＮＡ分子を配列決定することによって決められる全てのヌクレオチド配列は、Applied Biosystems, Inc.製のModel 3730×1のような自動ＤＮＡシーケンサーを用いて決定した。したがって、この自動化手法により決められるDNA配列に関する技術分野で知られているように、本明細書中で決定される任意のヌクレオチド配列はいくつかの誤りを含み得る。自動化によって決定されたヌクレオチド配列は、典型的には、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列と少なくとも約９５％同一、より典型的には少なくとも約９６％から少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当技術分野において周知の手動DNA配列決定法を含む他の方法によってより正確に決定することができる。当技術分野でも知られているように、実際の配列と比較して決定されたヌクレオチド配列における単一の挿入または欠失は、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる予測アミノ酸配列が、そのような挿入または欠失の地点で始まる配列決定ＤＮＡ分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは完全に異なるように、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトを引き起こす。
【００８１】
本技術の目的のために、２つの配列が、６×ＳＳＥ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液および100μｇの非特異的担体ＤＮＡのハイブリダイゼーション溶液中で二本鎖複合体を形成する場合、２つの配列はストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する。Ausubelらの前記文献、セクション2.9、補足27（1994）を参照のこと。配列は、６×ＳＳＥ、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液および１００μｇの非特異的担体ＤＮＡのハイブリダイゼーション溶液中で６０℃の温度として定義される「中程度のストリンジェンシー」でハイブリッド形成し得る。「高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーションでは、温度を68℃に上げる。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応に続いて、ヌクレオチドを２×ＳＳＥ＋０．０５％ＳＤＳの溶液中で室温で５回洗浄し、続いて０．１×ＳＳＣ＋０．１％ＳＯＳで６０℃にて１時間洗浄する。高いストリンジェンシーのためには、洗浄温度は６８℃に上げられる。本技術の目的のために、ハイブリッド形成したヌクレオチドは、10,000cpm/ngの比放射能を有する1ngの放射能標識プローブを使用して検出されるものであり、ここでハイブリッド形成したヌクレオチドは−７０℃でＸ線フィルムへの72時間未満の暴露後にはっきり見える。
【００８２】
本技術は、配列番号１〜２のいずれかに記載の核酸配列と少なくとも約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％または１００％同一である核酸分子を包含する。２つの核酸配列間の相違は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置において、またはそれらの末端位置間のどこかで、参照配列中のヌクレオチド間に個別にまたは参照配列内の１または２以上の隣接基のいずれかに散在して、起こり得る。
【００８３】
核酸構築物
本技術のいくつかの実施形態において、アルカロイド生合成を調節する転写因子の活性を増大させる配列が、植物または細胞への導入に適した核酸構築物に組み込まれる。すなわち、そのような核酸構築物は、植物または細胞において、ＮｔＥＲＦ２４１、および必要に応じて、Ａ６２２、ＮＢＢ１、ＰＭＴ、ＱＰＴ、ＭＰＯ、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣｌｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、またはＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つを過剰発現するために用いることができる。
【００８４】
組換え核酸構築物は標準的な技術を用いて作製することができる。例えば、転写用ＤＮＡ配列は、該配列を含むベクターを制限酵素で処理して適当なセグメントを切り出すことにより得ることができる。転写のためのＤＮＡ配列は、合成オリゴヌクレオチドをアニーリングおよびライゲーションすることによって、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において合成オリゴヌクレオチドを使用して各末端に適切な制限部位を与えることにより、産生することもできる。次いで、ＤＮＡ配列を上流プロモーターおよび下流ターミネーター配列などの適切な調節要素を含むベクター内にクローニングする。
【００８５】
本技術のいくつかの実施形態では、核酸構築物は、１または２以上の調節配列または制御配列に作動可能に結合された、アルカロイド生合成を調節する転写因子（すなわちＮｔＥＲＦ２４１）をコードしている配列を含み、通常の発生や生理学に過度に影響を与えることなく、特定の細胞型、臓器または組織において転写因子をコードしている配列の発現を引き起こす。
【００８６】
アルカロイド生合成を調節する転写因子の発現を減少または増加させるために細胞に導入された核酸配列の発現に有用なプロモーターは、カーネーションエッチリングウイルス（CERV）、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）35Sなどの構成的プロモーター、またはより具体的には、２つのＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを直列に含む二重増強カリフラワーモザイクウイルスプロモーター（「ダブル３５Ｓ」プロモーターと呼ばれる）であり得る。特定の状況下では、組織特異的、組織選択的、細胞型特異的および誘導性プロモーターが望ましい場合がある。例えば、組織特異的プロモーターは、他の組織における発現に影響を及ぼすことなく特定の組織における過剰発現を可能にする。
【００８７】
例示的なプロモーターとしては、根の組織において活性であるプロモーターが挙げられ、例えば、タバコRB7プロモーター（例えば、Hsuら著, Pestic. Sci. 44: 9-19 (1995）;米国特許第５，４５９，２５２号を参照）、トウモロコシプロモーターCRWAQ81（例えば、米国特許公開第２００５／００９７６３３号を参照）、シロイヌナズナ（Arabidopsis）ＡＲＳＫ１プロモーター（例えば、Hwang ＆ Goodman, Plant J. 8: 37-43 (1995）を参照）、トウモロコシＭＲ７プロモーター（例えば、米国特許第５，８３７，８４８号参照）、トウモロコシＺＲＰ２プロモーター（例えば、米国特許第５，６３３，３６３号を参照）、トウモロコシＭＴＬプロモーター（例えば、米国特許第５，４６６，７８５号および第６，０１８，０９９号を参照）、トウモロコシＭＲＳ１、ＭＲＳ２、ＭＲＳ３およびＭＲＳ４プロモーター（例えば、米国特許公開第２００５／００１０９７４号を参照）、シロイヌナズナの潜在的プロモーター（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１０６１０５号を参照）、および、ニコチン生合成に関与する酵素の発現上昇をもたらす条件下で活性化されるプロモーター、例えば、タバコRD2プロモーター（例えば、米国特許第５，８３７，８７６号を参照）、ＰＭＴプロモーター（例えば、Shojiら著, Plant Cell Physiol. 41: 831-39 (2000)；ＷＯ２００２／０３８５８８を参照）、またはＡ６２２プロモーター（例えば、Shojiら著, Plant Mol. Biol. 50: 427-40 (2002）を参照）が挙げられる。
【００８８】
本技術のベクターはまた、mRNAの転写が終結されるように、本技術の核酸分子の下流に位置する終結配列、および付加ポリA配列を含み得る。例示的なターミネーターとしては、アグロバクテリウムツメファシエンスノパリンシンターゼターミネーター（Ｔｎｏｓ）、アグロバクテリウムツメファシエンスマンノピンシンターゼターミネーター（Ｔｍａｓ）、およびＣａＭＶ３５Ｓターミネーター（Ｔ３５Ｓ）が挙げられる。終結領域は、エンドウリブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニット終結領域（ＴｒｂｃＳ）またはＴｎｏｓ終結領域を含む。発現ベクターはまた、エンハンサー、開始コドン、スプライシングシグナル配列、およびターゲティング配列を含み得る。
【００８９】
本技術の発現ベクターは、形質転換細胞を培養物中で同定することができる選択マーカーを含も得る。マーカーは、異種核酸分子、すなわちプロモーターに作動可能に結合された遺伝子と会合していてもよい。本明細書中で使用される場合、「マーカー」という用語は、マーカーを含む植物または細胞の選択またはそれらに対するスクリーニングを可能にする形質または表現型をコードしている遺伝子をいう。例えば植物では、マーカー遺伝子は抗生物質または除草剤耐性をコードしているであろう。これは、形質転換またはトランスフェクトされていない細胞の中からの形質転換細胞の選択を可能にする。
【００９０】
適切な選択マーカーの例には、アデノシンデアミナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン-B-ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、キサンチン-グアニンホスホ-リボシルトランスフェラーゼ、グリホサートおよびグルホシネート耐性、ならびにアミノ-グリコシド3'-O-ホスホトランスフェラーゼ（カナマイシン、ネオマイシンおよびG418耐性）が含まれるが、これらに限定されない。これらのマーカーは、G418、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシンおよびゲンタマイシンに対する耐性を含み得る。構築物はまた、グルホシネートアンモニウムのような除草性ホスフィノトリシン類似体に対する耐性を付与する選択マーカー遺伝子バーを含み得る。例えば、Thompsonら著, EMBO J. 9: 2519-23 (1987）を参照されたい。当該分野で公知の他の適切な選択マーカーも使用され得る。
【００９１】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの可視マーカーを使用することができる。細胞分裂の制御に基づいて形質転換植物を同定または選択する方法も記載されている。例えば、ＷＯ２０００／０５２１６８およびＷＯ２００１／０５９０８６を参照のこと。
【００９２】
ベクターを細菌またはファージ宿主中にクローニングすることを可能にする、細菌またはウイルス起源の複製配列も挙げられる。好ましくは、広い宿主範囲の原核生物の複製起点が使用される。所望の構築物を担持する細菌細胞の選択を可能にするために、細菌のための選択マーカーが含まれてもよい。適切な原核生物選択マーカーには、カナマイシンまたはテトラサイクリンなどの抗生物質に対する耐性も含まれる。
【００９３】
当技術分野で知られているように、追加の機能をコードしている他の核酸配列もベクター中に存在し得る。例えば、アグロバクテリウムが宿主である場合、その後の植物染色体への移入および植物染色体への組込みを容易にするためにT-DNA配列を含めることができる。
【００９４】
そのような遺伝子構築物は、アグロバクテリウムによる宿主植物への形質転換および改変アルカロイドレベルについてのスクリーニングによって活性について適切にスクリーニングされ得る。
【００９５】
適切には、遺伝子のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）ヌクレオチドデータベースから抽出され得、そして切断しない制限酵素について検索され得る。これらの制限部位は、これらの部位をPCRプライマーに組み込むことのような従来の方法によって、またはサブクローニングによって遺伝子に付加され得る。
【００９６】
構築物は、適切な宿主（植物）細胞における発現に適合した発現ベクターなどのベクター内に含まれてもよい。導入されたＤＮＡ配列を含む植物を産生することができる任意のベクターが十分であろうことが理解されるだろう。
【００９７】
適切なベクターは当業者に周知であり、そしてPouwelsら著, Cloning Vector, A Laboratory Manual, Elsevier, Amsterdam (1986）のような一般的な技術参考文献に記載されている。適切なベクターの例には、Ｔｉプラスミドベクターが含まれる。
【００９８】
いくつかの実施形態において、本技術は、ニコチンおよび様々なフラボノイドを含む他のアルカロイドの産生レベルを調節するための、ＮｔＥＲＦ２４１の過剰発現を可能にする発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本技術の発現ベクターはさらに、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣｌｂ、ＮｔＭＹＣ２ａおよびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つの過剰発現を可能にする。これらの発現ベクターは、当業者に知られている様々な方法によって、宿主植物細胞に一過性に導入するか、または宿主植物細胞のゲノムに安定的に組み込んでトランスジェニック植物を産生することができる。これらの発現ベクターが安定な細胞株またはトランスジェニック植物を産生するために宿主植物細胞のゲノムに安定に組み込まれている場合、単独でまたはアルカロイド生合成酵素または他の転写因子、例えばＮｔＭＹＣｌａ、ＮｔＭＹＣｌｂ、ＮｔＭＹＣ２ａまたはＮｔＭＹＣ２ｂと組み合わせてのＮｔＥＲＦ２４１の過剰発現を、この転写因子に応答性である内因性プロモーターのプロモーター活性化を調節するための方法として展開することができる。宿主植物細胞をさらに操作して、ＮｔＥＲＦ２４１に応答性の異種プロモーター構築物を得ることができる。目的の異種プロモーターのコアエレメントの上流に1つまたは複数のGAGモチーフを組み込むことによって修飾されている異種プロモーター構築物を受容するように宿主植物細胞をさらに操作することもできる。
【００９９】
目的のプロモーターの上流に１つまたは複数のＧＡＧモチーフおよび／または誘導体ＧＡＧモチーフを組み込むことによって、目的の任意のプロモーターを操作して、ジャスモン酸（ＪＡ）およびジャスモン酸メチル（ＭｅＪＡ）に反応するようにすることができる。適切なプロモーターとしては、植物細胞の転写機構によって活性化され得る任意の起源の様々なプロモーター、例えば様々な同種または異種植物プロモーター、ならびに細菌およびウイルスを含む植物病原体由来の様々なプロモーターが挙げられる。適切なプロモーターには、構成的に活性なプロモーターおよび誘導性プロモーターが含まれる。
【０１００】
以下に記載される発現ベクターに関して、アルカロイド、フラボノイドおよびニコチンの産生のための生合成経路に関与する酵素をコードしている様々な遺伝子は、目的のプロモーターに作動可能に結合され得る導入遺伝子として適切であり得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＮｔＥＲＦ２４１をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合されたプロモーターを含む。別の実施形態では、植物細胞株は、ＮｔＥＲＦ２４１をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合されたプロモーターを含む発現ベクターを含む。別の実施形態では、トランスジェニック植物は、ＮｔＥＲＦ２４１をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合されたプロモーターを含む発現ベクターを含む。別の実施形態では、ＮｔＥＲＦ２４１をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合されたプロモーターを含む発現ベクターを導入することを含んでなる、アルカロイド、フラボノイドおよびニコチンの産生を遺伝的に調節するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＮｔＭＹＣｌａ、ＮｔＭＹＣｌｂ、ＮｔＭＹＣ２ａおよびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合されたプロモーターをさらに含む。
【０１０２】
別の実施形態では、発現ベクターは、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２４１をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合した第１のプロモーター、および（ｉｉ）アルカロイドの生合成に関与する酵素をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合した第２のプロモーターを含む。別の実施形態では、植物細胞株は、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２４１をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合した第１のプロモーター含む発現ベクター、および（ｉｉ）アルカロイドの生合成に関与する酵素をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合した第２のプロモーターを含む。別の実施形態では、トランスジェニック植物は、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２４１をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合した第１のプロモーターを含む発現ベクター、および（ｉｉ）アルカロイドの生合成に関与する酵素をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合した第２のプロモーターを含む。別の実施形態では、（ａ）ＮｔＥＲＦ２４１をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合された第１のプロモーター、および（ｂ）アルカロイドの生合成に関与する酵素をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合された第２のプロモーターを含む発現ベクターを導入することを含んでなる、アルカロイドの産生レベルを遺伝的に調節する方法が提供される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＮｔＭＹＣｌａ、ＮｔＭＹＣｌｂ、ＮｔＭＹＣ２ａおよびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合されたプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、アルカロイド生合成に関与する酵素は、Ａ６２２、ＮＢＢ１、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、プトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）またはＮ−メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）のうちの１つ以上を含む。
【０１０３】
もう一つの実施形態において、発現ベクターは、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２４１をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合した第１のプロモーター、および（ｉｉ）フラボノイドの生合成に関与する酵素をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合した第２のプロモーターを含む。別の実施形態では、植物細胞株は、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２４１をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合した第１のプロモーターを含む発現ベクター、および（ｉｉ）フラボノイドの生合成に関与する酵素をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合した第２のプロモーターを含む。別の実施形態において、トランスジェニック植物は、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２４１をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合した第１のプロモーター、および（ｉｉ）フラボノイドの生合成に関与する酵素をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合した第２のプロモーターを含む発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＮｔＭＹＣｌａ、ＮｔＭＹＣｌｂ、ＮｔＭＹＣ２ａおよびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合されたプロモーターをさらに含む。別の実施形態において、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２４１をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合された第１のプロモーター、および（ｉｉ）フラボノイドの生合成に関わる酵素をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合された第２のプロモーターを含む発現ベクターを導入することを含んでなる、フラボノイドの産生レベルを調節する方法が提供される。本方法のいくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣｌｂ、ＮｔＭＹＣ２ａおよびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合されたプロモーターをさらに含む。
【０１０４】
もう一つの実施形態において、発現ベクターは、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２４１をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合した第１のプロモーター、および（ｉｉ）ニコチン生合成に関与する酵素をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合した第２のプロモーターを含む。別の実施形態では、植物細胞株は、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２４１をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合した第１のプロモーター、および（ｉｉ）ニコチン生合成に関与する酵素をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合した第２のプロモーターを含む発現ベクターを含む。別の実施形態では、トランスジェニック植物は、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２４１をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合した第１のプロモーター、および（ｉｉ）ニコチン生合成に関与する酵素をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合した第２のプロモーターを含む発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＮｔＭＹＣｌａ、ＮｔＭＹＣｌｂ、ＮｔＭＹＣ２ａおよびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合されたプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態では、ニコチン生合成に関与する酵素は、Ａ６２２、ＮＢＢ１、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、プトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）またはＮ−メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、ニコチン生合成に関与する酵素はＰＭＴである。別の実施形態では、（ｉ）ＮｔＥＲＦ２４１をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合された第１のプロモーター、および（ｉｉ）ニコチン生合成に関与する酵素をコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合された第２のプロモーターを含む発現ベクターを導入することを含んでなる、ニコチンの産生レベルを遺伝的に調節する方法が提供される。本方法のいくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣｌｂ、ＮｔＭＹＣ２ａおよびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードしているｃＤＮＡに作動可能に結合されたプロモーターをさらに含む。
【０１０５】
もう一つの実施形態は、ＮｔＥＲＦ２４１（配列番号２）をコードしている単離されたｃＤＮＡ、またはその生物学的に活性なその断片に関する。別の実施形態は、ＮｔＥＲＦ２４１をコードしていると共に、配列番号２と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の配列同一性を有する単離されたｃＤＮＡ、またはその生物学的に活性な変異体断片に関する。
【０１０６】
もう一つの実施形態は、ＮｔＥＲＦ２４１をコードしていると共に、配列番号２と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の配列同一性を有する単離されたｃＤＮＡまたはその生物学的に活性な断片を含む第１の配列を含む発現ベクターに関する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａおよびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードしていると共に、それぞれ配列番号４、６、８および１０と少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％の配列同一性を有する単離されたｃＤＮＡまたはその断片を含む追加の配列をさらに含む。
【０１０７】
もう一つの実施形態は、ＮｔＥＲＦ２４１をコードしていると共に、配列番号２と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する単離されたｃＤＮＡまたはその断片を含む発現ベクターを含む植物細胞株に関する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａおよびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードしていると共に、それぞれ配列番号４、６、８および１０と少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％の配列同一性を有する単離されたｃＤＮＡまたはその断片を含む追加の配列をさらに含む。
【０１０８】
もう一つの実施形態は、ＮｔＥＲＦ２４１をコードしていると共に、配列番号２と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の配列同一性を有する単離されたｃＤＮＡまたはその生物学的に活性な断片を含む発現ベクターを含むトランスジェニック植物に関する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａおよびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードしていると共に、それぞれ配列番号４、６、８および１０と少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％の配列同一性を有する単離されたｃＤＮＡまたはその断片を含む第２の配列をさらに含む。
【０１０９】
もう一つの実施形態は、ＮｔＥＲＦ２４１をコードしていると共に、配列番号２と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の配列同一性を有する単離されたｃＤＮＡまたはその断片を含む発現ベクターを植物に導入することを含んでなる、植物中のニコチンレベルを遺伝的に調節する方法に関する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａおよびＮｔＭＹＣ２ｂのうちの少なくとも１つをコードしていると共に、それぞれ配列番号４、６、８および１０と少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％約、９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％または１００％の配列同一性を有する単離されたｃＤＮＡまたはその断片を含む第２の配列をさらに含む。
【０１１０】
アルカロイド産生を調節する転写因子を抑制する方法
本技術のいくつかの実施形態において、アルカロイド産生を調節する転写因子を抑制し、アルカロイドレベルを変化させ、そしてアルカロイドレベルが変化した植物を産生するための方法および構築物が提供される。アルカロイド産生を調節する転写因子（例えば、ＮｔＥＲＦ２４１）を抑制するために使用することができる方法の例には、アンチセンス、センス共抑制、ＲＮＡｉ、人工マイクロＲＮＡ、ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）、アンチセンス、センス共抑制、および標的突然変異誘発アプローチが含まれる。
【０１１１】
ＲＮＡｉ技術は、ＲＮＡｉプラスミド構築物を用いた安定な形質転換を含む（Helliwell ＆ Waterhouse, Methods Enzymol. 392: 24-35 (2005））。そのようなプラスミドは、逆方向反復構造において沈黙化される標的遺伝子の断片から構成される。逆方向反復配列はスペーサー、多くの場合イントロンで区切られている。適切なプロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターによって駆動されるＲＮＡｉ構築物は植物ゲノムに組み込まれ、その後の導入遺伝子の転写により、それ自体の上に折り返されて二本鎖ヘアピンRNAを形成するＲＮＡ分子をもたらす。この二本鎖ＲＮＡ構築物は植物によって認識され、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる低分子ＲＮＡ（長さ約２１ヌクレオチド）に切断される。ｓｉＲＮＡはタンパク質複合体（ＲＩＳＣ）と会合し、これが続いて標的遺伝子に対するｍＲＮＡの直接分解を引き起こす。
【０１１２】
人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）技術は、植物および他の真核生物における内因性遺伝子を沈黙させるように機能するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）経路を利用する（Schwabら著, Plant Cell 18: 1121-33 (2006)； Alvarezら著, Plant Cell 18: 1134-51 (2006)）。この方法では、沈黙させる遺伝子の21ヌクレオチド長の断片をpre-miRNA遺伝子に導入してpre-amiRNA構築物を形成させる。プレｍｉＲＮＡ構築物は、当業者に明らかな形質転換方法を用いて植物ゲノムに導入される。プレamiRNAの転写後、プロセシングにより、21ヌクレオチドamiRNA配列とヌクレオチド同一性を共有する遺伝子を標的とするamiRNAが得られる。
【０１１３】
ＲＮＡｉサイレンシング技術では、２つの要因が断片の長さの選択に影響を及ぼし得る。断片が短くなるほど効果的なサイレンシングが達成される頻度は低くなるが、非常に長いヘアピンは細菌宿主株における組換えの可能性を高める。サイレンシングの有効性も遺伝子依存的であるように思われ、そして遺伝子が活性である細胞における標的ｍＲＮＡの接近可能性または標的ｍＲＮＡおよびｈｐＲＮＡの相対存在量を反映し得る。100〜800bp、好ましくは300〜600bpの断片長は、一般に、得られるサイレンシングの効率を最大にするのに適している。他の考慮事項は、標的とされるべき遺伝子の一部である。５'ＵＴＲ、コード領域、および３'ＵＴＲ断片を使用しても同様に良好な結果が得られる。サイレンシングのメカニズムは配列相同性に依存するので、関連ｍＲＮＡ配列のクロスサイレンシングの可能性がある。これが望ましくない場合は、5'または3'UTRなど、他の配列との配列類似性が低い領域を選択する必要がある。交差相同性サイレンシングを回避するための規則は、構築物と非標的遺伝子配列との間に20塩基を超える配列同一性のブロックを有さない配列を使用することであるように思われる。これらの同じ原理の多くは、amiRNAを設計するための標的領域の選択にも当てはまる。
【０１１４】
ウイルス誘発性遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）技術は、植物の内因性-抗ウイルス性防御を利用するＲＮＡｉ技術の変形である。宿主ＤＮＡの断片を含有する組換えＶＩＧＳウイルスによる植物の感染は、標的遺伝子に対する転写後遺伝子サイレンシングをもたらす。一実施形態では、タバコガラガラウイルス（ＴＲＶ）に基づくＶＩＧＳシステムを使用することができる。タバコガラガラウイルスに基づくＶＩＧＳシステムは、例えば、Baulcombe著, Curr. Opin. Plant Biol. 2: 109-113 (1999);Luら著, Methods 30: 296-303 (2003);Ratcliffら著, The Plant Journal 25: 237-245 (2001);および米国特許第７，２２９，８２９号に記載されている。
【０１１５】
アンチセンス技術は、目的の遺伝子によって産生されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドを植物に導入することを含む。「アンチセンス」オリゴヌクレオチドは、「センス」配列と呼ばれる遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に相補的な塩基配列を有する。ｍＲＮＡのセンスセグメントの活性はアンチセンスｍＲＮＡセグメントによって遮断され、それによって遺伝子発現を効果的に不活性化する。植物における遺伝子サイレンシングに対するアンチセンスの適用は、Stamら著, Plant J. 2127-42 (2000）により詳細に記載されている。
【０１１６】
センス共抑制技術は、高度に発現されたセンス導入遺伝子を植物に導入して導入遺伝子と内因性遺伝子の両方の発現を低下させることを含む（Depickerおよびvan Montagu著, Curr. Opin. Cell Biol. 9: 373-82（1997））。その効果は導入遺伝子と内在性遺伝子との間の配列同一性に依存する。
【０１１７】
標的化突然変異誘発技術、例えば、TILLING（ゲノムにおける標的化誘導局所病変）および高速中性子照射を用いる「遺伝子の削除」を用いて、植物における遺伝子機能をノックアウトすることができる（Henikoffら著, Plant Physiol. 135: 630-6(2004）；Liら著, Plant J. 27: 235-242(2001)）。TILLINGは、種子または個々の細胞を突然変異誘発物質で処理して点突然変異を引き起こすことを含み、それは次に単一ヌクレオチド突然変異検出のための高感度な方法を用いて目的の遺伝子において発見される。所望の変異（例えば、目的の遺伝子生成物の不活性化をもたらす変異）の検出は、例えばＰＣＲ法によって達成され得る。例えば、目的の遺伝子に由来するオリゴヌクレオチドプライマーを調製することができ、ＰＣＲを用いて変異誘発集団中の植物由来の目的の遺伝子の領域を増幅することができる。増幅された変異遺伝子を野生型遺伝子にアニーリングして、変異遺伝子と野生型遺伝子との間のミスマッチを見出すことができる。検出された差異は、変異遺伝子を有する植物まで遡ることができ、それによってどの変異誘発植物が所望の発現を有するであろうかを明らかにする（例えば、目的の遺伝子のサイレンシング）。次いでこれらの植物を選択的に交配して所望の発現を有する集団を作出することができる。TILLINGは、標的遺伝子の発現低下を示すミスセンスおよびノックアウト変異を含む対立遺伝子シリーズを提供することができる。TILLINGは、導入遺伝子の導入を含まない遺伝子ノックアウトへの可能なアプローチとして宣伝されており、したがって消費者にとってより許容可能であり得る。高速中性子照射は植物ゲノムに突然変異、すなわち欠失を誘発し、これもTILLINGと同様の方法でPCRを用いて検出することができる。
【０１１８】
宿主植物および細胞
いくつかの実施形態において、本技術は、アルカロイド生合成を調節する転写因子をコードしているポリヌクレオチド配列（例えば、ＮｔＥＲＦ２４１）を導入することによる植物または細胞の遺伝子操作に関する。したがって、本技術は、植物におけるアルカロイド合成を減少または増加させるための方法論および構築物を提供する。さらに、本技術は、植物細胞中でアルカロイドおよび関連化合物を産生するための方法を提供する。
【０１１９】
本技術において利用される植物は、単子葉植物および双子葉植物の両方、ならびに裸子植物を含む、遺伝子操作技術に適したアルカロイド産生高等植物のクラスを含み得る。いくつかの実施形態において、アルカロイド産生植物は、ナス科のタバコ、Duboisia、Solarium、AnthocercisおよびSalpiglossis属、またはキク科のEcliptaおよびZinnia属のニコチン性アルカロイド産生植物を含む。
【０１２０】
当技術分野において公知であるように、遺伝子および遺伝子構築物を植物に導入することができる多くの方法があり、そして植物形質転換および組織培養技術の組み合わせは、トランスジェニック作物植物を作製するための有効な方法にうまく統合されている。
【０１２１】
本技術において使用することができるこれらの方法は、他の箇所に記載されており(Potrykus著, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205-225 (1991); Vasil著, Plant Mol. Biol. 5: 925-29, 937 (1994); WaldenおよびWingender著, Trends Biotechnol. 13: 324-331 (1995); Songstadら著, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 40: 1-15 (1995)）、当業者に周知である。例えば、当業者であれば、真空浸潤によるシロイヌナズナのアグロバクテリウム媒介形質転換（Bechtoldら著, C.R. Acad. Sci. Ser. III Sci. Vie, 316: 1194-1199 (1993)）または創傷接種（atavicら著、Mol. Gen. Genet. 245: 363-370 (1994)）に加えて、アグロバクテリウムＴｉ−プラスミド媒介形質転換（例えばＡ．例えば、胚軸（DeBlockら著、Plant Physiol. 91: 694-701 (1989)）または子葉葉柄（Moloneyら著, Plant Cell Rep. 8: 238-242 (1989)創傷感染）、粒子衝撃／バイオリスティック法（Sanfordら著, J. Part. Sci. Technol. 5: 27-37 (1987); Nehraら著, Plant J. 5: 285-297 (1994); Beckerら著、Plant J. 299-307 (1994)）、またはポリエチレングリコール支援プロトプラスト形質転換方法（Rhodesら著, Science 240: 204-207 (1988); Shimamotoら著, Nature 335: 274-276 (1989)）を使用して他の植物および作物種を形質転換することも同様に可能であるが明らかに分かる。
【０１２２】
例えば、Guillonら著, Curr. Opin. Plant Biol. 9: 341-6 (2006)に記載のように、アグロバクテリウム・リゾゲネスを用いて、タバコを含む植物のトランスジェニック毛状根培養物を産生することができる。「タバコ毛状根」は、ゲノムに統合されているアグロバクテリウム・リゾゲネスのRiプラスミドからのT-DNAを有し、オーキシンおよび他の植物ホルモンの補充なしに培地で成長したタバコ根を意味する。タバコ毛状根は、タバコ植物全体の根が産生するようにニコチン性アルカロイドを産生する。
【０１２３】
さらに、植物はリゾビウム、シノリゾビウムまたはメソリゾビウム形質転換によって形質転換されてもよい（Broothaertsら著, Nature 433: 629-633 (2005））。
【０１２４】
植物細胞または植物の形質転換後、所望のＤＮＡが組み込まれている植物細胞または植物は、抗生物質耐性、除草剤耐性、アミノ酸類似体に対する耐性などの方法によって、または表現型マーカーを使用して選択することができる。
【０１２５】
植物細胞が遺伝子発現の変化を示すかどうかを決定するために様々なアッセイ、例えばノーザンブロッティングまたは定量的逆転写酵素PCR（RT-PCR）を使用することができる。トランスジェニック植物全体は、従来の方法によって形質転換細胞から再生することができる。このようなトランスジェニック植物は、ホモ接合系統を作出するために繁殖させそして自家受粉させることができる。そのような植物は、導入された形質についての遺伝子を含む種子を産生し、そして選択された表現型を産生する植物を産生するために成長させることができる。
【０１２６】
本技術に従ってもたらされる修飾アルカロイド含量は、病害抵抗性、病害虫抵抗性、高収量または他の形質などの他の興味ある形質と組み合わせることができる。例えば、アルカロイド含量を改変する適切な導入遺伝子を含む安定な遺伝子操作された形質転換体を用いて、改変アルカロイド含量形質を望ましい商業的に許容される遺伝的背景に移入し、それによって改変アルカロイドレベルを前記望ましい背景と組み合わせた品種または異種を得ることができる。例えば、還元ニコチンを有する遺伝子操作タバコ植物を用いて、還元ニコチン形質を、TMVに対する耐性、ブランクシャンク、または青いカビなどの耐病性形質を有するタバコ品種に遺伝子移入することができる。あるいは、本技術の改変アルカロイド含有植物の細胞を、目的の他の形質を付与する核酸構築物で形質転換することができる。
【０１２７】
本技術はまた、アルカロイド生合成を調節する転写因子をコードしている核酸配列を用いて細胞を遺伝子操作することを企図する（例えば、ＮｔＥＲＦ２４１）。
【０１２８】
さらに、アルカロイド生合成遺伝子を発現する細胞は、アルカロイド合成のための基質利用可能性を高めるための前駆体と共に供給され得る。細胞には、天然アルカロイドの類似体に組み込まれ得る前駆体の類似体を供給することができる。
【０１２９】
本技術による構築物は、アグロバクテリウム媒介形質転換、粒子衝撃、エレクトロポレーション、およびポリエチレングリコール融合、またはカチオン性脂質媒介トランスフェクションなどの適切な技術を用いて、任意の植物細胞に導入することができる。
【０１３０】
そのような細胞は、選択マーカーまたは可視マーカーを使用せずに本技術の核酸構築物を用いて遺伝子操作することができ、トランスジェニック生物は導入された構築物の存在を検出することによって同定することができる。特定の細胞中のタンパク質、ポリペプチド、または核酸分子の存在を測定して、例えば細胞がうまく形質転換またはトランスフェクトされたかどうかを判定することができる。例えば、そして当技術分野において日常的であるように、導入された構築物の存在は、ＰＣＲまたは特定の核酸またはポリペプチド配列を検出するための他の適切な方法によって検出することができる。さらに、遺伝子操作された細胞は、同様の条件下で培養される非形質転換細胞の増殖速度または形態学的特徴と比較した形質転換細胞の増殖速度または形態学的特徴の違いを認識することによって同定することができる。WO2004/076625を参照のこと。
【０１３１】
本技術はまた、本明細書に記載の核酸分子で形質転換され、ＮｔＥＲＦ２４１を発現している遺伝子操作された植物細胞を含むトランスジェニック植物細胞培養物を企図する。細胞はまた、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａ、またはＮｔＭＹＣ２ｂなどの少なくとも１つの追加の転写因子遺伝子、および／またはＡ６２２、ＮＢＢ１、ＱＰＴ、ＰＭＴまたはＭPOなどの少なくとも１つのニコチン生合成遺伝子を発現し得る。
【０１３２】
本技術はまた、本明細書に記載の核酸分子で形質転換され、ＮｔＥＲＦ２４１を発現している遺伝子操作された細胞を含む細胞培養系を企図する。ＰMＴを過剰発現しているトランスジェニック毛状根培養物は、薬学的に重要なトロパンアルカロイドであるスコポラミンの大規模商業産生のための有効な手段を提供することが示されている。Zhangら著, Proc. Nat'lAcad. Sci. USA 101: 6786-91 (2004)。したがって、ＮｔＥＲＦ２４１を過剰発現させることによってタバコ毛根培養において大規模または商業的量のニコチンアルカロイドを産生することができる。同様に、本技術は、ＮｔＥＲＦ２４１を発現させることによって大規模または商業的量のニコチン性アルカロイド、ニコチン類似体、またはニコチン前駆体を産生するための、細菌または昆虫細胞培養物などの細胞培養系を企図する。細胞はまた、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａまたはＮｔＭＹＣ２ｂなどの少なくとも１つの追加の転写因子遺伝子、および／またはＡ６２２、ＮＢＢ１、ＱＰＴ、ＰＭＴまたはMPOなどの少なくとも１つのニコチン生合成遺伝子を発現することができる。
【０１３３】
Ｄ．アルカロイド含量の定量
本技術のいくつかの実施形態では、遺伝子操作された植物および細胞はアルカロイド含量の減少を特徴としている。
【０１３４】
アルカロイドレベルの定量的減少は、例えば、気液クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ、および酵素免疫測定法に基づく定量化などのいくつかの方法によってアッセイすることができる。
【０１３５】
本技術の植物を記載する際に、「低下アルカロイド植物」または「減少アルカロイド植物」という表現は、アルカロイド含量が、同じ品種または種類の対照植物のアルカロイド含量の約５０％、約４０％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％または約１％未満まで減少した植物を包含する。
【０１３６】
本技術のいくつかの実施形態では、遺伝子操作された植物はアルカロイド含量の増加を特徴としている。同様に、遺伝子操作された細胞はアルカロイド産生の増加を特徴としている。
【０１３７】
本技術の植物を説明する際に、「増加アルカロイド植物」という表現は、同じ品種または種類の対照植物のアルカロイド含量に対して約10％、約25％、約30％、約40％、約50％、約７５％、約１００％、約１２５％、約１５０％、約１７５％、または約２００％を超えるアルカロイド含量の増加を示す遺伝子操作植物を包含する。
【０１３８】
うまく遺伝子操作された細胞はアルカロイド合成の増加を特徴とする。例えば、本技術の遺伝子操作された細胞は、対照細胞と比較してより多くのニコチンを産生し得る。
【０１３９】
ニコチン性アルカロイドレベルの定量的増加は、例えば、気液クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイ、および酵素免疫測定法に基づく定量化などのいくつかの方法によってアッセイすることができる。
【０１４０】
ＩＶ．生成物
アルカロイド生合成を調節すると予測されるＮｔＥＲＦ２４１転写因子をコードしているポリヌクレオチド配列は、変化したアルカロイドレベルを有する植物の産生に使用され得る。そのような植物は、アルカロイドが増加した植物の場合には病害虫抵抗性が増加する、アルカロイドが減少した植物の場合には毒性が減少しそして嗜好性が増加するなどの有用な性質を有することができる。
【０１４１】
本技術の植物は、植物の収穫部分に由来する生成物の産生において有用であり得る。例えば、アルカロイド減少タバコ植物は、禁煙のためのニコチン減少タバコの製造に有用であり得る。アルカロイドを増やしたタバコ植物は、危険性が修正されたタバコ生成物の産生に役立つかもしれない。
【０１４２】
さらに、本技術の植物および細胞は、治療薬、殺虫剤、または合成中間体として使用することができる、ニコチン類似体を含むアルカロイドまたはアルカロイド類似体の製造に有用であり得る。この目的のために、大規模または商業的量のアルカロイドおよび関連化合物は、限定はされないが毛状根培養物、懸濁培養物、カルス培養物および新芽培養物を含む遺伝子操作された植物、細胞または培養系から化合物を抽出することを含む、様々な方法によって製造することができる。
【実施例】
【０１４３】
以下の実施例は例示のためにのみ提供され、限定のためには提供されない。当業者は、本質的に同じまたは類似の結果を得るために変更または修正することができる様々な重要ではないパラメータを容易に認識するであろう。実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、決して本技術の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１４４】
転写因子ＮｔＥＲＦ２４１
全長ＮｔＥＲＦ２４１遺伝子（配列番号１）は1900bpの長さである。長さ７４１ｂｐであるＮｔＥＲＦ２４１のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、配列番号２に示され、配列番号３に示されるような２４６アミノ酸ポリペプチドをコードしていると予測される。この遺伝子がニコチン生合成に関与すると予測されていることはまだ報告されていない。
【０１４５】
ＮｔＥＲＦ２４１遺伝子は、ＮｔＥＲＦ３２（ＥＲＦ２またはＥＲＥＢＰ２としても知られている）の核酸およびアミノ酸配列を用いてＳｏｌＧｅｎｏｍｉｃｓデータベースを検索することによって発見された。ERFタバコ遺伝子のTOBFACデータベースに存在しない同定された遺伝子は、NtERF32と類似しているが同一ではない転写因子をコードしている。ＴＯＢＦＡＣデータベース中のＥＲＦ遺伝子のリストがＭＥＲＦ２４０で終わるので、新たに発見された遺伝子を本明細書ではＮｔＥＲＦ２４１と命名する。ＮｔＥＲＦ２４１の予測コード配列は、ＮｔＥＲＦ２４１遺伝子配列およびＮＣＢＩウェブサイトで入手可能な自動化された計算分析プログラムを使用することによって確立された。
【実施例２】
【０１４６】
ＮｔＥＲＦ２４１はニコチン生合成を正に制御する
この実施例は、植物および植物細胞培養においてニコチン生合成を正に制御するためのＮｔＥＲＦ２４１またはその生物学的に活性な断片の使用を実証する。
【０１４７】
（方法）
植物および細胞培養物。タバコ属タバカムの品種であるバーレイ２１植物は、Reichers, D.E.およびTimko著, M.P., Plant Mol. Biol. 41: 387-401 (1999)に記載のように成長させる。N.タバカム品種ブライトイエロー(BY-2)細胞懸濁培養物は、3%(w/v)スクロースおよび0.2mg/Lの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２．４−Ｄ）、ｐＨ５．８を含有するMurashige-Skoog(MS)培地中で成長させ、その少量を7日毎に新鮮なMS培地に移して、細胞が対数増殖期に維持されていることを確認した。ＭｅＪＡ処理のためには、細胞をオーキシン非含有培地に希釈し、振とうしながら２８℃で１日間増殖させた後、XuおよびTimko著, Plant Mol. Biol. 55: 743-761 (2004)に記載の方法に従って、50μMのＭｅＪＡで処理した。３週齢の植物を100μMのＭｅＪＡで処理しそして処理の２４時間後に集める。
【０１４８】
ベクター構築物。ＮｔＥＲＦ２４１を単独で、またはＮｔＭＹＣｌａ、ＮｔＭＹＣｌｂ、ＮｔＭＹＣ２ａおよび／またはＮｔＭＣＹ２ｂと組み合わせて過剰発現を分析するための発現ベクターは、Searsら著, Plant Mol. Biol. 84: 49-66 (2014)に記載の方法に従って調製する。ＲＮＡｉノックダウン研究のために、ＮｔＥＲＦ２４１−ＲＮＡｉベクターは、Searsらの文献(2014)に記載の方法に従って調製する。
【０１４９】
ＢＹ−２細胞のアグロバクテリウム形質転換。トランスジーン分析（例えば、過剰発現構築物、ＲＮＡｉノックダウン構築物）は、XuおよびTimko著, Plant Mol. Biol. 55: 743-761 (2004)およびZhangら著, Mol. Plant 5: 73-84 (2012）に記載のように、アグロバクテリウムツメファシエンスＬＢＡ４４０４を用いて形質転換されたＢＹ−２細胞において行われる。形質転換されたカルスを、50mg/Lカナマイシンまたは15mg/Lハイグロマイシン（ＲＮＡｉベクター用）および500mg/Lセファトキシムを含有するＭＳ寒天上で選択し、細胞懸濁液を上記のように増殖させる。
【０１５０】
遺伝子発現解析。全ＲＮＡを、Trizol試薬（Invitrogen）を用いて単離し、そしてThermoScript（商標）ＲＴ−ＰＣＲシステム（Invitrogen）を用いて製造業者のプロトコルに従って逆転写する。半定量的逆転写PCR（RT-PCR）アッセイは、96℃で1分間、94℃で30秒間の25サイクル、58℃で30秒間、72℃で90秒間、72℃で10分間の条件を用いる増幅ランにおいて遺伝子特異的プライマー対を用いて行われる。ＰＣＲ生成物を２％アガロースゲル上で分離する。
【０１５１】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）は、Zhangら(2012)の文献に記載のようにして、iQ(商標)SYBR(登録商標)グリーンスーパーミックス(Bio-Rad)を使用して行われる。
【０１５２】
ＢＹ−２細胞におけるアルカロイド分析。野生型またはトランスジェニックＢＹ−２細胞を増殖させ、そして上記のようにＭｅＪＡ処理に供する。処理後７２時間で、0.5gの細胞を真空濾過により集め、液体窒素中で凍結しそして凍結乾燥する。アルカロイドを乾燥試料から抽出し、Zhangらの文献(2012)に記載のようにして、Shimadzu GCMS 2010においてGCMSにより測定する。
【０１５３】
（結果）
ＮｔＥＲＦ２４１またはその生物学的に活性な断片を過剰発現するように遺伝子操作された植物および植物細胞培養物は、同様の条件下で生育した形質転換していない植物および植物細胞培養物と比較して増加したレベルのニコチンアルカロイドを産生するであろう。さらに、ＮｔＥＲＦ２４１と、ＮｔＭＹＣ１ａ、ＮｔＭＹＣ１ｂ、ＮｔＭＹＣ２ａおよびＮｔＭＹＣ２ｂのような少なくとも１つの追加の転写因子とを組み合わせた過剰発現が、ＮｔＥＲＦ２４１単独を過剰発現する植物または植物細胞培養物において観察されるものと比較して、この点において相乗効果を有すると予想される。
【０１５４】
（等価事項）
本技術は、本技術の個々の態様の単一の例示として意図されている、本出願に記載されている特定の実施形態に関して限定されるべきではない。当業者には明らかであるように、この本技術の多くの修正および変形がその精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書に列挙したものに加えて、本技術の範囲内の作動可能に等価な方法および装置は、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような修正形態および変形形態は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。本技術は、そのような特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲とともに、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。当然のことながら、この本技術は特定の方法、試薬、化合物組成物または生物学的システムに限定されず、もちろん変化し得る。本明細書で使用される用語は特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図するものではないこともまた理解されるべきである。
【０１５５】
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループに関して説明されている場合、当業者であれば、開示がマーカッシュグループの任意の個々の構成要素または構成要素のサブグループに関しても説明されていることを認識するであろう。
【０１５６】
当業者によって理解されるように、特に書面による説明を提供することに関して、ありとあらゆる目的のために、本明細書に開示されているすべての範囲はまた、ありとあらゆる可能な部分範囲およびそれらの部分範囲の組み合わせも包含する。列挙された範囲はいずれも、同じ範囲が少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１等に十分に説明され有効にされることを容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で論じられる各範囲は、下３分の１、中３分の１および上３分の１などに容易に分類することができる。当業者には理解されるように、「まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」などのようなすべての言語は、列挙された数字を含み、その後、上記のように下位範囲に分割することができる範囲を意味する。最後に、当業者には理解されるように、範囲は各個々の要素を含む。
したがって、例えば、１〜３個の細胞を有する群は、１個、２個、または３個の細胞を有する群を指す。同様に、１〜５個の細胞を有する群は、１、２、３、４個、または５個の細胞を有する群などを指す。
【０１５７】
本明細書で言及または引用したＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号を含むすべての特許、特許出願、仮出願および出版物は、それらが本明細書の明示的な教示と矛盾しない限り、すべての図および表を含めてその全体が参照により組み込まれる。
【０１５８】
他の実施形態が以下の請求の範囲内に含まれる。
【配列表】
2019526263000001.app
【国際調査報告】
2019526263.tif 000002
2019526263.tif 000003
2019526263.tif 000004