(57)【要約】  ほぼ確実にレシピエントを致死させることなく、人体の細胞の大部分、または９９．９％以上にも核酸配列を送達することを可能にする方法。これは、任意の遺伝子治療薬を安全に送達するために適用することができる。本発明は、ヒトの死亡原因となることが実証されたレベルより５桁以上高くなり得る、体内に導入される送達媒体（カプシドまたは合成キャリア）のレベルに対する免疫系の反応を抑制するために、新規な方法で組み合わされる多くがすでに承認済みである一組の公知の化合物を含む。開示されたＣＲＩＳＰＲ発現制御方法と協同して使用される場合、本方法は、発現を改善することができ、遺伝子治療の標的活性に対してより優れた制御をもたらすことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の細胞に核酸配列を送達する方法であって、
ａ．前記動物に、
ｉ．腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）阻害剤、
ｉｉ．核内因子κＢ（ＮＦκＢ）阻害剤、
ｉｉｉ．インターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）阻害剤、
ｉｖ．Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）阻害剤、
を備える免疫系モジュレーターを投与するステップと、
ｂ．前記動物の細胞内に、前記核酸配列を送達するステップと、
を備え、
ｃ．前記送達するステップは、前記投与するステップの後に行われ、
ｄ．前記核酸配列は、核酸送達媒体（ＮＡＤＶ）を使用して送達される、方法。
【請求項２】
ラパマイシンの機構的標的（ｍＴＯＲ）阻害剤を投与するステップをさらに備え、
前記送達するステップは、それぞれの前記投与するステップの後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムスおよびデフォロリムスからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）を投与するステップをさらに備え、
前記送達するステップは、それぞれの前記投与するステップの後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＳＳＲＩは、シタロプラム、エスシタロプラム、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチン、ダポキセチン、インダルピン、ジメリジン、セリクラミンおよびパヌラミンからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）を投与するステップをさらに備え、
前記送達するステップは、それぞれの前記投与するステップの後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＳＮＲＩは、ベンラファキシン、シブトラミン、デュロキセチン、アトモキセチン、デスベンラファキシン、ミルナシプランおよびレボミルナシプランからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＮＦα阻害剤は、アダリムマブ、エタネルセプト、インフリキシマブまたは２，５−ジメトキシ−４−ヨードアンフェタミンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＮＦκＢ阻害剤は、エクテイナシジン７４３、ジギトキシン、ウアバイン、ボルテゾミブ、クロモマイシンＡ３、エメチン、フルオロサラン、ナラシン、レスタウルチニブ、トリブロンサラン、ビチオノールおよびダウノルビシンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＩＲＦ３阻害剤は、セルトラリン、トリフルオペラジンまたはフルフェナジンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＬＲ９阻害剤は、３−［４−（６−（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール−２−イル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１−アミン、６−［３−（ピロリジン−１−イル）プロポキシ）−２−（４−（３−（ピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル］ベンゾ［ｄ］オキサゾールまたはヒドロキシクロロキンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＮＡＤＶは、ウイルスカプシドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＮＡＤＶは、ポリプレックスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＮＡＤＶは、エンベロープ型ポリプレックスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記送達するステップは、前記投与するステップの前に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記送達するステップは、前記投与するステップと同時に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
テトラサイクリン誘導プロモーターの制御下にある、クラスター化された規則的に間隔を空けられた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）をコードする核酸配列を有する、核酸配列。
【請求項１８】
シトシン−リン酸−グアニン（ＣｐＧ）オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）核酸配列をさらに備える、請求項１７に記載の核酸配列。
【請求項１９】
ａ．前記テトラサイクリン誘導プロモーターの制御下で２つ以上の遺伝子配列を連結する１つ以上のシス作用性ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列をさらに備え、
ｂ．前記２つ以上の遺伝子は、タンパク質をコードする、請求項１７に記載の核酸配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年５月１２日付けで出願された米国特許出願第６２／３３５，５６１号に基づき、その優先権を主張するＰＣＴ出願であり、その全体が完全に記載されたものとして本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、遺伝子治療の分野に属し、さらに、そのための技術を利用可能にする。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、敗血症およびＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の刺激のメカニズムの理解を必要とする。また、ＣＲＩＳＰＲ、遺伝子治療がどのようなものか、およびＣＨＹＳＥＬ系リンカーがどのようなものかの基礎的な理解も必要とする。
【０００４】
（高用量刺激による敗血症様症候群に対する免疫系の脆弱性）
敗血症の原因は、一般的に、感染と考えられている。しかしながら、専門的に言えば、敗血症は、免疫系が感受性を有する病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）に起因する。これらは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）および核酸モチーフに応答する細胞質内パターン認識受容体（ｃＰＲＲ）を誘発する。加えて、死細胞片からのダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）も炎症性サイトカインを誘発する。
【０００５】
敗血症の根本原因は、細菌、真菌またはウイルスからのＰＡＭＰであることもあるが、敗血症は通常、専門的にはエンドトキシンまたはリポ多糖（ＬＰＳ）と称される、分解された細菌の細胞壁によって誘発される。したがって、敗血症の標準的な実験モデルは、滅菌ＬＰＳの注入である。これはまた、しばしばＤＡＭＰの過剰刺激によって誘発される多臓器不全を繰り返す可能性もある。本事例では、誘発物質は、ビリオンカプシドであり、ほとんどの場合、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）株またはレンチウイルス（ＬＶ）株のビリオンカプシドである。加えて、核酸に対するサイトゾル受容体があり、ＴＬＲ間でクロストークが生じる。
【０００６】
マウスモデルにおいて、ＬＰＳのＬＤ50は、肝臓のタンパク質合成に依存する。２５グラムのマウスにおける正常なＬＰＳのＬＤ50は、およそ１５０マイクログラム（６ｍｇ／ｋｇ）であり、その過程が完了するのに３５時間を要する。しかしながら、肝臓のタンパク質合成を阻害するためにβ−ガラクトサミンで前処置したマウスでは、マウスＬＤ50はおよそ５ナノグラム（２００ｎｇ／ｋｇ）であり、３０，０００倍低い。比較すると、正常なヒトは、２〜４ナノグラム／キログラムのＬＰＳで反応を示す。ＬＰＳのヒトＬＤ50は、５マイクログラム／キログラム未満であり、マウスより３桁低い。ヒトは６０００倍大きいが、２５グラムのマウス致死用量のわずか２倍の用量で死亡する。ヒトがマウスの免疫系を有する場合、ＬＰＳのＬＤ50は、平均的な成人の場合、３００マイクログラムではなくおよそ９００ミリグラムであると予想される。ヒトのＬＰＳ感受性は、シアル酸結合Ｉｇ様レクチン（シグレック（ｓｉｇｌｅｃ））における突然変異に起因すると考えられる。表現型では、シグレックのノックアウトは、過反応性の免疫系要素を産生する。他の霊長類では活性であるシグレック１３の欠損および不活性化シグレック１７は、ＴＬＲ４への制御に影響を及ぼす。ＴＬＲ４は、ＬＰＳの受容体である。これはまた、ＤＡＭＰシグナル伝達においてＨＭＧＢ１の標的でもある。
【０００７】
ＴＬＲ４過剰刺激に対するヒト免疫系の制御がノックアウトされてしまうという事実は、全ての非ヒト霊長類を含むあらゆる動物モデルからの研究結果を見るときに常に留意すべきである。動物は、ヒトを致死させる免疫系の攻撃に対して容易に耐性を示すことができる。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、エンドトキシンと異なるＴＬＲを誘発する。遺伝子治療薬の送達に使用するために作り出された様々なＡＡＶ株がある。肝臓において、クッパー細胞は、ＴＬＲ２を介してＡＡＶ２に感受性であり、他の細胞は、ＴＬＲ９を介して感受性である。これらの応答は、受容体をブロックすることによって鈍化することはできるが、なくすことはできない。
【０００８】
「ＴＬＲ２は、グラム陽性菌由来のペプチドグリカン、酵母細胞壁由来のザイモサン、およびクルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）由来のグリコホスファチジルイノシトールアンカーを認識する。ＴＬＲ２はまた、ＴＬＲ１と二量体化される場合、細菌のリポタンパク質を認識することもでき、ＴＬＲ６と二量体化される場合、マイコプラスマリポタンパク質を認識することもできる。・・・ＴＬＲ９は、細菌のＤＮＡ中や、マウスサイトメガロウイルスおよび単純ヘルペスウイルスなどのウイルス中に存在する非メチル化ＣｐＧＤＮＡモチーフによって活性化される。」
【０００９】
２つの主要な炎症経路、すなわち古典的（標準的、直接的）経路および代替（非標準的、間接的）経路がある。古典的経路は、「骨髄分化一次応答遺伝子８８（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｇｅｎｅ  ８８）」（ＭｙＤ８８）を介して刺激し、代替経路は、「ＴＩＲドメイン含有アダプター誘導インターフェロン−β（ＴＩＲ−ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｄａｐｔｅｒ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β）」（ＴＲＩＦ）を介して刺激する。両方とも「核内因子κＢ」（ＮＦκＢ）に影響を及ぼす。ＴＲＩＦがＩＲＦ３を刺激し、同時にＭｙＤ８８がＩＲＦ７を刺激し、その両方によりＩ型インターフェロンの産生が引き起こされる。
【００１０】
ヒトにおけるＩ型インターフェロンは、ＩＦＮ−α（１３サブタイプ）、ＩＦＮ−β１およびＩＦＮ−β３、ＩＦＮ−κ、ＩＦＮ−ω１である。ＩＩ型インターフェロンは１つのみであり、ＩＦＮ−γである。
【００１１】
Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）受容体は、シトシン−リン酸−グアニン（ＣｐＧ）オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）またはＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣＰＧ−ＯＤＮｓ）によって誘発される。この受容体は、ＴＲＩＦ系を使用する。
【００１２】
（細胞年数（ｃｅｌｌ  ｙｅａｒ）の概念）
本発明の方法および構造の発明の特徴を例示するために、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔を空けられた短いパリンドローム反復（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ））の細胞年数の概念が、本明細書にわたり使用されることになる。この概念に関して、絶対的に完璧なＣＲＩＳＰＲ系は決してないと仮定されている。意図しないＤＮＡを改変するオフターゲット事象の確率は、一部の極めて低い数値×発現レベルに、細胞の数×ＣＲＩＳＰＲ系がそれらの細胞において活性である年数を掛けた値である。
【００１３】
Ｅ・Ｐ（ｅ）・Ｓ（ｅ）・Ｃ・Ｙ＝Ｐ（Ｒ）  式１
【００１４】
式中、Ｅ＝発現レベル、Ｐ（ｅ）＝オフターゲットエラーの確率、Ｓ（ｅ）＝オフターゲットエラーの重症度、Ｃ＝細胞の数、Ｙ＝年数、およびＰ（Ｒ）＝危険な可能性があるオフターゲット事象の確率である。ここで、危険な可能性があるオフターゲット事象が、がんに匹敵しないことに留意されたい。
【００１５】
式１は、異なる値を有する一連の発現を合計した比較照合的な形態で使用されてもよい。例えば、Ｅは、１つの細胞内の活性カセットの数に基づき変動してもよいし、オフターゲット事象の重症度からも変動してもよい。この式１は、リスク推定値を生成するためのガイドラインとして使用されてもよい。しかしながら、細胞培養における放射線ダメージが、０．０５グレイの全身照射によるヒトにおける突然変異の倍加速度についてのホールデン（Ｈａｌｄａｎｅ）の１９５５年の推定をもたらしたことに留意されたい。後の研究から、実際の最小の放射線量は２グレイであり、おそらく４〜６グレイ（例えば致死線量範囲）であることが示された。哺乳動物は、エラーを有する細胞を破壊することにおいてかなり優れている。
【００１６】
（ＣＨＹＳＥＬ系）
ＣＨＹＳＥＬ系は、翻訳後にタンパク質の分割を可能にする特有のアミノ酸配列をウイルスが有していると認識された後に開発された。この革新により、単一のプロモーターから等モル量の様々なタンパク質を発現させることが可能になった。これは、その発現を大いに簡単にすることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
（解決すべき問題）
遺伝子治療一般、特に「クラスター化された規則的に間隔を空けられた短いパリンドローム反復」（ＣＲＩＳＰＲ）遺伝子治療の開発を妨げる２つの問題がある。これらの問題は、ヒト体内の十分な細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡの送達と、長過ぎるＣＲＩＳＰＲ発現である。
【００１８】
（問題１−十分な数の細胞への送達）
遺伝子治療患者であるジェシー・ゲルシンガー（Ｊｅｓｓｅ  Ｇｅｌｓｉｎｇｅｒ）は、遺伝子治療薬を送達するために肝静脈に投与された用量３．８×１０13個のアデノウイルス粒子が原因で死亡した。その結果として、遺伝子治療を達成するために注入されるビリオンの通常の限界は、１０12個である。本発明は、この患者の死を引き起こした症候群を予防することを意図している。本発明者は、大学院を通じてこの問題を認識していたが、他のほとんどの者と同様に、その解決が難しいこと、さらに、それを解決する方法は、アデノウイルスカプシド、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシド、レンチウイルスカプシドなどより免疫原性が低い代替の送達方法を発見することであると認めていた。今日に至るまで、このストラテジーに対する支持者がなお多く存在する。しかしながら、先の開示である米国特許出願第１３／２９８，２５１号において、本発明者は、細胞内で作用すると思われる抗ＨＩＶ抗体をコードする遺伝子を送達する遺伝子治療法を使用してＨＩＶを治療することを記載した。この特許の送達の態様は、人体におけるトランスフェクションに関与する数に焦点を合わせたものである。免疫系の炎症性の態様や、それを制御するための方法、および、人工的に作り出された敗血症と感染で起こる敗血症との間の応答の相違は、発明者の心中では明らかであった。残念なことに、免疫系の過剰活性化に対してヒト免疫学が唯一無二であることに気付いている者は、がんを治療するための微生物の方法を取り扱う医師や科学者を含めてもごく少数である。結果として、ほとんどの専門家は、必要なものと現存の方法を使用可能なものとの間のギャップの規模を認識していない。これに対処するためには、免疫系の炎症サイクルを阻害するかまたはそれ以外の方法で抑制もしくは抑止するモジュレーターを用いて免疫系を制御することが必要である。
【００１９】
本発明のさらなる枠組として、人体には３．７２×１０13プラスマイナス数千億個の細胞があることに留意されたい。比較として、マウスは、約１０12個の細胞を有する。比例的に、２０グラムのマウスは、約１．２×１０10個の細胞を有するはずである。概して、遺伝子治療用プラスミドのウイルスカプシドパッケージングが使用される場合、１，０００個のカプシド中およそ１個が生き残って細胞をトランスフェクトする。
【００２０】
異なる倍数のトランスフェクション（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）（ＭＯＴ）で培養皿中の細胞が受けるビリオンの数は、ポアソン分布により説明される。
【００２１】
Ｐ（ｋ）＝ｅ-mｋ／ｋ！  式２
【００２２】
式中、Ｐ（ｋ）は、ｋ個のウイルス粒子に感染した細胞の割合であり、ｍは、ＭＯＴである。非感染細胞（ｋ＝０）、１回感染した細胞（ｋ＝１）、および複数回トランスフェクションを受けた細胞（ｋ＞１）の割合を計算するために、式を単純化することができる。
【００２３】
Ｐ（０）＝ｅ-m  式３
【００２４】
Ｐ（１）＝ｍｅ-m  式４
【００２５】
Ｐ（Ｋ＞０）＝１−ｅ-m  式３．１（上記で示した通り）
【００２６】
本開示の目的のために、１回以上のトランスフェクションを受けたあらゆる細胞が考えられる。最優先の検討事項は、Ｐ（０）が許容できる程度に十分小さいかかどうかである。そのようにして、式３．１を様々な値のＭＯＴ（ｍ）で使用して、１０-10〜１０の範囲のＭＯＴに関する以下の表を作成することができる。
【００２７】
【表１】
2019519501.tif 000002
【００２８】
他のトランスフェクション方法がある。細胞をトランスフェクトするためにＤＮＡを封入する代替の合成キャリアがあるが、それらはいずれもある程度の毒性を有し、それらはいずれも本発明に適用可能である。
【００２９】
むき出しのＤＮＡプラスミドは、細胞をトランスフェクトするために静脈内投与することができるが、莫大な量を必要とし、血管で局所的に過剰な圧力が発生することから、ヒトにおいては実用的ではない。このようなプラスミドは、複雑で危険な可能性がある外科的介入を必要とする。エレクトロポレーションを使用することもできるが、小さい領域において実用的である。
【００３０】
（問題２−ＣＲＩＳＰＲの発現）
ＣＲＩＳＰＲは、それが何を行うかによっては実に効率的であるが、ＤＮＡに対するオフターゲットの変化の問題がある。オリジナルのＣＡＳ９より優れた、非常に低いオフターゲット率を有する酵素がある。ＣＡＳ９酵素が活性である時間が長ければ長いほど、潜在的な問題を伴うオフターゲットの変化が生じる確率がより高くなる。おそらくその可能性は極めて低いが、それでもなお懸念がある。体は、天の川銀河中の星の数を１００分の１にしたほどの多数の細胞を有することから、非常に低い確率の事象でも比較的起こりやすい。そのため、特定のＣＲＩＳＰＲ系による活性の細胞年数を最小化することが望ましい。ほぼ完全な改変が全てのトランスフェクトされた細胞で起こるのに、数日かからないという仮説がある。
【００３１】
本発明の実施態様は、これらの目的を達成することによりこの分野における現存の短所を克服するものである。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
従来技術に見出される制限を最小化するために、さらに、明細書を読めば明らかな他の制限を最小化するために、本発明の好ましい実施態様は、ヒトおよび動物における体細胞の大部分へのＣＲＩＳＰＲおよび他の遺伝子治療薬の安全な送達のための方法および関連の構造を提供する。
【００３３】
これは、主に２つの主要なパート、すなわち、１０％以上の体細胞をトランスフェクトすることにより有意な生物の形質転換にとって十分多くの数の体細胞に送達することと、短期間のＣＲＩＳＰＲ発現とを介してなされる。本発明は、遺伝子治療に対するこれらの障害を解決できるように、３つの態様全てを達成する複数の方法を使用する。加えて、体細胞の大部分への送達方法は、他の種類の遺伝子治療薬にも有用である。
【００３４】
第１に、１つ以上の薬剤を使用して、注入されたウイルスカプシド負荷が危険でなくなるまで免疫系を抑制する。薬剤は、これらに限定されないが、経口、静脈内、リンパ管内、皮下、腹腔内、筋肉内、坐剤または経皮を含む、医学界で公知の任意の方式によって投与することができる。第２に、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子カセットを活性化するためにテトラサイクリンまたは関連薬剤（例えばドキシサイクリン）の存在を必要とする真核生物のテトラサイクリン／ドキシサイクリン誘導物質（ｔｅｔＲ、ＴＲＥ）などの、ＣＲＩＳＰＲカセットおよび／またはプロモーターを送達するための骨格として、数週間以内に制御されることが公知のプラスミドを選択する。
【００３５】
本発明のこれらおよび他の利点ならびに特徴を、当業者が本発明を理解できるように具体性をもって説明する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下の説明は、本発明の多数の実施態様および適用に対処するものである。他の実施態様を利用してもよく、本発明の範囲から逸脱することなく変化させてもよいことを理解されたい。
【００３７】
後述される様々な発明の特徴は、それぞれ互いに独立して、または他の特徴と組み合わせて使用することができる。しかしながら、いずれか単一の発明の特徴が、上術した問題のいずれにも対処していなくてもよいし、または上術した問題の１つのみに対処していてもよい。さらに、上術した問題の１つ以上が、後述する特徴のいずれかによって十分に対処されていなくてもよい。
【００３８】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数形の指示対象を包含する。「および」は、本明細書で使用される場合、明示的に別段の記載がない限り、「または」と同義的に使用される。本明細書で使用される場合、用語「約」は、列挙されたパラメーターの＋／−５％を意味する。本発明のあらゆる態様の全ての実施態様は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、組み合わせて使用することができる。
【００３９】
文脈上明らかに別段の要求がない限り、明細書および特許請求の範囲にわたり、単語「含む」、「備える」などは、排他的または網羅的な意味とは対照的に包括的な意味で、すなわち「備えているが、これらに限定されない」という意味で解釈されるものとする。単数または複数を使用する単語も、それぞれ複数および単数を包含する。加えて、用語「本明細書において」、「ここで」、「それに対して」、「上記」、および「下記」ならびに同様の意味を有する用語は、本願で使用される場合、本願のどこか特定の部分ではなく本願全体に言及しているものとする。
【００４０】
説明は、２つの主要なパートで構成される。パート１は、十分に高いＭＯＴでの患者への接種を可能にすることである。パート２は、短時間かつ制御された発現寿命を有するように、発現カセットプラスミドを設計することである。
【００４１】
（パート１：十分な数の細胞への核酸の送達）
対処すべき第１の問題は、どのように実際のＭＯＴをヒトで使用されるために１００もの高さにするかである。関与するメカニズムの性質を考慮すれば、実際のＭＯＴの１００は、形式的なＭＯＴがiｎ  ｖiｖｏで１０，０００〜１００，０００であることを要することを示唆すると予想される。以下で教示されるように、炎症を十分に阻害するには、一連の免疫系モジュレーターが必要である。
【００４２】
ＴＬＲ９は、核内因子κＢ（ＮＦκＢ）およびインターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）阻害剤の組合せでカバーされると予想される。しかしながら、これが問題になる場合、これらの経路を阻害する特異的な薬剤があり、これらに限定されないが、以下が挙げられる。
ａ．３−［４−（６−（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール−２−イル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１−アミン
ｂ．６−［３−（ピロリジン−１−イル）プロポキシ）−２−（４−（３−（ピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル］ベンゾ［ｄ］オキサゾール
ｃ．ヒドロキシクロロキン
【００４３】
核内因子κＢ（ＮＦκＢ）は、阻害剤として作用する薬剤を含む。
【００４４】
【表２】
2019519501.tif 000003
【００４５】
また、インターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）ならびにＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）、ＴＬＲ４およびＴＬＲ７／８は、阻害剤として作用する薬剤も含む。選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）およびセロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）のうち、このような薬剤がより多く存在してもよい。
【００４６】
【表３】
2019519501.tif 000004
【００４７】
また、抑制され得る根本原理となるサイトカインとして、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）も挙げられる。腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）は、関節リウマチの炎症の制御に成功している標的である。いくつかのＦＤＡ承認済のＴＮＦα阻害剤、アダリムマブ、エタネルセプト、およびインフリキシマブがある。５ＨＴ２Ａ／２Ｃ受容体薬剤、２，５−ジメトキシ−４−ヨードアンフェタミン（ＤＯＩ）は、最も強い公知のＴＮＦα阻害剤であるが、５ＨＴ２Ｃ受容体を攻撃するため、短期間である場合を除き摂取すべきではない。これらの生物製剤は、実際の感染において生存率を悪化させることに留意されたい。
【００４８】
さらなる標的は、ラパマイシンの機構的標的（ｍＴＯＲ）経路である。ラパマイシンおよび同様の薬剤は、抗ウイルスベクターに特異的な抗体およびＴ細胞を生成しないように、適応免疫系をノックダウンすることを可能にするであろう。それゆえに、ラパマイシン、または、例えばテムシロリムス、エベロリムス、またはデフォロリムスなどの別のｍＴＯＲ経路阻害剤をプロトコルに追加することは理にかなっている。
【００４９】
（核酸送達媒体）
一次免疫刺激のリスクは、生きた動物中で、特にヒトの場合、細胞に核酸を送達するのに使用される核酸送達媒体（ＮＡＤＶ）に起因する。一般的にこれらは、現存のウイルス、例えばアデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などの組換え体である。
【００５０】
他のＮＡＤＶが存在しており、これらは実験中である。ポリプレックスは、高い比率のヒスチジン、アルギニンおよびリシンを含む、典型的には樹状の合成ペプチド配列である。ポリプレックスは、１：１より高い質量比、典型的には４：１でＤＮＡと混合され、通常、注入前に４５分間インキュベートされる。
【００５１】
例えばＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５７０００に記載される、エンベロープ型ポリプレックスは、別のＮＡＤＶである。これらは、特定の細胞型を標的とする目的を有するポリマーを外面に付着させてもよいシリカコーティングでポリプレックスを封入する。
【００５２】
本発明者は、ポリプレックスおよびエンベロープ型ポリプレックスの発明者らと免疫系の刺激の問題を論じてきたが、人体においては、ヒト細胞の大部分に核酸を送達するのに必要な異常な用量のこれらのタイプのＮＡＤＶが、すでに詳述されている問題を引き起こすことであろうという立場を維持する。
【００５３】
ＮＡＤＶの他の形態が将来的に発明されると予想され、上記の議論が全てを網羅したわけではない。記載された２つの代替のＮＡＤＶが、現在のところ本発明者が認識する最良の可能性がある方法である。これらは十分優れており、本発明者は、それらの使用が理にかなっていると考えている。
【００５４】
合成ＮＡＤＶは、ほとんどの場合においてかなりの毒性を示しており、したがってそれらの現在の形態では、記載された種類の大規模なiｎ  ｖiｖｏ核酸送達のために、それらを使用することを試みる理由はほとんどない。この種の有毒な合成ＮＡＤＶの一例は、リポソームである。
【００５５】
（リスク管理）
上記の薬剤および生物製剤を使用する方法は、薬剤との中和作用により免疫系の活性化を低減または排除するように努めるものである。結果として、人工の敗血症／多臓器不全の兆候への応答は、薬剤用量が不十分であると予想される開示された方法の不可欠な部分であってもよい。本明細書の残りに関して、症候群は単に敗血症と称されることになるが、最も実用的な目的の観点でもそれで十分であり、その起こるべき危険を十分伝えるものである。敗血症の誘発は、本事例ではＮＡＤＶと見込まれる抗原の投与用量、ならびに肝機能状態および可能性のある未知の要因に依存する。患者は、慎重にモニターされるべきであり、評価は、遺伝子治療薬送達プロトコルの前に行うべきである。
【００５６】
処置の前に、タンパク質合成に対する患者の肝臓の状態を評価すべきである。その理由は、患者が肝機能障害を有する場合、有効量は、障害のない患者における有効量の１／１０，０００の可能性があるためである。これは必ずしも患者の失格事由ではないが、用量、患者が処置される時間の長さの調整、および場合によっては追加の薬剤使用を必要とすることもある。
【００５７】
プロトコルを始める前に、１回目が２．５ｎｇ／ｋｇで、２回目が５ｎｇ／ｋｇのＩＶエンドトキシンの２回の連続用量を、患者の応答を観察するために３６時間の間をあけて投与すべきである。患者の応答は、患者が、より多くの用量を必要とするかどうか、または投薬される期間をより長くする必要があるかどうかの指標として役立つ可能性がある。
【００５８】
プロトコルのこのパートに問題があり、患者が過剰応答する場合、これは、以下のように処置することができる。
ａ．２４時間で１ｍｇ／ｋｇから開始して５ｍｇ／ｋｇまでのＩＶポリミキシンＢ硫酸塩の投与。この抗生物質のＬＤ50は不明である。げっ歯類は、１ｋｇ当たり１００ｍｇ以上に対して耐性を有する。イヌは、８ｍｇ／ｋｇで死に始める。５ｍｇ／ｋｇがおそらくガイドラインである。腎臓の機能に特別な注意を払い患者を慎重にモニタリングすることにより、緊急の状況ではそれより多くの用量が許容されてもよい。
ｂ．ＤＭＯＧの注射または経口投与。
ｃ．ＩＬ−１０の注射。この根拠は、動物実験において、原因となった感染がなくなるまで敗血症を抑えることにおいてＩＬ−１０が有効であることが示されていることである。
ｄ．グレリンの注射。グレリンは、並外れた作用で敗血症から救うことが示されている。
ｅ．アダリムマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、ＤＯＩ、またはＴＮＦ−αアンタゴニストとしての他のものの投与。ＤＯＩ用量は１００〜５００マイクログラム／ｋｇの範囲内であり、承認された薬剤ではない。
ｆ．抗炎症性ステロイドの投与。
【００５９】
（免疫系シャットダウンのリスク）
このようなことが起こる可能性は低いが、患者にこれらの薬剤を投与するにつれ、その期間が長くなる場合、患者の状態が、重篤な放射線中毒を受けているヒトの状態に類似してくる可能性がある。例えば、患者が予想外の肝臓障害を有する場合、または遺伝子治療薬の接種から抗原性物質を取り除くために患者に異常に長い時間を与えることが必要な場合、患者は、好中球、ＮＫ細胞およびＴ細胞の減少を認めることもある。これは、エポジェン、グレリンおよび／または抗生物質ならびに他の放射線中毒の薬物標準治療と共に、それらを投与することを必要とする場合がある。感染を予防するために、消化管の運動性の維持を確実するように注意を払うべきである。この状況のときに患者が感染に罹患した場合、１．６〜２．２バールで１時間の高圧酸素治療を開始し、患者が明らかによくなるまで繰り返すべきである。
【００６０】
（アナフィラキシーへの応答）
患者が、処置の一部の要素に対してアナフィラキシー反応を起こし得ることが考えられる。この状況に対処するための標準的な材料が利用可能であり、手元にあることが好ましい。（例えば、エピネフリン、コルチコステロイド、抗ヒスタミン剤、気道用の器具）。コルチコステロイドは免疫系応答を劇的に妨害するため、エピネフリンおよび抗ヒスタミン剤が好ましい。化学療法でなされる方法と類似した予防薬としての抗ヒスタミン剤の投与は、ここで記載された手順を妨害しないと予想される。
【００６１】
（パート２：ＣＲＩＳＰＲカセットの発現）
本出願の目的に関して、ＣＲＩＳＰＲカセットは、ＣＲＩＳＰＲ系が活性化するために必要とされる全ての遺伝子、またはその系に対する任意の部分を指す。この用例におけるＣＲＩＳＰＲカセットは、１つ以上のプラスミドを包含していてもよいし、または全てが１つのプラスミド中にあってもよい。この用例において、プラスミドはまた、初代大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ゲノム中に発現カセットを作り出し、トポイソメラーゼまたは同様の酵素を使用して大腸菌遺伝子から発現カセットを切り出すような系も包含する。
【００６２】
パート２は、発現カセットの媒体または一部としてのＣｐＧ−ＯＤＮの使用、およびテトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在によって活性化されるｔｅｔＲまたはＴＲＥなどのプロモーター変異体の使用を含む。他のスイッチを使用してもよい。
【００６３】
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子治療薬のパルス的な発現を最大限にし、その長期発現を最小限にする２種の基礎技術がある。その技術とは、哺乳類の細胞によって認識されるＣｐＧ−ＯＤＮモチーフを含有するベースのプラスミドを利用することと、誘導プロモーターを使用して発現を制御することである。異所性のプラスミド遺伝子発現が、数週間以内に発現のパーセンテージを一桁に低下させる原因となるというＤＮＡ発現におけるこのＣｐＧ配列の問題が、長年にわたり課題として認識されている。本明細書のパート２のこの部分は、ＣｐＧフリーの系とは逆に、この問題を短期間の発現が達成される望ましい特徴として利用している。
【００６４】
ＣｐＧ−ＯＤＮモチーフの提供は、継続される場合、アテローム性動脈硬化症を引き起こす可能性があり、相当な懸念であるＴＬＲ９の有意なレベルでの発現を許容する。
【００６５】
ＣＲＩＳＰＲカセットの発現は、ｔｅｔＲまたはいくつかの他の真核生物の活性化プロモーター系の制御下にあると予想される。
【００６６】
発現カセットは、ＣＨＹＳＥＬ系リンカーを使用して、プロモーターと、末端配列、一般的にポリＡとの間に、発現カセットの残部に連結されたＨＤＲタンパク質を有していてもよい。
【００６７】
（発明の有利な作用）
本発明は、臨床的な治療の重要な２分野、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子治療および一般的な遺伝子治療に適用される。どちらの分野も社会への高い重要性を有しており、この分野における改善は大きな利益を提供することができる。それゆえに、前述のものは、本発明の原理の単なる例示とみなされる。さらに、当業者であれば数多くの改変および変化を容易に思いつくと予想されるため、示され説明された正確な開示に本発明を限定することは望ましくなく、したがって、全ての好適な改変および均等物は、本発明の範囲によって決まり、その範囲内に含めることができる。
【００６８】
本明細書のパート１は、細胞の大部分にトランスフェクトする必要がある筋ジストロフィーなどの状態に対して、必要な用量の遺伝子治療薬を送達しようとすれば、患者を死亡させることになるという遺伝子治療薬の送達における主要な問題に対処する。本発明は、対象となるほとんどの体細胞（例えば核を有する細胞）の形質転換を可能にするという点でこの問題を解決する。本発明のパート２は、制御性を改善し、ＣＲＩＳＰＲ活性が望ましくなくなったときにそれを最小化するものである。本発明のこのパートはまた、遺伝子治療薬の活性を徐々に増量することが望ましい場合、ＣＲＩＳＰＲの活性を繰り返し元に戻すことも可能にする。
【００６９】
（産業上の利用可能性）
前述の発明は、医学や、家畜を用いる農作業における遺伝子治療の分野の範囲内で製造および適用することができる物理的な産物である。
【００７０】
（実施態様の説明）
（パート１の好ましい実施態様）
本発明のパート１の好ましい実施態様は、免疫系を阻害するための薬剤の送達を備える方法であり、本方法は、以下のステップを備える。
ａ．ＮＦκＢの阻害剤。
ｂ．阻害剤、または、ＩＲＦ３、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４およびＴＬＲ７／８。毒性がより低いため、ＳＳＲＩ、セルトラリンが好ましい。他のＳＳＲＩ薬剤またはＳＮＲＩ薬剤も、この目的のために機能することを証明してもよい。
ｃ．必要な場合、ＴＬＲ９阻害剤。
ｄ．ＴＮＦα阻害剤。
ｅ．ｍＴＯＲ阻害剤。
ｆ．生きた動物の細胞に核酸を送達するためのＮＡＤＶ。
【００７１】
（パート２の好ましい実施態様）
本発明のパート２の好ましい実施態様は、以下の構造を備える。
ａ．ＣｐＧ−ＯＤＮを含有する発現ベクタープラスミド。
ｂ．ＴｅｔＲ系依存性のプロモーターを有する発現ベクタープラスミド。
ｃ．プロモーターと、その間にＣＨＹＳＥＬリンカーを有する複数のタンパク質コード配列とを有する発現ベクタープラスミド。
【００７２】
本開示の実施態様の説明は、網羅的であるか、または本開示の開示された正確な形態に限定するとは意図されない。本開示の具体的な実施態様およびそのための実施例が例示的な目的で本明細書に記載されるが、関連分野の当業者が認識していると予想される通り、様々な等価な改変が開示の範囲内で可能である。
【００７３】
本発明の好ましい実施態様の前述の説明は、例示および説明の目的で提示されたものである。網羅的であるか、または本発明を開示された正確な形態に限定することは意図されない。上記の教示を考慮して多くの改変および変形が可能である。本発明の範囲は、この詳細な説明によって限定されないが、ここに添付された特許請求の範囲および特許請求の範囲の均等物によって限定されることが意図される。
【００７４】
（別表）
Bianconi, E., et al. (2013): "An Estimation of the Number of Cells in the Human Body," Annals of Human Biology, 40, 463-471, 10.3109/03014460.2013.807878, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23829164
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月29日(2019.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト、または、１つ以上のヒト免疫系の脆弱性を有するように改変された非ヒト動物のいずれかである対象動物の細胞に核酸配列を送達するための遺伝子治療薬であって、
ａ．前記対象動物に投与するための複数の免疫系モジュレーターであって、
ｉ．腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）阻害剤、
ｉｉ．核内因子κＢ（ＮＦκＢ）阻害剤、
ｉｉｉ．インターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）阻害剤、
ｉｖ．Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）阻害剤、
を備える前記複数の免疫系モジュレーターと、
ｂ．前記対象動物の細胞内に前記核酸配列を送達するための核酸送達媒体（ＮＡＤＶ）と、を備え、
ｃ．ＮＡＤＶの用量は、１０13ＮＡＤＶ粒子以上である、遺伝子治療薬。
【請求項２】
前記核酸配列の前記送達は、前記複数の免疫系モジュレーターの前記投与の後に行われることが規定されている、請求項１に記載の遺伝子治療薬。
【請求項３】
前記対象動物に投与するためのラパマイシンの機構的標的（ｍＴＯＲ）阻害剤をさらに備え、
前記核酸配列の前記送達は、前記ｍＴＯＲの投与の後に行われることが規定されている、請求項２に記載の遺伝子治療薬。
【請求項４】
前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムスおよびデフォロリムスからなる群から選択される、請求項３に記載の遺伝子治療薬。
【請求項５】
前記対象動物に投与するための選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）をさらに備え、
前記核酸配列の前記送達は、前記ＳＳＲＩの投与の後に行われることが規定されている、請求項２〜４のいずれか一項に記載の遺伝子治療薬。
【請求項６】
前記対象動物に投与するためのセロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）をさらに備え、
前記核酸配列の前記送達は、前記ＳＮＲＩの投与の後に行われることが規定されている、請求項２〜５のいずれか一項に記載の遺伝子治療薬。
【請求項７】
前記ＴＮＦα阻害剤は、アダリムマブ、エタネルセプト、インフリキシマブおよび２，５−ジメトキシ−４−ヨードアンフェタミンからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子治療薬。
【請求項８】
前記ＮＦκＢ阻害剤は、エクテイナシジン７４３、ジギトキシン、ウアバイン、ボルテゾミブ、クロモマイシンＡ３、エメチン、フルオロサラン、ナラシン、レスタウルチニブ、トリブロンサラン、ビチオノールおよびダウノルビシンからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の遺伝子治療薬。
【請求項９】
前記ＩＲＦ３阻害剤は、セルトラリン、トリフルオペラジンおよびフルフェナジンからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の遺伝子治療薬。
【請求項１０】
前記ＴＬＲ９阻害剤は、３−［４−（６−（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール−２−イル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１−アミン、６−［３−（ピロリジン−１−イル）プロポキシ）−２−（４−（３−（ピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル］ベンゾ［ｄ］オキサゾールおよびヒドロキシクロロキンからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子治療薬。
【請求項１１】
前記ＮＡＤＶは、ウイルスカプシドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子治療薬。
【請求項１２】
前記ＮＡＤＶは、ポリプレックスである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子治療薬。
【請求項１３】
前記ＮＡＤＶは、エンベロープ型ポリプレックスである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子治療薬。
【請求項１４】
前記核酸配列の前記送達は、前記複数の免疫系モジュレーターの前記投与の前に行われることが規定されている、請求項１に記載の遺伝子治療薬。
【請求項１５】
前記核酸配列の前記送達は、前記免疫系モジュレーターの前記投与と同時に行われることが規定されている、請求項１に記載の遺伝子治療薬。
【請求項１６】
前記核酸配列は、テトラサイクリン誘導プロモーターの制御下にある、クラスター化された規則的に間隔を空けられた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）をコードする核酸配列を有する、核酸配列を備える、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の遺伝子治療薬。
【請求項１７】
前記核酸配列は、シトシン−リン酸−グアニン（ＣｐＧ）オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）核酸配列をさらに備える、請求項１６に記載の遺伝子治療薬。
【請求項１８】
ａ．前記核酸配列は、前記テトラサイクリン誘導プロモーターの制御下で２つ以上の遺伝子配列を連結する１つ以上のシス作用性ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列をさらに備え、
ｂ．前記２つ以上の遺伝子は、タンパク質をコードする、請求項１６または１７に記載の遺伝子治療薬。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
（別表）
Bianconi, E., et al. (2013): "An Estimation of the Number of Cells in the Human Body," Annals of Human Biology, 40, 463-471, 10.3109/03014460.2013.807878, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23829164
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以下の項目は、国際出願時の請求の範囲に記載の要素である。
（項目１）
動物の細胞に核酸配列を送達する方法であって、
ａ．前記動物に、
ｉ．腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）阻害剤、
ｉｉ．核内因子κＢ（ＮＦκＢ）阻害剤、
ｉｉｉ．インターフェロン調節因子３（ＩＲＦ３）阻害剤、
ｉｖ．Ｔｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）阻害剤、
を備える免疫系モジュレーターを投与するステップと、
ｂ．前記動物の細胞内に、前記核酸配列を送達するステップと、
を備え、
ｃ．前記送達するステップは、前記投与するステップの後に行われ、
ｄ．前記核酸配列は、核酸送達媒体（ＮＡＤＶ）を使用して送達される、方法。
（項目２）
ラパマイシンの機構的標的（ｍＴＯＲ）阻害剤を投与するステップをさらに備え、
前記送達するステップは、それぞれの前記投与するステップの後に行われる、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムスおよびデフォロリムスからなる群から選択される、項目２に記載の方法。
（項目４）
選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）を投与するステップをさらに備え、
前記送達するステップは、それぞれの前記投与するステップの後に行われる、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記ＳＳＲＩは、シタロプラム、エスシタロプラム、フルオキセチン、フルボキサミン、パロキセチン、ダポキセチン、インダルピン、ジメリジン、セリクラミンおよびパヌラミンからなる群から選択される、項目４に記載の方法。
（項目６）
セロトニン−ノルエピネフリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）を投与するステップをさらに備え、
前記送達するステップは、それぞれの前記投与するステップの後に行われる、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記ＳＮＲＩは、ベンラファキシン、シブトラミン、デュロキセチン、アトモキセチン、デスベンラファキシン、ミルナシプランおよびレボミルナシプランからなる群から選択される、項目６に記載の方法。
（項目８）
前記ＴＮＦα阻害剤は、アダリムマブ、エタネルセプト、インフリキシマブまたは２，５−ジメトキシ−４−ヨードアンフェタミンからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記ＮＦκＢ阻害剤は、エクテイナシジン７４３、ジギトキシン、ウアバイン、ボルテゾミブ、クロモマイシンＡ３、エメチン、フルオロサラン、ナラシン、レスタウルチニブ、トリブロンサラン、ビチオノールおよびダウノルビシンからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記ＩＲＦ３阻害剤は、セルトラリン、トリフルオペラジンまたはフルフェナジンからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記ＴＬＲ９阻害剤は、３−［４−（６−（３−（ジメチルアミノ）プロポキシ）ベンゾ［ｄ］オキサゾール−２−イル）フェノキシ］−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１−アミン、６−［３−（ピロリジン−１−イル）プロポキシ）−２−（４−（３−（ピロリジン−１−イル）プロポキシ）フェニル］ベンゾ［ｄ］オキサゾールまたはヒドロキシクロロキンからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記ＮＡＤＶは、ウイルスカプシドである、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記ＮＡＤＶは、ポリプレックスである、項目１に記載の方法。
（項目１４）
前記ＮＡＤＶは、エンベロープ型ポリプレックスである、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記送達するステップは、前記投与するステップの前に行われる、項目１に記載の方法。
（項目１６）
前記送達するステップは、前記投与するステップと同時に行われる、項目１に記載の方法。
（項目１７）
テトラサイクリン誘導プロモーターの制御下にある、クラスター化された規則的に間隔を空けられた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）をコードする核酸配列を有する、核酸配列。
（項目１８）
シトシン−リン酸−グアニン（ＣｐＧ）オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）核酸配列をさらに備える、項目１７に記載の核酸配列。
（項目１９）
ａ．前記テトラサイクリン誘導プロモーターの制御下で２つ以上の遺伝子配列を連結する１つ以上のシス作用性ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列をさらに備え、
ｂ．前記２つ以上の遺伝子は、タンパク質をコードする、項目１７に記載の核酸配列。
【国際調査報告】
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