(57)【要約】  本発明は、治療に使用するための鉛２１２の生成に関する。具体的には、本発明の実施形態である放射性免疫複合体などの鉛２１２をベースとする放射性標識タンパク質の生成に関連する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射性核種標識タンパク質を生成する方法であって、
ａ）224Ｒａ及び212Ｐｂを含む水溶液並びにキレート剤と結合したタンパク質を含む水溶液を用意すること、
ｂ）ａ）で用意された前記溶液を混合及びインキュベーションして放射性核種標識タンパク質を含む反応溶液を形成すること、
ｃ）ゲル濾過クロマトグラフィーによる前記反応溶液の精製、並びに
ｄ）ステップｃ）の前記精製から前記放射性核種標識タンパク質を回収すること
を含む方法。
【請求項２】
前記タンパク質が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、合成タンパク質、及びペプチドからなる群より選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記タンパク質が５００〜５００．０００ダルトンのサイズを有する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップａ）の224Ｒａ及び212Ｐｂを含む前記溶液が、１〜１００００ＭＢｑ、例えば５０〜１０００ＭＢｑなど、１ｋＢｑ〜１ＧＢｑ、例えば１０ｋＢｑ〜１００ＭＢｑなど、１００ｋＢｑ〜１０ＭＢｑなど、１０ＭＢｑ〜２００ＭＢｑなどの224Ｒａ及び212Ｐｂから生じた放射能を有する請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
ステップａ）の前記水溶液における212Ｐｂと224ＲａのＭＢｑでの活性比が、０．５〜２、例えば０．８〜１．５など、若しくは０．８〜１．３など、又は好ましくは０．９〜１．１５などである請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ステップｄ）で回収されたキレート剤と結合した抗体が、０．０５〜５０ｍｇ、例えば０．１〜２５ｍｇなど、０、５〜１０ｍｇなど、１〜５ｍｇなどの量で存在する請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップａ）の溶液が、１００μＬ〜１０００ｍＬ、例えば５００μＬ〜１００ｍＬなど、１ｍＬ〜１０ｍＬなどの体積である請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップａ）のキレート剤と結合した抗体を含む前記溶液が、０．１〜４ｍｇ／ｍｌ、例えば０．２５〜２ｍｇ／ｍｌなど、０．５〜１．５ｍｇ／ｍｌなど、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌなどのキレート剤と結合した抗体の濃度を有する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップｂ）の前記混合及びインキュベーションが、１〜１８０分、例えば５〜１２０分など、１５〜６０分など、２０〜４０分など、３０〜６０分などで行われる請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップｃ）の前記ゲル濾過クロマトグラフィーが、脱塩精製、脱塩とバッファー交換、及び脱塩ゲル排除分離からなる群より選択される請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記脱塩が純度を高めるために繰り返される請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｃ）の前記精製が、遠心分離駆動、圧力駆動、真空駆動、又は重力駆動からなる群より選択される方法の１つによって駆動される請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記キレート剤がＴＣＭＣである請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が、トラスツズマブ、リツキシマブ、ＨＨ１、セツキシマブ、ベバシズマブ、ダラツムマブ、アレムツズマブ、ペンブロリズマブ、エピラツズマブ、Ｌ１９、Ｆ８、Ｆ１６、ガリキシマブ、トラリズマブ、アレムツズマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、アフツズマブ、トシツモマブ、Ｒｅｄｉｔｕｘ、及びイブリツモマブからなる群のうちの１つ以上から選択される請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ１３８、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ−２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１８、ＣＥＡ、ＦＢＰ、ＮＧ２、ＥＰＣＡＭ、シンデカン−１、Ｃａ−１２５、ＬＫ−２６、ＨＭＦＧ、ＣＳ−１、及びＢＣＭＡからなる群より選択される抗原に特異的な抗体である請求項１〜１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法から回収される放射性核種標識タンパク質。
【請求項１７】
放射性核種標識タンパク質の精製用のキットであって、
（ｉ）224Ｒａ及び212Ｐｂを含む水溶液、
（ｉｉ）キレート剤と結合したタンパク質を含む水溶液、
（ｉｉ）ゲル濾過クロマトグラフィーのための手段、並びに
（ｉｖ）任意選択で、放射性核種標識タンパク質の生成のための取扱説明書
を含むキット。
【請求項１８】
放射性核種標識タンパク質組成物であって、
−タンパク質に結合した212Ｐｂ、
−タンパク質に結合した212Ｂｉ、
−０，１％〜２％の遊離224Ｒａ、
５０％未満の遊離212Ｂｉ、及び
２０％未満の遊離212Ｐｂ
を含む組成物。
【請求項１９】
前記タンパク質が５００〜５００．０００ダルトンのサイズを有する請求項１８に記載の放射性核種標識タンパク質組成物。
【請求項２０】
タンパク質に結合した212Ｐｂの量が、０．１〜４ｍｇ／ｍｌ、例えば０．２５〜２ｍｇ／ｍｌなど、０．５〜１．５ｍｇ／ｍｌなど、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌなどのキレート剤と結合した抗体の濃度を有する請求項１８〜１９に記載の放射性核種標識タンパク質組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療に使用するための鉛２１２の生成に関する。具体的には、本発明の実施形態である放射性免疫複合体などの鉛２１２をベースとする放射性標識タンパク質の生成に関連する方法である。
【背景技術】
【０００２】
鉛２１２（212Ｐｂ）は短寿命のアルファ放出娘核種を介して壊変し、212Ｐｂの壊変ごとに平均１つのアルファ粒子が生じるので有望な治療用放射性核種である。
【０００３】
２12Ｐｂの１０．６時間の半減期はその使用を制限し、迅速で且つ安全な製造及び精製手順が必要である。鉛２１２をベースとする放射性免疫複合体は現在、陽イオン交換カラム中の224Ｒａから分離され、放射性標識前に再溶解されなければならない鉱酸中に溶出された212Ｐｂを使用して腹膜がんに対する臨床試験に入っている。
【０００４】
現在の方法は、定量に満たない溶出アウトプット及び溶出と標識の間の時間のために損失をもたらす。
【０００５】
したがって、これらの問題を考慮に入れた新しい方法が必要である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、放射性核種標識タンパク質を生成する方法に関し、その方法は、ａ）224Ｒａ及び212Ｐｂを含む水溶液並びにキレート剤と結合したタンパク質を含む水溶液又は容易に溶解可能な製剤（formulation）を用意すること、ｂ）ａ）で用意された溶液を混合及びインキュベーションして放射性核種標識タンパク質を含む反応溶液を形成すること、ｃ）ゲル濾過クロマトグラフィーによる反応溶液の精製、並びにｄ）ステップｃ）の精製から放射性核種標識タンパク質を回収することを含む。
【０００７】
タンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、合成タンパク質、及びペプチドからなる群から選択されうる。
【０００８】
ステップｄ）の回収された放射性核種標識タンパク質は、212Ｂｉ及び212Ｐｂを含んでいてもよい。
【０００９】
本発明の１つの実施形態では、ステップａ）の224Ｒａ及び212Ｐｂを含む溶液は、１〜１０  ０００ＭＢｑ、例えば５０〜１０００ＭＢｑなど、１ｋＢｑ〜１ＧＢｑ、例えば１０ｋＢｑ〜１００ＭＢｑなど、１００ｋＢｑ〜１０ＭＢｑなど、１０ＭＢｑ〜２００ＭＢｑなどの224Ｒａ及び212Ｐｂから生じた放射能を有する。
【００１０】
本発明の別の実施形態では、ステップａ）の水溶液における212Ｐｂと224ＲａのＭＢｑでの活性比が、０．５〜２、例えば０．８〜１．５など、若しくは０．８〜１．３など、又は好ましくは０．９〜１．１５などである。
【００１１】
本発明のさらに別の実施形態では、ステップｄ）で回収されるキレート剤と結合したタンパク質は、０．０１〜５０ｍｇ、例えば０．１〜２５ｍｇなど、０，５〜１０ｍｇなど、１〜５ｍｇなどの量で存在する。
【００１２】
本発明のさらなる実施形態では、ステップａ）の溶液は、体積が、１０μＬ〜１０００ｍＬ、例えば５００μＬ〜１００ｍＬなど、１ｍＬ〜１０ｍＬなどである。
【００１３】
本発明の別の実施形態では、ステップａ）のキレート剤と結合したタンパク質を含む溶液は、０．１〜４ｍｇ／ｍｌ、例えば０．２５〜２ｍｇ／ｍｌなど、０．５〜１．５ｍｇ／ｍｌなど、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌなどのキレート剤と結合した抗体の濃度を有する。
【００１４】
本発明のさらに別の実施形態では、ステップｂ）の混合及びインキュベーションは、１〜１８０分、例えば５〜１２０分など、１５〜６０分など、２０〜４０分など、３０〜６０分などで行われる。
【００１５】
本発明の別の実施形態では、ステップｃ）のゲル濾過クロマトグラフィーは、脱塩精製、脱塩とバッファー交換、及び脱塩ゲル排除分離からなる群より選択される。
【００１６】
本発明の別の実施形態では、脱塩は純度を高めるために繰り返される。
【００１７】
別の実施形態では、精製対象の原溶液は、キレート剤を添加されて未複合化放射性核種を複合体化して、脱塩ステップから回収される最終の放射性複合体の純度をさらに高める。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態では、ステップｃ）の精製は、遠心分離駆動、圧力駆動、真空駆動、又は重力駆動からなる群より選択される方法の１つによって駆動される。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、キレート剤はＴＣＭＣである。
【００２０】
本発明の別の実施形態では、抗体は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ＨＨ１、セツキシマブ、ベバシズマブ、ダラツムマブ、アレムツズマブ、ペンブロリズマブ、エピラツズマブ、Ｌ１９、Ｆ８、Ｆ１６、ガリキシマブ、トラリズマブ、アレムツズマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、アフツズマブ、トシツモマブ、Ｒｅｄｉｔｕｘ、及びイブリツモマブからなる群のうちの１つ以上から選択される。
【００２１】
本発明の別の実施形態では、抗体は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ１３８、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ−２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１８、ＣＥＡ、ＦＢＰ、ＮＧ２、ＥＰＣＡＭ、シンデカン−１、Ｃａ−１２５、ＬＫ−２６、ＨＭＦＧ、ＣＳ−１、及びＢＣＭＡからなる群より選択される抗原に特異的である。
【００２２】
本発明の別の態様は、本発明による方法から回収された放射性核種標識タンパク質に関する。
【００２３】
本発明の別の態様は、224Ｒａ及び212Ｐｂを含む水溶液、キレート剤と結合したタンパク質を含む水溶液、ゲル濾過クロマトグラフィーのための手段、並びに任意選択で、放射性核種標識タンパク質の生成のための取扱説明書を含む放射性核種標識タンパク質の生成用キットに関する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
224Ｒａで標識されたタンパク質、例えば抗体などを生成するための現在の方法は、定量に満たない溶出アウトプット及び溶出と標識の間の時間に起因して損失をもたらす。
【００２５】
本発明の目的は、これらの問題を考慮に入れた代替的な新しい進歩性のある方法である。
【００２６】
１つの解決方法は、212Ｐｂをベースとする放射性標識タンパク質、例えば放射性免疫複合体などを調製する代替的な方法としての、224Ｒａ溶液中でモノクローナルの抗体などのタンパク質を212Ｐｂで、その場で（in situ）標識し、続いて224Ｒａを除去する方法である。
【００２７】
本発明の文脈では、放射性免疫複合体は、放射性核種、複合剤（conjugator）、及び抗体などのタンパク質を含む物質と定義される。またこれは、放射性核種標識タンパク質又は放射性核種標識抗体とも呼ばれる。
【００２８】
本発明は、放射性核種標識タンパク質を生成する方法に関し、その方法は、ａ）224Ｒａ及び212Ｐｂを含む水溶液並びにキレート剤と結合したタンパク質を含む水溶液又は容易に溶解可能な製剤を用意すること、ｂ）ａ）で用意された溶液を混合及びインキュベーションして放射性核種標識タンパク質を含む反応溶液を形成すること、ｃ）ゲル濾過クロマトグラフィーによる反応溶液の精製、並びにｄ）ステップｃ）の精製から放射性核種標識タンパク質を回収することを含む。
【００２９】
タンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片、合成タンパク質、及びペプチドからなる群より選択することができる。
【００３０】
タンパク質はまた、Ｇｌｕ−尿素モチーフ（Glu-urea motif）であってもよい。Ｇｌｕ−尿素モチーフはＰＳＭＡを標的とする。ＰＳＭＡを標的とするＧｌｕ−尿素モチーフは、ＰＳＭＡ−６１７、ＰＳＭＡ−１１、ＭＩＰ−１４２７からなる群から選択することができる。タンパク質はまた、ビオチン又はアビジン又は類似体、並びに葉酸及び誘導体からなる群から選択することもできる。
【００３１】
本発明のタンパク質のサイズは、本発明のサイズ排除による識別に起因して、224Ｒａより大きい任意のものでありうる。したがって、タンパク質のサイズは分子量Ｍrで約３００より大きい。本発明の１つの実施形態では、タンパク質のサイズは分子量Ｍrで５００〜５００．０００である。サイズはまた、分子量Ｍrで４０．０００〜２００．０００又は５００〜５０００であってもよい。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態では、タンパク質は抗体である。
【００３３】
本発明の１つの実施形態では、本発明の方法で使用される224Ｒａは、228Ｔｈに結合したキレート樹脂、例えばＡｃ−樹脂若しくはＴＲＵ−樹脂を用いて、又はＴｈＯスラリーから作ることができる。ＴｈＯスラリーは、例えば、米国特許第７，８８７，７８２号明細書に記載されている。
【００３４】
本発明の例は、モノクローナル抗体によって例示されるＴＣＭＣ結合タンパク質は、212Ｐｂと平衡状態にある224Ｒａの溶液中で212Ｐｂで効率的に標識できることを示す。
【００３５】
続いて、212Ｐｂ標識複合体は、例えば脱塩ゲル排除分離を用いてカチオン性の224Ｒａから分離することができる。これは、すぐに使用できる224Ｒａ／212Ｐｂ溶液が、集中供給元（centralized supplier）からエンドユーザーに出荷できることを意味する。
【００３６】
溶液中で224Ｒａを使用する利点は２つあり、（１）酸抽出ステップが回避されるので手順を実行するのに費やす時間が少ないこと及び（２）労力が少なく、酸などの蒸発などを必要としないことある。収率もより高い。
【００３７】
強直性脊椎炎の治療に224Ｒａを使用する研究から、適度な量（典型的には１０ＭＢｑ未満）が、無視できない骨髄毒性を伴わずに患者に投与できることが知られており、212Ｐｂをベースとする生成物中の１〜２％の含量、例えば１００ＭＢｑは、212Ｐｂ生成物が高い程度の骨髄毒性を生じさせない限り耐容されると思われることを示している。
【００３８】
224Ｒａに関してより純粋な生成物が必要と思われる場合は、第２のＰＤ−１０カラムで精製を繰り返すことでこれを達成しうる。（能力は急速に減少するが）数回「ミルキング」することができる現在のイオン交換に基づくジェネレータと比較して、記載の224Ｒａ溶液に基づくジェネレータは単回使用のみのためであることになる。
【００３９】
さらに、第２の、好ましくは低分子量のキレート剤、例えばＥＤＴＭＰを加えて、複合体との反応が終了し脱塩ステップを行う前に原溶液中の未複合化放射性核種を複合体化することは、最終の生成物の純度をさらに高めることができる。
【００４０】
したがって、本発明の例は、現在のイオン交換に基づく方法と比較して簡単で時間がかからない、212Ｐｂをベースとする放射性免疫複合体を作製するための出荷可能なジェネレータとして224Ｒａを使用する代替的なやり方を示す。
【００４１】
濃縮物の比と量
本発明の方法の溶液中の放射能は、目的の用途に応じて異なる強度でありうる。本発明の１つの実施形態では、ステップａ）の224Ｒａ及び212Ｐｂを含む溶液は、224Ｒａ及び212Ｐｂから生じた放射能が、１〜１００００ＭＢｑ、例えば５０〜１０００ＭＢｑなど、１ｋＢｑ〜１ＧＢｑ、例えば１０ｋＢｑ〜１００ＭＢｑなど、１００ｋＢｑ〜１０ＭＢｑなど、１０ＭＢｑ〜２００ＭＢｑなどである。
【００４２】
１つの実施形態では、放射能は１０ｋＢｑ〜１０ＭＢｑである。
【００４３】
好ましい実施形態では、放射能は１０ｋＢｑ〜１００ＭＢｑである。
【００４４】
224Ｒａ及び212Ｐｂを含む本発明の溶液は、228Ｔｈから生成することができる。
【００４５】
回収された放射性核種標識タンパク質は、212Ｐｂからさらに崩壊するため、212Ｂｉを含む可能性がある。したがって、本発明の組成物のタンパク質の212Ｂｉ／212Ｐｂ比は、＋／−３０％以内の１／１の比での212Ｂｉ／224Ｒａでありうる。ラジオは、＋／−２０％以内の１／１又は＋／−１０％以内の１／１でもよい。
【００４６】
本発明の１つの実施形態では、抗体などの回収された放射性核種標識タンパク質は、投与及び投薬に必要な量になるように調整されている。
【００４７】
したがって、本発明の１つの実施形態では、抗体などの回収された放射性核種標識タンパク質はその後医薬組成物として製剤化される。
【００４８】
医薬組成物は、本発明による抗体などの回収された放射性核種標識タンパク質と、希釈剤、担体、界面活性剤、及び／又は賦形剤とを含む。
【００４９】
許容される医薬担体としては、非毒性のバッファー、充填剤、等張溶液、溶媒及び共溶媒、抗菌防腐剤、抗酸化剤、湿潤剤、消泡剤、並びに増粘剤が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、医薬担体は、限定されないが、通常の生理食塩水（０．９％）、半生理食塩水、乳酸リンゲル液、溶解スクロース、デキストロース、例えば３．３％デキストロース／０．３％生理食塩水であることができる。生理学的に許容される担体は、放射線分解安定剤（radiolytic stabilizer）、例えば、アスコルビン酸、ヒト血清アルブミンであり、保存及び出荷中の放射性医薬の完全な状態を保護する。
【００５０】
１つの実施形態では、回収ステップｄ）の後に行われる医薬組成物として製剤がある。
【００５１】
224Ｒａの崩壊系列にはラドン娘核種が含まれており、空気中に拡散する可能性があるので、220Ｒｎの漏出を防ぐために生成物が入ったバイアルを密封する必要がある。
【００５２】
高度に局在したアルファ線照射の性質のために、放射線分解は潜在的な問題として考慮されなければならず、放射性医薬はこれを最小限に抑えるように設計されなければならない。当該分野の知識によれば、抗体などの放射性標識タンパク質は放射線分解の影響を受けやすく、したがって、キットシステムは212Ｐｂ及び／又は212Ｂを捕捉するためのキレーター結合抗体と組み合せることができる224Ｒａ溶液に有利である。
【００５３】
モノクローナル抗体の場合、放射線分解による結合特性の低下を避けるために、放射性医薬溶液を作るアルファ粒子の自己線量を０．５ｋＧｙ未満に保つことが通常は推奨される。したがって、遠方への出荷を意図した濃縮溶液については、抗体などのキレート剤結合タンパク質が注射の数時間〜１０分間前に224Ｒａ（娘核種を含む）溶液に添加されるキットシステムが推奨される。
【００５４】
投薬１回当たり１ｋＢｑ〜１０ＧＢｑの放射性核種の量で医薬組成物は調製される。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、ステップａ）の水溶液における212Ｐｂと224ＲａのＭＢｑでの活性比は、０．５〜２、例えば０．８〜１．５など、若しくは０．８〜１．３など、又は好ましくは０．９〜１．１５などである。活性比は好ましくは０．５〜２である。
【００５６】
例えば、212Ｐｂと224Ｒａの「活性比」という用語は、212Ｐｂの224Ｒａに対するＭＢｑの比に関する。
【００５７】
本発明のさらに別の実施形態では、ステップｄ）で回収されるキレート剤と結合した抗体などのタンパク質は、０．０５〜５０ｍｇ、例えば０．１〜２５ｍｇなど、０，５〜１０ｍｇなど、１〜５ｍｇなどの量で存在する。その量は好ましくは０．０５〜５０ｍｇである。
【００５８】
本発明のさらなる実施形態では、ステップａ）の溶液は、１００μＬ〜１０００ｍＬ、例えば５００μＬ〜１００ｍＬなど、１ｍＬ〜１０ｍＬなどの体積である。その体積は好ましくは１００μＬ〜１０００ｍＬである。
【００５９】
本発明の別の実施形態では、ステップａ）のキレート剤と結合した抗体などのタンパク質を含む溶液は、０．１〜４ｍｇ／ｍｌ、例えば０．２５〜２ｍｇ／ｍｌなど、０．５〜１．５ｍｇ／ｍｌなど、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌなどのキレート剤と結合した抗体などのタンパク質の濃度を有する。その濃度は好ましくは０．１〜４ｍｇ／ｍｌである。
【００６０】
混合及びインキュベーション
本発明のさらに別の実施形態では、ステップｂ）の混合及びインキュベーションは、１〜１８０分、例えば５〜１２０分など、１５〜６０分など、２０〜４０分など、３０〜６０分などで行われる。その時間は好ましくは３０〜６０分である。
【００６１】
混合は自動振盪器で行われうる。温度は、好ましくは３０〜４０℃、より好ましくは３７℃である。
【００６２】
ゲル濾過クロマトグラフィー
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、分子篩クロマトグラフィーとしても知られ、溶液中の分子をそのサイズ、場合によっては分子量によって分離するクロマトグラフィー法である。これは通常、タンパク質や工業用ポリマーなどの大きい分子や高分子複合体に適用される。典型的には、水溶液を用いて試料をカラムに通す場合、この技術はゲル濾過クロマトグラフィーとして知られるのに対して、有機溶媒を移動相として用いる場合にはゲル浸透クロマトグラフィーという名称が使用される。ＳＥＣは、ポリマーについて良好なモル質量分布（Ｍｗ）結果を提供できるので、広く使用されているポリマーキャラクタリゼーション法である。
【００６３】
したがって、本発明の別の実施形態では、ステップｃ）のゲル濾過クロマトグラフィーは、脱塩精製、脱塩とバッファー交換、及び脱塩ゲル排除分離からなる群より選択される。
【００６４】
したがって、本発明のゲル濾過クロマトグラフィーは、カラムに通すために水溶液を使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）としても知られる。
【００６５】
本発明の別の実施形態では、脱塩は純度を高めるために繰り返される。脱塩は、１回、２回、３回、又はそれより多く繰り返すことができる。
【００６６】
別の実施形態では、第２の、好ましくは低分子量のキレート剤、例えばＥＤＴＭＰが加えられて、複合体との反応が終了し脱塩ステップを行う前に原溶液中の未複合化放射性核種を複合体化して、最終の生成物の純度をさらに高める。
【００６７】
カラムの例としては、ＰＤ１０脱塩カラム（セファデックスＧ−２５  ＰＤ−１０カラム）及びエコノパック１０ＤＧ脱塩カラム（バイオ・ラッド）が挙げられる。
【００６８】
本明細書に提示の方法における精製のサイズ範囲はさまざまでありうる。１つの実施形態では、分子量Ｍrは１０００〜５０００００の範囲である。
【００６９】
選ばれた範囲は、確実に本発明の放射性免疫複合体などの放射性標識タンパク質が精製されるようにする。最適な精製のために他の範囲、例えば、分子量Ｍrで５００〜５０００、分子量Ｍrで１０００〜１００００が選ばれうる。
【００７０】
本発明のさらなる実施形態では、ステップｃ）の精製は、遠心分離駆動、圧力駆動、真空駆動、又は重力駆動からなる群より選択される方法の１つによって駆動される。
【００７１】
キレート剤
好ましくは、本発明の放射性核種は、キレート剤、又はより好ましくは二官能性キレート剤を使用することによって、抗体などのタンパク質に結合されることになる。
【００７２】
これらは、環状、直鎖状、又は分枝状のキレーターでありうる。主鎖窒素に結合した酸性（例えばカルボキシアルキル）基をもつ直鎖、環状、又は分岐ポリアザアルカン主鎖を含むポリアミノポリ酸キレート剤が特に参照することができる。
【００７３】
本発明のキレート剤は、212Ｐｂとの結合に敵している。これは、共有結合及び静電結合を含む当業者に公知の任意の従来の結合によってタンパク質に結合されうる。
【００７４】
好適なキレート剤の例としては、ＤＯＴＡ、及びｐ−イソチオシアナトベンジル−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＯＴＡ）などのＤＯＴＡ誘導体、並びにｐ−イソチオシアナトベンジル−ジエチレントリアミン五酢酸（ｐ−ＳＣＮ−Ｂｚ−ＤＴＰＡ）などのＤＴＰＡ誘導体が挙げられ、最初のものは環状キレート剤であり、後者は直鎖キレート剤である。
【００７５】
１つの実施形態では、キレート剤はＥＤＴＭＰ又はＤＯＴＭＰである。
【００７６】
本発明の別の実施形態では、キレート剤は、ＴＣＭＣとしても知られる２−（４−イソチオシアナトベンジル−１，４，７，１０−テトラアザ−１，４，７，１０，テトラ−（２−カルバモニルメチル（carbamonylmethyl））−シクロドデカンである。
【００７７】
抗体
本発明の抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。
【００７８】
本発明の１つの実施形態では、抗体は、トラスツズマブ、リツキシマブ、ＨＨ１、セツキシマブ、ベバシズマブ、ダラツムマブ、アレムツズマブ、ペンブロリズマブ、エピラツズマブ、Ｌ１９、Ｆ８、Ｆ１６、ガリキシマブ、トラリズマブ、アレムツズマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、アフツズマブ、トシツモマブ、Ｒｅｄｉｔｕｘ、及びイブリツモマブからなる群のうちの１つ以上から選択される。
【００７９】
本発明の別の実施形態では、抗体は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ７４、ＣＤ１３８、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ−２、ＥＧＦＲ、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−１８、ＣＥＡ、ＦＢＰ、ＮＧ２、ＥＰＣＡＭ、シンデカン−１、Ｃａ−１２５、ＬＫ−２６、ＨＭＦＧ、ＣＳ−１、及びＢＣＭＡからなる群より選択される抗原に特異的である。
【００８０】
放射性ヌクレオチド標識タンパク質
本発明の別の態様は、本発明による方法から回収される放射性核種標識抗体などの放射性核種標識タンパク質に関する。
【００８１】
本発明の別の態様は、遊離224Ｒａ及び抗体に結合した212Ｐｂを含む放射性核種標識抗体組成物などの放射性核種標識タンパク質に関する。
【００８２】
本発明の１つの実施形態では、この組成物は１０％未満の遊離224Ｒａを含む。
【００８３】
本発明の１つの実施形態では、この組成物は５％未満の遊離224Ｒａを含む。
【００８４】
本発明の別の実施形態では、この組成物は４％未満の遊離224Ｒａを含む。
【００８５】
本発明のさらなる実施形態では、この組成物は３％未満の遊離224Ｒａを含む。
【００８６】
本発明のさらなる実施形態では、この組成物は２％未満の遊離224Ｒａを含む。
【００８７】
本発明のさらなる実施形態では、この組成物は１％未満の遊離224Ｒａを含む。
【００８８】
本発明の別の実施形態では、この組成物は０．１％超の遊離224Ｒａを含む。
【００８９】
組成物はまた、０．１〜３％の遊離224Ｒａを含みうる。この範囲は、０．１〜２％の遊離224Ｒａ又は０．１〜１％の遊離224Ｒａであることもできる。
【００９０】
組成物は５０％未満の遊離212Ｂｉを含みうる。この量は１０〜５０％又は３０〜５０％であることもできる。
【００９１】
212Ｐｂの一部も遊離して、キレート剤−抗体に結合していないことがある。したがって、遊離212Ｐｂの量は１０％未満などの２０％未満でありうる。
【００９２】
したがって、本発明の態様は、タンパク質に結合した212Ｐｂ、タンパク質に結合した212Ｂｉ、０，１％〜２％の遊離224Ｒａ、５０％未満の遊離212Ｂｉ、及び２０％未満の遊離212Ｐｂを含む放射性核種標識タンパク質組成物に関する。
【００９３】
「遊離」という用語は、キレート剤−抗体に結合していない放射性核種を指す。これは本明細書に記載され、当業者に公知の技術で測定することができる。
【００９４】
キット
本発明の別の態様は、224Ｒａ及び212Ｐｂを含む水溶液、キレート剤と結合した抗体などのタンパク質を含む水溶液、ゲル濾過クロマトグラフィーのための手段、並びに任意選択で、放射性核種標識抗体などの放射性核種標識タンパク質の生成のための取扱説明書を含む、放射性核種標識抗体などの放射性核種標識タンパク質を生成するためのキットに関する。
【００９５】
ある実施形態では、キットは、患者への投与前に放射性医薬溶液のｐＨ及び／又は等張性を調整するための中和溶液を含むバイアルを含む。
【００９６】
本発明の１つの実施形態では、抗体などのキレート剤結合タンパク質は、放射性結合タンパク質又は放射性免疫複合体の回収の３０分〜６０分前に224Ｒａ及び212Ｐｂ溶液に加えられる。
【００９７】
本発明の１つの実施形態では、抗体などのキレート剤結合タンパク質は、放射性免疫複合体の回収の１分〜４５分前に224Ｒａ及び212Ｐｂ溶液に加えられる。
【００９８】
本発明の１つの実施形態では、抗体などのキレート剤結合タンパク質は、放射性免疫複合体の回収の２０分〜４５分前に224Ｒａ及び212Ｐｂ溶液に加えられる。
【００９９】
一般
本発明による化合物との関連で上述したいずれの特徴及び／又は態様も、本明細書に記載の方法への類推によって適用されることが理解されよう。
【０１００】
用語ＸとＹは互換可能に使用される。
【０１０１】
以下の図及び実施例は、本発明を説明するために下に提供される。これらは説明のためのものであり、決して限定と解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１０２】
実施例１  放射能測定
γ線分光分析を液体窒素で冷却した高純度ゲルマニウムウェル検出器システム（ＧＷＣ６０２１、Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、メリデン、コネチカット州、米国）をＤＳＡ１０００デジタルシグナルアナライザーに連結して行った。スペクトルを、Ｇｅｎｉｅ  ２０００ソフトウェア（バージョン３．１、Ｃａｎｂｅｒｒａ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、メリデン、コネチカット州、米国）で解析した。
【０１０３】
より多くの量の放射能を測定するために、放射性同位体キャリブレーター（ＣＲＣ−２５Ｒ、Ｃａｐｉｎｔｅｃ  Ｉｎｃ．、ラムジー、ニュージャージー州、米国）を使用した。
【０１０４】
放射性試料は、Ｃｏｂｒａ  ＩＩ  Ａｕｔｏｇａｍｍａカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｄｏｗｎｅｒ  Ｇｒｏｖｅ、イリノイ州、米国）又はＨｉｄｅｘ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｈｉｄｅｘ、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）でカウントした。
【０１０５】
実施例２  224Ｒａジェネレータ
224Ｒａジェネレータは、カラムにアクチノイド樹脂とともに充填された228Ｔｈ源から構成された。カラムは228Ｔｈを保持するが、224Ｒａ（及び娘核種）は１Ｍ  ＨＣｌで溶出することができる。溶媒の蒸発を含む濃縮放射性調製物を用いた作業はすべて、グローブボックス内で行った。
【０１０６】
１Ｍ  ＨＮＯ3中の228Ｔｈ源は供給業者（commercial supplier）から入手し、ＤＩＰＥＸ（登録商標）Ｅｘｔｒａｃｔａｎｔをベースとするアクチノイド樹脂は、２ｍｌの予め充填したカートリッジの形でＥｉｃｈｒｏｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＬＬＣ（ライル、イリノイ州、米国）から入手した。アクチニド樹脂カートリッジの材料を抽出し、樹脂を１Ｍ  ＨＣｌで前処理した。より少量の溶媒を使用するために、約２５％（０．５ｍｌ）の樹脂を、より小さい１ｍｌカラムであるＩｓｏｌｕｔｅ  ＳＰＥ（Ｂｉｏｔａｇｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）に再充填した。ジェネレータが動いている間に若干の228Ｔｈ放出がある場合、少量の228Ｔｈのキャッチャー層（catcher layer）として機能するように、不活性樹脂をカラムの底部に導入した。０．１Ｍ  ＨＮＯ3中の約４０％（０．４ｍｌ）のカートリッジ内容物と６００μｌの228Ｔｈのスラリーをバイアル（４ｍｌバイアル、Ｅ−Ｃ  ｓａｍｐｌｅ、Ｗｈｅａｔｏｎ、Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ、ニュージャージー州、米国）中で調製し、228Ｔｈを固定するために少なくとも４時間穏やかに攪拌しながらインキュベーションした。その後、放射性スラリーをカラムに載せた。
【０１０７】
このカラムから２ｍｌの１Ｍ  ＨＣｌでラジウムを常時（regularly）溶出することができた。さらなる精製では、２ｍｌの１Ｍ  粗ＨＣｌを蒸発させずに使用し、第２のアクチノイド樹脂カートリッジに載せ、１Ｍ  ＨＣｌを０．５ｍｌ追加して洗浄し、224Ｒａを含有する２．５ｍｌの溶出液を生成した。この溶液を、ヒーターブロックを用いて、バイアル瓶のゴム／テフロン（登録商標）セプタムのテフロン（登録商標）チューブの入口及び出口を通してバイアルにＮ2ガスを流し、Ｎ2ガスの流れによって酸蒸気を飽和ＮａＯＨのビーカーに導くことで蒸発乾固させた。蒸発後の残渣を０．２ｍｌ以上の０．１Ｍ  ＨＣｌに溶かした。
【０１０８】
溶出液中の228Ｔｈのブレークスルー（breakthrough）の可能性を、溶出液からの試料を224Ｒａの最低１０半減期（３６日）の間保存することによって調べ、活性を検定した。
【０１０９】
224Ｒａ溶液の純度
生成した224Ｒａ溶液の５％試料を保存することによって、228Ｔｈに対する224Ｒａの純度を評価することができた。少なくとも３か月間保存した、無作為に選択した５つの試料を使用した。存在するいずれの228Ｔｈも、測定時に224Ｒａ及び娘核種と平衡状態にあったであろう。測定は、228Ｔｈについて較正したＨｉｄｅｘガンマカウンターを使用して行った。
【０１１０】
実施例３  抗体の放射性標識
キレート剤であるＴＣＭＣ（２−（４−イソチオシアナトベンジル−１，４，７，１０−テトラアザ−１，４，７，１０，テトラ−（２−カルバモニルメチル（carbamonylmethyl）−シクロドデカン）に結合したヒト化抗−ＨＥＲ２  ＩｇＧ１モノクローナル抗体であるトラスツズマブ（ハーセプチン、ロシュ、バーゼル、スイス）を、212Ｐｂでの放射性標識に使用した。ＴＣＭＣに結合する前に、遠心濃縮機（Ｖｉｖａｓｐｉｎ１５Ｒ、５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ゲッティンゲン、ドイツ）で４時間洗浄することによってトラスツズマブ試料のバッファーを炭酸バッファー（金属を含まない水中の０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3及び５ｍＭ  Ｎａ2ＣＯ3）に交換した。バッファー交換後、抗体濃度を分光光度法で測定した。５ｍＭ  ＨＣｌに溶かしたＴＣＭＣの溶液を、炭酸バッファー中のトラスツズマブに５倍モル過剰で加えた。混合物を穏やかに撹拌しながら室温で２時間反応させた。ＴＣＭＣ−トラスツズマブから非結合キレート剤を分離し、同時に炭酸バッファーを０．９％ＮａＣｌに交換するために、遠心分離濾過カートリッジ（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  １５Ｒ、５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を使用した。試料を０．９％ＮａＣｌで１：１０に希釈し、抗体複合体を遠心分離によって１０倍に濃縮した。この手順を合計３回繰り返した。ＴＣＭＣ−トラスツズマブ複合体を放射性標識するまで４℃で保存した。
【０１１１】
娘核種と平衡した224Ｒａの溶液を１０％の５Ｍ  ＮＨ4ＯＡｃで緩衝化した。ｐＨを用いて溶液のｐＨが５〜６であることを確認した。ＴＣＭＣ−トラスツズマブと放射性溶液を混合し、サーモシェーカーで７５０ｒｐｍ及び３７℃にて最低３０分間インキュベーションした。以下では、212Ｐｂ標識トラスツズマブ、遊離224Ｒａ、及び娘核種からなるこの溶液を「反応混合物」と呼ぶ。標識は、０．１〜４ｍｇ／ｍｌの範囲の、最終反応混合物中のさまざまなＴＣＭＣ−トラスツズマブ濃度で行った。
【０１１２】
実施例４  インスタント薄層クロマトグラフィー（Instant thin layer chromatography）アッセイ手順
反応混合物中の212Ｐｂ標識抗体の放射化学的純度を、インスタント薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）ストリップ（モデル＃１５０−７７２、Ｂｉｏｄｅｘ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ、シャーリー、ニューヨーク州、米国）で評価した。反応混合物のアリコートを、２倍過剰（体積に基づく）の、ＤＰＢＳ中に７．５％  ヒト血清アルブミンと５ｍＭ  ＥＤＴＡからなる調合バッファー（formulation buffer）と混ぜ、ＮａＯＨで約ｐＨ７に調整した。混合物を４〜５秒間回転混合（whirlmix）し、さらに５〜１０分間放置した。原点（origin line）に典型的には１〜４μｌの試料を用いてストリップをスポットし、展開のために約０．５ｍｌの０．９％ＮａＣｌの入った小さなビーカーに入れた。溶媒フロントが指定の溶媒フロントラインに移動した後、ストリップをカットラインで半分に切り、各半分を計数用の５ｍｌ試験管に入れた。この系では、212Ｐｂ標識抗体は、下半分から移動せず、ＥＤＴＡとの複合212Ｐｂは上半分に移動する。
【０１１３】
実施例５  放射性標識抗体の精製
この研究に記載の方法の所望の最終生成物は、212Ｐｂ標識ＴＣＭＣ−トラスツズマブの純粋な溶液である。これを達成するために、遊離224Ｒａと他の非結合娘核種を除去するように我々の反応混合物を精製する必要がある。２つの異なる精製方法、遠心濃縮による精製及び脱塩カラムによる精製を評価した。
【０１１４】
遠心濃縮による精製は、５０ｋＤａ  ＭＷＣＯのＶｉｖａｓｐｉｎ４を用いて行った。反応混合物を濃縮器スピンチューブに入れ、総体積が４ｍｌになるまで０．９％ＮａＣｌで希釈した。さらに内容物を遠心分離により約１０倍に濃縮した。濾液と精製抗体溶液の両方を集め、放射能を測定した。これらの測定値から、本発明の方法の収率を推定した。
【０１１５】
【数１】
2019523232.tif 000002
【０１１６】
次いで、224Ｒａと212Ｐｂを再測定する前に、それらの間の平衡を確立するために試料を最低４８時間壊変させ、精製抗体溶液中の２２４Ｒａの％割合を計算した。
【０１１７】
【数２】
2019523232.tif 000003
【０１１８】
セファデックスＧ−２５  ＰＤ−１０カラム（アマシャム・バイオサイエンス、Ｕｐｐｓａｌ、スウェーデン）を反応混合物の精製に使用した。最初に、溶出バッファーとして０．５％ＢＳＡを補充したダルベッコのＰＢＳを用いて、製造元のプロトコールに従ってカラムを平衡化した。ＰＤ１０精製を粗反応混合物と、１０倍過剰の（体積に基づく）調合バッファーを加えた反応混合物で行った。
【０１１９】
調合バッファーは、遊離放射性核種と複合体形成するＥＤＴＡを含有した。混合物をＰＤ１０カラムに加える前に最低１０分間反応させた。反応混合物をカラムの上部に載せ、追加の溶出バッファーを加える前にカラムに完全に入るようにした。さらなる放射能測定のために、各１ｍｌの７つの画分をエッペンドルフチューブに集めるまで溶出過程を続けた。放射性標識された抗体は典型的には画分３〜５に溶出され、この方法の収率を測定値から推定した。
【０１２０】
【数３】
2019523232.tif 000004
【０１２１】
画分４の生成物のＲＣＰを前述のＩＴＬＣ手順で決定した。次いで、224Ｒａと212Ｐｂを再測定する前に、それらの間の平衡を確立するために試料を最低４８時間壊変させ、画分３〜５中の224Ｒａの％割合を計算した。
【０１２２】
【数４】
2019523232.tif 000005
【０１２３】
実施例６  結果
224Ｒａの放射化学的純度
遡って測定された５つの試料すべてについて、228Ｔｈは、224Ｒａの１ＭＢｑ当たり１Ｂｑと推定される検出限界（壊変補正済み）を下回っていた。したがって、精製方法は、生物医学用途のための224Ｒａを調製するのに非常に適していると思われる。
【０１２４】
ＴＣＭＣ−トラスツズマブの鉛２１２標識
224Ｒａの存在下での溶液中の212Ｐｂの標識は、抗体複合体の０．１５ｍｇ／ｍｌ以上で９０％を超える収率で良好に機能した（表１）。
【０１２５】
微小濃縮（microconcentration）遠心分離装置を用いた本発明の224Ｒａカチオンからの212Ｐｂ標識抗体複合体の精製
カチオン性224Ｒａに対する212Ｐｂ標識トラスツズマブの濃縮及び分離に関するデータを表２に示す。表から分かるように、手順に起因する、212Ｐｂ標識トラスツズマブの約３分の１の有意な損失がある。放射性複合体からの224Ｒａの分離は７５％完了し、212Ｐｂ標識トラスツズマブの224Ｒａに対する比が１：１から約３：１に向上することを示し、これは212Ｐｂ標識放射性免疫複合体の生物医学的な使用に満足いくものではない。
【０１２６】
ＰＤ−１０ゲル濾過使い捨てカラムによる脱塩を用いた本発明の224Ｒａカチオンからの212Ｐｂ標識抗体複合体の精製
カチオン性の224Ｒａに対する212Ｐｂ標識トラスツズマブの濃縮及び分離に関するデータを表２に示す。212Ｐｂ−トラスツズマブの回収率は典型的には８０％又はそれ以上であり、これは非常に好ましい。また、212Ｐｂ−トラスツズマブのＲＣＰは９５％超に増加する傾向がある。そのうえ、ＥＤＴＡを使用して反応混合物をクエンチした場合、溶液からの224Ｒａの除去は非常に効果的であり、典型的には212Ｐｂ−トラスツズマブ画分に２％未満の溶出である。したがって、224Ｒａ／212Ｐｂ混合物から調製したＰＤ−１０精製212Ｐｂ−トラスツズマブの使用が実行可能でありうる。
【０１２７】
表１  224Ｒａ溶液における212ＰｂでのＴＣＭＣ−抗体複合体標識
【０１２８】
【表１】
2019523232.tif 000006
【０１２９】
表２  224Ｒａ溶液における212ＰｂでのＴＣＭＣ−抗体複合体標識
遠心分離微小濃縮器を使用した224Ｒａ溶液に対する212Ｐｂ標識ＴＣＭＣ−抗体複合体の精製
【０１３０】
【表２】
2019523232.tif 000007
【０１３１】
ＰＤ１0:
表３  セファデックスＧ−２５  ＰＤ１０ゲル濾過脱塩使い捨てカラムを使用した224Ｒａ溶液に対する212Ｐｂ標識ＴＣＭＣ−抗体複合体の精製
【０１３２】
【表３】
2019523232.tif 000008
【０１３３】
実施例７  考察
今回の研究は、212Ｐｂと平衡状態にある224Ｒａの溶液中で、効率的にＴＣＭＣ−結合モノクローナル抗体を212Ｐｂで標識できることを示している。それに続いて、脱塩ゲル排除分離を用いて、212Ｐｂ標識複合体をカチオン性の224Ｒａから分離することができる。これは、すぐに使える224Ｒａ／212Ｐｂ溶液が、集中供給元からエンドユーザーに出荷できることを意味する。溶液中で224Ｒａを使用する利点は２つあり、（１）酸抽出ステップが回避されるので手順を実行するのに費やす時間が少ない及び（２）労力が少なく、酸の蒸発などを必要としないことある。強直性脊椎炎の治療に224Ｒａを使用する研究から、適度な量（典型的には１０ＭＢｑ未満）が、無視できない骨髄毒性を伴わずに患者に投与できることが知られており、（３）212Ｐｂをベースとする生成物中の１〜２％の含量、例えば１００ＭＢｑは、212Ｐｂ生成物が高い程度の骨髄毒性を生じさせない限り許容されると思われることを示している。224Ｒａに関してより純粋な生成物が必要と思われる場合は、第２のＰＤ−１０カラムで精製を繰り返すことでこれを達成しうる。（能力は急速に減少するが）数回「ミルキング」することができる現在のイオン交換に基づくジェネレータと比較して、記載の224Ｒａ溶液に基づくジェネレータは単回使用のみのためであることになる。結論として、今回の研究は、現在のイオン交換に基づく方法と比較して、簡単で費やす時間を少なくできる、212Ｐｂをベースとする放射性免疫複合体を作製するための出荷可能なジェネレータとして224Ｒａを使用する代替的なやり方を示す。
【０１３４】
実施例８  新規の224Ｒａをベースとするジェネレータ溶液を用いた212Ｐｂ標識モノクローナル抗体の調製
方法
放射能測定
放射性試料は、Ｃｏｂｒａ  ＩＩ  Ａｕｔｏｇａｍｍａカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｄｏｗｎｅｒ  Ｇｒｏｖｅ、イリノイ州、米国）の７０〜８０ｋｅＶウィンドウ又はＨｉｄｅｘ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｇａｍｍａ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｈｉｄｅｘ、Ｔｕｒｋｕ、フィンランド）の６０〜１１０ｋｅＶウィンドウと５２０〜６４０ｋｅＶウィンドウで測定した。１１０ｋｅＶ未満のエネルギー範囲は、系列の他の放射性核種からの寄与が非常に小さく、212Ｐｂからのγ放射線を主にカウントすると考えられた。224Ｒａ壊変は、212Ｐｂからのより豊富なγ線を含むエネルギー領域での適度なγ線放出を有するので、224Ｒａ活性は７０〜８０ｋｅＶ又は６０〜１１０ｋｅＶのウィンドウでのカウントから間接的に決定した。これは、試料中に存在する初期の212Ｐｂが崩壊し、224Ｒａと新しく生成された212Ｐｂとの平衡が達せられた３日後又はそれ以降に、試料を再測定することによって行った。非常に豊富な208Ｔｌγ線から間接的に212Ｂｉを測定するための５２０〜６４０ｋｅＶのウィンドウを評価した。212Ｐｂと208Ｔｌ  212Ｂｉの間の過渡平衡を得るために212Ｂｉの試料を約２０分間保ち、その後に測定した。表１には、１％より高い存在度（abundancy）を有する224Ｒａ系列のγ線が示されている。これは、６０〜１１０ｋｅＶ及び５２０〜６４０ｋｅＶのウィンドウにＸ線及び／又はγ線を有する放射性核種の概要を示す。５０ｋＢｑを超える放射能の量は、ラジオアイソトープキャリブレーター（ＣＲＣ−２５Ｒ、Ｃａｐｉｎｔｅｃ  Ｉｎｃ．、ラムジー、ニュージャージー州、米国）で測定した。
【０１３５】
224Ｒａジェネレータ
トリウム２２８（Ｅｃｋｅｒｔ  ＆  Ｚｉｅｇｌｅｒ、ブラウンシュヴァイク、ドイツ）を、カラムカートリッジ内のＤＩＰＥＸ（登録商標）（Ｅｉｃｈｒｏｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＬＬＣ、ライル、イリノイ州、米国）アクチニド樹脂上に固定した。カートリッジをＨＣｌで溶出することにより、２２４Ｒａをジェネレータから抽出した。224Ｒａ発生装置のセットアップの詳細は他の文献で示されている（米国特許第９４３３６９０（Ｂ１）号明細書）。
【０１３６】
抗体の放射性標識
モノクローナル抗体トラスツズマブ（ハーセプチン、ロシュ、バーゼル、スイス）をキレート剤ＴＣＭＣ（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ  Ｉｎｃ．、ダラス、テキサス州、米国）に結合し、212Ｐｂで放射性標識するのに使用した。
【０１３７】
ＴＣＭＣ標識の前に、トラスツズマブの元のバッファーを炭酸バッファー（ｐＨ  Ｅｕｒグレードの金属を含まない水中の０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3及び５ｍＭ  Ｎａ2ＣＯ3）で交換した。遠心濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ１５Ｒ、３０又は５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ゲッティンゲン、ドイツ）を使用して、炭酸バッファーでトラスツズマブの溶液を洗浄し、４倍に濃縮した。各繰り返しステップの間、トラスツズマブは１０倍に濃縮された。濃度測定には、０．１％溶液について２８０ｎｍでの免疫グロブリンの標準吸光度値１．４を使用するＵＶ分光光度法（日立Ｕ−１９００、日立ハイテクノロジーズ株式会社、東京、日本）を用いた。ＴＣＭＣを抗体に結合させるために、５ｍＭ  ＨＣｌに溶かしたＴＣＭＣの溶液を炭酸バッファー中のトラスツズマブに５〜１０倍モル過剰で加えた。混合物を穏やかに撹拌しながら、室温で２時間反応させた後、上記のように遠心濃縮器カートリッジ（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  １５Ｒ、３０又は５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）を用いて炭酸バッファーを０．９％ＮａＣｌと繰り返し交換することによって、非結合キレート剤をＴＣＭＣ−トラスツズマブから分離し、ｐＨを下げた。ＴＣＭＣ−トラスツズマブ複合体を放射性標識するまで冷蔵庫に保存した。
【０１３８】
０．１Ｍ  ＨＣｌ及び０．５Ｍ  ＮＨ4ＯＡｃ中の子孫核種と平衡状態のラジウム２２４を放射性標識に使用した。溶液のｐＨは、ｐＨ指示紙（メルクミリポアの一般的なｐＨ指示紙、メルクＫＧａＡ、ダルムシュタット、ドイツ）を用いて約５〜６であることを確認した。ＴＣＭＣ−トラスツズマブを、ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒＲ（エッペンドルフＡＧ、ハンブルク、ドイツ）で３７℃及び７５０ｒｐｍにて、224Ｒａ溶液と最低３０分間インキュベーションした。この溶液を「反応混合物」と呼ぶ。224Ｒａ溶液中のさまざまな濃度（０．１〜６ｍｇ／ｍＬの範囲）のＴＣＭＣ−トラスツズマブ複合体を記載の方法で試験した。典型的には、反応混合物の体積は３０〜１３０μＬｌであった。
【０１３９】
ＴＣＭＣ−トラスツズマブ（４ｍｇ／ｍｌ）の212Ｐｂと212Ｂｉの標識を評価する特別な実験では、試料を５分後、１５分後、及び２５分後に反応バイアルから取り出し、インスタント薄層クロマトグラフィーで分析した。
【０１４０】
くわえて、反応混合物を一晩インキュベーションして放射性標識された生成物に対する高い放射線量を得ることによって、放射線分解実験を行った。続いて、生成物を高速液体クロマトグラフィーで分析した。
【０１４１】
さらに、免疫反応性画分を、以前に記載されているようにワンポイントアッセイ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27776176）を使用することによって、抗原陽性腫瘍細胞を用いて決定した。
【０１４２】
インスタント薄層クロマトグラフィーアッセイ手順
標識収率は、反応混合物中の212Ｐｂ標識抗体の放射化学的純度（ＲＣＰ）も意味し、即時薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）ストリップ（モデル＃１５０−７７２、Ｂｉｏｄｅｘ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ、シャーリー、ニューヨーク州、米国）で測定した。反応混合物の試料を、ダルベッコＰＢＳ中の７．５％ヒト血清アルブミンと５ｍＭ  ＥＤＴＡからなる２倍過剰の調合バッファー（ＦＢ）と混合し、ＮａＯＨでｐＨ７に調整した。反応混合物／ＦＢを約５秒間振盪し、少なくとも５分間放置して、未結合の放射性同位体がＥＤＴＡと複合体を形成できるようにした。原点に典型的には３μＬの試料を用いてＩＴＬＣストリップをスポットし、展開のために少量の０．９％ＮａＣｌの入った小さなビーカーに入れた。溶媒フロントがほぼ上端に移動した後、ストリップを引き出し、ストリップをカットラインで半分に切り、各半分をカウント用ガラス管に入れた。この系では、212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブは、下半分に固定された状態のままで（Ｂ）、ＥＤＴＡとの複合212Ｐｂ（及び他の遊離放射性核種）は上半分に移動する（Ｕ）。抗体付いた％割合としての212Ｐｂの画分を次のように決定した。
【０１４３】
【数５】
2019523232.tif 000009
【０１４４】
式中、ＣＰＭは１分当たりの計数率を表す。
【０１４５】
免疫反応性画分の決定
212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブの免疫反応性画分を、以前に論文報告されているようにワンポイント細胞結合アッセイ（Westrom et al 2016)で決定した。
【０１４６】
手短に言えば、１６〜２０×１０6個のＨＥＲ２を発現するヒト骨肉腫細胞ＯＨＳの試料を、212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブと室温でインキュベーションするか、又は212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブを加える前に過剰のトラスツズマブでブロックした。洗浄前に加えた全活性及び洗浄後の結合活性を各試料について測定した。212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブの免疫反応性画分は、洗浄前に加えた合計で割り、ブロックした試料について決定した同じ画分を引いた洗浄後の全結合で決定した分画であると推定した。
【０１４７】
高速液体クロマトグラフィー
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムは、サイズ排除ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、製品番号０８５４１）、ＵＶ（２２０と２８０ｎｍ）、と放射検出器（Ｒａｄｉｏｍａｔｉｃ  １５０ＴＲ  Ｆｌｏｗ  Ｓｃｉｎｃｉｌｌａｔｏｒ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、パーキンエルマー）を組み合わせた１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＶＬシステムから構成した。移動相は、２５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）から作製した。０．８ｍｌ／分の流量を用いた。
【０１４８】
放射性標識抗体の精製
遠心濃縮器と精製又は脱塩カラムのいずれかを使用して精製を行った。遠心濃縮を用いた場合、反応混合物を濃縮器スピンチューブ（Ｖｉｖａｓｐｉｎ４、５０ｋＤａ  ＭＷＣＯ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ゲッティンゲン、ドイツ）に載せ、総体積が４ｍｌになるまで０．９％ＮａＣｌで希釈した。内容物を遠心分離により約１０倍に濃縮した。濃縮物（Ｃ）を集め、直ちに測定した（ｔ＝０）。この精製方法の収率（Ｙ）を濃縮物中の抗体結合212Ｐｂ活性の％割合として推定した。
【０１４９】
【数６】
2019523232.tif 000010
【０１５０】
遠心濃縮器に載せた全活性（Ｔ）を、精製前に採取した反応混合物から取り出し、密封した試料から決定した。224Ｒａと212Ｐｂの平衡に達した、最初の測定の最低３日後（ｔ＝ｅｑ）に、すべての試料を再度測定し、濃縮物に残存する224Ｒａの％割合を計算した。
【０１５１】
【数７】
2019523232.tif 000011
【０１５２】
評価した代替精製法では、非結合放射性核種から放射性標識ＴＣＭＣ−トラスツズマブを分離するためにセファデックスＧ−２５  ＰＤ−１０カラム（ヘルスケアバイオサイエンスＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用した。カラムを、０．５％ウシ血清アルブミンを補充した少なくとも２０ｍＬのダルベッコＰＢＳで洗浄した後、精製に使用した。粗反応混合物及び調合バッファーを加えた反応混合物をＰＤ−１０で精製した。反応混合物を調合バッファーと少なくとも１０分間反応させて、添加前にＥＤＴＡが未結合放射性同位体と複合体を形成できるようにした。
【０１５３】
精製にＰＤ−１０カラムを使用する場合、試料をカラムの上部に載せ、追加の溶出バッファーを加える前にカラムベッドに完全に入るようにした。エッペンドルフチューブにそれぞれ１ｍＬの少なくとも７つの画分を集めるまで、溶出過程を続けた。すべての画分の活性を直ちに測定した。放射性標識された抗体は、通常、画分３〜５（Ｆ３〜Ｆ５）に溶出された。これはＴＬＣ分析で確認された。本発明の方法の収率は、全添加212Ｐｂ活性に対するこれらの画分中の抗体結合212Ｐｂ活性の％割合であると推定された。
【０１５４】
【数８】
2019523232.tif 000012
【０１５５】
ＰＤ−１０カラムに載せた、全添加212Ｐｂ活性（Ｔ）を、精製の前に採取した反応混合物のアリコートから調製した密封標準試料から決定した。画分４の生成物のＲＣＰは前述のＩＴＬＣ手順によって決定した。少なくとも３日後、試料を再測定し、画分３〜５に残存する224Ｒａの％割合を計算した。
【０１５６】
【数９】
2019523232.tif 000013
【０１５７】
放射性核種とタンパク質画分との共溶出を評価するために、放射性標識及びＰＤ−１０精製を上記のように行ったが、ＴＣＭＣ結合トラスツズマブの代わりに非結合トラスツズマブを用いた実験を行った。７つの回収画分中の212Ｐｂと212Ｂｉの存在は、６０〜１１０と５２０〜６４０ｋｅＶのウィンドウでの測定によって決定した。ＰＤ−１０の精製が完了した５分後、２０分後、１時間後、１日後、及び５日後の試料を測定することによって、壊変率も評価することができた。これは、５２０〜６４０ｋｅＶのウィンドウでのγ線活性が、208Ｔｌに加えて212Ｂｉの存在を反映しているかどうかを確認するために必要であった。すべての試料が平衡に達した５日目の測定から、224Ｒａの量を測定した。
【０１５８】
ＴＣＭＣキレート剤によるα線放出212Ｐｂ娘核種212Ｂｉの保持
平衡状態にある224Ｒａ溶液において、212Ｐｂ活性に対する212Ｂｉ活性の比はほぼ１に等しい。子孫核種と平衡状態にある密封した224Ｒａ試料を、６０〜１１０ｋｅＶと５２０〜６４０ｋｅＶのウィンドウの効率係数（efficiency factor）（Ｂｑ／ｃｐｍ）を決定するための標準物質として使用した。ＥＤＴＡでクエンチした反応混合物をＰＤ−１０精製した後、画分４を、精製終了の１０分後、２０分後、６０分後、及び２２時間後に測定した。さまざまな時点における212Ｂｉ対212Ｐｂの比を、効率係数を用いて評価した。オンラインユニバーサル減衰計算機（online universal decay calculator）（http://www.wise-uranium.org/rcc.html）を使用して、212Ｂｉが存在しない純粋な212Ｐｂの試料から、活性比が１に等しい試料までの範囲にある、異なる初期の212Ｂｉ対212Ｐｂ比に基づく時間の関数として理論的な212Ｂｉ対212Ｐｂ比を求めた。精製後直ちに画分４中のすべての活性が抗体複合体に結合したと仮定して、ＴＣＭＣ−キレート剤中に保持された212Ｂｉの部分の推定値は、実験的に決定された比を、異なる理論的な212Ｂｉ対212Ｐｂ比の内部増殖のプロットと比較することによって演繹することができた。
【０１５９】
結果及び考察
娘核種と平衡状態にある224Ｒａの溶液中の212Ｐｂを用いたＴＣＭＣ−トラスツズマブの放射性標識が成功した。この手順によって、０．１５ｍｇ／ｍＬの抗体複合体で既に９０％超のＲＣＰをもつ生成物及び１ｍｇ／ｍＬ以上の高い濃度で９５％超のＲＣＰをもつ生成物が得られた。３つの標識実験において、生成物の免疫反応性画分を測定した。それは５７〜６６％の範囲であり、212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブの免疫反応性に関して以前に論文報告された結果と一致している。
【０１６０】
標識は娘核種と平衡状態にある224Ｒａの溶液中で行ったので、インキュベーションの間に212Ｂｉが存在することになる。したがって、永続平衡に達して212Ｂｉを構成した後、ＲＣＰを208Ｔｌウィンドウでも測定した。この測定から、５０〜８０の範囲の値が得られた。４ｍｇ／ｍｌＴＣＭＣ−トラスツズマブ濃度において、212Ｐｂは反応の５分後に既に定量的に複合体を形成しており、８０％を超える212Ｂｉも複合体を形成していたことが判明した。
【０１６１】
さまざまな範囲の抗体濃度にわたる212Ｐｂ標識の成功は、放射性免疫複合体の多様な比活性が得られうること示す。
【０１６２】
この研究は主に概念の証明を示すことを目的としていたので、臨床の現場で期待されるものと比較して比較的低い活性レベルが用いられた。したがって、放射性標識は、関連する臨床的な活性濃度をシミュレーションするために、非常に少量、典型的には３０〜１３０μＬで実施した。少量であるために、使用した活性が低いにもかかわらず、最終生成物の比較的高い比活性を得ることが可能であった。この研究で達成された212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブの最高比活性は、約３０ＭＢｑ／ｍｇであり、212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブを用いた最近の臨床試験で使用されたものに匹敵する。
【０１６３】
224Ｒａの完全な壊変に際し、安定した208Ｐｂが形成されるが、それはＴＣＭＣキレート剤への結合に関して212Ｐｂと競合する可能性がある。ここで使用された活性レベルでは、208Ｐｂの存在が、達成することが可能である比較的高い比活性に起因する放射性標識の収率に影響を及ぼしたということを示唆するものはなかった。しかし、より高い224Ｒａ活性が使用され、以下の推定が行われた場合、状況は異なる可能性がある：１００ＭＢｑの224Ｒａの溶液中に１ｍｇの標識された抗体を仮定する。これは、４×１０15分子に相当し、１つの抗体当たり２〜５つのＴＣＭＣキレート剤を想定でき、８〜２０×１０15個の利用可能な鉛結合部位を与える。１００ＭＢｑの224Ｒａの完全な壊変は約４．５×１０13個の208Ｐｂ原子を形成することになる。これらの数字は、これらの数字は、２０８Ｐｂの存在が放射性標識の収率に有意な程度影響してはならないことを示している。
【０１６４】
この研究に記載の方法の所望の最終生成物は、純粋な212Ｐｂ標識ＴＣＭＣ−抗体の溶液である。所望の最終生成物を達成するために212Ｐｂ標識抗体複合体を含む溶液を精製して遊離224Ｒａ及び他の非結合娘核種を除去した。遠心分離による精製と脱塩カラムによる精製の２つの異なる精製方法を評価した。両方法は、遊離イオン、結合していないキレート剤分子、及び塩などの低分子量化合物からの抗体−複合体のサイズに依存する分離に基づく。
【０１６５】
カチオン性224Ｒａ及び他の非結合娘核種から212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブを分離するための遠心濃縮機の使用は、７０．５±９．６％（ｎ＝６）の濃縮物中の抗体結合212Ｐｂ活性をもたらした。この手順に起因する212Ｐｂ標識トラスツズマブの約３分の１の損失は有意であるが、それでもＰＤ−１０カラム精製後の212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブの既報の収率（７３±３％）と一致する。濃縮物中に残存する224Ｒａの量は２５．９±１３．１％（ｎ＝６）であり、すなわち、放射性免疫複合体からの224Ｒａの分離は７５％しか完了しなかった。212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブの224Ｒａに対する比は、１：１からわずかに約３：１に改善したが、これは212Ｐｂ標識放射性免疫複合体の生物医学的使用にとって満足のいく結果ではない。くわえて、我々は、より多くの量の抗体−複合体が適用された場合、精製後の濃縮物中に224Ｒａがより高い％割合で残るというわずかな傾向に気付いた。この観察結果は、膜を通るイオンの濾過効率を低下させるタンパク質による膜の飽和又は詰まりを示しうる。
【０１６６】
ＰＤ−１０ゲル濾過カラムを使用した場合、224Ｒａ及び他の非結合娘核種からの212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブの分離が一段と成功した。ＰＤ−１０のようなゲル濾過カラムの使用は、放射性標識抗体の精製に一般的であり、抗体含有溶液からの非結合放射性核種などの低分子量物質の迅速な除去を可能にする。212Ｐｂ−トラスツズマブの回収率は非常に好ましいものであり、反応混合物をＥＤＴＡでクエンチすることとは無関係に、画分３〜５において約８０％の収率であった。表３から、タンパク質複合体の大部分（約７０％）が３〜４ｍＬ（画分４）から溶出されたことも明らかである。これは、２．５〜４．２ｍＬから回収されたＰＤ−１０溶出液における収率が７３％（１．７ｍＬ）であることを報告しているＢａｉｄｏｏらと一致する。212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブを含有する溶液からの224Ｒａの除去は非常に効率的であり、典型的には画分３〜５に４％未満の224Ｒａが残り、ＥＤＴＡを使用して反応混合物をクエンチした場合、分離がより効率的である傾向があった。224Ｒａが４．５ｍＬの後に溶出し始めることがいくつかの実験で見られ、224Ｒａの量を最小限にするために、画分５を分析から除外することを決定した。次いで、224Ｒａのブレークスルーは、ＥＤＴＡを用いた場合及び用いなかった場合で、０．９±０．８％及び２．７±３．６％に低下する可能性があったが、しかし、約５％の212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブの収率の控えめな低下を犠牲にして、それぞれ７６．７±１１．７％及び７６．１±５．９％になった。画分４のＩＴＬＣ分析は、精製前と比較して212Ｐｂ−トラスツズマブのＲＣＰの増加をもたらし、平均９８±１％（ｎ＝８）であった。結果はすべて、224Ｒａ／212Ｐｂ混合物から調製したＰＤ−１０精製212Ｐｂ−トラスツズマブの使用が実行可能であることを明らかに示している。
【０１６７】
224Ｒａ溶液中の放射性核種のいずれかがトラスツズマブに非特異的に結合し、それによってタンパク質画分と共溶出するかどうかを調べるために実験を行い、そこでは、ＴＣＭＣ−トラスツズマブをトラスツズマブで置き換えたことを除いて、放射性標識プロトコール及びＰＤ−１０精製を通常通り行った。212Ｂｉ、212Ｐｂ、及び224Ｒの存在を、ＰＤ−１０精製が完了した後のさまざまな時点で７つの回収画分を測定することによって評価した。６０〜１１０ｋｅＶ及び５２０〜６４０ｋｅＶのウィンドウにおける全活性の％割合をそれぞれ試験した。ＥＤＴＡが存在しない場合、相当量（３２％）の212Ｂｉが画分４と画分５の抗体と共溶出した。崩壊率から、このウィンドウ（５２０〜６４０ｋｅＶ）で測定された活性は、親核種212Ｂｉの半減期とともに壊変するにつれて、212Ｂｉから208Ｔｌへの内部増殖（in-growth）から明らかに生じることが分かる。
【０１６８】
ＥＤＴＡを使用して反応混合物をクエンチした場合、212Ｂｉの共溶出は同じ画分で１．３％に減少した。ＥＤＴＡが存在する場合、212Ｐｂの共溶出はＰＤ−１０溶出液の画分３と画分４において重要ではなく、画分５では２％未満であった。ＥＤＴＡが存在しない場合、画分３〜５において、全212Ｐｂ活性の約５％が抗体と共溶出した。５日目の測定値からわかるように、224Ｒａの共溶出はどちらの場合もごくわずかであった（０．７％未満）。まとめると、結果は、212Ｐｂをベースとする放射性免疫複合体の調製に224Ｒａ溶液を使用したとき、ＰＤ−１０カラムでの精製前にＥＤＴＡを使用して反応混合物をクエンチすることは、生成物純度を最大にすることを明らかに示している。この手段は、抗体画分からの非特異的結合212Ｂｉ及び212Ｐｂを除去すると同時に、最終生成物中に残存する224Ｒａをより少なくする。
【０１６９】
ＴＣＭＣにキレートされた212Ｐｂが壊変する場合、212Ｂｉの最終的にどうなるかについての知識を持つことは興味深い。遊離212Ｂｉによって引き起こされる放射能毒性を回避するためには、212Ｂｉの実質的な部分が崩壊に際してＴＣＭＣ−キレート剤によって保持されることが望ましい。Ｍｉｒｚａｄｅｈらは、212Ｐｂが崩壊したときに212Ｂｉの３６％がＤＯＴＡ−キレート剤から放出されることを見出し、複合体の分解は、励起された212Ｂｉ核から放出されたγ線からの内部変換によるものであると主張した。我々は、212Ｐｂが崩壊するときにＴＣＭＣ−キレート剤による212Ｂｉの保持についての対応する試験を見出さなかったので、我々のデータに基づいて推定を行った。我々は精製を終了した後のさまざまな時点でのＰＤ−１０精製生成物の画分４の212Ｂｉ対212Ｐｂ比を決定した。存在する212Ｂｉの初期量に依存して、212Ｂｉ／212Ｐｂ比は、核種が過度平衡状態にある最大プラトーに達する前に、程度の差はあるものの増加する。画分４のすべての活性が精製後直ちに抗体複合体に結合するという仮定の下、精製終了時から測定時まで間の212Ｐｂからの212Ｂｉの内部増殖を考慮に入れて、最小でも212Ｂｉの６０％が、212Ｐｂの崩壊後にＴＣＭＣ−キレート剤と結合していたと推定される。我々が見出した値は、ＤＯＴＡ−キレート剤による212Ｂｉ保持に関する既述のデータとよく一致している。ＴＣＭＣ−キレート剤の４つのＮ−ドナー原子及び４つのＯ−ドナー原子は、ビスマスとの良好な結合能をもたらすことになり、したがってＴＣＭＣ−キレート剤の212Ｂｉの比較的高い保持は起こりそうにないと主張されている。
【０１７０】
今回の研究は、ＴＣＭＣ−結合モノクローナル抗体が、子孫との平衡状態にある224Ｒａの溶液からの212Ｐｂで効率的に標識できることを示す。４ｍｇ／ｍｌのＴＣＭＣ−トラスツズマブの濃度を用いた場合、わずか５分後に212Ｐｂでの標識は定量的であろう。この濃度では、212Ｂｉの大部分が抗体複合体によってキレート化されることになることも観察された。その後続いて、212Ｐｂ標識複合体は、脱塩ゲル排除分離を用いてカチオン性の224Ｒａから分離することができる。（最大で２週間にわたって）数回溶出できるイオン交換に基づく現在のジェネレータとは対照的に、ここに記載の212Ｐｂジェネレータは、単回投与量のみの調製のために設計されている。
【０１７１】
ここで提案する方法では、すぐに使える224Ｒａ溶液を集中供給者元からエンドユーザーに出荷することができる。これは、ロジスティックの観点からも、エンドユーザーに必要な作業が軽減され、簡素化されるので、有益である。我々は、放射能レベルが高い濃縮酸溶液の取扱いと蒸発を伴うステップが、病院又は放射性医薬取り扱い薬局（radiopharmacy）の設定で完全に回避できることが、本発明の方法の利点であると考えている。酸消化手順を排除することに伴うさらなる利点は、実施される必要があるのが、実際の抗体の標識及び精製のみであるため、病院での総調製時間が短くなることであろう。Ｂａｉｄｏｏらは、この方法のこの部分は、注射による投薬の総調製時間約２１０分のうちのわずか８０分を必要とすることを報告した。より短い調製時間は、壊変によって引き起こされる活性損失を減らし、したがって、患者に投与される212Ｐｂの量の増加につながる。これは、注射時に製品中の遊離娘核種の量を制限すること及び抗体の放射線分解に伴う潜在的な問題のリスクを最小限にすることの両方に有益である。
【０１７２】
抗体の放射性標識のための提案の方法の評価において、放射線安全要求事項に対処することも重要である。α線放出放射性核種のオープンソースにかかわるすべての手順と同様に、吸入や摂取を避けるために事前に注意を払わなければならない。したがって、すべての取扱いは、作業者を保護するために、バイオセーフティーベンチ又は陰圧下のグローブボックスのいずれかで行われるべきである。これは特に、224Ｒａ系列を取り扱う場合、220Ｒｎが娘核種の１つであるので重要である。さらに、作業スペースを適切に遮蔽する必要がある。224Ｒａの娘核種の１つは208Ｔｌであり、基本的に必要とされる遮蔽材の厚さを決定することになる放出率３６％の２．６ＭｅＶの高エネルギーγ線を有する。Ｂａｉｄｏｏらには、224Ｒａの最大で７４０ＭＢｑｍまでの活性に対する適切な遮蔽材は約１５ｃｍの鉛であることが記載されている。娘核種と平衡状態にある、この活性をもつ224Ｒａの点線源から３０ｃｍの距離での線量率は、１５ｃｍの鉛遮蔽材を使用した場合、約１６００から３μＳｖ／ｈに減少することになる。我々がここで提示した212Ｐｂジェネレータ溶液は、単回患者投与量の調製を目的としているので、遮蔽の要件がＢａｉｄｏｏらによって記載されたものを超えることになるのが妥当であるとは我々は考えない。Ｂａｉｄｏｏらによって提示された方法に従って作業する場合のカラム上でのみではなく、我々の方法で224Ｒａが精製するまでが存在したとしても、これは、系列のγ線活性の９９％が212Ｐｂ及び娘核種、特に208Ｔｌからの前述の高エネルギーγ線に由来するので、遮蔽要件を変更しないであろう。Ｂａｉｄｏｏらによって記載の方法に含まれる蒸発ステップは、グローブボックス又はある種の閉鎖系で実施すべきであり、そこで空気中の放射性汚染物質を生み出すリスクを最小限に抑えるために蒸気が集められ、この過程に専用の設備を必要とすることになる。我々の提案する方法にはそのような設備は必要ないであろう。
【０１７３】
考察で前述のように、今回の研究は比較的低い活性レベルで実施した。より高い、臨床に関連する活性の224Ｒａ溶液を使用する場合に放射線曝露の問題が生じる可能性がある。放射性標識反応において純粋な212Ｐｂの代わりに212Ｐｂと平衡状態にある224Ｒａを使用することの潜在的な欠点は、α粒子活性の増加による反応溶液への放射線量の増加である。抗体−複合体への放射線曝露は、放射性標識手順の間に最も高くなる可能性が高い。その時点で、224Ｒａ及びすべての子孫核種は線量に寄与することになるが、精製後は主に212Ｐｂ及び娘核種から出る線量であることになる。212Ｐｂと娘核種の壊変から放出されるわずか８．８ＭｅＶと比較して、224Ｒａと子孫核種からの全壊変エネルギー（光子を除く）は２７．８ＭｅＶである。抗体を高放射線量に曝露するために、３０分間のインキュベーション時間の後、我々は、約７００Ｇｙの線量が達成されるまで、212Ｐｂ標識ＴＣＭＣ−トラスツズマブを224Ｒａ溶液中に平衡状態で保存し続けた。サイズ排除ＨＰＬＣを用いた分析は、未変化のＴＣＭＣ−トラスツズマブと一致する時点で総放射能の９６％を含むピークを示し、１．３及び２．９％未満がそれぞれ、より高い分子量及びより低い分子量の化合物に関連していた。７００Ｇｙに曝露された212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブも、２８０ｎｍでの吸収の検出を用いて非標識ＴＣＭＣ−トラスツズマブと比較した。放射性標識された抗体を分析すると、結果はＩｇＧよりも低い分子量化合物のピークを示した。
【０１７４】
このピークは約１１％を占め、非標識ＴＣＭＣ−トラスツズマブでは見られなかった。したがって、タンパク質の放射線分解によって生じている可能性が高い。高分子種の量は２つの試料間で類似していた（１．６％未満）。しかし、抗体の画分に対する明らかな放射線分解損傷は、生成物の免疫反応性画分に影響しないようであった。１００及び７００Ｇｙに曝露した212Ｐｂ標識ＴＣＭＣ−トラスツズマブの２つの試料をＰＤ−１０カラムで精製した。画分４の免疫反応性は、それぞれ６０及び５７％であると決定された。どちらの場合も非特異的結合は低かった（３％未満）。これは、抗体の細胞結合画分を有意に減少させることなく最大で１０００Ｇｙまでの曝露が許容された文献の結果と一致している。
【０１７５】
まとめると、高線量での放射線分解の可能性に関する試験は、抗体に対する線量を７００Ｇｙ未満に保つべきであることを示している。腹腔内投与212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブの第Ｉ相試験では、患者が受けた最高線量は２７．４ＭＢｑ／ｍ2であった。成人がん患者の研究で見出された平均体表面積１．７９ｍ2を用いることによって、この線量は患者当たり４９ＭＢｑに相当する。この活性を有する患者線量を調製するために、１００ＭＢｑの224Ｒａの活性が充分であると仮定することは合理的である。これは、Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブを第Ｉ相試験で患者に投与した212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブの最高線量の約２倍に相当するからである。ＰＤ−１０ゲル排除精製フォーマットと適合する１．５ｍＬの反応体積で１００ＭＢｑの224Ｒａを用いて３０分間標識する間の抗体溶液に対する放射線量は、５３４Ｇｙと推定された。これらの計算に基づいて、本明細書に記載の方法は、高い活性レベルが使用される臨床の現場においても有用でありうることが予測される。
【０１７６】
224Ｒａに対する212Ｐｂの純度は、212Ｐｂ標識放射性免疫複合体に関する重要な品質パラメーターである。この論文で提案されているその場での（in situ）標識方法が現行のプロトコールの実行可能な代替法であるためには、最終生成物中の224Ｒａの許容限度を定義するのに熟考が必要である。幸いにも、224Ｒａは動物とヒトの両方で広範に研究されており、毒性プロフィールはよく知られている。他のラジウム放射性同位体と同様に、静脈注射後、224Ｒａは主に骨に沈着する。その本来備わっている骨親和性のために、１９４０年代に既に強直性脊椎炎の対症療法として導入された。これは数十年（１９９０年まで）使用され、その後２０００年から２００５年の間に別の製造元が同じ適応症に対して一時的に再導入した。週に１回の１ＭＢｑの注射の合計１０回の注射までの導入が成人患者の治療レジメンとしてとして使用されており、国際放射線防護委員会が提案するモデルに従って行った線量計算は、224Ｒａ二塩化物の静脈注射後の吸収線量は骨表面及び赤色骨髄で最も高いことを示した。この投与量を受けた約１０００人の患者を含む報告から、そのような量の224Ｒａ二塩化物は、無視できない骨髄毒性なしに投与できることが示されている。これらの歴史的データは、212Ｐｂ生成物自体が高い程度の骨髄毒性を引き起こさない限り、投薬１回当たり１ＭＢｑ又は累積で計１０ＭＢｑの224Ｒａは、成人患者に許容されうることを示す。
【０１７７】
腹腔内投与された212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブの第Ｉ相試験において、有意な骨髄抑制は見出されなかった。ここで得られた結果から、ＥＤＴＡを使用してＰＤ−１０精製前に反応混合物をクエンチした場合、最終生成物中の224Ｒの残存量を１％未満に保つことができた。これは、５０ＭＢｑの212Ｐｂをベースとする生成物を与えられた患者に投与された０．５ＭＢｑの224Ｒａに相当する。約４９ＭＢｑの患者線量が、前述の第Ｉ相試験で投与された212Ｐｂ−ＴＣＭＣ−トラスツズマブ（２７．４ＭＢｑ／ｍ２）の最高線量であった。まとめると、これらの推定値は、224Ｒａ溶液から調製した212Ｐｂ標識放射性免疫複合体の最終生成物中の224Ｒａに対する212Ｐｂの充分な純度が、投与１回当たり最大で１ＭＢｑの224Ｒａが許容量であるという前提のもとで達成されうることを示す。
【０１７８】
結論
今回の研究は、212Ｐｂをベースとする放射性免疫複合体を作製するための出荷可能なジェネレータ溶液としての224Ｒａ溶液の利便性を示す。本発明の212Ｐｂ標識複合体の生成は、現在のイオン交換に基づく方法と比較して、エンドユーザーにとって使用が容易で且つ費やす時間が少ない。
【国際調査報告】
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