(57)【要約】  本発明は、動物の真皮へのワクチンの投与によるブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）による感染症及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエによる感染症に対する動物の予防的治療に使用するための、ブタサーコウイルス２型の非複製的免疫原とマイコプラズマ・ハイオニューモニエの非複製的免疫原と水中鉱油ナノエマルジョンを含むアジュバントとを組み合わせて含むワクチンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の真皮へのワクチンの投与によるブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）による感染症及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエによる感染症に対する動物の予防的治療における使用のための、ブタサーコウイルス２型の非複製的免疫原と、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの非複製的免疫原と、水中鉱油ナノエマルジョンを含むアジュバントと、を組み合わせて含むワクチン。
【請求項２】
単一用量によって投与されることを特徴とする、請求項１に記載の使用のためのワクチン。
【請求項３】
無針ワクチン接種装置で投与されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用のためのワクチン。
【請求項４】
ＰＣＶ２の前記非複製的免疫原がＰＣＶ２の組換え発現ＯＲＦ２タンパク質であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン。
【請求項５】
ＰＣＶ２の前記非複製的免疫原がＰＣＶ２のバキュロウイルス発現ＯＲＦ２タンパク質であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン。
【請求項６】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエの前記非複製的免疫原がバクテリンであることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン。
【請求項７】
弱毒生ＰＲＲＳウイルスをさらに含むことを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン。
【請求項８】
前記弱毒生ＰＲＲＳウイルスが、投与前２４時間以内にＰＣＶ２及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエの前記免疫原と組み合わされることを特徴とする、請求項７に記載の使用のためのワクチン。
【請求項９】
前記弱毒生ＰＲＲＳウイルスが、投与前６時間以内にＰＣＶ２及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエの前記免疫原と組み合わされることを特徴とする、請求項８に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１０】
ローソニア・イントラセルラリスの非複製的免疫原をさらに含むことを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１１】
ローソニア・イントラセルラリスの前記免疫原が、投与前２４時間以内にＰＣＶ２及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエの前記免疫原と組み合わされることを特徴とする、請求項１０に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１２】
ローソニア・イントラセルラリスの前記免疫原が、投与前６時間以内にＰＣＶ２及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエの前記免疫原と組み合わされることを特徴とする、請求項１１に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１３】
ローソニア・イントラセルラリスの前記免疫原が、ローソニア・イントラセルラリスバクテリンの凍結乾燥組成物の形態でワクチンに添加されることを特徴とする、請求項１０から１２のいずれか一項に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１４】
ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の非複製的免疫原と、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの非複製的免疫原と、水中鉱油ナノエマルジョンを含むアジュバントと、を組み合わせて含むワクチンを動物に皮内投与することによって、ＰＣＶ２による感染症及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエによる感染症に対して動物を予防的に治療する方法。
【請求項１５】
ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）による感染症及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエによる感染症に対して動物を予防的に治療するための前記動物に皮内投与用の、ＰＣＶ２の非複製的免疫原とマイコプラズマ・ハイオニューモニエの非複製的免疫原と水中鉱油ナノエマルジョンを含むアジュバントとを組み合わせて含むワクチンを製造するための、ＰＣＶ２の非複製的免疫原及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエの非複製的免疫原の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ブタの健康の分野に関する。ブタは多くの病原性微生物にかかりやすい。感染の制御は、一般的に、安定した飼料管理、抗ウイルス薬及び抗生物質などの医薬品による治療、又はワクチンを用いた予防的治療によって行われる。特に、本発明は、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ−２）及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染症に対するワクチン、並びにワクチンを用いて動物をこのような感染症から保護する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
養豚業において重大な経済的損失をもたらす最も重要な病原体は、ＰＣＶ２（ブタサーコウイルス２型）、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、ＰＲＲＳ（ブタ生殖器呼吸器症候群）ウイルス及びローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）である。
【０００３】
ＰＣＶ−２は、子ブタで観察される離乳後多臓器性発育不良症候群（ＰＭＷＳ）と関連している。この病気は１９９１年にカナダで初めて生じた。臨床徴候及び病理学が１９９６年に公開され、進行性の衰弱、呼吸困難、頻呼吸、時には黄疸（ｉｃｔｅｒｕｓ）及び黄疸（ｊａｕｎｄｉｃｅ）が含まれる。
【０００４】
Ｎａｙａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｖｅｔ．Ｊ．Ｖｏｌｕｍｅ  ３８，Ｊｕｎｅ  １９９７は、ＰＭＷＳの臨床症状を有するブタでブタサーコウイルスを検出し、ＰＫ−１５細胞の自然の存在として認識される公知のＰＣＶ以外のＰＣＶがＰＭＷＳと関連し得ると結論づけた。後の刊行物（Ｈａｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（６），５２６２−５２６７，１９９８；Ｍｅｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７９，２１７１−２１７９，１９９８）がこれらの知見を裏付け、新たな病原性ＰＣＶをＰＣＶ−２と呼び（Ｍｅｅｈａｎら、上記）、元のＰＫ−１５細胞培養物単離物（Ｔｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９５，６４−６６，１９８２）をＰＣＶ−１と呼ぶべきであることが提案された。
【０００５】
ＰＣＶ−２は、環状一本鎖ＤＮＡゲノムを含む小型（１７〜２２ｎｍ）正二十面体非エンベロープウイルスである。ＰＣＶ−２ゲノムの長さは約１７６８ｂｐである。世界中の異なる領域に由来するＰＣＶ−２単離株は互いに密接に関連しており、９５〜９９％のヌクレオチド配列同一性を示す（Ｆｅｎａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，３８（７），２４９４−２５０３，２０００）。ＰＣＶのＯＲＦ−２は、ウイルスのカプシドタンパク質をコードする。ＰＣＶ２のＯＲＦ２は約２３３アミノ酸のタンパク質をコードする。全てのＰＣＶ−２単離株のＯＲＦ２は、９１〜１００％のヌクレオチド配列同一性及び９０〜１００％の推定アミノ酸配列同一性を共有する。
【０００６】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（Ｍｈｙｏ）は、ブタを冒す非常に感染性の慢性疾患である疾患ブタ流行性肺炎（Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｅｎｚｏｏｔｉｃ  Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）を引き起こすことが知られている細菌の一種である。Ｍｈｙｏはサイズが小さく（４００〜１２００ｎｍ）、小型ゲノム（８９３〜９２０キロ塩基対（ｋｂ））を有し、細胞壁が欠けている。Ｍｈｙｏは、ブタの肺の上皮細胞の繊毛に付着する。これらは繊毛に鼓動、凝集及び消失を停止させ、最終的に上皮細胞死をもたらす。これがブタ流行性肺炎のブタの肺に見られる病変の原因である。この損傷は、正常な繊毛クリアランスを妨げ、しばしば二次感染が発症する。これにより、動物の成長体重が著しく減少する。米国での損失が年間最大１０億ドルであると以前推定された。ブタ流行性肺炎は世界中で風土病であり、Ｍｈｙｏはほとんど全てのブタ群に存在する。ブタにおけるＭｈｙｏの存在によって引き起こされる免疫応答は、遅く、効果がない。そのため、この疾患の治療は最も重要であるが、抗生物質に限定され、感染を完全に除去しないので、現在は部分的にしか有効でない。ワクチンが病気の重症度を低下させることが分かっているが、感染したブタに病気が発生するのを完全に防ぐことはできない。
【０００７】
ＰＲＲＳウイルスは、１９８７年に北米及び中央ヨーロッパで初めて報告された。ＰＲＲＳウイルスは、小型のエンベロープＲＮＡウイルスである。これは、約１５キロベースのサイズを有する一本鎖、プラス鎖ＲＮＡゲノムを含む。ゲノムは９個のオープンリーディングフレームを含む。ウイルスは、ニドウイルス（Ｎｉｄｏｖｉｒａｌｅｓ）目、アルテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）科、アルテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｕｓ）属のメンバーである。ＰＲＲＳＶの２つのプロトタイプ株は、北米株、ＶＲ−２３３２、及び欧州株、レリスタッドウイルス（Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ｖｉｒｕｓ）（ＬＶ）である。欧州及び北米のＰＲＲＳＶ株は、同様の臨床症状を引き起こす。２０００年代前半に、北米遺伝子型の高病原性株が中国で出現した。この株、ＨＰ−ＰＲＲＳＶは他の全ての株より毒性が強く、世界的にアジア諸国で大きな損失を引き起こしている。ＰＲＲＳウイルスについては、不顕性感染が一般的であり、その臨床徴候は群れで散発的にしか起こらない。臨床徴候には、流産及び死産又はミイラ変性胎児の出産などの雌ブタの生殖障害、並びに耳及び外陰部のチアノーゼが含まれる。新生児ブタでは、この病気は呼吸困難を引き起こし、グレーサー病などの呼吸器感染症に対する感受性が高まる。
【０００８】
ローソニア・イントラセルラリスは、世界中で離乳後ブタの一般的な腸疾患である、回腸炎としても知られる増殖性腸疾患を引き起こす。特徴的な病変は、回腸腸陰窩における未成熟腸細胞の増殖であり、これらの細胞は、通常、それらの頂端細胞質内に原因細菌を含む。剖検で、組織病変を、特に腸細胞で１．５〜２．５μｍの長さのビブリオ様形状の細菌の可視化によってローソニア陽性と確認することができるが、しばしば陰窩間の粘膜固有層及び腸間膜リンパ節に位置するマクロファージ内にもある。腸細胞からの細菌のクリアランスは、関連する増殖性病変の解消をもたらし、細菌の陰窩に対する直接的な局所的効果を示す。これらの病変におけるローソニア・イントラセルラリスの存在は、病気を示す動物と不顕性感染のみを示す動物の両方においてＰＣＲを用いて実証されている。臨床症例は通常、飼育業者−仕上げ業者の期間に存在し、ある高齢仕上げブタで、急性出血性形態が記録されている。
【０００９】
上で同定された病原体に対するワクチンは、一般的に公知である。ＰＣＶ２による感染症に対して動物、特にブタを予防的に治療するための慣用的なワクチンは、（非複製的）免疫原としての全不活性化ＰＣＶ−２ウイルスに基づき得る。また、当技術分野では、ＯＲＦ２にコードされたカプシドタンパク質（例えば、組換え発現される場合）が、十分なワクチンに使用するためのブタサーコウイルス２型のサブユニット免疫原として適していることが示されている。ＤＮＡ及び非構造タンパク質がカプシドの内側に存在しないという事実が本質的に異なるが、このサブユニットが循環系においてウイルス自体と同じ様式を示すのでこれが理解され得る。当技術分野では、ＰＣＶ２に対するいくつかのワクチンが商業的に入手可能である。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、オランダから入手可能）は、３週齢以上のブタに使用するための、ブタをブタサーコウイルス２型から保護するためのワクチンである。２回接種（２回投与）ワクチンとして投与する場合、免疫持続期間（ＤＯＩ）は２２週間であり、ブタの肥育期間をほぼ完全にカバーする。Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＣｉｃｒｏＦｌｅｘ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから入手可能）は、２週齢以上のブタに使用するための、ブタをブタサーコウイルス２型から保護するためのワクチンである。これは１回接種（１回投与）ワクチンとしてのみ登録されている。Ｃｉｒｃｏｖａｃ（登録商標）（Ｍｅｒｉａｌ、Ｌｙｏｎ、フランスから入手可能）は、３週齢以上のブタに使用するための、ブタをブタサーコウイルス２型から保護するためのワクチンである。Ｓｕｖａｘｙｎ（登録商標）ＰＣＶ（Ｚｏｅｉｔｉｓ、Ｃａｐｅｌｌｅ  ａ／ｄ  ＩＪｓｓｅｌ、オランダから入手可能）は、３週齢以上のブタに使用するための、ブタをブタサーコウイルス２型から保護するためのワクチンである。他のＰＣＶ２ワクチンは、例えば国際公開第２００７／０２８８２３号、国際公開第２００７／０９４８９３号及び国際公開第２００８／０７６９１５号に記載されている。
【００１０】
マイコプラズマ・ハイオニューモニエに関して、多くの商業的ワクチンが存在し、これらは商業的養豚業務の大部分において日常的に使用されている。一般に、これらのワクチンは、典型的には非経口注射によって投与される、サブユニットタンパク質及び／又はバクテリン（すなわち、全細胞、（部分）溶解、均質化、フレンチプレス、この組み合わせとして死細胞を含む、又は組成物が死細菌培養物から得られる限り別の形態の死細胞を含む組成物）などの非複製的免疫原を含む。いくつかの例は、ＲｅｓｐｉＳｕｒｅ（登録商標）（Ｚｏｅｔｉｓ）、Ｉｎｇｅｌｖａｃ（登録商標）Ｍ．ｈｙｏ及びＭｙｃｏＦＬＥＸ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、Ｈｙｏｒｅｓｐ（登録商標）（Ｍｅｒｉａｌ）、Ｓｔｅｌｌａｍｕｎｅ（登録商標）Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ（Ｅｌａｎｃｏ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）、Ｆｏｓｔｅｒａ（登録商標）ＰＣＶ  ＭＨ（Ｚｏｅｔｉｓ）及びＭ＋Ｐａｃ（登録商標）（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）である。
【００１１】
ＰＲＲＳウイルスに関しては、不活化ウイルスワクチンが記載され商業的に入手可能であるが、弱毒生形態の欧州型（Ｉ型）又は北米型（ＩＩ型）のいずれかを含む修飾生ワクチン（ＭＬＶ）ワクチンが、その制御のための主要な免疫学的ツールである。いくつかのワクチンが当技術分野で商業的に入手可能である。Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、オランダから入手可能）は、弱毒生ＰＲＲＳウイルスＩ型を含むワクチンであり、ＰＲＲＳウイルスによる感染によって引き起こされる感染症（ウイルス血症）を軽減するために登録されている。Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳ（登録商標）ＭＬＶ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍから入手可能）は、ＰＲＲＳウイルスによって引き起こされる病気の軽減を助けるワクチンであり、このワクチンは異なる種類の株に対する交差防御を提供する。Ｆｏｓｔｅｒａ（登録商標）ＰＲＲＳ（Ｚｏｅｉｔｉｓ、Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、米国から入手可能）もＭＬＶワクチンであり、ＰＲＲＳウイルスによって引き起こされる呼吸器と生殖の両方の形態の病気に対する防御のために登録されている。他のＰＲＲＳワクチンは、例えば国際公開第２００６／０７４９８６号、米国特許第８７２８４８７号明細書及び国際公開第２０１４／０４８９５５号に記載されている。
【００１２】
活性保護を誘導することによりローソニア・イントラセルラリスと戦うためのワクチンは商業的に入手可能であり、当技術分野で記載されている。これらのワクチンは、弱毒生ワクチンである商品名Ｅｎｔｅｒｉｓｏｌ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｖｅｔｍｅｄｉｃａ、米国）、及び、バクテリンの形態のローソニア・イントラセルラリスの非複製的免疫原を含むワクチンであるＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｉｌｅｉｔｉｓ（Ｍｅｒｃｋ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、米国）で入手可能である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２００７／０２８８２３号
【特許文献２】国際公開第２００７／０９４８９３号
【特許文献３】国際公開第２００８／０７６９１５号
【特許文献４】国際公開第２００６／０７４９８６号
【特許文献５】米国特許第８７２８４８７号明細書
【特許文献６】国際公開第２０１４／０４８９５５号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｎａｙａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ．Ｖｅｔ．Ｊ．Ｖｏｌｕｍｅ  ３８，Ｊｕｎｅ  １９９７
【非特許文献２】Ｈａｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（６），５２６２−５２６７，１９９８
【非特許文献３】Ｍｅｅｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７９，２１７１−２１７９，１９９８
【非特許文献４】Ｔｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９５，６４−６６，１９８２
【非特許文献５】Ｆｅｎａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｏｒｂｉｏｌ．，３８（７），２４９４−２５０３，２０００。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
ブタの健康管理のための、簡便で安全で効果的な手段が絶えず必要とされている。本発明の目的は、この必要性、特に新規なＰＣＶ２／Ｍｈｙｏ混合ワクチンの必要性を満たすワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の目的を達成するために、動物の真皮へのワクチンの投与によるブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）による感染症及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエによる感染症に対する動物の予防的治療に使用するための、ブタサーコウイルス２型の非複製的免疫原およびマイコプラズマ・ハイオニューモニエの非複製的免疫原、および水中鉱油ナノエマルジョンを含むアジュバント、を組み合わせて含む新規なワクチンが考案された。
【００１７】
両病原体ワクチンは公知であり商業的に入手可能であるが、若い動物で使用するのに効果的であって、同時に安全な、皮内投与に利用可能な混合ワクチンはない。一般に公知であるように、企図又は示唆された抗原の全ての組み合わせが安全で有効な混合ワクチンをもたらすことができるわけではない。実際、単一（一価）ワクチンが安全且つ効果的である場合、又は混合ワクチンが別の投与部位での使用について公知である場合でさえ、特定の投与部位での使用についての混合ワクチンの安定性、安全性及び有効性に関して高レベルの不確実性が存在する。驚くべきことに、皮内投与用の安全且つ有効な混合ワクチンに到達するために、水中鉱油ナノエマルジョンを含むアジュバント組成物を使用することができることが分かった。驚きの理由は、この種のエマルジョンは、筋肉内投与に使用する場合、典型的には安全でないとみなされるためであった。これは、ナノエマルジョンＭｏｎｔａｎｉｄｅ（登録商標）ＩＭＳ  ２５１を使用すると、ワクチン接種４時間後に、２℃のブタの平均体温上昇（試験した他の５種の製剤のいずれについても−０．８〜１．５℃であるのと比較して）をもたらす有害発熱効果が存在することを表ＩＩで示す、アジュバント開発及び製造企業ＳＥＰＰＩＣの科学者による刊行物（Ｄｅｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ  ｉｎ  Ｒｅｖｕｅ  Ｍｅｄ．Ｖｅｔ，２００９，１６０，１１，５１４−５１９）からとりわけ公知である。２℃の上昇は、Ｍｈｙｏワクチンについて欧州薬局方の２４４８条によって許可されている１．５℃をはるかに上回っており、これが鉱油のナノエマルジョンがブタワクチンに商業的に使用されていない理由を説明し得るだろう。
【００１８】
一般に、混合ワクチンに関しては、欧州医薬品審査庁（ＥＭＥＡ）の獣医用医薬品委員会が、その刊行物「混合獣医製品の要件に関するガイダンス（Ｎｏｔｅ  ｆｏｒ  ｇｕｉｄａｎｃｅ：ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」（ＥＭＥＡ，２０００，ＣＶＭＰ／ＩＷＰ／５２／９７−ＦＩＮＡＬ）で、以下のように言及している（２／６頁）：「混合ワクチンの開発は容易ではない。各組み合わせは、品質、安全性及び有効性の点で個別に開発及び試験されるべきである」。委員会はさらに、優れた混合ワクチンの探索には、典型的には、例えば、保存剤、賦形剤及び安定剤、不活性化剤及びアジュバントを含む混合ワクチン中の個々の成分間の適合性が含まれることを示している。３頁、一番上の段落には、「混合ワクチンでは、２種以上の成分の存在がしばしば相互作用を引き起こし、（１又は複数の）特定の成分を単独で投与した場合と比較して、個々の成分に対する減少又は増加した応答をもたらし得る。このような相互作用はしばしば免疫学的な性質であるが、免疫系に対するあまり直接的でない効果を有する他の因子によっても引き起こされ得る」及び「アジュバントを使用して混合ワクチンに対する免疫応答を増大させる場合、特別な問題が生じ得る」とも述べられている。
【００１９】
アメリカ保健福祉省、食品医薬品局、生物学的製剤評価研究センターは、１９９７年４月に、「予防可能な疾患のための混合ワクチンを評価するための業界ガイダンス：製造、試験及び臨床研究（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔａｂｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ）」を公開し、このガイダンスの中で、（３頁、「成分の適合性」）「一価ワクチンを組み合わせると、望ましいものより安全性又は有効性が低い新たな組み合わせがもたらされ得ることが経験から明らかになった。時には、不活化ワクチンの成分が、活性成分の１種又は複数に対して有害に作用することがある。」と述べられており、特に、不活化ワクチンが生ワクチンの有効性に悪影響を及ぼし得、例えば生百日咳ワクチンと不活化ポリオウイルスワクチンを組み合わせると、百日咳の効力が低下したワクチンが得られるということが起こったことを示している。個々のワクチンと比較して、ワクチン中の任意の追加の成分が最終製品の安全性及び効力を複雑にすることが示されている。
【００２０】
世界保健機関（ＷＨＯ）は、「ワクチン安全性の基礎」と呼ばれるｅラーニングコースを公開し、履修単位２では混合ワクチンを意図している。この履修単位は、「認可された混合ワクチンは、製品が安全で、有効で、許容可能な品質であることを保証するために、国家当局によって承認される前に広範な試験を受けている」で始まっている。「そのため、全ての組み合わせで、製造業者は各抗原成分の効力、免疫を誘導するために組み合わせた場合のワクチン成分の有効性、毒性への復帰の可能性のリスク、及び他のワクチン成分との反応を評価しなければならない」とも述べられている。
【００２１】
したがって、特定の投与部位用の新しいワクチンは言うまでもなく、新しい混合ワクチンを考案することは容易ではない。例えば、世界保健機関（ＷＨＯ）は、「ワクチン安全性の基礎」と呼ばれるｅラーニングコースを公開し、このコースの５３頁では、「投与経路は、ワクチン（又は薬物）を身体と接触させる経路である。これは予防接種が成功するための重要な因子である。物質は、侵入部位から、その作用が起こることが望まれる身体の部分まで輸送されなければならない。しかしながら、この目的のために身体の輸送機構を使用することは単純なことではない。」と報告されている。
【００２２】
この点で、カリフォルニア州保健局の予防接種部は、正しい予防接種のためのガイドラインを公開している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｖａｃｃｉｎｅｓ／ｐｕｂｓ／ｐｉｎｋｂｏｏｋ／ｄｏｗｎｌｏａｄｓ／ａｐｐｅｎｄｉｃｅｓ／ｄ／ｖａｃｃ＿ａｄｍｉｎ．ｐｄｆ）。投与部位に関しては、７頁の最初の全段落に、「各ワクチンの推奨経路及び部位は、臨床試験、実際の経験及び理論的考察に基づく。この情報は各ワクチンの製造業者の製品情報に含まれている。ワクチンの投与に使用される５つの経路が存在する。推奨経路からの逸脱は、ワクチン有効性を低下させるか、又は局所的有害反応を増加させる可能性がある。」と言及されている。１４頁には、唯一の米国で認可された皮内ワクチンが記載されている：「Ｆｌｕｚｏｎｅ  Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌは、皮内経路によって投与される唯一の米国で認可されたワクチンである。これは１８歳〜６４歳の人への使用のみが承認されている。このＦｌｕｚｏｎｅ製剤は、不活化インフルエンザワクチン（ＴＩＶ）の筋肉内製剤と同じではない。他のＴＩＶ製剤は、皮内経路によって投与すべきではない。」。
【００２３】
概して、特定の部位での混合ワクチンのワクチン接種は言うまでもなく、特定の部位でのワクチン接種は容易ではなく、安全性及び有効性を決定するための実験を必要とすることが一般に知られている。
【００２４】
皮内投与に関しては、ＩＤＡＬ（登録商標）ワクチン接種装置（オランダのＢｏｘｍｅｅｒのＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈから入手可能）などの無針ワクチン接種装置を用いて皮内投与を行うことができるが、「皮内」投与自体を「無針」投与と同一視すべきではない。世界保健機関は、２００９年８月２７日の「ワクチンの皮内送達；低及び中所得国で使用するための開発に関する文献及び可能性の概説」と題された論文で、実際に明らかに、「無針」ワクチン接種が、必ずしも「皮内」ワクチン接種を意味するわけではないことを示している（表１、概説の３頁参照）。無針装置が「皮内ワクチン接種用に構成されている」場合にのみ、ワクチンは実際に（少なくとも部分的に）真皮内に送達され得る。そうでなければ、ワクチンは、その全体が皮下又は筋肉内に送達され得る。
【００２５】
本発明はまた、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）の非複製的免疫原とマイコプラズマ・ハイオニューモニエの非複製的免疫原と水中鉱油ナノエマルジョンを含むアジュバントと、を組み合わせて含むワクチンを動物に皮内投与することによって、ＰＣＶ２による感染症及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエによる感染症に対して動物を予防的に治療する方法、並びにブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）による感染症及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエによる感染症に対して動物を予防的に治療するための動物への皮内投与用の、ＰＣＶ２の非複製的免疫原と、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの非複製的免疫原と、水中鉱油ナノエマルジョンを含むアジュバントと、を組み合わせて含むワクチンを製造するための、ＰＣＶ２の非複製的免疫原及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエの非複製的免疫原の使用に関する。
【００２６】
ワクチンにおいて、免疫原（抗原とも呼ばれる）は、典型的には、薬学的に許容される担体、すなわち生体適合性媒体、すなわち、投与後に対象動物において有意な有害反応を誘導せず、ワクチンの投与後に宿主動物の免疫系に免疫原を提示することができる媒体、例えば水を含む液体及び／又は任意の他の生体適合性溶媒、或いは凍結乾燥ワクチン（糖及び／又はタンパク質に基づく）を得るために一般的に使用されるような固体担体と組み合わされ、場合により、野生型微生物による感染症に対して動物を治療するため、すなわちこのような感染症又はそこから生じる障害を予防、改善又は治癒するのを補助するための、動物に投与すると免疫応答を誘導する免疫刺激剤（アジュバント）を含んでもよい。場合により、安定剤、粘度調整剤又は他の成分などの他の物質を、ワクチンの意図される用途又は要求される特性に応じて添加してもよい。
【００２７】
定義
ワクチンは、対象動物に投与することが安全であり、その動物において病原性微生物に対する防御免疫を誘導する、すなわち、以下に定義される成功した予防的治療を誘導することができる医薬組成物である。
【００２８】
病原体の非複製的免疫原は、（弱毒形態の野生型における）全体として生きた複製病原体以外の病原体に相当する任意の物質又は化合物であり、この病原体に対して免疫学的応答が誘発され、対応する病原性病原体又はその病原性因子の１つもしくは複数が、それらの免疫応答の結果として宿主の免疫系によって認識され、最終的には少なくとも部分的に中和される。非複製的免疫原の典型的な例は、死滅した全病原体及びこれらの病原体のサブユニット、例えばカプシドタンパク質及び表面発現タンパク質、例えば組換え発現タンパク質である。
【００２９】
弱毒生病原体は、病原性が減少した病原体の生存可能、複製可能な（生存可能な）形態である。弱毒化の過程は、感染性病原体をとり、典型的には細胞系を通した病原体の複数回継代によって又は病原体を遺伝子組換えすることによって、それが無害又は弱毒性になるように変える。
【００３０】
病原体による感染症に対する予防的治療は、治療後の病原性病原体による曝露から生じる、病原体による感染症又はその感染症から生じる障害を予防又は改善するのを補助し、特にこのような曝露後の宿主中のその量を減少させるのを補助し、場合により病原体による感染から治療後に生じる１つ又は複数の臨床症状を予防又は改善するのを補助する。
【００３１】
ナノエマルジョンは、エマルジョンが、５体積％の分散油で白色（乳様）であるマイクロエマルジョンとは対照的に、５体積％の分散油の濃度で、半透明〜オパール色となるように、体積平均粒径が３００ｎｍ（可視光の波長）未満である粒子のエマルジョンである。ナノエマルジョンでは、典型的には、粒子の９０％超が３００ｎｍ未満の粒径を有し、（体積）平均粒径のピーク値は典型的には２０〜２００ｎｍである。
【００３２】
予防的治療における使用のためのワクチンの単一用量投与は、防御免疫に到達するために、ワクチンの第２の投与でワクチン接種を追加する必要がないことを意味する。２回接種レジメンでは、第１の（プライム）ワクチン接種が、典型的には第１の投与から６週間以内、一般的には第１の投与から３週間以内又は２週間以内にさらに追加され、第２の（ブースト）投与後にのみ、防御免疫、すなわち上に定義される成功した予防的治療を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＰＣＶ２血清学的応答の結果を示す図である。
【図２】ＰＲＲＳ血清学的応答の結果を示す図である。
【図３】ウイルス血症データを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
第１の実施形態では、ワクチンが単一用量によって投与される。単一用量投与が有効なワクチンをもたらすことが分かった。これは、両病原体に対して動物を保護するための非常に簡便で経済的な方法を提供する。
【００３５】
次の実施形態では、ワクチンが動物の皮膚を通して真皮に到達するために、ワクチンの噴射を使用して無針ワクチン接種装置で投与される。この実施形態では、真皮へのワクチン接種は、典型的には０．０５〜０．２ｍｌの範囲の非常に低容量のワクチンを使用して、ワクチンの液体噴射（高加圧流体流）を使用する無針ワクチン接種装置によって提供される。これによって、ワクチンの安全性及び投与方法がさらに増加する。
【００３６】
別の実施形態では、非複製的免疫原は、例えば当技術分野で公知のようにバキュロウイルスによって発現された、ブタサーコウイルス２型の組換え発現ＯＲＦ２タンパク質である。この組換えタンパク質は、本発明に適用するのに適していることが判明している。特に、ＯＲＦ２タンパク質は、国際公開第２００７／０２８８２３号、国際公開第２００７／０９４８９３号又は国際公開第２００８／０７６９１５号に記載されるようなバキュロウイルス発現系で発現され得る。
【００３７】
さらに別の実施形態では、マイコプラズマ・ハイオニューモニエの非複製的免疫原はバクテリンである。このようなＭｈｙｏ抗原は、製造が比較的容易であり、毎日の養豚業業務において優れた有効性の実績を有する。
【００３８】
さらに別の実施形態では、ワクチンは、弱毒生ＰＲＲＳウイルスをさらに含む。この実施形態では、ワクチンは、ただ１種のワクチンを使用することによって、３つの主要なブタ病原体に対する防御を提供することができる。
【００３９】
さらに別の実施形態では、弱毒生ＰＲＲＳウイルスは、投与前２４時間以内、好ましくは６時間以内にワクチンに組み合わせられる。多くの医薬組成物について、そのように知られており、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２抗原（例えば、ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈから入手可能なＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏ）を含む混合ワクチンについてさえ公知であるが、長期安定性は少なくともいずれの薬学的に許容される担体組成物についても達成するのが依然として容易ではないので、投与直前に抗原を組み合わせることによって、賦形剤を選択する自由度が増す。
【００４０】
別の実施形態では、ワクチンは、ローソニア・イントラセルラリスの非複製的免疫原をさらに含む。この実施形態では、ワクチンは、ただ１種のワクチンを使用することによって、３つの主要なブタ病原体に対する防御を提供することができる。ＰＲＲＳ免疫原のワクチンへの添加に関して前に述べたことに対応して、一実施形態では、ローソニア・イントラセルラリスの免疫原は、投与前２４時間以内、好ましくは投与前６時間以内にＰＣＶ２及びマイコプラズマ・ハイオニューモニエの免疫原と組み合わされる。さらなる実施形態では、ローソニア・イントラセルラリスの免疫原は、ローソニア・イントラセルラリスバクテリンの凍結乾燥組成物の形態でワクチンに添加される。
【００４１】
本発明を、以下の実施例を用いてさらに説明する。
【００４２】
［実施例］
試験１
目的
この試験の目的は、子ブタにおける皮内施用のための異なる実験的ＰＣＶ２／Ｍｈｙｏ混合ワクチンの安全性及び有効性を評価することであった。
【００４３】
実験設計
この試験では約１０匹の雌ブタの子孫が利用可能であった。動物は、ＰＣＶ２に対する母系由来抗体（ＭＤＡ）を有していた。合計５０匹の子ブタをそれぞれ１０匹の子ブタからなる４つの処理群及びそれぞれ５匹の子ブタからなる２つの対照群に割り当てた。ＰＣＶ２抗原を、限外濾過（ＵＦ）を用いる第１のものと、重力（Ｇ）を用いる第２のものとの２つの異なる濃縮過程によって製造した。ワクチンを、油の最終濃度が異なる、商業的に入手可能なマイクロエマルジョンアジュバントＸＳｏｌｖｅ（０．５μｍよりわずかに小さい平均粒径；ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、オランダより入手可能）を使用して、２種類の異なるアジュバントを添加することによって製剤化した。ＸＳｏｌｖｅ  ５０は２０．８％の鉱油を含み、Ｘ−ｓｏｌｖｅ  ３０は１２．５％の鉱油を含んでいた。
【００４４】
１〜４群の子ブタに、約３週齢の時に、ＩＤＡＬ（登録商標）ワクチン接種装置（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）により施用される単一用量０．２ｍｌワクチンを皮内ワクチン接種した。５群及び６群の子ブタには同様にプラセボを注射した。混合ワクチンは、１用量あたり９μｇの最終濃度のＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質及び１ＰＣＶＵ／用量のＭｈｙｏバクテリン（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈの商業的に入手可能なワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍ  Ｈｙｏ  ＩＤ  ＯＮＣＥと同じ）を含んでいた。以下に、異なる群を示す：
１群：ＰＣＶ／Ｍｈｙｏ、ＸＳｏｌｖｅ  ３０、ＵＦ
２群：ＰＣＶ／Ｍｈｙｏ、ＸＳｏｌｖｅ  ５０、ＵＦ
３群：ＰＣＶ／Ｍｈｙｏ、ＸＳｏｌｖｅ  ３０、Ｇ
４群：ＰＣＶ／Ｍｈｙｏ、ＸＳｏｌｖｅ  ５０、Ｇ
５群：プラセボ、ＸＳｏｌｖｅ  ３０
６群：プラセボ、ＸＳｏｌｖｅ  ５０。
【００４５】
全ての子ブタを臨床徴候について毎日観察した。ワクチン接種の日に、ワクチン接種の１時間後及び４時間後に全ての動物において臨床徴候を監視した。−１日目から＋４日目まで、及びワクチン接種４時間後に、体温を全ての動物から取った。ワクチン接種日に開始して、ワクチン接種４週間後まで又は反応の退行まで、触診によって局所反応を監視した。ワクチン接種前日、およびワクチン接種２、３、５及び１０週間後に、全ての動物から血液試料を採取した。ワクチン接種前、およびその２、３、５及び１０週間後に採取した各動物からの血清試料を、ブタサーコウイルス２型（ＰＣＶ２）に対する抗体について試験した。
【００４６】
結果
実験の開始時に、全ての動物が健康であることが分かった。
【００４７】
ワクチン接種時及びワクチン接種後１日後以降、全ての群が同等の温度を示した。ワクチン接種４時間後で、混合ワクチンをワクチン接種された全ての群が、対照群と比較して体温のかなりの上昇を示した。ＵＦ群とＧ群との間に有意な差は見られなかった。ワクチン接種群の平均体温上昇は、対照動物の平均体温よりも最大１．０℃高かった。ピーク値は４１℃をはるかに上回り（最大４１．６℃）、対照群の値は３９℃〜４０℃の範囲にあり、ピーク値は４０．２℃であった。
【００４８】
触診によって評価される局所反応に関して、対照群では、ＸＳｏｌｖｅ  ３０群の動物は局所反応を示さなかった。ＸＳｏｌｖｅ  ５０群では、動物の６０％が局所反応を示したが、最大サイズは１．５ｃｍ未満であった。ワクチン接種群については、状況は全く異なっていた。ＸＳｏｌｖｅ３０ワクチンを受けた動物のうち、６０〜９０％が局所反応を示し、最大サイズは約５ｃｍであった。ＸＳｏｌｖｅ  ５０群では、動物の７０〜８０％が局所反応を示し、最大サイズが約６ｃｍであり、局所反応は動物にとってひどく及び／又は有痛性であった。
【００４９】
ワクチンに対する血清学的応答は良好であったが（結果は示されていない）、ワクチンは、特に重度の局所反応のために、概して安全でないとみなされた。
【００５０】
試験２
目的
試験１に関して、この第２の試験の目的は、有効性を保持しながら、マイクロエマルジョンの量を減少させた場合に混合ワクチンをより安全にすることができるかどうかを評価すること、及び安全で効果的な混合ワクチンに到達することを目指して他の潜在的なアジュバントを試験することでもあった。
【００５１】
実験設計
合計６０匹の子ブタを、それぞれ１５匹の子ブタからなる４つの処理群に割り当てた。子ブタに、約３週齢の特に、ワクチン接種した。１〜３群の子ブタに、鉱油（ＸＳｏｌｖｅ  １２）について５％の濃度のＸＳｏｌｖｅアジュバントを用いて、試験１で使用されるＰＣＶ２−Ｍｈｙｏ抗原を用いて製剤化した単一用量の０．２ｍｌワクチン、又は代わりにＸＳｏｌｖｅマイクロエマルジョンに加えて、一般的に許容されるミョウバンアジュバントを使用した同じワクチン、又はスクアラン（水素添加サメ肝油）アジュバントに基づくアジュバントを使用したワクチン（０．２ｍｌ）を、ワクチン接種した。４群の子ブタに、単一用量のＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍｈｙｏ  ＩＤ  ＯＮＣＥ（０．２ｍｌ）をワクチン接種した。全ての子ブタに首の右側に皮内ワクチン接種した。以下に、異なる群を示す：
１群：ＰＣＶ／Ｍｈｙｏ、ＸＳｏｌｖｅ  １２
２群：ＰＣＶ／Ｍｈｙｏ、ＸＳｏｌｖｅ  １２＋Ａｌｕｍ（Ａｌ（ＯＨ）３
３群：ＰＣＶ／Ｍｈｙｏ、スクアラン
４群：Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍ  Ｈｙｏ  ＩＤ  ＯＮＣＥ、陽性対照。
【００５２】
試験日（ＳＤ）２９日に、全ての動物を、毒性Ｍｈｙｏ株１０ｍｌで連続２日間気管内曝露感染させた。ＳＤ５２又は５３に、全ての動物を剖検した。
【００５３】
全ての子ブタを臨床徴候についてワクチン接種後に毎日観察した。ワクチン接種日に開始して、ワクチン接種２９日後まで又は局所反応が解消するまで、２日ごとに触診によって局所反応を監視した。ワクチン接種日並びにＳＤ２２、２９及び５２／５３に、全ての動物から血清試料を採取した。ＰＣＶ２及びＭｈｙｏに対する抗体について試料を試験し、互いに比較した。剖検時に、Ｍｈｙｏ特異的肺病変を採点した。
【００５４】
結果
実験の開始時に、全ての動物が健康であることが分かった。
【００５５】
ワクチン接種後、局所反応の重症度（平均最大サイズ、局所反応を有する動物の数）は、１群（ＸＳｏｌｖｅ  １２）及び３群（スクアラン）で最も低かった。これらの群では、局所反応の平均最大サイズがそれぞれ１．１及び０．９ｃｍであり、局所反応を有する動物の割合は４０及び６５％であった。他の群では、ほとんどの動物が局所反応を有し（子ブタの９０〜１００％）、平均最大サイズが１．５〜１．８ｃｍであった。これらの数字は全て、実際に使用が許可されたワクチンで許容される。
【００５６】
ＰＣＶ血清学に関しては、ワクチン接種時（ＳＤ０）には、全ての動物がＰＣＶ２  ＩｇＭ抗体に関して陰性であった。ワクチン接種後、試験群１、２及び３の間で平均ＰＣＶ２総Ｉｇ抗体応答の明らかな差異を観察することはできなかった。ワクチン接種３週間後、ＰＣＶ２  ＩｇＭ陽性動物の割合は、１試験群当たり８０〜１００％であり、対照については０％であった。このことは、混合ワクチンが抗ＯＲＦ２抗体価を活発に誘導することができたことを示している。
【００５７】
Ｍｈｙｏに関しては、実験開始時、子ブタのいずれもＭｈｙｏに対する抗体について陽性ではなかった。ワクチン接種４週間後（ＳＤ２９）、試験群１〜３では、Ｍｈｙｏに対する応答が最小であった。２群の１匹の動物のみが陽性であった。陽性対照群（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  Ｍｈｙｏ  ＩＤ  Ｏｎｃｅ）では、子ブタの１０匹（６７％）がＭｈｙｏ抗体応答を示した。Ｍｈｙｏ曝露後、ほぼ全ての動物が陽性Ｍｈｙｏ血清学的応答を示した。このことは、混合ワクチンが許容される有効性を有さないことを示し、この指標を、表１に要約される肺病原スコアを評価することによって確認した。
【表１】
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【００５８】
結論として、ミョウバンアジュバントを添加してもよい鉱油の低濃縮マイクロエマルジョンを使用する、又はスクアランをアジュバントとして使用することによって、安全なＰＣＶ２／Ｍｈｙｏ混合ワクチンが考案され得るが、これらのワクチンは、マイコプラズマ・ハイオニューモニエによる感染症と戦うのに十分には効果的ではないとみなされた。
【００５９】
試験３
目的
第３の試験の目的は、ＩＤ使用のためのＰＣＶ２／Ｍｈｙｏ混合ワクチンを安全にするために使用することができ、同時に有効性を保持し、ローソニア・イントラセルラリスの非複製的免疫原を混和するのに適していてもよい代替アジュバントを見出すことであった。
【００６０】
実験設計
合計７５匹の子ブタを、それぞれ１５匹の子ブタからなる５つの処理群に割り当てた。子ブタに、約３週齢の特に、ワクチン接種した。製造業者の指示にしたがって、鉱油Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ２５１Ｃ（フランスのＳＥＰＰＩＣから入手可能）のナノエマルジョンを用いて、試験１で使用されるＰＣＶ２−Ｍｈｙｏ抗原を用いて製剤化した単一用量の０．２ｍｌワクチンを、１〜３群の子ブタにワクチン接種した。１群のワクチンは、他の群と比較して半用量のＭｈｙｏ抗原（０．５ＰＣＶＵ／用量）を含んでいた。ワクチン接種前に、凍結乾燥したローソニアバクテリン（約１０８個細胞の用量）を３群のワクチンに添加した。４群の子ブタに、単一用量のＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍｈｙｏ  ＩＤ  Ｏｎｃｅ（０．２ｍｌ）をワクチン接種した。全ての子ブタに首の右側に皮内ワクチン接種した。５群の子ブタにはワクチン接種しなかった（陰性対照群）。以下に、異なる群を示す：
１群：ＰＣＶ／Ｍｈｙｏ、０．５  ＰＣＶＵ  Ｍｈｙｏ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ
２群：ＰＣＶ／Ｍｈｙｏ、１  ＰＣＶＵ  Ｍｈｙｏ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ
３群：ＰＣＶ／Ｍｈｙｏ、１  ＰＣＶＵ  Ｍｈｙｏ＋ローソニア、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ
４群：Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍ  Ｈｙｏ  ＩＤ  ＯＮＣＥ、陽性対照
５群：ワクチン接種なし、陰性対照。
【００６１】
試験日（ＳＤ）３５日に、全ての動物を、毒性Ｍｈｙｏ株１０ｍｌで連続２日間気管内曝露感染させた。ＳＤ５９又は６０に、全ての動物を剖検した。
【００６２】
全ての子ブタを臨床徴候についてワクチン接種後に毎日観察した。体温並びに局所反応を監視した。ワクチン接種日に開始してワクチン接種２６日後まで又は局所反応が解消するまで、２日ごとに触診によって後者を監視した。ワクチン接種日並びにＳＤ２２、２９及び３５に、全ての動物から血清試料を採取した。ＰＣＶ２、Ｍｈｙｏ及びローソニア（３群及び５群のみ）に対する抗体について試料を試験し、互いに比較した。剖検時に、Ｍｈｙｏ特異的肺病変を採点した。
【００６３】
結果
実験の開始時に、全ての動物が健康であることが分かった。
【００６４】
ワクチン接種時（ＳＤ０）には、全ての群が同等の平均直腸温度を有していた。ワクチン接種４時間後で、全ての処理群について平均直腸温度のごくわずかな上昇が観察された（平均上昇は０．４〜０．６℃）。１匹の動物について１．８℃の最大温度上昇が２群で観察された。これらの温度上昇は、ブタワクチンに許容される。
【００６５】
ワクチン接種群では、動物のほとんどが局所反応を有していたが（子ブタの８０〜１００％）、陽性対照を含む全てのワクチン接種群について、平均サイズは小さい、すなわち２ｃｍであった。局所反応を有し、最も小さい平均サイズを有する動物の最も低い百分率は２群で見られ、すなわち、それぞれ８０％及び１．８ｃｍであった。これらの数字は、実際に使用が許可されたワクチンで許容される。
【００６６】
ＰＣＶ血清学に関しては、ワクチン接種時（ＳＤ０）には、全ての動物がＰＣＶ２  ＩｇＭ抗体に関して陰性であった。ワクチン接種後、試験群１、２及び３の間で平均ＰＣＶ２総Ｉｇ抗体応答の明らかな差異を観察することはできなかった。ワクチン接種３週間後、ＰＣＶ２  ＩｇＭ陽性動物の割合は、１〜３群で９３％であり、対照については０％であった。このことは、混合ワクチンが抗ＯＲＦ２抗体価を活発に誘導することができたことを示している。
【００６７】
Ｍｈｙｏに関しては、実験開始時、子ブタのいずれもＭｈｙｏに対する抗体について陽性ではなかった。ワクチン接種４週間後（ＳＤ３０）、試験群１、２及び３において、動物の９３〜１００％がＭｈｙｏ陽性であった。陽性対照群では、これは４０％であった。肺病変スコアは、表２で以下に示されるように、Ｍｈｙｏ感染症に対する優れた有効性を確認した。
【００６８】
ローソニア血清学に関して、試験開始時には３群及び５群の全ての動物が、ローソニアに対する抗体について陰性であった。試験の過程で、ＬＦＤワクチン接種群における陽性動物の割合は、ＳＤ３０で６０％から試験終了時に１００％まで増加した。対照群の動物のいずれにも、試験終了までローソニア血清学的応答はなかった。
【表２】
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【００６９】
試験４
目的
第４の試験の目的は、試験３に記載されるナノエマルジョンアジュバントを使用して、弱毒生ＰＲＲＳウイルスを添加して三種混合ワクチンに到達したＰＣＶ２／Ｍｈｙｏ混合ワクチンの有効性及び安全性を評価することであった。抗ＯＲＦ２血清学を評価することによって、ＰＣＶ２による感染に対する防御有効性を評価した。マイコプラズマ・ハイオニューモニエによる感染に対する有効性を、血清学的応答を商業的に入手可能なＭｈｙｏワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍｈｙｏ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、オランダ）のそれと比較することによって評価した。ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する有効性は、ワクチン接種４週間後の病原性ＰＲＲＳ株での曝露時のＰＲＲウイルス血症を評価することによって評価される。
【００７０】
実験設計
この試験では１０匹の雌ブタの子孫が利用可能であった。合計４０匹の動物をそれぞれ１０匹の子ブタからなる４つの群に割り当てた。全て動物を、約４週齢の時に、動物施設に移した。１〜４群に、首の右側にＩＤＡＬ（登録商標）ワクチン接種装置を用いて皮内ワクチン接種した。１群及び２群それぞれに、生ＰＲＲＳウイルスワクチン（Ｐｏｒｃｉｌｉｓ  ＰＲＲＳ）を再構成し、さらにＭｈｙｏバクテリン（商業的に入手可能な製品Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍ  Ｈｙｏと同じ抗原）を含むＯＲＦ２タンパク質ベースのＰＣＶ２ワクチンを受けさせた。１群のワクチンは、３％卵アルブミンを添加したフランスのＳＥＰＰＩＣから入手可能なＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ  ２５１に基づいていた。２群のワクチンは同じアジュバントを含んでいたが、卵アルブミンは添加しなかった。各ワクチンは、９μｇ／用量のＯＲＦ２タンパク質、及び商業的に入手可能なワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍ  Ｈｙｏ  ＩＤ  ＯＮＣＥ中のＭ  Ｈｙｏ抗原の濃度の１〜２倍のＭｈｙｏ抗原を含んでいた。ＰＲＲＳワクチンは凍結乾燥ワクチンであり、投与直前に適切なＰＣＶ２ワクチン又は希釈剤を用いて２００μｌの１用量当たり１０４．５ＴＣＩＤ５０のウイルスを含むように再構成した。３群はＰＲＲＳワクチンのみを受け、４群は未ワクチン接種のままであり対照として役立った。全ての子ブタを臨床徴候について毎日観察した。これらの動物に、約８週齢（２８日目）の時に、病原性ＰＲＲＳウイルス（Ｉ型）を曝露感染させた。曝露材料は、２ｍｌ中（計算用量）５．３ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０のウイルスを含んでいた。材料を、鼻孔１つ当たり１ｍｌ、鼻腔内投与した。観察期間の終了時（曝露２１日後に相当するワクチン接種４９日後）に、全てのブタを屠殺した。０日目、１４日目、２８日目（曝露直前）、３１日目、３５日目、３８日目、４２日目及び４９日目に、血液試料（頚静脈を介して）を全ての動物から個別に採取し、ＰＲＲＳＶ、ＰＣＶ２及びＭｈｙｏに対する抗体についてＰＲＲＳウイルスの存在について試験した。
【００７１】
結果
いずれの動物もワクチン接種による臨床徴候を示さず、直腸温度は対照から１．５℃以内のままであった。したがって、ワクチンは安全とみなされる。
【００７２】
Ｍｈｙｏに関しては、混合ワクチンの血清学的応答は、商業的に入手可能なワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ  Ｍ  Ｈｙｏ（図に数値的結果は示されていない）で得られるものに匹敵するようである。したがって、ワクチンは、Ｍｈｙｏによる感染から保護すると推定され得る。
【００７３】
ＰＣＶ２血清学的応答の結果を図１に示す。２つの混合ワクチンは陽性抗ＯＲＦ２抗体応答を誘導するようであり、これはワクチンが野生型ＰＣＶ２による感染に対する防御を誘導することを意味する。
【００７４】
ＰＲＲＳ血清学的応答の結果を図２に示す。商業的に入手可能なＰＲＲＳワクチンと同様に、２つの混合ワクチンは、曝露前に陽性抗ＰＲＲＳ抗体応答を誘導するようである。これは、ワクチンがＰＲＲＳウイルス感染に対する防御を提供することの指標である。図３に、ウイルス血症データを示す。ウイルス血症レベルが、各時点で陽性対照動物（４群）のレベルよりも低いので、３種全てのワクチンがＰＲＲＳウイルス感染に対する防御を提供すると思われる。
【００７５】
試験５
第５の試験の目的は、試験３に記載されるナノエマルジョンアジュバントと比較した場合の、代替ナノエマルジョンアジュバントを使用するＰＣＶ２／Ｍｈｙｏ混合ワクチンの有効性及び安全性を評価することであった。ＰＣＶ２に関して、有効性を、抗ＯＲＦ２血清学を評価することによって評価した。マイコプラズマ・ハイオニューモニエに関して、有効性を、血清学的応答を商業的に入手可能なＭｈｙｏワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）Ｍ  Ｈｙｏ  ＩＤ  ＯＮＣＥ（ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｏｘｍｅｅｒ、オランダ）のそれと比較することによって評価した。
【００７６】
実験設計は、上に記載されるのとほぼ同じであった。特に、合計５０匹の子ブタを５つの処理群：それぞれ１０匹の子ブタからなる５つの群に割り当てた。子ブタに、約３週齢の特に、皮内ワクチン接種した。
【００７７】
１〜３群の子ブタに、試験３で使用されるＰＣＶ２−Ｍｈｙｏ抗原及び水中鉱油ナノエマルジョン（エマルジョンが実際はナノエマルジョンであるという事実は顕微鏡的に確立された）に基づく３種類のアジュバントを用いて製剤化した単一用量のワクチン（０．２ｍｌ）をワクチン接種した。第１のアジュバント（１群が受けた）は、Ａｍｐｈｉｇｅｎ（登録商標）様ナノエマルジョンとして、すなわち、Ａｍｐｈｉｇｅｎ（登録商標）（Ｚｏｅｔｉｓから入手可能）と同じアジュバントエマルジョンであるが、アジュバントを顕微溶液化に供することによってナノエマルジョンとしての鉱油を含むアジュバントエマルジョンとして製剤化した。第２のアジュバント（２群が受けた）は、酢酸ビタミンＥを商業的に入手可能なアジュバントに添加し、顕微溶液化によってナノエマルジョンになるようアジュバントを乳化することによって作製した、Ｍｅｔａｓｔｉｍ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）様アジュバントとして製剤化した。第３のアジュバント（３群が受けた）は、酢酸ビタミンＥを添加し、エマルジョンを得る方法が異なる、すなわち、純粋な油／界面活性剤中間体（すなわち、ワクチンを製剤化するために油性濃縮物を使用する）の代わりに、水性中間体エマルジョン（すなわち、ワクチンを製剤化するために水性濃縮物を使用する）を介するという事実を別にすれば、実施例３で使用されるＩＭＳ２５１に似ていた。４群の子ブタにはＰｏｒｃｉｌｉｓ  Ｍ  Ｈｙｏ  ＩＤ  ＯＮＣＥをワクチン接種した。５群の子ブタにはワクチン接種しなかった。
【００７８】
結果は、代替の水中鉱油ナノエマルジョンに基づく３つの実験ワクチンが完全に安全であることを示し：ワクチン接種後に、体温の上昇は認められず、平均局所反応は商業的ワクチンＰｏｒｃｉｌｉｓ  Ｍ  Ｈｙｏ  ＩＤ  ＯＮＣＥで観察される平均局所反応より小さいか又はこれと同等であった。ＰＣＶ２血清学は、混合ＰＣＶ２／Ｍｈｙｏワクチン（１〜３群）を受けた３つの群全てにおいて、ワクチン接種により抗ＯＲＦ２力価が増加したのに対し、４群及び５群では、同じ期間に連続減少が見られた。Ｍｈｙｏに関して、全ての動物（１〜５群）に曝露した。曝露後の陽性動物の割合は、１〜３群で９０〜１００％であり、陽性対照群４（商業的に入手可能なＭ  Ｈｙｏワクチンを受けた）と同じであった。陰性対照群５では、抗体陽性動物の割合が０％であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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