(57)【要約】本発明は、一般式（Ｉ）：（Ｉ）、式中：Ｒ１およびＲ２は、一緒に二重結合を形成し、またはＲ１およびＲ２は、一緒にシクロプロピル基を形成し；Ｒ３、Ｒ４は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択され、またはＲ３およびＲ４は、一緒に二重結合を形成し；Ｒ５、Ｒ６は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択され；またはＲ５およびＲ６は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ５およびＲ６は、一緒に二重結合を形成し、またはＲ５およびＲ６は、一緒にシクロプロピル基を形成し；Ｒ７＝メチルまたはエチルであり；Ｒ８＝水素またはメチルである、で表される化合物の、ヒト頭皮における育毛を促進し、かつ／または脱毛を抑制もしくは遅延させるための使用、ならびにかかる使用に適した化粧品および医薬組成物に関する。【選択図】  図１
2019519502.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
【化１】
2019519502.tif 000015
式中：
Ｒ１およびＲ２は、一緒に二重結合を形成し、またはＲ１およびＲ２は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ３、Ｒ４は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択され、またはＲ３およびＲ４は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ５、Ｒ６は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択され；またはＲ５およびＲ６は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ５およびＲ６は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ７＝メチルまたはエチルであり；
Ｒ８＝水素またはメチルである、
で表される化合物の、
ヒト頭皮における育毛を促進し、かつ／または脱毛を抑制もしくは遅延させるための、化粧品的使用。
【請求項２】
前記式（Ｉ）で表される化合物が３−メチル−５−（２，２，３−トリメチルシクロペンタ−３−エン−１−イル）ペンタン−２−オールであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記式（Ｉ）で表される化合物が（４Ｚ）−３−メチル−５−（２，２，３−トリメチルシクロペンタ−３−エン−１−イル）ペンタ−４−エン−２−オールであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記式（Ｉ）で表される化合物が１−メチル−２−（（１，２，２−トリメチルビシクロ（３．１．０）ヘキサ−３−イル）メチル）−シクロプロパンメタノールであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記式（Ｉ）で表される化合物が（Ｅ）−３，３−ジメチル−５−（２，２，３−トリメチルシクロペンタ−３−エン−１−イル）ペンタ−４−エン−２−オールであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記式（Ｉ）で表される化合物が２−メチル−４−（２，２，３−トリメチル−３−シクロペンテン−１−イル）ブタノールであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記式（Ｉ）で表される化合物が（Ｅ）−２−エチル−４−（２，２，３−トリメチルシクロペンタ−３−エン−１−イル）ブタ−２−エン−１−オールであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記式（Ｉ）で表される化合物が（Ｅ）−２−メチル−４−（２，２，３−トリメチル−３−シクロペンテン−１−イル）−２−ブテン−１−オールであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
請求項１に記載の使用のための化粧品組成物であって、それが活性成分として少なくとも式（Ｉ）：
【化２】
2019519502.tif 000016
式中、
Ｒ１およびＲ２は、一緒に二重結合を形成し、またはＲ１およびＲ２は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ３、Ｒ４は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択され、またはＲ３およびＲ４は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ５、Ｒ６は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択され；またはＲ５およびＲ６は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ５およびＲ６は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ７＝メチルまたはエチルであり；
Ｒ８＝水素またはメチルである、
で表される化合物を含むことを特徴とする、前記化粧品組成物。
【請求項１０】
活性成分として、少なくとも式（Ｉ）で表される化合物を０．１〜１０重量％（ｗ／ｗ％）の量において含み、局所的投与に適した成分と共に処方されていることを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
ヒト頭皮における育毛を促進し、かつ／または脱毛を処置するにあたっての治療的使用のための、一般式（Ｉ）：
【化３】
2019519502.tif 000017
式中：
Ｒ１およびＲ２は、一緒に二重結合を形成し、またはＲ１およびＲ２は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ３、Ｒ４は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択され、またはＲ３およびＲ４は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ５、Ｒ６は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択され；またはＲ５およびＲ６は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ５およびＲ６は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ７＝メチルまたはエチルであり；
Ｒ８＝水素またはメチルである、
で表される化合物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の化合物を活性成分として含む、医薬組成物。
【請求項１３】
活性成分として、少なくとも式（Ｉ）で表される化合物を０．１〜１０重量％（ｗ／ｗ％）の量において含み、局所的投与に適した成分と共に処方されていることを特徴とする、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
活性成分として、化合物３−メチル−５−（２，２，３−トリメチルシクロペンタ−３−エン−１−イル）ペンタン−２−オールを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
活性成分として、化合物２−メチル−４−（２，２，３−トリメチル−３−シクロペンテン−１−イル）ブタノールを含むことを特徴とする、請求項１２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトにおける毛髪成長を促進し、かつ／または脱毛を阻害もしくは遅延させるための化合物の使用、ならびに活性成分としてのかかる化合物を含むかかる使用のための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
白檀材の用語は、サンタラム属の樹木からの木材のクラスを指す。白檀材のエッセンシャルオイルは、通常成熟した白檀材の樹木からの木材の水蒸気蒸留によって抽出され、香料としての周知の貴重な成分である。
【０００３】
その貴重な香りに主に関連する化粧品分野における多くの種々の用途の中で、白檀材油はまた、多くの種々の用途のための薬用の、および経験的な製造に関する特許公報の主題であり、脱毛およびフケの一般的処置を含み、例えば実際に漢方薬として定義される医薬抽出物を記載する特許公報特許文献１であり、マグノリアの花芽、ローズフラワー、リコリスルート、ピーニーバークパウダー、ケンフェリア、ライラック、ハーバアサリ、ジンセンおよびアンジェリカダウリカの根と混合された白檀材を含む。
【０００４】
特許文献２および特許文献３には、同様の漢方薬が記載されており、前者は、白檀材、アンジェリカルート、根茎ケンフェリエ種子、タルク、カミメボウキ、天然インジゴおよびスパイクナルドの混合物製であり、後者は、白檀材、フリースフラワー根、松葉およびタンジンの混合物製であり、毛髪に適用するべきものである。
【０００５】
実質的に同様の一般的用途のために、特許文献４には、ヤシ油、ユーカリ油、丁子油、ラベンダー油およびローズマリー油と混合したビャクダン油を含む、毛髪落ちを防止するための組成物が記載されている。
【０００６】
かかる経験的調製物について、最終的な油に混合される各成分の特定の役割は、かかる刊行物において定義されておらず、したがって混合物中の成分ビャクダン油のいずれの特定の機能も、香料としても、またはおそらくそれ以外としても、決定されていない。
【０００７】
いずれの場合においても、白檀材油の主成分は、α−サンタロール（ｓａｎｔａｌｏｌ）およびβ−サンタロールであり、それは、基本的にセスキテルペンタイプの鎖を示すアルコールである。α−サンタロールの構造式は、以下の通りであり：
【化１】
2019519502.tif 000003
一方、β−サンタロールは、以下であり：
【化２】
2019519502.tif 000004
それぞれ末端のトリシクロヘプタ−３−イルまたはビシクロヘプタ−２−イル基によって特徴づけられる。
【０００８】
他方、サンダロア（ｓａｎｄａｌｏｒｅ）として知られている化合物は、白檀材に類似した芳香を有する合成の匂い物質であり、結果として香料、皮膚軟化剤および皮膚洗浄剤において、サンダロウッドの香りを模倣する、より高価でない成分として使用される。サンダロア、およびブラマノール（ｂｒａｈｍａｎｏｌ）と称される構造的に類似した化合物は、天然のビャクダン油の前記成分、すなわちα−サンタロールおよびβ−サンタロールとは全く別個の化学構造を有するアルコールである。
【０００９】
実際、次式：
【化３】
2019519502.tif 000005
を有するサンダロア、すなわちサンダルペンタノール（ｓａｎｄａｌ  ｐｅｎｔａｎｏｌ）および次式：
【化４】
2019519502.tif 000006
を有するブラマノール、すなわちサンダルシクロペンタン（ｓａｎｄａｌ  ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｅ）は、共に末端のシクロペンテン−１−イル基によって特徴づけられる合成分子であり、セスキテルペン鎖を有さない。それらはまた、化粧品配合物、例えばシャンプーおよびヘアコンディショナー中の毛髪の処置に関する特許公報の主題であるが、しかしながら、実際には貴重な白檀材の香りを模倣するそれらの特性を使用する特定の目的のために芳香剤として使用されるに過ぎない。例えば、特許文献５には、脱臭効果を改善するための脱臭剤組成物が記載されており、ここで、幅広い数の物質および幅広い数の用途の中で、サンダロアおよびブラマノールの使用はまた、ヘアケア製品、例えばシャンプー、コンディショナー、ヘアリンス、毛髪着色剤、パーマネントウェーブ剤、ワックス、ヘアスプレーおよびムース中の脱臭芳香剤として記載されている。特許文献５において芳香剤として使用するべき天然起源の芳香剤物質は、ビャクダン油を含み、サンダロアおよびブラマノールは、上記物質の商品名として定義され、したがって、この文献によれば、天然抽出物によって提供される芳香剤とその合成代替物との間に区別はないことを意味する。
【００１０】
特許文献６は、同様の範囲を有する毛髪の色のための脱臭剤組成物に関する。かかる文献には、脱毛の処置のための、または育毛を促進するためのかかる合成匂い物質の記載は、一般的にさえもない。
【００１１】
非特許文献１によると、サンダロアおよびブラマノールは、皮膚性嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４のアゴニストとして同定され、培養したヒトケラチノサイトにおいてＣａ２＋シグナルを誘発すると見出された。サンダロアでのケラチノサイトの長期刺激によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ創傷スクラッチアッセイにおいてケラチノサイト単層の細胞増殖、移動および再生に正の影響が及ぼされ、サンダロア刺激によって、ヒト皮膚器官培養における表皮創傷治癒が増強される。
【００１２】
Ｂｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．によると、天然のビャクダン油および他の合成の白檀材匂い物質は、嗅覚受容体ＯＲ２ＡＴ４のアゴニストではなく、同一の表皮創傷治癒効果を示さないという証拠が、記載されている。
【００１３】
嗅覚受容体（ＯＲ）発現は、鼻腔上皮に限定されず、また異なるヒト組織中に存在する。非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４を参照。多くの研究には、様々なヒト細胞タイプ（非特許文献５）、例えば精子（非特許文献６；非特許文献７）、前立腺上皮細胞（非特許文献８）、腸の腸クロム親和性細胞（非特許文献９）におけるＯＲの生理学的役割について記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＣＮ１０７５２５０Ａ
【特許文献２】ＣＮ１０２０００２９３
【特許文献３】ＣＮ１０３７３５４４３
【特許文献４】インド特許公報ＩＮ００１７７ＭＵ２００２Ａ
【特許文献５】欧州特許第１５６１４７６号
【特許文献６】欧州特許第１３４６７２０号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｂｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｓａｎｄａｌｗｏｏｄ  Ｏｄｏｒａｎｔ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｗｏｕｎｄ−Ｈｅａｌｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＯＲ２ＡＴ４，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１４，１３４：２８２３−２８３２
【非特許文献２】Ｆｅｌｄｍｅｓｓｅｒ  Ｅ，Ｏｌｅｎｄｅｒ  Ｔ，Ｋｈｅｎ  Ｍ，Ｙａｎａｉ  Ｉ，Ｏｐｈｉｒ  Ｒ，Ｌａｎｃｅｔ  Ｄ．，Ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｅｃｔｏｐｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２００６年５月２２日；７：１２１
【非特許文献３】Ｚｈａｎｇ  Ｘ，Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ  Ｓ．，Ｎｏｓｅ  ｔｈｙｓｅｌｆ：ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｇｅｎｏｍｅ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００７；８（１１）：２３０
【非特許文献４】Ｆｌｅｇｅｌ  Ｃ，Ｍａｎｔｅｎｉｏｔｉｓ  Ｓ，Ｏｓｔｈｏｌｄ  Ｓ，Ｈａｔｔ  Ｈ，Ｇｉｓｓｅｌｍａｎｎ  Ｇ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｅｃｔｏｐｉｃ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂｙ  ｄｅｅｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３；８（２）：５５３６８
【非特許文献５】Ｋａｎｇ  Ｎ，Ｋｏｏ  Ｊ．Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｙ  ｔｉｓｓｕｅｓ．ＢＭＢ  Ｒｅｐ．２０１２年１１月；４５（１１）：６１２−２２
【非特許文献６】Ｓｐｅｈｒ  Ｍ，Ｇｉｓｓｅｌｍａｎｎ  Ｇ，Ｐｏｐｌａｗｓｋｉ  Ａ，Ｒｉｆｆｅｌｌ  ＪＡ，Ｗｅｔｚｅｌ  ＣＨ，Ｚｉｍｍｅｒ  ＲＫ，Ｈａｔｔ  Ｈ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ  ｏｄｏｒａｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍ  ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００３年３月２８日；２９９（５６１５）：２０５４−８
【非特許文献７】Ｖｅｉｔｉｎｇｅｒ  Ｔ，Ｒｉｆｆｅｌｌ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｏｒｙ  Ｃａ２＋  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１１年５月１３日；２８６（１９）：１７３１１−２５
【非特許文献８】Ｎｅｕｈａｕｓ  ＥＭ，Ｚｈａｎｇ  Ｗ，Ｇｅｌｉｓ  Ｌ，Ｄｅｎｇ  Ｙ，Ｎｏｌｄｕｓ  Ｊ，Ｈａｔｔ  Ｈ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００９；２８４（２４）：１６２１８−１６２２５
【非特許文献９】Ｂｒａｕｎ  Ｔ，Ｖｏｌａｎｄ  Ｐ，Ｋｕｎｚ  Ｌ，Ｐｒｉｎｚ  Ｃ，Ｇｒａｔｚｌ  Ｍ．Ｅｎｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｆｆｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ：ｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｓｐｉｃｅｓ  ａｎｄ  ｏｄｏｒａｎｔｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００７年５月；１３２（５）：１８９０−９０１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明によれば、驚くべきことに、ヒト頭皮において、一般式（Ｉ）：
【化５】
2019519502.tif 000007
式中：
Ｒ１およびＲ２は、一緒に二重結合を形成し、またはＲ１およびＲ２は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ３、Ｒ４は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択され、またはＲ３およびＲ４は、一緒に二重結合を形成し；
Ｒ５、Ｒ６は、同一であるかまたは異なり、独立して水素、メチルから選択され；またはＲ５およびＲ６は、一緒に二重結合を形成し；またはＲ５およびＲ６は、一緒にシクロプロピル基を形成し；
Ｒ７＝メチルまたはエチルであり；
Ｒ８＝水素またはメチルである、
で表される化合物の使用により、育毛を促進することができ、脱毛を抑制または遅延させることができることが、見出された。
【００１７】
本発明による新たな使用の範囲内で、前述のサンダルペンタノール（化合物１）およびサンダルシクロペンタン（化合物５）を含む式（Ｉ）で表される好ましい化合物を、以下の表に報告する：
【００１８】
【表１】
2019519502.tif 000008
【００１９】
本発明の目的はまた、ヒト頭皮に対する局所的投与に適した、育毛を促進し、かつ／または脱毛を抑制もしくは遅延させるにあたって使用するための組成物であって、１種以上の式（Ｉ）で表される化合物を、活性成分として、好ましくは０．１〜１０重量％（ｗ／ｗ％）の量において、局所的投与に適した成分と共に処方して用いる、前記組成物である。
本発明の組成物は、ヒト頭皮において育毛を促進し、かつ／または脱毛を処置するにあたっての化粧品および治療的使用の両方に適しており、ここで一般式（Ｉ）で表される少なくとも１種の化合物は、活性成分として含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の特徴および利点を最良に理解するために、その非限定的な実例を、以下に記載する。成分は、ＩＮＣＩ命名法に従って命名される。
【実施例】
【００２１】
実施例１
ローション
【表２】
2019519502.tif 000009
【００２２】
実施例２
シャンプー前マスク
【表３】
2019519502.tif 000010
【００２３】
実施例３
スタイリングジェルの強化
【表４】
2019519502.tif 000011
【００２４】
実施例４
ヘアコンディショナーの強化
【表５】
2019519502.tif 000012
【００２５】
実施例５
シャンプーの再生
【表６】
2019519502.tif 000013
【００２６】
実施例６
ムース
【表７】
2019519502.tif 000014
【００２７】
添付した図面の図１〜５を参照して、
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、ヒト頭皮組織および毛包（ＨＦ）の試料から採取した免疫蛍光画像を示す。
【図２】図２は、毛幹伸長に関する図式を示す。
【図３】図３は、育毛サイクルに関する図式を示し、特に休止相を参照する。
【図４】図４は、毛髪マトリックスケラチノサイト増殖およびアポトーシスに関する図式を示す。
【図５】図５は、休止期促進成長因子ＴＧＦβ２に関する図式を示す。
【００２９】
図１〜５は、以下の実験的研究において得られた結果に関し、したがって以下の記載において詳細に記載する。
【００３０】
実験的研究
本発明による前記化合物１、すなわちサンダルペンタノールを、実験目的のために試験するべき式（Ｉ）で表される化合物の中から以下のように選択した。サンダルペンタノールを、図２〜５の図式においてサンダロアと称する。
【００３１】
試験設計
第１のステップとして、標準的な免疫蛍光技法を、ＯＲ２ＡＴ４がヒト頭髪毛包（ＨＦ）において発現するか否かを評価するために、健常ドナーからのヒト頭皮皮膚組織切片に対して用いた。
【００３２】
次に、ＯＲ２ＡＴ４の刺激がヒト育毛に影響し得るか否かを評価するために、顕微解剖したＨＦを、アゴニストとして５００μΜの濃度でのサンダルペンタノールで処理し、毛幹伸長測定を、実施した（Ｐｈｉｌｐｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０を参照）。さらに、キナーゼアッセイを、いずれのシグナル伝達経路がサンダルペンタノールによるＯＲ２ＡＴ４の特異的刺激に関与するかを同定するために実施した。
【００３３】
その後、サンダルペンタノールの成長期延長効果が特異的であることを確認するために、ＨＦ器官培養を、サンダルペンタノールをアゴニストとして用い、合成香料である特異的アンタゴニストであるＰｈｅｎｉｒａｔ（イソ酪酸フェノキシエチル）を用いて行った。Ｂｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．、上で述べた参考文献を参照。
【００３４】
ＨＦを、ビヒクル、サンダルペンタノール、ＰｈｅｎｉｒａｔまたはサンダルペンタノールおよびＰｈｅｎｉｒａｔの混合物のいずれかで処理した。毛周期の修飾を分析するために、Ｋｉ６７／ＴＵＮＥＬを実施し、それを使用して、毛周期スコアおよび毛髪マトリックスケラチノサイト増殖およびアポトーシスを評価した。
【００３５】
さらに、強力な休止期誘発物質であるＴＧＦβ２を、同一の上記の化合物に関して調査した。
【００３６】
ヒトＨＦにおけるＯＲ２ＡＴ４の発現をダウンレギュレートし、育毛におけるこの作用を研究するために、ＨＦを、ＯＲ２ＡＴ４−ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。
【００３７】
ｑＲＴ−ＰＣＲおよび（免疫）組織形態計測分析を用いて、顕微解剖したＨＦにおけるＯＲ２ＡＴ４遺伝子およびタンパク質の成功にｓｉＲＮＡ媒介されたダウンレギュレーションを確認した。最後に、ＯＲ２ＡＴ４のノックダウンがヒト育毛にいかにして影響するかを調査するために、Ｋｉ６７／ＴＵＮＥＬ免疫蛍光法を用いて、毛周期スコアならびに毛髪マトリックスケラチノサイト増殖およびアポトーシスを定量した。
【００３８】
ノックダウンが休止期誘発に影響し得るか否かをチェックするために、ＴＧＦβ２発現を、免疫蛍光法により分析した。
【００３９】
材料および方法
組織標本
側頭部の、および後頭部の正常なヒト頭皮を、インフォームド・コンセントおよび倫理的承認後、日常的な美容整形手術を受けている健康なドナー（年齢範囲３８〜６９歳における）から得た。
【００４０】
免疫蛍光法
ＯＣＴ包埋試料を、クリオスタットで切片化した（厚さ６μｍ）。切片を、４％パラホルムアルデヒド中で固定し、１０％のヤギ血清（ＯＲ２ＡＴ４について）または５％のヤギ血清＋０．３％のＴｒｉｔｔｏｎ  Ｘ−１００（切断したカスパーゼ３について）と共にプレインキュベートし、対応する一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした（ＯＲ２ＡＴ４について１／１００および切断したカスパーゼ３について１／４００）。二次抗体インキュベーションを、ＲＴで４５分間行った。ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍＬ）での対比染色を行って、核を可視化した。ＴＧＦｂ２について、試料をアセトン中で固定し、内因性ペルオキシダーゼを３％のＨ２Ｏ２で遮断した。このステップに、アビジン−ビオチン遮断ステップおよびＴＮＢ緩衝液（Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ＋ＮａＣｌ＋カゼイン）とのプレインキュベーションを後続させた。対応する一次抗体を、４℃で一晩インキュベートした（ＴＧＦｂ２について１／１０００）。二次抗体インキュベーションを、ＲＴで４５分間行い、その後Ｔｙｒａｍｉｄｅシグナル増幅キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用した。ＤＡＰＩでの対比染色を実施して、核を可視化した。アポトーシス細胞および増殖細胞を染色するために、本発明者らは、アポプタグキット（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を製造者のプロトコルに従って使用し、続いてＫｉ６７染色を行った。一次抗体を、ＴｄＴ酵素ステップの後に一晩インキュベートした（Ｋｉ６７、１／２０）。二次抗体を、アポプタグキットの蛍光標識した抗ジゴキシゲニンステップの後にＲＴで４５分間インキュベートした。ＤＡＰＩでの対比染色を実施して、核を可視化した。陰性対照を、一次抗体を省略することによって供した。画像を、Ｋｅｙｅｎｃｅ蛍光顕微鏡（大阪、日本国）を用い、さらなる分析のために画像化を通して一定の設定露出時間を維持して撮影した。
【００４１】
ＨＦ器官培養
ヒト頭皮試料を、美容整形手順の後に得、同日にヒトアナゲンＶＩ頭皮ＨＦを顕微解剖するために用いた。顕微解剖したヒト頭皮ＨＦを、３７℃で５％ＣＯ２で、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、１０ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μｇ／ｍｌのインスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン混合物（Ｇｉｂｃｏ）（ＷＥＭ）を補充したＷｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の最小培地中で、以前記載されているように（Ｐｈｉｌｐｏｔｔ，１９９０；Ｋｌｏｅｐｐｅｒ，２０１０；Ｌａｎｇａｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）培養した。
【００４２】
１）ヒト顕微解剖ＨＦのＯＲ２ＡＴ４サンダルペンタノール（アゴニスト）およびフェニラート（アンタゴニスト）での化学的刺激
２４時間のインキュベーションの後、ＷＥＭ培地を交換し、ＨＦを、対応する物質で実験条件に従って６日間処理した。ＨＦを、ビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ）、サンダルペンタノール（５００μΜ）、フェニラート（アゴニストに対して１：１の比率において）、またはサンダルペンタノール＋フェニラートの混合物のいずれかで処理した。
【００４３】
Ｐｈｅｎｉｒａｔを、サンダルペンタノールの３０分前に添加した。毛幹伸長を、単対物双眼顕微鏡（Ｐｈｉｌｐｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）を用いて毎日測定し、培養培地を、２日毎に交換した。次いで、ＨＦを、次にクリオマトリックス（ｃｒｙｏｍａｔｒｉｘ）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に包埋し、液体窒素中でスナップ凍結した。厚さ６μｍの切片を、クリオスタットで切断し、さらなる免疫組織化学的分析のために−８０℃で保存した。
【００４４】
定量的（免疫）組織形態測定
染色強度を、良好に規定した参照領域において、以前記載されているように（Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、ＮＩＨ  ＩＭＡＧＥソフトウェア（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いた）、定量的（免疫）組織形態計測により評価した。
【００４５】
統計的分析
すべてのデータを、平均±ＳＥＭとして表し、２つより多い群を比較した場合にはＯｎｅ  Ｗａｙ  ＡｎｏｖａまたはＫｒｕｓｋａｌｌ  Ｗａｌｌｉｓ検定により、およびサンダルペンタノール処理をビヒクルに対して比較した場合にはスチューデントｔ−検定またはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により分析した（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６，ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）。
【００４６】
結果
結果を、図１〜５の添付した図面を参照して記載する。
１）ヒトＨＦは嗅覚受容体２ＡＴ４を発現する
最初に、ＨＦ中の嗅覚受容体２ＡＴ４（ＯＲ２ＡＴ４）の存在を、調査した。ＯＲ２ＡＴ４は、図１における免疫蛍光によって示すように、ヒト頭皮成長期ＨＦの球上（ｓｕｐｒａｂｕｌｂａｒ）外毛根鞘（ＯＲＳ）ケラチノサイトにおいて観察された。
【００４７】
図１からの写真Ａ）〜Ｄ）は、３人の異なるドナー（ｎ＝３）からのヒト頭皮におけるＨＦ（写真Ａおよび対応する拡大を参照）ならびに顕微解剖したＨＦ（写真Ｂ〜Ｄおよび対応する拡大を参照）におけるＯＲ２ＡＴ４免疫蛍光を表す。ＣＴＳは結合組織鞘を意味し、ＤＰは毛乳頭を意味し、ＨＭは毛母体を意味し、ＩＲＳは内毛根鞘を意味し、ＯＲＳは外毛根鞘を意味し、ＨＳは毛幹を意味し、ＨＢは毛球を意味し、ＨＦは毛包を意味する。点線は、ＩＲＳ（内毛根鞘）、ＯＲＳ（外毛根鞘）およびＤＰ（毛乳頭）の輪郭を示す。
【００４８】
図１は、ＯＲ２ＡＴ４が、成長期頭皮ＨＦの球上ＯＲＳケラチノサイトにおいて、ならびに球上および延髄性ＯＲＳにおいて、ならびに顕微解剖した成長期ＨＦにおける毛母体先端ケラチノサイトにおいて発現されることを示す。
【００４９】
顕微解剖した成長期ＨＦ（Ｐｈｉｌｐｏｔｔモデル）によって、毛球における、すなわちＯＲＳおよび毛母体（ＨＭ）先端におけるＯＲ２ＡＴ４細胞、図１Ｂを参照、が、特徴的な球上濾胞内発現、図１Ｄを参照、に加えて明らかになった。
【００５０】
２）サンダルペンタノールによるＯＲ２ＡＴ４の特異的刺激によって毛幹伸長が促進され、アポトーシスシグナル伝達経路が阻害される
ＯＲ２ＡＴ４の活性化がヒトＨＦの毛周期に影響し得るか否かをチェックするために、顕微解剖したヒトＨＦを、潜在的アゴニストであるサンダルペンタノールで特異的に刺激した。サンダルペンタノール処理の効果を、毛幹伸長をビヒクルと比較して測定することによって評価した。
【００５１】
ＨＦ伸長を、培養した顕微解剖したＨＦにおいて測定した。平均±ＳＥＭ、各ドナーについてｎ＝１８  ＨＦ、ドナー２人、スチューデントｔ検定、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６。個体間の差異にもかかわらず、結果によって、図２の図式に示すように、濃度５００μΜでのサンダルペンタノールが２人のドナーに由来する培養した顕微解剖したＨＦの毛幹伸長を刺激することが明らかになり、ビヒクルと比較したサンダロアの培養の日数に対する％伸長を報告する。
【００５２】
３）サンダルペンタノールによるＯＲ２ＡＴ４の活性化によって、ヒト毛母体ケラチノサイトにおける休止期誘発が有意に遅延し、アポトーシスが減少する
サンダルペンタノールによるＯＲ２ＡＴ４刺激の毛髪成長に対する効果の特異性を調査するために、顕微解剖したＨＦをサンダルペンタノールおよび／またはフェニラートで培養し、毛周期を以前記載されているようにステージング分析した（Ｋｌｏｅｐｐｅｒ，２０１０；Ｌａｎｇａｎ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）。毛周期スコアを、６日間の培養の後、処理した、およびビヒクルのＨＦの両方において測定した。３人の患者からＮ＝１６〜２４のＨＦ、平均±ＳＥＭ、事後ｈｏｃ検定としてのＫｒｕｓｋａｌ  Ｗａｌｌｉｓ検定およびＤｕｎｎの多重比較検定、ｎｓ、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、＃ｐ＜０．０５、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６。
【００５３】
得られた結果は、図３の図式に示すように、５００μΜの濃度でのサンダルペンタノール単独によるＯＲ２ＡＴ４の特異的刺激によって、処理したＨＦｓにおける休止期誘発が、６日の培養の後にビヒクルと比較して遅延したことを示す。対照的に、両方の比較基準、Ｐｈｅｎｉｒａｔ単独およびＰｈｅｎｉｒａｔと共に投与したサンダルペンタノールの混合物によって、ビヒクルと比較して、処理したＨＦにおける成長期は延長されなかった。データから、サンダルペンタノールによるＯＲ２ＡＴ４の刺激によって休止期遅延が促進され、一方これらの効果はＰｈｅｎｉｒａｔを用いた場合のＯＲ２ＡＴ４阻害によって打ち消されることが示唆される。
【００５４】
要約すると、図３は、本発明の化合物によって休止期発生が有意に遅延することを示す。
【００５５】
４）サンダルペンタノールによって毛母体ケラチノサイトアポトーシスが有意に減少する
図４の証拠を参照して、サンダルペンタノールが毛母体ケラチノサイト増殖およびアポトーシスに影響するか否かを調査するために、Ｋｉ６７／ＴＵＮＥＬ染色を実施した。増殖（図４Ａの図式）およびアポトーシス（図４Ｂの図式）毛母体ケラチノサイトを、処理した、およびビヒクルのＨＦの毛母体中で計数した。Ｋｉ６７／ＴＵＮＥＬの代表的な写真を、図４、Ｃ〜Ｅに示す。平均±ＳＥＭ、３人の患者からのｎ＝１８〜２１  ＨＦ、事後ｈｏｃ検定としてのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定およびＤｕｎｎの複数比較検定、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、＃ｐ＜０．０５、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６。
【００５６】
６日間の培養の後、毛母体ケラチノサイト増殖は、サンダルペンタノールまたはＰｈｅｎｉｒａｔ単独で処理したＨＦにおいては変化しなかった。しかしながら、ＯＲ２ＡＴ４の特異的アンタゴニストであるＰｈｅｎｉｒａｔのサンダルペンタノールと一緒の同時投与によって、図４Ａに示すように、毛母体ケラチノサイト増殖に関する有意な減少が誘発された。
【００５７】
図４Ｂに示すように、サンダルペンタノール処理によって、毛母体ケラチノサイトアポトーシスが有意に減少し、一方サンダルペンタノール＋Ｐｈｅｎｉｒａｔの同時投与によって、毛母体ケラチノサイトアポトーシスが有意に増加した。
【００５８】
５）サンダルペンタノールによるＯＲ２ＡＴ４の特異的刺激によって、休止期促進成長因子ＴＧＦβ２が有意に減少した
図５の証拠を参照して、いかにしてＯＲアゴニストおよびアンタゴニストがＨＦ増殖に影響するかをさらに調査するために、近位ＯＲにおける、生理学的ヒトＨＦサイクリングの間の関連する休止期促進成長因子、すなわちＴＧＦβ２の発現（Ｓｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）を、試験した。サンダルペンタノールで６日間処理した後、タンパク質レベルでのＴＧＦβ２発現の有意な減少が観察され、一方受容体をＰｈｅｎｉｒａｔで遮断することによって変化は検出されなかった。この場合において、サンダルペンタノールのＰｈｅｎｉｒａｔとの同時投与によって、図５Ａの図式に示すように、サンダルペンタノール単独の投与によって得られたのと同等の結果が示された。ＴＧＦβ２発現を、処理した、およびビヒクルのＨＦ中のＯＲＳケラチノサイトにおいて測定した。
【００５９】
ＴＧＦβ２免疫蛍光の対応する代表的な写真を、図５に示す。Ｂ（ビヒクル）、Ｃ（サンダロア）、Ｄ（サンダロア＋Ｐｈｅｎｉｒａｔ）。
【００６０】
ＴＧＦβ２発現を、Ｉｍａｇｅ  Ｊを用いて定量化した。２人の患者からの平均±ＳＥＭ、ｎ＝１４〜２２  ＨＦ、事後ｈｏｃ検定としてＫｒｕｓｋａｌ−ＷａｌｌｉｓおよびＤｕｎｎの多重比較検定、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、およびＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定、ｎｓ．Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６。
【００６１】
結論
上記結果は、全体的に、ＯＲ２ＡＴ４が育毛モジュレーターであり、本発明の化合物が成長期延長剤であることを示す。本発明の化合物によるＯＲ２ＡＴ４の刺激によって、毛幹伸長が増加し、休止期相転移が遅延し、一方当該効果は、ＯＲ２ＡＴ４阻害剤Ｐｈｅｎｉｒａｔでは得られず、本発明の化合物をＰｈｅｎｉｒａｔと同時投与した場合に実質的に打ち消される。
【００６２】
本発明の化合物によるＯＲ２ＡＴ４の刺激によって、アポトーシスシグナル伝達経路が調節され、ヒト毛母体ケラチノサイトにおけるアポトーシスが有意に減少し、一方この効果はＰｈｅｎｉｒａｔでは得られず、本発明の化合物をＰｈｅｎｉｒａｔと同時投与した場合に実質的に打ち消される。本発明の化合物によるＯＲ２ＡＴ４の刺激によって、関連する休止期促進成長因子ＴＧＦβ２が有意に減少し、一方この効果は、Ｐｈｅｎｉｒａｔでは得られない。
【００６３】
一般的用語において、実験的証拠によって、上記で定義した式（Ｉ）で表される化合物を、ヒト頭皮における育毛を促進するために、および／または脱毛を抑制もしくは遅延させるために有効に使用することができることが示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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