(57)【要約】本発明は、１つ以上のＮＲＦ２スプライス変異体またはＮＲＦ２標的遺伝子の発現レベルを分析することによって、肺癌などの、がんを有する対象を特定する方法を提供する。本発明はまた、ＮＲＦ２経路アンタゴニストで対象におけるがんを治療する方法を提供し、対象は、１つ以上のＮＲＦ２スプライス変異体を発現するか、または１つ以上のＮＲＦ２標的遺伝子を過剰発現する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象においてがんを診断する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定することと、
（ｂ）前記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを、前記少なくとも１つの遺伝子の参照発現レベルと比較することと、を含み、前記少なくとも１つの遺伝子の前記参照発現レベルに対する、前記試料における前記少なくとも１つの遺伝子の前記発現レベルの増加が、がんを有する対象を特定する、前記方法。
【請求項２】
ＮＲＦ２依存性癌であるがんを有する対象を特定する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定することと、
（ｂ）前記少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを、前記少なくとも１つの遺伝子の参照発現レベルと比較することと、
（ｃ）前記対象のがんがＮＲＦ２依存性癌であるかを決定することと、を含み、前記少なくとも１つの遺伝子の前記参照発現レベルに対する、前記試料における前記少なくとも１つの遺伝子の前記発現レベルの増加が、ＮＲＦ２依存性癌を有する対象を特定する、前記方法。
【請求項３】
前記対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも２つの遺伝子の発現レベルが決定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも３つの遺伝子の発現レベルが決定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも４つの遺伝子の発現レベルが決定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬの発現レベルが決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、またはＮＱＯ１のうちの１つ以上の発現レベルが決定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、及びＡＫＲ１Ｃ３のうちの１つ以上の発現レベルが決定される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）前記試料における前記少なくとも２つの遺伝子の発現レベルが、前記試料の前記少なくとも２つの遺伝子の平均であり、
（ｂ）前記少なくとも２つの遺伝子の参照発現レベルが、前記参照の前記少なくとも２つの遺伝子の平均であり、
（ｃ）前記試料の前記少なくとも２つの遺伝子の平均が、前記参照の前記少なくとも２つの遺伝子の平均と比較される、請求項３〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記参照発現レベルが、対象の集団における前記少なくとも１つの遺伝子の発現の平均レベルである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象の集団が、共通の民族性を共有する対象の集団である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記参照発現レベルが、がんを有する対象の集団における前記少なくとも１つの遺伝子の発現の平均レベルである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記参照発現レベルが、肺癌を有する対象の集団における前記少なくとも１つの遺伝子の発現の平均レベルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記肺癌が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮＳＣＬＣが、扁平上皮ＮＳＣＬＣである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記発現レベルが、ｍＲＮＡ発現レベルである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｍＲＮＡ発現レベルが、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、遺伝子発現プロファイリング、遺伝子発現の連続分析、またはマイクロアレイ分析によって決定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記発現レベルが、タンパク質発現レベルである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質発現レベルが、ウェスタンブロット、免疫組織化学、または質量分析法によって決定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＮＲＦ２のＤＮＡ配列を決定することをさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ配列が、ＰＣＲ、エクソーム−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、または全ゲノム配列決定によって決定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
対象においてがんを診断する方法であって、前記方法が、前記対象から得られる試料におけるＮＲＦ２のＤＮＡ配列を決定することを含み、そのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２ＤＮＡの存在が、前記対象をがんを有するとして特定する、前記方法。
【請求項２３】
前記ＤＮＡ配列が、ＰＣＲ、エクソーム−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、または全ゲノム配列決定によって決定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
がんを有する対象を特定する方法であって、前記方法が、前記対象から得られる試料におけるそのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２のｍＲＮＡ発現レベルを決定することを含み、そのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２の存在が、前記対象をがんを有するとして特定する、前記方法。
【請求項２５】
前記ｍＲＮＡ発現レベルが、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、遺伝子発現プロファイリング、遺伝子発現の連続分析、またはマイクロアレイ分析によって決定される、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＮＲＦ２のＤＮＡ配列を決定することをさらに含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＮＡ配列が、ＰＣＲ、エクソーム−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、または全ゲノム配列決定によって決定される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＮＲＦ２が、そのエクソン３の全部または一部の欠失をさらに含む、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
対象においてがんを診断する方法であって、前記方法が、前記対象から得られる試料におけるそのＮｅｈ２ドメインの全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２の前記タンパク質発現レベルを決定することを含み、そのＮｅｈ２ドメインの全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２の存在が、前記対象をがんを有するとして特定する、前記方法。
【請求項３０】
がんを有する対象を特定する方法であって、前記方法が、前記対象から得られる試料におけるそのＮｅｈ２ドメインの全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２の前記タンパク質発現レベルを決定することを含み、そのＮｅｈ２ドメインの全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２の存在が、前記対象をがんを有するとして特定する、前記方法。
【請求項３１】
前記ＮＲＦ２が、そのＮｅｈ４ドメインの全部または一部の欠失をさらに含む、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記タンパク質発現が、ウェスタンブロット、免疫組織化学、または質量分析法によって決定される、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象に治療有効量のＮＲＦ２経路アンタゴニストを投与することをさらに含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象に治療有効量の抗がん剤を投与することをさらに含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法が、抗がん剤及びＮＲＦ２経路アンタゴニストを投与することを含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗がん剤及び前記ＮＲＦ２経路アンタゴニストが、同時投与される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗がん剤及び前記ＮＲＦ２経路アンタゴニストが、連続投与される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗がん剤が、抗血管新生剤、化学療法剤、成長阻害剤、細胞傷害性剤、及び免疫療法からなる群から選択される、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗血管新生剤が、ＶＥＧＦアンタゴニストである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＮＲＦ２経路アンタゴニストが、ＣＲＥＢアンタゴニスト、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）アンタゴニスト、Ｍａｆアンタゴニスト、活性化転写因子４（ＡＴＦ４）アンタゴニスト、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）アンタゴニスト、Ｊｕｎアンタゴニスト、グルココルチコイド受容体アンタゴニスト、ＵｂｃＭ２アンタゴニスト、ＨＡＣＥ１アンタゴニスト、ｃ−Ｍｙｃアゴニスト、ＳＵＭＯアゴニスト、ＫＥＡＰ１アゴニスト、ＣＵＬ３アゴニスト、またはレチノイン酸受容体α（ＲＡＲα）アゴニストからなる群から選択される、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
がんを有する対象を治療する方法であって、前記方法が、前記対象に治療有効量のＮＲＦ２経路アンタゴニストを投与することを含み、前記対象から得られる試料における下記の遺伝子ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬのうちの少なくとも１つの発現レベルが、前記少なくとも１つの遺伝子の参照発現レベルに対して増加したと決定されている、前記方法。
【請求項４２】
前記対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも２つの遺伝子の発現レベルが決定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも３つの遺伝子の発現レベルが決定される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも４つの遺伝子の発現レベルが決定される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬの発現レベルが決定される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、またはＮＱＯ１のうちの１つ以上の発現レベルが決定される、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、及びＡＫＲ１Ｃ３のうちの１つ以上の発現レベルが決定される、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
（ａ）前記試料における少なくとも２つの遺伝子の発現レベルが、前記試料の前記少なくとも２つの遺伝子の平均であり、
（ｂ）前記少なくとも２つの遺伝子の参照発現レベルが、前記参照の前記少なくとも２つの遺伝子の平均であり、
（ｃ）前記試料の前記少なくとも２つの遺伝子の平均が、前記参照の前記少なくとも２つの遺伝子の平均と比較される、請求項４１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記参照発現レベルが、対象の集団における前記少なくとも１つの遺伝子の発現の平均レベルである、請求項４１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記対象の集団が、共通の民族性を共有する対象の集団である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記参照発現レベルが、がんを有する対象の集団における前記少なくとも１つの遺伝子の発現の平均レベルである、請求項４１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記肺癌が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＮＳＣＬＣが、扁平上皮ＮＳＣＬＣである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記発現レベルが、ｍＲＮＡ発現レベルである、請求項４１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ｍＲＮＡ発現レベルが、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、遺伝子発現プロファイリング、遺伝子発現の連続分析、またはマイクロアレイ分析によって決定される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ｍＲＮＡ発現レベルが、ＲＮＡ−ｓｅｑによって決定される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記発現レベルが、タンパク質発現レベルである、請求項４１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記タンパク質発現が、ウェスタンブロット、免疫組織化学、または質量分析法によって決定される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＮＲＦ２のＤＮＡ配列を決定することをさらに含む、請求項４１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＤＮＡ配列が、ＰＣＲ、エクソーム−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、または全ゲノム配列決定によって決定される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
がんを有する対象を治療する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記対象から得られる試料におけるそのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２のｍＲＮＡ発現レベルを決定することであって、そのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２ｍＲＮＡの存在が、前記対象をがんを有するとして特定する、前記決定することと、
（ｂ）前記対象に治療有効量のＮＲＦ２経路アンタゴニストを投与することと、を含む、前記方法。
【請求項６２】
前記ｍＲＮＡ発現が、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、遺伝子発現プロファイリング、遺伝子発現の連続分析、またはマイクロアレイ分析によって決定される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ｍＲＮＡ発現が、ＲＮＡ−Ｓｅｑによって決定される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＮＲＦ２のＤＮＡ配列を決定することをさらに含む、請求項６１〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＤＮＡ配列が、ＰＣＲ、エクソーム−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、または全ゲノム配列決定によって決定される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
がんを有する対象を治療する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記対象から得られる試料におけるそのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２のＤＮＡ配列を決定することであって、そのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２ＤＮＡの存在が、前記対象をがんを有するとして特定する、前記決定することと、
（ｂ）前記対象に治療有効量のＮＲＦ２経路アンタゴニストを投与することと、を含む、前記方法。
【請求項６７】
前記ＤＮＡ配列が、ＰＣＲ、エクソーム−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、または全ゲノム配列決定によって決定される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＮＲＦ２が、そのエクソン３の全部または一部の欠失をさらに含む、請求項６１〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
がんを有する対象を治療する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記対象から得られる試料におけるそのＮｅｈ２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２のタンパク質発現レベルを決定することであって、そのＮｅｈ２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２タンパク質の存在が、前記対象をがんを有するとして特定する、前記決定することと、
（ｂ）前記対象に治療有効量のＮＲＦ２経路アンタゴニストを投与することと、を含む、前記方法。
【請求項７０】
前記ＮＲＦ２タンパク質が、そのＮｅｈ４ドメインの全部または一部の欠失をさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記タンパク質発現が、ウェスタンブロット、免疫組織化学、または質量分析法によって決定される、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記方法が、前記対象に治療有効量の抗がん剤を投与することを含む、請求項４１〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記抗がん剤及び前記ＮＲＦ２経路アンタゴニストが、同時投与される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記抗がん剤及び前記ＮＲＦ２経路アンタゴニストが、連続投与される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記抗がん剤が、抗血管新生剤、化学療法剤、成長阻害剤、細胞傷害性剤、及び免疫療法からなる群から選択される、請求項７２〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記抗血管新生剤が、ＶＥＧＦアンタゴニストである、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＮＲＦ２経路アンタゴニストが、ＣＲＥＢアンタゴニスト、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）アンタゴニスト、Ｍａｆアンタゴニスト、活性化転写因子４（ＡＴＦ４）アンタゴニスト、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）アンタゴニスト、Ｊｕｎアンタゴニスト、グルココルチコイド受容体アンタゴニスト、ＵｂｃＭ２アンタゴニスト、ＨＡＣＥ１アンタゴニスト、ｃ−Ｍｙｃアゴニスト、ＳＵＭＯアゴニスト、ＫＥＡＰ１アゴニスト、ＣＵＬ３アゴニスト、またはレチノイン酸受容体α（ＲＡＲα）アゴニストからなる群から選択される、請求項４１〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記対象から得られる前記試料が、腫瘍試料である、請求項１〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記対象から得られる前記試料が、生検試料である、請求項１〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記試料が、前治療を受けていない対象から得られる、請求項１〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記対象が、肺癌または頭頸部癌を有する、請求項１〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記肺癌が、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記ＮＳＣＬＣが、扁平上皮ＮＳＣＬＣである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記頭頸部癌が、扁平上皮頭頸部癌である、請求項８１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１７年７月１０日に作成されたそのＡＳＣＩＩコピーは、５０４７４−１２７ＷＯ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿７．１０．１７＿ＳＴ２５と命名され、２１６，０９２バイトの大きさである。
【０００２】
本発明は、一般的には、がん、例えば、肺癌の診断、治療、及び予後判定の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
がんは、依然としてヒトの健康に対する最も死に至る危険のある脅威のうちの１つである。特に肺癌は、近年の治療処置の進歩にかかわらず、米国において男女共にがん関連死の主因である。肺癌の大多数は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）であり、ほとんどの場合、腺腫または扁平上皮サブタイプのいずれかである。近年の研究はこれらの徴候の根拠をなす点変異のパターンを特定した（Ｉｍｉｅｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．１５０（６）：１１０７−１１２０，２０１２）が、様々な細胞経路に関連する特定された変異の数の増加にかかわらず、これらの細胞経路に対するこれらの変異の性質及び影響の包括的な理解は不足している。
【０００４】
よって、肺癌などの、がんのための効果的な診断及び治療戦略を開発する分野において満たされていないニーズがある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、がん、例えば、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））及び頭頸部癌の診断、治療、及び予後判定提供のための組成物及び方法を提供する。
【０００６】
一態様では、本発明は、対象においてがんを診断する方法を特徴とし、方法は、（ａ）対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個の）遺伝子の発現レベルを決定することと、（ｂ）少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを少なくとも１つの遺伝子の参照発現レベルと比較することと、を含み、試料における少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの、少なくとも１つの遺伝子の参照発現レベルに対する増加は、がんを有する対象を特定する。
【０００７】
別の態様では、本発明は、ＮＲＦ２依存性癌であるがんを有する対象を特定する方法を特徴とし、方法は、（ａ）対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個の）遺伝子の発現レベルを決定することと、（ｂ）少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを少なくとも１つの遺伝子の参照発現レベルと比較することと、（ｃ）対象のがんがＮＲＦ２依存性癌であるかを決定することと、を含み、試料における少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの、少なくとも１つの遺伝子の参照発現レベルに対する増加は、ＮＲＦ２依存性癌を有する対象を特定する。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個の）遺伝子の発現レベルが決定される。いくつかの実施形態では、対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも３つの（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個の）遺伝子の発現レベルが決定される。いくつかの実施形態では、対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも４つの（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個の）遺伝子の発現レベルが決定される。いくつかの実施形態では、対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬの発現レベルが決定される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、またはＮＱＯ１のうちの１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の）発現レベルが決定される。いくつかの実施形態では、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、及びＡＫＲ１Ｃ３のうちの１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の）発現レベルが決定される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、（ａ）試料における少なくとも２つの遺伝子の発現レベルは、試料の少なくとも２つの遺伝子の平均（例えば、平均値または中央値）であり、（ｂ）少なくとも２つの遺伝子の参照発現レベルは、参照の少なくとも２つの遺伝子の平均（例えば、平均値または中央値）であり、（ｃ）試料の少なくとも２つの遺伝子の平均（例えば、平均値または中央値）は、参照の少なくとも２つの遺伝子の平均と比較される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、参照発現レベルは、対象の集団における少なくとも１つの遺伝子の発現の平均レベルである。いくつかの実施形態では、対象の集団は、共通の民族性を共有する対象の集団である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、参照発現レベルは、がん（例えば、肺癌、例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、例えば、扁平上皮ＮＳＣＬＣ）を有する対象の集団における少なくとも１つの遺伝子の発現の平均レベルである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、発現レベルは、ｍＲＮＡ発現レベルである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、遺伝子発現プロファイリング、遺伝子発現の連続分析、またはマイクロアレイ分析によって決定される。
【００１３】
他の実施形態では、発現レベルは、タンパク質発現レベルである。いくつかの実施形態では、タンパク質発現レベルは、ウェスタンブロット、免疫組織化学、または質量分析法によって決定される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、前述の方法のいずれかは、ＮＲＦ２のＤＮＡ配列を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、ＰＣＲ、エクソーム−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、または全ゲノム配列決定によって決定される。
【００１５】
別の態様では、本発明は、対象においてがんを診断する方法を特徴とし、方法は、対象から得られる試料におけるＤＮＡ配列を決定することを含み、そのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２ＤＮＡの存在は、対象をがんを有するとして特定する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、ＰＣＲ、エクソーム−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、または全ゲノム配列決定によって決定される。
【００１６】
別の態様では、本発明は、がんを有する対象を特定する方法を特徴とし、方法は、対象から得られる試料におけるそのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２のｍＲＮＡ発現レベルを決定することを含み、そのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２の存在は、対象をがんを有するとして特定する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、遺伝子発現プロファイリング、遺伝子発現の連続分析、またはマイクロアレイ分析によって決定される。いくつかの実施形態では、方法は、ＮＲＦ２のＤＮＡ配列を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、ＰＣＲ、エクソーム−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、または全ゲノム配列決定によって決定される。
【００１７】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＮＲＦ２は、そのエクソン３の全部または一部の欠失をさらに含む。
【００１８】
別の態様では、本発明は、対象においてがんを診断する方法を特徴とし、方法は、対象から得られる試料におけるそのＮｅｈ２ドメインの全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２のタンパク質発現レベルを決定することを含み、そのＮｅｈ２ドメインの全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２の存在は、対象をがんを有するとして特定する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、がんを有する対象を特定する方法を特徴とし、方法は、対象から得られる試料におけるそのＮｅｈ２ドメインの全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２のタンパク質発現レベルを決定することを含み、そのＮｅｈ２ドメインの全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２の存在は、対象をがんを有するとして特定する。
【００２０】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＮＲＦ２は、そのＮｅｈ４ドメインの全部または一部の欠失をさらに含む。いくつかの実施形態では、タンパク質発現は、ウェスタンブロット、免疫組織化学、または質量分析法によって決定される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、方法は、対象に治療有効量のＮＲＦ２経路アンタゴニストを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象に治療有効量の抗がん剤を投与することをさらに含む。他の実施形態では、方法は、抗がん剤及びＮＲＦ２経路アンタゴニストを投与することを含む。いくつかの実施形態では、抗がん剤及びＮＲＦ２経路アンタゴニストは、同時投与される。他の実施形態では、抗がん剤及びＮＲＦ２経路アンタゴニストは、連続投与される。いくつかの実施形態では、抗がん剤は、抗血管新生剤、化学療法剤、成長阻害剤、細胞傷害性剤、及び免疫療法からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗血管新生剤は、ＶＥＧＦアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２経路アンタゴニストは、ＣＲＥＢアンタゴニスト、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）アンタゴニスト、Ｍａｆアンタゴニスト、活性化転写因子４（ＡＴＦ４）アンタゴニスト、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）アンタゴニスト、Ｊｕｎアンタゴニスト、グルココルチコイド受容体アンタゴニスト、ＵｂｃＭ２アンタゴニスト、ＨＡＣＥ１アンタゴニスト、ｃ−Ｍｙｃアゴニスト、ＳＵＭＯアゴニスト、ＫＥＡＰ１アゴニスト、ＣＵＬ３アゴニスト、またはレチノイン酸受容体α（ＲＡＲα）アゴニストからなる群から選択される。
【００２２】
別の態様では、本発明は、がんを有する対象を治療する方法を特徴とし、方法は、対象に治療有効量のＮＲＦ２経路アンタゴニストを投与することを含み、対象から得られる試料における下記の遺伝子ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬのうちの少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個の）発現レベルが、少なくとも１つの遺伝子の参照発現レベルに対して増加したと決定されている。他の実施形態では、対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個の）遺伝子の発現レベルが決定される。他の実施形態では、対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも３つの（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個の）遺伝子の発現レベルが決定される。他の実施形態では、対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも４つの（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個の）遺伝子の発現レベルが決定される。他の実施形態では、対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬの発現レベルが決定される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、またはＮＱＯ１のうちの１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の）発現レベルが決定される。他の実施形態では、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、及びＡＫＲ１Ｃ３のうちの１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の）発現レベルが決定される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、（ａ）試料における少なくとも２つの遺伝子の発現レベルは、試料の少なくとも２つの遺伝子の平均であり、（ｂ）少なくとも２つの遺伝子の参照発現レベルは、参照の少なくとも２つの遺伝子の平均であり、（ｃ）試料の少なくとも２つの遺伝子の平均は、参照の少なくとも２つの遺伝子の平均と比較される。いくつかの実施形態では、参照発現レベルは、対象の集団における少なくとも１つの遺伝子の発現の平均レベルである。いくつかの実施形態では、対象の集団は、共通の民族性を共有する対象の集団である。いくつかの実施形態では、参照発現レベルは、がんを有する対象の集団における少なくとも１つの遺伝子の発現の平均レベルである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、例えば、扁平上皮ＮＳＣＬＣである。
【００２６】
いくつかの実施形態では、発現レベルは、ｍＲＮＡ発現レベルである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、遺伝子発現プロファイリング、遺伝子発現の連続分析、またはマイクロアレイ分析によって決定される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルは、ＲＮＡ−ｓｅｑによって決定される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、方法は、ＮＲＦ２のＤＮＡ配列を（例えば、ＰＣＲ、エクソーム−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、または全ゲノム配列決定によって）決定することをさらに含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、発現レベルは、タンパク質発現レベルである。いくつかの実施形態では、タンパク質発現は、ウェスタンブロット、免疫組織化学、または質量分析法によって決定される。
【００２９】
別の態様では、本発明は、がんを有する対象を治療する方法を特徴とし、方法は、（ａ）対象から得られる試料におけるそのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２のｍＲＮＡ発現レベルを決定することであって、そのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２ｍＲＮＡの存在が、対象をがんを有するとして特定する、決定することと、（ｂ）対象に治療有効量のＮＲＦ２経路アンタゴニストを投与することと、を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ発現は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、遺伝子発現プロファイリング、遺伝子発現の連続分析、またはマイクロアレイ分析によって決定される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ発現レベルは、ＲＮＡ−ｓｅｑによって決定される。いくつかの実施形態では、方法は、ＮＲＦ２のＤＮＡ配列を（例えば、ＰＣＲ、エクソーム−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、または全ゲノム配列決定によって）決定することをさらに含む。
【００３１】
別の態様では、本発明は、がんを有する対象を治療する方法を特徴とし、方法は、（ａ）対象から得られる試料におけるそのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２のＤＮＡ配列を決定することであって、そのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２ＤＮＡの存在が、対象をがんを有するとして特定する、決定することと、（ｂ）対象に治療有効量のＮＲＦ２経路アンタゴニストを投与することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、ＰＣＲ、エクソーム−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、または全ゲノム配列決定によって決定される。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２（例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）は、そのエクソン３の全部または一部の欠失をさらに含む。
【００３２】
別の態様では、本発明は、がんを有する対象を治療する方法を特徴とし、方法は、（ａ）対象から得られる試料におけるそのＮｅｈ２ドメインの全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２のタンパク質発現レベルを決定することであって、そのＮｅｈ２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２タンパク質の存在が、対象をがんを有するとして特定する、決定することと、（ｂ）対象に治療有効量のＮＲＦ２経路アンタゴニストを投与することと、を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２タンパク質は、そのＮｅｈ４ドメインの全部または一部の欠失をさらに含む。いくつかの実施形態では、タンパク質発現は、ウェスタンブロット、免疫組織化学、または質量分析法によって決定される。いくつかの実施形態では、方法は、ＮＲＦ２のＤＮＡ配列を（例えば、ＰＣＲ、エクソーム−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、または全ゲノム配列決定によって）決定することをさらに含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、方法は、対象に治療有効量の抗がん剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、抗がん剤及びＮＲＦ２経路アンタゴニストは、同時投与される。他の実施形態では、抗がん剤及びＮＲＦ２経路アンタゴニストは、連続投与される。いくつかの実施形態では、抗がん剤は、抗血管新生剤、化学療法剤、成長阻害剤、細胞傷害性剤、及び免疫療法からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗血管新生剤は、ＶＥＧＦアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２経路アンタゴニストは、ＣＲＥＢアンタゴニスト、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）アンタゴニスト、Ｍａｆアンタゴニスト、活性化転写因子４（ＡＴＦ４）アンタゴニスト、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）アンタゴニスト、Ｊｕｎアンタゴニスト、グルココルチコイド受容体アンタゴニスト、ＵｂｃＭ２アンタゴニスト、ＨＡＣＥ１アンタゴニスト、ｃ−Ｍｙｃアゴニスト、ＳＵＭＯアゴニスト、ＫＥＡＰ１アゴニスト、ＣＵＬ３アゴニスト、またはレチノイン酸受容体α（ＲＡＲα）アゴニストからなる群から選択される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、対象から得られる試料は、例えば、生検試料からの、腫瘍試料である。いくつかの実施形態では、試料は、前治療を受けていない対象から得られる。いくつかの実施形態では、対象は、肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、例えば、扁平上皮ＮＳＣＬＣ）または頭頸部癌（例えば、扁平上皮頭頸部癌）を有する。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１−１】Ａは、ＲＮＡ−ｓｅｑ、エクソーム−ｓｅｑ、及びＳＮＰアレイ分析に供された９６個の肺癌細胞株を示すプロットである。ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＫＥＡＰ１、ＥＧＦＲ、ＳＴＫ１１、ＮＦＥ２Ｌ２、及びＮＦ１の変化が示される。Ｂは、ＮＦＥ２Ｌ２（ＮＲＦ２）遺伝子における点変異を示すタンパク質配列表現である。Ｃは、ＫＥＡＰ１遺伝子における点変異を示すタンパク質配列表現である。Ｄは、ＫＥＡＰ１／ＮＲＦ２ペプチド複合体の結晶構造の画像である。
【図１−２】Ａは、ＲＮＡ−ｓｅｑ、エクソーム−ｓｅｑ、及びＳＮＰアレイ分析に供された９６個の肺癌細胞株を示すプロットである。ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＫＥＡＰ１、ＥＧＦＲ、ＳＴＫ１１、ＮＦＥ２Ｌ２、及びＮＦ１の変化が示される。Ｂは、ＮＦＥ２Ｌ２（ＮＲＦ２）遺伝子における点変異を示すタンパク質配列表現である。Ｃは、ＫＥＡＰ１遺伝子における点変異を示すタンパク質配列表現である。Ｄは、ＫＥＡＰ１／ＮＲＦ２ペプチド複合体の結晶構造の画像である。
【図１−３】Ａは、ＲＮＡ−ｓｅｑ、エクソーム−ｓｅｑ、及びＳＮＰアレイ分析に供された９６個の肺癌細胞株を示すプロットである。ＫＲＡＳ、ＴＰ５３、ＫＥＡＰ１、ＥＧＦＲ、ＳＴＫ１１、ＮＦＥ２Ｌ２、及びＮＦ１の変化が示される。Ｂは、ＮＦＥ２Ｌ２（ＮＲＦ２）遺伝子における点変異を示すタンパク質配列表現である。Ｃは、ＫＥＡＰ１遺伝子における点変異を示すタンパク質配列表現である。Ｄは、ＫＥＡＰ１／ＮＲＦ２ペプチド複合体の結晶構造の画像である。
【図２】図２Ａは、変異体（ｎ＝２５）対野生型（ＷＴ）（ｎ＝７４）ＫＥＡＰ１ＮＳＣＬＣ細胞株における全ての遺伝子についての平均発現レベルの比及び差次的発現分析から得られる関連する調節されたｐ値を示すボルカノプロットである。有意に差次的に発現した遺伝子（＞２倍、ｐ＜０．０１）が示され、ＮＲＦ２標的として以前特定された遺伝子セットが黒点として特定される。図２Ｂは、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＫＥＡＰ１変異に関連する２７個の遺伝子の上方制御を示す教師なしウォードクラスタリングの結果を示すヒートマップである。
【図３】図３Ａは、ＮＳＣＬＣ細胞株由来ＫＥＡＰ１遺伝子シグネチャーが、がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）から４０個中３２個（８０％）のＫＥＡＰ１変異体肺腺癌を分類したことを示す、教師なしウォードクラスタリングの結果を示すヒートマップである。図３Ｂは、ＮＳＣＬＣ細胞株由来ＫＥＡＰ１遺伝子シグネチャーがＴＣＧＡから２２個中１９個（８６％）のＫＥＡＰ１変異体及び２７個中２７個（１００％）のＮＲＦ２変異体肺扁平上皮細胞癌を分類することを示す、教師なしウォードクラスタリングの結果を示すヒートマップである。
【図４】変異体（ｎ＝６）及びＷＴ（ｎ＝３７）ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＫＥＡＰ１遺伝子シグネチャーのタンパク質産物の相対存在量を示すグラフである。
【図５】１９個の腫瘍兆候において見られる反復性スプライス変化の頻度を示すヒートマップである。
【図６】ＲＮＡ−ｓｅｑデータから予測されるＮＲＦ２エクソン及びスプライスジャンクションを示す。２つのアノテーションｒｅｆＧｅｎｅ転写物と一貫した予測される特徴は、灰色で示される。エクソン２（Ｊ２、Ｊ５）またはエクソン２＋３（Ｊ３、Ｊ６）のスキップに対応する特定されたエクソン間ジャンクションは、それぞれ黒色及び灰色で示される。ヒートマップは、ｌｏｇ２（ｘ＋１）変換後のＦＰＫＭスケール上の４８２個のＴＣＧＡ肺扁平上皮癌（行）にわたるエクソン間ジャンクション（列）についてのリード証拠を示す。
【図７】ＥＧＦＲ、ＮＲＦ２、ＭＥＴ、及びＣＴＮＮＢ１におけるスプライス変化のタンパク質構造に対する効果を描写する概略図である。矢印は、スプライス変化の結果としてのインフレーム欠失を示す。
【図８】図８Ａは、扁平上皮ＮＳＣＬＣにおけるＮＲＦ２スプライス変化及びＫＥＡＰ１またはＮＲＦ２の変異の相互排他的な発生を示すベン図である。図８Ｂは、２７個の候補ＮＲＦ２標的遺伝子に基づく扁平上皮ＮＳＣＬＣのクラスタリングを示すヒートマップである。変異状態及びＮＲＦ２スプライス変化は、各試料について示される。
【図９】図９Ａは、頭頸部癌におけるＮＲＦ２スプライス変化及びＫＥＡＰ１またはＮＲＦ２の変異の相互排他的な発生を示すベン図である。図９Ｂは、２７個の候補ＮＲＦ２標的遺伝子に基づく頭頸部癌のクラスタリングを示すヒートマップである。変異状態及びＮＲＦ２スプライス変化は、各試料について示される。
【図１０】ＲＮＡ−ｓｅｑによって定量化される、ＫＭＳ−２７及びＪＨＨ−６細胞におけるエクソン２をスキップするジャンクションリードの存在を示すグラフである。
【図１１】図１１Ａは、それぞれ右向き及び左向き矢印によって示される、エクソン１及びエクソン３／４に由来するフォワード及びリバースプライマーに関して、ＷＴ及びエクソン２欠失ＮＲＦ２（Δｅ２ＮＲＦ２）ｍＲＮＡ内のエクソンの位置を示す概略図である。図１１Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲによって正常白血球、ＪＨＨ−６細胞、及びＫＭＳ−２７細胞の総ＲＮＡから増幅されたＲＮＡ産物を示す一連のアガロースゲル画像である。ＮＲＦ２エクソン２を囲む領域を指定されたプライマーで増幅した。野生型ＮＲＦ２、Δｅ２ＮＲＦ２、及びプライマーダイマーからの断片が示される。Δｅ２ＮＲＦ２ＲＮＡの存在を示すバンドがＪＨＨ−６及びＫＭＳ−２７細胞において見られる。
【図１２】図１２Ａは、ＮＲＦ２におけるエクソン２の欠失を示す、ＪＨＨ−６及びＫＭＳ−２７細胞からのＰＣＲ産物の配列決定結果を示すグラフである。図１２Ｂは、Δｅ２ＮＲＦ２についての核酸及びアミノ酸配列を示す。図１２Ｃは、野生型ＮＲＦ２についての核酸及びアミノ酸配列を示す。エクソン２配列は網掛けされている。
【図１３】ＨＵＨ−１、ＪＨＨ−６、及びＨｕＣＣＴ１細胞によるリン酸化ＮＲＦ２、野生型ＮＲＦ２、及びΔｅ２ＮＲＦ２の相対発現を示すウェスタンブロット実験の結果を示す。指定された細胞株からのタンパク質溶解物をＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分離した。＊は、ＮＲＦ２ｓｉＲＮＡトランスフェクションによって枯渇しないので、適当な非特異的バンドを表す。
【図１４−１】Ａは、ラムダホスファターゼ（λ  Ｐ’ｔａｓｅ）の存在及び不在下でのＨＵＨ−１、ＪＨＨ−６、及びＨｕＣＣＴ１細胞によるリン酸化ＮＲＦ２、野生型ＮＲＦ２、及びΔｅ２ＮＲＦ２の相対発現を示すウェスタンブロット実験の結果を示す。細胞を６ウェル皿において成長させ、１００μｇ／ｍｌのシクロヘキサミド（ＣＨＸ）で指定された時間にわたって処理した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥによる分離及びＮＲＦ２抗体でのウェスタンブロッティング前に、溶解物をバッファーまたは４００ユニットλホスファターゼのいずれかで３０分間インキュベートした。Ｂは、ＣＨＸの存在下でＨｕＣＣＴ１細胞（丸）、ＪＨＨ−６細胞（四角）、及びＨＵＨ１細胞（三角）によって発現されるＮＲＦ２タンパク質の安定性を示すグラフである。Ａに示される結果からのバンド強度を定量化し、単相減衰曲線にあてはめ、各曲線の隣に示されるタンパク質半減期推定を求めた。相対タンパク質発現を各細胞株の初期濃度のパーセントとして得た。Ｃは、ｓｉＮＴＣ（５０ｎＭ）またはｓｉＫＥＡＰ１（５０ｎＭ）のいずれかでのトランスフェクション後のＨＵＨ−１、ＪＨＨ−６、及びＨｕＣＣＴ１細胞によるＮＲＦ２及びΔｅ２ＮＲＦ２の相対発現を示すウェスタンブロット実験の結果を示す。細胞を６ウェル皿において成長させ、１００μｇ／ｍｌのシクロヘキサミド（ＣＨＸ）で指定された時間にわたって処理した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥによる分離及びＮＲＦ２抗体でのウェスタンブロッティング前に、溶解物を４００ユニットλホスファターゼで３０分間インキュベートした。Ｄは、ｓｉＮＴＣ（実線）またはｓｉＫＥＡＰ１（破線）でのトランスフェクション後ＣＨＸの存在下でＨｕＣＣＴ１細胞（丸）、ＪＨＨ−６細胞（四角）、及びＨＵＨ１細胞（三角）によって発現されるＮＲＦ２タンパク質の安定性を示すグラフである。Ｃに示される結果からのバンド強度を定量化し、単相減衰曲線にあてはめ、各曲線の隣に示されるタンパク質半減期推定を求めた。相対タンパク質発現を各細胞株の初期濃度のパーセントとして得た。
【図１４−２】Ａは、ラムダホスファターゼ（λ  Ｐ’ｔａｓｅ）の存在及び不在下でのＨＵＨ−１、ＪＨＨ−６、及びＨｕＣＣＴ１細胞によるリン酸化ＮＲＦ２、野生型ＮＲＦ２、及びΔｅ２ＮＲＦ２の相対発現を示すウェスタンブロット実験の結果を示す。細胞を６ウェル皿において成長させ、１００μｇ／ｍｌのシクロヘキサミド（ＣＨＸ）で指定された時間にわたって処理した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥによる分離及びＮＲＦ２抗体でのウェスタンブロッティング前に、溶解物をバッファーまたは４００ユニットλホスファターゼのいずれかで３０分間インキュベートした。Ｂは、ＣＨＸの存在下でＨｕＣＣＴ１細胞（丸）、ＪＨＨ−６細胞（四角）、及びＨＵＨ１細胞（三角）によって発現されるＮＲＦ２タンパク質の安定性を示すグラフである。Ａに示される結果からのバンド強度を定量化し、単相減衰曲線にあてはめ、各曲線の隣に示されるタンパク質半減期推定を求めた。相対タンパク質発現を各細胞株の初期濃度のパーセントとして得た。Ｃは、ｓｉＮＴＣ（５０ｎＭ）またはｓｉＫＥＡＰ１（５０ｎＭ）のいずれかでのトランスフェクション後のＨＵＨ−１、ＪＨＨ−６、及びＨｕＣＣＴ１細胞によるＮＲＦ２及びΔｅ２ＮＲＦ２の相対発現を示すウェスタンブロット実験の結果を示す。細胞を６ウェル皿において成長させ、１００μｇ／ｍｌのシクロヘキサミド（ＣＨＸ）で指定された時間にわたって処理した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥによる分離及びＮＲＦ２抗体でのウェスタンブロッティング前に、溶解物を４００ユニットλホスファターゼで３０分間インキュベートした。Ｄは、ｓｉＮＴＣ（実線）またはｓｉＫＥＡＰ１（破線）でのトランスフェクション後ＣＨＸの存在下でＨｕＣＣＴ１細胞（丸）、ＪＨＨ−６細胞（四角）、及びＨＵＨ１細胞（三角）によって発現されるＮＲＦ２タンパク質の安定性を示すグラフである。Ｃに示される結果からのバンド強度を定量化し、単相減衰曲線にあてはめ、各曲線の隣に示されるタンパク質半減期推定を求めた。相対タンパク質発現を各細胞株の初期濃度のパーセントとして得た。
【図１５】ＫＭＳ−２７細胞によるΔｅ２ＮＲＦ２の発現を示すウェスタンブロット実験の結果を示す。ＨＣＣ−１３５４、ＫＭＳ−２７、及びＨｕＣＣＴ１細胞からの２０μｇの溶解物を調製し、ＨｕＣＣＴ１を除く全てについて、λ  Ｐ’ｔａｓｅで処理した。未処理及び被処理溶解物を次いでＳＤＳ  ＰＡＧＥに供し、ＮＲＦ２及びアクチンを検出した。
【図１６】ＮＲＦ２の核局在化を示すウェスタンブロット実験の結果を示す。ＨｕＣＣＴ１、ＨＵＨ−１、及びＪＨＨ−６細胞を、１０ｃｍ皿において成長させ、核及び細胞質画分に分割した。画分をＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分離し、ＮＲＦ２を可視化した。核及び細胞質純度を、細胞質マーカーとしてＨｓｐ９０及び核マーカーとしてＨＤＡＣ２を使用して推定した。
【図１７】図１７Ａは、Ｋｌｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（３）：３０６−３１２，２０１４）に記載のＲＮＡ−ｓｅｑデータを用いて（黒色四角、塗りつぶし灰色丸、及び中抜き灰色丸によって表される）１６個の肝細胞癌細胞株における（各々ｘ軸上に示される）ＫＥＡＰ１遺伝子シグネチャーの２７個のシグネチャーＮＲＦ２標的遺伝子の発現を示すグラフである。塗りつぶし灰色丸は、変異体ＫＥＡＰ１肝癌細胞株を表し、中抜き灰色丸は、ＪＨＨ−６細胞株を表す。図１７Ｂは、Ｋｌｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（３）：３０６−３１２，２０１４）に記載のＲＮＡ−ｓｅｑデータを用いて（黒色四角及び中抜き灰色丸によって表される）１８個の多発性骨髄腫細胞株における（各々ｘ軸上に示される）ＫＥＡＰ１遺伝子シグネチャーの２７個のシグネチャーＮＲＦ２標的遺伝子の発現を示すグラフである。中抜き灰色丸は、ＫＭＳ−２７細胞株を表す。
【図１８】図１８Ａは、１６個の肝細胞癌細胞株におけるＮＲＦ２標的遺伝子スコア（フルデータセットにわたり決定される２７個のＮＲＦ２標的遺伝子についての平均ｚスコア）を示す棒グラフである。ＫＥＡＰ１及びＮＲＦ２変化は、それぞれ塗りつぶし及び中抜きボックスとして示される。図１８Ｂは、１８個の多発性骨髄腫細胞株におけるＮＲＦ２標的遺伝子スコア（フルデータセットにわたり決定される２７個のＮＲＦ２標的遺伝子についての平均ｚスコア）を示す棒グラフである。中抜きボックスは、ＮＲＦ２変化を示す。
【図１９】ＮＲＦ２を標的とするｓｉＲＮＡの存在または不在下でのＨＵＨ−１、ＪＨＨ−６、及びＨｕＣＣＴ１細胞の生存率を示す棒グラフである。細胞を、非標的化ｓｉＲＮＡ対照（ＮＴＣ）、またはＮＲＦ２を標的とするｓｉＲＮＡ（ＮＲＦ２）のいずれかを含有する９６ウェルプレートに播種した。生存率は、４日後ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏを用いて測定した。生存率は、ＮＴＣ発光の割合として提示される。
【図２０】ＨＵＨ−１、ＪＨＨ−６、及びＨｕＣＣＴ１細胞による相対ＮＲＦ２発現に対するトランスフェクション試薬の効果を示す一連の棒グラフである。細胞を６ウェル皿において成長させ、ＮＲＦ２のＮＲＦ２エクソン５を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。総ＲＮＡを４８時間後に単離し、ＮＲＦ２発現をエクソン５を標的とするＴａｑｍａｎプローブを用いて測定した。
【図２１】ＨＵＨ−１細胞（濃灰色網掛けバー）、ＪＨＨ−６細胞（淡灰色網掛けバー）、及びＨｕＣＣＴ１細胞（黒色網掛けバー）によって発現させる、４つの十分に特徴分析されたＮＲＦ２標的遺伝子、ＳＬＣ７Ａ１１、ＧＣＬＣ、ＮＲ０Ｂ１、及びＳＧＲＮに対するトランスフェクション試薬の効果を示す一連の棒グラフである。細胞を６ウェル皿において成長させ、ＮＲＦ２のＮＲＦ２エクソン５を標的とするｓｉＲＮＡ、または非標的化ｓｉＲＮＡ（ＮＴＣ）でトランスフェクトした。総ＲＮＡを４８時間後に単離し、遺伝子発現を指定されたＮＲＦ２標的遺伝子を標的とするＴａｑｍａｎプローブを用いて測定した。
【図２２】ＨＵＨ−１、ＪＨＨ−６、及びＨｕＣＣＴ１細胞におけるＤＮＡ断片化に対するｓｉＲＮＡを標的とするＮＲＦ２の効果を示す一連の代表的なＦＡＣＳヒストグラムである。細胞を陽性対照としてスタウロスポリンで処理した。
【図２３】ＫＥＡＰ１相互作用に対するＮＲＦ２エクソン２及びエクソン２＋３欠失の効果を示すイムノブロットのセットである。２９３個の細胞を、ＦＬＡＧ−ＮＲＦ２、Δｅ２ＦＬＡＧ−ＮＲＦ２、Δｅ２＋３ＦＬＡＧ−ＮＲＦ２、またはＨＡ−ＫＥＡＰ１を発現するプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を溶解し、溶解物（上ゲル）または抗ＦＬＡＧ免疫沈降物のいずれかを、指定された抗体を用いるウェスタンブロッティングによって分析した。
【図２４】図２４Ａは、ＮＲＦ２安定性に対するシクロへキサミドの効果を示す免疫ブロットのセットである。２９３個の細胞を図２３に記載されるものと同じプラスミドでトランスフェクトし、１００μｇ／ｍｌのシクロへキシミド（ＣＨＸ）で指定された時間にわたり処理した。細胞をＳＤＳ  ＰＡＧＥによって溶解及び分離し、ＮＲＦ２及び抗アクチン抗体を用いてウェスタンブロットした。図２４Ｂは、時間に伴うＫＥＡＰ１発現後に切断されたＮＲＦ２の安定性を示すグラフである。
【図２５】様々なトランスフェクション条件下での様々なＮＲＦ２標的遺伝子の発現を示す一連の棒グラフである。細胞は図２４Ａ〜２４Ｂのように処理したが、総ＲＮＡについて採取し、Ｔａｑｍａｎ  ＲＴ−ＰＣＲを用いて指定された遺伝子の発現を分析するのに使用された。
【図２６】ＫＥＡＰ１及びＮＲＦ２の変異状態に従ってプロットされる、ＴＣＧＡ扁平上皮ＮＳＣＬＣ腫瘍における指定されたＮＲＦ２標的遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを示す一連のグラフである。エクソーム−ｓｅｑ及びＲＮＡ−ｓｅｑデータの両方が利用可能な試料のみ考慮した。ＮＲＦ２及びＫＥＡＰ１の両方の変異を有する１つの試料を除外した。加えて、ＮＲＦ２コピー数変化の証拠│ｌｏｇ２（ＣＡＮ）│＞０．５を有する試料を除外した。
【図２７】図２７Ａは、エクソン２にマッピングするリードの減少を示す、８０８個のがん細胞株にわたる相対ＮＲＦ２エクソン存在量を示すエクソーム−ｓｅｑグラフである。図２７Ｂは、１，２１８個の扁平上皮ＮＳＣＬＣ腫瘍にわたるエクソンリードカバレッジについての正規化ｚスコアを示すエクソーム−ｓｅｑグラフである。エクソン２またはエクソン２＋３についての減少したリードカウントを示す１１個の腫瘍は、近くの対照領域と比較される。
【図２８Ａ】ＮＲＦ２エクソン２またはエクソン２＋３に影響を及ぼすゲノム変化を支持する７つの腫瘍における一致しないリードペアのゲノム位置を示す概略図である。
【図２８Ｂ】ＮＲＦ２エクソン２（左パネル）及びエクソン２＋３（右パネル）焦点欠失を有する４つの腫瘍試料を示す染色体２のコピー数分析を示す一連のグラフである。矢印はＮＲＦ２エクソン２及び／またはエクソン３を指す。標的領域のｌｏｇ比は黒色で示され、対照領域は灰色で示される。
【図２８Ｃ】ＪＨＨ−６細胞、ＫＭＳ−２７細胞、ならびに原発腫瘍及び隣接する一致ＤＮＡにおけるＮＲＦ２エクソン２を囲む微小欠失の存在を示す一連の全ゲノム配列決定グラフである。欠失にわたるリードの配列を示すＮＲＦ２ＮＲＦ２。
【図２９】扁平上皮ＮＳＣＬＣを有する選択患者の総ＲＮＡから増幅されたＲＮＡ産物を示す一連のアガロースゲル画像である。ＲＴ−ＰＣＲによる患者＃５８腫瘍組織、患者＃６４腫瘍組織、患者＃６３正常組織、及び患者＃６３腫瘍組織からの増幅産物が示される。ＮＲＦ２エクソン２を囲む領域を図１１Ａに示されるプライマーで増幅した。野生型ＮＲＦ２及びΔｅ２ＮＲＦ２からの断片が示される。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、患者＃６３を、隣接する正常組織と比較して腫瘍において高度に富化された、ＮＲＦ２エクソン２の喪失を有するとして特定した。
【図３０】ＲＮＡ−ｓｅｑによって定量化される、腫瘍及び正常細胞におけるエクソン２をスキップするジャンクションリードの存在を示すグラフである。
【図３１】肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）からのＴＣＧＡ試料についての変異体ＫＥＡＰ１遺伝子シグネチャースコアのヒストグラムである。濃灰色のヒストグラムはＫＥＡＰ１／ＮＲＦ２変異体腫瘍を表し、淡灰色のヒストグラムはエクソン２／３欠失腫瘍を表し、中間灰色のヒストグラムはＫＥＡＰ１／ＮＲＦ２野生型腫瘍を表す。所与の試料についての遺伝子シグネチャースコアを、遺伝子シグネチャーにおける全ての遺伝子にわたる遺伝子発現ｚスコアの合計によって決定した。
【図３２】肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、肺腺腫（ＬＵＡＤ）、及び頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）からのＴＣＧＡ試料についての変異体ＫＥＡＰ１遺伝子シグネチャースコアの一連のヒストグラムである。濃灰色のヒストグラムはＫＥＡＰ１／ＮＲＦ２変異体腫瘍を表し、淡灰色のヒストグラムはエクソン２／３欠失腫瘍を表し、中間灰色のヒストグラムはＫＥＡＰ１／ＮＲＦ２野生型腫瘍を表す。所与の試料についての遺伝子シグネチャースコアを、遺伝子シグネチャーにおける全ての遺伝子にわたる遺伝子発現ｚスコアの合計によって決定した。
【図３３】肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、肺腺腫（ＬＵＡＤ）、及び頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）からのＴＣＧＡ試料についての変異体ＫＥＡＰ１遺伝子シグネチャースコアの一連のヒストグラムである。濃灰色のヒストグラムは腫瘍試料を表し、淡灰色のヒストグラムは正常試料を表す。所与の試料についての遺伝子シグネチャースコアを、遺伝子シグネチャーにおける全ての遺伝子にわたる遺伝子発現ｚスコアの合計によって決定した。
【図３４】ＷＧＳによって特定される、ＪＨＨ−６細胞、ＫＭＳ−２６細胞、及び原発腫瘍における欠失の構造を示す一連のジャンクションリード配列である。ＪＨＨ−６細胞の３’末端、５’末端、及びジャンクションリードのＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号６１〜６３によって提供される。ＫＭＳ−２７細胞の３’末端、５’末端、及びジャンクションリードのＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号６４〜６６によって提供される。原発腫瘍細胞の３’末端、５’末端、及びジャンクションリードのＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号６７〜６９によって提供される。
【図３５】ＮＲＦ２の相対発現を示す一連のウェスタンブロットである。指定された細胞株を、独立した非標的対照（ＮＴＣ）または３つの独立したＮＲＦ２ｓｈＲＮＡ配列（ｓｈ１、ｓｈ２、及びｓｈ３）を発現するレンチウィルスに感染させ、ピューロマイシン選択後に５００ｎｇ／ｍＬのドキシサイクリン（ｄｏｘ）あり（＋）またはなし（−）で４８時間インキュベートした。
【図３６】７日間のｄｏｘありまたはなしでのインキュベーション後の図３５に示される細胞株の生存率を示すグラフである。生存率はＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（ＣＴＧ）ＡＴＰ検出を用いて測定した。各丸は６つのテクニカルレプリケートの平均であり、値は３つの独立したＮＴＣ＋ｄｏｘの平均生存率パーセントに正規化した。
【図３７】ｄｏｘ対ｄｏｘなしで処理された細胞株の生存率を示すグラフである。細胞を４日間成長させ、生存率をＣＴＧ  ＡＴＰ測定を用いて測定した。有意性をスチューデントのｔ検定を用いて計算した。
【図３８】ＮＴＣ処理と比較したＮＲＦ２ｓｉＲＮＡでの処理後の２８個のＮＳＣＬＣ細胞株の生存率を示すグラフである。細胞をＫＥＡＰ１遺伝子型によってグループ分けした。有意性をスチューデントのｔ検定を用いて計算した。
【図３９】ＫＥＡＰ１変異体腫瘍におけるＮＲＦ２の発現を示すウェスタンブロット実験である。マウスにＮＲＦ２ｓｈ１０を発現するＡ５４９細胞を移植した。腫瘍が約２００ｍｍ３に到達したとき、１ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンまたは５％スクロースを飲料水に添加した。５日後、腫瘍抽出物をＮＲＦ２についてブロットした。
【図４０】ＫＥＡＰ１野生型腫瘍におけるＮＲＦ２の発現を示すウェスタンブロット実験である。マウスにＮＲＦ２ｓｈ１０を発現するＨ４４１細胞を移植した。腫瘍が約２００ｍｍ３に到達したとき、１ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンまたは５％スクロースを飲料水に添加した。５日後、腫瘍抽出物をＮＲＦ２についてブロットした。
【図４１】図４１Ａは、ＫＥＡＰ１変異体腫瘍が移植されたマウスにおける腫瘍体積の動力学を示すグラフである。マウスにＮＲＦ２ｓｈ１０を発現するＡ５４９細胞株を移植した。腫瘍が約２００ｍｍ３に到達したとき、マウスを１０個の群にランダム化し、１ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンまたは５％スクロースのいずれかを飲料水に添加した。腫瘍を２８日間にわたって測定した。エラーバーは、ＳＥＭ（ｎ＝１０）を表す。図４１Ｂは、ＫＥＡＰ１野生型腫瘍が移植されたマウスにおける腫瘍体積の動力学を示すグラフである。マウスにＮＲＦ２ｓｈ１０を発現するＨ４４１細胞株を移植した。腫瘍が約２００ｍｍ３に到達したとき、マウスを１０個の群にランダム化し、１ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンまたは５％スクロースのいずれかを飲料水に添加した。腫瘍を２８日間にわたって測定した。エラーバーは、ＳＥＭ（ｎ＝１０）を表す。
【図４２】様々な成長条件におけるＡ５４９またはＨ４４１細胞の生存率を示す一連の棒グラフである。ＮＴＣまたはＮＲＦ２ｓｈ１０ｓｈＲＮＡを発現するＡ５４９及びＨ４６０細胞を、２Ｄ組織培養処理プラスチック皿または超低接着（ＵＬＡ）被覆組織培養プレートに播種した。それらを次いで５日間にわたり環境酸素濃度または０．５％酸素（低酸素）のいずれかで培養した。細胞生存率をＣＴＧ  ＡＴＰ測定によって評価した。
【図４３】ビヒクル、５００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘ、または１ｍＭの還元グルタチオン（ＧＳＨ）を含む軟寒天におけるＫＥＡＰ１変異体細胞株（Ａ５４９、Ｈ１４３７、及びＨ４６０）及びＫＥＡＰ１野生型細胞株（Ｈ１０４８、Ｈ４４１、及びＣａｌｕ６）のコロニー形成を示す一連の写真である。プレートの代表的な領域を撮影した。
【図４４】図４３に示される各細胞タイプ及び処理群についての定量化されたコロニー形成を示す一連の棒グラフである。エラーバーは、生体３重のウェルからの標準偏差を表す。
【図４５】ＳＣＩＶＡＸ（登録商標）マイクロパターン化ナノ培養皿上でのＡ５４９コロニー形成を示す一連の写真である。細胞を５００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘの存在または不在下での培養の約５日後に撮影した。
【図４６】ＣＴＧ  ＡＴＰ測定によって定量化される、図４５からの細胞の生存率を示す棒グラフである。各処理群の左欄は１，０００個細胞培養を表し、右欄は５，０００個細胞培養を表す。
【図４７】メチルセルロース含有組織培養皿に播種された５，０００、５０，０００、または５００，０００個のＮＴＣまたはＮＲＦ２ｓｈ１０ｓｈＲＮＡ発現Ａ５４９細胞を示す一連の写真である。細胞を５００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンの存在または不在下での培養の約１０日後に撮影した。
【図４８】通常の組織培養皿（上）または軟寒天（下）に播種されたＮＲＦ２ｓｈ１０ｓｈＲＮＡを発現するＡ５４９細胞を示す一連の写真である。細胞を、２ｍＭのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）の存在または不在下、ビヒクルまたは５００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンのいずれかで処理した。２Ｄ成長における生存率を約５日後にＣＴＧ  ＡＴＰ測定によって測定し、軟寒天における細胞の写真を成長の約１０日後に取得した。
【図４９】２’，７’−ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート（Ｈ２ＤＣＦ）を用いて測定される指定された条件下での活性酸素種（ＲＯＳ）レベルを示す棒グラフである。エラーバーは、３重のウェルからの標準偏差を表す。
【図５０】ＳＬＣ７Ａ１１の発現に対するＮＲＦ２ノックダウンの効果を示すウェスタンブロット実験である。ＮＲＦ２ｓｈ１０を発現するＡ５４９細胞を、指定された時点についてビヒクルまたは５００ｎｇ／ｍｌのｄｏｘで処理し、ＳＬＣ７Ａ１１及びβ−アクチン抗体を使用してブロットした。
【図５１】様々な濃度のエラスチンにわたりＮＴＣ１またはＮＲＦ２ｓｈ１０を発現するＡ５４９細胞によるシスチン取り込みを示す棒グラフである。ＮＴＣ１またはＮＲＦ２ｓｈ１０を発現するＡ５４９細胞を、ビヒクルまたはｄｏｘで４８時間インキュベートした後、０．５ｕＣｉ１４Ｃ−シスチンで２０分間インキュベートした。細胞を溶解し、細胞内シスチンを液体シンチレーション計数によって測定した。
【図５２】ＮＲＦ２ノックダウンへの応答におけるＡ５４９及びＨ１４３７細胞のグルタチオン（ＧＳＨ）レベルを示す棒グラフである。
【図５３】Ｈ２ＤＣＦによって測定される、ｓｈＮＲＦ２及び／またはエラスチンへの応答において増加するＲＯＳレベルを示すヒストグラムである。
【図５４】ＣＴＧ  ＡＴＰ測定を使用して測定される、約４日後のエラスチンの用量応答にわたってｓｈＮＴＣまたはｓｈＮＦＲ２を発現するＡ５４９細胞の生存率を示すグラフである。
【図５５】図５５Ａは、図５４に示される用量応答グラフから誘導される、ＫＥＡＰ１野生型細胞株対ＫＥＡＰ１変異体細胞株についてのエラスチンのＩＣ５０を示すグラフである。図５５Ｂは、図５４に示される用量応答グラフの曲線下面積として、エラスチンへの応答におけるＫＥＡＰ１野生型細胞株対ＫＥＡＰ１変異体細胞株の生存率を示すグラフである。
【図５６】図５６Ａは、ＫＥＡＰ１野生型細胞株対ＫＥＡＰ１変異体細胞株についてのグルタミナーゼ阻害剤ＢＰＴＥＳのＩＣ５０を示すグラフである。図５６Ｂは、グルタミナーゼ阻害剤ＢＰＴＥＳへの応答におけるＫＥＡＰ１野生型細胞株対ＫＥＡＰ１変異体細胞株の生存率を示すグラフである。
【図５７】図５７Ａは、ＫＥＡＰ１野生型細胞株対ＫＥＡＰ１変異体細胞株についてのグルタチオンシンターゼ阻害剤ブチオニンシルホキシミン（ＢＳＯ）のＩＣ５０を示すグラフである。図５７Ｂは、ＢＳＯへの応答におけるＫＥＡＰ１野生型細胞株対ＫＥＡＰ１変異体細胞株の生存率を示すグラフである。
【図５８】３Ｄメチルセルロース培養対２Ｄプラスチック組織培養皿１５日間成長ＫＥＡＰ１変異体ＮＳＣＬＣ細胞における指定された遺伝子毎の平均ｇＲＮＡ発現を示す散布図である。Ａ５４９細胞を、４８１個のＮＲＦ２／ＫＥＡＰ１標的遺伝子及び３７個の対照遺伝子を含むｇＲＮＡライブラリーを発現するレンチウィルス（１０００ｘカバレッジで０．３ＭＯＩ）に感染させた。ピューロマイシン耐性細胞を、次いで２Ｄプラスチック組織培養皿に播種するか、またはメチルセルロースにおいて成長させた。様々な時点後、細胞を回収し、ｇＲＮＡをＮｅｘｔ  Ｇｅｎ配列決定によって特定した。
【図５９】ヌードマウス（異種）移植対２Ｄプラスチック組織培養皿１５日間成長ＫＥＡＰ１変異体ＮＳＣＬＣ細胞における指定された遺伝子毎の平均ｇＲＮＡ発現を示す散布図である。Ａ５４９細胞を、４８１個のＮＲＦ２／ＫＥＡＰ１標的遺伝子及び３７個の対照遺伝子を含むｇＲＮＡライブラリーを発現するレンチウィルス（１０００ｘカバレッジで０．３ＭＯＩ）に感染させた。ピューロマイシン耐性細胞を、次いで２Ｄプラスチック組織培養皿に播種するか、またはヌードマウスに移植した。様々な時点後、細胞を回収し、ｇＲＮＡをＮｅｘｔ  Ｇｅｎ配列決定によって特定した。
【図６０】ヌードマウス（異種）移植対３Ｄメチルセルロース培地１５日間成長ＫＥＡＰ１変異体ＮＳＣＬＣ細胞における指定された遺伝子毎の平均ｇＲＮＡ発現を示す散布図である。Ａ５４９細胞を、４８１個のＮＲＦ２／ＫＥＡＰ１標的遺伝子及び３７個の対照遺伝子を含むｇＲＮＡライブラリーを発現するレンチウィルス（１０００ｘカバレッジで０．３ＭＯＩ）に感染させた。ピューロマイシン耐性細胞を次いでメチルセルロースにおいて成長させ、ヌードマウスに移植した。様々な時点後、細胞を回収し、ｇＲＮＡをＮｅｘｔ  Ｇｅｎ配列決定によって特定した。
【図６１】Ｅｒｂ２抗体ＹＷ５７．８８．５での処理への応答におけるＡ５４９異種移植片腫瘍体積の動力学を示すグラフである。
【図６２】ＩＧＦ１Ｒ阻害剤リンシチニブ及びＮＶＰ−ＡＥＷ５４１の存在下、ならびにグルタチオンの存在または不在下で軟寒天（足場非依存性条件）において成長させたＫＥＡＰ１変異体細胞株及びＫＥＡＰ１野生型細胞株のコロニー形成を示す一連の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
Ｉ．導入
本発明は、肺癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）または頭頸部扁平上皮癌（例えば、ＨＮＳＣ）などの、がんのための診断方法及び付随する治療方法を提供する。本発明は、少なくとも部分的に、エクソン２またはエクソン２＋３を除去するＮＲＦ２におけるスプライス変異体が、がんにおいてＮＲＦ２活性化を与える予想外のメカニズムをもたらすという発見に基づく。ＮＲＦ２スプライス変異体は、ＫＥＡＰ１またはＮＲＦ２における変異からの相互排他的なメカニズムによってＮＲＦ２活性化をもたらし、また同様のＮＲＦ２標的遺伝子発現プロファイルをもたらす。これらのＮＲＦ２スプライス変異体をもたらす微小欠失を有する細胞株には、ＮＲＦ２−ＫＥＡＰ１相互作用の喪失、増加したＮＲＦ２安定化、ＮＲＦ２転写応答の誘発、及びＮＲＦ２経路依存性がある。これは扁平上皮ＮＳＣＬＣの３〜６％及びＨＮＳＣの１〜２％において発生し、ＫＥＡＰ１変異と同様のＮＲＦ２標的遺伝子の活性化及び経路への依存性をもたらす。
【００３８】
この発見は、（例えば、ＮＲＦ２スプライス変異体を検出することによって、またはＮＲＦ２スプライス変異体の存在と一貫した遺伝子もしくはタンパク質発現プロファイルを検出することによって）がんに罹患している対象を診断すること、及び（治療有効量のＮＲＦ２経路アンタゴニスト、例えば、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）結合タンパク質（ＣＢＰ）阻害剤を投与することによって）このような診断に従って対象を治療することに有用である。
【００３９】
ＩＩ．定義
「診断する」、「診断すること」、または「診断」という用語は、本明細書では分子的または病理学的状態、疾患、または病態（例えば、がん）の特定または分類を指すために使用される。例えば、「診断」とは、特定のタイプのがんの特定を指し得る。「診断」はまた、例えば、組織病理学的基準による、または分子的特徴による、がんの特定のサブタイプ（例えば、１つのバイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせ（例えば、特定の遺伝子またはその遺伝子によってコードされたタンパク質）の発現を特徴とするサブタイプ）の分類を指し得る。
【００４０】
「がん」及び「がん性」という用語は、典型的には制御されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか、または説明する。この定義には、良性及び悪性がん、ならびに潜伏腫瘍または微小転移が含まれる。がんの例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、膠芽細胞腫、肉腫、及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。がんとしては、例えば、乳癌、扁平上皮細胞癌、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌（例えば、扁平上皮ＮＳＣＬＣ）を含む）、様々なタイプの頭頸部癌（例えば、ＨＮＳＣ）、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）または胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）（消化管癌を含む）、膵臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）または腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、及び肝癌、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非開裂細胞性ＮＨＬ、巨大病変性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びワルデンストレームマクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞性白血病、慢性骨髄芽球性白血病、及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、及びメイグス症候群に関連する異常血管増殖を挙げることができる。
【００４１】
本明細書における「患者」または「対象」は、がんなどの疾患または障害の１つ以上の兆候、症状、または他の指標を経験しているまたは経験したことがある、治療に適格な、ヒトなどの任意の単一の動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、動物園動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、非ヒト霊長類、及びヒトなどの、哺乳動物を含む）を指す。患者として含まれることが意図されるのは、疾患のいかなる臨床的兆候も示さない臨床研究に関与する任意の患者、疫学的研究に関与する患者、または一度対照として用いられた患者である。患者は、ＮＲＦ２経路アンタゴニストまたは別の薬物で以前に治療されていても、治療されてなくてもよい。患者は、本明細書における治療が開始されるときに使用される追加の薬物（複数可）に対してナイーブであってもよく、すなわち、患者は、「ベースライン」で（すなわち、治療が開始される前に対象をスクリーニングする日など、本明細書における治療方法におけるＮＲＦ２経路アンタゴニストの第１の用量の投与前の時点における設定点で）、例えば、ＮＲＦ２経路アンタゴニスト（例えば、ＶＥＧＦアンタゴニストまたはＰＤ−１軸結合アンタゴニスト）以外の療法で以前に治療されていない場合がある。このような「ナイーブな」患者または対象は、一般に、このような追加の薬物（複数可）での治療の候補者とみなされる。
【００４２】
「発現のレベル」または「発現レベル」という用語は、一般に互換的に使用され、一般に生体試料におけるバイオマーカーの量を指す。「発現」は概して、これにより情報（例えば、遺伝子コード及び／またはエピジェネティック情報）が、細胞において存在し、機能する構造に変換されるプロセスを指す。したがって、本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドへの転写、ポリペプチドへの翻訳、またはさらにポリヌクレオチド及び／もしくはポリペプチド修飾（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾）を指し得る。転写ポリヌクレオチド、翻訳ポリペプチド、またはポリヌクレオチド及び／もしくはポリペプチド修飾（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾）の断片はまた、それらが代替的スプライシングによって生成される転写物もしくは分解転写物に由来しようが、または例えば、タンパク質分解による、ポリペプチドの翻訳後プロセシングに由来しようが、発現したとみなされる。「発現した遺伝子」は、ｍＲＮＡとしてポリヌクレオチドに転写され、その後、ポリペプチドに翻訳されるもの、及びまたＲＮＡに転写されるが、ポリペプチドに翻訳されないもの（例えば、転移及びリボソームＲＮＡ）を含む。
【００４３】
「バイオマーカー」及び「マーカー」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、または糖脂質ベースの分子マーカーを指すために本明細書では互換的に使用され、対象または患者の試料におけるこの発現または存在は、標準的な方法（または本明細書に開示される方法）によって検出することができる。このようなバイオマーカーは、表１に記載されるｍＲＮＡ配列、及びこれらのコードされたタンパク質を含むが、これらに限定されない。このようなバイオマーカーの発現は、参照レベル（例えば、患者、例えば、がんを有し、ＮＲＦ２経路アンタゴニストへの応答性について試験されている患者の群／集団からの試料におけるバイオマーカーの平均（例えば、平均または中央）発現レベル、患者、例えば、がんを有し、ＮＲＦ２経路アンタゴニストに応答しないとして特定された患者の群／集団からの試料におけるバイオマーカーの中央発現レベル、前回個体から予め入手していた試料におけるレベル、または原発腫瘍環境においてＮＲＦ２経路アンタゴニストでの前治療を受け、現在は転移を経験し得る患者からの試料におけるレベルを含む）よりも、ＮＲＦ２経路アンタゴニストに感受性または応答性の患者から得られる試料においてより高いまたはより低いことが決定され得る。表１に記載されるものなどの、少なくとも１つの遺伝子の参照発現レベルよりも高いまたは低い発現レベルを有する個体は、ＮＲＦ２経路アンタゴニストでの治療に応答する可能性がある対象／患者として特定することができる。例えば、参照レベル（平均レベルなど）に対して（すなわち、これよりも高い、または低い）最も極端に５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％の発現レベルを示すこのような対象／患者は、ＮＲＦ２経路アンタゴニストでの治療に応答する可能性がある対象／患者（例えば、がんを有する患者）として特定することができる。
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【００４４】
本明細書で使用される「ＡＢＣＣ２」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＡＢＣＣ２（ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＣ、メンバー２）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＡＢＣＣ２、及び細胞内でのプロセシングから得られるＡＢＣＣ２の任意の形態を包含する。用語は、ＡＢＣＣ２の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＡＢＣＣ２の核酸配列は、配列番号１に記載される。ヒトＡＢＣＣ２によってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３３に示される。
【００４５】
本明細書で使用される「ＡＫＲ１Ｂ１０」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＡＫＲ１Ｂ１０（アルド−ケトレダクターゼファミリー１、メンバーＢ１０）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＡＫＲ１Ｂ１０、及び細胞内でのプロセシングから得られるＡＫＲ１Ｂ１０の任意の形態を包含する。用語は、ＡＫＲ１Ｂ１０の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＡＫＲ１Ｂ１０の核酸配列は、配列番号２に記載される。ヒトＡＫＲ１Ｂ１０によってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３４に示される。
【００４６】
本明細書で使用される「ＡＫＲ１Ｂ１５」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＡＫＲ１Ｂ１５（アルド−ケトレダクターゼファミリー１、メンバーＢ１５）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＡＫＲ１Ｂ１５、及び細胞内でのプロセシングから得られるＡＫＲ１Ｂ１５の任意の形態を包含する。用語は、ＡＫＲ１Ｂ１５の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＡＫＲ１Ｂ１５の核酸配列は、配列番号３に記載される。ヒトＡＫＲ１Ｂ１５によってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３５に示される。
【００４７】
本明細書で使用される「ＡＫＲ１Ｃ２」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＡＫＲ１Ｃ２（アルド−ケトレダクターゼファミリー１、メンバーＣ２）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＡＫＲ１Ｃ２、及び細胞内でのプロセシングから得られるＡＫＲ１Ｃ２の任意の形態を包含する。用語は、ＡＫＲ１Ｃ２の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＡＫＲ１Ｃ２の核酸配列は、配列番号４に記載される。ヒトＡＫＲ１Ｃ２によってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３６に示される。
【００４８】
本明細書で使用される「ＡＫＲ１Ｃ３」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＡＫＲ１Ｃ３（アルド−ケトレダクターゼファミリー１、メンバーＣ３）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＡＫＲ１Ｃ３、及び細胞内でのプロセシングから得られるＡＫＲ１Ｃ３の任意の形態を包含する。用語は、ＡＫＲ１Ｃ３の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＡＫＲ１Ｃ３の核酸配列は、配列番号５に記載される。ヒトＡＫＲ１Ｃ３によってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３７に示される。
【００４９】
本明細書で使用される「ＡＫＲ１Ｃ４」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＡＫＲ１Ｃ４（アルド−ケトレダクターゼファミリー１、メンバーＣ４）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＡＫＲ１Ｃ４、及び細胞内でのプロセシングから得られるＡＫＲ１Ｃ４の任意の形態を包含する。用語は、ＡＫＲ１Ｃ４の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＡＫＲ１Ｃ４の核酸配列は、配列番号６に記載される。ヒトＡＫＲ１Ｃ４によってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３８に示される。
【００５０】
本明細書で使用される「ＣＡＢＹＲ」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＣＡＢＹＲ（カルシウム結合チロシン−（Ｙ）−リン酸化制御）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＣＡＢＹＲ、及び細胞内でのプロセシングから得られるＣＡＢＹＲの任意の形態を包含する。用語は、ＣＡＢＹＲの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＣＡＢＹＲの核酸配列は、配列番号７に記載される。ヒトＣＡＢＹＲによってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号３９に示される。
【００５１】
本明細書で使用される「ＣＹＰ４Ｆ１１」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＣＹＰ４Ｆ１１（染色体Ｐ４５０、ファミリー４、サブファミリーＦ、ポリペプチド１１）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＣＹＰ４Ｆ１１、及び細胞内でのプロセシングから得られるＣＹＰ４Ｆ１１の任意の形態を包含する。用語は、ＣＹＰ４Ｆ１１の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＣＹＰ４Ｆ１１の核酸配列は、配列番号８に記載される。ヒトＣＹＰ４Ｆ１１によってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４０に示される。
【００５２】
本明細書で使用される「ＦＥＣＨ」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＦＥＣＨ（フェロケラターゼ）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＦＥＣＨ、及び細胞内でのプロセシングから得られるＦＥＣＨの任意の形態を包含する。用語は、ＦＥＣＨの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＦＥＣＨの核酸配列は、配列番号９に記載される。ヒトＦＥＣＨによってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４１に示される。
【００５３】
本明細書で使用される「ＦＴＬ」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＦＴＬ（フェリチン、軽鎖ポリペプチド）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＦＴＬ、及び細胞内でのプロセシングから得られるＦＴＬの任意の形態を包含する。用語は、ＦＴＬの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＦＴＬの核酸配列は、配列番号１０に記載される。ヒトＦＴＬによってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４２に示される。
【００５４】
本明細書で使用される「ＧＣＬＭ」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＧＣＬＭ（グルタミン酸システインリガーゼ、修飾因子サブユニット）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＧＣＬＭ、及び細胞内でのプロセシングから得られるＧＣＬＭの任意の形態を包含する。用語は、ＧＣＬＭの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＧＣＬＭの核酸配列は、配列番号１１に記載される。ヒトＧＣＬＭによってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４３に示される。
【００５５】
本明細書で使用される「ＧＳＲ」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＧＳＲ（グルタチオンレダクターゼ）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＧＳＲ、及び細胞内でのプロセシングから得られるＧＳＲの任意の形態を包含する。用語は、ＧＳＲの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＧＳＲの核酸配列は、配列番号１２に記載される。ヒトＧＳＲによってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４４に示される。
【００５６】
本明細書で使用される「ＫＹＮＵ」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＫＹＮＵ（キヌレニナーゼ）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＫＹＮＵ、及び細胞内でのプロセシングから得られるＫＹＮＵの任意の形態を包含する。用語は、ＫＹＮＵの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＫＹＮＵの核酸配列は、配列番号１３に記載される。ヒトＫＹＮＵによってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４５に示される。
【００５７】
本明細書で使用される「ＭＥ１」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＭＥ１（リンゴ酸酵素１、ＮＡＤＰ（＋）依存性、細胞質性）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＭＥ１、及び細胞内でのプロセシングから得られるＭＥ１の任意の形態を包含する。用語は、ＭＥ１の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＭＥ１の核酸配列は、配列番号１４に記載される。ヒトＭＥ１によってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４６に示される。
【００５８】
本明細書で使用される「ＮＦＥ２Ｌ２」または「ＮＲＦ２」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＮＦＥ２Ｌ２またはＮＲＦ２（核内因子、赤血球系２様２）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＮＦＥ２Ｌ２、及び細胞内でのプロセシングから得られるＮＦＥ２Ｌ２の任意の形態を包含する。用語は、ＮＦＥ２Ｌ２の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＮＦＥ２Ｌ２の核酸配列は、配列番号１５に記載される。ヒトＮＦＥ２Ｌ２によってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４７に示される。
【００５９】
本明細書で使用される「ＮＱＯ１」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＮＱＯ１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ、キノン１）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＮＱＯ１、及び細胞内でのプロセシングから得られるＮＱＯ１の任意の形態を包含する。用語は、ＮＱＯ１の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＮＱＯ１の核酸配列は、配列番号１６に記載される。ヒトＮＱＯ１によってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４８に示される。
【００６０】
本明細書で使用される「ＮＲ０Ｂ１」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＮＲ０Ｂ１（核内受容体サブファミリー０、グループＢ、メンバー１）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＮＲ０Ｂ１、及び細胞内でのプロセシングから得られるＮＲ０Ｂ１の任意の形態を包含する。用語は、ＮＲ０Ｂ１の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＮＲ０Ｂ１の核酸配列は、配列番号１７に記載される。ヒトＮＲ０Ｂ１によってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号４９に示される。
【００６１】
本明細書で使用される「ＯＳＧＩＮ１」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＯＳＧＩＮ１（酸化ストレス誘発性成長阻害剤１）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＯＳＧＩＮ１、及び細胞内でのプロセシングから得られるＯＳＧＩＮ１の任意の形態を包含する。用語は、ＯＳＧＩＮ１の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＯＳＧＩＮ１の核酸配列は、配列番号１８に記載される。ヒトＯＳＧＩＮ１によってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５０に示される。
【００６２】
本明細書で使用される「ＰＧＤ」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＰＧＤ（ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＰＧＤ、及び細胞内でのプロセシングから得られるＰＧＤの任意の形態を包含する。用語は、ＰＧＤの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＰＧＤの核酸配列は、配列番号１９に記載される。ヒトＰＧＤによってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５１に示される。
【００６３】
本明細書で使用される「ＲＳＰＯ３」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＲＳＰＯ３（Ｒ−スポンジン３）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＲＳＰＯ３、及び細胞内でのプロセシングから得られるＲＳＰＯ３の任意の形態を包含する。用語は、ＲＳＰＯ３の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＲＳＰＯ３の核酸配列は、配列番号２０に記載される。ヒトＲＳＰＯ３によってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５２に示される。
【００６４】
本明細書で使用される「ＳＬＣ７Ａ１１」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＳＬＣ７Ａ１１（溶質ファミリー７（アニオン性アミノ酸輸送体軽鎖、Ｘｃ−システム）、メンバー１１）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＳＬＣ７Ａ１１、及び細胞内でのプロセシングから得られるＳＬＣ７Ａ１１の任意の形態を包含する。用語は、ＳＬＣ７Ａ１１の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＳＬＣ７Ａ１１の核酸配列は、配列番号２１に記載される。ヒトＳＬＣ７Ａ１１によってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５３に示される。
【００６５】
本明細書で使用される「ＳＲＸＮ１」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＳＲＸＮ１（スルフィレドキシン１）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＳＲＸＮ１、及び細胞内でのプロセシングから得られるＳＲＸＮ１の任意の形態を包含する。用語は、ＳＲＸＮ１の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＳＲＸＮ１の核酸配列は、配列番号２２に記載される。ヒトＳＲＸＮ１によってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５４に示される。
【００６６】
本明細書で使用される「ＴＡＬＤＯ１」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＴＡＬＤＯ１（トランスアルドラーゼ１）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＴＡＬＤＯ１、及び細胞内でのプロセシングから得られるＴＡＬＤＯ１の任意の形態を包含する。用語は、ＴＡＬＤＯ１の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＴＡＬＤＯ１の核酸配列は、配列番号２３に記載される。ヒトＴＡＬＤＯ１によってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５５に示される。
【００６７】
本明細書で使用される「ＴＲＩＭ１６」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＴＲＩＭ１６（１６含有トリパルタイトモチーフ）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＴＲＩＭ１６、及び細胞内でのプロセシングから得られるＴＲＩＭ１６の任意の形態を包含する。用語は、ＴＲＩＭ１６の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＴＲＩＭ１６の核酸配列は、配列番号２４に記載される。ヒトＴＲＩＭ１６によってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５６に示される。
【００６８】
本明細書で使用される「ＴＲＩＭ１６Ｌ」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＴＲＩＭ１６Ｌ（トリパルタイトモチーフ含有１６様）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＴＲＩＭ１６Ｌ、及び細胞内でのプロセシングから得られるＴＲＩＭ１６Ｌの任意の形態を包含する。用語は、ＴＲＩＭ１６Ｌの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＴＲＩＭ１６Ｌの核酸配列は、配列番号２５に記載される。ヒトＴＲＩＭ１６Ｌによってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５７に示される。
【００６９】
本明細書で使用される「ＴＸＮ」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＴＸＮ（チオレドキシン）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＴＸＮ、及び細胞内でのプロセシングから得られるＴＸＮの任意の形態を包含する。用語は、ＴＸＮの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＴＸＮの核酸配列は、配列番号２６に記載される。ヒトＴＸＮによってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５８に示される。
【００７０】
本明細書で使用される「ＴＸＮＲＤ１」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＴＸＮＲＤ１（チオレドキシンレダクターゼ１）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＴＸＮＲＤ１、及び細胞内でのプロセシングから得られるＴＸＮＲＤ１の任意の形態を包含する。用語は、ＴＸＮＲＤ１の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＴＸＮＲＤ１の核酸配列は、配列番号２７に記載される。ヒトＴＸＮＲＤ１によってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号５９に示される。
【００７１】
本明細書で使用される「ＵＧＤＨ」という用語は、別途指定されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の任意の天然ＵＧＤＨ（ウリジンジホスホ（ＵＤＰ）−グルコース６−デヒドロゲナーゼ）を指す。用語は、「全長」の非プロセシングＵＧＤＨ、及び細胞内でのプロセシングから得られるＵＧＤＨの任意の形態を包含する。用語は、ＵＧＤＨの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。例示的ヒトＵＧＤＨの核酸配列は、配列番号２８に記載される。ヒトＵＧＤＨによってコードされる例示的タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号６０に示される。
【００７２】
「試料」及び「生体試料」という用語は、体液、体組織（例えば、腫瘍組織）、細胞、または他の源を含む個体から得られる任意の生体試料を指すために互換的に使用される。体液は、例えば、リンパ、血清、全生血、末梢血単核細胞、凍結全血、血漿（生または凍結を含む）、尿、唾液、精液、滑液、及び髄液である。試料には、乳房組織、腎組織、結腸組織、脳組織、筋組織、滑膜組織、皮膚、毛包、骨髄、及び腫瘍組織も含まれる。哺乳動物に由来する組織生検及び体液を得るための方法は当該技術分野で周知である。
【００７３】
「組織試料」または「細胞試料」とは、対象または個体の組織から得られる同様の細胞の集合を意味する。組織または細胞試料の供給源は、生、凍結、及び／または保存器官、組織試料、生検、及び／または吸引物からの固形組織；血液または血漿などの任意の血液成分；脳脊髄液、羊膜液、腹水、または間質液などの体液；対象の妊娠または発達中の任意の時点からの細胞であってもよい。組織試料はまた、初代または培養細胞または細胞株であってもよい。任意に、組織または細胞試料は、疾患組織／器官から得られる。組織試料は、防腐剤、抗凝血剤、緩衝剤、固定剤、栄養剤、抗生物質などの天然の組織と天然では混合しない化合物を含有し得る。
【００７４】
本明細書で使用される「参照試料」、「参照細胞」、「参照組織」、「対照試料」、「対照細胞」、または「対照組織」とは、比較目的のために使用される試料、細胞、組織、標準物、またはレベルを指す。一実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、同じ対象または個体の身体の健常及び／または非罹患部分（例えば、組織または細胞）から得られる。例えば、罹患細胞または組織に隣接する健常及び／または非罹患細胞または組織（例えば、腫瘍に隣接する細胞または組織）。別の実施形態では、参照試料は、同じ対象または個体の身体の未治療組織及び／または細胞から得られる。また別の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、対象または個体ではない個体の身体の健常及び／または非罹患部分（例えば、組織または細胞）から得られる。さらに別の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、対象または個体ではない個体の身体の未治療組織及び／または細胞から得られる。別の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、１つ以上の細胞株（例えば、１つ以上の正常細胞株）から得られる。
【００７５】
本明細書で使用される「患者を特定すること」または「患者を特定する」という語句は、患者を、ＮＲＦ２経路アンタゴニストを含む療法から利益を得る可能性が高い、または低いとして特定または選択するために、患者の試料における表１に記載される遺伝子のうちの少なくとも１つのレベル、そのエクソン２もしくはエクソン２＋３の全部もしくは一部の欠失を有するＮＲＦ２ｍＲＮＡの存在、またはそのＮｅｈ２もしくはＮｅｈ２＋４の全部もしくは一部の欠失を有するＮＲＦ２タンパク質の存在に関して生成された情報またはデータを使用することを指す。使用または生成される情報またはデータは、任意の形態、文書、口頭、または電子であり得る。いくつかの実施形態では、生成された情報またはデータの使用は、通信、提示、報告、保存、送信、移行、供給、伝送、分配、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、通信、提示、報告、保存、送信、移行、供給、伝送、分配、またはこれらの組み合わせは、コンピュータデバイス、アナライザユニット、またはこれらの組み合わせによって行われる。いくつかのさらなる実施形態では、通信、提示、報告、保存、送信、移行、供給、伝送、分配、またはこれらの組み合わせは、実験または医療従事者によって行われる。いくつかの実施形態では、情報またはデータは、表１に記載される遺伝子のうちの少なくとも１つレベルの、参照レベルとの比較を含む。いくつかの実施形態では、情報またはデータは、表１に記載される遺伝子のうちの少なくとも１つが試料に存在する、または存在しない指標を含む。いくつかの実施形態では、情報またはデータは、ＮＲＦ２ｍＲＮＡがそのエクソン２またはエクソン２＋３の全部または一部の欠失を有する指標を含む。いくつかの実施形態では、情報またはデータは、ＮＲＦ２タンパク質がそのＮｅｈ２またはＮｅｈ２＋４の全部または一部の欠失を有する指標を含む。いくつかの実施形態では、情報またはデータは、患者がＮＲＦ２経路アンタゴニストを含む療法に応答する可能性が高い、または低い指標を含む。
【００７６】
「プライマー」という用語は、一般に遊離３’−ＯＨ基を提供することによって、核酸にハイブリダイズし、相補的核酸の重合を可能にすることができる一本鎖ポリヌクレオチドを指す。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「治療」という用語（及び「治療する」または「治療すること」などの、その変形）は、治療されている個体の自然経過を変化させることを目的とした臨床介入を指し、予防のために、または臨床病理の経過中に実施され得る。治療の望ましい効果としては、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的病理結果の低減、転移の防止、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、及び寛解または予後向上が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体を使用して、疾患の発達を遅延させるか、または疾患の進行を減速させる。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「投与すること」は、ある投薬量の化合物（例えば、ＮＲＦ２経路アンタゴニスト）を対象に与える方法を意味する。本明細書に記載される方法に用いられる組成物は、例えば、硝子体内（例えば、硝子体内注射により）、点眼により、筋肉内、静脈内、皮内、経皮、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、髄腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、腹膜内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼内、眼窩内、経口、局所、経皮、吸入により、注射により、移植により、注入により、持続注入により、標的細胞に直接的に浸す局所灌流により、カテーテルにより、洗浄により、クリーム中で、または脂質組成物中で投与され得る。本明細書に記載の方法で利用される組成物はまた、全身または局所投与され得る。投与方法は、様々な因子（例えば、投与される化合物または組成物、及び治療される状態、疾患、または障害の重症度）に応じて多様であり得る。
【００７９】
薬剤、例えば、医薬製剤の「有効量」とは、必要な投与量で必要な期間にわたって所望の治療または予防結果を達成するのに有効な量を指す。
【００８０】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異的抗体）、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
【００８１】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するように、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後に、かついかなる保存的置換も配列同一性の一部とは見なさずに、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列は、当該技術分野の範囲内の様々な方法で、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。当業者であれば、比較されている配列の完全長にわたって最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって記述され、ソースコードは、ユーザ文書と共に米国著作権庁（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，２０５５９）に提出されており、米国著作権番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．から公的に入手可能であるか、またはソースコードからコンパイルされ得る。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムにより設定されており、変動しない。
【００８２】
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に用いられる状況下で、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％（代替的に、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、またはそれに対する特定のアミノ酸配列同一性％を有するか、または含む、所与のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、以下のように計算される：
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列整列プログラムＡＬＩＧＮ−２によってそのプログラムのＡとＢとの整列において完全な一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは等しくないことが理解される。別途具体的に示されない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、直前の段落に記載されるようにＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して得られる。
【００８３】
「抗腫瘍剤」という用語は、少なくとも１つの活性治療剤、例えば、「抗がん剤」を含むがん治療において有用な組成物を指す。治療剤（抗がん剤）の例としては、例えば、化学療法剤、成長阻害剤、細胞傷害性剤、放射線療法で使用される薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、及びがんを治療するための他の薬剤、例えば、抗ＨＥＲ−２抗体、抗ＣＤ２０抗体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（商標）、血小板由来成長因子阻害剤（例えば、ＧＬＥＥＶＥＣ（商標）（メシル酸イマチニブ））、ＣＯＸ−２阻害剤（例えば、セレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、またはＶＥＧＦ受容体（複数可）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２のうちの１つ以上に結合するアンタゴニスト（例えば、中和抗体）、ならびに他の生物活性及び有機化学剤などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの組み合わせもまた、本発明に含まれる。
【００８４】
本明細書で使用される「細胞傷害性剤」という用語は、細胞機能を阻害もしくは阻止する、及び／または細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性剤には、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体）；化学療法剤または化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレート剤）；成長阻害剤；核酸分解酵素などの酵素及びそれらの断片、抗生物質、それらの断片及び／または変異体を含む、細菌、真菌、植物、または動物由来の小分子毒素または酵素活性毒素などの毒素、ならびに以下に開示される様々な抗腫瘍剤または抗がん剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
「化学療法剤」は、がんの治療に有用な化学化合物である。「化学療法剤」の例は、がんの治療に有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、例えば、テモゾロミド（ＴＭＺ）、アルキル化剤ダカルバジンのイミダゾテトラジン誘導体などの、アルキル化剤が挙げられる。化学療法剤のさらなる例としては、例えば、パクリタキセルもしくはトポテカンまたはペグ化リポソームドキソルビシン（ＰＬＤ）が挙げられる。化学療法剤の他の例としては、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）シクロスホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、及びウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチローロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンイミン及びメチルアメラミン；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン（ｃｈｌｏｒｎａｐｈａｚｉｎｅ）、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムヌスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ）などのニトロスレア；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアミシン、特にカリケアミシンγ１Ｉ及びカリケアミシンωＩ１（例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３−１８６（１９９４）参照）などの抗生物質；ダイネミシンＡを含む、ダイネミシン；クロドロネートなどの、ビスホスホネート；エスペラミシン；ならびにネオカルチノスタチン発光団及び関連色素タンパク質エネジイン抗生物質発光団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシ��、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシン及びアンサマイトシンなどのマイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標）パクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）パクリタキセルのクレモフォールフリーのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌ．）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）ドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン、及びカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）（イリノテカンと５−ＦＵ及びロイコボリンの治療レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；コムブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン治療レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）を含む、オキサリプラチン；ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ．ＲＴＭ．）；細胞増殖を低減するＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ（例えば、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ．ＲＴＭ．））、及びＶＥＧＦの阻害剤、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。
【００８６】
「プログラム死リガンド１」及び「ＰＤ−Ｌ１」という用語は、本明細書において、天然配列ＰＤ−Ｌ１ポリペプチド、ポリペプチド変異体、ならびに天然配列ポリペプチド及びポリペプチド変異体の断片を指す。本明細書に記載されるＰＤ−Ｌ１ポリペプチドは、ヒト組織型から、もしくは別の源からなど、多様な源から単離されるか、または組換え法もしくは合成法によって調製されたものであり得る。
【００８７】
「ＰＤ−Ｌ１軸結合アンタゴニスト」という用語は、ＰＤ−１シグナル伝達軸上のシグナル伝達に起因するＴ細胞機能障害を除去するように、ＰＤ−Ｌ１軸結合パートナーとその結合パートナーのうちの１つ以上との相互作用を阻害し、結果として、Ｔ細胞機能が復元または増強される分子を指す。本明細書で使用される場合、ＰＤ−Ｌ１軸結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト及びＰＤ−１結合アンタゴニスト、ならびにＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との間の相互作用を妨害する分子（例えば、ＰＤ−Ｌ２−Ｆｃ融合体）を含む。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニスト」は、ＰＤ−Ｌ１と、ＰＤ−１及び／またはＢ７−１などのその結合パートナーのうちの１つ以上との相互作用から生じるシグナル形質導入を低下、遮断、阻害、抑止、または妨害する分子である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１の、その結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１の、ＰＤ−１及び／またはＢ７−１への結合を阻害する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びその抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、小分子アンタゴニスト、ポリヌクレオチドアンタゴニスト、ならびにＰＤ−Ｌ１と、ＰＤ−１及び／またはＢ７−１などのその結合パートナーのうちの１つ以上との相互作用に起因するシグナル形質導入を低下、遮断、阻害、抑止、または妨害する他の分子を含む。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１を介したシグナル伝達により媒介される、Ｔリンパ球及び他の細胞上で発現される細胞表面タンパク質によりまたはそれを介して媒介される、負のシグナルを低減し、これにより、機能不全のＴ細胞の機能不全状態を軽減する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。具体的な態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０である。別の具体的な態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＤＸ−１１０５である。さらに別の具体的な態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）である。さらに別の具体的な態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）である。さらに別の具体的な態様では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）である。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「ＰＤ−１結合アンタゴニスト」は、ＰＤ−１と、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＰＤ−Ｌ２などのその結合パートナーのうちの１つ以上との相互作用から生じるシグナル形質導入を低下、遮断、阻害、抑止、または妨害する分子である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１の、その結合パートナーへの結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１の、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＰＤ−Ｌ２への結合を阻害する。例えば、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−１抗体及びその抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、小分子アンタゴニスト、ポリヌクレオチドアンタゴニスト、ならびにＰＤ−１と、ＰＤ−Ｌ１及び／またはＰＤ−Ｌ２との相互作用から生じるシグナル形質導入を低下、遮断、阻害、抑止、または妨害する他の分子を含む。一実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を介したシグナル伝達により媒介される、Ｔリンパ球及び他の細胞上で発現される細胞表面タンパク質によりまたはそれを介して媒介される、負のシグナルを低減し、これにより、機能不全のＴ細胞の機能不全状態を軽減する。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−１抗体である。具体的な態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＭＤＸ−１１０６（ニボルマブ）である。別の具体的な態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＭＫ−３４７５（ペンブロリズマブ）である。別の具体的な態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＣＴ−０１１（ピジリズマブ）である。別の具体的な態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＭＥＤＩ−０６８０（ＡＭＰ−５１４）である。別の具体的な態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤＲ００１である。別の具体的な態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、本明細書に記載されるＲＥＧＮ２８１０である。別の具体的な態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、本明細書に記載されるＢＧＢ−１０８である。別の具体的な態様では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ−２２４である。
【００９０】
「血管内皮成長因子」または「ＶＥＧＦ」という用語は、血管内皮成長因子を指す。「ＶＥＧＦ」という用語は、そのホモログ及びアイソフォームを包含する。「ＶＥＧＦ」という用語はまた、ＶＥＧＦの、既知のアイソフォーム、例えば、スプライスアイソフォーム、例えば、ＶＥＧＦ１１１、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、及びＶＥＧＦ２０６を、Ｆｅｒｒａｒａ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．２１：６８７（２０１０）、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１３０６（１９８９）、及びＨｏｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．，５：１８０６（１９９１）に記載されるＶＥＧＦ１６５のプラスミン切断によって生成された１１０個のアミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子を含む、これらの天然に存在する対立遺伝子及びプロセシング形態と共に包含する。「ＶＥＧＦ」という用語はまた、マウス、ラット、または霊長類などの非ヒト種に由来するＶＥＧＦを指す。特定の種に由来するＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦではｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦではｍＶＥＧＦなどの用語によって示されることがある。「ＶＥＧＦ」という用語はまた、１６５個のアミノ酸のヒト血管内皮細胞成長因子のアミノ酸８〜１０９または１〜１０９を含む、ポリペプチドの切断形態を指して使用される。ＶＥＧＦの任意のこのような形態への参照は、本出願では、例えば、「ＶＥＧＦ１０９」、「ＶＥＧＦ（８〜１０９）」、「ＶＥＧＦ（１〜１０９）」、または「ＶＥＧＦ１６５」によって特定することができる。「切断された」天然ＶＥＧＦのアミノ酸位は、天然ＶＥＧＦ配列に示される通りに番号付けされる。例えば、切断された天然ＶＥＧＦでのアミノ酸１７位（メチオニン）は、天然ＶＥＧＦでも１７位（メチオニン）である。切断された天然ＶＥＧＦは、ＫＤＲ及びＦｌｔ−１受容体に対して、天然ＶＥＧＦに匹敵する結合親和性を有する。本明細書で使用される「ＶＥＧＦ変異体」という用語は、天然ＶＥＧＦ配列に１つ以上のアミノ酸変異を含むＶＥＧＦポリペプチドを指す。任意で、１つ以上のアミノ酸変異には、アミノ酸置換（複数可）が含まれる。本明細書に記載されるＶＥＧＦ変異体を簡潔に表記する目的で、数字は、（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、上記及びＨｏｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．、上記に提供される）推定上の天然ＶＥＧＦのアミノ酸配列に沿ったアミノ酸残基の位置を指すことが知られている。
【００９１】
「ＶＥＧＦアンタゴニスト」という用語は、本明細書で使用されるとき、ＶＥＧＦに結合するか、ＶＥＧＦ発現レベルを低減するか、または１つ以上のＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦ結合、ＶＥＧＦシグナル伝達、ならびにＶＥＧＦ媒介血管新生及び内皮細胞生存もしくは増殖を含むが、これらに限定されないＶＥＧＦ生物学的活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減、もしくは妨害することができる分子を指す。例えば、ＶＥＧＦの生物学的活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減、または妨害することができる分子は、１つ以上のＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、膜結合ＶＥＧＦ受容体（ｍｂＶＥＧＦＲ）、または可溶性ＶＥＧＦ受容体（ｓＶＥＧＦＲ））に結合することによって、その作用を発揮することができる。ＶＥＧＦに特異的に結合するポリペプチド、抗ＶＥＧＦ抗体及びその抗原結合断片、ＶＥＧＦに特異的に結合し、それにより１つ以上の受容体へのその結合を封鎖する受容体分子及び誘導体、融合タンパク質（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ））、及びＶＥＧＦ１２１−ゲロニン（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ）が、本発明の方法で有用なＶＥＧＦアンタゴニストとして含まれる。ＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦポリペプチドのアンタゴニスト変異体、ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも１つの断片に相補的なアンチセンス核酸塩基オリゴマー、ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも１つの断片に相補的な小ＲＮＡ、ＶＥＧＦを標的とするリボザイム、ＶＥＧＦに対するペプチボディ、及びＶＥＧＦアプタマーも含まれる。ＶＥＧＦアンタゴニストにはまた、ＶＥＧＦＲに結合するポリペプチド、抗ＶＥＧＦＲ抗体、及びその抗原結合断片、ならびにＶＥＧＦＲに結合し、それによってＶＥＧＦの生物学的活性（例えば、ＶＥＧＦのシグナル伝達）を遮断、阻害、抑止、低減、もしくは妨害する誘導体、または融合体タンパク質が含まれる。ＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲに結合し、かつＶＥＧＦの生物学的活性を遮断、阻害、抑止、低減、または妨害することができる非ペプチド小分子も含まれる。したがって、「ＶＥＧＦ活性」という用語は、ＶＥＧＦのＶＥＧＦ媒介生物学的活性を具体的に含む。特定の実施形態では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦの発現レベルまたは生物学的活性を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上低減または阻害する。いくつかの実施形態では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストによって阻害されるＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ（８−１０９）、ＶＥＧＦ（１−１０９）、またはＶＥＧＦ１６５である。
【００９２】
本明細書で使用されるとき、ＶＥＧＦアンタゴニストとしては、抗ＶＥＧＦＲ２抗体及び関連分子（例えば、ラムシルマブ、タニビルマブ、アフリベルセプト）、抗ＶＥＧＦＲ１抗体及び関連分子（例えば、イクルクマブ、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ−Ｅｙｅ、ＥＹＬＥＡ（登録商標））、及びジブ−アフリベルセプト（ｚｉｖ−ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）（ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ、ＺＡＬＴＲＡＰ（登録商標）））、二重特異性ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＭＰ−０２５０、バヌシズマブ（ＶＥＧＦ−ＡＮＧ２）、及びＵＳ２００１／０２３６３８８に開示される二重特異性抗体）、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦＲ１、及び抗ＶＥＧＦＲ２アームのうちの２つの組み合わせを含む二重特異性抗体、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ、セバシズマブ、及びラニビズマブ）、ならびに非ペプチド小分子ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、パゾパニブ、アキシチニブ、バンデタニブ、スチバーガ、カボザンチニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、オランチニブ、テラチニブ、ドビチニグ、セジラニブ、モテサニブ、スルファチニブ、アパチニブ、フォレチニブ、ファミチニブ、及びチボザニブ）が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００９３】
「抗ＶＥＧＦ抗体」、「ＶＥＧＦに結合する抗体」、及び「ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体」という用語は、抗体がＶＥＧＦを標的とする際に診断及び／または治療剤として有用であるように、十分な親和性でＶＥＧＦに結合することができる抗体を指す。一実施形態では、無関係の非ＶＥＧＦタンパク質への抗ＶＥＧＦ抗体の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定される、ＶＥＧＦへの抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、ＶＥＧＦに結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、異なる種由来のＶＥＧＦ間で保存されるＶＥＧＦのエピトープに結合する。
【００９４】
特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与する疾患または状態を標的とし、かつそれを妨害する際に治療剤として使用され得る。また、抗体は、例えば、治療剤としてのその有効性を評価するために、他の生物学的活性アッセイに供され得る。このようなアッセイは、当該技術分野で既知であり、抗体の標的抗原及び意図される使用に依存する。例としては、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ、腫瘍細胞成長阻害アッセイ（例えば、ＷＯ８９／０６６９２に記載のもの）、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）及び補体媒介細胞傷害性（ＣＤＣ）アッセイ（米国特許第５，５００，３６２号）、ならびにアゴニスト活性または造血アッセイ（ＷＯ９５／２７０６２を参照のこと）が挙げられる。抗ＶＥＧＦ抗体は、通常、ＶＥＧＦ−ＢまたはＶＥＧＦ−Ｃなどの他のＶＥＧＦ相同体にも、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦ、またはｂＦＧＦなどの他の成長因子にも結合しない。一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣ  ＨＢ１０７０９によって産生されたモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４．６．１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である。別の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９に従って生成される組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であり、ベバシズマブ（ＢＶ、ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））として知られる抗体が挙げられるが、これに限定されない。
【００９５】
「Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）」または「ｒｈｕＦａｂ  Ｖ２」としても知られる抗ＶＥＧＦ抗体「ラニビズマブ」は、ヒト化親和性成熟抗ヒトＶＥＧＦ  Ｆａｂ断片である。ラニビズマブは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現ベクターでの標準の組換え技術方法及び細菌発酵によって産生される。ラニビズマブは、グリコシル化されておらず、約４８，０００ダルトンの分子量を有する。ＷＯ９８／４５３３１及びＵＳ２００３／０１９０３１７を参照されたい。さらなる好ましい抗体としては、各々参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００５／０１２３５９号及び同第ＷＯ２００５／０４４８５３号に記載のＧ６またはＢ２０シリーズ抗体（例えば、Ｇ６−３１、Ｂ２０−４．１）が挙げられる。さらなる好ましい抗体については、米国特許第７，０６０，２６９号、同第６，５８２，９５９号、同第６，７０３，０２０号、同第６，０５４，２９７号、ＷＯ９８／４５３３２、ＷＯ９６／３００４６、ＷＯ９４／１０２０２、ＥＰ０６６６８６８Ｂ１、米国特許出願公開第２００６／００９３６０号、同第２００５／０１８６２０８号、同第２００３／０２０６８９９号、同第２００３／０１９０３１７号、同第２００３／０２０３４０９号、及び同第２００５／０１１２１２６号、ならびにＰｏｐｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２８８：１４９−１６４（２００４）を参照されたい。他の好ましい抗体としては、残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｙ２５、Ｑ８９、１９１、Ｋ１０１、Ｅ１０３、及びＣ１０４を含むか、またはあるいは残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、１８３、及びＱ８９を含むヒトＶＥＧＦ上の機能的エピトープに結合するものが挙げられる。さらなる抗ＶＥＧＦ抗体としては、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２００９／１５５７２４号に記載の抗ＶＥＧＦ抗体が挙げられる。
【００９６】
「同時投与」という用語は、本明細書において投与の少なくとも一部が時間的に重なる２つ以上の治療剤の投与を指すために使用される。したがって、同時投与は、１つ以上の他の薬剤（複数可）の投与を中止した後に、１つ以上の薬剤（複数可）の投与が継続するときの投薬レジメンを含む。
【００９７】
「腫瘍」は、本明細書で使用される場合、悪性か良性かを問わず、全ての腫瘍性細胞成長及び増殖、ならびに全ての前がん性及びがん性細胞及び組織を指す。「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」、及び「腫瘍」は、本明細書で言及されるように、相互排他的ではない。
【００９８】
ＩＩＩ．方法
Ａ．診断方法
本明細書では、対象においてがん（例えば、肺癌（例えば、扁平上皮ＮＳＣＬＣまたは非扁平上皮ＮＳＣＬＣ）または頭頸部癌（例えば、ＨＮＳＣ））を診断するための方法が提供される。また本明細書では、ＮＲＦ２依存性癌であるがん（例えば、肺癌、例えば、扁平上皮非小細胞肺癌もしくは非扁平上皮非小細胞肺癌、または頭頸部癌）を有する対象を特定するための方法が提供される。方法のいずれも、本明細書で提供されるバイオマーカー、例えば、ＮＲＦ２のスプライス変異体（例えば、ＮＲＦ２ｍＲＮＡまたはＮＲＦ２タンパク質）の発現レベル、または１つ以上のＮＲＦ２標的遺伝子の増加した発現に基づき得る。方法のいずれも、対象にＮＲＦ２経路アンタゴニストを投与することをさらに含み得る。方法のいずれも、有効量の第２の治療剤（例えば、１つ以上の（例えば、１、２、３、または４つ以上の）追加のＮＲＦ２経路アンタゴニストまたは１つ以上の（例えば、１、２、３、または４つ以上の）抗がん剤）を対象に投与することをさらに含み得る。
【００９９】
本発明は、対象においてがんを診断する方法を提供し、方法は、対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個の遺伝子）の発現レベルを決定することと、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを少なくとも１つの遺伝子の参照発現レベルと比較することと、を含み、試料における少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの、少なくとも１つの遺伝子の参照発現レベルに対する増加は、がんを有する対象を特定する。
【０１００】
本発明は、ＮＲＦ２依存性癌であるがんを有する対象を特定する方法をさらに提供し、方法は、対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個の遺伝子）の発現レベルを決定することと、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを少なくとも１つの遺伝子の参照発現レベルと比較することと、対象のがんがＮＲＦ２依存性癌であるかを決定することと、を含み、試料における少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの、少なくとも１つの遺伝子の参照発現レベルに対する増加は、ＮＲＦ２依存性癌を有する対象を特定する。
【０１０１】
前述の方法のいずれにおいても、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、またはＮＱＯ１のうちの１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の）発現レベルが決定される。
【０１０２】
前述の方法のいずれにおいても、１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の）新たに特定されたＮＲＦ２標的遺伝子の発現レベルが決定される。新たに特定されたＮＲＦ２標的遺伝子としては、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、及びＡＫＲ１Ｃ３が挙げられる。
【０１０３】
本発明は、対象においてがんを診断する方法をさらに提供し、方法は、対象から得られる試料（例えば、腫瘍試料）におけるそのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２のｍＲＮＡ発現レベルを決定することを含み、そのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２の存在は、対象をがんを有するとして特定する。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２は、そのエクソン３の全部または一部の欠失をさらに含む。遺伝子（例えば、ＮＲＦ２、ＫＥＡＰ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、またはＦＴＬ）の存在及び／または発現レベルは、これらに限定されないが、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質断片、及び／または遺伝子コピー数を含む、当該技術分野で知られている任意の適切な基準に基づいて定性的または定量的に決定され得る。
【０１０４】
本発明は、対象においてがんを診断する方法をさらに提供し、方法は、対象から得られる試料におけるそのＮｅｈ２ドメインの全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２のタンパク質発現レベルを決定することを含み、そのＮｅｈ２ドメインの全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２の存在は、対象をがんを有するとして特定する。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２は、そのＮｅｈ４ドメインの全部または一部の欠失をさらに含む。
【０１０５】
本発明は、がんを有する対象を特定する方法をさらに提供し、方法は、対象から得られる試料（例えば、腫瘍試料）におけるそのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２のｍＲＮＡ発現レベルを決定することを含み、そのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２の存在は、対象をがんを有するとして特定する。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２は、そのエクソン３の全部または一部の欠失をさらに含む。遺伝子（例えば、ＮＲＦ２、ＫＥＡＰ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、またはＦＴＬ）の存在及び／または発現レベルは、これらに限定されないが、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質断片、及び／または遺伝子コピー数を含む、当該技術分野で知られている任意の適切な基準に基づいて定性的または定量的に決定され得る。
【０１０６】
本発明は、がんを有する対象を特定する方法をさらに提供し、方法は、対象から得られる試料におけるそのＮｅｈ２ドメインの全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２のタンパク質発現レベルを決定することを含み、そのＮｅｈ２ドメインの全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２の存在は、対象をがんを有するとして特定する。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２は、そのＮｅｈ４ドメインの全部または一部の欠失をさらに含む。
【０１０７】
試料における本明細書に記載の様々なバイオマーカーの存在及び／または発現レベル／量は、いくつかの方法論によって分析され得、これらの多くは、当該技術分野で知られ、当業者に理解されており、免疫組織化学（「ＩＨＣ」）、ウェスタンブロット分析、免疫沈降、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ、蛍光活性化細胞選別（「ＦＡＣＳ」）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、プロテオミクス、定量的血液ベースアッセイ（例えば、血清ＥＬＩＳＡ）、生化学的酵素活性アッセイ、インサイチュハイブリダイゼーション、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、サザン分析、ノーザン分析、全ゲノム配列決定、大規模並列ＤＮＡ配列決定（例えば、次世代配列決定）、ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ（登録商標）、例えば、分岐状ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなどの、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）及び他の増幅型検出方法を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、遺伝子発現プロファイリング、及び／または遺伝子発現連続分析（「ＳＡＧＥ」）、ならびにタンパク質、遺伝子、及び／または組織アレイ分析によって行われ得る多種多様なアッセイのうちのいずれか１つを含むが、これらに限定されない。遺伝子及び遺伝子産物の状態を評価するための典型的なプロトコルは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔｓ２（ノーザンブロッティング）、４（サザンブロッティング）、１５（イムノブロッティング）、及び１８（ＰＣＲ分析）において見出される。Ｒｕｌｅｓ  Ｂａｓｅｄ  ＭｅｄｉｃｉｎｅまたはＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（「ＭＳＤ」）から入手可能なものなどの多重化イムノアッセイもまた、使用され得る。
【０１０８】
本明細書に記載される方法のいずれかのいくつかの実施形態では、臨床腫瘍試料からのＤＮＡは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｆｒａｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．３１（１１）：１０２３−１０３３，２０１３）に記載される標的化遺伝子プルダウン配列決定方法などの、次世代配列決定方法を使用して配列決定することができる。このような次世代配列決定方法は、小試料（例えば、小コア針生検、細針吸引、及び／またはセルブロック由来）または固定試料（例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料）の使用を可能にしながら、様々な変異（例えば、挿入、欠失、塩基置換、焦点遺伝子増幅、及び／またはホモ接合性遺伝子欠失）を検出する本明細書に開示される方法のいずれかと共に使用することができる。
【０１０９】
前述の方法のいずれにおいても、バイオマーカー（例えば、ＮＲＦ２、ＫＥＡＰ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、またはＦＴＬ）の存在及び／または発現レベル／量は、バイオマーカーのタンパク質発現レベルを決定することによって測定される。特定の実施形態では、方法は、バイオマーカーの結合を許容する条件下で、生体試料を、バイオマーカーに特異的に結合する抗体（例えば、抗ＮＲＦ２抗体）と接触させることと、抗体とバイオマーカーとの間で複合体が形成されるかどうかを検出することとを含む。このような方法は、インビトロまたはインビボ方法であり得る。タンパク質発現レベルを測定する、当該技術分野で既知であるか、または本明細書に記載される任意の方法を使用してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、バイオマーカーのタンパク質発現レベルは、フローサイトメトリー（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ（商標）））、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫蛍光、放射免疫測定、ドットブロッティング、免疫検出方法、ＨＰＬＣ、表面プラズモン共鳴、光学分光、質量分析法、及びＨＰＬＣからなる群から選択される方法を使用して決定される。いくつかの実施形態では、バイオマーカーのタンパク質発現レベルは、腫瘍細胞において決定される。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、バイオマーカー（例えば、ＮＲＦ２、ＫＥＡＰ１、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、またはＦＴＬ）の存在及び／または発現レベル／量は、バイオマーカーのｍＲＮＡ発現レベルを決定することによって測定される。特定の実施形態では、遺伝子の存在及び／または発現レベル／量は、（ａ）試料（対象がん試料など）について遺伝子発現プロファイリング、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲなど）、ＲＮＡ−ｓｅｑ、マイクロアレイ分析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技法、またはＦＩＳＨを行うことと、ｂ）試料におけるバイオマーカーの存在及び／または発現レベル／量を決定することと、を含む方法を使用して決定される。一実施形態では、ＰＣＲ方法は、ｑＲＴ−ＰＣＲである。一実施形態では、ＰＣＲ方法は、多重ＰＣＲである。いくつかの実施形態では、遺伝子発現は、マイクロアレイによって測定される。いくつかの実施形態では、遺伝子発現は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定される。いくつかの実施形態では、発現は、多重ＰＣＲによって測定される。
【０１１１】
細胞におけるｍＲＮＡの評価方法は周知であり、例えば、相補的ＤＮＡプローブを使用したハイブリダイゼーションアッセイ（１つ以上の遺伝子に特異的な標識リボプローブを使用したインサイチュハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、及び関連技法など）、及び様々な核酸増幅アッセイ（遺伝子のうちの１つ以上に特異的な相補的プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ、及び他の増幅型検出方法、例えば、分岐状ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）を含む。哺乳動物由来の試料は、ノーザン、ドットブロット、またはＰＣＲ分析を使用してｍＲＮＡについて好都合にアッセイされ得る。加えて、このような方法は、（例えば、アクチンファミリーメンバーなどの「ハウスキーピング」遺伝子の比較対照ｍＲＮＡ配列のレベルを同時に調査することによって）生体試料における標的ｍＲＮＡのレベルを決定することを可能にする１つ以上のステップを含み得る。
【０１１２】
方法のいずれかのいくつかの実施形態では、バイオマーカーは、ＮＲＦ２（例えば、エクソン２欠失ＮＲＦ２またはエクソン２＋３欠失ＮＲＦ２）である。一実施形態では、バイオマーカーの発現レベルは、試料（患者から得られる腫瘍試料など）についてのＷＧＳ分析を行うことと、試料におけるバイオマーカーの発現レベルを決定することと、を含む方法を用いて決定される。いくつかの実施形態では、エクソン２欠失ＮＲＦ２またはエクソン２＋３欠失ＮＲＦ２は、参照に対して決定される。いくつかの実施形態では、参照は、参照値である。いくつかの実施形態では、参照は、参照試料（例えば、対照細胞株試料、非癌患者からの組織試料、または野生型ＮＲＦ２組織試料）である。
【０１１３】
ｍＲＮＡ発現分析に対して追加的または代替的に、タンパク質発現などの他のバイオマーカーは、上述の方法に従って定量化され得る。例えば、本発明の方法は、試料をゲノムバイオマーカー（例えば、エクソン２欠失ＮＲＦ２もしくはエクソン２＋３欠失ＮＲＦ２の存在、または１つ以上のＮＲＦ２標的遺伝子、例えば、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、もしくはＦＴＬの上方制御）について試験することと、追加で試料をタンパク質バイオマーカー（例えば、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、またはＦＴＬのうちの１つ以上のタンパク質転写物）について試験することと、を含む。
【０１１４】
方法のいずれかのいくつかの実施形態では、ＤＮＡ配列は、バイオマーカーとしての役割を果たし得る。ＤＮＡは、これらに限定されないが、ＰＣＲ、エクソーム−ｓｅｑ（例えば、全エクソーム配列決定）、ＤＮＡマイクロアレイ分析、ＮＡＮＯＳＴＲＩＮＧ（登録商標）、または全ゲノム配列決定を含む、当該技術分野で知られる任意の方法に従って定量化することができる。
【０１１５】
いくつかの事例では、試料における遺伝子の発現レベルは、遺伝子の平均（例えば、平均発現または中央発現）であり、遺伝子の参照発現レベルは、参照の遺伝子の平均（例えば、平均発現または中央発現）であり、試料の遺伝子の平均は、参照の遺伝子の平均と比較される。
【０１１６】
特定の実施形態では、第１の試料におけるバイオマーカーの存在及び／または発現レベル／量は、第２の試料における存在／不在及び／または発現レベル／量と比較して増加または上昇する。特定の実施形態では、第１の試料におけるバイオマーカーの存在／不在及び／または発現レベル／量は、第２の試料における存在及び／または発現レベル／量と比較して減少または低減する。特定の実施形態では、第２の試料は、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織である。遺伝子の存在／不在及び／または発現レベル／量を決定するためのさらなる開示が本明細書に記載されている。
【０１１７】
特定の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、試験試料が得られたときとは異なる１つ以上の時点で得られる同じ対象または個体由来の単一の試料または組み合わされた複数の試料である。例えば、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、試験試料が得られたときよりも早い時点で同じ対象または個体から得られる。このような参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、参照試料ががんの初期診断中に得られ、かつ試験試料がその後がんが転移性となったときに得られる場合に有用であり得る。
【０１１８】
特定の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、患者ではない１つ以上の健常な個体由来の組み合わされた複数の試料である。特定の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、対象または個体ではない、疾患または障害（例えば、がん）を有する１つ以上の個体由来の組み合わされた複数の試料である。特定の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、正常組織由来のプールされたＲＮＡ試料、または患者ではない１つ以上の個体由来のプールされた血漿もしくは血清試料である。特定の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、腫瘍組織由来のプールされたＲＮＡ試料、または患者ではない、疾患もしくは障害（例えば、がん）を有する１つ以上の個体由来のプールされた血漿もしくは血清試料である。
【０１１９】
方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、上昇または増加した発現とは、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織と比較した、本明細書に記載されるものなどの標準の当該技術分野で既知の方法によって検出される、バイオマーカー（例えば、タンパク質または核酸（例えば、遺伝子（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ））のレベルの約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のうちのいずれかの全体的な増加を示す。特定の実施形態では、上昇した発現とは、試料におけるバイオマーカーの発現レベル／量の増加を指し、増加は、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織におけるそれぞれのバイオマーカーの発現レベル／量の少なくとも約１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、または１００倍のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、上昇した発現とは、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、対照組織、または内部対照（例えば、ハウスキーピング遺伝子）と比較した、約１．５倍、約１．７５倍、約２倍、約２．２５倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３．０倍、または約３．２５倍を超える全体的な増加を指す。
【０１２０】
方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、低減した発現とは、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織と比較した、本明細書に記載されるものなどの標準の当該技術分野で既知の方法によって検出される、バイオマーカー（例えば、タンパク質または核酸（例えば、遺伝子（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）））のレベルの約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のうちのいずれかの全体的な低減を指す。特定の実施形態では、低減した発現とは、試料におけるバイオマーカーの発現レベル／量の減少を指し、減少は、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織におけるそれぞれのバイオマーカーの発現レベル／量の少なくとも約０．９倍、０．８倍、０．７倍、０．６倍、０．５倍、０．４倍、０．３倍、０．２倍、０．１倍、０．０５倍、または０．０１倍のうちのいずれかである。
【０１２１】
Ｂ．治療方法
本発明は、がん（例えば、肺癌（例えば、扁平上皮ＮＳＣＬＣまたは非扁平上皮ＮＳＣＬＣ）または頭頸部癌（例えば、ＨＮＳＣ））に罹患している患者を治療するための方法を提供する。いくつかの事例では、本発明の方法は、有効量のＮＲＦ２経路アンタゴニストを患者に投与することを含む。本明細書に記載されているか、またはそうでなければ当該技術分野で知られているＮＲＦ２経路アンタゴニストのいずれかが方法において使用され得る。いくつかの事例では、方法は、患者から得られる試料におけるＮＲＦ２スプライス変異体（例えば、エクソン２欠失ＮＲＦ２またはエクソン２＋３欠失ＮＲＦ２）またはＮＲＦ２標的遺伝子の存在及び／または発現レベルを決定することと、例えば、本明細書において以下の実施例に記載されているか、当該技術分野において知られている方法のいずれかを用い、ＮＲＦ２スプライス変異体（例えば、エクソン２欠失ＮＲＦ２またはエクソン２＋３欠失ＮＲＦ２）またはＮＲＦ２標的遺伝子の存在及び／または発現レベルに基づいてＮＲＦ２経路アンタゴニストを患者に投与することと、を含む。
【０１２２】
本発明は、がん（例えば、肺癌（例えば、扁平上皮ＮＳＣＬＣまたは非扁平上皮ＮＳＣＬＣ）または頭頸部癌（例えば、ＨＮＳＣ））に罹患している対象を治療する方法を提供し、方法は、対象から得られる試料におけるＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＳＲＸＮ１、ＯＳＧＩＮ１、ＦＥＣＨ、ＧＣＬＭ、ＴＲＩＭ１６、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＳＬＣ７Ａ１１、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＢＣＣ２、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、ＵＧＤＨ、ＴＸＮＲＤ１、ＧＳＲ、ＡＫＲ１Ｃ３、ＴＡＬＤＯ１、ＰＧＤ、ＴＸＮ、ＮＱＯ１、及びＦＴＬからなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、または２７個の遺伝子）の発現レベルを決定することと、少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを少なくとも１つの遺伝子の参照発現レベルと比較することであって、試料における少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの、少なくとも１つの遺伝子の参照発現レベルに対する増加が、がんを有する対象を特定する、比較することと、対象に治療有効量の１つ以上のＮＲＦ２経路アンタゴニストを投与することと、を含む。
【０１２３】
本発明は、がん（例えば、肺癌（例えば、扁平上皮ＮＳＣＬＣまたは非扁平上皮癌ＮＳＣＬＣ）または頭頸部癌）に罹患している対象を治療する方法をさらに提供し、１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２個の）新たに特定されたＮＲＦ２標的遺伝子の発現レベルが決定される。新たに特定されたＮＲＦ２標的遺伝子としては、ＡＫＲ１Ｂ１０、ＡＫＲ１Ｃ２、ＭＥ１、ＫＹＮＵ、ＣＡＢＹＲ、ＴＲＩＭ１６Ｌ、ＡＫＲ１Ｃ４、ＣＹＰ４Ｆ１１、ＲＳＰＯ３、ＡＫＲ１Ｂ１５、ＮＲ０Ｂ１、及びＡＫＲ１Ｃ３が挙げられる。
【０１２４】
いくつかの事例では、本発明は、がん（例えば、肺癌（例えば、扁平上皮ＮＳＣＬＣまたは非扁平上皮癌ＮＳＣＬＣ）または頭頸部癌）に罹患している対象を治療する方法であって、ＮＲＦ２のｍＲＮＡ発現レベルが、対象から得られる試料におけるそのエクソン２の全部または一部の欠失を含み、そのエクソン２の全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２の存在が、対象をがんを有するとして特定する、方法、及び対象に治療有効量の１つ以上のＮＲＦ２経路アンタゴニストを投与する方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２は、そのエクソン３の全部または一部の欠失をさらに含む。
【０１２５】
いくつかの事例では、本発明は、がん（例えば、肺癌（例えば、扁平上皮ＮＳＣＬＣまたは非扁平上皮癌ＮＳＣＬＣ）または頭頸部癌（例えば、ＨＮＳＣ））に罹患している対象を治療する方法であって、ＮＲＦ２タンパク質が、対象から得られる試料におけるそのＮｅｈ２ドメインの全部または一部の欠失を含み、そのＮｅｈ２ドメインの全部または一部の欠失を含むＮＲＦ２の存在が、対象をがんを有するとして特定する、方法、及び対象に治療有効量の１つ以上のＮＲＦ２経路アンタゴニストを投与する方法をさらに提供する。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２は、そのＮｅｈ４ドメインの全部または一部の欠失をさらに含む。
【０１２６】
前述の方法のいずれにおいても、ＮＲＦ２経路アンタゴニストは、当該技術分野で知られているか、または本明細書に記載されている任意のＮＲＦ２経路アンタゴニストであり得る。
【０１２７】
いくつかの事例では、方法は、対象に有効量の第２の治療剤（例えば、１つ以上の抗がん剤）を投与することをさらに含む。いくつかの事例では、第２の治療剤は、血管新生阻害剤、化学療法剤、成長阻害剤、細胞傷害性剤、免疫療法、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、免疫療法は、ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、抗ＶＥＧＦＲ２抗体及び関連分子（例えば、ラムシルマブ、タニビルマブ、アフリベルセプト）、抗ＶＥＧＦＲ１抗体及び関連分子（例えば、イクルクマブ、アフリベルセプト（ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ−Ｅｙｅ、ＥＹＬＥＡ（登録商標））、及びジブ−アフリベルセプト（ｚｉｖ−ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ）（ＶＥＧＦ  Ｔｒａｐ、ＺＡＬＴＲＡＰ（登録商標）））、二重特異性ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＭＰ−０２５０、バヌシズマブ（ＶＥＧＦ−ＡＮＧ２）、及びＵＳ２００１／０２３６３８８に開示される二重特異性抗体）、抗ＶＥＧＦ、抗ＶＥＧＦＲ１、及び抗ＶＥＧＦＲ２アームのうちの２つの組み合わせを含む二重特異性抗体、抗ＶＥＧＦ抗体（例えば、ベバシズマブ、セバシズマブ、及びラニビズマブ）、ならびに非ペプチド小分子ＶＥＧＦアンタゴニスト（例えば、パゾパニブ、アキシチニブ、バンデタニブ、スチバーガ、カボザンチニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、オランチニブ、テラチニブ、ドビチニグ、セジラニブ、モテサニブ、スルファチニブ、アパチニブ、フォレチニブ、ファミチニブ、及びチボザニブ）である。他の実施形態では、免疫療法は、ＰＤ−１軸結合アンタゴニスト（例えば、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＤＸ−１１０５、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）、ＭＥＤＩ４７３６（デュルバルマブ）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（アベルマブ）、ＭＤＸ−１１０６（ニボルマブ）、ＭＫ−３４７５（ペンブロリズマブ）、ＣＴ−０１１（ピジリズマブ）、ＭＥＤＩ−０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＰＤＲ００１、ＲＥＧＮ２８１０、ＢＧＢ−１０８、またはＡＭＰ−２２４）である。
【０１２８】
本明細書に記載される方法に用いられる組成物（例えば、ＮＲＦ２経路アンタゴニスト）は、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経皮、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、髄腔内、鼻腔内、腟内、直腸内、局所、腫瘍内、腹膜、結膜下、小胞内、粘膜、心膜内、臍帯内、眼内、眼窩内、経口、局所、経皮、硝子体内（例えば、硝子体内注射による）、点眼による、吸入による、注射による、移植による、注入による、持続注入による、標的細胞を直接的に浸す局所灌流による、カテーテルによる、洗浄による、クリーム中、または脂質組成物中を含む、任意の適切な方法により投与され得る。本明細書に記載の方法で利用される組成物はまた、全身または局所投与され得る。投与方法は、様々な因子（例えば、投与される化合物または組成物、及び治療される状態、疾患、または障害の重症度）に応じて多様であり得る。いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２経路アンタゴニストは、静脈内、筋肉内、皮下、局所、経口、経皮、腹腔内、眼窩内、移植により、吸入により、髄腔内、脳室内、または鼻腔内投与される。投薬は、投与が短期であるかまたは長期であるかに部分的に応じて、任意の適切な経路により、例えば、静脈内または皮下注射などの注射により得る。単回または様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書では企図される。
【０１２９】
本明細書に記載のＮＲＦ２経路アンタゴニスト（及び追加の抗がん剤）は、良好な医療行為と一致する様式で製剤化、投薬、及び投与され得る。この文脈において考慮すべき因子としては、治療されている特定の障害、治療されている特定の哺乳動物、個別の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に知られている他の因子が挙げられる。ＮＲＦ２経路アンタゴニストは、その必要はないが、任意に、問題の障害を予防または治療するために現在使用されている１つ以上の薬剤と共に製剤化及び／または投与される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するＮｒｄ２経路阻害剤の量、障害または治療のタイプ、及び上で考察される他の因子に依存する。これらは一般に、本明細書に記載されるものと同じ投薬量及び投与経路で、または本明細書に記載される投薬量の約１〜９９％、または経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、方法は、対象に有効量の第２の治療剤（例えば、１つ以上の抗がん剤）を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の治療剤は、抗血管新生剤、化学療法剤、成長阻害剤、細胞傷害性剤、免疫療法、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１３１】
上記のこのような併用療法は、組み合わされた投与（２つ以上の治療剤（例えば、ＮＲＦ２経路アンタゴニスト及び抗がん剤）が同じかまたは別々の製剤に含まれる）及びＮＲＦ２経路アンタゴニストの投与が、追加の抗がん剤（複数可）の投与の前、それと同時、及び／またはそれに続いて発生し得る、別々の投与を包含する。一実施形態では、ＮＲＦ２経路アンタゴニストの投与及び追加の抗がん剤の投与は、互いの約１ヶ月以内、または約１、２、もしくは３週間以内、または約１、２、３、４、５、もしくは６日以内に発生する。
【０１３２】
Ｃ．本発明の方法での使用のためのＮＲＦ２経路アンタゴニスト
本明細書では、対象に治療有効量のＮＲＦ２経路アンタゴニストを投与することを含む、対象においてがん（例えば、肺癌（例えば、扁平上皮ＮＳＣＬＣ）または頭頸部癌）の進行を治療または遅延するための方法が提供される。前述の方法のいずれも、本明細書で提供されるバイオマーカーの発現レベル、例えば、腫瘍試料、例えば、腫瘍細胞を含有する生検におけるＮＲＦ２発現またはＮＲＦ２経路に関与する任意のタンパク質もしくはｍＲＮＡの発現に基づき得る。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２経路アンタゴニストは、小分子、例えば、ＮＲＦ２またはＮＲＦ２の発現、安定性、もしくは活性を制御するタンパク質もしくは遺伝子に結合することができる小分子である。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２経路アンタゴニストは、ＮＲＦ２アゴニストのアンタゴニストである。ＮＲＦ２アゴニストの例としては、これらに限定されないが、ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）、Ｍａｆ、活性化転写因子４（ＡＴＦ４）、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）、Ｊｕｎ、グルココルチコイド受容体、ＵｂｃＭ２、ならびにＥ６−ＡＰカルボキシル末端ドメイン及びＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ１（ＨＡＣＥ１）を含有するアンキリン反復に相同するものが挙げられる。したがって、ＮＲＦ２経路アンタゴニストの例としては、これらに限定されないが、表２に記載されるものなどの、ＣＲＥＢアンタゴニスト、ＣＢＰアンタゴニスト、Ｍａｆアンタゴニスト、ＡＴＦ４アンタゴニスト、ＰＫＣアンタゴニスト、Ｊｕｎアンタゴニスト、グルココルチコイド受容体アンタゴニスト、ＵｂｃＭ２アンタゴニスト、及びＨＡＣＥ１アンタゴニストが挙げられる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２経路アンタゴニストは、ＮＲＦ２アンタゴニストのアゴニストである。ＮＲＦ２アンタゴニストの例としては、これらに限定されないが、ｃ−Ｍｙｃ、ＳＵＭＯ、ＫＥＡＰ１、ＣＵＬ３、レチノール酸受容体α（ＲＡＲα）が挙げられる。したがって、ＮＲＦ２経路アンタゴニストの例としては、これらに限定されないが、表３に記載されるものなどの、ｃ−Ｍｙｃアゴニスト、ＳＵＭＯ、ＫＥＡＰ１アゴニスト、ＣＵＬ３アゴニスト、及びＲＡＲαアゴニストが挙げられる。
2019531699.tif 000003
2019531699.tif 000004
【０１３６】
本発明のいくつかの実施形態では、表２または３に列挙される化合物の誘導体も、ＮＲＦ２経路アンタゴニストとして投与され得る。表２または３に列挙される化合物の誘導体は、親化合物とは構造が異なるが、ＮＲＦ２経路をアンタゴナイズする能力を保持する小分子である。化合物の誘導体は、親化合物に対する特定の他の分子またはタンパク質とのその相互作用を変化し得る。化合物の誘導体は、塩、付加物、または親化合物の他の変異体も含み得る。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物（例えば、表２または３に列挙される化合物のうちのいずれか１つの化合物）のいずれかの誘導体は、親化合物の代わりに使用され得る。いくつかの実施形態では、表２または３に列挙される化合物のいずれの誘導体も、肺癌などの、がんを有する対象を治療する方法に使用され得る。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２経路アンタゴニストは、抗体（例えば、抗ＮＲＦ２抗体またはＮＲＦ２発現、安定性、もしくは活性を制御するタンパク質もしくは遺伝子、例えば、表２もしくは３に列挙される標的に対する抗体）である。いくつかの実施形態では、抗ＮＲＦ２抗体は、ＮＲＦ２と抗酸化剤応答配列との間の結合を阻害することができる。いくつかの実施形態では、抗ＮＲＦ２抗体は、ＮＲＦ２と補因子（例えば、Ｍａｆ、ＰＫＣ、Ｊｕｎ、ＡＴＦ４、またはＣＢＰ）との間の結合を阻害することができる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及び（Ｆａｂ’）２断片からなる群から選択される抗体断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、上記の特性のいずれかを有する既知の抗体の誘導体である。抗体の誘導体は、その親抗体に対して約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８５％、８０％以下の配列同一性を有する抗体変異体を含む。アミノ酸配列同一性パーセント（％）は、上述のように、ＡＬＩＧＮ−２によるものを含む、当該技術分野で知られる方法に従って決定される。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２経路アンタゴニストは、任意の下流バイオマーカーの阻害剤（例えば、遺伝子もしくはタンパク質、例えば、鉄封鎖に関与する遺伝子もしくはタンパク質（例えば、フェリチン、軽鎖ポリペプチド（ＦＴＬ）、フェリチン、重鎖ポリペプチド１（ＦＴＨ）、またはヘムオキシゲナーゼ１（ＨＭＯＸ１））、ＧＳＨ利用（例えば、グルタチオンペルオキシダーゼ２（ＧＰＸ２）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼα１（ＧＳＴＡ１）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼα２（ＧＳＴＡ２）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼα３（ＧＳＴＡ３）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼα５（ＧＳＴＡ５）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼμ１（ＧＳＴＭ１）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼμ２（ＧＳＴＭ２）、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼμ３（ＧＳＴＭ３）、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼπ１（ＧＳＴＰ１））、キノン解毒（例えば、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈデヒドロゲナーゼ、キノン１（ＮＱＯ１））、ＧＳＨ産生及び再生（例えば、グルタミン酸−システインリガーゼ、修飾因子サブユニット（ＧＣＬＭ）、グルタミン酸−システインリガーゼ、触媒サブユニット（ＧＣＬＣ）、グルタチオンレダクターゼ（ＧＳＲ）、または溶質輸送体ファミリー７（アニオン性アミノ酸輸送体軽鎖、Ｘｃ−システム）、メンバー１１（ＳＬＣ７Ａ１１、またはＸＣＴ））、チオレドキシン（ＴＸＮ）産生、再生、及び利用（例えば、チオレドキシン１、（ＴＸＮ１）、チオレドキシンレダクターゼ１（ＴＸＮＲＤ１）、またはペルオキシレドキシン１（ＰＲＤＸ１））、ＮＡＤＰＨ産生（例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）、ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＧＤ）、リンゴ酸酵素１、ＮＡＤＰ（＋）依存性細胞質性（ＭＥ１）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＮＡＤＰ＋）、可溶性（ＩＤＨ１））、または表１のこれらの遺伝子もしくはタンパク質のいずれか）を含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２経路アンタゴニストは、（例えば、ＮＲＦ２上のＡＲＥ結合部位に競合的に結合することによって、ＡＲＥに競合的に結合することによって、またはそうでなければ転写補因子（例えば、小Ｍａｆタンパク質）を妨害することによって）ＮＲＦ２が抗酸化剤応答配列（ＡＲＥ）に結合するのを阻害する化合物を含む。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、ＮＲＦ２経路アンタゴニストは、化合物の薬理学的効果がＮＲＦ２媒介転写の下流の１つ以上の経路の下方制御を含むように、ＮＲＦ２関連遺伝子のアゴニストまたはアンタゴニストを含む。このようなＮＲＦ２関連遺伝子としては、例えば、Ｋｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１（ＫＥＡＰ１）、（ＢＴＢドメインを含む）外胚葉−神経皮質１（ＥＮＣ１）、タンパク質キナーゼＣδ（ＰＲＫＣＤ）、タンパク質キナーゼＣβ（ＰＲＫＣＢ）、ポリアミン調節因子１（ＰＭＦ１）、カリン３（ＣＵＬ３）、核内因子、赤血球２（ＮＦＥ２）、活性化転写因子４（ＡＴＦ４）、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＭＯＸ１）、ヘムオキシゲナーゼ２（ＨＭＯＸ２）、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）、Ｖ−Ｍａｆトリ筋腱膜線維肉腫がん遺伝子ホモログＫ（ＭＡＦＫ）、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ１ファミリー、ポリペプチドＡ６（ＵＧＴ１Ａ６）、Ｖ−Ｍａｆトリ筋腱膜線維肉腫がん遺伝子ホモログＦ（ＭＡＦＦ）、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＲＥＢＢＰ）、Ｖ−Ｍａｆトリ筋腱膜線維肉腫がん遺伝子ホモログＧ（ＭＡＦＧ）、ＣＡＭＰ応答配列結合タンパク質１（ＣＲＥＢ１）、ＦＸＹＤドメイン含有イオン輸送制御因子２（ＦＸＹＤ２）、Ｊｕｎがん原遺伝子（ＪＵＮ）、小ユビキチン様修飾因子２（ＳＵＭＯ２）、小ユビキチン様修飾因子１（ＳＵＭＯ１）、Ｖ−Ｍｙｃトリ骨髄細胞腫ウィルスがん遺伝子ホモログ（ＭＹＣ）、ζクリスタリン（キノンレダクターゼ）（ＣＲＹＺ）、アルド−ケトレダクターゼファミリー７、メンバーＡ２（アフラトキシンアルデヒドレダクターゼ）（ＡＫＲ７Ａ２）、及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼα２（ＧＳＴＡ２）が挙げられる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、細胞におけるＮＲＦ２のユビキチン化を増加する方法が提供され、方法は、細胞をＮＲＦ２経路の阻害剤に、細胞におけるＮＲＦ２経路の阻害を可能にする条件下で接触させることを含む。ＮＲＦ２の増加したユビキチン化は、例えば、既知の方法に従った、トリプシン消化後のユビキチン化ＮＲＦ２の免疫親和性の増強、その後の質量分析によって決定することができる。いくつかの実施形態では、ユビキチン化の増加は、ＮＲＦ２経路アンタゴニストに接触させた細胞もしくは細胞集団における野生型ＮＲＦ２のユビキチン化と、ＮＲＦ２経路アンタゴニストに接触させた細胞もしくは細胞集団におけるエクソン２もしくはエクソン２＋３欠失ＮＲＦ２のユビキチン化及び／またはＮＲＦ２経路アンタゴニストに接触させた細胞もしく細胞集団におけるエクソン２もしくはエクソン２＋３欠失ＮＲＦ２のユビキチン化とを比較することによって決定され得る。
【０１４２】
本発明のいくつかの実施形態では、ＮＲＦ２経路アンタゴニストは、アスコルビン酸、ブルサトール、ルテオリン、またはオクラトキシンＡである。
【実施例】
【０１４３】
実施例１：材料及び実験方法
Ａ．変異及びコピー数分析
９９個のＮＳＣＬＣ細胞株について、ＫＲａｓ、ＬＫＢ１、ＫＥＡＰ１、及びＮＲＦ２の非同義変異及びコピー数データをＫｌｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（３）：３０６−３１２，２０１５）から入手した。１３個の追加のＮＳＣＬＣ細胞株をコピー数分析に供した。加えて、エクソーム配列決定を１０４個のＮＳＣＬＣ細胞株に適用した。がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）について、腫瘍変異及びコピー数データを、ＲソフトウェアパッケージＣＧＤＳ−Ｒを用いてｃＢｉｏＰｏｒｔａｌから検索した（Ｃｅｒａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．２：４０１−４０４，２０１２、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ．Ｓｉｇｎａｌ．６：１１，２０１３）。
【０１４４】
Ｂ．変異体ＫＥＡＰ１遺伝子発現シグネチャーのＲＮＡ−ｓｅｑ分析及び誘導
９９個のＮＳＣＬＣ細胞株の生のＲＮＡ−ｓｅｑデータを欧州ゲノムフェノムアーカイブから検索した（アクセッション番号ＥＧＡＳ００００１０００６１０）（ＰＭＩＤ：２５４８５６１９）。ＮＳＣＬＣ細胞株の各々におけるＫＥＡＰ１及びＮＲＦ２の変異を表４に提供する。生のＲＮＡ−ｓｅｑデータをＴＣＧＡからダウンロードし、ＧＳＮＡＰバージョン２０１３−１０−１０（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｎａｃｕ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ２６：８７３−８８１，２０１０）を用い、最大２つの不一致を許容して、ヒト参照ゲノム（ＧＲＣｈ３７／ｈｇＩ９）に整列させた（パラメータ：「−Ｍ２−ｎ１０−Ｂ２−ｉ１−Ｎ１−ｗ２０００００−Ｅ１−−ｐａｉｒｍａｘ−ｒｎａ＝２０００００」）。遺伝子発現レベルを、各ＲｅｆＳｅｑ遺伝子にマッピングされたリード数から誘導されるＲＰＫＭ（標的のキロベース及び配列決定された百万リード当たりのリード）値で定量化した。ＤＥＳｅｑ  Ｒパッケージ（ＰＭＩＤ：２０９７９６２１）を用い、差次的遺伝子発現をＫＥＡＰ１変異体及びＫＥＡＰ１野生型細胞株の間で測定し、倍率変化及び関連する調節されたｐ値として報告した。分散における（ユークリッド距離を用いる）試料及び遺伝子のウォードクラスタリングについて、安定化カウントデータを使用した。「ＮＭＦ」Ｒパッケージを使用して関連ヒートマップを作成した。
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【０１４５】
Ｃ．スプライス変異体分析
スプライス変異体の分析を、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒプロジェクトウェブサイトから入手可能なＳＧＳｅｑソフトウェアパッケージを用いて行った（Ｇｅｎｔｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．５：Ｒ８０，２００４）。エクソン及びスプライスジャンクションを、パラメータα＝２、ｐｓｉ＝０、β＝０．２、γ＝０．２を用いて既知のがん遺伝子の５４個のゲノム遺伝子座で７，３８４個のＴＣＧＡ試料についてＢＡＭファイルから予測した。予測された特徴を試料にわたって統合し、エクソンを分離したエクソンビンにプロセシングした。スプライスジャンクション及びエクソンビンをゲノムワイドスプライスグラフにまとめた。２つ以上の代替スプライス変異体からなるスプライス事象をグラフから特定した。スプライス変異体をＦＰＫＭ及び相対使用量Ψに関して定量化した。簡潔に、変異体の開始及び終了での相対使用量の局所的推定は、変異体と互換性である断片の割合として得た。事象開始及び終了での推定は、加重平均を用いて組み合わされ、重量は境界にわたる断片の合計数に比例した。２０未満の分母での相対使用量推定をＮＡに設定した。変異体開始及び終了での絶対発現の局所的推定を得るために、互換性カウントｎをｎＩ（ＮｘＬ）ｘ１０９としてＦＰＫＭに変換し、Ｎは整列した断片の合計数であり、Ｌは有効長（互換性断片の許容される位置の数）である。ＴＣＧＡ試料において検出されたスプライス変異体はまた、正常ヒト組織からの２，９５８個の遺伝子型組織発現プロジェクト（ＧＴＥｘ）試料において定量化した（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３４８：６４８−６６０，２０１５）。
【０１４６】
Ｄ．がん特異的スプライス変異体の特定
（代替転写物開始または終了を含まない）内部スプライス変異体のみを考慮し、各スプライス変異体の開始及び終了は、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒウェブサイトからダウンロードされたアノテーション参照遺伝子転写物に属するエクソンを重複または拡張するのに必要であった（Ｐｒｕｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：Ｄ５０１−５０４，２００５、Ｒｏｓｅｎｂｌｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４３：Ｄ６７０−６８１，２０１５）。保持されたイントロンを除外した。１９少なくとも１００個のがん試料を含んだＴＣＧＡ兆候（合計６，３５９個のがん試料）を考慮し、（ｉ）少なくとも１つのがん試料におけるＦＰＫＭ＞２と相対使用量Ψ＞０．２ならびに（ｉｉ）ＧＴＥｘ試料の＞９９．９％におけるＦＰＫＭ＜１、ならびに（ｉｉｉ）ＧＴＥｘ試料の＞９７．５％におけるＦＰＫＭ約０を有するスプライス変異体を選択した。ＦＰＫＭベースの基準は、スプライス変異体の開始及び終了の両方で満たす必要があった。Ψを推定することができないＦＰＫＭベースの基準を満たす変異体を手動検査後に含めた。
【０１４７】
Ｅ．標的化ペアエンドエクソーム−ｓｅｑデータの分析
ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＣＯＲＥ内の全ての試料を、以前に記載のものと同様にプロセシング及び配列決定した（Ｆｒａｍｐｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１，１０２３−１０３１，２０１４）。ＮＲＦ２エクソン２及びエクソン２＋３欠失を、２つの異なるアプローチを用いてＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＣＯＲＥデータセット（ｎ＝５８，７０７）にわたりスクリーニングした。
【０１４８】
まず、一致しないリードペア及び／またはスプリットリードに基づく再構成コールを、ＮＲＦ２エクソン２またはエクソン２＋３の喪失の直接的証拠について調査した。このアプローチは対象の欠失の直接的証拠を提供するが、ＮＲＦ２のイントロン領域は捕捉されないので、欠失は切断点がベイト領域内にある場合のみこのアプローチで発見することができる。よって、このアプローチは、切断点がイントロン−エクソン境界近くまたはエクソン内で発生するＮＲＦ２エクソン２またはエクソン２＋３欠失の限られたサブセットを特定する。
【０１４９】
第２のアプローチは、個別のベイト領域からのコピー数ｌｏｇ比データを利用する。コピー数ｌｏｇ比値を、各試料の特異的な腫瘍細胞性に教育されたインハウスアルゴリズムで決定した。ｚスコアを、ＮＲＦ２における各エクソンについてのｌｏｇ比をＮＲＦ２にすぐ隣接する対照多型捕捉領域（ｎ＝１５、ＮＲＦ２の約３ＭＢ上流及び約１２ＭＢ下流から約１ＭＢ毎に等間隔）と比較して計算した。同時発生するエクソン３欠失を伴う、及び伴わないエクソン２欠失を特に調査した。これらは本明細書において対象のエクソン（ＥＯＩ）と称される。（１）ＮＲＦ２における非ＥＯＩではなくＥＯＩについてのｚスコアが＜−２であり、（２）ＮＲＦ２における非ＥＯＩからの０．２のｌｏｇ比低下が計算された場合、ＥＯＩ欠失をコールした。ＮＲＦ２エクソン２またはエクソン２＋３欠失とＮＲＦ２またはＫＥＡＰ１における短い変異体との間の相互排他性を、特に肺扁平上皮細胞癌（ｎ＝１，２１８）内で調査した。
【０１５０】
Ｆ．細胞培養
ＫＭＳ−２７（ＲＰＭＩ−１６４０）、ＪＨＨ−６（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｍｅｄｉａ  Ｅ）、ＨｕＣＣＴ１（ＲＰＭＩ−１６４０）、及びＨＵＨ−１（ＤＭＥＭ）細胞はＪＣＲＢからのものであり、２９３（ＥＭＥＭ）細胞はＡＴＣＣからのものであった。細胞を指定された培地において２ｍＭのグルタミン及び１０％ＦＢＳの存在下で培養した。
【０１５１】
Ｇ．ウェスタンブロッティング
細胞溶解物を、完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）及びｐｈｏＳＴＯＰ（Ｒｏｃｈｅ）、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ２（Ｓｉｇｍａ）及びＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ３（Ｓｉｇｍａ）ホスファターゼ阻害剤が補足されたＲＩＰＡバッファー（Ｓｉｇｍａ）で調製した。溶解物にＮｏｖｅｘトリス−グリシン４〜１２％勾配ゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上でのランを行い、ｉＢｌｏｔニトロセルロース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に移した。ブロットをＴＢＳＴ（１０ｍＭのトリスｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣＩ、０．１％ＴＷＥＥＮ−２０）中の５％脱脂粉乳（Ｍｅｒｃｋ）でプレインキュベートし、続いて抗体を含有するＴＢＳＴ中の５％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）でインキュベートした。使用された二次抗体は、（共にＧＥ  Ｈｅａｔｈｃａｒｅからの）ＥＣＬ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＨＲＰ及びＥＣＬ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＨＲＰであった。ブロットをＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ）で展開し、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ  ＨＤ２イメージャー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ）で可視化した。この研究で使用された抗体は、ＫＥＡＰ１（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｇ１０１０）、ＮＲＦ２（Ａｂｃａｍ  ａｂ６２３５２）、ＨＳＰ９０（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ４８７７）、ＨＤＡＣ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ５１１３）、β−アクチン（Ｓｉｇｍａ  Ａ２２２８）、ＨＡ（Ｒｏｃｈｅ１１８１５０１６００１）、及びＦＬＡＧ（Ｓｉｇｍａ  Ｆ２４２６）に対するものである。λホスファターゼはＮＥＢからのものであり（Ｐ０７５３Ｌ）、ホスファターゼ阻害剤はこれらの実験では溶解バッファーから省略した。
【０１５２】
Ｈ．細胞生存率及びＤＮＡ断片化分析
ｓｉＲＮＡを細胞にＤｈａｒｍａｆｅｃｔ２試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）でリバーストランスフェクトした。トランスフェクションの４日後、細胞を生存率についてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定し、発光をＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉ−ｌａｂｅｌ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上で検出した。ｓｉＲＮＡを細胞にＤｈａｒｍａｆｅｃｔ２試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）でリバーストランスフェクトした。トランスフェクションの４日後、細胞をアポトーシスについてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）染色及び公表されたプロトコル（Ｒｉｃｃａｒｄｉ  ａｎｄ  Ｎｉｃｏｌｅｔｔｉ  Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：１４５８−１４６１，２００６）に従ったフローサイトメトリーを用いて測定した。スタウロスポリン、１μＭ、（Ｅｎｚｏ）を陽性対照に染色の２４時間前に添加した。ＮＲＦ２エクソン２を標的とするｓｉＲＮＡは、配列：５’−ＴＧＧＡＧＴＡＡＧＴＣＧＡＧＡＡＧＴＡ−３’（配列番号２９）及び５’−ＡＣＡＡＣＴＡＧＡＴＧＡＡＧＡＧＡＣＡ−３’（配列番号３０）を有した。ＮＲＦ２エクソン５を標的とするｓｉＲＮＡは、配列：５’−ＴＧＡＣＡＧＡＡＧＴＴＧＡＣＡＡＴＴＡ−３’（配列番号３１）及び５’−ＧＴＡＡＧＡＡＧＣＣＡＧＡＴＧＴＴＡＡ−３’（配列番号３２）を有し、対照ｓｉＲＮＡである非標的ｓｉＲＮＡと共に使用した。染色された細胞をＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｅｒ装置で分析した。ＫＥＡＰ１を標的とするｓｉＲＮＡは、Ｄｈａｍａｃｏｎからのものであった（Ｌ０１２４５３−００）。
【０１５３】
ＤＮＡ断片をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって定量化し、Ｒｉｃｃａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，１：１４５８−１４６１（２００６））に従ったフローサイトメトリーによって測定した。
【０１５４】
Ｉ．Ｔａｑｍａｎ分析
ＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で総細胞ＲＮＡを抽出した。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、Ｔａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるＴａｑｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎプライマー−プローブセット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）でｃＤＮＡを増幅した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７Ｆｌｅｘ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ上でＴａｑｍａｎ増幅／検出を行った。使用されたプライマー−プローブセットは、それぞれＮＲＦ２エクソン２及び５を検出するためのＨｓ００２３２３５２＿ｍｌ及びＨｓ００９７５９６１＿ｇｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）であった。使用されたＮＲＦ２標的遺伝子Ｔａｑｍａｎプライマー−プローブセットは、全てＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒからのＳＬＣ７Ａ１１（Ｈｓ００９２１９３８＿ｍｌ）、ＳＧＲＮ（Ｈｓ００９２１９３８＿ｍｌ）、ＮＲ０Ｂ１（Ｈｓ０３０４３６５８＿ｍｌ）、ＧＣＬＣ（ＨｓＯＯＩ５５２４９＿ｍｌ）、及びＧＰＸ２（Ｈｓ０１５９１５８９＿ｍｌ）であった。
【０１５５】
Ｊ．２９３トランスフェクション
プラスミドＤＮＡを、製造業者プロトコルによって推奨されるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて細胞にトランスフェクトした。溶解物をトランスフェクションの２〜３日後に調製した。使用された発現プラスミドは、ｐＲＫ５．ＮＲＦ２、ｐＲＫ５．ＮＲＦ２．ｄｅｌｔａ．ｅ２、ｐＲＫ５．ＮＲＦ２．ｄｅｌｔａ．ｅ２，３、ｐＲＫ５．ＮＲＦ２．ＦＬＡＧ、及びｐＲＫ５．ＫＥＡＰ１．ＨＡであった。
【０１５６】
Ｋ．腫瘍異種移植片モデル
１１〜１２週齢雌Ｃ．Ｂ−１７ＳＣＩＤ．ベージュマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右側横腹に、マウス当たり１００μｌのＨＢＳＳ／ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中１０ｘ１０６個のＡ５４９ｓｈＲＮＡ細胞または１００μｌのＨＢＳＳ中１０ｘ１０６個のＨ４４１ｓｈＲＮＡ細胞を接種した。腫瘍体積が約１５０〜２５０ｍｍ３に到達したとき、マウスはランダム化され、（５％スクロース中の）１ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンを含有するか、または（５％スクロース単独で）ドキシサイクリンを含有しない飲料水を自由摂取した。ドキシサイクリンを週に３回置き換え、スクロースを週に１回置き換えた。式（ＬｘＷｘＷ）／２を用いるデジタルキャリパー（Ｆｒｅｄ  Ｖ．Ｆｏｗｌｅｒ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．）を用いて腫瘍体積を決定し、平均腫瘍体積（ｍｍ３）＋／−ＳＥＭとしてプロットした。腫瘍成長阻害（ＴＧＩ％）を、ＴＧＩ％＝１００ｘ１−（ＡＵＣ治療／日）／（ＡＵＣビヒクル／日）であるように、ビヒクルに対する１日当たりのそれぞれの用量群についてのあてはめ曲線下面積（ＡＵＣ）の割合として計算した。別の研究において、１５０〜２５０ｍｍ３の腫瘍を有するマウスに、腫瘍を切除する前の５日間１ｍｇ／ｍｌのドキシサイクリンを投薬し、ＮＲＦ２レベルについてウェスタンブロッティングによって分析した。
【０１５７】
Ｌ．ＥｒｂＢ３抗体で処理されたＡ５４９異種移植片
１日目の皮下Ａ５４９腫瘍（７５〜１４４ｍｍ３）を有する雌ヌードマウス（ｎ＝１０）を、４週間にわたり各週１回（ｑｗｋ  ｘ４）静脈内投与されるビヒクルまたは５０ｍｇ／ｋｇのＹＷ５７．８８．５（１００ｍｇ／ｋｇの負荷用量）で処理した。腫瘍を各週２回測定し、各動物をエンドポイントについてその腫瘍が１０００ｍｍ３の体積に到達するか、または治療レジメンの最終日のいずれか早い方で安楽死させた。
【０１５８】
実施例２：ＫＥＡＰ１及びＮＲＦ２における変異を有するＮＳＣＬＣ細胞株の特定
ＮＳＣＬＣにおけるＫＥＡＰ１及びＮＲＦ２の変異、コピー数、及びヘテロ接合性の喪失（ＬＯＨ）を特定するために、ＲＮＡ−ｓｅｑ、エクソーム−ｓｅｑ、またはＳＮＰアレイによってプロファイリングされた１１３個のＮＳＣＬＣ細胞株のパネルを文書化した（図１Ａ）。ＫＥＡＰ１変異は２９／１１３個の細胞株（２６％）において見られ、ＮＲＦ２変異は４／１１３個の細胞株（４％）において検出された。ＮＣＩ−Ｈ６６１細胞株を除き、全てのＫＥＡＰ１変異細胞株は、変異対立遺伝子のホモ接合性発現を示し、これは一般的にはコピーニュートラルＬＯＨと関連付けられた。対照的に、ＮＲＦ２変異はヘテロ接合性であり、ＬＯＨと関連付けられなかった。さらなる２つの細胞株（ＨＣＣ１５３４及びＮＣＩ−ＨＩ４３７）は、ＫＥＡＰ１ＤＮＡの二対立遺伝子喪失によって検出可能なＫＥＡＰ１ｍＲＮＡを示さなかった。ＮＲＦ２変異は、ＫＥＡＰ１界面領域における以前に特定されたホットスポットにあり（図１Ｂ）（Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：１３５６８−１３５７３，２００８）、点変異及びインフレーム３アミノ酸欠失を含んだ。ＫＥＡＰ１における変異は一次配列全体に散在し（図１Ｃ）、明らかなホットスポットはほとんどなかった。しかしながら、ＫＥＡＰ１／ＮＲＦ２ペプチド結晶構造にマッピングされる場合（Ｆｕｋｕｔｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３４：８３２−８４６，２０１４）、変異はＮＲＦ２との相互作用部位の近くのＫＥＡＰ１コアβプロペラから延在するループにクラスタリングする（図１Ｄ）。
【０１５９】
実施例３：変異体ＫＥＡＰ１遺伝子シグネチャーの特定
ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＫＥＡＰ１変異の転写結果を決定するために、野生型ＫＥＡＰ１細胞株と比較してＫＥＡＰ１変異細胞株において有意に異なって発現した遺伝子（ｐ＜０．０１、絶対平均倍率変化＞２）を特定した。全体的に、２７個の遺伝子はＫＥＡＰ１変異体細胞株において有意に上方制御され（図２Ａ〜２Ｂ）、そのうち１５個は以前にＣｈＩＰ−ｓｅｑまたはＲＮＡ−ｓｅｑ研究からＮＲＦ２標的遺伝子として特定されている（Ｃｈｏｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４：７４１６−７４２９，２０１２、Ｈｉｒｏｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４０：１０２２８−１０２３９，２０１２、Ｍａｌｈｏｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８：５７１８−５７３４，２０１０）。ただ１つの遺伝子、ＨＳＰＢ１を、これらのカットオフを用いて有意に下方制御されたものとして特定した。
【０１６０】
これらの２７個の遺伝子の発現に基づく２３０個のＴＣＧＡ肺腺癌の教師なしクラスタリングは、２つの主要なグループの分割をもたらした（図３Ａ）。１つのグループは主に２７個のシグネチャー遺伝子の高発現を特徴とし、４３個の腫瘍を含有し、そのうちの３２個（７４％）はＫＥＡＰ１変異体であった。低発現を特徴とする他のグループは１８７個の腫瘍を含有し、そのうちの１７９個はＫＥＡＰ１野生型であった。著しく、肺扁平上皮細胞癌をクラスタリングするのに同じ遺伝子を用い、ＮＲＦ２及びＫＥＡＰ１変異体腫瘍はＮＲＦ２／ＫＥＡＰ１野生型腫瘍から区別され（図３Ｂ）、ＮＲＦ２がＫＥＡＰ１喪失／変異の転写結果のほとんどを媒介することを示した。興味深いことに、ＫＥＡＰ１またはＮＲＦ２のいずれかにおける任意の既知の変異を有さないＫＥＡＰ１変異体遺伝子の高発現を示したいくつかの扁平上皮ＮＳＣＬＣ腫瘍があった。ＫＥＡＰ１変異体細胞株における上方制御された２７個の遺伝子のうち、プロテオームデータは細胞株のより小さなサブセットにおける１７個について入手可能であった（３７個の野生型ＫＥＡＰ１、６個の変異体ＫＥＡＰ１）。変異体ＫＥＡＰ１細胞株におけるこれらの遺伝子のｍＲＮＡの増加したレベルと一貫して、これらの１７個の遺伝子のうちの１つ（低いペプチドカバレッジを有する、ＳＬＣ７Ａ１１）を除く全てのタンパク質標的も、野生型細胞株に対して変異体ＫＥＡＰ１細胞株における増加した発現を示した（図４）。
【０１６１】
実施例４：腫瘍試料におけるＮＲＦ２の異常スプライシングの特定
２７個の候補ＮＲＦ２標的遺伝子の高発現を有する腫瘍の大部分について、上昇した遺伝子発現は、ＫＥＡＰ１またはＮＲＦ２における変異によって説明することができる。しかしながら、ＫＥＡＰ１またはＮＲＦ２のいずれかにおける特徴分析された変異の不在下で候補ＮＲＦ２標的遺伝子の高発現を示したいくつかの腫瘍があった。がん関連転写物変化は、考えられる駆動因子事象としてますます認識される。したがって、これらの腫瘍におけるＮＲＦ２経路活性化は全エクソーム配列決定によって認識されないスプライス変化によって駆動され得るという仮説が立てられた。５４個の既知のがん遺伝子を分析し、ＴＣＧＡからのがん細胞では反復的に観察されるが、ＧＴＥｘからの正常試料ではめったに検出されないスプライス変異体を特定した（実施例１参照）。各々少なくとも１００個のがん試料を含む、１９個のがんタイプを選択した（合計６，３５９個の試料）。５４個の考慮されたがん遺伝子において、９つの反復性候補がん特異的スプライス変異体を特定した（≧２個の試料及び所与のがんタイプの試料の＞１％）。がん試料と同じ検出基準を用い、正常対照ではこれらの変異体のいずれも検出することができなかった（合計２，９５８個の試料）。共有スプライス部位を有する関連変異体のグループ分けは、４つのがん遺伝子における５つの独立した変化をもたらした（図５）。これらの変化には、脳癌におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ、肺腺癌におけるＭＥＴエクソン１４スキッピング、及び結腸直腸癌におけるＣＴＮＮＢ１エクソン３欠失を含む、いくつかの十分に文書化された発がん性スプライス変異体が含まれた（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７１（２４）：７５８７−７５９６，２０１１、Ｋｏｎｇ−Ｂｅｌｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６６（１）：２８３−２８９，２００６、Ｉｗａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（５）：１０２１−１０２６，１９９８）。興味深いことに、ＮＲＦ２における以前に特徴分析されていないスプライス変異体は、扁平上皮ＮＳＣＬＣを有する患者（３．３％、１６／４８１）において頻繁に、ＨＮＳＣを有する患者（１．５％、６／４０３）においてより低い有病率で観察され、発生した（図５Ａ）。肺扁平上皮癌におけるＮＲＦ２スプライス変異体のより詳細な分析は、同じ患者において同時発生する２つのスプライス変異体を明らかにし、２つの代替プロモーターのうちのいずれか１つから転写されたｍＲＮＡにおけるＮＲＦ２エクソン２のスキップに対応した（２．１％、１０／４８１）（図６）。２つの追加のスプライス変異体は、異なるセットの患者において同時発生し（１．２％、６／４８１）、２つの代替転写物開始のうちのいずれか１つを有するｍＲＮＡにおけるＮＲＦ２エクソン２及び３の両方（エクソン２＋３）のスキップに対応した（図６）。エクソン２またはエクソン２＋３を欠くＮＲＦ２スプライス変異体を発現する全ての患者はまた、エクソン２の包含を支持するスプリットリードによって証明される正常ＮＲＦ２転写物の発現を示した。エクソン２及び３の両方はＮＲＦ２コード配列の一部であり、エクソン２またはエクソン２＋３のスキップはＮ末端切断またはインフレーム欠失のいずれかを有するタンパク質アイソフォームをもたらすことが予測される（図７）。エクソン２を欠くＮＲＦ２転写物の高い反復性及びコード能力の保存は、これらのスプライス変異体が選択的利点を与える機能獲得事象を表し得ることを示す。これは、エクソン２がＮｅｈ２ドメインをコードし、扁平上皮肺癌の１５％では変異される、ＫＥＡＰ１との相互作用を可能にするという発見によって支持される（Ｉｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３（１）：７６−８６，１９９９）。
【０１６２】
観察されたＮＲＦ２スプライス変異体がＫＥＡＰ１またはＮＲＦ２の変異を有さない患者におけるＮＲＦ２経路活性化を説明することができるかを評価するために、ＮＲＦ２スプライス変異体及びＮＲＦ２経路変異の同時発生を観察した。ＴＣＧＡコレクションにおいて、扁平上皮肺腫瘍のうちの１７８個をエクソーム−ｓｅｑによってプロファイリングした。このサブセットでは、エクソン２またはエクソン２＋３欠失を示す１０個の腫瘍（６％）は、ＮＲＦ２またはＫＥＡＰ１いずれかの変異を示す４８個の腫瘍（２７％）と相互排他的であった（図８Ａ）。また、全てのエクソン２欠失腫瘍は、２７個の候補ＮＲＦ２標的遺伝子の高発現を示した（図８Ｂ）。頭頸部癌について同様の観察が行われ、５つの腫瘍（２％）におけるＮＲＦ２エクソン欠失は、２６個の腫瘍（９％）におけるＮＲＦ２またはＫＥＡＰ１の変異と相互排他的であった（図９Ａ〜９Ｂ）。これらの結果は、エクソン２の欠失が扁平上皮ＮＳＣＬＣ及び頭頸部腫瘍のサブセットにおけるＮＲＦ２の活性化のための代替メカニズムを表すことを示す。重要なことに、これらの結果は、エクソーム配列決定に加えて、スプライス変化の考慮が、推定ＮＲＦ２経路活性化を有するとして特定された患者の割合を、肺扁平上皮癌では２７％（４８／１７８）〜３３％（５８／１７８）まで、頭頸部扁平上皮癌では９％（２６／２７５）〜１１％（３１／２７５）まで増加させたことを示す。
【０１６３】
実施例５：細胞株におけるＮＲＦ２スプライシング欠損の実証
さらなる研究のための細胞株モデルを特定するために、ＲＮＡ−ｓｅｑデータにおける特定されたスプライス変異体のリード証拠をヒトがん細胞株の大パネルから分析した（Ｋｌｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（３）：３０６−３１２，２０１４に記載）。６１１個の細胞株のうち、共にジャンクションリードによるＮＲＦ２エクソン２のヘテロ接合性スキップの証拠を示す、１つの多発性骨髄腫細胞株ＫＭＳ−２７及び１つの肝細胞癌細胞株ＪＨＨ−６を特定した（図１０）。ＪＨＨ−６及びＫＭＳ−２７ｍＲＮＡにおけるＲＴ−ＰＣＲによるＮＲＦ２エクソン２スキッピングが実証された。それぞれエクソン１及びエクソン３／４に由来する一連のフォワード及びリバースプライマーを用いて（図１１Ａ）、ＪＨＨ−６及びＫＭＳ−２７細胞から単離されたｍＲＮＡにおけるエクソン２欠失（Δｅ２ＮＲＦ２）が確認された（図１１Ｂ）。ＰＣＲ産物の配列決定は、予想されたエクソン２の欠失を確認した（図１２Ａ〜１２Ｃ）。ＲＮＡ−ｓｅｑデータに基づき、点変異は、ＪＨＨ−６またはＫＭＳ−２７におけるＮＲＦ２またはＫＥＡＰ１のコード配列では検出されなかった（Ｋｌｉｊｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（３）：３０６−３１２，２０１４）。
【０１６４】
ＮＲＦ２／ＫＥＡＰ１変化は、肝細胞癌（１０％）ではかなり一般的であるが、多発性骨髄腫（０％）ではまれであるので、ＪＨＨ−６細胞をさらに試験した。具体的には、ＮＲＦ２タンパク質のエクソン２欠失形態の発現を試験した。ＪＨＨ−６細胞、ならびにＫＥＡＰ１変異体ＨＵＨ−１株、及び代表的な野生型ＫＥＡＰ１肝癌細胞株としてのＨｕＣＣＴ１細胞からの全細胞溶解物のウェスタンブロッティングを行った。ＪＨＨ−６細胞におけるＮＲＦ２のレベルは、ＨＵＨ−１細胞において見られるものと同等であり、これらは野生型ＫＥＡＰ１ＨｕＣＣＴ１細胞におけるものよりはるかに高かった（図１３）。また、エクソン２の欠失と一貫した、より低分子量の種は、ＪＨＨ−６において検出可能であり、ＮＦＥ２Ｌ２ｓｉＲＮＡトランスフェクション後に低減し、これが実際にＮＲＦ２の形態を表すことを確認した。変化したＮＲＦ２アイソフォームは目に見えたが、ＫＥＡＰ１相互作用モチーフの欠如を考慮すると、より豊富ではなかったことは驚きであった。エクソン２欠失ＮＲＦ２のリン酸化形態は、使用された４〜１２％ゲルにおいて野生型ＮＲＦ２の非リン酸化形態と共遊走し得るという仮説が立てられた。実際に、ＪＨＨ−６溶解物の脱リン酸化は、ＮＲＦ２のエクソン２欠失形態が野生型形態よりも有意に豊富であったことを示した（図１４Ａ、中央パネル）。同様に、ＫＭＳ−２７細胞は、ＮＲＦ２のエクソン２欠失形態を発現し、これは脱リン酸化後に見られる主要な種であった（図１５）。
【０１６５】
３つの肝癌細胞株におけるＮＲＦ２の安定性を、総タンパク質合成を無効にするシクロヘキシミドを用いて試験した。総ＮＲＦ２のより正確な定量化を可能にするために、脱リン酸化溶解物を使用した。実験は、ＨＵＨ−１細胞におけるＮＲＦ２と同等な、ＪＨＨ−６細胞におけるΔｅ２ＮＲＦ２の増加した安定性を示し、これらは共にＨｕＣＣＴ１細胞におけるＮＲＦ２より安定であった（図１４Ａ〜１４Ｂ）。ＪＨＨ−６細胞におけるＮＲＦ２のエクソン２欠失形態はまた、ＨＵＨ−１細胞と比較される場合もまた、顕著な核局在化を示した。（図１６）。
【０１６６】
ＪＨＨ−６細胞におけるエクソン２の欠失がＮＲＦ２をＫＥＡＰ１による制御に対して抵抗性としたかを決定するために、ＫＥＡＰ１ノックダウンへの応答におけるＮＲＦ２の安定性を試験した。ＨｕＣＣＴ１細胞におけるＫＥＡＰ１のノックダウンは、増加した安定性によるＮＲＦ２の増加した定常状態レベルをもたらした（図１４Ｃ）。しかしながら、ＪＨＨ−６細胞におけるＫＥＡＰ１のノックダウンは、エクソン２欠失ＮＲＦ２のレベルまたは安定性に影響を及ぼさなかった。予想通り、ＫＥＡＰ１のノックダウンは、ＫＥＡＰ１変異体ＨＵＨ−１細胞株において野生型ＮＲＦ２の安定性を増加させなかった（図１４Ｄ）。
【０１６７】
実施例６：ＮＲＦ２上のエクソン２及び／またはエクソン２＋３欠失の評価
実施例３に記載のＮＲＦ２／ＫＥＡＰ１遺伝子シグネチャーを利用して、１６個の肝細胞癌細胞株のうち、ＪＨＨ−６細胞は、ＲＮＡ−ｓｅｑデータから、変異体ＫＥＡＰ１発現株において見られるものと同様の、ＮＲＦ２標的遺伝子の最高発現の１つを示すことが決定された（図１７Ａ）。同様に、調査された１８個の多発性骨髄腫細胞株のうち、ＫＭＳ−２７細胞は、これらの遺伝子の最高発現の１つを示す（図１７Ｂ）。これらの遺伝子の発現は、調査された６１１個の細胞株にわたる個別の標的遺伝子のｚスコアの平均として計算される「ＮＲＦ２標的遺伝子スコア」によって要約することができる。これは、所与の株におけるシグネチャー遺伝子の過剰発現の程度を反映する細胞株毎の単一スコアをもたらす。ＮＲＦ２標的スコアは、ＪＨＨ−６細胞がＫＥＡＰ１変異を発現する肝癌細胞株と同様のスコアを示し（図１８Ａ）、多発性骨髄腫が（負の値によって示される）低い全体的なＮＲＦ２標的遺伝子スコアを示すにもかかわらず、ＫＭＳ−２７細胞が多発性骨髄腫細胞株の中で最も高いスコアを示す（図１８Ｂ）ことを確認する。
【０１６８】
次に、ＮＲＦ２タンパク質の発現に対するエクソン２欠失ＮＲＦ２を発現するＪＨＨ−６細胞の依存性を、野生型ＮＲＦ２発現ＨｕＣＣＴ１細胞と比較した。ＪＨＨ−６細胞におけるＮＲＦ２のノックダウンは、変異体ＫＥＡＰ１肝細胞癌細胞株ＨＵＨ−１において見られるものと同様の、細胞生存率の顕著な低下を引き起こした。対照的に、ＮＲＦ２ノックダウンは、ＨｕＣＣＴ１細胞の生存率に対してはより控えめな効果を有した（図１９）。ＮＲＦ２ノックダウンは全ての３つの細胞株において同等に効率的であったので、これはＨｕＣＣＴ１細胞におけるＮＲＦ２ノックダウン不良によるものではなかった（図２０）。ＮＲＦ２のノックダウンは、４つの十分に特徴分析されたＮＲＦ２標的遺伝子の減少した発現ももたらしたが、これは野生型ＫＥＡＰ１ＨｕＣＣＴ１細胞株ではわずかに低減した（図２１）。低下した生存率は、少なくとも部分的に、断片化ＤＮＡの増加によって測定されるアポトーシスに起因する可能性が高かった（図２２）。
【０１６９】
ＮＲＦ２エクソン２の喪失がＫＥＡＰ１によって制御されるＮＲＦ２の能力にどのように影響を及ぼすかを説明するために、２９３個の細胞における一過性発現を使用した。ＫＥＡＰ１は全長ＮＲＦ２の発現を減少させたが、エクソン２またはエクソン２＋３を欠くＮＲＦ２の発現に対してより小さい効果を有した（図２３、上パネル）。全長ＮＲＦ２発現に対するＫＥＡＰ１の阻害効果は、予想通り、プロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２によってほとんど無効化された。全長ＮＲＦ２及びＫＥＡＰ１は互いに相互作用し、一方でエクソン２またはエクソン２＋３の欠失はＮＲＦ２に結合するＫＥＡＰ１の能力を完全に無効化した（図２３、下パネル）。結果として、切断されたＮＲＦ２は、野生型ＮＲＦ２とは対照的に、ＫＥＡＰ１発現後に安定なままであったが（図２４Ａ〜２４Ｂ）、ＮＲＦ２の切断形態はわずかに低下した固有の安定性を有するようであった。しかしながら、変化したＮＲＦ２アイソフォームは、ＮＲＦ２標的遺伝子発現を増加させるそれらの能力によって判断されるように、転写活性であった（図２５）。ほとんどの遺伝子は、全長ＮＲＦ２と比較して、エクソン２またはエクソン２＋３欠失ＮＲＦ２によって同様に増加し、ＫＥＡＰ１過剰発現の効果に対して耐性であった。興味深いことに、エクソン２＋３欠失ＮＲＦ２は、ＧＰＸ２発現を増加させるには不良であり、この形態のＮＲＦ２の転写活性化に微妙な相違があり得ることを示した。この観察と一貫して、ＧＰＸ２に加えて実施例３に記載の２７個の標的遺伝子のうちの２２個は、エクソン２欠失腫瘍と比較してエクソン２＋３欠失扁平上皮肺腫瘍における発現のより低い中央値を示した（図２６）。
【０１７０】
実施例７：ＮＲＦ２エクソン２スプライス変化の機構的分析
ＫＭＳ−２７及びＪＨＨ−６についてのエクソーム−ｓｅｑデータの分析は、エクソン２にマッピングするリードの減少を示し、観察された転写物変異体がゲノム変化の結果であり得ることを示す（図２７Ａ）。ＪＨＨ−６及びＫＭＳ−２７の全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）は、これらの細胞株が、それぞれ４，６８５及び２，９８１ヌクレオチドに及ぶ、ＮＲＦ２エクソン２を囲む微小欠失を持つことを示した（図２７Ｂ）。患者において因果メカニズムを調査するために、高いリードカバレッジ（＞３００ｘ）を有する臨床扁平上皮ＮＳＣＬＣ腫瘍の大コホート（ｎ＝１，２１８）からの標的とされるペアエンドエクソーム−ｓｅｑデータを分析した。このデータセットでは、１１個の腫瘍が、近くの対照領域と比較して、エクソン２またはエクソン２＋３についてコピー数の減少を示した（材料及び方法、図２７Ｂ）。欠失の焦点となる性質は、配列決定について標的とされる定義されたゲノム領域からｌｏｇ比を調査することによって理解することができる（図２８Ｂ）。一致しないリードペアを有する７個の腫瘍は、数キロベースのＤＮＡを包含し、エクソン２またはエクソン２＋３に影響を及ぼす構造変異体と一貫していた（図２８Ａ）。合計で１６人の患者がＮＲＦ２エクソン２またはエクソン２＋３に影響を及ぼすゲノム変化の証拠を示し、特定された事象は、この経路を活性化することが知られる、ＮＲＦ２及びＫＥＡＰ１における点変異またはインデルと相互排他的であった。４５個の扁平上皮ＮＳＣＬＣ腫瘍の追加コホートが分析され、これにはＲＮＡ及びＤＮＡの両方が利用可能であった。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、隣接する正常組織と比較して腫瘍において高度に富化された、エクソン２の喪失を有する単一の患者を特定した（図２９）。ＲＮＡ−ｓｅｑ分析は、転写物変異体が特定された腫瘍において発現したが、隣接する正常組織では不在であったことを確認した（図３０）。ＮＲＦ２標的遺伝子の発現はまた、この経路における既知の変異を有するＴＣＧＡ腫瘍と同様の程度まで上昇し、一方で隣接する正常組織はこれらの遺伝子の低発現を示した（図３１）。最後に、全ゲノム配列決定は、転写物変異体がエクソン２を囲む５，２３３ヌクレオチドの体細胞ゲノム微小欠失の結果であることを確認した（図２８Ｃ）。これらのデータは、ゲノム微小欠失がＮＲＦ２経路活性化のための臨床的に関連するメカニズムであることを示す。
【０１７１】
これらのデータは、ＮＲＦ２によって制御される遺伝子のセットが異なる組織及び状態にわたって保存されることを示す。これは、ＮＳＣＬＣ及びＨＮＳＣの両方におけるＮＲＦ２活性化を有する腫瘍を特定するための単一の遺伝子シグネチャーの使用において実用的価値を有する（図３２）。興味深いことに、このＮＲＦ２／ＫＥＡＰ１シグネチャーは、腫瘍においてのみ活性化される。肺及び頭頸部腫瘍についての一致した正常試料は、低いＮＲＦ２標的遺伝子活性のみを示した（図３３）。これは、ＮＲＦ２経路の阻害が正常組織と比較して経路脱制御を示す腫瘍において選択的な利益を有し得ることを示す。
【０１７２】
がん原遺伝子の活性化をもたらす遺伝子内ゲノム欠失は、ＥＧＦＲ及びＣＴＮＮＢ１を含む、多数の遺伝子について以前に報告されている。このような変異体は、部分的には現在のゲノム技術の限界によって、日常的にはアッセイされていない。特に、個別のエクソンに影響を及ぼす、小さなコピー数変更を含む小さな逸脱は、単独のエクソーム−ｓｅｑによって検出するのが難しい。よって、遺伝子内欠失は比較的調査されないままであり、新たな変異体はいまだに発見されている。小細胞肺癌及び成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫の最近の研究は、全ゲノム配列決定を用いてＴＰ７３、ＩＫＺＦ２、及びＣＡＲＤ１１における反復性微小欠失を特定した（Ｇｅｏｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ５２４，４７−５３：２０１５、Ｋａｔａｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４７：１３０４−１３１５，２０１５）。本研究では、ＴＣＧＡプロジェクトの一部として生成された公表されているＲＮＡ−ｓｅｑデータを使用し、既知のがん遺伝子における反復性転写変化を特定した。患者コホート間の相違によって、ＮＲＦ２エクソン欠失の一般的な有病率を評価するのは難しい。例えば、入手可能なＲＮＡ−ｓｅｑデータ（ｎ＝４８１）でＴＣＧＡ肺扁平上皮癌を分析する場合、我々は、ＮＲＦ２エクソン２またはエクソン２＋３の欠失を有する患者の３％（１６／４８１）を特定した。体細胞変異コーリングを行うことができる、入手可能なエクソーム−ｓｅｑデータ（ｎ＝１７８）で患者のサブセットを分析する場合、ＮＲＦ２エクソン欠失を有する患者の割合は６％（１０／１７８）であった。ＮＲＦ２エクソン欠失が、推定ＮＲＦ２経路活性化を有する患者の割合を、エクソーム−ｓｅｑ単独によるＮＲＦ２またはＫＥＡＰ１における変異の評価と比較して、肺扁平上皮癌において２７％（４８／１７８）〜３３％（５８／１７８）まで、頭頸部扁平上皮癌において９％（２６／２７５）〜１１％（３１／２７５）まで増加させたことを説明する（図８Ａ及び９Ａ）。ゲノムプロファイリングが行われた患者からの実世界の臨床試料の分析は、肺扁平上皮癌の１〜２％のＮＲＦ２エクソン欠失の有病率を示した。しかしながら、可変腫瘍含有量を有する試料における単一エクソン欠失を決定するための最適化基準がまだ確立されておらず、明らかな欠失のみが考慮されたので、後者の分析は感度が不足している。それにもかかわらず、本明細書に提示される結果は、この経路の調節が、扁平上皮ＮＳＣＬＣ及び頭頸部癌などの、特定の腫瘍兆候において頻繁に変化するという概念と一貫している。イントロンを含む完全遺伝子座の配列決定を介した、またはエクソーム及びＲＮＡ配列決定実験からのデータを組み合わせることによる既知のがん遺伝子の追加スクリーニングも行われ得る。
【０１７３】
ＷＧＳによって特定される３つの欠失の構造の分析は切断点が異なることを示したが、各事例では欠失に隣接するゲノム領域は配列相同性を有する２〜６ヌクレオチドを示した（図３４）。ＪＨＨ−６細胞の３’末端、５’末端、及びジャンクションリードのＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号６１〜６３によって提供される。ＫＭＳ−２７細胞の３’末端、５’末端、及びジャンクションリードのＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号６４〜６６によって提供される。原発腫瘍細胞の３’末端、５’末端、及びジャンクションリードのＤＮＡ配列は、それぞれ、配列番号６７〜６９によって提供される。
【０１７４】
ＮＲＦ２は、点変異に加えて、ゲノム増幅を示すことが多い。興味深いことに、ＲＴ−ＰＣＲ分析によるＫＭＳ−２７細胞におけるＮＲＦ２欠失産物の強度は、野生型ＮＲＦ２と同様であり、ＪＨＨ−６細胞においてより豊富であるようだった（図１３）。これはＷＧＳリードカウントにおいても反映され、野生型対立遺伝子と比較して欠失形態のより高い存在量を示した（図２７Ｂ）。これらの結果は、ＪＨＨ−６細胞がＳＮＰアレイによるＮＲＦ２遺伝子座の５コピーを有する一方でＫＭＳ−２７細胞が２コピーを有するという観察と一貫している。ＮＲＦ２の増幅は、扁平上皮（４．５％）及び腺腫性（２．６％）ＮＳＣＬＣ、ＨＮＳＣ（１２．２％）、ならびに肝臓癌（３．６％）を含む、分析されたＴＣＧＡ試料において合理的な頻度であり、ＮＲＦ２転写出力を増加させるメカニズムを表す。ＪＨＨ−６細胞の事例では、これらのデータは、欠失対立遺伝子が優先的に増幅されており、この細胞株においてＮＲＦ２シグナル伝達を強化するさらなるメカニズムを提供することを示す。しかしながら、切断／スプライスされた対立遺伝子の優先的な増幅は原発腫瘍では観察されず、エクソン２または２＋３欠失単独でクローン選択に十分なＮＲＦ２活性を提供することができることを示す。
【０１７５】
エクソン２の欠失は、ＤＮＡ結合及び転写活性化機能について機能的にインタクトな遺伝子の残部を保持しながら、ＫＥＡＰ１との相互作用部位を除去することによってＮＲＦ２活性を増加させる優れたメカニズムを提供する。実際に、我々の生化学分析は、エクソン２が欠失した場合にＫＥＡＰ１結合のほとんど完全な喪失及び得られるＮＲＦ２の安定化を確認した（図２３及び２４）。腫瘍において見られるＮＲＦ２点変異について考慮する場合、ＥＴＧＥ高親和性結合部位を囲む変異は、ＫＥＡＰ１相互作用の完全な喪失をもたらし、より低い親和性のＤＬＧモチーフにおける変異は、ＮＲＦ２／ＫＥＡＰ１複合体を破壊するそれらの能力において様々である（Ｆｕｋｕｔｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３４（５）：８３２−８４６，２０１４、Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０５（３６）：１３５６８−１３５７３，２００８）。しかしながら、複合体を破壊しない点変異でさえも、ＮＲＦ２のＫＥＡＰ１媒介ユビキチン化を防止するように相互作用の性質を変更する（Ｓｈｉｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０５（３６）：１３５６８−１３５７３，２００８）。エクソン２及び３の両方の欠失の事例においてＫＥＡＰ１との相互作用は同様に無効化されるが、エクソン３は、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質）結合タンパク質（ＣＢＰ）への結合を介したＮＲＦ２によって転写活性化において以前に関連付けられたＮｅｈ４ドメインを含有する（Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃｅｌｌｓ．６（１０）：８５７−８６８，２００１）。（エクソン３に含有される）Ｎｅｈ４及び（エクソン４に含有される）Ｎｅｈ５は、ＣＢＰのリクルートにおいて相乗的に作用することが示された。これと一貫して、いくつかのＮＲＦ２標的遺伝子を誘発するΔｅ２＋３ＮＲＦ２の、Δｅ２ＮＲＦ２またはＮＲＦ２における腫瘍関連点変異と比較して低下した能力が観察された（図２５及び２６）。
【０１７６】
Ｅ３リガーゼとの相互作用ドメインを除去するヒト腫瘍において見られる欠失は、他の遺伝子でも観察されている。例えば、２２２個中７個の結腸直腸腫瘍は、そのＥ３リガーゼβ−ＴＲＣＰ（Ｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．９（４）：２０７−２１０，１９９９）の相互作用部位を除去するβ−カテニン（Ｉｗａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８（５）：１０２１−１０２６，１９９８）のエクソン３を囲む小さなゲノム欠失（２３４−６７７ｂｐ）を示した。同様に、前立腺癌において見られるＴＭＰＲＳＳ−ＥＲＧ融合タンパク質の大部分は、それらをＳＰＯＰによって媒介されるユビキチン化及び分解に対して耐性にするＥＲＧの切断バージョンをコードする（Ａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．５９（６）：９０４−９１６，２０１５）。
【０１７７】
加えて、ＭＥＴエクソン１４スキッピングをもたらす変異は、アミノ酸残基Ｙ１００３を除去し、これはＣｂｌ要件ならびにその後のユビキチン化及び下方制御に必要である。したがって、小さな遺伝子内の欠失は、腫瘍発生及び進展中に発生期のがん遺伝子が正常な分解を免れる効果的なメカニズムを表す。
【０１７８】
実施例８：変異体ＫＥＡＰ１細胞におけるＮＲＦ２ノックダウン
この実施例は、異なる成長環境下でのＮＲＦ２活性の要件に対するＫＥＡＰ１変異の効果の特徴分析を提供し、ＮＲＦ２活性が足場非依存性条件における成長に必須であることを示す。
【０１７９】
野生型及び変異体ＫＥＡＰ１及びＮＲＦ２細胞株にわたるＮＲＦ２阻害の結果を調査した。ドキシサイクリンの制御下で３つの独立したＮＲＦ２ｓｈＲＮＡを発現する安定な細胞株、及び３つの独立した非標的化対照（ＮＴＣ）を構築した。これらのＮＲＦ２ｓｈＲＮＡは、５つのＫＥＡＰ１変異体細胞株、２つのＮＲＦ２変異体細胞株、及び５つの野生型ＮＳＣＬＣ細胞株において、ならびに不死化されたが形質転換されていない肺上皮ＢＥＡＳ２Ｂ細胞において、ＮＲＦ２タンパク質レベルを低減するのに効果的であった（図３５）。ドキシサイクリン添加後、ほとんどの細胞株の生存率は様々な程度まで減少し、ＫＥＡＰ１変異体細胞株が一般的には有意により大きな減少を示した（図３６及び３７）。ＮＳＣＬＣ細胞株のより大きなパネルにおけるｓｉＲＮＡによるＮＲＦ２のノックダウンは、細胞生存率に対する遺伝子型依存性効果を確認した（図３８）。
【０１８０】
腫瘍異種移植片におけるＮＲＦ２ノックダウンの結果を特徴分析した。ｄｏｘ誘発性ＮＲＦ２ｓｈＲＮＡを発現するＫＥＡＰ１変異体Ａ５４９細胞株及びＫＥＡＰ１野生型Ｈ４４１細胞株を、雌ＳＣＩＤマウスの横腹に移植した。両方の腫瘍においてドキシサイクリンで処理されたマウスにおいてＮＲＦ２を効果的にノックダウンした（図３９及び４０）。ＫＥＡＰ１変異体Ａ５４９細胞株におけるＮＲＦ２ノックダウンは、腫瘍成長に対して劇的な効果を有し、１０個中５個の腫瘍において完全な腫瘍退縮をもたらした（図４１Ａ）。対照的に、ＫＥＡＰ１野生型Ｈ４４１成長に対する効果は、より控えめであり、腫瘍成長の３７％低減をもたらし、全ての動物が維持された腫瘍負荷を示した（図４１Ｂ）。
【０１８１】
異種移植片における腫瘍増殖に対するＮＲＦ２ノックダウン対プラスチック上での２Ｄ成長の間の異なる効果を理解するために、いくつかの追加の細胞培養環境を試験した。低接着プレート及び／または低酸素（０．５％）で成長させた細胞におけるＮＲＦ２ノックダウンは、プラスチック上で成長させた細胞と同様の結果を示した（図４２）。対照的に、ＫＥＡＰ１変異体細胞株の成長は、軟寒天中（図４３及び４４）、マイクロパターン化プラスチックフィルム上（図４５及び４６）、またはメチルセルロース中（図４７）で培養された場合に、著しく損なわれた。軟寒天における成長を使用して、ＮＲＦ２ノックダウンの結果をより詳細に特徴分析した。ＮＲＦ２のノックダウンは３つのＫＥＡＰ１変異体細胞株においてコロニー形成を完全に無効にしたが、Ｈ１０４８及びＨ４４１、２つの野生型ＫＥＡＰ１ＮＳＣＬＣ細胞株においてほとんど効果を有さなかった（図４３及び４４）。この経路は高いＮＲＦ２活性によって促進される生存特性を媒介することが示されたので、ＮＲＦ２ノックダウンへの応答におけるグルタチオン経路の役割を評価した。還元グルタチオンの追加は一般的に全ての試験された細胞株が軟寒天においてコロニーを形成する能力を増加したが、ＮＲＦ２ノックダウンの結果をレスキューすることはできなかった（図４３及び４４）。同様の陰性結果は、Ｎ−アセチルシステインで見られた（ＮＡＣ、図４８）。外因性グルタチオンは、ジクロロフルオレセイン染色によって測定されるように、細胞に侵入し、活性酸素（ＲＯＳ）レベルを低減することができた（図４９）。よって、ＮＲＦ２活性の要件は、驚くべきことにグルタチオン合成経路に非依存性である。
【０１８２】
ＮＲＦ２応答におけるグルタチオン経路の効果をさらに調査するために、ｘＣＴグルタミン酸／システインアンチポーターの発現及び活性、グルタチオン合成における律速段階のうちの１つを監視した。ＳＬＣ７Ａ１１発現は、ＮＲＦ２ノックダウン後に低減し（図５０）、還元グルタチオン（図５２）に関連したシスチン取り込みの減少（図５１）を引き起こした。ＮＲＦ２ノックダウンは、ＲＯＳレベルの大幅な増加も引き起こした（図５３）。ＳＬＣ７Ａ１１発現及びシスチン取り込みの阻害がＮＲＦ２ノックダウン後に減少した生存率の一因であったかを決定するために、ｘＣＴ機能はエラスチンを用いて開始し、これはシスチン取り込みを阻害し（図５１）、酸化ストレスを増加した（図５３）。しかしながら、これは、ＫＥＡＰ１変異体細胞株Ａ５４９（図５４）またはほとんどの他のＫＥＡＰ１変異体細胞株（図５５）の生存率を減少するのに十分ではなかった。エラスチン及びＮＲＦ２ノックダウンの組み合わせは、しかしながら、生存率の劇的な減少をもたらした（図５４）。同様に、グルタチオンシンターゼ阻害剤ブチオニンスルホキシミン（ＢＳＯ）またはグルタミナーゼ阻害剤ＢＰＴＥＳも、ＫＥＡＰ１変異体細胞株について優先的な毒性を示さなかった（図５６及び５７）。これらの結果は、グルタチオンの補充がＮＲＦ２ノックダウンによって誘発される致死性をレスキューするのに十分ではなく、グルタチオンの枯渇もＫＥＡＰ１変異体細胞株を殺滅するのに十分ではなかったことを示す。
【０１８３】
ＮＲＦ２活性化またはＫＥＡＰ１喪失の結果としてどの経路が活性化されたかを理解するために、ＣＲＩＳＰＲスクリーンは、Ａ５４９細胞においてＮＲＦ２ノックダウン後に減少及び／またはＫＥＡＰ１変異体ＮＳＣＬＣ細胞株のパネルにおいて上昇した遺伝子のライブラリーを用いて行われた。２Ｄ、３Ｄ、及び異種移植条件においてＮＲＦ２ノックダウン後に異なる結果が観察されたので、スクリーンは、個別の依存性が特定され得るかを決定するために全ての３つの環境下で行われた。全ての３つの条件について１５日時点で、全ての３つのスクリーンは同様に機能し、ｇＲＮＡは有意なドロップアウトを示す少数の遺伝子のみを表した（図５８〜６０）。ＮＦＥ２Ｌ２及びその結合パートナー、ＭＡＦＧは、最も有意な遺伝子の中にあり、スクリーンが予想通りに機能したことを示した。ペントースリン酸経路遺伝子ＰＧＤ、Ｇ６ＰＤ、及びＴＫＴ、既知のＮＲＦ２標的遺伝子も、強いドロップアウトを示した。スクリーンにおける他の強いヒットは、２つの成長因子受容体遺伝子、ＩＧＦ１Ｒ及びＥＲＢＢ３、ならびにレドックスシグナル伝達リレーの３つの成分をコードする遺伝子、ＰＲＤＸ１、ＴＸＮ、及びＴＸＮＲＤ１であった。
【０１８４】
ＥｒｂＢ３の発現は、Ａ５４９細胞におけるＮＲＦ２ノックダウン後に減少した（図５８〜６０）。腫瘍異種移植モデルにおけるＹＷ５７．８８．５での処理は、Ａ５４９増殖にはＥｒｂＢ３が必要であることを示した（図６１）。
【０１８５】
ＩＧＦ１Ｒの発現は、ＫＥＡＰ１野生型ＮＳＣＬＣ細胞株に対するＫＥＡＰ１変異体ＮＳＣＬＣ細胞においてより大きかった。ＫＥＡＰ１変異体及びＫＥＡＰ１野生型細胞に対するＩＧＦ１Ｒ阻害の効果を試験するために、細胞株をリンシチニブ、有効な選択的ＩＧＦ１Ｒ小分子阻害剤で処理した。リンシチニブは、３つの野生型及び３つの変異体ＫＥＡＰ１ＮＳＣＬＣ細胞株において試験された場合、増殖に対する効果をほとんど示さなかった。しかしながら、この化合物は、軟寒天におけるＡ５４９細胞のコロニー成長を阻害するのに非常に有効であり、約２０ｎＭのＩＣ５０を有した。また、ＮＳＣＬＣ細胞株の大パネルに対して試験された場合、ＫＥＡＰ１変異体細胞株ではこの化合物の軟寒天における選択的成長阻害があるようであった。足場非依存性条件下で成長させた場合のＫＥＡＰ１変異体細胞株に対する同様の選択的効果は、独立したＩＧＦ１Ｒ阻害剤ＮＶＰ−ＡＥＷ５４１でも見られた（図６２）。
【０１８６】
よって、ＩＧＦ１Ｒ及びＥｒｂＢ３を介してシグナル伝達する成長因子は、ＫＥＡＰ１変異体細胞の成長の有意なメディエーターである。
【０１８７】
他の実施形態
前述の発明は、明確な理解のために例証及び実施例によっていくらか詳細に記載されているが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用される全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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