(57)【要約】本発明は、房水及び／または硝子体液に由来する細胞外小胞の組成物、ならびに眼疾患の治療のために眼組織に治療剤を送達するためのそれらの用途に関する。さらに、該組成物を作る方法を開示する。眼症状を治療及び診断する方法も開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の房水細胞外小胞及び／または硝子体液細胞外小胞
を含む組成物であって、
前記細胞外小胞が、１つ以上の外因性作用物質を含有するように改変されている、
前記組成物。
【請求項２】
前記１つ以上の外因性作用物質が、核酸分子、タンパク質またはポリペプチド、小分子、ホルモン及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記外因性作用物質が、リボ核酸、低分子ＲＮＡ分子、相補的ＲＮＡ、非コードＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ、ｐｉ−ＲＮＡ分子、マイクロＲＮＡ分子、ｓｎｏ−ＲＮＡ分子、長鎖非コードＲＮＡ分子、伝令ＲＮＡ分子、リボソームＲＮＡ分子、アンチセンス核酸分子、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンタゴミル、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集ＲＮＡ、トランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、「足場」配列からなる短鎖合成ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、低分子カハール体特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、天然シスアンチセンスｓｉＲＮＡ（ｃｉｓ−ｎａｔ−ｓｉＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、反復配列関連低分子干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、７ＳＫ、転移−伝令ＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、７ＳＬ  ＲＮＡ、シグナル認識粒子ＲＮＡ（ＳＲＰ）及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸分子を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記外因性作用物質が、低分子デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子、ｃＤＮＡ分子、オリゴヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、デオキシリボ核酸アプタマー、デオキシリボ核酸ザイム及びそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記外因性作用物質が、
ウイルスベクター、細菌ベクター、プラスミドベクターまたはそれらの任意の組み合わせ
の中に入った状態で運ばれる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記外因性作用物質がタンパク質またはポリペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記外因性作用物質が小分子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記１つ以上の細胞外小胞が、哺乳動物対象の房水及び／または硝子体液を含有する眼内液から単離される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記哺乳動物対象がヒト対象またはウシ対象である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記１つ以上の細胞外小胞が、真核細胞特異的な標的指向性分子を前記小胞の外表面に提示するようにさらに改変されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記外因性作用物質が治療剤を含み、
前記組成物が、薬学的に許容できる担体をさらに含んでいる、
請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
徐放性または持続放出性材料へと製剤化される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
対象の選定された細胞または組織に治療剤を送達する方法であって、以下の段階：
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物を提供する段階であって、前記外因性作用物質が治療剤を含む、段階；ならびに、
治療剤を含有するように改変された前記房水細胞外小胞及び／または硝子体液細胞外小胞を前記対象の前記選定された細胞または組織に送達するのに有効な条件下で、前記対象に前記組成物を投与する段階
を含む、前記方法。
【請求項１４】
眼疾患を有する対象を選択する段階をさらに含み、
前記投与する段階が、前記眼疾患の治療として前記治療剤を前記対象の眼細胞または組織に送達するために行われる、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与が、局所投与、全身投与、眼周囲投与または眼内投与から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記眼内投与が、前房内（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌ）投与、硝子体内投与または網膜下投与によって行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記眼周囲投与が、結膜下注射、テノン嚢下注射、直接眼周囲注射または眼周囲蓄積注射によって行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記全身投与が、静脈内投与、経口投与、動脈内投与、吸入、鼻腔内投与、腹膜腔内投与、腹腔内投与、皮下投与、関節内投与、クモ膜下腔内投与、経硬膜投与、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）投与、粘膜下投与、舌下投与、経腸投与、非経口投与、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与、関節周囲投与または脳室内投与によって行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
硝子体液及び／または房水を含む哺乳動物眼内液試料を提供する段階；
前記眼内液試料から細胞外小胞を単離する段階；ならびに
前記単離された細胞外小胞の中に前記１つ以上の外因性作用物質を挿入する段階
を含む、請求項１に記載の組成物を作る方法。
【請求項２０】
前記挿入する段階が、電気穿孔、トランスフェクション、ウイルスベクター送達またはそれらの任意の組み合わせを用いて行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記挿入する段階に先立って、前記単離された細胞外小胞の内在性内容物を除去する段階
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記除去する段階が、紫外線照射を用いて行われる、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１６年９月９日に出願された米国仮特許出願第６２／３８５，７１１号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、米国国立衛生研究所から助成金番号ＵＬ１  ＴＲ０００４５７−０６の下に政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、眼疾患の治療のために治療剤を眼組織に送達するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
眼内構造体への核酸（例えば、遺伝子、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは他の非コードＲＮＡ）、タンパク質及び／または小分子の送達を伴う療法は、眼疾患を含めた疾患において極めて大きな治療的可能性を有する。しかしながら、生物学的活性分子をその標的部位に直接送達することができないことは、眼疾患の治療における大きな制約である。血液−網膜関門は網膜内へのほとんどの分子の透過を防止する。同様の制約が他の眼組織に存在する。
【０００５】
例えば、多くの網膜変性症状の原因は、単一遺伝子の突然変異である。突然変異遺伝子の正常なコピー、または当該遺伝子によってコードされるタンパク質の送達は、そのような疾患の進行を防止する潜在能を有する。これらの遺伝子の直接送達は、細胞外環境における遊離遺伝物質の不安定性をはじめとする複数の因子によって制限される。タンパク質の直接送達は同様に、細胞外組織における不安定性ならびに、血液−網膜関門及び他の天然の関門の透過に対する制約によって制限され得る。核酸、タンパク質または小分子を細胞内へもたらすプロセスの開発は、眼科療法に変革をもたらす可能性がある。
【０００６】
同様に、複数の網膜疾患、例えば、湿潤型加齢黄斑変性症、糖尿病網膜症、複数の原因による黄斑浮腫などは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）レベルの上昇と関連付けられている。ＶＥＧＦを阻害する抗体または小分子の硝子体内注射はこれらの疾患に有効な療法であるが、頻繁な注射を必要とすることが多い。ｓＦＬＴ−１などの天然に存在する抗ＶＥＧＦタンパク質をコードする遺伝子を使用する遺伝子療法など、代替的手法によってＶＥＧＦを低減する複数の手法が試みられてきた。これらの遺伝子療法手法は、過去には、アデノウイルスベクター（またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）などのウイルスベクターを遺伝子送達のために使用してきた。網膜疾患のためのＡＡＶベクターに基づく遺伝子送達は、ウイルスベクター自体の潜在的毒性または免疫原性のために制限される。その上、近年の治験はこの技術を利用することを試みたが、治験は失敗のために中止された。
【０００７】
本発明の狙いは、当技術分野におけるこのような欠点を克服することである。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の第１の態様は、１つ以上の房水細胞外小胞及び／または硝子体液細胞外小胞を含む組成物に関する。組成物の房水小胞及び硝子体小胞は、１つ以上の外因性作用物質を含有するように改変されている。
【０００９】
本発明の別の態様は、対象の選定された細胞または組織に治療剤を送達する方法に関する。この方法は、１つ以上の房水小胞及び／または硝子体液小胞を含む組成物を提供することを伴い、組成物の小胞は、１つ以上の治療剤を含有するように改変されている。方法はさらに、治療剤（複数可）を含有するように改変された１つ以上の房水細胞外小胞及び／または硝子体液細胞外小胞を含む組成物を対象の選定された細胞または組織に送達するのに有効な条件下で、対象に組成物を投与することを伴う。
【００１０】
本発明の別の態様は、１つ以上の房水小胞及び／または硝子体液小胞を含む組成物を作る方法に関するものであり、組成物の小胞は、１つ以上の外因性作用物質を含有するように改変されている。この方法は、硝子体液及び／または房水を含む哺乳動物眼内液試料を提供する段階、及び上記眼内液試料から小胞を単離する段階を伴う。方法はさらに、単離された小胞の中に１つ以上の外因性作用物質を挿入する段階を伴う。
【００１１】
本明細書では、治療目的のために眼の硝子体液中及び／または房水中に存在する小胞を使用して遺伝子、タンパク質または小分子を送達する、組成物ならびに方法について記載する。これらの小胞は、眼から安全に採取することができ、それらの天然の内容物を空にすることができ、その後に治療物質（核酸、タンパク質または小分子）で満たすことができる。次いでそれらを、静脈内または眼内への注射をはじめとするいくつかの経路によって患者に投与することができる。小胞は標的細胞によって吸収され、治療効果を発揮するのに適した形態で搭載薬が放出される。小胞の細胞表面上の標的指向性分子を、小胞が疾患部位を直接標的とすることができるように改変することができ、それによって、無関係な組織への毒性を低減することができる。最も重要なことには、これらの小胞が硝子体中に既存する内因性生理学的物体であるため、眼の繊細な神経構造体に対する毒性または免疫原性をほとんど伴わずにそれらの採集、装填及び再投与を治療目的のために実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａ〜図１Ｇは、細胞外小胞（ＥＶ）が、ホルマリン固定されたウシ硝子体組織から脱出する、及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）−ホルマリン固定によって保持されることを示す。図１Ａは、洗浄用緩衝液（上清）中に浸され３７℃に加熱されたホルマリン固定硝子体（Ｖｉｔ）組織がＥＶ（矢尻）及び硝子体コラーゲン（Ｃ、塗り潰し矢印）の上清中への脱出を招くことを示す模式図である。図１Ｂ〜図１Ｃは、ホルマリン固定されたウシ硝子体組織から３７℃でのインキュベーション後に採取した上清の代表的な透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）顕微鏡写真であり、酢酸ウラニル（ＵＡ）及びクエン酸塩による染色は、洗浄用緩衝液へと逸出したコラーゲン鎖（Ｃ、塗り潰し矢印）及び多数のＥＶ（矢尻）の証拠を示す。図１Ｄは、洗浄用緩衝液中に浸され３７℃に加熱されたＥＤＣ−ホルマリン固定硝子体組織が、上清中へのＥＶの逸出を伴わず硝子体コラーゲン鎖の逸出を最小限に抑えてＥＶの組織中での保持をもたらすことを示す模式図である。図１Ｅは、３７℃でのインキュベーション後のＥＤＣ−ホルマリン固定硝子体組織からの上清の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真を示し、ＵＡ及びクエン酸塩による染色は、上清中にコラーゲン鎖（Ｃ、塗り潰し矢印）がほとんどなくＥＶが全くないことを示している。図１Ｆは、特異性対照であるＰＢＳ単独の代表的ＴＥＭ写真を示し、これは上清においてコラーゲン線維もＥＶも示していないが、２０ｎｍ未満と測定される高電子密度焦点の非特異的な点状染色（ＮＳ、開矢印）を示している。図１Ｇは、ホルマリン固定硝子体組織の上清（洗浄用緩衝液）（左レーン）及び硝子体液試料（右レーン）の中のエクソソームマーカーＴＳＧ−１０１を検出しているウェスタンブロッティングを示す。スケールバーは、（図１Ｂでは）２．５μｍ、（図１Ｃでは）５００ｎｍ、（図１Ｅ〜図１Ｆでは）２００ｎｍである。
【図２−１】図２Ａ〜図２Ｆは、多焦点顕微鏡法（ＭＰＭ）によって撮像されるウシ硝子体のＥＤＣ−ホルマリン固定がホルマリン固定単独と比較してＥＶを保持することを示す。図２Ａは、高透明度のゲル様構造体であることを実証する、視力検査カード上に置かれたウシ硝子体の全体画像である。図２Ｂは、ホルマリン単独で固定され、タンパク質をマークするためにＣＦＳＥ（橙色）、及び核をマークするためにヘキスト（紫色）で染色された、全載ウシ硝子体標本の代表的なＭＰＭ顕微鏡写真を示す。ＣＦＳＥ信号は、核を囲んでいるのが観察されるが（図２Ｂ、左パネル、開矢印）、細胞外空間には観察されない。核染色は細胞外の染色を示さない（図２Ｂ、左パネル、紫色、開矢印）。図２Ｃは、ＣＦＳＥ（橙色）及びヘキスト（紫色）で染色されたＥＤＣ−ホルマリン固定硝子体の代表的なＭＰＭ顕微鏡写真を示す。画像の重ね合わせは、細胞体（開矢印で表される）に合致する陽性信号ならびに、大きさ及び形状がＥＶに合致する細胞外タンパク質信号の焦点（矢尻）を示している。図２Ｄは、図２Ｃの挿入図（白い四角）であるが、核染色の領域（図２Ｄ、右パネル、開矢尻、紫色）を囲んでいる複数個の丸い細胞内焦点（図２Ｄ、左パネル、開矢尻、橙色）が示されている。大きさ及び形状がＥＶに合致する多数の集束点状の細胞外タンパク質信号が観察され（図２Ｄ、左パネル、塗り潰し矢尻、橙色）、細胞外ＤＮＡは観察されない。図２Ｅは、硝子体細胞１つあたりのＥＶの平均±標準偏差個数を表すグラフであり、ＥＤＣ−ホルマリン固定された硝子体が、ホルマリン固定された硝子体よりも著しく多いＥＶを呈することを示す。ｐ値は０．０５未満である。スケールバーは、（図２Ａでは）１ｃｍ、（図２Ｂでは）４０μｍ、（図２Ｃでは）５０μｍであり、（図２Ｄでは）１０μｍである。
【図２−２】図２Ａ〜図２Ｆは、多焦点顕微鏡法（ＭＰＭ）によって撮像されるウシ硝子体のＥＤＣ−ホルマリン固定がホルマリン固定単独と比較してＥＶを保持することを示す。図２Ｆは、ＭＰＭによって撮像したウシ硝子体ＥＶ直径の頻度分布のグラフ図である。４，０００個のＥＶについてＥＶの大きさを測定し、ＥＶの頻度をＥＶの直径に対してプロットした。多光子顕微鏡観察の下限は２００ｎｍであり、６０００ｎｍまでのＥＶが測定された。ＥＶは細胞とは区別され、細胞外ＤＮＡを伴わず細胞外タンパク質またはＲＮＡを含有するものとして定義された。
【図３】図３Ａ〜図３Ｃは、ＥＤＣ−ホルマリンによるウシ硝子体の固定がＥＶ及び細胞外ＲＮＡを原位置に保持することを示す。図３Ａ〜図３Ｃは、ＤＮＡ及びＲＮＡをマークするためにヨウ化プロピジウム（ＰＩ、赤色）、ＤＮＡ及び核を可視化するためにヘキスト（青色）、ならびにタンパク質を染色するためのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、緑色）で染色した、ＥＤＣ−ホルマリン（図３Ａ及び図３Ｂ）またはホルマリン単独（図３Ｃ）と架橋させた全載ウシ硝子体標本の代表的な共焦点蛍光顕微鏡写真を示す。図３Ａは、ＥＤＣ−ホルマリン固定ウシ硝子体からの画像の重ね合わせであり、細胞体（図３Ａ、開矢印で表される）及び細胞外ＲＮＡの焦点（塗り潰し矢尻）に合致する陽性信号、ならびに大きさ及び形状がＥＶに合致する細胞外タンパク質（塗り潰し矢尻）を示す。図３Ｂは、ＥＤＣ−ホルマリン固定硝子体の代表的な共焦点蛍光顕微鏡写真を示し、複数個の丸い細胞性焦点（図３Ｂ、全パネル、開矢尻）ならびに、細胞間にある細胞外ＲＮＡ（図３Ｂ、左パネル、ＰＩ染色剤、赤色）及び細胞外タンパク質（図３Ｂ、右パネル、ＣＦＳＥ染色剤、緑色）の多数の集束点状の信号を示す。図３Ｃは、ホルマリン単独で固定された全載ウシ硝子体の代表的な顕微鏡写真を示し、核染色（図３Ｃ、中央パネル、ヘキスト、青色）と類似している核内のＲＮＡの信号（図３Ｃ、左パネル、ＰＩ、赤色）を示す。ホルマリン単独で固定された硝子体は細胞外ＲＮＡ信号の焦点を示さない（図３Ｃ、左パネル）。ＣＦＳＥ染色剤は細胞性信号（開矢印）を示すが、ＥＶ形状の細胞外タンパク質信号を示さない（図３Ｃ、右パネル、緑色、開矢印の間には点状染色が観察されない）。細胞の大きさはホルマリン単独固定ではより小さく見え、それはおそらく、ＥＤＣ−ホルマリンがホルマリン単独と比較してより多くの細胞質性のＲＮＡ及びタンパク質を保持しているからである。スケールバーは、（図３Ａでは）２５μｍ、（図３Ｂ〜図３Ｃでは）５０μｍである。
【図４】図４Ａ〜図４Ｃは、ＰＩで染色されたＥＤＣ−ホルマリン固定ウシ硝子体のＲＮアーゼ処理が低い細胞外信号を示していることを示す。図４Ａは、ＥＤＣ−ホルマリンで架橋させＰＩ（図４Ａ、上パネル、赤色）で染色した全載ウシ硝子体標本の低出力広視野蛍光顕微鏡写真を示すとともに、硝子体組織の細胞外環境における信号（挿入図、塗り潰し矢尻で表される）を示し、標識された核（図４Ａ、中央パネル、ヘキスト、青色）及び融合画像（図４Ａ、下パネル）を示す。硝子体細胞核はＰＩ及びヘキストで陽性に染色され、共局在信号が緑色で示されている（図４Ａ、下パネル、挿入図）。細胞は開矢尻で表され、細胞外ＰＩ信号の焦点は塗り潰し矢尻でマークしている（図４Ａ、上及び中央パネル、挿入図）。核を染色したが、細胞外ＤＮＡ信号は観察されない（図４Ａ、下パネル）。図４Ｂは、ＥＤＣ−ホルマリンで固定しＲＮアーゼＡで処理した全載ウシ硝子体の顕微鏡写真を示す。ＰＩ（図４Ｂ、上パネル、赤色）、ヘキスト（図４Ｂ、中央パネル）で染色した試料、及び融合画像（図４Ｂ、下パネル）を示す。ＲＮアーゼＡで処理された試料は、細胞体間における信号の欠如（図４Ｂ、上及び中央パネル）によって実証されるように、細胞外ＲＮＡの証拠を示さず、２つの細胞核の間に信号を示さない（開矢印）。ＲＮアーゼＡ処理試料における細胞質ＲＮＡのＰＩ信号（図４Ｂ、上パネル）は、おそらくＥＤＣ−ホルマリンがより多くの細胞質ＲＮＡを保持するため、ＲＮアーゼ処理前の試料（図４Ａ、上パネル）よりも小さく見える。図４Ｃは、ＲＮアーゼ処理前及びＲＮアーゼ処理後の、ＰＩで染色されたＥＤＣ−ホルマリン固定組織の細胞外信号の平均±標準偏差焦点のグラフ図であり、ＲＮアーゼ処理後にＥＶがより著しく少ないことを示している。細胞１個あたりのＥＶの平均±標準誤差焦点はＲＮアーゼ処理前には６０．７＋／−３５．１であり、ＲＮアーゼ処理後には０．０３＋／−０．０４であり、ＲＮアーゼ処理前では細胞１個あたりのＥＶが有意により多いことが分かる（ｐ＜０．００１）（図４Ｃ）。スケールバーは、（図４Ａ〜図４Ｂでは）５０μｍであり、（図４Ａ挿入図、図４Ｂ挿入図では）２０μｍである。
【図５】図５Ａ〜図５Ｂは、ウシ硝子体のＥＤＣ−ホルマリン固定がＥＶを保持することを顕微鏡写真で示す。図５Ａ〜図５Ｂは、ＥＤＣ−ホルマリン（図５Ａ）またはホルマリン単独（図５Ｂ）で架橋させた全載ウシ硝子体標本の低出力広視野蛍光顕微鏡写真を示す。図５Ａは、ＥＤＣ−ホルマリン固定され、タンパク質を標識するＣＦＳＥ（図５Ａ、上及び中央パネル、白色）及び核を標識するヘキスト（図５Ａ、下パネル、青色）で染色されたウシ硝子体の代表的な顕微鏡写真を示し、ＥＶに合致する多数の細胞外タンパク質信号（上及び中央パネル、ＣＳＦＥ、白色）と共に複数個の細胞性焦点（図５Ａ、全パネル、開矢尻）を示す。図５Ｂは、ホルマリン単独で固定された全載ウシ硝子体の顕微鏡写真において核染色剤（図５Ｂ、中及び下パネル、ヘキスト、青色）がＣＦＳＥ（図５Ｂ、上及び中央パネル、白色）と共局在しておりそれぞれ細胞ＤＮＡ及び細胞核酸に合致していることを示す。細胞外タンパク質信号の証拠は存在していない（図５Ｂ、上及び中央パネル、ＣＳＦＥ、白色）。ＣＦＳＥ染色細胞の大きさは、ホルマリン単独固定（図５Ｂ、中央パネル）ではＥＤＣ−ホルマリン固定（図５Ａ、中央パネル）と比較してより小さく見え、それはおそらくＥＤＣ−ホルマリンがホルマリン固定単独と比較してより多くの小タンパク質を保持しているからである。スケールバー（図５Ａ〜図５Ｂ）は１００μｍである。
【図６】図６Ａ〜図６Ｉは、ウシ及びヒト硝子体液がＥＶを含有することを示す。図６Ａは、酢酸ウラニル（ＵＡ）及びクエン酸塩によって染色されたウシ硝子体組織切片の代表的な透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）顕微鏡写真を示し、大きさに多形性がありコラーゲン鎖（矢印で「Ｃ」とマークした）と接触している相当数のＥＶ（矢尻）を示す。挿入図（右上隅）は、右下隅の四角で囲んだ領域の拡大であり、コラーゲン鎖と結びついているＥＶを示す。図６Ｂは、ウシ硝子体から単離され高電子密度のタンパク質染色剤ＣＳＦＥで染色されたＥＶの代表的なＴＥＭ顕微鏡写真を示すが、これはＥＶの形態を描写しており、大きさに多形性がある多数のＥＶを示している（小さめのＥＶに矢尻でマークし、大きめのＥＶに二重矢尻でマークした）。図６Ｃは、ウシ硝子体から単離したＥＶの代表的なＴＥＭ顕微鏡写真及び高電子密度の核酸染色剤アクリジンオレンジ（ＡＯ）による染色を示し、大きなＥＶ（二重矢尻）の陽性核酸信号を示す。図６Ｄは、高電子密度の核酸染色剤である臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）で染色された全載ウシ硝子体中のコラーゲンのネットワークの中の複数個のＥＶ（矢尻）を示す。図６Ｅは、ウシ硝子体から単離したＥＶのナノ粒子軌跡解析に基づくＥＶ直径に応じた平均（黒線）±標準誤差（赤色バー）濃度ＥＶのグラフ図を示す。図６Ｆは、ＵＡ及びクエン酸塩で染色された死後ヒト眼切片の代表的なＴＥＭ顕微鏡写真が、毛様体の無色素上皮（ＮＰＥ）に隣接する硝子体基底部（Ｖｉｔ）にある相当数のＥＶ（小さめのＥＶに矢尻でマークし、大きめのＥＶに二重矢尻でマークした）を示していることを示す。ＥＶ（図６Ｆ〜図６Ｇ、矢尻）はコラーゲン鎖（矢印）と接触している。図６Ｈは、ヒト硝子体から単離されＡＯで染色されたＥＶの代表的なＴＥＭ顕微鏡写真が陽性核酸信号を伴ったＥＶ（矢尻）を示していることを示す。図６Ｉは、ヒト硝子体ＥＶ直径の頻度分布のグラフ図である。スケールバーは、（図６Ａ、図６Ｇでは）１００ｎｍ、（図６Ｂでは）５０ｎｍ、（図６Ｃ〜図６Ｄ、図６Ｈでは）２００ｎｍ、（図６Ｆでは）２μｍである。
【図７】図７Ａ〜図７Ｄは、正常ウシ硝子体におけるＥＶ特異タンパク質ＴＧＳ−１０１の免疫組織化学染色を示す。図７Ａは、ホルマリンで固定し低温処理した全載ウシ硝子体標本の代表的な広視野蛍光顕微鏡写真を示し、細胞外空間におけるＥＶ関連タンパク質ＴＧＳ−１０１の免疫組織化学染色（図７Ａ、上及び中央パネル、矢尻、Ａｌｅｘａ４８８、緑色）を実証する。挿入図（図７Ａ、全パネル、右上）は中央の四角（図７Ａ、全パネル）の高倍率画像である。核はヘキスト対比染色剤でマークされている（図７Ａ、上及び下、青色、開矢印）。何百もの点状の細胞外信号が観察された（図７Ａ、上及び中央）。細胞外ＤＮＡの証拠は認められなかった（図７Ａ、下）。図７Ｂは、ＴＳＧ−１０１免疫組織化学の特異性対照である、非特異的ＩｇＧ抗体（緑色）で標識された全載正常ウシ硝子体からの代表的な顕微鏡写真を示す。挿入図（図７Ｂ、全パネル、右上）は中央の四角（図７Ｂ、全パネル）の高倍率画像である。核を囲んでいる信号が観察された（図７Ｂ、上及び中央、Ａｌｅｘａ４８８、緑色）。画像は細胞外信号の証拠を示さない（図７Ｂ、上及び下、ヘキスト、青色）。図７Ｃは、細胞外及び細胞内空間におけるＴＳＧ−１０１信号の平均＋／−標準誤差のグラフ図であり、対応のない２群のスチューデントのｔ検定によれば＊ｐ＜０．０５である。図７Ｄは、ホルマリン固定硝子体の細胞外空間にＴＳＧ−１０１の陽性信号（図７Ｄ、左、緑色）が観察されることを示す。核はヘキスト（図７Ｄ、左、青色）及びＰＩ（図７Ｄ、右、赤色）で標識されている。ホルマリン固定試料では細胞外ＲＮＡの証拠がない（図７Ｄ、右、赤色）。スケールバーは、（図７Ａ〜図７Ｂでは）４０μｍ、（図７Ａ挿入図、図７Ｂ挿入図及び図７Ｄでは）１０μｍである。
【図８】図８Ａ〜図８Ｂは、低速遠心分離後にウシ硝子体から細胞が除去されていることを示す。図８Ａは、低速遠心分離とそれに続くヘマトキシリン及びエオジン染色の後の全載ウシ硝子体の代表的な低出力光顕微鏡観察の顕微鏡写真を示す。これらの画像は、ヘマトキシリン染色された細胞核の証拠を伴わない、硝子体コラーゲンに合致するエオジン好性信号を示す（桃色、矢印）。図８Ｂは、遠心分離前の全載硝子体の画像を示す。これらの画像は、ヘマトキシリン染色された細胞核（紫色、開矢印）の証拠を伴う、硝子体コラーゲンに合致するエオジン好性信号（桃色、矢印）を示す。スケールバーは（図８Ａ〜図８Ｂについて）５０μｍである。
【図９】図９Ａ〜図９Ｉは、ヒト及びウシ硝子体ＥＶが内在性ＲＮＡを培養細胞内に移入させることを示す。図９Ａ〜図９Ｃは、核酸染色剤アクリジンオレンジ（ＡＯ）で予め標識された多量のウシ硝子体ＥＶで２４時間処理した後のヒト網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）の代表的な共焦点顕微鏡写真画像を示す。画像は、ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＥＶ標識ＲＮＡの取込みを示す（図９Ａ、緑色）。核が標識され（図９Ｂ、ヘキスト、紫色）、融合画像（図９Ｃ）は、細胞質におけるＡＯ信号によってＡＲＰＥ−１９細胞のトランスフェクションを示している。図９Ｄは、ウシ硝子体ＥＶで処理されたＡＲＰＥ−１９細胞のトランスフェクション効率（トランスフェクトされた細胞の％）のグラフ図である（エラーバーは標準偏差を表し、ｎ＝３、ｐ＜０．０５である）。図９Ｅ〜図９Ｆは、ＡＯで予め標識された多量のウシＥＶで２４時間処理したヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞の代表的な共焦点顕微鏡写真を示し、細胞質における染色を示す（図９Ｅ）。核が染色され、融合画像が示されている（図９Ｆ）。図９Ｇ及び図９Ｈは、死後ヒト硝子体から単離されＡＯで予め標識された多量のＥＶで３時間処理したＡＲＰＥ−１９細胞の代表的な低出力蛍光顕微鏡写真画像である。図９Ｇの画像は細胞のトランスフェクションを示す（図９Ｇ、ＡＯ、緑色）。核をマークした（図９Ｈ、ヘキスト、青色）。図９Ｉは、ヒト硝子体ＥＶで処理されたＡＲＰＥ−１９細胞のトランスフェクション効率（トランスフェクトされた細胞の％）のグラフ図である（エラーバーは標準偏差を表し、ｎ＝３、ｐ＜０．０５である）。スケールバーは、（図９Ａ〜図９Ｃでは）５０μｍ、（図９Ｅ〜図９Ｆでは）１５μｍ、（図９Ｇ〜図９Ｈでは）１００μｍである。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｆは、ウシ硝子体細胞外小胞（ＥＶ）による組換えウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパク質及び組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の培養ヒト網膜色素上皮（ＡＲＰＥ−１９）細胞への送達を示す。図１０Ａは、３００Ｖの電気穿孔によって１μｇのフルオレセイン結合ＢＳＡが予め装填された多量のウシ硝子体ＥＶで処理したＡＲＰＥ−１９細胞の代表的な顕微鏡写真である。図１０Ａの左の画像は、細胞質におけるフルオレセイン染色（黄色）を示す。図１０Ａの中央の画像は、ヘキスト染色剤（青色）で標識された核を示し、融合画像（図１０Ａ、右）は、トランスフェクトされた相当数の細胞を示している。図１０Ｂは、電気穿孔を伴わずに（０Ｖ、対照）ＢＳＡ−フルオレセインと混合されていた多量のウシ硝子体ＥＶで処理したＡＲＰＥ−１９細胞の代表的な顕微鏡写真である。図１０Ｂの左の画像はフルオレセイン染色を示さないが、図１０Ｂの右の画像はヘキスト染色剤（青色）による核標識を示す。図１０Ｃは、３００Ｖの電気穿孔によって３μｇ、１μｇまたは０．５μｇのＢＳＡ−フルオレセインが装填された硝子体ＥＶ及び、電気穿孔なし（０Ｖ、対照）で０．５μｇのＢＳＡ−フルオレセインが装填されたかまたは電気穿孔なし（０Ｖ、対照）でＰＢＳ単独が装填されたＥＶで処理した、ＡＲＰＥ−１９細胞の平均±標準偏差トランスフェクション効率（トランスフェクトされた細胞の％）のグラフ図である。３００Ｖで装填したどのＢＳＡ−フルオレセイン投薬量についても、０Ｖでの対照に対してｐ＜０．００１である。図１０Ｄは、３００Ｖの電気穿孔によって１μｇの組換えＧＦＰが予め装填されていた多量のウシ硝子体ＥＶを塗布したＡＲＰＥ−１９細胞の代表的な顕微鏡写真である。図１０Ｄの左の画像は、細胞質における陽性ＧＦＰ染色（緑色）を示す。図１０Ｄの中央の画像は、ヘキスト染色剤（青色）で標識された核を示し、融合画像（図１０Ｄ、右）は、トランスフェクトされた相当数の細胞を示す。図１０Ｅの右の画像は、電気穿孔なし（０Ｖ、対照）でＧＦＰと混合されていた多量のウシ硝子体ＥＶを塗布した後のＡＲＰＥ−１９細胞の代表的な顕微鏡写真においてフルオレセイン染色がないことを示す。対照試料におけるヘキスト染色剤（青色）による核標識は図１０Ｅの右の画像に示されている。図１０Ｆは、３００Ｖの電気穿孔によって１μｇ、０．５μｇもしくは０．２５μｇのＧＦＰが装填された、または電気穿孔なし（０Ｖ、対照）で１μｇのＧＦＰが装填されたＥＶを塗布した後のＡＲＰＥ−１９細胞の平均±標準偏差トランスフェクション効率（トランスフェクトされた細胞％）のグラフ図である。３００Ｖで装填したどのＧＦＰ投薬量についても、０Ｖでの対照に対してｐ＜０．０５である。スケールバーは（図１０Ａ〜図１０Ｅについて）５０μｍである。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｄは、生体内でウシ硝子体ＥＶが網膜を標的とし、組換えタンパク質を送達することを示す。図１１Ａは、フルオレセインと結合した組換えウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が希釈量で装填されたウシＥＶを注射した後の、注射後３日目のマウス網膜組織切片の代表的な広視野蛍光顕微鏡写真である。図１１Ａの左の画像はＢＳＡフルオレセイン単独を示し、図１１Ａの中央の画像はヘキスト単独による核染色を示し、図１１Ａの右の画像は融合画像を示す。図１１Ａの画像は、内境界膜（ＩＬＭ）を透過しない硝子体における信号を示す。図１１Ｂは、網膜外網状層（ＯＰＬ）及び内網状層（ＩＰＬ、矢印）における発現を示す、ＢＳＡ−フルオレセイン注射後３週目のマウス網膜組織切片の代表的な共焦点顕微鏡写真である。図１１Ｂの左の画像はＢＳＡフルオレセイン単独を示し、図１１Ｂの中央の画像は核染色のみを示し、図１１Ｂの右の画像は融合画像を示す。図１１Ｃは、ＩＰＬ及びＯＰＬを横切る細胞ならびに（四角い挿入図でマークされた）神経節細胞における信号を示す画像である。（図１１Ｃ）からの四角い挿入図はより高い出力で（図１１Ｄ）に示されており、神経節細胞層（ＧＣＬ）及び網膜神経線維層の細胞群における陽性染色を実証している。図１１Ｃ〜図１１Ｄの左の画像はＢＳＡフルオレセイン単独を示し、図１１Ｃ〜図１１Ｄの中央の画像は核染色のみを示し、図１１Ｃ〜図１１Ｄの右の画像は融合画像を示す。スケールバーは、（図１１Ａでは）３０μｍ、（図１１Ｂ〜図１１Ｃでは）５０μｍ、（図１１Ｄでは）２５μｍである。視細胞セグメント（ｐｈセグメント）、外顆粒層（ＯＮＬ）、内顆粒層（ＯＮＬ）。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｅは、生体内でウシ硝子体ＥＶが角膜、毛様体及び網膜を標的とし、組換えタンパク質を送達することを示す。図１２Ａは、フルオレセインと結合した組換えウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＢＳＡ−フルオレセイン）が電気穿孔（３００Ｖ）によって装填されたウシＥＶを注射された後の、注射後３週目のマウス眼組織切片の代表的な共焦点蛍光顕微鏡写真であり、角膜において内皮細胞及び角膜細胞からの信号を示している（図１２Ａの左の画像はＢＳＡフルオレセイン単独を示し、図１２Ａの中央の画像はヘキスト単独による核染色を示し、図１２Ａの右の画像は融合画像を示す）。図１２Ｂは、電気穿孔なし（０Ｖ）でＢＳＡ−フルオレセインと混合されたウシＥＶの対照群からの注射３週間後の画像であり、内皮細胞にも角膜細胞にも発現を示していないが、角膜上皮の非特異的な染色を示している（図１２Ｂの左の画像はＢＳＡフルオレセイン単独を示し、図１２Ｂの中央の画像はヘキスト単独による核染色を示し、図１２Ｂの右の画像は融合画像を示す）。図１２Ｃは、電気穿孔（３００Ｖ）によってＢＳＡ−フルオレセインが装填されたＥＶを注射して３週間後のマウスの眼から得た、無色素毛様体上皮細胞における信号を示す代表的な共焦点蛍光顕微鏡写真である（図１２Ａの左の画像はＢＳＡフルオレセイン単独を示し、図１２Ｃの中央の画像はヘキスト単独による核染色を示し、図１２Ｃの右の画像は融合画像を示す）。図１２Ｄは、視細胞、内網状層（ＩＰＬ）、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞及び脈絡膜におけるＢＳＡ−フルオレセインの堅牢な発現を示す画像である（図１２Ｄの左の画像はＢＳＡフルオレセイン単独を示し、図１２Ｄの中央の画像はヘキスト単独による核染色を示し、図１２Ｄの右の画像は融合画像を示す）。図１２Ｅは、ＥＶによって送達された組換えＢＳＡタンパク質をトランスフェクトされているマウス網膜視細胞及び網膜色素上皮（ＲＰＥ）の画像である。スケールバーは２５μｍである（図１２Ａ〜図１２Ｅ）。角膜上皮（Ｅｐｉ）、角膜内皮（ｅｎｄｏ）、外網状層（ＯＰＬ）、外顆粒層（ＯＮＬ）、内網状層（ＯＮＬ）。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｉは、蛍光標識ｓｉＲＮＡが装填されたウシ硝子体小胞がヒト網膜色素上皮細胞中に高効率でトランスフェクトされることを示す。図１３Ａ〜図１３Ｃは、ウシ小胞での３５０Ｖの電気穿孔の後でのシアニン３色素と結合した抗ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３）のトランスフェクション（図１３Ａ、黄色、Ｃｙ３）、及びヘキスト色素によってマークされた核（図１３Ｂ、青色）を示す、ヒト網膜色素上皮（ＡＲＰＥ−１９）細胞の低出力蛍光顕微鏡写真であり、図１３Ａと図１３Ｂとの融合画像は、トランスフェクトされた相当数の細胞を示す（図１３Ｃ）。図１３Ｄ〜図１３Ｆは、２００Ｖでの電気穿孔後のｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３を含有するウシ硝子体小胞で処理したＡＲＰＥ−１９細胞の低出力顕微鏡写真である。図１３Ｄは、細胞質におけるｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３染色（黄色）を示す。核をヘキスト染色剤で標識し（図１３Ｅ、青色）、図１３Ｆの融合画像は、３５０Ｖのときに比べて細胞染色が減少している細胞質の染色を示す。図１３Ｇ〜図１３Ｈは、電気穿孔なし（０Ｖ）で多量のウシ硝子体小胞及び抗ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３で処理したＡＲＰＥ−１９細胞を示す画像である。図１３Ｇは、ＡＲＰＥ−１９細胞におけるｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３染色を示しておらず、図１３Ｈは、ヘキスト染色剤（青色）によってマークされた核を示している。図１３Ｉのグラフは、ｓｉＲＮＡ−ＧＡＰＤＨ−Ｃｙ３をトランスフェクトされた細胞のパーセントを電気穿孔電圧に関して示す。スケールバーは（図１３Ａ〜図１３Ｈについて）５０μｍである。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｆは、ウシ毛様体無色素上皮が大量の小胞を産生すること、及びそれが細胞内空間に放出されることを示す。図１４Ａ〜図１４Ｃは、拡大された細胞間空間（ＩＳＰ）の腔内でＮＰＥ表面（図１４Ａ、星印）から発生している複数個の小胞（図１４Ａ、矢尻）を示す、酢酸ウラニルで染色された毛様体無色素上皮（ＮＰＥ）のウシ切片から得たＴＥＭ顕微鏡写真画像である。画像は、ＮＰＥの基底部、及び（ＶＩＴ）でマークされた硝子体基底部、及び内境界膜（ＩＬＭ）が示されるような配向となっている。図１４Ｂは、図１４Ａの上側の四角からの挿入図であり、ＩＳＰ内の小胞を示す。図１４Ｃは、図１４Ａからの下側の挿入図を示し、ＩＳＰの腔内に小胞（図１４Ｃ、星印）が発生しているＮＰＥ細胞を示す。図１４Ｄは、高電子密度物体を細胞内（図１４Ｄ、楔印）及びＩＳＰ腔内の小胞内（図１４Ｄ、矢尻）に示しているＮＰＥのＴＥＭ顕微鏡写真である。図１４Ｅは、発生している小胞の証拠がないことを示している毛様体色素上皮（ＰＥ）のＴＥＭ顕微鏡写真である。図１４Ｆは、コラーゲンマトリックス（図１４Ｆ、矢印）中にいくつかの硝子体（図１４Ｆ、矢尻）を伴っているコラーゲン線維を示す、毛様体に付着しているウシ硝子体基底部のＴＥＭ画像である。スケールバーは、（図１４Ａでは）１ｕｍ、（図１４Ｂ及び図１４Ｆでは）２００ｎｍ、（図１４Ｃでは）２５０ｎｍ，（図１４Ｄ〜図１４Ｅでは）５００ｕｍである。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｉは、外因性タンパク質が装填された硝子体小胞がヒト網膜色素上皮細胞内に高効率でトランスフェクトされることを示す。図１５Ａ〜図１５Ｃは、外因性ウシ血清アルブミンの取込みを示す、ヒト網膜色素上皮（ＡＲＰＥ−１９）細胞の低出力蛍光顕微鏡写真である。ＢＳＡ−フルオレセインを使用してウシ硝子体液小胞を３５０Ｖで電気穿孔し、その後、多量にＡＲＰＥ−１９細胞に与えたが、これは細胞質における相当な染色を示した（図１５Ａ、黄色）。核がヘキスト染色剤によって標識され（図１５Ｂ、青色）、図１５Ａと図１５Ｂとの融合画像は、相当数のＡＲＰＥ−１９細胞がフルオレセインで染色されることを示している（図１５Ｃ）。（２００Ｖで電気穿孔した）ＢＳＡ−フルオレセインを含有するウシ硝子体小胞で処理されたＡＲＰＥ−１９細胞も、細胞質における染色を示す（図１５Ｄ）。これらの細胞の核をヘキスト染色剤によって標識し（図１５Ｅ、青色）、融合画像（図１５Ｆ）は細胞質における細胞質染色の減少を示しており、これは、トランスフェクトされた細胞が、３００Ｖで電気穿孔したＥＶに曝露された細胞に比べてより少ないことを意味する。図１５Ｇ〜図１５Ｈは、電気穿孔なしでウシ小胞及びＢＳＡ−フルオレセインで処理されたＡＲＰＥ−１９細胞を示している顕微鏡写真を示す。図１５Ｇに示されているとおり、ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＢＳＡ−フルオレセイン染色は観察されなかった。核をヘキスト染色剤によってマークした（図１５Ｈ、青色）。図１５Ｉは、タンパク質トランスフェクション効率を示すグラフである（エラーバーは測定の標準偏差であり、ｎ＝３である）。スケールバーは５０μｍである（図１５Ａ〜図１５Ｈ）。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｅは、房水が小胞を大量に含有していることを示す。図１６Ａは、様々な大きさの複数の小胞状物体（図１６Ａの一重矢尻、二重矢尻及び矢印はそれぞれ小型、中型及び大型の小胞をマークしたものである）を示す、アクリジンオレンジで標識された全載ウシ房水のＴＥＭ顕微鏡写真である。図１６Ｂは、コラーゲン鎖（図１６Ｂ、矢印）と結びついているＣＦＳＥ染色された小胞（図１６Ｂ、矢尻）を描写するＴＥＭ顕微鏡写真である。図１６Ｃ〜図１６Ｄは、酢酸ウラニル（図１６Ｃ）及びアクリジンオレンジ（図１６Ｄ）で染色された、勾配超遠心分離によって単離された後のウシ前房エクソソームのＴＥＭ顕微鏡写真であり、様々な大きさの小胞群（図１６Ｃ）を示している。図１６Ｅは、超遠心分離によって単離したエクソソームのナノ粒子軌跡解析から平均を求めた有限軌跡長調節サイズ／濃度グラフである（エラーバーは平均の標準誤差＋／−１を表す）。データは、濃度が１．１０ｅ８、平均が１４０．８ｎｍ、標準偏差が１２７．９ｎｍ、ピークが１５ｎｍ、３５ｎｍ、６５ｎｍ、１１５ｎｍ、１８５ｎｍ、２０５ｎｍ、２２５ｎｍ、２７５ｎｍ、４１５ｎｍ、５０５ｎｍ及び６１５ｎｍであった（図１６Ｅ）。スケールバーは、（図１６Ａ、図１６Ｃ〜図１６Ｄでは）２００ｎｍ、（図１６Ｂでは）５００ｎｍである。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｒは、単離されたウシＥＶをヒト皮膚細胞にトランスフェクトすることができることを示す。単離されたウシＥＶの内在性タンパク質（ＣＦＳＥ）及びＲＮＡ（アクリジンオレンジ）を標識し、その後、培養下でヒト皮膚細胞（ＰＡＭ−２１２）にトランスフェクトした。図１７Ａ〜図１７Ｃは、トランスフェクションから３時間後の、アクリジンオレンジ（ＡＯ）で標識したウシ硝子体ＲＮＡをトランスフェクトされたヒト皮膚細胞ＰＡＭ−２１２の低出力広視野顕微鏡写真である。図１７Ｄ〜図１７Ｆは、トランスフェクションから２４時間後の、ＡＯ標識ＥＶをトランスフェクトされたＰＡＭ−２１２細胞を示す。画像は、ウシＥＶ  ＲＮＡのヒト皮膚細胞への堅牢な移入を示す。図１７Ｇ〜図１７Ｉの画像は、ＣＦＳＥを使用して全てのタンパク質を予め標識し、ＥＶを再単離し、その後にＰＡＭ２１２細胞を多量のＥＶ標識タンパク質で曝露して、ウシ硝子体ＥＶがＰＡＭ−２１２細胞にトランスフェクトされたことを示す。トランスフェクションから３時間後（図１７Ｇ〜図１７Ｉ）及び２４時間後（図１７Ｊ〜図１７Ｌ）に細胞はウシＥＶタンパク質の堅牢な取込みを示す。陰性対照は３時間目（図１７Ｍ〜図１７Ｏ）及び２４時間目（図１７Ｐ〜図１７Ｑ）にトランスフェクションを示さない。どの画像についてもスケールバーは１００μｍである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明は、健常なヒト及びウシの眼の硝子体液及び房水の小胞ネットワークの予想外な発見に基づく。このネットワークの小胞には、それによって他の眼組織へ短距離及び長距離輸送される多様なタンパク質ならびにコード及び非コードＲＮＡの積荷が装填されている。本明細書において記載及び実証されるように、これらの小胞は、健常個体の眼内液から安全に単離されること、及び改変されて治療薬送達ビヒクルとしての役割を果たすことができる。
【００１４】
したがって、本発明の第１の態様は、１つ以上の房水細胞外小胞及び／または硝子体液細胞外小胞を含む組成物に関する。組成物の房水細胞外小胞及び／または硝子体細胞外小胞は、１つ以上の外因性作用物質を含有するように改変されている。
【００１５】
本明細書中で使用する「細胞外小胞」という用語は、細胞によって分泌されるナノサイズの膜性粒子を指す。細胞外小胞は、ＥＶ、多胞体及びエクトソームとも呼ばれるが、タンパク質、脂質及びＲＮＡなどの生体分子の細胞から別の細胞への移送によって細胞内伝達に関与している天然の輸送ナノ小胞である。細胞外小胞は、その大きさに基づいて他の分泌小胞、例えばエクソソーム及びアポトーシス小体とは異なっており、つまり、エクソソームは典型的に直径が約４０〜１００ｎｍであり、細胞外小胞は典型的に大きさが１００〜１０００ｎｍであり、アポトーシス小体は典型的に大きさが１〜５μｍである。
【００１６】
本開示によれば、硝子体液及び房水の細胞外小胞はそれらの大きさすなわちそれらの直径によって特徴付けられる。「直径」という用語は、小胞が必ずしも球形である必要はないと理解された上で、小胞の最大寸法を指す。小胞直径は、ナノ粒子の大きさを測定するための従来技術、例えば顕微鏡観察技術（例えば、透過型電子顕微鏡観察または光散乱技術）を用いて測定することができる。別の実施形態では、小胞直径は、ナノ粒子軌跡解析を用いて測定される（Ｃａｒｒ  ａｎｄ  ＧｅｄｄｅｓｓのＷＯ０３／０９３８０１を参照されたいが、参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００１７】
硝子体液の小胞は大きさが不均一であり、直径が１００〜６０００ｎｍの範囲である。一実施形態では、硝子体液に由来する組成物の細胞外小胞は直径が１００〜１０００ｎｍの範囲である。別の実施形態では、硝子体液に由来する組成物の細胞外小胞は直径が約１５０〜５００ｎｍである。別の実施形態では、硝子体液に由来する組成物の細胞外小胞は直径が約１５０〜３００ｎｍである。
【００１８】
房水の小胞も大きさが不均一であり、概して硝子体小胞よりも小さい。一実施形態では、房水に由来する組成物の細胞外小胞は直径が５０〜６００ｎｍの範囲である。別の実施形態では、房水に由来する組成物の細胞外小胞は直径が約５０〜４００ｎｍである。別の実施形態では、房水に由来する組成物の細胞外小胞は直径が約５０〜２００ｎｍである。
【００１９】
一実施形態では、房水細胞外小胞及び／または硝子体液細胞外小胞を含む組成物は、小胞の集団を含む。小胞の「集団」は、少なくとも２個の小胞、少なくとも５個の小胞、少なくとも１０個の小胞、少なくとも５０個の小胞、少なくとも１００個の小胞、少なくとも５００個の小胞、少なくとも１０００個の小胞、少なくとも１００００個の小胞、少なくとも１００，０００個の小胞、少なくとも１，０００，０００個以上の小胞の、セットを指す。
【００２０】
別の実施形態では、硝子体液及び房水の小胞は、それらのプロテオームシグネチャによって特徴付けられる。例えば、硝子体液の小胞は、ＣＤ−９、Ｈｓｐ−９０β、アネキシン−ＩＩ及びＴＳＧ−１０１タンパク質を含めたいくつかの既知のエクソソームマーカーを発現する。硝子体細胞外小胞に存在し富化されている全てのエクソソームマーカータンパク質の一覧表を以下の表１に示す。一実施形態では、組成物は、表１に列挙されている１つ以上のエクソソームマーカーを発現している硝子体液細胞外小胞の集団を含む。別の実施形態では、組成物は、表１に列挙されているエクソソームマーカーのうちの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個全てを発現している硝子体液細胞外小胞の集団を含む。
【００２１】
本開示の組成物の硝子体液小胞はさらに、本明細書の実施例に記載されているような眼特異タンパク質の多様なプロテオームシグネチャも有している（下表２参照）。一実施形態では、組成物は、表２に列挙されている眼特異タンパク質のうちの１つ以上を発現している硝子体液細胞外小胞の集団を含む。別の実施形態では、組成物は、表２に列挙されている眼特異タンパク質のうちの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個または１１個全てを発現している硝子体液細胞外小胞の集団を含む。
【００２２】
硝子体細胞外小胞の総タンパク質シグネチャを以下の表３に示す。表３は、硝子体液の細胞外小胞画分と硝子体液の細胞不含画分との間での、列挙されているタンパク質の差次的発現を示す。かくして、一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、表３に列挙されている１つ以上のタンパク質を発現している細胞外小胞の集団を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、硝子体画分の細胞外画分において富化されているタンパク質のうちの１つ以上を発現している細胞外小胞の集団を含む。別の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、細胞外小胞画分においてのみ発現するものとして表３中で同定されているタンパク質のうちの１つ以上を発現している細胞外小胞の集団を含む。本明細書に記載の細胞外小胞の集団は、細胞外小胞画分においてのみ差次的に発現するものとして同定されているタンパク質の任意の組み合わせの発現によって定義することができる。
【００２３】
一実施形態では、組成物の房水小胞及び／または硝子体液小胞は、単離された小胞である。本明細書中で使用する場合、「単離された」という用語は、ヒトまたは動物の身体から、つまり動物またはヒトの眼内液から取り出され、生体内で通常結びついている細胞または細胞残屑から実質的に引き離されている、小胞を指す。一実施形態では、細胞外小胞を含む組成物は、生体内で上記小胞と通常結びついている細胞または細胞残屑の７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超が除去されている。
【００２４】
組成物の細胞外小胞は、いくつかの技術を用いて単離及び／または精製され得る。これらには、濾過、遠心分離、イオンクロマトグラフィーまたは濃縮が、単独か組み合わせかのどちらかで含まれる。例示的な単離方法は本明細書において記載されており、一連の低速遠心分離を伴う。当技術分野で知られており本発明に係る用途に適する、細胞外小胞を単離または精製するその他の例示的な方法としては、限定されないが、例えば、ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｃｅｎｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ｐｒｅｓｅｎｃｅ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，”Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １４：４８−５６（２０１６）、Ｂａｌａｊの米国特許出願公開第２０１６／０２１６２５３号、ＣｏｈｅｎのＷＯ２０１５／１４３１１３、ＤｈｅｌｌｉｎのＷＯ２０００／４４３８９、及びＬａｍｐａｒｓｋｉのＷＯ２００１／８２９５８によって開示されているものが挙げられ、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００２５】
一実施形態では、本明細書において開示される組成物は、硝子体液からの細胞外小胞を含む。硝子体液または硝子体は水晶体と網膜との間に位置する。それは、光学的に透明な、大部分において非細胞性であるゲル様構造体であり、生物学的機能があまり知られていない。一実施形態では、細胞外小胞は、健常な正常硝子体から、つまり健常対象から得られる。別の実施形態では、細胞外小胞は、眼疾患を有する対象の硝子体から得られる。別の実施形態では、組成物は、房水からの細胞外小胞を含む。房水は、水晶体と角膜との間に位置する前眼房を満たしている透明な液体である。一実施形態では、細胞外小胞は、健常な正常房水から、つまり健常対象から得られる。別の実施形態では、細胞外小胞は、眼疾患を有する対象の房水から得られる。別の実施形態では、組成物は、房水及び硝子体液から得られる細胞外小胞の混合物を含む。
【００２６】
一実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、毛様体、例えば毛様体上皮から分泌される。別の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、毛様体色素上皮、毛様体無色素上皮、毛様体突起によって分泌される。別の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、ミュラー細胞、神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、視細胞（桿体及び錐体）双極細胞、網膜色素上皮または網膜内皮細胞を含めた網膜細胞によって分泌される。別の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、角膜上皮、角膜支質（角膜細胞）、角膜内皮または縁幹細胞を含めた角膜の細胞によって分泌される。別の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、色素もしくは無色素細胞、紡錘形線維芽細胞、マクロファージ（Koganeiの塊細胞）、括約筋の平滑筋、または後部上皮を含めた虹彩の細胞によって分泌される。別の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、シュレム管の線維柱帯細胞または内皮細胞層を含めた線維柱帯細胞によって分泌される。別の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、水晶体上皮、水晶体線維または水晶体嚢を含めた水晶体の細胞によって分泌される。別の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、立方上皮細胞、上衣細胞層、脈絡叢上皮細胞または脈絡膜内皮細胞を含めた脈絡膜の細胞によって分泌される。別の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、オリゴデンドロサイト、網膜神経節細胞軸索または神経膠細胞を含めた視神経の細胞によって分泌される。別の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、間葉系幹細胞、縁幹細胞、網膜幹細胞を含めた幹及び前駆細胞によって分泌される。
【００２７】
本明細書に記載の組成物の硝子体液細胞外小胞及び／または房水細胞外小胞は、任意の哺乳動物硝子体液細胞外小胞または房水細胞外小胞であり得る。一実施形態では、組成物は、ウシ硝子体液細胞外小胞及び／または房水細胞外小胞を含む。別の実施形態では、組成物は、ヒト硝子体液細胞外小胞及び／または房水細胞外小胞を含む。別の実施形態では、組成物は、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯動物（例えば、マウス、ラット及びモルモット）、ウマ、シカ、ヒツジまたはブタに由来する硝子体液細胞外小胞及び／または房水細胞外小胞を含む。
【００２８】
本明細書において実証されるように、硝子体液及び房水の細胞外小胞は、単離することができ、１つ以上の外因性作用物質を含有するように改変することができ、１つ以上の外因性作用物質を標的組織または細胞に送達するための送達ビヒクルとして利用することができる。外因性作用物質は治療剤または診断剤とすることができる。好適な治療剤及び診断剤としては、限定されないが例えば、核酸分子、タンパク質及びポリペプチド、小分子、ホルモン、ならびにそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００２９】
一実施形態では、外因性作用物質は治療核酸分子である。核酸分子は一本鎖または二本鎖核酸とすることができる。一本鎖核酸には、ホスホジエステル、２’Ｏ−メチル、２’メトキシ−エチル、ホスホロアミダイト、メチルホスホネート及び／またはホスホロチオエート主鎖化学を有するものが含まれる。一実施形態では、核酸分子は、リボ核酸分子（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド、その修飾ＲＮＡ分子、修飾ＤＮＡ分子または修飾ＲＮＡ／ＤＮＡ分子から選択される治療核酸分子である。
【００３０】
一実施形態では、治療核酸分子は、ＲＮＡ分子、例えば、低分子ＲＮＡ分子、相補的ＲＮＡ、非コードＲＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ、ｐｉ−ＲＮＡ分子、マイクロＲＮＡ分子、ｓｎｏ−ＲＮＡ分子、長鎖非コードＲＮＡ分子、伝令ＲＮＡ分子、リボソームＲＮＡ分子、アンチセンス核酸分子、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンタゴミル、ＲＮＡアプタマー、ｍｉＲＮＡ模倣体、ｍｉＲスポンジ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集ＲＮＡ、トランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、「足場」配列からなる短鎖合成ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、低分子カハール体特異的ＲＮＡ（ｓｃａＲＮＡ）、天然シスアンチセンスｓｉＲＮＡ（ｃｉｓ−ｎａｔ−ｓｉＲＮＡ）、トランス作用性ｓｉＲＮＡ（ｔａｓｉＲＮＡ）、反復配列関連低分子干渉ＲＮＡ（ｒａｓｉＲＮＡ）、７ＳＫ、転移−伝令ＲＮＡ（ｔｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、７ＳＬ  ＲＮＡ、シグナル認識粒子ＲＮＡ（ＳＲＰ）及びそれらの任意の組み合わせである。
【００３１】
一実施形態では、細胞外小胞は、眼疾患または眼症状の治療に適した治療ＲＮＡを含有するように改変されている。眼疾患の治療に適する治療ＲＮＡとしては、限定されないが例えば、緑内障の治療のためのβ２−アドレナリン受容体指向性ｓｉＲＮＡ（ＳＹＬ０４００１２）（Ｐａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ＳＹＬ０４００１２，ａ  ｓｉＲＮＡ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｏ  ｇｌａｕｃｏｍａ，”ＡＯＰＴ  ２０１３  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  １：９６（２０１３）、参照によりその全体が本明細書に援用される）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の治療のためのＶＥＧＦ指向性ｓｉＲＮＡ（ベバシラニブ）、ＡＭＤの治療のためのＶＥＧＦ受容体指向性ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ−０２７）（Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“ＲＮＡｉ−ｂａｓｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＳｉＲＮＡ−０２７，”Ａｍ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１５０：３３−３９（２０１０）、参照によりその全体が本明細書に援用される）、ならびにＡＭＤ及び糖尿病網膜症の治療のためのＲＴＰ８０１指向性ｓｉＲＮＡ（ＰＦ−６５５）（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｓｅ  １  ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａ  ｓｉＲＮＡ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＲＴＰ８０１  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ，”Ｅｙｅ（Ｌｏｎｄ）２６：１０９９−１１０５（２０１２）、及びＮｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｏｓｅ−ｒａｎｇｉｎｇ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  ｓｉＲＮＡ  ＰＦ−０４５２３６５５  ｆｏｒ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｍａｃｕｌａｒ  ｅｄｅｍａ（ｔｈｅ  ＤＥＧＡＳ  Ｓｔｕｄｙ），”Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．５３：７６６６−７６７４（２０１２）、参照によりその全体が本明細書に援用される）が挙げられる。本明細書に記載の組成物の細胞外小胞に導入することができる、眼疾患の治療に適するその他の治療ＲＮＡ分子は、Ｇｕｚｍａｎ−Ａｒａｎｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｍａｌｌ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）ａｓ  ａ  Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  Ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１７０（４）：７３０−７４７（２０１３）、参照によりその全体が本明細書に援用される）に記載されている。
【００３２】
別の実施形態では、本明細書に記載の方法を用いて得られた、単離された硝子体液及び／または房水の細胞外小胞は、ｍＲＮＡを発現するまたは組み込むように改変される。ｍＲＮＡは、過剰なレベルで存在することが眼疾患、眼障害または眼症状と関連付けられているタンパク質の発現及び／または活性を阻害、下方制御、低減する治療剤をコードし得る。そのような治療剤は、本明細書に記載の任意のものを含めたペプチド、抗体または他のポリペプチドもしくはタンパク質であり得る。一実施形態では、ｍＲＮＡは、抗体、可溶性受容体または他の結合タンパク質をコードする。典型的には、好適なｍＲＮＡは、眼疾患、眼障害または眼症状において過剰な量及び／または活性で存在するタンパク質を阻害、下方制御または低減する抗体をコードする。いくつかの実施形態では、好適なｍＲＮＡは、眼疾患、眼障害または眼症状において欠乏しているタンパク質活性を活性化させる、上方制御する、または増加させる抗体をコードする。本明細書に記載の硝子体液及び／または房水の細胞外小胞に導入することができるｍＲＮＡによってコードされる例示的な抗体としては、限定されないが、ＶＥＧＦ、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１またはＶＥＧＦ受容体などの可溶性受容体（例えばＶＥＧＦＲ１）に対する抗体が挙げられる。
【００３３】
本明細書に記載の細胞外小胞を用いる眼疾患または眼症状の治療に適するその他のｍＲＮＡ分子としては、限定されないが例えば、新血管形成の軽減のための、エンドスタチン、アンジオスタチン、組織メタロプロテイナーゼ３阻害物質（ＴＩＭＰ３）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または可溶性血管上皮成長因子受容体（ｓＦｌｔ−１）のタンパク質または生物学的活性断片をコードするｍＲＮＡ分子；色素性網膜炎の治療のための、Ｐｒｐｈ２、Ｒｈｏ、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼβ−サブユニット（ＢＰＤＥ）、Ｂｃｌ２、ＰＥＤＦ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）及びｃ−ｍｅｒ原がん遺伝子チロシンキナーゼ（Ｍｅｒｔｋ）のタンパク質または生物学的活性断片をコードするｍＲＮＡ分子；緑内障の治療のための、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＣＮＴＦ及びＧＤＮＦのタンパク質または生物学的活性断片をコードするｍＲＮＡ分子；ぶどう膜炎の治療のための、ＩＬ−１０及びインターロイキン−１受容体作動薬（ＩＬ−１Ｒａ）のタンパク質または生物学的活性断片をコードするｍＲＮＡ分子；ならびに、網膜芽細胞腫の治療のための、ＩＦＮ−β及びチミジンキナーゼ（ＴＫ）のタンパク質または生物学的活性断片をコードするｍＲＮＡ分子が挙げられる。
【００３４】
一実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞は、以下のｍＲＮＡ治療薬、ｍＲＮＡ−１４４０、ｍＲＮＡ−１８５１、ｍＲＮＡ  ＭＲＫ−１７７７、ｍＲＮＡ−１３８８、ｍＲＮＡ−１３２５、ｍＲＮＡ−１７０６、ｍＲＮＡ−１６４７、ｍＲＮＡ−１６５３、ｍＲＮＡ−４１５７、ｍＲＮＡ−２４１６、ｍＲＮＡ−２９０５、ｍＲＮＡ  ＡＺＤ−８６０１、ＭＲＧ−１０６、ＭＩＲ−１５５、ＭＲＧ−２０１、ＭＲＧ−１０７及びＭＲＧ−１１０のうちの１つ以上を運ぶように改変されている。
【００３５】
別の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞内に装填されるｍＲＮＡ分子はワクチン抗原をコードする。ｍＲＮＡは、天然の感染症がするのと同じように、但し疾患または蔓延を招く能力を伴わずに、分泌されるまたは細胞上に配される抗原タンパク質を産生または発現するように細胞を仕向ける。治療ワクチンの場合、本明細書に記載の細胞外小胞を使用してｍＲＮＡベースの個人向けがんワクチンを送達して、がん細胞を認識する免疫系を初回刺激し、個人向けに調整された強い応答を個々の患者のがんに対して向ける。細胞外小胞は、患者特異的新生抗原またはその特定患者の腫瘍に存在する独特の突然変異をコードするｍＲＮＡを含む。
【００３６】
別の実施形態では、ＲＮＡ分子は触媒性ＲＮＡである。リボザイムは、酵素として機能する触媒性ＲＮＡであり、触媒のためにタンパク質を必要としない。最も知られている天然のリボザイムは、ＲＮＡ切断及びライゲーション反応を触媒する自己プロセシングＲＮＡである。本明細書に記載の細胞外小胞を使用して送達されることができる、適したリボザイム治療薬としては、限定されないが例えば、アンギオザイム、ヘプタザイム、ＭＹ−２、ＲＲｚ１、ＯＺ１（ＲＲｚ１）、ＣＣＲ５リボザイム、Ｌ−ＴＲ／Ｔａｔｎｅｏが挙げられる。
【００３７】
本明細書に記載の細胞外小胞を使用する疾患または症状の治療に適するその他のＲＮＡ治療分子としては、限定されないが例えば、ＳＰＣ３６４９（ＬＮＡ）、ベバシラニブ、ＡＧＮ−７４５、ＰＦ−６５５、ＱＰＩ−１００７、ＴＤ１０１、ＳＹＬ０４００１２、ＳＹＬ１００１、ＥｘｃｅｌｌａｉｒＴＭ、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１、ＣＥＱ５０８、ｓｉＧ１２Ｄ  ＬＯＤＥＲ、ＴＫＭ−ＡｐｏＢ、ＴＫＭ−ＰＬＫ１、ＡＬＮ−ＶＳＰ０２、ＡＬＮ−ＴＴＲ０１、Ｂｃｒ−Ａｂｌ  ｓｉＲＮＡ、Ａｔｕ０２７、Ｉ５ＮＰ、ＣＡＬＡＡ−０１、ＦＡＮＧワクチン、ｉＰｓｉＲＮＡ、Ｔａｔ／Ｒｅｖ  ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ−ＥｐｈＡ２−ＤＯＰＣ、ＴＤ１０１、Ａｔｕ０２７、ＮＤ−Ｌ０２−ｓ０２０１、ＤＣＲ−ＰＨ１、ＳＴＰ７０５、ＡＬＮ−ＧＯ１、フィツシラン（ＡＬＮ−ＡＴ３ＳＣ）、ＡＬＮ−ＣＣ５、ＡＬＮ−ＡＳ１、ＤＣＲ−ＭＹＣ、ＴＫＭ０８０３０１、ｓｉＧ１２Ｄ−ＬＯＤＥＲ、インクリシラン（ＡＬＮ−ＰＣＳＳＣ）、ＰＦ−６５５、ＳＹＬ１００１、バモシラン（ＳＹＬ０４００１２）、ＱＰＩ−１００７、ＱＰＩ−１００２、パチシラン（ＡＬＮ−ＴＴＲ０２）、ＩＳＴＨ００３６、ＥＺＮ−２９６８（ＲＯ７０７０１７９）、ＬＥｒａｆＡＯＮ−ＥＴＵ、ＡＫＣＥＡ−ＡＰＯＣＩＩＩ−ＬＲｘ、ＢＩＩＢ０６７（ＩＯＮＩＳ−ＳＯＤ１Ｒｘ）、ＡＺＤ５３１２、Ｃｅｎｅｒｓｅｎ、ＩＯＮＩＳ−ＨＴＴ  Ｒｘ、ＩＯＮＩＳ  ＡＮＧＰＴＬ３−ＬＲｘ、ＡＺＤ９１５０、ＱＲ−０１０、ＳＢ０１２、ＡＥＧ３５１５６、ＤＳ−５１４１ｂ、ＡＫＣＥＡ−ＡＰＯ（ａ）−ＬＲｘ、Ａｐａｔｏｒｓｅｎ（ＯＧＸ−４２７）、ＩＯＮＩＳ−ＨＢＶ  Ｒｘ、ＩＯＮＩＳ−ＧＣＧＲ  Ｒｘ、ＡＳＭ８、ＳＢ０１０、ＳＢ０１１、Ｇ４４６０、プレキシジェベルセン（ＢＰ１００１）、ＩＯＮＩＳ−ＦＸＩ  Ｒｘ、アガニルセン（ＧＳ−１０１）、エテプリルセン（ＡＶＩ−４６５８）、アリカフォルセン、ボラネソーセン、ＩＯＮＩＳ−ＴＴＲＲｘ、クスチルセン（ＯＧＸ−０１１）、Ｌｉｐｏ−ＭＥＲＩＴ、ＩＶＡＣ  ｍｕｔａｎｏｍｅ／ｗａｒｅｈｏｕｓｅ、ＴＮＢＣ−ＭＥＲＩＴ、ＣＶ７２０１、ＣＶ８１０２、ｍＲＮＡ−１８５１、ｍＲＮＡ−１４４０、ｍＲＮＡ  ＭＲＫ−１７７７、ｍＲＮＡ  ＡＺＤ−８６０１、ｍＲＮＡ−１３２５、ＣＶ９１０３、ＡＧＳ−００４、ＡＧＳ−００３−ＬＮＧ、ｉＨＩＶＡＲＮＡ−０１、ＡＧＳ−００３が挙げられる。
【００３８】
一実施形態では、本明細書に記載の方法を用いて得られる、単離された硝子体液及び／または房水の細胞外小胞は、ゲノムを編集するのに有用なヌクレアーゼゲノム編集システムを発現または組み込むように改変される。本明細書に記載のゲノム編集は、遺伝子の挿入、欠失、修飾（例えば、１つ以上のヌクレオチドのヌクレオチド転位、転換、挿入もしくは欠失、または任意のヌクレオチド配列の重複）、遺伝子活性化及び遺伝子サイレンシングを含み得る。当業者であれば認識するであろうことであるが、ゲノム編集は、望ましくない遺伝子突然変異を訂正すること、遺伝子突然変異を導入すること、（例えば遺伝子機能を向上させる、強化する、または阻害するために）遺伝子配列を変更すること、（例えば遺伝子発現を活性化させる、または阻害するために）遺伝子配列を挿入することなどを目的とするものであり得る。ヌクレアーゼゲノム編集システムの例としては、限定されないが、クラスター化され規則的に間隔があいた反復短回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）ヌクレアーゼシステム、例えば、標的指向性ｇＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子を含むもの、例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びｍｉｔｏ−ＴＡＬＥＮ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ならびに他の治療核酸、例えば、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、抗マイクロＲＮＡ、拮抗薬、低分子ヘアピンＲＮＡ及びアプタマー（ＲＮＡ、ＤＮＡまたはペプチド系（アフィマーを含む））が挙げられる。
【００３９】
一実施形態では、本明細書に記載の組成物の細胞外小胞は、Ｃａｓヌクレアーゼ及び、トランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）との融合を含むものであるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステム、例えばＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集システムを発現または組み込むように遺伝子改変されている。ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡは、標的指向性ＲＮＡ配列、及び別個の一連の非コード同方向ＲＮＡ配列を含む。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、選択されたＣａｓヌクレアーゼに関係しているものである。当業者であれば理解するであろうように、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが１つ以上の特定Ｃａｓヌクレアーゼにとって特異的なものでありかつそれによって認識されるという意味で、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ｇＲＮＡの成分）と、Ｃａｓヌクレアーゼとが「関係している」と表示される。
【００４０】
一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムは、眼症状に関連する１つ以上の遺伝子欠陥を編集するように設計される。例えば、限定されないが、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃａｓ９  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ａｇｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｍａｃｕｌａｒ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７：４１９−４２６（２０１７）（参照によりその全体が本明細書に援用される）において記載されているように、加齢黄斑変性症において過剰発現するＶＥＧＦ遺伝子を編集するようにＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムを設計してもよい。別の実施形態では、Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｉａ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｉｎ  Ｒｏｄ  Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，”Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２７：８３０−８３３（２０１７）（参照によりその全体が本明細書に援用される）によって記載されているように、色素性網膜炎に関連する変性を防止する目的でＮｒｌまたはＮＲ２ｅ３遺伝子を不活性化させるようにＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼシステムを設計してもよい。
【００４１】
別の実施形態では、核酸分子はＤＮＡ分子である。好適なＤＮＡ分子としては、限定されないが例えば、低分子ＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ分子、オリゴヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、デオキシリボ核酸アプタマー、デオキシリボ核酸ザイム（ＤＮＡザイム）及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００４２】
一実施形態では、治療核酸は、タンパク質、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体及びタンパク質／ペプチド変異型を発現する、または発現するのに適し得る、ゲノム配列、例えばｃＤＮＡ配列及びより小さな操作型遺伝子セグメントを含む。核酸は、約５〜約１２０００以上のヌクレオチド、ヌクレオシドまたは塩基対の連続核酸配列を含み得る。本発明のこの態様に係る治療核酸分子は、サイトカイン、酵素、ホルモン、疾患に関与するタンパク質の天然の作動薬及び拮抗薬などをコードし得る。治療核酸分子には、疾患または健康関連症状の治療または防止に有益であると証明されている治療核酸の生物学的機能性等価体も含まれる。したがって、既知の核酸分子との配列同一性が約７０％〜約９９％である配列は、本発明のこの態様に係る好適な治療核酸分子である。
【００４３】
一実施形態では、細胞外小胞は、眼疾患または眼症状の治療に適した治療ＤＮＡ分子を含有するように改変されている。好適な治療ＤＮＡ分子としては、限定されないが例えば、新血管形成の軽減のための、エンドスタチン、アンジオスタチン、組織メタロプロテイナーゼ３阻害物質（ＴＩＭＰ３）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）または可溶性血管上皮成長因子受容体（ｓＦｌｔ−１）のタンパク質または生物学的活性断片をコードするＤＮＡ分子；色素性網膜炎の治療のための、Ｐｒｐｈ２、Ｒｈｏ、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼβ−サブユニット（ＢＰＤＥ）、Ｂｃｌ２、ＰＥＤＦ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）及びｃ−ｍｅｒ原がん遺伝子チロシンキナーゼ（Ｍｅｒｔｋ）のタンパク質または生物学的活性断片をコードするＤＮＡ分子；緑内障の治療のための、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＣＮＴＦ及びＧＤＮＦのタンパク質または生物学的活性断片をコードするＤＮＡ分子；ぶどう膜炎の治療のための、ＩＬ−１０及びインターロイキン−１受容体作動薬（ＩＬ−１Ｒａ）のタンパク質または生物学的活性断片をコードするＤＮＡ分子；ならびに、網膜芽細胞腫の治療のための、ＩＦＮ−β及びチミジンキナーゼ（ＴＫ）のタンパク質または生物学的活性断片をコードするＤＮＡ分子が挙げられる。本明細書に記載の組成物の細胞外小胞内に導入されることができるその他の好適なＤＮＡ治療薬は当技術分野で既知であり、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，”Ｐｏｓｔｇｒａｄ．Ｍｅｄ．Ｊ．８７（１０２９）：４８７−９５（２０１１）（参照によりその全体が本明細書に援用される）を参照されたい。
【００４４】
別の実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞内に装填される眼疾患の治療に適する治療ＤＮＡ分子はアプタマーである。好適なアプタマーとしては、限定されないが例えば、眼内新生血管疾患の治療のための、ＶＥＧＦの活性を標的とするＭａｃｕｇｅｎ／ペガプタニブ（ＮＸ１８３８）、加齢黄斑変性症の治療のための、ＰＤＧＦ  Ｂ鎖の活性を標的とするＦｏｖｉｓｔａ／ペグプレラニブ（ＮＸ１９７５）、及び加齢黄斑変性症の治療のための、補体成分５（Ｃ５）の活性を標的とするＺｉｍｕｒａ／ＡＲＣ１９０５が挙げられる（Ｄｒｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｉｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｅｙｅ：Ａｐｔａｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．２６（３）：１２７−１４６（２０１６）を参照のこと。参照によりその全体が本明細書に援用される）。その他の好適なアプタマーとしては、例えば、ＲＮＡアプタマー（ＲＢ００６またはペグニバコギン）、ＡＲＣ１９４９９（ＢＡＸ４９９）、ＲＥＧ１（ＲＢ００６とＲＢ００７）、ＡＲＣ１９０５、ＴＡＲデコイ、ＲＲＥデコイが挙げられる。
【００４５】
一実施形態では、治療ＲＮＡ分子と治療ＤＮＡ分子との組み合わせを本明細書に記載の組成物の細胞外小胞内に導入する。一実施形態では、治療ＲＮＡ分子と治療ＤＮＡ分子とが眼疾患の治療のために協働的に作用する。例えば、限定されないが、色素性網膜炎の治療のために、突然変異体ロドプシン発現の発現をサイレンシングすることができるｓｉＲＮＡ分子を、野生型ロドプシン遺伝子をコードするＤＮＡ分子と組み合わせて投与することができる（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，“ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，”Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．８１：１２７−１３５（２００７）。参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００４６】
別の実施形態では、核酸は診断用核酸である。診断用核酸は、疾患または健康関連症状の診断において適用することができる核酸である。診断用核酸の配列は１つ以上のレポータータンパク質をコードする。「レポータータンパク質」は、細胞内または組織中に存在するときに、検出可能でありかつ、細胞内に存在する他の遺伝子配列またはコードされるポリペプチドとの区別が可能である、アミノ酸配列を指す。いくつかの実施形態では、治療核酸分子は、レポータータンパク質をコードする診断用核酸と融合していてもよい。例えば、２つの核酸分子を、同じプロモーターに例えば配列内リボソーム進入部位によって繋げてもよいし、または双方向プロモーターに繋げてもよい。そのような技術を用いると治療核酸及び診断用核酸の発現が相互に関連し合う。かくして、組成物を本明細書に記載の方法に使用する場合、治療核酸の位置、量及び発現持続期間を測ることができる。
【００４７】
レポーター配列は、存在か、検出可能部分との結びつきか、検出可能信号の生成をもたらす活性かのいずれかによって容易に検出されることができるタンパク質をコードすることが好ましい。特定の態様では、検出可能部分は、放射性核種、蛍光発色団、発色団、微粒子、マイクロスフェア、酵素、酵素基質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ナノ粒子及び／またはナノスフェアを含み得、これらはどれも、レポーターを認識する及び／またはそれと相互作用する抗体またはリガンドに連結され得る。例示的な診断用核酸分子としては、限定されないが、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、膜結合タンパク質、例えばＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、ソマトスタチン受容体、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質、共輸送体（例えばＮＩＳ）及び当技術分野でよく知られているその他のものをコードする核酸分子が挙げられる。
【００４８】
一実施形態では、本明細書に記載の組成物の細胞外小胞は、裸の核酸分子、例えば裸のＤＮＡまたは裸のＲＮＡを含むように改変されている。別の実施形態では、核酸は、原核生物もしくは真核生物またはそれらの両方における発現、好ましくは哺乳動物細胞における発現に適した発現ベクター内にパッケージングされている。好適な発現ベクターとしては、例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ワクチニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター）、細菌ベクター、プラスミドベクター、人工染色体、バクテリオファージまたはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。発現ベクターは一般に、調節配列、ならびに挿入されたコード配列の翻訳及び／または転写に必要な他のエレメントを含有する。例えば、コード配列は、所望の遺伝子産物の発現を制御するのに役立つプロモーター及び／またはエンハンサーに機能可能に繋げられていることが好ましい。生物工学において使用されるプロモーターは、意図される遺伝子発現制御の種類によって種類が異なる。それらは概して、恒常的プロモーター、組織特異的または発達段階特異的プロモーター、誘導性プロモーター、及び合成プロモーターに分類され得る。利用するベクター系及び宿主に応じて任意の数の好適な転写及び翻訳エレメントが使用され得る。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターを使用することが好ましい。
【００４９】
所望の核酸分子ならびに適切な転写及び翻訳制御エレメントを含有する発現ベクターを構築する方法は当技術分野でよく知られている。これらの方法としては、例えば、試験管内での組換えＤＮＡ技術、合成的技術、及び生体内での遺伝子組換えが挙げられる。そのような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）、及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）に記載されており、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００５０】
細胞外小胞には、例えば電気穿孔などの当技術分野で知られている技術を用いて核酸または関心対象の核酸を装填することができる。電気穿孔は、電流パルス（例えば１００〜４００Ｖ／ｃｍ）を使用して小胞に細孔を導入することを伴い、当該細孔を介して核酸（複数可）が小胞内に侵入する。あるいは、マイクロインジェクションまたは粒子衝突を用いて細胞外小胞に関心対象の核酸（複数可）を装填することができる。あるいは、リポフェクションもしくはトランスフェクションを用いて市販のキット及び試薬を使用して、または熱ショックを用いる形質転換によって、細胞外小胞に装填することができる。
【００５１】
別の実施形態では、送達用の治療タンパク質及び／またはペプチドを硝子体液小胞及び／または房水小胞に装填する。一実施形態では、治療タンパク質は外因性タンパク質またはペプチドである。外因性とは、小胞に通常関係していないタンパク質またはペプチドを指す。
【００５２】
小胞内に装填されることになるタンパク質及び／またはペプチドは、標的細胞に対するそのタンパク質及び／またはペプチドの所望の効果に基づいて選択される。単一のタンパク質またはペプチドを小胞内に組み込んでもよい。あるいは、１つより多いタンパク質及び／またはペプチドを小胞内に組み込んでもよい。１つより多いタンパク質及び／またはペプチドは、同じまたは異なる標的に対して作用して所望の治療効果及び／または防止効果をもたらすものであり得る。
【００５３】
一実施形態では、小胞内に装填されることになるタンパク質及び／またはペプチドは抗体または抗体断片である。本明細書中で言及する「抗体」という用語は、全抗体（すなわち２本の重鎖と２本の軽鎖）、その抗体結合断片、例えば、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（例えば、ナノボディまたはＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びそれらの変異型、例えば、タンデムｓｃＦｖ、Ｆｄ断片、ダイアボディ、トリアボディを含む。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来技術を用いて得られ得、断片は完全抗体と同様の方法で利用のためにスクリーニングされ得る。
【００５４】
本明細書において開示される抗体及び抗体断片は結合ドメインに関して一価、二価または三価のものとすることができ、結合ドメインは単一特異的、二重特異的または三重特異的な結合特異性に設計され得る。好適な抗体としては、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体混合物が挙げられる。抗体は、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト化抗体または上記のいずれかの抗原結合部分であってもよい。治療抗体は、限定されないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ウシ及び軟骨魚類を含めた様々な種に由来するものであり得る。
【００５５】
一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、眼疾患または眼症状の治療に適したものである。好適な抗体またはその抗原結合断片としては、限定されないが例えば、疾患に関連するインテグリンに結合する、好ましくはその活性を遮断または低減するもの、例えば抗αＶβ３インテグリン抗体及び抗α４β１インテグリン抗体が挙げられる。本明細書に記載の組成物の細胞外小胞内に導入されることができるその他の好適な抗体としては、限定されないが例えば、抗上皮成長因子受容体抗体、抗血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、例えば、ベバシズマブ、ラニビズマブ、抗ＴＮＦα抗体、例えば、インフリキシマブ及びアダリムマブ、抗線維芽細胞成長因子抗体、抗上皮成長因子抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体ならびに抗ＩＬ−２抗体が挙げられる。
【００５６】
本明細書に記載の組成物の細胞外小胞内に導入されることができるその他の好適な抗体としては、限定されないが例えば、アブシキシマブ（レオプロ）、アダリムマブ（ヒュミラ、アムジェビタ）、アレファセプト（アメビブ）、アレムツズマブ（キャンパス）、バシリキシマブ（シムレクト）、ベリムマブ（ベンリスタ）、ベズロトクスマブ（ジーンプラバ）、カナキヌマブ（イラリス）、セルトリズマブペゴル（シムジア）、セツキシマブ（アービタックス）、ダクリズマブ（ゼナパックス、ジンブリタ）、デノスマブ（プロリア、Ｘゲバ）、エファリズマブ（ラプティバ）、ゴリムマブ（シンポニー、シンポニーアリア）、インフレクトラ（レミケード）、イピリムマブ（ヤーボイ）、イキセキズマブ（トルツ）、ナタリズマブ（タイサブリ）、ニボルマブ（オプジーボ）、オララツマブ（ラルトルボ）、オマリズマブ（ソレア）、パリビズマブ（シナジス）、パニツムマブ（ベクティビックス）、ペンブロリズマブ（キイトルーダ）、リツキシマブ（リツキサン）、トシリズマブ（アクテムラ）、トラスツズマブ（ハーセプチン）、セクキヌマブ（コセンティクス）、ウステキヌマブ（ステラーラ）が挙げられる。さらなる抗血管新生タンパク質／ペプチド治療薬としては、限定されないが例えば、ラムシルマブ、アキシチニブ、アキシチニブ、ＭＧＣＤ５１６、セジラニブ、オラパリブ、レスタウルチニブ、オラパリブ、セジラニブ、パゾパニブ、ドセタキセル、パゾパニブ塩酸塩、ＴＲＣ１０５、パゾパニブ、Ｘ４ｐ−００１、ニボルマブ、エリブリンメシル酸塩、ケトコナゾール、治療薬ヒドロコルチゾン、抗体Ｊ５９１、ドセタキセル、プリナブリン、ＳＦ１１２６、カルフィルゾミブ、ヒドロキシクロロキン、アルデスロイキン、ベバシズマブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、バンデタニブ、デュルバルマブ、オラパリブ、セジラニブ、サパニセルチブ、ｚｉｖ−アフリベルセプト、ベバシズマブ、ＬＹ２１５７２９９一水和物（ＬＹ２１５７２９９）、テモゾロミド、ＳＧＴ−５３、セジラニブマレイン酸塩、オラパリブ、ベバシズマブ、オシメルチニブ、レゴラフェニブ、イトラコナゾールが挙げられる。
【００５７】
別の実施形態では、治療タンパク質は、抗体模倣体である。「抗体模倣体」は、抗体のように抗原に特異的に結合することができる約３〜２０ｋＤａの任意の化合物、例えばペプチドまたはポリペプチドを包含する。一実施形態では、抗体模倣体は、抗体のＣＤＲループに類似する露出ループ中のアミノ酸を介してその標的抗原に結合する足場を含む。これらの抗体模倣体としては、限定されないが例えば、アドネクチン、リポカリン、Ｋｕｎｉｔｚドメインに基づく結合剤、アビマー、ノッティン、フィノマー、アトリマー、及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質−４（ＣＴＬＡ４）に基づく結合剤（Ｗｅｉｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ−ｂａｓｅｄ  Ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＆  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １０：１５５−１６８（２０１３）で総説されており、参照によりその全体が本明細書に援用される）が挙げられる。
【００５８】
別の実施形態では、治療タンパク質は、タンパク質阻害薬またはペプチド阻害薬である。タンパク質阻害薬またはペプチド阻害薬は、天然において、処置する疾患または症状に関連する１つ以上の受容体、酵素、ホルモン、プロテアーゼ、キナーゼ、成長因子、シグナル伝達経路、転写因子などの作用または活性に拮抗する、またはそれを阻害する、完全長タンパク質またはその生物学的活性ペプチド断片であり得る。タンパク質阻害薬またはペプチド阻害薬は、優勢な陰性受容体もしくはリガンド、またはデコイ受容体もしくはリガンドとして作用し得る。
【００５９】
一実施形態では、本明細書に記載の組成物の細胞外小胞は、眼疾患の治療に適したタンパク質阻害薬またはペプチド阻害薬を含有するように改変されている。例えば、タンパク質阻害薬またはペプチド阻害薬は血管新生の阻害薬であってもよい。血管新生の好適なタンパク質阻害剤／ペプチド阻害剤としては、限定されないが例えば、完全長アンジオスタチン及び生物学的に活性なその断片及び類縁体を含めたアンジオスタチンならびに、完全長エンドスタチン及び生物学的に活性なその断片及び類縁体を含めたエンドスタチン；他のコラーゲン由来ペプチド、例えば、タムスタチンペプチド、タムスタチン断片、及びペンタスタチン；シレンジタイドなどのＲＧＤ含有ペプチド、ならびに他のフィブロネクチン由来ペプチド；ならびにラミニンに由来するペプチド、例えばＣ１６Ｙ及びＣ１６Ｓが挙げられる（Ｒｏｓｃａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．１２（８）：１１０１−１１１６（２０１１）を参照のこと。参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【００６０】
細胞外小胞内に装填されることができる他の好適なタンパク質阻害剤またはペプチド阻害剤としては、限定しないが例えば、インテグリン拮抗薬、例えば、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−４、Ｍａｃ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＶＣＡＭ拮抗薬、ケモカイン拮抗薬、例えば、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−５、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ１α、ＣＣＲ５、ＲＡＮＴＥＳ拮抗薬、及びセレクチン拮抗薬、例えば、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びＬ−セレクチン拮抗薬が挙げられる。
【００６１】
細胞外小胞内に装填されることができる他の好適なタンパク質阻害剤またはペプチド阻害剤としては、限定しないが例えば、抗ＶＥＧＦ剤、ラニビズマブ（ルセンティス、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、アフリベルセプト（アイリーア、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，Ｎ．Ｙ．）、ルセンティス、ベバシズマブ（アバスチン、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、コルチコステロイド、硝子体内ステロイド、持続放出型生分解性デキサメタゾンインプラント、オズルデックス（Ａｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，Ｃａｌｉｆ．）、オクリプラスミン（ジェトレア、ＴｈｒｏｍｂｏＧｅｎｉｃｓ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ））を含めたＶｉｔｒｅｏｌｙｔｉｃｓ、抗ＰＤＧＦ治療薬、ＲＴＨ２５８、ＶＥＧＦ−Ａの全てのアイソフォームを阻害する低分子ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体断片、抗ＶＥＧＦ  ＤＡＲＰｉｎ（アビキパルペゴル）、抗ＰＤＧＦ剤フォビスタ（Ｏｐｈｔｈｏｔｅｃｈ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）及び、ステロイドであるフルオシノロンアセトニドを溶出する、ＤＭＥに適用される非生分解性インプラントであるイルビエンが挙げられる。
【００６２】
多様な技術によって外因性タンパク質及び／またはペプチドを小胞内に導入することができる。一実施形態では、電気穿孔またはトランスフェクション試薬の使用によって小胞への装填がなされる。電気穿孔の条件は治療薬積荷の電荷及び大きさによって様々であり得る。典型的な電圧は２０〜１０００Ｖ／ｃｍ、例えば２０〜１００Ｖ／ｃｍの範囲であり、静電容量は典型的には２５〜２５０μＴ、例えば２５〜１２５μＴである。小胞に抗体を装填するには１５０〜２５０ｍＶの範囲の電圧、特に２００ｍＶの電圧が好ましい。
【００６３】
あるいは、トランスフェクション試薬を使用して小胞に外因性タンパク質及び／またはペプチドを装填してもよい。小胞の大きさが小さいにもかかわらず、従来のトランスフェクション剤をタンパク質及び／またはペプチドの小胞へのトランスフェクションのために使用することができる。本発明に係る用途に好ましいトランスフェクション試薬としては例えばカチオン性リポソームが挙げられる。
【００６４】
別の実施形態では、細胞から産生される小胞としての細胞外小胞の中に治療タンパク質またはペプチドが取込まれるように、関心対象の治療タンパク質またはペプチドを発現する核酸構築物を宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトすることによって細胞外小胞に装填することもできる。
【００６５】
別の実施形態では、送達用の治療小分子を硝子体液小胞及び／または房水小胞に装填する。一実施形態では、小分子は、眼疾患を治療するために使用される小分子である。硝子体液細胞外小胞及び／または房水細胞外小胞に装填されることができる好適な眼科用治療剤としては、限定されないが例えば、炭酸脱水酵素阻害薬、例えばブリンゾラミド；βアドレナリン遮断薬、例えば、ベタキソロール、カルテオロール、レボブノロール、メチプラノロール、チモロールマレイン酸塩及びチモロール半水和物；α２アドレナリン作動薬、例えば、アプラクロニジン、ロピンジン（Ｌｏｐｉｎｄｉｎｅ）、ブリモニジン及びアルファガン；プロスタグランジン、例えば、ビマトプロスト、ロテプレドノール及びブロムフェナク；抗感染剤、例えば、抗生物質、抗真菌剤及び抗ウイルス剤；シクロスポリン、親油性ステロイド、及び抗生物質とステロイドとの合剤のような、Ｔ細胞免疫抑制剤；低分子チロシンキナーゼ阻害薬（ＴＫＩ）、例えばスニチニブ及びソラフェニブが挙げられる。
【００６６】
眼組織へ送達するための本明細書に記載の細胞外硝子体液小胞及び／または細胞外房水小胞の中へ装填されることができるさらなる治療薬としては、限定されないが例えば、Ｉｑｕｉｘ（ジェネリック名：レボフロキサシン）、ナタシン（ジェネリック名：ナタマイシン）、トブレックス（ジェネリック名：トブラマイシン）、ポリトリム（ジェネリック名：ポリミキシンｂ／トリメトプリム）、シロクサン（ジェネリック名：シプロフロキサシン）、ヴィロプティック（ジェネリック名：トリフルリジン）、モキセザ（ジェネリック名：オキシフロキサシン）、ザイマール（ジェネリック名：ガチフロキサシン）、ベシバンス（ジェネリック名：ベシフロキサシン）、ベガモックス（ｖｉｇａｍｏｘ）（ジェネリック名：モキシフロキサシン）、ジルガン（ジェネリック名：ガンシクロビル）、アザサイト（ジェネリック名：アジスロマイシン）、ａｋ−ｃｈｌｏｒ（ジェネリック名：クロラムフェニコール）、ａｋ−ｐｏｌｙ−ｂａｃ（ジェネリック名：バシトラシン／ポリミキシンｂ）、ａｋ−ｔｏｂ（ジェネリック名：トブラマイシン）、ベタダイン点眼液（ジェネリック名：ポビドンヨウ素）、ｂｌｅｐｈ−１０（ジェネリック名：スルファセタミドナトリウム）、眼科用クロロマイセチン（ジェネリック名：クロラムフェニコール）、ｃｈｌｏｒｏｐｔｉｃ（ジェネリック名：クロラムフェニコール）、デンドリド（ジェネリック名：イドクスウリジン）、ｅｙｅｍｙｃｉｎ（ジェネリック名：エリスロマイシン）、眼科用ガラマイシン（ジェネリック名：ゲンタマイシン）、ゲノプチック（ジェネリック名：ゲンタマイシン）、ｇｅｎｔａｃｉｄｉｎ（ジェネリック名：ゲンタマイシン）、ゲンタック（ジェネリック名：ゲンタマイシン）、ゲンタソール（ジェネリック名：ゲンタマイシン）、アイロタイシン（ジェネリック名：エリスロマイシン）、アイソプトセタミド（ジェネリック名：スルファセタミドナトリウム）、ネオポリシン（ジェネリック名：バシトラシン／ネオマイシン／ポリミキシンｂ）、ネオシジン（ジェネリック名：ａｃｉｔｒａｃｉｎ／ネオマイシン／ポリミキシンｂ）、眼科用ネオシジン溶液（ジェネリック名：グラミシジン／ネオマイシン／ポリミキシンｂ）、眼科用ネオスポリン（ジェネリック名：グラミシジン／ネオマイシン／ポリミキシンｂ）、ｏｃｕ−ｃｈｌｏｒ（ジェネリック名：クロラムフェニコール）、ｏｃｕ−ｍｙｃｉｎ（ジェネリック名：ゲンタマイシン）、ｏｃｕ−ｓｐｏｒｅ−ｂ（ジェネリック名：バシトラシン／ネオマイシン／ポリミキシン）、ｏｃｕ−ｓｐｏｒｅ−ｇ（ジェネリック名：グラミシジン／ネオマイシン／ポリミキシンｂ）、ｏｃｕ−ｔｒａｃｉｎ（ジェネリック名：バシトラシン）、ｏｃｕｆｌｏｘ（ジェネリック名：オフロキサシン）、ｐｏｌｙｃｉｎ−ｂ（ジェネリック名：バシトラシン／ポリミキシンｂ）、ｑｕｉｘｉｎ（ジェネリック名：レボフロキサシン）、ｒｏｙｍｉｃｉｎ（ジェネリック名：エリスロマイシン）、ｓｕｌｆ−１０（ジェネリック名：スルファセタミドナトリウム）、テラマイシンとポリミキシンｂ硫酸塩（ジェネリック名：オキシテトラサイクリン／ポリミキシンｂ）、ｔｏｂｒａｓｏｌ（ジェネリック名：トブラマイシン）、ｔｏｍｙｃｉｎｅ（ジェネリック名：トブラマイシン）、ｖｉｒａ−ａ（ジェネリック名：ビダラビン）、ｖｉｔｒａｓｅｒｔ（ジェネリック名：ガンシクロビル）、ｚｙｍａｘｉｎ、アトロピン、エイゾプト、バシトラシン、ベタダイン、ベタキソロール、ベトプティック、ブリンゾラミド、ｂｓｓ（平衡化塩溶液）、カルバコール、セファゾリン、セルルビスク、クロラムフェニコール、シロクサン、シプロフロキサシン、コソプト、デメカリウム、デキサメタゾン、ジピベフリン、ドルゾラミド、エピネフリン、フルオレセイン、フルルビプロフェン、ｐｈｙｓｏｓｔｉｍｉｎｅ、ゲンタマイシン、ピロカルピン、ｇｏｎｉｏｓｏｌ、ポリミキシンｂ、グラミシジン、プレドニゾロン、ｈｕｍｏｒｓｏｌ、プロパラカイン、ｈｙｌａｒｔｉｎ、ｐｒｏｐｉｎｅ、高張度ｎａｃｌ、ｐｕｒａｌｕｂｅ、インドシアニングリーン、ローズベンガル、イトラコナゾール、ヒアルロン酸ナトリウム、ラタノプロスト、スプロフェン、マンニトール、テラマイシン、メタゾラミド、チモロール、ミコナゾール、トブラマイシン、ミオスタット、トリアムシノロン、ｍｕｒｏ１２８、トリフルリジン、ネオマイシン、トロピカミド、ネプタザン  トルソプト、オキュフロックス、ビダラビン、オフロキサシン、ｖｉｒａ−ａ、オキシテトラサイクリン、ヴィロプティック、フェニレフリン、キサラタン、ＮＶＣ−４２２、ＦＳＴ−１００、Ｌｕｖｅｎｉｑ、ＥＳＢＡ１０５、マプラコラト（ＺＫ２４５１８６／ＢＯＬ−３０３２４２−Ｘ）、ネパフェナク０．３％、ＤｅｘａＳｉｔｅ（またはＩＳＶ−３０５）、ＡｚａＳｉｔｅ  Ｐｌｕｓ（またはＩＳＶ−５０２）、ＣＦ１０１、及びリフィテグラスト（ＳＡＲ１１１８）が挙げられる。
【００６７】
緑内障を治療するために眼組織へ送達するための本明細書に記載の細胞外硝子体液小胞及び／または細胞外房水小胞の中へ装填されることができるさらなる治療薬としては、限定されないが例えば、キサラタン（登録商標）（ラタノプロスト）、ルミガン（登録商標）（ビマトプロスト）、トラバタンｚ（登録商標）（トラボプロスト）及びジオプタン（商標）（タフルプロスト）を含めたプロスタグランジン類縁体、チモロールなどのベータ遮断薬、アルファ作動薬［アルファガン（登録商標）ｐ（ブリンゾラミド）、アイオピジン（登録商標）］、［トルソプト（登録商標）（ドルゾラミド）、エイゾプト（登録商標）（ブリンゾラミド）］及びダイアモックス（アセタゾラミド）及びネプタザン（登録商標）（メタゾラミド）及びブリンゾラミドを含めた炭酸脱水酵素阻害剤、コソプト（登録商標）や保存料不含製剤としてのもの（コソプト（登録商標）ｐｆ）を含めた合剤医薬、コンビガン、シムブリンザ（登録商標）、アイオジピン（登録商標）、アプラクロニジン塩酸塩０．５％、１％、アルファガン（登録商標）、ブリモニジン酒石酸塩０．１％、０．１５％、チモロールマレイン酸塩ｕｓｐ、チモロールマレイン酸塩０．５％、ベトプティック（登録商標）、ベタキソロール塩酸塩０．２５％、０．５％、ベタガン（登録商標）、レボブノロール塩酸塩眼科用溶液，ｕｓｐ  ０．２５％、０．５％、オプティプラノロール（登録商標）、メチプラノロール０．３％イスタロール（登録商標）チモロールマレイン酸塩眼科用溶液０．５％、チモプティック−ｘｅ（登録商標）、チモロールマレイン酸塩眼科用ゲル形成溶液０．２５％、０．５％、ベチモール（登録商標）、チモロール半水和物０．２５％、０．５％、エイゾプト（登録商標）、ブリンゾラミド眼科用懸濁液１％、ネプタザン（登録商標）、メタゾラミド、トルソプト（登録商標）、ドルゾラミド塩酸塩２％、ダイアモックス（登録商標）ｓｅｑｕｅｌｓ（登録商標）、アセタゾラミド、アイソプト（登録商標）カルピン、ピロカルピン塩酸塩１％、２％、４％、アイソプト（登録商標）カルバコール、０．７５％、１．５％、３％、ｐｉｌｏｐｉｎｅ  ＨＳ（登録商標）塩酸塩ゲル４％、ピロカルピン塩酸塩眼科用溶液ｕｓｐ、ピロカルピン塩酸塩１％、２％、４％、コンビガン（商標）、ブリモニジン酒石酸塩とチモロールマレイン酸塩、コソプト（登録商標）、ドルゾラミド塩酸塩とチモロールマレイン酸塩、シムブリンザ（登録商標）懸濁液、ブリンゾラミド／ブリモニジン酒石酸塩眼科用懸濁液１％／０．２％、トラバタンｚ（登録商標）、トラボプロスト（ｔｒａｖａｐｒｏｓｔ）０．００４％、ルミガン（登録商標）、ビマトプロスト０．０１％、０．０３％、ジオプタン（商標）、タフルプロスト眼科用溶液０．００１５％、キサラタン（登録商標）、ラタノプロスト０．００５％、ＲＯＣＫ阻害薬、Ｙ−２７６３２、ＡＴＳ９０７、ＡＴＳ８５３５、ＡＲ−１２２８６、ＡＲ−１３３２４、ＡＭＡ００７６、ＢＯＬ−３０３２５９−Ｘが挙げられる。
【００６８】
ドライアイを治療するために眼組織へ送達するための細胞外硝子体液小胞及び／または細胞外房水小胞の中へ装填されることができるさらなる治療薬としては、限定されないが例えば、眼科用レスタシス、眼科用ラクリサート、眼科用ｓｙｓｔａｎｅ  ｕｌｔｒａ、眼科用カルボキシメチルセルロースナトリウム、眼科用ｓｏｏｔｈｅ  ｘｐ、眼科用ｓｙｓｔａｎｅ（プロピレングリコール）、眼科用ｆｒｅｓｈｋｏｔｅ、眼科用ｒｅｆｒｅｓｈ  ｏｐｔｉｖｅ  ａｄｖａｎｃｅｄ、眼科用ｇｅｎｔｅａｌゲル、眼科用ｒｅｔａｉｎｅ  ＭＧＤ（ｐｆ）、ｃｌｅａｒ  ｅｙｅｓ  ｉｔｃｈｙ  ｅｙｅ  ｒｅｌｉｅｆ、眼科用ｓｙｓｔａｎｅ  ｂａｌａｎｃｅ  、ｒｅｆｒｅｓｈ  ｔｅａｒｓ、眼科用ｒｅｆｒｅｓｈ  ｌｉｑｕｉｇｅｌ、ｈｙｐｏｔｅａｒｓ、ｃｌｅａｒ  ｅｙｅｓ  ｒｅｄｎｅｓｓ  ｒｅｌｉｅｆ、ｂｉｏｎ  ｔｅａｒｓ（ｐｆ）、眼科用ｐｅｇ４００−プロピレングリコール、ｒｅｆｒｅｓｈ  ｏｐｔｉｖｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（ｐｆ）  ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｍ、眼科用ｒｅｆｒｅｓｈ  ｐｌｕｓ、ｔｅａｒｓ  ｎａｔｕｒａｌｅ  ｆｒｅｅ（ｐｆ）、ｌｉｑｕｉｔｅａｒｓ、眼科用シクロスポリン、眼科用ｇｅｎｔｅａｌ  ｐｍ、眼科用ｓｙｓｔａｎｅ  ｎｉｇｈｔｔｉｍｅ、眼科用ｇｅｎｔｅａｌ  ｓｅｖｅｒｅ、眼科用ｓｙｓｔａｎｅゲル、眼科用ｒｅｆｒｅｓｈ  ｌａｃｒｉ−ｌｕｂｅ、眼科用ｒｅｆｒｅｓｈ  ｐ．ｍ．点眼薬、アイソプトｔｅａｒｓ、眼科用ｐｕｒａｌｕｂｅ、ｔｈｅｒａｔｅａｒｓ、眼科用ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール−ポリビニルアルコールｅｙｅ、ｔｅａｒｓ  ｎａｔｕｒａｌｅ  ｐｍ、ｔｅａｒｓ  ｎａｔｕｒａｌｅ  ｆｏｒｔｅ、眼科用デキストラン７０−ヒプロメロース、眼科用ｌｕｂｒｉｆｒｅｓｈ  ｐｍ、潤滑剤点眼薬、眼科用ｒｅｆｒｅｓｈセルルビスク、眼科用カルボキシメチルセルロース−グリセリン（ｐｆ）、潤滑剤ｅｙｅ（ｐｇ−ｐｅｇ４００）、眼科用ｓｙｓｔａｎｅ液体ゲル、眼科用ｓｏｏｔｈｅ  ｈｙｄｒａｔｉｏｎ、眼科用ｒｅｆｒｅｓｈ  ｃｌａｓｓｉｃ（ｐｆ）、眼科用ｒｅｆｒｅｓｈ  ｏｐｔｉｖｅ、眼科用ｓｙｓｔａｎｅ  ｕｌｔｒａ（ｐｆ）、眼科用ｓｙｓｔａｎｅ（ｐｆ）、眼科用ｓｏｏｔｈｅ  ｌｕｂｒｉｃａｎｔ、眼科用ｃｌｅａｒ  ｅｙｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ、眼科用ｒｅｔａｉｎｅ  ｐｍ、点眼薬（ポビドン含有）、人工涙液（ポリビニルアルコール）、眼科用バイシンｔｏｔａｌｉｔｙ、眼科用ｏｐｔｉ−ｃｌｅａｒ、眼科用テトラヒドロゾリン−ｐｅｇ、眼科用ｍｏｉｓｔｕｒｅ  ｄｒｏｐｓ、ｔｅａｒｓ  ａｇａｉｎ、ｔｅａｒｓ  ｐｕｒｅ、眼科用ｇｏｎｉｏｓｏｆｔ、眼科用ｇｏｎａｋ、眼科用ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇ  ｄｒｏｐｓ、眼科用ポリビニルアルコールポビドン、眼科用白色ワセリン−鉱油、人工涙液（ヒプロメロース）、眼科用ｇｅｎｔｅａｌ  ｍｉｌｄ、眼科用ｇｏｎｉｏｔａｉｒｅ、ｔｅａｒｆａｉｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｙｅ、ｎａｔｕｒｅ’ｓ  ｔｅａｒｓ、無菌点眼薬、眼科用ｕｌｔｒａ  ｆｒｅｓｈ、眼科用ｕｌｔｒａ  ｆｒｅｓｈ  ｐｍ、眼科用ｐｅｇ  ４００−ヒプロメロース−グリセリン、眼科用ナファゾリン−ｐｅｇ３００、眼科用ナファゾリン−ヒプロメロース、眼科用プロピレングリコール、眼科用ａｌｌ  ｃｌｅａｒ  ＡＲ、眼科用プロピレングリコール−グリセリン、ｐｕｒｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｔｌｅ  ｅｙｅ、眼科用ｆｏｒ  ｓｔｙ  ｒｅｌｉｅｆ、人工涙液（デキストラン−ヒプロメロース−グリセリン）、眼科用無菌潤滑剤、眼科用ヒドロキシプロピルセルロース、点眼薬ａｄｖａｎｃｅｄ  ｒｅｌｉｅｆ、潤滑剤ｅｙｅ、眼科用軽質鉱油−鉱油、ｄｒｙ  ｅｙｅ  ｒｅｌｉｅｆ、眼科用ｒｅｄｎｅｓｓ  ｒｅｌｉｅｆ、眼科用ｔｅｔｒａｈｙｄｒａｌａｚｉｎｅ−デキストラン７０−ｐｅｇ４００−ｐｏｖｄｎ、眼科用ラノリン含有人工涙液、ｅｙｅ潤滑剤合剤ｎｏ．１、眼科用カルボキシメチルセルロース  ｓｏｄ−ｈｙｐｒｏｍｅｌｌ、ａｄｖａｎｃｅｄ  ｅｙｅ  ｒｅｌｉｅｆ、眼科用ナファゾリン−グリセリン、眼科用ｇｅｎｔｅａｌ  ｍｉｌｄ  ｔｏ  ｍｏｄｅｒａｔｅ、人工涙液（ヒプロメロース）（ｐｆ）、眼科用カルボキシメチルセルロース−グリセリン、眼科用潤滑剤ｒｅｄｎｅｓｓ  ｒｅｌｉｅｖｅｒ、人工涙液（グリセリン／プロピレングリコール）、眼科用ナファゾリン−硫酸亜鉛−グリセリン、潤滑剤点眼薬（グリセリン−プロピレングリコール）、眼科用ｒｅｄｎｅｓｓ  ｒｅｌｉｅｖｅｒ潤滑剤、眼科用ｇｏｎｉｏｖｉｓｃ、眼科用ａｄｖａｎｃｅｄ  ｅｙｅ  ｒｅｌｉｅｆ（ｍｏ−ｗｐｅｔ）、眼科用ｒｅｆｒｅｓｈ  ｃｏｎｔａｃｔｓ、眼科用デキストラン７０−ヒプロメロース（ｐｆ）、人工涙液（ｐｆ）、ｎａｔｕｒａｌ  ｔｅａｒｓ（ｐｆ）、眼科用テトラヒドロゾリン−ｐｅｇ４００−ｈｙｐｒｏｍ−ｇｌｙｃ、潤滑剤ｅｙｅ（デキストラン７０／ヒプロメロース）、人工涙液（ワセリン／鉱油）、点眼薬ｔｅａｒｓ、眼科用ポビドン、眼科用ｐｅｇ４００−プロピレングリコール（ｐｆ）、眼科用ポリビニルアルコール−ポビドン（ｐｆ）、眼科用ａｄｖａｎｃｅｄ  ｆｏｒｍｕｌａ点眼薬、眼科用ｒｅｔａｉｎｅ  ｃｍｃ、眼科用軽質鉱油−鉱油（ｐｆ）、眼科用カルボキシメチルセルロース−グリセリン−ｐｏｌｙｓｏｒｂ８０、眼科用ｍａｘｉｍｕｍ  ｒｅｄｎｅｓｓ  ｒｅｌｉｅｆ、潤滑剤ｄｒｙ  ｅｙｅ  ｒｅｌｉｅｆ、眼科用ｅｑ  ｇｅｎｔｌｅ、眼科用カルボキシメチル−グリセリン−ｐｏｌｙｓｏｒｂ８０−ｐｆ、ｕｌｔｒａ潤滑剤ｅｙｅ、眼科用ｍｏｉｓｔｕｒｉｚｉｎｇ潤滑剤、眼科用ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇ  ｐｌｕｓ、眼科用ｒｅｖｉｖｅ  ｐｌｕｓ、眼科用ｎａｐｈａｚｏ  ｈｃｌ−ｈｙｐｒｏｍｅ−ｐｓ８０−ｚｎ  ｓｕｌｆ、眼科用ａｋｗａ  ｔｅａｒｓ（ポリビニルアルコール）、眼科用バイシンｔｅａｒｓ、バイシンｔｉｒｅｄ  ｅｙｅ  ｒｅｌｉｅｆ、バイシンｍａｘ  ｒｅｄｎｅｓｓ  ｒｅｌｉｅｆ、バイシンａｄｖａｎｃｅｄ  ｒｅｄｎｅｓｓ  ｒｅｌｉｅｆ、眼科用ｒｅｆｒｅｓｈ  ｏｐｔｉｖｅ  ａｄｖａｎｃｅｄ（ｐｆ）、眼科用テトラヒドロゾリン−亜鉛−ｐｅｇ４００−ｈｙｐｒｏｍｅｌｌｏ−グリセリン、眼科用ｒｅｔａｉｎｅ  ｈｐｍｃ、眼科用潤滑剤ｅｙｅ（プロピレングリコール）、眼科用潤滑剤ｅｙｅ（カルボキシメチルセルロース−グリセリン）、眼科用潤滑剤ｅｙｅ（ｃｍｃ−グリセリン）（ｐｆ）、眼科用潤滑剤ｅｙｅ（ｐｇ−ｐｅｇ４００）（ｐｆ）、眼科用ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇ  ｒｅｌｉｅｆ、眼科用潤滑剤ゲル、眼科用ｒｅｓｔｏｒｅ  ｔｅａｒｓ、眼科用潤滑剤ｐｌｕｓ、眼科用ｎａｔｕｒａｌ  ｂａｌａｎｃｅ  ｔｅａｒｓ、眼科用ｃｌｅａｒ  ｅｙｅｓ  ｃｏｏｌｉｎｇ  ｃｏｍｆｏｒｔ、眼科用ｃｌｅａｒ  ｅｙｅｓ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｒｅｄｎｅｓｓ  ｒｅｌｉｅｆ、眼科用ｇｅｎｔｅａｌ  ｔｅａｒｓ、眼科用ｔｅａｒｓ  ａｇａｉｎ（ｐｖａ）、眼科用人工涙液（デキストラン７０−ヒプロメロース）、眼科用人工涙液（ポリビニルアルコール／ポビドン）、眼科用人工涙液（ｐｇ４００−ヒプロメロース−グリセリン）、眼科用ｇｅｎｔｅａｌ  ｔｅａｒｓ（ｄｘｔｒｎ−ｈｐｍ−ｇｌｙ）、及びキシイドラ（登録商標）（リフィテグラスト眼科用溶液）５％または他の任意の百分率もしくは組み合わせが挙げられる。
【００６９】
一実施形態では、組成物の硝子体液細胞外小胞及び／または房水細胞外小胞はさらに、小胞の外表面に真核細胞特異的な標的指向性分子または部分を発現または提示するように改変されている。一実施形態では、標的指向性部分は、細胞外小胞の表面に発現することが典型的である膜貫通タンパク質との融合タンパク質として発現するペプチドである。好適なペプチドは、標的となる細胞の細胞表面にみられる受容体またはそのリガンドなどの細胞表面部分に結合するものである。好適な標的指向性部分の例は、短鎖（典型的には１００アミノ酸未満の長さ、例えば、５０アミノ酸未満の長さ、３０アミノ酸未満の長さで、最短長さが１０、５、３、２または１アミノ酸（複数可）である）ペプチド、完全長タンパク質、抗体またはその抗原結合断片及び誘導体（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖなど）、ならびに完全タンパク質であり、但し条件として標的指向性部分は、細胞外小胞の表面に発現することができる、かつ細胞外小胞内への膜タンパク質の挿入を妨害しないものとする。典型的には、標的指向性ペプチドは膜貫通細胞外小胞タンパク質とは異種である。
【００７０】
標的指向性部分は、例えば眼、筋肉、脳、肝臓、膵臓、肺などの特定組織種に細胞外小胞を標的とする、または腫瘍などの疾患組織を標的とするように、選択されることができる。本発明の一実施形態では、細胞外小胞は眼組織を標的とする。
【００７１】
一実施形態では、細胞外小胞は、眼組織取込み輸送体によって認識される部分またはリガンドを細胞外小胞の外面に発現することによって、眼組織を標的とすることができる。いくつかのアミノ酸輸送体及びペプチド輸送体は眼組織上及び眼細胞上に発現する。例えば、アミノ酸輸送体ＡＳＣＴ１（ＳＬＣ１Ａ４）は角膜及び初代角膜上皮細胞において発現し、アミノ酸輸送体ＡＳＣＴ２（ＳＬＣ１Ａ５）は網膜ミュラー細胞上に発現する。Ｂ０，＋（ＳＬＣ６Ａ１４）は、角膜上皮に発現する広範な基質特異性を有する中性及びカチオン性アミノ酸輸送体である。Ｌａｔ１（ＳＬＣ７Ａ５）はヒト角膜において発現し、ＬＡＴ２（ＳＬＣ７Ａ８）は網膜色素上皮細胞において発現する。ペプチド輸送体ＰＥＰＴ１及びＰＥＰＴ２は、角膜上皮及び網膜ミュラー細胞において発現する。アミノ酸輸送体及びペプチド輸送体の他にも、有機カチオン／アニオン（ＳＬＣ２２）、モノカルボキシレート（ＳＬＣ１６）及びヌクレオシド輸送体（ＳＬＣ２８及び２９）が様々な眼組織上で同定されている。かくして、細胞外小胞を輸送体特有の標的指向性部分で装飾して、細胞外小胞によって運ばれる治療積荷の送達を促すことができる。好適な標的指向性部分としては、限定されないが例えば、Ｂ（０，＋）アミノ酸輸送体による送達を促すＬ−アスパラギン酸エステル、ガンマ−グルタミン酸エステル及びフェニルアラニン（例えば、Ｍａｊｕｍｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｒａｎｓｃｏｒｎｅａｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−  ａｎｄ  Ｄ−ａｓｐａｒｔａｔｅ  Ｅｓｔｅｒ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｏｆ  Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ：Ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  Ｖｅｒｓｕｓ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ，”Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２６（５）：１２６１−９（２００９）、Ａｎａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｏｆ  Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ  ａｓ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｏｃｕｌａｒ  ＨＳＶ−１  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｎｅｕｔｒａｌ  ａｎｄ  Ｃａｔｉｏｎｉｃ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ，”Ｃｕｒｒ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２９（２−３）：１５３−６６（２００４）、及びＤｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｄ−ｓｅｒｉｎｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌｓ，”Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．８４（１）：１９１−９（２００７）を参照のこと。参照によりその全体が本明細書に援用される）；網膜上及び角膜上のオリゴペプチド輸送体による送達を促すＬ−バリン、グリシン−バリン、バリン−バリン、チロシン−バリン部分（例えば、Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｍｉｔｒａ，“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌ−ｖａｌｙｌ  Ｅｓｔｅｒ  ｏｆ  Ａｃｙｃｌｏｖｉｒ：Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｃｏｒｎｅａ，”Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．１９（８）：１１９４−２０２（２００２）、Ｇｕｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｒｎｅａｌ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｅｒｉｏｒ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｏｎｏｅｓｔｅｒ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｏｆ  Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）：Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｓｅ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｗｉｔｈ  Ｖａｌ−ＧＣＶ  ａｎｄ  ＧＣＶ  ｉｎ  Ｒａｂｂｉｔｓ，”Ｊ  Ｏｃｕｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２２（６）：４６５−７６（２００６）、Ｍａｊｕｍｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．“Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｏｎｏｅｓｔｅｒ  Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  ＨＳＶ−１−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｔｉｓ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ，”Ｊ  Ｏｃｕｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２１（６）：４６３−７４（２００５）、Ｋａｔｒａｇａｄｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｅｆｆｌｕｘ  ｂｙ  Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ：ａｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｎｆｌｕｘ  ａｃｒｏｓｓ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｃｏｒｎｅａ，”Ｊ  Ｏｃｕｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２２（２）：１１０−２０（２００６）、Ｋａｎｓａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｏｎｏｅｓｔｅｒ  Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｓｃｌｅｒａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｏｎ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｎａ，”Ｊ  Ｏｃｕｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２３（４）：３２１−３４（２００７）を参照のこと。参照によりその全体が本明細書に援用される）、網膜上のナトリウム依存性マルチビタミン輸送体による送達を促すビオチン（例えば、Ｊａｎｏｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｖｉｔｒｅａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ：Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓｏｄｉｕｍ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｍｕｌｔｉｖｉｔａｍｉｎ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｏｎ  Ｒｅｔｉｎａ，”Ｊ  Ｏｃｕｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２５（１）：３９−４９（２００９）を参照のこと。参照によりその全体が本明細書に援用される）、ならびに網膜色素上皮細胞上のＧＬＵＴ１受容体への送達を促すグルコース（例えば、Ｄａｌｐｉａｚ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｄｏｐａｍｉｎｅ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，”Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ．３３６（１）：１３３−９（２００７）を参照のこと。参照によりその全体が本明細書に援用される）が挙げられる。
【００７２】
ペプチド標的指向性部分は、細胞外小胞膜貫通タンパク質との融合タンパク質として発現することによって細胞外小胞の表面に発現する。複数のタンパク質が細胞外小胞と結びつくことが知られており、つまり、それらは形成されたときに細胞外小胞内に組み込まれる。本発明の細胞外小胞を標的とするための使用に好ましいタンパク質は、膜貫通タンパク質であるものである。例としては、限定されないが、Ｌａｍｐ−１、ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ、Ｓｙｎｔａｘｉｎ−３、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＨＬＡ−ＤＭ（ＭＨＣ  ＩＩ）、免疫グロブリン、ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ構成要素、及びテトラスパニンが挙げられる。
【００７３】
他の実施形態では、特異的な標的指向性部分は、細胞外小胞内に含まれている必要はない。例えば、療法が必要とされる部位に細胞外小胞を直接投与してもよい。あるいは、所望の奏効を生じるには眼周囲または眼内投与による送達で十分であり得る。
【００７４】
いくつかの実施形態では、特に組成物の細胞外小胞が外因性治療剤を含有するように改変されている場合、組成物は、薬学的に許容できる担体をさらに含む。「薬学的に許容できる担体」（賦形剤）は、組成物の細胞外小胞を対象に送達するための、薬学的に許容できる溶媒、懸濁化剤または薬学的に不活性な他の任意のビヒクルである。典型的な薬学的に許容できる担体としては、限定されないが、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトース及びその他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレートまたはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素添加植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。
【００７５】
本明細書において提供される組成物は、医薬組成物において一般的にみられる他の補助成分をさらに含有し得る。したがって、組成物は例えば、適合性を有する付加的薬理活性材料を含有してもよいし、または本発明の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化するのに役立つ付加的材料、例えば、色素、香味剤、保存料、酸化防止剤、増粘剤及び安定化剤を含有してもよい。しかしながら、そのような材料は、添加された場合に、本明細書において提供される組成物の成分の生物学的活性を過度に妨害するものであってはならない。
【００７６】
一実施形態では、硝子体液細胞外小胞及び／または房水細胞外小胞の組成物は、徐放性または持続放出性材料へと製剤化される。例えば、一実施形態では、組成物の細胞外小胞を標的領域または標的組織へ徐々に放出する薄膜コーティングを含むように組成物を製剤化することができる。徐放性または持続放出性コーティングに適するコーティングを調製するために用いることができる方法及び材料は当業者によく知られている。好適なコーティングは、生体適合性であるとともに細胞外小胞組成物との適合性を有するものでなければならない。一実施形態では、薄膜は、生体吸収性ポリマー（複数可）からなる。好適な生体吸収性エラストマーの例は、Ｂｅｚｗａｄａの米国特許第５，４６８，２５３号及びＭｅｈｔａの米国特許第６，６２７，２４６号に記載されている。有用なポリマーは、Ｌ−ラクチド、Ｄ−ラクチド、イプシロン−カプロラクトン及びグリコリドの混合物を含む。これらの混合物の相対的組成を用いてコーティングの加水分解及び吸着の速度、細胞外小胞放出速度、及び膜強度を制御することができる。徐放に適する薄膜を調製するために使用することができる他の高分子材料としては、（限定されないが）例えば、ポリアミド、ポリアルキレンオキサラート、ポリ（アミノ酸）、コポリ（エーテル−エステル）、ポリ（イミノカーボネート）ポリオルトエステル、ポリ（酸無水物）及びそれらのブレンドが挙げられる。徐放性眼科用組成物のための、眼内で分解され得る天然に存在するポリマーとしては、例えば、ヒアルロン酸、吸収性生体適合性多糖、例えばキトサンまたはデンプン、フィブリン、エラスチン、フィブリノゲン、コラーゲン及び脂肪酸（及びそのエステル）が挙げられる。一実施形態では、例えば、細胞外小胞の組成物を含有する溶解ポリマーを含有する溶液を、コーティングすべき表面に噴霧することによって、またはこれらの溶液中にインプラントの一部を浸漬することによって、細胞外小胞の組成物を含有するポリマーをインプラントに塗布することができる。薄膜は典型的には、膜中の治療薬が使い果たされるまで数週間にわたって持続的送達を提供する。厚みは、どれだけ長く送達が望まれるか、及び細胞外小胞装填濃度に依存するであろう。厚みは典型的には５〜３０ミクロン以下であるが、それ以外の厚みも容認される。
【００７７】
本開示の別の態様は、対象の選定された細胞または組織に治療剤を送達する方法に関する。この方法は、治療剤を含有するように改変された硝子体液細胞外小胞及び／または房水細胞外小胞の組成物を提供すること、ならびに治療剤を含有するように改変された硝子体液細胞外小胞及び／または房水細胞外小胞を含む組成物を対象の選定された細胞または組織に送達するのに有効な条件下で、対象に組成物を投与することを伴う。
【００７８】
本発明のこの態様によれば、好適な対象は任意の哺乳動物対象を含む。対象は典型的にはヒトであるが、本明細書に記載の細胞外小胞の組成物を受けることができる非ヒト哺乳動物としては、例えば、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯動物（例えば、マウス、ラット、モルモット）、ウマ、シカ、ウシ及び乳牛、ヒツジ、ならびにブタが挙げられる。
【００７９】
一実施形態では、細胞外小胞の組成物は、自家組成物である、つまり、組成物の細胞外小胞は、組成物を投与されるのと同じ対象の眼内液すなわち硝子体液及び／または房水から単離されたものである。別の実施形態では、組成物は、細胞外小胞を含有する眼内液を提供したドナー対象と、処置されるレシピエント対象とが同じ種であるが異なる個体である、同種異系組成物である。代替的実施形態では、組成物は異種のものであり得る。この実施形態では、硝子体液小胞及び／または房水小胞は、レシピエント種とは異なる種のドナー対象から得られる。例えば、ウシ細胞外小胞は、単離され得、ヒト対象を治療するのに適した組成物を生成すべく改変され得る。
【００８０】
一実施形態では、本明細書に記載の細胞外小胞の組成物が投与される対象は、眼疾患を有する対象であり、組成物の投与は、眼疾患の治療として治療剤を対象の眼細胞または眼組織に送達する。
【００８１】
本明細書に記載の組成物の投与によって治療することができる眼疾患としては、限定されないが例えば、眼変性疾患、例えば、乾燥型黄斑変性症、脈管障害に続発する黄斑浮腫、色素性網膜炎、及び湿潤型黄斑変性症；全ての形態の緑内障、開放隅角緑内障（例えば、低眼圧及び正常眼圧緑内障）、閉塞隅角緑内障、先天性緑内障、続発緑内障、新生血管緑内障、色素性緑内障、原発若年緑内障、偽落屑緑内障、虹彩角膜内皮症候群、及び種々雑多な起源を有する緑内障（例えば、眼内腫瘍、網膜剥離、化学火傷、虹彩萎縮及び中毒性緑内障に関連する緑内障）；炎症疾患、例えば、散弾様網膜症、糖尿病網膜症、原田病及びＶｏｇｔ−小柳−原田症候群、虹彩炎、多巣性脈絡膜炎及び汎ぶどう膜炎、扁平部炎、後部強膜炎、サルコイドーシス、全身性紅斑性狼瘡に起因する網膜炎、交換性眼炎、網膜下線維症、ぶどう膜炎症候群、白点症候群；加齢黄斑変性症、網膜色素線条症、網膜静脈分枝閉塞症、脈絡膜炎、角膜外傷関連障害、糖尿病関連虹彩新血管形成、糖尿病網膜症、突発性脈絡膜新血管形成、病的近視、網膜剥離、網膜腫瘍、未熟児網膜症及び鎌状赤血球網膜症を含めた新血管形成に関連する眼症状；脈絡膜、網膜または角膜に関連する眼感染症、例えば、サイトメガロウイルス網膜炎、ヒストプラズマ網脈絡膜炎、トキソプラズマ網脈絡膜炎及び結核性脈絡膜炎；網膜、脈絡膜、ぶどう膜、硝子体または角膜における異常な組織成長、脈絡膜メラノーマ、脈絡膜、硝子体または網膜における眼内リンパ腫、転移性病変、網膜芽細胞腫及び網膜芽細胞腫から硝子体への播種などの、新生物疾患；ならびに外傷、例えば、怪我もしくは手術に起因する外傷、またはレーザーもしくは強力な光への曝露に起因する網膜損傷が挙げられる。
【００８２】
本明細書に記載の方法及び組成物を用いる治療に適する角膜の特定の障害としては、例えば、角膜擦過傷、角膜ジストロフィー、角膜潰瘍、角膜新血管形成、フックスジストロフィー、角膜炎、円錐角膜、アレルギー性結膜炎、ドライアイ症候群、ドライアイ、関節リウマチ、シェーグレン症候群、角膜形成術後の問題、角膜創傷、アレルギー、細菌性角膜炎、ウイルス性角膜炎、単純ヘルペスウイルス（ｈｓｖ）感染症、及び水痘帯状疱疹ウイルス（ｖｚｖ）が引き起こす眼部帯状疱疹、真菌性角膜炎（角膜真菌症）、原虫性角膜炎（Ｐｒｏｔｏｚｏａｌ Ｋｅｒａｔｉｔｉｓ）、アカントアメーバ角膜炎、巨大角膜、小角膜、扁平角膜、球状角膜、角膜混濁、辺縁角膜炎、酒さ性角膜炎、潰瘍性角膜炎、翼状片、蚕食性角膜潰瘍、凹窩、フリクテン症、テリエン辺縁変性、老人環、ｖｏｇｔ’ｓ  ｌｉｍｂａｌ  ｇｉｒｄｌｅ、滴状角膜、脂質角膜症、帯状角膜症、球状変性、ザルツマン結節状変性、クロコダイルシャグリーン、フックス内皮ジストロフィー、格子状ジストロフィー、地図状斑点状指紋状ジストロフィー、ペルーシド辺縁変性、球状角膜、虹彩角膜内皮（ｉｃｅ）症候群、露出性角膜症、乱視、薬剤性角膜炎、ｔｈｙｇｅｓｏｎ点状表層角膜炎、シスチン症、免疫タンパク質蓄積、ムコ多糖症ならびにウィルソン病が挙げられる。
【００８３】
本明細書に記載の方法及び組成物を用いる治療に適する結膜の障害としては、限定されないが例えば、急性結膜炎、急性アトピー性結膜炎、急性化学性結膜炎、慢性アレルギー性結膜炎、他の慢性アレルギー性結膜炎、アデノウイルス性結膜炎、ウイルス性結膜炎、結膜弛緩症、結膜出血、瞼裂斑、瞼裂斑炎、漿液性結膜炎、が挙げられる。
【００８４】
本明細書に記載の方法及び組成物を用いる治療に適する角膜ジストロフィーとしては、限定されないが例えば、内皮（フックス）、顆粒状、格子状、紅斑性、他の遺伝性の角膜ジストロフィー、例えば、前部基底膜ジストロフィー及び後部多形性角膜ジストロフィー、アベリノ角膜ジストロフィー、斑状角膜ジストロフィー、膠様滴状角膜ジストロフィー、シュナイダー角膜ジストロフィー、ｆｒａｎｃｏｉｓ−ｎｅｅｔａｎｓ斑状ジストロフィー、先天性遺伝間質ジストロフィーが挙げられる。さらに、角膜浮腫／混濁／変性、水疱性角膜症、コンタクトレンズによる角質浮腫、特発性角膜浮腫、続発性角膜浮腫、デスメ膜破裂、角膜中央部混濁、周辺部角膜混濁、他の角膜瘢痕及び混濁、軽微な角膜混濁、老人環、帯状角膜症、角膜軟化症、結節状角膜変性、周辺部角膜変性、安定した円錐角膜、不安定な円錐角膜、角膜拡張、デスメ膜瘤、角膜移植、角膜移植片拒絶、角膜移植不全、角膜移植感染症、角膜移植のその他の合併症も含まれる。本明細書に記載の方法及び組成物を用いる治療に適するものにはさらに、角膜異物／怪我／裂傷、角膜異物、結膜異物、角膜及び結膜嚢の火傷、異物を伴わない結膜創傷及び角膜擦過傷、眼内組織の脱出または喪失を伴う眼裂傷及び眼破裂、眼内組織の脱出または喪失を伴わない眼裂傷及び眼破裂、眼球及び周辺組織の打撲（例えば、外傷性前房出血）、単純ヘルペス、ヘルペスウイルス性角膜炎、ヘルペスウイルス性結膜炎、その他のヘルペスウイルス性疾患、帯状疱疹、帯状疱疹結膜炎、帯状疱疹角膜炎、帯状疱疹強膜炎、その他の帯状疱疹、角膜炎、中心部角膜潰瘍、環状角膜潰瘍、前房蓄膿を伴う角膜潰瘍、辺縁角膜潰瘍、蚕食性角膜潰瘍、真菌性角膜潰瘍、穿孔性角膜潰瘍、角膜嚢腫、糸状、光線角膜炎光線角膜炎、点状露出角結膜炎、乾性角結膜炎、神経栄養性角結膜炎、角結膜炎を伴う乾燥症候群、フリクテン性角結膜炎、間質性角膜炎（例えば、コーガン症候群）、限局性角膜血管侵入、ドライアイ、再発性角膜びらん、コンタクトレンズに起因する角膜障害、シェーグレン症候群、乾燥症候群、翼状片、周辺翼状片、定在性翼状片、進行性翼状片、再発性翼状片も含まれる。
【００８５】
白内障を含めた水晶体の障害も、本明細書に記載の方法及び組成物で治療することができる。
【００８６】
本明細書に記載の方法及び組成物で治療することができる神経眼症状としては、限定されないが例えば、眼瞼痙攣、脳神経麻痺、顔面ジストニア、巨細胞性／一過性動脈炎、頭蓋内圧亢進、虚血性視神経症、多発性硬化症、視神経腫瘍、視神経炎、視神経症、視野欠損及び非動脈炎性虚血性視神経症（ｎａｉｏｎ）が挙げられる。
【００８７】
本明細書に記載の方法及び組成物で治療することができる網膜疾患としては、限定されないが例えば、網膜静脈分枝閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、中心性漿液性脈絡網膜症、脈絡膜剥離、複雑網膜剥離、先天性Ｘ染色体連鎖性網膜分離症、網膜上膜、家族性滲出性硝子体網膜症、特発性傍中心窩毛細血管拡張症、感染性網膜炎、眼内レンズ偏位、黄斑浮腫、黄斑円孔、第一次硝子体過形成遺残、ポリープ状脈絡膜血管症、後部硝子体剥離、推定眼ヒストプラズマ症候群、水晶体核落下、網膜動脈閉塞、色素性網膜炎及び人工網膜、未熟児網膜症、河川盲目症／オンコセルカ症、硝子体黄斑牽引症候群、網膜芽細胞腫、黄斑パッカー、黄斑円孔、飛蚊症、ｂｉｅｔｔｉ結晶性角膜網膜ジストロフィー、ヒストプラズマ症、網膜芽細胞腫、アッシャー症候群が挙げられる。
【００８８】
本明細書に記載の方法及び組成物で治療することができる網膜障害としては、限定されないが例えば、以下の合併症を伴うまたは伴わない１型真性糖尿病による糖尿病網膜症が挙げられる。合併症の記載のないもの、黄斑浮腫を伴い軽度の非増殖性網膜症を伴うもの、黄斑浮腫を伴わず軽度の非増殖性網膜症を伴うもの、黄斑浮腫を伴い中等度の非増殖性網膜症を伴うもの、黄斑浮腫を伴わず中等度の非増殖性網膜症を伴うもの、黄斑浮腫を伴い重度の非増殖性網膜症を伴うもの；黄斑浮腫を伴わず重度の非増殖性網膜症を伴うもの、黄斑浮腫を伴い増殖性網膜症を伴うもの；黄斑浮腫を伴わず増殖性網膜症を伴うもの。２型真性糖尿病による糖尿病網膜症；合併症の記載のないもの、黄斑浮腫を伴い軽度の非増殖性網膜症を伴うもの、黄斑浮腫を伴わず軽度の非増殖性網膜症を伴うもの、黄斑浮腫を伴い中等度の非増殖性網膜症を伴うもの、黄斑浮腫を伴わず中等度の非増殖性網膜症を伴うもの、黄斑浮腫を伴い重度の非増殖性網膜症を伴うもの、黄斑浮腫を伴わず重度の非増殖性網膜症を伴うもの、黄斑浮腫を伴い増殖性網膜症を伴うもの、黄斑浮腫を伴わず増殖性網膜症を伴うもの。その他の網膜の障害としては、例えば、黄斑変性及び後極型、非滲出型黄斑変性（乾燥型）、滲出型黄斑変性（湿潤型）黄斑嚢胞、円孔または偽円孔、中心性漿液性脈絡網膜症、嚢胞様黄斑変性（ｃｍｅ）、黄斑パッカー（ｅｒｍ）、黄斑のドルーゼン（変性）、硝子体黄斑牽引、白内障手術後の嚢胞様黄斑浮腫、硝子体型変性、例えば、硝子体出血、硝子体変性（例えばｐｖｄ）硝子体黄斑癒着（ｖｍｔ）、硝子体内結晶沈着、他の硝子体混濁（例えば飛蚊症）、他の硝子体の障害、視神経型障害、例えば、視神経円盤のコロボーマ、視神経円盤のドルーゼン、虚血性視神経症、視神経乳頭炎、他の視神経萎縮症、頭蓋内圧亢進に関連する乳頭浮腫、原発性視神経萎縮症、眼球後方神経炎、眼内炎、その他の眼内炎、汎眼球炎（急性）、汎ぶどう膜炎、化膿性内眼球炎、交換性ぶどう膜炎が挙げられる。遺伝性網膜ジストロフィー、主に網膜色素上皮が関与するジストロフィー、主に感覚網膜が関与するその他のジストロフィー（例えばＳｔａｒｇａｒｄｔ病）、色素性（例えば色素性網膜炎）ジストロフィー、硝子体網膜ジストロフィー、虹彩毛様体炎、慢性虹彩毛様体炎、水晶体誘導虹彩毛様体炎、原発性虹彩毛様体炎、再発性急性虹彩毛様体炎、続発性感染性虹彩毛様体炎、続発性非感染性虹彩毛様体炎、一過性黒内障、眼球萎縮（例えば眼球癆）、白内障手術後の眼内の白内障（水晶体）核落下、変性近視（例えば悪性）、複視（二重視）、前兆を伴い非難治性である偏頭痛；前兆を伴い非難治性であり偏頭痛発作重積状態を伴う偏頭痛；前兆を伴い難治性であり偏頭痛発作重積状態を伴わない偏頭痛；前兆を伴い難治性であり偏頭痛発作重積状態を伴う偏頭痛；偏頭痛発作重積状態を伴わないもの、眼痛、非難治性眼筋麻痺性偏頭痛、難治性眼筋麻痺性偏頭痛、他の異常グルコース（例えば前糖尿病）他の難治性偏頭痛；非難治性であり偏頭痛発作重積状態を伴う他の偏頭痛；難治性であり偏頭痛発作重積状態を伴わない他の偏頭痛；難治性であり偏頭痛発作重積状態を伴う他の偏頭痛；偏頭痛発作重積状態を伴わないもの、他の長期（現在）の薬物療法、他の視力障害（視界不良）、他の自覚的視力障害（例えば光視症）関節リウマチ、突然の視力低下、一過性視力低下、紅斑性狼瘡、後極部の黄斑瘢痕（炎症後）（外傷後）、日光網膜症、脈絡網膜炎症、脈絡膜出血、脈絡膜破裂、脈絡膜の良性新生物、剥離に対する手術の後の脈絡網膜瘢痕、漿液性脈絡膜剥離、出血性脈絡膜剥離、高血圧性網膜症、滲出型網膜症、網膜細動脈瘤、詳細不明の網膜新血管形成、詳細不明のその他の非糖尿病性増殖性網膜症網膜出血、網膜浮腫（例えば綿花状白斑）網膜虚血、周辺部網膜変性型、網膜格子状変性、微小類嚢胞敷石状網膜変性、網膜変性、加齢性網膜網状変性、続発性硝子体網膜変性、網膜剥離、単一裂孔を有する網膜剥離、多発裂孔を有する網膜剥離、巨大網膜裂孔を有する網膜剥離、鋸状縁離断を伴う網膜剥離、網膜全剥離、その他の網膜剥離、詳細不明の網膜牽引剥離（例えば、網膜剥離を伴うＰＶＲ）、網膜分離症、その他の網膜分離症及び網膜嚢胞、漿液性網膜剥離、網膜裂孔型漿液性網膜剥離、網膜裂孔、剥離を伴わない馬蹄型網膜裂孔、剥離を伴わない網膜円孔、剥離を伴わない多発性網膜欠陥。
【００８９】
本明細書に記載の方法及び組成物であらゆる種類の網膜血管閉塞症を治療することもでき、これには、網膜中心動脈閉塞症（ｃｒａｏ）、網膜動脈分枝閉塞症（ｂｒａｏ）、網膜中心静脈閉塞症（ｃｒｖｏ）、網膜支流（分枝）静脈閉塞症（ｂｒｖｏ）、未熟児網膜症（ＲＯＰ）型未熟児網膜症第０期ＲＯＰ、第１期未熟児網膜症、第２期未熟児網膜症、第３期未熟児網膜症、第４期未熟児網膜症、第５期未熟児網膜症が含まれる。中心性漿液性脈絡網膜症（ｃｓｒ）、漿液性網膜色素上皮剥離及び出血性網膜色素上皮剥離を含めた網膜層分離も、本明細書に記載の方法及び組成物によって治療することができる。
【００９０】
本明細書に記載の方法及びＥＶ組成物で治療することができる脈絡膜及び網膜の障害としては、限定されないが例えば、脈絡網膜炎症、孤立性脈絡網膜炎症、孤立性脈絡網膜炎、脈絡膜炎、網膜炎、網脈絡膜炎、散在性脈絡網膜炎症  散在性：脈絡網膜炎、脈絡膜炎、網膜炎、網脈絡膜炎、滲出型網膜症、後部毛様体炎、扁平部炎、他の脈絡網膜炎症、原田病、詳細不明の脈絡網膜炎症；脈絡網膜炎、脈絡膜炎、網膜炎、網脈絡膜炎、脈絡網膜瘢痕、後極部黄斑瘢痕（炎症後）（外傷後）、日光網膜症、脈絡膜変性、脈絡膜萎縮、脈絡膜硬化症、網膜色素線条症、遺伝性脈絡膜ジストロフィー、コロイデレミア、脈絡膜ジストロフィー（中心性輪紋状）（全般性）（周辺部）、脳回転状萎縮、脈絡膜オルニチン血症、脈絡膜出血破裂、特定不能の脈絡膜出血、駆逐性脈絡膜剥離、脈絡膜のその他の特定障害、他のどこかに分類される疾患における脈絡網膜障害、他のどこかに分類される疾患における脈絡網膜障害、他のどこかに分類される感染性及び寄生虫疾患における脈絡網膜炎症、梅毒性の、後期の、トキソプラズマ性の、結核性の脈絡網膜炎、他のどこかに分類される疾患における他の脈絡網膜障害、網膜剥離裂孔、網膜剥離、網膜分離症（Ｘ染色体連鎖性網膜分離症を含む）、網膜動脈閉塞、網膜静脈閉塞、高血圧性網膜症、加齢黄斑変性、網膜上皮黄斑変性、周辺部網膜変性、遺伝性網膜ジストロフィー、色素性網膜炎、中心性漿膜性網膜症、網膜剥離、網膜色素上皮剥離、他の特定網膜障害、黄斑浮腫、詳細不明の網膜障害、他のどこかに分類される疾患における網膜障害が挙げられる。
【００９１】
本明細書に記載の方法及び組成物でさらに治療することができる眼瞼及び涙器系及び眼窩の障害としては、限定されないが例えば、眼瞼外反、兎眼、眼瞼皮膚弛緩症、眼瞼下垂、霰粒腫、麦粒腫、眼瞼黄色腫、他のどこかに分類される疾患における眼瞼の寄生虫侵入、ニキビダニ属に起因する眼瞼皮膚炎、リーシュマニア症、ロア糸状虫症、オンコセルカ症、シラミ寄生症を含めた眼瞼の寄生虫侵入、他のどこかに分類される感染性疾患における眼瞼の関与が挙げられる。ヘルペスウイルス（単純ヘルペス）性感染における眼瞼の関与、らい病、伝染性軟属腫、結核、帯状疱疹、他のどこかに分類される疾患における眼瞼の関与、膿痂疹における眼瞼の関与、涙腺炎、流涙症、甲状腺機能不全性眼球突出、甲状腺眼疾患が挙げられる。
【００９２】
本明細書に記載の方法及び組成物で治療することができる緑内障障害としては、限定されないが例えば、境界域所見を示す開放隅角前緑内障、開放隅角、低リスク、解剖学的狭隅角原発閉塞隅角の疑い、ステロイドレスポンダー、高眼圧症、緑内障損傷を伴わない原発性閉塞隅角（視神経または視野の喪失を伴わないｐａｓまたは高ｉｏｐ）、詳細不明の開放隅角緑内障、原発性開放隅角緑内障、慢性単純緑内障、低眼圧緑内障、色素性緑内障、水晶体の偽落屑を伴う水晶体嚢緑内障、開放隅角緑内障の残遺期、詳細不明の原発性閉塞隅角緑内障、急性閉塞隅角緑内障発作、慢性閉塞隅角緑内障、間欠性閉塞隅角緑内障、残遺期閉塞隅角緑内障、眼外傷に続発する緑内障、眼炎症に続発する緑内障、網膜血管閉塞症、合併症を有する１型糖尿病、合併症を有する２型糖尿病、水晶体の障害、眼内レンズの障害、他の眼症候の後の障害、新生物、良性新生物または悪性のものを含めた他の眼障害に続発する緑内障が挙げられる。さらに、薬物に続発する緑内障、上強膜静脈圧の上昇を伴う緑内障、過分泌緑内障、房水誤指向（ａｑｕｅｏｕｓ  ｍｉｓｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）悪性緑内障、他のどこかに分類される疾患における緑内障、先天緑内障、アクセンフェルト奇形、牛眼、小児緑内障、新生児緑内障、先天性緑内障（ｈｙｄｒｏｐｈｔｈａｌｍｏｓ）、球状角膜、緑内障を伴う先天緑内障巨大角膜、先天緑内障における巨大眼球、緑内障を伴う巨大角膜、絶対緑内障も挙げられる。さらには、眼科用薬物及び製剤の副作用、急性濾胞性結膜炎、炭酸脱水素酵素阻害薬の副作用、及び眼科用薬物及び製剤の投薬下での副作用も挙げられる。
【００９３】
本明細書に記載の方法及び組成物で治療することができる視神経の障害としては、限定されないが例えば、緑内障性視神経萎縮、視神経乳頭炎、球後視神経炎、詳細不明の視神経萎縮、原発性視神経萎縮、詳細不明の視神経炎、その他の視神経炎、視神経円板の偽乳頭浮腫、詳細不明の乳頭浮腫、乳頭浮腫、虚血性視神経症、視交差の障害、他の新生物に関連する視交差の障害、血管障害に関連する視交差の障害、炎症性障害に関連する視交差の障害、視神経のその他の障害、視神経の圧迫、中毒性視神経症、栄養性視神経症、遺伝性視神経萎縮、皮質盲、眼窩の肉芽腫（例えば、眼窩の偽腫瘍（炎症性））、緊張性瞳孔、脳下垂体の良性新生物、眼窩の不明部位の良性新生物、瞳孔不同、感覚症候を伴う転換性障害、脳髄膜の良性新生物、眼痛、びまん性甲状腺腫を伴い甲状腺クリーゼを伴う甲状腺中毒症（例えば、グレーブス病、特定不能の眼球突出性または中毒性の甲状腺腫）、びまん性甲状腺腫を伴い甲状腺クリーゼを伴わない甲状腺中毒症（例えば、グレーブス病、特定不能の眼球突出性または中毒性の甲状腺腫）、散瞳、瞳孔不同、両眼運動の詳細不明の障害（例えば斜方偏位）、輻輳不全型核間性眼筋麻痺、他の巨細胞性動脈炎、緊張性瞳孔、他の自覚的視力障害（例えば光視症）、赤血球沈降速度上昇、脳梗塞、（例えば脳卒中）一過性脳虚血発作、眼窩の悪性新生物、進行性外眼筋麻痺、乳頭周囲孤立性脈絡網膜炎症、後天性色覚異常、盲点の暗点、（例えばホーレンホーストの）部分型網膜動脈閉塞、共同注視麻痺（痙攣）、複視（二重視）その他の斜視型、内斜位、外斜位、上下斜視（例えば上斜視）、麻痺型、第３眼球運動神経、第４眼球運動神経、第６眼球運動神経、眼瞼下垂、先天性眼瞼下垂、機械的眼瞼下垂、筋原性眼瞼下垂、麻痺性眼瞼下垂、視野障害、一過性視力喪失（例えば閃輝性暗点）、同側性両側視野欠損、交叉性両側視野欠損が挙げられる。
【００９４】
本明細書に記載の方法及び組成物で治療することができる神経系の障害としては、限定されないが例えば、一過性黒内障、ホルネル症候群、眼瞼痙攣、多発性硬化症、一過性脳虚血発作、良性頭蓋内圧亢進、非難治性の眼筋麻痺性偏頭痛、難治性の眼筋麻痺性偏頭痛、（急性）増悪を伴わない重症筋無力症、（急性）増悪を伴う重症筋無力症、間代性片側顔面痙攣が挙げられる。
【００９５】
本明細書に記載の治療剤を含有するように改変された硝子体液細胞外小胞及び／または房水細胞外小胞の組成物による治療を受けることができる他の症状としては、限定されないが例えば、血液悪性腫瘍、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、病的線維症、皮膚線維症、突発性肺線維症、他の線維性の兆候、神経変性、虚血、急性間欠性ポルフィリン症、固形がん、肝臓がん、副腎皮質がん腫、膵臓がん、高コレステロール血症、糖尿病黄斑浮腫、急性非動脈炎前部虚血性視神経症、急性腎損傷の防止、腎移植レシピエントにおける移植片機能遅延、家族性アミロイド多発神経炎、進行がん、トリグリセライド上昇、筋萎縮性側索硬化症、前立腺がん、骨髄異形成症候群、ハンチントン病、トリグリセライド上昇／家族性高コレステロール血症、固形がん、嚢胞性線維症、潰瘍性大腸炎、固形がん、ドゥシェンヌ型筋ジストロフィー、高リポタンパク血症（ａ）、Ｂ型肝炎感染症、２型糖尿病、アレルゲン誘導喘息、喘息、アトピー性皮膚炎、液状がん、骨髄性白血病、凝血障害、回腸嚢炎、家族性乳糜血症候群、家族性部分型リポジストロフィー、家族性アミロイド多発神経炎、前立腺がん、非小細胞肺がん、メラノーマ、三重陰性乳がん、狂犬病、ＲＳＶ、ＨＩＶ、インフルエンザＡ、心血管疾患、ジカウイルス感染症、前立腺がん、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、非小細胞肺がん、腎細胞がん腫、固形がん、先天性爪肥厚症、肝線維症、原発性１型高シュウ酸尿症、肥厚性瘢痕、重度血友病ＡまたはＢ、発作性夜間ヘモグロビン尿症、肝及び肺疾患、血友病及び稀な出血性障害、高コレステロール血症、急性肝性ポルフィリン症、補体媒介性疾患、原発性１型高シュウ酸尿症、遺伝性ＡＴＴＲアミロイド症、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス感染症、ＨＣＶ、ＡＭＤ／ＤＭＥ、ＡＭＤ、ＮＡＩＯＮ、先天性爪肥厚症、ＦＡＰ／結腸がん、ＰＤＡＣ、ＣＭＬ、ＡＫＩ及びＤＧＦが挙げられる。
【００９６】
本開示のこの実施形態によれば、組成物の細胞外小胞は、眼疾患を治療するのに適した１つ以上の治療剤を含有するように改変されている。好適な治療剤、すなわち核酸分子（治療ＲＮＡ及び治療ＤＮＡ）、タンパク質及びペプチド治療薬ならびに小分子治療薬は上に記載されている。特定の眼疾患のための好適な治療薬の選択は眼科分野の当業者の技量レベル範囲内である。
【００９７】
本開示のこの態様によれば、硝子体液細胞外小胞及び／または房水細胞外小胞を含有する組成物は、それを必要とする患者に、局所投与、全身投与、眼周囲投与または眼内投与を用いて投与することができる。選択される特定の投与経路は、治療しようとする症状及び組成物の剤形に依存する。
【００９８】
一実施形態では、組成物を全身投与する。全身投与は、静脈内投与、経口投与、動脈内投与、吸入、鼻腔内投与、腹膜腔内投与、腹腔内投与、皮下投与、関節内投与、クモ膜下腔内投与、経硬膜投与、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）投与、粘膜下投与、舌下投与、経腸投与、非経口投与、経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）投与、関節周囲投与または脳室内投与によって成し遂げることができる。
【００９９】
別の実施形態では、組成物を局所投与する。一実施形態では、組成物を眼組織に局所投与する。本明細書中で言及しているように、眼組織は、強膜内組織（例えば網膜）及び強膜外組織（例えば、眼窩内の眼筋）を含めた眼を指す。眼組織は、神経学的に眼に連結されている（但し、眼から遠くはない）組織、例えば、視神経、膝状体及び視覚野も含む。眼組織への局所投与は、眼内投与によって成し遂げることができる。この実施形態によれば、眼内投与は、前房内（ｉｎｔｒａｃａｍｅｒａｌ）投与、硝子体内投与または網膜内投与によって行うことができる。
【０１００】
別の実施形態では、眼組織への局所投与は、眼周囲投与によって成し遂げることができる。眼周囲投与は、結膜下注射、テノン嚢下注射、直接眼周囲注射または眼周囲蓄積注射によって行うことができる。
【０１０１】
細胞外小胞の標的細胞及び／または組織は、任意の所望の細胞及び／または組織種を含み得る。一実施形態では、標的細胞は眼細胞である。本明細書に記載の細胞外小胞によって治療剤を送達するのに適した眼細胞としては、限定されないが例えば、毛様体上皮、色素毛様体上皮、無色素毛様体上皮、毛様体突起、ミュラー細胞、神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、視細胞（桿体及び錐体）双極細胞、網膜色素上皮または網膜内皮細胞を含めた網膜細胞、角膜上皮、角膜支質（角膜細胞）、角質内皮または縁幹細胞を含めた角膜の細胞、色素もしくは無色素細胞、紡錘形線維芽細胞、マクロファージ（小金井の塊細胞）、括約筋の平滑筋、または後部上皮を含めた虹彩の細胞、シュレム管の線維柱帯細胞または内皮細胞層を含めた線維柱帯細胞、水晶体上皮、前部水晶体上皮細胞、クリスタリン含有水晶体線維細胞、水晶体線維または水晶体嚢を含めた水晶体の細胞、立方上皮細胞、上衣細胞層、脈絡叢上皮細胞または脈絡膜内皮細胞を含めた脈絡膜の細胞、オリゴデンドロサイト、網膜神経節細胞軸索または神経膠細胞を含めた視神経の細胞、間葉系幹細胞、縁幹細胞、網膜幹細胞を含めた幹及び前駆細胞が挙げられる。
【０１０２】
別の実施形態では、治療剤を運ぶ細胞外小胞の標的細胞及び／または組織は非眼細胞を含む。本明細書に記載の細胞外小胞を使用する治療薬送達のための非眼標的細胞及び組織としては、限定されないが例えば外分泌細胞及び組織が挙げられ、これには、限定されないが、上皮細胞、唾液腺粘膜細胞（多糖に富む分泌物）、唾液腺１番（糖タンパク質酵素に富む分泌物）、舌内のフォン・エブネル腺細胞（味蕾を浄化する）、乳腺細胞（乳分泌）、涙腺細胞（涙液分泌）、耳内の耳垢腺細胞（耳垢分泌）、エクリン汗腺の暗調細胞（糖タンパク質分泌）、エクリン汗腺の明調細胞（小分子分泌）、アポクリン汗腺細胞（匂いを有する分泌物、性ホルモン感受性）、眼瞼内のモル腺細胞（特別な汗腺）、皮脂腺細胞（脂質に富む皮脂分泌物）、鼻内のボーマン腺細胞（嗅上皮を浄化する）、十二指腸内のブルンネル腺細胞（酵素及びアルカリ性粘液）、精嚢細胞（精子を泳がせるための果糖を含む精液成分を分泌する）、前立腺細胞（精液成分を分泌する）、尿道球腺（粘液分泌）、バルトリン腺（膣潤滑液分泌）、尿道腺細胞（粘液分泌）、子宮内膜細胞（糖質分泌）、気道及び消化管の離隔した杯細胞（粘液分泌）、胃壁粘膜細胞（粘液分泌）、胃腺胃酵素限細胞（ペプシノゲン分泌）、胃腺酸分泌細胞（塩酸分泌）、膵腺房細胞（重炭酸塩及び消化酵素分泌）、小腸のパネート細胞（リゾチーム分泌）、肺のｉｉ型肺細胞（界面活性剤分泌）、肺のクラブ細胞が含まれる。
【０１０３】
別の実施形態では、治療剤を運ぶ細胞外小胞の標的細胞及び／または組織はホルモン分泌細胞を含み、これには、限定されないが、脳下垂体前葉細胞、ソマトトロピン産生細胞、プロラクチン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、脳下垂体中葉細胞、分泌性メラニン細胞刺激ホルモン、巨細胞性神経分泌細胞、オキシトシン非分泌性、バソプレシン分泌性、腸管及び気管細胞、セロトニン分泌性、エンドルフィン分泌性、ソマトスタチン分泌性、ガストリン分泌性、セクレチン分泌性、コレシストキニン非分泌性、インスリン分泌性、グルカゴン分泌性、ボンベシン非分泌性、甲状腺細胞、甲状腺上皮細胞、傍濾胞細胞、副甲状腺細胞、副甲状腺主細胞、好酸性細胞、副腎細胞、クロム親和性細胞、ステロイドホルモン分泌性（鉱質コルチコイド及びグルココルチコイド）、テストステロンを分泌する精巣のライディッヒ細胞、エストロゲンを分泌する卵胞の内莢膜細胞、プロゲステロンを分泌する卵胞破裂の黄体細胞、顆粒膜黄体細胞、卵胞膜黄体細胞、傍糸球体細胞（レニン分泌）、腎臓の緻密斑細胞、腎臓の極周囲細胞、腎臓のメサンギウム細胞、膵島（ランゲルハンス島）、アルファ細胞（グルカゴンを分泌する）、ベータ細胞（インスリン及びアミリンを分泌する）、デルタ細胞（ソマトスタチンを分泌する）、ｐｐ細胞（ガンマ細胞）（膵臓ポリペプチドを分泌する）、イプシロン細胞（グレリンを分泌する）が含まれる。
【０１０４】
別の実施形態では、治療剤を運ぶ細胞外小胞の標的細胞及び／または組織は、外胚葉に主として由来する細胞を含み、これには、外皮系由来細胞、角化上皮細胞、表皮角化細胞（分化している表皮細胞）、表皮基底細胞（幹細胞）、手の爪及び足の爪の角化細胞、爪床基底細胞（幹細胞）、毛髄質細胞、毛皮質細胞、毛小皮細胞、毛根鞘小皮細胞、ハックスレー層の毛根鞘細胞、ヘンレ層の毛根鞘細胞、外毛根鞘細胞、毛母細胞（幹細胞）、湿性重層バリア上皮細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道及び膣の重層扁平上皮の表面上皮細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道及び膣の上皮の基底細胞（幹細胞）、（膀胱及び尿管に沿った）尿管上皮細胞が含まれる。
【０１０５】
別の実施形態では、治療剤を運ぶ細胞外小胞の標的細胞及び／または組織は神経系細胞を含み、これには、限定されないが、感覚トランスデューサー細胞、コルチ器官内の聴覚内有毛細胞、コルチ器官内の聴覚内有毛細胞、コルチ器官内の聴覚内有毛細胞、嗅上皮の基底細胞（嗅神経の幹細胞）、低温感受性一次知覚ニューロン、高温感受性一次知覚ニューロン、表皮のメルケル細胞（接触センサー）、嗅覚受容器ニューロン、痛覚感受性一次知覚ニューロン（様々な種類）、眼内の網膜の視細胞、桿体視細胞、眼の青色感受性錐体視細胞、眼の緑色感受性錐体視細胞、眼の赤色感受性錐体視細胞、固有受容性一次知覚ニューロン（様々な種類）、接触感受性一次知覚ニューロン（様々な種類）、ｉ型頸動脈小体細胞（血液ｐｈセンサー）、ｉｉ型頸動脈小体細胞（血液ｐｈセンサー）、耳の前庭系のｉ型有毛細胞（加速度及び重力）、耳の前庭系のｉｉ型有毛細胞（加速度及び重力）、ｉ型味蕾細胞、自律神経細胞、コリン作動性神経細胞（様々な種類）、アドレナリン作動性神経細胞（様々な種類）、ペプチド作動性神経細胞（様々な種類）、感覚器及び周辺ニューロン支持細胞、コルチ器官の内柱細胞、コルチ器官の外柱細胞、コルチ器の内指節細胞、コルチ器の外指節細胞、コルチ器の境界細胞、コルチ器のヘンゼン細胞、前庭器支持細胞、味蕾支持細胞、嗅上皮支持細胞、シュワン細胞、サテライトグリア細胞（末梢神経細胞体を封入している）、腸管神経膠細胞、中枢神経系ニューロン及び神経膠細胞、神経細胞（未だあまり分類されていない多様な種類）、介在ニューロン、バスケット細胞、ｃａｒｔｗｈｅｅｌ細胞、星状細胞、顆粒細胞、ルガロ細胞、単極ブラシ細胞、マルチノッティ細胞、シャンデリア細胞、中型有棘ニューロン、カハール・レチウス細胞、ダブルブーケ細胞、ニューログリアフォーム細胞、螺旋状介在ニューロン、レンショー細胞、主細胞、紡錘神経細胞、錐体細胞、場所細胞、格子細胞、スピード細胞、頭方位細胞、ベッツ細胞、星状細胞、境界細胞、星状膠細胞（様々な種類）、オリゴデンドロサイト、上衣細胞及び伸長上衣細胞が含まれる。
【０１０６】
別の実施形態では、治療剤を運ぶ細胞外小胞の標的細胞及び／または組織は、中胚葉に主として由来する細胞を含み、これには、限定されないが、代謝貯蔵細胞、脂肪細胞、白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞、肝臓脂質細胞、バリア機能細胞（肺、胃腸、外分泌腺及び尿生殖路）、腎臓、腎臓壁側細胞、腎臓糸球体有足細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、ヘンレ係蹄の細い脚の細胞、腎臓遠位尿細管細胞、腎臓集合管細胞、主細胞、間在細胞、その他のｉ型肺細胞（肺胞上皮細胞）、膵管細胞（腺房中心細胞）、（汗腺、唾液腺、乳腺などの）平滑筋導管細胞、主細胞、介在細胞、（精嚢、前立腺などの）導管細胞、（微絨毛を有する）腸刷子縁細胞、外分泌腺横紋筋導管細胞、胆嚢上皮細胞、精巣輸出管非線毛細胞、精巣上体主細胞、精巣上体基底細胞、内皮細胞が含まれる。
【０１０７】
別の実施形態では、治療剤を運ぶ細胞外小胞の標的細胞及び／または組織は細胞外基質細胞を含み、これには、限定されないが、エナメル上皮芽細胞（歯のエナメル質分泌）、耳の前庭系の半月面上皮細胞（プロテオグリカン分泌）、コルチ器歯間上皮細胞（有毛細胞を覆う蓋膜を分泌する）、疎性結合組織線維芽細胞、角膜線維芽細胞（角膜細胞）、腱線維芽細胞、骨髄細網細胞線維芽細胞、その他の非上皮線維芽細胞、周皮細胞、椎間板の髄核細胞、セメント芽細胞／セメント細胞（歯根骨様ｅｗａｎ細胞分泌）、象牙芽細胞／象牙細胞（歯象牙質分泌）、硝子軟骨軟骨細胞、線維軟骨細胞、弾性軟骨細胞、骨芽細胞／骨細胞、骨幹細胞（骨芽細胞の幹細胞）、眼の硝子体の硝子体細胞、耳の外リンパ腔の星状細胞、肝星細胞（伊東細胞）、膵星細胞が含まれる。
【０１０８】
別の実施形態では、治療剤を運ぶ細胞外小胞の標的細胞及び／または組織は収縮性細胞を含み、これには、限定されないが、骨格筋細胞、赤色骨格筋細胞（遅い）、白色骨格筋細胞（速い）、中間骨格筋細胞、筋紡錘の核嚢細胞、筋紡錘の核鎖細胞、衛星細胞（幹細胞）、心筋細胞、通常の心筋細胞、結節性心筋細胞、プルキンエ線維細胞、平滑筋細胞（様々な種類）、虹彩の筋上皮細胞、外分泌腺の筋上皮細胞が含まれる。
【０１０９】
別の実施形態では、治療剤を運ぶ細胞外小胞の標的細胞及び／または組織は血液及び免疫系細胞を含み、これには、限定されないが、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）（赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ））、巨核球（血小板前駆体）、単球（白血球）、結合組織マクロファージ（様々な種類）、表皮ランゲルハンス細胞、（骨中の）破骨細胞、（リンパ組織中の）樹状細胞、（中枢神経系の）小膠細胞、好中性顆粒球、好酸性顆粒球、好塩基性顆粒球、ハイブリドーマ細胞、マスト細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、網状赤血球、血液及び免疫系の幹細胞及び前駆細胞（様々な種類）、限定されないが卵原細胞／卵母細胞、精子細胞、精母細胞、精原細胞（精母細胞の幹細胞）、精子を含めた胚細胞、限定されないが卵胞細胞、（精巣内の）セルトリ細胞、胸腺上皮細胞を含めたナース細胞ならびに、間質腎細胞を含めた間質細胞が含まれる。
【０１１０】
本開示のこの態様によれば、対象に治療的有効量の組成物が投与される。治療的有効量は、治療する症状の少なくとも１つの症候または他の側面を緩和する、阻害する、低減する、遅延させる、及び／または防止するのに有効な量である。別の実施形態では、治療的有効量は、治療する眼症状を改善させるのに有効な量である。用量は、様々なパラメータに応じて、特に、治療される患者の症状の重症度、年齢及び体重；投与経路；ならびに必要とされる投薬計画に応じて決定され得る。医師であれば、任意の特定患者に必要とされる投与経路及び投薬量を決定することができるであろう。最適投薬量は、投与する組成物の相対力価に応じて様々であり得、通常は、試験管内及び生体内モデルにおいて有効であると見出された半数効果濃度（ＥＣ５０）に基づいて推定することができる。通常、投薬量は０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。典型的な１日用量は、特定の構築物の力価、治療される対象の年齢、体重及び症状、疾患の重症度、ならびに投与の頻度及び経路に応じて、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。投与が全身投与によるのかまたは局所投与によるのかに応じて異なる投薬量の構築物が投与され得る。
【０１１１】
治療剤のクリアランス（及び任意の標的指向性治療分子の分解）ゆえに対象を反復的に、例えば、１日、１週間、１ヶ月または１年に１回以上治療せねばならないことがある。当業者であれば、測定された体液中または組織中の構築物の滞留時間及び濃度に基づいて投薬反復率を簡単に推定することができる。好結果な治療の後、患者に維持療法を受けさせることが好ましい場合があり、この場合、構築物を１日、１ヶ月、１年などに１回以上、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の維持用量で投与する。
【０１１２】
本開示の別の態様は、本明細書に記載の硝子体液細胞外小胞及び／または房水細胞外小胞を含む組成物を作る方法に関する。例示的な方法は、硝子体液及び／または房水を含む哺乳動物眼内液試料を提供すること、ならびに眼内液試料から小胞を単離することを伴う。方法は、単離された小胞の中に前記１つ以上の外因性作用物質を挿入することをさらに伴い得る。
【０１１３】
一実施形態では、眼内液試料はヒト眼内液試料である。別の実施形態では、眼内液試料はウシ眼内液試料である。別の実施形態では、眼内液は非ヒト哺乳動物眼内液試料、例えば、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯動物、シカ、ヒツジ、ブタなどから得られる眼内液試料である。
【０１１４】
一実施形態では、眼内液試料は健常な正常眼内液試料である。別の実施形態では、眼内液試料は、罹患した眼内液試料であるか、または眼疾患もしくは眼症状を有する対象から得られるものである。眼内液試料は、当技術分野で知られている、及び本明細書において記載されている方法を用いて得ることができる。一実施形態では、眼内液試料は、硝子体生検または房水生検もしくは吸引によって得られる。
【０１１５】
眼内液から細胞外小胞を単離する好適な方法は本明細書において記載されている。一実施形態では、細胞外小胞を単離する方法は一連の遠心分離ステップを伴う。本明細書において言及する「眼内液」は、限定されないが、硝子体液からの流体、房水からの流体または、硝子体液及び／または房水を含んでいる任意の眼内液試料を含む。
【０１１６】
本明細書において記載されているように、房水及び／または硝子体液から単離された細胞外小胞は、１つ以上の外因性作用物質を含有するように改変される。外因性作用物質（複数可）を細胞外小胞内に挿入する方法は、限定されないが電気穿孔、トランスフェクション、ウイルスベクター送達またはそれらの任意の組み合わせを含めた、当技術分野において知ること及び実践することが容易である方法及び技術を用いて成し遂げることができる。
【０１１７】
一実施形態では、１つ以上の外因性作用物質の挿入に先立って、単離された細胞外小胞の内在性内容物を除去する。細胞外小胞の内在性内容物を除去する方法は、紫外線照射を用いて成し遂げることができる。小胞の内容物を空にするための、当技術分野で知られているその他の方法も、本開示のこの態様に従って用いるのに適している。
【０１１８】
本開示の別の態様は、対象の眼疾患を同定、検出、診断、追跡評価または予後予測する方法に関する。この方法は、対象からの硝子体液及び／または房水を含む眼内液試料を提供すること、ならびに眼内液試料から細胞外小胞を単離することを伴う。この方法は、単離された細胞外小胞の少なくとも１つの分子的または物理的特性を分析すること及び、単離された小胞の少なくとも１つの分析された分子的特性または物理的特性を、基準試料から得られた単離された小胞における分子的特性または物理的特性と比較することをさらに伴う。眼疾患の存在または非存在は、その比較に基づいて同定、検出または診断される。あるいは、比較は、眼疾患または眼症状の進行または予後に関する情報を提供する。硝子体液細胞外小胞及び／または房水細胞外小胞の分子的特徴及び／または物理的特性に基づいて検出、診断及び追跡評価することができる眼症状の総合的一覧は上に提供されている。
【０１１９】
本明細書では、正常で健常な硝子体液及び房水における広範囲にわたる細胞外小胞ネットワークの発見について記載している。包括的プロテオーム解析を行ってこの細胞外小胞ネットワークの正常で健常なプロテオームを特性評価した。このプロテオームシグネチャの変化は、個体における眼の健康の変化を同定、検出、診断、予後予測及び／または追跡評価する手段として利用することができる。同様に、単離された細胞外小胞のその他の分子的特性、例えば正常で健常な眼内液から得られた試料の中の細胞外小胞の遺伝子発現及び脂質含有量を、経時的な個体の眼の健康の変化を追跡するための基準値として得て利用することもできる。細胞外小胞の遺伝子発現及び／または脂質含有量の変化を用いて個体における眼の健康の変化を同定、検出、診断、予後予測及び／または追跡評価することができる。
【０１２０】
かくして、一実施形態では、健常対象から得られた房水及び／または硝子体液を含む眼内液試料ならびにその中に含まれる細胞外小胞を単離または精製する。プロテオーム、ゲノムまたは脂質解析を行って対象のベースラインまたは基準でのタンパク質もしくは遺伝子発現シグネチャまたは脂質含有量を決定する。次に、房水及び／または硝子体液を含む第２の眼内液試料を得、房水及び／または硝子体液の細胞外小胞を単離し、細胞外小胞のタンパク質発現、遺伝子発現及び／または脂質含有量プロファイルを決定する。第２の眼内液試料は、第１の試料を採集した後の任意の時間に対象から採集することができる。一実施形態では、第２の試料は、対象が眼症状の１つ以上の症候を被っている時またはそのあたりで採集する。他の実施形態では、第２の試料は、対象がまだ眼の健康の変化を何ら被っていないまたは呈していない時に採集する。第１の採集試料のタンパク質発現、遺伝子発現及び／または脂質含有量を第２の採集試料のタンパク質発現、遺伝子発現及び／または脂質含有量とそれぞれ比較して、１つ以上の因子、すなわちタンパク質発現、遺伝子発現及び／または脂質含有量の変化を検出する。タンパク質発現、遺伝子発現または脂質含有量の任意の変化を１つ以上の眼症状の既知の変化と相関させて個体の眼の健康を同定、検出、診断及び／または予後予測する。
【０１２１】
別の実施形態では、眼症状の進行（または進行がないこと）を追跡する手段として、対象の房水及び／または硝子体液から得られた細胞外小胞試料におけるタンパク質発現、遺伝子発現及び／または脂質含有量の変化を経時的に追跡評価する。別の実施形態では、治療介入の有効性を追跡または追跡評価する手段として、対象の房水及び／または硝子体液から得られた細胞外小胞試料におけるタンパク質発現、遺伝子発現及び／または脂質含有量の変化を経時的に追跡評価する。タンパク質もしくは遺伝子の発現または脂質含有量の経時変化は、治療介入の有効性を指し示し得る。同様に、タンパク質もしくは遺伝子の発現または脂質含有量に経時変化がほとんどまたは全くないことは、選択した治療介入が追跡評価個体において無効であることの早期の指標として役立ち得る。そのような知見は、有効性及び治療を改善するための治療介入の改変の根拠となり得る。
【０１２２】
診断、予後予測または関連する目的のために１つ以上の分子的特性、例えばタンパク質発現、遺伝子発現及び／または脂質含有量の変化を追跡及び／または追跡評価することの他にも、１つ以上の分子的特性と一緒に、またはそれの代替として、硝子体液及び／または房水に由来する細胞外小胞の１つ以上の物理的特性を追跡評価することができる。測定及び追跡評価することができる細胞外小胞の好適な物理的特性としては、限定されないが例えば、細胞外小胞の大きさ、量、形状及び形態が挙げられる。硝子体液及び／または房水試料に由来する細胞外小胞のそのような物理的特性を測定する方法は本明細書において記載されている。
【０１２３】
第１の眼内細胞外小胞試料を得ることと第２または後のさらなる任意の眼内細胞外小胞試料を得ることとの間の時間は、好適であると医師によって及び眼症状の特徴に基づいて決定された任意の所望の期間、例えば、週、月、年とすることができる。一実施形態では、第１の試料は治療前に得られ、第２の試料は治療後に得られる。あるいは、第２の試料を第１の試料よりもいくぶん後の時点に得ながら両試料を１つ以上の治療処置の後に得ることができる。
【実施例】
【０１２４】
以下の実施例は、本発明の実施を例示することを意図したものであるが、決してその範囲を限定するものではない。
【０１２５】
実施例のための材料及び方法
死後試料からの組織の調製及び処理。疾患を有さない死後ヒトの眼を得た（Ｔｈｅ  Ｅｙｅ−Ｂａｎｋ  ｆｏｒ  Ｓｉｇｈｔ  Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。ウシの眼は地域の精肉店（Ｇｒｅｅｎ  Ｖｉｌｌａｇｅ  Ｐａｃｋｉｎｇ，Ｇｒｅｅｎ  Ｖｉｌｌａｇｅ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）から入手した。解剖手順のために眼を氷上の１００ｍｍのプラスチック製ペトリ皿に入れてＲＮＡ及びタンパク質の変性を防止した。ＳＺＸ−１６実体解剖顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して、眼球に付着した眼窩脂肪及び眼外筋肉を取り除いた。５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有しｐＨが８．０に調節された氷冷Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）５ｍｌで眼球を４℃で１分間すすいだ。１６ｇ針を使用して（それぞれヒト及びウシの眼の）縁から４ｍｍまたは８ｍｍ後ろのところで強膜切開し、次いでハサミで周囲を矢状に切開することによって硝子体を切断して眼球を前方カップと後方カップとに分けた。有形硝子体を切って取り出すため及び硝子体と眼構造体との接着を断ち切るためにハサミを使用した。脈絡膜メラノサイト及び神経網膜が硝子体へ混入することを回避するように気を付けた。その他の、脈絡膜、網膜、毛様体、水晶体及び角膜を含めた眼組織を特定して切り離した。組織試料はＴＢＳ（ｐＨ８．０）によって４℃で１分間すすいだ。電子顕微鏡観察及びＥＶ単離のために、採集した標本を固定せずにすぐさま以下に記載するように処理した。免疫組織化学、ウェスタンブロッティングまたはＥＤＣ−ホルマリン固定のために使用する試料は１５ｍｌの遠心分離チューブに入れ、ＴＢＳ（ｐＨ８．０）で希釈された４％のホルマリン（ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドまたはＰＦＡとしても知られる）１０ｍｌに４℃で少なくとも２４時間浸した。「ホルマリン単独」の組織を４℃で５分間、ＴＢＳ（ｐＨ８．０）で３回洗浄し、それ以上は処理またはＥＤＣによる固定を行わなかった。ホルマリン単独の組織を免疫組織化学、ウェスタンブロッティングまたは、核酸及びタンパク質撮像のために使用した。ＥＤＣ−ホルマリン固定標本は以下に記載するようにさらに処理した。
【０１２６】
ヒト対象の外科的硝子体標本採集。Ｗｅｉｌｌ  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅから施設内審査委員会（ＩＲＢ）の承認が得られ、プロトコールは、ＮＩＨ指針、医療保険の携行及び責任に関する法律、及びヘルシンキ宣言によって提示された理念に準拠していた。インフォームドコンセントは全ての対象から得られた。対象は、既存の病状のために硝子体切除術を受けている患者であった。硝子体生検の方法は以前に記載されている（Ｍａｌｅｃａｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ  ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−ｌｉｋｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ，”Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  １１２：１４７６−１４８２（１９９４）。参照によりその全体が本明細書に援用される）。手短に述べると、経毛様体扁平部硝子体切除術の開始時に０．５〜１ｍｌの未希釈硝子体（医療目的のための硝子体切除術中に取り出されるもの）を、吸引のための無菌３ｍＬシリンジに連結された硝子体切除用プローブを使用して採集した。全ての試料を匿名化及びコード化した。硝子体標本をすぐさま氷上に置き、ＴＥＭまたは以下に記載する硝子体小胞単離のために実験室へ移した。
【０１２７】
ＥＤＣ−ホルマリン組織固定。ＥＤＣ−ホルマリン固定の方法は、以前に報告されたものに修正を加えたものであった（Ｖａｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  ａｎｄ  ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｃｅｌｌｓ，”Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９：６５４−６５９（２００７）、Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，“ＤＮＡ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，”Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ４５：４９−５３（１９９７）。参照によりその全体が本明細書に援用される）。硝子体の１片（１ｃｍ×１ｃｍ）を記載のとおりに単離し、顕微鏡下で調べて試料に網膜や脈絡膜のような混入組織が含まれていないことを確認した。組織を１００ｍｍのプラスチック製ペトリ皿に入れ、５ｍｌのＴＢＳ（ｐＨ８．０）で、４℃で５分間２回洗浄した。ＴＢＳ（ｐＨ８．０）で希釈した４％のホルマリン５ｍｌに試料を２４時間浸し、加湿チャンバ内で、４℃で貯蔵した。試料を４℃で、５分間氷冷ＴＢＳ（ｐＨ８．０）中で３回洗浄した。残留リン酸塩を組織から除去するために、新しく調製した０．１Ｍの１−メチルイミダゾール緩衝液（０．１Ｍの１−メチルイミダゾール、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨは１２ＮのＮａＯＨで８．０に調節）１０ｍｌ中で試料を３０分間４℃で洗浄した。次に、ＥＤＣ固定溶液を調製した。まず、０．１Ｍの１−メチルイミダゾール緩衝液９．６ｍｌを作り、１３０ｍｇの５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、終濃度は０．１Ｍであった）を添加した。ｐＨを１２ＮのＮａＯＨで８．０に調節した。次に、１９２ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、終濃度０．１０Ｍ）を１−メチルイミダゾール−ＥＴＴ溶液に添加した。必要に応じて溶液のｐＨを１２ＭのＨＣｌの添加によってｐＨ８．０に再調整した。その後、硝子体組織片（１ｃｍ×１ｃｍ）を３５ｍｍのプラスチック製ペトリ皿に移し、２ｍｌのＥＤＣ固定溶液を添加した。次いで試料を加湿チャンバ内に入れ、標本を３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後にＥＤＣ−ＥＴＴ溶液を除去し、ＴＢＳで希釈した０．２％（ｗ／ｖ）グリシン５ｍｌ（ｐＨ７．４）で標本を洗浄した。試料をＴＢＳ（ｐＨ７．４）中で２回洗浄した。最後に試料のＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を以下に記載するとおりに染色した。
【０１２８】
ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質の染色。上記のとおり４％のホルマリン単独またはＥＤＣ−ホルマリンで固定した硝子体組織を染色した。組織をその後に様々な色素に浸してＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質を標識した。ＤＮＡを標識するために、切り取った硝子体片（１ｃｍ×１ｃｍ）を３５ｍｍのペトリ皿に入れ、０．５μｇ／ｍｌのヘキスト３３３４２染色液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）１ｍｌに浸した。試料を３７℃で、１５分間室温でインキュベートし、その後、１ｘのＴＢＳ（ｐＨ７．４）５ｍｌで組織を室温で３分間洗浄した。洗浄ステップを２回繰り返した。試料を第２のマーカーで染色するかまたは撮像のために載置した。ＤＮＡとＲＮＡとの両方を単一色素で標識するためにヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用したが、これは、ＤＮＡ塩基間にインターカレートするものであり、より低い親和性でＲＮＡに結合するものでもある（Ｌｅ  Ｇｏｆｆ  ａｎｄ  Ｂｉｓｈｏｐ，“Ａｄｕｌｔ  Ｖｉｔｒｅｏｕｓ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｐｏｓｔｎａｔａｌ  Ｃｈａｎｇｅｓ，”Ｅｙｅ（Ｌｏｎｄ）２２：１２１４−１２２２（２００８）。参照によりその全体が本明細書に援用される）。ＴＢＳで希釈した５０μｇ／ｍｌのＰＩ溶液（ｐＨ７．４）は、全載硝子体試料のＤＮＡ及びＲＮＡを共染色するのに最適なＰＩの濃度であることが分かった。そのため、組織を３５ｍｍのペトリ皿に入れ、その後、加湿チャンバ内で５０μｇ／ｍｌの（ＴＢＳ希釈）ＰＩ溶液１ｍｌ中に３７℃で２４時間浸した。試料をＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３回洗浄した。試料を別のマーカーで染色するかまたは撮像のために載置した。ＤＮＡとＲＮＡとの区別を付けるために、全ての組織をヘキスト３３３４２染色液で共染色した。ヘキストはＤＮＡに対して強い親和性を有し、ＲＮＡを標識しない。ヘキスト及びＰＩ染色された試料についてヘキスト信号を除くことによってＲＮＡ信号を決定した。全載硝子体中の細胞タンパク質及び細胞外タンパク質を標識するために、細胞内アミンと共有結合するものである細胞透過性かつ高電子密度のカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した（Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａｌｌｙ  Ｕｓｅｆｕｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｆｒｏｍ  Ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ，Ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｅｃｔｉｏｎｓ，”Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ４６：３９７−４０３（１９９８）、及びＴｋａｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒｙ，“Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ：Ｗｈｅｒｅ  Ｗｅ  Ａｒｅ  ａｎｄ  Ｗｈｅｒｅ  Ｗｅ  Ｎｅｅｄ  ｔｏ  Ｇｏ．”Ｃｅｌｌ  １６４：１２２６−１２３２（２０１６）。参照によりその全体が本明細書に援用される）。硝子体組織を３５ｍｍのプラスチック製ペトリ皿に入れ、その後、ＴＢＳで希釈した５００μＭのＣＦＳＥ１ｍｌ（ｐＨ７．４）に組織を浸し、試料を３７℃で、２４時間加湿チャンバ内でインキュベートした。インキュベート後、ＣＦＳＥ溶液を除去し、組織を１００ｍｍのプラスチック製ペトリ皿に入れた。ＴＢＳで希釈した０．２％（ｗ／ｖ）グリシン５ｍｌ（ｐＨ７．４）中で組織を３０分間室温で洗浄した。次に、組織をＴＢＳ１０ｍｌ（ｐＨ７．４）で、５分間室温で洗浄し、洗浄ステップを２回繰り返した。最後に、記載のヘキスト及びまたはＰＩで試料を対比染色した。それぞれの色素（複数可）で染色した後、以下に記載する共焦点型または広視野型の多光子蛍光顕微鏡での撮像のために試料をあつらえのチャンバ内に載置した。
【０１２９】
原位置での細胞外ＲＮＡのＲＮアーゼ消化。硝子体組織をＥＤＣ−ホルマリンで固定し、１００μｇ／ｍＬのＲＮアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する（５０ｍＭのｐＨ８．０のＴｒｉｓ−Ｃｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡからなる）ＲＮアーゼ緩衝液２ｍｌに浸し、その後、４２℃で１６時間インキュベートした。次に、ＲＮアーゼ溶液を除去し、試料を洗浄し、（上記の）ＰＩで染色し、広視野蛍光顕微鏡法で撮像した。
【０１３０】
光学顕微鏡観察、共焦点顕微鏡観察及び撮像処理。Ａｘｉｏｃａｍ  １０５カラーカメラ（Ｚｅｉｓｓ）を装備したＮｉｋｏｎ  ｅｃｌｉｐｓｅ倒立ｅ６００顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）でカラー明視野画像をキャプチャし、画像をＺｅｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ、バージョン４．３）で処理した。蛍光撮像試験のために組織を６０ｍｍのガラス底皿（２０ｍｍの観察面積、ＭａｔＴｅｋ）に載置した。Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を以下のフィルターセットで使用した：ヘキストのためにはＺｉｅｓｓフィルターセット４９（Ｚｉｅｓｓ）；Ａｌｅｘａ４８８、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びフルオレセインのためにはＺｉｅｓｓフィルターセット３８（Ｚｉｅｓｓ）；ならびにＰＩのためにはＺｉｅｓｓフィルターセット４５（Ｚｉｅｓｓ）。共焦点撮像は、２５ｘ／０．８ＮＡレンズを使用してＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ８８０顕微鏡で行った。画像はｉｍａｇｅＪソフトウェアを使用してキャプチャ及び処理した。
【０１３１】
多光子撮像。ウシの眼を上記のように解剖し、硝子体をおよそ１ｃｍ×１ｃｍの切片に切り出した。記載されているようにＥＤＣ−ホルマリンまたはホルマリン単独で組織を固定した。記載されているようにＤＮＡ、ＲＮＡ及び／またはタンパク質をヘキスト、ＰＩ及び／またはＣＳＦＥで標識した。シリコン及びガラス製カバースリップで作られた専用チャンバに全載硝子体組織を載置し、チャンバの上に置いた。カバースリップを１ｘのＴＢＳ１ｍｌ中に浸し、次いでＭＰＭ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００ＭＰＥ、専用２５ｘ／１．０５ＮＡ水浸対物レンズ使用、Ｗｅｉｌｌ−Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）を使用して撮像した。その後、硝子体を扇形に撮像した。画像をキャプチャし、ｚ−ｓｔａｃｋを組み立て、二次元再構築物を構築した（Ｆｉｊｉソフトウェア（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  ｔｏ  ＩｍａｇｅＪ：２５  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：６７１−６７５（２０１２）（参照によりその全体が本明細書に援用される）及びＩｍａｒｉｓソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）、硝子体１つあたり６領域を撮像、ｎ＝３）。データを細胞外タンパク質の染色について解析した。ＥＶ及び硝子体細胞を測定及び計数した。
【０１３２】
硝子体細胞及び細胞外小胞の定義付け。目的は、硝子体組織中の細胞外小胞（ＥＶ）及び細胞外ＲＮＡを同定することであった。これを行うために、硝子体細胞（推定硝子体細胞）及びＥＶを以下の方法で差別化した。ヘキストとＣＦＳＥとで共染色されたＥＤＣ−ホルマリン固定ウシ硝子体の多光子または共焦点画像を上記のとおりに取得した。これらの画像を使用して、硝子体細胞を、ヘキスト信号を用いて核を同定することによって同定し、その後に細胞体を、ＣＦＳＥ信号を用いることによって同定した。その後、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して１００個超の細胞の直径（ｎ＝３生物学的試料、試料１つあたり６画像フレーム）から細胞体の直径を測定した（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“ＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  ｔｏ  ＩｍａｇｅＪ：２５  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９：６７１−６７５（２０１２）。参照によりその全体が本明細書に援用される）。平均硝子体細胞体直径及び標準偏差（ＳＤ）を算出し、データをグラフで表した。平均硝子体細胞径は１０．５μｍ±１．７７μｍであり正規分布していると分かった。このことから、平均（１４μｍ）より２ＳＤ上の上限径はおよそ９７．５％の細胞を包含するであろう。したがって、ＩｍａｇｅＪソフトウェアでは、核を中心とする１４μｍの円を描き、この円の中の陽性信号を細胞内タンパク質とみなした。この１４μｍ円より外側の信号は細胞外のものとみなした。２名の独立し盲検化された研究補助者を使用してＥＶを計数した。ＥＶを計数する基準には、丸い形であること、細胞半径より外側に位置すること、及び大きさが１００ｎｍより大きく細胞より小さいことが含まれた。データは、１フレームあたりのＥＶ計数をフレーム内の細胞数で割ることによって正規化した。データをグラフで表す。ウシ硝子体ＥＶの大きさも、同様の技術を用いて測定した（ｎ＝４、及び３生物学的反復）。
【０１３３】
硝子体液、房水及び眼組織の電子顕微鏡観察。ヒト及びウシ硝子体組織を上記のとおりに得た。低速遠心分離によって試料から細胞を取り除き、Ｈ＆Ｅ染色及び以下に記載する撮像によって全載標本を試験した。硝子体については、２μＬをピペットで取って台上に置き、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液中グルタルアルデヒド２．５％、パラホルムアルデヒド４％、ピクリン酸０．０２％の溶液の中で固定し、室温で６０分間インキュベートした（Ｒａｐｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  Ｓｅｃｒｅｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３：１１６１−１１７２（１９９６）。参照によりその全体が本明細書に援用される）。標本を過剰量の緩衝液（ｐＨ７．３）で、各々５分間室温で洗浄した。試料を１％ＯｓＯ４−１．５％Ｋ−フェリシアニド（水性）で、６０分間室温で後固定した（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ａｎｄ  Ｈａｙ，“Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｄｕｒｉｎｇ  Ｐａｌａｔａｌ  Ｆｕｓｉｏｎ：Ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  Ｔｒａｃｅｓ  Ｃｅｌｌｓ  ａｔ  Ｌｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  Ｌｅｖｅｌｓ，”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１６：１０８７−１０９９（１９９２）。参照によりその全体が本明細書に援用される）。試料を緩衝液で３回、各々５分間室温で洗浄した。試料を一括で置いて１．５％の酢酸ウラニルで、６０分間室温で染色した。試料を勾配エタノールシリーズによって脱水し、アセトニトリルによって移行させた。標本をＥｍｂｅｄ８１２樹脂（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に浸透させて包埋した。Ｌｅｉｃａ  Ｕｌｔｒａｃｕｔ  Ｔウルトラミクロトーム（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＤｉａｔｏｍｅダイアモンドナイフ（Ｄｉａｔｏｍｅ）を使用して組織切片を６０〜６５ｎｍに切り出した。切片をクエン酸塩で造影し（Ｄｒａｇｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｉｚｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７：７８０−７８８（２０１１）。参照によりその全体が本明細書に援用される）、１００ｋＶで作動させたＪＥＭ１４００電子顕微鏡（ＪＥＯＬ，ＵＳＡ，Ｉｎｃ）で観察した。デジタル画像はＶｅｌｅｔａ  ２Ｋ  ｘ  ２Ｋ  ＣＣＤカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ−ＳＩＳ）でキャプチャした。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して電子顕微鏡画像の記録ならびに大きさ及び頻度の解析を行った。
【０１３４】
ヒト及びウシからの細胞外小胞の全載試料のＴＥＭ可視化では、硝子体を超遠心分離後に得てホルムアルデヒド中に再懸濁させ、フォルムバール／カーボン被覆ＥＭ格子上に載せ、１％のグルタルアルデヒドで後固定し、ｐＨ７の２％の酢酸ウラニル、及びｐＨ４のメチルセルロース２％／酢酸ウラニル０．４％、またはアクリジンオレンジもしくはＣＦＳＥで逐次的に造影した。
【０１３５】
細胞外小胞の単離及び精製。流体から細胞外小胞を単離する方法（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｃｅｎｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ｐｒｅｓｅｎｃｅ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，”．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １４：４８−５６（２０１６）。参照によりその全体が本明細書に援用される）に修正を加えた。この試験での目的は、細胞を含まない硝子体標本を得ることであった。それゆえ、硝子体を一連の低速遠心分離によってきれいにした。およそ８ｍｌの硝子体を１５ｍｌチューブに入れてＳｏｒｖａｌｌ  ｌｅｇｅｎｄ  ＲＴスイングバケット（Ｓｏｒｖａｌｌ）で２，０００ｇ（２５００ｒｐｍ）で、３０分間４℃で遠心分離した。その後、上清を新しい１５ｍｌチューブに移した。その後、遠心分離ステップを繰り返した。その後、上清を新しいチューブに移し、ＳＳ−３４ローター（ＤｕＰｏｎｔ）を使用してＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−５８遠心分離機（Ｓｏｒｖａｌｌ）で、１０，０００ｇで３０分間４℃で遠心分離した。硝子体液及び房水の各アリコートに対して以下に記載するように全載ヘマトキシリン及びエオジン染色（Ｈ＆Ｅ）を行って細胞に関して調査した（図１１）。その後、全載スライドを撮像し、全ての細胞不含試料をさらに処理した。その後、上清を移してステップを繰り返した。試料を超遠心分離チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ）に移し、スイングバケットローター（ＳＷ−４１、Ｂｅｃｋｍａｎ）に入れ、Ｌ７−５５超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ）で、１００，０００ｇで１時間４℃で遠心分離した。上清を新しいチューブに移した。ステップを繰り返した。試料を５０μｌの無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．５）中に再懸濁させ、シリコン加工チューブに入れた。撮像用の試料はすぐさま処理し、残りの試料は−８０℃で凍結させた。
【０１３６】
試料の無細胞性を確認するための硝子体組織学的染色。硝子体ＥＶ単離技術を最適化するために、低速遠心分離の後に組織学的染色を適用して、細胞が混入した硝子体試料を排除した。上記のとおりに硝子体試料を切り離し採集した。無細胞性は、遠心分離した硝子体をスライドガラス上に全載してその後に標本をヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）による組織学的染色に供することによって確認した。およそ１ｍｌの硝子体上清をＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓスライドガラス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に置き、その後、チャンバ内で、１６時間４℃で乾燥させた。乾燥したスライドを１ｘのＴＢＳ５ｍｌで、３分間室温ですすぎ、その後再び洗浄した。次いで、標準的手順を用いてスライドをＨ＆Ｅで染色した。スライドは、ガラス製カバースリップを載置してその後密封することによって保存した。試料を以下に記載するように光学顕微鏡法によって分析した。細胞がヘマトキシリンで染色された標本は、再び遠心分離に供したかまたは廃棄した。したがって、さらなる実験に使用したどの細胞外画分も、硝子体細胞の混入を含まないものであった。
【０１３７】
ナノ粒子軌跡解析。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００システム（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して、溶液中の３０〜８００ｎｍの粒子を特性評価するナノ粒子軌跡解析を実施した。ウシ硝子体から単離した細胞外小胞を１ｍｌあたりおよそ２．５μｇのタンパク質の濃度で１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）中に再懸濁させ、その後、試料を解析のためにＰＢＳの２ｍｌの終体積に希釈した。粒子を投入し、カメラの焦点を合わせ、５回のビデオを各々６０秒間キャプチャした。ビデオを記録し、その後、ＮａｎｏＳｉｇｈｔソフトウェア（バージョン３．０）を使用して解析してＥＶの粒度分布及び粒子濃度を決定した。グラフを作成した。各粒子のブラウン運動をフレーム間で追跡し、最終的にはストークス・アインシュタイン式の適用によって粒径を算出することが可能である。
【０１３８】
ホルマリン固定組織からの細胞外小胞の単離。上記のとおりに小さく切り出したウシ全硝子体を５０ｍｌの円錐形チューブに入れ、その後、ＴＢＳで希釈した４％のホルマリン１０ｍｌ（ｐＨ７．４）中に浸漬し、４℃で２４時間インキュベートした。固定の後、組織を氷上でおよそ１ｃｍ×１ｃｍの切片に切り出し、硝子体切片の重量を記録した。その後、組織を１５ｍｌの遠心分離チューブに入れた。組織を２５０μｌのＴＢＳ中に浸し、試料とその上に掛けた洗浄用緩衝液（または上清）とを３７℃で３０分間、１時間、３時間、６時間及び２４時間インキュベートした（ｎ＝３）。硝子体組織及び上清を回収し、さらなるタンパク質試験のために別個の１．５ｍｌチューブに入れた。ホルマリン固定された硝子体組織については、標本を４℃で均質化し、その後、等体積のＮＰ−４０溶解用緩衝液の中で溶解させた。溶解物を１．５ｍｌチューブに移し、４℃で１５分間１２，０００ｇで、遠心分離した。白色ペレットを含まない水相を新しいチューブに移した。４℃で１５分間１２，０００ｇで遠心分離して上清を除去することによってタンパク質ペレットを回収した。その後、ペレットを３０μｌの水に溶解させ、ウェスタンブロッティングのために使用した。上清については、４℃で１５分間１２，０００ｇで遠心分離することによって試料から細胞残屑を取り除いた。等体積のＮＰ−４０溶解用緩衝液に溶けたタンパク質上清を回収した。溶解物をウェスタンブロッティングのために使用した。
【０１３９】
ウェスタンブロッティング。指定の時間及び温度でのインキュベーションの後に硝子体組織または硝子体上清（２５０μｌ）を回収した。硝子体上清は１２，０００ｇで、３０分間４℃で遠心分離することによって予め清澄化し、その後、緩衝液（ｐＨ８．０の５０ｍＭのＴｒｉｓ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＮＰ−４０、プロテアーゼ阻害剤、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解させた。各試料からの等量のタンパク質（ＢＩＯ−ＲＡＤタンパク質アッセイによって決定した）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離させ、タンパク質ブロッティング膜（Ｈｙｂｏｎｄ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写し、標準的手順に従ってブロッティングした。使用した一次抗体は、ウサギモノクローナル抗体ＴＳＧ１０１（Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含んでいた。モノクローナル抗体を二次抗体ＩＲＤｙｅ６８０ＬＴ  ヤギ抗ウサギ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｉｎｃ．）でブロッティングし、続いて蛍光撮像システム（Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＣＬｘ，Ｌｉ−Ｃｏｒ）による検出を製造者の推奨に従って行った。
【０１４０】
硝子体中のエクソソームマーカータンパク質の免疫組織化学。全載４％ホルマリン固定ウシ硝子体に対して免疫組織化学を実施した。ホルマリン架橋が逆戻りするのを防ぎ、そうしてＥＶ逸失率を低減するために、顕微鏡撮像を除く全てを実験の継続期間にわたって４℃で行った。ウシ硝子体液をおよそ１ｃｍ×１ｃｍの切片に切り出し、その後、標本を５ｍｌの氷冷ＴＢＳ（ｐＨ７．４）で、３分間４℃ですすいだ。洗浄ステップを２回繰り返した。次いで標本を解剖顕微鏡（ＳＺＸ−１６  Ｏｌｙｍｐｕｓ）で調べて潜在的混入組織を除去した。その後、試料を５００μｌの遮断用緩衝液（ＴＢＳで希釈した１０％のヤギ血清）に１時間４℃で浸した。試料を５ｍｌのＴＢＳで短時間、４℃で３分間洗浄した。ＴＳＧ−１０１に対する抗体（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１：５００希釈）を使用してウシ硝子体を４℃で一晩免疫染色した。試料を５ｍｌのＴＢＳで、３分間４℃で洗浄した。洗浄ステップを２回繰り返した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８と結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）である二次抗体を使用してＩＨＣ染色を可視化した。試料を３回洗浄した。ウシ硝子体を（上記のとおりに）ヘキスト染色剤で対比染色して核をマークし、次いで５ｍｌのＴＢＳで、５分間４℃で洗浄した。その後、硝子体をすぐさま撮像し、顕微鏡写真を記録した。陰性対照のために、一次抗体の代わりに正常ヤギ血清（１：１０００希釈液）を使用した（第２抗体のみとした）。抗体がＴＳＧ１０１に対して特異的であることがウェスタンブロッティングを用いて検証され、予測された４５ｋＤのタンパク質バンドが観察された。
【０１４１】
硝子体プロテオーム解析。上記プロトコールを用いてウシ硝子体試料から細胞を取り除き、上に記載したような全載Ｈ＆Ｅ染色ならびにその後の撮像によって全載試料が細胞を含んでいないと判定された。次いで、細胞を含んでいない試料をプロテオーム解析のために選抜した。細胞外小胞画分または細胞不含硝子体画分からのタンパク質を８Ｍの尿素で変性させ、ヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）によるアルキル化に先立ってシステインをジチオスレイトール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で還元した。タンパク質をＬｙｓＣ（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、続いてトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化し、ＥｍｐｏｒｅＣ１８  ＳＴａＧＥＴｉｐｓ（３Ｍ）で脱塩した（Ｓｋｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ＲＮＡ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｔｈａｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｐｒｏｖｉｄｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ”Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０：１４７０−１４７６（２００８）。参照によりその全体が本明細書に援用される）。総タンパク質１μｇをナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析（Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のために注入した。流速２００ｎＬ／分で１６０分にわたって５〜４０％の勾配（緩衝剤Ａは０．１％のギ酸、緩衝剤Ｂはアセトニトリル中０．１％のギ酸）で１２ｃｍ×７５μｍのＣ１８カラム（Ｎｉｋｋｙｏ  Ｔｅｃｈｎｏｓ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．Ｊａｐａｎ）を使用してペプチドを分離した。Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓはデータ依存モードで、上位２０位法（ｔｏｐ  ２０  ｍｅｔｈｏｄ）で作動させた。ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータはＭａｘＱｕａｎｔ（バージョン１．５）及びＰｅｒｓｅｕｓソフトウェア（バージョン１．４）を使用して解析し（Ｔｙａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｐｅｒｓｅｕｓ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  （Ｐｒｏｔｅ）ｏｍｉｃｓ  Ｄａｔａ，”Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３（９）：７３１−７４０（２０１６）。参照によりその全体が本明細書に援用される）、メチオニンの酸化及びタンパク質Ｎ末端アセチル化を許容してペプチド及びタンパク質レベルで１％の偽発見率のフィルターを掛けて検索をＵｎｉｐｒｏｔ  Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓデータベース（７月１４日にダウンロードしたもの）に対して行った。ｉＢＡＱ値を使用してタンパク質を定量した。タンパク質の濃縮具合を硝子体細胞外小胞画分と細胞不含硝子体画分とで比較した。
【０１４２】
細胞培養。１０％のウシ胎仔血清、ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ：Ｆ１２培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中でヒト網膜色素上皮細胞ＡＲＰＥ−１９（ＡＴＣＣ）を培養した。細胞はどれも３７℃で９５％空気及び５％ＣＯ２でインキュベートし、標準的滅菌技術を用いて維持した。
【０１４３】
ＥＶ内への組換えタンパク質の装填。上記のとおりにウシ硝子体ＥＶを得、総タンパク質濃度を測定した（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ  タンパク質アッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。下記濃度のＢＳＡ−フルオレセイン（３μｇ、１μｇ及び０．５μｇ）またはＧＦＰ（０．２５μｇ、０．５μｇ及び１μｇ）と一緒に、４μｇの硝子体ＥＶを試験管内処置のために使用し、０．０２５μｇのウシ硝子体ＥＶを生体内注射のために使用した。４ｍｍキュベット内で組換えタンパク質とＥＶとを３００μｌの電気穿孔用緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）中に混合し、電気穿孔を行った。ＥＶに対する電気穿孔は、矩形波プログラムを使用して下記条件下で実施した；電圧３００Ｖ、パルス時間長３５ｍｓ、パルス数２、及びパルス間隔０．１秒。試験管内実験では、１００μｌの電気穿孔溶液を３００μｌの温培地に添加し、ＡＰＲＥ−１９細胞が７０％コンフルエンスで播種された１２ウェルプレートの各ウェルに溶液を移した（ｎ＝３）。培養物を２４時間インキュベートし、その後、培地を完全培地で置き換えた。細胞を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、処理から４８時間後に撮像した。生体内試験では、４ｍｍキュベット内の３００μｌの電気穿孔用緩衝液（ＢｉｏＲａｄ）中で電気穿孔を３００Ｖで実施した。試料を５体積の平衡塩溶液中に再懸濁させた後に脱塩し、次いで遠心分離用サイズ排除フィルター（Ａｍｉｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ）で濃縮した。平衡塩溶液（ＢＳＳ）中再懸濁液の体積は７５μｌであり、注射１回につき０．５μｌを使用した。
【０１４４】
培養細胞に対するＥＶの試験管内適用。上記のとおりにウシまたは死後ヒトの硝子体ＥＶを単離し、電気穿孔によって組換えタンパク質を装填した。ＡＲＰＥ−１９細胞は１２ウェルプレート上で培養され、ＥＶ処理の時におよそ７０％コンフルエントであった。次いで１００μｌの電気穿孔ＥＶ溶液を１ｍｌの完全培地に添加した。細胞を標準的培養条件下で１６時間インキュベートし、その後、培地を除去して完全培地で置き換えた。処理から４８時間後に細胞培地を除去し、培養物を１ｍｌのヘキスト染色剤に浸し、３７℃で１５分間インキュベートした。染色剤を除去し、細胞を２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ＰＢＳで希釈された４％のホルマリン２ｍｌで、１０分間室温で固定した。細胞を２ｍｌのＰＢＳで５分間洗浄した。洗浄を２回繰り返した。広視野蛍光顕微鏡法を用いてトランスフェクション効率について細胞を評価した。
【０１４５】
硝子体ＥＶの生体内注射。全ての手順はＮＩＨ指針に準拠して実施され、Ｗｅｉｌｌ  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。Ｗｅｉｌｌ  Ｃｏｒｎｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅの研究動物資源センター（ＲＡＲＣ）にて雄の６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）を１２時間の明／暗サイクルで飼育した。どの実験変数においてもマウスの眼の硝子体内注射を８週齢の時に行った（ｎ≧３）。ＮＩＨ動物福祉指針に準拠してケタミンとキシラジンとのカクテルによって動物を鎮静させた。２．５％のフェニレフリン１滴及び１％のトピカミド１滴によって瞳孔を散大させ、その後、眼科軟膏を塗布した。１５分後、注射に向けて動物の準備を整えた。眼科軟膏を綿花スワブで除去し、眼を１ＸのＴＢＳ１０滴ですすいだ。解剖顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＳＺＸ５０）下で３２ゲージ針を縁に配置し、その後に強膜から後房内へと横切らせることによって、眼内に誘導路を作った。水晶体の破壊を防ぐように気を付けた。その後、ガイド針を引き抜き、微量注入器（Ｐｎｅｕｍａｔｉｃ  ｐｉｃｏｐｕｍｐ、ＰＶ８３０、Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）をガイド針内に配置し、網膜を避けながら後房内へガラスピペットチップを挿入した。５００ｎｌのＥＶ溶液または対照溶液を注射した。注射完了後、ガラスピペットを除去する前に１０秒間の合間を維持した。ガラスピペットを除去し、注射した眼に眼科抗生物質軟膏を硝子体内注射手順の直後に塗布した。その後、動物を麻酔からの回復のために監視し、その後にＷｅｉｌｌ  Ｃｏｒｎｅｌｌ  ＭｅｄｉｃｉｎｅのＲＡＲＣ施設へ戻した。
【０１４６】
齧歯動物の眼に硝子体内注射されたＥＶまたは対照の生体分布の評価。ＥＶ硝子体内注射剤の生体分布を注射後３日目、１週目及び２週目に分析した（ｎ≧３）。ＮＩＨ動物福祉指針に準拠して動物を鎮静し安楽死させた。眼を摘出し、４℃で１Ｘ  ＴＢＳ中４％のホルマリン５ｍｌの中に１６時間入れ、その後、ＴＢＳで希釈された０．５Ｍのスクロース５ｍｌの中に１２時間４℃で浸した。組織をＯＣＴ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）内に載置し、Ｃｒｙｏｍｏｌｄ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）内の乾燥氷／エタノール浴中で凍結させ、すぐさまクライオスタット（Ｌｅｉｃａ  ３０５０Ｓ、Ｌｅｉｃａ）で５〜４０μｍに連続切断し、ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓガラススライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に載せた。標本を１ｍｌのヘキスト染色剤で、１５分間室温で対比染色した。スライドを５ｍｌのＴＢＳ（ｐＨ７．４）で、５分間室温ですすいだ。洗浄ステップを２回繰り返した。次いで３００μｌの載置用培地を添加し、カバースリップ（ＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＬＬＣ）を置いた。ＢＳＡ−フルオレセインについては広視野蛍光顕微鏡法で、またはＨ＆Ｅ染色試料については明視野顕微鏡法で、スライドを撮像した。未処理の標本、または載置されたスライドを−８０℃で貯蔵した。
【０１４７】
房水ＥＶの単離。穿刺術によって房水を採集した。手短に述べると、１８ゲージ針を縁からおよそ２ｍｍ前方の所に挿入し、その後、２５０μＬの流体を１ｍｌシリンジ内に抜き取った。流体をすぐさま１．５ｍｌのシリコン加工微量遠心分離チューブに移し、試料を氷上に置いた。硝子体ＥＶについて記載されているようにＥＶを単離した。
【０１４８】
統計解析。エクセル（バージョン２０１１、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を使用してグラフ可視化、計算を実施した。特に明記しない限り、どの実験も３以上のｎで実施した。ナノ粒子軌跡解析では、ストークス・アインシュタイン式を使用して粒径、濃度及び分布を計算した。全てのエラーバーは標準偏差であり、全ての試験においてｐ値＜０．０５である。
【０１４９】
実施例１−細胞外小胞（ＥＶ）はホルマリン固定ウシ硝子体組織から脱出するが１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）−ホルマリン固定では保持される
本明細書に記載の試験は、ＥＶを細胞外空間に保持すべく組織固定を最適化することに重点的に取り組んだ。組織の組織学的及び形態学的構造を保存するために、従来の固定方法は、１０％ホルマリンを採用してタンパク質−タンパク質架橋を作り出す。固定プロセスは一般的に室温以上での処理ステップまたはインキュベーションを伴うが、高い温度は、ホルマリンのタンパク質−タンパク質架橋（Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｉｎ  Ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ，Ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ：Ａｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  Ｏｖｅｎ  Ｈｅａｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｅｃｔｉｏｎｓ，”Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ３９：７４１−７４８（１９９１）、Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａｌｌｙ  Ｕｓｅｆｕｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｆｒｏｍ  Ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ，Ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｅｃｔｉｏｎｓ，”Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ４６：３９７−４０３（１９９８）。参照によりその全体が本明細書に援用される）及びＲＮＡ−タンパク質架橋（Ｐｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，“ｍｉＲＮＡ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  ａｎｄ  ＥＤＣ−ｆｉｘｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，”Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：１３９−１４１（２００９）。参照によりその全体が本明細書に援用される）を逆戻りさせることが知られている。図１Ａの模式図に示すようにナノメートルサイズのＥＶは室温以上での洗浄ステップの間にホルマリン固定組織標本から逸出するという仮説を立てた。ホルマリン固定組織からのＥＶ逸出の程度を調べるために、ホルマリン固定ウシ硝子体組織を様々な時点にわたって３７℃の洗浄用緩衝液に浸し、その後に上清を回収した。上清の超微細構造内容物を、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を用いて撮像し、早ければ３０分で、相当数のＥＶが洗浄用緩衝液中に存在しておりホルマリン固定組織から漏出したということが分かった（図１Ｂ〜図１Ｃ）。４℃より高い温度への曝露はＲＮＡの脱出も招き（Ｐｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，“ｍｉＲＮＡ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ  ａｎｄ  ＥＤＣ−ｆｉｘｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，”Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６：１３９−１４１（２００９）。参照によりその全体が本明細書に援用される）、おそらくタンパク質の脱出も招いた。これらのナノメートルサイズのＥＶを組織中及び周囲の細胞外空間内に保持するために、ＥＶタンパク質の正に帯電したアミノ基側鎖とカルボキシル基との不可逆的架橋を水溶性カルボジイミドであるＥＤＣによって作り出すさらなる固定ステップを追加した。このようにして、試料をまずホルマリンで固定することと、続いてその後にＥＤＣを架橋することとを伴う２ステップ固定を行った。ＥＤＣ−ホルマリン固定後に硝子体組織を様々な温度の洗浄用緩衝液中に入れ、上清をＴＥＭで撮像した���図１Ｄ）。上清中にＥＶは検出されなかった（図１Ｅ）。ＥＤＣ−ホルマリン上清中及び洗浄用緩衝液対照中に微粒子状物質が観察された（図１Ｆ）。よってＥＶはＥＤＣ−ホルマリン固定組織から脱出しなかった。硝子体組織からのＥＶの逸出を定量するためにウェスタンブロッティングを用いて既知のエオジンマーカーＴＳＧ−１０１を検出した。ホルマリン固定硝子体の上清は、上清における顕著な量のＴＳＧ−１０１信号を示した（図１Ｇ）。これらのデータは、ホルマリン固定組織では相当量のＥＶが洗浄用緩衝液中に失われることを示唆している。
【０１５０】
実施例２−共焦点顕微鏡法（ＭＰＭ）によって撮像されるウシ硝子体のＥＤＣ−ホルマリン固定は、ホルマリン固定単独と比較してＥＶを保持する
目的は、正常硝子体組織（図２Ａ）の細胞外空間におけるＥＶの構造的関係性を可視化することであり、したがって、ウシ硝子体の従来の固定（ホルマリン単独）をＥＤＣ−ホルマリンと比較し、次いで原位置でＥＶを可視化することを試みた。ＥＶはタンパク質を含有することが知られており、それゆえ全載試料において全タンパク質を標識し、その後、多光子顕微鏡法で撮像した（図２Ｂ〜図２Ｄ）。タンパク質を標識するために、アミンと共有結合する細胞透過性蛍光色素であるカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（Ｂｒｏｎｎｅｒ−Ｆｒａｓｅｒ，Ｍ．，“Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｃｒｅｓｔ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈａｔ  Ａｆｆｅｃｔｓ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ，”Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０１：６１０−６１７（１９８５）。参照によりその全体が本明細書に援用される）を使用した。ホルマリン固定組織は硝子体細胞の近傍または内部で陽性タンパク質信号を示すが細胞外タンパク質信号の証拠は示さないということが分かった（図２Ａ〜図２Ｂ、ｎ＝４）。これらのデータは、ＥＶが、硝子体組織中に存在していないかホルマリン固定硝子体標本の処理中に失われたかのどちらかであることを示唆していた。対照的に、ＥＤＣ−ホルマリン固定試料は、大きさ及び形状がＥＶに合致する細胞外マトリックス中のタンパク質の堅牢な信号を示した（図２Ｃ〜図２Ｄ）。さらに、ＣＦＳＥで染色されたＥＤＣ−ホルマリン固定組織は、ホルマリン単独に比べて有意により多くのＥＶ（１２０倍）を一貫して示した（図２Ｅ、ｐ＜０．０５）。
【０１５１】
ＭＰＭによって撮像したウシＥＶは、大きさに多形性があり、およそ２００〜６０００ｎｍに及ぶ大きさであり、平均直径が１５１３．０ｎｍ（標準誤差７０８．８ｎｍ）、大きさの最頻値が８００〜１４００ｎｍであった（図２Ｆ）。２００ｎｍ未満のＥＶを解像する能力は多光子顕微鏡の解像度の下限によって制限された。
【０１５２】
実施例３−ウシ硝子体のＥＤＣ−ホルマリンによる固定は、ＥＶ及び細胞外ＲＮＡを原位置に保持する
ＥＶは、細胞外ＲＮＡも含有することが知られており（Ｖａｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  ａｎｄ  ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｃｅｌｌｓ，”Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９：６５４−６５９（２００７）。参照によりその全体が本明細書に援用される）、それゆえ硝子体組織中の細胞外ＲＮＡを可視化することを試みた。ＤＮＡを染色するだけでなく低親和性ながらＲＮＡも染色するものであるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）でウシ硝子体核酸を標識した（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，“ＤＮＡ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，”Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ４５：４９−５３（１９９７）。参照によりその全体が本明細書に援用される）。ＥＤＣ−ホルマリン固定組織を共焦点顕微鏡法で撮像することで、細胞外ＲＮＡ及び細胞外タンパク質について陽性である信号が示されたが、細胞外ＤＮＡは検出されなかった（図３Ａ〜図3Ｂ）。細胞外ＲＮＡの信号はＥＶタンパク質信号と共局在していることが見出され（図３Ａ）、細胞外ＲＮＡが小胞内にあることが示唆された。対照的に、ホルマリン単独による固定では細胞外ＲＮＡ及びタンパク質の信号がより大幅に小さくなった（図３Ｃ）。さらに、ＥＤＣ−ホルマリン固定組織中の硝子体細胞の細胞質中には、従来の固定と比較してより大幅に多いＲＮＡが保持されていることも分かった。細胞外ＰＩ信号が確かにＲＮＡであることを検証するためにＥＤＣ−ホルマリン固定試料をＲＮアーゼで処理し、細胞外信号が顕著に減少したことが分かった（図４Ａ〜図４Ｂ）。標準的な蛍光顕微鏡を使用してＥＶ信号の増強が観察され得るか否かを判定するために、ホルマリン及びＥＤＣ−ホルマリンで固定された硝子体試料からの画像をＣＦＳＥ及びＰＩで染色し、その後、広視野蛍光顕微鏡でキャプチャし、比較した。データは、ＥＤＣ−ホルマリン固定試料が細胞外タンパク質及びＲＮＡの強い信号を実証した一方で、ホルマリン固定標本が細胞外タンパク質信号を示さずに終わったことを示している（図５Ａ〜図５Ｂ）。総合するとこれらのデータは、ＥＶタンパク質及び細胞外ＲＮＡを組織中に保持する上で、ＥＤＣ−ホルマリン固定がホルマリン固定単独よりも優れていることを示唆している。しかもこの技術は、原位置でのＥＶの硝子体組織内での空間的関係性を決定することを可能にする。
【０１５３】
実施例４−ウシ及びヒト硝子体液はＥＶを含有する
ＥＤＣ−ホルマリン固定組織からの顕微鏡写真で観察された知見を、ＥＶを可視化するために用いられる他の方法と相関させるために、硝子体ＥＶの超微細構造をＴＥＭで試験した（Ｒａｐｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  Ｓｅｃｒｅｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３：１１６１−１１７２（１９９６）。参照によりその全体が本明細書に援用される）。ウシ硝子体標本は酢酸ウラニル及びクエン酸塩によって負に染色され、画像は、大きさに多形性がある相当量のＥＶを示した（図６Ａ）。次に、ウシ硝子体から単離したＥＶを、タンパク質のアミンと共有結合する高電子密度色素であるＣＦＳＥで標識し（Ｒａｐｏｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  Ｓｅｃｒｅｔｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，”Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８３：１１６１−１１７２（１９９６）。参照によりその全体が本明細書に援用される）、画像は、ＥＶが豊富にあることを濃い小胞内染色によって示した（図６Ｂ）。ＥＶはＲＮＡを含有することが知られているので（Ｖａｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  ａｎｄ  ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｃｅｌｌｓ，”Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９：６５４−６５９（２００７）。参照によりその全体が本明細書に援用される）、ウシ硝子体から単離したＥＶを高電子密度かつ核酸選択的な色素アクリジンオレンジ（ＡＯ）による染色の後に撮像し、それはＥＶ内の陽性信号を示した（図６Ｃ）。全載ウシ硝子体を別の高電子密度核酸染色剤である臭化エチジウムで染色することによってもＥＶ内の陽性信号が示された（図６Ｄ）。ウシ硝子体ＥＶの濃度及び粒度分布を決定するためにナノ粒子軌跡解析（ＮＴＡ）（Ｄｒａｇｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｉｚｉｎｇ  ａｎｄ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｔｒａｃｋｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７：７８０−７８８（２０１１）。参照によりその全体が本明細書に援用される）を用い、細胞外小胞の濃度は、ウシの眼１個あたり２０億個超のＥＶに相当する、１ｍｌあたり少なくとも２．９８×１０７個粒子（標準誤差は１ｍｌあたり±８．９８ｘ１０６粒子）であることが分かった（図６Ｅ）。データは、細胞外小胞の大きさが不均一であることを示し、平均が２１２ｎｍ（標準誤差±１０ｎｍ）、最頻値が１４３ｎｍ（標準誤差±２０．４ｎｍ）、ピークが１２５ｎｍ及び２１５ｎｍであり、いくつかの細胞外小胞は最大で５５０ｎｍであった（図６Ｅ）。ＮＴＡによって測定されたＥＶの大きさは、多光子顕微鏡法によって観察されたＥＶの大きさとは異なっていたが、これはおそらく、大きめのＥＶを除去する超遠心分離に基づく単離方法による結果である（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｃｅｎｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ，Ｐｒｅｓｅｎｃｅ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ，”．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １４：４８−５６（２０１６）。参照によりその全体が本明細書に援用される）。眼全体における硝子体ＥＶの分布を決定するために、死後ヒトの眼に対してＴＥＭを実施し、硝子体基底部及び毛様体の付近において多数の硝子体ＥＶの濃度が高いことが実証された（図６Ｆ〜図６Ｇ）。死後ヒト硝子体標本から精製されＡＯで染色されたＥＶも、ＥＶに合致する大きさ及び形状を明らかにした（図６Ｈ〜図６Ｉ）。これらのデータは、硝子体ＥＶが確かに存在し、その数が豊富であり、大きさが不均一であり、ＣＦＳＥ及び核酸選択的色素によって陽性に染色される、ということを示している。
【０１５４】
実施例５−正常ウシ硝子体におけるＥＶ特異的タンパク質ＴＧＳ−１０１の免疫組織化学染色
硝子体ＥＶがＥＶ関連タンパク質を発現するか否かを判定するために、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を用いてプロテオーム解析を行い、（低速遠心分離で細胞が除去された）ウシ硝子体をＥＶ単離画分と比較した（ｎ＝６のウシ硝子体。試料をプールした）。硝子体及びＥＶ単離画分は、合同したプロテオーム一覧において合計１６８６個のタンパク質を示し、６８２個及び４６４個のタンパク質がそれぞれ全硝子体画分またはＥＶ画分において濃縮されており、５４０個のタンパク質はどちらにおいても存在量が同程度であった。ＥＶ及び全硝子体画分において検出された１７７９個のタンパク質の包括的一覧を以下の表３に示す。表３の一覧は、タンパク質をそのタンパク質名（１列目）、ならびにそのＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号及び名前を含むタンパク質識別子で同定している。表３に列挙される各タンパク質について細胞不含硝子体画分と比較したときのＥＶ画分におけるタンパク質量のｌｏｇ２差が５列目に列挙されているが、これは、ＥＶ濃縮画分（３列目）及び細胞不含硝子体画分（４列目）における無標識定量（ＬＦＱ）強度によって定量したタンパク質量に基づくものである。ＥＶ画分において濃縮されているタンパク質を「ＥＶ画分のみ」と表す（５列目）。タンパク質の合計強度をｉＢＡＱ値で表す（６列目）。
【０１５５】
プロテオームデータのさらなる解析は、表１に示すようにＴＳＧ−１０１（タンパク質存在量を表すｉＢＡＱ値は２．３０Ｅ＋０５であった）、ＣＤ−９（ｉＢＡＱ値は２．８０Ｅ＋０６）、ＨＳＰ９０−β（ｉＢＡＱ値は３．００Ｅ＋０８）及びアネキシンＩＩタンパク質（ｉＢＡＱ値は９．４０Ｅ＋０５）を含めたいくつかの既知のＥＶ関連タンパク質がＥＶ画分において濃縮されていることを示した。
【０１５６】
（表１）細胞不含硝子体に比べてウシ硝子体ＥＶにおいて存在し濃縮されているエクソソームマーカータンパク質
2019529400.tif 000002
＊ＴＳＧ１０１＝腫瘍感受性遺伝子１０１；†ＨＳＰ＝熱ショックタンパク質
＊＊表１の参考文献（参照によりその全体が本明細書に援用される）：
2019529400.tif 000003
【０１５７】
解析は、細胞不含硝子体画分に比べてＥＶではいくつかの眼特異的タンパク質も濃縮されていることをさらに示した。これらの眼特異的タンパク質を以下の表２に列挙する。
【０１５８】
（表２）ウシ硝子体ＥＶにおいて濃縮されている眼特異的タンパク質
2019529400.tif 000004
表２の参考文献（参照によりその全体が本明細書に援用される）
2019529400.tif 000005
【０１５９】
ＥＤＣ−ホルマリン固定硝子体において観察されたタンパク質信号が確かにＥＶであったことを確認するために、免疫組織化学（ＩＨＣ）を行って既知エクソソームタンパク質ＴＳＧ−１０１の分布を原位置で可視化した。組織のＥＤＣ−ホルマリン固定はＩＨＣ染色との適合性を有していなかった。しかも、室温で実験を行った場合にホルマリン固定組織では、おそらくＥＶが洗浄用緩衝液中に逸出したために、ＴＳＧ−１０１信号を確実に検出することができなかった。しかしながら、ホルマリン架橋の逆戻りは温度依存性であることが知られており（Ｉｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａｌｌｙ  Ｕｓｅｆｕｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｆｒｏｍ  Ｆｏｒｍａｌｉｎ−ｆｉｘｅｄ，Ｐａｒａｆｆｉｎ−ｅｍｂｅｄｄｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｅｃｔｉｏｎｓ，”Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ４６：３９７−４０３（１９９８）。参照によりその全体が本明細書に援用される）、逆戻りが起こる速度は温度が低くなるにつれて遅くなる。そのため、撮像を除く全ての処理ステップにおいてホルマリン固定ウシ硝子体標本に対するＩＨＣを４℃で実施した。ＩＨＣは、ＣＦＳＥで染色したＥＤＣ−ホルマリン固定組織における空間的ＥＶ分布（図２Ｃ）に合致して、細胞外空間において点状のＴＳＧ−１０１陽性信号の量が豊富であることを示した（図７Ａ）。特異性対照は細胞外信号を示さなかった（図７Ｂ）。ＴＳＧ−１０１は、硝子体細胞外空間内で見出される可能性が硝子体細胞体中での場合に比べて１３６倍高いことが分かった（図７Ｃ）。ＰＩを使用してホルマリン固定ＩＨＣ試料のＲＮＡも共染色したが、細胞外ＲＮＡは検出することができず（図７Ｄ）、ＥＶ関連ＲＮＡを保持するためにはＥＤＣ−ホルマリン固定が必要であることがさらに示唆された。これらのデータは、硝子体ＥＶがＥＶタンパク質マーカーを含有し、低温条件下でＩＨＣによって撮像され得る、ということを実証している。
【０１６０】
実施例６−硝子体ＥＶは内在ＲＮＡ組換えウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を培養細胞内に移入させる
硝子体ＥＶが、ＲＮＡ及びタンパク質積荷を標的細胞内に移入させることが知られている他のＥＶと同様の生物学的活性を有するか否かを調査した。初期の研究では、試験管内でＥＶがｍＲＮＡ及びマイクロＲＮＡを細胞内へ運ぶことが示された（Ｖａｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  ａｎｄ  ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｓ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｃｅｌｌｓ，”Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ９：６５４−６５９（２００７）、Ｓｋｏｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ＲＮＡ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｔｈａｔ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｐｒｏｖｉｄｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ”Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０：１４７０−１４７６（２００８）。参照によりその全体が本明細書に援用される）。それゆえ、ウシ及び死後ヒトの硝子体ＥＶがそれらの内在性ＲＮＡを培養細胞内に移入させる能力を試験した。ウシまたはヒト硝子体ＥＶ  ＲＮＡをＡＯ蛍光色素で標識し、ＥＶ画分を精製し（図８Ａ〜図８Ｂ）、網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）を多量の標識ＥＶに曝露した。ウシＥＶ−ＲＮＡの場合、培養ＡＲＰＥ−１９細胞において４８時間目に最大で９６．２％±０１．９％のトランスフェクション率が認められ（図９Ａ〜図９Ｃ）、これは対照よりも有意に高かった。ヒト胚性腎臓細胞も好結果にトランスフェクトされた（図９Ｄ〜図９Ｆ）。単離された死後ヒト硝子体ＥＶも、２４時間目に、標識ＥＶ−ＲＮＡをＡＲＰＥ−１９細胞に対照よりも有意に高く９６％±３．８％移入させることができた（図９Ｇ〜図９Ｉ）。
【０１６１】
ＥＶは、組換えタンパク質を標的細胞へ送達することができるベクターとしても知られている。それゆえ、蛍光発色団（フルオレセイン）と結合させたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、６６ｋＤのタンパク質）を３００Ｖでの電気透過化によって３μｇのウシ硝子体ＥＶの中に装填し、ＢＳＡ−フルオレセイン装填ＥＶを再精製し、その後、培養したＡＲＰＥ−１９細胞をこのベクターで処理した。ＢＳＡ−フルオレセインの濃度が３μｇ、１μｇ及び０．５μｇである場合に細胞はそれぞれ９７．６％±０．８５％、９５．３％±２．４２８％、及び８８．９％±１．７４５％トランスフェクトされたということが認められた。対照であるＰＢＳ単独、または電気穿孔なしでＢＳＡ−フルオレセインと混合したＥＶは、ＡＲＰＥ−１９細胞のトランスフェクションをもたらさず（図１０Ａ〜図１０Ｃ）、これらの群は試験群に比べて統計学的に異なっていた（ｐ＜０．０５、ｎ＝３）。これらの対照データは、ＡＲＰＥ−１９細胞によるＢＳＡ−フルオレセインの取込みにはＥＶベクターが必要であったことを実証した。硝子体ＥＶが、蛍光を発するには配座状態を保持していなければならないものである機能性タンパク質をトランスフェクトすることができるか否かを評価するために、組換え緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を３μｇの硝子体ＥＶの中に装填した。データは、ＧＦＰの濃度が０．２５μｇ、０．５μｇ及び１μｇである場合にＡＲＰＥ−１９細胞はそれぞれ８８．３％±４．２％、８１．４％±４．８％、及び７２．９％±３．９％トランスフェクトされたということを示した（図１０Ｄ〜図１０Ｆ）。対照は信号を示さず、試験群よりも有意に低かった（ｐ＜０．０５、ｎ＝３）。これらのデータは、試験管内で硝子体ＥＶがその内在性ＲＮＡならびに外因性組換えタンパク質を細胞に移入させることができることを示している。
【０１６２】
ウシ硝子体及び房水のＥＶは、それらの内在性タンパク質及びＲＮＡを眼細胞以外のヒト細胞、例えば皮膚細胞に移入させることができる。ウシ硝子体ＥＶの内在性ＲＮＡ及び外因性タンパク質は、標識されて、図１７Ａ〜１７Ｌに示すように高効率でヒト皮膚細胞内に移入された。対照条件下では移入は認められなかった（図１７Ｍ〜図１７Ｒ）。これらのデータは、硝子体ＥＶが広い向性を有し、多種多様な症状のために身体の全体にわたって治療薬送達ビヒクルとして使用されることができる、ということを示唆している。
【０１６３】
実施例７−生体内でウシ硝子体ＥＶは網膜を標的として組換えタンパク質を送達する
生体内で硝子体ＥＶのトランスフェクション効率の妥当性を立証すること及び眼内の標的細胞を判定することを試みた。電気穿孔によって０．５μｇのＢＳＡ−フルオレセインが装填された希釈量のＥＶ（０．０２５μｇ）を、眼内送達のために用いられる一般的技術である硝子体内注射によって齧歯動物の眼に投与した。処置後３日目にＥＶは、網膜を横切った証拠を示さず、内境界膜を透過しない（図１１Ａ）。注射後３週目に、複数の網膜細胞層においてトランスフェクションが認められた（図１１Ｂ〜図１１Ｄ）。特異性対照については、ＰＢＳ単独、または電気透過化なしでＢＳＡ−フルオレセインと混合したＥＶ試料ではトランスフェクションの証拠が認められなかった。総合するとこれらのデータは、硝子体ＥＶが生物学的に活性であり、生体内で組換えタンパク質を送達するベクターとして機能する、ということを示している。加えて、硝子体ＥＶは網膜細胞を標的とし、持続的トランスフェクションを最大で３週間にわたって維持する。
【０１６４】
実施例８−生体内でウシ硝子体ＥＶは角膜、毛様体及び網膜を標的として組換えタンパク質を送達する
フルオレセインと結合した組換えウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＢＳＡ−フルオレセイン）が電気穿孔（３００Ｖ）によって装填されたウシＥＶをマウスの眼に注射した。注射後３週目にマウス眼切片をＢＳＡ−フルオレセイン送達について調べ、図１２Ａの顕微鏡写真に示すように角膜において内皮細胞及び角膜細胞からの送達が認められた。電気穿孔なし（０Ｖ）でＢＳＡ−フルオレセインと混合したウシＥＶの対照群からの注射３週間後の画像は、内皮細胞においても角膜細胞においても発現を示さないが、角膜上皮の非特異的な染色は示している（図１２Ｂ）。図１２Ｃは、電気穿孔（３００Ｖ）によってＢＳＡ−フルオレセインが装填されたＥＶを注射してから３週間後のマウスの眼からの代表的な共焦点蛍光顕微鏡写真であり、毛様体、毛様体無色素上皮細胞における信号を示す。図１２Ｄの画像は、視細胞、内網状層（ＩＰＬ）、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞及び脈絡膜におけるＢＳＡ−フルオレセインの堅牢な発現を示す。全組織切片中の核はヘキストブルーで染色され、これらは図１２Ａ〜図１２Ｄの中央パネルに示されている。融合画像を図１２Ａ〜図１２Ｄの左端パネルに示す。図１２Ｅの画像は、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）及び脈絡膜におけるＢＳＡ−フルオレセインの発現を示す。
【０１６５】
実施例９−蛍光標識ｓｉＲＮＡが装填されたウシ硝子体小胞は高効率でヒト網膜色素上皮細胞内にトランスフェクトする
外因性低分子干渉ＲＮＡによる改変を硝子体小胞が可能とするか否かを判定するために、シアニン３と結合した抗ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡを小胞内に電気穿孔を用いて導入した。様々な電気穿孔電圧で小胞内に装填したＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３に、ＡＲＰＥ−１９細胞を曝露し、ｓｉＲＮＡ装填小胞は、より高い電圧ではより高い効率で（図１３Ａ〜図１３Ｃ）、より低い電圧ではより低い効率で（図１３Ｄ〜図１３Ｆ）、細胞にトランスフェクトしたが、電気穿孔なしでは検出不可能であった（図１３Ｇ〜図１３Ｈ）、ということが見出された。図１３Ｉは、トランスフェクション効率を電気穿孔電圧に関して示すグラフである。
【０１６６】
実施例１０−ウシ毛様体無色素上皮は細胞内空間内へと放出される小胞を豊富に産生する
次に、眼内液小胞の起源を同定することを試みた。小胞は毛様体から産生されるという仮説を立てた、というのも、１）硝子体液コラーゲン線維の濃度は、水晶体の後方で毛様体と隣接している硝子体基底部の近くにおいて最も高く、２）毛様体は、表面積が大きいこと及び房水を産生することが知られているからである。それゆえ、酢酸ウラニルで染色したウシ毛様体の組織切片に対してＴＥＭを行い、無色素上皮において細胞内空間内へと発生している小胞が見つかった（図１４Ａ〜図１４Ｄ）。色素上皮における小胞発生は認められなかった（図１４Ｅ）。これらのデータは、毛様体が眼内の小胞の少なくとも部分的な供給源であることを示唆している。
【０１６７】
実施例１１−ウシ硝子体小胞は様々な電圧でタンパク質をヒト網膜色素上皮細胞内に高効率で送達する
上に述べたとおり、ウシ小胞は多様なプロテオームを含有する。これらの小胞は、外因性タンパク質を装填されることができ、タンパク質を標的細胞に送達するツールとして使用されることができると推論した。かくして、硝子体小胞が外因性タンパク質による改変を可能とするか否かを調べた。フルオレセインと結合したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ−フルオレセイン）を様々な電圧で電気穿孔を用いて小胞内に導入し、装填されたＢＳＡ−フルオレセイン小胞にＡＲＰＥ−１９細胞を曝露した。ＢＳＡ−フルオレセイン装填小胞は、１００Ｖを用いてタンパク質を装填された場合（図１５Ｄ〜図１５Ｆ）よりも３５０Ｖを用いてタンパク質を装填された場合（図１５Ａ〜図１５Ｃ）の方が大幅に高い効率でＡＲＰＥ−１９細胞にトランスフェクトしたことが見出された。電気穿孔なしではトランスフェクションは認められなかった（図１５Ｇ〜図１５Ｈ）。
【０１６８】
実施例１２−ウシ房水は小胞を豊富に含有する
硝子体小胞が高レベルであることから、小胞は房水中で後眼房内に位置している可能性もあるという仮説を立てるに至った。かくして、房水をＴＥＭ撮像法で調べ、広く分布している小胞が見つかった（図１６Ａ〜図１６Ｃ）。小胞画分を単離し、ナノ粒子軌跡解析によって小胞の大きさ及び濃度を決定し、これによって、濃度が１ｍｌあたり少なくとも１．１０×１０８個粒子（図１６Ｅ、標準誤差は１ｍｌあたり±９．２５×１０７個粒子、ｎ＝１０）、眼球１個あたり１ｍｌあたり合計２．７×１０８個粒子（図１６Ｅ、ｎ＝１０）であり、平均の大きさが１５５ｎｍ（標準誤差±２７．９ｎｍ）、及び最頻値が８８．７ｎｍ（標準誤差±３４．１ｎｍ）であることが示された。興味深いことに、房水中の小胞の粒度分布は硝子体小胞に比べて大幅に小さかった。
【０１６９】
実施例の考察
要約すると、従来のホルマリン固定に基づく技術は哺乳動物組織からの相当量のＥＶの脱出を招き、この結果として原位置でのＥＶの可視化は一貫性がなくなるかまたは陰性になる。それに対して、ＥＤＣ−ホルマリン固定は組織中でのＥＶの保持を著しく改善し、原位置での堅牢なＥＶ撮像を可能にする。この方法は、生物学的機能がほとんどないと長い間みなされてきた眼の正常硝子体液において以前に同定されなかったＥＶのネットワークを明らかにした。加えて、本明細書において提示されるデータは、試験管内及び生体内で組換えタンパク質及び核酸分子を送達するベクターとして硝子体ＥＶを操作することができることを実証する。結論として、この方法は、正常組織標本または、眼疾患、神経障害及びがんなどＥＶによって媒介されると考えられる多種多様な疾患を含む罹患組織標本において、ＥＶの構造及び機能を研究するための新しい可能性を切り開く。
【０１７０】
本明細書では好ましい実施形態を詳しく描写及び記載してきたが、当該分野の当業者であれば、本発明の趣旨から逸脱することなく様々な改変、追加、置き換えなどを行うことができることは明らかであろうし、それゆえにこれらは、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲に含まれるものとみなされる。
【０１７１】
（表３）細胞外小胞画分及び細胞不含硝子体画分に発現するタンパク質
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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