(57)【要約】【課題】  本発明は、一般式（I）の化合物に関する。【解決手段】  本発明はさらに、Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体の生成方法に関し、この方法は、水性培地中で、少なくとも１つの組換え細胞をアセテートと接触させることを含み、組換え細胞は、野生型細胞に比べて、（ａ）Ｅ１酵素、つまりホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３）、及び／又は、Ｅ５酵素、つまりアスパルトキナーゼ（ＥＣ２．７．２．４）、並びに（ｂ）Ｅ２酵素、つまりホモセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．３１）の活性が増大しており、アセテートは、水性培地中で、少なくとも約０．００１ｇ／Ｌの濃度に維持される。【化１】2019523271.tif 000020
2019523271.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Iの化合物。
【化１】
2019523271.tif 000019
【請求項２】
前記化合物は、Ｏ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−Ｌ−ホモセリン又はＯ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−Ｄ−ホモセリンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体の生成方法であって、
水性培地中で、少なくとも１つの組換え細胞をアセテートと接触させることを含み、
前記組換え細胞は、野生型細胞に比べて、
（ａ）Ｅ１酵素、つまりホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３）、及び／又は、Ｅ５酵素、つまりアスパルトキナーゼ（ＥＣ２．７．２．４）、並びに
（ｂ）Ｅ２酵素、つまりホモセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．３１）
の活性が増大しており、
前記アセテートは、前記水性培地中で、少なくとも約０．００１ｇ／Ｌの濃度に維持される、方法。
【請求項４】
前記アセテートは外因的に生成される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記方法は、前記水性培地からＮ−アセチルホモセリン及びその誘導体を抽出することを含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞は、アシネトバクタ属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、バークホルデリア属、クロレラ属、コリネバクテリウム属、シアノバクテリア、エルウィニア属、エスケリキア属、クレブシエラ属、セラチア属、プロビデンシア属、シュードモナス属、リゾビウム属、サルモネラ属、ノストク属からなる群から選択される、請求項３から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞は、コリネバクテリウムグルタミクムと大腸菌からなる群から選択される、請求項３から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｅ２酵素は、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２由来のホモセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＭｅｔＸ）又はそのバリアントである、請求項３から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｅ２酵素は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列又はそのバリアントを含む、請求項３から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｅ１酵素の活性の増大は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（Ｅ１）及び／又はアスパルトキナーゼ（Ｅ５）における少なくとも１回の点変異によるものである、請求項３から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｅ１酵素は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列又はそのバリアントを含み、前記Ｅ５酵素は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列又はそのバリアントを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換え細胞は、前記野生型細胞に比べてＥ１、Ｅ５及びＥ２酵素の活性の増大を現す、請求項３から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体は、Ｏ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−Ｌ−ホモセリン、Ｏ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−Ｄ−ホモセリン、Ｎ−アセトアミド−Ｌ−ホモセリン、Ｎ−アセトアミド−Ｄ−ホモセリンからなる群から選択されてもよい、請求項３から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換え細胞はさらに、野生型細胞に比べて、
（ａ）Ｅ３酵素、つまりジアミノピメレートデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．２０）、及び／又は、
（ｂ）Ｅ４酵素、つまりホモセリンＯ−トランススクシニラーゼ（ＥＣ２．３．１．４６）
の活性が減少している、請求項３から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
アセテートからＮ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体を生成する、少なくとも１つの組換え細胞の使用であって、
前記組換え細胞は、野生型細胞に比べて、
（ａ）Ｅ１酵素、つまりホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３）、及び／又は、Ｅ５酵素、つまりアスパルトキナーゼ（ＥＣ２．７．２．４）、並びに
（ｂ）Ｅ２酵素、つまりホモセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．３１）
の活性が増大している、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−アセチルホモセリン及びその誘導体の生成方法に関する。特に、Ｎ−アセチルホモセリン及びその誘導体はメチオニンを生成する前駆体として用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸は飼料の添加剤として、またヒト用の栄養補助食品として特に有用である。アミノ酸はさらに、輸液にも使用できる上、医薬品や農薬の製造に用いられる合成中間体として機能することもできる。システイン、ホモシステイン、メチオニン、Ｓ−アデノシルメチオニンなどの化合物は、通常、食品添加剤や飼料添加剤、医薬品に使用されている。特にメチオニンは動物の体内では合成できない必須アミノ酸であり、多くの身体機能に重要な役割を果たす。現在は、シアン化水素、アクロレイン、メチルメルカプタンから化学合成によりＤ，Ｌ−メチオニンを生成している。アクロレインやメチルメルカプタンのような石油系出発原料は、ガソリンや石油を分解して得られるが、環境汚染をもたらす。また、これらの出発原料のコストは石油価格と直結しているため、近い将来に石油価格の上昇が予想され、石油価格の上昇に伴ってメチオニンの価格も上昇するであろう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
メチオニンの生成手段として、いくつかの化学的工法が挙げられる。一例として、塩基の存在下で、３−メチルチオプロパナールを青酸と共に原料として用いる。反応の結果として得た炭酸アンモニウムに対し、続いて加水分解を行なう。この方法では、加水分解後の反応液に二酸化炭素を導入して結晶化させ、メチオニンを結晶として分離する。この方法は、メチオニン生成用の原料として二酸化炭素と水素を使用している。しかしながら大量の水素が残るので、この方法は非効率的である。
【０００４】
メチオニンはまた、Ｎ−アセチルメチオニンを含み得る。一般的には、アセト無水物のようなアセチル化化合物を用いてＮ−アセチルメチオニンを化学的に形成する。これは追加のステップであり、アセテートなどの副産物を生成する。アセテートを放出すると、Ｎ−アセチルメチオニンはアセテートの臭いを部分的に吸収する。よって、この方法により生成したメチオニンは微量のアセテートを含む。
【０００５】
メチオニン需要の増加に伴って、Ｎ−アセチルメチオニンを含むあらゆる種類のメチオニンの微生物生成は、非常に魅力的な代替案である。従って、本分野は、Ｎ−アセチルメチオニンを生成するための、より安価でより効率的なバイオテクノロジ手段を必要としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、新規のＮ−アセチルホモセリン誘導体、及び本化合物と他の関連化合物の生成手段に関する。具体的には、新規のＮ−アセチルホモセリン誘導体は、Ｏ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−ＤＬ−ホモセリンであってもよい。本発明はまた、Ｎ−アセトアミド−ＤＬ−ホモセリンの生成手段に関する。Ｎ−アセチルホモセリン及びその誘導体は、遺伝子組換えによりＥ１酵素、つまりホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３）、及び／又は、Ｅ５酵素、つまりアスパルトキナーゼ（ＥＣ２．７．２．４）、並びにＥ２酵素、つまりホモセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．３１）の活性を増大させた組換え細胞の使用を含むバイオテクノロジ法により生成されてもよい。これらのＮ−アセチルホモセリン及びその誘導体は、メチオニン生成の前駆体として用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の一態様によると、一般式Iの化合物が提供される。
【化１】
2019523271.tif 000003
【０００８】
本発明のいずれかの態様による化合物は、Ｏ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−Ｌ−ホモセリン又はＯ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−Ｄ−ホモセリンであってもよい。Ｏ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−ＤＬ−ホモセリンは、メチオニン生成用の前駆体として用いることができる。Ｄ−とＬ−のうちいずれのＯ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−ホモセリンが形成されたのかによって、この化合物がＤ−メチオニンあるいはＬ−メチオニンの生成のどちらかに使用されるのかが決まる。
【０００９】
本発明の他の態様によると、Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体の生成方法が提供される。この方法は、水性培地中で、少なくとも１つの組換え細胞を炭素源と接触させることを含み、組換え細胞は、野生型細胞に比べて、
（ａ）Ｅ１酵素、つまりホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３）及び／又はＥ５酵素、つまりアスパルトキナーゼ（ＥＣ２．７．２．４）、並びに
（ｂ）Ｅ２酵素、つまりホモセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．３１）
の活性が増大している。
【００１０】
炭素源は、遊離アセテート又はアセテートに転換できる基質を含んでもよい。例えば、水性培地は、Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体の生成に用いられる、本発明のいずれかの態様による細胞発酵用の少なくとも１つの炭素源を含む。水性培地は、さらに遊離アセテートを含む。一例において、水性培地は、Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体の生成に用いられる、本発明のいずれかの態様による細胞発酵用の少なくとも１つの炭素源、並びに遊離アセテートを含む。
【００１１】
本発明のいずれかの態様による細胞発酵用の炭素源には、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースなどの任意の炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などの脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセリン、エタノールなどのアルコール類、酢酸などの有機酸が含まれてもよい。これらの化合物又はその混合物を炭素源として用いることができる。炭素源は、さらにアセテートを含んでもよい。一例では、炭素源はアセテートのみである。
【００１２】
本明細書における「アセテート」は、酢酸及び酢酸塩（ＣＨ３−ＣＯＯ−）の両方を指す。これは、本技術分野でも知られているように、微生物は水性環境で作用し、塩と酸のバランスが常に取れているため当然のことである。アセテートに対する分子酢酸の比は系のｐＨに左右される。つまり「アセテート」の一定の濃度では、ｐＨが低いほど酢酸塩に対する分子酢酸の濃度が高くなる。
【００１３】
アセテートは外因的に生成されてもよい。これは、本発明のいずれかの態様に従って用いられる組換え細胞はそれ自体ではアセテートを生成しない可能性があることを意味する。よってアセテートは、細胞が炭素源と接触する前に、外因的に生成され、水性培地に導入される。具体的には、組換え細胞を含む水性培地は、組換え細胞がＮ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体の生成を開始する前に既にアセテートを含んでいる。より具体的には、アセテートは二酸化炭素及び／又は一酸化炭素などの炭素源の存在下で組換え細胞により出発原料として用いられ、その後、アセテートの存在下でＮ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体を生成することができる。アセテートは、Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体の生成において、完全に使い果たされない。具体的に言えば、アセテートは、組換え細胞によりＮ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体の生成における選択性の向上に用いられる。よって、反応混合物中のアセテートの存在は、副産物でなくＮ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体の生成を促進するために維持される。
【００１４】
細胞が内因性アセテートを生成するまで待つというよりも、外因的に生成されたアセテートが水性培地中に最初から存在していてもよい。具体的に言えば、本明細書において「外因的に生成された」アセテートという用語は、細胞が生成したアセテートとは対照的に、組換え細胞との接触前に、別途の反応容器で生成又は精製したエタノールのアセテートを意味する。別の例では、「外因的に生成された」アセテートという用語は、本発明の任意の態様による組換え細胞と接触する前に、酢酸生成細菌細胞によって生成されたアセテートを含む。一例では、アセテートを反応容器から取り出し、第２の反応容器中で組換え細胞と接触させる。別の例では、組換え細胞と酢酸生成細胞は同じ反応容器にある。アセテートは、少なくとも１つの炭素源と接触させた酢酸生成細胞によって生成してもよい。外因性アセテートの存在下で、組換え細胞は、この外因性アセテートをＮ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体に転換させることができる。より具体的に言えば、組換え細胞が触媒する反応が続く限り、水性培地中の外因的に生成されたアセテートの濃度を最初の値あるいは最初の数値範囲で維持させる。さらに、水性培地中に存在するアセテートの全量に対して８０％以上、特に９０％以上が外因的に生成されたアセテートである場合、水性培地中のアセテートを外因性と見なす。
【００１５】
本発明のいずれかの態様による水性培地中のアセテートの濃度は、本発明において非常に重要な要素と言える。本発明のいずれかの態様に従って使用される水性培地中のアセテートの濃度は、本明細書に記載の特定の濃度に維持してもよい。具体的には、水性培地におけるアセテートの濃度は、少なくとも約１ｐｐｍ（つまり０．００１ｇ／Ｌ）であってもよい。この濃度を水性培地で維持することができる。一例では、アセテートの濃度を、少なくとも実質的に上記に記載の濃度、例えば少なくとも０．０ｇ／Ｌを超える濃度、あるいは約０．００１ｇ／Ｌ、約０．００２ｇ／Ｌ、約０．００３ｇ／Ｌ、約０．００４ｇ／Ｌ、約０．００５ｇ／Ｌ、約０．０１ｇ／Ｌ、約０．０１５ｇ／Ｌ、約０．０２ｇ／Ｌ、約０．０２５ｇ／Ｌ、約０．０３０ｇ／Ｌ、約０．０５０ｇ／Ｌ以上の濃度に維持している。水性培地は少なくとも０．００１ｇ／Ｌのアセテートを含む。具体的には、水性培地中のアセテートの濃度は、０．０１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの濃度に維持されてもよい。より具体的には、水性培地中のアセテートの濃度は、０．０１ｇ／Ｌ〜７ｇ／Ｌの濃度に維持されてもよい。さらに具体的には、水性培地中のアセテートの濃度は、約２ｇ／Ｌの濃度に維持されてもよい。当業者であれば、水性培地中のアセテート濃度を一貫してチェックし、アセテートの濃度が要求値を下回るときはアセテートを供給し、濃度が所望の値を超えるときは供給を停止することで、アセテートの濃度を維持することができるであろう。
【００１６】
一例では、アセテートの濃度は水性培地中の全炭素源の３４〜１００％である。具体的には、アセテートの濃度は、水性培地中の全炭素源の約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％であってもよい。より具体的には、アセテートの濃度が、水性培地中の全炭素源の約３５〜１００％、約４０〜１００％、約４５〜１００％、約５０〜１００％、約３５〜９０％、約４０〜９０％、約４５〜９０％であってもよい。
【００１７】
本明細書における「約」という用語は、２０％以内の変動を指す。具体的には本明細書において「約」という用語は所与の測定値又は数値の±２０％、より具体的には±１０％、さらに具体的には±５％を指す。
【００１８】
当業者であれば、本分野で知られている方法によってアセテートの濃度を所望の値に維持することができるであろう。具体的には、当業者は水性培地中のアセテート濃度を定期的に測定し、それに応じて培地に高濃度又は低濃度のアセテートを添加することでアセテートの濃度を調製することができる。一例では、ＮＭＲを用いてアセテートを測定することができる。具体的には、半定量的１Ｈ−ＮＭＲ分光法を用いてアセテートの濃度を測定することができる。内部定量標準としてトリメチルシリルプロピオン酸ナトリウム（Ｔ（Ｍ）ＳＰ）を使用してもよい。別の例では、Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍの酵素キット（品番：１０１４８２６１０３５）を使用し、製造業者の指示に従ってアセテートの濃度を測定することができる。一例では、水性培地の連続供給とは別途の連続流によりアセテートを水性培地に添加する。別の例では、アセテートは補給される培地の一部である。具体的には、アセテートを栄養素供給物の一部として、あるいは栄養素供給物とは別々に水性培地に添加してもよい。水性培地にアセテートをいずれの経路から供給するとしても、当業者であれば、水性培地中のアセテート濃度を維持する手段について理解するであろう。一例では、発酵過程において約２０時間毎にアセテートを補給し、培地中のアセテート濃度を維持する。別の例では、培養及び／又は発酵工程の開始時点から約５時間、約１０時間、約１５時間、約２０時間、約２５時間、約３０時間毎に培地におけるアセテートの補給を行なう。別の例では、アセテートをＮ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体の生成方法に使用しないため、アセテートを必ずしも補充する必要はない。
【００１９】
一例では、水性培地中のアセテート濃度は、反応期間の８０％にわたって本発明のいずれかの様態による任意の濃度に維持される。別の例では、反応時間の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％、あるいは１００％の時間にわたってアセテートの濃度を維持する。これについて、「反応時間」とは、工程が行なわれる間の期間を意味する。具体的には、反応時間とは、反応が開始してから反応が終了及び／又は完了するまで、つまり基質が使い果たされるまでの期間を指す。一例では、基質はアセテートであってもよく、発酵槽内のアセテートが使い果たされて反応が停止し、それ以上アセテートが発酵槽に供給されなくなったときに、反応の完了と見なす。従って反応時間は、発酵の開始（つまり、適切な発酵条件で、アセテートが発酵槽内の少なくとも１つの組換え細胞と最初に接触するとき）から、発酵の終了（つまり、発酵槽内のアセテートが全てなくなったとき、及び／又は、発酵槽内で反応の持続を中止せざるを得ない別の制限要因が生じたとき）までの期間を意味する。一例では、反応期間は２４時間、４２時間、７２時間、９６時間などである。別の例では、反応期間は９０時間、９１時間、９２時間、９３時間、９４時間、９５時間、９７時間などである。
【００２０】
本発明のいずれかの態様による方法からのアセテートは、再活用してもよい。これは、本発明のいずれかの態様により形成されたＮ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体を蓄積し、本分野で既知の手段により分離してもよいことを意味する。それによって、アセテートは反応混合物の中にそのまま残り、再活用されることになる。形成されたＮ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体を回分式又は連続式に取り除いてもよい。後者の場合、形成されたＮ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体は、本分野で既知の分離ステップにより連続的に取り除かれる。
【００２１】
本発明のいずれかの態様による方法は、水性培地からＮ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体を抽出するステップを含んでもよい。
【００２２】
極性が低く、最終生成物のＮ−アセチルメチオニンが好ましい効能性質を有しているため、Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体の方が、それぞれのＯ−アセチル化合物に比べ、単離作業がより容易である。
【００２３】
Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体を、Ｎ−アセチルメチオニンの形成に用いてもよい。一般的には、無水酢酸のようなアセチル化化合物を用いてＮ−アセチルメチオニンを化学的に形成する。これは追加のステップであり、アセテートなどの副産物を生成する。
【００２４】
Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体を抽出する手段は、本分野で既知の任意の抽出方法を含み得る。抽出方法は、例えばポリエチレングリコールやアミンを含む水性二相系、毛管電気分解、クロマトグラフィなどを含んでもよい。一例では、クロマトグラフーが抽出手段として使用される場合、イオン交換カラムが用いられる。別の例では、Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体を、ｐＨシフトを用いて沈殿させている。Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体は、カルボン酸のように作用すると見なしてもよい。従って、カルボン酸を抽出する本分野において既知の方法を使用して、Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体を抽出することができる。当業者であれば、単純な試行錯誤により、Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体の最も適合な抽出手段を容易に探し出せるであろう。
【００２５】
本明細書において、細胞又は微生物と組み合わせて用いられる「野生型」という用語は、野生で見られる形態のゲノム構成を有する細胞を意味している。この用語は、全細胞と、個々の遺伝子の両方に適用可能である。従って、「野生型」という用語は、他の態様において（つまり、１つ以上の遺伝子に対して）遺伝子組換えが行なわれているが、対象遺伝子に対しては遺伝子組換えを行なっていない細胞も含まれてもよい。一方、「野生型」という用語は、組換え法を用いて対象となる特定の遺伝子の遺伝子配列を少なくとも人の手により部分的に書き換えている細胞は含まない。よって、本発明のいずれかの態様による野生型細胞とは、人為的な手段により全ゲノム及び／又は特定の遺伝子に対して遺伝子変異が生じていない細胞を指す。従って、一例では、Ｅ１酵素に対する野生型細胞は、細胞内でＥ１酵素の天然の／未変異の発現を示す細胞を意味する。Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５酵素などに対する野生型細胞に関しても同様に解釈してもよく、細胞内でＥ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５酵素などの天然の／未変異の発現をそれぞれ示す細胞を意味する。
【００２６】
本発明のいずれかの態様により用いられる酵素は、単離酵素であってもよい。具体的には、本発明のいずれかの態様により用いられる酵素を、活性状態で、且つ、活性において重要な役割を果たす補因子、基質、補助ポリペプチド及び／又は活性化ポリペプチド、あるいは因子が全て存在している状態で用いてもよい。本明細書において「単離」という用語は、対象の酵素が自然に発生している細胞と比べて濃縮されていることを示す。ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動及び／又は活性アッセイにより酵素を濃縮してもよい。例えば、クマシーブルー染料により染色した後、ポリアクリルアミドゲルに対して目視検査を行ない確認している通り、対象の酵素は、調製物に存在する全てのポリペプチドの５％、１０％、２０％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％以上を構成してもよい。
【００２７】
本発明のいずれかの態様により用いられる酵素は、組換えであり得る。本明細書における「組換え」という用語は、天然の状態では生じないが、遺伝子操作の結果として得られた、特にポリペプチドや核酸などの分子そのもの、分子によりコード化されている状態、あるいは、組換え分子を含む細胞を意味する。例えば、核酸分子が触媒活性ポリペプチドをコード化する配列に機能的に連結されているプロモータを有し、プロモータは、上記の触媒活性ポリペプチドが、元の変異していない核酸分子を含む対応の野生型細胞のポリペプチドの存在量に比べ過剰発現するように操作されている場合、核酸分子を組換え型と称する。同様に、本明細書における「組換え細胞」とは、野生型細胞又は微生物とは遺伝的に異なるように、遺伝子組換えを行なわれた原核生物又は真核生物の微生物株を意味する。具体的には、本発明のいずれかの態様による組換え細胞は、遺伝子組換えにより、野生型細胞に比べると少なくともＥ１及びＥ２酵素の発現が増大していてもよい。別の例では、本発明のいずれかの態様による組換え細胞は、遺伝子組換えにより、野生型細胞に比べると少なくともＥ１及びＥ２酵素の活性が増大している。Ｅ１及びＥ２酵素の活性の増大は、Ｅ１及びＥ２酵素が細胞内の特定の反応をより効率的に触媒できるようにする、細胞から見つけられた酵素の変異の結果である。
【００２８】
当業者であれば、本分野で既知の任意の方法により、細胞又は微生物に対して遺伝子組換えを行なうことができるであろう。本発明のいずれかの態様によると、遺伝子組換えを行なった結果、遺伝子組換え細胞は、２時間以内、具体的には８時間又は２４時間以内という所定の時間間隔にて、野生型細胞よりも少なくとも１倍又は２倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、あるいは、少なくとも１００００倍以上のＮ−アセチルホモセリン及びその誘導体を形成する。生成物形成の増加は、例えば、本発明のいずれかの態様による細胞と野生型細胞をそれぞれ別々に同様の条件（同じ細胞密度、同じ栄養培地、同じ培養条件）下で、特定の時間、適切な栄養培地を用いて培養し、栄養培地における目標生成物（Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体）の生成量を測定して定める。
【００２９】
遺伝子組換え細胞又は微生物は、野生型細胞又は微生物とは遺伝的に異なる。本発明のいずれかの態様による遺伝子組換え微生物と野生型微生物との遺伝的差異は、完全遺伝子、アミノ酸、ヌクレオチド等の存在の有無であると言えよう。つまり、遺伝子組換え微生物には存在するが、野生型微生物には存在しない。一例では、本発明のいずれかの態様による遺伝子組換え微生物は、野生型細胞に比べて、微生物がＮ−アセチルホモセリン及びその誘導体を生成することを可能にする酵素を有する。本発明の遺伝子組換え微生物と野生型微生物を比べると、野生型微生物は、遺伝子組換え微生物がＮ−アセチルホモセリン及びその誘導体を生成することを可能にする酵素の活性を有していないか、あるいは検出できるほどの活性を有していない。本明細書において、「遺伝子組換え微生物」という表現は「遺伝子組換え細胞」で代替可能に使用され得る。本発明のいずれかの態様による遺伝子組換えは、微生物の細胞に対して行なわれる。
【００３０】
本発明のいずれかの態様による細胞は、本分野で既知の任意の方法によって、遺伝的に形質転換されている。
【００３１】
本明細書における「組換え細胞は、その野生型に比べて酵素活性の増大を現す」とは、それぞれの酵素の活性が、少なくとも２倍、具体的には少なくとも１０倍、より具体的には少なくとも１００倍、さらに具体的には少なくとも１０００倍、また具体的には少なくとも１００００倍増大することを意味する。
【００３２】
本明細書における「酵素の活性増大」という句は、細胞内活性の増大と理解すべきである。基本的に、酵素活性の増大は、アミノ酸交換をもたらし、酵素の特定の活性を増大させる一方、特定の代謝産物による阻害やフィードバック阻害を緩和させる選択的変異、遺伝子配列又は酵素をコード化する遺伝子配列のコピー数の増加、強いプロモータ、あるいは活性が増大した対応の酵素をコード化する遺伝子又は対立遺伝子の使用、遺伝子のコドン使用の改変、多様な手法によるｍＲＮＡ又は酵素の半減期の増加、遺伝子発現調節の改変、並びに、場合によってこれらの手段を組み合わせることによって得ることができる。本発明のいずれかの態様による遺伝子組換え細胞は、例えば、所望の遺伝子、この遺伝子の対立遺伝子、あるいはその一部を含むベクタ、並びに遺伝子を発現させるベクタを用いて、形質転換、形質導入、接合やこれらの組み合わせにより生成することができる。異種発現は、具体的には、細胞の染色体あるいは染色体外複製ベクタに遺伝子又は対立遺伝子を組み込むことにより達成される。
【００３３】
同じ文脈において、本発明のいずれかの態様における「Ｅｘ酵素の活性の減少」という句は、活性が、少なくとも０．５倍、具体的には少なくとも０．１倍、より具体的には少なくとも０．０１倍、さらに具体的には少なくとも０．００１倍、また具体的には少なくとも０．０００１倍減少することを意味する。また、「活性の減少」という句は、検出できない活性（「活性０」）を含む。特定の酵素の活性減少は、例えば、選択的変異、あるいは、特定の酵素活性を低減する手法として当業者に既知の他の手段により可能となる。具体的には、当業者は、例えば、Ｄｕｂｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｓｉｎｇｈ＆Ｒｏｈｍ，２００８、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９などを参照とし、特定の遺伝子を中断することにより、タンパク質発現の修飾及び低減、並びにそれに伴う酵素活性の低減をもたらす手法を見出すことができる。本発明のいずれかの態様による核酸配列のうちの１つを含む遺伝子の修飾により細胞の酵素活性の減少を達成してもよい。ここにおいて、修飾は、遺伝子に対する外来ＤＮＡの挿入、遺伝子の少なくとも一部の欠失、遺伝子配列の点変異、ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、制御配列（例えばプロモータやターミネータ）、遺伝子に隣接するリボソーム結合部位の修飾（挿入、欠失、点変異）からなる群から選択される。標的遺伝子の発現減少を達成するために、例えば、遺伝子の発現、あるいは酵素タンパク質の触媒特性を低減又は排除することができる。必要によって上記２つの手法を組み合わせてもよい。
【００３４】
これに関連して、外来ＤＮＡは、遺伝子に対して（生物に対してではない）「外来」である任意のＤＮＡ配列を意味すると理解すべきである。つまり、内因性ＤＮＡ配列も「外来ＤＮＡ」として作用することができる。これに関連して、選択マーカ遺伝子の挿入により遺伝子が中断されるのが特に好ましいが、よってここでは選択マーカ遺伝子が外来ＤＮＡとなる。また、遺伝子座における相同組換えにより挿入を行なうのが好ましい。
【００３５】
本発明のいずれかの態様による細胞は、メチオニン前駆体の生成率の増加を可能にし得るＥ２の増大した発現を有し得る。Ｅ２酵素は、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡ及び／又はｍｅｔＸ）であってもよい。具体的には、酵素Ｅ２は、アセチル−ＣｏＡの存在下で、少なくとも１つのメチオニン前駆体、例えばＮ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体を生成することができる。一例では、本発明のいずれかの態様による細胞を修飾し、細胞内のメチオニン前駆体の合成に関わる真正又は内因性のｍｅｔＡ遺伝子及び／又はｍｅｔＸ遺伝子をノックアウトして、フィードバック系から遊離している外来又は外因性のｍｅｔＸ遺伝子及び／又はｍｅｔＡ遺伝子を導入する。メチオニン合成に関わるｍｅｔＡ、ｍｅｔＢ、ｍｅｔＣ、ｍｅｔＥ、ｍｅｔＨ遺伝子は、フィードバック制御系により抑制されている。従って本発明のいずれかの態様による細胞において外来のｍｅｔＡ及び／又はｍｅｔＸ遺伝子が発現すると、フィードバック制御系とは無関係にこの遺伝子（ｍｅｔＡ及び／又はｍｅｔＸ）の発現が可能となる。これによって、野生型細胞に対してＥ２酵素の発現が増大し、結果としてＮ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体の生成を増大させる。
【００３６】
一例では、細胞がＥ２酵素の発現を増大させることを可能にするために、メチオニン合成経路の転写調節因子を除去、あるいは弱化する。具体的には、大腸菌における通常の転写調節遺伝子のｍｅｔＪ遺伝子を細胞から排除し、ｍｅｔＡ及び／又はｍｅｔＸ遺伝子の発現を増大してもよい。ｍｅｔＪ遺伝子を排除し、ｍｅｔＡ及び／又はｍｅｔＸ遺伝子が過剰発現するこの例では、メチオニン前駆体の発現も増大することになる。
【００３７】
さらなる例では、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコード化するｍｅｔＸ及び／又はｍｅｔＡそれ自体の遺伝子を、Ｎ−アセチルホモセリン又はその誘導体、つまりメチオニン前駆体の合成を増大させる既知の基本的な遺伝子組換え方法を用いて、細胞内に導入する。
【００３８】
一例では、Ｅ２酵素はｍｅｔＡである。一部の特定微生物におけるホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼを、ｍｅｔＡと命名してもよい。具体的には、Ｅ２酵素はＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓから由来するｍｅｔＡである。
【００３９】
ｍｅｔＸは、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼの活性を有するタンパク質をコード化する遺伝子の一般的な名称である。ｍｅｔＸは、様々な微生物種から得ることができる。例えば、ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチドは、コリネバクテリウム属、レプトスピラ属、デイノコッカス属、シュードモナス属、マイコバクテリウム属から得た遺伝子によりコード化されてもよい。具体的には、Ｅ２酵素のホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチドは、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｍｅｙｅｒｉ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、あるいはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓから由来する遺伝子によりコード化されてもよい。より具体的には、Ｅ２酵素はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２又はそのバリアント（variant）から由来するホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼであってもよい。さらに具体的には、Ｅ２酵素は、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１又はそのバリアントを有する。
【００４０】
本発明のいずれかの態様による細胞におけるｍｅｔＸ及び／又はｍｅｔＡの発現を導入及び／又は増強する既知の方法であれば、特に制限なく適用することができる。一例では、組換えにより細胞に遺伝子を導入する方法が用いられる。具体的には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２又はそのバリアントの導入により、組換え細胞におけるＥ２酵素の発現が増大する。別の例では、遺伝子のプロモータ領域及び５’−ＵＴＲのヌクレオチド配列の修飾あるいは目標遺伝子のＯＲＦ領域に変異の導入を行なう。これらの方法を任意に組み合わせて行なっても、細胞内のＥ２酵素の発現を増大及び／又は増強することができる。ｍｅｔＸ遺伝子発現の増強により、メチオニン前駆体合成も増加する。具体的には、ｍｅｔＸ遺伝子発現の増強は、Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体の合成の増加をもたらし得る。
【００４１】
本発明のいずれかの態様による細胞はさらに、野生型細胞に比べ、（ａ）Ｅ１酵素、つまりホモセリンデヒドロゲナーゼ（１．１．１．３）の活性が増大していてもよい。Ｅ１酵素の活性増大は、Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体の前駆体のホモセリンの合成を増加させる。Ｅ１は二官能性アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ１であってもよい。一例では、Ｅ１酵素の活性増大は、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（Ｅ１）及び／又はアスパルトキナーゼ（Ｅ５）に少なくとも１つの点変異が生じた結果である。具体的には、Ｅ１酵素は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース番号Ｐ００５６１の遺伝子によりコード化された野生型タンパク質に比べると、アミノ酸位置３４５（Ｓｅｒ３４５Ｐｈｅ）に変異が生じている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むｔｈｒＡ遺伝子であってもよい。より具体的には、Ｅ１酵素をコード化する遺伝子は、塩基対位置１０３４に、ＣをＴに取り替えた点変異が生じており、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のペプチドをコード化する。さらに具体的には、Ｅ１酵素をコード化するヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５を有する。変異が生じたＥ１酵素は、本明細書では「変異型Ｅ１」と称する。
【００４２】
別の例では、Ｅ５酵素はアスパルトキナーゼである。具体的には、Ｅ５酵素は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベース番号Ｐ０８６６０の遺伝子によりコード化された野生型タンパク質に比べると、アミノ酸位置３４２（Ｔｈｒ３４２Ｉｌｅ）に変異が生じている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸配列を含むｌｙｓＣ遺伝子であってもよい。より具体的には、Ｅ５酵素をコード化する遺伝子は、塩基対位置１０５５に、ＣをＴに取り替えた点変異が生じており、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のペプチドをコード化する。さらに具体的には、Ｅ５酵素をコード化するヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を有する。変異が生じたＥ５酵素を、以下、「変異型Ｅ５」と称する。ｔｈｒＡ遺伝子及び／又はｌｙｓＣ遺伝子に変異を導入する手段、染色体に標的遺伝子をさらに導入する手段、あるいは加工プラスミドをさらに導入する手段により、ｔｈｒＡ及び／又はｌｙｓＣ活性を増強してもよい。より具体的には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６をそれぞれ導入することで、組換え細胞におけるＥ１及び／又はＥ５酵素の活性を増大してもよい。
【００４３】
さらなる例ではＥ１酵素の活性増大は、Ｅ１酵素の点変異及び／又はＥ５酵素の点変異によりもたらされる。この場合、Ｅ１及びＥ５酵素は、野生型細胞において天然発現（つまり、特定の変異なし）している。Ｅ１酵素の点変異は、トレオニンによるフィードバック阻害を防止する。Ｅ５酵素の点変異は、リジンによるフィードバック阻害を防止する。一例では、細胞は変異型Ｅ１のみを発現する。別の例では、細胞は変異型Ｅ５のみを発現する。さらなる例では、細胞は変異型Ｅ１と変異型Ｅ５の両方を発現する。従って、Ｅ１の活性増大は、Ｅ１及び／又はＥ５の変異によりもたらされることになる。
【００４４】
一例では、本発明のいずれかの態様による細胞は、野生型細胞ではＥ１及びＥ５を発現しなくてもよい。変異したＥ１及び／又はＥ５を細胞に導入し、Ｅ１活性の増大をもたらすことになる。
【００４５】
本発明のいずれかの態様による組換え細胞は、野生型細胞に比べ、Ｅ１、Ｅ５、Ｅ２酵素の活性が増大していてもよい。
【００４６】
本発明の教示は、本明細書が明示的に（例えば名称や受け入れ番号の明記）又は黙示的に言及しているアミノ酸配列や核酸配列を有する生物学的高分子は勿論、この配列のバリアントを用いても行なうことができる。本明細書における「バリアント」という用語は、基準となるアミノ酸配列又は核酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％，８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％類似するアミノ酸配列又は核酸配列を網羅する概念である。ここでは、機能、例えばタンパク質の触媒活性に不可欠ではないアミノ酸、あるいは分子の折り畳みや構造を、欠失、置換、又は挿入による代替するか、必須不可欠のアミノ酸を、基準配列やそれから由来する分子の生物学的活性はそのまま維持される保存方式で取り替えるのが好ましい。最近の技術では、所与の核酸配列又はアミノ酸配列２つを整列し、同一性の程度を算出するアルゴリズムがある。Ａｒｔｈｕｒ  Ｌｅｓｋ（２００８）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、Ｋａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）を参照されたい。「バリアント」という用語は、「相同体」という用語と同義的に且つ交換可能に使用される。そのようなバリアントは、アミノ酸配列又は核酸配列に高分子又はそのバリアントを用いる、導入、欠失、挿入、置換、融合により調製してもよい。一例では、アミノ酸配列に対する「バリアント」は、上記の配列同一性を有するアミノ酸配列は勿論、１つ以上の保存アミノ酸が基準配列や野生型配列に対して変化しているか、あるいは１つ以上の保存アミノ酸変化を含むアミノ酸配列をコード化する核酸配列を有しているアミノ酸配列をも網羅する。一例では、アミノ酸配列又は核酸配列の「バリアント」という用語には、上記の配列同一性を有する配列は勿論のこと、アミノ酸配列又は核酸配列の活性部分及び／又は断片、あるいはアミノ酸配列の活性部分及び／又は断片をコード化する任意の核酸配列をも含まれる。本明細書における「活性部分」という用語は、全長アミノ酸配列未満のアミノ酸配列、あるいは全長アミノ酸配列未満をコード化する核酸配列であり、上記のアミノ酸配列又はコード化アミノ酸配列は、それぞれ、本来の生物学的活性の少なくとも一部を保持している。例えば、プロテアーゼの活性部分及び／又は断片は、ポリペプチドのペプチド結合を加水分解することができる。本明細書における「本来の生物学的活性を少なくとも一部は保持している」という句は、問題のアミノ酸配列が背景活性を超える異なる生物学的活性を有し、この活性を特徴づける動態パラメータ、より具体的にはｋｃａｔ及びＫＭが、特定の基質に対して基準の分子が示す値より好ましくは３倍、２倍、又は１倍以内にあることを意味する。同様に、核酸の「バリアント」という用語は、相補鎖が、好ましくは厳しい条件下で、基準核酸又は野生型核酸とハイブリダイズする核酸を含む。当業者であれば、開示の機能を実行することができる酵素の配列を容易に定めることができるであろう。
【００４７】
ハイブリダイゼーション反応の妥当性は、当業者であれば容易に決定可能であり、一般的に、プローブ長、洗浄温度、塩濃度に基づく経験的算出により得られる。通常、プローブが長いほど、適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とし、一方プローブがより短ければ、温度はより低くなる。ハイブリダイゼーションは、通常、相補鎖の融解温度より低温の環境において相補鎖に再アニールする変性ＤＮＡの能力に左右される。プローブとハイブリダイズ可能な配列の相同性として所望する程度が高いほど、適用される相対温度も高くなる。その結果、相対温度が高いほど反応条件がより厳しくなり、温度が低いほど厳しさが緩和される傾向を示す。ハイブリダイゼーション反応の妥当性に関しては、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９５）を参照されたい。当業者は、ハイブリダイゼーションによりＤＮＡ配列を同定する手段につき、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社の「Ｔｈｅ  ＤＩＧ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｕｓｅｒｓ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（ドイツ国マンハイム、１９９３）、Ｌｉｅｂｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）を参照してもよい。一例では、任意のハイブリダイゼーションに厳しい条件を適用している。つまり、ハイブリダイゼーションは、プローブが目標配列と７０％以上同一である場合にのみ起こる。目標配列との同一性により低いプローブもハイブリダイズはできるが、そのようなハイブリッドは不安定であり、厳しい条件、例えば、塩濃度を２×ＳＳＣに、必要によって引き続き０．５×ＳＳＣに下げ、温度は優先度の高いものから順に、約５０℃〜６８℃、約５２℃〜６８℃、約５４℃〜６８℃、約５６℃〜約６８℃、約５８℃〜６８℃、約６０℃〜６８℃、約６２℃〜６８℃、約６４〜６８℃、約６６℃〜６８℃に設定する条件下の洗浄ステップにおいて取り除かれる。特に好ましい実施形態において、温度は約６４℃〜６８℃、あるいは６６℃〜６８℃である。塩濃度を０．２×ＳＳＣ、又はさらに０．１×ＳＳＣにも調整可能である。基準配列、又は野生型配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するポリヌクレオチド断片を単離してもよい。本明細書における「相同体」という用語は、遺伝情報の縮退に伴って、基準核酸配列と同じアミノ酸配列をコード化する任意の核酸配列を指す。
【００４８】
本発明のいずれかの態様による細胞は、広範囲の微生物細胞から選択してもよい。具体的には、細胞は原核細胞、又は下等真核細胞であってもよい。一例では、細胞は、アシネトバクタ属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、バークホルデリア属、クロレラ属、コリネバクテリウム属、シアノバクテリア、エルウィニア属、エスケリキア属、クレブシエラ属、セラチア属、プロビデンシア属、シュードモナス属、リゾビウム属、サルモネラ属、ノストク属からなる群から選択される。細胞は、コリネバクテリウムグルタミクムと大腸菌からなる群から選択されてもよい。一例では、細胞は、大腸菌である。別の例では、細胞は、コリネバクテリウムグルタミクムである。また別の例では、細胞は、サッカロミセス、カンジダ、ピキア、シゾサッカロミセス、ヤロウィアからなる群から選択される真菌、特には出芽酵母の下等真核生物である。細胞は単離細胞、すなわち単一下部の純粋培養物であってもよく、あるいは少なくとも２つの株の混合物を含んでいてもよい。バイオテクノロジ関連細胞は市販されており、例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）やドイツ微生物細胞培養保存機関（ＤＳＭＺ）から入手することができる。細胞を維持及び修飾する粒子は、先行技術、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ／Ｆｒｉｔｓｃｈ／Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）から入手可能である。
【００４９】
一例では、組換え細胞はさらに、野生型細胞に比べて、
（ａ）Ｅ３酵素、つまりジアミノピメレートデカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．２０）及び／又は、
（ｂ）Ｅ４酵素、つまりホモセリンＯ−トランススクシニラーゼ（ＥＣ２．３．１．４６）
の活性が減少している。
【００５０】
具体的には、Ｅ３及びＥ４酵素の活性を、本分野における既知の方法により低減又は抑制してもよい。一例では、Ｅ３酵素は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸配列を含む。本発明のいずれかの態様による組換え細胞における野生型配列から塩基対を欠失させることで、この酵素を不活性化してもよい。一例では、不活性型Ｅ３は、野生型ｌｙｓＡ配列のｂｐ４〜１２３９を欠失しているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のｌｙｓＡ遺伝子によりコード化される。
【００５１】
別の例では、Ｅ４酵素、つまりホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９のアミノ酸配列を含む。本発明のいずれかの態様による組換え細胞において野生型配列から塩基対を欠失させることで、この酵素を不活性化してもよい。一例では、不活性型Ｅ４は、野生型ｍｅｔＡ配列のｂｐ４〜９０９を欠失しているＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のｍｅｔＡ遺伝子によりコード化される。Ｅ４酵素に当たるｍｅｔＡは、Ｅ２酵素に当たるｍｅｔＡとは異なる。当業者であれば、双方が例えば同じ遺伝子名（つまりｍｅｔＡ）を共有していても、異なる機能及び固有のＥＣ分類番号を有することを理解するであろう。本発明のいずれかの態様によるＥ２酵素の定義の範疇に属するｍｅｔＡは、ＥＣ２．３．１．３１である。本発明のいずれかの態様によるＥ４酵素の定義の範疇に属するｍｅｔＡは、ＥＣ２．３．１．４６である。Ｅ４の不活性化により、Ｅ２酵素は、野生型細胞におけるフィードバック制御系からの干渉なしに機能を果たすことができる。
【００５２】
さらなる例では、本発明のいずれかの態様による細胞は、野生型細胞に比べ、Ｅ１（変異型Ｅ１）、Ｅ５（変異型Ｅ５）、Ｅ２酵素の活性は増大し、Ｅ３及びＥ４酵素の活性が減少している。一例では、本発明のいずれかの態様による細胞は、野生型細胞に比べ、Ｅ１（変異型Ｅ１）及びＥ２酵素の活性は増大し、Ｅ３及びＥ４酵素の活性が減少している。また別の例では、本発明のいずれかの態様による細胞は、野生型細胞に比べＥ５（変異型Ｅ５）及びＥ２酵素の活性は増大し、Ｅ３及びＥ４酵素の活性が減少している。
【００５３】
Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体は、Ｌ−立体構造、又はＤ−立体構造を有してもよい。具体的には、Ｎ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体は、Ｏ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−Ｌ−ホモセリン、Ｏ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−Ｄ−ホモセリン、Ｎ−アセトアミド−Ｌ−ホモセリン、Ｎ−アセトアミド−Ｄ−ホモセリンからなる群から選択される。
【００５４】
本明細書における「接触」という用語は、本発明のいずれかの態様による方法において、本発明のいずれかの態様による細胞と炭素源を含む培地との直接接触をもたらすことを指す。接触は、細胞及び水性培地との間の炭素源との直接接触であり得る。一例では、細胞、及び炭素源を含む培地は、異なる区画にある。具体的には、炭素源はガス状態であってもよく、本発明のいずれかの態様による細胞を含む培地に添加されてもよい。
【００５５】
「水性溶液」又は「培地」という用語は、水を含む任意の溶液であって、本発明のいずれかの態様による細胞を、少なくとも一次的に、代謝活性状態及び／又は生存可能な状態に保つ溶媒として主に水を使用し、必要であれば追加の基質を含む、溶液を指す。当業者は、本発明のいずれかの態様による細胞を保持する培地（例えば、大腸菌及び／又はコリネバクテリウムグルタミクムの場合、ＬＢ培地）として、様々な水性溶液の調製に精通している。水性溶液を最少培地、つまり複合培地とは対照的に、細胞代謝活性状態及び／又は生存可能な状態に保つために必須不可欠な最小の塩及び栄養素のみを含む、合理的に単純な組成の培地として使用すると、望まない副産物により生成物が不要に汚染されることを回避することができる。例えば、Ｍ９培地は最少培地として使用することができる。細胞を、所望の生成物、つまりＮ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体、及びバリアントを生成するまで十分な時間、炭素源と共にインキュベートする。その時間は、例えば少なくとも１時間、２時間、４時間、５時間、１０時間、又は２０時間となる。さらに、本発明のいずれかの態様による細胞が触媒活性又は代謝活性を維持できる温度を選ばなければならず、例えば１０〜４２℃、好ましくは３０〜４０℃であり、具体的には、細胞が大腸菌及び／又はコリネバクテリウムグルタミクムである場合、３２〜３８℃となる。
【００５６】
当業者であれば、本発明のいずれかの態様による方法の実行に必要な他の条件についても理解するであろう。具体的には、容器（例えば、発酵槽）における条件は、使用対象である第１、第２、第３の微生物に応じて変動してもよい。微生物が最適に機能するのに適した条件を変えることは、当業者の知識の範囲内である。
【００５７】
一例では、本発明のいずれかの態様による方法は、ｐＨ５〜８、５．５〜７の水性培地で実施することができる。圧力は１〜１０バールである。
【００５８】
本発明の他の態様によると、炭素源からＮ−アセチルホモセリン及び／又はその誘導体を生成する、少なくとも１つの組換え細胞の使用を提供し、組換え細胞は、野生型細胞に比べて、
（ａ）Ｅ１酵素、つまりホモセリンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．３）及び／又はＥ５酵素、つまりアスパルトキナーゼ（ＥＣ２．７．２．４）、並びに
（ｂ）Ｅ２酵素、つまりホモセリン−Ｏ−アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．３１）
の活性が増大している。
【実施例】
【００５９】
上記の好ましい実施形態につき、当業者には理解されるように、特許請求の範囲から逸脱することなく、設計、構成、動作における改良や修正を加えることができる。これらの改良は、例えば特許請求の範囲によって含まれることを意図している。
【００６０】
実施例１
大腸菌を用いた酢酸からのＯ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−ＤＬ−ホモセリンの形成
アセテートのＯ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−ＤＬ−ホモセリンへの生体転換のために、遺伝子組換え株の大腸菌Ｗ３１１０ΔｌｙｓＡ  ｌｙｓＣｆｂｒ  ｔｈｒＡｆｂｒΔｍｅｔＡ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｔｈｒＡ＿ｆｂｒ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ｍｅｔＸ＿Ｃｇ］を用いた。菌株は以下の特徴を有する。
ｉ．ジアミノピメレートデカルボキシラーゼをコード化する大腸菌Ｗ３１１０  ｌｙｓＡ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）の欠失
ｉｉ．ホモセリンＯ−トランススクシニラーゼをコード化する大腸菌Ｗ３１１０  ｍｅｔＡ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）の欠失
ｉｉｉ．アスパルトキナーゼ３のフィードバック耐性バリアントをコード化する大腸菌Ｗ３１１０  ｌｙｓＣ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の対立遺伝子の発現
ｉｖ．二官能性アスパルトキナーゼ１／ホモセリンデヒドロゲナーゼ１のフィードバック耐性バリアントをコード化する大腸菌Ｗ３１１０  ｔｈｒＡ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）の対立遺伝子の発現
ｖ．ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼをコード化するコリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣ  １３０３２ｍｅｔＸ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の発現
【００６１】
上記の特徴は、以下の操作によるものとした。
ｉ．ｐＫＯ３誘導体ＨＭ−ｐ−６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）による大腸菌Ｗ３１１０  ｌｙｓＡ遺伝子（ｂｐ４〜１２３９欠失）の不活性化。
ｉｉ．ｐＫＯ３誘導体ｐＧＲ−３−４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）による大腸菌Ｗ３１１０  ｍｅｔＡ遺伝子（ｂｐ４〜９０９欠失）の不活性化。
ｉｉｉ．ｐＫＯ３誘導体ｐＪＡＧ−４−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）による、ｌｙｓＣのフィードバック耐性バリアントをコード化するｌｙｓＣの別の対立遺伝子（ｂｐ１０５５の点変異：ＣをＴに取り替え、ｔｈｒ３４２ｌｌｅ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を用いた、大腸菌Ｗ３１１０  ｌｙｓＣ遺伝子の置換。
ｉｖ．ｐＫＯ３誘導体４−４９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）による、ｔｈｒＡのフィードバック耐性バリアントをコード化するｔｈｒＡの別の対立遺伝子（ｂｐ１０３４の点変異：ＣをＴに取り替え、Ｓｅｒ３４５Ｐｈｅ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を用いた、大腸菌Ｗ３１１０  ｔｈｒＡ遺伝子の置換。
ｖ．プラスミドｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｔｈｒＡ＿ｆｂｒ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ｍｅｔＸ＿Ｃｇ］（ＳＥＱ  ＩＤ：１１）の導入。
【００６２】
遺伝子欠失、並びに対立遺伝子置換に用いられるｐＫＯ３誘導体の構築するため、標的遺伝子の上流及び下流の相同配列を、下記のプライマを用いて、大腸菌Ｗ３１１０のゲノムＤＮＡから得たＰＣＲにより増幅した。アセンブリクローニングに用いられる相同体端末をプライマ内に導入した。
【００６３】
ｍｅｔＡ相同体配列１
【表１】
2019523271.tif 000004
【００６４】
ｍｅｔＡ相同体配列２
【表２】
2019523271.tif 000005
【００６５】
ｌｙｓＡ相同体配列１
【表３】
2019523271.tif 000006
【００６６】
ｌｙｓＡ相同体配列２
【表４】
2019523271.tif 000007
【００６７】
ｌｙｓＣｆｂｒ相同体配列１
【表５】
2019523271.tif 000008
【００６８】
ｌｙｓＣｆｂｒ相同体配列２
【表６】
2019523271.tif 000009
【００６９】
ｔｈｒＡｆｂｒ相同体配列１
【表７】
2019523271.tif 000010
【００７０】
ｔｈｒＡｆｂｒ相同体配列２
【表８】
2019523271.tif 000011
【００７１】
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用し、製造業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ市）に従ってＰＣＲを実施した。熱サイクルプロファイルは、初期変性のために、９８℃で３分間、それぞれ、１０秒間９８℃、３０秒間６０℃〜６８℃（勾配）、２０秒間７２℃、最後の１０分間７２℃で保持するステップを含み、３５サイクルを繰り返した。精製キット（ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット、及びＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キット：Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国ヒルデン市）の製造業者に従って、ゲル抽出、又はＰＣＲ精製を行ない、ＰＣＲ生成物を精製した。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用し、製造業者のマニュアル（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ市）に従って、精製したＰＣＲ生成物を、ＮｏｔＩ制限ｐＫＯ３プラスミドに組み立てた。形質転換受容性細胞（ＮＥＢ１０−βエレクトロコンピテント大腸菌、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ市）の製造業者に従って、大腸菌ＤＨ１０βの形質転換を実施した。切断解釈、並びにＤＮＡ配列の決定により、最終プラスミドの存在を確認した。
【００７２】
大腸菌Ｗ３１１０から得たアスパラギン酸キナーゼｔｈｒＡのフィードバック耐性バリアントをコード化するｔｈｒＡ、並びに、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２から得たホモセリンアセチルトランスフェラーゼをコード化するｍｅｔＸに用いられる大腸菌発現ベクタを構築するに当たり、両方の遺伝子を供与体生物のゲノムＤＮＡから得たＰＣＲにより増幅させた。フィードバック耐性バリアントをもたらすｔｈｒＡの点変異は、フォワードプライマにおいて行なわれた。ｔｈｒＡ遺伝子を、別のベクタから得たＰＣＲにより増幅されたｔａｃ−プロモータ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）の下流でクローニングした。増幅には、下記のプライマが用いられた。
【００７３】
ｍｅｔＸ＿Ｃｇ
【表９】
2019523271.tif 000012
【００７４】
Ｐｔａｃ
【表１０】
2019523271.tif 000013
【００７５】
ｔｈｒＡ−１
【表１１】
2019523271.tif 000014
【００７６】
ｔｈｒＡ−２
【表１２】
2019523271.tif 000015
【００７７】
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用し、製造業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ市）に従ってＰＣＲを実施した。熱サイクルプロファイルは、初期変性のために、９８℃で３分間、それぞれ、１０秒間９８℃、３０秒間６０℃〜７０℃（勾配）、４５秒間７２℃、最後の１０分間７２℃で保持するステップを含み、３５サイクルを繰り返した。精製キット（ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット、及びＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キット：Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国ヒルデン市）の製造業者に従って、ゲル抽出、又はＰＣＲ精製を行ない、ＰＣＲ生成物を精製した。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用し、製造業者のマニュアル（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ市）に従って、精製したＰＣＲ生成物を、ＮｄｅＩ／ＸｂａＩ制限高コピーベクタｐＪ２８１＿Ｐｌａｃｕｖ５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）に組み立てた。形質転換受容性細胞（ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ  ＤＨ１０Ｂ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国マサチューセッツ州ウォルサム市）の製造業者に従って、大腸菌ＤＨ１０βの形質転換を実施した。切断解釈、並びにＤＮＡ配列の決定により、最終プラスミドｐＪＡＧ−４−４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２）の存在を確認した。
【００７８】
さらに、ｔｈｒＡ遺伝子及びｍｅｔＸ遺伝子を、既にｔａｃプロモータ配列を含むＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限ｐＣＤＦ誘導体（ｐＣＤＦ＿Ｐｔａｃ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３）にサブクローニングした。サブクローニングのために、標的遺伝子をアセンブリクローニングに用いられる相同体配列を有する下記のプライマを使用してＰＣＲにより増幅した。
【００７９】
ｔｈｒＡ
【表１３】
2019523271.tif 000016
【００８０】
Ｐｌａｃｕｖ５−ｍｅｔＸ
【表１４】
2019523271.tif 000017
【００８１】
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用し、製造業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ市）に従ってＰＣＲを実施した。熱サイクルプロファイルは、初期変性のために、９８℃で３分間、それぞれ、１０秒間９８℃、２０秒間６０℃〜６８℃（勾配）、４５秒間７２℃、最後の１０分間７２℃で保持するステップを含み、３５サイクルを繰り返した。精製キット（ＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キット：Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国ヒルデン市）の製造業者に従って、ゲル抽出を行ない、ＰＣＲ生成物を精製した。
【００８２】
ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用し、製造業者のマニュアル（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ市）に従って、精製したＰＣＲ生成物を、ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩ制限ベクタｐＣＤＦ＿Ｐｔａｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）に組み立てた。形質転換受容性細胞（ＮＥＢ１０−βエレクトロコンピテント大腸菌、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ市）の製造業者に従って、大腸菌ＤＨ１０βの形質転換を実施した。切断解釈、並びにＤＮＡ配列の決定により、最終プラスミドｐＪＡＧ−４−５０（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４８）の存在を確認した。
【００８３】
プラスミドｐＫＯ３、並びに上記に記載した方法（Ｌｉｎｋ  ＡＪ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｄ、Ｃｈｕｒｃｈ  ＧＭ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９（２０）：６２２８−３７）を用いて、遺伝子欠失及び対立遺伝子置換を行なった。大腸菌Ｗ３１１０の形質転換は、本分野で既知の電気穿孔法を用いて行なわれた。
【００８４】
大腸菌を、ＬＢ寒天プレート（寒天１５ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、硫酸スペクチノマイシン１００ｍｇ／Ｌをさらに含む）を用いて、３７℃で２４時間培養した。
【００８５】
一次前培養の際には、１００ｍｌの振とうフラスコにＬＢ培地（酵母エキス５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、硫酸スペクチノマイシン１００ｍｇ／Ｌをさらに含む）３×５ｍｌを充填し、新しくインキュベートした寒天プレートから得た単一コロニを接種して、３７℃、２００ｒｐｍで７時間培養した。その結果、ＯＤ６００ｎｍ＞３．０となった。
【００８６】
二次前培養の際には、５００ｍｌの振とうフラスコにＭ９培地（ｐＨ７．４０、Ｎａ２ＨＰＯ４×１２  Ｈ２Ｏ  １３．６８ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ３．００ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ０．５０ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  ２．００ｇ／Ｌ、ＮＨ４酢酸塩  ５．００ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ０．４９ｇ／Ｌ、ＨＣｌ（２５％）０．１３ｍｌ／Ｌ、ＭｎＣｌ２×７  Ｈ２Ｏ  １．９１ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  １．８７ｍｇ／Ｌ、Ｎａ−ＥＤＴＡ×２  Ｈ２Ｏ  ０．８４ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ０．３０ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ０．２５ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ４．７０ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  １７．８０ｍｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．１５ｍｇ／Ｌ、硫酸スペクチノマイシン１００ｍｇ／Ｌ、３ｍＭメチオニン、３ｍＭリジンをさらに含む）８×５０ｍｌを充填し、プール次前培養物からそれぞれ得た０．５ｍｌ細胞懸濁液を接種して、３７℃、２００ｒｐｍで１８時間培養した。その結果、ＯＤ６００ｎｍ＞１．５となった。
【００８７】
続いて、細胞懸濁液を遠心分離にかけ、新しいＭ９培地で洗浄し、再度遠心分離にかけた。本培養の際には、新しいＭ９培地（メチオニン及びリジンは含まない）２００ｍｌを５００ｍＬのガラス瓶に充填し、遠心分離と洗浄にかけた前培養物の細胞を接種した。その結果、ＯＤ６００ｎｍは１．０となった。ブチルゴム栓で気密に密封できる耐圧ガラス瓶の中で、培養を行なった。培養物に対して、合成空気（Ｎ２  ７９．５％、Ｏ２  ２０．５％）を用いて、３０℃、１５０ｒｐｍ、通気速度４Ｌ／時間で１１９時間、オープンウォーターバスシェーカ内でインキュベートを行なった。反応器の中央に取り付けられた孔径１０μｍのスパージャを通して空気を培地中に排出した。２５％酢酸を自動的に添加し、ｐＨを７．３に保持した。４時間後、誘導のために１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。培養の開始時点及び培養期間中に、サンプルを採取した。採取したサンプルに対し、光学密度、ｐＨ、様々な対象について分析を行なった（ＮＭＲ及びＬＣ−ＭＳを使用）。ＨＲ−ＥＳＩ−ＬＣＭＳを、１５０×２ｍｍのＡｃｃｕｃｏｒｅ  ａｑ  Ｃ１８（Ｒ１３８）カラムを装備したＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｌｉｔｅを備えるＳｕｒｖｅｙｏｒ  ＨＰＬＣ１２５０により測定した。勾配溶出は、流速０．２ｍＬ／分と４０℃で、０％Ｂ（３）−９−６０％Ｂ−０、１−８０％Ｂ（５）であった。Ｏ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−ＤＬ−ホモセリンを、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンに対して定量した。
【００８８】
培養期間中、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンの濃度は０から１８０ｍｇ／Ｌに、Ｎ−アセチル−Ｌ−ホモセリンの濃度は０から７０８ｍｇ／Ｌに増加した。Ｏ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−ＤＬ−ホモセリンが６．９ｍｇ／Ｌ生成された。この間、アセテートの８．７ｇ／Ｌが用いられた。
【００８９】
実施例２
コリネバクテリウムグルタミクムを用いた酢酸からのＯ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−ＤＬ−ホモセリンの形成
アセテートのＯ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−ＤＬ−ホモセリンへの生体転換のために、遺伝子組換え株のコリネバクテリウムグルタミクムＭＨ２０−２２Ｂ  ｈｏｍ＿ｆｂｒ  ｐＥＣＸＣ９９Ｅ−｛Ｐｔｒｃ｝［ｍｅｔＸ＿Ｃｇ］を用いた。菌株のコリネバクテリウムグルタミクムＭＨ２０−２２Ｂは、Ｓｃｈｒｕｍｐｆ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９２）３７：５６６−５７１）に記載され、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼを発現する、化学変異体である。株を、Ｓａｈｍ  ｅＴ  ａｌ．  （Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９６年５月１５日、７８２：２５−３９）によって、フィードバック耐性ホモセリンデヒドロゲナーゼをさらに発現するコリネバクテリウムグルタミクムＭＨ２０−２２Ｂ  ｈｏｍ＿ｆｂｒ株に改変した。また、株に、コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２からのホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＸ）コード化するプラスミドｐＥＣＸＣ９９Ｅ−｛Ｐｔｒｃ｝［ｍｅｔＸ＿Ｃｇ］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）で、形質転換を施した。
【００９０】
ｍｅｔＸに用いられるコリネバクテリウムグルタミクム発現ベクタを構築するに当たり、遺伝子を、下記のプライマを用いて、供与体生物のゲノムＤＮＡから得たＰＣＲにより増幅させた。
【表１５】
2019523271.tif 000018
【００９１】
Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用し、製造業者（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ市）に従ってＰＣＲを実施した。熱サイクルプロファイルは、初期変性のために、９８℃で５分間、それぞれ、１０秒間９８℃、２０秒間６０℃、３９秒間７２℃、最後の１０分間７２℃で保持するステップを含み、３５サイクルを繰り返した。
【００９２】
精製キット（ＱｉａＱｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット：Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ国ヒルデン市）の製造業者に従って、ＰＣＲ精製を行ない、ＰＣＲ生成物を精製した。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ（登録商標）ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用し、製造業者のマニュアル（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ市）に従って、精製したＰＣＲ生成物を、ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ制限ベクタｐＥＣＸＣ９９Ｅ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２）に組み立てた。形質転換受容性細胞（ＮＥＢ  １０−β、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、米国マサチューセッツ州イプスウィッチ市）の製造業者に従って、大腸菌ＤＨ１０βの形質転換を実施した。切断解釈、並びにＤＮＡ配列の決定により、最終プラスミドｐＥＣＸＣ９９Ｅ−｛Ｐｔｒｃ｝［ｍｅｔＸ＿Ｃｇ］（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）の存在を確認した。
【００９３】
コリネバクテリウムグルタミクムＡＴＣＣ１３０３２の形質転換は、上記に記載しているように、例えばｖａｎ  ｄｅｒ  Ｒｅｓｔ  ＭＥ、Ｌａｎｇｅ  Ｃ、Ｍｏｌｅｎａａｒ  Ｄにより行なわれた。電気穿孔法の後の熱ショックは、異種プラスミドＤＮＡを用いたコリネバクテリウムグルタミクムの形質転換が非常に効率的に行なわれるように誘導する。Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９．５２（４）：５４１−５を参照されたい。
【００９４】
コリネバクテリウムグルタミクムＭＨ２０−２２Ｂ  ｈｏｍ＿ｆｂｒ  ｐＥＣＸＣ９９Ｅ−｛Ｐｔｒｃ｝［ｍｅｔＸ＿Ｃｇ］を、ＢＨＩ寒天プレート（脳抽出物７．８ｇ／Ｌ、グルコース２．０ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４  ２．０ｇ／Ｌ、心臓抽出物９．７ｇ／Ｌ、ペプトン１０．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５．０ｇ／Ｌ、寒天１５．０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４、クロラムフェニコール７．５ｍｇ／Ｌをさらに含む）を用いて、３０℃で７２時間培養した。
【００９５】
前培養の際には、５００ｍｌの振とうフラスコにＬＢ培地（酵母エキス５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、酢酸カリウム１７．９５ｇ／Ｌとクロラムフェニコール７．５ｍｇ／Ｌをさらに含む）４×５０ｍｌを充填し、新しくインキュベートした寒天プレートから得た細胞の全プールを接種して、３０℃、１２０ｒｐｍで２２時間培養した。その結果、ＯＤ６００ｎｍ＞３．０となった。続いて、細胞懸濁液を遠心分離にかけ、新しいＣＧＦ１培地で洗浄し、再度遠心分離にかけた。
【００９６】
本培養の際には、新しいＣＧＦ１培地（ｐＨは７．２、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  １ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４×１  Ｈ２Ｏ  ７．６ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ０．２４６ｇ／Ｌ、酢酸アンモニウム１０．８ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン０．１ｇ／Ｌ、クロラムフェニコール７．５ｍｇ／Ｌをさらに含む）２００ｍｌを５００ｍＬのガラス瓶に充填し、遠心分離と洗浄にかけた前培養物の細胞を接種した。その結果、ＯＤ６００ｎｍは１．０となった。ブチルゴム栓で気密に密封できる耐圧ガラス瓶の中で、培養を行なった。培養物に対して、合成空気（Ｎ２  ７９．５％、Ｏ２  ２０．５％）を用いて、３０℃、１２０ｒｐｍ、通気速度４Ｌ／時間で１３７時間、オープンウォーターバスシェーカ内でインキュベートを行なった。反応器の中央に取り付けられた孔径１０μｍのスパージャを通して空気を培地中に排出した。２５％酢酸を自動的に添加し、ｐＨを７．２に保持した。２１時間後、誘導のために１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。培養の開始時点及び培養期間中に、サンプルを採取した。採取したサンプルに対し、光学密度、ｐＨ、様々な対象について分析を行なった（ＮＭＲ及びＬＣ−ＭＳを使用）。ＨＲ−ＥＳＩ−ＬＣＭＳを、１５０×２ｍｍのＡｃｃｕｃｏｒｅ  ａｑ  Ｃ１８（Ｒ１３８）カラムを装備したＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｌｉｔｅを備えるＳｕｒｖｅｙｏｒ  ＨＰＬＣ１２５０により測定した。勾配溶出は、流速０．２ｍＬ／分と４０℃で、０％Ｂ（３）−９−６０％Ｂ−０、１−８０％Ｂ（５）であった。Ｏ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−ＤＬ−ホモセリンを、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンに対して定量した。
【００９７】
培養期間中、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンの濃度は０から２３０ｍｇ／Ｌに、Ｎ−アセチル−Ｌ−ホモセリンの濃度は０から３０６ｍｇ／Ｌに増加した。Ｏ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−ＤＬ−ホモセリンが８．３ｍｇ／Ｌ生成された。この間、アセテートの３５．２ｇ／Ｌが用いられた。
【００９８】
実施例３
コリネバクテリウムグルタミクムに用いた酢酸からのＯ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−ＤＬ−ホモセリンの非形成
アセテートのＬ−ホモセリンへの生体転換のために、遺伝子組換え株のコリネバクテリウムグルタミクムＭＨ２０−２２Ｂ  ｈｏｍ＿ｆｂｒを用いた。菌株のコリネバクテリウムグルタミクムＭＨ２０−２２Ｂは、Ｓｃｈｒｕｍｐｆ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９２）３７：５６６−５７１）に記載され、フィードバック耐性アスパラギン酸キナーゼを発現する、化学変異体である。株を、Ｓａｈｍ  ｅＴ  ａｌ．  （Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９６年５月１５日、７８２：２５−３９）によって、フィードバック耐性ホモセリンデヒドロゲナーゼをさらに発現するコリネバクテリウムグルタミクムＭＨ２０−２２Ｂ  ｈｏｍ＿ｆｂｒ株に改変した。
【００９９】
コリネバクテリウムグルタミクムＭＨ２０−２２Ｂ  ｈｏｍ＿ｆｂｒを、コリネバクテリウム寒天プレート（ｐＨ７．３、カゼインペプトントリプシン消化物１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、グルコース５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ）を用いて、３０℃で７２時間培養した。
【０１００】
前培養の際には、５００ｍｌの振とうフラスコにＣＧＳ１培地（ｐＨ７．００、ペプトン１０ｇ／Ｌ、牛肉抽出物５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ２．５ｇ／Ｌ、酢酸カリウム１７．９５ｇ／Ｌをさらに含む）２×５０ｍｌを充填し、新しくインキュベートした寒天プレートから得た細胞の全プールを接種して、３０℃、１２０ｒｐｍで２８時間培養した。その結果、ＯＤ６００ｎｍ＞１．０となった。培養の後、細胞懸濁液を遠心分離にかけ、新しいＣＧＦ１培地（ｐＨは７．２、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  １ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  １ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  １０  ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４×１  Ｈ２Ｏ  ７．６ｍｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ０．２４６ｇ／Ｌ）で洗浄し、再度遠心分離にかけた。
【０１０１】
本培養の際には、新しいＣＧＸ培地（ｐＨ７．４０、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ０．２５ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４×Ｈ２Ｏ  １０ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  １ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４×５  Ｈ２Ｏ  ０．３ｍｇ／Ｌ、ＮｉＣｌ２×６  Ｈ２Ｏ  ０．０３７ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．２ｍｇ／Ｌ、ＣａＣＯ３  ２０ｇ／Ｌ、グルコース４０ｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン０．０５ｇ／Ｌ）３０ｍｌを２５０ｍＬのガラス瓶に充填し、遠心分離と洗浄にかけた前培養物の細胞を接種した。その結果、ＯＤ６００ｎｍは０．２となった。培養物に対して、３０℃、１５０ｒｐｍで１４２時間、インキュベートを行なった。培養の開始時点及び培養期間中に、サンプルを採取した。採取したサンプルに対し、光学密度、ｐＨ、様々な対象について分析を行なった（ＮＭＲを使用）。
【０１０２】
培養期間中、Ｌ−ホモセリンの濃度は０から５３５ｍｇ／Ｌに、Ｌ−リジンの濃度は０から８８８ｍｇ／Ｌに、Ｌ−アラニンの濃度は０から３５０ｍｇ／Ｌに増加した。Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ホモセリン、あるいはＯ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−ＤＬ−ホモセリンは生成されなかった。
【０１０３】
実施例４
大腸菌に用いた酢酸からのＯ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−Ｌ−ホモセリンの非形成
本実施例では、遺伝子組換え株の大腸菌Ｗ３１１０ΔｌｙｓＡ  ｌｙｓＣｆｂｒ  ｔｈｒＡｆｂｒΔｍｅｔＡを用いた。菌株は以下の特徴を有する。
ｉ．ジアミノピメレートデカルボキシラーゼをコード化する大腸菌Ｗ３１１０  ｌｙｓＡ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）の欠失
ｉｉ．ホモセリンＯ−トランススクシニラーゼをコード化する大腸菌Ｗ３１１０  ｍｅｔＡ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）の欠失
ｉｉｉ．アスパルトキナーゼ３のフィードバック耐性バリアントをコード化する大腸菌Ｗ３１１０  ｌｙｓＣ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）の対立遺伝子の発現
ｉｖ．二官能性アスパルトキナーゼ１／ホモセリンデヒドロゲナーゼ１のフィードバック耐性バリアントをコード化する大腸菌Ｗ３１１０  ｔｈｒＡ遺伝子（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）の対立遺伝子の発現
【０１０４】
上記の特徴は、以下の操作によるものとした。
ｉ．ｐＫＯ３誘導体ＨＭ−ｐ−６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）による大腸菌Ｗ３１１０  ｌｙｓＡ遺伝子（ｂｐ４〜１２３９欠失）の不活性化。
ｉｉ．ｐＫＯ３誘導体ｐＧＲ−３−４６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）による大腸菌Ｗ３１１０  ｍｅｔＡ遺伝子（ｂｐ４〜９０９欠失）の不活性化。
ｉｉｉ．ｐＫＯ３誘導体ｐＪＡＧ−４−４７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）による、ｌｙｓＣのフィードバック耐性バリアントをコード化するｌｙｓＣの別の対立遺伝子（ｂｐ１０５５の点変異：ＣをＴに取り替え、ｔｈｒ３４２Ｉｌｅ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を用いた、大腸菌Ｗ３１１０  ｌｙｓＣ遺伝子の置換。
ｉｖ．ｐＫＯ３誘導体４−４９（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）による、ｔｈｒＡのフィードバック耐性バリアントをコード化するｔｈｒＡの別の対立遺伝子（ｂｐ１０３４の点変異：ＣをＴに取り替え、Ｓｅｒ３４５Ｐｈｅ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を用いた、大腸菌Ｗ３１１０  ｔｈｒＡ遺伝子の置換。
【０１０５】
ｐＫＯ３誘導体の構築は、実施例１に記載のように行なった。
【０１０６】
プラスミドｐＫＯ３、並びに上記に記載した方法（Ｌｉｎｋ  ＡＪ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｄ、Ｃｈｕｒｃｈ  ＧＭ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９（２０）：６２２８−３７）を用いて、遺伝子欠失及び対立遺伝子置換を行なった。大腸菌Ｗ３１１０の形質転換は、本分野で既知の電気穿孔法を用いて行なわれた。大腸菌を、ＬＢ寒天プレート（寒天１５ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）を用いて、３７℃で２４時間培養した。
【０１０７】
ＬＢ培地（酵母エキス５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）５ｍｌを培養管に充填し、新しくインキュベートした寒天プレートから得た単一コロニを接種して、３７℃、２００ｒｐｍで６時間培養した。Ｍ９−グルコース培地（ｐＨ７．４０、Ｎａ２ＨＰＯ４×１２  Ｈ２Ｏ  １３．６８ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ３．００ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ０．５０ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  ２．００ｇ／Ｌ、グルコース２０．００ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ０．４９ｇ／Ｌ、ＨＣｌ（２５％）０．１３ｍｌ／Ｌ、ＭｎＣｌ２×７  Ｈ２Ｏ  １．９１ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  １．８７ｍｇ／Ｌ、Ｎａ−ＥＤＴＡ×２  Ｈ２Ｏ  ０．８４ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ０．３０ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ０．２５ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ４．７０ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  １７．８０ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．１５ｍｇ／Ｌ）２０ｍＬを、３ｍＭメチオニンと３ｍＭリジンと共に、２５０ｍＬのバッフル付き振とうフラスコに充填し、細胞懸濁液０．５ｍＬを接種した。培養物に対して３７℃、２００ｒｐｍで一晩、インキュベートを行なった。その結果、ＯＤ６００ｎｍは１２．３となった。細胞懸濁液を用いて、２５０ｍｌのバッフル付き振とうフラスコに３ｍＭメチオニン及び３ｍＭリジンと共に充填したＭ９−グルコース培地５０ｍＬに接種した。その結果、ＯＤ６００ｎｍは０．２となった。培養物に対して３０℃、２００ｒｐｍで４．５時間、インキュベートを行なった。その結果、ＯＤ６００ｎｍは１．３９となった。ＩＰＴＧを濃度１ｍＭになるまで培養物に添加し、培養物に対して３０℃、２００ｒｐｍで２３．５時間、インキュベートを行なった。サンプルを２８時間の培養を通して採取し、ＮＭＲにより分析した。
【０１０８】
培養を０〜２８時間を行なう間、Ｏ−アセチル−Ｌ−ホモセリンやＯ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−Ｌ−ホモセリンは、一切検出されなかった。
【０１０９】
実施例５
発酵サンプルにおけるＯ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−ＤＬ−ホモセリンの検出
大腸菌Ｗ３１１０ΔｌｙｓＡ  ｌｙｓＣｆｂｒ  ｔｈｒＡｆｂｒΔｍｅｔＡ  ｐＣＤＦ｛Ｐｔａｃ｝［ｔｈｒＡ＿ｆｂｒ＿Ｅｃ］｛Ｐｌａｃｕｖ５｝［ｍｅｔＸ＿Ｃｇ］を、ＬＢ寒天プレート（寒天１５ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、硫酸スペクチノマイシン１００ｍｇ／Ｌをさらに含む）を用いて、３７℃で２４時間培養した。
【０１１０】
一次前培養の際には、１００ｍｌの振とうフラスコにＬＢ培地３×５ｍｌ（酵母エキス５ｇ／Ｌ、トリプトン１０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０、硫酸スペクチノマイシン１００ｍｇ／Ｌをさらに含む）を充填し、新しくインキュベートした寒天プレートから得た単一コロニを接種して、３７℃、２００ｒｐｍで７時間培養した。その結果、ＯＤ６００ｎｍ＞３．０となった。
【０１１１】
二次前培養の際には、５００ｍｌの振とうフラスコにＭ９培地（ｐＨ７．４０、Ｎａ２ＨＰＯ４×１２  Ｈ２Ｏ  １３．６８ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ３．００ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  ０．５０ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  ２．００ｇ／Ｌ、ＮＨ４酢酸塩  ５．００ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  ０．４９ｇ／Ｌ、ＨＣｌ（２５％）０．１３ｍｌ／Ｌ、ＭｎＣｌ２×７  Ｈ２Ｏ  １．９１ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  １．８７ｍｇ／Ｌ、Ｎａ−ＥＤＴＡ×２  Ｈ２Ｏ  ０．８４ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ０．３０ｍｇ／Ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４×２  Ｈ２Ｏ  ０．２５ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ４．７０ｍｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４×７  Ｈ２Ｏ  １７．８０ｍｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２×２  Ｈ２Ｏ  ０．１５ｍｇ／Ｌ、硫酸スペクチノマイシン１００ｍｇ／Ｌ、３ｍＭメチオニン、３ｍＭリジンをさらに含む）８×５０ｍｌを充填し、プール次前培養物からそれぞれ得た０．５ｍｌ細胞懸濁液を接種して、３７℃、２００ｒｐｍで１８時間培養した。その結果、ＯＤ６００ｎｍ＞１．５となった。
【０１１２】
続いて、細胞懸濁液を遠心分離にかけ、新しいＭ９培地で洗浄し、再度遠心分離にかける。本培養の際には、新しいＭ９培地（メチオニン及びリジンは含まない）２００ｍＬを５００ｍＬのガラス瓶に充填し、遠心分離と洗浄にかけた前培養物の細胞を接種した。その結果、ＯＤ６００ｎｍは１．０となった。ブチルゴム栓で気密に密封できる耐圧ガラス瓶の中で、培養を行なった。培養物に対して、合成空気（Ｎ２  ７９．５％、Ｏ２  ２０．５％）を用いて、３０℃、１５０ｒｐｍ、通気速度４Ｌ／時間で１１９時間、オープンウォーターバスシェーカ内でインキュベートを行なった。反応器の中央に取り付けられた孔径１０μｍのスパージャを通して空気を培地中に排出した。２５％酢酸を自動的に添加し、ｐＨを７．３に保持した。４時間後、誘導のために１ｍＭのＩＰＴＧを添加した。１１９時間が経った後、発酵からサンプルを採取し、ＬＣ−ＭＳを用いて分析した。ＨＲ−ＬＣＭＳを、１５０×２ｍｍのＡｃｃｕｃｏｒｅ  ａｑ  Ｃ１８（Ｒ１３８）カラムを装備したＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｅｌｉｔｅを備えるＡｃｃｅｌａ１２５０により測定した。勾配溶出は、流速０．２ｍＬ／分と４０℃で、０％Ｂ（１）−１９−８０％Ｂ（１５）であった。溶離液Ａは０．０５％ペルフルオロ酪酸を含む水であり、溶離液Ｂは０．０５％ペルフルオロ酪酸を含むメタノールであった。ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ＋］＋２０４．０８６８で６．６８分に溶出するピークは、Ｏ−アセチル−Ｎ−アセトアミド−ＤＬ−ホモセリンとして同定された。
【配列表】
2019523271000001.app
【国際調査報告】
2019523271.tif 000021
2019523271.tif 000022
2019523271.tif 000023