(57)【要約】  血管炎症および血管内皮機能不全の予防および／または治療用医薬の調製における２’，３’，５’−トリ−Ｏ−アセチル−Ｎ６−（３−ヒドロキシフェニル）アデノシンの応用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管炎症の予防および／または治療用医薬の調製における式（I）で表されるトリアセチル−３−ヒドロキシフェニルアデノシンの応用。
2019519505.tif 000017
【請求項２】
血管内皮機能不全の予防および／または治療用医薬の調製における式（I）で表されるトリアセチル−３−ヒドロキシフェニルアデノシンの応用。
2019519505.tif 000018
【請求項３】
前記血管炎症は、急性血管炎症または慢性血管炎症を含むことを特徴とする請求項１に記載の応用。
【請求項４】
前記慢性血管炎症は、高脂血症を伴う血管炎症を含むことを特徴とする請求項３に記載の応用。
【請求項５】
前記血管内皮機能不全は、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、冠動脈性心疾患、肥満、インスリン抵抗性または２型糖尿病を伴う血管内皮機能不全を含むことを特徴とする請求項２に記載の応用。
【請求項６】
血管炎症または内皮機能不全の予防、緩和または治療用医薬の調製における医薬組成物の応用において、前記医薬組成物は、式（I）に記載されるトリアセチル−３−ヒドロキシフェニルアデノシンおよび薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする応用。
2019519505.tif 000019
【請求項７】
前記血管炎症は、急性血管炎症または慢性血管炎症を含み、前記血管内皮機能不全は、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、冠動脈性心疾患、肥満、インスリン抵抗性または２型糖尿病を伴う血管内皮機能不全を含むことを特徴とする請求項６に記載の応用。
【請求項８】
前記慢性血管炎症は、高脂血症を伴う血管炎症を含むことを特徴とする請求項７に記載の応用。
【請求項９】
前記医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、丸剤、注射剤であることを特徴とする請求項６〜８のいずれか一項に記載の応用。
【請求項１０】
前記医薬組成物は、徐放性製剤、放出制御製剤または各種の微粒子投薬システムであることを特徴とする請求項６〜８のいずれか一項に記載の応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管炎症の予防および／または治療、または／および内皮機能不全の改善用医薬の調製におけるトリアセチル−３−ヒドロキシフェニルアデノシンおよびそれを含む医薬組成物の応用に関し、医薬・衛生分野に属するものである。
【背景技術】
【０００２】
アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病等の心血管疾患の発生、進展および最終的な標的器官の損傷は、血管内炎症および内皮機能不全（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，ＥＤ）に密接に関係する。内皮細胞は、血管拡張の促進、平滑筋過形成の抑制および血管内炎症反応の抑制等の一連の血管保護作用により血管内恒常性維持を制御する。しかし、これらの効果は主に、内因性血管拡張物質である一酸化窒素（Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ，ＮＯ）の影響を受ける。ＮＯ産生障害は、内皮機能不全をもたらし、内皮依存性拡張機能の損傷として表れる。血管内皮機能不全を改善して、アテローム性動脈硬化症、高血圧、糖尿病の発生や進展を防止することは極めて重要である。臨床実験において、スタチン系医薬が内皮機能障害を改善することによって、血中脂質に対する影響とは無関係に患者の冠動脈性心疾患のリスクを低減し、チアゾリジンジオン系およびアンジオテンシン変換酵素阻害剤がいずれも独立した内皮機能不全改善作用によって心血管疾患のリスクを低減することが明らかになっており、したがって、血管炎症を軽減しかつ内皮機能不全を改善することは、心血管疾患のリスクを低減することにとって極めて重要である。
【０００３】
現在、臨床的に、血管内皮機能を改善できる医薬としては主に、スタチン系、メトホルミン、チアゾリジンジオン、高血圧治療薬のアンジオテンシン変換酵素阻害剤等の従来の心血管疾患治療用医薬があり、それらは主に、一酸化窒素合成酵素の活力を向上させることによって、ＮＯ産生を増加させる作用を発揮する。しかし、スタチン系医薬の長期にわたる服用により引き起こされる筋肉痛等の有害反応は、患者が長期にわたって耐えるのは非常に困難であり、ビグアナイド系医薬は、胃腸障害を引き起こしたり、まれに乳酸性アシドーシスを引き起こしたりすることがあり、チアゾリジン誘導体は、体液貯留や体重増加、肝機能障害等の深刻な副作用を引き起こすことがあるため、使用時に注意を要する。
【０００４】
トリアセチル−３−ヒドロキシフェニルアデノシン（特許番号ＺＬ２００９８０１０１１３１．６）は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａ  Ｍｅｄｉｃａ，  ＣＡＭＳ  ＆  ＰＵＭＣがコルジセピン誘導体で選別した顕著な血中脂質調節活性を有する新規な構造タイプの化合物であり、また、毒性副作用が少なく、薬物動態学的に優れている等の特徴を有し、現在、臨床前の研究段階にある。現在、血管炎症を軽減し、かつ内皮型一酸化窒素合成酵素の活性を向上させて血管内皮機能不全を改善する、関連の疾患における該化合物の応用については報告されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする技術課題は、血管炎症または内皮機能不全の予防、緩和または治療用医薬の調製における式（I）で表されるトリアセチル−３−ヒドロキシフェニルアデノシンの応用を提供することである。
【０００６】
本発明の技術課題を解決するため、以下の技術態様を提供する。
【０００７】
本発明に係る技術形態の第一の態様は、血管炎症の予防および／または治療用医薬の調製における式（I）で表されるトリアセチル−３−ヒドロキシフェニルアデノシンの応用を提供することである。
2019519505.tif 000002
【０００８】
ここで、前記血管炎症は、急性血管炎症または慢性血管炎症を含み、前記慢性血管炎症は、高脂血症を伴う血管炎症を含む。
【０００９】
本発明に係る技術形態の第二の態様は、血管内皮機能不全の予防および／または治療用医薬の調製における式（I）で表されるトリアセチル−３−ヒドロキシフェニルアデノシンの応用を提供することである。
2019519505.tif 000003
【００１０】
ここで、前記血管内皮機能不全は、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、冠動脈性心疾患、肥満、インスリン抵抗性または２型糖尿病を伴う血管内皮機能不全を含む。
【００１１】
本発明に係るトリアセチル−３−ヒドロキシフェニルアデノシンは、血管内の白血球−内皮細胞の炎症反応を抑制することによって、血管内皮型一酸化窒素合成酵素の活性を向上させ、ＮＯ産生を増加させて、内皮機能障害およびその関連疾患を改善する。
【００１２】
本発明に係る技術態様の第三の態様は、血管炎症または内皮機能不全の予防、緩和または治療用医薬の調製における医薬組成物の応用において、前記医薬組成物は、式（I）に記載されるトリアセチル−３−ヒドロキシフェニルアデノシンおよび薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする応用を提供する。
2019519505.tif 000004
【００１３】
ここで、前記血管炎症は、急性血管炎症または慢性血管炎症を含み、前記血管内皮機能不全は、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、高血圧、冠動脈性心疾患、肥満、インスリン抵抗性または２型糖尿病を伴う血管内皮機能不全を含む。
【００１４】
さらに、前記慢性血管炎症は、高脂血症を伴う血管炎症を含む。
【００１５】
該医薬組成物は当該分野の公知の方法に基づいて調製することができる。本発明に係る化合物を一種以上の薬学的に許容可能な固体または液体の賦形剤および／またはアジュバントと組み合わせることで、ヒトや動物への使用に適したいずれかの剤形を調製することができる。本発明に係る化合物のその医薬組成物における含有量は一般的に０．１〜９５重量％である。
【００１６】
本発明に係る前記医薬組成物の剤形は、錠剤、カプセル剤、丸剤、注射剤、徐放性製剤、放出制御製剤または各種の微粒子投薬システムである。
【発明の効果】
【００１７】
トリアセチル−３−ヒドロキシフェニルアデノシンは、血管炎症を軽減し、かつ内皮型一酸化窒素合成酵素の活性を向上させ、血管内皮機能不全またはこれに関連する疾患を改善することができ、該作用はその脂質低下作用とは独立する、すなわち、該化合物の脂質低下作用とは関連性がない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＩＭＭ−Ｈ００７による、ＴＮＦ−αにより誘発される急性マウス血管内炎症反応の制御に関する図である。
【図２】ＩＭＭ−Ｈ００７による、高脂肪飼料で飼養したＡｐｏＥ−／−マウスの血管炎症反応の軽減に関する図である。
【図３】ＡｐｏＥ−／−マウスの血中脂質レベルに対するＩＭＭ−Ｈ００７の影響に関する図である。
【図４】ＡｐｏＥ−／−マウスの血清炎症因子ＴＮＦ−α、ＶＣＡＭ−１に対するＩＭＭ−Ｈ００７の影響に関する図である。
【図５】ＡｐｏＥ−／−マウスの腸間膜微細血管の内皮機能に対するＩＭＭ−Ｈ００７の影響に関する図である。
【図６】ＡｐｏＥ−／−マウスの大動脈血管内皮機能に対するＩＭＭ−Ｈ００７の影響に関する図である。
【図７】ＩＭＭ−Ｈ００７による、ＡＭＰＫ−ｅＮＯＳ経路を通じた内皮機能の改善に関する図である。
【図８】ＩＭＭ−Ｈ００７による、ＡｐｏＥ−／−マウスの動脈プラークの減少に関する図である。
【図９】ＩＭＭ−Ｈ００７による、Ｏｂ／Ｏｂ肥満マウスの微細血管の内皮機能の改善に関する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下の実施例を用いて本発明をさらに説明するが、本発明を何ら制限するものではない。
【００２０】
実施例１：トリアセチル−３−ヒドロキシフェニルアデノシン（ＩＭＭ−Ｈ００７）による、マウスの内皮機能不全による初期血管内炎症反応の抑制
【００２１】
１．ＩＭＭ−Ｈ００７による、ＴＮＦ−αにより誘発された急性マウス血管炎症（急性炎症モデル）の抑制
【００２２】
実験材料および機器
ＩＭＭ−Ｈ００７（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａ  Ｍｅｄｉｃａ，  ＣＡＭＳ  ＆  ＰＵＭＣ）、メトホルミンハイドロクロライドタブレット（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、Ａ７６９６６２（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｂｉｏｃｈｅｍｐａｒｔｎｅｒ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）、Ｍｕｒｉｎｅ  ＴＮＦ−α（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，ＩＮＣ）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−６Ｇ（ｓｉｇｍａ）、Ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ  Ｓｏｄｉｕｍ（Ｓｅｒｖａ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ）、並びに動態可視化微細血管研究システム（Ｇｅｎｅ＆I−ＳＭＣ１）
【００２３】
動物および実験設計
ＳＰＦ級の野生型（Ｗｉｌｄ  Ｔｙｐｅ，ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（雄性，６〜８週齢，１８〜２０ｇ）を、ＢＥＩＪＩＮＧ  ＨＦＫ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ  ＣＯ．，ＬＴＤより購入した。
【００２４】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス６０匹を体重に基づきランダムに６個の群に分け、それぞれ正常対照群、モデル対照群、ＩＭＭ−Ｈ００７群、陽性対照ＡＭＰＫアゴニスト群（メトホルミン群）、Ａ７６９６６２群およびアトルバスタチン群とし、それぞれ生理食塩水、ＩＭＭ−Ｈ００７（１００ｍｇ／ｋｇ）、メトホルミン（Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ，２６０ｍｇ／ｋｇ）、アトルバスタチン（ｌｉｐｉｔｏｒ，１０ｍｇ／ｋｇ）を胃内投与し、Ａ７６９６６２（３０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔注射して（経口は吸収し難いため）、連続して７日間投与し、８日目に、ブランク対照群に生理食塩水を腹腔注射したことを除き、他の各群はいずれもＴＮＦ−α（０．３μｇ／匹）を腹腔注射して血管内急性炎症の発生を誘発させ、ＴＮＦ−αを注射した４時間後に、視神経血管叢に１００μｌの０．０５％Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−６Ｇを静脈注射して白血球を蛍光マーキングした。ペントバルビタールナトリウムでマウスを麻酔し、マウスを右側臥位にして観察台上に固定し、腹腔に沿って小さく切開し、腸間膜血管床を軽く引き出し、マウスの小腸を観察窓に固定し、顕微鏡を用いて、低倍率顕微鏡により腸間膜静脈の鮮明な三箇所を探し出してから、２０倍の高倍率顕微鏡に調整して観察し、輝度および焦点距離を最適に調整した後、白光を消し、蛍光をつけて、動態可視化微細血管研究システム（Ｇｅｎｅ＆Ｉ−ＳＭＣ１）ＴｏｕｐＶｉｅｗソフトウェアを用いて各血管部（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｅｇｍｅｎｔの１ｍｉｎ間の白血球運動映像を収集した。白血球運動速度と白血球−内皮細胞接着数が血管内の炎症を反映した状況は、内皮機能不全の初期指標である。
【００２５】
検出指標
（１）白血球運動速度（白血球運動速度が減速して、血管内に炎症反応が発生したことを反映し、相応する医薬を投与した後に、投与後の白血球運動速度の変化を観察して炎症反応に対する医薬の制御作用を反映する。）：マウスごとに腸間膜小静脈の三箇所を選択して観察し、ｉｍａｇｅ  ｐｒｏ  ６．０を用いて白血球運動速度を分析し、観察視野の箇所ごとに少なくとも３個の観察点を選択し、マウスごとに最終的に少なくとも９個の観察点を統計して、平均値を求め、白血球平均運動速度を算出する。
【００２６】
（２）白血球−内皮細胞接着数（白血球接着数の増加は、血管内炎症反応が悪化したことを反映したものであり、内皮機能障害を引き起こす可能性がある）：血管の箇所ごとに２００μｍを選択して白血球接着数を観察する（３０秒以内に内皮細胞に接着して動きを止めることが、すなわち接着である）。
【００２７】
データ統計
実験結果を平均値Χ±ＳＤで表す。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてｔ−ｓｔｕｄｅｎｔ検査を行い、群間の差はｏｎｅ  ｗａｙ−ＡＮＯＶＡパラメータ分散分析を行うか、またはノンパラメータＬＳＤ−ｔ法で検査を行う。Ｐ＜０．０５は統計学的差を有することを表し、Ｐ＜０．０１は有意差を有する。
【００２８】
実験結果
ＴＮＦ−αのような炎症因子により引き起こされる血管内白血球運動速度の減速と、白血球−内皮細胞接着数の増加は、内皮機能不全を引き起こす重要な原因であり、内皮機能不全は血管損傷を悪化させ得る。実験の結果、正常対照群に比べて、ＴＮＦ−αを腹腔注射（０．３μｇ／匹）した４時間後に、血管内に急性炎症が発生し、モデル対照群の白血球運動速度が減速し、白血球接着数が増加したことが明らかになった。ＩＭＭ−Ｈ００７（１００ｍｇ／ｋｇ）を投与した後、モデル対照群に比べて、白血球運動速度が顕著に速くなり、内皮細胞接着数が顕著に低下し、これはＩＭＭ−Ｈ００７が炎症因子ＴＮＦ−αにより誘発された血管内炎症反応を軽減できることを説明する（結果は、表１、図１を参照）。
【００２９】
【表１】
2019519505.tif 000005
【００３０】
２．ＩＭＭ−Ｈ００７による、高脂肪飼料で飼養したＡｐｏＥ−／−マウスの血管内炎症反応の抑制（慢性炎症モデル）
【００３１】
実験材料および機器
ＩＭＭ−Ｈ００７（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａ  Ｍｅｄｉｃａ，  ＣＡＭＳ  ＆  ＰＵＭＣ）、メトホルミンハイドロクロライドタブレット（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、Ａ７６９６６２（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｂｉｏｃｈｅｍｐａｒｔｎｅｒ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ−６Ｇ（ｓｉｇｍａ）、Ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ  Ｓｏｄｉｕｍ（Ｓｅｒｖａ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ）、Ｍｏｕｓｅ  ＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ａｎｄｙ  ｇｅｎｅ）、Ｍｏｕｓｅ  ＶＣＡＭ−１  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ａｎｄｙ  ｇｅｎｅ）、並びに、動態可視化微細血管研究システム（Ｇｅｎｅ＆I−ＳＭＣ１）、ＢｉｏＴｅＫ  Ｅｐｏｃｈプレートリーダー。
【００３２】
動物および実験設計
Ｃ５７ＢＬ／６背景のＡｐｏＥ−／−マウス（雄性，６〜８週齢，１８〜２０ｇ）およびＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ  ＯＦ  ＲＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＡＮＩＭＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，ＣＡＭＳ  ＆  ＰＵＭＣ（ＢＥＩＪＩＮＧ  ＨＦＫ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ  ＣＯ．，ＬＴＤ）より購入した。
【００３３】
動物が適応するように１週間飼養した後、体重に基づきランダムに４個の群に分け、モデル対照群、Ａ７６９６６２（３０ｍｇ／ｋｇ，ｉｐ）、メトホルミン（２６０ｍｇ／ｋｇ）投与群、ＩＭＭ−Ｈ００７（１００ｍｇ／ｋｇ）投与群とし、群ごとに７匹であり、高脂肪飼料（基礎飼料７８．６％、ラード１０％、コレステロール１．００％、卵黄粉１０％、胆汁酸塩０．４％）を与えるとともに、０．１ｍｌ／１０ｇ体重に基づき胃内投与し、連続して投与して８週間飼養した。ペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ）で麻酔し、マウスを右側臥位にして観察台上に固定し、腹腔に沿って小さく切開し、腸間膜血管床を軽く引き出し、マウスの小腸を観察窓に固定し、顕微鏡を用いて、低倍率顕微鏡により腸間膜静脈の鮮明な三箇所を探し出してから、２０倍の高倍率顕微鏡に調整して観察し、輝度および焦点距離を最適に調整した後、白光を消し、蛍光をつけて、血管内白血球運動を視認できるように、動態可視化微細血管研究システム（Ｇｅｎｅ＆Ｉ−ＳＭＣ１）ＴｏｕｐＶｉｅｗソフトウェアを用いて各血管部の１ｍｉｎ間の白血球運動映像を収集した。ｉｍａｇｅ  ｐｒｏ  ６．０を用いて白血球運動速度および白血球内皮細胞接着数を分析した。
【００３４】
検出指標
（１）白血球運動速度（２）白血球−内皮細胞接着数
【００３５】
データ統計
実験結果を平均値Χ±ＳＤで表す。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてｔ−ｓｔｕｄｅｎｔ検査を行い、群間の差はｏｎｅ  ｗａｙ−ＡＮＯＶＡパラメータ分散分析を行うか、またはノンパラメータＬＳＤ−ｔ法で検査を行う。Ｐ＜０．０５は統計学的差を有することを表し、Ｐ＜０．０１は有意差を有する。
【００３６】
実験結果
高脂肪飼料は、血中低密度リポ蛋白質コレステロールを増加させ、内皮細胞を刺激して炎症反応を引き起こして、白血球運動速度の減速、白血球−内皮細胞接着数の増加をもたらして、内皮機能不全を引き起こし、さらにはアテローム性動脈硬化症の発生をもたらす可能性がある。ＩＭＭ−Ｈ００７（１００ｍｇ／ｋｇ）を投与した後、モデル対照群に比べて、白血球運動速度が顕著に速くなり、内皮細胞接着数が顕著に低下し、これはＩＭＭ−Ｈ００７が高脂肪飼料で飼養したＡｐｏＥ−／−マウスの白血球−内皮細胞炎症反応を顕著に制御し、高脂質により引き起こされる血管炎症が軽減されることを説明する（結果は、表２、図２を参照）。
【００３７】
【表２】
2019519505.tif 000006
【００３８】
実施例２：トリアセチル−３−ヒドロキシフェニルアデノシン（ＩＭＭ−Ｈ００７）による血管内皮機能の改善
【００３９】
実験材料および機器
ＩＭＭ−Ｈ００７（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａ  Ｍｅｄｉｃａ，  ＣＡＭＳ  ＆  ＰＵＭＣ）、Ａ７６９６６２（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｂｉｏｃｈｅｍｐａｒｔｎｅｒ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．）、メトホルミンハイドロクロライドタブレット（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、Ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ  Ｓｏｄｉｕｍ（Ｓｅｒｖａ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ）、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、グルコース、ＥＤＴＡ、アセチルコリン（ｓｉｇｍａ）、ニトロプルシド（ＶＥＴＥＣ）、Ｒ−（−）フェニレフリン（ＢＥＩＪＩＮＧ  Ｊ＆Ｋ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＬＴＤ）、Ｍｏｕｓｅ  ＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ａｎｄｙ  ｇｅｎｅ）、Ｍｏｕｓｅ  ＶＣＡＭ−１  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ａｎｄｙ  ｇｅｎｅ）、トリグリセリド測定キット、総コレステロール測定キット、高密度リポ蛋白質コレステロール測定キット、低密度リポ蛋白質コレステロール測定キット（ＢＩＯＳＩＮＯ  ＢＩＯ−ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ＆ＳＣＩＥＮＣＥ  ＩＮＣ）、遊離脂肪酸検出キット（ＳＥＫＩＳＵＩ  ＭＥＤＩＣＡＬ  ＣＯ．，  ＬＴＤ．）、並びに分析天秤、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＳＺ５１実体顕微鏡、シェーカー、スプレッダ、離体微細血管圧力−直径測定灌流システム（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｍｙｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍ−１２０ＣＰ）、高精度ミクロ外科用鉗子、高精度ミクロ外科用鋏、Ｏ２（９５％）とＣＯ２（５％）との混合気体、外科処置シリコンディスク。
【００４０】
動物および実験設計
Ｃ５７ＢＬ／６背景のＡｐｏＥ−／−マウス（雄性，６〜８週齢，１８〜２０ｇ）およびＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＢＥＩＪＩＮＧ  ＨＦＫ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥ  ＣＯ．，ＬＴＤより購入した。
【００４１】
動物が適応するように１週間飼養した後、体重に基づきランダムに７個の群に分け、正常対照群、モデル対照群、Ａ７６９６６２（３０ｍｇ／ｋｇ）投与群、メトホルミン（２６０ｍｇ／ｋｇ）投与群、ＩＭＭ−Ｈ００７低、中、高投与群（５０、１００、２００ｍｇ／ｋｇ）とし、群ごとに８匹であり、高脂肪飼料（基礎飼料７８．６％、ラード１０％、コレステロール１．００％、卵黄粉１０％、胆汁酸塩０．４％）を与えるとともに、０．１ｍｌ／１０ｇ体重に基づき胃内投与し、連続して投与して８週間餌付け、アテローム性動脈硬化症モデルを確立した。
【００４２】
検出指標
（１）ＡｐｏＥ−／−マウスの血中脂質レベルに対するＩＭＭ−Ｈ００７の影響：総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、低密度リポ蛋白質コレステロール（ＬＤＬ）、高密度リポ蛋白質コレステロール（ＨＤＬ）、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）
キット説明書に基づき処置する。
【００４３】
（２）ＡｐｏＥ−／−マウスの血清炎症因子ＴＮＦ−α、ＶＣＡＭ−１に対するＩＭＭ−Ｈ００７の影響
キット説明書に基づき処置する。
【００４４】
（３）ＡｐｏＥ−／−マウスの腸間膜微細血管の内皮機能に対するＩＭＭ−Ｈ００７の影響
説明書に基づきＰＳＳおよびＫＰＳＳ溶液を配置し、当日に配置したものを当日に使用する。実験を開始する前に、ＰＳＳ溶液を先に取り出し、２０ｍｉｎ程度酸素をプリチャージする。高脂肪飼料で飼養するとともに、１０週間投与したＡｐｏＥ−／−マウスを、ペントバルビタールナトリウムで麻酔し、マウスを仰臥させて固定し、正中線に沿って腹腔を開き、腸間膜血管床を分離して、２０分間予め酸素が通されたＰＳＳ緩衝液中に入れ、実体顕微鏡下で、一箇所が約３ｍｍの長さの腸間膜小動脈の三箇所を注意深く分離する。先ず、血管をＰ１端のガラスカニューレに固定して、コイルを締め付ける。注意深く近位部をＰ１端に接続し、Ｐ２端の血管を固定して、コイルを締め付ける。Ｃｈａｍｂｅｒを顕微鏡ステージ上に置いて、ＣｈａｍｂｅｒとＩｎｔｅｒｆａｃｅとの間のデータ接続線を査収する。バスをカバーで覆い、予め酸素が通されるようにする。管路内の空気を除去する。顕微鏡下で血管画像を探し出してから、顕微鏡をカメラモードに調整する。（接眼レンズの横のつまみをｇｒａｐｈまで回転させればよい）。ＭｙｏＶＩＥＷソフトウェアを用いる。ＣａｍｅｒａのウインドウのＣａｐｔｕｒｅをクリックして血管画像の表示を開始する。血管を１０ｍｍＨｇから６０ｍｍＨｇまでゆっくりと上昇させて平衡させ、ステップごとに３００ｓとする。平衡させるべきプロセスがすべて終了した後に、バス内の溶液を排出して、３７℃に予熱したＫＰＳＳ溶液を用いて血管を２ｍｉｎ刺激し（１０ｍｌ）、血管収縮変化を観察してから、ＰＳＳ溶液を用いて血管を基準線まで溶出する。６０ｍｍＨｇ、３７℃で４５分間平衡させ、この間に２０分ごとに溶液を一回交換する。次の通り実験を開始する。２μＭのフェニレフリンを与えて予め収縮させた後、１０−１０〜１０−５ＭのＡｃｈにより引き起こされる血管拡張反応を観察し、血管内皮機能に対する医薬の影響を評価する。実験終了後に、３７℃に予熱した新たなＰＳＳ緩衝液を３０ｍｉｎ平衡させ、２μＭのフェニレフリンを与えて予め収縮させた後、１０−１０〜１０−３Ｍのニトロプルシドにより引き起こされる血管拡張反応を観察し、血管平滑筋機能に対する医薬の影響を評価する。ＬＤ１は、異なる濃度でＡｃｈまたはニトロプルシドを与えた後の血管拡張後直径であり、ＬＤ２は、フェニレフリンを与えて予め収縮させた後の血管直径であり、ＬＤ３は、如何なる刺激剤も添加していない場合における血管の最大拡張直径を表す。
【００４５】
フェニレフリンで予め収縮させた後にＡｃｈおよびニトロプルシドを与えた拡張反応は、血管外径増加百分率として次のように表される。
Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ＝（ＬＤ１−ＬＤ２）／（ＬＤ３−ＬＤ２）×１００。
【００４６】
（４）ＡｐｏＥ−／−マウスの胸部大動脈内皮機能に対するＩＭＭ−Ｈ００７の影響
マウスを麻酔し、迅速に胸部大動脈を取り、周囲組織を注意深く剥離し、血管輪を３ｍｍ程度の長さに切開し、血管輪を張力変換装置上に用心深く掛け、初期張力を０．５ｇ与え、９０分以上平衡させる。平衡過程において、２０分ごとに溶液を一回交換し、通気を保持し、温度を３７℃に維持する。１時間程度平衡させ、飽和ＫＣｌ（６０ｍＭ）を用いて２回刺激して血管が活性を有するか否かを検出する。血管収縮が安定した後に、直ちにＫＣｌを洗い流す。最後に溶液を一回交換した後、２０分間平衡させ、フェニレフリン１μＭを投与して血管収縮を刺激し、血管収縮が安定した後に、アセチルコリン（Ａｃｈ，１×１０−１０〜１×１０−５）およびニトロプルシド（ＳＮＰ，１０−１０〜１０−４Ｍ）を累積投与して血管拡張曲線を記録する。
【００４７】
血管拡張率＝［ＰＥにより引き起こされる血管張力（ｇ）−ＡＣｈ添加後の血管張力（ｇ）］÷［ＰＥ収縮により引き起こされる張力（ｇ）−血管基礎張力（ｇ）］×１００％。
【００４８】
（５）内皮機能改善に対するＩＭＭ−Ｈ００７の機序の検討
Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＢｌｏｔｔｉｎｇでＡＭＰＫ、ｐＡＭＰＫ、ｐｅＮＯＳ、ｅＮＯＳ、Ｃａｖｅｏｌｉｎ−１蛋白質の発現量の分析および検出を行って、血清における総一酸化窒素合成酵素の活力を測定する。
【００４９】
（６）ＡｐｏＥ−／−マウスのプラーク面積に対するＩＭＭ−Ｈ００７の影響
大動脈根部および大動脈全長をオイルレッドＯで染色し、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ、Ｉｍａｇｅ  Ｊ、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェアを用いて病理学的画像を分析し、カイ二乗検定を用いて病理学的ランクデータを統計分析する。Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１の比較の結果、統計学的差を有する。
【００５０】
データ統計
実験結果を平均値Χ±ＳＤで表す。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてｔ−ｓｔｕｄｅｎｔ検査を行い、群間の差はｏｎｅ  ｗａｙ−ＡＮＯＶＡパラメータ分散分析を行うか、またはノンパラメータＬＳＤ−ｔ法で検査を行う。Ｐ＜０．０５は統計学的差を有することを表し、Ｐ＜０．０１は有意差を有する。
【００５１】
実験結果
（１）ＡｐｏＥ−／−マウスの血中脂質レベルに対するＩＭＭ−Ｈ００７の影響
実験の結果、高脂肪飼料を与えて８週間飼養した後、モデル対照群は、正常対照群に比べて、総コレステロール、トリグリセリド、低密度リポ蛋白質コレステロールおよび遊離脂肪酸がいずれも上昇しており、高密度リポ蛋白質コレステロールは低下したことが明らかになった。ＩＭＭ−Ｈ００７を５０ｍｇ／ｋｇ用量で投与した群は、総コレステロール、トリグリセリド、低密度リポ蛋白質コレステロール、遊離脂肪酸、高密度リポ蛋白質コレステロールのいずれに対しても影響がなく、ＩＭＭ−Ｈ００７を１００ｍｇ／ｋｇ用量で投与した群は、コレステロール、トリグリセリド、低密度リポ蛋白質コレステロール、高密度リポ蛋白質コレステロールに対しては影響がなく、遊離脂肪酸に対しては一定程度の低下があり、ＩＭＭ−Ｈ００７を２００ｍｇ／ｋｇ用量で投与した群は、モデル対照群に比べて、総コレステロール、低密度リポ蛋白質、遊離脂肪酸が低下した（結果は、表３、図３を参照）。
【００５２】
【表３】
2019519505.tif 000007
【００５３】
（２）ＡｐｏＥ−／−マウスの血清炎症因子ＴＮＦ−α、ＶＣＡＭ−１に対するＩＭＭ−Ｈ００７の影響
実験の結果、モデル対照群に比べて、ＩＭＭ−Ｈ００７の５０、１００、２００ｍｇ／ｋｇ用量はいずれもＡｐｏＥ−／−マウスの血清ＶＣＡＭ−１のレベルを減少させることができ、ＩＭＭ−Ｈ００７の５０ｍｇ／ｋｇ用量はＡｐｏＥ−／−マウスの血清ＴＮＦ−αの発現を減少させることが明らかになっており、これはＩＭＭ−Ｈ００７の投与が血清に関連する炎症因子のレベルを軽減できることを説明する（結果は、表４、図４を参照）。
【００５４】
【表４】
2019519505.tif 000008
【００５５】
（３）ＡｐｏＥ−／−マウスの腸間膜微細血管の内皮機能に対するＩＭＭ−Ｈ００７の影響
実験の結果、２μＭのフェニレフリンを予め投与して血管を予め収縮させた後に、異なる濃度勾配で投与された（１０−１０〜１０−５Ｍ）アセチルコリンにより引き起こされる血管拡張反応は、血管内皮機能に対する医薬の影響を評価できることが明らかになった。モデル対照群に比べて、ＩＭＭ−Ｈ００７を５０ｍｇ／ｋｇ用量で投与した群は、血中脂質レベルに影響を与えない状況において、高脂質により引き起こされる微細血管の内皮機能不全を顕著に改善することができ、ＩＭＭ−Ｈ００７を１００ｍｇ／ｋｇ用量で投与した群は、コレステロール、トリグリセリド、低密度リポ蛋白質コレステロール、高密度リポ蛋白質コレステロールに影響を与えない状況下において、アセチルコリンにより引き起こされる内皮依存性拡張反応を顕著に改善して、内皮機能不全を改善することができ、この結果、ＩＭＭ−Ｈ００７がその脂質低下作用とは独立して微細血管の内皮機能不全を改善できることを説明する（結果は、表５、６および図５を参照）。
【００５６】
【表５】
2019519505.tif 000009
【００５７】
【表６】
2019519505.tif 000010
【００５８】
（４）ＡｐｏＥ−／−マウスの胸部大動脈内皮機能に対するＩＭＭ−Ｈ００７の影響
実験の結果、１μＭノルエピネフリンを予め投与して血管を予め収縮させた後に、異なる濃度勾配で投与された（１０−１０〜１０−５Ｍ）アセチルコリンにより引き起こされる血管拡張反応は、血管内皮機能に対する医薬の影響を評価できることが明らかになっており、モデル対照群に比べて、ＩＭＭ−Ｈ００７を５０ｍｇ／ｋｇ用量で投与した群は、血中脂質レベルに影響を与えない状況において、高脂質により引き起こされる大動脈血管のアセチルコリンの内皮依存性拡張反応を顕著に改善して、内皮機能不全を改善することができ、これはＩＭＭ−Ｈ００７がその脂質低下作用とは独立して血管内皮機能不全を改善できることを説明する（結果は、表７、８および図６を参照）。
【００５９】
【表７】
2019519505.tif 000011
【００６０】
【表８】
2019519505.tif 000012
【００６１】
（５）ＩＭＭ−Ｈ００７による、ＡＭＰＫ−ｅＮＯＳ経路を通じた内皮機能の改善
Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇを用いてＡＭＰＫ、ｐＡＭＰＫ、ｐｅＮＯＳ、ｅＮＯＳ、Ｃａｖｅｏｌｉｎ−１蛋白質発現量の分析および検出を行って、血清における総一酸化窒素合成酵素の活力を測定し、血中脂質低下作用とは独立して内皮機能を改善するＩＭＭ−Ｈ００７の推定機序を分析する。実験から、ＩＭＭ−Ｈ００７は主に、ＡＭＰＫ−ｅＮＯＳ経路を活性化することにより、一酸化窒素合成酵素の活力を向上させ、ＮＯ産生を増加させて血管機能を改善することが見出された。（結果は図７を参照）。
【００６２】
（６）ＩＭＭ−Ｈ００７による、ＡｐｏＥ−／−マウスのプラーク面積の減少
ＡＭＰＫ−ｅＮＯＳ蛋白質レベルを上昇させることは、血管内皮機能不全の改善において、アテローム性動脈硬化症の発生や進行を緩和することに有利である。本研究では、アテローム性動脈硬化症モデルのＡｐｏＥ−／−マウスを用いて、高脂肪飼料を１０週間餌付け、大動脈全長および動脈根部のプラーク堆積を観察し、さらに、アテローム性動脈硬化症に対するＩＭＭ−Ｈ００７の作用を観察する。実験の結果、ＩＭＭ−Ｈ００７は、大動脈根部および大動脈全長のプラークの蓄積を顕著に減少することができ、大動脈根部切片の染色によって、プラーク部位の脂質堆積が減少することが見出され、ＩＭＭ−Ｈ００７による内皮機能不全の改善により、アテローム性動脈硬化症の進展を緩和し得ることが明らになった（結果は、表９および図８を参照）。
【００６３】
【表９】
2019519505.tif 000013
【００６４】
実施例３：トリアセチル−３−ヒドロキシフェニルアデノシン（ＩＭＭ−Ｈ００７）による、Ｏｂ／Ｏｂ肥満マウスの血管内皮機能の改善
【００６５】
実験材料および機器
ＩＭＭ−Ｈ００７（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａ  Ｍｅｄｉｃａ，  ＣＡＭＳ  ＆  ＰＵＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ）、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、グルコース、ＥＤＴＡ、アセチルコリン（ｓｉｇｍａ）、ニトロプルシド（ＶＥＴＥＣ）、Ｒ−（−）フェニレフリン（ＢＥＩＪＩＮＧ  Ｊ＆Ｋ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＬＴＤ）、トリグリセリド測定キット、総コレステロール測定キット、高密度リポ蛋白質コレステロール測定キット、低密度リポ蛋白質コレステロール測定キット（ＢＩＯＳＩＮＯ  ＢＩＯ−ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ＆ＳＣＩＥＮＣＥ  ＩＮＣ）、遊離脂肪酸検出キット（ＳＥＫＩＳＵＩ  ＭＥＤＩＣＡＬ  ＣＯ．，  ＬＴＤ．）、およびインスリン、グルコース、ロシュ血糖測定試験紙、分析天秤、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＳＺ５１実体顕微鏡、シェーカー、スプレッダ、離体微細血管圧力−直径測定灌流システム（Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｍｙｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍ−１２０ＣＰ）、高精度ミクロ外科用鉗子、高精度ミクロ外科用鋏、Ｏ２（９５％）とＣＯ２（５％）との混合気体、外科処置シリコンディスク。
【００６６】
動物および実験設計
Ｏｂ／Ｏｂ肥満マウス（雄性，４週齢）を、Ｍｏｄｅｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｏｆ  Ｎａｎｊｉｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙより購入。
【００６７】
動物が適応するように１週間飼養した後、体重に基づきランダムに２個の群に分け、モデル対照群、ＩＭＭ−Ｈ００７群（４００ｍｇ／ｋｇ）とし、群ごとに１０匹であり、一般飼料で飼養するとともに、０．１ｍｌ／１０ｇ体重に基づき胃内投与し、連続して投与して９週間飼養する。摂食と体重の変化を記録し、血中脂質、血糖等の通常の生化学的指標を測定し、９週間データを取った後に、群ごとに３匹の動物を取り、腸間膜小動脈を取って血管内皮機能を測定する。方法は実施例２と同じである。
【００６８】
検出指標
（１）通常の生化学的指標（２）血管内皮機能
【００６９】
データ統計
実験結果を平均値Χ±ＳＤで表す。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いてｔ−ｓｔｕｄｅｎｔ検査を行い、群間の差はｏｎｅ  ｗａｙ−ＡＮＯＶＡパラメータ分散分析を行うか、またはノンパラメータＬＳＤ−ｔ法で検査を行う。Ｐ＜０．０５は統計学的差を有することを表し、Ｐ＜０．０１は有意差を有する。
【００７０】
実験結果
実験の結果、Ｏｂ／Ｏｂ肥満マウスを一般飼料で９週間飼養した後の血糖およびインスリンレベルの測定から、インスリン抵抗性モデルを形成することが明らかになっており、インスリン抵抗性は、内皮機能不全をもたらす重要な原因であることが明らかになった。したがって、Ｏｂ／Ｏｂマウスの微細血管の内皮機能を９週間測定し、研究から、ＩＭＭ−Ｈ００７（４００ｍｇ／ｋｇ）群が、微細血管の内皮機能を改善し得ることが見出された（実験結果は、表１０、１１、１２および図９を参照）。
【００７１】
【表１０】
2019519505.tif 000014
【００７２】
【表１１】
2019519505.tif 000015
【００７３】
【表１２】
2019519505.tif 000016
【図１】
2019519505.tif 000020
【図２】
2019519505.tif 000021
【図３】
2019519505.tif 000022
【図４】
2019519505.tif 000023
【図５】
2019519505.tif 000024
【図６】
2019519505.tif 000025
【図７】
2019519505.tif 000026
【図８】
2019519505.tif 000027
【図９】
2019519505.tif 000028
【国際調査報告】
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