(57)【要約】  本発明は、水、少なくとも１種の炭素源、１種以上のビタミン、１種以上の塩、１種以上の脂肪酸、１種以上のバッファー構成成分、セレニウム、酸性スフィンゴミエリナーゼの機能阻害剤（ＦＩＡＳＭＡ）の群の少なくとも１種の物質、及び幹細胞分化を阻害する能力を有するＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１種のポリペプチドを含む、真核細胞培養のための化学組成既知の合成培地、ヒト多能性幹細胞の培養におけるその使用、ヒト多能性幹細胞及び化学組成既知の合成培地を含む細胞培養系、並びにヒト多能性幹細胞の増殖及び／又は維持のためのキットに関する。
2019519204.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞培養のための化学組成既知の合成培地であって、水、少なくとも１種の炭素源、１種以上のビタミン、１種以上の塩、１種以上の脂肪酸、１種以上のバッファー構成成分、セレニウム、酸性スフィンゴミエリナーゼの機能阻害剤（ＦＩＡＳＭＡ）の群の少なくとも１種の物質、及び幹細胞分化を阻害する能力を有するＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１種のポリペプチドを含む、化学組成既知の合成培地。
【請求項２】
ＦＩＡＳＭＡが、トリミプラミン、メパクリン、プロメタジン及びプロフェナミンの群から選択され、好ましくは、ＦＩＡＳＭＡが、トリミプラミンである、請求項１に記載の化学組成既知の合成培地。
【請求項３】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１種のポリペプチドが、アクチビン類、ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及びＧＤＦ３からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の化学組成既知の合成培地。
【請求項４】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１種のポリペプチドが、アクチビン類から選択され、好ましくは、ポリペプチドが、アクチビンａである、請求項３に記載の化学組成既知の合成培地。
【請求項５】
ヒト又は動物由来物質を完全に欠く、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化学組成既知の合成培地。
【請求項６】
ＦＧＦ−２、アルブミン及び／又はＴＧＦ−β１の構成成分のいずれも含まない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化学組成既知の合成培地。
【請求項７】
少なくとも１種のＦＩＡＳＭＡの濃度が、０．１ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの範囲内であり、好ましくは、０．５ｍｇ／Ｌ〜５ｍｇ／Ｌの範囲内である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化学組成既知の合成培地。
【請求項８】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１種のポリペプチドの濃度が、０．２μｇ／Ｌ〜２００μｇ／Ｌの範囲内であり、好ましくは、１μｇ／Ｌ〜１００μｇ／Ｌの範囲内であり、より好ましくは、２μｇ／Ｌ〜２０μｇ／Ｌの範囲内である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化学組成既知の合成培地。
【請求項９】
１種以上のバッファー構成成分が、無機炭酸水素塩、無機リン酸塩又は４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化学組成既知の合成培地。
【請求項１０】
セレニウムの濃度が、１μｇ／Ｌ〜１００μｇ／Ｌの範囲内であり、好ましくは、１０μｇ／Ｌ〜５０μｇ／Ｌの範囲内である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化学組成既知の合成培地。
【請求項１１】
インスリン及び／又はトランスフェリンをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化学組成既知の合成培地であって、トランスフェリンの濃度が、０．１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌの範囲内であり、好ましくは、１ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌの範囲内であり、より好ましくは、５ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌの範囲内である、及び／又はインスリンの濃度が、０，１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌの範囲内であり、好ましくは、１ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの範囲内である、化学組成既知の合成培地。
【請求項１２】
アスコルビン酸をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化学組成既知の合成培地であって、アスコルビン酸の濃度が、３ｍｇ／Ｌ〜３００ｍｇ／Ｌの範囲内であり、好ましくは、１０ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌの範囲内である、化学組成既知の合成培地。
【請求項１３】
真核細胞、好ましくは、ヒト多能性幹細胞、より好ましくは、ヒト人工多能性幹細胞を培養するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化学組成既知の合成培地の使用。
【請求項１４】
多能性幹細胞の培養が、接着細胞培養として行われ、好ましくは、多能性幹細胞の培養が、細胞外マトリックス、より好ましくは、ゼノフリー細胞外マトリックス上で行われる、請求項１３に記載の化学組成既知の合成培地の使用。
【請求項１５】
ヒト多能性幹細胞、好ましくは、ヒト人工多能性幹細胞及び請求項１〜１２のいずれかに記載の化学組成既知の合成培地を含む細胞培養系。
【請求項１６】
細胞外マトリックス、好ましくは、ゼノフリー細胞外マトリックスをさらに含む、請求項１５に記載の細胞培養系。
【請求項１７】
細胞培養におけるヒト多能性幹細胞の増殖及び／又は維持のためのキットであって、
−  細胞外マトリックス調製物、好ましくはゼノフリー細胞外マトリックス調製物を含む第１の組成物、
−  水、少なくとも１種の炭素源、１種以上のビタミン、１種以上の塩、１種以上の脂肪酸及び１種以上のバッファー構成成分を含む第２の組成物、
−  アスコルビン酸、セレニウム、インスリン、トランスフェリン、アクチビンａ及びトリミプラミンを含む第３の組成物、並びに
−  任意選択的に、細胞の解離のための第４の組成物
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞培養のための化学組成既知の合成培地、多能性幹細胞の増殖及び／又は維持のための培地の使用、多能性幹細胞及び化学組成既知の合成培地を含む細胞培養系、並びに多能性幹細胞の増殖及び／又は維持のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
自己再生及び様々な最終成熟細胞型へと分化する能力は、あらゆる種類の幹細胞によって共有される特徴である。これらの機構は、正常な幹細胞において密接に制御されるが、この潜在力は、最終分化した成熟細胞に向かう幹細胞の漸進的な多段階分化過程の間に進行的に失われる（Ｓａｎｇｅｓら、２０１０年）。
【０００３】
幹細胞のポテンシーは、異なる細胞型へと分化するその潜在力を定める。幹細胞は、そのポテンシーに従って分類することができ、例えば、全能性幹細胞は、あらゆる細胞型、胚性細胞及び胚外細胞へと分化することができる。全能性幹細胞は、卵及び精子細胞の融合体から産生され、完全で生存可能な生物を構築することができる。対照的に、単能性幹細胞は、１種の細胞型のみを産生することができるが、非幹細胞からこれを区別する、自己再生の特性を有する。全てではないがいくつかの細胞型へと分化することができる幹細胞の型は、複能性幹細胞であり、これは、密接に関係しているファミリーの細胞型のみではなく、多数の細胞型へと分化することができる。多能性幹細胞は、胚外組織、例えば胎盤を除外する、ほとんど全ての細胞へと分化することができる（Ｓｃｈｏｌｅｒ、２００７年）。
【０００４】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）の２種の最もよく知られた例は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）である（Ｓａｎｇｅｓら、２０１０年）。
【０００５】
胚性幹細胞は、単離され培養に付された最初の型の多能性幹細胞であり、１９８１年に、発生中のマウス胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）から初めて得られた（Ｐａｕｋｌｉｎら、２０１１年）。これらの細胞は、無制限に増殖し、遺伝的に安定している。
【０００６】
１９９８年におけるヒト胚性幹細胞の出現（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８年）は、幹細胞研究を新たな局面へと押し上げた。胚性幹細胞研究は、驚異的な速さで科学界を席巻し、細胞及び発生生物学に大きな進歩をもたらした（Ｗｏｂｕｓら、２００５年）。
【０００７】
今日、様々な種に由来する胚性幹細胞は、例えば、様々な細胞型への定方向分化、遺伝子標的化及びトランスジェニック動物の生成のための、多用途の生物学的ツールとなっている（Ｗｏｂｕｓら、２００５年）。重要なことに、治療上の価値を有する細胞へと分化する能力と組み合わせた、その無制限な自己再生能は、多くの治療不能な医学的状態の治療法に対する新たな希望を生じた。
【０００８】
２００６年にはマウス系について（Ｔａｋａｈａｓｈｉ及びＹａｍａｎａｋａ、２００６年）、２００７年には人間で（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年；Ｙｕら、２００７年）最初に記載されているが、ｉＰＳ細胞は、成熟体細胞を多能性状態へとリプログラミングすることにより人工的に生成される。原理は、様々な技術的アプローチを用いた、別個の多能性遺伝子の発現の誘導に基づく（Ｇｏｎｚａｌｅｚら、２０１１年）。このエレガントで革新的な技法は、胚盤胞由来ｈＥＳＣに伴う倫理的懸念の回避を可能にし、患者特異的な幹細胞及び疾患モデルの生成のための新たな可能性を開いた。一見すると、ｉＰＳＣは、ＥＳＣと多くの特色、例えば、形態、多能性及びマーカー発現を共有する。しかし、詳細な解析は、ｈＥＳＣ及びその人工的に生成された対応物の間のいくつかの基礎的な差、例えば、エピジェネティック修飾／ＤＮＡメチル化（「インプリンティング」）の変動、及び細胞の体細胞ステージにおける突然変異の蓄積を明らかにした（Ｐｕｒｉ及びＮａｇｙ、２０１２年）。
【０００９】
エピブラスト細胞から直接的に、又はその単能性子孫、始原生殖細胞（ＰＧＣ）から多能性胚性生殖細胞（ＥＧＣ）へのインビトロ脱分化により間接的に、多能性細胞株を確立することもできることに言及しておくことは重要である。
【００１０】
成熟体細胞を多能性状態へとリプログラムするための追加的な、ただし稀に使用される技法は、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）及び細胞融合（Ｓａｎｇｅｓら、２０１０年）である。ＳＣＮＴは、除核した卵母細胞への体細胞核の移植によりリプログラミング過程を達成する。この技法は、十分に機能的な胚を生成し、（トランスジェニック）動物のクローニング、例えば、「ヒツジのドリー」（「生殖クローニング」）（Ｗｉｌｍｕｔら、１９９７年）に使用される場合もあるが、患者特異的多能性細胞株の確立（「治療クローニング」）に使用することもできる。
【００１１】
最後に、細胞融合は、体細胞と多能性幹細胞との融合による、四倍体又は倍数体多能性細胞雑種の生成を用いる。
【００１２】
多能性細胞が保持する有意な治療潜在力にもかかわらず、目下、科学は、多能性細胞に基づく安全で効率的な治療法に要求される閾に達していない。
【００１３】
皮肉なことに、このような細胞の実質的に無制限な可能性は、広範囲の治療適用におけるその使用に対する主な障害となっている：移植のための細胞調製物における、残存する多能性細胞は、がん／腫瘍発症の高いリスクを課し、現時点では、斯かる危険な細胞不純物の非存在を保証する安全な技法は存在しない（Ｐｕｒｉ及びＮａｇｙ、２０１２年）。加えて、１５年間のｈＥＳＣ培養後であっても、機能的に移植可能な細胞をもたらす全体的な最適化された分化プロトコールは、依然としてほとんどない（Ｂｉｌｉｃ及びＩｚｐｉｓｕａ  Ｂｅｌｍｏｎｔｅ、２０１２年）。
【００１４】
ＰＳＣの多能性は、様々な直接的及び間接的な技術的アプローチによって評価することができる。動物細胞のための判断基準は、キメラの生成及び生殖系列伝達を含む全組織への寄与に関する検査である（Ｓｈｅｒｉｄａｎら、２０１２年；Ｊａｅｎｉｓｃｈ及びＹｏｕｎｇ、２００８年）。
【００１５】
ヒト多能性幹細胞に対し、多能性に関するこれらの厳密な検査は、明らかな倫理的理由から行うことができない。したがって、間接的方法（例えば、免疫低下マウスにおけるテラトーマの形成又は全三胚葉への分化による胚様体）が、ヒトＰＳＣの多能性検査の代替方法として使用される（Ｓｈｅｒｉｄａｎら、２０１２年）。これらのアプローチは、骨が折れ、高価で時間がかかり、技術的に難易度が高い。したがって、多能性マーカー発現パターン、例えば、Ｏｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ及びＴｒａ−抗原に関する検査も、多能性状態の間接的証拠として現在広く受け入れられている（Ｗｅｎｘｉｕら、２０１２年）。実際に、現在まで、機能的手段によって現存しているｈＰＳＣ系統の多能性を最終的に検証するために利用可能な技法はない。
【００１６】
よって、幹細胞培養における大きな課題の１つは、多能性の維持である。初期ＰＳＣ研究において、ＦＣＳを含有する組成未知の培養培地において、大部分はマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）であるフィーダー細胞層において胚性幹細胞を培養した（Ｗｏｂｕｓら、２００５年）。しかし、培養培地における未同定の物質（ｕｎｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）の存在は多くの場合、多能性の喪失をもたらす培養細胞の自発的分化をもたらした。後に、ＦＣＳは、組成がもっとよく分かっている血清による置き換えによって置き換えることができる。ＥＳＣの自己再生を支持する細胞外マトリックスコーティングの導入は、フィーダー細胞馴化培地を使用したフィーダーフリー培養を可能にした。しかし、培養過程は依然として、時間がかかり、骨が折れるものであり、不十分にしか規定されていないままであった。
【００１７】
近年、ＰＳＣ培養は、有意な技術的進歩を経験した。組成既知の培地組成物が標準になり、続いて最初のゼノフリー（ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ）で組成既知の配合物が標準になった。しかし、このような培養系は全て依然として、組成未知の、ゼノジニックの、標準化が不十分な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）調製物に依存していた。これは、組成既知の／ゼノフリーの培地を使用しているという観点で、矛盾している。実際に、研究はつい近年、このハードルを克服し、未分化ＰＳＣ増加を支持する天然／合成ＥＣＭ分子及びペプチドを同定したばかりである。科学者らは現在、ｈＰＳＣの完全に規定／ヒト化された誘導及び培養を行うことができる。
【００１８】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）のための最初に確立された組成既知のフィーダーフリーであるインビトロ培養系は、その増加、持続した自己再生及び多能性の維持をロバストに支持するために、ＦＧＦ−２（ＦＧＦＲリガンド）及びＴＧＦβ−１（ＡＬＫ５リガンド）を含有した（Ｌｕｄｗｉｇら、２００６年）。単独でのＦＧＦ−２又はＴＧＦβ−１は、組成既知の及びフィーダーフリーの培養条件下で未分化状態にｈＰＳＣをロバストに維持することができないが、ＦＧＦ／ＴＧＦシグナリングの組み合わされた活性化を行うことができる。
【００１９】
しかし、未分化ヒト幹細胞を培養するためのこれらの培地は、細胞の大規模培養のためには、十分に開発されていない。このような培地は、高価であり、バッチ間変動が起こり得る。
【００２０】
したがって、これらの近年の技術的前進にもかかわらず、確立されたｈＰＳＣ培養系は依然として、次の好ましくない特性のうち１種以上を共有する：超生理学的に多い量の成長因子を使用すること、ヒト若しくは動物起源から精製された物質を含有すること、又は動物由来及び／又は組成未知のＥＣＭに頼ること。
【００２１】
進行中の研究は、これらの好ましくない特性を回避しようと試みる。科学的研究は、ｈＰＳＣの自己再生支持を、少なくとも一部には、ＵＳ８，２１１，６９９  Ｂ２に記載されている通りのＥｒｂＢ３シグナリング経路又はＮｏｄａｌ／アクチビンシグナリング等の代替シグナリング経路の関与によって達成することもできることを実証した（Ｖａｌｌｉｅｒら、２００５年；Ｘｉａｏら、２００６年）。ＡｃｔＲＩＩＡ／ＡＬＫ４−リガンドであるアクチビンａは、単独で限られた数のｈＰＳＣ系統の多能性を拡張することができる（Ｘｉａｏら、２００６年）が、他の確立された系統に関してはそのようにできない（Ｖａｌｌｉｅｒら、２００５年）。対照的に、ＦＧＦ−２とアクチビンａとの組合せは、これらの培養条件下で多能性状態にｈＰＳＣをロバストに維持することができた（Ｖａｌｌｉｅｒら、２００９年）。
【００２２】
近年の科学的前進は、例えば、ｉＰＳ細胞株を生成するために、体細胞のリプログラミングを助けるように、細胞シグナリングを特異的に操作することができる小分子の出現をもたらす（Ｚｈａｎｇら、２０１２年）。そのような有機化学物質の一部は、古典的サイトカイン、例えば、ＦＧＦ−２及びＴＧＦβ−１の非存在下でのｈＰＳＣの自己再生及び多能性の維持を支持するための潜在力も有する。
【００２３】
トリミプラミンのようなジベンザゼピンの物質クラスの異なる三環系抗うつ薬神経伝達物質アンタゴニストは、添加されるＦＧＦ−２の非存在下で、及び組成既知のフィーダーフリーの培養条件で、ある特異的なｈＰＳＣ系統の多能性を特異的に拡張することが実証された（Ｋｕｍａｇａｉら、２０１３年）。しかし、これは、選択されたｈＰＳＣ系統のみに対する真実であるが、一般に適用されないと思われた。他の確立された細胞株は、漸進的分化を示し、トリミプラミンの存在下で繁殖させることができなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】米国特許第８，２１１，６９９号明細書
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Ｓａｎｇｅｓら、２０１０年
【非特許文献２】Ｓｃｈｏｌｅｒ、２００７年
【非特許文献３】Ｐａｕｋｌｉｎら、２０１１年
【非特許文献４】Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８年
【非特許文献５】Ｗｏｂｕｓら、２００５年
【非特許文献６】Ｔａｋａｈａｓｈｉ及びＹａｍａｎａｋａ、２００６年）
【非特許文献７】Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年
【非特許文献８】Ｙｕら、２００７年
【非特許文献９】Ｇｏｎｚａｌｅｚら、２０１１年
【非特許文献１０】Ｐｕｒｉ及びＮａｇｙ、２０１２年
【非特許文献１１】Ｗｉｌｍｕｔら、１９９７年
【非特許文献１２】Ｂｉｌｉｃ及びＩｚｐｉｓｕａ  Ｂｅｌｍｏｎｔｅ、２０１２年
【非特許文献１３】Ｓｈｅｒｉｄａｎら、２０１２年
【非特許文献１４】Ｊａｅｎｉｓｃｈ及びＹｏｕｎｇ、２００８年
【非特許文献１５】Ｗｅｎｘｉｕら、２０１２年
【非特許文献１６】Ｌｕｄｗｉｇら、２００６年
【非特許文献１７】Ｖａｌｌｉｅｒら、２００５年
【非特許文献１８】Ｘｉａｏら、２００６年
【非特許文献１９】Ｖａｌｌｉｅｒら、２００９年
【非特許文献２０】Ｚｈａｎｇら、２０１２年
【非特許文献２１】Ｋｕｍａｇａｉら、２０１３年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
したがって、本発明の目的は、培地を使用して連続的に継代されたときに多能性を維持している幅広い範囲にわたる確立された多能性幹細胞株の培養のための、改善された化学組成既知の細胞培養培地を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
（発明の要旨）
上述の目的は、本発明の対象物によって解決される。本発明は、水、少なくとも１種の炭素源、１種以上のビタミン、１種以上の塩、１種以上の脂肪酸、１種以上のバッファー構成成分、セレニウム、ＦＩＡＳＭＡの群の少なくとも１種の物質、及び幹細胞分化を阻害する能力を有するＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１種のポリペプチドを含む、真核細胞培養のための化学組成既知の合成培地を提供する。
【００２８】
本発明者らは、標準化された培養環境における、未分化状態でのｈＰＳＣの増加及び維持を可能にする、本発明に係る化学組成既知の培養培地内におけるＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーと組み合わせたＦＩＡＳＭＡの相乗効果を同定した。本発明に係る化学組成既知の合成培地は、ｈＰＳＣ自己再生の維持を示す、ｈＰＳＣ培養物の連続的増殖及び系列継代可能性を可能にする。ｈＰＳＣ培養が開始されると、細胞は、連続的に継代され得る。
【００２９】
培地配合物は、化学組成既知／ゼノフリーであるのみならず、ヒト又は動物起源から精製された物質をも完全に除外する。加えて、培地は、より低い生理的範囲内の、使用されている化合物の濃度で機能する。最適培養環境は、確立された多能性幹細胞株の十分に制御された培養過程、一貫した及び再現性がある性能、並びに多能性のロバストな支持を可能にする。
【００３０】
本発明は、真核細胞、好ましくはヒト多能性幹細胞、より好ましくはヒト人工多能性幹細胞を培養するための化学組成既知の合成培地の使用をさらに提供する。したがって、本発明は、ヒト多能性幹細胞、好ましくはヒト人工多能性幹細胞及び化学組成既知の合成培地を含む細胞培養系も提供する。
【００３１】
その上、本発明は、細胞培養におけるヒト多能性幹細胞の増殖及び／又は維持のためのキットであって、
−  細胞外マトリックス調製物、好ましくはゼノフリー細胞外マトリックス調製物を含む第１の組成物、
−  水、少なくとも１種の炭素源、１種以上のビタミン、１種以上の塩、１種以上の脂肪酸及び１種以上のバッファー構成成分を含む第２の組成物、
−  アスコルビン酸、セレニウム、インスリン、トランスフェリン、アクチビンａ及びトリミプラミンを含む第３の組成物、並びに
−  任意選択的に、細胞の解離のための第４の組成物
を含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、５０×拡大率での、１０μｇ／Ｌアクチビンａを含有する幹細胞培養培地（実施例４に定義されている通り）において１継代（５日間）増加させたｈＰＳＣの光学顕微鏡画像を示す。細胞は、有意な増殖を経験したが、高度に不均一な形態学的パターンを示した。細胞サイズは劇的に増加し（低い核：細胞質比）、培地交換の間に多数の剥離細胞が観察され、有意な分化と、アクチビンａがｈＰＳＣを未分化状態に維持する能力のないこととを示す。
【図２】図２は、５０×拡大率での、トリミプラミンを含有する幹細胞培養培地（実施例５に定義されている通り）において５日間培養されたｈＰＳＣの光学顕微鏡画像を示す。細胞は、高い核：細胞質比及び平滑縁コロニーを有する典型的な多能性幹細胞表現型を保持した。しかし、トリミプラミンにより、播種した細胞塊は、完全培養期間にわたりほとんど同じサイズのままであり、細胞増殖の完全欠如を示す。
【図３】図３は、５０×拡大率での高集密度（Ａ）及び２００×拡大率での低集密度（Ｂ）の、アクチビンａ及びトリミプラミンを含有する幹細胞培養培地（実施例１に定義されている通り）において３継代、増加させたｈＰＳＣの光学顕微鏡画像を示す。均一な培養物は、高い核：細胞質比及び平滑コロニー境界によって示される、ヒト多能性幹細胞のプロトタイプな形態学的成長パターンを安定に示す。分化の徴候は存在しない。
【図４】図４は、アクチビンａ及びトリミプラミンを含有する幹細胞培養培地（実施例１に定義されている通り）における３継代後のｈＰＳＣ多能性マーカー発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。ｘ軸は、ＳＳＥＡ−４発現を描写し、ｙ軸は、Ｏｃｔ−３／４発現を示す。Ａ）陰性対照、Ｂ）Ｏｃｔ−３／４及びＳＳＥＡ−４の二重染色。増加させたｈＰＳＣの９９％超が、外因的に添加されたＦＧＦ−２の非存在下で、確立されたｈＰＳＣ培養培地における３継続的継代後に、多能性マーカープロファイルＯｃｔ−３／４／ＳＳＥＡ−４に関して二重陽性である。
【図５】図５は、１００×拡大率での、（Ａ）トリミプラミン及びアクチビンａを含有する幹細胞培養培地（実施例１に定義されている通り）において９継続的継代培養されたｈＰＳＣ系統ＷＴＳｌｉ０２６−Ａ、及び、比較のため、（Ｂ）ＦＧＦ−２及びＴＧＦ−β１を含むｈＰＳＣ培養培地（実施例９に定義されている通り）において８継代培養されたｈＰＳＣ系統ＷＴＳｌｉ０２６−Ａの光学顕微鏡画像を示す。
【図６】図６は、トリミプラミン及びアクチビンａを含有する幹細胞培養培地（実施例１に定義されている通り）における９継代後（Ａ＋Ｂ）、並びにＦＧＦ−２及びＴＧＦ−β１を含むｈＰＳＣ培養培地（実施例９に定義されている通り）における８継代後（Ｃ＋Ｄ）の、ｈＰＳＣ系統ＷＴＳｌｉ０２６−ＡにおけるｈＰＳＣ多能性マーカー発現のフローサイトメトリー解析の結果を示す。ｘ軸は、ＳＳＥＡ−４発現を描写し、ｙ軸は、Ｏｃｔ−３／４発現を示す。Ａ＋Ｃは、陰性対照を表し、Ｂ＋Ｄは、Ｏｃｔ−３／４及びＳＳＥＡ−４の二重染色を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本明細書及び特許請求の範囲、並びに斯かる用語に与えられるべき範囲の明瞭で一貫した理解を得るために、次の定義が提供される。
【００３４】
用語「成分」は、本明細書において、化学的又は生物学的起源のものであるかにかかわらず、細胞培養培地において使用されて、細胞の成長又は増殖を維持又は促進することができる、いずれかの化合物を指す。用語「構成成分」及び「成分」は、互換的に使用されてよく、全て、斯かる化合物を指すことを目的とする。細胞培養培地において使用される典型的な成分は、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質その他を含む。エクスビボでの細胞の成長を促進又は維持する他の成分は、特定の必要に従って当業者によって選択され得る。
【００３５】
用語「培地」、「細胞培養培地」、「培養培地」及び「培地配合物」は、本明細書において、細胞を培養又は成長させるための栄養溶液を指す。
【００３６】
「細胞培養」は、本明細書において、人工的インビトロ環境において維持、培養又は成長される細胞又は組織を意味する。用語「育成」及び「培養」は同義である。
【００３７】
用語「ヒト多能性幹細胞」又は「ｈＰＳＣ」は、胚外組織を除外するほとんど全ての細胞へと分化することができる、ヒト起源の未分化生物学的細胞を指す。ｈＰＳＣは、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）に分けることができる。ＥＳＣは、初期着床前胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。よって、用語「ヒト胚性幹細胞」又は「ｈＥＳＣ」は、ヒト胚に由来する多能性幹細胞を指す。人工多能性幹細胞は、対照的に、成体細胞から生成され得る。よって、用語「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」は、本明細書において、成体細胞から直接的に生成され得る多能性幹細胞の型に関する。したがって、用語「ヒト人工多能性幹細胞」又は「ｈｉＰＳＣ」は、ヒト成体細胞から直接的に生成されたｉＰＣＳを指す。
【００３８】
不確定な幹細胞からより特殊化された細胞型への形質転換は、「分化」と呼ばれる。したがって、用語「幹細胞分化」は、本明細書において、不確定な幹細胞の特殊化について記載する。より特殊化された細胞型へと分化する潜在力は、ポテンシーと呼ばれる。よって、用語「ポテンシー」又は「分化潜在力」は、より特殊化された細胞型へと形質転換する幹細胞の潜在力を特定する。幹細胞は、その分化潜在力に従って分類され得る。胚性及び胚外細胞型へと分化する能力を有する幹細胞は、全能性と呼ばれる。斯かる細胞は、完全で生存可能な生物を構築することができる。全能性細胞の子孫は、ほとんど全ての細胞、すなわち、三胚葉のいずれかに由来する細胞へと分化し得る、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞である。より特殊化された細胞は、密接に関係しているファミリーの細胞のみではあるが多くの細胞へと分化し得る、複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞と呼ばれる。リンパ系又は骨髄系幹細胞のような、数種の細胞のみへと分化し得る幹細胞は、寡能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔ）幹細胞である。単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）細胞は、それ自体の細胞型のみを産生することができるが、自己再生の特性を有しているものであり、この事実は、この細胞を非幹細胞から区別する。
【００３９】
「化学組成既知の合成培地」は、本明細書において、全成分及び濃度が知られた培地である。これは特に、「無血清」である、すなわち、培地は、血清（例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ヒト血清、ウマ血清、ヤギ血清等）を含有しない。
【００４０】
用語「無血清培養条件」及び「無血清条件」は、いかなる種類の血清も除外した細胞培養条件を指す。
【００４１】
「培養器」とは、細胞を成長させるための無菌的環境をもたらし得る様々なサイズのガラス容器、プラスチック容器又は他の容器を意味する。例えば、フラスコ、シングル若しくはマルチウェルプレート、シングル若しくはマルチウェルディッシュ又はマルチウェルマイクロプレートが使用され得る。
【００４２】
用語「フィーディング」及び「培地交換」は、本明細書において、細胞が培養されている培地を置き換えることを指す。用語「継代」及び「継代すること」は、本明細書において、以前の培養物から新鮮細胞培養培地へと、一部又は全ての細胞を移すことを意味する。確立されたｈＰＳＣ培養のため、フィーディング間隔は、ｈＰＳＣ系統毎に経験的に決定されなければならない。本発明に係る化学組成既知の培養培地は、最大７２時間の延長された培地交換間隔を支持する。しかし、培養開始のため、毎日の培地交換が、最初の２〜３日間において推奨される。
【００４３】
用語「塩」又は「無機塩」は、本明細書において、細胞培養培地中に存在する元素の塩を指す。
【００４４】
「バッファー構成成分」は、本明細書において、溶液、すなわち、培養培地の酸性度（ｐＨ）を、選択された値の付近に維持するために使用される物質である。組織培養物におけるバッファー構成成分の機能は、ｐＨを狭い適した範囲内に維持し、細胞代謝物、例えば、乳酸塩による培養培地の酸性化によって起こり得る有害なｐＨ増減を防止するためのものである。
【００４５】
「生理的範囲」は、生物又はその部分における、天然起源の濃度での物質の存在について記載する。そのような濃度内で、前記物質は、生物又はその部分における生化学的過程に関与する。典型的には、生物又はその部分における物質の濃度は、平均濃度として示される。したがって、用語「より低い生理的範囲」又は「より高い生理的範囲」は、それぞれ物質の平均濃度を下回る又は上回る物質の濃度を指す。
【００４６】
本発明は、とりわけ、化学組成既知の細胞培養培地内における、酸性スフィンゴミエリナーゼの機能阻害剤（ＦＩＡＳＭＡ）の群の化合物、すなわちトリミプラミン及びＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバー、すなわちアクチビンａの組合せが、未分化多能性幹細胞の効率的インビトロ増加を支持するという知見に基づく。特に、培地は、外因的に添加されるＦＧＦ−２を要求しない。
【００４７】
本発明は、真核細胞培養のための化学組成既知の合成培地であって、水、少なくとも１種の炭素源、１種以上のビタミン、１種以上の塩、１種以上の脂肪酸、１種以上のバッファー構成成分、セレニウム、ＦＩＡＳＭＡの群の少なくとも１種の物質、及び幹細胞分化を阻害する能力を有するＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１種のポリペプチドを含む化学組成既知の合成培地を提供する。
【００４８】
本例に示されている通り、本発明に係る化学組成既知の合成培地は、多能性幹細胞の増加及び／又は維持のための価値あるツールである。本発明に係る化学組成既知の合成培地内におけるＦＩＡＳＭＡトリミプラミン及びＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーであるアクチビンａの特異的組合せは、多能性幹細胞の典型的特性を維持しながら、ｈＥＳＣの急速増加を可能にする。細胞は、平滑縁コロニーの典型的成長パターンを有し、数継代後に、多能性マーカーＯｃｔ−３／４及びＳＳＥＡ−４を依然として発現する。
【００４９】
「アクチビンａ」は、本明細書において、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／）の受託番号Ｐ０８４７６によって定義される、インヒビンベータＡサブユニットのホモ二量体及びその機能的均等物を指す。アクチビンａは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーである。ＴＧＦ−βスーパーファミリーは、構造的に関係する細胞調節タンパク質の大規模な群である。ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、例えば、多くの細胞型における増殖、分化及び他の機能において重要な役割を果たす。典型的には、タンパク質は、ホモ又はヘテロ二量体であるが、二量体は、単一のジスルフィド結合によって連結された２本の鎖でできているタンパク質の活性型を表す。
【００５０】
確立された幹細胞培地配合物において、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの最も顕著なメンバーであるＴＧＦ−βは、ｈＰＳＣの自己再生を支持するために使用されてきた。ＴＧＦ−βの非存在下において、自己再生は（単独で、又はさらに別の活性物質と組み合わせて）、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの他のメンバー、すなわち、ｎｏｄａｌ、ミオスタチン、増殖分化因子３（ＧＤＦ３）又はアクチビン類を含む培地において培養された細胞に観察される場合もある。しかし、同定されたタンパク質は、古典的ＴＧＦ−β活性化下流シグナリング経路を活性化しないが、代替経路、例えば、ＥｒｂＢ３−又はＮｏｄａｌ／アクチビン−シグナリング経路を誘発する（Ｐｅｒａ及びＴａｍ、２０１０年）。この知見は、幹細胞分化を調節する別個の細胞内シグナリング経路の存在を示す。
【００５１】
本発明の一実施形態では、本発明に係る化学組成既知の合成培地は、幹細胞分化を阻害する能力を有する、ＦＩＡＳＭＡ及びＴＧＦ−βスーパーファミリーのポリペプチドを含む。さらなる実施形態において、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのポリペプチドは、ＴＧＦ−βではない。
【００５２】
アクチビンａは、例えば、ＡｃｔＲＩＩＡ受容体に結合し、ＡｃｔＲＩ受容体の急速なリクルートメント、リン酸化及び活性化を開始する。これは続いて、細胞質ＳＭＡＤタンパク質のリン酸化及びその後の活性化によってＳＭＡＤ２／３カスケードを活性化する。これらのタンパク質は、核へと移行し、ＳＭＡＤ４と相互作用し、細胞分化の調節の原因となる遺伝子を含む多種多様な遺伝子の遺伝子発現をもたらす。
【００５３】
よって、本発明の一実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１種のポリペプチドは、アクチビン類、ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及びＧＤＦ３からなる群から選択される。
【００５４】
本発明のさらなる実施形態では、アクチビン類は、幹細胞分化の調節の原因となる同様のヘテロマーセリン／スレオニン特異的タンパク質キナーゼを活性化させるため、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、アクチビン類の群から選択される。好まれる実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、アクチビンａである。
【００５５】
本例は、アクチビンａ単独での使用が、ｈＰＳＣの急速分化をもたらすことを示す。本明細書で検査された細胞株に加えて、アクチビンａは、他の確立されたｈＰＳＣ、特にｈＥＳＣの多能性を拡張することができなかった（Ｖａｌｌｉｅｒら、２００５年）。
【００５６】
ＦＩＡＳＭＡは、このクラス内の全分子にわたって保存された物理化学的特性を共有する。現在までに同定された全ＦＩＡＳＭＡは、塩基性窒素原子及び親油性部分を有し、分子のカチオン性両親媒性特徴をもたらす。本例においてはトリミプラミンに示されている通り、これらの構造的及び機能的類似性によって、他のＦＩＡＳＭＡが、同じ効果を示すことが当然予想される。
【００５７】
ＦＩＡＳＭＡの中に、トリミプラミンとの構造的類似性が増加した分子の群、例えば、メパクリン、プロメタジン及びプロフェナミンが存在する。興味深いことに、分子のこの群、特にトリミプラミン、メパクリン、プロメタジン及びプロフェナミンは、ＦＧＦ２の非存在下において培養された場合に、幹細胞における公知多能性マーカーＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１及びＯＣＴ４の発現を誘導することが同定された（Ｋｕｍａｇａｉら、２０１３年）。この相関は、本例に提示されている結果を、ＦＩＡＳＭＡ群の他のメンバー、特に、メパクリン、プロメタジン及びプロフェナミンに移すことを可能にする。
【００５８】
したがって、本発明の別の実施形態では、ＦＩＡＳＭＡは、トリミプラミン、メパクリン、プロメタジン及びプロフェナミンの群から選択される。本発明の好まれる実施形態では、ＦＩＡＳＭＡは、トリミプラミンである。
【００５９】
本例は、トリミプラミン単独が、ｈＰＳＣの未分化増殖の維持に十分に有効ではないことを明らかにする。実際に、細胞は、未分化状態のままであり、一方、ｈＰＳＣの増殖は阻害されている。結果的に、トリミプラミン単独の使用は、未分化幹細胞の多能性を延長するだけである。
【００６０】
トリミプラミン及びアクチビンａ単独は、未分化多能性幹細胞の増殖及び維持の支持に十分ではないため、両物質は、組み合わせて用いられた場合に相乗効果を有することができる。
【００６１】
実際に、本発明者らは、驚いたことに、トリミプラミン及びアクチビンａの組合せが、多能性幹細胞の増殖及び維持を可能にすることを見出した。化学組成既知の細胞培養培地におけるトリミプラミン及びアクチビンａの組合せは、広範囲の多能性幹細胞の長期育成を可能にするシグナリング経路を誘発することができる。
【００６２】
本発明におけるさらなる実施形態では、化学組成既知の合成培地におけるＦＩＡＳＭＡは、トリミプラミンであり、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのポリペプチドは、アクチビンａである。
【００６３】
一実施形態において、ＦＩＡＳＭＡは、２５０ｇ／ｍｏｌ〜５００ｇ／ｍｏｌの範囲内の分子量を有する。トリミプラミンは、２９４．４ｇ／ｍｏｌの分子量を有する相対的小分子である。プロフェナミンは、３１２．４ｇ／ｍｏｌの分子量を有し、メパクリンは、３９９．９ｇ／ｍｏｌの分子量を有し、プロメタジンは、２８４．４ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。相対的小分子サイズのため、ＦＩＡＳＭＡは、多層組織に進入することができる。細胞内で、ＦＩＡＳＭＡは、細胞分化の重要な調節因子と直接的に相互作用することができる。成長因子のような幹細胞分化を阻害することが公知の他の活性薬剤は、細胞内へのシグナル伝達の受容体分子に頼る。受容体を介したシグナル伝達は、典型的に、ある閾値に達すると活性化される一方、タンパク質調節によるＦＩＡＳＭＡの直接的相互作用は、濃度依存性様式で起こり得る。
【００６４】
多能性及び自己再生シグナリング経路の活性化に伝統的に使用される成長因子、例えば、ＦＧＦ−２及びＴＧＦ−β１は、細胞培養条件下で、ＦＧＦ−２ではおよそ５〜７時間及びＴＧＦ−β１では５０分間しかない短い生物学的半減期を有する、高度に強力な、ただし非常に不安定な小型のタンパク質を表す。結果として、添加された成長因子の生物学的活性は、急速に縮小する。ｈＰＳＣの分化を防止するために、伝統的ｈＰＳＣ培養系は、毎日の培地交換間隔を要求する。
【００６５】
加えて、毎日の培地交換間隔内における潜在的分化効果（使用された成長因子の短い半減期による）を減らすために、最大１００ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２の超生理学的濃度が、ｍＴｅＳＲ又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８のような一部の組成既知のフィーダーフリーのｈＰＳＣ培地において使用される。しかし、超生理学的濃度のＦＧＦは、ｈＰＳＣの増殖及び自己再生を損なうことが実証された（Ｆｕｒｕｅら、２００８年）。実際に、研究は、改善された熱安定性を有する成長因子バリアントを開発するよう試みる。
【００６６】
対照的に、有機性質の合成化学物質であるＦＩＡＳＭＡは、伝統的成長因子の受容体媒介性効果と比較してより直接的な機構で作用するのみならず、その半減期に関する有意な利点をも示し、相当に延長された培地交換間隔を可能にする。トリミプラミンは、ＦＧＦ−２と比較して３倍高い値である２３時間の半減期を有する。これと合致して、本発明に係る化学組成既知の合成培地は、ｈＰＳＣ分化のロバストな阻害（ルーチンｈＰＳＣ培養の有意な技術的利益である）により、高い細胞密度であっても最大７２時間の培地交換間隔を支持する。
【００６７】
本発明に係る培養培地を使用した幹細胞多能性の維持におけるプラス効果は、ＦＩＡＳＭＡの０．１ｍｇ／Ｌの濃度で既に観察され得るものであり、注目すべき結果は、最大１０ｍｇ／Ｌの濃度で適用された場合に達成され得る。１５ｍｇ／Ｌよりも高い濃度において、ＦＩＡＳＭＡは、細胞傷害性効果を生じることができる。
【００６８】
よって、本発明に係る一実施形態では、化学組成既知の合成培地における少なくとも１種のＦＩＡＳＭＡの濃度は、０．１ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの範囲内である。
【００６９】
多能性維持に関する効率増加が、いずれのＦＩＡＳＭＡが使用されたかに応じて、約０．５ｍｇ／Ｌ〜約５ｍｇ／Ｌの濃度までの増加濃度のＦＩＡＳＭＡにより観察される。よって、本発明の別の実施形態では、ＦＩＡＳＭＡの濃度は、０．５ｍｇ／Ｌ〜５ｍｇ／Ｌの範囲内である。
【００７０】
トリミプラミンに関して、１ｍｇ／Ｌ〜４ｍｇ／Ｌの濃度で使用された場合に、ロバストな結果が達成された。よって、さらなる実施形態では、本発明に係る化学組成既知の合成培地内のＦＩＡＳＭＡの濃度は、１ｍｇ／Ｌ〜４ｍｇ／Ｌの範囲内である。特に、本発明に係る化学組成既知の合成培地におけるＦＩＡＳＭＡの濃度は、１ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、３．５ｍｇ／Ｌ又は４ｍｇ／Ｌである。
【００７１】
一実施形態では、本発明に係る化学組成既知の合成培地は、１ｍｇ／Ｌ〜４ｍｇ／Ｌの濃度範囲内のトリミプラミンを含み、特に、濃度は、１ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、３．５ｍｇ／Ｌ又は４ｍｇ／Ｌである。別の実施形態では、本発明に係る化学組成既知の合成培地は、１ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、３．５ｍｇ／Ｌ又は４ｍｇ／Ｌの濃度のメパクリンを含む。さらに別の実施形態では、本発明に係る化学組成既知の合成培地は、１ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、３．５ｍｇ／Ｌ又は４ｍｇ／Ｌの濃度のプロメタジンを含む。さらなる実施形態では、本発明に係る化学組成既知の合成培地は、１ｍｇ／Ｌ、１．５ｍｇ／Ｌ、２ｍｇ／Ｌ、２．５ｍｇ／Ｌ、３ｍｇ／Ｌ、３．５ｍｇ／Ｌ又は４ｍｇ／Ｌの濃度のプロフェナミンを含む。
【００７２】
本発明者らは、いずれのメンバーが使用されるかに応じて、相対的に広い濃度範囲のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーが、培養細胞の増殖潜在力をプラスに制御する、本発明に係る化学組成既知の合成培地に適用され得ることも見出した。０．２μｇ／ＬのＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーの濃度であっても既に効果を有すると思われる。理論に制約されたくはないが、２００μｇ／Ｌを上回るＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーの濃度が、非通常性「非正準シグナリング」を部分的に介して、細胞に有害な非特異的効果を有し得ることが想定される。よって、一実施形態において、本発明に係る化学組成既知の合成培地におけるＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１種のポリペプチドの濃度は、０．２μｇ／Ｌ〜２００μｇ／Ｌの範囲内である。
【００７３】
さらに、１μｇ／Ｌ〜１００μｇ／Ｌに及ぶ濃度のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーは、未分化多能性幹細胞の増殖及び維持を十分に支持する。１μｇ／Ｌから開始する濃度により、ロバストな結果が得られた。しかし、１００μｇ／Ｌを上回る濃度は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーの大部分の生理的濃度を超える。よって、さらなる実施形態では、本発明に係る化学組成既知の合成培地におけるＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１種のポリペプチドの濃度は、１μｇ／Ｌ〜１００μｇ／Ｌの範囲内である。
【００７４】
２μｇ／Ｌ〜２０μｇ／Ｌアクチビンａを補充した本発明に係る化学組成既知の合成培地において培養された細胞は、細胞の大部分が、数継代にわたって典型的多能性マーカーＯｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ−４及びＴＲＡ−１−６０を発現することをロバストに示す。１μｇ／Ｌ〜５０μｇ／Ｌの濃度範囲内のＧＤＦ３及び／又はミオスタチンは、インビトロで前記多能性マーカーの発現を誘発する。特に、１０μｇ／Ｌ〜２０μｇ／Ｌの濃度範囲内のＧＤＦ３及び／又はミオスタチンは、インビトロ培養された細胞において前記マーカー遺伝子のロバストな発現を示した。ｎｏｄａｌに関して、１０μｇ／Ｌ〜５００μｇ／Ｌに及ぶ濃度で適用された場合、多能性マーカー発現が観察され得、特に、ｎｏｄａｌが、５０μｇ／Ｌ〜２００μｇ／Ｌの濃度範囲内で本発明に係る培養培地中に存在する場合、安定な発現が達成された。
【００７５】
別の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーの濃度は、２μｇ／Ｌ〜２０μｇ／Ｌの範囲内である。特に、濃度は、２μｇ／Ｌ、５μｇ／Ｌ、７．５μｇ／Ｌ、１０μｇ／Ｌ、１２．５μｇ／Ｌ、１５μｇ／Ｌ又は２０μｇ／Ｌである。
【００７６】
好まれる実施形態では、本発明に係る化学組成既知の合成培地は、２μｇ／Ｌ〜２０μｇ／Ｌの濃度、特に、２μｇ／Ｌ、５μｇ／Ｌ、７．５μｇ／Ｌ、１０μｇ／Ｌ、１２．５μｇ／Ｌ、１５μｇ／Ｌ又は２０μｇ／Ｌの濃度のアクチビンａを含む。
【００７７】
理論に制約されたくはないが、成熟細胞への幹細胞の分化の調節に重要な下流細胞過程を微調整するために、規定された比でＦＩＡＳＭＡ及びＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーを適用することが有益となり得る。
【００７８】
斯かる調節機構には、ある特定の組織への細胞の分化の調節に重要なシグナリングカスケードの活性化及び／又は阻害の同調が関与し得る。多能性幹細胞の分化を調節する典型的シグナリングカスケードは、ＡＫＴ、ＳＭＡＤ、Ｗｎｔ／β／カテニン及びＰＩ（３）Ｋシグナリング並びにＭＥＫ／ＥＲＫカスケードである。
【００７９】
ＦＩＡＳＭＡ及びＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーは、上に概要を述べる広範囲の濃度で適用され得る。しかし、必要なシグナリング経路を活性化するには濃度が低すぎる場合、又は濃度が高すぎて物質が細胞傷害性になるか若しくは細胞がその多能性を失う（ｌｏｏｓｅ）場合には、限界がある。５０：１（ＦＩＡＳＭＡ：ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバー）の濃度比では、ＦＩＡＳＭＡは、それぞれのシグナリング経路を誘導することができ、ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーの濃度は、多能性に影響を与えることなく分化の阻害を可能にする。２０００：１の濃度比では、細胞は生存可能であるため、ＦＩＡＳＭＡは細胞傷害性ではなく、ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーの濃度は、多能性の維持に十分である。
【００８０】
比が、ＦＩＡＳＭＡ及びＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーの濃度（Ｗ／Ｖ）に基づくことに、留意されたい。ＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーと比較して低いその分子量により、化学組成既知の合成培地内のモル比は、さらにより高い。
【００８１】
本発明の一実施形態では、少なくとも１種のＦＩＡＳＭＡ及びＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１種のポリペプチドは、本発明に係る化学組成既知の合成培地内に２０００：１〜５０：１の比で適用される。
【００８２】
本発明の別の実施形態では、化学組成既知の合成培地は、２０００：１〜５０：１の比でトリミプラミン及びアクチビンａを含む。
【００８３】
本例から分かる通り、細胞が、約１０００：１の比をもたらす濃度のトリミプラミン及びアクチビンａを含む化学組成既知の合成培地において培養される場合、未分化多能性幹細胞の増殖及び維持が達成される。少なくとも１種のＦＩＡＳＭＡ及びＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１種のポリペプチドは、本発明のさらなる実施形態では、１０００：１の比で適用される。別の実施形態では、トリミプラミン及びアクチビンａは、本発明に係る化学組成既知の合成培地において１０００：１の比で適用される。
【００８４】
本発明者らは、４００：１の濃度比をもたらすＦＩＡＳＭＡ及びＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーの濃度の変化が、多能性の増殖及び維持の観点から細胞培養をさらに安定化することも観察した。よって、さらなる実施形態では、少なくとも１種のＦＩＡＳＭＡ及びＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１種のポリペプチドは、本発明に係る化学組成既知の合成培地において４００：１の比で適用される。好まれる実施形態では、化学組成既知の合成培地におけるトリミプラミン及びアクチビンａの比は、４００：１である。
【００８５】
さらに、本発明に係る化学組成既知の合成培地は、異なる幹細胞株に普遍的に適用可能である。確立された細胞株は、可変的培地要件を示す。化学組成既知の合成培地は、ｈＰＳＣの、ある範囲の可変的代謝的要件に対処する。
【００８６】
化学組成既知の合成培地を用意するために、血清の使用が防止される。これは、培地内の血清を置き換える必要を生じる。血清置き換えによる培地は、主に動物又はヒト起源の精製タンパク質、ペプトン又は加水分解物を補充される。細胞培養系におけるヒト又は動物由来物質の使用は、夾雑物又は病原体／ウイルスを導入する潜在的リスクを、過程において課し、よって、潜在的には最終産物に課す。よって、非動物由来産物による動物由来物質の完全置き換えのみが、安全な無血清培地をもたらす。
【００８７】
よって、本発明に係る一実施形態では、化学組成既知の合成培地は、タンパク質、アミノ酸、脂質、脂肪酸及び炭水化物を含むヒト又は動物由来物質を全く有さない。したがって、ある実施形態では、本発明の化学組成既知の合成培地内のＴＧＦ−βスーパーファミリーメンバーは、組換えアクチビンａである。
【００８８】
本発明の化学組成既知の合成培地は、都合悪いほど高濃度のＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）又はＴＧＦ−β等の成長因子を適用しない、一貫し再現性がある性能である、十分に制御された培養過程に最適な培養環境を提供する。成長因子は、成長及び分化に加えていくつかの他の非特異的細胞応答を誘発し得るため、高濃度の成長因子の使用は、望まれない副作用を惹起する。望まれない副作用の低下は、成長因子補充培地配合物において幹細胞を培養する場合の、特に、延長された培地交換間隔が要求されかつ／又は好まれる場合の課題を呈する。本発明に係る化学組成既知の合成培地は、多能性及び自己再生の維持のための、鍵となる成長因子ＦＧＦ−２のより安定した化学的置き換えにより機能する。関連する鍵となるシグナリング経路における直接的細胞内作用機序と共に、細胞培養条件下における改善された熱安定性は、言及されている副作用を伴わない、同様の又はさらに優れた結果を生じる。さらに、より安定した化学的模倣物によるＦＧＦ−２の置換は、古典的成長因子に基づくｈＰＳＣ培地と比較して、延長された培地交換間隔のための付随する選択肢を可能にする。
【００８９】
よって、本発明の一実施形態では、本発明に係る化学組成既知の合成培地は、ＦＧＦ−２及び／又はＴＧＦ−βを含まない。
【００９０】
アルブミンは、無血清細胞培養系のさらに別の重要な補充物である。典型的には、アルブミンは、いわゆる血清置き換えによって培養培地に導入される。ヒト（ＨＳＡ）又はウシ（ＢＳＡ）に由来する天然アルブミン（複数可）のみならず、組換えアルブミンが、細胞培養において典型的に使用される。インビトロで見出される多くの分子は、複合体パートナーに結合していないと、不安定又は破壊性である。アルブミンの機能は、ある範囲の重要な小分子及びイオンに結合、隔離及び安定化することである。しかし、全てのアルブミンが、細胞培養において同じ有効性を有するとは限らない。よって、アルブミンを含む細胞培養系は、細かく制御される必要がある。
【００９１】
このような細胞培養系の労働集約的制御を回避するために、本発明者らは、アルブミンを含有しない安定環境における細胞培養を可能にする培地配合物を開発した。さらなる実施形態において、本発明に係る化学組成既知の合成培地は、アルブミンを含まない。
【００９２】
本発明の別の実施形態では、本発明に係る化学組成既知の合成培地は、ＦＧＦ−２、アルブミン及び／又はＴＧＦ−β１を含まない。本発明のさらに別の実施形態では、本発明に係る化学組成既知の合成培地は、ＦＧＦ−２、アルブミン及びＴＧＦ−β１を含まない。
【００９３】
別の実施形態では、化学組成既知の合成培地の構成成分はそれぞれ、多能性幹細胞の増殖及び／又は維持の支持に十分な濃度で存在し、多能性幹細胞の分化が阻害される。いずれの成分の濃度も、化学組成既知の合成培地の総容量に基づく。
【００９４】
本発明に係る化学組成既知の合成培地（真核細胞培養のための全ての培地等）は、水、少なくとも１種の炭素源、１種以上のビタミン、１種以上の塩及びセレニウムを含有する。これらの構成成分は、本明細書において、「基礎培地成分」とも称される。本発明に係る化学組成既知の合成培地の調製において、基礎培地成分は、基本培地によって提供され得る。用語「基本培地」は、真核細胞の成長を支持し、追加的な成分の補充によって、本発明に係る細胞培養のための培地の形成に使用され得る、いずれかの培地を指す。基本培地は、塩、例えば、マグネシウム、カルシウム、ナトリウム及びカリウムの塩並びに任意選択的に微量元素の塩、並びにビタミン、炭素源、緩衝系及び必須アミノ酸を供給する。本発明において使用され得る基本培地として、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＨａｍのＦ−１２、ＤＭＥＭ：Ｆ１２、最小必須培地（ＭＥＭ）、基本培地イーグル（ＢＭＥ）、ＲＰＭＩ  １６４０、Ｆ−１０、α最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ−ＭＥＭ）及びイスコブ変法ダルベッコ培地並びにこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。好まれる基本培地配合物は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＨａｍのＦ−１２又はＤＭＥＭ：Ｆ１２である。
【００９５】
したがって、化学組成既知の合成培地は、少なくとも１種の炭素源を含む。炭素源は、好ましくは、グルコース、ガラクトース、マンノース及びフルクトースの群から選択されるヘキソース糖である。糖は特に、Ｄ−グルコースである。炭素源の濃度は、５．８×１０２ｍｇ／Ｌ〜５．８×１０３ｍｇ／Ｌの範囲内である。好ましくは、培養培地における炭素源の濃度は、８．８×１０２ｍｇ／Ｌ〜４．８×１０３ｍｇ／Ｌ、より好ましくは、１．８×１０３ｍｇ／Ｌ〜３．８×１０３ｍｇ／Ｌの範囲内である。
【００９６】
また、化学組成既知の合成培地は、１種以上の塩を含む。塩は、好ましくは、塩化カルシウム二水和物、塩化マグネシウム六水和物、硫酸マグネシウム無水物、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム二塩基性無水物、リン酸ナトリウム一塩基性無水物からなる群から選択される。
【００９７】
塩は、好ましくは、多能性幹細胞の増殖及び／又は維持の支持に十分な濃度で存在し、多能性幹細胞の分化が阻害される。塩は、例えば、次の濃度で培地に含有される：４０ｍｇ／Ｌ〜４００ｍｇ／Ｌの範囲内の塩化カルシウム二水和物、９ｍｇ／Ｌ〜９８ｍｇ／Ｌの範囲内の塩化マグネシウム六水和物、８ｍｇ／Ｌ〜８８ｍｇ／Ｌの範囲内の硫酸マグネシウム無水物、３７．４ｍｇ／Ｌ〜３７４ｍｇ／Ｌの範囲内の塩化カリウム、１．１１×１０３ｍｇ／Ｌ〜１．１１×１０４ｍｇ／Ｌの範囲内の塩化ナトリウム、７．８ｍｇ／Ｌ〜７８ｍｇ／Ｌの範囲内のリン酸ナトリウム二塩基性無水物、及び１２．４ｍｇ／Ｌ〜１２４ｍｇ／Ｌの範囲内のリン酸ナトリウム一塩基性無水物。
【００９８】
浸透圧が低すぎるか又は高すぎると、細胞成長が影響を受けることが示されてきたため、培養培地の浸透圧の正確な調整は、非常に重要である。典型的には、真核細胞培養の浸透圧は、２６０ｍＯＳＭ／ｋｇ〜３６０ｍＯＳＭ／ｋｇの範囲内である。よって、一実施形態では、本発明に係る細胞培養培地の浸透圧は、２６０ｍＯＳＭ／ｋｇ〜３６０ｍＯＳＭ／ｋｇの範囲内、好ましくは、２７０ｍＯＳＭ／ｋｇ〜２９０ｍＯＳＭ／ｋｇの範囲内である。
【００９９】
さらに別の基礎培地成分は、１種以上のビタミンである。１種以上のビタミンは、好ましくは、Ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸Ｃａ、葉酸、ニコチンアミド、塩酸ピリドキサール、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンＢ１２及びアスコルビン酸−２−ホスフェートを含むアスコルビン酸から選択される。
【０１００】
ビタミンは、多能性幹細胞の増殖及び／又は維持の支持に十分な濃度で存在し、多能性幹細胞の分化が阻害される。ビタミンは、例えば、次の濃度で培地に含有される：１．４×１０−３ｍｇ／Ｌ〜１．４×１０−２ｍｇ／Ｌの範囲内のＤ−ビオチン、０．５ｍｇ／Ｌ〜５ｍｇ／Ｌの範囲内のＤ−パントテン酸Ｃａ、０．４ｍｇ／Ｌ〜４ｍｇ／Ｌの範囲内の葉酸、０．４ｍｇ／Ｌ〜４ｍｇ／Ｌの範囲内のニコチンアミド、０．２ｍｇ／Ｌ〜２ｍｇ／Ｌの範囲内の塩酸ピリドキサール、５．６×１０−３ｍｇ／Ｌ〜５．６×１０−２ｍｇ／Ｌの範囲内の塩酸ピリドキシン、７．８×１０−２ｍｇ／Ｌ〜７．８×１０−１ｍｇ／Ｌの範囲内のリボフラビン、０．８ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌの範囲内の塩酸チアミン、０．２ｍｇ／Ｌ〜２ｍｇ／Ｌの範囲内のビタミンＢ１２。
【０１０１】
化学組成既知の合成培地は、アミノ酸の１種以上を含む。用語「１種以上のアミノ酸」は、ネイティブアミノ酸又はその誘導体（例えば、アミノ酸アナログ）並びにそれらのＤ及びＬ型を指す。アミノ酸の１種以上は、好ましくは、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンから選択される。より好ましくは、化学組成既知の合成培地は、これらのアミノ酸を全て含有する。
【０１０２】
アミノ酸は、好ましくは、下に規定する濃度範囲内で培地に含有される：４．５ｍｇ／Ｌ〜４５ｍｇ／Ｌの範囲内のグリシン、１．７ｍｇ／Ｌ〜１７ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−アラニン、２３ｍｇ／Ｌ〜２３０ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−アルギニン塩酸塩、２．５ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−アスパラギン一水和物、１．７ｍｇ／Ｌ〜１７ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−アスパラギン酸、２．４ｍｇ／Ｌ〜２４ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−システイン塩酸塩一水和物、３．７ｍｇ／Ｌ〜３７ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−シスチン二塩酸塩、１．１ｍｇ／Ｌ〜１１ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−グルタミン酸、３．７ｍｇ／Ｌ〜３７ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−ヒスチジン塩酸塩一水和物、１７ｍｇ／Ｌ〜１７０ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−イソロイシン、８．２ｍｇ／Ｌ〜８２ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−ロイシン、１６ｍｇ／Ｌ〜１６０ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−リジン塩酸塩、２ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−メチオニン、９．９ｍｇ／Ｌ〜９９ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−フェニルアラニン、５．８ｍｇ／Ｌ〜５８ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−プロリン、４．２ｍｇ／Ｌ〜４２ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−セリン、７．４ｍｇ／Ｌ〜７４ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−スレオニン、２．５ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−トリプトファン、１４．５ｍｇ／Ｌ〜１４５ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−チロシン二ナトリウム塩二水和物、９．５ｍｇ／Ｌ〜９５ｍｇ／Ｌの範囲内のＬ−バリン。
【０１０３】
一実施形態において、化学組成既知の合成培地は、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、グリシル−Ｌ−グルタミン及びＮ−アセチル−Ｌ−グルタミンからなる群から選択される１種以上のジペプチドをさらに含む。好ましくは、本発明に係る化学組成既知の合成培地は、６５ｍｇ／Ｌ〜６５０ｍｇ／Ｌの濃度範囲内のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを含む。
【０１０４】
微量元素セレニウムは、本発明に係る基礎構成成分である。本発明のある実施形態では、セレニウム含有塩は、１μｇ／Ｌ〜１００μｇ／Ｌの範囲内の濃度で存在する。さらなる実施形態では、セレニウムは、１０μｇ／Ｌ〜５０μｇ／Ｌの範囲内の濃度で存在する。
【０１０５】
化学組成既知の合成培地は、銅（Ｃｕ）、鉄（Ｆｅ）、亜鉛（Ｚｎ）から選択される標準微量元素をその上含むことができる。化学組成既知の合成培地は、好ましくは、Ｆｅを含む。化学組成既知の合成培地は、例えば、標準微量元素Ｃｕ及びＦｅを含むことができる。あるいは、化学組成既知の合成培地は、Ｆｅ及びＺｎを含むことができる。より好ましくは、化学組成既知の合成培地は、Ｃｕ、Ｆｅ及びＺｎを含む。
【０１０６】
Ｃｕ、Ｆｅ及びＺｎは、塩として化学組成既知の合成培地に導入される。好ましくは、Ｃｕは、硫酸銅五水和物として導入され、Ｆｅは、硝酸鉄九水和物及び／又は硫酸鉄七水和物として導入され、Ｚｎは、硫酸亜鉛七水和物として導入される。
【０１０７】
Ｃｕ、Ｆｅ及びＺｎは、好ましくは、多能性幹細胞の増殖及び／又は維持の支持に十分な濃度で存在し、多能性幹細胞の分化が阻害される。例えば、培地は、次の濃度を含有する：２×１０−４ｍｇ／Ｌ〜１．６×１０−３ｍｇ／Ｌの範囲内の硫酸銅五水和物、１．２×１０−２ｍｇ／Ｌ〜１．２×１０−１ｍｇ／Ｌの範囲内の硝酸鉄九水和物、７．５×１０−２ｍｇ／Ｌ〜７．５×１０−１ｍｇ／Ｌの範囲内の硫酸鉄七水和物及び４．７×１０−２ｍｇ／Ｌ〜４．７×１０−１ｍｇ／Ｌの範囲内の硫酸亜鉛七水和物。
【０１０８】
本発明に係る１種以上の脂肪酸は、飽和及び不飽和脂肪酸から選択され得る。１種以上の脂肪酸は、例えば、リノール酸、アラキドン酸、リノレン酸、ミリスチン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸（ｓａｐｉｅｎｉｃ  ａｃｉｄ）、エライジン酸、バクセン酸、リノエライジン酸（ｌｉｎｏｅｌａｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸からなる群から選択され得る。好ましくは、脂肪酸は、リノール酸である。
【０１０９】
本発明に係る一実施形態では、化学組成既知の合成培地は、好ましくは、４．６×１０−３ｍｇ／Ｌ〜４．６×１０−２ｍｇ／Ｌの範囲内の濃度の、１種の脂肪酸を含む。
【０１１０】
大部分の細胞は、増殖し、健康を維持するために血清タンパク質に頼るため、無血清環境における細胞の培養は課題である。しかし、血清の鍵となる構成成分を置き換える物質を使用することにより、細胞を、血清から移行させることに成功し得る。インスリン及びトランスフェリンは、血清の鍵となる２種の構成成分であり、培養における血清を除去するために一般的に使用される。インスリンは、細胞成長を支持し、グルコース、アミノ酸及び脂質の細胞取込み及び代謝を調節する。トランスフェリンは、鉄結合糖タンパク質である。これは、細胞外鉄貯蔵及び輸送を容易にする。トランスフェリンは、重要な抗酸化剤でもあり、生理的条件下でのフリーラジカルの形成を防止する。
【０１１１】
一実施形態において、化学組成既知の合成培地は、インスリン若しくはインスリン代替物及び／又はトランスフェリン若しくはトランスフェリン代替物をさらに含む。これらの構成成分のそれぞれは、好ましくは、多能性幹細胞の増殖及び／又は維持の支持に十分な濃度で化学組成既知の合成培地中に存在し、多能性幹細胞の分化が阻害される。
【０１１２】
本発明に係るさらなる実施形態では、化学組成既知の合成培地は、インスリン及びトランスフェリンを含む。本発明の好まれる実施形態では、化学組成既知の合成培地は、組換えインスリン及び組換えトランスフェリンを含む。
【０１１３】
本発明の別の実施形態において、トランスフェリンの濃度は、０．１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌの範囲内である、好ましくは、１ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌの範囲内である、より好ましくは、５ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌの範囲内である、及び／又はインスリンの濃度は、０．１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌの範囲内である、好ましくは、１ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの範囲内である。
【０１１４】
化学組成既知の合成培地のさらに別の構成成分は、好ましくは、次の濃度範囲内で使用される：プトレシン二塩酸塩は、好ましくは、３×１０−２ｍｇ／Ｌ〜３×１０−１ｍｇ／Ｌの範囲内で化学組成既知の合成培地中に存在し、ピルビン酸ナトリウムは、好ましくは、６．６ｍｇ／Ｌ〜６６．０ｍｇ／Ｌの範囲内で化学組成既知の合成培地中に存在し、チオクト酸は、好ましくは、３×１０−２ｍｇ／Ｌ〜３×１０−１ｍｇ／Ｌの範囲内で化学組成既知の合成培地中に存在し、チミジンは、好ましくは、５×１０−２ｍｇ／Ｌ〜５×１０−１ｍｇ／Ｌの範囲内で化学組成既知の合成培地中に存在し、ヒポキサンチンは、好ましくは、０．３３ｍｇ／Ｌ〜３．３ｍｇ／Ｌの範囲内で化学組成既知の合成培地中に存在し、ミオイノシトールは、好ましくは、４．２ｍｇ／Ｌ〜４２ｍｇ／Ｌの範囲内で化学組成既知の合成培地中に存在し、塩化コリンは、好ましくは、１ｍｇ／Ｌ〜１１ｍｇ／Ｌの範囲内で化学組成既知の合成培地中に存在する。
【０１１５】
一実施形態において、化学組成既知の合成培地は、無機炭酸水素塩、無機リン酸塩又は４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）から選択されるバッファー構成成分を含む。
【０１１６】
本発明に係る化学組成既知の合成培地は、好ましくは、１種以上のラジカルスカベンジャーをその上含む。斯かるラジカルスカベンジャーの例は、グルタチオン、トコフェロール酢酸エステル、β−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）、ビタミン、Ｌ−アスコルビン酸又はその安定リン酸塩形態のいずれかのアスコルビン酸である。
【０１１７】
一実施形態において、化学組成既知の合成培地のさらに別の成分は、好ましくは、多能性幹細胞の増殖及び／又は維持の支持に十分な濃度の、アスコルビン酸であり、多能性幹細胞の分化が阻害される。アスコルビン酸は、３ｍｇ／Ｌ〜３００ｍｇ／Ｌの範囲内、好ましくは、１０ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌの範囲内の濃度で化学組成既知の合成培地中に存在する。アスコルビン酸は、いくつかの酸化還元反応に重要な補助因子である。例えば、これは、電子を供与し、酸化を防止して、鉄及び銅原子をその還元状態に維持することにより還元剤として作用する。ラジカルスカベンジャーとして、アスコルビン酸は、潜在的に細胞傷害性のペルオキシルラジカルの形成を最小化する利点を有する。
【０１１８】
本発明の好まれる実施形態は、下に収載される構成成分を含む化学組成既知の合成培地である：塩化カルシウム二水和物、塩化マグネシウム六水和物、硫酸マグネシウム無水物、硫酸銅五水和物、硝酸鉄九水和物、硫酸鉄七水和物、塩化カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム二塩基性無水物、リン酸ナトリウム一塩基性無水物、硫酸亜鉛七水和物、Ｄ−グルコース無水物、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−アスパラギン一水和物、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物、Ｌ−シスチン二塩酸塩、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、塩化コリン、Ｄ−ビオチン、Ｄ−パントテン酸Ｃａ、葉酸、ミオイノシトール、ニコチンアミド、塩酸ピリドキサール、塩酸ピリドキシン、リボフラビン、塩酸チアミン、ビタミンＢ１２、ヒポキサンチン、リノール酸、フェノールレッドナトリウム塩、プトレシン二塩酸塩、ピルビン酸ナトリウム、チオクト酸、チミジン、アスコルビン酸−２−ホスフェート、組換えインスリン、亜セレン酸ナトリウム、トリミプラミンマレイン酸塩、組換えアクチビンａ、組換えトランスフェリン。
【０１１９】
一実施形態では、構成成分は、次の濃度範囲内で存在する：塩化カルシウム脱水物（ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）４０ｍｇ／Ｌ〜４００ｍｇ／Ｌ、塩化マグネシウム六水和物９ｍｇ／Ｌ〜９８ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム無水物８ｍｇ／Ｌ〜８８ｍｇ／Ｌ、硫酸銅五水和物２×１０−４ｍｇ／Ｌ〜１．６×１０−３ｍｇ／Ｌ、硝酸鉄九水和物１．２×１０−２ｍｇ／Ｌ〜１．２×１０−１ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄七水和物７．５×１０−２ｍｇ／Ｌ〜７．５×１０−１ｍｇ／Ｌ、塩化カリウム３７．４ｍｇ／Ｌ〜３７４ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．１１×１０３ｍｇ／Ｌ〜１．１１×１０４ｍｇ／Ｌ、リン酸ナトリウム二塩基性無水物７．８ｍｇ／Ｌ〜７８ｍｇ／Ｌ、リン酸ナトリウム一塩基性無水物１２．４ｍｇ／Ｌ〜１２４ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物４．７×１０−２ｍｇ／Ｌ〜４．７×１０−１ｍｇ／Ｌ、Ｄ−グルコース無水物１．８×１０３ｍｇ／Ｌ〜３．８×１０３ｍｇ／Ｌ、グリシン４．５ｍｇ／Ｌ〜４５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アラニン１．７ｍｇ／Ｌ〜１７ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン６５ｍｇ／Ｌ〜６５０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン塩酸塩２３ｍｇ／Ｌ〜２３０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物２．５ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸１．７ｍｇ／Ｌ〜１７ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物２．４ｍｇ／Ｌ〜２４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン二塩酸塩３．７ｍｇ／Ｌ〜３７ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸１．１ｍｇ／Ｌ〜１１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物３．７ｍｇ／Ｌ〜３７ｍｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン１７ｍｇ／Ｌ〜１７０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン８．２ｍｇ／Ｌ〜８２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−リジン塩酸塩１６ｍｇ／Ｌ〜１６０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン２ｍｇ／Ｌ〜２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン９．９ｍｇ／Ｌ〜９９ｍｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン５．８ｍｇ／Ｌ〜５８ｍｇ／Ｌ、Ｌ−セリン４．２ｍｇ／Ｌ〜４２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン７．４ｍｇ／Ｌ〜７４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン２．５ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン１４．５ｍｇ／Ｌ〜１４５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−バリン９．５ｍｇ／Ｌ〜９５ｍｇ／Ｌ、塩化コリン１ｍｇ／Ｌ〜１１ｍｇ／Ｌ、Ｄ−ビオチン１．４×１０−３ｍｇ／Ｌ〜１．４×１０−２ｍｇ／Ｌ、Ｄ−パントテン酸Ｃａ  ０．５ｍｇ／Ｌ〜５ｍｇ／Ｌ、葉酸０．４ｍｇ／Ｌ〜４ｍｇ／Ｌ、ミオイノシトール４．２ｍｇ／Ｌ〜４２ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド０．４ｍｇ／Ｌ〜４ｍｇ／Ｌ、塩酸ピリドキサール０．２ｍｇ／Ｌ〜２ｍｇ／Ｌ、塩酸ピリドキシン５．６×１０−３ｍｇ／Ｌ〜５．６×１０−２ｍｇ／Ｌ、リボフラビン７．８×１０−２ｍｇ／Ｌ〜７．８×１０−１ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン０．８ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  ０．２ｍｇ／Ｌ〜２ｍｇ／Ｌ、ヒポキサンチン０．３３ｍｇ／Ｌ〜３．３ｍｇ／Ｌ、リノール酸４．６×１０−３ｍｇ／Ｌ〜４．６×１０−２ｍｇ／Ｌ、フェノールレッドナトリウム塩０．１６ｍｇ／Ｌ〜１．６ｍｇ／Ｌ、プトレシン二塩酸塩３×１０−２ｍｇ／Ｌ〜３×１０−１ｍｇ／Ｌ、ピルビン酸ナトリウム６．６ｍｇ／Ｌ〜６６．０ｍｇ／Ｌ、チオクト酸３×１０−２ｍｇ／Ｌ〜３×１０−１ｍｇ／Ｌ、チミジン５×１０−２ｍｇ／Ｌ〜５×１０−１ｍｇ／Ｌ、アスコルビン酸−２−ホスフェート１０ｍｇ／Ｌ〜���００ｍｇ／Ｌ、組換えインスリン１ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌ、亜セレン酸ナトリウム１０μｇ／Ｌ〜５０μｇ／Ｌ、トリミプラミンマレイン酸塩１ｍｇ／Ｌ〜４ｍｇ／Ｌ、組換えアクチビンａ  ２μｇ／Ｌ〜２０μｇ／Ｌ、組換えトランスフェリン５ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌ。
【０１２０】
好ましくは、構成成分は、次の濃度で存在する：塩化カルシウム二水和物２．０１×１０２ｍｇ／Ｌ、塩化マグネシウム六水和物４．９０×１０１ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム無水物４．４０×１０１ｍｇ／Ｌ、硫酸銅五水和物７．８０×１０−４ｍｇ／Ｌ、硝酸鉄九水和物６．００×１０−２ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄七水和物３．７５×１０−１ｍｇ／Ｌ、塩化カリウム１．８７×１０２ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．６０×１０３ｍｇ／Ｌ、リン酸ナトリウム二塩基性無水物３．９１×１０１ｍｇ／Ｌ、リン酸ナトリウム一塩基性無水物６．２４×１０１ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物２．３８×１０−１ｍｇ／Ｌ、Ｄ−グルコース無水物２．９０×１０３ｍｇ／Ｌ、グリシン２．２５×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アラニン８．９０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン３．２５×１０２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン塩酸塩１．１８×１０２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物１．２８×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸８．６５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物１．２３×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン二塩酸塩１．８８×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸５．８８ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物１．８９×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン８．７２×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン４．１３×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−リジン塩酸塩８．２１×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン１．０３×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン４．９７×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン２．９３×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−セリン２．１０×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン３．７４×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン１．２６×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン７．２５×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−バリン４．７６×１０１ｍｇ／Ｌ、塩化コリン５．３９ｍｇ／Ｌ、Ｄ−ビオチン６．８３×１０−３ｍｇ／Ｌ、Ｄ−パントテン酸Ｃａ  ２．６９ｍｇ／Ｌ、葉酸２．３９ｍｇ／Ｌ、ミオイノシトール２．１４×１０１ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド２．２２ｍｇ／Ｌ、塩酸ピリドキサール１．２０ｍｇ／Ｌ、塩酸ピリドキシン２．７９×１０−２ｍｇ／Ｌ、リボフラビン３．９４×１０−１ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン４．１２ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  １．０９ｍｇ／Ｌ、ヒポキサンチン１．６８ｍｇ／Ｌ、リノール酸２．３１×１０−２ｍｇ／Ｌ、フェノールレッドナトリウム塩８．２５×１０−１ｍｇ／Ｌ、プトレシン二塩酸塩１．５８×１０−１ｍｇ／Ｌ、ピルビン酸ナトリウム３．３０×１０１ｍｇ／Ｌ、チオクト酸１．５８×１０−１ｍｇ／Ｌ、チミジン２．５６×１０−１ｍｇ／Ｌ、アスコルビン酸−２−ホスフェート２．７５×１０１ｍｇ／Ｌ、組換えインスリン２．８０ｍｇ／Ｌ、亜セレン酸ナトリウム３．３２×１０−２ｍｇ／Ｌ、トリミプラミンマレイン酸塩２．００ｍｇ／Ｌ、組換えアクチビンａ  ２．５５×１０−３ｍｇ／Ｌ、組換えトランスフェリン１．７６×１０１ｍｇ／Ｌ。
【０１２１】
化学組成既知の合成培地の成分は、本技術分野で公知のいずれかの方法によって組み合わされてよい。
【０１２２】
本発明に係る化学組成既知の合成培地は、次のプロトコールに従って調製され得る。先ず、細胞培養グレードの水の最終容量の９０％が、混合器に入れられる。参照する物質のストック溶液の秤量した量又は適切な含量がその後、持続的な撹拌下で添加される。最後に、容量は調整され、培地は０．２２μｍフィルターユニットを使用して濾過滅菌される。
【０１２３】
本発明に係る化学組成既知の合成培地は、真核細胞培養に適する。よって、本発明は、真核細胞を培養するための化学組成既知の合成培地の使用をさらに提供する。本例から分かる通り、本発明に係る化学組成既知の合成培地は、ヒト多能性幹細胞の培養に特に有用である。したがって、別の実施形態では、本発明の化学組成既知の合成培地は、ヒト多能性幹細胞、好ましくは、ヒト人工多能性幹細胞の培養に使用され得る。
【０１２４】
化学組成既知の培養培地の使用のある実施形態において、細胞は、胚性幹細胞ではなく、胚性幹細胞に由来しない。本例に示されている通り、化学組成既知の合成培地は、ヒト包皮線維芽細胞に由来するｈｉＰＳＣ（ＳＢＩ＃ＳＣ１０１Ａ−１）の育成、並びに２種のｈｉＰＳ参照細胞株ＷＴＳＩｉ０２６−Ａ及びＷＴＳＩｉ０４６−Ａに特に有用である。
【０１２５】
様々な種類の幹細胞が十分に特徴付けられており、これらの細胞を確実に同定するための技法が開発された。例として、多能性マーカー発現パターン、例えば、Ｏｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ及びＴｒａ抗原の検査も、多能性状態の間接的証拠として現在広く受け入れられている。
【０１２６】
よって、一実施形態では、多能性幹細胞の分化の阻害は、多能性マーカーＯｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＴＲＡ−２−５４及び／又はＳＳＥＡ−４の発現によって示された。
【０１２７】
多くの場合、脊椎動物に由来する細胞は、足場依存性であり（多能性幹細胞のように）、細胞接着及び自己再生の支持を可能にするよう特異的に処理される適した基材上で培養される必要がある。しかし、多くの細胞株は、懸濁培養に適応させることもできる。懸濁培養とは対照的に、接着細胞培養は、いくつかの利益を有する。接着細胞培養は、幹細胞を含む大部分の細胞型に適切である。これは、容易な目視検査のための顕微鏡解析も可能にする。一実施形態において、多能性幹細胞の培養は、接着細胞培養として行われる。
【０１２８】
接着細胞培養のため、培養器は、好ましくは、インテグリンのような接着性膜貫通分子を使用して細胞が結合することができるスキャフォールドを提供するために、細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされている。用語「細胞外マトリックス」、「ＥＣＭ」又は「基底膜様マトリックス」は、本明細書において、培養器のコーティングに使用されて、斯かるスキャフォールドを提供し得る種々の生物学的に活性な分子の組成物について記載する。細胞外マトリックスとしての使用のため、ラミニン、ビトロネクチン等の糖タンパク質、コラーゲン又はエラスチン等の線維性タンパク質、合成ペプチド（いわゆるＥＣＭ模倣物）、Ｅ−カドヘリン、ゼラチンのみならず、マトリゲル等のタンパク質混合物が確立された。
【０１２９】
本明細書において、用語「ゼノフリー」は、細胞培養において使用する細胞とは別の動物供給源に由来しない物質又は成分の使用について記載する。合成又は組換えにより産生された物質もまた、「ゼノフリー」と称される。例えば、ヒトラミニン又はビトロネクチンは、「ゼノフリー」ＥＣＭを表す、ヒト細胞培養においてＥＣＭとして使用され得る。
【０１３０】
さらなる実施形態において、多能性幹細胞の培養は、細胞外マトリックス上で行われる。好まれる実施形態では、多能性幹細胞の培養は、ゼノフリー細胞外マトリックス上で行われる。
【０１３１】
化学組成既知の合成培地の使用に関する実施形態が、化学組成既知の合成培地において多能性幹細胞を培養する方法にも適用されることが留意される。よって、用語「方法」は、用語「使用」と同義であり、一方の用語は、他方の用語によって置き換えられてよい。
【０１３２】
本発明は、さらに、多能性幹細胞及び本発明に係る化学組成既知の合成培地を含む細胞培養系に関する。細胞培養系の一実施形態において、多能性幹細胞は、ヒト多能性幹細胞、好ましくはヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。細胞培養系のさらなる実施形態において、細胞は、胚性幹細胞ではなく、胚性幹細胞に由来しない。
【０１３３】
ある実施形態において、細胞培養系は、細胞外マトリックスをさらに含む。細胞培養系の好まれる実施形態では、細胞外マトリックスは、ゼノフリーである。
【０１３４】
本発明は、細胞培養における多能性幹細胞の増殖及び／又は維持のためのキットであって、
−  細胞外マトリックス調製物、好ましくはゼノフリー細胞外マトリックス調製物を含む第１の組成物、
−  水、少なくとも１種の炭素源、１種以上のビタミン、１種以上の塩、１種以上の脂肪酸及び１種以上のバッファー構成成分を含む第２の組成物、並びに
−  アスコルビン酸、セレニウム、インスリン、トランスフェリン、アクチビンａ及びトリミプラミンを含む第３の組成物
を含むキットをさらに提供する。
【０１３５】
多能性幹細胞の培養のために、第１の組成物は、接着細胞培養のための培養器の調製に使用される。第２及び第３の組成物は、滅菌条件下で組み合わされ、調製された培養器に添加される。多能性幹細胞の培養のために、それぞれの多能性幹細胞は、調製された培養器に添加される。次に、細胞は、使用した多能性細胞株に応じた適した条件下で培養される。
【０１３６】
特に基本培地配合物が、ヒト多能性幹細胞の培養に適することが実証された。よって、本発明に係るキットの一実施形態では、第２の組成物は、水、少なくとも１種の炭素源、１種以上のビタミン、１種以上の塩、１種以上の脂肪酸及び１種以上のバッファー構成成分を含む。好まれる実施形態では、第２の組成物は、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＨａｍのＦ−１２又はＤＭＥＭ：Ｆ１２から選択される基本培地である。
【０１３７】
基本培地配合物（ｆｏｒｍｕｌａｉｏｎ）にトリミプラミン及びアクチビンａを補充することは、細胞培養における多能性幹細胞の増殖及び／又は維持を可能にする。基本培地にセレニウム及びアスコルビン酸並びにインスリン及び／又はトランスフェリンを補充することは、インビトロでの多能性幹細胞の増加を支持することが示された。よって、さらなる実施形態では、第３の組成物は、アスコルビン酸、セレニウム、インスリン、トランスフェリン、アクチビンａ及びトリミプラミンを含む。
【０１３８】
キットの一実施形態において、第１の組成物は、ゼノフリー細胞外マトリックス調製物を含む。多能性幹細胞の穏やかだが効率的な継代培養を容易にするために、培養された細胞は解離され得る。よって、別の実施形態では、キットは、任意選択的に、細胞の解離のための第４の組成物を含む。
【０１３９】
細胞の解離は、酵素的（ｅｎｚｙｍｅｔｉｃａｌｌｙ）又は非酵素的のいずれかにより達成され得、両者共に、細胞の塊及び単一細胞継代を支持する。コラゲナーゼＩＶ及びＡｃｃｕｔａｓｅ（商標）等の確立された酵素的組成物が使用され得ると共に、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ溶液、ｖｅｒｓｅｎｅ、ＥＤＴＡ／グリセロール／クエン酸ナトリウムのような非酵素的細胞解離を容易にする組成物も使用され得る。
【０１４０】
キットのさらなる実施形態では、任意選択的に、細胞の解離のための非酵素組成物が使用される。
【０１４１】
よって、本発明の一実施形態では、細胞培養における多能性幹細胞の増殖及び／又は維持のためのキットは、
−  細胞外マトリックス調製物、好ましくはゼノフリー細胞外マトリックス調製物を含む第１の組成物、
−  水、少なくとも１種の炭素源、１種以上のビタミン、１種以上の塩、１種以上の脂肪酸及び１種以上のバッファー構成成分を含む第２の組成物、
−  アスコルビン酸、セレニウム、インスリン、トランスフェリン、アクチビンａ及びトリミプラミンを含む第３の組成物、並びに
−  任意選択的に、細胞の解離のための第４の組成物
を含む。
【０１４２】
本発明は、次の非限定的な実施例によってさらに定義される。
【実施例】
【０１４３】
［実施例１］  −  本発明に係る化学組成既知の合成培地の調製
本発明に係る化学組成既知の合成培地である幹細胞培養培地を次の仕方で調製した。先ず、混合器に、最終容量の最大９０％まで細胞培養グレードの水を充填する。構成成分のストック溶液の秤量した量又は適切な含量をその後、持続的な撹拌下で添加する。ＮａＣｌ溶液を使用して浸透圧を２８０ｍＯＳＭ／ｋｇに調整する。全構成成分を溶解した後に、容量を調整し、培地を濾過滅菌する。最終培地は、次の組成を有した：塩化カルシウム二水和物２．０１×１０２ｍｇ／Ｌ、塩化マグネシウム六水和物４．９０×１０１ｍｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム無水物４．４０×１０１ｍｇ／Ｌ、硫酸銅五水和物７．８０×１０−４ｍｇ／Ｌ、硝酸鉄九水和物６．００×１０−２ｍｇ／Ｌ、硫酸鉄七水和物３．７５×１０−１ｍｇ／Ｌ、塩化カリウム１．８７×１０２ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５．６０×１０３ｍｇ／Ｌ、リン酸ナトリウム二塩基性無水物３．９１×１０１ｍｇ／Ｌ、リン酸ナトリウム一塩基性無水物６．２４×１０１ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛七水和物２．３８×１０−１ｍｇ／Ｌ、Ｄ−グルコース無水物２．９０×１０３ｍｇ／Ｌ、グリシン２．２５×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アラニン８．９０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン３．２５×１０２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン塩酸塩１．１８×１０２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン一水和物１．２８×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン酸８．６５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−システイン塩酸塩一水和物１．２３×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン二塩酸塩１．８８×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸５．８８ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物１．８９×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン８．７２×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン４．１３×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−リジン塩酸塩８．２１×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン１．０３×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン４．９７×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−プロリン２．９３×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−セリン２．１０×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−スレオニン３．７４×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン１．２６×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン７．２５×１０１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−バリン４．７６×１０１ｍｇ／Ｌ、塩化コリン５．３９ｍｇ／Ｌ、Ｄ−ビオチン６．８３×１０−３ｍｇ／Ｌ、Ｄ−パントテン酸Ｃａ  ２．６９ｍｇ／Ｌ、葉酸２．３９ｍｇ／Ｌ、ミオイノシトール２．１４×１０１ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド２．２２ｍｇ／Ｌ、塩酸ピリドキサール１．２０ｍｇ／Ｌ、塩酸ピリドキシン２．７９×１０−２ｍｇ／Ｌ、リボフラビン３．９４×１０−１ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン４．１２ｍｇ／Ｌ、ビタミンＢ１２  １．０９ｍｇ／Ｌ、ヒポキサンチン１．６８ｍｇ／Ｌ、リノール酸２．３１×１０−２ｍｇ／Ｌ、フェノールレッドナトリウム塩８．２５×１０−１ｍｇ／Ｌ、プトレシン二塩酸塩１．５８×１０−１ｍｇ／Ｌ、ピルビン酸ナトリウム３．３０×１０１ｍｇ／Ｌ、チオクト酸１．５８×１０−１ｍｇ／Ｌ、チミジン２．５６×１０−１ｍｇ／Ｌ、アスコルビン酸−２−ホスフェート２．７５×１０１ｍｇ／Ｌ、組換えインスリン２．８０ｍｇ／Ｌ、亜セレン酸ナトリウム３．３２×１０−２ｍｇ／Ｌ、トリミプラミンマレイン酸塩２．００ｍｇ／Ｌ、組換えアクチビンａ  ２．５５×１０−３ｍｇ／Ｌ、組換えトランスフェリン１．７６×１��１ｍｇ／Ｌ。
【０１４４】
［実施例２］  −  ｈＰＳＣ培養の開始
２．１  培養器の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）コーティング
ＥＣＭとしての０．５μｇ／ｃｍ２の組換えヒトビトロネクチンで培養器をコーティングした。これを行うため、培養器表面１ｃｍ２当たり１００μｌの希釈されたビトロネクチン溶液を培養器に塗布する。コーティングされた培養器を室温で２時間放置する。細胞を播種する直前にビトロネクチン溶液を吸引した。
【０１４５】
２．２  細胞を蒔く（０日目）
本実験に使用した細胞株は、ヒト包皮線維芽細胞由来ｈｉＰＳ細胞株ＳＢＩ＃ＳＣ１０１Ａ−１（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢＩ）、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏから、規定された参照番号にて入手可能）である。
【０１４６】
実施例１に記載されている通りに幹細胞培養培地を調製した。凍結保存された細胞のため、ＲＯＣＫ阻害剤（１０μＭ  Ｙ−２７６３２又は２μＭチアゾビビン（Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ））を幹細胞培養培地に添加する。あるいは、現在増殖している培養物のため、後述する実施例３に記載されている通りに集塊継代を行った。
【０１４７】
適切な量の培養培地を使用して、ＥＣＭコーティングされた組織培養器に１：２〜１：３比（組織培養器の容量と比べて）でｈＰＳＣを播種した。例えば、６ウェルプレートではウェル当たり２〜３ｍｌが使用され、Ｔ−７５フラスコでは１５〜２５ｍｌが使用される。
【０１４８】
２．３  細胞を付着させる（０日目）
蒔いた後に、継代培養されたｈＰＳＣを一晩付着させた（１２〜２４時間）。
【０１４９】
２．４  培地交換（１日目）
培地交換を行った：非付着細胞を含む幹細胞培養培地を吸引し、ダルベッコＰＢＳ、ｗ／ｏ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋で１回洗浄し、細胞に新鮮培養培地（ｗ／ｏ  ＲＯＣＫ阻害剤）を与えた。
【０１５０】
２．５  細胞増加（１＋日目）
１〜３日毎に培地交換を行った。単一コロニーが互いに触れるまで（通常３〜７日後）、又はコロニーが、その大きいサイズから惹起された分化の最初の徴候を示すまで、ｈＰＳＣを増加させた。
【０１５１】
［実施例３］  −  ｈＰＳＣ培養の系列継代
幹細胞培養培地を吸引し、ｈＰＳＣをダルベッコＰＢＳ、ｗ／ｏ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋で２回洗浄した。次に、２００〜３００μｌ／ｃｍ２の解離バッファーを添加し、３７℃及び５％ＣＯ２のインキュベーターにおいて溶液を６〜１０分間インキュベートした。解離バッファーを慎重に吸引し、１〜５ｍｌの新鮮培養培地を添加した。血清学的ピペットを使用して表面からコロニーを流した。十分なサイズの細胞塊を維持するために、４〜５回を超えて流すことを回避した。次いで、新鮮幹細胞培養培地を含有する新たなＥＣＭコーティングされた培養器に細胞塊を分配し、実施例２の細胞付着ステップ（ステップ２．３）に従って培養を続けた。
【０１５２】
［実施例４］  −  アクチビンａの存在下でのｈＰＳＣの培養
アクチビンａそれだけでは、大部分のｈＰＳＣ系統の未分化維持を十分に支持できない（Ｖａｌｌｉｅｒら、２００５年；Ｘｉａｏら、２００６年）という公表された観察を再現するために、トリミプラミンなしで実施例１に従って幹細胞培養培地の存在下で人工多能性幹細胞を培養した。実施例２に従ってｈＰＳＣ培養の開始を行い、続いて実施例３に従って細胞の継代培養を行った。
【０１５３】
培養物は、有意な細胞増殖を示したが、顕微鏡解析は、最初の継代の前であっても、分化を示す典型的な形態学的変化を明らかにした。培養物の最初の均一な形態学的パターンは、強調される不均一な外観へとスイッチした：多量の細長い／肥大した細胞（図１における低下した核：細胞質比に反映）及び多数の浮遊剥離細胞が存在する。ｈＰＳＣにおいて、これらの形態学的特質は、幹細胞分化及び多能性喪失の広く認識された明確な徴候を示す。
【０１５４】
結果として、アクチビンａは、組成既知のフィーダーフリーの培養条件下で、未分化状態における検査したｈＰＳＣ系統の維持をロバストに支持することができない。
【０１５５】
［実施例５］  −  トリミプラミンの存在下でのｈＰＳＣの培養
ヒト多能性幹細胞におけるトリミプラミンの公表された部分的自己再生支持能力（Ｋｕｍａｇａｉら、２０１３年）を再現することも目標とした。この目的のため、アクチビンａを欠如する実施例１に従って調製された幹細胞培養培地においてｈＰＳＣを培養した。実施例２に従ってｈＰＳＣ培養の開始を行い、続いて実施例３に従って細胞の継代培養を行った。
【０１５６】
顕微鏡画像は、アクチビンａとは対照的に、トリミプラミン単独が、高い核：細胞質比を有する細胞で構成された、平滑縁境界を有する丸みのあるコロニーによって表されるプロトタイプ多能性形態学的表現型を維持することができることを示した。しかし、トリミプラミンは、ヒト多能性幹細胞の有効な増加に十分ではない。図２から分かる通り、最初に蒔かれた細胞塊は、培養５日間にわたって実質的に同じサイズのままであり、細胞増殖の本質的非存在を示す。
【０１５７】
よって、トリミプラミン単独を含有する幹細胞培養培地における多能性幹細胞は、その多能性を維持するが、化学組成既知の培養条件下で増殖しない。
【０１５８】
［実施例６］  −  アクチビンａ及びトリミプラミンの組合せの存在下でのｈＰＳＣの培養
各構成成分それだけ（アクチビンａ又はトリミプラミン）では、インビトロでの未分化ｈＰＳＣの適切な増加及び維持が不可能であるが、代わりに、それぞれ培養細胞の急速な多能性喪失又は増殖不全をもたらす。ｈＰＳＣの初代培養であっても、記載された効果は、それぞれの化合物を含有する培地へのスイッチ後２日以内に明らかである。
【０１５９】
しかし、アクチビンａ及びトリミプラミンは、多能性の維持のための鍵となる２種の異なるシグナリング経路に独立的に及びプラスに作用する／模倣すると思われるため、これら２種の化合物の組合せは、両方の種類のシグナルの同時関与によるｈＰＳＣの完全自己再生及び増加支持を相乗的に伝え得ることが推測される。
【０１６０】
これを検査するために、アクチビンａ及びトリミプラミンを含む、実施例１に従った幹細胞培養培地を含む培養系内で多能性幹細胞を培養した。実施例２に従ってｈＰＳＣ培養の開始を行い、続いて実施例３に従って細胞の継代培養を行った。
【０１６１】
６．１  形態学的成長パターン
顕微鏡解析は、幹細胞培養培地にアクチビンａ及びトリミプラミンの組合せを補充することが、３〜４日間の一定の継代間隔での検査したｈＰＳＣ系統の急速増加を可能にすることを示した。図３から分かる通り、培養物は、単一細胞レベルで高い核：細胞質比と共に、平滑縁コロニーの典型的な成長パターンを示す。浮遊する分化した細胞は、培地交換間で実質的に存在しない。
【０１６２】
６．２  多能性マーカーの発現
分子レベルで未分化状態の適切な維持を確認するために、アクチビンａ及びトリミプラミンを含有する幹細胞培養培地における３継代後に、ヒト多能性マーカーＯｃｔ−３／４及びＳＳＥＡ−４の染色を行った。
【０１６３】
これを行うために、染色手順を開始する１時間前に、実施例１に従って調製された幹細胞培養培地において、実施例２及び３に従ってＴ２５  ＴＣ−フラスコ内で成長させた８０〜９０％コンフルエントｈＰＳＣ培養物において培地交換を行った。５ｍｌのヒトＡＢ−血清（血餅なし）を、４５ｍｌのダルベッコＰＢＳ  ｗ／ｏ  Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋（以降「ＰＢＳ」と称される）で希釈し、ＰＥＳ−膜を備える０．２２ミクロンシリンジフィルターを通して濾過する。細胞から幹細胞培養培地を吸引し、廃棄した。次いで、５ｍｌのＰＢＳ／０．５％  ＢＳＡ／２ｍＭ  ＥＤＴＡで細胞を２回洗浄した。５ｍｌのｈＰＳＣ解離バッファーを細胞に添加し、インキュベーターにおいて８分間、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。顕微鏡評価は、細胞剥離過程の初めを示す、付着したコロニーの輝く境界を示した。解離バッファーを直ちに吸引し、３〜５回反復的に流すことにより、緩く接着したｈＰＳＣコロニーを１０ｍｌのＰＢＳにより表面から洗い流す。次いで、１０ｍｌの血清学的ピペットを使用して細胞懸濁液を５〜１０回上下にピペッティングすることにより、細胞塊を完全に解離した。Ｍｕｓｅ細胞分析計によるＶｉａｃｏｕｎｔアッセイ試薬（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、細胞を計数する。細胞懸濁液を５分間、２００×ｇの遠心分離によってペレット化した。ヒトＡＢ−血清（ＰＢＳ中１０％）において１００．０００細胞／ｍｌに細胞を再懸濁し、室温で１０分間インキュベートした。３ｍｌの細胞懸濁液を５分間、２００×ｇの遠心分離によってペレット化した。上清を吸引し、細胞を３００μｌのヒトＡＢ−血清（ＰＢＳ中１０％）に再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液を２個の１５ｍｌコニカルチューブのそれぞれに移した（試料１及び試料２）。
【０１６４】
試料２に、１０μｌのＰｅｒＣＰコンジュゲートされたＳＳＥＡ−４抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｎｏ．ＦＡＢ１４３５Ｃ）を添加し、３０分間、４℃で暗所にてインキュベートした。未処理陰性対照試料１は、試料２と同時インキュベートした。０．５％ＢＳＡ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する２ｍｌのＰＢＳを、試料１及び試料２のそれぞれに添加し、５分間、２００×ｇの遠心分離によってペレット化した。試料１及び試料２の細胞ペレットをそれぞれ、１ｍｌの固定バッファー試薬（Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ細胞透過処理キット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｎｏ．ＧＡＳ００４）に再懸濁し、２０分間、４℃で暗所にてインキュベートした。２ｍｌの洗浄バッファー試薬（Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ細胞透過処理キット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｎｏ．ＧＡＳ００４）を、試料１及び試料２に添加し、細胞を５分間、２００×ｇの遠心分離によってペレット化した。次に、洗浄ステップを２ｍｌの洗浄バッファー試薬でさらに１回反復した。試料２の細胞ペレットを９０μｌの洗浄バッファー試薬に再懸濁し、１０μｌのＦＩＴＣ標識されたＯｃｔ−３／４抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｎｏ．ＩＣ−１７５９Ｆ）を添加した。試料１の細胞ペレットを１００μｌの洗浄バッファー試薬に再懸濁した。両方の試料を室温で６０分間、暗所にてインキュベートした。２ｍｌの洗浄バッファー試薬を、試料１及び試料２のそれぞれに添加し、細胞を５分間、２００×ｇの遠心分離によってペレット化した。次に、洗浄ステップを２ｍｌの洗浄バッファー試薬でさらに１回反復した。試料１及び試料２のそれぞれの細胞ペレットを、０．５％ＢＳＡ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する０．５ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、青色レーザーを備えるＧｕａｖａフローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して直ちに解析する。
【０１６５】
図４は、細胞の９９％超が、両方のマーカーに関して二重陽性に染色されることを示し、幹細胞特性の維持を示す先の形態学的／増加の知見を強く実証する。
【０１６６】
複数継代にわたる培養の自己再生の延長、典型的な形態学的成長パターン及び多能性マーカープロファイル発現によって実証される通り、本発明に係る幹細胞培養培地におけるトリミプラミン及びアクチビンａの組合せが、ｈＰＳＣの未分化での増加の持続に十分であると結論付けることができる。
【０１６７】
［実施例７］  −  さらに別の人工多能性幹細胞の培養
幅広い範囲にわたる多能性幹細胞株に対する、本発明に係る幹細胞培養培地の適用性を確認するために、表１に収載されているさらに別の幹細胞株を用いて、実施例４、５及び６の実験を反復した。これらの細胞株の成長実験は、ＳＢＩ＃ＳＣ１０１Ａ−１に匹敵する結果を示した。
【０１６８】
【表１】
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【０１６９】
［実施例８］  −  ｈＰＳＣ培養に適切なあらゆる確立された型のＥＣＭを使用することができる
細胞培養における本発明に係る幹細胞培養培地と、さらに別の確立された型のＥＣＭとの適合性を検査するために、ｈＰＳＣ培養のためにルーチンに使用される基底膜様マトリックスを使用して実験を実行した。検査されたＥＣＭは、マトリゲル（商標）、ラミニンに基づくマトリックス、ビトロネクチン、カドヘリンに基づくマトリックス及び確立されたＥＣＭ模倣物ペプチドマトリックスである。
【０１７０】
アクチビンａ及びトリミプラミンを含む幹細胞培養培地（実施例１に定義されている通り）を含む細胞培養において、検査されたＥＣＭのそれぞれを使用する。対照として、アクチビンａを含有せずトリミプラミンを含有しない培地配合物を検査する。
【０１７１】
アクチビンａ及びトリミプラミンを含有する幹細胞培養培地において培養された細胞は、いずれのＥＣＭが使用されたかとは無関係に、実験６に示す結果と同様の、数継代にわたるｈＰＳＣの典型的な形態学的成長パターン及び多能性マーカープロファイル発現を示す。
【０１７２】
よって、本発明に係る幹細胞培養培地は、ｈＰＳＣ培養に適切な実質的にあらゆる確立されたＥＣＭと組み合わせて使用することができ、ゼノフリーＥＣＭと組み合わせた使用に限定されない。
【０１７３】
［実施例９］  −  アクチビンａ及びトリミプラミンを含有する幹細胞培養培地、並びにＦＧＦ−２及びＴＧＦ−β１を含むｈＰＳＣ培養培地において培養されたｈＰＳＣの比較
本発明に係る幹細胞培養培地におけるトリミプラミン及びアクチビンａの組合せは、実施例６に実証される通り、ｈＰＳＣの未分化での増加の持続に十分である。
【０１７４】
ｈＰＳＣの増加に関する、本発明に係る幹細胞培養培地並びにＦＧＦ−２及びＴＧＦ−β１を含むｈＰＳＣ培地の適用性を比較するために、アクチビンａ及びトリミプラミンを含有する幹細胞培養培地（実施例１に定義されている通り）並びにＦＧＦ−２及びＴＧＦ−β１を含むｈＰＳＣ培養培地をそれぞれ含む培養系内でｈＰＳＣを増加させた。ＦＧＦ−２及びＴＧＦ−β１を含むｈＰＳＣ培養培地を、トリミプラミン及びアクチビンａの代わりに１０ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２及び１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦ−β１を用いる以外は実施例１に従って調製した。実施例２に従ってｈＰＳＣ培養の開始を行い、続いて実施例３に従って細胞の継代培養を行った。
【０１７５】
９．１  形態学的成長パターン
上の培地において培養されたｈＰＳＣの顕微鏡解析は、両方の培地が、それぞれ８（ｅｉｇｔｈ）及び９継代にわたる検査されたｈＰＳＣ系統の急速増加を可能にすることを確認する（図５を参照）。図５から分かる通り、２種の培養物は、高い核：細胞質比及び平滑コロニー境界によって示される、ヒト多能性幹細胞のプロトタイプ形態学的成長パターンを安定に示す。浮遊する分化した細胞は、培地交換の間に実質的に存在しない。
【０１７６】
トリミプラミン及びアクチビンａを含有する幹細胞培養培地において培養された細胞は、ＦＧＦ−２及びＴＧＦ−β１を含むｈＰＳＣ培養培地において培養された細胞と比較してより顕著に広がるため、特に、より低い細胞密度の区域において、僅かにより大きく見える。この観察は、トリミプラミン及びアクチビンａを含有する幹細胞培養培地において培養された場合、培養表面からの細胞の遊離に必要な解離バッファーによる、より長いインキュベーション時間によって支持される。しかし、観察される細胞サイズ効果は、細胞密度増加と共に縮小する。
【０１７７】
９．２  多能性マーカーの発現
トリミプラミン及びアクチビンａを含有する幹細胞培養培地（実施例１に定義されている通り）において培養されたｈＰＳＣ並びにＦＧＦ−２及びＴＧＦ−β１を含むｈＰＳＣ培養培地において培養されたｈＰＳＣの未分化状態の維持を分子レベルで比較するために、ヒト多能性マーカーＯｃｔ−３／４及びＳＳＥＡ−４の染色を、それぞれ８及び９継代後に、実施例６．２に記載されている通りに行った。
【０１７８】
増加させたｈＰＳＣの９６％超が、トリミプラミン及びアクチビンａを含有する幹細胞培養培地における９継続的継代後に、多能性マーカープロファイルＯｃｔ−３／４及びＳＳＥＡ−４に関して二重陽性である（図６を参照）。図６から分かる通り、ＦＧＦ−２及びＴＧＦ−β１を含むｈＰＳＣ培養培地における同じ細胞株の８継続的継代後に、匹敵する結果が達成される。
【０１７９】
ＦＧＦ−２及びＴＧＦ−β１を含むｈＰＳＣ培養培地に匹敵する、複数継代にわたる培養の自己再生の延長、典型的な形態学的成長パターン及び多能性マーカープロファイル発現によって実証される通り、本発明に係る幹細胞培養培地におけるトリミプラミン及びアクチビンａの組合せが、ｈＰＳＣの未分化での増加の持続に十分であると結論付けることができる。
【０１８０】
本明細書に示す本発明の多くの修飾及び他の実施形態は、本発明が属する技術分野における当業者であれば思い付き、前述の明細書及び添付の図面に示される教示の利益を有する。したがって、本発明が、開示されている特異的な実施形態に限定されるべきではなく、修飾及び他の実施形態が、添付の特許請求の範囲内に含まれるように企図されることを理解されたい。特異的な用語が本明細書において用いられているが、そのような用語は、単に一般的で説明的な意味で使用されており、限定を目的とするものではない。
【０１８１】
【表２】
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2019519204.tif 000005
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月21日(2019.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞培養のための化学組成既知の合成培地であって、水、少なくとも１種の炭素源、１種以上のビタミン、１種以上の塩、１種以上の脂肪酸、１種以上のバッファー構成成分、セレニウム、酸性スフィンゴミエリナーゼの機能阻害剤（ＦＩＡＳＭＡ）の群の少なくとも１種の物質、及び幹細胞分化を阻害する能力を有するＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１種のポリペプチドを含む、化学組成既知の合成培地。
【請求項２】
ＦＩＡＳＭＡが、トリミプラミン、メパクリン、プロメタジン及びプロフェナミンの群から選択され、好ましくは、ＦＩＡＳＭＡが、トリミプラミンである、請求項１に記載の化学組成既知の合成培地。
【請求項３】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１種のポリペプチドが、アクチビン類、ｎｏｄａｌ、ミオスタチン及びＧＤＦ３からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の化学組成既知の合成培地。
【請求項４】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１種のポリペプチドが、アクチビン類から選択され、好ましくは、ポリペプチドが、アクチビンａである、請求項３に記載の化学組成既知の合成培地。
【請求項５】
ヒト又は動物由来物質を完全に欠く、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化学組成既知の合成培地。
【請求項６】
ＦＧＦ−２、アルブミン及び／又はＴＧＦ−β１の構成成分のいずれも含まない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化学組成既知の合成培地。
【請求項７】
少なくとも１種のＦＩＡＳＭＡの濃度が、０．１ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの範囲内であり、好ましくは、０．５ｍｇ／Ｌ〜５ｍｇ／Ｌの範囲内である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化学組成既知の合成培地。
【請求項８】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーの少なくとも１種のポリペプチドの濃度が、０．２μｇ／Ｌ〜２００μｇ／Ｌの範囲内であり、好ましくは、１μｇ／Ｌ〜１００μｇ／Ｌの範囲内であり、より好ましくは、２μｇ／Ｌ〜２０μｇ／Ｌの範囲内である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化学組成既知の合成培地。
【請求項９】
１種以上のバッファー構成成分が、無機炭酸水素塩、無機リン酸塩又は４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化学組成既知の合成培地。
【請求項１０】
セレニウムの濃度が、１μｇ／Ｌ〜１００μｇ／Ｌの範囲内であり、好ましくは、１０μｇ／Ｌ〜５０μｇ／Ｌの範囲内である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化学組成既知の合成培地。
【請求項１１】
インスリン及び／又はトランスフェリンをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化学組成既知の合成培地であって、トランスフェリンの濃度が、０．１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌの範囲内であり、好ましくは、１ｍｇ／Ｌ〜５０ｍｇ／Ｌの範囲内であり、より好ましくは、５ｍｇ／Ｌ〜２５ｍｇ／Ｌの範囲内である、及び／又はインスリンの濃度が、０，１ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌの範囲内であり、好ましくは、１ｍｇ／Ｌ〜１０ｍｇ／Ｌの範囲内である、化学組成既知の合成培地。
【請求項１２】
アスコルビン酸をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化学組成既知の合成培地であって、アスコルビン酸の濃度が、３ｍｇ／Ｌ〜３００ｍｇ／Ｌの範囲内であり、好ましくは、１０ｍｇ／Ｌ〜１００ｍｇ／Ｌの範囲内である、化学組成既知の合成培地。
【請求項１３】
真核細胞、好ましくは、ヒト多能性幹細胞、より好ましくは、ヒト人工多能性幹細胞を培養する方法であって、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化学組成既知の合成培地中で前記真核細胞を培養することを含む、方法。
【請求項１４】
真核細胞が、多能性幹細胞であり、多能性幹細胞の培養が、接着細胞培養として行われ、好ましくは、多能性幹細胞の培養が、細胞外マトリックス、より好ましくは、ゼノフリー細胞外マトリックス上で行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ヒト多能性幹細胞、好ましくは、ヒト人工多能性幹細胞及び請求項１〜１２のいずれかに記載の化学組成既知の合成培地を含む細胞培養系。
【請求項１６】
細胞外マトリックス、好ましくは、ゼノフリー細胞外マトリックスをさらに含む、請求項１５に記載の細胞培養系。
【請求項１７】
細胞培養におけるヒト多能性幹細胞の増殖及び／又は維持のためのキットであって、
−  細胞外マトリックス調製物、好ましくはゼノフリー細胞外マトリックス調製物を含む第１の組成物、
−  水、少なくとも１種の炭素源、１種以上のビタミン、１種以上の塩、１種以上の脂肪酸及び１種以上のバッファー構成成分を含む第２の組成物、
−  アスコルビン酸、セレニウム、インスリン、トランスフェリン、アクチビンａ及びトリミプラミンを含む第３の組成物、並びに
−  任意選択的に、細胞の解離のための第４の組成物
を含むキット。
【国際調査報告】
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