(57)【要約】（ａ）標的認識抗体を一価的に結合することができる対応するＭＴＡＢ−ＤＭ試薬にそれぞれ結合した、少なくとも２つ以上の標的認識抗体を用意すること、（ｂ）試料を、対応するＭＴＡＢ−ＤＭ試薬にそれぞれ結合した２つ以上の標的認識抗体とインキュベートすること、（ｃ）ＭＴＡＢ−ＤＭに対応する少なくとも２つのイメージャー部分を、順次、バッチで、または同時に、のいずれかで適用すること、及び（ｄ）少なくとも２つのイメージャー部分を、順次、バッチで、または同時に、のいずれかでイメージングすること、を含む、試料中の少なくとも２つの標的を交換イメージングのための方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の少なくとも２つの標的の交換イメージングのための方法であって、
ａ．標的認識抗体を一価的に結合することができる対応するＭＴＡＢ−ＤＭ試薬にそれぞれ結合した、少なくとも２つ以上の標的認識抗体を用意すること、
ｂ．試料を、対応するＭＴＡＢ−ＤＭ試薬にそれぞれ結合した前記２つ以上の標的認識抗体とインキュベートすること、
ｃ．前記ＭＴＡＢ−ＤＭに対応する少なくとも２つのイメージャー部分を、順次、バッチで、または同時に、のいずれかで適用すること、
ｄ．少なくとも前記２つのイメージャー部分を、順次、バッチで、または同時に、のいずれかでイメージングすること、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記ＭＴＡＢが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、または一価の抗体フラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対応するＭＴＡＢ−ＤＭ試薬にそれぞれ結合した前記標的認識抗体のすべてが、同時に前記試料とインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記イメージャー部分が、２つ以上のイメージャー部分を有する少なくとも１つのバッチと少なくとも２つのバッチを有する方法とを用いてバッチで適用され、前記イメージングが少なくとも２つのバッチで起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標的認識抗体を前記試料とインキュベートする前に、過剰量のＭＴＡＢ−ＤＭを用いて遊離の標的認識抗体が過剰となるのを防止する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記標的認識抗体を前記試料とインキュベートする前に、限外濾過またはゲル濾過を使用して遊離のＭＴＡＢ−ＤＭが除去される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
非特異的抗体が、染色、洗浄及び／またはイメージング緩衝液に添加される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記非特異的抗体が、前記標的認識抗体と同じ宿主種由来の抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記非特異的抗体が、（標的タンパク質のいずれによっても免疫化されていない動物由来の）正常血清でみられるポリクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記非特異的抗体が、前記試料中に存在しないタンパク質に対するモノクローナル抗体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ａ．ＭＴＡＢ、
ｂ．前記ＭＴＡＢに共有結合したドッキング部分、
ｃ．第１のドメインが前記ドッキング部分に特異的に結合することができ、第２のドメインが前記ドッキング部分に特異的に結合することができない、前記第１のドメイン及び前記第２のドメインを有する中間部分、
を含む組成物。
【請求項１２】
前記ＭＴＡＢが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、または一価の抗体フラグメントである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
交換イメージングのための試薬を作製する方法であって、
ａ．ＭＴＡＢを用意すること、
ｂ．前記ＭＴＡＢをドッキング部分にコンジュゲートさせてＭＴＡＢ−ＤＭを形成すること、
ｃ．それぞれ、前記ドッキング部分に特異的に結合することができる第１のドメインと前記ドッキング部分に特異的に結合することができない第２のドメインとを有する、複数の中間部分を用意すること、
ｄ．前記複数の中間部分を前記ＭＴＡＢ−ＤＭと化合すること、
を含む前記方法。
【請求項１４】
ＭＴＡＢが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、または一価の抗体フラグメントである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の中間部分が、１つのバッチ反応で前記ＭＴＡＢ−ＤＭと化合される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数の中間部分が、別々に前記ＭＴＡＢ−ＤＭと化合される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
試料中の少なくとも２つの標的の交換イメージングのためのキットであって、
ａ．ＭＴＡＢと、イメージャー部分を特異的に結合することができるドッキング部分とを含む、少なくとも２つの異なるＭＴＡＢ−ＤＭ試薬、
ｂ．場合によって、少なくとも２つの異なる標的認識抗体、
ｃ．観察可能部分で標識され、個々に前記ＭＴＡＢ−ＤＭ試薬に特異的に結合することができる、少なくとも２つのイメージャー部分、
ｄ．場合によって、少なくとも１つの、標的のいずれにも特異的に結合しない抗体、
を含む前記キット。
【請求項１８】
前記ＭＴＡＢが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、または抗体の一価のフラグメントから選択される、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記ＭＴＡＢ−ＤＭが、少なくとも２つの異なる標的認識抗体を約１ｆＭ〜１ｎＭの親和性で結合することができる、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
請求項１７に記載の前記試薬を用いる、交換イメージングのための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的のために全体として本明細書に参照により組み入れている、２０１６年６月２日に提出された米国仮出願第６２／３４４，４４１号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
配列表
配列表は、作成日２０１７年５月１１日、サイズ２０，２００バイトのファイル名「２０１７−０５−１１＿０１１６８−０００６−００ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」で、ＡＳＣＩＩフォーマットされたテキストファイルとして本出願と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂで提出される。ＥＦＳ−Ｗｅｂで提出されたこの配列表は、明細書の一部であり、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本出願は、抗体ベースの交換イメージングを迅速化する組成物及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
超解像イメージングは、一つの試料の中の複数の標的を検出するために使用することができる。先に第１の標的に対する第１の抗体を使用して試料中の第１の標的を標識し、その標識をイメージングした後、第２の標的に対する第２の抗体などで試料を標識する前に第１の抗体またはその標識を除去または破壊した。しかし、この方法は、非常に労働集約的であり、各抗体を使って別々に長時間インキュベーションすることが必要であった。
【０００５】
交換イメージングよって、同一試料上の多数の標的をイメージングできるように多重化能力を獲得する、若干の改良が提供された。交換イメージングは、以下のステップ：（１）異なる復号可能な情報を運ぶ分子（ドッキング部分またはＤＭと呼ばれる）を、それぞれ異なる標的認識分子に付着すること、（２）個々にドッキング部分を特異的に認識する、観察可能部分を運ぶ分子のセット（イメージャー部分と呼ばれる）を使用して、ドッキング部分のサブセットを標識し、対応する標的のサブセットをイメージングすること、（３）ステップ２で使用したイメージャー部分のセットを除去する、またはかかるイメージャー部分上の観察可能部分を不活性化すること、及び（４）個々にドッキング部分を特異的に認識する、観察可能部分を運ぶイメージャー部分の別のセットを使用して、ドッキング部分の別のサブセットを標識し、対応する標的のサブセットをイメージングすること、を含むことができ、（５）場合によって、標的の多重サブセットを可視化するためにステップ３及び４を繰り返すことができる。
【０００６】
交換イメージングの非限定的な例の１つに、抗体を標的のタンパク質またはその他の生体分子をイメージングする標的認識分子として、ＤＮＡオリゴヌクレオチドをドッキング部分として、また、ドッキング部分に相補的でありフルオロフォアなどの観察可能部分で標識されたＤＮＡオリゴヌクレオチドをイメージャー部分として使用する、ＤＮＡ交換免疫蛍光法がある。ステップ３では、高温、変性剤、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡ分解酵素、及び／または鎖置換を使用してＤＮＡを除去してもよく、または、ドッキング部分上のフルオロフォアなどの観察可能部分を、化学的開裂、酵素的開裂、化学的漂白、光漂白、及び／または光化学的漂白によって除去してもよい。
【０００７】
ＤＮＡ交換免疫蛍光法の実施において、実行上の課題の１つは、標的認識抗体（一次抗体と呼ばれることもある）にドッキング部分を付着することである。ある従来型の簡便ではあるが限定的な方法では、異なる一次抗体を区別することができる全長の二次抗体を活用する。例えば、二重ＤＮＡ交換免疫蛍光法では、２つの一次抗体が２種の宿主のもの（例えば、一方はマウス由来、もう一方はウサギ由来）であれば、２つの異なるドッキング部分に付着される２つの既製の二次抗体（一方は抗マウス、もう一方は抗ウサギ）を使用することができる。同様に、抗体が違うアイソタイプのもの（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、またＩｇＧ２ｂ）であれば、アイソタイプ特異的な二次抗体を使用することができる。しかし、複数の一次抗体が同じ宿主種及びアイソタイプのものである場合、もはやこの戦略を使うことはできない。これに代わって、通常は、染色を実施する前に、ドッキング部分を標的認識抗体に直接的に付着することになる。抗体コンジュゲーション方法は多数存在するものの（例えば、Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３ｒｄ．Ｅｄ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ２  ａｎｄ  ２０，ＩＳＢＮ：９７８−０−１２−３８２２３９−０（２０１３）を参照されたい）、収量が低い、（おそらく事実上モノクローナル抗体である）高価な一次抗体を多量に必要とする、高純度が主要要件である、労働集約的である、または高価であるなどの理由から、それらのほとんどは望ましものではない。一次抗体はまた、アルブミンのようなキャリアタンパク質を含む製剤で売られていることも多く、かかるキャリアタンパク質は、特定の抗体コンジュゲーション技術を妨害することがある。
【０００８】
したがって、当技術分野は、交換イメージングにおいて使用する、ドッキング部分を一次抗体に付着するための改良された方法を必要としている。
【発明の概要】
【０００９】
この説明に従って、幾つかの実施形態において、試料中の少なくとも２つの標的の交換イメージングのための方法は、（ａ）標的認識抗体に一価的に結合することができる対応するＭＴＡＢ−ＤＭ試薬にそれぞれ結合した、少なくとも２つ以上の標的認識抗体を用意すること、（ｂ）試料を、対応するＭＴＡＢ−ＤＭ試薬にそれぞれ結合した２つ以上の標的認識抗体とインキュベートすること、（ｃ）ＭＴＡＢ−ＤＭに対応する少なくとも２つのイメージャー部分を、順次、バッチで、または同時に、のいずれかで適用すること、（ｄ）その少なくとも２つのイメージャー部分を、順次、バッチで、または同時に、のいずれかでイメージングすること、を含む。
【００１０】
幾つかの実施形態において、ＭＴＡＢは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、または一価の抗体フラグメントを含む。幾つかの実施形態において、ＤＭ（ドッキング部分）及びイメージャー部分は、核酸を含む。幾つかの実施形態において、それぞれ対応するＭＴＡＢ−ＤＭ試薬に結合した標的認識抗体はすべて、試料と同時にインキュベートされる。幾つかの実施形態において、イメージャー部分はすべて順次適用され、イメージングは順次起こる。幾つかの実施形態において、イメージャー部分はすべて同時に適用され、イメージングは同時に起こる。幾つかの実施形態において、イメージャー部分は、２つ以上のイメージャー部分を有する少なくとも１つのバッチと、少なくとも２つのバッチを有する方法とを用いてバッチで適用され、イメージングは少なくとも２つのバッチで起こる。幾つかの実施形態において、各イメージャー部分は、違う観察可能部分で標識される。幾つかの実施形態において、各イメージャー部分は、同じ観察可能部分で標識される。幾つかの実施形態において、一部のイメージャー部分は同じ観察可能部分で標識され、一部のイメージャー部分は違う観察可能部分で標識される。幾つかの実施形態において、標的認識抗体を試料とインキュベートする前に、過剰量のＭＴＡＢ−ＤＭを用いて遊離の標的認識抗体が過剰となるのを防止する。幾つかの実施形態において、標的認識抗体を試料とインキュベートする前に、限外濾過またはゲル濾過を使用して、遊離ＭＴＡＢ−ＤＭを除去する。幾つかの実施形態において、非特異的抗体を、染色、洗浄及び／またはイメージング緩衝液に添加する。幾つかの実施形態において、非特異的抗体は、標的認識抗体と同じ宿主種由来の抗体である。幾つかの実施形態において、非特異的抗体は、（標的タンパク質のいずれによっても免疫化されていない動物由来の）正常血清中にみられるポリクローナル抗体である。幾つかの実施形態において、非特異的抗体は、試料中に存在しないタンパク質に対するモノクローナル抗体である。幾つかの実施形態において、イメージャー部分は、ドッキング部分を直接的に結合する。幾つかの実施形態において、イメージャー部分は、ドッキング部分と、中間部分を介して間接的に結合する。
【００１１】
幾つかの実施形態において、組成物は、（ａ）ＭＴＡＢ、（ｂ）ＭＴＡＢに共有結合したドッキング部分、（ｃ）第１のドメインがドッキング部分に特異的に結合することができ、第２のドメインがドッキング部分に特異的に結合することができない、第１のドメイン及び第２のドメインを有する中間部分、を含む。
【００１２】
幾つかの実施形態において、ＭＴＡＢは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、または一価の抗体フラグメントである。幾つかの実施形態において、ドッキング部分及び中間部分は、核酸を含む。幾つかの実施形態において、ドッキング部分は、約５〜２０核酸長、約８〜１５、または約１０〜１２核酸長である。幾つかの実施形態において、中間部分は、約１０〜４０核酸長、約１６〜３０、または約２０〜２４核酸長である。
【００１３】
幾つかの実施形態において、交換イメージングのための試薬を作製する方法は、（ａ）ＭＴＡＢを用意すること、（ｂ）ＭＴＡＢをドッキング部分にコンジュゲートさせてＭＴＡＢ−ＤＭを形成すること、（ｃ）それぞれ、ドッキング部分に特異的に結合することができる第１のドメインとドッキング部分に特異的に結合することができない第２のドメインとを有する、複数の中間部分を用意すること、（ｄ）複数の中間部分をＭＴＡＢ−ＤＭと化合すること、を含む。
【００１４】
幾つかの実施形態において、ＭＴＡＢは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、または一価の抗体フラグメントである。幾つかの実施形態において、ドッキング部分及び中間部分は、核酸を含む。幾つかの実施形態において、ドッキング部分は、約５〜２０核酸長、約８〜１５、または約１０〜１２核酸長である。幾つかの実施形態において、中間部分は、約１０〜４０核酸長、約１６〜３０、または約２０〜２４核酸長である。幾つかの実施形態において、複数の中間部分は、１つのバッチ反応中でＭＴＡＢ−ＤＭと化合される。幾つかの実施形態において、複数の中間部分は、個々にＭＴＡＢ−ＤＭと化合される。
【００１５】
幾つかの実施形態において、試料中の少なくとも２つの標的の交換イメージングのためのキットは、（ａ）ＭＴＡＢと、イメージャー部分を特異的に結合することができるドッキング部分とを含む、少なくとも２つの異なるＭＴＡＢ−ＤＭ試薬、（ｂ）場合によって、少なくとも２つの異なる標的認識抗体、（ｃ）観察可能部分で標識され、個々にＭＴＡＢ−ＤＭ試薬に特異的に結合することができる、少なくとも２つのイメージャー部分、（ｄ）場合によって、いずれの標的にも特異的に結合しない少なくとも１つの抗体、を含む。
【００１６】
幾つかの実施形態において、ＭＴＡＢは、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、または抗体の一価のフラグメントから選択される。幾つかの実施形態において、ドッキング部分は核酸ドッキング部分であり、イメージャー部分は核酸イメージャー部分である。幾つかの実施形態において、ドッキング部分はタンパク質、ペプチド、または化合物であり、イメージャー部分は相補的なタンパク質、ペプチド、または化合物である。幾つかの実施形態において、ドッキング部分及びイメージャー部分は、それぞれ、いずれかの順で、ストレプトアビジン及びビオチンである。幾つかの実施形態において、ＭＴＡＢ及びドッキング部分は、ストレプトアビジン、またはＳＮＡＰ−Ｔａｇ（登録商標）、ＣＬＩＰ−Ｔａｇ（商標）、Ｈａｌｏ−Ｔａｇ（登録商標）及びＡｖｉ−Ｔａｇ（商標）などのコンジュゲーションドッキング部分を使用することによりコンジュゲートされる。幾つかの実施形態において、ＭＴＡＢ−ＤＭは、少なくとも２つの異なる標的認識抗体を約１ｆＭ〜１ｎＭの親和性で結合することができる。幾つかの実施形態において、観察可能部分は、光学的に観察可能な部分である。幾つかの実施形態において、観察可能部分は、Ｐ−ｄｏｔ、蛍光タンパク質、蛍光核酸、Ｑ−ｄｏｔ、ナノ粒子、またはＳＥＲＳレポーターである。幾つかの実施形態において、交換イメージングのための方法は、本明細書に記載の試薬を用いる。
【００１７】
さらなる目的及び利点は、以下の説明の中で部分的に記載するものとし、部分的に、説明から明らかとなるか、または実施により理解されうる。この目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘された要素及び組合せの手段によって実現、達成されるものである。
【００１８】
上述の全般的説明、及び以下の詳細な説明はいずれも、例示的及び説明的であるに過ぎず、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【００１９】
本明細書に組み入れられ、その一部を構成する添付図面は、一（幾つかの）実施形態（複数可）を示し、説明と共に、本明細書に記載の原理を説明するのに役立つものである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】２つの標的を標識するためのＭＴＡＢ−ＤＭの実施形態を示す図である。標的１に対する抗体は、結合端に三角形状を有し、標的２に対する抗体は、結合端に半円形状を有する。黒の長方形は、ＭＴＡＢ及びを表し、配列尾部はドッキング部分を表す。
【図２】ＭＴＡＢ−ＤＭの使用において精製を回避する一戦略を示す図である。非特異的抗体は、結合端に平らな形状を有し、図１で説明したその他の特徴を有する。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、ドッキング部分のイメージャー部分への直接的及び間接的結合を示す図である。図３Ａでは、ドッキング部分がイメージャー部分に直接的に結合している。図３Ｂでは、ドッキング部分が中間部分に結合し、中間部分がイメージャー部分に結合している。
【図４】２段階染色及び順次染色を使用するＤＮＡ交換イメージングの例示的実施形態を示す図である。
【図５】実施例１に対応した、ＭＴＡＢとしてＦａｂを、またドッキング部分としてＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用する実現可能性を示す画像である。
【図６】実施例２に対応した、Ａｌｅｘａ４８８標識抗体：ＴＯＭ２０（ミトコンドリアマーカー）標的ＭＴＡＢ−ＤＭ複合体、及びＡｌｅｘａ６４７標識抗体：ラミンＢ（核膜マーカー）標的ＭＴＡＢ−ＤＭ複合体で染色したＨｅＬａ細胞の画像である。ＦＩＴＣチャネル（Ａ）及びＣｙ５チャネル（Ｂ）の画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
配列の説明
表１は、本出願で言及した特定の配列を説明する。
【表１】
2019526034.tif 000002
2019526034.tif 000003
2019526034.tif 000004
【００２２】
Ｉ．ドッキング部分を標的認識抗体に付着する改良された方法を使用する多重イメージング
ドッキング部分を標的認識抗体に付着する改良された方法を使用する多重イメージングを、本明細書に記載する。いったんドッキング部分を標的認識抗体へ付着してしまえば、ドッキング部分で標識された抗体は様々な超解像または標準的な解像イメージングにおいて使用することができる。
【００２３】
例えば、状況によって、多重イメージングは、超解像イメージングであってもよい。あるクラスの超解像イメージング技術は確率的超解像と呼ばれ、これは、蛍光標識からの点滅シグナルまたは明滅シグナルを含有する画像を特徴とする。確率的超解像は、データの処理方法によって、１分子局在化顕微鏡法（ＳＭＬＭ）と超解像光学ゆらぎイメージング（ｓｕｐｅｒ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｌｕｃｔｕａｔｉｏｎ  ｉｍａｇｉｎｇ）（ＳＯＦＩ）とに分けることができる。点滅または明滅反応は、有機色素の光活性化（例えば、確率的光学再構築顕微鏡法またはＳＴＯＲＭとして広く知られる技術において）、蛍光タンパク質の光スイッチング（例えば、光活性化局在性顕微鏡法またはＰＡＬＭとして広く知られる技術において）、及び量子ドットの固有の点滅特性など、幾つかのメカニズムによって得ることができる。
【００２４】
ＰＡＩＮＴ（ナノスケールトポグラフィーイメージングのための点集積（ｐｏｉｎｔ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ））は、溶液中の標的認識分子に付着した観察不可能なドッキング部分と観察可能な分子との間の動的で一過性の非共有結合性相互作用によって生じる、蛍光標識からの点滅シグナルまたは明滅シグナルを実現する、簡単で強力な一技術である。ＰＡＩＮＴをベースとした超解像イメージングは、Ｊｕｎｇｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  １１（３）：３１３−８（２０１４）（参照：ＰＭＩＤ  ２４４８７５８３）によって免疫蛍光法に適用されており、標的認識分子として抗体を使用する。ここでは、我々は本技術をＰＡＩＮＴベース超解像免疫蛍光法（ＰＳＲＩＦ）と称する。
【００２５】
これらのイメージング方法のいずれにおいても、（ａ）ドッキング部分を標的認識抗体に直接的に付着すること、または（ｂ）標的認識抗体とそれらを標識することができる二次抗体（１つのマウス標的認識抗体と１つのウサギ抗マウス二次抗体、１つのラット標的認識抗体と１つのウサギ抗ラット二次抗体など）との間に１：１の対応があるように標的認識抗体の数及びタイプを限定することに代えて、一価の強固な抗体結合剤（ＭＴＡＢ）を使用して、ドッキング部分を標的認識抗体に間接的に付着してもよい。ＭＴＡＢ、及びそれらの標的認識抗体に対する親和性は、下記の第Ｉ節Ａで説明する。図１（ステップ１ａ及び１ｂ）に示すように、異なる標的認識抗体を、同時にそれらの対応するＭＴＡＢ−ＤＭと複合体形成させることによって、異なるドッキング部分を異なる標的認識抗体に導入することができる。
【００２６】
Ａ．一価の強固な抗体結合剤
幾つかの実施形態において、一価の強固な抗体結合剤（ＭＴＡＢ）を使用して、ドッキング部分を標的認識抗体に付着してもよい。ＭＴＡＢは、プロテインＡ、プロテインＧ、ならびに他の抗体の定常領域（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ）に対する一価のモノクローナル及びポリクローナル抗体を含む。プロテインＡ及びプロテインＧは、免疫グロブリンを結合することが知られている細菌由来のタンパク質である。ＭＴＡＢのこれらの種類については、下記にてさらに個々に説明する。
【００２７】
解離定数（Ｋｄ）で測定した、ＭＴＡＢの標的認識抗体への親和性は、約１ｆＭ〜１ｎＭ、約１ｆＭ〜１ｐＭ、または約１ｐＭ〜１ｎＭの範囲であってもよい。幾つかの実施形態において、Ｋｄ値は、約１ｆＭ以下、１０ｆＭ、１００ｆＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、または１ｎＭであってもよい。任意の特定のイメージング実験で使用する標的認識抗体に対するＭＴＡＢ候補物質の親和性は、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、等温滴定熱量測定、ならびに結合速度及び／または解離速度を測定する蛍光ベースのアッセイによって評価してもよい。あるＭＴＡＢをある標的認識抗体と組み合わせてもよいかどうかを評価するためのその他の選択肢については、下記の第Ｉ節．Ｃで論じる。
【００２８】
標的認識抗体のタイプによって、異なるＭＴＡＢを選択してもよい。この点について表２に教示する。次の表は、様々な免疫グロブリンタイプに対するプロテインＡ及びプロテインＧの親和性に関する情報を提供する。
【表２】
2019526034.tif 000005
【００２９】
本出願において、ＭＴＡＢは一価である。これは、ＭＴＡＢの１分子が標的認識抗体の１分子だけを結合することを意味する。したがって、全長の二次抗体は、ＭＴＡＢにはなり得ない。これは、全長の二次抗体の１分子は、同時に２つの標的認識一次抗体を結合することができ、一次抗体の１分子は、二次抗体（二次抗体がモノクローナル、オリゴクローナル、またはポリクローナルのいずれであっても）の複数の分子によって同時に結合されることができるためである。さらに、かかる多価相互作用は、試料を通過できない高分子量複合体を創出しうる可能性がある。
【００３０】
１．プロテインＡ
プロテインＡは、３ヘリックスバンドルにフォールディングする５つの相同なＩｇ結合ドメインから構成される。各ドメインは、多くの哺乳動物種由来のタンパク質を結合することができ、中でも突出してＩｇＧを結合する。各ドメインはまた、ほとんどの免疫グロブリンのＦｃ領域内の重鎖、及び一部の抗体のＦａｂ領域内の重鎖も結合する。十分に特徴づけされたプロテインＡの一種はＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ由来であるが、その他のプロテインＡ供給源を用いてもよい。プロテインＡは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓから分離してもよく、または遺伝子組換えによって作製してもよい。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＰｒｏｔｅｉｎＡがＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから利用することができる。プロテインＡの断片、変異体、及び誘導体もまた、それらが標的認識抗体に十分に結合する限りは使用してもよく、全長プロテインＡという用語が使用されていない限り、プロテインＡという用語へのあらゆる言及において含まれる。
【００３１】
プロテインＡは、十分に特徴づけされたタンパク質であり、（全長型、断片のいずれであっても）その免疫グロブリンＦｃドメインに結合する能力は当技術分野で理解されている。Ｇｒａｉｌｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＭ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｓｕｐｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，ＰＮＡＳ  ９７（１０）：５３９９−５４０４（２０００）を参照されたい。場合によっては、プロテインＡは、ドメインＤのらせんＩＩ及びＩＩＩを含む。したがって、適切なプロテインＡは、標的認識抗体が選択された後に選択されうる。
【００３２】
プロテインＡの配列を、配列番号９として示す。プロテインＡという用語は、ポリペプチドの全長を通して配列番号９と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である任意のポリペプチドを含む（より短い配列がその全長を通してパーセント相同性を満たしていれば、より短い配列を含むことを意味する）。幾つかの実施形態において、プロテインＡの断片は、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００アミノ酸長であってもよい。
【００３３】
化学的修飾を受けたプロテインＡなどのプロテインＡの誘導体もまた、本明細書では含んでもよい。
【００３４】
２．プロテインＧ
プロテインＡと同様に、プロテインＧは、免疫グロブリンに結合する、細菌によって産生されたタンパク質である。プロテインＧは、Ｃ群及びＧ群レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａ）によって産生され、抗体のＦａｂ及びＦｃ領域に結合する。プロテインＧはまた、アルブミン及び細胞表面にも結合し、したがって、アルブミン及び細胞表面結合部位を欠く組換え体で利用することができる。プロテインＧの断片、変異体、及び誘導体もまた、それらが標的認識抗体に十分に結合する限りは使用してもよく、全長プロテインＧという用語が使用されていない限り、プロテインＧという用語へのあらゆる言及において含まれる。幾つかの実施形態において、アルブミン結合部位を欠く組換えプロテインＧを用いてもよい。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＰｒｏｔｅｉｎＧは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから利用することができ、アルブミン及び細胞表面結合ドメインをいずれも欠いている。
【００３５】
プロテインＧは、十分に特徴づけされたタンパク質であり、（全長型、断片のいずれであっても）その免疫グロブリンＦｃドメインに結合する能力は当技術分野で理解されている。Ｓｊｏｂｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ，ＪＢＣ  ２６６（１）：３９９−４０５（１９９１）を参照されたい。幾つかの実施形態において、プロテインＧは、プロテインＧのＣ１ドメインを含む。したがって、適切なプロテインＧは、標的認識抗体が選択された後に選択されうる。
【００３６】
プロテインＧの配列を、配列番号１０として示す。プロテインＧという用語は、ポリペプチドの全長を通して配列番号１０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である任意のポリペプチドを含む（より短い配列がその全長を通してパーセント相同性を満たしていれば、より短い配列を含むことを意味する）。幾つかの実施形態において、プロテインＧの断片は、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００アミノ酸長であってもよい。
【００３７】
化学的修飾を受けたプロテインＧを含むプロテインＧの誘導体もまた、本明細書では含んでもよい。
【００３８】
３．プロテインＡ／Ｇ
プロテインＡ／Ｇは、プロテインＡ及びプロテインＧの両方のＩｇＧ結合ドメインを合わせもつ組換え融合タンパク質である。全長プロテインＡ／Ｇは、プロテインＡ由来の４つのＦｃ結合ドメイン、及びプロテインＧ由来の２つのＦｃ結合ドメインを含有する。プロテインＡ／Ｇは、ヒトＩｇＧのすべてのサブクラスに結合するため、サブクラスが決定されていない抗体への結合に有用である。
【００３９】
プロテインＡ／Ｇの断片、変異体、及び誘導体もまた、それらが標的認識抗体に十分に結合する限りは使用してもよく、全長プロテインＡ／Ｇという用語が使用されていない限り、プロテインＡ／Ｇという用語へのあらゆる言及において含まれる。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＰｒｏｔｅｉｎＡ／ＧがＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから利用することができる。化学的修飾を受けたプロテインＡ／Ｇを含むプロテインＡ／Ｇの誘導体もまた、本明細書では含んでもよい。
【００４０】
４．プロテインＬ
プロテインＬは、免疫グロブリンに結合する、細菌によって産生される別のタンパク質である。プロテインＬは、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓによって産生され、Ｌ鎖相互作用を介して免疫グロブリンに結合し、そこからその名前が提案された。プロテインＬの断片、変異体、及び誘導体は、それらが標的認識抗体に十分に結合する限りは使用してもよく、全長プロテインＬという用語が使用されていない限り、プロテインＬという用語へのあらゆる言及において含まれる。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＰｒｏｔｅｉｎＬがＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから使用することができる。プロテインＬは、カッパー軽鎖を含有する抗体に結合する。
【００４１】
プロテインＬは、十分に特徴づけされたタンパク質であり、（全長型、断片のいずれであっても）その免疫グロブリンＦｃドメインへ結合する能力は当技術分野で理解されている。Ｋａｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｒｅｐｅａｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｄｏｍａｉｎ，ＪＢＣ  ２６７（１８）：１２８２０−１２８２５（１９９２）を参照されたい。幾つかの実施形態において、プロテインＬは、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのＢドメインの反復を含む。したがって、適切なプロテインＬは、標的認識抗体が選択された後に選択されうる。
【００４２】
プロテインＬの配列を、配列番号１１として示す。プロテインＬという用語は、ポリペプチドの全長を通して配列番号１１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である任意のポリペプチドを含む（より短い配列がその全長を通してパーセント相同性を満たしていれば、より短い配列を含むことを意味する）。幾つかの実施形態において、プロテインＬの断片は、少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、９００、または９５０アミノ酸長であってもよい。
【００４３】
化学的修飾を受けたプロテインＬを含むプロテインＬの誘導体もまた、本明細書では含んでもよい。
【００４４】
５．抗体の一価のフラグメントまたは誘導体
一価抗体もまた、当該標的認識抗体に十分に結合する限りは使用してもよい。この用語は、抗体の可変領域を含むなんらかのフラグメントを含むあらゆる一価の抗体形態を含む。これらは、抗体のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、及びｓｃＦｖフラグメントを含むが、それだけに限定されない。標的認識抗体に対する二次抗体の一価のフラグメントは、ＭＴＡＢとして用いてもよい。例えば、標的認識抗体がマウス抗体である場合、ウサギ抗マウス抗体の一価のフラグメントまたは誘導体をＭＴＡＢとして用いてもよい。かかる抗体フラグメントＭＴＡＢは、完全な抗体から酵素的に分断してもよく、または遺伝子組換えによって調製してもよい。
Ｂ．ドッキング部分
【００４５】
ドッキング部分（またはＤＭ）は、上で論じたように、容易に標的認識抗体と複合体形成ができるように、ＭＴＡＢに結合させてもよい。
【００４６】
幾つかの実施形態において、ドッキング部分は核酸を含む。ドッキング部分が核酸である場合、ドッキング鎖とも記述してもよい。幾つかの実施形態において、核酸は、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体などの一本鎖の核酸である。核酸類似体は、改変されたリン酸骨格、改変されたペントース糖、及び／または改変された核酸塩基を含んでもよい。核酸類似体は、２’−Ｏ−メチルリボ核酸、２’−フルオロリボ核酸、ペプチド核酸、モノホリノ及びロックド核酸、グリコール核酸、ならびにトレオース核酸を含んでもよいが、それだけに限定されない。
【００４７】
幾つかの実施形態において、ドッキング部分は、一本鎖の核酸を含み、約５〜２０核酸長、約８〜１５、または約１０〜１２核酸長であってもよい。幾つかの実施形態において、ドッキング部分は、約５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、または２０核酸長である。
【００４８】
幾つかの実施形態において、ドッキング部分は、タンパク質、ペプチド、または化合物である。下記第Ｉ節Ｆ．１に記述するように、ドッキング部分として作用しうる多くのタンパク質及びタンパク質のドメインは、イメージャー部分として作用しうるその他のタンパク質、ドメイン、またはペプチドと相互作用することが知られている。最も知られているドメインの一部としては、ＳＨ２、ＳＨ３、及びＷＤ４０ドメインが挙げられる。ほとんどの場合、これらのタンパク質及びドメインの結合相手は既知であり、遺伝子操作して所望の親和性を得ることできる。場合によっては、ある生物（例えば酵母菌）由来の天然の結合ペアを用いて、別の生物（例えばヒト）由来の試料を調べて交差相互作用を回避することができる。多くの化合物は、他の化合物またはタンパク質と特異的に相互作用することができ、その親和性は、この状況にそのまま好適である、または遺伝子操作して好適とすることができる。例えば、ビオチンとアビジン／ストレプトアビジンは、十分な特異性をもって相互作用する。ジゴキシゲニン、フルオレセイン、タクロリムス、及びラパマイシンなどの多くのその他の化合物もまた、周知の結合相手を有する。
【００４９】
１．間接的コンジュゲーション
図３Ｂに示した実施形態など、幾つかの実施形態において、ドッキング部分は、中間部分を介するなどして間接的にイメージャー部分に結合することができる。例えば、ドッキング部分及びイメージャー部分が核酸である場合、中間部分がドッキング部分に相補的な第１の領域とイメージャー部分に相補的な第２の領域とを有する限りは、核酸を含む中間部分を用いてもよい。この実施形態では、ドッキング部分がイメージャー部分に相補的である必要はない。汎用のドッキング部分を使用することは、ＭＴＡＢ−ＤＭを１つのタイプのみの調製が求められ、合成するのが容易であり、ドッキング部分が核酸ドッキング部分である場合、中間部分として非常に安価なオリゴヌクレオチドを使用することできるという利点を提供することができる。
【００５０】
したがって、幾つかの実施形態において、組成物は、ＭＴＡＢ、ＭＴＡＢに結合したドッキング部分（場合によって共有結合した）、ならびに、第１のドメインがドッキング部分を特異的に結合することができ、第２のドメインがドッキング部分に特異的に結合することができない、第１のドメイン及び第２のドメインを有する中間部分を含む。
【００５１】
さらに、幾つかの実施形態において、交換イメージングのための試薬を作製する方法は、ＭＴＡＢを用意すること；ＭＴＡＢをドッキング部分にコンジュゲートさせてＭＴＡＢ−ＤＭを形成すること（場合によって共有結合で）；それぞれ、ドッキング部分に特異的に結合することができる第１のドメインとドッキング部分に特異的に結合できない第２のドメインとを有する、複数の中間部分を用意すること；複数の中間部分をＭＴＡＢ−ＤＭと化合すること、を含む。幾つかの実施形態において、複数の中間部分は、１つのバッチ反応中でＭＴＡＢ−ＤＭと化合される。これによって、ＭＴＡＢ−ＤＭ：中間部分の混合集団が得られる。幾つかの実施形態において、複数の中間部分は、同時に別々に組合せて、ＭＴＡＢ−ＤＭと化合される。これによって、多様な、ＭＴＡＢ−ＤＭ：中間部分の実質的に均一な集団が得られる。
【００５２】
幾つかの実施形態において、中間部分は、約１０〜４０核酸長、約１６〜３０、または約２０〜２４核酸長である
【００５３】
Ｃ．ＭＴＡＢ−ＤＭが所定の抗体と使用できるかどうかを決定する
多くのＭＴＡＢ候補物質（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＡ／Ｇ、及びポリクローナルＦａｂ）は、Ａｂｃａｍ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、及びＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒなどの供給業者から市販されている。さらに、一部のＭＴＡＢ候補物質は、市販の前駆体から作製することができる。例えば、ポリクローナルＦａｂ’は、ＤＴＴなどの還元剤でポリクローナルＦ（ａｂ’）２（順次市販されている）を還元するによって作製することができる（Ｃｒｉｖｉａｎｕ−Ｇａｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆａｂ’  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｆｒｏｍ  Ｆ（ａｂ）２  ｕｎｉｔｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ２：２３−２８（２０１５））。これらのＭＴＡＢ候補物質を使用してドッキング部分（第Ｉ節Ｄを参照されたい）とコンジュゲートして、ＭＴＡＢ−ＤＭ候補物質を形成することができる。
【００５４】
ＭＴＡＢ−ＤＭには多くの選択肢があるものの、複数のタイプのタンパク質がＭＴＡＢとして作用しうるため、所与の抗体に対して、選択したＭＴＡＢ−ＤＭが好適であることを確証することが重要である。これは、２つの基準を満たしうることを意味する。第１に、幾つかの実施形態において、ＭＴＡＢ−ＤＭの結合によって、標的を強固に結合する抗体の能力が失われないことである。第２に、幾つかの実施形態において、ＭＴＡＢ−ＤＭが、実験の間、抗体：ＭＴＡＢ−ＤＭ複合体が有意なレベルまで解離しない十分な親和性をもって抗体を結合することである。
【００５５】
第２の基準に関して、解離レベルの低下によって利点が得られるとはいえ、解離の許容レベルは適用によって異なる。適用が定性的である場合、標的は大量である、または、検出方法は十分な感受性があり、抗体：ＭＴＡＢ−ＤＭ複合体が残存する少量の分画でも検出すことができる。したがって、解離の許容レベルは、８０％超であってもよい。対照的に、より定量的な適用においては、標的存在量が少ない場合、または検出方法の感受性が高くない場合、解離の許容レベルは５％未満であってもよい。幾つかの実施形態において、ＭＴＡＢ−ＤＭの約１％以下、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％が、イメージングの間に標的認識抗体から解離する。
【００５６】
一部の抗体に対するＭＴＡＢとして作用しうる一部のタンパク質は、その他の抗体に対するＭＴＡＢとして作用しえないことは周知のことである。例えば、プロテインＡは、ウサギＩｇＧを強固に結合するが、マウスＩｇＧ１はほとんど結合しないことが知られている。既知の結合基準に頼ることに加えて、ＭＴＡＢとして作用するタンパク質の適性が不明である場合は、簡単な実験で調べることができる。
【００５７】
事前に指定した抗体及び事前に指定した適用を与えて、ＭＴＡＢ−ＤＭが抗体と十分を強固に結合しうるかどうかを簡単な方法で実験的に評価することができる。（１）一次抗体の特性が、一次抗体染色には温度Ｔｅｍｐ−ＸでＸ時間がかかると規定すること、（２）適用が、抗体：ＭＴＡＢ−ＤＭ複合体を洗浄した後、標的をイメージングする前に、その他のステップにさらに温度Ｔｅｍｐ−ＹでＹ時間が必要であると規定すること、（３）適用が、解離の最大許容レベルはＺ％であると規定すること、及び（４）ドッキング部分とイメージャー部分との間の親和性は十分に高いことが予め決定されている（例えば、当業者に既知の多くの方法のいずれか１つを使用して、温度Ｔｅｍｐ−ＸでＸ時間及び温度Ｔｅｍｐ−ＹでＹ時間の後、解離は僅かであると予想する）こと、を仮定して、下記の実施例３及び／または４のプロトコールを使用して、ＭＴＡＢ−ＤＭが抗体を十分に安定して結合するかどうかを調べることができる。
【００５８】
Ｄ．ドッキング部分をＭＴＡＢにコンジュゲートするための方法
ＭＴＡＢをドッキング部分にコンジュゲートして、ＭＴＡＢ−ＤＭコンジュゲートを形成してもよい。
【００５９】
ＭＴＡＢとして機能しうるタンパク質を含む、ほとんどのタンパク質は、その表面に（側鎖上に第一級アミン基を含有する）リジン残基を有する。この場合、アミン反応性架橋剤を使用して、ドッキング部分をＭＴＡＢにコンジュゲートすることができる。幾つかの実施形態において、連結は、二官能性架橋剤を使用して達成してもよい。例えば、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ＳＭ（ＰＥＧ）２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃａｔ＃  ２２１０２）などを使用して、ＭＴＡＢ上のリジン残基を、チオール含有ドッキング部分（例えば、ドッキング部分がペプチドでシステインを含有する場合）またはチオール修飾ドッキング部分（例えば、チオール修飾オリゴヌクレオチド）上のチオール基と連結させることができる。別法として、アジド−ＮＨＳエステル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃａｔ＃  ８８９０２）を使用して、アジド基をＭＴＡＢのリジン残基に導入し、ドッキング部分をアルキン基で修飾し、銅の助けをかりるクリックケミストリーを用いてアジド基とアルキン基を連結してもよい。
【００６０】
多くのタンパク質はまた、システイン残基の一部として、コンジュゲーションの取っ手として使用できるチオール基を表面に有する。ＳＭＣＣ、ＳＭ（ＰＥＧ）２などを使用して、ＭＴＡＢのチオール基と、アミン含有ドッキング部分上のアミン基（例えば、ドッキング部分がペプチドで、リジンまたはＮ末端アミンを含有する場合）またはアミン修飾ドッキング部分（例えば、アミン修飾オリゴヌクレオチド）とを連結することができる。同様に、Ａｚｉｄｏ−ＰＥＧ３−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔ＃  ｓｃ−４９６４０４）、Ａｚｉｄｅ−ＰＥＧ４−マレイミド（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ  Ｃａｔ＃  ＡＺ１０７２５）などを使用して、アジド基をＭＴＡＢのシステイン残基に導入し、ドッキング部分をアルキン基で修飾し、銅の助けをかりるクリックケミストリーを用いてアジド基とアルキン基を連結してもよい。
【００６１】
遺伝子組換えによってＭＴＡＢを作製する場合、オリゴヌクレオチドドッキング部分へのコンジュゲーションを容易にするために、ストレプトアビジン（またはその誘導体もしくは関連タンパク質）などの別のコンジュゲーションし易いコンジュゲーションタグタンパク質、またはＳＮＡＰ−ｔａｇ（登録商標）、ＣＬＩＰ−ｔａｇ（商標）、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）、及びＡｖｉＴａｇ（商標）などの市販されているコンジュゲーションドッキング部分を融合することができる。
【００６２】
Ｅ．標的認識抗体
標的認識抗体とは、全長抗体と、標的分子を検出するために使用することができる抗体様分子、及びＭＴＡＢの結合のためのドメインを含有する、抗体のあらゆる遺伝子操作されたバリエーションまたはフラグメントを含む、全長抗体の抗原結合フラグメントとの両方を指す。例えば、単鎖抗体、ｓｃＦｖ−Ｆｃｓなどを標的認識抗体として用いてもよい。抗体とは、標的分子を特異的に認識することができる、あらゆる種由来のあらゆる免疫グロブリンを指す。したがって、全長抗体という用語が使用されない限り、抗体という用語は、ＭＴＡＢの結合のためのドメインを含有する、抗体の抗原結合フラグメントを含む。
【００６３】
当業者は、試料中の標的を特定した後、その標的に対する抗体を生成するか、市販の抗体を見つけるかのどちらかができる。血清精製抗体または組換え抗体のどちらを用いてもよい。これらの実施形態において標的認識抗体として作用しうる一次抗体は、様々な販売業者によって豊富に提供されており、Ａｂｃａｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなどの供給業者、及びＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＰｉｅｒｃｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓからの広く多数の標的に対して利用可能な一次抗体が含まれる。
【００６４】
幾つかの実施形態において、すべての標的認識抗体を試料に適用して、試料を同時に染色することができる。抗体のインキュベーションは用いた各標的認識抗体の濃度によって非常に長くなりうるため、これによって最大効率、及び最短の実験時間が得られる。２つ以上の抗体が、そのうちの少なくとも１つが意図する標的に結合することを妨害する場合などの他の実施形態において、これらの抗体は、インキュベーション及び試料への結合ではバッチを別々に分けることができ、イメージングは、同時に試料に適用された複数の標的認識抗体を用いる多重フォーマットでイメージングが起きる少なくとも１つの反応セットと共に、少なくとも２つの反応セットを含みうる。試料への複数の標的認識抗体の同時適用を図１に示す。
【００６５】
Ｆ．イメージャー部分及び観察可能部分
観察可能部分に結合されたイメージャー部分によって、ドッキング部分のイメージングが可能となる。イメージャー部分は、一過性または非一過性のどちらかでドッキング部分に結合してもよい。一過性結合とは、以下のうちの少なくとも１つが当てはまる結合相互作用を指す。（１）結合した複合体の解離速度定数（ｋｏｆｆと表されることが多い）が０．１ｓ−１以上である、または（２）解離定数（Ｋｄ表されることが多い）が１００ｎＭ以上である。非一過性結合とは、結合した複合体の解離速度定数（ｋｏｆｆ）が０．１ｓ−１未満であり、解離定数（Ｋｄ）が１００ｎＭ未満である、結合相互作用を指す。一過性及び非一過性の結合に関する選択肢については、米国仮出願第６２／３２７，６０４号の中でさらに論じられている。
【００６６】
１．イメージャー部分
イメージャー部分は、第Ｉ節Ｂで上述したように、ドッキング部分に特異的に結合することができる。ドッキング部分が核酸である場合、イメージャー部分もまた核酸を含む。イメージャー部分が核酸を含んでなる場合、イメージャー部分はイメージャー鎖とも記述してもよい。幾つかの実施形態において、核酸は、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡまたは核酸類似体などの一本鎖の核酸である。核酸類似体は、改変されたリン酸骨格、改変されたペントース糖、及び／または改変された核酸塩基を含んでもよい。核酸類似体は、２’−Ｏ−メチルリボ核酸、２’−フルオロリボ核酸、ペプチド核酸、モノホリノ及びロックド核酸、グリコール核酸、及びトレオース核酸を含んでもよいが、それだけに限定されない。
【００６７】
特異的な結合によって、ドッキング部分及びイメージャー部分が核酸である場合、それらを高イオン強度緩衝液条件下でハイブリダイズしてもよく、例えば、室温で高イオン強度緩衝液条件（例えば、１×生理的食塩クエン酸ナトリウム緩衝液、または１５０ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、または６００ｍＭ塩化ナトリウムのリン酸緩衝液）を用いて、ハイブリダイゼーションを評価してもよい。
【００６８】
幾つかの実施形態において、イメージャー部分は、一本鎖の核酸を含み、約５〜２０核酸長、約８〜１５、または約１０〜１２核酸長であってもよい。幾つかの実施形態において、イメージャー部分は、約５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、または２０核酸長である。
【００６９】
幾つかの実施形態において、イメージャー部分は、上記の第Ｉ節Ｂで論じたドッキング部分選択肢に対する相手として、タンパク質、ペプチド、または化合物である。
【００７０】
幾つかの実施形態において、ドッキング部分は、中間部分を介するなどして間接的にイメージャー部分に結合してもよい。例えば、ドッキング部分及びイメージャー部分が核酸である場合、中間部分がドッキング部分に相補的な第１の領域とイメージャー部分に相補的な第２の領域とを有する限りは、核酸を含む中間部分を用いてもよい。この実施形態において、ドッキング部分はイメージャー部分に相補的である必要はない。
【００７１】
例えば、表３では、異なる標的認識抗体の標識に用いることができる以下のドッキング部分とイメージャー部分とのペアを示す。ここでは、ドッキング部分１とイメージャー部分１がペアを組むなどとする。その他の同様のペアも容易に調製することができる。
【表３】
2019526034.tif 000006
【００７２】
２．観察可能部分
様々な観察可能部分を、本明細書に記載のイメージャー部分に固定してもよい。幾つかの実施形態において、任意の観察可能部分を用いてもよく、幾つかの実施形態において、観察可能部分は光学的に観察可能である。観察可能部分は、シグナルを吸収またはシグナルを放出することができる。シグナルを放出する分子のうち、それだけに限定されないがフルオレセイン、ローダミン、シアニン色素、Ａｌｅｘａ色素、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）色素、Ａｔｔｏ色素などのフルオロフォアを含む、有機低分子などの蛍光を発する分子を用いてもよいが、それだけに限定されない。
【００７３】
幾つかの実施形態において、Ｐ−ｄｏｔなどの有機ポリマーを用いてもよい。幾つかの実施形態において、観察可能部分は、蛍光タンパク質または蛍光核酸（Ｓｐｉｎａｃｈ及びその誘導体を含む蛍光ＲＮＡを含む）を含む生物学的分子であってもよいが、それだけに限定されない。幾つかの実施形態において、観察可能部分は、Ｑ−ｄｏｔを含む無機部分であってもよい。幾つかの実施形態において、観察可能部分は、ナノ粒子、及び表面増強ラマン分光（ＳＥＲＳ）レポーター（例えば、４−メルカプト安息香酸、２，７−メルカプト−４−メチルクマリン）など、弾性または非弾性散乱のいずれかの散乱を通して作動する部分であってもよい。幾つかの実施形態において、観察可能部分は、ルテニウム複合体及びルシフェラーゼなどの、化学発光／電気化学発光物質であってもよい。観察可能部分は、光学シグナル、（電磁スペクトル全域にわたる）電磁シグナル、（例えば質量分析によって検出可能な）原子／分子量、（例えば原子間力顕微鏡によって検出可能な）触知可能な集合体、電流、または電圧を発生してもよい。
【００７４】
幾つかの実施形態において、ただ１つのタイプの観察可能部分が、異なるイメージャー部分のすべてに結合されてもよい。このような場合、観察可能部分を有するイメージャー部分１を適用し、イメージングし、洗浄ステップを実施することができ、また、観察可能部分を有するイメージャー部分２を適用し、イメージングするなどすることができる。コンピューターアセンブリーによって、最終画像を得ることができる。
【００７５】
別法として、異なる観察可能部分を、イメージングプロトコールで使用する異なるイメージャー部分の少なくとも幾つかに（またはすべてにも）結合させることができる。これによって、バッチによるイメージングステップ（すべてではないが一部のイメージャー部分が異なる観察可能部分を有する場合）、または単一のイメージングステップ（すべてのイメージャー部分が異なる観察可能部分を有する場合）のいずれかが可能となる。当業者は、実験条件、イメージングのための標的の数、手近にある材料などに適合する、適切な観察可能部分または一連の観察可能部分を選択することができる。
【００７６】
Ｇ．方法ステップ
本明細書に記載したイメージングは、本明細書に記載したような追加のステップ及び構成要素と共に交換イメージングの基本的な概説を行った後に続ける。（１）最初のステップとして、ＭＴＡＢ−ＤＭコンジュゲートを調製する、（２）ＭＴＡＢ−ＤＭを標的認識抗体と化合して、ＭＴＡＢ−ＤＭ：標的認識抗体複合体を形成する（３）ＭＴＡＢ−ＤＭ：標的認識抗体複合体を試料と共にインキュベートした後、任意選択の洗浄ステップを行う、（４）それぞれが特異的にドッキング部分を認識してドッキング部分のすべてまたはサブセットのいずれかを標識する観察可能部分を有するイメージャー部分を適用し、対応する標的をイメージングする、（５）場合によって、ステップ（４）で用いたイメージャー部分のセットを除去、またはかかるイメージャー部分上の観察可能部分を不活性化した後、任意選択の洗浄ステップを行う、及び（６）場合によって、それぞれが特異的にドッキング部分を認識し、観察可能部分を運ぶイメージャー部分の別のセットを使用して、ドッキング部分の別のサブセットを標識し、対応する標的のサブセットをイメージングする。
【００７７】
各イメージャー部分が全く別の観察可能部分で標識されている場合、ステップ（５）及び（６）は不要である。研究者が利用できる観察可能部分の数、及びイメージングされるべき標的の数によって、ステップ（５）及び（６）はまた、繰り返してもよい。場合によっては、ステップ（３）で、ＭＴＡＢ−ＤＭ：標的認識抗体複合体のすべてを一緒にインキュベートし、その他の場合では、ステップ（３）の例のうちの少なくとも１つにおいて一緒にインキュベートされた複数のＭＴＡＢ−ＤＭ：標的認識抗体複合体を用いて、ステップ（３）〜（４）または（３）〜（６）を少なくとも１回繰り返す。
【００７８】
標的認識抗体と試料とをインキュベートするための反応条件は、当技術分野では周知であり、研究者が利用できる標的認識抗体の濃度、試料中に存在する標的の量、標的に対する標的認識抗体の親和性、及び研究者がインキュベーションに取りうる時間を考慮に入れる。染色後に、標準的な洗浄ステップを実施することが多い。
【００７９】
Ｈ．追加の実施形態
１．標的認識抗体の量との関係におけるＭＴＡＢ−ＤＭの量の調整
追加の任意選択の実施形態もまた、標的認識抗体の量との関係におけるＭＴＡＢ−ＤＭの量を調整することによって用いてもよい。
【００８０】
幾つかの実施形態において、標的認識抗体とＭＴＡＢ−ＤＭとの比は、イメージングのためにＭＴＡＢ−ＤＭ及び標的認識抗体を試料に適用する前に、遊離抗体またはＭＴＡＢ−ＤＭが残留しないように調整することができる。イメージングに先立つインキュベーションステップにおいて過剰な遊離抗体が存在すると、シグナルを発生しない一部の遊離抗体が標的に結合することがある。これが起こった場合、遊離抗体がイメージングの全般的なシグナル発生能力を低下させると考えられる。
【００８１】
さらに、第１の標的認識抗体に結合することが意図されるＭＴＡＢ−ＤＭが過剰濃度で存在し、第２の標的認識抗体に結合する（すなわち、違う標的を認識する）場合、シグナルの精度が低下する可能性が発生しうる。したがって、ＭＴＡＢ−ＤＭの濃度、結合部位の数、及び標的認識抗体に対する親和性によって、標的認識抗体１を標識することを意図される一部のＭＴＡＢ−ＤＭ１が、標的認識抗体１へのコンジュゲーションには過剰に存在するか、または解離して、標的認識抗体２への結合に利用できるようになる可能性がある。ＭＴＡＢ−ＤＭ１が標的認識抗体２に結合してしまうと、精度が低下したシグナルが生じうると考えられる。
【００８２】
過剰によって、使用者は、ＭＴＡＢ−ＤＭ調製物がそれぞれの標的認識抗体上に複数の結合部位を有する場合があることを覚えておく必要がある。例えば、一価のポリクローナル抗体がＭＴＡＢとして作用する場合、様々な成分の抗体が、標的認識抗体上の様々な位置に結合する場合がある。
【００８３】
したがって、幾つかの実施形態において、精製ステップには、遊離の標的認識抗体及び／または遊離のＭＴＡＢ−ＤＭを除去することが含まれていてもよい。例えば、ＭＴＡＢ−ＤＭが分子量において抗体より小さい場合、限外濾過またはゲル濾過を使用して、抗体：ＭＴＡＢ−ＤＭ複合体と遊離のＭＴＡＢ−ＤＭとを分離することができる。例えば、ＭＴＡＢがＦａｂドメイン（約５０ｋＤ、約１５０ｋＤである標的認識抗体との比較で）である場合、また、ＭＴＡＢ−ＤＭの非Ｆａｂ部分が累積的に５０ｋＤ未満である場合、これを用いてもよい。場合によって、標的認識抗体が過剰になることを防止するために、これを最初にＭＴＡＢ−ＤＭが過剰に使用されるときに組み合わせてもよい。
【００８４】
２．非特異的抗体の使用
任意選択の実施形態として、非特異的抗体を、本明細書に記載の方法に加えてもよい。抗体：ＭＴＡＢ−ＤＭ相互作用は非共有結合であるため、標的認識抗体の濃度に対して理想量のＭＴＡＢ−ＤＭが存在したとしても、ＭＴＡＢ−ＤＭ分子は、染色、洗浄、及びイメージングの間に、もともと複合体形成していた抗体から解離し、その後、第２の標的に結合した２のタイプの標的認識抗体第に結合することがあり、これによって精度が低下したシグナルが発生する可能性がある。
【００８５】
幾つかの実施形態において、任意選択の精製プロセスの任意選択の代替として、標的認識抗体と競合させる方法でＭＴＡＢ−ＤＭも結合しうる非特異的分子を加えてもよい。ここでは、非特異的抗体は、イメージングされる試料の成分へ特異的に結合することはない。ＭＴＡＢ−ＤＭ分子もともと複合体形成していた抗体から解離している場合、ＭＴＡＢ−ＤＭ分子が溶液中で、異なる標的に結合した抗体に結合するよりも、むしろ標的非特異的分子に結合するように、かかる非特異的抗体を染色、洗浄及び／またはイメージング緩衝液へ添加してもよい。
【００８６】
このような非特異的分子の一例には、標的認識抗体の宿主種由来の正常血清中にみられうる（すなわち、標的タンパク質のいずれかによって免疫化されていない）抗体またはかかる抗体の混合物、またはかかる血清から精製した免疫グロブリン含有タンパク質混合物がある。別法として、試料に関連のないタンパク質に対するモノクローナル抗体を非特異的抗体として用いてもよい。この非特異的抗体は、標的認識抗体との会合後に過剰に存在するか、またはイメージングプロセスの間に標的認識抗体から解離しうるかのどちらかである任意の未結合のＭＴＡＢ−ＤＭに対して、シンクとして作用する。
【００８７】
３．ＭＴＡＢ−ＤＭを使用する２段階染色及び順次染色
さらに、はじめに抗体：ＭＴＡＢ−ＤＭ複合体を作製した後、この複合体で試料を染色する（これによって『１段階染色』と称する戦略）、抗体単独で試料を染色した後、二次抗体のやり方と同じように、ＭＴＡＢ−ＤＭを使用して試料染色しうる、図１及び２に示したワークフローを用いる。この戦略を『２段階染色』と称する。２段階染色では、異なるＭＴＡＢ−ＤＭを用いて試料を同時に染色した場合、ＭＴＡＢ−ＤＭがそれぞれの意図された抗体を特異的に結合することができ、交差結合しないことを保証することができる。例えば、１つのマウス一次抗体及び１つのウサギ一次抗体を用いて試料を染色し、次いで、抗マウスＦａｂを、マウス一次抗体を結合することを意図されたＭＴＡＢ−ＤＭのＭＴＡＢとして用いることができ、抗ウサギＦａｂを、ウサギ一次抗体を結合することを意図されたＭＴＡＢ−ＤＭのＭＴＡＢとして用いることができる。一次抗体が異なるサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂなど）のものである場合も、同様の戦略を用いることができる。
【００８８】
一次抗体が、同じ生物由来の同じサブタイプのものである場合、それらを区別することができるＭＴＡＢを見出すことは不可能または非現実的であると考えられる。この状況で、２段階染色戦略をまだ用いてもよいが、２つの一次抗体を順次使用する。一例として、同じ種の同じアイソタイプの２つの抗体を使用して、かかる順次染色ワークフローの一実施態様を図４に示す。はじめに、第１の標的に対し意図された第１の抗体で試料を染色した後、ＰＢＳで洗浄する。次いで（ステップＡ）、第１の標的に対し意図されたＭＴＡＢ−ＤＭ（例えばＦａｂ−オリゴヌクレオチドコンジュゲート）で試料を染色した後、ＰＢＳ中で洗浄する。次いで（ステップＢ）、後で添加される第２の標的に対し意図されたＭＴＡＢ−ＤＭによって結合されうる、第１の一次抗体上の未占有部位がある場合、これをすべて塞ぐことができる非標識のＭＴＡＢ（例えば、未修飾のＦａｂ、黒の輪郭の角の丸い灰色の長方形で示す）で試料を処理した後、ＰＢＳ中で洗浄する。次に（ステップＣ）、第２の標的に対し意図された第２の一次抗体で試料を染色した後、ＰＢＳで洗浄する。このステップは、その第１の標的に対し意図されたＭＴＡＢ−ＤＭと先に使用した非標識のＭＴＡＢとがいずれも一価であるため、実施することができる。ＭＴＡＢの代わりに従来の二次抗体を使用する場合、第１の一次抗体によって占有されていない可変領域は第２の一次抗体を結合することができ、これは二次抗体の誤った局在化をもたらす。次に（ステップＤ）、第２の標的に対し意図されたＭＴＡＢ−ＤＭで試料を染色する。第１の一次抗体上の利用できる結合部位は、第１の標的に対し意図されたＭＴＡＢ−ＤＭ、またはステップＢで導入した非標識のＭＴＡＢのどちらかによってすでに塞がれているため、このＭＴＡＢ−ＤＭは第２の一次抗体のみ結合し、第１の一次抗体を結合しない。さらに多くの標的を可視化する必要がある場合、対応する一次抗体及びＭＴＡＢ−ＤＭを用いて、ステップＢ、Ｃ、Ｄを繰り返すことができる。
【００８９】
１段階染色及び２段階染色は、同じ試料に対して実施できることを留意されたい。例えば、最初に１段階染色を使用してＭＴＡＢ−ＤＭをある標的のサブセットに導入し、次いで２段階染色を使用してＭＴＡＢ−ＤＭを別の標的のサブセットに導入してもよく、またはその逆も同様に行ってもよい。
【実施例】
【００９０】
実施例１．ＤＮＡコンジュゲートＦａｂフラグメントがＭＴＡＢ−ＤＭとして使用できることの実証
本文書に記載の技術の一実施形態において、ＦａｂフラグメントをＭＴＡＢとして使用し、ＤＮＡオリゴヌクレオチドをドッキング部分として使用する。本実施形態の実現可能性に関する２つの重要な問いは、（ａ）ＭＴＡＢ−ＤＭ：抗体複合体が十分に速く形成しうるかどうかということ、及び（ｂ）ＭＴＡＢ−ＤＭ：抗体複合体が、典型的な免疫蛍光法の適用に対し、十分に安定であるかどうかということである。本実施例は、この問いに答える手順を示し、市販のＦａｂフラグメントとアミン標識ＤＮＡオリゴヌクレオチドとをコンジュゲートすることによって作製したＭＴＡＢ−ＤＭが、素早く一次抗体を結合し、十分に安定な複合体を形成することができることを実証する。ＭＴＡＢ−ＤＭを創製するために、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｔ＃  １１５−００７−００３）をアジド−（ＰＥＧ）４−ＮＨＳ（Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ、Ｃａｔ＃  Ａ１０３Ｐ−５００）とＰＢＳ中で１．５時間混合することによって修飾した（Ｆａｂフラグメント及びアジド−（ＰＥＧ）４−ＮＨＳの最終濃度は、それぞれ１ｍｇ／ｍＬ及び０．１ｍＭである）後、ゲル濾過カラムを使用して緩衝液を交換した。次いで、このアジド−（ＰＥＧ）４修飾Ｆａｂフラグメントを、配列：５’−ＴＣＴＧＣＴＴＴＣＣＣＧ−３’（配列番号１３）を有する５’−ＤＢＣＯ標識オリゴヌクレオチドの過剰量と共に一晩インキュベートして、ＭＴＡＢ−ドッキング部分として作用するＦａｂ−ＤＮＡコンジュゲートを生成した。遊離のＤＢＣＯ標識ＤＮＡは、３０Ｋ分画分子量の限外濾過によって除去した。検出を容易にするために、このＦａｂ−ＤＮＡコンジュゲーションを配列５’−ＴＣＴＧＣＴＴＴＣＣＣＧＴＴＡＴＡＣＡＴＣＴＡ−３’（配列番号１２）を有する５’−ＡＴＴＯ４８８標識オリゴヌクレオチドの過剰量とインキュベートした後、３０Ｋ分画分子量の限外濾過によって未結合のＡＴＴＯ４８８標識オリゴヌクレオチド（配列番号１２）を除去し、ＵＶ分光法及びスペクトル線状分離法を使用して定量化した。この最終複合体を「Ｆａｂ−ＤＮＡ：ＤＮＡ−ＡＴＴＯ４８８」と名づける。
【００９１】
６４．５ｐｍｏｌのＦａｂ−ＤＮＡ：ＤＮＡ−ＡＴＴＯ４８８をマウス抗αチューブリン抗体（クローンＤＭ１Ａ）１．５マイクログラムと１．５時間インキュベートした。次いで、マウス正常血清７．５マイクロリットルをその混合物に添加して標的非特異抗体を供給し、一次抗体（すなわち、マウス抗αチューブリン抗体）に結合されていないＦａｂ−ＤＮＡ：ＤＮＡ−ＡＴＴＯ４８８をクエンチした。次いで、抗体希釈緩衝液（１％ＢＳＡ、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、５ｕＭ（ｄＴ）３０オリゴヌクレオチド含有ＰＢＳ）１３６マイクロリットルを混合物に添加した。この最終混合物を用いて、事前に（３％パラホルムアルデヒド及び０．１％グルタルアルデヒドを１０分間使用する）固定及び（ブロッキング緩衝液：３％ＢＳＡ＋０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳで１．５時間）ブロッキングを行ったＨｅＬａ細胞を、ＬａｂＴｅｋチャンバーで、４℃で一晩染色した。次いで、このＨｅＬａ細胞をＰＢＳで４回、各回５分かけて洗浄し、４８８ｎｍレーザー、及びＦＩＴＣチャネルフィルターキューブを使用してイメージングした。図５に示した画像から、微小管がはっきりと染色されており、これは、（１）１．５時間のインキュベーションが抗体とＭＴＡＢ−ＤＭとの複合体（すなわち、Ｆａｂ−ＤＮＡ：ＤＮＡ−ＡＴＴＯ４８８）形成には十分であり、（２）一晩のインキュベーションの間、抗体：ＭＴＡＢ−ＤＭ複合体のレベルは十分なままであったこと示していることがわかる。
【００９２】
実施例２．抗体：ＭＴＡＢ−ＤＭ複合体の間の交換の欠如
ここに記載の技術を使用して多重免疫蛍光法実施するために、実験の間、ある一次抗体を結合することを意図されたＭＴＡＢ−ＤＭがその一次抗体（またはＭＴＡＢ−ＤＭをクエンチするために使用した標的非特異抗体）から解離して、次いで別の一次抗体に結合することがないことを保証しなければならない。これは、複数のＭＴＡＢが、試料中で使用された多重抗体を結合することができる場合、特に重要である。例えば、異なる標的タンパク質の２つのウサギ一次抗体を使用すべきで（ここでは抗体１と抗体２と名付ける）、２つのＭＴＡＢ−ＤＭ分子（ここではＭＴＡＢ−ＤＭ１及びＭＴＡＢ−ＤＭ２と名付ける）のためのＭＴＡＢとして抗ウサギＦａｂを使用する場合、抗体１及び抗体２を、それぞれ、ＭＴＡＢ−ＤＭ１及びＭＴＡＢ−ＤＭ２と複合体を形成させてもよい。この場合、実験の間、ＭＴＡＢ−ＤＭ１が抗体２を結合しないことを保証しなければならない。このためには、実験中にＭＴＡＢ−ＤＭ：抗体複合体が非常に早く解離しないように、抗体に対するＭＴＡＢ固有の親和性が高くなくてはならないことが必要である。
【００９３】
ＭＴＡＢ−ＤＭの代替物として蛍光標識Ｆａｂフラグメントを使用して、Ｆａｂフラグメントが、一次抗体への固有の親和性を有してこの所望の挙動を達成するどうかを調べた。これを行うために、ここで混合物１及び混合物２と名付ける２つの混合物を調製した。混合物１では、ウサギ抗ＴＯＭ２０抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｃａｔ＃  ＦＬ−１４５）約０．３マイクログラムと、Ａｌｅｘａ４８８標識ヤギ抗ウサギＦｃ（ＩｇＧ）Ｆａｂフラグメント約１．５マイクログラムとを、８マイクロリットルの最終液量で約３時間混合した。混合物２では、ウサギ抗ラミンＢ抗体（Ａｂｃａｍ  Ｃａｔ＃  ａｂ１６０４８）約１．５マイクログラムと、Ａｌｅｘａ６４７標識ヤギ抗ウサギＦｃ（ＩｇＧ）Ｆａｂフラグメントとを、８マイクロリットルの最終液量で約３時間混合した。いずれの混合物とも緩衝液はＰＢＳであった。いずれの混合物でも、一次抗体はウサギが宿主生物であることを留意されたい。次に、ウサギ正常血清１５マイクロリットルを各混合物に添加した。次に、抗体希釈緩衝液（１％ＢＳＡ、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、５ｕＭ（ｄＴ）３０オリゴヌクレオチド含有ＰＢＳ）７５マイクロリットルを各混合物に添加した。次に、この２つの混合物を合わせて、事前に（３％パラホルムアルデヒド及び０．１％グルタルアルデヒドを１０分間使用して）固定及び（ブロッキング緩衝液：３％ＢＳＡ＋０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有ＰＢＳで１．５時間）ブロッキングを行ったＨｅＬａ細胞を、ＬａｂＴｅｋチャンバー中で、４℃で一晩染色した。次いで、このＨｅＬａ細胞をＰＢＳで４回、各回５分かけて洗浄し、（ａ）４８８ｎｍレーザー、及びＦＩＴＣチャネルフィルターキューブ、ならびに（ｂ）約６４２ｎｍレーザー、及びＣｙ５チャネルフィルターキューブを使用してイメージングした。その画像を図６Ａ〜Ｂに示す。ＴＯＭ２０（ミトコンドリアマーカー）が意図された標的で観察可能であるＦＩＴＣチャネルでは、ラミンＢ（核膜マーカー）は観察できないことと、ラミンＢが意図された標的で観察可能であるＣｙ５チャネルでは、ＴＯＭ２０は観察できないこととがわかる。したがって、抗体：ＭＴＡＢ−ＤＭ複合体の間で交換はみられなかったと結論づけることができる。すなわち、Ｆａｂフラグメントは、一次抗体への固有の親和性を十分に有する。
【００９４】
実施例３：標的認識抗体に結合するＭＴＡＢ−ＤＭの評価
以下のプロトコールを用いて、標的認識抗体に結合するＭＴＡＢ−ＤＭの評価、ならびに、どの程度までＭＴＡＢ−ＤＭが標的認識抗体から解離するかを評価してもよい。
【００９５】
（１）事前に固定、透過処理、及び（例えばＢＳＡで）ブロッキングした試料を、所定の最適温度でＸ時間、所定の最適濃度の一次抗体で染色する。Ｘ時間は、研究者が標的認識抗体で試料を染色するために使用すると予定する時間を指す。
【００９６】
（２）試料を、室温で、ＰＢＳで４回、各回５分かけて洗浄する。
【００９７】
（３）抗体を、室温で、１０分間、１００ｎＭのＭＴＡＢ−ＤＭで染色する。
【００９８】
（４）試料を、室温で、ＰＢＳで４回、各回５分かけて洗浄する。
【００９９】
（５）抗体を、室温で、１０分間、１００ｎＭの蛍光標識イメージャー部分で染色する。
【０１００】
（６）試料を、室温で、ＰＢＳで４回、各回５分かけて洗浄する。
【０１０１】
（７）試料をイメージングし、イメージング条件（光強度、フィルターキューブの情報、露光時間）を書き留める。
【０１０２】
（８）試料を、温度Ｔｅｍｐ−ＸでＸ時間、次いで温度Ｔｅｍｐ−ＹでＹ時間、インキュベートする。Ｔｅｍｐ−Ｘ及びＸ時間は、研究者が標的認識抗体で試料を染色するために使用すると予定する温度及び時間を指し、Ｔｅｍｐ−Ｙ及びＹ時間は、標的をイメージングする前で抗体：ＭＴＡＢ−ＤＭ複合体を洗浄する後の温度及び時間を指す。
【０１０３】
（９）ステップ（７）と同じイメージング条件を使用して、試料を再度イメージングする。
【０１０４】
（１０）蛍光画像を定量化し、ステップ（７）及びステップ（９）の画像中の同じ面積の蛍光強度を比較する。
【０１０５】
ＭＴＡＢ−ＤＭの非特異的結合はみられないと仮定して、ステップ（７）のシグナル強度が標準的な免疫蛍光法から予想されるシグナル強度より実質的に（例えば、９０％を超えて）低い場合、またはステップ（９）の画像上の蛍光強度がステップ（７）の画像上の蛍光強度より、所望のパーセント閾値（Ｚ％）を超えるほど低い場合、ＭＴＡＢ−ＤＭの親和性は非常に低いと判断することができる。そうでない場合、ＭＴＡＢ−ＤＭの親和性は十分に高いと判断することができる。
【０１０６】
実施例４：さらなるＭＴＡＢ−ＤＭの検証
実施例３のプロトコールに加えて、本実施例のプロトコールを使用して、ＭＴＡＢ−ＤＭが、ＭＴＡＢ−ＤＭの結合によって標的を強固に結合する抗体の能力が失われないことを保証することさらに検証してもよい。
【０１０７】
（１）一次抗体１．５ｕｇを、過剰量のＭＴＡＢ−ＤＭと１時間混合する。
【０１０８】
（２）過剰量の標的非特異抗体を加えて、１時間、未結合のＭＴＡＢ−ＤＭをクエンチし、次いで、液量が試料を十分に覆うが１５０ｕＬ未満であるように、混合物をＰＢＳで希釈する。
【０１０９】
（３）混合物を、事前に固定、透過処理、及びブロッキングした試料に適用し、温度Ｔｅｍｐ−ＸでＸ時間、室温でインキュベートする。Ｔｅｍｐ−Ｘ及びＸ時間は、研究者が標的認識抗体で試料を染色するために使用すると予定する温度及び時間を指す。
【０１１０】
（４）試料を、室温で、ＰＢＳで４回、各回５分かけて洗浄する。
【０１１１】
（５）１００ｎＭの蛍光標識イメージャー部分を試料に適用し、１０分間インキュベートする。
【０１１２】
（６）試料を、室温で、ＰＢＳで４回、各回５分かけて洗浄する。
【０１１３】
（７）試料をイメージングし、イメージング条件（光強度、フィルターキューブの情報、露光時間）を書き留める。
【０１１４】
（８）試料を、温度Ｔｅｍｐ−ＹでＹ時間インキュベートする。Ｔｅｍｐ−Ｙ及びＹ時間は、標的をイメージングする前で抗体：ＭＴＡＢ−ＤＭ複合体を洗浄する後の温度及び時間を指す。
【０１１５】
（９）ステップ（７）と同じイメージング条件を使用して、試料を再度イメージングする。
【０１１６】
（１０）蛍光画像を定量化し、ステップ（７）及びステップ（９）の画像中の同じ面積の蛍光強度を比較する。
【０１１７】
ＭＴＡＢ−ＤＭの非特異的結合はみられないと仮定して、ステップ（７）のシグナル強度が、標準的な免疫蛍光法から予想されるシグナル強度より実質的に（例えば、９０％を超えて）低い場合、またはステップ（９）画像上の蛍光強度がステップ（７）の画像上の蛍光強度より、所望のパーセント閾値Ｚ％を超えるほど低い場合、ＭＴＡＢ−ＤＭの親和性は非常に低い、または抗体に結合するＭＴＡＢ−ＤＭによって抗体の標的への安定した結合能力が失われる、すなわち、いずれかの場合、ＭＴＡＢ−ＤＭは不適格であると考えられると判断することができる。そうではない場合、ＭＴＡＢ−ＤＭの親和性は十分に高く、ＭＴＡＢ−ＤＭは本出願のために使用することができると判断することができる。
【０１１８】
実施例５：実施形態
以下の番号付けした項目は、本明細書に記載の特定の実施形態を示す。
【０１１９】
項目１．試料中の少なくとも２つの標的の交換イメージングのための方法であって、
ａ．標的認識抗体に一価的に結合することができる対応するＭＴＡＢ−ＤＭ試薬にそれぞれ結合した、少なくとも２つ以上の標的認識抗体を用意すること
ｂ．試料を、対応するＭＴＡＢ−ＤＭ試薬にそれぞれ結合した２つ以上の標的認識抗体とインキュベートすること
ｃ．ＭＴＡＢ−ＤＭに対応する少なくとも２つのイメージャー部分を、順次、バッチで、または同時に、のいずれかで適用すること，
ｄ．少なくとも２つのイメージャー部分を、順次、バッチで、または同時に、のいずれかでイメージングすること、を含む前記方法。
【０１２０】
項目２．ＭＴＡＢが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、または一価の抗体フラグメントを含む、項目１に記載の方法。
【０１２１】
項目３．ＤＭ（ドッキング部分）及びイメージャー部分が核酸を含む、項目１または２のいずれか一項に記載の方法。
【０１２２】
項目４．対応するＭＴＡＢ−ＤＭ試薬にそれぞれ結合した標的認識抗体のすべてが、同時に試料とインキュベートされる、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【０１２３】
項目５．イメージャー部分のすべてが順次適用され、イメージングが順次起こる、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【０１２４】
項目６．イメージャー部分のすべてが同時に適用され、イメージングが同時に起こる、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【０１２５】
項目７．イメージャー部分が、２つ以上のイメージャー部分を有する少なくとも１つのバッチと、少なくとも２つのバッチを有する方法とを用いてバッチで適用され、イメージングが少なくとも２つのバッチで起こる、項目１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【０１２６】
項目８．各イメージャー部分が異なる観察可能部分で標識される、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【０１２７】
項目９．各イメージャー部分が同じ観察可能部分で標識される、項目１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【０１２８】
項目１０．一部のイメージャー部分が同じ観察可能部分で標識され、一部のイメージャー部分が異なる観察可能部分で標識される、項目１〜５、または７のいずれか一項に記載の方法。
【０１２９】
項目１１．標的認識抗体を試料とインキュベートする前に、過剰量のＭＴＡＢ−ＤＭを用いて遊離の標的認識抗体が過剰となるのを防止する、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【０１３０】
項目１２．標的認識抗体を試料とインキュベートする前に、限外濾過またはゲル濾過を使用して遊離のＭＴＡＢ−ＤＭが除去される、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【０１３１】
項目１３．非特異的抗体が、染色、洗浄及び／またはイメージング緩衝液に添加される、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【０１３２】
項目１４．非特異的抗体が、標的認識抗体と同じ宿主種由来の抗体である、項目１３に記載の方法。
【０１３３】
項目１５．非特異的抗体が、（標的タンパク質のいずれによっても免疫化されていない動物由来の）正常血清でみられるポリクローナル抗体である、項目１４に記載の方法。
【０１３４】
項目１６．非特異的抗体が、試料中に存在しないタンパク質に対するモノクローナル抗体である、項目１４に記載の方法。
【０１３５】
項目１７．イメージャー部分が、直接的にドッキング部分を結合する、項目１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【０１３６】
項目１８．イメージャー部分が、中間部分を介して間接的にドッキング部分を結合する、項目１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【０１３７】
項目１９．組成物であって：
ａ．ＭＴＡＢ、
ｂ．ＭＴＡＢに共有結合したドッキング部分
ｃ．第１のドメインがドッキング部分に特異的に結合することができ、第２のドメインがドッキング部分に特異的に結合することができない、第１のドメイン及び第２のドメインを有する中間部分、
を含む前記組成物。
【０１３８】
項目２０．ＭＴＡＢが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、または一価の抗体フラグメントである、項目１９に記載の組成物。
【０１３９】
項目２１．ドッキング部分及び中間部分が核酸を含む、項目１９〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【０１４０】
項目２２．ドッキング部分が、約５〜２０核酸長、約８〜１５、または約１０〜１２核酸長である、項目２１に記載の組成物。
【０１４１】
項目２３．中間部分が、約１０〜４０核酸長、約１６〜３０、または約２０〜２４核酸長である、項目２１または２２のいずれか一項に記載の組成物。
【０１４２】
項目２４．交換イメージングのための試薬を作製する方法であって：
ａ．ＭＴＡＢを用意すること、
ｂ．ＭＴＡＢをドッキング部分にコンジュゲートさせてＭＴＡＢ−ＤＭを形成すること、
ｃ．それぞれ、ドッキング部分に特異的に結合することができる第１のドメインとドッキング部分に特異的に結合することができない第２のドメインとを有する、複数の中間部分を用意すること、
ｄ．複数の中間部分をＭＴＡＢ−ＤＭと化合させること、
を含む前記方法。
【０１４３】
項目２５．ＭＴＡＢが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、または一価の抗体フラグメントである、項目２４に記載の方法。
【０１４４】
項目２６．ドッキング部分及び中間部分が核酸を含む、項目２４または２５のいずれか一項に記載の方法。
【０１４５】
項目２７．ドッキング部分が、約５〜２０核酸長、約８〜１５、または約１０〜１２核酸長である、項目２６に記載の方法。
【０１４６】
項目２８．中間部分が、約１０〜４０核酸長、約１６〜３０、または約２０〜２４核酸長である、項目２６または２７のいずれか一項に記載の方法。
【０１４７】
項目２９．複数の中間部分が、１つのバッチ反応でＭＴＡＢ−ＤＭと化合される、項目２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【０１４８】
項目３０．複数の中間部分が、別々にＭＴＡＢ−ＤＭと化合される、項目２４〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【０１４９】
項目３１．試料中の少なくとも２つの標的の交換イメージングのためのキットであって、
ａ．ＭＴＡＢと、イメージャー部分を特異的に結合することができるドッキング部分とを含む、少なくとも２つの異なるＭＴＡＢ−ＤＭ試薬、
ｂ．場合によって、少なくとも２つの異なる標的認識抗体、
ｃ．観察可能部分で標識され、個々にＭＴＡＢ−ＤＭ試薬に特異的に結合することができる、少なくとも２つのイメージャー部分、
ｄ．場合によって、少なくとも１つの、標的のいずれにも特異的に結合しない抗体、
を含む前記キット。
【０１５０】
項目３２．ＭＴＡＢが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、プロテインＬ、または抗体の一価のフラグメントから選択される、項目３１に記載のキット。
【０１５１】
項目３３．ドッキング部分が核酸ドッキング部分であり、イメージャー部分が核酸イメージャー部分である、項目３１または３２のいずれか一項に記載のキット。
【０１５２】
項目３４．ドッキング部分がタンパク質、ペプチド、または化合物であり、イメージャー部分が相補的なタンパク質、ペプチド、または化合物である、項目３２または３３のいずれか一項に記載のキット。
【０１５３】
項目３５．ドッキング部分及びイメージャー部分が、それぞれ、いずれかの順で、ストレプトアビジン及びビオチンである、項目３４に記載のキット。
【０１５４】
項目３６．ＭＴＡＢ及びドッキング部分が、ストレプトアビジン、またはＳＮＡＰ−ｔａｇ（登録商標）、ＣＬＩＰ−ｔａｇ（商標）、ＨａｌｏＴａｇ（登録商標）、及びＡｖｉＴａｇ（商標）などのコンジュゲーションドッキング部分を使用することによってコンジュゲートされる、項目３１〜３５のいずれか一項に記載のキット。
【０１５５】
項目３７．ＭＴＡＢ−ＤＭが、少なくとも２つの異なる標的認識抗体を約１ｆＭ〜１ｎＭの親和性で結合することができる、項目３１〜３６のいずれか一項に記載のキット。
【０１５６】
項目３８．観察可能部分が、光学的に観察可能な部分である、項目３１〜３７のいずれか一項に記載のキット。
【０１５７】
項目３９．観察可能部分が、Ｐ−ｄｏｔ、蛍光タンパク質、蛍光核酸、Ｑ−ｄｏｔ、ナノ粒子、またはＳＥＲＳレポーターである、項目３８に記載のキット。
【０１５８】
項目４０．項目１９〜２３、または３１〜３９のいずれか一項に記載の試薬を用いる、交換イメージングのための方法。
【０１５９】
前述の明細書は、当業者が実施形態を実施可能とするために十分であるとみなされる。前述の説明及び実施例は、特定の実施形態を詳述し、発明者らによって企図された最良の方法を説明するものである。ただし、これらの前述の記載が本文中でどのように詳細を明らかにしうるかに拘わらず、実施形態は、多くの方法で実施されうるものであり、添付の特許請求の範囲及びそれらのあらゆる等価物に従って解釈される必要があることが理解されるであろう。
【０１６０】
本明細書で使用する場合、「約」という用語は、明確に示されているかどうかに関わらず、例えば整数、分数、及び百分率を含む数値を指す。「約」という用語は、一般的に、当業者が列挙した値と等価である（例えば、同じ機能または結果を有する）とみなすと思われる数値の範囲（例えば、列挙された範囲の＋／−５〜１０％）を指す。「などの」、「少なくとも」、及び「約」という用語が数値または範囲のリストの前に置かれる場合、これらの用語は、リスト中に提供された値または範囲のすべてを修飾する。場合によっては、「約」という用語は、最も近い有効数字に四捨五入された数値を含んでもよい。
【０１６１】
本明細書において引用された文書はすべて、それらが引用される情報のために、全体として参照により組み入れている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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