(57)【要約】  マイクロ流体デバイスは、標的細胞と非標的細胞とを含むサンプルを受容するための少なくとも１つの入口と、中心領域の上流端と周辺領域の下流端とを有する第１のスパイラルチャネル部分であって、上流端が入口に結合され、第１のスパイラルチャネル部分が、標的細胞と非標的細胞とが下流端で異なるストリームを占有するように構成される、第１のスパイラルチャネル部分と、第１のスパイラルチャネル部分の下流端で非標的細胞のストリームに結合するように配置された第１の廃棄物出口と、第１のスパイラルチャネル部分の下流端で標的細胞のストリームに結合するように配置されたリンクチャネル部分と、周辺領域の上流端と中心領域の下流端とを有する第２のスパイラルチャネル部分であって、第２のチャネル部分の上流端がリンクチャネル部分に結合され、第２のスパイラルチャネル部分が、標的細胞と非標的細胞とが下流端で異なるストリームを占有するように構成される、第２のスパイラルチャネル部分と、第２のスパイラルチャネル部分の下流端で非標的細胞のストリームに結合するように配置された第２の廃棄物出口と、第２のスパイラルチャネル部分の下流端で標的細胞のストリームに結合するように配置されたサンプル出口と、を含む。
2019509016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体デバイスであって、
標的細胞と非標的細胞とを含むサンプルを受容するための少なくとも１つの入口と、
中心領域の上流端と周辺領域の下流端とを有する第１のスパイラルチャネル部分であって、前記上流端が前記入口に結合され、前記第１のスパイラルチャネル部分が、前記標的細胞と前記非標的細胞とが前記下流端で異なるストリームを占有するように構成される、第１のスパイラルチャネル部分と、
前記第１のスパイラルチャネル部分の前記下流端で非標的細胞のストリームに結合するように配置された第１の廃棄物出口と、
前記第１のスパイラルチャネル部分の前記下流端で標的細胞のストリームに結合するように配置されたリンクチャネル部分と、
周辺領域の上流端と中心領域の下流端とを有する第２のスパイラルチャネル部分であって、前記第２のチャネル部分の前記上流端が前記リンクチャネル部分に結合され、前記第２のスパイラルチャネル部分が、前記標的細胞と前記非標的細胞とが前記下流端で異なるストリームを占有するように構成される、第２のスパイラルチャネル部分と、
前記第２のスパイラルチャネル部分の前記下流端で非標的細胞のストリームに結合するように配置された第２の廃棄物出口と、
前記第２のスパイラルチャネル部分の前記下流端で標的細胞のストリームに結合するように配置されたサンプル出口と、
を含むマイクロ流体デバイス。
【請求項２】
前記第１のスパイラルチャネル部分の前記上流端に結合された第１の緩衝液入口であって、シース緩衝液を受容するように構成された第１の緩衝液入口と、前記第２のスパイラルチャネル部分の前記上流端に結合された第２の緩衝液入口であって、シース緩衝液を受容するように構成された第２の緩衝液入口と、をさらに含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
前記第１の緩衝液入口が、前記第１のスパイラルチャネル部分の内側壁に近接する前記第１のスパイラルチャネル部分に前記シース緩衝液を導入するように配置され、かつ前記少なくとも１つの入口が、前記第１のスパイラルチャネル部分の外側壁に近接する前記第１のスパイラルチャネル部分に前記サンプルを導入するように配置される、請求項２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
前記第１のスパイラルチャネル部分の前記下流端を前記第１の廃棄物出口に結合する圧力コンペンセーター路であって、前記第２のスパイラルチャネル部分の流体抵抗を補償するように選択された流体抵抗を有する圧力コンペンセーター路をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
前記サンプルが血液サンプルまたは血液成分である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
前記標的細胞が循環腫瘍細胞または循環希薄細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
前記第１および第２のスパイラルチャネル部分が、前記標的細胞が慣性集束を起こすようにかつ前記非標的細胞がディーン力の影響下で横方向位置にマイグレートするように構成される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項８】
前記標的細胞が細胞直径閾値超の細胞直径を有し、かつ前記非標的細胞が前記細胞直径閾値未満の直径を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項９】
前記第１の廃棄物出口および前記チャネルリンク部分に関連するフロー抵抗がフロー比に基づいて構成される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
前記第１の廃棄物出口および前記チャネルリンク部分に関連するチャネル幅が前記フロー比に基づいて構成される、請求項９に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
前記第２の廃棄物出口および前記サンプル出口に関連するフロー抵抗が前記フロー比に基づいて構成される、請求項９または１０に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
前記第２の廃棄物出口および前記サンプル出口に関連するチャネル幅が前記フロー比に基づいて構成される、請求項１１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
前記フロー比が０．１〜１０の範囲内である、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明の実施形態は、サイズベース慣性分離を用いて血液および他の体液から標的細胞を富化するマイクロ流体デバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
マイクロフルイディクスチップなどのマイクロ流体デバイスは、典型的には、材料（たとえば、ガラス、シリコン、またはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのポリマー）中にエッチングまたは成形された一群のマイクロチャネルを含む。かかるマイクロフルイディクスチップの用途は、不均一サンプルから希薄濃度の比較的大きな粒子／細胞の富化である。典型的な例は、非常に高いスループットで血液細胞から循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を富化することである。患者の血液サンプルからＣＴＣを富化することは、癌の診断および治療に不可欠である。難題は、患者の血液サンプル中のＣＴＣが希薄なことである。すなわち、ＣＴＣは、転移疾患の患者では全血１ｍＬ当たりＣＴＣ１〜１０個程度の頻度で見いだされるが、同一体積の血液中には数百万個の白血球（ＷＢＣ）および十億個の赤血球（ＲＢＣ）が存在する。
【０００３】
図１は、国際特許出願ＰＣＴ／ＳＧ２０１３／０００４４２号（国際公開第２０１５／０５７１５９号として公開された）に記載のバイオチップ設計の模式図を示す。マイクロ流体デバイス１００は、スパイラルカーブマイクロチャネル１１０を含む。サンプル入口ＳＩ１１２およびシース緩衝液入口ＢＩ１１４は、スパイラルカーブマイクロチャネル１１０の中心領域に位置する。サンプル入口結合路１１６は、サンプル入口をスパイラルカーブマイクロチャネル１１０に結合する。緩衝液入口結合路１１８は、シース緩衝液入口１１４をスパイラルカーブマイクロチャネル１１０に結合する。サンプル入口結合路１１６および緩衝液入口結合路１１８は、スパイラルカーブマイクロチャネル１１０の上流端の合流点１２０で連結する。スパイラルカーブマイクロチャネル１１０の下流端には、チャネルがサンプル出口結合路１２４と廃棄物出口結合路とにスプリットする二分岐点１２０が存在する。サンプル出口結合路１２４は、サンプル出口ＳＯ１２６に接続され、廃棄物出口結合路１２８は、廃棄物出口ＷＯ１３０に接続される。サンプルは、チャネル湾曲の外側からスパイラルカーブマイクロチャネル１１０に導入される。細胞は、シース緩衝液の助けを借りて外側チャネル壁に整列する。カーブスパイラルマイクロチャネル１１０は、ＣＴＣなどの大きな細胞をＷＢＣおよびＲＢＣなどのより小さな細胞から分離するように構成される。カーブスパイラルマイクロチャネル１１０の寸法は、より小さな細胞はディーン力の影響下でチャネルを横切って移動するが大きな細胞は単一平衡位置に集束させてそれを占有するように選択される。このことは、ディーンサイクルの半分の後では大きな細胞も小さな細胞もチャネルの内側を占有することを意味する。カーブセクションの端までの長さは、より小さな細胞が１回のディーンサイクルを終了するように選択される。そのため、カーブセクションの端では、より小さな細胞は１回のディーンサイクルを終了しており、チャネルの外側に移動していることになる。したがって、二分岐点１２２では、より大きなＣＴＣは、内側チャネル壁に集束されてサンプル出口１２６から捕集されるが、より小さな細胞は、外側チャネル壁の個別ストリーム中に存在し、廃棄物出口１３０から出る。
【０００４】
ＰＣＴ／ＳＧ２０１３／０００４４２号に記載のマイクロ流体チップは、０．２５ｍＬ／ｍｉｎの駆動で、１．５倍濃縮ＲＢＣ枯渇血液溶液において、標的ＣＴＣから９９．９９％の白血球を除去可能である。つまり、元の血液サンプル７．５ｍＬを処理した場合、何千個ものＷＢＣ汚染とＣＴＣとを取り出すことが可能である。これらのＷＢＣはより小さなサイズであるが、入力時の高い細胞負荷により引き起こされる立体的相互作用に起因して、細胞はＣＴＣチャネル内に捕集される。これは理想的なシナリオであるが、臨床サンプルでは条件はより複雑になる。ＷＢＣの全数は、化学療法後に劇的に増加する可能性があり、血餅の発生確率もまた、後期癌患者で増加する可能性がある。また、チップを介してサンプルを処理するためのポンプシステムの正確性および安定性の必要性も非常に高い。こうして、ＷＢＣ汚染は、スパイラルマイクロ流体チップを用いたシングルステージ分離後に何万個にも増加する可能性がある。このＷＢＣ汚染は、低いシグナル対ノイズに起因してこれらの希薄標的細胞の下流の分析（たとえば、蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、または次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を制限する可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明の第１の態様によれば、マイクロ流体デバイスが提供される。マイクロ流体デバイスは、標的細胞と非標的細胞とを含むサンプルを受容するための少なくとも１つの入口と、中心領域の上流端と周辺領域の下流端とを有する第１のスパイラルチャネル部分であって、上流端が入口に結合され、第１のスパイラルチャネル部分が、標的細胞と非標的細胞とが下流端で異なるストリームを占有するように構成される、第１のスパイラルチャネル部分と、第１のスパイラルチャネル部分の下流端で非標的細胞のストリームに結合するように配置された第１の廃棄物出口と、第１のスパイラルチャネル部分の下流端で標的細胞のストリームに結合するように配置されたリンクチャネル部分と、周辺領域の上流端と中心領域の下流端とを有する第２のスパイラルチャネル部分であって、第２のチャネル部分の上流端がリンクチャネル部分に結合され、第２のスパイラルチャネル部分が、標的細胞と非標的細胞とが下流端で異なるストリームを占有するように構成される、第２のスパイラルチャネル部分と、第２のスパイラルチャネル部分の下流端で非標的細胞のストリームに結合するように配置された第２の廃棄物出口と、第２のスパイラルチャネル部分の下流端で標的細胞のストリームに結合するように配置されたサンプル出口と、を含む。
【０００６】
マイクロ流体デバイスは、スパイラルチャネル部分をそれぞれ有する２ステージを含む。血液サンプルなどのサンプルが第１ステージのスパイラルチャネルを通り抜けた後、ＷＢＣの大部分は第１の廃棄物出口を介して枯渇され、第２ステージに入る全細胞は劇的に低減される。この低濃度により第２ステージでは立体的相互作用または細胞間相互作用のいずれの可能性も排除されるので、高富化ＣＴＣサンプルが提供される。血液サンプルを用いた試験では、全ＷＢＣ数を血液７．５ｍＬ当たり５００細胞以内に十分に制御可能であることが確認される。これは言い換えれば、ＷＢＣに対してＣＴＣが１００，０００倍富化されることになる。
【０００７】
実施形態では、マイクロ流体デバイスは、第１のスパイラルチャネル部分の上流端に結合された第１の緩衝液入口であって、シース緩衝液を受容するように構成された第１の緩衝液入口と、第２のスパイラルチャネル部分の上流端に結合された第２の緩衝液入口であって、シース緩衝液を受容するように構成された第２の緩衝液入口と、をさらに含む。第１の緩衝液入口は、第１のスパイラルチャネル部分の内側壁に近接する第１のスパイラルチャネル部分にシース緩衝液を導入するように配置し得るとともに、少なくとも１つの入口は、第１のスパイラルチャネル部分の外側壁に近接する第１のスパイラルチャネル部分にサンプルを導入するように配置される。
【０００８】
実施形態では、マイクロ流体デバイスは、第１のスパイラルチャネル部分の下流端を第１の廃棄物出口に結合する圧力コンペンセーター路であって、第２のスパイラルチャネル部分の流体抵抗を補償するように選択された流体抵抗を有する圧力コンペンセーター路をさらに含む。
【０００９】
サンプルは、血液サンプルまたは血液成分であり得るとともに、標的細胞は、循環腫瘍細胞または循環希薄細胞、たとえば、循環胎児細胞、循環内皮細胞、および循環幹細胞であり得る。
【００１０】
実施形態では、第１および第２のスパイラルチャネル部分は、標的細胞が慣性集束を起こすようにかつ非標的細胞がディーン力の影響下で横方向位置にマイグレートするように構成される。
【００１１】
実施形態では、標的細胞は細胞直径閾値超の細胞直径を有し、かつ非標的細胞は細胞直径閾値未満の直径を有する。
【００１２】
実施形態では、第１の廃棄物出口およびチャネルリンク部分に関連するフロー抵抗は、フロー比に基づいて構成される。第１の廃棄物出口およびチャネルリンク部分に関連するチャネル幅もまた、フロー比に基づいて構成し得る。
【００１３】
第２の廃棄物出口およびサンプル出口に関連するフロー抵抗は、フロー比に基づいて構成し得る。第２の廃棄物出口およびサンプル出口に関連するチャネル幅もまた、フロー比に基づいて構成し得る。
【００１４】
フロー比は０．１〜１０の範囲内であり得る。
【００１５】
図面の簡単な説明
以下では、限定されるものではないが例として添付の図面を参照して本発明の実施形態を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】シングルスパイラルチャネルステージを有するマイクロ流体デバイスの例を示す。
【図２ａ】２つのスパイラルチャネルステージを有する本発明の実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す。
【図２ｂ】２つのスパイラルチャネルステージを有する本発明の実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す。
【図３】図１に示されるマイクロ流体デバイスのフロー抵抗の模式モデルを示す。
【図４ａ】図２ａまたは２ｂに示されるマイクロ流体デバイスのフロー抵抗の模式モデルを示す。
【図４ｂ】図４ａに示される模式モデルの簡略図を示す。
【図５】シングルステージマイクロ流体デバイスおよび２ステージマイクロ流体デバイスにより達成される富化の比較を模式的に示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の実施形態は、スパイラルマイクロチャネルでサイズベース慣性分離を用いて細胞を単離するためのマイクロ流体デバイスに関する。マイクロ流体デバイスは、材料、たとえば、ガラス、シリコン、またはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などのポリマー中にエッチングまたは成形された一群のマイクロチャネルを有するマイクロ流体チップとして実現し得る。
【００１８】
スパイラルマイクロチャネル内を流れる細胞は、慣性揚力と遠心加速度誘起ディーン抗力との組合せに晒される。細胞サイズの４乗で変化する慣性揚力は、マイクロチャネル断面内の識別可能な複数の平衡位置に細胞を集束させることに関与する。スパイラル形マイクロチャネルを設計することにより、ディーン抗力の成分を加えて、これらの複数の平衡位置を内側マイクロチャネル壁近傍の１つだけに低減することが可能である。異なる細胞サイズでは慣性揚力とディーン抗力との比が異なるので、細胞はそのサイズに基づいてマイクロチャネル断面に沿った識別可能な位置に平衡化し得る。その際、最も大きな細胞は、マイクロチャネル壁の最も近くに平衡化する。この結果、適切な出口の設計により独立して捕集できる識別可能な細胞ストリームが発生する。
【００１９】
そのため、マイクロ流体デバイスの少なくとも１つの入口で細胞懸濁液を断面の一部に閉じ込めることにより、かつより大きな細胞のみが慣性力による影響を受け、一方、より小さな細胞はディーン抗力による影響のみを受けることを保証することにより、高分解能分離を達成可能である。
【００２０】
曲線チャネルを通って流れる流体は、半径方向外向きに遠心加速度を受けて、チャネルの頂部半分および底部半分にディーンボルテックスとして知られる２つの異方向回転ボルテックスの形成をもたらす。これらの二次フローの大きさは、
【数１】
2019509016.tif 000003
により与えられる無次元パラメーターのディーン数（Ｄｅ）により定量化される。式中、ρは流体密度（ｋｇ／ｍ３）であり、Ｕｆは平均フロー速度（ｍ／ｓ）であり、μは流体の粘度（ｋｇ／ｍｓ）であり、ＲＣはチャネル路の曲率半径（ｍ）であり、ＤＨはチャネル水力直径（ｍ）であり、かつＲｅはフローのレイノルズ数（慣性力対粘性力の比）である。フロー速度は、流量またはポンプモジュール（たとえばシリンジポンプ）の圧力を変化させることにより調整される。そのため、曲線チャネル内を流れる粒子は、これらの横方向ディーンフローの存在により抗力を受けて、ボルテックス内のフロー方向に沿って連行および駆動される。この運動は言い換えれば、内側壁と外側壁との間でチャネル幅に沿って粒子が往復移動することになり、頂部または底部から可視化したときに下流距離が増加する。これらの細胞がチャネル内を流れるときに横方向にマイグレートする速度はディーン数に依存し、
【数２】
2019509016.tif 000004
を用いて計算可能である。式中、ρは流体密度（ｋｇ／ｍ３）であり、μは流体の粘度（ｋｇ／ｍｓ）であり、ＤＨはチャネル水力直径（ｍ）であり、かつｋは、これらの曲線チャネルに対して経験的に約０．０１と決定される、かつこれらのチャネルのＣＯＭＳＯＬモデルを用いて検証される、スケーリング係数である。
【００２１】
ディーンボルテックスに沿って粒子が横切る横方向距離は、「ディーンサイクル」により定義可能である。たとえば、マイクロチャネル内側壁近傍に初期に位置決めされて下流の所与の距離でチャネル外側壁にマイグレートする粒子は、ディーンサイクルの１／２を終了したと言われる。マイクロチャネル内側壁近傍の元の位置に戻るとフルディーンサイクルが終了する。そのため、所与のマイクロチャネル長さでは、流量（Ｒｅ）増加条件を用いると粒子は複数のディーンサイクルマイグレーションを起こすことが可能である。完全ディーンサイクルマイグレーションの長さは、
ＬＤＣ≒２ｗ＋ｈ  （ｍ）  （３）
として計算可能である。式中、ｗはマイクロチャネル幅（ｍ）であり、かつｈはマイクロチャネル高さ（ｍ）である。その結果、ディーンマイグレーションに必要とされる全マイクロチャネル長さは、
【数３】
2019509016.tif 000005
により与えられる。ストークスの法則：
ＦＤ＝３πμＵディーンａｃ  （Ｎ）  （５）
によりディーン抗力の大きさが与えられることを認識すべきである。式中、ａｃは細胞直径（ｍ）である。
【００２２】
ディーン抗力以外に、マイクロチャネル寸法に匹敵する直径を有するより大きな細胞はまた、認知可能な慣性揚力（ＦＬ）（剪断誘起および壁誘起の両方）を受けて、それらの集束および平衡化をもたらす。ポアズイユフローの放物線速度プロファイルの結果として生じる剪断誘起慣性揚力ＦＩＬが粒子に作用して、粒子はマイクロチャネル中心からチャネル壁に方向付けられる。これらの粒子がチャネル壁のより近くに移動するにつれて、粒子の周りに形成された回転後流が壁の突然の存在により撹乱されて揚力（ＦＷＬ）が誘起され、粒子は壁からマイクロチャネル中心に方向付けられる。これらの２つの対向する揚力の結果として、粒子は、マイクロチャネル周辺近傍の識別可能かつ予測可能な位置に平衡化（集束）する。この作用は、マイクロチャネル寸法に匹敵するサイズすなわちａｃ／ｈ≒０．１を有する粒子では支配的である。とくに、慣性揚力（ＦＬ）の大きさは、
【数４】
2019509016.tif 000006
により与えられる。式中、ＣＬは、チャネル断面を横切る粒子位置の関数である揚力係数であり０．５の平均値が仮定され、かつＧは、流体の剪断速度（１／ｓ）である。ポアズイユフローのＧの平均値はＧ＝Ｕｍａｘ／ＤＨにより与えられる。式中、Ｕｍａｘは最大流体速度（ｍ／ｓ）であり、２×ＵＦとして近似可能である。したがって、次いで、以上の式（６）の慣性揚力（ＦＬ）は、再度、
【数５】
2019509016.tif 000007
として表現可能である。曲線ジオメトリーを有するマイクロチャネルでは、慣性揚力（ＦＬ）とディーン抗力（ＦＤ）との間の相互作用により、平衡位置を頂部および底部の各ディーンボルテックス内の内側チャネル壁近傍の２つだけに低減する。２つの平衡位置は、マイクロチャネル高さに沿って互いに重なり合い、所与の粒子サイズではマイクロチャネル内側壁から同一距離に位置決めされる。すなわち、マイクロチャネル幅を横切って単一位置とみなされる。
【００２３】
これらの２つ現象、すなわち、ディーンマイグレーションおよび慣性集束の利点を生かせば、さまざまなサイズの粒子および細胞の混合物を分離することが可能である。マイクロチャネルパラメーター（すなわち、幅、高さ、長さ、曲率半径、および流量）の大きさは、より大きな細胞／粒子が慣性集束を起こし、一方、より小さな細胞／粒子（サイズカットオフ未満）は集束作用を受けないことを保証するように以上に記載の数学モデルに基づいて選択される。入口では、細胞／粒子混合物はマイクロチャネルの内側壁近傍に閉じ込められ、細胞／粒子が下流に移動するにつれて、より小さな粒子はディーン抗力の影響下でチャネル断面の他方の半分に移る。これに対して、サイズカットオフ超の細胞／粒子は、強い慣性揚力を受けて内側チャネル壁近傍に集束した状態を維持する。こうして、出口では、より小さな細胞／粒子は小細胞出口から捕集可能であり、一方、より大きな細胞／粒子は大細胞出口から捕集可能であるので、分離および単離が達成される。サイズカットオフは、２つの力（すなわち、慣性揚力（ＦＬ）およびディーン抗力（ＦＤ））の比：
【数６】
2019509016.tif 000008
により推定可能である。式中、ｉＦは力の比であり、かつ残りのパラメーターは、式（１）、（５）、および（６）で定義した上記の内容に従って理解すべきである。フロー密度（ρ）および液体粘度（μ）とは、密度および粘度の組合せを意味する。シースまたはサンプルのいずれかを調整することにより、最終的な流体の密度および粘度を調整することが可能である。得られた実験データによれば、ｉＦの閾値は、粒子／細胞の慣性集束に関しては約２である。ｉＦの上限は＞１００であり得る。２未満のｉＦの試験条件では、粒子／細胞は、ディーン抗力の影響のみを受けるので、ディーンフローで循環する。すなわち、粒子／細胞が慣性集束を起こすには、ｉＦを２以上（すなわちｉＦ≧２）にすべきである。こうして、力の比ｉＦは、粒子／細胞が慣性集束を起こすかを決定する閾値因子として作用することが分かる。式（８）から、ｉＦは、曲率半径、粒子／細胞の直径（すなわち、細胞／粒子のサイズ）、さらには水力直径などのいくつかのパラメーターにより決定されることが分かる。
【００２４】
これらのパラメーターのうち、水力直径および粒子／細胞のサイズは、細胞／粒子が慣性集束を受けるか否かの決定に最も有意な影響を及ぼす。低アスペクト比の長方形断面チャネルを分離に使用すべきであるので、チャネル高さｈは、既知の直径を有する粒子／細胞がチャネルの側部に集束可能であるかまたはディーンフローに沿って移動するかを決定する重要なパラメーターである（ＤＨは、低アスペクト比のチャネルではｈにより置換え可能である）。したがって、対象の粒子／細胞のサイズ範囲内で、チャネルの内側に集束させる必要のある粒子／細胞に対してｈ＜１０×ａｃとなるようにチャネル高さを選択することが妥当である。
【００２５】
以上のことから、本明細書に記載の研究は、そうした２つの現象、すなわち、ディーンマイグレーションおよび慣性集束の利点を生かして、血液からＣＴＣを単離するその能力を実証することに注目すべきである。より具体的には、マイクロ流体デバイスで血液からＣＴＣを分離および単離するためのサイズベース分離法を以下に説明する。これは、ＣＴＣと他の血液細胞とのサイズ差を活用することにより機能する（すでに上述した通り）。
【００２６】
図２ａは、本発明の実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す。マイクロ流体デバイス２００は、第１のスパイラルマイクロチャネルステージ２１０と第２のスパイラルマイクロチャネルステージ２５０とを含む。第１のスパイラルマイクロチャネルステージ２１０は、第１のスパイラルマイクロチャネル部分２２０を含む。第１のスパイラルマイクロチャネル部分２２０は、上流端２２２から下流端２２４まで２つの略環状のループを有する反時計方向のスパイラル路に従う。上流端２２２は、第１のマイクロチャネル部分２２０の中心領域に位置する。下流端２２４は、第１のマイクロチャネル部分の周辺領域に位置する。そのため、第１のマイクロチャネル部分２２０の半径は、上流端２２２から下流端２２４まで増加する。
【００２７】
サンプル入口ＳＩ２１２および第１の緩衝液入口ＢＩ１２１４は、第１のマイクロチャネル部分２２０の中心領域に位置する。サンプル入口２１２および第１の緩衝液入口２１４は両方とも、第１のスパイラルマイクロチャネル部分２２０の上流端２２２に結合される。サンプル入口結合路２１６は、サンプル入口２１２を第１のマイクロチャネル部分２１０の上流端２２２に結合し、第１の緩衝液入口結合路２１８は、第１の緩衝液入口２１４を第１のスパイラルマイクロチャネル部分２２０の上流端２２２に結合する。サンプル入口結合路２１６は、第１の緩衝液入口結合路２１８よりも狭い。第１のスパイラルマイクロチャネル部分２２０の上流端２２２は、サンプル入口結合路２１６と第１の緩衝液入口結合路２１８との合流点を形成する。合流点では、サンプル入口結合路２１６は、第１のスパイラルマイクロチャネル部分２２０の外側に位置し、第１の緩衝液入口結合路２１８は、第１のスパイラルマイクロチャネル部分２２０の内側に位置する。
【００２８】
第１のスパイラルチャネル部分２２０の下流端２２４は、二分岐点２２６に結合され、そこで、マイクロチャネルは、リンクチャネル部分２４０と第１の廃棄物出口部分２３０とにスプリットする。リンクチャネル部分２４０は、第１のスパイラルマイクロチャネルステージ２１０を第２のスパイラルマイクロチャネルステージ２５０に結合する。第１の廃棄物出口部分２３０は、第１のスパイラルマイクロチャネルステージ２１０を第１の廃棄物出口ＷＯ１２３２に結合する。リンクチャネル部分２４０は、第１のスパイラルチャネル部分２２０の下流端２２４の内側壁に位置する。第１の廃棄物出口部分２３０は、第１のスパイラルチャネル部分２２０の下流端２２４の外側壁に位置する。チャネルリンク部分２４０のチャネル幅は、第１の廃棄物出口チャネル部分２３０のチャネル幅未満である。第１の廃棄物出口チャネル部分２３０は、曲げ部により接続された複数の直線セクションを含む。直線セクションおよび曲げ部は、圧力コンペンセーター路２３４を構成する。
【００２９】
第２のスパイラルマイクロチャネルステージ２５０は、第２スパイラルマイクロチャネル部分２６０を含む。第２のスパイラルマイクロチャネル部分２６０は、上流端２６２から下流端２６４まで２つの略環状のループを有する反時計方向のスパイラル路に従う。上流端２６２は、第２のスパイラルマイクロチャネル部分２６０の周辺領域に位置する。下流端２６４は、第２のマイクロチャネル部分２６０の中心領域に位置する。そのため、第２のマイクロチャネル部分２６０の半径は、上流端２６２から下流端２６４まで減少する。
【００３０】
第２のスパイラルマイクロチャネルステージ２５０は、第２の緩衝液入口結合路２５４に結合された第２の緩衝液入口ＢＩ２２５２をさらに含む。第２の緩衝液入口結合路２５４は、合流点２５６でチャネルリンク路２４０に連結する。合流点２５６は、第２のスパイラルマイクロチャネル部分２６０の上流端２６２に結合される。合流点２５６では、チャネルリンク路２４０は、第２のスパイラルマイクロチャネル部分２６０の外側壁に連結し、第２の緩衝液入口結合路２５４は、第２のスパイラルマイクロチャネル部分２６０の内側壁に連結する。チャネルリンク路２４０のチャネル幅は、第２の緩衝液入口結合路２５４のチャネル幅未満である。
【００３１】
第２のスパイラルマイクロチャネル部分２６０の下流端２６４は、チャネルがサンプル出口結合路２６６と第２の廃棄物出口結合路２６８とにスプリットする二分岐点を形成する。サンプル出口結合路２６６は、第２のスパイラルマイクロチャネル部分２６０の内側壁に位置し、第２の廃棄物出口結合路２６８は、第２のスパイラルマイクロチャネル部分２６０の外側壁に位置する。サンプル出口結合路２６６のチャネル幅は、第２の廃棄物出口結合路２６６のチャネル幅未満である。サンプル出口結合路２６６は、第２のスパイラルマイクロチャネル部分２６０をサンプル出口２７０に結合する。第２の廃棄物出口結合路２６８は、第２のスパイラルマイクロチャネル部分２６０を第２の廃棄物出口２７２に結合する。
【００３２】
次に、サンプル中の標的細胞を非標的細胞から分離するためのマイクロ流体デバイス２００の使用について説明する。サンプルはたとえば血液サンプルであり得るとともに、標的細胞はＣＴＣでありかつ非標的細胞はＷＢＣおよびＲＢＣであり得る。標的ＣＴＣは非標的細胞よりも大きなサイズを有するが、かなり低い濃度で存在する。
【００３３】
標的細胞と非標的細胞とを含有するサンプルはサンプル入口２１２に導入され、シース緩衝液は第１の緩衝液入口２１４に導入される。サンプルおよびシース緩衝液の入力圧力はポンプシステムを用いて制御される。第１のスパイラルマイクロチャネル部分２２０の上流端２２２では、標的細胞および非標的細胞は両方とも、合流点でのサンプル入口結合路２１６および第１の緩衝液入口結合路２１８の位置に起因してチャネルの外側壁の近くに位置するであろう。
【００３４】
細胞が第１のスパイラルマイクロチャネル部分２２０を回って移動するにつれて、慣性揚力と以上に記載の遠心加速度誘起ディーン抗力との組合せに晒される。第１のスパイラルマイクロチャネル部分２２０の寸法は、標的細胞が慣性集束を起こし、一方、より小さな非標的細胞はディーン抗力のみを受けるように選択される。細胞が受ける力により、細胞はすべて第１のスパイラルチャネル部分２２０の外側壁から内側壁に向かって移動する。より小さな非標的細胞はディーン力の影響下で移動するので、非標的細胞がフルディーンサイクルを行った後、それらは移動して外側壁の近くの位置に戻っているであろう。より大きな標的細胞は、標的細胞を内側壁の近くの平衡位置に到達させる慣性集束を起こす。
【００３５】
第１のスパイラルマイクロチャネル部分２２０の長さは１回の完全ディーンサイクルに必要とされる長さになるように選択されるので、第１のスパイラルチャネル部分２２０の下流端２２４では、標的細胞は内側チャネル壁の近くの位置に存在し、一方、非標的細胞は外側細胞壁の近くに存在するであろう。
【００３６】
したがって、二分岐点２２６では、標的細胞はチャネルリンク路２４０に移動し、非標的細胞は第１の廃棄物出口部分２３０に移動するであろう。
【００３７】
第２のスパイラルマイクロチャネルステージ２５０に入る非標的細胞の数は、サンプル入口の数と比較して著しく枯渇されるであろう。第２のスパイラルマイクロチャネルステージ２５０で起こるプロセスは以上に記載のものに類似しているが、非標的細胞の大部分が第１のスパイラルマイクロチャネルステージ２１０で除去されるので、２つのステージの組合せにより標的細胞の非常に高い富化を達成可能である。
【００３８】
合流点２５６では、第１のスパイラルマイクロチャネルステージ２１０で富化された標的細胞を含むサンプルは、第２のシース緩衝液入口２５２を介して入力されるシース緩衝液と組み合わされる。チャネルリンク路２４０は第２のスパイラルマイクロチャネル部分２６０の外側壁に位置するので、細胞は初期に外側チャネル壁の近くの位置を占有する。第１のスパイラルマイクロチャネルステージ２１０で起こるものに類似したプロセスでは、標的細胞は、内側チャネル壁の近くの平衡位置に移動させる慣性集束を受ける。非標的細胞は、初期に内側チャネル壁に向かって移動させるディーン抗力を受ける。非標的細胞は、フルディーンサイクルを受けた後、外側チャネル壁の近くの位置に移動しているであろう。そのため、第２のスパイラルマイクロチャネル部分の長さをフルディーンサイクルに対応するように選択すれば、非標的細胞は、第２のスパイラルマイクロチャネル部分２６０の上流端２６４で外側チャネル壁の近くの位置を占有するであろう。したがって、残りの非標的細胞は第２の廃棄物出口結合路２６８に入り、一方、標的細胞はサンプル出口結合路２６６に入るであろう。
【００３９】
第１の廃棄物出口チャネル部分２３０の圧力コンペンセーター路２３４は、第２のスパイラルマイクロチャネルステージ２５０に起因するチャネル抵抗を補償するように含まれる。
【００４０】
図２ｂは、本発明の実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す。図２ｂに示されるマイクロチャネル装置３００のスパイラルマイクロチャネルステージの構成は、図２ａに示されるマイクロチャネル装置２００の構成と異なる。同じ特徴部に対しては図２ａと同じ参照数字が図２ｂで使用される。
【００４１】
マイクロ流体デバイス３００は、第１のスパイラルマイクロチャネルステージ２１０と第２のスパイラルマイクロチャネルステージ２５０とを含む。図２ｂのマイクロ流体デバイス３００では、第１のスパイラルステージのマイクロチャネルステージ２１０および第２のマイクロチャネルステージ２５０は両方とも、同一の回転方向のフローを有する。第１のスパイラルマイクロチャネルステージ２１０は、時計方向のスパイラル路に従う第１のスパイラルマイクロチャネル部分２２０を含む。図２ａに示されるマイクロ流体デバイス３００と同様に、サンプル入口ＳＩ２１２および第１の緩衝液入口ＢＩ１２１４は、第１のマイクロチャネル部分２２０の中心領域に位置する。
【００４２】
第１のスパイラルチャネル部分２２０の下流端２２４は、二分岐点２２６に結合され、そこで、マイクロチャネルは、リンクチャネル部分２４０と第１の廃棄物出口部分２３０とにスプリットする。リンクチャネル部分２４０は、第１のスパイラルマイクロチャネルステージ２１０を第２のスパイラルマイクロチャネルステージ２５０に結合する。第１の廃棄物出口部分２３０は、第１のスパイラルマイクロチャネルステージ２１０を第１の廃棄物出口ＷＯ１２３２に結合する。この実施形態では、第１の廃棄物出口部分２３０は、反時計回転方向のスパイラル路を有する。
【００４３】
第２のスパイラルマイクロチャネルステージ２５０は、図２ａを参照して以上に記載した通りである。
【００４４】
図３は、図１に示されるマイクロ流体デバイスのフロー抵抗の模式図を示す。ＰＢＩ、ＰＳＩ、ＰＳＯ、およびＰＷＯは、それぞれ、緩衝液入口１１４、サンプル入口１１２、サンプル出口１２６、および廃棄物出口１３０の圧力を表す。ＲＢおよびＲＳは、それぞれ、緩衝液入口結合部分１１８およびサンプル入口結合部分１１６のフロー抵抗を表す。ＲＣは、スパイラルマイクロチャネル部分１１０のフロー抵抗を表す。ＲＲおよびＲＷは、それぞれ、サンプル出口結合部分２３４および廃棄物出口結合部分１２８のフロー抵抗を表す。各チャンネルセクションのフロー抵抗は、ハーゲン・ポアズイユの法則：
ΔＰ＝１２８μＬ  Ｑ／（πｄ４）  （８．１）
に従って計算可能である。式中、ΔＰは圧力損失であり、Ｌはチャンネルセクションの長さであり、μは流体の動粘度であり、Ｑは体積流量であり、ｄはチャネルの水力直径である。
【００４５】
そのため、所与のチャネルに対して、このチャンネルセクションの抵抗は、
Ｒ＝ΔＰ／Ｑ＝１２８μＬ／（πｄ４）  （８．２）
に固定される。
【００４６】
シングルステージ設計では、主要因子の１つは、回収（サンプル出口）側と廃棄物側との流量比ｒＯである。この比は回収率と富化率とのバランスを決定する。所与のマイクロチャネル設計に対してこの比を計算するために、図３に示されるものに類似したフロー抵抗の模式図を描くことが可能である。本発明の場合には、非圧縮性ニュートン流体の層流を考える。ここで、流量比ｒＯは、ハーゲン・ポアズイユの法則を用いて計算可能である。このモデルは、サンプル／廃棄物の出力比、たとえば、ｒＯ＝ＱＳ／ＱＷの計算用である。式中、ＱＳおよびＱＷは、それぞれ、サンプル出力フローおよび廃棄物出力フローである。ｒＯは、標的細胞と共に捕集される汚染細胞の数を制限するので、富化係数にきわめて重要である。たとえば、ＣＴＣ単離では、ｒＯの調整は、単離の回収率および汚染率に重大な影響を及ぼす可能性があり、設計上、主要因子の１つである。
【００４７】
図４ａは、２ステージマイクロ流体デバイス、たとえば、図２ａおよび２ｂに示されるもののフロー抵抗を示す。かかる設計では、適正流量さらには効率的富化を保証するために２ステージ間の抵抗を一致させることが適切である。図４ａは、第２ステージのサンプル入力に接続された第１ステージのサンプル出力を有する２つのシングルステージシステムとして２ステージ設計をモデル化することにより得られる。ここで、図４ａでは、図２ａおよび２ｂのチャネルリンク路２４０は、第１ステージのサンプル出口抵抗ＲＲ１と第２ステージのサンプル入口結合抵抗ＲＳ２との組合せに対応することに留意されたい。図４ａの下付き文字１または２は、それぞれ、第１ステージおよび第２ステージを表す。
【００４８】
図４ｂは、図４ａに例示されるシステムの簡略平衡図を示す。図４ｂでは、第１の廃棄物出口の出口圧力（ＰＷＯ１）、第２の廃棄物出口の出口圧力（ＰＷＯ２）、およびサンプル出口の出口圧力（ＰＳＯ）がすべて等しいと仮定される。図４ｂでは、流量は次のように示される。すなわち、ＱＢＩ１＋ＳＩは、第１のスパイラルステージへのサンプルおよび緩衝液の両方の入力流量であり、ＱＷＯ１は、第１ステージの廃棄物出力の流量であり、ＱＢＩ２は、第２ステージへのシース緩衝液の入力流量であり、かつＱＳＯ＋ＷＯ２は、第２ステージのサンプル出力および廃棄物出力の出力流量である。第２ステージのサンプル入力レートＱＳＩ２は第１ステージのサンプル出力に等しいことに留意されたい。なぜなら、それはチャネルリンク路２４０を通るフローであるからである。
【００４９】
図４ｂでは、ＲＷ１は、第１の廃棄物出口部分２３０のフロー抵抗である。ＲＲ１＋Ｓ２は、チャネルリンク路２４０のフロー抵抗である。ＲＣ２＋Ｒ２／／Ｗ２は、第２のスパイラルマイクロチャネル部分２６０およびサンプル出口結合路２６６と第２の廃棄物出口結合路２６８との平行な組合せのフロー抵抗である。出力の要件さらにはシステムの安定性を満たすように注意深く設計または選択しなければならないのは、図４ｂに示される各要素のフロー抵抗である。
【００５０】
第２ステージの設計問題は、以下のように記述可能である。
【００５１】
ＱＢＩ２およびＱＢＩ１＋ＳＩを仮定して、
ＱＳＯ１／ＱＷＯ１＝ＱＳＩ２／ＱＷＯ１＝（ＱＢＩ１＋ＳＩ−ＱＷＯ１）／ＱＷＯ１＝ｒＯ１  （９）
となるようにＲＲ１＋Ｓ２、ＲＣ２＋Ｒ２／／Ｗ２、およびＲＷ１を計算する。
【００５２】
ここで、ＱＢＩ２およびＱＢＩ１＋ＳＩのフローインならびにＱＳＯ＋ＷＯ２およびＱＷＯ１のフローアウトは正であると仮定する。
【００５３】
質量保存およびハーゲン・ポアズイユの法則に従って、
ＱＢＩ２＋ＱＢＩ１＋ＳＩ＝ＱＳＯ＋ＷＯ２＋ＱＷＯ１  （１０）
が得られる。
【００５４】
すべての出口圧力が等しいと仮定することにより、式（８．２）に従えば、ｃ１の後の圧力低下の大きさは、流体がｗ１およびｃ２を通って流れるとき、等しいことになる。すなわち、
ＱＳＯ＋ＷＯ２ＲＣ２＋Ｒ２／／Ｗ２＋ＱＳＩ２ＲＲ１＋Ｓ２＝ΔＰＣ２＋Ｒ２／／Ｗ２＋ΔＰＲ１＋Ｓ２＝ΔＰＷ１＝ＱＷＯ１ＲＷ１  （１１）
または
ＲＣ２＋Ｒ２／／Ｗ２／（ＲＷ１−ｒＯ１ＲＲ１＋Ｓ２）＝ＱＷＯ１／ＱＳＯ＋ＷＯ２  （１１．１）
【００５５】
式（９）および（１０）から、ＱＳＯ＋ＷＯ２およびＱＷＯ１の所望の値を得ることが可能である。
【００５６】
ｒＯ’＝ｒＯ１＋ＱＢＩ２／ＱＷＯ１＝（ＱＢＩ２＋ＱＳＩ２）／ＱＷＯ１を定義することにより、
ｒＯ’＝（ＱＢＩ２＋ＱＳＩ２）／ＱＷＯ１
＝ＱＳＯ＋ＷＯ２／ＱＷＯ１
＝（ＲＷ１−ｒＯ１ＲＲ１＋Ｓ２）／ＲＣ２＋Ｒ２／／Ｗ２  （１２）
を得ることが可能である。
【００５７】
フロー抵抗ＲＣ２＋Ｒ２／／Ｗ２、ＲＷ１、およびＲＣ２＋Ｒ２／／Ｗ２のうち２つの値が与えられれば、最後の１つは計算可能であることが式（１２）から分かる。これら値を設計する目的はｒＯ１またはｒＯ’をできる限り安定になるようにすることであるので、こうして２ステージチップの全設計のガイドラインは以下のように与えることが可能であると要約できる。
【００５８】
最初に、大きな粒子がチャネルの内側に集束し、一方、小さな成分はディーンボルテックスフローに従ってチャネル断面の外側半分にマイグレートする要件を満たすように、主要セクション、すなわち、すべてのステージのスパイラルセクションの長さ、曲率半径、チャネル断面の幅および高さを決定する。一般的には、チャネルの設計を単純化するために、各ステージのスパイラルセクションが同一の形状パラメーター、すなわち、長さ、曲率半径、チャネル断面の幅および高さを共有するようにできる。チップのチャネル構造を２次元に維持することが望まれるので、すべてのチャンネルセクションの高さＨをスパイラルセクションの高さに等しい高さに固定することが可能である。
【００５９】
次いで、ポアズイユの式を用いてＲＣ１＝ＲＣ２＝ＲＣ＝１２８μＬｃ／（πｄｃ４）を計算することが可能である。さらに設計を単純化するために、ｒＯ１＝ｒＯ２およびＱＢＩ２＝ＱＷＯ１とすることが可能である。したがって、ｒＯ’＝ｒＯ１＋１＝ｒＯ２＋１が得られる。一実施形態では、サンプル側の入力体積の約２７％および各ステージの廃棄物側の７３％を捕集する。すなわち、ｒＯ１＝ｒＯ２≒０．３７。この出力比の実用範囲は、実際の分離実験では０．１〜１０であり得る。
【００６０】
次いで、二分岐点２６４近傍の乱流の発生を防止するために、ｒＯ２≒ＷＲ２／ＷＷ２となるように最終ステージの出力セクションの幅ＷＲ２およびＷＷ２を決定する。これらのセクションの長さは、ｒＯ２＝ＱＳＯ２／ＱＷＯ２＝ＲＷＯ２／ＲＳＯ２の要件を満たすようにポアズイユの式に従って設計可能である。
【００６１】
次いで、平衡フロー抵抗ＲＣ２＋Ｒ２／／Ｗ２＝ＲＣ２＋ＲＲ２／／ＲＷ２を計算する。ここで、ＲＲ２／／ＲＷ２は、並列の抵抗の組合せを表す。
【００６２】
次いで、ｒＯ１≒ＷＲ１／ＷＷ１となるように第１ステージの出力セクションの幅ＷＲ１およびＷＷ１を決定可能である。
【００６３】
チップ製造に対する許容差の制限から、より狭いチャネル（サンプル側）よりもより広いチャネル（廃棄物側）の方が抵抗の正確性を制御しやすいことが分かる。そのため、図４ｂの３つの抵抗セクションすべてが流量分配に重要な役割を果たすが、２ステージのリンクセクションをより短くすること、すなわち、ＲＲＩ＋Ｓ２を可能な限り小さくすることが有利であり、これは、図２ａおよび２ｂに示されるチャネルリンクセクション２４０に対応する。次いで、第１の廃棄物出力の長さをそれに応じて計算可能である。
【００６４】
入力時の適正なサンプル分配を保証するために、入力の幅は、それぞれ、各入力の流量に比例するように設計すべきである。
【００６５】
次いで、セクションの長さが要件を満たすとともに互いに近づきすぎない位置に、入力および出力ポートを計画し配置することが可能である。ポンプ機構の負荷を低減するために大きな抵抗のセクションは回避すべきである。
【実施例】
【００６６】
一実施形態例では、マイクロ流体デバイスはＣＴＣ分離に使用される。目標は、他の血液細胞（ＲＢＣ約８μｍ、ＷＢＣ約１０〜１５μｍ、ＷＢＣの直径の典型的な値は約１２μｍである）からＣＴＣ（約２０μｍ）を単離することである。図２ａに類似したレイアウトおよび１０ｍｍの曲率半径を有する５００μｍ（幅）×１７５μｍ（高さ）×約２．２５ループのチャネルを有する２ステージ設計を用いて分離を完了する。最終ステージでかなりロバストな純度を達成可能であるので、このチップのスループットをシングルチップよりも高くすることも可能である。現在の設計の等価なスループットはＲＢＣ溶解全血約３４０μＬ／ｍｉｎであるので、７．５ｍＬの血液サンプルを２２分で処理可能である。ＣＴＣの回収率は＞５０％であり、かつ全ＷＢＣ数を５００個以内に制御可能であるので、下流の各種分子分析に好適である。
【００６７】
以下の表ＡおよびＢは、シングルステージチップおよび２ステージチップで７．５ｍｌの血液をスパイクしたときの癌細胞系（Ｈ１９７５細胞）の回収率および得られた不純物レベル（全白血球数）に関してシングルステージチップと２ステージチップとの比較を示す。
【００６８】
【表１】
2019509016.tif 000009
【００６９】
【表２】
2019509016.tif 000010
【００７０】
以上の表は、２ステージチップではシングルステージチップのほぼ１００倍の不純物枯渇を達成可能であることを示す。
【００７１】
慣性マイクロ流体技術を用いたサイズベース分離の品質に影響を及ぼし得る各種因子が存在する。不純物からの標的細胞の富化に関して、理由としては、サンプルの品質、細胞の濃度、ポンプの安定性および繰返し性、チップ製造の許容差などが挙げられる。細胞の小さな凝塊は、マイクロチャネル内の流動プロファイルを撹乱する可能性があり、何百／何千個もの不純物を標的細胞出力に誘導するおそれがある。さらに、高濃度のサンプルたとえば血液サンプルでは、立体的相互作用もまた、標的チャネル出力に入る非標的細胞をもたらして富化率を低減する可能性がある。ポンプストラテジーの脈動は、標的細胞出力に入る不純物を著しく増加させて富化係数を低減する可能性がある。製造または他の問題に起因する出力体積比の偏りは、定常不純物フローを標的細胞出力に導いて富化率をさらに低減するおそれがある。
【００７２】
図５は、シングルステージチップおよび２ステージチップを用いた富化（不純物の枯渇）を示す模式グラフ（原寸通りではない）である。
【００７３】
図５に示されるように、シングルステージチップを用いた場合、２ステージチップと比較して、流量変動、出力圧力差、チップ間の製造許容差、およびサンプル品質の変動を伴って、標的細胞の富化（不純物の枯渇）に劇的な影響がある。
【００７４】
以上に列挙した理由により、シングルステージのスパイラルマイクロチャネルバイオチップでは、図５に示される高富化を達成することは困難である。マルチステージチップ設計を用いれば、上述した理由により、影響を最小限に抑えることが可能である。不純物の大部分は第１ステージで除去されるであろうから、第２ステージに入る細胞負荷（ロード）は全サンプルの＜０．１％になるであろう。かかる低細胞濃度では、サンプル品質、細胞間の立体的相互作用、ポンプの安定性、さらには製造の許容差の影響は最小限に抑えられるので、図５に示されるより高い安定性および繰返し性が得られる。
【００７５】
添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の実施形態に対して形態および詳細のさまざまな修正および変更を行い得ることは、当業者であれば分かるであろう。
【図１】
2019509016.tif 000011
【図２ａ】
2019509016.tif 000012
【図２ｂ】
2019509016.tif 000013
【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
2019509016.tif 000017
【手続補正書】
【提出日】平成28年10月14日(2016.10.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞と非標的細胞とを含むサンプルを受容するための少なくとも１つの入口と、
中心領域の上流端と周辺領域の下流端とを有する第１のスパイラルチャネル部分であって、前記上流端が前記入口に結合され、前記第１のスパイラルチャネル部分が、前記標的細胞と前記非標的細胞とが前記下流端で異なるストリームを占有するように構成される、第１のスパイラルチャネル部分と、
前記第１のスパイラルチャネル部分の前記下流端で非標的細胞のストリームに結合するように配置された第１の廃棄物出口と、
前記第１のスパイラルチャネル部分の前記下流端で標的細胞のストリームに結合するように配置されたリンクチャネル部分と、
周辺領域の上流端と中心領域の下流端とを有する第２のスパイラルチャネル部分であって、前記第２のチャネル部分の前記上流端が前記リンクチャネル部分に結合され、前記第２のスパイラルチャネル部分が、前記標的細胞と前記非標的細胞とが前記下流端で異なるストリームを占有するように構成される、第２のスパイラルチャネル部分と、
前記第２のスパイラルチャネル部分の前記下流端で非標的細胞のストリームに結合するように配置された第２の廃棄物出口と、
前記第２のスパイラルチャネル部分の前記下流端で標的細胞のストリームに結合するように配置されたサンプル出口と、
を含むマイクロ流体デバイスであって
前記マイクロ流体デバイスが、前記第１のスパイラルチャネル部分の前記下流端を前記第１の廃棄物出口に結合する圧力コンペンセーター路であって、前記第２のスパイラルチャネル部分の流体抵抗を補償するように選択された流体抵抗を有する圧力コンペンセーター路をさらに含む、マイクロ流体デバイス。
【請求項２】
前記第１のスパイラルチャネル部分の前記上流端に結合された第１の緩衝液入口であって、シース緩衝液を受容するように構成された第１の緩衝液入口と、前記第２のスパイラルチャネル部分の前記上流端に結合された第２の緩衝液入口であって、シース緩衝液を受容するように構成された第２の緩衝液入口と、をさらに含む、請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項３】
前記第１の緩衝液入口が、前記第１のスパイラルチャネル部分の内側壁に近接する前記第１のスパイラルチャネル部分に前記シース緩衝液を導入するように配置され、かつ前記少なくとも１つの入口が、前記第１のスパイラルチャネル部分の外側壁に近接する前記第１のスパイラルチャネル部分に前記サンプルを導入するように配置される、請求項２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項４】
前記サンプルが血液サンプルまたは血液成分である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項５】
前記標的細胞が循環腫瘍細胞または循環希薄細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項６】
前記第１および第２のスパイラルチャネル部分が、前記標的細胞が慣性集束を起こすようにかつ前記非標的細胞がディーン力の影響下で横方向位置にマイグレートするように構成される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項７】
前記標的細胞が細胞直径閾値超の細胞直径を有し、かつ前記非標的細胞が前記細胞直径閾値未満の直径を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項８】
前記第１の廃棄物出口および前記チャネルリンク部分に関連するフロー抵抗がフロー比に基づいて構成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項９】
前記第１の廃棄物出口および前記チャネルリンク部分に関連するチャネル幅が前記フロー比に基づいて構成される、請求項８に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
前記第２の廃棄物出口および前記サンプル出口に関連するフロー抵抗が前記フロー比に基づいて構成される、請求項８または９に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
前記第２の廃棄物出口および前記サンプル出口に関連するチャネル幅が前記フロー比に基づいて構成される、請求項１０に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
前記フロー比が０．１〜１０の範囲内である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
【国際調査報告】
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