(57)【要約】  抗デルタ様リガンド３（ＤＬＬ３）抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を使用して、神経内分泌に移行するリスクのある腫瘍を処置する方法が提供される。
2019516705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において神経内分泌表現型に移行するリスクのある腺癌を治療する方法であって、前記方法は、対象に、治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）又はその薬学的に許容される塩を投与するステップを含み、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が、式Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎを含み、
Ｍは、抗ＤＬＬ３抗体を含み、
Ｌは、任意選択のリンカーを含み、
Ｄは、細胞毒性剤を含み、
ｎは、１〜２０の整数である、方法。
【請求項２】
対象において神経内分泌表現型に移行するリスクのある腺癌の再発を低減又は阻害する方法であって、前記方法は、対象に、治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）又はその薬学的に許容される塩を投与するステップを含み、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が、式Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎを含み、
Ｍは、抗ＤＬＬ３抗体を含み、
Ｌは、任意選択のリンカーを含み、
Ｄは、細胞毒性剤を含み、
ｎは、１〜２０の整数である、方法。
【請求項３】
腺癌がＡＳＣＬ１＋細胞を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
腺癌が、対照試料と比べて、網膜芽細胞腫１（ＲＢ１）、リプレッサー要素１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、ＳＡＭポインテッドドメイン含有Ｅｔｓ転写因子（ＳＰＤＥＦ）、プロスタグランジンＥ２受容体４（ＰＴＧＥＲ４）及びＥＴＳ関連遺伝子（ＥＲＧ）のうちの１又は複数の発現低下を示す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
腺癌が、対照試料と比較すると、父親性発現１０（ＰＥＧ１０）の発現の増加を示す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
腺癌が、再発性、不応性、再燃性又は抵抗性である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
対象が標的治療を受けた、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
対象が、腫瘍減量手法を以前に受けた、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
腺癌が、肺、前立腺、泌尿生殖路、胃腸管、甲状腺又は腎臓に起こる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
腺癌が前立腺がんを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前立腺がんが去勢抵抗性前立腺がんを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
腺癌がアンドロゲン遮断療法に抵抗性である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
腺癌が肺がんを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
肺がんが非小細胞肺がんを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
腺癌が、活性化しているＥＧＦＲ変異を有すると特徴づけられる、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
腺癌が、ＥＧＦＲ阻害剤治療法に抵抗性である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
腺癌がＤＬＬ３−／ｌｏｗである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
抗ＤＬＬ３抗体が、モノクローナル抗体、霊長類化抗体、多重特異的抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、ダイアボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片及びＳｃＦｖ断片；又はこれらの免疫反応性断片からなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
抗ＤＬＬ３抗体が、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体及びヒト化抗体からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
抗ＤＬＬ３抗体が、配列番号１又は２に示されるＤＬＬ３タンパク質のＤＳＬドメイン内のエピトープに特異的に結合する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
抗ＤＬＬ３抗体が、配列番号１４９として示される軽鎖可変領域及び配列番号１５１として示される重鎖可変領域を含む抗体、又はヒトＤＬＬ３タンパク質との結合について上記抗体と競合する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
抗ＤＬＬ３抗体が、配列番号１４９として示される軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域、及び配列番号１５１として示される重鎖可変領域の３つの相補性決定領域を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
抗ＤＬＬ３抗体が、ＣＤＲ−Ｌ１について、配列番号１４９の残基２４〜３４、ＣＤＲ−Ｌ２の場合、配列番号１４９の残基５０〜５６、ＣＤＲ−Ｌ３について、配列番号１４９の残基８９〜９７、ＣＤＲ−Ｈ１について、配列番号１５１の残基３１〜３５、ＣＤＲ−Ｈ２について、配列番号１５１の残基５０〜６５、ＣＤＲ−Ｈ３について、配列番号１５１の残基９５〜１０２を含み、残基は、Ｋａｂａｔに従って番号付けされている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
抗ＤＬＬ３抗体が、配列番号４０５として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号４０７として示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
細胞毒性剤が、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、オーリスタチン、メイタンシノイド、カリケアマイシン又は放射性同位体である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
細胞毒性剤がピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ＰＢＤが、リンカーを介して、抗ＤＬＬ３抗体に共有結合により連結されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
細胞毒性剤が、式ＡＣ：
【化１】
2019516705.tif 000040
（式中、
点線は、二重結合が任意選択的に存在することを示し、所与の環中の点線の１つのみが二重結合になることができ、
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、ＯＳＯ２Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ及びハロから選択され、ＲＤは、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ及びハロから選択され、
Ｒ６及びＲ９は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロからそれぞれ独立して選択され、
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから選択され、
Ｒ１０は、抗ＤＬＬ３抗体に結合しているリンカーＬであり、
Ｑは、Ｏ、Ｓ及びＮＨから選択され、
Ｒ１１は、Ｈ又はＲのどちらかである、又はＱは、Ｏ、ＳＯ３Ｍであり、Ｍは金属陽イオンであり、
Ｒ及びＲ’は、置換されていてもよいＣ１〜１２アルキル基、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基及びＣ５〜２０アリール基からそれぞれ独立して選択され、任意選択的に、基ＮＲＲ’に関連して、Ｒ及びＲ’は、これらが結合している窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４員、５員、６員又は７員の複素環式環を形成し、
Ｘは、Ｏ、Ｓ及びＮ（Ｈ）から選択され、
Ｒ２”、Ｒ６”、Ｒ７”、Ｒ９”及びＸ”は、それぞれ、Ｒ２、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９及びＸに準拠して定義され、
Ｒ”はＣ３〜１２アルキレン基であり、これは、１又は複数のヘテロ原子、１又は複数の環、又は１又は複数のヘテロ原子と１又は複数の環との両方によって任意選択的に分断された鎖を含み、任意選択的な１又は複数の環は、置換されていてもよい）
を含むピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
Ｒ２がＲであり、Ｒは、Ｃ５〜２０アリール基であり、
Ｒ６及びＲ９が、Ｈであり、
Ｒ７がＯＲであり、Ｒは、Ｃ１アルキルであり、
ＱがＯであり、Ｒ１１は、Ｈである、及び／又は
Ｘ及びＸ”が、Ｏである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＰＢＤが、以下：
【化２】
2019516705.tif 000041
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を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
リンカーが切断可能なリンカーを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
切断可能なリンカーがジペプチドを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ジペプチドが、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ又はＴｒｐ−Ｃｉｔである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ジペプチドがＶａｌ−Ａｌａである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
抗体薬物コンジュゲートが、構造：
【化３】
2019516705.tif 000043
（式中、アスタリスクは、リンカーの細胞毒性剤への結合点を示し、波線は、リンカーの残余部分への結合点を示す）
を含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
リンカーが、マレイミド基をさらに含む、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
抗ＤＬＬ３抗体にリンカーを介して共有結合により連結しているＰＢＤが、
【化４】
2019516705.tif 000044
2019516705.tif 000045
2019516705.tif 000046
（式中、Ａｂは、抗ＤＬＬ３抗体又はこの免疫反応性断片を含み、ｎは、約１〜約２０の整数である）
からなる群から選択される構造であるＡＤＣを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
神経内分泌表現型に移行するリスクのある腫瘍に罹患している対象を治療する方法であって、前記方法は、
（ａ）対象から得た腫瘍試料をＡＳＣＬ１抗体と接触させるステップと、
（ｂ）腫瘍試料に結合したＡＳＣＬ１抗体を検出するステップと、
（ｃ）ＡＳＣＬ１＋腫瘍表現型を有する対象を選択するステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）において選択された対象を抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート（ＤＬＬ３  ＡＤＣ）により治療するステップと
を含み、腫瘍試料がＤＬＬ３−／ｌｏｗ表現型を含む、方法。
【請求項３９】
腫瘍試料をＤＬＬ３抗体と接触させるステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＡＳＣＬ１抗体を検出するステップが、免疫組織化学を使用して行われる、請求項３８及び３９に記載の方法。
【請求項４１】
腫瘍試料が化学的に固定されている、請求項３８〜４０に記載の方法。
【請求項４２】
腫瘍試料がホルマリンを使用して化学的に固定されている、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
腫瘍試料がパラフィンに包埋されている、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
腫瘍試料に、網膜芽細胞腫１（ＲＢ１）、リプレッサー要素１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、ＳＡＭポインテッドドメイン含有Ｅｔｓ転写因子（ＳＰＤＥＦ）、プロスタグランジンＥ２受容体４（ＰＴＧＥＲ４）及びＥＴＳ関連遺伝子（ＥＲＧ）のうちの１又は複数を検出する薬剤と接触させるステップと、
腫瘍試料中の薬剤を検出するステップと、
対照試料と比べて、網膜芽細胞腫１（ＲＢ１）、リプレッサー要素１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、ＳＡＭポインテッドドメイン含有Ｅｔｓ転写因子（ＳＰＤＥＦ）、プロスタグランジンＥ２受容体４（ＰＴＧＥＲ４）及びＥＴＳ関連遺伝子（ＥＲＧ）のうちの１又は複数の発現低下を観察するステップと
をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
腫瘍試料を、父親性発現１０（ＰＥＧ１０）を検出するＰＥＧ１０剤と接触させるステップと、
腫瘍試料中のＰＥＧ１０剤を検出するステップと、
対照試料と比較して、父親性発現１０（ＰＥＧ１０）の発現の増加を観察するステップと
をさらに含む、請求項３８〜４４に記載の方法。
【請求項４６】
腫瘍が、再発性、不応性、再燃性又は抵抗性である、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
対象が標的治療を受けた、請求項３８〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
対象が、腫瘍減量手法を以前に受けた、請求項３８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
腫瘍が腺癌を含む、請求項３８〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
腺癌が、肺、前立腺、泌尿生殖路、胃腸管、甲状腺又は腎臓に起こる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
腺癌が前立腺がんを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前立腺がんが去勢抵抗性前立腺がんを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前立腺がんがアンドロゲン遮断療法に抵抗性である、請求項５１又は５２に記載の方法。
【請求項５４】
腺癌が肺がんを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
肺がんが小細胞肺がんを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
肺がんが非小細胞肺がんを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
腺癌が、活性化しているＥＧＦＲ変異を有すると特徴づけられる、請求項５５又は５６に記載の方法。
【請求項５８】
腺癌が、ＥＧＦＲ阻害剤治療法に抵抗性である、請求項５５〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
ＡＳＣＬ１抗体が検出可能な標識にコンジュゲートされているか、又はそれ以外の方式で検出可能な標識と結合されている、請求項３８〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
ＡＳＣＬ１抗体が標識されていない、請求項３８〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
ＡＳＣＬ１抗体を検出するステップが、（ｂ）の腺癌試料を、ＡＳＣＬ１抗体に特異的に結合する抗体に接触させるステップと、ＡＳＣＬ１抗体に特異的に結合した抗体を検出するステップとをさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ポジティブに染色されるＤＬＬ３−／ｌｏｗ腫瘍中の細胞の割合が、ＤＬＬ３抗体を用いて求めた場合、約１０％未満である、請求項３８〜６１に記載の方法。
【請求項６３】
ポジティブに染色されるＤＬＬ３−／ｌｏｗ腫瘍中の細胞の割合が、ＤＬＬ３抗体を用いて求めた場合、約５％未満である、請求項３８〜６２に記載の方法。
【請求項６４】
ポジティブに染色されるＤＬＬ３−／ｌｏｗ腫瘍中の細胞の割合が、ＤＬＬ３抗体を用いて求めた場合、約２％未満である、請求項３８〜６３に記載の方法。
【請求項６５】
ポジティブに染色されるＤＬＬ３−／ｌｏｗ腫瘍中の細胞の割合が、ＤＬＬ３抗体を用いて求めた場合、約１％未満である、請求項３８〜６４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それぞれ参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる２０１６年５月２０日に出願された米国仮出願第６２／３３９，７７６号、２０１７年５月１２日に出願された米国仮出願第６２／５０５，５３９号の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩの写しは、２０１７年５月１６日に作成され、ｃ１６０６ＷＯＯ１＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇと名付けられ、大きさが６６３ＫＢ（６７９，８６９バイト）である。
【０００３】
本出願は、がん、及びその何らかの再発、再燃又は転移を治療する方法に一般に関する。幅広い態様において、本発明は、がんを治療するための、デルタ様リガンド３（ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  ｌｉｇａｎｄ  ３：ＤＬＬ３）抗体薬物コンジュゲートの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
がんの従来の治療としては、化学療法、放射線治療、手術、免疫療法、標的治療又はこれらの組合せが挙げられる。残念なことに、ある種のがんは、このような治療に対して非応答性であるか、又は最小限にしか応答しない。例えば、ある患者において、腫瘍は、選択治療の一般的な有効性にもかかわらず、腫瘍を非応答性にする遺伝子変異を示す。さらに、がんのタイプ、及びがんが取る形態に応じて、手術のようないくつかの利用可能な治療は、実現可能な代替肢にならないことがある。現在の標準治療法における固有の制限は、以前の治療を受けて、この後に再燃した患者の治療を試みた場合に、特に、明白になる。このような場合、成功しなかった治療レジメン及びこの結果生じた患者の悪化は、不応性及び／又は再燃性腫瘍の一因となることがあり、これは、最終的に治癒不能であると分かる、比較的、侵襲的な疾患として現れることが多い。再燃性疾患は非常に侵襲的な性質があることを考慮すると、再燃が検出されて治療をすぐに開始するほど、予後は良くなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
何年にもわたり、がんの診断及び治療に大きな改善がもたらされてきたが、多数の固形腫瘍の全生存率は、再燃、腫瘍再発及び腫瘍転移を予防するための既存治療が不首尾となるために、大きく変わっていない。したがって、がんに対する、とりわけ再燃性がんを有する患者に対する、一層の標的治療及び有効な治療を開発することは依然として難題のままである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
幅広い態様において、本発明は、神経内分泌表現型に移行するリスクのある腺癌を治療する方法、及び神経内分泌表現型に移行するリスクのある腺癌の再発を低減又は阻害する方法を提供する。本発明の他の態様は、単離された抗ＤＬＬ３抗体、単離された抗ＡＳＣＬ１抗体、及び対応する抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。
【０００７】
一実施形態において、対象において神経内分泌表現型に移行するリスクのある腺癌を治療する方法が提供される。このような方法は、治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を対象に投与するステップであって、該抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が式Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎを含み、Ｍが抗ＤＬＬ３抗体を含み、Ｌが任意選択のリンカーを含み、Ｄが細胞毒性剤を含み、ｎが１〜２０の整数である、ステップを含む。ある特定の実施形態において、腺癌は、神経内分泌表現型に移行する前、検出可能なレベルのＤＬＬ３を相対的にほとんど又は全く発現しない。顕著なことに、ある特定の実施形態において、腺癌は、ＤＬＬ３  ＡＤＣによる治療時に、検出可能なレベルのＤＬＬ３タンパク質を相対的にほとんど又は全く発現しない（例えば、それは、ＤＬＬ３−／ｌｏｗである）が、腺癌はマーカータンパク質（例えば、ＡＳＣＬ１）を発現することがあり、このことは、神経内分泌表現型を含む腫瘍に移行するリスクがあることを示すものである。
【０００８】
別の実施形態において、対象において神経内分泌表現型に移行するリスクのある腺癌の再発を低減又は阻害する方法が提供される。このような方法は、治療有効量の抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート又はその薬学的に許容される塩を対象に投与するステップであって、該抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が式Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎを含み、Ｍが抗ＤＬＬ３抗体を含み、Ｌが任意選択のリンカーを含み、Ｄが細胞毒性剤を含み、ｎが１〜２０の整数である、ステップを含む。選択された実施形態において、腺癌は、神経内分泌表現型に移行する前、検出可能なレベルのＤＬＬ３を相対的にほとんど又は全く発現しない。やはり、ある特定の実施形態において、腺癌は、ＤＬＬ３  ＡＤＣによる治療時に、検出可能なレベルのＤＬＬ３タンパク質を相対的にほとんど又は全く発現しない（例えば、それは、ＤＬＬ３−／ｌｏｗである）が、腺癌はマーカータンパク質（例えば、ＡＳＣＬ１）を発現することがあり、このことは、神経内分泌表現型を含む腫瘍に移行するリスクがあることを示すものである。
【０００９】
いくつかの実施形態において、腺癌は、ＡＳＣＬ１＋細胞を含む。ある特定の実施形態において、腺癌は、対照試料と比べて、網膜芽細胞腫１（ＲＢ１）、リプレッサー要素１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、ＳＡＭポインテッドドメイン含有Ｅｔｓ転写因子（ＳＰＤＥＦ）、プロスタグランジンＥ２受容体４（ＰＴＧＥＲ４）及びＥＴＳ関連遺伝子（ＥＲＧ）のうちの１つ以上の発現低下を示す。他の実施形態において、腺癌は、対照試料と比較すると、父親性発現１０（ｐａｔｅｒｎａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  １０：ＰＥＧ１０）の発現の増加を示す。
【００１０】
本発明のいくつかの態様において、対象は、標的治療又は化学療法を現在受けている、又は過去に受けている。他の態様において、腺癌は、再発性、不応性、再燃性又は抵抗性である。さらに他の態様において、対象は、腫瘍減量手法を以前に受けている。
【００１１】
示されている通り、本発明は、腺癌を治療する方法、及び神経内分泌表現型に移行するリスクのある腺癌の再発を予防、低減又は阻害する方法を提供する。いくつかの態様において、腺癌は、肺、前立腺、泌尿生殖路（膀胱を含む）、胃腸管、甲状腺又は腎臓に発生する。
【００１２】
一態様において、腺癌は前立腺がんを含む。ある特定の実施形態において、前立腺がんは、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＰＲＣ）を含む。さらなる実施形態において、腺癌は、アンドロゲン遮断療法に抵抗性であり、ある特定の実施形態において、ＣＰＲＣは、アンドロゲン遮断療法（ＡＲ−ＣＰＲＣ）抵抗性である。
【００１３】
別の態様において、腺癌は肺がんを含む。ある特定の実施形態において、肺がんは非小細胞肺がんを含む。さらなる実施形態において、腺癌は、活性化しているＥＧＦＲ変異を有するものとして特徴づけられる。さらに別の実施形態において、腺癌はＥＧＦＲ阻害剤治療法に抵抗性である。
【００１４】
本発明は、抗ＤＬＬ３抗体、又は抗ＤＬＬ３抗体を含むＡＤＣを含む。いくつかの態様において、抗ＤＬＬ３抗体は、配列番号３又は４に示されるＤＬＬ３タンパク質のＤＳＬドメイン内のエピトープに特異的に結合する。ある特定の態様において、抗ＤＬＬ３抗体は、アミノ酸Ｇ２０３、Ｒ２０５及びＰ２０６（配列番号４）を含むエピトープに特異的に結合する。
【００１５】
一実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体は、配列番号１４９として示される軽鎖可変領域及び配列番号１５１として示される重鎖可変領域を含む抗体、又はヒトＤＬＬ３タンパク質との結合について上記抗体と競合する。別の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体は、配列番号１４９として示される軽鎖可変領域の３つの相補性決定領域、及び配列番号１５１として示される重鎖可変領域の３つの相補性決定領域を含む。さらに別の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体は、ＣＤＲ−Ｌ１の場合、配列番号１４９の残基２４〜３４、ＣＤＲ−Ｌ２の場合、配列番号１４９の残基５０〜５６、ＣＤＲ−Ｌ３の場合、配列番号１４９の残基８９〜９７、ＣＤＲ−Ｈ１の場合、配列番号１５１の残基３１〜３５、ＣＤＲ−Ｈ２の場合、配列番号１５１の残基５０〜６５、ＣＤＲ−Ｈ３の場合、配列番号１５１の残基９５〜１０２を含み、残基は、Ｋａｂａｔに従って番号付けされている。ある特定の実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体は、配列番号４０５として示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号４０７として示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００１６】
いくつかの態様において、抗ＤＬＬ３抗体は、モノクローナル抗体、霊長類化抗体、多重特異的抗体、二重特異性抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、ダイアボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片及びＳｃＦｖ断片；又はこれらの免疫反応性断片からなる群から選択される。ある特定の態様において、抗ＤＬＬ３抗体は、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体及びヒト化抗体からなる群から選択される。
【００１７】
示される通り、本発明のある特定の実施形態は、式Ｍ−［Ｌ−Ｄ］ｎの抗体薬物コンジュゲートを含み、Ｄは細胞毒性剤を含む。いくつかの実施形態において、細胞毒性剤は、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、オーリスタチン、メイタンシノイド、カリケアマイシン又は放射性同位体である。ある特定の実施形態において、細胞毒性剤はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である。いくつかの態様において、ＰＢＤは、リンカーを介して、抗ＤＬＬ３抗体に共有結合で連結されている。
【００１８】
ある特定の態様において、本発明はＡＤＣを含み、細胞毒性剤は、式ＡＣ：
【００１９】
【化１】
2019516705.tif 000003
を含むピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）であり、
式中、点線は、二重結合が任意選択的に存在することを示し、所与の環中の点線の１つのみが二重結合になることができ、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、ＯＳＯ２Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ及びハロから選択され、ＲＤは、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ及びハロから選択され、Ｒ６及びＲ９は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロからそれぞれ独立して選択され、Ｒ７は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから選択され、Ｒ１０は、抗ＤＬＬ３抗体に結合しているリンカーＬであり、Ｑは、Ｏ、Ｓ及びＮＨから選択され、Ｒ１１は、Ｈ又はＲである、又はＱはＯであり、Ｒ１１は、ＳＯ３Ｍとすることができ、Ｍは金属陽イオンであり、Ｒ及びＲ’は、置換されていてもよいＣ１〜１２アルキル基、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基及びＣ５〜２０アリール基からそれぞれ独立して選択され、任意選択的に、基ＮＲＲ’に関連して、Ｒ及びＲ’は、これらが結合している窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４員、５員、６員又は７員の複素環式環を形成し、Ｘは、Ｏ、Ｓ及びＮ（Ｈ）から選択され、Ｒ２”、Ｒ６”、７”、Ｒ９”及びＸ”は、それぞれ、Ｒ２、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９及びＸに準拠して定義され、Ｒ”はＣ３〜１２アルキレン基であり、これは、１個以上のヘテロ原子、１つ以上の環、又は１個以上のヘテロ原子と１つ以上の環との両方によって、任意選択的に分断された鎖を含み、任意選択的な１つ以上の環は、置換されていてもよい。ある特定の態様において、Ｒ２はＲであり、Ｒは、置換されていてもよいＣ１〜１２アルキルであり、Ｒ６及びＲ９はＨであり、Ｒ７はＯＲであり、ＲはＣ１アルキルであり、ＱはＯであり、Ｒ１１はＨであり、かつ／又はＸ及びＸ”はＯである。
【００２０】
別の態様において、本発明はＡＤＣを含み、いずれのリンカーからの切断後でも、ＰＢＤは以下：
【００２１】
【化２】
2019516705.tif 000004
を含む。
【００２２】
本発明の他の態様において、ＡＤＣはリンカーを含む。一態様において、リンカーは、切断可能なリンカーを含む。ある特定の態様において、切断可能なリンカーは、ジペプチドを含む。さらなる態様において、ジペプチドは、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｒｇ又はＴｒｐ−Ｃｉｔである。さらにさらなる態様において、ジペプチドはＶａｌ−Ａｌａである。さらに他の態様において、リンカーは、マレイミド基をさらに含む。
【００２３】
ある特定の態様において、抗体薬物コンジュゲートは、以下の構造：
【００２４】
【化３】
2019516705.tif 000005
を含み、
式中、アスタリスクは、リンカーの細胞毒性剤への結合点を示し、波線は、リンカーの残余部分への結合点を示す。
【００２５】
本発明の別の態様は、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）による治療を行うための対象を選択する方法を提供する。このような方法は、以下：（ａ）対象から得られた腫瘍試料をＡＳＣＬ１抗体と接触させるステップであって、ＡＳＣＬ１抗体が、配列番号５２１として示される軽鎖可変領域及び配列番号５２３として示される重鎖可変領域；配列番号５２５として示される軽鎖可変領域及び配列番号５２７として示される重鎖可変領域；配列番号５２９として示される軽鎖可変領域及び配列番号５３１として示される重鎖可変領域；配列番号５３３として示される軽鎖可変領域及び配列番号５３５として示される重鎖可変領域；配列番号５３７として示される軽鎖可変領域及び配列番号５３５として示される重鎖可変領域；配列番号５３７として示される軽鎖可変領域及び配列番号５３９として示される重鎖可変領域；配列番号５４１として示される軽鎖可変領域及び配列番号５４３として示される重鎖可変領域；配列番号５４５として示される軽鎖可変領域及び配列番号５４７として示される重鎖可変領域；配列番号５４９として示される軽鎖可変領域及び配列番号５５１として示される重鎖可変領域；配列番号５５３として示される軽鎖可変領域及び配列番号５５５として示される重鎖可変領域；配列番号５５７として示される軽鎖可変領域及び配列番号５５９として示される重鎖可変領域；配列番号５６１として示される軽鎖可変領域及び配列番号５６３として示される重鎖可変領域；配列番号５６５として示される軽鎖可変領域及び配列番号５６７として示される重鎖可変領域；配列番号５６９として示される軽鎖可変領域及び配列番号５７１として示される重鎖可変領域；又は配列番号５２１として示される軽鎖可変領域及び配列番号５７３として示される重鎖可変領域を含む抗体、又は上記抗体とヒトＡＳＣＬ１タンパク質への結合について競合し得る、ステップ、（ｂ）腫瘍試料に結合したＡＳＣＬ１抗体を検出するステップ、及び（ｃ）抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）により治療するＡＳＣＬ１＋腫瘍試料を有する対象を選択するステップを含む。ある特定の実施形態において、ＡＳＣＬ１抗体は、上述の抗体を含む、又はこの抗体と競合する。ＡＳＣＬ１抗体を検出するステップにおいて、この抗体は、コンジュゲートされていてもよいし、若しくはそれ以外の方式で検出可能な標識に結合されていてもよく、又はこのステップは、当該技術分野において周知の通り、ＡＳＣＬ１抗体に特異的に結合してシグナルを増幅する二次及び／又は三次抗体を使用して行われてもよい。他の選択された実施形態において、選択された対象は、選択時に、検出可能なレベルのＤＬＬ３を相対的にほとんど又は全く発現しないことがある。
【００２６】
さらなる態様において、本発明は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含むヒトＡＳＣＬ１に結合する抗体を含み、該軽鎖可変領域は、配列番号５２１、配列番号５２５、配列番号５２９、配列番号５３３、配列番号５３７、配列番号５４１、配列番号５４５又は配列番号５４９；配列番号５５３、配列番号５５７、配列番号５６１、配列番号５６５又は配列番号５６９として示される軽鎖可変領域のうちの３つのＣＤＲを有しており、該重鎖可変領域は、配列番号５２３、配列番号５２７、配列番号５３１、配列番号５３５、配列番号５３９、配列番号５４３、配列番号５４７、配列番号５５１、配列番号５５５、配列番号５５９及び配列番号５６３、配列番号５６７；配列番号５７１又は配列番号５７３として示される重鎖可変領域のうちの３つのＣＤＲを有する。以下に詳述されている通り、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ又はＡｂＭの方法論に従い定義され得る。
【００２７】
抗ＤＬＬ３  ＡＤＣを用いて治療する対象を選択する方法のある特定の態様は、免疫組織化学向けのＡＳＣＬ１抗体の使用を含むことが理解される。一実施形態において、ＡＳＣＬ１抗体を検出するステップは、免疫組織化学を使用して行われる。いくつかの実施形態において、腫瘍試料は化学的に固定されている。ある特定の実施形態において、腫瘍試料はホルマリンを使用して化学的に固定されている。他の実施形態において、腫瘍試料はパラフィンに包埋されている。
【００２８】
他の態様において、抗ＤＬＬ３  ＡＤＣによる治療を行う対象を選択する方法は、以下のステップのいずれか又は全て：腫瘍試料を、網膜芽細胞腫１（ＲＢ１）、リプレッサー要素１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、ＳＡＭポインテッドドメイン含有Ｅｔｓ転写因子（ＳＰＤＥＦ）、プロスタグランジンＥ２受容体４（ＰＴＧＥＲ４）及びＥＴＳ関連遺伝子（ＥＲＧ）のうちの１つ以上を検出する、１種以上の薬剤と接触させるステップ、腫瘍試料中の１種以上の薬剤を検出するステップ、及び対照試料と比べて、網膜芽細胞腫１（ＲＢ１）、リプレッサー要素１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、ＳＡＭポインテッドドメイン含有Ｅｔｓ転写因子（ＳＰＤＥＦ）、プロスタグランジンＥ２受容体４（ＰＴＧＥＲ４）及びＥＴＳ関連遺伝子（ＥＲＧ）のうちの１つ以上の発現低下を観察するステップをさらに含むことができる。
【００２９】
さらに他の態様において、抗ＤＬＬ３  ＡＤＣによる治療を行う対象を選択する方法は、以下のステップ：腫瘍試料を、父親性発現１０（ＰＥＧ１０）を検出する薬剤と接触させるステップ、腫瘍試料中の該薬剤を検出するステップ、及び対照試料と比較して、父親性発現１０（ＰＥＧ１０）の発現増加を観察するステップをさらに含むことができる。
【００３０】
さらにさらなる態様において、抗ＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療する対象を選択する上述の方法のそれぞれが、対象に抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートを投与するステップをさらに含むことができる。
【００３１】
この点において、本発明のある特定の態様は、神経内分泌表現型に移行するリスクのある腫瘍に罹患している対象を治療する方法であって、（ａ）ＡＳＣＬ１抗体を、対象から得られた腫瘍試料と接触させるステップ、（ｂ）腫瘍試料に結合したＡＳＣＬ１抗体を検出するステップ、（ｃ）ＡＳＣＬ１＋腫瘍表現型を有する対象を選択するステップ、及び（ｄ）ステップ（ｃ）において選択された対象を抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート（ＤＬＬ３  ＡＤＣ）により治療するステップを含む、方法を含む。ある特定の好ましい態様において、腫瘍は腺癌を含む。さらなる実施形態において、対象は、ＤＬＬ３発現に関して試験され得る（例えば、ＤＬＬ３抗体を使用する）。このような実施形態において、対象は、腺癌がＡＳＣＬ１＋  ＤＬＬ３−／ｌｏｗ表現型を含む場合でさえも、ＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療され得る。
【００３２】
抗ＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療する対象を選択する上述の方法のいくつかの態様において、腫瘍は、神経内分泌表現型に移行するリスクにある。ある特定の態様において、対象は、標的治療又は化学療法を現在受けている、及び／又は過去に受けている。さらなる態様において、腫瘍は、再発性、不応性、再燃性又は抵抗性である。さらに他の態様において、対象は、腫瘍減量手法を以前に受けている。
【００３３】
抗ＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療する対象を選択する方法のある特定の態様において、腫瘍は、肺、前立腺、泌尿生殖路、胃腸管、甲状腺又は腎臓に発生する。
【００３４】
一態様において、腫瘍は前立腺がんを含む。ある特定の態様において、前立腺がんは、去勢抵抗性前立腺がんを含む。さらにさらなる態様において、前立腺がんは、アンドロゲン遮断療法に抵抗性である。
【００３５】
別の態様において、腫瘍は肺がんを含む。ある特定の態様において、肺がんは小細胞肺がんを含む。さらなる態様において、肺がんは非小細胞肺がんを含む。さらに別の態様において、腫瘍は、活性化しているＥＧＦＲ変異を有するものとして特徴づけられる。さらにさらなる態様において、腫瘍は、ＥＧＦＲ阻害剤治療法に抵抗性である。
【００３６】
上記は概要であり、したがって、必要により、単純化、一般化及び詳細の省略を含む。結果として、当業者は、この概要が例示にすぎず、決して限定を意図していないことを理解する。本明細書に記載の方法、組成物及び／又は装置及び／又は他の主題の他の態様、特徴及び利点は、本明細書に記載の教示から明らかになる。この概要は、以下で詳細な説明においてさらに説明される単純化された形態の概念の選択を紹介するために、提供される。本概要は、特許請求されている主題の重要な特徴又は必須特徴を特定することを意図するものでもなく、特許請求されている主題の範囲を決定する一助として使用されることを意図するわけでもない。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ−１】いくつかの例示的なマウス及びヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の連続的アミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を表形式で提示している図である。
【図１Ａ−２】いくつかの例示的なマウス及びヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の連続的アミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を表形式で提示している図である。
【図１Ａ−３】いくつかの例示的なマウス及びヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の連続的アミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を表形式で提示している図である。
【図１Ａ−４】いくつかの例示的なマウス及びヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の連続的アミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を表形式で提示している図である。
【図１Ａ−５】いくつかの例示的なマウス及びヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の連続的アミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を表形式で提示している図である。
【図１Ａ−６】いくつかの例示的なマウス及びヒト化ＤＬＬ３抗体の軽鎖可変領域の連続的アミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を表形式で提示している図である。
【図１Ｂ−１】いくつかの例示的なマウス及びヒト化ＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の連続的アミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を表形式で提示している図である。
【図１Ｂ−２】いくつかの例示的なマウス及びヒト化ＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の連続的アミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を表形式で提示している図である。
【図１Ｂ−３】いくつかの例示的なマウス及びヒト化ＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の連続的アミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を表形式で提示している図である。
【図１Ｂ−４】いくつかの例示的なマウス及びヒト化ＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の連続的アミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を表形式で提示している図である。
【図１Ｂ−５】いくつかの例示的なマウス及びヒト化ＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の連続的アミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を表形式で提示している図である。
【図１Ｂ−６】いくつかの例示的なマウス及びヒト化ＤＬＬ３抗体の重鎖可変領域の連続的アミノ酸配列（配列番号２１〜４０７、奇数）を表形式で提示している図である。
【図２】例示的なＤＬＬ３抗体のドメインレベルマッピング解析の結果を概略形式で示している図である。
【図３Ａ】例示的なマウス抗ＡＳＣＬ１抗体（配列番号：５２１〜５７３）の軽鎖可変領域の連続的アミノ酸配列を表形式で提示している図である。
【図３Ｂ】例示的なマウス抗ＡＳＣＬ１抗体（配列番号：５２１〜５７３）の重鎖可変領域の連続的アミノ酸配列を表形式で提示している図である。
【図３Ｃ−１】例示的なマウス抗ＡＳＣＬ１抗体（配列番号：５２１〜５７３）の軽鎖及び重鎖可変領域のヌクレオチド配列を表形式で提示している図である。
【図３Ｃ−２】例示的なマウス抗ＡＳＣＬ１抗体（配列番号：５２１〜５７３）の軽鎖及び重鎖可変領域のヌクレオチド配列を表形式で提示している図である。
【図３Ｃ−３】例示的なマウス抗ＡＳＣＬ１抗体（配列番号：５２１〜５７３）の軽鎖及び重鎖可変領域のヌクレオチド配列を表形式で提示している図である。
【図３Ｃ−４】例示的なマウス抗ＡＳＣＬ１抗体（配列番号：５２１〜５７３）の軽鎖及び重鎖可変領域のヌクレオチド配列を表形式で提示している図である。
【図４】アンドロゲン抵抗性の去勢抵抗性前立腺がん（ＡＲ−ＣＲＰＣ）における、ＤＬＬ３発現を図示した図である。
【図５】転移性前立腺がんにおける、ＤＬＬ３発現を図示した図である。
【図６】神経分泌分化（ＮＥＰＣ）を有するアンドロゲン抵抗性の前立腺がん（ＡＲ−ＣＲＰＣ）における、ＤＬＬ３発現の図である。
【図７】腫瘍が最初に後退するが急速にＮＥＰＣとして再燃したときの、マウス宿主の去勢中の、経時的なＤＬＬ３発現を示す図である。
【図８】腫瘍が最初に後退するが急速にＮＥＰＣとして再燃したときの、マウス宿主の去勢中の、ＬＴＬ３３１における、経時的なＰＥＧ１０、ＤＬＬ３、ＳＰＤＥＦ、ＰＴＧＥＲ４及びＥＲＧ発現を示す図である。
【図９】ＡＲ−ＣＲＰＣにおける、ＤＬＬ３発現を示す図である。
【図１０】小細胞の形質転換及びＥＭＴ後の、ＤＬＬ３のレベルの向上を示す、ＥＧＦＲ変異ＴＫＩ抵抗性の肺腺癌腫瘍を示す図である。
【図１１】複数のタイプの腫瘍を有する一般的ながんアレイにおけるＤＬＬ３及びＣＨＧＡ発現を示す図である。
【図１２】抗ＡＳＣＬ１抗体クローンＳＣ７２．２を有する、様々な小細胞肺がんＰＤＸ試料における、ＡＳＣＬ１発現に関する免疫組織化学結果を表形式で提示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、多くの様々な形態で具現化され得る。本明細書には、本発明の原理を例示する本発明の非限定的な説明的実施形態が開示されている。本明細書で使用されるいずれの項目の見出しも、組織化を目的とするだけのものであり、記載されている主題を限定するものと解釈されるべきでない。本開示の目的に関して、全ての特定されている配列受託番号は、別途記載がない限り、ＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）データベース及び／又はＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アーカイブ配列データベースで見出され得る。
【００３９】
Ｉ．概要
ＤＬＬ３発現は、決定因子として、いくつかの腫瘍タイプと関連性があることが驚くべきことに見出されており、このような腫瘍の治療に利用され得る。このような腫瘍の中において、腺癌中のＤＬＬ３発現は、標的がん治療又は化学療法に対して抵抗性となり、神経内分泌表現型に移行する腫瘍と相関があることが示されている。本発明は、開示されたリスク因子を有する患者が、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートによる治療に対する候補として特定可能となるよう、神経内分泌表現型に移行するリスクのある腫瘍を特定するための方法及び組成物を提供する。例えば、本明細書において詳述されている通り、いくつかのタンパク質は、神経内分泌表現型への移行中及び検出可能なＤＬＬ３発現前の腫瘍に発現される。このようなマーカータンパク質は、腫瘍が、治療時に、検出可能なレベルのＤＬＬ３を相対的にほとんど又は全く発現しない場合でさえも、ＤＬＬ３  ＡＤＣによる治療に応答し得る対象に関して指標となる。同様に、本明細書において開示されている通り、標的治療により以前に治療された腫瘍は、神経内分泌移行を特に受けやすく、本明細書において開示されている治療又は予防の方法に感受性がある。したがって、開示したリスク因子及び／又は本明細書において開示されているバイオマーカーの特定により、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートによりＤＬＬ３−／ｌｏｗ腫瘍を治療する新規の治療的戦略がもたらされる。このような治療を使用して、最終的に神経内分泌表現型を示すと思われる、再発性、不応性、再燃性又は抵抗性の腫瘍の出現を予防又は遅延させることができることが理解される。
【００４０】
ＩＩ．神経内分泌移行に対するリスク因子
多数の腫瘍、特に腺癌は、神経内分泌表現型に移行、形質転換又は分化して、神経内分泌特徴を呈することができる。この移行の機構は十分に理解されていないが、神経内分泌表現型は、元の腫瘍中に存在する希な神経内分泌細胞から発生し得る。ある特定の治療的治療時に、このような細胞は、元の腫瘍の細胞が除去されると、優先的に生き残り、拡大することがある。代替的に、腫瘍は、神経内分泌細胞への組織型形質転換を受けることがある。いずれにせよ、このような移行は、腫瘍を治療するために設計された治療的介入により、刺激されてもよいし、誘発されてもよいし、又はそれ以外の方式で惹起されてもよい。他の場合において、このような神経内分泌移行は、自発的なことがある。
【００４１】
本出願は、神経内分泌表現型への移行が可能な、又はこの可能性がある腫瘍のリスク因子を提供する。本発明の一態様において、神経内分泌に移行するリスクのある腫瘍は、本明細書において開示されている、特定のマーカー（例えば、ＡＳＣＬ１）の発現の増加、及び／又は選択されたマーカーの発現の低下によって特定される。本発明の別の態様において、本発明者は、本明細書において定義されている標的治療により以前に治療された腫瘍もまた、神経内分泌表現型に移行するリスクにあることを発見した。リスクのこのような腫瘍は、これらの腫瘍が、治療時に、ＤＬＬ３（ＤＬＬ３−／ｌｏｗ）がネガティブ又は低い発現であることを示すにもかかわらず、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートを使用して効果的に治療され得る。
【００４２】
Ａ．  神経内分泌表現型
分散性内分泌腺系から発生する、真の又は標準的な神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）は、比較的希であり、出現率は、１００，０００名あたり２〜５名であるが、非常に侵襲的である。神経内分泌腫瘍は、腎臓、泌尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頚部及び子宮内膜）、胃腸管（結腸、胃）、甲状腺（甲状腺髄様がん）及び肺（小細胞肺癌及び大細胞神経内分泌癌）に起こる。これらの腫瘍は、カルチノイド症候群として知られている症状の衰弱を誘発することができる、セロトニン及び／又はクロモグラニンＡを含む、いくつかのホルモンを分泌することがある。このような腫瘍は、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ、ガンマエノラーゼとしても知られている、遺伝子シンボル＝ＥＮＯ２）、ＣＤ５６（又はＮＣＡＭ１）、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）及びシナプトフィジン（ＳＹＰ）のようなポジティブな免疫組織化学的マーカーによって、又はＡＳＣＬ１のような発現の向上を示すことが知られている遺伝子によって、示され得る。残念なことに、従来の化学療法は、ＮＥＴを治療するのに特に有効性がなく、肝臓転移が一般的な転帰である。
【００４３】
擬似神経内分泌腫瘍（ｐＮＥＴ）は、遺伝子型により又は表現型が、擬似である、類似している、又は標準的な神経内分泌腫瘍を有する一般的な形質を示す腫瘍である。擬似神経内分泌腫瘍又は神経内分泌特徴を有する腫瘍は、びまん性神経内分泌系細胞から発生する腫瘍、又は神経内分泌分化カスケードが、発がん過程の間に異常に再活性された細胞から発生する腫瘍である。このようなｐＮＥＴは、生化学的に活性なアミン、神経伝達物質及びペプチドホルモンのサブセットを生じる能力を含めた、従来定義されている神経内分泌腫瘍を有する、ある特定の表現型特徴又は生化学的特徴を一般に共有する。組織学的に、このような腫瘍（ＮＥＴ及びｐＮＥＴ）は、特徴に乏しい細胞病理学及び円形から点状の楕円核からなる最小限の細胞質を有する緊密に結合した小細胞を示すことが多い、共通の外観を共有している。本発明の目的の場合、神経内分泌移行のリスクの特徴づけとして、本明細書において同定された因子は、擬似神経内分泌に移行するリスクの特定に等しく適用可能である。
【００４４】
Ｂ．  神経内分泌移行のリスクのある腫瘍を特定するためのバイオマーカー
本明細書において開示されている通り、様々なバイオマーカーの発現の変化は、神経内分泌表現型に移行するリスクのある腫瘍を特定するために使用することができる。代表的なバイオマーカーは、（１）Ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅホモログ１（ＡＳＣＬ１）、父親性発現１０（ＰＥＧ１０）又はセリン／アルギニン反復マトリックス４（ＳＲＲＭ４）のうちの１種以上の発現の増加、及び（２）網膜芽細胞腫１（ＲＢ１）、リプレッサー要素１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、ＳＡＭポインテッドドメイン含有Ｅｔｓ転写因子（ＳＰＤＥＦ）、プロスタグランジンＥ２受容体４（ＰＴＧＥＲ４）又はＥＴＳ関連遺伝子（ＥＲＧ）のうちの１つ以上の発現の低下又は低減を含む。発現のこのような相対的変化は、マーカーを発現する細胞数の変化、すなわちポジティブな発現、低発現又はネガティブ発現を有するものとして特徴づけることが可能な試料内に、より多くの細胞又はより少ない細胞が存在することに起因し得る。代替的に又は追加的に、これらの相対的変化は、任意の所与の細胞又は細胞群における発現のレベルの変化の結果とすることができる。
【００４５】
本発明の選択された態様において、選択された決定因子の発現は、蛍光性の抗体染色を含むフローサイトメトリーを使用して測定され得る。このような技術を使用する場合、腫瘍細胞は、蛍光シグナルに基づいて、マーカーレベルがポジティブ、低い及びネガティブとなることを示すものとして定義され得る。負（つまり、「ＦＭＯ」）の発現を有する細胞は、蛍光チャネル中のアイソタイプ対照抗体を、別の蛍光チャネルの目的の他のタンパク質を標識する完全抗体染色カクテルの存在下で観察した発現の９５パーセンタイル以下で発現する細胞として定義されてよい。当業者は、この負の事象を定義するための手法が、「１を引いた蛍光対照（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｉｎｕｓ  ｏｎｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ）」又は「ＦＭＯ  ｃｏｎｔｒｏｌ」染色として参照されることを認識する。上記で述べたＦＭＯ染色手法を用いてアイソタイプ対照抗体で観察された発現の９５パーセンタイルを上回る発現を有する細胞は、「正」（つまり「ＦＭＯ＋」）と定義されてよい。本明細書において定義されている通り、ＦＭＯ＋として定義され得るものを含めた、「ポジティブ」として広く定義される細胞の様々な集団が存在する。抗原の平均発現観測値が、上記のようにアイソタイプ対照抗体でＦＭＯ染色を用いて決定された９５パーセンタイルを上回る場合、細胞はＦＭＯ＋として定義される。正の細胞は、平均発現観測値がＦＭＯ染色によって決定された９５パーセンタイルを上回るが、９５パーセンタイルの１標準偏差以内である場合、「低発現」（つまり、「ＦＭＯ−ｌｏ」）の細胞と称され得る。代替的に、正の細胞は、平均発現観測値がＦＭＯ染色によって決定された９５パーセンタイルを上回り、９５パーセンタイルを上回る１標準偏差より大きい場合、「高発現」（つまり、「ＦＭＯ−ｈｉ」）の細胞と称され得る。他の実施形態において、９９パーセンタイルは、好ましくは、負と正のＦＭＯ染色の間の分界点として使用することができる。特定のマーカーに対するＦＭＯ＋である試料、例えば、ＡＳＣＬ１＋は、対照試料と比較すると、検出可能レベルのマーカーの発現を有する。特定のマーカーに対してポジティブとなる腫瘍は、１つ以上の細胞において、検出可能レベルのマーカーを有することができる。
【００４６】
本発明のある特定の態様において、所与のマーカー（ＡＳＣＬ１＋）の発現の増加は、対照試料（例えば、正常な、非腫瘍形成性組織）における対応するマーカーの発現レベルと比較して、試料（例えば、腫瘍試料）におけるマーカーの発現レベルの有意な任意の増加を包含することが意図される。例えば、所与のマーカーに対して増加した、又はより高い発現レベルは、対照試料中の基準発現レベルと比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、２００％、４００％又はそれ超となるマーカーの発現レベルの統計的に有意な任意の向上とすることができる。本開示によれば、このような発現の増加を示す腫瘍試料は、適切な対照比較した場合、「＋」又は「ｈｉ」として分類され得る。代替的に、所与のマーカーのための発現レベルの向上は、対照試料中の対応するマーカーの発現レベルの値よりも、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１２倍、１４倍、１６倍、２０倍又はそれ超となる任意の倍率向上とすることができる。本開示によれば、このような発現レベルの増加を示す腫瘍試料は、適切な対照と比較した場合、「＋」又は「ｈｉ」として分類され得る。いずれの場合でも、試料中に観察される特定のマーカーの発現の増加は、試料においてマーカーを発現する正の細胞数の増加、及び／又は試料内の任意の所与の細胞若しくは細胞群におけるマーカー発現のレベルの向上の結果とすることができる。
【００４７】
所与のマーカーの低下した、より低い若しくは低減した発現レベル、又は発現の喪失は、対照試料における対応するマーカーの発現レベルと比べて、試料におけるマーカーの発現レベルの任意の有意な低下を指す。例えば、対照試料における基準発現レベルに比べて、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はこれを超える値の、対象試料におけるマーカーの発現レベルの有意な低下。本開示によれば、このような発現レベルの増加を示す腫瘍試料は、適切な対照と比べると、「−」又は「ｌｏｗ」として分類され得る。代替的に、所与のマーカーの発現レベルの低下は、対照試料中の対応するマーカーの発現レベルと比較して、少なくとも１．５分の１倍、２分の１倍、３分の１倍、４分の１倍、５分の１倍、６分の１倍、７分の１倍、８分の１倍、９分の１倍、１０分の１倍、１２分の１倍、１４分の１倍、１６分の１倍、２０分の１倍又はそれ未満である任意の倍率低下とすることができる。本開示によれば、このような発現レベルの向上を示す腫瘍試料は、適切な対照と比較すると、「−」又は「ｌｏｗ」として分類され得る。試料中に観察される特定のマーカーの発現の低下は、試料においてマーカーを発現する正の細胞数の低下、及び／又は試料内の任意の所与の細胞若しくは細胞群におけるマーカー発現のレベルの低下とすることができる。
【００４８】
対照又は対照試料は、試料におけるマーカーの発現の変化を測定するための基準点を提供する。対照は、試料の一群に基づいた、所定の値であってもよく、又は個々の試料に基づく、単一値であってもよい。対照は、対象試料と平行して試験した試料とすることができる。ある特定の態様において、対照試料は、例えば、神経内分泌表現型への移行を経験していない、任意の正常組織試料又は任意の腫瘍試料を含むことができる。
【００４９】
マーカーの発現レベルは、任意の所与のマーカーのタンパク質レベルの発現によって、又は任意の所与のマーカーの核酸発現レベル、例えば、マーカーをコードするＲＮＡの発現レベルによって測定され得ることが理解される。さらに、１種超のマーカーの発現レベルは、様々な検出用試薬（例えば、様々な抗体）の使用により、又は様々な方法論の組合せにより、所与の試料に対して決定され得る。このような発現測定を単一で又は組み合わせて使用し、記述的な細胞又は腫瘍表現型（例えば、ＡＳＣＬ１＋、ＤＬＬ３−／ｌｏｗ）をもたらすことができる。
【００５０】
マーカーの発現を測定する様々なアッセイは、当該技術分野において公知であり、以下及び実施例においてより詳細に議論されている。タンパク質レベルを評価するための代表的な技術には、例えば、蛍光顕微鏡法若しくはフローサイトメトリーのような蛍光検出アッセイ、免疫組織化学又は酵素検出アッセイのような免疫アッセイが含まれる。好ましい態様において、免疫組織化学（ＩＨＣ）技術を使用して、本明細書における教示及びマーカーにより、細胞又は腫瘍の表現型を提供する。例として、Ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅホモログ１（ＡＳＣＬ１）、父親性発現１０（ＰＥＧ１０）若しくはセリン／アルギニン反復マトリックス４（ＳＲＲＭ４）、網膜芽細胞腫１（ＲＢ１）、リプレッサー要素１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、ＳＡＭポインテッドドメイン含有Ｅｔｓ転写因子（ＳＰＤＥＦ）、プロスタグランジンＥ２受容体４（ＰＴＧＥＲ４）又はＥＴＳ関連遺伝子（ＥＲＧ）を特異的に認識する抗体は、本明細書において開示されているか、市販されているか、又はそれ以外の方式で当該技術分野において公知であり、ＩＨＣに使用することができる。これらのマーカーのＲＮＡ発現レベルを測定するための代表的なアッセイには、例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲのようなＲＴ−ＰＣＲが含まれる。神経内分泌移行のリスクを示す本明細書に記載されているマーカー発現を評価するために、タンパク質又はＲＮＡ発現レベルを評価する、いずれの当該技術分野で認識されている技術も、本発明に従って使用され得る。
【００５１】
ある特定の好ましい実施形態において、アッセイは、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ、又はこの変形（例えば、蛍光性、発色性の標準ＡＢＣ、標準ＬＳＡＢなど）、又は免疫化学又はこの変形（例えば、直接的、間接的、蛍光性、発色性など）を含むことができる。
【００５２】
この点に関して、本発明のある特定の態様は、免疫組織化学（ＩＨＣ）のための標識されたＡＳＣＬ１の使用を含む。より詳細には、ＩＨＣ（例えば、ＡＳＣＬ１  ＩＨＣ）は、神経内分泌表現型に移行するリスクのある腫瘍を含めた、様々な増殖性疾患の診断を補助するため、及び治療、例えば、ＤＬＬ３  ＡＤＣ治療に対する潜在的な応答を監視するための診断ツールとして使用され得る。適合する診断アッセイは、化学的に固定された組織（適合技術には、以下に限定されないが、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウム、二クロム酸カリウム、酢酸、アルコール、亜鉛塩、塩化第二水銀、四酸化クロム及びピクリン酸が含まれる）並びに包埋された組織（以下に限定されないが、適合法には、グリコールメタクリレート、パラフィン及び樹脂が含まれる）、又は凍結により保存された組織に対して、実施され得る。このようなアッセイは、治療の決定に対する道筋を立て、投与レジメン及びタイミングを決定するために使用され得る。
【００５３】
当該技術分野で公知の通り、免疫組織化学技術を使用して、開示されたマーカーへの抗体を使用する当該技術分野において公知のＨスコアを誘導することができる。手短に言えば、腫瘍切片は（好ましくは、明視野顕微鏡法によって）目視され、切片にした腫瘍におけるマーカー（例えば、ＡＳＣＬ１）発現は、Ｈスコアを導くと明記されている。例示的なＨスコアは、以下の式：３×強力に染色した核の割合＋２×中程度に染色した核の割合＋弱く染色した核の割合によって得ることができ、０〜３００の範囲となる。
【００５４】
このようなＨスコアを使用して、どの患者が好適な組成物（例えば、抗ＤＬＬ３  ＡＤＣ）により治療を受けやすくなり得るかを示すことができる。選択された実施形態において、３００ポイントスケールに対する、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０若しくは約２００、又はそれ超のＨスコアを使用して、どの患者が本発明の治療法（例えば、ＤＬＬ３  ＡＤＣ及び／又は化学治療剤による）に好都合に応答する可能性があるかを示すことができる。例えば、ある特定の実施形態において、ＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療される患者は、３００ポイントスケールに対して、少なくとも９０のＡＳＣＬ１  Ｈスコア（すなわち、腫瘍はＡＳＣＬ１＋である）を有する。他の実施形態において、本発明において示されているＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療される患者は、少なくとも１２０のＡＳＣＬ１  Ｈスコアを有する。さらに他の実施形態において、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療される患者は、少なくとも１８０のＨスコアを有する。本開示の目的に関すると、３００ポイントスケールに対する９０以上のＨスコアを示すいずれの腫瘍も、以下にさらに記載されている、ＡＳＣＬ１の転写標的の標的化を含めた、神経内分泌腫瘍を治療するのに有用な任意の公知の治療法により治療する、ＡＳＣＬ１＋及び対象と考えられる。
【００５５】
他の選択された実施形態において、２００ポイントスケールを含むＨスコアを使用して、本明細書において開示されている治療に対応する可能性のある患者を選択又は診断することもできる。このような２００のＨスコアスケールの場合、１２０のＨスコアは、３００Ｈスコアスケールに対する１８０のＨスコアにほぼ等しい。両方の場合（例えば、１２０／２００又は１８０／３００）において、このようなＨスコアは、ポジティブとして分類され得（例えば、これらのＨスコアがどちらも、３００ポイントスケールに対して９０のＨスコア超となる、及び／又は構成細胞の≧１０％が以下に記載されているＡＳＣＬ１を発現する場合のＡＳＣＬ１＋）、本発明の治療法に好都合に応答し得る患者を示唆する。
【００５６】
他の実施形態において、患者選択は、腫瘍試料においてポジティブに染色された細胞の割合を測定することに基づき得る。この点に関して、マーカー抗体、例えば抗ＡＳＣＬ１抗体により求めた場合、ＩＨＣ試料においてポジティブに染色された細胞のある割合を示す患者は、ＡＳＣＬ１＋と見なされ、本明細書における教示に準拠した治療に選択される。このような実施形態において、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超又は５０％超の正の細胞染色を示す腫瘍試料は、正の細胞率として測定した場合、マーカー（例えば、ＡＳＣＬ１＋）に対してポジティブと分類され得る。他の実施形態において、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超又は９５％超の正の細胞染色を示す腫瘍試料は、正の率として測定した場合、マーカーポジティブと分類され得る。ある特定の好ましい態様において、ＡＳＣＬ１＋腫瘍は、ポジティブ率として測定した場合、構成細胞の≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧４０％又は≧５０％でＡＳＣＬ１を発現する。上述の実施形態の各々において、ＡＳＣＬ１ポジティブ率となる腫瘍を罹患している患者は、本明細書において示されている、ＤＬＬ３  ＡＤＣより治療され得る。ＡＳＣＬ１マーカーが例示されているが、他の開示されたマーカー（例えば、ＰＥＧ１０及びＳＲＲＭ４）もまた、患者が本発明の治療レジメンに対する候補になるかどうか、及びこの範囲に明示的に含まれるかについて予測となることが理解される。
【００５７】
さらに他の実施形態において、患者選択は、ある種の強度でマーカーの正の細胞染色率に基づいて予測され得る。例として、＞２０％の細胞が２＋以上のＡＳＣＬ１強度を示す腫瘍は、ＡＳＣＬ１＋である、及びＤＬＬ３  ＡＤＣによる治療に対する候補となる。他の実施形態において、マーカー抗体（例えば、抗ＡＳＣＬ１抗体）により染色させて、本明細書に開示されている標準ＩＨＣプロトコルに従って試験した場合に、≧２０％、≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％又は≧８０％の腫瘍細胞が強度＋１以上を示す場合、患者は、ＤＬＬ３  ＡＤＣ又は他の化学治療剤による治療に対する候補となる。他のある特定の実施形態において、マーカー抗体により染色させて、本明細書に開示されている標準ＩＨＣプロトコルに従って試験した場合に、≧２０％、≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％又は≧８０％の腫瘍細胞が強度２以上を示す場合、患者は、ＤＬＬ３  ＡＤＣ又は他の化学治療剤による治療に対する候補となる。さらに他の選択された実施形態において、マーカー抗体により染色させて、本明細書に開示されている標準ＩＨＣプロトコルに従って試験した場合に、≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧４０％又は≧５０％の腫瘍細胞が強度１以上を示す場合、患者は、ＤＬＬ３  ＡＤＣ又は他の化学治療剤による治療に対する候補となる。さらに他の実施形態において、マーカー抗体により染色させて、本明細書に開示されている標準ＩＨＣプロトコルに従って試験した場合に、≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧４０％又は≧５０％の腫瘍細胞が強度２以上を示す場合、患者は、ＤＬＬ３  ＡＤＣ又は他の化学治療剤による治療に対する候補となる。さらに別の実施形態は、腫瘍細胞を含む腫瘍を有する対象を治療する方法を含み、この場合、マーカー抗体により染色させて、抗ＤＬＬ３  ＡＤＣを投与するステップを含む、標準ＩＨＣプロトコルに準拠して試験した場合に、≧１０％の腫瘍細胞が１＋以上の強度を示す。前述の実施形態の各々に関すると、マーカー抗体による染色強度は、標準病理技術又は当業者が精通している方法論を使用して容易に決定され得ることが理解される。
【００５８】
ある特定の態様において、本発明は、腫瘍試料におけるＡＳＣＬ１発現の検出によって、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートにより治療するための対象を選択する方法を提供する。このような方法は、（ａ）対象から得られた腫瘍試料を抗ＡＳＣＬ１抗体と接触させるステップ、（ｂ）腫瘍試料における抗ＡＳＣＬ１抗体を検出するステップ、及び（ｃ）抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）により治療するＡＳＣＬ１＋腫瘍試料を有する対象を選択するステップを含むことができる。同時に又は逐次に、本明細書において開示されている追加のマーカー（例えば、ＰＥＧ１０、ＳＲＲＭ４、ＲＢ１、ＲＥＳＴ、ＳＡＭ、ＳＰＤＥＦ、ＰＴＧＥＲ４及びＥＲＧ）の１種以上に特異的に結合する抗体を使用して、神経内分泌移行のリスクをさらに評価する、又は特徴づけることができる。例えば、特定のマーカーとの組合せを、様々なリスクのレベルの表示として定量化して、抗ＤＬＬ３  ＡＤＣ治療を含めた適切な治療の選択に導くことができる。ある特定の実施形態において、腫瘍試料は、相対的に低いレベルのＤＬＬ３を発現する。
【００５９】
上で議論されている通り、ある種のマーカーレベル及びＤＬＬ３発現は、対照試料における基準発現レベルに比べて、低下又は低減する。より詳細には、神経内分泌表現型に移行するリスクのある腫瘍は、網膜芽細胞腫１（ＲＢ１）、リプレッサー要素１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、ＳＡＭポインテッドドメイン含有Ｅｔｓ転写因子（ＳＰＤＥＦ）、プロスタグランジンＥ２受容体４（ＰＴＧＥＲ４）及びＥＴＳ関連遺伝子（ＥＲＧ）からなる群から選択されるマーカーの１つを一層低いレベルで発現することができる。さらに、このような腫瘍は、相対的に低いレベルのＤＬＬ３タンパク質を発現することができ、ＡＳＣＬ１  ＤＬＬ３−／ｌｏｗとして分類され得、この場合、ＤＬＬ３−は、発現が検出不能レベルであること、又はほとんど検出可能なレベルではないことを示し、ＤＬＬ３ｌｏｗは、ある特定の腫瘍（例えば、腺癌）において見出されるＤＬＬ３レベルが相対的に低下したことを示す。この点において、ＤＬＬ３ｌｏｗは、対照試料の基準発現レベルと比較して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はこれを超える値で低下するＤＬＬ３発現レベルを含む任意の腫瘍を意味することが支持される（例えば、ＤＬＬ３＋又はｈｉ腫瘍）。ある特定の実施形態において、ＤＬＬ３発現は、対照試料における基準発現レベルと比較して、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はこれを超える値で低下する。さらに他の実施形態において、ＤＬＬ３発現は、対照試料における基準発現レベルと比較して、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はこれを超える値で低下する一方、他の実施形態において、ＤＬＬ３発現は、対照試料における基準発現レベルと比較して、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はこれを超える値で低下する。選択された実施形態において、ＤＬＬ３発現は、ＤＬＬ３＋腫瘍から得られた試料と比較して、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％、低下する。
【００６０】
他の実施形態において、腫瘍試料は、ＤＬＬ３を発現しないことが知られている対照腫瘍試料（ネガティブ対照）と比較され得る。このような比較が行われる場合、対象から得られる腫瘍試料は、この試料が、ネガティブ対照として、実質的に同じレベルのＤＬＬ３を示す場合、ＤＬＬ３−として分類され得る。
【００６１】
さらに他の実施形態において、ＤＬＬ３−／ｌｏｗ腫瘍は、本開示を鑑みて、ＩＨＣを使用して熟練病理学者により容易に特定され得る。より詳細には、腫瘍試料が得られて、好ましくは固定され、本明細書において開示されている抗ＤＬＬ３抗体により染色されて、当該技術分野で認識されている技術を使用して読み取ることができる。ある特定の実施形態において、ＤＬＬ３の発現は、適切なポジティブ対照及びネガティブ対照を使用して、病理学者によって視覚により決定され得る。他の実施形態において、スコア化は、誘導されたＨスコアに基づくことができ、腫瘍試料においてポジティブに染色された細胞の割合の測定を含むことができる。後者に関すると、腫瘍は、標準ＩＨＣ技術を使用して、約２０％、１５％、１０％、８％、５％、４％、３％、２％又は１％未満の細胞染色がポジティブとなる場合に、ＤＬＬ３−／ｌｏｗであると分かり得る。他の実施形態において、腫瘍は、本明細書に記載されているＤＬＬ３抗体を用いて求めた場合、約０．８％、０．６％、０．４％、０．２％又は０．１％未満の細胞染色がポジティブである場合に、ＤＬＬ３−／ｌｏｗであることが分かり得る。したがって、好ましい態様において、本発明は、腫瘍に罹患している患者の治療を含み、ＤＬＬ３抗体を用いて求めた場合、ＤＬＬ３−／ｌｏｗ腫瘍中の細胞の割合は、約１０％未満である。別の好ましい態様において、本発明は、腫瘍に罹患している患者の治療を含み、ポジティブに染色されるＤＬＬ３−／ｌｏｗ腫瘍における細胞の割合は、ＤＬＬ３抗体を用いて求めた場合、約５％未満である。及び、別の好ましい態様において、本発明は、腫瘍に罹患している患者の治療を含み、ポジティブに染色されるＤＬＬ３−／ｌｏｗ腫瘍における細胞の割合は、ＤＬＬ３抗体を用いて求めた場合、約１％未満である。
【００６２】
他の実施形態において、当業者は、相対強度、染色パターン、試料起源及び調製、使用した抗体及びレポーターなどのような要因に基づいて、スライドを観察した際に、何がＤＬＬ３−／ｌｏｗ腫瘍を構成しているかについて定性的に判断をすることができる。先に言及したように、ＤＬＬ３発現のレベルに関する任意の判定は、適切なポジティブ対照及びネガティブ対照の文脈において行われ、相対的な精度である。したがって、このような決定は、どの患者が本明細書に記載されているＤＬＬ３  ＡＤＣによる治療に感受性があるかについての標識となる。
【００６３】
より一般に、本明細書における教示に基づいて、当業者であれば、いくつかの適合技術を使用して、及び潜在的な神経内分泌腫瘍として、どの腫瘍がＤＬＬ３−／ｌｏｗ表現型を含むか、開示されている方法を使用して、抗ＤＬＬ３  ＡＤＣによる治療に対する候補となるかを容易に判定することができる。
【００６４】
さらに、このような方法において使用するための代表的な抗体は、本明細書において提示されている実施例に記載されている通りに生じた新規な抗ＤＬＬ３及び抗ＡＳＣＬ１抗体を含む。図１Ａ及び１Ｂ並びに図３Ａ及び３Ｂは、多数の抗ＤＬＬ３及び抗ＡＳＣＬ１結合ドメインの注釈つき配列をそれぞれ提示している。より詳細に、ＡＳＣＬ１抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のアミノ酸配列が、それぞれ、図３Ａ及び図３Ｂに図示されており、配列番号５２１〜５７３の奇数により表される。同様に、開示した診断方法及び治療方法と適合性のある、代表的な抗ＤＬＬ３抗体は、図１Ａ及び１Ｂに示されている（配列番号：２１〜４０７、奇数）。
【００６５】
Ｃ．  神経内分泌移行のリスクを伴う標的治療
標的がん治療は、本明細書で使用する場合、特定のタイプのがんを標的とする、腫瘍に関連する特定の分子を標的とする、並びに／又は腫瘍発生、腫瘍生存、腫瘍成長及び／若しくは転移に必要な特定の分子を標的とする治療法である。標的化がん治療法は、腫瘍の根本的な分子変化に特異的な治療剤を調和させるという利益をもたらし、正常細胞及び組織に対する毒性副作用を最小化すると同時に、腫瘍細胞に対して選択的な阻害作用の改善をもたらす。この戦略には、腫瘍における、標的とするがんドライバー発がん遺伝子変異又は遺伝子発現経路の変更が含まれる。一例として、前立腺がんの成長にとって必須のアンドロゲンを除去する、アンドロゲン遮断療法は、前立腺腺癌を有する多数の患者に対して有効な治療である。別の例として、一部の肺腺癌において発生する、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）タンパク質又は未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）遺伝子座における腫瘍特異的異常は、エルロチニブ及びゲフィチニブのようなＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＥＧＦＲ−ＴＫＩ）によって、又はクリゾチニブ及びセリチニブのような標的化ＡＬＫ阻害剤（Ｒｏｖｉｅｌｌｏ、ＰＭＩＤ：２６０８２４２１）によって、それぞれ標的とされ得る。
【００６６】
標的治療を使用すると、初期臨床応答が観察される場合が多いにもかかわらず、多数の患者は、結局、様々な機構により、薬剤への耐性を発症する。さらに、本発明者は、標的治療により治療された腫瘍は、非標的治療、すなわち化学療法及び放射線のような多数の又は全ての腫瘍タイプに対して有効な治療法により治療されている腫瘍と比較すると、神経内分泌表現型への移行の発生率がより高くなることを示すことを発見した。
【００６７】
抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートは、神経内分泌表現型に移行するリスクのある、いかなる腺癌を治療するためにも使用され得るが、本発明の特定の態様において、腺癌は、これらのがんタイプの治療のために現在、使用中の標的治療が行われている、前立腺がん、肺がん又は膀胱がんである。
【００６８】
Ｃ．１肺がん
上記の通り、活性化しているＥＧＦＲ変異を有する肺腺癌を有する患者は、ＥＧＦＲ阻害剤（例えばＥＧＦＲ−ＴＫＩ）を使用する、標的治療により治療され得る。活性化している上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）変異は、上皮成長因子受容体の活性化をもたらす任意の変異である。例えば、活性化しているＥＧＦＲ変異は、ＥＧＦＲエクソン１９の欠失、又はＥＧＦＲのエクソン２１におけるＬ８５８Ｒポイント変異を含むことができる。
【００６９】
活性化しているＥＧＦＲ変異を有するがん細胞は、ＥＧＦＲ阻害剤により治療され、ＥＧＦＲ阻害剤治療法に対する耐性を獲得するおそれがある。ＥＧＦＲ阻害剤治療法に抵抗性の腫瘍細胞は、神経内分泌表現型に移行するリスクがある。獲得した抵抗性のいくつかの機構は知られており、例えば、７９０位（Ｔ７９０Ｍ）におけるメチオニンのスレオニンへの置換、小細胞形質転換、ＭＥＴ増幅、上皮−間葉細胞分化移行及びＰＩＫ３ＣＡ変異を含む。
【００７０】
ＥＧＦＲ−ＴＫＩへの抵抗性は、１０カ月のメジアン時間後に観察される。獲得した抵抗性の主要機構は、５０〜６５％の患者に見られる、優性の第二点ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異の発生である。ＥＧＦＲ−ＴＫＩ治療の前に、腫瘍に存在する微量のアレルを表し得るゲートキーパー変異は、薬物がＥＧＦＲタンパク質の活性な立体構造に結合する能力を妨害する。ディープシークエンシング技術により、最大６８％の患者において、ＥＧＦＲ−ＴＫＩによる治療前に、事前に存在しているＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍクローンが検出されること、及びＥＧＦＲ−ＴＫＩによる治療は、このような阻害剤に対して抵抗性があるＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ腫瘍を発生させることが示された（Ｗａｔａｎａｂｅ  Ｍ．ら、２０１５年）。第２世代のＥＧＦＲ−ＴＫＩ（例えば、ダコミチニブ、アファチニブ及びネラチニブ）は、ＥＧＦＲに対してより高い親和性を有するが、獲得した抵抗性を有する患者において活性は制限されていることを示している。代替的に、セツキシマブのような抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩに対して抵抗性を獲得した後、ある臨床的利益を示すが、第２世代のＥＧＦＲ−ＴＫＩを有するこれらの抗体との組合せは、有害な副作用を有する。初期活性化されているＴ７９０Ｍ耐性変異と主に獲得されたＴ７９０Ｍ耐性変異との両方を選択的に標的とするよう設計されている、第３世代のＥＧＦＲ−ＴＫＩ（例えば、ロシレチニブ及びＡＺＤ９２９１）は、初期試験において臨床的活性を示すが、他の発がん性シグナル伝達分子の増幅は、結局、患者にロシレチニブ耐性を生じることがある（Ｈａｒｉｎｇｓｍａら、２０１５年）。ＥＧＦＲ−ＴＫＩの場合と同様に、クリゾチニブのような標的化ＡＬＫ阻害剤を服用している患者は、標準化学療法よりも臨床的利益を示すが、再燃は不可避である。クリゾチニブへの獲得した抵抗性は、さらなる第二点ＡＬＫ変異又はＡＬＫ遺伝子増幅により、臨床において観察される（Ｒｏｖｉｅｌｌｏ  Ｇ．ら、２０１５年）。やはり、クリゾチニブ−抵抗性のこれらの機構はどちらも、標的治療のために、選択圧の文脈において、改変された標的特性を有する腫瘍細胞サブクローンの発生を示すことがある。
【００７１】
標的治療への獲得した抵抗性の代替的な機構は、治療的標的における、二次変異又は遺伝子増幅の獲得、又はこれらの選択を含まない。代わりに、腫瘍は、組織型形質変換を受けるように思われる。例えば、ＥＧＦＲ−変異体肺腺癌の約１０〜１５％において、これらの腫瘍は、元のＥＧＦＲ変異を維持する一方、これらの腫瘍は、ＥＧＦＲ−ＴＫＩにもはや応答せず、代わりに組織型形質転換を示し、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）に似ている（Ｎｉｅｄｅｒｓｔ  Ｍ．Ｊ．ら、２０１５年、Ｓｅｑｕｉｓｔ  Ｌ．Ｖ．ら、２０１１年）。ＳＣＬＣ形質転換により第３世代のＥＧＦＲ−ＴＫＩに対して獲得した抵抗性は、再燃後に生検をした１２名の患者のうち２名に観察された（１７％）ことは特筆すべきことである（Ｐｉｏｔｒｏｗｓｋａ  Ｚ．ら、２０１５年）。個別に、第３世代のＥＧＦＲ−ＴＫＩによる治療後に、ＳＣＬＣに移行するＥＧＦＲ変異肺腺癌の２種のさらなる例が、報告されている（Ｈａｍ  Ｊ．Ｓ．ら、２０１５年）。ＳＣＬＣに形質転換したＥＧＦＲ−変異体肺腺癌から生成した細胞株は、ゲフィチニブに対して、及び第３世代のＥＧＦＲ−ＴＫＩ  ＷＺ４００２に対して抵抗性である（Ｎｉｅｄｅｒｓｔ  Ｍ．Ｊ．ら、２０１５年）。これらの腫瘍におけるＥＧＦＲ変異状態は、元の腫瘍に比べて変化していないので、ＥＧＦＲ−ＴＫＩへの応答の欠如は、ＥＧＦＲ発現の低下又はサイレンシングを反映している（Ｎｉｅｄｅｒｓｔ  Ｍ．Ｊら、２０１５年）。ＳＣＬＣ表現型への移行は、神経内分泌マーカーの発現、ＡＳＣＬ１発現の獲得、及びＲＢ１の喪失又は低下を含む、遺伝的変化の獲得を伴う（Ｎｉｅｄｅｒｓｔ  Ｍ．Ｊ．ら、２０１５年）。
【００７２】
耐性機構としてＡＬＫにより再配列された肺腺癌のＳＣＬＣへの形質転換が、ＡＬＫ阻害剤標的治療であるクリゾチニブ及びアレクチニブに応答した６名の患者においてやはり報告された（Ｌｅｖａｃｑ  Ｄ．ら、２０１６年；Ｆｕｊｉｔａ  Ｓ．ら、２０１６年；Ｃａｕｍｏｎｔ  Ｃ．ら、２０１６年；Ｃｈａ  Ｙ．Ｊ．ら、２０１６年；Ｔａｋｅｇａｗａ，Ｎ．ら、２０１６年；Ｍｉｙａｍｏｔｏ  Ｓ．ら、２０１６年）。これらの形質転換した腫瘍は、ＡＬＫ転座を保持しており、ＲＢ１、ＴＰ５３及びＰＴＥＮの喪失及び変異を含めた、ＳＣＬＣにおいて通常、観察される、さらなる変異を得る。時として、これらの腫瘍は、腺癌とＳＣＬＣとの両方の混合体を保持しており、化学治療剤及び標的剤は、クローン検出に影響を及ぼす。
【００７３】
ＥＧＦＲ−変異体肺腺癌はまた、ＥＧＦＲ−ＴＫＩによる治療の間に、大細胞神経内分泌癌（ＬＣＮＥＣ）への組織型形質転換を受けることがやはり観察された（Ｋｏｇｏ  Ｍ．ら、２０１５年）。一例において、元の腫瘍は、ＩＨＣによって検出された、ＥＧＦＲ及びＲＢ１タンパク質を発現したが、ＬＣＮＥＣへの形質転換後、ＥＧＦＲとＲＢ１タンパク質の両方の発現が失われる一方、ＥＧＦＲ変異は保持された（Ｋｏｇｏ  Ｍ．ら、２０１５年）。同様に、獲得されたＡＬＫ阻害剤であるクリゾチニブに対する抵抗性は、ＬＣＮＥＣへの移行によって起こることが報告された（Ｏｍａｃｈｉ  Ｎ．ら、２０１４年；Ｃａｕｍｏｎｔ  Ｃ．ら、２０１６年）。やはり、元のＡＬＫ融合がＬＣＮＥＣ細胞において維持される一方、耐性をもたらすことができないさらなるＡＬＫ変異は検出されなかった。
【００７４】
標的治療抵抗性をもたらす二次変異の獲得において観察される通り、ＳＣＬＣに形質変換した非小細胞肺腫瘍の発生は、元の異種性腫瘍に由来する腫瘍細胞サブクローンを選択する可能性がある。非小細胞肺がんとして分類されるにもかかわらず、約１０〜２０％の非小細胞肺がんは、ある神経内分泌特性（Ｂｅｒｅｎｄｓｅｎ  Ｈ．Ｈ．ら、１９８９年）を示し、肺腺癌のサブセット（３０／１７１；１７％）は、ＡＳＣＬ１及び他の神経内分泌遺伝子を発現し、予後は不良である（Ｆｕｊｉｗａｒａ  Ｔ．ら、２０１１年）。標的治療が、腫瘍異種性により腫瘍表現型の変化を媒介することができるということは、エルロチニブにより治療され、この腫瘍がＳＣＬＣへの形質変換を受けた、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ変異を有する肺腺癌と診断された患者の場合により例示される。ＳＣＬＣ腫瘍は、ＰＩＫ３ＣＡにおける活性化している変異、及びＴＰ５３とＲＢ１の両方の喪失又は低減を含めた一般的なＳＣＬＣ変異を獲得すると同時に、類似のアレル頻度を有する元のＥＧＦＲ変異を保持した。ＳＣＬＣに対する標準治療である、シスプラチン／エトポシドによる、形質変換したＳＣＬＣ腫瘍の治療により、エルロチニブにやはり感受性であった、Ｌ８５８Ｒ  ＥＧＦＲ変異を有する肺腺癌の再発生がもたらされた。検死の時に、この患者は、肺及び肝臓において、２つのＳＣＬＣに形質変換した腫瘍、及び腺癌の組織学を有する肺病変を保持した。３つの部位は全て、元のＥＧＦＲ変異を保持し、腺癌病変はＴ７９０Ｍ耐性変異を保持する一方、ＳＣＬＣ病変は、保持しなかった（Ｎｉｅｄｅｒｓｔ  Ｍ．Ｊ．ら、２０１５年）。まとめると、これらのデータは、元の腫瘍に存在している希な神経内分泌細胞と一致しており、元の腫瘍は、標的化治療による選択圧力の関連において、腫瘍のバルクとなるが、ただし、さらなる変異が存在する、又は獲得される（例えば、ＲＢ１の喪失又は低減）条件とする。
【００７５】
本明細書における実施例において実証されている通り、ＤＬＬ３発現は、ＥＧＦＲ阻害剤治療法に対して抵抗性であり、かつ神経内分泌表現型に移行した肺腺癌において増加する。本発明は、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートが、ＥＧＦＲ阻害剤治療法を受けた患者を含め、神経内分泌表現型に移行するリスクがあると特定された肺腺癌を有する患者に対して効果的な治療的処置戦略として使用され得ることを提供する。
【００７６】
このような腫瘍は、通常、再発性、不応性、再燃性又は抵抗性である。本発明の特定の態様において、肺腺癌腫瘍は、ＥＧＦＲ阻害剤治療法により以前に治療された非小細胞肺がんを含む。
【００７７】
Ｃ．２．前立腺がん
耐性機構としての組織型形質変換は、肺腺癌に限定されない。標的治療に応答する腫瘍の形質変換は、前立腺腺癌においても観察される。早期の前立腺腺癌は、放射線により治療される一方、局所進行型及び転位型前立腺腺癌は、内科的又は外科的去勢により治療されて、アンドロゲン受容体（ＡＲ）推進性腫瘍成長を標的とする（Ｐａｒｉｍｉ  Ｖ．ら、２０１４年）。しかし、大部分の患者は、結局、再燃し、アンドロゲン遮断療法に抵抗性となり、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＰＲＣ）と呼ばれる疾患の致死期へと進行する。２０１５年において、ＣＰＲＣにより、米国では２７，５４０名の男性が死亡していると推定され（米国がん協会）、ＣＲＰＣの場合の５年間の全生存率は、１２．６％であり、ＣＲＰＣは、最も致死性の高い、前立腺がんの侵襲的なサブタイプとなっている。肺腺癌の場合に観察されるものと同様に、ＣＲＰＣにおける標的治療の抵抗性の発症の根本となる機構は様々であるが、（１）二次変異又はＡＲ増幅の獲得による、ＡＲシグナル伝達の回復、（２）ＡＲシグナル伝達経路における、他の発がん性ドライバーの獲得による、ＡＲタンパク質により媒介される直接的なシグナル伝達のバイパス、又は（３）ＡＲと完全に無関係なものに群分けされ得る（Ｗａｔｓｏｎら、２０１５年）。留意すべきことに、ＣＲＰＣにおいてＡＲと完全に無関係であることは、小細胞神経内分泌特徴を有する組織学的に形質変換された腫瘍として現れ得る（例えば、ＣＨＧＡ、ＥＮＯ２、ＮＣＡＭ１、ＳＹＰなどのような標準的な神経内分泌マーカーの発現）。ＳＣＬＣを推進する主要な神経内分泌転写因子である、ＡＳＣＬ１は、アンドロゲン遮断により上方調節され、ＣＲＰＣにおける神経内分泌表現型の発症と関連している（Ｒａｐａ  Ｉ．ら、２０１３年）。ＲＢ１の喪失又は低減、並びにＡＵＲＫＡ及びＭＹＣＮの同時過剰発現が、ＣＲＰＣにおいて高められる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｄ．ら、２０１５年、Ｂｅｌｔｒａｎ  Ｈら、２０１１年）。
【００７８】
小細胞神経内分泌表現型を有する腫瘍へのＣＲＰＣの形質変換により、個別の臨床的特徴：大型の腫瘍塊を伴う迅速な進行、内臓疾患の高い頻度、頻度の高い骨転移、及びより大きな疾患負荷に対する不均衡な程の低いＰＳＡレベル、ホルモン療法に対する応答不良、及び化学治療剤に対する短い応答（メジアン生存は１年）を有する疾患が、もたらされる（Ａｐａｒｉｃｉｏ  Ａ．ら、２０１１年）。ＣＲＰＣで死亡した検死患者の約１０〜２０％は、小細胞の神経内分泌分化を有する（Ｔｕｒｂａｔ−Ｈｅｒｒｅｒａ  Ｅ．Ａ．ら、１９８８年；Ｔａｎａｋａ  Ｍ．ら、２００１年）。神経内分泌分化の程度は、疾患進行に伴って、及びアンドロゲン遮断療法に応答して向上する（Ｐａｒｉｍｉ  Ｖ．ら、２０１４年）。全アンドロゲン遮断治療法が最近に現れ、神経内分泌特徴を有するＣＲＰＣがかなり向上し得る（Ｚｈａｎｇ  Ｘ．、２０１５年）。アンドロゲン遮断療法と神経内分泌分化を有するＣＲＰＣの発症との間の直接的な因果関係は、断続的なアンドロゲン遮断療法と連続アンドロゲン遮断療法とを比較した検討によってさらに支持され、この場合、断続的アンドロゲン遮断により、神経内分泌分化が遅延又は予防されることが観察された（Ｓｃｉａｒｒａ  Ａ．、２００３年）。
【００７９】
どの前立腺腫瘍が神経内分泌移行を受けるかを判定する要因は、十分に理解されていない。あるデータは、ほとんど全ての前立腺腺癌腫瘍は、局所神経内分泌分化の部位が異種性であることを示唆している（Ｃｉｎｄｏｌｏ  Ｌ．ら、２００７年；Ｎｅｌｓｏｎ  Ｃ．Ｅ．ら、２００７年）。神経内分泌細胞は、決まった手法であるヘマトキシリン及びエオシン染色により、典型的な腺癌細胞と判別不能であるが、典型的な神経内分泌免疫組織化学を用いて区別することができる（ＣＨＧＡ、ＳＹＰ、ＮＣＡＭ１など；Ｐｒｉｅｍｅｒ  Ｄ．Ｓ．ら、２０１６年）。神経内分泌細胞の数は、新生物の進行速度と関連しており、神経内分泌細胞のクラスターは、個々の単離された神経内分泌細胞とは反対に、予後不良を伴う（Ｃｉｎｄｏｌｏ  Ｌ．ら、２００７年）。希な神経内分泌細胞は、迅速に増殖する細胞を支援して血管新生を促進する、神経ペプチド及び成長因子の生成による、前立腺腺癌の一因となり得る。ＲＢ１の喪失若しくは低減、又はＭＹＣの増幅のようなさらなる遺伝的変異は、小細胞の神経内分泌表現型への完全移行のさらなる一因となり得る。神経内分泌移行の発症時に発現されることが示された早期マーカーの１つは、ＰＥＧ１０である（Ａｋａｍａｔｓｕ  Ｓ．ら、２０１５年）。大幅に上方調節される別の遺伝子は、ＰＴＧＥＲ４（Ｔｅｒａｄａ  Ｎ．ら、２０１０年）である一方、スプライシングの変化による、ＳＲＲＭ４発現、及びＲＥＳＴ活性の喪失又は低減もまた、ＣＲＰＣにおける神経内分泌（ｎｅｕｒｏｅｎｄｒｏｃｒｉｎｅ）表現型の発症に関連している（Ｚｈａｎｇ  Ｘ．ら、２０１５年）。ＲＥＳＴは、非ニューロン組織におけるニューロン遺伝子発現の既知のリプレッサーであり、したがって、この喪失又は低減は、神経内分泌遺伝子の上方調節に進行するおそれがある。
【００８０】
一般に、形態学的にＮＥに形質転換したＣＲＰＣ（ＣＲＰＣ−ＮＥ）は、腺癌形態を保持するＣＲＰＣ（ＣＲＰＣ−Ａｄ）に類似した変異状況を有する。ＣＲＰＣ−ＮＥ腫瘍は、ＡＲ変異がほとんどないこと、ＲＢ１の喪失又は低減があること、ＴＰ５３の変異若しくは喪失若しくは低減があること、及びＣＹＬＤの喪失又は低減があること、ＳＰＤＥＦ発現の過剰メチル化及び喪失若しくは低減があること、並びにＥＺＨ２発現がより高いにもかかわらず、より少ないＡＲタンパク質発現を有する点で、ＣＲＰＣ−Ａｄ腫瘍と区別され得る（Ｂｅｌｔｒａｎ  Ｈ．ら、２０１６年）。ＣＲＰＣ−ＮＥの発症前及び発症後の患者由来の、並びに抵抗性腫瘍発症の２つのタイプ（Ｔ７９０Ｍ  ＥＧＦＲ変異を有するＣＲＰＣ−ＡｄとＣＲＰＣ−ＮＥの両方）を有する患者由来の複数の生検試料の評価は、同様の分子遺伝学により複数のクローンを生じさせる共通の腺癌前駆体が、転移性ＣＲＰＣのクローンの分岐進化への方向性を指し示すという議論をかき立てている（Ｂｅｌｔｒａｎ  Ｈら、２０１６年）。ＣＲＰＣ−ＮＥにおいて見られる、ＤＮＡメチル化異常を主に有する同一患者における、ＣＲＰＣ−ＡｄとＣＲＰＣ−ＮＥの腫瘍間の大きなエピジェネティックな差異が存在しており（Ｂｅｌｔｒａｎ  Ｈら、２０１６年）、このことは、ＮＥ状態への移行に、エピジェネティックな調節異常が含まれることを示唆している。
【００８１】
アンドロゲン遮断療法及び神経内分泌分化の関連性に加えて、放射線療法もまた、前立腺がんの神経内分泌分化を誘発し得ることが示されており、放射線療法により治療された患者は、血清のクロモグラニンＡレベルが向上することを示し、腫瘍における神経内分泌細胞の増加を示す（Ｈｕ  Ｃ．Ｄ．ら、２０１５年）。この考えは、希な神経内分泌細胞が、元の異種性前立腺腺癌に存在している可能性が高いこと、及び腫瘍のバルクを有効に根絶することができる治療時に、希な神経内分泌細胞は、これらの治療法に抵抗性であり、腫瘍の性質を転換するという発想を支持するものである。
【００８２】
大型細胞の神経内分泌表現型は、従来の腺癌と小細胞の神経内分泌癌との間の移行段階であると提唱もされているが、多くの場合、腫瘍異種性が観察され、３つの表現型の全てが、同一腫瘍に存在している（Ａｐａｒｉｃｉｏ  Ａ．ら、２０１１年；Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｊ．Ｌ．ら、２０１４年）。全ての前立腺腺癌のおよそ半分が、ＥＲＧ又は別のＥＴＳ遺伝子ファミリーメンバーを発現し、ＥＲＧは、神経内分泌分化に関与する遺伝子を抑制する（Ｍｏｕｎｉｒ  Ｚ．ら、２０１５年）。アンドロゲン遮断療法はＥＲＧを下方調節し、アンドロゲン遮断療法に抵抗性となる腫瘍における神経内分泌細胞の急速な増加をもたらす（Ｍｏｕｎｉｒ  Ｚ．ら、２０１５年）。同様に、ＡＲの遺伝子増幅は、ＣＲＰＣの発症、及び可能性として、神経内分泌表現型への分化においてある役割を果たしている（Ｐｒｉｅｍｅｒ  Ｄ．Ｓ．ら、２０１６年）。
【００８３】
ＣＲＰＣは、致死を迅速にもたらすので、神経内分泌表現型に移行するリスクのある患者は、転移性疾患の完全な発症が検出される前に、治療からの利益を受けることができる。腫瘍に存在する希な神経内分泌細胞を根絶しない標的治療による治療後に生じる、神経内分泌分化細胞を治療するために、新規な戦略が必要である。これらの治療戦略は、アンドロゲン遮断と組み合わせた、補助療法を含んで、ＣＲＰＣ発症を予防又は遮断することができる。代替的に、ＣＲＰＣの発症後のサルベージ治療が行われ得るが、疾患進行は非常に迅速であるので、転移性疾患を治療するよりもむしろ予防の方が好ましい。
【００８４】
本明細書における実施例において実証されている通り、ＤＬＬ３発現は、アンドロゲン遮断療法に対して抵抗性であり、かつ神経内分泌表現型に移行した前立腺腺癌において増加する。本発明は、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートが、アンドロゲン遮断療法を受けた患者のような、去勢抵抗性前立腺がんの患者を含めた、神経内分泌表現型に移行するリスクがあると特定された前立腺腺癌を有する患者に対して効果的な治療的治療戦略として使用され得ることを実現する。リスクのあるこれらの腫瘍は、多くの場合、再発性、不応性、再燃性又は抵抗性である。
【００８５】
Ｃ．３膀胱がん
本明細書において提示されている実施例に記載されている通り、ＤＬＬ３の正の細胞は、膀胱腺癌の試料中に存在している。小細胞の神経内分泌腫瘍は膀胱に発生し、非常に侵襲的であるが、おそらく、標的治療が欠如しているため、標準化学療法により治療された膀胱のＴＣＣは、小細胞の神経内分泌腫瘍に形質変換すると報告されてこなかった。神経内分泌癌と同時発生する腺癌が記載されており（Ｊｉａｎｇ  Ｙ  ２０１４年）、したがって、膀胱癌は、腫瘍不異種性のために、神経内分泌表現型に移行するリスクにあり得る。
【００８６】
本発明は、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートが、再発性、不応性、再燃性又は抵抗性の膀胱腫瘍を含めた、神経内分泌表現型に移行するリスクがあると特定された膀胱腺癌を有する患者に対して効果的な治療的治療戦略として使用され得ることを実現する。
【００８７】
Ｃ．４さらなる腺癌
デノボ小細胞又は神経内分泌腫瘍は、副腎、乳房、胆嚢、卵巣、子宮頚部、子宮内膜、腎臓、膵臓、結腸、胃及び甲状腺を含めた、追加の組織に非常に低い頻度で発生する。腺癌は、肺、結腸、膵臓、前立腺、乳房、食道、胃、腎臓、子宮頚部、子宮内膜及び甲状腺に由来する腺状構造を有する細胞に発生する。これらの腺癌の大部分の場合、腫瘍形成を推進する特異的な発がん経路を標的とする治療法は、未だ開発されていない。標的治療に対する抵抗性は、これらの腺癌の小細胞の形質転換によって生じ得る。
【００８８】
ＩＩＩ．ＤＬＬ３生理学
ＤＬＬ３の表現型決定因子が、神経内分泌特徴を示す新生物を含む様々な増殖性障害と臨床的に関連すること、並びにＤＬＬ３タンパク質及びこの変異体又はアイソフォームが、関連する疾患の治療に利用され得る有用な腫瘍マーカーを提供することが見出された。この点において、本発明は、抗ＤＬＬ３抗体標的薬剤及びペイロード（例えば、ＰＢＤ弾頭を含むペイロード）を含む、いくつかの抗体薬物コンジュゲートを提供する。以下でより詳細に議論されるように、本開示の抗ＤＬＬ３  ＡＤＣは、腫瘍形成性細胞を除去するのに特に有効であり、したがって、ある特定の増殖性障害又はこの進行若しくは再発の治療及び予防に有用である。
【００８９】
さらに、細胞表面ＤＬＬ３タンパク質のようなＤＬＬ３マーカー又は決定因子が、がん幹細胞（腫瘍永続細胞としても公知）と治療上関連し、これを除去するか又は無症状にするために効果的に利用することができることが見出された。本明細書で開示するような抗ＤＬＬ３コンジュゲートの使用によるがん幹細胞を選択的に減少させる又は除去する能力は、このような細胞が一般的に多くの従来の治療に抵抗性であることが公知であることから、驚くべきことである。すなわち、伝統的及び最近の標的治療方法の有効性は、これらの多様な治療方法にもかかわらず腫瘍成長を永続させることができる抵抗性がん幹細胞の存在及び／又は発生によってしばしば制限される。さらに、がん幹細胞に関連している決定因子は、低いか若しくは一貫性のない発現、腫瘍形成性細胞付随した状態に留まれないこと又は細胞表面上に存在できないことのために、しばしば不十分な治療標的である。従来技術の教示と極めて対照的に、本明細書に開示されたＡＤＣ及び方法は、この固有の抵抗性を効果的に克服し、このようながん幹細胞の分化を特異的に除去するか、枯渇させるか、沈黙させるか又は促進することにより、潜在する腫瘍成長を持続させるか又は再誘発するがん幹細胞の能力を無効にする。
【００９０】
したがって、本明細書において開示されているもののようなＤＬＬ３コンジュゲートは、選択された増殖性（例えば、新生物）障害又はこの進行若しくは再発の治療及び／又は予防に有利に使用され得る。本発明の好ましい実施形態は、とりわけ特定のドメイン、領域若しくはエピトープに関して又は神経内分泌特徴を含むがん幹細胞若しくは腫瘍及び本開示の抗体薬物コンジュゲートとのこれらの相互作用に関連して下記に詳細に議論されるが、当業者が、本発明の範囲がこのような例示的実施形態によって限定されないことを理解することが、理解される。むしろ、本発明の最も広範囲の実施形態及び添付の特許請求の範囲は、いかなる特定の作用機序又は特に標的とされる腫瘍、細胞若しくは分子成分にかかわらず、本開示の抗ＤＬＬ３コンジュゲート、並びに新生物障害又は細胞増殖性障害を含めた様々なＤＬＬ３関連障害若しくはＤＬＬ３媒介障害の治療及び／又は予防におけるこれらの使用を、広く及び明示的に対象としている。
【００９１】
線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）及びショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）において最初に同定され、続いて、無脊椎動物から脊椎動物まで進化的に保存されていることが示された、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路は、正常な胚発生、成人組織の組織ホメオスタシス及び幹細胞維持を含めた、基礎的な一連の生物学的過程に関与している（Ｄ’Ｓｏｕｚａら、２０１０年；Ｌｉｕら、２０１０年）。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、特異化、パターン形成及び形態形成の間、様々な細胞タイプにとって重要である。多くの場合、これは、側方阻害の機構により起こり、この場合、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する細胞は、デフォルトの細胞運命を選んで、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の刺激により、隣接細胞におけるこの運命をやはり抑制する（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、１９８８年；Ｃａｂｒｅｒａ  １９９０年）。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達によって媒介されるこの二者択一的な細胞運命の選択が、神経系の発達（ｄｅ  ｌａ  Ｐｏｍｐａら、１９９７年）、造血系及び免疫系（Ｂｉｇａｓ及びＥｓｐｉｎｏｓｏａ、２０１２年；Ｈｏｙｎｅら、２０１１年；Ｎａｇａｓｅら、２０１１年）、胃腸（Ｆｒｅら、２００５年；Ｆｒｅら、２００９年）、膵臓内分泌腺（Ａｐｅｌｑｖｉｓｔら、１９９９年；Ｊｅｎｓｅｎら、２０００年）、下垂体（Ｒａｅｔｚｍａｎら、２００４年）及びびまん性神経内分泌系（Ｉｔｏら．、２０００年；Ｓｃｈｏｎｈｏｆｆら、２００４年）を含めた、多数の組織においてある役割を果たすことが見出されている。この二者択一の切り替えを実行する一般化された機構は、進化系が幅広い範囲にあるにもかかわらず、保存されているように思われ、この場合、Ｎｏｔｃｈは、デフォルトの細胞運命の選択が、塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）タンパク質として知られている転写調節因子により決定される細胞において、ある役割を果たしており、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達により、あるクラスのＮｏｔｃｈ応答遺伝子の活性化がもたらされて、ひいては、ｂＨＬＨタンパク質の活性を抑制する（Ｂａｌｌ、２００４年）。これらの二者択一の決定は、進化やシグナル伝達の刺激の幅広い状況において起こり、このような刺激は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が増殖を実行したり又はこれを阻害したりして、自己再生の引き金となったり又はこれを阻害したりする。
【００９２】
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）において、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、１つのＮｏｔｃｈ受容体遺伝子、並びにセレート及びデルタとして知られている２つのリガンド遺伝子により主に媒介される（Ｗｈａｒｔｏｎら、１９８５年；Ｒｅｂａｙら、１９９１年）。ヒトにおいて、４種の公知のＮｏｔｃｈ受容体、及び５種のＤＳＬ（デルタ−セレートＬＡＧ２）リガンド（Ｊａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２として知られているセレートの２種のホモログ、並びにデルタ様リガンド又はＤＬＬ１、ＤＬＬ３及びＤＬＬ４と呼ばれる、３種のデルタのホモログ）が存在する。一般に、シグナル受信細胞の表面におけるＮｏｔｃｈ受容体は、対向するシグナル送信細胞の表面において発現されたリガンドとの相互作用（トランス相互作用と命名）によって活性化される。これらのトランス相互作用は、Ｎｏｔｃｈ受容体の一連のプロテアーゼ媒介性切断をもたらす。結果として、Ｎｏｔｃｈ受容体細胞内ドメインは、膜から核へと自由に転座し、核内で、転写因子のＣＳＬファミリー（ヒトにおけるＲＢＰＪ）とパートナーを組み、これをＮｏｔｃｈ応答性遺伝子の転写制御因子からアクチベーターへと変換する。
【００９３】
ヒトＮｏｔｃｈリガンドのうち、ＤＬＬ３は、トランス相互作用によりＮｏｔｃｈ受容体を活性化することができないと思われるという点において異なる（Ｌａｄｉら、２００５年）。Ｎｏｔｃｈリガンドは、シスで（同じ細胞において）Ｎｏｔｃｈ受容体と相互作用して、Ｎｏｔｃｈシグナルの阻害をもたらすこともできるが、シス阻害の正確な機構は、依然として不明であり、リガンドに応じて変動し得る（例えば、Ｋｌｅｉｎら、１９９７年；Ｌａｄｉら、２００５年；Ｇｌｉｔｔｅｎｂｅｒｇら、２００６年を参照）。２つの仮定される阻害機序として、トランス相互作用を防止することによって、あるいは受容体のプロセシングを撹乱することによる又は小胞体若しくはゴルジ内における受容体の保持を物理的に引き起こさせることによる、細胞表面におけるＮｏｔｃｈ受容体の量の低減によって、細胞表面におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達をモジュレートすることが挙げられる（Ｓａｋａｍｏｔｏら、２００２年；Ｄｕｎｗｏｏｄｉｅ、２００９年）。しかし、隣接する細胞におけるＮｏｔｃｈ受容体及びリガンドの発現の確率差分が、転写及び非転写プロセスの両方により増幅され得ること、並びにシス及びトランス相互作用の僅かなバランスが、隣接する組織における多様な細胞運命のＮｏｔｃｈ媒介性に関する描写の微調整をもたらし得ることが明らかである（Ｓｐｒｉｎｚａｋら、２０１０年）。
【００９４】
ＤＬＬ３（デルタ様３又はＳＣＤＯ１としても知られている）は、Ｎｏｔｃｈ  ＤＳＬリガンドのデルタ様ファミリーのメンバーである。代表的なＤＬＬ３タンパク質オルソログは、以下に限定されないが、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０５８６３７及びＮＰ＿９８２３５３）、チンパンジー（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００３３１６３９５）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３１８９２）及びラット（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿４４６１１８）を含む。ヒトにおいて、ＤＬＬ３遺伝子は、染色体１９ｑ１３に位置する９．５ｋＢｐに及ぶ８のエクソンからなる。最後のエクソン内の選択的スプライシングは、２種のプロセシングされた転写物を生じ、一方は２３８９塩基（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１６９４１）であり、もう一方は２０５２塩基（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿２０３４８６）である。前者の転写物は、６１８アミノ酸のタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０５８６３７；配列番号１）をコードする一方、後者は、５８７アミノ酸のタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿９８２３５３；配列番号２）をコードする。ＤＬＬ３のこれら２種のタンパク質アイソフォームは、これらの細胞外ドメイン及び膜貫通ドメインにわたって、全体として１００％の同一性を共有し、長い方のアイソフォームが、タンパク質のカルボキシ末端に３２個の追加残基を含有する延びた細胞質尾部を含有するという点しか違いがない。アイソフォームの生物学的な関連性は不明であるが、両方のアイソフォームが腫瘍細胞において検出され得る。一般に、ＤＳＬリガンドは一連の構造ドメイン：固有のＮ末端ドメイン、続いて保存されているＤＳＬドメイン、複数のタンデム上皮成長因子（ＥＧＦ）様リピート、膜貫通ドメイン、及びリガンド間で高度には保存されていないが、固有のＥ３ユビキチンリガーゼによる潜在的なユビキチン化部位である複数のリジン残基を含む細胞質ドメインから構成される。ＤＳＬドメインは、Ｎｏｔｃｈ受容体との相互作用に必要であるが、不十分な変性ＥＧＦドメインである（Ｓｈｉｍｉｚｕら、１９９９年）。さらに、大部分のＤＳＬリガンドの最初の２つのＥＧＦ様リピートは、ＤＯＳドメインとして知られるより小さいタンパク質配列モチーフを含み、これはＮｏｔｃｈシグナル伝達が活性化されると、ＤＳＬドメインと協同的に相互作用する。
【００９５】
ＤＬＬ３タンパク質の細胞外領域は、６つのＥＧＦ様ドメイン、１つのＤＳＬドメイン及びＮ末端ドメインを含む。一般に、ＥＧＦドメインは、ｈＤＬＬ３（配列番号１及び２）のほぼアミノ酸残基２１６〜２４９（ドメイン１）、２７４〜３１０（ドメイン２）、３１２〜３５１（ドメイン３）、３５３〜３８９（ドメイン４）、３９１〜４２７（ドメイン５）及び４２９〜４６５（ドメイン６）において発生すると認識されており、ＤＳＬドメインは、ほぼアミノ酸残基１７６〜２１５に、Ｎ末端ドメインは、約アミノ酸残基２７〜１７５において発生する。ＥＧＦ様ドメインのそれぞれ、ＤＳＬドメイン及びＮ末端ドメインは、別個のアミノ酸配列によって定義されるＤＬＬ３タンパク質の一部を含む。本開示の目的のため、それぞれのＥＧＦ様ドメインが、ＥＧＦ１〜ＥＧＦ６と命名され得、ＥＧＦ１がタンパク質のＮ末端部分に最も近くなることに留意されたい。タンパク質の構造組成に関して、本発明の重要な一態様は、開示されているＤＬＬ３モジュレーターが、選択されたドメイン、モチーフ又はエピトープと反応するように、生成、製作、操作又は選択され得ることである。ある特定の場合、このような部位特異的モジュレーターは、これらの主要な作用機序に応じて、反応性及び／又は有効性の増強をもたらすことができる。特に好ましい実施形態において、抗ＤＬＬ３  ＡＤＣは、ＤＳＬドメインに結合し、さらにより好ましい実施形態において、ＤＳＬドメイン内のＧ２０３、Ｒ２０５、Ｐ２０６（配列番号４）を含むエピトープに結合する。
【００９６】
本明細書において使用する場合、用語「成熟タンパク質」又は「成熟ポリペプチド」は、本明細書において使用される場合、哺乳動物細胞での発現により産生されるタンパク質の形態を指すことに留意されたい。粗面小胞体を通過する成長中のタンパク質鎖の輸送が一旦、開始されると、哺乳類細胞により分泌されるタンパク質はシグナルペプチド（ＳＰ）配列を有しており、この配列が完全なポリペプチドから切断されて「成熟した」形態のタンパク質が産生されると一般に仮定されている。ＤＬＬ３のどちらのアイソフォームにおいても、成熟タンパク質は、細胞表面発現前に切り取られ得る２６アミノ酸のシグナルペプチドを含む。したがって、成熟タンパク質において、Ｎ末端ドメインは、タンパク質の２７位からＤＳＬドメインの始まりまで延びる。当然ながら、タンパク質がこのようにプロセシングされない場合、Ｎ末端ドメインは配列番号３及び４の１位まで延びるよう保たれ得る。
【００９７】
様々なデルタ様リガンドのうち、ＤＬＬ３は、変性ＤＳＬドメインを含み、ＤＯＳモチーフを含まず、かつリジン残基を欠く細胞内ドメインを含むので、このファミリーの他のものとの相違が最も大きい。変性ＤＳＬ、及びＤＯＳモチーフの欠如は、ＤＬＬ３がトランスで（細胞間）Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を惹起できないことと一致し、ＤＬＬ３が、ＤＬＬ１又はＤＬＬ４とは異なり、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害因子としてしか作用しないことが示唆される（Ｌａｄｉら、２００５年）。検討により、ＤＬＬ３が主にシスゴルジに存在する可能性のあることが示されており（Ｇｅｆｆｅｒｓら、２００７年）、これは、Ｎｏｔｃｈ受容体を細胞内に留まらせる、又はＮｏｔｃｈ受容体のプロセシングを妨げることにより細胞表面への輸送を防ぎ、代わりにこれをリソソームに再び標的化させる能力があるという仮説と一致する（Ｃｈａｐｍａｎら、２０１１年）。しかし、一部のＤＬＬ３タンパク質は、モデル系においてタンパク質を人為的に過剰発現させると、細胞表面に現れ得るが（Ｌａｄｉら、２００５年）、これが正常な生物学的状況においても、ＤＬＬ３  ｍＲＮＡ転写物が増加する腫瘍においても該当するということは明白ではない。やや意外なことに、腫瘍タイプに検出されるタンパク質レベルは、多量のＤＬＬ３タンパク質が様々な腫瘍の細胞表面に逃れることを示している。
【００９８】
ＤＬＬ３遺伝子の欠損は、ヒトにおいて、脊椎の異常形成及び肋骨異常をもたらす重症な先天性の出生時欠損である脊椎肋骨異骨症に関連している（Ｄｕｎｗｏｏｄｉｅ、２００９年）。これは、適切な発生にＮｏｔｃｈ、Ｗｎｔ及びＦＧＦシグナル伝達経路間の微調節された振動性の相互作用を必要とする、椎骨の胚前駆体である体節の極性の決定及びパターン形成において決定的な役割を果たすことが知られるＮｏｔｃｈシグナル伝達の変化と関連している（Ｋａｇｅｙａｍａら、２００７年；Ｇｏｌｄｂｅｔｅｒ及びＰｏｕｒｑｕｉｅ、２００８年）。ＤＬＬ１及びＤＬＬ３は、通常、発生中のマウス胚内において同様の位置に発現するが、トランスジェニックマウスによる実験により、ＤＬＬ３がＤＬＬ１を補償しないことが実証されている（Ｇｅｆｆｅｒｓら、２００７年）。ＤＬＬ１ノックアウトマウスは、胚性致死性であるものの、ＤＬＬ３変異体マウスは生き残り、脊椎肋骨異骨症のヒトに見られるものと同様の表現型を示す（Ｋｕｓｕｍｉら、１９９８年；Ｓｈｉｎｋａｉら、２００４年）。これらの結果のデータは、正常な発達に不可欠なＮｏｔｃｈトランス及びシス相互作用の僅かな相互関係と一致している。
【００９９】
さらに、上で議論した通り、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、神経内分泌細胞及び神経内分泌特徴を示す腫瘍の発生及び維持においてある役割を果たす。これに関すると、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、正常な内分泌器官及びびまん性神経内分泌系における広範な細胞運命決定に関与している。例えば、膵臓において、ｂＨＬＨ転写因子ＮＧＮ３により媒介される既定の内分泌表現型の発生を抑制するために、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が必要である（Ｈａｂｅｎｅｒら、２００５年）。同様のＮｏｔｃｈ媒介性の内分泌細胞運命の抑制が腸内分泌細胞（Ｓｃｈｏｎｈｏｆｆら、２００４年）、甲状腺傍濾胞細胞（Ｃｏｏｋら、２０１０年）、下垂体における神経内分泌細胞タイプの相対比の指定（Ｄｕｔｔａら、２０１１年）において起こり、肺内において、細胞が神経内分泌表現型をとるか又は非神経内分泌表現型をとるかの決定に関与している可能性が高い（Ｃｈｅｎら、１９９７年；Ｉｔｏら、２０００年；Ｓｒｉｕｒａｎｐｏｎｇら、２００２年）。したがって、多数の組織において、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の抑制が神経内分泌表現型と関連していることは明らかである。
【０１００】
発生シグナル伝達経路の不適切な再活性化又は正常なシグナル伝達経路の調節障害は、腫瘍において一般に観察され、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の場合、多数の腫瘍タイプに関連付けられている（Ｋｏｃｈ及びＲａｄｔｋｅ、２０１０年；Ｈａｒｒｉｓら、２０１２年）。Ｎｏｔｃｈ経路は、リンパ腫、結腸直腸がん、膵臓がん、及びあるタイプの非小細胞肺がんにおける発がん遺伝子として研究されている（Ｚａｒｅｎｃｚａｎ及びＣｈｅｎ、２０１０年、及びこの中の参考文献を参照）。対照的に、Ｎｏｔｃｈは、神経内分泌特徴を有する腫瘍において腫瘍抑制因子として作用することが報告されている（Ｚａｒｅｎｃｚａｎ及びＣｈｅｎ、２０１０年、上掲を参照）。神経内分泌特徴を有する腫瘍は広範な原発部位に希に生じ、この網羅的な分類は依然として問題であるが（Ｙａｏら、２００８年；Ｋｌｉｍｓｔｒａら、２０１０年；Ｋｌｏｐｐｅｌ、２０１１年）、上記の腫瘍は、４つの主要なタイプ：低悪性度の良性カルチノイド、悪性挙動を伴う低悪性度の高分化型神経内分泌腫瘍、混合型神経内分泌特徴及び上皮特徴を有する腫瘍、並びに高悪性度の低分化型神経内分泌癌に分類され得る。これらの分類のうち、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）のサブセットを含む低分化型神経内分泌癌は、予後不良のがんタイプである。ＳＣＬＣは起源が気管支であり、一部に、肺神経内分泌細胞から生じると仮説が立てられてきた（Ｇａｌｌｕｚｚｏ及びＢｏｃｃｈｅｔｔａ、２０１１年）。神経内分泌表現型を有するこれらの腫瘍の各々について具体的な細胞の出所が何であれ、Ｎｏｔｃｈ経路遺伝子これ自体における直接的な病変、又はＮｏｔｃｈシグナル伝達を抑制する他の遺伝子の活性化のどちらかによるＮｏｔｃｈシグナル伝達の抑制は、これらの腫瘍の神経内分泌表現型の獲得をもたらす可能性があることが予測され得る。さらに言えば、Ｎｏｔｃｈ経路の摂動をもたらす遺伝子が、神経内分泌表現型を有する腫瘍の治療、特に現在臨床転帰が不良である適応症に対する治療標的をもたらし得る。
【０１０１】
ＡＳＣＬ１は、ＤＬＬ３によりＮｏｔｃｈシグナル伝達経路と相互作用するように見えるような一遺伝子である。ＡＳＣＬ１（Ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅホモログ１）は、転写因子の塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスファミリーのメンバーであり、Ｅボックス（５’−ＣＡＮＮＴＧ−３’）と称されるＤＮＡコンセンサス配列への結合により、転写を制御する。
【０１０２】
代表的なＡＳＣＬ１タンパク質オルソログは、以下に限定されないが、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４３０７）、チンパンジー（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００９４２４４５８）、カニクイザル（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＰ＿００５５７２１０１）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３２５７９）及びマウス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３２５７９）を含む。ヒトにおいて、ＡＳＣＬ１遺伝子は、染色体１２ｑ２３．２に位置する約３ｋＢｐに及ぶ２のエクソンからなる。ヒトＡＳＣＬ１遺伝子座の転写により、２３６のアミノ酸タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４３０７）をコードする２４９０のヌクレオチド転写物（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４３１６）が産生される。代替のスプライシングされた転写物又はバリアントタンパク質は、報告されていない。
【０１０３】
多くの神経内分泌腫瘍が、分化が不十分な（すなわち部分的に完全な）内分泌表現型、例えば、様々な内分泌タンパク質及びポリペプチド（例えばクロモグラニンＡ、ＣＨＧＡ；カルシトニン、ＣＡＬＣＡ；プロオピオメラノコルチン（ｐｒｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｉｎ）、ＰＯＭＣ；ソマトスタチン、ＳＳＴ）、分泌小胞に関連するタンパク質（例えば、シナプトフィジン、ＳＹＰ）、及び生物活性アミンの合成を担う生化学的経路に関与する遺伝子（例えば、ドーパデカルボキシラーゼ、ＤＤＣ）の著しい向上又は発現を示すことは明らかである。おそらく意外ではないが、これらの腫瘍は、多くの場合、神経及び神経内分泌表現型をもたらす遺伝子カスケードをまとめる役割を果たすことが知られる転写因子であるＡＳＣＬ１（マウスにおいてｍＡＳＨ１、又はヒトにおいてｈＡＳＨ１としても知られる）を過剰発現する。カスケードの具体的な分子詳細は依然として不明確であるが、ある特定の細胞タイプ、特に甲状腺傍濾胞細胞（Ｋａｍｅｄａら、２００７年）、副腎髄質のクロム親和細胞（Ｈｕｂｅｒら、２００２年）及び肺のびまん性神経内分泌系において見出された細胞（Ｃｈｅｎら、１９９７年；Ｉｔｏら、２０００年；Ｓｒｉｕｒａｎｐｏｎｇら、２００２年）の場合、ＡＳＣＬ１は微調整される発生調節ループの一部であることが次第に明らかとなりつつあり、このループにおいて、ＡＳＣＬ１媒介性遺伝子発現カスケードとＮｏｔｃｈ媒介性遺伝子発現カスケードとのバランスにより、細胞運命選択が媒介される。例えば、ＡＳＣＬ１は正常なマウス肺神経内分泌細胞において発現することが見出された一方、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達エフェクターＨＥＳ１は、肺の非神経内分泌細胞において発現した（Ｉｔｏら、２０００年）。これらの２つのカスケードが潜在的な交差調節による微細なバランスを保っていることが、次第に認識されつつある。ＮｏｔｃｈエフェクターＨＥＳ１は、ＡＳＣＬ１発現を下方調節することが示されている（Ｃｈｅｎら、１９９７年；Ｓｒｉｕｒａｎｐｏｎｇら、２００２年）。これらの結果は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が神経内分泌分化を抑制し得ることを、明確に実証している。しかし、ＤＬＬ３プロモーターと結合したＡＳＣＬ１が、ＤＬＬ３発現を活性化させるという実証（Ｈｅｎｋｅら、２００９年）及びＤＬＬ３がＮｏｔｃｈシグナル伝達を減弱するという観察（Ｌａｄｉら、２００５年）から、細胞運命選択の遺伝子回路は神経内分泌表現型と非神経内分泌表現型との間で閉じられている。
【０１０４】
Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が、近隣細胞間の僅かな差異を増幅して、多様な分化経路を有する境界の明瞭な組織ドメイン（例えば、上記の「側方阻害」）を可能にするように進化してきたように思われることを考慮すると、これらのデータは、まとめると、神経内分泌表現型を有するがんにおいて、微調整される発生調節ループが再活性化されて、調節不全になっていることを示唆する。ＤＬＬ３が細胞内部の膜コンパートメント内に通常、存在し（Ｇｅｆｆｅｒｓら、２００７年）、この内部においてＮｏｔｃｈと相互作用すると推定されることを考慮すると、ＤＬＬ３が抗体治療剤の開発に好適な細胞表面標的を提供し得ることは明白ではないが、結果として起こる神経内分泌腫瘍におけるＤＬＬ３発現の向上が、神経内分泌表現型を有する腫瘍（例えば、ＮＥＴ及びｐＮＥＴ）の固有の治療標的をもたらすことができる可能性がある。実験室システムにおいて、タンパク質を多量に過剰発現させると、過剰発現したタンパク質が細胞内に誤って局在化し得ることは一般に観察されることである。したがって、実験的検証なしには明らかにはならないが、腫瘍におけるＤＬＬ３の過剰発現により、タンパク質がある程度、細胞表面に発現し、これにより抗体治療剤の開発目標が提供され得るというのは合理的な仮説である。
【０１０５】
ＩＶ．抗体
Ａ．抗体の構造
抗体並びにそのバリアント及び誘導体は、承認されている命名法及び番号付けシステムを含め、例えば、Ａｂｂａｓら（２０１０）、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第６版）、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ；又はＭｕｒｐｈｅｙら（２０１１）、Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（第８版）、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅに詳細に記載されている。
【０１０６】
「抗体」又は「無傷な（ｉｎｔａｃｔ）抗体」は、通常、ジスルフィド共有結合及び非共有結合性相互作用により一緒に保持された２つの重鎖（Ｈ）ポリペプチド鎖と２つの軽鎖（Ｌ）ポリペプチド鎖とを含むＹ字型４量体タンパク質を指す。各軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）と１つの定常ドメイン（ＣＬ）とで構成される。各重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）と、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ抗体の場合にＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３と称される３つのドメインを含む（ＩｇＭ及びＩｇＥは第４のドメインＣＨ４を含む）定常領域とを含む。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤクラスにおいて、ＣＨ１及びＣＨ２ドメインは、可変長のプロリン及びシステインリッチセグメントであるフレキシブルなヒンジ領域（様々なＩｇＧサブクラスにおいて約１０から約６０のアミノ酸）によって分離されている。軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメインは、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって定常ドメインに連結されており、重鎖は、約１０の付加的アミノ酸の「Ｄ」領域も有する。抗体の各クラスは、対のシステイン残基によって形成される鎖間及び鎖内のジスルフィド結合をさらに含む。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、マルチクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化及び霊長類化抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト抗体、組換え産生抗体、細胞内抗体、多重特異的抗体、二重特異的抗体、一価抗体、多価抗体、抗イディオタイプ抗体、合成抗体、例えば、これらのムテイン及びバリアント、免疫特異的抗体断片、例えば、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）断片、単鎖断片（例えば、ＳｃＦｖ及びＳｃＦｖＦｃ）並びにＦｃ融合及び他の修飾を含むそれらの誘導体、並びに決定因子との優先的結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）又は結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）を示す限り、あらゆる他の免疫反応分子を含む。さらに、文脈上の制約によって他に指示されない限り、用語はさらに全ての抗体のクラス（つまり、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ）並びに全てのサブクラス（つまり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）を含む。様々な抗体のクラスに対応する重鎖定常領域は、通常、対応するギリシャ語の小文字α、δ、ε、γ及びμでそれぞれ示される。いずれかの脊椎動物種からの抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる種類の１つに割り当てることができる。
【０１０８】
抗体の可変ドメインは、抗体毎にアミノ酸組成にかなりの違いを示し、主に抗原認識及び結合の役割を担っている。各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成しており、したがって無傷なＩｇＧ抗体は２つの結合部位を有する（すなわち、これは２価である）。ＶＨ及びＶＬドメインは、非常に可変性のある３つの領域を含み、これらの領域は超可変領域、又はより一般的には相補性決定領域（ＣＤＲ）と称され、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られる４つの可変性の少ない領域によって囲まれ分離されている。ＶＨ及びＶＬ領域間の非共有結合性の結合は、抗体の２つの抗原結合部位の１つを含有するＦｖ断片（「可変部断片」を表す）を形成している。遺伝子工学により得ることができるＳｃＦｖ断片（単鎖可変断片の場合）は、単一ポリペプチド鎖において、ペプチドリンカーにより分離された抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域に結合する。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、アミノ酸の各ドメイン、フレームワーク領域及びＣＤＲに対する割り付けは、他に記載がない限り、Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版）、米国保健福祉省、ＰＨＳ、ＮＩＨ、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８７、ＰＭＩＤ：３６８１９８１；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、ＰＭＩＤ：２６８７６９８；ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、ＰＭＩＤ：８８７６６５０；又はＤｕｂｅｌ編（２００７）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第３版、Ｗｉｌｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ又はＡｂＭ  （Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ／ＭＳＩ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ）によって提供されるスキームの１つに従い得る。当該技術分野で周知のように、可変領域残基の番号付けは、典型的にはＣｈｏｔｈｉａ又はＫａｂａｔに示されている通りである。Ａｂｙｓｉｓウエブサイトデータベース（下記）から取得されるＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｃｏｎｔａｃｔとしても知られる）及びＡｂＭによって定義される、ＣＤＲを含むアミノ酸残基を下に示す。ＭａｃＣａｌｌｕｍは、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムを用いていることに注意されたい。
【０１１０】
【表１】
2019516705.tif 000006
【０１１１】
抗体配列における可変領域及びＣＤＲは、当該技術分野で展開されている一般的法則（上記に示したもの、例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステム）に従って、又は既知の可変領域のデータベースに対して配列を整列させることにより同定され得る。これらの領域を同定するための方法は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｌ編、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２００１及びＤｉｎａｒｅｌｌｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ、２０００に記載されている。抗体配列の例示的なデータベースは、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓの「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイト（英国、ロンドン、ロンドン大学の生化学・分子生物学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）部門のＡ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎによって保持）及びｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇのＶＢＡＳＥ２ウェブサイト（Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３３（データベース号）：Ｄ６７１〜Ｄ６７４（２００５）に記載されている）に記載されている又はこれらを通じてアクセスされ得る。
【０１１２】
好ましくは、配列は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ及びタンパク質データバンク（ＰＤＢ）からの配列データを、ＰＤＢからの構造データと統合したＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して解析される。Ｄｒ．Ａｎｄｒｅｗ  Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ’ｓ  ｂｏｏｋ  ｃｈａｐｔｅｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（編集：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ＩＳＢＮ−１３：９７８−３５４０４１３５４７、ウェブサイトのｂｉｏｉｎｆｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓでも利用可能）参照。Ａｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトは、本明細書の教示に従って使用され得る、ＣＤＲを同定するために展開された一般的な規則をさらに含む。他に示さない限り、本明細書に示す全てのＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに従ってＡｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトにより導き出されたものである。
【０１１３】
本発明で議論される重鎖定常領域アミノ酸位置について、番号付けは、Ｅｕインデックスに従う。このインデックスは、最初にＥｄｅｌｍａｎら、１９６９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６３（１）：７８〜８５において記載された。この文献は骨髄腫タンパク質Ｅｕのアミノ酸配列を記載しており、この配列は最初に配列決定されたヒトＩｇＧ１と報告されている。ＥｄｅｌｍａｎのＥｕインデックスは、Ｋａｂａｔら、１９９１（前掲）にも示されている。したがって、重鎖の文脈における用語「Ｋａｂａｔに記載のＥｕインデックス」又は「ＫａｂａｔのＥｕインデックス」又は「Ｅｕインデックス」又は「Ｅｕ番号付け」は、Ｋａｂａｔら、１９９１（前掲）に示されたＥｄｅｌｍａｎらのヒトＩｇＧ１  Ｅｕ抗体に基づく残基番号付けシステムを指す。軽鎖定常領域アミノ酸配列で使用される番号付けシステムは、同様に、Ｋａｂａｔら（前掲）に示されている。本発明に適合する例示的なカッパ軽鎖定常領域アミノ酸配列を直下に示す：
【０１１４】
【化４】
2019516705.tif 000007
【０１１５】
同様に、本発明に適合する例示的なＩｇＧ１重鎖定常領域アミノ酸配列を直下に示す：
【０１１６】
【化５】
2019516705.tif 000008
【０１１７】
開示された定常領域配列、又はこのバリアント若しくは誘導体は、このまま使用されることもある、又は本発明のＡＤＣに組み込まれることもある完全長抗体をもたらすよう、標準分子生物学的技術を使用して、開示された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域と操作可能に結合させることができる。
【０１１８】
免疫グロブリン分子内には、２種類のジスルフィド架橋又は結合、つまり鎖間及び鎖内ジスルフィド結合がある。当該技術分野で周知のように、鎖間ジスルフィド結合の位置及び数は、免疫グロブリンのクラス及び種類によって変化する。本発明は、抗体の任意のクラス又は特定のサブクラスに限定されるものではないが、ＩｇＧ１免疫グロブリンが、例示のために、本開示を通して使用される。野生型ＩｇＧ１分子には、１２の鎖内ジスルフィド結合（それぞれ重鎖に４つとそれぞれ軽鎖に２つ）と、４つの鎖間ジスルフィド結合とがある。鎖内ジスルフィド結合は、一般にやや保護されており、鎖間結合よりも相対的に還元されにくい。逆に、鎖間ジスルフィド結合は、免疫グロブリンの表面に位置しており、溶媒に接触可能で、通常は比較的還元されやすい。２つの鎖間ジスルフィド結合は、重鎖間に存在し、さらにそれぞれの重鎖からそれぞれの軽鎖に存在するジスルフィド結合が存在する。鎖間ジスルフィド結合は、鎖の結合に必須ではないことが実証されている。ＩｇＧ１ヒンジ領域は、重鎖に鎖間ジスルフィド結合を形成するシステインを含有しており、これらのシステインが、構造的な支えと共にＦａｂの動きを容易にする柔軟性をもたらす。重／重ＩｇＧ１鎖間ジスルフィド結合は、残基Ｃ２２６及びＣ２２９（Ｅｕ番号付け）に位置し、一方でＩｇＧ１の軽鎖及び重鎖間（重／軽）のＩｇＧ１鎖間ジスルフィド結合は、カッパ又はラムダ軽鎖のＣ２１４と、重鎖の上流ヒンジ領域のＣ２２０との間に形成される。
【０１１９】
Ｂ．抗体生成及び産生
本発明の抗体は、当該技術分野で公知の様々な方法を使用して産生され得る。
【０１２０】
１．宿主動物におけるポリクローナル抗体の生成
様々な宿主動物におけるポリクローナル抗体の産生は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（編集）（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ；及びＨａｒｌｏｗら（１９８９）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ＮＹ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ参照）。ポリクローナル抗体を生成するために、免疫適格性の動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、非ヒト霊長類など）を、抗原性タンパク質又は抗原性タンパク質を含む細胞若しくは調製物で免疫化する。一定時間後に、ポリクローナル抗体含有血清を、動物を出血させるか又は屠殺することにより取得する。血清は動物から取得した形態で使用されてもよく、又は抗体を部分的若しくは完全に精製して免疫グロブリン分画若しくは単離された抗体調製物を得てもよい。
【０１２１】
この点において、本発明の抗体は、免疫適格性の動物における、免疫応答を誘発するいかなるＤＬＬ３又はＡＳＣＬ１決定因子からも生成することができる。本明細書において使用する場合、「決定因子」又は「標的」は、特定の細胞、細胞集団若しくは組織内で又はこれらの上で、同定可能的に結合するか又は特異的に見出される、任意の検出可能な形質、特性、マーカー又は因子を意味する。決定因子又は標的は、形態的性質の場合もあり、機能的性質の場合もあり、又は生化学的性質の場合もあり、表現型であることが好ましい。好ましい実施形態において、決定因子は、特定の細胞型又はある特定の条件下の細胞（例えば、細胞周期の特定の点又は特定の微小環境における細胞の間）によって異なって発現（過剰発現又は過小発現）されるタンパク質である。本発明の目的のために、決定因子は、好ましくは、異常ながん細胞上で異なって発現され、ＤＬＬ３タンパク質又はそのスプライスバリアント、アイソフォーム、ホモログ若しくはファミリーメンバー、又はこれらの特異的ドメイン、領域若しくはエピトープのいずれかを含み得る。「抗原」、「免疫原性決定因子」、「抗原性決定因子」又は「免疫原」は、免疫適格性の動物に導入された場合に、免疫応答を刺激することができ、そして免疫応答により生じる抗体によって認識される、任意のＤＬＬ３又はＡＳＣＬ１タンパク質又はこの任意の断片、領域若しくはドメインを意味する。本明細書において検討される決定因子の存在又は不在は、細胞、細胞小集団又は組織（例えば、腫瘍、腫瘍形成性細胞又はＣＳＣ）を同定するために使用され得る。
【０１２２】
任意の形態の抗原又は抗原を含有する細胞若しくは調製物を、ＤＬＬ３決定因子に特異的な抗体を生成するために使用することができる。本明細書に示す用語「抗原」は、広義で使用され、任意の免疫原性断片又は選択された標的の決定因子、例えば、単一のエピトープ、複数のエピトープ、単一若しくは複数のドメイン又は全細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はタンパク質を含み得る。抗原は、単離された完全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、これらの表面上の抗原の少なくとも一部を発現する細胞により免疫化されている）又は可溶性タンパク質（例えば、タンパク質のＥＣＤ部分しか免疫化されていない）又はタンパク質構築物（例えば、Ｆｃ抗原）であってもよい。抗原は、遺伝的に修飾された細胞において産生されてもよい。前述の抗原のいずれかが単独で使用されてもよく、当該技術分野で公知の１つ以上の免疫原性増強アジュバントと組み合わせて使用されてもよい。抗原をコードしているＤＮＡは、ゲノムであっても非ゲノム（例えば、ｃＤＮＡ）であってもよく、免疫原性応答を誘発するのに十分なＥＣＤの少なくとも一部をコードしていてもよい。任意のベクターを使用して、抗原が発現される細胞を形質転換してもよく、例えばベクターとして、これらに限定されないが、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、プラスミド及びカチオン性脂質などの非ウイルス性ベクターが挙げられる。
【０１２３】
２．モノクローナル抗体
選択された実施形態において、本発明では、モノクローナル抗体の使用を検討する。当該技術分野で公知であるように、用語「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、微量に存在し得る可能性のある変異（例えば、天然に生じる変異）を除いて同一である集団を構成する個別の抗体から取得される抗体を指す。
【０１２４】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、組換え技術、ファージディスプレイ技術、トランスジェニック動物（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標））又はこれらの何らかの組合せを含む、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して調製され得る。例えば、モノクローナル抗体は、例えば、Ａｎ，Ｚｈｉｇｉａｎｇ（編集）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ  Ｂｅｎｃｈ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、第１版  ２００９；Ｓｈｉｒｅら、（編集）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ  ＬＬＣ、第１版  ２０１０；Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓ、第２版  １９８８；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３〜６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１）により詳細に記載されているハイブリドーマ及び生化学的遺伝子操作技術を使用して産生され得る。決定因子に特異的に結合する複数のモノクローナル抗体の産生後、特に有効な抗体を、様々なスクリーニングプロセスを通じて、例えば、決定因子に対するそれらの親和性又は内在化速度に基づいて、選択してもよい。本明細書に記載されるように産生される抗体は「出所（ｓｏｕｒｃｅ）」抗体として使用することができ、さらに、例えば、標的への親和性を改善するため、細胞培養における産生性を向上させるため、インビボでの免疫原性を減少させるため、多重特異的構築物を生成するために修飾してもよい。モノクローナル抗体の産生及びスクリーニングのより詳細な説明は、下記及び添付の実施例に示される。
【０１２５】
３．ヒト抗体
別の実施形態において、抗体は、完全ヒト抗体を含み得る。語「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体及び／又は下記に記載のヒト抗体を作製する技術のいずれかを使用して作製された抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を指す。
【０１２６】
ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を使用して産生され得る。技術の１つは、（好ましくはヒト）抗体のライブラリがファージ上に合成されている、ファージディスプレイであり、この技術において、ライブラリは、目的の抗原又はこの抗体結合部分を用いてスクリーニングされ、抗原に結合するファージが単離され、これらから免疫反応性断片を得ることができる。このようなライブラリを調製してスクリーニングする方法は、当該技術分野において周知であり、ファージディスプレイライブラリを生成するためのキットは市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１、及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリの生成及びスクリーニングに使用することができる他の方法及び試薬もある（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２２３，４０９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；及びＢａｒｂａｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８巻：７９７８〜７９８２頁（１９９１年）を参照）。
【０１２７】
一実施形態において、組換えヒト抗体は、上記の通り調製された組換えコンビナトリアル抗体ライブラリをスクリーニングすることにより単離され得る。一実施形態において、ライブラリは、Ｂ細胞から単離されたｍＲＮＡから調製されたヒトＶＬ及びＶＨ  ｃＤＮＡを使用して生成されたｓｃＦｖファージディスプレイライブラリである。
【０１２８】
ナイーブなライブラリ（天然又は合成のいずれか）により産生された抗体は、中程度の親和性（Ｋａは、約１０６〜１０７Ｍ−１）を有することができるが、親和性成熟は、当該技術分野において記載されている二次ライブラリから構築及び再選択することにより、インビトロにおいて模倣され得る。例えば、変異は、エラープローンポリメラーゼを使用することにより、インビトロにおいてランダムに導入され得る（ＬｅｕｎｇらのＴｅｃｈｎｉｑｕｅ、１巻：１１〜１５頁（１９８９年）に報告されている）。さらに、親和性成熟は、選択された個々のＦｖクローンにおいて、例えば、目的のＣＤＲにかかるランダム配列を有するプライマーを用いるＰＣＲを使用して１種以上のＣＤＲをランダムに変異させることにより、及びより高次の親和性クローンをスクリーニングすることによって、行われ得る。ＷＯ９６０７７５４は、軽鎖遺伝子のライブラリを作成するために、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲに変異誘発を誘導する方法を記載している。別の有効な手法は、未免疫ドナーから得た天然Ｖドメインバリアントのレパートリーによるファージディスプレイによって選択されたＶＨ又はＶＬドメインを組み換えること、及びＭａｒｋｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１０巻：７７９〜７８３頁（１９９２年）に記載されている、数回のチェーンリシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｒｅｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）においてより高い親和性をスクリーニングすることである。この技術は、約１０−９Ｍ以下の解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する抗体及び抗体断片の産生を可能にする。
【０１２９】
他の実施形態において、同様の手順は、これらの表面に結合ペアを発現する、真核細胞（例えば、酵母）を含むライブラリを使用して用いられ得る。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７００，３０２及びＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．１２／４０４，０５９を参照されたい。一実施形態において、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現するファージライブラリから選択される（Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４巻：３０９〜３１４頁（１９９６年）：Ｓｈｅｅｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５巻：６１５７〜６１６２頁（１９９８年））。他の実施形態において、ヒト結合ペアは、酵母のような真核細胞において生成するコンビナトリアル抗体ライブラリから単離され得る。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７００，３０２を参照されたい。このような技術により、多数の候補モジュレーターのスクリーニングを有利なことに可能にし、候補配列の比較的簡単な操作を提供する（例えば、親和性成熟又は組換えシャッフリングによる）。
【０１３０】
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座をトランスジェニック動物、例えば、内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化され、ヒト免疫グロブリン遺伝子が導入されたマウスに導入することにより作製することもできる。チャレンジすると、ヒト抗体産生が観察される。この産生は、遺伝子再配列、アセンブリ及び抗体レパートリーを含む全ての点において、ヒトで見られるものと緊密に類似している。このアプローチは、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５４５，８０７；５，５４５，８０６；５，５６９，８２５；５，６２５，１２６；５，６３３，４２５；５，６６１，０１６並びにＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）技術に関するＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，０７５，１８１及び６，１５０，５８４；並びにＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。代替的には、ヒト抗体は、標的抗原に対して向けられた抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化を介して調製され得る（このようなＢリンパ球は、新生物障害に罹患している個体から回収し得る又はインビトロで免疫化され得る）。例えば、Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、ｐ．７７（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４７（Ｉ）：８６−９５（１９９１）；及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７５０，３７３を参照。
【０１３１】
出所が何であろうとも、ヒト抗体配列は、当該技術分野において公知の分子操作技術を使用して作製され、本明細書に記載されている発現システム及び宿主細胞に導入され得ることが理解される。このような非天然に組換えにより産生したヒト抗体（及び、対象組成物）は、本開示の教示と完全に適合し、本発明の範囲内に明示的に保持されている。ある特定の選択態様において、本発明のＡＤＣは、細胞結合剤として作用する、組換えにより産生したヒト抗体を含む。
【０１３２】
４．誘導された抗体
出所抗体は、上記のように生成され、選択され、単離された後、改善された医薬的特徴を有する抗ＤＬＬ３抗体又は抗ＡＳＣＬ１抗体となるようにさらに改変されてもよい。好ましくは、出所抗体は、所望の治療学的特性を有する誘導抗体をもたらすように公知の分子操作技術を使用して修飾又は改変されてもよい。
【０１３３】
４．１．キメラ及びヒト化抗体
本発明の選択された実施形態は、ＤＬＬ３に免疫特異的に結合する又はＡＳＣＬ１に免疫特異的に結合する、マウスモノクローナル抗体を含み、この抗体は、「出所」抗体と見なすことができる。選択された実施形態において、本発明の抗体は、このような「出所」抗体から、出所抗体の定常領域及び／又はエピトープ結合アミノ酸配列の任意選択の修飾を通じて誘導され得る。ある特定の実施形態では、抗体は、出所抗体の選択されたアミノ酸が、欠失、変異、置換、統合又は組合せを通じて変化する場合、出所抗体から「誘導される」。別の実施形態において、「誘導された」抗体は、出所抗体の断片（例えば、１つ以上のＣＤＲ又は全重鎖及び軽鎖可変領域）がアクセプター抗体配列と組み合わされるか又はアクセプター抗体配列に組み込まれて、誘導抗体（例えば、キメラ又はヒト化抗体）を提供する抗体である。これらの「誘導」抗体は、例えば、決定因子に対する親和性を改善するか、抗体安定性を改善するか、細胞培養物における産生及び収率を改善するか、インビボでの免疫原性を低減するか、毒性を低減するか、活性部分のコンジュゲーションを促進するか、又は多重特異的抗体を作製するなどのために、下記に記載されている標準的な分子生物学的技術を使用して産生され得る。このような抗体は、出所抗体から、化学的手段又は翻訳後修飾による成熟分子の修飾（例えば、グリコシル化パターン又はペグ化）を通じて、誘導されてもよい。
【０１３４】
一実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも２つの異なる抗体の種又はクラス由来の共有結合的に連結されたタンパク質セグメントに由来するキメラ抗体を含み得る。用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来する又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、鎖の残りは、別の種に由来する又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体並びにこのような抗体の断片の対応する配列と同一又は相同である構築物を指す（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，８１６，５６７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、ＰＭＩＤ：６４３６８２２）。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のキメラ抗体は、ヒト軽鎖及び重鎖定常領域に操作可能に連結されている選択されたマウス重鎖及び軽鎖可変領域の全て又はほとんどを含んでもよい。他の選択された実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体又は抗ＡＳＣＬ１抗体は、本明細書において開示されているマウス抗体から「誘導」され得る。
【０１３５】
他の実施形態において、本発明のキメラ抗体は、「ＣＤＲグラフト化」抗体であり、この場合に、ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭｃＣａｌｌｕｍなどを使用して定義される）は、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属しており、抗体の残りは別の種から大きく誘導されるか又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属している。ヒトで使用するために、１つ以上の選択されたげっ歯類ＣＤＲ（例えば、マウスＣＤＲ）は、ヒトアクセプター抗体にグラフト化され、天然に存在するヒト抗体のＣＤＲの１つ以上と置き換えられ得る。これらの構築物は、一般的に、対象による抗体に対する望ましくない免疫応答を低減しながら、十分な強度のヒト抗体機能、例えば、補体依存細胞傷害性（ＣＤＣ）及び抗体依存細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）をもたらすという利点を有する。一実施形態において、ＣＤＲグラフト化抗体は、ヒトフレームワーク配列に組み込まれたマウスから取得される１つ以上のＣＤＲを含む。
【０１３６】
ＣＤＲグラフト化抗体に類似しているのが「ヒト化」抗体である。本明細書で使用するとき、「ヒト化」抗体は、１つ以上の非ヒト抗体（ドナー又は出所抗体）に由来する１つ以上のアミノ酸配列（例えば、ＣＤＲ配列）を含むヒト抗体（アクセプター抗体）である。ある特定の実施形態では、「逆変異」が、ヒト化抗体に導入されていてもよい。この逆変異では、レシピエントのヒト抗体の可変領域の１つ以上のＦＲが、非ヒト種ドナー抗体の対応する残基によって置換されている。このような逆変異は、グラフト化ＣＤＲの適切な三次元立体配置の維持を補助し、それにより親和性及び抗体安定性を改善し得る。様々なドナー種由来の抗体を使用することができ、例えば、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類が挙げられる。さらに、ヒト化抗体は、例えば、抗体の性能をさらに洗練するために、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない新たな残基を含んでもよい。出所抗体由来のマウス成分及びアクセプター抗体由来のヒト成分を含む、本発明に適合するＣＤＲグラフト化及びヒト化抗体は、下記実施例に示すように提示される。
【０１３７】
当該技術分野で認識されている様々な技術を使用して、どのヒト配列をアクセプター抗体として使用するかを決定し、本発明に従ってヒト化構築物を提供することができる。適合するヒト生殖系列配列の編纂及びそれらのアクセプター配列としての適性を決定するための方法は、例えば、Ｄｕｂｅｌ  ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ（編）（２０１４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ＧｍｂＨ；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ、Ｉ．Ａ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６〜７９８；Ｃｏｏｋ、Ｇ．Ｐ．ら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １６：２３７〜２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｄ．ら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９〜８１７；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎら（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：４６２８〜４６３８）に開示されている。ヒト免疫グロブリン可変領域配列の網羅的なディレクトリを提供している（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫにより編集）Ｖ−ＢＡＳＥディレクトリ（ＶＢＡＳＥ２−Ｒｅｔｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３３；６７１〜６７４、２００５）を使用して適合するアクセプター配列を同定してもよい。さらに、例えばＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３００，０６４に記載されているコンセンサスヒトフレームワーク配列も適合するアクセプター配列であり得、本教示に従って使用し得る。一般に、ヒトフレームワークアクセプター配列は、マウス由来フレームワーク配列との相同性と、出所抗体及びアクセプター抗体のＣＤＲ古典的構造の解析とに基づいて選択される。次いで、誘導された抗体の重鎖及び軽鎖可変領域の誘導された配列が、当該技術分野で認識されている技術を使用して合成され得る。
【０１３８】
例として、ＣＤＲグラフト化及びヒト化抗体並びに関連する方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，１８０，３７０及び５，６９３，７６２に記載されている。さらなる詳細は、例えば、Ｊｏｎｅｓら、１９８６、（ＰＭＩＤ：３７１３８３１）；並びにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，９８２，３２１及び７，０８７，４０９を参照。
【０１３９】
ＣＤＲグラフト化又はヒト化抗体の可変領域のヒトアクセプター可変領域の配列同一性又はホモロジーは、本明細書で議論したように決定されそして本明細書で議論したように測定されるとき、好ましくは少なくとも６０％又は６５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９３％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を共有する。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）の側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されている置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセント又は類似度を上方調節させて置換の保存的性質を正しくしてもよい。
【０１４０】
添付の図１Ａ、１Ｂ、３Ａ及び３Ｂに示される注釈の付されたＣＤＲ及びフレームワーク配列は、専売のＡｂｙｓｉｓデータベースを使用して、Ｋａｂａｔらに従って定義されていることが理解される。しかしながら、本明細書で説明されるように、当業者は、Ｃｈｏｔｈｉａら、ＡＢＭ又はＭａｃＣａｌｌｕｍらによって提供される定義に従って、ＣＤＲを、Ｋａｂａｔらと同様に容易に同定し得る。このように、前述のシステムのいずれかに従って誘導された１つ以上のＣＤＲを含む抗ＤＬＬ３又は抗ＡＳＣＬ１ヒト化抗体は、本発明の範囲内に明確に保持される。
【０１４１】
４．２．部位特異的抗体
本発明の抗体は、細胞毒又は他の抗がん剤へのコンジュゲーションを容易にするために（下記でより詳細に議論されるように）操作されてもよい。抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）調製にとって、抗体上の細胞毒の位置及び薬物抗体比（ＤＡＲ）の観点から、均質なＡＤＣ分子集団を含むことが有利である。本発明に基づいて、当業者は本明細書に記載されるような部位特異的操作構築物を容易に作製することができる。本明細書で使用するとき、「部位特異的抗体」又は「部位特異的構築物」は、重鎖又は軽鎖のいずれかの少なくとも１つのアミノ酸が、欠失、改変又は（好ましくは別のアミノ酸で）置換されて少なくとも１つの遊離システインを与えている抗体又はその免疫反応性断片を意味する。同様に、「部位特異的コンジュゲート」は、部位特異的抗体と、不対又は遊離システインにコンジュゲートした少なくとも１つの細胞毒又は他の化合物（例えば、レポーター分子）とを含むＡＤＣを意味する。ある特定の実施形態において、不対システイン残基は、不対鎖内システイン残基を含む。他の実施形態において、遊離システイン残基は、不対鎖間システイン残基を含む。さらに他の実施形態において、遊離システインを、抗体のアミノ酸配列内（例えば、ＣＨ３ドメイン内）へと改変させてもよい。いずれにしても、部位特異的抗体は、様々なアイソタイプの抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤであることができ；これらのクラス内で、抗体は、様々なサブクラスの抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４であることができる。ＩｇＧ構築物に関して、抗体の軽鎖は、Ｃ２１４がそれぞれ組み込まれたカッパ又はラムダのいずれかのアイソタイプを含んでもよく、選択された実施形態において、Ｃ２１４は、ＩｇＧ１重鎖のＣ２２０残基がないことにより、不対であってもよい。
【０１４２】
したがって、本明細書において使用する場合、用語「遊離システイン」又は「不対システイン」は、他に文脈により指示されていない限り、相互に交換可能に使用することができる用語であり、天然に存在しているか又は分子操作技術を使用して選択された残基位置に特別に組み込まれているかにかかわらず、生理学的条件下において天然に存在している（「又は未処理の」）ジスルフィド結合の部分ではない、抗体の任意のシステイン（又はチオール含有）成分（例えば、システイン残基）を意味するものとする。ある特定の選択された実施形態において、遊離システインは、天然の鎖内又は鎖間ジスルフィド架橋パートナーが置換されたか、除去されたか又は他の方法で変化したことにより生理学的条件下で天然に存在しているジスルフィド架橋が破壊され、それによって部位特異的コンジュゲーションに適切な不対システインとなっている、天然のシステインを含み得る。他の好ましい実施形態において、遊離又は不対システインは、抗体の重鎖又は軽鎖アミノ酸配列内の所定の部位に選択的に配置されているシステイン残基を含む。コンジュゲーションの前に、遊離又は不対システインが、チオール（還元されたシステイン）として、キャッピングされたシステイン（酸化されている）として又は系の酸化状態に依存した同一又は異なる分子上の別のシステイン若しくはチオール基との非天然分子内又は分子間ジスルフィド結合（酸化されている）の一部として、存在してもよいことが認識される。下記でより詳細に説明するように、適切に操作された抗体構築物の穏やかな還元は、部位特異的コンジュゲーションに利用可能なチオールをもたらす。したがって、特に好ましい実施形態において、遊離又は不対システインは（天然に存在するものか又は組み込まれたものかにかかわらず）、選択的還元及びこの後のコンジュゲーションを受けて、均一なＤＡＲ組成物をもたらす。
【０１４３】
本開示の改変コンジュゲート調製物により示される好ましい特性は、コンジュゲーションの位置及び組成物の絶対的ＤＡＲ値の観点からコンジュゲーションを詳細に指定し、作製されたコンジュゲートを大きく限定する能力に基づき、少なくとも部分的に、予測されるものであることが理解される。従来の多くのＡＤＣ調製物と異なり、本発明は、ランダムコンジュゲーション部位及び比較的制御されていないＤＡＲ種を生成する抗体の部分的又は完全な還元に完全に依拠する必要はない。むしろ、特定の態様において、本発明は、好ましくは、標的化抗体を改変して天然に存在する（つまり「未処理の（ｎａｔｉｖｅ）」）鎖内又は鎖間ジスルフィド架橋の１つ以上を破壊することにより又は任意の位置にシステイン残基を導入することにより、１つ以上の所定の不対（又は遊離の）システイン部位を用意する。この目的のために、選択された実施形態において、システイン残基は、標準的分子操作技術を使用して、抗体（又はそれらの免疫反応性断片）の重鎖若しくは軽鎖のいずれの場所に組み込まれてもよく又は付加されてもよいことが理解される。他の好ましい実施形態において、天然ジスルフィド結合の破壊は、後にコンジュゲーション部位として使用され得る非天然システインの導入（後に遊離システインを含む）との組合せで行われ得る。
【０１４４】
ある特定の実施形態において、操作された抗体は、鎖内又は鎖間システイン残基に少なくとも１つのアミノ酸欠失又は置換を含む。本明細書で使用するとき、「鎖間システイン残基」は、抗体の軽鎖と重鎖との間又は抗体の２つの重鎖間のいずれかの天然のジスルフィド結合に含まれるシステイン残基を意味し、一方で、「鎖内システイン残基」は、同じ重鎖又は軽鎖内の別のシステインと天然に対をなしているシステイン残基である。一実施形態において、鎖間システイン残基の欠失又は置換は、軽鎖と重鎖との間のジスルフィド結合の形成に関与している。別の実施形態において、システイン残基の置換又は欠失は、２つの重鎖間のジスルフィド結合に関与している。典型的な実施形態において、軽鎖が重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインと対形成しており、１つの重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインが相補的重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインと対形成している抗体の相補的な構造により、いずれかの軽鎖又は重鎖の単一のシステインの変異又は欠失によって、操作された抗体における２つの不対システイン残基が生じる。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、鎖間システイン残基は欠失している。他の実施形態において、鎖間システインは、別のアミノ酸（例えば、天然アミノ酸）で置換されている。例えば、アミノ酸置換は、鎖間システインの、中性（例えば、セリン、スレオニン若しくはグリシン）又は親水性（例えば、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシン）残基での置き換えを生じ得る。選択された実施形態において、鎖間システインは、セリンと置き換えられている。
【０１４６】
本発明で意図されるいくつかの実施形態において、欠失又は置換システイン残基は、軽鎖（カッパ又はラムダのいずれか）上にあり、したがって重鎖上に遊離システインが残る。他の実施形態において、欠失又は置換システイン残基は重鎖上にあり、軽鎖定常領域上に遊離のシステインを残す。アセンブリにおける無傷な抗体の軽鎖又は重鎖のいずれかの単一システインの欠失又は置換は、２つの不対システイン残基を有する部位特異的抗体をもたらすことが理解される。
【０１４７】
一実施形態において、ＩｇＧ軽鎖（カッパ又はラムダ）の２１４位のシステイン（Ｃ２１４）が欠失又は置換されている。別の実施形態において、ＩｇＧ重鎖の２２０位のシステイン（Ｃ２２０）が欠失又は置換されている。さらなる実施形態において、重鎖の２２６位又は２２９位のシステインが欠失又は置換されている。一実施形態において、重鎖のＣ２２０がセリンに置換されて（Ｃ２２０Ｓ）、軽鎖に好ましい遊離システインをもたらす。別の実施形態において、軽鎖のＣ２１４がセリンに置換されて（Ｃ２１４Ｓ）、重鎖に好ましい遊離システインをもたらす。このような部位特異的構築物は、以下の実施例においてさらに詳細に記載されている。適合する部位特異的構築物の概要を直下の表２に示す。ここで、番号付けは一般的にＫａｂａｔに示されるＥＵインデックスに従い、ＷＴは、「野生型」又は天然の改変のない定常領域配列を表し、デルタ（Δ）はアミノ酸残基の欠失を指す（例えば、Ｃ２１４Δは、２１４位のシステイン残基が欠失していることを示す）。
【０１４８】
【表２】
2019516705.tif 000009
【０１４９】
システイン残基又は遊離システインを提供するための残基を（天然のジスルフィド結合の破壊とは対照的に）導入又は付加することに関して、抗体又は抗体断片上の適合する位置は、当業者によって容易に判別され得る。したがって、選択された実施形態において、システインは、所望のＤＡＲ、抗体構築物、選択されたペイロード及び抗体標的に応じて、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン若しくはＣＨ３ドメイン又はそれらの任意の組合せに導入され得る。他の好ましい実施形態において、システインは、カッパ又はラムダＣＬドメイン内に導入されてもよく、特に好ましい実施形態において、ＣＬドメインのｃ末端領域に導入されてもよい。それぞれの場合において、システインの挿入部位に近位の他のアミノ酸残基を変更、除去又は置換して、分子の安定性、コンジュゲーションの効率性を促進させてもよく又は一度付加されたペイロードに保護的環境を与えてもよい。特定の実施形態において、置換される残基は、抗体の任意の接触可能部位にある。このような表面残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基は、抗体が容易に接触可能な部位に位置づけられ、本明細書でさらに記載されているように選択的に還元され得る。ある特定の実施形態において、置換される残基は、抗体の接触可能部位にある。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基は、抗体が接触可能な部位に位置づけられ、抗体と選択的にコンジュゲートするために使用され得る。ある特定の実施形態において、以下の残基の任意の１つ以上が、システインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（Ｅｕ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（Ｅｕ番号付け）。さらなる置換位置及び適合する部位特異的抗体の作製方法は、その全体が本明細書に組み込まれるＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，５２１，５４１に記載されている。
【０１５０】
本明細書に記載されるような、定義された部位で抗体薬物コンジュゲートを生成するためのストラテジー及び薬物負荷の化学量論は、抗体の保存された定常領域の操作に主に関わるので、全ての抗ＤＬＬ３又は抗ＡＳＣＬ１抗体に広く適用可能である。抗体の各クラス及びサブクラスのアミノ酸配列及び天然のジスルフィド結合は十分に文献に記載されているので、当業者は、様々な抗体の操作された構築物を、過度の実験を必要とせずに容易に作製することができ、したがってこのような構築物は、本発明の範囲内にあるとして明確に意図されている。
【０１５１】
本明細書において開示されている、定義された部位で抗体薬物コンジュゲートを生成するための戦略及び薬物負荷の化学量論は、抗体の保存された定常領域の操作に主に関わるので、全ての抗ＤＬＬ３抗体又は抗ＡＳＣＬ１抗体に広く適用可能である。抗体の各クラス及びサブクラスのアミノ酸配列及び天然のジスルフィド架橋は十分に文献に記載されているので、当業者は、様々なＤＬＬ３又はＡＳＣＬ１抗体の操作された構築物を、過度の実験なしに容易に作製することができ、したがって、このような構築物は、本発明の範囲内にあるとして明確に企図されている。
【０１５２】
４．３．定常領域の修飾又は改変された糖鎖結合
本発明の選択された実施形態は、定常領域（つまりＦｃ領域）の置換又は修飾、例えば、限定されないが、アミノ酸残基の置換、変異及び／又は修飾を含んでもよく、この置換又は修飾により、薬物動態の変化、血清半減期の延長、結合親和性の増加、免疫原性の減少、生産増加、ＦｃリガンドのＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合の変化、ＡＤＣＣ又はＣＤＣの増強又は減少、糖鎖結合及び／又はジスルフィド結合の変化並びに結合特異性の変更を含むがこれらに限定されない特徴が、化合物にもたらされる。
【０１５３】
改善されたＦｃエフェクター機能を有する化合物は、例えば、ＦｃドメインとＦｃ受容体との間の相互作用（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ及びＢ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃＲｎ）に関与するアミノ酸残基の変化を通じて生成することができ、これにより、血清半減期の延長のような細胞毒性の増加及び／又は薬物動態の変化が導かれ得る（例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７〜９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５〜３４（１９９４）；及びｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０〜４１（１９９５）を参照。
【０１５４】
選択された実施形態において、インビボ半減期が延長された抗体は、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との間の相互作用に関与することが同定されたアミノ酸残基を修飾（例えば、置換、欠失又は付加）することにより生成することができる（例えば、ＷＯ９７／３４６３１；ＷＯ０４／０２９２０７；Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，７３７，０５６及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００３／０１９０３１１を参照）。このような実施形態に関して、Ｆｃバリアントは、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、５日より長いか、１０日より長いか、１５日より長いか、好ましくは２０日より長いか、２５日より長いか、３０日より長いか、３５日より長いか、４０日より長いか、４５日より長いか、２カ月より長いか、３カ月より長いか、４カ月より長いか又は５カ月より長い、半減期を与え得る。延長された半減期により血清力価が高くなり、したがって、抗体の投与頻度を減少させそして／又は投与される抗体の濃度を減少させる。インビボにおけるヒトＦｃＲｎへの結合及びヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現しているトランスジェニックマウス若しくはトランスフェクトされたヒト細胞株又はバリアントＦｃ領域を有するポリペプチドが投与された霊長類でアッセイされ得る。ＷＯ２０００／４２０７２は、ＦｃＲｎへの結合が向上した又は減少した抗体バリアントを記載している。さらに、例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１〜６６０４（２００１）を参照。驚くべきことに、本発明のある特定のＡＤＣは、任意選択の部位特異的コンジュゲートをもたらすために使用されるもの以外のいかなる抗体定常領域修飾なしに、終末相半減期の延長（例えば、２週間程度）を示す。
【０１５５】
他の実施形態において、Ｆｃ改変により、ＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性の増強又は低下が導かれ得る。当該技術分野で既知のように、ＣＤＣは、補体の存在下での標的細胞の溶解を指し、ＡＤＣＣは、細胞毒性の１形態を指し、ある特定の細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞、好中球及びマクロファージ）に存在するＦｃＲへ分泌Ｉｇが結合すると、これらの細胞毒性エフェクター細胞が抗原保有標的細胞に特異的に結合可能となり、この後、細胞毒により標的細胞が殺傷される。本発明の文脈において、抗体バリアントは、「改変された」ＦｃＲ結合親和性を有し、親若しくは非修飾抗体又は天然のＦｃＲ配列を含む抗体と比較して、結合が増強又は減少している。低下した結合を示すこのようなバリアントは、明らかな結合をほとんど又は全く有さず、例えば、天然配列と比較してＦｃＲに対する結合は、例えば当該技術分野で周知の技術で決定するとき、０〜２０％であり得る。他の実施形態において、バリアントは、天然の免疫グロブリンＦｃドメインと比較して増強された結合を示す。これらの種類のＦｃバリアントは、本開示の抗体の有効な抗新生物特性を増強するために有利に使用し得ることが理解される。さらに他の実施形態において、このような改変は、結合親和性の増加、免疫原性の減少、生産増加、糖鎖結合及び／若しくはジスルフィド結合の変化（例えば、コンジュゲーション部位に対して）、結合特異性の変更、ファゴサイトーシスの増加及び／又は細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などを導く。
【０１５６】
さらに他の実施形態は、１つ以上の操作されたグリコフォーム、例えば、タンパク質（例えばＦｃドメイン中の）に共有結合されている改変された糖鎖結合パターン又は改変された炭化水素組成を含む部位特異的抗体を含む。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ、Ｒ．Ｌ．ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３〜２６７４０を参照。操作されたグリコフォームは、様々な目的、例えば、これらに限定されないが、エフェクター機能の増強又は減少、標的に対する抗体の親和性の増加又は抗体の産生促進のために、有用であり得る。ある特定の実施形態において、エフェクター機能の減少が所望される場合、分子を操作してアグリコシル化された形態を発現させ得る。１つ以上の可変領域フレームワーク糖鎖結合部位の消去に至り得る置換、したがってこの部位での糖鎖結合を消去し得る置換は、周知である（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，７１４，３５０及び６，３５０，８６１参照）。逆に、増強されたエフェクター機能又は改善された結合が、１つ以上のさらなる糖鎖結合部位の操作によって、Ｆｃ含有分子に付与されてもよい。
【０１５７】
他の実施形態としては、改変された糖鎖組成を有するＦｃバリアント、例えば、フコシル残基の量が減少している低フコシル化抗体又は二分化ＧｌｃＮＡｃ構造が増加している抗体が挙げられる。このような改変された糖鎖結合パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を向上させることが実証されている。操作されたグリコフォームは、当業者に公知の任意の方法により、例えば、操作されたか又はバリアントの発現系統を使用し、１つ以上の酵素（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））の共発現によって様々な生物又は様々な生物由来の細胞株にＦｃ領域を含む分子を発現させることにより、又はＦｃ領域を含む分子を発現させた後、炭水化物を修飾することにより（例えば、ＷＯ２０１２／１１７００２参照）、生成され得る。
【０１５８】
４．４．断片
本発明の実施のためにどの形態の抗体（例えば、キメラ、ヒト化など）を選択したかにかかわらず、免疫反応断片を、それ自体で又は抗体薬物コンジュゲートの一部として、本明細書の教示に従って使用し得ることが理解される。「抗体断片」は、無傷な抗体の少なくとも１部を含む。本明細書で使用するとき、抗体分子の「断片」という用語は、抗体の抗原結合断片を含んでおり、用語「抗原結合断片」は、選択された抗原又はこの免疫原性断片に免疫特異的に結合するか又は反応し、この断片が由来する無傷抗体と特異的な抗原結合について競合する、免疫グロブリン又は抗体のポリペプチド断片を指す。
【０１５９】
例示的な部位特異的断片としては、可変軽鎖断片（ＶＬ）、可変重鎖断片（ＶＨ）、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体断片、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子及び抗体断片から形成された多重特異的抗体が挙げられる。さらに、活性部位特異的断片は、抗原／基質又は受容体と相互作用する能力を維持し、無傷抗体と同様の様式でそれらを修飾する（ただしおそらくはやや効率が劣る）、抗体の部分を含む。このような抗体断片は、本明細書に記載されるような１つ以上の遊離システインを含むようにさらに操作されてもよい。
【０１６０】
他の実施形態において、抗体断片は、Ｆｃ領域を含む断片であって、Ｆｃ領域が無傷抗体に存在しているときに通常伴われる少なくとも１つの生物学的機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合を維持している断片である。一実施形態において、抗体断片は、無傷抗体と実質的に同様のインビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、断片にインビボ安定性を付与することが可能な少なくとも１つの遊離システインを含むＦｃ配列に連結された抗原結合アームを含んでもよい。
【０１６１】
当業者であれば十分に認識されるように、断片は、分子操作技術により又は無傷の若しくは完全な抗体若しくは抗体鎖の化学的若しくは酵素的処理（例えばパパイン若しくはペプシン）を介するか又は組換え手段により、取得することができる。抗体断片のより詳細な説明は、例えばＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９９）を参照。
【０１６２】
４．５．多価構築物
他の実施形態において、本発明の抗体及びコンジュゲートは、一価又は多価（例えば、二価、三価など）であり得る。本明細書で使用するとき、用語「価数」は、抗体に関連した可能な標的結合部位の数を指す。各標的結合部位は、標的分子上の１つの標的分子又は特異的位置若しくは遺伝子座に特異的に結合する。抗体が一価であるとき、分子の各結合部位は、単一抗原位置又はエピトープで特異的に結合する。抗体が２つ以上の標的結合部位（多価）を含むとき、各標的結合部位は同じ又は異なる分子に特異的に結合してもよい（例えば、異なるリガンド若しくは異なる抗原又は同じ抗原上の異なるエピトープ若しくは位置に結合してもよい）。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１３０１０５を参照。
【０１６３】
一実施形態において、抗体は、二重特異的抗体であり、２つの鎖が、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ、３０５：５３７〜５３９に記載されるように、異なる特異性を有している。他の実施形態には、さらなる特異性を有する抗体、例えば三重特異的抗体が含まれる。他のより精巧な適合する多重特異的構築物及びそれらの作製方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００９／０１５５２５５並びにＷＯ９４／０４６９０；Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０及びＷＯ９６／２７０１１に記載されている。
【０１６４】
多価抗体は、所望の標的分子の異なるエピトープに免疫特異的に結合してもよく、又は異種性ポリペプチド若しくは固形支持材料のような標的分子と異種性エピトープとの両方に免疫特異的に結合してもよい。選択された実施形態は２つの抗原にのみ結合する（つまり、二重特異的抗体である）ことができるが、さらなる特異性を有する抗体、例えば三重特異的抗体も本発明に包含される。二重特異的抗体には、架橋又は「ヘテロコンジュゲート」抗体も含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の１つはアビジンに結合することができ、他方はビオチンに結合することができる。このような抗体は、例えば、不要な細胞に対して免疫系細胞を標的化させるために（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０）及びＨＩＶ感染の治療のために（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３及びＥＰ０３０８９）提唱されてきた。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の都合のよい架橋方法を使用して作製することができる。適切な架橋剤は当該技術分野で周知であり、いくつかの架橋技術と共にＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，６７６，９８０に開示されている。
【０１６５】
５．抗体の組換え産生
抗体及びそれらの断片は、抗体産生細胞及び組換え技術から得られた遺伝子材料を使用して作製又は修飾されてもよい（例えば、Ｄｕｂｅｌ  ａｎｄ  Ｒｅｉｃｈｅｒｔ（編）（２０１４）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ＧｍｂＨ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（編）（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、ＮＹ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００２）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｊｏｈｎ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７０９，６１１を参照）。
【０１６６】
本発明の別の態様は、本発明の抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、全細胞、細胞溶解物又は部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、他の細胞成分又は他の混入物、例えば、他の細胞核酸若しくはタンパク質から、標準技術、例えば、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動及び当該技術分野で周知の他のものを使用して分離されるとき、「単離される」又は実質的に純化される。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ及びこの人工バリアント（例えば、ペプチド核酸）であり得、一本鎖若しくは二本鎖又はＲＮＡ、ＲＮＡであってもよく、イントロンを含んでも含まなくてもよい。選択された実施形態において、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０１６７】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学的技術を使用して取得され得る。ハイブリドーマ（例えば、下記実施例に記載された調製されるハイブリドーマ）により発現される抗体については、抗体の軽鎖及び重鎖をコードしているｃＤＮＡは、標準的ＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって取得され得る。免疫グロブリン遺伝子ライブラリから（例えば、ファージディスプレイ技術を使用して）取得される抗体については、抗体をコードしている核酸分子が、ライブラリから収集され得る。
【０１６８】
ＶＨ及びＶＬセグメントをコードしているＤＮＡ断片は、標準的組換えＤＮＡ技術によりさらに操作され、例えば、可変領域遺伝子を、完全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作において、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域又はフレキシブルリンカーのような、別のタンパク質又はタンパク質断片をコードする別のＤＮＡ断片に操作可能に連結される。用語「操作可能に連結される」は、この文脈で使用される場合、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように２つのＤＮＡ断片が連結されていることを意味する。
【０１６９】
ＶＨ領域をコードしている単離されたＤＮＡは、重鎖定常領域（ＩｇＧ１の場合は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子にＶＨコードＤＮＡを操作可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、（１９９１）（前掲））、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅により取得され得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であり得るが、最も好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域である。例示的ＩｇＧ１定常領域は、配列番号２に示される。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子に関して、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードしている別のＤＮＡ分子に操作可能に連結され得る。
【０１７０】
ＶＬ領域をコードしている単離されたＤＮＡは、軽鎖定常領域ＣＬをコードしている別のＤＮＡ分子にＶＬコードＤＮＡを操作可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（並びにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔら、（１９９１）（前掲））、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的ＰＣＲ増幅によって取得され得る。軽鎖定常領域は、カッパ又はラムダ定常領域であり得るが、最も好ましくはカッパ定常領域である。例示的な適合性カッパ軽鎖定常領域は、配列番号５に示されている。
【０１７１】
本明細書において、本発明のポリペプチドに対する「配列同一性」、「配列類似性」又は「配列相同性」を示すある特定のポリペプチド（例えば、抗原又は抗体）が検討される。例えば、誘導されたヒト化抗体ＶＨ又はＶＬドメインは、出所（例えば、マウス）又はアクセプター（例えば、ヒト）ＶＨ又はＶＬドメインと配列類似性を示し得る。「相同」ポリペプチドは、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性を示し得る。他の実施形態において、「相同」ポリペプチドは、９３％、９５％又は９８％の配列同一性を示し得る。他の実施形態において、「相同」ポリペプチドは、９３％、９５％又は９８％の配列同一性を示し得る。本明細書で使用するとき、２つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、２つの配列間の同一性パーセントと同等である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり（つまり、％相同性＝同一位置の数／位置の合計数×１００）、２つの配列の最適な整列のために導入することが必要なギャップの数と各ギャップの長さが考慮に入れられる。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、下記の非限定的実施例に記載されるように、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
【０１７２】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１〜１７（１９８８））を使用し、ＰＡＭ１２０ウェイト残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップ・レングス・ペナルティ、４のギャップペナルティを使用して決定され得る。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４〜４５３（１９７０））を使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス並びに１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップ・ウェイト及び１、２、３、４、５又は６のレングス・ウェイトを使用して決定され得る。
【０１７３】
追加的に又は代替的に、本発明のタンパク質配列は、公的データベースに対して検索を行い、例えば関連する配列を同定するために、「クエリー配列」として使用されてもよい。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明の抗体分子に相同なアミノ酸配列を取得するために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いて実施されてもよい。比較のためのギャップありアラインメントを取得するために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２に記載されているように利用されてもよい。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用するときは、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用されてもよい。
【０１７４】
同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換又は非保存的アミノ酸置換によって異なり得る。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）の側鎖を有する別のアミノ酸残基によって置換されている置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、置換の保存的性質を訂正するために、配列同一性パーセント又は類似度を上昇させるように調整してもよい。非保存的アミノ酸による置換が存在する場合、実施形態において、配列同一性を示すポリペプチドは、本発明のポリペプチド（例えば、抗体）の所望の機能又は活性を保持する。
【０１７５】
本発明の核酸に対して「配列同一性」、「配列類似性」又は「配列相同性」を示す核酸も、本明細書で検討される。「相同配列」は、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性を示す核酸分子の配列を意味する。他の実施形態において、核酸の「相同配列」は、参照核酸に対して、９３％、９５％又は９８％の配列同一性を示し得る。
【０１７６】
本発明は、プロモーターに操作可能に連結されていてもよい上記に記載されたこのような核酸（例えば、ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／０１０３６；及びＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，４６４参照）と、真核生物分泌経路の他の転写調節及びプロセシング制御エレメントとを含むベクターも提供する。本発明は、これらのベクターを包含する宿主細胞及び宿主発現系も提供する。
【０１７７】
本明細書で使用される場合、用語「宿主発現系」は、本発明の核酸、又はポリペプチド及び抗体のいずれかを生成するように操作することができる任意のタイプの細胞系を含む。このような宿主発現系としては、これらに限定されないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡで形質転換又はトランスフェクトされた微生物（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）又はＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；組換え酵母発現ベクターでトランスフェクトされた酵母（例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ））又は哺乳動物細胞若しくはウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター）のゲノムに由来するプロモーターを含有する組換え発現構築物を包含する哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ−Ｓ、ＨＥＫ−２９３Ｔ、３Ｔ３細胞）が挙げられる。宿主細胞は、２つの発現ベクター、例えば、重鎖由来ポリペプチドをコードしている第１のベクター及び軽鎖由来ポリペプチドをコードしている第２のベクターで同時トランスフェクトされていてもよい。
【０１７８】
哺乳動物細胞を形質転換する方法は当該技術分野で周知である。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，３９９，２１６、４，９１２，０４０、４，７４０，４６１及び４，９５９，４５５参照。宿主細胞は、様々な特徴を有する抗原結合分子の産生を可能にするように操作されていてもよい（例えば、修飾グリコフォーム又はＧｎＴＩＩＩ活性を有するタンパク質）。
【０１７９】
組換えタンパク質の長期的な高収率生産のために、安定な発現が好ましい。したがって、選択された抗体を安定に発現する細胞株は、当該技術分野で認識されている標準技術を使用して操作されてもよく、本発明の一部を形成する。ウイルス複製起源を含有する発現ベクターを使用せずに、宿主細胞は、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター又はエンハンサー配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など）及び選択可能マーカーにより制御されたＤＮＡで形質転換されてもよい。当該技術分野で周知の選択系のいずれも使用することができ、例えば、選択された条件下で発現を増強する効率的なアプローチを提供するグルタミン合成酵素遺伝子発現系（ＧＳ系）を使用してもよい。ＧＳ系は、全体的又は部分的に、ＥＰ０２１６８４６、ＥＰ０２５６０５５、ＥＰ０３２３９９７及びＥＰ０３３８８４１並びにＵ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，５９１，６３９及び５，８７９，９３６に関連して述べられている。安定な細胞株の開発のための別の適合する発現系は、Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ−Ｓキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。
【０１８０】
本発明の抗体が、組換え発現又は任意の他の開示された技術で産生されたら、当該技術分野で公知の方法で精製又は単離されてもよく、これにより抗体は、同定され、それらの天然環境から分離されそして／若しくは回収され、抗体又は関連ＡＤＣの診断的又は治療的用途に干渉する混入物から分離される。単離された抗体には、組換え細胞内のインサイチュの抗体が含まれる。
【０１８１】
これらの単離された調製物は、当該技術分野で認識されている様々な技術、例えば、イオン交換及びサイズ排除クロマトグラフィー、透析、ダイアフィルトレーション及び親和性クロマトグラフィー、特にタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーを使用して精製されてもよい。下記の実施例において、適合する方法をより詳細に説明する。
【０１８２】
６．産生後選択
取得される方法にかかわらず、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、酵母コロニーなど）は、選択され、クローニングされ、そして所望の特徴（例えば、堅固な成長、抗体高産生及び目的の抗原に対する高い親和性などの望ましい抗体特徴）のためにさらにスクリーニングされてもよい。ハイブリドーマは、細胞培養においてインビトロで又は同系遺伝子免疫無防備状態動物において、インビボで拡大増殖させることができる。ハイブリドーマ及び／又はコロニーを選択、クローニング及び拡大増殖する方法は、当業者に周知である。所望の抗体が同定されたら、当該技術分野で認識されている一般的な分子生物学及び生化学的技術を使用して、関連する遺伝子材料を単離、操作及び発現させてもよい。
【０１８３】
ナイーブなライブラリ（天然又は合成のいずれか）で産生された抗体は、中程度の親和性（約１０６から１０７Ｍ−１のＫａ）を有する抗体であり得る。親和性を増加させるために、親和性成熟が、抗体ライブラリの構築（例えば、エラープローンポリメラーゼを使用したインビトロでのランダム変異の導入による）及び抗原に対して高親和性を有する抗体の第２ライブラリからの再選択（例えば、ファージ又は酵母ディスプレイの使用による）により、インビトロで模倣されてもよい。ＷＯ９６０７７５４は、軽鎖遺伝子のライブラリを作成するために、免疫グロブリン軽鎖のＣＤＲに変異誘発を誘導する方法を記載している。
【０１８４】
様々な技術が、抗体を選択するために使用され得、例えば、これらに限定されないが、ヒトコンビナトリアル抗体又はｓｃＦｖ断片のライブラリがファージ又は酵母で合成されるファージ又は酵母ディスプレイを使用でき、このライブラリを、目的の抗原又はその抗体結合部分でスクリーニングし、この抗原に結合するファージ又は酵母を単離して、これらから抗体又は免疫反応性断片を取得し得る（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６、ＰＭＩＤ：９６３０８９１；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８、ＰＭＩＤ：９６００９３４；Ｂｏｄｅｒら、１９９７、ＰＭＩＤ：９１８１５７８；Ｐｅｐｐｅｒら、２００８、ＰＭＩＤ：１８３３６２０６）。ファージ又は酵母ディスプレイライブラリを生成するためのキットは市販されている。抗体ディスプレイライブラリの生成及びスクリーニングに使用され得る他の方法及び試薬もある（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，２２３，４０９；ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９２／１５６７９、ＷＯ９３／０１２８８、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／０９６９０；及びＢａｒｂａｓら、１９９１、ＰＭＩＤ：１８９６４４５参照）。このような技術は、多数の候補抗体のスクリーニングを有利に可能にし、配列の比較的簡単な操作を提供する（例えば、組換えシャッフリングによる）。
【０１８５】
Ｖ．抗体の特徴
ある特定の実施形態において、抗体産生細胞（例えば、ハイブリドーマ、酵母コロニーなど）は、選択され、クローニングされ、並びに好ましい特性、例えば、堅固な成長、抗体高産生及び下記に詳細に記載されるような望ましい部位特異的抗体特徴のためにさらにスクリーニングされてもよい。他の場合において、抗体の特徴は、動物の接種のために、特定の抗原（例えば、特異的ＤＬＬ３又はＡＳＣＬ１アイソフォーム）又は標的抗原の免疫応答性断片を選択することによって付与されてもよい。さらに他の実施形態において、選択された抗体は、上記のように操作されて、免疫化学的特徴、例えば親和性又は薬物動態が増強又は洗練されてもよい。
【０１８６】
Ａ．中和抗体
ある特定の実施形態において、コンジュゲートは「中和」抗体、又はこの誘導体若しくは断片を含む。すなわち、本発明は、特異的なドメイン、モチーフ又はエピトープと結合する抗体分子であって、ＤＬＬ３又はＡＳＣＬ１の生物活性を遮断、低減又は阻害することが可能な抗体分子を含むことができる。より一般に、用語「中和抗体」は、標的分子又はリガンドに結合する、又はこれらと相互作用して、標的分子と受容体又は基質のような結合パートナーとの結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）又は結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を防ぎ、これにより、中和抗体を用いない場合にこれらの分子の相互作用から生じると思われる生物学的応答を、妨害する抗体を指す。
【０１８７】
当該技術分野において公知の競合的結合アッセイを用いて、抗体又はこの免疫学的機能性断片若しくは誘導体の結合及び特異性が評価され得ることは理解される。本発明に関すると、抗体又は断片は、例えばＮｏｔｃｈ受容体活性によって又はインビトロ競合的結合アッセイにおいて測定すると、過剰な抗体により、ＤＬＬ３又はＡＳＣＬ１に結合する結合パートナーの量が少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又はこれを超えて減少した場合に、ＤＬＬ３又はＡＳＣＬ１の結合パートナー又は基質への結合を阻害又は低減することが支持される。例えば、ＤＬＬ３に対する抗体の場合、中和抗体又はアンタゴニストは、好ましくはＮｏｔｃｈ受容体の活性を少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％又はそれを超えて改変する。この改変された活性は、当該技術分野で認識されている技術を直接使用して測定されてもよく、又は下流において改変された活性が有する影響（例えば、腫瘍発生、細胞生存又はＮｏｔｃｈ応答遺伝子の活性化若しくは抑制）によって測定されてもよいことが理解される。好ましくは、抗体がＤＬＬ３活性を中和する能力は、Ｎｏｔｃｈ受容体に対するＤＬＬ３結合の阻害によって、又はＤＬＬ３媒介性のＮｏｔｃｈシグナル伝達抑制を軽減する上記の抗体の能力を評価することによって評価される。
【０１８８】
Ｂ．内在化抗体
ある特定の実施形態において、抗体は、抗体が決定因子と結合し、腫瘍形成性細胞のような選択された標的細胞に内在化される（任意のコンジュゲートされた薬学的に活性な成分を伴う）ような、内在化抗体を含み得る。内在化する抗体分子の数は、抗原発現細胞、特に、抗原発現腫瘍形成性細胞を殺傷するのに十分であり得る。抗体又は一部の場合には抗体薬物コンジュゲートの効力に応じて、単一抗体分子の細胞への取込みが、抗体が結合する標的細胞を殺傷するために十分であり得る。本発明に関連して、発現されたＤＬＬ３タンパク質の実質的な部分が腫瘍形成性細胞表面に結合して残り、それにより本開示の抗体又はＡＤＣの局在化及び内在化を可能にしているという証拠がある。選択された実施形態において、このような抗体は、内在化に際して細胞を殺傷する１つ以上の薬物と結合されるか又はコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣは、内在化部位特異的ＡＤＣを含む。
【０１８９】
本明細書で使用されるとき、「内在化する」抗体は、関連する決定因子に結合する際に、標的細胞によって（任意のコンジュゲートされた細胞毒と共に）取り込まれる抗体を指す。このような内在化するＡＤＣの数は、決定因子発現細胞、特に、決定因子発現がん幹細胞を殺傷するのに十分であることが好ましい。細胞毒又はＡＤＣの全体としての効力に応じて、一部の場合には、抗体の数分子の細胞内への取込みが、抗体が結合する標的細胞を殺傷するために十分である。例えば、ＰＢＤ又はカリチアマイシンのようなある特定の薬物は強力であるため、抗体にコンジュゲートされた毒素の数分子の内在化が、腫瘍細胞を殺傷するために十分である。抗体が哺乳類細胞に結合して内在化するかどうかは、当該技術分野で認識されている様々なアッセイ（例えば、Ｍａｂ−Ｚａｐ及びＦａｂ−Ｚａｐのようなサポリンアッセイ；アドバンストターゲティングシステム）により決定され得る。抗体が細胞に内在化するかどうかを検出する方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，６１９，０６８にも記載されている。
【０１９０】
Ｃ．枯渇抗体
他の実施形態において、本発明の抗体は枯渇抗体である。用語「枯渇」抗体は、好ましくは細胞表面上又は細胞表面近傍で抗原に結合し、（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ又は細胞毒性剤の導入により）細胞の死を誘導するか、促進するか又はもたらす抗体を指す。実施形態において、選択された枯渇抗体は、細胞毒にコンジュゲートされている。
【０１９１】
好ましくは、枯渇抗体は、定義された細胞集団におけるＤＬＬ３発現細胞又はＡＳＣＬ１発現細胞の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％又は９９％を殺傷することができる。いくつかの実施形態において、細胞集団は、濃縮されたか、区分されたか、精製されたか又は単離された腫瘍形成性細胞、例えば、がん幹細胞を含み得る。他の実施形態において、細胞集団は、全腫瘍試料又はがん幹細胞を含む異種性腫瘍抽出物を含み得る。標準的な生化学的技術が使用され、腫瘍形成性細胞の枯渇が、本明細書に記載の技術に従って監視及び定量されてもよい。
【０１９２】
Ｄ．結合親和性
本明細書において、特定の決定因子、例えば、ＤＬＬ３又はＡＳＣＬ１に対して高い結合親和性を有する抗体が開示される。用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数又は見かけの親和性を指す。本発明の抗体は、解離定数ＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）が≦１０−７Ｍであるとき、その標的抗原に免疫特異的に結合することができる。抗体は、ＫＤが≦５×１０−９Ｍであるとき、高親和性で抗原に特異的に結合し、ＫＤが≦５×１０−１０Ｍであるとき、非常に高い親和性で抗原に特異的に結合する。本発明の一実施形態において、抗体は、≦１０−９ＭのＫＤと、約１×１０−４／秒のオフ速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）を有する。本発明の一実施形態において、オフ速度は、＜１×１０−５／秒である。本発明の他の実施形態において、抗体は、約１０−７Ｍから１０−１０ＭのＫＤで決定因子に結合し、さらに別の実施形態において、ＫＤ≦２×１０−１０Ｍで決定因子に結合する。本発明のさらに他の選択された実施形態は、１０−６Ｍ未満、５×１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、５×１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、５×１０−１４Ｍ未満、１０−１５Ｍ未満又は５×１０−１５Ｍ未満のＫＤ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する抗体を含む。
【０１９３】
ある特定の実施形態において、決定因子、例えば、ＤＬＬ３又はＡＳＣＬ１に免疫特異的に結合する本発明の抗体は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも２×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１又は少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１の結合速度定数又はｋｏｎ（又はｋａ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋｏｎ←抗体−Ａｇ）を有し得る。
【０１９４】
別の実施形態において、決定因子、例えば、ＤＬＬ３又はＡＳＣＬ１に免疫特異的に結合する本発明の抗体は、１０−１ｓ−１未満、５×１０−１ｓ−１未満、１０−２ｓ−１未満、５×１０−２ｓ−１未満、１０−３ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満又は１０−１０ｓ−１未満の解離速度定数又はｋｏｆｆ（又はｋｄ）速度（抗体＋抗原（Ａｇ）ｋｏｆｆ←抗体−Ａｇ）を有し得る。
【０１９５】
結合親和性は、当該技術分野で公知の様々な技術、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、二面偏波式干渉法、静的光散乱法、動的光散乱法、等温滴定型カロリメトリー、ＥＬＩＳＡ、超遠心分析法及びフローサイトメトリーを使用して決定され得る。
【０１９６】
Ｅ．ビニング（Ｂｉｎｎｉｎｇ）及びエピトープマッピング
本明細書に開示された抗体は、それらが結合する個別のエピトープの観点で特徴づけることができる。「エピトープ」は、抗体又は免疫反応性断片が特異的に結合する決定因子の部分である。免疫特異的結合は、上記の結合親和性に基づいて又はタンパク質及び／若しくは巨大分子の複雑な混合物における（例えば、競合アッセイにおける）その標的抗原の抗体による優先的な認識により、確認し、定義することができる。「線状エピトープ」は、抗体の免疫特異的結合を可能にする、抗原における連続的アミノ酸により形成される。線状エピトープに優先的に結合する能力は、一般に、抗原が変性されたときでも維持される。逆に、「立体エピトープ」は、通常、抗原のアミノ酸配列における非連続的アミノ酸であるが、抗原の二次的、三次的又は四次的構造の概念において、単一の抗体に同時に結合されるために十分に近接している非連続的アミノ酸を含む。立体エピトープを有する抗原が変性されたとき、通常、抗体はもはや抗原を認識しない。エピトープ（連続的又は非連続的）は、特有の空間的立体配置に、通常少なくとも３個、より一般的には少なくとも５個又は８〜１０個又は１２〜２０個のアミノ酸を含む。
【０１９７】
本発明の抗体は、それらが属する群又は「ビン（ｂｉｎ）」の観点で特徴づけることもできる。「ビニング」は、免疫原性決定因子に同時に結合することができない抗体の対を同定し、それによって結合について「競合する」抗体を同定する、競合的抗体結合アッセイの使用を指す。抗体の競合は、試験される抗体又は免疫学的に機能的な断片が、共通の抗原に対する参照抗体の特異的結合を予防又は阻害するアッセイによって決定され得る。そのようなアッセイは、典型的には、固体表面又は細胞、非標識試験抗体及び標識参照抗体に結合した精製抗原（例えば、ＤＬＬ３、ＡＳＣＬ１又はこのドメイン若しくは断片）の使用が含まれる。競合阻害は、試験抗体の存在下に固体表面又は細胞に結合した標識の量を決定することにより測定される。競合的結合を決定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書に記載の実施例で提供される。通常、競合抗体が過剰に存在するとき、競合抗体は、参照抗体の共通抗原に対する特異的な結合を、少なくとも３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する。いくつかの例において、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％以上阻害される。逆に、参照抗体が結合しているとき、参照抗体は、後で添加する試験抗体（つまり、ＤＬＬ３抗体又はＡＳＣＬ１抗体）の結合を、好ましくは、少なくとも、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する。いくつかの例において、試験抗体の結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％以上阻害される。
【０１９８】
一般に、ビニング又は競合結合は、当該技術分野で認識されている様々な技術、例えば、イムノアッセイ、例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定アッセイ、蛍光イムノアッセイ及びタンパク質Ａイムノアッセイを使用して決定され得る。このようなイムノアッセイは慣例であり、当該技術分野で周知である（Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ参照）。さらに、交差ブロックアッセイを使用することができる（例えば、ＷＯ２００３／４８７３１；及びＨａｒｌｏｗら（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ参照）。
【０１９９】
競合的阻害（したがって「ビン」）を決定するために使用される他の技術としては、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴；例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用したバイオレイヤー干渉法；又は、例えば、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）若しくはマルチプレックスＬＵＭＩＮＥＸ（商標）検出アッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用したフローサイトメトリービーズアレイが挙げられる。
【０２００】
Ｌｕｍｉｎｅｘは、大規模マルチプレックス抗体対合を可能にするビーズベースのイムノアッセイプラットフォームである。アッセイは、抗体の対の標的抗原への同時結合パターンを比較する。抗体の対の１つ（捕捉ｍＡｂ）がＬｕｍｉｎｅｘビーズに結合し、一方でそれぞれの捕捉ｍＡｂは異なる色のビーズに結合する。他の抗体（検出因子ｍＡｂ）は、蛍光シグナル（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ））に結合する。アッセイは、抗原に対する抗体の同時結合（対合）を解析し、同様の対合プロファイルを有する抗体を共にグループ化する。検出因子ｍＡｂ及び捕捉ｍＡｂの同様のプロファイルは、２つの抗体が同じか又は密接に関連したエピトープに結合することを示す。一実施形態において、対合プロファイルは、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数を使用して決定され、試験される一連の抗体の任意の特定の抗体に最も密接に相関する抗体を同定することができる。実施形態において、抗体の対のＰｅａｒｓｏｎ相関係数が少なくとも０．９である場合、試験／検出因子ｍＡｂは、参照／捕捉ｍＡｂと同じビンにあると決定される。他の実施形態において、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は、少なくとも０．８、０．８５、０．８７又は０．８９である。さらなる実施形態において、Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数は、少なくとも０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９又は１である。Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイから得られたデータを解析する他の方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．８，５６８，９９２に記載されている。同時に１００種類（又はそれ以上）の異なるビーズを解析するＬｕｍｉｎｅｘの能力により、ほぼ無制限の抗原及び／又は抗体表面が用意され、バイオセンサーアッセイ上の抗体エピトーププロファイリングにおいて改善された処理能力及び解像度がもたらされる（Ｍｉｌｌｅｒら、２０１１、ＰＭＩＤ：２１２２３９７０）。
【０２０１】
同様に、表面プラズモン共鳴を含むビニング技術は、本発明に適合する。本明細書で使用されるとき、「表面プラズモン共鳴」は、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化を検出することにより、特異的相互作用のリアルタイム解析を可能にする光学的現象を指す。ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００システムのような市販の機器を使用して、選択された抗体が、定義された抗原に対する結合に関して互いに競合するか否かを容易に決定することができる。
【０２０２】
他の実施形態において、試験抗体が結合に関して参照抗体と「競合する」かを決定するために使用し得る技術は「バイオレイヤー干渉法」である。この干渉法は、２つの表面、つまりバイオセンサーチップ上に固定化されたタンパク質の層及び内部参照層から反射される白色光の干渉パターンを解析する光学的解析技術である。バイオセンサーチップに結合した分子の数の任意の変化は、リアルタイムで測定され得る干渉パターンのシフトを引き起こす。このようなバイオレイヤー干渉法アッセイは、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ機器を使用して以下のように実施され得る。参照抗体（Ａｂ１）を、抗マウス捕捉チップ上に捕捉させ、次いで、高濃度の非結合抗体を使用して、チップをブロックし、ベースラインを収集する。単量体の組換え標的タンパク質を、次いで特異的抗体（Ａｂ１）に捕捉させ、チップを対照と同じ抗体（Ａｂ１）を含むウェル中又は異なる試験抗体（Ａｂ２）を含むウェル中に浸漬させる。結合レベルを対照Ａｂ１と比較して決定して、さらなる結合が生じない場合、Ａｂ１及びＡｂ２は「競合する」抗体と決定される。Ａｂ２でさらなる結合が観察された場合、Ａｂ１及びＡｂ２は互いに競合しないと決定される。このプロセスは、固有のビンを示す９６ウェルのプレート中の抗体の完全な列を使用して、固有の抗体の大きなライブラリをスクリーニングするために拡大され得る。実施形態において、参照抗体が共通の抗原に対する試験抗体の特異的結合を少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する場合、試験抗体は参照抗体と競合する。他の実施形態において、結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９７％以上阻害される。
【０２０３】
競合抗体の群を包含するビンが定義されたら、この抗体の群が結合する抗原上の特異的ドメイン又はエピトープを決定するために、さらなる特徴づけを実施してもよい。ドメイン−レベルエピトープマッピングは、Ｃｏｃｈｒａｎら、２００４、ＰＭＩＤ：１５０９９７６３に記載されているプロトコルを改変して使用することにより実施され得る。ファインエピトープマッピングは、抗体が結合する決定因子のエピトープを含む抗原上の特異的アミノ酸を決定するプロセスである。
【０２０４】
ある特定の実施形態において、ファインエピトープマッピングは、ファージ又は酵母ディスプレイを使用して実施することができる。他の適合エピトープマッピング技術としては、アラニンスキャニング変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ、２００４、ＰＭＩＤ：１４９７０５１３）又はペプチド切断解析が挙げられる。さらに、エピトープ除去、エピトープ抽出及び抗原の化学的修飾のような方法（Ｔｏｍｅｒ、２０００、ＰＭＩＤ：１０７５２６１０）も、タンパク分解酵素のような酵素（例えば、トリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎ、キモトリプシンなど）；スクシンイミジルエステル及びそれらの誘導体、一級アミン含有化合物、ヒドラジン及びカルボヒドラジン、遊離アミノ酸のような化学物質を使用して利用することができる。別の実施形態において、抗原構造ベースの抗体プロファイリング（Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ、ＡＳＡＰ）としても公知の修飾補助プロファイリング（Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）を使用して、化学的又は酵素的に修飾された抗原表面に対する各抗体の結合プロファイルの類似性に従って、同じ抗原に向かう多数のモノクローナル抗体を分類することができる（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００４／０１０１９２０）。
【０２０５】
抗原上の所望のエピトープが決定されたら、このエピトープに対するさらなる抗体を、例えば、本明細書に記載の技術を使用して、選択されたエピトープを含むペプチドで免疫化することにより、生成することができる。
【０２０６】
ＶＩ．抗体コンジュゲート
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、薬学的に活性な又は診断的成分とコンジュゲートして、「抗体薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）又は「抗体コンジュゲート」を形成し得る。用語「コンジュゲート」は広義に使用され、結合の方法にかかわらず、任意の薬学的に活性な又は診断的成分と本発明の抗体との共有結合的又は非共有結合的結合を意味する。ある特定の実施形態において、この結合は、抗体のリシン又はシステイン残基を通じて達成される。いくつかの実施形態において、薬学的に活性な又は診断的成分は、１つ以上の部位特異的な遊離システインを介して抗体にコンジュゲートされ得る。開示されるＡＤＣは、治療及び診断目的のために使用され得る。
【０２０７】
本発明のＡＤＣが使用されて、所定の弾頭を、標的位置（例えば、腫瘍形成性細胞及び／又はＤＬＬ３を発現する細胞）に選択的に送達し得ることが理解される。本明細書において示される場合、用語「薬物」又は「弾頭」は、相互に交換可能に使用され得、任意の生物学的に活性（例えば、薬学的活性化合物又は治療成分）分子若しくは化合物、又は対象に導入すると、生理学的作用又はレポーター機能を有する検出可能な分子若しくは化合物を意味する。誤解を避けるためにいうと、このような弾頭には、以下に記載されている抗がん剤又は細胞毒が含まれる。「ペイロード」は、ＡＤＣが標的に到達するまで、比較的安定な医薬品複合体を好ましくはもたらす、任意選択のリンカー化合物（例えば、治療用ペイロード）と組み合わせた薬物又は弾頭を含み得る。例として、コンジュゲート上の弾頭又は薬物は、ペプチド、タンパク質、又はインビボで代謝されて活性剤となるプロドラッグ、ポリマー、核酸分子、小分子、結合剤、模倣剤、合成薬物、無機分子、有機分子及び放射性同位体を含み得る。ある特定の実施形態において、薬物又は弾頭は、リンカーを介して、共有結合により抗体にコンジュゲートされる。他の実施形態（例えば、放射性同位体）において、薬物又は弾頭は、抗体に直接コンジュゲートされる、又は抗体に組み込まれる。
【０２０８】
好ましい実施形態において、開示されるＡＤＣは、結合したペイロード（例えば、薬物リンカー）を、弾頭の放出及び活性化の前に、比較的非反応性の非毒性状態で標的部位に向かわせる（例えば、本明細書において開示されているＰＢＤＳ１〜５）。弾頭のこの標的化放出は、好ましくは、ペイロードの安定なコンジュゲーション（例えば、抗体上の１つ以上のシステイン又はリシンを介する）及び過剰にコンジュゲートされた毒性ＡＤＣ種を最小にするＡＤＣ調製物の比較的均質な組成物により達成される。腫瘍部位への送達時に、弾頭を大量に放出するように設計された薬物リンカーと結合すると、本発明のコンジュゲートは、望ましくない非特異的毒性を実質的に低減することができる。これにより、腫瘍部位で比較的高レベルの活性な細胞毒が、非標的化細胞及び組織への曝露を最小にしつつ有利に提供され、これにより増強した治療指数が提供される。
【０２０９】
本発明のいくつかの実施形態は、治療成分（例えば、細胞毒）が組み込まれたペイロードを含むが、診断剤及び生体適合性修飾剤が組み込まれた他のペイロードも、開示されるコンジュゲートにより、提供される標的化送達から利益を得る場合があることが理解される。したがって、例示的な治療的ペイロードに関する任意の開示は、文脈による他の指示がない限り、本明細書に述べられている診断剤又は生体適合性修飾剤を含むペイロードにも適用可能である。選択されたペイロードは、共有結合的に又は非共有結合的に抗体に連結することができ、少なくとも部分的にコンジュゲーションを達成するために使用される方法に依存して、様々な化学量論的モル比率を示し得る。
【０２１０】
本発明のコンジュゲートは一般的に、式：
Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ
（式中、
ａ）Ａｂは、抗ＤＬＬ３抗体を含み、
ｂ）Ｌは、任意選択のリンカーを含み、
ｃ）Ｄは、薬物を含み、
ｄ）ｎは、約１から約２０の整数である）
又はその薬学的に許容される塩によって表され得る。
【０２１１】
当業者は、前述の式によるコンジュゲートは、いくつかの異なるリンカー及び薬物を使用して作製することができ、コンジュゲーション方法は、成分の選択により様々であることを理解する。このように、開示される抗体の反応性残基（例えば、システイン又はリシン）と結合する任意の薬物又は薬物リンカー化合物は、本明細書における教示と適合する。同様に、選択される薬物の抗体に対するコンジュゲーション（部位特異的コンジュゲーションを含む）を可能にする任意の反応条件は、本発明の範囲内である。前記にかかわらず、本発明のいくつかの好ましい実施形態は、薬物又は薬物リンカーの遊離システインとの、本明細書に記載の穏やかな還元剤と組み合わせた安定化剤を使用した選択的なコンジュゲーションを含む。このような反応条件は、非特異的コンジュゲーション及び混入物がより少なく、したがって毒性が少ない、より均質な調製物を提供する傾向がある。
【０２１２】
Ａ．ペイロード及び弾頭
１．治療剤
議論した通り、本発明の抗体は、治療成分又は抗がん剤のような薬物を含む、任意の薬学的活性化合物、例えば、これらに限定されないが、細胞毒性剤（又は細胞毒）、細胞分裂停止剤、抗血管新生剤、腫瘍減量剤、化学治療剤、放射性治療剤、標的化抗がん剤、生物学的応答修飾剤、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、抗転移剤及び免疫療法剤と、コンジュゲート、連結、又は融合、又は他の方法で結合されてもよい。
【０２１３】
例示的な抗がん剤又は細胞毒（それらのホモログ及び誘導体を含む）としては、１−デヒドロテストステロン、アントラマイシン、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、カリチアマイシン（ｎ−アセチルカリチアマイシンを含む）、コルヒチン、シクロホスファミド、サイトカラシンＢ、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ジヒドロキシアントラシン、ジオン、デュオカルマイシン、エメチン、エピルビシン、臭化エチジウム、エトポシド、グルココルチコイド、グラミシジンＤ、リドカイン、ＤＭ−１及びＤＭ−４（免疫原）のようなマイタンシノイド、ベンゾジアゼピン誘導体（免疫原）、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、パクリタキセル、プロカイン、プロプラノロール、ピューロマイシン、テニポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、テトラカイン並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物、酸、若しくは誘導体が挙げられる。
【０２１４】
さらなる適合細胞毒は、ドラスタチン及びオーリスタチン類、例えば、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）及びモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、アマニチン類、例えば、α−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン又はε−アマニチン（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｐｈａｒｍａ）、ＤＮＡ副溝結合剤、例えば、デュオカルマイシン誘導体（Ｓｙｎｔａｒｇａ）、アルキル化剤、例えば、修飾若しくは二量体ピロロベンゾジアゼピン類（ＰＢＤ）、メクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ及びシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン、スプライシング阻害剤、例えば、メアヤマイシン類似体又は誘導体（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，８２５，２６７に示されるＦＲ９０１４６４）、チューブリン（ｔｕｂｕｌａｒ）結合剤、例えば、エポチロン類似体及びチューブリシン、パクリタキセル及びＤＮＡ損傷剤、例えば、カリチアマイシン及びエスペラミシン、抗代謝物質、例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン及び５−フルオロウラシル  デカルバジン、抗有糸分裂剤、例えば、ビンブラスチン及びビンクリスチン及びアントラサイクリン類、例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）及びドキソルビシン並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩又は溶媒和物、酸又は誘導体を含む。
【０２１５】
選択された実施形態において、本発明の抗体は、細胞傷害性Ｔ細胞を動員し、腫瘍形成性細胞に標的化させるために、抗ＣＤ３結合分子と結合され得る（ＢｉＴＥ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；例えば、Ｆｕｈｒｍａｎｎら、（２０１０）Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ＡＡＣＲ要約番号５６２５を参照）。
【０２１６】
さらなる実施形態において、本発明のＡＤＣは、適切なリンカーを使用してコンジュゲートされる治療用放射性同位体を含む細胞毒を含んでもよい。このような実施形態に適合し得る例示的な放射性同位体としては、これらに限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、銅（６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ）、硫黄（３５Ｓ）、ラジウム（２２３Ｒ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ビスマス（２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ、７６Ｂｒ、２１１Ａｔ及び２２５Ａｃが挙げられる。他の放射性核種も診断剤及び治療剤として利用可能であり、特にエネルギー範囲６０から４，０００ｋｅＶのものを利用し得る。
【０２１７】
他の選択された実施形態において、本発明のＡＤＣは、細胞毒性ベンゾジアゼピン誘導体弾頭にコンジュゲートされる。本開示の抗体にコンジュゲートされ得る適合ベンゾジアゼピン誘導体（及び任意選択のリンカー）は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．８，４２６，４０２並びにＰＣＴ出願ＷＯ２０１２／１２８８６８及びＷＯ２０１４／０３１５６６に記載されている。ＰＢＤと同様に、適合ベンゾジアゼピン誘導体は、ＤＮＡの副溝に結合し、核酸合成を阻害すると考えられる。このような化合物は、強力な抗腫瘍特性を有することが報告され、したがって、本発明のＡＤＣに用いるのにとりわけ適している。
【０２１８】
いくつかの実施形態において、本発明のＡＤＣは、ＰＢＤ及びその薬学的に許容される塩又は溶媒和物、酸又は誘導体を、弾頭として含み得る。ＰＢＤは、ＤＮＡの副溝に共有結合することにより抗腫瘍活性を発揮し、核酸合成を阻害するアルキル化剤である。ＰＢＤは、強力な抗腫瘍特性を有する一方で、最小の骨髄抑制を示すことが示されてきた。本発明に適合するＰＢＤは、いくつかの種類のリンカー（例えば、遊離のスルフヒドリルを有するマレイミド部分を含むペプチジルリンカー）を使用して抗体に連結されてもよく、ある特定の実施形態では二量体の形態である（すなわち、ＰＢＤ二量体）。開示される抗体にコンジュゲートさせ得る適合ＰＢＤ（及び任意選択のリンカー）は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，３６２，３３１、７，０４９，３１１、７，１８９，７１０、７，４２９，６５８、７，４０７，９５１、７，７４１，３１９、７，５５７，０９９、８，０３４，８０８、８，１６３，７３６、２０１１／０２５６１５７及びＰＣＴ出願ＷＯ２０１１／１３０６１３、ＷＯ２０１１／１２８６５０、ＷＯ２０１１／１３０６１６、ＷＯ２０１４／０５７０７３及びＷＯ２０１４／０５７０７４に記載されている。本発明と適合するＰＢＤ化合物の例は、このすぐ後に一層詳細に議論されている。
【０２１９】
本発明に関すると、ＰＢＤは、強力な抗腫瘍特性を有する一方、最小の骨髄抑制を示すことが示されてきた。本発明に適合するＰＢＤは、いくつかの種類のリンカーのうちのいずれか１つ（例えば、遊離のスルフヒドリルを有するマレイミド部分を含むペプチジルリンカー）を用いてＤＬＬ３標的剤に連結されてもよく、特定の実施形態において、二量体の形態である（すなわち、ＰＢＤ二量体）。ＰＢＤは、以下の一般構造のものである。
【０２２０】
【化６】
2019516705.tif 000010
【０２２１】
これらは、芳香族Ａ環及びピロロＣ環の両方における置換基の数、種類及び位置並びにＣ環の飽和の程度が異なる。Ｂ環において、ＤＮＡのアルキル化に関与する求電子中心であるＮ１０−Ｃ１１位にイミン（Ｎ＝Ｃ）、カルビノールアミン（ＮＨ−ＣＨ（ＯＨ））又はカルビノールアミンメチルエーテル（ＮＨ−ＣＨ（ＯＭｅ））のいずれかが存在する。全ての公知の天然産物は、Ｃ環からＡ環の方を見るときに右回りのねじれをもたらすキラルＣ１１ａ位における（Ｓ）−立体配置を有する。これは、Ｂ型ＤＮＡの副溝に対してイソらせん性となるための適切な三次元形状を天然産物に付与して、結合部位におけるぴったりとした結合をもたらす（Ｋｏｈｎ、Ｉｎ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ＩＩＩ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３−１１頁（１９７５）；Ｈｕｒｌｅｙ及びＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ、Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．、１９巻、２３０−２３７頁（１９８６））。副溝における付加体を形成する天然産物の能力は、ＤＮＡプロセシングを妨害すること、したがって細胞毒性剤としてのこれらの使用を可能にする。上で言及したように、これらの効力を増大させるために、ＰＢＤは、本明細書で述べたように抗ＤＬＬ３抗体にコンジュゲートされ得る二量体でしばしば用いられる。
【０２２２】
特に好ましい実施形態において、本開示のモジュレーターにコンジュゲートされ得る適合性ＰＢＤは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７に記載されている。この開示において、ＰＢＤ二量体、すなわち２つのＰＢＤ部分を含むものが好ましいものとなり得る。したがって、本発明の好ましいコンジュゲートは、式（ＡＢ）又は（ＡＣ）：
【０２２３】
【化７】
2019516705.tif 000011
を有するものである。
式中、
点線は、Ｃ１とＣ２又はＣ２とＣ３との間に二重結合が任意選択で存在していることを示し、
Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ及びＣＯＲから独立して選択され、任意選択的に、ハロ又はジハロからさらに選択され、
ＲＤは、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ及びハロから独立して選択され、
Ｒ６及びＲ９は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから独立して選択され、
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから独立して選択され、
Ｒ１０は、本明細書に記載されているＤＬＬ３抗体、又はこの断片若しくは誘導体に結合しているリンカーであり、
Ｑは、Ｏ、Ｓ及びＮＨから独立して選択され、
Ｒ１１は、Ｈ又はＲであり、又はＱはＯである場合、Ｒ１１は、ＳＯ３Ｍとすることができ、Ｍは金属陽イオンであり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｈ）から選択され、選択された実施形態において、Ｏを含み、
Ｒ”は、Ｃ３〜１２アルキレン基であり、この鎖は、１個以上のヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ及び／又は芳香族環、例えば、ベンゼン又はピリジンであり、この環は、置換されていてもよい）により中断されていてもよく、
Ｒ及びＲ’は、置換されていてもよいＣ１〜１２アルキル、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル及びＣ５〜２０アリール基からそれぞれ独立して選択され、任意選択的に、基ＮＲＲ’に関連して、Ｒ及びＲ’は、それらが結合している窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４員、５員、６員又は７員の複素環式環を形成し、
Ｒ２”、Ｒ６”、Ｒ７”、Ｒ９”、Ｘ”、Ｑ”及びＲ１１”（存在する場合）は、それぞれ、Ｒ２、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ９、Ｘ、Ｑ及びＲ１１に従って定義され、Ｒｃは、キャッピング基である。
【０２２４】
前述の構造を含む選択された実施形態をこのすぐ後により詳細に記載する。
【０２２５】
二重結合
一実施形態において、Ｃ１とＣ２との間及びＣ２とＣ３との間に存在する二重結合は存在しない。
【０２２６】
一実施形態において、点線は、以下に示すように、Ｃ２とＣ３との間の二重結合の任意選択の存在を示す。
【０２２７】
【化８】
2019516705.tif 000012
【０２２８】
一実施形態において、二重結合は、Ｒ２がＣ５〜２０アリール又はＣ１〜１２アルキルである場合に、Ｃ２とＣ３との間に存在する。好ましい実施形態において、Ｒ２は、メチル基を含む。
【０２２９】
一実施形態において、点線は、以下に示すように、Ｃ１とＣ２との間の二重結合の任意選択の存在を示す。
【０２３０】
【化９】
2019516705.tif 000013
【０２３１】
一実施形態において、二重結合は、Ｒ２がＣ５〜２０アリール又はＣ１〜１２アルキルである場合に、Ｃ１とＣ２との間に存在する。好ましい実施形態において、Ｒ２は、メチル基を含む。
【０２３２】
Ｒ２
一実施形態において、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ及びＣＯＲから独立に選択され、ハロ又はジハロから任意選択的にさらに選択される。
【０２３３】
一実施形態において、Ｒ２は、Ｈ、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、ＣＮ、Ｒ、ＯＲ、＝ＣＨ−ＲＤ、＝Ｃ（ＲＤ）２、Ｏ−ＳＯ２−Ｒ、ＣＯ２Ｒ及びＣＯＲから独立に選択される。
【０２３４】
一実施形態において、Ｒ２は、Ｈ、＝Ｏ、＝ＣＨ２、Ｒ、＝ＣＨ−ＲＤ及び＝Ｃ（ＲＤ）２から独立に選択される。
【０２３５】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＨである。
【０２３６】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＲであり、Ｒは、ＣＨ３を含む。
【０２３７】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に＝Ｏである。
【０２３８】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に＝ＣＨ２である。
【０２３９】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＣＨ−ＲＤである。ＰＢＤ化合物内において、＝ＣＨ−ＲＤ基は、下に示すいずれかの立体配置を有し得る。
【０２４０】
【化１０】
2019516705.tif 000014
一実施形態において、立体配置は、立体配置（Ｉ）である。
【０２４１】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に＝Ｃ（ＲＤ）２である。
【０２４２】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＣＦ２である。
【０２４３】
一実施形態において、Ｒ２は、独立にＲである。
【０２４４】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ５〜２０アリールである。
【０２４５】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ１〜１２アリールである。
【０２４６】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ５〜２０アリールである。
【０２４７】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ５〜７アリールである。
【０２４８】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいＣ８〜１０アリールである。
【０２４９】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいフェニルである。
【０２５０】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいナフチルである。
【０２５１】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいピリジルである。
【０２５２】
一実施形態において、Ｒ２は、独立に、置換されていてもよいキノリニル又はイソキノリニルである。
【０２５３】
一実施形態において、Ｒ２は、１つから３つの置換基を有し、１つ及び２つがより好ましく、一置換基が最も好ましい。置換基は、いずれの位置にあってもよい。
【０２５４】
Ｒ２がＣ５〜７アリール基である場合、単一置換基は、好ましくは化合物の残余部分に対する結合に隣接しない環原子上にある。すなわち、単一置換基は、好ましくは化合物の残余部分に対する結合に対してβ又はγである。したがって、Ｃ５〜７アリール基がフェニルである場合、置換基は、好ましくはメタ位又はパラ位にあり、より好ましくはパラ位にある。
【０２５５】
一実施形態において、Ｒ２は、
【０２５６】
【化１１】
2019516705.tif 000015
（式中、アスタリスクは、結合点を示す）から選択される。
【０２５７】
Ｒ２がＣ８〜１０アリール基、例えば、キノリニル又はイソキノリニルである場合、Ｒ２は、キノリニル環又はイソキノリニル環のいかなる位置におけるいかなる数の置換基も有し得る。いくつかの実施形態において、Ｒ２は、１つ、２つ又は３つの置換基を有し、これらは、近位及び遠位の環のいずれか又は両方（２つ以上の置換基の場合）に存在し得る。
【０２５８】
一実施形態において、Ｒ２が置換されていてもよい場合、置換基は、下の置換基の項に示す置換基から選択される。
【０２５９】
Ｒが置換されていてもよい場合、置換基は、好ましくは以下から選択される：
ハロ、ヒドロキシル、エーテル、ホルミル、アシル、カルボキシ、エステル、アシルオキシ、アミノ、アミド、アシルアミド、アミノカルボニルオキシ、ウレイド、ニトロ、シアノ及びチオエーテル。
【０２６０】
一実施形態において、Ｒ又はＲ２が置換されていてもよい場合、置換基は、Ｒ、ＯＲ、ＳＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、ハロ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＯＮＨ２、ＣＯＮＨＲ及びＣＯＮＲＲ’からなる群から選択される。
【０２６１】
Ｒ２がＣ１〜１２アルキルである場合、任意選択の置換基は、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基及びＣ５〜２０アリール基をさらに含み得る。
【０２６２】
Ｒ２がＣ３〜２０ヘテロシクリルである場合、任意選択の置換基は、Ｃ１〜１２アルキル基及びＣ５〜２０アリール基をさらに含み得る。
【０２６３】
Ｒ２がＣ５〜２０アリール基である場合、任意選択の置換基は、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基及びＣ１〜１２アルキル基をさらに含み得る。
【０２６４】
「アルキル」という用語が、アルケニルサブクラス及びアルキニルサブクラス並びにシクロアルキルを含むことが、理解される。したがって、Ｒ２が置換されていてもよいＣ１〜１２アルキルである場合、アルキル基が、共役系の一部をなし得る、１つ以上の炭素−炭素二重又は三重結合を任意選択的に含むことが理解される。一実施形態において、置換されていてもよいＣ１〜１２アルキル基は、少なくとも１つの炭素−炭素二重又は三重結合を含み、この結合は、Ｃ１とＣ２との間又はＣ２とＣ３との間に存在する二重結合とコンジュゲートしている。一実施形態において、Ｃ１〜１２アルキル基は、飽和Ｃ１〜１２アルキル、Ｃ２〜１２アルケニル、Ｃ２〜１２アルキニル及びＣ３〜１２シクロアルキルから選択される基である。
【０２６５】
Ｒ２上の置換基がハロである場合、置換基は、好ましくはＦ又はＣｌ、より好ましくはＣｌである。
【０２６６】
Ｒ２上の置換基がエーテルである場合、置換基は、いくつかの実施形態において、アルコキシ基、例えば、Ｃ１〜７アルコキシ基（例えば、メトキシ、エトキシ）であってもよく又は、いくつかの実施形態において、Ｃ５〜７アリールオキシ基（例えば、フェノキシ、ピリジルオキシ、フラニルオキシ）であってもよい。
【０２６７】
Ｒ２上の置換基がＣ１〜７アルキルである場合、置換基は、好ましくはＣ１〜４アルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル）であり得る。
【０２６８】
Ｒ２上の置換基がＣ３〜７ヘテロシクリルである場合、置換基は、いくつかの実施形態において、Ｃ６窒素含有ヘテロシクリル基、例えば、モルホリノ、チオモルホリノ、ピペリジニル、ピペラジニルであり得る。これらの基は、窒素原子を介してＰＢＤ部分の残余部分に結合することができる。これらの基は、例えば、Ｃ１〜４アルキル基によりさらに置換することができる。
【０２６９】
Ｒ２上の置換基がビス−オキシ−Ｃ１〜３アルキレンである場合、これは、好ましくはビス−オキシ−メチレン又はビス−オキシ−エチレンである。
【０２７０】
Ｒ２の特に好ましい置換基は、メトキシ、エトキシ、フルオロ、クロロ、シアノ、ビス−オキシ−メチレン、メチル−ピペラジニル、モルホリノ及びメチルチエニルを含む。
【０２７１】
特に好ましい置換Ｒ２基は、４−メトキシ−フェニル、３−メトキシ−フェニル、４−エトキシ−フェニル、３−エトキシ−フェニル、４−フルオロ−フェニル、４−クロロ−フェニル、３，４−ビスオキシメチレン−フェニル、４−メチルチエニル、４−シアノフェニル、４−フェノキシフェニル、キノリン−３−イル及びキノリン−６−イル、イソキノリン−３−イル及びイソキノリン−６−イル、２−チエニル、２−フラニル、メトキシナフチル及びナフチルを含むが、これらに限定されない。
【０２７２】
一実施形態において、Ｒ２は、ハロ又はジハロである。一実施形態において、Ｒ２は、置換基がそれぞれ（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）として下に例示されている、−Ｆ又は−Ｆ２である。
【０２７３】
【化１２】
2019516705.tif 000016
ＲＤ
一実施形態において、ＲＤは、Ｒ、ＣＯ２Ｒ、ＣＯＲ、ＣＨＯ、ＣＯ２Ｈ及びハロから独立に選択される。
【０２７４】
一実施形態において、ＲＤは、独立にＲである。
【０２７５】
一実施形態において、ＲＤは、独立にハロである。
【０２７６】
Ｒ６
一実施形態において、Ｒ６は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ−及びハロから独立に選択される。
【０２７７】
一実施形態において、Ｒ６は、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＮＨ２、ＮＯ２及びハロから独立に選択される。
【０２７８】
一実施形態において、Ｒ６は、Ｈ及びハロから独立に選択される。
【０２７９】
一実施形態において、Ｒ６は、独立にＨである。
【０２８０】
一実施形態において、Ｒ６及びＲ７は、一緒になって−Ｏ−（ＣＨ２）ｐ−Ｏ−基を形成しており、ｐは、１又は２である。
【０２８１】
Ｒ７
Ｒ７は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、Ｍｅ３Ｓｎ及びハロから独立に選択される。
【０２８２】
一実施形態において、Ｒ７は、独立にＯＲである。
【０２８３】
一実施形態において、Ｒ７は、独立にＯＲ７Ａであり、Ｒ７Ａは、独立に、置換されていてもよいＣ１〜６アルキルである。
【０２８４】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立に、置換されていてもよい飽和Ｃ１〜６アルキルである。
【０２８５】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立に、置換されていてもよいＣ２〜４アルケニルである。
【０２８６】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立にＭｅである。
【０２８７】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立にＣＨ２Ｐｈである。
【０２８８】
一実施形態において、Ｒ７Ａは、独立にアリルである。
【０２８９】
一実施形態において、化合物は、二量体であって、各単量体のＲ７基が一緒になって、単量体を連結する式Ｘ−Ｒ”−Ｘを有する二量体架橋を形成している。
【０２９０】
Ｒ９
一実施形態において、Ｒ９は、Ｈ、Ｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲＲ’、ＮＯ２、  Ｍｅ３Ｓｎ−及びハロから独立に選択される。
【０２９１】
一実施形態において、Ｒ９は、独立にＨである。
【０２９２】
一実施形態において、Ｒ９は、独立にＲ又はＯＲである。
【０２９３】
Ｒ１０
好ましくは、本明細書に記載されるような適合リンカーは、Ｒ１０位（すなわち、Ｎ１０）における共有結合によりＤＬＬ３抗体をＰＢＤ薬物部分に結合させる。
【０２９４】
Ｑ
特定の実施形態において、Ｑは、Ｏ、Ｓ及びＮＨから独立に選択される。
【０２９５】
一実施形態において、Ｑは、独立にＯである。
【０２９６】
一実施形態において、Ｑは、独立にＳである。
【０２９７】
一実施形態において、Ｑは、独立にＮＨである。
【０２９８】
Ｒ１１
選択された実施形態において、Ｒ１１は、Ｈ若しくはＲであり、又はＱがＯである場合、ＳＯ３Ｍであり得、Ｍは、金属陽イオンである。陽イオンは、Ｎａ＋であり得る。
【０２９９】
特定の実施形態において、Ｒ１１は、Ｈである。
【０３００】
特定の実施形態において、Ｒ１１は、Ｒである。
【０３０１】
特定の実施形態において、ＱがＯである場合、Ｒ１１は、ＳＯ３Ｍであり得、Ｍは、金属陽イオンである。陽イオンは、Ｎａ＋であり得る。
【０３０２】
特定の実施形態において、ＱがＯである場合、Ｒ１１は、Ｈである。
【０３０３】
特定の実施形態において、ＱがＯである場合、Ｒ１１は、Ｒである。
【０３０４】
Ｘ
一実施形態において、Ｘは、Ｏ、Ｓ又はＮ（Ｈ）から選択される。
【０３０５】
好ましくは、Ｘは、Ｏである。
【０３０６】
Ｒ”
Ｒ”は、鎖が１つ以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ及び／又は環が置換されていてもよい芳香環、例えば、ベンゼン若しくはピリジンによって中断されていてよいＣ３〜１２アルキレン基である。
【０３０７】
一実施形態において、Ｒ”は、鎖が１つ以上のヘテロ原子及び／又は芳香環、例えば、ベンゼン又はピリジンによって中断されていてよいＣ３〜１２アルキレン基である。
【０３０８】
一実施形態において、該アルキレン基は、Ｏ、Ｓ及びＮＭｅから選択される１つ以上のヘテロ原子並びに／又は環が置換されていてもよい芳香環によって、任意選択的に中断されている。
【０３０９】
一実施形態において、芳香環は、Ｃ５〜２０アリレン基であり、アリレンは、芳香族化合物の２個の芳香環原子から２個の水素原子を除去することにより得られた二価部分に関し、この部分は、５から２０個の環原子を有する。
【０３１０】
一実施形態において、Ｒ”は、鎖が１つ以上のヘテロ原子、例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｈ）、ＮＭｅ及び／又は環がＮＨ２により置換されていてもよい、芳香環、例えば、ベンゼン若しくはピリジンによって中断されていてよい、Ｃ３〜１２アルキレン基である。
【０３１１】
一実施形態において、Ｒ”は、Ｃ３〜１２アルキレン基である。
【０３１２】
一実施形態において、Ｒ”は、Ｃ３、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ９及びＣ１１アルキレン基から選択される。
【０３１３】
一実施形態において、Ｒ”は、Ｃ３、Ｃ５及びＣ７アルキレン基から選択される。
【０３１４】
一実施形態において、Ｒ”は、Ｃ３及びＣ５アルキレン基から選択される。
【０３１５】
一実施形態において、Ｒ”は、Ｃ３アルキレン基である。
【０３１６】
一実施形態において、Ｒ”は、Ｃ５アルキレン基である。
【０３１７】
上に示したアルキレン基は、１つ以上のヘテロ原子及び／又は環が置換されていてもよい芳香環、例えば、ベンゼン若しくはピリジンによって、任意選択的に中断されていてよい。
【０３１８】
上に示したアルキレン基は、１つ以上のヘテロ原子及び／又は芳香環、例えば、ベンゼン若しくはピリジンによって、任意選択的に中断されていてよい。
【０３１９】
上に示したアルキレン基は、非置換直鎖脂肪族アルキレン基であり得る。
【０３２０】
Ｒ及びＲ’
一実施形態において、Ｒは、置換されていてもよいＣ１〜１２アルキル基、Ｃ３〜２０ヘテロシクリル基及びＣ５〜２０アリール基から独立に選択される。
【０３２１】
一実施形態において、Ｒは、独立に、置換されていてもよいＣ１〜１２アルキルである。
【０３２２】
一実施形態において、Ｒは、独立に、置換されていてもよいＣ３〜２０ヘテロシクリルである。
【０３２３】
一実施形態において、Ｒは、独立に、置換されていてもよいＣ５〜２０アリールである。
【０３２４】
好ましいアルキル基及びアリール基並びに任意選択の置換基の同一性及び数に関する様々な実施形態を、Ｒ２に関して上で述べた。Ｒ２について示した選択は、それがＲに適用されるとき、適切な場合、例えば、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８又はＲ９がＲである場合、全ての他の基Ｒに適用できる。
【０３２５】
Ｒについての選択は、Ｒ’にも適用される。
【０３２６】
本発明のいくつかの実施形態において、−ＮＲＲ’置換基を有する化合物を提供する。いくつかの実施形態において、Ｒ及びＲ’は、これらが結合している窒素原子と一緒になって、置換されていてもよい４、５、６又は７員ヘテロ環を形成している。環は、さらなるヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ又はＳを含み得る。
【０３２７】
一実施形態において、ヘテロ環は、それ自体Ｒ基で置換されている。さらなるＮヘテロ原子が存在する場合、置換基は、Ｎヘテロ原子上に存在し得る。
【０３２８】
前述のＰＢＤに加えて、特定の例示的な二量体ＰＢＤは、とりわけ活性であることが示され、本発明と共に用いられ得る。この目的を達成するために、本発明の抗体薬物コンジュゲート（すなわち、本明細書で開示するＡＤＣ１〜６）は、ＰＢＤ１〜５としてこのすぐ後に示すＰＢＤ化合物を含み得る。以下のＰＢＤ１〜５は、本明細書においてより詳細に記載されているもののような、リンカーの分離後に放出される毒性弾頭を含む。薬物−リンカー化合物の成分としてのＰＢＤ１〜５のそれぞれの合成は、このような合成について参照により組み込むＷＯ２０１４／１３０８７９に極めて詳細に示されている。ＷＯ２０１４／１３０８７９を考慮すると、本発明のＡＤＣの選択された弾頭を含み得る細胞毒性化合物を容易に作製し、本明細書で示すように用いることができる。したがって、リンカーからの分離の際に、開示されるＡＤＣから放出され得る選択されたＰＢＤ化合物は、このすぐ後に示される：
【０３２９】
【化１３】
2019516705.tif 000017
【０３３０】
前記二量体ＰＢＤ弾頭のそれぞれが、好ましくは、標的細胞による内在化及びリンカーの破壊に際して放出されることが理解される。下記においてさらに詳細に記載されているように、ある特定のリンカーは、リンカーのいかなる部分も保持することなく、活性なＰＢＤ弾頭の放出を可能にする自己崩壊部分を組み込むことができる切断可能リンカーを含む。放出に際し、ＰＢＤ弾頭は、標的細胞のＤＮＡに結合及び架橋する。このような結合は、報告されている通り、標的がん細胞のＤＮＡヘリックスを歪ませることなく標的がん細胞の分裂を阻止することから、一般的な突発的な薬物耐性現象を潜在的に防ぐと報告されている。他の好ましい実施形態において、弾頭は、自己崩壊部分を含まない切断可能リンカーによってＤＬＬ３標的部分に結合され得る。
【０３３１】
腫瘍部位におけるこのような化合物の送達及び放出は、本開示により増殖性障害を治療又は管理するのに臨床的に有効であることが証明され得る。該化合物に関して、本開示のＰＢＤのそれぞれが、各Ｃ環における１つのｓｐ２中心のみを有する化合物より、ＤＮＡの副溝における強い結合（したがってより大きい毒性）を可能にし得る、各Ｃ環における２つのｓｐ２中心を有することが理解される。したがって、本明細書に示すＤＬＬ３  ＡＤＣに用いる場合、本開示のＰＢＤは、増殖性障害の治療にとりわけ有効であることが証明され得る。
【０３３２】
前述のことは、本発明に適合する例示的ＰＢＤ化合物をもたらし、このことは、本明細書における教示に従って抗ＤＬＬ３コンジュゲートに組み込まれることに成功し得る他のＰＢＤを限定することを決して意味しない。むしろ、本明細書で議論されるようにかつ下記実施例において示されるように、抗体にコンジュゲートされ得る任意のＰＢＤは、本開示のコンジュゲートと適合し、明確に本発明の範囲内にある。
【０３３３】
前述の作用剤に加えて、本発明の抗体は、生物学的応答修飾剤にコンジュゲートされてもよい。ある特定の実施形態において、生物学的応答修飾剤は、インターロイキン２、インターフェロン、又は様々なタイプのコロニー刺激因子（例えば、ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ）を含む。
【０３３４】
より一般に、関連薬物成分は、所望の生物活性を有するポリペプチドとすることができる。このようなタンパク質としては、例えば、毒素、例えば、アブリン、リシンＡ、オンコナーゼ（Ｏｎｃｏｎａｓｅ）（又は別の細胞傷害性ＲＮアーゼ）、シュードモナス菌体外毒素、コレラ毒素、ジフテリア毒素；アポトーシス剤、例えば、腫瘍壊死因子、例えば、ＴＮＦα又はＴＮＦβ、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＡＩＭ  Ｉ（ＷＯ９７／３３８９９）、ＡＩＭ  ＩＩ（ＷＯ９７／３４９１１）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９４、ＰＭＩＤ：７８２６９４７）及びＶＥＧＩ（ＷＯ９９／２３１０５）、血栓性物質（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、抗血管新生剤、例えば、アンジオスタチン又はエンドスタチン、リンホカイン、例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又は成長因子、例えば、成長ホルモン（ＧＨ）が挙げられ得る。
【０３３５】
２．診断剤又は検出剤
他の実施形態において、本発明の抗ＡＳＣＬ１抗体又は抗ＤＬＬ３抗体又はその断片若しくは誘導体は、例えば、生物学的分子（例えば、ペプチド又はヌクレオチド）、小分子、フルオロフォア又は放射性同位体であり得る診断剤若しくは検出剤、マーカー又はレポーターにコンジュゲートされる。標識化抗体は、過剰増殖障害の発生若しくは進行を監視するのに、又は開示する抗体（すなわち診断治療薬）を含む特定の治療の有効性を決定するための若しくは治療の今後の方針を決定するための臨床的試験手法の一部として、有用であり得る。このようなマーカー又はレポーターは、抗体分析（例えば、エピトープ結合又は抗体ビニング）に使用するための選択された抗体を精製するために、腫瘍形成性細胞を分離若しくは単離するために又は前臨床的手法若しくは毒性研究においても、有用であり得る。
【０３３６】
このような診断、解析及び／又は検出は、抗体を検出可能な物質、例えば、これらに限定されないが、様々な酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、例えば、これらに限定されないがストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチン；蛍光材料、例えば、これらに限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ｉｓｏｔｈｉｏｃｙｎａｔｅ）、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン  フルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリン；発光材料、例えば、これらに限定されないが、ルミノール；生物発光材料、例えば、これらに限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリン；放射活性材料、例えば、これらに限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、及びテクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、８９Ｚｒ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ及び１１７Ｔｉｎ；様々なポジトロン放出トモグラフィを使用したポジトロン放出金属、非放射活性常磁性金属イオン及び特定の放射性同位体に放射標識又はコンジュゲートした分子にカップリングすることによって行われ得る。このような実施形態において、適切な検出方法は、当該技術分野で周知であり、多数の市販供給源から容易に利用可能である。
【０３３７】
他の実施形態において、抗体又はその断片は、マーカー配列又は化合物、例えば、ペプチド又はフルオロフォアに融合又はコンジュゲートされて、精製又は診断又は分析的手法、例えば、免疫組織化学、バイオレイヤー干渉法、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、競合的ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣなどを容易にすることができる。いくつかの実施形態において、マーカーは、ヒスチジンタグ、例えば、多くの市販品の中でもとりわけｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）によって提供されるヒスチジンタグを含む。精製のために有用な他のペプチドタグとしては、これらに限定されないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに対応するヘマグルチニン「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）及び「フラッグ」タグ（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．４，７０３，００４）が挙げられる。
【０３３８】
３．生体適合性修飾因子
選択された実施形態において、本発明の抗体は、所望の通りに特徴を調整、変化、改善又は緩和するために使用され得る生体適合性修飾因子とコンジュゲートしてもよい。例えば、インビボ半減期が増加した抗体又は融合構築物は、比較的分子量の大きいポリマー分子、例えば、市販のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は同様の生体適合性ポリマーを結合することによって生成されてもよい。当業者は、ＰＥＧが、多くの様々な分子量及び分子構造で取得され得、これらを選択して抗体に特定の特性を付与することができる（例えば半減期を調節し得る）ことを理解する。ＰＥＧは、ＰＥＧの前記抗体若しくは抗体断片のＮ若しくはＣ末端へのコンジュゲーションを通じて又はリシン残基上に存在するεアミノ基を介して、多機能リンカーあり又はなしで、抗体又は抗体断片又は誘導体に結合し得る。生物学的活性の損失を最小にする線状又は分岐ポリマー誘導体が使用され得る。コンジュゲーションの度合いは、ＰＥＧ分子の抗体分子への最適なコンジュゲーションを確実にするために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び質量分析により密接に監視され得る。未反応のＰＥＧは、抗体−ＰＥＧコンジュゲートから、例えば、サイズ排除又はイオン交換クロマトグラフィーにより分離され得る。同様の方法において、開示される抗体は、抗体若しくは抗体断片をインビボでより安定にするために又はインビボでより長い半減期を有するためにアルブミンにコンジュゲートされ得る。この技術は、当該技術分野で周知である。例えば、ＷＯ９３／１５１９９、ＷＯ９３／１５２００及びＷＯ０１／７７１３７；及びＥＰ０４１３，６２２を参照。他の生体適合性コンジュゲートは当業者にとって明らかであり、本明細書に記載の教示に従って容易に同定され得る。
【０３３９】
Ｂ．リンカー化合物
上で示されているように、本発明に適合するペイロードは、１つ以上の弾頭、及び任意選択的に、弾頭を抗体標的剤と結合させるリンカーを含む。多数のリンカー化合物が、関連する弾頭に本発明の抗体をコンジュゲートするために使用され得る。リンカーは、抗体上の反応性残基（好ましくはシステイン又はリシン）と選択された薬物化合物とを共有結合することが必要とされるにすぎない。したがって、選択された抗体残基と反応し、本発明の比較的安定なコンジュゲート（部位特異的又はそれ以外のコンジュゲート）を提供するために使用され得る任意のリンカーは、本明細書の教示に適合する。
【０３４０】
適合リンカーは、求核性である還元されたシステイン及びリシンに有利に結合し得る。還元されたシステイン及びリシンに関与するコンジュゲーション反応としては、これらに限定されないが、チオール−マレイミド、チオールハロゲノ（アシルハライド）、チオール−エン、チオール−イン、チオール−ビニルスルホン、チオール−ビスルホン、チオール−チオスルホネート、チオール−ピリジルジスルフィド及びチオールパラフルオロ反応が挙げられる。本明細書でさらに議論されるように、チオール−マレイミド生体コンジュゲーションは、この速い反応速度と穏やかなコンジュゲーション条件により、最も広く使用されているアプローチの１つである。このアプローチの１つの問題点は、レトロミカエル反応の可能性、及び抗体から血漿中の他のタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンへの、マレイミド連結ペイロードの損失又は移行である。しかしながら、いくつかの実施形態において、コンジュゲートを安定化し、この望ましくない移行を減少させるために、本明細書で下記の実施例に示される選択的還元及び部位特異的抗体の使用が使用され得る。チオール−アシルハライド反応は、レトロミカエル反応が起こり得ない生体コンジュゲートを提供し、それゆえさらに安定である。しかしながら、チオール−ハライド反応は、一般にマレイミドに基づくコンジュゲーションと比較して反応速度が遅いことから効率的でなく、所望しない薬物抗体比をもたらす。チオール−ピリジルジスルフィド反応は、よく使用される別の生体コンジュゲーション経路である。ピリジルジスルフィドは、遊離チオールとの速い交換が進行し、それにより混成のジスルフィド及びピリジン−２−チオンの放出がもたらされる。混成のジスルフィドは還元的な細胞環境で切断され、ペイロードが放出され得る。生体コンジュゲーションにおいてさらに注目を集める他のアプローチは、チオール−ビニルスルホン及びチオールビスルホン反応であり、これらのそれぞれが本明細書の教示に適合し、明確に本発明の範囲内に含まれる。
【０３４１】
選択された実施形態において、適合リンカーは、細胞外環境においてＡＤＣに安定性を付与し、ＡＤＣ分子の凝集を予防し、ＡＤＣの水性媒体及び単量体状態における自由な可溶性を保持する。細胞への移動又は送達の前に、ＡＤＣは、好ましくは安定であり、無傷のままであり、つまり、抗体は薬物部分に連結したままである。リンカーは、標的細胞外で安定であるが、細胞内でいくぶん効果的な速度で切断又は分解されるように設計され得る。したがって、効果的なリンカーは、：（ｉ）抗体の特異的結合特性を維持し、（ｉｉ）コンジュゲート又は薬物部分の細胞内送達を可能にし、（ｉｉｉ）コンジュゲートがその標的部位に送達又は輸送されるまで、安定及び無傷のままである、すなわち切断も分解もされない；かつ（ｉｖ）薬物部分の細胞傷害性、細胞殺傷効果又は細胞分裂停止効果（いくつかの場合には任意のバイスタンダー効果を含む）を維持する。ＡＤＣの安定性は、標準的な解析技術、例えば、ＨＰＬＣ／ＵＰＬＣ、質量分析、ＨＰＬＣ並びに分離／解析技術ＬＣ／ＭＳ及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって測定され得る。前述のように、抗体及び薬物部分の共有結合は、リンカーに、２つの反応性官能基、すなわち反応性という意味において２価を有することを要求する。ＭＭＡＥ及び抗体のような、２つ以上の機能的又は生物学的に活性な部分を結合するために有用な二価のリンカー試薬は公知であり、本明細書における教示と適合するそれらの結果として生じるコンジュゲートを得るための方法が記載されている。
【０３４２】
本発明に適合するリンカーは、広義において、切断可能リンカー及び非切断可能リンカーとして分類され得る。切断可能リンカーは、酸不安定性リンカー（例えば、オキシム及びヒドロゾン）プロテアーゼ切断可能リンカー及びジスルフィドリンカーを含み得、標的細胞に内在化され、細胞内のエンドソーマル−リソソーマル経路において切断される。細胞毒の放出及び活性化は、酸不安定性化学的連結、例えば、ヒドラゾン又はオキシムの切断を容易にするエンドソーム／リソソーム酸性区画に依存する。リソソーマル特異的なプロテアーゼ切断部位がリンカー内へと操作される場合、細胞毒がそれらの細胞内標的の近傍で放出される。代替的に、混合ジスルフィドを含有するリンカーは、細胞傷害性ペイロードが、血流中の酸素リッチ環境ではなく細胞の還元環境内で選択的に切断されるときに細胞内に放出されるアプローチを提供する。対照的に、アミド連結ポリエチレングリコール又はアルキルスペーサーを含有する適合性非切断可能リンカーは、標的細胞内でＡＤＣがリソソーマル分解される間に毒性ペイロードを解放する。いくつかの観点で、リンカーの選択は、コンジュゲートで使用される特定の薬物、特定の指標及び抗体標的に依存する。
【０３４３】
したがって、本発明のある特定の実施形態は、細胞内環境（例えば、リソソーム又はエンドソーム又はカベオラ内）に存在する切断剤により切断可能であるリンカーを含む。リンカーは、例えば、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素、例えば、これらに限定されないが、リソソーマル又はエンドソーマルプロテアーゼによって切断されるペプチジルリンカーであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長又は少なくとも３アミノ酸長である。切断剤は、カテプシンＢ及びＤ並びにプラスミンを含むことができ、これらのそれぞれは、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して標的細胞内に活性な薬物を放出することが知られている。カテプシン−Ｂは、がん性組織で高発現することが見出されているので、チオール−依存性プロテアーゼカテプシン−Ｂによって切断可能な例示的なペプチジルリンカーは、Ｐｈｅ−Ｌｅｕを含むペプチドである。このようなリンカーの他の例は、例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．６，２１４，３４５に記載されている。特定の実施形態において、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカー、Ｖａｌ−Ａｌａリンカー又はＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである。治療剤の細胞内タンパク分解性放出を利用する１つの利点は、この薬剤はコンジュゲートされると通常減弱化される薬剤であり、かつこのコンジュゲートの血清安定性が比較的高いことである。
【０３４４】
他の実施形態において、切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性である。通常、ｐＨ感受性リンカーは、酸性条件下で加水分解性である。例えば、リソソーム中で加水分解性である酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、オキシム、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、ｃｉｓ−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．５，１２２，３６８；５，８２４，８０５；５，６２２，９２９を参照）。このようなリンカーは、中性ｐＨ条件、例えば、血液のｐＨ条件下で比較的安定であるが、ほぼリソソームのｐＨであるｐＨ５．５又は５．０未満で不安定（例えば、切断可能）である。
【０３４５】
さらに他の実施形態において、リンカーは、還元条件下で切断可能である（例えば、ジスルフィドリンカー）。様々なジスルフィドリンカーが当該技術分野で公知であり、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）及びＳＭＰＴ（Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）を使用して形成可能なものが挙げられる。さらに他の特定の実施形態において、リンカーは、マロネートリンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：１３８７−９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９−１３０４）又は３’−Ｎ−アミドアナログ（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ−Ｍｅｄ−Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５−１２）である。
【０３４６】
本発明のある特定の態様において、選択されたリンカーは、式
【０３４７】
【化１４】
2019516705.tif 000018
（式中、アスタリスクは薬物への結合点を示し、ＣＢＡ（ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ、つまり細胞結合剤）は、抗ＤＬＬ３抗体を含み、Ｌ１は、リンカー単位及び任意選択的に切断可能リンカー単位を含み、Ａは、Ｌ１を抗体上の反応性残基に連結する（任意選択的にスペーサーを含む）連結基であり、Ｌ２は、好ましくは共有結合であり、Ｕは、存在していてもしていなくてもよく、腫瘍部位における弾頭からのリンカーの完全な分離を促進する自己崩壊性単位の全て又は一部を含み得る）の化合物を含む。
【０３４８】
いくつかの実施形態（Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２０１１／０２５６１５７に示される形態など）において、適合リンカーは、
【０３４９】
【化１５】
2019516705.tif 000019
（式中、アスタリスクは薬物への結合点を示し、ＣＢＡ（ｃｅｌｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ、つまり細胞結合剤）は、抗ＤＬＬ３抗体を含み、Ｌ１は、リンカー及び任意選択的に切断可能リンカーを含み、Ａは、Ｌ１を抗体上の反応性残基に連結する（任意選択的にスペーサーを含む）連結基であり、Ｌ２は、共有結合である又は−ＯＣ（＝Ｏ）−と一緒になって自己崩壊部分を形成する）を含み得る。
【０３５０】
Ｌ１及びＬ２の性質は、存在する場合、広く変動し得ることが理解される。これらの基は、これらの切断特徴に基づき選択され、コンジュゲートが送達される部位の条件によって指示され得る。酵素の作用により切断されるリンカーが好ましいが、ｐＨの変化（例えば、酸若しくは塩基不安定性）、温度の変化又は放射線照射（例えば、感光性）によって切断可能なリンカーも使用され得る。還元又は酸化条件下で切断可能であるリンカーも本発明で使用され得る。
【０３５１】
ある特定の実施形態において、Ｌ１は、アミノ酸の連続配列を含んでもよい。アミノ酸配列は酵素切断の標的基質となり得、それにより薬物を放出し得る。
【０３５２】
一実施形態において、Ｌ１は、酵素の作用により切断可能である。一実施形態において、酵素は、エステラーゼ又はペプチダーゼである。
【０３５３】
別の実施形態において、Ｌ１は、カテプシン不安定性リンカーである。
【０３５４】
一実施形態において、Ｌ１は、ジペプチドを含む。ジペプチドは、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−として表される場合があり、ここで−ＮＨ−及び−ＣＯ−は、それぞれアミノ酸基Ｘ１及びＸ２のＮ末端及びＣ末端を表す。ジペプチドのアミノ酸は、天然アミノ酸の任意の組合せであり得る。リンカーがカテプシン不安定性リンカーである場合、ジペプチドは、カテプシン媒介切断の作用部位となり得る。
【０３５５】
さらに、カルボキシル又はアミノ側鎖官能基を有するアミノ酸基、例えば、それぞれＧｌｕ及びＬｙｓに対して、ＣＯ及びＮＨが、この側鎖官能基であり得る。
【０３５６】
一実施形態において、ジペプチド、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ｃｉｔ−、−Ｌｅｕ−Ｃｉｔ−、−Ｉｌｅ−Ｃｉｔ−、−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−及び−Ｔｒｐ−Ｃｉｔ−から選択され、ここでＣｉｔはシトルリンである。
【０３５７】
好ましくは、ジペプチド、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−、−Ａｌａ−Ｌｙｓ−及び−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−から選択される。
【０３５８】
最も好ましくは、ジペプチド、−ＮＨ−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯ−における基−Ｘ１−Ｘ２−は、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−又は−Ｖａｌ−Ａｌａ−又はＶａｌ−Ｃｉｔである。特定の選択された実施形態において、ジペプチドは、−Ｖａｌ−Ａｌａ−を含む。
【０３５９】
一実施形態において、Ｌ２は存在し、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−と一緒になって自己崩壊性リンカーを形成する。一実施形態において、Ｌ２は、酵素活性の基質であり、これにより弾頭の放出を可能にする。
【０３６０】
一実施形態において、Ｌ１が酵素の作用により切断可能であり、Ｌ２が存在する場合、酵素は、Ｌ１とＬ２との間の結合を切断する。
【０３６１】
Ｌ１及びＬ２は、存在する場合、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合によって連結されていてもよい。
【０３６２】
Ｌ２に連結されているＬ１のアミノ基は、アミノ酸のＮ末端であり得、又はアミノ酸側鎖、例えば、リシンアミノ酸側鎖のアミノ基に由来し得る。
【０３６３】
Ｌ２に連結されているＬ１のカルボキシル基は、アミノ酸のＣ末端であり得、又はアミノ酸側鎖、例えば、グルタミン酸アミノ酸側鎖のカルボキシル基に由来し得る。
【０３６４】
Ｌ２に連結されているＬ１のヒドロキシル基は、アミノ酸側鎖、例えば、セリンアミノ酸側鎖のヒドロキシル基に由来し得る。
【０３６５】
用語「アミノ酸側鎖」は、（ｉ）天然に存在するアミノ酸、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン；（ｉｉ）マイナーなアミノ酸、例えば、オルニチン及びシトルリン；（ｉｉｉ）非天然アミノ酸、ベータ−アミノ酸、合成類似体及び天然に存在するアミノ酸の誘導体；並びに（ｉｖ）全てのエナンチオマー、ジアステレオマー、異性体的に濃縮された形態、同位体で標識された形態（例えば、２Ｈ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ）、保護された形態及びそれらのラセミ体混合物で見出されるそれらの基を含む。
【０３６６】
一実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−及びＬ２は、一緒になって基：
【０３６７】
【化１６】
2019516705.tif 000020
（式中、アスタリスクは、薬物又は細胞毒性剤の位置に対する結合点を示し、波線は、リンカーＬ１への結合点を示し、Ｙは、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−であり、ｎは０から３である）を形成する。フェニレン環は、１、２又は３つの置換基で置換されていてもよい。一実施形態において、フェニレン基は、ハロ、ＮＯ２、アルキル又はヒドロキシアルキルで置換されていてもよい。
【０３６８】
一実施形態において、Ｙは、ＮＨである。
【０３６９】
一実施形態において、ｎは０又は１である。好ましくは、ｎは０である。
【０３７０】
ＹがＮＨであり、ｎが０である場合、自己崩壊性リンカーは、ｐ−アミノベンジルカルボニルリンカー（ＰＡＢＣ）と称され得る。
【０３７１】
他の実施形態において、リンカーは、自己崩壊性リンカー及びジペプチドを含み、一緒になって、基−ＮＨ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ−を形成してもよい。他の選択された実施形態において、リンカーは、下記に示すＮＨ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＣＯ−ＮＨ−ＰＡＢＣ基を含んでもよい：
【０３７２】
【化１７】
2019516705.tif 000021
（式中、アスタリスクは、選択された細胞毒性部分に対する結合点を示し、波線は、抗体にコンジュゲートされ得るリンカーの残余部分（例えば、スペーサー−抗体結合セグメント）への結合点を示す）。ジペプチドの酵素切断に際し、自己崩壊性リンカーは遠位部位が活性化されるとき、以下に示す流れに沿って進み、保護された化合物（つまり、細胞毒）の完全な放出を可能にする：
【０３７３】
【化１８】
2019516705.tif 000022
（式中、アスタリスクは、選択された細胞毒性部分への結合点を示し、Ｌ・は、切断されるペプチジル単位を含むリンカーの残余部分の活性化形態である）。弾頭の明確な放出は、所望の毒性活性の維持を確実にする。
【０３７４】
一実施形態において、Ａは、共有結合である。したがって、Ｌ１と抗体とは直接的に連結される。例えば、Ｌ１が、連続するアミノ酸配列を含む場合、配列のＮ末端は、抗体残基に直接連結し得る。
【０３７５】
別の実施形態において、Ａは、スペーサー基である。したがって、Ｌ１と抗体は、間接的に連結する。
【０３７６】
ある特定の実施形態において、Ｌ１及びＡは、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ−及び−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ−から選択される結合によって連結され得る。
【０３７７】
下記にさらに詳細に述べられるように、本発明の薬物リンカーは、好ましくは、システイン、例えば、遊離システイン上の反応性チオール求核基に連結する。この目的に関して、抗体のシステインは、様々な還元剤、例えば、ＤＴＴ又はＴＣＥＰ又は本明細書に記載の穏やかな還元剤での処理によってリンカー試薬とコンジュゲートするために反応し得る。他の実施形態において、本発明の薬物リンカーは、好ましくはリシンに連結される。
【０３７８】
好ましくは、リンカーは、抗体上の求核性官能基と反応する求電子性官能基を含む。抗体上の求核性基としては、これらに限定されないが：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えば、リシン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えば、システイン及び（ｉｖ）抗体がグリコシル化されている場合の糖のヒドロキシル又はアミノ基が挙げられる。アミン、チオール及びヒドロキシル基は、求核性であり、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性基と反応して共有結合を形成することができる。リンカー試薬としては、（ｉ）マレイミド基、（ｉｉ）活性化ジスルフィド、（ｉｉｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル、ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）エステル、ハロホルメート及び酸ハロゲン化物；（ｉｖ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド；及び（ｖ）アルデヒド、ケトン、及びカルボキシル基が挙げられる。
【０３７９】
本発明と適合する例示的な官能基を、すぐ下に示す：
【０３８０】
【化１９】
2019516705.tif 000023
【０３８１】
いくつかの実施形態において、システイン（部位特異的抗体の遊離システインを含む）と薬物リンカー部分との間の結合は、リンカーに存在しているチオール残基及び末端マレイミド基を通じたものである。このような実施形態において、抗体と薬物リンカーとの連結は、
【０３８２】
【化２０】
2019516705.tif 000024
（式中、アスタリスクは、薬物リンカーの残余部分との結合点を示し、波線は、抗体の残余部分との結合点を示す）であってもよい。この実施形態において、Ｓ原子は、好ましくは、部位特異的遊離システインに由来する。
【０３８３】
他の適合可能なリンカーに関して、結合部分は、抗体上の活性化残基と反応し得る末端ヨードアセトアミドを含んで、所望のコンジュゲートをもたらすことができる。いずれにしても、当業者は、本開示の薬物リンカー化合物のそれぞれと、適合する抗ＤＬＬ３抗体（例えば、部位特異的抗体）とを、本開示に鑑みて、容易にコンジュゲートすることができる。
【０３８４】
本開示によれば、本発明は、適合する抗体薬物コンジュゲートを作製する方法であって、抗ＤＬＬ３抗体を下記からなる群から選択される薬物リンカー化合物にコンジュゲートすることを含む方法を提供する：
【０３８５】
【化２１】
2019516705.tif 000025
2019516705.tif 000026
2019516705.tif 000027
【０３８６】
本出願の目的に関し、ＤＬは、「薬物リンカー」（又は、式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎ中のリンカー−薬物「Ｌ−Ｄ」）の略称として使用され、上記に示す薬物リンカー１〜６（つまり、ＤＬ１、ＤＬ２、ＤＬ３、ＤＬ４、ＤＬ５及びＤＬ６）を含む。ＤＬ１及びＤＬ６は、同じ弾頭及び同じジペプチドサブユニットを含むが、連結基スペーサーが異なることに注意されたい。したがって、リンカーの切断によりＤＬ１及びＤＬ６の両方がＰＢＤ１を放出する。
【０３８７】
末端マレイミド部分（ＤＬ１〜ＤＬ４及びＤＬ６）又はヨードアセトアミド部分（ＤＬ５）が付されたリンカーは、本明細書において開示されている当該技術分野で認識されている技術を使用して、選択されたＤＬＬ３抗体の遊離スルフヒドリルにコンジュゲートされてもよいことが理解される。前述の化合物に関する合成経路は、前述のＤＬ化合物の合成に関して明示的に参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ２０１４／１３０８７９に示されているが、このようなＰＢＤのリンカーの組合せをコンジュゲートする具体的な方法は、以下の実施例に示されている。
【０３８８】
こうして、選択された態様において、本発明は、このすぐ下のＡＤＣ１〜６に実質的に示されているＤＬＬ３イムノコンジュゲートをもたらす、本開示のＤＬ部分にコンジュゲートされているＤＬＬ３抗体に関する。したがって、ある特定の態様において、本発明は、以下からなる群から選択される構造を含む、式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎのＡＤＣを対象としている：
【０３８９】
【化２２】
2019516705.tif 000028
2019516705.tif 000029
2019516705.tif 000030
（式中、Ａｂは、抗ＤＬＬ３抗体又はこの免疫反応性断片を含み、ｎは、１〜２０の整数である）。ある特定の実施形態において、ｎは、１〜８の整数であり、選択された実施形態において、ｎは、２又は４を含む。
【０３９０】
当業者は、上述のＡＤＣ構造が式Ａｂ−［Ｌ−Ｄ］ｎにより定義されること、及びこの中に図示されている１つより多い薬物リンカー分子がＤＬＬ３抗体に共有結合によりコンジュゲートされ得ること（例えば、ｎは約１〜約２０の整数とすることができる）を理解している。より詳細に、下記にさらに詳細に議論するように、１つより多いペイロードが各抗体にコンジュゲートされ得ること、及び上の概略図はそのように解釈されなければならないことが、理解される。例として、上において示されているＡＤＣ１は、１、２、３、４、５、６、７若しくは８又はそれ超のペイロードにコンジュゲートされているＤＬＬ３抗体を含むことができ、このようなＡＤＣの組成物は、薬物がロードされた化学種からなる混合物を一般に含む。
【０３９１】
ある特定の態様において、本発明のＤＬＬ３  ＰＢＤ  ＡＤＣは、添付されている実施例又はこの免疫反応性断片に示されている抗ＤＬＬ３抗体を含む。特定の実施形態において、ＡＤＣ３は、ｈＳＣ１６．５６（例えば、ｈＳＣ１６．５６  ＰＢＤ１）を含む。このような実施形態において、ＡＤＣは、２つのペイロードを好ましくは含む。他の好ましい実施形態において、ＤＬＬ３  ＡＤＣは、ｎが２であるＡＤＣ１を含む。
【０３９２】
Ｃ．コンジュゲーション
いくつかの周知の反応を使用して、薬物部分及び／又はリンカーを選択された抗体に結合させ得ることが理解される。例えば、システインのスルフヒドリル基を活用する様々な反応が、所望の部分をコンジュゲートするために利用されてもよい。いくつかの実施形態は、下記に詳細に述べられた１つ以上の遊離システインを含む抗体のコンジュゲーションを含む。他の実施形態において、本発明のＡＤＣは、選択された抗体に存在するリシン残基の溶媒露出されたアミノ基への薬物のコンジュゲーションを通じて生成され得る。さらに他の実施形態は、Ｎ末端スレオニン及びセリン残基の活性化を含み、この活性化が利用されて、本開示のペイロードが抗体に連結され得る。選択されるコンジュゲーション方法は、好ましくは、抗体に結合する薬物の数を最適化し、比較的高い治療指数を得るためにあつらえられる。
【０３９３】
治療化合物をシステイン残基にコンジュゲートさせるための様々な方法は、当該技術分野において公知であり、当業者に明らかである。塩基性条件下で、システイン残基を脱プロトン化すると、マレイミド及びヨードアセトアミドなどのソフトな求電子剤と反応し得るチオレート求核剤が生成される。一般にこのようなコンジュゲーションのための試薬は、システインチオールと直接反応してコンジュゲート化タンパク質を形成してもよく又はリンカー−薬物と直接反応してリンカー−薬物中間体を形成してもよい。リンカーの場合、有機化学反応、条件及び試薬を用いる複数の経路が当業者に公知であり、例えば、（１）本発明のタンパク質のシステイン基をリンカー試薬と反応させて、共有結合を介してタンパク質−リンカー中間体を形成し、次いで、活性化化合物と反応させる経路；及び（２）化合物の求核性基をリンカー試薬と反応させて、共有結合を介した薬物−リンカー中間体を形成し、次いで本発明のタンパク質のシステイン基と反応させる経路がある。前述の記載から当業者に明らかなように、二官能性（又は二価）リンカーが本発明において有用である。例えば、二官能性リンカーは、システイン残基と共有結合するためのチオール修飾基、及び化合物と共有又は非共有結合するための少なくとも１つの結合部分（例えば、第２チオール修飾部分）を含み得る。
【０３９４】
コンジュゲーションの前に、抗体を、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を用いた処理により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに対して反応性にしてもよい。他の実施形態において、抗体にさらなる求核性基を、リシンと試薬との反応により導入してもよく、試薬としては、これらに限定されないが、アミンをチオールに変換する２−イミノチオラン（Ｔｒａｕｔ試薬）、ＳＡＴＡ、ＳＡＴＰ又はＳＡＴ（ＰＥＧ）４が挙げられる。
【０３９５】
このようなコンジュゲーションに関して、システインチオール又はリシンアミノ基は求核性であり、リンカー試薬又は化合物−リンカー中間体又は薬物、例えば、（ｉ）活性エステル、例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート及び酸ハロゲン化物；（ｉｉ）アルキル及びベンジルハロゲン化物、例えば、ハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基；並びに（ｉｖ）ジスルフィド、例えば、ピリジルジスルフィド、の求電子性基と、スルフィド交換を介して反応して共有結合を形成することができる。化合物又はリンカー上の求核性基としては、これらに限定されないが、リンカー部分又はリンカー試薬の求電子性基と反応して共有結合を形成することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート及びアリールヒドラジド基が挙げられる。
【０３９６】
コンジュゲーション試薬としては、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドスクシンイミジルエステル、イソチオシアネート、スルホニルクロリド、２，６−ジクロロトリアジニル、ペンタフルオロフェニルエステル及びホスホラミダイトが、一般に挙げられるが、他の官能基も使用され得る。ある特定の実施形態において、方法は、例えば、マレイミド類、ヨードアセトアミド類又はハロアセチル／アルキルハライド、アジリジン、アクリロイル誘導体を使用して、システインのチオールと反応させて、化合物と反応するチオエーテルを製造することを含む。遊離チオールと活性化されたピリジルジスルフィドとのジスルフィド交換は、コンジュゲートの製造（例えば、５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）の使用）のためにも有用である。好ましくは、マレイミドが使用される。
【０３９７】
上述のように、リシンは、本明細書に示されるコンジュゲーションを達成する反応性残基としても使用することができる。求核性リシン残基は、一般に、アミン反応性スクシンイミジルエステルを通して標的化される。最適な数の脱プロトン化リシン残基を得るために、水溶液のｐＨは、リシンアンモニウム基のｐＫａである約１０．５より低くすべきであり、したがって、反応の典型的なｐＨは約８及び９である。カップリング反応のための一般的試薬は、リシンアシル化機構を介して求核性リシンと反応するＮＨＳ−エステルである。同様の反応を行う他の適合試薬は、イソシアネート及びイソチオシアネートを含むが、本明細書の教示と共に使用してＡＤＣを提供することもできる。リシンが活性化されたら、前述の連結基の多くが、弾頭を抗体に共有結合させるために使用され得る。
【０３９８】
化合物をスレオニン又はセリン残基（好ましくはＮ末端残基）にコンジュゲートさせるための方法も当該技術分野で公知である。例えば、カルボニル前駆体を、セリン又はスレオニンの１，２−アミノアルコールから誘導し、過ヨウ素酸酸化により選択的にかつ迅速にアルデヒド形態に変換させることができる方法が記載されている。アルデヒドを、本発明のタンパク質に結合する化合物におけるシステインの１，２−アミノチオールと反応させることにより、安定なチアゾリジン生成物が形成される。この方法は、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基でタンパク質を標識するために特に有用である。
【０３９９】
いくつかの実施形態において、反応性チオール基が、選択された抗体（又はその断片）に、１、２、３、４又はより多くの遊離システイン残基を導入することにより（例えば、１つ以上の遊離非天然システインアミノ酸残基を含む抗体を調製することにより）、導入され得る。少なくとも部分的には、本明細書に示す改変された遊離システイン部位及び／又は新規コンジュゲーション手法が提供されるため、このような部位特異的抗体又は改変抗体により、コンジュゲート調製物が、向上した安定性及び実質的な均一性を示すことが可能になる。鎖内又は鎖間抗体ジスルフィド結合のそれぞれを完全又は部分的に還元してコンジュゲーション部位を提供する従来のコンジュゲーション方法（本発明に完全に適合する）と異なり、本発明はある特定の調製された遊離システイン部位の選択的還元及びそれに対する薬物リンカーの結合をさらに提供する。
【０４００】
これに関して、部位の改変及び選択的還元により特異的に促進されたコンジュゲーションにより、所望の位置での部位特異的コンジュゲーションの割合が高くなるのを可能にすることが理解される。重大なことに、これらのコンジュゲーション部位の一部、例えば、軽鎖定常領域の末端領域に存在するコンジュゲーション部位は、他の遊離システインと交差反応しやすいために、一般に有効にコンジュゲートすることが困難である。しかしながら、得られた遊離システインの分子的操作及び選択的還元により、望ましくない高ＤＡＲ混入物及び非特異的毒性を大きく減少させる効率的なコンジュゲーション率が得られ得る。より一般的には、選択的還元を含む改変された構築物及び本開示の新規コンジュゲーション方法は、改善された薬物動態及び／又は薬力学並びに潜在的な改善された治療指数を有するＡＤＣ調製物を提供する。
【０４０１】
ある特定の実施形態において、部位特異的構築物は、遊離システインを提示しており、還元されると、上記で開示するようなリンカー部分の求電子性基と反応して共有結合を形成することができる求核性チオール基を含む。上記のように、本発明の抗体は、還元可能な不対の鎖間若しくは鎖内システイン又は導入された非天然システイン、つまりこのような求核性基を提供するシステインを有してもよい。したがって、ある特定の実施形態において、還元された遊離システインの遊離スルフヒドリル基と、開示される薬物リンカーの末端マレイミド又はハロアセトアミド基との反応により、所望のコンジュゲーションが提供される。このような場合に、抗体の遊離システインは、還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）又は（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）での処理により、リンカー試薬とのコンジュゲーションに反応性にされてもよい。したがって、各遊離システインは、理論的には、反応性チオール求核剤を提供する。このような試薬は、本発明に特に適合するが、部位特異的抗体のコンジュゲーションは、当業者に一般に公知の様々な反応、条件及び試薬を使用して行われ得ることが理解される。
【０４０２】
さらに、操作された抗体の遊離システインは、選択的に還元されて、部位特異的コンジュゲーションの向上及び望ましくない潜在的な毒性混入物の減少をもたらし得ることが見出された。より詳細には、アルギニンなどの「安定化剤」は、タンパク質中の分子内又は分子間相互作用を調節することが見出され、選択された還元剤（好ましくは比較的穏やか）と組み合わせて使用され、遊離システインを選択的に還元し、本明細書に示される部位特異的コンジュゲーションを容易にし得る。本明細書で使用される場合、用語「選択的還元」又は「選択的に還元される」は、相互に交換可能に使用され得、改変抗体に存在する天然ジスルフィド結合を実質的に破壊することのない遊離システインの還元を意味する。選択された実施形態において、この選択的な還元は、ある特定の還元剤又はある特定の還元剤濃度の使用により行われ得る。他の実施形態において、改変構築物の選択的還元は、還元剤（穏やかな還元剤を含む）と組み合わせた安定化剤の使用を含む。用語「選択的コンジュゲーション」は、本明細書に記載の細胞毒の存在下で選択的に還元されている、操作された抗体のコンジュゲーションを意味することが理解される。この点に関して、選択された還元剤と組み合わせたこのような安定化剤（例えば、アルギニン）の使用は、抗体重鎖及び軽鎖のコンジュゲーションの程度並びに調製物のＤＡＲ分布により決定される部位特異的コンジュゲーションの効率を顕著に改善し得る。適合する抗体構築物並びに選択的コンジュゲーション技術及び試薬は、本明細書に詳細に組み込むＷＯ２０１５／０３１６９８においてこのような方法及び構築物に関して詳細に開示されている。
【０４０３】
特定の理論に制限されることは望まないが、このような安定化剤は、所望のコンジュゲーション部位で静電気的微小環境を調節及び／又は立体配座変化を調節するように作用し得、それにより比較的穏やかな還元剤（無傷の天然のジスルフィド結合を実質的に還元しない）に、所望の遊離システイン部位でのコンジュゲーションを促進させる。このような物質（例えば、ある特定のアミノ酸）は、塩橋を形成（水素結合及び静電相互作用を介して）することが知られており、好ましい立体配座変化を生じさせ得、そして／又は好ましくないタンパク質−タンパク質相互作用を減少させる安定化効果を付与するようにタンパク質−タンパク質相互作用を調節し得る。さらに、このような物質は、還元後の望ましくない分子内（及び分子間）システイン−システイン結合の形成を阻害するように作用し得、したがって、改変された部位特異的システインが（好ましくはリンカーを介して）薬物に結合する所望のコンジュゲーション反応が促進される。選択的還元条件は、無傷の天然のジスルフィド結合を顕著に還元しないので、後のコンジュゲーション反応は自然に、遊離システイン上の比較的反応性の少ないチオール（例えば、好ましくは抗体あたり２つの遊離チオール）に向かう。先に言及したように、このような技術は、本開示に従って作製されるコンジュゲート調製物における非特異的コンジュゲーション及び対応する望ましくないＤＡＲ種のレベルを相当に減少させるために使用され得る。
【０４０４】
選択された実施形態において、本発明に適合する安定化剤は、一般的に、塩基性ｐＫａを有する少なくとも１つの成分を有する化合物を含む。ある特定の実施形態において、この成分は、一級アミンを含むが、他の実施形態において、アミン部分は、二級アミンを含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、三級アミン又はグアニジニウム基を含む。他の選択された実施形態において、アミン部分は、アミノ酸を含み、他の適合する実施形態において、アミン部分は、アミノ酸側鎖を含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、タンパク質性アミノ酸を含む。さらに他の実施形態において、アミン部分は、非タンパク質性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、適合する安定化剤は、アルギニン、リシン、プロリン及びシステインを含み得る。ある特定の好ましい実施形態において、安定化剤は、アルギニンを含む。さらに適合安定化剤は、グアニジン及び塩基性ｐＫａを有する窒素含有複素環を含み得る。
【０４０５】
ある特定の実施形態において、適合安定化剤は、約７．５より大きいｐＫａを有する少なくとも１つのアミン部分を有する化合物を含む。他の実施形態において、対象アミン部分は、約８．０より大きいｐＫａを有し、さらに他の実施形態において、アミン部分は、約８．５より大きいｐＫａを有し、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約９．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。他の実施形態は、アミン部分が約９．５より大きいｐＫａを有する安定化剤を含み、一方で、ある特定の他の実施形態は、約１０．０より大きいｐＫａを有する少なくとも１つのアミン部分を示す安定化剤を含む。さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１０．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、他の実施形態において、安定化剤は、約１１．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１１．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１２．０より大きいｐＫａを有するアミン部分を有する化合物を含み、さらに他の実施形態において、安定化剤は、約１２．５より大きいｐＫａを有するアミン部分を含む。当業者は、関連するｐＫａが、標準的技術を使用して容易に計算又は決定され得、安定化剤としての選択された化合物の使用の適応性を決定するために使用され得ることを理解する。
【０４０６】
開示される安定化剤は、ある特定の還元剤と組み合わされるときに、遊離の部位特異的システインに対するコンジュゲーションの標的化において特に有効であることが示される。本発明の目的に関して、適合する還元剤は、改変抗体の天然ジスルフィド結合を顕著に破壊することなく、コンジュゲーションについて部位特異的な還元された遊離のシステインを生じさせる、任意の化合物を含み得る。好ましくは、このような選択された安定化剤と還元剤との組合せによりもたらされる条件下において、活性化薬物リンカーは、所望の遊離の部位特異的システイン部位に結合するよう大きく制限されることになる。比較的低濃度で使用され、穏やかな条件を与える比較的穏やかな還元剤又は還元剤が、特に好ましい。本明細書で使用される場合、用語「穏やかな還元剤」又は「穏やかな還元条件」は、改変抗体に存在する天然ジスルフィド結合を実質的に破壊することなく、遊離システイン部位でチオールを提供する還元剤により（任意選択的に安定化剤の存在下で）もたらされる任意の物質又は条件を意味することが支持される。つまり、穏やかな還元剤又は条件（好ましくは安定化剤との組合せ）は、タンパク質の天然ジスルフィド結合を顕著に破壊することなく、遊離システインを効果的に還元する（チオールを提供する）ことができる。所望の還元条件は、選択的コンジュゲーションのための適切な環境を確立するいくつかのスルフヒドリル系化合物により提供され得る。実施形態において、穏やかな還元剤は、１つ以上の遊離チオールを有する化合物を含み得、いくつかの実施形態において、穏やかな還元剤は、単一の遊離チオールを有する化合物を含む。本発明の選択的還元技術に適合する還元剤の非限定的な例としては、グルタチオン、ｎ−アセチルシステイン、システイン、２−アミノエタン−１−チオール及び２−ヒドロキシエタン−１−チオールが挙げられる。
【０４０７】
上記に示される選択的還元プロセスは、遊離のシステインに対する標的化コンジュゲーションで特に効果的であることが理解される。この点に関して、部位特異的抗体における、所望の標的部位に対するコンジュゲーションの程度（ここでは「コンジュゲーション効率」として定義する）は、当該技術分野で受け入れられている様々な技術により決定され得る。抗体に対する薬物の部位特異的コンジュゲーション効率は、全ての他のコンジュゲーション部位に対する標的コンジュゲーション部位（例えば、各軽鎖のｃ末端の遊離システイン）のコンジュゲーションのパーセンテージを評価することによって決定され得る。ある特定の実施形態において、本明細書における方法は、遊離システインを含む抗体に薬物を効率的にコンジュゲートすることを提供する。いくつかの実施形態において、コンジュゲーション効率は、全ての他のコンジュゲーション部位に対する標的コンジュゲーションのパーセンテージにより測定して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又はそれ以上である。
【０４０８】
コンジュゲーション可能な改変抗体は、抗体が産生又は保存されるときに、阻止又はキャップされるスルフヒドリル基を含む遊離システイン残基を含有し得ることが、さらに理解される。このようなキャップとしては、小分子、タンパク質、ペプチド、イオン及びスルフヒドリル基と相互作用し、コンジュゲート形成を予防又は阻害する他の物質が挙げられる。いくつかの場合において、コンジュゲートしていない改変抗体は、同じ又は異なる抗体上の他の遊離システインに結合する遊離システインを含んでもよい。本明細書で述べられているように、このような交差反応性は、作製手順の間に様々な混入物を導き得る。いくつかの実施形態において、改変抗体は、コンジュゲーション反応の前にキャップをはずすことを必要とし得る。特定の実施形態において、本明細書の抗体は、キャップされておらず、コンジュゲーション可能な遊離スルフヒドリル基を提示する。特定の実施形態において、本明細書の抗体は、天然に存在するジスルフィド結合を破壊せず、再配列もしない、キャップ除去反応にかけられる。ほとんどの場合において、キャップ除去反応は通常の還元反応（還元又は選択的還元）中に生じることが理解される。
【０４０９】
Ｄ．ＤＡＲ分布及び精製
選択された実施形態において、本発明に適合するコンジュゲーション及び精製方法は、狭いＤＡＲ分布を含む比較的均質なＡＤＣ調製物を生成する能力を有利にもたらす。この点に関して、本開示の構築物（例えば、部位特異的構築物）及び／又は選択的コンジュゲーションは、薬物と改変抗体との間の化学量論比の観点及び毒素の位置に関して、試料内のＡＤＣ種に均質性を提供する。上記で簡単に議論したように、用語「薬物対抗体比」又は「ＤＡＲ」は、ＡＤＣ調製物中の薬物対抗体のモル比を指す。ある特定の実施形態において、コンジュゲート調製物は、このＤＡＲ分布に関して実質的に均質であり得、このことは、ＡＤＣ調製物内において、ローディングの部位（すなわち、遊離システイン上）に関して、やはり均一である特定薬物のローディング（例えば、２又は４の薬物ローディング）を有する部位特異的ＡＤＣが主要な種であることを意味する。本発明の他のある特定の実施形態において、部位特異的抗体及び／又は選択的還元並びにコンジュゲーションの使用を通じて所望の均質性を達成することができる。他の実施形態において、所望の均質性は、選択的還元と組み合わせた部位特異的構築物の使用を通じて達成し得る。さらに他の実施形態において、適合する調製物は、所望の均質性を得るために分析的又は分取クロマトグラフィー技術を使用して精製され得る。これらの実施形態のそれぞれにおいて、ＡＤＣ試料の均質性は、当該技術分野で公知の様々な技術、例えば、これらに限定されないが、質量分析、ＨＰＬＣ（例えば、サイズ排除ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＨＩＣ−ＨＰＬＣなど）又はキャピラリー電気泳動を使用して解析され得る。
【０４１０】
ＡＤＣ調製物の精製に関して、所望の純度を得るために、標準的医薬調製方法が使用され得ることが理解される。本明細書において述べられているように、液体クロマトグラフィー方法、例えば、逆相（ＲＰ）及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、薬物負荷値により混合物中の化合物を分離することができる。一部の場合に、イオン交換（ＩＥＣ）又は混合モードクロマトグラフィー（ＭＭＣ）を使用して、特異的薬物負荷を有する種を単離してもよい。
【０４１１】
いずれにしても本開示のＡＤＣ及びその調製物は、抗体の立体構造に依存して、そしてコンジュゲーションを達成するために使用される方法に少なくとも部分的に依存して、様々な化学量論モル比の薬物部分及び抗体成分を含むことができる。ある特定の実施形態において、ＡＤＣあたりの薬物負荷は、１から２０の弾頭を含み得る（すなわち、ｎは１〜２０である）。他の選択された実施形態は、１から１５の弾頭の薬物負荷を有するＡＤＣを含む。さらに他の実施形態において、ＡＤＣは、１から１２の弾頭、又はより好ましくは１から１０の弾頭を含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＤＣは、１から８の弾頭を含む。
【０４１２】
理論的薬物負荷は比較的高くてもよいが、遊離システイン交差反応性及び弾頭疎水性などの実際上の限定により、このようなＤＡＲを含む均質な調製物の生成は、凝集物及び他の混入物により限定される傾向がある。つまり、高い薬物負荷、例えば、＞８又は１０の薬物負荷は、ペイロードによって、ある特定の抗体薬物コンジュゲートの、凝集、不溶性、毒性又は細胞透過性の消失を引き起こし得る。このような懸念の観点から、本発明により提供される薬物負荷は、好ましくは、コンジュゲートあたり１から８個の薬物の範囲であり、すなわち各抗体に１、２、３、４、５、６、７又は８個の薬物が共有結合している（例えば、ＩｇＧ１の場合には、他の抗体が、ジスルフィド結合の数に応じて異なる負荷性を有し得る）。好ましくは、本発明の組成物のＤＡＲは、およそ２、４又は６であり、いくつかの実施形態において、ＤＡＲはおよそ２である。
【０４１３】
本発明により提供される比較的高いレベルの均質性にかかわらず、本開示の組成物は、ある範囲の（ＩｇＧ１の場合は１から８の範囲の）薬物化合物を有するコンジュゲートの混合物を実際に含む。このように、開示されるＡＤＣ組成物は、コンジュゲートの混合物を含み、ここで構成要素の抗体のほとんどは、１つ以上の薬物部分に共有結合的に連結されており、（改変された構築物及び選択的還元によりもたらされる相対的なコンジュゲート特異性にもかかわらず、）薬物部分は様々なチオール基により抗体に結合されていてもよい。つまり、以下のコンジュゲート、本発明の組成物は、様々な濃度の異なる薬物負荷（例えば、ＩｇＧ１抗体あたり１から８の薬物）を有するＡＤＣの混合物を含む（遊離システインの交差反応性によって主に引き起こされるある特定の反応混入物を含む）。しかしながら選択的還元及び作製後の精製を使用して、コンジュゲート組成物は、単一の主要な所望のＡＤＣ種（例えば、２の薬物負荷を有する）を大量に含み、他のＡＤＣ種（例えば、１、４、６などの薬物負荷を有する）は比較的低レベルとなる点に導かれ得る。平均ＤＡＲ値は、組成物全体に対する薬物負荷（すなわち、全てのＡＤＣ種をまとめたもの）の加重平均を表す。用いられる定量法の固有の不確定性と商業的状況において非優勢ＡＤＣ種を完全に除去することの困難性とにより、許容可能なＤＡＲ値又は特異度、平均値、範囲又は分布として表されることが多い（すなわち、平均ＤＡＲが２＋／−０．５）。好ましくは、範囲内（すなわち、１．５から２．５）に測定された平均ＤＡＲを含む組成物が、医薬的状況において使用される。
【０４１４】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、１、２、３、４、５、６、７又は８でそれぞれ＋／−０．５の平均ＤＡＲを有する組成物を含む。他の実施形態において、本発明は、２、４、６又は８＋／−０．５の平均ＤＡＲを含む。最終的に、選択された実施形態において、本発明は、２＋／−０．５又は４＋／−０．５の平均ＤＡＲを含む。この範囲又は偏差は、いくつかの実施形態において、０．４未満であり得ることが理解される。したがって、他の実施形態において、組成物は、１、２、３、４、５、６、７若しくは８でそれぞれ＋／−０．３の平均ＤＡＲ、２、４、６若しくは８＋／−０．３の平均ＤＡＲ、さらにより好ましくは２若しくは４＋／−０．３の平均ＤＡＲ、又はさらには２＋／−０．３の平均ＤＡＲを含む。他の実施形態において、ＩｇＧ１コンジュゲート組成物は、好ましくは、平均ＤＡＲが１、２、３、４、５、６、７又は８でそれぞれ＋／−０．４で、非優勢ＡＤＣ種が比較的低いレベル（すなわち、３０％未満）である組成物を含む。他の実施形態において、ＡＤＣ組成物は、２、４、６又は８でそれぞれ＋／−０．４の平均ＤＡＲを含み、非優勢ＡＤＣ種を比較的低レベル（＜３０％）で含む。いくつかの実施形態において、ＡＤＣ組成物は、２＋／−０．４の平均ＤＡＲを含み、非優勢ＡＤＣ種を比較的低いレベル（＜３０％）で含む。さらに他の実施形態において、優勢ＡＤＣ種（例えば、２の薬物負荷又は４の薬物負荷を含む）は、組成物中に存在する他の全てのＤＡＲ種に対して測定すると、５０％超の濃度、５５％超の濃度、６０％超の濃度、６５％超の濃度、７０％超の濃度、７５％超の濃度、８０％超の濃度、８５％超の濃度、９０％超の濃度、９３％超の濃度、９５％超の濃度又はさらに９７％超の濃度で存在する。
【０４１５】
以下の実施例において詳述されているように、コンジュゲーション反応由来のＡＤＣの調製物における抗体あたりの薬物の分布は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度法、逆相ＨＰＬＣ、ＨＩＣ、質量分析法、ＥＬＩＳＡ及び電気泳動法のような従来手段により特徴づけられ得る。抗体あたりの薬物の観点でＡＤＣの定量的分布も、決定され得る。ＡＤＣの特定の調製物における抗体あたりの薬物の平均値は、ＥＬＩＳＡによって決定され得る。しかし、抗体価あたりの薬物分布は、抗体−抗原結合、及びＥＬＩＳＡの検出限界によって認識されない。同様に、抗体−薬物コンジュゲートの検出向けのＥＬＩＳＡアッセイは、薬物部分が抗体の（抗体の重鎖若しくは軽鎖断片、又は特定のアミノ酸残基などの）どこに結合しているかを決定しない。
【０４１６】
ＶＩＩ．診断及びスクリーニング
Ａ．診断
本発明は、増殖性障害を検出、診断又は監視するためのインビトロ及びインビボの方法並びに患者からの細胞をスクリーニングして、腫瘍形成性細胞を含む腫瘍細胞を同定するための方法を提供する。このような方法は、がんを有する個体を治療のために特定すること又はがんの進行を監視する方法であって、患者又は患者から得られた試料を、ＤＬＬ３又はＡＳＣＬ１を特異的に認識し、結合することができる検出剤（例えば、抗体又は核酸プローブ）と、（インビボ又はインビトロのいずれかで）接触させること及び試料における検出剤の存在若しくは不在又は結合のレベルを検出することを含む、方法を含む。選択された実施形態において、検出剤は、本明細書に記載の検出可能な標識又はレポーター分子と結合した抗体を含む。さらに他の実施形態（例えば、インサイチュハイブリダイゼーション又はＩＳＨ）において、ゲノムＤＬＬ３又はＡＳＣＬ１決定因子と反応する核酸プローブは、増殖性障害の検出、診断又は監視に使用される。
【０４１７】
より一般的に、ＤＬＬ３又はＡＳＣＬ１決定因子の存在及び／又はレベルは、タンパク質又は核酸解析のために当業者に利用可能ないくつかの任意の技術、例えば、直接的物理学的測定（例えば、質量分析）、結合アッセイ（例えば、イムノアッセイ、凝集アッセイ及びイムノクロマトグラフィーアッセイ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ；ＲＴ−ｑＰＣＲ）技術、分岐オリゴヌクレオチド技術、ノザンブロット技術、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション技術並びにインサイチュハイブリダイゼーション技術を使用して測定されてもよい。方法には、化学反応、例えば、光学的吸光度の変化、蛍光の変化、化学発光若しくは電気化学発光の生成、反射率、屈折率若しくは光散乱の変化、検出可能標識の蓄積若しくは表面からの放出、酸化若しくは還元若しくは酸化還元種、電流若しくは電位、磁場の変化などから生じるシグナルの測定を含んでもよい。適切な検出技術は、光発光（例えば、蛍光、時間分解蛍光、エバネッセント波蛍光、アップコンバート性リン、多光子蛍光の測定を介する）、化学発光、電気化学発光、光散乱、光吸収、放射能、磁場、酵素活性（例えば、光吸収若しくは蛍光の変化を生じさせる又は化学発光の放射を生じさせる酵素反応を通じた酵素活性の測定による）を介した標識の測定を通じて、標識された結合試薬の参加を測定することにより、結合事象を検出してもよい。代替的に、標識の使用を必要としない検出技術、例えば、質量（例えば、表面弾性波測定）、屈折率（例えば、表面プラズモン共鳴測定）又は分析物の固有の発光の測定に基づく技術を使用してもよい。
【０４１８】
いくつかの実施形態において、検出剤と試料中の特定の細胞又は細胞成分との結合は、試料が腫瘍形成性細胞を含む可能性があることを示しており、したがって、がんを有する個体を本明細書に記載の抗体又はＡＤＣを用いて効果的に治療し得ることを示している。
【０４１９】
ある特定の好ましい実施形態において、アッセイには、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ若しくはこの変形（例えば、蛍光、色素生産性、標準ＡＢＣ、標準ＬＳＡＢなど）、免疫細胞化学若しくはこの変形（例えば、直接、間接、蛍光、色素生産性など）又はインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）若しくはこの変形（例えば、色素生産性インサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）若しくは蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＤＮＡ−ＦＩＳＨ又はＲＮＡ−ＦＩＳＨ］））が含まれてもよい。
【０４２０】
この点に関して、本発明のある特定の態様は、免疫組織化学（ＩＨＣ）のための標識されたＤＬＬ３又は標識されたＡＳＣＬ１の使用を含む。より詳細には、ＤＬＬ３  ＩＨＣ又はＡＳＣＬ１  ＩＨＣは、様々な増殖性障害の診断を補助するため及びＤＬＬ３抗体療法を含む治療に対する潜在的な応答を監視するための診断ツールとして使用され得る。本明細書において議論され、以下の実施例において示されている通り、適合する診断アッセイは、化学的に固定された組織（適合技術には、以下に限定されないが、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、四酸化オスミウム、二クロム酸カリウム、酢酸、アルコール、亜鉛塩、塩化第二水銀、四酸化クロム及びピクリン酸が含まれる）並びに包埋された組織（以下に限定されないが、適合法には、グリコールメタクリレート、パラフィン及び樹脂が含まれる）、又は凍結により保存された組織に対して、実施され得る。このようなアッセイは、治療の決定に対する道筋を立て、投与レジメン及びタイミングを決定するために使用され得る。
【０４２１】
免疫組織化学技術を使用して、当該技術分野で公知のＡＳＬＣ１  Ｈスコアを導き出すことができる。このようなＨスコアを使用して、どの患者が本発明の組成物により治療を受けやすくなり得るかを示すことができる。選択された実施形態において、３００ポイントスケールに対する、約９０、約１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０若しくは約２００、又はそれ超のＨスコアを使用して、どの患者が本発明の治療法に好都合に応答することができるかを示すことができる。したがって、一実施形態において、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療される患者は、３００ポイントスケールに対して、少なくとも９０（すなわち、腫瘍はＡＳＣＬ１＋である）のＨスコアを有する。他の実施形態において、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療される患者は、ＡＳＬＣ１のＨスコアを少なくとも１２０有する。さらに他の実施形態において、本発明のＤＬＬ３  ＡＤＣにより治療される患者は、ＡＳＬＣ１のＨスコアを少なくとも１８０有する。本開示の目的のため、３００ポイントスケールに対して９０以上のＡＳＬＣ１  Ｈスコアを示すいかなる腫瘍も、ＡＳＣＬ１＋腫瘍、及び開示される抗体又はＡＤＣにより治療する対象と考えられる。
【０４２２】
さらに他の実施形態において、患者選択は、ある強度でマーカー（例えば、ＡＳＣＬ１）の正の細胞染色率に基づいて予測され得る。例として、＞２０％の細胞が２＋以上の強度を示す腫瘍は、ＤＬＬ３  ＡＤＣによる治療に対する候補となる。他の実施形態において、マーカー抗体（例えば、抗ＡＳＣＬ１抗体）により染色させて、本明細書に開示されている標準ＩＨＣプロトコルに従って試験した場合に、≧２０％、≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％又は≧８０％の腫瘍細胞が強度１＋以上を示す場合、患者は、ＤＬＬ３  ＡＤＣ又は他の化学治療剤による治療に対する候補となる。他のある特定の実施形態において、マーカー抗体により染色させて、本明細書に開示されている標準ＩＨＣプロトコルに従って試験した場合に、≧２０％、≧３０％、≧４０％、≧５０％、≧６０％、≧７０％又は≧８０％の腫瘍細胞が強度２＋以上を示す場合、患者は、ＤＬＬ３  ＡＤＣ又は他の化学治療剤による治療に対する候補となる。さらに他の選択された実施形態において、マーカー抗体により染色させて、本明細書に開示されている標準ＩＨＣプロトコルに従って試験した場合に、≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧４０％又は≧５０％の腫瘍細胞が強度１＋以上を示す場合、患者は、ＤＬＬ３  ＡＤＣ又は他の化学治療剤による治療に対する候補となる。さらに他の実施形態において、マーカー抗体により染色させて、本明細書に開示されている標準ＩＨＣプロトコルに従って試験した場合に、≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧４０％又は≧５０％の腫瘍細胞が強度２＋以上を示す場合、患者は、ＤＬＬ３  ＡＤＣ又は他の化学治療剤による治療に対する候補となる。さらに別の実施形態は、マーカー抗体により染色させて、標準ＩＨＣプロトコルに準拠して試験した場合に、≧１０％の腫瘍細胞が１＋以上の強度を示す腫瘍細胞を含む腫瘍を有する対象を治療する方法であって、抗ＤＬＬ３  ＡＤＣを投与するステップを含む方法を含む。前述の実施形態の各々に関すると、マーカー抗体による染色強度は、標準病理技術又は当業者が精通している方法論を使用して容易に決定され得ることが理解される。
【０４２３】
上で議論されている通り、ある種のマーカーレベル及びＤＬＬ３発現は、対照試料における基準発現レベルに比べて、低下又は低減する。より詳細には、神経内分泌表現型に移行するリスクのある腫瘍は、網膜芽細胞腫１（ＲＢ１）、リプレッサー要素１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、ＳＡＭポインテッドドメイン含有Ｅｔｓ転写因子（ＳＰＤＥＦ）、プロスタグランジンＥ２受容体４（ＰＴＧＥＲ４）及びＥＴＳ関連遺伝子（ＥＲＧ）からなる群から選択されるマーカーの１つを一層低いレベルで発現することができる。さらに、このような腫瘍は、相対的に低いレベルのＤＬＬ３タンパク質を発現することができ、ＡＳＣＬ１＋  ＤＬＬ３−／ｌｏｗとして分類され得、この場合、ＤＬＬ３−は、発現が検出不能レベルである又はほとんど検出可能レベルではないことを示し、ＤＬＬ３ｌｏｗは、ある特定の腫瘍（例えば、腺癌）において見出されるＤＬＬ３レベルが相対的に低下したことを示す。この点において、ＤＬＬ３ｌｏｗは、対照試料の基準発現レベルと比較して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はこれを超える値で低下するＤＬＬ３発現レベルを含む任意の腫瘍を意味することが支持される（例えば、ＤＬＬ３＋又はｈｉ腫瘍）。ある特定の実施形態において、ＤＬＬ３発現は、対照試料における基準発現レベルと比較して、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はこれを超える値で低下する。さらに他の実施形態において、ＤＬＬ３発現は、対照試料における基準発現レベルと比較して、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はこれを超える値で低下する一方、他の実施形態において、ＤＬＬ３発現は、対照試料における基準発現レベルと比較して、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はこれを超える値で低下する。選択された実施形態において、ＤＬＬ３発現は、ＤＬＬ３＋腫瘍から得られた試料と比較すると、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％、低下する。
【０４２４】
他の実施形態において、腫瘍試料は、ＤＬＬ３を発現しないことが知られている対照腫瘍試料（ネガティブ対照）と比較され得る。このような比較が行われる場合、対象から得られる腫瘍試料は、この試料が、ネガティブ対照として、実質的に同じレベルのＤＬＬ３を示す場合、ＤＬＬ３−として分類され得る。
【０４２５】
さらに他の実施形態において、ＤＬＬ３−／ｌｏｗ腫瘍は、本開示を鑑みて、ＩＨＣを使用して熟練病理学者により容易に同定され得る。より詳細には、腫瘍試料が得られて、好ましくは固定され、本明細書において開示されている抗ＤＬＬ３抗体により染色されて、当該技術分野で認識されている技術を使用して読み取ることができる。ある特定の実施形態において、ＤＬＬ３の発現は、適切なポジティブ対照及びネガティブ対照を使用して、病理学者によって視覚的に決定され得る。他の実施形態において、スコア化は、導かれたＨスコアに基づくことができ、腫瘍試料においてポジティブに染色された細胞の割合の測定を含むことができる。後者に関すると、腫瘍は、標準ＩＨＣ技術を使用して、約２０％、１５％、１０％、８％、５％、４％、３％、２％又は１％未満の細胞染色ポジティブとなる場合に、ＤＬＬ３−／ｌｏｗであると分かり得る。他の実施形態において、腫瘍は、本明細書に記載されているＤＬＬ３抗体を用いて求めた場合、約０．８％、０．６％、０．４％、０．２％又は０．１％未満の細胞染色ポジティブである場合に、ＤＬＬ３−／ｌｏｗであることが分かり得る。他の実施形態において、当業者は、相対強度、染色パターン、試料起源及び調製、使用した抗体及びレポーターなどのような要因に基づいて、スライドを観察した際に、何がＤＬＬ３−／ｌｏｗ腫瘍を構成しているかについて定性的に判断をすることができる。先に言及したように、ＤＬＬ３発現のレベルに関する任意の判定は、適切なポジティブ対照及びネガティブ対照の文脈において行われ、相対的な精度である。したがって、このような決定は、どの患者が本明細書に記載されているＤＬＬ３  ＡＤＣによる治療に感受性があるかについての標識となる。
【０４２６】
他の特に適合する本発明の態様は、ＤＬＬ３又はＡＳＣＬ１決定因子を検出又は監視するためのインサイチュハイブリダイゼーションの使用を含む。インサイチュハイブリダイゼーション技術又はＩＳＨは、当業者にとって周知である。簡潔には、細胞を固定し、特定のヌクレオチド配列を含有する検出可能なプローブを固定した細胞に加える。細胞が相補的ヌクレオチド配列を含有する場合には、検出され得るプローブは、それらの配列にハイブリダイズする。本明細書に示す配列情報を使用して、遺伝子型ＤＬＬ３又はＡＳＣＬ１決定因子を発現する細胞を特定するようにプローブを設計することができる。プローブは、好ましくは、そのような決定因子に対応するヌクレオチド配列にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件は、不完全な相補的ハイブリダイゼーションによるバックグラウンドシグナルを最小化するように慣用的に最適化することができるが、好ましくは、プローブは、選択されたＤＬＬ３又はＡＳＣＬ１決定因子に完全に相補的であることが好ましい。選択された実施形態において、プローブは、プローブに付された蛍光色素で標識されており、つまり標準的蛍光方法により容易に検出可能である。
【０４２７】
インビボの診断治療又は診断に適合するアッセイには、当業者に公知の磁気共鳴画像、コンピュータ断層撮影（例えば、ＣＡＴスキャン）、陽電子放射断層撮影（例えば、ＰＥＴスキャン）、Ｘ線撮影、超音波のような当該技術分野で認識されている画像化又は監視技術を含めてもよい。
【０４２８】
ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、患者試料（例えば、血漿又は血液）中の特定の決定因子（例えば、ＤＬＬ３タンパク質又はＡＳＣＬ１タンパク質）のレベルを検出及び定量するために使用することができ、同様に、関連する決定因子が関与する増殖性障害を検出、診断又は監視するために使用することができる。関連する実施形態において、本発明の抗体は、循環腫瘍細胞をインビボ又はインビトロのいずれかで検出、監視及び／又は定量するために使用され得る（ＷＯ２０１２／０１２８８０１）。さらに他の実施形態において、循環腫瘍細胞は、腫瘍形成性細胞を含み得る。
【０４２９】
本発明のある特定の実施形態において、対象又は対象由来の試料における腫瘍形成性細胞は、治療又はレジメンのベースラインが確立される前に、本開示の抗体を使用して評価又は特徴づけされ得る。他の例において、腫瘍形成性細胞は、治療された対象に由来する試料から評価され得る。
【０４３０】
別の実施形態において、本発明は、がんの進行及び／又は病因をインビボで分析する方法を提供する。別の実施形態において、がんの進行及び／又は病因のインビボでの解析は、腫瘍の進行の程度を決定することを含む。別の実施形態において、解析は、腫瘍の同定を含む。別の実施形態において、腫瘍の進行の解析が、原発性腫瘍に対して行われる。別の実施形態において、解析は、当業者にとって公知のように、がんの種類に応じて経時的に行われる。別の実施形態において、原発性腫瘍の転移性細胞に起因する二次性腫瘍の解析が、さらにインビボで行われる。別の実施形態において、二次性腫瘍の大きさと形状が解析される。いくつかの実施形態において、さらにエクスビボの解析が行われる。
【０４３１】
別の実施形態において、本発明は、がんの進行及び／又は病因をインビボで解析する方法であって、細胞の転移を決定すること又は循環腫瘍細胞のレベルを検出すること及び定量することを含む方法を提供する。さらに別の実施形態において、細胞転移の解析は原発性腫瘍から不連続の部位において、細胞の進行性成長を測定することを含む。いくつかの実施形態において、手法は、血管、リンパ、体腔内又はそれらの組合せを通じて分散する腫瘍細胞を監視するために行うことができる。別の実施形態において、細胞転移解析は、細胞遊走、播種、血管外漏出、増殖又はそれらの組合せの結果として行われる。
【０４３２】
ある特定の例において、対象又は対象由来の試料における腫瘍形成性細胞は、治療の前にベースラインを確立するために、本開示の抗体を使用して評価又は特徴づけてもよい。他の例において、試料は、治療された対象に由来する。いくつかの例において、試料は、対象が治療を開始又は終了してから少なくとも約１、２、４、６、７、８、１０、１２、１４、１５、１６、１８、２０、３０、６０、９０日、６カ月、９カ月、１２カ月又は＞１２カ月後の対象から得られる。ある特定の実施例において、腫瘍形成性細胞は、一定数の投与の後（例えば、治療の２、５、１０、２０、３０回以上の投与の後）に、評価又は特徴づけされる。他の例において、腫瘍形成性細胞は、１回以上の治療を受けてから１週、２週、１カ月、２カ月、１年、２年、３年、４年以上後に、特徴づけ又は評価される。
【０４３３】
Ｂ．スクリーニング
ある特定の実施形態において、本発明の抗体は、決定因子との相互作用により腫瘍細胞の機能又は活性を変化させる化合物又は作用因子（例えば、抗体又はＡＤＣ）を同定するために、試料のスクリーニングに使用することができる。一実施形態において、腫瘍細胞は、抗体又はＡＤＣと接触され、この抗体又はＡＤＣは、ある特定の標的（例えばＤＬＬ３又はＡＳＣＬ１）を発現する細胞について腫瘍をスクリーニングするために使用され、このような細胞を、例えば限定されないが、診断目的などの目的のために同定すること、このような細胞を監視して治療の有効性を決定すること又はこのような標的発現細胞のための細胞集団を濃縮することができる。
【０４３４】
さらに別の実施形態において、方法は、腫瘍細胞を試験薬剤又は化合物に直接的又は間接的に接触させることと、試験薬剤又は化合物が、決定因子結合腫瘍細胞の活性又は機能を調節するかどうか、例えば、細胞の形態又は生存性の変化、マーカーの発現、分化又は脱分化、細胞の呼吸作用、ミトコンドリア活性、膜完全性、成熟性、増殖性、生存性、アポトーシス又は細胞死を調節するかどうかを決定することとを含む。直接的相互作用の一例は物理的相互作用であり、一方で、間接的相互作用としては、例えば、参照実体（例えば、細胞又は細胞培養物）に順に作用する中間的分子に対する組成物の作用が挙げられる。
【０４３５】
スクリーニング方法は、ハイスループットスクリーニングを含み、この方法は、例えば、培養皿、チューブ、フラスコ、ローラーボトル又はプレート上において、任意選択的に所定の位置に配置されたか又は置かれた、細胞のアレイ（例えば、マイクロアレイ）を含み得る。ハイスループットのロボット又は手作業による方法は、化学的相互作用を調べ、短期間に多くの遺伝子の発現レベルを決定することができる。分子シグナルを利用する、例えば、フルオロフォア又はマイクロアレイを介する技術（Ｍｏｃｅｌｌｉｎ  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｉ、２００７、ＰＭＩＤ：１７２６５７１３）が開発され、さらに情報を非常に迅速に処理する解析（例えば、Ｐｉｎｈａｓｏｖら、２００４、ＰＭＩＤ：１５０３２６６０参照）が自動化されてきた。スクリーニングされ得るライブラリは、例えば、小分子ライブラリ、ファージディスプレイライブラリ、全ヒト抗体酵母ディスプレイライブラリ（Ａｄｉｍａｂ）、ｓｉＲＮＡライブラリ及びアデノウイルストランスフェクションベクターを含む。
【０４３６】
ＶＩＩＩ．医薬調製物及び治療的使用
ＤＬＬ３＋腫瘍向けの抗ＤＬＬ３  ＡＤＣ治療は、十分に記載されている。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１３１２６７４６及びＷＯ２０１４１３０８７９；及びＰｉｅｔａｎｚａら、ＥＭＳＯアブストラクト２０１５を参照。特に、ＤＬＬ３発現は、神経内分泌表現型に移行する腫瘍と関連があり、その後、標準治療を使用する高度な治療は不可能である。本発明は、開示されたリスク因子を有する患者が、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートによる、ＤＬＬ３−／ｌｏｗである腫瘍の治療に対する候補として特定可能となるよう、神経内分泌移行のリスクのある腫瘍を特定するための方法及び組成物を提供する。本明細書において上述されている通り、リスク因子には、（１）様々なタンパク質が、神経内分泌表現型への移行中及び実質的にＤＬＬ３が発現する前の腫瘍に発現されること、及び（２）標的治療による事前治療が含まれる。
【０４３７】
神経内分泌表現型に移行するリスクのある腫瘍の早期治療は、腫瘍再発を低減又は阻害するために有益である。特に、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートは、神経内分泌移行に関する、本明細書において開示されている、１つ以上のリスク因子を示すＤＬＬ３−／ｌｏｗ腫瘍の治療に有効となり得、これにより、再発の出現率が低減する。再燃性又は再発性のがんの場合、リスクのある腫瘍には、標的がん治療により以前に治療されたものが含まれる。
【０４３８】
本発明の一態様において、抗ＤＬＬ３  ＡＤＣは、腺癌が神経内分泌表現型に完全に移行する前に患者に投与され、この場合、腫瘍は、通常、ＤＬＬ３−／ｌｏｗである。関連態様において、抗ＤＬＬ３  ＡＤＣは、標的がん治療による治療前に投与される。別の態様において、抗ＤＬＬ３  ＡＤＣは、標的がん治療との併用療法として投与され、投与は、抗ＤＬＬ３  ＡＤＣと同時に、又は連続して行われる。さらに別の態様において、抗ＤＬＬ３抗体は、化学治療レジメンの前、後又はこれと同時に、ＤＬＬ３−／ｌｏｗ腫瘍を有する対象に投与される。さらに別の態様において、抗ＤＬＬ３  ＡＤＣは、腺癌が抵抗性を発症した後、又はそれ以外の方式で標的がん治療に対して抵抗性を発症するリスクを示した後に患者に投与される。
【０４３９】
再発を低減又は阻害するとは、対照と比べて、疾患再発の任意のかなりの低下を意味する。例えば、対照に比べて、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はこれを超える値の、有意な低下。代替的に、再発の低減又は阻害とは、対照と比較して、少なくとも１．５分の１倍、２分の１倍、３分の１倍、４分の１倍、５分の１倍、６分の１倍、７分の１倍、８分の１倍、９分の１倍、１０分の１倍、１２分の１倍、１４分の１倍、１６分の１倍、２０分の１倍又はそれ未満である任意の倍率低下とすることができる。代表的な対照には、例えば、抗ＤＬＬ３  ＡＤＣ治療の非存在下で、所与の標的治療を受ける患者集団における再発率が含まれる。
【０４４０】
Ａ．製剤及び投与経路
本発明の組成物は、抗体薬物コンジュゲートの形態、意図される送達様式、治療又は監視される疾患及び多数の他の変異に応じて、当該技術分野で認識されている技術を用いて所望の通りに製剤化され得る。いくつかの実施形態において、本発明の治療組成物は、無添加で又は最小量の追加成分と共に投与されてもよい一方、他では、当該技術分野において周知の賦形剤及び助剤を含む好適な薬学的に許容可能な担体を含有するように任意選択的に製剤化されてもよい（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｗｉｔｈ  Ｆａｃｔｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ：Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ  Ｐｌｕｓ、第２０版（２００３年）；Ａｎｓｅｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００４年）；Ｋｉｂｂｅら、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第３版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ（２０００年）を参照）。ビヒクル、アジュバント及び希釈剤を含む、様々な薬学的に許容可能な担体が、多数の商業的供給元から容易に入手可能である。さらに、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、安定化剤、湿潤剤などのような、薬学的に許容可能な補助物質の組合せもまた利用可能である。ある特定の非限定的な例示的担体には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せが含まれる。
【０４４１】
より詳細には、いくつかの実施形態において、本発明の治療組成物は無添加で又は最小量の追加成分と共に投与されてもよいことが理解される。逆に、本発明のＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートは、当該技術分野において周知の賦形剤及び助剤であって、抗体薬物コンジュゲートの投与を促進する又は作用部位への送達に薬学的に最適化された調製物となるよう活性化合物の加工を補助する比較的不活性な物質である賦形剤及び助剤を含む好適な薬学的に許容可能な担体を含有するよう、任意選択的に製剤化されてもよい。例えば、賦形剤は形態若しくは稠度を付与することができ、又は希釈剤として作用し、抗体薬物コンジュゲートの薬物動態又は安定性を改善することができる。好適な賦形剤又は添加剤には、以下に限定されないが、安定化剤、湿潤剤及び乳化剤、オスモル濃度を変化させる塩、封入剤、緩衝剤及び皮膚浸透促進剤が含まれる。特定の好ましい実施形態において、本医薬組成物は凍結乾燥形態で提供されて、投与前に、例えば緩衝食塩水中に再構成されてもよい。
【０４４２】
全身投与のための開示された抗体薬物コンジュゲートは、経腸的、非経口的又は局所的投与のために製剤化され得る。実際、３種類の製剤全てが、活性成分の全身投与を達成するために同時に使用され得る。非経口的及び経口的薬物送達のための賦形剤及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に示されている。非経口投与向けの好適な製剤は、水溶性形態にある、例えば、水溶性塩の活性化合物の水溶液を含む。さらに、油性注射用懸濁液向けに適切なものとして、活性化合物の懸濁液剤が投与されてもよい。好適な親油性溶媒又はビヒクルには、脂肪油、例えば、ヘキシル置換ポリ（ラクチド）、ゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチル又はトリグリセリドが含まれる。水性注射懸濁液剤は、懸濁液剤の粘度を向上させる物質を含んでもよく、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール及び／又はデキストランを含む。任意選択的に、懸濁液剤はまた、安定化剤を含有していてもよい。細胞に送達するために、リポソームを使用して、薬剤を封入することもできる。
【０４４３】
経腸投与のために適切な製剤は、硬ゼラチン又は軟ゼラチンカプセル剤、丸剤、錠剤、例えば、被覆錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ又は吸入剤及びこれらの制御放出形態を含む。
【０４４４】
一般に、ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートを含む本発明の化合物及び組成物は、インビボで、それを必要とする対象に、様々な経路、例えば、これらに限定されないが、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口的、鼻腔内、筋肉内、頭蓋内、心臓内、脳室内、気管内、バッカル、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮及びくも膜下内、又はそれ以外に移植若しくは吸入により投与され得る。本組成物は、固体、半固体、液体又は気体形態の調製物に製剤化することができ、例えば、これらに限定されないが、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、浣腸剤、注射剤、吸入剤及びエアロゾルが挙げられる。適切な製剤及び投与経路は、意図する適用及び治療レジメンにより選択され得る。
【０４４５】
Ｂ．投与量
同様に、特定の投与レジメン、すなわち、用量、タイミング及び反復は、特定の個体及び該個体の病歴、並びに薬物動態（例えば、半減期、クリアランス速度など）のような実験的検討事項に依存する。投与頻度は、治療過程にわたり決定されて、調節されてもよく、増殖性細胞又は腫瘍形成性細胞の数の低下、このような新生物細胞の低下の維持、新生物細胞の増殖の低減又は転移の発生の遅延に基づく。他の実施形態において、投与量を調節又は低下させて、潜在的な副作用及び／又は毒性を管理することができる。代替的に、対象とする治療組成物の持続的な連続放出製剤が適切なことがある。
【０４４６】
一般に、抗体薬物コンジュゲートは、様々な範囲で投与されてもよい。これらの範囲としては、用量あたり約１０μｇ／ｋｇ体重から約１００ｍｇ／ｋｇ体重、用量あたり約５０μｇ／ｋｇ体重から約５ｍｇ／ｋｇ体重、用量あたり約１００μｇ／ｋｇ体重から約１０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。他の範囲としては、用量あたり約１００μｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重及び用量あたり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重から約２０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。特定の実施形態において、投与量は、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０４４７】
選択された実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、用量あたりおよそ１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００μｇ／ｋｇ体重で投与される。他の実施形態は、用量あたり２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００又は９００μｇ／ｋｇ体重での抗体薬物コンジュゲートの投与を含む。他の好ましい実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ｍｇ／ｋｇで投与される。さらに他の実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、用量あたり１２、１４、１６、１８又は２０ｍｇ／ｋｇ体重で投与され得る。さらに他の実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、用量あたり２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０又は１００ｍｇ／ｋｇ体重で投与され得る。本明細書の教示によれば、当業者は、前臨床動物研究、臨床観察並びに標準的な医学及び生化学的技術及び測定に基づいて、様々な抗体薬物コンジュゲートのための適切な投与量を容易に決定することができる。特に好ましい実施形態において、このような抗体薬物コンジュゲートの投与量は、ある期間にわたり、静脈内投与される。さらに、このような投与量は、治療の定められた過程にわたり、複数回、投与されてもよい。
【０４４８】
他の投与レジメンは、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，７４４，８７７に開示されているような体表面積（ＢＳＡ）計算に基づき、予測され得る。周知のように、ＢＳＡは、患者の身長及び体重を使用して計算され、彼又は彼女の身体の表面積によって表される対象の大きさの尺度を提供する。ある特定の実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、１０ｍｇ／ｍ２から８００ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２から５００ｍｇ／ｍ２の投与量及び１００ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２又は４５０ｍｇ／ｍ２の投与量で投与され得る。当該技術分野で認識されておりかつ経験的な技術が、適切な投与量を決定するために使用され得ることも理解される。
【０４４９】
いずれにせよ、ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートは、それを必要とする対象に、必要に応じて好ましくは投与される。投与の頻度の決定は、担当医のような当業者によって、治療される状態、治療される対象の年齢、治療される状態の重症度、治療される対象の全体的健康状態などの検討事項に基づいて行われ得る。一般に、ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートの有効量は、対象に１回以上投与される。より詳細には、抗体薬物コンジュゲートの有効量は、対象に、１カ月に１回、１カ月に１回を超えて又は１カ月に１回未満投与される。ある特定の実施形態において、ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートの有効量は、複数回、例えば少なくとも１カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１年、少なくとも２年又は数年間投与され得る。さらに他の実施形態において、数日（２、３、４、５、６若しくは７日）、数週間（１、２、３、４、５、６、７若しくは８週間）又は数カ月間（１、２、３、４、５、６、７若しくは８カ月間）またさらには１若しくは数年間が、抗体薬物コンジュゲートの投与の間に経過し得る。
【０４５０】
ある特定の好ましい実施形態において、抗体薬物コンジュゲートを含む治療の過程は、数週間又は数カ月の期間にわたり、選択された薬物製品を複数回投与することを含む。より詳細には、抗体薬物コンジュゲートは、１日毎に１回、２日毎に１回、４日毎に１回、１週間毎に１回、１０日毎に１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、１カ月毎に１回、６週間毎に１回、２カ月毎に１回、１０週間毎に１回又は３カ月毎に１回投与され得る。これに関して、患者の応答及び診療に基づき、投与量を変化させてもよく、投与間隔を調整してもよいことが理解される。
【０４５１】
投与量及びレジメンも、本開示の組成物を個体に１回以上投与して実験的に決定され得る。例えば、個体に、本明細書に記載されるように製造された治療組成物を漸増する投与量で与えてもよい。選択された実施形態において、投与量は、実験的に決定されたか又は観察された副作用又は毒性にそれぞれ基づいて、徐々に増加又は減少又は減弱化されてもよい。選択された組成物の有効性を評価するために、特定の疾患、障害又は状態のマーカーを前述のように伴ってもよい。個体ががんを有する実施形態において、これらには、触診又は視覚的観察を介した腫瘍サイズの直接的測定、Ｘ線又は他の画像化技術による腫瘍サイズの間接的測定、直接的な腫瘍生検によって評価される改善及び腫瘍試料の顕微鏡検査；間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺がんに対するＰＳＡ）又は本明細書に記載の方法により特定された抗原の測定、疼痛又は麻痺の減少、会話、視力、呼吸若しくは他の腫瘍に関連する障害の改善、食欲の増進、又は容認された試験若しくは生存の延長によって測定される生活の質の向上が挙げられる。当業者は、投与量が、個体、新生物状態の種類、新生物状態の病期、新生物状態の個体の他の位置への転移並びに過去及び現在に使用している治療に依存して変わることを認識する。
【０４５２】
Ｃ．  併用療法
本明細書に記載されている通り、腺癌腫瘍は、多くの場合、異種性であり、標的抗がん治療法に抵抗性がある、希な神経内分泌細胞を含むことがある。したがって、有効な治療戦略は、抗がん剤との併用療法として、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートを投与することを含む。一実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートは、標的抗がん治療（例えば、標的化抗がん剤）による併用療法として投与される。一態様において、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートは、標的抗がん治療と同時に投与され得る。他の態様において、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートの投与は、腫瘍が標的抗がん治療に抵抗性になった後に行われる。さらに他の態様において、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートの投与は、標的抗がん治療の投与の前に行われる。
【０４５３】
併用療法は、望まない新生物細胞増殖を減少させるか若しくは抑制するため、がんの発生を減少させるため、がんの再発を低減させるか若しくは予防するため、又はがんの広がり若しくは転移を低減させるか若しくは予防するために、とりわけ有用であり得る。このような場合、抗体薬物コンジュゲートは、これがなければ出現して腫瘍塊を存続させると思われるがん細胞を除去することにより、感作剤又は化学感作剤として機能することができ、これにより、現在の標準治療である腫瘍減量剤又は抗がん剤のより有効な使用を可能にする。すなわち、抗体薬物コンジュゲートは、ある特定の実施形態において、別の投与された治療剤の作用機序を増強させる効果の増強（例えば、事実上相加又は相乗的）をもたらし得る。本発明の文脈において、「併用療法」は、広く解釈されるものとし、抗体薬物コンジュゲート、並びに細胞毒性剤、細胞分裂停止剤、抗血管新生剤、腫瘍減量剤、化学療法剤、放射線療法及び放射線治療剤、標的抗がん治療又は治療剤（モノクローナル抗体及び小分子体の両方を含む）、ＢＲＭ、治療抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線治療及び抗転移剤、並びに特異的及び非特異的アプローチを含む免疫療法剤を含むが、これらに限定されない、１つ以上の抗がん剤の投与を単に指す。
【０４５４】
併用の結果は、各治療（例えば、抗体薬物コンジュゲート及び抗がん剤）が別個に行われる場合に認められる効果の相加的なものであることを要件としない。少なくとも相加効果が一般的に望ましいが、単独療法の１つを上回る抗腫瘍効果の増大は有益である。さらに、本発明は、相乗効果を示すことを併用治療に要求しない。しかし、当業者は、好ましい実施形態を含む特定の選択された組合せにより、相乗効果が認められる可能性があることを理解する。
【０４５５】
併用療法の実施において、抗体薬物コンジュゲート及び抗がん剤（例えば、標的抗がん治療）は、単一の組成物又は同じ若しくは異なる投与経路を使用する２つ以上の別個の組成物において、対象に同時に投与することができる。代替的に、抗体薬物コンジュゲートは、例えば、数分から数週間の間隔で、抗がん剤治療に先行又は追随してもよい。各送達の間の期間は、抗がん剤及び抗体薬物コンジュゲートが、腫瘍に対して併用効果を発揮することが可能な期間である。少なくとも一実施形態において、抗がん剤と抗体薬物コンジュゲートとの両方が、互いに約５分から約２週間以内に投与される。さらに他の実施形態において、数日（２、３、４、５、６又は７）、数週間（１、２、３、４、５、６、７又は８）又は数カ月間（１、２、３、４、５、６、７又は８）が、抗体薬物コンジュゲートの投与と抗がん剤の投与との間に経過してもよい。
【０４５６】
併用療法は、１回、２回又は少なくとも状態が治療される、緩和され又は治癒されるまでのある期間にわたり投与され得る。いくつかの実施形態において、併用療法は、複数回、例えば１日３回から６カ月に１回投与される。投与は、１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、毎週１回、２週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、６カ月に１回のようなスケジュールであってもよく、又はミニポンプによって連続投与されてもよい。併用療法は、上で明記した通り、任意の経路で投与されてよい。併用療法は、腫瘍部位から離れた部位に投与されてもよい。
【０４５７】
一実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、それを必要とする対象に短い治療サイクル間、１つ以上の抗がん剤（例えば、標的抗がん治療）と結合して投与される。本発明には、不連続投与又は数回の部分投与に分割された１日用量も包含される。抗体薬物コンジュゲート及び抗がん剤は、交互に、隔日又は隔週で投与されてもよく又は一連の抗体薬物コンジュゲート治療を行った後に１つ以上の抗がん剤治療による治療を行ってもよい。いずれにしても、当業者であれば理解するように、化学療法剤の適切な用量は、一般に、化学療法剤が単独で又は他の化学療法剤との併用で投与される臨床治療において既に採用されている用量程度である。
【０４５８】
別の好ましい実施形態において、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートは、疾患の初期症状後の腫瘍再発の確率を減少又は無くすための維持療法に使用されてもよい。好ましくは、障害は、治療されたことがあり、最初の腫瘍塊は除去、減少又は他の方法で緩和されており、患者は無症状である又は寛解状態にある。このような場合、標準的診断手法を使用して疾患の徴候がほとんど又は全くない場合でも、対象は、薬学的に有効な量の本開示の抗体薬物コンジュゲートが１回以上投与されてもよい。いくつかの実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、毎週、２週間毎、毎月、６週間毎、２カ月毎、３カ月毎、６カ月毎又は１年毎のようなある期間にわたり、定期的なスケジュールで投与される。本明細書における教示を考慮すると、当業者であれば、疾患再発の可能性を低減するため、都合のよい投与量及び投与レジメンを容易に決定することができる。さらに、このような治療は、患者の応答、並びに臨床的パラメータ及び診断パラメータに応じて、数週間、数カ月、数年の期間、又は期限を設けることさえなく、継続され得る。
【０４５９】
別のさらに好ましい実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、予防的に又は腫瘍減量手法後の腫瘍転移の可能性を予防又は減少させるためのアジュバント療法として使用され得る。本開示で使用する場合、「腫瘍減量手法」は、幅広く定義され、腫瘍又は腫瘍増殖をなくす、低減する、治療する又は改善する、任意の手法、技術又は方法を意味するものとする。例示的腫瘍減量手法としては、限定されないが、外科手術、放射線治療（つまり、ビーム照射）、化学療法、免疫療法又はアブレーションが挙げられる。本開示に鑑みて当業者により容易に決定される適切な時間に、本開示の抗体薬物コンジュゲートは、臨床的、診断的又は治療診断的手法により示唆されるように腫瘍転移を低減させるために投与されてもよい。抗体薬物コンジュゲートは、標準技術を使用して決定される、医薬品として有効な投与量で、１回以上、投与され得る。好ましくは、投与レジメンは、修飾が可能な、適切な診断技術又は監視技術を伴う。
【０４６０】
Ｄ．抗がん剤
抗体薬物コンジュゲートは、抗がん剤と組み合わせて使用されてもよい。用語「抗がん剤」又は「抗増殖剤」は、がんのような細胞増殖性障害を治療するために使用することができる任意の薬剤を意味し、これらに限定されないが、細胞毒性剤、細胞分裂停止剤、抗血管新生剤、腫瘍減量剤、化学療法剤、放射線治療及び放射線治療剤、標的化抗がん剤、ＢＲＭ、治療抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法及び抗転移剤及び免疫療法剤を含む。
【０４６１】
本明細書において使用する場合、用語「細胞毒性剤」は、細胞に対して毒性である物質、細胞の機能を低下若しくは阻害する物質、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。通常、物質は、生きる生物に由来した天然分子である。細胞毒性剤の例としては、これらに限定されないが、小分子毒素又は酵素的に活性な細菌毒素（例えば、ジフテリア（Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）毒素、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌体内毒素及び菌体外毒素、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシンＡ）、菌類（例えば、αサルシン、レストリクトシン）、植物（例えば、アブリン、リシン、モルデクシン、ビスクミン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｉｄｉｎ）、トリコサンチン、オオムギ毒素、アレウリテス・フォルジ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジランチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラッカ・メリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・カランティア（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィキナリス（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン及びトリコテセン）又は動物（例えば、細胞傷害性ＲＮアーゼ、例えば、細胞外膵ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼＩ、これらの断片及び／又はバリアントを含む）が挙げられる。
【０４６２】
本発明の目的に関すると、「化学治療剤」は、がん細胞の成長、増殖及び／又は生存を非特異的に低下させる又は阻害する化学化合物を含む（例えば、細胞毒性剤又は細胞分裂停止剤）。このような化学剤は、細胞の成長又は分裂に必要な細胞内プロセスをしばしば対象とし、したがって、一般的に急速に成長し、分裂する、がん性細胞に対して特に有効である。例えば、ビンクリスチンは、微小管を解重合し、こうして、細胞が有糸分裂に入ることを阻害する。一般に、化学治療剤は、がん性細胞、又はがん性になる可能性がある若しくは腫瘍形成性後代（例えば、ＴＩＣ）を発生する可能性がある細胞を阻害する又は阻害するように設計されている化学剤を含み得る。このような薬剤が投与されることが多く、組み合わせて、例えば、ＣＨＯＰ又はＦＯＬＦＩＲＩのようなレジメンにおいて最も有効となることが多い。
【０４６３】
抗体薬物コンジュゲートと組み合わせて使用され得る抗がん剤の例には、以下に限定されないが、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アジリジン、エチレンイミン及びメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ−１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エリュテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチイン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジイン抗生物質、ダイネミシン、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝産物、エルロチニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ，セリチニブ、ソラフェニブ、イブルチニブ、エンザルタミド、葉酸類似体、プリン類似体、アンドロゲン、抗副腎薬、フロリニン酸のような葉酸補充剤、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビスアントレン、エダトラキセート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジコン、エルフォルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダイニン、メイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２−エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）多糖類複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（とりわけ、Ｔ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類似体、ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバン��ロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；細胞増殖を低減するＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲ及びＶＥＧＦ−Ａの阻害剤、並びに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体が含まれる。腫瘍に対するホルモンの作用を調節する又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン剤及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター、副腎におけるエストロゲンの生成を調節する酵素であるアロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤並びに抗アンドロゲン剤並びにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦ発現阻害剤及びＨＥＲ２発現阻害剤などのリボザイム、ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ−２、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤、ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ、ビノレルビン及びエスペラミシン並びに上記のうちのいずれかの薬学的に許容される塩、酸又は誘導体なども本定義に含まれる。
【０４６４】
特に好ましい抗がん剤は、商業的又は臨床的に利用可能な化合物、例えば、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍ．）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、５−ＦＵ（フルオロウラシル、５−フルオロウラシル、ＣＡＳ番号５１−２１−８）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）、Ｌｉｌｌｙ）、ＰＤ−０３２５９０１（ＣＡＳ番号３９１２１０−１０−９、Ｐｆｉｚｅｒ）、シスプラチン（ｃｉｓ−ジアミン、ジクロロ白金（ＩＩ）、ＣＡＳ番号１５６６３−２７−１）、カルボプラチン（ＣＡＳ番号４１５７５−９４−４）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、テモゾロミド（４−メチル−５−オキソ−２，３，４，６，８−ペンタアザビシクロ［４．３．０］ノナ−２，７，９−トリエン−９−カルボキサミド、ＣＡＳ番号８５６２２−９３−１、ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）、ＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、タモキシフェン（（Ｚ）−２−［４−（１，２−ジフェニルブタ−１−エニル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタンアミン、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、ＩＳＴＵＢＡＬ（登録商標）、ＶＡＬＯＤＥＸ（登録商標））及びドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標））を含む。さらなる商業的又は臨床的に利用可能な抗がん剤は、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）、スーテント（ＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（登録商標）、ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−５１８（Ｍｅｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ、ＷＯ２００７／０４４５１５）、ＡＲＲＹ−８８６（Ｍｅｋ阻害剤、ＡＺＤ６２４４、Ａｒｒａｙ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ、Ａｓｔｒａ  Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＦ−１１２６（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｓｅｍａｆｏｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＢＥＺ−２３５（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＸＬ−１４７（ＰＩ３Ｋ阻害剤、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、リューコボリン（フォリン酸）、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標）、ＧＳＫ５７２０１６、Ｇｌａｘｏ  Ｓｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ）、ロナファーニブ（ＳＡＲＡＳＡＲ（商標）、ＳＣＨ  ６６３３６、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（登録商標）、ＢＡＹ４３−９００６、Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標）、ＣＰＴ−１１、Ｐｆｉｚｅｒ）、ティピファニブ（ＺＡＲＮＥ��ＴＲＡ（商標）、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ−ｆｒｅｅ）、パクリタキセルのアルブミン改変ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌ）、バンデタニブ（ｒＩＮＮ、ＺＤ６４７４、ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、クロラムブシル、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ  ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、パゾパニブ（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、カンフォスファミド（ＴＥＬＣＹＴＡ（登録商標）、Ｔｅｌｉｋ）、チオテパ及びシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標））、ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）、タモキシフェン（例えば、ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）、クエン酸タモキシフェン、ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標）（クエン酸トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｉｎｅ））、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）（酢酸メゲストロール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、フォルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）（ボロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）（レトロゾール；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）（アナストロゾール；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）を含む。
【０４６５】
他の実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、現在臨床試験にある又は市販のいくつかの抗体（又は免疫療法剤）のいずれか１つと組み合わせて使用し得る。この目的のため、抗体薬物コンジュゲートは、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ、カンツズマブ、カツマキソマブ、セツキシマブ、シタツズマブ、シクスツムマブ、クリバツズマブ、コナツムマブ、ダラツズマブ、ドロジツマブ、デュリゴツマブ、ドゥシギツマブ、デツモマブ、ダセツズマブ、ダロツズマブ、エクロメキシマブ、エロツズマブ、エンシツキシマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファルレツズマブ、フィクラツズマブ、フィギツムマブ、フランボツマブ、フツキシマブ、ガニツマブ、ゲムツズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ、イブリツモマブ、イゴボマブ、イムガツズマブ、インダツキシマブ、イノツズマブ、インテツムマブ、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ、ルカツムマブ、マパツムマブ、マツズマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モキセツモマブ、ナルナツマブ、ナプツモマブ、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブ（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂｎ）、オカラツズマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブ、オレゴボマブ、パニツムマブ、パルサツズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ、シブロツヅマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、ソリトマブ、タカツズマブ、タプリツモマブ、テナツモバブ、テプロツムマブ、チガツズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、ツコツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ、ボルセツズマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、ＣＣ４９、３Ｆ８、及びこれらの組合せからなる群から選択される抗体と組み合わせて使用され得る。
【０４６６】
さらに他の特に好ましい実施形態は、以下に限定されないが、リツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン（ｏｚｏｇａｍｃｉｎ）、アレムツズマブ、イブリツモマブチウキセタン、トシツモマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、イピリムマブ及びブレンツキシマブベドチンを含めた、がん治療法に承認を受けた抗体の使用を含む。当業者は、本明細書の教示に適合するさらなる抗がん剤を容易に特定することができる。
【０４６７】
Ｅ．放射線療法
本発明は、抗体薬物コンジュゲートと、放射線療法（つまり、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘導する任意の機構、例えば、ガンマ線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出など）との組合せも提供する。腫瘍細胞への放射性同位体の方向付けられた送達を使用する併用療法も検討され、標的抗がん剤又は他の標的化手段と結び付けて使用することができる。典型的には、放射線療法は、約１〜約２週間の期間にわたりパルスで投与される。放射線療法は、頭頚部がんを有する対象に約６〜７週間投与されてもよい。任意選択的に、放射線療法は、単回用量として又は複数回の連続用量として投与されてもよい。
【０４６８】
ＩＸ．適応症
抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートは、任意のＤＬＬ３＋がん、及びＤＬＬ３＋になるリスクのあるがん、例えば本明細書に記載されている神経内分泌移行のリスクにあるＤＬＬ３（−／ｌｏｗ）腫瘍の発生又は再発を治療する、予防する、管理する又は阻害するために使用され得る。
【０４６９】
したがって、単独で投与されるにしろ、又は抗がん剤若しくは放射線療法と組み合わせて投与されるにしろ、抗体薬物コンジュゲートは、一般に、良性又は悪性腫瘍（例えば、副腎癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、胃癌、卵巣癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、肺癌、甲状腺癌、肝臓癌、子宮頚癌、子宮内膜癌、食道癌及び子宮癌；肉腫；神経膠芽腫；及び様々な頭頚部腫瘍）；白血病及びリンパ性悪性疾患；ニューロン、グリア、アストロサイト、視床下部及び他の腺、マクロファージ、上皮、間質及び胞胚腔障害のような他の障害；及び炎症性障害、血管新生障害、免疫障害及び病原体により引き起こされる障害を含み得る、患者又は対象における新生物状態の治療に特に有用である。特に、治療の重要な標的は、固形腫瘍を含む新生物状態であるが、血液悪性疾患が、本発明の範囲内にある。好ましくは、治療される「対象」又は「患者」はヒトであるが、本明細書で使用する場合、これらの用語は、あらゆる哺乳動物種を含むことが明示的に保持されている。
【０４７０】
より詳細には、本発明に従った新生物状態の治療対象は、限定されないが、以下の群から選択され得る；副腎腫瘍、ＡＩＤＳ−関連がん、胞巣状軟部肉腫、星細胞系腫瘍、膀胱がん（扁平上皮がん及び移行上皮がん）、骨がん（アダマンチノーマ、動脈瘤様骨のう腫（ａｎｅｕｒｉｓｍａｌ  ｂｏｎｅ  ｃｙｓｔ）、骨軟骨腫、骨肉腫）、脳及び脊髄がん、転移性脳腫瘍、乳がん、頸動脈球腫瘍、子宮頚部がん、軟骨肉腫、脊索腫、嫌色素性腎細胞癌、腎明細胞癌、結腸がん、結腸直腸がん、深在性良性線維性組織球腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、上衣腫、ユーイング腫瘍、骨格性粘液様軟骨肉腫、骨性線維形成不全症（ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔａ  ｏｓｓｉｕｍ）、線維性骨異形成症、胆嚢及び胆管がん、妊娠性絨毛性疾患、胚細胞腫瘍、頭頚部がん、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん（腎芽腫、乳頭状腎細胞がん）、白血病、脂肪腫／良性脂肪腫様腫瘍、脂肪肉腫／悪性脂肪腫様腫瘍、肝臓がん（肝芽腫、肝細胞がん）、リンパ腫、肺がん（小細胞がん、腺がん、扁平上皮がん、大細胞がんなど）、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、多発性内分泌腺腫瘍症、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、神経芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、卵巣がん、膵臓がん、甲状腺乳頭がん、副甲状腺腫瘍、小児科がん、末梢神経鞘腫瘍、褐色細胞腫、下垂体膿瘍腫瘍、前立腺がん、後ブドウ膜黒色腫、希少血液障害（ｒａｒｅ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、腎性転移性がん、ラブドイド腫瘍、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、滑膜肉腫、精巣がん、胸腺癌、胸腺腫、甲状腺転移性がん及び子宮がん（子宮頸部癌、子宮内膜癌及び平滑筋腫）。
【０４７１】
ある特定の好ましい実施形態において、増殖性障害は、以下に限定されないが、副腎、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、子宮頚部、子宮、食道、結腸直腸、前立腺、膵臓、肺（小細胞及び非小細胞の両方）、甲状腺、癌、肉腫、神経膠芽腫及び様々な頭頚部の腫瘍を含めた、固形腫瘍を含む。他の好ましい実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（例えば、扁平上皮細胞非小細胞肺がん又は扁平上皮細胞小細胞肺がん）を治療するのにとりわけ有効である。一実施形態において、肺がんは、白金をベースとする薬剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン、トポテカン）及び／又はタキサン（例えば、ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル又はカバジタキセル）に対して、不応性、再燃性又は抵抗性がある。小細胞肺がんに関すると、特に好ましい実施形態は、抗体薬物コンジュゲートの投与を含む。選択された実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、局限期疾患を示す患者に投与される。他の実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、進行期疾患を示す患者に投与される。他の好ましい実施形態において、抗体薬物コンジュゲートは、不応性患者（すなわち、初期治療の過程中又はこの完了の直後に再燃した患者）に投与される。さらに他の実施形態は、感受性のある患者（すなわち、再燃が一次治療の後の２〜３カ月より長い患者）への抗体薬物コンジュゲートの投与を含む。
【０４７２】
上で議論した通り、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートは、神経内分泌腫瘍を含む、神経内分泌特徴又は表現型を有する腫瘍を予防する、治療する又は診断するために使用することができる。抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートはまた、本明細書において開示されているリスク因子により特定可能な、神経内分泌表現型に移行するリスクのある腫瘍を治療するために使用することもできる。したがって、抗ＤＬＬ３抗体薬物コンジュゲートは、バイオマーカー発現の変化により、及び／又は標的治療を以前に受けたことにより、神経内分泌移行のリスクにあると特徴づけられる、上記のがんタイプの任意の腫瘍を治療するために使用することができる。本発明の特定の態様において、神経内分泌移行のリスクのある腫瘍は、肺、前立腺、膀胱、腎臓、泌尿生殖路（膀胱、前立腺、卵巣、子宮頚部及び子宮内膜を含む）；結腸及び胃を含めた胃腸管、甲状腺髄様がんを含めた甲状腺、及び小細胞肺癌を含めた肺に発生する腺癌、並びに大細胞神経内分泌癌を含む。
【０４７３】
Ｘ．製品
本発明は、１つ以上の容器又はレセプタクルを含む医薬パック又はキットを含み、ここで、容器は、１用量以上の本発明の抗体又はＡＤＣを含み得る。このようなキット又はパックは、本質的に診断用又は治療用である。特定の実施形態において、パック又はキットは、１つ以上の追加の薬剤及び任意選択的に１つ以上の抗がん剤を含む又は含まない、例えば、本発明の抗体又はＡＤＣを含む組成物の所定の量を意味する、単位用量を含む。特定の他の実施形態において、パック又はキットは、がん性細胞の検出、定量化及び／又は視覚化のための結合レポーター分子及び任意選択的に１つ以上の追加の薬剤を含むか又は含まない、検出可能な量の抗ＤＬＬ３抗体、抗ＡＳＣＬ１抗体、又は抗ＤＬＬ３  ＡＤＣを含む。さらに他の実施形態において、本発明に適合するキットは、Ａｃｈａｅｔｅ−ｓｃｕｔｅホモログ１（ＡＳＣＬ１）、父親性発現１０（ＰＥＧ１０）又はセリン／アルギニン反復マトリックス４（ＳＲＲＭ４）、網膜芽細胞腫１（ＲＢ１）、リプレッサー要素１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、ＳＡＭポインテッドドメイン含有Ｅｔｓ転写因子（ＳＰＤＥＦ）、プロスタグランジンＥ２受容体４（ＰＴＧＥＲ４）及びＥＴＳ関連遺伝子（ＥＲＧ）からなる群から選択される、マーカーを検出するために有用な１種以上の薬剤を含むことができる。
【０４７４】
いずれにしても本発明のキットは、一般的に、薬学的に許容される製剤を含む適切な容器又はレセプタクル内に、本発明の抗体又はＡＤＣを含み、任意選択的に、同じ又は異なる容器に１つ以上の抗がん剤を含む。キットは、診断又は併用療法用のいずれかのために、他の薬学的に許容される製剤又は装置を含んでもよい。診断装置又は機器の例としては、細胞又は増殖性障害に伴うマーカーの検出、監視、定量化又はプロファイルに使用し得るものを含む（このようなマーカーの完全な列挙について、上記参照）。いくつかの実施形態において、装置は、インビボ又はインビトロのいずれかで、循環する腫瘍細胞を検出、監視、及び／又は定量化するために使用することができる（例えば、ＷＯ２０１２／０１２８８０１を参照）。さらに他の実施形態において、循環する腫瘍細胞は、腫瘍形成性細胞を含んでもよい。本発明で検討されるキットは、本発明の抗体又はＡＤＣを抗がん剤又は診断剤と組み合わせるための適切な試薬を含んでもよい（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．７，４２２，７３９参照）。
【０４７５】
キットの成分が１つ以上の液体溶液で提供される場合、液体溶液は非水性であり得るが、典型的には水溶液が好ましく、滅菌水溶液が特に好ましい。キット内の製剤は、乾燥粉末として、又は適切な液体の添加により再構成され得る凍結乾燥形態で提供されてもよい。再構成に使用される液体は、別個の容器に含有され得る。このような液体は、滅菌の薬学的に許容されるバッファー又は他の希釈剤、例えば、注射用静菌水、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液又はデキストロース溶液を含み得る。キットが、本発明の抗体又はＡＤＣをさらなる治療薬又は薬剤との組合せで含む場合、溶液はモル当量の組合せで、又は一方の成分を他方より過剰にして予め混合されていてもよい。代替的に、本発明の抗体又はＡＤＣ及びいずれかの任意選択の抗がん剤又は他の薬剤は、患者への投与前は別個の容器内で別個に維持されていてもよい。
【０４７６】
キットは、１個若しくは複数の容器又はレセプタクル、及び封入された組成物が、選択される疾患状態を診断又は治療するために使用されることを表示する、容器内、容器表面若しくは容器に添付されたラベル又は添付文書を含むことができる。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、注入バッグ（ＩＶバッグ）などが含まれる。容器は、様々な材料、例えば、ガラス又は薬学的に適合するプラスチックなどで形成することができる。特定の実施形態において、容器は、滅菌アクセスポートを含んでもよく、例えば、容器は、皮下注射針によって穴を開けることができるストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい。
【０４７７】
いくつかの実施形態において、キットは、抗体及びいずれかの任意選択の成分を患者に投与するための手段、例えば、製剤を対象に注射若しくは導入する又は身体の疾患領域に適用することができる、１つ以上の針又はシリンジ（充填済又は空）、点眼器、ピペット又は他の同様の装置を含んでもよい。本発明のキットは、典型的に、バイアル又はそれと同様のもの、及び市販のために厳重に密封された状態の他の要素、例えば、所望のバイアル及び他の装置を配置及び保持できる中空プラスチック容器を含有するための手段も含む。
【０４７８】
ＸＩ．その他
本明細書において別段に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学的用語及び技術的用語は、当業者に一般に理解される意味を有する。さらに、文脈によって別途要求されない限り、単数形は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含む。さらに、本明細書及び添付の特許請求の範囲において提供される範囲は、両方の終点及び終点の間の全ての点を含む。したがって、２．０から３．０の範囲は、２．０、３．０及び２．０と３．０との間の全ての点を含む。
【０４７９】
一般的に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学及び化学に関する技術は、当該技術分野において周知であり、一般に使用されているものである。本明細書で使用される命名法は、このような技術に関連して、当該技術分野でも一般に使用されている。他に指示されていない限り、本発明の方法及び技術は、一般的に、当該技術分野で周知の及び本明細書を通じて引用されている様々な参照文献に記載された通常の方法に従って実施される。
【０４８０】
ＸＩＩ．参照文献
本明細書で引用されている全ての特許、特許出願及び出版物並びに電子工学的に利用可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列提出物、並びに例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列提出物並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける注釈の付されたコード領域からの翻訳物を含む）の完全な開示は、「参照により組み込まれる」という文言が特定の参照文献に関連して使用されているか否かにかかわらず、参照により組み込まれる。前述の詳細な説明及び以下の実施例は、理解を明確にするためにのみ提供される。それによって不必要に限定されないことが理解されるものとする。本発明は、示され、記載されている正確な詳細に限定されない。当業者にとって明らかな変形は、特許請求の範囲によって定義された本発明に含まれる。本明細書で使用されるあらゆる標題は組織化を目的とするものにすぎず、記載される方法の主題を限定するものとして解釈されるべきでない。
【０４８１】
ＸＩＩＩ．配列
本出願には、いくつかの核酸配列及びアミノ酸配列を含む図及び配列表が添付されている。以下の表３は、含まれる配列の概要を提示している。
【０４８２】
【表３】
2019516705.tif 000031
2019516705.tif 000032
【０４８３】
下記の実施例２に議論されている通り、上記の表３はさらに、図１Ａ及び図１Ｂにおいて記述した例示的なＫａｂａｔ  ＣＤＲに関する配列番号を指定するために使用され得る。より詳細に、図１Ａ及び図１Ｂは、重鎖可変領域配列（ＣＤＲＨ）及び軽鎖可変領域配列（ＣＤＲＬ）の各々の３つのＫａｂａｔ  ＣＤＲを示し、上記の表３は、軽鎖のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３の各々並びに重鎖のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３の各々に適用され得る配列番号指定の割り当てを提示している。この方法論を使用して、図１Ａ及び図１Ｂに示される各々の固有のＣＤＲ（並びに、図３Ａ及び３Ｂも同様に）は、一連の配列番号に割り当てられ得、本発明の誘導した抗体を提供するために使用され得る。
【０４８４】
ＸＩＶ．腫瘍リスト
ＰＤＸ腫瘍細胞のタイプは、特定の腫瘍細胞株を表す略称とそれに続く番号で示されている。試験した試料の継代数は、試料の命名に付属したｐ０〜ｐ＃で表され、ここでｐ０は患者腫瘍から直接取得された非継代の試料を示し、ｐ＃は試験前のマウスから腫瘍が継代された回数を示す。本明細書で使用される場合、腫瘍のタイプ及びサブタイプの略称が以下の通り表４に示される：
【０４８５】
【表４】
2019516705.tif 000033
2019516705.tif 000034
2019516705.tif 000035
【実施例】
【０４８６】
上記で全体的に説明した本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに容易に理解される。以下の実施例は、例証として提供され、本発明を限定することを意図していない。実施例は、以下の実験が、実施される全て又は唯一の実験であることを表すことを意図していない。別途指示しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧又は大気圧近傍である。
【０４８７】
［実施例１］
マウス抗ＤＬＬ３抗体の生成
抗ＤＬＬ３マウス抗体は、以下の通り生成した。第１の免疫付与キャンペーンにおいて、３匹のマウス（次の株のそれぞれから１匹：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢ）に、等量のＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）又はアラムアジュバントにより乳化したヒトＤＬＬ３−ｆｃタンパク質（ｈＤＬＬ３−Ｆｃ）を接種した。ｈＤＬＬ３−Ｆｃ融合構築物は、Ａｄｉｐｏｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから購入した（カタログ番号ＡＧ−４０Ａ−０１１３）。初回免疫付与は、ＴｉｔｅｒＭａｘ中のマウス１匹あたり１０μｇのｈＤＬＬ３−Ｆｃのエマルションにより行った。次に、アラムアジュバント中のマウス１匹あたり５μｇのｈＤＬＬ３−Ｆｃにより２週間毎に、マウスを追加免疫した。融合前の最後の注射は、ＰＢＳ中のマウス１匹あたり５μｇのｈＤＬＬ３−Ｆｃにより行った。
【０４８８】
第２の免疫付与キャンペーンにおいて、６匹のマウス（次の株のそれぞれにつき２匹：Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１、ＦＶＢ）に、等量のＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）又はアラムアジュバントにより乳化したヒトＤＬＬ３−Ｈｉｓタンパク質（ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ）を接種した。組換えｈＤＬＬ３−Ｈｉｓタンパク質は、ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓを過剰発現するように操作されたＣＨＯ−Ｓ細胞の上清から精製した。初回免疫付与は、ＴｉｔｅｒＭａｘ中のマウス１匹につき１０μｇのｈＤＬＬ３−Ｈｉｓのエマルションにより行った。次に、アラムアジュバント中のマウス１匹につき５μｇのｈＤＬＬ３−Ｈｉｓにより２週間毎にマウスを追加免疫した。最終注射は、ｈＤＬＬ３を過剰発現するように操作された２×１０５個のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞により行った。
【０４８９】
固相ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ヒトＤＬＬ３に特異的なマウスＩｇＧ抗体に関してマウス血清をスクリーニングした。バックグラウンドを上回る陽性シグナルは、ＤＬＬ３に特異的な抗体を示した。手短に言うと、９６ウェルプレート（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カタログ番号６１０７４４）を、ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液中の０．５μｇ／ｍｌの組換えＤＬＬ３−Ｈｉｓで一晩コーティングした。０．０２％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳによる洗浄後に、ＰＢＳ中の３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを２００μＬ／ウェルにより、ウェルを１時間、室温（ＲＴ）にてブロッキングした。マウス血清を滴定（１：１００、１：２００、１：４００及び１：８００）し、５０μＬ／ウェルにて、ＤＬＬ３をコーティングしたプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、次いで、３％ＢＳＡ−ＰＢＳ又はＰＢＳ中の２％ＦＣＳに１：１０，０００に希釈した５０μＬ／ウェルのＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧと共に１時間、室温でインキュベートした。再度、これらのプレートを洗浄し、４０μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ３４０２８）を１５分間、室温で添加した。発色後に、等量の２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を添加して、基質発色を停止させ、分光光度計によってＯＤ４５０でプレートを解析した。
【０４９０】
血清陽性免疫付与マウスを屠殺し、流入リンパ節（膝窩、鼠径及び内側腸骨）を解離し、抗体産生細胞源として使用した。エレクトロセルフュージョンにより、モデルＢＴＸ  Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅシステム（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して、Ｂ細胞（ｈＤＬＬ３−Ｆｃ免疫付与マウスから約２２９×１０６個の細胞及びｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ免疫付与マウスから５１０×１０６個の細胞）の細胞懸濁液を、非分泌型Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と１：１の比で融合した。アザセリン、１５％胎性クローンＩ血清、１０％ＢＭ  Ｃｏｎｄｉｍｅｄ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ＩＵペニシリン−ストレプトマイシン及び５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを補足したＤＭＥＭ培地からなるハイブリドーマ選択培地に細胞を再懸濁し、４個のＴ２２５フラスコ内で、フラスコあたり１００ｍＬの選択培地に培養した。フラスコを、５％ＣＯ２及び９５％空気を含有する加湿３７℃インキュベータ内に６〜７日間、置いた。
【０４９１】
融合後６又は７日目に、ハイブリドーマライブラリ細胞をフラスコから採集し、２００μＬの補足済みハイブリドーマ選択培地（上述）においてウェルあたり１個の細胞となるよう（ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｉ細胞ソーターを使用）、６４のＦａｌｃｏｎ９６ウェルプレートに蒔き、ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ免疫付与キャンペーンの場合、４８の９６ウェルプレートに蒔いた。ライブラリの残りは、液体窒素中に貯蔵した。
【０４９２】
ハイブリドーマを１０日間、培養し、以下の通り、フローサイトメトリーを使用して、ｈＤＬＬ３に特異的な抗体について上清をスクリーニングした。ヒトＤＬＬ３、マウスＤＬＬ３（色素により予め染色）又はカニクイザルＤＬＬ３（Ｄｙｌｉｇｈｔ８００により予め染色）を過剰発現するように操作された、ウェルあたり１×１０５個のＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、２５μＬハイブリドーマ上清と共に３０分間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ／２％ＦＣＳにより洗浄し、次いで、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中、１：３００に希釈された、試料あたり２５μＬのＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９標識ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ断片特異的二次抗体と共にインキュベートした。１５分間のインキュベート後、細胞を、ＰＢＳ／２％ＦＣＳにより２回、洗浄し、ＤＡＰＩを含むＰＢＳ／２％ＦＣＳに再懸濁させ、アイソタイプ対照抗体により染色された細胞の蛍光を超える蛍光についてのフローサイトメトリーにより解析した。未使用ハイブリドーマライブラリ細胞の残りを、今後のライブラリ試験及びスクリーニングのために、液体窒素中で凍結した。
【０４９３】
ｈＤＬＬ３−Ｈｉｓ免疫付与キャンペーンは、約５０種のマウス抗ｈＤＬＬ３抗体を生じ、ｈＤＬＬ３−Ｆｃ免疫付与キャンペーンは、約９０種のマウス抗ｈＤＬＬ３抗体を生じた。
【０４９４】
［実施例２］
抗ＤＬＬ３抗体の配列決定
前述に基づいて、見かけ上高親和性で、固定化されたヒトＤＬＬ３又はｈ２９３−ｈＤＬＬ３細胞に結合するいくつかの例示的な別個のモノクローナル抗体を、配列決定及びさらなる解析のために選択した。実施例１において生成した、選択したモノクローナル抗体由来の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列解析により、多くが新規の相補性決定領域を有し、多くの場合、新規のＶＤＪ配置を表示したことが確認された。
【０４９５】
所望の抗体を発現する最初に選択されたハイブリドーマ細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に溶解して、抗体をコードするＲＮＡを調製した。１０４〜１０５個の間の細胞を１ｍＬのＴｒｉｚｏｌに再懸濁し、２００μＬのクロロホルムを添加した後、激しく振とうした。次に、試料を４℃で１０分間、遠心分離し、水相を新しい微量遠心管に移し、等量の７０％エタノールを添加した。試料を、２ｍＬ収集チューブ内に置いたＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉスピンカラムにロードし、製造業者の指示書に従って処理した。全ＲＮＡを、１００μＬのＲＮアーゼ不含水により直接、スピンカラム膜から溶出することによって抽出した。使用するまで−８０℃で貯蔵する前に、１％アガロースゲル中に３μＬを分画することにより、ＲＮＡ調製物の品質を決定した。
【０４９６】
各ハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を、完全マウスＶＨレパートリーを標的とするように設計した３２のマウス特異的リーダー配列プライマーを含む５’プライマーミックスと、全てのマウスＩｇアイソタイプに特異的な３’マウスＣγプライマーとを組み合わせて使用して増幅させた。同様に、カッパ軽鎖を増幅させ配列決定するため、Ｖκマウスファミリーのそれぞれを増幅するように設計した３２の５’Ｖκリーダー配列を含むプライマーミックスを、マウスカッパ定常領域に特異的な単一リバースプライマーと組み合わせて使用した。ラムダ軽鎖を含有する抗体の場合、マウスラムダ定常領域に特異的な１つのリバースプライマーと組み合わせた３種の５’ＶＬリーダー配列を使用して増幅を行った。ＶＨ及びＶＬ転写産物は、１００ｎｇの全ＲＮＡから、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキットを以下のように使用して増幅した。全部で８つのＲＴ−ＰＣＲ反応を各ハイブリドーマについて実施し、４つはＶκ軽鎖について、４つはＶＨ重鎖に対して行った。ＰＣＲ反応混合物は、３μＬのＲＮＡ、０．５μＬの１００μＭの重鎖又はカッパ軽鎖いずれかのプライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄａｔａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによりカスタム合成）、５μＬの５×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、１μＬのｄＮＴＰ、１μＬの逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを含有する酵素ミックス並びに０．４μＬのリボヌクレアーゼ阻害剤ＲＮａｓｉｎ（１ユニット）を含んだ。サーマルサイクラープログラムは、５０℃で３０分、９５℃で１５分、続いて３０サイクル×（９４．５℃で３０秒、４８℃で３０秒、７２℃で１分間）のＲＴ工程であった。次いで、最終インキュベーションを７２℃で１０分間実施した。
【０４９７】
抽出されたＰＣＲ産物を、可変領域の増幅について上述したものと同じ特異的可変領域プライマーを使用して配列決定した。直接的ＤＮＡ配列決定のためのＰＣＲ産物を調製するために、製造業者のプロトコルに従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲ産物を精製した。５０μＬの滅菌水を使用してスピンカラムからＤＮＡを溶出させて、次に、両方の鎖から直接的に配列決定した（ＭＣＬＡＢ）。
【０４９８】
選択したヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴ配列解析ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｍｅｄｉｃａｌ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ａｎａｌｙｓｉｓ．ｈｔｍｌ）を使用して分析し、最も高い配列相同性を有する生殖細胞系Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子メンバーを特定した。これらの誘導した配列は、専売抗体配列データベースを使用してＶＨ及びＶＬ遺伝子をマウス生殖系列データベースにアラインメントすることにより、ＩｇのＶ−及びＪ−領域の既知の生殖系列ＤＮＡ配列と比較した。
【０４９９】
図１Ａは、抗ＤＬＬ３抗体由来の多数の新規マウス軽鎖可変領域、及び代表的なマウス抗ＤＬＬ３抗体の可変軽鎖に由来する例示的なヒト化軽鎖可変領域の連続的アミノ酸配列を描写している（以下の実施例３の通り）。図１Ｂは、同じ抗ＤＬＬ３抗体由来の新規のマウス重鎖可変領域、及びヒト化軽鎖をもたらす同じマウス抗体に由来するヒト化重鎖可変領域の連続的アミノ酸配列を描写する（以下の実施例３の通り）。マウス軽鎖及び重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号２１〜３８７の奇数番号で示されている一方、ヒト化軽鎖及び重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号３８９〜４０７の奇数番号で示されている。
【０５００】
したがって、まとめると、図１Ａ及び図１Ｂは、ＳＣ１６．３、ＳＣ１６．４、ＳＣ１６．５、ＳＣ１６．７、ＳＣ１６．８、ＳＣ１６．１０、ＳＣ１６．１１、ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．１８、ＳＣ１６．１９、ＳＣ１６．２０、ＳＣ１６．２１、ＳＣ１６．２２、ＳＣ１６．２３、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．２６、ＳＣ１６．２９、ＳＣ１６．３０、ＳＣ１６．３１、ＳＣ１６．３４、ＳＣ１６．３５、ＳＣ１６．３６、ＳＣ１６．３８、ＳＣ１６．４１、ＳＣ１６．４２、ＳＣ１６．４５、ＳＣ１６．４７、ＳＣ１６．４９、ＳＣ１６．５０、ＳＣ１６．５２、ＳＣ１６．５５、ＳＣ１６．５６、ＳＣ１６．５７、ＳＣ１６．５８、ＳＣ１６．６１、ＳＣ１６．６２、ＳＣ１６．６３、ＳＣ１６．６５、ＳＣ１６．６７、ＳＣ１６．６８、ＳＣ１６．７２、ＳＣ１６．７３、ＳＣ１６．７８、ＳＣ１６．７９、ＳＣ１６．８０、ＳＣ１６．８１、ＳＣ１６．８４、ＳＣ１６．８８、ＳＣ１６．１０１、ＳＣ１６．１０３、ＳＣ１６．１０４、ＳＣ１６．１０５、ＳＣ１６．１０６、ＳＣ１６．１０７、ＳＣ１６．１０８、ＳＣ１６．１０９、ＳＣ１６．１１０、ＳＣ１６．１１１、ＳＣ１６．１１３、ＳＣ１６．１１４、ＳＣ１６．１１５、ＳＣ１６．１１６、ＳＣ１６．１１７、ＳＣ１６．１１８、ＳＣ１６．１２０、ＳＣ１６．１２１、ＳＣ１６．１２２、ＳＣ１６．１２３、ＳＣ１６．１２４、ＳＣ１６．１２５、ＳＣ１６．１２６、ＳＣ１６．１２９、ＳＣ１６．１３０、ＳＣ１６．１３１、ＳＣ１６．１３２、ＳＣ１６．１３３、ＳＣ１６．１３４、ＳＣ１６．１３５、ＳＣ１６．１３６、ＳＣ１６．１３７、ＳＣ１６．１３８、ＳＣ１６．１３９、ＳＣ１６．１４０、ＳＣ１６．１４１、ＳＣ１６．１４２、ＳＣ１６．１４３、ＳＣ１６．１４４、ＳＣ１６．１４７、ＳＣ１６．１４８、ＳＣ１６．１４９及びＳＣ１６．１５０と命名された多数のマウス抗ＤＬＬ３結合ドメイン又は標的ドメイン、並びにｈＳＣ１６．１３、ｈＳＣ１６．１５、ｈＳＣ１６．２５、ｈＳＣ１６．３４及びｈＳＣ１６．５６と命名されたヒト化抗体の注釈つき配列を示す。
【０５０１】
本発明の特定の態様において、ＡＤＣ結合ドメインは、ｈＤＬＬ３に特異的に結合し、配列番号２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び配列番号２３の重鎖可変領域（ＶＨ）；又は配列番号２５のＶＬ及び配列番号２７のＶＨ；又は配列番号２９のＶＬ及び配列番号３１のＶＨ；又は配列番号３３のＶＬ及び配列番号３５のＶＨ；又は配列番号３７のＶＬ及び配列番号３９のＶＨ；又は配列番号４１のＶＬ及び配列番号４３のＶＨ；又は配列番号４５のＶＬ及び配列番号４７のＶＨ；又は配列番号４９のＶＬ及び配列番号５１のＶＨ；又は配列番号５３のＶＬ及び配列番号５５のＶＨ；又は配列番号５７のＶＬ及び配列番号５９のＶＨ；又は配列番号６１のＶＬ及び配列番号６３のＶＨ；又は配列番号６５のＶＬ及び配列番号６７のＶＨ；又は配列番号６９のＶＬ及び配列番号７１のＶＨ；又は配列番号７３のＶＬ及び配列番号７５のＶＨ；又は配列番号７７のＶＬ及び配列番号７９のＶＨ；又は配列番号８１のＶＬ及び配列番号８３のＶＨ；又は配列番号８５のＶＬ及び配列番号８７のＶＨ；又は配列番号８９のＶＬ及び配列番号９１のＶＨ；又は配列番号９３のＶＬ及び配列番号９５のＶＨ；又は配列番号９７のＶＬ及び配列番号９９のＶＨ；又は配列番号１０１のＶＬ及び配列番号１０３のＶＨ；又は配列番号１０５のＶＬ及び配列番号１０７のＶＨ；又は配列番号１０９のＶＬ及び配列番号１１１のＶＨ；又は配列番号１１３のＶＬ及び配列番号１１５のＶＨ；又は配列番号１１７のＶＬ及び配列番号１１９のＶＨ；又は配列番号１２１のＶＬ及び配列番号１２３のＶＨ；又は配列番号１２５のＶＬ及び配列番号１２７のＶＨ；又は配列番号１２９のＶＬ及び配列番号１３１のＶＨ；又は配列番号１３３のＶＬ及び配列番号１３５のＶＨ；又は配列番号１３７のＶＬ及び配列番号１３９のＶＨ；又は配列番号１４１のＶＬ及び配列番号１４３のＶＨ；又は配列番号１４５のＶＬ及び配列番号１４７のＶＨ；又は配列番号１４９のＶＬ及び配列番号１５１のＶＨ；又は配列番号１５３のＶＬ及び配列番号１５５のＶＨ；又は配列番号１５７のＶＬ及び配列番号１５９のＶＨ；又は配列番号１６１のＶＬ及び配列番号１６３のＶＨ；又は配列番号１６５のＶＬ及び配列番号１６７のＶＨ；又は配列番号１６９のＶＬ及び配列番号１７１のＶＨ；又は配列番号１７３のＶＬ及び配列番号１７５のＶＨ；又は配列番号１７７のＶＬ及び配列番号１７９のＶＨ；又は配列番号１８１のＶＬ及び配列番号１８３のＶＨ；又は配列番号１８５のＶＬ及び配列番号１８７のＶＨ；又は配列番号１８９のＶＬ及び配列番号１９１のＶＨ；又は配列番号１９３のＶＬ及び配列番号１９５のＶＨ；又は配列番号１９７のＶＬ及び配列番号１９９のＶＨ；又は配列番号２０１のＶＬ及び配列番号２０３のＶＨ；又は配列番号２０５のＶＬ及び配列番号２０７のＶＨ；又は配列番号２０９のＶＬ及び配列番号２１１のＶＨ；又は配列番号２１３のＶＬ及び配列番号２１５のＶＨ；又は配列番号２１７のＶＬ及び配列番号２１９のＶＨ；又は配列番号２２１のＶＬ及び配列番号２２３のＶＨ；又は配列番号２２５のＶＬ及び配列番号２２７のＶＨ；又は配列番号２２９のＶＬ及び配列番号２３１のＶＨ；又は配列番号２３３のＶＬ及び配列番号２３５のＶＨ；又は配列番号２３７のＶＬ及び配列番号２３９のＶＨ；又は配列番号２４１のＶＬ及び配列番号２４３のＶＨ；又は配列番号２４５のＶＬ及び配列番号２４７のＶＨ；又は配列番号２４９のＶＬ及び配列番号２５１のＶＨ；又は配列番号２５３のＶＬ及び配列番号２５５のＶＨ；又は配列番号２５７のＶＬ及び配列番号２５９のＶＨ；又は配列番号２６１のＶＬ及び配列番号２６３のＶＨ；又は配列番号２６５のＶＬ及び配列番号２６７のＶＨ；又は配列番号２６９のＶＬ及び配列番号２７１のＶＨ；又は配列番号２７３のＶＬ及び配列番号２７５のＶＨ；又は配列番号２７７のＶＬ及び配列番号２７９のＶＨ；又は配列番号２８１のＶＬ及び配列番号２８３のＶＨ；又は配列番号２８５のＶＬ及び配列番号２８７のＶＨ；又は配列番号２８９のＶＬ及び配列番号２９１のＶＨ；又は配列番号２９３のＶＬ及び配列番号２９５のＶＨ；又は配列番号２９７のＶＬ及び配列番号２９９のＶＨ；又は配列番号３０１のＶＬ及び配列番号３０３のＶＨ；又は配列番号３０５のＶＬ及び配列番号３０７のＶＨ；又は配列番号３０９のＶＬ及び配列番号３１１のＶＨ；又は配列番号３１３のＶＬ及び配列番号３１５のＶＨ；又は配列番号３１７のＶＬ及び配列番号３１９のＶＨ；又は配列番号３２１のＶＬ及び配列番号３２３のＶＨ；又は配列番号３２５のＶＬ及び配列番号３２７のＶＨ；又は配列番号３２９のＶＬ及び配列番号３３１のＶＨ；又は配列番号３３３のＶＬ及び配列番号３３５のＶＨ；又は配列番号３３７のＶＬ及び配列番号３３９のＶＨ；又は配列番号３４１のＶＬ及び配列番号３４３のＶＨ；又は配列番号３４５のＶＬ及び配列番号３４７のＶＨ；又は配列番号３４９のＶＬ及び配列番号３５１のＶＨ；又は配列番号３５３のＶＬ及び配列番号３５５のＶＨ；又は配列番号３５７のＶＬ及び配列番号３５９のＶＨ；又は配列番号３６１のＶＬ及び配列番号３６３のＶＨ；又は配列番号３６５のＶＬ及び配列番号３６７のＶＨ；又は配列番号３６９のＶＬ及び配列番号３７１のＶＨ；又は配列番号３７３のＶＬ及び配列番号３７５のＶＨ；又は配列番号３７７のＶＬ及び配列番号３７９のＶＨ；又は配列番号３８１のＶＬ及び配列番号３８３のＶＨ；又は配列番号３８５のＶＬ及び配列番号３８７のＶＨ；又は配列番号３８９のＶＬ及び配列番号３９１のＶＨ；又は配列番号３９３のＶＬ及び配列番号３９５のＶＨ；又は配列番号３９７のＶＬ及び配列番号３９９のＶＨ；又は配列番号４０１のＶＬ及び配列番号４０３のＶＨ；又は配列番号４０５のＶＬ及び配列番号４０７のＶＨを含む抗体を含む、又は結合に関して、この抗体と競合する。
【０５０２】
本出願の目的のため、各特定の抗体の配列番号は、連続した奇数である。したがって、モノクローナル抗ＤＬＬ３抗体であるＳＣ１６．３は、それぞれ軽鎖及び重鎖可変領域に関してアミノ酸配列番号２１及び２３を含む。ＳＣ１６．４は、配列番号２５及び２７を含む。ＳＣ１６．５は、配列番号２９及び３１を含むなどである。各抗体アミノ酸配列に対応する核酸配列は、添付の配列表に含まれ、対応するアミノ酸配列番号の直前の配列番号を有する。したがって、例えば、ＳＣ１６．３抗体のＶＬ及びＶＨの配列番号は、それぞれ２１及び２３であり、ＳＣ１６．３抗体のＶＬ及びＶＨをコードする核酸配列の配列番号は、それぞれ配列番号２０及び２２である。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらにより（上記）、Ａｂｙｓｉｓデータベース専売バージョンを使用して定義される。
【０５０３】
［実施例３］
キメラ及びヒト化抗ＤＬＬ３抗体の生成
本発明と適合性のヒト化結合ドメインの評価基準を提示するため、以下の通りに当該技術分野で認識されている技術を使用して、キメラ抗ＤＬＬ３抗体を生成した。実施例１に示される通りに、ハイブリドーマから全ＲＮＡを抽出し、増幅した。マウス抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖のＶ、Ｄ及びＪ遺伝子セグメントに関するデータは、誘導した核酸配列から得た。抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖のリーダー配列に特異的なプライマーセットを、次の制限部位を使用して設計した：ＶＨ断片に対してＡｇｅＩ及びＸｈｏＩ並びにＶＬ断片に対してＸｍａＩ及びＤｒａＩＩＩ。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）により精製し、次いでＶＨ断片に対して制限酵素ＡｇｅＩ及びＸｈｏＩ並びにＶＬ断片に対してＸｍａＩ及びＤｒａＩＩＩを用いて消化した。ＶＬ及びＶＨ消化したＰＣＲ産物を精製し、それぞれカッパＣＬ（配列番号５）ヒト軽鎖定常領域発現ベクター又はＩｇＧ１（配列番号６）ヒト重鎖定常領域発現ベクターにライゲーションした。
【０５０４】
ライゲーション反応を、全体積１０μＬの２００ＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、７．５μＬの消化及び精製した遺伝子特異的ＰＣＲ産物並びに２５ｎｇの直線化ベクターＤＮＡ中で実施した。コンピテントのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ菌（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、４２℃の熱ショックを介して、３μＬのライゲーション産物を用いて形質転換し、濃度１００μｇ／ｍＬでアンピシリンを含むプレートの上に蒔いた。増幅ライゲーション産物の精製及び消化後、ＶＨ断片を、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＡｇｅＩ−ＸｈｏＩ制限部位にクローニングし、ＶＬ断片を、ｐＥＥ１２．４Ｈｕ−Ｋａｐｐａ発現ベクター（Ｌｏｎｚａ）のＸｍａＩ−ＤｒａＩＩＩ制限部位にクローニングした。
【０５０５】
キメラ抗体を、ｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１及びｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパ発現ベクターを用いてＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクションすることにより発現させた。トランスフェクションの前に、標準条件下で、１０％熱不活化ＦＣＳ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１００Ｕ／ｍＬペニシリンＧを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、１５０ｍｍプレート内でＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を培養した。一過性トランスフェクションのため、８０％の集密度まで細胞を成長させた。各１２．５μｇのｐＥＥ６．４ＨｕＩｇＧ１及びｐＥＥ１２．４Ｈｕ−カッパベクターＤＮＡを、１．５ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中５０μＬのＨＥＫ−２９３Ｔトランスフェクト試薬に加えた。混合物を室温で３０分間、インキュベートし、蒔いた。上清を、トランスフェクションから３から６日後に採取した。組換えキメラ抗体を含有する培養上清を、８００×ｇで１０分間遠心分離することにより細胞デブリから清澄化し、４℃で保存した。組換えキメラ抗体は、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによって精製した。
【０５０６】
同じマウス抗ＤＬＬ３抗体（例えば、ＳＣ１６．１３、ＳＣ１６．１５、ＳＣ１６．２５、ＳＣ１６．３４及びＳＣ１６．５６）は、ＣＤＲグラフト化又はヒト化結合ドメインの誘導にも使用した。専売のコンピュータの支援によるＣＤＲグラフト化法（Ａｂｙｓｉｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＵＣＬ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ）及び以下の標準分子操作技術を使用して、マウス抗体をヒト化した。可変領域のヒトフレームワーク領域を、ヒト生殖系列抗体配列のフレームワーク配列及びＣＤＲ古典的構造と、関連マウス抗体のフレームワーク配列及びＣＤＲとの間の最も高い相同性に基づき設計した。解析のために、アミノ酸のＣＤＲドメインのそれぞれに対する帰属をＫａｂａｔらに従って行った。可変領域が一旦、設計されると、これらを合成遺伝子セグメントから生成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ヒト化抗体をクローニングし、キメラ抗体について上述した分子的方法を使用して発現させた。
【０５０７】
選択したヒト受容体可変領域の遺伝的組成を、ヒト化抗体のそれぞれについて、直下の表５に示している。表５に図示された配列は、配列番号３８９及び３９１（ｈＳＣ１６．１３）、配列番号３９３及び３９５（ｈＳＣ１６．１５）、配列番号３９７及び３９９（ｈＳＣ１６．２５）、配列番号４０１及び４０３（ｈＳＣ１６．３４）並びに配列番号４０５及び４０７（ｈＳＣ１６．５６）に示された連続可変領域配列に対応する。表５は、選択した抗体の好都合な結合特性を維持するのに、フレームワーク変化又は逆変異を必要としなかったことを示している。
【０５０８】
【表５】
2019516705.tif 000036
【０５０９】
フレームワーク領域における残基は改変されなかったが、ヒト化クローンの１つ（ｈＳＣ１６．１３）において、安定性懸念に対処するため、変異を重鎖ＣＤＲ２に導入した。改変されたＣＤＲを有する抗体の結合親和性を確認して、これが、対応するキメラ抗体又はマウス抗体のいずれとも等しいことを確認した。
【０５１０】
ヒト化後に、得られたＶＬ及びＶＨ鎖アミノ酸配列を解析して、マウスドナー及びヒト受容体軽鎖及び重鎖可変領域に関するこれらの相同性を決定した。直下の表５に示されている結果により、ヒト化構築物が、マウスドナー配列によるものよりも高い、ヒト受容体配列に関する相同性を一貫して示したことが明らかである。マウス重鎖及び軽鎖可変領域は、ヒト化抗体及びドナーハイブリドーマタンパク質配列の相同性（７４％〜８３％）と比較して、ヒト生殖系列遺伝子の最も近い一致に対し同様の全体相同性率（８５％〜９３％）を示す。
【０５１１】
【表６】
2019516705.tif 000037
【０５１２】
キメラ抗体と同様に、ヒト化ＶＬ及びＶＨ消化したＰＣＲ産物を精製し、それぞれカッパＣＬ（配列番号５）ヒト軽鎖定常領域発現ベクター又はＩｇＧ１（配列番号６）ヒト重鎖定常領域発現ベクターにライゲーションした。発現後、表面プラズモン共鳴を使用し、誘導したヒト化構築物のそれぞれを解析して、ＣＤＲグラフト化プロセスが、ＤＬＬ３タンパク質に対するこの見かけの親和性を認識できるほどに改変したかどうか決定した。ヒト化構築物を、ヒト化構築物に使用されるものと実質的に等しいマウス親（又はドナー）重鎖及び軽鎖可変ドメイン並びにヒト定常領域を含むキメラ抗体と比較した。ヒト化抗ＤＬＬ３抗体は、キメラ親抗体によって示されるものに概ね匹敵する結合特徴を示した（データ図示せず）。
【０５１３】
［実施例４］
部位−特異的抗体の生成
操作されたヒトＩｇＧ１／カッパ抗ＤＬＬ３部位特異的抗体は、天然の軽鎖（ＬＣ）定常領域及び重鎖（ＨＣ）定常領域を含んで、構築し、この場合、ＬＣにおけるシステイン２１４（Ｃ２１４）との鎖間ジスルフィドを形成する、ＨＣの上部ヒンジ領域におけるシステイン２２０（Ｃ２２０）を、セリン（Ｃ２２０Ｓ）により置き換えた。組み立て時に、ＨＣ及びＬＣは、治療剤にコンジュゲートするのに好適な、２つの遊離システインを含む抗体を形成する。別途記載しない限り、定常領域残基の全ての番号付けは、Ｋａｂａｔらに示されるＥＵ番号付けスキームに従っている。
【０５１４】
操作された抗体は、以下の通り生成した。完全長ヒト化抗ＤＬＬ３抗体ｈＳＣ１６．５６をコードする発現ベクターを、ＰＣＲ増幅及び部位特異的突然変異の鋳型として使用した。部位特異的突然変異は、製造業者の指示書に従って、Ｑｕｉｃｋ−ｃｈａｎｇｅ（登録商標）システム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。
【０５１５】
ｈＳＣ１６．５６の変異体Ｃ２２０Ｓ重鎖をコードするベクターに、ＣＨＯ−Ｓ細胞において、天然の完全長カッパ軽鎖を同時トランスフェクトし、哺乳動物の一過性発現システムを使用して発現させた。Ｃ２２０Ｓ変異体を含有する操作された抗ＤＬＬ３部位特異的抗体を、ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１と命名した。一旦発現させると、改変抗ＤＬＬ３抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより特徴づけ、正確な変異体が生成されていることを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのプレキャスト１０％Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅミニゲル上で、還元剤、例えば、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）の存在及び不在下で実施した。電気泳動後、ゲルをクーマシーコロイド溶液で染色した。還元条件下、遊離ＬＣ及び遊離ＨＣに対応する２つのバンドを観察した（データ示さず）。このパターンは、還元条件のＩｇＧ分子に典型的である。非還元条件下、バンドパターンは、ＨＣとＬＣとの間のジスルフィド結合の不在を示す天然ＩｇＧ分子とは異なる。ＨＣ−ＨＣダイマーに対応する約９８ｋＤのバンドが観察された。さらに、遊離ＬＣに対応するかすかなバンドと、ＬＣ−ＬＣダイマーに対応する約４８ｋＤの顕著なバンドが観察された。若干量のＬＣ−ＬＣ種の形成は、各ＬＣ上のＣ末端における遊離システインにより予測される。
【０５１６】
［実施例５］
抗ＤＬＬ３抗体のドメイン及びエピトープマッピング
開示した抗ＤＬＬ３抗体が結合するエピトープを特徴づけて、位置づけるために、Ｃｏｃｈｒａｎら、２００４年（上記）によって記載されたプロトコルの修正したものを使用して、ドメインレベルのエピトープマッピングを行った。特異的アミノ酸配列を含むＤＬＬ３の個々のドメインを酵母表面に発現させ、各抗ＤＬＬ３抗体による結合をフローサイトメトリーにより決定した。
【０５１７】
以下の構築物の発現のために、酵母ディスプレイプラスミド構築物を作製した：ＤＬＬ３細胞外ドメイン（アミノ酸２７〜４６６）；ＤＬＬ３のＥＧＦ様ドメイン１〜６（アミノ酸２２０〜４６６）に融合されたＤＬＬ１のＮ末端領域及びＤＳＬドメイン（アミノ酸２２〜２２５）からなるＤＬＬ１−ＤＬＬ３キメラ；ＤＬＬ１のＥＧＦ様ドメイン１〜８（アミノ酸２２２〜５１８）に融合されたＤＬＬ３のＮ末端領域及びＤＳＬドメイン（アミノ酸２７〜２１４）からなるＤＬＬ３−ＤＬＬ１キメラ；ＥＧＦ１（アミノ酸２１５〜２４９）；ＥＧＦ２（アミノ酸２７４〜３１０）；ＥＧＦ１及びＥＧＦ２（アミノ酸２１５〜３１０）；ＥＧＦ３（アミノ酸３１２〜３５１）；ＥＧＦ４（アミノ酸３５３〜３８９）；ＥＧＦ５（アミノ酸３９１〜４２７）；並びにＥＧＦ６（アミノ酸４２９〜４６５）。ドメイン情報に関して、一般に、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔデータベースエントリーＱ９ＮＹＪ７を参照されたい。アミノ酸の番号付けが、配列番号１に示す配列中に含まれるリーダー配列を有するプロセシングされていないＤＬＬ３タンパク質を参照することに留意されたい。全体としてのＮ末端領域又はＥＧＦドメインの解析のため、タンパク質フォールディングに伴う潜在的な問題を最小化するための断片とは対照的に、ファミリーメンバーＤＬＬ１を有するキメラ（ＤＬＬ１−ＤＬＬ３及びＤＬＬ３−ＤＬＬ１）を使用した。ドメインマッピングされた抗体は、ＤＬＬ１と交差反応しないことが以前に示され、これらの構築物への任意の結合が、構築物のＤＬＬ３部分との結合により発生していたことを示す。Ｃｏｃｈｒａｎらに記載されている通り、これらのプラスミドを酵母に形質転換し、次に、酵母を成長させて誘導した。
【０５１８】
特定の構築物への結合に関して試験するために、所望の構築物を発現する２００，０００個の誘導された酵母細胞をＰＢＳ＋１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（ＰＢＳＡ）で２回洗浄し、５０μＬのＰＢＳＡにおいて０．１μｇ／ｍＬのビオチン化抗ＨＡクローン３Ｆ１０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）及び５０ｎＭの精製した抗体又は７日間培養したハイブリドーマ由来の未精製上清の１：２希釈物のいずれかと共にインキュベートした。細胞を９０分間、氷上でインキュベートし、続いてＰＢＳＡ中で２回洗浄した。次に、５０μＬのＰＢＳＡにおいて、適切な二次抗体と共に細胞をインキュベートした：マウス抗体の場合、Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲートストレプトアビジン及びＡｌｅｘａ６４７コンジュゲートヤギ抗マウス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各１μｇ／ｍＬで添加した。ヒト化又はキメラ抗体の場合、Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートストレプトアビジン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＲ−フィコエリトリンコンジュゲートヤギ抗ヒト（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を各１μｇ／ｍＬで添加した。氷上で２０分間のインキュベート後に、細胞をＰＢＳＡにより２回洗浄し、ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで解析した。ＤＬＬ３−ＤＬＬ１キメラに結合した抗体は、Ｎ末端領域＋ＤＳＬへの結合として表した。特定のＥＧＦ様ドメインに存在するエピトープに特異的に結合した抗体は、このそれぞれのドメインへの結合として表した（図２）。
【０５１９】
立体構造（例えば、非連続的）又は線形としてエピトープを分類するために、ＤＬＬ３  ＥＣＤを表示する酵母を３０分間、８０℃で熱処理してＤＬＬ３  ＥＣＤを変性し、次に、氷冷ＰＢＳＡにおいて２回、洗浄した。上記と同じ染色プロトコルを使用したＦＡＣＳによって、変性した酵母に結合する抗ＤＬＬ３抗体の能力を試験した。変性及び天然酵母の両方に結合した抗体は、線形エピトープへの結合として分類した一方、天然酵母に結合したが、変性酵母には結合しなかった抗体は、立体構造的に特異的として分類した。
【０５２０】
試験した抗体のドメイン−レベルエピトープマッピングデータの概要の要約が図２に示されており、線形エピトープに結合している抗体に下線を引き、決定した場合、対応するビンを括弧内に明記した。図２を精査すると、抗ＤＬＬ３抗体の大部分が、ＤＬＬ３又はＥＧＦ２のＮ末端／ＤＳＬ領域のいずれかに見出されるエピトープにマッピングする傾向があったことを示している。図２は、様々な抗ＤＬＬ３抗体の場合の、ビン決定及びドメインマッピングに関する同様のデータを、表形式で示している。
【０５２１】
２つの方法のうち一方を使用して、選択した抗体に関する微細エピトープマッピングをさらに行った。第１の方法は、製造業者の指示書に従って使用された、Ｐｈ．Ｄ．−１２ファージディスプレイペプチドライブラリキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた。Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ管（Ｎｕｎｃ）において、３ｍＬの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液（ｐＨ８）中の５０μｇ／ｍＬで、エピトープマッピングのための抗体を一晩、コーティングした。炭酸水素塩溶液中の３％ＢＳＡ溶液により、管をブロッキングした。次に、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中の１０１１個のインプットファージを結合させて、続いて０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０により１０回の連続した洗浄を行って、非結合ファージを洗い流した。穏やかに撹拌しながら、１ｍＬの０．２Ｍグリシンにより１０分間、室温において、残るファージを溶出し、次いで１５０μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）により中和した。選択ストリンジェンシーを増加させるために洗浄ステップの間に、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を使用して、溶出したファージを増幅し、再度１０１１個のインプットファージでパニングした。第２ラウンド由来の溶出したファージの２４個のプラーク由来のＤＮＡを、Ｑｉａｐｒｅｐ  Ｍ１３スピンキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離し、配列決定した。ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、クローナルファージの結合を確認し、このアッセイにおいて、マッピングされた抗体又は対照抗体を、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングしてブロッキングし、各ファージクローンに曝露させた。ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｍ１３抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び１−Ｓｔｅｐ  Ｔｕｒｂｏ  ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、ファージ結合を検出した。Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、特異的に結合するファージ由来のファージペプチド配列を、抗原ＥＣＤペプチド配列に対して整列させて、結合のエピトープを決定した。
【０５２２】
代替的に、酵母ディスプレイ方法（Ｃｈａｏら、２００７年、ＰＭＩＤ：１７４０６３０５）を使用して、選択した抗体のエピトープをマッピングした。クローンあたり１アミノ酸変異の標的変異誘発率について、ヌクレオチドアナログの８−オキソ−２’デオキシグアノシン−５’−三リン酸及び２’−デオキシ−ｐ−ヌクレオシド−５’三リン酸（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏ）を使用した、エラープローンＰＣＲにより、ＤＬＬ３  ＥＣＤ変異体のライブラリを生成した。これらを酵母ディスプレイフォーマットへと形質転換した。ドメインレベルマッピングに関する上述の技術を使用して、ＨＡ及び５０ｎＭにおいて結合する抗体に関するライブラリを染色した。ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ）を使用して、野生型ＤＬＬ３  ＥＣＤと比較して結合の損失を示したクローンを選別した。これらのクローンを再成長させて、標的抗体への結合の損失を選別するＦＡＣＳの別のラウンドに供した。Ｚｙｍｏｐｒｅｐ酵母プラスミドミニプレップキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、個々のＥＣＤクローンを単離し、配列決定した。必要な場合、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して、変異を単一変異体ＥＣＤクローンとして再フォーマットした。
【０５２３】
次に、個々のＥＣＤクローンをスクリーニングして、結合の喪失が、エピトープにおける変異によるものであるか、ミスフォールディングを引き起こした変異によるものであるか決定した。ミスフォールディング変異が高く見込まれるため、システイン、プロリン及び終止コドンが関与した変異を自動的に廃棄した。次に、残るＥＣＤクローンを、非競合性の立体構造的に特異的な抗体への結合に関してスクリーニングした。非競合性の立体構造的に特異的な抗体への結合を失ったＥＣＤクローンは、ミスフォールディング変異を含有すると結論付けされた一方、野生型ＤＬＬ３  ＥＣＤと等しい結合を保持したＥＣＤクローンは、適切にフォールディングされたと結論付けられた。後者の群のＥＣＤクローンにおける変異は、エピトープに存在すると結論付けられた。
【０５２４】
抗体結合に関与するアミノ酸残基を含むこの誘導エピトープを有する選択した抗体の概要を、以下の表７に一覧表示する。抗体ＳＣ１６．３４及びＳＣ１６．５６は、図２に示したビニング情報及びドメインマッピング結果に一致する共通アミノ酸残基と相互作用する。さらに、ＳＣ１６．２３は、別個の連続エピトープと相互作用することが判明し、ＳＣ１６．３４又はＳＣ１６．５６によりビニングしないことが判明した。添付の配列表の目的のため、配列番号４が、位置２０４にプレースホルダーアミノ酸を含むことに留意されたい。
【０５２５】
【表７】
2019516705.tif 000038
【０５２６】
［実施例６］
ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）への抗ＤＬＬ３抗体のコンジュゲート
遊離スルフヒドリル基を有する末端マレイミド部分を介して、ヒト化抗ＤＬＬ３抗体（ｈＳＣ１６．５６）及びヒト化部位特異的抗ＤＬＬ３抗体（ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１）をピロロベンゾジアゼピン（ＤＬ１、ＰＢＤ１）にコンジュゲートし、ｈＳＣ１６．５６ＰＢＤ１及びｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＰＢＤ１と称するＡＤＣを作製した。ｈＳＣ１６．５６ＰＢＤ１（すなわち、ＳＣ１６ＬＤ６．５）及びｈＳＣ１６．５６ｓｓ１ＰＢＤ１は、臨床試験における使用を意図するので、ＧＭＰ条件下で作製した。ヒト化ＤＬＬ３（ｈＳＣ１６．５６）抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、２つの個別の段階：還元工程、及びｈＳＣ１６．５６にＰＢＤ１をコンジュゲートするコンジュゲート工程で調製した。次に、ＡＤＣを陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーにより処理し、次いで、ダイアフィルトレーション、薬物物質を生成する製剤化工程を行った。この方法を以下に詳細に記載する。
【０５２７】
２００ｍＭのＴｒｉｓ塩基、３２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．５）を添加することにより、抗体をｐＨ７．５に調節した。次に、ｐＨ調節したＤＬＬ３抗体のシステイン結合を、抗体１ｍｏｌあたりのｍｏｌ数のトリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）の所定のモル濃度の添加により、２０℃で９０分間、部分的に還元した。次いで、得られた部分還元調製物を、２０℃において最低３０分間、マレイミドリンカーを介してＰＢＤ１にコンジュゲートした（上で示した）。次いで、水中で調製した１０ｍＭの原液を使用して、リンカー薬物と比較して過剰のＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を添加することにより、反応物をクエンチした。最低２０分間、クエンチした後、０．５Ｍの酢酸の添加によりｐＨを５．５に調整した。次に、ＡＤＣの調製物を、結合モード及び段階溶出を伴う溶出モードの陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィーにより処理し、コンジュゲート工程中に形成された凝集物を除去した。次に、ＣＥＸ精製済みＡＤＣを、３０ｋＤａ膜を使用するダイアフィルトレーションによりダイアフィルトレーションバッファーにバッファー交換した。次に、ダイアフィルトレーションした抗ＤＬＬ３  ＡＤＣを、ショ糖及びポリソルベート２０を用いて目的の最終濃度に製剤化して、薬物物質を生成した。
【０５２８】
部位特異的ヒト化抗ＤＬＬ３（ｈＳＣ１６．５６ｓｓ１）ＡＤＣは、修正部分還元過程を使用してコンジュゲートした。この点において、所望の生成物は、各ＬＣ定常領域上の不対システイン（Ｃ２１４）に最大限にコンジュゲートし、２より大きい（ＤＡＲ＞２）薬物対抗体比（ＤＡＲ）を有するＡＤＣを最小化する一方で、ＤＡＲが２の（ＤＡＲ＝２）ＡＤＣを最大化する、ＡＤＣである。コンジュゲーションの特異性をさらに改善するため、安定化剤（例えば、Ｌ−アルギニン）及び穏やかな還元剤（例えば、グルタチオン）を含むプロセスを使用して抗体を選択的に還元し、この後、リンカー薬物を用いてコンジュゲーションを行った。次に、ＡＤＣを分取疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）により処理し、次いで、ダイアフィルトレーション及び製剤化工程を行い、薬物物質を生成した。この方法を以下に詳細に記載する。
【０５２９】
部位特異的抗体の構築物は、所定濃度の還元済みグルタチオン（ＧＳＨ）を含む、ｐＨ８．０の１Ｍ  Ｌ−アルギニン／５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するバッファー中、室温で最低２時間、部分的に還元した。次いで、全ての調製物を、３０ｋＤａ膜を用いて２０ｍＭのＴｒｉｓ／３．２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０のバッファーへとバッファー交換し、還元バッファーを除去した。次いで、得られた部分的還元調製物を、２０℃で最低３０分間、マレイミドリンカーを介してＰＢＤ１（前述の通り）にコンジュゲートした。次いで、水中で調製した１０ｍＭの原液を使用して、リンカー薬物と比較して過剰のＮＡＣを添加することにより、反応物をクエンチした。最低２０分間クエンチした後、０．５Ｍの酢酸の添加によりｐＨを６．０に調整した。次に、ｐＨを調整したＡＤＣを、結合モード及び段階溶出を伴う溶出モードの分取疎水相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）（Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ）によって処理し、ＤＡＲ２種をさらに精製した。次に、精製済みＡＤＣを、３０ｋＤａ膜を使用するダイアフィルトレーションによりダイアフィルトレーションバッファーにバッファー交換した。次いで、ダイアフィルトレーションした抗ＤＬＬ３  ＡＤＣを、ショ糖及びポリソルベート２０を用いて目的の最終濃度に製剤化して、部位特異的薬物物質を生成した。
【０５３０】
［実施例７］
組換えＡＳＣＬ１融合タンパク質のクローニング及び発現、並びにＡＳＣＬ１タンパク質を過剰発現する細胞株の操作
ヒトＡＳＣＬ１及びＡＳＣＬ２タンパク質をコードするＤＮＡ断片
ヒトＡＳＣＬ１（ＡＳＣＬ１）タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００４３０７）に関する、本発明に必要な全ての細胞物質を生成するため、ＡＳＣＬ１  ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４３１６、ｎｔｓ５７２−１２８２）のオープンリーディングフレームをコードする合成ＤＮＡ断片を、標準分子技術を使用して、ＣＭＶ駆動発現ベクターにインフレームで、及びＩｇＫシグナルペプチド配列の下流に、及び９−ヒスチジンタグかヒトＩｇＧ２  Ｆｃ  ｃＤＮＡのどちらか一方の上流にサブクローニングした。これらのＣＭＶ駆動発現ベクターにより、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞及び／又はＣＨＯ−Ｓ細胞において、高いレベルの一過性発現が可能になる。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の懸濁液若しくは接着培養物、又は懸濁液ＣＨＯ−Ｓ細胞に、トランスフェクト試薬として、ポリエチレンイミンポリマーを使用して、これらの発現構築物をトランスフェクトした。トランスフェクトして３〜５日後に、ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ、及びそれぞれ、ニッケル−ＥＤＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）又はＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムのどちらか一方を使用して、組換えＨｉｓタグ付け又はＦｃタグ付けタンパク質を、清澄化した細胞−上清から精製した。ＡＳＣＬ２  ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５１７０、ｎｔｓ６２１−１２０２）のオープンリーディングフレームをコードした合成ＤＮＡ断片を使用して、組換えＡＳＣＬ２タンパク質を同様に作製した。
【０５３１】
ｈＡＳＣＬ１タンパク質をコードするレンチウイルスベクタープラスミドを作製するため、ｈＡＳＣＬ１オープンリーディングフレームをコードする合成ＤＮＡを、多重クローニング部位（ＭＣＳ）の上流に、ＤＤＤＫエピトープタグをコードするヌクレオチド配列を導入するよう予め修飾した、レンチウイルス発現ベクターｐＣＤＨ−ＥＦ１−ＭＣＳ−Ｔ２Ａ−ＧＦＰ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ  ＣＡ）の多重クローニング部位（ＭＣＳ）にインフレームでサブクローニングした。ＭＣＳの下流のＴ２Ａ配列は、ペプチド結合の縮合部のリボソームスキッピングを促進し、２つの独立したタンパク質：Ｔ２Ａペプチドの下流においてコードされるＧＦＰマーカータンパク質の共発現を伴う、Ｔ２Ａペプチドの上流においてコードされる、ＤＤＤＫタグ付きタンパク質の高レベル発現をもたらす。このクローニング工程により、レンチウイルスベクタープラスミドｐＬＭＥＧＰＡ−ｈＡＳＣＬ１−ＮＦｌａｇが生成した。
【０５３２】
細胞株の操作
ｈＡＳＣＬ１タンパク質を過剰発現する操作した細胞株を、上記のｐＬＭＥＧＰＡ−ｈＡＳＣＬ１−ＮＦｌａｇレンチウイルスベクターを使用して構築し、当業者に周知の標準レンチウイルス形質導入技術を使用し、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株に形質導入した。ｈＡＳＣＬ１正の細胞は、高発現性ＨＥＫ−２９３Ｔサブクローン（例えば、細胞中にＡＳＣＬ１を細胞内高発現するためのサロゲートとして働く、ＧＦＰに対して強くポジティブとなる細胞）の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して選択した。
【０５３３】
［実施例８］
マウス抗ＡＳＣＬ１抗体の生成
抗ＡＳＣＬ１マウス抗体を、以下の通り２つの免疫付与キャンペーンで生成した。株Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ−１及びＦＶＢに由来するマウスに、等量のＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）アジュバントを用いて乳化した１０μｇのｈＡＳＣＬ１−Ｆｃを接種した。最初の接種に続いて、このマウスに、等量のアラムアジュバント及びＣｐＧを用いて乳化した、１０μｇのｈＡＳＣＬ１タンパク質を４週間、毎週２回、注射した。
【０５３４】
マウスを屠殺し、流入リンパ節（膝窩、鼠径及び内側腸骨）を解離し、抗体産生細胞源として使用した。Ｂ細胞の単一細胞懸濁液を生成し、（１２２．５×１０６細胞を）エレクトロセルフュージョンにより、モデルＢＴＸ  Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して、非分泌ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５８１）と、１：１の比で融合した。細胞を、アザセリン、１５％の胎性クローンＩ血清（Ｔｈｅｒｍｏ＃ＳＨ３００８０−０３）、１０％のＢＭ順化培地（Ｒｏｃｈｅ＃１０６６３５７３００１）、１ｍＭの非必須アミノ酸（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃２５−０２５−ＣＩ）、１ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃２５−０６０−ＣＩ）、１００ＩＵのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３０−００２−ＣＩ）及び１００ＩＵのＬ−グルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃２５−００５−ＣＩ）を補足したＤＭＥＭ培地からなるハイブリドーマ選択培地に再懸濁し、１００ｍＬの選択培地を含有する３つのＴ２２５フラスコ中で培養した。フラスコを、７％ＣＯ２及び９５％空気を含有する加湿３７℃インキュベータ内に６日間、置いた。
【０５３５】
融合後の６日目に、ハイブリドーマライブラリ細胞を一時的に冷凍した。この細胞は、ハイブリドーマ選択培地中で解凍し、３７℃の加湿インキュベータ中、１日間、休ませた。細胞をフラスコから選別し、９０μＬの補足したハイブリドーマ選択培地（上記の通り）中の、ウェルあたり細胞１個で、１２のＦａｌｃｏｎ３８４ウェルプレートに蒔いた（ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｉ細胞ソーターを使用）。未使用ハイブリドーマライブラリ細胞の残りを、今後のライブラリ試験及びスクリーニングのために、液体窒素中で凍結した。
【０５３６】
ハイブリドーマを１０日間、培養して、１２×３８４クローン由来の上清を、以下の方法を使用して、ファミリーメンバーｈＡＳＣＬ２と未だ交差反応していないｈＡＳＣＬ１に特異的な抗体について、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ＰＢＳバッファー中、０．５μｇ／ｍＬの精製したｈＡＳＣＬ１−Ｆｃ又はｈＡＳＣＬ２−Ｆｃによりプレートを被覆し、４℃において一晩、インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳＴにより洗浄し、５％ＦＢＳを含むＰＢＳにより３７℃において３０分間、ブロッキングした。このブロッキング溶液を除去し、１５μｌのＰＢＳＴをウェルに加えた。ハイブリドーマ上清２５μｌを加えて、４℃で一晩、インキュベートした。ＰＢＳＴにより洗浄した後、ＰＢＳＡ中、１：１０，０００に希釈した、ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを３０μＬ／ウェルで、室温で３０分間、加えた。このプレートを洗浄して、２５μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を室温で約５分間、加えることにより展開させた。等量の０．２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えて、基質展開を停止させた。次に、この試料をＯＤ４５０において分光光度計により分析した。ＡＳＣＬ１プレートに対するバックグラウンドの３倍大きなＯＤ４５０を有した上清を、正の反応性があると見なした一方、ＡＳＣＬ２プレートに対するバックグラウンドの３倍大きなＯＤ４５０をやはり有した任意のクローンは交差反応性があるとして除外した。ｈＡＳＣＬ１−Ｆｃ免疫付与キャンペーンに由来するこれらの１２×３８４クローンのスクリーニングにより、ｈＡＳＣＬ１に特異的に結合したが、関連ファミリーメンバーＡＳＣＬ２には特異的に結合しなかった多数の抗体が生成し、これらの８０種をさらなる特徴づけのために持ち越した。
【０５３７】
第２の免疫付与キャンペーンは、以下の修正を伴う、第１のキャンペーンと同様に行った：１）２９９×１０６細胞をエレクトロセルフュージョンにより、モデルＢＴＸ  Ｈｙｂｒｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して、非分泌ＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５８１）と、１：１の比で融合した。融合後の６日目に、ハイブリドーマ細胞を解凍して、この日に選別した。１０日間の培養後、６×３８４クローンを、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングして、ｈＡＳＣＬ１−ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）に対してポジティブな抗体を選択し、ＧＳＴによりタグ付けされた無関係タンパク質をカウンタースクリーニングした。この一部として、１：１０：０００に希釈したＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇＧの代わりに、ＰＢＳＡ中に１：５０００に希釈したＡＬＫホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを使用した。ＥＬＩＳＡ試料は、ＯＤ４５０の代わりにＯＤ４０５で解析した。
【０５３８】
［実施例９］
抗ＡＳＣＬ１抗体の配列決定
前述に基づいて、見かけ上高親和性で、固定化されたヒトＡＳＣＬ１又はｈ２９３−ｈＡＳＣＬ１細胞に結合するいくつかの例示的な別個のモノクローナル抗体を、配列決定及びさらなる解析のために選択した。実施例８において生成した、選択したモノクローナル抗体由来の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列解析により、多くが新規の相補性決定領域を有し、多くの場合、新規のＶＤＪ配置を表示したことが確認された。
【０５３９】
実施例２において生成した抗ＡＳＣＬ１マウス抗体は、以下に記載されている通りに配列決定した。全ＲＮＡは、製造業者の指示に従い、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、選択されたハイブリドーマ細胞から精製した。試料あたり１０４〜１０５個の間の細胞を使用した。単離されたＲＮＡ試料は、使用するまで−８０℃において保存した。
【０５４０】
各ハイブリドーマのＩｇ重鎖の可変領域を、完全マウスＶＨレパートリーを標的とするように設計した８６のマウス特異的リーダー配列プライマーを含む２つの５’プライマーミックスと、全てのマウスＩｇアイソタイプに特異的な３’マウスＣγプライマーとを組み合わせて使用して増幅させた。同様に、Ｖκマウスファミリーのそれぞれを増幅するように設計した６４の５’Ｖκリーダー配列を含む２つのプライマーミックスを、マウスカッパ定常領域に特異的な単一リバースプライマーと組み合わせて使用し、カッパ軽鎖を増幅させ配列決定した。ＶＨ及びＶＬ転写産物は、１００ｎｇの全ＲＮＡから、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｎｅ工程ＲＴ−ＰＣＲキットを以下のように使用して増幅した。全部で４つのＲＴ−ＰＣＲ反応を各ハイブリドーマについて実施し、２つはＶκ軽鎖について、２つはＶＨ重鎖に対して行った。ＰＣＲ反応混合物は、１．５μＬのＲＮＡ、０．４μＬの１００μＭの重鎖又はカッパ軽鎖いずれかのプライマー（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによりカスタム合成）、５μＬの５×ＲＴ−ＰＣＲバッファー、１μＬのｄＮＴＰ並びに逆転写酵素及びＤＮＡポリメラーゼを含有する０．６μＬの酵素ミックスを含んでいた。サーマルサイクラープログラムは、５０℃で６０分、９５℃で１５分、続いて３５サイクル×（９４．５℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で１分間）のＲＴ工程であった。次いで最終インキュベーションを７２℃で１０分間実施した。
【０５４１】
抽出されたＰＣＲ産物を、可変領域の増幅について上述したものと同じ特異的可変領域プライマーを使用して配列決定した。ＰＣＲ産物を、ＰＣＲ精製及び配列決定サービスのための外部配列決定提供業者（ＭＣＬＡＢ）へと送付した。ヌクレオチド配列を、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴｍｅｄｉｃａｌ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ａｎａｌｙｓｉｓ．ｈｔｍｌと特定されるウエブサイトにおいてオンラインで入手可能な、ＩＭＧＴ配列解析ツールを使用して分析し、最も高い配列相同性を有する生殖細胞系Ｖ、Ｄ及びＪ遺伝子メンバーを特定した。誘導した配列は、専売抗体配列データベースを使用してＶＨ及びＶＬ遺伝子をマウス生殖系列データベースにアラインメントすることにより、ＩｇのＶ−及びＪ−領域の既知の生殖系列ＤＮＡ配列と比較した。
【０５４２】
図３Ａは、抗ＡＳＣＬ１抗体からの新規なマウス軽鎖可変領域の連続するアミノ酸配列を図示している一方、図３Ｂは、同じ抗ＡＳＣＬ１抗体からの新規なマウス重鎖可変領域の連続するアミノ酸配列を図示している。マウス軽鎖及び重鎖可変領域アミノ酸配列が一緒になって、配列番号５２１〜５７３（奇数）に示されている。
【０５４３】
より詳細に、図３Ａ及び３Ｂは、（１）配列番号５２１の軽鎖可変領域（ＶＬ）及び配列番号５２３の重鎖可変領域（ＶＨ）；又は（２）配列番号５２５のＶＬ及び配列番号５２７のＶＨ；又は（３）配列番号５２９のＶＬ及び配列番号５３１のＶＨ；又は（４）配列番号５３３のＶＬ及び配列番号５３５のＶＨ；又は（５）配列番号５３７のＶＬ及び配列番号５３９のＶＨ；又は（６）配列番号５４１のＶＬ及び配列番号５４３のＶＨ；又は（７）配列番号５４５のＶＬ及び配列番号５４７のＶＨ；又は（８）配列番号５４９のＶＬ及び配列番号５５１のＶＨ；又は（９）配列番号５５３のＶＬ及び配列番号５５５のＶＨ；又は（１０）配列番号５５７のＶＬ及び配列番号５５９のＶＨ；又は（１１）配列番号５６１のＶＬ及び配列番号５６３のＶＨ；又は（１２）配列番号５６５のＶＬ及び配列番号５６７のＶＨ；又は（１３）配列番号５６９のＶＬ及び配列番号５７１のＶＨ；又は（１４）配列番号５２１のＶＬ及び配列番号５７３のＶＨを含めた、マウス抗ＡＳＣＬ１抗体の注釈つき配列を提示している。
【０５４４】
開示される抗体（又は、これらを生成するクローン）を、これらのそれぞれの表示（例えば、ＳＣ７２．２、ＳＣ７２．２８など）及び可変領域核酸又はアミノ酸の配列番号（図３Ａ〜３Ｃを参照）と一緒してまとめたものが、直下の表８に示されている。
【０５４５】
【表８】
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【０５４６】
図３Ａ及び図３Ｂにおいて、ＶＬ及びＶＨアミノ酸配列に注釈をつけて、Ｋａｂａｔらに準拠して定義される、フレームワーク領域（すなわち、ＦＲ１〜ＦＲ４）及び相補性決定領域（すなわち、図３Ａ中のＣＤＲ−Ｌ１〜ＣＤＲ−Ｌ３又は図３Ｂ中のＣＤＲ−Ｈ１〜ＣＤＲ−Ｈ３）を同定する。可変領域配列は、Ａｂｙｓｉｓデータベースの専売のバージョンを使用して解析し、ＣＤＲ及びＦＲの表示を得た。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらに従い定義されるが、当業者は、ＣＤＲ及びＦＲの表示はまた、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は他の任意の許容された命名法システムに従って定義され得ることを理解する。さらに、図３Ｃは、図３Ａ及び３Ｂに示されているアミノ酸配列をコードする核酸配列（配列番号５２０〜５７２、偶数）を提示している。
【０５４７】
図３Ａ及び３Ｂ、並びに表８において分かる通り、特定のマウス抗体のそれぞれに対する重鎖及び軽鎖可変領域アミノ酸配列の配列番号は、一般に、連続する奇数である。したがって、モノクローナル抗ＡＳＣＬ１抗体ＳＣ７２．２は、それぞれ軽鎖及び重鎖可変領域に関してアミノ酸配列番号５２１及び５２３を含む。ＳＣ７２．２８は、配列番号５２５及び５２７を含む。ＳＣ７２．５２は、配列番号５２９及び５３１を含むなどである。連続する番号付けスキームの唯一の例外は、固有の重鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号５７３）を伴う、クローンＳＣ７２．２（配列番号５２１）と同じ軽鎖可変領域アミノ酸配列を含むＳＣ７２．９３である。いずれにしても、マウス抗体アミノ酸配列（図３Ｃに示されている）をコードする対応するアミノ酸配列は、対応するアミノ酸の配列番号の直前の配列番号を有する。したがって、例えば、ＳＣ７２．２抗体のＶＬ及びＶＨの核酸配列の配列番号は、それぞれ配列番号５２０及び５２２となる。
【０５４８】
［実施例１０］
標的治療を受けた腫瘍中のＤＬＬ３発現
ＤＬＬ３は、転写因子ＡＳＣＬ１の標的であり、ＳＣＬＣ及び他の神経内分泌腫瘍において発現する。公に入手可能なデータセットをＤＬＬ３発現に関して解析し、得られたデータを図４〜１０に図示する。この解析の結果より、ＤＬＬ３発現は、様々な腺癌の形質転換時に、神経内分泌表現型、特に標的治療を以前に受けた腫瘍に上方調節されることが示唆される。
【０５４９】
図４は、Ｔｚｅｌｅｐｉ、２０１２年（ＰＭＩＤ：２２１５６６１２）に記載されているデータの解析を示す。この解析により、ＤＬＬ３発現は、正常な前立腺試料又はＡＲ発現を維持するＣＲＰＣ（ＣＲ／ＡＲ＋）とは対照的に、ＡＲ発現を喪失（ＣＲ／ＡＲ−）し、かつＣＨＧＡ及びＳＹＰのような神経内分泌マーカーを発現するＣＲＰＣの患者由来異種移植片（ＰＤＸ）試料に限られることが明らかである。
【０５５０】
図５は、Ｖａｒａｍｂａｌｌｙ、２００５年（データベースＧＳＥ３３２５；ＰＭＩＤ：１６２８６２４７）に記載されているデータの解析を示す一方、この解析により、４つの転移性前立腺がん試料のうちの２つにおいて、ＤＬＬ３発現があることが明らかになり、良性前立腺試料又は臨床的に局在化している前立腺腺癌では、ＤＬＬ３発現はなかった。
【０５５１】
図６は、Ｌｉｎ、２０１３年（ＰＭＩＤ：２４３５６４２０）に記載されている解析を示しており、この解析により、神経内分泌に形質変換されたＣＲＰＣ（ＮＥＰＣ）においてＤＬＬ３発現があり、前立腺腺癌（ＰＣａ）にはＤＬＬ３発現がなかったことが明らかとなった。
【０５５２】
図７は、Ａｋａｍａｔｓｕ、２０１５年（ＰＭＩＤ：２６２３５６２７）に記載されているデータの解析を示しており、これらのデータにより、ＡＲ＋及びＰＳＡ＋であるホルモンナイーブな前立腺腺癌に由来する生検のＬＴＬ３３１は、ＤＬＬ３ネガティブであることが明らかになった。ＣＲＰＣ（再燃性）の再燃及び発症後の患者に由来するこの後の生検により、ＤＬＬ３の発現が高いことが示される。ＬＴＬ３３１は、後で、ビカルタミドによる処理によって去勢されたマウス宿主におけるＰＤＸとして確立された。時間点（去勢後日数）により、去勢マウス（ＬＴＬ３３１Ｒ）において、ＣＲＰＣを発症するまでＤＬＬ３発現がないことが示される。ＡＳＣＬ１、ＥＮＯ２、ＮＣＡＭ１及びＳＹＰを含めた、神経内分泌マーカーもやはり、ＬＴＬ３３１Ｒ、及び再燃時の患者生検において、専ら発現する。ＣＨＧＡ発現は、ＣＲＰＣを発症する直前の８４日目に起こる。
【０５５３】
図８は、Ａｋａｍａｔｓｕ、２０１５年（ＰＭＩＤ：２６２３５６２７）に記載されているデータをさらに解析したものを示しており、この解析により、この患者では、ＰＥＧ１０を含む、ある特定のマーカーの発現が再燃前に変化したことが明らかとなった。より詳細には、ＰＥＧ１０発現は、去勢の３週間後に向上し、ＣＲＰＣ発症の間、上昇し続けている。この解析により、ＳＰＤＥＦ、ＰＴＧＥＲ４及びＥＲＧ発現の段階的な低下及び／又は喪失が、マウス宿主の去勢中の早期に始まり、このことは、ＰＥＧ１０、ＳＰＤＥＦ、ＰＴＧＥＲ４及びＥＲＧが、神経内分泌表現型に移行するリスクにある腺癌のマーカーとして有用となり得ることを示唆している。
【０５５４】
図９は、Ｚｈａｎｇ、２０１５年（ＰＭＩＤ：２６０７１４８１）に記載されているデータの解析を示しており、この解析により、２０の前立腺腺癌（ＰＲ−Ａｄ）ＰＤＸは、ＤＬＬ３発現が低い又は全くない一方、４つの神経内分泌に形質転換したＣＲＰＣ  ＰＤＸは、ＤＬＬ３を高いレベルで発現することが明らかになった。
【０５５５】
図１０は、Ｎｉｅｄｅｒｓｔ、２０１５年（ＰＭＩＤ２５７５８５２８）に記載されているデータの解析を示しており、この解析により、ＥＧＦＲ  ＴＫＩ（感受性）に感受性の高いＥＧＦＲ変異体肺腺癌生検において、ＤＬＬ３発現がないこと、及びＴ７９０Ｍ抵抗性変異（抵抗性−Ｔ７９０Ｍ）を保持する肺線癌患者に由来する６つの生検試料においてＤＬＬ３発現がないことが明らかになった。対照的に、上皮間葉化移行（ＭＥＴ）（抵抗性−ＭＥＴ）、又はＳＣＬＣ形質転換（抵抗性−ＳＣＬＣ、同一患者からの２つの生検体）のどちらかのために、生理学的形質転換を受けてＥＧＦＲ  ＴＫＩに抵抗性となった肺腺癌において、ＤＬＬ３発現が向上していることが認められる。まとめると、この解析により、ＣＲＰＣ、及び神経内分泌表現型に形質転換した肺線癌において、ＤＬＬ３  ＲＮＡ発現が向上したことが示された。
【０５５６】
凝集物において、これらのデータにより、ＥＧＦＲ活性変異を有する前立腺腺癌又は肺腺癌のどちらかにおいて、ＤＬＬ３は集中的に発現されないことが示されている。しかし、標的治療、前立腺腺癌向けのアンドロゲン遮断療法、又はＥＧＦＲ変異肺腺癌向けのチロシンキナーゼ阻害剤による処理後、神経内分泌成分を有するように見える治療抵抗性腫瘍が発生している。この治療抵抗性腫瘍は、現在、ＤＬＬ３を発現している。
【０５５７】
［実施例１１］
抗ＤＬＬ３のＩＨＣにより、ＤＬＬ３がＣＲＰＣ腫瘍に発現することが実証される
ＤＬＬ３タンパク質発現がＣＲＰＣに認められることを確認するため、ＣＲＰＣ患者に由来する６つの骨転移生検試料を、抗ＤＬＬ３抗体を用いる免疫組織学により染色した。
【０５５８】
ＩＨＣは、実質的に以下の通り行った。ホルマリン固定してパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織の平面切片を切り出し、顕微鏡のガラス製スライド上に載せた。キシレンにより脱パラフィン化した後、切片を抗原賦活溶液（Ｄａｋｏ）により、９９℃で２０分間、予備処理し、２０分間、室温まで冷却して、次に、ＰＢＳ中の０．３％過酸化水素、次いでアジビン／ビオチンブロッキング溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により処理した。次に、ＦＦＰＥ切片を、ＰＢＳバッファー中の３％ＢＳＡ中の１０％ウマ又はロバ血清により、室温で３０分間、ブロッキングした。抗ＤＬＬ３抗体（クローンＳＣ１６．６５）は、３％ＢＳＡ／ＰＢＳに１０μｇ／ｍｌとなるまで希釈し、クロマグラニンＡ（クローンＳＰ１２、Ｓｐｒｉｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体をＢＳＡ／ＰＢＳ中、１：２００に希釈した。一次抗体を、切片に対して、室温で６０分間のインキュベートを適用した。ＦＦＰＥ切片を、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、２．５μｇ／ｍｌに希釈した、ビオチン−コンジュゲート化ウマ抗マウス二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）又はロバ抗ウサギ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）二次抗体と共に、室温で３０分間、インキュベートし、次いで、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  Ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中でインキュベートした。ＤＬＬ３染色の場合、増幅工程を使用した。ＦＦＰＥ切片を、室温で５分間、ビオチニルトリアミド中でインキュベートし、次いで、３０分間、ストレプトアビジンＨＲＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）中でインキュベートした。発色性検出を３，３’−ジアミノベンジジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、室温で５分間、展開し、組織をマイヤーヘマトキシリン（ＩＨＣ  Ｗｏｒｌｄ）により対比染色し、アルコールにより洗浄して、キシレン中に浸漬した。次に、切片を明視野顕微鏡法により観察し、ＤＬＬ３発現及びＣＨＧＡ発現をスコア化した。
【０５５９】
免疫組織化学により、１／６のＣＲＰＣ骨転移生検試料において、ＤＬＬ３タンパク質発現があることが分かり、開示したＤＬＬ３  ＡＤＣは、ＣＲＰＣの治療に使用することができることがさらに示された。
【０５６０】
［実施例１２］
ＩＨＣにより、ＤＬＬ３が選択した膀胱腫瘍に発現することが実証される
ある特定のマーカーが、ＤＬＬ３ポジティブ膀胱腫瘍の指標になるかどうかを判定するため、市販の腫瘍アレイを使用して、本明細書に示されている通り、ＩＨＣデータを生成した。
【０５６１】
この点において、図１１は、複数の腫瘍タイプによる、一般的ながんアレイ（Ｉｍｇｅｎｅｘ；ＩＭＨ−３２７）の免疫組織化学染色後に、ＤＬＬ３発現及びＣＨＧＡ発現を表形式でまとめたものである。データのさらなる解析により、９つの前立腺腺癌のうちの３つは、ＣＨＧＡをある程度発現することが明らかになり、これらのＣＨＧＡポジティブ腫瘍の１つは、ＤＬＬ３発現が＜１％の腫瘍細胞ポジティブを有した。
【０５６２】
この解析の結果は、アンドロゲン遮断療法による治療によりＡＲ依存性腫瘍細胞の大部分が殺傷された後でも、腫瘍異種性のために、希な神経内分泌に形質転換した細胞は成長可能であることを示唆した。前立腺に加えて、３／９の膀胱移行上皮癌（ＴＣＣ）生検試料及び１つの膀胱膠様腺癌において、希なＤＬＬ３に正の細胞が観察されたが、これらはＣＨＧＡネガティブであった（図１１）。
【０５６３】
小細胞の神経内分泌腫瘍は、膀胱に発生し、非常に侵襲的であるが、おそらく、標的治療がないために、標準化学療法により治療された膀胱のＴＣＣは、小細胞の神経内分泌腫瘍に形質変換すると報告されていなかった。神経内分泌癌と同時発生する腺癌が記載されており（Ｊｉａｎｇ  Ｙ  ２０１４年；ＰＭＩＤ：２５５８２２５１）、したがって、本明細書において提示されている解析に基づくと、膀胱癌も、腫瘍異種性のために、神経内分泌表現型に移行するリスクにあると同定することができる。
【０５６４】
［実施例１３］
ＰＤＸ腫瘍におけるＡＳＣＬ１  ｍＲＮＡの発現
固形腫瘍ががん患者に存在するときの、固形腫瘍の細胞異種性を特徴づけて、所与の腫瘍兆候内の分子サブタイプを明瞭にするため、当該技術分野で認識されている技術を使用して、ＰＤＸ腫瘍バンクを開発して維持した。多数の個別の腫瘍細胞株を含む、ＰＤＸ腫瘍バンクを、元々、様々な固形悪性腫瘍に罹患しているがん患者から得られた腫瘍細胞の複数回の継代により、免疫無防備状態マウスにおいて増殖させた。継代の少ないＰＤＸ腫瘍は、この天然環境における腫瘍を代表しており、腫瘍成長を推進する根本的な機構及び現在の治療法に対する耐性への臨床的に関連する洞察を提供する。次に、膵臓、結腸直腸及び肺の腫瘍の選択されたＰＤＸ細胞株を、直下に示すように調べた。
【０５６５】
ＡＳＣＬ１マイクロアレイ解析を行うため、ＰＤＸ腫瘍を、これらが８００〜２，０００ｍｍ３に達した後に、マウスから切除した。切除したＰＤＸ腫瘍を切り離して、当該技術分野で認識されている酵素消化技術を使用し、単一細胞懸濁液に入れた（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｎ．２００７／０２９２４１４を参照）。死滅細胞を検出するための４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、マウス細胞を特定するための抗マウスＣＤ４５及びＨ−２Ｋｄ抗体、及びヒト細胞を特定するための抗ヒトＥＰＣＡＭ抗体と共に、切り離したバルク腫瘍細胞をインキュベートした。１％  ２−メルカプトエタノールを補足したＲＬＴｐｌｕｓ  ＲＮＡ溶解バッファー（Ｑｉａｇｅｎ）中で細胞を溶解することにより、腫瘍細胞からＲＮＡを抽出し、この溶解物を−８０℃において凍結し、次に、ＲＮｅａｓｙ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出するため、溶解物を解凍した。ＲＮＡは、Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び／又はＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して定量した。正常組織のＲＮＡは、様々な供給元（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、ＢｉｏＣｈａｉｎ及びＣｌｏｎｔｅｃｈ）から購入した。得られた全ＲＮＡ調製物をマイクロアレイ解析（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって評価した。
【０５６６】
様々なＰＤＸ株（及び、操作した２９３の細胞対照）に関するマイクロアレイ実験を行い、以下の通りデータを解析した：ＰＤＸ株から、実質的に上記のように、全腫瘍の総ＲＮＡ１〜２μｇを抽出した。ヒトゲノムにおいて、２７，９５８の遺伝子及び７，４１９のｌｎｃＲＮＡに対して設計された、５０，５９９の生物学的プローブを含むＡｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  ＧＥヒト８ｘ６０  ｖ２マイクロアレイプラットフォームを使用して、これらのＲＮＡ試料を解析した。標準的な業界の慣習を使用して、強度値を正規化して変換し、各試料に関する遺伝子発現を定量した。ＡＳＣＬ１発現の正規化された強度が、「マイクロアレイ発現」と題する図１２の列１に示されている。
【０５６７】
図１２に示されている通り、マイクロアレイ解析により、ＡＳＣＬ１は、いくつかの肺がん細胞株において発現することが実証され、ある特定の新生物障害、及び神経内分泌表現型に移行するリスクのある腫瘍の潜在的マーカーを検出する、診断する又は監視するためのマーカーを提供することができることを示している。
【０５６８】
［実施例１４］
ＩＨＣによるＡＳＣＬ１の発現
マイクロアレイ解析及び免疫組織化学（ＩＨＣ）を、ＰＤＸ腫瘍切片に実施し、腫瘍細胞におけるＡＳＣＬ１の発現を評価した。
【０５６９】
ＩＨＣは、実質的に以下の通り行った。ホルマリン固定してパラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織の平面切片を切り出し、顕微鏡のガラス製スライド上に載せた。キシレンにより脱パラフィン化した後、５μｍの切片を抗原賦活溶液（Ｄａｋｏ）により、９９℃で２０分間、予備処理し、７５℃まで冷却して、次に、ＰＢＳ中の０．３％過酸化水素、次いでアジビン／ビオチンブロッキング溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により処理した。次に、ＦＦＰＥスライドを、ＰＢＳバッファー中の３％ＢＳＡ中の１０％ウマ血清によりブロックし、一次抗ＡＳＣＬ１抗体（クローンＳＣ７２．２）によりインキュベートし、室温で３０分間、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で１０μｇ／ｍｌまで希釈した。ＦＦＰＥスライドは、ビオチン−コンジュゲート化ウマ抗マウス抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートし、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ中、室温で３０分間、２．５μｇ／ｍｌまで希釈し、次いで、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅ  Ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中でインキュベートした。発色性検出を３，３’−ジアミノベンジジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、室温で５分間、展開し、組織をマイヤーヘマトキシリン（ＩＨＣ  Ｗｏｒｌｄ）により対比染色し、アルコールにより洗浄して、キシレン中に浸漬した。次に、切片を明視野顕微鏡法により観察し、ＡＳＣＬ１発現を書き留めた。検討の結果が図１２に示されている。
【０５７０】
図１２の精査により、ＡＳＣＬ１発現が、ＡＳＣＬ１（２９３−ＡＳＣＬ１）を発現するよう操作されている２９３の細胞の核（ｎ）中に検出されたが、ナイーブな２９３の細胞では検出されなかったことが示される。ＰＤＸ腫瘍は、ＩＨＣにより染色し（図１２）、ＩＨＣによるＡＳＣＬ１タンパク質発現は、マイクロアレイ結果に基づいて予想されるＡＳＣＬ１  ｍＲＮＡ発現と相関がある。
【０５７１】
当業者はさらに、本発明が、本趣旨又は中心的な特性から逸脱することなく、他の特定の態様に具現化され得ることを理解している。本発明の上述の記載がこの例示的な実施形態しか開示していないという点において、他の変形が本発明の範囲内であることが企図されることが理解される。したがって、本発明は、本明細書において詳細に記載されている特定の実施形態に限定されない。むしろ、参照は、本発明の範囲及び内容の指標として添付の特許請求の範囲に対してなされるべきである。
【図１Ａ−１】
2019516705.tif 000047
【図１Ａ−２】
2019516705.tif 000048
【図１Ａ−３】
2019516705.tif 000049
【図１Ａ−４】
2019516705.tif 000050
【図１Ａ−５】
2019516705.tif 000051
【図１Ａ−６】
2019516705.tif 000052
【図１Ｂ−１】
2019516705.tif 000053
【図１Ｂ−２】
2019516705.tif 000054
【図１Ｂ−３】
2019516705.tif 000055
【図１Ｂ−４】
2019516705.tif 000056
【図１Ｂ−５】
2019516705.tif 000057
【図１Ｂ−６】
2019516705.tif 000058
【図２】
2019516705.tif 000059
【図３Ａ】
2019516705.tif 000060
【図３Ｂ】
2019516705.tif 000061
【図３Ｃ−１】
2019516705.tif 000062
【図３Ｃ−２】
2019516705.tif 000063
【図３Ｃ−３】
2019516705.tif 000064
【図３Ｃ−４】
2019516705.tif 000065
【図４】
2019516705.tif 000066
【図５】
2019516705.tif 000067
【図６】
2019516705.tif 000068
【図７】
2019516705.tif 000069
【図８】
2019516705.tif 000070
【図９】
2019516705.tif 000071
【図１０】
2019516705.tif 000072
【図１１】
2019516705.tif 000073
【図１２】
2019516705.tif 000074
【配列表】
2019516705000001.app
【国際調査報告】
2019516705.tif 000075
2019516705.tif 000076