(57)【要約】  本発明は、脳腫瘍の治療に必要とされるベバシズマブの有効量を低減する方法に関する。本発明は、前述の方法に使用するキットも提供する。本発明の方法は、ベバシズマブ治療と超音波曝露とを併用するストラテジを採用し、少なくとも以下の工程：ベバシズマブを対象に投与する工程と、超音波応答性媒体を前記対象に投与する工程と、前記対象に超音波曝露を行う工程と、を含む。ベバシズマブ治療及び超音波曝露についての具体的な有効量を特定した。従来のベバシズマブ治療の有効性が有意に改善された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳腫瘍の治療に必要とされるベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）の有効量を低減する方法であって、以下の工程：
ベバシズマブを対象に投与する工程と［ここで、前記ベバシズマブの量は、０．０１１〜１１ｍｇ／ｋｇ体重である］、
超音波応答性媒体を前記対象に投与する工程と、
前記対象に０．１〜２ＭＩの超音波曝露を行う工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記超音波曝露が０．４７〜１．２６ＭＩである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記超音波曝露が０．５５〜０．８４ＭＩである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ベバシズマブの量が０．１１〜１１ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ベバシズマブの量が１．１〜１１ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ベバシズマブの前記投与が静注によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記超音波応答性媒体の投与が静注によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記超音波応答性媒体が複数の粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記粒子の平均直径が０．１〜１０μｍである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記投与において、前記複数の粒子の量が１．９×１０6〜１．１７×１０8粒子／ｋｇ体重である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記粒子がマイクロバブルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記超音波曝露が前記対象の中枢神経系に対して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記脳腫瘍が多形性膠芽腫（Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
脳腫瘍を治療するためのキットであって、
ベバシズマブ製剤と、
超音波応答性媒体と、
超音波トランスデューサー（ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）を含む超音波システムと、を含む、キット。
【請求項１５】
前記ベバシズマブ製剤が、０．１１〜２５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブと注入用担体とを含み、前記ｍｇ／ｍＬが、前記ベバシズマブ製剤の合計体積に基づくものである、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記注入用担体が、水、塩類溶液、ポリマー、乳化剤、界面活性剤、又はこれらの組み合わせである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記超音波応答性媒体が、１×１０4〜１×１０12粒子／ｍＬの粒子を含み、前記粒子／ｍＬは、前記超音波応答性媒体の合計体積に基づくものである、請求項１４に記載のキット。
【請求項１８】
前記粒子の平均直径が０．１〜１０μｍである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記超音波応答性媒体が注入用担体と混合される、請求項１４に記載のキット。
【請求項２０】
前記注入用担体が、水、塩類溶液、ポリマー、乳化剤、界面活性剤、又はこれらの組み合わせである、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記脳腫瘍が多形性膠芽腫である、請求項１４に記載のキット。
【請求項２２】
前記超音波システムが、医用イメージングをベースとしたガイダンス超音波システム（ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｓｙｓｔｅｍ）である、請求項１４に記載のキット。
【請求項２３】
前記医用イメージングが、ニューロナビゲーション、超音波検査、光学イメージング、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、核イメージング、又は磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を含む、請求項２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０１５年１１月１１日に出願された米国特許仮出願第６２／２５３，８０５号に基づく。
【０００２】
（先行技術の記載）
多形性膠芽腫（ＧＢＭ）患者は、通常、５年生存率がわずか５％未満であり、侵襲的な外科術（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ）並びにそれに続く補助化学療法及び放射線療法後の全生存期間の中央値はわずか１５ヶ月である。ＧＢＭは、不規則で広範囲の血管増殖、血管新生因子の発現増大、及び顕著に高レベルで分泌された血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を示す、高度に血管が新生した腫瘍であることから、抗血管新生療法が新しい治療開発の取り組みの焦点となっている。ＧＢＭとの関連性の高いＶＥＧＦ発現により、腫瘍の低酸素状態及び壊死と相関する血管内皮細胞の成長及び増殖が生じ、腫瘍の血管新生及び進行を誘発する。
【０００３】
ベバシズマブは、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームに特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体であり、血管内皮細胞の増殖を中和する。ベバシズマブは、腫瘍による血管新生を低減し、血管の完全性を改善し、腫瘍に関連する浮腫を低減して、臨床上の生活水準を向上させる。理論上、一貫した抗血管新生薬の投与により、血管網が破壊され、酸素及び栄養輸送が妨害され、腫瘍は最終的に飢餓状態に陥ることになる。しかしながら、これらの抗腫瘍効果はまた、血管透過性を効果的に低減しかつ異常な毛細血管漏出を一時的に逆転する（ｔｅｍｐｏｒａｌｌｙ  ｒｅｖｅｒｓｅ）抗ＶＥＧＦ剤の能力を介した「血管の正常化」にも妨げられる。一時的な「血管の正常化」は、ＢＢＢの完全性を回復させ、ベバシズマブの脳実質への更なる透過（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）を制限することから、ＧＢＭ細胞の血管新生の抑制及び持続的な腫瘍の飢餓状態を減少させ、患者の生存を改善する。
【発明の概要】
【０００４】
前述の観点から、本発明の目的の１つは、抗血管新生療法を用いて脳腫瘍を治療する方法を提供するというものである。本発明の別の目的は、脳腫瘍を治療するためのキットを提供するというものである。かかる方法及びキットでは、より少ない投与量の抗血管新生薬を使用しながらもより適切な有効性を提供することができる。
【０００５】
前述の目的を達成するため、本発明は、脳腫瘍の治療に必要とされるベバシズマブの有効量を低減する方法であって、以下の工程：ベバシズマブを対象に投与する工程［ここで、かかるベバシズマブは０．０１１〜１１ｍｇ／ｋｇ体重の量である］；かかる対象に超音波応答性媒体（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍｅｄｉｕｍ）を投与する工程；並びにかかる対象に０．１〜２ＭＩ（メカニカルインデックス、Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｉｎｄｅｘ）の超音波曝露を行う工程を含む、方法を提供する。好ましくは、かかる超音波曝露は０．４７〜１．２６ＭＩであり；より好ましくは０．５５〜０．８４ＭＩである。
【０００６】
好ましくは、かかるベバシズマブの量は、０．１１〜１１ｍｇ／ｋｇ体重である。より好ましくは、かかるベバシズマブの量は、１．１〜１１ｍｇ／ｋｇ体重である。好ましくは、かかるベバシズマブのかかる投与は、静注による。
【０００７】
好ましくは、かかる超音波応答性媒体のかかる投与は、静注による。好ましくは、かかる超音波応答性媒体は複数の粒子である。好ましくは、かかる粒子の平均直径は０．１〜１０μｍである。好ましくは、かかる投与に当たり、かかる複数の粒子の量は１．９×１０6〜１．１７×１０8粒子／ｋｇ体重である。好ましくは、かかる粒子はマイクロバブルである。
【０００８】
好ましくは、かかる超音波曝露はかかる対象の中枢神経系に対して行われる。好ましくは、かかる脳腫瘍は多形性膠芽腫である。
【０００９】
本発明は、脳腫瘍を治療するためのキットであって、ベバシズマブ製剤と、超音波応答性媒体と、超音波トランスデューサーを含む収束超音波（ｆｏｃｕｓ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ）システムと、を含む、キットも提供する。
【００１０】
好ましくは、かかるベバシズマブ製剤は、０．１１〜２５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブと注入用担体とを含み、かかるｍｇ／ｍＬは、かかるベバシズマブ製剤の合計体積に基づくものである。好ましくは、かかる注入用担体は、水、塩類溶液、ポリマー、乳化剤、界面活性剤、又はこれらの組み合わせである。
【００１１】
好ましくは、かかる超音波応答性媒体は、１×１０4〜１×１０12粒子／ｍＬの粒子を含み、かかる粒子／ｍＬは、かかる超音波応答性媒体の合計体積に基づくものである。好ましくは、かかる粒子の平均直径は０．１〜１０μｍである。
【００１２】
好ましくは、かかる超音波応答性媒体は、注入用担体と混合される。好ましくは、かかる注入用担体は、水、塩類溶液、ポリマー、乳化剤、界面活性剤、又はこれらの組み合わせである。
【００１３】
好ましくは、かかる脳腫瘍は多形性膠芽腫である。
【００１４】
好ましくは、かかる超音波システムは、医用イメージングをベースとしたガイダンス超音波システム（ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｓｙｓｔｅｍ）である。好ましくは、かかる医用イメージングは、ニューロナビゲーション、超音波検査、光学イメージング、コンピュータ断層撮影、核イメージング（ＣＴ）、又は磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】神経膠腫を有するマウスにおいて、超音波により誘導されるＢＢＢ開口を用いベバシズマブの送達を増強する実験デザインについて、時間経過を示す。５０ｍｇ／ｋｇ体重で静注によりベバシズマブを毎週投与し（初回のＭＲＩスクリーニング後、１、８、１５、２２、及び２９日目）、腫瘍の進行及び生存をＴ２−ＭＲＩにより長期的に追跡した。超音波曝露は毎週実施した（初回のＭＲＩスクリーニング後、ベバシズマブの静注投与前、１、８、１５、２２、及び２９日目）。
【図２】超音波により誘導される血液脳関門（ＢＢＢ）の開口についての概念及びＭＲＩ観察例を示す。（ａ）超音波により誘導される血液脳関門の開口を用い、神経膠腫治療の際のベバシズマブの送達を増強する実験アプローチについての概念図。（Ｂ〜Ｉ）中等度（０．４ＭＰａ、すなわち、０．６３ＭＩ）及び高強度（０．８ＭＰａ、すなわち、２ＭＩ）の超音波曝露レベルで超音波により誘導されるＢＢＢ開口についてのＣＥ−ＭＲＩ解析例。（ｂ、ｃ）造影Ｔ１強調像のマップにおいてのシグナル強度レベルの増加量（％）；（ｄ、ｅ）Ｒ１マップの曲線下面積（ＡＵＣ）の累積（ｓ-1．ｍｉｎ）；（ｆ、ｇ）Ｋｔｒａｎｓマップ（ｍｉｎ-1）；（ｈ、ｉ）Ｖｅマップ。
【図３】送達されたベバシズマブの透過に対しての定量、ＭＲイメージングとの相関、及びウェスタンブロッティングを示す。（ａ）ＨＰＬＣにより測定された異なる超音波曝露（それぞれ０、０．４、及び０．８ＭＰａ；すなわち、０、０．６３、及び２ＭＩ）レベルでのベバシズマブ濃度；（ｂ〜ｅ）ベバシズマブ濃度と、Ｔ１−ＷＩ（パネル（ｂ））、Ｒ１−ＡＵＣレベルの変化（パネル（ｃ））、Ｋｔｒａｎｓレベルの変化（パネル（ｄ））、及びＶｅレベルの変化（パネル（ｅ））におけるＳＩ増加を含む、造影ＭＲＩの異なるインデックスとの相関。（ｆ）超音波により誘導されるＢＢＢ開口後にベバシズマブのＣＮＳへの透過が増強されたことを示すウェスタンブロット。（ｇ）ウェスタンブロット強度の定量分析の比較。記号「***」は、ｐ＜０．００１を表す。ＢＥＶ＝ベバシズマブ。
【図４】超音波支援による７０ｋＤａの蛍光標識デキストランのＣＮＳ送達についての、蛍光顕微鏡による観察結果を示す。（ａ、ｂ）は超音波に曝露されていない対照動物の左半球及び右半球である。ＢＢＢが完全な状態であることから、蛍光シグナルは検出されなかった。（ｃ、ｄ）右半球を０．３ＭＰａで超音波曝露処理した動物（蛍光強度４２３５４±３９３７ａ．ｕ．）。（ｅ、ｆ）右半球を０．４ＭＰａで超音波曝露（すなわち、０．６３ＭＩ）処理した動物（蛍光強度８１３２９±７９２６ａ．ｕ．）。（ｇ、ｈ）右半球を０．５３ＭＰａで超音波曝露（すなわち、０．８４ＭＩ）処理した動物（蛍光強度８５３４８±１０５０ａ．ｕ．）。バー＝１００μｍ。
【図５】超音波支援による１５０ｋＤａの蛍光標識デキストランのＣＮＳ送達についての、蛍光顕微鏡による観察結果を示す。（ａ、ｂ）超音波曝露していない対照動物の左半球及び右半球。ＢＢＢが完全な状態であることから、蛍光シグナルは検出されなかった。（ｃ、ｄ）右半球を０．３ＭＰａ／０．４ＭＨｚで超音波曝露処理した動物（蛍光強度２２７１６±３７０６ａ．ｕ．）。（ｅ、ｆ）右半球を０．４ＭＰａで超音波曝露（すなわち、０．６３ＭＩ）処理した動物（蛍光強度２９２０８±７５１８ａ．ｕ．）。（ｇ、ｈ）右半球を０．５３ＭＰａ／０．４ＭＨｚで超音波曝露（すなわち、０．８４ＭＩ）処理した動物（蛍光強度５２６４３±１１６４４ａ．ｕ．）。バー＝１００μｍ。
【図６】超音波支援による２５０ｋＤａの蛍光標識デキストランのＣＮＳ送達についての、蛍光顕微鏡による観察結果を示す。（ａ、ｂ）超音波曝露していない対照動物の左半球及び右半球。ＢＢＢが完全な状態であることから、蛍光シグナルは検出されなかった。（ｃ、ｄ）右半球を０．３ＭＰａ（すなわち、０．４７ＭＩ）で超音波曝露処理した動物（蛍光強度４２０１２±５７６４ａ．ｕ．）。（ｅ、ｆ）右半球を０．４ＭＰａで超音波曝露（すなわち、０．６３ＭＩ）処理した動物（蛍光強度６０５０４．８１±１９５６．９７ａ．ｕ．）。（ｇ、ｈ）右半球を０．５３ＭＰａで超音波曝露（すなわち、０．８４ＭＩ）処理した動物（蛍光強度７１６７２±７７７０ａ．ｕ．）。バー＝１００μｍ。
【図７】それぞれ異なる誘発された圧力、及び超音波により増強された分子サイズの下での、蛍光強度変化の比較を示す。超音波曝露を施していない対照動物では、ＢＢＢが妨害するため、デキストランは透過しない。適用される音圧が高くなるほど、あるいは投与される蛍光標識デキストランの大きさが小さくなるほど、検出され得る蛍光強度は高くなった。
【図８】蛍光強度と、３種類の濃度の蛍光標識デキストランとの相関を示す。（ａ〜ｃ）様々な大きさの蛍光標識デキストランは、全て、蛍光強度対濃度間の相関が高いことを示す（それぞれ７０ｋＤａ（パネル（ａ））、１５０ｋＤａ（パネル（ｂ））、及び２５０ｋＤａ（パネル（ｃ））について、ｒ２＝０．９５１７、０．８４４７、及び０．９６７９）。
【図９】腫瘍の進行を追跡するＴ２強調ＭＲＩ例を示す。（ａ〜ｄ）各試験群において、Ｔ２強調ＭＲＩを使用して、７日目〜３５日目までの間、毎週、脳腫瘍の進行を監視した。超音波により誘導されるＢＢＢ開口のみを行った場合には（パネル（ｂ））、未処理の対照（パネル（ａ））と同様の腫瘍進行が示されたのに対し、ベバシズマブ投与のみの場合には、腫瘍進行の抑制が向上していることが示された（パネル（ｃ））。各群の中でも、超音波により誘導されるＢＢＢ開口と、ベバシズマブ投与とを併せて行った場合に最も有意な腫瘍抑制効果が提供された（パネル（ｄ））。
【図１０】腫瘍の進行及び動物の生存率分析を示す。（ａ、ｂ）各試験群における７日目〜３５日目の腫瘍進行。パネル（ａ）は腫瘍体積（ｍｍ３）を示し、パネル（ｂ）は腫瘍の週毎の進行率（％）を示す。（ｃ）各試験群の動物の生存率を示すカプランマイヤープロット。ＢＥＶ＝ベバシズマブ。
【図１１】ＨＥ染色及びＣＤ−３１染色した免疫化学（ＩＨＣ）蛍光顕微鏡法の比較を示す。（ａ〜ｃ）ベバシズマブ投与のみで処理した脳腫瘍を示すＨＥ染色及びＣＤ−３１  ＩＨＣ顕微鏡観察像。（ｄ〜ｆ）超音波により誘導されるＢＢＢ開口と併せてベバシズマブ投与で処理した脳腫瘍を示す、ＨＥ染色及びＣＤ−３１  ＩＨＣ顕微鏡観察像。バー＝５００μｍ。（ｇ）腫瘍領域内で測定された血管密度の定量比較。（ｈ、ｉ）それぞれ（Ｃ）及び（Ｆ）により得られた、ＣＤ−３１標識された血管構造を示す拡大画像。バー＝１００μｍ。
【図１２】68Ｇａ−ベバシズマブの注入後１５分の時点でのＢＢＢ開口マウスの減衰補正したＰＥＴ／ＣＴ画像を示す。ａ．試験群（ｎ＝３）において、マウスは超音波で処理し、６８Ｇａ−ベバシズマブを注入した。円は、超音波による標的部位を示す。対照群（ｎ＝３）は、68Ｇａ−ベバシズマブの注入量は等しいものの、超音波処理は行っていない。ｂ．ＢＢＢ開口効果についてのＰＥＴ定量と、両群の主要臓器（心臓、肝臓、腎臓、肺、筋肉）に関する生体分布プロファイル。
【図１３】送達されたベバシズマブ透過量を示す。「ブランク」は対照群（未処理群）を表す。「５０ｍｇ」、「３０ｍｇ」及び「１０ｍｇ」は、それぞれ、超音波曝露はせずに５０ｍｇ／ｋｇ体重、３０ｍｇ／ｋｇ体重、及び１０ｍｇ／ｋｇ体重のベバシズマブで処理した群を表す。「超音波＋５０ｍｇ」、「超音波＋３０ｍｇ」及び「超音波＋１０ｍｇ」は、それぞれ、超音波曝露と共に５０ｍｇ／ｋｇ体重、３０ｍｇ／ｋｇ体重、及び１０ｍｇ／ｋｇ体重のベバシズマブで処理した群を表す。
【図１４】体積をもとに腫瘍の進行を示す。「対照」は対照群（未処理群）を表す。「５０ｍｇ」は、超音波曝露はせずに５０ｍｇ／ｋｇ体重のベバシズマブで処理した群を表す。「超音波＋３０ｍｇ」及び「超音波＋１０ｍｇ」は、それぞれ超音波曝露と共に３０ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重のベバシズマブで処理した群を表す。
【図１５】実験モデルマウスの生存確率を示す。「対照」は対照群（未処理群）を表す。「５０ｍｇ」は、超音波曝露はせずに５０ｍｇ／ｋｇ体重のベバシズマブで処理した群を表す。「超音波＋３０ｍｇ」及び「超音波＋１０ｍｇ」は、それぞれ超音波曝露と共に３０ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重のベバシズマブで処理した群を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
低圧バーストモードでの経頭蓋の超音波曝露は、局所的、一時的、及び可逆的にＢＢＢを開口することができる。経頭蓋の超音波曝露により、局所エネルギーを脳の深部領域に非侵襲的に送達することができる。ＢＢＢの破綻は、正常組織には影響を及ぼさずに、治療薬の脳における局所濃度を上昇させることができる。
【００１７】
本明細書で使用するとき、用語「有効量」は、試薬、薬剤、又は医薬を必要としている対象が所望の効果を得るのに十分な試薬、薬剤、又は医薬の量を指す。本明細書において、「脳腫瘍を治療する」又は同等の記述は、腫瘍の進行の低減及び／若しくは予防、腫瘍の大きさの縮小、対象の正常な生理機能に対する腫瘍による影響の低減及び／若しくは予防、あるいはこれらの組み合わせを指すものであるが、但し限定するものではない。
【００１８】
本明細書で使用するとき、用語「超音波応答性媒体」は、超音波の音響出力（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｐｏｗｅｒ）に応答してキャビテーションを提供することのできる媒体を呼称するものである。好ましい実施形態では、かかるキャビテーションはＢＢＢを開口可能であり、より好ましくはＢＢＢ全体の透過性を増加させることができる。理論に束縛されるものではないが、かかる超音波応答性媒体は、かかる超音波曝露と相乗的に使用され、ＢＢＢを開口すなわち破綻し、これにより医薬の透過性を増加させる。
【００１９】
本発明の一態様は、脳腫瘍の治療におけるベバシズマブの有効性を増強する方法を提供する。本方法を使用することにより、脳腫瘍の治療に必要とされるベバシズマブの有効量が低減され得る。代替的な実施形態では、かかる脳腫瘍は、髄膜腫又は星状細胞腫であり得る。特定の実施形態では、かかる星状細胞腫は多形性膠芽腫である。
【００２０】
本発明の方法は、ベバシズマブを対象に投与すること、超音波応答性媒体をかかる対象に投与すること、並びにかかる対象に超音波曝露を行うこと、を含む。代替的な実施形態では、上記の３つの工程の実施に特に順序はない。
【００２１】
好ましい実施形態では、かかるベバシズマブの投与量はヒトを対象とするものである。代替的な実施形態では、ベバシズマブのかかる投与量は、マウスモデルの実験より得られたデータをもとに計算される。例えば、計算は、Ｒｅａｇａｎ−Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００８  Ｍａｒ；２２（３）：６５９−６１において教示される式に基づく。一実施形態では、かかるベバシズマブの量は０．０１１〜１１ｍｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは０．１１〜１１ｍｇ／ｋｇ体重であり、より好ましくは１．１〜１１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００２２】
代替的な実施形態では、かかる超音波応答性媒体は複数の粒子である。好ましい実施形態では、かかる粒子の投与量は１．９×１０6〜１．１７×１０8粒子／ｋｇ体重である。代替的な実施形態では、かかる粒子の平均直径は０．１〜１０μｍである。
【００２３】
好ましくは、かかる粒子はマイクロバブルである。代替的な実施形態では、かかるマイクロバブルはコアシェル構造を有し、ここで、かかるシェルは生体適合性材料（アルブミン、脂質、又はポリマー等が挙げられるがこれらに限定されない）からなり、コアは生体適合性気体媒体である。代替的な実施形態では、かかるマイクロバブルは、アルブミンコートマイクロバブル、脂質シェルマイクロバブル、ガス充填マイクロバブル、又はこれらの組み合わせを含む。別の代替的な実施形態では、かかるマイクロバブルは、例えば、ＳｏｎｏＶｕｅ（登録商標）、Ｄｅｆｉｎｉｔｙ（登録商標）、Ｏｐｔｉｓｏｎ（登録商標）、Ｉｍａｇｅｎｔ（登録商標）、Ｌｅｖｏｖｉｓｔ（登録商標）、又はＬｕｍａｓｏｎ（登録商標）などの市販品であり得る。
【００２４】
代替的な実施形態では、かかる超音波曝露は０．１〜２ＭＩ（メカニカルインデックス；
【００２５】
【数１】
2019502657.tif 000002
として定義され、式中、Ｐは最大負音圧（ＭＰａ）であり、ｆは周波数（ＭＨｚ））であり、好ましくは０．４７〜１．２６ＭＩであり、より好ましくは０．５５〜０．８４ＭＩである。好ましくは、かかる超音波曝露は対象の中枢神経系に対し実施され、より好ましくは、対象の脳に対し実施される。
【００２６】
本発明の別の態様は、脳腫瘍を治療するためのキットである。代替的な実施形態では、かかるキットを使用して本発明の方法を実施する。代替的な実施形態では、かかる脳腫瘍は、髄膜腫又は星状細胞腫であり得る。特定の実施形態では、かかる星状細胞腫は多形性膠芽腫である。本発明のキットは、ベバシズマブ製剤と、超音波応答性媒体と、超音波システムと、を含む。代替的な実施形態では、かかるベバシズマブ製剤は、０．１１〜２５ｍｇ／ｍＬのベバシズマブと、注入用担体とを含む。かかる注入用担体は、水、塩類溶液、ポリマー、乳化剤、界面活性剤、又はこれらの組み合わせであり得るがこれらに限定されない。
【００２７】
本発明のキットのかかる超音波応答性媒体は、本発明の方法に関し前項に記載のものと同じである。好ましい実施形態では、かかる超音波応答性媒体は製剤としての注入用担体と混合され、かかる製剤は、１×１０4〜１×１０12粒子／ｍＬの粒子を含み、かかる粒子／ｍＬは、かかる製剤の合計体積に基づくものである。代替的に、かかる注入用担体は、水、塩類溶液、ポリマー、乳化剤、界面活性剤、又はこれらの組み合わせである。好ましい実施形態では、かかる粒子は、かかる粒子と、塩類溶液と、ヘパリンと、を含む調製物として配合される。
【００２８】
典型的な超音波システムは、通常、超音波トランスデューサーと、水槽とを含む。特定の実施形態では、かかる超音波システムは、医用イメージングをベースとしたガイダンス超音波システムである。好ましい実施形態では、かかる超音波システムはニューロナビゲーションガイド超音波システムであり、かかるシステムはニューロナビゲーションシステム（Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（ＩＵＳ），２０１５  ＩＥＥＥ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を更に含む。代替的な実施形態では、かかる超音波システムは、超音波検査ガイド超音波システム、光学イメージングガイド超音波システム、コンピュータ断層撮影ガイド超音波システム、核イメージング（ＣＴ）ガイド超音波システム、又はＭＲＩガイド超音波システムであり得る。
【００２９】
以下の実験及び詳細は、本発明の趣旨及び概念を更に説明するために提供される。以下の情報は本発明の特許請求の範囲を制限することを意図するものではないことに留意されたい。当業者であれば、本発明の趣旨から逸脱することなく、以下に記載の本発明の詳細な説明に改変を施すことができる。
【００３０】
実験１〜４。
以下の実験１〜４の材料及び方法
１．Ｕ８７神経膠腫動物モデル。
Ｕ８７マウス神経膠腫細胞を、３７℃、５％  ＣＯ2下で、１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加したＭＥＭで培養した。ＢｉｏＬＡＳＣＯ（Ｔａｉｗａｎ）の雄性無菌ＮＵ／ＮＵマウス（５〜７週齢、２０〜２５ｇ）を制御環境下に収容した。全ての実験は所属の動物実験委員会の承認を受けた。Ｕ８７細胞を移植するに当たり、マウスには２％イソフルランガスで麻酔を行い、定位固定フレーム上に固定した。頭蓋冠を覆う皮膚の矢状切開を行い、露出させた頭蓋において、ブレグマの１．５ｍｍ前側かつ２ｍｍ外側に対し、２７Ｇの針を使用して孔を形成した。５分かけて脳表面から２ｍｍ深部に５μＬのＵ８７細胞懸濁液（１×１０5個／μＬ）を注入し、針を２分かけて引き抜いた。移植から１０日後に、異種移植片の成長をＭＲＩにより監視した。
【００３１】
２．実験デザイン。
１２匹の正常マウス及び４２匹の腫瘍マウスを使用した。第１群の目的は、超音波により誘導されるＢＢＢ開口が正常マウス（ｎ＝４）においてベバシズマブの透過を増強させたかを評価すること、並びに適切な超音波出力範囲（ｎ＝４）及びウェスタンブロット分析（ｎ＝８；正常４匹と腫瘍４匹）を決定することとした。第２群の目的は、腫瘍マウスにおいて、ベバシズマブと超音波曝露とを併用することによる治療効果を評価することとした。下位群は次の４つであった：（１）偽処置（ｎ＝７）；（２）超音波のみ（ｎ＝９）；（３）ベバシズマブのみ（ｎ＝６）、５０ｍｇ／ｋｇ体重で静注によりベバシズマブを毎週投与した（初回のＭＲＩスクリーニング後、１、８、１５、２２、及び２９日目）、並びに（４）ベバシズマブ＋超音波によるＢＢＢ開口（ｎ＝１２）、５０ｍｇ／ｋｇ体重で静注によりベバシズマブを毎週投与した（初回のＭＲＩスクリーニングから１、８、１５、２２、及び２９日後）。第２群において、エンドポイントは、ＭＲＩ測定による腫瘍体積が２００ｍｍ3超であること、又は１週間の体重低下が２０％超であることとした。実験デザインの時間経過を図１に示す。
【００３２】
３．超音波曝露。
超音波は、Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（ＩＵＳ），２０１５  ＩＥＥＥ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによりニューロナビゲーションガイドされる超音波とする。超音波トランスデューサー（Ｓｏｎｉｃ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ；直径＝６０ｍｍ，曲率半径＝５２ｍｍ，周波数＝４００ｋＨｚ）を適用して集束（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）超音波処理エネルギーを生成した。任意波形発生器（３３２２０Ａ，Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して駆動信号を生成し、かかる信号をバーストモードの高周波電力増幅器（Ｎｏ．５００−００９，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）に送信した。麻酔をかけたマウスを定位フレームに固定し、ＰＥ−１０カテーテルを尾静脈に挿入した。アクリル製水槽下、底部の４×４ｃｍ2薄膜ウインドウ（ｔｈｉｎ−ｆｉｌｍ  ｗｉｎｄｏｗ）に頭部をしっかりと固定してマウスを直接配置し、超音波エネルギーを進入させた。ＳｏｎｏＶｕｅ（登録商標）ＳＦ6を充填した超音波応答性粒子（ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）（２〜５μｍ，１０μＬ／マウス，２×１０8個マイクロバブル／ｍＬ；Ｂｒａｃｃｏ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）を超音波の前に静脈内投与した。腫瘍を移植した脳半球部位を、次にバーストトーンモードの超音波に曝露した（電力＝４〜１８Ｗ；最大負音圧＝０．１〜２ＭＩ；バースト長＝１０ｍｓ；パルス繰り返し周波数＝１Ｈｚ；照射時間＝６０秒）。
【００３３】
４．磁気共鳴画像（ＭＲＩ）。
造影ＭＲＩを使用して、Ｇｄ−ＤＴＰＡ投与（Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ，Ｗａｙｎｅ，ＮＪ，ＵＳＡ）を介しＢＢＢ透過性の増加を評価し、以下のイメージングインデックスを得た：（１）Ｇｄ−ＤＴＰＡ注入１０後のＴ１強調像におけるシグナル強度の増加；（２）期間中のＲ１緩和度の曲線下面積（Ｒ１−ＡＵＣとして記載）；（３）動態パラメーター「Ｋｔｒａｎｓ」、血管内の系から細胞外血管外スペースへの移動速度定数、Ｋｅｔｙのコンパートメントモデルにより評価；（４）動態パラメーター「Ｖｅ」、ＥＥＳ中の造影剤の体積分率、Ｋｅｔｙのコンパートメントモデルにより評価。
磁化率強調画像シーケンスを取得して、大規模な赤血球溢出を特定した（パラメーター：ＴＲ／ＴＥ＝３０ｍｓ／１８ｍｓ；フリップ角＝４０°；スライス厚＝０．６ｍｍ；マトリックスサイズ＝２５６×３８４；及びＦＯＶ＝８０×１３０ｍｍ2）。マウスの脳頂部に対し、７テスラの磁気共鳴断層撮影装置（Ｂｒｕｋｅｒ  ＣｌｉｎＳｃａｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と４チャンネルの表面コイルとを使用して、ＭＲＩ画像を取得した。麻酔下のマウスをアクリルホルダーに置き、マグネット部に配置した。次のパラメーターでターボスピンエコーベースのＴ２強調像を使用して、腫瘍サイズを定量した：パルス繰り返し時間（ＴＲ）／エコー時間（ＴＥ）＝２５４０／４１ｍｓ；ＦＯＶ＝１９×３０ｍｍ2（１５６×３２０ピクセル）；スライス厚＝０．５ｍｍ；フリップ角＝１８０；合計撮像時間＝１５５秒。最大の腫瘍面積を含む１枚のイメージスライドを測定することにより相対的な腫瘍サイズを評価した。マウスは、初回のＭＲＩスクリーニングから７日毎に３５日目まで長期的に撮像した。
【００３４】
５．組織学的検査。
エバンスブルー色素を静脈内に注入して２時間後にマウスを屠殺した。パラホルムアルデヒド固定し、パラフィン包埋した脳の１０μｍの切片に対し、病理組織診断を行った。塩酸−フェロシアン化カリウム溶液を入れた染色ジャーにスライドを入れ、室温で３０分間置いた。スライドをヌクレアファストレッドで５分間対比染色した。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を使用して、脳組織の損傷及び腫瘍進行を評価した。
血管分布を評価するため、抗マウス−ＣＤ３１抗体（１：５００，５５０２７４，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）及びヤギ−抗ラットＤｙｌｉｇｈｔ  ４８８抗体（１：２００，４０５４０９，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用い、スライドに対し免疫蛍光検査を行った。腫瘍の血管を、腫瘍断面積に対する総血管面積として定量した。
【００３５】
６．ウェスタンブロット。
均質化した脳組織からの５０μｇタンパク質（ヤギ−抗ヒトＩｇＧ，ＡＰ１１２Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）をウェスタンブロット分析に使用した。ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＵＶＰ  ＬＬＣ，Ｕｐｌａｎｄ，ＣＡ）を使用して、フィルム上のバンドの光学密度を分析した。
【００３６】
７．定量的ベバシズマブ分析。
超音波処理の２時間後にマウスを屠殺し、脳を左半球と右半球に分割し、１０μＬ／ｍｇ  ｍＬメタノールで均質化した。抽出したベバシズマブを、Ｌ−２４００  ＵＶモデルの検出器、及びＬ−２１３０モデルのポンプ（Ｈｉｔａｃｈｉ）、及びＳＵＰＥＬＣＯＳＩＬ（商標）ＬＣ−１８カラム（４．６×２５０ｍｍ）を使用してＨＰＬＣ分析した。
【００３７】
８．統計解析。
対応のない両側ｔ検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔ）又はマンテルコックス検定のいずれかを用いて統計的有意性を計算した。生存分析にはカプラン・マイヤー法を使用した。統計的有意性はｐ＜０．０５で評価した。
【００３８】
実験１：超音波は効率的にＢＢＢを開口し、脳中のベバシズマブ濃度を増大させる。
この実験では、上記の方法に従い、０．６３ＭＩ又は２ＭＩ（すなわち、０．４ＭＰａ又は０．８ＭＰａの最大負音圧）の経頭蓋超音波に曝露し、ＢＢＢ開口効果について評価した。同様にして、超音波曝露の実施前にベバシズマブを投与して、超音波曝露がベバシズマブのＢＢＢ透過に対する効果に何らかの作用を有するかを確認した。
【００３９】
ＢＢＢの開口は造影ＭＲＩにより確認した。この確認には４種類のＣＥ−ＭＲＩインデックスを使用した。０．６３ＭＩ及び２ＭＩの超音波曝露の両方で、標的とする脳領域においてＢＢＢが有効に開口したことを示す結果を図２に示す。更に、高圧をかけると、より強いＢＢＢ開口効果がもたらされた。
【００４０】
ＨＰＬＣを使用して、脳中のベバシズマブ濃度を定量した。その結果、超音波処理はＣＮＳ実質におけるベバシズマブ濃度を増大させることが示された。中等度の０．６３ＭＩの超音波曝露では、結果として、０．１７５±０．１５μＭのベバシズマブがＣＮＳに透過した一方（すなわち、５．７３倍に増加）、高強度の２ＭＩの超音波曝露では、ベバシズマブは１．５５４±０．３７μＭに著しく増加した（すなわち、５８．７７倍に増加）（図３ａ）。対照においては、ベバシズマブの循環は正常に制限され、ＣＮＳへの透過は極微量であった（０．０２６±０．０２μＭ）。４つのＣＥ−ＭＲＩインデックスを、ベバシズマブ濃度との相関についても解析した（図３ｂ〜ｅ）。Ｒ１−ＡＵＣは、測定したベバシズマブレベルについては最も高い線形相関を有することが観察された（図３ｃ；ｒ2＝０．７３８）。Ｔ１強調像又はＫｔｒａｎｓにおけるシグナル強度の増加はいずれも、相関係数０．６超でベバシズマブレベルと中等度の相関を提供した（それぞれｒ2＝０．６７８及び０．６０６；図３ｂ及び３ｄ）一方、Ｖｅとベバシズマブレベルとの相関は最も低かった（ｒ2＝０．５６；図３ｅ）。最終的に、４つのインデックスにより、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、超音波により誘導されるＢＢＢ開口と、ＣＮＳのベバシズマブ送達の増強との十分な相関が提供された。
【００４１】
実験２：超音波により誘導されるＢＢＢ開口の、大きさの異なる分子の分子透過に対する効果。
分子の大きさ及び超音波曝露レベルの分子透過への影響を理解するため、ベバシズマブ（１５０ｋＤａ）と同様の分子量を有する蛍光標識デキストラン（７０〜２５０ｋＤａ）をサロゲートとして、中等度曝露レベル付近（すなわち、０．４ＭＰａ／０．６３ＭＩ）に精密調整（ｆｉｎｅ−ｔｕｎｅ）した曝露レベル（０．５５〜０．８４ＭＩ）に供した。０．５５ＭＩ超の音圧レベルでは、ＢＢＢ開口を誘導可能であり、７０ｋＤａ（図４）、１５０ｋＤａ（図５）、及び２５０ｋＤａ（図６）の蛍光標識デキストランを含む全ての大きさの分子を透過させることができることが判明した。これにより、０．６３ＭＩの曝露レベルでは、少なくとも最大で２５０ｋＤａまでの分子については、安定かつ一貫した分子透過を提供することが示された。更に、超音波曝露レベルを増強させること、又は分子量を減少させることのいずれによっても、脳における蛍光強度は増加したことから、分子が小さくなる程、又は曝露レベルが強くなるほど分子透過の増加がもたらされることが示された（図７）。超音波曝露を０．８４ＭＩに増加させると、明らかな、但し極小の赤血球溢出が誘導され始めたものの（図８ｃ）、より低い曝露レベルではこれは観察されなかった（図８ａ〜ｂ）。０．８４ＭＩへの曝露により生じたこれらの溢出はＴ２*  ＭＲＩでは検出不能であった；対照的に、２ＭＩの曝露では、Ｔ２*  ＭＲＩにおけるシグナル強度に明らかな低下が誘導されたことから、０．８４ＭＩにの曝露より赤血球の相対的に大規模な溢出が誘導されたことが示される。これらを鑑み、以降、神経膠腫を含む腫瘍の超音波処理には０．６３ＭＩの超音波曝露レベルを選択した。
【００４２】
ウェスタンブロットを実施して、超音波曝露を行った脳におけるベバシズマブのタンパク質レベルを測定した（図３ｆ）。対照マウス又は超音波のみのマウスのいずれにおいてもベバシズマブは検出されなかった。ベバシズマブ投与のみの場合では、１５０ｋＤａのバンドのみが検出され、ＣＮＳ中にベバシズマブが存在していることが示された。対照的に、超音波曝露（０．６３ＭＩ）とベバシズマブ投与との併用により、検出可能なベバシズマブタンパク質のレベルは顕著に増加した。超音波とベバシズマブ投与との併用では、ハイブリダイゼーション強度はほとんど３倍に増加しており（図３ｇ）、これはＨＰＬＣ分析により測定される透過性の改善と同様であった（検出カウント数１２，２３８対４，１３８）。
【００４３】
実験３：神経膠腫の治療のための超音波とベバシズマブとの併用ストラテジ
本発明者らは、超音波により誘導されるＢＢＢ開口により増強されたベバシズマブ送達が神経膠腫治療を改善したかを評価することを目的とした。関連する赤血球血管外漏出を回避するべく、計画した５週間の反復治療レジメンには０．６３ＭＩの超音波曝露レベルを選択した。「実験デザイン」のセクション及び図１を参照のこと。
【００４４】
Ｔ２−ＭＲＩにより測定される腫瘍体積の増加と共に（図１０ａ〜ｂ）、典型的な腫瘍のフォローアップ・イメージを図９（７日目〜３５日目）に示す。最終的に、未処理対照（図９ａ）及び超音波曝露のみ（図９ｂ）が、腫瘍成長の進行を示した（１０〜３５日間のフォローアップ期間では、腫瘍進行比はそれぞれ１７２±３３．２％及び１８５±２２．６％であった）。ベバシズマブのみの処理（図９ｂ）では、最初の４週間の処理では腫瘍抑制効果が示されたものの、第５週目には腫瘍進行は急激に前進した。対照群（ｐ＝０．６４７７）又は超音波のみで処理した群（ｐ＝０．３７３５）では、最終的な腫瘍進行（１５２±２７．７％）に有意な差はなかった。Ｔ２−ＭＲＩにより評価した場合に（４５±１６．１１％，ｐ＝０．００１６対対照群；図１０ａ〜ｂ）、５週間の処理レジメンを通し、ベバシズマブ投与と超音波によるＢＢＢ開口（図９ｄ）との併用により腫瘍進行は一貫して減少し、最も顕著な腫瘍進行の制御が示された。この結果から、超音波曝露によりベバシズマブの透過増強を促すことで、腫瘍の進行を制御する安定で持続した抗血管新生効果が提供されることが示された。
【００４５】
超音波とベバシズマブとの併用処理を５週間実施した後（７日〜３５日間）、１００日目に動物の生存率を評価した（図１０ｃ及び表１）。超音波のみの動物では、生存期間の有効な延長は示されなかった。同様のことが、ＭＲＩで監視した腫瘍進行からも観察された（対照の３１日間と比較して、生存期間中央値＝３４日間；ＩＳＴ中央値＝９．６８％；ｐ＝０．５４０７）。５週間のベバシズマブ投与により、対照と比較して、生存期間が４６日間にまで有意に延長された（ＩＳＴ中央値＝４８．３９％；ｐ＝０．０３６９）。超音波により誘導されるＢＢＢ開口とベバシズマブ投与とを併用するストラテジにより、結果として、対照の生存期間中央値の２．３５倍、及びベバシズマブのみの場合の１．５８倍という、生存期間中央値の有意な向上（７３日）が得られた。平均生存及びＩＳＴ平均を計算したときにも同等の観察結果が得られた。
【００４６】
表１．動物の生存率分析についての要約。超音波／ベバシズマブの併用群では生存期間中央値の延長（ＩＳＴ中央値；％）は１３５％であり、ベバシズマブのみの群の４８％よりも性能に優れていたことが判明した。同様にして、平均生存期間における延長（ＩＳＴ平均；％）は超音波／ベバシズマブ併用群では１４３％であり、ベバシズマブのみの群の７６％よりも優れていたことが判明した。ｐ値は全て対照群に対するものである。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
ベバシズマブのみの投与、又は超音波により誘導されるＢＢＢ開口との併用のいずれかの後に、Ｈ＆Ｅ染色及びＣＤ−３１免疫組織化学（ＩＨＣ）を使用し、腫瘍異種移植から第４週目の時点での形態変化及び血管分布を評価した（図１１）。同様の腫瘍形態、すなわち、高度に増殖性の腫瘍周縁部を伴う壊死性の腫瘍コア（ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｃｏｒｅ）の形態を、ベバシズマブのみ、又はベバシズマブ＋超音波によるＢＢＢ開口の場合において検出した。ベバシズマブのみで処理した腫瘍では、ＣＤ−３１  ＩＨＣにより腫瘍周縁部に豊富な血管構造が可視化されたものの、腫瘍コアの可視化はされなかった（白色矢印により図示）。対照的に、ＣＤ−３１により検出される血管分布の有意な減少は、ベバシズマブ＋超音波処理した異種移植片において観察され、腫瘍周縁部は、ベバシズマブのみで処理した腫瘍よりも大きさが有意に小さかった（破線により輪郭を描画；図１１ｃ及び図１１ｆ）。腫瘍血管の定量分析により、ベバシズマブのみで処理した動物の腫瘍異種移植片における血管面積の平均（±ＳＤ）％は０．９３±０．１９％であったことが実証された。血管面積は、超音波とベバシズマブとを併用して処理した異種移植片で顕著に減少しており、すなわち０．２±０．０７％であった（図１１ｃ、図１１ｆ、図１１ｇ）。腫瘍周囲の領域において、Ｈ＆Ｅ染色により組織壊死も観察された（図１１ｂ、図１１ｅ）。これらのデータは、超音波によるＢＢＢ開口を加えることで、ベバシズマブの透過が増強されたこと、並びに特に腫瘍周辺において血管新生が効率的に抑制され、結果的に腫瘍の制御が改善されたことを示す。
【００４９】
実験４
実験４：超音波により誘導されるＢＢＢ開口はベバシズマブの透過を増加させる。
本発明者らは、前述の実験において、超音波処理により大きさの異なる分子の分子透過が増加したことを示した。超音波曝露により、多形神経膠芽腫（ｇｉｌｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ）の治療において必要とされるベバシズマブ投与量を低減可能であることも更に示された。本発明者らの仮説を検証するため、超音波処理あり又はなしで様々な投与量のベバシズマブにより正常マウス及び腫瘍マウスを処理した。ＣＮＳ実質におけるベバシズマブ濃度をＨＰＬＣにより検出した。透過曲線（投与量ｖｓＣＮＳ実質におけるベバシズマブ濃度）をそれに応じて作成した。超音波処理及びＨＰＬＣの操作は、前述の実験１〜４に記載のものと同じとした。
【００５０】
具体的には、かかる実験において、４２匹の正常マウスと４２匹の腫瘍マウスとを使用した。第１群では、マウスには、５０ｍｇ／ｋｇ体重のベバシズマブのみを投与し（ｎ＝３）、又はかかる投与と超音波処理とを行った（ｎ＝３）；第２群では、マウスには、２５ｍｇ／ｋｇ体重のベバシズマブのみを投与し（ｎ＝３）、又はかかる投与と超音波処理とを行った（ｎ＝３）；第３群では、マウスには、１０ｍｇ／ｋｇ体重のベバシズマブのみを投与し（ｎ＝３）、又はかかる投与と超音波処理とを行った（ｎ＝３）；第４群では、マウスは陰性対照として未処理とした（ｎ＝３）。マイクロＰＥＴ／マイクロ−ＣＴによりベバシズマブ濃度も求めることができる。以下は、マイクロＰＥＴ／マイクロ−ＣＴによるベバシズマブ分布の動的変化の評価についての主要な結果である。
【００５１】
ベバシズマブ分布についての動的変化は、ベバシズマブを放射性同位体68Ｇａ3+（半減期：６８分；手順については補足の方法を参照のこと）で放射標識して、マイクロＰＥＴ／マイクロ−ＣＴ融合画像により評価した。静注の１５分後にＰＥＴイメージを撮像し、両群の代表的な冠状断ＰＥＴ像を取得した。この時点では、非特異的結合により、標的とする領域のコントラストは最大に達していた。
【００５２】
超音波処理と粒子投与との併用により、ＢＢＢ開口マウスにおける68Ｇａ−ベバシズマブ透過は、高周波の音波を照射した領域において有意に増強されていることが示された。68Ｇａ−ベバシズマブの透過は、０．１６±０．０２６  ＳＵＶｍａｘから０．６４±０．０９  ＳＵＶｍａｘに増加していた（図１２ａ）。これは４倍増加に相当し、ＨＰＬＣによる定量結果（５．７３倍）と同等である。全身性の取り込みにより、ベバシズマブは主に腎臓で吸収され、代謝されることが示された。ＳＵＶｍａｘレベルは対照群と比較したときにわずかに減少していたものの（７．５３±４．０５  ＳＵＶｍａｘ対８．１９±７．２９  ＳＵＶｍａｘ；ｐ＞０．０５；図１２ｂを参照されたい）、超音波によるＢＢＢ開口を行った動物では、ベバシズマブの代謝経路に変化はない。
【００５３】
実験５
以下実験５の材料及び方法：
１．実験デザイン
正常マウス（ｎ＝１９）及び腫瘍マウス（ｎ＝２６）を含む合計４５匹の腫瘍マウス（ｔｕｍｏｒ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｍｉｃｅ）を使用した。実験は２群に分割した。実験群１では、主目的は、超音波により誘導されるＢＢＢ開口が、脳組織におけるベバシズマブの透過及び蓄積を促進するかを評価することとした（ｎ＝１９）。正常な動物のほとんどを、超音波により誘導されるＢＢＢ開口（ｎ＝１０）なし、及び超音波により誘導されるＢＢＢ開口あり（ｎ＝９）の２群に割り付け、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）キットを使用して脳サンプルのベバシズマブ濃度を定量した。ベバシズマブ投与の２時間後に全ての動物を屠殺し、脳サンプルを保存した。
【００５４】
実験群２の目的は、腫瘍マウスにおいて、ベバシズマブと超音波とを併用することによる治療効果を評価することとした。ベバシズマブの摂取は、Ｕ８７神経膠腫細胞の移植から１０日後に実施した。ベバシズマブを５回静脈内投与（Ｕ８７神経膠腫細胞の移植後１０日、１７日、２４日、３１日、及び３８日）し、腫瘍の進行及び生存の両方を長期的に追った。動物を４つの下位群に分割した：（１）偽処置（ベバシズマブ投与なし）（ｎ＝１０）；（２）週当たり１０ｍｇ／ｋｇのベバシズマブと超音波により誘導されるＢＢＢ開口との併用を５週間（ｎ＝８）；（３）週当たり３０ｍｇ／ｋｇのベバシズマブと超音波により誘導されるＢＢＢ開口との併用を５週間（ｎ＝１２）、及び（４）週当たり５０ｍｇ／ｋｇのベバシズマブを５週間（ｎ＝６）。
【００５５】
２．超音波パラメーター
超音波は、Ｔｓａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ（ＩＵＳ），２０１５  ＩＥＥＥ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌによる、ニューロナビゲーションガイドされる超音波とする。超音波トランスデューサー（Ｉｍａｓｏｎｉｃｓ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ；直径＝６０ｍｍ，曲率半径＝８０ｍｍ，周波数＝４００ｋＨｚ）を適用して、収束（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）超音波処理エネルギーを生成した。任意波形発生器（３３１２０Ａ，Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して駆動信号を生成し、かかる信号をバーストモードの高周波電力増幅器（Ｎｏ．５００−００９，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）に送信した。マウスには２％イソフルランガスで麻酔を行い、定位固定フレーム上に固定した。頭蓋の頂部をクリッパーで刈り取り、ＰＥ−１０カテーテルを尾静脈に挿入した。アクリル製水槽下（底部に、超音波エネルギーの進入が可能な薄膜で密閉された４×４ｃｍ2のウインドウを備える）に、頭部をしっかりと薄膜ウインドウに固定してマウスを直接配置した。ＳｏｎｏＶｕｅ  ＳＦ6を充填した超音波応答性粒子（２〜５μｍ，１０μＬ／マウス，２×１０8個マイクロバブル／ｍＬ；Ｂｒａｃｃｏ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）を処理の前に静脈内投与した。腫瘍移植をした脳部位を、次にバーストトーンモードの超音波に曝露してＢＢＢを局所的に開口させた（０．６３ＭＩ；バースト長＝１０ｍｓ；パルス繰り返し周波数＝１Ｈｚ；照射時間＝６０秒）。
【００５６】
３．マウス神経膠腫モデル
Ｕ８７マウス神経膠腫細胞を、３７℃、５％  ＣＯ2雰囲気下で、１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した最小必須培地（ＭＥＭ）で培養した。トリプシン処理により細胞を回収して、リン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）で１回洗浄し、マウス脳の線条体に移植するためＭＥＭに再懸濁した（１．６ｘ１０5個／μＬ）。無菌の雄性ＮＵ／ＮＵマウス（５〜７週齢）をＢｉｏＬＡＳＣＯ（Ｔａｉｗａｎ）から購入した。マウスを制御環境下に収容及び維持し、全ての手順は長庚大学動物委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｃｈａｎｇ  Ｇｕｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の動物の飼養に関するガイドラインに従って実施した。Ｕ８７腫瘍細胞を移植するに当たり、マウスには２％イソフルランガスで麻酔を行い、定位固定フレーム上に固定した。頭蓋冠を覆う皮膚の矢状切開を行い、露出させた頭蓋において、ブレグマの２ｍｍ前側かつ２ｍｍ外側に対し、２３Ｇの針を使用して孔を形成した。脳表面から２ｍｍ深部に３μＬのＵ８７神経膠腫細胞懸濁液を注入した。３分間注入を実施し、更に２分間かけて針を引き抜いた。腫瘍細胞の移植後１０日間にわたり、マウスの脳の成長をＭＲＩで監視した。
【００５７】
４．定量的ベバシズマブ分析
ベバシズマブの投与の２時間後に脳組織を摘出した。脳組織を均質化し、上清と組織成分との明瞭な分離が観察されるまで、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｍｙ  Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）によりベバシズマブの濃度を測定した。吸光分光光度計により４５０ｎｍで光学密度を測定し、６２０ｎｍでバックグラウンドを差し引いた。
【００５８】
実験５：超音波はベバシズマブの透過を増加させ、多形性膠芽腫の治療におけるベバシズマブの有効性を増強する。
図１３に示す結果によると、基本的に、ベバシズマブの投与量が多くなるほど、脳におけるベバシズマブの透過が多くなることが見て取れる。更に、１０ｍｇ／ｋｇ体重のベバシズマブと超音波とで併用処理した場合、超音波曝露せず５０ｍｇ／ｋｇ体重のベバシズマブで処理した場合と同等の脳サンプル中ベバシズマブ濃度が示された。３０ｍｇ／ｋｇ体重のベバシズマブと超音波との併用処理により、超音波曝露せず５０ｍｇのベバシズマブで処理した場合よりも更に多量のベバシズマブ透過が示された。この結果から、超音波により補助することで、脳において同程度の濃度を達成するのに必要とされるベバシズマブ量が少なくなることが示された。更に処理群では、対照群と比較して腫瘍の進行が抑えられた。加えて、超音波曝露を行った群では、ベバシズマブ投与量が少ない場合でも結果が示された（図１４）。
【００５９】
更に、特に生存試験では（図１５）、３０ｍｇ／ｋｇ体重のベバシズマブと超音波との併用により、他の群れと比べて、最も良好な生存率が提供された。１０ｍｇ／ｋｇ体重のベバシズマブと超音波との併用により処理した群の生存率は、超音波処理せずに５０ｍｇ／ｋｇ体重のベバシズマブで処理した群とほとんど同程度に良好であった。この結果は、超音波がより多くのベバシズマブの透過を補助し、ひいては生存率を良好にすることを示す前述の透過実験と一致した。
【００６０】
結論
結論として、超音波の使用により誘導される血液脳関門の開口は、抗血管新生ｍＡｂ、ベバシズマブのＣＮＳ送達を増強する。ＣＮＳベバシズマブ濃度は最大で５７倍に増強され（図２ａ）、結果として、腫瘍周辺に顕著な抗血管新生効果が生じており、更に重要なことに、現在のＧＢＭ治療におけるベバシズマブに関する血管の正常化にまつわる課題が解決される。更に、超音波を併用してベバシズマブ送達を増強する本試験では、ベバシズマブ投与のみの場合の４８％の改善と比較して、生存期間中央値の１３５％の改善をもたらす、より顕著な治療効果の改善が観察された（表１）。本研究は、モノクローナル抗体（又はその他の巨大分子）のＣＮＳ送達を増強するべく超音波を包含する治療ストラテジの開発に関する原理の証明を提供し、抗ＧＢＭストラテジを前進させるものとして超音波／ベバシズマブの併用を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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