(57)【要約】本開示は、核酸配列の対流ベースのＰＣＲ及び非酵素的増幅を実施するための方法、組成物及び装置を提供する。これらの方法に採用される技術及び試薬は、核酸試験及びアッセイで使用するための、開放系及び閉鎖系におけるトーホールドプローブ、鎖置換反応、レイリー・ベナール対流、温度勾配、多重増幅、多重検出、及びＤＮＡ官能化を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のオリゴヌクレオチド複合体を有する表面を含む装置であって、前記オリゴヌクレオチド複合体はそれぞれ、
第１のＤＮＡ配列と、第１のオリゴヌクレオチドを前記表面に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第１のオリゴヌクレオチド、及び
第２のＤＮＡ配列と第３のＤＮＡ配列とを含む第２のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第２のＤＮＡ配列は、前記第１のＤＮＡ配列に相補的であり、それにハイブリダイズされ、
前記第２のＤＮＡオリゴヌクレオチドは、蛍光部分を含まず、前記表面に不可逆的に連結されない、装置。
【請求項２】
前記第２のＤＮＡ配列のそれぞれが同一である、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記第２のＤＮＡ配列のそれぞれが同一ではない、請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項２に記載の装置。
【請求項５】
前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項３に記載の装置。
【請求項６】
前記第１のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、蛍光部分を含む、請求項１〜５に記載の装置。
【請求項７】
前記第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、蛍光消光剤を含む、請求項６に記載の装置。
【請求項８】
前記空間的に離散した領域のそれぞれが、第４のＤＮＡ配列と第５のＤＮＡ配列とを含む第３のオリゴヌクレオチドを更に含み、前記第４のＤＮＡ配列は、前記第３のＤＮＡ配列に相補的である、請求項４〜５に記載の装置。
【請求項９】
前記第３のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、蛍光消光剤部分を含む、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記連結部分が、歪みアルキンを含むアルキン基、又はアジド基を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１１】
前記第１のＤＮＡ配列のそれぞれが、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜１０に記載の装置。
【請求項１２】
前記第３のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜１０に記載の装置。
【請求項１３】
前記第３のＤＮＡ配列のそれぞれが、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記第５のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約２０ヌクレオチドの長さを有する、請求項８に記載の装置。
【請求項１５】
前記第４のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項８に記載の装置。
【請求項１６】
流体反応チャンバであって、
第１の表面と、
前記第１の表面に接触しない第２の表面であって、前記第１及び第２の表面が互いに対向する、第２の表面と、
前記第１の表面及び前記第２の表面に接触し、前記反応チャンバの外側境界を形成する、材料と、
前記第１の表面及び前記第２の表面に接触し、前記反応チャンバの内側境界を形成する、材料と
を含み、
前記第１の表面は、複数のオリゴヌクレオチド複合体を含み、前記オリゴヌクレオチド複合体はそれぞれ、
第１のＤＮＡ配列と、第１のオリゴヌクレオチドを前記表面に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第１のオリゴヌクレオチド、及び
第２のＤＮＡ配列と第３のＤＮＡ配列とを含む第２のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第２のＤＮＡ配列は、前記第１のＤＮＡ配列に相補的であり、それにハイブリダイズされ、
前記第２のＤＮＡオリゴヌクレオチドは、前記第１の表面に不可逆的に連結されず、任意で蛍光部分を含まない、流体反応チャンバ。
【請求項１７】
前記第２のＤＮＡ配列のそれぞれが同一である、請求項１６に記載の流体反応チャンバ。
【請求項１８】
前記第２のＤＮＡ配列のそれぞれが同一ではない、請求項１６に記載の流体反応チャンバ。
【請求項１９】
前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項１７に記載の流体反応チャンバ。
【請求項２０】
前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項１８に記載の流体反応チャンバ。
【請求項２１】
前記第１のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、蛍光部分を含む、請求項１６〜２０に記載の流体反応チャンバ。
【請求項２２】
前記第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、蛍光消光剤部分を含む、請求項２１に記載の流体反応チャンバ。
【請求項２３】
前記空間的に離散した領域のそれぞれが、第４のＤＮＡ配列と第５のＤＮＡ配列とを含む第３のオリゴヌクレオチドを更に含み、前記第４のＤＮＡ配列は、前記第３のＤＮＡ配列に相補的である、請求項２０〜２１に記載の流体反応チャンバ。
【請求項２４】
前記第３のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、蛍光消光剤部分を含む、請求項２３に記載の流体反応チャンバ。
【請求項２５】
前記連結部分が、歪みアルキンを含むアルキン基、又はアジド基を含む、請求項１６に記載の流体反応チャンバ。
【請求項２６】
前記第１のＤＮＡ配列のそれぞれが、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１６〜２５に記載の流体反応チャンバ。
【請求項２７】
前記第３のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１６〜２５に記載の流体反応チャンバ。
【請求項２８】
前記第３のＤＮＡ配列のそれぞれが、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項２７に記載の流体反応チャンバ。
【請求項２９】
前記第５のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約２０ヌクレオチドの長さを有する、請求項２３に記載の流体反応チャンバ。
【請求項３０】
前記チャンバの前記内側及び外側の境界を形成する第１及び第２の表面に接触する前記材料が、４０マイクロメートル（４０μｍ）〜２ミリメートル（２ｍｍ）の厚さを有する、請求項１６〜２９に記載の流体反応チャンバ。
【請求項３１】
円形、楕円形、正方形、矩形、三角形、六角形、八角形、菱形又は台形である、請求項１６〜３０に記載の流体反応チャンバ。
【請求項３２】
前記流体反応チャンバが均一な温度ではなく、前記反応チャンバの最高温度領域が前記反応チャンバの最低温度領域より少なくとも１０℃高い、請求項１６〜３１に記載の流体反応チャンバ。
【請求項３３】
前記反応チャンバの前記最低温度領域が、約５０℃〜約７５℃である、請求項１６〜３２に記載の流体反応チャンバ。
【請求項３４】
前記反応チャンバの前記最高温度領域が、約８０℃〜約１００℃である、請求項１６〜３３に記載の流体反応チャンバ。
【請求項３５】
前記流体反応チャンバ内に配置された流体を更に含み、前記流体溶液は、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びＰＣＲ緩衝液を含む、請求項１６〜３４に記載の流体反応チャンバ。
【請求項３６】
標的核酸を増幅する方法であって、
（ａ）請求項１６に記載の流体反応チャンバを提供する工程であって、前記流体反応チャンバは、第１及び第２の熱源と動作可能な関係にあり、前記第１及び第２の熱源は、環状チャンバに異なる第１及び第２の熱レベルを適用することができ、前記第１及び第２の熱レベルは同一ではない、工程と、
（ｂ）前記流体反応チャンバ内に標的核酸配列、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）緩衝液を含む流体を導入する工程と、
（ｃ）第１及び第２の熱レベルを前記流体反応チャンバに適用する工程と
を含む、方法。
【請求項３７】
前記標的核酸の増幅を検出する工程を更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第２のＤＮＡ配列のそれぞれが同一である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２のＤＮＡ配列のそれぞれが同一ではない、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、蛍光部分を含む、請求項３６〜４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、蛍光消光剤部分を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記空間的に離散した領域のそれぞれが、第４のＤＮＡ配列と第５のＤＮＡ配列とを含む第３のオリゴヌクレオチドを更に含み、前記第４のＤＮＡ配列は、前記第３のＤＮＡ配列に相補的である、請求項４２〜４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第３のオリゴヌクレオチドがそれぞれ、蛍光消光剤部分を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記連結部分が、歪みアルキンを含むアルキン基、又はアジド基を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１のＤＮＡ配列のそれぞれが、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項３６〜４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記第３のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項３６〜４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記第３のＤＮＡ配列のそれぞれが、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記第５のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約２０ヌクレオチドの長さを有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記流体が、非特異的な核酸染色色素を更に含む、請求項３６〜１２０に記載の方法。
【請求項５２】
前記流体反応チャンバが、円形、楕円形、正方形、三角形、矩形、六角形、八角形、菱形又は台形である、請求項３６〜５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記流体反応チャンバが、均一な温度ではなく、前記反応チャンバの最高温度領域が前記反応チャンバの最低温度領域より少なくとも１０℃高い、請求項３６〜５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記反応チャンバの前記最低温度領域が、約５０℃〜約７５℃である、請求項３６〜５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記反応チャンバの前記最高温度領域が、約８０℃〜約１００℃である、請求項３６〜５４に記載の方法。
【請求項５６】
第１の表面領域及び第２の表面領域を含む装置であって、
前記第１の表面領域は、
第１のＤＮＡ配列と、第１のオリゴヌクレオチドを前記第１の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第１のオリゴヌクレオチド、及び
第２のＤＮＡ配列と第３のＤＮＡ配列とを含む第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の配列は、前記第１の配列に相補的である、第２のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第２の表面領域は、
第４のＤＮＡ配列と、第３のオリゴヌクレオチドを前記第２の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第３のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第４の配列は、前記第２の配列、前記第３の配列、又は少なくとも前記第２の配列の６つの連続するヌクレオチドと前記第３の配列の６つの連続するヌクレオチドとの組み合わせに相補的である、装置。
【請求項５７】
第１の表面領域及び第２の表面領域を含む装置であって、
前記第１の表面領域は、
第１のＤＮＡ配列と、第１のオリゴヌクレオチドを前記第１の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第１のオリゴヌクレオチド、及び
第２のＤＮＡ配列と第３のＤＮＡ配列とを含む第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の配列は、前記第１の配列に相補的である、第２のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第２の表面領域は、
第４のＤＮＡ配列と、第３のオリゴヌクレオチドを前記第２の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第３のオリゴヌクレオチド、及び
第５のＤＮＡ配列と第６のＤＮＡ配列とを含む第４のオリゴヌクレオチドであって、前記第５の配列は、前記第４の配列に相補的である、第４のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第２の配列は、前記第５の配列に相補的であるか、又は前記第６の配列に相補的である、装置。
【請求項５８】
前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドが、蛍光部分を含む、請求項５６〜５７に記載の装置。
【請求項５９】
前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドが、蛍光消光剤を含む、請求項５６〜５７に記載の装置。
【請求項６０】
前記第２のＤＮＡ配列のそれぞれが同一である、請求項５６〜５９に記載の装置。
【請求項６１】
前記第２のＤＮＡ配列のそれぞれが同一ではない、請求項５６〜５９に記載の装置。
【請求項６２】
前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項６０に記載の装置。
【請求項６３】
前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項６１に記載の装置。
【請求項６４】
前記連結部分が、歪みアルキンを含むアルキン基、又はアジド基を含む、請求項５６〜５７に記載の装置。
【請求項６５】
前記第１のＤＮＡ配列のそれぞれが、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項５６〜６４に記載の装置。
【請求項６６】
前記第３のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項５６〜６５に記載の装置。
【請求項６７】
前記第３のＤＮＡ配列のそれぞれが、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項６６に記載の装置。
【請求項６８】
前記第５のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約２０ヌクレオチドの長さを有する、請求項５６〜６７に記載の装置。
【請求項６９】
前記第４のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項５６〜６７に記載の装置。
【請求項７０】
前記第６のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項５６〜６７に記載の装置。
【請求項７１】
流体反応チャンバであって、
第１の表面と、
前記第１の表面に接触しない第２の表面であって、前記第１及び第２の表面が互いに対向する、第２の表面と、
前記第１の表面及び前記第２の表面に接触し、前記反応チャンバの外側境界を形成する、材料と、
前記第１の表面及び前記第２の表面に接触し、前記反応チャンバの内側境界を形成する、材料と
を含み、
（ａ）前記第１の表面は、
第１のＤＮＡ配列と、第１のオリゴヌクレオチドを第１の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第１のオリゴヌクレオチド、及び
第２のＤＮＡ配列と第３のＤＮＡ配列とを含む第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の配列は、前記第１の配列に相補的である、第２のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第２の表面領域は、
第４のＤＮＡ配列と、第３のオリゴヌクレオチドを前記第２の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第３のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第４の配列は、前記第２の配列、前記第３の配列、又は少なくとも前記第２の配列の６つの連続するヌクレオチドと前記第３の配列の６つの連続するヌクレオチドとの組み合わせに相補的であるか、あるいは、
（ｂ）前記第１の表面領域は、
第１のＤＮＡ配列と、第１のオリゴヌクレオチドを前記第１の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第１のオリゴヌクレオチド、及び
第２のＤＮＡ配列と第３のＤＮＡ配列とを含む第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第２の配列は、前記第１の配列に相補的である、第２のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第２の表面領域は、
第４のＤＮＡ配列と、第３のオリゴヌクレオチドを前記第２の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第３のオリゴヌクレオチド、及び
第５のＤＮＡ配列と第６のＤＮＡ配列とを含む第４のオリゴヌクレオチドであって、前記第５の配列は、前記第４の配列に相補的である、第４のオリゴヌクレオチド
を含み、
前記第２の配列は、前記第５の配列に相補的であるか、又は前記第６の配列に相補的である、流体反応チャンバ。
【請求項７２】
前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドが、蛍光部分を含む、請求項７１に記載の流体反応チャンバ。
【請求項７３】
前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドが、蛍光消光剤を含む、請求項７１に記載の流体反応チャンバ。
【請求項７４】
前記第２のＤＮＡ配列のそれぞれが同一である、請求項７１〜７３に記載の流体反応チャンバ。
【請求項７５】
前記第２のＤＮＡ配列のそれぞれが同一ではない、請求項７１〜７３に記載の流体反応チャンバ。
【請求項７６】
前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項７４に記載の流体反応チャンバ。
【請求項７７】
前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項７５に記載の流体反応チャンバ。
【請求項７８】
前記連結部分が、歪みアルキンを含むアルキン基、又はアジド基を含む、請求項７１に記載の流体反応チャンバ。
【請求項７９】
前記第１のＤＮＡ配列のそれぞれが、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項７１〜７８に記載の流体反応チャンバ。
【請求項８０】
前記第３のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項７１〜７９に記載の流体反応チャンバ。
【請求項８１】
前記第３のＤＮＡ配列のそれぞれが、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項８０に記載の流体反応チャンバ。
【請求項８２】
前記第５のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約２０ヌクレオチドの長さを有する、請求項７１に記載の流体反応チャンバ。
【請求項８３】
前記第４のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項８０に記載の流体反応チャンバ。
【請求項８４】
前記第６のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項７１に記載の流体反応チャンバ。
【請求項８５】
円形、楕円形、正方形、三角形、矩形、六角形、八角形、菱形又は台形である、請求項７１〜８４に記載の流体反応チャンバ。
【請求項８６】
前記流体反応チャンバが均一な温度ではなく、前記反応チャンバの最高温度領域が前記反応チャンバの最低温度領域より少なくとも１０℃高い、請求項７１〜８５に記載の流体反応チャンバ。
【請求項８７】
前記反応チャンバの前記最低温度領域が、約１０℃〜約５０℃である、請求項７１〜８６に記載の流体反応チャンバ。
【請求項８８】
前記反応チャンバの前記最高温度領域が、約５１℃〜約１００℃である、請求項７１〜８７に記載の流体反応チャンバ。
【請求項８９】
前記流体反応チャンバ内に配置された流体を更に含み、前記流体は、１つ以上のオリゴヌクレオチド及びハイブリダイゼーション緩衝液を含む、請求項７１〜８８に記載の流体反応チャンバ。
【請求項９０】
前記流体が、非特異的な核酸染色色素を更に含む、請求項８９に記載の流体反応チャンバ。
【請求項９１】
標的核酸を増幅する方法であって、
（ａ）請求項７１に記載の流体反応チャンバを提供する工程であって、前記流体反応チャンバは、第１及び第２の熱源と動作可能な関係にあり、前記第１及び第２の熱源は、環状チャンバに異なる第１及び第２の熱レベルを適用することができ、前記第１及び第２の熱レベルは同一ではない、工程と、
（ｂ）前記流体反応チャンバ内に、標的核酸配列を含む流体を導入する工程と、
（ｃ）第１及び第２の熱レベルを前記流体反応チャンバに適用する工程と
を含む、方法。
【請求項９２】
前記標的核酸の増幅を検出する、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドが、蛍光部分を含む、請求項９１〜９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記第１又は第２のオリゴヌクレオチドが、蛍光消光剤を含む、請求項９１〜９２に記載の方法。
【請求項９５】
前記第２のＤＮＡ配列のそれぞれが同一である、請求項９１〜９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記第２のＤＮＡ配列のそれぞれが同一ではない、請求項９１〜９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
前記複数の前記オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれが、前記表面上で空間的に離散した領域内に位置する、請求項９５に記載の方法。
【請求項９９】
前記連結部分が、歪みアルキンを含むアルキン基、又はアジド基を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項１００】
前記第１のＤＮＡ配列のそれぞれが、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項９１〜９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記第３のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項９１〜１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記第３のＤＮＡ配列のそれぞれが、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記第５のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約２０ヌクレオチドの長さを有する、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０４】
前記第４のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
前記第６のＤＮＡ配列のそれぞれが、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有する、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０６】
前記流体反応チャンバが、円形、楕円形、正方形、矩形、三角形、六角形、八角形、菱形又は台形である、請求項９１〜１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記流体反応チャンバが、均一な温度ではなく、前記反応チャンバの最高温度領域が前記反応チャンバの最低温度領域より少なくとも１０℃高い、請求項９１〜１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記反応チャンバの前記最低温度領域が、約１０℃〜約５０℃である、請求項９１〜１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記反応チャンバの前記最高温度領域が、約５１℃〜約１００℃である、請求項９１〜１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記流体が、非特異的な核酸染色色素を更に含む、請求項９１〜１０９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１６年３月２９日出願の米国特許仮出願第６２／３１４，９０９号に対する優先権を主張し、これらの全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
本開示は、科学的及び臨床的な研究並びに診断用途のための、特定の核酸配列の検出及び定量化のための新しい試薬、器具、及び方法を記載する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ほとんどの商用核酸（ＮＡ）アッセイは、分子又はシグナル増幅のために酵素の使用を必要とする。ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素は、高速かつ特異的であるように最適化されてきた。リソースが限られた条件での凍結乾燥酵素の再生は、コールドチェーンの必要性を低減させる。ＮＥＡＲ、ＬＡＭＰ及びＮＡＳＢＡなどの等温核酸増幅アッセイは、複雑な温度サイクル機器を用いることなく、ＤＮＡ／ＲＮＡプロファイリングを可能にする。これら多くの進歩にもかかわらず、所望の特性（例えば、高速、高忠実度、及び化学物質／インヒビターに対して堅牢）をすべて同時に取り込む酵素を設計する／進化させることが困難であるため、既存の核酸検出技術は未だ、病原体バイオマーカーの迅速なＰｏＣ（ポイントオブケア）検出に問題を抱えている。
【０００４】
マイクロアレイ、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、分岐状ＤＮＡデンドリマー（Ｐａｎｏｍｉｃｓ）、及び蛍光バーコード（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）を含む、多数の既存の核酸分析技術は、酵素フリーである。これらのアプローチにおいて、ＤＮＡ又はＲＮＡ標的分子は、化学量論的にリクルートするか又は限られた数の蛍光基に変換される。これは、単一の核酸分子でも無限に増幅され、任意の多数のアンプリコン分子を生産するＰＣＲとは異なる。この結果、生体サンプルに存在する少量のＤＮＡ又はＲＮＡ標的を検出及び分析するために必要な分子感度を得るため、これらのアプローチには高価かつ嵩高な機器が必要とされ、これらのアプローチの使用は、限られたリソース条件でのＰｏＣ用途に制限される。
【０００５】
核酸識別技術の別の群では、溶液ベースの酵素フリーのＤＮＡ増幅アプローチが採用される。ここで、一本鎖ＤＮＡ標的分子は、無制限の方法で予め組み立てられたＤＮＡ検出複合体から標的と同一配列のＤＮＡオリゴヌクレオチドを触媒によって遊離させることができる。この一群のアプローチに関して、臨床的に関連する検出の限界はまだ実証されていない。これらのシステムでは、標的配列の検出がない場合にアンプリコン分子の遊離を招くＤＮＡ「ブリージング」事象により、偽陽性の増幅が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
このように、本開示によると、
複数のオリゴヌクレオチド複合体を有する表面を含む装置であって、当該オリゴヌクレオチド複合体はそれぞれ、
第１のＤＮＡ配列と、第１のオリゴヌクレオチドを表面に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第１のオリゴヌクレオチド、及び
第２のＤＮＡ配列と第３のＤＮＡ配列とを含む第２のオリゴヌクレオチド
を含み、
第２のＤＮＡ配列は、第１のＤＮＡ配列に相補的であり、それにハイブリダイズされ、
かかる第２のＤＮＡオリゴヌクレオチドは、蛍光部分を含まず、表面に不可逆的に連結されない、装置
が提供される。
【０００７】
かかる第２のＤＮＡ配列のそれぞれは、同一であってもよく、同一でなくてもよい。複数の当該オリゴヌクレオチド複合体は、当該表面上で空間的に離散した領域内に位置してもよい。第１のオリゴヌクレオチドは、蛍光部分を含んでもよく、かかる第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、蛍光消光剤を含んでもよい。かかる空間的に離散した領域のそれぞれは、第４のＤＮＡ配列と第５のＤＮＡ配列とを含む第３のオリゴヌクレオチドを更に含み得、第４のＤＮＡ配列は、第３のＤＮＡ配列に相補的である。第３のオリゴヌクレオチドはそれぞれ、蛍光消光剤部分を含んでもよい。連結部分は、歪みアルキンを含むアルキン基、又はアジド基を含んでもよい。
【０００８】
第１のＤＮＡ配列のそれぞれは、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第３のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約８０ヌクレオチドの長さ、又は約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第５のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約２０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第４のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。
【０００９】
別の実施形態では、
流体反応チャンバであって、
第１の表面と、
第１の表面に接触しない第２の表面であって、かかる第１及び第２の表面が互いに対向する、第２の表面と、
第１の表面及び第２の表面と接触し、当該反応チャンバの外側境界を形成する、材料と、
第１の表面及び第２の表面と接触し、当該反応チャンバの内側境界を形成する、材料と
を含み、
第１の表面は、複数のオリゴヌクレオチド複合体を含み、当該オリゴヌクレオチド複合体はそれぞれ、
第１のＤＮＡ配列と、第１のオリゴヌクレオチドを表面に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第１のオリゴヌクレオチド、及び
第２のＤＮＡ配列と第３のＤＮＡ配列とを含む第２のオリゴヌクレオチド
を含み、
第２のＤＮＡ配列は、第１のＤＮＡ配列に相補的であり、それにハイブリダイズされ、
かかる第２のＤＮＡオリゴヌクレオチドは、第１の表面に不可逆的に連結されず、任意で蛍光部分を含まない、流体反応チャンバ
が提供される。
【００１０】
かかる第２のＤＮＡ配列のそれぞれは、同一であってもよく、同一でなくてもよい。かかる複数の当該オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれは、当該表面上で空間的に離散した領域内に位置してもよい。かかる第１のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、蛍光部分を含んでもよい。かかる第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、蛍光消光剤部分を含んでもよい。かかる空間的に離散した領域のそれぞれは、第４のＤＮＡ配列と第５のＤＮＡ配列とを含む第３のオリゴヌクレオチドを更に含んでもよく、第４のＤＮＡ配列は、第３のＤＮＡ配列に相補的である。第３のオリゴヌクレオチドはそれぞれ、蛍光消光剤部分を含んでもよい。連結部分は、歪みアルキンを含むアルキン基、又はアジド基を含んでもよい。流体反応チャンバは、サンプルを送達する第１のポートと、任意で、サンプルが第１のポートに誘導されたときに空気／流体が出て行くことを可能にする第２の別のポートとを有してもよい。
【００１１】
第１のＤＮＡ配列のそれぞれは、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第３のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第３のＤＮＡ配列のそれぞれは、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第５のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約２０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第４のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。チャンバの内側及び外側の境界を形成する第１及び第２の表面に接触する材料は、４０マイクロメートル（４０μｍ）〜２ミリメートル（２ｍｍ）の厚さを有してもよい。
【００１２】
流体反応チャンバは、円形、楕円形、正方形、矩形、三角形、六角形、八角形、菱形若しくは台形、又は本明細書に定義されているように環状であってもよい。流体反応チャンバは、均一な温度でなくてもよく、反応チャンバの最高温度領域は、反応チャンバの最低温度領域より少なくとも１０℃高い温度であってもよい。反応チャンバの最低温度領域は、約５０℃〜約７５℃であってもよい。反応チャンバの最高温度領域は、約８０℃〜約１００℃であってもよい。流体反応チャンバは、流体反応チャンバ内に配置された流体を更に含んでもよく、当該流体溶液は、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びＰＣＲ緩衝液を含む。
【００１３】
更に別の実施形態では、
標的核酸を増幅する方法であって、
（ａ）請求項１６に記載の流体反応チャンバを提供する工程であって、当該流体反応チャンバは、第１及び第２の熱源と動作可能な関係にあり、かかる第１及び第２の熱源は、環状チャンバに異なる第１及び第２の熱レベルを適用することができ、かかる第１及び第２の熱レベルは同一ではない、工程と、
（ｂ）当該流体反応チャンバ内に標的核酸配列、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）緩衝液を含む流体を導入する工程と、
（ｃ）第１及び第２の熱レベルを当該流体反応チャンバに適用する工程と
を含む、方法が提供される。この方法は、かかる標的核酸の増幅を検出する工程を更に含んでもよい。
【００１４】
かかる第２のＤＮＡ配列のそれぞれは、同一であってもよく、同一でなくてもよい。複数の当該オリゴヌクレオチド複合体は、当該表面上で空間的に離散した領域内に位置してもよい。かかる第１のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、蛍光部分を含んでもよく、かかる第２のオリゴヌクレオチドのそれぞれは、蛍光消光剤部分を含んでもよい。かかる空間的に離散した領域のそれぞれは、第４のＤＮＡ配列と第５のＤＮＡ配列とを含む第３のオリゴヌクレオチドを更に含み得、第４のＤＮＡ配列は、第３のＤＮＡ配列に相補的である。第３のオリゴヌクレオチドは、それぞれ蛍光消光剤部分を含んでもよい。連結部分は、歪みアルキンを含むアルキン基、又はアジド基を含んでもよい。
【００１５】
第１のＤＮＡ配列は、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第３のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第３のＤＮＡ配列のそれぞれは、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第５のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約２０ヌクレオチドの長さを有する。流体反応チャンバは、円形、楕円形、正方形、三角形、矩形、六角形、八角形、菱形又は台形であってもよい。
【００１６】
流体反応チャンバは、均一な温度でなくてもよく、反応チャンバの最高温度領域は、反応チャンバの最低温度領域より少なくとも１０℃高い温度であってもよい。反応チャンバの最低温度領域は、約５０℃〜約７５℃であってもよい。反応チャンバの最高温度領域は、約８０℃〜約１００℃であってもよい。
【００１７】
なお更なる実施形態では、
第１の表面領域及び第２の表面領域を含む装置であって、
第１の表面領域は、
第１のＤＮＡ配列と、第１のオリゴヌクレオチドを第１の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第１のオリゴヌクレオチド、及び
第２のＤＮＡ配列と第３のＤＮＡ配列とを含む第２のオリゴヌクレオチドであって、第２の配列は、第１の配列に相補的である、第２のオリゴヌクレオチド
を含み、
第２の表面領域は、
第４のＤＮＡ配列と、第３のオリゴヌクレオチドを第２の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第３のオリゴヌクレオチドを含み、
第４の配列は、第２の配列、第３の配列、又は少なくとも第２の配列の６つの連続するヌクレオチドと第３の配列の６つの連続するヌクレオチドとの組み合わせに相補的である、装置、
あるいは、
第１の表面領域及び第２の表面領域を含む装置であって、
第１の表面領域は、
第１のＤＮＡ配列と、第１のオリゴヌクレオチドを第１の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第１のオリゴヌクレオチド、及び
第２のＤＮＡ配列と第３のＤＮＡ配列とを含む第２のオリゴヌクレオチドであって、第２の配列は、第１の配列に相補的である、第２のオリゴヌクレオチド
を含み、
第２の表面領域は、
第４のＤＮＡ配列と、第３のオリゴヌクレオチドを第２の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第３のオリゴヌクレオチド、及び
第５のＤＮＡ配列と第６のＤＮＡ配列とを含む第４のオリゴヌクレオチドであって、第５の配列は、第４の配列に相補的である、第４のオリゴヌクレオチド
を含み、
第２の配列は、第５の配列に相補的であるか、又は第６の配列に相補的である、装置
が提供される。
【００１８】
第１又は第２のオリゴヌクレオチドは、蛍光部分を含んでもよく、第１又は第２のオリゴヌクレオチドは、蛍光消光剤を含んでもよい。第２のＤＮＡ配列は、同一であってもよく、同一でなくてもよい。複数の当該オリゴヌクレオチド複合体は、当該表面上で空間的に離散した領域内に位置してもよい。連結部分は、歪みアルキンを含むアルキン基、又はアジド基を含んでもよい。流体反応チャンバは、サンプルを送達する第１のポートと、任意で、サンプルが第１のポートに誘導されたときに空気／流体が出て行くことを可能にする第２の別のポートとを有してもよい。
【００１９】
第１のＤＮＡ配列のそれぞれは、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第３のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第３のＤＮＡ配列のそれぞれは、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第５のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約２０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第４のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第６のＤＮＡ配列のそれぞれは、５〜８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。
【００２０】
なお更なる実施形態では、
流体反応チャンバであって、
第１の表面と、
第１の表面に接触しない第２の表面であって、かかる第１及び第２の表面が互いに対向する、第２の表面と、
第１の表面及び第２の表面と接触し、当該反応チャンバの外側境界を形成する、材料と、
第１の表面及び第２の表面と接触し、当該反応チャンバの内側境界を形成する、材料と
を含み、
（ａ）第１の表面は、
第１のＤＮＡ配列と、第１のオリゴヌクレオチドを第１の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第１のオリゴヌクレオチド、及び
第２のＤＮＡ配列と第３のＤＮＡ配列とを含む第２のオリゴヌクレオチドであって、第２の配列は、第１の配列に相補的である、第２のオリゴヌクレオチド
を含み、
第２の表面領域は、
第４のＤＮＡ配列と、第３のオリゴヌクレオチドを第２の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第３のオリゴヌクレオチドを含み、
第４の配列は、第２の配列、第３の配列、又は少なくとも第２の配列の６つの連続するヌクレオチド及び第３の配列の６つの連続するヌクレオチドの組み合わせに相補的であるか、あるいは、
（ｂ）第１の表面領域は、
第１のＤＮＡ配列と、第１のオリゴヌクレオチドを第１の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第１のオリゴヌクレオチド、及び
第２のＤＮＡ配列と第３のＤＮＡ配列とを含む第２のオリゴヌクレオチドであって、第２の配列は、第１の配列に相補的である、第２のオリゴヌクレオチド
を含み、
第２の表面領域は、
第４のＤＮＡ配列と、第３のオリゴヌクレオチドを第２の表面領域に不可逆的に連結するための連結部分とを含む、第３のオリゴヌクレオチド、及び
第５のＤＮＡ配列と第６のＤＮＡ配列とを含む第４のオリゴヌクレオチドであって、第５の配列は、第４の配列に相補的である、第４のオリゴヌクレオチド
を含み、
第２の配列は、第５の配列に相補的であるか、又は第６の配列に相補的である、流体反応チャンバが提供される。
【００２１】
第１又は第２のオリゴヌクレオチドは、蛍光部分を含んでもよく、第１又は第２のオリゴヌクレオチドは、蛍光消光剤を含んでもよい。かかる第２のＤＮＡ配列のそれぞれは、同一であってもよく、同一でなくてもよい。かかる複数の当該オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれは、当該表面上で空間的に離散した領域内に位置してもよい。連結部分は、歪みアルキンを含むアルキン基、又はアジド基を含んでもよい。流体反応チャンバは、サンプルを送達する第１のポートと、任意で、サンプルが第１のポートに誘導されたときに空気／流体が出て行くことを可能にする第２の別のポートとを有してもよい。
【００２２】
第１のＤＮＡ配列のそれぞれは、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第３のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第３のＤＮＡ配列のそれぞれは、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第５のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約２０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第４のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第６のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。
【００２３】
流体反応チャンバは、円形、楕円形、正方形、三角形、矩形、六角形、八角形、菱形若しくは台形、又は本明細書に定義されているように環状であってもよい。流体反応チャンバは、均一な温度でなくてもよく、反応チャンバの最高温度領域は、反応チャンバの最低温度領域より少なくとも１０℃高い温度であってもよい。反応チャンバの最低温度領域は、約１０℃〜約５０℃であってもよい。反応チャンバの最高温度領域は、約５１℃〜約１００℃であってもよい。流体反応チャンバは、流体反応チャンバ内に配置された流体を更に含んでもよく、当該流体は、１つ以上のオリゴヌクレオチド及びハイブリダイゼーション緩衝液を含み、流体は、非特異的核酸染色色素を更に含んでもよい。
【００２４】
更に別の実施形態は、
標的核酸を増幅する方法であって、
（ａ）請求項７１に記載の流体反応チャンバを提供する工程であって、当該流体反応チャンバは、第１及び第２の熱源と動作可能な関係にあり、かかる第１及び第２の熱源は、環状チャンバに異なる第１及び第２の熱レベルを適用することができ、かかる第１及び第２の熱レベルは同一ではない、工程と、
（ｂ）当該流体反応チャンバ内に標的核酸配列を含む流体を導入する工程と、
（ｃ）第１及び第２の熱レベルを当該流体反応チャンバに適用する工程と
を含む、方法を含む。
【００２５】
この方法は、かかる標的核酸の増幅を検出することを更に含んでもよい。第１又は第２のオリゴヌクレオチドは、蛍光部分を含んでもよく、第１又は第２のオリゴヌクレオチドは、蛍光消光剤を含んでもよい。かかる第２のＤＮＡ配列のそれぞれは、同一であってもよく、同一でなくてもよい。かかる複数の当該オリゴヌクレオチド複合体のそれぞれは、当該表面上で空間的に離散した領域内に位置する。連結部分は、歪みアルキンを含むアルキン基、又はアジド基を含んでもよい。
【００２６】
第１のＤＮＡ配列のそれぞれは、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第３のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第３のＤＮＡ配列のそれぞれは、約１５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第５のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約２０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第４のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。第６のＤＮＡ配列のそれぞれは、約５〜約８０ヌクレオチドの長さを有してもよい。
【００２７】
流体反応チャンバは、円形、楕円形、正方形、矩形、三角形、六角形、八角形、菱形若しくは台形、又は本明細書に定義されているように環状であってもよい。流体反応チャンバは、均一な温度でなくてもよく、反応チャンバの最高温度領域は、反応チャンバの最低温度領域より少なくとも１０℃高い温度であってもよい。反応チャンバの最低温度領域は、約１０℃〜約５０℃であってもよい。反応チャンバの最高温度領域は、約５１℃〜約１００℃であってもよい。流体は、非特異的核酸染色色素を更に含む。
【００２８】
別の実施形態は、
反応チャンバであって、
（ａ）第１の領域及び第２の領域であって、第１のヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドは、第１の表面領域に官能化され、第２のヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドは、第２の表面領域に官能化され、第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列は同一でない、第１の領域及び第２の領域と、
（ｂ）非均一温度でＤＮＡハイブリダイゼーションに適応できる緩衝液であって、第１の表面領域及び第２の表面領域に接触する、緩衝液と、
（ｃ）第３のヌクレオチド配列を含む第３のオリゴヌクレオチドであって、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる、第３のオリゴヌクレオチドと、
（ｄ）第１の温度帯及び第２の温度帯であって、第１の温度帯は、第２の温度帯の温度より少なくとも１０℃高い温度を有する、第１の温度帯及び第２の温度帯と
を含む、反応チャンバを含む、システムを含む。
【００２９】
第１の表面領域は、第１の表面上に位置してもよく、第２の表面領域は、第１の表面上に位置する。第１の表面領域は、第１の表面上に位置してもよく、第２の表面領域は、第２の表面上に位置し、第１の表面と第２の表面とは異なる表面である。第１のヌクレオチド配列は、第３のヌクレオチド配列に相補的ではない第１のヌクレオチド領域を含んでもよい。第３のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列に相補的ではない第２のヌクレオチド領域を含んでもよい。
【００３０】
緩衝液は、少なくとも６０質量％の水と、少なくとも１ｍＭの濃度のカオチンとを含んでもよい。第１のオリゴヌクレオチドの長さ及び第２のオリゴヌクレオチドの長さは、５ヌクレオチド〜２０，０００ヌクレオチドであってもよい。第１のオリゴヌクレオチド及び第２のヌクレオチドの長さは、５ヌクレオチド〜２００ヌクレオチドであってもよい。第３のオリゴヌクレオチドの長さは、５ヌクレオチド〜２０，０００ヌクレオチドであってもよい。第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド及び第３のオリゴヌクレオチドは、同一であっても異なっていてもよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチドアナログ及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される核酸を含んでもよい。
【００３１】
ヌクレオチドアナログは、ＬＮＡ、ＰＮＡ、モルホリンオリゴヌクレオチド、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されてもよい。第１のオリゴヌクレオチド、第２のオリゴヌクレオチド及び第３のオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、化学的部分で官能化されてもよく、化学的部分は、オリゴヌクレオチドの検出を可能にする。化学的部分は、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、ＨＥＸ、有機蛍光色素分子、量子ドット、ナノ粒子、メチレンブルー、電気化学的活性分子、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されてもよい。
【００３２】
緩衝液は、検出可能な分子を含んでもよく、検出可能な分子は、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ色素、Ｓｙｔｏ色素及びＥｖａＧｒｅｅｎ色素からなる群から選択される検出可能な分子のように、オリゴヌクレオチドに非不可逆的に結合しているとき、溶液中で自由であるときとは異なる単位のシグナルを呈する。第１の表面及び第２の表面は、ガラス、石英、プラスチック、ポリマー、金属、複合材料、及び表面自己組織化単分子層からなる群から選択される同一又は別個のものであってもよい。ポリマーは、ＰＤＭＳであってもよい。
【００３３】
第１の表面領域は、緩衝液の最高温度より１０℃低い温度を含んでもよく、第２の表面領域は、緩衝液の最高温度よりも１０℃低い温度を含んでもよい。システムは、第１の表面領域及び第２の表面領域に接触する少なくとも１つの加熱／冷却素子を更に含んでもよい。少なくとも１つの加熱／冷却素子は、熱板、加熱ファン、赤外線ヒーター、及び水浴からなる群から選択されてもよい。熱板は、熱抵抗加熱器及びペルチェ素子からなる群から選択されてもよい。システムは、酵素が核酸テンプレートのテンプレート指向拡張を容易にするように、テンプレート指向方法で核酸を修飾する酵素を更に含んでもよい。
【００３４】
核酸標的の酵素フリー増幅及び検出の方法であって、
（ａ）サンプルを反応チャンバ内の組成物と接触させる工程であって、組成物は、
ＤＮＡハイブリダイゼーションに適応可能な緩衝液と、
第１の表面領域及び第２の表面領域であって、緩衝液は、第１の表面領域及び第２の表面領域に接触する、第１の表面領域及び第２の表面領域と、
第１のヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドであって、第１の表面領域に官能化される、第１のオリゴヌクレオチドと、
第２のヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドであって、第２の表面領域に官能化される、第２のオリゴヌクレオチドと、
第３のヌクレオチド配列を含む第３のオリゴヌクレオチドであって、第１のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる、第３のオリゴヌクレオチドと
を含み、
第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列は同一ではなく、第３のヌクレオチドは、第１のヌクレオチド配列に相補的ではない第１のヌクレオチド領域を含む、工程と、
（ｂ）反応チャンバの一部を別個に加熱する工程であって、チャンバの領域の最高温度は、チャンバの最低温度より少なくとも１０℃高い、工程と、
（ｃ）電位増幅を検出する工程と
を含む、方法。
【００３５】
反応チャンバは、ガラス、石英、プラスチック、ポリマー、金属、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの材料を含んでもよい。ポリマーは、ＰＤＭＳであってもよい。チャンバの領域の最高温度は、６０℃〜１００℃であってもよい。チャンバの最低温度は、２０℃〜６０℃であってもよい。第１の表面領域及び第２の表面領域は、チャンバの領域の最高温度の１０℃以内までは加熱され得ない。
【００３６】
組成物は、反応チャンバ内に局在してもよく、第１の表面領域は、第１の表面上に位置し、第２の表面領域は、第１の表面上に位置する。組成物は、反応チャンバ内に局在してもよく、第１の表面領域は、第１の表面上に位置してもよく、第２の表面領域は、第２の表面上に位置してもよく、第１の表面及び第２の表面は、異なる表面である。電位増幅を検出することは、フォトダイオード、光電子増倍管、蛍光顕微鏡、ＣＣＤカメラ、及び任意の他の光検出装置からなる群から選択される検出装置を介した、蛍光変化の光検出を更に含んでもよい。電位増幅を検出することは、電気化学ポテンショスタット／ガルバノスタットを介した電気化学的検出を更に含んでもよい。電位増幅を検出することは、水晶振動子マイクロバランス技術を使用して第１の表面領域の質量を測定することを更に含んでもよい。
【００３７】
なお更なる実施形態では、
酵素依存の増幅及び核酸標的の検出の方法であって、
（ａ）サンプルを反応チャンバ内の組成物に接触させる工程であって、組成物は、
ＤＮＡハイブリダイゼーションに適応可能な緩衝液と、
表面領域であって、緩衝液は表面領域に接触する、表面領域と、
第１のヌクレオチド配列を含む第１のオリゴヌクレオチドであって、第１のオリゴヌクレオチドは、表面領域に官能化される、第１のオリゴヌクレオチドと、
第２のヌクレオチド配列を含む第２のオリゴヌクレオチドと、温度指向の方法で核酸を修飾する酵素とを含み、第２のヌクレオチド配列は、第１のヌクレオチド配列に相補的でないヌクレオチド領域を含む、工程と、
（ｂ）反応チャンバの一部を別個に加熱する工程であって、チャンバの領域の最高温度は、チャンバの最低温度より少なくとも１０℃高い、工程と、
（ｃ）電位増幅を検出する工程と
を含む、方法が提供される。
【００３８】
第１のオリゴヌクレオチドは、第２のヌクレオチド配列に相補的ではない第２のヌクレオチド領域を含んでもよい。酵素は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、エンドヌクレアーゼ、及びエキソヌクレアーゼからなる群から選択されてもよい。反応チャンバは、ガラス、石英、プラスチック、ポリマー、金属、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの材料を含んでもよい。ポリマーは、ＰＤＭＳであってもよい。
【００３９】
チャンバの領域の最高温度は、８０℃〜１００℃であってもよい。チャンバの最低温度は、２０℃〜８０℃であってもよい。表面領域は、チャンバの領域の最高温度の１０℃以内までは加熱され得ない。電位増幅を検出することは、フォトダイオード、光電子増倍管、蛍光顕微鏡、ＣＣＤカメラ、及び任意の他の光検出装置からなる群から選択される検出装置を介した、蛍光変化の光検出を更に含んでもよい。電位増幅を検出することは、電気化学ポテンショスタット／ガルバノスタットを介した電気化学的検出を更に含んでもよい。電位増幅を検出することは、水晶振動子マイクロバランス技術を使用して第１の表面領域の質量を測定することを更に含んでもよい。
【００４０】
本開示の一実施形態では、表面オリゴヌクレオチド官能化は、限定するものではないが、共有結合固定、静電相互作用、又はビオチンとアビジン（又はその類似物）などの非共有結合固定を含む、様々な化学的及び物理的方法によって実施され得る。
【００４１】
本開示の一実施形態では、検出標的分子は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの混合物であってもよい。
【００４２】
本開示の一実施形態では、アンプリコン検出及び反応モニタリングは、限定するものではないが、蛍光（表面プラズモン共鳴、ＳＰＲを含む）、紫外線吸光度、電気化学的検出（ｐＨ変化及び電荷移動を含む）、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）を含む方法による。
【００４３】
本開示の一実施形態では、提案されたアプローチは、薬剤耐性又は病気の予後を示し得る単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）を含む、核酸配列変異体の識別に使用され得る。
【００４４】
本開示の一実施形態で、提案されたアプローチは、特異的な生体サンプル中の１つ、いくつか、又は多数の標的分子の定量のために使用され得る。
【００４５】
本明細書で使用するとき、用語「環状」は、上述のように、チャンバの形状を指すのに使用することができ、円形、楕円形又は円板状というその通常の意味を有し得る。しかし、環状はまた、このコンテキストでは、チャンバが終わり及び始まりのない連続回路を構成している限り、他の規則的又は不規則的な形状を有するものと解釈され得る。
【００４６】
本明細書で使用するとき、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味し得る。本明細書の特許請求の範囲で使用するとき、単語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と共に使用する場合、１つ又は２つ以上を意味し得る。
【００４７】
本開示は、代替のみ及び「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を指す定義を支持しているが、特許請求の範囲内の用語「又は（ｏｒ）」の使用は、代替のみを指すことを明示的に示していないか、又は代替が相互に排他的でない限り、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味するために使用される。本明細書で使用するとき、「別の（ａｎｏｔｈｅｒ）」は、少なくとも２番目以降を意味し得る。
【００４８】
本出願全体を通して、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、値を決定するために採用されている方法に関しては、値が装置に固有の誤差変動を含むこと、又は研究対象間に存在することを示すために使用される。このような固有の変動は、記載される値の±１０％の変動であってもよい。
【００４９】
本出願全体を通して、用語「不可逆的な連結」は、意図した用途の通常の状況下で安定している化学的相互作用を示すために使用される。いくつかの実施形態では、不可逆的な連結は、アジドアルキンクリック化学などによる共有結合を指す場合があり、他の実施形態では、ビオチンアビジン相互作用又は他の非共有結合の永続的な相互作用を指す場合がある。
【００５０】
本出願全体を通して、用語「ＰＣＲ緩衝液」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介するＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅に適合する、塩分及び化学組成を有する水溶液を示すために使用される。緩衝液は、ＤＮＡポリメラーゼ自体、プライマー及び／又はｄＮＴＰと共に使用され得る。
【００５１】
本出願全体を通して、用語「ハイブリダイゼーション緩衝液」は、ＤＮＡハイブリダイゼーション及び相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチドによる安定したＤＮＡ二重鎖の形成に適合する、塩分及び化学組成を有する水溶液を示すために使用される。すべてのＰＣＲ緩衝液は、ハイブリダイゼーション緩衝液とみなすことができるが、ハイブリダイゼーション緩衝液をＰＣＲ緩衝液とみなすことはできない。
【００５２】
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかしながら、詳細な説明及び具体的な例は、本発明の好ましい実施形態を示すが、本開示の趣旨及び範囲内の様々な変化及び修正がこの詳細な説明から当業者には明らかとなるため、例示目的のみで付与されることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の態様を更に示すために含まれる。本開示は、これらの図面のうちの１つ以上を、本明細に提示された特異的な実施形態の詳細な説明と併せて参照することによってよりよく理解され得る。
（図１）  異なる温度でヒーターに垂直に装着された流体チップの一実施形態の概略図を示す。流体チップは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを官能化するための表面を有する反応チャンバを含む。いくつかの実施形態では、このチップは、核酸の多重ＰＣＲに基づく検出を行うために使用される。
（図２）  流体チップが異なる温度でヒーターに垂直に装着されるシステムの一実施形態を示す。水平に装着された光源は、チップに官能化されたＤＮＡ上の蛍光部分を励起し、蛍光シグナルは、示されている検出器を介して定量化される。
（図３）  流体チップ（左）、ヒーターに装着されたチップ（中間）、及びヒーターに装着された矩形のチャンバ付きチップ（右）のカメラ写真を示す。
（図４）  検出プローブの一部を形成するためのＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いたガラススライドの官能化の化学的アプローチの一例を示す。プロセスは、アジド−ＰＥＧ−アミン（１１−アジド−３，６，９−トリオキサウンデカン−１−アミン）によるＰＤＩＴＣ（ｐ−フェニレン−ジイソシアネート）活性化ガラスと、それに続く、親水性ＰＥＧリンカーを介したオリゴヌクレオチドの付着をもたらす、銅触媒を用いるアルキンとアジドとの環化付加によるアルキン官能化オリゴヌクレオチドとの共役と、の２段階反応である。官能化表面の親水性は、標的ＤＮＡ、プライマー及び酵素などの反応成分の非特異的吸着を防止する。歪みシクロアルキンによって修飾されたオリゴヌクレオチドを有するアジド官能化表面の銅フリー反応はまた、表面へのオリゴヌクレオチドの安定した非常に特異的な共有結合をもたらす。
（図５）  官能化されたプローブ構造の一例を示す。表面に官能化されたオリゴヌクレオチドは、蛍光色素分子で標識化され、表面官能化プローブにハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは、消光剤で標識化される。検出標的が、消光剤で標識化されたオリゴヌクレオチドを表面から移動させると、表面の蛍光強度が増加する。下部パネルは、標的導入の前後の蛍光顕微鏡画像を示しており、ここでスポット径は１ｍｍである。オリゴヌクレオチドは、以下のとおりであった。
2019509751.tif 000002
（図６）  対流が適用されたときの、流体チップ内のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）テンプレートのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の概略図を示し、配列（１０）はフォワードプライマー、配列（１１）はリバースプライマーを示す。フォワード鎖中のドメイン１０−１５−１６−１７と、リバース鎖中のドメイン１１−１２−１３−１４とを含む、二本鎖アンプリコンは、９５℃の高温帯で変性され、次いで対流によって６０℃帯に搬送され、そこで消光剤で標識化されたオリゴヌクレオチドを変位させて、対応するスポット内に増強蛍光を発生させることができる。
（図７）  対流チップ内でのＰＣＲ増幅の結果を示す。左パネルは、増幅産物のアガロースゲル電気泳動を示す。レーン１は、対流チップにおいて３０分増幅された１０ｎｇのＮＡ１８５６２  ｇＤＮＡテンプレートの増幅産物を示す。プライマー濃度は、フォワードプライマーの場合は６００ｎＭ、リバースプライマーの場合は２００ｎＭである。レーン２は、プライマー、ポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、及びプローブスポットによる、ただしｇＤＮＡインプットのない、陰性対照を示す。ラダーは、５０ｂｐラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を基準とする。右パネルは、増幅反応を介したスポット強度の蛍光時間経過を示す。この実験のプローブ及びプライマーは、標的ｒｓ７５１７８３３（図２０を参照のこと）用に設計された。
（図８）  流体チップ内の対流を示す。左上パネルは、チップにわたって温度勾配のない（いずれのヒーターも６０℃）、蛍光追跡ビーズの蛍光画像を示す。右上パネルは、温度勾配が適用されたときの（左ヒーター９５℃、右ヒーター６０℃）、蛍光追跡ビーズのタイムラプス（２秒）蛍光画像を示す。下部パネルは、チャンバ厚に基づいて観測された平均対流流速を要約する。
（図９）  流体チップ内の複数のアンプリコンのアレイに基づいた読み出しの概略図を示す。右パネルは、２４個のプリントスポットを有するチップの蛍光画像を示す。Ｍのマークが付いたスポットは、消光剤で標識化されたオリゴヌクレオチドが欠如している陽性対照スポットである。他のスポットはそれぞれ、特定のアンプリコン配列に特異的である。
（図１０）  対流ＰＣＲの前後における流体チップのプローブアレイ領域の蛍光画像を示す。スポット２、３、及び４のプローブに対応するアンプリコンを生成するプライマーは、１０ｎｇのｇＤＮＡテンプレートと共に導入された（それぞれのフォワードプライマーは６００ｎＭ、それぞれのリバースプライマーは２００ｎＭ）。スポット１４の高い蛍光性は、意図的ではなく、不完全に官能化又はハイブリダイズされたＤＮＡプローブ分子に起因するものであり得る。
（図１１）  対流流体チップにおける９重ＰＣＲ増幅の時間経過蛍光を示す。それぞれのスポットの蛍光強度は、背景蛍光及びマーカースポットＭの蛍光強度に基づいて個別に定量化され、正規化された。それぞれのフォワードプライマー濃度は２００ｎＭであり、それぞれのリバースプライマー濃度は１００ｎＭであり、ｇＤＮＡのインプットは１０ｎｇである。
（図１２−１）  ヒト、マウス、及びラットＤＮＡのプライマーに対応する対流流体チップにおける３重ＰＣＲ増幅を示す。ここで、一列内のすべてのスポットは、同一のアンプリコンについての同一の配列同一性及びレポートを有する。上部の列は、陽性対照プローブである。反応チャンバでは、それぞれのフォワードプライマーは６００ｎＭ、それぞれのリバースプライマーは２００ｎＭ、ｇＤＮＡテンプレートは１０ｎｇであった。実験に使用された配列は、以下のとおりである。
プライマー
2019509751.tif 000003
アーム
2019509751.tif 000004
消光剤
2019509751.tif 000005
アンカー
2019509751.tif 000006
（図１２−２）  ヒト、マウス、及びラットＤＮＡのプライマーに対応する対流流体チップにおける３重ＰＣＲ増幅を示す。ここで、一列内のすべてのスポットは、同一のアンプリコンについての同一の配列同一性及びレポートを有する。上部の列は、陽性対照プローブである。反応チャンバでは、それぞれのフォワードプライマーは６００ｎＭ、それぞれのリバースプライマーは２００ｎＭ、ｇＤＮＡテンプレートは１０ｎｇであった。実験に使用された配列は、以下のとおりである。
プライマー
2019509751.tif 000007
アーム
2019509751.tif 000008
消光剤
2019509751.tif 000009
アンカー
2019509751.tif 000010
（図１３Ａ）  ２つの表面領域を有する反応チャンバの概略図を示し、それぞれ異なるＤＮＡオリゴヌクレオチド試薬で官能化されている。図１とは異なり、オリゴヌクレオチド試薬は、配列非依存ではなく、むしろ酵素フリー増幅用に合理的に設計されている。
（図１３Ｂ）  ２つの表面領域の２つの可能な実施形態を示しており、２つの表面領域は異なる表面上にあるか、又は同一表面上であるが直接相互作用を防止するために遠位に位置しているかのいずれかである。
（図１４Ａ−１）  第６の配列（６）及び第７の配列（７）を担持する標的核酸配列の線形増幅の機構を示す。標的核酸配列は、第２の配列（２）及び第３の配列（３）を担持する複数のオリゴヌクレオチドを表面領域１から表面領域２へ触媒的に移送する。高温帯内の二本鎖ＤＮＡ分子（２３：６７）の自発性解離は、迅速な代謝回転を可能にするために重要である。
（図１４Ａ−２）  第６の配列（６）及び第７の配列（７）を担持する標的核酸配列の線形増幅の機構を示す。標的核酸配列は、第２の配列（２）及び第３の配列（３）を担持する複数のオリゴヌクレオチドを表面領域１から表面領域２へ触媒的に移送する。高温帯内の二本鎖ＤＮＡ分子（２３：６７）の自発性解離は、迅速な代謝回転を可能にするために重要である。
（図１４Ｂ）  図１４Ａに記載のプロセスの正味の反応、並びにリアルタイム読み出しを可能にする蛍光標識化戦略を示す。
（図１４Ｃ）  反転した５’／３’配向による代替の実施例を示す（文献内の慣例として、半分の矢印頭部は３’の端部を示す）。
（図１５−１）  標的核酸配列が表面結合オリゴヌクレオチドの化学量論的再配列を誘導する、対照実験の機構を示す。
（図１５−２）  標的核酸配列が表面結合オリゴヌクレオチドの化学量論的再配列を誘導する、対照実験の機構を示す。
（図１６）  標的核酸の様々な濃度が導入されたときの、表面領域１の時間経過蛍光を示す。線形増幅チップ内の蛍光は、化学量論的な変換チップ内よりも迅速に減少し、酵素フリーのＤＮＡ増幅の機構を支持する。
（図１７−１）  標的核酸配列の指数関数的増幅の機構を示す。
（図１７−２）  標的核酸配列の指数関数的増幅の機構を示す。
（図１８）  ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ又はＥｖａＧｒｅｅｎなどの介在色素の使用による酵素フリー増幅の報告の視覚的表現を示す。表面領域１の蛍光強度は、反応の過程で減少し、表面領域２の蛍光強度は増加する。
（図１９）  蛍光色素分子官能化オリゴヌクレオチドの使用による酵素フリー増幅の報告の視覚的表現を示す。表面領域１の蛍光強度は、反応の過程で増加し、表面領域２の蛍光強度は、反応の過程を通して暗いままとなる。
（図２０−１）  ＰＣＲ増幅／検出に使用されるプライマー及びプローブ（アンカー＋アーム＋消光剤）のリストを示す。
（図２０−２）  ＰＣＲ増幅／検出に使用されるプライマー及びプローブ（アンカー＋アーム＋消光剤）のリストを示す。
（図２０−３）  ＰＣＲ増幅／検出に使用されるプライマー及びプローブ（アンカー＋アーム＋消光剤）のリストを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
詳細な説明
ここで、本発明者らは、ＤＮＡ増幅アッセイのための装置、システム、及び方法を提示する。本開示は、偽陽性に起因する意図しない分子事象を防止するために、試薬の固相分離を採用し、二本鎖アンプリコンの自発性解離を可能にするために対流循環を使用する。本発明と比較した３つの関連する従来技術及びそれらの制限事項を以下に記載する。
【００５５】
１．対流ＰＣＲ
液体は、非均一な温度に保持され、ある体積に閉じ込められると、レイリー・ベナール（Ｒａｙｌｅｉｇｈ−Ｂｅｎａｒｄ）対流［１］として知られるプロセスを介して循環する。レイリー・ベナール対流は、ＰＣＲに必要な温度サイクル（対流ＰＣＲ、ｃｆ−ＰＣＲ）を提供する低コスト装置を生成するための分子診断に使用されてきた［２、米国特許第６，５８６，２３３（Ｂ２）号、米国特許第８，７３５，１０３（Ｂ２）号、米国特許第８，１８７，８１３（Ｂ２）号］。ｃｆ−ＰＣＲは、高いエネルギー消費の熱サイクル器具を必要とせず、およそ９５℃の高温及びおよそ６０℃の低温（アニーリング／伸張温度）で維持される静的温度勾配のみを必要とする。
【００５６】
ｃｆ−ＰＣＲは、特異的なＤＮＡ配列の一重［３〜５、米国特許第８，１８７，８１３（Ｂ２）号］及び多重検出［６］の両方に関して実証されている。多重アプローチでは、エンドポイント電気泳動結果検査を利用した。ｃｆ−ＰＣＲは、従来のｑＰＣＲアッセイの温度均一性に欠けているため、単一ヌクレオチド変異体（ＳＮＶ）の検出又はプロファイリングの用途などの高い配列選択性を必要とする用途においてはｃｆ−ＰＣＲは難航しており、そのため、ＳＮＶに特異的なｃｆ−ＰＣＲはまだ示されていない。ｃｆ−ＰＣＲのリアルタイム検出は、非特異的蛍光色素（ＳＹＢＲグリーンＩ）検出法［７］を採用する溶液相のみで示されている。このアプローチは、ｃｆ−ＰＣＲが多重設定に使用されることを制限する。同様に、５’−ヌクレアーゼアッセイ化学又はハイブリダイゼーションプローブなどの配列に特異的なリアルタイム検出の適用は、蛍光色素分子スペクトルの重なりのため、５〜６個以下の標的を同時に検出することを可能にする。本開示は、後続の分析のための開管（ｏｐｅｎ−ｔｕｂｅ）工程を必要とせずに空間的に分解された多重読み出しを提供する点で、ｃｆ−ＰＣＲと差別化される。加えて、本開示の酵素フリーの実施形態では、増幅に酵素を必要としない。
【００５７】
２．マイクロアレイ
マイクロアレイ技術は、生体サンプルの多重スクリーニングの主要テクニックの１つである。複数のプローブ配列は、表面に官能化され、特定のスポットの蛍光シグナルは、対応する配列の定量的読み出しとなる。この技術は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物及び細胞などの様々なタイプの生体分析物の検出の実証に成功してきた［８〜１２］。マイクロアレイ技術の適用は、核酸実験の分野において最も広範な使用法を見出した。マイクロアレイ技術は、全ゲノムハイブリダイゼーション、新しい配列決定、再配列決定、比較ゲノミクス、トランスクリプトームハイブリダイゼーション又は一塩基変異の識別［１３〜１５］のためのＮＡマイクロアレイの適用を示してきた。上記ＮＡの適用例はいずれも、ハイブリダイゼーション用に大量のＮＡ標的を必要とし、その結果、マイクロアレイは典型的に、ＰＣＲ増幅産物に対する最終読み出しとして使用される。マイクロアレイの読み出しは典型的に遅く、夜通しのハイブリダイゼーションを必要とし、また、開管プロセスによるアンプリコン汚染の危険を伴う。
【００５８】
３．トーホールドプローブ及び酵素フリー増幅
トーホールド媒介性の鎖置換反応［１９〜２１］は、酵素が存在しないときに生じる競合ハイブリダイゼーションのプロセスであり、本開示に関連する。トーホールド媒介性の鎖置換を使用して、均質な溶液中のＤＮＡ及びＲＮＡ分析物配列の酵素フリー増幅が実証されてきた［２２〜２７］（米国特許第８，０４３８１０（Ｂ２）号、米国特許第８，１１０，３５３（Ｂ２）号）。本開示の酵素フリー増幅の実施形態は、熱対流を使用して、二本鎖アンプリコンを自発的に解離させ、表面の官能化を使用して、反応試薬を互いに隔離して偽陽性を低減させる点で異なる。トーホールド媒介性の鎖置換は、標的分析物配列の他の配列への化学量論的変換のために、表面官能化ＤＮＡオリゴヌクレオチド（米国特許第８，６３０，８０９（Ｂ２）号）に適用されてきた。本開示は、検出標的の増幅を提供する点で異なる。
【００５９】
４．出願人の技術
本開示は、特定の核酸標的配列の増幅及び検出のための試薬及び装置を記載する。本開示は、偽陽性に起因する意図しない分子事象を防止するためのオリゴヌクレオチド試薬の固相官能化及び隔離と、標的再生のためのレイリー・ベナール熱対流の適用と、ＤＮＡ表面ハイブリダイゼーション速度則（反応混合物のより効率液な混合）の促進とを利用する。レイリー・ベナール対流レジメンは、反応チャンバを置くことによって実現され得、反応チャンバは、定義された角度で傾斜する２つの別個に制御された熱板（図１〜３）の間を、厚さ２５０μｍのスペーサとして両面粘着テープで分けられている２つの１ｍｍ厚の白色ガラス顕微鏡スライドからなる。スペーサの形状は、反応チャンバの形状を決定し、対流流速及び軌道を変更するように修正され得る。ガラスは、チャンバにわたって均一な温度勾配の維持を容易にし、合成オリゴヌクレオチドによる表面の官能化を可能にするため、チップ材料としてガラスが選択される。
【００６０】
熱板は、液体反応混合物が充填された反応チャンバにわたる温度勾配を引き起こす、２つの異なる温度を維持するように設定される（それぞれ冷ヒーター及び温ヒーター）。チャンバの高温部近傍に存在する液体は、より高い温度を有し、このため、より低い温度のチャンバの部分に存在する液体よりも密度が低い。閉じ込められた体積内の液体密度のこのような分布は、浮力と重力との差（それぞれ温ヒーター及び冷ヒーターの近傍）をもたらし、次いで、循環性の定常状態対流の機構をもたらす。
【００６１】
液体中に溶解されたすべての分子は、対流によって引っ張られることにより、温度帯間の循環に関与する。分子は、温度帯沿いに進みながら、周期的な温度変化を経験する。例えば、循環性対流内に置かれる二本鎖ＤＮＡ分子は、加熱及び冷却の複数のサイクルを経験する。高温帯内の溶液の温度がＤＮＡ二重鎖を融解させるのに十分であり、低温帯の温度が、所与の核酸を二本鎖形態に維持するのに有利である場合、この対流内の核酸の循環は、再現可能な変性及びアニールサイクルをもたらす。ｄｓ−ＤＮＡ変性及びアニールの複数サイクルの観察は、例えば、蛍光顕微鏡を使用して、ＤＮＡサンプルと共に反応混合物内に置かれた非特異的なＤＮＡ染色色素の強度を記録するなど、様々な方法によって実施され得る。
【００６２】
原型の加熱器具は、アルミニウムプレートに密着した２つの抵抗カプトン（Ｋａｐｔｏｎ）フォイルヒーターからなり、同時に使用することで、最大５つの流体チップに対する示差加熱を提供し得る。２つの低ワット電源が、ヒーターに電力を供給する。提案される増幅システムは、±２℃の範囲の発熱体温度の不正確性に耐性があり、精密なコンピュータ制御ハードウェアを必要としない。
【００６３】
５．酵素フリーの線形増幅の実施形態
本開示は、標的核酸の酵素フリー増幅を表し、アンプリコン濃度は経時的に直線状に増加する（図１４Ａ）。２つの表面領域は、２つのＤＮＡオリゴヌクレオチド、ドナーＤ（ドメイン１を含む）及び受容体Ａ（ドメイン４〜５を含む）で不可逆的に官能化される。表面領域１に官能化されたドナーオリゴヌクレオチドは、一本鎖ドメイン２が溶液に暴露されトーホールド配列の役割を果たすような方法で、ドメイン４〜５に相補的である、ドメイン２〜３を含む、一本鎖Ｓと最初にハイブリダイズされる。受容体鎖は、表面領域２に不可逆的に官能化され、最初は一本鎖オリゴヌクレオチドである。表面領域１及び２は、３５℃に保持された温度帯（３５℃帯）に局在化され、ここでＤ−Ｓ二重鎖は、検出アッセイの時間スケールにわたって高く安定するように設計される。標的分子Ｔ（ドメイン６〜７を含む）は、反応溶液中に導入され、対流によって反応チャンバの３５℃帯に移送される。標的Ｔは、ドメイン７（「トーホールド」ドメイン）を介してシグナルＳに結合し、トーホールド媒介性の鎖置換機構によってドメイン３を表面から溶液へ移動させる。次いで、レイリー・ベナール対流が二重鎖をチャンバの高温帯（８５℃に保持）に搬送し、そこで二重鎖が解離する。２つの一本鎖分子、標的鎖Ｔ及びシグナル鎖Ｓは次いで、チャンバの３５℃帯に戻され、鎖Ｓは、表面領域２に官能化された受容体オリゴヌクレオチドＡに結合する。同時に、一本鎖標的Ｔを許容することで、別のシグナルＳ分子を表面領域１から触媒によって移動させ、触媒サイクルを完了させる。このトリガは、シグナル分子Ｓが表面領域１から表面領域２に完全に移送されるまで連続的に進行するべきである。
【００６４】
線形増幅スキームは、オリゴヌクレオチド反応物質の固相隔離と、温度推進性の対流とを同時に使用する利点を実証する。異なる表面領域上でのオリゴヌクレオチド試薬の固定化は、標的配列が存在しないときの偽陽性シグナル分子の遊離（スプリアス増幅）を回避し、熱対流は、自発的輸送及び改善された物質伝達と並び、標的シグナル複合体（Ｔ−Ｓ）の融解による標的再生を誘導する。対照的に、溶液全体の温度の変化は、表面からのすべてのオリゴヌクレオチドの自発的解離につながるため、望ましくない。
【００６５】
蛍光色素によるシグナル鎖Ｓの標識化は、線形増幅プロセスのリアルタイムモニタリングのための１つのアプローチを表す。表面領域１から記録される蛍光の強度の減少、並びに表面領域２から記録される蛍光強度の増加は、反応増幅反応の進行の様子を効果的に反映し得る。
【００６６】
６．化学量論的検出の実施形態
酵素フリー増幅法が複数の代謝回転を呈することを実証するため、発明者らは、対流装置（図１５）を使用して対応する化学量論的検出システムを構築した。化学量論的システムはまた、ドナーで官能化された２つの表面領域、ドメイン１１〜１２を含むＤｓ鎖と、ドメイン１６を含むＡｓ鎖とを含む。Ｄｓ鎖は、ドメイン１４〜１５を含むブリッジオリゴヌクレオチドＢｓ及びドメイン１３を含むシグナルオリゴヌクレオチドＳｓからなるシグナル複合体とハイブリダイズされる。Ｂｓ鎖及びＡｓ鎖のドメイン１４は、同一の配列を有する。反応に導入されるドメイン１７〜１８を含む標的分子Ｔは、ドナーＤｓのトーホールドドメイン１１に結合し、次いでシグナル複合体を溶液中に移動させる。このプロセス中、標的Ｔは、ドナーＤｓと結合し、表面領域１からの別のシグナル複合体の遊離をトリガするため、チャンバの高温帯での再生が不可能となる。移動したシグナル複合体は、対流によって８５℃帯に移送され、そこで解離する。解離後、シグナル分子Ｓｓは、３５℃帯に戻され、表面領域２に官能化された受容体オリゴヌクレオチドＡｓによって捕捉される。このように、捕捉されたシグナル鎖Ｓｓの量は、システムに導入された標的Ｔの量と等しくなる。
【００６７】
化学量論的検出システムのリアルタイム観察はまた、蛍光色素によるシグナル鎖Ｓｓの単純な標識化と、表面領域２の蛍光強度の変化の記録とを介して実施され得る。図１６は、検出標的の同一の初期量が与えられた線形増幅及び化学量論的検出システムに関する、表面領域１における時間に基づく蛍光の減少を示す。線形増幅システムにおける蛍光シグナルの減少は、それぞれの標的分子が複数のシグナル分子を表面１から表面２へ触媒的に移送している設計された機構を支持する、線形増幅アッセイにおける減少よりも速い。
【００６８】
７．酵素フリーの指数関数的増幅の実施形態
図１７は、試薬が消費されるまで（図１７）、検出標的が、時間と共に濃度が指数関数的に増加するアンプリコン産物の遊離をトリガする、本発明の一実施形態を示す。このシステムでは、２つの表面領域が部分的に二本鎖のオリゴヌクレオチド複合体で官能化される。ドメイン３が一本鎖に留まりトーホールド配列の役割を果たすような方法で、表面に不可逆的に付着し、ドメイン３−２を含むオリゴヌクレオチドＳ１とハイブリダイズしている、単一ドメインのオリゴヌクレオチドからなる複合体を、表面領域１は有する。表面領域２は、表面領域１をミラーリングし、表面に官能化されたオリゴヌクレオチド試薬の類似のアーキテクチャを有する。ドメイン４を含むオリゴヌクレオチドは、表面に不可逆的に官能化され、ドメイン６〜５を含むオリゴヌクレオチドＳ２とハイブリダイズし、ドメイン６は、一本鎖のトーホールドを表す。ドメイン７及び８（配列においてそれぞれドメイン６及び５と同一）を含む標的鎖Ｔの反応混合物への注入により、オリゴヌクレオチドＳ１が二本鎖アンプリコンの形状で表面領域１から遊離する。
【００６９】
対流は、二重鎖が融解する８５℃帯に二重鎖を搬送する。ここで、２つの一本鎖オリゴヌクレオチド、初期標的Ｔ及び遊離した鎖Ｓ１が、３５℃帯に逆流し、それぞれが表面からオリゴヌクレオチド種の新たな遊離をトリガする。特に、標的オリゴヌクレオチドＴは、表面領域１から第２の鎖Ｓ１を触媒的に遊離させ、最初に遊離した鎖Ｓ１は、第２の表面領域から鎖Ｓ２の遊離をトリガする。このように、それぞれの対流サイクルの最後に、溶液中に存在するオリゴヌクレオチド種の量は倍になり、その結果、アンプリコン種が溶液相に指数関数的に蓄積する。
【００７０】
８．代替検出方法
図１４Ｂは、反応の進行をアッセイするための１つの可能な検出機構を提示する。蛍光顕微鏡法を使用する代替の読み出しアプローチも可能である。ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ及びＳｙｔｏ色素などの配列非特異的な挿入核酸染色色素を使用して、蓄積した二本鎖産物の合計量を示すことができる（図１８）。表面領域２に固定化された受容体鎖Ａ（ドメイン４〜５）は、反応の開始時は一本鎖状であるため、挿入色素は、鎖Ａに対して低い親和性を有することになる。反応の過程において、更に多くの鎖Ｓ（ドメイン２〜３）は、表面官能化鎖Ａ（ドメイン４〜５）とハイブリダイズする。新たに形成された複合体Ａ−Ｓはここで、表面領域２の蛍光の増加を引き起こす色素によって効率的に染色される。反対の状況が、表面領域１で潜在的に観察され得る。
【００７１】
ＦＲＥＴに基づいた検出技術の適用が、指数関数的な増幅の例に示されている（図１９）。例えば、蛍光色素で不可逆的に標識化された表面固定化鎖（ドメイン１が標識化されて示されている）は、標的が添加される前に、シグナル鎖を官能化した消光剤（ドメイン２〜３を有する鎖が、蛍光消光剤と共に示されている）で効率的に消光され得る。標的の添加により、表面からシグナル鎖が指数関数的に遊離し、表面固定化鎖が発光する。
【００７２】
９．対流ＰＣＲのリアルタイム検出
本開示に記載の組成物の別の用途として、この組成物は、溶液中で進行する酵素核酸増幅プロセスの表面ベースのリアルタイムモニタリングのための効率的な手段として使用され得る。表面官能化プローブを使用した対流ベースのＰＣＲのリアルタイムモニタリングについて報告された例は存在しない。
【００７３】
図６は、温度推進性の対流で実施されたＰＣＲ反応のリアルタイムモニタリングのための本願組成物を利用したアプローチを示す。最初に、６０℃帯に存在する表面領域１は、ドメイン１及び蛍光色素を含むアンカーオリゴヌクレオチドで官能化される。ドメイン３−２を含むアームオリゴヌクレオチドは、その２ドメインを介してアンカーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。アンカーアームオリゴヌクレオチド複合体は、次いで、ドメイン４及び５並びに蛍光消光剤を含む消光剤オリゴヌクレオチドと、そのドメイン４を介してハイブリダイズされる。ドメイン５は一本鎖である。反応溶液は、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸の混合物、二価イオン（Ｍｇ２＋）などのオリゴヌクレオチドプライマー（ドメイン１０及び１１）の酵素的伸長のための試薬を含む。標的分子（ｇＤＮＡ）は注入後、９５℃で自発的に融解する。次いで、融解したｇＤＮＡは、対流によって６０℃帯に移送され、そこでプライマーはそれらの特異的な標的配列にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され、フォワード鎖にドメイン１０−１５−１６−１７及びリバース鎖にドメイン１１−１２−１３−１４を含む二本鎖アンプリコン分子の形成がもたらされる。アンプリコン分子は、９５℃で融解し、６０℃帯に戻り、そこでフォワード鎖１０−１５−１６−１７が、表面官能化複合体アンカーアームから、消光剤オリゴヌクレオチドを移動させて、表面領域１から記録される蛍光シグナルの増加をもたらす。
【００７４】
１０．複数の標的配列の同時モニタリング
本開示の提案される組成物及び方法は、複数の核酸標的配列の増幅（酵素フリー又は酵素ベースのいずれか）を同時にモニタリングすることを可能にする。異なる表面領域での異なるオリゴヌクレオチドプローブの空間パターンは、アレイベース又はカメラベースの読み出しが、それぞれの標的増幅反応のアンプリコン濃度の独立した情報を提供することを可能にする。
【００７５】
１１．例示的なオリゴヌクレオチド
以下のオリゴヌクレオチド配列が、例として提供されるが、限定するものではない。
【００７６】
線形増幅システムのオリゴヌクレオチド
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化学量論的検出システムのオリゴヌクレオチド
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【００７７】
１２．参照文献
以下の参照文献は、それらが例示的な手順又は本明細書に示されるものに対して補足的な他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に組み込まれる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ−１】
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【図１４Ａ−２】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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