(57)【要約】  本願は、式（Ｉ）に示されるような新規な５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物、およびそれらの立体異性体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、またはプロドラッグを開示する。加えて、本願はさらに、化合物の製造方法、本発明の化合物を含んでなる医薬組成物および本化合物の使用を開示する。2019519521.tif 000082
2019519521.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）により表される５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物、またはその立体異性体、互変異性体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ：
【化１】
2019519521.tif 000062
［式中、
ｎおよびｍは、０、１または２から独立に選択され；
Ｌは、Ｏ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ２−、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＮＨまたはＳ（Ｏ）２であり； 
Ａは、置換もしくは非置換複素環、置換もしくは非置換ベンゼン環、または置換もしくは非置換ヘテロアリール環から選択され、かつ、母核およびＬへのその結合部位は任意に選択され；
Ｂは、置換もしくは非置換脂肪族環、置換もしくは非置換複素環、置換もしくは非置換ベンゼン環、または置換もしくは非置換ヘテロアリール環から独立に選択され、かつ、Ｌへのその結合部位は任意に選択され；
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に水素、Ｃ１−Ｃ４アルキル、ハロゲン、およびシアノから選択され、またはＲ１およびＲ２はそれらが結合する炭素原子と一緒に３員または４員炭素環を形成し、またはＲ１およびＲ２は一緒になってオキソ基を形成し；
Ｙは、シアノ、
【化２】
2019519521.tif 000063
から選択され；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に、水素、非置換Ｃ１−Ｃ４アルキル、ヒドロキシ置換Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシＣ１−４アルキル、ハロゲン、シアノ、または−（ＣＨ２）ｑＮ（ＲａＲｂ）から選択され、ここで、ｑは１、２、３、または４であり、かつ、ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、水素、および非置換Ｃ１−Ｃ４アルキルから選択され；
ただし、Ｒ１およびＲ２の一方が水素であって他方がメチルである場合、Ｙはシアノであり、Ａはベンゼン環であり、ＬはＯであり、ｍは１であり、かつ、ｎは２であり、Ｂは置換もしくは非置換ベンゼン環でなく；Ｒ１およびＲ２の両方が水素である場合、Ａはベンゼン環であり、ｍは１であり、かつ、ｎは２であり、Ｂは置換もしくは非置換ベンゼン環、または置換もしくは非置換ピリジン環でなく；Ｒ１およびＲ２の両方が水素である場合、Ａはピリジン環であり、ｍは１であり、かつ、ｎは２であり、Ｂは置換もしくは非置換ベンゼン環でなく；Ｒ１およびＲ２の両方が水素である場合、Ａはベンゼン環であり、ＬはＯであり、ｍは１であり、かつ、ｎは１であり、Ｂは置換もしくは非置換ベンゼン環でない］。
【請求項２】
ｎおよびｍが０、１、および２から独立に選択され；ＬがＯ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ２−、ＮＨまたはＳ、より好ましくは、Ｏ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、またはＮＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ａが置換もしくは非置換複素環、置換もしくは非置換ベンゼン環、または置換もしくは非置換ヘテロアリール環から選択され、かつ、母核およびＬへのその結合部位は任意に選択され；Ｂが置換もしくは非置換脂肪族環、置換もしくは非置換複素環、置換もしくは非置換ベンゼン環および置換もしくは非置換ヘテロアリール環から独立に選択され、かつ、Ｌへのその結合部位が任意に選択され；ここで、
前記置換ベンゼン環は、フェニル基における任意の位置での、水素、メチル、メトキシ、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシシおよびシアノ基からなる群から選択される任意の置換基による置換を意味し；好ましくは、前記置換ベンゼン環は、フルオロ置換フェニル基、またはクロロ置換フェニル基、より好ましくは、２，４−ジフルオロフェニル基、または４−クロロフェニル基であり；
前記非置換ヘテロアリール環は、フラン、ピロール、チオフェン、オキサゾール、イソキサゾール、ピラゾール、イミダゾール、チアゾール、イソチアゾール、オキサジアゾール、トリアゾール、チアジアゾール、テトラゾリウム、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、またはトリアジンを意味し；かつ、前記置換ヘテロアリール環は、任意の位置に水素、メチル、メトキシル、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシルおよびシアノからなる群から選択される任意の置換基を有する前記基を意味し；より好ましくは、置換ピリジンは、クロロピリジン、特に好ましくは、４−クロロ−ピリジン−２−イルであり；
前記非置換脂肪族環は、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、またはシクロオクタンを意味し；かつ、前記置換脂肪族環は、任意の位置に水素、メチル、メトキシル、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシおよびシアノからなる群から選択される任意の置換基を有する前記基を意味し；
前記非置換複素環は、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロピロール、ピペリジン、
【化３】
2019519521.tif 000064
を意味し、ここで、ｗは、０、１または２から選択され；かつ前記置換複素環は、任意の位置に水素、メチル、メトキシ、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシおよびシアノからなる群から選択される任意の置換基を有する前記基を意味する、
請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
好ましくは、Ｒ１およびＲ２の両方が水素であるか、またはそのうち一方が水素であって他方がＣ１−Ｃ４アルキル基であるか、またはＲ１およびＲ２はそれらが結合する炭素原子と一緒にシクロプロピルを形成し；より好ましくは、Ｒ１およびＲ２の両方が水素であるか、またはそのうち一方が水素であって他方がメチルであるか、またはＲ１およびＲ２はそれらが結合する炭素原子と一緒にシクロプロピルを形成する、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
好ましくは、式（ＩＩ）により表される５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物、またはその立体異性体、互変異性体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ：
【化４】
2019519521.tif 000065
［式中、Ｌ、Ａ、ＢおよびＹは、前記式（Ｉ）と同様に定義され；
ただし、Ａがベンゼン環である場合、Ｂは置換もしくは非置換ベンゼン環、または置換もしくは非置換ピリジン環でなく；およびＡがピリジン環である場合、Ｂは置換もしくは非置換ベンゼン環でない］；
より好ましくは、式（ＩＩ）の５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物は以下の化合物：
【化５】
2019519521.tif 000066
［式（ＩＩ−１）または（ＩＩ−２）中のＬ、ＢおよびＹは、前記式（Ｉ）と同様に定義され；
ただし、Ｂは置換もしくは非置換ベンゼン環、または置換もしくは非置換ピリジン環でない］
のうちの１つであるか；あるいは
好ましくは、式（ＩＩＩ）により表される５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物、またはその立体異性体、互変異性体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ：
【化６】
2019519521.tif 000067
［式中、Ｌ、Ａ、ＢおよびＹは前記式（Ｉ）と同様に定義され；
ただし、Ｙがシアノ基であり、Ａがベンゼン環であり、かつ、ＬがＯである場合、Ｂは置換もしくは非置換ベンゼン環でなく］；
より好ましくは、式（ＩＩＩ）の５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物は以下の化合物：
【化７】
2019519521.tif 000068
［式（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＩＩ−３）および（ＩＩＩ−４）中のＬ、ＢおよびＹは前記式（Ｉ）と同様に定義され；
ただし、Ｙがシアノ基であり、かつ、ＬがＯである場合、Ｂは置換もしくは非置換ベンゼン環でない］
のうちの１つであるか；あるいは
好ましくは、式（ＩＶ）により表される５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物、またはその立体異性体、互変異性体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ：
【化８】
2019519521.tif 000069
［式中、Ｌ、Ａ、Ｂ，およびＹは前記式（Ｉ）と同様に定義される］；
より好ましくは、式（ＩＶ）の５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物は以下の化合物：
【化９】
2019519521.tif 000070
［式（ＩＶ−１）または（ＩＶ−２）中のＬ、ＢおよびＹは前記式（Ｉ）と同様に定義される］
のうちの１つである、
請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
ＬがＯであり；
Ｂが
【化１０】
2019519521.tif 000071
であり；かつ、
Ｙが−ＣＮ、
【化１１】
2019519521.tif 000072
であり、ここで、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に、水素、非置換Ｃ１−Ｃ４アルキル、ヒドロキシ置換Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシＣ１−Ｃ４アルキル、ハロゲン、シアノまたは−（ＣＨ２）ｑＮ（ＲａＲｂ）から選択され、ここで、ｑは１、２、３、または４であり、かつ、ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、水素、または非置換Ｃ１−Ｃ４アルキルから選択される、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
以下：
【化１２】
2019519521.tif 000073
2019519521.tif 000074
2019519521.tif 000075
2019519521.tif 000076
2019519521.tif 000077
から選択される化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、またはプロドラッグ。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物を製造する方法であって、
（１）式（Ｖ）の化合物と式（ＶＩ）の化合物との反応により式（ＶＩＩ）の化合物を提供し；
【化１３】
2019519521.tif 000078
（２）式（ＶＩＩ）の化合物の加水分解により式（ＶＩＩＩ）の化合物を与え；
【化１４】
2019519521.tif 000079
（３）式（ＶＩＩＩ）の化合物からの保護基ＰＧの除去により式（ＩＸ）の化合物を提供し；
【化１５】
2019519521.tif 000080
（４）式（ＩＸ）の化合物と式（Ｘ）の化合物との反応による式（Ｉ）の化合物を提供すること；
【化１６】
2019519521.tif 000081
を含んでなり、
前記式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩＩ）、式（ＶＩＩＩ）、式（ＩＸ）および式（Ｘ）の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｌ、Ａ、Ｂ、Ｙ、ならびにｍおよびｎは式（Ｉ）に関してと同義であり、ＰＧはアミノ保護基であり、Ｒ３はＣ１−Ｃ４アルキル基、好ましくは、エチルであり、かつ、Ｘはクロロ、ブロモまたはヒドロキシルである、方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含んでなる医薬組成物。
【請求項１０】
ＢＴＫ阻害剤の薬剤の製造における請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物または請求項９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１１】
ＢＴＫ阻害剤がＢＴＫにより媒介される疾患を予防または治療し、前記疾患が自己免疫疾患、炎症性疾患、異種免疫病態または疾患、血栓塞栓性疾患、および癌から選択される、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品化学の技術分野に属し、特に、高い選択性と良好な薬物動態特性を示す、ＢＴＫ阻害剤としての新規かつ有効な５−アミノピラゾールカルボキサミド誘導体、ならびにその製造方法およびそれを含んでなる医薬組成物を含む。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質キナーゼは、５０を超えるタンパク質を含む、ヒトの生体酵素の最大ファミリーである。特に、チロシン残基上のフェノール官能基であるチロシンキナーゼは、重要な生体シグナル伝達効果を発揮するためにリン酸化され得る。チロシンキナーゼファミリーのメンバーは、細胞の増殖、移動および分化を制御する。異常なキナーゼ活性は、癌、自己免疫疾患、および炎症性疾患を含む多くのヒト疾患と密接に関連していることが示されている。
【０００３】
ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）は、細胞質非受容体型チロシンキナーゼであり、ＴＥＣキナーゼファミリー（全５メンバーＢＴＫ、ＴＥＣ、ＩＴＫ、ＴＸＫ、およびＢＭＸを含む）の一メンバーである。ＢＴＫ遺伝子は、Ｘ染色体上のＸｑ２１．３３−Ｘｑ２２に位置し、全部で３７．５ｋｂのゲノムＤＮＡにわたる１９のエキソンを有する。
【０００４】
ＢＴＫは、ほとんど総ての造血細胞（Ｔ細胞および形質細胞を除く）で発現され、特に、Ｂリンパ球の発生、分化、シグナル伝達および生存に不可欠な役割を果たす。Ｂ細胞はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を介して活性化され、ＢＴＫはＢＣＲシグナル伝達経路に重要な役割を果たす。Ｂ細胞上のＢＣＲの活性化は、ＢＴＫの活性化を引き起こし、これは次に下流ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）濃度の上昇をもたらし、ＩＰ３およびＤＡＧシグナル伝達経路を活性化する。このシグナル伝達経路は、細胞増殖、接着および生存を促進し得る。ＢＴＫ遺伝子の突然変異は、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）として知られるまれな遺伝性のＢ細胞特異的免疫不全疾患をもたらす。この疾患では、ＢＴＫの機能が阻害され、Ｂ細胞の産生または成熟の遅延が起こる。ＸＬＡ疾患に罹患している人は体内にＢ細胞がほとんど無く、循環抗体が少なく、重篤なまたはさらには致死的な感染を起こしやすい。このことは、ＢＴＫがＢ細胞の増殖および分化に極めて重要な役割を果たすことを強く証明する。
【０００５】
小分子ＢＴＫ阻害剤は、ＢＴＫと結合し、ＢＴＫの自己リン酸化を阻害し、ＢＴＫの活性化を妨げることができる。これはＢＣＲ経路を介したシグナル伝達を遮断し、Ｂリンパ腫細胞の増殖を阻害し、腫瘍細胞の接着を破壊し、腫瘍細胞のアポトーシスを促進し、アポトーシスを誘導することができる。このことはＢＴＫをＢ細胞関連癌、特に、Ｂ細胞リンパ腫ならびに非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および再発性または難治性マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）などの白血病において魅力的な薬物標的とする。
【０００６】
Ｂ細胞リンパ腫および白血病を阻害することに加えて、ＢＴＫ阻害剤は、自己抗体およびＢ細胞のサイトカインの産生を阻害することもできる。自己免疫疾患では、Ｂ細胞は、自己抗原を提示し、Ｔ細胞の炎症誘発因子の活性化および分泌を促進し、これが組織損傷を引き起こし、多数の抗体を産生するようにＢ細胞を活性化し、それにより自己免疫応答を誘発する。Ｔ細胞とＢ細胞の相互作用はフィードバック調節鎖を構成し、制御を欠いた自己免疫応答および組織病理学的損傷の増悪を招く。従って、ＢＴＫは、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、およびアレルギー性疾患（例えば、食道炎などの疾患）などの自己免疫疾患の治療のための薬物標的として働き得る。
【０００７】
加えて、ＢＴＫ阻害剤は、化学療法薬または免疫チェックポイント阻害剤と併用でき、臨床試験において複数の固形腫瘍に対してより良好な治療効果を示すことも報告されている。
【０００８】
現在市販されている薬剤の中で、イブルチニブはＰｈａｒｍａｃｙｃｌｉｃｓとＪｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎにより共同開発された不可逆的ＢＴＫ阻害剤であり、それぞれ２０１３年１１月と２０１４年２月にマントル細胞リンパ球（ＭＣＬ）および慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）の治療のためにＦＤＡにより承認された。イブルチニブは、ＢＴＫ中のシステイン上のチオール基と反応させ、共有結合を形成することでＢＴＫ酵素を不活化し、それによりその治療効果を達成する「ブレイクスルー」新薬としてＦＤＡにより設計されたものである。しかしながら、イブルチニブは、投与の際に容易に代謝され（代謝酵素により二水酸化産物へと酸化代謝されるか、または他のチオール含有酵素、システイン、グルタチオンなどの作用により不活化される）、それにより治療効果に影響を及ぼす。臨床投与用量は１日当たり５６０ｍｇに達する可能性があり、これは患者の負担を増す。加えて、イブルチニブはまた、ＢＴＫ以外のいくつかのキナーゼにいくらかの阻害効果を持ち、特に、ＥＧＦＲの阻害は、発疹、下痢およびその他のなどのより重篤な有害反応を引き起こし得る。よって、当技術分野では、より有効、選択的で、かつ、関連疾患の治療に良好な薬物動態特性を有する新たなクラスのＢＴＫ阻害剤を開発する必要がなお存在する。
【発明の概要】
【０００９】
以下は本願で詳細に説明される対象の概要であるが、請求の範囲を限定するものではない。
【００１０】
本発明者らは、タンパク質キナーゼＢＴＫの有効、安全かつ高選択性の阻害剤である新規な５−アミノピラゾールカルボキサミド誘導体のクラスを開発した。
【００１１】
本発明の実施態様は、新規な５−アミノピラゾールカルボキサミド誘導体を提供する。それはシステインとのその反応性を変更することによって標的とのその親和性を改善し、それによりその有効性、選択性および安全性を改善する新規な共有結合性の阻害剤である。
【００１２】
本発明の実施態様はまた、上記誘導体の製造方法も提供する。
【００１３】
本発明の実施態様はまた、上記誘導体を含んでなる医薬組成物も提供する。
【００１４】
本発明の実施態様はまた、上記誘導体の使用も提供する。
【００１５】
具体的には、本発明の実施態様では、本発明は、式（Ｉ）により表される新規な５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物：
【化１】
2019519521.tif 000003
［式中、
ｎおよびｍは、０、１または２から独立に選択され；
Ｌは、Ｏ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ２−、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＮＨまたはＳ（Ｏ）２であり； 
Ａは、置換もしくは非置換複素環、置換もしくは非置換ベンゼン環、または置換もしくは非置換ヘテロアリール環から選択され、かつ、母核およびＬへのその結合部位は任意に選択されてよく；
Ｂは、置換もしくは非置換脂肪族環、置換もしくは非置換複素環、置換もしくは非置換ベンゼン環、または置換もしくは非置換ヘテロアリール環から独立に選択され、かつ、Ｌへのその結合部位は任意に選択されてよく；
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に水素、Ｃ１−Ｃ４アルキル、ハロゲン、およびシアノから選択され、またはＲ１およびＲ２はそれらが結合する炭素原子と一緒に３員または４員炭素環を形成し、またはＲ１およびＲ２は一緒になってオキソ基を形成し；
Ｙは、シアノ、
【化２】
2019519521.tif 000004
から選択され；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に、水素、非置換Ｃ１−Ｃ４アルキル、ヒドロキシ置換Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシＣ１−４アルキル、ハロゲン、シアノ、または−（ＣＨ２）ｑＮ（ＲａＲｂ）から選択され、ここで、ｑは１、２、３、または４であり、かつ、ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、水素、および非置換Ｃ１−Ｃ４アルキルから選択され；
ただし、Ｒ１およびＲ２の一方が水素であって他方がメチルである場合、Ｙはシアノであり、Ａはベンゼン環であり、ＬはＯであり、ｍは１であり、かつ、ｎは２であり、Ｂは置換もしくは非置換ベンゼン環でなく；Ｒ１およびＲ２の両方が水素である場合、Ａはベンゼン環であり、ｍは１であり、かつ、ｎは２であり、Ｂは置換もしくは非置換ベンゼン環、または置換もしくは非置換ピリジン環でなく；Ｒ１およびＲ２の両方が水素である場合、Ａはピリジン環であり、ｍは１であり、かつ、ｎは２であり、Ｂは置換もしくは非置換ベンゼン環でなく；Ｒ１およびＲ２の両方が水素である場合、Ａはベンゼン環であり、ＬはＯであり、ｍは１であり、かつ、ｎは１であり、Ｂは置換もしくは非置換ベンゼン環でない］
またはその立体異性体、互変異性体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを提供する。
【００１６】
本発明の一つの実施態様では、本発明は、ｎおよびｍが０、１、または２から独立に選択され；ＬがＯ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−ＣＨ２−、ＮＨまたはＳ、より好ましくは、Ｏ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、またはＮＨである、式（Ｉ）の５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物を提供する。
【００１７】
本発明の一つの実施態様では、本発明は、Ａが置換もしくは非置換複素環、置換もしくは非置換ベンゼン環、または置換もしくは非置換ヘテロアリール環から選択され、かつ、母核およびＬへのその結合部位は任意に選択されてよく；Ｂが置換もしくは非置換脂肪族環、置換もしくは非置換複素環、置換もしくは非置換ベンゼン環、または置換もしくは非置換ヘテロアリール環から独立に選択され、かつ、Ｌへのその結合部位が任意に選択されてもよく；ここで、
前記置換ベンゼン環は、フェニル基上の任意の位置が水素、メチル、メトキシ、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシルおよびシアノ基からなる群から選択される置換基で置換されていてもよい(optionally substituent)ことを意味し；好ましくは、前記置換ベンゼン環は、フルオロ置換フェニル基、またはクロロ置換フェニル基、より好ましくは、２，４−ジフルオロフェニル基、または４−クロロフェニル基であり；
前記非置換ヘテロアリール環は、フラン、ピロール、チオフェン、オキサゾール、イソキサゾール、ピラゾール、イミダゾール、チアゾール、イソチアゾール、オキサジアゾール、トリアゾール、チアジアゾール、テトラゾリウム、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、またはトリアジンを意味し；かつ、前記置換ヘテロアリール環は、任意の位置に水素、メチル、メトキシル、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシルおよびシアノからなる群から選択される任意の置換基を有する上記の基を意味し；より好ましくは、前記置換ピリジンは、クロロピリジン、特に好ましくは、４−クロロ−ピリジン−２−イルであり；
非置換脂肪族環は、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、またはシクロオクタンを意味し；前記置換脂肪族環は、任意の位置に水素、メチル、メトキシル、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシおよびシアノからなる群から選択される任意の置換基を有する上記の基を意味し；
前記非置換複素環は、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロピロール、ピペリジン、
【化３】
2019519521.tif 000005
を意味し、ここで、ｗは、０、１または２から選択され；前記置換複素環は、任意の位置に水素、メチル、メトキシ、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシおよびシアノからなる群から選択される任意の置換基を有する上記の基を意味する、
式（Ｉ）の５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物を提供する。
【００１８】
本発明の一つの実施態様では、本発明は、好ましくは、Ｒ１およびＲ２の両方が水素であるか、またはそのうち一方が水素であって他方がＣ１−Ｃ４アルキル基（メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、またはｔ−ブチル）であるか、またはＲ１およびＲ２はそれらが結合する炭素原子と一緒にシクロプロピル基を形成し；より好ましくは、Ｒ１およびＲ２の両方が水素であるか、またはそのうち一方が水素であって他方がメチルであるか、またはＲ１およびＲ２はそれらが結合する炭素原子と一緒にシクロプロピル基を形成する、式（Ｉ）の５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物を提供する。
【００１９】
本発明の好ましい実施態様では、本発明は、式（ＩＩ）により表される５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物：
【化４】
2019519521.tif 000006
［式中、
Ｌ、Ａ、ＢおよびＹは、上記式（Ｉ）と同様に定義され；
ただし、Ａがベンゼン環である場合、Ｂは置換もしくは非置換ベンゼン環、または置換もしくは非置換ピリジン環でなく；Ａがピリジン環である場合、Ｂは置換もしくは非置換ベンゼン環でない］
またはその立体異性体、互変異性体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを提供する。
【００２０】
本発明のより好ましい実施態様では、本発明により提供される式（ＩＩ）の５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物は、以下の化合物：
【化５】
2019519521.tif 000007
のうちの１つであり、
式（ＩＩ−１）または（ＩＩ−２）中のＬ、ＢおよびＹは上記式（Ｉ）と同様に定義され；
ただし、Ｂは置換もしくは非置換ベンゼン環、または置換もしくは非置換ピリジン環でない。
【００２１】
本発明の好ましい実施態様では、本発明は、（式ＩＩＩ）により表される５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物：
【化６】
2019519521.tif 000008
［式中、Ｌ、Ａ、ＢおよびＹは上記式（Ｉ）と同様に定義され；
ただし、Ｙがシアノ基であり、Ａがベンゼン環であり、かつ、ＬがＯである場合、Ｂは置換もしくは非置換ベンゼン環でない］
またはその立体異性体、互変異性体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを提供する。
【００２２】
本発明のより好ましい実施態様では、本発明により提供される式（ＩＩＩ）の５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物は、以下
【化７】
2019519521.tif 000009
のうちの１つであり、
式（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＩＩ−３）および（ＩＩＩ−４）中のＬ、ＢおよびＹは上記式（Ｉ）と同様に定義され；
ただし、Ｙがシアノ基であり、かつ、ＬがＯである場合、Ｂは置換もしくは非置換ベンゼン環でない。
【００２３】
本発明の好ましい実施態様では、本発明は、式（ＩＶ）により表される５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物：
【化８】
2019519521.tif 000010
［式中、Ｌ、Ａ、Ｂ、およびＹは上記式（Ｉ）に定義される］
またはその立体異性体、互変異性体、薬学的に許容可能な塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグを提供する。
【００２４】
本発明のより好ましい実施態様では、本発明により提供される式（ＩＶ）の５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物は、以下の化合物：
【化９】
2019519521.tif 000011
のうちの１つであり、
式（ＩＶ−１）または（ＩＶ−２）中のＬ、ＢおよびＹは上記式（Ｉ）と同様に定義される。
【００２５】
本発明のより好ましい実施態様では、本発明は、
ＬがＯであり；
Ｂが
【化１０】
2019519521.tif 000012
であり；かつ
Ｙが−ＣＮ、
【化１１】
2019519521.tif 000013
であり、ここで、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はそれぞれ独立に、水素、非置換Ｃ１−Ｃ４アルキル、ヒドロキシ置換Ｃ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシＣ１−Ｃ４アルキル、ハロゲン、シアノまたは−（ＣＨ２）ｑＮ（ＲａＲｂ）から選択され、ここで、ｑは１、２、３、または４であり、かつ、ＲａおよびＲｂはそれぞれ独立に、水素、または非置換Ｃ１−Ｃ４アルキルから選択される、
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩ−１）、（ＩＩ−２）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ−１）、（ＩＩＩ−２）、（ＩＩＩ−３）、（ＩＩＩ−４）、（ＩＶ）、（ＩＶ−１）、または（ＩＶ−２）の化合物を提供する。
【００２６】
本発明の特定の好ましい実施態様では、本発明により提供される５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物は、以下の化合物：
【化１２】
2019519521.tif 000014
2019519521.tif 000015
2019519521.tif 000016
2019519521.tif 000017
2019519521.tif 000018
から選択されるものである。
【００２７】
本発明の実施態様では、用語「薬学的に許容可能な塩」は、薬学的に許容可能な酸付加塩または薬学的に許容可能な塩基付加塩を指す。
【００２８】
用語「薬学的に許容可能な酸付加塩」は、その他の副作用なく、遊離塩基の生物学的有効性を保持することができる無機酸または有機酸を伴って形成される塩を指す。無機酸塩としては、限定されるものではないが、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、およびリン酸塩などが含まれ；有機酸塩としては、限定されるものではないが、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびサリチル酸塩などが含まれる。これらの塩は、当技術分野で公知の方法によって作製することができる。
【００２９】
用語「薬学的に許容可能な塩基付加塩」は、その他の副作用なく、遊離酸の生物学的有効性を保持することができる塩を指す。これらの塩は、遊離酸に無機塩基または有機塩基を付加することによって作製される。無機塩基から誘導される塩としては、限定されるものではないが、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩などが含まれる。有機塩基から誘導される塩としては、限定されるものではないが、アンモニウム塩、トリエチルアミン塩、リシン塩、およびアルギニン塩などが含まれる。これらの塩は、当技術分野で公知の方法によって作製することができる。
【００３０】
本発明の実施態様では、用語「溶媒和物」は、溶媒を伴って本発明の化合物により形成される複合体を指す。溶媒和物は、溶媒中で反応させるか、または溶媒から沈澱もしくは結晶化させることによって得られる。例えば、水を伴って形成された複合体は「水和物」と呼ばれる。
【００３１】
本発明の実施態様では、本発明の化合物は、１以上のキラル中心を含んでなってもよく、異なる光学的に活性な形態で存在し得る。１つのキラル中心を含んでなる場合、化合物はその鏡像異性体を含んでなる。本発明は、これら２種の異性体およびそれらの混合物、例えば、ラセミ混合物を包含する。鏡像異性体は、結晶化およびキラルクロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の方法によって分割することができる。式（Ｉ）の化合物が２つ以上のキラル中心を含んでなる場合、ジアステレオマーが存在し得る。本発明の実施態様は、いずれの特定の分割された光学的に純粋な異性体ならびにジアステレオマーの混合物も包含する。ジアステレオマーは、結晶化および分取クロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の方法によって分割することができる。
【００３２】
本発明の実施態様では、プロドラッグは、親化合物が既知のアミノ保護基またはカルボキシ保護基を生理学的条件下で加水分解するか、または酵素反応により遊離させるかによって得られ得ることを意味する。特定のプロドラッグ製造法として、Saulnier, MG; Frennesson, DB; Deshpande, MS; Hansel, S. B and Vysa, DM Bioorg. Med. Chem Lett. 1994, 4, 1985-1990. Greenwald, RB; Choe , YH; Conover, CD; Shum, K.; Wu, D.; Royzen, MJ Med. Chem. 2000, 43, 475を参照することができる。
【００３３】
第２の面において、本発明は、上記式（Ｉ）により表される５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物の製造方法であって、
（１）式（Ｖ）の化合物と式（ＶＩ）の化合物とを反応させて式（ＶＩＩ）の化合物を提供する工程；
【化１３】
2019519521.tif 000019
（２）式（ＶＩＩ）の化合物を加水分解して式（ＶＩＩＩ）の化合物を与える工程；
【化１４】
2019519521.tif 000020
（３）式（ＶＩＩＩ）の化合物から保護基ＰＧを除去して式（ＩＸ）の化合物を提供する工程；
【化１５】
2019519521.tif 000021
（４）式（ＩＸ）の化合物と式（Ｘ）の化合物とを反応させて式（Ｉ）の化合物を提供する工程
【化１６】
2019519521.tif 000022
を含んでなる方法を提供する。
【００３４】
上記式（Ｖ）、式（ＶＩ）、式（ＶＩＩ）、式（ＶＩＩＩ）、式（ＩＸ）および式（Ｘ）の置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｌ、Ａ、Ｂ、Ｙ、ならびにｎおよびｍは上記式（Ｉ）に関してと同義であり、ＰＧはアミノ保護基（好適なアミノ保護基としては、アシル（例えば、アセチル）、カルバミン酸基（例えば、２’，２’，２’−トリクロロエトキシカルボニル、Ｃｂｚ（ベンジルオキシカルボニル）またはＢＯＣ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル））およびアリールアルキル（例えば、Ｂｎ（ベンジル）が含まれる）であり、これらは加水分解（例えば、ジオキサン中塩化水素の溶液またはジクロロメタン中トリフルオロ酢酸の溶液などの酸の使用）または還元（例えば、ベンジルもしくはベンジルオキシカルボニルの水素化分解または酢酸中での亜鉛還元性を使用する）２’，２’，２’−トリクロロエトキシカルボニルの還元的除去）により除去され得る。他の好適なアミノ保護基としては、トリフルオロアセチル（−ＣＯＣＦ３）（アルカリ触媒加水分解により除去され得る）、ベンジルオキシカルボニルまたはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基が含まれ、T. W. Greene 'Protective Groups in Organic Synthesis' (第4版, J. Wiley an and Sons, 2006))を参照することができ、Ｒ３はＣ１−Ｃ４アルキル基（好ましくは、エチル）であり、かつ、Ｘはクロロ、ブロモまたはヒドロキシルである。
【００３５】
本発明の実施態様では、本発明は、上記式（Ｉ）により表される５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物の製造方法を提供し、ここで、式（ＶＩ）の化合物は以下のように得ることができる：
【化１７】
2019519521.tif 000023
上記化合物中の置換基Ｒ４は、Ｃ１−Ｃ４アルキル（好ましくは、メチル）であり；Ｘは、クロロまたはブロモ、好ましくは、クロロであり；かつ、Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ４アルキル（好ましくは、エチル）であり；Ｌ、ＡおよびＢは、式（Ｉ）の化合物に関するものと同様に定義される。
【００３６】
より具体的には、以下の合成経路に従い得る。
【化１８】
2019519521.tif 000024
【００３７】
本発明の実施態様では、本発明は、上記式（Ｉ）により表される５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物の製造方法を提供し、ここで、式（Ｖ）の化合物は以下の方法を参照して製造することができる。
【化１９】
2019519521.tif 000025
【００３８】
本発明の実施態様では、本発明はまた、限定されるものではないが、
【化２０】
2019519521.tif 000026
（式中、Ｂｏｃはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基であり、かつ、Ｃｂｚはベンジルオキシカルボニル基である）
を含む、上記５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物の合成の中間化合物も提供する。
【００３９】
第３の面では、本発明は、有効用量の、本発明の上記実施態様による上記５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物、またはそれらの立体異性体、互変異性体、溶媒和物または薬学的に許容可能な塩のうち１以上を含んでなる医薬組成物を提供する。医薬組成物は薬学的に許容可能な補助物質をさらに含んでなる。
【００４０】
本発明の医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル、ミクロスフェアおよびエアロゾルなどの固体、半固体、液体または気体処方物に処方することができる。
【００４１】
本発明の医薬組成物は、製薬分野で周知の方法によって製造することができる。例えば、The Science and Practice of Pharmacy, 第20版 (Philadelphia College of Pharmacy and Science, 2000)参照。
【００４２】
本発明の医薬組成物の投与経路としては、限定されるものではないが、経口投与、局所投与、経皮投与、筋肉内投与、静脈内投与、吸入投与、非経口投与、舌下投与、直腸投与、膣投与、および鼻腔内投与が含まれる。例えば、経口投与の好適な投与形としては、カプセル剤、錠剤、顆粒、およびシロップなどが含まれる。これらの製剤中に含有される本発明の式（Ｉ）の化合物は、固体粉末または顆粒；水性または非水性液中の溶液または懸濁液；油中水型または水中油型エマルションなどが含まれる。上記投与形は、有効化合物と１以上の担体または賦形剤から従来の製薬方法によって製造することができる。これらの担体は有効化合物または他の補助物質と適合する必要がある。固体処方物の場合、一般的な非毒性担体としては、限定されるものではないが、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、セルロース、グルコース、およびスクロースなどが含まれる。液体製剤用の担体としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水、水性デキストロース、エチレングリコール、およびポリエチレングリコールなどが含まれる。有効化合物は上記担体を伴って溶液または懸濁液を形成し得る。特定の投与様式および投与形は、化合物それ自体の物理化学的特性、ならびに治療される疾患の重篤度などによって異なる。当業者は、自分自身の知識と組み合わせて上記の因子に基づき特定の投与経路を決定することができる。例えば、Li Jun, "Clinical Pharmacology", People's Health Publishing House, 2008.06; Ding Yufeng, Disscussion on clinical dosage form factors and drug rational use in hospital, Herald of Medicine, 26 (5), 2007; Howard C. Ansel, Loyd V. Allen, Jr., Nicholas G. Popovich (編), Jiang Zhiqiang (訳), “Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems”, China Medical Science Press, 2003.05参照。
【００４３】
本発明の実施態様における医薬組成物は、単位用量当たりに所定量の有効成分を含有する単位投与形で提供することができる。好ましい単位用量組成物は、一日用量もしくは部分用量、またはその適当な画分の有効成分を含有するものである。よって、このような単位用量は、１日に２回以上投与することができる。好ましい単位用量組成物は、本明細書の上記に記載したように、一日用量もしくは部分用量（１日２回以上の投与）、またはその適当な画分を含有するものである。
【００４４】
本発明の実施態様による医薬組成物は、診療ガイドラインに従って処方、定量、および投与される。本発明の実施態様による化合物の「治療上有効な量」は、治療される特定の病態、治療される個体、病態の原因、薬物の標的、および投与様式などによって決定される。一般に、非経口投与のための用量は、１〜２００ｍｇ／ｋｇであってよく、経口投与のための用量は１〜１０００ｍｇ／ｋｇであってよい。
【００４５】
本明細書で提供される有効用量の範囲は、本発明の範囲を限定するものではなく、好ましい用量範囲を示すことを意図する。しかしながら、最も好ましい用量は、当業者により認識され決定され得るように、個々の対象に対して調節可能である（例えば、Berkow, et al., The Merck Manuals, 16th ed., Merck, Rahway, NJ, 1992参照）。
【００４６】
第４の面では、本発明は、ＢＴＫにより媒介される疾患を予防または治療するための薬剤の製造における、上記５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物またはその立体異性体、互変異性体、溶媒和物もしくは薬学的に許容可能な塩の使用を提供する。
【００４７】
本発明は、本発明の上記５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物またはその立体異性体、互変異性体、溶媒和物もしくは薬学的に許容可能な塩、あるいは本発明の上記５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物またはその立体異性体、互変異性体、溶媒和物もしくは薬学的に許容可能な塩を含んでなる医薬組成物の投与を含んでなる、ＢＴＫ活性を阻害する方法を提供する。
【００４８】
いくつかの実施態様では、生物系は、酵素、細胞、または哺乳動物である。
【００４９】
本発明はまた、治療上有効な量の本発明の上記５−アミノピラゾールカルボキサミド化合物またはその立体異性体、互変異性体、溶媒和物もしくは薬学的に許容可能な塩のうち１以上と免疫調節剤、免疫チェックポイント阻害剤、グルココルチコイド、非ステロイド系抗炎症薬、Ｃｏｘ−２特異的阻害剤、ＴＮＦ−α結合タンパク質、インターフェロン、インターロイキンおよび化学療法薬からなる群から選択される１以上の薬物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、ＢＴＫにより媒介される疾患を予防または治療する方法も提供する。
【００５０】
本発明の実施態様では、ＢＴＫにより媒介される疾患としては、自己免疫疾患、炎症性疾患、異種免疫病態または疾患、血栓塞栓性疾患、および癌が含まれる。いくつかの特定の実施態様では、癌は、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、急性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、マントル細胞リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、ワルデンストロームマクログロブリン血症、または固形腫瘍を含んでなる。いくつかの特定の実施態様では、自己免疫疾患および炎症性疾患は、関節リウマチ、骨関節炎、若年性関節炎、慢性閉塞性肺疾患、多発性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、乾癬、乾癬性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、および過敏性腸症候群からなる群から選択される。いくつかの特定の実施態様では、異種免疫病態または疾患は、移植片対宿主病、移植、輸血、アレルギー反応、アレルギー、Ｉ型過敏症、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎またはアトピー性皮膚炎を含んでなる。
【００５１】
本発明により提供される上記５−アミノピラゾリルカルボキサミド化合物は、タンパク質キナーゼＢＴＫの有効かつ安全な阻害剤である。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
添付の図面は本発明の例をさらに説明するために示され、本明細書の一部を構成する。図面および発明の詳細な説明を参照する以下の本発明の実施態様の詳細は、本発明の実施態様を限定するものではない。
図１は、本発明の化合物はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株ＴＭＤ−８のｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖を有意に阻害し、対照化合物イブルチニブと同等の抗腫瘍効果を示すことを示す。
【発明の具体的説明】
【００５３】
本発明の実施態様を以下に詳細に記載する。下記のような本明細書に含まれる実験、合成方法、および中間体の特定の例は本願の例示であり、本願の範囲を限定するものではないと理解されるべきである。矛盾のない場合、本願の例およびその中の特徴は互いに任意の組み合わせてもよいことに留意されたい。
【００５４】
本発明の例で使用される出発材料は、試薬供給者から購入されるか、または既知の原料から当技術分野で周知の方法によって製造される。特に断りのない限り、以下の条件が本明細書の例に適用される。
【００５５】
温度単位はセ氏（℃）であり；室温は１８〜２５℃と定義される；
有機溶媒は、無水硫酸マグネシウムまたは無水硫酸ナトリウムで乾燥させ；ロータリーエバポレーターを用い、減圧および高温下（例えば、１５ｍｍＨｇ、３０℃）で回転乾燥させる；
２００〜３００メッシュのシリカゲルがフラッシュカラムクロマトグラフィーの担体として使用され、ＴＬＣは薄層クロマトグラフィーを表す；
通常、反応の進行は、ＴＬＣまたはＬＣ−ＭＳによりモニタリングされる；
最終生成物の同定は、核磁気共鳴（Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ３００、３００ＭＨｚ）およびＬＣ−ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ  ｅｓｑｕｉｎｅ  ６０００、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズ）により行われる。
【実施例】
【００５６】
実施例１
５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（１−シアノ−６−メチルピペリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４００）の製造
【化２１】
2019519521.tif 000027
【００５７】
工程１．  ６−メチルピペリジン−３−オールの製造
５−ヒドロキシ−２−メチルピリジン（１ｇ、９ｍｍｏｌ）を酢酸（２０ｍＬ）に溶かした後、二酸化白金（０．２５ｇ）を加えた。反応混合物を５０ｐｓｉの圧力下、水素雰囲気中で一晩振盪した。溶液を濾過し、回転乾燥させて粗生成物６−メチルピペリジン−３−オールを得た。
【００５８】
工程２．  ５−ヒドロキシ−２−メチルピペリジン−１−カルボン酸ベンジルの製造
６−メチルピペリジン−３−オールをジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶かした後、トリエチルアミン（７．５当量）、次いで、塩化ベンジルオキシカルボニル（２ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）を滴下した。反応は１６時間撹拌した後に完了した。この反応溶液を回転乾燥させ、残渣を、シリカカラムを用いて精製し、目的生成物５−ヒドロキシル−２−メチルピペリジン−１−カルボン酸ベンジル（無色の油状物、６０％）を得た。
【００５９】
工程３．  ２−メチル−５−オキソピペリジン−１−カルボン酸ベンジルの製造
５−ヒドロキシ−２−メチルピペリジン−１−カルボン酸ベンジル（１ｇ、３．９６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶かし、０℃に冷却し、デス・マーチン試薬（１当量）を加えた。反応物を０℃で１時間、次いで、室温で５時間撹拌した。反応物を飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液で注意深く急冷した後、水およびジクロロメタンで希釈した。有機層を保持し、飽和ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。有機層を濃縮した後、得られた粗生成物２−メチル−５−オキソピピリジン−１−カルボン酸ベンジルをそれ以上精製せずにそのまま次の工程で使用した。
【００６０】
工程４．  （５Ｅ）−５−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラゾノ］−２−メチルピペリジン−１−カルボン酸ベンジルの製造
２−メチル−５−オキソピペリジン−１−カルボン酸ベンジル（２．００ｇ、８．０９ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶かした後、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジン（１．２当量）を室温で加えた。反応物を２．５時間還流した。次に、溶媒を蒸発させ、粗生成物（５Ｅ）−５−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラゾノ］−２−メチルピペリジン−１−カルボン酸ベンジルを白色固体として得た。
【００６１】
工程５．  ５−［２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジノ］−２−メチルピペリジン−１−カルボン酸ベンジルの製造
（５Ｅ）−５−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラゾノ］−２−メチルピペリジン−１−カルボン酸ベンジル（１．２ｇ、４ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）に溶かした後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（１当量）を室温で加えた後、テトラヒドロフラン中ｐ−トルエンスルホン酸一水和物（１当量）の溶液（２ｍＬ）を滴下した。反応溶液を室温で２０時間撹拌した。反応溶液を減圧下で濃縮し、酢酸エチル（１００ｍＬ）を加え、これを飽和重炭酸ナトリウム水溶液、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液、水および飽和ブラインで順次洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。溶液を濃縮した後、粗生成物５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）ヒドラジノ］−２−メチルピペリジン−１−カルボン酸ベンジルを白色固体として得た。
【００６２】
工程６．  ５−ヒドラジノ−２−メチルピペリジン−１−カルボン酸ベンジルの製造
５−［２−（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）ヒドラジノ］−２−メチルピペリジン−１−カルボン酸ベンジル（１．７８ｇ、４．９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶かした後、トリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を室温で滴下した。反応溶液を室温で５時間撹拌した。反応溶液を濃縮し、淡黄色の粗生成物５−ヒドラジノ−２−メチルピペリジン−１−カルボン酸ベンジルを得た。
【００６３】
工程７．  ４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）安息香酸メチルの製造
４−ヒドロキシ安息香酸メチル（６．５ｇ、４９ｍｍｏｌ）、５−クロロ−２−フルオロピリジン（５．０ｇ、３３ｍｍｏｌ）および炭酸セシウム（２０ｇ、６５ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルアミド(N,N-dimethyl foramide)（５０ｍＬ）に溶かした。反応溶液を１１０℃で１２時間還流し、反応の完了を薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝５：１）によりモニタリングし、溶媒を回転乾燥させた。粗化合物を酢酸エチル（２５０ｍＬ）と水（２５０ｍＬ）とで分液した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗化合物を精製し、カラムクロマトグラフィーにより分離し、生成物４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）安息香酸メチル（９．０ｇ、９３％）を得た。
MS: m/z 264.2 [M+1]
【００６４】
工程８．  ４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）安息香酸の製造
４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）安息香酸メチル（６．５ｇ、４９ｍｍｏｌ）をメタノール（１００ｍＬ）および水（５ｍＬ）に溶かした。この反応系に水酸化リチウム（２．３ｇ）を加えた。反応溶液を４５℃で１２時間反応させ、薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝１：１）を用いて反応の完了をモニタリングし、溶媒を回転乾燥させた粗化合物を希塩酸（１００ｍＬ、１Ｍ）に加えてｐＨを７に調整した。この時、実質量の固体が生成し、これらの固体を濾過し、炉で乾燥させて生成物４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）安息香酸（６．５ｇ、白色固体として、８４％）を得た。
MS: m/z 250.1 [M+1]
【００６５】
工程９．  塩化４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）ベンゾイルの製造
４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）安息香酸（６．５ｇ、２３ｍｍｏｌ）を塩化チオニル（２０ｍＬ）に加えた。反応溶液を８０℃で３時間反応させ、薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝３：１）を用いて反応の完了をモニタリングし、溶媒を回転乾燥させた。粗生成物塩化４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）ベンゾイル７ｇ、黄色固体として）をそのまま次の工程で使用した。
【００６６】
工程１０．  ２−（（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）（ヒドロキシ）メチレン）マロノニトリルの製造
０℃の条件で、マロノニトリル（３．７２ｇ、５６．４ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶かした後、水素化ナトリウム（３．６ｇ、９０ｍｍｏｌ、６０％）をゆっくり加えた。添加が完了した後、反応物を１時間撹拌しながら室温まで温め、次いで、０℃に冷却した。塩化４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）ベンゾイル（６ｇ、２２．２ｍｍｏｌ）を無水テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶かし、上記反応溶液をゆっくり滴下した。滴下工程の完了後、反応溶液を０℃で１時間撹拌した。薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝３：１）を用いて反応の完了をモニタリングし、新たなスポットが生成された。反応溶液を飽和塩化アンモニウム（１００ｍＬ）で急冷し、ＥｔＯＡｃで３抽出した（１００ｍＬ×３）。有機相を飽和ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、回転乾燥させた。粗化合物を石油エーテル：酢酸エチル＝５０：１で混練し、２−（（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）（ヒドロキシ）メチレン）マロノニトリル（８．０ｇ、淡黄色固体として、８２％）を得た。
MS: m/z 298 [M+1]
【００６７】
工程１１．  ２−（（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）（エトキシ）メチレン）マロノニトリルの製造
２−（（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）（ヒドロキシ）メチレン）マロノニトリル（５．０ｇ、１６．８ｍｍｏｌ）をオルトギ酸トリエチル（５０ｍＬ）に加え、反応物を１２時間撹拌しながら８０℃まで温めた。薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝３：１）は生成物の生成を示した。反応溶液を濾過し、濾液を回転乾燥させて(rptary dried)固体を得、これをメタノールで混練し、２−（（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）（エトキシ）メチレン）マロノニトリル（１．５ｇ、白色生成物として、２７．７％）を得た。
MS: m/z 326.0 [M+1]
【００６８】
工程１２．  ５−（５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−４−シアノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−２−メチルピペリジン−１−カルボン酸ベンジルの製造
２−（（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）（エトキシ）メチレン）マロノニトリル（１．０ｇ、３．０９ｍｍｏｌ）、５−ヒドラジノ−２−メチルピペリジン−１−カルボン酸ベンジル（１．２８ｇ、３．７１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．５６ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）をエタノール（２０ｍＬ）に溶かした。反応溶液を  ２５℃で１２時間反応させ、反応の完了を薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝２：１）によりモニタリングし、反応を水で急冷し、酢酸エチル（２５ｍＬ＊３）で抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、回転乾燥させた。粗化合物を石油エーテル：酢酸エチル＝５０：１で２回混練し、生成物５−（５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−４−シアノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−２−メチルピペリジン−１−カルボン酸ベンジル（１．５ｇ、８８％）を得た。
MS: m/z 555.2 [M+1]
【００６９】
工程１３．  ５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（６−メチルピペリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミドの製造
５−（５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−４−シアノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−２−メチルピペリジン−１−カルボン酸ベンジル（７５０ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）を室温で９０％濃硫酸に加え（１０分かけて）、１５分間撹拌した後、反応物を２４時間３０℃に温めた。薄層クロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）を用いて反応が完了したことを検出し、反応溶液をアンモニア水（５０ｍｌ）にゆっくり注ぎ、ｐＨ＝７に調整し、酢酸エチルで３回抽出した（３０ｍＬ＊３）。合わせた有機相を飽和ブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、回転乾燥させた。粗化合物をカラムで精製し、５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（６−メチルピペリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（４８０ｍｇ、７８％、淡黄色固体として）を得た。
MS: m/z 439.2 [M+1]
【００７０】
工程１４．  ５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（（３Ｒ，６Ｓ）−１−シアノ−６−メチルピペリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミドの製造
５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（６−メチルピペリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（５０ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に溶かした後、炭酸セシウム（１１０ｍｇ、０．３４２ｍｍｏｌ）および臭化シアノゲン（１２．５ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液を室温で２時間撹拌した。薄層クロマトグラフィーを行って反応の完了を検出した。反応混合物を酢酸エチル（５０ｍＬ）に注ぎ、水（２０ｍＬ＊３）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発乾固した。粗生成物を分取プレート（ジクロロメタン：メタノール＝５０：１）により精製し、生成物５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（１−シアノ−６−メチルピペリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（１５ｍｇ、１５％）を得た。
MS: m/z 452.2 [M+1]
【００７１】
実施例２
５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（（３Ｒ，６Ｓ）−１−シアノ−６−メチルピペリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４０１）の製造
【化２２】
2019519521.tif 000028
【００７２】
実施例２の化合物は、実施例１の工程１４からの生成物のキラル分割から得ることができる。分割条件は、超臨界流体クロマトグラフィー（ＣｈｉｒａｌＰａｋ  ＡＤ  ５μ、２１×２５０ｍｍ  ｃｏｌ、２７％メタノール(metanol)、７０ｍＬ／分）であった。MS: m/z 452.2 [M+1]
【００７３】
実施例３
５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（（３Ｓ，６Ｒ）−１−シアノ−６−メチルピペリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４０２）の製造
【化２３】
2019519521.tif 000029
【００７４】
実施例３の化合物は、実施例１の工程１４からの生成物のキラル分割から得ることができる。分割条件は、超臨界流体クロマトグラフィー（ＣｈｉｒａｌＰａｋ  ＡＤ  ５μ、２１×２５０ｍｍ  ｃｏｌ、２７％メタノール、７０ｍＬ／分）であった。MS: m/z 452.2 [M+1]
【００７５】
実施例４
５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（（３Ｒ，６Ｒ）−１−シアノ−６−メチルピペリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４０３）の製造
【化２４】
2019519521.tif 000030
【００７６】
実施例４の化合物は、実施例１の工程１４からの生成物のキラル分割から得ることができる。分割条件は、超臨界流体クロマトグラフィー（ＣｈｉｒａｌＰａｋ  ＡＤ  ５μ、２１×２５０ｍｍ  ｃｏｌ、２７％メタノール、７０ｍＬ／分）であった。MS: m/z 452.2 [M+1]
【００７７】
実施例５
５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（（３Ｓ，６Ｓ）−１−シアノ−６−メチルピペリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４０４）の製造
【化２５】
2019519521.tif 000031
【００７８】
実施例５の化合物は、実施例１の工程１４からの生成物のキラル分割から得ることができる。分割条件は、超臨界流体クロマトグラフィー（ＣｈｉｒａｌＰａｋ  ＡＤ  ５μ、２１×２５０ｍｍ  ｃｏｌ、２７％メタノール、７０ｍＬ／分）であった。MS: m/z 452.2 [M+1]
【００７９】
実施例６
５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（４−シアノ−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４０５）の製造
【化２６】
2019519521.tif 000032
【００８０】
工程１．  ４−ヒドロキシ酪酸メチルの製造
ジヒドロフラン−２（３Ｈ）−オン（１００ｇ、１．１６３ｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４６０ｇ、４．６５ｍｏｌ）をメタノール溶液（１Ｌ）に加え、反応物を６０℃で２４時間反応させた。薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝２：１）を用いて反応の完了を検出し、反応溶液を回転乾燥させ、４−ヒドロキシ酪酸メチル（１２０ｇ、８７．６％、黄色液体として）得、これをそのまま次の工程で使用した。
【００８１】
工程２．  ４−オキソ酪酸メチルの製造
４−ヒドロキシ酪酸メチル（１２０ｇ、１．０２ｍｏｌ）をジクロロメタン溶液（１．２Ｌ）に加えた後、上記反応溶液にクロロクロム酸ピリジニウム（３３０ｇ、１．５３ｍｏｌ）を加え、反応を室温で１２時間行った。薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝３：１）を用いて反応が完了したことを検出した。反応溶液をセライトで濾過し、回転乾燥させて４−オキソ酪酸メチル（６０ｇ、５０％、黄色液体として）を得、これをそのまま次の工程で使用した。
【００８２】
工程３．  ４−ヒドロキシ−５−ニトロ吉草酸メチルの製造
氷水浴中、４−オキソ酪酸メチル（６０ｇ、０．４６ｍｏｌ）、ニトロメタン（４２ｇ、０．６９ｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（３００ｍＬ）、およびｔｅｒｔ−ブタノール（３００ｍＬ）を反応フラスコに加えた。次に、上記反応系にカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（５ｇ）をゆっくり加え、温度を室温に上げ、２時間反応を行った。薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝３：１）を用いて反応が完了したことを検出し、水（３０ｍＬ）を加えて反応を急冷した。溶媒を回転乾燥させた。水（３００ｍＬ）および酢酸エチル（３００ｍＬ）を液体の分離のために加えた。有機相を飽和ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、回転乾燥させて粗４−ヒドロキシ−５−ニトロ吉草酸メチル（４５ｇ、淡黄色油性液体として）を得、これをそのまま次の工程で使用した。
【００８３】
工程４．  ５−ヒドロキシピペリジン−２−オンの製造
４−ヒドロキシ−５−ニトロペンタン酸メチル（４５ｇ、０．２３ｍｏｌ）およびパラジウム炭素（２．１ｇ）をメタノール溶液（５００ｍＬ）に加え、反応溶液を６０℃、Ｈ２下で２４時間反応させた。薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝１：１）を用いて反応の完了を検出した。反応溶液をセライトで濾過し、濾液を回転乾燥させて５−ヒドロキシピペリジン−２−オン（１０ｇ、黄色固体として、３８％）を得、これをそのまま次の反応で使用した。
【００８４】
工程５．  １−ベンジル−５−（ベンジルオキシ）ピペリジン−２−オンの製造
５−ヒドロキシピペリジン−２−オン（１０ｇ、０．１ｍｏｌ）を室温でジメチルスルホキシド（１００ｍＬ）に加えた後、上記反応系に水素化ナトリウム（１０ｇ、０．２５ｍｏｌ）をゆっくり加えた。添加の完了後、反応溶液に臭化ベンジル（４３．５ｇ、０．２５ｍｏｌ）を加え、一晩撹拌した。薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝１：１）を用いて反応が完了したことを検出した。反応系に飽和塩化アンモニウム水溶液（１００ｍＬ）を加えて反応を急冷した。反応物をＥｔＯＡｃで３回抽出し（１００ｍＬ＊３）、飽和ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、回転乾燥させ、カラムクロマトグラフィーにより精製し、１−ベンジル−５−（ベンジルオキシ）ピペリジン−２−オン（１６ｇ、黄色固体として、５４％）を得た。
【００８５】
工程６．  ４−ベンジル−６−（ベンジルオキシ）−４−アザスピロ［２．５］オクタンの製造
１−ベンジル−５−（ベンジルオキシ）ピペリジン−２−オン（１５ｇ、５０ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気の保護下、−７８℃で無水テトラヒドロフラン（１５０ｍＬ）に溶かした後、この反応フラスコに臭化エチルマグネシウム（１５０ｍＬ）をゆっくり滴下した。滴下工程が完了した後、上記反応系にチタン酸テトラプロピル（４５ｇ、１５０ｍｍｏｌ）を加えた。添加が完了した後、反応物を室温に温め、２時間撹拌した。薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝１０：１）を用いて反応が完了したことを検出した。反応系に飽和塩化アンモニウム水溶液（１００ｍｌ）を加えることにより反応物を急冷し、酢酸エチルで３回抽出し（１００ｍＬ＊３）、飽和ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、回転乾燥させ、カラムクロマトグラフィーにより精製し、４−ベンジル−６−（ベンジルオキシ）−４−アザスピロ［２．５］オクタン（５．１ｇ、黄色固体として、３１％）を得た。
【００８６】
工程７．  ４−アザスピロ［２．５］オクト−６−オールの製造
４−ベンジル−６−（ベンジルオキシ）−４−アザスピロ［２．５］オクタン（５．５ｇ、１８ｍｍｏｌ）およびパラジウム炭素（２ｇ、１．８ｍｍｏｌ）をメタノール（２００ｍＬ）および塩化水素（２ｍＬ）の溶液に加えた。反応溶液をＨ２下、６０℃で４８時間反応させた。薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝１０：１）を用いて反応が完了したことを検出した。反応溶液をセライトで濾過し、濾液を回転乾燥させて４−アザスピロ［２．５］オクト−６−オール（２．５ｇ、黄色固体として）を得、これをそのまま次の工程で使用した。
【００８７】
工程８．  ６−ヒドロキシ−４−アザスピロ［２．５］オクタン−４−カルボン酸ベンジルの製造
４−アザスピロ［２．５］オクト−６−オール（２．５ｇ、２１ｍｍｏｌ）および重炭酸ナトリウム（３．８ｇ、４５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランの溶液（１００ｍＬ）に加えた後、上記反応系に塩化ベンジルオキシカルボニル（４．２５ｇ、２５ｍｍｏｌ）を滴下した。反応溶液を室温で４８時間反応させた。薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝３：１）を用いて反応が完了したことを検出した。反応溶液を抽出し、濾液を回転乾燥させ、カラムクロマトグラフィーにより精製し、６−ヒドロキシ−４−アザスピロ［２．５］オクタン−４−カルボン酸ベンジル（４．２ｇ）を得た。
【００８８】
工程９．  ６−オキソ−４−アザスピロ［２．５］オクタン−４−カルボン酸ベンジルの製造
６−ヒドロキシ−４−アザスピロ［２．５］オクタン−４−カルボン酸ベンジル（４．２ｇ、１６ｍｍｏｌ）および２−ヨードキシ安息香酸（６．７ｇ、２４ｍｍｏｌ）をアセトンの溶液（１００ｍＬ）に加えた。次に、反応溶液を６０℃に温めて１２時間反応させた。薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝２：１）を用いて反応が完了したことを検出し、反応溶液を抽出し、濾液を回転乾燥させ、カラムクロマトグラフィーにより精製し、６−オキソ−４−アザスピロ［２．５］オクタン−４−カルボン酸ベンジル（３．６ｇ、８５％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δppm 7.34-7.35 (m, 5H), 5.15 (s, 2H), 4.07 (s, 2H), 2.55-2.58 (m, 2H), 1.95-1.98 (m, 2H), 1.09-1.11 (m, 2H), 0.85-0.86 (m, 2H)。
【００８９】
工程１０．  （Ｅ）−６−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラゾノ）−４−アザスピロ［２．５］オクタン−４−カルボン酸ベンジルの製造
６−オキソ−４−アザスピロ［２．５］オクタン−４−カルボン酸ベンジル（３．６ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）およびｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルヒドラジン（１．９８ｇ、１５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランの溶液（５０ｍＬ）に加えた。反応溶液を７０℃に温めて２時間反応させた。薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝２：１）を用いて反応が完了したことを検出した。反応溶液を抽出し、濾液を回転乾燥させ、カラムクロマトグラフィーにより精製し、（Ｅ）−６−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラゾノ）−４−アザスピロ［２．５］オクタン−４−カルボン酸ベンジル（５．０ｇ、９０％）を得た。
【００９０】
工程１１．  ６−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジノ）−４−アザスピロ［２．５］オクタン−４−カルボン酸ベンジルの製造
（Ｅ）−６−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラゾノ）−４−アザスピロ［２．５］オクタン−４−カルボン酸ベンジル（５．０ｇ、１３．４ｍｍｏｌ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフランの溶液（１００ｍＬ）に加えた後、上記反応系にｐ−トルエンスルホン酸（３．８ｇ、２０ｍｍｏｌ）を滴下した。反応溶液を室温で３６時間反応させた。薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝１：１）を用いて反応が完了したことを検出した。反応溶液を抽出し、濾液を回転乾燥させ、カラムクロマトグラフィーにより精製し、６−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジノ）−４−アザスピロ［２．５］オクタン−４−カルボン酸ベンジル（４．２ｇ、８０．４％）を得た。
【００９１】
工程１２．  ６−ヒドラジノ−４−アザスピロ［２．５］オクタン−４−カルボン酸ベンジルの製造
６−（２−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ヒドラジノ）−４−アザスピロ［２．５］オクタン−４−カルボン酸ベンジル（４．２ｇ、１１ｍｍｏｌ）を塩化水素／酢酸エチルの溶液（５０ｍＬ）に加えた。反応を室温で１２時間行い、薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝２：１）を用いて反応が完了したことを検出した。反応溶液を抽出し、濾液を回転乾燥させ、カラムクロマトグラフィーにより精製し、６−ヒドラジノ−４−アザスピロ［２．５］オクタン−４−カルボン酸ベンジル（３．５ｇ）を得た。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δppm 7.21-7.35 (m, 10H), 4.46-4.54 (m, 2H), 3.89-3.93 (m, 1H), 3.78-3.81(m, 1H), 3.68-3.73 (m, 1H), 2.86-2.90 (m, 1H), 2.63-2.68 (m, 1H), 2.08-2.12 (m, 1H), 1.57-1.85 (m, 2H), 1.24-1.29 (m, 1H), 0.65 (s, 2H).0.41-0.44 (m, 2H)
【００９２】
工程１３．  ４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）安息香酸メチルの製造
４−ヒドロキシ安息香酸メチル（６．５ｇ、４９ｍｍｏｌ）、５−クロロ−２−フルオロピリジン（５．０ｇ、３３ｍｍｏｌ）および炭酸セシウム（２０ｇ、６５ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）に溶かした。反応溶液を１１０℃で１２時間還流した。薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝５：１）を用いて反応が完了したことを検出し、溶媒を回転乾燥させた。粗化合物を酢酸エチル（２５０ｍＬ）と水（２５０ｍＬ）とで分液した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発乾固した。粗化合物をカラムクロマトグラフィーにより精製し、生成物４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）安息香酸メチル（９．０ｇ、９３％）を得た。
MS: m/z 264.2 [M+1]
【００９３】
工程１４．  ４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）安息香酸の製造
４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）安息香酸メチル（６．５ｇ、４９ｍｍｏｌ）をメタノール（１００ｍＬ）および水（５ｍＬ）に溶かした。次に、反応系に水酸化リチウム（２．３ｇ）を加えた。反応溶液を４５℃で１２時間反応させた。薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝１：１）を用いて反応が完了したことを検出した。溶媒を回転乾燥させた。粗化合物に希塩酸水溶液（１００ｍＬ、１Ｍ）を加えたｐＨ＝７とした。この時、実質量の固体が生成し、これらの固体を濾過し、炉で乾燥させ、生成物４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）安息香酸（６．５ｇ、白色固体として、８４％）を得た。
MS: m/z 250.1 [M+1]
【００９４】
工程１５．  塩化４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）ベンゾイルの製造
４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）安息香酸（６．５ｇ、２３ｍｍｏｌ）をジクロロスルホキシド（２０ｍＬ）に加え、反応溶液を８０℃で３時間反応させた。薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝３：１）を用いて反応が完了したことを検出した。溶媒を回転乾燥させ、粗生成物塩化４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）ベンゾイル（７ｇ、黄色固体として）をそのまま次の工程で使用した。
【００９５】
工程１６．  ２−（（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）（ヒドロキシ）メチレン）マロノニトリルの製造
マロノニトリル（３．７２ｇ、５６．４ｍｍｏｌ）を０℃で無水テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶かした後、水素化ナトリウム（３．６ｇ、９０ｍｍｏｌ、６０％）をゆっくり加えた。添加が完了した後、反応物を室温まで温め、１時間撹拌し、その後、０℃に冷却した。無水テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）に溶かした塩化４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）ベンゾイル（６ｇ、２２．２ｍｍｏｌ）を上記反応溶液にゆっくり滴下した。滴下工程が完了した後、反応溶液を０℃で１時間撹拌した。薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝３：１）を用いて反応の完了を検出し、新たなスポットが生成された。反応溶液を飽和塩化アンモニウム水溶液（１００ｍＬ）で急冷し、ＥｔＯＡｃで３回抽出した（１００ｍＬ＊３）。有機相を飽和ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、回転乾燥させた。粗化合物を石油エーテル：酢酸エチル＝５０：１で混練し、２−（（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）（ヒドロキシ）メチレン）マロノニトリル（８．０ｇ、淡黄色固体として、８２％）を得た。
MS: m/z 298 [M+1]
【００９６】
工程１７．  ２−（（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）（エトキシ）メチレン）マロノニトリルの製造
２−（（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）（ヒドロキシ）メチレン）マロノニトリル（５．０ｇ、１６．８ｍｍｏｌ）をオルトギ酸トリエチル（５０ｍＬ）に加えた。反応物を８０℃に温め、１２時間撹拌した。薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝３：１）は、生成物が生成されたことを示した。反応溶液を濾過し、濾液を回転乾燥させた。得られた固体をメタノールで混練し、２−（（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）（エトキシ）メチレン）マロノニトリル（１．５ｇ、白色生成物として、２７．７％）を得た。
MS: m/z 326.0 [M+1]
【００９７】
工程１８．  ６−（５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−４−シアノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−４−アザスピロ［２．５］オクタン−４−カルボン酸ベンジルの製造
２−（（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）（エトキシ）メチレン）マロノニトリル（１．０ｇ、３．０９ｍｍｏｌ）、６−ヒドラジノ−４−アザスピロ［２．５］オクタン−４−カルボン酸塩ベンジル（１．２８ｇ、３．７１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．５６ｇ、１５．５ｍｍｏｌ）をエタノール（２０ｍＬ）に溶かした。反応溶液を２５℃で１２時間反応させ、薄層クロマトグラフィー（石油エーテル：酢酸エチル＝２：１）を用いて反応が完了したことを検出し、反応物を、水を添加することで急冷し、酢酸エチルで抽出した（２５ｍＬ＊３）。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、回転乾燥させた。粗化合物を石油エーテル：酢酸エチル＝５０：１で２回混練し、生成物６−（５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−４−シアノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−４−アザスピロ［２．５］オクタン−４−カルボン酸ベンジル（１．５ｇ、８８％）を得た。
MS: m/z 555.2 [M+1]
【００９８】
工程１９．  ５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミドの製造
６−（５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−４−シアノ−１Ｈ−ピラゾール−１−イル）−４−アザスピロ［２．５］オクタン−４−カルボン酸ベンジル（７５０ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）を室温で９０％濃硫酸に加え（１０分かけて）、１５分間撹拌した後、反応系を３０℃に温めて２４時間反応させた。薄層クロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）を用いて反応が完了したことを検出した。反応溶液をアンモニア水（５０ｍｌ）にゆっくり注ぎ、ｐＨ＝７に調整し、酢酸エチルで３回抽出した（３０ｍＬ＊３）。合わせた有機相を飽和ブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、回転乾燥させた。粗化合物をカラムクロマトグラフィーにより精製し、５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（４８０ｍｇ、７８％、淡黄色固体として）を得た。
MS: m/z 439.2 [M+1]
【００９９】
工程２０．  ５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（４−シアノ−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミドの製造
５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（５０ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に溶かした後、炭酸セシウム（１１０ｍｇ、０．３４２ｍｍｏｌ）および臭化シアノゲン（１２．５ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ）を加えた。反応溶液を室温で２時間撹拌した後、薄層クロマトグラフィーに付して反応が完了したことを検出した。反応溶液を酢酸エチル（５０ｍＬ）に注ぎ、水で洗浄し（２０ｍＬ＊３）、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発乾固した。粗生成物を分取プレート（ジクロロメタン：メタノール＝５０：１）により精製し、生成物５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（４−シアノ−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（１５ｍｇ、１５％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δppm 8.12 (s, 1H), 7.66-7.69 (dd, J1=2.4 Hz, J2=8.4 Hz 2H), 7.56-7.58 (d, J=8Hz, 2H), 7.21-7.23 (d, J=8Hz, 2H), 6.92-6.94 (d, J=8Hz, 1H), 5.61 (s, 1H), 5.19-5.30 (m, 2H), 4.19-4.25 (m, 1H), 3.52-3.66 (m, 2H), 2.34-2.45 (m, 2H), 2.19 (s, 1H), 1.25-1.30 (m, 1H), 1.15-1.20 (m, 1H), 0.78-0.89 (m, 2H), 0.66-0.71 (m, 1H)。
MS: m/z 446.2 [M+1]
【０１００】
実施例７
（Ｅ）−５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（４−（４−ヒドロキシブト−２−エノイル）−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４０６）の製造
【化２７】
2019519521.tif 000033
【０１０１】
実施例６の工程１９の反応からの生成物を出発材料として用い、以下の工程により実施例７の化合物を製造した。
工程１．  （Ｅ）−５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（４−（４−ヒドロキシブト−２−エノイル）−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミドの製造
４−ヒドロキシ−２−ブテン酸（１００ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２８０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（２６０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１６０ｍｇ、１．４４ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２ｍＬ）に溶かし、室温で１５分間撹拌した。次に、上記反応溶液に５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（１００ｍｇ、０．２２６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。ＴＬＣを用いて反応の完了を検出した。反応を減圧下で蒸発乾固した。残渣を酢酸エチルに溶かし（２０ｍＬ＊３）、水で洗浄し（３０ｍＬ＊３）、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発乾固した。粗生成物を分取プレート（ジクロロメタン：メタノール＝１０：１）で精製し、生成物（Ｅ）−５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（４−（４−ヒドロキシブト−２−エノイル）−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（１７ｍｇ、１５％）を得た。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δppm 8.17 (s, 1H), 7.68-7.69 (d, J=4 Hz, 1H), 7.36-7.57 (m, 2H), 7.24 (brs., 2H), 6.87-6.94 (m, 2H), 6.37-6.43 (m, 1H), 5.75-5.79 (m, 1H), 4.66-4.70 (m, 1H), 3.73-4.06 (m, 2H), 3.28-3.32 (m, 1H), 2.55-2.58 (m, 1H), 2.11-2.21 (m, 2H), 1.18-1.35 (m, 2H), 1.15-1.16 (brs, 1H), 0.72-0.79 (m, 2H)。
MS: m/z 523.2 [M+1]
【０１０２】
実施例８
１−（４−アクリロイル−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４０７）の製造
【化２８】
2019519521.tif 000034
【０１０３】
実施例６の工程１９からの反応の生成物を出発材料として用い、以下の工程により実施例８の化合物を製造した。
工程１．  １−（４−アクリロイル−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミドの製造
アクリル酸（８ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２ｍＬ）に溶かした２−（７−アゾベンゾトリアゾール）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（６５ｍｇ、０．１７１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３５ｍｇ、０．３４２ｍｍｏｌ）に加え、１５分間撹拌した。次に、上記反応溶液に５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（５０ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。ＴＣＬを用いて反応の完了を検出した。反応物を減圧下で蒸発乾固した。残渣を酢酸エチルに溶かし（２０ｍＬ＊３）、水で洗浄し（３０ｍＬ＊３）、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発乾固した。粗生成物を分取ＨＰＬＣにより精製し、生成物１−（４−アクリロイル−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（８ｍｇ、赤色固体として）を得た。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δppm 8.17 (s, 1H), 7.68-7.69 (d, J=4 Hz, 1H), 7.36-7.57 (m, 2H), 7.24 (brs., 2H), 6.87-6.94 (m, 2H), 6.37-6.43 (m, 1H), 5.75-5.79 (m, 1H), 4.66-4.70 (m, 1H), 3.73-4.06 (m, 2H), 3.28-3.32 (m, 1H), 2.55-2.58 (m, 1H), 2.11-2.21 (m, 2H), 1.18-1.35 (m, 2H), 1.15-1.16 (brs, 1H), 0.72-0.79 (m, 2H)。
MS: m/z 493.2 [M+1]
【０１０４】
実施例９
５−アミノ−１−（４−シアノ−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−３−（４−（２，４−ジフルオロフェノキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４０８）の製造
【化２９】
2019519521.tif 000035
【０１０５】
実施例９の化合物は、対応する出発材料から出発し、実施例６と同様の方法により製造した。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δppm 7.47-7.49 (dd, J1=8 Hz, J2=8.4 Hz 2H), 7.08-7.14 (m, 1H), 6.87-7.02 (m, 4H), 5.56 (s, 1H), 5.13-5.16 (s, 2H), 4.17-4.22 (m, 1H), 3.60-3.66 (m, 1H), 3.48-3.51 (m, 1H), 2.34-2.41 (m, 2H), 2.15-2.17 (s, 1H), 1.26-1.30 (m, 1H), 1.14-1.19 (m, 1H), 0.78-0.88 (m, 2H), 0.66-0.70 (m, 1H)。
MS: m/z 465.2 [M+1]
【０１０６】
実施例１０
（Ｅ）−５−アミノ−３−（４−（２，４−ジフルオロフェノキシ）フェニル）−１−（４−（４−ヒドロキシブト−２−エノイル）−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４０９）の製造
【化３０】
2019519521.tif 000036
【０１０７】
実施例１０の化合物は、対応する出発材料から出発し、実施例７と同様の方法により製造した。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δppm 7.49-7.51 (d, J=8 Hz, 2H), 7.07-7.18 (m, 1H), 7.69-7.01 (m, 3H), 6.87-6.94 (m, 2H), 5.74 (s, 2H), 5.16 (s, 1H), 4.62 (brs., 1H), 4.40 (s, 2H), 3.93 (s, 1H), 3.22 (m, 1H), 2.14-2.17 (d, J=12 Hz, 2H), 1.99-2.00 (m, 1H), 1.36-1.42 (m, 2H), 1.16-1.21 (m, 1H), 0.69-0.73 (m, 2H)。
MS: m/z 524.4 [M+1]
【０１０８】
実施例１１
１−（４−アクリロイル−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−５−アミノ−３−（４−（２，４−ジフルオロフェノキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４１０）の製造
【化３１】
2019519521.tif 000037
【０１０９】
実施例１１の化合物は、対応する出発材料から出発し、実施例８と同様の方法により製造した。
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6): δppm 7.46-7.49 (d, J=12Hz, 2H), 7.08-7.18 (m, 1H), 6.99-7.01 (m, 2H), 6.42-6.43 (d, J=4 Hz, 1H), 5.63-5.77 (brs., 1H), 5.62 (s, 2H), 5.09 (brs., 2H), 4.64 (m, 1H), 3.91 (m, 1H), 3.24 (m, 1H), 2.57 (m, 1H), 2.01-2.18 (m, 2H), 1.31-1.40 (m, 1H), 1.22-1.24 (m, 1H), 1.12-1.18 (m, 1H), 0.68-0.77 (m, 2H)。
MS: m/z 494.3 [M+1]
【０１１０】
実施例１２
（Ｒ）−５−アミノ−１−（４−シアノ−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−３−（４−（２，４−ジフルオロフェノキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４１１）および（Ｓ）−５−アミノ−１−（４−シアノ−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−３−（４−（２，４−ジフルオロフェノキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４１２）の製造
【化３２】
2019519521.tif 000038
【０１１１】
実施例１２の化合物は、実施例９の生成物のキラル分割から得た。分割条件は、超臨界流体クロマトグラフィー（ＣｈｉｒａｌＰａｋ  ＡＤ  ５μ、２１×２５０ｍｍ  ｃｏｌ、２７％メタノール、７０ｍＬ／分）であった。
WS-411スペクトルデータ:
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 7.48 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.15-7.09 (m, 1H), 7.02-6.95 (m, 3H), 6.92-6.88 (m, 1H), 5.75 (s, 2H), 5.29 (s, 2H), 4.32-4.26 (m, 1H), 3.65-3.52 (m, 2H), 2.42-2.30 (m, 2H), 2.18-2.15 (m, 1H), 1.19-1.14 (m, 1H), 0.87-0.67 (m, 4H)。
MS: m/z 465.4 [M+H]
WS-412スペクトルデータ:
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 7.48 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.15-7.09 (m, 1H), 7.02-6.95 (m, 3H), 6.92-6.88 (m, 1H), 5.75 (s, 2H), 5.29 (s, 2H), 4.32-4.26 (m, 1H), 3.65-3.52 (m, 2H), 2.42-2.30 (m, 2H), 2.18-2.15 (m, 1H), 1.19-1.14 (m, 1H), 0.87-0.67 (m, 4H)。
MS: m/z 465.4 [M+H]
【０１１２】
実施例１３
（Ｒ）−５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（４−シアノ−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４１３）および（Ｓ）−５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１−（４−シアノ−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４１４）の製造
【化３３】
2019519521.tif 000039
【０１１３】
実施例１３の生成物は、実施例６の生成物のキラル分割から得た。分割条件は、超臨界流体クロマトグラフィー（ＣｈｉｒａｌＰａｋ  ＡＤ  ５μ、２１×２５０ｍｍ  ｃｏｌ、２７％メタノール、７０ｍＬ／分）であった。
【０１１４】
WS-413スペクトルデータ:
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 8.12 (s, 1H), 7.69-7.67 (m, 1H), 7.57 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.22 (d, J=8.4 Hz, 2H), 6.93 (d, J=8.8 Hz, 1H), 5.60 (s, 2H), 5.24 (s, 2H), 4.25-4.20 (m, 1H), 3.67-3.48 (m, 2H), 2.42-2.35 (m, 2H), 2.19-2.16 (m, 1H), 1.30-1.26 (m, 1H), 1.21-1.16 (m, 1H), 0.90-0.79 (m, 2H), 0.71-0.67 (m, 1H)。
MS: m/z 464.4 [M+H]
WS-414スペクトルデータ:
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 8.12 (s, 1H), 7.69-7.67 (m, 1H), 7.57 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.22 (d, J=8.4 Hz, 2H), 6.93 (d, J=8.8 Hz, 1H), 5.60 (s, 2H), 5.24 (s, 2H), 4.25-4.20 (m, 1H), 3.67-3.48 (m, 2H), 2.42-2.35 (m, 2H), 2.19-2.16 (m, 1H), 1.30-1.26 (m, 1H), 1.21-1.16 (m, 1H), 0.90-0.79 (m, 2H), 0.71-0.67 (m, 1H)。
MS: m/z 464.4 [M+H]
【０１１５】
実施例１４
５−アミノ−１−（４−（２−ブチノイル）−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４１５）の製造
【化３４】
2019519521.tif 000040
【０１１６】
実施例１４の化合物は、対応する出発材料から出発し、実施例８と同様の方法により製造した。
1H-NMR (400 MHz, MeOD): δppm 8.08 (s, 1H), 7.85 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.61-7.57 (m, 2H), 7.23-7.20 (m, 2H), 7.05 (d, J=8.8 Hz, 1H), 4.40-4.37 (m, 1H), 4.22-3.90 (m, 2H), 3.60-3.31 (m, 1H), 2.34-2.31 (m, 1H), 2.16-2.09 (m, 2H), 2.06 (s, 3H), 1.14-0.75 (m, 4H)。
MS: m/z 505.1 [M+H]
【０１１７】
実施例１５
（Ｒ）−５−アミノ−１−（４−（２−ブチノイル）−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４１６）および（Ｓ）−５−アミノ−１−（４−（２−ブチノイル）−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４１７）の製造
【化３５】
2019519521.tif 000041
【０１１８】
実施例１５の化合物は、実施例１４の生成物のキラル分割から得た。分割条件は、超臨界流体クロマトグラフィー（ＣｈｉｒａｌＰａｋ  ＡＤ  ５μ、２１×２５０ｍｍ  ｃｏｌ、２７％メタノール、７０ｍＬ／分）であった。
WS-416スペクトルデータ:
1H-NMR (400 MHz, MeOD): δppm 8.08 (s, 1H), 7.85 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.61-7.57 (m, 2H), 7.23-7.20 (m, 2H), 7.05 (d, J=8.8 Hz, 1H), 4.40-4.37 (m, 1H), 4.22-3.90 (m, 2H), 3.60-3.31 (m, 1H), 2.34-2.31 (m, 1H), 2.16-2.09 (m, 2H), 2.06 (s, 3H), 1.14-0.75 (m, 4H)。
MS: m/z 505.1 [M+H]
WS-417スペクトルデータ:
1H-NMR (400 MHz, MeOD): δppm 8.08 (s, 1H), 7.85 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.61-7.57 (m, 2H), 7.23-7.20 (m, 2H), 7.05 (d, J=8.8 Hz, 1H), 4.40-4.37 (m, 1H), 4.22-3.90 (m, 2H), 3.60-3.31 (m, 1H), 2.34-2.31 (m, 1H), 2.16-2.09 (m, 2H), 2.06 (s, 3H), 1.14-0.75 (m, 4H)。
MS: m/z 505.1 [M+H]
【０１１９】
実施例１６
（Ｒ）−１−（４−アクリロイル−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４１８）および（Ｓ）−１−（４−アクリロイル−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−５−アミノ−３−（４−（（５−クロロピリジン−２−イル）オキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４１９）の製造
【化３６】
2019519521.tif 000042
【０１２０】
実施例１６の化合物は、実施例８の化合物のキラル分割から得た。分割条件は、超臨界流体クロマトグラフィー（ＣｈｉｒａｌＰａｋ  ＡＤ  ５μ、２１×２５０ｍｍ  ｃｏｌ、２７％メタノール、７０ｍＬ／分）であった。
WS-418スペクトルデータ:
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 8.12 (s, 1H), 7.69-7.66 (m, 1H), 7.59 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.21 (d, J=8.4Hz, 2H), 6.94-6.88 (m, 3H), 6.41-6.37 (m, 1H), 5.75 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 4.68-4.66 (m, 1H), 4.01-3.95 (m, 1H), 3.31-3.19 (m, 2H), 2.63-2.56 (m, 1H), 2.19-2.12 (m, 2H), 1.40-1.37 (m, 2H), 1.25-1.10 (m, 2H)。
MS: m/z 493.1[M+H]
WS-419スペクトルデータ:
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 8.12 (s, 1H), 7.69-7.66 (m, 1H), 7.59 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.21 (d, J=8.4 Hz, 2H), 6.94-6.88 (m, 3H), 6.41-6.37 (m, 1H), 5.75 (s, 2H), 5.43 (s, 2H), 4.68-4.66 (m, 1H), 4.01-3.95 (m, 1H), 3.31-3.19 (m, 2H), 2.63-2.56 (m, 1H), 2.19-2.12 (m, 2H), 1.40-1.37 (m, 2H),1.25-1.10 (m, 2H)。
MS: m/z 493.1[M+H]
【０１２１】
実施例１７
５−アミノ−１−（４−（２−ブチノイル）−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−３−（４−（２，４−ジフルオロフェノキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４２０）の製造
【化３７】
2019519521.tif 000043
【０１２２】
実施例１７の化合物は、対応する出発材料から出発し、実施例８と同様の方法により製造した。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 7.52 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.13-7.10 (m, 1H), 7.03-6.95 (m, 3H), 6.91-6.88 (m, 1H), 5.65 (s, 2H), 5.18 (s, 2H), 4.56-3.92 (m, 3H), 3.25-3.20 (m, 1H), 2.52-2.51 (m, 1H), 2.21-2.14 (m, 2H), 2.09 (s, 3H), 1.08-0.88 (m, 2H), 0.72-0.65 (m, 2H)。
MS: m/z 506.4 [M+H]
【０１２３】
実施例１８
（Ｒ）−５−アミノ−１−（４−（２−ブチノイル）−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−３−（４−（２，４−ジフルオロフェノキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４２１）および（Ｒ）−５−アミノ−１−（４−（２−ブチノイル）−４−アザスピロ［２．５］オクト−６−イル）−３−（４−（２，４−ジフルオロフェノキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４２２）の製造
【化３８】
2019519521.tif 000044
【０１２４】
実施例１８の生成物は、実施例１７の生成物のキラル分割から得た。分割条件は、超臨界流体クロマトグラフィー（ＣｈｉｒａｌＰａｋ  ＡＤ  ５μ、２１×２５０ｍｍ  ｃｏｌ、２７％メタノール、７０ｍＬ／分）であった。
WS-421スペクトルデータ:
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 7.52 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.13-7.10 (m, 1H), 7.03-6.95 (m, 3H), 6.91-6.88 (m, 1H), 5.65 (s, 2H), 5.18 (s, 2H), 4.56-3.92 (m, 3H), 3.25-3.20 (m, 1H), 2.52-2.51 (m, 1H), 2.21-2.14 (m, 2H), 2.09 (s, 3H), 1.08-0.88 (m, 2H), 0.72-0.65 (m, 2H)。
MS: m/z 506.4 [M+H]
WS-422スペクトルデータ:
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 7.52 (d, J=8.0 Hz, 1H), 7.13-7.10 (m, 1H), 7.03-6.95 (m, 3H), 6.91-6.88 (m, 1H), 5.65 (s, 2H), 5.18 (s, 2H), 4.56-3.92 (m, 3H), 3.25-3.20 (m, 1H), 2.52-2.51 (m, 1H), 2.21-2.14 (m, 2H), 2.09 (s, 3H), 1.08-0.88 (m, 2H), 0.72-0.65 (m, 2H)。
MS: m/z 506.4 [M+H]
【０１２５】
実施例１９
５−アミノ−１−（１−シアノ−ピロリジン−３−イル）−３−（４−（２，４−ジフルオロフェノキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４２３）の製造
【化３９】
2019519521.tif 000045
【０１２６】
実施例１９の化合物は、対応する出発材料から出発し、実施例６と同様の方法により製造した。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 7.50 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.16-7.10 (m, 1H), 7.02-6.95 (m, 3H), 6.92-6.88 (m, 1H), 5.52 (s, 2H), 5.34 (s, 2H), 4.69-4.66 (m, 1H), 3.87-3.76 (m, 3H), 3.60-3.54 (m, 1H), 2.56-2.51 (m, 1H), 2.35-2.30 (m, 1H)。
MS: m/z 425.3 [M+H]
【０１２７】
実施例２０
５−アミノ−１−（１−シアノピペリジン−４−イル）−３−（４−（２，４−ジフルオロフェノキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４２４）の製造
【化４０】
2019519521.tif 000046
【０１２８】
実施例２０の化合物は、対応する出発材料から出発し、実施例６と同様の方法により製造した。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 7.49 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.15-7.09 (m, 1H), 7.02-6.92 (m, 3H), 6.92-6.88 (m, 1H), 5.43 (s, 2H), 5.21 (s, 2H), 3.99-3.93 (m, 1H), 3.66-3.62 (m, 2H), 3.23-3.17 (m, 2H), 2.41-2.32 (m, 1H), 2.03-2.01 (m, 1H)。
MS: m/z 439.2 [M+H]
【０１２９】
実施例２１
１−（１−アクリロイル−６−メチルピペリジン−３−イル）−５−アミノ−３−（４−（２−クロロ−４−フルオロフェノキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４２５）の製造
【化４１】
2019519521.tif 000047
【０１３０】
実施例２１の化合物は、対応する出発材料から出発し、実施例６と同様の方法により製造した。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 7.52-7.49 (m, 2H), 7.25-7.25 (m, 1H), 7.09-6.97 (m, 4H), 6.59-6.57 (m, 1H), 6.32-6.12 (m, 1H), 5.87-5.85 (m, 2H), 5.68-5.60 (m, 2H), 4.70-4.25 (m, 1H), 3.88-3.85 (m, 1H), 3.48-3.46 (m, 1H), 2.72-2.61 (m, 1H), 2.04-1.97 (m, 2H), 1.82-1.77 (m, 2H), 1.41-1.35 (m, 3H)。
MS: m/z 498.2 [M+H]
【０１３１】
実施例２２
５−アミノ−３−（４−（２−クロロ−４−フルオロフェノキシ）フェニル）−１−（１−シアノ−６−メチルピペリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４２６）の製造
【化４２】
2019519521.tif 000048
【０１３２】
実施例２２の化合物は、対応する出発材料から出発し、実施例６と同様の方法により製造した。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 7.49 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.23-7.24 (m, 1H), 7.07-7.11 (m, 1H), 6.97-7.04 (m, 3H), 6.55 (s, 1H), 5.55 (s, 1H), 5.21 (s, 1H), 4.03-4.09 (m, 1H), 3.60-3.71 (m, 2H), 3.34-3.40 (m, 1H), 2.29-2.35 (m, 1H), 1.93-2.04 (m, 2H),1.82-1.86 (m, 1H), 1.38 (d, J=6.8 Hz, 2H)。
MS: m/z 469.3 [M+H]
【０１３３】
実施例２３
５−アミノ−１−（１−（２−ブチノイル）−６−メチルピペリジン−３−イル）−３−（４−（２−クロロ−４−フルオロフェノキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４２７）の製造
【化４３】
2019519521.tif 000049
【０１３４】
実施例２３の化合物は、対応する出発材料から出発し、実施例６と同様の方法により製造した。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 7.52-7.49 (m, 2H), 7.29-7.23 (m, 1H), 7.06-6.97 (m, 4H), 5.63-5.61 (m, 2H), 5.35-5.23 (m, 2H), 4.91-4.72 (m, 1H), 3.91-3.81 (m, 1H), 3.26-3.17 (m, 1H), 2.51-2.42 (m, 2H), 2.06 (d, J=16.8 Hz, 2H), 1.81-1.76 (m, 2H), 1.41-1.34 (m, 3H)。
MS: m/z 510.2 [M+H]
【０１３５】
実施例２４
５−アミノ−３−（４−（４−クロロ−２−フルオロフェノキシ）フェニル）−１−（１−シアノ−６−メチルピペリジン−３−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４２８）の製造
【化４４】
2019519521.tif 000050
【０１３６】
実施例２４の化合物は、対応する出発材料から出発し、実施例６と同様の方法により製造した。
1H-NMR (400 MHz, CD3OD): δppm 7.49 (d, J=8.8 Hz, 2H), 7.40-7.36 (m, 1H), 7.25-7.16 (m, 2H), 7.07 (d, J=8.8 Hz, 2H), 4.33 (s, 2H), 3.70-3.63 (m, 1H), 3.60-3.57 (m, 1H), 3.42-3.38 (m, 1H), 2.28-2.25 (m, 1H), 2.19-2.19 (m, 3H), 1.37 (d, J=6.8 Hz, 3H)。
MS: m/z 469.1 [M+H]
【０１３７】
実施例２５
１−（１−アクリロイル−６−メチルピペリジン−３−イル）−５−アミノ−３−（４−（４−クロロ−２−フルオロフェノキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４２９）の製造
【化４５】
2019519521.tif 000051
【０１３８】
実施例２５の化合物は、対応する出発材料から出発し、実施例６と同様の方法により製造した。
1H-NMR (400 MHz, CDOD3): δppm 7.55-7.53 (m, 2H), 7.40-7.38 (m, 1H), 7.25-7.16 (m, 2H), 7.09 (d, J=8.4 Hz, 1H), 6.85-6.73 (m, 1H), 6.24-6.15 (m, 1H), 5.78-5.72 (m, 1H), 4.70-4.40 (m, 2H), 4.23-4.01 (m, 1H), 2.38-2.32 (m, 1H), 2.04-2.02 (m, 1H), 1.91-1.77 (m, 2H), 1.37 (d, J=6.8, 3H)。
MS: m/z 498.1 [M+H]
【０１３９】
実施例２６
５−アミノ−１−（１−（２−ブチノイル）−６−メチルピペリジン−３−イル）−３−（４−（４−クロロ−２−フルオロフェノキシ）フェニル）−１Ｈ−ピラゾール−４−カルボキサミド（ＷＳ−４３０）の製造
【化４６】
2019519521.tif 000052
【０１４０】
実施例２６の化合物は、対応する出発材料から出発し、実施例６と同様の方法により製造した。
【０１４１】
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δppm 7.54-7.50 (m, 2H), 7.25-7.22 (m, 1H), 7.20-7.02 (m, 4H), 5.37 (s, 2H), 5.92-5.91 (m, 1H), 4.61-4.59 (m, 1H), 4.68-4.41 (m, 1H), 3.94-3.83 (m, 1H), 3.69-3.63 (m, 1H), 2.52-2.43 (m, 1H), 2.03 (d, J=16.8 Hz, 3H), 2.011-1.76 (m, 3H), 1.41-1.34 (m, 3H)。
MS: m/z 510.1 [M+H]
【０１４２】
実施例２７〜４０
実施例２７〜４０で示される構造を有する化合物は、本発明の実施例１〜２６と同様の方法により製造することができる。
【０１４３】
【表１】
2019519521.tif 000053
2019519521.tif 000054
2019519521.tif 000055
2019519521.tif 000056
【０１４４】
実施例４１
キナーゼ活性（ＢＴＫ）阻害アッセイ
本明細書に開示される化合物のＢＴＫキナーゼ活性に対する阻害効果を、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）法に基づくアッセイで試験した。組換えＢｔｋを本明細書に開示される化合物とともに、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２０ｎＭ  ＳＥＢ、０．１％ＢＳＡ、０．００５％  ｔｗｅｅｎ−２０を含有するアッセイバッファー中、室温で１時間プレインキュベーションを行った。反応はＡＴＰ（ＡＴＰ  Ｋｍ濃度）およびペプチド基質（ビオチン−ＡＶＬＥＳＥＥＥＬＹＳＳＡＲＱ−ＮＨ２）の添加により開始した。室温で１時間のインキュベーション後、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．０、８００ｍＭ  ＫＦ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＢＳＡ、Ｅｕクリプテート結合ｐ−Ｔｙｒ６６抗体およびストレプトアビジン標識ＸＬ６６５を含有する等容量の停止溶液を加えて反応を停止させた。プレートを室温でさらに１時間インキュベートした後、ＴＲ−ＦＲＥＴシグナルをＢＭＧ  ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳ装置（ｅｘ３３７ｎｍ、ｅｍ６２０ｎｍ／６６５ｎｍ）で読み取った。６６５ｎｍに対する６１５ｎｍの蛍光シグナルの比に基づき、漸増化合物濃度での酵素活性を計算した。各化合物のＩＣ５０は、データをＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアの４パラメーター式に当てはめることによって得た。
【０１４５】
上記試験法によれば、本発明の化合物はＢＴＫキナーゼの阻害効果を示し（ＩＣ５０＜１０００ｎＭ）、好ましい化合物のいくつかは極めて有効な活性を有する（ＩＣ５０＜１００ｎＭ）。具体的な結果を下表に示す。
【０１４６】
【表２】
2019519521.tif 000057
【０１４７】
キナーゼ阻害活性グレードはＡ、Ｂ、およびＣに割り付け、具体的には、Ａ（ＩＣ５０＜１００ｎＭ）、Ｂ（１００ｎＭ＜ＩＣ５０＜１０００ｎＭ），Ｃ（ＩＣ５０＞１０００ｎＭ）である。
【０１４８】
実施例４２
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏキナーゼ選択性アッセイ
ＥＧＦＲおよびＩＴＫキナーゼ活性に関するアッセイプラットフォームは、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動に基づく方法を用いて確立し；ＬＣＫ、ＳＲＣおよびＬＹＮキナーゼ活性に関するアッセイプラットフォームは、Ｚ’−Ｌｙｔｅ法を用いて確立し；ＴＥＣおよびＪＡＫ３キナーゼ活性に関するアッセイプラットフォームは、Ｌａｎｃｅ  Ｕｌｔｒａ法を用いて確立した。本明細書に開示されている化合物の種々のキナーゼ活性に対する阻害効果は、各化合物について１１濃度で個別に試験した。各化合物のＩＣ５０値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いて計算した。
【０１４９】
上記試験法によれば、本発明のいくつかの化合物は高いキナーゼ選択特性を示し、それは対照化合物イブルチニブよりも有意に良好であった。結果については下表を参照。
【０１５０】
【表３】
2019519521.tif 000058
【０１５１】
キナーゼ阻害活性グレートはＡ、Ｂ、およびＣに割り付け、具体的には、Ａ（ＩＣ５０＜１００ｎＭ）、Ｂ（１００ｎＭ＜ＩＣ５０＜１０００ｎＭ）、Ｃ（ＩＣ５０＞１０００ｎＭ）である。
【０１５２】
実施例４３
Ｂ細胞阻害アッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、正常ヒトＢ細胞においてＢ細胞の活性化を阻害するには、ＢＴＫ阻害剤への一時的暴露で十分である。このプロトコールは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて推定される細胞の阻害剤への暴露を模倣し、Ｂ細胞の阻害は阻害剤が洗い流された際にも維持されることを示す。
【０１５３】
Ｂ細胞は、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＢ細胞濃縮ミックスを用いた負の選択により、健常ドナーの血液からの精製によって得られた。細胞を増殖培地（１０％ＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎仔血清）に播種し、阻害剤を特定の濃度で加えた。３７℃で１時間のインキュベーションの後、細胞を３回洗浄し、各洗液を増殖培地での８倍希釈に使用した。次に、細胞を３７℃で１８時間１０μｇ／ｍＬ  ＩｇＭ  Ｆ（ａｂ’）２で刺激した。続いて、細胞を抗ＣＤ６９−ＰＥ抗体で染色し、標準的な条件を用いてフローサイトメトリーにより分析した。
【０１５４】
上記方法に従い、本発明の好ましい化合物は、１０ｎＭ未満のＩＣ５０でＢ細胞に対して強い阻害活性を有すると判定される。
【０１５５】
実施例４４
Ｔ細胞阻害アッセイ
Ｔ細胞は、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトＴ細胞濃縮ミックスを用いた負の選択により、健常ドナーの血液の精製によって得られた。細胞を増殖培地（１０％ＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎仔血清）に播種し、阻害剤を特定の濃度で加えた。３７℃で１時間のインキュベーションの後、細胞を３回洗浄し、各洗液を増殖培地での１０倍希釈に使用した。次に、細胞を３７℃で１８時間、抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティングビーズ（ビーズ／細胞比１：１）で刺激した。続いて、細胞を抗ＣＤ６９−ＰＥ抗体で染色し、標準的な条件を用いてフローサイトメトリーにより分析した。上記方法に従い、本発明の好ましい化合物は、４０００ｎＭより高いＩＣ５０値で、Ｔ細胞に対する阻害活性が極めて低いか全くないと判定される。
【０１５６】
実施例４５
ヒト全血Ｂ細胞に対する阻害アッセイ
ヒト全血（ｈＷＢ）は健常ボランティアから得、血液はヘパリンナトリウム抗凝固剤バキュテナーチューブへの静脈穿刺により採取した。試験化合物をＰＢＳで１０倍希釈して必要な初期薬物濃度とした後、ＰＢＳ中１０％のＤＭＳＯで３倍連続希釈を行い、９点用量応答曲線を得た。５．５μＬの各希釈化合物をａｉｉｌ９６ウェルＶ底プレートに二反復で加え、ＰＢＳ中１０％のＤＭＳＯ５．５μＬを対照および非刺激ウェルに加えた。ヒト全血（１００μＬ）を各ウェルに加え、混合後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２、湿度１００％で３０分間インキュベートした。抗ヒトＩｇＭ  Ｆ（ａｂ’）２（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）（１０μＬの５００μｇ／ｍＬ溶液、終濃度５０μｇ／ｍＬ）を、ボルテックスにかけながら各ウェルに加え（非刺激ウェルを除く）、プレートをさらに２０時間インキュベートした。２０時間のインキュベーションの後、サンプルを２０μＬの蛍光プローブ標識ＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ６９（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とともに３７℃、５％ＣＯ２、湿度１００％で３０分間インキュベートした。誘導対照、非染色および単染色サンプルを補償および初期電圧設定用に含めた。次に、サンプルを１ｍｌのＩＸ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｌｙｓｅバッファー（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で溶解させ、プレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引によって除去し、残ったペレットをさらに１ｍｌのＩＸ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ｌｙｓｅバッファーで溶解させ、プレートを上記のように遠心分離した。上清を吸引除去し、残ったペレットをＦＡＣｓバッファー（ＰＢＳ＋１％ＦＢＱ）で洗浄した。遠心分離して上清を除去した後、ペレットを１５０μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁させた。このサンプルをＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターのＨＴＳ  ９６ウェルシステムでの操作に好適な９６ウェルプレートに移した。使用する蛍光団に好適な励起波長および発光波長を用いてデータを取得し、陽性細胞のパーセント値はＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウエアを用いて得た。結果はまずＦＡＣＳ分析ソフトウエア（Ｆｌｏｗ  Ｊｏ）を用いて分析した。次に、ＸＬｆｉｔ  ｖ３、Ｅｑｕａｔｉｏｎ  ２０１を用いてＩＣ５０値を計算した。
【０１５７】
上記方法に従い、選択された本発明の化合物は、２００ｎＭ未満のＩＣ５０値で、ヒト全血中のＢ細胞に対して強い阻害活性を有すると判定される。
【０１５８】
実施例４６
肝ミクロソームにおける化合物の安定性試験
１．試験化合物をアセトニトリルに溶かして濃度０．５ｍＭの保存溶液を調製した。
【０１５９】
２．２μＬの保存溶液を１．５ｍｌの遠沈管に加えた後、１４８μＬのリン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）および１０μＬの肝ミクロソーム懸濁液（タンパク質濃度は２０ｍｇ／ｍｌであった）［ＢＤ  Ｇｅｎｔｅｓｔ］を加えた。肝ミクロソームはヒト、イヌ、ラットおよびマウス種に由来するものであり、対照群には１５８μＬのリン酸バッファー（１００ｍＭ、ｐＨ７．４）を加えた。
【０１６０】
３．工程２で得られた混合物を３７℃の水浴中で３分間プレインキュベートした後、４０μＬのＮＡＤＰＨ生成系（ＮＡＤＰ＋：６．５ｍＭ、グルコース６リン酸：１６．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２：１６．５ｍＭ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ：２Ｕ／ｍｌを含有）を加えて反応を開始させた。この反応系を３７℃の水浴中で１時間ンキュベートした。
【０１６１】
４．反応を１時間行った後、遠沈管を水浴から取り出し、４００μＬのアセトニトリルを加えることにより反応を終了させ、次いで、３分間ボルテックスにかけた。最後に、遠沈管を５分間遠心分離し（１３，０００ｒｐｍ、４℃）、ＨＰＬＣによる残留薬物濃度Ｃｒの検出のために上清を採取した。
【０１６２】
５．並行して０分反応サンプルを調製する方法：工程２で調製した混合物を３７℃の水浴中で３分間プレインキュベートした。それを水浴から取り出した後、４００μＬのアセトニトリルを加え、次いで、４０μＬのＮＡＤＰＨ生成系を加えた。３分間ボルテックスをかけた後、遠心分離（１３，０００ｒｐｍ、４℃）を５分間行った。ＨＰＬＣによる薬物濃度Ｃ０の検出のために上清を採取した。
【０１６３】
６．６０分のインキュベーションの後、インキュベーション系において残留する薬物のパーセンテージを次のように計算した：
残留薬物（％）＝Ｃｒ／Ｃ０×１００％
【０１６４】
上記試験法によれば、選択された本発明の化合物のいくつかは、様々な種の肝ミクロソームで残留パーセンテージ＞３０％という改善したミクロソーム安定性を示す。
【０１６５】
実施例４７
ＣＹＰ酵素の阻害に関する化合物の評価
ＣＹＰ酵素代謝は薬物生体変換の主要な経路であり、ＣＹＰ酵素の量および活性はｉｎ  ｖｉｖｏにおける薬物の活性化および代謝に直接影響を及ぼす。外因性の化合物の主要な代謝酵素として、シトクロムＣＹＰは、様々な外因性化合物の酸化的および還元的代謝を触媒し得重要な第Ｉ相薬物代謝酵素である。ＣＹＰ酵素は、薬物の排出に極めて重要な役割を果たし、組合せ薬物療法の際に薬物相互作用を生じる主要な因子でもある。
【０１６６】
方法：本試験はカクテルプローブ基質アプローチを用い、ヒト肝ミクロソームにおける５つのＣＹＰ４５０酵素に対する化合物の阻害効果を同時に決定した。ヒトミクロソームはＢＤ  Ｇｅｎｔｅｓｔからのものであった。
【０１６７】
試験工程は次の通りである：
反応は１００ｍＭのリン酸バッファー中で行い、総容量は２００μＬであった。反応系のミクロソームの濃度は０．２５ｍｇ／ｍＬであり、試験化合物の濃度は２０μＭ、６．６７μＭ、２．２２μＭ、０．７４μＭ、および０．２５μＭであった。特定のプローブ基質および濃度はそれぞれ、フェナセチン（ＣＹＰ１Ａ２）４０μＭ、デキストロメトルファン（ＣＹＰ２Ｄ６）５μＭ、ジクロフェナク（ＣＹＰ２Ｃ９）１０μＭ、Ｓ−メフェニトイン（ＣＹＰ２Ｃ１９）４０μＭ、テストステロン（ＣＹＰ３Ａ４）８０μＭであった。混合物を３７℃の恒温シェーカーで５分間プレインキュベートし、ＮＡＤＰＨ生成系（１．３ｍＭ  ＮＡＤＰ＋、３．３ｍＭグルコース６リン酸、０．４Ｕ／Ｌグルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、３．３ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含有）を加えて反応を開始させた。４５分間のインキュベーションの後、等容量のアセトニトリルを加えることにより反応を停止させた。チューブをボルテックスにかけ、１３，０００ｒｐｍで遠心分離した。得られた上清をＬＣ−ＭＳ−ＭＳに付して、生成された代謝産物の量を測定した。特定の代謝産物はそれぞれ、アセトアミノフェン（ＣＹＰ１Ａ２）、デキストロルファン（ＣＹＰ２Ｄ６）、４−ヒドロキシジクロフェナク（ＣＹＰ２Ｃ９）、４−ヒドロキシメフェントイン（ＣＹＰ２Ｃ１９）、および６β−ヒドロキシテストステロン（ＣＹＰ３Ａ４）であった。参照として使用した特定の阻害剤はそれぞれ、フラフィリン（ＣＹＰ１Ａ２）、キニジン（ＣＹＰ２Ｄ６）、スルファフェナゾール（ＣＹＰ２Ｃ９）、トラニルシプラミン（ＣＹＰ２Ｃ１９）、およびケトコナゾール（ＣＹＰ３Ａ４）である。本試験の最終結果は、算出される半数阻害濃度またはＩＣ５０値である。ＩＣ５０＝（（５０％−最低阻害パーセンテージ％）／（最高阻害パーセンテージ％−最低阻害パーセンテージ％））×（最高濃度−最低濃度）＋最低濃度。
【０１６８】
上記試験法によれば、選択された本発明の化合物のいくつかは、様々なＣＹＰ酵素に対する阻害効果が極めて低いか全くなく、他の薬物の代謝にほとんど影響を持たないことを示す。
【０１６９】
実施例４８
ラットにおける化合物の薬物動態学に関する研究方法
１．雄ＳＤラット（ＨＦＫ）を到着後７日間実験室で馴化した。
【０１７０】
２．９個体のＳＤラットを各群３個体ずつ３群に無作為に分けた。１つの群には強制経口投与（ｐ．ｏ．）により投与し、他の群には尾静注（ｉ．ｖ．）により投与した。ｐ．ｏ．群のラットは薬物投与前に一晩絶食させた。
【０１７１】
３．薬物投与後に、以下の時点で眼窩後方静脈叢アプローチによりラットから血液サンプルを採取した：Ｉ．Ｖ．：（薬物投与前）、０．０８時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間；Ｐ．Ｏ．：０．０８時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間。各時点で約３００μｌの血液を採取した。
【０１７２】
４．採取した血液サンプルを４℃、１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上層血漿サンプルを採取し、冷凍庫にて−２０℃で保存した。
【０１７３】
５．実験操作を表４にまとめた。
【０１７４】
【表４】
2019519521.tif 000059
【０１７５】
６．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（ＵＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ：液体クロマトグラフィーＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（ＵＳＡ）および質量分析５５００  Ｑ  Ｔｒａｐ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ／ＭＤＳ  ＳＣＩＥＸ）またはＨＰＬＣ−ＭＳ＼ＭＳ（液体クロマトグラフィーＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズ（ＵＳＡ）および質量分析ＡＰＩ  ４０００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ／ＭＤＳ  ＳＣＩＥＸ））を用いて血漿中の化合物濃度を決定した。典型的な検出条件は次の通りである：
【０１７６】
【表５】
2019519521.tif 000060
【０１７７】
【表６】
2019519521.tif 000061
【０１７８】
薬物動態パラメーターは、薬物動態ソフトウエアＷｉｎＮｏｎｌｉｎ［モデル：Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）６．１；製造者：Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ］を用いて計算した［Ｐｈｏｅｎｉｘ  １．１ユーザーガイド：ｐ２５１−ｐ３００］。
【０１７９】
上記試験法によれば、本発明において測定された化合物は、良好なバイオアベイラビリティを示す（＞４０％）。
【０１８０】
実施例４９
ｈＥＲＧ結合アッセイ（ドフェチリド法）
ｈＥＲＧ阻害の化合物のＩＣ５０値は、特許出願ＵＳ２００５０２１４８７０Ａ１に記載の方法に従って決定することができる。選択された本発明の化合物は、１０００ｎＭより大きいＩＣ５０値で、ｈＥＲＧに対する阻害効果が極めて低いか、全くない。
【０１８１】
実施例５０
薬力学的アッセイ
重度免疫不全ＮＯＤ．ＳＣＩＤマウスをＢｅｉｊｉｎｇ  Ｖｉｔａｌ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．から購入し、ＳＰＦ級動物室で飼育した。ＴＭＤ−８細胞を十分な量まで培養した後、細胞を遠心分離により回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。最後に、細胞を無血清ＲＰＭＩ  １６４０培地およびマトリゲル（１：１ｖ／ｖ）中に再懸濁させた。０．２ｍｌの細胞懸濁液を、１ｍｌのシリンジおよび２５Ｇのシリンジニードルを用い、各マウスの右側腹部に皮下注射した。注射から約１週間後に腫瘍サイズをノギスで測定した。腫瘍体積は下式に従って計算した：腫瘍体積＝（長さ×幅２）／２。腫瘍体積が約１００〜２００ｍｍ３に達した際にマウスを群に分け、２１日間毎日ｐ．ｏ．投与した。
【０１８２】
化合物ＷＳ４１１、ＷＳ４１３、ＷＳ４１６、およびＷＳ４２２は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫細胞株ＴＭＤ−８の増殖を有意に阻害し、対照化合物イブルチニブと同等の抗腫瘍効果を示した（試験結果については図１を参照）。
【０１８３】
産業上の利用可能性
本発明により提供される新規な５−アミノピラゾールカルボキサミド誘導体は、タンパク質キナーゼＢＴＫの有効、安全かつ高選択性の阻害剤であり、ＢＴＫにより媒介される疾患を治療するための薬剤として使用することができる。
【図１】
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【国際調査報告】
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