(57)【要約】  動物飼料ペレットであって、動物飼料を摂取した動物に利益を与えるのに充分な量で飼料ペレットに組み込まれた生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉ細菌を含む、前記動物飼料ペレットが提供される。また、その製造方法およびその使用も提供される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物飼料ペレットであって、当該ペレット中に組み込まれた、生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉ細菌を含んでいる、前記動物飼料ペレット。
【請求項２】
前記細菌が、少なくとも１×１０５ＣＦＵ／ｇの量である、請求項１に記載の動物飼料ペレット。
【請求項３】
前記の生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉが、当該動物飼料ペレット中に組み込まれた飼料添加物に埋め込まれている、請求項１または２に記載の動物飼料ペレット。
【請求項４】
前記飼料添加物がマトリックスを含んでおり、該マトリックスは、当該ペレットへの組み込み前に＜０．３である水分活性（ａｗ）を有する、請求項３に記載の動物飼料ペレット。
【請求項５】
前記マトリックスが、親水コロイド形成多糖を含んでいる、請求項４に記載の動物飼料ペレット。
【請求項６】
前記親水コロイド形成多糖が第１の多糖であり、前記マトリックスがさらに、前記の第１の多糖とは異なる第２の多糖を含んでいる、請求項５に記載の動物飼料ペレット。
【請求項７】
前記親水コロイド形成多糖が第１の多糖であり、前記飼料添加物がさらに、その表面の少なくとも一部の上に配置された被覆を含んでおり、かつ、該被覆は、前記の第１の多糖とは異なる第２の多糖を含んでいる、請求項５に記載の動物飼料ペレット。
【請求項８】
前記マトリックスが孔を含んでいる、請求項５〜７のいずれか一項に記載の動物飼料ペレット。
【請求項９】
前記被覆が微粒子状カルシウム含有化合物を含んでいる、請求項７に記載の動物飼料ペレット。
【請求項１０】
前記カルシウム含有化合物が乳酸カルシウムを含んでいる、請求項９に記載の動物飼料ペレット。
【請求項１１】
前記親水コロイド形成多糖がアルギン酸を含んでいる、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の動物飼料ペレット。
【請求項１２】
前記飼料添加物がさらに二糖を含んでいる、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の動物飼料ペレット。
【請求項１３】
前記二糖が、スクロース、トレハロースまたはそれらの組み合わせを含んでいる、請求項１２に記載の動物飼料ペレット。
【請求項１４】
前記飼料添加物がさらにアミノ酸の塩を含んでいる、請求項１２または１３に記載の動物飼料ペレット。
【請求項１５】
前記アミノ酸の前記塩がＬ−グルタミン酸の塩を含んでいる、請求項１４に記載の動物飼料ペレット。
【請求項１６】
動物飼料ペレットに生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを組み込むための飼料添加物であって、当該飼料添加物は、マトリックスに埋め込まれた前記非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを含んでおり、該マトリックスは、＜０．３である水分活性（ａｗ）を有し、かつ、親水コロイド形成多糖を含んでいる、前記飼料添加物。
【請求項１７】
前記親水コロイド形成多糖が第１の多糖であり、前記マトリックスが前記の第１の多糖とは異なる第２の多糖を含んでいる、請求項１６に記載の動物飼料ペレットに生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを組み込むための飼料添加物。
【請求項１８】
前記親水コロイド形成多糖が第１の多糖であり、当該飼料添加物がさらに、その表面の少なくとも一部の上に配置された被覆を含んでおり、該被覆は、前記の第１の多糖とは異なる第２の多糖を含んでいる、請求項１６に記載の動物飼料ペレットに生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを組み込むための飼料添加物。
【請求項１９】
前記マトリックスが孔を含んでいる、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の動物飼料ペレットに生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを組み込むための飼料添加物。
【請求項２０】
前記被覆が微粒子状カルシウム含有化合物を含んでいる、請求項１８に記載の動物飼料ペレットに生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを組み込むための飼料添加物。
【請求項２１】
前記カルシウム含有化合物が乳酸カルシウムを含んでいる、請求項１８に記載の動物飼料ペレットに生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを組み込むための飼料添加物。
【請求項２２】
前記親水コロイド形成多糖がアルギン酸を含んでいる、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の動物飼料ペレットに生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを組み込むための飼料添加物。
【請求項２３】
さらに二糖を含んでいる、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の動物飼料ペレットに生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを組み込むための飼料添加物。
【請求項２４】
前記二糖が、スクロース、トレハロースまたはそれらの組み合わせを含んでいる、請求項２３に記載の動物飼料ペレットに生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを組み込むための飼料添加物。
【請求項２５】
さらにアミノ酸の塩を含んでいる、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の動物飼料ペレットに生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを組み込むための飼料添加物。
【請求項２６】
前記アミノ酸の前記塩がＬ−グルタミン酸の塩を含んでいる、請求項２５のいずれか一項に記載の動物飼料ペレットに生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを組み込むための飼料添加物。
【請求項２７】
少なくとも１×１０６ＣＦＵ／ｇの前記Ｅ．  ｃｏｌｉを含んでいる、請求項１６〜２６のいずれか一項に記載の動物飼料ペレットに生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを組み込むための飼料添加物。
【請求項２８】
動物飼料ペレットを調製するための方法であって、当該方法は：
ａ．  前記飼料ペレットを製造するための材料および飼料添加物を提供することを含んでおり、該飼料添加物は、生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを含んでおり；
ｂ．  前記材料および前記飼料添加物をペレット化して前記動物飼料ペレットを取得することを含んでいる、
前記方法。
【請求項２９】
前記飼料添加物が、請求項１６〜２７のいずれか一項に記載の飼料添加物を含んでいる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記飼料添加物の前記提供が、飼料添加物を粒子形態で提供することを含んでおり、該粒子は、第１の平均直径サイズを有する粒子の第１の個体群および第２の平均直径サイズを有する粒子の第２の個体群を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記飼料添加物の前記提供が、前記の第１の個体群および前記の第２の個体群の量を、第１対第２の比が＞１となるように選択することを含んでいる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ペレット化が、前記材料および前記飼料添加物を蒸気調節に曝露することを含んでいる、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本願は、エリック  ナデューによって２０１６年６月１４日付けで出願された米国仮特許出願シリアル番号第６２／３４９，８４３号の利益を主張する。上記文献の内容は、それら全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本願は概して、飼料添加物を含む動物飼料ペレット、その製造方法およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ペレット状の動物飼料は、典型的には、任意の機械的処理によって圧縮し、かつ、ダイス開口部を通らせることにより個別の材料または混合物を押出することによって形成される、塊状になった飼料と定義される。基本的には、ペレット化の目的は、細かく分けられた、時にはほこり状である、味が悪く扱いが困難である飼料材料を採用し、かつ、高い熱、湿度（蒸気調節）および圧力を用いることによって、それをより大きい粒子にすることである。
【０００４】
商業的飼料粉砕に用いられる、広範囲の温度と保持時間との組み合わせの調節が存在し（ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｆｅｅｄｓ，  Ｓｕｐｐｌｙ，  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｖｅ  Ｖａｌｕｅ，  ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （２００２），  ｐｐ．  ３０１−３１６）、かつ典型的には、ペレット化処理は、サルモネラ菌および大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のような飼料由来の病原体を制御するために、好ましくない熱、湿度および圧力条件を伴う。現行の業界実務では、例えば、いくつかの飼料粉砕機におけるコンディショナー温度は９０℃に達するかも知れず、飼料業界は、飼料由来の病原体を制御するために、いっそう高く、かつ、過酷な飼料処理条件へと移行する傾向にある。
【０００５】
動物飼料ペレットに組み込まれる生菌補給は、熱安定的であり、かつ、常温保存が可能である細菌の菌株を用いて可能である。なぜなら、そうでなければ、ペレット化の過酷な圧力、温度および湿度条件に対する細菌の不安定性が、ペレット状の飼料へのそれらの使用に問題をもたらすからである。
【０００６】
例えば、胞子の形態で存在し得る菌株は、動物飼料ペレットに組み込むのに有用であり得る。細菌胞子は、極端な温度、湿度の欠如／渇水または化学物質および放射線への曝露を含む細菌の生息場所における極端な変化に対して抵抗性であることによって、細菌が生存するのを補助する休眠生命体である。したがって、細胞胞子は、生菌を動物飼料ペレットに組み込もうとする時に有益であり得る。最も胞子を形成する細菌は、バチルスおよびクロストリジウム属に含有される。
【０００７】
胞子を形成しない生菌の細胞株は、典型的にはペレットに組み込まれないが、ペレット上に被覆される（すなわち、ペレットの材料を上記の過酷な条件に差し出した後で）。例えば、国際公開第２０１１／０９４４６９号公報には、飼料ペレットがまず脂肪ベースの湿度バリアで噴霧され、その後で生菌を含有する乾燥組成物と接触させ、最後に脂肪ベースの湿度バリアの追加被覆で噴霧され、飼料ペレットの表面上の被覆の量が約１０重量％〜１５重量％であるようになっている、生菌ペットフードおよび魚餌の調製について記載されている。
【発明の概要】
【０００８】
概要
この概要は、詳細な説明において以下でさらに説明される概念の抜粋を簡易な形態で紹介するために提供される。この概要は、請求される主題の重要な態様または必須の態様を特定することを意図しない。
【０００９】
本明細書で具現化され、かつ、概括的に説明されるように、本開示は、生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを含む動物飼料ペレットに関し、該Ｅ．  ｃｏｌｉはペレットに組み込まれている。Ｅ．  ｃｏｌｉは、動物飼料を摂取した動物に有益な効果を付与するのに十分な量である。Ｅ．  ｃｏｌｉは、典型的には食品と関連付けられない微生物である；したがって、Ｅ．  ｃｏｌｉが自発的に動物飼料に含まれることは、ありふれたことでも従来から行われていることでもない。
【００１０】
先に説明したように、業界で用いられるペレット化条件は、サルモネラ菌およびＥ．  ｃｏｌｉのような病原体を制御する（すなわち、殺す）ために、飼料材料を過酷な条件に差し出すように設計されている。１つの実施形態では、本開示は、未だ病原体を制御しながら、非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉ細菌を飼料ペレットに組み込むために、必要である過酷な条件の効果を和らげる手段を提案する。
【００１１】
１つの実施形態では、動物飼料ペレットは、少なくとも１×１０５ＣＦＵ／ｇのペレットに組み込まれた生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉ細菌を含んでいる。
【００１２】
１つの実施形態では、生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉは、飼料添加物に埋め込まれている。その後、飼料添加物は動物飼料ペレットに組み込まれる。実用的実施形態では、飼料添加物は、種々の形態で動物飼料に組み込まれてもよい。例えば、飼料添加物は、動物飼料と同時に押し出されたり、動物飼料内に包まれたりしてもよい。当業者であれば、飼料添加物を動物飼料に組み込む種々の手段が本開示の文脈の範囲内で用いられてもよいことを容易に認識するであろう。
【００１３】
本明細書で具現化され、かつ、概括的に説明されるように、本開示はまた、生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを動物飼料ペレットに組み込むための飼料添加物に関し、該飼料添加物はマトリックスに埋め込まれた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを含んでおり、マトリックスはペレットへの組み込み前に＜０．３の水分活性（ａｗ）を有する。マトリックスは、親水コロイド形成多糖を含んでいる。
【００１４】
非限定的な実施形態では、飼料添加物はさらに、次の一式の特徴のうちの１つ以上を含んでいる：
・マトリックスは、親水コロイド形成多糖とは異なる第２の多糖を含んでいてもよい。必要に応じて、マトリックスは二糖を含んでいてもよい。
・マトリックスは、その表面の少なくとも一部の上に配置された被覆を含んでいてもよい。
・マトリックスは、孔を含んでいてもよい。
・被覆は、親水コロイド形成多糖とは異なる第２の多糖を含んでいてもよい。必要に応じて、被覆は二糖を含んでいてもよい。
・被覆は、微粒子状カルシウム含有化合物を含んでいてもよい。
・マトリックスは孔を含んでいてもよく、かつ、被覆は孔を定める表面上に少なくとも配置されてもよい。
【００１５】
当業者であれば、飼料添加物の実施形態が上記の特徴の任意の組み合わせを含んでいてもよいことを容易に認識するであろう。
【００１６】
上記の実施形態では、当業者であれば、マトリックスが、動物の消費に適した、かつ／または、非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉと適合した１つ以上の要素を含んでいてもよいことを容易に認識するであろう。 
【００１７】
非限定的な実施形態では、飼料添加物は、少なくとも１×１０６ＣＦＵ／ｇのＥ．  ｃｏｌｉを含んでいる。例えば、当該飼料添加物は、少なくとも１×１０７ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１×１０８ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１×１０９ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１×１０１０ＣＦＵ／ｇ、少なくとも１×１０１１ＣＦＵ／ｇを含んでいてもよい。
【００１８】
非限定的な実施形態では、飼料添加物は粒子の形態である。実用的実装では、粒子の少なくとも一部が、先に説明したような被覆を含むブリッジによって一緒に保持された粒子の凝集体を形成してもよい。
【００１９】
１つの実用的で非限定的な実施形態では、本明細書に記載の微粒子状カルシウム含有化合物は、乳酸カルシウムを含んでいる。
【００２０】
非限定的な実施形態では、飼料添加物は、飼料添加物としての従来の貯蔵／出荷条件を付与する、かつ／または、動物飼料に組み込まれた時に細菌の細胞生存率および／もしくは機能的特徴に対する有意な有害効果を伴うことのない、１つ以上の要素を含んでいてもよい。換言すれば、特定の実施形態において非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉが天然の対応物を有していてよくても、後者は従来の貯蔵／出荷条件に苦しみ、それが細菌の細胞生存率の有意な低下および／または機能的特徴の損失をもたらすようになっている。したがって、本明細書に記載の飼料添加物は、従来の貯蔵／出荷条件（例えば、周囲温度および相対湿度における、または、周囲温度および相対湿度より上の条件を例えば含んでいてもよい）下で長期間Ｅ．  ｃｏｌｉを安定化させ、かつ、その活性を保存するかも知れない。かかる要素の例は、本文書における他の場所でさらに説明される。
【００２１】
追加的または代替的な実施形態では、飼料添加物は、１つ以上の要素を含んでいてもよく、Ｅ．  ｃｏｌｉが天然起源のＥ．  ｃｏｌｉと比べて顕著に変化した特性を有するようになっており、該特性としては、例えば次の項目のうちの少なくとも１つが挙げられるが、それらに限定されない： 
・飼料添加物は、細菌の細胞生存率の有意な低下および／または機能的特徴の損失を伴わず、飼料添加物の調製および／または貯蔵の間にＥ．  ｃｏｌｉのフリーズドライまたは凍結を有利に可能にするかも知れない１つ以上の低温保存料を含んでいてもよい；
・飼料添加物は、官能特性に良い影響を与えるかも知れない１つ以上の要素を含んでいてもよく、動物飼料への組み込みの際に動物飼料がかかる１つ以上の要素を欠く組成物中の天然起源のＥ．  ｃｏｌｉと比べてより心地良い食感を有していてもよいようになっている。例えば、培養液と混合した非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを含む飼料添加物は、動物を退け、したがって、飼料の投与を有意により困難にする典型的な４つのにおい／味わいを有し、一方で、官能特性に良い影響を与える１つ以上の要素の存在は、かかる４つのにおい／味わいをごまかしてもよく、中和してもよい；
・飼料添加物は、ペレット化する時にＥ．  ｃｏｌｉの動物飼料への組み込みを容易にするかも知れないＥ．  ｃｏｌｉ製剤の形態（例えば、ゲル様の広げることが可能な堅さ、および／または、多孔質の固体もしくは半固体構造体など）に影響を与えるかも知れない１つ以上の要素を含んでいてもよい；
・飼料添加物は、カスタマイズ可能な粒子サイズを有する粒子の形態であってもよく、カスタムサイズまたはサイズ範囲は所望の結果物を取得するように選択されてもよい。例えば、粒子の第１の個体群が第１の平均直径サイズを有するように選択されてもよく、かつ、粒子の第２の個体群が第２の平均直径サイズを有するように選択されてもよい。第１の平均直径サイズと第２の平均直径サイズとは、異なっていてもよい（すなわち、＞１であるサイズ比（第１：第２）を有していてもよい）。当業者であれば、かかる粒子サイズ分布が所望の結果物を取得するためにカスタマイズ可能である溶解率をもたらすかも知れないことを認識するであろう。
【００２２】
当業者であれば、飼料添加物の実施形態が上記の特徴の任意の組み合わせを含んでいてもよいことを容易に認識するであろう。
【００２３】
上記の実施形態は、天然起源のＥ．  ｃｏｌｉのものと比べて顕著な特徴の相違を示すかも知れない（なぜなら、それらが、本発明の性質に関連するやり方でその天然の対応物とは別個の動物飼料ペレットをもたらすためである）、改変された特性の非限定的な例を表す。
【００２４】
非限定的な実施形態では、カスタマイズ可能な粒子サイズは、乾燥Ｅ．  ｃｏｌｉの増大した、かつ／または、一貫した溶解率を取得することを可能にするかも知れず、これは天然起源の乾燥Ｅ．  ｃｏｌｉの対応する遅く、かつ、一貫しない溶解率とは逆である。実際、カスタマイズされた溶解率は、粒子の第１および第２の個体群の間の適切な粒子サイズ比の選択に基づいて取得されてもよい。
【００２５】
非限定的な実施形態では、カスタマイズ可能な粒子サイズは、非病原性菌株の時間放出性（ｔｉｍｅ−ｒｅｌｅａｓｅ；徐放性）送達を取得することを可能にするかも知れず、これは、天然起源のＥ．  ｃｏｌｉまたは他の形態で投与されるＥ．  ｃｏｌｉ（例えば、飲料水中）の一気の送達とは逆である。かかる徐放性送達は、大きい／小さい粒子の比をカスタマイズすることに基づいていてもよく、全体ではＥ．  ｃｏｌｉが所定の期間過酷な腸管環境から保護されるようになっている。次に、制御されたＥ．  ｃｏｌｉの送達タイミングは、腸管に沿う予め選択された位置における送達を可能にし得る。換言すれば、当業者は、Ｅ．  ｃｏｌｉの所定の徐放を可能にするために特定の粒子サイズ分布を選択してもよく、腸管輸送に影響を与える種々の要因をファクタリングする時にＥ．  ｃｏｌｉが腸管の所定の部分に主に送達され得るようになっている。
【００２６】
本明細書で具現化され、かつ、概括的に説明されるように、本開示はまた、本明細書に記載の飼料添加物を動物飼料ペレットに組み込むためのシステムに関する。当該システムは、ユーザーが動物飼料に組み込まれる細菌の量または各動物飼料ワゴンおよび／もしくは飼料システムに提示される細菌の量を制御することを可能にするユーザーインターフェースを含んでいてもよい。これは、次の非限定的な実用的実装のうちの１つ以上によって取得されてもよい：
・飼料添加物に埋め込まれた、所定量の、生きているが休眠している細菌を活性化させること。このことは、例えば、所定量の細菌／飼料添加物への適切な活性剤（水蒸気、糖などのようなものであるが、それらに限定されない）の添加によって達成され得る。続いて、飼料添加物は、ペレットを取得するために動物飼料に組み込まれてもよい。その後、ペレットは、動物飼料システムおよび／または動物飼料ワゴンに送達され得る；
・動物飼料ペレットに組み込まれる飼料添加物の粒子の特定の割合を選択すること。かかる実用的実装では、粒子は、生きた非病原性細菌の第１の量（コロニー形成単位、「ＣＦＵ」）を有する粒子の第１の個体群と、前記の生きた非病原性細菌の第２のＣＦＵを有する粒子の第２の個体群とを含んでいてもよい。
【００２７】
本明細書で具現化され、かつ、概括的に説明されるように、本開示はまた、本明細書に記載の飼料添加物を形成するためのキットに関する。当該キットは、第１のバイアルに本明細書に記載の第１の親水コロイド形成多糖を含んでおり、別個の第２のバイアルに本明細書に記載のＥ．  ｃｏｌｉを含んでおり、別個の第３のバイアルに第１の多糖とは異なる本明細書に記載の第２の多糖を含んでおり、かつ、別個の第４のバイアルに本明細書に記載の二糖を含んでいる。必要に応じて、本明細書に記載の第２、第３および／または第４のバイアルのうちの１つはさらに、カルシウム塩を含んでいてもよい。別の選択肢では、カルシウム塩は、別個の第５のバイアルに含まれていてもよい。
【００２８】
当業者であれば、先行して説明したキットが、同一のバイアルに存在する、列挙された要素のうちの１つ以上を含んでいてもよいことを容易に理解するであろう（そのように含まれることに適合することが条件）。
【００２９】
１つの非限定的な実施形態では、本明細書に記載の二糖は、スクロース、トレハロースまたはそれらの組み合わせを含んでいる。
【００３０】
非限定的な実施形態では、本明細書に記載のカルシウム塩は、乳酸カルシウムを含んでいてもよい。
【００３１】
本明細書で具現化され、かつ、概括的に説明されるように、本開示はまた、動物飼料ペレットを調製するための方法に関し、当該方法は：飼料ペレットを製造するための材料と飼料添加物とを提供することを含んでおり、該飼料添加物は生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを含んでおり；材料と飼料添加物をペレット化して動物飼料ペレットを取得することを含んでいる。 
【００３２】
非限定的な実施形態では、飼料添加物を提供するステップは、飼料添加物を粒子の形態で提供することを含んでおり、該粒子は、第１の平均直径サイズを有する粒子の第１の個体群と、第２の平均直径サイズを有する粒子の第２の個体群とを有する。
【００３３】
本明細書で具現化され、かつ、概括的に説明されるように、本開示はまた、本明細書に記載の飼料添加物を形成するための方法に関する。当該方法は、粒子と本明細書に記載のＥ．  ｃｏｌｉとを提供することを含んでおり、該粒子は、親水コロイド形成多糖である第１の多糖と、第１の多糖とは異なる第２の多糖と、スクロース、トレハロースまたはそれらの組み合わせを含む二糖とを含んでいる。当該方法はまた、粒子を乾燥させて＜０．３である水分活性（ａｗ）を取得することを含んでいる。
【００３４】
非限定的な実施形態では、粒子を提供するステップは、Ｅ．  ｃｏｌｉを第１の多糖と混合して混合物を形成することと；該混合物から粒子を形成することと；該粒子をスクロースまたはトレハロースおよび第２の多糖を含む保存溶液と接触させることとを含んでいる。
【００３５】
別の非限定的な実施形態では、粒子を提供するステップは、Ｅ．  ｃｏｌｉを第１の多糖と混合し、かつ、スクロースまたはトレハロースおよび第２の多糖を含む保存溶液と混合して混合物を形成することと；該混合物から粒子を形成することとを含んでいる。
【００３６】
１つの実施形態では、動物飼料ペレットは、家禽、ブタおよびウシのうちのいずれか１つによる消費のためのものである。
【００３７】
本開示に記載され、かつ、相互に排他的ではない実施形態のすべての特徴は、互いに組み合わせられ得る。１つの実施形態の要素は、さらなる言及を伴わず、その他の実施形態において利用され得る。本発明のその他の態様および特徴は、添付の図面とともに以下の特定の実施形態の説明を検討した当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
特定の実施形態の詳細な説明が、添付の図面を参照して以下で提供される：
【００３９】
【図１】図１は、本開示の実施形態による、細菌培養物を調製するための非限定的なフローチャートを示している。
【図２】図２は、本開示の実施形態による、埋め込まれたＥ．  ｃｏｌｉを有するビーズを乾燥させるための非限定的なフローチャートを示している。
【図３】図３は、本開示の実施形態による、飼料添加物を分配するためのシステムの非限定的な図を示している。
【図４】図４は、本開示の実施形態による、風乾後の細菌生存率に対する保存溶液Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４の効果を描いた非限定的な棒グラフを示している。
【図５】図５は、本開示の実施形態による、風乾後の細菌生存率に対する保存溶液Ｓ１、Ｓ５、Ｓ６およびＳ７の効果を描いた非限定的な棒グラフを示している。
【図６】図６は、本開示の実施形態による、風乾後の細菌生存率に対する保存溶液Ｓ１、Ｓ０、Ｓ８およびＳ９の効果を描いた非限定的な棒グラフを示している。
【図７】図７は、本開示の実施形態による、風乾後の細菌生存率に対する保存溶液Ｓ１、Ｓ１０、Ｓ１１およびＳ１２の効果を描いた非限定的な棒グラフを示している。
【図８】図８は、本開示の実施形態による、風乾後の細菌生存率に対する保存溶液Ｓ１、Ｓ１３、Ｓ１４およびＳ１５の効果を描いた非限定的な棒グラフを示している。
【図９】図９は、本開示の実施形態による、風乾後の細菌生存率に対する保存溶液Ｓ１、Ｓ１６、Ｓ１７およびＳ１８の効果を描いた非限定的な棒グラフを示している。
【図１０】図１０は、本開示の実施形態による、風乾後の細菌生存率に対する保存溶液Ｓ１およびＳ１９の効果を描いた非限定的な棒グラフを示している。
【図１１Ａ】図１１Ａ、図１１Ｂおよび図１Ｃは、図４〜図１０に表された生データを示している。
【図１１Ｂ】図１１Ａ、図１１Ｂおよび図１Ｃは、図４〜図１０に表された生データを示している。
【図１１Ｃ】図１１Ａ、図１１Ｂおよび図１Ｃは、図４〜図１０に表された生データを示している。
【図１２】図１２は、２４週間にわたる、乾燥した粒子ビーズ中のＣＦＵ安定性の非限定的なグラフ表示を示している。黒塗りの円および白塗りの円は、同一の製造工程を用いた２つの異なるバッチ生産の結果である。
【図１３】図１３は、本開示の実施形態による飼料添加物を組み込んだ動物飼料を与えられたブタ（ＩＰ）および飼料添加物のない動物飼料を与えられたブタ（「ＣＰ」）の、７日後の平均体重増加（Ｋｇ）を描いた非限定的な棒グラフである。棒エラーは、標準誤差を描いている（ｐ＝０．０４４）。
【図１４】図１４は、図１３のブタの、７日間の平均一日体重増加（ｇ／日）を描いた非限定的な棒グラフである。棒エラーは、標準誤差を描いている（ｐ＝０．０４４）。
【図１５】図１５は、本開示の実施形態による飼料添加物粒子の断面を示している。
【図１６】図１６は、図１５の飼料添加物粒子の変形（粒子が孔を有する）の断面を示している。
【図１７】図１７は、表２９および表３０に表された生データを含む次の図をどのように読み込むかを描いている。次の図は、１７Ａ〜１７Ｐである。
【図１７Ａ】図１７は、表２９および表３０に表された生データを含む次の図をどのように読み込むかを描いている。次の図は、１７Ａ〜１７Ｐである。
【図１７Ｂ】図１７は、表２９および表３０に表された生データを含む次の図をどのように読み込むかを描いている。次の図は、１７Ａ〜１７Ｐである。
【図１７Ｃ】図１７は、表２９および表３０に表された生データを含む次の図をどのように読み込むかを描いている。次の図は、１７Ａ〜１７Ｐである。
【図１７Ｄ】図１７は、表２９および表３０に表された生データを含む次の図をどのように読み込むかを描いている。次の図は、１７Ａ〜１７Ｐである。
【図１７Ｅ】図１７は、表２９および表３０に表された生データを含む次の図をどのように読み込むかを描いている。次の図は、１７Ａ〜１７Ｐである。
【図１７Ｆ】図１７は、表２９および表３０に表された生データを含む次の図をどのように読み込むかを描いている。次の図は、１７Ａ〜１７Ｐである。
【図１７Ｇ】図１７は、表２９および表３０に表された生データを含む次の図をどのように読み込むかを描いている。次の図は、１７Ａ〜１７Ｐである。
【図１７Ｈ】図１７は、表２９および表３０に表された生データを含む次の図をどのように読み込むかを描いている。次の図は、１７Ａ〜１７Ｐである。
【図１７Ｉ】図１７は、表２９および表３０に表された生データを含む次の図をどのように読み込むかを描いている。次の図は、１７Ａ〜１７Ｐである。
【図１７Ｊ】図１７は、表２９および表３０に表された生データを含む次の図をどのように読み込むかを描いている。次の図は、１７Ａ〜１７Ｐである。
【図１７Ｋ】図１７は、表２９および表３０に表された生データを含む次の図をどのように読み込むかを描いている。次の図は、１７Ａ〜１７Ｐである。
【図１７Ｌ】図１７は、表２９および表３０に表された生データを含む次の図をどのように読み込むかを描いている。次の図は、１７Ａ〜１７Ｐである。
【図１７Ｍ】図１７は、表２９および表３０に表された生データを含む次の図をどのように読み込むかを描いている。次の図は、１７Ａ〜１７Ｐである。
【図１７Ｎ】図１７は、表２９および表３０に表された生データを含む次の図をどのように読み込むかを描いている。次の図は、１７Ａ〜１７Ｐである。
【図１７Ｏ】図１７は、表２９および表３０に表された生データを含む次の図をどのように読み込むかを描いている。次の図は、１７Ａ〜１７Ｐである。
【図１７Ｐ】図１７は、表２９および表３０に表された生データを含む次の図をどのように読み込むかを描いている。次の図は、１７Ａ〜１７Ｐである。
【００４０】
図中、実施形態は、例として示されている。説明および図面は、特定の実施形態を説明する目的のためのみのものであり、かつ、理解の補助であることが明確に理解されるべきである。請求の範囲は、本開示に記載の実施形態によって限定されるべきではなく、全体として説明と一致する最も広い解釈をされるべきである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
実施形態の詳細な説明
本開示は概括的には、動物飼料ペレットであって、Ｅ．  ｃｏｌｉ細菌を、動物飼料を摂取した動物に有益な効果を与えるのに十分な量で含む前記動物飼料ペレットに関する。
【００４２】
１つの実用的実装では、動物飼料は、生きたＥ．  ｃｏｌｉ細菌を含む動物飼料ペレットである。本開示では、用語「生きた」は、動物飼料中の細菌が非活動的な（休眠）状態にあると考えられ得る一方で、これら細菌が、細菌を特定の条件（例えば、十分な温度、湿度および／または酸素）に曝露する際に活動的な状態へと戻され得るという概念に関する。
【００４３】
有利なことに、かかる動物飼料ペレットの投与は、動物生産者による最小限の取り扱いしか必要としなくてもよく、かつ／または、用量調製を必要としなくてもよい。さらに、他の手段（例えば、飲水）を通した長期間の投与は、本明細書に記載の飼料と比べて菌株の生存に有意な影響を与えるかも知れない。
【００４４】
大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）は胞子を形成しない細菌であり、そのようであるので、胞子を形成する細菌よりも過酷な条件に対する耐性が低い。さらに、圧力、温度および湿度条件に関する、飼料をペレット化する際の現行の業界実務は、Ｅ．  ｃｏｌｉおよびサルモネラ菌のような病原体を最少レベルに制御して汚染リスクを低減させることを目的とする。本願は驚くべきことに、Ｅ．ｃｏｌｉを大量に含むが、動物の消費に適した動物飼料ペレットに関する。換言すれば、本開示に記載の動物飼料ペレットは、非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを、飼料を摂取する動物に所望の利益を提供するのに十分な量で含んでいるが、動物飼料ペレットは、病原性Ｅ．  ｃｏｌｉのレベルを制御した（最小化した）ことで消費に未だに適している。
【００４５】
本開示は、少なくとも、本開示におけるペレット化された飼料を製造する時に、先行して説明した病原体制御条件が未だに実装され、したがって病原体が制御される一方で、非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉの生存率が、ペレット化ステップを進める前に所望のＥ．  ｃｏｌｉ菌株を適切な飼料添加物に埋め込むことによって十分に維持されるという点で驚くべきものである。
【００４６】
本発明者は、驚くべきことに、かつ、意外なことに、本明細書に記載されるように飼料添加物に埋め込まれた生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを含む動物飼料ペレットが、その商業的使用のために、２５℃において２６週間という長期の所定期間にわたって十分な細菌ＣＦＵの生存率および機能を保存し得たことを観察した。
【００４７】
飼料添加物へのＥ．  ｃｏｌｉの埋め込み
飼料添加物に細菌（生菌ではあるが）を組み込む実用的実装が、本技術分野で提案されている。
【００４８】
例えば、国際公開第２０１１／０９４４６９号公報には、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム／オリゴ糖の重量比が１：１〜１０であるオリゴ糖（イヌリン、マルトデキストリン、デキストランなど）、二糖および加水分解タンパク質の混合物を含む組成物について記載されている。国際公開第２０１３／１４２７９２号公報には、オリゴ糖、二糖および多糖、ならびに、加水分解された動物性または植物性タンパク質を含むタンパク質成分を含む組成物について記載されている。これら文献にはそれぞれ、乾燥形態にある飼料添加物に包まれた生菌を取得するための同一の手順について記載されている：
・第１のステップでは、組成物の混合物および生菌（生菌は、冷凍液体培養物由来または生菌細菌の商業的粉末状由来のいずれかである）を含有する冷凍ビーズを形成する。冷凍ビーズは、混合物の小滴を液体窒素に浸すこと、および、結果として生じるビーズを−８０℃で貯蔵することによって取得される。
・第２のステップでは、冷凍ビーズは、ビーズが０．３より小さい水分活性に達するまで、真空下で乾かされる。 
【００４９】
これら文献に記載のカプセル化手順は、したがって、液体窒素中での冷凍という過酷な条件と、それに続く乾燥という過酷な条件とを組み合わせる。かかる過酷な条件は、これら文献において乾燥安定化組成物（例えば、国際公開第２０１１／０９４４６９号公報における図７および国際公開第２０１３／１４２７９２号公報における図１４を参照）であるとして教示される組成物の存在にも関わらず、取得される０．７３〜０．９０というＣＦＵ  ｌｏｇ損失を用いて反映される細菌の生存率に対する損害を出す。これら文献に記載の方法および組成物は、したがって、出発材料として液体細菌培養物を採用する時（ＣＦＵ  ｌｏｇ損失が理想の経済よりも小さくなり得る）には、業界の状況にとって最適化されない。
【００５０】
細菌（生菌ではあるが）にとってのその他の実用的保存および貯蔵条件もまた、先行して示唆されている。
【００５１】
乾燥中の低温曝露に起因して、細菌の保存および貯蔵のためにフリーズドライ（またの名を凍結乾燥）がしばしば用いられる（Ｒｈｏｄｅｓ，  Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｅｄ．  Ｊｏｎｅｓ，  ＤＧ，  １９９３，  ｐ．  ４１１−４３９，  Ｌｏｎｄｏｎ：  Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ）。しかしながら、それは、生存率を有意に低下させ、かつ、時間およびエネルギー集約的であるという望まれない特徴を有する。保護剤が提案されてきたが、フリーズドライ中に所定の添加物によって与えられる保護は、微生物の種とともに変化する（Ｆｏｎｔ  ｄｅ  Ｖａｌｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １９８３，  ２０：  ５６０−５６６）。
【００５２】
脱水を伴うような風乾もまた、細菌の保存および貯蔵に用いられてきた。真空乾燥がフリーズドライと類似の工程である一方で、それは３０分から数時間の間、０°〜４０℃にて起こる。この工程のメリットは、生産物が冷凍されておらず、したがって、エネルギー消費および関連する経済的影響が低減されることである。生産物の観点から、凍害は回避される。しかしながら、低温または周囲温度での脱水はゆっくりであり、汚染を回避するための余計な予防措置を必要とし、かつ、不満足な生存率をしばしばもたらす（Ｌｉｅｖｅｎｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １９９４，  ５１：７１−８９）。 
【００５３】
アルギン酸カルシウム（アルギン酸Ｃａ）ビーズのような親水コロイド形成多糖マトリックスに細菌を包むこともまた、異なる用途の広く、かつ、ますます増える範囲で細菌の保存および貯蔵に用いられてきた（Ｉｓｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０１０，  ２０：１３６７−１３７７）。代謝的にも生理的にも要求にかなう状態で細菌を維持し、したがって、所望の利益を取得するために、かかるマトリックスに適切な保存製剤を添加することが示唆されてきた。保存製剤は、典型的には、適切な担体中にある有効成分と、貯蔵、輸送中および標的領域において微生物細胞の安定化および保護を補助する添加剤とを含有する。
【００５４】
新規製剤の開発は、しかしながら、困難なタスクであり、かつ、すべての製剤が所定の細菌に有効であるわけではない（Ｙｏｕｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．，  ２００６  Ｓｅｐ  ５；９５（１）：７６−８３）。さらに、カプセル化された細菌についての特定の問題は、生産物の適切な貯蔵寿命を確実にするために、調製、貯蔵および／または輸送中、湿気への細菌の曝露を注意深く最小限にしなければならないという結果をもたらす。
【００５５】
本明細書に記載の物質の組成物およびその製造方法は、（１）飼料添加物を製造する時に実行される乾燥条件および（２）動物飼料をペレット化する時に用いられる過酷な温度、湿度および圧力条件に対して、生きたＥ．  ｃｏｌｉ細菌を保護するのを補助する飼料添加物を提供する（具体的には、液体培養物から製造される時に）。実際、本開示において取得された結果は、乾燥ステップに続いて、しばしば０．３０に近付く、意外であり、かつ、驚くべきＣＦＵ平均ｌｏｇ損失を示している。例えば、０．７０より小さく、または０．６０より小さく、または０．５０より小さく、または０．４０より小さく、または０．３０より小さく、または０．２５より小さく、または０．２０より小さく、または０．１５より小さく、または０．１０より小さい。
【００５６】
例えば、生きたＥ．  ｃｏｌｉは、本明細書で後に説明されるように、有意なＣＦＵ損失（ＣＦＵ  ｌｏｓｓ）を伴うことなく、少なくとも０．４、または少なくとも０．５、または少なくとも０．６、または少なくとも０．７である飼料添加剤への埋め込み手順中の粒子におけるａｗ分の１の減少（ａｗ  ｆｏｌｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を持続し得る。
【００５７】
有利なことに、本明細書に記載の飼料添加物を製造する方法は、既知の手順のデメリットのうちの少なくともいくつかを伴うことなく、業界の状況において実装され得る。例えば、業界の状況においては、大きい生産バッチが多かれ少なかれ連続的な態様で生産され、典型的には、長期間（例えば、数時間〜数日）、細菌を高い温度および／または湿度に差し出す場合がしばしばである。本明細書に記載の手順は、非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉをかかる条件から十分に保護し、Ｅ．  ｃｏｌｉが長期間の生存にとって理想的な温度／湿度状況にはない期間が長いにもかかわらず、提案された所望の結果のための十分な生存（すなわち、十分なＣＦＵ）を与える。
【００５８】
実用的実施形態では、動物飼料ペレットを製造するための方法は、飼料ペレットを製造するための材料と、飼料添加物とを提供することを含んでいてもよく、該飼料添加物は、生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを含んでいる。当該方法は、その後、材料と飼料添加物とをペレット化して動物飼料ペレットを取得することをさらに含んでいる。ペレット化手順は本技術分野で公知であり、したがって、本明細書ではさらに説明されないであろう。
【００５９】
１つの実施形態では、当該方法はさらに、飼料添加物を粒子の形態で提供することを含んでいてもよい。有利なことに、粒子は、平均粒子サイズの異質な個体群を有していてもよい。例えば、粒子は、第１の平均直径サイズを有する粒子の第１の個体群と、第２の平均直径サイズを有する粒子の第２の個体群とを含んでいてもよい。篩分けまたは濾過のような所定の平均直径を有する粒子を取得するための手順は公知であり、かつ、本明細書ではさらに説明されないであろう。特定の実施形態では、飼料添加物は、ある量の第１の個体群と、ある量の第２の個体群とを含んでいてもよく、これらは、＞１である第２の個体群に対する第１の個体群の割合を取得するように選択される。１つの非限定的な実施形態では、第１の粒子平均サイズは、少なくとも２５０ミクロン、または少なくとも５００ミクロン、または少なくとも１ｍｍである。
【００６０】
非限定的な実施形態では、飼料添加物は、所望の形状およびサイズに切断され得、または、押し砕かれ、かつ、流動性粉末へと機械練りされ得る。飼料添加物は、湿式もしくは乾式造粒、合粒、タブレット化、圧縮、ペレット化、または、当業者に容易に利用可能な任意のその他の種類の送達工程を用いてさらに処理され得る。粉砕、製粉、破砕または微粉砕のための工程は、本技術分野で周知である。例えば、ハンマーミル、空気ミル、衝撃ミル、ジェットミル、ピンミル、ワイリーミルまたは類似の製粉機が用いられ得る。
【００６１】
飼料添加物の特徴
図１５は、本開示の実施形態による飼料添加物粒子１６００の断面を示している。
【００６２】
図１５に示されている特定の実施形態では、粒子１６００は、マトリックス１５１０（その中に埋め込まれたＥ．  ｃｏｌｉ１５２０を有する）を含んでいる。マトリックス１５１０は、粒子１６００の表面の少なくとも一部を覆う被覆１５５０を含み得る。被覆１５５０は、被覆適用工程のいくつかにおいては内在的であるかも知れない厚さのバリエーションを有するものとして示されている。
【００６３】
図１６を参照すると、マトリクッス１５１０は孔を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、粒子は、マトリックスを製造するのに用いられる材料に内在的であるかも知れない孔を含んでいてもよい。その他の実施形態では、粒子は、粒子を製造する時に混合物に空気／ガスを注入することによって作られる孔を含んでいてもよい。その他の実施形態では、粒子は、両方の概念の組み合わせに起因する孔を含んでいてもよい。有利なことに、孔の存在は、ボイド領域１５３０の存在に起因して、マトリックスを製造するのに必要とされる材料を少なくするかも知れず、かつ／または、粒子への材料の侵入を増大させるかも知れない。図１６に示されているように、被覆１５５０は、孔を定める粒子の表面の表面の少なくとも一部を覆っていてもよい。
【００６４】
いくつかの特定の実施形態については、被覆１５５０は、飼料添加物粒子１６００の全表面を多かれ少なかれ覆っていてもよい。
【００６５】
有利なことに、本明細書に記載されるように生きたＥ．  ｃｏｌｉをマトリックスに埋め込むことは、動物飼料または飼料添加物製造手順中、周囲湿度、酸素および／または温度への細菌の曝露を最少化し得る。例えば、押出機を用いて動物飼料ペレットを生産する時、典型的には、押出中、比較的高い圧力、温度および湿度条件に動物飼料材料を曝露し、そのことによって、細胞がなんらかの方法で保護されていない時にはＣＦＵ損失をもたらす。典型的な生菌を用いる時のように細菌が胞子形成細菌である時には、追加的な保護は必ずしも要件ではない。この場合、しかしながら、Ｅ．  ｃｏｌｉは概して、かかる過酷な押出条件に敏感であり、したがって、本明細書に記載のマトリックスへの細菌の埋め込みは、かかる過酷な押出条件への曝露から生じるダメージを最小化し、そのことによってＣＦＵ損失を最少化することを補助するかも知れない。
【００６６】
追加的または代替的には、本明細書に記載されるようにマトリックスに細菌を埋め込むことは、貯蔵／取扱い中の細菌安定性を補助するかも知れない。実際、貯蔵／取扱い中の周囲湿度、酸素および／または温度への細菌の曝露は、細菌が非活動的な状態（休眠）から活動的な状態へと切り替わることを引き起こすかも知れない。この曝露が制御されなければ、かかる切替は、数量化できず、かつ、制御できない細菌の生長をもたらすかも知れず、このことは、かかる細菌を含有する飼料動物を摂取する動物に送達される有効な服用量に影響を与え、そのことによって、期待される結果の一貫性に影響を与えるであろう。
【００６７】
追加的または代替的には、本明細書に記載されるようにマトリックスに細菌を埋め込むことは、動物による摂取に続いて、動物飼料からの細菌の制御された放出を提供し、そのことによって、時間放出性または位置放出性（ｌｏｃａｔｉｏｎ−ｒｅｌｅａｓｅ）細菌送達システムを可能にするかも知れない。
【００６８】
例えば、マトリクックスが腸液または胃液によってはほぼ消化できない材料を含んでいる時、細菌は、マトリックスによって保護される一方で、胃での破壊から保護される。非限定的な実施形態では、マトリックスは、したがって、適切な環境（例えば、腸内）に達した際に細菌を放出するように適合し得る。かかる実施形態では、マトリックスは、胃の微生物叢によって容易に消化できる（その時には、送達された生きた細菌は、その後、それらの完全な形態で放出される）一方で、腸液または胃液によってはほぼ消化できない、高アミロース澱粉および／またはペクチンのような化合物を含み得る。マトリックス成分の適切な濃度の選択は、したがって、動物による摂取に続く、動物飼料からの細菌の制御された放出を可能にするかも知れない。換言すれば、この実施形態は、細菌の時間放出または位置放出を提供するかも知れない。
【００６９】
別の例では、マトリックスは粒子の形態であり得、粒子のサイズは、動物による摂取に続く、動物飼料からの細菌の制御された時間放出または位置放出を可能にし得る。換言すれば、より大きいサイズの粒子は、より小さいサイズの粒子に対して、所定の胃液および／または腸内環境により長期間置かれた後で完全に劣化するかも知れない。マトリックスの粒子サイズは、したがって、動物飼料からの細菌の制御された時間放出または位置放出を可能にするように選択／カスタマイズされる。非限定的な実施形態では、粒子は、飼料ペレットより小さい平均直径サイズ（それには、例えば、２ｍｍより小さい、または１ｍｍより小さいなどが含まれる）を有していてもよい。その他の実施形態では、マトリックスは、粒子であって、第１の粒子平均サイズを有する粒子の第１の個体群と第２の粒子平均サイズを有する粒子の第２の個体群とを少なくとも有し、第１および第２の粒子平均サイズの間のサイズ比が１より大きい前記粒子の形態であってもよい。１つの非限定的な実施形態では、第１の粒子平均サイズは、少なくとも２５０ミクロン、または少なくとも５００ミクロン、または少なくとも１ｍｍである。
【００７０】
有利には、本明細書に記載の動物飼料ペレットは、異質な飼料添加物粒子平均直径サイズ含んでいてもよく、飼料添加物が、制御され、かつ、予め定められた方法で細菌を放出可能であるようになっている。例えば、ペレットは、異質な直径の飼料添加物粒子サイズを含んでいてもよく、各飼料添加物粒子が所定の時間および／または所定の腸内位置で有効に消化されるようになっており、このことは、粒子の実際の平均直径サイズに基づく。例えば、ペレット化された動物飼料は、０．１ｍｍ、０．５ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍなどのような種々のサイズの飼料添加物粒子を含んでいてもよい（粒子が動物飼料ペレットより小さい限り）。当業者であれば、適切な飼料添加物粒子サイズの任意の組み合わせが、本開示の範囲に属することが意味されることを容易に理解するであろう。
【００７１】
追加的または代替的には、動物飼料に飼料添加物を組み込むこと（飼料添加物は異質な粒子サイズ分布を有する粒子の形態である）は、腸に到達する細菌の量を調節し、したがって動物中での細菌の放出を制御することを可能にする。本明細書に記載の飼料添加物を含むペレット化された飼料の摂取の際、ペレット化された飼料は胃を通って移行し、該胃では、ペレットが少なくとも部分的に劣化し、そのことによって、飼料添加物を少なくとも部分的に放出し得る。飼料添加物は、有利には、胃の酸性ｐＨから細菌を保護する要素を含んでいてもよい。このことは、動物であって、飼料添加物中の細菌に鈍感になるかも知れず、細菌の「パルス−タイプ」送達（細菌全体が短期間で放出される）を制限することが賢明であるかも知れないようになっている前記動物において特に有利であるかも知れない。
【００７２】
実用的実装では、本明細書に記載の飼料添加物は、所定の動物飼料に組み込まれる細菌の量をカスタマイズするのに用いられてもよい。
【００７３】
例えば、所定の制御された濃度の生きた非病原性細菌を有する飼料添加物は、特定の動物用の動物飼料ペレットの製造に用いられ得る。例えば、家禽を意図した動物飼料ペレットは、有益な効果を取得するために、ブタまたはウシを意図した比較の動物飼料ペレットと同一の量の生きた非病原性細菌を必ずしも必要としないであろう。所望されれば、家禽飼料に対してブタ飼料を製造する時に飼料添加物の異なる個体群を用いなければならないのではなく、当業者であれば、その代わりに、同様の個体群であるが、所定の制御された濃度のブタ特有の非病原性細菌を含む飼料添加物を有するものを用い得る。
【００７４】
換言すれば、飼料添加物は、意図した動物の仕様にしたがって製造されてもよく、かつ、意図した動物に適した所定のＣＦＵ／ｇ量を含んでいてもよい（すなわち、「ブタ級」、「ウシ級」、「家禽級」などにしたがって）。
【００７５】
代替的には、同一の「級」は、動物飼料ペレットを製造するための出発材料として用いられてもよいが、その代わりに、動物の仕様のカスタマイズは、家禽飼料に対してブタ飼料を製造する時に異なる割合の飼料添加物を用いることによって飼料ペレット製造レベルでなされてもよい。
【００７６】
追加的または代替的には、所定の制御された濃度の非病原性細菌を有する飼料添加物は、特定の動物の成長曲線の特定の段階のための動物飼料ペレットの製造に用いられ得る。例えば、ブタ用の動物飼料ペレットは、離乳後の段階において、その後の複数の肥育段階と比べて異なる、制御された量の生きた細菌を有していてもよい。
【００７７】
例えば、特定の非限定的な実装では、動物飼料ペレットは、少なくとも１０４、または少なくとも１０５、または少なくとも１０６、または少なくとも１０７、または少なくとも１０８、または少なくとも１０９、または少なくとも１０１１である多数の生きた細菌のＣＦＵ／ｇを含んでいてもよい。例えば、動物飼料ペレットは、１×１０５〜１×１０１１ＣＦＵ／ｇまたはその中の任意の値を含んでいてもよい。かかる異なる数のＣＦＵ／ｇは、例えば、動物飼料ペレットの製造中に、制御された量の生きた細菌をますます多くの量で含む飼料添加物を組み込むことによって、または、異なる級の飼料添加物を組み込むことによって取得され得る。当業者であれば、この文脈において、飼料添加物の級が、異なる制御された量の生きた細菌を有する飼料添加物に対応することを容易に理解するであろう。所定の動物飼料中の細菌の量のかかるカスタマイズは、チェーン供給に沿った任意の位置（例えば、粒子ビーズ生産位置において、動物飼料生産位置において、エンドユーザー位置においてなど）でなされ得る。
【００７８】
したがって、読者はまた、飼料添加物が適切な量（ＣＦＵ／ｇ）のＥ．  ｃｏｌｉ菌株を含んでおり、動物飼料ペレットにおいて先行して説明した所望のＣＦＵ／ｇを達成することを容易に理解するであろう。例えば、飼料添加物は、少なくとも１×１０６ＣＦＵ／ｇ、または少なくとも１×１０７、または少なくとも１×１０８、または少なくとも１×１０９、または１×１０１０、または少なくとも１×１０１１などを含んでいてもよい。
【００７９】
所定の動物飼料中の細菌の量の本明細書に記載のカスタマイズは、肉生産用に飼育された動物の文脈で有用であり得、例えば、ブタ業界では、農場は、典型的には、異なる飼料供給段階（例えば、２〜４段階）を有する飼料供給プログラムを用いて動物に飼料を与え、第１の飼料（すなわち、第１の離乳飼料）は、約１週間〜２週間の期間、与えられ得る。かかる場合、所定の動物飼料中の細菌の量のかかるカスタマイズを有することは、異なる飼料供給段階について、動物飼料中の異なるレベルの細菌を取得するのに有用であり得る。例えば、飼料添加物に含まれるＥ．  ｃｏｌｉが、ブタに特有の腸のストレスに対処する場合、動物飼料をカスタマイズして、第１の離乳および第１の肥育飼料供給段階のためにその中に特定のレベルの細菌を含むようにすることは、業界的に有用であるかも知れない。なぜなら、これら２つの段階が、ブタについての腸のストレスの２つのウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ；窓）を表しているからである。
【００８０】
Ｅ．  ｃｏｌｉ細菌
非限定的な実施形態では、本明細書に記載の非病原性大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）は、任意の組み換えの、もしくは、野生のＥ．  ｃｏｌｉ菌株、または、それらの任意の組み合わせを含んでいる。
【００８１】
非限定的な実施形態では、Ｅ．  ｃｏｌｉ菌株は、米国特許第７，９８１，４１１号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載された、受領番号ＩＤＡＣ２１０１０５−０１の下で２００５年１月２１日付けでカナダの国際寄託当局（ＩＤＡＣ）に寄託された菌株、もしくは、米国特許第９，４５３，１９５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載された、２０１３年６月２０日付けでカナダの国際寄託当局（ＩＤＡＣ）に寄託され、受領番号２００６１３−０１が付与された菌株、または、それらの組み合わせである。 
【００８２】
ＩＤＡＣは、１９９６年９月２１日付けでカナダが特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）に加盟したことによって可能とされた特許微生物寄託機関である。さらに、ブダペスト条約との整合性を保証するためのカナダ特許法および特許規則の改正が、１９９６年１０月１日付けで発効した。ＩＤＡＣの実際の住所は：カナダ国、Ｒ３Ｅ  ３Ｒ２、ウィニペグ、アーリントン  ストリート  １０１５である。
【００８３】
当業者であれば、Ｅ．  ｃｏｌｉが、マトリックスに埋め込まれる前は、乾燥形態であってもよく、未加工の形態であってもよく、冷凍形態であってもよいことを容易に認識するであろう。かかる形態は、培養物の形態（すなわち、培養培地の存在下での菌株）から直接取得されてもよく、培養培地から１つ以上の要素を除去し、または、例えば、冷凍保存または任意の別の後に続く処理ステップに適した別の１つ以上の要素と交換するような１つ以上の処理ステップの後で取得されてもよい。
【００８４】
冷凍保存に適した１つ以上の要素の例は、次の特徴のうちの少なくとも１つを満たしているかも知れない：高度に水溶性である、細胞の内部に侵入する、毒性が低い、非反応性である、および、高濃度で沈殿しない。例えば、冷凍保存に適した１つ以上の要素は、例えば、グリセロール、スクロース、トレハロース、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含んでいてもよいが、それらに限定されない。
【００８５】
マトリックス
マトリックスは、親水コロイド形成多糖を含んでいる。いくつかの親水コロイド形成多糖が、単独で、または、それらの任意の組み合わせで、本明細書に記載の使用に適している。
【００８６】
高アミロース澱粉は、沸騰水中で澱粉粒を水和させ、高せん断ミキサーを用いて粒を分散させ、その後で約０〜１０℃まで溶液を冷却した後で堅固なゲルを形成することが可能である適切な親水コロイド形成多糖の例である。ゲルの堅さおよび強度は、溶液中の澱粉の濃度に依存し、最大有効濃度は１０重量体積％までである。 
【００８７】
ペクチンは、高アミロース澱粉と非常に類似した役割を果たす、適切な親水コロイド形成多糖の別の例である。ペクチンは、ペクチンゲルマトリックスの強度が、糖高分子のカルボキシル基の間にブリッジを形成するＣａ２＋のような二価カチオンの添加によってさらに増大し得るので、追加のメリットを有する。 
【００８８】
アルギン酸は、二価カチオンとの架橋によって堅固なゲルマトリックスを形成し得る適切な親水コロイド形成多糖の別の適切な例である。アルギン酸は、アルギン酸の第１の多糖をジカチオン（例えば、Ｃａ２＋）と内部架橋することによって（例えば、細糸、ひも、または、実質的に球形のビーズ形態にあるアルギン酸をＣａ２＋の浴槽へと押し出すことによって）、堅固なゲルマトリックスへと硬化され得る。アルギン酸は、Ｃａ２＋との相互作用の際に硬化する。本技術分野で公知のマトリックスの調製の代替的な方法としては、Ｃａ２＋を含有する浴槽への混合物のスプレー噴霧、エマルジョンベースの技術、ならびに、流動床凝集および被覆が挙げられる。
【００８９】
非限定的な実施形態では、親水コロイド形成多糖は、０．１％〜２０％の値である総乾燥物の重量パーセントでマトリックス中に存在する。非限定的な実施形態では、親水コロイド形成多糖は、０．１％〜１９％、または０．１％〜１８％、または０．１％〜１７％、または０．１％〜１６％、または０．１％〜１５％、または０．１％〜１４％、または０．１％〜１３％、または０．１％〜１２％、または１％〜１２％の値であり、その中の任意の値を含む総乾燥物の重量パーセントでマトリックス中に存在する。
【００９０】
１つの実施形態では、多糖は第１の多糖であり、かつ、マトリックスはさらに、第１の多糖とは異なる第２の多糖を含んでいる。必要に応じて、マトリックスは二糖を含んでいてもよい。
【００９１】
代替的または追加的には、マトリックスは、マトリックスの表面の少なくとも一部の上に配置された被覆を含んでいてもよい。被覆は、第１の多糖とは異なる第２の多糖を含んでいてもよい。必要に応じて、被覆は二糖を含んでいてもよい。 
【００９２】
非限定的な実施形態では、二糖および第２の多糖は、１：１０〜１０：１である二糖／第２の多糖（重量％／重量％）の比で、被覆中および／またはマトリックス中に存在する。別の非限定的な実施形態では、この比は、９：１、９：２、９：３、９：４、９：５、９：６、９：７、９：８、８：１、８：２、８：３、８：４、８：５、８：６、８：７、７：１、７：２、７：３、７：４、７：５、７：６、６：１、６：２、６：３、６：４、６：５、５：１、５：２、５：３、５：４、４：１、４：２、４：３、３：１、３：２、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、２：３、２：４、２：５、２：６、２：７、２：８、２：９、３：４、３：５、３：６、３：７、３：８、３：９、４：５、４：６、４：７、４：８、４：９、５：６、５：７、５：８、５：９、６：７、６：８、６：９、７：８、７：９または８：９であり、その間の任意の比の値を含んでいる。
【００９３】
別の非限定的な実施形態では、二糖／第２の多糖（重量％／重量％）の比は１０より小さく、より好ましくは５より小さい。非限定的な実施形態では、二糖／第２の多糖（重量％／重量％）の比は約１である。
【００９４】
非限定的な実施形態では、二糖は、０．１％〜９０％、または０．１％〜７５％、または０．１％〜５０％、または０．１％〜３５％、または０．１％〜２０％、または０．１％〜１５％、または０．１％〜１０％であり、その中の任意の値を含む値にて（総乾燥物の重量パーセントで）被覆中および／またはマトリックス中に存在する。
【００９５】
非限定的な実施形態では、二糖はスクロースを含んでいる。
【００９６】
非限定的な実施形態では、二糖はトレハロースを含んでいる。
【００９７】
非限定的な実施形態では、二糖はスクロースとトレハロースとを含んでいる。
【００９８】
非限定的な実施形態では、第２の多糖はマルトデキストリンを含んでいる。
【００９９】
非限定的な実施形態では、第２の多糖はデキストランを含んでいる。
【０１００】
非限定的な実施形態では、第２の多糖はマルトデキストリンとデキストランとを含んでいる。
【０１０１】
非限定的な実施形態では、デキストランは２０〜７０ｋＤａの分子量を有する。
【０１０２】
非限定的な実施形態では、飼料添加物（すなわち、マトリックスおよび／または被覆）はさらに、アミノ酸の塩を含んでいる。 
【０１０３】
非限定的な実施形態では、アミノ酸の塩はＬ−グルタミン酸の塩を含んでいる。
【０１０４】
非限定的な実施形態では、塩はＬ−グルタミン酸のナトリウム塩である。
【０１０５】
本明細書に記載のマトリックスは、本明細書に記載の乾燥ステップから出る際に、＜０．３の水分活性（「ａｗ」）を有し、例えば、０．０４＜ａｗ＜０．３、０．０４＜ａｗ＜２．５、０．０４＜ａｗ＜２．０、０．０４＜ａｗ＜１．５などである。本開示の文脈における「水分活性」または「ａｗ」は、水の利用可能性を意味し、システム中の水のエネルギー状態を表す。それは概して、同一の温度における純水のもので割ったサンプルより上の水の蒸気圧として定義される。水分活性は、本技術分野で公知の材料および手順により（例えば、Ａｑｕａｌａｂ  Ｗａｔｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｅｔｅｒ  ４ＴＥ（Ｄｅｃａｇｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、米国）を用いて）測定されてもよい。乾燥は、スプレー乾燥、流動床乾燥、凍結乾燥、真空乾燥のようなステップを含んでいてもよい。乾燥ステップの非限定的な実用的実装が、本明細書において後にさらに説明される。
【０１０６】
動物飼料ペレット被覆層
別の実用的実装では、動物飼料ペレットはさらに、動物飼料ペレット表面の少なくとも一部を覆う層（該層は、飼料添加物を含んでいる）を含み、被覆された動物飼料ペレットを形成してもよい。動物飼料ペレットの被覆は、スプレー乾燥、スプレー冷却、スプレー噴霧、流動床凝集およびエマルジョンベースの技術のような本技術分野で公知の方法にしたがって実行されてもよい。被覆されていない動物飼料ペレット上への被覆の完全な分散は、被覆されていない動物飼料ペレットをタンブリング作用に曝露することによって達成されてもよい。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ペレット中のＥ．  ｃｏｌｉの追加の供給源（すなわち、外層中の第１の供給源およびペレットに組み込まれた第２の供給源）の存在は、Ｅ．  ｃｏｌｉの時間放出または位置を特定した送達を可能にするかも知れない。実際、外層は、所定の割合で、または、動物の胃腸管に沿った所定の位置で溶解する材料で形成されていてもよく、これは、動物飼料に組み込まれたＥ．  ｃｏｌｉの送達の割合とは異なり得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、動物飼料ペレットの被覆はさらに、湿度および腐敗に対する保護を向上させ、かつ、動物飼料ペレットの貯蔵寿命を増大させるかも知れない。動物飼料ペレットの被覆はさらに、汚染物質に対する保護を向上させるかも知れない。
【０１０９】
その他の実施形態では、動物飼料ペレットの被覆は、動物飼料ペレットの嗜好性を改善するかも知れず、このことはさらにペレットに嗜好性増強剤を添加する必要性を減少させる。動物飼料ペレットの被覆はまた、強烈な臭気および風味をマスキングして、動物による被覆された動物飼料ペレットの摂取を向上させるかも知れない。
【０１１０】
包装
１つの実用的実装では、本開示は、包装であって、周囲湿度に対するその中の内容物の曝露を制御するのに十分である湿度制御バリアを有する前記包装に関する。換言すれば、包装は、周囲湿度に対する本開示の生きた非病原性細菌（すなわち、飼料添加物中および／または飼料ペレット中の）の曝露を制御するかも知れない。湿度制御バリアを有する有利な効果は、内容物に含有される細菌が、実質的に非活動的な状態のままであってもよく、そのことにより、飼料添加物および／または飼料ペレットの有用な貯蔵寿命を増大させることである。
【０１１１】
実用的実装では、包装はさらに別個の区画を含んでいてもよく、該別個の区画は、少なくとも１つの区画に飼料ペレットに組み込まれる飼料添加物を貯蔵し、かつ、少なくとも別の区画に湿度制御要素を貯蔵するように構成されている。
【０１１２】
非限定的な実施形態では、包装は、ポリエチレン、ポリウレタンまたは任意のその他の飼料適合性高分子を含む内側の裏地を含んでいてもよい。裏地は、単一の層であってもよく、多層の材料であってもよい。いかなる理論にも拘束されることを希望することなく、裏地は、少なくとも漏れ、湿度、酸素、汚染および紫外線（ＵＶ）放出に対する保護を提供するかも知れず、かつ、飼料添加物および／または飼料ペレットの適切な貯蔵寿命を保証すると考えられる。
【０１１３】
実用的実装では、包装は、任意の密封機構を通して、上端にシールを含んでいてもよい。上端におけるシールの開口部は、飼料添加物および／または飼料ペレットを分配するための出口を提供し得る。
【０１１４】
別の実用的実装では、包装は別個の区画を含んでいてもよく、該別個の区画は、少なくとも１つの区画に飼料添加物を貯蔵し、かつ、少なくとも別の区画に飼料ペレット材料を貯蔵するように構成されている。
【０１１５】
非限定的な実施形態では、飼料添加物を貯蔵するための少なくとも１つの区画と、飼料ペレット材料を貯蔵するための少なくとも別の区画とは、その間の流体連通を防止するように構成されていてもよく、すなわち、それらが相互接続しないようになっている。相互接続の欠如は、飼料ペレット材料および飼料添加物の早期の混合を防止するかも知れない。
【０１１６】
非限定的な実施形態では、飼料添加物を貯蔵するための少なくとも１つの区画は、飼料ペレット材料を貯蔵するための少なくとも別の区画の内容物全体への添加に適した大量の飼料添加物（すなわち、生きた細菌の大量のＣＦＵに等しい）を貯蔵するように構成されていてもよい。この実施形態によれば、飼料添加物を有する飼料ペレットの調製は、ユーザーがペレット化される飼料に添加すべき飼料添加物の量を計算する必要がないので、簡略化される。先行して説明されたように、飼料添加物中のＣＦＵの量は、異なる級にしたがってカスタマイズされてもよい（すなわち、特定の動物用途にしたがって変化してもよい）。かかる用途では、ペレット化される飼料に添加されるべき飼料添加物の量を計算しなければならないのではなく、ユーザーは、飼料添加物中に適量のＣＦＵを既に有する特定の「ブタ」包装を求め、「ブタ」飼料ペレットを取得することを選択すればよい。非限定的な例として、数量λの飼料添加物を有する包装は、離乳後の仔ブタ用の飼料ペレットの調製に適しているかも知れず、一方で、数量βの飼料添加物を有する包装は、肥育段階にある仔ブタ用の飼料ペレットの調製に適しているかも知れない。
【０１１７】
その他の実施形態では、包装はさらに、異なる飼料添加物または種々の数量の飼料添加物を貯蔵するように構成された追加の区画を含んでいてもよい。
【０１１８】
有利には、包装は、「消費期限」または「販売有効期限」の日付で印を付けられ、「消費期限」または「販売有効期限」の日付における所望の最少量のＣＦＵ（すなわち、所望のＣＦＵ／ｇ）を保証してもよい。実際、当業者であれば、例えば、所定の期間後の飼料添加物の予期される湿度／温度／酸素への曝露を考慮することによって、所定の期間後に残る有用な量のＣＦＵを外挿法から推定することが可能である。 
【０１１９】
飼料添加物を分配するためのシステム
図３は、本明細書に記載の飼料添加物を分配するためのシステム１０００を示している。システム１０００は、遠隔制御ユニット１１００、飼料添加物を貯蔵するように構成されたホッパー１２００、スタンド１３００、密封機構１４００および分配機構１５００を少なくとも含むいくつかの別個の部品を含んでいる。
【０１２０】
非限定的な実施形態では、遠隔制御ユニット１１００はコンピューターを含んでおり、かつ、データネットワーク（図示せず）にわたってスタンド１３００にしっかりと接続され得るキャビネット（図示せず）内に収容されていてもよい。実用的実装では、データネットワークは、公衆ネットワーク（例えば、インターネット）、プライベートネットワーク（例えば、ＬＡＮもしくはＷＡＮ）、有線ネットワーク（例えば、イーサネットネットワーク）、無線ネットワーク（例えば、８０２．１１ネットワークもしくはＷｉ−Ｆｉネットワーク）、セルラーネットワーク（例えば、ロングタームエボリューション（ＬＴＥ）ネットワーク）、ルーター、ハブ、スイッチ、サーバーコンピューター、および／または、それらの任意の組み合わせを含むがそれらに限定されない、任意の適切なネットワークであってもよい。
【０１２１】
ホッパー１２００は、上端において開口しており、飼料添加物を受け取るように構成されていてもよい。ホッパー１２００は、下端において密封機構１４００に接続されていてもよい。密封機構１４００は、ホッパー１２００の内部が分配機構１５００と連通していない閉位置（図３に示されているような）と、ホッパー１２００の内部が分配機構１５００と連通している開位置（図示せず）との間で移動可能であってもよい。
【０１２２】
非限定的な実施形態では、分配機構１５００は、一定のメッシュサイズの取り外し可能であるメッシュを含んでいてもよい。好ましい実施形態では、メッシュサイズは、特定の直径の飼料添加物のビーズのみが分配機構を通して分配されるように選択される。非限定的な例として、メッシュサイズは、２５０ミクロンまでの、５００ミクロンまでの、１ｍｍまでの、または、２ｍｍまでのビーズのみが分配機構を通して分配されてもよいように選択されてもよい。供給源である飼料添加物のビーズ直径分布に依存して、分配機構は、同質または異質である直径のビーズを分配するのに用いられてもよい。
【０１２３】
その他の実施形態では、分配機構１５００は、互いの上に重なった別個のメッシュサイズの複数の取り外し可能であるメッシュを含んでいてもよく、分配機構が、有利なことに、異質であるビーズサイズ分布を有する飼料添加物を供給源として用いて、同質である直径の飼料添加物のビーズを分配するのに用いられてもよいようになっている。すなわち、別個のビーズ直径を有するいくつかの飼料添加物が、混合され、かつ、ホッパー１２００に詰め込まれ、ホッパー１２００中に異質であるビーズサイズ分布を有する飼料添加物をもたらしてもよい。メッシュの取り外しの適切なシーケンスを用いて、本発明のシステムは、異質であるビーズサイズ分布から、第１のビーズ直径、したがって、量Ｘである生きた非病原性細菌の第１のＣＦＵを有する飼料添加物の第１の部分と、第２のビーズ直径、したがって、量Ｙである生きた非病原性細菌の第２のＣＦＵを有する飼料添加物の第２の部分とを分配するのに便宜に用いられてもよい。したがって、システム１０００は、異なる「級」の、本明細書の至る所で説明されている飼料添加物／飼料ペレットを取得するのに用いられてもよい。簡潔には、特定の量のＣＦＵが、その後ペレットの製造のために分配される特定の粒子サイズと量との比を選択することによって所定の用途（例えば、動物の種および／または成長段階）のために選択および提供され得る（すなわち、カスタマイズされ得る）。
【０１２４】
非限定的な実施形態では、ホッパー１２００は、好ましくは、ステンレス鋼製である。
【０１２５】
非限定的な実施形態では、ホッパー１２００はさらに、その内部に混合手段（図示せず）を含み、ホッパー１２００の下端における詰まりを防止してもよい。その他の実施形態では、飼料添加物は、水のような液体ともに分配され、システムの詰まりを防止してもよい。
【０１２６】
当業者であれば、その他のディスペンサーシステムが、本発明から逸脱することなく適用可能であってもよいことを容易に理解するであろう。 
【実施例】
【０１２７】
以下の実施例では、３つの保存溶液が、保存溶液Ｓ１とともに試験された。試験は三重に実行され、かつ、１つの標準偏差が次の式にしたがって計算された： 
【０１２８】
【数１】
2019519232.tif 000003
【０１２９】
式中、ｎはサンプルの数であり、かつ、
【０１３０】
【数２】
2019519232.tif 000004
【０１３１】
はサンプル個体群の平均である。
【０１３２】
以下の実施例のそれぞれにおいて、細菌生存率が、本技術分野で公知のプロトコルにしたがってコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を測定することによって評価された。
【０１３３】
以下の実施例で用いられた保存溶液は、表１に示されている。
【０１３４】
【表１】
2019519232.tif 000005
【０１３５】
１．  実施例１
この実施例には、本開示の実施形態による飼料添加物の調製について記載されている。この実施例では、細菌が、アルギン酸カルシウムで作られたマトリックスに包まれている。アルギン酸カルシウムマトリックスは粒子の形態であり、用途に依存して異質または同質である平均直径サイズを有し得る。ビーズが出発材料として液体細菌培養物を用いて製造されるので、当業者であれば、本明細書に記載の乾燥したＥ．  ｃｏｌｉビーズの最終組成が、細菌培養培地の成分を含んでいるかも知れないことを理解するであろう。
【０１３６】
ａ．  Ｅ．  ｃｏｌｉ培養物
図１を参照すると、Ｅ．  ｃｏｌｉ菌株が、第１のステップ１００において、動物由来ではないトリプチックソイ寒天上で培養された。六（６）個の隔離されたコロニーが、その後、第２のステップ２００において、３７℃にて２時間、３０ｍＬの動物由来ではないトリプチックソイブロス（ＴＳＢ）（１ＬのＴＳＢについて：２０ｇのＳｏｙ  Ｐｅｐｔｏｎｅ  Ａ３  ＳＣ−（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ）、２．５ｇの米国薬局方収載の無水デキストロース−（Ｊ．Ｔ．  Ｂａｋｅｒ）、５ｇの米国薬局方収載の塩化ナトリウム−（Ｊ．Ｔ．  Ｂａｋｅｒ）、および、２．５ｇの米国薬局方収載のリン酸二カリウム−（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ））中で２００ｒｐｍにて撹拌して、Ｅ．  ｃｏｌｉ菌株を培養するのに用いられた。
【０１３７】
結果として生じた培養物１は、ＴＳＢ中で１０倍に希釈され、その後、第３のステップ３００において、３７℃にて２時間、１００ｍＬの動物由来ではないＴＳＢ中で２００ｒｐｍにて撹拌して、Ｅ．  ｃｏｌｉ菌株を培養するのに用いられた。結果として生じた培養物２は、ＴＳＢ中で１０倍に希釈され、その後、第４のステップ４００において、３７℃にて５時間、１Ｌの動物由来ではないＴＳＢ中で２００ｒｐｍにて撹拌して、Ｅ．  ｃｏｌｉ菌株を培養するのに用いられた。結果として生じた培養物３は、その後、マトリックスにＥ．  ｃｏｌｉを埋め込むのに用いられた。本明細書に記載の培養物プロトコルのバリエーションおよび改善が可能であり、本願の教示を考慮した当業者に明らかになるであろう。例えば、非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉはまた、本技術分野で公知のプロトコルにしたがって嫌気条件で培養されてもよい（Ｓｏｎ  ＆  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｃｕｒｒ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ２０１２，  ２７：５Ａ．４.１  −  ５Ａ．４．９）。後に続く実施例のビーズを調製する際、受領番号ＩＤＡＣ２１０１０５−０１の下で２００５年１月２１日付けでカナダの国際寄託当局（ＩＤＡＣ）に寄託された非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉ菌株が用いられた。
【０１３８】
ｂ．マトリックスの調製
Ｂａｃｔｏ商標ペプトン（１．５ｇ、ＢＤ、カナダ国ミシサガ）が、１．５Ｌの加熱水と混合され、混合物が取得された。アルギン酸（３０ｇ  Ｇｒｉｎｄｓｔｅｄ登録商標、ＤｕＰｏｎｔ商標、Ｄａｎｉｓｃｏ登録商標、カナダ国ミシサガ）が、マグネチックバーを用いて３６０ｒｐｍにて混合しながら、混合物にゆっくりと添加された。アルギン酸の完全な可溶化が約３時間で取得され、２質量体積％のアルギン酸溶液が取得された。マグネチックバーを含む溶液は、その後、標準条件下でオートクレーブされた。本明細書に記載のマトリックス調製プロトコルのバリエーションおよび改善が可能であり、本願の教示を考慮した当業者に明らかになるであろう。
【０１３９】
ｃ．  マトリックスへのＥ．  ｃｏｌｉの埋め込み
以下のものが、マグネチックバーで混合しながら、オートクレーブされたマトリックス溶液（１．５Ｌ）に添加され、スラリーが取得された：１Ｌの動物由来ではないＴＳＢと、０．５ＬのＥ．  ｃｏｌｉの結果として生じる培養物３（図１参照）。
【０１４０】
スラリー（３Ｌ）は、重合浴槽（水中に、３００ｍＭのＣａＣｌ２、０．１重量体積％のＢａｃｔｏ商標トリプトン、０．１重量体積％のＢａｃｔｏ商標ペプトンおよび０．０５重量体積％のＢａｃｔｏ商標酵母抽出物）に押し出されて、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ商標  Ｒｅａｃｔｉ−Ｖａｐ商標  Ｅｖａｐｏｒａｔｏｒｓから採用された９個の出口を有するシリンジシステムを用いてビーズが形成された。浴槽は、スラリーを注入する間、緩やかにかき混ぜられた。マトリックスビーズは、約３０分で架橋が可能となり、かつ、結果として生じる硬化したビーズは、その後、採取された。本明細書に記載の埋め込みプロトコルのバリエーションおよび改善が可能であり、本願の教示を考慮した当業者に明らかになるであろう。ビーズは、その後、約２４時間、室温にて空気乾燥機における箱形乾燥機上に配置され、半乾燥ビーズが取得され、かつ、半乾燥ビーズは、その後、６４時間、脱水機に配置され、その中では、乾燥しており、かつ、フィルタリングされた空気が吹き付けられ、乾燥ビーズが取得された。
【０１４１】
本発明者は、驚くべきことに、かつ、意外なことに、乾燥前に約２０分間緩やかにかき混ぜながら保存溶液中で埋め込まれたＥ．ｃｏｌｉをインキュベートすることが、乾燥ステプ中の細菌の損失を有意に減少させ、乾燥ビーズの形成をもたらすことを観察した。
【０１４２】
ｄ．  埋め込まれたＥ．  ｃｏｌｉの乾燥および試験
各保存溶液について、乾燥および試験が、少なくとも三重に実行された。図２を参照すると、第１のステップ５００において、マトリックス中に埋め込まれたＥ．  ｃｏｌｉを有するビーズは、保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ２、保存溶液Ｓ３または保存溶液Ｓ４中に配置され、約２０分間緩やかにかき混ぜられた。それぞれの場合において、総ＣＦＵの判定５５０が、保存溶液への浸漬後に実行された。第２のステップ６００において、ビーズは、その後、約２４時間、室温にて空気乾燥機における箱形乾燥機上に配置され、半乾燥ビーズが取得された。それぞれの場合において、水分活性ａｗの測定６５０が、Ａｑｕａｌａｂ  Ｗａｔｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｅｔｅｒ  ４ＴＥ（Ｄｅｃａｇｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、米国）を用いて半乾燥ビーズに対して実行された。第３のステップ７００において、半乾燥ビーズは、その後、約６４時間、脱水機に配置され、その中では、乾燥しており、かつ、フィルタリングされた空気が吹き付けられた。本開示の実施形態によれば、乾燥工程８００は、少なくとも２つのステップを含んでいる：室温にて２４時間、空気乾燥機にビーズを配置し、半乾燥ビーズを取得することを含むステップ６００と、６４時間、脱水機に半乾燥ビーズを配置し、乾燥ビーズを取得することを含むステップ７００。それぞれの場合において、総ＣＦＵの判定７５０と水ａｗの測定７６０とが、乾燥ビーズに対して実行された。水分活性ａｗ＜０．３である乾燥ビーズが取得された。
【０１４３】
それぞれの場合において、かつ、図２を参照して、ａｗ分の１の減少は、下記にしたがって計算された：
【０１４４】
【数３】
2019519232.tif 000006
【０１４５】
それぞれの場合において、かつ、図２を参照して、生存率低下（ＣＦＵ  ｌｏｇ損失）が下記にしたがって計算された：
【０１４６】
【数４】
2019519232.tif 000007
【０１４７】
それぞれの場合において、平均生存率低下と、保存溶液Ｓ１を用いて取得された結果に対する標準化された平均生存率低下とが計算された。
【０１４８】
結果は、図４に示されている。保存溶液４は、０．１４２±０．００４である水分活性を持続しながら、０．３２である標準化された平均生存率低下を示した。
【０１４９】
実施例１の結果を編集したものが、表２および表３に示されている。これら結果は、保存溶液Ｓ１およびＳ４の要素が、乾燥マトリックスに埋め込まれたＥ．  ｃｏｌｉの生存率、および、乾燥工程７００に対するその耐性に対して、有意な効果を提供したことを示している。
【０１５０】
【表２】
2019519232.tif 000008
【０１５１】
【表３】
2019519232.tif 000009
【０１５２】
ｅ．  動物飼料への乾燥した埋め込まれたＥ．  ｃｏｌｉの組み込み（「ペレット化」）
動物飼料に乾燥マトリックス（例えば、飼料添加物の形態にある）を組み込むためのプロトコルが、本技術分野で公知である。そのようにすることの説明的な例が、例えば、大量の動物飼料に５００ｇ〜１０００ｇの乾燥マトリックスビーズを組み込むことによって行われ得る。所望されれば、飼料はまた、活動的でない酵母産物を適量で含み得る。例えば、埋め込まれたＥ．  ｃｏｌｉを含む乾燥マトリックスビーズ（すなわち、飼料添加物）は、同質化タンク中で、すべてのその他の材料のうちの少なくとも一部と混合され得る。好ましくは、混合物は、ペレット化工程中、継続して混合される。混合された材料は、その後、押出機に向けてポンピングされる
【０１５３】
蒸気が混合された材料に適用され（すなわち、蒸気調節）、該適用は、それが今にも押出機の中に入りそうな時、または、押出機内に配置された区画内にある時のいずれかで行われる（すなわち、したがって、混合物の温度はこの段階で上昇する）。温度の典型的な値は、約７０〜約９０℃の範囲内で変化してもよい。適切な圧力が混合物に適用され、該適用は押出機内部のその通過中に行われる。圧力の典型的な値は、約２０ｐｓｉｇ〜約８０ｐｓｉｇの範囲内で変化してもよい。形成されたペレットは、その後、押出機から冷却タンクへと排出される（３０〜４０℃までの急速な温度低下の後に別の冷却が続き、周囲温度に到達する）。飼料添加物（埋め込まれたＥ．  ｃｏｌｉを含むマトリックス）を含むペレット化された飼料は、その後、以下でさらに説明されるように、例えば袋／容器中で貯蔵され得る。本明細書に記載のペレット化プロトコルのバリエーションおよび改善が可能であり、本願の教示を考慮した当業者に明らかになるであろう。
【０１５４】
２．  実施例２
ここで試験される各保存溶液について、乾燥および試験が、少なくとも三重に実行された。図２を参照すると、第１のステップ５００において、実施例１の場合のように調製されたビーズが、保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ５、保存溶液Ｓ６または保存溶液Ｓ７中に配置され、約２０分間緩やかにかき混ぜられた。それぞれの場合において、総ＣＦＵの判定５５０が、保存溶液への浸漬後に実行された。第２のステップ６００において、ビーズは、その後、約２４時間、室温にて空気乾燥機における箱形乾燥機上に配置され、半乾燥ビーズが取得された。それぞれの場合において、水分活性ａｗの測定６５０が、Ａｑｕａｌａｂ  Ｗａｔｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｅｔｅｒ  ４ＴＥ（Ｄｅｃａｇｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、米国）を用いて半乾燥ビーズに対して実行された。第３のステップ７００において、半乾燥ビーズは、その後、約６４時間、脱水機に配置され、その中では、乾燥しており、かつ、フィルタリングされた空気が吹き付けられた。本開示の実施形態によれば、乾燥工程８００は、少なくとも２つのステップを含んでいる：室温にて２４時間、空気乾燥機にビーズを配置し、半乾燥ビーズを取得することを含むステップ６００と、６４時間、脱水機に半乾燥ビーズを配置し、乾燥ビーズを取得することを含むステップ７００。それぞれの場合において、総ＣＦＵの判定７５０と水ａｗの測定７６０とが、乾燥ビーズに対して実行された。水分活性ａｗ＜０．３である乾燥ビーズが取得された。
【０１５５】
それぞれの場合において、かつ、図２を参照して、ａｗ分の１の減少は、下記にしたがって計算された：
【０１５６】
【数５】
2019519232.tif 000010
【０１５７】
それぞれの場合において、かつ、図２を参照して、生存率低下（ＣＦＵ  ｌｏｇ損失）が下記にしたがって計算された：
【０１５８】
【数６】
2019519232.tif 000011
【０１５９】
それぞれの場合において、平均生存率低下と、保存溶液Ｓ１を用いて取得された結果に対する標準化された平均生存率低下とが計算された。
【０１６０】
結果は、図５に示されている。保存溶液７は、０．２９８±０．０１３である水分活性を持続しながら、０．３８である標準化された平均生存率低下を示した。
【０１６１】
実施例２の結果を編集したものが、表４および表５に示されている。これら結果は、保存溶液Ｓ７の要素が、乾燥マトリックスに埋め込まれたＥ．  ｃｏｌｉの生存率、および、乾燥工程７００に対するその耐性に対して、有意な保護効果を提供したことを示している。
【０１６２】
【表４】
2019519232.tif 000012
【０１６３】
【表５】
2019519232.tif 000013
【０１６４】
３．  実施例３
ここで試験される各保存溶液について、乾燥および試験が、少なくとも三重に実行された。図２を参照すると、第１のステップ５００において、実施例１の場合のように調製されたビーズが、保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ０、保存溶液Ｓ８または保存溶液Ｓ９中に配置され、約２０分間緩やかにかき混ぜられた。それぞれの場合において、総ＣＦＵの判定５５０が、保存溶液への浸漬後に実行された。第２のステップ６００において、ビーズは、その後、約２４時間、室温にて空気乾燥機における箱形乾燥機上に配置され、半乾燥ビーズが取得された。それぞれの場合において、水分活性ａｗの測定６５０が、Ａｑｕａｌａｂ  Ｗａｔｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｅｔｅｒ  ４ＴＥ（Ｄｅｃａｇｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、米国）を用いて半乾燥ビーズに対して実行された。第３のステップ７００において、半乾燥ビーズは、その後、約６４時間、脱水機に配置され、その中では、乾燥しており、かつ、フィルタリングされた空気が吹き付けられた。本開示の実施形態によれば、乾燥工程８００は、少なくとも２つのステップを含んでいる：室温にて２４時間、空気乾燥機にビーズを配置し、半乾燥ビーズを取得することを含むステップ６００と、６４時間、脱水機機に半乾燥ビーズを配置し、乾燥ビーズを取得することを含むステップ７００。それぞれの場合において、総ＣＦＵの判定７５０と水ａｗの測定７６０とが、乾燥ビーズに対して実行された。水分活性ａｗ＜０．３である乾燥ビーズが取得された。
【０１６５】
それぞれの場合において、かつ、図２を参照して、ａｗ分の１の減少は、下記にしたがって計算された：
【０１６６】
【数７】
2019519232.tif 000014
【０１６７】
それぞれの場合において、かつ、図２を参照して、生存率低下（ＣＦＵ  ｌｏｇ損失）が下記にしたがって計算された：
【０１６８】
【数８】
2019519232.tif 000015
【０１６９】
それぞれの場合において、平均生存率低下と、保存溶液Ｓ１を用いて取得された結果に対する標準化された平均生存率低下とが計算された。
【０１７０】
結果は、図６に示されている。
【０１７１】
実施例３の結果を編集したものが、表６および表７に示されている。
【０１７２】
【表６】
2019519232.tif 000016
【０１７３】
【表７】
2019519232.tif 000017
【０１７４】
４．  実施例４
ここで試験される各保存溶液について、乾燥および試験が、少なくとも三重に実行された。図２を参照すると、第１のステップ５００において、実施例１の場合のように調製されたビーズが、保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ１０、保存溶液Ｓ１１または保存溶液Ｓ１２中に配置され、約２０分間緩やかにかき混ぜられた。それぞれの場合において、総ＣＦＵの判定５５０が、保存溶液への浸漬後に実行された。第２のステップ６００において、ビーズは、その後、約２４時間、室温にて空気乾燥機における箱形乾燥機上に配置され、半乾燥ビーズが取得された。それぞれの場合において、水分活性ａｗの測定６５０が、Ａｑｕａｌａｂ  Ｗａｔｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｅｔｅｒ  ４ＴＥ（Ｄｅｃａｇｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、米国）を用いて半乾燥ビーズに対して実行された。第３のステップ７００において、半乾燥ビーズは、その後、約６４時間、脱水機に配置され、その中では、乾燥しており、かつ、フィルタリングされた空気が吹き付けられた。本開示の実施形態によれば、乾燥工程８００は、少なくとも２つのステップを含んでいる：室温にて２４時間、空気乾燥機にビーズを配置し、半乾燥ビーズを取得することを含むステップ６００と、６４時間、脱水機に半乾燥ビーズを配置し、乾燥ビーズを取得することを含むステップ７００。それぞれの場合において、総ＣＦＵの判定７５０と水ａｗの測定７６０とが、乾燥ビーズに対して実行された。水分活性ａｗ＜０．３である乾燥ビーズが取得された。
【０１７５】
それぞれの場合において、かつ、図２を参照して、ａｗ分の１の減少は、下記にしたがって計算された：
【０１７６】
【数９】
2019519232.tif 000018
【０１７７】
それぞれの場合において、かつ、図２を参照して、生存率低下（ＣＦＵ  ｌｏｇ損失）が下記にしたがって計算された：
【０１７８】
【数１０】
2019519232.tif 000019
【０１７９】
それぞれの場合において、平均生存率低下と、保存溶液Ｓ１を用いて取得された結果に対する標準化された平均生存率低下とが計算された。
【０１８０】
結果は、図７に示されている。保存溶液Ｓ７は、０．５８である標準化された平均生存率低下を示した。
【０１８１】
実施例４の結果を編集したものが、表８および表９に示されている。
【０１８２】
【表８】
2019519232.tif 000020
【０１８３】
【表９】
2019519232.tif 000021
【０１８４】
５．  実施例５
ここで試験される各保存溶液について、乾燥および試験が、少なくとも三重に実行された。図２を参照すると、第１のステップ５００において、実施例１の場合のように調製されたビーズが、保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ１３、保存溶液Ｓ１４または保存溶液Ｓ１５中に配置され、約２０分間緩やかにかき混ぜられた。それぞれの場合において、総ＣＦＵの判定５５０が、保存溶液への浸漬後に実行された。第２のステップ６００において、ビーズは、その後、約２４時間、室温にて空気乾燥機における箱形乾燥機上に配置され、半乾燥ビーズが取得された。それぞれの場合において、水分活性ａｗの測定６５０が、Ａｑｕａｌａｂ  Ｗａｔｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｅｔｅｒ  ４ＴＥ（Ｄｅｃａｇｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、米国）を用いて半乾燥ビーズに対して実行された。第３のステップ７００において、半乾燥ビーズは、その後、約６４時間、脱水機に配置され、その中では、乾燥しており、かつ、フィルタリングされた空気が吹き付けられた。本開示の実施形態によれば、乾燥工程８００は、少なくとも２つのステップを含んでいる：室温にて２４時間、空気乾燥機にビーズを配置し、半乾燥ビーズを取得することを含むステップ６００と、６４時間、乾燥機に半乾燥ビーズを配置し、乾燥ビーズを取得することを含むステップ７００。それぞれの場合において、総ＣＦＵの判定７５０と水ａｗの測定７６０とが、乾燥ビーズに対して実行された。水分活性ａｗ＜０．３である乾燥ビーズが取得された。
【０１８５】
それぞれの場合において、かつ、図２を参照して、ａｗ分の１の減少は、下記にしたがって計算された：
【０１８６】
【数１１】
2019519232.tif 000022
【０１８７】
それぞれの場合において、かつ、図２を参照して、生存率低下（ＣＦＵ  ｌｏｇ損失）が下記にしたがって計算された：
【０１８８】
【数１２】
2019519232.tif 000023
【０１８９】
それぞれの場合において、平均生存率低下と、保存溶液Ｓ１を用いて取得された結果に対する標準化された平均生存率低下とが計算された。
【０１９０】
結果は、図８に示されている。保存溶液Ｓ７は、０．３５である標準化された平均生存率低下を示した。
【０１９１】
実施例５の結果を編集したものが、表１０および表１１に示されている。
【０１９２】
【表１０】
2019519232.tif 000024
【０１９３】
【表１１】
2019519232.tif 000025
【０１９４】
６．  実施例６
ここで試験される各保存溶液について、乾燥および試験が、少なくとも三重に実行された。図２を参照すると、第１のステップ５００において、実施例１の場合のように調製されたビーズが、保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ１６、保存溶液Ｓ１７または保存溶液Ｓ１８中に配置され、約２０分間緩やかにかき混ぜられた。それぞれの場合において、総ＣＦＵの判定５５０が、保存溶液への浸漬後に実行された。第２のステップ６００において、ビーズは、その後、約２４時間、室温にて空気乾燥機における箱形乾燥機上に配置され、半乾燥ビーズが取得された。それぞれの場合において、水分活性ａｗの測定６５０が、Ａｑｕａｌａｂ  Ｗａｔｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｅｔｅｒ  ４ＴＥ（Ｄｅｃａｇｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、米国）を用いて半乾燥ビーズに対して実行された。第３のステップ７００において、半乾燥ビーズは、その後、約６４時間、脱水機に配置され、その中では、乾燥しており、かつ、フィルタリングされた空気が吹き付けられた。本開示の実施形態によれば、乾燥工程８００は、少なくとも２つのステップを含んでいる：室温にて２４時間、空気乾燥機にビーズを配置し、半乾燥ビーズを取得することを含むステップ６００と、６４時間、脱水機に半乾燥ビーズを配置し、乾燥ビーズを取得することを含むステップ７００。それぞれの場合において、総ＣＦＵの判定７５０と水ａｗの測定７６０とが、乾燥ビーズに対して実行された。水分活性ａｗ＜０．３である乾燥ビーズが取得された。
【０１９５】
それぞれの場合において、かつ、図２を参照して、ａｗ分の１の減少は、下記にしたがって計算された：
【０１９６】
【数１３】
2019519232.tif 000026
【０１９７】
それぞれの場合において、かつ、図２を参照して、生存率低下（ＣＦＵ  ｌｏｇ損失）が下記にしたがって計算された：
【０１９８】
【数１４】
2019519232.tif 000027
【０１９９】
それぞれの場合において、平均生存率低下と、保存溶液Ｓ１を用いて取得された結果に対する標準化された平均生存率低下とが計算された。
【０２００】
結果は、図９に示されている。
【０２０１】
実施例６の結果を編集したものが、表１２および表１３に示されている。
【０２０２】
【表１２】
2019519232.tif 000028
【０２０３】
【表１３】
2019519232.tif 000029
【０２０４】
７．  実施例７
ここで試験される各保存溶液について、乾燥および試験が、少なくとも三重に実行された。図２を参照すると、第１のステップ５００において、実施例１の場合のように調製されたビーズが、保存溶液Ｓ１または保存溶液Ｓ１９中に配置され、約２０分間緩やかにかき混ぜられた。それぞれの場合において、総ＣＦＵの判定５５０が、保存溶液への浸漬後に実行された。第２のステップ６００において、ビーズは、その後、約２４時間、室温にて空気乾燥機における箱形乾燥機上に配置され、半乾燥ビーズが取得された。それぞれの場合において、水分活性ａｗの測定６５０が、Ａｑｕａｌａｂ  Ｗａｔｅｒ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｅｔｅｒ  ４ＴＥ（Ｄｅｃａｇｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，  Ｉｎｃ．、米国）を用いて半乾燥ビーズに対して実行された。第３のステップ７００において、半乾燥ビーズは、その後、約６４時間、脱水機に配置され、その中では、乾燥しており、かつ、フィルタリングされた空気が吹き付けられた。本開示の実施形態によれば、乾燥工程８００は、少なくとも２つのステップを含んでいる：室温にて２４時間、空気乾燥機にビーズを配置し、半乾燥ビーズを取得することを含むステップ６００と、６４時間、脱水機に半乾燥ビーズを配置し、乾燥ビーズを取得することを含むステップ７００。それぞれの場合において、総ＣＦＵの判定７５０と水ａｗの測定７６０とが、乾燥ビーズに対して実行された。水分活性ａｗ＜０．３である乾燥ビーズが取得された。
【０２０５】
それぞれの場合において、かつ、図２を参照して、ａｗ分の１の減少は、下記にしたがって計算された：
【０２０６】
【数１５】
2019519232.tif 000030
【０２０７】
それぞれの場合において、かつ、図２を参照して、生存率低下（ＣＦＵ  ｌｏｇ損失）が下記にしたがって計算された：
【０２０８】
【数１６】
2019519232.tif 000031
【０２０９】
それぞれの場合において、平均生存率低下と、保存溶液Ｓ１を用いて取得された結果に対する標準化された平均生存率低下とが計算された。
【０２１０】
結果は、図１０に示されている。
【０２１１】
実施例７の結果を編集したものが、表１４および表１５に示されている。
【０２１２】
【表１４】
2019519232.tif 000032
【０２１３】
【表１５】
2019519232.tif 000033
【０２１４】
８．  実施例８
ここで試験される各保存溶液について、乾燥および試験が、少なくとも三重に実行された。実施例１の場合のように調製されたビーズが、保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ２、保存溶液Ｓ３または保存溶液Ｓ４中に配置され、約２０分間緩やかにかき混ぜられた。ビーズは、その後、約２４時間、室温にて空気乾燥機における箱形乾燥機上に配置され、半乾燥ビーズが取得された。半乾燥ビーズは、その後、約６４時間、脱水機に配置され、その中では、乾燥しており、かつ、フィルタリングされた空気が吹き付けられた。水分活性ａｗ＜０．３である乾燥ビーズが取得された。
【０２１５】
それぞれの場合において、菌株生存率は、乾燥ビーズのＣＦＵ／ｇを測定することによって、４℃における貯蔵条件下で四（４）週間にわたって試験された。試験は少なくとも三重に実行され、かつ、１つの標準偏差が計算された。
【０２１６】
実施例８の結果は、表１６に示されており、試験された保存溶液はすべて、４℃にて貯蔵された時、少なくとも４週間の間、飼料添加物菌株安定性を与えた。
【０２１７】
【表１６】
2019519232.tif 000034
【０２１８】
９．実施例９
ここで試験される各保存溶液について、乾燥および試験が、少なくとも三重に実行された。実施例１の場合のように調製されたビーズが、保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ５、保存溶液Ｓ６または保存溶液Ｓ７中に配置され、約２０分間緩やかにかき混ぜられた。ビーズは、その後、約２４時間、室温にて空気乾燥機における箱形乾燥機上に配置され、半乾燥ビーズが取得された。半乾燥ビーズは、その後、約６４時間、脱水機に配置され、その中では、乾燥しており、かつ、フィルタリングされた空気が吹き付けられた。水分活性ａｗ＜０．３である乾燥ビーズが取得された。
【０２１９】
それぞれの場合において、菌株生存率は、乾燥ビーズのＣＦＵ／ｇを測定することによって、４℃における貯蔵条件下で四（４）週間にわたって試験された。試験は少なくとも三重に実行され、かつ、１つの標準偏差が計算された。
【０２２０】
実施例９の結果は、表１７に示されており、試験された保存溶液はすべて、４℃にて貯蔵された時、少なくとも４週間の間、飼料添加物菌株安定性を与えた。
【０２２１】
【表１７】
2019519232.tif 000035
【０２２２】
１０．  実施例１０
ここで試験される各保存溶液について、乾燥および試験が、少なくとも三重に実行された。実施例１の場合のように調製されたビーズが、保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ０、保存溶液Ｓ８または保存溶液Ｓ９中に配置され、約２０分間緩やかにかき混ぜられた。ビーズは、その後、約２４時間、室温にて空気乾燥機における箱形乾燥機上に配置され、半乾燥ビーズが取得された。半乾燥ビーズは、その後、約６４時間、脱水機に配置され、その中では、乾燥しており、かつ、フィルタリングされた空気が吹き付けられた。水分活性ａｗ＜０．３である乾燥ビーズが取得された。
【０２２３】
それぞれの場合において、菌株生存率は、乾燥ビーズのＣＦＵ／ｇを測定することによって、４℃における貯蔵条件下で四（４）週間にわたって試験された。試験は少なくとも三重に実行され、かつ、１つの標準偏差が計算された。
【０２２４】
実施例１０の結果は、表１８に示されており、試験された保存溶液はすべて、４℃にて貯蔵された時、少なくとも４週間の間、飼料添加物菌株安定性を与えた。
【０２２５】
【表１８】
2019519232.tif 000036
【０２２６】
１１．  実施例１１
ここで試験される各保存溶液について、乾燥および試験が、少なくとも三重に実行された。実施例１の場合のように調製されたビーズが、保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ１１、保存溶液Ｓ１２または保存溶液Ｓ１３中に配置され、約２０分間緩やかにかき混ぜられた。ビーズは、その後、約２４時間、室温にて空気乾燥機における箱形乾燥機上に配置され、半乾燥ビーズが取得された。半乾燥ビーズは、その後、約６４時間、脱水機に配置され、その中では、乾燥しており、かつ、フィルタリングされた空気が吹き付けられた。水分活性ａｗ＜０．３である乾燥ビーズが取得された。
【０２２７】
それぞれの場合において、菌株生存率は、乾燥ビーズのＣＦＵ／ｇを測定することによって、４℃における貯蔵条件下で四（４）週間にわたって試験された。試験は少なくとも三重に実行され、かつ、１つの標準偏差が計算された。
【０２２８】
実施例１１の結果は、表１９に示されており、試験された保存溶液はすべて、４℃にて貯蔵された時、少なくとも４週間の間、飼料添加物菌株安定性を与えた。
【０２２９】
【表１９】
2019519232.tif 000037
【０２３０】
１２．  実施例１２
ここで試験される各保存溶液について、乾燥および試験が、少なくとも三重に実行された。実施例１の場合のように調製されたビーズが、保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ１３、保存溶液Ｓ１４または保存溶液Ｓ１５中に配置され、約２０分間緩やかにかき混ぜられた。ビーズは、その後、約２４時間、室温にて空気乾燥機における箱形乾燥機上に配置され、半乾燥ビーズが取得された。半乾燥ビーズは、その後、約６４時間、脱水機に配置され、その中では、乾燥しており、かつ、フィルタリングされた空気が吹き付けられた。水分活性ａｗ＜０．３である乾燥ビーズが取得された。
【０２３１】
それぞれの場合において、菌株生存率は、乾燥ビーズのＣＦＵ／ｇを測定することによって、４℃における貯蔵条件下で四（４）週間にわたって試験された。試験は少なくとも三重に実行され、かつ、１つの標準偏差が計算された。
【０２３２】
実施例１２の結果は、表２０に示されており、試験された保存溶液はすべて、４℃にて貯蔵された時、少なくとも４週間の間、飼料添加物菌株安定性を与えた。
【０２３３】
【表２０】
2019519232.tif 000038
【０２３４】
１３．  実施例１３
ここで試験される各保存溶液について、乾燥および試験が、少なくとも三重に実行された。実施例１の場合のように調製されたビーズが、保存溶液Ｓ１、保存溶液Ｓ１６、保存溶液Ｓ１７または保存溶液Ｓ１８中に配置され、約２０分間緩やかにかき混ぜられた。ビーズは、その後、約２４時間、室温にて空気乾燥機における箱形乾燥機上に配置され、半乾燥ビーズが取得された。半乾燥ビーズは、その後、約６４時間、脱水機に配置され、その中では、乾燥しており、かつ、フィルタリングされた空気が吹き付けられた。水分活性ａｗ＜０．３である乾燥ビーズが取得された。
【０２３５】
それぞれの場合において、菌株生存率は、乾燥ビーズのＣＦＵ／ｇを測定することによって、４℃における貯蔵条件下で四（４）週間にわたって試験された。試験は少なくとも三重に実行され、かつ、１つの標準偏差が計算された。
【０２３６】
実施例１３の結果は、表２１に示されており、試験された保存溶液はすべて、４℃にて貯蔵された時、少なくとも４週間の間、飼料添加物菌株安定性を与えた。
【０２３７】
【表２１】
2019519232.tif 000039
【０２３８】
１４．  実施例１４
ここで試験される各保存溶液について、乾燥および試験が、少なくとも三重に実行された。実施例１の場合のように調製されたビーズが、保存溶液Ｓ１または保存溶液Ｓ１９中に配置され、約２０分間緩やかにかき混ぜられた。ビーズは、その後、約２４時間、室温にて空気乾燥機における箱形乾燥機上に配置され、半乾燥ビーズが取得された。半乾燥ビーズは、その後、約６４時間、脱水機に配置され、その中では、乾燥しており、かつ、フィルタリングされた空気が吹き付けられた。水分活性ａｗ＜０．３である乾燥ビーズが取得された。
【０２３９】
それぞれの場合において、菌株生存率は、乾燥ビーズのＣＦＵ／ｇを測定することによって、４℃における貯蔵条件下で四（４）週間にわたって試験された。試験は少なくとも三重に実行され、かつ、１つの標準偏差が計算された。
【０２４０】
結果は、表２２に示されており、試験された保存溶液はすべて、４℃にて貯蔵された時、少なくとも４週間の間、飼料添加物菌株安定性を与えた。
【０２４１】
【表２２】
2019519232.tif 000040
【０２４２】
１５．  実施例１５
この実施例には、本開示の実施形態による飼料添加物を製造するための変形工程について記載されている。この実施例では、細菌が、２つの異なる生産方法（実施例１において説明された６ステップ工程または以下で説明される４ステップ工程）にしたがってアルギン酸カルシウムで作られたマトリックスに包まれている。アルギン酸カルシウムマトリックスは粒子の形態であり、用途に依存して異質または同質である平均直径サイズを有し得る。ビーズが出発材料として液体細菌培養物を用いて製造されるので、当業者であれば、本明細書に記載の乾燥したＥ．  ｃｏｌｉビーズの最終組成が、細菌培養培地の成分を有するかも知れないことを理解するであろう。
【０２４３】
６ステップ工程は、以下のステップを含んでいる：
・ステップ１：Ｅ．  ｃｏｌｉ培養物
・ステップ２：細菌／アルギン酸スラリーの調製
・ステップ３：ビーズの形成および重合
・ステップ４：ビーズの洗浄
・ステップ５：保存溶液との接触
・ステップ６：乾燥
【０２４４】
４ステップ工程は、以下のステップを含んでいる：
・ステップ１：Ｅ．  ｃｏｌｉ培養物
・ステップ２：細菌／アルギン酸スラリーの調製
・ステップ３：ビーズの形成および重合
・ステップ６：乾燥
【０２４５】
ａ．  Ｅ．  ｃｏｌｉ培養物
この実施例では、Ｅ．  ｃｏｌｉは、実施例１の場合のように調製された。
【０２４６】
結果として生じた培養物は、その後、飼料添加物の生産に用いられる前または−８０℃にて凍結される前に、撹拌を伴わず、１４〜１８時間、４℃にて保たれた。凍結前、一部の培養物が、一部の保存溶液および一部の新たな培養培地と混合された（すなわち、１：１：１の比で）。保存溶液は、１５重量体積％のマルトデキストリンと、２１重量体積％のスクロースと、３重量体積％のＬ−グルタミン酸一ナトリウムとを含んでいた。
【０２４７】
ｂ．  マトリックスへのＥ．  ｃｏｌｉの埋め込み
以下の段落では、Ｅ．  ｃｏｌｉは、まずアルギン酸／細菌スラリーを調製し、その後でそれから粒子を形成することによって、マトリックスに埋め込まれる。２つの変形（６ステップ工程および４ステップ工程）が説明される。
【０２４８】
６ステップ工程
一部の細菌培養物（例えば、５００ｍｌ）が、２部の培養培地（例えば、１Ｌ）および３部のアルギン酸溶液（２重量体積％のＧｒｉｎｄｓｔｅｄ登録商標  Ａｌｇｉｎａｔｅ  ＦＤ１５５、０．１重量体積％のＢａｃｔｏ商標ペプトン）（例えば、１．５Ｌ）と混合され、スラリーが取得された。
【０２４９】
アルギン酸細菌培養物スラリーは、その後、液体が１２Ｌの塩化カルシウム重合溶液（水中に、３００ｍＭのＣａＣｌ２、０．１重量体積％のＢａｃｔｏ商標トリプトン、０．１重量体積％のＢａｃｔｏ商標ペプトンおよび０．０５重量体積％のＢａｃｔｏ商標酵母抽出物）を含有する１８Ｌのタンクに一滴ずつ落下することを可能にする速度にて、９個のポートを有するＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ商標  Ｒｅａｃｔｉ−Ｖａｐ商標  Ｅｖａｐｏｒａｔｏｒを３個用いて適合された、２７個の針（２０Ｇ、１／２インチ）を保持するシステムを通してポンピングされ、粒子ビーズが形成された。重合溶液は、ゆっくりとかき混ぜられ、ビーズが崩れないことを確実にした。一旦アルギン酸培養物スラリー全体が重合溶液へと移動すると、ビーズが、ゆっくりとしたかき混ぜの下、さらに３０分間、溶液中で保たれ、重合工程が完了した。
【０２５０】
重合後、粒子ビーズは、重合溶液を流し落とされ、かつ、洗浄溶液（５０ｍＭのＣａＣｌ２）中に１０分間浸漬された。
【０２５１】
ビーズが排出され、重さを量られ、かつ、２０分間の撹拌の下、保存溶液（１０重量体積％のデキストラン４０、１４重量体積％のスクロース、２重量体積％のＬ−グルタミン酸一ナトリウム）中にビーズ１ｇあたり１ｍｌの溶液の割合にて浸漬された。最後に、ビーズが排出および乾燥された。
【０２５２】
追加の実験がまた、同一の方法であるが浸漬溶液中に１４重量体積％のスクロースのみを用いて実行され、同様の結果が得られた。
【０２５３】
４ステップ工程
一部の細菌培養物（例えば、５００ｍｌ）が、１部の保存溶液（１５重量体積％のマルトデキストリン、２１重量体積％のスクロース、３重量体積％のＬ−グルタミン酸一ナトリウム）（例えば、５００ｍｌ）、１部の培養培地（例えば、５００ｍｌ）および３部のアルギン酸溶液（２重量体積％のＧｒｉｎｄｓｔｅｄ登録商標  Ａｌｇｉｎａｔｅ  ＦＤ１５５、０．１重量体積％のＢａｃｔｏ商標ペプトン）（例えば、１．５Ｌ）と混合され、スラリーが取得された。
【０２５４】
アルギン酸細菌培養物スラリーは、その後、液体が１２Ｌの乳酸カルシウム重合溶液（５重量体積％の乳酸カルシウム）を含有する１８Ｌのタンクに一滴ずつ落下することを可能にする速度にて、９個のポートを有するＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ商標  Ｒｅａｃｔｉ−Ｖａｐ商標  Ｅｖａｐｏｒａｔｏｒを３個用いて適合された、２７個の針（２０Ｇ、１／２インチ）を保持するシステムを通してポンピングされ、粒子ビーズが形成された。重合溶液は、ゆっくりとかき混ぜられ、ビーズが崩れないことを確実にした。一旦アルギン酸培養物スラリー全体が重合溶液へと移動すると、ビーズが、ゆっくりとしたかき混ぜの下、さらに３０分間〜４時間、溶液中で保たれ、重合工程が完了した。粉状のカルシウム含有残渣が、ビーズの表面の少なくとも一部の上に微粒子被覆を形成することが観察された。
【０２５５】
ｃ．  埋め込まれたＥ．  ｃｏｌｉの乾燥および試験
粒子ビーズがアルミニウムトレイに配置され、かつ、分散して、深さ＜１．５ｃｍのビーズの層が取得された。粒子ビーズが、その後、実施例１の場合のように空気乾燥された。乾燥前後の粒子ビーズの重量が、乾燥の際の損失を計算するのに用いられた。
【０２５６】
実施例１５の結果を編集したものが、以下の表に示されている。これら結果は、六（６）ステップ工程および四（４）ステップ工程が、乾燥マトリックスに埋め込まれたＥ．  ｃｏｌｉの生存率、および、乾燥工程に対するその耐性に対して、有意な効果を提供したことを示している。
【０２５７】
４ステップ工程は、６ステップ工程を最適化するために開発され、材料を節約し、かつ、処理時間を減少させた。重要な要件が、細菌が乾燥ステップを生き残ることを確実にすることである。このことを達成するために、６ステップ工程においては、粒子は、ビーズの乾燥前に保存溶液と接触した。
【０２５８】
第１のプロトタイプの４ステップ工程が、本発明者によって試験された。このプロトタイプの４ステップ工程では、本発明者は、保存溶液との接触ステップを削除することが可能であるか否かを試験し、その代わりに、ビーズの形成および重合の前に、細菌／アルギン酸スラリーに保存溶液を添加した。このプロトタイプの４ステップ工程は、２つの異なる保存溶液を用いて試験された：デキストラン４０を有する第１の保存溶液およびマルトデキストリン（デキストラン４０の代わりに）を有する第２の保存溶液。本発明者はまた、塩化カルシウム中での重合の後の洗浄ステップを削除することが可能であるか否かを試験した。
【０２５９】
表２３Ａにおいて報告された結果は、第１のプロトタイプの４ステップ工程では、洗浄ステップの削除が乾燥ビーズにおける有意なＣＦＵ損失を引き起こすことを示している。
【０２６０】
洗浄ステップを保つことがより良好な結果を与えた一方で、乾燥粒子ビーズ中のＣＦＵ計数は、１ｌｏｇ１０を越えて、６ステップ工程についてのものより未だに少なかった（平均して、３．９×１０８対５．９×１０９ＣＦＵ／ｇ）。デキストラン４０を用いて試験された第１のプロトタイプの４ステップ工程は、マルトデキストリンを用いたものよりも同様の結果を与えた。第１のプロトタイプの４ステップ工程から生じるビーズの間の主たる相違点の一つが、乾燥工程の程度であった。実際、乾燥ステップ前の洗浄／保存溶液との接触ステップを削除することが、乾燥の際に質量の９２〜９５％を失った粒子ビーズをもたらした。これを工程が洗浄／保存溶液との接触ステップを含んでいる場合と対照すると、結果として生じた粒子ビーズは、それらの質量の８５％を失った（表２３）。
【０２６１】
【表２３】
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【０２６２】
【表２３Ａ】
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【０２６３】
業界の状況では、重合工程および粒子ビーズが重合溶液と接触する期間は、製造工程中、大いに変化するかも知れない。実際、処理経路は、用いられる産業機械およびバッチサイズのような種々の条件に基づいて多かれ少なかれ変化し、したがって、粒子ビーズが重合溶液と接触する期間を含む処理時間に影響を与えるかも知れない。特定の実用的実装では、かかる可変性は、スラリーを製造するステップと、針からスラリーを落下させて粒子ビーズを形成するステップとの間に必要とされる期間に影響を与えるかも知れない。
【０２６４】
第２のプロトタイプの４ステップ工程では、本発明者は、異なる重合溶液を用いることの効果を試験した：第１の重合溶液は塩化カルシウムを含んでおり、第２の重合溶液は乳酸カルシウムを含んでいた。本発明者はまた、重合溶液との種々の接触時間（すなわち、１時間、３時間または４時間）を試験した。
【０２６５】
表２４において報告された結果は、第２のプロトタイプの４ステップ工程では、乳酸カルシウムが塩化カルシウムよりも優れた結果を提供したことを示しており、工程中のステップの数を減少させる時には前者が後者よりも適切であることを示唆している。この相違点は、重合時間が３時間に増大した（すなわち、重合溶液との接触時間が増大した）時に、より有意であった。 
【０２６６】
【表２４】
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【０２６７】
本発明者はまた、乳酸カルシウム重合溶液との接触時間を１時間から４時間に増大した時の、粒子ビーズ中の細菌の生存率を試験した。表２５において報告された結果は、接触時間を４時間に増大したにもかかわらず、そのステップ中に生存率の低下がないことを示している。
【０２６８】
【表２５】
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【０２６９】
本発明者はまた、スラリー（アルギン酸、細菌培養物および保存溶液を含有する混合物）中の細菌の生存率を試験し、細菌が、スラリーの要素との接触状態に置かれた時に、周囲の室内条件下で長期間生き残るか否かを判定した。２つのアッセイが実行された：第１のアッセイは、スラリー中に保存溶液を含んでおり、一方で、第２のアッセイは、スラリー中に保存溶液を含んでいなかった。スラリーは先に記載したように調製され、４８時間、２５℃にて、撹拌の下で保たれた。表２６において報告された結果は、スラリー中に保存溶液が存在しない時と比べて、細菌がスラリー中の保存溶液と接触した時に、４８時間後に細菌ＣＦＵの損失を示さなかった。
【０２７０】
【表２６】
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【０２７１】
提案された４ステップ工程において重合ステップ前に細胞培養物を保存料溶液と混合することが、提案された６ステップ工程に対してステップの数の減少をもたらし、したがって、工業的生産時間、材料費の減少を可能にし、かつ／または、市場に出る速度を速めた。追加的または代替的には、いくつかの場合、貯蔵および／または輸送目的でＥ．  ｃｏｌｉ培養物を冷凍することが必要とされる時に（例えば、−２０または−８０℃にて）４ステップ工程を実装し、したがって、生産チェーンに沿った便宜である在庫管理用途を与えることもまた有利であるかも知れない。
【０２７２】
実際、本発明者は、−８０℃にて冷凍され、２４時間−２０℃にて配置され、その後で解凍され、かつ、１４日間４℃にて保たれた後の細菌の生存率を分析した。これら種類の条件は、典型的には、大規模の工業的工程中に予期される。結果が表２８に提示され、かつ、細菌の生存率が、冷凍培地が保存溶液を含んでいる時には、冷凍−解凍工程によっては有意な影響を受けないこと（すなわち、生存率が、４℃にて１４日間ゆっくりと減少し、０．３５ｌｏｇ１０の最終損失を有すること）を示している。
【０２７３】
【表２８】
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【０２７４】
本発明者はまた、２５℃における貯蔵条件下での、経時的であるのみの、または、ペレット化された動物（ブタ）飼料中の、飼料添加物中の乾燥した細菌の安定性を試験した。図１２は、２４週間の貯蔵後、飼料添加物（粒子ビーズ）中の乾燥した細菌が比較的安定していることを示している。
【０２７５】
１６．  実施例１６
本実施例では、動物飼料添加物は、本開示の実施形態にしたがって動物飼料に組み込まれた。この実施例では、本発明者は、かかる動物飼料が、十分な生きた非病原性Ｅ．  ｃｏｌｉを有して取得され、このＥ．  ｃｏｌｉから所望の利益を取得し得ることを示している。
【０２７６】
この実施例では、本発明者は、米国特許第７，９８１，４１１号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載された、受領番号ＩＤＡＣ２１０１０５−０１の下で２００５年１月２１日付けでカナダの国際寄託当局（ＩＤＡＣ）に寄託されたＥ．  ｃｏｌｉ菌株を組み込んだ。このＥ．  ｃｏｌｉは、腸送達に続いて動物の体重増加を促進することが知られている。試験の目的は、したがって、本開示の実施形態による飼料添加物が、ペレット化手順中にＥ．  ｃｏｌｉ菌株を十分に保護し、飼料添加物を含むペレット化された動物飼料の投与が、動物への十分な生きたＥ．  ｃｏｌｉの投与をもたらし、予期された成長促進効果を示すようになっていたか否かを評価することである。
【０２７７】
１６．１  動物
スコットランド、イーストロージアンからの仔ブタ１２８匹。ラージホワイトとランドレースとの雑種、日齢２８±２、オスとメス。仔ブタは、第１の規定食の投与前の最後の三日間、Ｅ．  ｃｏｌｉに対して活動的であるいかなる処置も受けなかった。仔ブタは到着時（０日目）において健康であり、体重は５．１４ｋｇ〜１０．０４ｋｇであった。動物には、固有の耳標を用いて個別に番号が付けられた。
【０２７８】
１６．２  試験
研究は、試験菌株を有しないプレスターターダイエット（Ｐｒｅ−Ｓｔａｒｔｅｒ  ｄｉｅｔ）を供給されたコントロール群と比較される試験菌株を有するプレスターターダイエットを供給された処置群を構成要素とする２つの平行群を用いた、制御された無作為の予備研究であった。
【０２７９】
０日目において、仔ブタ１２８匹が、それらの離乳期の体重にしたがって、２つの群および囲いにおいて無作為化された。各群について、４匹の動物の１６個の囲いがあった。試験菌株の有効成分（生きたＥ．  ｃｏｌｉ菌株）の性質に起因して、群は、同一の環境条件を有する２つの異なる部屋に処置ごとに収容された（処理あたり１部屋）。試験された菌株は、アッセイの開始時（すなわち、０日目）に投与された。
【０２８０】
１６．３  評価されたパラメーター
本アッセイでは、評価されたパラメーターは、平均一日体重増加（ＡＤＧ）ならびに０日目および７日目における全体体重増加であった。
【０２８１】
飼料サンプルが、栄養学的分析のため、および、生きた細菌の計数によって飼料添加物細菌の数量を評価するために収集された。
【０２８２】
仔ブタの健康は毎日モニタリングされ、かつ、有害事象およびそれに伴う薬物治療が記録された。個別の体重が、予め定められた日に測定された。飼料摂取の量と戻された飼料重量とは、囲いごとに記録された。直腸スワブが、ＰＣＲ分析によって試験菌株の存在／不存在を確認するために、０日目および７日目に収集された。
【０２８３】
１６．４  動物飼料および飼料添加物
飼料添加物は、先行する実施例において記載したように製造され、かつ、Ｅ．  ｃｏｌｉ菌株を６．６×１０９ＣＦＵ／ｇにて含んでいた。この飼料添加物は、２〜８℃の間で冷蔵して貯蔵され、かつ、ポリエチレンの「ジッパー」密封袋における２５０ｇの包装に包装された。
【０２８４】
動物飼料は、Ｅ．  ｃｏｌｉ菌株を５．４×１０８ＣＦＵ／２００ｇの濃度にて組み込んだ。この「試験」動物飼料は、「プレスターターダイエット」とも呼ばれる。コントロール産物は、飼料添加物のないプレスターターダイエットであった。
【０２８５】
１６．５  投与
菌株は、７６０ｇ／メートルトンの割合でプレスターターダイエット（第１の飼料）を通して投与された。プレスターターダイエットは、抗菌剤および抗菌成長能力促進剤（ＡＧＰ）代替物（有機酸／塩、高レベルのＣｕ／Ｚｎなど）で補充されなかった。
【０２８６】
プレスターターダイエットは、研究の０日目〜７日目まで、７日間供給された。
【０２８７】
１６．６  結果
分析が、プレスターターダイエット動物飼料中の有効成分の存在および数量を確認した。試験された菌株は、処置群のすべてのブタからの排泄物においてＰＣＲによって検出され、かつ、コントロール群のブタからの排泄物においてはＰＣＲによって検出されなかった。
【０２８８】
アッセイ中、表２９に示されているように、飼料添加物にＥ．  ｃｏｌｉ菌株を組み込んだ動物飼料の消費の７日後、処置されたブタは、未処置のブタ（ｐ＝０．０４４）と比べると、１４３ｇより高い（１日２１ｇ）体重増加を有した。生データは、図１７Ａ〜図１７Ｐに示されており、かつ、図１７に示されているように読まれるべきである。
【０２８９】
【表２９】
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【０２９０】
１６．７  分析および結論
ｔ検定が、２つの個体群の間の不等分散を想定して実行された。計算されたｔ値は、帰無仮説（すなわち、２つの個体群の間に有意な差は存在しないという仮説）を拒絶するほど十分に高く、すなわち、ｔ  Ｓｔａｔ＞ｔ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｔｗｏ−ｔａｉｌであり、ｐ値＝０．０４４であった。標準誤差は、その後、各個体群について計算され、かつ、１つの標準誤差が、図１３および図１４における各グラフ上に示されている。
【０２９１】
図１３は、本開示の実施形態による飼料添加物を組み込む動物飼料（ＩＰ）を供給されたブタおよび飼料添加物のない動物飼料（「ＣＰ」）を供給されたブタの７日後の平均体重増加（Ｋｇ）を描いた非限定的な棒グラフを示している。棒エラーが、標準誤差（ｐ＝０．０４４）を描いている。図１４は、図１３からのブタの７日間の平均１日体重増加（ｇ／日）を描いた非限定的な棒グラフを示している。棒エラーが、標準誤差（ｐ＝０．０４４）を描いている。
【０２９２】
この効果は、米国特許第７，９８１，４１１号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるような飲料水における仔ブタへのこの菌株の投与時に予期された効果に則している。換言すれば、飼料添加物にＥ．  ｃｏｌｉを組み込んだ本明細書に記載の動物飼料は、一見したところ、動物飼料ペレットの製造中の過酷な条件にほとんど苦しまなかった、十分な生きたＥ．  ｃｏｌｉを含んでいた。
【０２９３】
主題または副題が、読者の便宜のために本開示全体にわたって用いられるかも知れないが、いかなる意味でも、これらが本発明の範囲を限定すべきでないことに注目されたい。さらに、特定の理論が、本明細書で提案および開示されるかも知れない；しかしながら、いかなる意味でも、それらは、正しいか誤っているかに関わらず、本発明がいかなる特定の理論および行動のスキームも考慮することなく本開示にしたがって実施される限り、本発明の範囲を限定すべきでない。
【０２９４】
本明細書全体にわたって引用されたすべての文献が、すべての目的でそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９５】
本明細書全体にわたって、ある用語の前に用いられる用語「１つの（ａ）」は、用語の言及するものを１つ以上含有する実施形態を包含することが、当業者によって理解されるであろう。また、本明細書全体にわたって、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」と同義である用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「によって特徴付けられる（ｃｈａｒｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」は、包括的であるか、または、オープンエンドであり、追加の言及されていない要素または方法ステップを排除しないことが、当業者によって理解されるであろう。
【０２９６】
そうでない旨の定義がなければ、本明細書で用いられるすべての技術および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者によって共通して理解されるのと同一の意味を有する。相反する場合は、本文書（定義を含む）が勝るであろう。
【０２９７】
本開示で用いられる場合、用語「約（ａｒｏｕｎｄ）」、「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、概して、本技術分野で概して受け入れられる許容誤差の範囲内にあることを意味する。したがって、本明細書で与えられた数量は、概して、かかる許容誤差を含んでおり、明確に言及さればければ、用語「約（ａｒｏｕｎｄ）」、「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」が推測され得るようになっている。
【０２９８】
本開示がかなり詳細な特定の実施形態において説明されてきたが、バリエーションおよび改善が可能であり、本願の教示を考慮した当業者に明らかになるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2019519232.tif 000057
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2019519232.tif 000059
【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１７Ｊ】
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【図１７Ｋ】
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【図１７Ｌ】
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【図１７Ｍ】
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【図１７Ｎ】
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【図１７Ｏ】
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【図１７Ｐ】
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【国際調査報告】
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