(57)【要約】  本発明は、概して、癌の治療のための併用療法に関し、特に、（ｉ）ＴＧＦβＲＩＩ又はＴＧＦβ結合能を有するその断片と、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）などの免疫チェックポイントタンパク質に結合する抗体又はその抗原結合断片とを含む二機能性分子と、（ｉｉ）少なくとも１つの追加の抗癌療法剤との併用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の少なくとも１つの追加の抗癌剤との併用で癌の治療に使用するための、ヒトＴＧＦβＲＩＩ又はＴＧＦβ結合能を有するその断片と、ヒトタンパク質プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合する抗体又はその抗原結合断片とを含むタンパク質
を含む医薬組成物であって、
前記抗癌剤との併用で使用される前記タンパク質は、それぞれ単独で投与される前記タンパク質及び前記少なくとも１つの追加の抗癌剤の効果と比較して亢進した治療効果を有する、医薬組成物。
【請求項２】
有効量の少なくとも１つの追加の抗癌剤との併用で腫瘍成長の阻害に使用するための、ヒトＴＧＦβＲＩＩ又はＴＧＦβ結合能を有するその断片と、ヒトタンパク質プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合する抗体又はその抗原結合断片とを含む第１の部分を含むタンパク質
を含む医薬組成物であって、
前記抗癌剤との併用で使用される前記タンパク質は、それぞれ単独で投与される前記タンパク質及び前記少なくとも１つの追加の抗癌剤の効果と比較して亢進した治療効果を有する、医薬組成物。
【請求項３】
ＰＤ−Ｌ１に結合する前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２のアミノ酸１〜１２０を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＰＤ−Ｌ１に結合する前記抗体又はその抗原結合断片は、Ｃ末端リジンがアラニンに突然変異していることを除いて配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＰＤ−Ｌ１に結合する前記抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＳＹＩＭＭ（ＨＶＲ−Ｈ１）、ＳＩＹＰＳＧＧＩＴＦＹＡＤＴＶＫＧ（ＨＶＲ−Ｈ２）及びＩＫＬＧＴＶＴＴＶＤＹ（ＨＶＲ−Ｈ３）を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ヒトＴＧＦβＲＩＩ又はＴＧＦβ結合能を有するその断片は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記タンパク質は、配列番号１及び配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記抗癌剤は、化学療法剤である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記抗癌剤は、放射線照射である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記化学療法剤は、アルキル化剤である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記アルキル化剤は、５−ＦＵである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記化学療法剤は、白金系薬剤である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記白金系薬剤は、オキサリプラチンである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記癌は、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、前立腺癌、腎癌、子宮頸癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、子宮内膜癌、子宮癌、膀胱癌、神経内分泌癌、頭頸部癌、肝癌、鼻咽腔癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮細胞皮膚癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫及び骨髄異形成症候群からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記タンパク質は、（ｉ）前記癌の治療に使用されることが公知の投与量、及び（ｉｉ）前記癌の治療に使用されることが公知の濃度と比較して低い投与量からなる群から選択される投与量で提供される、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記タンパク質は、（ｉ）前記癌の治療に使用されることが公知の投与量、及び（ｉｉ）前記癌の治療に使用されることが公知の濃度と比較して低い投与量からなる群から選択される投与量で提供される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記放射線照射は、（ｉ）前記癌の治療に使用されることが公知の投与量、及び（ｉｉ）前記癌の治療に使用されることが公知の濃度と比較して低い投与量からなる群から選択される投与量で提供される、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記タンパク質は、前記癌の治療に使用されることが公知の前記投与量の２〜１０分の１の投与量で提供される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
原発性腫瘍の放射線照射との併用で使用される前記タンパク質は、放射線照射で治療される前記原発性腫瘍の遠位にある二次性腫瘍又は転移の成長を阻害する、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
癌を治療する方法であって、
（ｉ）ヒトＴＧＦβＲＩＩ又はＴＧＦβ結合能を有するその断片と、ヒトタンパク質プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合する抗体又はその抗原結合断片とを含むタンパク質、及び
（ｉｉ）有効量の少なくとも１つの追加の抗癌剤
を癌患者に投与することを含み、それにより、それぞれ単独で投与される前記タンパク質及び前記少なくとも１つの追加の抗癌剤の効果と比較して亢進した治療効果を有する併用療法を提供する、方法。
【請求項２１】
腫瘍成長を阻害する方法であって、
（ｉ）ヒトＴＧＦβＲＩＩ又はＴＧＦβ結合能を有するその断片と、ヒトタンパク質プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）に結合する抗体又はその抗原結合断片とを含む第１の部分を含むタンパク質、及び
（ｉｉ）有効量の少なくとも１つの追加の抗癌剤
に前記腫瘍を曝露することを含み、それにより、それぞれ単独で投与される前記タンパク質及び前記少なくとも１つの追加の抗癌剤の効果と比較して亢進した治療効果を有する併用療法を提供する、方法。
【請求項２２】
ＰＤ−Ｌ１に結合する前記抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２のアミノ酸１〜１２０を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
ＰＤ−Ｌ１に結合する前記抗体又はその抗原結合断片は、Ｃ末端リジンがアラニンに突然変異していることを除いて配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２４】
ＰＤ−Ｌ１に結合する前記抗体又はその抗原結合断片は、アミノ酸配列ＳＹＩＭＭ（ＨＶＲ−Ｈ１）、ＳＩＹＰＳＧＧＩＴＦＹＡＤＴＶＫＧ（ＨＶＲ−Ｈ２）及びＩＫＬＧＴＶＴＴＶＤＹ（ＨＶＲ−Ｈ３）を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヒトＴＧＦβＲＩＩ又はＴＧＦβ結合能を有するその断片は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記タンパク質は、配列番号１及び配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗癌剤は、化学療法剤である、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗癌剤は、放射線照射である、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記化学療法剤は、アルキル化剤である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記アルキル化剤は、５−ＦＵである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記化学療法剤は、白金系薬剤である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記白金系薬剤は、オキサリプラチンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌は、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、前立腺癌、腎癌、子宮頸癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、子宮内膜癌、子宮癌、膀胱癌、神経内分泌癌、頭頸部癌、肝癌、鼻咽腔癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮細胞皮膚癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫及び骨髄異形成症候群からなる群から選択される、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項３４】
化学療法の初回用量の投与後に前記タンパク質の投与が続く、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
放射線照射の初回線量の投与後に前記タンパク質の投与が続く、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
複数回用量の化学療法が投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
複数回線量の放射線照射が投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
複数回用量の前記タンパク質が投与される、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項３９】
前記タンパク質の投与量は、（ｉ）前記癌の治療に使用されることが公知の投与量、及び（ｉｉ）前記癌の治療に使用されることが公知の濃度と比較して低い投与量からなる群から選択される、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項４０】
前記化学療法剤の投与量は、（ｉ）前記癌の治療に使用されることが公知の投与量、及び（ｉｉ）前記癌の治療に使用されることが公知の濃度と比較して低い投与量からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
前記放射線照射の投与量は、（ｉ）前記癌の治療に使用されることが公知の投与量、及び（ｉｉ）前記癌の治療に使用されることが公知の濃度と比較して低い投与量からなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
前記タンパク質のより低い投与量は、前記癌の治療に使用されることが公知の前記投与量の２〜１０分の１である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記タンパク質及び１つの追加の抗癌剤は、逐次的に投与される、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項４４】
放射線照射で治療される原発性腫瘍の遠位にある二次性腫瘍又は転移の成長を阻害する、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本願は、２０１６年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／３７４，６２１号に対する優先権及びその利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
[0002]  本発明は、概して、癌の治療のための併用療法に関し、特に、（ｉ）ＴＧＦβＲＩＩ又はＴＧＦβ結合能を有するその断片と、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）などの免疫チェックポイントタンパク質に結合する抗体又はその抗原結合断片とを含む二機能性分子と、（ｉｉ）少なくとも１つの追加の抗癌療法剤との併用に関する。抗癌療法剤には、例えば、放射線照射、化学療法剤、生物製剤又はワクチンが含まれる。本発明の特定の実施形態において、本併用療法は、相乗的抗癌効果をもたらす。
【背景技術】
【０００３】
背景
[0003]  癌治療では、長い間、化学療法が高毒性に関連し、耐性癌細胞変異体の出現につながり得ることが認識されてきた。ほとんどの化学療法剤は、心毒性及び腎毒性、脱毛、悪心嘔吐を含めた望ましくない副作用を引き起こす。癌治療では放射線療法も用いられる。かかる治療では、Ｘ線、ガンマ線、電子ビーム又は陽子などの高エネルギー粒子又は波を使用して癌細胞を破壊し、又はそれに損傷を与える。全身が抗癌薬物に曝露される化学療法と異なり、放射線療法は、通常、局所治療である。しかしながら、治療放射線を異常組織のみに選択的に投与することは困難であり、従って、治療を通じて、異常組織に近接した正常組織も、損傷を与える可能性のある線量の放射線に曝露される。
【０００４】
[0004]  癌免疫療法は、癌細胞を標的化することに代えて、免疫系の活性化に重点を置く癌治療の新しいパラダイムである。その原理は、宿主の免疫応答、特に適応Ｔ細胞応答を備え直すことにより、癌細胞、詳細には他の形態の治療を逃れた最小の残存疾患を死滅させるための免疫監視機構を提供し、ひいては持続性の防御免疫を実現するというものである。
【０００５】
[0005]  ２０１１年の黒色腫の治療に対する抗ＣＴＬＡ−４抗体イピリムマブのＦＤＡ承認は、癌免疫療法の新時代の先駆けとなった。臨床試験において抗ＰＤ−１又は抗ＰＤ−Ｌ１療法が黒色腫、腎癌、及び肺癌で持続的な応答を誘導したことが実証され、その時代の到来を更に知らしめている（Pardoll, D.M., Nat Immunol. 2012; 13:1129-32）。しかしながら、イピリムマブ療法はその毒性プロファイルが制約となり、この毒性は恐らく、主要Ｔ細胞阻害チェックポイントを妨害することによるものである抗ＣＴＬＡ−４治療が、新規の自己反応性Ｔ細胞の生成につながり得ることが理由である。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用を阻害すると、ほとんどが本質的に抗ウイルス性又は抗癌である枯渇したＴ細胞における既存の慢性免疫応答の脱阻害がもたらされるが（Wherry, E.J., Nat Immunol. 2011; 12:492-9）、それにも関わらず、抗ＰＤ−１療法は時に致死的となる可能性のある肺関連の自己免疫性有害事象をもたらし得る。これまでの抗ＰＤ１及び抗ＰＤ−Ｌ１の有望な臨床活性にも関わらず、治療活性の増加又は毒性の低下のいずれか、又はその両方による治療指数の増加は、依然として免疫療法薬開発の中心的な目標である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要
[0006]  本発明は、ＴＧＦβ結合能を有するＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）の少なくとも一部分と、ヒトタンパク質プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）などの免疫チェックポイントタンパク質に結合する抗体又は抗原結合断片とを含む二機能性タンパク質の投与を含む癌の併用療法の発見に基づく。本併用療法は、例えば、放射線照射、化学療法剤、生物製剤及び／又はワクチンなどの抗癌療法剤の投与も含む。本併用療法は、個々の薬剤を別個に投与する効果と比較して相乗効果を呈する。
【０００７】
[0007]  従って、第１の態様において、本発明は、（ｉ）ヒトＴＧＦβＲＩＩ又はＴＧＦβ結合能を有するその断片（例えば、可溶性断片）と、ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体又はその抗原結合断片（例えば、本明細書に記載される抗体又は抗体断片のいずれか）とを含む二機能性タンパク質の投与、及び（ｉｉ）少なくとも１つの追加の第２の抗癌療法剤の投与を含む対象の癌を治療する方法を特徴とする。
【０００８】
[0008]  特定の実施形態において、本発明の併用治療方法は、（ａ）ＰＤ−Ｌ１に結合する抗体の重鎖の少なくとも可変ドメイン（例えば、配列番号２のアミノ酸１〜１２０）、及び（ｂ）ヒトＴＧＦβＲＩＩ又はＴＧＦβ結合能を有するその可溶性断片（例えば、ヒトＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、配列番号９のアミノ酸２４〜１５９又は本明細書に記載されるもののいずれか）を含むポリペプチドの、少なくとも１つの追加の抗癌療法剤との併用での使用を特徴とする。本ポリペプチドは、可変ドメインのＣ末端をヒトＴＧＦβＲＩＩ又はＴＧＦβ結合能を有するその可溶性断片のＮ末端に連結するアミノ酸リンカーを更に含み得る。本ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列又は配列番号３と実質的に同一のアミノ酸配列を含み得る。抗体断片は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖ断片であり得る。
【０００９】
[0009]  特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩとを含む。抗体は、任意選択で、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１０】
[0010]  特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２を含む抗体又はその抗原結合断片とＴＧＦβ結合能を有するヒトＴＧＦβＲＩＩの断片（例えば、可溶性断片）とを含む。抗体は、任意選択で、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１１】
[0011]  特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１２】
[0012]  特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜１２０を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１３】
[0013]  特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜１２０を含む抗体又はその抗原結合断片とＴＧＦβ結合能を有するヒトＴＧＦβＲＩＩの断片（例えば、可溶性断片）とを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１４】
[0014]  特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜１２０を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１５】
[0015]  特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２に存在する超可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１６】
[0016]  特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２に存在する超可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片とＴＧＦβ結合能を有するヒトＴＧＦβＲＩＩの断片（例えば、可溶性断片）とを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１７】
[0017]  特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号２に存在する超可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１８】
[0018]  特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号１２を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００１９】
[0019]  特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号１２を含む抗体又はその抗原結合断片とＴＧＦβ結合能を有するヒトＴＧＦβＲＩＩの断片（例えば、可溶性断片）とを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００２０】
[0020]  特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号１２を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００２１】
[0021]  特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号１２に存在する超可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００２２】
[0022]  特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号１２に存在する超可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片とＴＧＦβ結合能を有するヒトＴＧＦβＲＩＩの断片（例えば、可溶性断片）とを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００２３】
[0023]  特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号１２に存在する超可変領域を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００２４】
[0024]  特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号１４を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００２５】
[0025]  特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号１４を含む抗体又はその抗原結合断片とＴＧＦβ結合能を有するヒトＴＧＦβＲＩＩの断片（例えば、可溶性断片）とを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００２６】
[0026]  特定の実施形態において、本タンパク質又はポリペプチドは、配列番号１４を含む抗体又はその抗原結合断片とヒトＴＧＦβＲＩＩ  ＥＣＤとを含む。抗体は、修飾定常領域（例えば、Ｃ末端Ｌｙｓ→Ａｌａ置換、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）配列からＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）への突然変異、又はＩｇＧ１ヒンジ領域とＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインとを含むハイブリッド定常領域を含めた、本明細書に記載されるいずれか）を含み得る。
【００２７】
[0027]  本発明は、本発明の併用療法における、上記に記載されるポリペプチドと、ポリペプチドと組み合わせたときにＰＤ−Ｌ１に結合する抗原結合部位を形成する抗体の軽鎖の少なくとも可変ドメインとを含むタンパク質の使用も提供する。このタンパク質は、（ａ）それぞれ配列番号３のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有する２つのポリペプチド、及び（ｂ）それぞれ配列番号１のアミノ酸配列からなるアミノ酸配列を有する２つの追加のポリペプチドを含み得る。
【００２８】
[0028]  本発明は、癌の治療に使用されるか又は腫瘍成長の阻害に使用される１つ以上の追加の抗癌療法剤の投与と併用した、上記に記載されるタンパク質の投与を含む癌の治療用の併用療法を特徴とする。１つ以上の追加の抗癌療法剤には、放射線照射、化学療法剤、生物製剤及び／又はワクチンが含まれる。
【００２９】
[0029]  癌又は腫瘍は、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、前立腺癌、腎癌、子宮頸癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、子宮内膜癌、子宮癌、膀胱癌、神経内分泌癌、頭頸部癌、肝癌、鼻咽腔癌、精巣癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮細胞皮膚癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫及び骨髄異形成症候群からなる群から選択され得る。
【００３０】
[0030]  本発明は、腫瘍成長を阻害するか又は癌を治療する併用療法方法も特徴とする。本方法は、上記に記載されるタンパク質に腫瘍を曝露することを含む。この方法は、腫瘍を放射線及び又は化学療法薬、生物学的製剤、若しくはワクチンの投与に曝露するステップを更に含み得る。特定の実施形態において、腫瘍又は癌は、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頸部の腫瘍又は癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頸部、肝臓、上咽頭、精巣の腫瘍又は癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮細胞皮膚癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫及び骨髄異形成症候群からなる群から選択される。
【００３１】
[0031]  「ＴＧＦβＲＩＩ」又は「ＴＧＦβ受容体ＩＩ」とは、野生型ヒトＴＧＦβ受容体２型アイソフォームＡ配列（例えば、ＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）受託番号ＮＰ＿００１０２００１８（配列番号８）のアミノ酸配列）を有するポリペプチド、又は野生型ヒトＴＧＦβ受容体２型アイソフォームＢ配列（例えば、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ＿００３２３３（配列番号９）のアミノ酸配列）を有するポリペプチド又は配列番号８若しくは配列番号９のアミノ酸配列と実質的に同一の配列を有するポリペプチドが意味される。ＴＧＦβＲＩＩは、野生型配列のＴＧＦβ結合活性の少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２５％、３５％、５０％、７５％、９０％、９５％、又は９９％を保持し得る。発現したＴＧＦβＲＩＩのポリペプチドはシグナル配列を欠いている。
【００３２】
[0032]  「ＴＧＦβ結合能を有するＴＧＦβＲＩＩの断片」とは、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ＿００１０２００１８（配列番号８）又はＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ＿００３２３３（配列番号９）、又は配列番号８若しくは配列番号９と実質的に同一の配列の任意の一部分であって、野生型受容体又は対応する野生型断片のＴＧＦβ結合活性の少なくとも一部（例えば、少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２５％、３５％、５０％、７５％、９０％、９５％、又は９９％）を保持する少なくとも２０（例えば、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７５、又は２００）アミノ酸長の一部分が意味される。典型的にはかかる断片は可溶性断片である。例示的なかかる断片は、配列番号１０の配列を有するＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインである。
【００３３】
[0033]  「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列と少なくとも５０％、望ましくは６０％、７０％、７５％、又は８０％、より望ましくは８５％、９０％、又は９５％、及びより望ましくは９９％のアミノ酸配列同一性を呈するポリペプチドが意味される。比較配列の長さは、概して、少なくとも１０アミノ酸、望ましくは少なくとも１５連続アミノ酸、より望ましくは少なくとも２０、２５、５０、７５、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、又は３５０連続アミノ酸、及びより望ましくは完全長アミノ酸配列であり得る。
【００３４】
[0034]  「患者」とは、ヒト或いは非ヒト動物（例えば、哺乳動物）のいずれもが意味される。
【００３５】
[0035]  患者における疾患、障害、又は病態（例えば、癌）を「治療する」とは、患者に治療剤を投与することによって疾患、障害、又は病態の少なくとも１つの症状を軽減することが意味される。
【００３６】
[0036]  「癌」とは、異常な状態で増殖する細胞群が意味される。
【００３７】
[0037]  本明細書において、以下に本発明の他の実施形態及び詳細を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】[0038]１つの抗ＰＤ−Ｌ１抗体が（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４Ｇｌｙリンカーを介してＴＧＦβ受容体ＩＩの２つの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に融合したものを含む抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ分子の概略図である。
【図２】[0039]試験「ＴＩ１３−０２７：Ｃ５７Ｂ／Ｌ６野生型マウスのＭＣ３８腫瘍モデルにおける抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップと５−ＦＵ及びオキサリプラチン療法との併用」（ここで、群及び治療は、Ｎ＝１０匹マウス／群である）の試験設計を要約する表である。
【図３】[0040]試験「ＴＩ１４−０１２：Ｂ細胞欠損マウスのＭＣ３８腫瘍モデルにおける抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップと５−ＦＵ及びオキサリプラチン療法との併用」（ここで、群及び治療は、Ｎ＝１０匹マウス／群である）の試験設計を要約する表である。
【図４Ａ】[0041]オキサリプラチン／５−ＦＵと抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとの併用が腫瘍成長阻害及び腫瘍応答性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を亢進させることを示す一連のグラフである（Ｃ５７ＢＬ／６マウス；試験ＴＩ１３−０２７）。腫瘍容積は、試験期間を通じて週２回測定した。腫瘍容積データは、対数変換し、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを実施した。全てのＡＮＯＶＡに多重比較のチューキーの補正を含めて治療群間の統計的有意差を測定した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判定した。
【図４Ｂ】[0041]オキサリプラチン／５−ＦＵと抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとの併用が腫瘍成長阻害及び腫瘍応答性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を亢進させることを示す一連のグラフである（Ｃ５７ＢＬ／６マウス；試験ＴＩ１３−０２７）。腫瘍重量データは、一元配置ＡＮＯＶＡで評価した。全てのＡＮＯＶＡに多重比較のチューキーの補正を含めて治療群間の統計的有意差を測定した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判定した。
【図４Ｃ】[0041]オキサリプラチン／５−ＦＵと抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとの併用が腫瘍成長阻害及び腫瘍応答性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を亢進させることを示す一連のグラフである（Ｃ５７ＢＬ／６マウス；試験ＴＩ１３−０２７）。ＩＦＮ−γ産生Ｐ１５Ｅ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって定量化した。ＥＬＩＳｐｏｔデータは、一元配置ＡＮＯＶＡで評価した。全てのＡＮＯＶＡに多重比較のチューキーの補正を含めて治療群間の統計的有意差を測定した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判定した。
【図４Ｄ】[0041]オキサリプラチン／５−ＦＵと抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとの併用が腫瘍成長阻害及び腫瘍応答性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を亢進させることを示す一連のグラフである（Ｃ５７ＢＬ／６マウス；試験ＴＩ１３−０２７）。腫瘍容積は、試験期間を通じて週２回測定した。腫瘍容積データは、対数変換し、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを実施した。全てのＡＮＯＶＡに多重比較のチューキーの補正を含めて治療群間の統計的有意差を測定した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判定した。
【図５Ａ】[0042]オキサリプラチン／５−ＦＵと抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとの併用が腫瘍成長阻害及び腫瘍応答性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を亢進させることを示す一連のグラフである（Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｉｇｈｍｔｍ１Ｃｇｎ／Ｊマウス；試験ＴＩ１４−０１２）。腫瘍容積データは、対数変換し、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを実施した。全てのＡＮＯＶＡに多重比較のチューキーの補正を含めて治療群間の統計的有意差を測定した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判定した。
【図５Ｂ】[0042]オキサリプラチン／５−ＦＵと抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとの併用が腫瘍成長阻害及び腫瘍応答性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を亢進させることを示す一連のグラフである（Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｉｇｈｍｔｍ１Ｃｇｎ／Ｊマウス；試験ＴＩ１４−０１２）。腫瘍重量データは、一元配置ＡＮＯＶＡで評価した。全てのＡＮＯＶＡに多重比較のチューキーの補正を含めて治療群間の統計的有意差を測定した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判定した。
【図５Ｃ】[0042]オキサリプラチン／５−ＦＵと抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとの併用が腫瘍成長阻害及び腫瘍応答性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を亢進させることを示す一連のグラフである（Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｉｇｈｍｔｍ１Ｃｇｎ／Ｊマウス；試験ＴＩ１４−０１２）。ＩＦＮ−γ産生Ｐ１５Ｅ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって定量化した。ＥＬＩＳｐｏｔデータは、一元配置ＡＮＯＶＡで評価した。全てのＡＮＯＶＡに多重比較のチューキーの補正を含めて治療群間の統計的有意差を測定した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判定した。
【図５Ｄ】[0042]オキサリプラチン／５−ＦＵと抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとの併用が腫瘍成長阻害及び腫瘍応答性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を亢進させることを示す一連のグラフである（Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｉｇｈｍｔｍ１Ｃｇｎ／Ｊマウス；試験ＴＩ１４−０１２）。腫瘍容積データは、対数変換し、二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを実施した。全てのＡＮＯＶＡに多重比較のチューキーの補正を含めて治療群間の統計的有意差を測定した。ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判定した。
【図６Ａ】[0043]放射線照射及び抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップが相乗的な腫瘍成長阻害及び腫瘍応答性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘導することを示す一連のグラフである（ＴＩ１３−１０９）。腫瘍容積は、週２回計測し、平均腫瘍容積は、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として提示した。
【図６Ｂ】[0043]放射線照射及び抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップが相乗的な腫瘍成長阻害及び腫瘍応答性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘導することを示す一連のグラフである（ＴＩ１３−１０９）。腫瘍重量データは、１４日目に決定した。
【図６Ｃ】[0043]放射線照射及び抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップが相乗的な腫瘍成長阻害及び腫瘍応答性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘導することを示す一連のグラフである（ＴＩ１３−１０９）。ＩＦＮ−γ産生Ｐ１５Ｅ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度を１４日目にＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって定量化した。１６４μｇの用量レベルでの抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップのデータは、単剤療法又は併用のいずれとしても、５５μｇの用量レベルでのデータと同様であった。
【図７Ａ】[0044]放射線照射及び抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップが相乗的な腫瘍成長阻害及び腫瘍応答性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘導することを示す一連のグラフである（反復試験）（ＴＩ１４−０１３）。腫瘍容積は、週２回測定し、平均腫瘍容積は、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として提示した。
【図７Ｂ】[0044]放射線照射及び抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップが相乗的な腫瘍成長阻害及び腫瘍応答性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘導することを示す一連のグラフである（反復試験）（ＴＩ１４−０１３）。腫瘍重量は、１４日目に評価した。
【図７Ｃ】[0044] 放射線照射及び抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップが相乗的な腫瘍成長阻害及び腫瘍応答性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を誘導することを示す一連のグラフである（反復試験）（ＴＩ１４−０１３）。ＩＦＮ−γ産生Ｐ１５Ｅ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度を１４日目にＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって定量化した。
【図８Ａ】[0045]放射線及び抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップが腫瘍浸潤性ＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＮＫ細胞を促進することを示す一連のグラフである（ＴＩ１４−０１３）。腫瘍浸潤性ＣＤ８＋  ＴＩＬ。
【図８Ｂ】[0045]放射線及び抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップが腫瘍浸潤性ＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＮＫ細胞を促進することを示す一連のグラフである（ＴＩ１４−０１３）。腫瘍浸潤性ＮＫ１．１＋  ＴＩＬ。
【図８Ｃ】[0045]放射線及び抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップが腫瘍浸潤性ＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＮＫ細胞を促進することを示す一連のグラフである（ＴＩ１４−０１３）。ＣＤ８＋  ＴＩＬ  ＥＯＭＥＳ発現。
【図８Ｄ】[0045]放射線及び抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップが腫瘍浸潤性ＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＮＫ細胞を促進することを示す一連のグラフである（ＴＩ１４−０１３）。ＣＤ８＋  ＴＩＬ脱顆粒。
【図９Ａ】[0046]アブスコパル効果に関して試験するための原発性及び二次性腫瘍を担持するマウスにおける放射線投与を示す概略図である。
【図９Ｂ】[0047]治療開始からの日数におけるマウスの原発性腫瘍容積を示す折れ線グラフである。
【図９Ｃ】[0048]治療開始からの日数におけるマウスの二次性腫瘍容積（ｍｍ３）を示す折れ線グラフである。（●＝アイソタイプ対照４００μｇ；◆＝抗ＰＤＬ１−ＴＧＦβトラップμｇ；■＝放射線５００ラド；▼＝放射線＋抗ＰＤＬ１−ＴＧＦβトラップ）。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
詳細な説明
[0049]  本発明は、概して、癌の治療のための併用療法に関し、特に、（ｉ）ＴＧＦβＲＩＩ又はＴＧＦβ結合能を有するその断片とプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）などの免疫チェックポイントタンパク質に結合する抗体又はその抗原結合断片とを含む二機能性分子と、（ｉｉ）少なくとも１つの追加の抗癌療法剤との併用に関する。かかる抗癌療法剤には、例えば、放射線照射、化学療法剤、生物製剤及び／又はワクチンが含まれる。本発明の特定の実施形態において、本併用療法は、相乗的抗癌効果をもたらす。
【００４０】
[0050]  本発明の併用療法は、各薬剤単独の効果と比較して抗癌効果が亢進するのみならず、各薬剤による単剤療法と比較したときに併用療法中の１つ以上の薬剤の投与量を減らすことができる一方、なおも全体的な抗癌効果を実現し得るため、特に有利である。相乗効果により、患者に投与する薬物の総量を有利に減らすことができ、結果として副作用が低下し得る。
【００４１】
[0051]  本発明の併用療法は、特定の腫瘍細胞又は免疫細胞の外表面上に存在する細胞性免疫チェックポイント受容体を標的化する抗体部分に係留された可溶性サイトカイン受容体（ＴＧＦβＲＩＩ）を使用してＴＧＦβを捕捉することにより、腫瘍微小環境におけるＴＧＦβの局所的な低減を可能にする。本発明の抗体部分の例は、免疫チェックポイントタンパク質であり、抗ＰＤ−Ｌ１である。この二機能性分子（本明細書では「抗体−サイトカイントラップ」と称されることもある）は、抗受容体抗体とサイトカイントラップとが物理的に結び付いているため正確に有効となる。この得られる利点（例えば、抗体と受容体とを別個の分子として投与するのと比べたときの）は、一部には、サイトカインがオートクリン及びパラクリン機能によって主に局所環境で機能することが理由である。抗体部分がサイトカイントラップを腫瘍微小環境に仕向け、そこでサイトカイントラップは局所的免疫抑制オートクリン又はパラクリン効果を中和することによって最も有効となり得る。更に、抗体の標的が抗体結合時にインターナライズされる場合、サイトカイン／サイトカイン受容体複合体の有効なクリアランス機構がもたらされる。ＰＤ−Ｌ１について、抗体介在性の標的インターナリゼーションが示されている。これは、抗ＴＧＦβ抗体の使用と比べて特徴的な利点であり、なぜなら、第一に、抗ＴＧＦβ抗体は完全には中和しない可能性があり；及び第二に、この抗体はサイトカインの半減期を延長させる担体として機能することもあり、且つ多くの場合に抗体／サイトカイン複合体は、蓄積して最終的に解離することによりサイトカインを循環中に放出して戻す循環シンクとして機能するためである（Montero-Julian et al., Blood. 1995; 85:917-24）。サイトカイントラップを使用したリガンドの中和は、ＣＳＦ−１の場合のような、抗体による受容体の遮断と比べても優れた戦略でもあり得る。ＣＳＦ−１は受容体介在性エンドサイトーシスによって循環から取り除かれるため、抗ＣＳＦ−１受容体抗体の遮断は循環ＣＳＦ−１濃度の大幅な上昇を引き起こした（Hume et al., Blood. 2012;119:1810-20）。
【００４２】
[0052]  以下に記載するとおり、少なくとも１つの追加の抗癌療法と併用した抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップによる治療は、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１と免疫細胞上のＰＤ−１との間の相互作用の同時遮断、腫瘍微小環境中のＴＧＦβの中和、及び抗癌剤の治療効果により相乗的抗腫瘍効果を生じさせる。理論によって拘束されるものではないが、これは、恐らく、単一の分子実体による２つの主要な免疫エスケープ機構の同時遮断、加えて腫瘍微小環境中のＴＧＦβの標的化された枯渇によって達成される相乗効果、並びに追加の１つ又は複数の抗癌剤の抗腫瘍効果に起因する。この枯渇は、（１）腫瘍細胞の抗ＰＤ−Ｌ１ターゲティング、（２）ＴＧＦβトラップによる腫瘍微小環境中のＴＧＦβオートクリン／パラクリンの結合、及び（３）ＰＤ−Ｌ１受容体介在性エンドサイトーシスを通じた結合したＴＧＦβの破壊によって実現する。前述の作用機構は、単剤の抗ＰＤ−Ｌ１、ＴＧＦβトラップ及び追加の抗癌治療法の併用療法によって実現できない。更に、Ｆｃ（ＩｇＧの結晶化断片）のＣ末端に融合したＴＧＦβＲＩＩは、ＴＧＦβＲＩＩをＦｃのＮ末端に置いたＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃと比べて数倍強力であった。抗ＰＤＬ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐで得られる卓越した効力は、ＴＧＦβＲＩＩがＴＧＦβ２を捕捉しないというある種の懸念も緩和する。Yang et al., Trends Immunol. 2010; 31:220-227が指摘するとおり、ある種の腫瘍型は、確かに最初にＴＧＦβ２を分泌するが、腫瘍が進行するにつれ、腫瘍微小環境内のＴＧＦβは主に骨髄由来のサプレッサー細胞によって分泌され、この細胞はＴＧＦβ１を分泌する。有効な免疫腫瘍治療薬として非常に有望視されることに加え、可溶性ＴＧＦβＲＩＩによる治療は、ＴＧＦβ標的化療法、特にＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害薬の心毒性の懸念を潜在的に低減し得る。これは、心臓の胚発生並びに虚血再灌流傷害後の心筋損傷の修復においてＴＧＦβ２が重要な役割を果たすためである（Roberts et al., J Clin Invest. 1992; 90:2056-62）。
【００４３】
癌標的としてのＴＧＦβ
[0053]  ＴＧＦβは、二重人格的な癌分子としてのその逆説的な役割に起因して、癌免疫療法における幾らか問題のある標的であった（Bierie et al., Nat Rev Cancer. 2006; 6:506-20）。他の幾つかのサイトカインと同様に、ＴＧＦβ活性は開発段階であり、コンテクスト依存的である。実際、ＴＧＦβは、腫瘍プロモーター又は腫瘍サプレッサーのいずれとしても機能することができ、腫瘍発生、進行及び転移に影響を及ぼし得る。このＴＧＦβの二重の役割の根底にある機構は依然として不明のままである（Yang et al., Trends Immunol. 2010; 31:220-227）。Ｓｍａｄ依存的シグナル伝達がＴＧＦβシグナル伝達の成長阻害を媒介する一方、Ｓｍａｄ非依存的経路がその腫瘍促進効果に寄与することが仮定されているが、Ｓｍａｄ依存的経路が腫瘍進行に関わることを示すデータもある（Yang et al., Cancer Res. 2008; 68:9107-11）。
【００４４】
[0054]  ＴＧＦβリガンド及び受容体の両方が、治療標的として精力的に研究されている。３つのリガンドアイソフォーム、ＴＧＦβ１、２及び３があり、その全てがホモ二量体として存在する。また、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）も３つあり、それらはＴＧＦβＲ  Ｉ型、ＩＩ型及びＩＩＩ型と呼ばれる（Lopez-Casillas et al., J Cell Biol. 1994; 124:557-68）。ＴＧＦβＲＩはシグナル伝達鎖であり、リガンドと結合することはできない。ＴＧＦβＲＩＩは高親和性でリガンドＴＧＦβ１及び３と結合するが、ＴＧＦβ２とは結合しない。ＴＧＦβＲＩＩ／ＴＧＦβ複合体はＴＧＦβＲＩを動員してシグナル伝達複合体を形成する（Won et al., Cancer Res. 1999; 59:1273-7）。ＴＧＦβＲＩＩＩは、そのシグナル伝達受容体に対するＴＧＦβ結合の正の調節因子であり、３つ全てのＴＧＦβアイソフォームと高親和性で結合する。細胞表面上で、ＴＧＦβ／ＴＧＦβＲＩＩＩ複合体はＴＧＦβＲＩＩと結合し、次にＴＧＦβＲＩを動員して、ＴＧＦβＲＩがＴＧＦβＲＩＩＩに取って代わることによりシグナル伝達複合体を形成する。
【００４５】
[0055]  ３つの異なるＴＧＦβアイソフォームの全ては、同じ受容体を介してシグナルを伝達するが、それらはインビボで差次的発現パターン及び非重複機能を有することが知られている。３つの異なるＴＧＦ−βアイソフォームノックアウトマウスは個別的な表現型を有し、多数の非代償性の機能が指摘される（Bujak et al., Cardiovasc Res. 2007; 74:184-95）。ＴＧＦβ１ヌルマウスは造血及び血管形成欠損を有し、及びＴＧＦβ３ヌルマウスは肺発生及び口蓋形成不全を示し、ＴＧＦβ２ヌルマウスは様々な発生異常を示し、最も顕著なものは心多重奇形である（Bartram et al., Circulation. 2001; 103:2745-52; Yamagishi et al., Anat Rec. 2012; 295:257-67）。更に、ＴＧＦβは、虚血再灌流傷害後の心筋損傷の修復において重要な役割を果たすことが示唆されている。成人の心臓では、心筋細胞はＴＧＦβを分泌し、これがオートクリンとして機能することで自発拍動数が維持される。重要なことに、心筋細胞によって分泌されるＴＧＦβの７０〜８５％がＴＧＦβ２である（Roberts et al., J Clin Invest. 1992; 90:2056-62）。要約すれば、それぞれ腫瘍微小環境及び心臓生理学におけるＴＧＦβ１及びＴＧＦβ２の主な役割を考えると、ＴＧＦβ１は中和するがＴＧＦβ２は中和しない治療剤であれば、抗腫瘍活性を損なうことなく心毒性を最小限に抑えることにより、最適な治療指数をもたらし得る。これは、サルにおいて抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐに心毒性を含め毒性がないことを観察した本発明者らの知見と整合する。
【００４６】
[0056]  ＴＧＦβを中和する治療手法は、ＴＧＦβ受容体の細胞外ドメインを可溶性受容体トラップ及び中和抗体として使用することを含む。受容体トラップ手法のなかでは、可溶性ＴＧＦβＲＩＩＩが、３つ全てのＴＧＦβリガンドと結合するため当然の選択であるように思われ得る。しかしながら、７６２アミノ酸残基の細胞外ドメインを含む２８０〜３３０ｋＤグルコサミノグリカン（ＧＡＧ）糖タンパク質として天然に存在するＴＧＦβＲＩＩＩは、生物学的療法薬の開発には極めて複雑なタンパク質である。ＧＡＧを欠いている可溶性ＴＧＦβＲＩＩＩを昆虫細胞で作製することができ、強力なＴＧＦβ中和剤であることが示されている（Vilchis-Landeros et al, Biochem J 355:215, 2001）。ＴＧＦβＲＩＩＩの２つの別個の結合ドメイン（エンドグリン関連及びウロモジュリン関連）は独立に発現し得るが、しかし、これらは、可溶性ＴＧＦβＲＩＩＩの２０〜１００分の１の低さの親和性及びはるかに低い中和活性を有することが示された（Mendoza et al., Biochemistry. 2009; 48:11755-65）。他方で、ＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインは僅か１３６アミノ酸残基長であり、２５〜３５ｋＤのグリコシル化タンパク質として作製することができる。更に、組換え可溶性ＴＧＦβＲＩＩは、２００ｐＭのＫＤ（これは細胞上の完全長ＴＧＦβＲＩＩの５０ｐＭのＫＤとほぼ同程度である）でＴＧＦβ１と結合することが示された（Lin et al., J Biol Chem. 1995; 270:2747-54）。可溶性ＴＧＦβＲＩＩ−Ｆｃが抗癌剤として試験されており、腫瘍モデルにおいて樹立マウス悪性中皮腫成長を阻害することが示された（Suzuki et al., Clin Cancer Res. 2004; 10:5907-18）。ＴＧＦβＲＩＩはＴＧＦβ２と結合せず、且つＴＧＦβＲＩＩＩはＴＧＦβＲＩＩより低い親和性でＴＧＦβ１及び３と結合するため、ＴＧＦβＲＩＩＩのエンドグリンドメインとＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメインとの融合タンパク質が細菌で作製されており、細胞ベースのアッセイにおいてＴＧＦβＲＩＩ又はＲＩＩＩのいずれよりも有効にＴＧＦβ１及び２のシグナル伝達を阻害することが示された（Verona et al., Protein Eng Des Sel. 2008; 21:463-73）。腫瘍モデルにおけるある種の有望な抗腫瘍活性にも関わらず、本発明者らの知る限り、ＴＧＦβ受容体トラップ組換えタンパク質が臨床で試験されたことはない。
【００４７】
[0057]  ＴＧＦβリガンドの３つ全てのアイソフォームを中和するなおも別の手法は、汎中和抗ＴＧＦβ抗体、又は受容体がＴＧＦβ１、２及び３に結合することを阻止する抗受容体抗体に関してスクリーニングすることである。進行悪性黒色腫又は腎細胞癌患者における第Ｉ／ＩＩ相試験において、ＴＧＦβの全てのアイソフォームに特異的なヒト抗体であるＧＣ１００８があった（Morris et al., J Clin Oncol 2008; 26:9028 (Meeting abstract)）。この治療は安全で良好に忍容されることが分かったが、限られた臨床的効力のみが観察され、従って免疫学的効果を更に特徴付けることなしには、抗ＴＧＦβ療法の重要性を解釈することは困難であった（Flavell et al., Nat Rev Immunol. 2010; 10:554-67）。また、臨床で試験されたＴＧＦβアイソフォーム特異的抗体もあった。第２相臨床試験において、緑内障手術の過度の術後瘢痕を防止するための治療として、ＴＧＦβ１に特異的な抗体であるメテリムマブが試験された；及びＴＧＦβ２に特異的な抗体であるレルデリムマブが、第３相試験において、安全であるものの眼手術後の瘢痕の改善には効果がないことが分かった（Khaw et al., Ophthalmology 2007; 114:1822-1830）。受容体が３つ全てのＴＧＦβアイソフォームに結合することを阻止する抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体、例えば抗ヒトＴＧＦβＲＩＩ抗体ＴＲ１及び抗マウスＴＧＦβＲＩＩ抗体ＭＴ１もマウスモデルにおいて原発腫瘍の増殖及び転移に対する幾らかの治療効力を示している（Zhong et al., Clin Cancer Res. 2010; 16:1191-205）。現在までに、ＴＧＦβを標的化した抗癌治療に関する試験の大多数は、多くの場合に極めて毒性が高いＴＧＦβシグナル伝達の小分子阻害薬を含め、ほとんど前臨床ステージであり、得られる抗腫瘍効力は限られたものとなっている（Calone et al., Exp Oncol. 2012; 34:9-16; Connolly et al., Int J Biol Sci. 2012; 8:964-78）。
【００４８】
[0058]  本発明の併用療法における使用のための本発明の抗体−ＴＧＦβトラップは、ＴＧＦβ結合能を有するヒトＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）の少なくとも一部分を含む二機能性タンパク質である。一実施形態において、ＴＧＦβ  ｔｒａｐポリペプチドは、ＴＧＦβ結合能を有するヒトＴＧＦβ受容体２型アイソフォームＡ（配列番号８）の可溶性部分である。更なる実施形態において、ＴＧＦβ  ｔｒａｐポリペプチドは配列番号８のアミノ酸７３〜１８４を少なくとも含む。更に別の実施形態において、ＴＧＦβ  ｔｒａｐポリペプチドは配列番号８のアミノ酸２４〜１８４を含む。別の実施形態において、ＴＧＦβ  ｔｒａｐポリペプチドは、ＴＧＦβ結合能を有するヒトＴＧＦβ受容体２型アイソフォームＢ（配列番号９）の可溶性部分である。更なる実施形態において、ＴＧＦβ  ｔｒａｐポリペプチドは配列番号９のアミノ酸４８〜１５９を少なくとも含む。更に別の実施形態において、ＴＧＦβ  ｔｒａｐポリペプチドは配列番号９のアミノ酸２４〜１５９を含む。更に別の実施形態において、ＴＧＦβ  ｔｒａｐポリペプチドは配列番号９のアミノ酸２４〜１０５を含む。
【００４９】
免疫チェックポイント脱阻害
[0059]  治療用抗体によって脱阻害するためＴ細胞阻害チェックポイントを標的化する手法は、精力的に研究されている領域である（レビューについては、Pardoll, Nat Rev Cancer. 2012; 12:253-264を参照されたい）。１つの手法では、抗体部分又はその抗原結合断片がＴ細胞上のＴ細胞阻害チェックポイント受容体タンパク質、例えば：ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、及びＬＡＩＲ１などを標的化する。別の手法では、抗体部分が抗原提示細胞及び腫瘍細胞上の対抗受容体（これらの細胞は自身の免疫回避のためこれらの対抗受容体の幾つかを取り入れる）、例えば：ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）、Ｂ７−ＤＣ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ−４、Ｂ７−Ｈ３、又はＢ７−Ｈ４などを標的化する。
【００５０】
[0060]  本発明は、脱阻害のためその抗体部分又はその抗原結合断片を介してＴ細胞阻害チェックポイントを標的化する抗体ＴＧＦβ  ｔｒａｐの使用を企図する。そのため、本発明者らは、ＴＧＦβ  ｔｒａｐと様々なＴ細胞阻害チェックポイント受容体タンパク質を標的化する抗体、例えば抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＴＩＭ−３及び抗ＬＡＧ３との組み合わせの抗腫瘍効力を試験した。本発明者らは、ＴＧＦβ  ｔｒａｐを抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせると、単剤療法で観察されたものを超える顕著な抗腫瘍活性が示されることを見出した。対照的に、上記に列挙する標的に対する抗体との他の組み合わせのなかには、優れた効力を示すものはなかった。詳細には、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１は互いに結合して免疫チェックポイント阻害を達成するコグネイト受容体であるため、ＴＧＦβ  ｔｒａｐと抗ＰＤ−１抗体との併用治療が抗ＰＤ−Ｌ１で観察されるものと同程度の活性を実証することを予想し得た。しかしながら、これは本発明者らが見出したことではない。
【００５１】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体
[0061]  本発明は、当該技術分野において記載される任意の抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合断片の使用を含み得る。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば２９Ｅ２Ａ３抗体（Biolegend、カタログ番号３２９７０１）など、市販されている。抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト抗体であり得る。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ及びＦｖ断片が含まれ、これらについては以下に更に詳細に記載する。
【００５２】
[0062]  例示的抗体が国際公開第２０１３／０７９１７４号に記載される。これらの抗体は、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３配列を含む重鎖可変領域ポリペプチドを含むことができ、ここで：
（ａ）ＨＶＲ−ＨＩ配列はＸ１ＹＸ２ＭＸ３であり；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２配列はＳＩＹＰＳＧＧＸ４ＴＦＹＡＤＸ５ＶＫＧであり；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３配列はＩＫＬＧＴＶＴＴＶＸ６Ｙであり；
更に、式中：Ｘ１はＫ、Ｒ、Ｔ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｍ、Ｉ、又はＳであり；Ｘ２はＶ、Ｒ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、又はＩであり；Ｘ３はＨ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｖ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、又はＭであり；Ｘ４はＦ又はＩであり；Ｘ５はＳ又はＴであり；Ｘ６はＥ又はＤである。
【００５３】
[0063]  一実施形態において、Ｘ１はＭ、Ｉ、又はＳであり；Ｘ２はＲ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、又はＩであり；Ｘ３はＦ又はＭであり；Ｘ４はＦ又はＩであり；Ｘ５はＳ又はＴであり；Ｘ６はＥ又はＤである。
【００５４】
[0064]  別の実施形態において、Ｘ１はＭ、Ｉ、又はＳであり；Ｘ２はＬ、Ｍ、又はＩであり；Ｘ３はＦ又はＭであり；Ｘ４はＩであり；Ｘ５はＳ又はＴであり；Ｘ６はＤである。
【００５５】
[0065]  更に別の実施形態において、Ｘ１はＳであり；Ｘ２はＩであり；Ｘ３はＭであり；Ｘ４はＩであり；Ｘ５はＴであり；Ｘ６はＤである。
【００５６】
[0066]  別の態様において、ポリペプチドは、式：（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）に係るＨＶＲ間に並ぶ可変領域重鎖フレームワーク配列を更に含む。
【００５７】
[0067]  なおも別の態様において、フレームワーク配列はヒトコンセンサスフレームワーク配列又はヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に由来する。
【００５８】
[0068]  更に別の態様において、フレームワーク配列の少なくとも１つは以下である：
ＨＣ−ＦＲ１はＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳであり；
ＨＣ−ＦＲ２はＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳであり；
ＨＣ−ＦＲ３はＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲであり；
ＨＣ−ＦＲ４はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳである。
【００５９】
[0069]  更に別の態様において、重鎖ポリペプチドが、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む可変領域軽鎖と更に組み合わされ、ここで：
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１配列はＴＧＴＸ７Ｘ８ＤＶＧＸ９ＹＮＹＶＳであり；
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２配列はＸ１０ＶＸ１１Ｘ１２ＲＰＳであり；
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３配列はＳＳＸ１３ＴＸ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７ＲＶであり；
更に、式中：Ｘ７はＮ又はＳであり；Ｘ８はＴ、Ｒ、又はＳであり；Ｘ９はＡ又はＧであり；Ｘ１０はＥ又はＤであり；Ｘ１１はＩ、Ｎ又はＳであり；Ｘ１２はＤ、Ｈ又はＮであり；Ｘ１３はＦ又はＹであり；Ｘ１４はＮ又はＳであり；Ｘ１５はＲ、Ｔ又はＳであり；Ｘ１６はＧ又はＳであり；Ｘ１７はＩ又はＴである。
【００６０】
[0070]  別の実施形態において、Ｘ７はＮ又はＳであり；Ｘ８はＴ、Ｒ、又はＳであり；Ｘ９はＡ又はＧであり；Ｘ１０はＥ又はＤであり；Ｘ１１はＮ又はＳであり；Ｘ１２はＮであり；Ｘ１３はＦ又はＹであり；Ｘ１４はＳであり；Ｘ１５はＳであり；Ｘ１６はＧ又はＳであり；Ｘ１７はＴである。
【００６１】
[0071]  更に別の実施形態において、Ｘ７はＳであり；Ｘ８はＳであり；Ｘ９はＧであり；Ｘ１０はＤであり；Ｘ１１はＳであり；Ｘ１２はＮであり；Ｘ１３はＹであり；Ｘ１４はＳであり；Ｘ１５はＳであり；Ｘ１６はＳであり；Ｘ１７はＴである。
【００６２】
[0072]  更に別の態様において、軽鎖は、式：（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）に係るＨＶＲ間に並ぶ可変領域軽鎖フレームワーク配列を更に含む。
【００６３】
[0073]  更に別の態様において、軽鎖フレームワーク配列はヒトコンセンサスフレームワーク配列又はヒト生殖細胞系列フレームワーク配列に由来する。
【００６４】
[0074]  更に別の態様において、軽鎖フレームワーク配列はλ軽鎖配列である。
【００６５】
[0075]  更に別の態様において、フレームワーク配列の少なくとも１つは以下である：
ＬＣ−ＦＲ１はＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣであり；
ＬＣ−ＦＲ２はＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹであり；
ＬＣ−ＦＲ３はＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣであり；
ＬＣ−ＦＲ４はＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬである。
【００６６】
[0076]  別の実施形態において、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体又は抗原結合断片を提供し、ここで：
（ａ）重鎖は、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ここで更に：（ｉ）ＨＶＲ−Ｈ１配列はＸ１ＹＸ２ＭＸ３であり；（ｉｉ）ＨＶＲ−Ｈ２配列はＳＩＹＰＳＧＧＸ４ＴＦＹＡＤＸ５ＶＫＧであり；（ｉｉｉ）ＨＶＲ−Ｈ３配列はＩＫＬＧＴＶＴＴＶＸ６Ｙであり、及び；
（ｂ）軽鎖は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、ここで更に：（ｉｖ）ＨＶＲ−Ｌ１配列はＴＧＴＸ７Ｘ８ＤＶＧＸ９ＹＮＹＶＳであり；（ｖ）ＨＶＲ−Ｌ２配列はＸ１０ＶＸ１１Ｘ１２ＲＰＳであり；（ｖｉ）ＨＶＲ−Ｌ３配列はＳＳＸ１３ＴＸ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７ＲＶであり；式中：Ｘ１はＫ、Ｒ、Ｔ、Ｑ、Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｍ、Ｉ、又はＳであり；Ｘ２はＶ、Ｒ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、又はＩであり；Ｘ３はＨ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ａ、Ｖ、Ｙ、Ｗ、Ｆ、又はＭであり；Ｘ４はＦ又はＩであり；Ｘ５はＳ又はＴであり；Ｘ６はＥ又はＤであり；Ｘ７はＮ又はＳであり；Ｘ８はＴ、Ｒ、又はＳであり；Ｘ９はＡ又はＧであり；Ｘ１０はＥ又はＤであり；Ｘ１１はＩ、Ｎ、又はＳであり；Ｘ１２はＤ、Ｈ、又はＮであり；Ｘ１３はＦ又はＹであり；Ｘ１４はＮ又はＳであり；Ｘ１５はＲ、Ｔ、又はＳであり；Ｘ１６はＧ又はＳであり；Ｘ１７はＩ又はＴである。
【００６７】
[0077]  一実施形態において、Ｘ１はＭ、Ｉ、又はＳであり；Ｘ２はＲ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、又はＩであり；Ｘ３はＦ又はＭであり；Ｘ４はＦ又はＩであり；Ｘ５はＳ又はＴであり；Ｘ６はＥ又はＤであり；Ｘ７はＮ又はＳであり；Ｘ８はＴ、Ｒ、又はＳであり；Ｘ９はＡ又はＧであり；Ｘ１０はＥ又はＤであり；Ｘ１１はＮ又はＳであり；Ｘ１２はＮであり；Ｘ１３はＦ又はＹであり；Ｘ１４はＳであり；Ｘ１５はＳであり；Ｘ１６はＧ又はＳであり；Ｘ１７はＴである。
【００６８】
[0078]  別の実施形態において、Ｘ１はＭ、Ｉ、又はＳであり；Ｘ２はＬ、Ｍ、又はＩであり；Ｘ３はＦ又はＭであり；Ｘ４はＩであり；Ｘ５はＳ又はＴであり；Ｘ６はＤであり；Ｘ７はＮ又はＳであり；Ｘ８はＴ、Ｒ、又はＳであり；Ｘ９はＡ又はＧであり；Ｘ１０はＥ又はＤであり；Ｘ１１はＮ又はＳであり；Ｘ１２はＮであり；Ｘ１３はＦ又はＹであり；Ｘ１４はＳであり；Ｘ１５はＳであり；Ｘ１６はＧ又はＳであり；Ｘ１７はＴである。
【００６９】
[0079]  更に別の実施形態において、Ｘ１はＳであり；Ｘ２はＩであり；Ｘ３はＭであり；Ｘ４はＩであり；Ｘ５はＴであり；Ｘ６はＤであり；Ｘ７はＳであり；Ｘ８はＳであり；Ｘ９はＧであり；Ｘ１０はＤであり；Ｘ１１はＳであり；Ｘ１２はＮであり；Ｘ１３はＹであり；Ｘ１４はＳであり；Ｘ１５はＳであり；Ｘ１６はＳであり；Ｘ１７はＴである。
【００７０】
[0080]  更なる態様において、重鎖可変領域は、（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）のとおりＨＶＲ間に並ぶ１つ以上のフレームワーク配列を含み、及び軽鎖可変領域は、（ＬＣ−ＦＲ１  ＭＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）のとおりＨＶＲ間に並ぶ１つ以上のフレームワーク配列を含む。
【００７１】
[0081]  更に別の態様において、フレームワーク配列はヒトコンセンサスフレームワーク配列又はヒト生殖細胞系列配列に由来する。
【００７２】
[0082]  更に別の態様において、重鎖フレームワーク配列の１つ以上は以下である：
ＨＣ−ＦＲ１はＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳであり；
ＨＣ−ＦＲ２はＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳであり；
ＨＣ−ＦＲ３はＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲであり；
ＨＣ−ＦＲ４はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳである。
【００７３】
[0083]  更に別の態様において、軽鎖フレームワーク配列はλ軽鎖配列である。
【００７４】
[0084]  更に別の態様において、軽鎖フレームワーク配列の１つ以上は以下である：
ＬＣ−ＦＲ１はＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣであり；
ＬＣ−ＦＲ２はＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹであり；
ＬＣ−ＦＲ３はＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣであり；
ＬＣ−ＦＲ４はＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬである。
【００７５】
[0085]  更に別の態様において、重鎖可変領域ポリペプチド、抗体、又は抗体断片は、少なくともＣＨ１ドメインを更に含む。
【００７６】
[0086]  より具体的な態様において、重鎖可変領域ポリペプチド、抗体、又は抗体断片は、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインを更に含む。
【００７７】
[0087]  更に別の態様において、可変領域軽鎖、抗体、又は抗体断片は、ＣＬドメインを更に含む。
【００７８】
[0088]  更に別の態様において、抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＬドメインを更に含む。
【００７９】
[0089]  更に別の具体的な態様において、抗体は、ヒト又はマウス定常領域を更に含む。
【００８０】
[0090]  更に別の態様において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４からなる群から選択される。
【００８１】
[0091]  更に別の具体的な態様において、ヒト又はマウス定常領域はＩｇＧ１である。
【００８２】
[0092]  更に別の実施形態において、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を特徴とし、ここで：
（ａ）重鎖は、それぞれＳＹＩＭＭ、ＳＩＹＰＳＧＧＩＴＦＹＡＤＴＶＫＧ、及びＩＫＬＧＴＶＴＴＶＤＹと少なくとも８０％の全体的な配列同一性を有するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、及び
（ｂ）軽鎖は、それぞれＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳ、ＤＶＳＮＲＰＳ、及びＳＳＹＴＳＳＳＴＲＶと少なくとも８０％の全体的な配列同一性を有するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００８３】
[0093]  ある具体的な態様において、配列同一性は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。
【００８４】
[0094]  更に別の実施形態において、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を特徴とし、ここで：
（ａ）重鎖は、それぞれＭＹＭＭＭ、ＳＩＹＰＳＧＧＩＴＦＹＡＤＳＶＫＧ、及びＩＫＬＧＴＶＴＴＶＤＹと少なくとも８０％の全体的な配列同一性を有するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、及び
（ｂ）軽鎖は、それぞれＴＧＴＳＳＤＶＧＡＹＮＹＶＳ、ＤＶＳＮＲＰＳ、及びＳＳＹＴＳＳＳＴＲＶと少なくとも８０％の全体的な配列同一性を有するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００８５】
[0095]  ある具体的な態様において、配列同一性は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。
【００８６】
[0096]  更に別の態様において、本発明に係る抗体又は抗体断片では、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３の配列と比較したとき、少なくとも以下のとおり下線によって強調表示されるアミノ酸は変わらないままであり：
（ａ）ＨＶＲ−Ｈ１において
【化１】
2019527706.tif 000002
（ｂ）ＨＶＲ−Ｈ２において
【化２】
2019527706.tif 000003
（ｃ）ＨＶＲ−Ｈ３において
【化３】
2019527706.tif 000004
更にここで、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の配列と比較したとき、少なくとも以下のとおり下線によって強調表示されるアミノ酸は変わらないままである。
（ａ）ＨＶＲ−Ｌ１  ＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳ
（ｂ）ＨＶＲ−Ｌ２
【化４】
2019527706.tif 000005
（ｃ）ＨＶＲ−Ｌ３
【化５】
2019527706.tif 000006
【００８７】
[0097]  別の態様において、重鎖可変領域は、（ＨＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｈ１）−（ＨＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｈ２）−（ＨＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｈ３）−（ＨＣ−ＦＲ４）のとおりＨＶＲ間に並ぶ１つ以上のフレームワーク配列を含み、及び軽鎖可変領域は、（ＬＣ−ＦＲ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＬＣ−ＦＲ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＬＣ−ＦＲ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＬＣ−ＦＲ４）のとおりＨＶＲ間に並ぶ１つ以上のフレームワーク配列を含む。
【００８８】
[0098]  なおも別の態様において、フレームワーク配列はヒト生殖細胞系列配列に由来する。
【００８９】
[0099]  更に別の態様において、重鎖フレームワーク配列の１つ以上は以下である：
ＨＣ−ＦＲ１はＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳであり；
ＨＣ−ＦＲ２はＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳであり；
ＨＣ−ＦＲ３はＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲであり；
ＨＣ−ＦＲ４はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳである。
【００９０】
[00100]  更に別の態様において、軽鎖フレームワーク配列はλ軽鎖配列に由来する。
【００９１】
[00101]  更に別の態様において、軽鎖フレームワーク配列の１つ以上は以下である：
ＬＣ−ＦＲ１はＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣであり；
ＬＣ−ＦＲ２はＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹであり；
ＬＣ−ＦＲ３はＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣであり；
ＬＣ−ＦＲ４はＦＧＴＧＴＫＶＴＶＬである。
【００９２】
[00102]  更に別の具体的な態様において、抗体はヒト又はマウス定常領域を更に含む。
【００９３】
[00103]  更に別の態様において、ヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４からなる群から選択される。
【００９４】
[00104]  更に別の実施形態において、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を特徴とし、ここで：
（ａ）重鎖配列は、重鎖配列：
【化６】
2019527706.tif 000007
と少なくとも８５％の配列同一性を有し、及び
（ｂ）軽鎖配列は、軽鎖配列：
【化７】
2019527706.tif 000008
と少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【００９５】
[00105]  ある具体的な態様において、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。
【００９６】
[00106]  更に別の実施形態において、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体を提供し、ここで：
（ａ）重鎖配列は、重鎖配列：
【化８】
2019527706.tif 000009
と少なくとも８５％の配列同一性を有し、及び
（ｂ）軽鎖配列は、軽鎖配列：
【化９】
2019527706.tif 000010
と少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【００９７】
[00107]  ある具体的な態様において、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％である。別の実施形態において、抗体は、ヒト、マウス、又はカニクイザルＰＤ−Ｌ１に結合する。ある具体的な態様において、抗体は、ヒト、マウス、又はカニクイザルＰＤ−Ｌ１とそれぞれのヒト、マウス、又はカニクイザルＰＤ−１受容体との間の相互作用を遮断する能力を有する。
【００９８】
[00108]  別の実施形態において、抗体は、５×１０−９Ｍ以下のＫＤ、好ましくは２×１０−９Ｍ以下のＫＤ、及び更により好ましくは１×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。
【００９９】
[00109]  更に別の実施形態において、本発明は、ヒトＰＤ−Ｌ１の残基Ｙ５６及びＤ６１を含めた機能性エピトープに結合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合断片に関する。
【０１００】
[00110]  ある具体的な態様において、機能性エピトープは、ヒトＰＤ−Ｌ１のＥ５８、Ｅ６０、Ｑ６６、Ｒ１１３、及びＭ１１５を更に含む。
【０１０１】
[00111]  より具体的な態様において、抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１の残基５４〜６６及び１１２〜１２２を含めた立体エピトープに結合する。
【０１０２】
[00112]  更なる実施形態において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１に対する結合に関して本明細書に記載されるとおりの本発明に係る抗体と交差競合する抗ＰＤ−Ｌ１抗体又はその抗原結合断片の使用に関する。
【０１０３】
[00113]  更に別の実施形態において、本発明は、本発明の併用療法における使用のための、上述の抗ＰＤ−Ｌ１抗体のいずれかを少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体との組み合わせで含むタンパク質及びポリペプチドを特徴とする。
【０１０４】
[00114]  更に別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりのポリペプチド、又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体の軽鎖若しくは重鎖可変領域配列、又はその抗原結合断片をコードする単離核酸の使用を特徴とする。更に別の実施形態において、本発明は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の軽鎖又は重鎖可変領域配列をコードする単離核酸を提供し、ここで：
（ａ）重鎖は、それぞれＳＹＩＭＭ、ＳＩＹＰＳＧＧＩＴＦＹＡＤＴＶＫＧ、及びＩＫＬＧＴＶＴＴＶＤＹと少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３配列を含み、又は
（ｂ）軽鎖は、それぞれＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳ、ＤＶＳＮＲＰＳ、及びＳＳＹＴＳＳＳＴＲＶと少なくとも８０％の配列同一性を有するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３配列を含む。
【０１０５】
[00115]  ある具体的な態様において、配列同一性は、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である。
【０１０６】
[00116]  更なる態様において、重鎖の核酸配列は、
【化１０】
2019527706.tif 000011
であり、及び軽鎖の核酸配列は、
【化１１】
2019527706.tif 000012
である。
【０１０７】
[00117]  抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐに使用し得る更なる例示的抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、米国特許出願公開第２０１０／０２０３０５６号に記載されている。本発明の一実施形態において、抗体部分はＹＷ２４３．５５Ｓ７０である。本発明の別の実施形態において、抗体部分はＭＰＤＬ３２８０Ａである。
【０１０８】
[00118]  更なる実施形態において、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体部分の使用を特徴とし、ここで：
（ａ）重鎖配列は、重鎖配列：
【化１２】
2019527706.tif 000013
と少なくとも８５％の配列同一性を有し、及び
（ｂ）軽鎖配列は、軽鎖配列：
【化１３】
2019527706.tif 000014
と少なくとも８５％の配列同一性を有する。
【０１０９】
[00119]  ある具体的な態様において、配列同一性は、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。
【０１１０】
[00120]  更なる実施形態において、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体部分の使用を特徴とし、ここで：
（ａ）重鎖可変領域配列は、
【化１４】
2019527706.tif 000015
であり、及び
（ｂ）軽鎖可変領域配列は、
【化１５】
2019527706.tif 000016
である。
【０１１１】
[00121]  更なる実施形態において、本発明は、重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体部分を特徴とし、ここで：
（ａ）重鎖可変領域配列は、
【化１６】
2019527706.tif 000017
であり、及び
（ｂ）軽鎖可変領域配列は、
【化１７】
2019527706.tif 000018
である。
【０１１２】
[00122]  抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐに使用し得る更に別の例示的抗ＰＤ−Ｌ１抗体が、米国特許第７，９４３，７４３号に記載されている。
【０１１３】
[00123]  本発明の一実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＤＸ−１１０５である。
【０１１４】
[00124]  更に別のある実施形態において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体はＭＥＤＩ−４７３６である。
【０１１５】
定常領域
[00125]  本発明の併用療法における使用のためのタンパク質及びペプチドは、免疫グロブリンの定常領域又は定常領域の断片、類似体、変異体、突然変異体若しくは誘導体を含み得る。好ましい実施形態において、定常領域は、ヒト免疫グロブリン重鎖、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又は他のクラスに由来する。一実施形態において、定常領域はＣＨ２ドメインを含む。別の実施形態において、定常領域はＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含み、又はヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。或いは、定常領域は、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインの全て又は一部分を含み得る。
【０１１６】
[00126]  一実施形態において、定常領域は、Ｆｃ受容体に対する親和性を低下させるか又はＦｃエフェクター機能を低下させる突然変異を含む。例えば、定常領域は、ＩｇＧ重鎖の定常領域内のグリコシル化部位を除去する突然変異を含み得る。一部の実施形態では、定常領域は、ＩｇＧ１のＬｅｕ２３４、Ｌｅｕ２３５、Ｇｌｙ２３６、Ｇｌｙ２３７、Ａｓｎ２９７、又はＰｒｏ３３１（アミノ酸はＥＵ命名法に従って付番される）に対応するアミノ酸位置に突然変異、欠失、又は挿入を含む。詳細な実施形態において、定常領域は、ＩｇＧ１のＡｓｎ２９７に対応するアミノ酸位置に突然変異を含む。代替的実施形態において、定常領域は、ＩｇＧ１のＬｅｕ２８１、Ｌｅｕ２８２、Ｇｌｙ２８３、Ｇｌｙ２８４、Ａｓｎ３４４、又はＰｒｏ３７８に対応するアミノ酸位置に突然変異、欠失、又は挿入を含む。
【０１１７】
[00127]  一部の実施形態では、定常領域は、ヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖に由来するＣＨ２ドメインを含む。好ましくは、ＣＨ２ドメインは、ＣＨ２ドメイン内のグリコシル化部位を除去する突然変異を含む。一実施形態では、この突然変異は、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖のＣＨ２ドメイン内のＧｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ（配列番号１５）アミノ酸配列内におけるアスパラギンを改変する。好ましくは、この突然変異はアスパラギンをグルタミンに変える。或いは、この突然変異は、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ（配列番号１５）アミノ酸配列内におけるフェニルアラニン及びアスパラギンの両方を改変する。一実施形態では、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ（配列番号１５）アミノ酸配列がＧｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ（配列番号１６）アミノ酸配列に置換される。Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ（配列番号１５）アミノ酸配列内におけるアスパラギンはＩｇＧ１のＡｓｎ２９７に対応する。
【０１１８】
[00128]  別の実施形態において、定常領域はＣＨ２ドメインとヒンジ領域の少なくとも一部分とを含む。ヒンジ領域は免疫グロブリン重鎖、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又は他のクラスに由来し得る。好ましくは、ヒンジ領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又は他の好適なクラスに由来する。より好ましくは、ヒンジ領域はヒトＩｇＧ１重鎖に由来する。一実施形態では、ＩｇＧ１ヒンジ領域のＰｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１７）アミノ酸配列におけるシステインが改変される。好ましい実施形態では、Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１７）アミノ酸配列がＰｒｏ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１８）アミノ酸配列に置換される。一実施形態では、定常領域は第１の抗体アイソタイプに由来するＣＨ２ドメインと、第２の抗体アイソタイプに由来するヒンジ領域とを含む。具体的な実施形態では、ＣＨ２ドメインがヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ４重鎖に由来し、一方、ヒンジ領域が、改変されたヒトＩｇＧ１重鎖に由来する。
【０１１９】
[00129]  Ｆｃ部分と非Ｆｃ部分との接合部近傍でアミノ酸を改変すると、Ｆｃ融合タンパク質の血清中半減期が劇的に増加し得る（国際公開第０１／５８９５７号（その開示は本明細書によって参照により援用される））。従って、本発明のタンパク質又はポリペプチドの接合領域は、免疫グロブリン重鎖及びエリスロポエチンの天然に存在する配列と比べて好ましくは接合点の約１０アミノ酸の範囲内にある改変を含み得る。これらのアミノ酸変化は疎水性の増加を引き起こし得る。一実施形態において、定常領域は、Ｃ末端リジン残基が置換されているＩｇＧ配列に由来する。好ましくは、ＩｇＧ配列のＣ末端リジンは非リジンアミノ酸、例えばアラニン又はロイシンに置換され、それにより血清中半減期が更に増加する。別の実施形態において、定常領域は、潜在的な接合部Ｔ細胞エピトープが除去されるように定常領域のＣ末端近傍のＬｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）アミノ酸配列が改変されているＩｇＧ配列に由来する。例えば、一実施形態では、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒアミノ酸配列がＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）アミノ酸配列に置換される。他の実施形態では、Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）セグメント内のアミノ酸がグリシン又はプロリンなどの他のアミノ酸に置換される。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又は他の免疫グロブリンクラス分子のＣ末端近傍におけるＬｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）セグメントのアミノ酸置換を生成する詳細な方法は、米国特許出願公開第２００３／０１６６８７７号（その開示は本明細書によって参照により援用される）に記載されている。
【０１２０】
[00130]  本発明の好適なヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及び他の免疫グロブリンクラスに由来し得る。ＩｇＧ１ヒンジ領域は３つのシステインを有し、そのうちの２つは、免疫グロブリンの２つの重鎖間のジスルフィド結合に関与する。これらの同じシステインが、Ｆｃ部分間の効率的で且つ一貫したジスルフィド結合形成を可能にする。従って、本発明の好ましいヒンジ領域はＩｇＧ１、より好ましくはヒトＩｇＧ１に由来する。一部の実施形態では、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域内の第１のシステインが別のアミノ酸、好ましくはセリンに突然変異している。ＩｇＧ２アイソタイプヒンジ領域は、組換え系において分泌中にオリゴマー形成及び恐らく正しくないジスルフィド結合を促進する傾のある４つのジスルフィド結合を有する。好適なヒンジ領域はＩｇＧ２ヒンジに由来し得る；第１の２つのシステインが、各々、好ましくは別のアミノ酸に突然変異している。ＩｇＧ４のヒンジ領域は、鎖間ジスルフィド結合の形成が非効率であることが知られている。しかしながら、本発明に好適なヒンジ領域は、好ましくは重鎖由来の部分間におけるジスルフィド結合の正しい形成を増進する突然変異を含んだＩｇＧ４ヒンジ領域に由来し得る（Angal S, et al. (1993) Mol. Immunol., 30:105-8）。
【０１２１】
[00131]  本発明において、定常領域は、異なる抗体アイソタイプに由来するＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインとヒンジ領域、即ちハイブリッド定常領域を含み得る。例えば、一実施形態において、定常領域は、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４に由来するＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインとＩｇＧ１に由来する突然変異ヒンジ領域とを含む。或いは、別のＩｇＧサブクラス由来の突然変異ヒンジ領域がハイブリッド定常領域に使用される。例えば、２つの重鎖間の効率的なジスルフィド結合を可能にする突然変異形態のＩｇＧ４ヒンジを使用することができる。突然変異ヒンジは、最初の２つのシステインが各々別のアミノ酸に突然変異しているＩｇＧ２ヒンジにも由来し得る。かかるハイブリッド定常領域のアセンブルは、米国特許出願公開第２００３／００４４４２３号（その開示は本明細書によって参照により援用される）に記載されている。
【０１２２】
[00132]  本発明において、定常領域は、本明細書に記載される１つ以上の突然変異を含み得る。Ｆｃ部分における突然変異の組み合わせは、二機能性分子の血清中半減期の延長及びインビボ有効性の増加に対して相加効果又は相乗効果を有し得る。従って、一例示的実施形態において、定常領域は、（ｉ）Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１９）アミノ酸配列がＡｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２０）アミノ酸配列に置換されているＩｇＧ配列に由来する領域；（ｉｉ）リジンに代わるＣ末端アラニン残基；（ｉｉｉ）例えばＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインと改変ＩｇＧ１ヒンジ領域など、異なる抗体アイソタイプに由来するＣＨ２ドメインとヒンジ領域；及び（ｉｖ）ＩｇＧ２由来のＣＨ２ドメイン内のグリコシル化部位を除去する突然変異、例えば、ＩｇＧ２由来ＣＨ２ドメイン内のＧｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ（配列番号１５）アミノ酸配列に代わるＧｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ（配列番号１６）アミノ酸配列を含み得る。
【０１２３】
抗体断片
[00133]  本発明の併用療法で使用するための本発明のタンパク質及びポリペプチドは、抗体の抗原結合断片も含み得る。例示的抗体断片には、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びラクダ科動物起源のものなど単一ドメインＶＨＨ断片が含まれる。
【０１２４】
[00134]  一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としても知られる一本鎖抗体断片は、典型的には抗原又は受容体と結合する組換えポリペプチドである；これらの断片は、１つ以上の相互接続リンカーを伴い又は伴わず抗体可変軽鎖配列（ＶＬ）の少なくとも１つの断片に係留した抗体可変重鎖アミノ酸配列（ＶＨ）の少なくとも１つの断片を含む。かかるリンカーは、一本鎖抗体断片の由来である全抗体の標的分子結合特異性を維持するため連結後にＶＬ及びＶＨドメインの適切な三次元折り畳みが起こることを確実にするように選択される短鎖の可動性ペプチドであり得る。概して、ＶＬ又はＶＨ配列のカルボキシル末端がかかるペプチドリンカーによって相補的なＶＬ及びＶＨ配列のアミノ酸末端に共有結合的に連結される。一本鎖抗体断片は、分子クローニング、抗体ファージディスプレイライブラリ又は同様の技法によって作成することができる。これらのタンパク質は、真核細胞でも、或いは細菌を含めた原核細胞でも作製することができる。
【０１２５】
[00135]  一本鎖抗体断片は、本明細書に記載される全抗体の可変領域又はＣＤＲの少なくとも１つを有するアミノ酸配列を含むが、そうした抗体の定常ドメインの一部又は全てを欠いている。これらの定常ドメインは抗原結合に不要であるが、全抗体の構造の主要な部分を成す。従って一本鎖抗体断片は、定常ドメインの一部又は全てを含む抗体の使用に伴う一部の問題を解消し得る。例えば、一本鎖抗体断片は、生体分子と重鎖定常領域との間の好ましくない相互作用、又は他の望ましくない生物学的活性を有しない傾向がある。加えて、一本鎖抗体断片は全抗体と比べて大幅に小さく、従って全抗体と比べて高い毛細血管透過性を有し得るため、一本鎖抗体断片は標的抗原結合部位に一層効率的に局在化及び結合することが可能である。また、抗体断片は原核細胞において比較的大規模に作製することができ、従ってその作製が容易である。更に、一本鎖抗体断片はサイズが比較的小さいため、全抗体と比べてレシピエントにおいて免疫応答を誘発する可能性が低い。
【０１２６】
[00136]  全抗体と同じ又は同等な結合特性を有する抗体の断片も存在し得る。かかる断片は、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片の一方又は両方を含み得る。これらの抗体断片は、全抗体の６つ全てのＣＤＲを含むことができ、しかし、かかる領域の全数未満、例えば３つ、４つ又は５つのＣＤＲを含む断片も機能する。
【０１２７】
タンパク質作製
[00137]  抗体−サイトカイントラップタンパク質は、概して、そのタンパク質を発現するように操作された核酸を含む哺乳類細胞を使用して組換えで作製される。好適な細胞株及びタンパク質作製方法の一例を実施例１及び２に記載しているが、多種多様な好適なベクター、細胞株及びタンパク質作製方法を用いて抗体ベースのバイオ医薬品が作製されており、これらの抗体−サイトカイントラップタンパク質の合成に使用することができる。
【０１２８】
治療適応
[00138]  本発明は、癌の治療又は腫瘍成長の低減のための併用療法に関し、特に、（ｉ）ＴＧＦβＲＩＩ又はＴＧＦβ結合能を有するその断片とプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）などの免疫チェックポイントタンパク質に結合する抗体又はその抗原結合断片とを含む二機能性分子と、（ｉｉ）少なくとも１つの追加の抗癌療法剤との併用に関する。抗癌療法剤には、例えば、放射線照射、化学療法剤、生物製剤又はワクチンが含まれる。本発明の特定の実施形態において、本併用療法は、相乗的抗癌効果をもたらす。
【０１２９】
[00139]  例示的癌としては、結腸直腸、乳房、卵巣、膵臓、胃、前立腺、腎臓、子宮頸部の癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺、子宮内膜、子宮、膀胱、神経内分泌、頭頸部、肝臓、上咽頭、精巣の癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、黒色腫、基底細胞皮膚癌、扁平上皮細胞皮膚癌、隆起性皮膚線維肉腫、メルケル細胞癌、膠芽腫、神経膠腫、肉腫、中皮腫及び骨髄異形成症候群が挙げられる。
【０１３０】
[00140]  化学療法及び／又は放射線療法など、１つ以上の追加の抗癌療法試薬との併用で抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップにより治療される癌又は腫瘍は、腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１及びＴＧＦβの発現又は発現上昇、それらの発現レベルと予後又は疾患進行との相関、並びにＰＤ−Ｌ１及びＴＧＦβを標的とする治療に対する腫瘍の感受性に関する前臨床及び臨床経験に基づいて選択され得る。かかる癌又は腫瘍には、限定はされないが、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、前立腺癌、腎癌、子宮頸癌、膀胱癌、頭頸部癌、肝癌、非小細胞肺癌、黒色腫、メルケル細胞癌及び中皮腫が含まれる。
【０１３１】
医薬組成物
[00141]  本発明は、本発明の療法的方法における使用のための、本明細書に記載されるタンパク質の治療有効量を含む医薬組成物も特徴とする。本組成物は、種々の薬物送達システムにおける使用向けに製剤化することができる。本組成物には、適切な製剤化のため１つ以上の生理学的に許容可能な賦形剤又は担体も含まれ得る。本発明における使用に好適な製剤化は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985に掲載されている。薬物送達方法の簡単なレビューについては、例えば、Langer (Science 249:1527-1533, 1990)を参照されたい。
【０１３２】
[00142]  本医薬組成物は、治療処置のため、非経口、鼻腔内、局所、経口、又は局所投与、例えば経皮的な手段によることが意図される。本医薬組成物は、非経口的に（例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下注射によって）、又は経口摂取により、又は血管病態若しくは癌病態が発症した範囲における局所適用若しくは関節内注射により投与することができる。更なる投与経路としては、血管内、動脈内、腫瘍内、腹腔内、脳室内、硬膜外内、並びに鼻内、眼内、強膜内、眼窩内、直腸、局所、又はエアロゾル吸入投与が挙げられる。従って、本発明は、許容可能な担体、好ましくは水性担体、例えば、水、緩衝用水、生理食塩水、ＰＢＳなどに溶解又は懸濁された上述の薬剤を含む非経口投与用の組成物を提供する。本組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、等張化剤、湿潤剤、デタージェントなど、生理的条件を近似する必要に応じて薬学的に許容可能な補助物質を含有し得る。本発明は、経口送達用の組成物も提供し、これは、錠剤、カプセルなどを製剤化するための結合剤又は充填剤などの不活性成分を含有し得る。更に、本発明は局所投与用の組成物を提供し、これは、クリーム、軟膏などを製剤化するための溶媒又は乳化剤などの不活性成分を含有し得る。
【０１３３】
[00143]  これらの組成物は、従来の滅菌技法によって滅菌され得、又は滅菌ろ過され得る。得られる水溶液はそのまま使用するため包装され得、又は凍結乾燥され得、凍結乾燥製剤は投与前に滅菌水性担体と合わされる。製剤のｐＨは、典型的には３〜１１、より好ましくは５〜９又は６〜８、及び最も好ましくは７〜８、例えば７〜７．５であり得る。得られた固体形態の組成物は、錠剤又はカプセルのシールパッケージなど、各々が上述の１つ又は複数の薬剤の一定量を含有する複数の単一用量単位で包装され得る。固体形態の組成物は、局所適用可能なクリーム又は軟膏用に設計されたスクイーズチューブなど、分量の変動を許容する容器に包装することもできる。
【０１３４】
治療
[00144]  本発明の任意の態様により治療の投与量及び継続期間を決定することは、十分に当業者の技能の範囲内にある。当業者は、容易に患者をモニタして、治療を開始、継続、中断又は再開すべきかどうかを決定することが可能である。本発明の併用治療方法を実施するための抗体−ＴＧＦβトラップ、抗癌療法の量又は放射線の投与量は、治療下の病態、患者の全般的な健康、並びに投与の方法、経路及び用量などの要因に応じて変わることになる。
【０１３５】
[00145]  特定の実施形態によれば、抗体−ＴＧＦβトラップ及び少なくとも１つの追加の抗癌剤は、特定の癌型の治療に使用されることが公知の治療量で投与される。他の実施形態によれば、本発明の併用療法に伴って観察される相乗効果により、抗体−ＴＧＦβトラップ及び少なくとも１つの追加の抗癌剤は、単剤療法で癌の治療に使用されることが公知の治療量よりも低い量で投与することができる。
【０１３６】
[00146]  サイトカイントラップは大過剰で使用されるため、抗体−ＴＧＦβ  ｔｒａｐの最適用量は、最大治療効果を実現するための抗体部分によるパーセント受容体占有率に基づく。例えば、細胞受容体を標的化するモノクローナル抗体の治療用量は、トラフ濃度が約１０〜１００μｇ／ｍｌ、即ち６０〜６００ｎＭとなる（６ｎＭの解離定数（ＫＤ）の抗体について、このトラフ濃度であれば、細胞上の標的受容体の９０〜９９％が抗体によって占有されることが確実となる）ように決定される。これは大過剰のサイトカインであり、サイトカインは典型的には循環中にｐｇ〜ｎｇ／ｍｌで存在する。
【０１３７】
[00147]  本発明の療法的方法における使用のための抗体−ＴＧＦβトラップポリペプチドの最適用量は、治療下の疾患、疾患の重症度及び副作用の存在に依存することになる。最適用量は、ルーチンの実験によって決定することができる。非経口投与には、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、或いは０．５ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、或いは１ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、或いは１０ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ、或いは５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、或いは２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、或いは５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの用量が投与され、例えば治療サイクルにつき週１回、２週間に１回、３週間に１回、又は月１回与えられ得る。本発明の一部の実施形態において、併用療法で治療効果を実現するために必要な抗体−ＴＧＦβトラップの有効用量は、抗体−ＴＧＦβトラップ単剤療法で同様の治療効果を実現するために必要な有効用量と比べて低くなる。
【０１３８】
[00148]  本発明の一部の実施形態において、有効用量は、抗体−ＴＧＦβトラップ単剤療法で同様の治療効果を実現するために必要な有効用量の約２〜１０分の１となる。別の実施形態において、有効用量は、抗体−ＴＧＦβトラップ単剤療法で同様の治療効果を実現するために必要な有効用量の約２〜５分の１であり得る。
【０１３９】
[00149]  癌の治療に抗体−ＴＧＦβトラップとの併用で使用するための追加の化学療法試薬又は放射線療法の有効投与量は、利用される特定の化合物又は医薬組成物、投与方法、治療下の病態及び治療下の病態の重症度に応じて変わり得る。通常の技能を有する医師又は臨床医は、癌の治療又は進行の予防に必要な各追加の化学療法試薬又は放射線の有効量を容易に決定することができる。本発明の一部の実施形態において、本発明の併用療法で治療効果を実現するために必要な追加の化学療法試薬又は放射線療法の有効用量は、化学療法又は放射線の単剤療法で同様の治療効果を実現するために必要な有効用量と比べて低くなる。
【０１４０】
[00150]  本発明の方法によれば、化学療法剤を抗体−サイトカイントラップ分子と併用して投与することにより、癌を治療するか又は腫瘍成長を低減することができる。かかる化学療法剤には、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、植物性アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害薬、抗新生物抗生物質、ホルモン剤、抗血管新生剤、分化誘導剤、細胞成長停止誘導剤、アポトーシス誘導剤、細胞傷害剤及び他の抗腫瘍剤が含まれる。かかる薬物は、細胞分裂又はＤＮＡ合成及び機能に何らかの方法で影響を及ぼし得る。代表的な化学療法剤としては、限定はされないが、アルキル化剤（シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、ダカルバジン、ロムスチン、カルムスチン、プロカルバジン、クロラムブシル及びイホスファミドなど）、代謝拮抗薬（フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、メトトレキサート、シトシンアラビノシド、フルダラビン、及びフロクスウリジンなど）、抗有糸分裂薬（パクリタキセル及びドセタキセルなどのタキサン系並びにビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、及びビンデシンなどのビンカアルカロイド系を含む）、アントラサイクリン系（ドキソルビシン、ダウノルビシン、バルルビシン、イダルビシン、及びエピルビシン、並びにアクチノマイシンＤなどのアクチノマイシン系を含む）、細胞傷害性抗生物質（マイトマイシン、プリカマイシン、及びブレオマイシンを含む）、及びトポイソメラーゼ阻害薬（イリノテカン及びトポテカンなどのカンプトテシン系並びにアムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、及びテニポシドなどのエピポドフィロトキシン誘導体を含む）が挙げられる。
【０１４１】
[00151]  特定の実施形態において、シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチンなどの白金ベースの療法薬が利用される。抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ分子との併用がその治療及び効果に有益となり得る他の抗癌剤には、ＤＮＡ合成を妨げるフルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗薬が含まれる。特定の実施形態において、１つ以上の化学療法剤の併用が抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ分子と共に投与され得る。他の実施形態において、１つ以上の化学療法剤の併用が放射線療法及び抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ分子と共に投与され得る。
【０１４２】
[00152]  本発明の具体的な実施形態において、オキサリプラチンは、２０ｍｇ／ｍ２〜２００ｍｇ／ｍ２、或いは４０ｍｇ／ｍ２〜１６０ｍｇ／ｍ２、或いは６０ｍｇ／ｍ２〜１４５ｍｇ／ｍ２、或いは８５ｍｇ／ｍ２〜１３５ｍｇ／ｍ２、或いは４０ｍｇ／ｍ２〜６５ｍｇ／ｍ２の用量で投与され得る。
【０１４３】
[00153]  本発明の具体的な実施形態において、５−ＦＵは、１００ｍｇ／ｍ２〜３０００ｍｇ／ｍ２、或いは２５０ｍｇ／ｍ２〜２４００ｍｇ／ｍ２、或いは４００ｍｇ／ｍ２〜１５００ｍｇ／ｍ２、或いは２００ｍｇ／ｍ２〜６００ｍｇ／ｍ２の用量で投与され得る。本発明のある実施形態において、５−ＦＵ用量は、例えば、注入によって長期間投与され得る。
【０１４４】
[00154]  本発明の具体的な実施形態において、５−ＦＵの効果を亢進させるため又は化学療法に伴う副作用を低下させるため、ロイコボリンも投与され得る。
【０１４５】
[00155]  本発明の具体的な実施形態において、以下の化学療法レジメンが、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ分子と併用した使用の例として提供される。１日目に８５ｍｇ／ｍ２のオキサリプラチン及び２００ｍｇ／ｍ２のロイコボリンを投与し、続いて２時間後に４００ｍｇ／ｍ２ボーラスの５−ＦＵ及び６００ｍｇ／ｍ２注入の５−ＦＵを投与する。２日目に２００ｍｇ／ｍ２のロイコボリンを投与し、続いて２時間後に４００ｍｇ／ｍ２ボーラスの５−ＦＵ及び６００ｍｇ／ｍ２注入の５−ＦＵを行う。
【０１４６】
[00156]  本発明の別の実施形態において、化学療法レジメンは、例えば、１日目に８５ｍｇ／ｍ２用量のオキサリプラチン、４００ｍｇ／ｍ２用量のロイコボリン、４００ｍｇ／ｍ２  ＩＶボーラス用量の５−ＦＵ及び６００ｍｇ／ｍ２注入の５−ＦＵ、続いて１２００ｍｇ／ｍ２／日×２日（４６〜４８時間で合計２４００ｍｇ／ｍｌ２）のＩＶ持続注入の投与を含む。治療は、２週間毎に繰り返される。
【０１４７】
[00157]  別の実施形態において、４００ｍｇ／ｍ２のロイコボリンの２時間注入を投与し、続いて２４００ｍｇ／ｍ２の５−ＦＵ  ４６時間注入を行う。オキサリプラチンも１日目に１３０ｍｇ／ｍ２の用量で２時間注入される。治療は、２週間毎に繰り返される。
【０１４８】
[00158]  本発明の方法によれば、放射線を抗体−サイトカイントラップ分子と併用して投与することにより、癌を治療することができる。放射線療法は、典型的には、Ｘ線及びガンマ線などの高エネルギー粒子又は波のビームを使用して細胞ＤＮＡに突然変異を誘導することにより癌細胞を根絶する。癌細胞は正常細胞よりも急速に分裂するため、腫瘍組織は、正常組織よりも放射線に対する感受性が高くなる。放射線の線量が重大な負の副作用なく患者に忍容される限り、任意の種類の放射線を患者に投与することができる。好適な種類の放射線療法には、例えば、電離放射線（例えば、Ｘ線、ガンマ線又は高線エネルギー放射線）が含まれる。電離放射線は、電離、即ち電子の獲得又は放出を生じさせるのに十分なエネルギーを有する粒子又は光子を含む放射線として定義される。放射線の効果は、臨床医が少なくとも部分的に制御することができる。放射線の線量は、好ましくは、標的細胞曝露が最大限となり且つ毒性が低下するように分割される。放射線は、腫瘍細胞の死滅を亢進させる放射線増感剤、又は健常組織を放射線の有害効果から保護する放射線防護剤（例えば、ＩＬ−１又はＩＬ−６）と同時に投与することができる。同様に、熱、即ちハイパーサーミア又は化学療法の適用は、組織を放射線に対して増感させることができる。
【０１４９】
[00159]  放射線の供給源は、患者にとって外部又は内部であり得る。外部放射線療法が最も一般的であり、典型的には、これには、例えばリニアアクセレレータを使用して、皮膚を通じて高エネルギー放射線のビーム（粒子ビーム）を腫瘍部位に指向させることが関わる。放射線のビームは、腫瘍部位に限局されるが、正常な健常組織の曝露を回避することは不可能に近い。しかしながら、外部放射線は、通常、患者に十分に忍容される。
【０１５０】
[00160]  別の例において、放射線は、ガンマ線を使用して患者に外部から供給される。ガンマ線は、コバルト６０などの放射性同位体の崩壊によって生成される。体幹部定位放射線療法（ＳＢＲＴ）と呼ばれる治療手法を用いると、ガンマ線を厳密に標的腫瘍組織のみに集束させることができ、健常組織が損傷を受けることがほぼなくなる。ＳＢＲＴは局所腫瘍を有する患者に用いられ得る。他方では、粒子加速器によって生成されるＸ線は、体のより広範囲にわたる放射線の投与に用いられ得る。
【０１５１】
[00161]  内部放射線療法には、体内の腫瘍部位又はその近傍にビーズ、ワイヤ、ペレット、カプセル等の放射線放出源を植え込むことが関わる。使用される放射線は、限定はされないが、ヨウ素、ストロンチウム、リン、パラジウム、セシウム、イリジウム、リン酸塩又はコバルトなどの放射性同位体から発せられる。かかるインプラントは、治療後に取り出されることもあり、又は体内に非放射性のまま残されることもある。内部放射線療法の種類としては、限定はされないが、小線源照射療法、組織内照射及び腔内照射が挙げられる。現在あまり一般的でない形態の内部放射線療法には、放射免疫療法であるような放射性同位体の生物学的担体が関わり、ここでは、放射性物質に結合した腫瘍特異的抗体が患者に投与される。こうした抗体が腫瘍抗原に結合し、それにより、ある線量の放射線が関連する組織に有効に投与される。
【０１５２】
[00162]  放射線療法は、原発性腫瘍の成長を制御するレジメンの一構成要素として有用である（例えば、Comphausen et al. (2001)’Radiation Therapy to a Primary Tumor Accelerates Metastatic Growth in Mice,’Cancer Res. 61:2207-2211を参照されたい）。放射線療法単独は、癌の治療にそれほど有効でないこともあるが、本明細書に記載されるとおり放射線を抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ分子と併用すると、放射線療法の局所的な及び全身の有効性を亢進させることができる。
【０１５３】
[00163]  放射線は、免疫エフェクター細胞を死滅させるため、放射線の線量及びタイミングが重要である。照射を受けた腫瘍中のＴ細胞及び樹状細胞は、照射直後に減少する。しかしながら、Ｔ細胞レベルは、ベースラインレベルよりも高く戻る。投与方法を問わず、放射線の全１日線量が１日で投与され得る。好ましくは、総線量は、数日にわたって分割して投与される。従って、放射線の１日線量は、約１〜５０Ｇｙ／日、例えば少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、１〜４、１〜１０、１〜２０、１〜５０、２〜４、２〜１０、２〜２０、２〜２５、２〜５０、３〜４、３〜１０、３〜２０、３〜２５、３〜５０Ｇｙ／日を含むことになる。
【０１５４】
[00164]  １日線量は、単一線量として投与され得、又は１日に２つ以上の部分量で投与される「小分割」線量であり得る。内部放射線源、例えば小線源照射療法又は放射免疫療法が用いられる場合、典型的には露光時間が増加し、対応して放射線強度が低下することになる。
【０１５５】
[00165]  本発明の一部の実施形態によれば、抗体−ＴＧＦβトラップと少なくとも１つの追加の抗癌剤とは、同時に投与される。別の実施形態によれば、抗体−ＴＧＦβトラップと少なくとも１つの追加の抗癌剤とは、逐次的に投与される。
【０１５６】
[00166]  抗体−ＴＧＦβトラップ及び少なくとも１つの追加の抗癌療法剤の投与頻度は、投与する医師の判断に基づいて治療経過中に調整され得る。
【実施例】
【０１５７】
実施例
[00167]  本発明は、ここで、概略的に説明されているが、以下の例を参照することにより更に容易に理解されるであろう。以下の例は単に本発明の特定の態様及び実施形態を例示するために含まれるものであり、いかなる方法であれ本発明の範囲を限定することは意図されない。
【０１５８】
実施例１  −  ＤＮＡ構築及びタンパク質発現
[00168]  抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは、抗ＰＤ−Ｌ１抗体−ＴＧＦβ受容体ＩＩ融合タンパク質である。この分子の軽鎖は抗ＰＤ−Ｌ１抗体の軽鎖（配列番号１）と同一である。この分子の重鎖（配列番号３）は、可動性（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４Ｇｌｙリンカー（配列番号１１）を介して可溶性ＴＧＦβ受容体ＩＩ（配列番号１０）のＮ末端に遺伝子融合した抗ＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖（配列番号２）を含む融合タンパク質である。融合接合部において、抗体重鎖のＣ末端リジン残基をアラニンに突然変異させて、タンパク質分解切断を低減した。抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの発現のため、同じ発現ベクター又は別個の発現ベクターのいずれかにおける抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖をコードするＤＮＡ（配列番号４）及び抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ受容体ＩＩをコードするＤＮＡ（配列番号５）を使用して、一過性の又は安定的なトランスフェクションの標準プロトコルを用いて哺乳類細胞をトランスフェクトした。馴化培養培地を回収し、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ融合タンパク質を標準プロテインＡセファロースクロマトグラフィーによって精製した。１つの抗ＰＤ−Ｌ１抗体と２つの可溶性ＴＧＦβ受容体ＩＩ分子とを含むこの精製タンパク質（図１）は、サイズ排除クロマトグラフィー及び非還元条件下におけるＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で約１９０キロダルトンの推定分子量（ＭＷ）を有する。還元条件下では、軽鎖及び重鎖はそれぞれ２８及び７５キロダルトンの見かけのＭＷを有する。
【０１５９】
[00169]  類似重鎖融合ポリペプチド（配列番号７）と可変領域にＰＤ−Ｌ１に対する結合を無効にする突然変異Ａ３１Ｇ、Ｄ５２Ｅ、Ｒ９９Ｙを有する軽鎖（配列番号６）とを含む抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ融合タンパク質を同様に調製した。これは続く実験でＴＧＦβ  Ｔｒａｐ対照として使用した。
【０１６０】
実施例２  −  生物学的療法薬としての抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの作製
[00170]  ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ）細胞の一過性のトランスフェクションによって作製した抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐは、様々な程度のクリッピング種を含有することが分かり、これらの種は還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥで見かけのＭＷが約６０ｋＤの薄いバンドとして現れた。このバンドは、融合接合部に近いＴＧＦβＲＩＩのＮ末端部分内のある部位で切断された抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの重鎖であると確認された。
【０１６１】
[00171]  浮遊培養で無血清培地中での成長に予め適合させたＣＨＯ−Ｓ宿主細胞株において、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐを発現する安定クローンを作成した。細胞に、抗ＰＤ−Ｌ１−ＴＧＦβＲＩＩタンパク質をコードする遺伝子及びグルタミンシンテターゼ選択マーカーを含む発現ベクターをトランスフェクトした。続く安定した組込み体の選択はＬ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を用いて行った。ミニプール手法を用いて抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐ発現細胞株を作成し、続いてBeckton-Dickinson蛍光活性化セルソーター（FACS Aria II）を使用して３８４ウェルプレートに単一細胞を堆積させた。成長、産生率、及びタンパク質品質を汎用プラットフォームフェドバッチアッセイで評価した。これらの分析に基づき、更なる試験のリード候補として１４個のクローンを選択した。クローンのスケールアップ中に樹立したリサーチセルバンクから、これらのクローンによる安定性試験を約９０ＰＤＬ（集団倍化数）まで行った。ミニプール開発の終わりに、一過性発現で見られたとおり、重鎖−リンカー−ＴＧＦβＲＩＩサブユニットがクリッピングを起こしたことが発見された。この安定性試験の全てのクローンがクリッピング種を生じ、しかし、プロテインＡ精製材料では、インタクトなサブユニットに対するクリッピング種のパーセントはクローン毎に異なることが示された。加えて、プロテインＡクロマトグラフィーと、続く強陽イオン交換からなる改良した精製プロセスを開発して、クリッピング種の共精製を低減した。この改良したプロセスであっても、低クリッピングレベルを生じるクローンを使用して＜５％の要求される最終クリッピング種レベルを有する精製材料を得ることができたに過ぎなかった。これらの複合的な分析に基づき、クローン０２Ｂ１５を最終的な候補クローンとして選択した。このクローンが０ＰＤＬ、３０ＰＤＬ、６０ＰＤＬ及び９０ＰＤＬで発現する抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの分析が示すところによれば、集団倍化数に伴うクリッピング率の増加はなかった。
【０１６２】
実施例３  −  皮下ＭＣ３８腫瘍マウスモデルにおける化学療法と抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとの併用
[00172]  結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、男性で３番目及び女性で２番目によく見られる癌であり、世界中で新規症例が１２０万例を超える。この１０年間で治療が大幅に進歩しているにも関わらず、ＣＲＣは、癌関連死亡の４番目によく見られる原因である。従って、新規治療モダリティが必要とされている。以下に記載する実施例では、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ分子の有効性をマウス結腸直腸癌モデルでオキサリプラチン（Ｏｘ）及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）ベースの療法と併用して調べた。
【０１６３】
[00173]  皮下ＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおける抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップと化学療法試薬Ｏｘ／５−ＦＵとによる併用治療は、腫瘍成長の有意な阻害をもたらした。これらの前臨床データは、臨床における結腸直腸癌の治療のため化学療法（Ｏｘ／５−ＦＵ）を抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ免疫療法と併用する戦略を裏付けている。
【０１６４】
材料及び方法
[00174]  ＭＣ３８腫瘍細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手した。ＭＣ３８細胞株を試験して、迷入ウイルス及びマイコプラズマが含まれていないことを確認した。Ｃ５７ＢＬ／６マウス、８〜１２週齢は、チャールズリバーラボラトリーズ（Charles River Laboratories）から入手した。Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｉｇｈｍｔｍ１Ｃｇｎ／Ｊマウス、８〜１２週齢は、ジャクソン研究所（Jackson Laboratories）から入手した。
【０１６５】
[00175]  試験材料用量は、以下のとおりであった：抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ：２４．６ｍｇ／ｋｇ；４９２μｇ／マウス；２．４６ｍｇ／ｍＬ；０．２ｍＬ用量容積を静脈内投与。フルオロウラシル（５−ＦＵ）：６０．０ｍｇ／ｋｇ；１２０μｇ／マウス；６．００ｍｇ／ｍＬ；０．０２ｍＬ用量容積を静脈内投与。オキサリプラチン：５．０ｍｇ／ｋｇ；１０μｇ／マウス  ０．５００ｍｇ／ｍＬ  ０．０２ｍＬをｉ．ｐ．投与。ｍｇ／ｋｇ単位の値は、近似であり、１マウス当たり２０ｇの平均体重と仮定した。
【０１６６】
[00176]  陰性対照は、４００μｇ／マウスの試験濃度で投与した不活性アイソタイプ対照（抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ））であった。
【０１６７】
[00177]  細胞培養物。１０％熱失活ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）中で無菌条件下においてＭＣ３８細胞を培養し、３７℃及び５％ＣＯ２に維持した。インビボ移植前に、５０〜７０％コンフルエンスに達したところで細胞を１：５の比で合計２代にわたって継代した。トリプシン処理によって細胞を回収し、血球計算器及びトリパンブルー色素排除染色を用いて生存細胞数を決定した。細胞培養試薬の全ては、Life Technologies（Gaithersburg, MD）から購入した。
【０１６８】
[00178]  ＭＣ３８腫瘍モデル。試験ＴＩ１３−０２７では、ＭＣ３８腫瘍細胞（１×１０６細胞／マウス）を１００μＬの滅菌ＰＢＳ中に懸濁し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に移植した。腫瘍サイズが平均約４５ｍｍ３に達したとき、マウスを４群（Ｎ＝１０匹マウス／群）に無作為化して療法を開始した。治療は、図２及び図３に示す用量スケジュールに従って投与した。腫瘍の長さ（Ｌ）、幅（Ｗ）及び高さ（Ｈ）は、デジタルノギスで測定し、週２回、WinWedgeソフトウェアを使用して自動でコンピュータに記録した。体重も週２回記録して忍容性を評価した。腫瘍容積は、楕円体体積の式によって計算した：容積＝π／６＊（Ｌ×Ｗ×Ｈ）；式中、Ｌ＝腫瘍の長さ、Ｗ＝幅及びＨ＝高さである。有効性は、インビボ試験の継続期間全体を通じて腫瘍容積を測定することにより決定し、腫瘍重量は、以下に記載するとおりに試験終了時に測定した。動物は、全て１７日目に犠牲死させ、腫瘍を切除して秤量した。脾臓を回収してＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ分析にかけた。
【０１６９】
[00179]  試験ＴＩ１４−０１２では、上記に記載したとおり、ＭＣ３８腫瘍細胞をＢ６．１２９Ｓ２−Ｉｇｈｍｔｍ１Ｃｇｎ／Ｊマウスに注入した。腫瘍成長及び治療有効性を判定する他の全ての手順も上記に記載したとおりであった。
【０１７０】
[00180]  ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ。酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイを用いて、ＭＣ３８腫瘍における公知のＴ細胞拒絶エピトープであるｐ１５Ｅ抗原に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を測定した（Yang and Perry-Lalley J Immunotherapy 2000; 23:177-183）。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、ｐ１５ＥエピトープＫＰＳＷＦＴＴＬを負荷した抗原提示細胞（ＡＰＣ）との共培養後のＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度を測定する。ニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）に由来する無関係のペプチド、ＳＩＩＮＦＥＫＬを負荷したＡＰＣを陰性対照として供した。陽性対照試料は、細胞傷害性Ｔリンパ球の非特異的活性化を惹起するＰＭＡ及びイオノマイシンで刺激した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、BD BiosciencesのマウスＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔキットを製造者の指示に従って使用して実施した。試験ＴＩ１３−０２７の１７日目にＮ＝５匹マウス／群の脾臓を回収し、単一細胞懸濁液に処理し、１μｇ／ｍＬの最終濃度のＰ１５Ｅペプチドで刺激し、次に３７℃で７日間培養した。インビトロ刺激後、ＣＤ８＋  Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotech）及びAutoMACS Pro Separatorを使用した磁気活性化細胞選別によってＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離した。インビトロ刺激ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ用の共培養系を樹立するため、ナイーブマウス脾細胞に由来するＡＰＣをＫＰＳＷＦＴＴＬペプチド又は無関係なＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドで１時間パルスし、次にGammaCell 40 Exactorにおいて２Ｇｙで照射した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイプレート（抗ＩＦＮ−γ抗体コート済み）において、実験マウスから単離したＣＤ８＋  Ｔ細胞（１×１０５細胞／ウェル）をペプチドパルス照射ＡＰＣ（２．５×１０５細胞／ウェル）と共にトリプリケートで培養した。
【０１７１】
[00181]  試験ＴＩ１４−０１２の１８日目、エキソビボＥＬＩＳｐｏｔアッセイを樹立し、ここでは、Ｎ＝５匹マウス／群の脾臓を回収し、単一細胞懸濁液に処理し、ＣＤ８＋  Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotech）及びAutoMACS Pro Separatorを使用した磁気活性化細胞選別によりＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離した。エキソビボＥＬＩＳｐｏｔアッセイ用の共培養系を樹立するため、ナイーブマウス脾細胞に由来するＡＰＣをＫＰＳＷＦＴＴＬペプチド又は無関係なＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドで１時間パルスし、次にGammaCell 40 Exactorにおいて２Ｇｙで照射した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイプレート（抗ＩＦＮ−γ抗体コート済み）において、実験マウスから単離したＣＤ８＋  Ｔ細胞（５×１０５細胞／ウェル）をペプチドパルス照射ＡＰＣ（５×１０５細胞／ウェル）と共にトリプリケートで培養した。
【０１７２】
[00182]  両方の実験とも、実験的ＣＤ８＋  Ｔ細胞はペプチドパルスＡＰＣと３７℃で１９〜２０時間共培養し、その後、アッセイプレートから取り出した。ビオチニル化抗ＩＦＮ−γ抗体をプレートの各ウェルに加え、続いて洗浄ステップを行い、次にストレプトアビジン−ＨＲＰ検出コンジュゲートを加えた。更にもう１回の洗浄ステップ後、プレートを発色基質溶液とインキュベートした。反応をモニタし、次にプレートを水でリンスすることにより停止させた。CTL-Immunospot S5UV Analyzer（Cellular Technology Limited）を使用してアッセイプレートの各ウェルのＩＦＮ−γ陽性スポット数をカウントした。データは、平均スポット数／ウェル±ＳＥＭとして表す。
【０１７３】
[00183]  試験中、死亡チェックを１日１回実施した。臨床所見。試験中、以前記載されたとおりのボディコンディション（ＢＣ）評価法を用いて（Ullman-Cullere and Foltz, Lab Anim Sci. 1999; 49:319-23）、全ての動物に関して臨床徴候（健康不良及び行動変化など）を１日１回記録した。瀕死マウスは、ＣＯ２窒息により人道的に安楽死させた。試験中の全ての動物の体重を、各群の終了日を含め、週２回記録した。腫瘍容積をデジタルノギスで三次元測定し、実験の継続期間中にわたり週２回、WinWedgeソフトウェアを使用して自動でコンピュータに記録した。腫瘍容積は楕円体体積の式：容積＝０．５２３６（Ｌ×Ｗ×Ｈ）（式中、Ｌ＝腫瘍の長さ、Ｗ＝幅及びＨ＝高さである）を用いて計算した。犠牲時に原発性腫瘍を切除し、副次有効性エンドポイントとして秤量した。ＩＦＮ−γ産生Ｐ１５Ｅ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって定量化した。マウスＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔキット（BD Biosciences）を製造者の指示に従って使用してマウスＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実施した。
【０１７４】
[00184]  統計的分析。腫瘍容積は、試験期間全体を通じて週２回計測した。腫瘍容積データは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として提示した。腫瘍成長阻害％Ｔ／Ｃ比は、治療群の腫瘍容積を対照群の腫瘍容積で除し、次に１００を乗じたものとして計算した。腫瘍容積データは、対数変換し、治療群間の統計的有意差を測定するため多重比較のチューキーの補正を含む二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを実施した。Ｔ／Ｃは、治療群の腫瘍容積を対照群の腫瘍容積で除したものとして計算した。腫瘍重量は、試験終了時に測定した。データは、平均値±ＳＥＭとして表した。％Ｔ／Ｃ比は、治療群の腫瘍重量を対照群の腫瘍重量で除し、次に１００を乗じたものとして計算した。腫瘍重量データは、治療群間の統計的有意差を測定するため多重比較のチューキーの補正を含む一元配置ＡＮＯＶＡで評価した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔデータは、平均値±ＳＥＭとして表した。統計的分析には、GraphPad Prismソフトウェアを使用して、多重比較のチューキーの補正を含む一元配置ＡＮＯＶＡを用いた。ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判定した。
【０１７５】
結果
[00185]  試験ＴＩ１３−０２７では、Ｂ細胞コンピテントマウスにおいて完全ヒト化抗体によって引き起こされる免疫原性のため、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ分子は、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスにおいて１週間で３回のみ投与することができた。結果的に、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ単剤療法では有意な抗腫瘍活性は観察されなかった（腫瘍容積％Ｔ／Ｃ＝９１％；図４を参照されたい）。オキサリプラチン／５−ＦＵ治療は、アイソタイプ対照と比較してＭＣ３８皮下腫瘍モデルにおいて有意な腫瘍成長阻害を誘導した（腫瘍容積％Ｔ／Ｃ＝５３．２％；ｐ＜０．０００１）。抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとオキサリプラチン／５−ＦＵとの併用療法は、対照群と比較してＭＣ３８腫瘍成長を有意に阻害した（腫瘍容積％Ｔ／Ｃ＝３３．２％；ｐ＜０．０００１）。更に、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとオキサリプラチン／５−ＦＵとの併用は、オキサリプラチン／５−ＦＵ単独と比べて腫瘍成長制御を有意に改善した（腫瘍容積４３９．６ｍｍ３対７０３．７ｍｍ３；ｐ＜０．０００１）。同じ傾向が観察され、併用治療が抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ単独と比較して腫瘍成長制御の統計的に有意な改善を生じさせた（４３９．６ｍｍ３対１２０４．０ｍｍ３；ｐ＜０．０００１）（図４Ａ〜図４Ｄ及び表１を参照されたい）。
【０１７６】
【表１】
2019527706.tif 000019
【０１７７】
[00186]  最後に、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ単剤療法又はオキサリプラチン／５−ＦＵ単剤療法は、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定したとき、アイソタイプ対照群と比較してＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度を有意に増加させることが観察された（それぞれｐ＜０．０５及びｐ＜０．０５）。抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとオキサリプラチン／５−ＦＵとの併用は、いずれの単剤療法群と比べてもＰ１５Ｅ特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度を有意に亢進させた（ｐ＜０．０５；図４Ｃを参照されたい）。
【０１７８】
[00187]  試験ＴＩ１４−０１２では、Ｂ細胞欠損マウスを利用することによりマウス抗ヒト抗体（ＭＡＨＡ）応答を回避して、実験動物を抗ＰＤＬ１／ＴＧＦβトラップで５回治療した。意外ではないが、野生型マウスが３回治療されたのみである試験ＴＩ１３−０２７（腫瘍容積％Ｔ／Ｃ＝９１％）と比較して抗ＰＤＬ１／ＴＧＦβトラップ単剤療法（腫瘍容積％Ｔ／Ｃ＝５７．３％）でより高い抗腫瘍活性が観察された。試験ＴＩ１４−０１２では、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとオキサリプラチン／５−ＦＵとの併用治療は、単剤療法（ｐ＜０．０００１）又はアイソタイプ対照（ｐ＜０．０００１）のいずれと比較しても有意に有効性が高かった（図５Ｄ及び表２を参照されたい）。
【０１７９】
【表２】
2019527706.tif 000020
【０１８０】
[00188]  同様に、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ単剤療法は、アイソタイプ対照と比較してＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度の有意な増加をもたらした（図５Ｃを参照されたい；ｐ＜０．０５）。抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとオキサリプラチン／５−ＦＵとの併用治療は、単剤療法群又はアイソタイプ対照のいずれと比較してもＰ１５特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度の相乗的増加をもたらした（図５Ｃを参照されたい；ｐ＜０．０５）。
【０１８１】
[00189]  抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸及びＴＧＦβシグナル伝達の二重ターゲティングを通じて腫瘍微小環境中の細胞内因性免疫抑制及び外因性免疫抑制の両方を逆転させるように設計された二機能性抗体−サイトカイン受容体融合タンパク質である。本明細書に記載される試験では、皮下ＭＣ３８腫瘍を有するマウスにおいて抗ＰＤＬ１／ＴＧＦβトラップとＯｘ／５−ＦＵ治療との併用による有意なＭＣ３８腫瘍成長阻害及びＰ１５Ｅ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞ＩＦＮ−γ産生の相乗的誘導が観察された。野生型マウスで観察された抗腫瘍有効性及び免疫応答に対するこれらの効果は、Ｂ細胞欠損マウスで増強された。この差異は、第一に、より多い用量数の抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップを投与したこと及びＢ細胞欠損マウスにＭＡＨＡ（マウス抗ヒト抗体）応答が存在しないことに起因すると考えられる。まとめると、これらのデータは、化学療法の構成要素（Ｏｘ／５−ＦＵ）を抗ＰＤＬ１／ＴＧＦβトラップ療法と有効に併用してマウス結腸直腸癌モデルの腫瘍成長阻害及び腫瘍応答性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答を亢進させ得ることを実証している。結論として、本前臨床結果は、臨床における結腸直腸癌治療のための併用を裏付けている。
【０１８２】
実施例４  −  筋内ＭＣ３８腫瘍マウスモデルにおける放射線療法と抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとの併用
[00190]  抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ分子には、ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖のＣ末端に共有結合的に連結したヒトＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメイン（ＴＧＦβトラップ）が含まれる。抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ単剤療法は、複数の前臨床モデルで優れた抗腫瘍有効性を示している。ここに報告する試験では、本発明者らは、筋内ＭＣ３８結腸直腸腫瘍を担持するＢ６．１２９Ｓ２−Ｉｇｈｍｔｍ１Ｃｇｎ／Ｊマウスにおける分割局所放射線療法との併用での抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップの抗腫瘍活性について調べた。このデータから、４つの分割線量の局所放射線（３６０ラド／投与）として与えられる放射線と抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップの単回投与（５５μｇ）との併用が顕著な相乗的抗腫瘍効果を有し、１００％のマウスで腫瘍寛解をもたらしたことが示された。加えて、４つの分割線量の局所放射線（５００ラド／投与）として与えられる放射線と抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップの単回投与（１６４μｇ）との併用は、照射されている腫瘍から遠位の部位にある腫瘍に対して抗癌効果を生じており、これは、アブスコパル効果の実証であり、かかる治療が転移の治療において有用となり得ることが指摘される。比較すると、放射線照射又は抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ治療のいずれか単独による単剤療法は、腫瘍負荷の中程度の減少をもたらした。更に、併用療法を受けるマウスでは、Ｐ１５Ｅ特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度の有意な増加が観察された。最後に、併用療法は、エフェクターＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＮＫ細胞によるＭＣ３８腫瘍の浸潤の改善に関連した。これらの結果は、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ治療が放射線照射との相乗作用によりＴ細胞媒介性抗腫瘍応答を促進することを示している。以下に記載する結果は、臨床適用の可能性に向けたこの併用戦略を裏付けている。
【０１８３】
材料及び方法
[00191]  細胞株：ＭＣ３８マウス結腸癌細胞株は、スクリプス研究所（Scripps Research Institute）から供与された。細胞株を試験して、マウスウイルス及びマイコプラズマが含まれていないことを確かめた。動物Ｂ６．１２９Ｓ２−Ｉｇｈｍｔｍ１Ｃｇｎ／Ｊマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）、８〜１２週齢は、ジャクソン研究所（Jackson Laboratories）から入手した。
【０１８４】
[00192]  試験材料用量は、以下のとおりであった：抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ：２．７５ｍｇ／ｋｇ；５５μｇ／マウス；１３．７５ｍｇ／ｍＬ；０．２ｍＬ用量容積を静脈内投与及び抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ：８．２５ｍｇ／ｋｇ；１６４μｇ／マウス；４１．２５ｍｇ／ｍＬ；０．２ｍＬ用量容積を静脈内投与。
【０１８５】
[00193]  陰性対照は、以下のとおりであった：不活性アイソタイプ対照（抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）Ａ１１−１２１−６）を１３３μｇ／マウス又は４５μｇ／マウスのいずれかの試験濃度で投与した。
【０１８６】
[00194]  １０％熱失活ウシ胎仔血清を含有するダルベッコ最小必須培地中で無菌条件下においてＭＣ３８細胞を培養し、３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。インビボ移植前に、５０〜７０％コンフルエンスに達したところで細胞を１：５の比で合計２代にわたって継代した。トリプシン処理によって細胞を回収し、血球計算器及びトリパンブルー色素排除染色を用いて生存細胞数を決定した。
【０１８７】
[00195]  Ｃ３８腫瘍モデル：−８日目にＣ５７ＢＬ／６．１２９Ｓ２−Ｉｇｈｍｔｍ１Ｃｇｎ／Ｊマウスの右大腿に０．１ｍｌ  ＰＢＳ中の０．５×１０６個のＭＣ３８腫瘍生細胞を筋内移植した。腫瘍が約１２８ｍｍ３の平均容積に達したところで、マウスを治療群に無作為化した。治療は０日目（腫瘍細胞接種後８日）に開始した。
【０１８８】
[00196]  局所放射線療法は、遠位部位に抗癌効果を生じさせることができ、これは、「アブスコパル」効果として知られる現象である。放射線療法のアブスコパル効果に対して抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップが及ぼす効果を試験するため、治療７日前にマウスに０．５×１０６個のＭＣ３８腫瘍生細胞を接種して右大腿に原発性筋内ＭＣ３８腫瘍を作成し、及び左側腹部に１×１０６個のＭＣ３８細胞を皮下接種して二次性皮下ＭＣ３８腫瘍を作成した（図９Ａ）。７日目に治療を開始した。
【０１８９】
[00197]  放射線療法：マウスを専用のプレキシガラストレーに配置し、照射する腫瘍の範囲を除いて鉛遮蔽によって全身を保護した。GammaCell 40 Exactorを用いて放射線療法を腫瘍照射野に送達した。
【０１９０】
[00198]  酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイ：ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて、ＭＣ３８腫瘍によって発現される公知のＴ細胞拒絶エピトープであるｐ１５Ｅ抗原（Yang and Perry-Lalley 2000を参照されたい）に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を測定した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、ｐ１５ＥエピトープＫＰＳＷＦＴＴＬを負荷した抗原提示細胞（ＡＰＣ）との共培養後にＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度を測定する。ニワトリオボアルブミン（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）に由来する無関係のペプチドを負荷したＡＰＣを陰性対照として供した。陽性対照試料は、ＣＴＬの非特異的活性化を惹起するＰＭＡ及びイオノマイシンで刺激した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、BD Biosciencesのキットを使用して実施した。試験１４日目、各試験群につき１匹のマウスから脾臓を回収し、単一細胞懸濁液に処理した。Miltenyi BiotechからのＣＤ８＋  Ｔ細胞単離キット、及びAutoMACS Pro Separatorを使用した磁気活性化細胞選別によってＣＤ８＋  Ｔ細胞を単離した。次に、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイプレート（抗ＩＦＮ−γ抗体コート済み）内のＫＰＳＷＦＴＴＬペプチドで１時間パルスして、次にGammaCell 40 Exactorにおいて２Ｇｙで照射したナイーブマウス脾細胞に由来するＡＰＣとの共培養物中にＣＤ８＋  Ｔ細胞を播種した。３７℃で１６〜２０時間インキュベートした後、アッセイプレートから細胞を取り出した。ビオチニル化抗ＩＦＮ−γ抗体をプレートの各ウェルに加え、続いて洗浄ステップを行い、次にストレプトアビジン−ＨＲＰ検出コンジュゲートを加えた。更にもう１回の洗浄ステップ後、プレートを発色基質溶液とインキュベートした。反応をモニタし、次にプレートを水でリンスすることにより停止させた。Immunospot ELISpotリーダーシステムを使用してアッセイプレートの各ウェルのＩＦＮ−γ陽性スポット数を測定した。
【０１９１】
[00199]  免疫表現型：脾臓から機械的破壊によって細胞懸濁液を調製し、続いて赤血球を溶解させた。細切した腫瘍スラリーの酵素消化によって腫瘍細胞懸濁液を調製した。スラリーをＩＶ型コラゲナーゼ（４００単位／ｍｌ）及びＤＮａｓｅ  １（１００μｇ／ｍｌ）の溶液中３７℃で１時間、頻繁に撹拌しながらインキュベートした。腫瘍消化後、沈降によってデブリを分離し、懸濁液を４０μｍナイロン細胞ストレーナに通過させた。ＦＡＣＳ分析用の脾臓及び腫瘍細胞懸濁液の抗体染色を製造者（例えば、eBioscience又はBD Biosciences）の推奨に従って実施した。
【０１９２】
[00200]  脾臓試料の分析のため、前方及び側方散乱特徴によって同定されるとおりのリンパ球集団の周りに親ゲートを作成した。リンパ球ゲートから、ドットプロット上に免疫細胞の部分集団：ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋）、ＮＫ細胞（ＮＫ１．１＋）、エフェクターメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＣＤ８＋／ＣＤ４４高／ＣＤ６２Ｌ低）、セントラルメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＣＤ８＋／ＣＤ４４高／ＣＤ６２Ｌ高）及び調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／Ｆｏｘｐ３＋）を同定した。溶解活性の尺度としての脱顆粒を評価するため、リンパ球細胞表面上のＣＤ１０７ａを測定した。細胞表面タンパク質の染色後、試料を固定して透過処理することにより、Ｔボックス転写因子（Ｅｏｍｅｓ及びＴ−ｂｅｔ）及びエフェクターサイトカイン（ＩＦＮ−γ及びグランザイムＢ）の細胞内染色を可能にした。白血球ゲートから、ドットプロット上に骨髄性細胞の部分集団：樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋／Ｉ−Ａｂ＋）、好中球（ＣＤ１１ｂ＋／Ｌｙ６Ｇ＋）、マクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋／Ｌｙ−６Ｃ高）及びＭＤＳＣ（Ｇｒ−１＋／ＣＤ１１ｂ＋）を同定した。
【０１９３】
[00201]  腫瘍試料の分析にも同様のゲーティング戦略を用い、但し、親ゲートは、初めにＣＤ４５＋細胞集団の周りに作成して、他の腫瘍細胞及び間質成分からの腫瘍浸潤性白血球を同定した。
【０１９４】
[00202]  試験設計。Ｂ細胞欠損マウスのＭＣ３８モデルにおける放射線照射と抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとのＴＩ１３−１０９併用療法。群及び治療（Ｎ＝１０）。
【０１９５】
【表３】
2019527706.tif 000021
【０１９６】
パート２：ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ：１４日目、全てのマウスを犠牲死させて、Ｎ＝５匹マウス／群のサブセットを機能的応答に関してＥＬＩＳｐｏｔアッセイで分析した。脾臓を回収し、上記に記載したとおりＥＬＩＳｐｏｔアッセイ用に処理した。Immunospot ELISpotリーダーシステムを使用してアッセイプレートの各ウェルのＩＦＮ−γ陽性スポット数を測定した。
【０１９７】
[00203]  試験設計：Ｂ細胞欠損マウスのＭＣ３８モデルにおける放射線照射と抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとのＴＩ１４−０１３併用療法。群及び治療（Ｎ＝１０）。
【０１９８】
【表４】
2019527706.tif 000022
【０１９９】
パート２：ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ及び免疫表現型。１４日目、全てのマウスを犠牲死させて、Ｎ＝５匹マウス／群のサブセットをＥＬＩＳｐｏｔアッセイによる脾臓機能的応答及びＴＩＬの免疫表現型に関して分析した。脾臓を回収し、上記に記載したとおりＥＬＩＳｐｏｔアッセイ用に処理した。Immunospot ELISpotリーダーシステムを使用してアッセイプレートの各ウェルのＩＦＮ−γ陽性スポット数を測定した。腫瘍組織も回収し、上記に記載したとおり処理した。ＴＩＬ表現型は、％ＣＤ８＋  ＴＩＬ、％ＮＫ１．１＋  ＴＩＬ、ＣＤ８＋  ＴＩＬ  ＥＯＭＥＳ発現、及びＣＤ８＋  ＴＩＬ脱顆粒に関してＦＡＣＳ分析によって分析した。
【０２００】
[00204]  試験中、以前記載されたとおりのボディコンディション（ＢＣ）スコアシステムを用いて（Ullman-Cullere and Foltz, Lab Anim Sci. 1999; 49:319-23）、全ての動物について臨床徴候（病気及び健康行動変化など）を１日１回記録した。瀕死マウスは、ＣＯ２窒息により人道的に安楽死させた。試験中の全ての動物の体重を、各試験の終了日を含め、週２回記録した。実験の継続期間中、腫瘍は、デジタルノギスで三次元測定した。腫瘍容積は、式：容積＝０．５２３６（Ｌ×Ｗ×Ｈ）（式中、Ｌ＝腫瘍の長さ、Ｗ＝幅及びＨ＝高さである）を用いて計算した。腫瘍接種から犠牲死までの時間間隔を定量化するカプラン・マイヤー生存曲線を作成し、各治療群の生存期間中央値を計算した。
【０２０１】
[00205]  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いてＩＦＮ−γ産生Ｐ１５Ｅ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度を定量化し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって定量化した。脾細胞及び腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の免疫表現型は、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）により実施した。
【０２０２】
[00206]  統計的分析：腫瘍容積は、試験期間全体を通じて週２回測定した。腫瘍容積データは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として提示した。腫瘍容積データは、対数変換し、治療群間の統計的有意差を測定するため多重比較のチューキーの補正を含む二元配置反復測定ＡＮＯＶＡを実施した。試験終了時に腫瘍重量を収集した。データは、平均値±ＳＥＭとして表した。Ｔ／Ｃ比は、治療群の腫瘍容積（又は腫瘍重量）を対照群の腫瘍容積（又は腫瘍重量）で除したものとして計算した。腫瘍重量データは、治療群間の統計的有意差を測定するため多重比較のチューキーの補正を含む一元配置ＡＮＯＶＡで評価した。ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって定量化し、１ウェル当たりの平均スポット数として表した（平均値±ＳＥＭ）。統計的分析には、GraphPad Prismソフトウェアを使用して多重比較のチューキーの補正を含む一元配置ＡＮＯＶＡを用いた。ｐ＜０．０５を統計的に有意であると判定した。
【０２０３】
[00207]  試験設計：アブスコパル効果を試験するためのＢ細胞欠損マウスのＭＣ３８モデルにおける放射線照射と抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとの併用療法。群及び治療（Ｎ＝６）。治療は、０日目にアイソタイプ対照（４００μｇ、０、２、４日目）、放射線照射（５００ラド／日、０、１、２、３日目）、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ（１６４μｇ、０日目）、及び抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ（１６４μｇ、０日目）＋放射線照射（５００ラド／日、０、１、２、３日目）で開始した。（図９Ａ）に示されるとおり、放射線照射は、原発性腫瘍にのみ適用した。原発性腫瘍容積及び二次性腫瘍容積を週２回測定した。腫瘍容積は、平均値±ＳＥＭとして提示する。
【０２０４】
結果
[00208]  放射線と抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとの併用は、相乗的抗腫瘍有効性を実証した。ＭＣ３８筋内腫瘍モデル（ＴＩ１３−１０９）では、放射線照射（３６０ラド／日、０〜３日目）又は抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ単剤療法（５５又は１６４μｇ、２日目）が有意な腫瘍成長阻害を引き起こし（それぞれｐ＜０．０００１、対アイソタイプ対照）、一方で放射線照射と抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとの併用は、１０日目に放射線照射（ｐ＜０．０００１）又は抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ（ｐ＜０．０００１）のいずれによる単剤療法と比較しても顕著な治療的相乗作用を引き起こした（図６Ａを参照されたい）。腫瘍重量に基づく１４日目のＴ／Ｃ比は、放射線療法について０．４５、５５μｇ及び１６４μｇの抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップについてそれぞれ０．５０及び０．３６、及び放射線照射と抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとの併用群（それぞれ５５μｇ対１６４μｇ）について０．０４対０．０１であった（図６Ｂを参照されたい）。早くも抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ治療の４日後には、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ単剤療法で治療されたマウスの５０％（２０匹中１０匹）、併用療法で治療されたマウスの１００％（２０匹中２０匹）、及び放射線照射単剤療法で治療されたマウスの僅か１０％（１０匹中１匹）に腫瘍退縮が観察された。更に、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップは、単回用量としてのみ与えたため、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ単剤療法群では、退縮した腫瘍の１０個中４個が再び成長したが、併用群では、退縮した腫瘍の全ては、免疫機能を判定するためマウスを犠牲死させた１４日目まで収縮し続けた。
【０２０５】
[00209]  免疫活性化は、抗腫瘍有効性と相関した。１４日目、マウスを犠牲死させ、エキソビボＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いてＩＦＮ−γ産生腫瘍応答性（Ｐ１５Ｅ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度を定量化した（図６Ｃを参照されたい）。放射線照射及び抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ単剤療法群では、ＩＦＮ−γ産生腫瘍応答性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の誘導は、中程度にのみ観察された（それぞれｐ＞０．０５及びｐ＜０．０５、対アイソタイプ対照）。しかしながら、観察された抗腫瘍有効性と一致して、併用療法で治療したマウスでは、Ｐ１５Ｅ特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度の相乗的誘導が起こった（図６Ｃを参照されたい）。併用療法によって誘導されたＣＤ８＋  Ｔ細胞ＩＦＮ−γ産生は、アイソタイプ対照の７倍に上り、単剤療法の少なくとも５倍に上った（それぞれｐ＜０．００１、対各単剤療法）。この試験（ＴＩ１３−１０９）では、併用療法における抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップの用量を５５μｇから１６４μｇに増加させても、腫瘍退縮は、それ以上加速しなかった。高用量群における低いＣＤ８＋  Ｔ細胞収率のため、ＩＦＮ−γ産生腫瘍応答性（Ｐ１５Ｅ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度の適切な評価を実施できなかった。従って、これらの知見の一貫性を確かめるために反復試験を実施した。
【０２０６】
[00210]  低用量の５５μｇの抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップによる反復実験（ＴＩ１４−０１３）では、併用療法で腫瘍成長阻害及びＰ１５Ｅ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞ＩＦＮ−γ産生の誘導の両方に関してほぼ同一の相乗効果が生じた（図７Ａ〜図７Ｃを参照されたい）。
【０２０７】
[00211]  試験ＴＩ１４−０１３で治療したマウスの腫瘍浸潤リンパ球の分析により、単剤療法又はアイソタイプ対照群のいずれかと比べた放射線照射と抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとの併用による治療後のＣＤ８＋  ＴＩＬ及びＮＫ細胞の頻度の評価が明らかになった（図８Ａ〜図８Ｂを参照されたい）。更なる分析から、放射線照射と抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ療法との併用がＴボックス転写因子Ｅｏｍｅｓの発現、及び腫瘍浸潤性ＣＤ８＋  Ｔ細胞上の脱顆粒（ＣＤ１０７ａ）を促進したことが示された（図８Ｃ〜図８Ｄ）。
【０２０８】
[00212]  放射線照射と単回用量の抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとによる併用療法は、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ又は放射線照射単独と比べて原発性腫瘍容積を低減した（両方ともｐ＜０．０００１、１４日目）（図９Ｂ）。しかしながら、併用療法は、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ又は放射線照射単独と比べて二次性腫瘍容積も低減した（それぞれｐ＝０．００６６及びｐ＝０．０００６、１４日目）（図９Ｃ）。特に、放射線照射単独も、また単回低用量の抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップも、アイソタイプ対照治療と比べて二次性腫瘍の成長を有意に阻害することはなかったため、抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップが放射線照射との相乗作用によりアブスコパル効果を誘導することが指摘される。
【０２０９】
[00213]  エフェクターＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＮＫ細胞による浸潤の亢進を伴った、抗腫瘍有効性及び腫瘍応答性ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋  Ｔ細胞の頻度で観察された相乗作用は、放射線と抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ分子とによる併用療法による自然及び適応抗腫瘍免疫応答の著しい誘導と一致する。従って、この治療的併用には、癌患者の放射線療法の改善に向けた臨床的に有意味な適用性がある。
【０２１０】
[00214]  本明細書に記載されるデータは、ＭＣ３８結腸直腸癌モデルにおいて標準治療外部ビーム放射線療法（ＥＢＲＴ）を抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ療法と併用して相乗的腫瘍成長阻害及び腫瘍応答性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の誘導を実現し得ることを実証している。Ｐ１５Ｅは、ＭＣ３８腫瘍細胞株によって発現される内因性レトロウイルス抗原であるため（Zeh et al. J Immunol.1999; 162:989-94）、観察されたＰ１５Ｅ特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増加は、併用療法後の腫瘍応答性に相当し、一般化されたＴ細胞応答ではない。この相乗的免疫応答は、この治療レジメンで観察される抗腫瘍有効性の亢進と一致し、放射線照射と抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとによる併用治療がＣＤ８＋  Ｔ細胞媒介性抗腫瘍応答を促進することを示している。放射線と抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップ療法との併用は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞及びＮＫ細胞によるＭＣ３８腫瘍浸潤を促進することも示された。更に、併用療法は、転写因子Ｅｏｍｅｓ、及び脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａのより高い発現レベルからも明らかなとおり、エフェクターＣＤ８＋  ＴＩＬ表現型を誘導した。
【０２１１】
[00215]  観察される結果は、臨床適用の可能性に向けたこの併用戦略の相乗作用を裏付けている。放射線と抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップとの連続療法は、放射線療法後に循環ＴＧＦβレベルが増加した患者にとって有益となり得る。更に、単回低用量の抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＧＦβトラップであっても観察される強力な相乗効果のため、かかる併用療法による臨床において好ましい安全性プロファイルが期待される。
【０２１２】
配列
配列番号１
分泌抗ＰＤ−Ｌ１λ軽鎖のペプチド配列
【化１８】
2019527706.tif 000023
配列番号２
抗ＰＤＬ１の分泌Ｈ鎖のペプチド配列
【化１９】
2019527706.tif 000024
配列番号３
抗ＰＤＬ１／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの分泌Ｈ鎖のペプチド配列
【化２０】
2019527706.tif 000025
配列番号４
抗ＰＤ−Ｌ１λ軽鎖の翻訳開始コドンから翻訳終止コドンまでのＤＮＡ配列（ＶＬに先行するリーダー配列はウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター由来のシグナルペプチドである）
【化２１】
2019527706.tif 000026
配列番号５
翻訳開始コドンから翻訳終止コドンまでのＤＮＡ配列（ｍＶＫ  ＳＰリーダー：小文字下線；ＶＨ：大文字；ＫからＡへの突然変異を有するＩｇＧ１ｍ３：小文字；（Ｇ４Ｓ）ｘ４−Ｇリンカー：太字大文字；ＴＧＦβＲＩＩ：太字下線小文字；２つの終止コドン：太字下線大文字）
【化２２】
2019527706.tif 000027
配列番号６
突然変異Ａ３１Ｇ、Ｄ５２Ｅ、Ｒ９９Ｙを有する、抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの分泌λ軽鎖のポリペプチド配列
【化２３】
2019527706.tif 000028
配列番号７
抗ＰＤ−Ｌ１（ｍｕｔ）／ＴＧＦβ  Ｔｒａｐの分泌重鎖のポリペプチド配列
【化２４】
2019527706.tif 000029
配列番号８
ヒトＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＡ前駆体ポリペプチド（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ＿００１０２００１８）
【化２５】
2019527706.tif 000030
配列番号９
ヒトＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＢ前駆体ポリペプチド（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ＿００３２３３
【化２６】
2019527706.tif 000031
配列番号１０
ヒトＴＧＦβＲＩＩアイソフォームＢ細胞外ドメインポリペプチド
【化２７】
2019527706.tif 000032
配列番号１１
（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４Ｇｌｙリンカー
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ
配列番号１２
抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＭＰＤＬ３２８０Ａの分泌重鎖可変領域のポリペプチド配列
【化２８】
2019527706.tif 000033
配列番号１３
抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＭＰＤＬ３２８０Ａ及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＹＷ２４３．５５Ｓ７０の分泌軽鎖可変領域のポリペプチド配列
【化２９】
2019527706.tif 000034
配列番号１４
抗ＰＤ−Ｌ１抗体ＹＷ２４３．５５Ｓ７０の分泌重鎖可変領域のポリペプチド配列
【化３０】
2019527706.tif 000035
【０２１３】
参照による援用
[00216]  本明細書で参照される特許文献及び科学論文の各々の開示の全ては、あらゆる目的から参照によって援用される。米国特許出願第１４／６１８，４５４号の開示全体は、あらゆる目的から全体として参照により本明細書に援用される。
【０２１４】
均等物
[00217]  本発明は、その趣旨又は本質的な特徴から逸脱することなく他の特定の形態で具体化され得る。従って前述の実施形態は、本明細書に記載される発明を限定するのでなく、あらゆる点で例示的なものと見なされるべきである。種々の実施形態の様々な構造要素及び様々な開示される方法ステップを様々に組み合わせ、及び並べ換えて利用することができ、かかる変形形態の全ては、本発明の形態であると見なされるべきである。従って本発明の範囲は、前述の説明によるのでなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等の意味及び範囲内に入るあらゆる変更形態が、特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１】
2019527706.tif 000036
【図２】
2019527706.tif 000037
【図３】
2019527706.tif 000038
【図４Ａ】
2019527706.tif 000039
【図４Ｂ】
2019527706.tif 000040
【図４Ｃ】
2019527706.tif 000041
【図４Ｄ】
2019527706.tif 000042
【図５Ａ】
2019527706.tif 000043
【図５Ｂ】
2019527706.tif 000044
【図５Ｃ】
2019527706.tif 000045
【図５Ｄ】
2019527706.tif 000046
【図６Ａ】
2019527706.tif 000047
【図６Ｂ】
2019527706.tif 000048
【図６Ｃ】
2019527706.tif 000049
【図７Ａ】
2019527706.tif 000050
【図７Ｂ】
2019527706.tif 000051
【図７Ｃ】
2019527706.tif 000052
【図８Ａ】
2019527706.tif 000053
【図８Ｂ】
2019527706.tif 000054
【図８Ｃ】
2019527706.tif 000055
【図８Ｄ】
2019527706.tif 000056
【図９Ａ】
2019527706.tif 000057
【図９Ｂ】
2019527706.tif 000058
【図９Ｃ】
2019527706.tif 000059
【配列表】
2019527706000001.app
【国際調査報告】
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