(57)【要約】  本発明は、診断方法の分野に関する。具体的には、本発明は、少なくとも１つのバイオマーカーの量を決定することに基づいて、被験体において心不全と肺疾患とを鑑別する方法を想定する。本発明はまた、診断用デバイスなどの、上述の方法を実施するためのツールに関する。【選択図】図１
2019509476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心不全と肺疾患とを被験体において鑑別するための方法であって、
a. 被験体のサンプル中の、少なくとも3つのバイオマーカーの量を決定するステップであって、前記少なくとも3つのバイオマーカーが、
i. 少なくとも1つのトリアシルグリセリド、少なくとも1つのコレステリルエステル、及び少なくとも1つのホスファチジルコリン;
ii. 少なくとも1つのトリアシルグリセリド、少なくとも1つのホスファチジルコリン、及び少なくとも1つのスフィンゴミエリン;
iii. 少なくとも1つのトリアシルグリセリド、少なくとも1つのコレステリルエステル、及び少なくとも1つのスフィンゴミエリン;
iv. 少なくとも1つのホスファチジルコリン、少なくとも1つのコレステリルエステル、及び少なくとも1つのスフィンゴミエリン;並びに
v. 表2のパネル1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、若しくは199のバイオマーカー、又は表2aのパネル200、201、202、203、204、205、若しくは206のバイオマーカー
である、ステップと、
b. I)ステップa.で決定された量と、参照量とを、又はII)前記少なくとも3つのバイオマーカーの量に基づくスコアと、参照スコアとを比較することによって、心不全と肺疾患とが被験体において鑑別されるステップと
を含む、前記方法。
【請求項２】
ステップb)が、
b1)ステップa)に記載された少なくとも3つのバイオマーカーの決定された量に基づくスコアを計算するステップ、及び
b2)かくして計算されたスコアと参照スコアとを比較することによって、心不全と肺疾患とが被験体において鑑別されるステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パネル1のバイオマーカーの量が決定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
パネル2のバイオマーカーの量が決定されるか、又はパネル200のバイオマーカーの量が決定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
被験体が肺疾患又は心不全に罹患すると疑われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
被験体が息切れ(呼吸困難)に罹患している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
息切れが急性の息切れである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
息切れが慢性の息切れである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
被験体がヒト被験体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
サンプルが血液、血清又は血漿である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
すくなくとも3つのバイオマーカーの量が質量分析(MS)によって決定される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
息切れの原因として心不全と肺疾患とが鑑別される、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
被験体に由来するサンプル中のBNP又はNT-proBNPの量の決定を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法を実行するための診断用デバイスであって、
a)請求項１、３及び４のいずれか一項に記載の少なくとも3つのバイオマーカーについての少なくとも1つの検出器を含む分析ユニットであって、前記分析ユニットが、少なくとも1つの検出器によって検出される前記バイオマーカーの量を決定するために適合されている、分析ユニット、及びそれと作動可能に結合された、
b)少なくとも3つのバイオマーカーの決定された量と参照量との比較を実行するための実体的に組み込まれたコンピュータープログラムコードを含むコンピューターと、前記バイオマーカーについての前記参照量を含むデータベースとを含む評価ユニットであって、それにより、肺疾患と心不全とが鑑別される、評価ユニット
を含む、診断用デバイス。
【請求項１５】
被験体における心不全と肺疾患とを鑑別するため、又は被験体における心不全と肺疾患とを鑑別するための医薬組成物及び/若しくは診断用組成物の調製のための被験体のサンプルにおける請求項１、３及び４のいずれか一項に記載の少なくとも3つのバイオマーカーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断方法の分野に関する。具体的には、本発明は、少なくとも1つのバイオマーカーの量を決定することに基づいて、被験体において心不全と肺疾患とを鑑別する方法を想定する。本発明はまた、診断用デバイスなどの、上述の方法を実施するためのツールに関する。
【背景技術】
【０００２】
心不全は近代医学において重篤な問題である。心臓の機能障害は、生命に関わる状態を生じ、心不全を患う患者にとって不快をもたらす。心不全は、右心室又は左心室のそれぞれに影響を及ぼす可能性があり、強度も異なり得る。ニューヨーク心臓協会(New York Heart association、NYHA)によって最初に分類システムが開発された。この分類システムによると、軽症の心不全はクラスIの症例として分類される。これらの患者は、過度の運動時にのみ症候を示す。中程度の症例は、より少ない運動時にすでにより顕著な症候を示す(クラスII及びIII)が、クラスIVは、安静時にすでに症候を示す(New York Heart Association. Diseases of the heart and blood vessels. Nomenclature and criteria for diagnosis, 6th ed. Boston: Little, Brown and co, 1964;114)。
【０００３】
心不全の有病率は、過去数年にわたって、欧米先進国の集団において着実に増加している。この増加の理由の1つは、近代医学による平均余命の上昇及び心筋梗塞後の生存の改善にあるとみられている。
【０００４】
心不全の診断は、今日、臨床症状、イメージングモダリティ、並びにバイオマーカー、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)及びアミノ末端プロ脳性ナトリウム利尿ペプチド(NT-proBNP)に主に頼っている。最近、心不全を診断するため及び/又は心不全の進行若しくは退行をモニタリングするための代謝バイオマーカーが報告されている(それぞれWO2011/092285及びWO2013/014286を参照)。
【０００５】
心不全の典型的な症状は息切れ(呼吸困難)である。息切れの診断は、主に心電図および胸部X線写真を用いて行われる。息切れは、しかしながら、肺疾患などの種々の心臓以外の原因を有しうる。症状の潜在的な心臓による原因を考慮して、心不全と肺疾患を鑑別することが非常に推奨される。息切れの原因を正しく特定することにより、適切な治療手段の開始が可能となる。
【０００６】
心不全と肺疾患との鑑別(区別)を可能にする手段と方法が長く必要とされてきた。こうした手段及び方法は、信頼できかつ効率的な鑑別を可能にするであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2011/092285号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2013/014286号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】New York Heart Association. Diseases of the heart and blood vessels. Nomenclature and criteria for diagnosis, 6th ed. Boston: Little, Brown and co, 1964;114
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の根底にある技術的な課題は、前記の必要性に対応するための手段及び方法の提供とされるべきである。
【００１０】
該技術的課題は、特許請求の範囲及び以下において特徴付けられる実施形態により解決される。
【００１１】
したがって、本発明は、被験体において心不全と肺疾患とを鑑別するための方法であって、以下のステップ:
(a)被験体のサンプルにおいて、特に、少なくとも3つのバイオマーカーの量を決定するステップ、及び
(b) i)ステップ(a)で決定された前記バイオマーカーの量を、参照量と比較するか、又はii)前記少なくとも3つのバイオマーカーの量に基づくスコアと、参照スコアとを比較し、それにより、被験体において心不全と肺疾患とが鑑別されることとなるステップ、
を含む、方法に関する。
【００１２】
本発明は、被験体において心不全と肺疾患とを鑑別する方法であって、以下のステップ:
(a)被験体のサンプルにおいて、表１の第1列に示すバイオマーカーから選択される、少なくとも1つのバイオマーカーの量を決定するステップ、及び
(b) ステップ(a)で決定された前記バイオマーカーの量を、参照量と比較し、それにより、被験体において心不全と肺疾患とが鑑別されることとなるステップ、
を含む、方法に関する。
【００１３】
本発明に従って参照される方法は、上述のステップから本質的になる方法又はさらなるステップを含む方法を含む。例えば、該方法は、追加のマーカー、例えば下記に本明細書に記載するタンパク質マーカーなどの量の決定を含みうる。しかし、本方法は、好ましい実施形態では、in vitro又はex vivoで行われる方法、すなわち、人体又は動物体に対して実施されない方法であることを理解されたい。本方法は、好ましくは自動化により補助され得る。
【００１４】
本明細書に使用される「心不全と肺疾患とを鑑別する(区別する)」という句は、好ましくは、肺疾患に罹患している被験者と心不全に罹患している被験者とを鑑別することを意味する。この表現は、好ましくは、肺疾患および心不全を示差的に診断すること、さらにより好ましくは、低減された駆出率の心不全と肺疾患とを示差的に診断することを含む。「心不全と肺疾患とを鑑別する(鑑別する)」という用語は、特に、呼吸困難の原因として肺疾患と心不全とを鑑別することを意味する（「息切れ」という用語についての説明については下記を参照のこと）。したがって被験者の息切れが肺疾患または心不全により引き起こされるかが評価される。当業者に理解されるとおり、そのような評価は、試験される被験体の100％に対して正しいことが好ましいが、通常はそうでない可能性がある。しかし、この用語は、統計学的に有意な一部の被験体を正確に評価でき、したがって鑑別できることを必要とする。一部が統計学的に有意であるかどうかは、種々の周知の統計学的評価ツール、例えば、信頼区間の決定、p値の決定、スチューデントのt検定、マン・ホイットニー検定などを用いて、当業者によって労苦もなく決定され得る。詳細は、Dowdy and Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983に見出される。好ましい信頼区間は、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、又は少なくとも95％である。p値は、好ましくは、0.2以下、0.1以下、又は0.05以下である。好ましくは、鑑別（区別）は、本発明の方法において決定されるバイオマーカー、すなわち、本発明の方法のステップ(a)において具体的に言及される少なくとも3つのバイオマーカー、及び決定される場合は、NT-proBNP若しくはBNPに基づく。
【００１５】
ある実施形態において、本明細書に言う鑑別は、該鑑別の検証などのさらなる工程を含みうる。したがって、本明細書にいう鑑別は、好ましくは、心不全と肺疾患との間の鑑別を補助するであろう。
【００１６】
本明細書で使用する「被験体（被験者）」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物に関する。より好ましくは、被験体は霊長類であり、最も好ましくはヒトである。被験体は、女性、または特に男性被験体であり得る。
【００１７】
試験される被験体は、好ましくは、心不全または肺疾患に罹患している疑いがあるものである。心不全または肺疾患に罹患していると疑われる被験体は、好ましくは、息切れ（呼吸困難とも言う）を罹患するものである。
【００１８】
好ましい実施形態において、息切れは慢性の息切れである。
【００１９】
別の好ましい実施形態では、息切れは急性の息切れである。
【００２０】
したがって、試験される被験体は息切れに苦しんでいることが想定される。それゆえ、本発明は、息切れを患っている被験体における心不全と肺疾患とを鑑別する方法に関する。特に、息切れの原因として、心不全と肺疾患とが鑑別される。
【００２１】
「息切れ」という用語は当該技術分野において広く知られている。本明細書において使用されるとおり、この用語は好ましくは呼吸障害をいう。好ましくは、該呼吸障害は、呼吸量の上昇及び／又は呼吸頻度の上昇をもたらす。これは、様々な強度の定性的に異なる感覚を含む、呼吸不快感の主観的経験である。独特の感覚（異なる感覚）としては、例えば、胸部の圧迫感及び空気飢餓感が挙げられる。息切れは、通常の酸素飽和レベルよりも低い、少なくとも95％酸素飽和レベルで起こり得る。息切れは過呼吸の原因となり得る。上記のように、息切れは、急性の息切れおよび慢性の息切れを包含する。急性息切れは好ましくは非永続的に生じる息切れであるのに対して、慢性息切れは好ましくは永続的に起こる息切れである。急激な息切れは、通常、進行的に悪化する。好ましくは、急性息切れは、急性発症から1週間を超えずに持続するが、慢性呼吸困難は、1週間を超える期間、特に1ヶ月以上持続することを特徴とする。
【００２２】
好ましくは、被験体は成人である。より好ましくは、被験体は40歳以上、最も好ましくは50歳以上である。さらに、被験体は54歳以上（54歳よりも高齢）であるが、61歳よりも若いことが想定される。
【００２３】
ある実施形態において、被験体は、54歳より高齢であり、特に60歳より高齢であり、さらには、70歳よりも高齢である。
【００２４】
別の実施形態において、被験体は、26.8kg/m2を超える、特に28.0kg/m2を超える、または30.0kg/m2を超える肥満指数（BMI）を有する。
【００２５】
好ましくは、被験体は、しかしながら、上記の疾患および障害以外については、明らかに健康である。また、好ましくは、被験体は、卒中（脳卒中）又は心筋梗塞にサンプル採取前の最後の4月以内に、或いは急性又は慢性の炎症性疾患や悪性腫瘍に罹患していないものである。さらに、被験体は、サンプルを採取する前の最後の4週間以内に、好ましくは安定した投薬中である。
【００２６】
ある好ましい実施形態において、試験される被験体は、腎機能の障害を患っていない。しかしながら、被験者が腎機能障害を患っていることも肯定される。腎機能は、例えば糸球体ろ過速度（GFR）を測定することにより、評価することができる。好ましくは、GFRが60mL/分/1.73m2未満、特に50mL/分/1.73m2未満である場合、被験体は腎機能障害を患っている。好ましくは、被験体は、GFRが60mL/分/1.73m2以上、特に70mL /分/1.73m2超である場合、腎機能障害を患っていない。
【００２７】
より好ましくは、腎疾患を患っていない被験体は、慢性腎疾患ステージ3〜5に罹患していない（分類については、例えば、National Kidney Foundationによる、2002のK/DOQI clinical practice guidelines for chronic kidney disease: evaluation, classification, and stratification. Am. J. Kidney Dis. 39, S1-266を参照されたい。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。
【００２８】
GFRは、血液および尿中の物質の比較測定によって正確に計算され得るか、または単に血液検査結果（eGFR）を使用する公式によって推定され得る。通常、これらの推定値は、特に信頼できる尿収集が困難な高齢者及び病気患者において臨床の現場で使用される。これらの試験は、例えば慢性腎機能不全の等級付けにおいて、腎臓の排泄機能を評価する上で重要である。
【００２９】
eGFRは大規模な臨床研究によってGFRと関連している（National Kidney Foundation（2002年2月）、「K/DOQI clinical practice guidelines for chronic kidney disease: evaluation, classification, and stratification（慢性腎疾患のためのK/DOQI臨床診療ガイドライン：評価、分類、および層別）」American Journal of Kidney Diseases 39 (2 Suppl 1): S1-266. doi:10.1016/S0272-6386(02)70081-4. PMID 11904577)。臨床評価のために、eGFRおよびGFRのスケールは互換的に使用可能である。
【００３０】
「肺疾患」という用語は、当業者によってよく理解されている。本明細書で使用するとおり、この用語は、任意の種類の肺疾患をいう。特に、この用語は、息切れを引き起こすあらゆる種類の肺疾患をいう。そのような疾患は当該技術分野において広く知られている。好ましくは、肺疾患という用語は、COPD（慢性閉塞性肺疾患）、肺線維症、喘息、気胸、肺感染、急性呼吸窮迫症候群、肺水腫、肺傷害又は出血、呼吸不全および肺塞栓症を含む。特に、この用語には、COPD、喘息および肺線維症が含まれる。
【００３１】
用語「心不全」は、当技術分野で周知である。本明細書中で使用される場合、心臓の機能障害に関する。これは、心臓が、組織の代謝要求を満たすのに十分な速度で酸素化血液を供給しない、進行性障害である。好ましくは、用語心不全は、本明細書中で使用される場合、鬱血性心不全(CHF)に関する。
【００３２】
心不全は、多くの心血管疾患の最終的な共通の段階であり、最終段階の患者が、心臓の構造又は機能の異常から生じる努力不耐性(effort intolerance)及び/又は体液貯留(fluid retention)の典型的な兆候及び症状を示す、臨床的症候群として定義される。上記のとおり、心不全の典型的な症状は息切れである。
【００３３】
心臓の機能障害は、心臓からの血液の駆出率の顕著な低下、及びしたがって血流の減少をもたらす収縮機能障害であり得る。具体的には、収縮期心不全は、顕著に低下した左心室駆出率(LVEF)、好ましくは50％未満の駆出率(駆出率の低下を有する心不全、HFrEF)を特徴とする。あるいは、この障害は、拡張機能障害、すなわち心室が適切に弛緩できないことであり得る。後者は通常、より硬い心室壁を伴う。拡張機能障害は、心室の不充分な充填を引き起こし、したがって、一般的に血流に対する影響をもたらす。したがって、拡張機能障害はまた、拡張末期圧の上昇をもたらし、最終結果は収縮機能障害の場合と同等である(左心不全の肺浮腫、右心不全の末梢浮腫)。したがって、心不全は、右心(肺循環)、左心(体循環)又はその両方に影響し得る。心機能障害及びしたがって心不全を測定する技術は、当該技術分野において周知であり、心エコー検査、電気生理学、血管造影を含む。心臓の機能障害は、永久に、又は特定のストレス若しくは運動条件下でのみ生じ得ることが理解される。症状の強さに依存して、心不全は、本明細書の他の箇所に記載されているように分類され得る。心不全の典型的な症状は、呼吸困難、胸痛、めまい、混乱、肺及び/又は末梢浮腫を含む。症状の発生及びその重症度は、心不全の重症度並びに心不全の特徴及び原因、収縮期又は拡張期又は限定的、すなわち右心若しくは左心に位置する心不全に依存し得ることが理解される。心不全のさらなる症状は、当該技術分野において周知であり、Stedman又はBrunnwaldなどの医学の標準テキストブックに記載されている。
【００３４】
異なる病態生理学を有する心不全の2つのサブセットは、各心拍で押し出される左心室における血液の総量のパーセンテージである左心室駆出率(LVEF)の測定に基づいて記載される: 左心室駆出率の低下を有する心不全(HFrEF)及び左心室駆出率の維持を有する心不全(HFpEF)。好ましくは、心不全という用語はHFpEF及びHFrEFの両方を含む。本発明の好ましい実施形態において心不全はHFrEFである。
【００３５】
収縮性心不全としても知られるHFrEFは、心筋収縮の低下及び左心室の排出(emptying)を特徴とする。表現「左心室駆出率の低下」は、好ましくは、50％より低い左心室駆出率(LVEF)に関する。
【００３６】
HFrEFの多くの原因があるが、最も一般的なものは、冠動脈疾患から生じ、心筋梗塞より前の虚血性心筋症に関連する。虚血性心筋症(ICMP)は、冠動脈の狭窄又は閉塞が、心臓組織への血流及び酸素供給を制限し、心筋を損傷又は弱める(機能的心筋の喪失)場合に生じる。さらに、HfrEFは、非虚血性原因を有し得る。HFrEFの最も一般的な非虚血性原因の1つは、拡張型心筋症(dilatative cardiomyopathy)(DCMP、拡張型心筋症(dilated cardiomyopathy)とも称される)である。DCMPは、心臓の主要なポンピングチャンバーである左心室が拡大し、拡張し、弱いため、血液を送る心臓の能力が低下している状態である。DCMPの原因は、心筋感染(心筋炎)、高血圧、心臓弁膜症、及びアルコール乱用から家族性(遺伝性)形態まで及び得る。好ましくは、用語NICMP(非虚血性心筋症)及びDCMPは、本明細書中で交換可能に使用される。
【００３７】
したがって、HFrEFに罹患している被験体は、拡張型心筋症(dilatative cardiomyopathy)(DCMP、拡張型心筋症(dilated cardiomyopathy)と称されることも多い)又は虚血性心筋症(ICMP)に罹患し得る。
【００３８】
したがって、用語HFrEFは、好ましくは、ICMP及びDCMPを包含する。ICMPに罹患している被験体は、好ましくは、LVEFの低下及び50％を超える冠動脈狭窄を有する。DCMPに罹患している被験体は、好ましくは、LVEFの低下及び50％未満の冠動脈狭窄を有する。特に、DCMPに罹患している被験体は、好ましくは、LVEFの低下、50％未満の冠動脈狭窄及び左心室壁厚>55mmを有する。さらに、DCMPに罹患している被験体は、LVEFの低下、50％未満の冠動脈狭窄及び55mmより大きい左心室拡張末期径を有し得る。
【００３９】
心不全の症状は、当該技術分野において周知であり、上に記載されている。無症候性心不全は、好ましくは、NYHAクラスIによる心不全である。NYHAクラスIによる心不全を有する被験体は、身体活動の制限がなく、通常の身体活動は、過度の息切れ、疲労、又は動悸を引き起こさない。症候性心不全は、好ましくは、NYHAクラスII、III及び/又はVIによる、特にNYHAクラスII及び/又はIIIによる心不全である。NYHAクラスII又はIIIによる心不全を有する被験体は、身体活動のわずかな(NYHAクラスII)又は著しい(NYHAクラスIII)制限があり、安静時には苦痛が無いが、通常の(NYHAクラスII)又は通常を下回る(NYHAクラスIII)身体活動は、過度の息切れ、疲労、又は動悸をもたらす。
【００４０】
本発明の方法のステップを実施することにより、被験体の息切れが心不全に起因するか他の原因によるかを評価することもできる。この文脈において、他の原因には、肺疾患、肥満、高体重、訓練されていないか若しくは訓練が不十分な被験者の身体状態、不安状態などの心理的状態が含まれる。息切れを患っている被験体からのサンプル(試料)中の本明細書で言及されるバイオマーカーの量の決定に基づき、被験体が心不全に罹患しているか否かを評価することができる。被験者が心不全に罹患している場合、心不全が息切れの原因である可能性が高い。被験者が心不全に罹患していない場合、息切れは心不全以外の原因（例えば肺疾患）を有する可能性が高い。
【００４１】
本発明の方法は、実施例の部の表１の第１欄に示される少なくとも1つのバイオマーカーの決定(測定)を想定する。特に本発明は、少なくとも3つのバイオマーカーの、すなわち、少なくとも3つのバイオマーカーの組み合わせの量の決定を想定する。好ましい組み合わせは、本明細書中他の箇所に記載される。用語「バイオマーカー」は、本明細書中で使用される場合、本明細書において言及される疾患又は効果の指標として機能する分子種を指す。前記分子種は、被験体のサンプル中に見出される代謝産物自体であってもよい。さらに、特定の場合には、バイオマーカーはまた、前記代謝産物に由来する分子種であってもよい。そのような場合、実際の代謝産物は、サンプル中で又は決定過程の間に化学的に修飾され、前記修飾の結果として、化学的に異なる分子種、すなわちアナライトが決定される分子種となる。そのような場合、アナライトは実際の代謝産物を表し、各医学的状態の指標として同じ可能性を有することが理解される。本発明の一実施形態では、トリアシルグリセリドが、それ自体、本明細書中他の箇所に記載されるように、決定される。本発明の一実施形態では、ホスファチジルコリンが、それ自体、本明細書中他の箇所に記載されるように、決定される。本発明の一実施形態では、セラミドが、それ自体、本明細書中他の箇所に記載されるように、決定される。本発明の一実施形態では、スフィンゴミエリンが、それ自体、本明細書中他の箇所に記載されるように、決定される。本発明の一実施形態では、コレステリルエステルが、それ自体、本明細書中他の箇所に記載されるように、決定される。好ましくは、本発明において決定される少なくとも3つのバイオマーカーは、代謝産物バイオマーカーである(ペプチド/タンパク質マーカーであるさらなるマーカーBNP及びNT-proBNPを除いて。以下参照)。用語「代謝産物」は、当技術分野において周知である。好ましくは、本発明における代謝産物は、小分子化合物である。
【００４２】
本発明の方法において、表１の第１欄に示される少なくとも1つのバイオマーカーの量が決定される。特に、少なくとも、少なくとも3つのバイオマーカーの(すなわち、少なくとも3つの代謝産物バイオマーカーの)量が決定される。用語「少なくとも3つのバイオマーカー」は、本明細書で使用される場合、3つ又は4つ以上を意味する。したがって、3、4、5、6、7、8、9、10又はさらにそれ以上のバイオマーカーの量が、決定され(かつ参照と比較され)得る。好ましくは、3〜10個のバイオマーカー、特に代謝産物バイオマーカーの量が、決定され(かつ参照と比較され)る。
【００４３】
好ましくは、決定されるバイオマーカーは、脂質バイオマーカー（脂質代謝物バイオマーカー）である。したがって、バイオマーカーは、好ましくは、代謝産物バイオマーカー(すなわち、脂質バイオマーカー)である。より好ましくは、決定されるバイオマーカーは、少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、少なくとも1つのコレステリルエステルバイオマーカー、少なくとも1つのホスファチジルコリンバイオマーカー、及び/又は少なくとも1つのセラミドバイオマーカーからなる群から選択される。したがって、本発明の方法は、1つ以上のスフィンゴミエリンバイオマーカー、1つ以上のトリアシルグリセリドバイオマーカー、1つ以上のコレステリルエステルバイオマーカー、1つ以上のホスファチジルコリンバイオマーカー、及び/又は1つ以上のセラミドバイオマーカーの決定を想定する。さらに、グルタミン酸の量が決定され得る。一実施形態では、(i)少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、(ii)少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、及び(iii)少なくとも1つのコレステリルエステルバイオマーカー若しくは少なくとも1つのホスファチジルコリンバイオマーカーの量が決定される。
【００４４】
決定される少なくとも3つのバイオマーカーは、好ましくは、上記の異なる化合物クラスの少なくとも3つに属する。例えば、少なくとも3つのバイオマーカーの1つはトリアシルグリセリドバイオマーカーであり、1つはスフィンゴミエリンバイオマーカーであり、1つはコレステリルエステルバイオマーカーである。しかし、少なくとも3つのバイオマーカーが、単一の化合物クラス、又は2つの化合物クラスに属することも想定される。さらに、心不全と肺疾患とを鑑別するために、表１の第１欄に示されるバイオマーカーから選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を決定し、参照量と比較することができる。例えば、SM23またはOSS2の量を決定することができる。さらに、両方のマーカー、すなわちSM23およびOSS2の量を決定することができる。
【００４５】
本発明において決定される好ましいバイオマーカーは、実施例のセクションの表1の第1列に開示される。
【００４６】
したがって、少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカーは、好ましくは、OSS2、SOP2、SPP1、SSP2、SSS、PPO1、及びPPPからなる群から選択され、より好ましくは、OSS2、SOP2、SPP1、SSP2、PPO1及びPPPからなる群から選択され、さらにより好ましくは、OSS2、SOP2、SPP1、SSP2及びPPO1、特にOSS2及びSOP2から選択され、最も好ましくはOSS2である。好ましくは、1、2、若しくは3個、又はそれ以上のトリアシルグリセリドバイオマーカーが決定される。
【００４７】
少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーは、好ましくは、SM10、SM18、SM2、SM21、SM23、SM24、SM28、SM29、SM3、SM5、SM8、及びSM9からなる群から(特に、SM10、SM18、SM21、SM23、SM24及びSM28から)選択される。より好ましくは、少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーは、SM23、SM24、及びSM18からなる群から選択される。さらにより好ましくは、少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーはSM18又はSM24であり、最も好ましくはSM23である。好ましくは、1、2、3、4個又はそれ以上のスフィンゴミエリンバイオマーカーが決定される。
【００４８】
少なくとも1つのセラミドバイオマーカーは、好ましくは、Cer(d16:1/24:0)、Cer(d17:1/24:0)、Cer(d18:1/23:0)、Cer(d18:1/24:1)、及びCer(d18:2/24:0)からなる群から選択される。好ましくは、1若しくは2個、又はそれ以上のセラミドバイオマーカーの量が決定される。より好ましくは、少なくとも1つのセラミドバイオマーカーは、Cer(d16:1/24:0)、及びCer(d18:1/24:1)からなる群から選択される。さらにより好ましくは、少なくとも1つのセラミドバイオマーカーはCer(d16:1/24:0)である。
【００４９】
少なくとも1つのホスファチジルコリンバイオマーカーは、好ましくは、PC4又はPC8である。好ましくは、1つのホスファチジルコリンバイオマーカー、特にPC4の量が決定される。しかし、バイオマーカーPC4及びPC8の両方を決定することも想定される。
【００５０】
少なくとも1つのコレステリルエステルバイオマーカーは、好ましくは、コレステリルエステルC18:0又はコレステリルエステルC18:2である。好ましくは、1つのコレステリルエステルバイオマーカー、特に、コレステリルエステルC18:2の量が決定される。しかし、コレステリルエステルC18:0及びコレステリルエステルC18:2の両方を決定することも想定される。好ましくは、コレステリルエステルバイオマーカーは、コレステリルエステルC18:1ではない。
【００５１】
したがって、本発明の方法のステップ(a)で参照されるバイオマーカー（１又は複数）は、好ましくは、OSS2、SOP2、SPP1、SSP2、SSS、PPO1、PPP、SM10、SM18、SM2、SM21、SM23、SM24、SM28、SM29、SM3、SM5、SM8、SM9、Cer(d16:1/24:0)、Cer(d17:1/24:0)、Cer(d18:1/23:0)、Cer(d18:1/24:1)、Cer(d18:2/24:0)、PC4、PC8、コレステリルエステルC18:0、コレステリルエステルC18:2、及びグルタミン酸からなるバイオマーカーの群から選択される。上述のバイオマーカーは、代謝産物バイオマーカーである。
【００５２】
少なくとも1つのバイオマーカーの量が決定される場合、バイオマーカーは、好ましくは、SM23、PC4、OSS2、及びコレステリルエステルC18:2から選択される。特に、SM23またはOSS2の量が決定される（および参照と比較される）。さらに、SM23およびOSS2の量が決定されることが想定される。
【００５３】
バイオマーカーの定義
本発明において、OSS2、SOP2、SPP1、SSP2、SSS、PPO1、PPP、SM10、SM18、SM2、SM21、SM23、SM24、SM28、SM29、SM3、SM5、SM8、SM9、Cer(d16:1/24:0)、Cer(d17:1/24:0)、Cer(d18:1/23:0)、Cer(d18:1/24:1)、Cer(d18:2/24:0)、PC4、PC8、コレステリルエステルC18:0、コレステリルエステルC18:2及びグルタミン酸からなる群から選択される少なくとも１つの代謝産物バイオマーカーの量、特に少なくとも3つの代謝産物バイオマーカーの量を決定することができる。
【００５４】
これらのバイオマーカーの好ましい定義は、実施例のセクションの表1に提供される。したがって、バイオマーカーは、好ましくは、以下のように定義される。
【００５５】
トリアシルグリセリド(TAG)バイオマーカー
バイオマーカーOSS2、SOP2、SPP1、SSP2、SSS、PPO1、及びPPPは、トリアシルグリセリド(TAG：トリアシルグリセリド)である。
・OSS2は、TAG(C18:1, C18:0, C18:0)である
・PPO1は、TAG(C16:0, C16:0, C18:1)である
・PPPは、TAG(C16:0, C16:0, C16:0)である
・SOP2は、TAG(C18:0, C18:1, C16:0)である
・SPP1は、TAG(C18:0, C16:0, C16:0)である
・SSP2は、TAG(C18:0, C18:0, C16:0)である
・SSSは、TAG(C18:0, C18:0, C18:0)である
【００５６】
トリアシルグリセリドTAG(Cx1:y1, Cx2:y2, Cx3:y3)は、好ましくは、トリアシルグリセリドが3つの脂肪酸エステル残基を含み、ここで、1つの脂肪酸エステル残基がCx1:y1であり、これは、この残基がx1個の炭素原子及びy1個の二重結合を含むことを意味し、1つの脂肪酸エステル残基がCx2:y2であり、これは、この残基がx2個の炭素原子及びy2個の二重結合を含むことを意味し、1つの脂肪酸エステル残基がCx3:y3であり、これは、この残基がx3個の炭素原子及びy3個の二重結合を含むことを意味することを意味することが示される。好ましくは、これらの脂肪酸エステル残基のいずれかが、グリセロールの任意の元のヒドロキシル基に結合されてよい。
【００５７】
例えば、SOP2は3つの脂肪酸エステル残基を含み、ここで、1つの脂肪酸エステルがC18:0であり、これは、この残基が18個の炭素原子及び0個の二重結合を含むことを意味し、1つの脂肪酸エステル残基がC18:1であり、これは、この残基が18個の炭素原子及び1個の二重結合を含むことを意味し、1つの脂肪酸エステル残基がC16:0であり、これは、この残基が16個の炭素原子及び0個の二重結合を含むことを意味する。好ましくは、これらの脂肪酸エステル残基のいずれかが、グリセロールの任意の元のヒドロキシル基に結合されてよい。
【００５８】
セラミド(CER)バイオマーカー
バイオマーカーCer(d16:1/24:0)、Cer(d17:1/24:0)、Cer(d18:1/23:0)、Cer(d18:1/24:1)、及びCer(d18:2/24:0)はセラミドである。
【００５９】
セラミドCER(dx1:y1/x2:y2)は、好ましくは、セラミドが「スフィンゴシン骨格」dx1:y1(式中、x1は炭素原子の数を表し、y1は二重結合の数を表す)及び「脂肪酸アミド」残基x2:y2(式中、x2は炭素原子の数を表し、y2はその二重結合の数を表す)を含むことを意味することが示される。好ましくは、「d」は、骨格が2つのヒドロキシル基を含むことを示す。
・Cer(d16:1/24:0)は、セラミド(d16:1/24:0)である
・Cer(d17:1/24:0)は、セラミド(d17:1/24:0)である
・Cer(d18:1/23:0)は、セラミド(d18:1/23:0)である
・Cer(d18:1/24:1)は、セラミド(d18:1/24:1)である
・Cer(d18:2/24:0)は、セラミド(d18:2/24:0)である
【００６０】
例えば、セラミドCer(d16:1/24:0)は、好ましくは、セラミドが、16個の炭素原子及び1個の二重結合を含む「スフィンゴシン骨格」d16:1、並びに24個の炭素原子及び0個の二重結合を含む「脂肪酸アミド」残基24:0を含むことを意味することが示される。
【００６１】
スフィンゴミエリン(SM)バイオマーカー
SMは、スフィンゴミエリンの略称である。本明細書中以下に記載されるように、スフィンゴミエリンバイオマーカーSM10、SM18、SM2、SM21、SM23、SM24、SM5及びSM9の量は、サンプル中の単一のスフィンゴミエリン種の量を決定することによって、又は同一若しくは実質的に同一の分子量を有する2つ(若しくはさらには3つ)のスフィンゴミエリン種の総量を決定することによって、決定され得る(実施例のセクションの表1を参照)。例えば、SM10については、スフィンゴミエリン(d18:1/18:0)の量、又はスフィンゴミエリン(d18:1/18:0)及びスフィンゴミエリン(d16:1/20:0)の総量が決定され得る。単一種又は2種(若しくは3種)の量が決定されるかどうかは、決定に使用されるアッセイに依存し得る。例えば、決定ステップ(ステップa)の基礎となるアッセイが単一種の決定を可能にする場合、単一の種の量が決定される。決定ステップの基礎となるアッセイが2種(又は3種)の総量のみの決定(単一種の決定ではなく)を可能にする場合、言い換えれば、アッセイが2種(又は3種)のそれぞれの量を別々に決定することができない場合、2種(又は3種)の総量が決定され得る。例えば、バイオマーカーの量の決定が質量分析を含む場合、種のピークが重複するので、バイオマーカーの量の決定は、好ましくは、2種(又は3種)の質量スペクトルにおける単一ピークに基づく。これは、当業者によって考慮される。本明細書中以下に(若しくは表1に)記載される単一種の決定、及び2種(若しくは3種)の決定は、信頼できる鑑別（区別）を可能にする。さらに、同じ分子量を有する2種(又は3種)の総量の決定は、あまり複雑ではない(単一種の決定と比較して)。同じことがPC8の決定にも当てはまりる(下記参照)。
【００６２】
実施例のセクションの表1において、SM10、SM18、SM2、SM21、SM23、SM24、SM5及びSM9についての好ましいスフィンゴミエリン種が列挙されている(この種はこの表において「アナライト」と称される)。
【００６３】
SM10、SM2、SM24、SM5、及びSM9の場合、2つのアナライト(アナライト1及びアナライト2)が列挙される。前記バイオマーカーは、好ましくは、アナライト2(例えば、SM2について：SM(d16:1/16:0))、より好ましくはアナライト1(例えば、SM2について：SM(d18:1/14:0))、最も好ましくはアナライト1及び2(SM2について：スフィンゴミエリン(d18:1/14:0)及びスフィンゴミエリン(d16:1/16:0))を指す。したがって、表1に2種が列挙されているバイオマーカーは、アナライト1、アナライト2又はアナライト1とアナライト2との組み合わせである。 
【００６４】
したがって、前記バイオマーカーの量は、好ましくは、アナライト2の、又はより好ましくはアナライト1の量を決定することによって、最も好ましくはアナライト1及びアナライト2の組み合わせた量(したがって総量)を決定することによって、決定される。したがって、前記バイオマーカーの量は、アナライト1若しくは2の量、又はアナライト1及び2の量の合計である。同じことがPC8に当てはまる。
【００６５】
バイオマーカーSM18、SM21及びSM23の場合、3つのアナライト(アナライト1、2及び3)が列挙される。前記バイオマーカーは、好ましくは、アナライト3、より好ましくはアナライト2、さらにより好ましくはアナライト1、最も好ましくはアナライト1、2及び3を指す。したがって、表1に3種が列挙されているバイオマーカーは、アナライト1、アナライト2、若しくはアナライト3、又はアナライト1、アナライト2及びアナライト3の組み合わせである。
【００６６】
2つのアナライトがバイオマーカーについて列挙されている場合(アナライト1及びアナライト2)、バイオマーカーはアナライト1であることが想定される。あるいは、バイオマーカーはアナライト2であってもよい。3つのアナライトがバイオマーカーについて列挙されている場合(アナライト1、アナライト2及びアナライト3)、バイオマーカーはアナライト1であることが想定される。あるいは、バイオマーカーはアナライト2であってもよい。また、バイオマーカーはアナライト3であってもよい。あるいは、バイオマーカーは、アナライト1とアナライト2の組み合わせであってもよい。あるいは、バイオマーカーは、アナライト1とアナライト3の組み合わせであってもよい。あるいは、バイオマーカーは、アナライト2とアナライト3の組み合わせであってもよい。あるいは、バイオマーカーは、アナライト1、アナライト2及びアナライト3の組み合わせであってもよい。
【００６７】
したがって、前記バイオマーカーの量は、好ましくは、アナライト3の、又はより好ましくはアナライト2の、さらにより好ましくはアナライト1の量を決定することによって、最も好ましくはアナライト1、アナライト2、及びアナライト3の組み合わせた量(したがって総量)を決定することによって、決定される。したがって、前記バイオマーカーの量は、アナライト1、2、若しくは3の量、又はアナライト1、2及び3の量の合計である。
【００６８】
以下が特に適用される:
バイオマーカーSM10は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:1/18:0)を、又はより好ましくはスフィンゴミエリン(d18:1/18:0)及びスフィンゴミエリン(d16:1/20:0)を指す。したがって、バイオマーカーSM10は、スフィンゴミエリン(d18:1/18:0)、又はスフィンゴミエリン(d18:1/18:0)及びスフィンゴミエリン(d16:1/20:0)の組み合わせである。
【００６９】
したがって、SM10の量は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:1/18:0)の量を決定することによって、又はスフィンゴミエリン(d18:1/18:0)及びスフィンゴミエリン(d16:1/20:0)の組み合わせた量(したがって総量)を決定することによって、決定される。したがって、SM10の量は、スフィンゴミエリン(d18:1/18:0)の量、又はスフィンゴミエリン(d18:1/18:0)及びスフィンゴミエリン(d16:1/20:0)の量の合計である。
【００７０】
バイオマーカーSM18は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:1/21:0)を、又はより好ましくはスフィンゴミエリン(d18:1/21:0)、スフィンゴミエリン(d16:1/23:0)及びスフィンゴミエリン(d17:1/22:0)を指す。したがって、バイオマーカーSM18は、スフィンゴミエリン(d18:1/21:0)、又はスフィンゴミエリン(d18:1/21:0)、スフィンゴミエリン(d16:1/23:0)及びスフィンゴミエリン(d17:1/22:0)の組み合わせである。
【００７１】
したがって、SM18の量は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:1/21:0)の量を決定することによって、又はスフィンゴミエリン(d18:1/21:0)、スフィンゴミエリン(d16:1/23:0)及びスフィンゴミエリン(d17:1/22:0)の組み合わせた量(したがって総量)を決定することによって、決定される。したがって、SM18の量は、スフィンゴミエリン(d18:1/21:0)の量、又はスフィンゴミエリン(d18:1/21:0)、スフィンゴミエリン(d16:1/23:0)及びスフィンゴミエリン(d17:1/22:0)の量の合計である。
【００７２】
バイオマーカーSM2は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:1/14:0)を、又はより好ましくはスフィンゴミエリン(d18:1/14:0)及びスフィンゴミエリン(d16:1/16:0)を指す。したがって、バイオマーカーSM2は、スフィンゴミエリン(d18:1/14:0)、又はスフィンゴミエリン(d18:1/14:0)及びスフィンゴミエリン(d16:1/16:0)の組み合わせである。
【００７３】
したがって、SM2の量は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:1/14:0)の量を決定することによって、又はスフィンゴミエリン(d18:1/14:0)及びスフィンゴミエリン(d16:1/16:0)の組み合わせた量(したがって総量)を決定することによって、決定される。したがって、SM2の量は、スフィンゴミエリン(d18:1/14:0)の量、又はスフィンゴミエリン(d18:1/14:0)及びスフィンゴミエリン(d16:1/16:0)の量の合計である。
【００７４】
バイオマーカーSM21は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d17:1/23:0)を、又はより好ましくはスフィンゴミエリン(d17:1/23:0)、スフィンゴミエリン(d18:1/22:0)及びスフィンゴミエリン(d16:1/24:0)を指す。したがって、バイオマーカーSM21は、スフィンゴミエリン(d17:1/23:0)、又はスフィンゴミエリン(d17:1/23:0)、スフィンゴミエリン(d18:1/22:0)、及びスフィンゴミエリン(d16:1/24:0)の組み合わせである。
【００７５】
したがって、SM21の量は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d17:1/23:0)の量を決定することによって、又はスフィンゴミエリン(d17:1/23:0)、スフィンゴミエリン(d18:1/22:0)及びスフィンゴミエリン(d16:1/24:0)の組み合わせた量(したがって総量)を決定することによって、決定される。したがって、SM21の量は、スフィンゴミエリン(d17:1/23:0)の量、又はスフィンゴミエリン(d17:1/23:0)、スフィンゴミエリン(d18:1/22:0)及びスフィンゴミエリン(d16:1/24:0)の量の合計である。
【００７６】
バイオマーカーSM23は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)を、又はより好ましくはスフィンゴミエリン(d18:1/23:1)、スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)及びスフィンゴミエリン(d17:1/24:1)を指す。したがって、バイオマーカーSM23は、スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)、又はスフィンゴミエリン(d18:1/23:1)、スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)、及びスフィンゴミエリン(d17:1/24:1)の組み合わせである。さらに、別の実施形態では、SM23がスフィンゴミエリン(d17:1/24:1)であることが想定される。
【００７７】
したがって、SM23の量は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)の量を決定することによって、又はスフィンゴミエリン(d18:1/23:1)、スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)及びスフィンゴミエリン(d17:1/24:1)の組み合わせた量(したがって総量)を決定することによって、決定される。したがって、SM23の量は、スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)の量、又はスフィンゴミエリン(d18:1/23:1)、スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)、及びスフィンゴミエリン(d17:1/24:1)の量の合計である。さらに、別の実施形態では、SM23の量が、スフィンゴミエリン(d17:1/24:1)の量を決定することによって決定されることが想定される。
【００７８】
一実施形態では、バイオマーカーSM23は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)を指す。したがって、この実施形態では、バイオマーカーSM23は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:2/C23:0)の量を決定することによって決定される。
【００７９】
バイオマーカーSM24は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:1/23:0)を、又はより好ましくはスフィンゴミエリン(d18:1/23:0)及びスフィンゴミエリン(d17:1/24:0)を指す。したがって、バイオマーカーSM24は、スフィンゴミエリン(d18:1/23:0)、又はスフィンゴミエリン(d18:1/23:0)及びスフィンゴミエリン(d17:1/24:0)の組み合わせである。
【００８０】
したがって、SM24の量は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:1/23:0)の量を決定することによって、又はスフィンゴミエリン(d18:1/23:0)及びスフィンゴミエリン(d17:1/24:0)の組み合わせた量(したがって総量)を決定することによって、決定される。したがって、SM24の量は、スフィンゴミエリン(d18:1/23:0)の量、又はスフィンゴミエリン(d18:1/23:0)及びスフィンゴミエリン(d17:1/24:0)の量の合計である。
【００８１】
バイオマーカーSM28は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:1/24:0)である。
【００８２】
バイオマーカーSM29は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:2/17:0)である。
【００８３】
バイオマーカーSM3は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d17:1/16:0)である。
【００８４】
バイオマーカーSM5は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:1/16:0)を、又はより好ましくはスフィンゴミエリン(d18:1/16:0)及びスフィンゴミエリン(d16:1/18:0)を指す。したがって、バイオマーカーSM5は、スフィンゴミエリン(d18:1/16:0)、又はスフィンゴミエリン(d18:1/16:0)及びスフィンゴミエリン(d16:1/18:0)の組み合わせである。
【００８５】
したがって、SM5の量は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:1/16:0)の量を決定することによって、又はスフィンゴミエリン(d18:1/16:0)及びスフィンゴミエリン(d16:1/18:0)の組み合わせた量(したがって総量)を決定することによって、決定される。したがって、SM5の量は、スフィンゴミエリン(d18:1/16:0)の量、又はスフィンゴミエリン(d18:1/16:0)及びスフィンゴミエリン(d16:1/18:0)の量の合計である。
【００８６】
バイオマーカーSM8は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:2/18:1)である。
【００８７】
バイオマーカーSM9は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:1/18:1)を、又はより好ましくはスフィンゴミエリン(d18:1/18:1)及びスフィンゴミエリン(d18:2/18:0)を指す。したがって、バイオマーカーSM9は、スフィンゴミエリン(d18:1/18:1)、又はスフィンゴミエリン(d18:1/18:1)及びスフィンゴミエリン(d18:2/18:0)の組み合わせである。
【００８８】
したがって、SM9の量は、好ましくは、スフィンゴミエリン(d18:1/18:1)の量を決定することによって、又はスフィンゴミエリン(d18:1/18:1)及びスフィンゴミエリン(d18:2/18:0)の組み合わせた量(したがって総量)を決定することによって、決定される。したがって、SM9の量は、スフィンゴミエリン(d18:1/18:1)の量、又はスフィンゴミエリン(d18:1/18:1)及びスフィンゴミエリン(d18:2/18:0)の量の合計である。
【００８９】
上記のように、本発明は、少なくとも3つのバイオマーカーの量に基づく。この文脈において、SM10、SM18、SM2、SM21、SM23、SM24、SM5、及びSM9、並びにPC8は、これらのバイオマーカーの決定が、単一種、2種(又は3種)の決定に基づくかどうかにかかわらず、単一のバイオマーカーとみなされることが留意される。したがって、少なくとも2つのさらなるバイオマーカーが決定される必要がある。
【００９０】
スフィンゴミエリンSM(dx1:y1/x2:y2)は、好ましくは、スフィンゴミエリンが、「スフィンゴシン骨格」dx1:y1(式中、x1は炭素原子の数を表し、y1は二重結合の数を表す)及び「脂肪酸アミド」残基x2:y2(式中、x2は炭素原子の数を表し、y2はその二重結合の数を表す)を含むことを意味することが示される。
【００９１】
スフィンゴミエリン(d18:2/18:0)は、好ましくは、スフィンゴミエリンが「スフィンゴシン骨格」d18:2(18個の炭素原子及び2個の二重結合を含む)及び「脂肪酸アミド」残基18:0(18個の炭素原子及び0個の二重結合を含む)を含むことを意味することが示される。
【００９２】
コレステリルエステル(CE)バイオマーカー
CEは、コレステリルエステルの略称である。
【００９３】
本発明において、2つの異なるコレステリルエステルの、すなわちコレステリルエステルC18:0及び/又はコレステリルエステルC18:2の決定が予期される。これらのバイオマーカーは、当技術分野で周知である。コレステリルエステル(Cx1:y1)は、好ましくは、コレステリルエステルが脂肪酸エステル残基を含むことを意味することが示され、ここで、前記脂肪酸エステル残基は、Cx1:y1(この残基がx1個の炭素原子及びy1個の二重結合を含むことを意味する)である。
【００９４】
例えば、コレステリルエステルC18:0は、コレステリルエステルC18:0が脂肪酸エステル残基を含むことを意味することが示され、ここで、前記脂肪酸エステル残基は、C18:0(この残基が18個の炭素原子及び0個の二重結合を含むことを意味する)である。
【００９５】
ホスファチジルコリン(PC)バイオマーカー
PCは、ホスファチジルコリンの略称である。ホスファチジルコリンPC(Cx1:y1 Cx2:y2)は、好ましくは、このホスファチジルコリンが、2つの脂肪酸エステル残基を含むことを意味することが示され、ここで、1つの脂肪酸エステル残基は、Cx1:y1(この残基がx1個の炭素原子及びy1個の二重結合を含むことを意味する)であり、1つの脂肪酸エステル残基は、Cx2:y2(この残基がx2個の炭素原子及びy2個の二重結合を含むことを意味する)である。 
【００９６】
例えば、ホスファチジルコリン(C16:0 C18:2)は、好ましくは、このホスファチジルコリンが、2つの脂肪酸エステル残基を含むことを意味することが示され、ここで、1つの脂肪酸エステル残基は、C16:0(この残基が16個の炭素原子及び0個の二重結合を含むことを意味する)であり、1つの脂肪酸エステル残基は、C18:2(この残基が18個の炭素原子及び2個の二重結合を含むことを意味する)である。
【００９７】
バイオマーカーPC4は、ホスファチジルコリン(C16:0 C18:2)である。バイオマーカーPC8は、好ましくは、ホスファチジルコリン(C18:0 C18:2)を、又はより好ましくはホスファチジルコリン(C18:0 C18:2)及びホスファチジルコリン(C18:1 C18:1)を指す。したがって、バイオマーカーPC8は、ホスファチジルコリン(C18:0 C18:2)、又はホスファチジルコリン(C18:0 C18:2)及びホスファチジルコリン(C18:1 C18:1)の組み合わせである。
【００９８】
したがって、PC8の量は、好ましくは、ホスファチジルコリン(C18:0 C18:2)の量を決定することによって、又はホスファチジルコリン(C18:0 C18:2)及びホスファチジルコリン(C18:1 C18:1)の組み合わせた量(したがって総量)を決定することによって、決定される。したがって、PC8の量は、ホスファチジルコリン(C18:0 C18:2)の量、又はホスファチジルコリン(C18:0 C18:2)及びホスファチジルコリン(C18:1 C18:1)の量の合計である。
【００９９】
好ましいバイオマーカーの組み合わせ
上記のように、被験体において心不全と肺疾患とを鑑別するための本発明の方法は、少なくとも１つの代謝物質バイオマーカー（表１の第１列に示されるバイオマーカーから選択されるもの）の量を決定することを含む。
【０１００】
特に被験体のサンプルにおける少なくとも3つのバイオマーカーの量が決定される。したがって、少なくとも3つのバイオマーカーの組み合わせの量の決定が予期される。本発明において決定される少なくとも3つのバイオマーカーの好ましい組み合わせは、本明細書中以下に記載される。
【０１０１】
被験体における心不全と肺疾患との鑑別のための少なくとも3つのバイオマーカーは、好ましくは、以下である:
i. 少なくとも1つのトリアシルグリセリド、少なくとも1つのコレステリルエステル、及び少なくとも1つのホスファチジルコリン;
ii. 少なくとも1つのトリアシルグリセリド、少なくとも1つのホスファチジルコリン、及び少なくとも1つのスフィンゴミエリン;
iii. 少なくとも1つのトリアシルグリセリド、少なくとも1つのコレステリルエステル、及び少なくとも1つのスフィンゴミエリン;
iv. 少なくとも1つのホスファチジルコリン、少なくとも1つのコレステリルエステル、及び少なくとも1つのスフィンゴミエリン;
v. コレステリルエステルC18:2、SSS及びCer(d17:1/24:0);
vi. SM2、SM3、SM5、SM18、SM23、SM24、及びSM28からなる群から選択される少なくとも2つのスフィンゴミエリン、並びにSOP2、SPP1若しくはPPO1からなる群から選択される、又はSOP2、SPP1若しくはPPPからなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリド;
vii. OSS2、SOP2、SPP1及びSSP2からなる群から選択される少なくとも2つのトリアシルグリセリド、並びにSM23及びSM24からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリン;
viii. SM18、SM24及びSM28;
ix. 表2のパネル1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、若しくは199のバイオマーカー、又は
x. 表2aのパネル200、201、202、203、204、205、若しくは206のバイオマーカー。
【０１０２】
決定される好ましいコレステリルエステル、トリアシルグリセリド、ホスファチジルコリン及びスフィンゴミエリンバイオマーカー、並びに少なくとも3つのバイオマーカーのさらなる好ましい組み合わせは、以下に記載される(特に、項目i.、ii.、iii.、及びiv.について)。
【０１０３】
好ましくは、i.、ii.、及びiii.における少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカーは、SOP2、OSS2、SPP1、SSP2、PPO1及びPPPからなる群から選択され、i.、iii.及びiv.における少なくとも1つのコレステリルエステルバイオマーカーは、コレステリルエステルC18:2及びコレステリルエステルC18:0からなる群から選択され、i.、ii.、及びiv.における少なくとも1つのホスファチジルコリンバイオマーカーは、PC4及びPC8からなる群から選択され、ii.、iii.及びiv.における少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーは、SM18、SM24、SM23、SM21、SM28、SM5、SM3、SM29及びSM8からなる群から選択される。
【０１０４】
あるいは、i.、ii.、及びiii.における少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカーは、SOP2、OSS2、SPP1、SSP2、PPO1及びSPP1からなる群から選択される。
【０１０５】
好ましい実施形態では、少なくとも、上記の項目i.、ii.、iii.、vi、vii.、ix.又はx.の(特に、項目i.、ii.、iii.、vi、vii.又はix.の)バイオマーカーの量が決定される。特に、i.、ii.及びiii.における少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカーは、SOP2、OSS2、SSP2、PPO1及びPPPからなる群から選択され、並びに/又は(特に並びに)i.及びiii.における少なくとも1つのコレステリルエステルバイオマーカーは、コレステリルエステルC18:2であり、並びに/又は(特に並びに)i.及びii.における少なくとも1つのホスファチジルコリンバイオマーカーは、PC4であり、並びに/又は(特に並びに)ii.及びiii.における少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーは、SM18、SM24、SM23、SM28、SM5、及びSM3からなる群から選択される。好ましくは、少なくとも、これらのバイオマーカーを含む表2のいずれかのパネルのバイオマーカーの量が決定される。より好ましくは、少なくとも、表2におけるパネル1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、又は56のバイオマーカーの量が決定される。
【０１０６】
用語「少なくとも〜量(at least the amounts)」は、好ましくは、原則として、さらなるバイオマーカーが決定され得ることを意味する。一実施形態では、この用語は、「量」を意味する。好ましくは、本明細書中に開示される方法のステップ(a)で言及される少なくとも3つのバイオマーカーの量は、ステップ(b)における比較に使用される。
【０１０７】
さらに好ましい実施形態では、少なくとも、i.、ii.、iii.、vi.、ix.又はx.の(特に、項目i.、ii.、iii.、vi. 又はix.の)バイオマーカーの量が決定され、ここで、i.、ii.及びiii.における少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカーは、SOP2及び/若しくはOSS2であり、並びに/又は(特に並びに)i.及びiii.における少なくとも1つのコレステリルエステルバイオマーカーは、コレステリルエステルC18:2であり、並びに及び/又は(特に並びに)i.及びii.における少なくとも1つのホスファチジルコリンバイオマーカーは、PC4であり、並びに/又は(特に並びに)ii.及びiii.における少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーは、SM18、SM24、SM23、及びSM3からなる群から選択される。好ましくは、少なくとも、これらのバイオマーカーを含む表2のいずれかのパネルのバイオマーカーの量が決定される。特に、少なくとも、表2におけるパネル1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、又は18のバイオマーカーの量が決定される。
【０１０８】
さらに好ましい実施形態では、少なくとも、i.、ii.、iii.、vi.、ix.又はx.の(特に、i.、ii.、iii、vi、又はix.の)バイオマーカーの量が決定され、ここで、i.、ii.及びiii.における少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカーは、SOP2及び/若しくはOSS2であり、並びに/又は(特に並びに)i.及びiii.における少なくとも1つのコレステリルエステルバイオマーカーは、コレステリルエステルC18:2であり、並びに/又は(特に並びに)i.及びii.における少なくとも1つのホスファチジルコリンバイオマーカーは、PC4であり、並びに/又は(特に並びに)ii.及びiii.における少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーは、SM23である。好ましくは、少なくとも、これらのバイオマーカーを含む表2のいずれかのパネルのバイオマーカーの量が決定される。特に、少なくとも、表2におけるパネル1、2、3、又は4のバイオマーカーの量が決定される。好ましくは、少なくとも、OSS2、PC4及びSM23の量が、特にNT-proBNP又はBNPの量の決定と組み合わせて(本明細書中他の箇所を参照)、決定される(パネル1)。あるいは、パネル3、13及び60のバイオマーカーが決定され得る。また好ましくは、少なくとも、OSS2、コレステリルエステルC18:2及びSM23の量が決定される(パネル2)。あるいは、パネル20、21、22、23、32又は60のバイオマーカーが決定され得る。
【０１０９】
さらに好ましい実施形態では、少なくとも、iii.のバイオマーカーの量が決定され、ここで、少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカーは、SOP2及び/若しくはOSS2であり、並びに/又は(特に並びに)少なくとも1つのコレステリルエステルバイオマーカーは、コレステリルエステルC18:2であり、並びに/又は(特に並びに)少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーは、SM23である。特に、少なくとも、SOP2、OSS2、PC4、コレステリルエステルC18:2、SM18、SM28、SM24、SSP2、及びSM23の量が決定される(パネル3)。
【０１１０】
前の段落に記載したように、パネル3に含まれるバイオマーカーの量、並びにしたがって、SOP2、OSS2、PC4、コレステリルエステルC18:2、SM18、SM28、SM24、SSP2、及びSM23の量を決定すること(又は少なくともそれらの量を決定すること)が、特に想定される。
【０１１１】
また好ましくは、パネル3のバイオマーカーの少なくとも3つのバイオマーカーの、少なくとも4つのバイオマーカーの、より好ましくは少なくとも5又は6個のバイオマーカーの、さらにより好ましくは少なくとも7個のバイオマーカーの、最も好ましくは少なくとも8個のバイオマーカーの量(又は少なくとも量)が、本発明の方法のステップ(a)において決定される。
【０１１２】
パネル3のバイオマーカーの(又は前の段落に記載のバイオマーカーの)量が決定される場合、本方法は、好ましくは、NT-proBNP及び/又はBNPの量のさらなる決定を含まない。特に、この方法は、BNP及び/若しくはNT-proBNPの量のさらなる決定、並びにBNP及び/若しくはNT-proBNPの量の参照との比較を含まなくてもよい。したがって、本発明の方法による鑑別は、NT-proBNPの決定に基づくものではない。したがって、この方法は、非BNP及び非NT-proBNPベースの方法である。同じことが、例えば、パネル1及び2にも適用され得る。
【０１１３】
あるいは、この方法は、NT-proBNP及び/又はBNPの量のさらなる決定を含み得る。特に、この方法は、BNP若しくはNT-proBNPの量のさらなる決定、並びにBNP若しくはNT-proBNPの量の参照との比較を含み得る。
【０１１４】
パネル3のバイオマーカーの(パネル3のバイオマーカーの少なくとも3、4、5、6、7又は8個のバイオマーカーの)量が決定される場合、好ましくは、交絡因子についての補正は行われない。あるいは、交絡因子についての補正が行われてもよい。同じことが、例えば、パネル1及び2に適用され得る。
【０１１５】
好ましい実施形態では、少なくとも、i.、ii.、iii.又はvii.に示されるバイオマーカーの量が決定され、ここで、i.、ii.及びiii.における少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカーは、SOP2、OSS2、及びSSP2からなる群から選択され、並びに/又は(特に並びに)i.及びiii.における少なくとも1つのコレステリルエステルバイオマーカーは、コレステリルエステルC18:2であり、並びに/又は(特に並びに)i.及びii.における少なくとも1つのホスファチジルコリンバイオマーカーは、PC4であり、並びに/又は(特に並びに)ii.及びiii.における少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーは、SM24、SM23、SM28、及びSM3からなる群から選択される。好ましくは、少なくとも、これらのバイオマーカーを含む表2のいずれかのパネルのバイオマーカーの量が決定される。より好ましくは、少なくとも、表2におけるパネル19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、又は36のバイオマーカーの量が決定される。
【０１１６】
さらに好ましい実施形態では、少なくとも、ii.、又はiii.に示されるバイオマーカーの量が決定され、ここで、ii.及びiii.における少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカーは、SOP2及び/若しくはOSS2であり、並びに/又は(特に並びに)iii.における少なくとも1つのコレステリルエステルバイオマーカーは、コレステリルエステルC18:2であり、並びに/又は(特に並びに)ii.における少なくとも1つのホスファチジルコリンバイオマーカーは、PC4であり、並びに/又は(特に並びに)ii.及びiii.における少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーは、SM23及び/若しくはSM24である。好ましくは、少なくとも、これらのバイオマーカーを含む表2のいずれかのパネルのバイオマーカーの量が決定される。より好ましくは、少なくとも、表2におけるパネル31、32、33、34、35、又は36のバイオマーカーの量が決定される。
【０１１７】
好ましい実施形態では、少なくとも、ii.、iii.又はvi.に示されるバイオマーカーの量が決定され、ここで、ii.及びiii.における少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカーは、SOP2及び/若しくはOSS2であり、並びに/又は(特に並びに)iii.における少なくとも1つのコレステリルエステルバイオマーカーは、コレステリルエステルC18:2であり、並びに/又は(特に並びに)ii.における少なくとも1つのホスファチジルコリンバイオマーカーは、PC4であり、並びに/又は(特に並びに)ii.における少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーは、SM18、SM24、及びSM23からなる群から選択される。好ましくは、少なくとも、これらのバイオマーカーを含む表2のいずれかのパネルのバイオマーカーの量が決定される。より好ましくは、少なくとも、表2におけるパネル37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、又は56のバイオマーカーの量が決定される。
【０１１８】
さらに好ましい実施形態では、少なくとも、iii.に示されるバイオマーカーの量が決定され、ここで、少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカーは、SOP2であり、並びに/又は(特に並びに)少なくとも1つのコレステリルエステルバイオマーカーは、コレステリルエステルC18:2であり、並びに/又は(特に並びに)少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーは、SM18及び/若しくはSM23である。好ましくは、少なくとも、これらのバイオマーカーを含む表2のいずれかのパネルのバイオマーカーの量が決定される。より好ましくは、少なくとも、表2におけるパネル51、52、53、54、55、又は56のバイオマーカーの量が決定される。
【０１１９】
好ましい実施形態では、少なくとも、ii.、iii.、vi.、vii.、ix.又はx.の(特に、ii.、iii.、vi.、vii.又はix.の)バイオマーカーの量が決定され、ここで、ii.及びiii.における少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカーは、SOP2、OSS2、及びPPO1からなる群から選択され、並びに/又は(特に並びに)iii.における少なくとも1つのコレステリルエステルバイオマーカーは、コレステリルエステルC18:2であり、並びに/又は(特に並びに)ii.における少なくとも1つのホスファチジルコリンバイオマーカーは、PC4であり、並びに/又は(特に並びに)ii.及びiii.における少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーは、SM24及びSM23からなる群から選択される。好ましくは、少なくとも、これらのバイオマーカーを含む表2のいずれかのパネルのバイオマーカーの量が決定される。より好ましくは、少なくとも、表2におけるパネル7、8、9、10、11、12、19、20、21、22、23、24、37、38、39、40、41、又は42のバイオマーカーの量が決定される。
【０１２０】
さらに好ましい実施形態では、ここで、少なくとも、iii.又はviのバイオマーカーの量が決定され、ここで、iii.における少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカーは、SOP2であり、並びに/又は(特に並びに)iii.における少なくとも1つのコレステリルエステルバイオマーカーは、コレステリルエステルC18:2であり、並びに/又は(特に並びに)iii.における少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーは、SM24及びSM23からなる群から選択される。好ましくは、少なくとも、これらのバイオマーカーを含む表2のいずれかのパネルのバイオマーカーの量が決定される。より好ましくは、少なくとも、表2におけるパネル7、8、9、10、11、又は12のバイオマーカーの量が決定される。
【０１２１】
好ましい実施形態では、少なくとも、iii.又はvii.のバイオマーカーの量が決定され、ここで、iii.における少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカーは、SOP2及びOSS2からなる群から選択され、並びに/又は(特に並びに)iii.における少なくとも1つのコレステリルエステルバイオマーカーは、コレステリルエステルC18:2であり、並びに/又は(特に並びに)iii.における少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーは、SM23である。好ましくは、少なくとも、これらのバイオマーカーを含む表2のいずれかのパネルのバイオマーカーの量が決定される。より好ましくは、少なくとも、表2におけるパネル19、20、21、22、23、又は24のバイオマーカーの量が決定される。
【０１２２】
好ましい実施形態では、少なくとも、iii.又はvi.のバイオマーカーの量が決定され、ここで、iii.における少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカーは、SOP2であり、並びに/又は(特に並びに)iii.における少なくとも1つのコレステリルエステルバイオマーカーは、コレステリルエステルC18:2であり、並びに/又は(特に並びに)iii.における少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーは、SM24及びSM23からなる群から選択される。好ましくは、少なくとも、これらのバイオマーカーを含む表2のいずれかのパネルのバイオマーカーの量が決定される。より好ましくは、少なくとも、表2におけるパネル37、38、39、40、41、又は42のバイオマーカーの量が決定される。
【０１２３】
一実施形態では、少なくとも、上記のii.、vi.又はvii.のバイオマーカーの量が決定され、ここで、ii.における少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカーは、SOP2、SSP2、SPP1及びPPO1からなる群から選択され、並びに/又は(特に並びに)ii.における少なくとも1つのホスファチジルコリンバイオマーカーは、PC4及びPC8からなる群から選択され、並びに/又は(特に並びに)ii.における少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーは、SM18、SM24、SM23、SM28、SM5、及びSM3からなる群から選択される。好ましくは、少なくとも、これらのバイオマーカーを含む表2のいずれかのパネルのバイオマーカーの量が決定される。より好ましくは、少なくとも、表2におけるパネル79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、又は102のバイオマーカーの量が決定される。さらにより好ましくは、少なくとも、ii.のバイオマーカーの量が、決定され、ここで、少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカーは、SSP2、SPP1及びPPO1からなる群から選択され、並びに/又は(特に並びに)少なくとも1つのホスファチジルコリンバイオマーカーは、PC4であり、並びに/又は(特に並びに)少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーは、SM24、SM5、及びSM3からなる群から選択される。最も好ましくは、少なくとも、ii.のバイオマーカーの量が決定され、ここで、少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカーは、SSP2であり、並びに/又は(特に並びに)少なくとも1つのホスファチジルコリンバイオマーカーは、PC4であり、並びに/又は(特に並びに)少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカーは、SM24及びSM5からなる群から選択される。好ましくは、少なくとも、表2におけるパネル95、97、99、又は101のバイオマーカーの量が決定される。
【０１２４】
一実施形態では、NT-proBNP又はBNPの量が、上記の少なくとも１つのバイオマーカー（表１の第１列に示すバイオマーカーから選択される）の量に加えて、特に少なくとも3つのバイオマーカーの得られた組み合わせの量に加えて、決定される。別の実施形態では、NT-proBNP又はBNPの量は、上記の少なくとも１つのバイオマーカーの量又は少なくとも3つのバイオマーカーの得られた組み合わせの量に加えて決定されない(本明細書中他の箇所を参照)。
【０１２５】
上記のように、パネル1〜206のいずれか1つのバイオマーカーの量を決定することが想定される。パネル1〜199のバイオマーカーは、表2に示される(第2列)。パネル200〜206のバイオマーカーは、表2aに示される(第2列)。好ましいパネルは、パネル1、パネル2、パネル3、パネル4及びパネル200である。
【０１２６】
好ましい実施形態では、パネル1又は2のバイオマーカーの量は、本発明の方法のステップ(a)で決定される。別の好ましい実施形態では、パネル200のバイオマーカーが決定される。
【０１２７】
例えば、パネル1のバイオマーカーの量が決定される場合、SM23、OSS2及びPC4の量が決定される。本明細書中他の箇所に記載されているように、SM23は、(i)スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)、(ii)スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)、(iii)スフィンゴミエリン(d17:1/24:1)、又は(iv)スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)、スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)及びスフィンゴミエリン(d17:1/24:1)の組み合わせであり得る。一実施形態では、SM23は、スフィンゴミエリン(d17:1/24:1)である。別の実施形態では、SM23は、スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)である。
【０１２８】
パネル1のバイオマーカーが決定される場合、以下を決定することが特に想定される：
・OSS2の量、スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)の量及びPC4の量、
・OSS2の量、スフィンゴミエリン(d17:1/24:1)の量及びPC4の量、又は
・OSS2の量、スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)、スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)、及びスフィンゴミエリン(d17:1/24:1)の組み合わせた量、並びにPC4の量。
【０１２９】
例えば、パネル2又は4のバイオマーカーの量が決定される場合、SM23、OSS2及びコレステリルエステルC18:2の量が決定される。本明細書中他の箇所に記載されているように、SM23は、(i)スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)、(ii)スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)、(iii)スフィンゴミエリン(d17:1/24:1)、又は(iv)スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)、スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)及びスフィンゴミエリン(d17:1/24:1)の組み合わせであり得る。特に、SM23は、スフィンゴミエリン(d17:1/24:1)又はスフィンゴミエリン(d18:1/23:1)である。
【０１３０】
パネル2又は4のバイオマーカーが決定される場合、以下を決定することが特に想定される：
・OSS2の量、スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)の量及びコレステリルエステルC18:2の量、
・OSS2の量、スフィンゴミエリン(d17:1/24:1)の量及びコレステリルエステルC18:2の量、又は
・OSS2の量、スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)、スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)、スフィンゴミエリン(d17:1/24:1)の組み合わせた量、及びコレステリルエステルC18:2の量。
【０１３１】
例えば、パネル200のバイオマーカーの量が決定される場合、コレステリルエステルC18:2、SM23、OSS2及びPC4の量が決定される。本明細書中他の箇所に記載されているように、SM23は、(i)スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)、(ii)スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)、(iii)スフィンゴミエリン(d17:1/24:1)、又は(iv)スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)、スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)及びスフィンゴミエリン(d17:1/24:1)の組み合わせであり得る。一実施形態では、SM23は、スフィンゴミエリン(d17:1/24:1)である。別の実施形態では、SM23は、スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)である。
【０１３２】
パネル200のバイオマーカーが決定される場合、以下を決定することが特に想定される：
・コレステリルエステルC18:2の量、OSS2の量、スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)の量及びPC4の量、
・コレステリルエステルC18:2の量、OSS2の量、スフィンゴミエリン(d17:1/24:1)の量及びPC4の量、又は
・コレステリルエステルC18:2の量、OSS2の量、スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)、スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)、及びスフィンゴミエリン(d17:1/24:1)の組み合わせた量、並びにPC4の量。
【０１３３】
パネル1に加えて、パネル200は、コレステリルエステルC18:2をさらに含む。
【０１３４】
パネル2及び4に加えて、パネル200は、PC4をさらに含む。
【０１３５】
本明細書中他の箇所に記載されているように、表１の第1列に示すバイオマーカーから選択される少なくとも１つのバイオマーカーに加えて、又は上述のパネル(1〜206)のバイオマーカーの量に加えて、NT-proBNP又はBNPの量を決定することがさらに想定される。例えば、NT-proBNP又はBNPは、パネル1の少なくとも3つのバイオマーカーの量に加えて決定される。さらに、一実施形態では、交絡因子についての補正が実施されないことが想定される(例えば、パネル1について)。
【０１３６】
心不全と肺疾患の鑑別のための少なくとも3つのバイオマーカーのさらなる好ましい組み合わせが以下に開示される。
【０１３７】
さらに、少なくとも3つのバイオマーカーは、好ましくは以下のとおりである。特に、ステップa.において以下の量を決定することが想定される：
i. SM18、SM21、SM23、SM24、SM28、SM3、SM5、SM2、SM9及びSM10からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリン(SM)バイオマーカー、特に、SM18、SM21、SM23、SM24、SM28、SM3及びSM5からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリン(SM)バイオマーカー、
ii. OSS2、PPO1、SOP2、SSP2及びSPP1からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、特に、OSS2、PPO1、SOP2、及びSSP2からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、並びに
iii. Cer(d16:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)、コレステリルエステルC18:2、PC4、PC8、Cer(d18:2/24:0)、Cer(d17:1/24:0)及びグルタミン酸1からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー、特に、Cer(d16:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)、コレステリルエステルC18:2、及びPC4からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー。
【０１３８】
したがって、i.の少なくとも1つのバイオマーカー、ii.の少なくとも1つのバイオマーカー、及びiii.の少なくとも1つのバイオマーカーが決定される。同じことが以下の組み合わせに当てはまる。
【０１３９】
好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM28、SM23、SM21、及びSM5からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. SOP2及び/若しくはOSS2、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及び/若しくはPC4。
【０１４０】
さらなる好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM28、SM21、及びSM5からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、特にSM28、又はSM18、SM21、及びSM5からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、特にSM18、並びに
ii. SOP2、並びに
iii. PC4。
【０１４１】
さらなる好ましい実施形態では、ここで、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM18、SM2、SM23、SM24、SM28、SM3、及びSM5からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. OSS2、PPO1、SOP2、SSP2及びSPP1からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、並びに
iii. Cer(d16:1/24:0)、コレステリルエステルC18:2、PC4及びグルタミン酸1からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー。
【０１４２】
さらなる好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM23、SM2、及びSM24からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. SOP2、OSS2、及びPPO1からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及び/若しくはPC4、特にコレステリルエステルC18:2。
【０１４３】
特に、少なくとも、SM23及び/又はSM2の、特にSM23の、SOP2の、及びPC4の量が決定される。
【０１４４】
本発明の好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM10、SM18、SM21、SM23、SM24、SM28、SM3及びSM9からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. OSS2、PPO1、SOP2、SSP2及びSPP1からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、並びに
iii. Cer(d16:1/24:0)、Cer(d18:1/24:1)、Cer(d17:1/24:0)、Cer(d18:2/24:0)、コレステリルエステルC18:2、PC4及びPC8からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー。
【０１４５】
さらなる好ましい実施形態では、以下が決定される：
i. SM18、SM3、SM24、及びSM23からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、特にSM18、
ii. SOP2及び/若しくはOSS2、特にSOP2、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及び/若しくはPC4、特にPC4。
【０１４６】
特に、少なくとも、SM18及び/若しくはSM24、SOP2、並びにPC4の量が決定される。
【０１４７】
好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM23、SM18、SM24、SM28、SM2及びSM3からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、特に、SM23、SM18、SM24、及びSM28からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. OSS2及び/又はSOP2、特にOSS2、
iii. コレステリルエステルC18:2及び/又はPC4。
【０１４８】
特に、少なくとも、SM23、OSS2、及びコレステリルエステルC18:2の量が決定される。
【０１４９】
さらなる好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM23 SM18、SM2、SM24及びSM28からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. SOP2、及び
iii. コレステリルエステルC18:2。
【０１５０】
特に、少なくとも、バイオマーカーSM23、SOP2、及びコレステリルエステルC18:2の量が決定される。
【０１５１】
好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM18、SM23、SM3からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、又はSM28、SM23及びSM3からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. OSS2、及び
iii. コレステリルエステルC18:2及び/又はPC4。
【０１５２】
特に、少なくとも、SM18及び/若しくはSM28の、OSS2の、並びにコレステリルエステルC18:2の量が決定される。
【０１５３】
上述の組み合わせは、好ましくは、心不全の、特にHFrEFの診断のために使用される。一実施形態では、心不全は、症候性心不全、特に症候性HFrEFである。したがって、試験される被験体は、好ましくは、心不全の症状を示す。
【０１５４】
本発明の好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM23、SM24、SM28、及びSM3からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、特に、SM23、SM24、及びSM28からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. SOP2及び/若しくはOSS2、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及び/若しくはPC4。
【０１５５】
特に、少なくとも、SM23の、SOP2の、及びコレステリルエステルC18:2の量が決定される。
【０１５６】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM23、
ii. OSS2及び/若しくはSOP2、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2。
【０１５７】
特に、少なくとも、SM23、OSS2、及びコレステリルエステルC18:2の量が決定される。
【０１５８】
本発明の好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM28及び/若しくはSM3、
ii. SOP2及び/若しくはOSS2、並びに
iii. PC4。
【０１５９】
特に、少なくとも、SM28、SOP2の、及びPC4の量が決定される。
【０１６０】
別の好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM23、SM24、SM28及びSM18からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、特に、SM23、SM24、及びSM28からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. SOP2、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2。
【０１６１】
特に、少なくとも、SM23、SOP2、及びコレステリルエステルC18:2の量が決定される。
【０１６２】
さらなる好ましい実施形態において、少なくともSM18、SOP2、及びコレステリルエステルC18:2の量が決定される。
【０１６３】
前記少なくとも3つのバイオマーカーは、以下であることがさらに想定される：
i. SM23、SM2、及びSM24からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. SOP2、OSS2、及びPPO1からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2、PC4、及びSM5からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー。
【０１６４】
したがって、被験体は、好ましくは、心不全の症状を示さない。
【０１６５】
前記少なくとも3つのバイオマーカーは、SM24、SM5、SM23、SOP2及びPPO1からなる群から選択されるマーカーであることがさらに想定される。好ましくは、SM24、SM5及びSOP2の、又はSM23、SM5及びPPO1の量が決定される。
【０１６６】
一実施形態では、上記の少なくとも3つのバイオマーカーの、得られた組み合わせの量に加えて、NT-proBNP又はBNPの量が決定される。別の実施形態では、上記の(本明細書中他の箇所を参照)少なくとも3つのバイオマーカーの、得られた組み合わせの量に加えて、NT-proBNP又はBNPの量が決定されない。
【０１６７】
心不全及び/又はそのサブフォームの診断のための少なくとも3つのバイオマーカーのさらなる好ましい組み合わせ
好ましい実施形態では、少なくとも3つのバイオマーカーは以下である：
i. SM18、SM23、SM24、SM3、SM5、SM2、及びSM28からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリン(SM)バイオマーカー、並びに特に、SM18、SM23、SM24、SM3、及びSM5からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリン(SM)バイオマーカー、
ii. OSS2、SOP2、SSP2及びPPO1からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、特に、OSS2及びSOP2からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及びPC4からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー。
【０１６８】
したがって、i.の少なくとも1つのバイオマーカー、ii.の少なくとも1つのバイオマーカー、及びiii.の少なくとも1つのバイオマーカーが決定される。同じことは、以下の組み合わせに適用する。
【０１６９】
好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM18、SM23、SM24、SM3、及びSM5からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. OSS2及びSOP2からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及びPC4からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー。
【０１７０】
特に、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM18、SM3、及びSM5からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、特にSM18、並びに
ii. OSS2及びSOP2からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、特にSOP2、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及びPC4からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー、特にPC4。
【０１７１】
好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM18、SM2、SM23、SM24、SM28、及びSM5からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. OSS2、PPO1、SOP2、及びSSP2からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及びPC4からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー。
【０１７２】
より好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM23、SM24、SM18、及びSM2からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、特にSM23、
ii. SOP2、OSS2、及びPPO1からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、特にSOP2、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及びPC4からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー、特にコレステリルエステルC18:2。
【０１７３】
さらにより好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM23、SM18、及びSM2からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、特にSM23、
ii. SOP2、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及び/若しくはPC4、特にコレステリルエステルC18:2。
【０１７４】
好ましい実施形態では、以下が決定される：
i. SM18、SM23、SM24、SM28、及びSM3からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. OSS2及びSOP2からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及びPC4からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー。
【０１７５】
好ましくは、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM18、
ii. SOP2、及び
iii. コレステリルエステルC18:2。
【０１７６】
特に、少なくとも、SM18及び/若しくはSM24、特にSM18の、SOP2の、並びにPC4の量が決定される。
【０１７７】
さらなる好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM23、SM18、SM3、SM24、SM28からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、特に、SM23及びSM18からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. OSS2、SOP2及びPPO1からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、特にOSS2、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及びPC4からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー。
【０１７８】
特に、少なくとも、SM23、OSS2、及びコレステリルエステルC18:2の量が決定される。
【０１７９】
さらなる好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM23及びSM24からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、特にSM23、
ii. SOP2及びOSS2からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、特にSOP2、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及びPC4からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー、特にコレステリルエステルC18:2。
【０１８０】
特に、少なくとも、SM23、SOP2、及びコレステリルエステルC18:2の量が決定される。
【０１８１】
さらなる好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM18、SM23、SM3、SM28及びSM24からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、特に、SM18、SM23及びSM3からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. SOP2及びOSS2からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及びPC4からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー。
【０１８２】
特に、少なくとも、SM18の、OSS2の、及びコレステリルエステルC18:2の量が決定される。
【０１８３】
さらに好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM23、SM24、SM3及びSM28からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、特に、SM23及びSM24からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. SOP2及びOSS2からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及びPC4からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー。
【０１８４】
特に、少なくとも、SM23の、SOP2の、及びコレステリルエステルC18:2の量が決定される。
【０１８５】
さらなる好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM23及びSM24からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. SOP2及びOSS2からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2。
【０１８６】
特に、少なくとも、SM23、OSS2、及びコレステリルエステルC18:2の量が決定される。
【０１８７】
さらなる好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM3、SM24及びSM28からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. SOP2及びOSS2からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及びPC4からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー。
【０１８８】
特に、少なくとも、SM3、OSS2の、及びPC4の量が決定される。
【０１８９】
さらなる好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM18、SM23、及びSM24からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、特に、SM18及びSM23からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. SOP2及びPPO1からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、特にSOP2、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及びPC4からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー、特にコレステリルエステルC18:2。
【０１９０】
特に、少なくとも、SM18、SOP2、及びコレステリルエステルC18:2の量が決定される。
【０１９１】
さらなる好ましい実施形態では、少なくとも、以下の量が決定される：
i. SM24及びSM23からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. SOP2及びPPO1からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及びPC4からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー、特にコレステリルエステルC18:2。
【０１９２】
特に、少なくとも、SM24、SOP2、及びコレステリルエステルC18:2の量が決定される。
【０１９３】
さらなる好ましい実施形態では、少なくとも、SM18、SOP2、及びコレステリルエステルC18:2の量が決定される。
【０１９４】
さらに、無症候性心不全の診断のために、以下の量を決定することが想定される：
i. SM23、SM24、SM18、及びSM2からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、特にSM23、
ii. SOP2、OSS2、及びPPO1からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、特にSOP2、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2、PC4、SM5及びSSP2からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー、特にコレステリルエステルC18:2。
【０１９５】
さらに、以下の量を決定することが想定される：
i. SM23、SM18、及びSM2からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、特にSM23、
ii. SOP2、並びに
iii. SM5、コレステリルエステルC18:2、PC4からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー、特にSM5。
【０１９６】
さらに、以下の量を決定することが想定される：
i. SM23及びSM24からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、
ii. SOP2及びOSS2からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、特にSOP2、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及びSM28からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー、特にコレステリルエステルC18:2。
【０１９７】
さらに、以下の量を決定することが想定される：
i. SM23及びSM24からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、特にSM23、
ii. SOP2及びOSS2からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、特にOSS2、並びに
iii. コレステリルエステルC18:2及びSSP2、特にコレステリルエステルC18:2。
【０１９８】
さらに、以下の量を決定することが想定される：
i. SM24及びSM23からなる群から選択される少なくとも1つのスフィンゴミエリンバイオマーカー、特にSM24、
ii. SOP2及びPPO1からなる群から選択される少なくとも1つのトリアシルグリセリドバイオマーカー、特にSOP2、並びに
iii. SM5、コレステリルエステルC18:2及びPC4からなる群から選択される少なくとも1つのさらなるバイオマーカー、特にコレステリルエステルC18:2、特にSM5、又は特にPC4。
【０１９９】
一実施形態では、上で説明された少なくとも3つのバイオマーカーの得られた組合せの量に加えて、NT-proBNP又はBNPの量が決定される。別の実施形態では、上で説明された少なくとも3つのバイオマーカーの得られた組合せの量に加えて、NT-proBNP又はBNPの量は決定されない(本明細書の他所を参照)。
【０２００】
決定される１以上のバイオマーカーがトリアシルグリセリドであるなら、このバイオマーカーの量の決定が、このマーカーの誘導体化を包含しないことが好ましくは想定される。したがって、このバイオマーカーの決定は、前記トリアシルグリセリドに由来する1つ以上の脂肪酸残基の決定に基づかないことが想定される。したがって、全体のトリアシルグリセリドの量が測定される。なお、誘導体化を行うこともできる。
【０２０１】
用語「サンプル」は、本明細書で使用される場合、体液、好ましくは、血液、血漿、血清、唾液若しくは尿からのサンプル、又は例えば、生検により、細胞、組織若しくは器官から、特に心臓から得たサンプルを指す。より好ましくは、サンプルは、血液、血漿、又は血清サンプルであり、最も好ましくは、血漿サンプルである。生物学的サンプルは、本明細書の他所で特定される被験体から得ることができる。前述の異なる種類の生物学的サンプルを得るための技術は、当該技術分野において周知である。例えば、血液サンプルは、血液採取により得てもよく、一方、組織又は器官サンプルは、例えば、生検により得ることができる。
【０２０２】
本発明の好ましい実施形態では、サンプルは、空腹時サンプル、特に空腹時血液、血清、又は血漿サンプルである。したがって、サンプルは、空腹時被験体から得られるべきである。空腹時被験体は、特に、試験されるサンプルを得る前に、水を除き、食物及び飲料を控えた被験体である。好ましくは、空腹時被験体は、試験されるサンプルを得る前に少なくとも8時間、水を除き、食物及び飲料を控えた。より好ましくは、サンプルは、一晩の絶食後、被験体から得られる。
【０２０３】
前述のサンプルは、本発明の方法のため使用される前に、好ましくは、前処理される。以下でより詳細に記載される通り、前記前処理は、化合物を放出するか、若しくは分離するため、又は過剰の材料若しくは老廃物を取り除くために必要な処置を含んでもよい。適切な技術は、化合物の遠心分離、抽出、分画、限外濾過、タンパク質沈殿、その後の、濾過、並びに精製及び/又は濃縮を含む。さらに、他の前処理は、化合物分析に適切な形態又は濃度での化合物を提供するために行われる。例えば、ガス-クロマトグラフィー結合質量分析が、本発明の方法で使用される場合、前記ガスクロマトグラフィーの前に、化合物を誘導体化することが必要である。適切かつ必須の前処理は、本発明の方法を行うために使用される手段に依存し、当業者に周知である。上記の前処理されたサンプルも、本発明に従い使用される用語「サンプル」に含まれる。
【０２０４】
本明細書において以下でより詳細に記載される通り、本明細書で言及されるバイオマーカーの量の決定は、好ましくは、分離ステップ、すなわち、サンプルに含まれる化合物が分離されるステップを含む。好ましくは、化合物の分離が、クロマトグラフィーにより、特に液体クロマトグラフィー(LC)、又は高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により行われる。好ましくは、サンプルの前処理は、サンプルにより含まれる、化合物、特に上で言及された代謝産物バイオマーカーの後の分離を可能にすることができる。目的の分子、特に上で言及されたバイオマーカーは、サンプルの適切な抽出溶媒との混合を含む、抽出ステップにおいて抽出されてもよい。抽出溶媒は、サンプル中のタンパク質を沈殿させ、それにより、除去しないと、上で言及されたバイオマーカーの後の分析を妨害し得る汚染タンパク質の、好ましくは遠心分離ベースの除去を促進することができる。好ましくは、決定されるべき代謝物質バイオマーカー、特に上で言及された全ての脂質バイオマーカーは、抽出溶媒に溶解可能である。より好ましくは、抽出溶媒は、1つの相の溶媒である。なおより好ましくは、抽出溶媒は、ジクロロメタン(DCM)、クロロホルム、第3級ブチルメチルエーテル(tBME又はMTBE、2-メトキシ-2-メチルプロパンとしても公知)、エタン酸エチル、及びイソオクタンからなる群から選択される第1の溶媒、並びにメタノール、エタノール、イソプロパノール、及びジメチルスルホキシド(DMSO)からなる群から選択される第2の溶媒を含む混合物である。一実施形態では、抽出溶媒は、メタノール及びDCMを、特に約2:1〜約3:2の比、好ましくは約2:1又は約3:2の比(好ましくは、v/v)で含む。用語「約」は、本明細書で使用される場合、後で示される正確な値、又は前記正確な値から+/-20％、+/-10％、+/-5％、+/-2％、又は+/-1％異なる値のいずれかを指す。
【０２０５】
好ましくは、サンプルの前処理は、適切な抽出溶媒での抽出ステップを含む。この抽出ステップは加えて、サンプルにより含まれるタンパク質の沈殿をもたらす。続いて、サンプルにより含まれるタンパク質は、遠心分離により取り除かれる。
【０２０６】
本明細書において以下で記載される通り、本発明の方法は、ナトリウム利尿ペプチド、好ましくは、NT-proBNP又はBNPの量の決定をさらに含んでもよい。ナトリウム利尿ペプチドは、BNP又はNT-proBNPに特異的に結合する抗体を使用することにより(又は当該技術分野において公知の他の方法により)、好ましくは決定されるタンパク質マーカーである。上の2つの段落において記載された前処理は、したがって、タンパク質マーカー、特にBNP及びNT-proBNPの決定に適用しない。好ましくは、前処理は、代謝産物バイオマーカーのみの、すなわち、スフィンゴミエリン、トリアシルグリセリド、コレステリルエステル、ホスファチジルコリン、セラミド、及び/又はグルタミン酸の量の決定に適用する。
【０２０７】
本明細書で言及される特に代謝産物バイオマーカーに関する用語「量を決定すること」は、サンプル中の本発明の方法により決定されるバイオマーカーの少なくとも1つの特徴的な特性を決定することを指す。本発明に従った特徴的な特性は、バイオマーカーの生化学的特性を含む物理的及び/又は化学的特性を特徴付ける、特性である。そのような性質は、例えば、分子量、粘度、密度、電荷、スピン、光学活性、色、蛍光、化学発光、元素組成、化学構造、他の化合物と反応する能力、生物学的読出システムにおいて応答を引き出す(例えば、レポーター遺伝子の誘導)能力等を含む。前記性質の値は、特徴的な特性として働いてもよく、当該技術分野において周知の技術により決定することができる。さらに、特徴的な特性は、標準的操作、例えば、掛け算、割り算、又は対数微分積分のような数学的計算により、バイオマーカーの物理的及び/又は化学的性質の値からもたらされる、任意の特性であってもよい。最も好ましくは少なくとも1つの特徴的な特性は、前記少なくとも1つのバイオマーカー及びその量の決定、並びに/又は化学的同定を可能にする。したがって、特徴的な値はまた、特徴的な値が導き出される、バイオマーカーの存在量に関する情報も好ましくは含む。例えば、バイオマーカーの特徴的な値は、質量スペクトルにおけるピークであってもよい。そのようなピークは、バイオマーカーの特徴的な情報、すなわち、m/z情報、並びにサンプル中の前記バイオマーカーの存在量に関する強度値(すなわち、その量)を含有する。
【０２０８】
上で考察された通り、サンプルにより含まれるそれぞれのバイオマーカーは、本発明に従い、定量的に、又は半定量的に好ましくは決定され得る。定量的決定のため、バイオマーカーの絶対又は正確な量のいずれかが決定されるか、又はバイオマーカーの相対量が、本明細書において上で言及された特徴的な特性について決定された値に基づき、決定される。相対量は、バイオマーカーの正確な量を決定することができないか、又は決定されないとする場合、決定されてもよい。前記場合に、バイオマーカーが存在する量が、前記バイオマーカーを第2の量で含む第2のサンプルに関して、拡大又は減少されるかどうかを決定することができる。好ましい実施形態では、前記バイオマーカーを含む前記第2のサンプルは、本明細書の他所で特定される、計算された参照であるものとする。バイオマーカーを定量的に分析することはしたがって、また、バイオマーカーの半定量的分析として時に言及されるものも含む。
【０２０９】
したがって、本明細書で言及されるバイオマーカーの量の決定は、化合物分離ステップ、及びその後の質量分析ステップにより、好ましくは行われる。したがって、本発明の方法で使用される決定は、分析ステップの前に、化合物分離ステップを使用することを好ましくは含む。好ましくは、前記化合物分離ステップは、サンプルに含まれる、代謝産物、特に、本発明の方法に関連して記載された前記少なくとも１つ又は前記少なくとも3つのバイオマーカーの時間分解分離をもたらす。本発明に従い好ましくは使用される分離の適切な技術は、それ故に、液体クロマトグラフィー(LC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ガスクロマトグラフィー(GC)、薄層クロマトグラフィー、サイズ排除又はアフィニティークロマトグラフィーのような全てのクロマトグラフィーの分離技術を含む。これらの技術は、当該技術分野において周知であり、さらなる困難を伴わずに当業者が適用することができる。最も好ましくは、LC及び/又はHPLCは、本発明の方法により想定されるクロマトグラフィーの技術である。バイオマーカーのそのような決定の適切なデバイスは、当該技術分野において周知である。好ましくは、質量分析は、特に、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)、液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)、ダイレクトインフュージョン質量分析若しくはフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析(FT-ICR-MS)、キャピラリー電気泳動質量分析(CE-MS)、高速液体クロマトグラフィー結合質量分析(HPLC-MS)、四重極質量分析、MS-MS若しくはMS-MS-MSのような、任意の順次結合質量分析、誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MS)、熱分解質量分析(Py-MS)、イオン移動度質量分析、又は飛行時間型質量分析(TOF)が使用される。より好ましくは、LC-MS、特に、LC-MS/MS、最も好ましくは、HPLC-MS、特に、HPLC-MS/MSが、以下で詳細に記載される通り、使用される。したがって、前記少なくとも１つのバイオマーカー又は前記少なくとも3つのバイオマーカーの量の決定は、HPLC-MS、特に、HPLC-MS/MS(高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析)により、好ましくは行われる。上記の技術は、例えば、Nissen 1995, Journal of Chromatography A, 703: 37-57、米国特許第4,540,884号、又は米国特許第5,397,894号において開示され、その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１０】
代替の質量分析技術として、又は質量分析技術に加えて、以下の技術が、化合物決定のため使用されてもよい:核磁気共鳴(NMR)、核磁気共鳴画像法(MRI)、フーリエ変換赤外分析(FT-IR)、紫外(UV)分光法、屈折率(RI)、蛍光検出、放射化学的検出、電気化学的検出、光散乱(LS)、分散ラマン分光法、又はフレームイオン化検出(FID)。これらの技術は当業者に周知であり、さらなる困難を伴わずに適用することができる。
【０２１１】
本発明の方法は、自動化により、好ましくは補助される。例えば、サンプル処理、又は前処理は、ロボット工学により自動化することができる。データ処理、並びに比較は、適切なコンピュータープログラム及びデータベースにより好ましくは補助される。本明細書において上で記載された自動化は、本発明の方法をハイスループットアプローチで使用することを可能にする。
【０２１２】
上で記載される通り、前記少なくとも１つのバイオマーカーの量、特に少なくとも3つのバイオマーカーの量の前記決定は、好ましくは質量分析(MS)を含むことができる。したがって、質量分析ステップは、分離ステップ(例えば、LC又はHPLCによる)後に行われる。本明細書で使用される質量分析は、本発明に従い決定される化合物、すなわち、バイオマーカーに対応する分子量(すなわち、質量)、又は可変の質量の決定を可能にする、全ての技術を包含する。好ましくは、本明細書で使用される質量分析は、GC-MS、LC-MS、ダイレクトインフュージョン質量分析、FT-ICR-MS、CE-MS、HPLC-MS、四重極質量分析、MS-MS若しくはMS-MS-MSのような、任意の順次結合質量分析、ICP-MS、Py-MS、TOF、又は前述の技術を使用した任意の組合せたアプローチに関する。これらの技術を適用する方法は、当業者に周知である。さらに、適切なデバイスは市販されている。より好ましくは、本明細書で使用される質量分析は、LC-MS、及び/又はHPLC-MSに、すなわち、前の液体クロマトグラフィー分離ステップに作動可能に結合された質量分析に関する。好ましくは、質量分析は、タンデム質量分析(MS/MSとしても公知)である。MS/MSとしても公知の、タンデム質量分析は、2つ以上の質量分析ステップを、段階の間で生じる断片化と共に含む。タンデム質量分析において、一連の2つの質量分析計は、衝突セルにより接続している。質量分析計は、クロマトグラフィーのデバイスに結合される。クロマトグラフィーにより分離されたサンプルは、ソートされ、第1の質量分析計において質量が測定され、次に、衝突セルにおいて不活性ガスによって断片化され、小片又は複数の小片が第2の質量分析計においてソートされ、質量が測定される。断片は、ソートされ、第2の質量分析計において質量が測定される。MS/MSによる同定が、より正確である。
【０２１３】
一実施形態では、質量分析は、本明細書で使用される場合、四重極MSを包含する。最も好ましくは、前記四重極MSは、以下の通り行われる:(a)質量分析計の第1の分析四重極においてイオン化により作り出されたイオンの質量/電荷比(m/z)の選択、(b)衝突ガスで充填され、衝突室として機能する、追加の続く四重極において加速電圧を適用することによる、ステップ(a)において選択されたイオンの断片化、(c)追加のその後の四重極においてステップ(b)における断片化プロセスにより作り出されたイオンの質量/電荷比の選択、方法のステップ(a)〜(c)は、少なくとも1回行われる。
【０２１４】
より好ましくは、前記質量分析は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)MS、特にHPLC-MS/MSのような液体クロマトグラフィー(LC)MSである。本明細書で使用される液体クロマトグラフィーは、液又は超臨界相における化合物(すなわち、代謝産物)の分離を可能にする、全ての技術を指す。液体クロマトグラフィーは、移動相中の化合物が、固定相を通過することを特徴とする。化合物が、固定相を異なる速度で通過するとき、それぞれの個々の化合物はその特定の保持時間(すなわち、化合物がシステムを通過するのに必要とする時間)を有するので、それらは、時間で分けられる。本明細書で使用される液体クロマトグラフィーはまた、HPLCも含む。液体クロマトグラフィーのためのデバイスは、例えば、Agilent Technologies，USAから市販されている。例えば、HPLCは、例えば、C8、C18、又はC30固定相を有する市販の逆相分離カラムで行うことができる。当業者は、HPLC、又は本明細書に記載される任意の他のクロマトグラフィー方法に適切な溶媒を選択する能力がある。クロマトグラフィーデバイスから現れる溶出液は、上で言及されたバイオマーカーを含むべきである。
【０２１５】
脂質クロマトグラフィーのための溶出に適切な溶媒を、当業者は決定することができる。一実施形態では、HPLC分離における勾配溶出のための溶媒は、極性溶媒、及び脂質溶媒からなる。好ましくは、極性溶媒は、水と、酸変性剤を含む水混和性溶媒の混合物である。水と完全に混和性である適切な有機溶媒の例は、C1-C3-アルカノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトンのようなC3-C4-ケトン、及びアセトニトリル、並びにその混合物を含み、メタノールが特に好ましい。加えて、脂質溶媒は、前述の溶媒の、ジクロロメタン(DCM)、クロロホルム、第3級ブチルメチルエーテル(tBME、又はMTBE)、エタン酸エチル、及びイソオクタンからなる群からの疎水性溶媒と一緒の混合物である。酸変性剤の例は、ギ酸、又は酸性酸である。勾配溶出のための好ましい溶媒は、実施例の章において開示される。
【０２１６】
本発明に従い適用されてもよいガス-クロマトグラフィーは、原則として、液体クロマトグラフィーと同等に作動する。しかしながら、固定相を通過する液体移動相中に化合物(すなわち、代謝産物)を有するのではなく、化合物は、気体体積中に存在する。化合物は、固体支持材料を固定相として含有し得る、又は固定相として機能し得るか、若しくは固定相でコーティングされた壁を含有し得るカラムを通過する。ここでもまた、それぞれの化合物は、カラムを通過するのに必要とする、特定の時間を有する。さらに、ガスクロマトグラフィーの場合、化合物は、好ましくはガスクロマトグラフィーの前に誘導体化されることが想定される。誘導体化の適切な技術は、当該技術分野において周知である。好ましくは、本発明に従った誘導体化は、好ましくは極性化合物の、メトキシメーション及びトリメチルシリル化、並びに好ましくは無極性(すなわち、親油性)化合物の、トランスメチレーション、メトキシメーション、及びトリメチルシリル化に関する。
【０２１７】
質量分析のため、サンプル中のアナライトは、荷電分子、又は分子断片を生じるようにイオン化される。その後、イオン化されたアナライトの、特にイオン化されたバイオマーカー、又はその断片の、電荷に対する質量が、測定される。
【０２１８】
したがって、質量分析ステップは、決定されるバイオマーカーがイオン化される、イオン化ステップを好ましくは含む。当然、サンプル/溶出液に存在する他の化合物が、同様にイオン化される。バイオマーカーのイオン化は、適切とみなされる任意の方法により、特に、電子衝撃イオン化、高速原子衝撃、エレクトロスプレーイオン化(ESI)、大気圧化学イオン化(APCI)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)により行うことがきる。
【０２１９】
好ましくは、イオン化ステップは、大気圧化学イオン化(APCI)により行われる。より好ましくは、イオン化ステップ(質量分析のため)は、エレクトロスプレーイオン化(ESI)により行われる。したがって、質量分析は、好ましくは、ESI-MS(又は、タンデムMSが行われるなら、ESI-MS/MS)である。エレクトロスプレーは、いずれの化学結合を壊すことなく、イオンの形成をもたらす、ソフトイオン化方法である。
【０２２０】
エレクトロスプレーイオン化(ESI)は、高い電位をサンプルに適用して、エアロゾルを作り出す、エレクトロスプレーを用いてイオンを産生するために質量分析で使用される技術である。それは、イオン化の際、これらの分子のフラグメント化の傾向を克服するので、イオンを高分子から産生する際に特に有用である。
【０２２１】
好ましくは、エレクトロスプレーイオン化は、陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化である。したがって、イオン化は、好ましくは、プロトン化(又はNH4+、Na+、又はK+、特にNH4+のような正に荷電したイオンとの付加物形成)である。したがって適切なカチオン、好ましくは、プロトン(H+)が、決定されるバイオマーカーに(及び当然、サンプル中、すなわち、クロマトグラフィーカラムからの溶出液中の任意の化合物に)加えられる。それ故、前記少なくとも１つのバイオマーカーの量、特に前記少なくとも3つのバイオマーカーの量の決定は、プロトン化されたバイオマーカーの量の決定であってもよい。
【０２２２】
当業者は、イオン化ステップが、質量分析ステップの始めに行われることを知っている。タンデムMSが行われるなら、イオン化、特にエレクトロスプレーイオン化は、第1の質量分析ステップにおいて行われる。
【０２２３】
バイオマーカーのイオン化は、クロマトグラフィーカラムから(特にLC又はHPLCカラムから)溶出する液体を、エレクトロスプレーに直接供給することにより、好ましくは行うことができる。あるいは、画分を集め、古典的なナノエレクトロスプレー-質量分析設定において後に分析することができる。
【０２２４】
上で説明された通り、質量分析ステップは、分離ステップ、特にクロマトグラフィーステップの後に行われる。一実施形態では、クロマトグラフィーカラム(例えば、LC又はHPLCカラム)から現れる溶出液は、それを質量分析ステップに供する前に、前処理されてもよい。好ましくは、アンモニウムバッファー(最も好ましくは、ギ酸アンモニウム、又は酢酸アンモニウム)が、セラミド及びTAGのようないくつかの脂質のためのエレクトロスプレープロセスにおいてイオン化効率を増強するために溶出液に加えられる。好ましくは、ギ酸アンモニウムバッファーは、勾配HPLC溶媒(最も好ましくは、メタノール)と混和性の溶媒において溶解される。
【０２２５】
本発明の好ましい実施形態では、少なくとも3つのバイオマーカーは、1回の測定で一緒に決定される。特に1回のLC-MS(又はLC-MS/MS)、HPLC-MS(HPLC-MS/MS)測定(すなわち、実行)において一緒に量を決定することが想定される。
【０２２６】
一実施形態では、少なくとも3つのバイオマーカーの量の決定は、実施例の章において記載されるステップを含む。例えば、少なくとも3つのバイオマーカーを、実施例３において記載される通り、決定することができる。特にパネル1、2、又は200のバイオマーカーを、実施例の章(好ましくは、実施例３)において記載される通り、決定することができる。
【０２２７】
例えば、血液、血清、又は血漿サンプル(特に血漿サンプル)を分析することができる。サンプルは、新鮮サンプル、又は凍結サンプルであってもよい。凍結されるなら、サンプルは、適切な温度において適切な時間解凍されてもよい。次に、サンプルのアリコート(例えば、前記サンプルのアリコートは、10μlの体積を有してもよい)が、微量遠心チューブに移され、適切な抽出溶媒(例えば、メタノール/ジクロロメタン(2:1v/v)中の約1:150v/v)と混合される。内部標準が加えられてもよい。例えば、パネル1の少なくとも3つのバイオマーカーの量が決定される場合、メタノール/ジクロロメタン(2:1v/v)に溶解されたホスファチジルコリン(C19:0 C19:0)が、内部標準として使用されてもよく、例えば、メタノール/ジクロロメタン(2:1v/v)中のそれぞれ0.05ミリモルの溶液10μl。その後、(例えば、ボルテクサーを用いて5分間)抽出が行われる。抽出後、サンプルは、(例えば、約20.000gにおいて)遠心分離されてもよい。上清のアリコート(例えば、200μl)は、マーカーの定量のため使用することができる。上清は、-20℃において、(好ましくは、最大3カ月)保存されてもよい。
【０２２８】
加えて、少なくとも1つの内部標準化合物を、サンプルに加えることができる。本明細書で使用される用語「内部標準化合物」は、サンプルに加えられ、決定される化合物を指す(すなわち、内部標準化合物の量が決定される)。少なくとも1つの内部標準化合物は、試験されるサンプルの抽出の前、間、又は後に加えることができる。一実施形態では、少なくとも1つの内部標準化合物が、サンプルのアリコートを抽出溶媒と混合した後、加えられる。好ましくは、内部標準化合物はしたがって、抽出溶媒に溶解される。一実施形態では、抽出溶媒は、本明細書の他所で記載される抽出溶媒(例えば、メタノール/ジクロロメタン(2:1v/v))である。好ましくは少なくとも1つの内部標準化合物は、脂質代謝産物バイオマーカーである。より好ましくは、内部標準化合物は、本質的に存在しないか、又は試験されるサンプルに存在しない、化合物、特に脂質である。したがって、化合物は、好ましくは、試験されるサンプルに天然に存在しない。好ましくは、内部標準は、本発明による、それぞれの脂質バイオマーカーと非常に類似する。一実施形態では、少なくとも1つの標準化合物は、リゾホスファチジルコリンC17:0、セラミドd18:1/17:0、ホスファチジルコリンC19:0 C19:0、コレステリルヘプタデカノエート(CE C17:0)、及びグリセリルトリヘプタデカノエート(MMM)からなる群から選択される。特に、内部標準化合物は、ホスファチジルコリンC19:0 C19:0である。
【０２２９】
内部標準化合物は、適切な溶媒に溶解することができる(内部標準化合物、及び適切な溶媒を含む溶液は、本明細書において、「内部標準溶液」としても言及される)。好ましくは、溶媒は、塩化メチル、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタンの様な、無極性液体溶媒を含むか、又は塩化メチル、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタンの様な、無極性液体溶媒である。好ましくは、本明細書の他所で記載される抽出溶媒が使用される。なおより好ましくは、溶媒は、ジクロロメタン(DCM)及びメタノールを含む混合物である。一実施形態では、抽出溶媒は、メタノール及びDCMを、特に約2:1の比(好ましくは、体積対体積)で含む。
【０２３０】
好ましくは、内部標準溶液は、サンプルを、本明細書の他所で記載される抽出溶媒で抽出し、タンパク質をサンプルから遠心分離により取り除いた後、試験されるサンプルに加えられる。これにより、内部標準溶液は、前処理されたサンプルに加えられる。
【０２３１】
ホスファチジルコリンC19:0 C19:0が内部標準化合物として使用されるなら、サンプル(前処理された)に加えられる内部標準溶液中の内部標準化合物の濃度は、好ましくは、1〜200μg/ml、より好ましくは、35〜50μg/ml、最も好ましくは、40〜45μg/mlの範囲内である。調製後の(すなわち、実際の測定のため使用される) サンプルに関して、内部標準化合物の濃度は、サンプル調製後、好ましくは、0.01〜1.3μg/ml、より好ましくは、0.23〜0.33μg/ml、最も好ましくは、0.26〜0.30μg/mlの範囲内である。
【０２３２】
一実施形態では、使用される内部標準溶液の体積は、前処理前のサンプルと同じ体積である。例えば、10μlの血漿及び内部標準溶液が使用される。
【０２３３】
内部標準の量の決定は、本明細書で言及される前記少なくとも１つのバイオマーカーの量、特に前記少なくとも3つのバイオマーカーの量の標準化（正規化）を好ましくは可能にするものとする。好ましくは前記少なくとも１つのバイオマーカー、特に前記少なくとも3つのバイオマーカーについて決定されたピーク面積を、少なくとも1つの内部標準化合物のピーク面積により除算する。
【０２３４】
特に、試験サンプル(試験される被験体由来のサンプルに加えてキャリブレーションサンプル)についての補正因子を計算することが可能である。この補正因子は、装置の変動、固有のシステムエラー等について、前記バイオマーカーのピーク面積を補正するために使用することができる。ピーク面積として決定されるそれぞれのバイオマーカーについて、バイオマーカーピーク面積の内部標準ピーク面積に対する面積比を決定することができる。
【０２３５】
好ましくは少なくとも1つの標準化合物の決定は、前記少なくとも１つのバイオマーカー又は前記少なくとも3つのバイオマーカーの量の決定を妨害しない。
【０２３６】
用語「量」は、本明細書で使用される場合、本明細書で言及されるバイオマーカーの絶対量、前記バイオマーカーの相対量若しくは濃度、並びにそれと関連するか、若しくはそれからもたらされ得る任意の値又はパラメーターを好ましくは包含する。そのような値又はパラメーターは、前記バイオマーカーから得られた特異的な物理的若しくは化学的性質由来の強度シグナル値を含む。特に、包含されるのは、この記載の他所で特定される間接的測定により得られる、値又はパラメーターである。前述の量又はパラメーターに関連する値はまた、標準的な数学操作によっても得ることがきることは、理解されよう。
【０２３７】
一実施形態では、用語「量」は、絶対量を指す。
【０２３８】
加えて、本明細書で言及される少なくとも3つのバイオマーカーの量のみを決定することが予期され、すなわち、さらなるバイオマーカー(NT-proBNPのようなナトリウム利尿ペプチドを除く)は決定されない。例えば、パネル1のバイオマーカーが決定されるなら、量OSS2、PC4、及びSM23のみが、決定され(そして心疾患と肺疾患との鑑別のために考慮される、また場合によりナトリウム利尿ペプチドが決定される)。したがって、決定される脂質バイオマーカーの群は、OSS2、PC4、及びSM23からなる。パネル2のバイオマーカーが決定されるなら、決定される脂質バイオマーカーの群は、OSS2、SM23、CE C18:2からなる。パネル200のバイオマーカーが決定されるなら、決定される脂質バイオマーカーの群は、OSS2、SM23、CE C18:2、PC4からなる。
【０２３９】
本発明の好ましい実施形態では、本発明による方法は、被験体由来のサンプル中のナトリウム利尿ペプチドの量、例えばBNP(B型ナトリウム利尿ペプチドとしても公知の、脳性ナトリウム利尿ペプチド) の量、又は、特にNT-proBNP(プロホルモン脳性ナトリウム利尿ペプチドのN-末端)の量の決定をさらに含み、次に、BNP又はNT-proBNPのこれにより決定された量が、参照と比較される。好ましい実施形態では、本発明による方法は、特にステップ(a)において、被験体由来のサンプル中のBNP(脳性ナトリウム利尿ペプチド、B型ナトリウム利尿ペプチドとしても公知)、又は、特にNT-proBNP(プロホルモン脳性ナトリウム利尿ペプチドのN-末端)の量の決定をさらに含む。次に、BNP又はNT-proBNPのこれにより決定された量が、BNP又はNT-proBNPについての参照と(ステップbにおいて)比較される。したがって、前記少なくとも１つ又は前記少なくとも3つのバイオマーカー、及びBNP若しくはNT-proBNPは、同時に(しかしながら、好ましくは異なるアッセイにより)決定されてもよい。本発明の別の好ましい実施形態では、NT-proBNP又はBNPの量は、さらなるステップ(c)においてサンプルにおいて決定され、さらなるステップ(d)においてNT-proBNP又はBNPについての参照と比較される。ステップ(b)及び(d)に基づき、心不全と肺疾患との鑑別が行われる。したがって、前記少なくとも１つ又は前記少なくとも3つのバイオマーカーの量の決定と、BNP又はNT-proBNPの量の決定の間の時間ギャップ(例えば、1日、又は1週)があってもよい。
【０２４０】
あるいは、NT-proBNP又はBNPの量を、試験される被験体の医療記録から得ることができる。したがって、本発明の方法は、NT-proBNP又はBNPの量(すなわち、このマーカーの値)についての情報をもたたらす、及び/又は回収するステップを含んでもよい。
【０２４１】
NT-proBNP及びBNPは、タンパク質マーカーである。マーカーNT-proBNP及びBNPは、当該技術分野において周知である。BNPは、心臓の筋肉細胞(心筋細胞)の過剰の伸展に応答して心臓の心室により分泌される32個のアミノ酸のポリペプチドである。NT-proBNPは、脳性ナトリウム利尿ペプチドを放出するようproBNPから切断される、76個のアミノ酸のN末端の不活性なタンパク質である。BNPは、活性ホルモンであり、それぞれの不活性な相対物NT-proBNPより短い半減期を有する。ヒトBNP及びNT-proBNPの構造は、既に詳細に記載されており、例えば、国際公開第02/089657号、国際公開第02/083913号を参照のこと。
【０２４２】
タンパク質マーカーBNP又はNT-proBNPが決定されるなら、タンパク質マーカーが、本明細書で言及される少なくとも3つの(代謝産物)バイオマーカーに加えて、本発明の方法に従い決定されることが理解される。
【０２４３】
BNP/NT-proBNPの量の決定は、本発明の方法との関連で言及される前記少なくとも１つ又は少なくとも3つのバイオマーカーの量の決定と異なってもよい(前記少なくとも１つ又は前記少なくとも3つのバイオマーカーの量は、クロマトグラフィー及び質量分析を含む方法により、好ましくは決定されるため、本明細書の他所を参照のこと)。好ましくは、NT-proBNP又はBNPの量は、血液、血清、又は血漿サンプルにおいて決定される。好ましくは、量は、NT-proBNP又はBNPに特異的に結合する、少なくとも1つの抗体を使用することにより、決定される。少なくとも1つの抗体は、決定されるマーカー(NT-proBNP、又はBNP)と複合体を形成する。その後、形成された複合体の量が測定される。複合体は、マーカー及び抗体(複合体の検出を可能にするために標識されていてもよい)を含む。
【０２４４】
NT-proBNP又はBNPが決定されるサンプルは、本明細書で言及される他のバイオマーカーが決定されるサンプルの前処理と異なる前処理を必要とするか、又は必要とし得ることが理解されるものとする。例えば、このマーカーが決定されるサンプルにより含まれるタンパク質は、沈殿されない。これは、当業者により考慮される。しかしながら、好ましくは前記少なくとも１つのバイオマーカー又は前記少なくとも3つのバイオマーカーの、及びBNP若しくはNT-proBNPの量は、同じサンプルから得たアリコートにおいて測定される。あるいは、前記少なくとも１つのバイオマーカー又は前記少なくとも3つのバイオマーカーの、及びBNP若しくはNT-proBNPの量は、被験体由来の別々のサンプルから得たアリコートにおいて測定されてもよい。
【０２４５】
ナトリウム利尿ペプチド、例えばNT-proBNP又はBNPのさらなる決定は、より信頼できる鑑別を可能にする。
【０２４６】
NT-proBNP若しくはBNPの代わりに、又はNT-proBNP若しくはBNPに加えて、本発明は、ANP(心房性ナトリウム利尿ペプチド)、あるいはNT-proANP(プロホルモン脳性ナトリウム利尿ペプチドのN-末端)の量の決定をさらに想定する。あるいは、C型ナトリウム利尿ペプチド、又はナトリウム利尿ペプチド前駆体Cの量を決定することができる。したがって、ナトリウム利尿ペプチド、例えばNT-proBNP、BNP、ANP、又はNT-proANPを、前記少なくとも１つ又は少なくとも３つの（代謝物質）バイオマーカーに加えて、決定することができる。
【０２４７】
一実施形態では、本発明の方法は、交絡因子についての補正を行うことをさらに含んでもよい。好ましくは、本発明により被験体のサンプルにおいて決定された値あるいは比は、参照と比較する前に、年齢、BMI、性別、又は他の存在する疾患、例えば、糖尿病の存在又は非存在について調整される。あるいは、参照は、年齢、BMI、性別について同様に調整された、値又は比から得ることができる(実施例を参照)。そのような調整は、個々の被験体が調査対象の被験体とこれらのパラメーターに関して本質的に同一である、被験体の群由来の参照並びに基礎となる値若しくは比を導出することにより、成すことができる。あるいは、調整は、統計的計算により成されてもよい。したがって、交絡因子についての補正が行われてもよい。好ましい交絡因子は、年齢、BMI(ボディマスインデックス)、及び性別である。
【０２４８】
別の実施形態において、交絡因子についての補正は行われない。
【０２４９】
診断方法に関連して用語「参照」は、当該技術分野において周知である。本発明に従った参照は、心不全と肺疾患との鑑別を可能にする。適切な参照は、さらなる困難を伴わずに当業者により確立され得る。適用される参照は、本発明の方法において決定される前記少なくとも１つ又は少なくとも3つのバイオマーカーのそれぞれについての(及び決定されるなら、BNP又はNT-proBNPについての)個々の参照であってもよい。したがって、本発明の方法のステップ(a)において言及される前記少なくとも１つ又は少なくとも3つのバイオマーカー(及び決定されるなら、BNP又はNT-proBNP)のそれぞれの量が、前記少なくとも１つ又は少なくとも3つのバイオマーカーのそれぞれについての(及び決定されるなら、BNP又はNT-proBNPについての)参照と比較される。例えば、3つのバイオマーカーが、ステップ(a)において決定されるなら、3つの参照(第1のマーカーについての参照、第2のマーカーについての参照、及び第3のマーカーについての参照)が、ステップ(b)において適用される。BNP又はNT-proBNPの量が、ステップ(a)において決定されるなら、BNP又はNT-proBNPについてのさらなる参照が使用されてもよい。前記少なくとも１つ又は少なくとも3つのバイオマーカーの量(及びBNP又はNT-proBNPが決定されるなら、BNP又はNT-proBNPの量)の、参照との比較に基づき、心不全と肺疾患との鑑別を確立することができる。
【０２５０】
用語「参照」は、心不全と肺疾患との鑑別を可能とする特徴的な特性の値、すなわち本明細書で言及される、心不全の存在若しくは非存在、疾患状態、又は効果を指す。好ましくは、参照は、本発明に関連して言及される前記少なくとも１つのバイオマーカー又は前記少なくとも3つのバイオマーカーについての閾値であり、それにより、調査対象サンプルにおいて見出された、閾値より高い(またはマーカーによっては、より低い)値が、心不全を示し、一方、より低いもの(またはマーカーによっては、より高い)が、肺疾患を示す。
【０２５１】
診断用アルゴリズム、すなわち鑑別のためのアルゴリズムは、参照に依存してもよい。参照量が、例えば、心不全に罹患していることが知られている被験体、又は被験体の群に由来する場合、心不全の存在は、参照と本質的に同一である、試験サンプル中の量により好ましくは示される。参照量が、例えば、肺疾患に罹患している被験体、又はその群であって心不全に罹患していないものに由来する場合、心不全の存在は、参照と異なる(例えば、参照と比較して、増大される(「上昇」)か、又は低減される(「下降」)、試験サンプル中の少なくとも3つのバイオマーカーの量により好ましくは示される。
【０２５２】
前述の本発明の方法に従い、参照(又は複数の参照)は、好ましくは、心不全に罹患していることが知られている被験体又は被験体の群由来のサンプルから得られた参照(又は複数の参照)である。そのような場合、本質的に同一である試験サンプルにおいて見られる前記少なくとも１つのバイオマーカーの値又は前記少なくとも3つのバイオマーカーのそれぞれについての値は、心不全の存在を示す。さらに、参照はまた、好ましくは、肺疾患に罹患していることが知られている被験体又は被験体の群に由来し得る。そのような場合、参照に関して変化した、試験サンプルにおいて見られる前記少なくとも１つのバイオマーカーの値又は前記少なくとも3つのバイオマーカーのそれぞれの値は、肺疾患の不存在を示す。あるいは、参照に関して本質的に同一である、試験サンプルにおいて見られる前記少なくとも１つのバイオマーカーの値又は前記少なくとも3つのバイオマーカーのそれぞれについての値は、肺疾患の存在を示す。同じことは、計算された参照について、最も好ましくは、調査被験体を含む個体の集団のバイオマーカーの相対又は絶対値についての平均値又は中央値に準用する。集団の前記個体のバイオマーカーの絶対又は相対値は、本明細書の他所で特定される通り、決定することができる。適切な参照値、好ましくは、平均値又は中央値の計算の方法は、当該技術分野において周知である。前に言及された被験体集団は、多数の被験体、好ましくは少なくとも5、10、50、100、1,000、又は10,000個の被験体を含むべきである。本発明の方法により評価される被験体、及び前記多数の被験体の被験体は、同じ種のものであることが理解される。
【０２５３】
特徴的な特性についての値、及び定量的決定の場合、強度値が本質的に同一であるなら、試験サンプルのバイオマーカーに関する値、及び参照値は、本質的に同一である。本質的に同一は、2つの値の間の差が、好ましくは、有意でなく、強度についての値が、少なくとも、参照値の1〜99パーセンタイル、5〜95パーセンタイル、10〜90パーセンタイル、20〜80パーセンタイル、30〜70パーセンタイル、40〜60パーセンタイル、好ましくは、参照値の50、60、70、80、90、又は95パーセンタイルの間隔内であることを特徴とすることを意味する。2つの量又は値が、本質的に同一であるかどうかを決定するための統計的試験は、当該技術分野において周知であり、本明細書の他所でまた記載される。
【０２５４】
2つの値について観察される差は、他方で、統計的に有意であろう。相対又は絶対値における差は、好ましくは、参照値の45〜55パーセンタイル、40〜60パーセンタイル、30〜70パーセンタイル、20〜80パーセンタイル、10〜90パーセンタイル、5〜95パーセンタイル、1〜99パーセンタイルの外側で有意である。
【０２５５】
好ましい実施形態では、特徴的な特性についての値はまた、本明細書の他所で説明される「エラスティックネット」の様な分類アルゴリズムのスコアのような計算されたアウトプットでもあり得る。
【０２５６】
好ましくは、参照、すなわち、バイオマーカーの少なくとも1つの特徴的な特性についての値若しくは複数の値(例えば、量)、又はその比は、データベースのような適切なデータ記憶媒体において保存され、したがって、さらなる評価のため入手可能である。
【０２５７】
用語「比較すること」は、バイオマーカーの決定された値、又はスコア(以下を参照)が、参照と本質的に同一であるか、又はそれと異なるかどうかを決定することを好ましくは指す。好ましくは、この記載の他所で言及される統計的技術により決定することができる観察された差が、統計的に有意であるなら、バイオマーカーに関する値(又はスコア)は、参照と異なるとみなされる。差が統計的に有意でないなら、バイオマーカー値及び参照は、本質的に同一である。上で言及された比較に基づき、被験体を、心不全に(特に駆出率の低減された心不全又は別の心不全のサブフォームに)罹患しているか、又は肺疾患に罹患しているか、評価することができる。
【０２５８】
本明細書で言及される特定のバイオマーカーについて、相対量あるいは比における変化(すなわち、平均の比として表される変化)についての好ましい値、あるいは変化の方向の種類(すなわち、より大きな若しくはより小さな相対及び/又は絶対量、あるいは比をもたらす、「上昇」又は「下降」、あるいは増大又は低減)が、実施例の章における表１において示される。平均値の比は、増大又は低減の程度を示し、例えば、2の値は、量が、参照と比較して、バイオマーカーの量が2倍であることを意味する。さらに、「上方制御」、又は「下方制御」が存在するかどうかは、明白である。「上方制御」の場合、平均値の比は1.0を超えるが、一方、「下方」制御の場合、それは1.0未満である。したがって、調節の方向は、同様に表から得ることができる。平均値の代わりに、中央値を同様に使用することができることは理解される。
【０２５９】
例えば、パネル1のバイオマーカーに関して、心不全は、サンプル中のOSS2の量が参照より多く、サンプル中のSM23の量が参照より少なく、サンプル中のPC4の量が参照より少ないとき、被験体において好ましくは診断される。
【０２６０】
実施例のセクションの表１の最後の列から導き出すことができることから、心不全患者における個々のバイオマーカーの量は、肺疾患を有する患者の量と比較して不変であり得る。しかしながら、本明細書で言及されるマーカーの組み合わせの量の決定、これらの量に基づくその後のスコアの計算、および参照スコアとの比較は、本発明の方法を実施することを可能とした。参照スコアについては、本明細書の他の箇所を参照のこと。
【０２６１】
NT-proBNP又はBNPの量が決定されるなら、このマーカーの増大した量は、心不全の存在を示し、一方、低減した又は本質的に同一の量は、心不全の非存在を(そして肺疾患の存在を)示す。一実施形態では、NT-proBNPについての参照量は、好ましくは、血清又は血漿サンプル中で、特にヒト被験体について、約125pg/mLである。しかしながら、(例えば、レベルは年齢に依存し得るので)さらなる参照が使用されてもよい。
【０２６２】
「心不全の存在」または「心不全の存在を示す」という語句はまた、息切れが心不全によって引き起こされたことを意味する。また「肺疾患の存在」または「肺疾患の存在を示す」という語句は、息切れが肺疾患によって引き起こされたことを意味する。
【０２６３】
診断用アルゴリズム、すなわち鑑別のためのアルゴリズムは、適用される参照又は複数の参照に依存してもよいことが理解される。しかしながら、これは、本明細書において提供される鑑別に基づき、適切な参照値及び/又は診断用アルゴリズムを確立することができる当業者により考慮される。例えば、参照は、心不全に罹患していることが知られている被験体又は被験体の群に由来し得る。この場合、以下が当てはまる:トリアシルグリセリドバイオマーカーに関して、参照と比較して、本質的に同一であるか、又は増大した、被験体由来のサンプル中のトリアシルグリセリド(複数可)の量は、心不全の存在を示す。決定することができる、残りのバイオマーカーに関して、参照と比較して、減少したか、又は本質的に同一である、被験体由来のサンプル中の残りのバイオマーカー(複数可)の量は、心不全の存在を示す。
【０２６４】
比較は、自動化により好ましくは補助される。例えば、2つの異なるデータセット(例えば、特徴的な特性の値を含むデータセット)の比較のためのアルゴリズムを含む適切なコンピュータープログラムが、使用されてもよい。そのようなコンピュータープログラム、及びアルゴリズムは、当該技術分野において周知である。上記に関わらず、比較をまた、手動で行うこともできる。
【０２６５】
本発明のステップ(b)との関連における、本発明の方法のステップ(a)において言及されるバイオマーカーの群の量は、参照又は複数の参照と比較される。それにより、心不全と肺疾患とを（特に息切れの原因として）鑑別することができる。一実施形態では、個々の決定されたバイオマーカーに関する参照、すなわち、ステップ(a)において言及されるバイオマーカーのそれぞれについての参照が、適用される。しかしながら、本発明の方法のステップ(a)において言及される少なくとも3つのバイオマーカーの量に基づき、スコア(特に単一のスコア)、すなわち、単一のスコアを計算すること、及びこのスコアを参照スコアと比較することも想定される。好ましくは、スコアは、試験被験体由来のサンプル中の少なくとも3つのバイオマーカーの量に基づき、NT-proBNP又はBNPが決定されるなら、試験被験体由来のサンプル中の少なくとも3つのバイオマーカー量、及びNT-proBNP若しくはBNPの量に基づく。例えば、パネル1のバイオマーカーの量が決定されるなら、計算されたスコアは、試験被験体由来のサンプル中のSM23、OSS2、及びPC4の量に基づく。加えて、NT-proBNPが決定されるなら、スコアは、試験被験体のSM23、OSS2、PC4、及びNT-proBNPの量に基づく。
【０２６６】
計算されたスコアは、少なくとも3つのバイオマーカーの量についての情報を組合せる。さらに、スコアにおいて、バイオマーカーは、鑑別の確立へのそれらの関与に従い、好ましくは、重み付けされる。本発明の方法において適用されるバイオマーカーの組合せに基づき、個々のバイオマーカーの重みは異なってよい。
【０２６７】
スコアは、心不全と肺疾患とを被験体において鑑別するための分類子パラメーターと考えることができる。特にそれは、人が、単一のスコアに基づく鑑別を提供することを可能にする。参照スコアは、試験される被験体において、心不全と肺疾患とを鑑別することを可能にする、好ましくは値、特にカットオフ値である。好ましくは、参照は単一の値である。したがって、人は、個々のバイオマーカーの量についての全体の情報を解釈する必要はない。
【０２６８】
値は数学的にスコアに変換されるので、本明細書に記載されるスコアリングシステムを使用して、有利には、異なる次元の値、又はバイオマーカーに関する単位が使用されてもよい。したがって、例えば、絶対濃度についての値が、ピーク面積比を有するスコアにおいて組み合わされてもよい。
【０２６９】
適用される参照スコア(基準スコア)は、所望の感度または所望の特異度に基づいて選択され得る。適切な基準スコアを選択する方法は、当該技術分野において広く知られている。例えば、実施例の実施例6では、6つの異なるカットオフ（参照スコア）を決定した。
【０２７０】
したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法のステップ(b)において説明されるバイオマーカーの量の参照との比較は、ステップ(a)において言及されるバイオマーカーの決定された量に基づき、スコアを計算するステップ(b1)、及びこれにより、計算されたスコアを参照スコアと比較するステップ(b2)を包含する。より好ましくは、ロジスティック回帰法が、スコアを計算するため使用され、最も好ましくは、前記ロジスティック回帰法は、エラスティックネット正則化を含む。
【０２７１】
あるいは、少なくとも3つのバイオマーカーのそれぞれの量が、参照と比較され、この比較の結果が、スコア(特に単一のスコア)の計算のため使用され、前記スコアが、参照スコアと比較される。
【０２７２】
したがって、本発明、特に被験体において心不全と肺疾患とを鑑別る方法は、
(a)本明細書で言及される被験体のサンプルにおいて、上で言及された少なくとも3つのバイオマーカーの量を決定するステップ、及び
(b1)ステップ(a)において言及された少なくとも3つのバイオマーカーの決定された量に基づき、スコアを計算するステップ、及び
(b2)こうして計算されたスコアを参照スコアと比較するステップであって、それにより、心不全と肺疾患とが被験体において鑑別される、ステップ、
を含む。
【０２７３】
本明細書の他所で説明される通り、前述の方法は、ステップ(a)において、BNP又はNT-proBNPの量の決定をさらに含んでもよい。BNP又はNT-proBNPの量は、ステップ(b)において計算されるスコアに寄与してもよい。したがって、本方法は、以下のステップ:
(a)本明細書で言及される被験体のサンプルにおいて、上で言及された少なくとも3つのバイオマーカーの量、及びBNP若しくはNT-proBNPの量を決定するステップ、並びに
(b1)ステップ(a)において言及された少なくとも3つのバイオマーカーの決定された量に、及びBNP若しくはNT-proBNPの量に基づき、スコアを計算するステップ、並びに
(b2)こうして計算されたスコアを参照スコアと比較するステップであって、それにより、心不全と肺疾患とが被験体において鑑別される、ステップ
を含む。
【０２７４】
本明細書の他所で説明される通り、NT-proBNP又はBNPの量をまた、試験される被験体の医療記録から得ることもできる。この場合、ステップ(a)において、このマーカーの量を決定することは必要とされない。
【０２７５】
あるいは、BNP又はNT-proBNPの量は、ステップ(b1)において計算されるスコアに寄与しなくてもよい。したがって、本方法は、以下のステップ:
(a)本明細書で言及される被験体のサンプルにおいて、上で言及された少なくとも3つのバイオマーカーの量、及びBNP若しくはNT-proBNPの量を決定するステップ、並びに
(b1)少なくとも3つのバイオマーカーの決定された量に基づき、スコアを計算するステップ、並びに
(b2)こうして計算されたスコアを参照スコアと比較し、BNP若しくはNT-proBNPの量を参照と比較するステップであって、それにより、心不全と肺疾患とが被験体において鑑別される、ステップ
を含む。
【０２７６】
本明細書の他所で説明される通り、NT-proBNP又はBNPの量はまた、試験される被験体の医療記録から得ることもできる。この場合、ステップ(a)において、このマーカーの量を決定することは必要とされない。
【０２７７】
好ましくは、参照スコアは、被験体が、心不全又は肺疾患に罹患しているか否かを鑑別することを可能とする。好ましくは、鑑別（識別）は、試験被験体のスコアが、参照スコアより上であるか、又は下であるかを評価することにより、成される。ある実施形態では、参照スコアを超えるスコアは心不全を示すのに対し、参照スコアを下回るスコアは肺疾患を示す。
【０２７８】
したがって、一実施形態では、正確な参照スコアをもたらすことは必須ではない。関連する参照スコアは、好ましくは、ROC曲線分析を使用して、感度及び特異度、並びに任意のスコアについての感度/特異度を関連付けることにより得ることができる。高い感度をもたらす参照スコアは、より低い特異度をもたらし、逆も真なりである。したがって、参照スコアは、所望の感度、及び/又は特異度に依存してもよい。好ましくは、参照スコアは、スコアと同じマーカー(例えば、少なくとも3つのバイオマーカー、及びNT-proBNP)に基づく。
【０２７９】
参照スコアは、被験体において心不全の存在と非存在とを識別することを可能にする、「カットオフ」値であってもよい。
【０２８０】
本発明に従い、参照スコアは、好ましくは、心不全に罹患していることが知られている被験体、又は被験体の群由来のサンプルから得られた参照スコアである。そのような場合、本質的に同一である試験サンプルにおけるスコアは、疾患の、すなわち、心不全の存在を示す。さらに、参照スコアはまた、好ましくは、肺疾患に罹患していることが知られている被験体又は被験体の群由来であり得る。そのような場合、参照スコアに関して、変化している、特に低減している試験サンプルにおけるスコアは、肺疾患の存在を示す。あるいは、前記参照スコアと本質的に同一である試験サンプルにおけるスコアは、肺疾患の存在を示す。
【０２８１】
好ましくは、スコアは、適切なスコアリングアルゴリズムに基づき計算される。前記スコアリングアルゴリズムは、決定されるバイオマーカーの量に基づき、被験体が、本明細書で言及される疾患に罹患しているか否かを識別することを好ましくは可能にする。
【０２８２】
好ましくは、前記スコアリングアルゴリズムは、本明細書で言及される心不全に罹患している患者由来、及び肺疾患に罹患している患者由来のサンプル中の、ステップ(a)において言及される個々のバイオマーカーの量に関する情報を比較することにより、事前に決定される。したがって、ステップ(b)はまた、スコアリングアルゴリズムを決定又は実行することのステップ(b0)も含んでもよい。好ましくは、このステップは、ステップ(b1)及び(b2)の前に行われる。
【０２８３】
一実施形態では、参照スコアは、参照スコアと比較して試験被験体のスコアの増大した値が、心不全の存在を示し、及び/又は参照スコアと比較して試験被験体のスコアの低減した値が、肺疾患の存在を示すように、計算される。特にスコアはカットオフ値であってもよい。
【０２８４】
本発明の(例えば、方法、デバイス、使用等の)好ましい実施形態では、参照スコアは、単一のカットオフ値である。好ましくは、前記値は、試験被験体を、心不全に罹患している被験体の群、又は肺疾患に罹患している被験体の群のいずれかに割り当てることを可能にする。好ましくは、参照スコアより低い被験体についてのスコアは、前記被験体における肺疾患の存在を示す一方、参照スコアより高い被験体についてのスコアは、前記被験体における心不全の存在を示す。
【０２８５】
本発明の(例えば、方法、デバイス、使用等の)別の好ましい実施形態では、参照スコアは、参照スコア範囲である。これに関連して、心不全の存在を示す参照スコア範囲、肺疾患の存在を示す参照スコア範囲、又は2つの参照スコア範囲(すなわち、心不全の存在を示す参照スコア範囲及び肺疾患の存在を示す参照スコア範囲)を適用することができる。
【０２８６】
適切なスコアリングアルゴリズムは、さらなる困難を伴わずに、当業者により本発明の方法のステップ(a)において言及される少なくとも3つの(及び場合によりBNP又はNT-proBNPの)バイオマーカーを用いて決定することができる。例えば、スコアリングアルゴリズムは、心不全に罹患している被験体のコホート、及び肺疾患に罹患している被験体のコホートにおける少なくとも3つのバイオマーカー(及び場合によりBNP若しくはNT-proBNP)の量に関する情報を使用する、数学関数であってもよい。スコアリングアルゴリズムを決定する方法は、当該技術分野において周知であり、マイクロアレイの有意性分析、ツリーハーベスティング、CART、MARS、自己組織マップ、頻出アイテムセット、ベイジアンネットワーク、マイクロアレイの予測分析(PAM)、SMO、単純ロジスティック回帰、ロジスティック回帰、多層パーセプトロン、ベイズネット、ナイーブベイズ、単純ナイーブベイズ、ナイーブベイズアップ、IB1、Ibk、Kstar、LWL、AdaBoost、ClassViaRegression、Decorate、マルチクラスクラシファイア、ランダムコミッティー、j48、LMT、NBTree、Part、ランダムフォレスト、順序クラシファイア、スパース線形プログラミング(SPLP)、スパースロジスティック回帰(SPLR)、エラスティックネット、サポートベクターマシン、残差平方和の予測(PRESS)、罰金付ロジスティック回帰、相互情報量を含む。好ましくは、スコアリングアルゴリズムは、本明細書の他所で説明される交絡因子についての補正有り、又は無しで決定される。
【０２８７】
さらに、当業者は、さらなる困難を伴わずに、前記少なくとも1つの（代謝産物）バイオマーカーおよびBNPまたはNT-proBNPを用いて、適切なスコアリングアルゴリズムを決定することができる。一実施形態では、スコアリングアルゴリズムは、少なくとも3つのバイオマーカー、及び場合によりBNP若しくはNT-proBNPを用いるエラスティックネットで決定される(実施例の章も参照)。
【０２８８】
典型的には、エラスティックネット法を実行するアルゴリズムなどの分類アルゴリズムが、スコアリングのため使用されてもよい(Zou 2005, Journal of the Royal Statistical Society, Series B: 301-320, Friedman 2010, J. Stat. Sotw. 33)。したがって、被験体についてのスコアは、好ましくは、例えばRパッケージglmnetで実行されるようなエラスティックネットアルゴリズムを使用することによりフィッティングされた、ロジスティック回帰モデルで計算することができる。より具体的には、スコアは、以下の式
【数１】
2019509476.tif 000003
又は数学的に均等な式により、計算されてもよく、
但し、特性
2019509476.tif 000004
が、
【数２】
2019509476.tif 000005
(式中、xiは、対数変換された測定値、例えば、ピーク面積比及び/又は濃度値であり、mi、siは、特性に特異的なスケーリング因子であり、wiは、モデルの係数である[w0、切片；w1、第1の特性(例えば、NT-proBNP、又は本明細書において言及される脂質バイオマーカーのいずれか1つ)についての係数；w2・・・wn、さらなる特性についての係数；n、パネルにおける特性の数])である。
【０２８９】
参照スコアより大きいスコアは、心不全に罹患している被験体を示し、一方、参照スコアより小さい(又は同等の)スコアは、肺疾患に罹患している被験体を示す。
【０２９０】
参照スコアは、例えば、心不全の検出のため、ヨーデン指数(Youden index)を最大にするよう決定することができる。
【０２９１】
スコア及び参照スコアを計算するための、さらなる好ましい方法は、実施例の章において記載される。さらに、実施例４及び５は、パネル１についての好ましい参照スコアを開示する。例えば、NT-proBNPとの組合せにおけるパネル1についての参照スコアは、0.738であってもよい。
【０２９２】
上で言及された少なくとも3つのバイオマーカーの量は、心不全と肺疾患とを鑑別することを可能とする。したがって、サンプル中の上で特定される少なくとも3つのバイオマーカーを、原則として、心不全と肺疾患とを鑑別するために使用することができる。これは、疾患の効率的な鑑別、並びに特に息切れを罹患してる患者の前臨床的及び臨床的管理の改善に役立つ。
【０２９３】
上でなされた用語の定義及び説明は、本明細書中以下に別段指定する場合を除き、変更すべきところは変更して、本発明の以下の実施形態(例えば、キット、デバイス、使用、さらなる方法等)について準用する。
【０２９４】
本発明の方法を行うことにより、心不全の治療を必要とする又は肺疾患の治療を必要とする被験体を同定することができる。したがって、本発明は、被験体が、心不全の治療を必要とする又は肺疾患の治療を必要とするかを同定する方法に関する。したがって、本発明は好ましくは、息切れに罹患している被験体が、心不全の治療を必要とするか又は肺疾患の治療を必要とするかを同定する方法に関する。
【０２９５】
本明細書で使用される語句「心不全の治療を必要とする」又は「肺疾患の治療を必要とする」は、被験体における疾患が、心不全又は肺疾患若しくはそれらに付随する症状を改善するか、又は処置するために、治療的介入が必要であるか、あるいは有益である、状態にあることを意味する。したがって、本発明の基礎となる研究の知見は、被験体において心不全と肺疾患とを鑑別することを可能にするばかりでなく、心不全治療又は肺疾患治療により処置されるべき被験体を同定することも可能にする。一旦、被験体が同定されると、本方法は、治療についての推奨を行うステップをさらに含んでもよい。
【０２９６】
本発明に従い使用される心不全の治療は、ACE阻害剤(ACEI)、ベータ遮断薬、AT1-阻害剤、アルドステロン拮抗薬、レニン拮抗薬、利尿薬、Ca-増感剤、ジギタリスグリコシド、抗血小板薬、ビタミンK拮抗薬、タンパク質S100ファミリーのポリペプチド(参照により本明細書に組み込まれる、DE000003922873A1、DE000019815128A1、又はDE000019915485A1)、BNP(ネシリチド(ヒト組み換え脳性ナトリウム利尿ペプチド-BNP))又はANPのようなナトリウム利尿ペプチドからなる群から選択される少なくとも1つの薬物の投与を含むか又はからなる治療に好ましくは関する。
【０２９７】
一般に、患者は、European Society of Cardiologyのガイドライン(参考文献：European Heart Journal (2012), 33:1787-1847)により推奨される薬剤で好ましくは処置される。
【０２９８】
別の実施形態では、心不全に罹患している患者は、2013年ACCF/AHAガイドライン(Circulation. 2013; 128: e240-e327)により推奨される通り、処置される。
【０２９９】
さらに、心不全に罹患している被験体は、アンジオテンシン受容体遮断薬(ARB)、イバブラジン、ジゴキシン及び他のジギタリスグリコシド、ヒドララジン及び二硝酸イソソルビド(血管拡張剤)、並びにオメガ-3多価不飽和脂肪酸で処置されてもよい。
【０３００】
本発明の方法の好ましい実施形態では、前記少なくとも1つのバイオマーカー又は前記少なくとも3つのバイオマーカーの決定は、質量分析技術(好ましくは、GC-MS、及び/又はLC-MS)、NMR、又は本明細書において上で言及された他のものにより達成される。そのような場合、好ましくは、分析されるサンプルは、前処理される。前記前処理は、サンプル材料由来の少なくとも1つ、好ましくは少なくとも3つのバイオマーカーを好ましくは含み、例えば、血漿又は血清は、全血から得られてもよく、又は少なくとも1つ、好ましくは少なくとも3つのバイオマーカーは、サンプル材料から特異的に抽出されてすらよい。さらに、GC-MSのため、少なくとも1つのバイオマーカーの誘導体化のようなさらなるサンプル前処理が、好ましくは必要とされる。さらに、前処理はまた、サンプル材料を希釈すること、及びそこに含まれる成分の濃度を調整するか、又は標準化することも好ましくは含む。この目的で、好ましくは、標準化標準が、少なくとも1つのバイオマーカーと参照の量の比較、及び/又は分析される異なるサンプル間の比較を行うことを可能にする、予め定義された量でサンプルに加えられてもよい。好ましくは、標準化標準は、本明細書の他所で定義される、内部標準化合物である。例えば、バイオマーカーのそれぞれのクラスについての1つの標準、例えば、トリアシルグリセリドについての1つの標準、スフィンゴミエリンについての1つの標準等が、標準化を可能にするために加えられてもよい。別の好ましい実施形態では、SMバイオマーカーの定量は、検出器応答が同じであるという観察に基づき、標的代謝産物と異なる鎖長を有する市販のスフィンゴミエリン標準を加えることにより、達成される。さらなる好ましい実施形態では、キャリブレーション溶液を、脱脂血漿(市販)において調製して、実際の血漿とできるだけ近く、マトリックスを模倣する。
【０３０１】
したがって、本発明は、本発明を実施するに当たって、前記少なくとも１つ又は前記少なくとも3つのバイオマーカーを対照として含む、組成物、又はキットの使用にさらに関する。
【０３０２】
加えて、本発明は、本発明の方法を実施するに当たってのキャリブレーション溶液の使用に関し、前記キャリブレーション溶液は、前記少なくとも１つ又は前記少なくとも3つのバイオマーカーを含む。キャリブレーション溶液は、前記少なくとも１つのバイオマーカー又は前記少なくとも3つのバイオマーカーの量を決定するために使用されるデバイスのキャリブレーションを可能にする。好ましくは、キャリブレーション溶液は、本明細書において以下で定義される、キャリブレーションサンプル/複数のキャリブレーションサンプルの調製のためのストック溶液として機能する。好ましくは前記少なくとも１つ又は前記少なくとも3つのバイオマーカーを、適切な溶媒に溶解して、キャリブレーション溶液を一緒に形成する。したがって、キャリブレーション溶液は、適切な溶媒、及び前記少なくとも3つのバイオマーカーを含む前記組成物を好ましくは含む。好ましくは、溶媒は、塩化メチル、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタンの様な、無極性液体溶媒を含むか、又は塩化メチル、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタンの様な、無極性液体溶媒である。好ましくは、本明細書の他所で記載される抽出溶媒が使用される。なおより好ましくは、溶媒は、ジクロロメタン(DCM)及びメタノールを含む混合物である。一実施形態では、抽出溶媒は、メタノール及びDCMを、特に約2:1の比(好ましくは、体積対体積)で含む。
【０３０３】
さらに、本発明は、本発明の組成物(すなわち、本発明の方法に関連して説明される、少なくとも3つのバイオマーカーを含む)、及び脱脂血清若しくは血漿を含むキャリブレーションサンプルの使用に関する。好ましくは、キャリブレーションサンプルは、適切な溶媒、特に本明細書の他所で定義される抽出溶媒をさらに含む。
【０３０４】
前記組成物、キャリブレーション溶液、又は前記キャリブレーションサンプルは、特に少なくとも3つのバイオマーカーの量を決定するためデバイスを制御するか、及び/又はキャリブレーションするため、本発明を行うとき、対照として使用することができる。
【０３０５】
好ましい実施形態では、脱脂血清又は血漿は、脱繊維化されている。
【０３０６】
一実施形態では、前記脱脂サンプルは、脱脂血清である。別の実施形態では、前記脱脂サンプルは、脱脂血漿である。
【０３０７】
好ましくは、前記組成物、キャリブレーション溶液、又はキャリブレーションサンプルは、少なくとも3つのバイオマーカーを予め定義された量又は比で含む。
【０３０８】
用語「脱脂(delipidized)」(「脱脂化された(delipidated)」と言及されることも多い)」は、当該技術分野において周知である。好ましくは、この用語は、前記サンプル(例えば、血清、血漿)に天然で存在する脂質(例えば、トリグリセリド、コレステロール、リン脂質、及び非エステル化脂肪酸)が、前記サンプルから取り除かれたことを意味する(例えば、Cham et al. J Lipid Res. 1976 Mar;17(2):176-81. A solvent system for delipidation of plasma or serum without protein precipitationを参照)。前記サンプルを脱脂後、少なくとも3つのバイオマーカーが、本明細書において言及され、前記脱脂血清又は血漿に加えられ、特に人工的に加えられる。したがって、少なくとも3つのバイオマーカーは、前記脱脂サンプル中に好ましくは添加される。好ましくは少なくとも3つのバイオマーカーは、脱脂血清又は血漿に予め定義された量で加えられる。好ましくは、前記予め定義された量は、キャリブレーション及び/又はコントロールを可能にする。あるいは、前記予め定義された量は、参照を表す。
【０３０９】
前記少なくとも１つ又は前記少なくとも3つのバイオマーカーを脱脂血清又は血漿に加えるために、前記少なくとも１つ又は3つのバイオマーカーが、適切な溶媒(特に本明細書の他所で定義される抽出溶媒である)に溶解される。次に、得られた溶液が、加えられる、すなわち、脱脂血清又は血漿と組み合わされる。好ましくは、脱脂血清又は血漿の溶媒に対する比は、約1:10〜1:1000、より好ましくは、約1:100〜1:500、又はなおより好ましくは、約1:100〜1:200、最も好ましくは、約1:150である。
【０３１０】
キャリブレーションのため、キャリブレーション溶液のアリコートは、脱脂血清又は血漿と混合され、それにより、キャリブレーションサンプル又は一連のキャリブレーションサンプルを生成することができる。好ましくは、さらなるキャリブレーションサンプルが、最高濃度のバイオマーカーを含むキャリブレーション溶液であるストック溶液から調製されてもよい。内部標準が加えられる場合、好ましくは、同じ量の内部標準が、一連のキャリブレーションサンプルのそれぞれのメンバーに与えられる(以下を参照)。
【０３１１】
本発明の好ましい実施形態では、組成物、キャリブレーション溶液、キャリブレーションサンプル、又はキットは、区別（鑑別）のため使用される、脂質バイオマーカー(すなわち、同じ組合せの脂質バイオマーカー、例えば、パネル1、2、又は200のバイオマーカー)を含む。
【０３１２】
しかしながら、脂質バイオマーカーは、他のバイオマーカーで置き換えられ、前記他のバイオマーカーは、同じ化合物クラスに好ましくは属することが想定される。したがって、トリアシルグリセリドバイオマーカーは、異なるトリアシルグリセリドで置き換えられてもよく、コレステリルエステルバイオマーカーは、異なるコレステリルエステルで置き換えられてもよく、ホスファチジルコリンバイオマーカーは、異なるホスファチジルコリンで置き換えられてもよく、スフィンゴミエリンバイオマーカーは、異なるスフィンゴミエリンで置き換えられてもよく、セラミドバイオマーカーは、異なるセラミドで置き換えられてもよい。例えば、本発明の方法が、SM23の決定を含むなら、脱脂サンプルは、SM27を代わりに含んでもよい。SM27は、スフィンゴミエリン(d18:1/24:1)若しくはスフィンゴミエリン(d18:2/24:0)、又はその組合せを好ましくは指す。好ましい実施形態では、SM27は、スフィンゴミエリン(d18:1/24:1)である。好ましいトリアシルグリセリド、コレステリルエステル、ホスファチジルコリン、セラミド、及びスフィンゴミエリンは、本明細書の他所で記載される。
【０３１３】
本明細書に規定する、組成物、キャリブレーション溶液、キャリブレーションサンプル、又はキットはしたがって、
i.少なくとも1つのトリアシルグリセリド、少なくとも1つのコレステリルエステル、及び少なくとも1つのホスファチジルコリン;
ii.少なくとも1つのトリアシルグリセリド、少なくとも1つのホスファチジルコリン、及び少なくとも1つのスフィンゴミエリン;
iii.少なくとも1つのトリアシルグリセリド、少なくとも1つのコレステリルエステル、及び少なくとも1つのスフィンゴミエリン;又は
iv.少なくとも1つのホスファチジルコリン、少なくとも1つのコレステリルエステル、及び少なくとも1つのスフィンゴミエリン
を好ましくは含む。
【０３１４】
別の好ましい実施形態では、組成物、キャリブレーション溶液、キャリブレーションサンプル、又はキットは、少なくとも1つのトリアシルグリセリド、少なくとも1つのコレステリルエステル、少なくとも1つのスフィンゴミエリン、及び少なくとも1つのホスファチジルコリンを含んでもよい。
【０３１５】
特に好ましい実施形態では、組成物、キャリブレーション溶液、キャリブレーションサンプル、又はキットは、OSS2、PC4、及びSM23を含む。別の特に好ましい実施形態では、組成物、キャリブレーション溶液、又はキャリブレーションサンプルは、OSS2、PC4、及びSM27を含む。
【０３１６】
好ましい実施形態では、特にパネル1について、PC4:SM27の比(モル濃度に基づく)は、50:1〜2.5:1の範囲内であり、より好ましい実施形態では、比は、25:1〜5:1の範囲内である。別の好ましい実施形態では、特にパネル1について、SM27:OSS2の比(モル濃度に基づく)は、30:1〜1.5:1の範囲内であり、より好ましい実施形態では、比は、15:1〜2:1の範囲内である。特にPC4:SM27:OSS2の比(モル濃度に基づく)は、約100:7.9:1.1である。SM23が、SM27の代わりに、組成物、キャリブレーション溶液、キャリブレーションサンプル、又はキットの一部である場合、上で述べられた同じ比が当てはまる。
【０３１７】
別の特に好ましい実施形態では、組成物、キャリブレーション溶液、キャリブレーションサンプル、又はキットは、OSS2、CE18:2、及びSM23を含む。別の特に好ましい実施形態では、組成物、キャリブレーション溶液、又はキャリブレーションサンプルは、OSS2、CE18:2、及びSM27を含む。好ましい実施形態では、特にパネル2について、CE18:2:SM27の比(モル濃度に基づく)は、500:1〜2:1の範囲内であり、より好ましい実施形態では、比は、100:1〜10:1の範囲内である。別の好ましい実施形態では、特にパネル2について、SM27:OSS2の比(モル濃度に基づく)は、30:1〜1.5:1の範囲内であり、より好ましい実施形態では、比は、15:1〜2:1の範囲内である。特にCE8:2:SM27:OSS2の比(モル濃度に基づく)は、約100:2.7:0.39である。SM23が、SM27の代わりに、組成物、キャリブレーション溶液、キャリブレーションサンプル、又はキットの一部である場合、上で述べられた同じ比が当てはまる。
【０３１８】
別の特に好ましい実施形態では、組成物、キャリブレーション溶液、キャリブレーションサンプル、又はキットは、OSS2、PC4、SM23、及びCE18:2を含む。別の特に好ましい実施形態では、組成物、キャリブレーション溶液、又はキャリブレーションサンプルは、OSS2、PC4、CE18:2、及びSM27を含む。好ましい実施形態では、特にパネル200について、PC4:SM27の比(モル濃度に基づく)は、50:1〜2.5:1の範囲内であり、より好ましい実施形態では、比は、25:1〜5:1の範囲内である。別の好ましい実施形態では、特にパネル200について、SM27:OSS2の比(モル濃度に基づく)は、30:1〜1.5:1の範囲内であり、より好ましい実施形態では、比は、15:1〜2:1の範囲内である。別の好ましい実施形態では、CE18:2:SM27の比(モル濃度に基づく)は、500:1〜2:1の範囲内であり、より好ましい実施形態では、比は、100:1〜10:1の範囲内である。特にCE18:2:PC4:SM27:OSS2の比(モル濃度に基づく)は、約100:34.2:2.7:0.4である。SM23が、SM27の代わりに、組成物、キャリブレーション溶液、キャリブレーションサンプル、又はキットの一部である場合、上で述べられた同じ比が当てはまる。
【０３１９】
加えて、本発明は、一連の本発明のキャリブレーション溶液、及び/又はキャリブレーションサンプル、及び/又は組成物に関する。好ましくは、前記一連のキャリブレーション溶液/キャリブレーションサンプルは、少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも4つ、最も好ましくは少なくとも5つの異なるキャリブレーション溶液、及び/又はキャリブレーションサンプル、及び/又は組成物を含む。前記キャリブレーション溶液、及び/又はキャリブレーション溶液、及び/又は組成物は、前記溶液/サンプル/組成物により含まれる脂質バイオマーカーの事前に定義された量で異なるべきである。したがって、本発明は、本発明のキャリブレーション溶液及び/又はキャリブレーションサンプルの希釈系列を想定する。一実施形態では、一連のキャリブレーション溶液及び/又はキャリブレーションサンプルにより含まれるバイオマーカーの量は、最高濃度のものが、ストック溶液として使用することができるように、直線関係にある。
【０３２０】
キャリブレーション溶液に存在するバイオマーカーPC4、CE18:2、SM27、及びOSS2の好ましい量は、下記に示される。実施例の章の表13において示される。表５及び表５Ａは、キャリブレーションのため使用されるストック溶液を列挙する。バイオマーカーの好ましい比は、パネル200、パネル２、及びパネル１について表５(特にSTD1の列を参照)において示される。
【０３２１】
好ましくは、キャリブレーション溶液は、OSS2、PC4、及び/又はSM27を含む。好ましくは、濃度は以下の通りである:
PC4：約6〜約193nmol/ml
OSS2：約0.07〜約2.2nmol/ml、及び/又は
SM27：約0.5〜約15.2nmol/ml。
【０３２２】
キャリブレーション溶液がCE18:2を含むなら、濃度は、好ましくは、約18〜約570nmol/mlである。
【０３２３】
一実施形態では、パネル1のバイオマーカーが決定されるなら、PC4、OSS2、及びSM27を含むキャリブレーション溶液又はキャリブレーションサンプルが使用される。別の実施形態では、パネル1のバイオマーカーが決定されるなら、PC4、OSS2、及びSM23を含むキャリブレーション溶液又はキャリブレーションサンプルが使用される。
【０３２４】
一実施形態では、パネル2のバイオマーカーが決定されるなら、OSS2、CE18:2、及びSM27を含むキャリブレーション溶液、又はキャリブレーションサンプル、又はキットが使用される。別の実施形態では、パネル2のバイオマーカーが決定されるなら、OSS2、CE18:2、及びSM23を含むキャリブレーション溶液、又はキャリブレーションサンプル、又はキットが使用される。
【０３２５】
一実施形態では、パネル200のバイオマーカーが決定されるなら、PC4、OSS2、CE18:2、及びSM27を含むキャリブレーション溶液、又はキャリブレーションサンプル、又はキットが使用される。別の実施形態では、パネル200のバイオマーカーが決定されるなら、PC4、OSS2、CE18:2、及びSM23を含むキャリブレーション溶液若しくはキャリブレーションサンプル、又はキットが使用される。しかしながら、パネル1又はパネル2のバイオマーカーが決定されるなら、このキャリブレーション溶液、又はキャリブレーションサンプル、又はキットを使用することができることも、想定することができる。
【０３２６】
さらなる好ましいキャリブレーション溶液は、実施例の章において記載され、例えば、実施例３を参照のこと。
【０３２７】
上で説明された通り、組成物、キャリブレーション溶液、キャリブレーションサンプル、又はキットは、少なくとも3つのバイオマーカーを含むべきである。少なくとも3つのバイオマーカーが、同じキャリブレーション溶液、又はキャリブレーションサンプルにより含まれる必要がないことは、理解される。故に、多数のキャリブレーション溶液、又はキャリブレーションサンプルを調製することができる。むしろ、それらを、個々のキャリブレーション溶液、又はキャリブレーションサンプルにおいて含むことができる。したがって、3つのバイオマーカー(マーカーA、マーカーB、及びマーカーC)が決定される場合、個々のバイオマーカーを、マーカーA、B、及びCを有する1つのキャリブレーション溶液/サンプル、2つのキャリブレーション溶液/サンプル(1つはA及びBを有し、1つはCを有するか;又は1つはA及びCを有し、1つはBを有するか;1つはA及びCを有し、1つはBを有する)、又は3つのキャリブレーション溶液/サンプルにおいて含むことができる。
【０３２８】
したがって、本発明は、(i)本発明の方法に関連して説明される少なくとも3つのバイオマーカーを含む単一のキャリブレーション溶液、又は(ii)本発明の方法に関連して説明される少なくとも3つのバイオマーカーを含む多数のキャリブレーション溶液を含むキットに関し、好ましくは、多数のキャリブレーション溶液において、それぞれのキャリブレーション溶液が、前記少なくとも3つのバイオマーカーの少なくとも1つを含む。より好ましくは、多数のキャリブレーション溶液におけるキャリブレーション溶液は、同一のバイオマーカーを含まない。好ましい実施形態では、少なくとも3つのバイオマーカーは、パネル1、2、又は200のバイオマーカーであり、SM23は、SM27により置き換えられている。例えば、パネル1に関して、キットは、バイオマーカーOSS2、PC4、及びSM23、又はOSS2、PC4、及びSM27を含む。いくつかのパネルのバイオマーカーに関する好ましい濃度又は比は、上に記載した通りである。加えて、キットは、本発明の内部標準溶液を含んでもよい。好ましくは、内部標準溶液は、ホスファチジルコリンC19:0 C19:0を含む。
【０３２９】
本発明の組成物、キャリブレーション溶液、キャリブレーションサンプル、又はキットの好ましい実施形態では、組成物、キャリブレーション溶液、キャリブレーションサンプル、又はキットは、1つ以上の内部標準化合物をさらに含む。好ましくは、組成物、キャリブレーション溶液、キャリブレーションサンプル、又はキットは、ホスファチジルコリンC19:0 C19:0をさらに含む。本発明の実施形態では、パネル1、2、及び/又は200について、最高濃度のそれぞれのバイオマーカーを有するキャリブレーションサンプルは、OSS2、及びホスファチジルコリンC19:0 C19:0(モル濃度に基づく)を、0.05:1〜2:1の比で含み、好ましい実施形態では、比は、0.1:1〜0.5:1の範囲内である。特にパネル1について、PC4:SM27:OSS2:ホスファチジルコリンC19:0 C19:0の比(モル濃度に基づく)は、約100:7.9:1.1:5.2である。SM27の代わりに、SM23が使用されるなら、同じ比が当てはまる。
【０３３０】
本発明はまた、本明細書において上記された内部標準溶液に関する。好ましくは、内部標準溶液は、少なくとも1つの内部標準化合物を含む。一実施形態では、内部標準化合物は、ホスファチジルコリンC19:0 C19:0である。好ましくは少なくとも1つの内部標準化合物を、適切な溶媒に溶解して、内部標準溶液を一緒に形成する。したがって、内部標準溶液は、適切な溶媒、及び前記少なくとも3つのバイオマーカーを含む前記組成物を好ましくは含む。好ましくは、溶媒は、塩化メチル、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタンの様な、無極性液体溶媒を含むか、又は塩化メチル、ジクロロメタン、クロロホルム、1,2-ジクロロエタンの様な、無極性液体溶媒である。好ましくは、本明細書の他所で記載される抽出溶媒が使用される。なおより好ましくは、溶媒は、ジクロロメタン(DCM)及びメタノールを含む混合物である。一実施形態では、抽出溶媒は、メタノール及びDCMを、特に約2:1の比(好ましくは、体積対体積)で含む。
【０３３１】
本発明の方法は、好ましい実施形態では、その上、ステップ(b)において確立された鑑別の結果にしたがって被験体に推奨するか、及び/又は被験体を管理するステップをさらに含む。そのような推奨は、一態様において、生活環境を改善することを目的にしたライフスタイル、栄養摂取等の適応、本明細書の他所で説明される治療的処置の適用、及び/又は定期的な疾患のモニタリングであってもよい。
【０３３２】
前述の方法の別の好ましい実施形態では、ステップ(b)は、本明細書の他所で説明される評価ユニットにより行われる。
【０３３３】
さらに、本発明はまた、一態様において、本発明の心不全と肺疾患とを被験体において鑑別する方法のステップ(a)及び(b)、並びに被験体が心不全又は肺疾患を有する場合、該被験体を処置するさらなるステップ(c)を含む、心不全を処置する方法に関する。
【０３３４】
上でなされた定義及び説明は、以下で別段の指定がされている場合を除き、適宜変更を加えて本発明の以下の実施形態にも適用される。
【０３３５】
前述の少なくとも１つ又は前記の少なくとも3つのバイオマーカーの決定方法は、デバイスに実装することができる。本明細書で使用されるデバイスは、少なくとも前述の手段を含むべきである。さらに、デバイスは、好ましくは前記少なくとも１つ又は前記少なくとも3つのバイオマーカーの検出された特徴的な特性、及びまた好ましくは決定されたシグナル強度の比較並びに評価の手段を含む。デバイスの手段は、好ましくは、互いに作動可能に結合される。手段を動作するように結合させる方法は、デバイスに含まれる手段のタイプに依存する。例えば、バイオマーカーを自動で定性的又は定量的に決定する手段が適用される場合、そのような自動で動作する手段により得られたデータは、評価を促進するために、例えばコンピュータープログラムにより処理することができる。そのような場合において、手段は、好ましくは単一のデバイスに含まれる。したがって、前記デバイスは、バイオマーカーのための分析ユニット、及び評価のために得られたデータを処理するためのコンピューターユニットを含んでもよい。好ましいデバイスは、専門臨床医の特定の知識なく適用することができるものであり、例えば、サンプルのローディングを単に要求する電子デバイスである。
【０３３６】
あるいは、少なくとも1つのバイオマーカーの決定方法は、好ましくは、互いに作動可能に結合されたいくつかのデバイスを含む、システムに実装することができる。具体的には、手段は、上で詳細に記載された本発明の方法を行うことを可能にするような手法で結合されなければならない。それ故、好ましくは、本明細書で使用される、作動可能に結合されることは、機能的に結合されることを意味する。本発明のシステムのため使用される手段に依存して、前記手段は、それぞれの手段を他と、前記手段間においてデータ輸送を可能にする手段により、結びつけることにより、機能的に結合されてもよい。好ましいシステムは、バイオマーカーを決定するための手段を含む。本明細書で使用されるバイオマーカーを決定する手段は、クロマトグラフィーのデバイスのような、バイオマーカーを分離するための手段、及び質量分析デバイスのような、代謝産物決定のための手段を包含する。適切なデバイスは、上で詳細に記載されている。本発明のシステムで使用される化合物分離のための好ましい手段は、クロマトグラフィーのデバイス、より好ましくは、液体クロマトグラフィー、HPLC、及び/又はガスクロマトグラフィーのためのデバイスを含む。化合物決定のための好ましいデバイスは、質量分析デバイス、より好ましくは、GC-MS、LC-MS、ダイレクトインフュージョン質量分析、FT-ICR-MS、CE-MS、HPLC-MS、四重極質量分析、順次結合質量分析(MS-MS、又はMS-MS-MSを含む)、ICP-MS、Py-MS、又はTOFを含む。分離及び決定手段は、好ましくは、互いに結合される。最も好ましくは、LC-MS、特にHPLC-MS、及び/又はGC-MSは、明細書の他所で詳細に記載される本発明のシステムで使用される。前記少なくとも１つ又は前記少なくとも3つのバイオマーカー(及び場合によりNT-proBNP又はBNP)の決定のための手段から得られた結果を比較する、及び/又は分析するための手段が、さらに含まれる。結果を比較し、及び/又は分析するための手段は、少なくとも1つのデータベース、並びに結果の比較のため実行されるコンピュータープログラムを含んでもよい。前述のシステム及びデバイスの好ましい実施形態はまた、以下で詳細に記載される。
【０３３７】
それ故、本発明は、診断用デバイスであって、以下：
(a)少なくとも1つの検出器により検出される、本発明に関連して本明細書で言及される前記少なくとも１つのバイオマーカー、特に前記少なくとも3つのバイオマーカーのための少なくとも1つの検出器を含む分析ユニット、及びそれと作動可能に結合された、
(b) 前記少なくとも１つのバイオマーカーの決定された量、特に前記少なくとも3つのバイオマーカーの決定された量と参照量との比較を実施するための実体的に組み込まれたコンピュータープログラムコードを含むコンピューターと、前記バイオマーカーについての前記参照量を含むデータベースとを含む評価ユニットであって、それにより、心不全と肺疾患とが鑑別される、評価ユニット
を含む、診断用デバイスに関する。
【０３３８】
あるいは、(b)の下の評価ユニットは、少なくとも3つのバイオマーカーの決定された量に基づきスコアを計算するため、及び計算されたスコアと参照スコアの比較を行うための、実体的に組み込まれたコンピュータープログラムコードを含み、ここで前記評価ユニットは、前記参照スコアを含むデータベースをさらに含み、それにより、心不全と肺疾患とが鑑別される。
【０３３９】
用語「スコア」、及び「参照スコア」は、本明細書の他所で決定される。
【０３４０】
一実施形態では、デバイスは、NT-proBNP及び/又はBNPのための少なくとも1つの検出器を含む、少なくとも1つのさらなる分析ユニットをさらに含み、前記さらなる分析ユニットは、少なくとも1つの検出器により検出されるBNP及び/又はNT-proBNPの量を決定するための適合されている。
【０３４１】
したがって、本発明は、診断用デバイスであって、以下：
(a)本発明に関連して本明細書で言及される少なくとも１つのバイオマーカ、特に少なくとも3つのバイオマーカーのための少なくとも1つの検出器を含む分析ユニットであって、少なくとも1つの検出器により検出される前記バイオマーカーの量を決定するために適合されている、分析ユニット、及び場合によりNT-proBNP及び/又はBNPのための少なくとも1つの検出器を含む少なくとも1つのさらなる分析ユニットであって、NT-proBNP及び/又はBNPのための少なくとも1つの検出器により検出されるBNP及び/又はNT-proBNPの量を決定するために適合されている分析ユニット、及びそれと作動可能に結合されてた、
(b)前記少なくとも１つのバイオマーカ又は前記少なくとも3つのバイオマーカー、及び場合によりBNP若しくはNT-proBNPの決定された量と参照量との比較を行うための実体的に組み込まれたコンピュータープログラムコードを含むコンピューターと、前記バイオマーカーについての前記参照量を含むデータベースとを含む評価ユニットであって、それにより、心不全と肺疾患とが鑑別される、評価ユニット
を含む、診断用デバイスに関する。
【０３４２】
あるいは、(b)の下の評価ユニットは、少なくとも3つのバイオマーカーの決定された量、並びにBNP及び/若しくはNT-proBNPの決定された量に基づきスコアを計算するため、並びに計算されたスコアと参照スコアの比較を行うための、実体的に組み込まれたコンピュータープログラムコードを含むコンピューターを含み、ここで、前記評価ユニットは、前記参照スコアを含むデータベースをさらに含み、それにより、心不全と肺疾患とが鑑別される。
【０３４３】
好ましくは、デバイスは、本発明の方法を行うために適合されている。
【０３４４】
好ましくは、コンピュータープログラムコードは、本明細書の他所で詳細に特定される本発明の方法のステップを実行することができる。したがって、デバイスを、被験体のサンプルに基づき、本明細書において特定される被験体における心不全と肺疾患との鑑別に使用することができる。
【０３４５】
好ましい実施形態では、デバイスは、表１においてそれぞれのバイオマーカーについて示される、制御の種類及び/又は制御値の倍数を含む、さらなるデータベース、並びに決定された、制御の種類及び/又は制御値の倍数と、データベースにより含まれるものとの間での比較を行うための、さらなる実体的に組み込まれたコンピュータープログラムコードを含む。別の好ましい実施形態では、デバイスは、少なくとも3つのバイオマーカーの量に基づき計算されたスコアについて示された、制御の種類及び/又は制御値の倍数を含む、さらなるデータベース、並びに決定された、スコアについての制御の種類及び/又は制御値の倍数と、データベースにより含まれるものとの間での比較を行うための、さらなる実体的に組み込まれたコンピュータープログラムコードを含む。
【０３４６】
一般に、本発明は、心不全と肺疾患とを鑑別するための、又は心不全と肺疾患とを鑑別するための医薬及び/若しくは診断用組成物の調製のための、被験体のサンプルにおける、心不全と肺疾患とを被験体において鑑別する方法に関連して本明細書で言及される少なくとも3つのバイオマーカー及び場合によりBNP若しくはNT-proBNPの使用を想定する。好ましい組合せは、本明細書の他所で開示される。
【０３４７】
一般に、本発明は、被験体において心不全と肺疾患とを鑑別するための、又は被験体における心不全と肺疾患との鑑別のための組成物及び／又は診断組成物の調製のための、被験体の試料中の、表1の第1欄に示されるバイオマーカーから選択される少なくとも1つのバイオマーカー、および場合によりBNPまたはNT-proBNPの使用を想定する。
【０３４８】
本発明はまた、本発明の方法を行うためのキットに関し、前記キットは、心不全と肺疾患とを被験体において鑑別する方法に関連して説明される少なくとも3つのバイオマーカーのバイオマーカーのそれぞれについての検出物質を含む。ある実施形態において、キットは、ナトリウム利尿ペプチド、例えばNT-proBNP又はBNPのための検出物質をさらに含んでもよい。
【０３４９】
用語「キット」は、本明細書で使用される場合、好ましくは、別々に、又は単一の容器内で提供される、前述の化合物の集合物を指す。検出物質は、「すぐに使える」液体形態で、又は乾燥形態で、本発明のキットにおいて提供されてもよい。キットは、対照、バッファー、及び/又は試薬をさらに含んでもよい。キットはまた、本発明の方法を行うための指示書、並びに参照値についての情報をさらに含む。これらの指示書は、マニュアルの形態であってもよいか、又は電気的にアクセス可能な情報であってもよい。後者の情報は、光学記憶媒体(例えば、コンパクトディスク)のようなデータ記憶媒体若しくはデバイス上で、又はコンピューター若しくはデータ処理デバイス上で直接的に提供されてもよい。
【０３５０】
バイオマーカーの適切な検出物質は、本明細書の他所で詳細に特定されている。例えば、検出物質は、抗体若しくはアプタマー、又はバイオマーカーに特異的に結合する能力がある他の分子であってもよい。
【０３５１】
本発明のキットは、好ましくは、本発明の方法を行うため、すなわち、本明細書の他所で詳細に特定される心不全と肺疾患とを被験体において区別するために、使用することができる。
【０３５２】
本明細書において上で与えられた定義並びに説明はまた、以下の方法、及び使用に当てはまる。
【０３５３】
さらに、本発明は、被験体において心不全と肺疾患とを鑑別する方法であって、
(a)被験体のサンプルにおいて、ホスファチジルコリン(C18:1 C18.1)、SM(d18:1/18:1)、SM(d18:2/17:0)、OSS2、PPO1、PPP、SOP2、SPP1、SSP2、及びSSSからなる群から選択される少なくとも1つのバイオマーカーの量を決定するステップ、及び
(b)ステップ(a)において決定された前記バイオマーカーの量を参照と比較するステップであって、それにより心不全と肺疾患とが鑑別される、ステップ
を含む、方法に関する。
【０３５４】
さらに、本発明は、心不全と肺疾患との鑑別のための、被験体のサンプルにおける、ホスファチジルコリン(C18:1 C18.1)、SM(d18:1/18:1)、SM(d18:2/17:0)、OSS2、PPO1、PPP、SOP2、SPP1、SSP2、及びSSSからなる群から選択される少なくとも1つのバイオマーカーの使用に関する。
【０３５５】
本発明の実施形態/項目
パネル1についての項目
好ましい実施形態においては、パネル1におけるバイオマーカーの量が決定される。診断される心不全を、NYHAクラスI又はIIとして分類することができる。好ましくは、決定は、HFrEFの診断のため、特に、50%より低いが、35%よりは大きい左心室駆出率を有するHFrEFの診断のために実行される。さらに、被験体は心不全の症状を示さないことが想定される。
【０３５６】
さらに、少なくとも3つのバイオマーカーに加えて、NT-proBNPの量を決定することが想定される。好ましくは、交絡因子(特に、年齢、BMI及び性別)についての補正は実行されない。
【０３５７】
パネル1に関して、以下の項目が好ましい。上記の明細書に与えられた定義及び説明は、好ましくは、本発明の以下の好ましい項目に変更すべきところは変更して適用される。
1. 心不全と肺疾患とを被験体において鑑別するための方法であって、以下のステップ：
a. 被験体のサンプルにおいて、SM23、OSS2及びPC4の量を決定するステップ、及び
b. ステップa.において決定された量を参照と比較するステップであって、それによって心不全と肺疾患とが被験体において鑑別される、ステップ
を含む、方法。
【０３５８】
2. 被験体が心不全又は肺疾患に罹患すると疑われる、項目1に記載の方法。
【０３５９】
3. 被験体が息切れに罹患する、項目1及び2に記載の方法。
【０３６０】
4. 被験体がヒト被験体である、項目1〜3のいずれか1つに記載の方法。
【０３６１】
5. サンプルが血液、血清又は血漿である、項目1〜4のいずれか1つに記載の方法。
【０３６２】
6. NT-proBNP又はBNPの決定を含まない、項目1〜5のいずれか1つに記載の方法。
【０３６３】
7. サンプル/被験体に由来するサンプル中のNT-proBNP又はBNPの量を決定するステップと、NT-proBNP又はBNPの量を参照と比較するステップとをさらに含む、項目1〜6のいずれか1つに記載の方法。
【０３６４】
8. 交絡因子についての補正を実行するステップをさらに含む、項目1〜7のいずれか1つに記載の方法。
【０３６５】
9. 交絡因子が年齢、BMI及び/又は性別、特に、年齢、BMI及び性別である、項目8に記載の方法。
【０３６６】
10. 交絡因子についての補正が実行されない、項目1〜9のいずれか1つに記載の方法。
【０３６７】
11. 交絡因子である年齢、BMI及び性別についての補正が実行されない、項目10に記載の方法。
【０３６８】
12. ステップb)において、スコアが少なくとも3つのバイオマーカーの決定された量に基づいて計算され、参照が参照スコアであり、スコアが参照スコアと比較される、項目1〜11のいずれか1つに記載の方法。
【０３６９】
13. 参照又は参照スコアが、肺疾患に罹患していることが知られている被験体又は被験体の群に由来する、項目1〜12のいずれか1つに記載の方法。
【０３７０】
14. 試験サンプル中の少なくとも3つのバイオマーカーのそれぞれについての値、又はスコアが、参照又は参照スコアと比較して本質的に同一であることが、肺疾患の存在を示す、項目12に記載の方法。
【０３７１】
15. 参照又は参照スコアが、心不全に罹患していることが知られている被験体又は被験体の群に由来する、項目1〜12のいずれか1つに記載の方法。
【０３７２】
16. 試験サンプル中の見い出された少なくとも3つのバイオマーカーのそれぞれについての値、又はスコアが、参照又は参照スコアと比較して本質的に同一であることが、心不全の存在を示す、項目15のいずれか1つに記載の方法。
【０３７３】
17. 少なくとも3つのバイオマーカーの量が、質量分析(MS)によって決定される、項目1〜16のいずれか1つに記載の方法。
【０３７４】
18. 質量分析がLC-MS、特にLC-MS/MS、又はHPLC-MS、特にHPLC-MS/MSである、項目17に記載の方法。
【０３７５】
19. 質量分析が、少なくとも3つのバイオマーカーがイオン化されるイオン化ステップを含む、項目17及び18に記載の方法。
【０３７６】
20. イオン化ステップが、エレクトロスプレーイオン化によって、特に陽イオンモードエレクトロスプレーイオン化によって実行される、項目19に記載の方法。
【０３７７】
21. OSS2がTAG(C18:1, C18:0, C18:0)である、項目1〜20に記載の方法。
【０３７８】
22. 項目1〜21に記載の方法(ホスファチジルコリン(C16:0 C18:2))。
【０３７９】
23. SM23がスフィンゴミエリン(d18:1/23:1)、ii)スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)、iii)スフィンゴミエリン(d17:1/24:1)、又はiv)スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)、スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)及びスフィンゴミエリン(d17:1/24:1)の組み合わせである、項目1〜22のいずれか1つに記載の方法。
【０３８０】
24. SM23の量が、i)スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)の量、スフィンゴミエリン(d17:1/24:1)の量、又は特に、スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)、スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)、及びスフィンゴミエリン(d17:1/24:1)の組み合わせた量、の量を決定することによって決定される、項目23に記載の方法。
【０３８１】
25. SM23の量が、スフィンゴミエリン(d18:1/23:1)、スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)、及びスフィンゴミエリン(d17:1/24:1)の組み合わせた量を決定することによって決定される、項目1〜24のいずれか1つに記載の方法。
【０３８２】
26. 項目1〜25のいずれか1つに記載の方法を実行するための診断用デバイスであって、以下:
a)バイオマーカーSM23、OSS2及びPC4についての少なくとも1つの検出器を含む分析ユニットであって、前記分析ユニットが、少なくとも1つの検出器によって検出される前記バイオマーカーの量を決定するために適合されている、分析ユニット、及びそれと作動可能に結合された、
b)バイオマーカーの決定された量と参照量との比較を実行するための実体的に組み込まれたコンピュータープログラムコードを含むコンピューターと、前記バイオマーカーについての前記参照量を含むデータベースとを含む評価ユニットであって、それにより、肺疾患と心不全とが鑑別される、評価ユニット
を含む、診断用デバイス。
【０３８３】
27. 被験体における心不全と肺疾患とを鑑別するため、又は被験体における心不全と肺疾患とを鑑別するための医薬組成物及び/若しくは診断用組成物の調製のための被験体のサンプルにおけるSM23、OSS2及びPC4の使用。
【図面の簡単な説明】
【０３８４】
【図１】NT-proBNPのみと比較した、パネル1 + NT-proBNPを用いて単一患者レベルで計算された、試験セットに由来する131人のHFrEF患者(十字)及び肺疾患を有する34人の患者(丸)に関する予測確率である。
【０３８５】
(実施例)
以下の実施例は、本発明を例示する。しかし、それらは、本発明の範囲を限定するものと解釈されない。
【実施例１】
【０３８６】
心不全と肺疾患との鑑別のためのバイオマーカー及びバイオマーカーパネル
心不全と肺疾患との鑑別のためのバイオマーカーを、表1に示す。表1に由来するバイオマーカーの組合せを表す、心不全と肺疾患との鑑別のためのバイオマーカーパネルを、表2及び表2Aに示す。表1はまた、心不全患者を健康な対照に対して比較した場合のバイオマーカーの変化の方向も列挙する。変化の方向を、ANOVAモデルlog10(バイオマーカー)〜群 + 施設 + (性別 + 年齢 + BMI)2(ここで、「バイオマーカー」は、対応する内部標準のピーク面積で除算したバイオマーカーのピーク面積であり(実施例3を参照されたい)、群は、特定のサンプルが属する試験群(心不全患者又は健康な対照)であり、施設は、サンプルが採取された臨床施設(Berlin、Kiel、又はHeidelberg)であり、性別、年齢及びBMIは、それぞれ、サンプルが採取された被験体の性別、年齢及びBMIである)を用いるANOVAによって、各バイオマーカーについて計算した。
【０３８７】
表1に由来するバイオマーカーについて、肺疾患を有する被験体に対する、HFrEF患者における変化の方向を、ANOVAモデルlog10(バイオマーカー)〜群 + 施設 + (性別 + 年齢 + BMI)2(ここで、「バイオマーカー」は、μg/dlで与えられるバイオマーカーの絶対濃度であり (以下の実施例3を参照されたい)、「群」は、特定のサンプルが属する試験群(HFrEF患者又は肺疾患を有する患者)であり、「施設」は、サンプルが採取された臨床施設(Berlin、Kiel、又はHeidelberg)であり、性別、年齢及びBMIは、それぞれ、サンプルが採取された被験体の性別、年齢及びBMIである)を用いるANOVAによって計算した。
【０３８８】
HFと肺疾患との鑑別のための表1に由来するバイオマーカーの特定の組合せを表すバイオマーカーパネルを、表2及び表2Aに示す。表1に最終列は、肺疾患を有する患者と比較した、心不全患者における個々のバイオマーカーの量の比較を示す。
【０３８９】
【表１】
2019509476.tif 000006
【０３９０】
【表２】
2019509476.tif 000007
2019509476.tif 000008
2019509476.tif 000009
2019509476.tif 000010
2019509476.tif 000011
【実施例２】
【０３９１】
試験設計 - 選択基準及び得られる患者コホート
心不全患者のための一般的選択基準:
一般的な試験対象患者基準は、文書によるインフォームドコンセント、35〜75歳の年齢、20〜35kg/m2のBMI、安定体重(±2.0kg)及び試験対象となる前の少なくとも4週間にわたる医薬(心臓薬、血圧薬、糖尿病薬、脂質薬、精神薬理薬及び甲状腺薬に関する)であった。一般的な除外基準は、NYHA機能クラスIV、6ヶ月を超える(例外的な事例では、12ヶ月未満)イメージング(心エコー又はMRI)、サンプリング時点での貧血(Hb<10g/dl)、7日以内のICDショック、妊娠、最近4ヶ月以内の脳卒中又は心筋梗塞、最近1ヶ月以内の外科手術又は薬物療法の任意の改変、既知の慢性又は急性炎症疾患(例えば、身体検査及び病歴によって示される、B又はC型肝炎、HIVなど)、腎機能低下、制御されていない糖尿病(HbA1c>8%)、自己免疫疾患(例えば、1型糖尿病)、最近5年以内の悪性腫瘍(皮膚基底細胞腫を除く)及び関連する有機機能障害(HFを除く)であった。
【０３９２】
心不全患者のための特定の選択基準:
虚血性心筋症(ICMP)を、心エコー又はMRIから誘導される50%以下の左心室(LV)駆出率(EF)低下並びに領域的又は全体的な壁運動異常のイメージングによる証拠をもたらす、血管造影により確認される冠動脈疾患(CAD; 少なくとも1つの冠動脈の50%を超える内腔閉塞)の病歴と定義した。冠動脈造影を用いない稀な症例(n=3)では、心臓磁気共鳴イメージング(cMRI)及び/又はCT-血管造影による虚血源の代替的なイメージングによる証拠を、試験対象患者基準として許容した。拡張型心筋症(DCMP)を、心エコー又はMRI上での50%以下のLVEFを有するLV機能の低下と定義した。除外基準は、領域的又は全体的な壁運動異常のイメージングによる証拠をもたらす、血管造影により確認される冠動脈疾患(CAD; 少なくとも1つの冠動脈の50%を超える内腔閉塞)の病歴と定義した。冠動脈造影（n=5)または冠動脈造影の失敗(n=9)においてCADの証拠を有する稀な症例では、心筋生検および/またはLV機能低下の程度がCAD若しくは虚血源によって説明されないイメージングに由来する証拠があった場合、患者をDCMPと分類した。
【０３９３】
肥大型心筋症(HCMP)を、拡張期心不全(50%以上のLVEFを有するポンプ機能の低下なし、又は軽度な低下)を有し、心中隔厚さ>18mmを有さない、同心性心肥大(心エコー:心中隔>12mm及び後部心筋壁>11mm)と定義した。
【０３９４】
健康な対照群のための選択基準:
正常な対照被験体のための除外基準は、35歳未満の年齢又は75歳を超える年齢、任意の慢性疾患又は急性疾患、規則的な医薬の摂取、能動的喫煙、慢性薬物又はアルコール乱用(病歴又は臨床的証拠による)であった。全対照は、正常な身体検査、正常な休止12誘導心電図を有し、連続測定における高血圧値を有さなかった。心エコー又は心臓MRI(cMRI)は、LV肥大(正常: 隔壁厚さ<11mm、後壁厚さ<11mm)、LV拡張(正常、55mm以下)、LV収縮機能障害(正常: 55%以上のLVEF)、心臓弁膜症、又はストレス心エコー若しくはcMRI上でのストレス誘導性LV壁運動異常若しくは血流欠損の非存在を示した。
【０３９５】
肺疾患を有する患者のための選択基準:
試験対照患者基準は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺線維症又は喘息(0.70未満のFEV1/FVC; 30%以上のFEV1)を含む肺起源に起因する呼吸困難であった。また、患者は、55%以上のLVEFを確認するために心エコー検査を受ける必要があった。除外基準は、COPD GOLDステージIV(0.70未満のFEV1/FVC；30%未満のFEV1)又は慢性呼吸不全、嚢胞性線維症、急性増悪及び肺高血圧であった。
【０３９６】
心不全患者コホート:
上記基準から得られた心不全患者コホートは、190人の男性及び女性のDCMP患者、181人の男性及び女性のICMP患者、並びに208人の男性及び女性のHCMP患者並びに244人の健康な対照を含む、823人の被験体を含んでいた。
【０３９７】
この心不全患者コホートから、534人の無作為に選択された被験体(サブグループによって階層化)を、統計分析のための訓練セットとして取り、残りの289人の被験体を、試験セットとして取った。訓練セット中の534人の無作為に選択された被験体のうち、123人はDCMP患者であり、117人はICMP患者であり、134人はHCMP患者であり、160人は健康な対照であった。試験セット中の289人の被験体のうち、67人はDCMP患者であり、64人はICMP患者であり、74人はHCMP患者であり、84人は健康な対照であった。
【０３９８】
肺疾患患者コホート:
それぞれの肺疾患コホートは、34人の被験体を含んでいた。
【実施例３】
【０３９９】
分析プロトコール
心不全患者由来サンプルを、半定量的に分析した。すなわち、バイオマーカーの量を、同じサンプル中のそれぞれの内部標準のピーク面積により除算した、各バイオマーカーのピーク面積として取得した。PC 5-40をSM23、CE C18:2、及びOSS2のための内部標準として使用したが、PC 5-70をPC4のための内部標準として使用した。PC 5-40とPC 5-70は両方とも、同じ化学物質(ホスファチジルコリン[PC]C19:0/C19:0)を指すが、データ獲得のために使用したMRM設定において異なる(表4)。心不全患者由来サンプルの分析は、以下に記載される、「サンプル抽出及びHPLC-MS/MSシステム」、「液体クロマトグラフィー」及び「多重反応モニタリング(MRM)を使用する質量分析」のステップを含んでいた。
【０４００】
肺疾患を有する患者に由来するサンプルを、定量的に分析した。すなわち、バイオマーカーの量を、絶対濃度として取得し、単位μg/dlで報告した。絶対定量化を、既知量のSM27(Avanti Polar Lipids, CA, U.S.A.から購入した、SM23の定量化のための、スフィンゴミエリンd18:1/24:1)、PC4、CE C18:2、及びOSS2を含有するキャリブレーションサンプルを使用して達成した。肺疾患を有する患者に由来する各サンプル中のそれぞれの内部標準のピーク面積に対する各バイオマーカーのピーク面積の比と、キャリブレーションサンプル中のそれぞれの内部標準のピーク面積に対する各バイオマーカーのピーク面積の比とを比較することにより、絶対濃度を算出した。PC 5-40をSM23、CE C18:2、及びOSS2のための内部標準として使用したが、PC 5-70をPC4のための内部標準として使用した。PC 5-40とPC 5-70は両方とも、同じ化学物質(ホスファチジルコリン[PC]C19:0/C19:0)を指すが、データ獲得のために使用したMRM設定において異なる(表4)。肺疾患を有する患者由来サンプルの分析は、以下に記載される、「サンプル抽出及びHPLC-MS/MSシステム」、「キャリブレーションサンプルの調製」、「液体クロマトグラフィー」及び「多重反応モニタリング(MRM)を使用する質量分析」のステップを含んでいた。
【０４０１】
サンプル抽出及びHPLC-MS/MSシステム:
10μlの血漿を、2mlのセーフロック微小遠心チューブ(Eppendorf、Germany)中で、メタノール/ジクロロメタン(2：1、v/vの比)を含有する1500μlの抽出溶媒及び10μlの内部標準混合物と混合した。内部標準溶液は、抽出溶媒中の、41.28μg/mlのホスファチジルコリン(PC)C19:0 C19:0(Avanti Polar Lipids、CA、U.S.A.)を含有していた。超純水(Milli-Q水系、Millipore)及び分析グレードの化学物質を抽出、希釈のために、又はLC溶媒として使用した。品質管理及び参照サンプルを市販のヒト血漿(RECIPE Chemicals + Instruments GmbH)から調製した。キャリブレータ及びブランクの調製には脱脂血漿(血漿、ヒト、脱繊維化、脱脂、2Xチャコール処理、高純度; USBio)を使用した。20℃で5分間完全に混合した後、沈殿したタンパク質を10分間の遠心分離により除去した。液体上清のアリコートを適切なガラスバイアルに移し、LC-MS/MSによる分析まで-20℃で保存した。ABSciex(商標)API4000トリプル四重極質量分析計(ABSCIEX、Toronto、Canada；この方法は、例えば、ABSciex(商標)3200MDベンチトップ型LC-MS/MSシステムと適合するよう意図される)に連結されたAgilent 1100 LCシステム(Agilent Technologies、Waldbronn、Germany)からなるHPLC-MS/MSシステム中に、最大で5μLの粗抽出物を注入した。
【０４０２】
キャリブレーションサンプルの調製:
SM23、PC4、CE C18:2及びOSS2の絶対定量のための検量線を作成するために、MeOH/CH2Cl2(2/1、v/v)中で、既知の量のSM27(SM23の定量のため)、PC4、CE C18:2及びOSS2を含む7つのキャリブレーション溶液(STD1、STD2、STD3、STD4、STD5、STD6、STD7)を調製した(表5)。キャリブレーションサンプル/キャリブレーションサンプル調製のためのキャリブレーション溶液内の化合物の濃度比(CE C18:2に対する)を、表5aに与える。これらのキャリブレーション溶液のそれぞれから、50μlを、10μlの脱脂血漿(市販のもの)と750μlのMeOH/CH2Cl2(2/1)との混合物に添加した。10μlの内部標準を、上記のように添加し、さらに700μlのMeOH/CH2Cl2(2/1)を添加して、1520μlの最終キャリブレーションサンプル容量を達成した。次いで、得られた7つのキャリブレーションサンプルを、バイオマーカー決定のための実際の血漿サンプルと同じ方法で処理した。
【０４０３】
液体クロマトグラフィー:
溶媒B(tert-ブチルメチルエーテル、2-プロパノール、メタノール、ギ酸、400:200:100:1、w/w/w)に対する溶媒A(メタノール、水、ギ酸、400:400:1、w/w/w)の勾配を使用する、C18固定相(Ascentis(登録商標)Express C18カラム(5cm x 2.1mm、2.7μm、Phenomenex、Germany)を含む市販の逆相分離カラム上、55℃でHPLC分析を実施した。溶媒C(メタノール、水中の0.1Mギ酸アンモニウム溶液、20:3、w/w)を、トリグリセリドの溶出時間中にポストカラムに添加した。勾配の詳細を、表3に与える。
【０４０４】
【表３】
2019509476.tif 000012
【０４０５】
多重反応モニタリング(MRM)を使用する質量分析:
供給源パラメーターは、ネブライザーガス、50；ヒーターガス、60；カーテンガス、25；CADガス、4；イオンスプレー電圧、5500V；温度、400℃；質量範囲間の休止、5ms；解像度Q1及びQ3、単位であった。MRMパラメーター、保持時間、及び各メタボロミックバイオマーカー中に含有される分子種を、表4に列挙する。心不全患者由来サンプルのため、及び肺疾患を有する患者に由来するサンプルのために、異なるMRM設定を使用した(表4中の星印で示される)。
【０４０６】
【表４】
2019509476.tif 000013
【０４０７】
【表５】
2019509476.tif 000014
【実施例４】
【０４０８】
統計
以下に記載されるステップを使用して、試験セットに由来する67人のDCMP患者及び64人のICMP患者(合わせて試験セットに由来するHFrEF患者と呼ばれる)に関して、並びに肺疾患を有する34人の患者に関して、パネル1 + NT-proBNPを用いて予測確率を計算した。NT-proBNPのさらなる含有を用いて、又は用いずに、表2及び表2Aに列挙されたパネルのいずれかを使用して、同等の計算を実施することができる。
【０４０９】
予測確率の計算:
各サンプルに関する予測確率を、
【数３】
2019509476.tif 000015
(式中、特性
【数４】
2019509476.tif 000016
は、
【数５】
2019509476.tif 000017
である。xiは、表6及び表6aに列挙される単位を考慮に入れた対数変換された分析結果であり、mi及びsiは、特性に特異的なスケーリング因子であり、wiは、モデルの係数である[表6及び表6a; w0、切片；w1、NT-proBNPについての係数；w2・・・wn、メタボロミック特性についての係数；n、パネル + NT-proBNP中の特性の総数])である)
として計算した。
【０４１０】
特性に特異的なスケーリング因子mi及びsi:
心不全患者及び健康な対照に由来するサンプルについて使用された特性に特異的なスケーリング因子mi及びsi(表6)を、823人全員の被験体の対数変換され、スケーリングされたピーク面積が、0の平均値及び1の標準偏差を有するように選択した。肺疾患を有する患者に由来するサンプルについて使用された特性に特異的なスケーリング因子mi及びsi(表6A)を、よく混合され、十分な数のアリコートに分割された、市販のヒト血漿からなるウルトラプールサンプルを含む追加のステップを用いて、心不全患者及び健康な対照に由来するサンプルから決定した。ウルトラプールサンプルのアリコートを、分析のそれぞれの日に心不全患者及び健康な対照に由来するサンプルと共に含有させた。このように、ウルトラプールサンプルのアリコート中の各バイオマーカーに関するピーク面積比を取得した。さらに、ウルトラプールサンプルのさらなるアリコート中の各バイオマーカーの絶対濃度を、肺疾患を有する患者に由来するサンプルについて記載されたものと同様の方法で、既知量のSM27(SM23の定量のため)、PC4、及びOSS2を含有するキャリブレーションサンプルを使用して取得した。心不全患者又は健康な対照に由来する各サンプル中のSM23、PC4、及びOSS2のピーク面積比を、前記患者サンプルと同じ分析日に測定されたウルトラプールサンプルのアリコート中のそれぞれのピーク面積比の中央値で除算した後、ウルトラプールサンプル中の、それぞれ、SM23、PC4、及びOSS2の既知の濃度で乗算することによって、心不全患者及び健康な対照に由来するサンプル中のSM23、PC4、及びOSS2の絶対濃度を計算した。次いで、肺疾患を有する患者に由来するサンプルについて使用された特性に特異的なスケーリング因子mi及びsiを、823人全員の心不全患者及び健康な対照の対数変換され、スケーリングされた絶対濃度が、0の平均値及び1の標準偏差を有するように選択した。
【０４１１】
係数wi:
上記のように、534人の無作為に選択された心不全患者及び健康な対照(サブグループによって階層化される)を、統計分析のために訓練セットとして取り、残りの289人の心不全患者及び健康な対照を、試験セットとして取った。係数wiを、Rパッケージglmnet(Zou, H. and Hastie, T., 2003: Regression shrinkage and selection via the elastic net, with applications to microarrays. Journal of the Royal Statistical Society: Series B, 67, 301-320; Friedman, J., Hastie, T., and Tibshirani, R, 2010: Regularization Paths for Generalized Linear Models via Coordinate Descent. J. Stat. Softw. 33)中に実装されたエラスティックネットアルゴリズムを用いて訓練セットに由来する534人の心不全患者及び健康な対照上でフィッティングした。L1及びL2ペナルティは、等しい重みを与えられた。
【０４１２】
カットオフ値:
パネル1 + NT-proBNPを使用して、それぞれのサンプルについて、0.738のカットオフ値よりも大きい予測確率を、診断陽性として取り、このカットオフ値よりも小さいか、又は等しい予測確率を、診断陰性として取った。0.738のカットオフ値は、NT-proBNPのみを用いた場合と同じ、訓練セット中の534人の心不全患者及び健康な対照における心不全の検出のための感度を得るために選択された。NT-proBNPのみのために、125pg/mlのカットオフ値を用いた。
【０４１３】
曲線下面積(AUC):
パネル1 + NT-proBNP並びにNT-proBNPのみに関する診断性能の尺度として、曲線下面積(AUC)を計算した。試験セットに由来する131人のHFrEF患者と、肺疾患を有する34人の患者とを比較する受信者操作特性(ROC)曲線から、AUCを決定した。曲線下面積を比較するための従法線モデルに基づいて、近似されたROC曲線を計算した(Zhou X-H, McClish DK, Obuchowski NA. Statistical methods in diagnostic medicine: John Wiley & Sons; 2009)。従法線を達成するために、ロジット関数を用いて予測確率を変換し、NT-proBNP値を対数変換した。
【０４１４】
【表６】
2019509476.tif 000018
【実施例５】
【０４１５】
パネル1 + NT-proBNPを用いたHFrEF患者と肺疾患を有する患者の鑑別
HFrEF患者と肺疾患を有する患者の鑑別のためのパネル1 + NT-proBNPの性能を評価するために、試験セットに由来するHFrEFを有する患者の131のサンプル及び肺疾患を有する患者の34のサンプル(肺起源の呼吸困難及び実施例2に記載された基準による収縮期及び拡張期LV機能障害の非存在)を、比較のために選択した。
【０４１６】
0.738のカットオフ値を有するパネル1 + NT-proBNPを用いて、肺疾患を有する患者における心不全の非存在を正確に診断するための特異性は、肺疾患を有する34人の患者のうちの5人の分類の改善のため(HF陰性として)、NT-proBNPのみと比較して73.5%から88.2%に増加した。それぞれの患者分類を、表7及び図1に示す。
ROC曲線のAUCは、パネル1 + NT-proBNPについては0.887であり、NT-proBNPのみについては0.873であった。
【０４１７】
【表７】
2019509476.tif 000019
【実施例６】
【０４１８】
パネル1〜206 + NT-proBNPを用いた、HFrEF患者と肺疾患を有する患者との鑑別
HFrEF患者と肺疾患を有する患者との鑑別のためのパネル1〜206 + NT-proBNPの性能を評価するために、HFrEFを有する患者の367のサンプル及び健康な対照(呼吸困難を除く)に由来する239のサンプルを、訓練セットとして用いた。
【０４１９】
次いで、得られた関連する重み及びスケーリング因子を有するパネル1-206を、肺疾患(肺起源の呼吸困難及び実施例2に記載された基準による収縮期及び拡張期LV機能障害の非存在)を有する患者の34のサンプルの分類に適用した。結果を、表8に示す。
【０４２０】
HFrEF及び健康な対照の分離のための6つの異なるカットオフを、以下の考慮に基づいて各パネルについて計算した(表8を参照されたい):
・Youden: Youden指数に基づくカットオフ
・optim.group sep.: 最適グループ分離のためのカットオフ
・Sensitivity fix 0.85: パネルが85%の感度に達するように選択されたカットオフ
・Sensitivity NT 0.8: パネルが125pg/mLのNT-proBNPカットオフでNT-proBNPと同じ感度、すなわち、80%に達するように選択されたカットオフ
・Specificity fix 0.9: パネルが90%の特異度に達するように選択されたカットオフ
・Specificity NT 0.85: パネルが125pg/mLのNT-proBNPカットオフでNT-proBNPと同じ特異度、すなわち、90%に達するように選択されたカットオフ。
【０４２１】
試験したカットオフの少なくとも1つを有する呼吸困難患者を分類した場合、全てのパネルが、67%より高い特異度に達した。トップ性能のパネルは90%を超える特異度に達した。
【０４２２】
【表８】
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表13に対するあらゆる言及は存在しないものとして考慮されるべきである。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年1月30日(2018.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において心不全と肺疾患とを鑑別するための方法であって、
a)  被験体の血液、血清又は血漿サンプルにおいて、少なくともOSS2、PC4及びSM23の３つのバイオマーカー量、及びNT-proBNP又はBNPの量を決定するステップ、及び
b1)ステップa)の決定された前記3つのバイオマーカーの量及びNT-proBNP又はBNPの量に基づくスコアを計算し、かくして計算されたスコアと参照スコアとを比較し、それにより心不全と肺疾患とが被験体において鑑別されることとなるステップ、又は
b2) 決定された前記3つのバイオマーカーの量に基づきスコアを計算し、かくして計算されたスコアと参照スコアとを比較すること、及び、NT-proBNP又はBNPの量を参照と比較すること、それにより心不全と肺疾患とが被験体において鑑別されることとなるステップ、
を含み、
ここでSM23はスフィンゴミエリン(d18:1/23:1), ii) スフィンゴミエリン(d18:2/23:0), iii) スフィンゴミエリン(d17:1/24:1)、又はiv)スフィンゴミエリン(d18:1/23:1), スフィンゴミエリン(d18:2/23:0)及びスフィンゴミエリン(d17:1/24:1)の組み合わせであり、OSS2はTAG(C18:1, C18:0, C18:0)であり、PC4はホスファチジルコリン(C16:0 C18:2)である、
前記方法。
【請求項２】
被験体が肺疾患又は心不全に罹患すると疑われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験体が息切れ(呼吸困難)に罹患している、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
息切れが急性の息切れである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
息切れが慢性の息切れである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
被験体がヒト被験体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
すくなくとも3つのバイオマーカーの量が質量分析(MS)によって決定される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
息切れの原因として心不全と肺疾患とが鑑別される、請求項３〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法を実行するための診断用デバイスであって、
a)請求項１に記載の少なくとも3つのバイオマーカーについての少なくとも1つの検出器を含む分析ユニットであって、前記分析ユニットが、少なくとも1つの検出器によって検出される前記バイオマーカーの量を決定するために適合されている、分析ユニット、及びそれと作動可能に結合された、
b)少なくとも3つのバイオマーカーの決定された量と参照量との比較を実行するための実体的に組み込まれたコンピュータープログラムコードを含むコンピューターと、前記バイオマーカーについての前記参照量を含むデータベースとを含む評価ユニットであって、それにより、肺疾患と心不全とが鑑別される、評価ユニット
を含む、診断用デバイス。
【請求項１０】
被験体における心不全と肺疾患とを鑑別するための、被験体の血液、血清又は血漿サンプルにおける、i) 請求項１に記載の少なくとも3つのバイオマーカーの、及びii) NT-proBNP又はBNPの使用。
【請求項１１】
被験体における心不全と肺疾患とを鑑別するための医薬組成物及び/若しくは診断用組成物の調製のため被験体の血液、血清又は血漿サンプルにおける、i) 請求項１に記載の少なくとも3つのバイオマーカーの、及びii) NT-proBNP又はBNPの使用。
【国際調査報告】
2019509476.tif 000033
2019509476.tif 000034