(57)【要約】  本明細書では、幹細胞および／または分化細胞を含み、撹拌タンクバイオリアクタにおける閉鎖系の使用を含む、細胞凝集体の増殖および継代のための新規な方法が提供される。本発明の方法は、関連する多能性マーカーおよび分化能を有する多能性幹細胞および／またはその子孫の閉鎖系連続継代の増殖を可能にする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
閉鎖系における細胞凝集体の増殖のための方法であって、
細胞培養容器を提供するステップと、
前記容器内で凝集体を形成するステップと、
前記容器内で細胞凝集体を自動的に灌流するステップと、
前記灌流中に細胞凝集体を重力沈降させるステップと、
前記閉鎖系において凝集体の採取および継代を行うステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記閉鎖系において前記継代を行うステップは、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤の存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記閉鎖系における前記継代を行うステップは、継代された単分散または脱凝集多能性細胞の生存率を維持する薬剤の実質的に非存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
多能性細胞の前記生存率を維持する前記薬剤は、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
増殖された前記細胞凝集体は、ヒト多能性幹細胞を含む、請求項１乃至４の１つまたは複数に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞培養容器は、撹拌タンクバイオリアクタである、請求項１乃至５の１つまたは複数に記載の方法。
【請求項７】
前記自動的に灌流するステップは、人的介入なしに前記閉鎖系で行われる、請求項１乃至６の１つまたは複数に記載の方法。
【請求項８】
前記重力沈降チャンバは、少なくとも１ｃｍの長さであり、細胞凝集体の重力沈降を引き起こす方向に配置される、請求項１乃至７の１つまたは複数に記載の方法。
【請求項９】
前記自動的に灌流するステップは、約１００ミクロン〜約８００ミクロン直径の細胞凝集体の重力沈降を可能にする速度で行われる、請求項１乃至８の１つまたは複数に記載の方法。
【請求項１０】
連続継代を行うことにより、前記細胞凝集体またはその子孫の１つまたは複数をさらに増殖させるステップをさらに含む、請求項１乃至９の１つまたは複数に記載の方法。
【請求項１１】
細胞凝集体の連続継代は、前記閉鎖系においてスライサーグリッドを用いた無酵素継代により可能である、請求項１乃至１０の１つまたは複数に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞凝集体は、約１００ミクロンの距離などの、約２０〜約５００ミクロンの距離だけ離れたブレードを有するスライサーグリッドで分離される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞凝集体は、配管に沿うスライサーグリッドおよび細胞凝集体の混合のための装置により分離される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記スライサーは、疎水性材料でコーティングされるか、または疎水性材料を含む、請求項１１、１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
増殖された各細胞凝集体の平均直径は、約８００ミクロン以下の大きさ、例えば、約５００ミクロン以下の大きさである、請求項１乃至１４の１つまたは複数に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養容器の容積は、約５０ｍＬ〜約１００Ｌである、請求項１乃至１５の１つまたは複数に記載の方法。
【請求項１７】
閉鎖系における細胞凝集体の増殖のための方法であって、
撹拌タンクバイオリアクタ容器を提供するステップと、
前記容器内で凝集体を形成するステップと、
前記容器内で細胞凝集体を自動的に灌流するステップと、
前記灌流中に細胞凝集体を重力沈降させるステップと、
細胞凝集体の凝集体採取および無酵素スライシングを行うステップと、
前記閉鎖系において継代を行うステップと
を含む方法。
【請求項１８】
前記閉鎖系における前記継代を行うステップは、継代された単分散または脱凝集多能性細胞の生存率を維持する薬剤の実質的に非存在下で行われる、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、撹拌タンクバイオリアクタを使用する細胞および／または細胞凝集体の増殖ならびに継代に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞バンキング（例えば、誘導された多能性幹細胞）、細胞の商業的生産（例えば、ＧＥのＣｙｔｉｖａＴＭ心筋細胞）、および臨床試験用の細胞増殖における応用のための大規模な多能性幹細胞培養の必要性が出現している。フィーダフリー多能性幹細胞培養の進歩により、フラスコ、マイクロキャリア（直径１５０〜２５０ミクロン）またはバイオリアクタ内のマクロキャリア（直径約６ｍｍ）上での大規模な細胞増殖が可能になった。懸濁培養の使用は、キャリアからの細胞の非効率的な播種および放出、採取中のマイクロキャリアおよび細胞の物理的分離、ならびに細胞の表現型の変化につながり得る細胞キャリアの凝集を形成を含む伝統的なマイクロキャリア上で多能性細胞を培養する場合に生じるいくつかの課題を回避する。通常、灌流は、バイオリアクタ中の懸濁培養に使用される。
【０００３】
しかしながら、灌流／懸濁培養における１つの課題は、どのようにして細胞をバイオリアクタ内に保持するかということである。従来技術は、いくつかの基本的な分離技術、すなわち、１）濾過、２）重力沈降、および３）遠心分離を提供する。濾過方法は、必要な数週間の動作にわたってフィルタが目詰まりを起こさないようにするためのいくつかの手段が必要である。重力沈降の問題は、異なる細胞の沈降特性の変化、産業システムへのスケールアップの難しさ、および無菌性の維持が困難であることである。同様に、遠心分離は、オープンセル培養では日常的に使用されているが、完全閉鎖系細胞培養では、無菌性に関する懸念から限られた用途しか見出されていない。
【０００４】
多能性幹細胞および／または分化したヒト細胞を含む細胞の培養プロセス中の人的介入および交差汚染を減少させる技術が、この分野で必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】欧州特許出願公開第２９６６１６３号明細書
【発明の概要】
【０００６】
多能性幹細胞および／または分化ヒト細胞を含む、細胞を培養するための改良された方法が本明細書に記載される。
【０００７】
本明細書に提供されるのは、閉鎖系における細胞凝集体の増殖のための方法であって、
細胞培養容器を提供するステップと、
容器内で凝集体を形成するステップと、
容器内で細胞凝集体を自動的に灌流するステップと、
灌流中に細胞凝集体を重力沈降させるステップと、
閉鎖系において凝集体の採取および継代を行うステップと、
を含む。
【０００８】
また、本明細書に記載の方法を用いて細胞凝集体を増殖させる際に使用するための閉鎖系が本明細書に提供される。
【０００９】
本発明のこれらおよび他の特徴、態様、ならびに利点は、図面を通して同様の文字が同様の部品を表している添付の図面を参照して以下の詳細な説明が読まれるときに、より良く理解されることになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】使用済み培地がバイオリアクタから垂直方向に除去されている撹拌タンクバイオリアクタにおける重力沈降および培地交換のための配管アセンブリを示す図である。
【図２】新鮮な培地がバイオリアクタに垂直方向に付加されている撹拌タンクバイオリアクタにおける重力沈降および培地交換のための配管アセンブリを示す図である。
【図３】使用済み培地がバイオリアクタから傾斜した方向に除去されている撹拌タンクバイオリアクタにおける重力沈降および培地交換のための配管アセンブリを示す図である。
【図４】新鮮な培地がバイオリアクタに傾斜した方向に付加されている撹拌タンクバイオリアクタにおける重力沈降および培地交換のための配管アセンブリを示す図である。
【図５】１００μｍ〜３００μｍの厚さを有する１０ｍｍスライサーグリッド構造を示す図である。
【図６】壁間の間隔が１００μｍであり、壁の厚さが３０μｍである正方形グリッドスライサーを示す図である。
【図７】壁間の間隔が１００μｍであり、壁の厚さが３０μｍである六角形グリッドスライサーを示す図である。
【図８】スライサーを介した凝集体の閉鎖系処理のための方法を示す図である。ポンプおよびインライン円錐状バッグによって駆動される循環ループが凝集体を懸濁させ、分配する。スライサーに通じる配管は、主循環ループに接続され、細胞凝集体の一部は、低速で動作する第２のポンプを介してスライサーに供給される。
【図９】ＣＴ２ヒト胚性幹細胞のスライスされた凝集体の形態の画像を示す図である。
【図１０】４ｘ１０＾５細胞／ｍＬで播種したＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体上のスライサーによる酵素的継代または機械的継代後の増殖速度の比較を示す図である。
【図１１】１．５ｘ１０＾６細胞／ｍＬで播種したＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体上のスライサーによる酵素的継代または機械的継代後の増殖速度の比較を示す図である。（１）Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）＋ＲＯＣＫ阻害剤で継代したＣＴ−２、（２）正方形グリッド＋ＲＯＣＫ阻害剤で継代したＣＴ−２、（３）六角形グリッド＋ＲＯＣＫ阻害剤で継代したＣＴ−２、（４）正方形グリッド＋ＲＯＣＫ阻害剤で継代したＣＴ−２、（５）六角形グリッド＋ＲＯＣＫ阻害剤で継代したＣＴ−２。
【図１２】撹拌タンクリアクタ中のＣＴ２ヒト胚性幹細胞凝集体の形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
単数形（「Ａ」または「ａｎ」）は、本明細書では１つまたは複数、少なくとも１つを意味する。複数形が本明細書で使用される場合、それは一般に単数を含む。
【００１２】
本明細書中で使用される場合、「灌流」とは、細胞を新鮮な培地で連続的に供給し、細胞を培養しながら使用済み培地を除去することによって培養細胞を生存させるプロセスを指す。
【００１３】
「凝集体」は、結合が基板への接着ではなく細胞−細胞相互作用によって引き起こされる細胞の結合を指す。凝集体では、２つ以上の細胞が互いに生物学的付着によって相互に結合する。これは、細胞外マトリックスタンパク質などの表面タンパク質を介することができる。一実施形態では、細胞は、基板上で最初に増殖することができ、いくつかの細胞が基板と結合する（接着する）が、さらなる増殖は、さらなる成長した細胞と基板との結合（接着）に依存しない細胞−細胞結合（凝集）を形成する。別の実施形態では、細胞は、懸濁液中で自発的に結合して、表面への付着とは独立して細胞−細胞付着を形成する。セル状フィーダー層もまた基板と考えられる。したがって、フィーダー層への細胞の付着は、細胞の付着がお互いにではなく、フィーダー層中の細胞に付着するので、付着培養（凝集体ではない）の形態でもある。
【００１４】
「増殖」は、分化の有無にかかわらず、細胞の増殖を意味し、継代なし、１つの継代もしくは２つ以上の継代および／または連続継代を含むことができる。一実施形態では、増殖は、分化のない細胞の増殖を指し、１つの継代もしくは２つ以上の継代および／または連続継代を含む。
【００１５】
「幹細胞」は、自己再生（すなわち、同じ分化能を有する子孫）を受け、さらに分化能がより制限された子孫細胞を産生することができる細胞を意味する。本開示の文脈内では、幹細胞は、例えば、核移植によって、より原始的な幹細胞との融合によって、特異的転写因子の導入によって、または特定の条件下の培養によって、分化していないより分化した細胞も包含する。「多能性幹細胞」は、身体がそれ自体を修復する必要がある細胞または組織を潜在的に産生する可能性がある。多能性幹細胞もまた自己複製することができ、絶え間なくより多くの複製を作成することができる。多能性幹細胞には、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および胚性幹細胞（ＥＳＣ）が含まれる。
【００１６】
「培養容器」は、使い捨ておよび非使い捨てのプラスチック製品、バッグおよび／または容器および／またはバイオリアクタを含む。この用語は、一回使用のプラスチック製品、バッグおよび／または容器および／またはバイオリアクタならびに複数回使用のプラスチック製品、バッグおよび／または容器および／またはバイオリアクタを含む。
【００１７】
「閉鎖系」とは、閉鎖および／または密閉されている間に予め滅菌され、完全性および／または無菌性を保持する培養容器および付属部品をいう。容器および部品は、系の完全性に違反することなく利用され、滅菌を維持しながら流体の移送および／または流出を可能にし、一体性を失うことなく他の閉鎖系に接続可能である。閉鎖系バイオリアクタおよび／または容器とは、系の完全性に違反することなく、細胞、細胞培養培地、化学物質および試薬が無菌的に添加、除去および／または操作される系を指す（例えば、チューブのキャップを開けること、または細胞培養プレートまたは皿から蓋を持ち上げることによって）。閉鎖系内の一回使用または複数回使用のバッグおよび／または容器および／またはバイオリアクタは、閉鎖系の上または中に、例えば容器またはバイオリアクタの部位で滅菌チューブ溶接によって付加される。
【００１８】
「被験体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、ヒト、家畜、スポーツ動物、およびペットが含まれるが、これらに限定されない。本発明の方法による治療を必要とする被験体には、身体的または疾患に関連する損傷の結果としての機能の喪失に苦しんでいる人々が含まれる。
【００１９】
「治療有効量」という用語は、哺乳動物において任意の治療応答を生じるように決定される量を指す。例えば、治療用細胞または細胞関連物質の有効量は、患者の生存性を延長させる可能性がある。あるいは、前記治療は、予防的であり、明白な臨床症状を予防および／または抑制することができる。本明細書中で使用される用語の意味内で治療的に有効な治療には、それ自体が疾患の転帰を改善しないとしても、被験体の生活の質を改善する治療が含まれる。そのような治療的に有効な量は、臨床および前臨床試験などの被験体集団への日常的な適用を通じて、当業者によって確認される。したがって、「治療する」とは、そのような量を送達することを意味する。
【００２０】
「治療する」、「治療すること」または「治療」は、本発明に関して広く使用され、そのような各用語は、とりわけ、欠損、機能不全、疾患または治療を妨げるおよび／もしくは治療に起因するものを含む他の有害なプロセスを改善、阻害、または治癒することを包含する。
【００２１】
多能性幹細胞バンキング（例えば、誘導された多能性幹細胞）、細胞の商業生産（例えば、ＧＥのＣｙｔｉｖａＴＭ心筋細胞）、および／または臨床試験のための細胞増殖には、大規模な多能性幹細胞培養が必要である。多能性幹細胞は、人工多能性細胞（ｉＰＳ細胞）、胚由来の「真の」胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体細胞核移植によって作製された胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、または未受精卵由来の胚性幹細胞（単為生殖胚性幹細胞、またはｐＥＳ細胞）であってよい。フラスコ内の大規模な細胞フィーダフリーの胚性幹細胞の増殖は労働集約的であり、空間を禁止し、分離した集団は表現型のドリフトを呈することがある。したがって、大規模な多能性幹細胞培養のための代替アプローチを開発するための現場での試みがあり、それは例えば、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ（Ｎｕｎｃ（登録商標））およびバイオリアクタ（マイクロキャリアまたは懸濁培養）である。
【００２２】
撹拌タンクリアクタ、スピナーフラスコ、軌道シェーカー、ロッキングモーション、およびパドルホイールを含むが、これに限定されない、細胞培養に使用される多くのタイプのバイオリアクタがある。当業者であれば、バイオリアクタにおける細胞培養のための代替的なアプローチもあることを認識するであろう。
【００２３】
インペラー撹拌タンクバイオリアクタシステムにおける多能性幹細胞の懸濁凝集体培養は、バイオリアクタ培養において任意の基板または担体の必要性を排除することが実証されている（Ｃｈｅｎ、ＶＣ  ｅｔ．ａｌ、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｍａｙ；８（３）：３８８−４０２）。懸濁培養から細胞を継代するためのＣｈｅｎ法では、凝集体を遠心分離によって採取した。対照的に、本明細書で提供される方法は、撹拌タンクバイオリアクタを使用する閉鎖系における多能性幹細胞および／または多能性幹細胞凝集体の閉鎖系増殖（播種、灌流、継代および採取を含む）を可能にする。さらに、本明細書に記載される方法は、閉鎖系における無菌性の維持を可能にする膜フィルタおよび／または遠心分離および／または酵素消化を用いることなく、閉鎖系における多能性幹細胞の懸濁および／または非接着培養を可能にし、（例えば、遠心分離機を設置するための）コストを低減し、交差汚染を低減するのに役立つ人的介入も低減する。また、膜フィルタの使用および／または遠心分離などを含むことができて、細胞または細胞凝集体のさらなる継代における凝集体の分離のための酵素消化の使用を含むことができる細胞または細胞凝集体のさらなる継代と組み合わせた本発明の方法の使用が、本明細書中に提示される実施形態の範囲内で考えられる。
【００２４】
撹拌タンクバイオリアクタ内の多能性幹細胞の増殖のために以前に記載された方法（例えば、Ｎｉｅｂｒｕｅｇｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐａｒｔ  Ａ，２００８，Ｖｏｌｕｍｅ  １４，Ｉｓｓｕｅ  １０，Ｐａｇｅｓ  １５９１−１６０１）は、マウス幹細胞の増殖を開示している。さらに、このような以前に記載された方法は、幹細胞の培養を十分な期間、一般的には幹細胞の結果的な分化の維持に集中させる。対照的に、本明細書に記載される方法は、ヒト幹細胞の増殖、続いて凝集体の分離、および分離した細胞の継代が可能であり、その結果、細胞は、増殖および連続継代を通じて多分化能を保持する。さらに、本明細書に記載の増殖および継代の方法は、製造プロセス中の無菌性を保証する閉鎖系で実施される。通常、前述の幹細胞増殖方法は、酵素的継代中に細胞培養を維持するためにＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ阻害剤（ＲＯＣＫ阻害剤）を用いる。幹細胞の増殖および継代のためにＲＯＣＫ阻害剤を使用することの欠点は、ＲＯＣＫ阻害剤が染色体の安定性に影響を与え、おそらく核型の異常および幹細胞の遺伝的ドリフトを引き起こすことである。対照的に、本明細書に記載の幹細胞の増殖および継代は、ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で実施され、それによって核型異常および遺伝的ドリフトを減少させ、幹細胞の継代中の多分化能の保持を可能にする。
【００２５】
本明細書に記載の方法は、閉鎖系における自動化された灌流と組み合わせた重力沈降に依存する。さらに、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、スライサーの使用を含み、それにより、細胞の連続的な継代間で細胞凝集体の酵素を含まない分離を可能にする。特定の前述の層状重力沈降剤は、細胞または細胞凝集体が傾斜した平面／チューブを転がすことを必要とする。懸濁凝集用途のためのそのような層状重力沈降剤の欠点は、細胞凝集体が、増殖プロセスの効率、不完全な沈降効率による大きな細胞損失、および重力沈降剤への凝集体結合／接着を低下させる剪断応力を受けやすいことである。層状重力沈降剤は、細胞凝集体を細胞集団から分離して廃棄するために使用されてきた。対照的に、本明細書に記載の方法は、その後の継代のための凝集体を保持しながら、単一細胞（低生存率幹細胞）を分離して廃棄する。
【００２６】
培地交換のための他の前述の方法は、撹拌を一時的に中断し、それによって凝集体を撹拌タンクバイオリアクタに重力沈降させることができる。凝集体が沈降した後に、使用済み培地の一部をバイオリアクタから取り出し、新鮮な培地と交換することができる。この方式のリスクは、凝集体が底面に集中している間に凝集体のコングロマリットが生じる可能性があるということである。
【００２７】
したがって、本明細書には、撹拌タンクバイオリアクタにおける、ヒト多能性幹細胞増殖を含む細胞凝集体の増殖のための方法が記載される。培養液の連続的または不連続的な撹拌は、混合および通気をもたらし、細胞増殖のための堅牢な環境をもたらす。本方法は、様々なサイズの培養容器を使用し、操作の容易さおよび交差汚染に対する保護を提供する。センサは、溶存酸素、ｐＨならびに乳酸およびグルコースなどの培地成分の連続的なモニタリングが可能であり、リアルタイムで制御し、データを保存する。プラットフォームソフトウェアは、閉鎖系で連続的または不連続的な灌流／培地交換を行う能力を提供する。
【００２８】
通常、灌流中に、使用済み培地を除去しながら細胞を培養中に保つための様々な方法がある。１つの方法は、細孔サイズが細胞のサイズよりも小さい毛細管繊維または膜を使用することによって、細胞をバイオリアクタ内に保つことである。別の方法は、培地を除去しながら細胞をバイオリアクタ内に保つ「リリーパッド」浮遊フィルタを利用することである。別の方法は、細胞を分離してバイオリアクタに戻すために遠心分離機を使用することである。さらに別の方法は、使用済み培地が除去されている間に、細胞培養容器または関連する配管内の細胞を捕捉するための音響などの物理的アプローチを使用する。
【００２９】
対照的に、本明細書に記載される方法は、同時に培地を除去することを可能にしながら細胞をバイオリアクタ内に保つために通常使用される濾過システムを使用せずに、使用済み培地の除去を可能にする細胞凝集体の重力沈降に依存する。この方法の利点は、多能性幹細胞培養において大部分は生存不能である単一細胞の喪失および凝集体の維持であり、それにより培養物の全体的な品質および生存率を増加させることである。
【００３０】
使用済み培地を連続的に除去し、新しい培地と交換することにより、最適な生育条件のために栄養レベルが維持され、毒性を回避するために細胞廃棄物が除去される。本明細書に記載の方法を用いて閉鎖系で灌流を行う場合には、汚染の可能性が低減される。有利には、本明細書に記載の閉鎖系および細胞培養方法は、細胞凝集体の重力沈降を利用し、これによって膜のない灌流を可能にし、濾過膜への細胞の付着による損失および／または濾過プロセス中の剪断による細胞の損傷を低減することを可能にする。
【００３１】
本明細書に記載される方法は、好ましくは、培養汚染および細胞交差汚染のリスクを最小限にし、高い生存率および高い細胞密度に確実に到達することを可能にするために閉鎖系で使用される。本明細書に記載の方法は、使いやすさと信頼性を考慮して設計されている。
【００３２】
本明細書では、連続継代を有する、撹拌タンクシステムにおける懸濁凝集体としての多能性幹細胞の増殖を記載する方法が提供される。また、継代のためのスライサーと組み合わせた撹拌タンクリアクタの使用が、一体化された閉鎖系での多能性幹細胞の増殖および連続継代、特に時間、薬剤および労力の削減に有利であることを示す実施例も本明細書で提供される。
【００３３】
本明細書では、自動化された培地交換を駆動するためにコンピュータ制御蠕動ポンプと相互作用する培養容器（例えば、撹拌タンクバイオリアクタ）に接続された配管の特定のアセンブリも提供される。一実施形態では、配管は、Ｔ字のような形状であり、下部垂直配管、分岐点、および分岐点で接続された２つの追加の長さの配管を有する。追加の配管は、ソフトウェアによって制御される蠕動ポンプ上に配置される。培地を取り出すために遅い採取速度が使用される。配管の垂直な性質により、凝集体は除去された培地の流速を超える速度で重力沈降する。正味の効果は、培地除去工程の間に、凝集体が容器（例えば、撹拌タンクバイオリアクタ）内の最適な細胞培養条件にとどまることである。培地の除去は、例えば８時間、４時間などまで継続することができるが、培地の除去は、はるかに短いまたはより長い時間にわたって行われてもよい。培地除去工程の後に、新鮮な培地が数秒から数分または任意の適切な時間にわたって容器（例えば、撹拌タンクバイオリアクタ）に迅速に付加される。所望の長さの細胞培養のために、培地除去／迅速な培地付加のサイクルを繰り返す。別の例では、潅流は不連続であってもよく、そのような実施形態もまた、本明細書に提示される実施形態の範囲内で企図される。
【００３４】
本明細書に記載の自動化された灌流設計は、本質的に低コストであり、撹拌タンクリアクタを含む培養容器と完全に適合し、他の培養容器と完全に適合するように調整することができ、コストを増大させ、汚損のリスクを増大させ、性能を低下させるフィルタを必要としない。さらに、本明細書に記載の自動化された灌流は、複雑さ、コスト、および失敗のリスクを増大させる可動部品または電子機器を含まない。
【００３５】
本明細書に提供される、閉鎖系における細胞凝集体の増殖のための方法は、
細胞培養容器を提供するステップと、
容器内で凝集体を形成するステップと、
容器内で細胞凝集体を自動的に灌流するステップと、
灌流中に細胞凝集体を重力沈降させるステップと、
閉鎖系において凝集体の採取および継代を行うステップと、
を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、閉鎖系における継代は、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤（例えば、容器内の細胞培養培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は約１０マイクロモルである）の存在下で行われる。上記の方法の他の実施形態では、閉鎖系における継代は、継代された単分散または脱凝集多能性細胞の生存率を維持する薬剤の実質的に非存在下で行われる。いくつかのこのような実施形態では、多能性細胞の生存率を維持する薬剤は、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤である。上記の方法のいくつかの実施形態では、閉鎖系における継代は、ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で行われる。このような実施形態のいくつかでは、ＲＯＣＫ阻害剤はＹ２７６３２である。本明細書中で使用される場合、一実施形態では、「継代された単分散または脱凝集多能性細胞の生存率を維持する薬剤の実質的に非存在下」とは、継代された単分散または脱凝集多能性細胞の生存率を維持するために、細胞培養培地にいかなる薬剤も添加しないことを意味する。別の実施形態では、「継代された単分散または脱凝集多能性細胞の生存率を維持する薬剤の実質的に非存在下」とは、容器内に存在する細胞培養培地中の薬剤濃度が１マイクロモル未満、または５マイクロモル未満、または１０マイクロモル未満であることを意味する。
【００３７】
いくつかの実施形態では、増殖された細胞凝集体は、植物、動物、昆虫または微生物由来である。いくつかの実施形態では、増殖された細胞凝集体は、ヒト多能性幹細胞または分化ヒト細胞またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、増殖された細胞凝集体は、ヒト多能性幹細胞を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、細胞培養容器は撹拌タンクバイオリアクタである。いくつかの実施形態では、前記自動的に灌流するステップは、人的介入なしに閉鎖系で行われる。
【００３９】
いくつかの実施形態では、重力沈降チャンバは、少なくとも１ｃｍの長さであり、細胞凝集体の重力沈降を引き起こす方向に配置される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、自動化された灌流は、約１００ミクロン〜約８００ミクロン直径の細胞凝集体の重力沈降を可能にする速度で行われる
いくつかの実施形態では、上記の方法は、連続継代を行うことにより、細胞凝集体および／またはその子孫の１つまたは複数をさらに増殖させるステップをさらに含む。このような実施形態のいくつかでは、細胞凝集体および／またはその子孫のさらなる増殖の１つまたは複数は、膜フィルタを有する第２の容器への継代によって行われる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、上記の方法は、細胞凝集体および／またはその子孫の１つまたは複数の追加の増殖を含み、１つまたは複数の追加の継代が同じ容器内で行われる。他の実施形態では、上記の方法は、細胞凝集体および／またはその子孫の１つまたは複数のさらなる増殖を含み、１つまたは複数のさらなる継代が、第２の容器内で、培養容器内の膜フィルタの不在下で（例えば、細胞凝集体の重力沈降により）行われる。他の例では、上記の方法は、細胞凝集体および／またはその子孫の１つまたは複数のさらなる増殖を含み、１つまたは複数のさらなる継代が膜フィルタ（例えば、浮遊膜フィルタ）を有する第２の容器内で行われる。
【００４２】
そのような実施形態では、さらなる増殖および／または継代を任意の順序で実行することができる。一例として、最初の継代は、培養容器内で膜のない条件下（例えば、細胞凝集体の重力沈降によって）で行われ、続いて１つまたは複数のさらなる増殖が膜フィルタを有する培養容器中で行われる。別の例として、膜フィルタを含む培養容器中で１回または複数回の初期増殖および／または継代を実施し、続いて膜のない濾過条件下（例えば、細胞凝集体の重力沈降による）で増殖および／または継代を行うことができる。したがって、膜濾過または膜を含のない濾過を含む増殖および／または継代の任意のシーケンスが、本明細書に記載される実施形態の範囲内で意図され、前記シーケンスは、この膜のない条件下での（例えば、細胞凝集体の重力沈降による）少なくとも１つの増殖を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、細胞凝集体の連続継代は、閉鎖系においてスライサーグリッドを用いた無酵素継代により可能である。そのような実施形態のうちのいくつかでは、細胞凝集体は、約２０〜約５００ミクロンの距離だけ離れたブレードを有するスライサーグリッドで分離される。いくつかの他の実施形態では、細胞凝集体は、約１００ミクロンの距離だけ離れたブレードを有するスライサーグリッドで分離される。そのような実施形態のうちのいくつかでは、細胞凝集体は、配管に沿うスライサーグリッドおよび細胞凝集体の混合のための装置により分離される。換言すれば、いくつかの実施形態では、細胞凝集体は、スライサーで分離する前に、例えば図８に示す円錐状のバッグ内で混合され、この混合バッグは、通常、閉鎖系において培養容器とスライサーとの間に配置される。
【００４４】
スライサーを通過するために使用される細胞凝集体濃度は、高い生存率でスライスされた細胞凝集体の回収に影響を及ぼす。予想外に、約３×１０＾６細胞／ｍＬ未満の細胞凝集体濃度のスライスは、図５〜図７に示すスライサー形状を使用して、約３×１０＾６細胞／ｍＬを超える細胞濃度よりも高い回収でより高い生存率サンプルを産生することが見出された。当業者であれば、代替的なスライサー形状が、相対的に高い生存率および回収をもたらすしきい値濃度を改変することを認識するであろう。図８に示す混合装置を使用するなどして、フローストリーム中の凝集体の均一な懸濁を維持することによって汚れを最小限に抑え、その結果、より高い細胞生存率および回収が得られた。有利には、スライサーの使用によって、スライスされた多能性幹細胞凝集体の増殖中にＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤の必要性がなくなるが、これは、単一の多能性細胞の生存率を維持するために一般的にＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤のような薬剤を必要とする酵素的に継代された多能性幹細胞凝集体とは異なるものである。
【００４５】
一群の実施形態では、スライサーは疎水性材料でコーティングされている。いくつかの実施形態では、スライサーは疎水性材料を含む。
【００４６】
特定の他の実施形態もまた企図されるが、そこでは細胞凝集体の連続継代が酵素の存在下で閉鎖系容器内の細胞凝集体の分離によって可能となる。そのような実施形態では、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下でさらなる増殖または継代を行うことができる。
【００４７】
上述の方法のいくつかの実施形態では、増殖および／または継代の間、増殖された各細胞凝集体の平均直径は、約８００ミクロン以下のサイズである。上述の方法のいくつかの実施形態では、増殖および／または継代の間、増殖された各細胞凝集体の平均直径は、約５００ミクロン以下のサイズである。上述の方法のいくつかの実施形態では、増殖および／または継代の間、増殖された各細胞凝集体の平均直径は、約４００ミクロン以下のサイズである。上述の方法のいくつかの実施形態では、増殖および／または継代の間、増殖された各細胞凝集体の平均直径は、約３００ミクロン以下のサイズである。
【００４８】
いくつかの実施形態では、培養容器の容量は約５０ｍＬ〜約１００Ｌである。いくつかの実施形態では、培養容器の容量は約５０ｍＬ〜約５０Ｌである。いくつかの実施形態では、培養容器の容量は約１００ｍＬ〜約１０Ｌである。いくつかの実施形態では、培養容器の容量は約１００ｍＬ〜約５Ｌである。いくつかの実施形態では、培養容器の容量は約１５０ｍＬ〜約１Ｌである。いくつかの実施形態では、培養容器の容量は約５０ｍＬ〜約２０Ｌである。いくつかの実施形態では、培養容器の容量は約２００ｍＬ〜約２Ｌであるか、または２Ｌより大きい。
【００４９】
本明細書にさらに提供されるのは、細胞凝集体を継代する方法であって、閉鎖系においてバイオリアクタに付随するスライサーグリッドによって細胞凝集体のサイズが縮小される。本明細書に記載される任意の方法の実施形態の一群では、細胞凝集体は、１００ｍＬを超える容積で継代される。言い換えれば、継代は、一般に、より少量の培地で、より少ない細胞数で行われている。対照的に、本発明の方法は、閉鎖系において大量の培地を使用することを可能にし、それによってバイオリアクタおよび／または工業規模での細胞凝集体の継代を可能にする。例えば、１００ｍＬを超えるような大量の細胞凝集体の継代のための閉鎖系におけるバイオリアクタと組み合わせたスライサーグリッドの使用は、本開示の前には当該技術分野で開示されていない。別の実施形態では、細胞凝集体は、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、１Ｌ、２Ｌまたは５Ｌを超える容積で継代される。一実施形態では、スライサーグリッドは多角形スライサーグリッドである。１つの例では、１００ｍＬを超える体積の細胞凝集体の前記継代は、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ２７６３２）を培地に添加することなく行われる。
【００５０】
上記の細胞を継代するための方法のいくつかの実施形態では、細胞凝集体は、約２０〜約５００ミクロンの距離だけ離れたブレードを有するスライサーグリッドで分離される。上記の細胞を継代するための方法のいくつかの実施形態では、細胞凝集体は、約１００ミクロンの距離だけ離れたブレードを有するスライサーグリッドで分離される。そのような実施形態のうちのいくつかでは、細胞凝集体は、配管に沿うスライサーグリッドおよび細胞凝集体の混合のための装置により分離される。場合によっては、スライサーは疎水性材料でコーティングされる。他の例では、スライサーは疎水性材料を含む。
【００５１】
上述の細胞を継代するための方法のいくつかの実施形態では、継代前の各細胞凝集体の平均直径は、約８００ミクロン以下のサイズである。上述の細胞を継代するための方法のいくつかの実施形態では、継代前の各細胞凝集体の平均直径は、約５００ミクロン以下のサイズである。上述の細胞を継代するための方法のいくつかの実施形態では、継代前の各細胞凝集体の平均直径は、約４００ミクロン以下のサイズである。上述の細胞を継代するための方法のいくつかの実施形態では、継代前の各細胞凝集体の平均直径は、約３００ミクロン以下のサイズである。
【００５２】
別の態様では、本明細書で提供されるのは、閉鎖系における細胞凝集体の増殖のための方法であって、
撹拌タンクバイオリアクタ容器を提供するステップと、
容器内で凝集体を形成するステップと、
容器内で細胞凝集体を自動的に灌流するステップと、
灌流中に細胞凝集体を重力沈降させるステップと、
細胞凝集体の凝集体採取および無酵素スライシングを行うステップと、
閉鎖系において継代を行うステップと
を含む。
【００５３】
上述の方法のいくつかの実施形態では、閉鎖系における継代は、ＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行われる（例えば、容器内の細胞培養培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は約１０マイクロモルである）。上記の方法の他の実施形態では、閉鎖系における継代は、継代された単分散または脱凝集多能性細胞の生存率を維持する薬剤の実質的に非存在下で行われる。いくつかのこのような実施形態では、多能性細胞の生存率を維持する薬剤は、Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤である。上記の方法のいくつかの実施形態では、閉鎖系における継代は、ＲＯＣＫ阻害剤の非存在下で行われる。このような実施形態のいくつかでは、ＲＯＣＫ阻害剤はＹ２７６３２である。本明細書中で使用される場合、一実施形態では、「継代された単分散または脱凝集多能性細胞の生存率を維持する薬剤の実質的に非存在下」とは、継代された単分散または脱凝集多能性細胞の生存率を維持するために、細胞培養培地にいかなる薬剤も添加しないことを意味する。別の実施形態では、「継代された単分散または脱凝集多能性細胞の生存率を維持する薬剤の実質的に非存在下」とは、容器内に存在する細胞培養培地中の薬剤濃度が１マイクロモル未満、または５マイクロモル未満、または１０マイクロモル未満であることを意味する。
【００５４】
したがって、本明細書で提供される方法は、いくつかのワークフローを可能にし、それは、限定はしないが、（１）酵素的に分離された凝集体（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標））、凍結保存されたストックおよび／または機械的にスライスされた凝集体（例えば、ポリゴンスライサーグリッド）を含むバイオリアクタ内の凝集体形成、（２）撹拌システムにおける増殖方法：重力沈降のための配管アセンブリを有する非灌流バイオリアクタおよび／または灌流バイオリアクタ、（３）連続継代：細胞培養容器（例えば、バイオリアクタ内のＡｃｃｕｔａｓｅ（商標））内の凝集体に添加された酵素、細胞培養容器の外側の凝集体および／または多角形スライサーグリッドを用いた機械的継代に添加された酵素を含む。
【００５５】
さらに、本明細書に記載の方法は、撹拌懸濁バイオリアクタ、ロッキングモーションバイオリアクタ、スピナーフラスコ、軌道運動バイオリアクタ、回転運動バイオリアクタ、および接線流体流バイオリアクタを含むがこれらに限定されない、細胞の懸濁培養に使用されている様々なバイオリアクタで使用するのに適している。本明細書に記載の方法は、灌流のためのフィルタのない重力沈降およびスライサーを用いた酵素を用いない継代を含み、このようなバイオリアクタシステムのすべてに適合し、このようなバイオリアクタにおける閉鎖系の凝集体の形成、灌流、増殖、採取および継代を可能にする。
【００５６】
本明細書で提供される実施形態の範囲内で考えられるのは、本明細書に記載の方法を、セルのバンクを生成するために、研究用途のために増殖された細胞凝集体を生成するために、治療および／または診断試験（例えば、臨床試験における薬物試験、毒物学または品質管理アッセイ）のために、ならびに／あるいは患者の治療のために使用することである。薬学的に許容される担体と、本明細書に記載の方法から得られた少なくとも１つの細胞および／または細胞凝集体と、を含む医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法が本明細書に提供される。
【００５７】
上記の方法で産生された細胞および／または凝集体の治療有効量を、それを必要とする被験体に投与することによって、治療を必要とする被験体における障害を治療する方法も本明細書に提供される。本方法は、薬学的に許容される担体および上記の方法で産生された細胞および／または凝集体を含む医薬組成物の治療有効量を投与することによって、治療を必要とする被験体における障害を治療する方法をさらに含む。本明細書に記載の方法は、多能性幹細胞および分化細胞にも適用可能であることが理解されよう。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で得られる、および／または被験体へ投与するための増殖された細胞の純度および／または均質性は、約１００％（実質的に均質）である。他の実施形態では、本明細書に記載の方法で得られる、および／または被験体へ投与するための増殖された細胞の純度および／または均質性は、９５％〜１００％である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で得られる、および／または被験体へ投与するための増殖された細胞の純度および／または均質性は、８５％〜９５％である。他の細胞との混合物の場合、その割合は、約１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜２５％、２５％〜３０％、３０％〜３５％、３５％〜４０％、４０％〜４５％、４５％〜５０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜９５％であってもよい。
【００５９】
所与の用途のために細胞を投与するための製剤の選択は、様々な要因に依存する。これらのうち顕著なものは、被験体の種、治療される状態の性質、被験体におけるその状態および分布、投与される他の療法および薬剤の性質、投与のための最適な経路、経路を通した生存性、投薬レジメン、および当業者には明らかである他の要因であろう。例えば、適切な担体および他の添加剤の選択は、正確な投与経路および特定の剤形の性質に依存する。細胞／培地の水性懸濁液の最終配合物は、通常、懸濁液のイオン強度を等張性（すなわち、約０．１〜０．２）および生理学的ｐＨ（すなわち、約ｐＨ６．８〜７．５）に調整することを含む。最終配合物はまた、通常、流体潤滑剤を含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、細胞は、溶液、懸濁液、またはエマルジョンなどの単位用量の注射可能な形態で処方される。細胞の注射に適した医薬配合物は、通常、滅菌水溶液および分散液である。注射可能な配合物のための担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。当業者は、本発明の方法において投与される組成物中の細胞および任意の添加物、ビヒクル、および／または担体の量を容易に決定することができる。
【００６１】
組成物は、特定の患者の年齢、性別、体重、および状態、および投与される配合物（例えば、固体対液体）などの要因を考慮して、医学および獣医学の当業者に周知の用量および技術によって投与することができる。
【００６２】
単一の用量は、一度に、分割して、またはある期間にわたって連続して送達できることを理解されたい。投与量全体を単一の場所に送達してもよいし、複数の場所に分けて分散してもよい。
【００６３】
様々な実施形態では、細胞は、初期用量で投与され、その後に、さらなる投与によって維持されてもよい。細胞は、最初に１つの方法で投与して、その後に、同じ方法または１つまたは複数の異なる方法によって投与してもよい。レベルは、細胞の進行中の投与によって維持することができる。種々の実施形態は、細胞を最初に投与するか、または被験体においてそのレベルを維持するか、またはその両方を静脈内注射によって投与する。様々な実施形態では、本明細書の他の箇所で論じられている患者の状態および他の要因に応じて他の投与形態が使用される。最初の投与およびさらなる投与のための、または逐次投与のための適切なレジメンは、すべて同じであってもよいし、変化してもよい。本開示、本明細書に引用された文献、および当該技術分野の知識から、適切なレジメンを当業者が確認することができる。治療の用量、頻度および期間は、疾患の性質、被験体、および同時に投与することができる他の療法を含む、多くの要因に依存する。本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、細胞は、分化していても分化していなくてもよい。本明細書に記載の実施形態のいずれにおいても、細胞は分離していても凝集していてもよい。本明細書中に記載の実施形態のいずれにおいても、細胞および／または細胞凝集体は、多能性幹細胞およびその子孫の組み合わせを含むことができる。
【００６４】
実施例
材料および方法
材料：図３〜図４に示すＧＥプロトタイプの撹拌タンク反応器で凝集体を培養した。Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｔａｉｎｅｒバッグを使用して供給用の新鮮な培地を保持し、使用済み培地を回収した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）は、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。ｍＴｅＳＲＴＭ１培地はＳＴＥＭＣＥＬＬ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤）はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ＣＴ２  ｈＥＳＣは、コネチカット大学保健センターのＲｅｎ−Ｈｅ  Ｘｕから得た。ポリゴングリッドスライサーおよび継代に使用される重力沈降のための配管アセンブリは、この用途のために特別に製造されたものであり、商業ベンダーを通じて購入されたものではない。
【００６５】
方法：ヒト胚性幹細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）から、撹拌タンクリアクタ実験の前に５継代を超える懸濁液凝集体に適合させた。ストック細胞は核型正常であることが確認された。連続継代はＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いて実施され、凝集体を播種後に懸濁凝集体を改質した小さなクラスターおよび単一の細胞に縮小した。Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＮＣ−２００（商標）（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて細胞数および生存率を測定した。
【００６６】
ヒト胚性幹細胞株ＣＴ２は、フィーダフリーの細胞ストックから適合された懸濁であり、バイオリアクタ培養の前に小規模で少なくとも５回継代された。Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）を用いた酵素的継代は、単一細胞および小さな（＜５細胞）クラスターの集団を産生した。容器に単一細胞／小さな凝集塊を付加してから２〜１２時間後に凝集体が形成された。細胞は、約５０〜２００μｍの直径の凝集体を形成した。平均凝集体直径の５０μｍ上および下の凝集体直径の分布を得ることは正常であった。大部分の凝集体はそのサイズの範囲内に収まったが、場合によっては約２００〜４００μｍのいくつかのより大きな凝集体が形成された。より小さい凝集体を好む条件は、より大きな凝集体では栄養の利用可能性が制限され得るが、より小さい凝集体は培養における相対的な増殖がより大きくなるため好ましい。
【００６７】
好ましい条件は、凝集を最小限にする球状凝集体を提供する。あまりにも多くの撹拌が凝集体の変形を含む剪断につながり、過剰な数の凝集していない単一の細胞を生成するので、バイオリアクタにおける撹拌のレベルを平衡させることが重要である。撹拌が少なすぎると、凝集体の凝集をまねく。
【００６８】
すべての多能性細胞株が同じ培養条件を好むわけではない。以下のパラメータをＰＳＣ増殖のために使用したが、当業者は、他の条件が類似の容器でＰＳＣ増殖を提供することを認識するであろう。すなわち、温度３７℃、ＣＯ２レベル５％、周囲Ｏ２（約２１％）または還元Ｏ２レベル、４０ｒｐｍの連続または不連続の撹拌速度である。
【００６９】
非灌流バッグにおける重力沈降および培地交換のための配管アセンブリ：
撹拌タンクバイオリアクタ上の配管アセンブリの概念的構成を図１〜図４に示す。アセンブリは、以下の機能を提供するが、これに限定されるものではない。（１）細胞／細胞培養培地混合物の除去、（２）出て行く細胞培養培地からの細胞凝集体の分離、（３）細胞培養培地の付加、および（４）細胞培養培地の除去。
【００７０】
細胞凝集体／細胞培養培地混合物の除去は、浸漬管の使用によって達成される。浸漬管は、細胞／培地が設置され動作している間にバイオリアクタから除去することができるように、十分な長さ／配向でなければならない。培地除去の際に十分な重力設定を保証するのに十分な長さ（高さ）および直径を有する重力沈降チャンバを導入することによって、出て行く培地からの細胞凝集体の分離が達成される。このチャンバの設計は、大きな直径のチューブに限定されず、十分な細胞凝集体分離のために必要ならば曲がりくねった経路を統合することもできる。並行して動作する１つまたは複数の配管アセンブリをバイオリアクタと関連させて、培地除去／付加の速度を増加させることができる。流体の追加／除去のための配管は、培地／廃棄物容器への接続を確実に達成するのに十分な長さである必要がある。流体除去は、流体付加経路を閉じたままにして、流体除去経路を通して培地を引き出すことによって達成される。流体付加は、流体除去経路を閉じたままにして流体付加経路を通して新鮮な培地を注入することによって達成される。図１〜図４の概念的な設計は、交互に培地除去および培地付加がある不連続灌流方法を示す。この概念の別の実施形態は、フィルタのない培地除去および培地付加のために別個の配管が使用される、連続的な灌流方法である。
【００７１】
不連続灌流の場合には、ソフトウェア制御は、特定量の使用済み培地の除去および新鮮培地の付加を調整する。この方式は、通常、容器の重量とは無関係である。好ましくは、所定の量の使用済み培地が除去された後に、所定の供給スケジュールに従って、新鮮な培地の量のボーラス付加が行われる。例えば、供給スケジュールは、２時間ごとに５０ｍＬの使用済み培地を除去し、続いて５０ｍＬの新鮮な培地を付加するように設定することができる。
【００７２】
撹拌タンクバイオリアクタからのフィルタなしの灌流。ＧＥプロトタイプの撹拌タンクバイオリアクタ内の２５０ｍＬ中で、約６００，０００細胞／ｍＬ（約９７％生存率）のＣＴ２ヒト胚性幹細胞を懸濁凝集体として培養し、約４０ｒｐｍで撹拌した。他の実験では、懸濁凝集体を４０〜７５ｒｐｍで撹拌した。バイオリアクタ内の凝集体サイズは、約１００μｍ〜約３００μｍの範囲であった（図１２）。重力沈降チャンバは、約４５度の角度で傾けられ、バイオリアクタの内縁に沿って動作した。配管の内径は３／３２”であった。フィルタなし灌流アセンブリの設計は、図３および図４のように示され、使用済み培地除去および新鮮培地付加の両方が可能になった。同じ配管内の新鮮な培地の付加は、配管に保持された任意の凝集体を主バイオリアクタチャンバに戻した。０．２ｍＬ／分〜０．４ｍＬ／分の流量を用いて約１５０ｍＬ／日を交換して、バイオリアクタから培地を除去し、新鮮培地付加のために８ｍＬ／分を付加した。培地交換は連続的ではなく、代わりに３０ｍＬを１日５回交換した。培養終了時には、１３００万個の細胞（主に単一細胞）のみが４５％の生存率で廃棄物中に見出されたが、これは廃棄物中の細胞がほとんど失われていないことを示している。
【００７３】
スライサーの設計：
スライサーは、様々な生体適合性材料で構成することができる。材料は、滅菌に適していなければならず、細胞試料の流れ中に受ける応力に耐えることができる機械的強度を有していなければならない。多能性幹細胞凝集体の継代培養について試験された２つの材料は、ニッケル合金およびシリコンであった。当業者は、他の材料が、凝集体の継代のために所望のスライサー性能を可能にする特性を有することを認識するであろう。スライサーは、例えば、正方形または六角形のグリッドなどの多角形のグリッド状パターンで設計され、５０ミクロン〜４００ミクロンのグリッドの壁間の間隔を有する。いくつかの実験では、スライサーを疎水性材料でコーティングして剪断および汚れを低減した。下記の多能性幹細胞凝集体の継代培養実験では、１００μｍ間隔の正方形および六角形のグリッドを使用した。スライサーは、閉鎖系内で配管を通ってスライサーを横切って凝集体の滅菌された流れを可能にする配管に沿って取り付けられた。スライサーは、限定はしないが、接着剤、溶融ポリマー流、または締付けを含む様々な締結機構によって閉鎖系に一体化されてもよい。好ましい方法では、ポンプおよびインライン円錐状バッグ（図８）によって駆動される循環ループを介して、凝集体を懸濁液中に維持する。スライサーに通じる配管は、主循環ループに接続され、循環ループ内の細胞凝集体の一部は、循環ループを制御するポンプよりも遅い速度で動作する第２のポンプを介してスライサーに送達される。スライスされた凝集体は別々の容器に集められるか、または同じ容器に再導入されてもよい。
【００７４】
細胞凝集体の継代中におけるスライサーの性能：
凝集体は、１００ｍＬ〜１Ｌの体積からなる流れストリーム中でスライサーを通過した。酵素的継代と比較したスライサーの利点は、時間、労力および試薬の削減である。約１００μｍの寸法に良好にスライスすることは、スライサーを一方向または双方向の流れの中を１回または複数回通過させることによって達成された。流量は剪断を最小にするように制御された。スライサーを１５〜１５０ｍＬ／分の流量で通過した多能性幹細胞凝集体で、サイズ縮小、細胞生存率の維持およびその後の増殖のための凝集スライス性能が実証された。当業者であれば、他の流量でも良好な性能を達成できることを認識するであろう。スライサーを通過するために使用された細胞凝集体濃度は、高い生存率でスライスされた細胞凝集体の回収に影響を与えることが判明した。スライサーの汚れは、細胞回収および生存率を低下させる可能性がある。約３×１０＾６細胞／ｍＬ未満の細胞凝集体濃度のスライスは、約３×１０＾６細胞／ｍＬを超える細胞濃度よりも高い回収でより高い生存率サンプルを産生することが判明した。図８に示す混合装置を使用するなどして、フローストリーム中の凝集体の均一な懸濁を維持することによって汚れを最小限に抑え、その結果、より高い細胞生存率および回収が得られた。スライスした凝集体のサンプル画像を図９に示す。スライス後の凝集形態は、不規則な形状、直方体形状および球形形状を含む。１００μｍのスライサーでは、凝集体の少なくとも１つの寸法は、約１００μｍの直径に縮小される。スライスした凝集体をｍＴｅＳＲ１および任意選択的に１〜１０μＭのＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤中で培養し、増殖を可能にした。単一多能性細胞の生存率を維持するために一般的にＹ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤などの薬剤を必要とする酵素的に継代された多能性幹細胞凝集体とは異なり、スライスされた多能性幹細胞凝集体の増殖には、Ｙ２７６３２  ＲＯＣＫ阻害剤は必要ではなかった。スライスされた凝集体の形態は、培養条件下で急速に球形に再形成された。スライスされた凝集体の増殖速度は、酵素的に継代された細胞の増殖速度と同様であった（図１０および図１１）。凝集体は、酵素的継代に必要なＰＢＳ洗浄を行わずにスライサーによって継代することができ、したがって、スライスによる継代は、酵素的継代よりも短い時間でよく、全体的な労力も少ない。当業者であれば理解するように、スライサーの機能および性能は、Ｘｕｒｉ  Ｃｅｌｌｂａｇバイオリアクタプラットフォームに依存せず、限定はしないが、他のロッキング運動、スピン運動もしくは軌道運動プラットフォームまたは撹拌タンクバイオリアクタを含む他のタイプのバイオリアクタと互換性がある。
【００７５】
本発明の特定の特徴だけを本明細書において例示および説明してきたが、多くの修正および変更が当業者に想到されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、そのようなすべての修正および変更を本発明の真の精神の範囲に包含されるものとして含むように意図されていることを、理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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