(57)【要約】本発明は、一般に、ＨＩＶ陰性個体のＨＩＶ感染を予防するための免疫療法に関する。特に、本方法は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏ濃縮を含む。本発明は、一般に、ＨＩＶを予防するためのワクチン接種、および免疫療法の分野に関する。特に、開示された予防方法は、ウイルスベクターの投与、および遺伝子を送達するためのシステム、ならびに他の療法用、診断用、または研究用の使用に関する。
2019509029.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ感染に耐性の細胞を産生するための方法であって、
（ａ）ＨＩＶ陰性の対象から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、治療有効量の刺激性作用剤と接触させるステップであって、前記接触がｅｘ  ｖｉｖｏで実施される、ステップ；
（ｂ）ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、少なくとも１つの遺伝的エレメントをコードするウイルス送達システムを用いて前記ＰＢＭＣに形質導入するステップであって、前記少なくとも１つの遺伝的エレメントが、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、またはＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とすることができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含む、ステップ；および
（ｃ）形質導入された前記ＰＢＭＣを、少なくとも１日間培養するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
形質導入された前記ＰＢＭＣを対象に注入するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象がヒトである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記刺激性作用剤がペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、ｇａｇペプチドを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記刺激性作用剤がワクチンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ワクチンが、ＨＩＶワクチンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＨＩＶワクチンが、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンまたはその改変体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルス送達システムが、レンチウイルス粒子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの遺伝的エレメントが、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、およびＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とすることができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＨＩＶ  ＲＮＡ配列が、ＨＩＶ  Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ  Ｔａｔ配列、またはそれらの改変体を含む、請求項１または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの遺伝的エレメントが、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む、請求項１または１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの遺伝的エレメントが、マイクロＲＮＡクラスターを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの遺伝的エレメントが、
【化５５】
2019509029.tif 000137
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有するマイクロＲＮＡを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの遺伝的エレメントが、
【化５６】
2019509029.tif 000138
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの遺伝的エレメントが、
【化５７】
2019509029.tif 000139
と少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性パーセントを有するか、または
【化５８】
2019509029.tif 000140
と少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性パーセントを有するマイクロＲＮＡを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの遺伝的エレメントが、
【化５９】
2019509029.tif 000141
を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記マイクロＲＮＡクラスターが、
【化６０】
2019509029.tif 000142
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記マイクロＲＮＡクラスターが、
【化６１】
2019509029.tif 000143
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
ＨＩＶ陰性対象のＨＩＶ感染を予防するための方法であって、
（ａ）有効量の第１の刺激性作用剤で前記対象を免疫化するステップ；
（ｂ）前記対象から白血球を取り出し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製するステップ；
（ｃ）ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、前記ＰＢＭＣを治療有効量の第２の刺激性作用剤と接触させるステップ；
（ｄ）ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、少なくとも１つの遺伝的エレメントをコードするウイルス送達システムを用いて前記ＰＢＭＣに形質導入するステップ；
（ｅ）形質導入された前記ＰＢＭＣを、少なくとも１日間培養するステップ；および
（ｆ）形質導入された前記ＰＢＭＣを前記対象に注入するステップ
を含む、方法。
【請求項２１】
前記第１の刺激性作用剤および前記第２の刺激性作用剤のうちの少なくとも１つが、ｇａｇペプチドを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の刺激性作用剤および前記第２の刺激性作用剤のうちの少なくとも１つが、ＨＩＶワクチンを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＨＩＶワクチンが、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンまたはその改変体を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの遺伝的エレメントが、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、またはＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とすることができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの遺伝的エレメントが、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、およびＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とすることができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含む、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１６年７月８日に出願され、「ＨＩＶ  ＶＡＣＣＩＮＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＹ」と題された米国仮特許出願第６２／２９２，７４８号（その開示は、参照によって本明細書に組み込まれる）に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般に、ＨＩＶを予防するためのワクチン接種および免疫療法の分野に関する。特に、開示された予防方法は、ウイルスベクターの投与および遺伝子を送達するためのシステム、ならびに他の療法用、診断用、または研究用の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
広範な実験研究および臨床研究にもかかわらず、疾患に対する持続的な防御を示すＨＩＶワクチンの生成は成功に至っていない。これらの研究の過程で、抗体および細胞溶解性Ｔ細胞応答を含む、ウイルス免疫の局面はほぼすべてが研究されており、防御のためのメカニズムに関連付けられている。防御メカニズムの幅広さは、ＨＩＶの重要な影響、およびＨＩＶが免疫システムを回避して持続感染の確立を可能にするためのメカニズムが、主にウイルス特異的ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の破壊に焦点を合わせていることを示唆する。
【０００４】
ＨＩＶに曝露されると、ウイルス特異的ヘルパーＴ細胞は、ＨＩＶに由来するペプチドを認識し、これらの細胞は高度に活性化され、増殖を開始する。病原体の存在に応答した活性化状態は、ＨＩＶ付着および侵入に対して、ＣＤ４  Ｔ細胞を特に感受性にする。活性化されたＴ細胞は、感染後に最も高いレベルのウイルスを産生し、体内でのウイルス増殖および播種の主な促進因子となる。ＨＩＶが、ウイルス特異的細胞を死滅させ、その過程で宿主免疫を無効にしつつ、ＣＤ４  Ｔ細胞活性化を引き起こし、かつその応答から利益を得る能力は、重要な疾患メカニズムである。
【０００５】
ワクチン接種は、疾患の大流行、汎流行、および流行を予防するための重要な公衆衛生ツールである。ＨＩＶ予防ワクチンに注力する国際的努力が相当程度なされているが、この努力は、これまでのところ、集団免疫化プログラムを正当化するほど十分に強力な産物の発見に成功していない。これまでで最も成功した研究では（「Thai治験」として公知である）、複数の注射を必要とする複合ワクチンが、ＨＩＶ感染に対して、あるレベルの一時的防御を提供した。このワクチンは集団使用に適切ではなかったが、臨床試験が成功したことにより、予防的ＨＩＶワクチンの生成が実現可能であることが実証された。最も重要なことには、Thai治験は、産生された抗体のタイプを含むワクチン応答の質的特徴が、産物の成功の期待内にあることを明らかにした。しかしながら、防御の持続性は、実用には短すぎた。
【０００６】
ワクチン接種の背後にある概念は、宿主の免疫システムが、既に十分な数のウイルス特異的細胞、特にＣＤ４  Ｔ細胞を有し、曝露が生じれば直ぐに応答する準備ができているため、感染性病原体に対して宿主が優位性を獲得するということである。ウイルス、この場合はＨＩＶが、ウイルス特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を攻撃し、そのレベルを減少させることができる場合、ワクチン接種の優位性は、急速に失われ、感染は予防されない。
【０００７】
特定のウイルスエンベロープ−宿主細胞受容体相互作用および遺伝子発現についてのウイルス機構の故に、標的細胞に遺伝子を形質導入するためにウイルスベクターを使用することができる。結果として、ウイルスベクターは、全Ｔ細胞または他の免疫細胞ならびに胚、受精卵、単離された組織試料、ｉｎ  ｓｉｔｕの組織標的、および培養細胞を含む多くの異なる細胞型への遺伝子の移入のためのビヒクルとして使用されてきている。細胞内に外来遺伝子または改変遺伝子を導入および発現する能力は、遺伝子治療、誘導多能性幹細胞の体細胞再プログラミング、および様々な型の免疫療法のような療法介入に有用である。
【０００８】
遺伝子治療は、ウイルスベクターの使用を含み得る新しい療法を作出する可能性を有する生物医学研究の最も成熟した領域の１つである。療法に利用可能な幅広い種類の潜在的な遺伝子を考慮すると、感染性疾患および非感染性疾患を治療する手段としての遺伝子治療の将来性を実現するためには、これらの遺伝子を送達する効率的な手段が必要である。マウスレトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（アデノ随伴ウイルス）、ワクシニアウイルス、およびヘルペスウイルスを含むいくつかのウイルスシステムが療法用遺伝子移入ベクターとして提案されている。
【０００９】
組織指向性、ウイルス調製物の安定性、発現の安定性および制御、ゲノムパッケージング能力、および構築物依存性ベクター安定性を含む、ウイルスベクターを開発する際に考慮しなければならない多くの因子がある。さらに、ウイルスベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ応用は、ウイルス構造タンパク質および／または形質導入遺伝子産物に対する宿主免疫応答によってしばしば制限される。
【００１０】
したがって、毒性および安全性は、対象の治療のためにｉｎ  ｖｉｖｏで使用されるウイルスベクターにとって克服されなければならない重要なハードルである。遺伝子送達ビヒクルまたは療法用遺伝子産物に対する宿主免疫応答に関連する問題を抱えた、ヒトにおける遺伝子治療応用の数多くの歴史的例が存在する。１つまたは複数の療法遺伝子と共にいくつかのウイルス遺伝子を同時形質導入するウイルスベクター（例えばアデノウイルス）は特に問題である。
【００１１】
レンチウイルスベクターは一般に細胞傷害性を誘導せず、強力な宿主免疫応答を誘発しないが、いくつかの免疫刺激遺伝子産物を有するＨＩＶ−１のようないくつかのレンチウイルスベクターは、細胞毒性を引き起こし、ｉｎ  ｖｉｖｏで強い免疫応答を誘導する可能性がある。しかしながら、これは、形質導入後に複数のウイルス遺伝子をコードしないレンチウイルス由来の形質導入ベクターにとっては問題ではないかもしれない。もちろん、臨床的に有用な免疫応答を引き起こすであろうタンパク質をコードすることがベクターの目的であることもあるので、このことが必ずしも当てはまるわけではないだろう。
【００１２】
レンチウイルスベクターの使用に関する他の重要な問題は、いくつかの細胞傷害性ウイルスタンパク質への曝露の際に起こり得る細胞病原性の問題である。特定のＨＩＶ−１タンパク質への曝露は、細胞死またはＴ細胞における機能不応答性を誘導するかもしれない。同様に、組換えによる複製コンピテントな毒性ウイルスを生成する可能性が、しばしば問題となる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
明らかに、当技術分野には、遺伝子治療および免疫療法によるＨＩＶに対するワクチン防御の効力および持続性の改善が必要とされており、本開示は、免疫化を遺伝子治療剤と組み合わせ、それによりＨＩＶに対するワクチンの防御効果を改善して、ウイルス特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の急速な枯渇を防止することによって、この必要性を満たす。
【００１４】
一態様では、ＨＩＶ陰性対象のＨＩＶ感染を予防するための方法が開示される。方法は、有効量の第１の刺激性作用剤で対象を免疫化するステップ；対象から白血球を取り出し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得るステップを含む。方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、ＰＢＭＣを、治療有効量の第２の刺激性作用剤と接触させるステップ；ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、少なくとも１つの遺伝的エレメントをコードするウイルス送達システムを用いてＰＢＭＣに形質導入するステップ；形質導入されたＰＢＭＣを適度な形質導入を保証する十分な期間にわたって培養するステップ；および形質導入されたＰＢＭＣを対象に注入するステップをさらに含む。実施形態では、形質導入されたＰＢＭＣを、約１日から約３５日まで培養してもよい。対象は、ヒトであってもよい。第１および第２の刺激性作用剤は、同じであってもよく、または異なっていてもよい。刺激性作用剤としては、対象でのＴ細胞応答を刺激するのに適切な任意の作用剤を挙げることができる。実施形態では、第１および第２の刺激性作用剤の少なくとも１つは、ペプチドまたはペプチドの混合物である。実施形態では、第１および第２の刺激性作用剤の少なくとも１つは、ｇａｇペプチドを含む。また、実施形態では、第１および第２の刺激性作用剤の少なくとも１つは、ワクチンを含む。ワクチンは、ＨＩＶワクチンであってもよく、実施形態では、ＨＩＶワクチンは、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンまたはその改変体である。実施形態では、ウイルス送達システムは、レンチウイルス粒子を含む。実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡを含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とすることができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、およびＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とすることができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含んでいてもよい。ＨＩＶ  ＲＮＡ配列は、ウイルス送達システムによる標的化に適切な任意のＨＩＶ配列を含む。実施形態では、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列は、ＨＩＶ  Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ  Ｔａｔ配列、またはそれらの改変体の１つまたは複数を含む。少なくとも１つの遺伝的エレメントとしては、ウイルス送達システムにより発現され得る任意の遺伝的エレメントが挙げられる。実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。さらなる実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、マイクロＲＮＡクラスターを含む。
【００１５】
別の態様では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化１】
2019509029.tif 000003
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有するマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化２】
2019509029.tif 000004
を含む。
【００１６】
別の態様では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化３】
2019509029.tif 000005
と少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性パーセントを有するか、または
【化４】
2019509029.tif 000006
と少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性パーセントを有するマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化５】
2019509029.tif 000007
を含む。
【００１７】
別の態様では、マイクロＲＮＡクラスターは、
【化６】
2019509029.tif 000008
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む。好ましい実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、
【化７】
2019509029.tif 000009
を含む。
【００１８】
別の態様では、ＨＩＶに耐性の細胞を産生するための方法が提供される。方法は、ＨＩＶ陰性の対象から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、治療有効量の刺激性作用剤と接触させるステップであって、接触が、ｅｘ  ｖｉｖｏで実施されるステップ；ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、少なくとも１つの遺伝的エレメントをコードするウイルス送達システムを用いてＰＢＭＣに形質導入するステップ；および形質導入されたＰＢＭＣを、適度な形質導入を保証する十分な期間にわたって培養するステップを、様々に含む。実施形態では、形質導入されたＰＢＭＣを、約１日〜約３５日まで培養してもよい。方法は、形質導入されたＰＢＭＣを対象に注入するステップをさらに含んでいてもよい。対象は、ヒトであってもよい。刺激性作用剤は、ペプチドまたはペプチドの混合物を含んでいてもよく、実施形態では、ｇａｇペプチドを含む。刺激性作用剤は、ワクチンを含んでいてもよい。ワクチンは、ＨＩＶワクチンであってもよく、実施形態では、ＨＩＶワクチンは、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンまたはその改変体である。実施形態では、ウイルス送達システムは、レンチウイルス粒子を含む。実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、またはＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とすることができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含んでいてもよい。実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡを含む。実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とすることができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含む。ＨＩＶ  ＲＮＡ配列は、ＨＩＶ  Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ  Ｔａｔ配列、またはそれらの改変体を含んでいてもよい。少なくとも１つの遺伝的エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含んでいてもよい。好ましい実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、マイクロＲＮＡクラスターを含む。
【００１９】
別の態様では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化８】
2019509029.tif 000010
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有するマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化９】
2019509029.tif 000011
を含む。
【００２０】
別の態様では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化１０】
2019509029.tif 000012
と少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性パーセントを有するか、または
【化１１】
2019509029.tif 000013
と少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性パーセントを有するマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化１２】
2019509029.tif 000014
を含む。
【００２１】
別の態様では、マイクロＲＮＡクラスターは、
【化１３】
2019509029.tif 000015
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む。好ましい実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、
【化１４】
2019509029.tif 000016
を含む。
【００２２】
別の態様では、レンチウイルスベクターが開示される。レンチウイルスベクターは、少なくとも１つのコードされた遺伝的エレメントを含み、少なくとも１つのコードされた遺伝的エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡを含む。また、少なくとも１つのコードされた遺伝的エレメントは、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とすることができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含んでいてもよい。別の態様では、少なくとも１つのコードされた遺伝的エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、およびＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とすることができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含む。ＨＩＶ  ＲＮＡ配列は、ＨＩＶ  Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ  Ｔａｔ配列、またはそれらの改変体を含んでいてもよい。少なくとも１つのコードされた遺伝的エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含んでいてもよい。少なくとも１つのコードされた遺伝的エレメントは、マイクロＲＮＡクラスターを含んでいてもよい。
【００２３】
別の態様では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化１５】
2019509029.tif 000017
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有するマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化１６】
2019509029.tif 000018
を含む。
【００２４】
別の態様では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化１７】
2019509029.tif 000019
と少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性パーセントを有するか、または
【化１８】
2019509029.tif 000020
と少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性パーセントを有するマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化１９】
2019509029.tif 000021
を含む。
【００２５】
別の態様では、マイクロＲＮＡクラスターは、
【化２０】
2019509029.tif 000022
と少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％の同一性パーセントを有する配列を含む。好ましい実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、
【化２１】
2019509029.tif 000023
を含む。
【００２６】
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現するためのレンチウイルスベクターシステムが開示される。システムは、本明細書に記載のようなレンチウイルスベクター、好ましくは細胞に感染するために最適化されているエンベロープタンパク質を発現するためのエンベローププラスミド、および目的の遺伝子を発現するための少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。実施形態では、目的の遺伝子は、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子の１つまたは複数を含む。実施形態では、レンチウイルスベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドは、パッケージング細胞株にトランスフェクトされる。さらなる実施形態では、レンチウイルス粒子は、パッケージング細胞株により産生される。実施形態では、レンチウイルス粒子は、目的の標的の産生をモジュレーションすることができる。実施形態では、目的の標的は、ケモカイン受容体ＣＣＲ５またはＨＩＶ  ＲＮＡ配列のいずれかである。システムは、第１のヘルパープラスミドおよび第２のヘルパープラスミドをさらに含んでいてもよい。実施形態では、第１のヘルパープラスミドは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を発現し、第２のヘルパープラスミドは、ｒｅｖ遺伝子を発現する。
【００２７】
別の態様では、細胞に感染することができるレンチウイルス粒子が提供される。レンチウイルス粒子は、好ましくは細胞に感染するために最適化されたエンベロープタンパク質、および本明細書に記載のようなレンチウイルスベクターを含む。実施形態では、エンベロープタンパク質は、Ｔ細胞に感染するために最適化されていてもよい。好ましい実施形態では、エンベロープタンパク質は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞に感染するために最適化されている。
【００２８】
別の態様では、改変細胞が提供される。改変細胞は、本態様および実施形態に従って使用するためのレンチウイルスベクターシステムに感染させることができる任意の細胞を含む。実施形態では、細胞は、レンチウイルス粒子に感染するＣＤ４＋  Ｔ細胞である。また、実施形態では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＨＩＶ抗原を認識するように選択されている。実施形態では、ＨＩＶ抗原は、ｇａｇ抗原を含む。実施形態では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、レンチウイルス粒子による感染後に、減少したレベルのＣＣＲ５を発現する。
【００２９】
別の態様では、療法的治療レジメン用に対象を選択するための方法が提供される。方法は、有効量の第１の刺激性作用剤で対象を免疫化するステップ；対象から白血球を取り出し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製し、ＰＢＭＣに関連する少なくとも１つの因子に関連する第１の定量化可能な測定値を決定するステップ；ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、ＰＢＭＣを治療有効量の第２の刺激性作用剤と接触させ、ＰＢＭＣに関連する少なくとも１つの因子に関連する第２の測定値を決定するステップを様々に含み、第２の定量化可能な測定値が、第１の定量化可能な測定値よりも高い場合、対象が、治療レジメン用に選択される。任意選択で、治療レジメンは、予防的治療レジメンである。少なくとも１つの因子は、Ｔ細胞増殖またはＩＦＮガンマ産生のいずれかを含んでいてもよい。
【００３０】
前述の一般的な記載ならびに以下の図面の簡単な説明および発明を実施するための形態は、例示的かつ説明的であり、特許請求する本発明のさらなる説明を提供することを意図している。他の目的、利点、および新規な特徴は、以下の図面の簡単な説明および発明を実施するための形態から当業者に容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本開示のｅｘ  ｖｉｖｏ治療法のフローダイヤグラムを示す。
【００３２】
【図２】図２は、本開示によるＣＤ４＋  Ｔ細胞の変更および新しい感染の予防を示す。
【００３３】
【図３】図３は、療法用ベクター、ヘルパープラスミド、およびエンベローププラスミドで構成されている例示的なレンチウイルスベクターシステムを示す。ここに示されている療法用ベクターは、本明細書ではＡＧＴ１０３とも呼ばれ、ｍｉＲ３０ＣＣＲ５−ｍｉＲ２１Ｖｉｆ−ｍｉＲ１８５−Ｔａｔを含む、好ましい療法用ベクターである。
【００３４】
【図４】図４は、環状化形態の例示的な３ベクターレンチウイルスベクターシステムを示す。
【００３５】
【図５】図５は、環状化形態の例示的な４ベクターレンチウイルスベクターシステムを示す。
【００３６】
【図６】図６は、例示的なベクター配列を示す。プロモーターおよびｍｉＲクラスターのプラス（つまり、ゲノム）鎖配列は、ＣＣＲ５指向性ＨＩＶ株の拡散を阻害するために開発された。下線で示されていない配列は、このｍｉＲクラスターの好ましいプロモーターであるとして選択されたＥＦ−１アルファ転写プロモーターを含む。下線で示した配列は、ｍｉＲ３０  ＣＣＲ５、ｍｉＲ２１  Ｖｉｆ、およびｍｉＲ１８５  ＴａｔからなるｍｉＲクラスターを示す（配列番号３３にまとめて示されている）。
【００３７】
【図７】図７は、本開示の種々の態様による例示的なレンチウイルスベクター構築物を示す。
【００３８】
【図８】図８は、実験ベクターによりＣＣＲ５がノックダウンされたこと、およびそれに対応して、ＡＧＴｃ１２０細胞でのＲ５指向性ＨＩＶ感染が予防されたことを示す。（Ａ）は、ＡＧＴ１０３レンチウイルスベクターを含むか、または含まないＡＧＴｃ１２０細胞におけるＣＣＲ５発現を示す。（Ｂ）は、ＨＩＶのＮｅｆ遺伝子に融合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＨＩＶ  ＢａＬウイルスストックによる感染に対する形質導入されたＡＧＴｃ１２０細胞の感受性を示す。
【００３９】
【図９】図９は、本開示のレンチウイルスベクターのｓｈＲＮＡ阻害剤配列によって、ＣＣＲ５発現が調節されたことを実証するデータを示す。（Ａ）潜在的な候補のスクリーニングデータが示されている。（Ｂ）ＣＣＲ５  ｓｈＲＮＡ−１（配列番号１６）を形質導入した後のＣＣＲ５ノックダウンデータが示されている。
【００４０】
【図１０】図１０は、本開示のレンチウイルスベクターのｓｈＲＮＡ阻害剤配列によって、ＨＩＶ成分が調節されたことを実証するデータを示す。（Ａ）ｒｅｖ／ｔａｔ標的遺伝子のノックダウンデータが示されている。（Ｂ）ｇａｇ標的遺伝子のノックダウンデータが示されている。
【００４１】
【図１１】図１１は、ＡＧＴ１０３が、本明細書に記載のように、ＨＩＶ発現プラスミドをトランスフェクトした細胞においてＴａｔタンパク質の発現を低減させることを実証するデータを示す。
【００４２】
【図１２】図１２は、本開示のレンチウイルスベクターの合成マイクロＲＮＡ配列によって、ＨＩＶ成分が調節されたことを実証するデータを示す。（Ａ）Ｔａｔノックダウンデータが示されている。（Ｂ）Ｖｉｆノックダウンデータが示されている。
【００４３】
【図１３】図１３は、本開示のレンチウイルスベクターの合成マイクロＲＮＡ配列によって、ＣＣＲ５発現が調節されたことを実証するデータを示す。
【００４４】
【図１４】図１４は、長鎖または短鎖ＷＰＲＥ配列を含む本開示のレンチウイルスベクターの合成マイクロＲＮＡ配列によって、ＣＣＲ５発現が調節されたことを実証するデータを示す。
【００４５】
【図１５】図１５は、ＷＰＲＥ配列を含むまたは含まない本開示のレンチウイルスベクターの合成マイクロＲＮＡ配列によって、ＣＣＲ５の発現が調節されたことを実証するデータを示す。
【００４６】
【図１６】図１６は、本開示のレンチウイルスベクターのＣＤ４プロモーター調節性合成マイクロＲＮＡ配列によって、ＣＣＲ５発現が調節されたことを実証するデータを示す。
【００４７】
【図１７】図１７は、ＨＩＶ  Ｇａｇ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の検出を実証するデータを示す。
【００４８】
【図１８】図１８は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の増殖およびレンチウイルス形質導入を実証するデータを示す。（Ａ）例示的な治療スケジュールが示されている。（Ｂ）ＣＤ４でゲートしたＴ細胞でのＩＦＮ−ガンマ産生が、本明細書に記載されているように示されている。（Ｃ）ＣＤ４でゲートしたＴ細胞でのＩＦＮ−ガンマ産生およびＧＦＰ発現が、本明細書に記載されているように示されている。（Ｄ）本明細書に記載されているような、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の頻度が示されている。（Ｅ）ワクチン接種後のＰＢＭＣからのＩＦＮ−ガンマ産生が、本明細書に記載されているように示されている。
【００４９】
【図１９】図１９は、ＡＧＴ１０３−ＧＦＰを増加させた際の用量応答およびＣＣＲ５発現の阻害に関する機能アッセイを実証するデータを示す。（Ａ）ＡＧＴ１０３−ＧＦＰの量を増加させた際の用量応答データが示されている。（Ｂ）ＣＣＲ５発現の点で正規分布した集団が示されている。（Ｃ）ＡＧＴ１０３−ＧＦＰの用量を増加させた際のＣＣＲ５発現の阻害パーセンテージが示されている。
【００５０】
【図２０】図２０は、初代ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞のＡＧＴ１０３形質導入効率を実証するデータを示す。（Ａ）形質導入された細胞（ＧＦＰ陽性）の頻度が、本明細書に記載されているように、ＦＡＣＳにより示されている。（Ｂ）細胞あたりのベクターコピー数が、本明細書に記載されているように示されている。
【００５１】
【図２１】図２１は、初代ＣＤ４＋  Ｔ細胞におけるＨＩＶ複製のＡＧＴ１０３阻害を実証するデータが、本明細書に記載されているように示されている。
【００５２】
【図２２】図２２は、ＨＩＶ誘導性枯渇からの初代ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞のＡＧＴ１０３防御を実証するデータを示す。
【００５３】
【図２３−１】図２３は、ＨＩＶ特異的ＡＧＴ１０３形質導入ＣＤ４  Ｔ細胞が高度に濃縮されたＣＤ４＋  Ｔ細胞集団の生成を実証するデータを示す。（Ａ）は、細胞集団のＣＤ４およびＣＤ８発現プロファイルを、本明細書に記載されているように示す。（Ｂ）は、細胞集団のＣＤ４およびＣＤ８発現プロファイルを、本明細書に記載されているように示す。（Ｃ）は、細胞集団のＩＦＮ−ガンマおよびＣＤ４発現プロファイルを、本明細書に記載されているように示す。（Ｄ）は、細胞集団のＩＦＮ−ガンマおよびＧＦＰ発現プロファイルを、本明細書に記載されているように示す。
【図２３−２】図２３は、ＨＩＶ特異的ＡＧＴ１０３形質導入ＣＤ４  Ｔ細胞が高度に濃縮されたＣＤ４＋  Ｔ細胞集団の生成を実証するデータを示す。（Ａ）は、細胞集団のＣＤ４およびＣＤ８発現プロファイルを、本明細書に記載されているように示す。（Ｂ）は、細胞集団のＣＤ４およびＣＤ８発現プロファイルを、本明細書に記載されているように示す。（Ｃ）は、細胞集団のＩＦＮ−ガンマおよびＣＤ４発現プロファイルを、本明細書に記載されているように示す。（Ｄ）は、細胞集団のＩＦＮ−ガンマおよびＧＦＰ発現プロファイルを、本明細書に記載されているように示す。
【００５４】
【図２４】図２４は、ＡＧＴ−ＬＶ−ＨＩＶ１．０（これら図中ではＬＶ−Ｒ５ＴａｔＶｉｆ）が、潜伏性の誘導可能なＨＩＶの細胞モデル（Ｊ１．１）中でＨＩＶ複製を阻害することを実証するデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
概要
機能的治癒を達成するためにヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）疾患を予防するための方法および組成物が、本明細書において開示される。本方法および組成物には、以下に記載される組み込みレンチウイルス、非組み込みレンチウイルス、および関連ウイルスベクター技術が含まれる。
【００５６】
療法用ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）、免疫療法、およびＨＩＶ感染を治療または予防するためにそれらを使用するための方法が、本明細書において開示される。本明細書の図１に示されているように、種々の態様および実施形態は、第１の刺激事象、例えば、例えばＨＡＡＲＴの毎日の投与によるウイルス血症の安定な抑制を有するＨＩＶ感染患者におけるＨＩＶに対する強力な免疫応答を生成することを意図したワクチンによる最初の療法的免疫化を含む。実施形態では、第１の刺激事象は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の画分を濃縮する。（１）末梢白血球を白血球アフェレーシスによって単離するか、またはＰＢＭＣを静脈血から精製するステップ、（２）第２の刺激事象、例えばｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、任意のワクチンまたはタンパク質、例えばＨＩＶまたはＨＩＶ関連ペプチドなどの適切な刺激性作用剤で、ＣＤ４  Ｔ細胞を再刺激するステップ、（３）療法用レンチウイルス形質導入、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、Ｔ細胞培養を行うステップ、および（４）元の患者へ再注入し戻すステップが、これに続く。上述の戦略は、ＨＩＶを予防するためのワクチンまたは予防的効果を提供するために、ＨＩＶ陰性患者にも使用することができる。
【００５７】
種々の方法および組成物を使用して、ＣＤ４＋  Ｔ細胞などの新しい細胞が、ＨＩＶに感染することを予防することができる。例えば、図２に例示されているように、新しい細胞の感染を予防するために、ＣＣＲ５発現を標的としてウイルス付着を防止することができる。さらに、あらゆる残存感染性ウイルスＲＮＡの破壊も標的とすることができる。先述の記載に鑑み、本明細書の図２を参照すると、既にＨＩＶに感染している細胞でのＨＩＶウイルスサイクルを停止させるための組成物および方法が提供される。ＨＩＶウイルスサイクルを停止させるために、潜伏感染ＣＤ４＋  Ｔ細胞などの潜伏感染細胞によって産生されるウイルスＲＮＡが標的とされる。
【００５８】
特に、防御的遺伝子改変を有する十分な数のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を得ることができなかったために、ＨＩＶの治癒を達成するためのこれまでの努力が及ばなかった。この数が臨界閾値を下回ると、本明細書に記載されているような機能的治癒は達成されない。例えば、抗レトロウイルス療法を中止すると、一般に、ＨＩＶ再出現が起こる。その後、患者は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の急速な破壊を経験することが多く、以前の遺伝子治療にもかかわらず、疾患の進行に戻ってしまうことが多い。本明細書に記載の組成物および方法による療法的免疫化を使用することにより、種々の実施形態では機能的治癒を含む、新しいＨＩＶ治療レジメンを開発した。
【００５９】
定義および解釈
本明細書中で別様に定義されていない限り、本開示に関して使用される科学用語および専門用語は、当業者により一般に理解される意味を有するものとする。さらに、状況により別様に求められない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含むものとする。一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関して使用される命名法および技術は、周知であり、当技術分野で一般に使用されているものである。本開示の方法および技術は、別様の指定がない限り、一般に、当技術分野で周知の従来法により、本明細書の全体にわたって引用および考察されている種々の一般的なおよびより専門的な参考文献に記載されているように実施される。例えば、Sambrook  J.およびRussell  D.  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.（２０００年）；Ausubelら、Short  Protocols  in  Molecular  Biology:  A  Compendium  of  Methods  from  Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Wiley,  John  &  Sons,  Inc.（２００２年）；HarlowおよびLane、Using  Antibodies:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.（１９９８年）；ならびにColiganら、Short  Protocols  in  Protein  Science、Wiley,  John  &  Sons,  Inc.（２００３年）を参照されたい。任意の酵素反応または精製技術は、製造業者の仕様に従って、当技術分野で一般に達成されるように、または本明細書に記載されているように実施される。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学、ならびに医学および医薬化学に関して使用される命名法、実験手順、および技術は、周知であり、当技術分野で一般に使用されているものである。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者によって理解され、使用される文脈に依存してある程度変化するであろう。使用される文脈を考慮しても、当業者に明白ではない用語の使用がある場合には、「約」は特定の用語のプラスまたはマイナス１０％を意味するであろう。
【００６１】
本明細書で使用される場合、活性剤の「投与」または「投与する」という用語は、本発明の活性剤を、治療の必要な対象に療法上有用な形態で治療有効量をその個体の体内に導入することができる形態で、提供することを意味する。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「ＡＧＴ１０３」という用語は、本明細書で詳述されているような、ｍｉＲ３０−ＣＣＲ５／ｍｉＲ２１−Ｖｉｆ／ｍｉＲ１８５−ＴａｔマイクロＲＮＡクラスター配列を含むレンチウイルスベクターの特定の実施形態を指す。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「ＡＧＴ１０３Ｔ」という用語は、ＡＧＴ１０３レンチウイルスベクターを含むレンチウイルスを用いて形質導入した細胞を指す。
【００６４】
本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの活用形は、記載されている整数または整数の群を含むが、任意の他の整数または整数の群を除外しないことを示唆すると理解されるであろう。さらに、本明細書で使用される場合、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は、含むが限定ではないことを意味する。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「移植」という用語は、当業者が、細胞供給源を注入した後の対象において持続した移植の定量的レベルを決定することができることを指す（例えば、Rosenbergら、N.  Engl.  J.  Med.  ３２３巻：５７０〜５７８頁（１９９０年）；Dudleyら、J.  Immunother.２４巻：３６３〜３７３頁（２００１年）；Yeeら、Curr.  Opin.  Immunol.１３巻：１４１〜１４６頁（２００１年）；Rooneyら、Blood  ９２巻：１５４９〜１５５５頁（１９９８年）を参照）。
【００６６】
「発現」、「発現した」、または「コードする」という用語は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。発現には、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシング、または他の形態の転写後修飾もしくは翻訳後修飾を含み得る。
【００６７】
「機能的治癒」という用語は、上記で参照されているように、および本明細書でさらに定義されているように、以前にｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴなどの継続中のＨＩＶ療法を必要としていたＨＩＶ＋個体が、そのようなＨＩＶ療法のより低い用量、断続的用量または投薬中止を使用して、ウイルス複製が低いまたは検出不可能な形で生存することができる状況または状態を指す。個体は、低いレベルのウイルス複製を維持し疾患の進行を遅くするかまたは排除するための補助療法を依然として必要としていても、「機能的に治癒した」と言われ得る。機能的治癒の可能性がある結果としては、特定の時間枠内、例えば、１か月、３か月、６か月、１年、３年、および５年、ならびに規定することができるすべての他の時間枠内で再発が検出されないような、すべてのまたは事実上すべてのＨＩＶの最終的な根絶がある。
【００６８】
「ＨＩＶワクチン」という用語は、ＨＩＶ特異的免疫応答を誘発することを意図した免疫原とビヒクルとアジュバントを包含する。「ＨＩＶワクチン」という用語は、本明細書に記載の「刺激性作用剤」という用語の意味内にある。「ＨＩＶワクチン」は、ＨＩＶであってもよい精製された不活化ウイルス粒子もしくは不活化ウイルス粒子全体、またはＨＩＶタンパク質、タンパク質断片もしくはペプチド、糖タンパク質断片もしくは糖ペプチドを発現することができる組換えウイルスベクターを、特定の免疫を誘発することができるＨＩＶタンパク質、糖タンパク質またはタンパク質断片を産生するように細胞を誘導することができる組換え細菌ベクター、プラスミドＤＮＡまたはＲＮＡに加えて含んでもよい。代替的には、形質導入の前にＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を濃縮する目的のために、または、レンチウイルス形質導入ＣＤ４  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイのために、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、Ｔ細胞受容体特異的抗体、分裂促進因子、スーパー抗原、および他の化学的または生物学的刺激を含む免疫刺激のための特定の方法を使用して、樹状、ＴもしくはＢ細胞を活性化することができる。活性化物質は、可溶性、ポリマー性集合体、リポソームまたはエンドソームベースであり得るかまたはビーズに連結され得る。インターロイキン−２、６、７、１２、１５、２３または他を含むサイトカインを添加して、刺激に対する細胞応答を改善し、ならびに／または培養および形質導入間隔を通じてＣＤ４  Ｔ細胞の生存を改善することができる。代替的には、前述のいずれにも限定されず、「ＨＩＶワクチン」という用語は、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンおよびその改変体を包含する。ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンは、公知の高度に弱毒化された二重組換えＭＶＡワクチンである。ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンは、ＨＩＶ−１  ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ配列を公知のＭＶＡベクターに挿入することにより構築された（例えば、Goepfertら（２０１４年）J.  Infect.  Dis.  ２１０巻（１号）：９９〜１１０頁を参照、および国際公開第２００６０２６６６７号を参照。両文献は、参照により本明細書に組み込まれる）。また、「ＨＩＶワクチン」という用語は、以下の表１に提供されている任意の１つまたは複数のワクチンを含む。
【表１−１】
2019509029.tif 000024
【表１−２】
2019509029.tif 000025
【表１−３】
2019509029.tif 000026
【表１−４】
2019509029.tif 000027
【表１−５】
2019509029.tif 000028
【表１−６】
2019509029.tif 000029
【表１−７】
2019509029.tif 000030
【表１−８】
2019509029.tif 000031
【表１−９】
2019509029.tif 000032
【表１−１０】
2019509029.tif 000033
【表１−１１】
2019509029.tif 000034
【表１−１２】
2019509029.tif 000035
【表１−１３】
2019509029.tif 000036
*IAVIは、国際エイズワクチン推進構想であり、その臨床試験データベースは、http://www.iavi.org/trials-database/trialsで公的に入手可能である。
**本明細書で使用される場合、「プライム」という用語は、本明細書の表1に参照されている所与の臨床試験において免疫学的接種材料として最初に使用された組成物を指す。
【００６９】
「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、生きている生物で生じるプロセスを指す。「ｅｘ  ｖｉｖｏ」という用語は、生きている生物の外部で生じるプロセスを指す。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ治療は、患者の体内で生じる治療を指し、ｅｘ  ｖｉｖｏ治療は、患者の体外で生じるが、その患者に由来する組織を使用するか、または組織に接近するか、または組織と相互作用する治療を指す。その後、ｅｘ  ｖｉｖｏ治療ステップは、引き続きｉｎ  ｖｉｖｏ治療ステップを含む場合がある。
【００７０】
「ｍｉＲＮＡ」という用語は、マイクロＲＮＡを指し、本明細書では「ｍｉＲ」と呼ばれる場合もある。「マイクロＲＮＡクラスター」という用語は、ベクター中で互いに近傍に位置し、同時発現される少なくとも２つのマイクロＲＮＡを指す。
【００７１】
「パッケージング細胞株」という用語は、レンチウイルス粒子を発現するために使用することができるあらゆる細胞株を指す。
【００７２】
２つまたはそれよりも多くの核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「同一性パーセント」という用語は、最大一致で比較および整列した場合に、下に記載されている配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ、または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）の１つを使用してまたは目視検査によって測定される、同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基の指定のパーセンテージを示す２つまたはそれよりも多くの配列または部分配列を指す。「同一性パーセント」は、適用に応じて、比較されている配列の領域にわたって、例えば機能的ドメインにわたって存在してもよく、または代替的には、比較される２つの配列の全長にわたって存在してもよい。配列比較の場合、典型的には、１つの配列は、試験配列をそれに対して比較する参照配列としての役目を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。その後、配列比較アルゴリズムにより、指定されているプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントが計算される。
【００７３】
比較するための最適な配列アラインメントは、例えば、SmithおよびWaterman、Adv.  Appl.  Math.２巻：４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズムにより、NeedlemanおよびWunsch、J.  Mol.  Biol.４８巻：４４３頁（１９７０年）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、PearsonおよびLipman、Proc.  Nat'l.  Acad.  Sci.  USA  ８５巻：２４４４頁（１９８８年）の類似性探索法（search  for  similarity  method）により、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装により（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査により（一般に、Ausubelら、上記を参照）実施することができる。
【００７４】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適切なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これは、Altschulら、J.  Mol.  Biol.２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターのウェブサイトから公的に利用可能である。
【００７５】
２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクス、ならびに４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）のＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。また、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４を使用するＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE.  MeyersおよびW.  Miller（CABIOS、４巻：１１〜１７頁（１９８９年））のアルゴリズムを使用して、決定することができる。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedlemanおよびWunsch（J.  Mol.  Biol.（４８巻）：４４４〜４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムを使用して決定することができる。
【００７６】
さらに、本開示の核酸配列およびタンパク質配列を、公開データベースの検索を実施するための「クエリー配列」として使用して、例えば、関連配列を特定することができる。そのような検索は、Altschulら（１９９０年）J.  Mol.  Biol.２１５巻：４０３〜１０頁のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＮＢＬＡＳＴプログラムをスコア＝１００、ワード長＝１２で用いて、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施して、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラムをスコア＝５０、ワード長＝３で用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施して、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ配列を得ることができる。比較目的のギャップ付きアラインメントを得るためには、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Altschulら（１９９７年）Nucleic  Acids  Res.２５巻（１７号）：３３８９〜３４０２頁に記載のように利用してもよい。ＢＬＡＳＴプログラムおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを使用してもよい。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または合理的なベネフィット／リスク比と釣り合う他の問題もしくは合併症を起こさず、ヒトおよび動物の組織、器官、および／または体液と接触させて使用するために適切である化合物、材料、組成物、および／または剤形を指す。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに等張剤および吸収遅延剤などを指し、それらを含む。組成物としては、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩を挙げることができる（例えば、Bergeら（１９７７年）J  Pharm  Sci  ６６巻：１〜１９頁を参照）。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）」という用語は、「配列番号（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＩＤ  Ｎｏ）」という用語と同義である。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「スモールＲＮＡ」とは、一般に長さ約２００ヌクレオチド未満またはそれ未満であり、サイレンシング（silencing）または干渉機能を持つ非コーディングＲＮＡのことを指す。他の実施形態では、スモールＲＮＡは、長さ約１７５ヌクレオチドもしくはそれ未満、約１５０ヌクレオチドもしくはそれ未満、約１２５ヌクレオチドもしくはそれ未満、約１００ヌクレオチドもしくはそれ未満、または約７５ヌクレオチドもしくはそれ未満である。そのようなＲＮＡには、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、および短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が含まれる。本開示の「スモールＲＮＡ」は、例えば、標的遺伝子ｍＲＮＡの破壊をもたらす経路を介して、標的遺伝子の遺伝子発現を阻害またはノックダウンすることが可能であるべきである。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「刺激性作用剤」という用語は、免疫応答を刺激するために使用することができ、限定ではないが、ワクチン、ＨＩＶワクチン、およびＨＩＶまたはＨＩＶ関連ペプチドを含む、あらゆる外因性作用剤を意味する。刺激性作用剤は、好ましくは、Ｔ細胞応答を刺激することができる。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト患者を含むだけでなく、他の哺乳動物も含む。「対象」、「個体」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書では交換可能に使用することができる。
【００８３】
「治療有効量」という用語は、所定の不快、傷害、疾患、または状態に苦しんでいる患者に見られる症状、進行、または合併症の発症を治療または予防するのに適切な組成物における、および適切な剤形における、本発明の活性剤の十分な量を指す。治療有効量は、患者の状態またはその重篤度、および治療される対象の年齢、体重などに依存して変化するであろう。治療有効量は、例えば、投与経路、対象の状態、ならびに当業者によって理解される他の要因を含む、多くの要因のいずれかに依存して変化し得る。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「療法用ベクター」という用語は、ＡＧＴ１０３ベクターなどのレンチウイルスベクターと同義である。
【００８５】
「治療」または「治療する」という用語は、一般に、治療される対象の自然経過を変える試みにおける介入のことを指し、予防のためにかまたは臨床病理の経過の間のいずれかに実施することができる。望ましい効果は、疾患の発生または再発を予防すること、症状を緩和すること、疾患の任意の直接的もしくは間接的な病理学的帰結を抑制、減少、または阻害すること、疾患状態を改善または軽減すること、および寛解または予後の向上を引き起こすことを含むが、これらに限定されない。
【００８６】
「ワクチン」という用語は、「療法用ワクチン」という用語と交換可能に使用され、個体に免疫応答を誘発することができる外因性作用剤を指し、限定ではないが、精製タンパク質、不活化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質（virally  vectored  protein）、細菌性ベクター化タンパク質（bacterially  vectored  protein）、ペプチドもしくはペプチド断片、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む。
【００８７】
本開示の態様の説明
本明細書に詳述されているように、一態様では、ＨＩＶ感染に耐性の細胞を産生するための方法が提供される。方法は、一般に、ＨＩＶ陰性対象から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、治療有効量の刺激性作用剤と接触させるステップであって、接触ステップが、ｅｘ  ｖｉｖｏで実施されるステップ；ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、少なくとも１つの遺伝的エレメントをコードするウイルス送達システムを用いてＰＢＭＣに形質導入するステップ；および形質導入されたＰＢＭＣをそのような形質導入を達成するのに十分な期間にわたって培養するステップを含む。実施形態では、形質導入されたＰＢＭＣは、約１日〜約３５日まで培養される。方法は、形質導入されたＰＢＭＣを対象に注入するステップをさらに含んでいてもよい。対象は、ヒトであってもよい。刺激性作用剤は、ペプチドまたはペプチドの混合物を含んでいてもよく、好ましい実施形態では、ｇａｇペプチドを含む。刺激性作用剤は、ワクチンを含んでいてもよい。ワクチンは、ＨＩＶワクチンであってもよく、好ましい実施形態では、ＨＩＶワクチンは、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンまたはその改変体である。実施形態では、ウイルス送達システムは、レンチウイルス粒子を含む。実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡを含んでいてもよい。実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とすることができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含む。他の実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、およびＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とすることができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含む。ＨＩＶ  ＲＮＡ配列は、ＨＩＶ  Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ  Ｔａｔ配列、またはそれらの改変体を含んでいてもよい。少なくとも１つの遺伝的エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含んでいてもよい。好ましい実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、マイクロＲＮＡクラスターを含む。
【００８８】
別の態様では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化２２】
2019509029.tif 000037
と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高い同一性パーセントを有するマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化２３】
2019509029.tif 000038
を含む。
【００８９】
別の態様では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化２４】
2019509029.tif 000039
と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、もしくはそれよりも高い同一性パーセントを有するか、または
【化２５】
2019509029.tif 000040
と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、もしくはそれよりも高い同一性パーセントを有するマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化２６】
2019509029.tif 000041
を含む。
【００９０】
別の態様では、マイクロＲＮＡクラスターは、
【化２７】
2019509029.tif 000042
と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高い同一性パーセントを有する配列を含む。好ましい実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、
【化２８】
2019509029.tif 000043
を含む。
【００９１】
別の態様では、ＨＩＶ陰性対象のＨＩＶ感染を予防するための方法が開示される。方法は、一般に、有効量の第１の刺激性作用剤で対象を免疫化するステップ；対象から白血球を取り出し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製するステップを含む。方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、ＰＢＭＣを治療有効量の第２の刺激性作用剤と接触させるステップ；ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、少なくとも１つの遺伝的エレメントをコードするウイルス送達システムを用いてＰＢＭＣに形質導入するステップ；および形質導入されたＰＢＭＣを、形質導入を達成するのに十分な期間にわたって培養するステップをさらに含む。方法は、例えば、好ましくはＣＤ４＋  Ｔ細胞についてＰＢＭＣを濃縮することにより、ＰＢＭＣをさらに濃縮するステップをさらに含んでいてもよい。実施形態では、形質導入されたＰＢＭＣは、約１日から約３５日まで培養される。方法は、形質導入されたＰＢＭＣを対象に注入するステップをさらに含んでいてもよい。対象は、ヒトであってもよい。第１および第２の刺激性作用剤は、同じであってもよく、または互いに異なっていてもよい。第１および第２の刺激性作用剤の少なくとも１つは、ペプチドまたはペプチドの混合物を含んでいてもよい。実施形態では、第１および第２の刺激性作用剤の少なくとも１つは、ｇａｇペプチドを含む。第１および第２の刺激性作用剤の少なくとも１つは、ワクチンを含んでいてもよい。ワクチンは、ＨＩＶワクチンであってもよく、好ましい実施形態では、ＨＩＶワクチンは、ＭＶＡ／ＨＩＶ６２Ｂワクチンまたはその改変体である。実施形態では、第１の刺激性作用剤は、ＨＩＶワクチンであり、第２の刺激性作用剤は、ｇａｇペプチドである。
【００９２】
実施形態では、ウイルス送達システムは、レンチウイルス粒子を含む。実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡを含む。実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とすることができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含む。実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、およびＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とすることができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含む。ＨＩＶ  ＲＮＡ配列は、ＨＩＶ  Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ  Ｔａｔ配列、またはそれらの改変体を含んでいてもよい。少なくとも１つの遺伝的エレメントは、マイクロＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡまたはそれらのクラスターを含んでいてもよい。好ましい実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、マイクロＲＮＡクラスターを含む。
【００９３】
別の態様では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化２９】
2019509029.tif 000044
と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高い同一性パーセントを有するマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化３０】
2019509029.tif 000045
を含む。
【００９４】
別の態様では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化３１】
2019509029.tif 000046
と少なくとも８０％、もしくは少なくとも８５％、もしくは少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性パーセントを有するか、または
【化３２】
2019509029.tif 000047
と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、もしくはそれよりも高い同一性パーセントを有するマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化３３】
2019509029.tif 000048
を含む。
【００９５】
別の態様では、マイクロＲＮＡクラスターは、
【化３４】
2019509029.tif 000049
と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高い同一性パーセントを有する配列を含む。好ましい実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、
【化３５】
2019509029.tif 000050
を含む。
【００９６】
別の態様では、レンチウイルスベクターが開示される。レンチウイルスベクターは、少なくとも１つのコードされた遺伝的エレメントを含み、少なくとも１つのコードされた遺伝的エレメントは、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、またはＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とすることができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含む。別の態様では、少なくとも１つのコードされた遺伝的エレメントが、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるスモールＲＮＡ、およびＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とすることができる少なくとも１つのスモールＲＮＡを含む、レンチウイルスベクターが開示される。ＨＩＶ  ＲＮＡ配列は、ＨＩＶ  Ｖｉｆ配列、ＨＩＶ  Ｔａｔ配列、またはそれらの改変体を含んでいてもよい。少なくとも１つのコードされた遺伝的エレメントは、マイクロＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含んでいてもよい。少なくとも１つのコードされた遺伝的エレメントは、マイクロＲＮＡクラスターを含んでいてもよい。
【００９７】
別の態様では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化３６】
2019509029.tif 000051
と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高い同一性パーセントを有するマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化３７】
2019509029.tif 000052
を含む。
【００９８】
別の態様では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化３８】
2019509029.tif 000053
と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、もしくはそれよりも高い同一性パーセントを有するか、または
【化３９】
2019509029.tif 000054
と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、もしくはそれよりも高い同一性パーセントを有するマイクロＲＮＡを含む。好ましい実施形態では、少なくとも１つの遺伝的エレメントは、
【化４０】
2019509029.tif 000055
を含む。
【００９９】
別の態様では、マイクロＲＮＡクラスターは、
【化４１】
2019509029.tif 000056
と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、またはそれよりも高い同一性パーセントを有する配列を含む。好ましい実施形態では、マイクロＲＮＡクラスターは、
【化４２】
2019509029.tif 000057
を含む。
【０１００】
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現するためのレンチウイルスベクターシステムが提供される。システムは、本明細書に記載のようなレンチウイルスベクター；好ましくは細胞に感染するために最適化されているエンベロープタンパク質を発現するための少なくとも１つのエンベローププラスミド；ならびに目的の遺伝子、例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子のいずれかを発現するための少なくとも１つのヘルパープラスミドを含み、レンチウイルスベクター、少なくとも１つのエンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドが、パッケージング細胞にトランスフェクトされると、パッケージング細胞によってレンチウイルス粒子が産生され、レンチウイルス粒子は、目的の標的配列をモジュレーションすることができ、例えば、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるかまたはＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とすることができる。
【０１０１】
別の態様では、細胞に感染することができるレンチウイルス粒子が開示される。レンチウイルス粒子は、好ましくは細胞に感染するために最適化された少なくとも１つのエンベロープタンパク質、および本明細書に記載のようなレンチウイルスベクターを含む。エンベロープタンパク質は、Ｔ細胞に感染するために最適化されていてもよい。好ましい実施形態では、エンベロープタンパク質は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞に感染するために最適化されている。
【０１０２】
別の態様では、改変細胞が開示される。実施形態では、改変細胞はＣＤ４＋  Ｔ細胞である。実施形態では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を、本明細書に記載のようなレンチウイルス粒子に感染させる。また、実施形態では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、刺激性作用剤による以前の免疫化に基づいて、ＨＩＶ抗原を認識するように選択されている。さらに好ましい実施形態では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞により認識されるＨＩＶ抗原は、ｇａｇ抗原を含む。さらに好ましい実施形態では、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、レンチウイルス粒子による感染後に、減少したレベルのＣＣＲ５を発現する。
【０１０３】
別の態様では、療法的治療レジメン用に対象を選択するための方法が開示される。方法は、一般に、有効量の第１の刺激性作用剤で対象を免疫化するステップ；対象から白血球を取り出し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製し、ＰＢＭＣに関連する少なくとも１つの因子に関連する第１の定量化可能な測定値を決定するステップ；ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、ＰＢＭＣを、治療有効量の第２の刺激性作用剤と接触させ、ＰＢＭＣに関連する少なくとも１つの因子に関連する第２の測定値を決定するステップを含み、第２の定量化可能な測定値が、第１の定量化可能な測定値と異なる（例えば、より高い）場合、対象が、治療レジメン用に選択される。少なくとも１つの因子は、Ｔ細胞増殖またはＩＦＮガンマ産生であってもよい。
【０１０４】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
一般に「ＨＩＶ」とも呼ばれるヒト免疫不全ウイルスは、ヒトにおいて後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすレトロウイルスである。ＡＩＤＳは、免疫システムの進行性の不全により、生命を脅かす日和見感染症およびがんが猛威を振るう状態である。治療なくしては、ＨＩＶ感染後の平均生存期間は、ＨＩＶサブタイプに依存して９〜１１年と推測される。ＨＩＶ感染は、血液、精液、膣液、前射精液、唾液、涙液、リンパ液もしくは脳脊髄液、または母乳を含むがそれらに限定されない体液の移入によって起きる。ＨＩＶは、感染した個体内に、遊離ウイルス粒子および感染した免疫細胞内の両方として、存在し得る。
【０１０５】
ＨＩＶは、ヘルパーＴ細胞のようなヒト免疫システムの生体細胞に感染するが、指向性はＨＩＶサブタイプ内で様々である可能性がある。ＨＩＶ感染に特異的に感受性であり得る免疫細胞には、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、マクロファージ、および樹状細胞が含まれるが、これらに限定されない。ＨＩＶ感染は、未感染バイスタンダー細胞のアポトーシス、感染細胞の直接的なウイルス死滅、および感染細胞を認識するＣＤ８細胞傷害性リンパ球による感染ＣＤ４＋  Ｔ細胞の死滅を含むが、これに限定されない数多くのメカニズムにより、ＣＤ４＋  Ｔ細胞のレベルの低下をもたらす。ＣＤ４＋  Ｔ細胞数が臨界レベル以下に低下すると、細胞性免疫が失われ、身体が日和見感染症およびがんに、進行性で、より感受性となる。
【０１０６】
構造的に、ＨＩＶは他の多くのレトロウイルスとは異なる。ＲＮＡゲノムは、１９個のタンパク質をコードする、少なくとも７つの構造的ランドマーク（ＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、およびＩＮＳ）および少なくとも９つの遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、時にはｔａｔ、ｅｎｖ、およびｒｅｖの融合物である１０番目のｔｅｖ）からなる。これらの遺伝子の３つのｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖには、新しいウイルス粒子の構造タンパク質を作るために必要な情報が含まれている。
【０１０７】
ＨＩＶは主にＣＤ４  Ｔ細胞において複製し、宿主免疫を低下させる細胞破壊または調節不全を引き起こす。ＨＩＶは、組み込まれたプロウイルスとして感染を確立し、特定の細胞におけるウイルス発現が、その細胞に影響を及ぼす細胞病理のレベルまたは宿主免疫システムによる検出のレベル未満にまで低下する、潜伏状態に移行する可能性があるため、ＨＩＶは治療が困難であり、長期間の高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）の後でさえも根絶されていない。また、ＨＩＶは、ＨＩＶ陰性個体での予防が困難である。生存期間はＨＡＡＲＴによって延長される場合があるが、ほとんどの場合、ＨＩＶ感染は致命的な疾患を引き起こす。
【０１０８】
ＨＩＶとの戦いにおける主な目標は、この疾患を治癒および／または予防するための戦略を開発することである。延長されたＨＡＡＲＴはこの目標の達成には至っていないので、研究者は代替手順に目を向けている。（例えば、感染が起きた後にワクチンを使用する）療法的免疫化による宿主免疫を改善するための初期の努力は、わずかな影響しかないか影響がなかった。同様に、治療の強化は中程度の影響を有したかまたは影響がなかった。
【０１０９】
遺伝子治療を用いることで、いくらかの進歩がみられたが、ポジティブな結果は孤発性であり、宿主細胞のウイルス浸透に重要な役割を果たすＣＣＲ５（ケモカイン受容体）をコードする遺伝子の１つまたは両方の対立遺伝子に欠損を有するまれなヒトの間でのみ見出された。しかしながら、多くの研究者は、遺伝子治療が最終的にＨＩＶ治癒を達成するための最高の将来性を持っていると楽観的である。
【０１１０】
本明細書に開示されるように、本開示の方法および組成物は、身体からのすべてのＨＩＶの完全な根絶を含んでも、または含まなくてもよい機能的治癒を達成することができる。上記で言及されているように、機能的治癒は、以前にＨＡＡＲＴを必要としていたＨＩＶ＋個体が、低いまたは検出不可能なウイルス複製とともに生存し、より低いまたは断続的な用量のＨＡＡＲＴを使用しているか、または潜在的にＨＡＡＲＴを完全に中止することができる、状況または状態として定義される。本明細書で使用されるように、機能的治癒は、低レベルのウイルス複製を維持し、疾患の進行を遅らせるかまたは排除するために、補助療法を必要とする可能性がなお、あるかもしれない。機能的治癒の可能な予後は、すべての再発の可能性を防ぐためのＨＩＶの最終的な根絶である。さらに、本開示の方法および組成物は、ＨＩＶ陰性個体のＨＩＶ感染を予防することができる。
【０１１１】
機能的治癒を達成するための主な障害は、ＨＩＶ自体の基本的な生物学にある。ウイルス感染は、ほぼすべての免疫機能にとって重要なＣＤ４  Ｔ細胞を欠失させる。最も重要なことに、ＨＩＶ感染およびＣＤ４  Ｔ細胞の枯渇は、個々の細胞の活性化を必要とする。活性化とは、再編成されたＴ細胞受容体を使用して病原体または他の分子を認識する個々のＣＤ４  Ｔ細胞クローンに特異的な機構である。
【０１１２】
ＨＩＶの場合、感染は、ウイルスにそれほど特異的でない他のＴ細胞の前に、ＨＩＶに特異的なＴ細胞の集団を活性化させ、結果的に枯渇させ、ウイルスに対する免疫システムの防御を効率的に無能化する。ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答の能力は、長期間のＨＡＡＲＴ中に再構築される；しかしながら、ＨＡＡＲＴが中断されると、反復性ウイルス感染はプロセスを反復し、再びウイルス特異的細胞を欠失させ、疾患の進行の時計をリセットする。
【０１１３】
明らかに、機能的治癒は、十分なＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞が保護されて、ＨＡＡＲＴが中断されても宿主の自然免疫がＨＩＶに対抗して制御するようになる場合にのみ可能である。同様に、ワクチンまたは予防戦略の成功には、ＨＩＶ陰性個体が最初にウイルスに遭遇した際に、ＨＩＶに対抗してＨＩＶを死滅させるのに十分なＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞が存在することも必要である。一実施形態では、本開示は、ＨＩＶ疾患の機能的治癒を提供するための遺伝子治療の有効性を改善するための方法および組成物を提供する。別の実施形態では、本開示は、機能的治癒を提供するために、ＨＩＶに対する宿主免疫を増強するための方法および組成物を提供する。さらに別の実施形態では、本開示は、機能的治癒を達成するために、患者のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を濃縮するための方法および組成物を提供する。
【０１１４】
一実施形態では、治療は、対象のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細を、約１００％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％、約６００％、約７００％、約８００％、約９００％、または約１０００％濃縮する結果となる。
【０１１５】
遺伝子治療
ウイルスベクターは、疾患の療法または予防の目的ために宿主細胞に遺伝子構築物を送達するために使用される。
【０１１６】
遺伝子構築物は、機能的遺伝子または既存の欠陥を修正または補完する遺伝子の一部、調節タンパク質をコードするＤＮＡ配列、アンチセンス、短いホモロジーＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡまたはその他を含む調節ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列、および疾患状態を変化させるために重要な細胞因子について競合するように設計されたＲＮＡまたはタンパク質のいずれかをコードするデコイ配列を含むことができるが、それらに限定されない。遺伝子治療は、特定の疾患の治療または緩和を提供するために、これらの療法用遺伝子構築物を標的細胞に送達することを含む。
【０１１７】
ＨＩＶ疾患の治療において遺伝子治療を利用する努力は複数行われてきているが、これまでのところ、結果は貧弱である。ＣＣＲ５遺伝子の自発的欠失（ＣＣＲ５ｄｅｌｔａ３２として公知である対立遺伝子）を有するまれなＨＩＶ患者において、少数の治療成功が得られた。
【０１１８】
レンチウイルスにより送達されたヌクレアーゼまたは遺伝子欠失／修飾のための他の機構を使用して、ＣＣＲ５の全体的発現を低下させ、および／またはＨＩＶ複製を低下させるのを助けることができる。レンチウイルスがＣＣＲ５ｄｅｌｔａ３２の遺伝的背景を有する患者に投与された場合にこの疾患の治療に成功したことを報じる研究が、少なくとも１つある。しかしながら、これは成功のわずか一例に過ぎず、ＣＣＲ５ｄｅｌｔａ３２遺伝子型を持たない多くの他の患者はうまく治療されていない。その結果、個々のウイルスベクター構築物の性能および機能的ＨＩＶ治癒を達成するための戦略によるベクターの使用の改善の両方の点で、ＨＩＶに対するウイルス遺伝子治療の性能を改善する実質的な必要性がある。
【０１１９】
例えば、いくつかの既存の療法は、細胞をＨＩＶ感染に対して抵抗性にする試みにおいて、ジンクフィンガーヌクレアーゼに依存して、ＣＣＲ５の一部を欠失させる。しかしながら、最適な治療の後でさえも、Ｔ細胞の３０％だけがヌクレアーゼによって改変されるのみであり、改変されたもののうち、全ＣＤ４  Ｔ細胞集団のわずか１０％がＨＩＶ感染を予防するように改変されただけであった。対照的に、開示された方法は、レンチウイルス導入遺伝子を保有する実質的にすべての細胞で、ＨＩＶ感染を可能にするのに必要なレベル未満までＣＣＲ５発現が減少する結果となる。
【０１２０】
開示される方法の目的のために、遺伝子治療には、親和性が増強されたＴ細胞受容体、ＣＤ４  Ｔ細胞上の（または代替的にＣＤ８  Ｔ細胞上の）キメラ抗原受容体、ウイルスタンパク質により引き起こされる細胞死を避けるためのシグナル伝達経路の改変、ＴＲＥＸ、ＳＡＭＨＤ１、ＭｘＡまたはＭｘＢタンパク質、ＡＰＯＢＥＣ複合体、ＴＲＩＭ５−アルファ複合体、テザリン（tetherin；ＢＳＴ２）、および哺乳動物細胞におけるＨＩＶ複製を減少させることができるものと識別された類似のタンパク質を含むＨＩＶ制限エレメントの発現の増加を含むことができるが、それらに限定されない。
【０１２１】
免疫療法
歴史的に、ワクチンは、天然痘、ポリオ、麻疹、黄熱病を含む、致命的な感染性疾患に対する頼りになる武器であった。残念ながら、現在のところ、ＨＩＶについては承認されているワクチンはない。ＨＩＶウイルスは、免疫システムを回避する独特の手段を持っており、人体はそれに対して有効な免疫応答を実装することができないようである。その結果、科学者はＨＩＶに対する保護を提供するために何が必要であるかを明確に把握していない。
【０１２２】
しかしながら、免疫療法は、従来のワクチン接種アプローチによっては以前に対処できなかった解決法を提供し得る。生物学的療法とも呼ばれる免疫療法は、感染症またはがんと戦うための身体の自然防御を強化するために設計された治療の一型である。それは、免疫システムの機能を改善、標的化、または回復させるために、身体あるいは実験室のいずれかにおいて作られた材料を使用する。
【０１２３】
本開示の一部の実施形態では、宿主の抗ＨＩＶ免疫を増加させる目的で、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の集団を濃縮するために、免疫療法アプローチを使用することができる。これは、ＨＩＶ陰性個体およびＨＩＶ陽性個体の両方にとって有益である。本開示の一部の実施形態では、宿主の抗ＨＩＶ免疫を増加させる目的で、宿主の免疫細胞に形質導入するために、組み込みまたは非組み込みのレンチウイルスベクターを使用することができる。本開示のさらに別の実施形態では、宿主の免疫応答を増加させるための適切なビヒクルおよび／または生物学的もしくは化学的アジュバントと組み合わせた、死滅粒子、ウイルス様粒子、ＨＩＶペプチドまたはペプチド断片、組換えウイルスベクター、組換え細菌ベクター、精製サブユニットまたはプラスミドＤＮＡを含むがこれらに限定されないＨＩＶタンパク質を含むワクチンは、ウイルス特異的Ｔ細胞または抗体の集団を濃縮するために使用することができ、ならびにこれらの方法は、レンチウイルスまたは他のウイルスベクターを使用したＨＩＶ標的化遺伝子治療の使用によってさらに増強され得る。
【０１２４】
方法
一態様では、本開示は、ＨＩＶ疾患の機能的治癒を達成するためにウイルスベクターを使用する方法を提供する。この方法は、一般に、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の割合を濃縮させるための免疫療法、続く、必要に応じてＨＩＶおよびＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４の阻害剤を送達するためのレンチウイルス形質導入を含む。これらの方法は、ＨＩＶ陰性個体およびＨＩＶ陽性個体の両方に関連して使用することができる。
【０１２５】
一実施形態では、方法は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の割合を濃縮させるための第１の刺激事象を含む。第１の刺激は、ワクチンを含むがそれに限定されない、患者のＨＩＶ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の濃縮に適切な任意の作用剤の１つまたは複数を投与することを含んでいてもよい。
【０１２６】
療法用ワクチンは、治療が行われている地理的領域の支配的なウイルス型を表すタンパク質配列を有する１つまたは複数のＨＩＶタンパク質を含むことができる。療法的ワクチンには、精製タンパク質、不活化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質、細菌性ベクター化タンパク質、ペプチドまたはペプチド断片、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、サイトカインおよび／もしくはケモカインを含む生物学的または化学的アジュバント、ビヒクル、ならびに免疫化のための方法が含まれ得る。ワクチン接種は、当該分野で公知の標準的な方法に従って投与することができ、ＨＩＶ患者は、免疫化の期間およびその後のレンチウイルス形質導入を含むｅｘ  ｖｉｖｏリンパ球培養の間に抗レトロウイルス療法を続けることができる。
【０１２７】
一部の実施形態では、ＨＩＶ−またはＨＩＶ＋患者をＨＩＶワクチンで免疫化して、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度を、約２、約２５、約２５０、約５００、約７５０、約１０００、約１２５０、または約１５００倍（またはこれらの値の間の任意の量）増加させる。ワクチンは、ワクチン送達システムとして使用される、開示されたレンチウイルス、他のウイルスベクターまたは他の細菌ベクターを含む、臨床的に利用されるかまたは実験的なＨＩＶワクチンであってもよい。別の実施形態では、ベクターは、中和抗体のより高い力価を誘導するためにウイルス様粒子（ＶＬＰ）をコードする。別の実施形態では、ベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、およびｔｅｖならびにＬＴＲ、ＴＡＲ、ＲＲＥ、ＰＥ、ＳＬＩＰ、ＣＲＳ、およびＩＮＳを含むがこれらに限定されないＨＩＶに関連するペプチドまたはペプチド断片をコードする。代替的には、開示された方法で使用されるＨＩＶワクチンは、精製タンパク質、不活化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質、細菌性ベクター化タンパク質、ペプチドまたはペプチド断片、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、またはサイトカインおよび／もしくはケモカインを含む生物学的または化学的アジュバントを含んでもよい。
【０１２８】
一実施形態では、本方法は、精製タンパク質、不活化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質、細菌性ベクター化タンパク質、サイトカインおよび／もしくはケモカインを含む生物学的または化学的アジュバント、ビヒクル、および再刺激のための方法を使用して、療法ワクチン接種により以前に免疫化された人または患者からのＣＤ４  Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ再刺激を含む。ｅｘ  ｖｉｖｏ再刺激は、ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化のために使用されるものと同じワクチンまたは免疫刺激化合物を使用して実施され得るか、またはｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化のために使用されるものとは異なるワクチンまたは免疫刺激化合物を使用して実施され得る。さらに、一部の実施形態では、個体がＨＩＶタンパク質に対して十分に高い抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞応答を有する場合、患者は、以前の療法ワクチン接種またはＣＤ４  Ｔ細胞の再刺激を必要としない。これらの実施形態では、そのような患者は、機能的治癒を達成するために、開示されたウイルスベクターの投与のみを必要とすることがある。
【０１２９】
実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は白血球アフェレーシスによって得られ、ｅｘ  ｖｉｖｏで処理され、約１×１０１０個のＣＤ４  Ｔ細胞を得、その約０．１％、約１％、約５％、または約１０％、または約３０％は、抗原応答の点でＨＩＶ特異的であり、かつ開示されたレンチウイルスベクターによって送達される療法用導入遺伝子を有することによりＨＩＶ耐性である。代替的には、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、約１×１０１０、約１×１０１１、または約１×１０１２個のＣＤ４  Ｔ細胞を再刺激のために単離することができる。重要なことに、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける再刺激のために、任意の適切な量のＣＤ４  Ｔ細胞が単離される。
【０１３０】
単離されたＣＤ４  Ｔ細胞は、以前の療法用ワクチン接種に存在する抗原を含み得る、ＨＩＶワクチン抗原による再刺激を通して、適切な培地中で培養することができる。逆転写酵素、プロテアーゼまたはインテグラーゼの阻害剤を含む抗レトロウイルス療法薬は、長期のｅｘ  ｖｉｖｏでの培養中のウイルス再出現を防ぐために添加することができる。ＣＤ４  Ｔ細胞再刺激は、培養物中のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の割合を濃縮するために使用される。同じ手順を、精製によって得られた末梢血単核細胞を有する少量の血液量を使用して、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞を識別し、この亜集団の頻度を測定する分析目的にもまた使用することができる。
【０１３１】
ＰＢＭＣ画分は、ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化のために以前に使用されたワクチンの成分と一致または相補的なＨＩＶタンパク質と細胞を接触させることによって、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞について濃縮され得る。ｅｘ  ｖｉｖｏ再刺激は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の相対頻度を約５、約１０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、または約２００倍増加させることができる。
【０１３２】
本方法はさらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでの療法的免疫化とｅｘ  ｖｉｖｏでのレンチウイルス形質導入および培養を用いたｅｘ  ｖｉｖｏでのＣＤ４  Ｔ細胞の再刺激とを組み合わせることを含む。本明細書に詳述されているように、これらの方法は、ＨＩＶ陰性個体にワクチン接種するためにまたは予防的（つまり、予防用）治療を提供するために使用することができる。
【０１３３】
したがって、一実施形態では、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞について濃縮された再刺激されたＰＢＭＣ画分は、療法用抗ＨＩＶレンチウイルスまたは他のベクターを用いて形質導入され得、そのような形質導入に十分な期間にわたって、最大約３５日を含む、例えば、約１〜約２１日まで、培養物中に維持され得る。代替的には、細胞は、約１〜約１８日間、約１〜約１５日間、約１〜約１２日間、約１〜約９日間、または約３〜約７日間培養され得る。したがって、形質導入された細胞は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、または約３５日間、培養されてもよい。
【０１３４】
さらなる実施形態では、形質導入された細胞が十分な期間にわたって培養されると、形質導入されたＣＤ４  Ｔ細胞が元の患者に注入し、戻される。注入は、当該技術分野において公知の様々なデバイスおよび方法を使用して実施することができる。一部の実施形態では、注入には、再移植の効率を高めるために、シクロホスファミドまたは同様の化合物での事前治療を伴ってもよい。再移植された細胞は、ＨＩＶ陰性であるが、その後将来的にＨＩＶウイルスに遭遇する対象にとって有効な予防的免疫応答を提供することができる。
【０１３５】
一部の実施形態では、ＣＣＲ５標的療法は、治療プロセスを通して継続して、対象の抗レトロウイルス療法レジメンに加えられてもよい。ＣＣＲ５標的療法の例としては、マラビロク（Maraviroc；ＣＣＲ５アンタゴニスト）またはラパマイシン（Rapamycin；ＣＣＲ５を低下させる免疫抑制剤）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、抗レトロウイルス療法は中止され、対象はウイルスのリバウンドについて試験されることができる。リバウンドが起こらない場合、アジュバント療法もまた取り除くことができ、対象はウイルスのリバウンドについて再び試験されることができる。
【０１３６】
種々の実施形態では、約２６週間にわたり、ｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを含めた抗レトロウイルス療法を減少させたか、または伴わなず、かつアジュバント療法を減少させたか、または伴わない継続的なウイルス抑制は、ＨＩＶの機能的治癒と考えることができる。機能的治癒の他の定義は、本明細書に記載されている。
【０１３７】
開示された方法で使用されるレンチウイルスベクターおよび他のベクターは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、もしくは少なくとも５つの目的の遺伝子、または少なくとも６つの目的の遺伝子、または少なくとも７つの目的の遺伝子、または少なくとも８つの目的の遺伝子、または少なくとも９つの目的の遺伝子、または少なくとも１０個の目的の遺伝子、または少なくとも１１個の目的の遺伝子、または少なくとも１２個の目的の遺伝子をコードし得る。ＨＩＶ標的化遺伝子治療の多様性および治療可能性を考慮すると、本発明のウイルスベクターは、（ｉ）感染性疾患に関連する抗原または感染性病原体により産生された毒素に対する抗体、（ｉｉ）免疫細胞の増殖または機能に必要で、ＨＩＶおよび他の慢性または急性のヒトウイルスまたは細菌病原体で遭遇する免疫調節不全のための療法であり得る、インターロイキンを含むサイトカイン、（ｉｉｉ）ＣＤ８抑制因子を含むｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＨＩＶの増殖を抑制する因子、（ｉｖ）ケモカイン受容体ＣＣＲ５の変異もしくは欠失、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ４の変異もしくは欠失、またはケモカイン受容体ＣＸＣＲ５の変異もしくは欠失、（ｖ）ＨＩＶに関連する特異的受容体もしくはペプチドまたはＨＩＶに関連する宿主タンパク質に対するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ、（ｖｉ）ＨＩＶに関連する特異的受容体もしくはペプチドまたはＨＩＶに関連する宿主タンパク質に対する低分子干渉ＲＮＡ、または（ｖｉｉ）ＨＩＶまたはＡＩＤＳを治療するために使用され得る様々な他の療法的に有用な配列を含むがそれらに限定されない遺伝子または核酸配列をコードしてもよい。
【０１３８】
開示された方法において使用することができるＨＩＶ標的化遺伝子治療のさらなる例は、親和性が増強されたＴ細胞受容体、ＣＤ４  Ｔ細胞上の（または代替的にはＣＤ８  Ｔ細胞上の）キメラ抗原受容体、ウイルスタンパク質により引き起こされる細胞死を避けるためのシグナル伝達経路の改変、ＴＲＥＸ、ＳＡＭＨＤ１、ＭｘＡまたはＭｘＢタンパク質、ＡＰＯＢＥＣ複合体、ＴＲＩＭ５−アルファ複合体、テザリン（ＢＳＴ２）、および哺乳動物細胞におけるＨＩＶ複製を減少させることができるものと識別された類似のタンパク質を含むＨＩＶ制限エレメントの発現の増加を含むことができるが、それらに限定されない。
【０１３９】
一部の実施形態では、患者は、本発明の方法に従って治療されている間と同時にｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを受けていてもよい。他の実施形態では、患者は、本発明の方法に従って治療される前または後に、ｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを受けてもよい。一部の実施形態では、ｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴは、本発明の方法に従った治療を通して維持され、患者は血液中のＨＩＶウイルス負荷についておよび血液中のレンチウイルス形質導入ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度についてモニターされてもよい。好ましくは、本発明の方法に従って治療される前にｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを受けている患者は、本発明の方法に従った治療の後にｃＡＲＴまたはＨＡＡＲＴを中止または減少することができる。他の実施形態では、患者は、ＨＩＶ陰性であり、ＨＩＶウイルスにまだ遭遇していない。
【０１４０】
有効性の目的のために、遺伝子治療効果についての新規の代用マーカーである形質導入されたＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度を、本明細書でより詳細に議論されているように決定してもよい。
【０１４１】
組成物
種々の態様では、本開示は、感受性細胞のＨＩＶ侵入を阻害するために遺伝子構築物を送達することができるレンチウイルスベクターを提供する。例えば、本明細書による１つの作用メカニズムは、感受性細胞へのウイルス進入の速度を減少させるために、ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４ケモカイン受容体のｍＲＮＡレベルを減少させることである。
【０１４２】
代替的には、開示されるレンチウイルスベクターは、入ってくるＨＩＶゲノムＲＮＡの安定性を減少させることによって、ＨＩＶ感染細胞の形成を阻害することができる。さらに別の実施形態では、開示されたレンチウイルスベクターは、潜伏感染細胞からのＨＩＶ産生を防止することができ、その作用メカニズムは、短い相同性、低分子干渉性、または他の調節ＲＮＡ種を含む阻害性ＲＮＡの作用により、ウイルスＲＮＡ配列の不安定性を引き起こすことである。
【０１４３】
開示される療法用レンチウイルスは、一般に、２つの型の遺伝子カーゴ(genetic  cargo）のうちの少なくとも１つを含む。第１に、レンチウイルスは、感受性細胞のＨＩＶ侵入にとって重要なケモカイン受容体ＣＣＲ５および／またはＣＸＣＲ４の産生を阻害することができるスモールＲＮＡの発現を導く遺伝的エレメントをコードしてもよい。第２の型の遺伝子カーゴは、逆転写、ＲＮＡスプライシング、タンパク質を産生するＲＮＡ翻訳、または粒子産生および感染蔓延のためのウイルスゲノムＲＮＡのパッケージングを防止する目的で、ＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とするスモールＲＮＡ分子を発現することができる構築物を含む。例示的な構造を図３に図示する。
【０１４４】
図３に示すように（上パネル）、例示的な構築物は、多数のセクションまたは構成要素を含むことができる。例えば、一実施形態では、例示的なＬＶ構築物は、以下のセクションまたは構成要素を含み得る：
・ＲＳＶ    −  ラウス肉腫ウイルス（Rous  Sarcoma  virus）末端反復配列；
・５’ＬＴＲ    −  染色体組み込み後にベクターの複製を阻止するために切断され得るＨＩＶ末端反復配列の一部；
・Ｐｓｉ    −  パッケージング中にベクターＲＮＡゲノムをウイルス粒子に取り込むことを可能にするパッケージングシグナル；
・ＲＲＥ    −  Ｒｅｖ反応性エレメントは、ＲＮＡを核から細胞の細胞質に移動することによって導入遺伝子からの発現を改善するために添加することができる；
・ｃＰＰＴ    −  宿主細胞の染色体に導入遺伝子を組み込む前に、第２鎖ＤＮＡ合成を促進するポリプリントラクト（ｐｏｌｙ  ｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）；
・プロモーター    −  プロモーターとは、マイクロＲＮＡクラスター（または構築物の他の遺伝子エレメント）を発現するために、組み込まれた導入遺伝子からＲＮＡ転写を開始するものであり、一部の実施形態では、ベクターはＥＦ−１プロモーターを使用してもよい；
・Ａｎｔｉ−ＣＣＲ５    −  宿主細胞因子ＣＣＲ５のメッセンジャーＲＮＡを標的として、細胞表面上の発現を減少させるマイクロＲＮＡ；
・Ａｎｔｉ−Ｒｅｖ／Ｔａｔ    −  ＨＩＶ  Ｒｅｖコーディング領域とＴａｔコーディング領域の間の接合部にあるＨＩＶゲノムＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを標的とするマイクロＲＮＡであり、時にはｍｉＲＮＡ  Ｔａｔと称されるか、またはこの出願において同様の記載が与えられる；
・Ａｎｔｉ−Ｖｉｆ    −  Ｖｉｆコーディング領域内のＨＩＶゲノムＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを標的とするマイクロＲＮＡ；
・ＷＰＲＥ    −  ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（woodchuckhepatitis  virus  post-transcriptional  regulatory  element）は、核のＲＮＡ輸送を促進するために使用することができる追加のベクター構成成分である；および
・ｄｅｌｔａＵ３  ３’ＬＴＲ  −  ベクターの安全性を改善するためにＵ３領域の一部が欠失している、ＨＩＶ  ３’末端反復配列の改変バージョン。
【０１４５】
当業者であれば、上記の構成成分は単なる例であり、そのような構成成分は、構築物がＨＩＶ遺伝子の発現を阻止し、感染の蔓延を減少させることができる限り、他のエレメントで再編成され、置換され、さもなければ改変され得ることを、認識し得る。
【０１４６】
本発明のベクターは、上に議論した遺伝子カーゴの型（すなわち、遺伝子の発現を導く遺伝子エレメントまたは翻訳もしくは転写を阻止することができるｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡのようなスモールＲＮＡ）の一方または両方を含んでもよく、本発明のベクターはまた、ＨＩＶの治療または診断の目的のためにさらなる有用な産物をコードしてもよい。例えば、一部の実施形態では、これらのベクターはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子改変細胞を選択的に維持する目的で、ベクターまたは抗生物質耐性遺伝子を追跡する目的で、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードしてもよい。
【０１４７】
開示されるベクターに組み込まれる遺伝的エレメントの組合せは、特に限定されない。例えば、本明細書のベクターは、１個のスモールＲＮＡ、２個のスモールＲＮＡ、３個のスモールＲＮＡ、４個のスモールＲＮＡ、５個のスモールＲＮＡ、６個のスモールＲＮＡ、７個のスモールＲＮＡ、８個のスモールＲＮＡ、９個のスモールＲＮＡ、または１０個のスモールＲＮＡ、または１１個のスモールＲＮＡ、または１２個のスモールＲＮＡをコードしてもよい。そのようなベクターは、ＨＩＶの発現および感染を阻止するために、スモールＲＮＡと協調して機能する他の遺伝的エレメントを、さらにコードしてもよい。
【０１４８】
当業者は、療法用レンチウイルスが、プロモーター領域、調節ＲＮＡの標的化、および調節ＲＮＡの型に対して代替配列を置換し得ることを理解し得る。さらに、本開示の療法用レンチウイルスは、レンチウイルス粒子をパッケージングするために使用されるプラスミド内に改変を含んでもよい；これらの改変は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける産生のレベルを増加させるために必要となる。
【０１４９】
レンチウイルスベクターシステム
本明細書の種々の態様および実施形態によるレンチウイルスビリオン（粒子）は、ビリオン（ウイルス粒子）の産生に必要なウイルスタンパク質をコードするベクターシステムによって発現される。種々の実施形態では、レンチウイルスｐｏｌタンパク質をコードする核酸配列を含む１つのベクターが、逆転写および組み込みのために提供されており、プロモーターに作動可能に連結されている。別の実施形態では、ｐｏｌタンパク質は、複数のベクターによって発現される。他の実施形態では、ウイルスカプシドを形成するためのレンチウイルスｇａｇタンパク質をコードし、プロモーターに作動可能に連結した核酸配列を含むベクターが提供される。実施形態では、このｇａｇ核酸配列は、ｐｏｌ核酸配列の少なくともいくつかとは別個のベクターに存在する。他の実施形態では、ｇａｇ核酸は、ｐｏｌタンパク質をコードする全てのｐｏｌ核酸配列とは別個のベクターに存在する。
【０１５０】
本明細書のベクターには、多数の改変を施すことができる。そうした改変は、野生型復帰変異体を得る可能性がさらに最小限に抑えられた粒子を作出するために使用される。それらには、ＬＴＲのＵ３領域の欠失、ｔａｔ欠失、およびマトリクス（ＭＡ）欠失が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５１】
実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖベクターは、レンチウイルスパッケージング配列と呼ばれる、レンチウイルスＲＮＡをパッケージングするレンチウイルスゲノム由来ヌクレオチドを含んでいない。
【０１５２】
粒子を形成するベクターは、好ましくは、エンベロープタンパク質を発現するレンチウイルスゲノム由来核酸配列を含んでいない。好ましくは、プロモーターに作動可能に連結したエンベロープタンパク質をコードする核酸配列を含む別のベクターが使用される。このｅｎｖベクターも、レンチウイルスパッケージング配列を含んでいない。一実施形態では、ｅｎｖ核酸配列は、レンチウイルスエンベロープタンパク質をコードする。
【０１５３】
別の実施形態では、エンベロープタンパク質は、レンチウイルスではなく、異なるウイルスに由来する。その結果生じる粒子は、偽型粒子と呼ばれる。エンベロープを適切に選択することにより、事実上あらゆる細胞に「感染」させることができる。例えば、インフルエンザウイルス、ＶＳＶ−Ｇ、アルファウイルス（セムリキ森林熱ウイルス、シンドビスウイルス）、アレナウイルス（リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス）、フラビウイルス（ダニ媒介性脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＧＢウイルス）、ラブドウイルス（水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）、パラミクソウイルス（流行性耳下腺炎または麻疹）、およびオルトミクソウイルス（インフルエンザウイルス）のものなどの、エンドサイトーシス性区画（endocytic  compartment）を標的とするエンベロープタンパク質をコードするｅｎｖ遺伝子を使用することができる。好ましく使用することができる他のエンベロープには、ＭＬＶ−Ｅ、ＭＬＶ−Ａ、およびＧＡＬＶなどの、モロニー白血病ウイルスに由来するものが含まれる。これら後者のエンベロープは、宿主細胞が初代細胞である場合、特に好ましい。所望の宿主細胞に応じて、他のエンベロープタンパク質を選択してもよい。例えば、脳送達には、ドーパミン受容体などの標的化特異的受容体を使用することができる。別の標的は、血管内皮であってもよい。これら細胞は、フィロウイルスエンベロープを使用して標的とすることができる。例えば、転写後修飾によりＧＰおよびＧＰ２糖タンパク質になるエボラのＧＰ。別の実施形態では、偽型エンベロープを有する様々なレンチウイルスカプシドを使用することができる（例えば、ＦＩＶまたはＳＨＩＶ［米国特許第５，６５４，１９５号］）。ＳＨＩＶ偽型ベクターは、サルなどの動物モデルで容易に使用することができる。
【０１５４】
本明細書に提供されているようなレンチウイルスベクターシステムは、典型的には、ｇａｇ、ｐｏｌ、またはｒｅｖ遺伝子の少なくとも１つを含む少なくとも１つのヘルパープラスミドを含む。ｇａｇ、ｐｏｌ、ｒｅｖ遺伝子の各々は、個々のプラスミドに提供されていてもよく、または１つもしくは複数の遺伝子が、同じプラスミドに一緒に提供されていてもよい。一実施形態では、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子は、同じプラスミドに提供されている（例えば、図４）。別の実施形態では、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子は、第１のプラスミドに提供されており、ｒｅｖ遺伝子は、第２のプラスミドに提供されている（例えば、図５）。したがって、３ベクターシステムおよび４ベクターシステムは両方とも、本明細書に記載のようなレンチウイルスを産生するために使用することができる。実施形態では、療法用ベクター、少なくとも１つのエンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドは、パッケージング細胞、例えばパッケージング細胞株にトランスフェクトされる。パッケージング細胞株の非限定的な例は、２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞株である。療法用ベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドが、パッケージング細胞株にトランスフェクトされると、最終的にレンチウイルス粒子が産生される。
【０１５５】
別の態様では、レンチウイルス粒子を発現するためのレンチウイルスベクターシステムが開示される。システムは、本明細書に記載のようなレンチウイルスベクター；細胞に感染するために最適化されているエンベロープタンパク質を発現するためのエンベローププラスミド；およびｇａｇ、ｐｏｌ、およびｒｅｖ遺伝子を発現するための少なくとも１つのヘルパープラスミドを含み、レンチウイルスベクター、エンベローププラスミド、および少なくとも１つのヘルパープラスミドが、パッケージング細胞株にトランスフェクトされると、パッケージング細胞株によってレンチウイルス粒子が産生され、レンチウイルス粒子は、ケモカイン受容体ＣＣＲ５の産生を阻害することができるかまたはＨＩＶ  ＲＮＡ配列を標的とすることができる。
【０１５６】
別の態様では、本明細書では療法用ベクターとも呼ばれるレンチウイルスベクターは、以下のエレメントを含む：ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号３４〜３５）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）（配列番号３６）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号３７）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）（配列番号３８）、ＥＦ−１αプロモーター（配列番号４）、ｍｉＲ３０ＣＣＲ５（配列番号１）、ｍｉＲ２１Ｖｉｆ（配列番号２）、ｍｉＲ１８５Ｔａｔ（配列番号３）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２または８０）、およびΔＵ３  ３’ＬＴＲ（配列番号３９）。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列改変を使用して、参照されている配列を改変することができる。
【０１５７】
別の態様では、ヘルパープラスミドは、以下のエレメントを含むように設計されている：ＣＡＧプロモーター（配列番号４１）；ＨＩＶ成分ｇａｇ（配列番号４３）；ＨＩＶ成分ｐｏｌ（配列番号４４）；ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号４５）；ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号４６）；およびＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号４７）。別の態様では、ヘルパープラスミドは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を発現するための第１のヘルパープラスミド、ならびにｒｅｖ遺伝子を発現するための第２の別のプラスミドを含むように改変されていてもよい。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列改変を使用して、参照されている配列を改変することができる。
【０１５８】
別の態様では、エンベローププラスミドは、以下のエレメントを含む：ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（ＣＭＶ）（配列番号６０）および水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）（配列番号６２）。別の態様では、置換、欠失、付加、または変異による配列改変を使用して、参照されている配列を改変することができる。
【０１５９】
種々の態様では、レンチウイルスパッケージングに使用されるプラスミドは、ベクター機能を喪失させずに、種々のエレメントの置換、付加、差引き（subtraction）、または変異により改変されている。例えば、限定ではないが、パッケージングシステムを含むプラスミドの類似エレメントの代わりに、以下のエレメントを使用することができる：伸長因子−１（ＥＦ−１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターを、ＣＭＶまたはＣＡＧプロモーターの代わりに使用することができる。ＳＶ４０ポリＡおよびｂＧＨポリＡを、ウサギベータグロビンポリＡの代わりに使用することができる。ヘルパープラスミドのＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶ株またはクレードから構築されていてもよい。ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質を、ネコ内在性ウイルス（ＲＤ１１４）、テナガザル類人猿白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、狂犬病（ＦＵＧ）、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、インフルエンザＡ型家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）、またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）に由来する膜糖タンパク質と置換することができる。
【０１６０】
種々のレンチウイルスパッケージングシステムは、商業的に入手することができ（例えば、ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤのＬｅｎｔｉ−ｖｐａｋパッケージングキット）、本明細書に記載のように設計することもできる。さらに、レンチウイルス粒子の産生効率を含む任意の数の関連要因を改善するために、レンチウイルスパッケージングシステムの態様を置換または改変することは、当業者の技術範囲にある。
【０１６１】
バイオアッセイ
種々の態様では、本発明は、機能的治癒を達成するためのＨＩＶ治療の成功を決定するためのバイオアッセイを含む。これらのアッセイは、患者における形質導入されたＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度を測定することによって、開示された免疫化および治療の方法の有効性を測定するための方法を提供する。ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞は、特に、増殖し、細胞表面マーカーの組成を改変させて、リン酸化を含むシグナル伝達経路および／または核成分を誘導するため、認識できる。特異的応答性ＣＤ４  Ｔ細胞は、例えば、またはフローサイトメトリー選別、磁気ビーズ分離または抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞単離についての他の認識されている方法を使用して、ＨＩＶ特異的細胞の選別を可能にする、標識モノクローナル抗体またはｍＲＮＡ配列の特異的ｉｎ  ｓｉｔｕ増幅を使用して、認識される。単離したＣＤ４  Ｔ細胞を試験して、組み込まれた療法用レンチウイルスを有する細胞の頻度を決定する。ＨＩＶに対する応答性および組み込まれた療法用レンチウイルスの存在を確認するための質量分析法、ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、または抗体染色と組み合わせた、個々の細胞のマイクロ流体分離を含む、単一細胞試験法もまた、使用してもよい。
【０１６２】
したがって、種々の実施形態では、本発明による治療（例えば、（ａ）免疫化、（ｂ）ｅｘ  ｖｉｖｏ白血球／リンパ球培養；（ｃ）精製タンパク質、不活化ウイルス、ウイルスベクター化タンパク質、細菌性ベクター化タンパク質、サイトカインおよび／またはケモカインを含む生物学的または化学的アジュバント、ビヒクルによる再刺激；および（ｄ）濃縮され形質導入されたＴ細胞の注入）の適用の後、治療の有効性を決定するために患者を次いで、アッセイしてもよい。体内の標的Ｔ細胞の閾値は、機能的治癒を測定するために、所定の値に、例えば、約１×１０８個の、療法用レンチウイルスによる遺伝子改変を有するＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞として確立してもよい。代替的には、閾値は、患者の体内において、約１×１０５、約１×１０６、約１×１０７、約１×１０８、約１×１０９、または約１×１０１０個のＣＤ４  Ｔ細胞であってもよい。
【０１６３】
療法用レンチウイルスによる遺伝子改変を有するＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞は、例えば、ただし限定されることのない、フローサイトメトリー、細胞選別、ＦＡＣＳ分析、ＤＮＡクローニング、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲもしくはＱ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ＦＩＳＨ、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、ハイスループット配列決定、ＲＮＡ配列決定、オリゴヌクレオチドプライマー伸長、または当該技術分野で公知の他の方法のような任意の適切な方法を使用して決定することができる。
【０１６４】
遺伝子改変を有する抗原特異的Ｔ細胞を規定するための方法は、当該技術分野において公知であるが、有効性の標準的な尺度として、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞の同定を、組み込まれたまたは組み込まれていない遺伝子治療構築物と組み合わせるこのような方法を利用することは、本明細書で様々に記載されているように、ＨＩＶ治療の分野における新規の概念である。
【０１６５】
用量および剤形
開示された方法および組成物は、疾患の様々な段階の間にＨＩＶ＋患者を治療するために使用することができる。したがって、投薬レジメンは、患者の状態および投与の方法に基づいて変化し得る。
【０１６６】
様々な実施形態では、最初のｉｎ  ｖｉｖｏ免疫化のためのＨＩＶ特異的ワクチンは、様々な用量で、必要とする対象に投与される。一般に、筋肉内注射によって送達されるワクチンは、約１０μｇ〜約３００μｇ、約２５μｇ〜約２７５μｇ、約５０μｇ〜約２５０μｇ、約７５μｇ〜約２２５、または約１００μｇ〜約２００μｇのＨＩＶタンパク質、あるいは不活化されたウイルス粒子、ウイルス様粒子、もしくは組換えシステムからの精製ウイルスタンパク質から調製されたか、またはウイルス調製物から精製された全ウイルスタンパク質を含む。組換えウイルスまたは細菌ベクターは、記載されたいかなるルートによって投与されてもよい。筋肉内ワクチンは、約１μｇ〜約１００μｇ、約１０μｇ〜約９０μｇ、約２０μｇ〜約８０μｇ、約３０μｇ〜約７０μｇ、約４０μｇ〜約６０μｇまたは約５０μｇの適切なアジュバント分子を含み、注射用量あたり０．１〜５ｍｌの容量の油、生理食塩水、緩衝液または水に懸濁され、可溶性またはエマルション調製物であってもよい。いくつかのウイルスベクター化または細菌性ベクター化ワクチン、融合タンパク質、リポソーム製剤または同様の調製物を含む、口腔、直腸、頬、生殖器粘膜または鼻腔内に送達されるワクチンは、より多量のウイルスタンパク質およびアジュバントを含んでもよい。経皮、真皮下または皮下ワクチンは、経口、直腸または鼻腔内送達ワクチンにより類似したタンパク質およびアジュバントの量を利用する。最初の免疫化に対する応答に依存して、ワクチン接種は、送達のための同じまたは代替的なルートを使用して、１〜５回繰り返してもよい。間隔は、免疫化間で２〜２４週間であってもよい。ワクチン接種に対する免疫応答は、血清、血漿、膣分泌物、直腸分泌物、唾液または気管支肺胞洗浄液中のＨＩＶ特異的抗体を、ＥＬＩＳＡまたは同様の方法を使用して試験することによって測定される。細胞性免疫応答は、ワクチン抗原を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激、続いて細胞内サイトカイン蓄積の染色、次いで、フローサイトメトリーまたはリンパ球増殖、リン酸化シグナル伝達タンパク質の発現または細胞表面活性化マーカーの変化を含む同様の方法によって試験される。投薬の上限は、個々の患者に基づいて決定されてもよく、個々の製品または製品ロットの毒性／安全性プロファイルに依存し得る。
【０１６７】
免疫化は、１回、２回、３回、または繰り返しで行われてもよい。例えば、ＨＩＶ免疫化のための薬剤は、週１回、隔週に１回、３週間に１回、１ヶ月に１回、隔月に１回、３ヶ月に１回、６ヶ月に１回、９ヶ月に１回、１年に１回、１８ヶ月に１回、２年に１回、３６ヶ月に１回、または３年に１回、必要な対象に投与されてもよい。
【０１６８】
免疫化は、一般に、ＣＤ４  Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖および濃縮の前に、少なくとも１回行われるであろうし、ｅｘ  ｖｉｖｏでのリンパ球の培養／再刺激および注入後は、１回、２回、３回、またはそれよりも多くの回数で、免疫化を行ってもよい。
【０１６９】
一実施形態では、免疫化のためのＨＩＶワクチンは、医薬組成物として投与される。一実施形態では、ＨＩＶワクチンを含む医薬組成物は、臨床応用のための幅広く様々な経鼻、経肺、経口、局所、または非経口剤形で製剤化される。各々の剤形は、様々な崩壊剤、界面活性剤、充填剤、増粘剤、結合剤、湿潤剤のような希釈剤または他の薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。ＨＩＶワクチンを含む医薬組成物はまた、注射用に製剤化することもできる。
【０１７０】
免疫化の目的のためのＨＩＶワクチン組成物は、鼻腔内、頬側、舌下、経口、直腸、眼、非経口（静脈内、皮内、筋肉内、皮下、大槽内、腹腔内）、肺内、膣内、部位的投与、局所投与、乱刺後の局所投与、粘膜投与、エアロゾルを介して、または頬側もしくは鼻スプレー製剤を介してなどの任意の薬学的に許容される方法を使用して投与することができる。
【０１７１】
さらに、ＨＩＶワクチン組成物は、固体剤形、錠剤、丸薬、ロゼンジ、カプセル、液体分散液、ゲル、エアロゾル、肺エアロゾル、鼻エアロゾル、軟膏、クリーム、半固体剤形、および懸濁液などの、任意の薬学的に許容される剤形に製剤化されることができる。さらに、組成物は、制御放出製剤、持続放出製剤、即時放出製剤、またはそれらの任意の組合せであってもよい。さらに、組成物は、経皮送達システムであってもよい。
【０１７２】
別の実施形態では、ＨＩＶワクチンを含む医薬組成物は、経口投与のための固体剤形で製剤化され、固体剤形は、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤または丸薬であり得る。さらに別の実施形態では、固体剤形は、炭酸カルシウム、デンプン、スクロース、乳糖、微結晶セルロースまたはゼラチンのような、１つまたは複数の賦形剤を含む。さらに、固体剤形は、賦形剤に加えて、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤を含むことができる。一部の実施形態では、経口剤形は、即時放出または改変放出形態である。改変放出剤形には、制御放出または持続放出、腸内放出などが含まれる。改変放出剤形において使用される賦形剤は、当業者に一般的に公知である。
【０１７３】
さらなる実施形態では、ＨＩＶワクチンを含む医薬的組成物は、舌下または頬側の剤形として製剤化される。そのような剤形は、頬と歯茎との間に位置した舌下および頬側錠剤の下で投与される、舌下錠剤または溶液組成物を含む。
【０１７４】
なおさらなる実施形態では、ＨＩＶワクチンを含む医薬組成物は、鼻用剤形として製剤化される。そのような本発明の剤形は、経鼻送達のための溶液、懸濁液およびゲル組成物を含む。
【０１７５】
一実施形態では、医薬組成物は、懸濁液、エマルションまたはシロップのような経口投与用の液体剤形で製剤化される。他の実施形態では、液体剤形は、水および流動パラフィンのような一般的に使用される単純希釈剤に加えて、保湿剤、甘味料、芳香剤または防腐剤のような様々な賦形剤を含むことができる。特定の実施形態では、ＨＩＶワクチンを含む組成物またはその薬学的に許容される塩は、小児患者への投与に適するように製剤化される。
【０１７６】
一実施形態では、医薬組成物は、滅菌水溶液、懸濁液、エマルション、非水性溶液または坐剤などの非経口投与のための剤形で製剤化される。他の実施形態では、非水性溶液または懸濁液は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、またはオレイン酸エチルのような注射可能なエステルを含む。坐剤のベースとして、ウィテプソール（witepsol）、マクロゴール（macrogol）、ツイーン６１（tween  61）、カカオ油、ラウリン油またはグリセリン化ゼラチンを使用することができる。
【０１７７】
医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、投与の時間および形態、排泄速度、および疾患の重篤度に依存して変化し得る。
【０１７８】
再刺激の目的のために、一般に、リンパ球、ＰＢＭＣ、および／またはＣＤ４  Ｔ細胞を患者から取り出し、再刺激および培養のために単離する。単離された細胞は、免疫化に使用されたものと同じＨＩＶワクチンもしくは活性化剤または異なるＨＩＶワクチンもしくは活性化剤と接触させてもよい。一実施形態では、単離された細胞は、培養物中の約１０６個の細胞あたり約１０ｎｇ〜５μｇ（または任意の他の適切な量）のＨＩＶワクチンまたは活性化剤と接触される。より具体的には、単離された細胞は、培養物中の約１０６個の細胞あたり、約５０ｎｇ、約１００ｎｇ、約２００ｎｇ、約３００ｎｇ、約４００ｎｇ、約５００ｎｇ、約６００ｎｇ、約７００ｎｇ、約８００ｎｇ、約９００ｎｇ、約１μｇ、約１．５μｇ、約２μｇ、約２．５μｇ、約３μｇ、約３．５μｇ、約４μｇ、約４．５μｇ、または約５μｇのＨＩＶワクチンまたは活性化剤と接触させてもよい。
【０１７９】
活性化剤またはワクチンは、一般に、各々のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養に１回使用されるが、約１５〜約３５日の間隔の後に繰り返してもよい。例えば、繰り返しの投薬は、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、または約３５日で行ってもよい。
【０１８０】
濃縮され、再刺激された細胞の形質導入のために、細胞は、レンチウイルスベクターまたは例えば図４に開示される他の公知のベクターシステムを用いて形質導入されてもよい。形質導入される細胞は、培養中の標的細胞あたり、（レンチウイルスベクターを含む培養液のＲＴ−ＰＣＲアッセイにより測定された）約１〜１，０００個（または任意の他の適切な量）のウイルスゲノムと接触させてもよい。レンチウイルスの形質導入は、培養物中の標的細胞あたり１〜１，０００個のウイルスゲノムの同じ範囲を使用して、１〜５回繰り返してもよい。
【０１８１】
細胞濃縮
種々の実施形態では、Ｔ細胞などの細胞をＨＩＶ感染患者から得て、培養する。培養は、マルチウェルプレートの、順化培地（「ＣＭ」）を含む培養培地中で行ってもよい。上清ｐ２４ｇａｇ（「ｐ２４」）のレベルおよびウイルスＲＮＡレベルは、標準的手段によって評価することができる。そのＣＭ培養細胞が１ｎｇ／ｍｌ未満のピークｐ２４上清レベルを有する患者は、さらなる抗ウイルス剤を使用してまたは使用せずにＣＭ中での大規模なＴ細胞増殖のために適切な患者であってもよい。加えて、異なる目的の薬物または目的の薬物の組合せを、異なるウェルに添加し、試料中のウイルスレベルに対する影響を、標準的手段によって評価してもよい。適度なウイルス抑制を提供する薬物の組合せは、治療上有用な組合せである。特定の対象に関して何が適度なウイルス抑制を構成するかを決定するのは、適格な技術者の能力内にある。目的の薬物がウイルス増殖を制限する有効性を試験するために、抗ＣＤ３抗体などのさらなる因子を培養物に添加して、ウイルス産生を刺激してもよい。ＨＩＶ感染細胞試料のための、当技術分野で公知の培養方法とは異なり、ＣＭは、２か月間よりも長期間にわたってＴ細胞の培養を可能にし、それにより、長期的な薬物有効性をアッセイするための有効なシステムを提供する。
【０１８２】
このアプローチは、ＣＭを含む培地で細胞を培養することにより、細胞集団においてＨＩＶ  ＬＴＲプロモーター領域によって駆動される遺伝子発現の阻害を可能にする。ＣＭ４中での培養は、転写媒介性タンパク質とＨＩＶ遺伝子発現調節エレメントとの間の１つまたは複数の相互作用を変更することによって、ＨＩＶ  ＬＴＲ駆動性遺伝子発現を阻害する可能性が高い。目的の転写媒介性タンパク質には、ＡＰ−１、ＮＦｋａｐｐａＢ、ＮＦ−ＡＴ、ＩＲＦ、ＬＥＦ−１、およびＳｐ１などの宿主細胞にコードされているタンパク質、ならびにＨＩＶにコードされているタンパク質Ｔａｔが含まれる。目的のＨＩＶ遺伝子発現調節エレメントには、ＡＰ−１、ＮＦｋａｐｐａＢ、ＮＦ−ＡＴ、ＩＲＦ、ＬＥＦ−１、およびＳｐ１の結合部位、ならびにＴａｔと相互作用するトランス作用性応答エレメント（「ＴＡＲ」）が含まれる。
【０１８３】
好ましい実施形態では、ＨＩＶ感染細胞は、感受性転写媒介性タンパク質配列および感受性ＨＩＶ調節エレメント配列を有する対象から得られる。より好ましい実施形態では、ＨＩＶ感染細胞は、野生型転写媒介性タンパク質配列および野生型ＨＩＶ調節配列を有する対象から得られる。
【０１８４】
Ｔ細胞を濃縮する別の方法では、免疫親和性に基づく選択が利用される。この方法は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞集団などの第１および第２の細胞集団を、同時に濃縮または選択することを含む。初代ヒトＴ細胞を含む細胞を、ＣＤ４に特異的に結合する第１の免疫親和性試薬およびＣＤ８に特異的に結合する第２の免疫親和性試薬と、インキュベーション組成物中にて、免疫親和性試薬が試料中の細胞の表面にあるＣＤ４およびＣＤ８分子にそれぞれ特異的に結合する条件下で接触させる。第１および／または第２の免疫親和性試薬と結合した細胞を回収し、それにより、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を含む濃縮された組成物を生成する。このアプローチは、組成物を、最適未満の収量濃度である濃度の第１および／または第２の免疫親和性試薬と共にインキュベーションすることを含んでいてもよい。特筆すべきことには、一部の実施形態では、形質導入された細胞は、混合Ｔ細胞集団であり、他の実施形態では、形質導入された細胞は、混合Ｔ細胞集団ではない。
【０１８５】
一部の実施形態では、固体支持体が、マイクロビーズまたはナノビーズなどのビーズなどの球体である、免疫親和性に基づく選択が使用される。他の実施形態では、ビーズは、磁気ビーズであってもよい。別の実施形態では、抗体は、球体またはクロマトグラフィーマトリクスなどの固体表面に固定化されている結合試薬と可逆的結合を形成し、抗体を固体表面に可逆的に固定化することができる１つまたは複数の結合パートナーを含む。一部の実施形態では、前記固体表面の抗体が結合する細胞表面マーカーを発現する細胞を、結合試薬と結合パートナーとの可逆的結合を壊すことによって、マトリクスから回収することができる。一部の実施形態では、結合試薬は、ストレプトアビジン、またはストレプトアビジン類似体もしくは変異体である。
【０１８６】
造血系および／または造血幹細胞の初代細胞の安定形質導入は、細胞の表面と、レンチウイルスベクターおよび細胞表面に結合する少なくとも１つの分子の両方と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで接触させることにより得ることができる。細胞は、成長および／または増殖を促す条件下で、２つまたはそれよりも多くの層を含む換気容器中で培養してもよい。一部の実施形態では、このアプローチは、非ＣＤ４＋  Ｔ細胞枯渇および／または広域ポリクローナル増殖（broad  polyclonal  expansion）と共に使用することができる。
【０１８７】
Ｔ細胞濃縮の別のアプローチでは、ＰＢＭＣをペプチドで刺激し、インターフェロン−ガンマなどのサイトカインを分泌する細胞について濃縮する。このアプローチは、一般に、Ｔ細胞を含む細胞の混合物を抗原で刺激するステップ、産物で標識される度合いに応じて、抗原で刺激された細胞の分離を達成するステップを含む。抗原刺激は、少なくとも１つのＴ細胞の抗原特異的刺激を誘発するのに有効な条件下で、細胞を、少なくとも１つの抗原に曝露することにより達成される。産物による標識化は、少なくとも１つの捕捉部分を含むように細胞の表面を修飾し、産物が分泌され、放出され、前記捕捉部分に特異的に結合する（「捕捉される」または「捕獲される」）条件下で細胞を培養し、捕捉された産物を標識部分で標識することにより達成され、ここで、標識された細胞は、標識手順の一部としても分離手順の一部としても溶解されない。捕捉部分には、濃縮ステップを精緻化し、一般には抗原特異的Ｔ細胞の、特にＣＤ４＋  Ｔ細胞の割合を増加させるために、細胞表面糖タンパク質ＣＤ３またはＣＤ４の検出が組み込まれていてもよい。
【０１８８】
以下の実施例は、本発明の態様を例示するために示されている。しかしながら、本発明は、これらの実施例において記載された特定の条件または詳細に限定されるものではないことが理解されるべきである。本明細書で参照されている刊行物は全て、参照により具体的に組み込まれる。
【実施例】
【０１８９】
（実施例１：レンチウイルスベクターシステムの開発）
レンチウイルスベクターシステムを、図３（線形形態）および図４（環状化形態）に要約されているように開発した。まず図３の上段部分を参照すると、代表的な療法用ベクターを、以下のエレメントを左から右に向かって有するように設計および生成した：ハイブリッド５’末端反復配列（ＲＳＶ／５’ＬＴＲ）（配列番号３４〜３５）、Ｐｓｉ配列（ＲＮＡパッケージング部位）（配列番号３６）、ＲＲＥ（Ｒｅｖ応答エレメント）（配列番号３７）、ｃＰＰＴ（ポリプリントラクト）（配列番号３８）、ＥＦ−１αプロモーター（配列番号４）、ｍｉＲ３０ＣＣＲ５（配列番号１）、ｍｉＲ２１Ｖｉｆ（配列番号２）、ｍｉＲ１８５Ｔａｔ（配列番号３）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２または８０）、およびΔＵ３  ３’ＬＴＲ（配列番号３９）。図３に詳述されている療法用ベクターは、本明細書ではＡＧＴ１０３とも呼ばれる。
【０１９０】
次に、図３の中段部分を参照すると、ヘルパープラスミドを、左から右に向かって以下のエレメントを有するように設計および生成した：ＣＡＧプロモーター（配列番号４１）；ＨＩＶ成分ｇａｇ（配列番号４３）；ＨＩＶ成分ｐｏｌ（配列番号４４）；ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号４５）；ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号４６）；およびＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号４７）。
【０１９１】
次に、図３の下段部分を参照すると、エンベローププラスミドを、左から右に向かって以下のエレメントを有するように設計および生成した：ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター（ＣＭＶ）（配列番号６０）および水疱性口内炎ウイルスＧ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）（配列番号６２）。
【０１９２】
レンチウイルス粒子を、２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞（American  Type  Culture  Collection、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから購入）で産生し、その後、療法用ベクター、エンベローププラスミド、およびヘルパープラスミド（図３に示されているような）をトランスフェクションした。機能的ウイルス粒子を産生した２９３Ｔ／１７  ＨＥＫ細胞のトランスフェクションでは、試薬ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を使用して、プラスミドＤＮＡ取り込みの効率を増加させた。最初に、プラスミドおよびＤＮＡを、無血清培養培地に３：１の比率（ＰＥＩ対ＤＮＡの質量比）で別々に添加した。２〜３日後、細胞培地を集め、レンチウイルス粒子を、高速遠心分離および／または濾過してから、陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。レンチウイルス粒子の濃度は、形質導入単位／ｍｌ（ＴＵ／ｍｌ）で表すことができる。ＴＵの決定は、培養液中のＨＩＶ  ｐ２４レベルを測定し（ｐ２４タンパク質は、レンチウイルス粒子に組み込まれている）、定量ＰＣＲで細胞あたりのウイルスＤＮＡコピー数を測定することにより、または細胞を感染させ、光を使用することにより（ベクターがルシフェラーゼまたは蛍光タンパク質マーカーをコードしている場合）達成した。
【０１９３】
上記で言及されているように、３ベクターシステム（つまり、２ベクターレンチウイルスパッケージングシステム）を、レンチウイルス粒子の産生用に設計した。３ベクターシステムの模式図は、図４に示されている。図４の模式図は、図３で上述した線形システムの環状化バージョンである。手短に言えば、図４を参照すると、最上段のベクターは、ヘルパープラスミドであり、この場合は、Ｒｅｖを含む。図４の中段に現れるベクターは、エンベローププラスミドである。最下段のベクターは、上述した療法用ベクターである。
【０１９４】
図４をより詳しく参照すると、ヘルパー+Ｒｅｖプラスミドは、ＣＡＧエンハンサー（配列番号４０）；ＣＡＧプロモーター（配列番号４１）；ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号４２）；ＨＩＶ  ｇａｇ（配列番号４３）；ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号４４）；ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号４５）；ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号４６）；ＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号４７）；およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号４８）を含む。
【０１９５】
エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号６０）；ベータグロビンイントロン（配列番号６１）；ＶＳＶ−Ｇ（配列番号６２）；およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号６３）を含む。
【０１９６】
ヘルパー（+Ｒｅｖ）およびエンベローププラスミドを含む２ベクターレンチウイルスパッケージングシステムの合成。
材料および方法：
ヘルパープラスミドの構築：ヘルパープラスミドは、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ遺伝子を含むｐＮＬ４−３  ＨＩＶプラスミド（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ試薬プログラム）に由来するＤＮＡ断片の最初のＰＣＲ増幅により構築した。プライマーは、ｐＣＤＮＡ３プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の同じ部位に挿入するために使用することができるＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ制限部位を有する断片を増幅するように設計した。フォワードプライマーは、（５’−ＴＡＡＧＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＴＧＣＣＡＧＧＡＡＧＡＴ−３’）（配列番号８１）であり、リバースプライマーは、（５’−ＣＣＡＴＡＣＡＡＴＧＡＡＴＧＧＡＣＡＣＴＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＧＡＡＴ−３’）（配列番号８２）であった。Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼ断片の配列は以下の通りであった：
【化４３−１】
2019509029.tif 000058
【化４３−２】
2019509029.tif 000059
【０１９７】
次に、Ｒｅｖ、ＲＲＥ、およびウサギベータグロビンポリＡ配列を含み、ＸｂａＩおよびＸｍａＩ隣接制限部位を有するＤＮＡ断片が、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。その後、ＤＮＡ断片を、プラスミドのＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位に挿入した。ＤＮＡ配列は、以下の通りであった：
【化４４】
2019509029.tif 000060
【０１９８】
最後に、ｐＣＤＮＡ３．１のＣＭＶプロモーターを、ＣＡＧエンハンサー／プロモーター+ニワトリベータアクチンイントロン配列と置換した。ＣＡＧエンハンサー／プロモーター／イントロン配列を含み、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ隣接制限部位を有するＤＮＡ断片が、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。その後、ＤＮＡ断片を、プラスミドのＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位に挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【化４５】
2019509029.tif 000061
【０１９９】
ＶＳＶ−Ｇエンベローププラスミドの構築：
隣接するＥｃｏＲＩ制限部位を有する水疱性口内炎インディアナウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）配列が、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。その後、ＤＮＡ断片を、ｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＥｃｏＲＩ制限部位に挿入し、ＣＭＶ特異的プライマーを使用して配列決定することにより、配向性が正しいことを決定した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【化４６】
2019509029.tif 000062
【０２００】
また、４ベクターシステム（つまり、３ベクターレンチウイルスパッケージングシステム）を、本明細書に記載されている方法および材料を使用して設計および生成した。４ベクターシステムの模式図は、図５に示されている。図５を参照して手短に言えば、最上段のベクターは、ヘルパープラスミドであり、この場合は、Ｒｅｖを含んでいない。最上段から２つ目のベクターは、別のＲｅｖプラスミドである。最下段から２つ目のベクターは、エンベローププラスミドである。最下段のベクターは、上述した療法用ベクターである。
【０２０１】
部分的に図５を参照して、ヘルパープラスミドは、ＣＡＧエンハンサー（配列番号４９）；ＣＡＧプロモーター（配列番号５０）；ニワトリベータアクチンイントロン（配列番号５１）；ＨＩＶ  ｇａｇ（配列番号５２）；ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号５３）；ＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号５４）；ＨＩＶ  ＲＲＥ（配列番号５５）；およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号５６）を含む。
【０２０２】
Ｒｅｖプラスミドは、ＲＳＶプロモーター（配列番号５７）；ＨＩＶ  Ｒｅｖ（配列番号５８）；およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号５９）を含む。
【０２０３】
エンベローププラスミドは、ＣＭＶプロモーター（配列番号６０）；ベータグロビンイントロン（配列番号６１）；ＶＳＶ−Ｇ（配列番号６２）；およびウサギベータグロビンポリＡ（配列番号６３）を含む。
【０２０４】
ヘルパー、Ｒｅｖ、およびエンベローププラスミドを含む３ベクターレンチウイルスパッケージングシステムの合成。
材料および方法：
Ｒｅｖを含まないヘルパープラスミドの構築：
Ｒｅｖを含まないヘルパープラスミドを、ＲＲＥおよびウサギベータグロビンポリＡ配列を含むＤＮＡ断片を挿入することにより構築した。隣接するＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位を有するこの配列は、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。その後、ＲＲＥ／ウサギポリＡベータグロビン配列を、ヘルパープラスミドのＸｂａＩおよびＸｍａＩ制限部位に挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りである：
【化４７】
2019509029.tif 000063
【０２０５】
Ｒｅｖプラスミドの構築：
ＲＳＶプロモーターおよびＨＩＶ  Ｒｅｖ配列が、隣接するＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位を有する単一ＤＮＡ断片として、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。その後、ＤＮＡ断片を、ＣＭＶプロモーターがＲＳＶプロモーターに置換されているｐＣＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＭｆｅＩおよびＸｂａＩ制限部位に挿入した。ＤＮＡ配列は以下の通りであった：
【化４８】
2019509029.tif 000064
【０２０６】
２ベクターおよび３ベクターパッケージングシステムのプラスミドを、類似のエレメントで改変し、ベクター機能を喪失させずにイントロン配列を潜在的に除去することができる。例えば、以下のエレメントを、２ベクターおよび３ベクターパッケージングシステムの類似エレメントの代わりに使用することができる可能性がある。
【０２０７】
プロモーター：伸長因子−１（ＥＦ−１）（配列番号６４）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）（配列番号６５）、およびユビキチンＣ（ＵｂＣ）（配列番号６６）を、ＣＭＶ（配列番号６０）またはＣＡＧプロモーター（配列番号１００）の代わりに使用することができる。
【０２０８】
ポリＡ配列：ＳＶ４０ポリＡ（配列番号６７）およびｂＧＨポリＡ（配列番号６８）を、ウサギベータグロビンポリＡ（配列番号４８）の代わりに使用することができる。
【０２０９】
ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ配列：ヘルパープラスミド中のＨＩＶ配列は、異なるＨＩＶ株またはクレードから構築することができる。例えば、Ｂａｌ株に由来するＨＩＶ  Ｇａｇ（配列番号６９）；ＨＩＶ  Ｐｏｌ（配列番号７０）；およびＨＩＶ  Ｉｎｔ（配列番号７１）を、本明細書で概説されているようなヘルパー／ヘルパー+Ｒｅｖプラスミドに含まれているｇａｇ、ｐｏｌ、およびｉｎｔ配列と交換することができる。
【０２１０】
エンベロープ：ＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質は、ネコ内在性ウイルス（ＲＤ１１４）（配列番号７２）、テナガザル類人猿白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）（配列番号７３）、狂犬病（ＦＵＧ）（配列番号７４）、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）（配列番号７５）、インフルエンザＡ型家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）（配列番号７６）、ロスリバーアルファウイルス（ＲＲＶ）（配列番号７７）、マウス白血病ウイルス１０Ａ１（ＭＬＶ）（配列番号７８）、またはエボラウイルス（ＥｂｏＶ）（配列番号７９）に由来する膜糖タンパク質と置換することができる。これらのエンベロープの配列は、本明細書中の配列部分で特定されている。
【０２１１】
要約すると、３ベクターシステム対４ベクターシステムは、部分的には、以下のように比較および対比させることができる。３ベクターレンチウイルスベクターシステムは、以下のものを含む：１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、インテグラーゼ、およびＲｅｖ／Ｔａｔ；２．エンベローププラスミド：ＶＳＶ−Ｇ／ＦＵＧエンベロープ；および３．療法用ベクター：ＲＳＶ  ５’ＬＴＲ、Ｐｓｉパッケージングシグナル、Ｇａｇ断片、ＲＲＥ、Ｅｎｖ断片、ｃＰＰＴ、ＷＰＲＥ、および３’デルタＬＴＲ。４ベクターレンチウイルスベクターシステムは、以下のものを含む：１．ヘルパープラスミド：ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびインテグラーゼ；２．Ｒｅｖプラスミド：Ｒｅｖ；３．エンベローププラスミド：ＶＳＶ−Ｇ／ＦＵＧエンベロープ；および４．療法用ベクター：ＲＳＶ  ５’ＬＴＲ、Ｐｓｉパッケージングシグナル、Ｇａｇ断片、ＲＲＥ、Ｅｎｖ断片、ｃＰＰＴ、ＷＰＲＥ、および３’デルタＬＴＲ。上記のエレメントに対応する配列は、本明細書の配列表部分で特定されている。
【０２１２】
（実施例２：抗ＨＩＶレンチウイルスベクターの開発）
この実施例の目的は、抗ＨＩＶレンチウイルスベクターを開発することであった。
【０２１３】
阻害性ＲＮＡ設計。ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ケモカインＣ−Ｃモチーフ受容体５（ＣＣＲ５）（ＧＣ０３Ｐ０４６３７７）ｍＲＮＡの配列を使用して、ヒト細胞のＣＣＲ５レベルをノックダウンする潜在的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ候補を探索した。潜在的ＲＮＡ干渉配列は、Ｂｒｏａｄ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからなどのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ設計プログラムまたはＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＢＬＯＣＫ−ｉＴ  ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒによって選択された候補から選んだ。ｓｈＲＮＡ発現を調節するために、Ｈ１、Ｕ６、または７ＳＫのようなＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのすぐ３’側へ、個々の選択したｓｈＲＮＡ配列をレンチウイルスベクターに挿入した。これらのレンチウイルス−ｓｈＲＮＡ構築物を使用して、細胞に形質導入し、特異的ｍＲＮＡレベルの変化を測定した。ｍＲＮＡレベルを減少させるために最も強力なｓｈＲＮＡは、ＣＭＶまたはＥＦ−１アルファＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターのいずれかによる発現を可能にするために、マイクロＲＮＡ骨格内に個々に埋め込んだ。マイクロＲＮＡ骨格はmirbase.org/から選択された。ＲＮＡ配列はまた、合成ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとして合成され、レンチウイルスベクターを使用せずに直接細胞内に導入された。
【０２１４】
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１  ８５ＵＳ＿ＢａＬ、受託番号ＡＹ７１３４０９）のＢａＬ株のゲノム配列を使用して、ヒト細胞におけるＨＩＶ複製レベルをノックダウンする潜在的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ候補を探索した。配列相同性および経験に基づいて、ＨＩＶのＴａｔおよびＶｉｆ遺伝子の領域に探索の焦点を合わせたが、当業者はこれらの領域の使用が非限定的であり、他の潜在的な標的が選択され得ることを理解し得る。重要なことに、ｇａｇまたはｐｏｌ遺伝子の高保存領域は、これらの同配列がベクター製造に必要なパッケージングシステム相補性プラスミドに存在したため、ｓｈＲＮＡによって標的化することができなかった。ＣＣＲ５（ＮＭ  ０００５７９．３、ＮＭ  ００１１００１６８．１特異的ＲＮＡ）と同様に、潜在的なＨＩＶ特異的ＲＮＡ干渉配列は、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（broadinstitute.org/mai/public）が主催するＧｅｎｅ−ＥソフトウェアスイートからなどのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ設計プログラムまたはＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＢＬＯＣＫ−ｉＴ  ＲＮＡｉ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ（rnadesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/setOption.do?designOption=shrna&pid=6712627360706061801）によって選択された候補から選択された。ｓｈＲＮＡ発現を調節するために、Ｈ１、Ｕ６、または７ＳＫのようなＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのすぐ３’側へ、個々の選択したｓｈＲＮＡ配列をレンチウイルスベクターに挿入した。これらのレンチウイルス−ｓｈＲＮＡ構築物を使用して、細胞に形質導入し、特異的ｍＲＮＡレベルの変化を測定した。ｍＲＮＡレベルを減少させるために最も強力なｓｈＲＮＡは、ＣＭＶまたはＥＦ−１アルファＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターのいずれかによる発現を可能にするために、マイクロＲＮＡ骨格内に個々に埋め込んだ。
【０２１５】
ベクター構築。ＣＣＲ５、ＴａｔまたはＶｉｆ  ｓｈＲＮＡについて、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含むオリゴヌクレオチド配列が、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ，ＬＬＣによって合成された。オーバーラップするセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド配列を混合し、７０℃から室温まで冷却する間にアニールさせた。レンチウイルスベクターを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで、３７℃で１時間、消化した。消化したレンチウイルスベクターをアガロースゲル電気泳動で精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＤＮＡゲル抽出キットを使用してゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度を決定し、ベクター対オリゴ（３：１の比）を混合し、アニールさせ、ライゲーションした。ライゲーション反応はＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて室温で３０分間実施した。２．５マイクロリットルのライゲーションミックスを２５マイクロリットルのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に添加した。形質転換は、４２℃でのヒートショック後に達成された。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細菌細胞を広げ、薬物耐性コロニー（アンピシリン耐性プラスミドの存在を示す）を回収し、精製し、ＬＢブロスで増殖させた。オリゴ配列の挿入をチェックするために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＤＮＡミニプレップキットを用いて、収穫した細菌培養物からプラスミドＤＮＡを抽出した。レンチウイルスベクター中のｓｈＲＮＡ配列の挿入を、ｓｈＲＮＡ発現を調節するために使用されるプロモーターのための特異的プライマーを使用したＤＮＡ配列決定によって確認した。ＨＩＶ複製を制限することが決定された例示的なベクター配列は、図６に見出すことができる。その後、例えば、ＣＣＲ５、Ｔａｔ、またはＶｉｆ遺伝子発現に対して最も高い活性を有するｓｈＲＮＡ配列を、ＥＦ−１アルファプロモーター制御下のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）クラスターに組み立てた。プロモーターおよびｍｉＲの配列を図６に示す。
【０２１６】
さらに、標準的な分子生物学技術（例えば、Sambrook；Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual、第４版）ならびに本明細書に記載されている技術を使用して、本明細書の図７に示されているように、一連のレンチウイルスベクターを開発した。
【０２１７】
ベクター１を開発した。ベクター１は、左から右に向かって以下のものを含む：末端反復配列（ＬＴＲ）部分（配列番号３５）；Ｈ１エレメント（配列番号１０１）；ｓｈＣＣＲ５（配列番号１６、１８、２０、２２、または２４−Ｙ）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２、８０）；および末端反復配列部分（配列番号１０２）。
【０２１８】
ベクター２を開発した。ベクター２は、左から右に向かって以下のものを含む：末端反復配列（ＬＴＲ）部分（配列番号３５）；Ｈ１エレメント（配列番号１０１）；ｓｈＲｅｖ／Ｔａｔ（配列番号１０）；Ｈ１エレメント（配列番号１０１）；ｓｈＣＣＲ５（配列番号１６、１８、２０、２２、または２４）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２、８０）；および末端反復配列部分（配列番号１０２）。
【０２１９】
ベクター３を開発した。ベクター３は、左から右に向かって以下のものを含む：末端反復配列（ＬＴＲ）部分（配列番号３５）；Ｈ１エレメント（配列番号１０１）；ｓｈＧａｇ（配列番号１２）；Ｈ１エレメント（配列番号１０１）；ｓｈＣＣＲ５（配列番号１６、１８、２０、２２、または２４）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２、８０）；および末端反復配列部分（配列番号１０２）。
【０２２０】
ベクター４を開発した。ベクター４は、左から右に向かって以下のものを含む：末端反復配列（ＬＴＲ）部分（配列番号３５）；７ＳＫエレメント（配列番号１０３）；ｓｈＲｅｖ／Ｔａｔ（配列番号１０）；Ｈ１エレメント（配列番号１０１）；ｓｈＣＣＲ５（配列番号１６、１８、２０、２２、または２４）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２、８０）；および末端反復配列部分（配列番号１０２）。
【０２２１】
ベクター５を開発した。ベクター５は、左から右に向かって以下のものを含む：末端反復配列（ＬＴＲ）部分（配列番号３５）；ＥＦ１エレメント（配列番号４）；ｍｉＲ３０ＣＣＲ５（配列番号１）；ＭｉＲ２１Ｖｉｆ（配列番号２）；ｍｉＲ１８５Ｔａｔ（配列番号３）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２、８０）；および末端反復配列部分（配列番号１０２）。
【０２２２】
ベクター６を開発した。ベクター６は、左から右に向かって以下のものを含む：末端反復配列（ＬＴＲ）部分（配列番号３５）；ＥＦ１エレメント（配列番号４）；ｍｉＲ３０ＣＣＲ５（配列番号１）；ＭｉＲ２１Ｖｉｆ（配列番号２）；ｍｉＲ１５５Ｔａｔ（配列番号１０４）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２、８０）；および末端反復配列部分（配列番号１０２）。
【０２２３】
ベクター７を開発した。ベクター７は、左から右に向かって以下のものを含む：末端反復配列（ＬＴＲ）部分（配列番号３５）；ＥＦ１エレメント（配列番号４）；ｍｉＲ３０ＣＣＲ５（配列番号１）；ＭｉＲ２１Ｖｉｆ（配列番号２）；ｍｉＲ１８５Ｔａｔ（配列番号３）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２、８０）；および末端反復配列部分（配列番号１０２）。
【０２２４】
ベクター８を開発した。ベクター８は、左から右に向かって以下のものを含む：末端反復配列（ＬＴＲ）部分（配列番号３５）；ＥＦ１エレメント（配列番号４）；ｍｉＲ３０ＣＣＲ５（配列番号１）；ＭｉＲ２１Ｖｉｆ（配列番号２）；ｍｉＲ１８５Ｔａｔ（配列番号３）；および末端反復配列部分（配列番号１０２）。
【０２２５】
ベクター９を開発した。ベクター９は、左から右に向かって以下のものを含む：末端反復配列（ＬＴＲ）部分（配列番号３５）；ＣＤ４エレメント（配列番号３０）；ｍｉＲ３０ＣＣＲ５（配列番号１）；ｍｉＲ２１Ｖｉｆ（配列番号２）；ｍｉＲ１８５Ｔａｔ（配列番号３）；ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（配列番号３２、８０）；および末端反復配列部分（配列番号１０２）。
【０２２６】
ベクターの開発
これらの実験のために開発されたベクターが必ずしもすべて予想通りに機能した訳ではなかったことに留意すべきである。より具体的には、ＨＩＶに対するレンチウイルスベクターは、３つの主要成分を含んでいてもよい：１）標的細胞表面のＨＩＶ結合タンパク質（受容体）のレベルを低減させて、初期ウイルス付着および侵入を遮断するための阻害性ＲＮＡ；２）ウイルスＴａｔタンパク質を隔離し、ウイルス遺伝子発現をトランス活性化するその能力を減少させることになるＨＩＶ  ＴＡＲ配列の過剰発現；および３）ＨＩＶゲノム内の重要な保存配列を攻撃する阻害性ＲＮＡ。
【０２２７】
上記の第１の点に関して、重要な細胞表面ＨＩＶ結合タンパク質は、ケモカイン受容体ＣＣＲ５である。ＨＩＶ粒子は、ＣＤ４およびＣＣＲ５細胞表面タンパク質に結合することにより、感受性Ｔ細胞に付着する。ＣＤ４は、Ｔ細胞の免疫学的機能に重要である必須細胞表面糖タンパク質であるため、その発現レベルを操作する標的としては選択しなかった。しかしながら、ＣＣＲ５遺伝子のヌル変異が生まれながらにホモ接合性であり、受容体発現が完全に欠如している人々は、少数の感染性疾患に対する感受性が増強されること、および希に自己免疫を発症する可能性があることを除けば、正常な生活を送る。したがって、ＣＣＲ５のモジュレーションは、比較的安全なアプローチであると決定し、抗ＨＩＶレンチウイルスベクターの開発における主要な標的とした。
【０２２８】
上記の第２の点に関して、ウイルスＴＡＲ配列は、ウイルスＴａｔタンパク質に強固に結合する、ＨＩＶゲノムＲＮＡの高度構造化領域である。Ｔａｔ：ＴＡＲ複合体は、ウイルスＲＮＡの効率的な生成に重要である。ＴＡＲ領域の過剰発現は、Ｔａｔタンパク質を隔離し、ウイルスＲＮＡのレベルを減少させる可能性があるデコイ分子として企図されている。しかしながら、ＴＡＲは、レンチウイルス粒子を製造するために使用される細胞を含むほとんどの哺乳動物細胞に対して毒性であることが証明された。さらに、ＴＡＲは、他の実験室ではウイルス遺伝子発現の阻害が非効率的であり、ＨＩＶ遺伝子治療における実行可能な成分としては放棄されている。
【０２２９】
種々の実施形態では、以下の３つの基準を満たすウイルス遺伝子配列を特定した：ｉ）一連のＨＩＶ単離株にわたって適度に保存されている配列が、目的の地理的領域の流行を代表するものであること；ｉｉ）ウイルスベクター中の阻害性ＲＮＡの活性によるＲＮＡレベルの低減が、ＨＩＶ複製を有意に低減させるのに十分な量だけ、対応するタンパク質レベルを低減させることになること；およびｉｉｉ）阻害性ＲＮＡによって標的とされるウイルス遺伝子配列が、製造中にウイルスベクター粒子をパッケージングおよび組み立てるのに必要な遺伝子中に存在しないこと。種々の実施形態では、ＨＩＶ  Ｔａｔ+Ｒｅｖ遺伝子の接合部の配列、およびＨＩＶ  Ｖｉｆ遺伝子内の第２の配列を、阻害性ＲＮＡによる標的とした。Ｔａｔ／Ｒｅｖ標的化は、この領域が、ＨＩＶゲノムのエンベロープ遺伝子と重複するため、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質発現を低減するというさらなる利益を有する。
【０２３０】
ベクターを開発および試験するための種々の方法は、まず、適切な標的を特定し（本明細書に記載のように）、その後、細胞モデルにおいて試験するための個々のまたは複数の阻害性ＲＮＡ種を発現するプラスミドＤＮＡを構築し、最終的には、実証済みの抗ＨＩＶ機能を有する阻害性ＲＮＡを含むレンチウイルスベクターを構築することに依存する。レンチウイルスベクターを、毒性、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生中の収量、およびＣＣＲ５発現レベルを低減させるかまたはウイルス遺伝子産物を低下させてウイルス複製を阻害する点におけるＨＩＶに対する有効性について試験する。
【０２３１】
以下の表２には、複数のバージョンの阻害性構築物を経て臨床候補に到着するまでの進行が実証されている。まず、ｓｈＲＮＡ（短い相同性ＲＮＡ）分子を設計し、プラスミドＤＮＡ構築物から発現させた。
【０２３２】
以下の表２に詳述されているプラスミド１〜４で、ＨＩＶのＧａｇ、Ｐｏｌ、およびＲＴ遺伝子に対するｓｈＲＮＡ配列を試験した。各ｓｈＲＮＡは、細胞モデルにおいてウイルスタンパク質発現の抑制に活性であったが、さらなる開発を妨げた２つの重要な問題があった。第１に、それら配列は、北米および欧州で現在循環しているクレードＢ  ＨＩＶ株を代表しないＨＩＶの実験室単離株を標的としていた。第２に、これらのｓｈＲＮＡは、レンチウイルスベクターパッケージングシステムの重要な成分を標的としていたため、製造中にベクター収量を著しく低減することになるであろう。表２に詳述されているプラスミド５は、ＣＣＲ５を標的とするように選択され、リード候補配列を提供した。表２に詳述されているプラスミド６、７、８、９、１０、および１１は、ＴＡＲ配列を組み込んでおり、レンチウイルスベクター製造に使用される細胞を含む哺乳動物細胞に対して許容できない毒性をもたらしたことが見出された。表２に詳述されているプラスミド２では、Ｔａｔ  ＲＮＡ発現を低減することができるリードｓｈＲＮＡ配列が特定された。表２に詳述されているプラスミド１２は、レンチウイルスベクターのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）として発現されたｓｈＣＣＲ５の有効性を実証し、それが最終産物内にあるべきことが確認された。表２に詳述されているプラスミド１３は、レンチウイルスベクターのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）として発現されたｓｈＶｉｆの有効性を実証し、それが最終産物内にあるべきことが確認された。表２に詳述されているプラスミド１４は、レンチウイルスベクターのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）として発現されたｓｈＴａｔの有効性を実証し、それが最終産物内にあるべきことが確認された。表２に詳述されているプラスミド１５は、ｍｉＲ  ＣＣＲ５、ｍｉＲ  Ｔａｔ、およびｍｉＲ  Ｖｉｆを、単一プロモーターから発現されるｍｉＲクラスターの形態で含んでいた。これらのｍｉＲは、レンチウイルスベクターパッケージングシステムの重要な成分を標的とせず、哺乳動物細胞に対する毒性が無視できる程度であることが証明された。クラスター内のｍｉＲは、以前に試験された個々のｍｉＲと同等に有効であった。全体的な影響は、ＣＣＲ５指向性ＨＩＶ  ＢａＬ株の複製の大幅な低減であった。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【０２３３】
機能アッセイ。ＣＣＲ５、ＴａｔまたはＶｉｆ  ｓｈＲＮＡ配列を含み、実験目的のために、ＣＭＶ即時型初期プロモーター（CMV  Immediate  Early  Promoter）の制御下で緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現し、ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰと命名された個々のレンチウイルスベクターを、ＣＣＲ５、ＴａｔまたはＶｉｆ発現をノックダウンする能力について試験した。ポリブレンの存在下または非存在下で、レンチウイルス粒子を哺乳動物細胞に形質導入した。細胞を２〜４日後に集めた；タンパク質およびＲＮＡをＣＣＲ５、ＴａｔまたはＶｉｆ発現について分析した。ウェスタンブロットアッセイまたは細胞を特異的蛍光抗体で標識すること（ＣＣＲ５アッセイ）によって、続いてＣＣＲ５特異的抗体またはアイソタイプ対照抗体のいずれかを使用して改変および非改変細胞の蛍光を比較する分析フローサイトメトリーによって、タンパク質レベルを試験した。
【０２３４】
レンチウイルスの試験の開始。１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０を使用して、Ｔ細胞培養培地を作製した。ＩＬ２  １０，０００ユニット／ｍｌ、ＩＬ−１２  １μｇ／ｍｌ、ＩＬ−７  １μｇ／ｍｌ、ＩＬ−１５  １μｇ／ｍｌのサイトカインストックもまた、前もって調製した。
【０２３５】
レンチウイルスの形質導入の前に、感染性ウイルス力価を決定し、適切な感染多重度（ＭＯＩ）のために加えるウイルス量を計算するために使用した。
【０２３６】
０〜１２日目：抗原特異的濃縮：０日目に、凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、３７℃の培地１０ｍｌで１２００ｒｐｍにて１０分間洗浄し、３７℃の培地中で２×１０６個／ｍｌの濃度で再懸濁した。３７℃で５％ＣＯ２中に、２４ウェルプレート内で０．５ｍｌ／ウェルで細胞を培養した。最適刺激条件を定義するために、以下の表３に列挙される試薬の組合せで細胞を刺激した：
【表３−１】
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【０２３７】
最終濃度：ＩＬ−２＝２０ユニット／ｍｌ、ＩＬ−１２＝１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−７＝１０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−１５＝１０ｎｇ／ｍｌ、ペプチド＝５μｇ／ｍｌ  個々のペプチド、ＭＶＡ  ＭＯＩ＝１。
【０２３８】
４および８日目に、０．５ｍｌの新鮮な培地および列挙された濃度（すべての濃度は培養物中の最終濃度を示す）でのサイトカインを刺激された細胞に添加した。
【０２３９】
１２〜２４日目：非特異的な増殖およびレンチウイルスの形質導入。１２日目に、刺激された細胞をピペットでプレートから取り出し、新鮮なＴ細胞培地に１×１０６個／ｍｌの濃度で再懸濁した。再懸濁した細胞をＴ２５培養フラスコに移し、製造業者の取扱説明書に従ってＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＣＤ３／ＣＤ２８および上に列挙したサイトカインで刺激した；フラスコを垂直位置でインキュベートした。
【０２４０】
１４日目に、ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰをＭＯＩ  ２０で加え、培養物をインキュベーターに２日間で戻した。この時点で、細胞をピペッティングにより回収し、１３００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって集め、同じ容量の新鮮な培地に再懸濁し、再び遠心分離して緩やかな細胞ペレットを形成した。その細胞ペレットを、前のステップで使用したのと同じサイトカインを含む新鮮な培地に、１ｍｌあたり０．５×１０６個の生存可能な細胞で再懸濁した。
【０２４１】
１４〜２３日目まで、２日ごとに細胞の数を評価し、細胞を新鮮な培地で０．５×１０６個／ｍ１に希釈した。サイトカインは毎回、添加された。
【０２４２】
２４日目に細胞を集め、ビーズを細胞から除去した。ビーズを除去するために、細胞を適切なチューブに移し、選別マグネット（sorting  magnet）中に２分間置いた。細胞を含む上清を新しいチューブに移した。その後、新鮮な培地中で１日間、１ｘ１０６個／ｍｌで細胞を培養した。抗原特異的Ｔ細胞およびレンチウイルス形質導入細胞の頻度を決定するためにアッセイを実施した。
【０２４３】
起こり得るウイルスの増殖を阻止するために、刺激の初日および培養中の隔日にアンプレナビル（amprenavir；０．５ｎｇ／ｍｌ）を培養物に添加した。
【０２４４】
ＩＦＮ−ガンマについての細胞内サイトカイン染色により抗原特異的Ｔ細胞を調べる。ペプチド刺激後または１ｘ１０６細胞／ｍｌでのレンチウイルス形質導入後の培養細胞を培地単独（陰性対照）、Ｇａｇペプチド（５μｇ／ｍｌの個々のペプチド）、またはＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ、陽性対照）で刺激した。４時間後、ＢＤ  ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）（１：１０００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加して、ゴルジ輸送を遮断した。８時間後、細胞を洗浄し、製造業者の取扱説明書に従ってＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（商標）キットを用いて、細胞外（ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体および細胞内（ＩＦＮ−ガンマ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体で染色した。試料をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーターで分析した。適切なアイソタイプ適合抗体で標識された対照試料を各々の実験に含めた。データは、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェアを使用して分析した。
【０２４５】
レンチウイルスの形質導入率は、ＧＦＰ＋細胞の頻度によって決定した。形質導入された抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＧＦＰ＋ＩＦＮガンマ＋細胞の頻度によって決定される；ＣＤ３＋ＣＤ８＋ＧＦＰ＋ＩＦＮガンマ＋細胞の試験は対照として含まれる。
【０２４６】
これらの結果は、標的Ｔ細胞集団であるＣＤ４  Ｔ細胞に、ＨＩＶ特異的タンパク質の発現を特異的にノックダウンするように設計されたレンチウイルスを用いて形質導入することができ、したがって、ウイルスに対して免疫性であるＴ細胞の増殖可能な集団を生成することを示す。この実施例は、ＨＩＶ患者において機能的治癒を生じさせるために、開示されたレンチウイルス構築物をワクチン接種と組み合わせて使用することができ、またＨＩＶ陰性対象を予防的に治療するために使用することができることを示す概念の証明となる。
【０２４７】
（実施例４：実験的ベクターでのＣＣＲ５ノックダウン）
ＡＧＴｃ１２０は、大量のＣＤ４およびＣＣＲ５を安定して発現するＨｅｌａ細胞株である。ＬＶ−ＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙ（ＣＭＶ即時型初期プロモーターの制御下で発現される赤色蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ）またはＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙを用いて、または用いずに、ＡＧＴｃ１２０を用いて形質導入した。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質の遺伝子発現は、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス即時型初期プロモーター）発現カセットによって制御された。ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙがＣＣＲ５、ＶｉｆおよびＴａｔに対する療法用ｍｉＲＮＡを発現した一方で、ＬＶ−ＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙベクターはマイクロＲＮＡクラスターを欠いていた。
【０２４８】
図８Ａに示すように、形質導入効率は＞９０％であった。７日後、細胞を集め、ＣＣＲ５に対する蛍光モノクローナル抗体で染色し、分析フローサイトメトリーに供した。ＣＣＲ５  ＡＰＣの平均蛍光強度（ｘ軸）に対してモードについて規格化した細胞数（ｙ軸）をプロットしたこれらのヒストグラムにおいて、アイソタイプ対照を灰色で示す。細胞表面ＣＣＲ５の染色後、レンチウイルス無しまたは対照レンチウイルス（ｍＣｈｅｒｒｙマーカーのみを発現する）で処理した細胞は、ＣＣＲ５密度の変化を示さなかった一方で、ＡＧＴ１０３（右側のセクション）はＣＣＲ５染色強度をほぼアイソタイプ対照のレベルまで低下させた。７日後、細胞をＲ５指向性ＨＩＶレポーターウイルスＢａｌ−ＧＦＰを用いてまたは用いずに感染させた。３日後、細胞を集め、フローサイトメトリーにより分析した。９０％を超える細胞が形質導入された。ＡＧＴ１０３−ＣＭＶ／ＣＭＶｍＣｈｅｒｒｙは、形質導入されたＡＧＴｃ１２０細胞におけるＣＣＲ５発現を低下させ、対照ベクターで処理した細胞と比較してＲ５指向性ＨＩＶ感染を遮断した。
【０２４９】
図８Ｂは、ＨＩＶの感染に対してのトランスフェクトされたＡＧＴｃ１２０細胞の相対非感受性を示す。上のように、レンチウイルスベクターはｍＣｈｅｒｒｙタンパク質を発現し、またＨＩＶに感染した形質導入細胞（ＧＦＰを発現する）は、偽色フローサイトメトリードットプロットの右上の象限に二重陽性細胞として現れる。ＨＩＶが存在しない場合（上パネル）、いかなる条件下においてもＧＦＰ＋細胞は存在しなかった。ＨＩＶ感染後（下パネル）、レンチウイルス形質導入の非存在下では５６％の細胞が感染し、ＬＶ−ＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙを用いて形質導入されたＡＧＴｃ１２０細胞では５３．６％の細胞が感染した。療法用ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ｍＣｈｅｒｒｙベクターを用いて細胞に形質導入した場合、０．８３％の細胞のみが二重陽性の象限に現れ、このことはそれらが形質導入され、感染したことを示している。
【０２５０】
５３．６２（対照ベクターとの二重陽性細胞の割合）を０．８３（療法用ベクターとの二重陽性細胞の割合）で割ると、ＡＧＴ１０３がこの実験システムにおいてＨＩＶに対して６５倍を超える防御を提供したことが示される。
【０２５１】
（実施例５：レンチウイルスベクターのｓｈＲＮＡ阻害剤配列によるＣＣＲ５発現の調節）
阻害性ＲＮＡ設計。ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）ケモカイン受容体ＣＣＲ５（ＣＣＲ５、ＮＣ０００００３．１２）の配列を使用して、ヒト細胞のＣＣＲ５レベルをノックダウンするための潜在的なｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ候補を探索した。潜在的ＲＮＡ干渉配列は、Ｂｒｏａｄ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからなどのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ設計プログラムまたはＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＢＬＯＣＫ−ＩＴ  ＲＮＡ  ｉＤｅｓｉｇｎｅｒによって選択された候補から選択した。ｓｈＲＮＡ配列は、ｓｈＲＮＡ発現を調節するために、Ｈ１、Ｕ６、または７ＳＫなどの、プラスミドのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの直後に挿入してもよい。また、ｓｈＲＮＡ配列は、類似のプロモーターが使用されているレンチウイルスベクターに挿入してもよく、またはＣＭＶもしくはＥＦ−１アルファなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターによる発現を可能にするために、マイクロＲＮＡ骨格内に埋め込んでもよい。ＲＮＡ配列はまた、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとして合成され、プラスミドまたはレンチウイルスベクターとは独立して利用されてもよい。
【０２５２】
プラスミド構築。ＣＣＲ５  ｓｈＲＮＡについて、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を含むオリゴヌクレオチド配列が、ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された。オリゴヌクレオチド配列を、７０℃でインキュベーションすることによってアニールさせ、その後室温に冷却した。アニールさせたオリゴヌクレオチドを、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで、３７℃で１時間、消化し、その後、酵素を７０℃で２０分間不活化した。並行して、プラスミドＤＮＡを、３７℃で１時間、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。消化したプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動で精製し、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＤＮＡゲル抽出キットを使用してゲルから抽出した。ＤＮＡ濃度を決定し、血漿（plasma）をオリゴヌクレオチド配列に、３：１のインサート対ベクター比でライゲーションした。ライゲーション反応はＴ４  ＤＮＡリガーゼを用いて室温で３０分間実施した。２．５μＬのライゲーションミックスを２５μＬのＳＴＢＬ３コンピテント細菌細胞に添加した。形質転換には、４２℃でのヒートショックが必要であった。アンピシリンを含有する寒天プレート上に細菌細胞を広げ、コロニーを、Ｌブロスで増殖させた。オリゴ配列の挿入をチェックするために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＤＮＡミニプレップキットを使用して、収穫した細菌培養物からプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素消化で試験した。プラスミドへのｓｈＲＮＡ配列の挿入は、ｓｈＲＮＡ発現を調節するために使用されるプロモーターに特異的なプライマーを使用してＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０２５３】
ＣＣＲ５  ｍＲＮＡ低減の機能アッセイ：ＣＣＲ５発現阻害のアッセイには、２つのプラスミドの同時トランスフェクションが必要であった。第１のプラスミドは、ＣＣＲ５  ｍＲＮＡに対して指向される５つの異なるｓｈＲＮＡ配列の１つを含む。第２のプラスミドは、ヒトＣＣＲ５遺伝子のｃＤＮＡ配列を含む。プラスミドを、２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。４８時間後に細胞を溶解し、ＱｉａｇｅｎのＲＮｅａｓｙキットを使用してＲＮＡを抽出した。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔキットを使用して、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。その後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  ＰＣＲ機械を使用して、定量的ＲＴ−ＰＣＲによって試料を分析した。ＣＣＲ５発現は、ポリメラーゼ連鎖反応分析の標準的条件で、フォワードプライマー（５’−ＡＧＧＡＡＴＴＧＡＴＧＧＣＧＡＧＡＡＧＧ−３’）（配列番号９３）およびリバースプライマー（５’−ＣＣＣＣＡＡＡＧＡＡＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＡＴＣＡ−３’）（配列番号９４）を使用して、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳＹＢＲグリーンを用いて検出した。試料は、ポリメラーゼ連鎖反応分析の標準的条件で、フォワードプライマー（５’−ＡＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＡ−３’）（配列番号９５）およびリバースプライマー（５’−ＧＧＣＧＡＣＧＴＡＧＣＡＣＡＧＣＴＴＣＰ−３’）（配列番号９６）を使用して、ベータアクチン遺伝子発現のｍＲＮＡに対して正規化した。ＣＣＲ５  ｍＲＮＡの相対的発現は、各試料のアクチンメッセンジャーＲＮＡのレベルに対して正規化されたそのＣｔ値によって決定した。結果は、図９に示されている。
【０２５４】
図９Ａに示されているように、ＣＣＲ５  ｓｈＲＮＡ構築物およびＣＣＲ５発現プラスミドの同時トランスフェクションによって、ＣＣＲ５ノックダウンを２９３Ｔ細胞で試験した。対照試料に、いかなるヒト遺伝子も標的としないスクランブルｓｈＲＮＡ配列およびＣＣＲ５発現プラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの６０時間後、試料を収穫し、ＣＣＲ５  ｍＲＮＡレベルを定量的ＰＣＲによって測定した。さらに、図９Ｂに示されているように、ＣＣＲ５  ｓｈＲＮＡ−１（配列番号１６）を発現するレンチウイルスを用いて形質導入した後、ＣＣＲ５はノックダウンされた。
【０２５５】
（実施例６：レンチウイルスベクターのｓｈＲＮＡ阻害剤配列によるＨＩＶ成分の調節）
阻害性ＲＮＡ設計。
ＨＩＶ１型Ｒｅｖ／Ｔａｔ（５’−ＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＣ−３’）（配列番号９）およびＧａｇ（５’−ＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡＴＧＡＣＡＧＣＡＴ−３’）（配列番号１１）の配列を使用して、
【化４９】
2019509029.tif 000075
ｓｈＲＮＡを設計し、それらを合成し、上記に記載のようにプラスミドにクローニングした。
【０２５６】
プラスミド構築。Ｒｅｖ／ＴａｔまたはＧａｇ標的配列を、細胞または組織における遺伝子発現のレポーターとして一般に使用されるホタルルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ（非翻訳領域）に挿入した。加えて、１つのプラスミドを、Ｒｅｖ／Ｔａｔ  ｓｈＲＮＡを発現するように構築し、第２のプラスミドを、Ｇａｇ  ｓｈＲＮＡを発現するように構築した。プラスミド構築は、上記に記載されている通りであった。
【０２５７】
Ｒｅｖ／ＴａｔまたはＧａｇ  ｍＲＮＡのｓｈＲＮＡ標的化の機能アッセイ：プラスミド同時トランスフェクションを使用して、本発明者らは、ｓｈＲＮＡプラスミドがルシフェラーゼメッセンジャーＲＮＡを分解することができるか否か、および同時トランスフェクトされた細胞の発光の強度を減少させることができるか否かを試験した。ｓｈＲＮＡ対照（スクランブル配列）を使用して、ルシフェラーゼをトランスフェクトした細胞からの光の最大発生量を確立した。３’−ＵＴＲ（ｍＲＮＡの非翻訳領域）に挿入されたＲｅｖ／Ｔａｔ標的配列を含むルシフェラーゼ構築物を、Ｒｅｖ／Ｔａｔ  ｓｈＲＮＡ配列と共に同時トランスフェクトした場合、発光のほぼ９０％低減がもたらされ、ｓｈＲＮＡ配列の機能が強力であることが示された。３’−ＵＴＲにＧａｇ標的配列を含むルシフェラーゼ構築物を、Ｇａｇ  ｓｈＲＮＡ配列と同時トランスフェクトした場合も、同様の結果が得られた。これらの結果は、ｓｈＲＮＡ配列の活性が強力であることを示す。
【０２５８】
図１０Ａに示されているように、Ｒｅｖ／Ｔａｔ標的遺伝子のノックダウンを、２９３Ｔ細胞の一過性トランスフェクションにより、３’ＵＴＲの標的ｍＲＮＡ配列と融合されていたルシフェラーゼの活性の低減によって測定した。図１０Ｂに示されているように、ルシフェラーゼ遺伝子と融合されていたＧａｇ標的遺伝子配列がノックダウンされた。結果は、各々三連での３回の独立したトランスフェクション実験の平均±ＳＤとして表示されている。
【０２５９】
（実施例７：ＡＧＴ１０３は、ＴａｔおよびＶｉｆの発現を減少させる）
例示的ベクターＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰを細胞にトランスフェクトした。ＡＧＴ１０３および他の例示的ベクターは、以下の表３に定義される。
【表３−２】
2019509029.tif 000076
【０２６０】
Ｔリンパ芽球様細胞株（ＣＥＭ；ＣＣＲＦ−ＣＥＭ；アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関カタログ番号ＣＣＬ１１９）にＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰを用いて形質導入した。４８時間後、ウイルス配列全体をコードするＨＩＶ発現プラスミドを細胞にトランスフェクトした。２４時間後、ＲＮＡを細胞から抽出し、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を使用してインタクトなＴａｔ配列のレベルについて試験した。インタクトなＴａｔ  ＲＮＡの相対発現レベルは、図１１に示すように、対照レンチウイルスベクターの存在下でのおよそ８５０から、ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰの存在下でのおよそ２００に減少し、＞４倍減少した。
【０２６１】
（実施例８：レンチウイルスベクターの合成マイクロＲＮＡ配列によるＨＩＶ成分の調節）
阻害性ＲＮＡ設計。ＨＩＶ−１  ＴａｔおよびＶｉｆ遺伝子の配列を使用して、ヒト細胞においてＴａｔまたはＶｉｆレベルをノックダウンする潜在的ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ候補を探索した。潜在的ＲＮＡ干渉配列は、Ｂｒｏａｄ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからなどのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ設計プログラムまたはＴｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからのＢＬＯＣＫ−ＩＴ  ＲＮＡ  ｉＤｅｓｉｇｎｅｒによって選択された候補から選んだ。ＴａｔまたはＶｉｆノックダウンが最も強力な、選択されたｓｈＲＮＡ配列を、ＣＭＶまたはＥＦ−ＩアルファなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターによる発現が可能になるように、マイクロＲＮＡ骨格内に埋め込んだ。また、ＲＮＡ配列を、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドとして合成し、プラスミドまたはレンチウイルスベクターとは独立して使用してもよい。
【０２６２】
プラスミド構築。Ｔａｔ標的配列（５’−ＴＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＣＡＴＡＧ−３’）（配列番号７）をｍｉＲ１８５骨格に組み込んで、Ｔａｔ  ｍｉＲＮＡ
【化５０】
2019509029.tif 000077
を作出し、それをレンチウイルスベクターに挿入し、ＥＦ−１アルファプロモーターの制御下で発現させた。同様に、Ｖｉｆ標的配列（５’−ＧＧＧＡＴＧＴＧＴＡＣＴＴＣＴＧＡＡＣＴＴ−３’）（配列番号６）をｍｉＲ２１骨格に組み込んで、Ｖｉｆ  ｍｉＲＮＡ
【化５１】
2019509029.tif 000078
を作出し、それをレンチウイルスベクターに挿入し、ＥＦ−１アルファプロモーターの制御下で発現させた。得られたＶｉｆ／Ｔａｔ  ｍｉＲＮＡ発現レンチウイルスベクターを、レンチウイルスベクターパッケージングシステムを使用して２９３Ｔ細胞中で産生させた。ＶｉｆおよびＴａｔ  ｍｉＲＮＡは、すべてＥＦ−１プロモーターの制御下で発現されるｍｉＲ  ＣＣＲ５、ｍｉＲ  Ｖｉｆ、およびｍｉＲ  Ｔａｔで構成されるマイクロＲＮＡクラスターに埋め込まれていた。
【０２６３】
Ｔａｔ  ｍＲＮＡ蓄積のｍｉＲ１８５  Ｔａｔ阻害の機能アッセイ。ｍｉＲ１８５  Ｔａｔを発現するレンチウイルスベクター（ＬＶ−ＥＦ１−ｍｉＲ−ＣＣＲ５−Ｖｉｆ−Ｔａｔ）を、５と等しい感染多重度で使用して２９３Ｔ細胞に形質導入した。形質導入の２４時間後、細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を標準的条件下で使用して、ＨＩＶ株ＮＬ４−３（ｐＮＬ４−３）を発現するプラスミドをトランスフェクトした。２４時間後、ＲＮＡを抽出し、ＴａｔメッセンジャーＲＮＡのレベルを、Ｔａｔ特異的プライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲによって試験し、対照のアクチンｍＲＮＡレベルと比較した。
【０２６４】
Ｖｉｆタンパク質蓄積のｍｉＲ２１  Ｖｉｆ阻害の機能アッセイ。ｍｉＲ２１  Ｖｉｆを発現するレンチウイルスベクター（ＬＶ−ＥＦ１−ｍｉＲ−ＣＣＲ５−Ｖｉｆ−Ｔａｔ）を、５と等しい感染多重度で使用して、２９３Ｔ細胞に形質導入した。形質導入の２４時間後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、ＨＩＶ株ＮＬ４−３（ｐＮＬ４−３）を発現するプラスミドを細胞にトランスフェクトした。２４時間後、細胞を溶解し、全可溶性タンパク質を試験して、Ｖｉｆタンパク質の含有量を測定した。細胞溶解物を、確立されている技術に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。分離されたタンパク質を、ナイロン膜に転写し、Ｖｉｆ特異的モノクローナル抗体またはアクチン対照抗体を用いてプローブした。
【０２６５】
図１２Ａに示されているように、Ｔａｔノックダウンを、対照レンチウイルスベクター、または合成ｍｉＲ１８５  ＴａｔもしくはｍｉＲ１５５  ＴａｔマイクロＲＮＡのいずれかを発現するレンチウイルスベクターのいずれかを形質導入した２９３Ｔ細胞中で試験した。２４時間後、ＨＩＶベクターｐＮＬ４−３を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて２４時間にわたってトランスフェクトし、その後、Ｔａｔ用のプライマーを用いてｑＰＣＲ分析するためにＲＮＡを抽出した。図１２Ｂに示されているように、Ｖｉｆノックダウンを、対照レンチウイルスベクター、または合成ｍｉＲ２１  ＶｉｆマイクロＲＮＡを発現するレンチウイルスベクターのいずれかを形質導入した２９３Ｔ細胞中で試験した。２４時間後、ＨＩＶベクターｐＮＬ４−３を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて２４時間にわたってトランスフェクトし、その後、ＨＩＶ  Ｖｉｆに対する抗体を用いてイムノブロット分析するためにタンパク質を抽出した。
【０２６６】
（実施例９：レンチウイルスベクターの合成マイクロＲＮＡ配列によるＣＣＲ５発現の調節）
ＣＥＭ−ＣＣＲ５細胞に、ＣＣＲ５の合成ｍｉＲ３０配列を含むレンチウイルスベクター（ＡＧＴ１０３：ＴＧＴＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＴＡ（配列番号９７）、ＡＧＴ１０３−Ｒ５−１：ＴＧＴＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＧＣＴＣＧＣ（配列番号９８）、またはＡＧＴ１０３−Ｒ５−２：ＣＡＴＡＧＡＴＴＧＧＡＣＴＴＧＡＣＡＣ（配列番号９９））を形質導入した。６日後、ＣＣＲ５発現を、ＡＰＣコンジュゲートＣＣＲ５抗体でのＦＡＣＳ分析によって決定し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって定量化した。ＣＣＲ５レベルは、ＬＶ−対照を１００％とした場合のＣＣＲ５の％として表した。ＡＧＴ１０３およびＡＧＴ１０３−Ｒ５−１の標的配列は、ＣＣＲ５標的配列＃５と同じ領域にある。ＡＧＴ１０３−Ｒ５−２の標的配列は、ＣＣＲ５標的配列＃１と同じである。ＡＧＴ１０３（全ＣＣＲ５の２％）は、ＡＧＴ１０３−Ｒ５−１（全ＣＣＲ５の３９％）、およびＣＣＲ５レベルを低減させなかったＡＧＴ１０３−Ｒ５−２と比較して、ＣＣＲ５レベルの低減に最も有効である。データは、本明細書の図１３に実証されている。
【０２６７】
（実施例１０：長鎖または短鎖ＷＰＲＥ配列のいずれかを含むレンチウイルスベクターの合成マイクロＲＮＡ配列によるＣＣＲ５発現の調節。）
ベクター構築。レンチウイルスベクターは、治療用遺伝子または遺伝子構築物を最適に発現させるためのＲＮＡ調節エレメントを必要とすることが多い。一般的な選択は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を使用することである。本発明者らは、全長ＷＰＲＥ：
【化５２】
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を含むＡＧＴ１０３を、短縮されたＷＰＲＥエレメント
【化５３】
2019509029.tif 000080
を含む改変ＡＧＴ１０３ベクターと比較した。
【０２６８】
ベクター配列内の長鎖ＷＰＲＥエレメント  対  短鎖ＷＰＲＥエレメントの関数としての、細胞表面ＣＣＲ５発現モジュレーションの機能アッセイ。長鎖または短鎖ＷＰＲＥエレメントを含むＡＧＴ１０３を、５と等しい感染多重度でＣＥＭ−ＣＣＲ５  Ｔ細胞に形質導入するために使用した。形質導入の６日後、細胞を集め、細胞表面ＣＣＲ５タンパク質を検出することができるモノクローナル抗体で染色した。抗体は、蛍光マーカーにコンジュゲートされていた。染色強度は、細胞表面のＣＣＲ５のレベルに正比例する。対照レンチウイルスは、細胞表面ＣＣＲ５レベルに影響を及ぼさず、７３．６単位の平均蛍光強度を有する単一集団をもたらした。長鎖ＷＰＲＥエレメントを有する従来のＡＧＴ１０３は、ＣＣＲ５発現を１１単位の平均蛍光強度レベルに低減させた。短鎖ＷＰＲＥエレメントを組み込むように改変されたＡＧＴ１０３は、１３単位の平均蛍光強度を有する細胞の単一集団をもたらした。したがって、短鎖ＷＰＲＥエレメントの置換は、ＡＧＴ１０３が細胞表面ＣＣＲ５の発現を低減させる能力にほとんどまたはまったく影響を及ぼさなかった。
【０２６９】
図１４に示されているように、ＣＥＭ−ＣＣＲ５細胞に、長鎖または短鎖ＷＰＲＥ配列のいずれかを含むＡＧＴ１０３を形質導入した。６日後、ＣＣＲ５発現を、ＡＰＣコンジュゲートＣＣＲ５抗体を用いたＦＡＣＳ分析によって決定し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として定量化した。ＣＣＲ５レベルは、ＬＶ−対照を１００％とした場合のＣＣＲ５の％として表した。ＣＣＲ５レベルの低減は、短鎖（全ＣＣＲ５の５．５％）または長鎖（全ＣＣＲ５の２．３％）ＷＰＲＥ配列のいずれかを有するＡＧＴ１０３について類似していた。
【０２７０】
（実施例１１：ＷＰＲＥ配列を含むまたは含まないレンチウイルスベクターの合成マイクロＲＮＡ配列によるＣＣＲ５発現の調節）
ベクター構築。ＣＣＲ５発現のＡＧＴ１０３下方調節にＷＰＲＥが必要か否かを試験するために、本発明者らは、ＷＰＲＥエレメント配列を含まない改変ベクターを構築した。
【０２７１】
ＡＧＴ１０３ベクターに長鎖ＷＰＲＥエレメントを含む場合またはそれを含まない場合の関数としての、細胞表面ＣＣＲ５発現モジュレーションの機能アッセイ。ＣＣＲ５発現レベルのＡＧＴ１０３モジュレーションにＷＰＲＥが必要であるか否かを試験するために、本発明者らは、５と等しい感染多重度を使用して、ＡＧＴ１０３またはＷＰＲＥを欠如する改変ベクターを用いてＣＥＭ−ＣＣＲ５  Ｔ細胞に形質導入した。形質導入の６日後、細胞を集め、細胞表面ＣＣＲ５タンパク質を認識することができるモノクローナル抗体で染色した。モノクローナル抗体は、蛍光マーカーに直接コンジュゲートされていた。染色強度は、細胞表面あたりのＣＣＲ５分子の数に正比例する。レンチウイルス対照ベクターは、細胞表面ＣＣＲ５レベルに影響を及ばさず、１６４の平均蛍光強度を有する均一な集団をもたらした。レンチウイルスベクター（長鎖ＷＰＲＥを有し、さらにＧＦＰマーカータンパク質を発現するＡＧＴ１０３）、ＧＦＰを欠如するが、長鎖ＷＰＲＥエレメントを含むＡＧＴ１０３、またはＧＦＰおよびＷＰＲＥを両方とも欠如するＡＧＴ１０３はすべて、細胞表面ＣＣＲ５発現モジュレーションに同様に有効であった。ＧＦＰを除去した後では、ＷＰＲＥエレメントを含むまたは含まないＡＧＴ１０３は、細胞表面ＣＣＲ５発現をモジュレーションするそれらの能力の点からは識別不能であった。
【０２７２】
ＣＥＭ−ＣＣＲ５細胞に、ＧＦＰおよびＷＰＲＥを含むまたは含まないＡＧＴ１０３を形質導入した。６日後、ＣＣＲ５発現を、ＡＰＣコンジュゲートＣＣＲ５抗体を用いたＦＡＣＳ分析によって決定し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として定量化した。ＣＣＲ５レベルは、ＬＶ−対照を１００％とした場合のＣＣＲ５の％として表した。ＣＣＲ５レベルの低減は、ＷＰＲＥ配列を含む（全ＣＣＲ５の０％）または含まない（全ＣＣＲ５の０％）ＡＧＴ１０３について類似していた。データは、図１５に実証されている。
【０２７３】
（実施例１２：レンチウイルスベクターのＣＤ４プロモーター調節性合成マイクロＲＮＡ配列によるＣＣＲ５発現の調節）
ベクター構築。改変バージョンのＡＧＴ１０３を構築して、ＣＣＲ５、Ｖｉｆ、およびＴａｔ遺伝子発現を抑制するマイクロＲＮＡクラスターを発現するために、代替的プロモーターを代用した場合の効果を試験した。本発明者らは、通常のＥＦ−１プロモーターの代わりに、以下の配列を使用して、ＣＤ４糖タンパク質を発現させるためのＴ細胞特異的プロモーターを代用した：
【化５４】
2019509029.tif 000081
【０２７４】
細胞表面ＣＣＲ５タンパク質発現を低減するための効力の点で、ＥＦ−１およびＣＤ４遺伝子プロモーターを比較する機能アッセイ。通常のＥＦ−１プロモーターの代わりにＣＤ４遺伝子プロモーターを使用することによって改変されたＡＧＴ１０３を、ＣＥＭ−ＣＣＲ５  Ｔ細胞の形質導入に使用した。形質導入の６日後、細胞を集め、細胞表面ＣＣＲ５タンパク質を認識することができるモノクローナル抗体で染色した。モノクローナル抗体は、蛍光マーカーにコンジュゲートされていた。染色強度は、細胞表面ＣＣＲ５タンパク質のレベルに正比例する。対照レンチウイルス形質導入は、ＣＣＲ５特異的モノクローナル抗体で染色され、８１．７単位の平均蛍光強度を示したＣＥＭ−ＣＣＲ５  Ｔ細胞の集団をもたらした。マイクロＲＮＡを発現するためにＥＦ−１プロモーターの代わりにＣＤ４遺伝子プロモーターが使用された改変ＡＧＴ１０３は、幅広い染色分布を示し、平均蛍光強度はおおよそ１７．３単位と等しかった。この結果に基づくと、ＥＦ−１プロモーターは、マイクロＲＮＡ発現用のＣＤ４遺伝子プロモーターと少なくとも同様であり、それよりも優れている可能性がある。所望の標的細胞集団にもよるが、ＥＦ−１プロモーターは、すべての細胞タイプで普遍的に活性であり、ＣＤ４プロモーターは、Ｔリンパ球でしか活性ではない。
【０２７５】
ＣＥＭ−ＣＣＲ５細胞に、ＣＣＲ５、Ｖｉｆ、およびＴａｔに対する合成マイクロＲＮＡ配列を調節するＣＤ４プロモーターを含むレンチウイルスベクター（ＡＧＴ１０３）を形質導入した。６日後、ＣＣＲ５発現を、ＡＰＣコンジュゲートＣＣＲ５抗体を用いたＦＡＣＳ分析によって決定し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として定量化した。ＣＣＲ５レベルは、ＬＶ−対照を１００％とした場合のＣＣＲ５の％として表した。ＬＶ−ＣＤ４−ＡＧＴ１０３を形質導入した細胞では、ＣＣＲ５レベルは全ＣＣＲ５の１１％であった。これは、ＥＦ１プロモーターを含むＬＶ−ＡＧＴ１０３で観察されたものと同等である。このデータは、図１６に実証されている。
【０２７６】
（実施例１３：ＨＩＶ  Ｇａｇ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の検出）
細胞および試薬。生存凍結末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ワクチン会社から得た。データは、候補ＨＩＶ療法用ワクチンを試験する初期段階臨床試験（試験登録：ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  ＮＣＴ０１３７８１５６）に登録されているＨＩＶ＋個体に由来する代表的な検体を用いて得られた。「ワクチン接種前」および「ワクチン接種後」研究用に、２つの検体を得た。細胞培養産物、補充物、およびサイトカインは、商業的供給業者からのものであった。細胞を、Thompson,  M.、S.  L.  Heath、B.  Sweeton、K.  Williams、P.  Cunningham、B.  F.  Keele、S.  Sen、B.  E.  Palmer、N.  Chomont、Y.  Xu、R.  Basu、M.  S.  Hellerstein、S.  Kwa、およびH.  L.  Robinson（２０１６年）。「DNA/MVA  Vaccination  of  HIV-1  Infected  Participants  with  Viral  Suppression  on  Antiretroviral  Therapy,  followed  by  Treatment  Interruption:  Elicitation  of  Immune  Responses  without  Control  of  Re-Emergent  Virus.」PLoS  One  １１巻（１０号）：ｅ０１６３１６４頁に記載されているように、Ｇｅｏｖａｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの組換え改変Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ  ６３Ｂに対する応答について試験した。ＨＩＶ−１  Ｇａｇポリタンパク質全体を表す合成ペプチドを、ＧｅｏＶａｘから得た。または、ＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａペプチドセットを、ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＧｍｂＨ（ｗｗｗ．ｊｐｔ．ｃｏｍ）、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙから得た。ＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａは、各々長さが１５アミノ酸であり、１１個アミノ酸が重複している１５０個のペプチドを含む。それらは、化学的に合成された後、精製され、液体クロマトグラフィー−質量分析によって分析されていた。一緒にすると、これらのペプチドは、ＨＩＶ  Ｇａｇポリタンパク質の主要な免疫原領域を表し、公知ＨＩＶ株の間での５７．８％の平均カバレッジ（average  coverage）のために設計されている。ペプチド配列は、ロスアラモス国立研究所（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｉｖ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ／ＮＥＷＡＬＩＧＮ／ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌ）のＨＩＶ配列データベースに基づく。ペプチドは、ペプチドあたり２５マイクログラムの乾燥トリフルオロ酢酸塩として提供されている。それを、およそ４０マイクロリットルのＤＭＳＯに溶解し、ＰＢＳで終濃度に希釈する。ＣＤ４および細胞質ＩＦＮ−ガンマを検出するためのモノクローナル抗体を商業的供給源から得た。細胞内染色は、インターフェロン−ガンマ用のＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ細胞内染色キットで実施した。ペプチドを、ＤＭＳＯに再懸濁した。本発明者らは、ＤＭＳＯのみの対照条件を含める。
【０２７７】
ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞を検出するための機能アッセイ。凍結ＰＢＭＣを解凍し、洗浄し、１０％ウシ胎仔血清、補充物、およびサイトカインを含むＲＰＭＩ培地に再懸濁した。ワクチン接種前または接種後に集めた培養ＰＢＭＣを、ＤＭＳＯ対照、ＭＶＡ  ＧｅｏＶａｘ（細胞あたり１プラーク形成単位と等しい感染多重度）、ペプチドＧｅｏＶａｘ（１マイクログラム／ｍｌ）、またはＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａペプチド混合物（１マイクログラム／ｍｌ）で、Ｇｏｌｇｉ  Ｓｔｏｐ試薬の存在下にて２０時間処理した。細胞を集め、洗浄し、固定し、透過化し、細胞表面ＣＤ４または細胞内インターフェロン−ガンマに特異的なモノクローナル抗体で染色した。染色した細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ分析用フローサイトメーターで分析した。データは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞サブセットをゲートしたものであった。四角で囲まれている領域内の強調されている細胞は、二重陽性であり、ＭＶＡまたはペプチド刺激後のインターフェロン−ガンマ発現に基づき、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞であると指定した。四角で囲まれている領域内の数値は、ＨＩＶ特異的であると特定された全ＣＤ４のパーセンテージを示す。本発明者らは、ＤＭＳＯまたはＭＶＡに対する強い応答を検出しなかった。ＧｅｏＶａｘのペプチドは、ＪＰＴのＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａペプチド混合物と比較して、より少ない応答性細胞を誘発したが、違いは小さく、有意ではなかった。
【０２７８】
図１７に示されているように、ワクチン接種前または接種後のＨＩＶ陽性患者に由来するＰＢＭＣを、ＤＭＳＯ（対照）、ＧｅｏＶａｘのＨＩＶ  Ｇａｇを発現する組換えＭＶＡ（ＭＶＡ  ＧｅｏＶａｘ）、ＧｅｏＶａｘのＧａｇペプチド（Ｐｅｐ  ＧｅｏＶａｘ、本明細書ではＧａｇペプチドプール１とも呼ばれる）またはＪＰＴのＧａｇペプチド（ＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａペプチド混合物、本明細書ではＧａｇペプチドプール２とも呼ばれる）で２０時間にわたって刺激した。ＩＦＮｇ産生を、標準的プロトコールを使用した細胞内染色およびフローサイトメトリーによって検出した。フローサイトメトリーデータは、ＣＤ４  Ｔ細胞をゲートしたものである。四角内に表示されている数値は、抗原特異的刺激に対するサイトカイン応答に基づき、「ＨＩＶ特異的」であると指定された全ＣＤ４  Ｔ細胞のパーセンテージである。
【０２７９】
（実施例１４：ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞増殖およびレンチウイルス形質導入）
ＰＢＭＣを濃縮してＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の割合を増加させ、それらの細胞にＡＧＴ１０３を形質導入して細胞産物ＡＧＴ１０３Ｔを産生するための方法の設計および試験。療法用ＨＩＶワクチンを受けたＨＩＶ陽性患者に由来するＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）をｅｘ  ｖｉｖｏ培養するためのプロトコールを設計した。この実施例では、療法用ワクチンは、ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖ遺伝子を発現する３用量のプラスミドＤＮＡ、その後の、同じＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖ遺伝子を発現する２用量のＭＶＡ  ６２−Ｂ（改変ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａナンバー６２−Ｂ）で構成されていた。プロトコールは、ワクチン産物に特定されず、免疫化後に十分なレベルのＨＩＶ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞を必要とするに過ぎない。静脈血を集め、ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって精製した。代替的には、ＰＢＭＣまたは規定された細胞トラクション（traction）は、抗体カクテルおよび蛍光活性化または磁気ビーズ選別を使用して、ポジティブまたはネガティブ選択法によって調製してもよい。精製したＰＢＭＣを、洗浄し、補充物、抗生物質、およびウシ胎仔血清を含む標準的培地中で培養する。これらの培養物に、ＨＩＶ  Ｇａｇポリタンパク質内の考え得るＴ細胞エピトープを表す合成ペプチドのプールを添加した。インターロイキン−２およびインターロイキン−１２、インターロイキン２およびインターロイキン−７、インターロイキン−２およびインターロイキン−１５の組合せを試験した後で選択したサイトカイン、インターロイキン２およびインターロイキン−１２を添加することにより培養物を補充する。ペプチド刺激を行い、その後およそ１２日間の培養を行う。１２日間の培養中、新鮮な培地および新鮮なサイトカイン補充物を、およそ４日に１回添加した。
【０２８０】
ペプチド刺激間隔は、ＰＢＭＣ培養物中のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度を増加させるように設計されている。これらのＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞は、以前の療法的免疫化によって活性化された。それらは、合成ペプチド曝露によって再刺激し、増殖させることができる。本発明者らの目標は、ペプチド刺激培養期間の終了時までに、ＨＩＶに特異的な全ＣＤ４  Ｔ細胞が１％よりも多いかまたは１％と等しくなることを達成することである。
【０２８１】
培養のおよそ１２日目に、細胞を洗浄して残留物質を除去し、その後、ＣＤ４  Ｔ細胞表面タンパク質ＣＤ３およびＣＤ２８に対する抗体で修飾されている合成ビーズで刺激する。Ｔ細胞をポリクローナル刺激するためのこの十分に確立されている方法は、細胞を再活性化し、それらをＡＧＴ１０３レンチウイルス形質導入に対してより感受性にするであろう。培養のおよそ１３日目に、１〜５の感染多重度を使用して、レンチウイルス形質導入を実施する。形質導入後、細胞を洗浄して残留レンチウイルスベクターを除去し、インターロイキン−２およびインターロイキン−１２を含む培地中で培養し、培養のおよそ２４日目までおよそ４日に１回、新鮮な培地およびサイトカインを添加する。
【０２８２】
培養間隔の全体にわたって、抗レトロウイルス薬サキナビルを、およそ１００ｎＭの濃度で添加して、可能性のあるＨＩＶのあらゆる増殖を抑制する。
【０２８３】
培養のおよそ２４日目に、細胞を収穫し、洗浄し、効力およびリリースアッセイ用の試料を確保し、次に残りの細胞を凍結保存培地に懸濁してから、ＡＧＴ１０３が形質移入されているおよそ１×１０８個のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞が含まれることになる用量あたりおよそ１×１０１０細胞の単一アリコートとして凍結する。
【０２８４】
細胞産物（ＡＧＴ１０３Ｔ）の効力を、２つの代替的効力アッセイの１つで試験する。効力アッセイ１では、ＣＤ４  Ｔ細胞あたりの平均ゲノムコピー数（組み込みＡＧＴ１０３ベクター配列）が試験される。産物をリリースするための最低限の効力は、ＣＤ４  Ｔ細胞あたりおよそ０．５のゲノムコピーである。このアッセイは、磁気ビーズ標識モノクローナル抗体を使用してＣＤ３陽性／ＣＤ４陽性Ｔ細胞をポジティブ選択し、全細胞ＤＮＡを抽出し、定量的ＰＣＲ反応を使用してＡＧＴ１０３ベクターに固有な配列を検出することによって実施する。効力アッセイ２では、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の亜集団内の組み込みＡＧＴ１０３の平均ゲノムコピー数が試験される。このアッセイ（essay）は、まず、ＨＩＶ  Ｇａｇタンパク質を表す合成ペプチドのプールでＰＢＭＣを刺激することによって達成される。その後、細胞を、ＣＤ４  Ｔ細胞に結合することができ、分泌されたインターフェロン−ガンマサイトカインを補捉することもできる特異的抗体試薬で染色する。ＣＤ４陽性／インターフェロン−ガンマ陽性細胞を、磁気ビーズ選択によって捕捉し、全細胞ＤＮＡを調製し、細胞あたりのＡＧＴ１０３のゲノムコピー数を、定量的ＰＣＲ反応で決定する。アッセイ２を使用した効力に基づくリリース基準は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞あたり０．５よりも多いかまたはそれと等しいゲノムコピーが、ＡＧＴ１０３細胞産物中に存在することを必要とする。
【０２８５】
療法用ＨＩＶワクチンを受けたＨＩＶ陽性患者のＰＢＭＣに由来するＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の濃縮および形質導入の機能試験。ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度に対する療法用ワクチン接種の影響を、ペプチド刺激アッセイで試験した（図１４パネルＢ）。ワクチン接種前のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度は、この代表的な個体では０．０３６％であった。ワクチン接種後のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度は、およそ２倍の値である０．０７６％に増加した。細胞質インターフェロン−ガンマの蓄積によって特定された応答性細胞（ＨＩＶ特異的）は、特異的ペプチド刺激後にのみ検出された。
【０２８６】
また、本発明者らは、ペプチド刺激してＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を濃縮し、その後ＡＧＴ１０３を形質導入することにより、培養物中の全ＣＤ４  Ｔ細胞のおよそ１％の、ＨＩＶ特異的であり、かつＡＧＴ１０３が形質導入されているＣＤ４  Ｔ細胞を生成するという本発明者らの目標が達成されるか否かを試験した。この場合、本発明者らは、緑色蛍光タンパク質を発現する実験バージョンのＡＧＴ１０３を使用した（ＧＦＰを参照）。図１４のパネルＣでは、ペプチド刺激（ＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａ）およびＡＧＴ１０３形質導入後のワクチン接種後培養物は、全ＣＤ４  Ｔ細胞の１．１１％が、ＨＩＶ特異的であり（ペプチド刺激に応答してインターフェロン−ガンマを発現することに基づく）、かつＡＧＴ１０３が形質導入されていた（ＧＦＰの発現に基づく）ことが実証された。
【０２８７】
療法用ＨＩＶワクチン研究の数人の患者を試験して、ペプチド刺激に対する応答の範囲を評価し、将来のヒト臨床試験の遺伝子治療アームに参加させるための適格性基準の規定を開始した。図１８のパネルＤは、４人のワクチン試験参加者のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度を示し、ワクチン接種前および接種後の検体が比較されている。３つの症例で、ワクチン接種後検体は、全ＣＤ４  Ｔ細胞の０．０７６％よりも高いかまたはそれと等しいＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の値を示す。この値に到達する能力は、ワクチン接種前の検体によっては予測されなかった。なぜなら、患者００１−００４および患者００１−００６は両者とも、開始時にはＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞のワクチン接種前値が０．０２％であったが、１人が最終的には０．１２％のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞のワクチン接種後値に達したのに対し、他方の個体はワクチン接種後にこの値を増加させることができていないためである。また、ワクチンに良好に応答した同じ３人の患者は、ＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度を増加させるという点では、ペプチド刺激および培養後にＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の実質的な濃縮を示した。図１８のパネルＥに示されている３つの症例では、ペプチド刺激およびその後の培養により、それぞれ全ＣＤ４  Ｔ細胞の２．０７％、０．７２％、または１．５４％が、ＨＩＶに特異的であった試料が生成された。これらの値は、全ＣＤ４  Ｔ細胞のおよそ１％の、ＨＩＶに特異的であり、最終細胞産物にＡＧＴ１０３が形質導入されているＣＤ４  Ｔ細胞を得るという本発明者らの目標を可能にするために、療法用ＨＩＶワクチンに応答する大半の個体が、ペプチド刺激に対する十分に大きなｅｘ  ｖｉｖｏ応答を有することになることを示す。
【０２８８】
図１８に示されているように、パネルＡは、治療のスケジュールを説明する。パネルＢは、ＰＢＭＣを、ＧａｇペプチドまたはＤＭＳＯ対照で２０時間にわたって刺激したことを実証する。ＩＦＮガンマ産生を、細胞内染色によって、ＦＡＣＳによって検出した。分析のためにＣＤ４＋  Ｔ細胞をゲート制御した。パネルＣは、パネルＡに示されているような方法を使用してＣＤ４＋  Ｔ細胞を増殖し、ＡＧＴ１０３−ＧＦＰを形質導入したことを実証する。増殖したＣＤ４＋  Ｔ細胞を、サイトカインを一切含まない新鮮な培地で２日間休息させ、ＧａｇペプチドまたはＤＭＳＯ対照で２０時間再刺激した。ＩＦＮガンマ産生およびＧＦＰ発現をＦＡＣＳによって検出した。分析のためにＣＤ４＋  Ｔ細胞をゲート制御した。パネルＤは、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞の頻度（ＩＦＮガンマ陽性、ワクチン接種前および接種後）を、４人の患者から検出したことを実証する。パネルＥは、４人の患者に由来するワクチン接種後ＰＢＭＣを増殖させ、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞を検査したことを実証する。
【０２８９】
（実施例１５：用量応答）
ベクター構築。改変バージョンのＡＧＴ１０３を構築して、ＡＧＴ１０３を増加させた際の用量応答、および細胞表面ＣＣＲ５レベルに対するその効果を試験した。ＡＧＴ１０３を、ＣＭＶプロモーターの制御下に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現カセットを含むように改変した。形質導入された細胞は、ｍｉＲ３０ＣＣＲ５  ｍｉＲ２１Ｖｉｆ  ｍｉＲ１８５ＴａｔマイクロＲＮＡクラスターを発現し、ＧＦＰ発現による緑色光を放つ。
【０２９０】
ＡＧＴ１０３−ＧＦＰを増加させた際の用量応答およびＣＣＲ５発現の阻害に関する機能アッセイ。細胞あたりの０から５までの感染多重度を使用して、ＣＥＭ−ＣＣＲ５  Ｔ細胞にＡＧＴ１０３−ＧＦＰを形質導入した。形質導入された細胞を、細胞表面ＣＣＲ５に特異的な蛍光コンジュゲート（ＡＰＣ）モノクローナル抗体で染色した。染色強度は、細胞表面あたりのＣＣＲ５分子の数に比例する。緑色蛍光の強度は、細胞あたりの組み込まれたＡＧＴ１０３−ＧＦＰコピー数に比例する。
【０２９１】
図１９に示されているように、パネルＡは、ＡＧＴ１０３−ＧＦＰを増加させた際の用量応答、および細胞表面ＣＣＲ５発現に対するその効果を実証する。０．４と等しい感染多重度では、１．０４％の細胞のみが、緑色（形質導入を示す）であり、かつＣＣＲ５発現の著しい低減を示す。１と等しい感染多重度では、低ＣＣＲ５、ＧＦＰ＋細胞の数は６８．１％に、５と等しい感染多重度では、低ＣＣＲ５、ＧＦＰ＋細胞の数は９５．７％に増加した。これらのデータは、図１９のパネルＢではヒストグラム形態で提示されており、ＣＣＲ５染色の点で正規分布した集団が、ＡＧＴ１０３−ＧＦＰ用量の増加と共により低い平均蛍光強度に向かって移動したことを示す。ＡＧＴ１０３−ＧＦＰの効力は、図１９のパネルＣではグラフ形態で提示されており、ＡＧＴ１０３−ＧＦＰの用量を増加させた際のＣＣＲ５発現の阻害パーセンテージが示されている。５と等しい感染多重度では、９９％よりも高いＣＣＲ５発現レベルの低減があった。
【０２９２】
（実施例１６：ＡＧＴ１０３は、初代ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞に効率的に形質導入する）
ＡＧＴ１０３レンチウイルスベクターの初代ＣＤ４  Ｔ細胞への形質導入。緑色蛍光タンパク質マーカー（ＧＦＰ）を含む改変ＡＧＴ１０３ベクターを０．２〜５の感染多重度で使用して、精製された初代ヒトＣＤ４  Ｔ細胞に形質導入した。
【０２９３】
初代ヒトＣＤ４  Ｔ細胞へのＡＧＴ１０３の形質導入効率の機能アッセイ。ＣＤ４  Ｔ細胞を、磁気ビーズ標識抗体および標準的手順を使用して、ヒトＰＢＭＣ（ＨＩＶ陰性ドナー）から単離した。精製したＣＤ４  Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでｅｘ  ｖｉｖｏ刺激し、ＡＧＴ１０３形質導入前に、インターロイキン−２を含む培地中で１日間培養した。レンチウイルスベクター用量（感染多重度）と形質導入効率との関係が、図２０のパネルＡに実証されており、０．２と等しい感染多重度では、９．２７％のＡＧＴ１０３が形質導入されたＣＤ４陽性Ｔ細胞がもたらされ、５と等しい感染多重度では、ＡＧＴ１０３が形質導入されたＣＤ４陽性Ｔ細胞のこの値は、６３．１％に増加したことが示されている。初代ＣＤ４陽性Ｔ細胞の効率的形質導入の達成に加えて、細胞あたりのゲノムコピー数を定量化することも必要である。図２０のパネルＢでは、いくつかの感染多重度で形質導入された初代ヒトＣＤ４  Ｔ細胞に由来する全細胞ＤＮＡを定量的ＰＣＲで試験して、細胞あたりのゲノムコピー数を決定した。０．２と等しい感染多重度では、本発明者らは、細胞あたり０．０９６のゲノムコピーを測定した。これは、パネルＡの９．２７％のＧＦＰ陽性ＣＤ４  Ｔ細胞と良好に一致した。１と等しい感染多重度では、細胞あたり０．６９１のゲノムコピーが生成され、５と等しい感染多重度では、細胞あたり１．２４５のゲノムコピーが生成された。
【０２９４】
図２０に示されているように、ＰＢＭＣから単離されたＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとＩＬ−２で１日間刺激し、種々の濃度のＡＧＴ１０３を形質導入した。２日後、ビーズを取り出し、ＣＤ４＋  Ｔ細胞を集めた。パネルＡに示されているように、形質導入された細胞（ＧＦＰ陽性）の頻度を、ＦＡＣＳで検出した。パネルＢに示されているように、細胞あたりのベクターコピー数を、ｑＰＣＲで決定した。５の感染多重度（ＭＯＩ）では、６３％のＣＤ４＋  Ｔ細胞に、細胞あたり平均１ベクターコピーが形質導入された。
【０２９５】
（実施例１７：ＡＧＴ１０３は、初代ＣＤ４＋  Ｔ細胞でのＨＩＶ複製を阻害する）
細胞にＡＧＴ１０３を形質導入することによる、初代ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞のＨＩＶ感染からの保護。療法用レンチウイルスＡＧＴ１０３を、細胞あたり０．２〜５の感染多重度で使用して、初代ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞に形質導入した。その後、形質導入された細胞に、侵入に細胞表面ＣＣＲ５を必要としないＣＸＣＲ４指向性ＨＩＶ株ＮＬ４．３をチャレンジした。このアッセイでは、ＨＩＶのＶｉｆおよびＴａｔ遺伝子に対するマイクロＲＮＡの効力が、初代ＣＤ４陽性Ｔ細胞における増殖性感染の予防の点で試験されるが、感染した初代ヒトＣＤ４  Ｔ細胞から放出されるＨＩＶの量を検出する間接法が使用される。
【０２９６】
初代ヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞のＣＸＣＲ４指向性ＨＩＶ感染に対するＡＧＴ１０３保護の機能アッセイ。ＣＤ４  Ｔ細胞を、磁気ビーズ標識抗体および標準的手順を使用して、ヒトＰＢＭＣ（ＨＩＶ陰性ドナー）から単離した。精製したＣＤ４  Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでｅｘ  ｖｉｖｏ刺激し、インターロイキン−２を含む培地で１日間培養してから、０．２〜５の感染多重度を使用してＡＧＴ１０３を形質導入した。形質導入の２日後、ＣＤ４陽性Ｔ細胞培養物に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するように操作されたＨＩＶ株ＮＬ４．３をチャレンジした。形質導入されＨＩＶに曝露された初代ＣＤ４  Ｔ細胞培養物を７日間維持してから、ＨＩＶを含む無細胞培養液を集めた。無細胞培養液を使用して、高度に許容性のＴ細胞株Ｃ８１６６に２日間感染させた。ＨＩＶに感染したＣ８１６６細胞の割合を、ＧＦＰ蛍光を検出するフローサイトメトリーによって決定した。模擬レンチウイルス感染の場合、ＮＬ４．３  ＨＩＶについての０．１の感染多重度の用量は、１５．４％のＣ８１６６Ｔ細胞で増殖性感染を確立することを可能にした量の培養液へ放出されたＨＩＶをもたらした。０．２感染多重度のＡＧＴ１０３の用量では、Ｃ８１６６細胞のＨＩＶ感染に関するこの値は、５．３％に低減され、１と等しい感染多重度のＡＧＴ１０３では、３．１９％のＣ８１６６Ｔ細胞しかＨＩＶに感染しなかった。Ｃ８１６６感染は、５と等しい感染多重度を使用したＡＧＴ１０３形質導入後、０．６２％にさらに低減された。形質導入に使用したＡＧＴ１０３の量と、培養培地に放出されたＨＩＶの量との間には明らかな用量応答関係性が存在する。
【０２９７】
図２１に示されているように、ＰＢＭＣから単離されたＣＤ４＋  Ｔ細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとＩＬ−２で１日間刺激し、種々の濃度（ＭＯＩ）のＡＧＴ１０３を形質導入した。２日後、ビーズを取り出し、ＣＤ４＋  Ｔ細胞に、０．１ＭＯＩのＨＩＶ  ＮＬ４．３−ＧＦＰを感染させた。２４時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＩＬ−２（３０Ｕ／ｍｌ）と共に７日間培養した。培養の終了時に、上清を集めて、ＨＩＶ許容性細胞株Ｃ８１６６に２日間感染させた。ＨＩＶに感染したＣ８１６６細胞（ＧＦＰ陽性）を、ＦＡＣＳで検出した。Ｃ８１６６細胞のより少ない感染により観察されるように、ＡＧＴ１０３の感染多重度が増加すると共に生存可能なＨＩＶが低減された（ＭＯＩ  ０．２＝６５．６％、ＭＯＩ  １＝７９．３％、およびＭＯＩ  ５＝９６％）。
【０２９８】
（実施例１８：ＡＧＴ１０３は、ＨＩＶ誘導性枯渇から初代ヒトＣＤ４＋  Ｔ細胞を保護する）
ＨＩＶ媒介性細胞病理および細胞枯渇から保護するための初代ヒトＣＤ４  Ｔ細胞のＡＧＴ１０３形質導入。ＰＢＭＣを、健康なＨＩＶ陰性ドナーから取得し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで刺激し、その後、インターロイキン−２を含む培地で１日間培養してから、０．２〜５の感染多重度を使用してＡＧＴ１０３を形質導入した。
【０２９９】
ＨＩＶ媒介性細胞病理からの初代ヒトＣＤ４  Ｔ細胞のＡＧＴ１０３保護の機能アッセイ。ＡＧＴ１０３を形質導入した初代ヒトＣＤ４  Ｔ細胞に、細胞進入にＣＣＲ５を必要としないＨＩＶ  ＮＬ４．３株（ＣＸＣＲ４指向性）を感染させた。ＣＸＣＲ４指向性ＮＬ４．３を使用する場合、ＨＩＶ複製に対するＶｉｆおよびＴａｔマイクロＲＮＡの効果のみを試験する。ＨＩＶ  ＮＬ４．３の用量は、０．１の感染多重度であった。ＨＩＶ感染の１日後、細胞を洗浄して残留ウイルスを除去し、培地とインターロイキン−２中で培養した。１４日間の培養中、細胞を３日毎に集め、その後、ＣＤ４に特異的であり、蛍光マーカーに直接コンジュゲートされているモノクローナル抗体で染色して、ＰＢＭＣ中のＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合の測定を可能にした。未処理ＣＤ４  Ｔ細胞、または対照レンチウイルスベクターを用いて形質導入したＣＤ４  Ｔ細胞は、ＨＩＶチャレンジに高度に感受性であり、ＰＢＭＣ中のＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合は、培養１４日目までに１０％未満に低下した。対照的に、ＡＧＴ１０３は、ＨＩＶチャレンジによる細胞枯渇の防止に対して用量依存的効果を示した。０．２の感染多重度のＡＧＴ１０３用量では、ＰＢＭＣの２０％超が、培養の１４日目までにＣＤ４  Ｔ細胞であり、５と等しい感染多重度のＡＧＴ１０３用量では、培養の１４日目までにＣＤ４陽性Ｔ細胞になったＰＢＭＣは、５０％よりも高い値に増加した。この場合も、ＡＧＴ１０３は、ヒトＰＢＭＣのＨＩＶ細胞病原性に対して明らかな用量応答効果を示した。
【０３００】
図２２に示されているように、ＰＢＭＣを、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズとＩＬ−２で１日間刺激し、種々の濃度（ＭＯＩ）のＡＧＴ１０３を形質導入した。２日後、ビーズを取り出し、細胞に０．１ＭＯＩのＨＩＶ  ＮＬ４．３を感染させた。２４時間後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＩＬ−２（３０Ｕ／ｍｌ）と共に培養した。細胞を、３日毎に集め、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の頻度を、ＦＡＣＳで分析した。ＨＩＶに曝露した１４日間後、ＬＶ−対照を形質導入したＣＤ４＋  Ｔ細胞は８７％低減され、ＡＧＴ１０３  ＭＯＩ０．２では６０％低減され、ＡＧＴ１０３  ＭＯＩ１では３７％低減され、ＡＧＴ１０３  ＭＯＩ５では１７％低減された。
【０３０１】
（実施例１９：ＨＩＶ特異性について濃縮され、ＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰを用いて形質導入されたＣＤ４＋  Ｔ細胞の集団の生成）
ＨＩＶに対する療法用ワクチン接種は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ４＋／ＣＤ８＋  Ｔ細胞の分布に最小限の影響しか及ぼさなかった。図２３Ａに示されるように、ＣＤ４  Ｔ細胞集団は、分析フローサイトメトリードットプロットの左上の象限に示され、ワクチン接種系列後、全Ｔ細胞の５２％から５７％に変化する。これらは代表的なデータである。
【０３０２】
ＨＩＶ療法用ワクチン試験における参加者からの末梢血単核細胞を、培地＋／−インターロイキン−２／インターロイキン−１２または＋／−インターロイキン−７／インターロイキン−１５で１２日間培養した。Ｔ細胞刺激のためのエピトープペプチドの供給源として、ＨＩＶ−１の全ｐ５５  Ｇａｇタンパク質（ＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａペプチド混合物）を表す重複ペプチドで、いくつかの培養物を刺激した。これらのペプチドは、長さが１０〜２０アミノ酸であり、その長さの２０〜５０％が重複しており、ＨＩＶ−１  ＢａＬ株由来のＧａｇ前駆体タンパク質（ｐ５５）全体を表す。個々のペプチドの組成および配列は、主な循環ＨＩＶ配列の領域変動を補償するために、または詳細な配列情報がこの療法を受けている個々の患者に利用可能である場合に、調整することができる。培養終了時に、細胞を回収し、抗ＣＤ４または抗ＣＤ８モノクローナル抗体で染色し、ＣＤ３＋集団をゲートし、ここに表示した。ワクチン接種前または接種後のいずれかの試料についてのＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａペプチド混合物刺激は培地対照と同様であり、このことは、ＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａペプチド混合物が細胞に対して毒性ではなく、ポリクローナル分裂促進因子としては作用しなかったことを示している。この分析の結果は、図２３Ｂに見出すことができる。
【０３０３】
ＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａペプチド混合物およびインターロイキン−２／インターロイキン−１２は、抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の最適な増殖のために提供された。図２３Ｃの上のパネルに示されるように、ＨＩＶ（ＧＡＧ）Ｕｌｔｒａペプチド混合物に曝露されたワクチン接種後検体において、サイトカイン（インターフェロン−ガンマ）分泌細胞の増加があった。ワクチン接種前の試料において、抗原性ペプチドへの曝露の結果として、サイトカイン分泌細胞が０．４３から０．６９％まで増加した。対照的に、ワクチン接種後の試料は、ペプチド刺激の結果として、全ＣＤ４  Ｔ細胞の０．６２から１．７６％までのサイトカイン分泌細胞の増加を示した。これらのデータは、ＨＩＶ抗原に対するＣＤ４  Ｔ細胞応答におけるワクチン接種の強い影響を実証する。
【０３０４】
最後に、抗原増殖したＣＤ４  Ｔ細胞のＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰ形質導入は、ＨＩＶに対する機能的治癒の一部として患者に注入するために必要とされるＨＩＶ特異的およびＨＩＶ耐性ヘルパーＣＤ４  Ｔ細胞を産生した（他の様々な態様および実施形態に応じて、ＡＧＴ１０３は単独で使用され、例えば、臨床実施形態はＣＭＶ−ＧＦＰセグメントを含まなくてもよい）。図２３Ｃの上のパネルは、培養物中のＣＤ４＋  Ｔ細胞集団を分析した結果を示す。図２３Ｃのｘ軸は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）放出を示しており、このことは、個々の細胞にＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰが形質導入されたことを示している。ワクチン接種後の試料において、いずれもサイトカインを分泌する全ＣＤ４  Ｔ細胞の１．１１％が回収され、このことは、細胞がＨＩＶ抗原に特異的に応答し、これらの細胞にＡＧＴ１０３／ＣＭＶ−ＧＦＰが形質導入されることを示している。これは、ＨＩＶの注入および機能的治癒を意図した標的細胞集団および臨床産物である。ｅｘ  ｖｉｖｏ培養の抗原刺激およびその後のポリクローナル増殖期の間の細胞増殖の効率で、４×１０８個の抗原特異的な、レンチウイルス形質導入ＣＤ４  Ｔ細胞を産生することができる。これは、細胞産生の標的を４倍超えており、およそ４０細胞／マイクロリットルの血液または全循環ＣＤ４  Ｔ細胞のおよそ５．７％の、抗原特異的およびＨＩＶ耐性ＣＤ４  Ｔ細胞の数を達成することができるであろう。
【０３０５】
下の表４は、開示されたベクターおよび方法を使用した、ＨＩＶ特異的およびＨＩＶ耐性ＣＤ４  Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏにおける産生の結果を示す。
【表４】
2019509029.tif 000082
【０３０６】
（実施例２０：ＨＩＶ陰性個体の予防的治療の臨床研究）
ＡＧＴ１０３Ｔは、ＡＧＴ１０３レンチウイルスベクターを用いてさらに形質導入されている＞５×１０７個のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を含む遺伝子改変自己由来ＰＢＭＣである。
【０３０７】
第Ｉ相臨床試験では、ＨＩＶ陰性成人研究参加者へのｅｘ  ｖｉｖｏ改変自己由来ＣＤ４  Ｔ細胞（ＡＧＴ１０３Ｔ）注入の安全性および実施可能性が試験されることになる。最大４０人の研究参加者が、特定の産物について確立された用量、経路、および製剤に従って、ＨＩＶ予防ワクチン候補を受ける。ワクチンは、ＨＩＶ  Ｇａｇポリタンパク質を含み、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞を誘発することができなければならない。例えば、ワクチンは、エレクトロポレーションによる３用量のプラスミドＤＮＡであって、ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖタンパク質の発現をコードするプラスミドで構成されていてもよい。続いて、ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖをコードする２用量の組換えＭＶＡ（ｒＭＶＡ）が、筋肉内免疫化で送達される。第２のｒＭＶＡ免疫化の７〜１０日後、ＨＩＶ−１  Ｇａｇポリタンパク質を表す重複した合成ペプチドのプールによる刺激に応答するＣＤ４＋  Ｔ細胞の頻度を測定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験のために、血液試料が集められる。強力なＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞応答を生じる対象が、ＡＧＴ１０３Ｔ細胞療法を受けるのに適格である。ＡＧＴ１０３Ｔを受ける基準は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでペプチド刺激し、インターフェロン−ガンマサイトカイン発現を細胞内染色することにより測定して、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞頻度が、免疫化後の全ＣＤ４  Ｔ細胞の≧０．０６５％であることである。試験参加者は白血球アフェレーシスを受け、その後ＰＢＭＣが精製され（フィコール密度勾配遠心分離または抗体によるネガティブ選択を使用して）、ＰＢＭＣは、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養され、ＨＩＶ  Ｇａｇペプチドとインターロイキン−２およびインターロイキン−１２で１２日間刺激され、その後、ＣＤ３／ＣＤ２８二重特異性抗体で修飾されているビーズで再び刺激される。ＣＤ３／ＣＤ２８刺激の１日後、細胞に、１〜１０の感染多重度でレンチウイルスベクターＡＧＴ１０３（ＬＶ−ＥＦ−１−ｍｉＲＣＣＲ５−ｍｉｒＶｉｆ−ｍｉＲＴａｔ）が形質導入される。形質導入された細胞は、さらに７〜１４日間培養され、その間に、形質導入された細胞は、ポリクローナル増殖によって増殖する。収穫することにより培養期間を終了させ、細胞を洗浄し、効力および安全性リリースアッセイのためにアリコートを取って置き、残りの細胞を、凍結保存培地に再懸濁する。単一用量は、≦１×１０１０個の自己由来ＰＢＭＣである。効力アッセイでは、ペプチド刺激に応答するＣＤ４  Ｔ細胞の頻度が、インターフェロン−ガンマの発現によって測定される。他のリリース基準としては、産物が、ＡＧＴ１０３をさらに形質導入した≧０．５×１０７個のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を含んでいなければならないことが挙げられる。別のリリース基準は、細胞あたりのＡＧＴ１０３ゲノムコピー数が、３を超過してはならないということである。ＡＧＴ１０３Ｔを注入する５日前に、対象は、１用量のブスルフラム（busulfuram）（またはシトキサン）条件付けレジメンを受け、その後、遺伝子改変ＣＤ４  Ｔ細胞を含む≦１×１０１０個のＰＢＭＣが注入される。
【０３０８】
患者選択
組み入れ基準：
・年齢が１８〜６０歳であること。
・研究登録前の１週間以内に血清学およびウイルスＲＮＡアッセイによりＨＩＶ陰性であることが実証されていること。
・過去２５年以内にＭＶＡまたは他の天然痘ワクチンを用いた免疫化を先に受けていないこと。
・研究で義務付けられている評価に応じる意思があり、研究期間中はＨＩＶの曝露前予防措置を使用しないことに合意しなければならない。
・ＣＤ４＋  Ｔ細胞数が、立方ミリメートルあたり＞６００個（細胞／ｍｍ３）であること
除外基準：
・あらゆるウイルス性肝炎
・ＨＩＶ感染
・少なくとも５年間寛解していないがんまたは悪性疾患、ただし治療に成功した皮膚の基底細胞癌は除く
・ＮＹＨＡグレード３または４のうっ血性心不全またはコントロールされていない狭心症もしくは不整脈と現在診断されていること
・出血障害の病歴
・過去３０日の慢性ステロイドの使用
・妊娠または授乳
・活性薬物またはアルコール乱用
・過去３０日の重度疾病
・別の臨床試験に現在参加しているか、またはあらゆる以前の遺伝子治療
安全性評価
・急性注入反応
・注入後の安全性追跡調査
有効性評価−第Ｉ相
・改変ＣＤ４  Ｔ細胞の数および頻度。
・改変ＣＤ４  Ｔ細胞の持続性。
・メモリーＴ細胞機能の尺度としてのＧａｇペプチド再刺激に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ応答（ＩＣＳアッセイ）。
・ＡＧＴ１０３Ｔに関する自己免疫または慢性炎症状態の欠如。
・ワクチンに対する抗体応答に変化も改善もないこと。
【０３０９】
ワクチンに対するＣＤ８細胞障害性Ｔ細胞応答に変化も改善もないこと。
【０３１０】
ＡＧＴ１０３Ｔは、ＡＧＴ１０３レンチウイルスベクターを用いてさらに形質導入した≧５×１０７個のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を含む最大１×１０１０個の遺伝子改変自己由来ＣＤ４＋  Ｔ細胞で構成される。第Ｉ相臨床試験では、ＨＩＶ陰性成人研究参加者へのｅｘ  ｖｉｖｏ改変自己由来ＣＤ４  Ｔ細胞（ＡＧＴ１０３Ｔ）注入の安全性および実施可能性が試験されることになる。最大４０人の研究参加者が、特定の産物について確立された用量、経路、および製剤に従ってＨＩＶ予防ワクチン候補を受ける。ワクチンは、ＨＩＶ  Ｇａｇポリタンパク質を含み、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞を誘発することができなければならない。例えば、ワクチンは、エレクトロポレーションによる３用量のプラスミドＤＮＡであって、ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖタンパク質の発現をコードするプラスミドで構成されていてもよい。続いて、ＨＩＶ  Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖをコードする２用量の組換えＭＶＡ（ｒＭＶＡ）が、筋肉内免疫化で送達される。第２のｒＭＶＡ免疫化の７〜１０日後、ＨＩＶ−１  Ｇａｇポリタンパク質を表す重複した合成ペプチドのプールによる刺激に応答するＣＤ４＋  Ｔ細胞の頻度を測定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験のために、血液試料が集められる。強力なＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞応答を生じる対象が、ＡＧＴ１０３Ｔ細胞療法を受けるのに適格である。ＡＧＴ１０３Ｔを受ける基準は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでペプチド刺激し、インターフェロン−ガンマサイトカイン発現を細胞内染色することにより測定して、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋  Ｔ細胞頻度が、免疫化後の全ＣＤ４  Ｔ細胞の≧０．０６５％であることである。試験参加者は、白血球アフェレーシスを受け、その後ＰＢＭＣが精製され（フィコール密度勾配遠心分離または抗体によるネガティブ選択を使用して）、抗体に基づくネガティブ選択によってＣＤ４＋  Ｔ細胞が濃縮される。濃縮されたＣＤ４＋  Ｔ細胞は、１０：１でＣＤ４陰性画分と混合され（抗原提示細胞を提供するため）、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養され、ＨＩＶ  Ｇａｇペプチドとインターロイキン−２およびインターロイキン−１２で１２日間刺激され、その後、ＣＤ３／ＣＤ２８二重特異性抗体で修飾されているビーズで再び刺激される。ＣＤ３／ＣＤ２８刺激の１日後、細胞に、１〜１０の感染多重度でレンチウイルスベクターＡＧＴ１０３（ＬＶ−ＥＦ−１−ｍｉＲＣＣＲ５−ｍｉｒＶｉｆ−ｍｉＲＴａｔ）が形質導入される。形質導入された細胞は、さらに７〜１４日間培養され、その間に、形質導入された細胞は、ポリクローナル増殖によって増殖する。収穫することにより培養期間を終了させ、細胞を洗浄し、効力および安全性リリースアッセイのためにアリコートを取って置き、残りの細胞を、凍結保存培地に再懸濁する。単一用量は、≦１×１０１０個の自己由来ＣＤ４＋  Ｔ細胞である。効力アッセイでは、ペプチド刺激に応答するＣＤ４  Ｔ細胞の頻度が、インターフェロン−ガンマの発現によって測定される。他のリリース基準としては、産物が、ＡＧＴ１０３をさらに形質導入した≧０．５×１０７個のＨＩＶ特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を含んでいなければならないことが挙げられる。別のリリース基準は、細胞あたりのＡＧＴ１０３ゲ��ムコピー数が、３を超過してはならないということである。ＡＧＴ１０３Ｔを注入する５日前に、対象は、１用量のブスルフラム（またはシトキサン）条件付けレジメンを受け、その後、遺伝子改変ＣＤ４  Ｔ細胞を含む≦１×１０１０個のＰＢＭＣが注入される。
【０３１１】
（実施例２１：ＡＧＴ−ＬＶ−ＨＩＶ１．０は、潜伏性の誘導可能なＨＩＶの細胞モデル（Ｊ１．１）においてＨＩＶ複製を効率的に阻害する）
Ｊ１．１細胞は、ＨＩＶプロウイルスＤＮＡのサイレントコピーを有し、サイトカインＴＮＦ−アルファによる処理によって活性化されると、非常に大量の無細胞ＨＩＶを産生する。図２４のパネル（Ａ）は、形質導入した細胞の＞９９％で緑色蛍光として見られる、ＡＧＴ−Ｔ−ＨＩＶ１．０−ＧＦＰ（別名ＬＶ−Ｒ５ＴａｔＶｉｆ）またはＧＦＰを有する対照レンチウイルスベクターを用いて形質導入されたＪ１．１細胞を示す。図２４のパネル（Ｂ）は、ＨＩＶ産生を誘導するために、形質導入した細胞をＴＮＦ−アルファ（５０ｎｇ／ｍｌ）で処理したことを示す。７日後に上清を集め、精製されたＰＨＡ／ＩＬ２刺激扁桃ＣＤ４  Ｔ細胞に感染させるために使用した。ＨＩＶ感染を、細胞内ｐ２４染色（ＫＣ５７−ＲＤ１、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）およびフローサイトメトリーアッセイによって検出した。ベクターＡＧＴ−ＬＶ−ＨＩＶ１．０は、活性化されたＪ１．１細胞によるＨＩＶ産生を著しく低減した。このアッセイは、ウイルス産生および感染性にとって不可欠なＨＩＶ遺伝子ＴａｔおよびＶｉｆに対するｍｉＲＮＡの活性を検証する。
【０３１２】
配列
以下の配列が、本明細書で言及されている：
【表６−１】
2019509029.tif 000083
【表６−２】
2019509029.tif 000084
【表６−３】
2019509029.tif 000085
【表６−４】
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【表６−５】
2019509029.tif 000087
【表６−６】
2019509029.tif 000088
【表６−７】
2019509029.tif 000089
【表６−８】
2019509029.tif 000090
【表６−９】
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【表６−１０】
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【表６−１１】
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【表６−１２】
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【表６−１３】
2019509029.tif 000095
【表６−１４】
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【表６−１５】
2019509029.tif 000097
【表６−１６】
2019509029.tif 000098
【表６−１７】
2019509029.tif 000099
【表６−１８】
2019509029.tif 000100
【表６−１９】
2019509029.tif 000101
【表６−２０】
2019509029.tif 000102
【表６−２１】
2019509029.tif 000103
【表６−２２】
2019509029.tif 000104
【表６−２３】
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【表６−２４】
2019509029.tif 000106
【表６−２５】
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【表６−２６】
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【表６−２７】
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【表６−２８】
2019509029.tif 000110
【表６−２９】
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【表６−３０】
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【表６−３１】
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【表６−３２】
2019509029.tif 000114
【表６−３３】
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【表６−３４】
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【表６−３５】
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【表６−３６】
2019509029.tif 000118
【表６−３７】
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【表６−３８】
2019509029.tif 000120
【表６−３９】
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【表６−４０】
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【表６−４１】
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【表６−４２】
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【表６−４３】
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【表６−４４】
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【表６−４５】
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【表６−４６】
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【表６−４７】
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【表６−４８】
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【表６−４９】
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【表６−５０】
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【表６−５１】
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【表６−５２】
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【表６−５３】
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【表６−５４】
2019509029.tif 000136
【０３１３】
上に本発明の好ましい実施形態についていくつか説明し、具体的に例示してきたが、本発明はそのような実施形態に限定されることを意図していない。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、様々な改変をそこに施してもよい。
【図１】
2019509029.tif 000144
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019509029.tif 000151
【図９Ａ】
2019509029.tif 000152
【図９Ｂ】
2019509029.tif 000153
【図１０】
2019509029.tif 000154
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2019509029.tif 000159
【図１６】
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【図１７】
2019509029.tif 000161
【図１８】
2019509029.tif 000162
【図１９】
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【図２０】
2019509029.tif 000164
【図２１】
2019509029.tif 000165
【図２２】
2019509029.tif 000166
【図２３−１】
2019509029.tif 000167
【図２３−２】
2019509029.tif 000168
【図２４】
2019509029.tif 000169
【配列表】
2019509029000001.app
【国際調査報告】
2019509029.tif 000170
2019509029.tif 000171