(57)【要約】本技術は、部分的には、核酸の等温増幅用の方法および組成物に関する。ある特定の態様では、核酸を増幅するための方法であって、等温増幅条件下で非変性試料核酸をａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、およびｂ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分を含む成分と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップを含む、方法が本明細書中で提供される。
2019510515.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するための方法であって、
ａ）前記試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、
前記標的配列が第１の鎖および第２の鎖を含み、
前記第１の鎖および前記第２の鎖が互いに相補的であり、かつ
前記増幅するステップが、切断剤不含、ヘリカーゼ不含、かつリコンビナーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが前記第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、
前記核酸増幅産物が、１）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたは実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列からなり、かつ
前記スペーサー配列が前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、
ｂ）前記核酸増幅産物を検出するステップであって、前記核酸増幅産物を検出するステップは、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ前記試料核酸を（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）と接触させた時から１０分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、超好熱菌ポリメラーゼもしくはその機能的断片、または超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片によって提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片、または配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片によって提供される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性が低いまたはエキソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼによって提供される、請求項１、２、または３に記載の方法。
【請求項５】
要素（ａ）（ｉｉ）が、逆転写酵素活性を提供する少なくとも１つの成分をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する前記少なくとも１つの成分が、逆転写酵素活性をさらに提供する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
増幅の前または増幅の間に前記試料核酸を変性させるステップを含まない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間に一本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質と接触させない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
精製されていない試料核酸が増幅される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記増幅が、約５５℃から約７５℃の一定温度で行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記増幅が、約６５℃の一定温度で行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記増幅が、約６０℃の一定温度で行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドがそれぞれ約８〜１６塩基の長さである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記核酸増幅産物が約２０〜４０塩基の長さである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記スペーサー配列が、１〜５塩基を含み、かつ前記試料核酸中の前記標的配列の一部分に連続的に相補的またはそれと実質的に同一である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記核酸増幅産物を検出するステップが、蛍光シグナルの検出を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記蛍光シグナルが分子ビーコンに由来する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸増幅産物を、ｉ）前記増幅産物中の配列に相補的なポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）フルオロフォアおよび消光剤を含むシグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
単一の反応容器中で行われる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
マルチプレックス増幅を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記増幅するステップが、切断剤不含、ヘリカーゼ不含、かつリコンビナーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが前記第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する成分からなる酵素成分
と接触させることを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ塩基、修飾ＤＮＡ塩基、またはＤＮＡ塩基および修飾ＤＮＡ塩基からなる第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡ塩基、修飾ＤＮＡ塩基、またはＤＮＡ塩基および修飾ＤＮＡ塩基からなる第２のポリヌクレオチドからなる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
核酸を増幅するための方法であって、
等温増幅条件下で非変性試料核酸を、
ａ）前記試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、および
ｂ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
を含む成分と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップ
を含む、方法。
【請求項２４】
核酸を増幅するための方法であって
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ａ）前記試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、および
ｂ）超好熱菌ポリメラーゼまたは超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼからなる酵素成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップ
を含む、方法。
【請求項２５】
核酸を増幅するための方法であって、
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ａ）前記試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、ならびに
ｂ）ｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性、および任意選択でｉｉ）逆転写酵素活性からなる酵素活性
と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップ
を含む、方法。
【請求項２６】
前記酵素活性が、ｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性、およびｉｉ）逆転写酵素活性からなる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
増幅の前または増幅の間に前記試料核酸を変性させるステップを含まない、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間にエンドヌクレアーゼと接触させない、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間に巻き戻し剤と接触させない、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間にヘリカーゼと接触させない、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間にリコンビナーゼと接触させない、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間に一本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質と接触させない、請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料核酸が、増幅の前に非修飾である、請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
非修飾の前記試料核酸が破砕細胞に由来する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料核酸がＤＮＡを含む、請求項２３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料核酸がゲノムＤＮＡを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料核酸がＲＮＡを含む、請求項２３〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記試料核酸がウイルスＲＮＡを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記試料核酸が細菌ＲＮＡを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記試料核酸が一本鎖核酸を含む、請求項２３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記試料核酸が、第１の鎖および第２の鎖を含む二本鎖核酸を含む、請求項２３〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含む、請求項２３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドからなる、請求項２３〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドがそれぞれ８〜１６塩基を含む、請求項４２または４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記試料核酸の前記第１の鎖中の標的配列に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記試料核酸の前記第２の鎖中の標的配列に相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、請求項４２、４３、または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記試料核酸の前記第１の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記試料核酸の前記第２の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、請求項４２、４３、または４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記試料核酸の前記第１の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記試料核酸の前記第２の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる、請求項４２、４３、または４４に記載の方法。
【請求項４８】
試料核酸が、増幅の前に被験体から得られる、請求項２３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
精製されていない試料核酸が増幅される、請求項２３〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
精製された試料核酸が増幅される、請求項２３〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
増幅の前に試料核酸を精製するステップをさらに含む、請求項２３〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、超好熱菌ポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、請求項２３〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、請求項２３〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、古細菌の超好熱菌ポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、請求項２３〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、請求項２３〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、請求項２３〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性が低いポリメラーゼによって提供される、請求項２３〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼによって提供される、請求項２３〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記増幅が約５５℃から約７５℃の一定温度で行われる、請求項２３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記増幅が約５５℃から約６５℃の一定温度で行われる、請求項２３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記増幅が約６５℃の一定温度で行われる、請求項２３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記増幅が約６０℃の一定温度で行われる、請求項２３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記核酸増幅産物が、１０分またはそれ未満以内に検出可能である、請求項２３〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記核酸増幅産物が、前記試料核酸中の標的配列に連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一のポリヌクレオチドを含む、請求項２３〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記核酸増幅産物が、前記試料核酸中の標的配列に連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一のポリヌクレオチドからなる、請求項２３〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記核酸増幅産物が、約２０〜４０塩基の長さである、請求項２３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記核酸増幅産物が、ｉ）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、ｉｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、およびｉｉｉ）前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列に挟まれているスペーサー配列を含む、請求項４３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記核酸増幅産物が、ｉ）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、ｉｉ）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、およびｉｉｉ）前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列に挟まれているスペーサー配列からなる、請求項４３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記スペーサー配列が１〜１０塩基を含む、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記スペーサー配列が１〜５塩基を含む、請求項６７または６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記スペーサー配列が、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもなく、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもない、請求項６７〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記スペーサー配列が、前記試料核酸中の標的配列の一部分に連続的に相補的またはそれと実質的に同一である、請求項６７〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記核酸増幅産物を検出するステップをさらに含む、請求項２３〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記核酸増幅産物を検出するステップが、前記試料核酸を、前記超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する前記成分および前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと接触させた時から１０分またはそれ未満以内に行われる、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記核酸増幅産物を検出するステップが、リアルタイム検出方法の使用を含む、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記核酸増幅産物を検出するステップが、蛍光シグナルの検出を含む、請求項７３、７４、または７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記蛍光シグナルが分子ビーコンに由来する、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記核酸増幅産物を、ｉ）前記増幅産物中の配列に相補的なポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）フルオロフォアおよび消光剤を含むシグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、請求項２３〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの１つまたは複数が、前記試料核酸中の配列に相補的でないポリヌクレオチドであって、シグナル生成オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、かつ前記方法が、前記増幅産物を、フルオロフォアおよび消光剤を含む前記シグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、請求項２３〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
単一の反応容量中で行われる、請求項２３〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
単一の反応容器中で行われる、請求項２３〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
マルチプレックス増幅を含む、請求項２３〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記試料核酸を、増幅の前または増幅の間に切断剤と接触させない、請求項２３〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するためのキットであって、
ａ）ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で前記試料核酸中の標的配列を増幅するための成分であって、以下：
ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドを含み、前記標的配列の前記第１の鎖および前記第２の鎖が互いに相補的である、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
を含む、成分と、
ｂ）核酸増幅産物のリアルタイム検出活性を提供する少なくとも１つの成分と
を含む、キット。
【請求項８５】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドから本質的になり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドから本質的になる、請求項８４に記載のキット。
【請求項８６】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる、請求項８４に記載のキット。
【請求項８７】
試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するためのキットであって、
ａ）ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で前記試料核酸中の標的配列を増幅するための成分であって、以下：
ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記標的配列の第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなり、前記標的配列の前記第１の鎖および前記第２の鎖が互いに相補的である、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
を含む、成分と、
ｂ）核酸増幅産物のリアルタイム検出活性を提供する少なくとも１つの成分と
を含む、キット。
【請求項８８】
前記試料核酸が、ヘリカーゼ不含かつリコンビナーゼ不含の等温増幅条件下で増幅される、請求項８４〜８７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項８９】
前記試料核酸が、ヘリカーゼ不含、リコンビナーゼ不含、かつ切断剤不含の等温増幅条件下で増幅される、請求項８４〜８７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９０】
超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する前記少なくとも１つの成分が、超好熱菌ポリメラーゼもしくはその機能的断片、または超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片を含む、請求項８４〜８９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９１】
超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する前記少なくとも１つの成分が、超好熱菌ポリメラーゼもしくはその機能的断片、または超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片からなる、請求項８４〜８９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９２】
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、古細菌の超好熱菌ポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、請求項８４〜９１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９３】
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、請求項８４〜９２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９４】
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、請求項８４〜９２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９５】
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性が低いポリメラーゼによって提供される、請求項８４〜９４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９６】
前記超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼによって提供される、請求項８４〜９４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９７】
要素（ａ）（ｉｉ）が、逆転写酵素活性を提供する少なくとも１つの成分をさらに含む、請求項８４〜９６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９８】
超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する前記少なくとも１つの成分が逆転写酵素活性をさらに提供する、請求項８４〜９６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９９】
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドがそれぞれ８〜１６塩基を含む、請求項８４〜９８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１００】
前記リアルタイム検出活性が分子ビーコンによって提供される、請求項８４〜９９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０１】
試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するための方法を実施するための指示をさらに含み、前記方法が、
ａ）前記試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、
前記標的配列が第１の鎖および第２の鎖を含み、
前記第１の鎖および前記第２の鎖が互いに相補的であり、
かつ前記増幅するステップが、ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが前記第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、前記核酸増幅産物が、１）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列を含み、かつ
前記スペーサー配列が前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、
ｂ）前記核酸増幅産物を検出するステップであって、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ前記試料核酸を（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）と接触させた時から１０分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップと
を含む、請求項８４〜１００のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０２】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドから本質的になり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドから本質的になり、かつ／または、前記核酸増幅産物が、１）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列から本質的になる、請求項１０１に記載のキット。
【請求項１０３】
前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなり、かつ／または、前記核酸増幅産物が、１）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列からなる、請求項１０１に記載のキット。
【請求項１０４】
試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するための方法を実施するための指示をさらに含み、前記方法が、
ａ）前記試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、
前記標的配列が第１の鎖および第２の鎖を含み、
前記第１の鎖および前記第２の鎖が互いに相補的であり、
かつ前記増幅するステップが、ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、前記第１のオリゴヌクレオチドが、前記第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドが、前記第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、前記核酸増幅産物が、１）前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列からなり、かつ
前記スペーサー配列が前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、
ｂ）前記核酸増幅産物を検出するステップであって、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ前記試料核酸を（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）と接触させた時から１０分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップと
を含む、請求項８４〜１００のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０５】
前記方法が、増幅の前または増幅の間に前記試料核酸を変性させるステップを含まない、請求項１０１〜１０４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０６】
前記試料核酸を、増幅の前、間、または後にエンドヌクレアーゼと接触させない、請求項１０１〜１０５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０７】
前記試料核酸が、増幅の前に非修飾である、請求項１０１〜１０６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０８】
非修飾の前記試料核酸が破砕細胞に由来する、請求項１０７に記載のキット。
【請求項１０９】
前記試料核酸がＤＮＡを含む、請求項１０１〜１０８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１０】
前記試料核酸がゲノムＤＮＡを含む、請求項１０９に記載のキット。
【請求項１１１】
前記試料核酸がＲＮＡを含む、請求項１０１〜１０８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１２】
前記試料核酸がウイルスＲＮＡを含む、請求項１１１に記載のキット。
【請求項１１３】
前記試料核酸が細菌ＲＮＡを含む、請求項１１１に記載のキット。
【請求項１１４】
前記試料核酸が一本鎖核酸を含む、請求項１０１〜１１３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１５】
前記試料核酸が二本鎖核酸を含む、請求項１０１〜１１３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１６】
試料核酸が、増幅の前に被験体から得られる、請求項１０１〜１１５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１７】
精製されていない試料核酸が増幅される、請求項１０１〜１１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１８】
精製された試料核酸が増幅される、請求項１０１〜１１６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１９】
前記方法が、増幅の前に試料核酸を精製するステップをさらに含む、請求項１０１〜１１８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２０】
前記増幅が約５５℃から約７５℃の一定温度で行われる、請求項１０１〜１１９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２１】
前記増幅が約５５℃から約６５℃の一定温度で行われる、請求項１０１〜１１９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２２】
前記増幅が約６５℃の一定温度で行われる、請求項１０１〜１１９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２３】
前記増幅が約６０℃の一定温度で行われる、請求項１０１〜１１９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２４】
前記核酸増幅産物が約２０〜４０塩基の長さである、請求項１０１〜１２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２５】
前記スペーサー配列が１〜５塩基を含む、請求項１０１〜１２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２６】
前記スペーサー配列が、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもなく、かつ前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもない、請求項１０１〜１２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２７】
前記スペーサー配列が、前記試料核酸中の標的配列の一部分に連続的に相補的またはそれと実質的に同一である、請求項１０１〜１２６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２８】
前記核酸増幅産物を検出するステップが、蛍光シグナルの検出を含む、請求項１０１〜１２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２９】
前記蛍光シグナルが分子ビーコンに由来する、請求項１２８に記載のキット。
【請求項１３０】
前記方法が、前記核酸増幅産物を、ｉ）前記増幅産物中の配列に相補的なポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）フルオロフォアおよび消光剤を含むシグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、請求項１０１〜１２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３１】
前記方法が単一の反応容量中で行われる、請求項１０１〜１３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３２】
前記方法が単一の反応容器中で行われる、請求項１０１〜１３１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３３】
前記方法がマルチプレックス増幅を含む、請求項１０１〜１３２のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する特許出願
この特許出願は、表題「ＩＳＯＴＨＥＲＭＡＬ  ＡＭＰＬＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＣＯＭＰＯＮＥＮＴＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ」の２０１６年４月４日に出願された米国特許出願第１５／０９０，４０５号（発明者としてＡｎｄｒｅｗ  Ｐ．ＭｉｌｌｅｒおよびＨｏｎｇｈｕａ  Ｚｈａｎｇの名前が挙げられ、代理人管理番号ＮＡＴ−１００１−ＵＴｔによって指定される）の利益を主張する。上記出願の全体の内容は、全ての目的のために、本文、表および図面全てを含めて参考として本明細書に援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出され、その全体が参考として本明細書に援用される配列表を含む。上記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１７年３月２日に作成され、ＮＡＴ−１００１−ＰＣ＿ＳＬ．ｔｘｔとの名称であり、１６，５３３バイトのサイズである。
【０００３】
本技術は、部分的には、核酸の等温増幅用の方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
核酸に基づく診断は、感染症、疾患、および／または遺伝的変異の迅速な検出に有用であり得る。例えば、試料中の細菌またはウイルス核酸の同定は、特定の種類の感染症の診断に有用であり得る。その他の例としては、疾患管理または法医学のための一塩基多型の同定、および遺伝子組み換え食品を示す遺伝的変異の同定が挙げられる。多くの場合、核酸に基づく診断アッセイは、試料中の核酸の特定部分の増幅を必要とする。核酸増幅のための一般的な技術はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この技術は、通常、変性（すなわち、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）複合体中の鎖の分離）ステップ、オリゴヌクレオチドプライマー（相補的ＤＮＡ配列の短い鎖）のアニーリングステップ、およびポリメラーゼによる相補的標的に沿ったプライマーの伸長ステップを進めるために、温度のサイクリング（すなわち、サーモサイクリング）を必要とする。そのようなサーモサイクリングは、一般に特化した機械を必要とする時間を消費する処理であり得る。したがって、サーモサイクリングなしで実行できる、より迅速な核酸増幅方法の必要性が存在する。そのような方法は、例えば現場での試験およびポイントオブケア診断のために有用であり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ある特定の態様では、核酸を増幅するための方法であって、等温増幅条件下で非変性試料核酸をａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、およびｂ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分を含む成分と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップを含む、方法が本明細書中で提供される。
【０００６】
ある特定の態様では、核酸を増幅するための方法であって、等温増幅条件下で非変性試料核酸をａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、およびｂ）超好熱菌ポリメラーゼまたは超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼからなる酵素成分と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップを含む、方法も本明細書中で提供される。
【０００７】
ある特定の態様では、核酸を増幅するための方法であって、等温増幅条件下で非変性試料核酸をａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、ならびにｂ）ｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性、および任意選択でｉｉ）逆転写酵素活性からなる酵素活性と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップを含む、方法も本明細書中で提供される。
【０００８】
ある特定の態様では、核酸を処理するための方法であって、等温増幅条件下で非変性試料核酸をａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、およびｂ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分と接触させることによって核酸増幅産物を生成することから本質的になる核酸を増幅するステップを含む、方法も本明細書中で提供される。
【０００９】
ある特定の態様では、核酸を処理するための方法であって、等温増幅条件下で非変性試料核酸をａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、およびｂ）超好熱菌ポリメラーゼまたは超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼからなる酵素成分と接触させることによって核酸増幅産物を生成することから本質的になる核酸を増幅するステップを含む、方法も本明細書中で提供される。
【００１０】
ある特定の態様では、核酸を処理するための方法であって、等温増幅条件下で非変性試料核酸をａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、ならびにｂ）ｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性、および任意選択でｉｉ）逆転写酵素活性からなる酵素活性と接触させることによって核酸増幅産物を生成することから本質的になる核酸を増幅するステップを含む、方法も本明細書中で提供される。
【００１１】
ある特定の態様では、核酸を処理するための方法であって、等温増幅条件下で非変性試料核酸をａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、およびｂ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分と接触させることによって核酸増幅産物を生成することからなる核酸を増幅するステップを含む、方法も本明細書中で提供される。
【００１２】
ある特定の態様では、核酸を処理するための方法であって、等温増幅条件下で非変性試料核酸をａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、およびｂ）超好熱菌ポリメラーゼまたは超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼからなる酵素成分と接触させることによって核酸増幅産物を生成することからなる核酸を増幅するステップを含む、方法も本明細書中で提供される。
【００１３】
ある特定の態様では、核酸を処理するための方法であって、等温増幅条件下で非変性試料核酸をａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、ならびにｂ）ｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性、および任意選択でｉｉ）逆転写酵素活性からなる酵素活性と接触させることによって核酸増幅産物を生成することからなる核酸を増幅するステップを含む、方法も本明細書中で提供される。
【００１４】
ある特定の態様では、試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するための方法であって、ａ）試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、標的配列が、互いに相補的な第１の鎖および第２の鎖を含み、かつ増幅するステップが、ヘリカーゼ不含かつ／またはリコンビナーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を、ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、第１のオリゴヌクレオチドが、第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびにｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、核酸増幅産物が、１）第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列を含み、かつスペーサー配列が第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、ｂ）核酸増幅産物を検出するステップであって、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ試料核酸を（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）と接触させた時から１０分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップとを含む、方法も本明細書中で提供される。
【００１５】
ある特定の態様では、試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するための方法であって、ａ）試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、標的配列が、互いに相補的な第１の鎖および第２の鎖を含み、増幅するステップが、ヘリカーゼ不含かつ／またはリコンビナーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸をｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、第１のオリゴヌクレオチドが、第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびにｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、核酸増幅産物が、１）第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列からなり、スペーサー配列が第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、ｂ）核酸増幅産物を検出するステップであって、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ試料核酸を（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）と接触させた時から１０分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップとを含む、方法も本明細書中で提供される。
【００１６】
ある特定の態様では、試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するためのキットであって、ａ）ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、第１のオリゴヌクレオチドが、標的配列の第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、標的配列の第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドを含み、標的配列の第１の鎖および第２の鎖が互いに相補的である、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびにｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分を含む、ヘリカーゼ不含かつ／またはリコンビナーゼ不含の等温増幅条件下で試料核酸中の標的配列を増幅するための成分と、ｂ）核酸増幅産物のリアルタイム検出活性を提供する少なくとも１つの成分とを含む、キットも本明細書中で提供される。
【００１７】
ある特定の態様では、試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するためのキットであって、ａ）ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、第１のオリゴヌクレオチドが、標的配列の第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、標的配列の第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなり、標的配列の第１の鎖および第２の鎖が互いに相補的である、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびにｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分を含む、ヘリカーゼ不含かつ／またはリコンビナーゼ不含の等温増幅条件下で試料核酸中の標的配列を増幅するための成分と、ｂ）核酸増幅産物のリアルタイム検出活性を提供する少なくとも１つの成分とを含む、キットも本明細書中で提供される。
【００１８】
さらに以下の説明、実施例、特許請求の範囲、および図面において、ある特定の実施形態が説明される。
【００１９】
図面は、本技術のある特定の実施形態を説明するものであり、限定的なものではない。イラストの明瞭性および容易さのために、図面は一定の拡大縮小率ではなく、一部の例では、特定の実施形態の理解を促進するために、様々な態様が誇張または拡大されて示されることがある。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、標的のない対照（ＮＴＣ；陰性対照）として使用されたｄＨ２Ｏまたはトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）を用いて二連で行ったクラミジアゲノムＤＮＡの増幅反応のリアルタイム検出を示す。
【００２１】
【図２】図２は、クラミジアゲノムＤＮＡアッセイ産物のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）検出を示す。
【００２２】
【図３】図３は、エンドポイント分子ビーコン検出によるクラミジアゲノムＤＮＡの検出限界（ＬＯＤ）を示す。
【００２３】
【図４】図４は、分子ビーコンによるクラミジアゲノムＤＮＡのリアルタイム検出を示す。
【００２４】
【図５−１】図５は、本明細書中に記載する等温増幅反応の概略図を示す。
【図５−２】図５は、本明細書中に記載する等温増幅反応の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
核酸を増幅するための方法および組成物が本明細書中で提供される。従来の核酸増幅方法は、通常、サーモサイクリング処理、核酸の変性、鎖の巻き戻し、鎖の分離、および／もしくは鎖の交換を促進するタンパク質（例えば、酵素）（例えば、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ）、ならびに／またはエンドヌクレアーゼ剤（例えば、制限酵素、ニッキング酵素）を必要とし、また最短でも２０〜３０分の反応時間を必要とすることが多い。本明細書中で提供する核酸増幅方法は、サーモサイクリングなし、核酸の変性なし、鎖の巻き戻し、鎖の分離、および／または鎖の交換を促進するタンパク質（例えば、酵素）の追加なし、エンドヌクレアーゼ剤なし、ならびに１０分以内の反応時間で行うことができる。
【００２６】
核酸、被験体、試料、および核酸の処理
核酸を増幅するための方法および組成物が本明細書中で提供される。「核酸」および「核酸分子」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され得る。該用語は、任意の組成の核酸、例えば、ＤＮＡ（例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）など）、ＲＮＡ（例えば、メッセージＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短鎖阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および／またはＤＮＡもしくはＲＮＡアナログ（例えば、塩基アナログ、糖アナログ、および／または非天然の骨格などを含有する）、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、およびポリアミド核酸（ＰＮＡ）を指し、これらの全ては一本鎖または二本鎖の形態であってよく、別段に限定しない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能できる天然ヌクレオチドの公知のアナログを包含し得る。核酸は、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、人工染色体、染色体、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたは宿主細胞、細胞、細胞核、ミトコンドリア、もしくはある特定の実施形態では細胞の細胞質中で複製できるまたは複製されることができるその他の核酸であり得、またはこれらに由来し得る。特に限定しない限り、該用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの公知のアナログを含有する核酸を包含する。別段に示さない限り、具体的な核酸配列は、明示的に示した配列に加えて、保存的に修飾されたその改変体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型（ＳＮＰ）、および相補的配列も暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成できる。核酸という用語は、遺伝子座、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと交換可能に使用され得る。該用語はまた、同等物として、ヌクレオチドアナログ、一本鎖（「センス」または「アンチセンス」、「プラス」鎖または「マイナス」鎖、「フォワード」リーディングフレームまたは「リバース」リーディングフレーム、「フォワード」鎖または「リバース」鎖）および二本鎖ポリヌクレオチドから合成されたＲＮＡまたはＤＮＡの誘導体、改変体、およびアナログも包含し得る。「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、一般に、遺伝子産物の転写／翻訳および転写／翻訳の調節に関与するコーディング領域の前および後の領域（リーダーおよびトレイラー（ｔｒａｉｌｅｒ））、ならびに個々のコーディングセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を包含する。ヌクレオチドまたは塩基は、一般に、核酸のプリンおよびピリミジン分子単位（例えば、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ））を指す。ＲＮＡの場合、塩基チミンはウラシルに置き換えられる。核酸の長さまたはサイズは、塩基数として表すことができる。
【００２７】
本明細書中で提供する方法の一部の実施形態では、１つまたは複数の核酸標的が増幅される。標的核酸は、標的配列、標的ポリヌクレオチド、および／または標的ポリヌクレオチド配列と称されることがあり、二本鎖および一本鎖核酸分子を包含し得る。標的核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。標的核酸がＲＮＡ分子である場合、分子は、例えば、二本鎖、一本鎖であってよく、または、ＲＮＡ分子は、一本鎖である標的配列を含み得る。標的核酸が二本鎖である場合、標的核酸は、一般に、第１の鎖および第２の鎖を含む。第１の鎖および第２の鎖は、フォワード鎖およびリバース鎖と称されることがあり、一般に互いに相補的である。標的核酸が一本鎖である場合、相補鎖は、例えば重合および／または逆転写によって生成することができ、標的核酸は二本鎖となり、第１／フォワード鎖および第２／リバース鎖を有するようになる。
【００２８】
標的配列は、核酸配列のセンスまたはアンチセンス鎖のいずれかを指すことがあり、また、標的核酸上、元々の標的配列の増幅コピー上、または増幅産物上に存在するときの配列を指すこともある。標的配列は、より大きいポリヌクレオチド内の部分配列であってもよい。例えば、標的配列は、増幅のために標的化された、核酸断片、染色体、プラスミド内の短い配列（例えば、２０〜５０塩基）であってもよい。一部の実施形態では、標的配列は、核酸を増幅するために使用されるオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー）に相補的な標的核酸中の配列を指すことがある。したがって、標的配列は、増幅のために標的化された配列全体を指してもよいし、またはオリゴヌクレオチドが結合する標的核酸中の部分配列を指してもよい。増幅産物は、標的配列、および少なくとも１つのその他の配列、またはその他のヌクレオチドを含むより大きい分子であってよい。一部の実施形態では、増幅産物は、標的配列とおおよそ同じ長さである。一部の実施形態では、増幅産物は、標的配列と全く同じ長さである。一部の実施形態では、増幅産物は標的配列を含む。一部の実施形態では、増幅産物は標的配列からなる。
【００２９】
標的配列の長さ、および／またはグアノシンシトシン（ＧＣ）濃度（パーセント）は、増幅反応が行われる温度に部分的に依存することがあり、そしてこの温度は、反応に使用されるポリメラーゼの安定性に部分的に依存することがある。１セットの反応条件のための適切な標的配列の長さおよびＧＣ濃度を決定するための試料アッセイを行うことができる。例えば、ポリメラーゼが６０℃〜６５℃まで安定である場合、標的配列は、例えば１９〜５０ヌクレオチドの長さ、または例えば、約４０〜５０、２０〜４５、２０〜４０、もしくは２０〜３０ヌクレオチドの長さであり得る。これらの条件下のＧＣ濃度は、例えば、６０％未満、５５％未満、５０％未満、または４５％未満であり得る。
【００３０】
標的核酸は、例えば、ゲノム核酸、プラスミド核酸、ミトコンドリア核酸、細胞性核酸、細胞外核酸、細菌核酸、およびウイルス核酸を含み得る。一部の実施形態では、標的核酸は、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ミトコンドリアのＤＮＡ、遺伝子、任意の種類の細胞性ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、細菌ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、または合成オリゴヌクレオチドを含み得る。ゲノム核酸は、例えば、動物、植物、昆虫、ウイルス、および細菌のゲノム、例えば、胞子中に存在するゲノムなどの任意のゲノム由来の任意の核酸を含み得る。一部の実施形態では、ゲノム標的核酸は、特定のゲノム遺伝子座または複数のゲノム遺伝子座内にあり得る。ゲノム遺伝子座は、オープンリーディングフレームＤＮＡ、非転写ＤＮＡ、イントロン配列、エクストロン配列（ｅｘｔｒｏｎｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、プロモーター配列、エンハンサー配列、隣接配列、または所与のゲノム遺伝子座に関連すると考えられる任意の配列のいずれかまたは組み合わせを含み得る。
【００３１】
一部の実施形態では、標的配列は、１つまたは複数の反復エレメント（例えば、多重反復配列、逆方向反復配列、パリンドローム配列、縦列反復、マイクロサテライト、ミニサテライトなど）を含む。一部の実施形態では、標的配列は、試料核酸内（例えば、核酸断片、染色体、ゲノム、プラスミド内）に反復エレメント（例えば、多重反復配列、逆方向反復配列、パリンドローム配列、縦列反復、マイクロサテライト反復、ミニサテライト反復など）として存在する。例えば、標的配列は、反復エレメントとして複数回存在してよく、かつ反復エレメント内の標的配列の１つ、一部、または全ての存在が、（例えば、単一対のプライマーを使用して）本明細書中に記載する方法を使用して増幅されてもよい。一部の実施形態では、標的配列は、重複および／またはパラログとして試料核酸内（例えば、核酸断片、染色体、ゲノム、プラスミド内）に存在する。
【００３２】
標的核酸はマイクロＲＮＡを含み得る。マイクロＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、または小分子ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ＲＮＡ）（ｓｔＲＮＡ）は、遺伝子調節に関与する短い（例えば、約２１〜２３ヌクレオチドの長さ）一本鎖のＲＮＡ配列である。マイクロＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡの翻訳に干渉することがあり、メッセンジャーＲＮＡに部分的に相補的である。標的核酸は、さらにプロセシングされてｍｉＲＮＡとなる、一次転写物（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）およびｐｒｅ−ｍｉＲＮＡステムループ構造ＲＮＡなどのマイクロＲＮＡ前駆体を含み得る。標的核酸は、ＲＮＡ干渉（例えば、ウイルスの複製または遺伝子発現の下方調節）に関与する短い（例えば、約２０〜２５ヌクレオチドの長さ）少なくとも部分的に二本鎖のＲＮＡ分子である短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含み得る。
【００３３】
本明細書中に記載する方法において利用される核酸は、任意の好適な生物学的検体または試料から得ることができ、多くの場合、被験体から得られた試料から単離される。被験体は、ヒト、非ヒト動物、植物、細菌、真菌、ウイルス、または原生生物を含むが、これらに限定されない、任意の生きているまたは生きていない生物体であってよい。哺乳動物、爬虫類、鳥類、両生類、魚類、有蹄動物、反すう動物、ウシ科動物（ｂｏｖｉｎｅ）（例えば、ウシ）、ウマ科動物（ｅｑｕｉｎｅ）（例えば、ウマ）、ヤギ属動物（ｃａｐｒｉｎｅ）およびヒツジ属動物（ｏｖｉｎｅ）（例えば、ヒツジ、ヤギ）、イノシシ科動物（ｓｗｉｎｅ）（例えば、ブタ）、ラクダ科動物（ｃａｍｅｒｉｄ）（例えば、ラクダ、ラマ、アルパカ）、サル、類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー）、クマ科動物（ｕｒｓｉｄ）（例えば、クマ）、家禽、イヌ、ネコ、マウス、ラット、魚類、イルカ、クジラ、およびサメを含むが、これらに限定されない、任意のヒトまたは非ヒト動物を選択することができる。被験体は雄性または雌性であってよく、被験体は任意の年齢（例えば、胚、胎児、乳児、小児、成体）であってよい。
【００３４】
試料または試験試料は、被験体またはその一部分から単離または取得された任意の検体であってよい。検体の非限定的な例としては、血液または血液産物（例えば、血清または血漿など）、臍帯血、骨髄、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、脊髄液、洗浄液（例えば、気管支肺胞、胃、腹膜、管、耳、関節鏡のもの）、生検試料、腹腔穿刺試料（ｃｅｌｏｃｅｎｔｅｓｉｓ  ｓａｍｐｌｅ）、細胞（例えば、血液細胞）またはその一部分（例えば、ミトコンドリア、核、または抽出物など）、メスの生殖管の洗液、尿、糞便、痰、唾液、鼻粘液、前立腺液、洗浄液、精液、リンパ液、胆汁、涙液、汗、母乳、乳汁（ｂｒｅａｓｔ  ｆｌｕｉｄ）、硬組織（例えば、肝臓、脾臓、腎臓、肺、または卵巣）などまたはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、被験体由来の流体または組織が挙げられる。血液という用語は、全血、血液産物、または血液の任意の画分、例えば、慣習的に定義されるような、血清、血漿、またはバフィコートなどを包含する。血漿とは、抗凝固剤で処理した血液の遠心分離により生じる全血の画分を指す。血清とは、血液試料を凝固させた後に残る流体の水性部分を指す。流体または組織試料は、多くの場合、病院または診療所で一般に従われる標準的なプロトコールに従って回収される。血液の場合、適切な量の末梢血（例えば、３〜４０ミリリットル）が回収されることが多く、調製の前または後に標準的な手順に従って貯蔵することができる。
【００３５】
試料または試験試料としては、胞子、ウイルス、細胞、原核生物もしくは真核生物由来の核酸、または任意の遊離核酸を含有する試料を挙げることができる。例えば、本明細書中に記載する方法は、（例えば、溶解を必要とせずに）胞子の外側の核酸を検出するために使用され得る。試料は、上記の被験体由来のものなどの、標的配列を含有することが疑われる任意の材料から単離され得る。ある特定の例では、標的配列は、生物体を含有することが疑われる空気、植物、土壌、またはその他の材料中に存在し得る。
【００３６】
核酸は、当該技術分野で公知の方法によって、１つまたは複数の供給源から取得（例えば、単離、抽出、精製）され得る。生体試料から核酸を単離、抽出、および／または精製するための任意の好適な方法を使用することができ、その非限定的な例としては、当該技術分野におけるＤＮＡ調製法、およびＱｉａｇｅｎのＱＩＡａｍｐ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ、ＱｉａＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、またはＱｉａＡｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ（商標）Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）、ＧＦＸ（商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｂｌｏｏｄ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）などの様々な市販されている試薬もしくはキット、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００３７】
一部の実施形態では、細胞溶解手順が行われる。細胞溶解は、（例えば、増幅のために細胞からＤＮＡおよび／またはＲＮＡを放出するために）本明細書中に記載する増幅反応の開始前に行われ得る。細胞溶解手順および試薬は当該技術分野で公知であり、一般に、化学的（例えば、界面活性剤、低張溶液、酵素手順など、またはこれらの組み合わせ）、物理的（例えば、フレンチプレス、超音波処理など）、または電解溶解方法によって行われ得る。任意の好適な溶解手順を利用することができる。例えば、化学的方法は、一般に、細胞を破砕し、細胞から核酸を抽出するための溶解剤、それに引き続いてカオトロピック塩での処理を用いる。一部の実施形態では、細胞溶解は、界面活性剤（例えば、イオン性、非イオン性、陰イオン性、双性イオン性）の使用を含む。一部の実施形態では、細胞溶解は、イオン性界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、デオキシコレート、コレート、サルコシル）の使用を含む。凍結／解凍それに引き続いて粉砕、細胞破砕機の使用などの物理的方法もまた有用であり得る。高塩濃度溶解手順も使用され得る。例えば、アルカリ溶解手順が利用され得る。後者の手順は従来、フェノール−クロロホルム溶液の使用を組み込んでおり、また、３つの溶液を伴う代替的なフェノール−クロロホルム不含の手順が利用され得る。後者の手順では、例えば、１つの溶液は、１５ｍＭトリス、ｐＨ８．０；１０ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１００μｇ／ｍｌリボヌクレアーゼＡを含有することができ、第２の溶液は、０．２Ｎ  ＮａＯＨおよび１％  ＳＤＳを含有することができ、第３の溶液は、３Ｍ  ＫＯＡｃ、ｐＨ５．５を含有することができる。一部の実施形態では、本明細書中に記載する方法および成分と組み合わせて細胞溶解緩衝液が使用される。
【００３８】
ある特定の実施形態では、核酸は、核酸を含有する試料を処理することなく、本明細書中に記載する方法を実行するために提供され得る。例えば、一部の実施形態では、核酸は、事前の核酸精製なしに、本明細書中に記載する増幅方法を実行するために提供される。一部の実施形態では、標的配列は、（例えば、任意の核酸抽出、単離、精製、および／または部分精製ステップを行うことなく）試料から直接的に増幅される。一部の実施形態では、核酸は、核酸を含有する試料の処理後に本明細書中に記載する方法を実行するために提供される。例えば、核酸は、試料から、抽出、単離、精製、または部分精製され得る。「単離された」という用語は、一般に、核酸がその元々の環境（例えば、天然に存在するものであれば天然の環境、または外因的に発現されたものであれば宿主細胞）から取り除かれたことを指し、したがってヒトの介入によって（例えば、「人間の手により」）その元々の環境から変化している。「単離された核酸」という用語は、被験体（例えば、ヒト被験体）から取り除かれた核酸を指すことができる。単離された核酸は、供給源試料中に存在する成分の量よりも少ない非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質、炭水化物）と共に提供され得る。単離された核酸を含む組成物は、非核酸成分を約５０％から９９％超含まないことがある。単離された核酸を含む組成物は、非核酸成分を約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超含まないことがある。「精製された」という用語は、一般に、提供された核酸が、核酸を精製手順に供する前に存在した非核酸成分（例えば、タンパク質、脂質、炭水化物）の量より少ない非核酸成分を含有することを指す。精製された核酸を含む組成物は、他の非核酸成分を約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超含まないことがある。
【００３９】
核酸は、核酸を修飾することなく、本明細書中に記載する方法を実行するために提供され得る。修飾は、例えば、変性、消化、ニッキング、巻き戻し、異種配列の組込みおよび／またはライゲーション、エピジェネティック修飾の付加、標識（例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉ、または３５Ｓなどの放射性標識；アルカリホスファターゼなどの酵素標識；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光標識；またはビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、蛍光色素などのその他の標識）の付加などを含み得る。したがって、一部の実施形態では、非修飾核酸が増幅される。
【００４０】
増幅
核酸を増幅するための方法が本明細書中で提供される。一部の実施形態では、核酸は、好適な増幅プロセスを使用して増幅される。核酸増幅は、通常、増幅されているヌクレオチド配列に相補的な配列を含有する核酸アンプリコン（コピー）の酵素合成を伴う。一部の実施形態では、増幅方法は、単一の容器、単一のチャンバー、および／または単一の容量（すなわち、連続の容量）中で行われる。一部の実施形態では、増幅方法および検出方法（例えば、本明細書中に記載する検出方法など）は、単一の容器、単一のチャンバー、および／または単一の容量（すなわち、連続の容量）中で行われる。
【００４１】
「増幅する」、「増幅」、「増幅反応」、または「増幅すること」という用語は、標的核酸のコピーを増大させるための任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理を指す。増幅は、標的核酸の「指数関数的」な増加を指すことがある。しかしながら、「増幅すること」は、標的核酸の数の直線的な増加を指すこともあるが、１回の、単一のプライマー伸長ステップとは異なる。一部の実施形態では、プレ増幅としても公知である限られた増幅反応を行うことができる。プレ増幅は、１０サイクルなど、行われているサイクル数が少ないことにより、限られた量の増幅が起こる方法である。プレ増幅は、ある程度の増幅を許容できるが、対数期の前に増幅を停止し、通常約５００コピーの所望のヌクレオチド配列を生成する。プレ増幅の使用は、ある特定の増幅反応における枯渇した反応物に付随する不正確さを制限するものであり得、かつ標的のヌクレオチド配列または種の存在量に起因する増幅バイアスも低減し得る。一部の実施形態では、１回のプライマー伸長が、直線的または指数関数的な増幅への準備として行われ得る。
【００４２】
増幅プロセスの一般的説明が本明細書中に提示される。例えば、プライマー（例えば、本明細書中に記載するオリゴヌクレオチド）および標的核酸を接触させ、相補的配列が互いにアニールまたはハイブリダイズする。プライマーは、目的の配列においてまたはその近くにおいて（例えば、その付近で、それに隣接してなど）標的核酸にアニールすることができる。標的へとアニールしたプライマーは、プライマー−標的ハイブリッド、ハイブリダイズしたプライマー−標的、またはプライマー−標的二重鎖と称され得る。目的のヌクレオチド配列に関する場合、近くまたは付近という用語は、プライマーの末端と標的の１つまたは複数のヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド配列）との間の距離（例えば、塩基数）または領域を指す。一般に、付近は、目的のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列から約１ヌクレオチドから約５０ヌクレオチド（例えば、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド）の範囲内で離れていることである。一部の実施形態では、１セットのプライマー（例えば、一対のプライマー、フォワードおよびリバースプライマー、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド）は、目的のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列から約１〜２０ヌクレオチド内でアニールし、増幅産物を生成する。一部の実施形態では、プライマーは、目的のヌクレオチドまたはヌクレオチド配列内でアニールする。アニーリング後、各プライマーはポリメラーゼによって標的（すなわち、鋳型鎖）に沿って伸長されて、相補鎖を生成する。例えば、検出可能な量の増幅産物が生成されるまで、数サイクルのプライマーのアニーリングおよび伸長が実行され得る。一部の実施形態では、標的核酸がＲＮＡである場合、逆転写による増幅ステップの前または間に標的ＲＮＡのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）が合成され得る。
【００４３】
増幅反応の成分は、例えば、１つまたは複数のプライマー（例えば、個々のプライマー、プライマー対、プライマーセット、オリゴヌクレオチド、マルチプレックス増幅用の複数のプライマーセットなど）、核酸標的（例えば、試料由来の標的核酸）、１つまたは複数のポリメラーゼ、ヌクレオチド（例えば、ｄＮＴＰなど）、および好適な緩衝液（例えば、界面活性剤、還元剤、一価イオン、および二価イオンを含む緩衝液）を含み得る。一部の実施形態では、増幅反応は、逆転写酵素をさらに含み得る。一部の実施形態では、増幅反応は、本明細書中に記載する検出剤の１つまたは複数などの、１つまたは複数の検出剤をさらに含み得る。一部の実施形態では、増幅反応の成分は、プライマー、標的核酸、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、および好適な緩衝液からなる。一部の実施形態では、増幅反応の成分は、プライマー、標的核酸、ポリメラーゼ、逆転写酵素、ヌクレオチド、および好適な緩衝液からなる。一部の実施形態では、増幅反応の成分は、プライマー、標的核酸、ポリメラーゼ、検出剤、ヌクレオチド、および好適な緩衝液からなる。一部の実施形態では、増幅反応の成分は、プライマー、標的核酸、ポリメラーゼ、逆転写酵素、検出剤、ヌクレオチド、および好適な緩衝液からなる。一部の実施形態では、増幅反応の成分は、プライマー、標的核酸、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、および好適な緩衝液から本質的になる。一部の実施形態では、増幅反応の成分は、プライマー、標的核酸、ポリメラーゼ、逆転写酵素、ヌクレオチド、および好適な緩衝液から本質的になる。一部の実施形態では、増幅反応の成分は、プライマー、標的核酸、ポリメラーゼ、検出剤、ヌクレオチド、および好適な緩衝液から本質的になる。一部の実施形態では、増幅反応の成分は、プライマー、標的核酸、ポリメラーゼ、逆転写酵素、検出剤、ヌクレオチド、および好適な緩衝液から本質的になる。増幅反応の成分がある特定の成分から本質的になる場合、増幅に顕著な効果を持たずかつ／または検出可能な産物を生成するために必要でない追加の成分または特徴が含まれ得る。例えば、本明細書中の成分および条件の、等温条件下で増幅を達成しかつ約１０分またはそれ未満以内に検出可能な増幅産物を生成する能力に対して顕著な効果を有しない追加の成分または特徴が含まれ得る。そのような追加の成分または特徴は、非必須成分と称することができ、塩、緩衝液、界面活性剤、イオン、油、タンパク質、ポリマーなどの、典型的な反応成分および／または一般的な添加物を含み得る。
【００４４】
核酸増幅は、例えば、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などの天然ヌクレオチド、および／または誘導体化されたヌクレオチドの存在下で実行され得る。天然ヌクレオチドとは、一般に、アデニル酸、グアニル酸、シチジル酸、チミジル酸、またはウリジル酸を指す。誘導体化されたヌクレオチドは、一般に、天然ヌクレオチド以外のヌクレオチドである。ヌクレオチドは、通常、以下の通りに表される。リボヌクレオシド三リン酸はＮＴＰまたはｒＮＴＰと称され、ここでＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｕであり得る。デオキシヌクレオシド三リン酸基質はｄＮＴＰと称され、ここでＮはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵであり得る。単量体ヌクレオチドサブユニットは、特にＤＮＡまたはＲＮＡに言及することなく、本明細書中でＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、またはＵと表され得る。一部の実施形態では、検出可能な標識（例えば、蛍光または比色定量標識）を含有するアナログなどの、天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログが使用され得る。例えば、核酸増幅は、例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、１２５Ｉ、または３５Ｓなどの放射性標識、アルカリホスファターゼなどの酵素標識、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの蛍光標識、またはビオチン、アビジン、ジゴキシゲニン、抗原、ハプテン、もしくは蛍光色素などのその他の標識などの、標識化ｄＮＴＰの存在下で実行され得る。一部の実施形態では、核酸増幅は、例えば、熱活性化ｄＮＴＰ（例えば、ＴｒｉＬｉｎｋのＣｌｅａｎＡｍｐ（商標）ｄＮＴＰ）などの、修飾ｄＮＴＰの存在下で実行され得る。
【００４５】
一部の実施形態では、増幅反応の成分は、非酵素成分および酵素成分を含み得る。非酵素成分は、例えば、プライマー、ヌクレオチド、緩衝液、塩、還元剤、界面活性剤、およびイオンを含み得、一般に、タンパク質（例えば、核酸結合性タンパク質）、酵素、または酵素活性を有するタンパク質、例えば、ポリメラーゼ、逆転写酵素、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、制限酵素、ニッキング酵素、リコンビナーゼなどを含まない。一部の実施形態では、酵素成分はポリメラーゼからなり得るか、またはポリメラーゼおよび逆転写酵素からなり得る。したがって、そのような酵素成分は、例えば、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、制限酵素、ニッキング酵素、リコンビナーゼなどの、その他のタンパク質（例えば、核酸結合性タンパク質および／または酵素活性を有するタンパク質）を除外する。
【００４６】
一部の実施形態では、増幅条件は酵素活性を含む。通常、酵素活性はポリメラーゼによって提供され、ある特定の例では、酵素活性はポリメラーゼおよび逆転写酵素によって提供される。一部の実施形態では、酵素活性はポリメラーゼ活性からなる。一部の実施形態では、酵素活性はポリメラーゼ活性および逆転写酵素活性からなる。したがって、一部の実施形態では、酵素活性は、例えば、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、制限酵素、ニッキング酵素、リコンビナーゼなどのその他の酵素によって提供される酵素活性を含まない。ある特定の例では、ポリメラーゼ活性および逆転写酵素活性は、別々の酵素または別々の酵素型（例えば、ポリメラーゼおよび逆転写酵素）によって提供される。ある特定の例では、ポリメラーゼ活性および逆転写酵素活性は、単一の酵素または酵素型（例えば、ポリメラーゼ）によって提供される。
【００４７】
一部の実施形態では、核酸の増幅は、非サーモサイクリング型のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。一部の実施形態では、核酸の増幅は、等温増幅プロセスを含む。一部の実施形態では、核酸の増幅は、等温のポリメラーゼ連鎖反応（ｉＰＣＲ）を含む。等温増幅は、一般に、一定温度で行われる増幅プロセスである。等温条件、等温で、および一定温度などの用語は、一般に、増幅反応の過程の間に反応の温度が本質的に一定に保たれる反応条件を指す。等温増幅条件は、一般に、増幅プロセス中のサーモサイクリング（すなわち、高温と低温との間のサイクリング）成分を含まない。等温条件下で増幅する場合、反応は本質的に一定の温度に保たれ得るが、これは、温度は正確に１つの温度に維持されなくてもよいことを意味する。例えば、温度の小さい変動（例えば、±１〜５℃）が、例えば、環境上のまたは装置に基づく変数に起因して等温増幅プロセスにおいて起こり得る。多くの場合、反応容量全体が本質的に一定の温度に保たれ、本明細書中の等温反応は一般に、反応容器内で生成された温度勾配および／または対流に基づく温度サイクリングに依拠する増幅条件を含まない。
【００４８】
本明細書中の等温増幅反応は本質的に一定の温度で実行され得る。一部の実施形態では、本明細書中の等温増幅反応は約５５℃の温度から約７５℃の温度で実行される。例えば、本明細書中の等温増幅反応は、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、または約７５℃の温度で実行され得る。一部の実施形態では、本明細書中の等温増幅反応は、約５５℃の温度から約６５℃の温度で実行される。例えば、本明細書中の等温増幅反応は、約６０℃の温度で実行され得る。本明細書中の等温増幅反応は、約６５℃の温度で実行され得る。一部の実施形態では、温度素子（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（例えば、熱源）は本質的に一定の温度に保たれる。一部の実施形態では、温度素子は、約７５℃またはそれ未満の本質的に一定の温度に保たれる。一部の実施形態では、温度素子は、約７０℃またはそれ未満の本質的に一定の温度に保たれる。一部の実施形態では、温度素子は、約６５℃またはそれ未満の本質的に一定の温度に保たれる。一部の実施形態では、温度素子は、約６０℃またはそれ未満の本質的に一定の温度に保たれる。
【００４９】
本明細書中の増幅プロセスは、一定の時間にわたって実行され得る。一部の実施形態では、増幅プロセスは、検出可能な核酸増幅産物が生成されるまで実行される。核酸増幅産物は、任意の好適な検出プロセスおよび／または本明細書中に記載する検出プロセスによって検出され得る。一部の実施形態では、増幅プロセスは、約２０分またはそれ未満以内の時間にわたって実行される。例えば、増幅プロセスは、約１分、約２分、約３分、約４分、約５分、約６分、約７分、約８分、約９分、約１０分、約１１分、約１２分、約１３分、約１４分、約１５分、約１６分、約１７分、約１８分、約１９分、または約２０分以内で実行され得る。一部の実施形態では、増幅プロセスは、約１０分またはそれ未満以内の時間にわたって実行される。
【００５０】
一部の実施形態では、核酸標的は、核酸を変性させる作用物質または条件へ曝露することなく増幅され得る。核酸を変性させる作用物質または条件は、鎖の分離を促進するおよび／または巻き戻しを促進する作用物質または条件を含み得る。一部の実施形態では、核酸標的は、鎖の分離を促進する作用物質または条件へ曝露することなく増幅され得る。一部の実施形態では、核酸標的は、巻き戻しを促進する作用物質または条件へ曝露することなく増幅され得る。一部の実施形態では、標的核酸は、増幅の前または増幅の間に、核酸を変性させるおよび／または鎖の分離を促進するおよび／または巻き戻しを促進する作用物質または条件へと曝露されていない場合に、非変性であるとみなされる。核酸を変性させるおよび／または鎖の分離を促進するおよび／または巻き戻しを促進する作用物質または条件は、例えば、熱的条件（例えば、高温）、ｐＨ条件（例えば、高いまたは低いｐＨ）、化学的作用物質、タンパク質（例えば、酵素剤）などを含み得る。
【００５１】
一部の実施形態では、核酸標的は、核酸を変性させる作用物質または条件へ曝露することなく増幅され得る。核酸の変性、または融解は、二本鎖核酸が巻き戻されて一本鎖に分離するプロセスである。核酸の変性を促進できる作用物質および条件としては、例えば、熱、高いｐＨ、低いｐＨ、および熱と組み合わせた変性剤（例えば、ホルムアミド）が挙げられる。一部の例では、変性は、核酸を含有する溶液をある特定の温度、例えば７５℃より高い、８０℃より高い、９０℃より高い、９５℃より高い、またはより高い温度へと加熱することによって達成され得る。一部の例では、変性は、例えば、熱と組み合わせてＮａＯＨ、ＨＣｌ、およびホルムアミドなどの変性剤へと曝露することによって達成され得る。ＤＮＡの変性の具体的な方法は、例えば、Ｓｉｎｇｈら、（１９７７年）Ｃｈｏｍｏｓｏｍａ  ６０巻：３７７〜３８９頁に記載されている。
【００５２】
一部の実施形態では、核酸標的は、鎖の分離および／または巻き戻しを促進する作用物質または条件へ曝露することなく増幅され得る。例えば、核酸標的は、ヘリカーゼへ曝露することなく増幅され得る。ヘリカーゼは、二本鎖核酸を巻き戻して一本鎖に分離できる酵素である。ヘリカーゼの例としては、ＤＮＡヘリカーゼＱ１、ブルーム症候群タンパク質、ウェルナー症候群タンパク質、ＤＮＡヘリカーゼＱ４、ＤＮＡヘリカーゼＱ５、ＤＮＡヘリカーゼ２サブユニット１、ＭＣＭ２、ＭＣＭ３、ＭＣＭ、ＭＣＭ５、ＭＣＭ６、ＭＣＭ７、ＭＣＭ８、ＭＣＭ９、ＭＣＭ１０、ヌクレオリン、ＣＨＤ２、ＣＨＤ７、ＸＰＢ、ＸＰＤ、リンパ系特異的ヘリカーゼ、ｈＩＮＯ、ＲｕｖＢ様１、ＲｕｖＢ様２、ＰＩＦ１、Ｔｗｉｎｋｌｅ、ＢＡＣＨ１、ＲｅｃＱ５アルファ、ＲｅｃＱ５ベータ、ＲｅｃＱ５ガンマ、およびＲＴＥＬ１などのヒトＤＮＡヘリカーゼ（およびその他の生物体におけるその同等物）；ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ１、ＲＮＡヘリカーゼｅＩＦ４Ａ−１、ＲＮＡヘリカーゼｅＩＦ４Ａ−２、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ３Ｘ、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ３Ｙ、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ４、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ５、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ６、ＲＮＡヘリカーゼＤＨＸ８、ＲＮＡヘリカーゼＡ、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ１０、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ１１、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ１２、ヘリカーゼＳＫＩ２Ｗ、ＲＮＡヘリカーゼＤＨＸ１５、ＲＮＡヘリカーゼＤＨＸ１６、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ１７、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ１８、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ１９Ａ、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ１９Ｂ、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ２０、核小体ＲＮＡヘリカーゼ２、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ２３、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ２４、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ２５、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ２７、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ２８、ＲＮＡヘリカーゼＤＨＸ２９、ＲＮＡヘリカーゼＤＨＸ３０、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ３１、ＲＮＡヘリカーゼＤＨＸ３２、ＲＮＡヘリカーゼＤＨＸ３３、ＲＮＡヘリカーゼＤＨＸ３４、ＲＮＡヘリカーゼＤＨＸ３５、ＲＮＡヘリカーゼＤＨＸ３６、ＲＮＡヘリカーゼＤＨＸ３７、ＲＮＡヘリカーゼＰＲＰ１６、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ３９、ＲＮＡヘリカーゼＤＨＸ４０、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ４１、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ４２、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ４３、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ４６、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ４７、ＲＮＡヘリカーゼｅＩＦ４Ａ−３、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ４９、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ５０、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ５１、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ５２、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ５３、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ５４、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ５５、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ５６、ＲＮＡヘリカーゼＤＨＸ５７、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ５８、ＲＮＡヘリカーゼＤＨＸ５８、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ５９、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ６０、スプライセオソームＲＮＡヘリカーゼＢＡＴ１、Ｕ５．ｓｎＲＮＰ  ２００ｋＤａヘリカーゼ、転写調節因子ＡＴＲＸヘリカーゼ、ＲＮＡヘリカーゼＳＵＰＶ３Ｌ１、ミトコンドリアのＳｕｐｅｒｋｉｌｌｅｒ  ｖｉｒａｌｉｃｉｄｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ２−ｌｉｋｅ  ２、およびファンコニ貧血Ｊ群タンパク質などのヒトＲＮＡヘリカ��ゼ（およびその他の生物体におけるその同等物）；ならびに市販されているヘリカーゼが挙げられる。ヘリカーゼの使用を含まない増幅条件は、本明細書中でヘリカーゼ不含の増幅条件と称され得る。
【００５３】
一部の実施形態では、核酸標的は、リコンビナーゼへ曝露することなく増幅され得る。リコンビナーゼは、遺伝子組換えに関与する酵素であり、核酸修復（例えば、組換えＤＮＡ修復）に関与することがある。リコンビナーゼは、例えば鎖の交換を開始させることができる。リコンビナーゼとしては、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、Ｔｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、ＲｅｃＡ、ＲＡＤ５１、ＲａｄＡ、Ｔ４  ｕｖｓＸを挙げることができる。一部の実施形態では、核酸標的は、例えば、リコンビナーゼローディング因子（例えば、Ｔ４  ｕｖｓＹ）などのリコンビナーゼアクセサリータンパク質へ曝露することなく増幅され得る。
【００５４】
一部の実施形態では、核酸標的は、核酸結合性タンパク質（例えば、一本鎖結合性タンパク質または一本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質（ＳＳＢ））へ曝露することなく増幅され得る。一本鎖結合性タンパク質は、一般に、未熟なアニーリングを防止するように機能し、ヌクレアーゼによる消化から一本鎖ＤＮＡを保護し、かつ／またはＤＮＡから二次構造を取り除いて（例えば、らせん二重鎖を不安定化して）その他の酵素による作用を可能とする。一部の実施形態では、核酸標的は、例えば、Ｔ４  ｇｐ３２などの一本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質へ曝露することなく増幅され得る。
【００５５】
一部の実施形態では、核酸標的は、トポイソメラーゼへ曝露することなく増幅され得る。
【００５６】
トポイソメラーゼは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡのいずれかに結合してＤＮＡリン酸骨格を切断することによってＤＮＡのオーバーワインディングまたはアンダーワインディング（ｕｎｄｅｒｗｉｎｄｉｎｇ）を調節する酵素である。トポイソメラーゼの使用を含まない増幅条件は、本明細書中でトポイソメラーゼ不含の増幅条件と称され得る。
【００５７】
核酸標的は、核酸を不安定化させる作用物質または条件へ曝露して、またはそれらへ曝露することなく増幅され得る。不安定化とは、一般に、（例えば、Ｌｅｎｇｌｅｔら、（２０１０年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２０１０巻、論文ＩＤ  ２９０９３５、１７頁に記載されているような、）傾斜させる、回転させる、ねじる、滑らせる、および反転させる効果のうちの１つまたは複数によって核酸分子の全体的な構成および幾何学的配向（例えば、二重らせん構造）を破壊することを指す。不安定化は、一般に、変性について上記したような核酸鎖の融解または分離を指さない。核酸の不安定化は、例えば、挿入物質（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒ）もしくはアルキル化剤などの作用物質、および／またはホルムアミド、尿素、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、もしくはＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン（ベタイン）などの化学物質への曝露によって達成され得る。一部の実施形態では、増幅方法は、１つまたは複数の不安定化剤の使用を含み得る。一部の実施形態では、増幅方法は、不安定化剤の使用を除外する。
【００５８】
一部の実施形態では、核酸標的は、リガーゼへ曝露することなく増幅され得る。リガーゼは、新たな化学結合を形成させることによってアミノ酸分子の連結を触媒できる酵素である。リガーゼの使用を含まない増幅条件は、本明細書中でリガーゼ不含の増幅条件と称され得る。
【００５９】
一部の実施形態では、核酸標的は、ＲＮＡレプリカーゼへ曝露することなく増幅され得る。ＲＮＡレプリカーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）、またはＲＤＲは、ＲＮＡ鋳型からのＲＮＡの複製を触媒する酵素である。ＲＮＡレプリカーゼの使用を含まない増幅条件は、本明細書中でＲＮＡレプリカーゼ不含の増幅条件と称され得る。
【００６０】
ある特定の実施形態では、核酸標的は、切断も消化もすることなく増幅され得る。例えば、一部の実施形態では、核酸は、１つまたは複数の切断剤へ事前に曝露することなく増幅され、インタクトな核酸が増幅される。ある特定の実施形態では、核酸は、増幅の間に１つまたは複数の切断剤へ曝露することなく増幅される。ある特定の実施形態では、核酸は、増幅後に１つまたは複数の切断剤へ曝露することなく増幅される。切断剤の使用を含まない増幅条件は、本明細書中で切断剤不含の増幅条件と称され得る。「切断剤」という用語は、一般に、１つまたは複数の特異的または非特異的な部位において核酸を切断できる作用物質、時には化学物質または酵素を指す。多くの場合、特異的切断剤は、特定の部位の特定のヌクレオチド配列に従って特異的に切断する。切断剤としては、エンドヌクレアーゼ（例えば、制限酵素、ニッキング酵素など）、エキソヌクレアーゼ（デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼＨ）、５’−３’エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩ）、３’−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）、およびポリ（Ａ）特異的３’−５’エキソヌクレアーゼ）、および化学切断剤を挙げることができる。
【００６１】
ある特定の実施形態では、核酸標的は、制限酵素および／またはニッキング酵素を使用せずに増幅され得る。制限酵素は、特定の部位においてＤＮＡを切断し、一般に二重鎖（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ）の両方の鎖を切断するタンパク質であり、ニッキング酵素は、二本鎖ＤＮＡに結合して二重鎖の一方の鎖を切断するタンパク質である。ある特定の実施形態では、核酸は、制限酵素および／またはニッキング酵素へ事前に曝露することなく増幅される。ある特定の実施形態では、核酸は、増幅の間に制限酵素および／またはニッキング酵素へ曝露することなく増幅される。ある特定の実施形態では、核酸は、増幅後に制限酵素および／またはニッキング酵素へ曝露することなく増幅される。制限酵素の使用を含まない増幅条件は、本明細書中で制限酵素不含の増幅条件と称され得る。ニッキング酵素の使用を含まない増幅条件は、本明細書中でニッキング酵素不含の増幅条件と称され得る。
【００６２】
ある特定の実施形態では、核酸標的は、エキソヌクレアーゼ処理なしで増幅され得る。エキソヌクレアーゼは、３’または５’末端のいずれかにおいてホスホジエステル結合を切断する加水分解反応を通じてポリヌクレオチド鎖の末端から１つずつヌクレオチドを切断することによって働く酵素である。エキソヌクレアーゼとしては、例えば、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ（例えば、リボヌクレアーゼＨ）、５’−３’エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩ）、３’−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）、およびポリ（Ａ）特異的３’−５’エキソヌクレアーゼが挙げられる。ある特定の実施形態では、核酸は、増幅の前のエキソヌクレアーゼ処理なしで増幅される。ある特定の実施形態では、核酸は、増幅の間のエキソヌクレアーゼ処理なしで増幅される。ある特定の実施形態では、核酸は、増幅後のエキソヌクレアーゼなしで増幅される。エキソヌクレアーゼの使用を含まない増幅条件は、本明細書中でエキソヌクレアーゼ不含の増幅条件と称され得る。ある特定の実施形態では、核酸は、デオキシリボヌクレアーゼ処理なしで増幅される。ある特定の実施形態では、核酸は、リボヌクレアーゼ処理なしで増幅される。ある特定の実施形態では、核酸は、リボヌクレアーゼＨ処理なしで増幅される。デオキシリボヌクレアーゼの使用を含まない増幅条件は、本明細書中でデオキシリボヌクレアーゼ不含の増幅条件と称され得る。リボヌクレアーゼの使用を含まない増幅条件は、本明細書中でリボヌクレアーゼ不含の増幅条件と称され得る。リボヌクレアーゼＨの使用を含まない増幅条件は、本明細書中でリボヌクレアーゼＨ不含の増幅条件と称され得る。
【００６３】
増幅された核酸は、本明細書中で核酸増幅産物またはアンプリコンと称され得る。一部の実施形態では、増幅産物は、天然に存在するヌクレオチド、天然に存在しないヌクレオチド、ヌクレオチドアナログなど、および前述のものの組み合わせを含み得る。増幅産物は、通常、試料核酸中の配列（例えば、標的配列）またはその相補体と同一または実質的に同一のヌクレオチド配列を有する。増幅産物中の「実質的に同一」のヌクレオチド配列は、一般に、増幅されているヌクレオチド配列またはその相補体との高い程度の配列同一性（例えば、約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％より高い配列同一性）を有し、変異は、ポリメラーゼの不忠実度（ｉｎｆｉｄｅｌｉｔｙ）またはその他の変数の結果であることがある。
【００６４】
一部の実施形態では、核酸増幅産物は、試料核酸中の標的配列に連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一のポリヌクレオチドを含む。連続的に相補的とは、一般に、例えば第１の鎖中のヌクレオチド配列において、（例えば、５’から３’へ読まれた）順に並んでいる各塩基が第２の鎖中の対応する順序の塩基と対となり、かつ連続的に相補的であると考えられる配列内にギャップも、追加の配列も、対とならない塩基もないことを指す。換言すれば、連続的に相補的とは、一般に、第１の鎖中のヌクレオチド配列の全ての連続する塩基が、第２の鎖中のヌクレオチド配列の対応する連続する塩基に相補的であることを指す。例えば、配列５’−ＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣ−３’（配列番号１０）を有する第１の鎖は、配列５’−ＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴ−３’（配列番号１１）を有する第２の鎖に連続的に相補的であると考えられ、この場合、第１の鎖中の全ての連続する塩基は、第２の鎖中の全ての対応する連続する塩基に相補的である。しかしながら、配列５’−ＡＴＧＣＡＴＡＡＡＡＡＡＧＣＡＴＧＣ−３’（配列番号１２）を有する第１の鎖は、配列５’−ＧＣＡＴＧＣＡＴＧＣＡＴ−３’（配列番号１１）を有する第２の鎖に連続的に相補的であるとはみなされない。なぜなら、第１の鎖の中央の６個のアデニン（６個のＡ）の配列が、第２の鎖中の塩基と対とならないからである。連続的に相補的な配列は、時には約５個の連続する塩基から約２５個の連続する塩基の長さであり、時には約６個の連続する塩基から約２０個の連続する塩基の長さであり、時には約７個の連続する塩基から約１８個の連続する塩基の長さであり、時には約８個の連続する塩基から約１６個の連続する塩基の長さである。一部の実施形態では、核酸増幅産物は、試料核酸中の標的配列に連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一のポリヌクレオチドからなる。したがって、一部の実施形態では、核酸増幅産物は、例えば、テイルドプライマー（ｔａｉｌｅｄ  ｐｒｉｍｅｒ）もしくはライゲーションによって増幅産物中に組み込まれた追加の配列、および／または切断剤認識部位（例えば、ニッキング酵素認識部位）を提供する追加の配列などの、標的配列に連続的に相補的でなくそれと実質的に同一でもない（例えば、５’および／もしくは３’末端における、または産物内における）いかなる追加の配列も含まない。一般に、標的配列が縦列反復を含まなければ、増幅産物は、縦列反復の形態の産物を含まない。
【００６５】
核酸増幅産物は、増幅反応において使用される１つまたは複数のプライマーに相補的なまたはそれと実質的に同一の配列を含み得る。一部の実施形態では、核酸増幅産物は、第１のプライマー配列に連続的に相補的なまたはそれと同一の第１のヌクレオチド配列、および第２のプライマー配列に連続的に相補的なまたはそれと同一の第２のヌクレオチド配列を含む。
【００６６】
一部の実施形態では、核酸増幅産物は、スペーサー配列を含む。一般に、増幅産物中のスペーサー配列は、試料核酸中の標的配列の一部分に連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の配列（１つまたは複数の塩基）であり、増幅反応において使用される１つまたは複数のプライマーに相補的なまたはそれと実質的に同一の増幅産物中の配列によって挟まれている。増幅産物中の配列によって挟まれたスペーサー配列は、一般に、（第１のプライマーに相補的なまたはそれと実質的に同一の）第１の配列と（第２のプライマーに相補的なまたはそれと実質的に同一の）第２の配列との間にある。したがって、増幅産物は、通常、第１の配列、その後ろのスペーサー配列、その後ろの第２の配列を含む。スペーサー配列は、一般に、プライマー中の配列に相補的でなくそれと実質的に同一でもない。一部の実施形態では、スペーサー配列は、約１〜１０塩基を含む。例えば、スペーサー配列は、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、または１０塩基を含む。一部の実施形態では、スペーサー配列は、約１〜５塩基を含む。
【００６７】
一部の実施形態では、核酸増幅産物は、第１のプライマー配列に連続的に相補的なまたはそれと同一の第１のヌクレオチド配列、第２のプライマー配列に連続的に相補的なまたはそれと同一の第２のヌクレオチド配列、およびスペーサー配列からなる。したがって、一部の実施形態では、核酸増幅産物は、例えば、テイルドプライマーもしくはループプライマー、ライゲーションまたはその他の機序によって増幅産物中に組み込まれた追加の配列などの、第１のプライマー配列および第２のプライマー配列に連続的に相補的でなくそれと同一でもなく、かつスペーサー配列の一部分でもない（例えば、５’および／もしくは３’末端における、または産物内における）いかなる追加の配列も含まない。
【００６８】
一部の実施形態では、核酸増幅産物は、第１のプライマー配列に連続的に相補的なまたはそれと同一の第１のヌクレオチド配列、第２のプライマー配列に連続的に相補的なまたはそれと同一の第２のヌクレオチド配列、およびスペーサー配列から本質的になる。したがって、一部の実施形態では、核酸増幅産物は、一般に、例えば、テイルドプライマーもしくはループプライマー、ライゲーションまたはその他の機序によって増幅産物中に組み込まれた追加の配列などの、第１のプライマー配列および第２のプライマー配列に連続的に相補的でなくそれと同一でもなく、かつスペーサー配列の一部分でもない（例えば、５’および／もしくは３’末端における、または産物内における）追加の配列を含まない。しかしながら、そのような実施形態では、核酸増幅産物は、例えば、増幅プロセス中のエラーまたは交雑（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）によって産物中に導入された（例えば、５’および／もしくは３’末端における、または産物内における）いくつかのミスマッチの（すなわち、非相補的な）塩基またはさらに１つもしくは複数の余分な塩基を含み得る。
【００６９】
核酸増幅産物は、５０塩基までの長さであり得る。一部の実施形態では、核酸増幅産物は、約１５から約４０塩基の長さである。例えば、核酸増幅産物は、１５塩基の長さ、１６塩基の長さ、１７塩基の長さ、１８塩基の長さ、１９塩基の長さ、２０塩基の長さ、２１塩基の長さ、２２塩基の長さ、２３塩基の長さ、２４塩基の長さ、２５塩基の長さ、２６塩基の長さ、２７塩基の長さ、２８塩基の長さ、２９塩基の長さ、３０塩基の長さ、３１塩基の長さ、３２塩基の長さ、３３塩基の長さ、３４塩基の長さ、３５塩基の長さ、３６塩基の長さ、３７塩基の長さ、３８塩基の長さ、３９塩基の長さ、または４０塩基の長さであり得る。一部の実施形態では、増幅産物は、約２０から約４０塩基の長さである。一部の実施形態では、増幅産物は、約２０から約３０塩基の長さである。一部の実施形態では、所与の標的配列についての核酸増幅産物は、同じ長さまたは実質的に同じ長さ（例えば、１〜５塩基内）を有する。したがって、所与の標的配列についての核酸増幅産物は、単一のシグナル（例えば、電気泳動ゲル上のバンド）を生じ得、また一般に、複数の長さを示す複数のシグナル（例えば、電気泳動ゲル上のラダーまたはスメア）を生じない。マルチプレックス反応の場合、異なる標的配列についての核酸増幅産物は、異なる長さを有し得る。
【００７０】
本明細書中に記載する方法および成分は、マルチプレックス増幅のために使用され得る。マルチプレックス増幅とは、一般に、１つより多くの目的の核酸の増幅（例えば、１つより多くの標的配列の増幅）を指す。例えば、マルチプレックス増幅は、同じ試料由来の複数の配列の増幅、または試料中の数個の配列のうちの１つの増幅を指し得る。マルチプレックス増幅はまた、複数の試料中に存在する１つまたは複数の配列を同時にまたは段階的に増幅することも指し得る。
【００７１】
例えば、マルチプレックス増幅は、増幅できる最低２つの標的配列を増幅するために使用され得る（例えば、増幅反応は、少なくとも２つの標的配列を増幅するための適切なプライマーおよび酵素を含む）。一部の例では、増幅反応は、少なくとも２つの標的配列を検出するように調製され得るが、試験されている試料中に標的配列のうちの１つのみが存在し得る。そのため、両方の配列が増幅されることができるが、１つの配列のみが増幅される。一部の例では、２つの標的配列が存在する場合、増幅反応は、両方の標的配列の増幅を生じ得る。マルチプレックス増幅反応は、適切なプライマーおよび酵素を含む標的配列の１つ、一部、または全ての増幅を生じ得る。一部の例では、増幅反応は、一対のプライマーにより２つの配列を検出するように調製することができ、ここで１つの配列は標的配列であり、１つの配列は対照配列（例えば、標的配列と同じプライマーによって増幅でき、かつ標的とは異なるスペーサーの塩基または配列を有する合成配列）である。一部の例では、増幅反応は、対応するプライマー対により複数セットの配列を検出するように調製することができ、ここで各セットは、標的配列および対照配列を含む。
【００７２】
プライマー
核酸増幅は、一般に、１つまたは複数のプライマーの存在下で実行される。プライマーは、一般に、特定の目的の領域（すなわち、標的配列）においてまたはその近く（例えば、その付近）において標的核酸にハイブリダイズまたはアニールできるヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドとして特徴付けられる。プライマーは、例えば、標的核酸ヌクレオチド配列の特異的決定または標的核酸の検出（例えば、配列の存在または非存在）もしくはその特徴の検出を可能とし得る。プライマーは、天然に存在するものであってもよいし、合成のものであってもよい。特異的または特異性という用語は、一般に、標的ポリヌクレオチドに対するプライマーなど、ある分子の別の分子に対する結合またはハイブリダイゼーションを指す。すなわち、特異的または特異性とは、２分子間の認識、接触、および安定な複合体の形成であって、これと比べてその他の分子とのこれら２分子のいずれかの認識、接触、または複合体形成が実質的により低いことをいう。アニールまたはハイブリダイズという用語は、一般に、２分子間の安定な複合体の形成を指す。プライマーに言及する場合、プライマー、オリゴ、またはオリゴヌクレオチドという用語は、本明細書中で交換可能に使用され得る。
【００７３】
プライマーは、好適なプロセスを使用して設計および合成することができ、また、標的配列にハイブリダイズしかつ本明細書中に記載する増幅プロセスを行うのに好適な任意の長さであり得る。多くの場合、プライマーは、標的核酸中の配列に従って設計される。一部の実施形態では、プライマーは、約５塩基の長さから約３０塩基の長さであり得る。例えば、プライマーは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０塩基の長さであり得る。一部の実施形態では、プライマーは、２８塩基未満の長さである。一部の実施形態では、プライマーは、約８から約１６塩基の長さである。一部の実施形態では、プライマーは、約１０から約１２塩基の長さである。プライマーは、天然に存在するおよび／もしくは天然に存在しないヌクレオチド（例えば、修飾ヌクレオチド、標識化ヌクレオチド）、またはこれらの混合物から構成され得る。本明細書中に記載する方法と共に使用するのに好適なプライマーは、任意の好適な技術を使用して合成および標識化され得る。例えば、プライマーは、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．、２２巻：１８５９〜１８６２頁、１９８１年により最初に記載された固相ホスホルアミダイトトリエステル法に従って、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２巻：６１５９〜６１６８頁、１９８４年に記載されるように自動合成装置を使用して化学合成され得る。プライマーの精製は、例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＲｅｇｎｉｅｒ、Ｊ．  Ｃｈｒｏｍ．、２５５巻：１３７〜１４９頁、１９８３年に記載されるように、例えば、非変性アクリルアミドゲル電気泳動または陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって実行され得る。
【００７４】
一部の実施形態では、プライマーは、修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、プライマーは、修飾ヌクレオチドから本質的になる。一部の実施形態では、プライマーは、修飾ヌクレオチドからなる。ヌクレオチド（または塩基）は、本明細書中に記載するまたは当該技術分野で公知の任意の修飾に従って修飾され得る。修飾は、プライマーの合成の間に為されるものを含むことができ、および／または合成後の修飾を含むことができる。修飾は、内部修飾、プライマーの３’末端における修飾、および／またはプライマーの５’末端における修飾を含み得る。一部の実施形態では、プライマーは、修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドとの混合物を含む。一部の実施形態では、プライマーは、非修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、プライマーは、非修飾ヌクレオチドから本質的になる。一部の実施形態では、プライマーは、非修飾ヌクレオチドからなる。
【００７５】
修飾および修飾塩基としては、例えば、リン酸化（例えば、３’リン酸化、５’リン酸化）；付着化学（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）またはリンカー修飾（例えば、Ａｃｒｙｄｉｔｅ（商標）、アデニル化、アジド（ＮＨＳエステル）、ジゴキシゲニン（ＮＨＳエステル）、コレステリル−ＴＥＧ、Ｉ−Ｌｉｎｋｅｒ（商標）、アミノ修飾因子（ａｍｉｎｏ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）（例えば、アミノ修飾因子Ｃ６、アミノ修飾因子Ｃ１２、アミノ修飾因子Ｃ６  ｄＴ、Ｕｎｉ−Ｌｉｎｋ（商標）アミノ修飾因子）、アルキン（例えば、５’ヘキシニル、５−オクタジイニルｄＵ（５−ｏｃｔａｄｉｙｎｙｌ  ｄＵ））、ビオチン化（例えば、ビオチン、ビオチン（アジド）、ビオチンｄＴ、ビオチン−ＴＥＧ、デュアルビオチン、ＰＣビオチン、デスチオビオチン−ＴＥＧ）、チオール修飾（例えば、チオール修飾因子Ｃ３  Ｓ−Ｓ、ジチオール、チオール修飾因子Ｃ６  Ｓ−Ｓ））；フルオロフォア（例えば、Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）色素、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素、ＬＩ−ＣＯＲ  ＩＲＤｙｅｓ（登録商標）、ＡＴＴＯ（商標）色素、ローダミン色素、ＷｅｌｌＲＥＤ色素、６−ＦＡＭ（アジド）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）−Ｘ（ＮＨＳエステル）、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）６４０（ＮＨＳエステル）、Ｄｙ  ７５０（ＮＨＳエステル））；Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ダーククエンチャー修飾（例えば、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱ）；ダーククエンチャー修飾（例えば、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）−１、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）−２、Ｄａｂｃｙｌ）；スペーサー（Ｃ３スペーサー、ＰＣスペーサー、ヘキサンジオール、スペーサー９、スペーサー１８、１’，２’−ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）；修飾塩基（例えば、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン（２−アミノ−ｄＡ）、５−ブロモｄＵ、デオキシウリジン、逆位ｄＴ、逆位ジデオキシ−Ｔ、ジデオキシ−Ｃ、５−メチルｄＣ、デオキシイノシン、Ｓｕｐｅｒ  Ｔ（登録商標）、Ｓｕｐｅｒ  Ｇ（登録商標）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−ニトロインドール、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、ヒドロキシメチルｄＣ（ｈｙｄｒｏｘｍｅｔｈｙｌ  ｄＣ）、ＵＮＡアンロックド核酸（ｕｎｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）（例えば、ＵＮＡ−Ａ、ＵＮＡ−Ｕ、ＵＮＡ−Ｃ、ＵＮＡ−Ｇ）、Ｉｓｏ−ｄＣ、Ｉｓｏ−ｄＧ、フルオロＣ、フルオロＵ、フルオロＡ、フルオロＧ）；ホスホロチオエート結合修飾（例えば、ホスホロチオエート化（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｄ）ＤＮＡ塩基、ホスホロチオエート化ＲＮＡ塩基、ホスホロチオエート化２’Ｏ−メチル塩基、ホスホロチオエート化ＬＮＡ塩基）；およびクリック化学修飾を挙げることができる。一部の実施形態では、修飾および修飾塩基としては、ウラシル塩基、リボヌクレオチド塩基、Ｏ−メチルＲＮＡ塩基、ホスホロチオエート連結、３’リン酸基、スペーサー塩基（Ｃ３スペーサーまたはその他のスペーサー塩基など）が挙げられる。例えば、プライマーは、１つまたは複数のＯ−メチルＲＮＡ塩基（例え���、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基）を含み得る。２’−Ｏ−メチルＲＮＡは、一般に、ｔＲＮＡおよびその他の小型ＲＮＡにおいて見られるＲＮＡの転写後修飾である。２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基を含むプライマーを直接合成することができる。この修飾は、例えば、ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のＴｍを増加させることができ、一本鎖のリボヌクレアーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼの存在下で安定性を提供することができる。２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基は、例えば、安定性および標的配列への結合親和性を増加させるためにプライマー中に含まれ得る。一部の実施形態では、プライマーは、１つまたは複数のホスホロチオエート連結（例えば、ホスホロチオエート結合修飾）を含み得る。ホスホロチオエート（ＰＳ）結合は、プライマーのリン酸骨格中の非架橋酸素を硫黄原子に置換する。この修飾は、通常、ヌクレオチド間連結をヌクレアーゼ分解に対して抵抗性にする。ホスホロチオエート結合は、例えばエキソヌクレアーゼ分解を阻害するために、プライマーの５’末端または３’末端における最後の約３〜５ヌクレオチドの間に導入され得る。ある特定の例では、プライマーの全体を通じて含まれるホスホロチオエート結合は、エンドヌクレアーゼによる攻撃の低減を助けることができる。一部の実施形態では、プライマーは３’リン酸基を含み得る。３’リン酸化は、ある特定の例では、ある特定の３’−エキソヌクレアーゼによる分解を阻害することができ、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を遮断するために使用することができる。一部の実施形態では、プライマーは、１つまたは複数のスペーサー塩基（例えば、１つまたは複数のＣ３スペーサー）を含み得る。Ｃ３スペーサーのホスホルアミダイトは、プライマーの内部または５’末端に組み込むことができる。例えばフルオロフォアまたはその他のペンダント基の付着のための長い親水性スペーサーアームを導入するために、複数のＣ３スペーサーをプライマーのいずれかの末端に加えてもよい。
【００７６】
一部の実施形態では、プライマーはＤＮＡ塩基を含む。一部の実施形態では、プライマーはＲＮＡ塩基を含む。一部の実施形態では、プライマーは、ＤＮＡ塩基とＲＮＡ塩基との混合物を含む。ＤＮＡ塩基は、修飾されていてもよいし、非修飾であってもよい。ＲＮＡ塩基は、修飾されていてもよいし、非修飾であってもよい。一部の実施形態では、プライマーは、ＤＮＡ塩基（例えば、修飾ＤＮＡ塩基および／または非修飾ＤＮＡ塩基）から本質的になる。一部の実施形態では、プライマーは、ＤＮＡ塩基（例えば、修飾ＤＮＡ塩基および／または非修飾ＤＮＡ塩基）からなる。一部の実施形態では、プライマーは非修飾ＤＮＡ塩基から本質的になる。一部の実施形態では、プライマーは非修飾ＤＮＡ塩基からなる。一部の実施形態では、プライマーは修飾ＤＮＡ塩基から本質的になる。一部の実施形態では、プライマーは修飾ＤＮＡ塩基からなる。一部の実施形態では、プライマーは、ＲＮＡ塩基（例えば、修飾ＲＮＡ塩基および／または非修飾ＲＮＡ塩基）から本質的になる。一部の実施形態では、プライマーは、ＲＮＡ塩基（例えば、修飾ＲＮＡ塩基および／または非修飾ＲＮＡ塩基）からなる。一部の実施形態では、プライマーは非修飾ＲＮＡ塩基から本質的になる。一部の実施形態では、プライマーは非修飾ＲＮＡ塩基からなる。一部の実施形態では、プライマーは修飾ＲＮＡ塩基から本質的になる。一部の実施形態では、プライマーは修飾ＲＮＡ塩基からなる。
【００７７】
一部の実施形態では、プライマーはＲＮＡ塩基を含まない。一部の実施形態では、プライマーは、３’末端にＲＮＡ塩基を含まない。一部の実施形態では、プライマーは、３’末端にＤＮＡ塩基（または修飾ＤＮＡ塩基）を含む。一部の実施形態では、プライマーはキメラプライマーではない。キメラプライマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡ塩基を含むプライマーである。一部の実施形態では、プライマーは、均質なプライマー（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｐｒｉｍｅｒ）である。一部の実施形態では、プライマーは、均質なＤＮＡプライマーである。均質なＤＮＡプライマーは、非修飾ＤＮＡ塩基、修飾ＤＮＡ塩基、または修飾ＤＮＡ塩基と非修飾ＤＮＡ塩基との混合物を含むことができ、一般にＲＮＡ塩基を含まない。
【００７８】
一部の実施形態では、プライマーは切断剤認識部位を含まない。例えば、本明細書中のプライマーは、ニッキング酵素認識部位を含まなくてもよい。一部の実施形態では、プライマーはテイルを含まない。一部の実施形態では、プライマーは、ニッキング酵素認識部位を含むテイルを含まない。
【００７９】
一部の実施形態では、プライマー配列の全体または一部分は、標的核酸に相補的または実質的に相補的であり得る。配列に関して実質的に相補的とは、一般に、ヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズすることを指す。様々な量の配列ミスマッチを許容するために、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変更することができる。一部の実施形態では、標的およびプライマー配列は、少なくとも７５％互いに相補的である。例えば、標的およびプライマー配列は、７５％もしくはそれより高く、７６％もしくはそれより高く、７７％もしくはそれより高く、７８％もしくはそれより高く、７９％もしくはそれより高く、８０％もしくはそれより高く、８１％もしくはそれより高く、８２％もしくはそれより高く、８３％もしくはそれより高く、８４％もしくはそれより高く、８５％もしくはそれより高く、８６％もしくはそれより高く、８７％もしくはそれより高く、８８％もしくはそれより高く、８９％もしくはそれより高く、９０％もしくはそれより高く、９１％もしくはそれより高く、９２％もしくはそれより高く、９３％もしくはそれより高く、９４％もしくはそれより高く、９５％もしくはそれより高く、９６％もしくはそれより高く、９７％もしくはそれより高く、９８％もしくはそれより高く、または９９％もしくはそれより高く、互いに相補的であり得る。
【００８０】
標的核酸配列に実質的に相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）なプライマーは、通常、標的核酸配列の相補体（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）と実質的に同一でもある。すなわち、プライマーは、核酸のアンチセンス鎖と実質的に同一である。配列に関して実質的に同一とは、一般に、ヌクレオチド配列が互いに少なくとも７５％同一であることを指す。例えば、標的核酸のアンチセンス鎖と実質的に同一のプライマーは、７５％もしくはそれより高く、７６％もしくはそれより高く、７７％もしくはそれより高く、７８％もしくはそれより高く、７９％もしくはそれより高く、８０％もしくはそれより高く、８１％もしくはそれより高く、８２％もしくはそれより高く、８３％もしくはそれより高く、８４％もしくはそれより高く、８５％もしくはそれより高く、８６％もしくはそれより高く、８７％もしくはそれより高く、８８％もしくはそれより高く、８９％もしくはそれより高く、９０％もしくはそれより高く、９１％もしくはそれより高く、９２％もしくはそれより高く、９３％もしくはそれより高く、９４％もしくはそれより高く、９５％もしくはそれより高く、９６％もしくはそれより高く、９７％もしくはそれより高く、９８％もしくはそれより高く、または９９％もしくはそれより高く、互いに同一であり得る。２つのヌクレオチド配列が実質的に同一であるかどうかを決定するための１つの試験は、共有する同一のヌクレオチド配列のパーセントを決定することである。
【００８１】
一部の実施形態では、プライマーは一対のプライマーを含む。一対のプライマーは、フォワードプライマーおよびリバースプライマー（例えば、標的核酸のセンスおよびアンチセンス鎖に結合するプライマー）を含み得る。一部の実施形態では、プライマーは、一対のプライマー（すなわち、フォワードプライマーおよびリバースプライマー）からなる。したがって、一部の実施形態では、標的配列の増幅は、一対のプライマーを使用して行われ、追加のプライマーまたはオリゴヌクレオチドは標的配列の増幅に含まれない（例えば、増幅反応成分は、所与の標的配列用の追加のプライマー対も、ネステッドプライマーも、バンパープライマー（ｂｕｍｐｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ）も、プライマー以外のオリゴヌクレオチドも、プローブなども含まない）。一部の実施形態では、プライマーは一対のプライマーからなるが、ある特定の例では、マルチプレックス増幅などにおいて、増幅反応は、異なる標的配列を増幅するための追加のプライマー対を含み得る。一部の実施形態では、プライマーは一対のプライマーからなるが、ある特定の例では、増幅反応は、増幅の部分とはみなされない検出プロセスのための追加のプライマー、オリゴヌクレオチド、またはプローブを含み得る。
【００８２】
一部の実施形態では、プライマーはセットで使用される。増幅プライマーセットは、所与の標的配列用の一対のフォワードおよびリバースプライマーを含み得る。マルチプレックス増幅の場合、第１の標的配列を増幅するプライマーが１つのプライマーセットとみなされ、第２の標的配列を増幅するプライマーは異なるプライマーセットとみなされる。
【００８３】
一部の実施形態では、増幅反応成分は、試料核酸の第１の鎖（例えば、センス鎖、フォワード鎖）中の標的配列に相補的な第１のプライマー（第１のオリゴヌクレオチド）および試料核酸の第２の鎖（例えば、アンチセンス鎖、リバース鎖）中の標的配列に相補的な第２のプライマー（第２のオリゴヌクレオチド）を含む。一部の実施形態では、第１のプライマー（第１のオリゴヌクレオチド）は、試料核酸の第１の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、かつ第２のプライマー（第２のオリゴヌクレオチド）は、試料核酸の第２の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドを含む。プライマー−標的について連続的に相補的とは、一般に、プライマー中のヌクレオチド配列において、順に並んでいる各塩基が標的配列中の対応する順序の塩基と対となり、かつ連続的に相補的と考えられる配列内にギャップも、追加の配列も、対とならない塩基もないことを指す。換言すれば、連続的に相補的とは、一般に、プライマー中のヌクレオチド配列の全ての連続する塩基が標的中のヌクレオチド配列の対応する連続する塩基に相補的であることを指す。
【００８４】
一部の実施形態では、第１のプライマー（第１のオリゴヌクレオチド）は、試料核酸の第１の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ第２のプライマー（第２のオリゴヌクレオチド）は、試料核酸の第２の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる。したがって、一部の実施形態では、プライマーは、例えば、テイルドプライマーもしくはループプライマー中に存在する追加の配列、および／または切断剤認識部位（例えば、ニッキング酵素認識部位）を提供する追加の配列などの、標的配列に連続的に相補的ではない（例えば、５’および／もしくは３’末端における、またはプライマー内における）いかなる追加の配列も含まない。一部の実施形態では、増幅反応成分は、例えば、テイルドプライマー、ループプライマー、ステムループ構造、ヘアピン構造を形成できるプライマー、および／または切断剤認識部位（例えば、ニッキング酵素認識部位）を提供する追加の配列などの、追加の配列（すなわち、標的配列に連続的に相補的な配列以外の配列）を含むプライマーを含まない。
【００８５】
一部の実施形態では、第１のプライマー（第１のオリゴヌクレオチド）は、試料核酸の第１の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドから本質的になり、かつ第２のプライマー（第２のオリゴヌクレオチド）は、試料核酸の第２の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドから本質的になる。したがって、一部の実施形態では、プライマーは、一般に、例えば、テイルドプライマーもしくはループプライマー中に存在する追加の配列、および／または切断剤認識部位（例えば、ニッキング酵素認識部位）を提供する追加の配列などの、標的配列に連続的に相補的ではない（例えば、５’および／もしくは３’末端における、またはプライマー内における）いかなる追加の配列も含まない。しかしながら、そのような実施形態では、プライマーは、プライマーに機能的特徴を付加しない（例えば、５’および／もしくは３’末端における、またはプライマー内における）１つまたは複数の追加の塩基を含み得る。例えば、テイルドプライマーまたはループプライマー中に存在する追加の配列は、一般に、機能的特徴を付加し、そのような実施形態におけるプライマーから除外される。
【００８６】
ある特定の実施形態では、プライマーは、１つまたは複数のイノシン、無塩基部位、ロックド核酸、副溝結合因子（ｍｉｎｏｒ  ｇｒｏｏｖｅ  ｂｉｎｄｅｒ）、二重鎖安定化因子（例えば、アクリジン、スペルミジン）、Ｔｍ修飾因子、またはプライマーの結合特性を変更する任意の修飾因子などの、修飾を含有し得る。ある特定の実施形態では、プライマーは、検出可能な分子または実体（例えば、フルオロフォア、放射性同位体、比色定量剤（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ａｇｅｎｔ）、粒子、酵素など）を含有し得る。
【００８７】
ポリメラーゼ
一部の実施形態では、増幅反応成分は、１つまたは複数のポリメラーゼを含む。
【００８８】
ポリメラーゼは、ヌクレオチドの特異的組込みを触媒して、例えば本明細書中に記載する増幅プライマーなどのプライマー分子の３’ヒドロキシル末端を、（例えば、プライマーがアニールする）核酸標的配列に対して伸長させることができるタンパク質である。ポリメラーゼとしては、例えば、上昇した反応温度（例えば、５５℃より高い、６０℃より高い、６５℃より高い、７０℃より高い、７５℃より高い、８０℃より高い、８５℃より高い、９０℃より高い、９５℃より高い、１００℃より高い）において活性を有することができる好熱性または超好熱性ポリメラーゼを挙げることができる。超好熱性ポリメラーゼは、超好熱菌ポリメラーゼと称され得る。超好熱性ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼは、超好熱菌ポリメラーゼ活性を有すると称され得る。ポリメラーゼは鎖置換能力を有していてもよいし、有していなくてもよい。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、１回の合成で約１〜約５０ヌクレオチドを組み込むことができる。例えば、ポリメラーゼは、１回の合成で約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個のヌクレオチドを組み込み得る。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、１回の合成で２０〜４０個のヌクレオチドを組み込むことができる。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、１回の合成で５０個までのヌクレオチドを組み込むことができる。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、１回の合成で４０個までのヌクレオチドを組み込むことができる。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、１回の合成で３０個までのヌクレオチドを組み込むことができる。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、１回の合成で２０個までのヌクレオチドを組み込むことができる。
【００８９】
一部の実施形態では、増幅反応成分は、１つまたは複数のＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、増幅反応成分は、下記のものから選択される１つまたは複数のＤＮＡポリメラーゼを含む：９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）γ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（大断片）、Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＤＮＡポリメラーゼＩ、大（クレノー）断片、クレノー断片（３’−５’エキソ−）、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴ  ＤＮＡ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＩＩ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＲｅｐｌｉＰＨＩ（商標）Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、大断片（ＩｓｏＴｈｅｒｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ）、ＭａｓｔｅｒＡｍｐ（商標）ＡｍｐｌｉＴｈｅｒｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｇ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｂｒ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼベータ、およびＴｈｅｒｍｏＰｈｉ  ＤＮＡポリメラーゼ。
【００９０】
一部の実施形態では、増幅反応成分は、１つまたは複数の超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼを含む。一般に、超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼは高温において熱安定性である。例えば、超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼは、９５℃において約５〜１０時間の半減期、および１００℃において約１〜３時間の半減期を有し得る。一部の実施形態では、増幅反応成分は、古細菌由来の１つまたは複数の超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、増幅反応成分は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ由来の１つまたは複数の超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、増幅反応成分は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｃｅａｅ古細菌由来の１つまたは複数の超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、増幅反応成分は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ由来の１つまたは複数の超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、増幅反応成分は、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ由来の１つまたは複数の超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、増幅反応成分は、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ由来の１つまたは複数の超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、増幅反応成分は、Ｔｈｅｒｍｕｓ由来の１つまたは複数の超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、増幅反応成分は、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の１つまたは複数の超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【００９１】
一部の実施形態では、増幅反応成分は、超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼまたはその機能的断片を含む。機能的断片は、一般に、例えば、（例えば、増幅反応において）ＤＮＡを重合する能力などの全長ポリメラーゼの１つまたは複数の機能を保持する。一部の例では、機能的断片は、全長ポリメラーゼの機能のレベルの少なくとも約５０％であるレベルで機能（例えば、増幅反応におけるＤＮＡの重合）を行う。一部の例では、機能的断片は、全長ポリメラーゼの機能のレベルの少なくとも約７５％であるレベルで機能（例えば、増幅反応におけるＤＮＡの重合）を行う。一部の例では、機能的断片は、全長ポリメラーゼの機能のレベルの少なくとも約９０％であるレベルで機能（例えば、増幅反応におけるＤＮＡの重合）を行う。一部の例では、機能的断片は、全長ポリメラーゼの機能のレベルの少なくとも約９５％であるレベルで機能（例えば、増幅反応におけるＤＮＡの重合）を行う。ポリメラーゼ活性のレベルは、例えば、例えば本明細書中に記載する検出可能な核酸増幅方法などの検出可能な核酸増幅方法を使用して評価することができる。一部の実施形態では、増幅反応成分は、配列番号８のアミノ酸配列を含む超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼまたは配列番号８の機能的断片を含む。一部の実施形態では、増幅反応成分は、配列番号９のアミノ酸配列を含む超好熱菌ＤＮＡポリメラーゼまたは配列番号９の機能的断片を含む。
【００９２】
一部の実施形態では、増幅反応成分は、超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片（すなわち、超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼの本明細書中に記載するような機能的断片）を含む。配列同一性の程度は、例えばアミノ酸配列アラインメントを行うことによって決定することができる。一部の実施形態では、増幅反応成分は、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片（すなわち、配列番号８と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼの本明細書中に記載するような機能的断片）を含む。一部の実施形態では、増幅反応成分は、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、増幅反応成分は、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、増幅反応成分は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片（すなわち、配列番号９と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼの本明細書中に記載するような機能的断片）を含む。一部の実施形態では、増幅反応成分は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片を含む。一部の実施形態では、増幅反応成分は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも約９９％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片を含む。
【００９３】
一部の実施形態では、ポリメラーゼは、逆転写能力を有し得る。そのような場合、増幅反応は、例えば、別個の逆転写酵素を使用することなく単一のステップで、ＲＮＡ標的を増幅することができる。逆転写酵素能力を有するポリメラーゼの非限定的な例としては、Ｂｓｔ（大断片）、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩなどが挙げられる。一部の実施形態では、増幅反応成分は、１つまたは複数の別個の逆転写酵素を含む。一部の実施形態では、１つより多いポリメラーゼが増幅反応中に含まれ得る。例えば、増幅反応は、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ、および逆転写酵素活性を有しない第２のポリメラーゼを含み得る。
【００９４】
一部の実施形態では、エキソヌクレアーゼ活性を有する１つまたは複数のポリメラーゼが増幅の間に使用される。一部の実施形態では、エキソヌクレアーゼ活性を有しない１つまたは複数のポリメラーゼが増幅の間に使用される。一部の実施形態では、エキソヌクレアーゼ活性が低い１つまたは複数のポリメラーゼが増幅の間に使用される。ある特定の例では、エキソヌクレアーゼ活性を有しないまたはエキソヌクレアーゼ活性が低いポリメラーゼは、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を低下させるまたは除去する１つまたは複数の改変（例えば、アミノ酸置換）を含む。エキソヌクレアーゼ活性が低い改変ポリメラーゼは、非改変のポリメラーゼと比べて１０％またはそれより低いエキソヌクレアーゼ活性を有し得る。例えば、エキソヌクレアーゼ活性が低い改変ポリメラーゼは、非改変のポリメラーゼと比べて約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満のエキソヌクレアーゼ活性を有し得る。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないまたは５’−３’エキソヌクレアーゼ活性が低い。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有しないまたは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低い。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、一本鎖依存性エキソヌクレアーゼ活性を有しないまたは一本鎖依存性エキソヌクレアーゼ活性が低い。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、二本鎖依存性エキソヌクレアーゼ活性を有しないまたは二本鎖依存性エキソヌクレアーゼ活性が低い。ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を低下させるまたは除去することができるある特定の改変の非限定的な例としては、配列番号８の１４１位および／もしくは１４３位および／もしくは４５８位、または配列番号８の１４１位および／もしくは１４３位および／もしくは４５８位に対応する位置における１つまたは複数のアミノ酸置換が挙げられる。配列番号８中の位置に対応するアミノ酸位置は、例えばアミノ酸配列アラインメントを行うことによって特定され得る。一部の例では、改変は、１４１位の天然のアミノ酸のアラニンへの置換を含む。一部の例では、改変はＤ１４１Ａを含む。一部の例では、改変は、１４３位の天然のアミノ酸のアラニンへの置換を含む。一部の例では、改変はＥ１４３Ａを含む。一部の例では、改変は、１４３位の天然のアミノ酸のアスパラギン酸への置換を含む。一部の例では、改変はＥ１４３Ｄを含む。一部の例では、改変は、４８５位の天然のアミノ酸のロイシンへの置換を含む。一部の例では、改変はＡ４８５Ｌを含む。一部の例では、改変はＡ４８５Ｌを含む。一部の例では、改変はＤ１４１Ａ、Ｅ１４３Ａ、およびＡ４８５Ｌを含む。
【００９５】
検出および定量化
本明細書中に記載する方法は、核酸増幅産物を検出および／または定量化するステップをさらに含み得る。増幅産物は、例えば本明細書中に記載する任意の検出方法または定量化方法を含む、任意の好適な検出および／または定量化方法によって検出および／または定量化され得る。検出および／または定量化方法の非限定的な例としては、分子ビーコン（例えば、リアルタイム、エンドポイント）、ラテラルフロー、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、蛍光偏光法（ＦＰ）、表面捕捉、５’−３’エキソヌクレアーゼ加水分解プローブ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ）、挿入／結合性色素、吸光度法（例えば、比色定量、濁度）、電気泳動（例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動）、質量分析、核酸シークエンシング、デジタル増幅、プライマー伸長法（例えば、ｉＰＬＥＸ（商標））、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ（ＭＩＰ）技術、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ分析）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分析、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰＣＲ）、パイロシークエンシング分析、ａｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅ分析、リバースドットブロット、ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびロックド核酸（ＬＮＡ）プローブ、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ、ＳＮＰｓｔｒｅａｍ、遺伝子ビット分析（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｂｉｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＧＢＡ）、マルチプレックスミニシークエンシング、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ＧＯＯＤアッセイ、マイクロアレイｍｉｎｉｓｅｑ、アレイ化プライマー伸長（ＡＰＥＸ）、マイクロアレイプライマー伸長、タグアレイ、コード化ミクロスフェア、鋳型特異的組込み（Ｔｅｍｐｌａｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（ＴＤＩ）、比色定量オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、配列コード化ＯＬＡ、マイクロアレイライゲーション、リガーゼ連鎖反応、パッドロックプローブ（ｐａｄｌｏｃｋ  ｐｒｏｂｅｓ）、ｉｎｖａｄｅｒアッセイ、少なくとも１つのプローブを使用するハイブリダイゼーション、少なくとも１つの蛍光標識化プローブを使用するハイブリダイゼーション、クローニングおよびシークエンシング、ハイブリダイゼーションプローブおよび定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＱＲＴ−ＰＣＲ）の使用、ナノポアシークエンシング、チップ、およびこれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出するステップは、リアルタイム検出方法の使用を含む（すなわち、産物は増幅プロセスの間に検出および／または連続的にモニターされる）。一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出するステップは、エンドポイント検出方法の使用を含む（すなわち、産物は増幅プロセスの完了または停止後に検出される）。核酸検出方法はまた、標的配列中または標的への相補的配列を含有するプローブ中に直接的に組み込まれた標識化ヌクレオチドの使用を用い得る。そのような標識は、放射性および／または蛍光性のものであってよく、本明細書中に論じる様式のいずれかで解像することができる。一部の実施形態では、核酸増幅産物の定量化は、以下に記載するある特定の検出方法を使用して達成され得る。ある特定の例では、検出方法は、シグナル強度の測定、ならびに／または核酸増幅産物の定量化用の検量線および／もしくはルックアップ表の生成（もしくはそれらへの参照）と組み合わせて使用され得る。
【００９６】
一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出するステップは分子ビーコン技術の使用を含む。分子ビーコンという用語は、一般に、検出可能な分子であって、ある特定の条件下で該分子の検出可能な特性が検出可能であることによって、該分子が特定の情報シグナルとして機能できるものを指す。検出可能な特性の非限定的な例としては、光学的特性（例えば、蛍光）、電気的特性、磁気的特性、化学的特性、および既知のサイズの開口部を通る時間または速度が挙げられる。核酸分子を検出するための分子ビーコンは、例えば、１つの末端にフルオロフォア、他方の末端に消光色素を含有するヘアピン型オリゴヌクレオチドであり得る。ヘアピンのループは、標的配列に相補的なプローブ配列を含有することができ、ステムはプローブ配列の両側に位置する相補的なアーム配列のアニーリングによって形成されている。フルオロフォアおよび消光分子は、各アームの反対の末端に共有結合的に連結することができる。オリゴヌクレオチドがその相補的標的にハイブリダイズするのを防止する条件下で、または分子ビーコンが溶液中に遊離している時に、蛍光および消光分子は互いに近位にあり、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を防止する。分子ビーコンが標的分子（例えば、核酸増幅産物）と遭遇した時にハイブリダイゼーションが起こり得、ループ構造が安定なより堅いコンホメーションに転換されてフルオロフォアおよび消光分子の分離を引き起こし、蛍光に繋がる（Ｔｙａｇｉら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４巻：１９９６年３月、３０３〜３０８頁）。プローブの特異性に起因して、蛍光の生成は、一般に、意図した増幅産物の合成のみに起因する。一部の例では、分子ビーコンのプローブ配列は、標的核酸中の配列と同一のまたはそれに相補的な増幅産物中の配列にハイブリダイズする。一部の例では、分子ビーコンのプローブ配列は、標的核酸中の配列と同一でなくそれに相補的でもない増幅産物中の配列にハイブリダイズする（例えば、テイルド増幅プライマーまたはライゲーションによって増幅産物に付加された配列にハイブリダイズする）。
【００９７】
分子ビーコンは特異性が高く、一塩基多型を識別することができる。分子ビーコンはまた、異なる色のフルオロフォアおよび異なる標的配列を用いて合成することができ、同じ反応中（例えば、マルチプレックス反応中）でいくつかの産物を同時に検出することが可能となる。定量的増幅プロセスの場合、分子ビーコンは、増幅の各サイクル後に増幅された標的に特異的に結合することができ、そしてハイブリダイズしていない分子ビーコンは暗いので、増幅産物の量を定量的に決定するためにプローブ−標的ハイブリッドを単離する必要がない。生じるシグナルは増幅産物の量に比例する。分子ビーコンを使用する検出は、リアルタイムでまたはエンドポイント検出方法として行うことができる。一部の例では、ある特定の反応条件は、正確度および精度を確実なものとするために、各プライマー／プローブセットについて最適化することができる。
【００９８】
一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出するステップは、ラテラルフローの使用を含む。ラテラルフローの使用は、通常、ラテラルフローデバイスの使用を含む。これらのデバイスは、一般に、流体が毛管力（ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｆｏｒｃｅ）によって流れる固相流体透過性流路を含む。例示的なデバイスとしては、様々な適切なコーティングを有するディップスティックアッセイおよび薄層クロマトグラフィープレートが挙げられるが、これらに限定されない。試料用の様々な結合性試薬、試料用の結合パートナーまたは結合パートナーを伴うコンジュゲート、およびシグナル生成系が流路上に固定化される。検出は、例えば、酵素的検出、ナノ粒子検出、比色定量検出、および蛍光検出を含むいくつかの様式で達成することができる。酵素的検出は、ラテラルフローデバイスの表面上の相補的な核酸標的（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｉｄ  ｔａｒｇｅｔｓ）にハイブリダイズする酵素標識化プローブを伴い得る。生じる複合体は、読取り可能なシグナルを生成する適切なマーカーを用いて処理することができる。ナノ粒子検出は、金コロイド、ラテックス、および／または常磁性ナノ粒子を使用し得るビーズ技術を伴う。一例では、ビーズを抗ビオチン抗体にコンジュゲート化することができる。標的配列は直接的にビオチン化されてもよいし、または標的配列は配列特異的なビオチン化プローブにハイブリダイズされてもよい。金およびラテックスは、肉眼で見える比色定量シグナルを生じ、常磁性粒子は磁場中で励起された時に不可視性のシグナルを生じ、特化した読取機によって解釈することができる。蛍光に基づくラテラルフロー検出方法も使用することができ、例えば、デュアルフルオレセインおよびビオチン標識化オリゴプローブ法、結晶中に包埋されたランタニド元素から構成されたアップコンバートの燐光レポーターを利用するＵＰＴ−Ｎ  ＡＬＰ（Ｃｏｒｓｔｊｅｎｓら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４７巻：１０号、１８８５〜１８９３頁、２００１年）、および量子ドットの使用が挙げられる。
【００９９】
核酸はラテラルフローデバイス上で捕捉され得る。捕捉の手段としては、抗体による方法および抗体によらない方法を挙げることができる。抗体による捕捉は、一般に、抗体捕捉ラインおよび標的への相補的配列の標識化プローブを含む。抗体によらない捕捉は、一般に、２つの結合パートナー間の非共有結合性相互作用、例えば、ビオチン化プローブとストレプトアビジンラインとの間の高親和性かつ非可逆的な連結を使用する。捕捉プローブは、ラテラルフロー膜に直接的に固定化され得る。例えばマルチプレックス反応において生成された増幅産物を検出するために、抗体による方法および抗体によらない方法の両方が使用され得る。
【０１００】
一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出するステップは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の使用を含む。ＦＲＥＴは、ドナー分子およびアクセプター分子の２つの発色団間のエネルギー移動機構である。簡潔に述べれば、ドナーフルオロフォア分子は特定の励起波長で励起される。その基底状態に戻る際のドナー分子からのその後の発光は、長距離間の双極子−双極子相互作用を通じてアクセプター分子へと励起エネルギーを移動させ得る。アクセプター分子の発光強度をモニターすることができ、そしてそれは、ドナーとアクセプターとの間の距離、ドナーの発光スペクトルとアクセプターの吸収スペクトルとの重なり、ならびにドナー発光の双極子モーメントおよびアクセプター吸収の双極子モーメントの配向の関数である。ＦＲＥＴは、例えば分子ビーコンについて記載したようなＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用における分子動力学の定量化に有用であり得る。特定の産物の生成のモニタリングのために、プローブを、その一方の末端をドナー分子で、他方をアクセプター分子で標識化することができる。プローブ−標的ハイブリダイゼーションは、ドナーおよびアクセプターの距離または配向の変化をもたらし、またＦＲＥＴ変化が観察される。
【０１０１】
一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出するステップは、蛍光偏光（ＦＰ）の使用を含む。蛍光偏光技術は、一般に、蛍光標識化合物は直線偏光によって励起された時に、その回転速度に逆相関する偏光度を有する蛍光を発するという原理に基づく。したがって、光が吸収される時間と放出される時間との間にフルオロフォアは回転を制約されるので、例えば蛍光標識を有するトレーサー−核酸コンジュゲートなどの分子が直線偏光によって励起された時に、放出された光は高度に偏光したままとなる。遊離のトレーサー化合物（すなわち、核酸に結合していない）が直線偏光によって励起された時に、その回転は対応するトレーサー−核酸コンジュゲートよりもはるかに速く、分子はよりランダムに配向されるので、放出された光は偏光解消される。したがって、蛍光偏光は、増幅反応において生成されたトレーサー−核酸コンジュゲートの量を測定するための定量的な手段を提供する。
【０１０２】
一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出するステップは、表面捕捉の使用を含む。これは、特定のオリゴヌクレオチドを表面へと固定化して高感度かつ選択性の高いバイオセンサーを作ることによって達成され得る。使用され得る例示的な表面としては金および炭素が挙げられ、表面捕捉方法は、表面にプローブを付着させるためのいくつかの共有結合性または非共有結合性の連結方法を使用することができる。標的核酸のその後の検出は、様々な方法によってモニターすることができる。
【０１０３】
一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出するステップは、５’−３’エキソヌクレアーゼ加水分解プローブ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ）の使用を含む。例えばＴＡＱＭＡＮプローブは、定量的増幅方法（例えば、定量的ＰＣＲ）の特異性を増加させることができる加水分解プローブである。ＴＡＱＭＡＮプローブの原理は、１）相補的な標的配列へのハイブリダイゼーションの間に二重標識化プローブを切断するＴａｑポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレアーゼ活性、および２）フルオロフォアに基づく検出に依拠する。生じる蛍光シグナルにより、指数関数的な増幅段階の間の増幅産物の蓄積の定量測定が可能となり、またＴＡＱＭＡＮプローブは、検出の特異性を有意に増加させることができる。
【０１０４】
一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出するステップは、挿入色素および／または結合性色素の使用を含む。一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出するステップは、核酸を特異的に染色する色素の使用を含む。例えば、挿入色素は、ＤＮＡまたはＲＮＡへの結合時に増強した蛍光を呈する。色素は、ＤＮＡまたはＲＮＡ挿入フルオロフォアを含んでよく、例えば、ＳＹＴＯ（登録商標）８２、アクリジンオレンジ、臭化エチジウム、ヘキスト系色素、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）、ヨウ化プロピジウム、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｉ（非対称性シアニン色素）、ＳＹＢＲ（登録商標）ＩＩ、ＴＯＴＯ（チアキソールオレンジ（ｔｈｉａｘｏｌｅ  ｏｒａｎｇｅ）ダイマー）およびＹＯＹＯ（オキサゾールイエローダイマー）を挙げることができる。色素は、様々な検出方法と組み合わせて使用された時に、核酸検出の感度を増加させるための機会を提供する。例えば、臭化エチジウムは、ゲル電気泳動後のアガロースゲル中のＤＮＡを染色するために使用され得る。ヨウ化プロピジウムおよびヘキスト３３２５８は、細胞のＤＮＡ倍数性を決定するためのフローサイトメトリーにおいて使用され得る。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  １は、レーザー誘発性の蛍光検出を用いるキャピラリー電気泳動による二本鎖ＤＮＡの分析において使用され得る。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）は、マッチしたイオン対ポリヌクレオチドクロマトグラフィー（ｍａｔｃｈｅｄ  ｉｏｎ  ｐａｉｒ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）後の二本鎖ＤＮＡの検出を増進するために使用され得る。
【０１０５】
一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出するステップは、吸光度法（例えば、比色定量、濁度）の使用を含む。一部の例では、核酸の検出および／または定量化は、例えば、吸光度（例えば、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度測定値）を濃度へと直接的に変換することによって達成することができる。測定の経路長および吸光率を使用して吸光度を濃度へと関係付けるランベルトベールの法則を使用して、核酸の直接的な測定値を濃度へと変換することができる。一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出するステップは、比色定量検出方法の使用を含む。任意の好適な比色定量検出を使用することができ、非限定的な例としては、ナノ粒子（例えば、金属ナノ粒子、修飾ナノ粒子、非修飾ナノ粒子）および／またはペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを使用するアッセイが挙げられる。例えば、ある特定の金ナノ粒子に基づく方法は、通常、標的の認識とナノ粒子の凝集との間の定量的なカップリングに依拠し、そしてそれがナノ粒子溶液の光量子特性（例えば、色）の変化をもたらし得る。
【０１０６】
一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出するステップは、電気泳動（例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動）の使用を含む。ゲル電気泳動は、マトリクス（一般に架橋ポリマー）中を通して分子を引っ張る起電力を使用して、マトリクス中で核酸を分離することを伴う。分子は異なる速度でマトリクス中を動いて産物間の分離を引き起こし、それを、以下に限定されないが、オートラジオグラフィー、燐光イメージング、および核酸キレート色素での染色を含むいくつかの方法によって可視化および解釈することができる。キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）は従来のゲル電気泳動と液体クロマトグラフィーとの組み合わせであって、ポリアクリルアミドなどの媒体を狭い口径の毛細管中で用いて、一塩基の分解能までの核酸分子の迅速かつ高効率の分離を生成する。ＣＧＥはレーザー誘起蛍光（ＬＩＦ）検出と組み合わせることができ、それにより６分子程度の染色ＤＮＡを検出することができる。ＣＧＥ／ＬＩＦ検出は、一般に、臭化エチジウム、ＹＯＹＯ、およびＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  １を含む蛍光性ＤＮＡ挿入色素の使用を伴い、また、蛍光色素がＤＮＡに共有結合した蛍光性ＤＮＡ誘導体の使用も伴い得る。いくつかの異なる標的配列（例えば、マルチプレックス反応からの産物）の同時の同定がこの方法を使用して行われ得る。
【０１０７】
一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出するステップは、質量分析の使用を含む。質量分析は、核酸の構造および量を決定するために使用され得る分析技術であり、複雑な混合物の迅速な分析を提供するために使用することができる。増幅後に試料をイオン化することができ、生じたイオンを質量対電荷比に従って電場中および／または磁場中で分離し、検出器によりイオンの質量対電荷比を測定する（Ｃｒａｉｎ，Ｐ．Ｆ．およびＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．Ａ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９巻：２５〜３４頁（１９９８年））。質量分析法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、またはエレクトロスプレーが挙げられる。これらの方法をガスクロマトグラフィー（ＧＣ／ＭＳ）および液体クロマトグラフィー（ＬＣ／ＭＳ）と組み合わせてもよい。質量分析（例えば、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ  ＭＳ））は、固体表面からの脱離の高速のシグナル取得および自動化分析によりハイスループットであり得る。
【０１０８】
一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出するステップは、核酸シークエンシングの使用を含む。増幅産物の全体の配列または部分配列を決定することができ、そして決定したヌクレオチド配列を読取りとして参照することができる。例えば、一部の実施形態では、（例えば、単分子シークエンシングの方法論を使用することによって）さらなる増幅なしに直接的に直線増幅産物を分析し得る。ある特定の実施形態では、直線増幅産物をさらなる増幅に供し、次いで、（例えば、ライゲーションによるシークエンシングまたはパイロシークエンシングの方法論を使用して）分析してもよい。読取りを異なる種類の配列分析に供してもよい。本明細書中に記載する増幅方法によって生成された検出可能な産物を検出するために、および一部の例ではその量を決定するために、任意の好適なシークエンシング方法を利用することができる。シークエンシング方法の非限定的な例としては、シングルエンドシークエンシング、ペアードエンドシークエンシング、可逆的ターミネーターに基づくシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング、パイロシークエンシング、合成によるシークエンシング、単分子シークエンシング、マルチプレックスシークエンシング、固相シングルヌクレオチドシークエンシング、およびナノポアシークエンシングが挙げられる。
【０１０９】
一部の実施形態では、核酸増幅産物を検出するステップは、デジタル増幅（例えば、デジタルＰＣＲ）の使用を含む。例えばデジタルＰＣＲは、単分子レベルでの核酸（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ）増幅を利用し、低コピー数の核酸の定量化のための高感度の方法を提供する。核酸のデジタル増幅および分析用のシステムが利用可能である（例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）。
【０１１０】
キット
キットは、例えば、本明細書中に記載するような、１つまたは複数のポリメラーゼおよび１つまたは複数のプライマー、ならびに任意選択で１つまたは複数の逆転写酵素を含み得る。１つの標的が増幅される場合、一対のプライマー（フォワードおよびリバース）がキットに含まれ得る。複数の標的配列が増幅される場合、複数のプライマー対がキットに含まれ得る。キットは、対照ポリヌクレオチドを含んでもよく、複数の標的配列が増幅される場合、複数の対照ポリヌクレオチドがキットに含まれ得る。
【０１１１】
キットはまた、任意の個数の別個の容器、チャンバー、コンテナ（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、パケット、チューブ、バイアル、マイクロタイタープレートなどの中に成分の１つまたは複数を含んでよく、または成分は、そのようなコンテナ中に様々な組み合わせで組み合わせられてもよい。キットの成分は、例えば１つまたは複数のコンテナ中に存在してもよい。一部の実施形態では、成分の全てが１つのコンテナ中に提供される。一部の実施形態では、酵素（例えば、ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素）はプライマーとは別個のコンテナ中で提供され得る。成分は、例えば、凍結乾燥されていてもよく、フリーズドライされていてもよく、または安定な緩衝液中にあってもよい。一例では、ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素は、単一のコンテナ中で凍結乾燥形態であり、かつプライマーは、異なるコンテナ中で、凍結乾燥されている、フリーズドライされている、または緩衝液中にある。一部の実施形態では、ポリメラーゼおよび／または逆転写酵素、ならびにプライマーは、単一のコンテナ中での凍結乾燥形態である。
【０１１２】
キットは、例えば、反応において使用されるｄＮＴＰ、もしくは修飾ヌクレオチド、反応のために使用される容器、キュベット、もしくはその他のコンテナ、または凍結乾燥成分を再度湿潤化（ｒｅｈｙｄｒａｔｅ）するための水もしくは緩衝液のバイアルをさらに含んでもよい。使用される緩衝液は、例えば、ポリメラーゼおよびプライマーの両方のアニーリング活性に適切であり得る。
【０１１３】
キットはまた、本明細書中に記載する１つもしくは複数の方法を行うための指示、および／または本明細書中に記載する１つもしくは複数の成分の説明を含んでもよい。指示および／または説明は、印刷された形態であってもよく、キット添付物に含まれてもよい。キットはまた、そのような指示または説明を提供するインターネット上の位置の書面での記載を含んでもよい。
【０１１４】
キットは、例えば、ＦＲＥＴのために使用される試薬などの検出方法のために使用される試薬、ラテラルフローデバイス、ディップスティック、蛍光色素、金コロイド粒子、ラテックス粒子、分子ビーコン、またはポリスチレンビーズをさらに含んでもよい。
【実施例】
【０１１５】
以下に記載する実施例は、ある特定の実施形態を説明するものであり、本技術を限定するものではない。
【０１１６】
（実施例１：等温増幅技術によるＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓの検出）
本実施例では、等温増幅技術を使用してＣｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ由来の核酸の検出を行う。
【０１１７】
クラミジアゲノムＤＮＡのリアルタイム検出
蛍光性ＤＮＡ色素を用いたクラミジアゲノムＤＮＡの検出用のリアルタイムアッセイを試験した。このアッセイではＳＹＴＯ８２を使用し、これはオレンジ蛍光性の核酸染色剤であり、核酸への結合時に明るいオレンジの蛍光を呈する。２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８、２５℃）、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１ｍＭ  ＤＴＴ、２μＭ  ＳＹＴＯ８２、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、および１反応あたり１ユニットの改変９  Ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｎｏｒｔｈ（９°Ｎｍ（商標））ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いてマスターミックス溶液を調製した。９°Ｎｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列は配列番号９として本明細書中に記載している。７，５００塩基対のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ潜在性プラスミドＤＮＡ内の特異的な配列を標的化するプライマーセットを使用し、これは１１ヌクレオチドのフォワードプライマー（すなわち、Ｃｔ＿Ｆ１１：５’−ＧＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧ−３’（配列番号１））および１０ヌクレオチドのリバースプライマー（すなわち、Ｃｔ＿Ｒ１０：５’−ＡＴＡＣＣＧＣＴＴＡ−３’（配列番号２））を含んでいた。１塩基のスペーサーを含む２２塩基のＤＮＡ産物を生成するためにアッセイを設計した。スペーサーはプライマーの３’末端の間のヌクレオチドであり、このヌクレオチドはいずれのプライマー配列中にも存在しない。最終濃度５００ｎＭでプライマーをそれぞれ使用し、２０００コピーのクラミジアゲノムＤＮＡ、または標的のない対照（ＮＴＣ）としてのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）のいずれかと混合した。ある特定の例では、ｄＨ２ＯをＮＴＣとして使用した。マスターミックス溶液とは別個の反応ウェル中にプライマー混合物を置いた。アッセイ成分を６５℃で２分間インキュベートし、次いで、合わせて、等温反応を開始させた。等温増幅反応の結果を図１に示す。
【０１１８】
等温増幅反応からの特異的な産物の生成のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）による確認
上記の等温増幅反応から生成された増幅産物をエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって試験して、アッセイの特異性を検証した。最終濃度５００ｎＭで上記のプライマーをそれぞれ使用し、２０，０００コピーのクラミジアゲノムＤＮＡ、または標的のない対照（ＮＴＣ）としてのトリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）のいずれかと混合した。ある特定の例では、ｄＨ２ＯをＮＴＣとして使用した。クラミジアゲノムＤＮＡを上記の条件下で１０分間、６５℃で増幅した。増幅後、トリス−ＥＧＴＡ（最終２０ｍＭトリス−ＥＧＴＡ、ｐＨ８．５）を用いて反応を不活化した。次いで反応を脱塩し、ＥＳＩ−ＭＳ分析の前に凍結乾燥した。
【０１１９】
図２に示すように、ＥＳＩ−ＭＳの結果により、ゲノムＤＮＡの等温増幅での主要な産物が、特異的な２２塩基の産物（すなわち、２２塩基のフォワード産物および２２塩基のリバース産物）であることが確認された。比較として、ＮＴＣ反応は、特異的な産物よりもはるかに低い強度の非特異的な産物を生成した。
【０１２０】
クラミジアゲノムＤＮＡの検出の検出限界（ＬＯＤ）
等温増幅アッセイを使用してクラミジアゲノムＤＮＡの検出の感度を試験した。このアプローチでは、非対称増幅条件下での１０ヌクレオチドのプライマーのアッセイをエンドポイント分子ビーコン検出のために使用した。２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８、２５℃）、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、および１反応あたり１ユニットの改変９  Ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｎｏｒｔｈ（９°Ｎｍ（商標））ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を用いてマスターミックス溶液を調製した。７，５００塩基対のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ潜在性プラスミドＤＮＡ内の特異的な配列を標的化するプライマーセットを使用し、これは１０ヌクレオチドのフォワードプライマー（すなわち、Ｃｔ＿Ｆ１０：５’−ＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧ−３’（配列番号３））および１０ヌクレオチドのリバースプライマー（すなわち、Ｃｔ＿Ｒ１０：５’−ＡＴＡＣＣＧＣＴＴＡ−３’（配列番号２））を含んでいた。１塩基のスペーサーを含む２１塩基のＤＮＡ産物を生成するためにアッセイを設計した。スペーサーはプライマーの３’末端の間のヌクレオチドであり、このヌクレオチドはいずれのプライマー配列中にも存在しない。プライマー（すなわち、７５０ｎＭのフォワードプライマーおよび２００ｎＭのリバースプライマー）をＮＴＣとしてのＴＥまたは異なる量のクラミジアゲノムＤＮＡ（すなわち、２０コピー、２００コピー、１，０００コピー、２，０００コピー）のいずれかと混合し、マスターミックス溶液とは別個の反応ウェル中に置いた。ある特定の例では、ｄＨ２ＯをＮＴＣとして使用した。アッセイ成分を６５℃で２分間インキュベートし、次いで、合わせて、等温反応を開始させた。反応を６５℃で１０分間実行し、次いで、氷上に置き、ＥＧＴＡを加えることによって不活化した。次いで、２１塩基の特異的なフォワード産物に相補的な２０塩基の配列を含有する分子ビーコン（すなわち、Ｃｔ  ＦＰ  ＭＢ５．１８：Ｆａｍ−ＣＴＧＧＣＴＡＣＣＧＣＴＴＡＡＣＴＣＣＡＴＡＡＧＣＣＡＧ−３ＢＨＱ１（配列番号４））を各反応ウェルに加えた。分子ビーコンのエンドポイント蛍光の読出しによって反応産物を検出した。図３に示すように、等温反応によって２０コピーのクラミジアゲノムＤＮＡを、分子ビーコンのエンドポイント検出を使用して６５℃、１０分で検出可能なレベルへと増幅することができる。
【０１２１】
分子ビーコンによるクラミジアゲノムＤＮＡのリアルタイム検出
クラミジアゲノムＤＮＡのリアルタイム検出のための別のアプローチは、検出のために分子ビーコンを使用することである。このアプローチでは、非対称的増幅条件下での１０ヌクレオチドのプライマーのアッセイを、ｄＨ２Ｏまたは標的のない対照（ＮＴＣ）として使用されるＴＥを用いるリアルタイム分子ビーコン検出のために使用した。２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８、２５℃）、１０ｍＭ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１０ｍＭ  ＫＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、５０ｎＭ  ｆＭＢ２  ３ＰＳ（分子ビーコン）、０．２５ｍＭ  ｄＮＴＰ、および１ユニット／反応の改変９  Ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｎｏｒｔｈ（９°Ｎｍ（商標））ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）を使用してマスターミックスを調製した。マスターミックスは、フォワード産物の一部分（大文字で示す１４塩基の配列）に相補的な１４塩基の配列を含む分子ビーコン（すなわち、Ｃｔ＿３ＰＳＭＢ．２：Ｆａｍ−ｃｃｇｃｇａｇｃｃｔｔＡＴＡＣＣＧＣＴＴＡＡＣＴＣｇ＊ｃ＊ｇ＊ｇ−ＩＢＦＱ（配列番号７））を含んでいた。＊で印をしたヌクレオチドはホスホロチオエート修飾ＤＮＡ塩基である。７，５００塩基対のＣ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ潜在性プラスミドＤＮＡ内の特異的な配列を標的化するプライマーセットを使用し、これは１０ヌクレオチドのフォワードプライマー（すなわち、Ｃｔ＿Ｆ１０＋２：５’−ＡＧＧＣＴＴＡＴＧＧ−３’（配列番号５））および１０ヌクレオチドのリバースプライマー（すなわち、Ｃｔ＿Ｒ１０−２：５’−ＴＴＡＴＡＣＣＧＣＴ−３’（配列番号６））を含んでいた。５塩基のスペーサーを含む２５塩基のＤＮＡ産物を生成するためにアッセイを設計した。スペーサーは各プライマーの３’末端の間に５ヌクレオチドを含み、これらの５ヌクレオチドはいずれのプライマー配列中にも存在しない。プライマー（すなわち、７５０ｎＭのフォワードプライマーおよび２００ｎＭのリバースプライマー）を反応ウェル中でＮＴＣとしてのＴＥまたは２０，０００コピーのクラミジアゲノムＤＮＡのいずれかと合わせた。ある特定の例では、ｄＨ２ＯをＮＴＣとして使用した。全ての成分を６５℃で２分間インキュベートし、次いで、合わせて、６５℃で実行される等温反応を開始させた。図４に示すように、分子ビーコンのリアルタイム蛍光の読出しによって様々な時点において反応産物が検出された。
【０１２２】
（実施例２：配列の例）
ある特定のヌクレオチドおよびアミノ酸配列の非限定的な例を以下に示す。
【表１】
2019510515.tif 000003
【０１２３】
（実施例３：実施形態の例）
以下に記載する実施例は、ある特定の実施形態を説明するものであり、本技術を限定するものではない。
【０１２４】
Ａ１．  核酸を増幅するための方法であって、
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、および
ｂ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
を含む成分と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップ
を含む、方法。
【０１２５】
Ａ１．１  核酸を増幅するための方法であって、
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、および
ｂ）超好熱菌ポリメラーゼまたは超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼからなる酵素成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップ
を含む、方法。
【０１２６】
Ａ１．２  核酸を増幅するための方法であって、
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、ならびに
ｂ）ｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性、および任意選択でｉｉ）逆転写酵素活性からなる酵素活性
と接触させることによって核酸増幅産物を生成するステップ
を含む、方法。
【０１２７】
Ａ１．３  酵素活性が、ｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性、およびｉｉ）逆転写酵素活性からなる、実施形態Ａ１．２に記載の方法。
【０１２８】
Ａ２．  増幅の前または増幅の間に試料核酸を変性させるステップを含まない、実施形態Ａ１からＡ１．３のいずれか１つに記載の方法。
【０１２９】
Ａ３．  試料核酸を、増幅の前または増幅の間にエンドヌクレアーゼと接触させない、実施形態Ａ１からＡ２のいずれか１つに記載の方法。
【０１３０】
Ａ４．  試料核酸を、増幅の前または増幅の間に巻き戻し剤（ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）と接触させない、実施形態Ａ１からＡ３のいずれか１つに記載の方法。
【０１３１】
Ａ５．  試料核酸を、増幅の前または増幅の間にヘリカーゼと接触させない、実施形態Ａ１からＡ４のいずれか１つに記載の方法。
【０１３２】
Ａ５．１  試料核酸を、増幅の前または増幅の間にリコンビナーゼと接触させない、実施形態Ａ１からＡ５のいずれか１つに記載の方法。
【０１３３】
Ａ５．２  試料核酸を、増幅の前または増幅の間に一本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質と接触させない、実施形態Ａ１からＡ５．１のいずれか１つに記載の方法。
【０１３４】
Ａ６．  試料核酸が、増幅の前に非修飾である、実施形態Ａ１からＡ５．２のいずれか１つに記載の方法。
【０１３５】
Ａ７．  非修飾の試料核酸が破砕細胞に由来する、実施形態Ａ６に記載の方法。
【０１３６】
Ａ８．  試料核酸がＤＮＡを含む、実施形態Ａ１からＡ７のいずれか１つに記載の方法。
【０１３７】
Ａ９．  試料核酸がゲノムＤＮＡを含む、実施形態Ａ８に記載の方法。
【０１３８】
Ａ１０．  試料核酸がＲＮＡを含む、実施形態Ａ１からＡ７のいずれか１つに記載の方法。
【０１３９】
Ａ１１．  試料核酸がウイルスＲＮＡを含む、実施形態Ａ１０に記載の方法。
【０１４０】
Ａ１２．  試料核酸が細菌ＲＮＡを含む、実施形態Ａ１０に記載の方法。
【０１４１】
Ａ１３．  試料核酸が一本鎖核酸を含む、実施形態Ａ１からＡ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０１４２】
Ａ１４．  試料核酸が、第１の鎖および第２の鎖を含む二本鎖核酸を含む、実施形態Ａ１からＡ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０１４３】
Ａ１５．  少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０１４４】
Ａ１６．  少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドからなる、実施形態Ａ１からＡ１４のいずれか１つに記載の方法。
【０１４５】
Ａ１６．１  第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドがそれぞれ８〜１６塩基を含む、実施形態Ａ１５またはＡ１６に記載の方法。
【０１４６】
Ａ１７．  第１のオリゴヌクレオチドが、試料核酸の第１の鎖中の標的配列に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、試料核酸の第２の鎖中の標的配列に相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１５、Ａ１６、またはＡ１６．１に記載の方法。
【０１４７】
Ａ１８．  第１のオリゴヌクレオチドが、試料核酸の第１の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、試料核酸の第２の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１５、Ａ１６、またはＡ１６．１に記載の方法。
【０１４８】
Ａ１９．  第１のオリゴヌクレオチドが、試料核酸の第１の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、試料核酸の第２の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる、実施形態Ａ１５、Ａ１６、またはＡ１６．１に記載の方法。
【０１４９】
Ａ２０．  試料核酸が、増幅の前に被験体から得られる、実施形態Ａ１からＡ１９のいずれか１つに記載の方法。
【０１５０】
Ａ２１．  精製されていない試料核酸が増幅される、実施形態Ａ１からＡ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０１５１】
Ａ２２．  精製された試料核酸が増幅される、実施形態Ａ１からＡ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０１５２】
Ａ２３．  増幅の前に試料核酸を精製するステップをさらに含む、実施形態Ａ１からＡ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０１５３】
Ａ２４．  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、超好熱菌ポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、実施形態Ａ１からＡ２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５４】
Ａ２５．  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、実施形態Ａ１からＡ２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５５】
Ａ２６．  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、古細菌の超好熱菌ポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、実施形態Ａ１からＡ２３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５６】
Ａ２７．  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、実施形態Ａ１からＡ２６のいずれか１つに記載の方法。
【０１５７】
Ａ２８．  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、実施形態Ａ１からＡ２６のいずれか１つに記載の方法。
【０１５８】
Ａ２８．１  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性が低いポリメラーゼによって提供される、実施形態Ａ１からＡ２８のいずれか１つに記載の方法。
【０１５９】
Ａ２８．２  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼによって提供される、実施形態Ａ１からＡ２８のいずれか１つに記載の方法。
【０１６０】
Ａ２９  増幅が約５５℃から約７５℃の一定温度で行われる、実施形態Ａ１からＡ２８．２のいずれか１つに記載の方法。
【０１６１】
Ａ３０．  増幅が約５５℃から約６５℃の一定温度で行われる、実施形態Ａ１からＡ２８．２のいずれか１つに記載の方法。
【０１６２】
Ａ３１．  増幅が約６５℃の一定温度で行われる、実施形態Ａ１からＡ２８．２のいずれか１つに記載の方法。
【０１６３】
Ａ３２．  増幅が約６０℃の一定温度で行われる、実施形態Ａ１からＡ２８．２のいずれか１つに記載の方法。
【０１６４】
Ａ３３．  核酸増幅産物が、１０分またはそれ未満以内に検出可能である、実施形態Ａ１からＡ３２のいずれか１つに記載の方法。
【０１６５】
Ａ３４．  核酸増幅産物が、試料核酸中の標的配列に連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ａ１からＡ３３のいずれか１つに記載の方法。
【０１６６】
Ａ３５．  核酸増幅産物が、試料核酸中の標的配列に連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一のポリヌクレオチドからなる、実施形態Ａ１からＡ３３のいずれか１つに記載の方法。
【０１６７】
Ａ３６．  核酸増幅産物が、約２０〜４０塩基の長さである、実施形態Ａ１からＡ３５のいずれか１つに記載の方法。
【０１６８】
Ａ３７．  核酸増幅産物が、ｉ）第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、ｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、およびｉｉｉ）第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列に挟まれているスペーサー配列を含む、実施形態Ａ１６からＡ３６のいずれか１つに記載の方法。
【０１６９】
Ａ３８．  核酸増幅産物が、ｉ）第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、ｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、およびｉｉｉ）第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列に挟まれているスペーサー配列からなる、実施形態Ａ１６からＡ３６のいずれか１つに記載の方法。
【０１７０】
Ａ３９．  スペーサー配列が１〜１０塩基を含む、実施形態Ａ３７またはＡ３８に記載の方法。
【０１７１】
Ａ４０．  スペーサー配列が１〜５塩基を含む、実施形態Ａ３７またはＡ３８に記載の方法。
【０１７２】
Ａ４１．  スペーサー配列が、第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもなく、かつ第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもない、実施形態Ａ３７からＡ４０のいずれか１つに記載の方法。
【０１７３】
Ａ４２．  スペーサー配列が、試料核酸中の標的配列の一部分に連続的に相補的またはそれと実質的に同一である、実施形態Ａ３７からＡ４１のいずれか１つに記載の方法。
【０１７４】
Ａ４３．  核酸増幅産物を検出するステップをさらに含む、実施形態Ａ１からＡ４２のいずれか１つに記載の方法。
【０１７５】
Ａ４４．  核酸増幅産物を検出するステップが、試料核酸を、超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する成分および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと接触させた時から１０分またはそれ未満以内に行われる、実施形態Ａ４３に記載の方法。
【０１７６】
Ａ４５．  核酸増幅産物を検出するステップが、リアルタイム検出方法の使用を含む、実施形態Ａ４３またはＡ４４に記載の方法。
【０１７７】
Ａ４６．  核酸増幅産物を検出するステップが、蛍光シグナルの検出を含む、実施形態Ａ４３、Ａ４４、またはＡ４５に記載の方法。
【０１７８】
Ａ４７．  蛍光シグナルが分子ビーコンに由来する、実施形態Ａ４６に記載の方法。
【０１７９】
Ａ４８．  核酸増幅産物を、ｉ）増幅産物中の配列に相補的なポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）フルオロフォアおよび消光剤を含むシグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、実施形態Ａ１からＡ４７のいずれか１つに記載の方法。
【０１８０】
Ａ４９．  少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの１つまたは複数が、試料核酸中の配列に相補的でないポリヌクレオチドであって、シグナル生成オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、かつ方法が、増幅産物を、フルオロフォアおよび消光剤を含むシグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、実施形態Ａ１からＡ４７のいずれか１つに記載の方法。
【０１８１】
Ａ５０．  単一の反応容量中で行われる、実施形態Ａ１からＡ４９のいずれか１つに記載の方法。
【０１８２】
Ａ５１．  単一の反応容器中で行われる、実施形態Ａ１からＡ５０のいずれか１つに記載の方法。
【０１８３】
Ａ５２．  マルチプレックス増幅を含む、実施形態Ａ１からＡ５１のいずれか１つに記載の方法。
【０１８４】
Ｂ１．  核酸を処理するための方法であって、
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、および
ｂ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することから本質的になる核酸を増幅するステップ
を含む、方法。
【０１８５】
Ｂ２．  核酸を処理するための方法であって、
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、および
ｂ）超好熱菌ポリメラーゼまたは超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼからなる酵素成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することから本質的になる核酸を増幅するステップ
を含む、方法。
【０１８６】
Ｂ３．  核酸を処理するための方法であって、
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、ならびに
ｂ）ｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性、および任意選択でｉｉ）逆転写酵素活性からなる酵素活性
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することから本質的になる核酸を増幅するステップ
を含む、方法。
【０１８７】
Ｂ４．  酵素活性が、ｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性、およびｉｉ）逆転写酵素活性からなる、実施形態Ｂ３に記載の方法。
【０１８８】
Ｂ５．  核酸を処理するための方法であって、
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、および
ｂ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することからなる核酸を増幅するステップ
を含む、方法。
【０１８９】
Ｂ６．  核酸を処理するための方法であって、
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、および
ｂ）超好熱菌ポリメラーゼまたは超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼからなる酵素成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することからなる核酸を増幅するステップ
を含む、方法。
【０１９０】
Ｂ７．  核酸を処理するための方法であって、
等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ａ）試料核酸中の標的配列に相補的なポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む非酵素成分、ならびに
ｂ）ｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性、および任意選択でｉｉ）逆転写酵素活性からなる酵素活性
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することからなる核酸を増幅するステップ
を含む、方法。
【０１９１】
Ｂ８．  酵素活性が、ｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性、およびｉｉ）逆転写酵素活性からなる、実施形態Ｂ７に記載の方法。
【０１９２】
Ｂ９．  試料核酸が、増幅の前に非修飾である、実施形態Ｂ１からＢ８のいずれか１つに記載の方法。
【０１９３】
Ｂ１０．  非修飾の試料核酸が破砕細胞に由来する、実施形態Ｂ９に記載の方法。
【０１９４】
Ｂ１１．  試料核酸がＤＮＡを含む、実施形態Ｂ１からＢ１０のいずれか１つに記載の方法。
【０１９５】
Ｂ１２．  試料核酸がゲノムＤＮＡを含む、実施形態Ｂ１１に記載の方法。
【０１９６】
Ｂ１３．  試料核酸がＲＮＡを含む、実施形態Ｂ１からＢ１０のいずれか１つに記載の方法。
【０１９７】
Ｂ１４．  試料核酸がウイルスＲＮＡを含む、実施形態Ｂ１３に記載の方法。
【０１９８】
Ｂ１５．  試料核酸が細菌ＲＮＡを含む、実施形態Ｂ１３に記載の方法。
【０１９９】
Ｂ１６．  試料核酸が一本鎖核酸を含む、実施形態Ｂ１からＢ１５のいずれか１つに記載の方法。
【０２００】
Ｂ１７．  試料核酸が、第１の鎖および第２の鎖を含む二本鎖核酸を含む、実施形態Ｂ１からＢ１５のいずれか１つに記載の方法。
【０２０１】
Ｂ１８．  少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１からＢ１７のいずれか１つに記載の方法。
【０２０２】
Ｂ１９．  少なくとも１つのオリゴヌクレオチドが第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドからなる、実施形態Ｂ１からＢ１７のいずれか１つに記載の方法。
【０２０３】
Ｂ１９．１  第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドがそれぞれ８〜１６塩基を含む、実施形態Ｂ１８またはＢ１９に記載の方法。
【０２０４】
Ｂ２０．  第１のオリゴヌクレオチドが、試料核酸の第１の鎖中の標的配列に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、試料核酸の第２の鎖中の標的配列に相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１８、Ｂ１９、またはＢ１９．１に記載の方法。
【０２０５】
Ｂ２１．  第１のオリゴヌクレオチドが、試料核酸の第１の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、試料核酸の第２の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１８、Ｂ１９、またはＢ１９．１に記載の方法。
【０２０６】
Ｂ２２．  第１のオリゴヌクレオチドが、試料核酸の第１の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、試料核酸の第２の鎖中の標的配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる、実施形態Ｂ１８、Ｂ１９、またはＢ１９．１に記載の方法。
【０２０７】
Ｂ２３．  試料核酸が、増幅の前に被験体から得られる、実施形態Ｂ１からＢ２２のいずれか１つに記載の方法。
【０２０８】
Ｂ２４．  精製されていない試料核酸が増幅される、実施形態Ｂ１からＢ２２のいずれか１つに記載の方法。
【０２０９】
Ｂ２５．  精製された試料核酸が増幅される、実施形態Ｂ１からＢ２２のいずれか１つに記載の方法。
【０２１０】
Ｂ２６．  増幅の前に試料核酸を精製するステップをさらに含む、実施形態Ｂ１からＢ２２のいずれか１つに記載の方法。
【０２１１】
Ｂ２７．  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、超好熱菌ポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、実施形態Ｂ１からＢ２６のいずれか１つに記載の方法。
【０２１２】
Ｂ２８．  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、実施形態Ｂ１からＢ２６のいずれか１つに記載の方法。
【０２１３】
Ｂ２９．  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、古細菌の超好熱菌ポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、実施形態Ｂ１からＢ２６のいずれか１つに記載の方法。
【０２１４】
Ｂ３０．  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、実施形態Ｂ１からＢ２９のいずれか１つに記載の方法。
【０２１５】
Ｂ３１．  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、実施形態Ｂ１からＢ２９のいずれか１つに記載の方法。
【０２１６】
Ｂ３１．１  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性が低いポリメラーゼによって提供される、実施形態Ｂ１からＢ３１のいずれか１つに記載の方法。
【０２１７】
Ｂ３２．２  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼによって提供される、実施形態Ｂ１からＢ３１のいずれか１つに記載の方法。
【０２１８】
Ｂ３２．  増幅が約５５℃から約７５℃の一定温度で行われる、実施形態Ｂ１からＢ３１．２のいずれか１つに記載の方法。
【０２１９】
Ｂ３３．  増幅が約５５℃から約６５℃の一定温度で行われる、実施形態Ｂ１からＢ３１．２のいずれか１つに記載の方法。
【０２２０】
Ｂ３４．  増幅が約６５℃の一定温度で行われる、実施形態Ｂ１からＢ３１．２のいずれか１つに記載の方法。
【０２２１】
Ｂ３５．  増幅が約６０℃の一定温度で行われる、実施形態Ｂ１からＢ３１．２のいずれか１つに記載の方法。
【０２２２】
Ｂ３６．  核酸増幅産物が、１０分またはそれ未満以内に検出可能である、実施形態Ｂ１からＢ３５のいずれか１つに記載の方法。
【０２２３】
Ｂ３７．  核酸増幅産物が、試料核酸中の標的配列に連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一のポリヌクレオチドを含む、実施形態Ｂ１からＢ３６のいずれか１つに記載の方法。
【０２２４】
Ｂ３８．  核酸増幅産物が、試料核酸中の標的配列に連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一のポリヌクレオチドからなる、実施形態Ｂ１からＢ３６のいずれか１つに記載の方法。
【０２２５】
Ｂ３９．  核酸増幅産物が、約２０〜４０塩基の長さである、実施形態Ｂ１からＢ３８のいずれか１つに記載の方法。
【０２２６】
Ｂ４０．  核酸増幅産物が、ｉ）第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、ｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、およびｉｉｉ）第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列に挟まれているスペーサー配列を含む、実施形態Ｂ２０からＢ３９のいずれか１つに記載の方法。
【０２２７】
Ｂ４１．  核酸増幅産物が、ｉ）第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、ｉｉ）第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、およびｉｉｉ）第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列に挟まれているスペーサー配列からなる、実施形態Ｂ２０からＢ３９のいずれか１つに記載の方法。
【０２２８】
Ｂ４２．  スペーサー配列が１〜１０塩基を含む、実施形態Ｂ４０またはＢ４１に記載の方法。
【０２２９】
Ｂ４３．  スペーサー配列が１〜５塩基を含む、実施形態Ｂ４０またはＢ４１に記載の方法。
【０２３０】
Ｂ４４．  スペーサー配列が、第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもなく、かつ第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもない、実施形態Ｂ４０からＢ４３のいずれか１つに記載の方法。
【０２３１】
Ｂ４５．  スペーサー配列が、試料核酸中の標的配列の一部分に連続的に相補的またはそれと実質的に同一である、実施形態Ｂ４０からＢ４４のいずれか１つに記載の方法。
【０２３２】
Ｂ４６．  核酸増幅産物を検出するステップをさらに含む、実施形態Ｂ１からＢ４５のいずれか１つに記載の方法。
【０２３３】
Ｂ４７．  核酸増幅産物を検出するステップが、試料核酸を、超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する成分および少なくとも１つのオリゴヌクレオチドと接触させた時から１０分またはそれ未満以内に行われる、実施形態Ｂ４６に記載の方法。
【０２３４】
Ｂ４８．  核酸増幅産物を検出するステップが、リアルタイム検出方法の使用を含む、実施形態Ｂ４６またはＢ４７に記載の方法。
【０２３５】
Ｂ４９．  核酸増幅産物を検出するステップが、蛍光シグナルの検出を含む、実施形態Ｂ４６、Ｂ４７、またはＢ４８に記載の方法。
【０２３６】
Ｂ５０．  蛍光シグナルが分子ビーコンに由来する、実施形態Ｂ４９に記載の方法。
【０２３７】
Ｂ５１．  核酸増幅産物を、ｉ）増幅産物中の配列に相補的なポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）フルオロフォアおよび消光剤を含むシグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｂ１からＢ５０のいずれか１つに記載の方法。
【０２３８】
Ｂ５２．  少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの１つまたは複数が、試料核酸中の配列に相補的でないポリヌクレオチドであって、シグナル生成オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含み、かつ方法が、増幅産物を、フルオロフォアおよび消光剤を含むシグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｂ１からＢ５０のいずれか１つに記載の方法。
【０２３９】
Ｂ５３．  単一の反応容量中で行われる、実施形態Ｂ１からＢ５２のいずれか１つに記載の方法。
【０２４０】
Ｂ５４．  単一の反応容器中で行われる、実施形態Ｂ１からＢ５３のいずれか１つに記載の方法。
【０２４１】
Ｂ５５．  マルチプレックス増幅を含む、実施形態Ｂ１からＢ５４のいずれか１つに記載の方法。
【０２４２】
Ｃ１．  試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するための方法であって、
ａ）試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、
標的配列が、互いに相補的な第１の鎖および第２の鎖を含み、かつ増幅するステップが、ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、上記第１のオリゴヌクレオチドが上記第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、かつ上記第２のオリゴヌクレオチドが上記第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、核酸増幅産物が、１）第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列を含み、かつ
スペーサー配列が第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、
ｂ）核酸増幅産物を検出するステップであって、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ試料核酸を（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）と接触させた時から１０分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップと
を含む、方法。
【０２４３】
Ｃ１．１  第１のオリゴヌクレオチドが、第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドから本質的になり、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドから本質的になり、かつ／または、核酸増幅産物が、１）第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列から本質的になる、実施形態Ｃ１に記載の方法。
【０２４４】
Ｃ１．２  第１のオリゴヌクレオチドが、第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなり、かつ／または、核酸増幅産物が、１）第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列からなる、実施形態Ｃ１に記載の方法。
【０２４５】
Ｃ１．３  試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するための方法であって、
ａ）試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、
標的配列が、互いに相補的な第１の鎖および第２の鎖を含み、かつ増幅するステップが、ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、上記第１のオリゴヌクレオチドが上記第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ上記第２のオリゴヌクレオチドが上記第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、核酸増幅産物が、１）第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列からなり、かつ
スペーサー配列が第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、
ｂ）核酸増幅産物を検出するステップであって、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ試料核酸を（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）と接触させた時から１０分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップと
を含む、方法。
【０２４６】
Ｃ１．４  増幅するステップが、ヘリカーゼ不含かつリコンビナーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を接触させることを含む、実施形態Ｃ１からＣ１．３のいずれか１つに記載の方法。
【０２４７】
Ｃ２．  超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分が、超好熱菌ポリメラーゼもしくはその機能的断片、または超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片を含む、実施形態Ｃ１からＣ１．４のいずれか１つに記載の方法。
【０２４８】
Ｃ３．  超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分が、超好熱菌ポリメラーゼもしくはその機能的断片、または超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片からなる、実施形態Ｃ１からＣ１．４のいずれか１つに記載の方法。
【０２４９】
Ｃ４．  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、古細菌の超好熱菌ポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、実施形態Ｃ１からＣ３のいずれか１つに記載の方法。
【０２５０】
Ｃ５．  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、実施形態Ｃ１からＣ４のいずれか１つに記載の方法。
【０２５１】
Ｃ６．  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、実施形態Ｃ１からＣ４のいずれか１つに記載の方法。
【０２５２】
Ｃ６．１  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性が低いポリメラーゼによって提供される、実施形態Ｃ１からＣ６のいずれか１つに記載の方法。
【０２５３】
Ｃ６．２  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼによって提供される、実施形態Ｃ１からＣ６のいずれか１つに記載の方法。
【０２５４】
Ｃ７．  要素（ａ）（ｉｉ）が、逆転写酵素活性を提供する少なくとも１つの成分をさらに含む、実施形態Ｃ１からＣ６．２のいずれか１つに記載の方法。
【０２５５】
Ｃ８．  超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分が逆転写酵素活性をさらに提供する、実施形態Ｃ１からＣ６．２のいずれか１つに記載の方法。
【０２５６】
Ｃ８．１  第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドがそれぞれ８〜１６塩基を含む、実施形態Ｃ１からＣ８のいずれか１つに記載の方法。
【０２５７】
Ｃ９．  増幅の前または増幅の間に試料核酸を変性させるステップを含まない、実施形態Ｃ１からＣ８．１のいずれか１つに記載の方法。
【０２５８】
Ｃ１０．  試料核酸を、増幅の前、間、または後にエンドヌクレアーゼと接触させない、実施形態Ｃ１からＣ９のいずれか１つに記載の方法。
【０２５９】
Ｃ１０．１  試料核酸を、増幅の前または増幅の間にリコンビナーゼと接触させない、実施形態Ｃ１からＣ１０のいずれか１つに記載の方法。
【０２６０】
Ｃ１０．２  試料核酸を、増幅の前または増幅の間に一本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質と接触させない、実施形態Ｃ１からＣ１０．１のいずれか１つに記載の方法。
【０２６１】
Ｃ１１．  試料核酸が、増幅の前に非修飾である、実施形態Ｃ１からＣ１０．２のいずれか１つに記載の方法。
【０２６２】
Ｃ１２．  非修飾の試料核酸が破砕細胞に由来する、実施形態Ｃ１１に記載の方法。
【０２６３】
Ｃ１３．  試料核酸がＤＮＡを含む、実施形態Ｃ１からＣ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０２６４】
Ｃ１４．  試料核酸がゲノムＤＮＡを含む、実施形態Ｃ１３に記載の方法。
【０２６５】
Ｃ１５．  試料核酸がＲＮＡを含む、実施形態Ｃ１からＣ１２のいずれか１つに記載の方法。
【０２６６】
Ｃ１６．  試料核酸がウイルスＲＮＡを含む、実施形態Ｃ１５に記載の方法。
【０２６７】
Ｃ１７．  試料核酸が細菌ＲＮＡを含む、実施形態Ｃ１５に記載の方法。
【０２６８】
Ｃ１８．  試料核酸が一本鎖核酸を含む、実施形態Ｃ１からＣ１７のいずれか１つに記載の方法。
【０２６９】
Ｃ１９．  試料核酸が二本鎖核酸を含む、実施形態Ｃ１からＣ１７のいずれか１つに記載の方法。
【０２７０】
Ｃ２０．  試料核酸が、増幅の前に被験体から得られる、実施形態Ｃ１からＣ１９のいずれか１つに記載の方法。
【０２７１】
Ｃ２０．１  精製されていない試料核酸が増幅される、実施形態Ｃ１からＣ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０２７２】
Ｃ２０．２  精製された試料核酸が増幅される、実施形態Ｃ１からＣ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０２７３】
Ｃ２１．  増幅の前に試料核酸を精製するステップをさらに含む、実施形態Ｃ１からＣ２０．２のいずれか１つに記載の方法。
【０２７４】
Ｃ２２．  増幅が約５５℃から約７５℃の一定温度で行われる、実施形態Ｃ１からＣ２１のいずれか１つに記載の方法。
【０２７５】
Ｃ２３．  増幅が約５５℃から約６５℃の一定温度で行われる、実施形態Ｃ１からＣ２１のいずれか１つに記載の方法。
【０２７６】
Ｃ２４．  増幅が約６５℃の一定温度で行われる、実施形態Ｃ１からＣ２１のいずれか１つに記載の方法。
【０２７７】
Ｃ２５．  増幅が約６０℃の一定温度で行われる、実施形態Ｃ１からＣ２１のいずれか１つに記載の方法。
【０２７８】
Ｃ２６．  核酸増幅産物が約２０〜４０塩基の長さである、実施形態Ｃ１からＣ２５のいずれか１つに記載の方法。
【０２７９】
Ｃ２７．  スペーサー配列が１〜５塩基を含む、実施形態Ｃ１からＣ２６のいずれか１つに記載の方法。
【０２８０】
Ｃ２８．  スペーサー配列が、第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもなく、かつ第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもない、実施形態Ｃ１からＣ２７のいずれか１つに記載の方法。
【０２８１】
Ｃ２９．  スペーサー配列が、試料核酸中の標的配列の一部分に連続的に相補的またはそれと実質的に同一である、実施形態Ｃ１からＣ２８のいずれか１つに記載の方法。
【０２８２】
Ｃ３０．  核酸増幅産物を検出するステップが、蛍光シグナルの検出を含む、実施形態Ｃ１からＣ２８のいずれか１つに記載の方法。
【０２８３】
Ｃ３１．  蛍光シグナルが分子ビーコンに由来する、実施形態Ｃ３０に記載の方法。
【０２８４】
Ｃ３２．  核酸増幅産物を、ｉ）増幅産物中の配列に相補的なポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）フルオロフォアおよび消光剤を含むシグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｃ１からＣ３１のいずれか１つに記載の方法。
【０２８５】
Ｃ３３．  単一の反応容量中で行われる、実施形態Ｃ１からＣ３２のいずれか１つに記載の方法。
【０２８６】
Ｃ３４．  単一の反応容器中で行われる、実施形態Ｃ１からＣ３３のいずれか１つに記載の方法。
【０２８７】
Ｃ３５．  マルチプレックス増幅を含む、実施形態Ｃ１からＣ３４のいずれか１つに記載の方法。
【０２８８】
Ｄ１．  試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するためのキットであって、
ａ）ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、第１のオリゴヌクレオチドが、標的配列の第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、標的配列の第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドを含み、標的配列の第１の鎖および第２の鎖が互いに相補的である、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
を含む、ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で試料核酸中の標的配列を増幅するための成分と、
ｂ）核酸増幅産物のリアルタイム検出活性を提供する少なくとも１つの成分と
を含む、キット。
【０２８９】
Ｄ１．１  第１のオリゴヌクレオチドが、標的配列の第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドから本質的になり、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、標的配列の第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドから本質的になる、実施形態Ｄ１に記載のキット。
【０２９０】
Ｄ１．２  第１のオリゴヌクレオチドが、標的配列の第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、標的配列の第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる、実施形態Ｄ１に記載のキット。
【０２９１】
Ｄ１．３  試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するためのキットであって、
ａ）ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、第１のオリゴヌクレオチドが、標的配列の第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、標的配列の第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなり、標的配列の第１の鎖および第２の鎖が互いに相補的である、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
を含む、ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で試料核酸中の標的配列を増幅するための成分と、
ｂ）核酸増幅産物のリアルタイム検出活性を提供する少なくとも１つの成分と
を含む、キット。
【０２９２】
Ｄ１．４  試料核酸が、ヘリカーゼ不含かつリコンビナーゼ不含の等温増幅条件下で増幅される、実施形態Ｄ１からＤ１．３のいずれか１つに記載のキット。
【０２９３】
Ｄ２．  超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分が、超好熱菌ポリメラーゼもしくはその機能的断片、または超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片を含む、実施形態Ｄ１からＤ１．４のいずれか１つに記載のキット。
【０２９４】
Ｄ３．  超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分が、超好熱菌ポリメラーゼもしくはその機能的断片、または超好熱菌ポリメラーゼと少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼもしくはその機能的断片からなる、実施形態Ｄ１からＤ１．４のいずれか１つに記載のキット。
【０２９５】
Ｄ４．  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、古細菌の超好熱菌ポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、実施形態Ｄ１からＤ３のいずれか１つに記載のキット。
【０２９６】
Ｄ５．  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、実施形態Ｄ１からＤ４のいずれか１つに記載のキット。
【０２９７】
Ｄ６．  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列を含むポリメラーゼまたはその機能的断片によって提供される、実施形態Ｄ１からＤ４のいずれか１つに記載のキット。
【０２９８】
Ｄ７．  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性が低いポリメラーゼによって提供される、実施形態Ｄ１からＤ６のいずれか１つに記載のキット。
【０２９９】
Ｄ８．  超好熱菌ポリメラーゼ活性が、エキソヌクレアーゼ活性を有しないポリメラーゼによって提供される、実施形態Ｄ１からＤ６のいずれか１つに記載のキット。
【０３００】
Ｄ９．  要素（ａ）（ｉｉ）が、逆転写酵素活性を提供する少なくとも１つの成分をさらに含む、実施形態Ｄ１からＤ８のいずれか１つに記載のキット。
【０３０１】
Ｄ１０．  超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分が逆転写酵素活性をさらに提供する、実施形態Ｄ１からＤ８のいずれか１つに記載のキット。
【０３０２】
Ｄ１１．  第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドがそれぞれ８〜１６塩基を含む、実施形態Ｄ１からＤ１０のいずれか１つに記載のキット。
【０３０３】
Ｄ１２．  リアルタイム検出活性が分子ビーコンによって提供される、実施形態Ｄ１からＤ１１のいずれか１つに記載のキット。
【０３０４】
Ｄ１３．  試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するための方法を実施するための指示をさらに含み、上記方法が、
ａ）試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、
標的配列が第１の鎖および第２の鎖を含み、
第１の鎖および第２の鎖が互いに相補的であり、
かつ増幅するステップが、ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、第１のオリゴヌクレオチドが第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドを含み、かつ第２のオリゴヌクレオチドが第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドを含む、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、核酸増幅産物が、１）第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列を含み、かつ
スペーサー配列が第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、
ｂ）核酸増幅産物を検出するステップであって、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ試料核酸を（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）と接触させた時から１０分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップと
を含む、実施形態Ｄ１からＤ１２のいずれか１つに記載のキット。
【０３０５】
Ｄ１３．１  第１のオリゴヌクレオチドが、第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドから本質的になり、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドから本質的になり、かつ／または、核酸増幅産物が、１）第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列から本質的になる、実施形態Ｄ１３に記載のキット。
【０３０６】
Ｄ１３．２  第１のオリゴヌクレオチドが、第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなり、かつ／または、核酸増幅産物が、１）第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列からなる、実施形態Ｄ１３に記載のキット。
【０３０７】
Ｄ１３．３  試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量を決定するための方法を実施するための指示をさらに含み、上記方法が、
ａ）試料核酸中の標的配列を増幅するステップであって、
標的配列が第１の鎖および第２の鎖を含み、
第１の鎖および第２の鎖が互いに相補的であり、
かつ増幅するステップが、ヘリカーゼ不含の等温増幅条件下で非変性試料核酸を
ｉ）第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドであって、第１のオリゴヌクレオチドが、第１の鎖中の配列に連続的に相補的な第１のポリヌクレオチドからなり、かつ第２のオリゴヌクレオチドが、第２の鎖中の配列に連続的に相補的な第２のポリヌクレオチドからなる、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド、ならびに
ｉｉ）超好熱菌ポリメラーゼ活性を提供する少なくとも１つの成分
と接触させることによって核酸増幅産物を生成することを含み、核酸増幅産物が、１）第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第１のヌクレオチド配列、２）第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに連続的に相補的なまたはそれと実質的に同一の第２のヌクレオチド配列、および３）１〜１０塩基を含むスペーサー配列からなり、かつ
スペーサー配列が第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列に挟まれている、ステップと、
ｂ）核酸増幅産物を検出するステップであって、リアルタイム検出方法の使用を含み、かつ試料核酸を（ａ）（ｉ）および（ａ）（ｉｉ）と接触させた時から１０分またはそれ未満以内に行われ、それによって試料核酸中の標的配列の存在、非存在、または量が決定される、ステップと
を含む、実施形態Ｄ１からＤ１２のいずれか１つに記載のキット。
【０３０８】
Ｄ１４．  方法が、増幅の前または増幅の間に試料核酸を変性させるステップを含まない、実施形態Ｄ１３からＤ１３．３のいずれか１つに記載のキット。
【０３０９】
Ｄ１５．  試料核酸を、増幅の前、間、または後にエンドヌクレアーゼと接触させない、実施形態Ｄ１３からＤ１４のいずれか１つに記載のキット。
【０３１０】
Ｄ１６．  試料核酸が、増幅の前に非修飾である、実施形態Ｄ１３からＤ１５のいずれか１つに記載のキット。
【０３１１】
Ｄ１７．  非修飾の試料核酸が破砕細胞に由来する、実施形態Ｄ１６に記載のキット。
【０３１２】
Ｄ１８．  試料核酸がＤＮＡを含む、実施形態Ｄ１３からＤ１５のいずれか１つに記載のキット。
【０３１３】
Ｄ１９．  試料核酸がゲノムＤＮＡを含む、実施形態Ｄ１８に記載のキット。
【０３１４】
Ｄ２０．  試料核酸がＲＮＡを含む、実施形態Ｄ１３からＤ１５のいずれか１つに記載のキット。
【０３１５】
Ｄ２１．  試料核酸がウイルスＲＮＡを含む、実施形態Ｄ２０に記載のキット。
【０３１６】
Ｄ２２．  試料核酸が細菌ＲＮＡを含む、実施形態Ｄ２０に記載のキット。
【０３１７】
Ｄ２３．  試料核酸が一本鎖核酸を含む、実施形態Ｄ１３からＤ２２のいずれか１つに記載のキット。
【０３１８】
Ｄ２４．  試料核酸が二本鎖核酸を含む、実施形態Ｄ１３からＤ２２のいずれか１つに記載のキット。
【０３１９】
Ｄ２５．  試料核酸が、増幅の前に被験体から得られる、実施形態Ｄ１３からＤ２４のいずれか１つに記載のキット。
【０３２０】
Ｄ２６．  精製されていない試料核酸が増幅される、実施形態Ｄ１３からＤ２５のいずれか１つに記載のキット。
【０３２１】
Ｄ２７．  精製された試料核酸が増幅される、実施形態Ｄ１３からＤ２５のいずれか１つに記載のキット。
【０３２２】
Ｄ２８．  方法が、増幅の前に試料核酸を精製するステップをさらに含む、実施形態Ｄ１３からＤ２７のいずれか１つに記載のキット。
【０３２３】
Ｄ２９．  増幅が約５５℃から約７５℃の一定温度で行われる、実施形態Ｄ１３からＤ２８のいずれか１つに記載のキット。
【０３２４】
Ｄ３０．  増幅が約５５℃から約６５℃の一定温度で行われる、実施形態Ｄ１３からＤ２８のいずれか１つに記載のキット。
【０３２５】
Ｄ３１．  増幅が約６５℃の一定温度で行われる、実施形態Ｄ１３からＤ２８のいずれか１つに記載のキット。
【０３２６】
Ｄ３２．  増幅が約６０℃の一定温度で行われる、実施形態Ｄ１３からＤ２８のいずれか１つに記載のキット。
【０３２７】
Ｄ３３．  核酸増幅産物が約２０〜４０塩基の長さである、実施形態Ｄ１３からＤ３２のいずれか１つに記載のキット。
【０３２８】
Ｄ３４．  スペーサー配列が１〜５塩基を含む、実施形態Ｄ１３からＤ３３のいずれか１つに記載のキット。
【０３２９】
Ｄ３５．  スペーサー配列が、第１のオリゴヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもなく、かつ第２のオリゴヌクレオチドの第２のポリヌクレオチドに相補的でなくそれと同一でもない、実施形態Ｄ１３からＤ３４のいずれか１つに記載のキット。
【０３３０】
Ｄ３６．  スペーサー配列が、試料核酸中の標的配列の一部分に連続的に相補的またはそれと実質的に同一である、実施形態Ｄ１３からＤ３５のいずれか１つに記載のキット。
【０３３１】
Ｄ３７．  核酸増幅産物を検出するステップが、蛍光シグナルの検出を含む、実施形態Ｄ１３からＤ３６のいずれか１つに記載のキット。
【０３３２】
Ｄ３８．  蛍光シグナルが分子ビーコンに由来する、実施形態Ｄ３７に記載のキット。
【０３３３】
Ｄ３９．  方法が、核酸増幅産物を、ｉ）増幅産物中の配列に相補的なポリヌクレオチド、ならびにｉｉ）フルオロフォアおよび消光剤を含むシグナル生成オリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、実施形態Ｄ１３からＤ３８のいずれか１つに記載のキット。
【０３３４】
Ｄ４０．  方法が単一の反応容量中で行われる、実施形態Ｄ１３からＤ３９のいずれか１つに記載のキット。
【０３３５】
Ｄ４１．  方法が単一の反応容器中で行われる、実施形態Ｄ１３からＤ４０のいずれか１つに記載のキット。
【０３３６】
Ｄ４２．  方法がマルチプレックス増幅を含む、実施形態Ｄ１３からＤ４１のいずれか１つに記載のキット。
【０３３７】
本明細書中で参照した各特許、特許出願、刊行物、および文献の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。上記特許、特許出願、刊行物、および文献の引用は、上記のいずれかが関連する先行技術であることを容認するものではなく、またこれらの刊行物または文献の内容または日付についていかなる容認も構成しない。これらの引用は、関連する開示についてサーチしたことを示すものではない。文献の日付または内容に関する全ての記述は、利用可能な情報に基づくものであり、その正確性または適切性を容認するものではない。
【０３３８】
本技術の基本的態様から逸脱することなく、上記したものに対して改変が為され得る。１つまたは複数の具体的実施形態を参照して本技術をかなり詳細に記載したが、本出願中に具体的に開示した実施形態に対して変更を行うことができ、これらの改変および改良も本技術の範囲および精神に含まれることを当業者は認識するであろう。
【０３３９】
好適なものとして本明細書中に実例を挙げて説明した技術は、本明細書中に具体的に開示されていない任意の要素の非存在下で実施され得る。よって、例えば、本明細書中の各例において、「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」という用語のいずれかは、その他の２つの用語のいずれかと交換され得る。用いられている用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用されたものであり、そのような用語および表現の使用は、示されかつ記載された特徴の任意の均等物またはその部分を除外するものではなく、様々な改変が特許請求される技術の範囲内で可能である。「ａ」または「ａｎ」という用語は、要素のいずれか１つまたは１つより多くの要素が記載されていることが文脈上明らかでない限り、それが修飾する要素の１つまたは複数を指し得る（例えば、「試薬（ａ  ｒｅａｇｅｎｔ）」は１つまたは複数の試薬を意味し得る）。本明細書中で使用される「約」という用語は、基礎となるパラメーターの１０％以内（すなわち、プラスまたはマイナス１０％）を指し、値の列挙の始まりにおける「約」という用語の使用は、それぞれの値を修飾する（すなわち、「約１、２、および３」は約１、約２、および約３を指す）。例えば、「約１００グラム」の質量は、９０グラムから１１０グラムの間の質量を包含し得る。さらに、値の列挙が本明細書中に記載されている場合（例えば、約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、または８６％）、列挙はその全ての中間の値および小数の値（例えば、５４％、８５．４％）を包含する。よって、代表的な実施形態および任意選択の特徴によって本技術を具体的に開示したが、本明細書中に開示した概念の改変および変更を当業者は行うことができ、そのような改変および変更は本技術の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０３４０】
本技術のある特定の実施形態が下記の特許請求の範囲に記載される。
【図１】
2019510515.tif 000004
【図２】
2019510515.tif 000005
【図３】
2019510515.tif 000006
【図４】
2019510515.tif 000007
【図５−１】
2019510515.tif 000008
【図５−２】
2019510515.tif 000009
【配列表】
2019510515000001.app
【国際調査報告】
2019510515.tif 000010
2019510515.tif 000011
2019510515.tif 000012