(57)【要約】  本発明は、化学発光測定による定量を用いて、チャレンジ誘発スーパーオキシドアニオン産生を示す白血球（主に好中球）の機能を決定することに基づいて、癌の再発を警告し、癌の進行を評価するための全血サンプルを検査する迅速で簡単な方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において、一定期間の処置後の癌の再発を含む腫瘍または他の癌の存在の指標として好中球機能レベルを評価する方法であって、
（ａ）前記対象から得た好中球を含む検査用サンプルと、好中球におけるスーパーオキシド産生を刺激することが可能な誘発物質を、そのような刺激に適切な条件下で接触させるステップ、
（ｂ）一定期間後、前記検査用サンプル中の基礎値を超えたスーパーオキシド産生の増加を決定して、第１の結果を得るステップ、および
（ｃ）前記第１の結果を第２の比較用結果と比較するステップ
を含み、これにより前記対象における、好中球機能に影響を及ぼすことが可能な腫瘍もしくは他の癌が存在すること、または腫瘍もしくは他の癌が存在しないことを決定する、方法。
【請求項２】
一定期間の癌処置後に、同じ対象に対してステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返すことをさらに含む請求項１に記載の方法であって、ステップ（ｃ）において、前記検査用サンプル中の基礎値を超えたスーパーオキシド産生の増加を第２の対照結果と比較し、これにより対照結果と比較した前記検査用サンプル中の誘発されたスーパーオキシド産生増加の減少が、好中球機能レベルに対する前記処置の抑制効果を示す、方法。
【請求項３】
癌の再発と関係した生理学的状態の変化の指標として、癌処置後の対象の好中球機能レベルを評価するための請求項１に記載の方法であって、前記検査用サンプル中の基礎値を超えたスーパーオキシド産生の増加を癌処置後のより早い時点でかつ前記対象の癌が寛解していると考えられる期間に採取した第２の比較用サンプル中の基礎値を超えたスーパーオキシド産生の増加と比較し、
前記第２の比較用サンプルと比較した前記検査用サンプル中の誘発されたスーパーオキシド産生の増加が癌再発の指標となる、方法。
【請求項４】
前記検査用サンプルが全血サンプルである、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記対象がヒトである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
疾患進行に基づいて癌患者をランク付けする方法であって、前記患者が処置後に寛解の可能性を含む特定の癌タイプの様々な進行度合いにあると予想される患者群であり、請求項１に記載の方法を前記患者由来のサンプルに適用することを含み、ステップ（ｃ）が、前記第１の結果を疾患進行を示す１つまたは複数の判断基準と相関させることにより各サンプルを１つのランクに割り当てることをさらに含む、方法。
【請求項７】
前記サンプルが全血サンプルである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１つまたは複数の判断基準が、１つまたは複数の腫瘍サイズ範囲、転移ありおよび転移なしから選択される、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記患者がヒト前立腺癌患者である、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
転移癌を有する癌患者を特定することができる、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
癌を有することが疑われるもしくは分かっている対象、または癌が寛解したことがあらかじめ分かっている対象の癌の状態を評価する方法であって、請求項１に記載の方法を前記対象に適用し、前記方法は
（ａ）前記対象から得た好中球を含む検査用サンプルと、好中球におけるスーパーオキシド産生を刺激することが可能な誘発物質を、そのような刺激に適切な条件下で接触させるステップ、
（ｂ）一定期間後、前記検査用サンプル中の基礎値を超えたスーパーオキシド産生の増加を決定して、第１の結果を得るステップ、および
（ｃ）前記第１の結果を、癌の状態に対応する１つまたは複数の判断基準と相関する予め定められた閾値である第２の比較用結果と比較して、それにより癌の状態を決定するステップ
を含む、方法。
【請求項１２】
前記検査用サンプルが全血サンプルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１つまたは複数の判断基準が、腫瘍サイズ範囲、転移ありおよび転移なしから選択される、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ヒトの前立腺癌状態を評価するための、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記癌状態が転移に進展しているまたは転移なしである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
好中球におけるスーパーオキシド産生を刺激することが可能な前記誘発物質が、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ  走化性ペプチド）、ザイモサン、リポ多糖またはアドレナリンである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
スーパーオキシド産生をルミノールまたはイソルミノールを用いて検出し、得られた化学発光を測定する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
好中球におけるスーパーオキシド産生を刺激することが可能な前記誘発物質がホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）であり、スーパーオキシド産生をルミノールを増幅剤として用いて検出し、得られた化学発光を測定する、請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
化学発光の定量的な検出のための光子検出器、および結果を解析して癌のリスクまたは癌の状態と関連付けられた好中球機能レベルに関して警告を発するためのシステムを備えた請求項１７または請求項１８に記載の方法を実施するのに適したシステム。
【請求項２０】
前記光子検出器が持ち運び可能なルミノメーターである、請求項１２に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体の癌の再発を予測し、癌の進行および処置をモニタリングするためのインビトロの方法に関する。より詳細には、インビトロでの活性化に応答して、チャレンジ性スーパーオキシドアニオン産生を示す、すなわち「呼吸バースト」を生じるという白血球（主に好中球）機能の決定に基づく方法を提供する。このような白血球の活性化は既知であり、多くの場合白血球対処能力（leucocyte coping capacity）（ＬＣＣ）と称されるが、本発明は、例えば、分画を必要することなく全血サンプルを用いて癌の状態を簡単にかつ迅速に評価するために使用できる、癌診断分野における新しい用途を提供する。本発明は、例えば、腫瘍サイズに基づいて前立腺癌患者を速やかにかつ便利にランク付けすることができ、転移のあるそのような患者を、転移がなく、腫瘍体積が比較的小さい患者と区別することができることが示されている。
【０００２】
このような方法は、癌処置の前に、または治療の有効性を評価するために一定期間の癌処置後に適用してもよい。この方法は、治療介入、例えば化学療法セッション間の時間間隔、薬物用量の変更または処置形態の変更を加減するための速やかかつ便利な指針を提供し得る。
【背景技術】
【０００３】
癌の進行をモニタリングするための現在の技術は、多くの場合、白血球総数（ＴＬＣ）または好中球絶対数（ＡＮＣ）などの総血球数を使用する。これらはそれぞれ、血液体積あたりの白血球数または好中球数を与えるものである。これらは特定の細胞の総数を与えるものであるが、医師に対してその細胞の機能に関しては何も示さない。さらに、これらの検査は病院、医療クリニックまたは医療従事者がいる他の医療の場で実施しなければならず、自己検査としては適さない。
【０００４】
化学療法は、好中球を産生する骨髄内で急速分裂細胞が破壊されることにより、循環好中球集団の減少（好中球減少症として知られる状態）を生じさせることが知られている。実際、好中球減少症は化学療法の主要な用量制限毒性であり、結果として相対用量強度（ＲＤＩ）が低くなるような投与延期および減量を引き起こす主な要因である（Lyman et al. (2003) J. Clin. Oncol. 21, 4524-4531.）。好中球減少症は、処置成績を落とし得るような化学療法の減量および投与延期だけでなく、生命に関わる感染症のリスクとも関連する（Crawford et al. (2004) Cancer 100, 228-237）。さらに研究者らは、治療をより効率的なものにし、かつ好中球減少症が原因の投与延期が少なくなるよう、早期乳癌患者のランク付け方法を改善する必要性を明確に確認している（Silber et al. (1998) Cancer, J. Clin. Oncol. 16, 2392-2400）。
【０００５】
驚くべきことに、ここで、簡単な全血検査を使用して、上述のような白血球によるチャレンジ誘発スーパーオキシド産生の決定に基づいて、処置の指針とするまたは癌の再発を見抜くための癌の状態の迅速で定量的に測定が得られることが判明した。このような検査プロトコルには、好中球機能を評価し、かつ望ましくない好中球減少症を警告するために、癌処置中にチャレンジなしで適用してもよいというさらなる利点がある。
【０００６】
ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）などの化学的誘発物質は末梢血サンプル中の好中球を活性化するものとして周知であり、これによりスーパーオキシド産生のために保持している能力を好中球機能の尺度として定量することができる（Hu et al. Cell Signal (1999) 11, 335-360）。化学発光によりスーパーオキシド産生を測定してＬＣＣスコアを得るというような全血サンプルの使用は、ヒトおよび動物の心理学的ストレスを定量するためにＯｘｆｏｒｄ  ＭｅｄｉＳｔｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄにより商業化された検査の基礎となるものである。欧州特許第１５５８９２９号明細書および公開された国際出願である国際公開第２００４／０４２３９５号パンフレットに由来する関連特許を参照のこと。しかし、本明細書で報告するデータは、同一タイプの血液検査が癌診断において全く異なる実用性をもつことに関する証拠を初めて提供するものである。特に興味深いのは、このような検査が前立腺癌患者由来の血液サンプルに適用でき、それによりＬＣＣスコアを疾患進行または持続的な寛解と関連付けることができると示されているということである。実施例２を参照のこと。このようなランク付けまたは層別化方法は、他の癌、特に例えば乳癌に対しても同様に適用できると考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記したように、本発明は、全血中の好中球、または好ましくは全白血球成分が、適切なインビトロの化学物質チャレンジに応答してスーパーオキシドを産生する能力を評価することによる。全血サンプルによるこのような定量された応答は、一般に白血球対処能力（ＬＣＣ）スコアと呼ばれる。しかし、これは主として好中球がこのような外部刺激に対して活性酸素種（ＲＯＳ）を産生するという能力により決定されるため、代わりに個体の好中球機能レベル（neutrophil functionality level）を参照してもよい。好中球機能レベルがより高い個体はより多くのスーパーオキシドを産生する可能性があることになり、生理学的に好中球機能がより高いということになる。
【０００８】
したがって、その最も広い態様では、本発明は、対象において、一定期間の処置後の癌の再発を含む腫瘍または他の癌の存在の指標として好中球機能レベルを評価する方法であって、
（ａ）前記対象から得た好中球を含む検査用サンプルと、好中球におけるスーパーオキシド産生を刺激することが可能な誘発物質を、そのような刺激に適切な条件下で接触させるステップ、
（ｂ）一定期間後、前記検査用サンプル中の基礎値を超えたスーパーオキシド産生の増加を決定して、第１の結果を得るステップ、および
（ｃ）前記第１の結果を第２の比較用結果と比較するステップ
を含み、これにより前記対象における、好中球機能に影響を及ぼすことが可能な腫瘍もしくは他の癌が存在すること、または腫瘍もしくは他の癌が存在しないことを決定する、方法を提供する。
【０００９】
一般に、短時間の誘発物質チャレンジの後に、例えばルミノールおよび持ち運び可能なルミノメーターを用いた従来の化学発光測定によりスーパーオキシド産生を決定する場合、サンプル中の基礎化学発光は常にきわめて少ないことになるので考慮する必要はない。したがって、このような状況では、測定された相対発光量（ＲＬＵ）の合計は誘発されたスーパーオキシド産生量と同等であり、好中球機能に直接正比例するとしてよい。例えば、全血サンプルのＬＣＣスコアリング用にＯｘｆｏｒｄ  ＭｅｄｉＳｔｒｅｓｓにより供給される凍結乾燥したＰＭＡ／ルミノールを使用し、その試薬を使用するための標準的なプロトコルに従ってサンプルを３７．５℃で１０分間インキュベートする場合の適用が確立されている。換言すれば、検査用サンプル中の「基礎値を超えたスーパーオキシド産生の増加を定量すること」は、好中球刺激期間、例えば誘発物質添加後１０〜３０分間の最後に存在するスーパーオキシドを簡単に１ステップで定量することと同等であるとしてよい。
【００１０】
腫瘍または他の癌の存在を判断することを、好ましくは、サイズおよび／または転移を含む進行度合いに関する１つもしくは複数の他の臨床的な指標の点から、腫瘍または他の癌のランク付けまたは状態を決定することに拡張してもよい。したがって、第２の比較用結果は、既知のタイプの癌患者由来のサンプルに関する特定の癌層別化状態、例えばサイズまたは転移、と同一であると理解される予め定められた閾値であってよい。
【００１１】
理論に束縛されるものではないが、方法の有効性は免疫活性部位としてふるまう癌に関連させてもよい。
【００１２】
第２の比較用結果は、理想的にはサンプル提供前にリラックスした状態にある、健康であると分かっている同種の様々な対象、例えば健康なヒト由来の対照サンプル中にて誘発されたスーパーオキシド産生に相当するものでよいということが認識されるであろう。それは一定期間の癌処置後に、寛解したと分かっている同じ個体から採取したサンプルであってよい。本発明の目的のために個体から採取するサンプルは、検査用サンプルと任意の比較用サンプルとの間の精神的ストレスの差による影響が最小となるように採取することになる。
【００１３】
本発明の一実施形態では、上記のような本発明の方法を、特定の癌タイプの処置後の寛解の可能性を含む様々な進行度合いにあると予想される患者由来の複数のサンプルに適用してもよく、かつ疾患進行を示すような１つまたは複数の判断基準、例えば予測される転移ありおよび転移なしと相関させることにより各サンプルを１つのランクに割り当てるために使用される誘発されたスーパーオキシド産生の定量結果、好ましくはＬＣＣスコアの比較に適用してもよい。前立腺癌患者由来の複数のサンプルを使用したこのような層別化方法は、実施例２により例示されている。このような層別化により、第２の比較用結果として使用することが可能な予め定められた閾値が得られることになり、その結果、本発明の方法を同じ癌に罹患していると疑われるまたは分かっている患者由来の後続のサンプルに適用し、癌状態を判断するまたは効果的な処置後のこのような癌の再発を確認することになる。
【００１４】
本発明の方法に用いられるサンプルは好ましくは全血サンプルということになり、この場合、上記したように、より一般に、スーパーオキシド産生量が白血球のスーパーオキシド産生能力（または代わりに、呼吸バーストを引き起こす上記の能力）と厳密に等しいことになる。このような方法では、細胞の反応性に影響を及ぼすことが知られている遠心分離を避け、かつ同じく機能に影響を及ぼす可能性のあるスライドガラスへの細胞のプレートアウトもまた避けることが重要である。従来の指用ランシングデバイスを使用して得られる約１０〜３０μｌほどの少量の血液サンプルで十分ということになる。
【００１５】
すでに上述のように、スーパーオキシド産生は、例えばルミノールまたはイソ−ルミノールを使用した既知の簡単な化学発光測定により簡便に測定し得る。好適なプロトコルは、例えばＯｘｆｏｒｄ  ＭｅｄｉＳｔｒｅｓｓの欧州特許第１５５８９２９号明細書に開示されている。一般にインキュベーション温度には３７〜３７．５℃を選択することになり、所定の時間、好ましくは化学発光測定値が最大またはほぼ最大と一致する時間、継続してインキュベートする。上述のように、ＬＣＣ検査のためにＯｘｆｏｒｄ  ＭｅｄｉＳｔｒｅｓｓにより供給されるＰＭＡおよびルミノール塩を含む凍結乾燥した組成物により、指先穿刺した全血から、わずか１０分間で好適な検査結果を得ることが可能となる。この組成物は実施例２にて報告する検査にて、好ましい試薬として使用した。
【００１６】
化学発光の検出には従来のルミノメーターを使用してもよいが、このような光検出器には高価かつ脆い光電子増倍管が必要となる。ゆえに、他の光子検出器の使用が好ましい場合がある。特に、例えばシリコン光電子増倍管（Ｓｉ−ＰＭ）が好まれる場合がある。このような光子検出器は目的のためにより頑丈であり、より良い費用効率と十分な光子検出感度とが組み合わさったものであると考えられる。好適な手持ち式のルミノメーターはまた、ＣｏｐｉｎｇＣａｐａｃｉｔｙ（商標）検査キットの一部としてやはりＯｘｆｏｒｄ  ＭｅｄｉＳｔｒｅｓｓから入手可能であり、この検査キットでは上記のような凍結乾燥したＰＭＡ／ルミノール含有の試薬組成物もまた提供される。
【００１７】
必要または所望であれば、各サンプルについて測定した基礎値を超えたスーパーオキシド産生量を、サンプル中の白血球または好中球数を参考に修正してもよい。上記したように、好中球は基礎値を超えたスーパーオキシド産生の大部分を担うと予測できるため、白血球のインビトロで誘導された誘発に対する基礎値を超えた余剰の産生能力は「好中球機能レベル」と称することができ、以下ではそのように呼ぶ。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＬＣＣスコアを使用した、最大コア腫瘍長（ＭＣＣＬ）および転移の有無に関する前立腺癌患者の層別化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の方法は、ヒト癌患者の癌の進行をモニタリングするという点で、またはこのような患者の処置後に癌再発の指標を提供するという点で特に興味深いが、獣医学分野、特に他の哺乳動物に関する癌処置に対する適用があることもまた理解されよう。
【００２０】
上記のように、対象において腫瘍または他の癌の存在を評価するための本発明の方法は、処置中の癌患者の好中球機能レベルに対する癌処置の影響を評価するために同様に適用し得るステップを含む。
（ｉ）患者から得た好中球を含む検査用サンプル、好ましくは全血サンプルと、好中球におけるスーパーオキシド産生を刺激することが可能な誘発物質を、そのような刺激に適切な条件下で接触させるステップ、
（ｉｉ）一定期間後、前記検査用サンプル中の基礎値を超えたスーパーオキシド産生の増加を決定して、第１の結果を得るステップ、および
（ｉｉｉ）前記第１の結果を第２の対照結果と比較するステップ
これにより、対照結果と比較した前記検査用サンプル中にて誘発されたスーパーオキシド産生増加の減少が好中球機能レベルに対する処置の抑制効果を示す。
【００２１】
対照結果は、前記処置に先だってまたは前記処置中に、より早い時点で同一患者から採取したサンプルに由来するものであってもよいということが理解されよう。
【００２２】
ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）を繰り返してもよく、その結果、これは患者の生理学的状態に対する癌処置の効果を長期にわたって（「長期」）モニタリングする際のきわめて便利な手段となる。このような方法は、例えば癌処置として化学療法および／または放射線療法を適用する際に臨床医による意思決定を手助けするための、例えば単に細胞を数えるまたは構造を調べる代わりに臨床的に関連のある細胞機能に基づくことになる化学療法および／または放射線療法セッション間の時間間隔を決定するための、便利な手段であると予想される。
【００２３】
したがって、重要なのは、本発明ではキット構成要素の単一の組み合わせを、癌診断およびランク付け両方のために、ならびに同一患者の好中球機能が癌処置中に望まずして低下するのをモニタリングするために、提供することが可能となることである。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、本発明は癌の再発と関係した生理学的状態の変化の指標として、癌処置後の対象の好中球機能レベルを評価する方法であって、
（ａ）前記対象から得た好中球を含む検査用サンプル、好ましくは全血サンプルと、好中球におけるスーパーオキシド産生を刺激することが可能な誘発物質を、そのような刺激に適切な条件下で接触させるステップ、
（ｂ）一定期間後、前記検査用サンプル中の基礎値を超えたスーパーオキシド産生の増加を決定するステップ、および
（ｃ）前記検査用サンプル中の基礎値を超えたスーパーオキシド産生の増加を第２の比較用サンプル中の基礎値を超えたスーパーオキシド産生の増加と同一時点および同一条件下で比較するステップであって、前記第２の比較用サンプルが癌処置後のより早い時点でかつ対象の癌が寛解していると考えられる期間に採取したサンプルである、ステップ
を含み、ここで、前記第２の比較用サンプルと比較した前記検査用サンプル中の誘発されたスーパーオキシド産生の増加が癌再発の指標となる、方法を提供する。
【００２５】
したがって、本発明の方法により、癌の管理および処置に関して以下の全てが可能となると予想できる。
１．癌の攻撃性および再発の予測因子としての白血球検査。
２．治療の有効性の客観的マーカーとしての白血球検査。
３．治療のエンドポイントとしての白血球検査の使用。
４．（単に細胞を数えるまたは構造を調べる代わりに）細胞機能を最適化し、治療介入（例えば、化学療法セッション間および放射線療法セッション間の時間間隔）のバランスをとり加減するための白血球検査。
５．治療中の制御されたチェックポイントとしての白血球検査。
６．癌治療中のミクロ環境のセンサーとしての白血球検査。
７．癌罹患中の治療介入を最適化するための白血球検査。
【００２６】
ここで注目したい他の可能な使用およびいくつかの可能な利益は、以下の通りである。
・癌の早期発見に使用可能である。
・至適奏効を判断するための家庭でのモニターとして使用可能である
・ライフスタイル（食べ物、運動、リラクセーション法）を調整して、最適な応答（個人に合わせた最適な結果）を決定することが可能である。
・癌のオーダーメイド処置（個別化医療）の助けとすることが可能である。例えば、限定するわけではないが、別の治療を用いた従来の医療の最適化である。
・別の医学的アプローチを組み合わせる（例えば従来のアプローチと食事療法）ために使用可能である。
・癌のホリスティック処置（ライフスタイル、従来のまたは別の養生法）を組み合わせ、最適化することが可能である。
・家庭でのモニタリングを定期的に実施して、処置の有効性をモニターし、最適化し、かつ追跡することが可能である。
・寛解後の再発を早期警告するものとして機能することが可能である。
・簡単で、使用しやすい。１０分で結果を得ることができ、低侵襲性である。
・プロトコル用の装置は実験室ベースではなく持ち運び可能であり、そのため費用を最小限にできる。
・臨床的に関連のある好中球機能の客観的な評価に基づいて、処置（従来の、代わりの、ライフスタイル）の統合を可能にするための最初の技術である。
・真に個別化した客観的な癌治療を容易なものとする。
【００２７】
本発明の方法は、乳癌、卵巣癌および他の癌タイプなどの種々の癌に広く適用可能であると予想される。このような方法を、例えば前立腺癌に関して特別に適用することを見出してもよい。
【００２８】
上記のように、使用の利便性と特に関係があるのは、分離された白血球または好中球分画を得るために血液サンプルを分画する必要がないということである。本発明の方法を実施するための血液サンプルは、好中球におけるスーパーオキシド産生を刺激することができる任意の化学的誘発物質と直接接触させてもよい。誘発物質は、好ましくはホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）であってよく、より好ましくは、例えばＳｉｇｍａから入手可能な微生物産物であるホルボール１２−ミリステート１３−アセテートであってもよい。しかし、用いてもよい代替的な誘発物質は周知である。これらには、Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆＭＬＰ  走化性ペプチド）、ザイモサン、リポ多糖またはアドレナリンが含まれる。化学的誘発物質は、適切な緩衝溶液、例えばリン酸塩緩衝生理食塩水に溶解させるため、凍結乾燥した試薬組成物、例えばペレットの形態で便利に貯蔵することができる。
【００２９】
上記に示したように、高感度と合わせた追加の利便性のため、スーパーオキシド産生量は、ルミノールまたはイソ−ルミノールなどの好適な増幅剤を使用した化学発光シグナル測定と関連付けられることになる（欧州特許第１５５８９２９号明細書、およびHu et al. (1999) Cell Signal 11, 355-360を参照）。ルミノールまたはイソ−ルミノールは、上記のＰＭＡおよびルミノールを含む市販の凍結乾燥した組成物により例示されるようなサンプルに追加する場合、単一の試薬組成物中の化学的誘発物質にうまく供給し得る。各サンプルについて、追加した誘発物質の存在下での化学発光は、従来の持ち運び可能なルミノメーターを使用して、好適な時点で測定してもよい。しかし上記に示したように、代わりのより高性能な光子検出器、例えば、特にシリコン光電子増倍管の使用が好ましい場合がある。
【００３０】
本発明のさらに別の態様では、持ち運び可能なルミノメーターまたはＳｉ−ＰＭなどの光検出器、および結果を解析して癌のリスクまたは癌の状態、例えば転移癌と関連付けられた好中球機能レベルに関して警告を発するためのシステムを備えた上述のような方法を実施するためのシステムを提供する。同一のシステムは、上述のように癌処置をモニタリングし、癌処置の変更または中止が望ましいことを支持するような好中球機能の低下に対してさらに警告を発する際にも用いてもよい。
【００３１】
上記のように癌の存在を検出するための上述したような本発明の方法のステップ（ａ）〜（ｃ）を、特定の癌タイプの、場合により処置後の寛解を含む種々の進行度合いの患者由来の複数のサンプルに適用する場合、疾患進行を示すような１つまたは複数の判断基準と相関させることにより各癌患者のランク付けに使用することができる結果が得られるようになるということが示されている。例えば、このような判断基準は１つまたは複数の腫瘍サイズ範囲、例えば最大コア腫瘍長（ＭＣＣＬ）の範囲、転移ありおよび転移なしであってよい。このようにして、癌を層別化して疾患重症度を評価するためにＬＣＣスコアを使用することができる。例えば、このような分析を前立腺癌患者由来の全血サンプルに適用することにより、転移性前立腺癌患者由来のサンプルのＬＣＣスコアは、寛解患者またはＭＣＣＬ４ｍｍ未満に相当する低グレードの非転移性前立腺癌患者由来の全血サンプルよりも著しく高いということが明らかになった。このような癌状態のランク付けは、他の腫瘍タイプ、例えば乳癌に同様に適用可能であり、かつＬＣＣスコアの閾値決定を腫瘍の進行または再発を判断する際に使用することを可能とするものであると予測することができる。
【００３２】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、腫瘍があると疑われるもしくは分かっている対象、または腫瘍が寛解したことがあらかじめ分かっている対象の癌の状態を評価する方法であって、
（ａ）前記対象から得た好中球を含む検査用サンプル、好ましくは全血サンプルと、好中球におけるスーパーオキシド産生を刺激することが可能な誘発物質を、そのような刺激に適切な条件下で接触させるステップ、
（ｂ）一定期間後、前記検査用サンプル中の基礎値を超えたスーパーオキシド産生の増加を決定して、第１の結果を得るステップ、および
（ｃ）前記第１の結果を、癌の状態に対応する１つまたは複数の判断基準、例えばサイズ範囲および／または転移と関連した予め定められた閾値である第２の比較用結果と比較して、それにより癌の状態を決定するステップ
を含む、方法を提供する。
【００３３】
癌の状態は、腫瘍なし、例えば持続的な寛解として評価してもよい。これは、腫瘍の進行度合い、例えば転移への進行を定義するような１つまたは複数の判断基準に従う腫瘍の存在と同じと考えてよい。このような方法は、前立腺または乳癌腫瘍などの腫瘍が転移に発展しているかどうかを迅速に評価する際に特に好ましい場合がある。
【００３４】
以下の非限定的実施例にて、本発明を説明する。
【実施例】
【００３５】
[実施例１]
全血サンプル中の好中球機能レベルを評価するためのＰＭＡチャレンジを使用するプロトコル例
バックグラウンドの血液の化学発光レベルを測定するため、全血１０μｌをシリコンの反射防止チューブ（anti-reflective tube）に移す。リン酸緩衝液で希釈した１０−４Ｍのルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロファラジン（dihydrophalazine）、Ｓｉｇｍａ）９０μｌを加える。その後、チューブを穏やかに振盪する。ＰＭＡチャレンジに応答して発生する化学発光を測定するため、１０−３Ｍの濃度のＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ）２０μｌを加える。各チューブについて、ルミノメーター内で５分毎に３０秒間、合計３０分間化学発光を測定してもよい。ルミノメーター内に入れていないときには、チューブを３７．５℃で、例えばドライブロックヒーター内でインキュベートする。
【００３６】
３７．５℃で１０分間インキュベートした後に１回測定することが、便利かつより好ましいことが判明する場合もある。
【００３７】
任意の十分に高感度な光子検出器を用いて同様のチャレンジ検査を実施してもよいということが理解されよう。例えば、Ｓｉ−ＰＭを用いてよい。
【００３８】
[実施例２]
ＬＣＣスコアを使用した前立腺癌患者の層別化
試験は地域の倫理委員会により承認され、ロンドンにあるＮＨＳ管轄の実習病院にて実施した。前立腺の根治放射線治療後、救済治療前に生化学的再発がみられた７０人の男性を試験に採用した。試験に同意後、かつ全身のマルチパラメトリックＭＲＩ（ＷＢ−ＭＲＩ）を実施する前に、指先穿刺による血液サンプル（１０マイクロリットル）を各患者から３度ずつ得、ＬＣＣスコアリング用にＯｘｆｏｒｄ  ＭｅｄｉＳｔｒｅｓｓから市販されている凍結乾燥したＰＭＡ／ルミノール試薬組成物を用いて好中球機能レベルを分析した。これには、血液と凍結乾燥したＰＭＡ／ルミノール混合物を含有する試薬の緩衝溶液（１００マイクロリットル）との混合を必要とした。ドライブロックヒーター内にて３７．５℃で１０分間インキュベート後、持ち運び可能なルミノメーター（３Ｍ  Ｃｌｅａｎ  Ｔｒａｃｅ（商標））を用いて測定した活性酸素種の産生に関してサンプルを評価した。各検査対象から、１セットのサンプル（３つ）を得た。
【００３９】
検査対象を、疾患重症度（「疾患の重大性」）に従って種々のカテゴリーにグループ分けすることにより検査結果を分析した。カテゴリーは以下の通りであった。
−  転移なし、再発の可能性は低い
−  転移なし、最大コア腫瘍長（ＭＣＣＬ）＜４ｍｍ
−  ＭＣＣＬが４ｍｍ〜１０ｍｍの間
−  ＭＣＣＬ＞１０ｍｍ
−  転移あり
【００４０】
これらのカテゴリーの各患者の好中球機能レベルのスコアを平均（平均）し、これらの平均値を図１に示すように棒グラフにプロットした。
【００４１】
結果
−  データは、ＬＣＣスコアと疾患重症度の増加との間の強い相関関係を示す。
−  ＬＣＣスコア＞４５０の患者１８人中１７人が、ＭＣＣＬ＞４または転移ありと同等の重大な疾患に罹患していた。
−  転移のある患者由来のサンプルと、癌なしまたは低グレードの癌の患者群（転移なし／再発なしもしくはＭＣＣＬ＜４）由来のサンプルとの間に、統計的に有意な差（ｔ検定により）が示された。
【００４２】
これらの結果は、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｅｄｉＳｔｒｅｓｓシステムを用いて測定されるＬＣＣスコアにより評価される好中球機能レベルを進行状態の判断基準に関連する腫瘍の層別化に使用することができるということを初めて示すものであり、かつ、例えば転移の可能性がある進行した前立腺癌を、癌なしまたは低グレードの癌から迅速に識別する手段としてＬＣＣスコアを使用することは特に興味深いということを示すものである。
【図１】
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【国際調査報告】
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