(57)【要約】  本発明は、Ｔ細胞、特にウイルスに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする外因性核酸を含む非活性化Ｔ細胞に関する。本発明の一実施形態は、ウイルス複製を阻害することができるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）エンベロープｓ１８３−１９１ ＴＣＲを発現する非活性化（休止）Ｔ細胞に関し、それは、前記ＴＣＲを発現する活性化Ｔ細胞と比べて、刺激に応答したパーフォリンおよび／またはグランザイムの発現の低下を示す。また、かかる細胞、組成物、医薬組成物およびかかる細胞を含むキットを生成するための方法、並びにその医学的使用も包含される。【選択図】図６Ａ、図６Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする外因性核酸を含み、非活性化Ｔ細胞である、任意で単離されているＴ細胞。
【請求項２】
非活性化Ｔ細胞が、ＴＣＲが特異的であるペプチドを用いた刺激に応答して、パーフォリンおよび／またはグランザイムの発現の増加を示さない、請求項１に記載のＴ細胞。
【請求項３】
ウイルスに感染した細胞におけるウイルスの複製を阻害することが可能である、請求項１または請求項２に記載のＴ細胞。
【請求項４】
ウイルスに感染した細胞におけるウイルスの複製を、細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変されていない、ウイルスに特異的なＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞によるウイルス複製阻害の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または１００％に阻害することが可能である、請求項１から３のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項５】
細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変されていない、ウイルスに特異的なＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞と比べて、ウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞に対して低減した細胞障害性を示す、請求項１から４のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項６】
ウイルスに特異的な改変されたＴ細胞を産生する方法、任意でｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、Ｔ細胞を、ウイルスに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するか、または含むように改変することを含み、改変されたＴ細胞が、非活性化Ｔ細胞である、方法。
【請求項７】
Ｔ細胞を、ウイルスに特異的なＴＣＲを発現するか、または含むように改変することが、ウイルスに特異的なＴＣＲをコードする核酸を、Ｔ細胞に導入することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
核酸が、形質導入、トランスフェクションまたはトランスポゾンベースの系によってＴ細胞に導入される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項６から８のいずれか一項に記載の方法によって得られるか、または得ることが可能である任意で単離されているＴ細胞。
【請求項１０】
請求項１から５および請求項９のいずれか一項に記載のＴ細胞、および薬学的に許容される担体、佐剤、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１１】
疾患もしくは障害を治療または防止する方法における使用のための、請求項１から５および請求項９のいずれか一項に記載のＴ細胞、または請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
疾患もしくは障害を治療または防止する方法における使用のための薬剤の製造における、請求項１から５および請求項９のいずれか一項に記載のＴ細胞、または請求項１０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１３】
疾患もしくは障害を治療または防止する方法であって、対象に、治療上または予防上有効量の請求項１から５および請求項９のいずれか一項に記載のＴ細胞、または請求項１０に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項１４】
対象における疾患もしくは障害を治療または防止する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのＴ細胞を対象から単離することと、
（ｂ）少なくとも１つのＴ細胞を、ウイルスに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するか、または含むように改変することと、
（ｃ）改変された少なくとも１つのＴ細胞を、対象に投与することと
を含み、改変された少なくとも１つのＴ細胞が、非活性化Ｔ細胞である、方法。
【請求項１５】
少なくとも１つのＴ細胞を、ウイルスに特異的なＴＣＲを発現するか、または含むように改変することが、ウイルスに特異的なＴＣＲをコードする核酸を、少なくとも１つのＴ細胞に導入することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
核酸が、形質導入、トランスフェクションまたはトランスポゾンベースの系によって少なくとも１つのＴ細胞に導入される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
既定量の請求項１から５および請求項９のいずれか一項に記載のＴ細胞、または請求項１０に記載の医薬組成物を含むキットオブパーツ。
【請求項１８】
１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変された、ウイルスに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞、任意で、単離されているＴ細胞。
【請求項１９】
細胞障害性因子が、パーフォリン、グランザイムＢ、グランザイムＡ、グラニュライシン、およびＦＡＳＬから選択される、請求項１８に記載のＴ細胞。
【請求項２０】
ウイルスに感染した細胞におけるウイルスの複製を阻害することが可能である、請求項１８または請求項１９に記載のＴ細胞。
【請求項２１】
ウイルスに感染した細胞におけるウイルスの複製を、細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変されていない、ウイルスに特異的なＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞によるウイルス複製阻害の少なくとも５０％に阻害することが可能である、請求項１８から２０のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項２２】
細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変されていない、ウイルスに特異的なＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞と比べて、ウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞に対し低減した細胞障害性を示す、請求項１８から２１のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項２３】
ＴＣＲをコードする外因性核酸を含む、請求項１８から２２のいずれか一項に記載のＴ細胞。
【請求項２４】
ウイルスに特異的な改変されたＴ細胞を産生する方法、任意でｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、Ｔ細胞を、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性を低減するように改変することを含み、改変されたＴ細胞が、ウイルスに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、方法。
【請求項２５】
Ｔ細胞を、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性を低減するように改変することが、Ｔ細胞を、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性を阻害するための薬剤で処置することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
細胞障害性因子が、パーフォリン、グランザイムＢ、グランザイムＡ、グラニュライシン、およびＦＡＳＬから選択される、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｔ細胞を、ウイルスに特異的なＴＣＲを発現するか、または含むように改変することをさらに含む、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
Ｔ細胞を、ウイルスに特異的なＴＣＲを発現するか、または含むように改変することが、ウイルスに特異的なＴＣＲをコードする核酸を、Ｔ細胞に導入することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２４から２８のいずれか一項に記載の方法によって得られるか、または得ることが可能である任意で単離されているＴ細胞。
【請求項３０】
請求項１８から２３および請求項２９のいずれか一項に記載のＴ細胞、および薬学的に許容される担体、佐剤、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項３１】
疾患もしくは障害を治療または防止する方法における使用のための、請求項１８から２３および請求項２９のいずれか一項に記載のＴ細胞、または請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
疾患もしくは障害を治療または防止する方法における使用のための薬剤の製造における、請求項１８から２３および請求項２９のいずれか一項に記載のＴ細胞、または請求項３０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３３】
疾患もしくは障害を治療または防止する方法であって、対象に、治療上または予防上有効量の請求項１８から２３および請求項２９のいずれか一項に記載のＴ細胞、または請求項３０に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項３４】
対象における疾患もしくは障害を治療または防止する方法であって、
（ａ）ウイルスに特異的な少なくとも１つのＴ細胞を対象から単離することと、
（ｂ）少なくとも１つのＴ細胞を、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変することと、
（ｃ）改変された少なくとも１つのＴ細胞を、対象に投与することと
を含む方法。
【請求項３５】
対象における疾患もしくは障害を治療または防止する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのＴ細胞を対象から単離することと、
（ｂ）少なくとも１つのＴ細胞を、ウイルスに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するか、または含むように改変することであって、
（ｉ）Ｔ細胞が、細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変されるか、または
（ｉｉ）方法が、少なくとも１つのＴ細胞を、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変することをさらに含む、改変することと、
（ｃ）改変された少なくとも１つのＴ細胞を、対象に投与することと
を含む方法。
【請求項３６】
少なくとも１つのＴ細胞を、ウイルスに特異的なＴＣＲを発現するか、または含むように改変することが、ウイルスに特異的なＴＣＲをコードする核酸を、少なくとも１つのＴ細胞に導入することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つのＴ細胞を、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変することが、少なくとも１つのＴ細胞を、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性を阻害するための薬剤で処置することを含む、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
細胞障害性因子が、パーフォリン、グランザイムＢ、グランザイムＡ、グラニュライシン、およびＦＡＳＬから選択される、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
既定量の請求項１８から２３および請求項２９のいずれか一項に記載のＴ細胞、または請求項３０に記載の医薬組成物を含むキットオブパーツ。
【請求項４０】
（ｉ）ウイルスに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸および（ｉｉ）細胞障害性因子の発現または活性を低減するための薬剤を含むキットオブパーツ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞、特に抗ウイルスＴ細胞、かかる細胞を産生する方法、かかる細胞を含む組成物、およびそれらの医学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在の抗ウイルス療法は、ＨＢＶ複製を制御することが可能であるが、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡを、感染した肝細胞から排除することはできない。標準的な治療戦略は高価であり、ヌクレオシド／ヌクレオチド類似体を用いた治療の場合のように、生涯にわたる治療を要するか、またはＩＦＮ−α療法を用いた場合と同様に重篤な負の副作用と関連付けられる。ＨＢＶ抗原への数年にわたる曝露後、ＨＢＶ特異的Ｔ細胞は多くの場合、慢性的に感染した患者において欠失されるか、または機能的に消耗される。ウイルス特異的Ｔ細胞応答を操作するための戦略は、慢性感染を治療するための臨床療法に通じ得るか、または重篤な急性感染に関連した死亡率を防止し得る。
【０００３】
Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のいずれかの遺伝的挿入による腫瘍特異性を達成するように設計構築されたＴリンパ球の養子移入は、播種性腫瘍の優れた制御を可能にする。ＨＢＶ特異的Ｔ細胞受容体を発現するＴ細胞の養子移入により新たなＨＢＶ特異的Ｔ細胞免疫を操作することによって、急性感染を消散させてウイルスを制御する、患者に存在する抗ウイルス免疫に類似し、また有望な治療戦略を示す抗ウイルス免疫が再構成され得る。
【０００４】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）特異的ＴＣＲを発現するように設計構築されたＴ細胞は、組み込まれたＨＢＶ  ＤＮＡからＨＢＶ抗原を発現する自然肝細胞がん（ＨＣＣ）細胞を認識することが可能であることが知られており（Ｇｅｈｒｉｎｇら、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ（２０１１年）５５巻（１）：１０３〜１１０頁）、ＨＢＶ特異的ＴＣＲを発現するように電気穿孔によって設計構築された活性化Ｔ細胞は、ＨＣＣ腫瘍細胞播種を防止することが可能であることが知られており、かかる細胞の複数注入は、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍成長を制御することが知られている（Ｋｏｈら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  （２０１３年）２巻：ｅ１１４）。さらに、ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）特異的ＴＣＲを発現するＴ細胞を用いた養子Ｔ細胞療法は、ＨＣＣ転移を伴う肝臓移植患者におけるＨＢｓＡｇのレベルを抑制することが知られている（Ｑａｓｉｍら、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ（２０１５年）６２巻（２）：４８６〜４９１頁）。
【０００５】
しかしながら、養子Ｔ細胞療法と関連付けられる重症の副作用および／または毒性が存在する。正常組織における低レベルの標的抗原の発現、またはＴＣＲと内因性タンパク質との交差反応性は、重症の副作用をもたらし得る。例えば、Ｍｏｒｇａｎら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２０１３年）  ３６巻（２）：１３３〜１５１頁は、おそらくヒトの脳におけるＭＡＧＥ−Ａ１２の発現の結果として、抗ＭＡＧＥ−Ａ３  ＴＣＲを発現するように設計構築されたＴ細胞を用いた養子Ｔ細胞療法と関連付けられる神経毒性について記載している。毒性の懸念は、必須の臓器を感染するウイルスに対して誘導されるウイルス特異的Ｔ細胞の養子移入を用いた療法の遂行を妨げている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、抗ウイルスであり、ウイルスに感染した細胞に対して実質的な細胞障害性を示さないウイルス特異的Ｔ細胞を操作することが可能であるという本発明者らの発見に基づく。本発明の目的は、宿主に対して毒性の低減を示すウイルス感染の制御に関する介入を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
特に、本発明者らは、非活性化Ｔ細胞を、ウイルスに特異的なＴＣＲを発現するように改変することにより、ウイルスに感染した細胞におけるウイルス複製を阻害することが可能であるが、ＴＣＲを発現するように設計構築された等価な活性化Ｔ細胞によって示される細胞障害性と比べて、それらの細胞に対して細胞障害性の低減を示すＴ細胞が産生されることを発見した。
【０００８】
本発明者らはまた、ウイルスに特異的なＴＣＲを含み、細胞障害性因子の発現／活性の低減のために改変されたＴ細胞が、ウイルスに感染した細胞におけるウイルス複製を阻害する能力を保持するが、それらの非改変対応物と比べて、それらの細胞に対して細胞障害性の低減を示すことを発見した。
【０００９】
第１の態様において、本発明は、ウイルスに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする外因性核酸を含み、非活性化Ｔ細胞である、任意で単離されているＴ細胞を提供する。幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞は、ＴＣＲが特異的であるペプチドを用いた刺激に応答して、パーフォリンおよび／またはグランザイムの発現の増加を示さない。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、ウイルスに感染した細胞におけるウイルスの複製を阻害することが可能である。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、ウイルスに感染した細胞におけるウイルスの複製を、細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変されていない、ウイルスに特異的なＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞によるウイルス複製阻害の少なくとも５０％に阻害することが可能である。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変されていない、ウイルスに特異的なＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞と比べて、ウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞に対して細胞障害性の低減を示す。
【００１０】
第２の態様において、本発明は、ウイルスに特異的な改変されたＴ細胞を産生する方法、任意でｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、Ｔ細胞を、ウイルスに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するか、または含むように改変することを含み、改変されたＴ細胞が、非活性化Ｔ細胞である、方法を提供する。幾つかの実施形態において、方法は、本発明の第１の態様によるＴ細胞を産生するためのものである。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞を、ウイルスに特異的なＴＣＲを発現するか、または含むように改変することは、ウイルスに特異的なＴＣＲをコードする核酸を、Ｔ細胞に導入することを含む。幾つかの実施形態において、核酸は、形質導入、例えばガンマレトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入によってＴ細胞に導入される。幾つかの実施形態において、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡトランスフェクション、例えばｍＲＮＡ電気穿孔によってＴ細胞に導入される。幾つかの実施形態において、核酸は、トランスポゾンベースの系、例えばＳｐｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙによってＴ細胞に導入される。
【００１１】
第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様による方法によって得られるか、または得ることが可能であるＴ細胞を提供する。
【００１２】
第４の態様において、本発明は、本発明の第１または第３の態様によるＴ細胞、および薬学的に許容される担体、佐剤、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
第５の態様において、本発明は、疾患もしくは障害を治療または防止する方法における使用のための、本発明の第１もしくは第３の態様によるＴ細胞、または本発明の第４の態様による医薬組成物を提供する。
【００１４】
第６の態様において、本発明は、疾患もしくは障害を治療または防止する方法における使用のための薬剤の製造における、本発明の第１もしくは第３の態様によるＴ細胞、または本発明の第４の態様による医薬組成物の使用を提供する。
【００１５】
第７の態様において、本発明は、疾患もしくは障害を治療または防止する方法であって、対象に、治療上または予防上有効量の本発明の第１もしくは第３の態様によるＴ細胞、または本発明の第４の態様による医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００１６】
第８の態様において、本発明は、対象における疾患もしくは障害を治療または防止する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのＴ細胞を対象から単離することと、
（ｂ）少なくとも１つのＴ細胞を、ウイルスに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するか、または含むように改変することと、
（ｃ）改変された少なくとも１つのＴ細胞を、対象に投与することと
を含み、改変された少なくとも１つのＴ細胞が、非活性化Ｔ細胞である、方法を提供する。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのＴ細胞を、ウイルスに特異的なＴＣＲを発現するか、または含むように改変することは、ウイルスに特異的なＴＣＲをコードする核酸を、少なくとも１つのＴ細胞に導入することを含む。幾つかの実施形態において、核酸は、形質導入、例えばガンマレトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入によってＴ細胞に導入される。幾つかの実施形態において、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡトランスフェクション、例えばｍＲＮＡ電気穿孔によって少なくとも１つのＴ細胞に導入される。幾つかの実施形態において、核酸は、トランスポゾンベースの系、例えばＳｐｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙによってＴ細胞に導入される。
【００１７】
第９の態様において、本発明は、既定量の本発明の第１もしくは第３の態様によるＴ細胞、または本発明の第４の態様による医薬組成物を含むキットオブパーツを提供する。
【００１８】
第１０の態様において、本発明は、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変された、ウイルスに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞、任意で単離されているＴ細胞を提供する。幾つかの実施形態において、細胞障害性因子は、パーフォリン、グランザイムＢ、グランザイムＡ、グラニュライシン、およびＦＡＳＬから選択される。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、ウイルスに感染した細胞におけるウイルスの複製を阻害することが可能である。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、ウイルスに感染した細胞におけるウイルスの複製を、細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変されていない、ウイルスに特異的なＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞によるウイルス複製阻害の少なくとも５０％に阻害することが可能である。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変されていない、ウイルスに特異的なＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞と比べて、ウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞に対して細胞障害性の低減を示す。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＴＣＲをコードする外因性核酸を含む。
【００１９】
第１１の態様において、本発明は、ウイルスに特異的な改変されたＴ細胞を産生する方法、任意でｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、Ｔ細胞を、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性を低減するように改変することを含み、改変されたＴ細胞が、ウイルスに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、方法は、本発明の第１０の態様によるＴ細胞を産生するためのものである。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞を、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性を低減するように改変することは、Ｔ細胞を、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性を阻害するための薬剤で処置することを含む。幾つかの実施形態において、細胞障害性因子は、パーフォリン、グランザイムＢ、グランザイムＡ、グラニュライシン、およびＦＡＳＬから選択される。幾つかの実施形態において、方法は、Ｔ細胞を、ウイルスに特異的なＴＣＲを発現するか、または含むように改変することをさらに含む。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞を、ウイルスに特異的なＴＣＲを発現するか、または含むように改変することは、ウイルスに特異的なＴＣＲをコードする核酸を、Ｔ細胞に導入することを含む。
【００２０】
第１２の態様において、本発明は、本発明の第１１の態様による方法によって得られるか、または得ることが可能である任意で単離されているＴ細胞を提供する。
【００２１】
第１３の態様において、本発明は、本発明の第１０または第１２の態様によるＴ細胞、および薬学的に許容される担体、佐剤、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
第１４の態様において、本発明は、疾患もしくは障害を治療または防止する方法における使用のための、本発明の第１０または第１２の態様によるＴ細胞、または本発明の第１３の態様による医薬組成物を提供する。
【００２３】
第１５の態様において、本発明は、疾患もしくは障害を治療または防止する方法における使用のための薬剤の製造における、本発明の第１０または第１２の態様によるＴ細胞、または本発明の第１３の態様による医薬組成物の使用を提供する。
【００２４】
第１６の態様において、本発明は、疾患もしくは障害を治療または防止する方法であって、対象に、治療上または予防上有効量の本発明の第１０または第１２の態様によるＴ細胞、または本発明の第１３の態様による医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【００２５】
第１７の態様において、本発明は、対象における疾患もしくは障害を治療または防止する方法であって、
（ａ）ウイルスに特異的な少なくとも１つのＴ細胞を対象から単離することと、
（ｂ）少なくとも１つのＴ細胞を、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変することと、
（ｃ）改変された少なくとも１つのＴ細胞を、対象に投与することと
を含む方法を提供する。
【００２６】
第１８の態様において、本発明は、対象における疾患もしくは障害を治療または防止する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのＴ細胞を対象から単離することと、
（ｂ）少なくとも１つのＴ細胞を、ウイルスに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するか、または含むように改変することであって、
（ｉ）Ｔ細胞が、細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変されるか、または
（ｉｉ）方法が、少なくとも１つのＴ細胞を、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変することをさらに含む、改変することと、
（ｃ）改変された少なくとも１つのＴ細胞を、対象に投与することと
を含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、少なくとも１つのＴ細胞を、ウイルスに特異的なＴＣＲを発現するか、または含むように改変することは、ウイルスに特異的なＴＣＲをコードする核酸を、少なくとも１つのＴ細胞に導入することを含む。
【００２７】
本発明の第１７および第１８の態様による幾つかの実施形態において、少なくとも１つのＴ細胞を、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変することは、少なくとも１つのＴ細胞を、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性を阻害するための薬剤で処置することを含む。幾つかの実施形態において、細胞障害性因子は、パーフォリン、グランザイムＢ、グランザイムＡ、グラニュライシン、およびＦＡＳＬから選択される。
【００２８】
第１９の態様において、本発明は、既定量の本発明の第１０または第１２の態様によるＴ細胞、または本発明の第１３の態様による医薬組成物を含むキットオブパーツを提供する。
【００２９】
第２０の態様において、本発明は、（ｉ）ウイルスに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸および（ｉｉ）細胞障害性因子の発現または活性を低減するための薬剤を含むキットオブパーツを提供する。
【００３０】
様々な態様に関連して、幾つかの実施形態において、本発明は、ウイルスに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む任意で単離されているＴ細胞を提供し、ここで、Ｔ細胞は、（ｉ）ウイルスに感染した細胞におけるウイルスの複製を阻害することが可能であり、（ｉｉ）細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変されていない、ウイルスに特異的なＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞と比べて、ウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞に対して細胞障害性の低減を示す。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＴＣＲをコードする外因性核酸を含む。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変されていない活性化Ｔ細胞の発現または活性のレベルと比べて、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性のレベルの低減を示す。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変される。幾つかの実施形態において、細胞障害性因子は、パーフォリン、グランザイムＢ、グランザイムＡ、グラニュライシン、およびＦＡＳＬから選択される。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変されていない活性化Ｔ細胞の発現または活性と比べて、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１３、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの１つ以上の発現または活性の低減を示す。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、ウイルスに感染した細胞におけるウイルスの複製を、細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変されていない、ウイルスに特異的なＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞によるウイルス複製阻害の少なくとも５０％に阻害することが可能である。
【００３１】
様々な態様に関連して、本発明によるウイルスに特異的なＴ細胞を産生する方法の幾つかの実施形態において、方法は、Ｔ細胞を、ウイルスに特異的なＴＣＲを発現するか、または含むように改変することを含む。幾つかの実施形態において、改変されたＴ細胞は、（ｉ）ウイルスに感染した細胞におけるウイルスの複製を阻害することが可能であり、（ｉｉ）細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変されていない、ウイルスに特異的なＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞と比べて、ウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞に対して細胞障害性の低減を示す。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞を、ウイルスに特異的なＴＣＲを発現するか、または含むように改変することは、ウイルスに特異的なＴＣＲをコードする核酸を、Ｔ細胞に導入することを含む。幾つかの実施形態において、核酸は、形質導入、例えばガンマレトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入によってＴ細胞に導入される。幾つかの実施形態において、核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡトランスフェクション、例えばｍＲＮＡ電気穿孔によってＴ細胞に導入される。幾つかの実施形態において、核酸は、トランスポゾンベースの系、例えばＳｐｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙによってＴ細胞に導入される。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞を、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性を低減するように改変することは、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性を阻害するための薬剤で処置することを含む。幾つかの実施形態において、細胞障害性因子は、パーフォリン、グランザイムＢ、グランザイムＡ、グラニュライシン、およびＦＡＳＬから選択される。
【００３２】
説明
Ｔ細胞
本発明による態様において、Ｔ細胞、任意で、単離されているＴ細胞が提供される。本明細書中の本発明の様々な態様によれば、「Ｔ細胞」は、任意で「Ｔ細胞の集団」であってもよく、「単離されているＴ細胞」は、任意で「Ｔ細胞の単離集団」であってもよい。
【００３３】
ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞は、適応免疫系の一部である。ＣＤ８＋Ｔ細胞の正常な機能は、がん細胞ならびに細菌およびウイルスなどの細胞内病原体に感染した細胞を死滅させることである。ＣＤ４＋Ｔ細胞は多くの場合、Ｔヘルパー細胞として特性決定され、Ｂ細胞による抗体の産生を促進して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の応答を増強および維持して、マクロファージ活性を調節する。
【００３４】
Ｔ細胞は、種々の発達段階を経由して、例えば、Ｔ細胞が特異的である抗原にＴ細胞が遭遇したかどうか、および任意のかかる遭遇の状況に依存して、種々の表現型を有する。Ｔ細胞発達および活性化は、例えば、Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００１年）第５版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、チャプター７および８に記載されており、それらは、全体が参照により組み込まれる。
【００３５】
活性化Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化のプロセスを受けたＴ細胞である。Ｔ細胞は、Ｔ細胞のＴＣＲが、抗原提示細胞（ＡＰＣ）からの正の同時刺激シグナルの状況で高い親和性を有するＭＨＣ−ペプチド複合体を結合するという結果として活性化されるようになり得る。活性化は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏであり得る。Ｔ細胞はまた、任意でＣＤ２８による刺激と組み合わせた、および任意で高ＩＬ−２条件下での培養と組み合わせた、ＣＤ３による刺激の結果として活性化されるようになり得る。幾つかの実施形態において、活性化Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、例えば、任意でアゴニスト抗ＣＤ２８抗体を用いた処置と組み合わせた、および任意で高ＩＬ−２条件下での培養と組み合わせた、アゴニスト抗ＣＤ３抗体を用いた処置による刺激によって活性化され得る。高ＩＬ−２条件は、１００ＩＵ／ｍｌを上回る、例えば５００ＩＵ／ｍｌを上回る、６００ＩＵ／ｍｌを上回る、８００ＩＵ／ｍｌを上回る、９００ＩＵ／ｍｌを上回るＩＬ−２濃度であり得る。
【００３６】
非活性化Ｔ細胞は、活性化されていない、即ち、Ｔ細胞活性化のプロセスを受けていないＴ細胞である。本明細書中で、非活性化Ｔ細胞は、休止Ｔ細胞として記載されてもよい。幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞は、Ｔ細胞のＴＣＲが、ＡＰＣからの正の同時刺激シグナルの状況で高い親和性を有するＭＨＣ−ペプチド複合体に遭遇していないＴ細胞である。幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞は、任意でＣＤ２８による刺激と組み合わせた、および任意で高ＩＬ−２条件下での培養と組み合わせた、ＣＤ３により刺激されていないＴ細胞である。幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、例えば、任意でアゴニスト抗ＣＤ２８抗体を用いた処置と組み合わせた、および任意で高ＩＬ−２条件下での培養と組み合わせた、アゴニスト抗ＣＤ３抗体を用いた処置による刺激によって活性化されていない。
【００３７】
本発明の様々な態様による幾つかの実施形態において、活性化Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞であり得る。本発明の様々な態様による幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞であり得る。本明細書中で使用する場合、ナイーブＴ細胞は、Ｔ細胞のＴＣＲが、例えばＡＰＣによって提示される高い親和性を有するペプチドまたはＭＨＣ−ペプチド複合体に遭遇していないＴ細胞である。
【００３８】
非活性化Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＡｈｌｅｒｓおよびＢｅｌｙａｋｏｖ、Ｂｌｏｏｄ（２０１０年）１１５巻（９）：１６７８〜１６８９頁に記載されるように、特定のマーカーの発現を参照することによって特性決定され得る。非活性化Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞はまた、細胞の機能的特性の観点で特性決定され得る。
【００３９】
幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞は、細胞表面でＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７もしくはＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を発現し得る。幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞の細胞表面での発現と比べて、細胞表面でより高レベルのＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７もしくはＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を発現し得る。
【００４０】
幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈ表現型を有し得る。本明細書中で使用する場合、ＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈ表現型を有するＴ細胞は、例えばフローサイトメトリーによって、細胞表面で高レベルのＣＤ４５ＲＡを発現すると決定される細胞である。当業者は、例えばフローサイトメトリーによる分析によって、例えば、細胞表面で分子を発現しないか、もしくはより低レベルの発現で分子を発現する対照細胞または細胞の集団を参照することによって、所定の分子の「高い」表面発現を示す細胞または細胞の集団を容易に決定することが可能である。
【００４１】
幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞の細胞表面での発現と比べて、細胞表面でより低レベルのＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４３もしくはＫＬＲＧ１の１つまたは複数を発現してもよく、または検出可能なレベルで、細胞表面でＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４３もしくはＫＬＲＧ１の１つまたは複数を発現しなくてもよい。
【００４２】
非活性化（休止）Ｔ細胞は、より分化された細胞型と比べて、細胞溶解性酵素の発現をほとんど示さないか、または全く示さず、また特定のサイトカインのより低い発現を示す（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ（２００９年）８５巻（１）：８８〜９７頁、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４３】
したがって、幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞による発現と比べて、パーフォリン、グランザイム（例えば、グランザイムＢまたはグランザイムＡ）、またはグラニュライシンの１つまたは複数によるより低レベルの発現によって規定され得る。幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞は、検出可能なレベルで、パーフォリン、グランザイム（例えば、グランザイムＢまたはグランザイムＡ）、またはグラニュライシンの１つまたは複数を発現しなくてもよい。幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞が特異的ＴＣＲを含むペプチドを用いた刺激後の活性化Ｔ細胞による発現と比べて、非活性化Ｔ細胞が特異的ＴＣＲを含むペプチドを用いた刺激後に、より低レベルのパーフォリン、グランザイム（例えば、グランザイムＢまたはグランザイムＡ）、またはグラニュライシンの１つまたは複数を発現してもよい。
【００４４】
幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞は、非活性化Ｔ細胞が特異的ＴＣＲを含むペプチドを用いた刺激後に、検出可能なレベルで、パーフォリン、グランザイム（例えば、グランザイムＢまたはグランザイムＡ）、またはグラニュライシンの１つまたは複数を発現しなくてもよい（例えば、フローサイトメトリーによって決定されるように）。幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞が特異的ＴＣＲを含むペプチドを用いた刺激後の非活性化Ｔ細胞によるパーフォリン、グランザイム（例えば、グランザイムＢまたはグランザイムＡ）、またはグラニュライシンの１つまたは複数の発現は、非活性化Ｔ細胞が特異的ＴＣＲを含むペプチドを用いて刺激されていない非活性化Ｔ細胞による発現と比べて増加されない。
【００４５】
ペプチドを用いた刺激は、実施例６において本明細書中に記載するように実施され得る。簡潔に述べると、Ｔ細胞が特異的ＴＣＲを含むペプチドを提示することが可能なＭＨＣを発現する細胞を、１μｇ／ｍｌのペプチドで１時間パルス化して、２度洗浄した後、任意でブレフェルジンＡの存在下で、Ｔ細胞とともに５時間または一晩、共培養し得る。
【００４６】
パーフォリン、グランザイム（例えば、グランザイムＢまたはグランザイムＡ）、またはグラニュライシンの遺伝子／タンパク質発現は、本明細書中に記載するように分析および定量化することができる。幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞が特異的ＴＣＲを含むペプチドを用いた刺激後に、本発明による非活性化Ｔ細胞は、ペプチドを用いた刺激前の非活性化Ｔ細胞による発現のレベル、またはペプチドで刺激されていない対照非活性化Ｔ細胞による発現のレベルの２倍未満、１．９倍未満、１．８倍未満、１．７倍未満、１．６倍未満、１．５倍未満、１．４倍未満、１．３倍未満、１．２倍未満、または１．１倍未満であるレベルで、パーフォリン、グランザイム（例えば、グランザイムＢまたはグランザイムＡ）、もしくはグラニュライシンの１つまたは複数を発現してもよい。
【００４７】
本明細書中の実施形態において、ペプチドを用いたＴ細胞の刺激は、Ｔ細胞を、ペプチド、ペプチドを含むウイルス、ペプチドを含む細胞、またはペプチドを含むウイルスを含む（例えば、ウイルスに感染した）細胞と接触させることを含む。幾つかの実施形態において、ペプチドを含む細胞は、ペプチドを含むか、または発現するように改変されていてもよい。例えば、幾つかの実施形態において、細胞は、ペプチドをコードする核酸を含むように改変されていてもよく、またはペプチドでパルス化されていてもよい。幾つかの実施形態において、刺激は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏであり得る。幾つかの実施形態において、刺激は、ｅｘ  ｖｉｖｏであり得る。
【００４８】
幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞による発現と比べて、より低レベルのＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１３、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの１つまたは複数を発現してもよい。発現は、本明細書中で以下に説明するように、遺伝子またはタンパク質発現であってもよい。
【００４９】
幾つかの実施形態において、活性化Ｔ細胞は、細胞表面でＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４３もしくはＫＬＲＧ１の１つまたは複数を発現してもよい。幾つかの実施形態において、活性化Ｔ細胞は、非活性化Ｔ細胞の細胞表面での発現と比べて、細胞表面でより高レベルのＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４３もしくはＫＬＲＧ１の１つまたは複数を発現してもよい。幾つかの実施形態において、活性化Ｔ細胞は、非活性化Ｔ細胞の細胞表面での発現と比べて、細胞表面でより低レベルのＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７もしくはＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を発現してもよく、あるいは検出可能なレベルで、細胞表面でＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７もしくはＣＤ６２Ｌの１つまたは複数を発現しなくてもよい。幾つかの実施形態において、活性化Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡｌｏｗ表現型を有してもよい。本明細書中で使用する場合、ＣＤ４５ＲＡｌｏｗ表現型を有するＴ細胞は、例えばフローサイトメトリーによって、検出可能なレベルで、細胞表面でＣＤ４５ＲＡを発現すると決定されるが、高レベルの発現ではないレベルで、細胞表面でＣＤ４５ＲＡを発現する細胞である。当業者は、例えばフローサイトメトリーによる分析によって、例えば、より高レベルの発現で、細胞表面で分子を発現する対照細胞または細胞の集団を参照することによって、所定の分子の「低い」表面発現を示す細胞または細胞の集団を容易に決定することが可能である。
【００５０】
幾つかの実施形態において、活性化Ｔ細胞は、非活性化Ｔ細胞による発現と比べて、より高レベルのパーフォリン、グランザイム（例えば、グランザイムＢまたはグランザイムＡ）、もしくはグラニュライシンの１つまたは複数を発現してもよい。幾つかの実施形態において、活性化Ｔ細胞は、非活性化Ｔ細胞が特異的ＴＣＲを含むペプチドを用いた刺激後の非活性化Ｔ細胞による発現と比べて、活性化Ｔ細胞が特異的ＴＣＲを含むペプチドを用いた刺激後に、より高レベルのパーフォリン、グランザイム（例えば、グランザイムＢまたはグランザイムＡ）、もしくはグラニュライシンの１つまたは複数を発現してもよい。
【００５１】
幾つかの実施形態において、活性化Ｔ細胞は、非活性化Ｔ細胞による発現と比べて、より高レベルのＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１３、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの１つまたは複数を発現してもよい。
【００５２】
幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞が特異的であるウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞に対して活性化Ｔ細胞によって示される細胞障害性と比べて、非活性化Ｔ細胞が特異的であるウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞に対する細胞障害活性の低減を示し得る。幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞は、非活性化Ｔ細胞が特異的であるウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞に対して細胞障害活性を示さなくてもよい。
【００５３】
幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞の細胞分裂の速度と比べて、より遅い速度の細胞分裂を有し得る（即ち、細胞は、単位時間当たりより少ない細胞分裂を受け得る）。所定の細胞／集団の細胞分裂の速度は、例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれるＦｕｌｃｈｅｒおよびＷｏｎｇ、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ（１９９９年）７７巻（６）：５５９〜５６４頁に記載されるように、例えば、３Ｈ−チミジンの取込みのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分析またはＣＦＳＥ希釈アッセイによって分析することができる。
【００５４】
本明細書中で使用する場合、「細胞障害性」は、Ｔ細胞が特異的であるウイルスに感染したか、もしくはウイルスのペプチドを含み、および／またはウイルスのペプチドを提示する細胞の細胞死あるいは細胞死の誘導を指す。所定のＴ細胞またはＴ細胞の集団の細胞障害活性は、当業者に周知の適切な手段によって、例えば、Ｔ細胞またはＴ細胞の集団を、ウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞と接触させた後に細胞溶解のマーカーのレベルを測定することによって測定することができる。幾つかの実施形態において、細胞障害性は、本明細書中に記載するように、ウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞に関するものである。
【００５５】
特定の実施形態において、非活性化Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞は、下記特色の１つまたは複数を参照することによって識別され得る：
ａ）ＣＤ４５ＲＡｈｉｇｈ、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ表現型を有する非活性化Ｔ細胞；
ｂ）ＣＤ４５ＲＡｌｏｗ、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ表現型を有する活性化Ｔ細胞；
ｃ）Ｔ細胞が特異的ＴＣＲを含むペプチドを用いた刺激に応答して、パーフォリンおよび／またはグランザイムの発現（例えば、遺伝子またはタンパク質発現）の増加を示さない非活性化Ｔ細胞；
ｄ）Ｔ細胞が特異的ＴＣＲを含むペプチドを用いた刺激に応答して、パーフォリンおよび／またはグランザイムの発現（例えば、遺伝子またはタンパク質発現）の増加を示す活性化Ｔ細胞；
ｅ）例えばフローサイトメトリーによって決定されるように、活性化Ｔ細胞の細胞表面での発現と比較した場合の、非活性化Ｔ細胞の細胞表面でのＣＤ４５ＲＡのより高レベルの発現；
ｆ）例えば遺伝子またはタンパク質発現によって決定されるように、活性化Ｔ細胞が特異的ＴＣＲを含むペプチドを用いた刺激後の活性化Ｔ細胞による発現と比較した場合の、非活性化Ｔ細胞が特異的ＴＣＲを含むペプチドを用いた刺激後の非活性化Ｔ細胞によるパーフォリンおよび／またはグランザイムのより低レベルの発現；
ｇ）例えば遺伝子またはタンパク質発現によって（例えば、ＥＬＩＳＡによって）決定されるように、活性化Ｔ細胞による発現と比較した場合の、非活性化Ｔ細胞によるＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１３、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βの１つまたは複数のより低レベルの発現；
ｈ）活性化Ｔ細胞に関する細胞分裂の速度と比較した場合の、非活性化Ｔ細胞に関する細胞分裂のより遅い速度；
ｉ）例えば細胞障害性に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイにおいて決定されるように、活性化Ｔ細胞と比較した場合の、非活性化Ｔ細胞に関する、Ｔ細胞が特異的ＴＣＲを含むウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞に対するより低レベルの細胞障害性。
【００５６】
本開示によれば、非活性化Ｔ細胞および／または活性化Ｔ細胞は、例えば、ウイルスに特異的なＴＣＲを発現するか、もしくは含むための改変前または後に特性決定され得る。
【００５７】
幾つかの実施形態において、かかる比較の目的での活性化Ｔ細胞および非活性化Ｔ細胞は、例えば本明細書中に記載するように、それらの非活性化／活性化状態を除いて同じであり得る。幾つかの実施形態において、非活性化Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞は、同じＴＣＲを含むか、または発現する。幾つかの実施形態において、活性化Ｔ細胞は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏで、活性化により非活性化Ｔ細胞から得られる。
【００５８】
Ｔ細胞によるマーカーの発現は、当業者に周知の様々な方法によって決定することができる。本明細書中で使用する場合、「発現」は、遺伝子発現またはタンパク質発現を指し得る。遺伝子発現は、当業者に周知の様々な手段によって測定することができる。例えば、所定の遺伝子の発現は、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により、またはレポーターベースの方法により、ｍＲＮＡのレベルを測定することによって測定することができる。同様に、タンパク質発現は、当該技術分野で周知の様々な方法、例えば抗体ベースの方法によって、例えば、ウェスタンブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ等によって測定することができる。発現はまた、レポーターベースの方法によって測定することができる。
【００５９】
例えば、細胞表面マーカーの発現は、細胞を、目的のマーカーに特異的に結合することが可能な薬剤（例えば、抗体）と接触させることによって、および薬剤の、細胞への結合を検出することによって、例えばフローサイトメトリーによる分析によって、分析することができる。細胞の活性は、例えば、目的の活性に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイを使用して分析することができる。
【００６０】
本開示によれば、発現または活性に関する読み取りは、細胞または試料間で比較されてもよく、あるいは参照値と比較されてもよい。例えば、レベルは、非活性化Ｔ細胞と、活性化Ｔ細胞との間で比較され得る。幾つかの実施形態において、発現／活性のレベルは、個々の細胞に関して、または細胞の集団に関して算出される。幾つかの実施形態において、発現／活性のレベルは、細胞または細胞の集団の平均値、例えば、発現／活性の平均またはメジアンレベルである。
【００６１】
幾つかの実施形態において、別の細胞に対して、所定の遺伝子もしくはタンパク質の低減された／より低レベルの発現を有するか、または低減された／より低レベルの所定の活性を有する細胞は、参照細胞による発現／活性のレベルの１００％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満である発現／活性のレベルを有し得る。
【００６２】
幾つかの実施形態において、別の細胞に対して、所定の遺伝子もしくはタンパク質の増加された／より高レベルの発現を有するか、または増加された／より高レベルの所定の活性を有する細胞は、参照細胞による発現／活性のレベルの１倍を上回る、１．１倍を上回る、１．２倍を上回る、１．３倍を上回る、１．４倍を上回る、１．５倍を上回る、１．６倍を上回る、１．７倍を上回る、１．８倍を上回る、１．９倍を上回る、２倍を上回る、２．１倍を上回る、２．２倍を上回る、２．２倍を上回る、２．３倍を上回る、２．４倍を上回る、２．５倍を上回る、２．６倍を上回る、２．７倍を上回る、２．８倍を上回る、２．９倍を上回る、３倍を上回る、３．１倍を上回る、３．２倍を上回る、３．３倍を上回る、３．４倍を上回る、３．５倍を上回る、３．６倍を上回る、３．７倍を上回る、３．８倍を上回る、３．９倍を上回る、４倍を上回る、４．１倍を上回る、４．２倍を上回る、４．３倍を上回る、４．４倍を上回る、４．５倍を上回る、４．６倍を上回る、４．７倍を上回る、４．８倍を上回る、４．９倍を上回る、または５倍を上回るレベルを有する。
【００６３】
上記表現型マーカーの他に、Ｔ細胞は、Ｔ細胞に関する１つまたは複数のマーカーの検出に基づいて、他の細胞（例えば、他のリンパ球および／または白血球）と識別され得る。Ｔ細胞マーカーとして、ＣＤ３ポリペプチド（例えば、ＣＤ３γＣＤ３εＣＤ３ζまたはＣＤ３δ）、ＴＣＲポリペプチド（ＴＣＲαまたはＴＣＲβ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４およびＣＤ８が挙げられる。
【００６４】
ウイルス特異性
本発明は特に、ウイルス特異的Ｔ細胞、即ち、ウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞に対して反応性のＴ細胞に関する。
【００６５】
本発明によるウイルス特異的Ｔ細胞は、Ｔ細胞が特異的であるウイルスから得られるペプチドを提示するＭＨＣ分子に結合することが可能なＴＣＲを含む。
【００６６】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、通常α−鎖およびβ−鎖を含むヘテロ二量体抗原結合性分子である。実際には、α−鎖およびβ−鎖は、インバリアントＣＤ３鎖との複合体としてＴ細胞の細胞表面で発現される（αβＴ細胞）。γおよびδ鎖を含む代替的ＴＣＲは、Ｔ細胞のサブセット上で発現される（γδＴ細胞）。ＴＣＲは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される抗原ペプチドを認識する（に結合する）。ＴＣＲ構造およびペプチド−ＭＨＣ複合体の認識は、例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれるＩｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ｊａｎｅｗａｙ  ＣＡ  Ｊｒ、Ｔｒａｖｅｒｓ  Ｐ、Ｗａｌｐｏｒｔ  Ｍら  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００１年）、チャプター３および６に詳述される。
【００６７】
ウイルスから得られるペプチドは、ビリオンから得られ得るか、またはウイルス由来の核酸によってコードされ得る。本明細書中で使用する場合、「ペプチド」は、ペプチド結合によって連結される２つまたはそれ以上のアミノ酸モノマーの鎖を指す。幾つかの実施形態において、ペプチドは、５０アミノ酸長またはそれよりも少ない長さであり得る。幾つかの実施形態において、ペプチドは、５〜１５、５〜１４、５〜１３、５〜１２、５〜１１、５〜１０、５〜９または５〜８アミノ酸長の１つである。幾つかの実施形態において、ペプチドは、５〜１５、６〜１５、７〜１５、８〜１５、９〜１５、１０〜１５、１１〜１５または１２〜１５アミノ酸長の１つである。幾つかの実施形態において、ペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸長の１つである。
【００６８】
ペプチドは、ＭＨＣ分子、例えばＭＨＣクラスＩ分子によって提示される。ＭＨＣクラスＩ分子は、α−鎖およびβ２−ミクログロブリンのヘテロ二量体である。α−鎖は、α１、α２およびα３と称される３つのドメインを有する。α１およびα２ドメインは一緒に、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるペプチドが結合する溝を形成して、ペプチド−ＭＨＣ複合体を形成する。ＭＨＣクラスＩα−鎖は多型であり、種々のα−鎖が、種々のペプチドを結合および提示することが可能である。ヒトにおいて、ＭＨＣクラスＩα−鎖は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子によってコードされる。
【００６９】
本開示によるＴ細胞のＴＣＲは、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるウイルスペプチドから得られるペプチドに結合することが可能である。
【００７０】
本発明によるウイルスは限定されず、任意のウイルスであり得る。ウイルスは、ｄｓＤＮＡウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）、ｓｓＲＮＡウイルス（例えば、パルボウイルス）、ｄｓＲＮＡウイルス（例えば、レオウイルス）、（＋）ｓｓＲＮＡウイルス（例えば、ピコルナウイルス、トガウイルス）、（−）ｓｓＲＮＡウイルス（例えば、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス）、ｓｓＲＮＡ−ＲＴウイルス（例えば、レトロウイルス）またはｄｓＤＮＡ−ＲＴウイルス（例えば、ヘパドナウイルス）であり得る。
【００７１】
特に、本開示は、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、パピローマウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、ヘパドナウイルス科、パルボウイルス科、アストロウイルス科、カリシウイルス科、ピコルナウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、トガウイルス科、ヘペウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科およびレオウイルス科のウイルスを意図する。
【００７２】
疾患または障害と関連付けられるウイルスは、特に興味深い。したがって、下記のウイルスは、本発明に関連して意図される：アデノウイルス、単純ヘルペス１型ウイルス、単純ヘルペス２型ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒトパピローマウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、天然痘、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルスＢ１９、ヒトアストロウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、ＴＢＥウイルス、風疹ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ハンタンウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、コルティウイルス、およびバンナウイルス。
【００７３】
特定の実施形態において、ウイルスは、肝炎ウイルス、例えば、Ｂ型肝炎ウイルスであり得る。
【００７４】
幾つかの実施形態において、ウイルスは、ウイルスに感染した細胞に対して直接的に細胞変性的ではないウイルスであってもよい。
【００７５】
本発明によるＴ細胞が反応性である細胞は、ウイルスに感染した細胞であってもよく、またはウイルスのペプチドを含むか、もしくは発現する細胞であってもよい。ウイルスに感染したか、またはウイルスを含むか、もしくは発現する細胞は、細胞表面で、ＭＨＣクラスＩ分子の状況でウイルスのペプチドを提示し得る。
【００７６】
ウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞は、Ｔ細胞のＴＣＲが特異的であるウイルスのペプチドを提示することが可能なＭＨＣクラスＩ分子をコードするＨＬＡ対立遺伝子を含み得る。幾つかの実施形態において、ウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞は、Ｔ細胞のＴＣＲによって認識されるウイルスペプチドに関してＨＬＡ適合され得る。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔ細胞のＴＣＲによって認識されるウイルスペプチドに関してＨＬＡ適合されるドナーから得られる。
【００７７】
幾つかの実施形態において、細胞は、ウイルスに感染している結果として、ウイルスのペプチドを発現し得るか、または含み得る。幾つかの実施形態において、細胞は、ウイルスのペプチドを含むか、または発現するように改変されていてもよい。例えば、幾つかの実施形態において、細胞は、ウイルスのペプチドをコードする核酸を含むように改変されていてもよく、またはウイルスのペプチドでパルス化されていてもよい。
【００７８】
特定の実施形態において、本発明によるＴ細胞は、「ｅｎｖ」として公知のウイルスエンベロープタンパク質をコードするＨＢＶの核酸領域によってコードされるポリペプチドのペプチドを認識することが可能なＴＣＲを含み得る。本明細書中で、ｅｎｖ領域によってコードされるＨＢＶポリペプチドは、「Ｅｎｖポリペプチド」と称される。幾つかの実施形態において、本発明によるＴＣＲまたはＴ細胞によって認識されるペプチドは、ＨＢＶ  Ｅｎｖポリペプチドの１７１〜１８０位にあるアミノ酸を含むアミノ酸の配列を含み、ここで、Ｅｎｖの残基は、ＨＢＶ遺伝子型Ｂ由来のＥｎｖに関連して番号を付される。幾つかの実施形態において、ペプチドは、ＨＢＶ  Ｅｎｖポリペプチドの１７１〜１８０位を含むアミノ酸の配列ＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡ（配列番号１）もしくはＬＬＧＰＬＬＶＬＱＡ（配列番号２）、またはアミノ酸配列において１つもしくは２つもしくは３つのアミノ酸置換を有するそれらの変異体を含むか、あるいはそれらの変異体で構成される。幾つかの実施形態において、ペプチドは、アミノ酸配列の一方または両方の末端で、１、２、３、４、５つのアミノ酸をさらに含む。幾つかの実施形態において、ペプチドは、アミノ酸配列の一方または両方の末端で、１〜２、１〜３、１〜４、または１〜５つのアミノ酸をさらに含む。
【００７９】
抗ウイルス活性
本発明によるＴ細胞は、抗ウイルスＴ細胞である。本明細書中で使用する場合、抗ウイルスＴ細胞は、ウイルスに対する抗ウイルス活性を保有する。
【００８０】
抗ウイルス活性は、本明細書中で使用する場合、ウイルス複製または機能の阻害を指す。特に、抗ウイルス活性は、ウイルスによる細胞への付着、ウイルスによる細胞への侵入、ウイルスタンパク質および／もしくはウイルス核酸の、細胞への放出、細胞内でのウイルスの複製、ウイルス粒子の構築、またはさらなる細胞の感染のための、細胞からのウイルス粒子の放出の１つまたは複数を低減あるいは阻害し得る。幾つかの実施形態において、本発明によるＴ細胞は、感染細胞におけるウイルスの複製を阻害／低減することが可能である。
【００８１】
幾つかの実施形態において、抗ウイルス活性は、ウイルス複製または機能の非細胞障害性（例えば、非細胞溶解性）阻害、即ち、感染細胞の細胞死（例えば、細胞溶解）を引き起こさないウイルス複製または機能の阻害を指す。
【００８２】
本明細書中で使用する場合、ウイルス複製は、ウイルスに感染した細胞におけるウイルス粒子の形成を指す。特定の処置によるウイルス複製阻害は、当業者に公知の方法によって、例えばかかる処置の非存在下での、または対照処置後のウイルスの量と比較した場合の、特定の処置後のウイルスに感染した細胞における低減量のウイルスの検出によって決定することができる。
【００８３】
本開示によれば、Ｔ細胞の、ウイルス複製を阻害する能力は、本発明によるＴ細胞への曝露の非存在下での培養後のウイルスに感染した細胞におけるウイルスの量と比較した場合の、Ｔ細胞の存在下での培養後のウイルスに感染した細胞における低減量のウイルスの検出によって決定することができる。ウイルス特異的Ｔ細胞の、ウイルス複製を阻害する能力は、本発明によるＴ細胞への曝露の非存在下での培養後の、またはウイルスに特異的ではないＴ細胞の存在下での培養後のウイルスに感染した細胞におけるウイルスの量と比較した場合の、ウイルス特異的Ｔ細胞の存在下での培養後のウイルスに感染した細胞における低減量のウイルスの検出によって決定することができる。
【００８４】
ウイルス複製阻害は、ウイルス感染した細胞またはその多数、ウイルスに感染した１つ以上の細胞を含む試料、またはウイルスに感染した対象から得られる試料において決定され得る。
【００８５】
所定の細胞、細胞の集団または試料の量は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＡｌｂｅｒｔｏｎｉら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｎｆｅｃ  Ｄｉｓ（２０１４年）２５巻：１４５〜１４９頁において概説されるものなどの、当業者に周知の方法によって定量化することができる。ウイルスの量は、ウイルス負荷として算出され得る。方法として、ウイルス核酸用の定量的ＰＣＲおよび／またはＲＴ−ＰＣＲ、プラークアッセイ、フォーカス形成アッセイ、エンドポイント希釈アッセイによる分析、ならびに抗体ベースの方法（例えば、ウェスタンブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ）またはレポーターベースの方法などのウイルスポリペプチド／ペプチドまたは活性の検出および定量化に関する方法が挙げられる。
【００８６】
幾つかの実施形態において、本発明によるＴ細胞は、参照細胞、例えば、ウイルスに特異的なＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞によって示される抗ウイルス活性の少なくとも１０％、２０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である抗ウイルス活性（例えば、ウイルス複製の阻害）を示す。
【００８７】
幾つかの実施形態において、本発明によるＴ細胞の抗ウイルス活性は、参照細胞、例えば、ウイルスに特異的なＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞と比較した場合の、Ｔ細胞が特異的であるウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞に関して分析される。幾つかの実施形態において、参照細胞は、本発明によるＴ細胞のＴＣＲと同じであるＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞である。幾つかの実施形態において、参照細胞は、例えば本明細書中に記載するように、参照Ｔ細胞が活性化された表現型を有すること以外は、本発明によるＴ細胞と同じである。幾つかの実施形態において、抗ウイルス活性は、本明細書中に記載するように、ウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞に関して分析される。
【００８８】
特定の実施形態において、本発明によるＴ細胞は、ウイルスに感染した細胞におけるウイルスの複製を、細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変されていない、ウイルスに特異的なＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞によるウイルス複製阻害の少なくとも１０％、２０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％に阻害することが可能である。幾つかの実施形態において、相対的な阻害は、少なくとも５０％である。幾つかの実施形態において、相対的な阻害は、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の１つである。
【００８９】
ウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞に対して細胞障害性の低減を示すウイルスに特異的なＴＣＲを含むＴ細胞が、ウイルスに特異的なＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞と比べて、相当な抗ウイルス活性を保持することは、特に驚くべき発見である。
【００９０】
幾つかの実施形態において、抗ウイルス活性は、ＬＴβＲ依存性であり得る。幾つかの実施形態において、抗ウイルス活性は、ＬＴβＲによるシグナル伝達を含み得る。幾つかの実施形態において、抗ウイルス活性は、ＬＴβＲとＬＩＧＨＴとの間の相互作用、またはＬＴβＲとＬＴβとの間の相互作用を含み得る。幾つかの実施形態において、抗ウイルス活性は、ＬＴβＲ／ＬＩＧＨＴシグナル伝達、またはＬＴβＲ／ＬＴβシグナル伝達を含み得る。幾つかの実施形態において、抗ウイルス活性は、ウイルスＤＮＡの分解を含み得る。
【００９１】
Ｔ細胞により示される抗ウイルス活性のメカニズムは、例えば、本出願の実施例に記載するように研究され得る。
【００９２】
細胞障害性
本発明によるＴ細胞は、参照細胞と比べて、細胞障害性の低減を示す。
【００９３】
本明細書中で使用する場合、細胞障害性は、別の細胞、例えば、例えばウイルス感染の結果としてウイルスペプチドもしくは核酸を含むか、または発現する細胞において細胞死をもたらす、Ｔ細胞の能力を指す。
【００９４】
Ｔ細胞は、パーフォリン、グランザイム（例えば、グランザイムＢまたはグランザイムＡ）、グラニュライシンを含む細胞障害性因子を放出することによって、および／またはＴ細胞上で発現されるＦＡＳＬにより感染細胞上のＦＡＳを連結することにより感染細胞のアポトーシスを誘導することによって、ウイルスに感染した細胞において細胞死をもたらすことが可能である（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｈａｖｅｚ−Ｇａｌａｎら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００９年）６巻（１）：１５〜２５頁に記載される）。
【００９５】
所定の標的細胞（即ち、ＨＢＶに感染したか、またはＨＢＶペプチドを含むか、もしくは発現する細胞）に対するＴ細胞の細胞障害性は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＺａｒｉｔｓｋａｙａら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  （２０１１年）、９巻（６）：６０１〜６１６頁において概説される方法にいずれかを使用して研究され得る。標的細胞に対するＴ細胞の細胞障害性に関するアッセイの一例は、５１Ｃｒ放出アッセイであり、ここでは、標的細胞は、それらが内部移行する５１Ｃｒで処置される。Ｔ細胞による標的細胞の溶解は、放射性５１Ｃｒの、細胞培養上清への放出をもたらし、それを検出することができる。
【００９６】
他の方法は、細胞損傷のマーカーの検出を含み得る。例えば、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）レベルは、例えば肝臓細胞の損傷の尺度として検出され得る。本発明によれば、ウイルスに感染した肝臓細胞に対する所定のＴ細胞の細胞障害性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、感染細胞をＴ細胞とともにインキュベートすることによって、続いて、ＡＳＴのレベルを検出することによって決定することができる。また、細胞障害性は、本明細書中の実施例に記載するように、細胞のイメージングによって、例えば静的またはライブイメージングによって分析することができる。
【００９７】
幾つかの実施形態において、本発明によるＴ細胞は、参照細胞、例えば、ウイルスに特異的なＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞と比べて、Ｔ細胞が特異的であるウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞に対して細胞障害性の低減を示す。幾つかの実施形態において、参照細胞は、本発明によるＴ細胞のＴＣＲと同じであるＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞である。幾つかの実施形態において、参照細胞は、例えば本明細書中に記載するように、参照Ｔ細胞が活性化された表現型を有すること以外は、本発明によるＴ細胞と同じである。幾つかの実施形態において、細胞障害性は、本明細書中に記載するように、ウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞に関して分析される。参照活性化Ｔ細胞は、１つまたは複数の細胞障害性因子の発現の低減のために改変されていないことが理解されよう。
【００９８】
幾つかの実施形態において、本発明によるＴ細胞は、匹敵するアッセイにおける参照細胞によって示される細胞障害性の１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％、または１％未満である細胞障害性を示す。
【００９９】
特に、本発明の目的は、（ｉ）ウイルスに特異的な同じＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞によって示される抗ウイルス活性の少なくとも１０％、２０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である抗ウイルス活性（例えば、ウイルス複製の阻害）を示し、また（ｉｉ）匹敵するアッセイにおける、ウイルスに特異的な同じＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞によって示される細胞障害性の１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、２％、または１％未満である、ウイルスに感染した細胞に対する細胞障害性を示すウイルスに特異的なＴＣＲを含むＴ細胞を提供することである。
【０１００】
設計構築されたＴ細胞
様々な態様において、本発明は、天然に存在しない産物を提供する。かかる産物は、組換え、人工、非自然または人工産物として様々に称され得る。特に、本発明は外因性ＴＣＲ、核酸およびＴ細胞に関する。
【０１０１】
「外因性」は、本明細書中で使用する場合、一般的に内因性ではないことを意味する。細胞の状況において、外因性ＴＣＲは、例えば、外因性ＴＣＲをコードする核酸の、細胞への任意の導入前に、細胞の核酸によってコードされないＴＣＲを指し得る。外因性核酸は、例えば、核酸の、細胞への任意の導入前に、細胞中に存在しない核酸を指す。
【０１０２】
対象の状況において、外因性ＴＣＲは、ＴＣＲの、対象への任意の導入前に、対象中に存在しないか、または対象の核酸、例えばゲノムによってコードされないＴＣＲを指し得る。外因性核酸は、例えば、核酸の、対象への任意の導入前に、対象中に存在しない核酸を指す。外因性細胞は、例えば、細胞および／または核酸の、対象への任意の導入前に、対象中に存在しない細胞を指す。
【０１０３】
様々な態様に関連して、本発明は、ＴＣＲをコードする核酸を含む。幾つかの実施形態において、核酸は、例えば、他の核酸、もしくは天然に存在する生物学的材料から精製または単離される。幾つかの実施形態において、核酸は、（ａ）可変領域および定常領域を含むＴＣＲα−鎖をコードする核酸配列を含む。幾つかの実施形態において、核酸は、（ｂ）可変領域および定常領域を含むＴＣＲβ−鎖をコードする核酸配列を含む。幾つかの実施形態において、核酸は、（ａ）可変領域および定常領域を含むＴＣＲα−鎖をコードする核酸配列、および（ｂ）可変領域および定常領域を含むＴＣＲβ−鎖をコードする核酸配列を含む。
【０１０４】
融合タンパク質としてＴＣＲαおよびβ−鎖を発現することが望ましい場合がある。これは、例えば、各鎖に関して同様のレベルのタンパク質発現を達成するのに望ましい場合がある。したがって、幾つかの実施形態において、核酸は、（ｃ）リンカー配列をコードする核酸配列をさらに含む。「リンカー配列」は、本明細書中で使用する場合、発現されるペプチドまたはポリペプチド配列を連結するためのアミノ酸の配列を指す。本発明では、リンカー配列は、ＴＣＲαおよびβ−鎖を連結するためのものである。
【０１０５】
幾つかの実施形態において、融合タンパク質として発現されたＴＣＲαおよびβ−鎖を分離することが望ましい場合がある。幾つかの実施形態において、これは、ＴＣＲα−鎖とＴＣＲβ−鎖との間の融合タンパク質を切断することを提供することによって達成され得る。
【０１０６】
したがって、幾つかの実施形態において、リンカー配列は、切断可能なリンカーであり得る。即ち、リンカー配列は、切断されることが可能であるアミノ酸の配列を含み得る。例えば、リンカー配列は、ペプチド結合を切断することが可能な酵素に対する基質として作用することが可能な配列、即ち切断部位を含み得る。多くのかかる切断部位は、分子生物学の当業者に公知であり、彼らに用いられ得る。幾つかの実施形態において、切断可能なリンカーは、自己切断部位を含み得る。自己切断部位は、酵素による処置を必要とせずに、自動的に切断される。自己切断部位の例は、ピコルナウイルス由来の２Ａ配列「ＮＰＧＰ」であり、それは、「Ｇ／Ｐ」で切断される。この自己切断配列は、本明細書中では、「ピコルナウイルス２Ａ（Ｐ２Ａ）」と称する。Ｐ２Ａを含むリンカー配列は、本明細書中ではＰ２Ａリンカーと称する。
【０１０７】
ＴＣＲαおよびβ−鎖が、リンカー配列によって結合された単一ポリペプチドとして発現されることが望ましい場合、ＴＣＲαおよびβ−鎖ならびにリンカーをコードする核酸配列は、同じリーディングフレーム中に供給されなくてはならないことが理解されよう。
【０１０８】
本発明に関連して使用する核酸は、配列（ａ）および（ｂ）、ならびに任意で（ｃ）、特に核酸における配向性を含み得る。即ち、配列は、特定の順序で供給され得る。配列（ａ）および（ｂ）、ならびに任意で（ｃ）の特定の５’から３’への順序は、例えば、核酸／発現される産物の、転写、転写後プロセシング、翻訳、翻訳後プロセシング、フォールディング、会合、安定性、分解、輸送、および／または機能的特性に影響を与え得る。
【０１０９】
本発明による核酸の幾つかの実施形態において、配列（ａ）および（ｂ）は、５’から３’への配向性：５’−（ｂ）−（ａ）−３’で供給される。幾つかの実施形態において、配列（ａ）および（ｂ）は、５’から３’への配向性：５’−（ａ）−（ｂ）−３’で供給される。幾つかの実施形態において、配列（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、５’から３’への配向性：５’−（ｂ）−（ｃ）−（ａ）−３’で供給される。幾つかの実施形態において、配列（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、５’から３’への配向性：５’−（ａ）−（ｃ）−（ｂ）−３’で供給される。
【０１１０】
幾つかの実施形態において、核酸は、発現されるＴＣＲα−鎖とＴＣＲβ−鎖との間の会合を増加および／もしくは安定化するための１つまたは複数の構造的特色をコードする。幾つかの実施形態において、特色は、特定のアミノ酸またはアミノ酸の配列であり得る。幾つかの実施形態において、核酸は、ＴＣＲα−鎖とＴＣＲβ−鎖との間に１つまたは複数のジスルフィド結合を形成するための１つまたは複数の非自然システイン残基をコードし得る。幾つかの実施形態において、核酸は、ＴＣＲαおよび／またはβ−鎖の定常領域において１つまたは複数の非自然システイン残基をコードし得る。
【０１１１】
本発明の態様の実施形態は、本明細書中に記載するような核酸を含むベクターの使用を含む。
【０１１２】
「ベクター」は、本明細書中で使用する場合、外因性核酸を細胞に移入するためのビヒクルとして使用される核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）である。ベクターは、細胞における核酸の発現のための発現ベクターであり得る。かかるベクターは、発現されるべき配列をコードする核酸に作動可能に連結されるプロモーター配列を含み得る。また、ベクターは、終止コドンおよび発現エンハンサーを含み得る。当該技術分野において公知の任意の適切なベクター、プロモーター、エンハンサーおよび終止コドンを使用して、本開示によるベクターからポリペプチドを発現させてもよい。適切なベクターとして、例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれるＭａｕｓら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１４年）３２巻：１８９〜２２５頁に記載されるように、プラスミド、バイナリーベクター、ＤＮＡベクター、ｍＲＮＡベクター、ウイルスベクター（例えば、ガンマレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター）、トランスポゾンベースのベクター、および人工染色体（例えば、酵母人工染色体）が挙げられる。
【０１１３】
本発明による幾つかの実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、または単純ヘルペスウイルスベクターであり得る。
【０１１４】
本明細書において、「作動可能に連結される」という用語は、選択核酸配列および調節核酸配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）が、調節配列の影響または制御下でヌクレオチド配列の発現を配置する（それにより、発現カセットを形成する）ような方法で共有結合的に連結される状況を含み得る。したがって、調節配列が、核酸配列の転写を達成することが可能である場合、調節配列は、選択核酸配列に作動可能に連結される。次に、必要に応じて、得られた転写物は、所望のポリペプチドに翻訳され得る。
【０１１５】
本発明は、Ｔ細胞を産生する方法を提供する。幾つかの実施形態において、方法は、ヒトまたは動物の身体には行われない。幾つかの実施形態において、方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。幾つかの実施形態において、方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏで実施される。
【０１１６】
本発明によるＴ細胞を産生する方法は通常、１つよりも多いＴ細胞を産生するためのものであることが理解されよう。即ち、通常、方法は、通常、Ｔ細胞の集団または調製物を産生するためのものである。
【０１１７】
本発明によるＴ細胞を産生する方法は、Ｔ細胞を、ウイルスに特異的なＴＣＲを発現するか、または含むように改変することを含み得る。幾つかの実施形態において、改変は、本開示による核酸またはベクターを、Ｔ細胞に導入することを含み得る。幾つかの実施形態において、方法は、Ｔ細胞による核酸またはベクターの発現に適した条件下で、Ｔ細胞を培養することをさらに含む。
【０１１８】
幾つかの実施形態において、核酸またはベクターを導入することは、形質導入、例えば、レトロウイルス形質導入を含む。したがって、幾つかの実施形態において、単離核酸またはベクターは、ウイルスベクター中に含まれるか、またはベクターは、ウイルスベクターである。幾つかの実施形態において、方法は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｏｈら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（２０１３年）２巻、ｅ１１４に記載されるように、電気穿孔によって本発明による核酸またはベクターを導入することを含む。
【０１１９】
幾つかの実施形態において、改変は、非活性化Ｔ細胞の改変であってもよい。幾つかの実施形態において、ウイルスに特異的なＴＣＲを発現するか、または含むためのＴ細胞の改変は、改変されたＴ細胞の活性化を引き起こさない可能性がある。特定の実施形態において、方法は、非活性化Ｔ細胞を、ウイルスに特異的なＴＣＲを発現するか、または含むように改変することを含み、ここで、改変後に、Ｔ細胞は、非活性化表現型を保持し、および／または活性化表現型を有さない。非活性化および活性化Ｔ細胞表現型は、本明細書中に記載するように、特定の遺伝子および／もしくはタンパク質の発現を参照することによって、またはＴ細胞に関する特定の活性を参照することによって規定することができる。
【０１２０】
幾つかの実施形態において、改変は、核酸の有効な取込みおよび／または発現のために宿主細胞分裂を要さない方法によるものである。特定の実施形態において、Ｔ細胞（例えば、非活性化Ｔ細胞）の改変は、ｍＲＮＡ電気穿孔によるものである。Ｔ細胞は、例えば、本明細書中の実施例５に記載するように、ＴＣＲをコードする核酸を用いたｍＲＮＡ電気穿孔によって改変され得る。
【０１２１】
好適には、ｍＲＮＡ電気穿孔は、核酸の有効な取込みおよび／または発現のために細胞分裂を要さず、したがって、本明細書中に記載するようなＴＣＲをコードする核酸を、非活性化Ｔ細胞などのゆっくりと分裂中の細胞または分裂していない細胞に導入することが可能である。
【０１２２】
本発明によるＴ細胞を産生する方法は、Ｔ細胞を、細胞障害性因子の発現および／または活性の低減のために改変することを含み得る。
【０１２３】
幾つかの実施形態において、細胞障害性因子は、パーフォリン、グランザイム（例えば、グランザイムＢまたはグランザイムＡ）、グラニュライシン、もしくはＦＡＳＬの１つまたは複数である。幾つかの実施形態において、細胞障害性因子は、パーフォリンおよび／またはグランザイム（例えば、グランザイムＢまたはグランザイムＡ）である。細胞障害性因子の発現および／または活性の低減のためのＴ細胞の改変後に、改変Ｔ細胞は、参照細胞、例えば細胞障害性因子の発現および／または活性の低減のために改変されていない匹敵する細胞による発現／活性のレベルの１００％未満、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満である細胞障害性因子の発現および／または活性のレベルを示し得る。
【０１２４】
発現は、タンパク質または遺伝子発現であり得る。細胞障害性因子の遺伝子発現は、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により、またはレポーターベースの方法により、例えば、ｍＲＮＡのレベルを測定することによって決定することができる。タンパク質発現は、例えば、ウェスタンブロット、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ等によって、またはレポーターベースの方法によって測定することができる。細胞障害性因子の活性は、例えば、細胞障害性因子の活性に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイ、例えば上記で参照により組み込まれるＺａｒｉｔｓｋａｙａら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２０１１年）、９巻（６）：６０１〜６１６頁に記載されるアッセイを使用して分析される。
【０１２５】
幾つかの実施形態において、改変は、細胞障害性因子の発現および／または活性を低減することが可能な薬剤を用いた処置によるものであり得る。幾つかの実施形態において、薬剤は、転写、ｍＲＮＡプロセシング（例えば、スプライシング）、ｍＲＮＡ安定性、翻訳、翻訳後プロセシング、タンパク質安定性、タンパク質分解および／またはタンパク質機能／活性に影響を与えることによって、遺伝子もしくはタンパク質の発現および／または活性の低減を達成し得る。
【０１２６】
幾つかの実施形態において、薬剤は、細胞障害性因子のｍＲＮＡの量に影響を及ぼす薬剤であり得る。幾つかの実施形態において、薬剤は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって細胞障害性因子の発現の低減を引き起こし得る。幾つかの実施形態において、薬剤は、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡを含むが、これらに限定されないアンチセンスまたは低分子干渉ＲＮＡなどの阻害性核酸であってもよい。幾つかの実施形態において、阻害性核酸は、ベクターに供給される。例えば、幾つかの実施形態において、薬剤は、１つまたは複数の細胞障害性因子に関するｓｈＲＮＡをコードするレンチウイルスベクターであってもよい。
【０１２７】
幾つかの実施形態において、薬剤は、Ｔ細胞によって細胞障害性因子の遺伝子もしくはタンパク質の発現および／または活性を低減するように、Ｔ細胞のゲノムを変更させることが可能な薬剤であり得る。例えば、薬剤は、パーフォリン、グランザイム（例えば、グランザイムＢまたはグランザイムＡ）、グラニュライシン、もしくはＦＡＳＬをコードする遺伝子を破壊および／または不活性化することが可能であってもよく、ならびに／あるいはパーフォリン、グランザイム（例えば、グランザイムＢまたはグランザイムＡ）、グラニュライシン、もしくはＦＡＳＬの遺伝子またはタンパク質の発現および／または活性を低減することが可能な分子をコードする配列をコードするＤＮＡ配列を組み込んでもよい。
【０１２８】
幾つかの実施形態において、薬剤は、パーフォリン、グランザイム（例えば、グランザイムＢまたはグランザイムＡ）、グラニュライシン、またはＦＡＳＬタンパク質の阻害剤であってもよい。例えば、薬剤は、細胞障害性因子に結合して、その活性を阻害することが可能な分子であり得る。幾つかの実施形態において、薬剤は、パーフォリン、グランザイム（例えば、グランザイムＢまたはグランザイムＡ）、グラニュライシン、またはＦＡＳＬに対して誘導される抗体であり得る。幾つかの実施形態において、薬剤は、パーフォリン、グランザイム（例えば、グランザイムＢまたはグランザイムＡ）、グラニュライシン、またはＦＡＳＬ活性の競合阻害剤であり得る。
【０１２９】
本発明はまた、細胞障害性因子の発現および／または活性を低減するように改変されたＴ細胞を含む。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、細胞障害性因子の発現および／または活性を低減することが可能な薬剤で改変されている。また、細胞障害性因子の発現および／または活性を低減することが可能な薬剤を含有するＴ細胞も提供される。
【０１３０】
幾つかの実施形態において、本発明の様々な態様による薬剤で改変および／または処置されるＴ細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞である。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ３＋，ＣＤ８＋Ｔ細胞である。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ３＋，ＣＤ４＋Ｔ細胞である。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、非活性化Ｔ細胞である。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、活性化Ｔ細胞である。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、細胞障害性Ｔ細胞である。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔヘルパー細胞である。
【０１３１】
任意の適切なＴ細胞が、本発明の方法に従って使用され得る。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、ドナーから得られてもよい。幾つかの実施形態において、ドナーは、ウイルス、細菌もしくは真菌感染またはがんなどの疾患状態を患い得るか、またはその危険性があり得る。幾つかの実施形態において、ドナーは、健常であってもよく、および／または疾患状態の特定の危険性がなくてもよい。
【０１３２】
幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔ細胞のＴＣＲが特異的であるウイルスのペプチドを提示することが可能なＭＨＣクラスＩ分子をコードするＨＬＡ対立遺伝子を含み得る。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔ細胞のＴＣＲによって認識されるウイルスペプチドに関してＨＬＡ適合性である。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔ細胞のＴＣＲによって認識されるウイルスペプチドに関してＨＬＡ適合性であるドナーから得られる。
【０１３３】
Ｔ細胞は、ドナー由来の適切な試料、例えば、脾臓もしくはリンパ節などのリンパ系組織由来、または血液もしくは腫瘍試料由来の試料から単離され得るか、または他のやり方で得られ得る。適切な単離技法は、当該技術分野で周知であり、例えば、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ：例えば、Ｒｈｅｉｎｈｅｒｚら（１９７９年）ＰＮＡＳ  ７６巻  ４０６１頁を参照）、細胞パニング（例えば、Ｌｕｍら（１９８２年）Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７２巻  １２２頁を参照）および抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用した単離（例えば、Ｇａｕｄｅｒｎａｃｋら  １９８６年  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９０巻  １７９頁を参照）が挙げられる。好都合なことに、Ｔ細胞サブセットは、細胞表面マーカーに対する抗体を使用して単離されてもよく、例えば、抗ＣＤ８抗体を使用して、ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離してもよく、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ４抗体を使用して単離されてもよい。例えば、試料は、抗体でコーティングされた磁気ビーズとともにインキュベートされてもよく、ビーズは、磁気分離を使用して単離されてもよい。
【０１３４】
幾つかの実施形態において、本発明の様々な態様による薬剤で改変および／または処置されるＴ細胞は、ドナー個体由来の細胞の試料中に含まれ得る。細胞の試料は、Ｔ細胞の他に、Ｂ細胞、樹状細胞およびマクロファージなどの他の細胞型を含む不均一試料であってもよい。
【０１３５】
幾つかの実施形態において、本明細書中に記載する方法は、Ｔ細胞を活性化することを含み得る。Ｔ細胞は、任意の利便性のよい技法によって活性化され得る。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＡＰＣの表面上でＭＨＣクラスＩ分子上に示されるペプチドなどの、Ｔ細胞のＴＣＲに対するアゴニストを用いた処置によって活性化され得る。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３および／またはＩＬ−２を用いて（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養によって）活性化され得る。
【０１３６】
様々な態様によれば、本発明の方法は、Ｔ細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで培養することを含み得る。本発明の方法は、Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することを含み得る。
【０１３７】
Ｔ細胞は、攪拌タンク発酵槽、エアリフト発酵槽、ローラーボトル、培養バッグまたは皿、および他のバイオリアクターを含む任意の適切な系において培養され得る。かかる系の使用は、当該技術分野で周知である。
Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養における使用に適した培養培地、特に、ＡＩＭ−Ｖ、Ｉｓｃｏｖｅｓ培地およびＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−ＧＩＢＣＯ）などの完全培地が利用可能である。培地は、血清、血清タンパク質および選択剤などの他の因子を補充してもよい。例えば、幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＡＩＭ−Ｖ＋２％ヒトＡＢ血清中で培養される。利便性がよく、細胞は、適切な培養培地中で、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下で３７℃にて培養される。
【０１３８】
本発明はまた、本発明によるＴ細胞を産生する方法によって得られるか、または得ることが可能なＴ細胞を提供する。
【０１３９】
医学的使用ならびに治療および予防の方法
本発明によるＴ細胞は、治療的および予防的方法における使用を見出す。本発明は、本発明によるＴ細胞および薬学的に許容される担体、佐剤、賦形剤、または希釈剤を含む医薬組成物を含む。
【０１４０】
本発明の治療的および予防的方法は通常、本発明による１つよりも多いＴ細胞の投与／使用を含むことが理解されよう。即ち、本発明の治療的および予防的方法は通常、本発明によるＴ細胞の集団または調製物の投与／使用を含む。
【０１４１】
一態様において、本発明は、疾患もしくは障害を治療または防止する方法における使用のための、本発明によるＴ細胞または医薬組成物を提供する。
【０１４２】
別の態様において、本発明は、疾患もしくは障害を治療または防止する方法における使用のための薬剤の製造における使用のための、本発明によるＴ細胞または医薬組成物の使用を提供する。
【０１４３】
別の態様において、本発明は、疾患もしくは障害を治療または防止する方法であって、対象に、治療上または予防上有効量の本発明によるＴ細胞または医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１４４】
特に、本発明によるＴ細胞または医薬組成物は、ウイルス感染、またはウイルス感染が危険因子である疾患もしくは障害によって引き起こされるか、または悪化される疾患を防止または治療するための使用を見出す。
【０１４５】
本発明に従って治療もしくは防止されるべき疾患または障害は、Ｔ細胞および／またはそのＴＣＲの特異性に基づいて選択される。
【０１４６】
本発明に従って治療もしくは防止されるべき疾患または障害は、ウイルス感染によって引き起こされるか、もしくは悪化される疾患または障害から選択され得る。本明細書中で、ウイルス感染は、ｄｓＤＮＡウイルス（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス）、ｓｓＲＮＡウイルス（例えば、パルボウイルス）、ｄｓＲＮＡウイルス（例えば、レオウイルス）、（＋）ｓｓＲＮＡウイルス（例えば、ピコルナウイルス、トガウイルス）、（−）ｓｓＲＮＡウイルス（例えば、オルソミクソウイルス、ラブドウイルス）、ｓｓＲＮＡ−ＲＴウイルス（例えば、レトロウイルス）、ｄｓＤＮＡ−ＲＴウイルス（例えば、ヘパドナウイルス）、アデノウイルス科、ヘルペスウイルス科、パピローマウイルス科、ポリオーマウイルス科、ポックスウイルス科、ヘパドナウイルス科、パルボウイルス科、アストロウイルス科、カリシウイルス科、ピコルナウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、トガウイルス科、ヘペウイルス科、レトロウイルス科、オルトミクソウイルス科、アレナウイルス科、ブニヤウイルス科、フィロウイルス科、パラミクソウイルス科、ラブドウイルス科またはレオウイルス科の成員、単純ヘルペス１型ウイルス、単純ヘルペス２型ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒトパピローマウイルス、ＢＫウイルス、ＪＣウイルス、天然痘、Ｂ型肝炎ウイルス（遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩまたはＪ）、パルボウイルスＢ１９、ヒトアストロウイルス、ノーウォークウイルス、コクサッキーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、ＴＢＥウイルス、風疹ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス、ハンタンウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、狂犬病ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、コルティウイルス、もしくはバンナウイルスによる感染、またはかかるウイルスによる感染が危険因子である疾患もしくは障害であり得る。
【０１４７】
例えば、本発明によるＴ細胞が、Ｂ型肝炎ウイルスに特異的なＴＣＲを含む場合、本発明によるＴ細胞または医薬組成物は、ＨＢＶ感染によって引き起こされるか、もしくは悪化される疾患または障害、あるいはＨＢＶ感染が危険因子である疾患または障害を防止あるいは治療するための使用を見出す。ＨＢＶ感染によって引き起こされる／悪化される疾患および障害は、Ｌｉａｎｇ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００９年）、４９巻（５  Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１３〜Ｓ２１に記載されており、急性肝炎（劇症肝不全を含む）、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞がん（ＨＣＣ）などの肝臓がん、またはすい臓がんを含む。ＨＢＶ感染が危険因子である疾患および障害は、膜性糸球体腎炎（ＭＧＮ）などの壊死性血管炎およびネフロパシーを含む。
【０１４８】
本発明によるＴ細胞または医薬組成物の投与は、好ましくは、「治療上有効な」または「予防上有効な」量であり、これは、対象に対して有益性を示すのに十分である。投与される実際の量、ならびに投与の速度および時間的経過は、疾患または障害の性質ならびに重篤性に依存する。治療の指示、例えば投与量に関する決定等は、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、通常、治療されるべき疾患／障害、個々の対象の状態、送達の部位、投与の方法および開業医に公知の他の因子を考慮に入れる。上述の技法およびプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版、２０００年、ｐｕｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓにおいて見出すことができる。
【０１４９】
本発明の実施形態において、治療または予防の方法は、Ｔ細胞の養子移入を含んでもよい。養子Ｔ細胞移入は概して、通常Ｔ細胞が単離される血液試料を採取することによって、Ｔ細胞が対象から得られるプロセスを指す。続いて、Ｔ細胞は通常、何らかの方法で、同じ対象に対して、または異なる対象に対して、処置または変更される。治療は通常、特定の所望の特徴を有するＴ細胞集団を、対象に供給すること、または対象におけるかかる特徴を有するＴ細胞の頻度を増加させることを目的としている。ウイルス特異的Ｔ細胞の養子移入は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｏｂｂｏｌｄら（２００５年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２巻：３７９〜３８６頁およびＲｏｏｎｅｙら（１９９８年）、Ｂｌｏｏｄ  ９２巻：１５４９〜１５５５頁に記載される。
【０１５０】
本発明において、養子移入は、対象におけるウイルス特異的抗ウイルスＴ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞を導入するという、またはそれらの頻度を増加するという目的で実施される。
【０１５１】
したがって、一態様において、本発明は、対象における疾患もしくは障害を治療または防止する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの非活性化Ｔ細胞を対象から単離することと、
（ｂ）少なくとも１つの非活性化Ｔ細胞を、ウイルスに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するか、または含むように改変することと、
（ｃ）改変された少なくとも１つの非活性化Ｔ細胞を、対象に投与することと
を含み、改変された少なくとも１つの非活性化Ｔ細胞が、細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変されていない、ウイルスに特異的なＴＣＲを含む活性化Ｔ細胞と比べて、ウイルスに感染したか、またはウイルスのペプチドを含む細胞に対して細胞障害性の低減を示す、方法を提供する。
【０１５２】
別の態様において、本発明は、対象における疾患もしくは障害を治療または防止する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのＴ細胞を対象から単離することと、
（ｂ）少なくとも１つのＴ細胞を、ウイルスに特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するか、または含むように改変することであって、
（ｉ）Ｔ細胞が、細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変されるか、または
（ｉｉ）方法が、少なくとも１つのＴ細胞を、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変する、改変することと、
（ｃ）改変された少なくとも１つのＴ細胞を、対象に投与することと
を含む方法を提供する。
【０１５３】
別の態様において、本発明は、対象における疾患もしくは障害を治療または防止する方法であって、
（ａ）少なくとも１つのＴ細胞を対象から単離することと、
（ｂ）少なくとも１つのＴ細胞を、１つ以上の細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変することと、
（ｃ）改変された少なくとも１つのＴ細胞を、対象に投与することと
を含む方法を提供する。
【０１５４】
本発明によれば、「対象」は、任意の対象であり得る。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞が単離される対象は、改変されたＴ細胞を投与した対象である。即ち、幾つかの実施形態において、Ｔ細胞の供給源は、自己性であり得る。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞が単離される対象は、改変されたＴ細胞を投与した対象とは異なる対象であってもよい。即ち、幾つかの実施形態において、Ｔ細胞の供給源は、同種異系であり得る。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、外因性であり得る。幾つかの実施形態において、Ｔ細胞は、異種であり得る。
【０１５５】
本発明に従って改変される少なくとも１つのＴ細胞は例えば、例えばウイルスに特異的なＴＣＲを発現するか、もしくは含むように、および／または細胞障害性因子の発現もしくは活性の低減のために、本明細書中に記載する方法に従って改変することができる。改変は、移入された核酸の永続的または一過性の発現のために、核酸移入を含み得る。
【０１５６】
任意の適切な遺伝子操作プラットフォームを使用して、本発明に従ってＴ細胞を改変してもよい。Ｔ細胞を改変するのに適した方法は、例えば上記で参照により組み込まれるＭａｕｓら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２０１４年）３２巻：１８９〜２２５頁に記載されるように、ガンマレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ＤＮＡトランスフェクション、トランスポゾンベースの遺伝子送達およびＲＮＡトランスフェクションなどの遺伝子操作プラットフォームの使用を含む。
【０１５７】
幾つかの実施形態において、方法は、下記ステップの１つまたは複数を含み得る：血液試料を対象から採取するステップ、少なくとも１つのＴ細胞（例えば、少なくとも１つの非活性化Ｔ細胞）を血液試料と単離するステップ、少なくとも１つのＴ細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞培養で培養するステップ、少なくとも１つのＴ細胞を、ウイルスに特異的なＴＣＲを発現するか、または含むように改変するステップ、少なくとも１つのＴ細胞を、細胞障害性因子の発現または活性の低減のために改変するステップ、少なくとも１つのＴ細胞を収集するステップ、改変されたＴ細胞を、佐剤、希釈剤、または担体と混合するステップ、改変されたＴ細胞を対象に投与するステップ。
【０１５８】
本明細書中の方法の幾つかの実施形態において、方法は、任意でＩＬ−２の存在下で、例えばＣＤ３／ＣＤ２８による刺激によって、および／またはＴ細胞が特異的ＴＣＲを含むペプチド−ＭＨＣを提示するＡＰＣとの接触によって、Ｔ細胞を活性化するステップを含み得る。
【０１５９】
当業者は、例えば、その全体が参照により組み込まれるＱａｓｉｍら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２０１５年）６２巻：４８６〜４９１頁を参照することによって、本発明によるＴ細胞の養子移入に適した試薬および手順を決定することが可能である。
【０１６０】
少なくとも１つの改変されたＴ細胞は通常、細胞の集団として対象に投与される。幾つかの実施形態において、約１×１０４個、５×１０４個、１×１０５個、５×１０５個、１×１０６個、２×１０６個、５×１０６個、１×１０７個、２×１０７個、３×１０７個、４×１０７個、５×１０７個、６×１０７個、７×１０７個、８×１０７個、９×１０７個、１×１０８個、２×１０８個、３×１０８個、４×１０８個、５×１０８個、６×１０８個、７×１０８個、８×１０８個、９×１０８個、１×１０９個、２×１０９個、３×１０９個、４×１０９個、５×１０９個、６×１０９個、７×１０９個、８×１０９個、９×１０９個、または１×１０１０個の細胞の１つが、対象に投与される。
【０１６１】
幾つかの実施形態において、細胞の集団は、改変されたＴ細胞の集団である。幾つかの実施形態において、対象に投与される細胞の集団は、細胞の混合集団である。細胞の混合集団は、改変されたＴ細胞の他に、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、非改変Ｔ細胞および／または樹状細胞（ＤＣ）を含み得る。
【０１６２】
対象に投与される細胞の集団は、種々の比率のＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を有するＴ細胞集団を含み得る。例えば、幾つかの実施形態において、対象に投与されるＴ細胞集団は、ＣＤ８＋Ｔ細胞約１００％およびＣＤ４＋Ｔ細胞０％、ＣＤ８＋Ｔ細胞約９５％およびＣＤ４＋Ｔ細胞５％、ＣＤ８＋Ｔ細胞約９０％およびＣＤ４＋Ｔ細胞１０％、ＣＤ８＋Ｔ細胞約８５％およびＣＤ４＋Ｔ細胞１５％、ＣＤ８＋Ｔ細胞約８０％およびＣＤ４＋Ｔ細胞２０％、ＣＤ８＋Ｔ細胞約７０％およびＣＤ４＋Ｔ細胞３０％、ＣＤ８＋Ｔ細胞約６０％およびＣＤ４＋Ｔ細胞４０％、またはＣＤ８＋Ｔ細胞約５０％およびＣＤ４＋Ｔ細胞５０％を含み得る。
【０１６３】
投与は通常、細胞の集団の注入（例えば、静脈内注入）によるものである。細胞の集団は、注入による投与に適するように製剤化される。
【０１６４】
本発明による方法は、１回よりも多い投与を含んでもよい。即ち、幾つかの実施形態において、方法は、少なくとも１つの改変されたＴ細胞の、対象への多重投与を含んでもよい。
【０１６５】
本発明による実施形態において、対象は、好ましくはヒト対象である。幾つかの実施形態において、本明細書中の本発明の治療的または予防的方法に従って治療されるべき対象は、ＨＬＡ遺伝子型に基づいて選択される。幾つかの実施形態において、対象は、ＭＨＣクラスＩ分子の状況で、発明によるＴ細胞のＴＣＲが特異的であるウイルスのペプチドを提示することが可能であるＭＨＣクラスＩα−鎖をコードするＨＬＡ対立遺伝子を有する。
【０１６６】
本発明による実施形態において、ウイルス感染によって引き起こされるか、もしくは悪化される疾患または障害、あるいはウイルス感染が危険因子である疾患または障害の治療のために、対象は、かかる疾患／障害、例えばウイルス感染の特定のマーカーに関する特性決定に基づいて選択され得る。対象は、治療を要する疾患もしくは障害であると診断されていてもよく、またはかかる疾患もしくは障害を有する疑いがあってもよい。本発明による実施形態において、ウイルス感染によって引き起こされるか、もしくは悪化される疾患または障害、あるいはウイルス感染が危険因子である疾患または障害の防止のための本明細書中の予防的方法のために、対象は、ウイルス感染に対する特定の危険因子に関する特性決定に基づいて選択され得る。
【０１６７】
本発明の様々な態様による実施形態において、本発明に従って疾患もしくは障害を治療または防止することは、併用療法を含み得る。かかる実施形態において、本発明によるＴ細胞または医薬組成物は、さらなる介入を含む過程の一部として投与され得る。
【０１６８】
幾つかの実施形態において、方法は、ウイルス感染、あるいはウイルス感染によって引き起こされるか、もしくは悪化される疾患または障害の防止あるいは治療のための、例えば適切な薬剤の投与による介入を含む。予防的介入は、ワクチン接種を含み得る。
【０１６９】
適切な治療剤は、特定のウイルス感染に適切であるように当業者によって容易に同定され得る。適切な薬剤として、アバカビル、アシクロビル（ａｃｉｃｌｏｖｉｒ）、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、アデホビル、アマンタジン、アンプレナビル、アンプリゲン（ａｍｐｌｉｇｅｎ）、アルビドール（ａｒｂｉｄｏｌ）、アタザナビル、アトリプラ、バラビル（ｂａｌａｖｉｒ）、シドホビル、コンビビル、ドルテグラビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、エコリエベル（ｅｃｏｌｉｅｖｅｒ）、ファムシクロビル、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、融合阻害剤、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル（ｉｍｕｎｏｖｉｒ）、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インテグラーゼ阻害剤、インターフェロンＩＩＩ型、インターフェロンＩＩ型、インターフェロンＩｄ型、インターフェロン、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド（ｌｏｖｉｒｉｄｅ）、マラビロク、モロキシジン、メチサゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネキサビル（ｎｅｘａｖｉｒ）、ニタゾキサニド、ヌクレオシド類似体、ノビル（ｎｏｖｉｒ）、オセルタミビル（タミフル）、ＰＥＧ−インターフェロンアルファ−２ａ、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、プロテアーゼ阻害剤、ラルテグラビル、逆転写酵素阻害剤、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、ピラミジン（ｐｙｒａｍｉｄｉｎｅ）、サキナビル、ソホスブビル、スタブジン、相乗的エンハンサー、テラプレビル、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル（バルトレックス）、バルガンシクロビル、ビクリビロック、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル（リレンザ）、およびジドブジンから選択される１つまたは複数の抗ウイルス剤が挙げられる。
【０１７０】
例えば、Ｂ型肝炎ウイルスによる感染の場合、適切な薬剤として、慢性Ｂ型肝炎感染を有するヒトの防止、管理および治療に関するＷＨＯガイドラインである２０１５年３月のＩＳＢＮ  ９７８９２４１５４９０５９ならびにＡｌｂｅｒｔｉおよびＣａｐｏｒａｓｏ、Ｄｉｇ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ、２０１１年  ４３巻Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ５７〜６３に記載されるものが挙げられ、それらはともに、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に、本発明は、ラミブジン（エピビル）、アデホビル（ヘプセラ）、テノホビル（ビリアード）、テルビブジン（タイゼカ（ｔｙｚｅｋａ））およびエンテカビル（バラクルード）、ならびにそれらの組合せ、さらにはインターフェロンアルファ−２ａおよびペグ化インターフェロンアルファ−２ａなどの抗ウイルス剤の使用を意図する。
【０１７１】
幾つかの実施形態において、方法は、肝臓がん、例えば肝細胞がんなどのウイルス感染と関連付けられるがんの治療もしくは防止のための治療的または予防的介入を含む。
【０１７２】
患者の選定
本発明はまた、本発明による治療的または予防的処置に関して対象を同定する方法を提供する。
【０１７３】
一態様において、治療的または予防的処置に関して対象を同定する方法は、対象に関するＨＬＡ型を決定することを含む。ＨＬＡタイピングは、当業者に周知の様々な方法によって、例えばタイピングされるべきＨＬＡ遺伝子（単数または複数）を配列決定すること、およびＤＮＡ配列を、公知のＨＬＡ対立遺伝子に関する配列と比較することによって実施され得る。幾つかの実施形態において、本発明によるＴ細胞のＴＣＲによって認識されるウイルスのペプチドを提示することが可能なＭＨＣクラスＩ分子をコードするＨＬＡ対立遺伝子を有すると決定された対象は、本発明による治療的または予防的処置に適した対象であると同定される。
【０１７４】
一態様において、治療的または予防的処置に関して対象を同定する方法は、対象が、ウイルス感染に感染されているか、またはウイルス感染による感染の危険性があるかどうかを決定することを含む。ウイルス感染は、当業者に周知の、また個体から得られる試料におけるウイルス核酸および／またはタンパク質の検出に関する方法を含む様々な方法によって診断することができる。幾つかの実施形態において、本発明によるＴ細胞が特異的ＴＣＲを含むウイルスに感染されていると決定された対象は、本発明による治療的または予防的処置に適した対象であると同定される。
【０１７５】
組成物
本発明はまた、本発明によるＴ細胞を含む組成物を提供する。幾つかの実施形態において、組成物は、医薬組成物である。幾つかの実施形態において、組成物は、研究、治療法、予防法および／または診断への使用に適した組成物である。
【０１７６】
本発明による組成物は通常、本発明による１つよりも多いＴ細胞を含むことが理解されよう。即ち、組成物は通常、本発明によるＴ細胞の集団または調製物を含む。
【０１７７】
幾つかの実施形態において、本発明によるＴ細胞は好ましくは、薬学的に許容される担体、佐剤、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝液、防腐剤、酸化防止剤、潤滑剤、安定剤、可溶化剤、界面活性剤（例えば、湿潤剤）、マスキング剤、着色剤、香味剤および甘味剤を含むが、これらに限定されない当業者に周知の１つまたは複数の他の薬学的に許容される成分と一緒に、薬剤または医薬品として製剤化される。「薬学的に許容される」という用語は、本明細書中で使用する場合、正当な医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比に釣り合って、過剰な毒性、炎症、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに問題となる対象（例えば、ヒト）の組織と接触させる使用に適している化合物、成分、材料、組成物、投薬形態等に関する。また、担体、佐剤、賦形剤等はそれぞれ、製剤の他の成分と適合性であるという意味合いで「許容され」なければならない。適切な担体、佐剤、賦形剤等は、標準的な医薬品テキスト、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、１９９０年、およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第２版、１９９４年において見出すことができる。
【０１７８】
製剤は、薬学の技術分野で周知の任意の方法によって調製され得る。かかる方法は、活性な化合物を、１つまたは複数の付属成分を構成する担体と会合させるステップを含む。概して、製剤は、活性な化合物を、担体（例えば、液体担体、微粉化固体担体等）と一様にかつ緊密に会合させること、続いて必要に応じて産物を成型することによって調製される。
【０１７９】
製剤は、多数の経路による投与用に調製され得る。薬剤および組成物は、流体または固体（粉末を含む）形態で製剤化され得る。投与に関する経路は、局所、非経口、全身、静脈内、動脈内、筋内、髄腔内、眼内、皮下、経口、または経皮的であり得る。幾つかの実施形態において、投与は、注射を含み得る。注射用製剤は、滅菌または等張性媒体中に選択した薬剤を含み得る。
【０１８０】
本発明の一態様において、既定量の本発明によるＴ細胞または医薬組成物を含むキットオブパーツが提供される。幾つかの実施形態において、キットは、本明細書中に記載するような方法において、Ｔ細胞または医薬組成物を使用するための指示書を含み得る。例えば、幾つかの実施形態において、キットは、本明細書中に記載するような疾患もしくは障害を治療または防止するための、Ｔ細胞または医薬組成物の、患者への投与に関する指示書を含み得る。
【０１８１】
別の態様において、ＴＣＲをコードする核酸および細胞障害性因子の発現または活性を低減するための薬剤を含むキットオブパーツが提供される。幾つかの実施形態において、キットは、本明細書中に記載するような方法において、核酸および／または薬剤を使用するための指示書を含み得る。例えば、幾つかの実施形態において、キットは、核酸をＴ細胞に導入するための指示書および／またはＴ細胞を、細胞障害性因子の発現もしくは活性を低減するための薬剤で処置するための指示書を含み得る。
【０１８２】
幾つかの実施形態において、キットは、本発明による方法を実施するための他の材料および／または試薬をさらに含み得る。例えば、幾つかの実施形態において、キットは、核酸をＴ細胞に導入するための、および／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞を培養するための材料ならびに／あるいは試薬をさらに含んでもよい。
【０１８３】
本発明は、記載する態様および好ましい特色の組合せを含むが、但し、かかる組合せが、明らかに容認できないか、または明確に回避される場合を除く。
【０１８４】
本明細書中で使用する項の見出しは、単に体系化の目的のためであり、記載する主題を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１８５】
ここで、本発明の態様および実施形態を、例として、添付の図面を参照して説明する。さらなる態様および実施形態は、当業者にとって明らかである。この文章において言及された文書は全て、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８６】
併記の特許請求の範囲を含む本明細書全体にわたって、文脈が他の状況を求めない限りは、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語ならびに「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などという変形は、指定の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の包含を含意するが、任意の他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の排除を含意しないと理解されよう。
【０１８７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他の状況を明らかに指示しない限りは、複数形を含むことに留意しなくてはならない。範囲は、本明細書中では、「約」ある特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表され得る。かかる範囲が表される場合、別の実施形態は、ある特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、値が、先行している「約」を用いることで概算として表される場合、特定の値が、別の実施形態を形成することが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
ここで、本発明の原理を示す実施形態および実験は、添付の図面を参照して論述される：
【図１】Ｔ細胞でのＨＢＶ  ＴＣＲ発現を示すグラフ。（Ａ）ペンタマー染色によって測定される場合のＨＢＶ  ＴＣＲをコードするｍＲＮＡで電気穿孔した休止細胞および活性化Ｔ細胞でのＨＢＶ  ＴＣＲの発現を示す散布図。（Ｂ）電気穿孔後の経時的なＴＣＲの発現のレベルを示すグラフ。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。
【図２】ＨＢＶ  ＴＣＲ  ｍＲＮＡで電気穿孔したＴ細胞の表現型を示すグラフ。（Ａ）電気穿孔休止Ｔ細胞によるＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７およびＣＤ２８発現を示す散布図、および休止Ｔ細胞サブセットの中でもＣＤ８＋デキストラマー＋細胞の％を示すチャート。（Ｂ）電気穿孔活性化Ｔ細胞によるＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２７およびＣＤ２８発現を示す散布図、および活性化Ｔ細胞サブセットの中でもＣＤ８＋デキストラマー＋細胞の％を示すチャート。ＣＭ＝セントラルメモリー、ＥＭ＝エフェクターメモリー、ＴＥＭ＝ターミナルエフェクターメモリー。
【図３】ＨＢＶ  ＴＣＲ  ｍＲＮＡで電気穿孔したＴ細胞による細胞障害性因子の発現を示すグラフ。（Ａ）非刺激活性化電気穿孔Ｔ細胞と比較した場合の、ペプチドで刺激した電気穿孔活性化Ｔ細胞によるパーフォリンおよびグランザイムの発現を示すヒストグラム。（Ｂ）非刺激休止電気穿孔Ｔ細胞と比較した場合の、ペプチドで刺激した電気穿孔休止Ｔ細胞によるパーフォリンおよびグランザイムの発現を示すヒストグラム。（Ｃ）リンパ球の総数のグランザイムＢ＋ＣＤ８細胞のパーセントを示すチャート、（Ｄ）リンパ球の総数のパーフォリン＋ＣＤ８細胞のパーセントを示すチャート、および（Ｅ）ペプチド特異的刺激の５時間もしくは２４時間後の、または刺激の非存在下での（非刺激）、活性化電気穿孔Ｔ細胞および休止電気穿孔Ｔ細胞に関する、リンパ球の総数のＩＦＮ−γ＋ＣＤ８細胞のパーセントを示すチャート。
【図４】ＨＢＶ抗原を発現する細胞に対して、ＨＢＶ  ＴＣＲ  ｍＲＮＡで電気穿孔したＴ細胞の細胞障害性を示すグラフおよび棒グラフ。（Ａ）種々のエフェクター：標的細胞比での休止電気穿孔Ｔ細胞によるＨＢＶ抗原を発現する細胞の細胞死滅％を示すグラフ。（Ｂ）種々のエフェクター：標的細胞比での活性化電気穿孔Ｔ細胞によるＨＢＶ抗原を発現する細胞の細胞死滅％を示すグラフ。（Ｃ）活性化電気穿孔Ｔ細胞、休止電気穿孔Ｔ細胞、活性化非電気穿孔Ｔ細胞および休止非電気穿孔Ｔ細胞によるＨＢＶ  Ｅｎｖ抗原を発現する細胞の細胞死滅％を示す棒グラフ。
【図５】活性化電気穿孔Ｔ細胞、休止電気穿孔Ｔ細胞、活性化非電気穿孔Ｔ細胞および休止非電気穿孔Ｔ細胞による様々な可溶性因子の発現を示す画像および棒グラフ。
【図６】種々のエフェクター：標的細胞比でのＨＣＶレプリコン感染肝臓細胞に対するＴ細胞の抗ウイルス活性および細胞障害性を示すグラフ。バーは、発光の低減％によって決定される場合のウイルス複製阻害を示し、線は、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルによって決定される場合の細胞溶解を示す。（Ａ）休止電気穿孔Ｔ細胞および休止非電気穿孔Ｔ細胞。（Ｂ）活性化電気穿孔Ｔ細胞および活性化非電気穿孔Ｔ細胞。
【図７】エフェクター：標的比１：３でのＨＢＶウイルス感染肝臓細胞に対するＴ細胞の抗ウイルス活性および細胞障害性を示すグラフ。バーは、ＨＢＶ  ＤＮＡに関してｑＰＣＲによって決定される場合のウイルス複製阻害を示し、線は、アスパラギン酸トランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルによって決定される場合の細胞溶解を示す。
【図８】休止ＣＤ８＋Ｔ細胞に対するリンホトキシンＢまたはＬＩＧＨＴの発現を示す散布図。（Ａ）ＨＢＶ  ＴＣＲ陽性非刺激ＣＤ８＋Ｔ細胞での発現。（Ｂ）ＴＣＲ特異的ペプチドでパルス化された細胞を用いた刺激の２４時間および４８時間後のＨＢＶ  ＴＣＲ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞での発現。（Ｃ）ＣＤ３およびＣＤ２８による活性化の２４時間および４８時間後のＨＢＶ  ＴＣＲ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞での発現。（Ｄ）ＩＦＮ−γによる処置の２４時間後のＨＢＶ  ＴＣＲ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞での発現。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１８９】
本発明者らは、下記実施例において、ウイルス特異的Ｔ細胞の生成および特性決定について記載している。
【実施例１】
【０１９０】
細胞株
ＨｅｐＧ２−ＥｎｖおよびＨｅｐＧ２−Ｃｏｒｅ発現ルシフェラーゼ細胞株を、１０％熱失活ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、ＭｅＭアミノ酸、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＭｅＭ非必須アミノ酸を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で培養し、２μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を添加して、選択を維持した。Ｔ２細胞は、上述するように補充したＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。完全ＨＢＶゲノムを安定に発現し、また感染性ウイルスを産生するＨｅｐＧ２細胞（ＨｅｐＧ２．２．１５）を、１０％熱失活ＦＢＳ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．５ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、および１５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を補充したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中で培養した。ヒトのタウロコール酸ナトリウム共輸送性ポリペプチド（ｈＮＴＣＰ）を安定に発現するＨｅｐＧ２細胞を、１０％熱失活ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で培養して、５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加して、選択を維持した。ＨＬＡ−Ａ２を発現し、またルシフェラーゼをコードするＨＣＶレプリコンを保有するＨｕｈ７細胞を、１０％熱失活ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＭｅＭ非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で培養して、１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８および３μｇ／ｍｌのブラストサイジンＳ塩酸塩を添加して、選択を維持した。
【実施例２】
【０１９１】
Ｔ細胞
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、インフォームドコンセントの下で健常なドナーから収集した。活性化Ｔ細胞を産生するために、ＰＢＭＣを、ＡＩＭ−Ｖ＋２％ヒトＡＢ血清中で６００ＩＵ／ｍｌのインターロイキン２（ｒＩＬ−２、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて８日間刺激して、電気穿孔の前日に、ｒＩＬ−２を１０００ＩＵ／ｍｌに増加した。非活性化（休止）Ｔ細胞を、汎Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して単離して、電気穿孔前に１００ＩＵ／ｍｌのｒＩＬ−２中で一晩培養した。
【実施例３】
【０１９２】
フローサイトメトリー
細胞表面染色用の抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（抗ヒトＣＤ８−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ８−Ｖ５００、ＣＤ４５ＲＡ−ＡＰＣ、ＣＤ６２Ｌ−ＰＥＣｙ７）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（抗ヒトＣＤ４５ＲＯ−ｅＦｌｕｏｒ６５０）、Ｉｍｍｕｄｅｘ  ａｎｄ  Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ（ＨＬＡ−Ａ２０１−ＨＢｓ１８３−９１−ＰＥデキストラマーまたはペンタマー）、およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ヒトＬＴβ受容体−Ｆｃキメラ）から入手した。細胞内サイトカイン染色用の抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（抗ヒトＩＦＮ−γ−ＡＰＣ、ＴＮＦ−α−Ａｌｅｘａ４８８、ＩＬ−２−ＰＥ、グランザイム−ＡＰＣ）およびＤｉａｃｌｏｎｅ（抗ヒトパーフォリン−ＦＩＴＣ）から入手した。細胞内サイトカイン染色は、ｃｙｔｏｆｉｘ／ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、細胞を固定および透過処理することによって実施した。フローサイトメトリーは、ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏフローサイトメーターまたはＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して実施して、データは、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａプログラム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。
【実施例４】
【０１９３】
ＨＢＶエンベロープｓ１８３−１９１  ＴＣＲ  ｍＲＮＡの産生
ＨＢＶエンベロープｓ１８３−１９１  ＴＣＲ構築物（ＨＢＶ  ｓ１８３−ＴＣＲ）は、ｐＵＣ５７−ｓ１８３ｃｙｓ  ｂ２Ａａベクターから得られ、それをｐＶＡＸ１ベクターにサブクローニングした。プラスミドを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で増やして、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  Ｔｏｐ１０大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製し、ＱＩＡＧＥＮ  Ｅｎｄｏ  Ｆｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製し、Ｘｂａｌ制限酵素を使用して線状にした。線状ＤＮＡを使用して、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ７  Ｕｌｔｒａキット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）またはＴ７  ｍＳｃｒｉｐｔ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｍＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｌｌｓｃｒｉｐｔ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）を使用してＴＣＲ  ｍＲＮＡを産生し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを添加して、転写を開始して、ＲＮＡをＡｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）でキャップした。続いて、ポリ（Ａ）−尾部を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼおよびＡＴＰによって付加した。得られた産物を、塩化リチウム沈殿によって濃縮して、緩衝液中に再溶解した。
【実施例５】
【０１９４】
Ｔ細胞のｍＲＮＡ電気穿孔
４Ｄ−ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ系（Ｌｏｎｚａ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた電気穿孔に関して、１０×１０６個の上述するような活性化Ｔ細胞または非活性化（休止）Ｔ細胞を、補充した４０−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ１００μｌ中に室温で懸濁して、ＨＢＶ  ｓ１８３−ＴＣＲ  ｍＲＮＡを２００μｇ／ｍｌで添加した。混合物をヌクレオキュベット中に配置して、刺激または非刺激Ｔ細胞用のプログラムを使用して電気穿孔した。電気穿孔後、細胞を、ＡＩＭ−Ｖ  １０％  ヒトＡＢ血清＋１００ＩＵ／ｍｌ  ｒＩＬ−２中に再懸濁して、分析するまで３７℃および５％ＣＯ２で培養した。
【実施例６】
【０１９５】
ｍＲＮＡ電気穿孔Ｔ細胞の機能
ＨＬＡ−Ａ２＋Ｔ２細胞を、１μｇ／ｍｌのｓ１８３−１９１ペプチドを用いて１０６個の細胞／ｍｌで１時間パルス化した後、２回洗浄した。ＨＢＶ  ｓ１８３−ＴＣＲ  ｍＲＮＡ電気穿孔活性化（活性化ＥＰ）または非活性化（休止ＥＰ）Ｔ細胞を、ペプチド負荷Ｔ２細胞とともに、それぞれ、１０μｇ／ｍｌまたは２μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡの存在下で、５時間または一晩共培養し、ＣＤ８、ＩＦＮ−γ、グランザイムおよびパーフォリンに関して染色した。
【実施例７】
【０１９６】
細胞障害性アッセイ
ＨｅｐＧ２−ＣｏｒｅまたはＨｅｐＧ２−Ｅｎｖ発現ルシフェラーゼ細胞株を、９６ウェルのＲａｔ底プレート中に一晩蒔いて、付着させた。標的細胞を洗浄して、ＨＢＶ  ｓ１８３−ＴＣＲ  ｍＲＮＡ電気穿孔活性化または非活性化（休止）Ｔ細胞とともに、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で（エフェクターは、ＣＤ８＋ペンタマー＋細胞の頻度に基づいて算出される）、三重反復でＡＩＭ−Ｖ＋２％ヒトＡＢ血清中で２４時間、共培養した。細胞障害性は、残存する標的細胞におけるルシフェラーゼ発現を定量化することによって測定した。簡潔に述べると、培養培地を廃棄して、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｌ）１００μｌを各ウェルに添加して、５分間インキュベートして、細胞溶解させた。発光は、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定した。エフェクターを用いない標的細胞を、最大発光に関する参照として使用した。結果は、溶解％＝１００％−（溶解後に残存する発光／最大発光）％として表し、三重反復測定値の平均値＋／−標準偏差として算出した。
【実施例８】
【０１９７】
ｍＲＮＡ電気穿孔Ｔ細胞と標的との共培養実験
ＨＢＶ  ｓ１８３−ＴＣＲ  ｍＲＮＡ電気穿孔活性化または非活性化（休止）Ｔ細胞を、ＨｅｐＧ２．２．１５またはＨＢＶ感染ＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰのいずれかとともに、１：３および１：１のＥ：Ｔ比で（エフェクターは、ＣＤ８＋ペンタマー＋細胞の頻度に基づいて算出される）、２４時間共培養した。ＨＣＶ  ＮＳ３  ＴＣＲ  ｍＲＮＡ電気穿孔非活性化（休止）Ｔ細胞を、Ｈｕｈ７  ＨＣＶレプリコン細胞とともに１８時間共培養した後、上述するように発光を定量化した。Ｔ細胞との共培養後の標的細胞溶解を評価するために、共培養実験からの上清を、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の測定用に２４時間後に収集したか、またはＣｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＸＴＴ）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、生存度アッセイを実施した。ＩＦＮ−γをブロックするために、２０μｇ／ｍｌの精製抗ヒトＩＦＮ−γまたはアイソタイプ対照マウスＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を添加した。リンホトキシン（ＬＴ）α１β２、ＬＴα２β１およびＬＩＧＨＴをブロックするために、１μｇ／ｍｌの組換えヒトＬＴβ受容体−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＵＳＡ）を使用した。
【実施例９】
【０１９８】
ＨＢＶ感染
ＨｅｐＡＤ３８細胞のおよそ８０〜１００倍濃縮した上清を、ＨＢＶ接種材料として使用した。２４ウェルプレートにおいて一晩播種したＨｅｐＧ２−ｈＮＴＣＰ細胞に、４％ポリエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する培地中で３０００個／ウェルのおおよその多重度のＨＢＶのゲノム等価体を２４時間接種した。感染後、細胞をＰＢＳで３回洗浄して、ＤＭＳＯを有する培養培地を添加して、２日毎に交換した。ウイルス感染は、フローサイトメトリーによって、感染細胞でのＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）発現を測定することによって分析し、ＨＢＶ  ＤＮＡは、リアルタイムＰＣＲによって定量化した。
【実施例１０】
【０１９９】
ＨＢＶゲノム等価体コピーの定量化
ｐＨ８のβ−メルカプトエタノールを有するＲＬＴ緩衝液または５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ、０．５％ＮＰ−４０を含有する溶解緩衝液を添加して、ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｐｉｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して細胞内ウイルス核酸の単離のために細胞を溶解して、ＨＢＶ  ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲによって定量化した。リアルタイムＰＣＲは、Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ  Ｑ２−ｐｌｅｘ機器（Ｑｉａｇｅｎ）において製造業者の指示書に従って、ａｒｔｕｓ  ＨＢＶ  ＲＧ  ＰＣＲキットを使用して実施した。
【実施例１１】
【０２００】
三次元マイクロデバイスベースのアッセイ
均質に解離させたＨｅｐＧ２標的を含有する２．５ｍｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンゲル溶液２００μｌを調製するために、１０×ＰＢＳ  ２０μｌを、ＮａＯＨ（０．５Ｍ）４μｌ、コラーゲンＩ型（Ｒａｔ  Ｔａｉｌ、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）１２９．２μｌ、５×１０６個の細胞／ｍｌのトリプシン処理および解離したてのＨｅｐＧ２標的２０μｌおよび細胞培養水２２．９μｌと混合した。ゲル溶液の最終ｐＨは、ｐＨ指示薬片を使用して測定した場合に、およそ７であった。次に、ＨｅｐＧ２標的を含有するコラーゲンゲル溶液を、デバイスのデバイス専用ゲル領域に注入して、細胞培養インキュベーターにおいて４０分間重合させた（３７℃、５％ＣＯ２）。ゲル重合の直後、ゲルに水分補給して、ＨｅｐＧ２標的を生き生きした状態に保つために、培地チャネルにＲ１０培地を充填した。また、細胞不透過性核色素ＤＲＡＱ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を３μＭの濃度でＲ１０培地中に添加して、生存細胞と死滅細胞とを区別した。続いて、デバイスを２４時間インキュベートして、ＨｅｐＧ２標的とコラーゲンマトリックスとの相互作用を可能にした。
【０２０１】
空のゲル領域を有するデバイス（対照）は、１０×ＰＢＳ  ２０μｌ、ＮａＯＨ（０．５Ｍ）４μｌ、コラーゲンＩ  １２９．２μｌおよび細胞培養水４２．８μｌを含有するコラーゲンゲル溶液を添加することによって、同様に調製された。デバイスにおけるＴ細胞の注入に先立って、デバイス中のＲ１０培地を、ＡＩＭ−Ｖ  ２％ヒトＡＢ血清＋１００ＩＵ／ｍｌのｒｌＬ−２を含有するＤＲＡＱ７と取り換えた。
【０２０２】
操作Ｔ細胞の空間位置を可視化するために、細胞を、３μＭのＲＰＭＩ  １６４０中のＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ  Ｖｉｏｌｅｔ  ＢＭＱＣ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で、３７℃にて３０分間染色した。続いて、Ｔ細胞懸濁液をＡＩＭ−Ｖ  ２％ヒトＡＢ血清で洗浄した後、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。次に、染色したＴ細胞を洗浄して、３×１０６個の細胞／ｍｌで相当する培地中に再懸濁させた。続いて、Ｔ細胞懸濁液３０μｌを、各デバイスの中心ゲル領域に隣接する２つの培養培地チャネルの一方に添加した。最終的に、デバイスは、指示条件下で一晩インキュベートした。
【０２０３】
ライブイメージング（タイムラプス）実験は、３７℃および５％ＣＯ２に設定した環境チャンバーを備えたＬＳＭ７８００共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＦＶ１２００共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｊａｐａｎ）のいずれかを使用して実施した。顕微鏡は、規定の時間間隔で、選択した領域のＺスタックを獲得するようにプログラミングした。静的イメージング実験に関して、Ｔ細胞添加前、および一晩のインキュベーション後に、対象とする同じ領域の共焦点画像を獲得した。
【実施例１２】
【０２０４】
統計分析
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈ−Ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ）において実施した。２つを上回る群を含む比較に関して、統計学的有意性は、多重比較に関して、Ｄｕｎｎの事後検定とともにＫｒｕｋｓａｌ  Ｗａｌｌｉｓ検定を使用して決定し、ｐ＜０．０５は、有意差の証拠として解釈された。
【実施例１３】
【０２０５】
ＴＣＲ  ｍＲＮＡ電気穿孔を使用したヒト非活性化Ｔ細胞でのＨＢＶ  ＴＣＲの発現
ｍＲＮＡ電気穿孔が、いかなる予備活性化も用いずにヒト初代リンパ球において導入遺伝子を導入することができることは公知である（Ｚｈａｏら  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ（２００６年）、１３巻（１）：１５１〜１５９頁）。このことは、臨床用途に関して有意な利点を有し得る。
【０２０６】
本発明者らは、ＨＢＶ  ＴＣＲが、非刺激非活性化（休止）Ｔ細胞で発現され得るかどうかを研究した。
【０２０７】
ＨＬＡ−Ａ２制限ＨＢＶエンベロープｓ１８３−ＴＣＲのアルファおよびベータ鎖をコードするｍＲＮＡを、非刺激非活性化（休止）Ｔ細胞、または抗ＣＤ３およびＩＬ−２で８日間活性化させたＴ細胞に電気穿孔した。
【０２０８】
電気穿孔の２４時間後に、非活性化（休止）Ｔ細胞の２５％および活性化Ｔ細胞の６４％が、導入されたＨＢＶ  ｓ１８３−ＴＣＲを発現した（図１Ａ）。
【０２０９】
電気穿孔後のＴＣＲ発現の動態もまた決定した。活性化Ｔ細胞と同様に、非活性化（休止）Ｔ細胞で発現されたＨＢＶ  ｓ１８３−ＴＣＲは、電気穿孔の６時間後に検出することができた。ＴＣＲ発現は、電気穿孔の２４時間後にピークとなり、７２時間後に消失した（図１Ｂ）。
【実施例１４】
【０２１０】
ＨＢＶ  ＴＣＲ  ｍＲＮＡ電気穿孔Ｔ細胞の分化表現型
ヒト養子Ｔ細胞療法臨床試験の予臨床動物モデルおよびレトロスペクティブ分析により、あまり分化されていない非活性化幹細胞メモリーまたはセントラルメモリーＴ細胞サブセットの注入が、養子Ｔ細胞療法の治療有効性を増加させることができることが示されている（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（２０１２年）、３５巻（９）：６５１〜６６０頁）。
【０２１１】
したがって、本発明者らは、導入されたＨＢＶ  ｓ１８３−ＴＣＲを発現する非活性化Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞の両方の分化表現型を分析した。
【０２１２】
８０％を上回る非活性化ＨＢＶ  ｓ１８３−ＴＣＲ  Ｔ細胞が、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋非活性化表現型を有する一方で、活性化ＨＢＶ  ｓ１８３−ＴＣＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋非活性化４０％、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリー４５％およびエフェクターメモリー表現型１５％の混合物を含む（図２Ａおよび図２Ｂ）。おそらく電気穿孔が細胞の増殖を刺激し得る（Ｑｉａｂｉｕｓら、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２０１５年）、３２巻（１）：２２９〜２３５頁）ので、９０％を上回る非活性化および活性化ＨＢＶ  ｓ１８３−ＴＣＲ  Ｔ細胞の両方が、同時刺激受容体ＣＤ２７およびＣＤ２８の両方を発現した（図２Ａおよび図２Ｂ）。
【０２１３】
非活性化または活性化Ｔ細胞のうちで、ＴＣＲ発現細胞との比較での非ＴＣＲ発現の分化表現型に差は観察されず、ｍＲＮＡ電気穿孔によって、特定の分化状況の細胞が優先的にトランスフェクトされることはないことを示した（データは示していない）。
【実施例１５】
【０２１４】
ＨＢＶ  ＴＣＲ  ｍＲＮＡ電気穿孔Ｔ細胞による細胞溶解性酵素産生の分析
細胞溶解性酵素（グランザイムおよびパーフォリン）およびサイトカインの発現は、Ｔ細胞成熟度および分化に関連し、非活性化（休止）Ｔ細胞は、より分化された細胞型と比較して、細胞溶解性酵素をあまり発現しないか、または細胞溶解性酵素を全く発現せず、サイトカインをあまり発現しないことが知られている（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙら、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ（２００９年）８５巻（１）：８８〜９７頁、上記で参照により組み込まれる）。したがって、本発明者らは、非活性化および活性化ＨＢＶ  ＴＣＲ  ｍＲＮＡ電気穿孔Ｔ細胞において、ペプチド特異的刺激の５時間および２４時間後に、グランザイムＢ、パーフォリンおよびＩＦＮ−γの発現を分析した。
【０２１５】
結果は、図３に示す。電気穿孔活性化Ｔ細胞は、電気穿孔非活性化（休止）Ｔ細胞よりも高いレベルのパーフォリン、グランザイムＢおよびＩＦＮ−γを発現することがわかった。
【実施例１６】
【０２１６】
ＨＢＶ  ＴＣＲ  ｍＲＮＡ電気穿孔Ｔ細胞の、標的細胞を溶解する能力の分析
電気穿孔活性化または非活性化（休止）Ｔ細胞を、標的細胞を溶解するそれらの能力に関して研究した。標的細胞死滅の量は、静的およびライブイメージングの両方を使用して定量化した。
【０２１７】
結果は、図４に示す。非活性化電気穿孔Ｔ細胞と同じ抗原特異的頻度に標準化した活性化電気穿孔Ｔ細胞の一晩の共培養は、標的を溶解させることが可能であった。しかしながら、非活性化電気穿孔Ｔ細胞は、標的細胞を溶解しなかった。
【実施例１７】
【０２１８】
ＨＢＶ  ＴＣＲ  ｍＲＮＡ電気穿孔Ｔ細胞によるサイトカイン産生の分析
電気穿孔活性化または非活性化Ｔ細胞を、種々のサイトカインの発現に関して分析し、結果は、図５に示す。
【０２１９】
電気穿孔活性化Ｔ細胞は、電気穿孔非活性化Ｔ細胞よりも多くのＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１３、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βを産生した。非電気穿孔活性化Ｔ細胞は、電気穿孔非活性化Ｔ細胞よりも多くのＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−１３、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βを産生した。
【実施例１８】
【０２２０】
ＨＢＶ  ＴＣＲ  ｍＲＮＡ電子穿孔Ｔ細胞の抗ウイルス活性の分析
ＨＣＶレプリコン系を使用して、電気穿孔Ｔ細胞が、標的細胞の溶解を引き起こすことなく、抗ウイルス活性を示すかどうかを分析した。
【０２２１】
Ｊｏら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２００９年）１３６巻（４）：１３９１〜１４０１頁に記載されるように、ＨＬＡ−Ａ２を発現するＨｕｈ７細胞に、ＨＣＶ  ＪＦＨ−１株およびルシフェラーゼをコードする構築物をトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は、ＨＣＶ  ＲＮＡ複製と相関し、したがって、ウイルス複製は、発光を測定することによって分析することができた。
【０２２２】
細胞を、１μｇ／ｍｌのＨＢＶ  ｅｎｖ１８３ペプチドで一晩パルス化して、続いて、ＨＢＶ  ｅｎｖ  ＴＣＲ電気穿孔活性化または非活性化Ｔ細胞とともに、２４時間共培養した。ペプチドでパルス化したＨＣＶレプリコン細胞を、様々なエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でＴ細胞とともに共培養して、発光の低減パーセントを算出することによって、抗ウイルス活性を決定した。共培養物の上清を収集して、標的細胞溶解のマーカーとしてアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）に関して分析した。
【０２２３】
実験の結果は、図６Ａおよび図６Ｂに示す。電気穿孔非活性化Ｔ細胞および電気穿孔活性化Ｔ細胞はともに、高いＥ：Ｔ比でさえ、高い抗ウイルス活性を有することが示された。例えば、Ｅ：Ｔ  １：５００でさえ、発光のおよそ８０％低減が観察された。
【０２２４】
重要なことに、電気穿孔非活性化Ｔ細胞は、電気穿孔活性化Ｔ細胞を用いた場合の共培養物と比べて、共培養上清中のより低レベルのＡＳＴの検出によって示されるように、広範な標的細胞溶解を伴わずに、この抗ウイルス活性を保有することが示された。
【０２２５】
電気穿孔非活性化Ｔ細胞（バルク集団、または表面マーカー発現に基づいて分類されるサブセットのいずれかとして）およびＨＢＶ産生ＨｅｐＧ２細胞を使用して、１：３のＥ：Ｔで２４時間、さらなる共培養実験を実施した。細胞内ＨＢＶ  ＤＮＡは、リアルタイムＰＣＲによって定量化され、ＡＳＴレベルは、共培養上清中で測定された。
【０２２６】
結果は、図７に示す。電気穿孔活性化および電気穿孔非活性化（休止）Ｔ細胞はともに、ＨＢＶウイルス負荷を阻害することが可能であった。しかしながら、電気穿孔活性化Ｔ細胞は、より高いＡＳＴレベルによって示されるように、標的細胞を溶解したのに対して、電気穿孔非活性化Ｔ細胞は、標的細胞を溶解しなかった。
【実施例１９】
【０２２７】
ＨＢＶ  ＴＣＲ  ｍＲＮＡ電気穿孔Ｔ細胞の抗ウイルス活性のメカニズムの研究
最近の研究により、肝細胞でのリンホトキシン−β受容体（ＬＴβＲ）活性化が、肝毒性を伴わずに、ＨＢＶ核共有結合性閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）の分解を引き起こし得ることが示唆されている（Ｌｕｃｉｆｏｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１４年）３４３巻（６１７６）：１２２１〜１２２８頁、Ｈａｙｂａｅｃｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ（２００９年）１６巻（４）：２９５〜３０８頁）。
【０２２８】
ＬＴβＲのリガンドは、ＬＴβおよびＬＩＧＨＴであり、それらは、非活性化（休止）電気穿孔Ｔ細胞で発現される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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