(57)【要約】  被験者の健康状態に関する情報を収集する方法が提案され、この方法は、好ましくは、ＣＴＳＤ、ＯＬＦＭ４、ＩＣＡＭ１からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の濃度を含む、ＴＨＢＳ１の濃度、遊離型ＰＳＡの割合（％ｆＰＳＡ）の、被験者の血清、血漿、又は血液における定量的検出を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の健康状態に関する情報を収集する方法であって、前記被験者の血清、血漿、又は血液におけるＴＨＢＳ１の濃度及び遊離型ＰＳＡの割合（％ｆＰＳＡ）の被験者定量的検出を含む、方法。
【請求項２】
前記被験者の血清、血漿、又は血液におけるＴＨＢＳ１の濃度、遊離型ＰＳＡの割合（％ｆＰＳＡ）、及び、ＣＴＳＤ、ＯＬＦＭ４、ＩＣＡＭ１からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の濃度の被験者定量的検出を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験者の血清、血漿、又は血液を、好ましくは前記被験者の血清、血漿、又は血液の希釈後に、それぞれのタンパク質についての少なくとも１つ、好ましくは２つの親和性試薬に接触させること、及び、前記それぞれのタンパク質と前記少なくとも１つの親和性試薬との間で結合が起こるかどうかを検出すること、及び、前記それぞれのタンパク質の濃度の定量的読出しを使用し、元の血清、血漿、若しくは血液中のそれぞれの濃度、又は、遊離型ＰＳＡの場合、遊離型ＰＳＡの割合の計算を可能にすることによって実施される、第１のステップと、
前記第１のステップにて決定された前記全てのタンパク質濃度及び遊離型ＰＳＡ割合に基づいて、組合せ式スコア値を計算する第２のステップと、
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２のステップ後に、第３のステップにおいて、前記被験者の生検陽性及び／又は前立腺癌陽性のリスクは、前記第２のステップにて決定された前記組合せ式スコア値に基づいて判定され、前記組合せ式スコア値の対応する閾値を超えることは、前立腺癌陽性の情報として及び／又は生検が必要であると考えられる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記組合せ式スコア値は、以下の式：
【数５】
2019527840.tif 000012
を使用して計算され、
ここで、βｉは実験データを使用する最適化によって前もって決定される回帰係数であり、β０は切片であり、ｘｉは、元の血清、血漿、又は血液中のそれぞれのタンパク質の測定濃度、そして、遊離型ＰＳＡの場合には、元の血清、血漿、又は血液におけるその割合（％ｆＰＳＡ）である、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
ＴＨＢＳ１の濃度（ｎｇ／ｍＬで表される）並びに遊離型ＰＳＡの割合（０〜１の数値範囲内で表される）（％ｆＰＳＡ）及び好ましくはさらにはＣＴＳＤの濃度（ｎｇ／ｍＬで表される）は前記第１のステップで測定され、好ましくは、前記組合せ式スコア値の計算について、ＴＨＢＳ１及び遊離型ＰＳＡの割合（％ｆＰＳＡ）を測定する場合、前記回帰係数は、次の通りに選択され：
β０、４．０〜５．５又は４．５〜５．０の範囲内、好ましくは、４．５〜５．０又は４．７〜４．８の範囲内；
βＴＨＢＳ１、（−０．０００１２）〜（−０．００００３）又は（−０．００００９）〜（−０．００００３）の範囲内、好ましくは、（−０．００００９）〜（−０．００００４）又は（−０．００００６）〜（−０．００００４）の範囲内；
β％ｆＰＳＡ、（−７．５）〜（−２．５）の範囲内、好ましくは、（−５．５）〜（−５．０）の範囲内；
さらに好ましくは、９０％感度でで、０．２８〜０．３５、好ましくは、０．３０〜０．３４又は０．３０〜０．３３の前記組合せ式スコア値の閾値が選択されるか；
又は、好ましくは、
前記組合せ式スコア値の計算について、ＴＨＢＳ１、遊離型ＰＳＡの割合（％ｆＰＳＡ）、及びＣＴＳＤを測定する場合、前記回帰係数は、次の通りに選択され：
β０、３〜４．２又は３〜３．４の範囲内、好ましくは、３．８〜４．０又は３．１〜３．３の範囲内；
βＣＴＳＤ、０．００３〜０．０５又は０．００５〜０．０５の範囲内、好ましくは、０．００４〜０．００６又は０．００８〜０．０１２の範囲内；
βＴＨＢＳ１、（−０．０００２）〜（−０．００００５）又は（−０．００００９）〜（−０．００００３）の範囲内、好ましくは、（−０．０００１２）〜（−０．００００８）又は（−０．００００７）〜（−０．００００６）の範囲内；
β％ｆＰＳＡ、（−７．５）〜（−２．５）の範囲内、好ましくは、（−５．２）〜（−５．０）又は（−５．２）〜（−２．５）の範囲内；
さらに好ましくは、９０％感度でで、０．２８〜０．４０又は０．２８〜０．３５、好ましくは、０．３５〜０．３７又は０．３３〜０．３４の前記組合せ式スコア値の閾値が選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＴＨＢＳ１の濃度（ｎｇ／ｍＬで表される）、遊離型ＰＳＡの割合（０〜１の数値範囲内で表される）（％ｆＰＳＡ）、及びＯＬＦＭ４の濃度（ｎｇ／ｍＬで表される）は前記第１のステップで測定され、好ましくは、前記組合せ式スコア値の計算について、前記回帰係数は、次の通りに選択され：
β０、４．０〜５．２の範囲内、好ましくは、４．４〜４．８の範囲内；
βＯＬＦＭ４、０．００１〜０．０１の範囲内、好ましくは、０．００２〜０．００４の範囲内；
βＴＨＢＳ１、（−０．００００９）〜（−０．００００２）の範囲内、好ましくは、（−０．００００６）〜（−０．００００４）の範囲内；
β％ｆＰＳＡ、（−７．５）〜（−２．５）の範囲内、好ましくは、（−５．９）〜（−４．８）の範囲内；
さらに好ましくは、９０％感度で、０．２７〜０．３５、好ましくは、０．３〜０．３４の前記組合せ式スコア値の閾値が選択され；
及び／又は、
ＴＨＢＳ１の濃度（ｎｇ／ｍＬで表される）、遊離型ＰＳＡの割合（０〜１の数値範囲内で表される）（％ｆＰＳＡ）、及びＩＣＡＭ１の濃度（ｎｇ／ｍＬで表される）は前記第１のステップで測定され、
好ましくは、前記組合せ式スコア値の計算について、前記回帰係数は、次の通りに選択され：
β０、４．０〜５．２の範囲内、好ましくは、４．６〜４．９の範囲内；
βＩＣＡＭ１、（−０．００２）〜（−０．０００１）の範囲内、好ましくは、（−０．００１０）〜（−０．０００５）の範囲内；
βＴＨＢＳ１、（−０．０００１）〜（−０．００００１）の範囲内、好ましくは、（−０．００００８）〜（−０．００００４）の範囲内；
β％ｆＰＳＡ、（−７．５）〜（−２．５）の範囲内、好ましくは、（−５．８）〜（−４．９）の範囲内；
さらに好ましくは、９０％感度で、０．２５〜０．３５、好ましくは、０．３〜０．３３の前記組合せ式スコア値の閾値が選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ＴＨＢＳ１の濃度（ｎｇ／ｍＬで表される）、遊離型ＰＳＡの割合（０〜１の数値範囲内で表される）（％ｆＰＳＡ）、並びにＯＬＦＭ４、ＩＣＡＭ１、及びＣＴＳＤの濃度（それぞれｎｇ／ｍＬで表される）は前記第１のステップで測定され、好ましくは、前記組合せ式スコア値の計算について、前記回帰係数は、次の通りに選択され：
β０、３〜３．８の範囲内、好ましくは、３．５〜３．６の範囲内；
βＯＬＦＭ４、０．００１〜０．００３の範囲内、好ましくは、０．００１５〜０．００２５の範囲内；
βＩＣＡＭ１、（−０．００４）〜（−０．００２）の範囲内、好ましくは、（−０．００３５）〜（−０．０００２５）の範囲内；
βＣＴＳＤ、０．００５〜０．０５の範囲内、好ましくは、０．００８〜０．０１２の範囲内；
βＴＨＢＳ１、（−０．００００９）〜（−０．００００３）の範囲内、好ましくは、（−０．００００７）〜（−０．００００６）の範囲内；
β％ｆＰＳＡ、（−７．５）〜（−２．５）の範囲内、好ましくは、（−５．２）〜（−４．８）の範囲内；
さらに好ましくは、９０％感度で、０．３〜０．３５、好ましくは、０．３２〜０．３３５の前記組合せ式スコア値の閾値が選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
測定されるＴＨＢＳ１及び／又はＣＴＳＤ、ＯＬＦＭ４、ＩＣＡＭ１の少なくとも１つは、グリコシル化、リン酸化、脂質化を含む翻訳後修飾を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＴＨＢＳ１、ＣＴＳＤ、ＯＬＦＭ４、ＩＣＡＭ１の少なくとも１つの濃度の測定について、前記被験者の血清、血漿、又は血液は、７〜７．４の範囲内のｐＨ値を有し、ｐＨ値を制御する試薬、好ましくは以下の系の少なくとも１つから選択されるｐＨ値を制御する試薬、及び以下の少なくとも１つの系から選択される任意添加成分を含む緩衝液を用いて希釈され、
好ましくは、前記緩衝液は、５０ｍＭ〜８５０ｍＭの範囲内、好ましくは２００ｍＭ〜４００ｍＭの範囲内又は２５０ｍＭ〜３７０ｍＭの範囲内のイオン強度を有し、
前記ｐＨを制御する試薬の系が、
Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）、
Ｐｉｐｅｓ（ピペラジン−１，４−ビス−２−エタンスルホン酸）、
Ｍｅｓ（４−モルホリノエタンスルホン酸）、
Ｈｅｐｅｓ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸）、
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）から選択され、
前記任意添加成分の系が、
好ましくは、０．０１％（ｖ／ｖ）〜０．１％（ｖ／ｖ）、好ましくは、０．０２５％（ｖ／ｖ）〜０．０５％（ｖ／ｖ）の、ドデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｍ（ｍは５〜４０の整数）；１−Ｏ−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｎ−オクチルグリコシド）；アルキルフェノールポリ（エチレングリコール−エーテル）ｍ（ｍは５〜４０の整数、好ましくはｍ＝１１）；１−Ｏ−ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシル（１−４）α−Ｄ−グルコピラノシド；ドデシルポリ−（エチレングリコールエーテル）ｍ（ｍは５〜４０の整数、好ましくはｍ＝２３）；ポリ（オキシエチレン）（２０）−ソルビタンモノオレエート、ポリ（オキシエチレン）（２０）−ソルビタンモノラウレート、ポリ（オキシエチレン）（２０）−ソルビタンモノパルミテート、ポリ（オキシエチレン）（２０）−ソルビタンモノステアレートから好ましくは選択されるポリ（オキシエチレン）（２０）−ソルビタンモノ脂肪酸エステル；オクチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）ｍ（ｍは５〜４０の整数、好ましくはｍ＝１０）からなる群の少なくとも１つから選択される非イオン性界面活性剤（non-ionic detergent）；ウシ血清アルブミン；マウスＩｇＧ；ウシγグロブリン；ウシ胎児血清；ウマ血清から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＴＨＢＳ１を測定するための希釈については、１：１０００〜１：２００００の範囲内の希釈係数が選択され、好ましくは、酵素結合免疫吸着アッセイについては１：１０００〜１：３０００又は１：２０００〜１：３０００の範囲内の希釈係数が、また、ビーズベースアッセイについては１：５０００〜１：１５０００の範囲内の希釈係数が選択され、
及び／又は、タンパク質ＣＴＳＤを測定するための希釈については、１：５〜１：７０又は１：５〜１：３０の範囲内の希釈係数が選択されは、好ましくは、酵素結合免疫吸着アッセイについては１：１０〜１：５０又は１：１０〜１：３０の範囲内の希釈係数が、また、ビーズベースアッセイについては１：１０〜１：２０の範囲内の希釈係数が選択され、
好ましくは、使用される緩衝液に、ポリ（オキシエチレン）（２０）−ソルビタンモノラウレートとして選択される非イオン性界面活性剤をさらに補い、０．０５％（ｖ／ｖ）のポリ（オキシエチレン）（２０）−ソルビタンモノラウレートの更なる濃度をもたらし、
及び／又は、ＩＣＡＭ１を測定するための希釈については、１：５０〜１：２００の範囲内、好ましくは、１：８０〜１：１５０の範囲内の希釈係数が選択され、好ましくは、使用される緩衝液に、２５０ｍＭの更なる塩化ナトリウム含量になるように塩化ナトリウムをさらに補い、
及び／又は、ＯＬＦＭ４を測定するための希釈については、１：５〜１：３０の範囲内、好ましくは、１：５〜１：２０の範囲内の希釈係数が選択され、好ましくは、使用される緩衝液に、２５０ｍＭの更なる塩化ナトリウム含量になるように塩化ナトリウム及びジチオトレイトールとして好ましくは選択される還元剤をさらに補い、ジチオトレイトールの５ｍＭの濃度をもたらす、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法は、前記被験者の血清、血漿、又は血液を、好ましくは前記被験者の血清、血漿、又は血液の希釈後に、それぞれのタンパク質についての少なくとも１つの親和性試薬に接触させること、及び、前記それぞれのタンパク質と前記少なくとも１つの親和性試薬との間で結合が起こるかどうかを検出すること、及び、前記それぞれのタンパク質濃度又は遊離型ＰＳＡの場合にはその割合の定量的読出しを使用し、元の血清、血漿、又は血液中のそれぞれの濃度の計算を可能にすることによって実施される、第１のステップを含み、
前記ステップにおいて、好ましくは可視的読出しによる前記それぞれのタンパク質に特異的なサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ及び／又は好ましくは蛍光読出しによる前記それぞれのタンパク質に対するサンドイッチビーズベース抗体アッセイが使用される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
好ましくは可視的読出しによる前記それぞれのタンパク質に特異的な前記サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ及び／又は好ましくは蛍光読出しによる前記それぞれのタンパク質に対する前記サンドイッチビーズベース抗体アッセイは、それぞれ、ヒトのＴＨＢＳ１、ＣＴＳＤ、ＩＣＡＭ１、及びＯＬＦＭ４の組換えタンパク質、並びに、抗体によるマウスの免疫化によって産生されるマウスのモノクロナール抗体を使用することによって得られるアッセイである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記それぞれの濃度の定量的検出は、外部タンパク質標準に対するバイオマーカーの濃度の測定を含み、前記測定は、前記サンプルと同一の測定セットにおいて測定されるタンパク質希釈物に用いるのと同じ緩衝液にて希釈された幾つかの、好ましくは５〜７のタンパク質標準の規定された濃度を測定することによる参照標準曲線の作成を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
癌、特に、限局性前立腺癌を含む前立腺癌の、モニタリング、診断、前立腺生検結果の予測、予後診断、リスク評価、治療選択、治療モニタリングのうちの少なくとも１つのステップ、又は、癌、特に、限局性前立腺癌を含む前立腺癌の、モニタリング、診断、前立腺生検結果の予測、予後診断、リスク評価、治療選択、治療モニタリングのうちの少なくとも１つのための請求項１〜１４のいずれか１項による方法の使用を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトサンプル中の、特に、ヒトの血清、血漿、又は血液中のタンパク質を測定する方法の分野に関し、同様に、特にリスク評価のためのアッセイ及びこうしたアッセイの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ある人のヒトサンプル中のタンパク質の測定は、特に、その人の栄養及び健康状態に関して、その人の全身的状態の監視及びリスク評価のための有力なツールである。
【０００３】
前立腺癌（ＰＣａ：Prostate Cancer）は、男性における最も頻繁に診断される癌であり、米国における男性の癌関連死の第２の主因である。
【０００４】
前立腺癌の診断及び治療は、１０年間の研究努力にもかかわらず、クリニックにおいて依然として主要な課題である。ＰＣａの進行は、残念ながら無症候性（silent）であり、より急速な進行及び潜在的に危険な病変の早期検出は患者の健康にとって重要である。その理由は、疾病からの完全寛解及び治癒は、疾病の早期段階においてのみ可能だからである。
【０００５】
ＰＣａのために利用可能な最も非侵襲的な診断試験は、デジタル直腸検査（ＤＲＥ：digital rectal examination）と組み合わせた血液中の前立腺特異抗原（ＰＳＡ：Prostate Specific Antigen）の検出である。ＰＳＡは前立腺の上皮細胞によって産生されるタンパク質である。ＰＳＡは、カリクレインＩＩＩ（kallikrein III）、セミニン（seminin）、セメノゲラーゼ（semenogelase）、γ−セミノタンパク質（γ-seminoprotein）、及びＰ−３０抗原としても知られており、ＰＳＡは、正常男性の血清中に少量で存在する３４ｋＤの糖タンパク質であり、ＰＣａが存在する場合及び他の前立腺疾患においてしばしば上昇する。ＤＲＥと組み合わせたＰＳＡを測定する血液検査は、ＰＣａの早期検出のために現在のところ利用可能な最も有効な検査である。正常より高いレベルのＰＳＡは、限局性ＰＣａと転移性ＰＣａの両方に関連付けられる。
【０００６】
ＰＳＡ単独での診断精度は、約６０％に過ぎず、その方法は、特異度において主要な欠点を有する（不必要な前立腺生検又は手術を受ける偽陽性事例があまりにも多い）。実際には、ＰＳＡレベルは、前立腺感染症、炎症、良性前立腺肥大（増大）又は良性前立腺過形成（ＢＰＨ）、及び、直近の射精（recent ejaculation）によっても増加し、偽陽性結果を生じ得る。
【０００７】
そのため、ＰＣａ診断は、現在のところＰＳＡ評価の高い偽陽性率がネックになっており、高い偽陽性率は、その結果として、陰性診断所見を伴う多数の前立腺生検をもたらす場合がある。さらに、これらの不必要な生検は、潜在的な副作用を有し得る。近年、ＰＳＡを使用するＰＣａについての男性の普及したスクリーニングは推奨されておらず、そのためＰＣａについてスクリーニングする男性がより少数になり、検出される早期段階の事例がより少数になっている。
【０００８】
従って、種々のパラメーター（例えば、遊離型及び総ＰＳＡ）の同時測定に基づく新規な方法が、全体の診断精度を上げるツールとして出現しているものの、偽陽性及び偽陰性結果を回避する信頼性がありかつ非侵襲的な診断／予後診断法は依然として欠如している。血液中のほとんどのＰＳＡは血清タンパク質と結合している。少量は、タンパク質と結合しておらず、遊離型ＰＳＡと呼ばれる。前立腺癌を患う男性においては、遊離型（未結合）ＰＳＡの総ＰＳＡに対する割合は減少する。癌のリスクは、遊離型ＰＳＡの総ＰＳＡに対する比（％ｆＰＳＡ）が２５％より小さい場合に増加する。この比が小さくなればなるほど、ＰＣａの確率が大きくなる。しかし、総ＰＳＡ及び遊離型ＰＳＡは共に、射精直後に増加し、２４時間以内にベースラインレベルまでゆっくり戻り、ＰＣａに関連しない他のメカニズムが遊離型ＰＳＡの総ＰＳＡに対する比に影響を及ぼすこともある。
【０００９】
新しい診断ツール、理想的には非侵襲的な診断ツールは、ＰＣａ診断を改善し、不必要な生検及び過剰な治療を減らすために緊急に必要とされている。血液のような容易にアクセス可能なサンプルタイプのより正確な診断により、医師及び患者は、ＰＣａの考えられる事例及び前立腺生検が必要か否かに関するより多くの情報を得た上での決定（more informed decisions）を行うことが可能になる。
【００１０】
診断と同様に、ＰＣａの治療及び／又はＰＣａの予後診断は、疾病の不均一性のために主要な課題のままである。ＰＣａの複数のメカニズムが提案されてきているが、患者を分類することができる適切な特徴（signature）はなく、治療介入治癒（therapeutic intervention cures）のために重要な目標タンパク質は依然として実現可能でない。
【００１１】
前立腺癌のための適切な診断システムを見出す１つのアプローチは、特許文献１において提案されており、ヒト血液中に存在することが知られており、かつ、対応する患者の健康状態に応じて下方調節又は上方調節されると予想される２４のタンパク質のリストのうちの少なくとも２つを測定することが提案されている。
【００１２】
既知のアプローチの問題は、癌が実際に存在するかという観点での感度及び特に特異度が欠けていること、及び、偽陽性及び偽陰性結果を回避する観点での診断信頼性が欠けていることである。更なる問題は、対応するツールを学術研究目的のためだけでなく幅広い用途のためにも適するようにする、対応する検出プローブ（抗体ベースであろうが、任意の他のタイプの検出であろうが）の実際の利用可能性である。更なる問題は、対応する検出システムが、単純であり、多数の個々の測定を伴うべきでないことである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２００９／１３８３９２号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、被験者の健康状態に関する情報を収集するための、特に、ヒトサンプル中の、特にヒト血清、血漿、又は血液中のタンパク質を検出するための新しい方法を提案することが本発明の目的であり、本発明は、特にＰＣａに関連する、特にリスク評価のためのアッセイ及びこうしたアッセイの使用に関する。ヒトカテプシンＤ（ＣＴＳＤ：cathepsin D）、ヒト細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１：intercellular adhesion molecule 1）、ヒトオルファクトメジン４（ＯＬＦＭ４：olfactomedin 4）、及びヒトトロンボスポンジン１（ＴＨＢＳ１：thrombospondin 1）についての４つの個々のイムノアッセイを開発し、技術的に検証した。これらの糖タンパク質のマウスホモログは、Ｐｔｅｎコンディショナルノックアウトマウスモデルを使用する質量分析法によって過去に同定された。ヒトホモログは、それ自体で又はＰＳＡ値、特に％ｆＰＳＡ値と組合せて、ＰＣａから良性前立腺状態を識別する能力を試験するために、臨床血清サンプル中で測定された。結果として、特許請求される組合せが、従来技術のアプローチの上記で述べた欠点を克服するために最適であることが確認された。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
より具体的には、本発明は、被験者の健康状態に関する情報を収集する方法に関する。この方法は、被験者の血清、血液、又は血漿中の特定のタンパク質の定量的検出を含む。被験者の血清、血液、又は血漿は貯蔵及び／又は前処理することもでき、例えば、被験者から採取された後でかつ本方法を実施する前に希釈することができる。具体的には、本方法は、ＴＨＢＳ１の濃度の測定及び遊離型ＰＳＡの割合（％ｆＰＳＡ、［遊離型ＰＳＡ］／［総ＰＳＡ］として与えられ、従って、０〜１の数値範囲内にある）の測定／決定を含む。好ましくは、本方法は、ＣＴＳＤ、ＯＬＦＭ４、ＩＣＡＭ１からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質の濃度の測定をさらに含む。換言すれば、少なくとも２つ又は好ましくは少なくとも３つのタンパク質含量が、情報を収集するためのサンプル中で測定／決定される。ＴＨＢＳ１、ＣＴＳＤ、ＯＬＦＭ４、及び／又はＩＣＡＭ１については、その濃度は、直接的に又は間接的に測定され、通常、ｎｇ／ｍＬで表され、一方、ＰＳＡについては、遊離型ＰＳＡの割合が、総ＰＳＡ及び遊離型ＰＳＡの濃度を定量化することによって（又は代替的に、総ＰＳＡ及び複合型ＰＳＡの濃度を定量化し、そこから遊離型ＰＳＡの割合を計算することによって）決定され、分析のために使用される。分析のために、好ましくは、元のサンプル中の、そのため元の血清、血液、又は血漿中の濃度値が使用され、測定する前に、元の血清、血液、又は血漿の希釈又は修飾ステップが存在する場合、元のサンプル中の濃度が逆算される。
【００１６】
予想外に、遊離型ＰＳＡの割合（％ｆＰＳＡ）と組合せて、前立腺生検陽性、従って、ＰＣａ陽性であるときに高いことが見出された。予想外に、総ＰＳＡとの組合せではなく、特に％ｆＰＳＡ値と組合せたＴＨＢＳ１は、対応する被験者の健康状態に関する陽性情報の判定を可能にすることが見出された。大規模コホート（large cohort）に関して実施された分析は、最適化されたロジスティック回帰モデルによって、受信者動作特性（ＲＯＣ：receiver operating characteristic）表現における非常に大きな曲線下面積（ＡＵＣ：area under the curve）を有すること、及び、９０％感度において特に高い特異度を有するパラメーター化が見出され得ることを示す。それに加えて、追加的な系ＣＴＳＤ、ＯＬＦＭ４、ＩＣＡＭ１のいずれについても、このコホートに関して単独で、かつさらには％ｆＰＳＡの割合と共に評価され最適化される場合、大きなＡＵＣを全く得ることができないことが見出された。しかし、特に、群ＣＴＳＤ、ＯＬＦＭ４、ＩＣＡＭ１の群のうちの更なる１つが測定される場合、特に、ＣＴＳＤが、ＴＨＢＳ１と共にかつ％ｆＰＳＡと連携して測定される場合、９０％感度における有意の更なる特異度が得られ得る。
【００１７】
対応する患者の年齢に関する等の情報を分析内にさらに含むことも可能であり、年齢等のこうした追加的な情報も、以下で与えられる式（１）において更なるパラメーターとして使用され得る。
【００１８】
通常、本方法は、上昇したＰＳＡ（２．０ｎｇ／ｍＬ及び１０ｎｇ／ｍＬ）値を有する、好ましくは、ＤＲＥ陰性及び／又は増大した前立腺（≧３５ｍｌ）をさらに有する被験者に関して実施される。
【００１９】
提案される方法の第１の好ましい実施形態によれば、方法は、
被験者の血清、血漿、又は血液、好ましくは血清を、好ましくは被験者の血清、血漿、又は血液の希釈後に、それぞれのタンパク質についての少なくとも１つ、好ましくは２つの（好ましくはサンドイッチアプローチを使用する）親和性試薬に接触させ、それぞれのタンパク質と少なくとも１つ（又は、２つ）の親和性試薬との間で結合が起こるかどうかを検出し、それぞれのタンパク質の濃度の定量的読出し、又は遊離型ＰＳＡの場合にはその割合％ｆＰＳＡ値を使用し、元の血清、血漿、又は血液中のそれぞれの濃度の計算を可能にすることによって実施される、第１のステップと、
上記第１のステップにて決定された全てのタンパク質の濃度及び遊離型ＰＳＡ割合に基づいて、組合せ式スコア値を計算する第２のステップと、
を含む。
【００２０】
タンパク質濃度及び遊離型ＰＳＡ割合は、通常、個々に測定される、例えば、それぞれイムノアッセイにおいて測定されるが、その後、測定された濃度／割合は、組合せ式スコア値を計算するために組合せ方式で使用される。そのため、測定された情報は、個々に使用されるのではなく、組合せ式スコア値の決定のために及び情報の更なる分析のために組合せ方式で使用される。
【００２１】
さらに好ましくは、第２のステップ後に、第３のステップにおいて、被験者の前立腺生検陽性、従って、ＰＣａを有するリスクは、第２のステップにて決定された組合せ式スコア値に基づいて決定することができ、組合せ式スコア値の対応する閾値を超えることは、生検陽性の予測（疾病の存在又は程度を決定するための検査のためのサンプル組織の抽出を意味し、その組織は、例えば病理学者によって顕微鏡下で検査され、陽性は、検査する人が、癌が存在するという結論を出すことを意味する）として、従って、確認のための生検を必要とするＰＣａ陽性の情報と考えられる。
【００２２】
組合せ式スコア値は、好ましくは、以下の式：
【数１】
2019527840.tif 000002
を使用して計算される。ここで、βｉは、実験データを使用して、最適化、通常は、ＲＯＣアプローチにおけるＡＵＣの最大化によって前もって決定される回帰係数であり、β０は切片であり、ｘｉは、元の血清、血漿、又は血液中のそれぞれのタンパク質の測定濃度（ｎｇ／ｍＬ）であり、％ｆＰＳＡの場合、ｘｉは、元の血清、血漿、又は血液中の総ＰＳＡに対する遊離型ＰＳＡの割合（０〜１の範囲内で表される）である。指数ｉは、従って、本状況において、０から少なくとも２まで延び、ＴＨＢＳ１及び％ｆＰＳＡ値のみが使用される状況の場合、少なくとも３まで延び、そこで、上記で述べた群から更なるタンパク質濃度値が測定される。
【００２３】
例えば、ＴＨＢＳ１、ＣＴＳＤ、及び％ｆＰＳＡは、組合せ式スコア値の計算のために測定され、ｉは３まで延び、β１はβＣＴＳＤであり、ｘ１は元の血清、血漿、又は血液中のＣＴＳＤの濃度であり、β２はβＴＨＢＳ１であり、ｘ２は元の血清、血漿、又は血液中のＴＨＢＳ１の濃度であり、β３はβ％ｆＰＳＡであり、ｘ３は元の血清、血漿、又は血液中の遊離型ＰＳＡの割合である。
【００２４】
ロジスティック回帰の対応する最適化は、被験者からの血清、血漿、又は血液に関する測定値を使用して実施され、健康状態に関するより詳細な情報がもたらされ、陰性又は前立腺生検陽性、従って、ＰＣａが存在するかどうかがわかる。従って、このコホートは高い感度において考えられる最も高い特異度を見出すために、ＲＯＣ表現において最適モデルを見出し、最大ＡＵＣを得るために使用される。回帰係数である対応するパラメーターβｉは、次に、健康状態に関する知識を持たない任意の個人に関して使用されて、被験者の健康状態に関する確率的記述を行い、このようにして、前立腺生検結果を予測し得る。
【００２５】
タンパク質の濃度／割合が、測定され、上記で述べた式に挿入されて、組合せ式スコア値が決定される。得られた対応する組合せ式スコア値は、その後、閾値と比較される。閾値は、所望の感度／特異度に従って選択され得る。この閾値を超える場合、前立腺生検陽性、従って、ＰＣａ診断が、生検を受けに行くという提案と共に与えられる。所望の感度に対応する閾値は、ＲＯＣ表現において、所望の感度が存在する曲線上の対応するポイントを選択し、組合せ式スコア値を、そのポイントについて採取することで決定される。特定のパラメーター化について以下で与えられる閾値は、常に９０％感度で与えられる。所与の閾値を超える場合、これは、前立腺生検、従って、ＰＣａの高い可能性を示し、詳細に調べるために生検が提案される。前立腺生検を受ける患者の４７４の血清サンプルに関する大規模コホートを使用して、以下の好ましいパラメーター化が、最適感度及び特異度について決定され、タンパク質、即ち、それぞれ、ＴＨＢＳ１、ＣＴＳＤ、ＩＣＡＭ１、及びＯＬＦＭ４の濃度は、それぞれ、ｎｇ／ｍＬとして式に挿入され、元の血液、血清、又は血漿について決定／逆算され、遊離型ＰＳＡの割合（％ｆＰＳＡ）は０〜１の範囲内の数字として使用される。
【００２６】
ＴＨＢＳ１の濃度及び遊離型ＰＳＡの割合（％ｆＰＳＡ）が第１のステップにて測定される事例の場合、好ましくは、組合せ式スコア値の計算について、回帰係数は次の通りに選択される：
β０、４．０〜５．５又は４．５〜５．０の範囲内、好ましくは、４．５〜５．０又は４．７〜４．８の範囲内；
βＴＨＢＳ１、（−０．０００１２）〜（−０．００００３）又は（−０．００００９）〜（−０．００００３）の範囲内、好ましくは、（−０．００００９）〜（−０．００００４）又は（−０．００００６）〜（−０．００００４）の範囲内；
β％ｆＰＳＡ、（−７．５）〜（−２．５）の範囲内、好ましくは、（−５．５）〜（−５．０）の範囲内。
【００２７】
この事例における９０％感度で、好ましくは、０．２８〜０．３５、好ましくは、０．３０〜０．３４又は０．３０〜０．３３の組合せ式スコア値の閾値が選択される。
【００２８】
ＴＨＢＳ１の濃度、遊離型ＰＳＡの割合（％ｆＰＳＡ）、及びＣＴＳＤの濃度が第１のステップにて測定される事例の場合、好ましくは、組合せ式スコア値の計算について、回帰係数は、次の通りに選択される：
β０、３〜４．２又は３〜３．４の範囲内、好ましくは、３．８〜４．０又は３．１〜３．３の範囲内；
βＣＴＳＤ、０．００３〜０．０５又は０．００５〜０．０５の範囲内、好ましくは、０．００４〜０．００６又は０．００８〜０．０１２の範囲内；
βＴＨＢＳ１、（−０．０００２）〜（−０．００００５）又は（−０．００００９）〜（−０．００００３）の範囲内、好ましくは、（−０．０００１２）〜（−０．００００８）又は（−０．００００７）〜（−０．００００６）の範囲内；
β％ｆＰＳＡ、（−７．５）〜（−２．５）の範囲内、好ましくは、（−５．２）〜（−５．０）又は（−５．２）〜（−４．５）の範囲内。
【００２９】
この事例における９０％感度で、好ましくは、０．２８〜０．４０又は０．２８〜０．３５、好ましくは、０．３５〜０．３７又は０．３３〜０．３４の組合せ式スコア値の閾値が選択される。
【００３０】
ＴＨＢＳ１の濃度、遊離型ＰＳＡの割合（％ｆＰＳＡ）、及びＯＬＦＭ４の濃度が第１のステップで測定される事例の場合、好ましくは、組合せ式スコア値の計算について、回帰係数は、次の通りに選択される：
β０、４．０〜５．２の範囲内、好ましくは、４．４〜４．８の範囲内；
βＯＬＦＭ４、０．００１〜０．０１の範囲内、好ましくは、０．００２〜０．００４の範囲内；
βＴＨＢＳ１、（−０．００００９）〜（−０．００００２）の範囲内、好ましくは、（−０．００００６）〜（−０．００００４）の範囲内；
β％ｆＰＳＡ、（−７．５）〜（−２．５）の範囲内、好ましくは、（−５．９）〜（−４．８）の範囲内。
【００３１】
この事例における９０％感度で、好ましくは、０．２７〜０．３５、好ましくは、０．３〜０．３４の組合せ式スコア値の閾値が選択される。
【００３２】
ＴＨＢＳ１の濃度、遊離型ＰＳＡの割合（％ｆＰＳＡ）、及びＩＣＡＭ１の濃度が第１のステップで測定される事例の場合、好ましくは、組合せ式スコア値の計算について、回帰係数は、次の通りに選択される：
β０、４．０〜５．２の範囲内、好ましくは、４．６〜４．９の範囲内；
βＩＣＡＭ１、（−０．００２）〜（−０．０００１）の範囲内、好ましくは、（−０．００１０）〜（−０．０００５）の範囲内；
βＴＨＢＳ１、（−０．０００１）〜（−０．００００１）の範囲内、好ましくは、（−０．００００８）〜（−０．００００４）の範囲内；
β％ｆＰＳＡ、（−７．５）〜（−２．５）の範囲内、好ましくは、（−５．８）〜（−４．９）の範囲内。
【００３３】
この事例における９０％感度で、好ましくは、０．２５〜０．３５、好ましくは、０．３〜０．３３の組合せ式スコア値の閾値が選択される。
【００３４】
ＴＨＢＳ１の濃度、遊離型ＰＳＡの割合（％ｆＰＳＡ）、並びにＯＬＦＭ４、ＩＣＡＭ１、及びＣＴＳＤの濃度が第１のステップで測定される事例の場合、組合せ式スコア値の計算について、回帰係数は、次の通りに選択される：
β０、３〜３．８の範囲内、好ましくは、３．５〜３．６の範囲内；
βＯＬＦＭ４、０．００１〜０．００３の範囲内、好ましくは、０．００１５〜０．００２５の範囲内；
βＩＣＡＭ１、（−０．００４）〜（−０．００２）の範囲内、好ましくは、（−０．００３５）〜（−０．０００２５）の範囲内；
βＣＴＳＤ、０．００５〜０．０５の範囲内、好ましくは、０．００８〜０．０１２の範囲内；
βＴＨＢＳ１、（−０．００００９）〜（−０．００００３）の範囲内、好ましくは、（−０．００００７）〜（−０．００００６）の範囲内；
β％ｆＰＳＡ、（−７．５）〜（−２．５）の範囲内、好ましくは、（−５．２）〜（−４．８）の範囲内。
【００３５】
この事例における９０％感度で、好ましくは、０．３〜０．３５、好ましくは、０．３２〜０．３３５の組合せ式スコア値の閾値が選択される。
【００３６】
測定されたＴＨＢＳ１及び／又はＣＴＳＤ、ＯＬＦＭ４、ＩＣＡＭ１の少なくとも１つは、グリコシル化、リン酸化、脂質化等を含む翻訳後修飾を含むことができる。ＴＨＢＳ１、ＣＴＳＤ、ＯＬＦＭ４、ＩＣＡＭ１の少なくとも１つの濃度の測定について、被験者の血清、血漿、又は血液は、緩衝液を使用して希釈することができ、通常は緩衝液を使用して希釈することが好ましい。
【００３７】
この緩衝液は、好ましくは７〜７．４の範囲内のｐＨ値を有し、好ましくは、ｐＨ値を制御する試薬をさらに含む。ｐＨ値を制御するこの試薬は、以下の系の少なくとも１つから選択される：Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）、Ｐｉｐｅｓ（ピペラジン−１，４−ビス−２−エタンスルホン酸）、Ｍｅｓ（４−モルホリノエタンスルホン酸）、Ｈｅｐｅｓ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジン−エタンスルホン酸）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）。
【００３８】
さらに、緩衝液は更なる成分を含むことができる。例えば、緩衝液は、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤を、好ましくは、０．０１％（ｖ／ｖ）〜０．１％（ｖ／ｖ）、好ましくは、０．０２５％（ｖ／ｖ）〜０．０５％（ｖ／ｖ）の濃度で含むことができる。この非イオン性界面活性剤は、以下からなる群の少なくとも１つから選択することができる：ドデシルポリ（エチレングリコールエーテル）ｍ（ｍは５〜４０の整数）；１−Ｏ−ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｎ−オクチルグルコシド）；アルキルフェノールポリ（エチレングリコール−エーテル）ｍ（ｍは５〜４０の整数、好ましくはｍ＝１１）；１−Ｏ−ｎ−ドデシル−β−Ｄ−グルコピラノシル（１−４）α−Ｄ−グリコピラノシド；ドデシルポリ−（エチレングリコールエーテル）ｍ（ｍは５〜４０の整数、好ましくはｍ＝２３）好ましくはポリ（オキシエチレン）（２０）−ソルビタンモノオレエート、ポリ（オキシエチレン）（２０）−ソルビタンモノラウレート、ポリ（オキシエチレン）（２０）−ソルビタンモノパルミテート、ポリ（オキシエチレン）（２０）−ソルビタンモノステアレートから好ましくは選択されるポリ（オキシエチレン）（２０）−ソルビタンモノ脂肪酸エステル；オクチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）ｍ（ｍは５〜４０の整数、好ましくはｍ＝１０）。
【００３９】
さらに、緩衝液は、ウシ血清アルブミン、トレハロース、スクロース、ウシ胎児血清、ウマ血清、マウスＩｇＧ、ウシγグロブリンのうちの少なくとも１つ等の成分を含むことができる。
【００４０】
好ましくは、緩衝液は、特定のタンパク質の事例について、ジチオトレイトール（ＤＴＴ：dithiothreitol）又は任意の他の還元剤を含まない。しかし、ＤＴＴを、特別に添加することもできる（以下の注記参照）。
【００４１】
好ましくは、緩衝液は、５０ｍＭ〜８５０ｍＭの範囲内、好ましくは２００ｍＭ〜４００ｍＭの範囲内又は２５０ｍＭ〜３７０ｍＭの範囲内のイオン強度を有する。
【００４２】
ＴＨＢＳ１を測定するための希釈について、１：１０００〜１：２００００の範囲内の希釈係数が選択でき、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）については１：１０００〜１：３０００又は１：２０００〜１：３０００の範囲内が好ましく、また、ビーズベースアッセイについては１：５０００〜１：１５０００の範囲内が好ましい。
【００４３】
タンパク質ＣＴＳＤを測定するための希釈について、１：５〜１：７０又は１：５〜１：３０の範囲内の希釈係数が選択でき、酵素結合免疫吸着アッセイについては１：１０〜１：５０又は１：１０〜１：３０の範囲内で、また、ビーズベースアッセイについて１：１０〜１：２０の範囲内が好ましい。好ましくは、使用される上述した緩衝液に、ポリ（オキシエチレン）（２０）−ソルビタンモノラウレートとして好ましくは選択される非イオン性界面活性剤をさらに追加で特別に補い、０．０５％（ｖ／ｖ）のポリ（オキシエチレン）（２０）−ソルビタンモノラウレートの追加的な濃度をもたらす。
【００４４】
ＩＣＡＭ１を測定するための希釈について、１：５０〜１：２００の範囲内の希釈係数が選択でき、１：８０〜１：１５０の範囲内が好ましい。好ましくは、使用される緩衝液に、イオン強度を増すように、２５０ｍＭの追加的な塩化ナトリウム含量になるように塩化ナトリウムをさらに補う。
【００４５】
ＯＬＦＭ４を測定するための希釈について、１：５〜１：３０の範囲内の希釈係数が選択でき、１：５〜１：２０の範囲内が好ましい。好ましくは、使用される緩衝液に、２５０ｍＭの追加的な塩化ナトリウム含量になるように塩化ナトリウム及びジチオトレイトール（ＤＴＴ）として好ましくは選択される還元剤をさらに補い、ジチオトレイトールの５ｍＭの濃度をもたらす。
【００４６】
さらに別の好ましい実施形態によれば、上記方法は、被験者の血清、血漿、又は血液を、好ましくは被験者の血清、血漿、又は血液の希釈後に、それぞれのタンパク質についての少なくとも１つの、好ましくはサンドイッチする２つの親和性試薬に接触させる、それぞれのタンパク質と少なくとも１つ（又は２つ）の親和性試薬との間で結合が起こるかどうかを検出し、それぞれのタンパク質濃度の定量的読出し、又は遊離型ＰＳＡの場合はその割合を使用し、元の血清、血漿、又は血液のそれぞれの濃度／割合の計算を可能にすることによって実施される、第１のステップを含み、このステップにて、好ましくは可視的読出しによるそれぞれのタンパク質に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡを用い、及び／又は好ましくは蛍光読出しによるそれぞれのタンパク質に対するサンドイッチビーズベース抗体アッセイが使用される。
【００４７】
好ましくは可視的読出しによるそれぞれのタンパク質に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡ及び／又は好ましくは蛍光読出しによるそれぞれのタンパク質に対するサンドイッチビーズベース抗体アッセイは、それぞれ、ヒトＴＨＢＳ１、ＣＴＳＤ、ＩＣＡＭ１、及びＯＬＦＭ４の組換えタンパク質、並びに、抗体によるマウスの免疫化によって産生されたマウスモノクロナール抗体を使用することによって得られるアッセイであり得る。
【００４８】
さらに別の好ましい実施形態によれば、それぞれの濃度の定量的検出は、外部タンパク質標準に対するかかるバイオマーカーの濃度の決定を含み、その決定は、サンプルの同じ測定セットにおいて測定されるタンパク質希釈物について、同じ緩衝液にて希釈される幾つかの、好ましくは５〜７のタンパク質標準の規定された濃度を既知の濃度とともに測定することによる参照標準曲線の作成を含む。
【００４９】
本方法は、癌、特に、限局性前立腺癌を含む前立腺癌の、モニタリング、診断、予後診断、リスク評価、治療選択、治療モニタリングのうちの少なくとも１つのステップをさらに含んでもよいし、又は、癌、特に、限局性前立腺癌を含む前立腺癌の、モニタリング、診断、予後診断、リスク評価、治療選択、治療モニタリングのうちの少なくとも１つに関連してさらに利用してもよい。
【００５０】
本発明の更なる実施形態は、従属請求項に記載される。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態は、図面を参照して以下で述べられる。図面は、本発明の現在の好ましい実施形態を示すためのものであって、本発明を限定するためのもではない。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、２ステップサンドイッチイムノアッセイの略図を示し、Ｌｕｍｉｎｅｘシステムの場合、検出は、検出抗体のビオチン（Ｂ）に付着する蛍光ストレプトアビジン−フィコエリスリンコンジュゲート（Ｓｔｒｅｐ−ＰＥ：Streptavidin-phycoerythrin conjugate）による蛍光を使用して実現され、一方、ＥＬＩＳＡの場合、ストレプトアビジン−酵素コンジュゲート及び当該酵素用の色原性基質（chromogenic substrate）、好ましくは、Ｓｔｒｅｐ−ＰＥの代わりのストレプトアビジン−ホースラディッシュペロオキシダーゼ（ＨＲＰ：horseradish peroxidase）コンジュゲート及びＨＲＰ色原性基質ＴＭＢを用いて得られる可視範囲内の色変化を使用して実現される。
【図２】図２は、組合せ式スコア値の評価のために、ＴＨＢＳ１が単独で測定されるとき、総ＰＳＡが単独で測定されるとき、％ｆＰＳＡが単独で測定されるとき、及び、ＴＨＢＳ１の濃度が％ｆＰＳＡの割合と共に使用されるときの事例について、前立腺生検陽性、従って、ＰＣａの個々の予測子の精度を示す最適化された受信者動作特性（ＲＯＣ）の訓練曲線を示す。
【図３】図３は、組合せ式スコア値の評価のために、ＣＴＳＤが単独で測定されるとき、％ｆＰＳＡが単独で測定されるとき、及び、ＣＴＳＤの濃度が％ｆＰＳＡの割合と共に使用されるときの最適化されたＲＯＣ曲線を示す。
【図４】図４は、組合せ式スコア値の評価のために、ＩＣＡＭ１が単独で測定されるとき、％ｆＰＳＡが単独で測定されるとき、及び、ＩＣＡＭ１の濃度が％ｆＰＳＡの割合と共に使用されるときの最適化されたＲＯＣ曲線を示す。
【図５】図５は、組合せ式スコア値の評価のために、ＯＬＦＭ４が単独で測定されるとき、％ｆＰＳＡが単独で測定されるとき、及び、ＯＬＦＭ４の濃度が％ｆＰＳＡの割合と共に使用されるときの最適化されたＲＯＣ曲線を示す。
【図６】図６は、前立腺生検陽性、従って、ＰＣａの個々の予測子の精度を示す受信者動作特性（ＲＯＣ）の訓練曲線を示す。％ｆＰＳＡ単独、ＣＴＳＤ及びＴＨＢＳ１、並びに、％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、及びＴＨＢＳ１の組合せについての最適化されたモデルのＲＯＣ曲線が示されている。
【図７】図７は、前立腺生検陽性、従って、ＰＣａの個々の予測子の精度を示す受信者動作特性（ＲＯＣ）の訓練曲線を示す。％ｆＰＳＡ単独、ＩＣＡＭ１及びＴＨＢＳ１、並びに、％ｆＰＳＡ、ＩＣＡＭ１、及びＴＨＢＳ１の組合せについての最適化されたモデルのＲＯＣ曲線が示されている。
【図８】図８は、前立腺生検陽性、従って、ＰＣａの個々の予測子の精度を示す受信者動作特性（ＲＯＣ）の訓練曲線を示す。％ｆＰＳＡ単独、ＯＬＦＭ４及びＴＨＢＳ１、並びに、％ｆＰＳＡ、ＯＬＦＭ４、及びＴＨＢＳ１の組合せについての最適化されたモデルのＲＯＣ曲線が示されている。
【図９】図９は、前立腺生検陽性、従って、ＰＣａの個々の予測子の精度を示す受信者動作特性（ＲＯＣ）の訓練曲線を示す。％ｆＰＳＡ単独、ＩＣＡＭ１及びＣＴＳＤ、並びに、％ｆＰＳＡ、ＩＣＡＭ１、及びＣＴＳＤの組合せについての最適化されたモデルのＲＯＣ曲線が示されている。
【図１０】図１０は、前立腺生検陽性、従って、ＰＣａの個々の予測子の精度を示す受信者動作特性（ＲＯＣ）訓練曲線を示す図である。％ｆＰＳＡ単独、ＯＬＦＭ４及びＣＴＳＤ、並びに、％ｆＰＳＡ、ＯＬＦＭ４、及びＣＴＳＤの組合せについての最適化されたモデルのＲＯＣ曲線が示される。
【図１１】図１１は、前立腺生検陽性、従って、ＰＣａの個々の予測子の精度を示す受信者動作特性（ＲＯＣ）の訓練曲線を示す。％ｆＰＳＡ単独、ＩＣＡＭ１及びＯＬＦＭ４、並びに、％ｆＰＳＡ、ＩＣＡＭ１、及びＯＬＦＭ４の組合せについての最適化されたモデルのＲＯＣ曲線が示されている。
【図１２】図１２は、９０％感度における生検陰性の減少率を示す。パーセンテージは、％ｆＰＳＡ単独、ＣＴＳＤ及びＴＨＢＳ１、並びに、％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、及びＴＨＢＳ１の組合せについて与えられている。
【図１３】図１３は、前立腺生検陽性、従って、ＰＣａの個々の予測子の精度を示す受信者動作特性（ＲＯＣ）の訓練曲線を示す。％ｆＰＳＡ単独、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、ＩＣＡＭ１、並びに、％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、及びＩＣＡＭ１の組合せについての最適化されたモデルのＲＯＣ曲線が示されている。
【図１４】図１４は、９０％感度における生検陰性の減少率を示す。パーセンテージは、％ｆＰＳＡ単独、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、及びＩＣＡＭ１、並びに、％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、及びＩＣＡＭ１の組合せについて与えられている。
【図１５】図１５は、組合せ式スコア値の評価のために、ＴＨＢＳ１がＥＬＩＳＡを使用して単独で測定されるとき、総ＰＳＡが単独で測定されるとき、％ｆＰＳＡが単独で測定されるとき、及び、ＥＬＩＳＡを使用して測定されるＴＨＢＳ１の濃度が％ｆＰＳＡの割合と共に使用されるときの事例について、前立腺生検陽性、従って、ＰＣａの個々の予測子の精度を示す最適化された受信者動作特性（ＲＯＣ）の訓練曲線を示す。
【図１６】図１６は、組合せ式スコア値の評価のために、ＣＴＳＤがＥＬＩＳＡを使用して単独で測定されるとき、％ｆＰＳＡが単独で測定されるとき、及び、ＥＬＩＳＡを使用して測定されるＣＴＳＤの濃度が％ｆＰＳＡの割合と共に使用されるときの最適化されたＲＯＣ曲線を示す。
【図１７】図１７は、前立腺生検陽性、従って、ＰＣａの個々の予測子の精度を示す受信者動作特性（ＲＯＣ）の訓練曲線を示す。％ｆＰＳＡ単独、共にＥＬＩＳＡを使用して測定されるＣＴＳＤ及びＴＨＢＳ１、並びに、％ｆＰＳＡ、共にＥＬＩＳＡを使用して測定されるＣＴＳＤ及びＴＨＢＳ１の組合せについての最適化されたモデルのＲＯＣ曲線が示されている。
【図１８】図１８は、９０％感度における生検陰性の減少率を示す。パーセンテージは、％ｆＰＳＡ単独、共にＥＬＩＳＡを使用して測定されるＣＴＳＤ及びＴＨＢＳ１、並びに、％ｆＰＳＡ、共にＥＬＩＳＡを使用して測定されるＣＴＳＤ及びＴＨＢＳ１の組合せについて与えられている。
【発明を実施するための形態】
【００５３】
本発明者らは、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ癌経路に焦点を当てた２段階遺伝子誘導発見アプローチ（two staged genetics-guided discovery approach）を使用してＰＣａ診断のための多数のタンパク質バイオマーカーを過去に同定してきた。第１段階において、糖タンパク質は、野生型の血清及び前立腺組織並びにＰｔｅｎ−ヌル癌マウスモデルから同定された。タンパク質の優先順序付けに続いて、プロテオミックプロファイルが、第２段階検証ステップにおいて、ＰＣａ患者及び対照個人の血清において同定された。その目的は、個々のタンパク質バイオマーカーについて高い感度でかつ高い特異度のイムノアッセイを同定し、及び開発し、及び検証することであった。質量分析法からイムノアッセイ技術への移行は、大規模サンプルコホートにおける高スループット臨床検証を可能にするために重要なステップである。さらに、その移行は、ルーチン診断検査室における試験の臨床適用を促進する。マイクロ粒子ベースＬｕｍｉｎｅｘプラットフォームは、マイクロタイタープレート又はマイクロタイターチューブと比較したときの、マイクロ粒子の高い表面積に起因する改善された反応速度（kinetics）の故に最初に選択された。さらに、磁気マイクロ粒子ベースアッセイは、チューブ又はマイクロタイタープレートベースアッセイよりも自動化し易く、従って、ランダムアクセスイムノアッセイ系において広く普及している。最後に、Ｌｕｍｉｎｅｘシステムの多重化能力は、イムノアッセイ開発のために、特に、より一般的で単純でかつよりユーザフレンドリーなＥＬＩＳＡのその後の開発のために抗体選択プロセスを促進した。
【００５４】
このセクションにおいて、医薬品評価研究センター（ＣＤＥＲ：Center for Drug Evaluation and Research）からのガイドラインによる同定、開発、及び技術的検証は、ヒトカテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、ヒト細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、ヒトオルファクトメジン４（ＯＬＦＭ４）、及びヒトトロンボスポンジン１（ＴＨＢＳ１）についての４つの個々のイムノアッセイについて述べられている。これらのヒト糖タンパク質のマウスホモログは、Ｐｔｅｎコンディショナルノックアウトマウスモデルを使用する質量分析法によって過去に同定された。ヒトホモログは、ＰＣａから良性前立腺状態を識別する能力を試験するために、臨床血清サンプルで測定された。その結果、特許請求される組合せが、従来技術のアプローチの上記で述べた欠点を克服するために最適であり、最も高い感度及び最も高い特異度を示すことが確認された。
【００５５】
開発は、分析物の希釈に関してインターバリアビリティ及びイントラバリアビリティ（ＣＶ）＜１５％及びリニアリティを有する複数の個々のイムノアッセイをもたらした。血清中で、ｅｘ  ｖｉｖｏタンパク質安定性（分析物の１５％未満の喪失）は、室温で少なくとも２４時間及び４℃で２日間で達成された。
【００５６】
材料及び方法
本明細書で一般に使用される遺伝子名、エントリー名、タンパク質名（短縮名）、及び受託番号は、ＵｎｉＰｒｏｔコンソーシアム（www.uniprot.org）に従って規定される。ＵｎｉＰｒｏｔコンソーシアムは、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ：European Bioinformatics Institute）、スイスバイオインフォマティクス研究所（ＳＩＢ：Swiss Institute of Bioinformatics）、及びタンパク質情報リソース（ＰＩＲ：Protein Information Resource）からなる。注記される又は予測される細胞局在化は、Emanuelsson O, Brunak S, von Heijne G, Nielsen H. (2007) Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nat Protoc. 2, 953-71による。
【００５７】
【表１】
2019527840.tif 000003
【００５８】
タンパク質標準／キャリブレーター
発現
組換えヒトＣＴＳＤ（残基１〜４１２、６Ｈｉｓタグが続く）、ＩＣＡＭ１（残基１〜４８０、８Ｈｉｓタグが続く）、ＴＨＢＳ１（残基１９から１１７０、シグナルペプチドが先行し、１１Ｈｉｓタグが続く）、及びＯＬＦＭ４（残基１〜５１０）がそれぞれ発現され、トランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清から精製した。ＣＴＳＤ、ＩＣＡＭ１、ＴＨＢＳ１は、Ｈｉｓ  Ｔｒａｐカラム（GE Healthcare）を使用して精製された。
【００５９】
精製
ＩＣＡＭ１の場合、硫酸アンモニウム沈殿を最初に実施した。３５％でのタンパク質沈殿を、遠心分離によって除いた。上清を、清浄なチューブに移し、硫酸アンモニウムを、７５％飽和に達するまで徐々に添加した。遠心分離後、上清を削除し、ペレットを、Ｈｉｓ  Ｔｒａｐカラム上で精製するために緩衝液中に溶解した。
【００６０】
ＯＬＦＭ４は、３０％の硫酸アンモニウム沈殿によって精製した。
【００６１】
ヒト血小板から精製された天然のＴＨＢＳ１を、Creative Biomartから購入し、免疫化のために使用した。組換えＴＨＢＳ１タンパク質は、R&D Systemsから最初に購入し、後に発現され、トランスフェクションされた自家製ＨＥＫ２９３細胞の細胞培養上清から精製した。
【００６２】
抗体
捕捉抗体及び検出抗体は、それぞれ、ヒトＣＴＳＤ、ＩＣＡＭ１、ＯＬＦＭ４、及び天然のＴＨＢＳ１の組換えタンパク質を用いたＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化によって生成されたマウスモノクロナール抗体であった。それぞれのタンパク質の異なるエピトープを認識する多数の抗体は、単離され、抗体対が、それぞれ、サンドイッチビーズベースイムノアッセイ及びＥＬＩＳＡイムノアッセイのその後の開発及び最適化のために選択された。
【００６３】
使用されるマイクロ粒子ベースＬｕｍｉｎｅｘ技術は、新しく開発されるイムノアッセイのために抗体を選択する汎用性の高いプラットフォームを提供した。多重化技術は、幾つかの捕捉抗体候補を異なる微小球セットに結合させることによって、抗体サンドイッチ対の同定を促進した。これらのセットは、一緒に混合されると、別個の検出抗体の同時試験を可能にし、試薬、サンプル、及び時間を節約することを可能にした（例えば、Baker HN, Murphy R, Lopez E, Garcia C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. J Vis Exp. 2012参照）。好適な抗体対が選択されると、緩衝液組成及び抗体濃度が、個々のイムノアッセイについて最適な条件（シグナル対バックグラウンド比、希釈リニアリティ、標準曲線のダイナミックレンジ、アッセイ感度）をもたらすために相応して最適化された。
【００６４】
ビーズベースイムノアッセイ
ビーズベースサンドイッチイムノアッセイは、次の通りにＬｕｍｉｎｅｘシステム上で確立された。捕捉抗体は、カルボキシル化されたＬｕｍｉｎｅｘマイクロ粒子に共有結合され、検出抗体は、標準法に従ってビオチン（Ｂ）で標識された。９６ウェルハーフエリアマイクロタイタープレート（Corning Inc.）は、ＥＬＩＳＡ用の１×ブロッキング剤（Roche Diagnostics）を用いて最低１５分間、ブロッキングされた。捕捉抗体でコーティング済みのマイクロ粒子とビオチン化済みの検出抗体との適切な濃度の混合物が、調製され、９６ウェルプレート中のアッセイ緩衝液にて希釈されたタンパク質（サンプル又は標準）に添加された。アッセイに依存するＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ  Ｃ中での２１℃又は３７℃での６０分又は１２０分のインキュベーション及び６５０ｒｐｍでの振盪に続いて、プレートは、磁気プレートセパレーター（Luminex Corporation）を使用してＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて洗浄された。アッセイ緩衝液にて希釈されたストレプトアビジン−フィコエリスリンコンジュゲート（Ｓｔｒｅｐ−ＰＥ、Moss Inc.）が添加され、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ  Ｃ中で、３０分間、２１℃で、６５０ｒｐｍでインキュベートされた。洗浄後、ビーズコンジュゲートは、ブロッキング剤中で再懸濁された。読出しは、４パラメーター曲線当てはめ（curve fit）を使用して濃度を計算するために同様に使用されたｘＰＯＮＥＮＴ４．１又は４．２ソフトウェアによって操作されるＬｕｍｉｎｅｘ  ＦｌｅｘＭａｐ３Ｄ又はＬｕｍｉｎｅｘ  ＭＡＧＰＩＸ機器を用いて実施された。全てのサンプルは、同じプレート上での独立した２重測定（duplicates）で測定された。規定されたタンパク質濃度を有する品質管理サンプルは、それぞれのプレート上に含まれた。
【００６５】
抗体の種々のエピトープについて、それぞれの捕捉抗体ビーズ及びビオチン化済み検出抗体が、生成され、試験され、捕捉抗体と検出抗体の最適対が、最適読出し強度に基づいて実験的に決定された（図１も参照）。
【００６６】
酵素結合免疫吸着アッセイ
サンドイッチＥＬＩＳＡは次の通りに確立された。上記章に記載されたビーズベースイムノアッセイを使用して決定され選択された捕捉抗体は、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０（代替法：５０ｍＭ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６）にて希釈され、４℃で一晩（代替法：３０℃で７５分間又は室温で１時間〜６時間の間）９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Nunc）にコーティングされた。溶液を取除き、ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で一回洗浄した後、プレートは、１．５時間の間、ＢＳＡブロック（Candor Bioscience）（代替法：１％ＢＳＡを有するＰＢＳ）でブロッキングされた。プレートは、その後、３回洗浄された。標準又は血清サンプルは、Ｌｏｗ  Ｃｒｏｓｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＬＣＢ；Candor Bioscience）（代替法：ＰＢＳベース又は１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．９％塩化ナトリウムベース緩衝液、共に、１％ＢＳＡ、０．１％ウシγグロブリン、０．１％マウスＩｇＧが補われた）にて希釈され、ＬＣＢ緩衝液にて希釈された上記章に記載されたビーズベースイムノアッセイを使用して決定され選択された等容積のビオチン化された検出抗体とウェル中で混合された。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ  Ｃ中での３７℃での６０分のインキュベーション及び６５０ｒｐｍでの振盪に続いて、プレートは、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて３回洗浄された。ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（Jackson ImmuneResearch）は、ＬＣＢ（代替法：等容積のＰＢＳにて希釈されたＢＳＡブロック）にて希釈され、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ  Ｃ中に添加され、３７℃で３０分間インキュベートし、６５０ｒｐｍで振盪した。ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて３回洗浄した後、ＴＭＢ基質（Sigma）溶液（３０ｍＭクエン酸、ｐＨ４．１中で、Ｈ２Ｏ２を用いて希釈された）（代替法：ＴＭＢ、すぐに使用できるＥｎｈａｎｃｅｄ  Ｋ−Ｂｌｕｅ  ＴＭＢ基質、Neogen）を添加し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒ  Ｃ中で、３７℃で３０分間インキュベートし、６５０ｒｐｍで振盪した。反応を、等容積の０．２５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４（代替法：１．０Ｍ  ＨＣｌ）の添加によってブロッキングした。吸光度は、４５０ｎｍで読取り、６２０ｎｍの読みを減算するＦＬＵＯＳｔａｒｔ  Ｏｐｔｉｍａ  ＥＬＩＳＡリーダー（BMG LabTech）で測定した。濃度は、ＦＬＵＯsｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡソフトウェア又はＴｅｃａｎからのＭａｇｅｌｌａｎを用いて５パラメーター曲線当てはめ（代替法：４パラメーター曲線当てはめを使用する）を使用して計算した。
【００６７】
ＰＳＡ測定
血清総ＰＳＡ（ｔＰＳＡ）及び遊離型ＰＳＡ（ｆＰＳＡ）は、ＡＤＶＩＡ  Ｃｅｎｔａｕｒイムノアッセイシステム（Siemens Healthcare）を使用して分析された。遊離型ＰＳＡのパーセント（％ｆＰＳＡ）は、下記式％ｆＰＳＡ＝ｆＰＳＡ／ｔＰＳＡを用いて、ｔＰＳＡ及びｆＰＳＡの測定値を使用して計算された。代替的に、総ＰＳＡ（ｔＰＳＡ）及び複合型ＰＳＡ（ｃＰＳＡ）が測定され、遊離型ＰＳＡの割合は、次の通りに計算することができる。％ｆＰＳＡ＝（ｔＰＳＡ−ｃＰＳＡ）／ｔＰＳＡ。割合ｆＰＳＡ／ｔＰＳＡは評価のために使用した。
【００６８】
特異的ビーズベースアッセイ
ＴＨＢＳ１アッセイの場合、サンプル血清（１：１００００の最終希釈の）又は組換え標準は、３７℃で６０分間、Ｌｏｗ  Ｃｒｏｓｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Candor Bioscience）（ＬＣＢ、ｐＨ７．２）中で捕捉抗体コーティング済みマイクロ粒子及びビオチン化済み検出抗体と共にインキュベートした。全てのサンプルは、アッセイのリニアな検出範囲内で定量したところ、測定された濃度（それぞれのサンプルについてＣＶ＜２０％、５．１％の１つのプレート上のサンプルについての平均ＣＶ）は１４．２μｇ／ｍＬと２０９μｇ／ｍＬとの間の範囲であった。
【００６９】
ＴＨＢＳ１アッセイの希釈の場合、下記の系：ＬＣＢ、ｐＨ７．２を使用した。
【００７０】
ＣＴＳＤアッセイの場合、サンプル血清（１：１５の最終希釈の）又は組換え標準を、３７℃で１２０分間、ＬＣＢ（ｐＨ７．２）＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ中で捕捉抗体コーティング済みマイクロ粒子及びビオチン化済み検出抗体と共にインキュベートされた。全てのサンプルは、アッセイのリニアな検出範囲内で定量したところ、測定された濃度（それぞれのサンプルについてＣＶ＜２０％、２．８％の１つのプレート上のサンプルについての平均ＣＶ）は４０ｎｇ／ｍＬと４５３ｎｇ／ｍＬとの間の範囲であった。
【００７１】
ＣＴＳＤアッセイの希釈の場合、下記の系：ＬＣＢ（ｐＨ７．２）＋０．０５％Ｔｗｅｅｎを使用した。
【００７２】
ＩＣＡＭ１アッセイの場合、サンプル血清（１：１００の最終希釈の）又は組換え標準を、３７℃で６０分間、ＬＣＢ（ｐＨ７．２）＋２５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で捕捉抗体コーティング済みマイクロ粒子及びビオチン化済み検出抗体と共にインキュベートした。全てのサンプルを、アッセイのリニアな検出範囲内で定量したところ、測定された濃度（それぞれのサンプルについてＣＶ＜１５％、２．２％の１つのプレート上のサンプルについての平均ＣＶ）は４４ｎｇ／ｍＬと２８７ｎｇ／ｍＬとの間の範囲であった。
【００７３】
ＩＣＡＭ１アッセイの希釈の場合、下記の系：ＬＣＢ（ｐＨ７．２）＋２５０ｍＭ  ＮａＣｌを使用した。
【００７４】
ＯＬＦＭ４アッセイの場合、サンプル血清（１：１０の最終希釈の）又は組換え標準を、３７℃で６０分間、ＬＣＢ（ｐＨ７．２）＋２５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋５ｍＭ  ＤＴＴ中で捕捉抗体コーティング済みマイクロ粒子及びビオチン化済み検出抗体と共にインキュベートした。３つを除いた全てのサンプルを、アッセイのリニアな検出範囲内で定量したところ、測定された濃度（それぞれのサンプルについてＣＶ＜１５％、５．５％の１つのプレート上のサンプルについての平均ＣＶ）は１ｎｇ／ｍＬと２９１ｎｇ／ｍＬとの間の範囲であった。
【００７５】
ＯＬＦＭ４アッセイの希釈の場合、下記の系：ＬＣＢ（ｐＨ７．２）＋２５０ｍＭ  ＮａＣｌ＋５ｍＭ  ＤＴＴを使用した。
【００７６】
定量的読出しを可能にするための濃度較正のために、それぞれのタンパク質の標準溶液を、以下の手順で使用した：
タンパク質バイオマーカーの測定は、外部タンパク質標準に対する当該バイオマーカーの濃度の定量を意味する。即ち、参照標準曲線は、同じサンプルの測定セット中で、アッセイ緩衝液にて希釈された５〜７のタンパク質標準の規定された濃度を測定することによって作成される。
【００７７】
個々の標準の以下の濃度が、ビーズベースアッセイのために使用された：
・ＴＨＢＳ１（ｎｇ／ｍＬ）：５０．００、２０．００、８．００、３．２０、１．２８、０．５１、０．２０
・ＣＴＳＤ（ｎｇ／ｍＬ）：７５．０、２．０、８．３３、２．７８、０．９３、０．３１、０．１０
・ＩＣＡＭ１（ｎｇ／ｍＬ）：１２．６、５．０４、２．０２、０．８１、０．３２、０．１３、０．０５
・ＯＬＦＭ４（ｎｇ／ｍＬ）：１２０、３４．２９、９．７９、２．７９、０．８０、０．２３、０．０７
【００７８】
個々の標準の以下の濃度が、ＥＬＩＳＡアッセイのために使用された：
・ＴＨＢＳ１（ｎｇ／ｍＬ）：２００又は２５０，１００，５０又は４０，  ２５又は１６，１２．５０又は６．４，６．２５又は２．６，３．１２５又は１．０
・ＣＴＳＤ（ｎｇ／ｍＬ）：１５．００，１０．００，６．２５又は６．７，  ３．９１又は４．４，２．４４又は３．０，１．５３又は２．０，０．９５又は１．３
【００７９】
標準曲線は、より高度な多項式曲線当てはめを可能にするコンピュータプログラムを使用して計算した。血清サンプルは、それらの測定値が標準によってカバーされる範囲内に入るようにアッセイ緩衝液にて希釈した。それらの濃度は、血清サンプルの濃度を決定するための、希釈係数で乗算して、標準の曲線に基づいて計算した。
【００８０】
特異的酵素結合免疫吸着アッセイ
サンプル血清を、ＴＨＢＳ１アッセイについては１：２５００の最終希釈で、ＣＴＳＤアッセイについては１：２０の最終希釈で測定した。同様に、ＣＴＳＤについては１：５０の希釈を用いた測定が可能である。
【００８１】
結果
最も低い測定費用で最も高い感度と最も高い特異度を可能にする最適測定戦略を決定するために、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、トロンボスポンジン１（ＴＨＢＳ１）、オルファクトメジン４（ＯＬＦＭ４）、及び細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）を含む複数の癌特異的タンパク質を個々に及び種々の組合せで測定する試験が提案される。試験結果は、％ｆＰＳＡ割合（ｆＰＳＡとｔＰＳＡとの比）をさらに含む。組合せ式スコアは、上記で述べた式（１）を使用して計算され、式（１）は、％ｆＰＳＡと、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、及びＩＣＡＭ１のそれぞれの系との数学的組合せ、並びに、％ｆＰＳＡと、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、及びＩＣＡＭ１の対の系との考えられる全ての組合せから得られる。同様に、％ｆＰＳＡは、ＣＴＳＤ及びＴＨＢＳ１、オプションで、ＯＬＦＭ４及びＩＣＡＭ１を用いて見られる。試験は、ＰＣａ診断の改善における、％ｆＰＳＡ等の確立された臨床パラメーターに対してその付加価値を示す検証研究において評価した。
【００８２】
目的：研究の目的は、提案されたタンパク質バイオマーカーのどの組合せが、高いｔＰＳＡ（２ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ）を有する男性の生検陰性の数を、最も効率的にかつ最も確実に減らすことができるかを試験することであった。さらに、研究に含まれる男性は、陰性（癌の存在についての疑いの欠如）デジタル直腸検査（ＤＲＥ）及び増大した前立腺を有していた。この患者のサブグループは、多くの男性が良性状態を有し、その範囲内でのｔＰＳＡ値の増加をもたらし、多数の偽陽性事例をもたらすため、前立腺生検を実施されるべきかどうかを決めることが最も難しいと考えらる。研究のゴールは、ＰＣａについて少なくとも９０％感度及び高悪性度ＰＣａ（グリーソンスコア（Gleason score）≧７）について高い（９０〜９５％）陰性予測値（ＮＰＶ：negative predictive value）を有しながら、生検陰性の数を少なくとも５０％減らすことであった。ＮＰＶは、陰性結果が真に陰性であるという確率を示す泌尿器科医にとって重要な尺度である。
【００８３】
設計、設定、及び参加者：前立腺生検を受けた、ｔＰＳＡ  ２ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ癌陰性ＤＲＥ及び増大した前立腺（容積≧３５ｍｌ）を有する男性の後方視的研究（retrospective study）を行った。前立腺癌陽性及び陰性の男性の全血サンプルを、北欧の主要な癌センターにて前立腺生検を受ける前に収集した。全てのサンプルは、書面による患者同意に従って２０１１年〜２０１６年の間に採取した。
【００８４】
測定：血清ｔＰＳＡ及びｆＰＳＡは、ＡＤＶＩＡ  Ｃｅｎｔａｕｒイムノアッセイシステム（Siemens Healthcare）を使用して全てのサンプルについて分析された。ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、及びＩＣＡＭ１の濃度レベルは、上記で詳述した、開発されたビーズベースイムノアッセイを使用して測定された。さらに、ＣＴＳＤ及びＴＨＢＳ１の濃度レベルは、開発されたＥＬＩＳＡイムノアッセイを使用して測定された。
【００８５】
結果：この研究に含まれた４７４名の男性の中で、２３６名の男性は生検陰性を有し、２３８名は、生検に基づいてＰＣａを有すると診断された。これらの中で、１３０名は、前立腺生検に従って、低悪性度ＰＣａ（グリーソンスコア≦６）を有し、１０６名は高悪性度ＰＣａ（グリーソンスコア≧７）を有していた。サンプルの測定された濃度／割合の値を、曲線下最大面積についてロジスティック回帰式を最適化する組合せ式スコア値についての上記で述べた式を使用して本研究に含まれる男性の実際の生検結果との最適な相関は、最適な感度及び特異度を決定するために使用した。
【００８６】
図２〜図１１、図１３、及び図１５〜図１７に示すＲＯＣ曲線は、訓練曲線、即ち、％ｆＰＳＡの測定された割合及びタンパク質のそれぞれの濃度を、前立腺生検に基づく真の診断に最適に相関させるモデルの最適化後に得られる曲線である。
【００８７】
ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、及びＩＣＡＭ１についての個々のモデル
第１のステップにて、分析される４つのタンパク質が、個々に調査され、最適化された組合せ式スコア値が、それぞれのタンパク質について単独及び％ｆＰＳＡとの組合せで決定された。
【００８８】
図２〜図５は、組合せ式スコア値の評価のために、ＴＨＢＳ１、ＣＴＳＤ、ＩＣＡＭ１、及びＯＬＦＭ４のグループのそれぞれのタンパク質が単独で測定されるとき、％ｆＰＳＡが単独で測定されるとき、及び、それぞれのタンパク質の濃度が％ｆＰＳＡの割合と共に使用されるときの事例について、前立腺生検陽性、従って、ＰＣａの個々の予測子の精度を示す最適化された受信者動作特性（ＲＯＣ）訓練曲線を示す。
【００８９】
図１５及び図１６は、組合せ式スコア値の評価のために、ＴＨＢＳ１及びＣＴＳＤがＥＬＩＳＡを使用して単独で測定されるとき、％ｆＰＳＡが単独で測定されるとき、及び、ＥＬＩＳＡによって測定されるそれぞれのタンパク質の濃度が％ｆＰＳＡの割合と共に使用されるときの事例について、前立腺生検陽性、従って、ＰＣａの個々の予測子の精度を示す最適化されたＲＯＣ訓練曲線を示す。
【００９０】
ＲＯＣ曲線からわかるように、間違いなく（by far）、最良の感度及び特異度が、ＴＨＢＳ１によって利用可能になる。ＴＨＢＳ１は、何らかの指示値を有することがこれまで知られていたが、こうした強くかつ信頼性のある相関子であることはこれまで同定されてこなかった。同様に認識され得ることは、個々に調査されるＣＴＳＤ、ＩＣＡＭ１、及びＯＬＦＭ４が、％ｆＰＳＡ単独と比較すると、ほとんど何も利益を与えないことである。特に、ＣＴＳＤが、本質的に無相関であり、個々に又は％ｆＰＳＡと組合せて見てみると、診断価値を全く持たないように見える。
【００９１】
総ＰＳＡ濃度値は、総ＰＳＡが高感度であるため、ＰＣａの陰性予測のために従来使用される。しかし、図２からわかるように、総ＰＳＡ濃度値は、総ＰＳＡが低特異度であるため、陽性予測のために全く役立たない。実際のところ、％ｆＰＳＡ値が使用される場合にのみ、合理的なＡＵＣ値を得ることができ、さらに、％ｆＰＳＡ値がＴＨＢＳ１と組合せて使用される場合にのみ、高感度が得られ得る。同様に、総ＰＳＡ値がＴＨＢＳ１と組合せて評価される場合、５０％より著しく低い９０％感度における特異度のみが得られ、ＡＵＣ値は０．８３より著しく小さい。
【００９２】
％ｆＰＳＡと組合せた、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、及びＩＣＡＭ１から選択される対についてのモデル
第２のステップにて、分析される４つのタンパク質が、対で調査され、最適化された組合せ式スコア値が、それぞれのタンパク質対について単独で及び％ｆＰＳＡと組合せて決定された。
【００９３】
図６〜図１１は、組合せ式スコア値の評価のために、ＴＨＢＳ１、ＣＴＳＤ、ＩＣＡＭ１、及びＯＬＦＭ４のグループのタンパク質の考えられる全てのペアが単独で測定されるとき、％ｆＰＳＡが単独で測定されるとき、及び、それぞれのタンパク質の対合の濃度が％ｆＰＳＡの割合と共に使用されるときの事例について、前立腺生検陽性、従って、ＰＣａの個々の予測子の精度を示す最適化された受信者動作特性（ＲＯＣ）訓練曲線を示す。
【００９４】
ＲＯＣ曲線からわかるように、間違いなく、最良の感度及び特異度が、ＣＴＳＤと組合せたＴＨＢＳ１によって利用可能にされ、それは、ＣＴＳＤ単独では識別を全く与えないので（図３参照）、非常に驚くべきことである。これは、ＥＬＩＳＡを使用してＴＨＢＳ１及びＣＴＳＤを測定するときに確認された（図１７参照）。同様に、ＴＨＢＳ１は、ＩＣＡＭ１及びＯＬＦＭ４と共に、ＣＴＳＤと組合せたＴＨＢＳ１と同じ程度ではないが、或る程度の更なる利益をもたらし、それは、ＣＴＳＤ単独（図３参照）と比較して、単独で採用されるＩＣＡＭ１及びＯＬＦＭ４（図４及び図５参照）の優れた挙動を考慮すると完全に予想外である。これまで知られていなかった、血液、血清、及び血漿中のＴＨＢＳ１レベルとＣＴＳＤレベルとの間の高い相関の程度があるように思われる。
【００９５】
対照的に、ＴＨＢＳ１を含まないペアは、図９〜図１１からわかるように、更なる利益を全く与えない。これは、同様に予想外である。その理由は、同様にこれらの事例において、ＲＯＣ分析における更なる利益をもたらす高い相関が存在している可能性があったからである。しかし、そのような利益は、試験されたコホートに関して同定することができなかった。
【００９６】
特異的モデル：％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１
図６は、このアプローチについての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。％ｆＰＳＡはＡＵＣ＝０．６４９８（Ｐ＜０．００１；９５％ＣＩ＝０．６００４〜０．６９９２）をもたらした。ＣＴＳＤ及びＴＨＢＳ１は共に、前立腺生検陰性の男性と前立腺生検陽性陽性の男性とを識別し、ＡＵＣ＝０．８３４３（Ｐ＜０．００１；９５％ＣＩ＝０．７９７４〜０．８７１２）であった。％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１の組合せは、ＡＵＣ＝０．８４４８（Ｐ＜０．００１；９５％ＣＩ＝０．８０９７〜０．８７９８）をもたらした。これらの結果は、ＥＬＩＳＡを使用してＴＨＢＳ１及びＣＴＳＤを測定することで確認された（図１７参照）。ＣＴＳＤ及びＴＨＢＳ１は共に、前立腺生検陰性の男性と前立腺生検陽性陽性の男性とを識別し、ＡＵＣ＝０．８３７６（Ｐ＜０．００１；９５％ＣＩ＝０．８０１０〜０．８７４２）であった。％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１の組合せは、ＡＵＣ＝０．８５０８（Ｐ＜０．００１；９５％ＣＩ＝０．８１６１〜０．８８５５）をもたらした。前立腺生検陽性、従って、ＰＣａについての９０％以上の感度において、％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、及びＴＨＢＳ１の組合せの特異度は６０％であった。比較すると、臨床診療において一般に使用される％ｆＰＳＡ試験は、同じ感度において２１％の特異度を有していた。これは、％ｆＰＳＡと組合せたＣＴＳＤ及びＴＨＢＳ１が、２３６名のうちの１４１名（６０％）の生検陰性を回避し、ＰＣａの１０％の診断を遅延させたであろうことを示す（図１２）。さらに、高悪性度ＰＣａ（グリーソンスコア≧７）について９４％の高いＮＰＶが達成された。これらの結果は、％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、及びＴＨＢＳ１の組合せが有意の改善をもたらすことを示す。
【００９７】
図１２は、前立腺生検陽性、従って、ＰＣａについての９０％感度における生検陰性の減少率を示す。パーセンテージは、％ｆＰＳＡ単独、ＣＴＳＤ及びＴＨＢＳ１、並びに、％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、及びＴＨＢＳ１の組合せについて与えられる。これらの結果は、ＥＬＩＳＡを使用してＴＨＢＳ１及びＣＴＳＤを測定することで確認された（図１８参照）。
【００９８】
他の事例の場合と同様にこのモデルにおいて、それぞれ、％ｆＰＳＡ単独、ＣＴＳＤ及びＴＨＢＳ１、並びに、％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、及びＴＨＢＳ１の組合せの測定濃度に基づいて、それぞれの事例において、組合せ式スコア値は、最適化後に得られた定数を有する上記で述べた式（１）を使用して計算される：
【００９９】
ロジスティック回帰式：
これら全ての結果において使用されるロジスティック回帰モデルは、式（１）において使用される係数の推定値を提供する：
【数２】
2019527840.tif 000004
ここで、βＳは回帰係数であり、β０は切片であり、ｘｉは整合独立変数の値である。結果（ｐｉ）は、独立変数の値の所与のパターンを有する観測が事象を有する確率である。
【０１００】
これらのｐｉはＲＯＣ曲線を構築するために使用されるスコアである。  
【０１０１】
特定のモデル：％ｆＰＳＡ、ＴＨＢＳ１の状況についてのこの式における変数は次の通りである：
【表２】
2019527840.tif 000005
【０１０２】
ＴＨＢＳ１の濃度及び％ｆＰＳＡ割合が第１のステップにて測定される状況の場合の、組合せ式スコア値の計算について、回帰係数は次の通りである：
β０＝４．６６３；βＴＨＢＳ１＝−０．００００５３；β％ｆＰＳＡ＝−５．３８１。
【０１０３】
９０％感度で、０．３１６より大きい組合せ式スコア値の閾値が与えられる。
【０１０４】
特異的モデル：％ｆＰＳＡ、ＴＨＢＳ１（ＴＨＢＳ１はＥＬＩＳＡを使用して測定される）の状況についてのこの式における変数は次の通りである：
【表３】
2019527840.tif 000006
【０１０５】
ＴＨＢＳ１の濃度（ＥＬＩＳＡを使用する）及び％ｆＰＳＡ割合が第１のステップにて測定される状況の場合の、組合せ式スコア値の計算について、回帰係数は次の通りである：
β０＝４．９０２；βＴＨＢＳ１＝−０．００００８６；β％ｆＰＳＡ＝−５．１４６。
【０１０６】
９０％感度で、０．３３５より大きい組合せ式スコア値の閾値が与えられる。
【０１０７】
特異的モデル：％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１の状況についてのこの式の変数は次の通りである：
【表４】
2019527840.tif 000007
【０１０８】
９０％感度で、０．３３０より大きい組合せ式スコア値の閾値が与えられる。
【０１０９】
そのため、例えば、以下の濃度／割合が特定のサンプルにおいて測定／決定されるとき：
【表５】
2019527840.tif 000008
以下が評価される：
【数３】
2019527840.tif 000009
【０１１０】
前立腺生検陽性、従って、ＰＣａについての９０％感度で、組合せ式スコア値ｐｉの閾値は０．３３０であるため、サンプルＨＨ０１０６について、対応する濃度値が、前立腺生検陽性、従って、ＰＣａの存在を示さないため、前立腺生検は提案されないことになる。
【０１１１】
特異的モデル：ＣＴＳＤ及びＴＨＢＳ１がＥＬＩＳＡを用いて測定される％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１の状況についてのこの式の変数は次の通りである：
【表６】
2019527840.tif 000010
【０１１２】
９０％感度で、０．３６２より大きい組合せ式スコア値の閾値が与えられる。
【０１１３】
ＴＨＢＳ１の濃度、遊離型ＰＳＡの割合（％ｆＰＳＡ）、及びＯＬＦＭ４の濃度が第１のステップにて測定される状況の場合、組合せ式スコア値の計算について、回帰係数は次の通りである：
β０＝４．６０６；βＯＬＦＭ４＝０．００２７１；βＴＨＢＳ１＝−０．００００５４；β％ｆＰＳＡ＝−５．４２３。
【０１１４】
９０％感度で、０．３２３より大きい組合せ式スコア値の閾値が与えられる。
【０１１５】
ＴＨＢＳ１の濃度、遊離型ＰＳＡの割合（％ｆＰＳＡ）、及びＩＣＡＭ１の濃度が第１のステップにて測定される状況の場合、組合せ式スコア値の計算について、回帰係数は次の通りである：
β０＝４．７６９；βＩＣＡＭ１＝−０．０００８４；βＴＨＢＳ１＝−０．００００５３；β％ｆＰＳＡ＝−５．３９５。
【０１１６】
９０％感度で、０．３１８より大きい組合せ式スコア値の閾値が与えられる。
【０１１７】
モデル：％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、ＩＣＡＭ１
図１３は、このアプローチについての受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。％ｆＰＳＡはＡＵＣ＝０．６４９８（Ｐ＜０．００１；９５％ＣＩ＝０．６００４〜０．６９９２）をもたらした。ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、及びＩＣＡＭ１は共に、前立腺生検陰性の男性と前立腺生検陽性陽性の男性を識別し、ＡＵＣ＝０．８３４５（Ｐ＜０．００１；９５％ＣＩ＝０．７９７８〜０．８７１３）であった。％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、及びＩＣＡＭ１の組合せは、ＡＵＣ＝０．８４６３（Ｐ＜０．００１；９５％ＣＩ＝０．８１２２〜０．８８１７）をもたらした。
【０１１８】
図１３は、前立腺生検陽性、従って、ＰＣａの個々の予測子の精度を示す受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。％ｆＰＳＡ単独、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、ＩＣＡＭ１、並びに、％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、及びＩＣＡＭ１の組合せについてのＲＯＣ曲線が示される。
【０１１９】
前立腺生検陽性、従って、ＰＣａについての９０％以上の感度において、％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、及びＩＣＡＭ１の組合せの特異度は５８％であった。比較すると、臨床診療において一般に使用される％ｆＰＳＡ試験は、同じ感度において２１％の特異度を有した。これは、％ｆＰＳＡと組合せたマーカーの提案されるセットが、２３６名のうちの１３６名（５８％）の生検陰性を回避し、ＰＣａの１０％の診断を遅延させたであろうことを示す（図１３）。さらに、高悪性度ＰＣａ（グリーソンスコア≧７）について９３％の高いＮＰＶが達成された。これらの結果は、％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、及びＩＣＡＭ１の組合せが、％ｆＰＳＡ単独に対する有意の改善をもたらすが、％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１に対して更なる有意な改善をもたらさないことを示す。
【０１２０】
図１４は、９０％感度における生検陰性の減少率を示す。パーセンテージは、％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、及びＩＣＡＭ１、並びに、％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、及びＩＣＡＭ１の組合せについて与えられる。
【０１２１】
同様にここで、図１３に示すＲＯＣ曲線は、訓練曲線、即ち測定濃度を、生検に基づく真の診断に、最適に相関させるモデルの最適化後に得られる曲線である。
【０１２２】
同様に、このモデルにおいて、それぞれの事例において、それぞれ、％ｆＰＳＡ単独、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、及びＩＣＡＭ１、並びに、％ｆＰＳＡ、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、ＯＬＦＭ４、及びＩＣＡＭ１の組合せの測定濃度に基づいて、識別子（discriminator）は、最適化後に得られる定数を有する以下の式を使用して計算される：
β０＝３．５６７；βＯＬＦＭ４＝０．００２；βＴＨＢＳ１＝−０．００００６３；βＣＴＳＤ＝０．０１；βＩＣＡＭ１＝−０．００３；β％ｆＰＳＡ＝−５．０３３。
【０１２３】
９０％感度で、０．３２９より大きい組合せ式スコア値の閾値が与えられる。
【０１２４】
ｐについての式によって、これは以下を意味する：
【数４】
2019527840.tif 000011
カットオフｐｉ＝９０％感度＝０．３２９（０．３２９超＝陽性）。
【０１２５】
結論
予想外に、ＴＨＢＳ１及び％ｆＰＳＡの組合せ、さらに、ＣＴＳＤ、ＴＨＢＳ１、及び％ｆＰＳＡの組合せが、高いｔＰＳＡ（２ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ）、増大した前立腺（≧３５ｍｌ）、及び陰性ＤＲＥを有する男性におけるＰＣａの非存在を判定するときに、ｔＰＳＡ又は％ｆＰＳＡ単独より有意に正確である。臨床診療におけるこれらの３つのパラメーターを含む試験の実施は、不必要な生検率を最大６０％だけ大幅に下げる可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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