(57)【要約】本発明は医学使用の為のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の配列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-Y1- X15-Y2-X16-Y3-X17-Y4-X18-Y5
配列中、少なくとも１つのXが存在し、且つ
X1は欠損又はMet又はN-ホルミル Metで表され；
X2は欠損又はHisで表され、
X3は欠損又はHisで表され、
X4は欠損又はHisで表され、
X5は欠損又はHisで表され、
X6は欠損又はHisで表され、
X7は欠損又はHisで表され、
X8は欠損又はHisで表され、
X9は欠損又はHisで表され、
X10は欠損又はAsp、Glu、Lys、又はArgから選択され、
X11は欠損又はAsp、Glu、Lys、又はArgから選択され、
X12は欠損又はAsp、Glu、Lys、又はArgから選択され、
X13は欠損又はAsp、Glu、Lys、又はArgから選択され、
X14は欠損又はAsp、Glu、Lys、又はArgから選択され、
X15はAsp又はAsn又はGluで表され、
X16はMet又はLys又はArgで表され、
X17はArg又はHis又はLysで表され、
X18はAsp又はAsn又はGluで表され、
又は医薬的に許容な塩、及び
Y1は配列番号11と少なくとも85%の配列の同一性を有し、
Y2は配列番号12と少なくとも85%の配列の同一性を有し、
Y3は配列番号13と少なくとも85%の配列の同一性を有し、
Y4は配列番号14と少なくとも85%の配列の同一性を有し、及び
Y5は配列番号15又は配列番号16と少なくとも85%の配列の同一性を持ち、
又は医薬的に許容な塩で、
但しX1〜X14が欠損し、X15がAsnで表され、X16がMetで表され、及びX17がArgで表されるとき、X18はAsnで表わす事ができない；
を有する、アルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項２】
次のアミノ酸残基：
Tyr 22、Asp 17、Cys 34、His 66、Lys 69、Lys 92、Asp96、Lys 118、His 122、His 123、Lys 130、Tyr 132、Cys 169、Leu 180、Iso 181、Pro 182、Arg 183を有し、
及び前記配列位置がヒトのwtアルファ-1-マイクログロブリンの位置と一致する(配列番号１)、請求項１に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項３】
前記Y1が配列番号11と少なくとも90%の同一性を有し、
Y2が配列番号12と少なくとも90%の同一性を有し、
Y3が配列番号13と少なくとも90%の同一性を有し、
Y4が配列番号14と少なくとも90%の同一性を有し、及び
Y5が配列番号15又は配列番号16と少なくとも90%の同一性を有する、
請求項１又は２に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項４】
前記Y1が配列番号11と少なくとも95%の同一性を有し、
Y2が配列番号12と少なくとも95%の同一性を有し、
Y3が配列番号13と少なくとも95%の同一性を有し、
Y4が配列番号14と少なくとも95%の同一性を有し、及び
Y5が配列番号15又は配列番号16と少なくとも95%の同一性を有する、
請求項１〜３のいずれか１つに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項５】
式Iで構成されるアミノ酸配列(配列番号10)及び式IIのアミノ酸配列（配列番号17）を持ち：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-GPVPTPPDN IQVQENF-X15-IS RIYGKWYNLA IGSTCPWLKK I-X16-DRMTVSTL VLGEGATEAE ISMTST-X17-WRK GVCEETSGAY EKTDTDGKFL YHKSKW-X18-ITM ESYV-VHTNYD EYAIFLTKKF SRHHGPTITA KLYGRAPQLR ETLLQDFRVV AQGVGIPEDS IFTMADRGEC VPGEQEPEPI LIPR (式I)
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-GPVPTPPDN IQVQENF-X15-IS RIYGKWYNLA IGSTCPWLKK I-X16-DRMTVSTL VLGEGATEAE ISMTST-X17-WRK GVCEETSGAY EKTDTDGKFL YHKSKW-X18-ITM ESYV-VHTNYD EYAIFLTKKF SRHHGPTITA KLYGRAPQLR ETLLQDFRVV AQGVGIPEDS IFTMADRGEC VPGEQEPEPI,(式II)
式中、Xの少なくとも一つが存在し、
X1は欠損又はMet又はN-ホルミル Metで表され；
X2は欠損又はHisで表され、
X3は欠損又はHisで表され、
X4は欠損又はHisで表され、
X5は欠損又はHisで表され、
X6は欠損又はHisで表され、
X7は欠損又はHisで表され、
X8は欠損又はHisで表され、
X9は欠損又はHisで表され、
X10は欠損又はAsp、Glu、Lys、又はArgから選択され、
X11は欠損又はAsp、Glu、Lys、又はArgから選択され、
X12は欠損又はAsp、Glu、Lys、又はArgから選択され、
X13は欠損又はAsp、Glu、Lys、又はArgから選択され、
X14は欠損又はAsp、Glu、Lys、又はArgから選択され、
X15はAsp又はAsn又はGluで表され、
X16はMet又はLys又はArgで表され、
X17はArg又はHis又はLysで表され、
X18はAsp又はAsn又はGluで表され、
又は医薬的に許容な塩で、
但しX1〜X14が欠損し、X15がAsnで表され、X16がMetで表され、及びX17がArgで表されるとき、X18はAsnで表わす事ができない、
請求項１〜４のいずれか１つに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項６】
前記X1がMet又はN-ホルミル Metであり、
X2, X3, X4, X5, X6, X7がHisであり、
X8及びX9が欠損し、
X10, X11, X12, 及びX13がAspであり、
X14がLysであり、
及びX15〜X18が上記で定義されたものである、請求項１〜５のいずれか１つに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項７】
前記X1がMet又はN-ホルミル Metであり、
X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8及びX9がHisであり、
X10, X11, X12, 及びX13がAspであり、
X14がLysであり、
及びX15〜X18が上記で定義されたものである、請求項１〜５のいずれか１つに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項８】
前記X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X10, X11, X12 ,X13及びX14が欠損し、
且つX15〜X18が上記で定義されたものであり、
但しX15がAsnで表され、X16がMetで表され、及びX17がArgで表されるとき、その時X18がAsnで表す事ができない、請求項１〜７のいずれか１つに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項９】
前記X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X10, X11, X12 及びX13が欠損し、
X14がMetであり、
X15がAspであり、
X16がMetであり、
X17がHisであり、
X18がAspである、請求項１〜５のいずれか１つに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項１０】
アミノ酸配列が配列番号３又は配列番号１８と一致する、請求項９に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項１１】
前記X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X10, X11, X12 及びX13が欠損し
X14がMetであり、
X15がAsnであり、
X16がLysであり、
X17がArgであり、
X18がAsnである、請求項１〜５のいずれか１つに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項１２】
アミノ酸配列が配列番号４又は配列番号１９と一致する、請求項１１に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項１３】
前記X1がMet又はN-ホルミル Metであり、
X2, X3, X4, X5, X6, X7がHisであり、
X8及びX9が欠損し、
X10, X11, X12, 及びX13がAspであり、
X14がLysであり、
X15がAspであり、
X16がMetであり、
X17がHisであり、
X18はAspである、請求項１〜５のいずれか１つに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項１４】
アミノ酸配列が配列番号５又は配列番号２０と一致する、請求項１３に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項１５】
前記X1がMet又はN-ホルミル Metであり、
X2, X3, X4, X5, X6, X7がHisであり、
X8及びX9が欠損し、
X10, X11, X12, 及びX13がAspであり、
X14がLysであり、
X15がAsnであり、
X16がLysであり、
X17がArgであり、
X18がAsnである、請求項１〜５のいずれか１つに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項１６】
アミノ酸配列が配列番号６又は配列番号２１と一致する、請求項１５に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項１７】
前記X1がMet又はN-ホルミル Metであり、
X2, X3, X4, X5, X6, X7,X8及びX9がHisであり、
X10, X11, X12, 及びX13がAspであり、
X14がLysであり、
X15がAspであり、
X16がMetであり、
X17がHisであり、
X18がAspである、請求項１〜５のいずれか１つに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項１８】
アミノ酸配列が配列番号７又は配列番号２２と一致する、請求項１７に記載のアルファ-1-マイクログロブリン誘導タンパク質。
【請求項１９】
前記X1がMet又はN-ホルミル Metであり、
X2, X3, X4, X5, X6, X7,X8及びX9がHisであり、
X10, X11, X12, 及びX13がAspであり、
X14がLysであり、
X15がAsnであり、
X16がLysであり、
X17がArgであり、
X18がAsnである、請求項１〜５のいずれか１つに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項２０】
アミノ酸配列が配列番号８又は配列番号２３と一致する、請求項１９に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項２１】
抗酸化物質である、請求項１〜２０のいずれか１つに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項２２】
ヘムと結合するタンパク質である、請求項１〜２１のいずれか１つに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１つに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質及び１つあるいはそれ以上の医薬的に許容な賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか１つに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質の薬物としての使用法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された特性を有するヒトアルファ-1-マイクログロブリンタンパク質の改変バリアント、及びこれらバリアントの医学的処置及び診断への使用に関する。発明者は驚くべき事にアルファ-1-マイクログロブリンの特定のアミノ酸置換の導入及び／又は特定のN-末端の拡張が、安定性、溶解性、及びヘムの結合に関して改変前のアルファ-1-マイクログロブリンに改善された特性を付与することを見いだした。
【背景技術】
【０００２】
A1M(アルファ-1-マイクログロブリン)は細胞外組織洗浄機能を持つ低分子量タンパク質である(Ekstrom et al., 1977; Akerstrom and Gram, 2014)。それは魚類、鳥類、齧歯類、ほ乳類、及びその他の脊椎動物中の全ての組織及び臓器に存在する。A1Mは主に肝臓で合成されるが、身体中のほとんど全てのその他の細胞中でより低い頻度でもまた合成される。それはアルファ-1-マイクログロブリン-ビクニン-前駆遺伝子(AMBP)によってコードされ、及び別のタンパク質と一緒に、連続したペプチド前駆体として全ての細胞及び種で翻訳される(Kaumeyer et al., 1986)。けれども、プロテアーゼ分解によって２つのタンパク質は分離され、処理され、異なる機能の２つの異なるタンパク質として血液中に分泌される(Lindqvist et al., 1992; Bratt et al., 1993)。A1M及びビクニンがいたるところで共合成される理由は未だ知られていない。血液中では、およそ50%のA1Mが遊離型で、単量体の形態であり、そして残りの50%は、イムノグロブリンA、アルブミン及びプロトロンビンと共有結合した高分子量の複合体である(Berggard et al., 1997)。
【０００３】
A1Mは、１つのドメインの、183アミノ酸のグリコシル化されたタンパク質である。E. coli中で発現させたA1Mの巨大な断片の結晶構造は最近公表された(Meining and Skerra, 2012)。この構造に基づくと、A1Mは、動物、植物、及び細菌からの50又はそれ以上のメンバーを有するリポカリンのタンパク質ファミリーに属する(Flower, 1996; Akerstrom et al., 2006)。リポカリンは、閉鎖端（底）及び開放端（頂点）を持つバレルを形成する８つの逆平行βストランドで構成される共通の三次元構造を有する。バレルは、ほとんどのリポカインで疎水性リガンドのためのポケットとして機能する。バレルの開放端のリムを構成する４つのループ（ループ１〜４）は、様々なリポカインの間でその長さ及び構成が非常に異なる。A1Mでは、これらのループ、又はポケットの内側に配置された少数のアミノ酸側鎖グループが、タンパク質の特定された機能に重要であることが示されている。このように、ループ1上の短いヘリックス上に配置した遊離型システインC34は、負の還元電位を有し、及びA1Mにレダクターゼ特性を与える(Allhorn et al., 2005)。２つのチロシン残基、Y22及び132はインビトロでラジカル酸化生成物により共有結合的に修飾されることが示された(Akerstrom et al., 2007)。４つのリジン残基、K69, 92, 118及び130は、レダクターゼ活性を制御し(Allhorn et al., 2005)、遊離ヘムグループの結合に影響し(Rutardottir et al., 2015)、及び低分子量の黄褐色異種物質の、ヒト尿及び羊水から精製されたA1M上で共有結合的に修飾されている(Berggard et al., 1999; Sala et al., 2004)。
【０００４】
レダクターゼ活性、ラジカル除去及びヘム結合の特性を用いることにより、A1Mは細胞及び組織を酸化ダメージから防御する抗酸化物質として働く。A1Mは、ヘモグロビン、ヘム及び活性酸素種(ROS) からの酸化ダメージに対抗して、インビトロの血液細胞培養物、胎盤組織及び肌を保護することが示されている(Olsson et al., 2008; May et al., 2011; Olsson et al., PloS One 2011; Olsson et al., ARS 2012)。A1Mは、胎盤及び腎臓組織へのヘモグロビン注入後のダメージに対して、ラット及びウサギにおけるインビボ保護効果もまた示されている(Sverrison et al., 2014; Naav et al., 2015)。一連の報告では、ヘモグロビン及び酸化ストレスは、深刻な妊娠の合併症である子癇前症の病原に関与することが示され(Centlow et al., 2008; Hansson et al., 2013)、及び肝臓、胎盤及び血漿中のA1M-mRNA及びタンパク質のレベルは子癇前症の妊婦において上昇した(Olsson et al., 2010; Anderson et al., 2011)。それゆえ、A1Mを、子癇前症の妊婦を治療し、酸化ダメージそして該疾患の臨床症状を改善する為の治療薬として採用しうることが示唆された(Olsson et al., 2010)。
【０００５】
組換え型ヒトA1Mの製造方法は、E.coliで開発され、及びレダクターゼ、ラジカル結合及びヘム結合の特徴を有することが示された(Kwasek et al., Allhorn et al., 2002; 2005; Akerstrom et al., 2007)。実際、この組換え型A1Mバリアントは、子癇前症のヒツジモデルにおいてインビボで治療効果を示した(Wester-Rosenlof et al., 2014)。けれども、機能的であるが、E.coli-発現組換え型A1Mはグリコシル化が欠損しており、尿や血漿から精製したヒトA1Mに比べて可溶性と安定性に乏しい。タンパク質の安定性と可溶性の欠如は、高濃度の溶液を得ること、及び生理的なpH及び塩の条件の緩衝液中での長期間保存条件が難しいことが主な原因となって、ヒトへの使用のための薬としての使用を制限する。
【０００６】
したがって、ヒトA1Mと構造的類似性を有するが、安定性と可溶性にについて改善した特性を有するタンパク質を開発する必要がある。その上、そのタンパク質は、治療上の使用のために適した量を調製することが比較的容易であるべきである。
【発明の概要】
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は、安定性と可溶性を改善した新規アルファ１―マイクログロブリンに関する。
【０００８】
部位特異的及び付加的突然変異誘発を用いて、維持された又は向上された可能性のある機能的特性を有するが、生理学的な緩衝液中での高濃度で長期間の保存を可能にする改善されたタンパク質安定性及び可溶性を有するA1M種を作出した。
本実施例からわかるように、変異アミノ酸側鎖グループの位置及び同一性を選択したときに、４つの一連の証明を行った。：
1)酸化ストレス、温度、酸素圧の観点での種々の予期された環境圧の様々な種由来の動物ホモログを発現した (N=12)；
2)56のシークエンスされたA1Mホモログの間でループ1~4中又は疎水性ポケットの内部表面  に配置された位置で頻繁に起こる単アミノ酸置換を、ヒト遺伝子構築物中へ導入して、発現した(N=3)；及び
3)有利に位置するリシル又はチロシル残基の添加又は、これらがC35チオリルのpKaに影響  する(Allhorn et al., 2005) 又はラジカル捕捉部位として働く(Berggard et al., 1999; Sala et al., 2004; Akerstrom et al. 2007)という仮説に基づいている(N=5);4)。
加えて、N末端の荷電及び親水性の延長の影響はいくつかのA1Mバリアントで試験された。試験されたN末端長の設計の背景にある原理は、1)精製のためのタグ(例えば His-タグ)、2) A1Mタンパク質のコアからタグを分離するためのリンカー、3)水溶液中で最大の安定性と可溶性を得るために親水性をタンパク質に与えるいくつか(1~5)の荷電アミノ酸側鎖グループを、4) A1Mの生理的機能を妥協せずに加えることである。
【０００９】
プロジェクトは３つの主要な段階に分割された：
フェーズＩ) 上記の27のA1Mバリアントの発現と、その後の可溶性、安定性及び機能の分析；
フェーズＩＩ) フェーズＩの結果に基づいて予期される最適の特性を有するいくつかのA1Mバリアントのデザイン、発現と分析；及び
フェーズＩＩＩ）非変異野生型(wt)-A1M及びN末端の荷電及び親水性の延長を有するか又は有さない最も成功したA1Mバリアントのデザイン、発現及び分析。
【００１０】
ここにより詳細な説明をするように、本発明は、式Ｉのアミノ酸配列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-GPVPTPPDN IQVQENF-X15-IS RIYGKWYNLA IGSTCPWLKK I-X16-DRMTVSTL VLGEGATEAE ISMTST-X17-WRK GVCEETSGAY EKTDTDGKFL YHKSKW-X18-ITM ESYV-VHTNYD EYAIFLTKKF SRHHGPTITA KLYGRAPQLR ETLLQDFRVV AQGVGIPEDS IFTMADRGEC VPGEQEPEPI LIPR (式Ｉ)
式中、少なくとも１つのXが存在し、且つ(括弧内はさらなる置換を提案する)
X1は欠損又はMet又はN-ホルミル Metで表され；
X2は欠損又はHisで表され；
X3は欠損又はHisで表され；
X4は欠損又はHisで表され；
X5は欠損又はHisで表され；
X6は欠損又はHisで表され；
X7は欠損又はHisで表され；
X8は欠損又はHisで表され；
X9は欠損又はHisで表され；
X10は欠損又はAsp及びGlu、Lys及びArgから選択され；
X11は欠損又はAsp及びGlu、Lys及びArgから選択され；
X12は欠損又はAsp及びGlu、Lys及びArgから選択され；
X13は欠損又はAsp及びGlu、Lys及びArgから選択され；
X14は欠損又はLys  Glu、Asp又はArg又はMet又はN-ホルミル Metで表され；
X15はAsp又はAsn又はGluで表され；
X16はMet又はLys又はArgで表され；
X17はArg又はHis又はLysで表され；
X18はAsp、又はAsn又はGluで表される；
を有するA1M由来タンパク質又はその医薬的に許容な塩を提供し、但しX1-X14が欠損し、X15がAsnで表され、X16がMetで表され、及びX17がArgで表されるとき、X18はAsnで表わす事ができない。
【００１１】
本発明は、A1Mの誘導体、すなわちX1-X14-A1Mも提供し、前記A1Mは表２で言及した種から得られたどのA1Mでもよい(すなわちヒト、マウス、ハダカデバネズミ、カエル、ニワトリ、ウサギ、リスザル、セイウチ、マナティー、プレイス、オランウータン)。本発明者らは、X1-X14の含有が少なくともヒトA1Mに改善された特性を付与することを見いだし、それゆえ、この開始配列が重要な改善された特性を他の種由来のA1M又は種組換え型A1Mへと与えることができると予期される。
【００１２】
本発明は、式ＩＩのアミノ酸配列：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-GPVPTPPDN IQVQENF-X15-IS RIYGKWYNLA IGSTCPWLKK I-X16-DRMTVSTL VLGEGATEAE ISMTST-X17-WRK GVCEETSGAY EKTDTDGKFL YHKSKW-X18-ITM ESYVVHTNYD EYAIFLTKKF SRHHGPTITA KLYGRAPQLR ETLLQDFRVV AQGVGIPEDS IFTMADRGEC VPGEQEPEPI (式ＩＩ)
式中、少なくとも１つのXが存在し、ならびに(括弧内はさらなる置換を提案する)
X1は欠損又はMet又はN-ホルミルMetで表され；
X2は欠損又はHisで表され；
X3は欠損又はHisで表され；
X4は欠損又はHisで表され；
X5は欠損又はHisで表され；
X6は欠損又はHisで表され；
X7は欠損又はHisで表され；
X8は欠損又はHisで表され；
X9は欠損又はHisで表され；
X10は欠損又はAsp及びGlu、Lys及びArgから選択され；
X11は欠損又はAsp及びGlu、Lys及びArgから選択され；
X12は欠損又はAsp及びGlu、Lys及びArgから選択され；
X13は欠損又はAsp及びGlu、Lys及びArgから選択され；
X14は欠損又はLys又はGlu、Asp又はArg又はMet又はN-ホルミル Metで表され；
X15はAsp、又はAsn又はGluで表され；
X16はMet又はLys又はArgで表され；
X17はArg又はHis又はLysで表され；
X18はAsp又はAsn又はGluで表される；
を有するA1M由来タンパク質又はその医薬的に許容な塩を提供し、但しX1-X14が欠損し、X15がAsnで表され、X16がMetで表され、及びX17がArgで表されるとき、X18はAsnで表わす事ができない。
【００１３】
本発明はすなわちX1-X14-A1MのようなA1Mの誘導体もまた提供し、前記A1Mは表２中で言及した種から得られたどのA1Mでもよく(すなわちヒト、マウス、ハダカデバネズミ、カエル、ニワトリ、ウサギ、リスザル、セイウチ、マナティー、プレイス、オランウータン)、前記A1Mは、C末端の4ペプチド配列LIPRがタンパク質の部分を形成しないようにC末端を切り取られている。
【発明の効果】
【００１４】
実施例から分かるように、本発明者らは：
i)最初の配列X1-X14は、改善された特性をA1Mに与えると考えられ、
ii)A1M分子の点変異M41K, R66H又はN17, 96Dは、維持されたA1Mの機能と共に改善された安定性を与え、
iii)変異(M41K+R66H)、(M41K+N17, 96D)、(R66H+N17, 96D)、及び／又は(M41K+R66H+N17, 96D) は、維持された機能と共に向上した可溶性及び／又は安定性を示し、
iv)変異(R66H+N17,96D)は、行った実験中でベストな総合的実績が得られ、
v)変異(R66H+N17,96D)及びN末端配列として最初の配列がMHHHHHHHHGGGGGIEGR(M8H5GIEGR); MHHHHHHHHDDDDK(M8H4DK)又はMHHHHHHHH(M8H) を持つA1Mを実験し、及びN末端配列としてM8H4DKを有するタンパク質バリアントが他のN末端延長と比較してより高い可溶性及び／又は安定性を示し、
vi)A1MのC末端の切断は、改善されたヘム結合及び分解を与えると考えられる
ことを見いだした。
【００１５】
興味深いことに、このN末端延長配列は、エンテロキナーゼ切断部位を有するHisタグと似ているが、しかしアミノ酸Alaが含まれないためにA1MからHisタグを切断する能力が無いことを記している。DDDKA中のAlaの存在は、エンテロキナーゼ切断部位を示す。このように、繰り返されるHis残基に５つの荷電アミノ酸が続いたとき、N末端配列自体が、改善されたタンパク質の安定性及び可溶性の特性をA1Mに付与すると考えられる。
【００１６】
これらの観察に基づいて、上記に従うA1Mタンパク質のバリエーションは、タンパク質にA1Mの機能性を付与するが、安定性及び／又は可溶性に関する改善された特徴を付与すると考えられる。
このように、本発明は、上記のX1〜X18を含むA1Mの全ての可能な組み合わせに関連する。
より具体的には、次のA1M由来タンパク質は本発明の範囲内であり、このように全てのタンパク質は、ヒト野生型A1Mの全長に対応してもよいし; 又はC末端が切り取られる、すなわちLIPRが無くてもよい：
【００１７】
【表１−１】
2019519466.tif 000002
【表１−２】
2019519466.tif 000003
【表１−３】
2019519466.tif 000004
【表１−４】
2019519466.tif 000005
【表１−５】
2019519466.tif 000006
【表１−６】
2019519466.tif 000007
【表１−７】
2019519466.tif 000008
【表１−８】
2019519466.tif 000009
【表１−９】
2019519466.tif 000010
【表１−１０】
2019519466.tif 000011
【発明を実施するための形態】
【００１８】
アルファ-1-マイクログロブリン-全般的な背景
A1Mは、高い割合で肝臓で合成され、血流中に分泌され、血管壁を横切って全ての臓器の血管外区画に輸送される。このタンパク質は、他の組織(血液細胞、脳、腎臓、皮膚)でも合成されるが、より低い割合である。サイズが小さいために、遊離のA1Mは、血液から腎臓中に迅速に濾過される。
【００１９】
A1Mは、保存された３次元構造を有するが多様な機能を有する、動物、植物および細菌からのタンパク質の一群である、リポカリンスーパーファミリーのメンバーである。各リポカリンは、160〜190アミノ酸の鎖からなり、内部が疎水性のβバレルポケットに折り畳まれる。少なくとも12のヒトリポカリン遺伝子が知られている。A1Mは、今までのところ哺乳動物、鳥類、魚類およびカエルにおいて同定されている26 kDaの血漿および組織タンパク質である。Ｘ線結晶構造解析により決定したA1Mの3次元構造を図10に示す。A1Mは、高い割合で肝臓で合成され、血流中に分泌され、血管壁を横切って全ての臓器の血管外区画に迅速に(T1/2 = ２〜３分)輸送される。A1Mは、遊離の単量体の形およびより大きい分子(IgA、アルブミン、プロトロンビン)との共有結合性複合体の形の両方で、血液および間質組織において見出される。サイズが小さいために、遊離のA1Mは、血液から腎臓中に迅速に濾過される。大部分は次いで再吸収されるが、著しい量が尿中に排出される。
【００２０】
抗酸化物質は、酸化体の除去又は有害な酸化反応を防ぐ保護因子である。ヒトの生物体は酸化ストレスに応答して抗酸化物質を生成できる。このような内因性の抗酸化物質は、スーパーオキシド-減少酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ(SOD) 、過酸化水素分解酵素であるカタラーゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼ、及びヘム分解酵素であるヘムオキシゲナーゼ-1(HO-1)を含む。A1Mは近年、ラジカル及びヘムのスカベンジャーとして、レダクターゼ及び及び酸化インヒビターとしての両方の機能によって酸化性の組織損傷に対する保護に関与することが知られていた。いくつかの最近の論文では、部分的には、A1Mがミトコンドリアに蓄積することで、ミトコンドリアの機能を保護することにより、A1Mが細胞培養物及び臓器外植片を酸化ダメージから保護することが実証されている。実際、ヒト組換えA1Mの注入は、動物モデルにおいて、酸化ストレスに関連した病気である子癇前症及びヘモグロビン誘導糸球体損傷のインビボでの治療に成功した。
【００２１】
A1Mの配列及び構造的特徴
ヒトA1Mの全長配列は既知である。このタンパク質は183のアミノ酸残基のポリペプチドからなる。多くのさらなるA1M cDNA及び／又はタンパク質が、他の哺乳動物、鳥類、両生類および魚類から検出、単離及び／又は配列決定されている。A1Mのペプチド鎖の長さは、主にＣ末端でのバリエーションにより種間でわずかに異なる。異なる推定アミノ酸配列のアラインメント比較は、同一性の割合がげっ歯類又は肉蹄類(ferungulates)及びヒトとの間でおよそ75〜80%変動し、魚類と哺乳動物との間でおよそ45%まで下がることを示す。34位の遊離システイン側鎖は、保存されている。この基は、酸化還元反応(以下を参照)、その他の血漿タンパク質との複合体形成、及び黄色-茶色色素との結合に関与することが示されている。A1Mの３次元構造は、C34が溶媒に曝露され、リポカリンポケットの開口部付近にあることを示す(図10を参照)。
【００２２】
本明細書に関係しては、「アルファ-1-マイクログロブリン」との用語は、配列番号１(ヒトA1M)、配列番号２(ヒト組換え型A1M)で同定されるアルファ-1-マイクログロブリンならびに他種からのA1Mで同定されるアルファ-1-マイクログロブリン、ならびに同様の治療活性を有するそのホモログ、断片またはバリアントを含むことを意図する。よって、本明細書で用いるA1Mは、配列番号１または配列番号２と少なくとも80％の配列同一性を有するタンパク質を意味することが意図される。好ましくは、本明細書で用いるA1Mは、配列番号１または配列番号２と少なくとも90％の配列同一性を有する。さらにより好ましくは、本明細書で用いるA1Mは、配列番号１または配列番号２と少なくとも95％、例えば99％または100％の配列同一性を有する。好ましい態様では、アルファ-1-マイクログロブリンは、本明細書で同定する配列番号１または２のとおりである。配列表において、ヒトA1M及びヒト組換え型A1M(それぞれ配列番号１及び２)のアミノ酸配列を示す。しかし、以下で同定するタンパク質の重要な部分を有するA1Mのホモログ、バリアント及び断片もまた、本明細書で用いる用語A1Mに含まれる。アラインメントと同一性に関しては次のパラグラフを参照する。
【００２３】
アラインメントと同一性の詳細
本明細書でのアミノ酸残基の位置はヒト血漿中で見出されるヒトのwt-A1M中の位置として言及する（配列番号１）。wt-A1M（配列番号２）、変異したヒトA1M又は他種のA1M中の初めの残基であるグリシン残基のN末端側に連結したメチオニン又はN-ホルミルメチオニン残基を有する組換え型A1M中のアミノ酸残基に言及するとき、当業者は、残基の位置を、例えば欠失又は挿入により位置がずれている場合であっても、ヒトwt-A1M (配列番号１) 中の残基に対応する残基をどのように固定するのかを理解するだろう。
【００２４】
組換え型タンパク質が生産される時、それらは初めのMet残基で最もよく始まるが、これは例えばメチオニンアミノペプチダーゼ又は別の似た活性を持つ別の酵素を用いて取り除かれてもよい。本明細書に示されるA1Mバリアントは、最初のMet残基が存在してもよいし、しなくてもよい。
【００２５】
A1Mのホモログ
上記のように、A1Mのホモログを、本明細書の記載に従って用いることもできる。理論的に、魚類(プレイス)から現在のところ見出された最も原始的なものを含む全ての種からのA1Mを、本明細書に記載する目的のために用いることができる。A1Mはヒト、オランウータン、リスザル、ラット、ハダカデバネズミ、マウス、ウサギ、モルモット、乳牛、カエル、ニワトリ、セイウチ、マナティー、及びプレイスから単離されたものもまた利用可能である。
A1Mのホモログ、バリアントおよび断片を考慮して、以下のものは、抗酸化効果のためにタンパク質の重要な部分として同定されている：
Y22(チロシン、22位、64~66塩基)
C34(システイン、34位、100~102塩基)
K69(リジン、69位、205~207塩基)
K92(リジン、92位、274~276塩基)
K118(リジン、118位、352~354塩基)
K130(リジン、130位、388~390塩基)
Y132(チロシン、132位、394~396塩基)
L180(ロイシン、180位、538~540塩基)
I181(イソロイシン、181位、541~543塩基)
P182(プロリン、182位、544~546塩基)
R183(アルギニン、183位、547~549塩基)
【００２６】
本書面全体を通してのアミノ酸及びヌクレオチドの番号付けは、配列番号１を参照する；他の種由来のその他のA1M、A1M類似体またはその組み換え配列を用いるならば、当業者は、配列番号１中のアミノ酸と対応するアミノ酸をどのように同定するかを知るだろう。
このように、A1Mが例えば配列番号１または２と80％(または90％または95％)の配列同一性を有する場合は、上記のアミノ酸は当該分子中の適切な位置に存在することが好ましい。
【００２７】
ヒトA1Mは三カ所がオリゴ糖と置換されており、２つはシアリル化複合型で、おそらく、N17およびN96に連結する２つの分岐鎖を有する炭水化物で、及び１つはT5に連結したより単純なオリゴ糖である。異なる種由来のA1Mタンパク質の炭水化物含量は、けれども、ツメガエル(Xenopus leavis)における全く糖鎖修飾されないものから、異なる糖鎖修飾パターンの範囲まで大きく変動する。けれども、１つのグリコシル化部位(ほ乳類中で保存され、ヒト中のN96に一致する)では、この特定の炭水化物は他の２つのオリゴ糖よりもタンパク質の構成により重要かもしれない。
【００２８】
A1Mは、血漿又は尿から精製されると黄褐色に着色している。この着色は、主にポケットへの入口に位置する種々のアミノ酸側鎖に共有結合した異種化合物が原因である。これらの修飾物は、インビボ中のA1Mによって共有結合的に捕捉された有機酸化物の酸化された分解生成物、例えばヘム、キヌレニン、及びチロシルラジカルを表す。
【００２９】
A1Mは、電荷およびサイズが不均質でもあり、茶色の着色がより強いA1M分子は、より負に荷電している。この不均質性の有望な説明は、異なる側基が異なるラジカルにより様々な程度で改変され、改変がタンパク質の実行電荷を変化させることである。共有的に連結された着色物質は、C34及びK92、K118及びK130に局在化し、後者の分子量は、100〜300Daの間である。トリプトファンの代謝産物であるキヌレニンは、血液透析患者の尿からのA1M中でリシル残基と共有的に付着して見出され、この場合にタンパク質の茶色の供給源であると考えられる[6]。合成ラジカルABTS (2,2'-アジノ-ジ-(３-エチルベンゾチアゾリン)-６-スルホン酸)の酸化断片が、Y22及びY132の側鎖と結合した。
【００３０】
C34は、A1Mの反応中心である。これは、非常に電気陰性になり、このことは、これがK69、K92、K118及びK130の正荷電側鎖の近傍で電子を供与する(これは、硫黄原子の酸化に必須のC34チオール基の脱プロトン化を誘導する)能力が高いことを意味する。予備的なデータは、C34が、既知の最も電気陰性の基の１つであることを示す。
【００３１】
理論的に、以下により詳細に記載するA1Mの性質の特徴となるアミノ酸(C34、Y22、K92、K118、K130、Y132、L180、I181、P182、R183)、は、別のフレームワーク、例えば同じ全体的な折り畳みを有するタンパク質(別のリポカリン)又はプラスチックポリマー、ナノ粒子又は金属ポリマーのような完全に人工的な有機または無機分子上に同様の３次元構造で配置させることができる。
【００３２】
これらのアミノ酸のいくつかの３次元配置(青色の卵型、リジンは「+」で示す)、A1M-フレームワーク(バレル)、電子の流れおよびラジカルの捕捉を図10に示す。
したがって、上記のような反応中心及びその周囲を含む構造を含むホモログ、断片又はバリアントが好ましい。
【００３３】
本開示のポリペプチドの構造に改変および変更を加え、オリジナルのポリペプチドと似た機能的特徴を有する分子(例えば保存アミノ酸置換)を得た。例えば、あるアミノ酸を、認識できる活性の喪失なしに配列中のその他のアミノ酸に置換できる。ポリペプチドの生物学的機能活性を定義するのは相互作用能力及びポリペプチドの性質であるので、あるアミノ酸配列置換をポリペプチド配列において作製し、にもかかわらず同様の特性を有するポリペプチドを得ることができる。
【００３４】
このような変化を作製する場合、アミノ酸のハイドロパシー指数を考慮できる。ポリペプチドに相互に作用する生物学的機能を与えることにおけるハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当業者において一般的に理解されている。あるアミノ酸が、同様のハイドロパシー指数又はスコアを有する他のアミノ酸で置換され、同様の生物学的活性を有するポリペプチドをまだもたらすことができることが知られている。それぞれのアミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシー指数を割り当てられる。これらの指数は、以下のとおりである: イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2); ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8); システイン/システイン(+2.5); メチオニン(+1.9); アラニン(+1.8); グリシン(-0.4); トレオニン(-0.7); セリン(-0.8); トリプトファン(-0.9); チロシン(-1.3); プロリン(-1.6); ヒスチジン(-3.2); グルタミン酸(-3.5); グルタミン(-3.5); アスパラギン酸(-3.5); アスパラギン(-3.5); リジン(-3.9); およびアルギニン(-4.5)。
【００３５】
アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性が、結果的に得られるポリペプチドの２次構造
を決定し、このことが次にポリペプチドとその他の分子（酵素、基質、受容体、抗体、抗原など）との相互作用を定義すると考えられている。アミノ酸を、同様のハイドロパシー指数を有するアミノ酸で置換して、機能的に等価なポリペプチドをまだ得ることができることが当該分野において知られている。このような変化において、ハイドロパシー指数が±2以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±1以内のものがより好ましく、±0.5以内のものがさらにより好ましい。
同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて行うこともでき、特にそれにより創出される生物学的機能が等価なポリペプチドまたはペプチドを、免疫学的実施形態において用いることを意図する。以下の親水性の値がアミノ酸残基に割り当てられている；アルギニン(+3.0); リジン(+3.0); アスパラギン酸(+3.0±１); グルタミン酸(+3.0±１); セリン(+0.3); アスパラギン(+0.2); グルタミン(+0.2); グリシン(０); プロリン(-0.5±１); トレオニン(-0.4); アラニン(-0.5); ヒスチジン(-0.5); システイン(-1.0); メチオニン(-1.3); バリン(-1.5); ロイシン(-1.8); イソロイシン(-1.8); チロシン(-2.3); フェニルアラニン(-2.5); トリプトファン(-3.4)。アミノ酸を、同様の親水性の値を有する別のもので置換して、生物学的に等価な、特に免疫学的に等価なポリペプチドをまだ得ることができることが理解される。このような変更では、親水性の値が±2以内のアミノ酸の置換が好ましくは、±1以内のものがより好ましく、±0.5以内のものがさらにより好ましい。
上で概説したように、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば
それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに一般的に基づく。上記の特徴の１つ以上を考慮した置換の典型的な例は、当該分野において知られており、それらに限定されないが、以下のものを含む(元の残基：例示的な置換): (Ala：Gly、Ser)、(Arg：Lys)、(Asn：Gln1 His)、(Asp：Glu、Cys、Ser)、(Gln：Asn)、(Glu：Asp)、(Gly：Ala)、(His：Asn、Gln)、(Ile：Leu、Val)、(Leu：Ile、Val)、(Lys：Arg)、(Met：Leu、Tyr)、(Ser：Thr)、(Thr：Ser)、(Trp：Tyr)、(Tyr：Trp、Phe)及び(Val：Lle、Leu)。本開示の実施形態は、よって、上記のポリペプチドの機能的又は生物学的同等物を企図する。特に、ポリペプチドの実施形態は、興味対象のポリペプチドと約50%、60%、70%、80%、90%及び95%の配列同一性を有するバリアントを含むことができる。
【００３６】
本明細書の関係では、２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列間のホモロジーは、「同一性」のパラメータにより記載される（上記もまた参照）。配列のアラインメント及びホモロジースコアの計算は、完全Smith-Watermanアラインメントを用いて行ってよく、タンパク質およびDNAの両方のアラインメントのために有用である。デフォルトスコアマトリクスBLOSUM50及び同一性マトリクスを、それぞれタンパク質およびDNAアラインメントのために用いる。ギャップ中の最初の残基のペナルティは、タンパク質について-12、及びDNAについて-16であるが、ギャップ中の追加の残基のペナルティは、タンパク質について-2であり、及びDNAについて-4である。アラインメントは、FASTAパッケージバージョンv20u6を用いて行ってよい。
【００３７】
タンパク質配列の多重アラインメントは、「ClustalW」を用いて行ってもよい。DNA配列の多重アラインメントは、タンパク質アラインメントを鋳型として用い、アミノ酸をDNA配列から一致するコドンで置き換えて行ってもよい。
代わりに、アミノ酸配列及びDNA配列を整列させるために異なるソフトウェアを用いることができる。2つのアミノ酸配列のアラインメントは、例えば、EMBOSSパッケージ(http://emboss.org)バージョン2.8.0.からのNeedle プログラムを用いることにより決定する。Needle プログラムは、記述されているグローバルアラインメントアルゴリズムを実行する。用いる置換マトリクスはBLOSUM62であり、ギャップオープンペナルティは10であり、ギャップ伸長ペナルティは0.5である。
アミノ酸配列（例えば配列番号1）と異なるアミノ酸配列（例えば配列番号2）との間の
同一性の程度は、２つの配列のアラインメントにおける厳密な一致の数を、「配列番号１」の長さ又は「配列番号２」の長さのいずれか短いほうで割ったものとして計算される。結果は、パーセント同一性として表現される。アラインメント及び同一性に関しては上記を参照。
【００３８】
厳密な一致は、２つの配列が重複部分の同じ位置に同一のアミノ酸残基を有する場合に起こる。
該当する場合、２つのヌクレオチド配列間の同一性の程度は、アイデンティティテーブル及び以下の多重アラインメントパラメータ:ギャップペナルティ10、及びギャップ長ペナルティ10とでLASER-GENE(商標)MEGALIGN(商標)ソフトウェア(DNASTAR, Inc.、Madison、WI)を用いるWilbur-Lipman法により決定することができる。ペアワイズアラインメントパラメータは、Ktuple=３、ギャップペナルティ=３及びウィンドウ=20である。
配列番号１のアミノ酸との又はそれに対するポリペプチドのアミノ酸配列の同一性の割合は、ｉ)２つのアミノ酸配列を、BLOSUM62置換マトリクス、ギャップオープニングペナルティ10及びギャップ伸長ペナルティ0.5でNeedleプログラムを用いて整列させ、ii)アラインメント中の正確な一致数を計算し、iii)厳密な一致数を、２つのアミノ酸配列のうちの短いほうの長さで割り、iv) iii)における除法の解を割合に変換することにより決定してもよい。本発明のその他の配列に対する、又は同一性の割合は、同様の様式で計算される。
【００３９】
例えば、ポリペプチド配列は、参照配列と相同であってよい(これは、100%相同である)か、又は%同一性が100%未満になるように参照配列と比較してある整数までのアミノ酸の変更を含んでよい。このような変更は、少なくとも１つのアミノ酸欠失、置換(保存置換および非保存置換を含む)または挿入から選択され、及び前記変更は、参照ポリペプチド配列のアミノもしくはカルボキシ末端の位置にて、又はこれらの末端の位置の間の任意の場所で、参照配列中のアミノ酸のうちに個別に散在して、又は参照配列内の１以上の隣接するグループのうちに生じることができる。
保存的アミノ酸バリアントは、天然に存在しないアミノ酸残基を含むことができる。天然に存在しないアミノ酸としては、限定されないが、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン、シス-4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチル-グリシン、アロ-トレオニン、メチルトレオニン、ヒドロキシ-エチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステイン、ニトロ-グルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-及び4-メチルプロリン、3,3-ジメチルプロリン、tert-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニル-アラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン及び4-フルオロフェニルアラニンが挙げられる。天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質に組み込む幾つかの方法が、当該分野において公知である。例えば、化学的にアミノアシル化したサプレッサーtRNAを用いてナンセンス変異を抑制されるインビトロ系を用いることができる。
アミノ酸を合成し、tRNAをアミノアシル化する方法は、当該分野において知られている。ナンセンス変異を含むプラスミドの転写及び翻訳は、E. coli S30抽出物及び市販の酵素及びその他の試薬を含む無細胞系で行なわれる。タンパク質はクロマトグラフィーにより精製される。第２の方法では、翻訳は、アフリカツメガエル卵母細胞で、変異mRNA及び化学的にアミノアシル化したサプレッサーtRNAのマイクロインジェクションにより行う。第３の方法では、E. coli細胞を、置換される天然アミノ酸(例えば、フェニルアラニン)の非存在下、及び所望の天然天然に存在しないアミノ酸(例えば、2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン又は4-フルオロフェニルアラニン)の存在下で培養する。天然に存在しないアミノ酸が、対応する天然物の代わりにタンパク質に組み込まれる。天然に存在するアミノ酸残基を、インビトロでの化学改変により天然に存在しない種に変換することができる。化学改変を部位特異的変異誘発と組み合わせて、置換の範囲を更に拡張することができる。A1Mの抗酸化特性を支持するに十分な三次元構造を提供する代替物の化学構造は、他の技術、例えば人工足場、アミノ酸置換などにより提供してもよい。更に、上記A1Mの活性部位を模倣する構造は、A1Mと同じ治療上又は生理的な機能を有すると考えられる。
【００４０】
医薬組成物および投与量
本発明は、
i) 造影剤を含む医薬組成物、及び
ii) A1M、配列番号1~10及び17のいずれか、又は本明細書で言及したA1M由来タンパク質いずれか(又は本明細書中で定義した変異体、アナログ、断片又はバリアント)を含む医薬組成物
を含むキットも提供する。
【００４１】
次の配列リストが与えられる。本発明は例えば本明細書に説明されるような全ての取り得る変化を含む。
配列番号1: wt hA1M
配列番号2: rhA1M(すなわち Met-A1M)
配列番号3:「伸長」なしに好ましい変異-N17, 96D, R66H
配列番号4: 無伸長、M41K
配列番号5: 6His、N17, 96D, R66Hの好ましい変異
配列番号6: 6His、M41K
配列番号7: 8His伸長、N17, 96D, R66Hの好ましい変異
配列番号8: 8His、M41K
配列番号9: 伸長+wt hA1M
配列番号10: オムニバスA1Mと可能な伸長
配列番号11-16: wt hA1Mのセグメント
配列番号17: オムニバスC末端切断A1Mと可能な伸長
配列番号18: 「伸長」なしの好ましい変異-N17, 96D, R66H; C末端切断
配列番号19: 無伸長、M41K; C末端切断
配列番号20: 6His、N17, 96D, R66H ; C末端切断の好ましい変異
配列番号21: 6His、M41K; C末端切断
配列番号22: 8His伸長、N17, 96D, R66H; C末端切断の好ましい変異
配列番号23: 8His、M41K; C末端切断
【００４２】
キットは、上記の２つの組成物を有する１つのパッケージの形である。
造影剤を含む医薬組成物は、典型的に、既に市場にある組成物である。
A1M(又は本明細書で定義したアナログ、断片もしくはバリアント)を含む医薬組
成物は、i.v.での投与が意図される。したがって、A1Mは、液体、例えば溶液、分散液、乳液、懸濁液などで処方できる。
非経口での使用のために適切な溶媒は、水、植物油、プロピレングリコール及びこのような目的のために一般的に認められている有機溶剤を含む。一般的に、当業者は、「Remington's Pharmaceutical Science」Gennaroら編、(Mack Publishing Company)、「Handbook of Pharmaceutical Excipients」Roweら編(PhP Press)、及び特定の製剤タイプのための適切な補形剤及び特定の製剤を調製するための方法に関連する公的なモノグラフ(例えばPh.Eur.またはUSP)に手引きを見出すことができる。
【００４３】
A1Mは、造影剤の投与との関連で単回又は複数回投薬される。好ましくは、各投薬は、単回投薬、単回投薬に続く60分間までの短時間の緩徐注入として、又は60分までの短時間の緩徐注入のみとしてi.v.投与される。最初の投薬は、造影剤と同時に又は造影剤注射後の0~60分前から0~30分後までの期間内に行なわれる。造影剤注射後に、追加のA1M投薬を行なうことができるが、必須ではない。各投薬は、患者の体重に関連する量(1〜15mg A1M/kg患者)のA1Mを含む。
【００４４】
Sequence Listing Free Text
SEQ ID NO:  1
<223> Wildtype human A1M, no mutations
SEQ ID NO:  2
<223> rhA1M, ie N-terminal Met
SEQ ID NO:  3
<223> hA1M, No tag, N-terminal Met, N17,96D; R66H
SEQ ID NO:  4
<223> hA1M, not tag, N-terminal Met, M41K
SEQ ID NO:  5
<223> 6His, N17,96D; R66H
SEQ ID NO:  6
<223> hA1M, 6His, M41K
SEQ ID NO:  7
<223> 8His, N17,96D; R66H
SEQ ID NO:  8
<223> hA1M, 8His, M41K
SEQ ID NO:  9
<223> hA1M, 8His, no mut
SEQ ID NO:  10
<211> 193
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220> 
<221> VARIANT
<222> 1
<223> Xaa = Met or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 1
<223> Xaa = Met or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 2
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 2
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 3
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 3
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 4
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 4
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 5
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<220> 
<221> VARIANT
<222> 5
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 8
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 8
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 9
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 9
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 10
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 10
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 11
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 11
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 12
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 12
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 13
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 13
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 14
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 14
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 31
<223> Xaa = Asn or Asp
<220> 
<221> VARIANT
<222> 55
<223> Xaa = Met or Lys
<220> 
<221> VARIANT
<222> 80
<223> Xaa = Arg or His
<220> 
<221> VARIANT
<222> 110
<223> Xaa = Asn or Asp
SEQ ID NO:  11
<223> Y1
SEQ ID NO:  12
<223> Y2
SEQ ID NO:  13
<223> Y3
SEQ ID NO:  14
<223> Y4
SEQ ID NO:  15
<223> Y5
SEQ ID NO:  16
<223> Y5
SEQ ID NO:  17
<211> 197
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220> 
<221> VARIANT
<222> 1
<223> Xaa = Met or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 1
<223> Xaa = Met or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 2
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 2
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 3
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 3
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 4
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 4
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 5
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 5
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 6
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 7
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 8
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 8
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 9
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 9
<223> Xaa = His or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 10
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 10
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 11
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 11
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 12
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 12
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 13
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 13
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 14
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 14
<223> Xaa = Asp, Glu, Lys, Arg, or absent
<220> 
<221> VARIANT
<222> 31
<223> Xaa = Asn or Asp
<220> 
<221> VARIANT
<222> 55
<223> Xaa = Met or Lys
<220> 
<221> VARIANT
<222> 80
<223> Xaa = Arg or His
<220> 
<221> VARIANT
<222> 110
<223> Xaa = Asn or Asp
SEQ ID NO:  18
<223> hA1M, No tag, N-terminal Met, N17,96D; R66H; truncated
SEQ ID NO:  19
<223> hA1M, not tag, N-terminal Met, M41K; truncated
SEQ ID NO:  20
<223> 6His, N17,96D; R66H; truncated
SEQ ID NO:  21
<223> hA1M, 6His, M41K; truncated
SEQ ID NO:  22
<223> 8His, N17,96D; R66H; truncated
SEQ ID NO:  23
<223> hA1M, 8His, M41K; truncated
SEQ ID NO:  24
<223> 1.M8H5GIEGR-Mouse
SEQ ID NO:  25
<223> 2. M8H5GIEGR-Naked Mole rat
SEQ ID NO:  26
<223> 3. M8H5GIEGR-Frog
SEQ ID NO:  27
<223> 4. M8H5GIEGR-Chicken
SEQ ID NO:  28
<223> 5. M8H5GIEGR-Rabbit
SEQ ID NO:  29
<223> 6. M8H5GIEGR-SQ Monkey
SEQ ID NO:  30
<223> 7. M8H5GIEGR-Walrus
SEQ ID NO:  31
<223> 8. M8H5GIEGR-Manatee
SEQ ID NO:  32
<223> 9. M8H5GIEGR-Plaice
SEQ ID NO:  33
<223> 10. M8H5GIEGR-Orangutan
SEQ ID NO:  34
<223> 11. M8H5GIEGR-Human P35K
SEQ ID NO:  35
<223> 12. M8H5GIEGR-Human M41K
SEQ ID NO:  36
. M8H5GIEGR-Human R66H
SEQ ID NO:  37
<223> 14. M8H5GIEGR-Human T75K
SEQ ID NO:  38
<223> 15. M8H5GIEGR-Human T75Y
SEQ ID NO:  39
<223> 16. M8H5GIEGR-Human M99K
SEQ ID NO:  40
<223> 17. M8H5GIEGR-Human S101Y
SEQ ID NO:  41
<223> 18. M8H5GIEGR-Human K69.92.118.130R
SEQ ID NO:  42
<223> 19. M8H5GIEGR-Coelacanth
SEQ ID NO:  43
<223> 21. M8H5GIEGR-Human L89T
SEQ ID NO:  44
<223> 22. M8H5GIEGR-Human N1796D
SEQ ID NO:  45
<223> 23. M8H5GIEGR-Human T45K
SEQ ID NO:  46
<223> 24. M8H5GIEGR-Human A135E
SEQ ID NO:  47
<223> 25. M8H5GIEGR-Human V170S
SEQ ID NO:  48
<223> 26. M8H5GIEGR-Human
SEQ ID NO:  49
<223> 27. M8H5GIEGR-Human G172Q
SEQ ID NO:  50
<223> 33. M8H4DK-Human M41K+
SEQ ID NO:  51
<223> 34. M8H4DK-Human M41K+N1796D 34
SEQ ID NO:  52
<223> 35. M8H4DK-Human R66H+N1796D
SEQ ID NO:  53
<223> 36. M8H4DK-Human M41K+R66H+N1796D
SEQ ID NO:  54
<223> 38. M8H4DK-Human R66H
SEQ ID NO:  55
<223> 39.M8H4DK-Human
SEQ ID NO:  56
<223> 40. M8H-Human wt
SEQ ID NO:  57
<223> 41. M8H-Human R66H+N1796D
SEQ ID NO:  58
<223> 60. M8H4DK-Human wt
SEQ ID NO:  59
<223> 1.M8H5GIEGR-Mouse
SEQ ID NO:  60
<223> 2. M8H5GIEGR-Naked Mole
SEQ ID NO:  61
<223> 3. M8H5GIEGR-Frog
SEQ ID NO:  62
<223> 4. M8H5GIEGR-Chicken
SEQ ID NO:  63
<223> 5. M8H5GIEGR-Rabbit
SEQ ID NO:  64
<223> 6. M8H5GIEGR-SQ Monkey
SEQ ID NO:  65
<223> 7. M8H5GIEGR-Walrus
SEQ ID NO:  66
<223> 8. M8H5GIEGR-Manatee
SEQ ID NO:  67
<223> 9. M8H5GIEGR-Plaice
SEQ ID NO:  68
<223> 10. M8H5GIEGR-Orangutan
SEQ ID NO:  69
<223> 11. M8H5GIEGR-Human P35K
SEQ ID NO:  70
<223> 12. M8H5GIEGR-Human M41K
SEQ ID NO:  71
<223> 13. M8H5GIEGR-Human R66H
SEQ ID NO:  72
<223> 14. M8H5GIEGR-Human T75K
SEQ ID NO:  73
<223> 15. M8H5GIEGR-Human T75Y
SEQ ID NO:  74
<223> 16. M8H5GIEGR-Human M99K
SEQ ID NO:  75
<223> 17. M8H5GIEGR-Human S101Y
SEQ ID NO:  76
<223> 18. M8H5GIEGR-Human K69.92.118.
SEQ ID NO:  77
<223> 19. M8H5GIEGR-Coelacanth
SEQ ID NO:  78
<223> 21. M8H5GIEGR-Human L89T
SEQ ID NO:  79
<223> 22. M8H5GIEGR-Human N1796D
SEQ ID NO:  80
<223> 23. M8H5GIEGR-Human T45K
SEQ ID NO:  81
<223> 24. M8H5GIEGR-Human A135E
SEQ ID NO:  82
<223> 25. M8H5GIEGR-Human V170S
SEQ ID NO:  83
<223> 26. M8H5GIEGR-Human V148D
SEQ ID NO:  84
<223> 27. M8H5GIEGR-Human G172Q
SEQ ID NO:  85
<223> 33. M8H4DK-Human M41K+R66H
SEQ ID NO:  86
<223> 34. M8H4DK-Human M41K+N1796D
SEQ ID NO:  87
<223> 35. M8H4DK-Human R66H+N1796D
SEQ ID NO:  88
<223> 36. M8H4DK-Human M41K+R66H+N1796D
SEQ ID NO:  89
<223> 37. M8H4DK-Human M41K
SEQ ID NO:  90
<223> 38. M8H4DK-Human R66H
SEQ ID NO:  91
<223> 39. M8H4DK-Human N1796D
SEQ ID NO:  92
<223> 40. M8H-Human wt
SEQ ID NO:  93
<223> 41. M8H-Human R66H+N1796D
SEQ ID NO: 94
<223> 42. untagged-Human R66H+N1796D
SEQ ID NO: 95
<223> 61. untagged-Human wt
【００４５】
略記
A1M: アルファ-1-マイクログロブリン、IB: 封入体、wt:野生型、R66H: A1M遺伝子の点変異で66位のArgの代わりにHisの発現を誘導する、N17, 96D: A1M遺伝子の点変異で17位及び96位のAsnの代わりにAspの発現を誘導する、M8H4DK: アミノ酸配列がMHHHHHHDDDDKのペプチド、M8H: アミノ酸配列がMHHHHHHHHのペプチド、M8H5GIEGR: アミノ酸配列がMHHHHHHHHGGGGGIEGRのペプチド、CV: カラム容量、SEC: サイズ排除クロマトグラフィー、DLS: 動的光散乱、DSF: 示差走査蛍光計、Gu-HCl: グアニジン塩酸塩、ORAC: 酸素ラジカル抗酸化能力、SD: 標準偏差、PAGE: ポリアクリルアミドゲル電気泳動
【００４６】
定義
開示された主題の記述及び請求において、次の用語は下記の定義に基づき用いられる。特に定義しない限りは、本明細書中に用いられる全ての技術及び科学用語は、この開示が属する分野での通常の技術を有するものによる一般的な理解と同じ意味を持つ。いくつかのケースでは、一般的に理解される意味の用語は、明瞭に、及び/又は容易な参照のために本明細書で定義され、本明細書にこのような定義を含むことは、必ずしも、当該分野において一般的に理解されるものと実質的な違いを表すと解釈されない。本明細書に記述又は参照される技術及び手順は一般的に良く理解され、当業者により慣習的な手法を用いて行われる。必要であれば、商業的に入手可能なキット及び試薬の使用を含む手順は、他に記載の無い限り製造会社が定義したプロトコル及び／又はパラメータに従って遂行される。本明細書に記載されたものと類似又は同等の任意の方法及び材料も、本開示の実施又は試験において使用されるが、好ましい方法及び材料が本明細書に記載される。
【００４７】
この明細書中では、その他に特定しない限りは、「a」又は「an」は「１つ又はそれ以上」を意味する。
本発明中に関連する様々な文法上の形態での「処置又は予防」の用語は、(1)障害の有害な効果、(2)障害の進行、又は(3)障害の原因因子の予防、治療、反転、減少、緩和、改善、阻害、最小化、抑制、又は中断をいう。
本発明に関連する「効果的な量」という用語は、所定の条件と投与計画のために治療効果を供給する量をいう。これは、必要な添加物及び希釈剤；すなわち、キャリアー、又は処理ビヒクルに関連する、治療効果を産み出す為に計算した活性物質の規定量である。さらに、それは、ホストの活性及び応答の臨床上の重大な不足を減らし、かつ最も好ましくは防ぐのに十分な量を意図する。あるいは、治療上効果的な量は、ホストの臨床上十分な状態の改善をもたらすのに十分である。これら当業者によって評価されるように、化合物の量は、その比活性によって変えられてもよい。適切な投薬量は、必要な希釈剤；すなわち、キャリアー、又は添加物に関連する望ましい治療効果を産み出す為に計算した活性組成物の規定量を含みうる。さらに、投与される用量は、有効成分又は使用される成分、処置される患者の年齢、体重などによって変化するが、一般的に0.001 から1000 mg/kg体重/日の範囲内である。さらに、投薬は投薬経路による。
【００４８】
「ポリペプチド」という用語は、タンパク質及びその断片を含む。ポリペプチドは本明細書中にアミノ酸残基配列として開示されている。これらの配列は、アミノ基末端からカルボキシ末端への方向に左から右へ書かれている。一般的な命名法に従って、アミノ酸残基配列は、次に示す3文字又は文字コードで名付けられる：アラニン(Ala, A), アルギニン (Arg, R), アスパラギン(Asn, N), アスパラギン酸(Asp, D), システイン(Cys, C), グルタミン (GIn, Q), グルタミン酸(GIu, E), グリシン(GIy1 G), ヒスチジン(His, H), イソロイシン(lie, I), ロイシン(Leu, L), リジン(Lys, K), メチオニン(Met, M)1 フェニルアラニン(Phe, F), プロリン(Pro, P), セリン(Ser, S), トレオニン(Thr, T), トリプトファン(Trp, W), チロシン(Tyr, Y), 及びバリン(VaI, V)。
【００４９】
「バリアント」は参照ポリペプチド又はポリヌクレオチドとは異なるが重要な特性を保持するポリペプチド又はポリヌクレオチドをいう。典型的なポリペプチドのバリアントは、別の、参照ポリペプチドとアミノ酸配列が異なる。一般的に、違いは、参照ポリペプチドの配列及びバリアントが全体としてきわめて類似し(ホモログ)、かつ多くの領域で、同一となるように制限される。バリアント及び参照ポリペプチドは、１つ以上の改変（例えば、置換、付加、及び／又は欠失）によってアミノ酸配列が異なりうる。置換又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝情報によってコードてもよいし、されなくてもよい。ポリペプチドのバリアントは、対立バリアントのように天然に生じてもよいし、又は天然に生じることが知られていないバリアントであってもよい。
【００５０】
本発明はさらに図で説明されるが、それに制限されない。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
図の凡例
【図１】12の異なる種のA1Mのアミノ酸配列アライメントプロジェクトフェーズＩで研究したヒトwt-A1M及び11の追加の種のアミノ酸配列は、 HYPERLINK "http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/" http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/のソフトウェアを用いて整列させた。ヒト配列に対する異なる配列の同一性は、パーセントとして表される。セット中の全ての種の間で同一のアミノ酸は、黄色でマークされる。加えて、ヒトA1M中で重要であると考えられているアミノ酸はマークされる：還元及び抗酸化特性に重要である対になっていないシステイン残基(C34) (Allhorn et al., 2005) とヘム結合は、ピンクでマークされる(Mening and Skerra, 2012)。グリコシル化されることが知られるアスパラギン(N17及び96)は、緑でマークされる(Escribano et al, 1990)。尿中のA1Mで修飾されて見つかり(Akerstrom et al., 1995; Berggard et al., 1999)、及び還元活性のために重要であると考えられている(Allhorn et al., 2005)4つのリジン(K69,92,118及び130) は、ライトブルーでマークされる。ヘム結合に関わると示唆されるH123(Meining and Skerra, 2012)は、グレーでマークされ、及び最後にラジカルスカベンジ(Akerstrom et al., 2007)に関与することが示されたチロシン(Y22及び132)は、ダークブルーでマークされる。
【図２】フェーズＩＩＩ中で発現したタンパク質のSDS-PAGE  非誘導試料(0でマークした) 及び誘導後1〜4時間たった試料(1,2,3,4でマークした)の等量の細菌溶解物はSDS-PAGEで分離された。これらの試料において、わずかに25kDa以下のバンドは、時間によって発現量が増加した。バンドの強度は、誘導後3時間で頂点に達した。M8Hタグ付加wt-A1M及びR66K+N17, 96D-A1Mは、M8H4DKよりわずかに小さい分子量で発現されるが、ここもまた、発現レベルはおよそ3時間で頂点に達する。タグなしなしwt-A1M及びR66H+N17,96D-A1Mはさらに小さなバンドで現れたが、ここでは特にwt-A1Mで、バンドの強さは3時間よりも4時間の方がより強く、わずかに遅れた発現を示す。
【図３】フェーズＩＩＩバリアントの収量、純度、及び凝集体  A. 全てのフェーズＩＩＩバリアントの精製A1Mの収量が比較された。全てのバリアントはよい収量が得られ、タグなしwt-A1Mはわずかに低い収量であった。B. 純度は、SDS-PAGEでの10μgの全てのバリアントの分離によって詳しく調べられた。純度は、全てのバンドと比較して、主な単量体バンドのデンシオメトリー分析によって、バイオラッド社由来のイメージソフトウェアを用いて決められた。全てのヒスチジンタグ付加バリアントはとても高い純度を示し、タグなしバリアントの純度は、わずかに低かった(およそ90%)。C. 大きな凝集体の存在は、ネイティブ PAGE での20μgのそれぞれのバリアントの分離によって分析された。主要な単量体バンドの強度及びアプリケーションスリット内に残っている材料（非常に大きな凝集体）は、デンシオメトリーによって測定された。M8H wt-A1M及びタグなしバリアントを除くほとんどのバリアントは、少量の大きな凝集体を示し、わずかに高い割合を示している。全てのバリアントは、パネルA中で与えられた番号によってコードされる。
【図４】様々な緩衝液中のフェーズＩＩＩのバリアント100μM及び1mM溶液の凝集体の分析  異なる緩衝液中で100μMから1mMへ濃縮した後の凝集の傾向は、ネイティブ PAGE分析によって調べられた。20μgのタンパク質は、それぞれのレーンに分けられた。大きな凝集の割合は、個々のバンド強度のデンシオメトリー分析を用いて計算されたA. 全てのバリアントは、pH8.0又は7.4の Tris緩衝液中で100μMから1mMへと濃縮され、そしてPAGEによって分離した。M8H4DK-wt、R6H+N1796D、M41K, R66H, N1796Dはそれぞれ60, 35, 37, 38及び39とラベルされ、M8H wt及びM8H-R66H+N1796Dは40及び41とラベルされ、そしてタグ付けしていないwt及びR66H+N1796Dは61及び42とラベルされた。B. 全てのバリアントは pH8.0又は7.4の Tris緩衝液及びpH7.4のPBS中で1mMへと濃縮され、一度の凍結解凍サイクルを受け、及びPAGEによって分離し、及び上記のように分析した。
【図５】フェーズＩＩＩバリアントのレダクターゼ及び抗酸化能力の分析  A. レダクターゼ活性は、ABTSラジカルの還元として分析された。0-2μM のA1Mが56μM ABTSラジカルに二度加えられた。還元は、95秒間の405nm の吸光度の減少として追跡した。それぞれの濃度の曲線下面積(AUC)は計算され、Net AUCは、緩衝液のみのAUCを引くことによって計算された。２度の平均Net AUC+/-SEMが、濃度に対してプロットされた。全てのM8H4DK-バリアントは、wt-A1Mとおよそ同じ活性を持ち、M41K及びR66Hの活性を低める傾向を持つ。M8H及びタグなしバリアントはまた、wt-A1Mと比較してR66H+N1796Dバリアントのより高い活性の小さな傾向を有する完全な活性を示す。  B. 抗酸化能力は、ORACアッセイによって分析された。A1Mバリアントの活性はTroloxスタンダードと比較され、Trolox当量の数値として表された。それぞれの分析は三度行われ、M84DK wtの結果を100%とした。全ての他のバリアントの抗酸化能力も関連して表された。M8H4DK-R66H+N17,96Dバリアントは、M8H4DK-wt-A1Mに比べて有意に高い能力を示した。タグが短くなったかは除かれた場合、違いは小さかった。データは２つの独立した実験の結果が結合されて表される。
【図６】フェーズＩＩＩバリアントのレダクターゼ活性とヘム結合の分析  A. A1Mバリアントがシトクロムcを還元する能力は、A1M の希釈系列(0-10μM)と100μMシトクロムc+100μM NADHを混合して、20分間での吸光度550nmの上昇によって調べられた。分析は二度行われた。AUCはそれぞれの濃度で計算され、及びNet AUCは緩衝液のみのAUCを引くことによって計算された。データは２つの独立した実験のNet AUC+/-SEMとして表される。オバルブミンはネガティブコントロールとして用いられた。ほとんどのA1Mバリアントは、wtに比べて低い濃度でわずかに低い還元能力を示した。N17, 96D-A1M及びR66H+N17, 96D-A1Mでは有意である(0.3-0.6μM)。タグの短縮及び除去はこの特性への影響はなかった。  B. A1Mバリアントへのヘムの組み込みは、410~420nmの間の吸光度ピークの出現、及びピークのレッドシフトの大きさ(Karnaukhova et al., 2014; Rutardottir et al., 2016)によって分析された。44μMのタンパク質溶液と40μMのヘムとの混合を２組行い、RTで2時間保温した。混合液は270~450nmの間の波長スキャンによって分析された。最大のピークの位置、及び413:386の比が計算された。全てのM8H4DKバリアントは、wt-A1Mとほぼ同じレッドシフト及び比を有し、M8Hタグ付加バリアントは有意に高い率を有した。タグなしバリアントはレッドシフト活性を失っており、それはこれまでの結果でも確認している(Karnaukhova et al., 2014)。  C. A1Mのヘムアガロースとの結合。A1Mの特異的結合は、A1M希釈系列、又はコントロールのオバルブミンと、ヘムアガロース又はコントロールアガロースとを混合することにより分析された。分析は二度行われた。初期物質及びヘムアガロース及びコントロールアガロースの保温からのフロースルーのタンパク定量はBCAを用いて決定した。これらのデータから、ヘムアガロースとの特異的結合するタンパク質量は、それぞれの試料について決めることができた。結合タンパクは、添加タンパク質に対してプロットされ、直線相関性は全てのバリアントにおいて見られた。直線の傾斜は線形回帰で計算され、２回の間の平均で示された。この方法において、全てのバリアントは、およそ同じ程度にヘムに結合する。
【図７】ヘム誘導細胞死からK562細胞の救助  K562細胞は、A1M(0-10μM)の希釈系列の存在下で100μMのヘムに1時間曝された。そして、細胞死は、培地へのLDHの放出として観察された。生細胞由来の吸光度を差し引き、A1Mなしのヘム・インキュベート細胞を100%にセットした。A1M保温の値は、これに関連して計算された。分析は二度行われた。３つの独立した実験からの結果の平均(mean +/- SEM)は図に示される。タグなしwt-A1Mより低い活性を有するタグなしR66H+17N, 96D-A1Mを除き、いずれどのバリアントの間でも有意差は見られなかった。
【図８】4℃及び室温での保存後のM8H4DK-R66H+N17, 96D-A1M 及びM8H4DK-wt-A1Mのサイズ分布とレダクターゼ活性。  M8H4DK-wt-A1M及びM8H4DK-R66H+N17, 96D-A1Mは「wt」及び「バリアント35」として記述され、上下のパネルでそれぞれ示される。凝集体はSEC-FPLCによって分析された。モノマーA1M及び大きな凝集体は、およそ15ml及び8mlからそれぞれ溶出された。およそ13-14mlで見られた小さなショルダーは、おそらくA1Mの二量体である。大きな凝集体の割合は、総ピーク領域と比較した8ml以下の領域から計算した。ストレス暴露後のタンパク質の回復(%;イタリック体で表記)は、初期物質の総ピーク領域との比較した総ピーク領域から計算された。ABTSの還元活性は2μM A1M溶液で分析された。データは２回の平均で示される。新鮮な解凍したA1M溶液は(A)に表され、5回の凍結-融解サイクルに曝された100μM A1M(B)、4℃で一晩保存した1mMA1M(C)、4℃で一週間保存した1mMA1M(D)、室温で一週間保存した100μM A1M(E)、及び室温で一週間保存した1mM A1M(F)。データは、M8H4DK-R66H+N1796Dが1mM までの濃度(C & D)及び室温での保存(E 及び F)によりよく耐えることを示す。
【図９】+37℃での保存後の1mM M8H4DK-wt-A1M及びM8H4DK-R66H;N17, 96D-A1Mのサイズ分布とレダクターゼ活性。  wt-A1M及びR66H+N17,96D-A1Mは「ht2014」及び「35」として記載され、上下のパネルでそれぞれ示される。凝集体はSEC-FPLCによって分析された。モノマーA1M及び大きな凝集体はそれぞれ、およそ20分及び12分から溶出された。およそ18-19分で見られた小さなショルダーは、おそらくA1M二量体である。大きな凝集体の割合は、総ピーク領域と比較した12分以下の領域から計算された。ストレス暴露後のタンパク質の回復(%;イタリック体で表記)は、初期物質の総ピーク領域と比較した総ピーク領域から計算された。ABTSの還元活性は2μM A1M溶液で分析された。データは２回の平均で示される。1.5時間(B)、2.5時間(C)、及び4.5時間(D)保存された1mM A1M溶液は、1mM A1M開始物質量(A)と比較された。4.5時間のM8H4DKwtは、完全に沈殿して分析できなかった。データは、M8H4DH-R66H+N1796Dが+37℃での保存でM8H4DK-wtよりもよく耐えることを示す。
【図１０】A1Mの構造モデル  モデルが、(ref 29)で記述されたように作成された。リボンとして示す、８つのβストランドは、内部が疎水性の：「リポカリンポケット」を有するわずかにコーン型のシリンダーを形成する。リポカリンポケットの一方の側は開いており(矢印で示す)、すなわちそれは低分子の進入を許容する。反対側は閉じている。２つのアルファ-ヘリックスはシリンダーとして示される。３つの炭化水素基(T5; N17; N96)及びレダクターゼ活性に関与する4つの側鎖(C34; K92; K118; K130) の位置を示す。
【図１１】ネイティブ PAGEでのシフト移動/蛍光消光(A及びB)、及びUV-吸光分光測光(C)によって分析したヘム結合  A. 15μg M8H4DK-wt A1M(wt-A1M)又はM8H4DK-35-A1M(35-A1M)は、異なる量のヘムと30分間20℃で保温され、ネイティブ PAGEによって分離し、ゲルはトリプトファン蛍光(蛍光)、及びクマシー染色（染色）後の濃度スキャンによって分析した。B. イメージはImage LabTM Software(Bio-Rad)を用いてデジタル化された。蛍光消光 (黒)及び泳動距離(青) として測定したヘム結合はA1M：ヘムのモル比に対してプロットされた。２つの実験の平均値は、wt-A1M(塗りつぶしシンボル)、35-A1M(白抜きシンボル)として示される。C. A1Mとヘムは混合され(それぞれ32及び19μM)、2時間20℃で保温され、スキャンした。32μMのタンパク質単独の吸光度は比較として示される。緩衝液(20mM Tris-HCl, pH 8.0 + 0.15M NaCl)の吸光度は、全てのスキャンからブランクとして差し引いた。
【図１２】M8H4DK-wt A1M(wt-A1M)及びM8H4DK-35-A1M(35-A1M)の酵素的特徴の比較A. 様々な濃度の新鮮な精製wt-A1M(■)又は35-A1M(○)は、マイクロタイターウェルプレート中の25mM リン酸ナトリウムバッファーpH8.0 中の56μM ABTS-ラジカルと混合され、還元の割合は次の405nmの吸光度を95秒間読むことで測定した。それぞれの濃度の吸光度は時間に対してプロットされ、0から95秒の間の曲線下の面積(AUC)は、それぞれの濃度で計算された。net AUCは、緩衝液のみのAUCを引くことで計算された。３回の平均値+/-SEMを示す。B. ABTS還元率はAに記載されているとおり、但し4℃又は室温かつ0.1又は1mMで7日間保存後のwt-A1M(■)又は35-A1M(○)を用いて決められた。一度の実験のものが示される。C. シトクロムcの還元は、wt-A1M(■)又は35-A1M(○)の希釈系列(0-10μM)と100μMシトクロムc+100μM NADHとの混合、及び混合後のの20分間での550nmの吸光度の上昇によって調べられた。分析は2度行われた。AUCはそれぞれの濃度で計算され、Net AUCは、緩衝液のみのAUCを引くことで計算された。データは、2つの独立した実験のNet AUC +/-SEMとして表される。ネガティブコントロールとしてオバルブミンが用いられた。D. 抗酸化能力はORAC分析で調べられた。5μMのA1Mバリアントの活性は、Troloxスタンダードと比較され、Trolox当量の数値として表した。それぞれの分析は3度行われ、wt-A1Mの結果を100%にセットした。示されたデータは、二つの独立した実験の平均値+/-SEMである。
【図１３】K562細胞は、96-ウェルマイクロタイタープレート中にウェルごとに105の細胞となるように培養し、M8H4DK-wt-A1M(wt-A1M)又はM8H4DK-35-A1M(35-A1M)の希釈系列(0-10μM)の存在下で100μMのヘムに1時間曝した。細胞死は、LDHの培地中への放出として観察された。生細胞由来のLDH値を差し引き、A1M未添加でのヘムインキュベート細胞のシグナルを100%にセットし、A1Mインキュベーションの値はこれに関連して計算された。分析は２度行われた。3つの独立した実験の結果の平均値(平均値+/-SEM)が示される。(■)はwt-A1M、(○)は35-A1Mである。
【図１４】HK-2細胞は、200μM(NH4)Fe(SO4)2、400μMの過酸化水素、及び2mMアスコルビン酸の混合物(フェントン反応はA及びBに記載した)、又は0-30μMヘム(C及びDに記載した)に、0~20μM M8H4DK-wt A1M(wt-A1M)(■及び黒カラムとして記載した)又はM8H4KDK-35-A1M(35-A1M)( ○及び白カラムとして記載した)を同時に添加又は未添加で、6時間曝された。インキュベーション後、細胞は、WST-1を用いて細胞生存能力 (A及びCに記載した)を分析されるか、又は材料と方法中に記載されたHO-1及びHsp70のmRNA発現(B及びDに記載した)を分析された。細胞生存能力(A及びC)は、未処理細胞由来のコントロール試料に対して標準化された。結果は、３度の実験から平均値±SEMとして表される。HO-1及びHsp70のmRNAの発現(B及びD)はGAPDHに対して標準化され、及び倍率変化として与えられる。倍率変化の値は、未処理細胞からコントロール試料に対して標準化することにより計算された。結果は３度の実験から及び平均値±SEMとして表される。それぞれの暴露とコントロール条件との間の違いは、post hoc Bonferroni correctionのOne way ANOVAを用いて分析された。*はフェントン(Bに記載した)又はヘム(Dに記載した)に対する統計上の比較を示す。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。wt-A1Mに対して35-A1Mを比較した場合に、有意差は観測されなかった。
【図１５】動物へ静脈注射したM8H4DK-wt A1M(wt-A1M)及びM8H4DK-35-A1M(35-A1M)の血漿クリアランス(薬物動力学、Aに示した)及び生体中の分布(Bに示した)。A. wt-A1M(■)又は35-A1M(○)はウィスターラットに注射され(5mg/kg)、血液は規則的な間隔で採取した。A1M濃度は、特定のA1Mバリアントをスタンダードとして用いRIAによって決定された。3匹の動物からのそれぞれの点は平均値±SEMとして表される。B.wt又は35-A1M 5mg/kgはC57BL/6NRj-マウスの静脈に注射され、注射後の10及び30分後に犠牲にした。臓器は標本にし、重量を測定し、ホモジナイズした。注射した(ヒト)AIM濃度はサンドイッチ-ELISA法によって決定された。3匹の動物からのそれぞれの点は、平均値±SDで表される。wt-A1M, 10 分(黒)及び30分(ダークグレー)；35-A1M、10分(白)及び30分(ライトグレー)。
【図１６】雌のC57BL/6マウスはグリセロール(2.0 ml/kg, i.m.)に曝され、続けて30分グリセロールの導入後、M8H4DK-wt A1M(wt-A1M)(ダークグレーのバー、n=10)、M8H4DK-35A1M(35-A1M)(白いバー、n=10)のどちらか、又はビヒクル緩衝液(偽のコントロール、グレーのバー、n=6)をi.v. 投与した。グリセロール投与後4時間の動物を安楽死させ、腎臓を取り出し、素早く凍らせ、続けてHO-1(A)およびHsp70(B)のmRNA発現をリアルタイムPCRで、材料と方法に記載したように分析した。mRNA発現はこれらのGAPDHに対して標準化され、倍率変化の値は未処理動物(コントロール)からのコントロール試料に対する標準化によって計算された。結果は箱型図で表され、中央値並びに25番目及び75番目の百分率で表示する。グループ間の統計的比較はANOVAとpost hoc Bonferroni correctionによって行われた。*はグリセロールに対する統計的比較を示す。*P < 0.05, **P < 0.01。wt-A1M対35-A1Mを比較したとき、有意差は見られなかった。  本発明は次の実施例でさらに説明する。実施例は実例であり、本発明の範囲はいずれの様態にも制限されない。
【実施例】
【００５２】
実験操作は３つの主なフェーズに分割される：
フェーズＩ)上記の27 のA1Mバリアントの発現とそれに続く可溶性、安定性及び機能の分析；
フェーズＩＩ) フェーズＩの結果に基づいて最良の特性が予期されたいくつかのA1Mバリアントの設計、発現と分析
フェーズＩＩＩ) wt-A1M 及びN末端のタグを付加した、あるいは付加しない最も成功した変異A1Mバリアントの設計、発現と分析。
フェーズＩにおいて、変異アミノ酸側鎖グループの位置と同一性の選択時に、４つの推論が使われた：1) 酸化ストレス、温度、酸素分圧の観点からの異なる予期された環境圧の様々な種からの動物ホモログが発現された(n=12)； 2)56の配列決定したA1Mホモログの間で、ループ1~4又は疎水性ポケットの内面にある位置でしばしば生じる単アミノ酸置換を、ヒト遺伝子構築物に導入して発現させた(N=3)；3) 有利に位置するリシル又はチロシル残基の付加又は除去(N=5)、これら残基がC35チロシルのpKaに影響しうる(Allhorn et al., 2005)又はラジカル捕捉部位となりしうる(Berggard et al., 1999; Sala et al., 2004; Akerstrom et al. 2007)という仮説に基づく。；4) 予測される機能又は折りたたみへの影響のない、タンパク質表面の疎水性から親水性への置換 (N=7)。
【００５３】
材料と方法
発現
A1Mバリアントの配列はDNA2.0, Inc.(USA) で供給され、遺伝子を合成し、これらをPJ401Express vector(T5 プロモーター、カナマイシン抵抗性)中にクローニングした。DNA配列はシークエンシングによって確認した。ベクターは、コンピテント E.coli (BL21 Star(DE3)(Invitrogen, Life technologies corp, USA))中に、製造者の取扱書に基づいて形質転換され、それぞれのバリアントの4つの個々のクローンは、微小発現の為に試験された。それぞれのバリアントの最も高く発現したクローンは、グリセロールストックを調製し、生産発現のために使われた。
A1Mバリアント発現クローンは、完全NYAT (15mM (NH4)2SO4, 84mM K2HPO4, 23mM NaH2PO4xH2O, 2.2mM (NH4)2Hクエン酸, 1% (w/v) グルコース, 2mM MgSO4, 9μM CaCl2x2H2O, 85μM FeCl3x6 H2O, 1.3μM ZnSO4x7 H2O, 1.3μM CuSO4x5 H2O, 1.8μM MnSO4x H2O, 1.5μM CoCl2x6 H2O, 108μM EDTA, 50μg/ml カナマイシン)中でOD600が1.5になるまで増殖させた。タンパク質発現は1mM IPTGの添加によって誘導された。生産は4時間行った。SDS-PAGE分析のための試料は、誘導前、並びに誘導後1,2,3及び4時間後に得た。
【００５４】
精製
培養液からの細菌は15分、5000 rpmの遠心分離によって集菌した。細菌ペレットは5度の凍結−融解サイクルによって溶菌し、20mM Tris-HCl pH8.0で三倍に希釈し、超音波処理した。封入体(IB's)は30分、6000rpmの遠心分離で回収され、再懸濁と遠心分離の３回以上のサイクルで洗浄した。抽出のために、IBは6M グアニジン塩酸塩、20mM Tris-HCl pH8.0 (6M Gu-HCl)で再懸濁され、一晩4℃で攪拌しながらインキュベートした。抽出物は60分間、26000gの高速遠心分離によって清澄化した。上清はさらなる清澄化のために保存し、ペレットは別の抽出サイクルに付した。抽出の上清はまとめられ、さらにデプス・フィルター濾過(K700P filter laid on top of KS50P filter, Pall Corp., USA) によって清澄化した。清澄化した抽出物中のA1MはNi-アガロースレジン(Sigma-Aldrich, USA)を用いて精製された。簡潔には、レジンは10ml容量の使い捨てのクロマトグラフィーカラム(Bio-Rad, USA)中に充填し、6M Gu-HClで平衡化した。A1M抽出物はカラムにアプライされ、自由落下で流して、フロースルーを回収した。カラムは5倍のカラム容量の6MGu-HClで洗浄され、4倍量の6MGu-HCl+0.5M イミダゾールで溶出した。出発物質、フロースルー、及び溶出分画はエタノールで沈殿させ、1xSDS-PAGEローディングバッファーに再分解しSDS-PAGEによって分離した。精製処置は、フロースルー中に多量のA1Mが含まれていた場合は繰り返された。抽出物中のタンパク質量は吸光度280nmによって決められた。
Ni-アガロース溶出物はおよそA280が5になるように希釈され、再折りたたみの前に４℃で冷やした。溶出物は2/3倍容量の20 mM Tris-HCl pH9.5 +0.1 M NaCl 中の0.275 M L-システインと混合した。そして16.7倍容量の再折りたたみ緩衝液は素早く加えられた。最終的な緩衝液の濃度は：（0.2 mg/ml A1M, 0.1M Tris, 0.6 M NaCl, 0.45 M L-アルギニン, 2 mM EDTA, 10 mM L-システイン 及び 1 mM L-システイン, pH 9.5）であった。混合物は1時間4℃で攪拌され、溶液は、初めのA1M溶液の容量まで、Centricon plus 70, 10K ultrafiltration devices(Merck Millipore; USA)を用いて濃縮した。濃縮後、A1M溶液は、同じ装置を用いて、pH8.0の20mM Tris-HClで、10度の連続した2.5x 希釈/濃縮サイクルでダイアフィルトレーションを行った。ダイアフィルトレーション後、溶液は15分間15000rpmで遠心分離し、0.2μmのフィルターを通して清澄化した。
【００５５】
再折りたたみA1Mは、すぐに5ml Bio-Scale Mini UNOsphere Q Cartridge(Bio-Rad)にアプライされ、20mM Tris-HCl pH8.0で平衡化した。カラムは、AKTA purifier 10 instrument (GE Healthcare, USA)でBio-Radのカートリッジの取扱説明書に従って作動させた。サンプルのアプライ後、カラムは5倍のカラム容量(CV)の20 mM Tris-HCl pH8.0で洗浄され、0-0.35M NaClの20CV直線濃度勾配で溶出した。最終的に、カラムは三倍量のCVの1M NaClで洗浄された。直線濃度勾配の間に集めたフロースルー及び選択された画分は、SDS-PAGEによって分析された。A1Mが残っているフロースルーは新しいカラムに再び通らせ、A1Mを含む画分を溜め、100μMに濃縮され、無菌濾過し、等分して-20℃で凍らせた。
【００５６】
ゲル電気泳動
SDS-PAGEはLaemmli(Laemmli, 1970)による通常のプロトコルを用いて行った。タンパク質はステインフリー 4-20% TGXゲル (Bio-Rad)で300V, 17分で分離された。ネイティブ PAGEはSDSなしで且つ還元剤無しで、ステインフリー 4-20% TGX ゲルで200V, 40分で行った。ゲルはChemidoc MP装置(Bio-Rad)で分析された。
【００５７】
円偏向二色性
円偏向二色性スペクトルはJasco-J180 spectrofluorimeter 装置(JASCO inc., Japan)で、2mm キュベット中の20mM Tris-HCl pH 8.0+ 0.15M NaCl中の10μM 溶液で記録された。溶液は22℃で190-260 nmの間でスキャンされた。それぞれの試料で3度の実験が重ね合わされた。αヘリックス及びβシートの構造の割合はhttp://k2d3.ogic.caソフトウェアを用いて計算された。
【００５８】
SEC-FPLC
タンパク質はAKTA purifier 10装置上の24-ml Superose 12 10/30 GL column(GE Healthcare)を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって分析された。カラムは20 mM Tris-HCl pH8.0+ 0.15M NaClで平衡化され、1ml/minの流速で用いた。100~200μgのタンパク質を100μlの容量でカラムに充填し、20 mM Tris-HCl pH8.0 + 0.15M NaCl溶液を0.75ml/minの流速で流して溶出した。典型的に、単量体A1Mは、15ml/20分後に、二量体は13-14ml/18-19分に、及び大きな凝集体は8ml/12分後に溶出された。大きな凝集の割合は、総ピーク領域と比較した8ml以下のピーク領域から計算された。ストレス処理後(下記参照)にカラムから回収した総タンパク質の割合は、処理した試料対未処理の試料の総ピーク領域を比較することによって計算された。
【００５９】
RP-HPLC
逆相HPLCはAgilent 1260 Infinity Binary LC systemにAeris Wildpore 3.6 μM XP-C8 column (Phenomenex Inc., USA)を用いて行った。カラムは25℃で流速1ml/min及び70% H2O+0.1%TFA及び30% アセトニトリル+0.1%TFA の混合液で平衡化して行った。10μl(=10μgのタンパク質)が導入され、30~50%のアセトニトリルの20分以上の直線濃度勾配により溶出した。カラムは95%のアセトニトリルで10分間洗浄することで再生した。
【００６０】
動的光散乱
非ストレス及び剪断ストレス試料の動的光散乱(DLS)分析はSARomics Biostructure AB, Lundのサービスを利用して行った。A1M試料は、10mM Tris-HCl pH8.0+ 0.125M NaCl中で10μMへ希釈され、Malvern APS装置で20℃で分析された。試料は２つ調製され、それぞれの試料は３度観察された。
【００６１】
示差走査蛍光計
A1Mバリアントの熱安定性は示差走査蛍光計(DSF) により分析され、SARomics Biostructure AB, Lundのサービスを利用して行った。10mM HEPES pH8.0 +0.125M NaCl中で4.4μMに希釈したA1MはSYPROオレンジ(SYPROオレンジは最終的に1000倍希釈)と混合された。分析は２度行い、及び平均融解温度(Tm)が計算された。
【００６２】
剪断力によるストレスの導入
10μlの100μM A1M溶液は、0-10μlピペットチップを用いたマルチチャンネルピペットによる80回のピペッティングによって剪断力ストレスに晒された。ストレス処理は２つの試料に行った。ピペッティング後、２つの試料は合わされ、及び上記のDLS分析にかける前に10倍に希釈された。
【００６３】
高濃度誘導ストレス
A1Mの可溶性及び安定性が高濃度で調べられた。500μlの100μM A1M溶液はAmicon Ultra-0.5, 10K 装置 (Merck Millipore)で10分間14000g遠心分離することで50μlへと10倍に濃縮された。濃縮後、容量は集められ、それぞれのフロースルーを用いて正確に50μlにした。濃縮試料及び非濃縮試料(10μg)はネイティブ PAGE上で隣り合って比較された。異なる緩衝液の影響は、濃縮前の試料のダイアフィルトレーションによって調べられた。これはAmicon Ultra-15, 10K 装置で10倍希釈/濃縮を５回のサイクルに繰り返すことによって行なわれた。
【００６４】
遊離チオール基の定量化
A1Mバリアントの遊離チオール基はMolecular probes社の「Thiol and sulfide quantification kit」によって決められた。分析は96ウェルプレート上でキットのマニュアルによって行われた。3μl容量のスタンダード又はA1M(100μM)は3μlのシスタミン作業溶液、100μlのパパイン-SSCH、100μlのL-BAPNAと混合された。分析は405nmの吸光度で読んだ。
【００６５】
ABTS還元分析
分析は、(Akerstrom et al 2007)の変法である。7mMの2,2 アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)ジアンモニウム塩(Sigma-Aldrich)は2.45mM K2S2O8で一晩酸化され、pH8.0の25mMリン酸ナトリウム緩衝液中で56μMに希釈した。96ウェルプレートに100μlのABTS作業溶液がウェルごとに加えられた。0時点のA405の測定がPerkin Elmer Plate readerを用いて行われた。2μlのA1M溶液(0-100μM)がマルチチャンネルピペットによって素早く加えられた。吸光度405nmの減少の動力学は95秒で素早く計った。実用的な理由から、8ウェルのみその時点で分析された。A1M希釈系列は、２回、又は３回実験された。分析される試料の数がいくつものプレートが必要であった場合、それぞれのプレートのために新しいABTSストックが作業ストックに希釈され、wt-A1M参照試料が全てのプレートに含まれた。それぞれの濃度の吸光度は時間に対してプロットされ、曲線下面積(AUC)はそれぞれの濃度で計算された。netAUCは、緩衝液のみのAUCを差し引くことによって計算された。
【００６６】
酸素ラジカル抗酸化能力(ORAC)分析
市販のキットOxySelectTM  Oxygen radical antioxidant capacity (ORAC) activity assay (Cell Biolabs, Inc. USA)は、ペルオキシルラジカルによる蛍光プローブの酸化及び破壊に基づく。抗酸化が現れた際、この破壊は阻害される。標準として、水溶性ビタミンE誘導体、Troloxが使われる。実行、分析及び計算は、キットのマニュアルに従い、2.5~5μM A1M濃度は標準曲線に適切にあった。オバルブミン(Sigma-Aldrich)はネガティブタンパク質コントロールとして使われた。
【００６７】
シトクロムc還元分析
分析は(Allhorn el al. 2005)から改変している。作業溶液はTris-HCl pH8.0 +0.125M NaCl中の100μMシトクロムc(Sigma-Aldrich)及び10mMの100μM NADHの混合によって作られた。11μlのA1M溶液(0-100μM)の96ウェルプレートへの添加を二組行った。100μlのシトクロムc作業溶液は、マルチチャンネルピペットを用いてウェル毎に素早く加えられた。吸光度550nmの上昇の動態は20分間追跡した。1つのプレートはその時点で分析された。時間経過によるバイアスは観察されなかった。いくつかのプレートを分析する際は、同じ作業溶液を使用され、この手順によって生じる観察可能なアーティファクトは何もなかった。測定後結果はABTS分析のとおりに分析された。
【００６８】
赤色シフト分析
A1Mにおける遊離ヘムの取り込みは、ソレー帯の吸光度ピークの赤色シフトを産み出し (Karnaukhova et al., 2014; Rutardottir et al., 2016) 、A1M変異体はA413/A386の比として評価された。20mM Tris-HCl pH8.0+0.25M NaCl 中の44μM A1Mは40μM遊離ヘムと混合した(Applichem)。インキュベーションは二組で行い、室温で2時間インキュベートされた。赤色シフトはBeckman Spectrophotometer中の波長スキャンによって、４倍に希釈したサンプルに対して行った。２組の最大ピークの平均と吸光度413及び386nmの間の平均比率は計算された。オバルブミン及び緩衝液のみがネガティブコントロールとして用いられた。
【００６９】
A1Mとヘム−アガロースとの特異的結合
A1Mとヘム−アガロースの結合は(Larsson et al., 2004)の方法によって分析され、(Rutardottir et al., 2016)に記載されているように改変した。ヘム−アガロース(Sigma-Aldrich) 及びコントロールSepharose 4B(Sigma-Aldrich)は20mM Tris-HCl pH8.0+ 0.25M NaClで平衡化され、50%スラリーとして用意された。75μl のA1M希釈系列(0~13.3μM)は96ウェルプレートに二組で加えられた(1つのプレートはヘムアガロースのために、及びもう一つはコントロールSepharoseのために)。20μlのヘム−アガロースochコントロールSepharoseスラリーは、同等量の移動を保証する為に注意深くピペッティングすることでウェルに加えられ、回転攪拌しながら室温で30分インキュベートした。混合液は注意深くAcroPrep Advance 96-well filter plate、1.2μm Supor membrane(Pall corp)へ移され、プレートは、低結合マイクロプレート中にフロースルーを集めるために1000gで２分間遠心された。25μlのそれぞれのフロースルー、及び非保温の初期物質はPierce BCA Protein Assay kit(Thermo Scientific Inc., USA)を用いてタンパク質含有量が分析された。タンパク質量は、ヘム−及びコントロールSepharose-保温試料の両方の結合量として(フロースルー中のマイナス量を加えて)再計算された。コントロールSepharoseとの結合量を引いた後、ヘムアガロースとの特異的結合量は、加えた量に対してプロットされた。曲線の傾きは、直線回帰で計算された。二組のSDはA1Mバリアントの間の違いの有意性を評価するために用いられた。
【００７０】
M8H4DK-wt A1M(wt-A1M)及びM8H4DK-35-A1M(35-A1M)のヘム結合
ヘム結合は以前に記載したネイティブ PAGE(Karnaukhova et al., 2014)及びUV-スペクトロフォトメトリー(Ruttarsdottir et al., 2016)によって分析された。簡潔には、ネイティブ PAGEは、A1M及び様々な濃度のヘムが室温で30分間pH8.0 のTris緩衝液中で保温され、ステインフリー12% Criterion TGXゲルで200V, 40分間のnative PAGEによって分離された。ゲルのバンドはChemidoc MP instrument(Bio-Rad)上で、Stain-free 設定を用いるトリプトファン蛍光について分析し、クマシーブリリアントブルーで染色し、Chemidoc上でクマシー設定を用いて脱染色及び再画像化した。そして、両方の一連のバンドはImage LabTM Software (Bio-Rad)を用いて定量化した。ヘム結合はクマシー染色後の総タンパク質量に比例するトリプトファン蛍光の消光量にとして評価した。吸光スペクトルはBeckman (Beckman Instruments, Fullerton, CA) DU 800 spectrophotometerで、22℃の250及び700nm間のUV-VIS領域中の600nm/minのスキャン率を用いて測定された。A1M及びヘムの濃度は、20mM Tris-HCl pH8.0, 0.15M NaCl中でそれぞれ32及び19μMであった。ヘムは、DMSO中の10mM保存溶液から加えられた。タンパク質溶液は、混合の2時間後にスキャンされた。
【００７１】
血漿クリアランス及び生体中の分布
血漿クリアランスの研究のために、それぞれのA1Mバリアントは6匹の雄のウィスターラットの静脈に(i.v.)導入され(20mMのpH8.0 Tris-HCl中の5.0 mg/kg; 保存溶液)、血液試料は、導入の1, 5, 15, 30分及び1, 3, 6, 16及び24時間後に、サンプリングの重なりを避けるために３匹のラットのグループ中の異なるサンプリング間隔を用いてEDTA-管に取られた。血漿は10分間の140xgの遠心分離後に吸引され、A1Mの濃度はラジオイムノアッセイ(RIA)によって、(Gram et al. 2015)に記載しているとおりに、特定のA1Mバリアントを標準として用いて決められた。生体中の分布の研究では、A1MバリアントはC57BL/6NRj マウス中にi.v.誘導された(20mMのpH8.0 Tris-HCl中の5.0 mg/kg; 保存溶液)。マウスは導入後10分(n=3)、及び30分後(n=3)で犠牲にした。臓器はサンプリングされ、重量が量られ、50 μl/mlの cOmplete Mini, EDTA-free proteinase inhibitor cocktail tablets (Roche, cat. no. 11836170001) を含むCell Extraction Buffer (Invitrogen, cat. No. FNN0011)中に5:1(容量：重量)の比で懸濁してホモジナイズした。A1M濃度は、社内のサンドイッチELISAによって決められた。簡潔には、96ウェルマイクロタイタープレートを4℃で一晩、マウスモノクローナル抗A1M(クローン35.14、PBS中の5μg/ml)でコートし、洗浄し、そしてA1M標準(ヒト尿中A1M)とインキュベートし、我々の研究室が記載した方法(Akerstrom et al., 1995)で精製し、又は組織試料をホモジナイズし、インキュベート緩衝液(PBS+0.05% Tween 20 +0.5% ウシ血清アルブミン)で希釈し、60分室温で置いた。洗浄後、ウェルはホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合マウスモノクローナル抗A1M(クローン57.10、インキュベート緩衝液中に5 ng/ml)と60分間室温でインキュベートした。プレートは洗浄され、及び暗所で20分間 SureBlue TMB Microwell Peroxidase Substrate (KPL)とインキュベートすることで発色させ、最終的に1M 硫酸で停止した。450nm 吸光度はWallac 1420 Multilabel Counterで読まれた。ヒト尿中A1Mに対する2つのマウスモノクローナル抗体は、AgriSera AB(Vannas, Sweden)によって調達した。ELISAはヒトA1Mに特異的で、内因性のマウス血漿A1Mに交差反応せず、ヒト尿中A1M、M8H4DK-wt A1M(wt-A1M及びM8H4DK-35-A1M(35-A1M)に同様に、反応した。
【００７２】
横紋筋融解誘導腎臓障害
本研究はMalmo-Lund, no. M21-15中の動物研究のための倫理委員会によって承認された。体重20.5±0.7gの雌のC57BL/6マウスがTaconic(デンマーク)から得られ、ワイヤーの蓋付きの3型のケージに収容し、室温に保ち12時間明暗サイクルで持続した。温度(20±0.5℃)及び相対する湿度(50±5%)が研究の間を通して維持された。全ての動物は自由に食物(RM1(E) SQC, SDS, England)、水道水及びケージ・エンリッチメントにアクセスできた。一晩の絶飲水の後(15時間)、動物の体重を量り、イソフルランを用いて麻酔し、そして次の4つのグループに配置された：1) コントロール(n=6)、筋肉内(i.m.)又は静脈下の(i.v.)投薬を受けない；2) グリセロール(n=10)、50%の滅菌グリセロール(Teknova, Hollister, CA, USA)i.m.(2.0 mg/kg 体重、単回投薬、両方の後肢に分けて)；3) グリセロール+M8H4DK-wt A1M(wt-A1M)(n=10)、グリセロール(2.0 ml/kg)をi.m.投与後30分後にwt-A1Mをi.v.(7 mg/kg 体重、単回投薬)を受けた；及び4) グリセロール+M8H4DK-35-A1M(35-A1M)(n=10)、グリセロール(2.0 ml/kg)をi.m.投与の30分後に35-A1Mをi.v.(7 mg/kg 体重、単回投薬)を受けた。i.m.投与に続いて、動物は起きている間熱パッド上に置かれ、そしてケージに戻され、食物と水に自由にアクセスさせた。4時間後(グリセロール導入後)、動物はイソフルランを用いて麻酔され、腎臓はRNA抽出のために集められ、以下に記載されるmRNA 評価を行った。
【００７３】
RNA 単離及びリアルタイムPCR
総RNAはHK-2細胞からDirect-zolTM RNA MiniPrep supplied by Zymo Research (Irvine, CA, USA)を用いて単離され、又はマウス腎臓からはNucleoSpin RNA/Protein (Machery-Nagel, Duren, Germany)とRNeasyR Mini Kit (QIAGEN, Germantown, MD, USA) を用いて単離された。RNAのOD率(260 nm/280 nmの最適密度)は常に1.9より高かった。逆転写は1.0μgの総RNAを用いてiScriptTM cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, CA, USA)の製造者に従って行った。RT2 qPCRプライマー分析 (QIAGEN由来のヒト (HK-2細胞)及びマウス(腎臓)プライマー)はヘムオキシゲナーゼ1(HO-1)及び熱ショックタンパク質70(Hsp70)のmRNA発現の定量化に用いられた。データはグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(ヒト(HK-2細胞)及びマウス(腎臓)GAPDH、QIAGEN由来のRT2 qPCRプライマー分析)によって標準化された。データはカラムとして表され、平均値±SEMはインビトロのデータ及びボックスプロットとして表され、中央値及び25番目及び75番目百分率は、インビボのデータとして表された。倍率変化の値は未処理細胞又は動物(コントロール)由来のコントロール試料に対する標準化によって計算された。発現はiTaq( Universal SYBRR Green Supermix (Bio-Rad)を用いて分析された。増幅は、製造者(Bio-Rad)が記載するように、iCycler Thermal Cycler (Bio-Rad)中で 40サイクル行われ、及びデータ分析にはiCycler iQ Optical System Software (Bio-Rad)を用いた。
【００７４】
ヘム誘導細胞死からのK562細胞の救出
A1Mは、ヒト赤血球K562細胞のヘム誘導性細胞死を阻害することが従来示されている(Olsson et al., 2008)。細胞はATCCの説明書に従ってglutamax+10% FCS及び抗生物質(Gibco, Life Technologies Corp., USA)を含むDMEMで培養した。細胞は洗浄され、フェノールレッド及びFCSは含まないがGlutamax I 及び抗生物質 (Gibco)が添加されたDMEM中に再懸濁された。細胞は96ウェルプレートに、1ウェルあたり105個播種され、0-10μMのA1M希釈系列の存在下で100μMのヘムに晒された。細胞死のポジティブコントロールとして、10μlのLDH detection kit (下記参照)由来の溶解液が加えられた。細胞は37℃の二酸化炭素-インキュベーターで1時間培養された。プレートは350gで4分間すみやかに遠心分離し、cytoTox 96R Non-Radioを用いるLDH放出の分析のために50μの培地が96ウェルマイクロプレートに移された。細胞毒性の分析(Promega Biotech AB, Sweden)は説明書に従った。ヘム導入細胞は、典型的に生細胞と比較して7倍高いシグナル、及び完全に溶解した細胞の70%のシグナルが与えられた。ヘム又はA1M添加無しに培養した細胞の平均シグナルを全てから差し引き、ヘムのみで培養した細胞のシグナルを100%に設定した。全ての他のシグナルはこの値に関連された。この手順はいくつかの独立した実験の比較を可能にした。
【００７５】
HK-2細胞の保護
ヒト腎皮質近位尿細管上皮細胞(HK-2, ATCCR, CRL-2190, ATCC, Teddington, UK)はウシ下垂体抽出物(BPE, 0.05 mg/ml)及び表皮増殖因子(5 ng/mL)(all from Invitrogen, Paisley, UK)を添加したケラチノサイト無血清培地(K-SFM)中で培養された。細胞がおよそ80~90%コンフルエントになった際、ヘム(0~30 μM, 10 mM保存溶液から調製した新鮮なもの)又は(NH4)Fe(SO4)2、過酸化水素、及びアスコルビン酸(0-200 μM, フェントン反応)の混合物に、同量のA1M(0~20 μM, M8H4DK-wt A1M(wt-A1M)及びM8H4DK-35-A1M(35-A1M)) を同時に添加したか又はしていないものが加えられ、細胞は6時間培養された。培養後、細胞の生存性を、WST-1(測定した細胞の代謝活性、例えば、WST-1安定テトラゾリウム塩の水溶性フォルマザン染色への細胞性切断の測定は生存細胞の数に直接相互に関連する)(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を取扱説明書に従って用いて分析した。細胞生存性は未処理細胞由来のコントロール試料に対して標準化された。平行して培養物はQiazol( Lysis reagent (for RNA extraction, QIAGEN, Germantown, MD, USA)を用いて回収された。Total RNAは以下に記載されているmRNAの発現を評価するために細胞から抽出された。
【００７６】
統計
無関係のグループの間の比較はpost hoc Bonferroni correctionとANOVA によって行われた。P値<0.05は有意だと考えられた。
【００７７】
結果及び討論
計画の概要
本研究の目的は、保存された機能的特性を有するより安定で可溶性のA1Mバリアントを同定することである。本計画は3つのフェーズによって行われた。フェーズＩでは、異なる種のA1M及びヒトA1Mの点変異は選別され、機能に妥協すること無しに明白な安定性の効果を有する個々のアミノ酸を同定した。フェーズＩＩでは、フェーズＩで明白な効果を有することが示されたアミノ酸は、よりよい組み合わせを見つけるために組み合わされた。最後のフェーズＩＩＩでは、フェーズＩ及びフェーズＩＩからのデータは確認され、異なるN末端のタグの効果が調べられた。全ての3つのフェーズで、タンパク質は同じE. coliのシステム、同じベクター及び精製プロトコルで発現された。全てのバリアントがそれぞれのフェーズ内で、同様のプロトコルと手順を用いて平行して発現され、精製され、分析された。それぞれのフェーズの分析パネルは表１に要約される。全ての構成物のアミノ酸及びDNA配列は、以下に見つけられる。
【００７８】
【表２】
2019519466.tif 000012
【００７９】
全ての構成物のアミノ酸配列：
60. M8H4DK-ヒトwt (rhA1M) (配列番号9)
MHHHHHHHHDDDDKGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
1.M8H5GIEGR-マウス(配列番号24)
MHHHHHHHHGGGGGIEGRDPASTLPDIQVQENFSESRIYGKWYNLAVGSTCPWLSRIKDKMSVQTLVLQEGATETEISMTSTRWRRGVCEEITGAYQKTDIDGKFLYHKSKWNITLESYVVHTNYDEYAIFLTKKSSHHHGLTITAKLYGREPQLRDSLLQEFKDVALNVGISENSIIFMPDRGECVPGDREVEPTSIAR
2. M8H5GIEGR-ハダカデバネズミ(配列番号25)
MHHHHHHHHGGGGGIEGRNPVPMPPDNIQVQENFDESRIYGKWFNLATGSTCPWLKRIKDRLSVSTMVLGKGTTETQISTTHTHWRQGVCQETSGVYKKTDTAGKFLYHKSKWNVTMESYVVHTNYDEYAIILTKKFSHHHGPTITAKLYGREPRLRDSLLQEFREMALGVGIPEDSIFTMANRGECVPGDQAPESTPAPR
3. M8H5GIEGR-カエル(配列番号26)
MHHHHHHHHGGGGGIEGRCSPIQPEDNIQIQENFDLQRIYGKWYDIAIGSTCKWLKHHKEKFNMGTLELSDGETDGEVRIVNTRMRHGTCSQIVGSYQKTETPGKFDYFNARWGTTIQNYIVFTNYNEYVIMQMRKKKGSETTTTVKLYGRSPDLRPTLVDEFRQFALAQGIPEDSIVMLPNNGECSPGEIEVRPRR
4. M8H5GIEGR-ニワトリ(配列番号27)
MHHHHHHHHGGGGGIEGRTPVGDQDEDIQVQENFEPERMYGKWYDVAVGTTCKWMKNYKEKFSMGTLVLGPGPSADQISTISTRLRQGDCKRVSGEYQKTDTPGKYTYYNPKWDVSIKSYVLRTNYEEYAVILMKKTSNFGPTTTLKLYGRSPELREELTEAFQQLALEMGIPADSVFILANKGECVPQETATAPER
5. M8H5GIEGR-ウサギ(配列番号28)
MHHHHHHHHGGGGGIEGRDPVPTLPDDIQVQENFELSRIYGKWYNLAVGSTCPWLKRIKDRMAVSTLVLGEGTSETEISMTSTHWRRGVCEEISGAYEKTDTDGKFLYHKAKWNLTMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRRHGPTITAKLYGREPQLRESLLQEFREVALGVGIPENSIFTMIDRGECVPGQQEPKPAPVLR
6. M8H5GIEGR-SQ サル(配列番号29)
MHHHHHHHHGGGGGIEGRSPVPTPPEGIQVQENFNLSRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRLKVSTLVLEEGATEAEISMTSTRWRKGFCEQTSWAYEKTDTDGKFLYHEPKWNVTMESYVAHTNYEEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGREPQLRESLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMANRGECVPGEQEPQPILHRR
7. M8H5GIEGR-セイウチ(配列番号30)
MHHHHHHHHGGGGGIEGRSPVLTPPDAIQVQENFDISRIYGKWFHVAMGSTCPWLKKFMDRMSMSTLVLGEGATDGEISMTSTRWRRGTCEEISGAYEKTSTNGKFLYHNPKWNITMESYVVHTDYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRQPQLRESLLEEFRELALGVGIPEDSIFTMANKGECVPGEQEPEPSPHMR
8. M8H5GIEGR-マナティー (配列番号31)
MHHHHHHHHGGGGGIEGRSPVKTPLNDIQVQENFDLPRIYGKWFNIAIGSTCQWLKRLKAGPTMSTLVLGEGATDTEISTTSTRWRKGFCEEISGAYEKTDTAGKFLYHGSKWNVTLESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRYGLTITAKLYGRQPQVRESLLEEFREFALGVGIPEDSIFTTADKGECVPGEQEPEPTAALR
9. M8H5GIEGR-プレイス (配列番号32)
MHHHHHHHHGGGGGIEGRLPVLPEPLYPTQENFDLTRFVGTWHDVALTSSCPHMQRNRADAAIGKLVLEKDTGNKLKVTRTRLRHGTCVEMSGEYELTSTPGRIFYHIDRWDADVDAYVVHTNYDEYAIIIMSKQKTSGENSTSLKLYSRTMSVRDTVLDDFKTLVRHQGMSDDTIIIKQNKGDCIPGEQVEEAPSQPEPKR
10. M8H5GIEGR-オランウータン(配列番号33) 
MHHHHHHHHGGGGGIEGRGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRRHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
11. M8H5GIEGR-ヒトP35K (配列番号34) 
MHHHHHHHHGGGGGIEGRGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCKWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
12. M8H5GIEGR-ヒトM41K (配列番号35) 
MHHHHHHHHGGGGGIEGRGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIKDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
13. M8H5GIEGR-ヒトR66H (配列番号36) 
MHHHHHHHHGGGGGIEGRGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTHWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
14. M8H5GIEGR-ヒトT75K (配列番号37) 
MHHHHHHHHGGGGGIEGRGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEEKSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
15. M8H5GIEGR-ヒトT75Y (配列番号38) 
MHHHHHHHHGGGGGIEGRGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEEYSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
16. M8H5GIEGR-ヒトM99K (配列番号39) 
MHHHHHHHHGGGGGIEGRGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITKESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
17. M8H5GIEGR-ヒトS101Y (配列番号40) 
MHHHHHHHHGGGGGIEGRGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMEYYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
18. M8H5GIEGR-ヒトK69.92.118.130R (配列番号41) 
MHHHHHHHHGGGGGIEGRGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRRGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHRSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKRFSRHHGPTITARLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
19. M8H5GIEGR-シーラカンス(配列番号42)
MHHHHHHHHGGGGGIEGRGSPLRDEDIQVQENFDLPRIYGKWYEIAIASTCPWVKNHKDKMFMGTMVLQEGEQSDRISTTSTRIRDGTCSQITGYYTLTTTPGKFAYHNSKWNLDVNSYVVHTNYDEYSIVMMQKYKSSNSTTTVRLYGRTQELRDSLHAEFKKFALDQGIDEDSIYILPKRDECVPGEPKAESLMAR
21. M8H5GIEGR-ヒトL89T (配列番号43) 
MHHHHHHHHGGGGGIEGRGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFTYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
22. M8H5GIEGR-ヒトN1796D (配列番号44) 
MHHHHHHHHGGGGGIEGRGPVPTPPDNIQVQENFDISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWDITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
23. M8H5GIEGR-ヒトT45K (配列番号45)
MHHHHHHHHGGGGGIEGRGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMKVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
24. M8H5GIEGR-ヒトA135E (配列番号46) 
MHHHHHHHHGGGGGIEGRGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGREPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
25. M8H5GIEGRヒトV170S (配列番号47) 
MHHHHHHHHGGGGGIEGRGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECSPGEQEPEPILIPR
26. M8H5GIEGR-ヒトV148D (配列番号48)
MHHHHHHHHGGGGGIEGRGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRDVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
27. M8H5GIEGR-ヒトG172Q (配列番号49) 
MHHHHHHHHGGGGGIEGRGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPQEQEPEPILIPR
33. M8H4DK-ヒトM41K+R66H (配列番号50)
MHHHHHHHHDDDDKGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIKDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTHWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
34. M8H4DK-ヒトM41K+N1796D (配列番号51)
MHHHHHHHHDDDDKGPVPTPPDNIQVQENFDISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIKDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWDITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
35. M8H4DK-ヒトR66H+N1796D (配列番号52)
MHHHHHHHHDDDDKGPVPTPPDNIQVQENFDISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTHWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWDITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
36. M8H4DK-ヒトM41K+R66H+N1796D (配列番号53)
MHHHHHHHHDDDDKGPVPTPPDNIQVQENFDISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIKDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTHWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWDITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
37. M8H4DK-ヒトM41K (配列番号8)
MHHHHHHHHDDDDKGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIKDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
38. M8H4DK-ヒトR66H (配列番号54) 
MHHHHHHHHDDDDKGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTHWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
39.M8H4DK-ヒトN1796D (配列番号55) 
MHHHHHHHHDDDDKGPVPTPPDNIQVQENFDISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWDITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
40. M8H-ヒトwt (配列番号56) 
MHHHHHHHHGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
41. M8H-ヒトR66H+N1796D (配列番号57) 
MHHHHHHHHGPVPTPPDNIQVQENFDISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTHWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWDITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
42.タグなしヒトR66H+N1796D (配列番号 3)
MGPVPTPPDNIQVQENFDISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTHWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWDITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
61タグなしヒトwt(配列番号2)
MGPVPTPPDNIQVQENFNISRIYGKWYNLAIGSTCPWLKKIMDRMTVSTLVLGEGATEAEISMTSTRWRKGVCEETSGAYEKTDTDGKFLYHKSKWNITMESYVVHTNYDEYAIFLTKKFSRHHGPTITAKLYGRAPQLRETLLQDFRVVAQGVGIPEDSIFTMADRGECVPGEQEPEPILIPR
【００８０】
全ての構成物のDNA配列：
60. M8H4DK-ヒトwt (配列番号58) 
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGATGACGATGACAAGGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
1.M8H5GIEGR-マウス (配列番号59)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGACCCTGCGTCAACACTGCCAGATATCCAGGTTCAGGAGAACTTCAGTGAGTCCCGGATCTATGGAAAATGGTACAACCTGGCGGTGGGATCCACCTGCCCGTGGCTGAGCCGCATTAAGGACAAGATGAGCGTGAGCACGCTGGTGCTGCAGGAGGGGGCGACAGAAACAGAGATCAGCATGACCAGTACTCGATGGCGGAGAGGTGTCTGTGAGGAGATCACTGGGGCGTACCAGAAGACGGACATCGATGGAAAGTTCCTCTACCACAAATCCAAATGGAACATAACCTTGGAATCCTATGTGGTCCACACCAACTATGACGAATATGCCATTTTCCTTACCAAGAAGTCCAGCCACCACCACGGGCTCACCATCACTGCCAAGCTCTATGGTCGGGAGCCACAGCTGAGGGACAGCCTTCTGCAGGAGTTCAAGGATGTGGCCCTGAATGTGGGCATCTCTGAGAACTCCATCATTTTTATGCCTGACAGAGGGGAATGTGTCCCTGGGGATCGGGAGGTGGAGCCCACATCAATTGCCAGATGA
2. M8H5GIEGR-ハダカデバネズミ(配列番号60)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCAATCCTGTGCCGATGCCGCCAGACAACATCCAAGTGCAGGAGAACTTTGATGAATCCCGGATCTATGGGAAATGGTTCAACCTGGCTACGGGCTCCACGTGCCCGTGGCTGAAGAGGATCAAAGACAGGCTGAGTGTGAGCACAATGGTGCTGGGCAAGGGGACCACGGAGACACAGATCAGCACAACCCACACCCACTGGCGGCAAGGGGTGTGCCAGGAGACCTCAGGGGTTTACAAGAAAACAGACACGGCTGGGAAGTTCCTCTACCACAAGTCCAAATGGAATGTAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATCATTCTAACTAAGAAGTTCAGCCACCACCATGGACCGACCATTACTGCCAAGCTCTATGGGAGAGAGCCGCGGCTGAGAGACAGCCTCCTGCAGGAATTCAGGGAGATGGCCCTGGGCGTAGGCATCCCCGAGGATTCCATCTTCACAATGGCCAACAGAGGGGAATGTGTCCCTGGTGACCAGGCACCAGAGTCCACCCCAGCCCCGAGGTGA
3. M8H5GIEGR-カエル(配列番号61) 
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCTGCAGCCCAATCCAGCCAGAGGACAATATCCAGATCCAGGAGAACTTTGATCTCCAGAGGATTTATGGCAAATGGTACGACATTGCCATCGGCTCCACCTGCAAATGGCTGAAGCACCACAAGGAAAAGTTCAACATGGGGACACTGGAGCTTAGCGATGGGGAGACCGACGGGGAGGTGCGGATTGTGAACACAAGGATGAGGCACGGAACCTGCTCTCAGATTGTTGGGTCCTATCAGAAGACAGAGACCCCAGGGAAGTTCGACTATTTCAACGCACGGTGGGGAACCACGATCCAAAACTACATTGTCTTCACTAACTACAATGAGTATGTCATCATGCAGATGAGGAAGAAGAAGGGATCGGAGACCACCACGACCGTCAAGCTGTATGGGCGGAGCCCAGACTTGCGTCCGACCCTCGTTGATGAATTCAGGCAGTTTGCCTTGGCTCAGGGCATTCCTGAAGACTCCATCGTGATGCTACCTAACAATGGTGAGTGCTCTCCAGGGGAAATAGAAGTGAGACCACGGAGATGA
4. M8H5GIEGR-ニワトリ(配列番号62)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCACGCCTGTTGGGGACCAGGATGAGGACATTCAAGTGCAAGAGAATTTTGAGCCTGAGCGGATGTATGGGAAATGGTATGACGTAGCTGTTGGCACCACCTGCAAGTGGATGAAGAACTACAAGGAGAAGTTCAGCATGGGCACACTGGTGCTGGGCCCCGGCCCCAGCGCTGACCAGATCAGTACCATCAGCACCAGGCTGCGGCAAGGTGACTGCAAACGTGTCTCAGGAGAGTACCAGAAAACTGACACCCCTGGCAAATACACCTACTATAACCCCAAGTGGGATGTGTCTATCAAGTCCTACGTGCTTCGCACCAACTATGAAGAATACGCAGTCATTCTGATGAAGAAGACAAGTAATTTTGGCCCAACCACCACACTGAAGCTGTATGGGAGAAGCCCAGAGCTGCGGGAAGAGCTCACCGAGGCTTTCCAGCAGCTGGCTCTGGAGATGGGCATCCCTGCAGATTCCGTCTTCATCCTGGCCAACAAAGGTGAATGTGTCCCACAGGAGACTGCCACTGCCCCTGAGAGGTGA
5. M8H5GIEGR-ウサギ(配列番号63)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGACCCCGTGCCCACCCTGCCGGACGACATCCAAGTGCAGGAGAACTTCGAGCTCTCTCGGATCTACGGGAAATGGTACAACCTGGCTGTGGGGTCCACCTGCCCGTGGCTGAAGAGGATCAAGGACAGGATGGCCGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGGACGAGCGAGACGGAGATCAGCATGACCAGCACGCACTGGCGGAGGGGCGTCTGTGAGGAGATCTCCGGGGCCTATGAGAAAACGGACACTGACGGGAAGTTCCTGTACCACAAAGCCAAATGGAACTTAACCATGGAGTCCTACGTGGTGCACACCAACTACGATGAGTATGCCATTTTTCTCACCAAGAAATTCAGCCGCCGCCACGGCCCCACCATCACCGCCAAGCTCTATGGGCGGGAGCCGCAGCTGAGGGAGAGCCTCCTGCAGGAGTTCAGGGAGGTGGCTCTCGGGGTGGGGATCCCCGAGAACTCCATCTTCACCATGATCGACAGAGGGGAATGTGTGCCCGGGCAGCAGGAACCAAAGCCTGCCCCCGTGTTGAGATGA
6. M8H5GIEGR-SQ サル(配列番号64)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCAGCCCAGTGCCGACGCCGCCCGAAGGCATTCAAGTGCAGGAAAACTTCAATCTCTCTCGGATCTACGGCAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTAAAGAAGATCATGGACAGGTTGAAAGTGAGCACGCTGGTGCTGGAAGAGGGCGCCACGGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGCTGGCGGAAAGGTTTCTGTGAGCAGACCTCTTGGGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACGAACCCAAATGGAACGTAACCATGGAGTCCTATGTGGCCCACACCAACTATGAGGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTATGGGCGGGAGCCACAGCTGAGGGAAAGCCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGATTCCATCTTCACCATGGCTAACCGAGGTGAATGCGTCCCTGGGGAGCAGGAACCACAGCCCATCCTACACCGGAGATGA
7. M8H5GIEGR-セイウチ(配列番号65) 
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCAGTCCCGTGCTGACGCCGCCTGACGCCATCCAAGTGCAAGAGAACTTCGACATCTCTCGGATCTACGGGAAGTGGTTTCATGTGGCCATGGGCTCCACCTGCCCGTGGCTGAAGAAGTTCATGGACAGGATGTCCATGAGCACGCTGGTGCTGGGCGAGGGGGCGACGGATGGGGAGATCAGCATGACCAGCACACGTTGGCGGAGAGGCACCTGTGAGGAGATCTCTGGGGCTTATGAGAAAACCAGCACTAACGGAAAGTTCCTCTATCATAATCCCAAATGGAACATCACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCGACTATGATGAGTACGCCATCTTTCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCACCATGGGCCCACCATTACTGCCAAGCTCTATGGGCGACAGCCGCAGCTTCGAGAAAGCCTGCTGGAGGAGTTCAGGGAGCTTGCCTTGGGTGTGGGCATCCCCGAGGACTCCATCTTCACCATGGCCAACAAAGGTGAGTGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCTCTCCACACATGAGGTGA
8. M8H5GIEGR-マナティー(配列番号66) 
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCAGCCCAGTGAAAACACCACTCAACGACATCCAAGTGCAGGAGAACTTTGACCTCCCTCGGATCTACGGGAAATGGTTCAACATAGCCATTGGCTCCACCTGCCAATGGCTGAAGAGGTTGAAGGCCGGGCCGACCATGAGCACCCTGGTCCTGGGAGAGGGAGCTACAGACACAGAGATCAGCACAACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGCTTCTGTGAGGAGATCTCTGGGGCATATGAGAAAACAGACACAGCTGGGAAGTTCCTTTATCACGGATCCAAATGGAATGTAACCTTGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTACGCCATTTTTCTGACCAAGAAATTCAGCCGCTATGGACTCACCATTACTGCTAAGCTCTATGGGCGGCAGCCTCAGGTGAGGGAGAGCCTCCTGGAGGAGTTCAGGGAATTTGCCCTGGGTGTGGGCATCCCTGAGGATTCCATCTTCACCACGGCCGACAAAGGTGAGTGTGTCCCTGGAGAGCAGGAGCCAGAACCCACCGCAGCCCTGAGATGA
9. M8H5GIEGR-プレイス (配列番号67)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCCTCCCTGTGCTCCCTGAACCTCTTTACCCGACACAGGAGAACTTTGATCTGACCCGGTTTGTGGGGACATGGCACGATGTTGCCTTGACGAGCAGCTGCCCCCATATGCAGCGTAACAGGGCGGATGCAGCCATTGGTAAACTGGTTCTGGAGAAAGACACTGGAAACAAACTCAAGGTGACACGAACTAGACTCAGACATGGAACATGTGTGGAGATGTCTGGAGAATATGAGTTAACCAGCACACCAGGACGAATCTTCTACCATATTGACAGGTGGGATGCAGACGTGGACGCCTACGTGGTTCACACCAACTACGACGAGTACGCAATTATAATAATGAGCAAACAGAAAACATCGGGGGAGAACAGCACCTCACTCAAGCTGTACAGTCGGACGATGTCTGTGAGAGACACTGTGCTGGATGACTTCAAAACTCTGGTCAGACATCAGGGAATGAGTGACGACACCATTATCATCAAGCAGAACAAAGGTGACTGTATTCCTGGAGAGCAGGTGGAAGAAGCACCATCTCAGCCAGAGCCCAAGCGGTGA
10. M8H5GIEGR-オランウータン(配列番号68) 
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGGCCCTGTGCCGACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACCCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACATCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCGTCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACCCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAACAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
11. M8H5GIEGR-ヒトP35K (配列番号69)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCAAATGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
12. M8H5GIEGR-ヒトM41K (配列番号70
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCAAAGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
13. M8H5GIEGR-ヒトR66H (配列番号71)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCATTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
14. M8H5GIEGR-ヒトT75K (配列番号72) 
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGAAATCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
15. M8H5GIEGR-ヒトT75Y (配列番号73)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGTATTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
16. M8H5GIEGR-ヒトM99K (配列番号74)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCAAAGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
17. M8H5GIEGR-ヒトS101Y (配列番号75)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTATTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
18. M8H5GIEGR-ヒトK69.92.118.130R (配列番号76)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGCGTGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACCGTTCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGCGTTTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCCGTCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
19. M8H5GIEGR-シーラカンス (配列番号77) 
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGGAAGTCCCCTTCGAGATGAAGACATCCAAGTGCAGGAGAACTTTGACCTTCCCAGGATTTATGGAAAATGGTACGAAATTGCAATCGCTTCGACCTGTCCCTGGGTGAAGAATCACAAGGATAAGATGTTCATGGGAACTATGGTGCTACAAGAGGGAGAGCAGAGTGACCGGATCAGTACCACCTCCACCCGAATCAGGGATGGAACCTGCTCACAGATCACTGGATATTACACGTTAACCACAACACCTGGGAAGTTCGCTTATCACAATTCTAAATGGAACTTGGATGTCAACAGTTATGTTGTTCACACTAACTATGACGAATACTCGATTGTGATGATGCAGAAATACAAAAGCTCTAACTCTACCACTACAGTCCGACTCTATGGAAGAACTCAAGAGCTACGAGACAGCTTGCATGCCGAGTTCAAAAAGTTTGCTCTGGATCAGGGAATAGATGAGGACTCCATTTACATTCTGCCAAAAAGAGATGAATGTGTACCTGGTGAACCTAAAGCAGAATCTCTCATGGCACGTTGA
21. M8H5GIEGR-ヒトL89T (配列番号78)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTACCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
22. M8H5GIEGR-ヒトN1796D (配列番号79)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCGATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGGATATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
23. M8H5GIEGR-ヒトT45K (配列番号80)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGAAAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
24. M8H5GIEGR-ヒトA135E (配列番号81)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGAACCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
25. M8H5GIEGR-ヒトV170S (配列番号82)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTTCTCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
26. M8H5GIEGR-ヒトV148D (配列番号83)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGATGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
27. M8H5GIEGR-ヒトG172Q (配列番号84)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGTGGAGGAGGGGGTATCGAGGGCCGCGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTCAGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
33. M8H4DK-ヒトM41K+R66H (配列番号85)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGATGACGATGACAAGGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCAAAGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCATTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
34. M8H4DK-ヒトM41K+N1796D (配列番号86)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGATGACGATGACAAGGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCGATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCAAAGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGGATATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
35. M8H4DK-ヒトR66H+N1796D (配列番号87) 
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGATGACGATGACAAGGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCGATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCATTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGGATATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
36. M8H4DK-ヒトM41K+R66H+N1796D (配列番号88)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGATGACGATGACAAGGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCGATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCAAAGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCATTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGGATATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
37. M8H4DK-ヒトM41K (配列番号89) 
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGATGACGATGACAAGGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCAAAGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
38. M8H4DK-ヒトR66H (配列番号90) 
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGATGACGATGACAAGGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCATTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
39. M8H4DK-ヒトN1796D (配列番号91)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGATGACGATGACAAGGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCGATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGGATATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
40. M8H-ヒトwt(配列番号92) 
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
41. M8H-ヒトR66H+N1796D (配列番号93)
ATGCATCACCATCACCATCACCATCACGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCGATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCATTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGGATATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
42.タグなしヒトR66H+N1796D (配列番号94) 
ATGGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCGATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCATTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGGATATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
61.タグなしヒトwt (配列番号95)
ATGGGCCCTGTGCCAACGCCGCCCGACAACATCCAAGTGCAGGAAAACTTCAATATCTCTCGGATCTATGGGAAGTGGTACAACCTGGCCATCGGTTCCACCTGCCCCTGGCTGAAGAAGATCATGGACAGGATGACAGTGAGCACGCTGGTGCTGGGAGAGGGCGCTACAGAGGCGGAGATCAGCATGACCAGCACTCGTTGGCGGAAAGGTGTCTGTGAGGAGACGTCTGGAGCTTATGAGAAAACAGATACTGATGGGAAGTTTCTCTATCACAAATCCAAATGGAACATAACCATGGAGTCCTATGTGGTCCACACCAACTATGATGAGTATGCCATTTTCCTGACCAAGAAATTCAGCCGCCATCATGGACCCACCATTACTGCCAAGCTCTACGGGCGGGCGCCGCAGCTGAGGGAAACTCTCCTGCAGGACTTCAGAGTGGTTGCCCAGGGTGTGGGCATCCCTGAGGACTCCATCTTCACCATGGCTGACCGAGGTGAATGTGTCCCTGGGGAGCAGGAACCAGAGCCCATCTTAATCCCGAGATGA
【００８１】
A1Mバリアント構造物の原理
ヒトwt-A1M、様々な種由来の11のA1Mホモログ、及び点変異を有する15のA1Mバリアント、すなわち計27のA1MバリアントがフェーズＩ中で構築され、発現され、精製され及び分析された(表２)。11のA1Mホモログが次のように選択された。A1Mは種の間で良く保存されている。異なる種のA1M配列はデータベース中から検索された(www.ncbi.nlm.nih.gov 及び www.uniprot.org)。67の異なる種由来のAMBP配列が見つけられた。配列はA1M特有の機能グループ (K69, K92, K118, K130, Y22; Y132, H122及びH123の存在)、リポカリンモチーフ(SCR1, 2, 3)(導入中の出典を参照)、及び予測された炭水化物結合部が調べられた(Escribano et al., 1990)。5つは、システイン34を欠損しているため非A1Mとして分類され、除外し、3つはシステイン169を欠損しているため除外し、４つはそれらが不完全であり、2つはそれらが長く、疑わしい、挿入を有した。残りの53のホモログのアミノ酸配列は整列され、それらの示唆される3D構造は、ヒトA1Mの結晶構造(Meining and Skerra, 2012)上にアミノ酸配列を投影して、リポカリンループ中又はポケットの内側もしくは外側の個々のアミノ酸側鎖の位置を同定することによってモデル化された。この結果は以下に記載されるA1Mの機能に影響する点変位の構築に使われた。最終的な11のホモログ(表２を参照)の選択の原理は、広範な進化論的表現、方法の実行可能性、種の生活習慣中で潜在的に増加した環境酸化ストレス、A1M-特有の機能グループの存在又は欠損、及びグリコシル化の欠損の組み合わせであった。点変異を有する15のA1Mバリアントは、次に記載されたように選択された。8つのバリアントは、機能的特性のアミノ酸を有利に変異させ、7つのバリアントは、安定性/可溶性を向上するために位置を晒した(表２)。8つの機能的変異は、それらが1) 他種においてA1Mの機能に潜在的に影響するだろう3D構造モデル(上記参照)中の位置に生じたこと、かつ／又は2) 理論上システイン34のpKaを低くし、かつ／又は3) 理論上特別なラジカル捕捉部位を供給することから選ばれた。全てのバリアントの予測データはhttp://www.alphalyse.com/gpmaw_lite.htmlツールを用いて計算された(表３)。
【００８２】
【表３−１】
2019519466.tif 000013
【表３−２】
2019519466.tif 000014
*番号付けは上記配列と一致する。
【００８３】
【表４】
2019519466.tif 000015
【００８４】
フェーズＩ
バリアントは、並列した震盪フラスコで発現された。発現レベルにはバラツキがあり、いくつかのA1Mバリアントについては、適当なタンパク量を得るために発現を数回繰り返さなければならなかった。良好な発現及び精製後の比較的大きな量(>10mg/L 培地)は、マウス、リスザル、セイウチ、オランウータン、M41K、R66H、T75Y、M99K、N17、96D、T45K及びV148Dで得られた。発現及び精製したタンパク量は、ヒトwt-A1Mを同様の条件下で発現及び精製した以前の生産量(12mg/L)と同様であった。低い発現レベルにより低い生産量(1~10mg/L)となったバリアントは、ハダカデバネズミ、カエル、ウサギ、マナティー、P35K、T75K、S101Y、L89T、V170S、及びG172Qであった。ニワトリ、プレイス、及びシーラカンスのA1Mは、精製生産量<1mg/L培地となる最適下限の発現量を示した。四カ所のヒト変異体K69,92,118,130Rはよく発現したが、うまく再折りたたみを行うことが不可能であった。T75K-A1Mもまた精製の間に沈殿が増加する傾向を示した。
【００８５】
全てのバリアントは、ニワトリ及びシーラカンスを除いて(純度95%で精製された)、SDS-PAGEにより>99%の純度で精製された。SDS-PAGEによると、全てのバリアントは最大0.5%の共有結合性の二量体を含み、バリアントの間には大きな違いは無い。円偏向二色性は全てのバリアントについて、大きな違いなくおよそ2%のαヘリックス及び40%のβシートの構造を明らかにし、A1Mについての期待値(Kwasek et al., 2007)であった。精製後、全てのバリアントは表４に要約されたように分析された。初めに、安定性と可溶性が分析された。新しく解凍した、ストレスを受けていない0.1mMのタンパク溶液の凝集傾向及び熱安定性は動的光散乱法(DLS)、PAGE(凝集)及び示差走査蛍光定量法(DSF)(熱耐性)によって分析された。加えて、剪断力又は1mMへの濃度に応答する凝集傾向が調べられた。ヒトwt-A1Mはこれらの分析で比較的良く行われたが(表４)、いくつかのバリアントはさらによい安定性／可溶性の特性をなしとげた：ニワトリA1M、マナティーA1M、及びN17,96D-A1M。ニワトリ及びマナティーA1Mは、ヒトA1Mに有益な個々のアミノ酸についての仮定を可能にするにはあまりにも多くの位置がヒトwt-A1Mとは異なり、更なる研究には使用されなかった。機能的特徴が調べられた際、M41K及びR66Hは同じ(R66H)、又は向上した(M41K)機能が見つけられた。これらのバリアントもまた高い熱安定性を持ち、及びほとんどの他のバリアントよりも凝集する傾向がわずかに高いのみであるので、それらは更なる研究のために選ばれた。それゆえ、N17,96D-A1M、M41K-A1M及びR66H-A1Mは計画のフェーズＩＩへ続けられた。
【００８６】
【表５−１】
2019519466.tif 000016
【表５−２】
2019519466.tif 000017
ヒトwt-A1Mと比較してよりよいと見なした特性は白抜きのダークブルー、太字でマークされた。ヒトwt-A1Mと比較して低いと見なした特性は赤でマークされた。全ての他の特性はヒトwt-A1Mと似ていると見なされた。
PAGEでは、大きな凝集が著しく高い割合のバリアントはヒトwt-A1Mより低いと見なされた。
DLSでは、平均半径>>3nm が凝集の指標と見なされ、測定の記録の難しさも考慮される（計算に使用される測定値の数が少ないと見なされる）。
DSFでは、ヒトwt-A1MのTm>3標準偏差がより高い、又は低いと見なされる。
ヒトwt-A1Mの遊離チオールは典型的に0.6~0.8の領域になり、これよりも著しく低いものは、低いと見なされる。
ヘム結合分析では、この分析ではヒトwt-A1Mはヘムと~80%で結合する。他のバリアントで75%以下、及び85%以上は異なると見なされる。
ヘム還元分析中のソレー帯が最大<400nmのものはヒトwt-A1Mより低いと見なされ、及び≧409nmはヒトwt-A1Mより優れていると見なされる。
ABTS分析では、T検定のP値が<0.2のものはABTS還元能力が低いことを示すと見なされる。
【００８７】
フェーズＩＩ
フェーズＩＩの計画の目的は、有益な変異 (M41K, R66H 及び N17, 96D)をまとめて、同程度又は向上した機能を有する、さらにより安定なバリアントが構築できるかを調べることであった。加えて、ヒトwt-A1Mに用いた同じN末端のタグ(M8H4DK)が導入された(表５)。このように、新たにまとめたM8H4DKバリアントはM8H4DKヒトwtと比較された。
【００８８】
【表６】
2019519466.tif 000018
【００８９】
4つの全ての新しいバリアント(M8H4DK-M41K+R66H, M8H4DK-M41K+N17,96D, M8H4DK-R66H+N17,96D 及び M8H4DK-M41K+R66H+N17,96D) はとても良く発現し、及び29, 13, 37 及び15 mg精製タンパク質/Lの生産量が得られた。4つの新しいバリアントはSDS-PAGEによると>99%の純度で精製され、およそ2%の共有結合性の二量体が見られたM8H4DK-M41K+R66Hを除いて、同じか又はより低い割合の共有結合性の二量体が見られた。
可溶化/安定性の特性が分析された(表６ａ)。データは、M41K及びR66Hの組み合わせが熱安定性の最適下限であることを明らかにした。N17, 96D変異は、一方で、概ね有益な可溶性及び安定性であり、及びR66Hの組み合わせ(すなわちM8H4DK-R66H+N17, 96D-A1M)はよりよい可溶性及び安定性を産み出した。
機能的特性は分析された(表６b)。データは、M41K変異がヘム還元能力を増加したが、ヘム結合は低下した事を示した。しかし、M41K変異体はN17,96Dと組み合わされたとき、ヘム誘導性細胞死から細胞を救出する可能性が低い事を示した。R66H+N17,96Dの組み合わせは、wt-A1M中の全ての調べられた機能的側面と比較して、同様の結果を生み出した。それゆえ、M8H4DKタグ付加R66H+N17,96D A1Mは、フェーズＩＩの後の期待できる候補であるが、M41K変異はそれほど有用ではない。
【００９０】
【表７ａ】
2019519466.tif 000019
ヒトwt-A1Mと比較してよりよいと見なした特徴は白抜きのダークブルー、太字でマークされた。ヒトwt-A1Mと比較して低いと見なした特性は赤でマークされた。全ての他の特性はヒトwt-A1Mと似ていると見なされた。
PAGEでは、大きな凝集が著しく高い割合のバリアントはヒトwt-A1Mより低いと見なされた。
DLSでは、平均半径>>3nm が凝集の指標と見なされ、測定の記録の難しさも考慮される（計算に使用される測定値の数が少ないと見なされる）。
DSFでは、ヒトwt-A1MのTm>3標準偏差がより高い、又は低いと見なされる。
【００９１】
【表７ｂ】
2019519466.tif 000020
ヘム-アガロース結合分析中のヒトwt-A1Mは 〜80%結合する。他のバリアントの結合率が75%以下及び85%以上を異なるとして見なす。
ヘム結合吸光度分析では、赤色シフトが<400nmをヒトwt-A1Mより下と見なし、及びシフトが≧417nmをヒトwt-A1Mよりよいとして見なす。
ABTS分析では、T検定のp値が<0.2なのはABTS還元能力が低いことを示している、と見なす。
【００９２】
フェーズＩＩＩ
フェーズＩＩＩの最初の目的は、同一条件下で平行して発現した際の、M8H4DK-タグ付加R66H+N17, 96D-A1Mと、wt-A1M及びフェーズＩ及びＩＩの有望なM8H4DK-タグ付加単変異体とを比較することであった。第２の目的は、タグの安定性、可溶性及び機能への影響を調べることであった。ヒトwt-A1M(M8H4DK)のN末端のタグは、8つのヒスチジンタグとそれに続くエンテロキナーゼ切断部位からなる。切断部位は、発現及び精製後のヒスチジンタグの切断を可能にする。それゆえ、wt-A1M及びR66H+N17,96D-A1MはN末端のM8H4DK-及びM8Hタグ、及びタグなしで発現された。第三の目的は、M8H4DK-wt A1M(wt-A1M)及びM8H4DK-R66H+N17,96D-A1M(35-A1M)のより詳細な特性の比較であった。全てのフェーズＩＩＩで発現したバリアントと予測したデータは表７で示された。
【００９３】
【表８】
2019519466.tif 000021
【００９４】
並行した発現及び精製により、発現レベル及び精製量のより正確な比較が可能になった。全てのA1Mバリアントを発現する細菌は、同じ割合 (記載しない)、及び同様に比較的良い生産量(図２)で増殖する事が分かった。唯一の相違は、タグなしバリアント(#60及び#42)が他と比較して緩やかに発現したことであった。2x750mlの発現から、20〜60mgのそれぞれのバリアントの精製を可能にした(図３ａ)。全てのヒスチジンタグ付加バリアントは>99%の純度で精製され、タグなしバリアント(#61及び#42)はいくらか低い純度(およそ90%)を示した(図３ｂ)。いずれも、低量の共有結合性の二量体を示した。PAGE分析は、M8Hwt(40)及びタグなしwt-A1M(#61)を除く全てのバリアントで1〜2%未満の大きな凝集を示した(図３ｃ)。このように、全ての単独及び複数のM8H4DKタグ付加、M8Hタグ付加、及びタグなしA1Mバリアントが作られた。
【００９５】
100μM溶液の凝集と熱安定性は逆相HPLC、動的光散乱、及び示差走査蛍光計によって分析された(表８)。M8H4DKタグ付加バリアントは、RP-HPLCで87~90%の主要ピーク中のタンパク質としておよそ12分で溶出された。唯一の例外はM8H4DK-M41Kで、保持時間9.8分に主要ピーク中が80%のタンパク質として現れた。データは、M41K変異がA1Mの予期せぬタンパク質の特性を生み、最適下限であることをもう一度示している。M8Hへのタグを変えること又はタグを完全に取り除くことは、結果として保持時間を12.2及び12.9分にそれぞれ増加させ、予期されるように、より疎水性の高いの分子を示す。M8H wt及び両方のタグなしバリアントの主要なピーク中には、少ないタンパク質が発現し、これらのバリアントのSDS-PAGE中に見られるわずかに低い純度をおそらく反映する。wtタグなしDLSのデータは、およそ全てのバリアントの３つの平均半径及び全ての６つの記録から集めたデータの可能性を示した。全てのバリアントは、M8H4DK-wt A1Mと比較して同じか又はより高い熱安定性を保持した。より高い安定性はN17,96D変異を導入した全てのバリアントで見られた。
【００９６】
【表９】
2019519466.tif 000022
【００９７】
フェーズＩＩＩのバリアントは、狭いピペットチップ中で80回ピペッティングを繰り返すことによって剪断力に晒された。剪断ストレス誘導性の凝集はDLSで分析された。概して、N17,96D変異を持つ全てのバリアントは、M8Hタグ付加R66H+1796Dバリアント(#41)を除き、剪断ストレスに対する高い耐性を示した(表９)。異なる緩衝液中での1mMの濃度によって誘導されたストレスに対する耐性もまた調べられた。全てのバリアントはpH8.0 又は7.4の20mM Tris-HCl+0.125M NaCl中で1mM に濃縮され、PAGEによって速やかに分析された(図４ａ、表１０)。0.1mM及び1mMの試料も、Tris緩衝液又はPBS中での１度の凍結-融解サイクルの後にPAGEで分析された(図４ｂ、表１０)。M8H4DKタグ付加バリアント中、N17,96Dを含む全ての変異はwt-A1Mと比較して濃縮、凍結融解、pHの低下及び緩衝液の交換(PBSへの)に対する耐性を向上した。R66H変異の追加により、さらに安定性及び可溶性を向上した。R66Hのみの変異は、wt-A1Mとほぼ同等の耐性を持ち、M41K変異は有意に低い耐性を持った。N末端のタグの短縮又は除去は、耐性に負の効果があり、対応するR66H+N17,96Dバリアントと比例して、wt-A1Mに顕著であった。
【００９８】
【表１０】
2019519466.tif 000023
【００９９】
【表１１】
2019519466.tif 000024
【０１００】
フェーズＩＩＩの全てのバリアントは機能は、公知のA1M機能の全ての可能性のある特性を網羅するための拡張されたプログラムで調べられた。非ヘム関連還元能力は、合成ABTSラジカル及び市販の酸素ラジカル抗酸化能力(ORAC)分析で調べられた(図５)。M8H4DKタグ付加N17, 96D-A1M及びR66H+N17,96D-A1Mは、wt-A1Mと同様の還元能力を示し、M8H4DKタグ付加M41K-A1M及びR66H-A1Mはわずかに低いABTS還元能力を示した(図５A)。タグの短縮又は除去は小さな影響をもたらしたが、R66H-N17,96Dバリアントは、M8H-タグ付加及び非付加の場合、wt-A1Mよりも高い還元能力を持つ傾向を示した。ORAC分析におけるM8H4DK-タグ付加wt-A1Mの能力は100%にセットされ、その他のバリアントはこれに関して比較された。全てのM8H4DK-バリアントは、著しく高い能力を持ったM8H4DK-R66H+N17,96Dを除いて、M8H4DKwtのORACと同じ結果を示した(図５ｂ)。M8Hタグ付加、及びタグなしR66H+N17,96D-A1Mもまたwt-A1Mに比べてわずかに高いORAC能力を示した。還元能力は、シトクロムｃ還元分析で調べられた(図６)。ほとんどのバリアントは、wt-A1Mと比較してわずかに低い還元能力を示し、N17,9D及びR66H+N17,96Dでこれは顕著であった(0.3~0.6μM)(図６Ａ)。この重要性は理解されない。タグの短縮及び除去はこの特性に影響しなかった。
【０１０１】
ヘム結合は、遊離ヘム取り込み分析及びヘム-アガロース結合分析によって調べられた(図６)。遊離ヘムの取り込みと配位はソレー帯(Karnaukhova et al., 2014; Rutardottir et al, 2016)と呼ばれるおよそ410~415nmのみかけの吸光度ピークで見られる。ヘムは通常380~390nmのピークを持ち、これは、単体で溶かした場合又はオバルブミンのような非結合コントロールタンパク質と混合してインキュベートした際にも見られる。けれども、ヘムがA1Mと混合されたとき、吸光度ピークは410~415nmの間に形成され、いわゆる赤色シフト (すなわち、高波長へのピークのずれ)、及び増加したAbs(413/386)比が生じた。赤色シフトの度合い及びAbs(413/386)比は、A1Mのヘム結合機能に関連する(Rutardottir et al, 2016)。よって、これらの特徴は、フェーズＩＩＩ中の全てのバリアントで比較された(図６ｂ)。M8H4DK-タグ付加バリアント中の全てが、より強いシフトを持ったM41Kバリアントを除き、wt-A1Mと同じ赤色シフトを示した。興味深いことに、M8Hのタグの短縮は、赤色シフトを増加し、タグの除去は赤色シフトが減少した。明確に、タグは、この特徴の強い影響を持った。ヘムのA1Mへの結合を、A1Mの希釈系列のヘム-アガロースへの結合として、コントロールアガロースとの結合と比較して調べられた。典型的に、オバルブミンのようなコントロールタンパク質は、コントロールアガロースへのバックグラウンド結合以上にはヘム-アガロースと結合しない(図６ｃ)。典型的に、添加したM8H4DK-wt A1M(35-A1M)の70~80%がヘムアガロースと結合し、一方、コントロールアガロースへの結合が見られなかった。フェーズＩＩＩの全てのバリアントで結合は比較された。いずれも、ヘムアガロースへの同程度の結合を示し(66-72%)、オバルブミンは結合が見られなかった。
【０１０２】
M8H4DK-wt A1M(wt-A1M)及びM8H4DK-35-A1M(35-A1M)のヘム結合は、移動度シフト、及び蛍光分析(Karnaukhova et al. 2014)を用いてさらに分析された(図１１)。ヘム取り込みの結果として、ネイティブPAGE分析におけるwt-A1Mと35-A1Mの移動はヘム：タンパク質比が<1でゆっくりとなり、ヘム：タンパク質比が>1で早くなり、ヘム濃度に同じ依存性を示した(図１１Ａ及びＢ)。高ヘム濃度では、両方のバリアントは、オリゴマー化の傾向を示し、これはwt-A1Mについての以前の発見を支持する(Karanaukhova et al. 2014)。同様に、ヘム-取り込みは、wt-A1M及び35-A1Mの両方で、同様の動態でトリプトファン蛍光の消光を誘導した(図１１Ｂ)。A1M中のヘムの配位は、415nmのUV-吸光ピークの形成を誘導することは以前に示されている(Ruttarsdottir et al., 2016; karnaukhova et al., 2014)。wt-A1M及び35-A1M/ヘム複合体の同様のUV吸光度のパターンが見られ(図１１ｃ)、35-A1Mピークの小さな赤色シフト(415→417 nm)のみ伴った。
【０１０３】
wt-A1M及び35-A1MのABTSラジカルの還元の速度が調べられ[10]、非ストレスの、新たに調製したタンパク質を用いたwt-A1M及び35-A1Mの場合と同様であった(図１２Ａ)。７日間の保存後、wt-A1Mは、1mMへの濃縮後、22℃で緩やかな還元速度を示し(図１２Ｂ)、これらの条件で示された凝集に加えてタンパク活性の消失が示唆された(表１２)。シトクロムｃ還元(Allhorn et al., 2005)は、35-A1Mで緩やかに低下し(図１２Ｃ)、対して35-A1MのORAC分析により測定された抗酸化能力は少し高かった(図１２Ｄ)。
【０１０４】
【表１２】
2019519466.tif 000025
補足説明：
1.特に提示の無い限り、室温である。
2.20 mM Tris-HCl, 0.125 M NaCl, pH8.0
3.20 mM Tris-HCl, 0.125 M NaCl, pH7.4
4.PBS
5.10,000xgで遠心分離後計算し、総ピーク領域は初期物質と比較した。
6.未決定
【０１０５】
K562細胞をヘム誘導性細胞死から救出するA1Mバリアントの能力の生物学的分析が調べられた(図７)。細胞死の程度は乳酸デヒドロゲナーゼの放出により、A1Mなしにヘムと培養した細胞を100%に定めた. wt-A1Mを含む全てのM8H4DK-タグ付加バリアントは10μMでほぼ100%の救助を示し (図７)、バリアントの間で有意差はない。M8H-タグ付加バリアントはほぼ同じ救出能力を示し、タグなしバリアントはわずかに低い能力が観測された。
【０１０６】
M8H4DK-wt A1M(35-A1M)及びM8H4DK-35-A1M(wt-A1M) の細胞保護能力
２つのA1Mバリアントの細胞保護能力は、K562細胞及びヒト腎皮質近位尿細管上皮細胞株(HK-2)で試験され、遊離ヘムと遊離鉄に晒された。図１２は、両方のA1Mバリアントが、0.1mMのヘムに晒されたK562細胞の細胞死を完全に阻害することを示しており、サイトゾルのマーカーであるLDHの細胞外への放出によって測定された。wt-A1M及び35-A1Mの容量反応曲線がほぼ完全に重なることから、同程度の細胞保護能力が示唆される。
HK-2細胞の保護は図１４で示される。第１に、細胞障害は、フェントン反応、遊離鉄の混合物、アスコルビン酸及びヒドロキシルラジカルを産み出す過酸化水素によって誘導された。細胞生存は、WST-1分析によって測定され、両方のA1Mバリアントによって修復されて、容量反応曲線が重なった(図１４Ａ)。酸化ストレス応答のよく立証されたバイオマーカー(Alam et al., 1999)であるヘム-オキシゲナーゼ-1(HO-1)のアップレギュレーションは、wt-A1M及び35-A1Mによって同程度に大きく抑制された(図１４Ｂ)。HK-2細胞の細胞障害もまたヘムとのインキュベーションによって誘導され、両方のA1Mバリアントによって阻害され得た(図１４Ｃ及びＤ)。重ねて、WST-1分析によって分析された細胞生存は、２つのヘム濃度(10及び30μM)を用いて、両方のタンパク質によって同程度まで修復された(図１４Ｃ)。HO-1及び別の細胞ストレス応答遺伝子であるHsp70のアップレギュレーションは、似た頻度で両方のA1Mバリアントによって阻害された(図１４Ｄ)。
【０１０７】
マウスにおけるM8H4DK-wt A1M(wt-A1M)及びM8H4DK-35-1M(35-A1M)のインビボ分布
静脈注射されたA1Mは、以前に示されたように、ラット及びマウスでは、血液から急速に取り除かれ、大部分は腎臓及び肝臓に局在化された(Larsson et al., 2001; Ahlstedt et al., 2015)。我々は、wt-A1M及び35-A1Mの血液中のクリアランス速度及び臓器中の分布を比較した(図１５)。同様のターンオーバー速度が最初の60分で見られ、対して35-A1Mは1時間後より早く取り除かれた。調べた臓器中の10及び30分後のA1Mの分布は、２つのタンパク質の間に何ら有意さは見られなかった。wt-A1M及び35-A1Mの両方は、主に腎臓で見られ、少量が心臓、肝臓、肺、皮膚及び脾臓で見られ、わずかな(neglible)量が脳で見られた。
【０１０８】
M8H4DK-wt A1M(wt-A1M)及びM8H4DK-35-A1M(35-A1M)による腎臓のインビボでの保護
以前に、A1Mは、ヘム及び酸化ストレスに関連する腎臓障害が誘導された動物モデルにおいて、インビボの治療効果を示した(Wester-Rosenlof et al., 2014; Naav et al., 2015; Sverrison et al., 2014)。ここで、我々はグリセロール注入横紋筋融解マウスモデル(急性腎障害(AKI) が、ミオグロビン、遊離ヘム、ラジカル、及び他の組織成分の放出を伴う筋肉の破裂の結果として進行する)における２つのA1Mバリアントのインビボでの保護効果を調べた。グリセロールの注入が、細胞ストレスの２つのバイオマーカーであるHO-1及びHsp70遺伝子を膨大にアップレギュレーションすることとなり(図１６Ａ及びＢ)、ほとんどのアップレギュレーションはwt-A1M又は35-A1Mの同時注射によって阻害された。２つのA1Mバリアントの間の有意差は、この投薬量(7 mg/kg 動物重量)では見られなかった。
要約すれば、フェーズＩＩＩの調査は、N17,96Dを含むA1Mの変異はA1M分子に著しい安定性を付与し、これはR66H変異を加えた場合に更に向上した。さらに、M8H4DKタグ付加A1Mバリアントは、タグの短縮又はタグのないバリアントより安定した。それゆえ、タグは、精製ツールとして働くだけでなく、A1Mに安定性及び安定性をもたらし、機能を阻害しない。M8H4DK-R66H+N1796D(35-A1M)分子は、同じか又はよりよい機能的特性を示し、おそらくシトクロムc還元は除かれる。結論として、安定性／可溶性及び機能的研究は、M8H4DK-R66H+N17,96D(35-A1M)はM8H4DK-wt A1M(wt-A1M)に比べて改善された分子機能を有すること、及びwt-A1M及び35-A1Mの両方が急性腎障害の横紋筋融解グリセロール注入モデルを用いた腎臓でのインビボ保護効果を示すことを示唆する。
【０１０９】
M8H4DK-R66H+N1796D対M8H4DK-wtの更なる安定性の研究。
M8H4DK-R66H+N1796D-A1M及びM8H4DK-wt A1Mをさらに比較するため、凝集及び機能を、凍結融解サイクル並びに4℃及び室温での保存の後、SEC-FPLC及びABTS還元分析とで試験した(図８)。wt-A1M及びR66H+N17,96D-A1Mの両方の試料(100μM)は、5度の凍結融解サイクルに非常に良く耐えた。以前より示されているように、wt-A1Mは、1mMへの濃縮後、R66H+N17,96D-A1Mよりも凝集することが示され、同様の結果が一晩の保存と比較した1週間の保存で見られた。wt-A1Mの凝集の増加は、2μM試料のABTS還元活性に影響しなかった。目視の観察で、凍結融解、濃縮及び4℃で1週間の保存後の両方のバリアント溶液が完全に透明であることが示される。A1M溶液にさらにストレスを加えるために、100μM及び1mM溶液は室温で1週間保存された。100μM溶液の目視の観察はwt-A1Mがわずかに濁るが、R66H+N17,96D-A1M溶液は透明なままであることを示した。SEC-FPLCは、wt-A1Mの曲線下面積が初期物質の80%へと減少することを示し、wt-A1Mの消失を示すが、大きな凝集の増加が見られなかった。この消失は、おそらくタンパク質の沈殿、及びFPLCの実験前の濾過による除去により起こった。R66H+N17,96D-A1Mでは、いくつかの凝集物の増加は見られたが、100μMで室温、1週間の保存後のタンパク質の消失はなかった。ABTS分析では、R66H+N17,96D-A1Mは未だ完全な活性を示し、wt-A1Mではわずかな減少が見られた。1週間保存した1mM溶液の目視での観察では両方のバリアントが曇ったことを示したが、wt-A1M溶液はより濁って見えた。SECに導入するために溶液を10倍に希釈したとき、R66H+N17,96D-A1Mの沈殿は消失されたが、wt-A1Mでは消失しなかった。SECでは、凝集はほとんど見られなかったが、44%のみwt-A1Mの初期物質が残っていた。これに対して、100%のR66H+N17,96D-A1Mが残っていた。ABTSの分析では、wt-A1Mは、活性を大きく減少させたがR66H+N17,96D-A1Mが同じ活性を維持した。本研究では、M8H4DK-R66H+N17,96D-A1Mは、室温での高濃度の保存を耐えることができるが、wt-A1Mが耐えることができないことが示された。
【０１１０】
37℃での1mM溶液の安定性が調べられた。試料を1.5, 2.5 及び4.5 時間インキュベートして目視で調べ、SEC-FPLC及びABTS還元分析によって分析した(図９)。1.5時間のインキュベート後、両方の溶液は目視で調べた際にはまだ透明であったが、SEC-FPLCにより、R66H+N17,96D-A1M溶液(28%)と比較してwt-A1Mはより凝集している(53%)ことが明らかになった。初期物質の67%のみがwt-A1MのSECで溶出され、100%のR66H+N17,96D-A1Mが溶出され、曲線下の面積によって評価した。両方のバリアントは、ABTS分析では完全な活性を示した。2.5時間のインキュベート後、wt-A1M溶液は濁り、沈殿は再懸濁が不可能であった。40%の初期物質がSECで見られ、ABTS活性は大きく減少した。R66H+N17,96D-A1M溶液はまだ透明で、ABTS分析では完全な活性を示したが、SEC-FPLCでは大きな凝集が28~38%増加した。4.5時間後では、wt-A1Mは厚い物質が発達し、ピペットで取ることが不可能であった。それゆえ、さらなる分析はされなかった。R66H+N17,96D-A1Mは濁ったが、まだピペットで取ることが可能であった。いくつかの沈殿が希釈後に残った。SECで溶出したタンパク質量は初期物質の44%であり、ABTS分析では活性の減少が見られた。本研究は、次の37℃でのインキュベートで、A1Mはまず溶解可能な凝集を形成し、そして、それは不可逆的な凝集を形成し、及びABTS分析中の活性は失われることを示す。wt-A1Mの完全に不可逆的な沈殿が2.5時間インキュベート後に見られ、部分的に不可逆的な沈殿がM8H4DK-R66H+N17,96DK-A1Mの4.5時間のインキュベート後のみに見られた。それゆえ、M8H4DK-R66H+N17,96DK-A1MはM8H4DK-wt A1Mよりも37℃での保存に、より耐性がある。
【０１１１】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年3月20日(2018.3.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Iからなるアミノ酸配列(配列番号10)：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-GPVPTPPDN IQVQENF-X15-IS RIYGKWYNLA IGSTCPWLKK I-X16-DRMTVSTL VLGEGATEAE ISMTST-X17-WRK GVCEETSGAY EKTDTDGKFL YHKSKW-X18-ITM ESYVVHTNYD EYAIFLTKKF SRHHGPTITA KLYGRAPQLR ETLLQDFRVV AQGVGIPEDS IFTMADRGEC VPGEQEPEPI LIPR (式I)
及び式IIからなるアミノ酸配列（配列番号17）：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-GPVPTPPDN IQVQENF-X15-IS RIYGKWYNLA IGSTCPWLKK I-X16-DRMTVSTL VLGEGATEAE ISMTST-X17-WRK GVCEETSGAY EKTDTDGKFL YHKSKW-X18-ITM ESYV-VHTNYD EYAIFLTKKF SRHHGPTITA KLYGRAPQLR ETLLQDFRVV AQGVGIPEDS IFTMADRGEC VPGEQEPEPI(配列番号17)
（式中、少なくとも１つのX1〜X14が存在し、
X1は欠損又はMet又はN-ホルミル Metで表され、
X2は欠損又はHisで表され、
X3は欠損又はHisで表され、
X4は欠損又はHisで表され、
X5は欠損又はHisで表され、
X6は欠損又はHisで表され、
X7は欠損又はHisで表され、
X8は欠損又はHisで表され、
X9は欠損又はHisで表され、
X10は欠損又はAsp、Glu、Lys、又はArgから選択され、
X11は欠損又はAsp、Glu、Lys、又はArgから選択され、
X12は欠損又はAsp、Glu、Lys、又はArgから選択され、
X13は欠損又はAsp、Glu、Lys、又はArgから選択され、
X14は欠損又はAsp、Glu、Lys、又はArgから選択され、
X15はAsp又はAsnで表され、
X16はMet又はLys又はArgで表され、
X17はArg又はHis又はLysで表され、
X18はAsp又はAsnで表される）
から選択されるアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質又はその医薬的に許容な塩であって、
但し配列が配列番号1又は配列番号2ではない、
アルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項２】
前記X1がMet又はN-ホルミル Metであり、
X2, X3, X4, X5, X6, X7がHisであり、
X8 及び X9が欠損し、
X10, X11, X12 及びX13がAspであり、
X14がLysであり、
及びX15〜X18が上記で定義されたものである、請求項１に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項３】
前記X1がMet又はN-ホルミル Metであり、
X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8 及びX9がHisであり、
X10, X11, X12 及びX13がAspであり、
X14がLysであり、
及びX15〜X18が上記で定義されたものである、請求項１に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項４】
前記X1がMetであり、
X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X10, X11, X12, X13, 及びX14, が欠損し、
X15がAspであり、
X16がMetであり、
X17がHisであり、
X18がAspである、請求項１に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項５】
配列番号3又は配列番号１８と一致するアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項６】
前記X1がMetであり、
X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X10, X11, X12, X13, 及びX14, が欠損し、
X15がAsnであり、
X16がLysであり、
X17がArgであり、
X18がAsnである、請求項１に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項７】
アミノ酸配列が配列番号４又は配列番号１９と一致する、請求項６に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項８】
前記X1がMet又はN-ホルミル Metであり、
X2, X3, X4, X5, X6, X7がHisであり、
X8 及び X9が欠損し、
X10, X11, X12 及びX13がAspであり、
X14がLysであり、
X15がAspであり、
X16がMetであり、
X17がHisであり、
X18がAspである、請求項１に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項９】
配列番号５又は配列番号２０と一致するアミノ酸配列を有する、請求項８に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項１０】
前記X1がMet又はN-ホルミル Metであり、
X2, X3, X4, X5, X6, X7がHisであり、
X8 及び X9が欠損し、
X10, X11, X12 及びX13がAspであり、
X14がLysであり、
X15がAsnであり、
X16がLysであり、
X17がArgであり、
X18がAsnである、請求項１に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項１１】
配列番号６又は配列番号２１と一致するアミノ酸配列を有する、請求項１０に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項１２】
前記X1がMet又はN-ホルミル Metであり、
X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8及びX9がHisであり、
X10, X11, X12 及びX13がAspであり、
X14がLysであり、
X15がAspであり、
X16がMetであり、
X17がHisであり、
X18がAspである、請求項１に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項１３】
配列番号７又は配列番号２２と一致するアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項１４】
前記X1がMet又はN-ホルミル Metであり、
X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8及びX9がHisであり、
X10, X11, X12 及びX13がAspであり、
X14がLysであり、
X15がAsnであり、
X16がLysであり、
X17がArgであり、
X18がAsnである、請求項１に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項１５】
配列番号８又は配列番号２３と一致するアミノ酸配列を有する、請求項１４に記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項１６】
抗酸化物質である、請求項１〜１５のいずれか１つに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項１７】
ヘムと結合するタンパク質である、請求項１〜１６のいずれか１つに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１つに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質及び1つ又はそれ以上の医薬的に許容な賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれかに記載のアルファ-1-マイクログロブリン由来タンパク質の薬物としての使用法。
【国際調査報告】
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2019519466.tif 000048
2019519466.tif 000049
2019519466.tif 000050