(57)【要約】  本発明は、サンプリング時に、関節リウマチ、ＡＡＶ、又はシェーグレン症候群を有していない個体が、前述の疾患を発症する危険性があるか否かを判定する手段及び方法を提供する。当該方法は、個体の抗体含有サンプルが、Ｆａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含む前記疾患に関連する自己抗体を含むか否かを判定することを備える。当該方法は、さらに、前記個体が前記疾患を発症する危険性を判定することを含む。前記疾患は、好ましくは、関節リウマチである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプリング時に、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又は抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）を有しない個体が前述の疾患を発症する危険性があるか否かを判定する方法であって、前記方法は、前記個体の抗体含有サンプルが前記疾患に関連する自己抗体を含むか否かを判定すること、及び、前記抗体が当該抗体のＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含むか否かを判定することを備え、前記方法は、前述の判定に基づき前記個体が前記疾患を発症する危険性を判定することをさらに備える、方法。
【請求項２】
個体の抗体含有サンプルを分析する方法であって、前記方法は、前記サンプルが、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶに関連する自己抗体であって、当該抗体のＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含む自己抗体を含むか否かを判定することを備え、前記方法は、前記サンプルが、サンプリング時に、関節リウマチの症状、シェーグレン症候群の症状、又はＡＡＶの症状を有しない個体のサンプルであることを特徴とする、方法。
【請求項３】
個体での、関節リウマチの症状、シェーグレン症候群の症状、又はＡＡＶの症状の発症を予防又は遅延する方法であって、
前記方法は、
前記個体のサンプルが、前述の疾患に関連する自己抗体を含有するか否かを判定すること、及び、
前記抗体が、Ｎ結合型グリコシル化Ｆａｂ部分を有するか否かを判定すること、
を備え、
前記サンプルは、前記個体の抗体含有サンプルであり、前記個体は、サンプリング時に、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶを有さず、及び、
前記方法は、
前記個体が前記疾患を示し始める前又は示し始めた時に、前記疾患用の薬剤で前記個体を治療すること、
を備える、方法。
【請求項４】
関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶを発症する危険性のある個体を監視する方法であって、前記方法は、個体の定期的抗体含有サンプルにおいて前述の疾患に関連する自己抗体の存在及び／又は発現を監視することを備え、前記方法は、前記疾患に関連する検出自己抗体が当該抗体のＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型糖鎖を含むか否かを判定することをさらに含むことを特徴とする、方法。
【請求項５】
関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶ薬剤であって、前述の疾患の１つ以上の発症の危険性のある個体の治療方法に使用するためのものであり、前記個体は、当該個体の抗体含有サンプルにおける、Ｆａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含んでいる前記疾患に関連する自己抗体の検出により、危険性を判定される、薬剤。
【請求項６】
前記個体は、当該個体が関節炎症状を示し始める前又は示し初めた時に治療される、請求項５に記載の薬剤。
【請求項７】
Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を含む抗体の測定のための抗体を精製する方法であって、
抗体サンプルを準備すること、
修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む固体表面に前記サンプルを接触させること、
未結合抗体を除去し、結合抗体を前記固体表面から溶出させること、
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子を含む固体表面とともに溶出抗体をインキュベートすること、
未結合分子を除去すること、及び、
結合抗体が前記サンプルにおける抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖の存在を示す、抗体が前記固体表面に結合したか否かを判定すること、
を備える、方法。
【請求項８】
Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する抗体の測定のための抗体を精製する方法であって、
抗体サンプルを準備すること、
修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む固体表面に前記サンプルを接触させること、
未結合抗体を除去すること、
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子とともに固体表面をインキュベートすること、
未結合分子を除去すること、及び、
結合分子が前記サンプルにおける抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖の存在を示す、分子が前記固体表面に結合したか否かを判定すること、
を備える、方法。
【請求項９】
Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する抗体の測定のための抗体を精製する方法であって、
抗体サンプルを準備すること、
修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む固体表面に前記サンプルを接触させること、
未結合抗体を除去すること、
前記抗体から糖鎖を分離する酵素とともに結合抗体をインキュベートすること、
糖鎖を収集すること、及び、
収集糖鎖がＦａｂ部分特異的糖鎖を含むか否かを判定すること、
を備え、
前記サンプルは、ＲＡ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶを発症する危険性のある個体の抗体サンプルであることを特徴とする、方法。
【請求項１０】
Ｆａｂ部分上にＮ結合型グリコシル化を有する抗体を精製する方法であって、
抗体サンプルを準備すること、
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子を含む固体表面とともに前記サンプルをインキュベートすること、
前記固体表面を洗浄し、結合抗体を収集すること、
修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質とともに収集抗体をインキュベートすること、
未結合抗体を除去すること、及び、
前記ペプチド又はタンパク質が結合抗体を有していたか否かを判定すること、
を備える、方法。
【請求項１１】
前記サンプルは精製抗体を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗体サンプルを準備すること、
修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む固体表面に前記サンプルを接触させること、
未結合抗体を除去すること、
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子とともに前記固体表面をインキュベートすること、
未結合分子を除去すること、及び、
分子が前記固体表面に結合したか否かを判定すること、
を備える、方法。
【請求項１３】
前記サンプルは、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶを発症する危険性のある個体の抗体サンプルである、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルは、早期抗体サンプルが自己抗体の検査で陽性であった個体の抗体サンプルである、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記早期抗体サンプルの前記自己抗体の１０％以下がそのＦａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記自己抗体は、抗修飾タンパク質抗体（ＡＭＰＡ）である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体は、Ｆａｂ及びＦｃ断片を生産するために、切断される、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
抗体サンプルが、抗修飾タンパク質抗体（ＡＭＰＡ）を、好ましくは、シトルリン、ホモシトルリン、及び／又はアセチル化リシンに結合するＡＭＰＡを含むか否かを判定する方法であって、
修飾タンパク質エピトープを、好ましくは、シトルリン、ホモシトルリン、又はアセチル化リシンを含む修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質に前記サンプルの抗体を接触させること、
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子に前記サンプルの抗体を接触させること、及び、
Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する抗体が前記ペプチド又はタンパク質内の前記修飾タンパク質エピトープに、好ましくは、シトルリン、ホモシトルリン、又はアセチル化リシンを含む前記修飾タンパク質エピトープに結合したか否かを判定すること、
を含む、方法。
【請求項１９】
前記サンプルは、サンプリング時に関節リウマチを有しない個体のサンプルである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＡＭＰＡが、好ましくは、シトルリン化タンパク質抗原抗体（ＡＣＰＡ）、リシンアセチル化タンパク質抗原抗体（ＡＡＰＡ）、及び／又は抗ＣａｒＰ抗体が、前記個体の類似早期サンプルで検出されたことを特徴とする、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記早期サンプル内の前記ＡＭＰＡは、前記抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型グリコシル化の存在の検査で陰性であった、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記個体は、関節炎、好ましくは、関節リウマチを発症する危険性がある、請求項１８から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
糖鎖結合分子が、レクチン、好ましくは、シアル酸残基結合レクチン、好ましくは、ＳＩＧＬＥＣファミリーの一員、好ましくは、ＣＤ２２又は前記レクチンのシアル酸結合部分である、請求項１８から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記レクチンは、２箇所のシアル酸残基、好ましくは、セイヨウニワトコ凝集素（ＳＮＡ）に同時に結合し得る、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
サンプル中での、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶに関連する自己抗体、ＡＭＰＡなど、の検出に有用なパーツのキットであって、前記キットは、前記自己抗体に結合し得るペプチド又はタンパク質、翻訳後修飾を含むペプチド又はタンパク質など、と、抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子とを含む、キット。
【請求項２６】
前記ペプチド、前記タンパク質、又は、Ｎ結合型糖鎖に結合し得る前記分子は、固体表面に結合している、請求項２５に記載のパーツのキット。
【請求項２７】
個体が、Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶに関連する自己抗体を含むか否かを判定する方法であって、前記方法は、
前記自己抗体に結合し得るペプチド又はタンパク質に前記個体のサンプルを含むＢ細胞を接触させることと、
前記ペプチド又はタンパク質に結合したＢ細胞を未結合Ｂ細胞から分離すること、
少なくとも、結合Ｂ細胞のＢ細胞受容体の、重鎖可変領域のＣＤＲ１及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１をコードする核酸をシーケンシングすること、及び、
前記核酸配列がＮ結合型グリコシル化コンセンサスアミノ酸配列をコードしているか否かを判定すること、
を含む、方法。
【請求項２８】
少なくとも重鎖可変領域の複数のＣＤＲ及び／又は軽鎖可変領域の複数のＣＤＲをシーケンシングすることを含む、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫疾患、特に、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、シェーグレン症候群、及び関節炎の分野に関連し、特に、関節リウマチの分野に関連する。また、本発明は、個体が前述の自己免疫疾患を発症するかを監視する方法又は自己免疫疾患、好ましくは、関節炎（関節リウマチ）を治療する方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＧは、Ｆｃ部分に存在するＡｓｎ２９７に位置する保存グリコシル化部位を含有する糖タンパク質である。構造的観点から、これらのＦｃ糖鎖は、内部スキャフォールドとして機能し、ＩｇＧ分子のＦｃ尾部の立体配座の維持に重要である。Ｆｃグリコシル化は、Ｆｃｙ受容体（ＦｃｙＲ）との相互作用を調節することができ、また、特定糖型が、補体経路（Ｃ１ｑ及びＭＢＬ媒介経路）を活性化でき、及び／又は、ＦｃｙＲ結合を調節できることから、他のエフェクター機能に関与している可能性がある。例えば、コアフコース残基はＦｃｙＲＩＩＩａへのＩｇＧ結合に影響し得、コアフコースの欠如は抗体依存性細胞毒性の増強の原因となる。同様に、Ｆｃ糖鎖でのシアル酸及びガラクトース残基の低含量は、ＦｃｙＲの活性化よりもＩｇＧの結合を選好することから、重要な炎症誘発特性をＩｇＧに付与する。
【０００３】
Ｆｃ結合Ｎ糖鎖に加えて、ヒト血清中のＩｇＧ分子の約１５〜２５％がＦａｂ部分に存在するＮ結合型糖鎖を含有する。また、Ｆａｂ糖鎖は、細胞機能を調節でき、おそらくは、糖鎖を介したレクチンへの異常Ｆａｂグリコシル化Ｂ細胞受容体架橋の提供を通じて、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、及びバーキットリンパ腫Ｂ細胞などのリンパ腫の出現に関係している。
【０００４】
最近、関節リウマチ（ＲＡ）の患者で、シトルリン化タンパク質抗原（ＡＣＰＡ）、ホモシトルリン化タンパク質抗原（抗ＣａｒＰ）、及びアセチル化リシンタンパク質抗原（ＡＡＰＡ）などの翻訳後修飾に結合し得る抗体（ＡＭＰＡ）が発見されている。こうした抗体は病因に関与している。ＲＡで増加する別の翻訳後修飾として、マロンジアルデヒド−アセトアルデヒド付加物（ＭＡＡ付加物）形成が挙げられる。この修飾は、ＡＣＰＡに関連する抗体応答をまねく（Ｔｈｉｅｌｅ等、２０１５：Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  Ｖｏｌ  ６７（３）：６４５−６５５：ｄｏｉ  １０．１００２／ａｒｔ．３８９６９）。ＲＡなどの自己免疫疾患の発症に関与するさまざまな翻訳後修飾がＴｒｏｕｗ等（２０１７、Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、ｄｏｉ：１０．１０５８／ｎｒｒｈｅｕｍ．２０１７．１５）でレビューされている。最近、本発明の発明者等は、ＲＡ患者から単離したＡＣＰＡが広範にＦａｂグリコシル化されているという興味深い観察結果を得た。ＡＣＰＡはＲＡに高度に特異的であり、それらの存在は疾患重症度に関連し且つ危険性のある対象でのＲＡの発症を予測する（Ｓｃｏｔｔ  ２０１０；Ｗｉｌｌｅｍｚｅ，Ａ．等、「Ｎｅｗ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ」、Ｎｅｔｈ  Ｊ  Ｍｅｄ  ７０．９（２０１２）：３９２−９）。ＩｇＧ分子上のＦａｂ糖鎖が正常免疫応答で特定の機能を調節できるか否かは未知だが、これらの存在がインビボでの抗体の半減期に加えてエピトープ認識に影響し得ることを支持する証拠が得られている（Ｇｏｌｅｔｚ  ２０１２、Ｃｏ  １９９３、Ｌｅｉｂｉｇｅｒ  １９９９）。
【０００５】
Ｎ結合型グリコシル化を経るために、タンパク質はＮ結合型グリコシル化コンセンサス配列（典型的には、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ、但し、Ｘ≠Ｐ、ここで、Ｎ＝アスパラギン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝トレオニン、Ｐ＝プロリン、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸、式中のＳ／Ｔは当該位置がＳ又はＴであることを意味し、ときに、Ｃ（システイン）がＳ／Ｔの位置にあることもある）を有する必要がある。重要なことだが、発明者等は、以前、ＡＣＰＡ−ＩｇＧでのＮ結合型グリコシル化コンセンサス部位が、生殖細胞系にコードされておらず、体細胞超変異中に導入されることを示した（Ｒｏｍｂｏｕｔｓ  ２０１５）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明において、発明者等は、関節リウマチ、シェーグレン症候群、及びＡＡＶに関連する自己抗体（関節リウマチでの、ＡＣＰＡ、抗ＣａｒＰ、抗ＭＡＡ付加物抗体、及びＡＡＰＡ抗体などのＡＭＰＡ抗体）のＦａｂドメイン内のＮ結合型糖鎖の構造を同定した。また、発明者等は、関節炎の臨床的兆候をまだ示していないＡＣＰＡ陽性個体（即ち、『危険性のある個体』）のＡＣＰＡ−ＩｇＧ分子が、ＲＡ罹患患者でのＡＣＰＡ−ＩｇＧと比べ、Ｆａｂグリコシル化の程度が低いという観察結果を得た。そこで、ＡＣＰＡのＦａｂ糖鎖の出現、及び／又は、ＡＣＰＡのＦａｂグリコシル化の程度は、前臨床相から臨床的に明白な関節炎の発症への遷移の目印となる。そこで、適切なバイオアッセイによるＡＣＰＡのＦａｂ糖鎖の検出は、この遷移を同定し、疾患の発症を予防又は遅延するための治療戦略をガイドするために、用いることができる。以上は、シェーグレン症候群及びＡＡＶに関連する自己抗体についても当てはまる。シェーグレン症候群及びＡＡＶの臨床的兆候をまだ示していない自己抗体陽性個体（即ち、当該疾患を発症する『危険性のある個体』）の自己抗体は、シェーグレン症候群及び／又はＡＡＶ罹患患者での自己抗体と比べ、Ｆａｂグリコシル化の程度が低い。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施形態では、サンプリング時に、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又は抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）を有しない個体が前述の疾患を発症する危険性があるか否かを判定する方法であって、前記方法は、前記個体の抗体含有サンプルが前記疾患に関連する自己抗体を含むか否かを判定すること、及び、前記抗体が当該抗体のＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含むか否かを判定することを備え、前記方法は、前述の判定に基づき前記個体が前記疾患を発症する危険性を判定することをさらに備える、方法が提供される。
【０００８】
また、個体の抗体含有サンプルを分析する方法であって、前記方法は、前記サンプルが、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶに関連する自己抗体であって、当該抗体のＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含む自己抗体を含むか否かを判定することを備え、前記方法は、前記サンプルが、サンプリング時に、関節リウマチの症状、シェーグレン症候群の症状、又はＡＡＶの症状を有しない個体のサンプルであることを特徴とする、方法も提供される。
【０００９】
さらに、個体での、関節リウマチの症状、シェーグレン症候群の症状、又はＡＡＶの症状の発症を予防又は遅延する方法であって、
前記方法は、
前記個体のサンプルが、前述の疾患に関連する自己抗体を含有するか否かを判定すること、及び、
前記抗体が、Ｎ結合型グリコシル化Ｆａｂ部分を有するか否かを判定すること、
を備え、
前記サンプルは、前記個体の抗体含有サンプルであり、前記個体は、サンプリング時に、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶを有さず、及び、
前記方法は、
前記個体が前記疾患を示し始める前に又は示し始めた時に、前記疾患用の薬剤で前記個体を治療すること、
を備える、方法も提供される。
【００１０】
また、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶを発症する危険性のある個体を監視する方法であって、前記方法は、個体の定期的抗体含有サンプルにおいて前述の疾患に関連する自己抗体の存在及び／又は発現を監視することを備え、前記方法は、前記疾患に関連する検出自己抗体が当該抗体のＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型糖鎖を含むか否かを判定することをさらに含むことを特徴とする、方法も提供される。
【００１１】
また、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶ薬剤であって、前述の疾患の１つ以上の発症の危険性のある個体の治療方法に使用するためのものであり、前記個体は、当該個体の抗体含有サンプルにおける、Ｆａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含んでいる前記疾患に関連する自己抗体の検出により、危険性を判定される、薬剤も提供される。ある実施形態では、前記個体は、前記薬剤投与時に前記疾患を有しない。
【００１２】
また、抗体サンプルが、抗修飾タンパク質抗体（ＡＭＰＡ）を、好ましくは、シトルリン、ホモシトルリン、及び／又はアセチル化リシンに結合するＡＭＰＡを含むか否かを判定する方法であって、
修飾タンパク質エピトープを、好ましくは、シトルリン、ホモシトルリン、又はアセチル化リシンを含む修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質に前記サンプルの抗体を接触させること、
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子に前記サンプルの抗体を接触させること、及び、
Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する抗体が前記ペプチド又はタンパク質内の前記修飾タンパク質エピトープに、好ましくは、シトルリン、ホモシトルリン、又はアセチル化リシンを含む前記修飾タンパク質エピトープに結合したか否かを判定すること、
を含む、方法も提供される。
【００１３】
さらに、サンプル中での、ＡＭＰＡの、好ましくは、ＡＣＰＡ抗体、抗ＣａｒＰ抗体、及び／又はＡＡＰＡ抗体の検出に有用なパーツのキットであって、前記キットは、翻訳後修飾エピトープを、好ましくは、シトルリン化エピトープ、ホモシトルリン化エピトープ、及び／又はアセチル化リシンエピトープを有するペプチド又はタンパク質と、抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子とを含む、キットも提供される。
【００１４】
さらに、サンプル中での、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶに関連する自己抗体、ＡＭＰＡなど、の検出に有用なパーツのキットであって、前記キットは、前記自己抗体に結合し得るペプチド又はタンパク質、翻訳後修飾を含むペプチド又はタンパク質など、と、抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子とを含む、キットも提供される。
【００１５】
また、一実施形態では、個体の抗体含有サンプルを分析する方法であって、前記方法は、前記サンプルが、Ｆａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型糖鎖を含むＡＭＰＡ（好ましくは、ＡＣＰＡ抗体、抗ＣａｒＰ抗体、及び／又はＡＡＰＡ抗体）を含むか否かを判定すること、を備え、前記方法は、前記サンプルが、サンプリング時に関節リウマチの兆候又は症状を有しない個体のサンプルであることを特徴とする、方法も提供される。
【００１６】
また、サンプリング時に関節リウマチを有しない個体が関節リウマチを発症する危険性があるか否かを判定する方法であって、前記個体の抗体含有サンプルが、抗修飾タンパク質抗体（ＡＭＰＡ）を、好ましくは、ＡＣＰＡ抗体、抗ＣａｒＰ抗体、及び／又はＡＡＰＡ抗体を含むか否かを判定すること、及び、前記抗体が当該抗体のＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型糖鎖を含むか否かを判定することを備え、前記方法は、前述の判定に基づき前記個体が前記関節リウマチを発症する危険性を判定することをさらに備える、方法も提供される。
【００１７】
サンプリング時に関節リウマチを有しない個体は、好ましくは、ＡＭＰＡの、好ましくは、ＡＣＰＡ、抗ＣａｒＰ、及び／又はＡＡＰＡの陽性個体であり、好ましくは、臨床的に及び／又はＸ線写真で検出可能な関節炎の兆候なく関節痛を有する個体であり、又は、無症候性の個体であり、ここで、ＡＣＰＡ、抗ＣａｒＰ、及び／又はＡＡＰＡの血清学は、偶発的発見として又はスクリーニング検査の一部として検出される。個体は、好ましくは、慢性関節炎症状を有しない。
【００１８】
さらに、関節リウマチ症状又はその発症について個体を治療する方法であって、前記方法は、
サンプルが、Ｎ結合型グリコシル化Ｆａｂ部分を有するＡＭＰＡを、好ましくは、ＡＣＰＡ抗体、抗ＣａｒＰ抗体、及び／又はＡＡＰＡ抗体を含有するか否かを判定すること（但し、前記サンプルは、前記個体の抗体含有サンプルであり、前記個体は、サンプリング時に関節リウマチを有さず）、及び、
前記個体が関節リウマチ症状を示し始める前又は示し始めた時に、好ましくは、関節リウマチ薬剤又は他の標的型介入で、前記個体を治療すること、
を備える、方法も提供される。
前記治療は、慢性関節炎の発症及び／又は関節リウマチ症状の発症を、予防する又は少なくとも遅らせる。また、前記治療は、慢性関節炎及び／又は関節リウマチ症状の重症度を減少させてもよい。
【００１９】
また、関節リウマチ症状又はその発症について個体を治療する方法であって、前記方法は、
サンプルが、ＡＭＰＡを、好ましくは、ＡＡＰＡ抗体、ＡＣＰＡ抗体、及び／又は抗ＣａｒＰ抗体を含有するか否かを判定すること、及び、
前記抗体が、Ｎ結合型グリコシル化Ｆａｂ部分を有するか否かを判定すること、
を備え、
前記サンプルは、前記個体の抗体含有サンプルであり、前記個体は、サンプリング時に、関節リウマチを有さず、及び、
前記方法は、
前記個体が関節リウマチ症状を示し始める前又は示し始めた時に、関節リウマチ薬剤で前記個体を治療すること、
を備える、方法も提供される。
【００２０】
また、関節炎を発症する危険性のある個体を監視する方法であって、前記方法は、前記個体の定期的抗体含有サンプルにおいて、ＡＭＰＡの、好ましくは、ＡＣＰＡ抗体、抗ＣａｒＰ抗体、及び／又はＡＡＰＡ抗体の存在及び／又は発現を監視することを備え、前記方法は、検出された、ＡＭＰＡが、好ましくは、ＡＣＰＡ抗体、抗ＣａｒＰ抗体、及び／又はＡＡＰＡ抗体が当該抗体のＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型糖鎖を含むか否かを判定することをさらに含むことを特徴とする、方法も提供される。
【００２１】
さらに、個体の治療方法に使用するための薬剤、好ましくは、関節炎薬剤、であって、当該方法は、前記個体の抗体含有サンプルにおけるＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含んでいるＡＭＰＡの、好ましくは、ＡＡＰＡ抗体、ＡＣＰＡ抗体、及び／又は抗ＣａｒＰ抗体の存在を検出すること、及び、前記抗体のＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含んでいるＡＭＰＡが検出された場合に前記個体を治療すること、を備える、薬剤も提供される。
【００２２】
さらに、個体が、Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶに関連する自己抗体を含むか否かを判定する方法であって、前記方法は、
前記自己抗体に結合し得るペプチド又はタンパク質に前記個体のサンプルを含むＢ細胞を接触させることと、
前記ペプチド又はタンパク質に結合したＢ細胞を未結合Ｂ細胞から分離すること、
結合Ｂ細胞のＢ細胞受容体又は抗体の、重鎖可変領域若しくはその一部及び／又は軽鎖可変領域若しくはその一部をコードする核酸をシーケンシングすること、及び、
前記核酸配列がＮ結合型グリコシル化コンセンサスアミノ酸配列をコードしているか否かを判定すること、
を含む、方法も提供される。
【００２３】
さらに、個体が、Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する抗修飾タンパク質抗体（ＡＭＰＡ）を含むか否かを判定する方法であって、前記方法は、
修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質に前記個体のサンプルを含むＢ細胞を接触させることと、
前記ペプチド又はタンパク質に結合したＢ細胞を未結合Ｂ細胞から分離すること、
結合Ｂ細胞のＢ細胞受容体又は抗体の、重鎖可変領域若しくはその一部及び／又は軽鎖可変領域若しくはその一部をコードする核酸をシーケンシングすること、及び、
決定された核酸配列がＮ結合型グリコシル化コンセンサスアミノ酸配列をコードしているか否かを判定すること、
を含む、方法も提供される。
【００２４】
可変領域の一部は、どの部分でもよく、限定されるわけではないが、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、又はＦＲ４などのフレームワーク領域でもよい。また、可変領域の一部は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３などの相補性決定領域（ＣＤＲ）でもよい。重鎖の可変領域の一部は、好ましくは、当該可変領域のＣＤＲであり、好ましくは、ＣＤＲ１であり、好ましくは、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２であり、好ましくは、すべてのＣＤＲである。軽鎖の可変領域の一部は、好ましくは、当該可変領域のＣＤＲであり、好ましくは、ＣＤＲ１であり、好ましくは、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２であり、好ましくは、すべてのＣＤＲである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】全ＩｇＧ（上）及びＡＣＰＡ  ＩｇＧ（下）でみられる糖鎖の典型的なプロファイルを示す。ＩｇＧ及びＡＣＰＡは同じ患者から単離された。糖鎖は遊離後にＨＰＬＣにより分析された。ＡＣＰＡのＦ（ａｂ）断片は、高度にシアル化された二分岐型Ｎ結合型糖鎖を含有する（紫の菱形＝シアル酸）。
【図２Ａ】ＡＣＰＡ＋ＲＡ患者及び彼らの健常ＡＣＰＡ＋第一度近親者（健常近親者）由来の血清サンプルをＡＣＰＡ上のＦ（ａｂ）糖鎖の存在について分析した。ＡＣＰＡ上のＦ（ａｂ）糖鎖の頻度は、ＲＡ患者由来ＡＣＰＡに比べて健常提供者由来ＡＣＰＡで顕著に低かった。
【図２Ｂ】ＲＡ診断前のＡＣＰＡ−ＩｇＧのＦａｂグリコシル化の百分率の予測値を示す。ＲＡ患者のＡＣＰＡ陽性健常第一度近親者２６名を経時的に追跡した。各丸は、関節リウマチの疾患発症まで追跡された（ＲＡ：黒丸）又はＲＡ発症なく同程度の期間にわたり追跡された（ＨＣ、健常対照群：白丸）１個体のＡＣＰＡのＦａｂグリコシル化のメジアンを表す。これら２６名の追跡個体のうち、４６％が時間経過に伴いＲＡを発症した。一般的なＩｇＧのＦａｂグリコシル化の百分率は１５〜２５％である。ＩｇＧ−Ｆａｂグリコシル化が５５％を超えると『異常』と考えられる。研究期間終了時にＲＡを発症していた健常個体は、ＲＡを発症しなかった個体に比べて、ＲＡ診断前のＦａｂグリコシル化の百分率が高かった。
【図３Ａ】アプローチＡ（方法２）を示す。ＳＮＡ、Ｆａｂ糖鎖構造上でみつかったα−２，６−結合シアル酸に特異的に結合するレクチンが、ＲＡ患者の血清から精製されたＡＣＰＡに結合する。本図に示す方法では、まず、ＡＣＰＡ陽性及びＡＣＰＡ陰性ＲＡ患者（上）の血清からＣＣＰ２コートビーズでＡＣＰＡを捕捉した。次に、ＡＣＰＡ陽性溶出物を抗ヒトＩｇＧでコート済みのＥＬＩＳＡプレートに添加した。次の工程で、ビオチン化ＳＮＡを結合ＡＣＰＡ−ＩｇＧに添加し、ＡＣＰＡのＦａｂグリコシル化の水準を分析した（下）。各ウェルに存在するＡＣＰＡ量の対照として、全ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡを行った（データ示さず）。
【図３Ｂ】グリコシル化ＡＣＰＡ−Ｆａｂ／全ＡＣＰＡ−ＩｇＧの割合（方法については、図３Ａ参照）は、ＡＣＰＡ陽性患者由来のＡＣＰＡ上のＦａｂ結合糖鎖の数が多いことを示すが、一方、ＡＣＰＡ陰性患者由来のＣＣＰコート溶出物は、ＳＮＡ結合を示さなかった。
【図３Ｃ】図３Ａ（下）に示す発明者等のＥＬＩＳＡでのＳＮＡがＦａｂグリコシル化抗体に特異的に結合することを証明するために、市販のＩＶＩｇ（Ｓａｎｑｕｉｎ製）を用いた。ＩＶＩｇをＳＮＡコートビーズとともにインキュベートし、フォロースルー（ＦＴ１）又は溶出物１（Ｅ１：ＰＢＳ及びラクトースにより溶出）又は溶出物２（Ｅ２：ラクトース酢酸溶液により溶出、Ｆａｂグリコシル化抗体を含有すると考えられる）を抗ヒトＩｇＧでコート済みのＥＬＩＳＡプレート上に添加した。ＩｇＧ上のＦａｂグリコシル化の水準を、異なる画分へのＳＮＡ結合により求めた（図３Ａ下に示すＥＬＩＳＡ法）。実際に、Ｆａｂグリコシル化抗体を含有する画分へのＳＮＡ結合が最も高値であった。画分を用いた追加のＨＰＬＣ分析は発明者等の発見を裏付けるものであった。
【図４Ａ１】アプローチＢ（方法３）を示す。まず、シアル化抗体を捕捉し、次に、ＡＣＰＡ富化の検出を行う。ＡＣＰＡ−ＩｇＧのＦａｂグリコシル化を評価するための方法では、プロテインＧを用い、続いて、ＳＮＡアガロースビーズを用いる。
【図４Ａ２】ＡＣＰＡ陽性ＲＡ患者の血清サンプルのセットでのＦａｂグリコシル化ＡＣＰＡの富化を示す。
【図４Ｂ】ＡＣＰＡ及び抗ＣａｒＰ抗体をＳＮＡにより捕捉した。ＩｇＧをＡＣＰＡ抗体陽性ＲＡ患者及び抗ＣａｒＰ抗体陽性ＲＡ患者の血清からプロテインＧビーズにより単離した。ＳＮＡアガロースビーズにより、ＳＮＡ結合ＩｇＧ抗体を単離し、ＳＮＡ結合（溶出液）及び非ＳＮＡ結合（フロースルー）画分（図４Ａ１）を得た。ＳＮＡ＋画分（図４Ａ１の溶出液）又はＳＮＡ陰性画分（図４Ａ１のフロースルー）を、ＣＣＰ２でコート済みのＥＬＩＳＡプレート（左：ＡＣＰＡ検出用）又はカルバミル化ＦＣＳでコート済みのＥＬＩＳＡプレート（右：抗ＣａｒＰ抗体検出用）のいずれかに添加し、ＩｇＧ結合を分析した。実際に、ＳＮＡ＋画分はＡＣＰＡ抗体及び抗ＣａｒＰ抗体を含有しており、このことは、Ｆａｂグリコシル化が、一般的なＩｇＧに比べて、ＡＣＰＡ抗体及び抗ＣａｒＰ抗体で上昇していることを示唆する。
【図５】正常抗体に対する（即ち、（ホモ）シトルリン化タンパク質（この場合は、抗破傷風毒素）に対するのではない）ＡＣＰＡ抗体及び抗カルバミル化タンパク質抗体のサイズシフトを示す。
【図６】フィブリノーゲンαのアミノ酸配列を示す。
【図７】フィブリノーゲンβのアミノ酸配列を示す。
【図８】フィブリノーゲンγのアミノ酸配列を示す。
【図９】ＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＩｇＧの精製及び分析の模式図を示す。１）ＡＣＰＡを、ＣＣＰ２（環状シトルリン化ペプチド）（ＣＣＰ  Ｃｉｔ）又はアルギニン対照（ＣＣＰ−Ａｒｇ）上でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、その後、プロテインＧ（Ｐｒｏｔ  Ｇ）及びプロテインＡ（Ｐｒｏｔ  Ａ）捕捉により、（ＡＣＰＡ枯渇）非シトルリン特異的ＩｇＧ１，２，４とともにＡＣＰＡ  ＩｇＧ１，２，４を得た。２）（ＡＣＰＡ）−ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片を、Ｉｄｅｓで精製抗体を消化することで生成した。得られたＦｃ部分を抗Ｆｃ抗体を用いて精製し、一方、Ｆ（ａｂ’）２断片を抗ＣＨ１ドメイン抗体を用いて単離した。３）抗体及び断片のＮ糖鎖を、２−アミノ安息香酸（２ＡＡ）で標識し、ＵＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析した。ただし、糖ペプチドはＬＣ−ＭＳで分析した。
【図１０Ａ】図１０は、ＲＡ患者から単離したＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＩｇＧ由来の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）のグリコシル化を示す。本図は、還元条件下でのＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。１つのＨＣ及び１つのＬＣを示すＮＣＳ−ＩｇＧと比べて、ＡＣＰＡ−ＩｇＧはＮ結合型グリコシル化により複数のＨＣ（ＨＣ１からＨＣ３）及びＬＣバンド（ＬＣからＬＣ２）を示した。
【図１０Ｂ】図１０は、ＲＡ患者から単離したＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＩｇＧ由来の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）のグリコシル化を示す。本図は、異なる電気泳動バンドから抽出したＮ糖鎖のＵＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１１Ａ】図１１は、ＡＣＰＡ−ＩｇＧが、Ｆａｂグリコシル化と比べると、Ｆｃでは異なったやり方でグリコシル化されていることを示す。本図は、代表的提供者から精製したＡＣＰＡ−ＩｇＧのＦｃ断片のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【図１１Ｂ】図１１は、ＡＣＰＡ−ＩｇＧが、Ｆａｂグリコシル化と比べると、Ｆｃでは異なったやり方でグリコシル化されていることを示す。本図は、代表的提供者から精製したＡＣＰＡ−ＩｇＧのＦ（ａｂ’）２断片のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを示す。
【図１２Ａ】図１２は、Ｆａｂ結合グリコシル化パターンがＲＡ患者から単離したＡＣＰＡ−ＩｇＧと非シトルリン特異的ＩｇＧとの間で異なることを示す。本図は、代表的ＲＡ患者のＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＩｇＧのＦ（ａｂ’）２糖鎖のＵＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１２Ｂ】図１２は、Ｆａｂ結合グリコシル化パターンがＲＡ患者から単離したＡＣＰＡ−ＩｇＧと非シトルリン特異的ＩｇＧとの間で異なることを示す。本図は、ガラクトシル化、シアル化、フコシル化の相対量で示したＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＩｇＧのＦａｂグリコシル化の糖鎖由来特性の違いを示す。
【図１３Ａ】図１３は、ＡＣＰＡ−ＩｇＧが非シトルリン特異的ＩｇＧに比べて高度にＦａｂグリコシル化されていることを示す。本図は、ＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＩｇＧのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳスペクトルを示す。
【図１３Ｂ】図１３は、ＡＣＰＡ−ＩｇＧが非シトルリン特異的ＩｇＧに比べて高度にＦａｂグリコシル化されていることを示す。本図は、ＵＨＰＬＣ及びＬＣ−ＭＳデータに由来するＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＩｇＧのＦａｂグリコシル化水準の比較を示す。
【図１３Ｃ】図１３は、ＡＣＰＡ−ＩｇＧが非シトルリン特異的ＩｇＧに比べて高度にＦａｂグリコシル化されていることを示す。本図は、滑液（ｎ＝３）及び血漿（ｎ＝６）由来のＡＣＰＡ−ＩｇＧ又は非シトルリン特異的ＩｇＧのＦａｂグリコシル化の比較を示す。
【図１４】露出したＮ結合型グリコシル化コンセンサス部位（強調及び下線で示す）を含むＶＨ又はＶＬ領域のアミノ酸配列を示す。
【図１５】さまざまな抗原及び抗体調製物を用いたＥｌｉｓａの結果を示す。
【図１６】ヒトアルブミンはシトルリン化及びカルバミル化などの翻訳後修飾の影響を受けやすい。本図は、ヒトアルブミンタンパク質（ＵｎｉｐｒｏｔデータベースのアクセッションコードＱ５６Ｇ８９）の配列を示す。
【図１７】ヒトα−１−抗トリプシンはカルバミル化などの翻訳後修飾の影響を受けやすい。本図は、ヒトα−１−抗トリプシン（ＮＣＢＩデータベースのアクセッションコードＡＡＢ５９３７５．１）の配列を示す。
【図１８Ａ】図１８は、自己抗体ＦａｂのＮグリコシル化の結果として生じるサイズシフトを示す。この自己抗体は、ＰＲ３−ＡＮＣＡ抗体であり、これらは、ＡＡＶと相関している。本図は、ある患者の全ＩｇＧ及びＰＲ３−ＡＮＣＡ抗体のＨＰＬＣサイズ分画画分を示している。これらの抗体は血管炎（ＡＡＶ）に関連する体（ＡＮＣＡ）に関与している。
【図１８Ｂ】図１８は、自己抗体ＦａｂのＮグリコシル化の結果として生じるサイズシフトを示す。この自己抗体は、ＰＲ３−ＡＮＣＡ抗体であり、これらは、ＡＡＶと相関している。本図は、別の患者の全ＩｇＧ及びＰＲ３−ＡＮＣＡ抗体のＨＰＬＣサイズ分画画分を示している。これらの抗体は血管炎（ＡＡＶ）に関連する体（ＡＮＣＡ）に関与している。
【図１９Ａ】図１９は、健常個体から得たＢＣＲ配列での部位と比較したＡＣＰＡのＢＣＲ配列でのＮグリコシル化部位の局在を示す。本図は、ＩｇＧ重鎖を示す。
【図１９Ｂ】図１９は、健常個体から得たＢＣＲ配列での部位と比較したＡＣＰＡのＢＣＲ配列でのＮグリコシル化部位の局在を示す。本図は、Ｉｇκ軽鎖を示す。
【図１９Ｃ】図１９は、健常個体から得たＢＣＲ配列での部位と比較したＡＣＰＡのＢＣＲ配列でのＮグリコシル化部位の局在を示す。本図は、Ｉｇλ軽鎖を示す。
【図２０】ＳＮＡの代わりにＣＤ２２を用いてＡＣＰＡのＦａｂ糖鎖を検出したことを示す。ＲＡ患者から単離したＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＩｇＧのＦ（ａｂ’）２断片をゲルに当量ずつ載せた（左）。次に、ＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＩｇＧのＦ（ａｂ’）２断片を載せた場所でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、その後、膜上にブロットした。この膜をＣＤ２２−Ｆｃとともにインキュベートした後、標識抗ヒトＦｃで染色した（右）。ＡＣＰＡ−ＩｇＧについてのみ反応性がみられ、この反応性はシアリダーゼでシアル酸を除去すると失われた。
【図２１Ａ】図２１は、ＡＣＰＡ−Ｆａｂグリコシル化とＲＡ発症との相関関係を示す。時間がたちＲＡを発症したＡＣＰＡ＋北アメリカ原住集団第一度近親者（ＦＤＲ）（ＦＤＲ  ＲＡ）及びこれまでのところＲＡを発症しなかったＡＣＰＡ＋ＦＤＲ（ＦＤＲ  ＨＣ）でのＡＣＰＡ−ＩｇＧのＦａｂグリコシル化を分析した。本図は、ＦＤＲ  ＨＣがＡＣＰＡ−ＩｇＧのＦａｂグリコシル化の正常水準を維持する一方で、ＦＤＲ  ＲＡ個体がより高度なＡＣＰＡ−ＩｇＧのＦａｂグリコシル化を有することを示す。
【図２１Ｂ】図２１は、ＡＣＰＡ−Ｆａｂグリコシル化とＲＡ発症との相関関係を示す。時間がたちＲＡを発症したＡＣＰＡ＋北アメリカ原住集団第一度近親者（ＦＤＲ）（ＦＤＲ  ＲＡ）及びこれまでのところＲＡを発症しなかったＡＣＰＡ＋ＦＤＲ（ＦＤＲ  ＨＣ）でのＡＣＰＡ−ＩｇＧのＦａｂグリコシル化を分析した。本図は、疾患発症以前にＡＣＰＡ−ＩｇＧのＦａｂグリコシル化がすでに高いことを示す。
【図２１Ｃ】図２１は、ＡＣＰＡ−Ｆａｂグリコシル化とＲＡ発症との相関関係を示す。時間がたちＲＡを発症したＡＣＰＡ＋北アメリカ原住集団第一度近親者（ＦＤＲ）（ＦＤＲ  ＲＡ）及びこれまでのところＲＡを発症しなかったＡＣＰＡ＋ＦＤＲ（ＦＤＲ  ＨＣ）でのＡＣＰＡ−ＩｇＧのＦａｂグリコシル化を分析した。本図は、ＦＤＲ  ＨＣのＡＣＰＡ−ＩｇＧのＦａｂグリコシル化が時間を経ても低いままであることを示す。
【図２２】精製ＡＣＰＡ−ＩｇＧのハイエンドＵＨＰＬ及び質量分析を示す。
【図２３】ＩＶＩＧを図４に詳述した構成を用いて分画し、その後、全ＩｇＧ分子（上のグラフ）及びＩｇＧのＦａｂ断片（下のグラフ）のＵＰＬＣ分析を行った。データから、ＳＮＡ精製が高度シアル化Ｆａｂ断片を含有するＩｇＧ分子を富化し（それぞれのグラフの一番上の線）、一方、これらの断片がＳＮＡフロースルー画分では欠如している（それぞれのグラフの一番下の線）ことが示される。ＩＶＩＧが約１５％のＦａｂグリコシル化ＩｇＧ分子を含有する（それぞれのグラフの真ん中の線）ことに注意されたい。
【図２４Ａ】図２４は、ＵＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳ、及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ−ＭＳを用いたＡＣＰＡ−ＩｇＧ上の三分岐糖鎖の同定を示す。本図は、ＡＣＰＡ−ＩｇＧの遊離糖鎖及び２ＡＡ標識糖鎖のＵＨＰＬＣクロマトグラムを示す。ここで、糖鎖ピークは既報のＧＰ２４糖鎖ピークの後に溶出した。ＧＰｘを集め、ＬＣ−ＭＳを行い、このピーク画分に存在する質量を調べた。このピークがＮ５Ｈ６Ｆ１Ｓ２の質量を有する糖鎖に対応すること明らかとなった。
【図２４Ｂ】図２４は、ＵＨＰＬＣ、ＬＣ−ＭＳ、及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ−ＭＳを用いたＡＣＰＡ−ＩｇＧ上の三分岐糖鎖の同定を示す。本図は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ−ＭＳによる構造の立体配座を示す。質量２８１２．７９２がＮ５Ｈ６Ｆ１Ｓ２の糖鎖質量に対応しており、断片化により、２つの２．６結合シアル酸を有する三分岐糖鎖が確認された。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
個体はヒト個体であることが好ましい。
【００２７】
自己免疫疾患は、正常身体部位への異常免疫応答から生じる状態である。自己免疫疾患は、心臓、脳、神経、筋肉、皮膚、目、関節、肺、腎臓、腺、消化管、及び血管をはじめとする身体のほとんどすべての部位に影響し得る。少なくとも８０種類の自己免疫疾患が存在する。ほとんど全ての身体部位が関与し得る。共通症状として、微熱及び倦怠感が挙げられる。しばしば、症状は現れてはすぐ消える。
【００２８】
全身性エリテマトーデスなどの一部の自己免疫疾患は家族内発症し、いくつかは感染症又は他の環境要因により誘発されることもある。自己免疫性であると一般的に考えられている一部の一般病としては、セリアック病、１型糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、及び全身性エリテマトーデスが挙げられる。
【００２９】
治療は状態の種類及び重症度に依存する。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）及び免疫抑制剤がしばしば用いられる。また、免疫グロブリン療法がときおり用いられることもある。治療は、通常症状を改善するものの、典型的には疾患を治せない。
【００３０】
一実施形態では、サンプリング時に特定自己免疫疾患を有しない個体が当該特定自己免疫疾患を発症する危険性があるか否かを判定する方法であって、前記方法は、前記個体の抗体含有サンプルが前記特定自己免疫疾患に関連する自己抗体を含むか否かを判定すること、及び、前記抗体が当該抗体のＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含むか否かを判定することを備え、前記方法は、前述の判定に基づき前記個体が前記特定自己免疫疾患を発症する危険性を判定することをさらに備える、方法が提供される。
【００３１】
個体が特定自己免疫疾患を発症する危険性は、特定自己免疫疾患に関連する自己抗体が検出され且つこの抗体が当該抗体のＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含む場合に、高い。Ｆａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含む自己抗体の割合が高くなるほど、この危険性も高くなる。
【００３２】
一実施形態では、個体の抗体含有サンプルを分析する方法であって、前記方法は、前記サンプルが、特定自己免疫疾患に関連する自己抗体であって、当該抗体のＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含む自己抗体を含むか否かを判定することを備え、前記方法は、前記サンプルが、サンプリング時に前記特定自己免疫疾患の症状を有しない個体のサンプルであることを特徴とする、方法が提供される。
【００３３】
また、特定自己免疫疾患症状又はその発症について個体を治療する方法であって、前記方法は、
サンプルが、前記特定自己免疫疾患に関連する自己抗体を含有するか否かを判定すること、及び、
前記抗体が、Ｎ結合型グリコシル化Ｆａｂ部分を有するか否かを判定すること、
を備え、
前記サンプルは、前記個体の抗体含有サンプルであり、前記個体は、サンプリング時に、前記自己免疫疾患を有さず、及び、
前記方法は、
前記個体が前記特定自己免疫疾患症状を示し始める前又は示し始めた時に、前記自己免疫疾患治療用薬剤で前記個体を治療すること、
を備える、方法も提供される。
【００３４】
さらに、特定自己免疫疾患を発症する危険性のある個体を監視する方法であって、前記方法は、前記個体の定期的抗体含有サンプルにおいて前記特定自己免疫疾患に関連する自己抗体の存在及び／又は発現を監視することを備え、前記方法は、前記自己抗体が当該抗体のＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型糖鎖を含むか否かを判定することをさらに含むことを特徴とする、方法も提供される。
【００３５】
また、個体の治療方法に使用するための薬剤であって、当該方法は、前記個体の抗体含有サンプルにおけるＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含んでいる特定自己免疫疾患に関連する自己抗体の存在を判定すること、及び、前記抗体のＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含んでいる前記特定自己免疫疾患に関連する前記自己抗体が検出された場合に前記個体を治療すること、を備える、薬剤も提供される。
【００３６】
一実施形態では、自己免疫疾患は、シェーグレン症候群、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）、及び関節炎の１つ以上である。関節炎は、関節リウマチであることが好ましい。シェーグレン症候群は、数々の他の医学的状態と関連しており、この状態の多くは、自己免疫性又はリウマチ性障害、例えば、セリアック病、ＳＬＥ（ループス）、自己免疫性甲状腺炎、多発性硬化症、及び脊椎関節症などである。また、シェーグレン症候群は、非ホジキンリンパ腫とも関連している。本発明の文脈では、シェーグレン症候群を参照する場合、一次性シェーグレン症候群のみを指す。シェーグレン症候群への特異性を有する典型的な自己抗体は、ＳＳ−Ａ及びＳＳ−Ｂである。一次性シェーグレン症候群を参照するとき、さまざまな自己免疫疾患に関連する二次性シェーグレン症候群は除く。
【００３７】
自己抗体は、個体自身のタンパク質の１つ以上に対する（自己抗原に対する）抗体である。自己抗体は、異なる自己抗原の数々に対するものであり得る。自己抗体は、表示した特異性を有する自己抗体が自己免疫疾患を有する個体で検出される頻度が正常／健常集団での頻度よりも有意に高い場合、自己免疫疾患に関連するといえる。シェーグレン症候群では、自己抗体は、典型的には、ＳＳ−Ａ又はＳＳ−Ｂの抗体（抗Ｒｏ／Ｌａとも呼ぶ）である。抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）は、好中球の異常浸潤、血管周囲組織でのスカベンジされていない白血球崩壊の集積、及び血管壁のフィブリノイド壊死を特徴とする自己免疫疾患のグループである。ＡＡＶを有する患者は高頻度で半月形糸球体腎炎により引き起こされた急速進行性腎不全を呈する。ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）及びプロテイナーゼ３（ＰＲ３）が２種の主要ＡＮＣＡ抗原であることが示されている。ＡＡＶでの自己抗体は、典型的には、これらのタンパク質の一方又は両方に対するものである。リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ−２）自己抗体は、追加ＡＮＣＡ亜型を表す。ＲＡでは、自己抗体は、典型的には、ＡＭＰＡ又はリウマチ因子である。
【００３８】
シェーグレン症候群は、身体の水分産生腺が影響を受ける長期自己免疫疾患である。これは、主に、口渇及びドライアイの発症をまねく。他の症状としては、乾燥肌、慢性咳、膣乾燥、腕及び脚の痺れ、疲労、筋肉及び関節の痛み、甲状腺機能障害を挙げることができる。罹患者はリンパ腫の危険性が増加する（５％）。シェーグレン症候群の診断は、臨床症状、分泌腺機能検査の測定結果、水分産生腺の生検、及び特定抗体を探すための血液検査を組み合わせて行われる。生検では典型的には腺内にリンパ球がある。
【００３９】
血管炎は、炎症により血管を破壊する障害のグループである。動脈及び静脈の両方が影響を受ける。ときとしてリンパ管炎も血管炎の一種と考えられる。血管炎は、主に、白血球遊走及びその結果として生じる損傷により引き起こされる。ＡＮＣＡ関連血管炎は、好中性顆粒球由来の抗原に対する自己抗体に関連する血管炎亜型である。こうした抗好中球細胞質抗体はＡＮＣＡとも呼ばれる。
【００４０】
関節炎は、自己免疫疾患のより一般的な形態である。１００を超える形態の関節炎が存在する。最も一般的な形態は、骨関節炎（変形性関節症）である。骨関節炎は、さまざまな原因を有するが、容易に同定できない原因もある。後者は、しばしば、集合的に、年齢関連骨関節炎と呼ばれる。他の関節炎形態としては、例えば、関節リウマチ、乾癬性関節炎、及び関連自己免疫疾患が挙げられる。
【００４１】
関節炎を有する個体の主訴は関節の痛みである。痛みは、しばしば持続性であり、影響を受けた関節に局在することもある。関節炎による痛みは、しばしば、関節に誘導された損傷の結果又は関節内又は周辺で生じた炎症の結果である。他の訴えとしては、強張りに抗い無理やり動かすことで引き起こされた筋肉緊張の結果として生じる痛み、痛む関節、及び疲労が挙げられる。関節リウマチは、治療せずに放置すると、消耗し進行する疾患である。ＲＡの疾患症状及び治療は、Ｓｃｏｔｔ等（２０１０、  Ｔｈｅ  ｌａｎｃｅｔ  ３７６、１０９４−１１０８頁）に詳述されている。当該刊行物の内容を参照により本明細書で援用する。本発明は、特に、ＲＡ症状及びＲＡ薬剤の記載について、この刊行物を参照する。このレビューは広範ではあるが、記載の症状及び薬剤は限定事項として読むべきではない。ここで、非限定的な症状の一覧の要約を以下に示す。関節リウマチは関節に影響する。関節の関節炎は、滑膜の炎症を伴う。関節は、腫れ、弱まり、熱くなり、また、その動きが強張りにより制限される。最も一般的に関連するのは手、足の小関節だが、より大きな関節（肩、膝、及び頚椎など）も関連し得る。ＲＡは、典型的には、炎症の兆候とともに、影響を受けた関節の腫れ、熱、痛み、強張りとともに、特に、早朝起床時又は以降の長引く不活動期に、現れる。早朝の強張りの増大は、しばしば、この疾患の顕著な特徴であり、典型的には、１時間を超えて持続する。病態の進行に伴い、炎症活性は、腱牽引、関節表面の浸食と破壊に繋がる。これにより、移動範囲を損ない、変形に繋がる。リウマチ結節は、ときとして皮膚にあるが、最も一般的な非関節的特徴である。これらは相当数の少数派の患者で生じる。これは病理学者に『壊死性肉芽腫』として知られる炎症応答の種類である。
【００４２】
抗シトルリン化タンパク質抗体（ＡＣＰＡ）は自己抗体（個体自身のタンパク質への抗体）である。この抗体はシトルリン化されているペプチド及び／又はタンパク質に対するものである。これらは関節リウマチを有する患者の大部分に存在する。臨床的には、環状シトルリン化ペプチド（ＣＣＰ）が、患者血清又は血漿でこれらの抗体を検出するために高頻度で用いられる。
【００４３】
シトルリン化又は脱イミノ化は、タンパク質にあるアミノ酸アルギニンからアミノ酸シトルリンへの変換である。ペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ）と呼ばれる酵素が、一級ケチミン基（＝ＮＨ）をケトン基（＝Ｏ）で置換する。シトルリン化は正常個体での機能を実行する。しかし、免疫系が、シトルリン化タンパク質を攻撃することもでき、これは関節リウマチで特異的に起きる。
【００４４】
シトルリンは、遺伝暗号においてＤＮＡによりコードされる２０種の標準的なアミノ酸の一つではない。むしろ、シトルリンは、翻訳後修飾の結果である。シトルリン化は、尿素サイクルの一部としての又は一酸化窒素合成酵素ファミリーの酵素の副産物としての遊離アミノ酸シトルリンの形成とは明確に異なる。
【００４５】
アルギニンは、中性ｐＨでは正に帯電しているが、シトルリンは、帯電していない。アルギニンからシトルリンへの反応では、アルギニン側鎖の末端窒素原子の一つが酸素に置換される。電荷の変化はタンパク質の疎水性を増加させ、タンパク質のフォールディングの変化に繋がる。そのため、シトルリン化はタンパク質の構造と機能を変化させ得る。フィブリン及びフィブリノーゲンは、リウマチ関節内でのアルギニン脱イミノ化の好適部位であるかもしれない。
【００４６】
ＡＣＰＡ−ＩｇＧの存在の検査は、ＲＡ診断用ＩｇＭリウマチ因子と同程度に、感度が良い。こうしたＡＣＰＡは臨床疾患発症前に検出可能である。ＡＣＰＡ検査はＲＡの診断スキームに現在のところルーチンとして含まれている。しかし、こうした抗体は、疾患発症前に数年にわたり存在し得ることを考慮すれば、それら自身から確定的とはいえない。
【００４７】
ホモシトルリンは、シトルリンよりもメチレン基１つ分長く、構造は類似している。この代謝物はリシン残基から生成される。炎症中のカルバミル化の大部分は酵素ＭＰＯが好中球から放出されたときに生じると考えられている。ホモシトルリン化ペプチド及びタンパク質への自己抗体（抗ＣａｒＰ）はＲＡに関連している。また、抗ＣａｒＰ抗体は、症状が発症するかなり前の発症前個体でも検出され得る（Ｓｈｉ等、  Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ．、２０１４、４月；７３（４）：７８０−３）。
【００４８】
タンパク質の翻訳後修飾のうち個体によりそれらへの自己抗体が産生され得るものの例として、シトルリン化及びカルバミル化が挙げられる。個体が自己抗体を産生し得る別の翻訳後修飾として、リシンアセチル化も挙げられる（Ｊｕａｒｅｚ等、２０１５、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：ａｎｎｒｈｅｕｍｄｉｓ−２０１４）。アセチル化は、タンパク質の、例えば、ヒストン、ｐ５３、及びチューブリンなどの翻訳後修飾として生じる。これらのタンパク質のなかで、クロマチンタンパク質及び代謝酵素が大いに代表となる。アセチル化はときとして共翻訳修飾とも呼ばれる。これは本発明では翻訳後修飾と呼ばれる。タンパク質はリシン残基上でアセチル化され得る。リシンアセチル化は少なくともある種のタンパク質では制御機能を有していると考えられる。リシンアセチル化はリシンの側鎖の末端を修飾する。リシンの側鎖は−ＮＨ２で終わるが、アセチル化リシンはＮＨ＝Ｏ−ＣＨ３で終わる。
【００４９】
他種の翻訳後修飾として、これらに限定されるわけではないが、リン酸化、メチル化、ユビキチン化、グリコシル化、及び／又はＳＵＭＯ化が挙げられる。本発明では、自己抗体により検出される翻訳後修飾は典型的にはグリコシル化ではない。好ましい翻訳後修飾として、シトルリン化、ホモシトルリン化、及びリシンアセチル化が挙げられる。翻訳後修飾を有するペプチド又はタンパク質は、修飾ペプチド若しくはタンパク質、又は、修飾エピトープを含むペプチド若しくはタンパク質とも呼ばれる。翻訳後修飾を含むエピトープに特異的に結合する抗体は抗修飾タンパク質抗体（ＡＭＰＡ）と呼ばれる。ＡＭＰＡは、ペプチド又はタンパク質が翻訳後修飾を含む場合のみ、ペプチド又はタンパク質に結合する。こうした修飾エピトープは、修飾タンパク質エピトープとも呼ばれる。ＡＭＰＡはペプチド又はタンパク質内の翻訳後修飾エピトープに結合することができる抗体である。ＡＭＰＡは典型的にはグリコシル化エピトープに結合する抗体ではない。ＡＭＰＡは、シトルリン、ホモシトルリン、及び／又はアセチル化リシンを含むエピトープに結合する抗体であることが好ましい。近年、ＲＡでの自己免疫が、シトルリン化タンパク質を標的とし、タンパク質ホモシトルリン化（カルバミル化としても知られる）及びアセチル化などの他のタンパク質修飾にも及ぶことが明らかとなった（Ｓｈｉ等、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２０１１：１０８：１７３７２−１７３７７；Ｊｕａｒｅｚ等、２０１６  Ａｎｎ．  Ｒｈｅｕｍ．  Ｄｉｓ  ７５：１０９９−１１０７）。別の態様では、ＡＭＰＡはタンパク質上のＭＡＡ付加物に結合する抗体である。ＡＭＰＡが結合し得る好ましいエピトープとしては、シトルリン、ホモシトルリン、アセチル化リシン残基、及び／又はマロンジアルデヒド−アセトアルデヒド付加物を含むエピトープが挙げられる。ＡＭＰＡが結合し得る好ましいエピトープとしては、シトルリン、ホモシトルリン、及び／又はアセチル化リシン残基を含むエピトープが挙げられる。ペプチド又はタンパク質内の翻訳後修飾エピトープは、生成後に修飾される正常ペプチド又はタンパク質であってもよい。また、翻訳後修飾エピトープは、所望の側鎖を含む人工アミノ酸を用いてペプチド（又は望むならタンパク質）の人工合成中にペプチド又はタンパク質内に直接に導入されてもよい。
【００５０】
本発明では、Ｆａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を有するＡＭＰＡの検出が、関節リウマチの発症とよく相関していることがわかった。ＡＭＰＡは、ペプチド又はタンパク質内のシトルリン化又はホモシトルリン化及び／又はアセチル化リシンエピトープに結合し得る抗体であることが好ましい。この抗体は、ＡＣＰＡ抗体、抗ＣａｒＰ抗体、及び／又はＡＡＰＡ抗体であることが好ましい。ＡＡＰＡ抗体、ＡＣＰＡ抗体、及び／又は抗ＣａｒＰ抗体の存在が疾患の発症の危険性の兆候であることが知られている。しかし、こうした抗体、特に、ＡＡＰＡ抗体、ＡＣＰＡ抗体、及び抗ＣａｒＰ抗体は、一般的に、ＲＡ発症前数年にわたり存在し得る。一方、こうした抗体のＦａｂ部分の１箇所以上のＮ結合型グリコシル化は、疾患の発症及び症状の発症をより正確に予測する。Ｆａｂ部分の１箇所以上のＮ結合型グリコシル化を含むＡＭＰＡが血清中にみられる時期は、症状の出現及び疾患の発症を示す。同じ現象が、シェーグレン症候群又はＡＡＶを発症する危険性のある個体でも見つかった。シェーグレン症候群、ＡＡＶ、又はＲＡの症状を、例えば、ＲＡの場合、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）などで、早期治療することが患者にとって有益であることが示されていることから、症状の出現の切迫度を知ることは有利である。また、発症前治療が長期的には個体にとって有益である可能性がある。ＲＡ症状は少なくとも遅延可能であり、及び／または、当該症状の重症度は、治療を受けていない又はＲＡ症状発症後に治療を受けた患者の重症度と比べて、緩和され得る。また、ペプチド又はタンパク質内の翻訳後修飾エピトープに結合し得るＦａｂグリコシル化抗体（ＡＡＰＡ抗体、ＡＣＰＡ抗体、及び／又は抗ＣａｒＰ抗体など）の出現前の病前治療が、ＲＡの発症を予防するかもしれないという可能性もある。
【００５１】
Ｎ結合型グリコシル化は、タンパク質のいくつかのアミノ酸モチーフで生じ得る翻訳後修飾である。血中で最初に見られるＡＣＰＡ抗体及び抗ＣａｒＰ抗体は、典型的には、当該抗体のＦａｂ部分に糖鎖を有しておらず、適切なコンセンサス配列を欠いている。Ｎ糖鎖は、一次構造での特定のコンセンサス配列（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ、又は、稀だが、Ａｓｎ−Ｘ−Ｃｙｓ、Ｘはプロリンではない可能性がある）内に位置するはずのアスパラギンに結合する。Ａｓｎは抗体の表面上に位置している必要があり、また、ＡｓｎはＮ結合型グリコシル化が開始するために小胞体の内腔側内にある必要がある。これらの条件を満たすモチーフはしばしば体細胞超変異による抗体成熟の際にのみ現れる。
【００５２】
本発明は、個体が、Ｆａｂ部分にＮ結合型グリコシル化を含む抗体を含むか否かを判定する方法であって、前記方法は、前記個体のＢ細胞を含むサンプル内で抗体ＶＨ及び／若しくはＶＬ又はその一部をコードする核酸分子を増幅すること、及び、増幅核酸分子がＮ結合型グリコシル化コンセンサス部位であるアミノ酸配列をコードしているか否かを判定すること、を備える、方法を提供する。抗体のＦａｂ部分の三次元構造はよく知られている。また、抗体のＦａｂ部分のアミノ酸のどの部分が露出し翻訳後Ｎ結合型修飾にアクセス可能であるか（分子の外側に露出しているか）も知られている。上述の方法の好ましい実施形態では、増幅核酸分子がＮ結合型グリコシル化についてアクセス可能なコンセンサス部位をコードする配列を含んでいるか否かが判定される。好ましい実施形態では、Ｂ細胞は、ペプチド又はタンパク質内の翻訳後修飾エピトープに結合し得るＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を含むＢ細胞である。こうしたＢＣＲの存在は、個体がＡＭＰＡを含むことを示す。こうしたＢ細胞は、Ｂ細胞の修飾タンパク質結合能に基づいてＢ細胞集団から精製できる。例えば、表面に修飾タンパク質エピトープを有するビーズにより行える。発明者等は、Ｎ結合型グリコシル化についてのアクセス可能なコンセンサス部位がＶＨ又はＶＬ領域にわたって無作為に分布しているわけではないことを発見した。こうしたコンセンサス部位は、重鎖及び軽鎖の両方で、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、又はＦＲ４などのフレームワーク領域にクラスター化され得る。また、この部分は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３などの相補性決定領域（ＣＤＲ）であり得る。ある実施形態では、コンセンサス部位はＣＤＲ領域周辺にクラスター化され、ほとんどの場合、ＶＨ又はＶＬのＣＤＲ１領域又はＣＤＲ３領域内又は周辺にクラスター化され、典型的には、ＣＤＲ１領域内又は周辺にクラスター化される。このため、少なくともＶＨ  ＣＤＲ１の配列が、好適にはＶＨ  ＣＤＲ１及びＶＬ  ＣＤＲ１の配列が、決定されることが好ましく、さらに、少なくとも、ＶＨ  ＣＤＲ３の配列が、好適には、ＶＨ  ＣＤＲ３及びＶＬ  ＣＤＲ３の配列が決定されることが好ましく、少なくとも、ＶＨ配列が、好適には、ＶＨ及びＶＬ配列の両方が、決定されることが好ましい。一実施形態では、本発明は、個体がＦａｂ部分にＮ結合型グリコシル化を含むＡＭＰＡを含むか否かを判定する方法であって、前記方法は、前記個体由来のＡＭＰＡを含むＢ細胞受容体を有するＢ細胞を収集すること、前記ＡＭＰＡのＶＨ及び／若しくはＶＬ又はその一部をコードする核酸分子を増幅すること、及び、増幅核酸分子がＮ結合型グリコシル化コンセンサス配列であるアミノ酸配列をコードするか否かを判定すること、を備える、方法を提供する。前記ＶＨ及び／又はＶＬタンパク質は、好ましくは、ＣＤＲコード配列であり、好ましくは、ＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ３コード配列である。抗シトルリン化タンパク質抗体ＩｇＧ発現Ｂ細胞のＢ細胞受容体のシーケンシングの例としては、Ｖｅｒｇｏｅｓｅｎ等  （２０１７）（Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ．、Ｄｏｉ：１０．１１３６／ａｎｎｒｈｅｕｍｄｉｓ−２０１７−２１２０５２）を参照されたい。
【００５３】
Ｆａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を有する、ＡＭＰＡ、好ましくは、ＡＡＰＡ抗体、ＡＣＰＡ抗体、又は抗ＣａｒＰ抗体の検出は、典型的には、個体がサンプル収集後直ぐに関節リウマチを発症することの前兆である。『免疫学的変換（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）』の検出、即ち、抗体のＦａｂ部分にＮ結合型糖鎖を含むＡＭＰＡの出現の検出は、好ましくは、可能な限り早期に、好ましくは、有効な（そして理想的には予防的な）治療を開始できるのに十分な長さで、行われる。抗体のＦａｂ部分にＮ結合型糖鎖を有するＡＭＰＡの検出は、典型的には、個体からのサンプル収集からの限られた時間枠内で個体が関節リウマチを発症することの前兆である。
【００５４】
一態様では、本発明は、ＡＭＰＡのＦａｂ部分でのＮ結合型グリコシル化を確かめる新規の方法を提供する。この方法は、翻訳後修飾を含むエピトープを含むタンパク質又はペプチドにサンプルの抗体を接触させること、抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子に前記サンプルの抗体を接触させること、及び、Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する抗体が前記タンパク質／ペプチドに翻訳後修飾を有する前記エピトープに結合しているか否かを判定すること、を備える。
【００５５】
翻訳後修飾を含むエピトープ（以下では、『修飾タンパク質エピトープ』という用語で呼ぶ）は、シトルリン化エピトープ、ホモシトルリン化エピトープ、及び／又はアセチル化リシンエピトープであることが好ましい。これらのエピトープへの抗体は、それぞれ、ＡＣＰＡ、抗ＣａｒＰ、及びＡＡＰＡと呼ばれる。ある実施形態では、翻訳後修飾は、ＭＡＡ又はＡＡ付加物である。マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）及びその分解産物であるアセトアルデヒド（ＡＡ）は、反応性の高いアルデヒドであり、両者がタンパク質を修飾してマロンジアルデヒド−アセトアルデヒド付加物（ＭＡＡ付加物）という名のＭＤＡ−ＡＡタンパク質付加物を生産することが示されている。ＭＡＡ付加物は免疫原性が高い。
【００５６】
本来、修飾はペプチド又はタンパク質の合成後又は合成中にペプチド又はタンパク質に導入され得る。後者の場合、修飾はリボソームにより既に合成されたタンパク質の一部に導入される。実験室では、新生アミノ酸鎖に修飾版のアミノ酸を取り込むことでも修飾を導入できる。実験室では、ペプチド又はタンパク質が修飾を含む人工アミノ酸の存在下で合成され、その結果、当該修飾が新生ペプチド又はタンパク質鎖に取り込まれることが好ましい。
【００５７】
サンプルは、典型的には、血液サンプルであり、好ましくは、血清又は血漿サンプルである。こうしたサンプルは、典型的には、抗体含有サンプルである。他の抗体含有サンプルとしては、例えば、滑液及び唾液が挙げられる。シークエンシングのためには、サンプルが抗体を産生する細胞を含有することが好ましい。こうした実施形態では、サンプルがＢ細胞を含むサンプルであることが好ましい。Ｂ細胞受容体陽性Ｂ細胞は、Ｂ細胞の細胞表面上のＢ細胞受容体の一部として存在する又は分泌される抗体を含有する。Ｂ細胞受容体又はＢＣＲは、Ｂ細胞の外表面上に位置する膜貫通受容体タンパク質である。受容体の結合モイエティは、膜結合抗体から構成され、当該抗体は、全ての抗体と同様に、独自であり無作為に決定された抗原結合部位を有する。ＢＣＲ陽性細胞を有する抗体含有サンプルは、例えば、発現ＢＣＲ又は発現抗体の可変領域をシークエンシングするために、例えば、可変領域がＮ結合型グリコシル化のためのコンセンサス配列を含むか否かを判定するために、用いることができる。Ｂ細胞含有サンプルは、例えば、滑液である。ＩｇＧ抗体は体液の全てでみられる。これらは、ＡＣＰＡ抗体、ＡＣＰＡ抗体、及び抗ＣａｒＰ抗体の判定に最も一般的に用いられるアイソタイプであり、Ｆａｂ部分のグリコシル化を判定するための適切な供給源を形成する。サンプルを本明細書で記載の検出方法で直に用いることもできるし、サンプルから抗体を精製した後に当該抗体を当該方法で用いることもできる。サンプルは、サンプリング時にＲＡを有しない個体のサンプルであることが好ましい。好ましくは、個体は、サンプリング時に、ＲＡ分類症状を、特に、関節炎を発現していない。
【００５８】
サンプルがＡＣＰＡ又は抗ＣａｒＰ抗体を含むか否かを判定するために、さまざまな方法が利用可能である。多数の方法は、シトルリン化又はホモシトルリン化エピトープを含むタンパク質又はペプチドを用いる。ペプチドは、典型的には、６〜５０アミノ酸の間のペプチドである。好ましくは、当該ペプチドは、１２から３０アミノ酸の間のペプチドであり、より好ましくは、１８から２２アミノ酸の間のペプチドであり、最も好ましくは、約２１アミノ酸のペプチドである。前述の範囲は、境界の数値を含む、即ち、１２から３０アミノ酸の範囲は１２アミノ酸のペプチド及び３０アミノ酸のペプチドを含む。ペプチドは、同程度の直鎖ペプチドの感受性及び／又は特異性に依存して、環状ペプチドであってもよいし、そうでなくてもよい。環状ペプチドは、環状性を生成するように任意の分子組成物内で生成することができる。タンパク質は、典型的には、３０以上のアミノ酸を含む。典型的には、５０以上のアミノ酸である。本発明の方法で用いることができるタンパク質の例として、図面に示すものが、即ち、フィブリノーゲンα（図６）、フィブリノーゲンβ（図７）、又はフィブリノーゲンγ（図８）、ヒトアルブミン（図１６）、及びヒトα−１−抗トリプシン（図１７）が挙げられる。特に好ましいペプチドとして、ＣＣＰ１及びＣＣＰ２、好ましくは、ＣＣＰ２が挙げられる。本発明のキットは、ＣＣＰ１及び／又はＣＣＰ２ペプチドを含むことが好ましい。
【００５９】
好ましい実施形態では、本発明の方法で用いるためのペプチド又はタンパク質は、ＲＡを有する患者で、シトルリン化、ホモシトルリン化、及び／又はアセチル化などの翻訳後修飾を受けることが知られているヒトタンパク質（の一部）である。好ましい実施形態では、ペプチドは、ヒトフィブリノーゲン由来のペプチドである。ペプチドは、フィブリノーゲンα（図６）、フィブリノーゲンβ（図７）、又はフィブリノーゲンγ（図８）のいずれか１つのアミノ酸配列に存在する、好ましくは、１２から３０アミノ酸の間の、より好ましくは、１８から２２アミノ酸の間の、最も好ましくは、約２１アミノ酸の連続アミノ酸を含む。別の好ましい実施形態では、ペプチドは、ヒトアルブミン（図１６）又はヒトα−１−抗トリプシン（図１７）由来のペプチドである。ペプチド又はタンパク質は、翻訳後修飾を有するエピトープを含む。エピトープは、未修飾タンパク質に存在する少なくとも１つのリシン（抗ＣａｒＰ又はＡＡＰＡ）又はアルギニン（ＡＣＰＡ）が、いまや、シトルリン、アセチル化リシン、又はホモシトルリンとなっているエピトープであることが好ましい。アセチル化リシン、シトルリン、又はホモシトルリンは、ペプチドの適切なアセチル化又は（ホモ）シトルリン化により導入できる。より適切には、ペプチドは、正しい位置にアセチル化リシン、シトルリン、又はホモシトルリンを有して合成される。
【００６０】
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る、ペプチド、タンパク質、又は分子は、典型的には、表面に結合される。表面は、典型的には、固体表面である。固体表面は、典型的にはプレートに存在するような、平面でもよい。また、固体表面は、ビーズなどの三次元構造であってもよい。また、固体表面は、ゲルマトリックスであるかもしれない。抗体が結合し得る固体表面は、特定材料と非特定材料との容易な分離を促進する。ペプチド及び／又はタンパク質を、カルバミル化形態、シトルリン化形態、又は天然形態で、表面に結合させるために、任意の方法を用いることができる。非限定的例として、直接コーティング又はビオチン−ストレプトアビジンコーティングが挙げられる。ペプチド又はタンパク質を表面に結合させる他の方法が当業者に利用可能である。
【００６１】
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得るさまざまな分子が利用可能である。糖鎖に結合し得る天然タンパク質の例は、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ  ｈｏｍｅｐａｇｅｐ（ｈｔｔｐ：／  ／ｗｗｗ．ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｌｙｃｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ／  ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ／ｍｏｌｅｃｕｌｅ／ｊｓｐ／ｇｂｐＭｏｌｅｃｕｌｅ−ｈｏｍｅ．ｊｓｐ）で見つけられる。ＳＩＧＬＥＣ（シアル酸結合免疫グロブリン型レクチン）は、シアル酸に結合する細胞表面タンパク質のファミリーである。これらは、主に免疫細胞の表面にみられ、Ｉ型レクチンのサブセットである。１４種類の異なる哺乳類ＳＩＧＬＥＣが存在し、多数の異なる機能を提供する。このファミリーは、以前は、ＳＩＧＬＥＣ１、ＳＩＧＬＥＣ２、………、ＳＩＧＬＥＣ１４と番号付けされていた。現在は、多くのＳＩＧＬＥＣが改名されている。ＣＤ２２又はｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ−２２は、ＳＩＧＬＥＣ２とも呼ばれる。これは、成熟Ｂ細胞の表面にみられ、より少ない程度で、いくらかの未熟Ｂ細胞でもみられる。一般的に言えば、ＣＤ２２は、免疫系の過剰活性化と自己免疫疾患の発症とを防ぐ調節分子である。本発明において興味深いことに、ＣＤ２２はそのＮ末端に位置する免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインでシアル酸に特異的に結合する糖結合膜貫通タンパク質である。図２０は、少なくともシアル酸結合ドメインが物理的にＦｃ尾部に結合するというＣＤ２２−Ｆｃ分子の特異的Ｎ糖鎖修飾Ｆａｂ結合特性を示す。ＳＩＧＬＥＣのシアル酸結合部は、典型的には、対応するＳＩＧＬＥＣの細胞外部を含有する。例えば、Ｆｃハイブリッドは容易に作成できる。好ましいＳＩＧＬＥＣはＣＤ２２である。抗体が、Ｎ結合型糖鎖に結合し得る分子の別の供給源である。レクチンが好ましい分子である。多数のレクチンは容易に生産でき、多くが実際に市販されている。抗体又はレクチンは、好ましくは、シアル酸結合抗体又はシアル酸結合レクチンであり、好ましくは、シアル酸結合レクチンである。単糖のシアル酸ファミリーのさまざまメンバー、構造多様性、及び基礎となる糖鎖への結合が、Ｖａｒｋｉ  Ａ、Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＲＤ、Ｅｓｋｏ  ＪＤ等編（２００９）『Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ』（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク））の第１４章に記載されている。また、この章には、さまざまなシアル酸結合レクチン及びそれらの特性性についても記載されている。本発明では、セイヨウニワトコ凝集素（Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；ＳＮＡ）及びイヌエンジュ凝集素（Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；ＭＡＡ）が、Ｆｃ部分のＮ結合型糖鎖をＦａｂ部分のＮ結合型糖鎖から区別するために特に適していることがわかった。そのため、抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得るシアル酸結合レクチンは、好ましくは、ＳＮＡ又はＭＡＡを含み、好ましくは、ＳＮＡを含む（Ｓｔａｄｌｍａｎｎ等、２０１０、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３０（Ｓ１）：���５−９）。明確性のために説明するが、イヌエンジュ凝集素（Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）はＭＡＡと省略するが、ＭＡＡ付加物はタンパク質上のマロンジアルデヒド−アセトアルデヒド付加物（ｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ−ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ  ａｄｄｕｃｔ）を意味する。
【００６２】
好ましい実施形態では、アセチル化リシンエピトープ又はシトルリン化若しくはホモシトルリン化エピトープなどの翻訳後修飾を有するエピトープを含むペプチド又はタンパク質にサンプルの抗体を接触させる工程は、表面に結合されたペプチド又はタンパク質で行われる。ペプチド／タンパク質結合画分は、未結合材料を除去するために洗浄されることが好ましい。その後、もしあるなら、抗体（好ましくは、ＡＡＰＡ抗体、ＡＣＰＡ抗体、及び／又は抗ＣａｒＰ抗体）を含有するペプチド／タンパク質結合画分が、収集され、抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子に接触させられる。次に、サンプルが、Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有するＡＣＰＡ抗体及び／又は抗ＣａｒＰ抗体を含有していたか否かを判定することもできる。これは、さまざまな方法で行える。好ましくは、これは、ヒト抗体（好ましくは、ヒトＩｇＧ）に結合する分子に分子含有サンプルを結合させることにより行われる。未結合分子は、次に、洗浄され、もしあるなら結合分子が標識で検出できる。好ましくは、分子は標識を含む。標識が検出されたら、Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する抗体がペプチド内のシトルリン化エピトープ（ＡＣＰＡ）又はホモシトルリン化エピトープ（抗ＣａｒＰ）に結合されており、サンプルがＦａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有するＡＣＰＡ及び／又は抗ＣａｒＰを含有していたと判定される。
【００６３】
別の好ましい実施形態では、抗体含有サンプルが、ＡＭＰＡを、好ましくは、ペプチド内のアセチル化リシンエピトープ、シトルリン化又はホモシトルリン化エピトープに結合し得る抗体を含むか否かを判定する方法は、
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子に前記サンプルの抗体を接触させること、及び、結合抗体を収集すること、及び、
もしあるなら、収集抗体を、翻訳後修飾エピトープを含むペプチド、好ましくは、アセチル化リシンエピトープ、シトルリン化又はホモシトルリン化エピトープを含むペプチドに接触させること、を備える。
好ましい実施形態では、サンプルの抗体は、まず、サンプル中の他の材料から分離され、そして、ヒト抗体に結合する分子にサンプルを結合させることで収集される。こうして、Ｎ結合型糖鎖を含み得る他の分子は本方法には持ち込まれない。次に、サンプルが、Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有するＡＭＰＡを、好ましくは、ＡＡＰＡ抗体、ＡＣＰＡ抗体、及び／又は抗ＣａｒＰ抗体を含有していたか否かを判定できる。これは、さまざまな方法で行える。好ましくは、これは、ＡＭＰＡに特異的な、好ましくは、ＡＡＰＡ、ＡＣＰＡ、及び／又は抗ＣａｒＰに特異的なＥＬＩＳＡを含む方法により行われる。サンプルの抗体は、アセチル化リシン、シトルリン化又はホモシトルリン化エピトープを含むペプチド／タンパク質と接触させられることが好ましい。ペプチド／タンパク質は表面に結合されることが好ましい。結合抗体は、次に、ヒト抗体（好ましくは、ＩｇＧ）に結合し得る分子により検出される。分子は標識を含むことが好ましい。
【００６４】
好ましい実施形態では、サンプルの抗体は、まず、サンプル中の他の材料から分離され、そして、ヒト抗体に結合する分子にサンプルを結合させることで収集される。こうして、Ｎ結合型糖鎖を含み得る他の分子は本方法には持ち込まれない。
【００６５】
本発明は、さらに、個体の抗体サンプルが、Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有するＡＭＰＡを、好ましくは、ＡＡＰＡ、ＡＣＰＡ、及び／又は抗ＣａｒＰ抗体を含むか否かを判定する方法であって、前記方法は、Ｆａｂ部分上のＮ結合型糖鎖が、抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子、好ましくは、シアル酸結合分子、好ましくは、ＳＮＡ又はＭＡＡを用いて検出されることを特徴とする、方法を含む。
【００６６】
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖を検出する工程は、有利には、本明細書に示すように、シアル酸に特異的に結合する分子に抗体又はそのＦａｂ部分を接触させることにより行うことができる。これは、抗体含有サンプルのハイスループットな検査を促進する。また、精製抗体調製物から得た糖鎖調製物で質量分析を行うこともできる。本明細書のさまざまな図面に示すように、こうした調製物の質量分析によれば、抗体から得た糖鎖の構造を開示するスペクトルが得られる。シアル酸含有糖鎖は、こうしたスペクトルで容易に識別することができる。自己抗体又はその抗原結合断片は、例えば、ビーズ上にコートされた特異的抗原に結合するに任せ、その後、１回以上洗浄して未結合抗体を除去することにより、調製物内の他の抗体から精製できる。Ｎ結合型糖鎖は、実施例で示した酵素切断により、こうしたビーズ又は溶出抗体（断片）から収集できる。収集糖鎖は、次に、質量分析により同定できる。質量分析は、かつては時間が掛かる試みであったが、いまや迅速に最適化及び簡素化が進んでおり、ハイスループット用途向けの媒体に適したものとなっている。適切な質量分析システムの例としては、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）から販売のシステム、例えば、Ｇｌｙｃｏｗｏｒｋｓ  ＲａｐｉＦｌｕｏｒ−ＭＳ  Ｎ−Ｇｌｙｃａｎ  ｋｉｔの商品名のものが挙げられる。
【００６７】
ヒト抗体に結合し得る分子は、抗体、例えば、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体であってもよい。他の分子としては、プロテインＡ及びプロテインＧが挙げられる。プロテインＡは、細菌である黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁で最初に見つかった４２ｋＤａの表面タンパク質である。プロテインＧは、Ｃ群及びＧ群のレンサ球菌内で発現する免疫グロブリン結合タンパク質であり、プロテインＡとよく似ているが結合特性が異なる。
【００６８】
本発明は、さらに、サンプル中での、好ましくは、シトルリン、ホモシトルリン、及び／又はアセチル化リシンに結合する、ＡＭＡＰの、好ましくは、ＡＡＰＡ抗体、ＡＣＰＡ抗体、及び／又は抗ＣａｒＰ抗体の検出に有用なパーツのキットを含む。キットは、翻訳後修飾を有するエピトープを含むペプチド、好ましくは、アセチル化リシンエピトープ、シトルリン化又はホモシトルリン化エピトープを含むペプチドと、抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子とを含むことが好ましい。Ｎ結合型糖鎖に結合し得るペプチド又は分子は、表面に結合されることが好ましい。キットは、さらに、ヒト抗体に結合し得る分子を含むことが好ましい。抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子は、好ましくは、シアル酸結合レクチンであり、好ましくは、ＳＮＡ又はＭＡＡであり、好ましくは、ＳＮＡである。分子は標識を含むことが好ましい。
【００６９】
抗体サンプルは、個体のサンプルであることが好ましい。好ましくは、ＲＡ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶを有しない個体のものである。好ましい実施形態では、サンプルは、Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を含まない前述の疾患に関連する自己抗体（ＡＭＰＡ、好ましくは、ＡＡＰＡ、ＡＣＰＡ、及び／又は抗ＣａｒＰ抗体など）の存在についての早期サンプルの検査が陽性であった個体に由来するサンプルである。ＡＭＰＡなどの自己抗体は、自己抗体の１０％以下が当該抗体のＦａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を含む場合に、前記抗体のＦａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有しない（又は当該糖鎖について陰性である）とみなされる。そこで、一態様では、早期サンプル内の自己抗体（好ましくは、ＡＭＰＡ）の１０％以下がＦａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を含む。本発明は、さらに、関節炎、シェーグレン症候群、又はＡＡＶを発症する危険性のある個体を監視する方法であって、前記方法は、前記個体の定期的抗体含有サンプルにおいて前述の疾患に関連する自己抗体（ＡＭＰＡ、好ましくは、ＡＡＰＡ、ＡＣＰＡ、及び／又は抗ＣａｒＰ抗体など）の存在及び／又は発現を監視することを備え、前記方法は、検出抗体が当該抗体のＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型糖鎖を含むか否かを判定することをさらに含むことを特徴とする、方法を含む。本発明の方法は、特に、未病の『危険相』から疾患相（ＲＡなど）に転換について、個体の集団をスクリーニングすることに適している。このために、本発明の方法で検査されるサンプルは、ＲＡについて予め検査されていた個体に由来するサンプルであることが好ましい。抗体は、ＡＡＰＡ抗体、ＡＣＰＡ抗体、及び／又は抗ＣａｒＰ抗体であることが好ましい。
【００７０】
抗体のＦａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有するＡＭＰＡ（好ましくは、ＡＡＰＡ、ＡＣＰＡ、及び／又は抗ＣａｒＰ抗体）の検出の際に、個体は、関節炎（好ましくは、関節リウマチ）を、好ましくは、関節炎薬剤（好ましくは、関節リウマチ薬剤）で、治療されてもよい。本明細書で上述したように、早期治療は患者に有益である。また、発症前治療がＲＡを発症する危険性のある個体に有益である。治療は、広範であり、典型的には、完全に副作用なし又はその可能性なしというわけにはいかない。発症前治療を、できるだけ早く、即ち、ＲＡの症状が予測され、少なくとも症状が切迫しているときに、開始することが好ましい。
【００７１】
人はいつでも疾患を引き付ける可能性がある。ある人は、本明細書に記載の方法を用いてその人が正常集団よりも増大した危険性を有する場合に危険性があるといえる。例えば、ＲＡを有しないがＡＭＰＡを有する人は、ＲＡを発症する増大した危険性を有する。こうした個体が、本明細書に記載の方法で検査され、Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有するＡＭＰＡを有することがわかった場合、その人は、ＡＭＰＡ陽性ＲＡ陰性個体集団全体と比べて、ＲＡを発症する増大した危険性を有する。ある人は、当該個体の抗体含有サンプル内で１０％より多くのＡＭＰＡ抗体がＦａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する場合に、好ましくは、当該個体の抗体含有サンプル内で、２０％より多く、好ましくは、３０％より多く、好ましくは、５０％より多く、好ましくは５５％より多くのＡＭＰＡ抗体がＦａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する場合に、Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有するＡＭＰＡを有する。以上はシェーグレン症候群又はＡＡＶを発症する危険性のある個体についても適用される。例えば、シェーグレン症候群又はＡＡＶを有しないがこれらの疾患に関連する自己抗体を有する人は、シェーグレン症候群又はＡＡＶを発症する増大した危険性を有する。こうした個体が、本明細書に記載の方法で検査され、Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する前記自己抗体を有することがわかった場合、その人は、前記自己抗体陽性シェーグレン症候群又はＡＡＶ陰性個体集団全体と比べて、シェーグレン症候群又はＡＡＶを発症する増大した危険性を有する。ある人は、当該個体の抗体含有サンプル内で１０％より多くの自己抗体がＦａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する場合に、好ましくは、当該個体の抗体含有サンプル内で、２０％より多く、好ましくは、３０％より多く、好ましくは、５０％より多く、好ましくは５５％より多くの自己抗体がＦａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する場合に、Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する自己抗体を有する。
【００７２】
そこで、本発明は、さらに、個体の治療方法に使用するための関節炎薬剤であって、当該方法は、前記個体の抗体含有サンプルに、Ｆａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含んでいるＡＭＰＡ、好ましくは、ＡＡＰＡ、ＡＣＰＡ、及び／又は抗ＣａｒＰ抗体が、存在するかしないかを判定すること、及び、Ｆａｂ部分にＮ結合型グリコシル化を含む前記抗体、好ましくは、ＡＡＰＡ、ＡＣＰＡ、及び／又は抗ＣａｒＰ抗体が検出された場合に前記個体を治療すること、を備える、薬剤を提供する。
【００７３】
また、関節リウマチ症状又はその発症について個体を治療する方法であって、前記方法は、
サンプルが、Ｆａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含むＡＭＰＡを、好ましくは、ＡＡＰＡ、ＡＣＰＡ、及び／又は抗ＣａｒＰ抗体を含有するか否かを判定すること（但し、前記サンプルは、前記個体の抗体含有サンプルであり、前記個体は、サンプリング時に関節リウマチを有さず）、及び、
前記個体が関節リウマチ症状を示し始める前又は示し始めた時に、関節リウマチ薬剤で、前記個体を治療すること、
を備える、方法も提供される。
【００７４】
ＲＡは、多くの異なる薬剤が利用可能な疾患である。好ましい薬剤は、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）である。ＤＭＡＲＤは、疾患進行を遅くするために関節リウマチで用いられることで定義され、他の点では関連のない薬のカテゴリーである。この用語は、しばしば、合成ＤＭＡＲＤ（ｓＤＭＡＲＤ、従来又は標的）又は生物学的ＤＭＡＲＤに分類され、非ステロイド性抗炎症薬（炎症を治療するが原因は治療しない剤を指す）及びステロイド（免疫応答を鈍らせるが疾患の進行を遅くするには十分ではない）とは対照的に用いられる。一実施形態では、本発明で呼ぶところの関節リウマチ薬剤は、非ステロイド性抗炎症薬又はステロイドである。好ましい実施形態では、関節リウマチ薬剤は、ｓＤＭＡＲＤである。メトトレキサートは好ましいｓＤＭＡＲＤである。他の好ましいＤＭＡＲＤとしては、アバタセプト、アダリムマブ、トシリズマブ、アザチオプリン、クロロキン及びヒドロキシクロロキン、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、レフルノミド、メトトレキサート、リツキシマブ及びスルファサラジンが挙げられる。加えて、トファシチニブなどの小分子阻害剤は、いくつかの国で利用可能な新規クラスのキナーゼ阻害剤を表す。好ましい実施形態では、ＤＭＡＲＤは、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）に結合し得るモノクローナル抗体である。関節リウマチ薬剤は、２種以上の薬剤の組み合わせでもよく、この組み合わせの１種以上はＤＭＡＲＤである。
【００７５】
検査個体は、当該個体が関節リウマチ症状を示し始める前又は示し始めた時に関節リウマチ薬剤を提供されることが好ましい。
【００７６】
ＡＡＶ又は一次シェーグレン症候群の治療のための薬剤は、ヒドロキシクロロキン、メトトレキサート、アザチオプリン、レフルノミド、グルココルチコイド、リツキシマブ、シクロホスファミド、又はミコフェノレートの１種以上であることが好ましい。
【００７７】
抗原結合（Ｆａｂ）部分は、抗原に結合する抗体上の領域、いわゆる、可変ドメインを含む。これは、抗体内の可変ドメインと関連する定常ドメインをさらに含むことが好ましい（まとめて、しばしば、Ｆａｂ断片と呼ばれる）。Ｆａｂ部分は、抗体の、重鎖の一部及び軽鎖の一部から構成される。Ｆｃ及びＦａｂ断片は研究室内で生成できる。パパイン酵素を用いて、免疫グロブリンモノマーを切断して２つのＦａｂ断片とＦｃ断片とを得ることができる。ペプシン酵素はヒンジ領域の下を切断するので、Ｆ（ａｂ’）２断片及びｐＦｃ’断片が形成される。最近、Ｆ（ａｂ’）２を生成するための別の酵素が市販されている。ＩｄｅＳ酵素（化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の免疫グロブリン分解酵素、商品名ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ）は中性ｐＨで配列特異的にＩｇＧを切断する。
【００７８】
方法の多くは、完全な抗体の代わりに、方法の一部又は全てで、Ｆａｂ部分又はＦａｂ断片を用いて、行われる。そのため、こうした方法も、本発明で提供される。これは典型的には当業者にとって明らかである。
【００７９】
抗体は、それらがサンプル中の他の抗体から分離された場合に、精製される。精製抗体は、典型的には、１種以上の特性に基づいて、他の抗体から分離される。結果として、精製抗体は、分離に用いた１種以上の特性を共有する。精製抗体は、１種の抗体のみを含まねばならないわけではない。ＡＭＰＡ抗体の場合、全ての精製抗体が、（例えば）ＣＣＰ２に結合するものの異なる可変ドメインを有することが可能であることが好ましい。同様に、抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合する分子への結合に基づき精製された抗体は、こうして精製された全ての抗体が当該分子に結合する限り、異なるＦａｂ部分結合糖鎖を有し得る。ある方法は、少なくとも１つの画分が精製前のサンプル内での百分率よりも高い画分中の全抗体に対する精製抗体の百分率を有するような複数の画分にサンプルの抗体を分離する場合に、抗体を精製する方法である。換言すれば、精製抗体は、実質的に純粋である必要はない。ただし、典型的には、精製サンプルが、サンプル中の全抗体に対して精製種を、少なくとも７０％、より好ましくは、少なくとも８０％、好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％含むことが好ましい。
【００８０】
個体が所与の期間内でＲＡを発症する危険性の判定は、個体が、Ｆａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を有するＡＭＰＡ（好ましくは、ＡＡＰＡ、ＡＣＰＡ、及び／又は抗ＣａｒＰ抗体）を有することを判定することにより行われる。こうした抗体の同定は、示した期間内に患者がＲＡを発症する増加した危険性を示す。こうした抗体が検出される水準は、ＲＡ症状を発症するまでの実際の時間に関するものさしである。高水準は疾患の発症が予期されることを示す。水準はサンプル中の抗体の全量に対して求められることが好ましい。好ましくは、水準はサンプル中の全ＡＡＰＡ、ＡＣＰＡ、及び／又は抗ＣａｒＰに対して求められる。
【００８１】
また、本発明は、Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を含む抗体の測定のための抗体を精製する方法であって、
抗体サンプルを準備すること、
修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む固体表面に前記サンプルを接触させること、
未結合抗体を除去し、結合抗体を前記固体表面から溶出させること、
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子を含む固体表面とともに溶出抗体をインキュベートすること、
未結合分子を除去すること、及び、
結合抗体が前記サンプルにおける抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖の存在を示す、抗体が前記固体表面に結合したか否かを判定すること、
を備える、方法を提供する。
必ずしも完全な抗体を精製する必要はない。サンプル中の抗体は、例えば、Ｆａｂ部分及びＦｃ断片に断片化されてもよく、次に、これらのＦａｂ部分断片が精製される。
【００８２】
また、本発明は、Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する抗体の測定のための抗体を精製する方法であって、
抗体サンプルを準備すること、
修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む固体表面に前記サンプルを接触させること、
未結合抗体を除去すること、
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子とともに固体表面をインキュベートすること、
未結合分子を除去すること、及び、
結合分子が前記サンプルにおける抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖の存在を示す、分子が前記固体表面に結合したか否かを判定すること、
を備える、方法を提供する。
【００８３】
さらに、Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する抗体の測定のための抗体を精製する方法であって、
抗体サンプルを準備すること、
修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む固体表面に前記サンプルを接触させること、
未結合抗体を除去すること、
前記抗体から糖鎖を分離する酵素とともに結合抗体をインキュベートすること、
糖鎖を収集すること、及び、
収集糖鎖がＦａｂ部分特異的糖鎖を含むか否かを判定すること、
を備え、
前記サンプルは、ＲＡ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶを発症する危険性のある個体の抗体サンプルであることを特徴とする、方法が提供される。
【００８４】
また、Ｆａｂ部分上にＮ結合型グリコシル化を有する抗体を精製する方法であって、
抗体サンプルを準備すること、
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子を含む固体表面とともに前記サンプルをインキュベートすること、
前記固体表面を洗浄し、結合抗体を収集すること、
修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質とともに収集抗体をインキュベートすること、
未結合抗体を除去すること、及び、
前記ペプチド又はタンパク質が結合抗体を有していたか否かを判定すること、
を備える、方法が提供される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、サンプルは精製抗体を含む。この場合、抗体は、典型的には、抗体に結合する結合剤によりサンプルの他のタンパク質から分離される。適切な剤としては、プロテインＡ又はプロテインＧが挙げられる。
【００８６】
また、抗体サンプルを準備すること、
修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む固体表面に前記サンプルを接触させること、
未結合抗体を除去すること、
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子とともに前記固体表面をインキュベートすること、
未結合分子を除去すること、及び、
分子が前記固体表面に結合したか否かを判定すること、
を備える、方法が提供される。
【００８７】
サンプルは、ＲＡ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶを発症する危険性のある個体の抗体サンプルであることが好ましい。好ましくは、サンプルは、早期抗体サンプルが自己抗体の検査で陽性であった個体の抗体サンプルである。好ましくは、前記早期抗体サンプルの前記自己抗体の１０％以下がそのＦａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を含む。前記自己抗体はＡＭＡＰであることが好ましい。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｆａｂ及びＦｃ断片を生産するために、切断される。
【００８８】
抗体は、さまざまな手段で固体表面から溶出できる。典型的には、これは、周囲の流体のｐＨ及び／又は塩濃度を変化させることで達成される。抗体は、一般的に、固相又は固体表面上の吸収剤に、吸収され、結合される。溶出は、『溶出液』と呼ばれる液体を吸収剤／抗体コンプレックスを通過させることにより吸収剤から検体を除去する処理である。溶剤分子が『溶出』又はカラムを通り下に移動するにつれて、溶剤分子は、吸収剤／検体コンプレックスの横を通り過ぎる、又は、検体の場所にある吸収剤に結合することで当該検体を置き換えることができる。溶剤分子が検体を置き換えた後、検体は分析用カラムから運び出され得る。
【００８９】
未結合抗体は、典型的には、固相をバッファーで洗浄することにより除去される。適切なバッファーは、抗体を固体表面上に載せるために用いられたバッファーである。リン酸緩衝生理食塩水は適切なバッファーである。
【００９０】
固体の定期的抗体含有サンプルは、固体の生活の異なる時点で取られたサンプルである。時点の間の間隔は変わり得る。それぞれのサンプルの間の時間は、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年、又はさらに長くてもよい。サンプルの間の期間は、自己抗体がＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖について陰性である場合は、もっと長くてもよい。一連の定期的サンプルのサンプル間期間は、代わり得、とても短くても（数日）、２年を超えてとても長くてもよく、一個体の定期的サンプルのものでそうなってもよい。
【００９１】
サンプリング時とは、個体のサンプルが収集される日である。サンプルの採取は、請求項の一部でもよいが、典型的には、請求項の一部ではない。本方法で提供される請求項で呼ぶところのサンプルは、典型的には、権限保持者により収集され、次に、本明細書に記載の方法に提供するために手渡される。
【００９２】
記載を明確にするため、同一の又は別の実施形態の一部として同じ記載特徴が本明細書で記載されるが、ただし、本発明の権利範囲は記載の特徴の全て又はいくつかの組み合わせを有する実施形態を含んでもよいことを理解されたい。
【００９３】
本発明は、さらに、抗体がＮ結合型糖鎖を含むか否かを判定する方法であって、前記方法は、抗体含有サンプルからＡＭＰＡを精製すること、及び、前記ＡＭＰＡが、表１のＨ５Ｎ４Ｓ２、Ｈ５Ｎ５Ｆ１Ｓ１、Ｈ５Ｎ４Ｆ１Ｓ２、Ｈ５Ｎ５Ｓ２、Ｈ５Ｎ５Ｆ１Ｓ２、及び／又はＨ６Ｎ５Ｆ１Ｓ２の糖鎖を含むか否かを検出すること、を含む、方法を提供する。好ましい実施形態では、前記方法は、さらに、前記糖鎖が検出された場合に、前記糖鎖が前記抗体のＦａｂ部分上に存在するか否かを判定することを含む。
【００９４】
【表１】
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ＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＩｇＧでみられる糖鎖の命名法。Ｇ２Ｓ２、Ｇ２ＦＳ１Ｂ、Ｇ２ＦＳ２、Ｇ２Ｓ２Ｂ、Ｇ２ＦＳ２Ｂは、これらの糖鎖構造がＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＩｇＧのＦａｂ断片により高度に発現され且つＦｃ断片上で低度に発現され又は発現していないため、Ｆａｂ糖鎖と考えられる。
【００９５】
（実施例）
（実施例１）
（材料と方法）
〔患者サンプル〕
ＡＣＰＡグリコシル化を全ＩｇＧグリコシル化と比較する実験のため、９名のＡＣＰＡ陽性ＲＡ患者から血漿（ｎ＝６）及び滑液（ｎ＝３）サンプルをＬＵＭＣ（ライデン大学メディカルセンター）のリウマチ科の外来診察室で収集した。全てのＲＡ患者は関節リウマチ分類基準（１９８７年、米国リウマチ学会）を満たした。
【００９６】
ＡＣＰＡ陽性ＲＡ患者及びそのＡＣＰＡ陽性健常近親者由来のＡＣＰＡのＡＣＰＡ−Ｆａｂ糖鎖を比較する実験のため、カナダの複数のリウマチ診療所で５３名のＡＣＰＡ陽性ＲＡ患者及びその未罹患ＡＣＰＡ陽性第一度近親者から血清サンプルを収集した。ＲＡ有病率はこれらのコミュニティにおいて一般的な白人集団よりも相当に高く、ＡＣＰＡは患者の健常近親者で増大した頻度で存在した［１，２］。ＲＡ患者は関節リウマチ分類基準（１９８７年、米国リウマチ学会）を満たした。
【００９７】
〔抗体精製〕
ライデンで収集したサンプルのＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＩｇＧを、既述のように［３］、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（Ａ¨ＫＴＡ、ＧＥヘルスケア製）で精製した。簡単に説明すると、サンプルを、ビオチン化ＣＣＰ２−シトルリン−ＨｉＴｒａｐ−ストレプトアビジンカラムが後に直列に接続されているビオチン化ＣＣＰ２−アルギニン−ＨｉＴｒａｐ−ストレプトアビジンカラム（ＧＥヘルスケア製）に載せた。フロースルー（ＦＴ）画分及びＡＣＰＡ溶出画分を、さらに、ＨｉＴｒａｐプロテインＧ上に載せ、その後、ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラム上に載せた（両方ともＧＥヘルスケア製）。ＡＣＰＡ枯渇ＩｇＧ（対照ＩｇＧ）及びＡＣＰＡ−ＩｇＧの精製画分をサイズ排除クロマトグラフィーにより濃縮脱塩した。
【００９８】
ＡＣＰＡ−ＩｇＧはマイクロビーズシステムを用いてカナダ人サンプルから精製した。簡単に説明すると、２５μｌの血漿又は血清を、ビオチン化ＣＣ（ｃｉｔ）Ｐペプチドに結合されたニュートラアビジンビーズに載せた。このサンプルを２時間インキュベートし、ＡＣＰＡをギ酸で溶出させてから、中和してｐＨを７．５とした。ＡＣＰＡ溶出画分をさらにＰｒｏｔ  Ｇビーズに載せＡＣＰＡ−ＩｇＧを最終的に得た。
【００９９】
〔構造分析〕
ＡＣＰＡを一般的なＩｇＧと比較するための構造分析を、単離ＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＩｇＧのＦ（ａｂ）２又はＦｃ断片で行った。Ｆ（ａｂ）２又はＦｃ断片は、ＩｄｅＳ（ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ、ジェノビス（Ｇｅｎｏｖｉｓ）製）での抗体消化により生成し、ＩｇＧ−Ｆｃ／ＣＨ１  ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｅａｄｓ（サーモフィッシャー製）により精製した。（ＡＣＰＡ）−ＩｇＧのＦ（ａｂ）２又はＦｃ断片由来のＮ糖鎖をＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いて溶液中に遊離させた。糖鎖を、２アミノ安息香酸（２−ＡＡ）で標識し、親水性相互作用クロマトグラフィー固相抽出（ＨＩＬＩＣ−ＳＰＥ）により精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）及び超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）により解析した。
【０１００】
ＡＣＰＡ陽性ＲＡ患者及びその健常近親者由来のＡＣＰＡのＡＣＰＡ−Ｆａｂ糖鎖を比較するための実験のため、構造分析を単離ＡＣＰＡ−ＩｇＧで行った。ＡＣＰＡ−ＩｇＧのＮ糖鎖をＰＮＧａｓｅを用いて溶液中に遊離させた。加えて、糖鎖を、２アミノ安息香酸（２−ＡＡ）で標識し、親水性相互作用クロマトグラフィー固相抽出（ＨＩＬＩＣ−ＳＰＥ）により精製し、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）により解析した。
【０１０１】
〔データ及び統計分析〕
ＵＨＰＬＣデータをＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎ  ７で分析した。このソフトはクロマトグラムの曲線下面積を計算する。糖鎖ピーク及びグリコシル化由来特性を既述の通り［４］明らかにした。ガラクトシル化、シアル化、及びフコシル化の百分率、並びに、ＩｇＧのバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン残基の頻度を、計算した。加えて、（ＧＰ１９からＧＰ２４までの合計）÷（ＧＰ１からＧＰ１４までの合計）×１００％という式を用いて、Ｆａｂグリコシル化百分率を計算した。統計分析はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を用いて行った。ノンパラメトリック・ペアード・ウィルコクソン検定をｐ＜０．０５の有意水準で適用した。
【０１０２】
《結果》
最近、発明者等は、ＲＡ患者から得たＡＣＰＡ−ＩｇＧが、非自己反応性ＩｇＧに比べて、１０〜２０ｋＤａ高い分子量を示すことを発見した。この特徴は、また、ＡＣＰＡ−ＩｇＧをリコール抗原に対する抗体又は他の疾患特異的自己抗体から際立たせた。構造分析は、ＡＣＰＡの（超）可変ドメイン（Ｆ（ａｂ）ドメイン）でのＮ結合型糖鎖の百分率がこの観察結果の原因であることを示した。Ｎ結合型糖鎖が位置する正確な部位の解明は、タンパク質のＮ結合型グリコシル化に必要なＮ結合型コンセンサス配列が、生殖細胞系にコードされておらず、体細胞超変異の際に導入されることを明らかにした［５］。ＡＣＰＡ上に存在するＮ結合型Ｆａｂ糖鎖の構造分析は、Ｆａｂ結合型糖鎖の組成が、Ｆｃ結合型糖とは異なり、より重要なことに、これらが高度にシアル化されていることを示した（図１）。さらに、定量に基づき、発明者等が評価したところ、血清中に存在するＡＣＰＡ分子の９０％超がＦ（ａｂ）糖鎖を持っており、この百分率は滑液中のＡＣＰＡではずっと高い。
【０１０３】
目覚ましいことに、発明者等の予備データは、高グリコシル化ＡＣＰＡの頻度が健常ＡＣＰＡ陽性近親者由来のＡＣＰＡでは顕著に低いことを示す（図２）。これは、健常個体に存在するＡＣＰＡはグリコシル化に必要なＡＣＰＡ可変領域にＮ結合型グリコシル化部位をまだ導入していないことを示すため、興味深い。
【０１０４】
上述の方法論はハイスループットアッセイに転用できるものの、ＡＣＰＡのＦ（ａｂ）高グリコシル化を検出するための現在のアッセイは、時間が掛かり、ハイエンドな質量分析機と専門技能を必要とする。そのため、日常的なルーチンで用いることのできるより便利な方法が好ましい。レクチンＳＮＡ（セイヨウニワトコ凝集素）への抗体の結合がＦ（ａｂ）グリコシル化により主に仲介されており、２つのシアル残基がＳＮＡへの結合のために必要なことが示されている。ＳＮＡは還元条件（これによりＣＨ２ドメイン間の接触面が開く）下でのみＦｃ部分に結合する［６−８］。大多数のＡＣＰＡのＦ（ａｂ）糖鎖は２つのシアル酸残基を含有するので、ＲＡ患者由来の血清抗体のＳＮＡ結合はＡＣＰＡについて富化される可能性が高い。そのため、ＡＣＰＡのＦ（ａｂ）糖鎖を検出するためのＳＮＡ結合型アプローチは、ハイエンドな質量分析機を必要とせずにこれらの糖鎖の存在を可視化するための有望な戦略といえる。そのため、発明者等は、ＳＮＡ検出に基づくハイスループット法を確立するために２つのアプローチに乗り出した。これらのアプローチは、ＡＣＰＡのＦ（ａｂ）糖鎖の検出をハイスループットなやり方でできるような標準化プロトコルの開発を目的とする。
【０１０５】
第１アプローチ（図３）では、まず、ＣＣＰコートマイクロビーズを用いてＡＣＰＡを捕捉する（上）。これらのビーズからのＡＣＰＡの溶出の後、標識ＳＮＡを用いてＦ（ａｂ）糖鎖の存在を可視化する（下）。発明者等の予備データは、Ｆ（ａｂ）糖鎖が、抗原と直接に相互作用するのではなく、従って、ＳＮＡにアクセス可能であるかもしれないことを示しているので、ビーズからのＡＣＰＡの溶出は必要というわけではなく、ＳＮＡをＡＣＰＡのＦ（ａｂ）糖鎖に直に結合させることもできると想到される。そのため、この可能性についても試験する。
【０１０６】
第２アプローチ（図４Ａ１）では、反対の戦略を取り、まず、ＳＮＡ上にＦ（ａｂ）グリコシル化ＩｇＧ（ＡＣＰＡ）を固定し、その後、ＣＣＰ−ＥＬＩＳＡを用いてＡＣＰＡを検出する。発明者等の予備データは、このアプローチが、実行可能であり、ハイスループットなやり方で用いることができることを示す（図４Ａ２）。現時点では、このアプローチは、シアル酸分子を持ち且つ血清中に存在する他の分子によるＳＮＡの『過剰充填（ｏｖｅｒｌｏａｄｉｎｇ）』を防ぐためのプロテインＡによるＩｇＧの事前単離（ｐｒｅ−ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）を含む。
【０１０７】
（実施例２）
（材料と方法）
〔患者サンプル〕
９名のＡＣＰＡ陽性ＲＡ患者から血漿（ｎ＝６）及び滑液（ｎ＝３）サンプルをライデン大学メディカルセンターのリウマチ科の外来診察室で収集した。全てのＲＡ患者は、関節リウマチ分類基準（１９８７年、米国リウマチ学会）を満たし、書面によるインフォームドコンセントを受けた［９］。治療は、疾患修正性抗リウマチ薬、生物学的薬剤、及び糖質コルチコイドを含んでいた。
【０１０８】
〔用いた化学物質、溶剤、及び酵素〕
ＴＦＡ、ＳＤＳ、リン酸水素二ナトリウム・二水和物、ＨＣＬ、グリシン、β−メルカプトエタノール、酢酸、及びＮａＣｌは、メルク（独国、ダルムシュタット）から購入した。５０％水酸化ナトリウム及びノニデットＰ−４０代替品、ヒアルロニダーゼ（ウシ精巣由来、タイプＩＶ）、ＥＤＴＡ、２−アミノ安息香酸、ボラン−２−ピコリンコンプレックス、水酸化アンモニウム、ＤＭＳＯ、及びギ酸は、シグマ・アルドリッチ（米国、セントルイス）から得た。Ｔｒｉｓはロシュ（米国、インディアナ）から購入し、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液をバイオ・ラッド（米国、カルフォルニア）から得た。Ｐｅｐｔｉｄｅ：Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ  Ｆ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）をロシュ・ダイアグノスティックス（独国、マンハイム）から、２，５−ジヒドロキシ安息香酸をブルカー・ダルトニクス（独国、ブレーメン）から、及びＨＰＬＣ  ＳｕｐｒａＧｒａｄｉｅｎｔ  ＡＣＮをバイオソルブ（蘭国、ファルケンスワールト）から購入した。全体を通して、ＭＱ（ミリＱ脱イオン水、Ｒ＞１８．２ＭΩｃｍ−１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｑ−Ｇａｒｄ  ２  ｓｙｓｔｅｍ、ミリポア、蘭国、アムステルダム）を用いた。ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ａｎｔｉ−ＩｇＧ  Ｆｃ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｒｉｘ及びａｎｔｉ−ＣＨ１  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｒｉｘをライフ・テクノロジーズ（蘭国、ライデン）から購入した。空のスピンカラム（閉じたスクリューキャップ、挿入されたプラグ、大型１０ｕｍフィルター付属）はＭｏＢｉＴｅｃ（独国、ゲッティンゲン）から提供された。ＰＢＳをビー・ブラウン（独国、メルズンゲン）から、ＩｄｅＳ酵素（商品名：ＦａｂＲＩＣＡＴＯＲ）をジェノビス（典国、ルンド）から得た。ＣＣＰ２アルギニン（対照）及びＣＣＰ２シトルリンペプチドは、Ｊ．Ｗ．Ｄｒｉｊｆｈｏｕｔ博士（蘭国、ライデン大学メディカルセンター（ＬＵＭＣ）、ＩＨＢ科）の好意により提供された。
【０１０９】
〔ＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＡＣＰＡ枯渇ＩｇＧの精製〕
ＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＩｇＧを、既述のように［５］、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（Ａ¨ＫＴＡ、ＧＥヘルスケア製）で精製した。サンプルを、ビオチン化ＣＣＰ２−シトルリン−ＨｉＴｒａｐ−ストレプトアビジンカラムが後に直列に接続されているビオチン化ＣＣＰ２−アルギニン−ＨｉＴｒａｐ１２６−ストレプトアビジンカラム（ＧＥヘルスケア製）に載せた。フロースルー（ＦＴ）及びＡＣＰＡ溶出画分を、さらに、ＨｉＴｒａｐプロテインＧ上に載せ、その後、ＨｉＴｒａｐプロテインＡカラム上に載せた（両方ともＧＥヘルスケア製）。その後、アイソタイプ１、２、及び４の精製ＩｇＧ及びＡＣＰＡ−ＩｇＧを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＺｅｂａＳｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ、７Ｋ  ＭＷＣＯ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により製造者の説明に従い濃縮脱塩した。
【０１１０】
〔Ｆｃ及びＦ（ａｂ’）２断片の生成及び精製〕
組換ストレプトコッカスＩｄｅｓ酵素を用いてＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＡＣＰＡ枯渇ＩｇＧを特異的に切断しＦｃ部分及びＦ（ａｂ’）２部分を得た。既述のように［５］簡略化のために供給元のプロトコルを調整した。簡単に説明すると、各サンプルについて、（ＡＣＰＡ）−ＩｇＧ抗体３０μｇを、遠心エバポレーター下で乾燥させ、ＩｄｅＳ  ３０Ｕを含む消化バッファー（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）２００μＬを添加し、オーバーナイトにわたり３７℃でインキュベートすることで、消化した。その後、１０μＭフィルタースピンカラム上に載せたａｎｔｉ−ＩｇＧ  Ｆｃ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｒｉｘ（ビーズスラリー）でのアフィニティークロマトグラフィーによりＦ（ａｂ’）２からＦｃ部分を分離した。Ｆｃ断片を、１００ｍＭギ酸でビーズから溶出させ、２Ｍ  Ｔｒｉｓで中和した。Ｆ（ａｂ’）２ドメインを捕捉するために、Ｆｃ精製から生じたＦＴ画分を、ａｎｔｉ−ＩｇＧ  Ｆｃ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｒｉｘと同様のプロトコルを用いて、ａｎｔｉ−ＩｇＧ−ＣＨ１  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｒｉｘで精製した。溶出画分を、２Ｍ  Ｔｒｉｓで中和し、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｚｅｂａ  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ、７ｋＤａ  ＭＷＣＯ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により脱塩した。精製後、精製Ｆｃ及びＦ（ａｂ’）２サンプル６μｇを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度分析し、ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  ａｃｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により定量した。糖鎖分析のため、サンプルを真空遠心により乾燥させた。
【０１１１】
〔構造分析〕
ＲＡ患者由来の単離ＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＩｇＧの、Ｆ（ａｂ）２若しくはＦｃ断片又は全分子のいずれかについて、構造分析を行った。加えて、（ＡＣＰＡ）−ＩｇＧのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。（ＡＣＰＡ）−ＩｇＧの、Ｎ糖鎖型の、全分子、Ｆ（ａｂ）２断片、及びＦｃ断片をＰＮＧａｓｅ  Ｆを用いて溶液中に遊離させ、一方、重鎖及び軽鎖（ＨＣ／ＬＣ）糖鎖をＰＮＧａｓｅによるゲル内消化後に得た。糖鎖の標識を、サンプル（２５μＬ溶液）と、２−アミノ安息香酸（２−ＡＡ、４８ｍｇ／ｍＬ）の１５％氷酢酸含有ＤＭＳＯ溶液１２．５μＬと、２−ピコリンボラン（１０７ｍｇ／ｍＬ）のＤＭＳＯ溶液１２．５μＬとを混合することにより、行った。この混合液を、６５℃で２時間インキュベートし、室温まで冷やし、精製前に８５％ＡＣＮに希釈した。２−ＡＡ標識糖鎖を、いくらかの修正を加えた上で既述の通り［１０］、コットンチップを用いてＨＩＬＩＣ  ＳＰＥにより精製した。簡単に説明すると、各サンプルについて、コットン５００μｇを、２００μＬピペットチップ内に詰め、ＭＱ  １５０μＬを３回、その後、８５％ＡＣＮ  ０．１％ＴＦＡ  １５０μＬを１回、及び、８５％ＡＣＮ  １５０μＬを２回ピペッティングすることにより、コンディショニングした。サンプル（８５％ＡＣＮ溶液）を、２５回ピペッティングすることで、反応混合液内にロードした。チップを、８５％ＡＣＮ  ０．１％ＴＦＡ  １５０μＬを１回、及び、８５％ＡＣＮ  １５０μＬを２回の組み合わせ３回で、３回洗浄した。最終的に、２−ＡＡ標識糖鎖を、ＭＱ  ３０μＬでコットンから溶出させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ及びＵＨＰＬＣで同定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析では、コットンＨＩＬＩＣ  ＳＰＥにより精製した糖鎖サンプル２μＬを、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡｎｃｈｏｒＣｈｉｐ  ｐｌａｔｅ（８００μｍ  ａｎｃｈｏｒ、ブルカー・ダルトニクス、独国、ブレーメン）上、スポット内で、２，５−ジヒドロキシ安息香酸マトリックス（２０ｍｇ／ｍＬ、５０％ＡＣＮ、５０％水の溶液）１μＬと混合し、周囲温度で乾燥するに任せた。測定は、ＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（ブルカー・ダルトニクス）のｌｉｎｅａｒ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅでＦｌｅｘＣｏｎｔｒｏｌ  ３．４  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ブルカー・ダルトニクス）を用いて行った。ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ（ブルカー・ダルトニクス）を用いて外部較正を行った。各スペクトルについて、ｍ／ｚ１０００から４０００の質量窓を用い、最低５０００回のレーザーショットを重ねた。ＵＨＰＬＣ分析では、精製２−ＡＡ標識Ｎ糖鎖溶液５μＬを、１．７μｍ  ２．１ｘ１００  ｍｍ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＨＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｇｌｙｃａｎ  ｃｏｌｕｍｎ（ウォーターズ）と蛍光検出器とを取り付けたＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィク）でのＨＩＬＩＣ−ＵＨＰＬＣにより分離・分析した。分離は、０．６ｍＬ／分の流速、６０℃で行った。勾配形成のために２種の溶液（溶液Ａ：ＡＣＮ、溶液Ｂ：１００ｍＭギ酸アンモニウムｐＨ４．４（ギ酸を水酸化アンモニウ���でｐＨ４．４まで緩衝化することで調整））を用いた。カラムを、０．５分間、８５％の溶液Ａで平衡化した。その後、サンプルを、７５％Ａに載せ、１０分間、８５％Ａで洗浄することにより、過剰な蛍光試薬をカラムから溶出させた。分離勾配は、７５％Ａから始め、３０分かけて、６３％まで直線的に減少させた。その後、カラム内に、４分間、４０％Ａを、０．４ｍＬ／分の流速で流し、その後、再平衡化のために、１０分間、８５％Ａを流した。蛍光検出では、３３０ｎｍを励起に用い、４２０ｎｍで発光を記録した。結果として得られたクロマトグラムを、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．１．２．１７１３（サーモ・フィッシャー・サイエンティフィク）を用いて分析した。最終的に、糖ペプチド水準での（ＡＣＰＡ）−ＩｇＧのＦｃ結合型グリコシル化を分析するために、抗体を、トリプシンで消化し、既述の通り［１１］、ＬＣ−ＭＳで分析した。
【０１１２】
〔データ及び統計分析〕
ＵＨＰＬＣデータをＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎ  ７で分析した。このソフトはクロマトグラムの曲線下面積を計算する。糖鎖ピーク及びグリコシル化由来特性を既述の通り［４］明らかにした。ガラクトシル化（非ガラクトシル化  Ｇ０、モノガラクトシル化  Ｇ１、ジガラクトシル化  Ｇ２）、シアル化（非シアル化  Ｎ、モノシアル化Ｓ１、ジシアル化Ｓ２）、フコシル化（Ｆ）の百分率、並びに、ＩｇＧのバイセクティングＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ、Ｂ）残基の頻度を、以下のように、計算した。Ｇ０＝ＧＰ１＋ＧＰ２＋ＧＰ４＋ＧＰ５＋ＧＰ６、Ｇ１＝ＧＰ７＋ＧＰ８＋ＧＰ９＋ＧＰ１０＋ＧＰ１１＋ＧＰ１６、Ｇ２＝ＧＰ１２＋ＧＰ１３＋ＧＰ１４＋ＧＰ１５＋ＧＰ１７＋ＧＰ１８＋ＧＰ１９＋ＧＰ２１＋ＧＰ２２＋ＧＰ２３＋ＧＰ２４、Ｎ＝ＧＰ１＋ＧＰ２＋ＧＰ４＋ＧＰ５＋ＧＰ６＋ＧＰ７＋ＧＰ８＋ＧＰ９＋ＧＰ１０＋ＧＰ１１＋ＧＰ１２＋ＧＰ１３＋ＧＰ１４＋ＧＰ１５、Ｓ１＝ＧＰ１６＋ＧＰ１９、Ｓ２＝ＧＰ２１＋ＧＰ２４、Ｆ＝ＧＰ１＋ＧＰ４＋ＧＰ６＋ＧＰ８＋ＧＰ９＋ＧＰ１０＋ＧＰ１１＋ＧＰ１４＋ＧＰ１５＋ＧＰ１６＋ＧＰ１８＋ＧＰ１９＋ＧＰ２３＋ＧＰ２４、及びＢ＝ＧＰ６＋ＧＰ１０＋ＧＰ１１＋ＧＰ１３＋ＧＰ１５＋ＧＰ１９＋ＧＰ２２＋ＧＰ２４。ＬＣ−ＭＳ糖鎖特性分析は既述の通り［１１］である。ＬＣ−ＭＳデータの処理については、観察した検体チャージ状態毎の最初の３つのアイソトープの合計強度を、以前記した通り［１２］、理論質量周辺の±０．０６Ｄａ及び手動抽出平均保持時間周辺の±２０秒の窓内で抽出した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる糖鎖同定は、既述の通り［１３］、明らかにした。統計分析はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を用いて行った。ノンパラメトリック・ペアード・ウィルコクソン検定をｐ＜０．０５の有意水準で適用した。
【０１１３】
《結果》
〔ＩｇＧ及びＡＣＰＡ−ＩｇＧにより発現されたＮ糖鎖の定量〕
発明者等は、ＲＡ患者により生産されたＡＣＰＡ−ＩｇＧが、他のＩｇＧ（自己）抗体に比べて、可変領域内で広範にＮグリコシル化されていることを示した［５］。ここで、発明者等は、ＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びその断片のグリコシル化の包括的な定量化及び定性化を行い、非シトルリン特異的ＩｇＧ（即ち、ＡＣＰＡが枯渇したもの、以降では、対照ＩｇＧと呼ぶ）のものと比較した。この目的のため、（ＡＣＰＡ）−ＩｇＧをアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、その糖鎖を、図９に示したスキームに従い、ＵＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、及び／又はＬＣ−ＭＳにより、分析した。精製後、（ＡＣＰＡ）−ＩｇＧの純度を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した（図１０Ａ）。期待の通り、対照ＩｇＧは重鎖及び軽鎖（ＨＣ及びＬＣ）に対応する２つの電気泳動バンドにより特徴づけられ、一方、ＡＣＰＡ−ＩｇＧは既述の通り（１３）より分子量が高い複数のＨＣ及びＬＣバンドを示した。ＩｇＧのＨＣ及びＡＣＰＡ−ＩｇＧのＨＣ１の両方からの遊離Ｎ糖鎖は、ＵＨＰＬＣでは典型的なＦｃ結合型糖鎖プロファイルを示し（２１、２５）、一方、ＩｇＧのＬＣ及びＡＣＰＡ−ＩｇＧのＬＣ１ではＮ糖鎖は検出されなかった（図１０Ｂ）。対照的に、ＡＣＰＡ−ＩｇＧのＬＣ２から遊離したＮ糖鎖は、異なるプロファイルを示し、高度にシアル化された二分岐糖形態の存在を示した（図１０Ｂ）。同様に、ＡＣＰＡ−ＩｇＧのＨＣ２及びＨＣ３由来のグリコシル化プロファイルは、Ｆｃドメインに通常は存在しない追加の糖鎖の存在とともに、Ｆｃ糖鎖の混合物の存在を示した（図１０Ｂ）。
【０１１４】
〔ＩｇＧの（自己）抗体のＦｃ結合型及びＦａｂ結合型糖鎖は典型的な抗体糖鎖パターンを示す〕
ＡＣＰＡ−ＩｇＧの追加ＨＣバンド、即ち、ＨＣ２及びＨＣ３で検出された糖鎖パターンが本当にＩｇＧ可変領域のグリコシル化を反映しているかを確かめるために［１４］。発明者等は、（ＡＣＰＡ）−ＩｇＧ及びその断片のＮグリコシル化（合計／Ｆｃ／Ｆａｂ）又は糖ペプチドのＮグリコシル化（Ｆｃのみ）を調べた（図９）。まず、発明者等は、（同じ提供者からの）ＡＣＰＡ−ＩｇＧ及び対照ＩｇＧのＦｃ及びＦ（ａｂ’）２断片から遊離されたＮ糖鎖の構造を分析・比較した。（ＡＣＰＡ）−ＩｇＧのＦｃ断片由来のＮグリコシル化プロファイルは、さまざまな数の分岐ガラクトース（０から２）及びシアル酸（０から１）残基を有する、二分岐の、しばしばコアの、フコシル化コンプレックス型種から構成された典型的なＦｃ結合型Ｎ糖鎖構造を示した（図１１Ａ）。また、Ｆｃ結合型糖鎖の一部は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃを含有していた。比較的高い割合の無ガラクトシル化糖鎖（Ｇ０）が既述の通り［１１］観察されたことに注意されたい。（ＡＣＰＡ）−ＩｇＧのＦ（ａｂ’）２断片から遊離したＮ糖鎖は、バイセクティングＧｌｃＮＡｃ及び／又はコアフコースを持っているかもしれない高度にガラクトシル化及びシアル化された二分岐の糖形態から構成されていた（図１１Ｂ）。まとめると、これらの結果は、ＩｇＧ（自己）抗体のＦｃ及びＦａｂ断片に結合した糖鎖種が、ＡＣＰＡ−ＩｇＧのＦａｂドメインに結合した糖鎖内の高度シアル化糖鎖種の目立つ存在とは異なることを示す。
【０１１５】
〔ＡＣＰＡ−ＩｇＧのＦａｂ結合型グリコシル化パターンは『従来』のＩｇＧでのパターンとは異なる〕
発明者等は、患者から単離したＡＣＰＡ−ＩｇＧのＦｃ結合型Ｎ糖鎖が、他のＩｇＧ分子のものよりも、ガラクトシル化及びシアル化の水準がより顕著な減少を呈し、一方、コアフコシル化の程度の増加を呈することを示している［１１、１５］。一致して、本研究で精製したＡＣＰＡ  ＩｇＧのＦｃ糖鎖が、対照ＩｇＧのものと比較して、より低水準のシアル化（ＳがＡＣＰＡ−ＩｇＧでは１２％［ＩＱＲ９−１６％］に対し対照ＩｇＧでは１６％［ＩＱＲ１３−１７．５％］）と、より高頻度のコアフコシル化（ＦがＡＣＰＡ−ＩｇＧでは９９．３％［ＩＱＲ９８．７−９９．７％］に対しＩｇＧでは９１．８％［ＩＱＲ９０．３−９９．７％］）とを示す。加えて、一方、発明者等のデータは、ＡＣＰＡ−ＩｇＧのＦａｂ結合型Ｎ糖鎖と対照ＩｇＧのＦａｂ結合型Ｎ糖鎖との間の重要な違いを明らかにした（図１２）。特に、ＡＣＰＡ−ＩｇＧのＦａｂのＮ糖鎖は、ジガラクトシル化種（Ｇ２がＩｇＧでは７３％［ＩＱＲ６９．５−８０％］に対しＡＣＰＡ−ＩｇＧでは８４％［ＩＱＲ７４−８７％］）及びジシアル化された２５９種（Ｓ２がＩｇＧでは２７％［ＩＱＲ１９−３０％］に対しＡＣＰＡ−ＩｇＧでは４４％［ＩＱＲ３４−４８．５％］）の頻度が高いことを示し、ガラクトースに対するシアル酸の割合の増加（ＳＡ／ＧａｌがＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＩｇＧについて３６％［ＩＱＲ３３−３７％］対３０％［ＩＱＲ２７−３１．５％］）も例証となる。加えて、発明者等は、９サンプル中の７サンプルでコアフコース及びバイセクティングＧｌｃＮＡｃ残基の水準が高くなっていることを発見した。全体として、ＡＣＰＡ−ＩｇＧ及び対照ＩｇＧのＦａｂドメイン由来の糖鎖構造の間で、Ｆｃ部分由来の糖鎖の間でよりも強い糖鎖の差異が観察された。
【０１１６】
〔ＡＣＰＡ−ＩｇＧはＦａｂグリコシル化のより高度の水準を示す〕
発明者等は、ＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＡＣＰＡ枯渇ＩｇＧ上に存在するＦａｂグリコシル化の量を定量した。Ｆａｂグリコシル化の水準を評価するために、糖鎖を、ＡＣＰＡ−ＩｇＧ及びＡＣＰＡ枯渇ＩｇＧから遊離させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳにより特徴づけし、その相対量をＵＨＰＬＣにより測定した。全ＩｇＧの糖鎖プロファイルはＦｃ結合型Ｎ糖鎖により支配され（Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、及びＧ２Ｆ）、一方、ＡＣＰＡ−ＩｇＧの全糖鎖プロファイルはＦａｂ結合型Ｎ糖鎖が大量であることを示した（Ｇ２ＦＢＳ１、Ｇ２ＦＳ２、及びＧ２ＦＢＳ２）（図１３Ａ）。重要な点として、Ｆｃ断片又はＦ（ａｂ’）２断片のいずれかについて特異的なこれらの糖形態の数々の同定、及び、全抗体分子から遊離させたこれらの糖形態の定量により、ＡＣＰＡ−ＩｇＧ又はＡＣＰＡ枯渇ＩｇＧのいずれかでのＦａｂ糖鎖の全体頻度を判定することが可能となった（図１３Ｂ）。全てのＡＣＰＡ−ＩｇＧサンプル（ｎ＝９）は、対照ＩｇＧに比べて、Ｆａｂグリコシル化の頻度が増加することを示した。ＡＣＰＡ枯渇ＩｇＧのメジアンＦａｂグリコシル化水準は、提供者間で大きな違いをもって、１７％［ＩＱＲ１２％−２６％］と評価された。対照的に、ＡＣＰＡ−ＩｇＧのメジアンＦａｂグリコシル化は９３％［ＩＱＲ７７−１２３％］に達した。まとめると、これらのデータは、ＡＣＰＡ−ＩｇＧのメジアンＦａｂグリコシル化が対照ＩｇＧのものよりも５倍分高いことを示す。
【０１１７】
〔血漿及び血清由来の（ＡＣＰＡ）−ＩｇＧは異なるＦａｂグリコシル化プロファイルを示す〕
発明者等は、滑液由来のＡＣＰＡ−ＩｇＧが、血清由来のＡＣＰＡ−ＩｇＧよりも炎症誘発性のＦｃグリコシル化プロファイルを示すことを示した［１６］。この観察結果を考慮して、発明者等は、ＡＣＰＡ−ＩｇＧ及び対照ＩｇＧのＦａｂ結合型糖鎖構造及び／又はＦａｂグリコシル化水準でも差異が生じると仮説を立てた。血漿のＡＣＰＡ−ＩｇＧ（ｎ＝６）のＦａｂ結合型糖鎖に比べて、滑液由来のＡＣＰＡ−ＩｇＧ（ｎ＝３）Ｆａｂ糖鎖は、ガラクトシル化、シアル化、及びバイセクティングＧｌｃＮＡｃの水準が低くなる傾向を示した。同様の傾向が、血漿ＩｇＧと比較した滑液対照ＩｇＧの糖鎖プロファイルでも観察された。発明者等は、次に、血漿（ＡＣＰＡ）−ＩｇＧのＦａｂグリコシル化の水準及び滑液の対応する値を定量した。図１３Ｃに示すように、滑液ＡＣＰＡ−ＩｇＧで血漿ＡＣＰＡ−ＩｇＧと比べてＦａｂグリコシル化の水準が有意に高いことがわかった（１３８％対８０％）。こうした差異が対照ＩｇＧでは観察されなかった（２０％対２０％）ことに注意されたい。まとめると、これらの観察結果は、定量的な意味で、滑液由来のＡＣＰＡ−ＩｇＧで血液由来のＡＣＰＡ−ＩｇＧと比べてＦａｂグリコシル化の水準がずっと顕著であることを示す。
【０１１８】
（実施例３）
（材料と方法）
〔ＡＣＰＡへのＩｇＧの又は抗ＣａｒＰ  ＩｇＧのＦａｂ部分のＮ結合型グリコシル化の決定〕
ビオチン化ＣＣＰ２又はアルギニン対照ペプチドを、異なる蛍光色に標識したストレプトアビジン四量体にコンジュゲートする。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により、四量体陽性Ｂ細胞をソートする。２種類の異なる方法でＢ細胞受容体（ＢＣＲ）配列を決定する。ＡＣＰＡ特異的Ｂ細胞を単離する一般的な方法は、Ｋｅｒｋｍａｎ等，６月２日，２０１５；Ａｎｎ．  Ｒｈｅｕｍ．  Ｄｉｓ  ０：１−７；ｄｏｉ：１０．１１３６／ａｎｎｒｈｅｕｍｄｉｓ−２０１４−２０７１８２に記載されている。
【０１１９】
第１の方法では、四量体陽性単一Ｂ細胞を、Ｌ細胞を発現するＣＤ４０Ｌの層上にあるサイトカインカクテルを有するＩＭＤＭ培地内で１０−１２日間にわたりインビトロで培養する。これらの培養物の上清をＥＬＩＳＡによるＣＣＰ２反応性で抗体について分析する。また、ＣＣＰ２陽性上清を対照ペプチドに対する反応性の欠如についてスクリーニングする。結果、ＣＣＰ２反応のうち、対照ペプチド陰性培養物ｍＲＮＡをＴＲＩｚｏｌで単離する。ｃＤＮＡを合成し、免疫グロブリン配列のアンカリングリバーストランスクリプション及びネステッドＰＣＲ増幅（Ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ；ＡＲＴＩＳＡＮ  ＰＣＲ）を行い、最終的に、サンガー配列を有するＢＣＲ配列を決定する。
【０１２０】
第２の方法では、１０から３０個の四量体陽性Ｂ細胞を、ｍＲＮＡを得るためのリシスバッファー内で直にソートし、その後、ＳＭＡＲＴＳｅｑのプロトコルに従いｃＤＮＡ合成及び前増幅を行う。第１のプロトコルと同様に、免疫グロブリン産物をＡＲＴＩＳＡＮ  ＰＣＲにより得た。第１の方法とは対照的に、次世代シーケンシング用ＰＡＣＢＩＯプラットフォーム上で産物をシーケンシングした。
【０１２１】
《結果》
単一細胞ソートの方法でシーケンシングした、８２％（２３／２８）のＩｇＧ、０％（０／３）のＩｇＭ、及び０％（０／１）のＩｇＡのＡＣＰＡ抗体が、Ｆａｂ部分にＮグリコシル化部位を有していた。多細胞ソート及び次世代シーケンシングの方法では、９４％（１７／１８）のＩｇＧ、４０％（２／５）のＩｇＭ、及び１００％（９／９）のＩｇＡのＡＣＰＡ抗体が、Ｆａｂ部分にＮグリコシル化部位を有していた。比較すると、健常提供者から得た全Ｂ細胞のＢＣＲレパートリーの配列分析は、約９％の抗体のみがＮグリコシル化部位を含有することを示す。このデータから、ＡＣＰＡ配列がＦａｂ領域にＮグリコシル化部位を有する百分率は健常個体由来の他の配列での百分率よりも有意に高い。
【０１２２】
この配列データは、全ＩｇＧ又は抗破傷風ＩｇＧと比べてＡＣＰＡ−ＩｇＧの高グリコシル化により分子量が増加するという早期に取得したデータに裏付けられている［５］。
【０１２３】
（実施例４）
〔ＡＣＰＡはアセチル化ペプチド（リシン及びオルニチン）を認識・結合できる〕
（材料と方法）
モノクローナル及びポリクローナルのＡＣＰＡ抗体が異なるＰＴＭを有する変異ビメンチンペプチドに結合できるか否かを決定した。Ｒｉｓｐｅｎｓ博士（Ｓａｎｑｕｉｎ）に提供されたモノクローナルＡＣＰＡ  Ｅ４  ＩｇＧ１［１７］を、ＰＴＭ改変ビメンチンペプチドへの反応性について分析した。ＲＡ患者由来のポリクローナルＡＣＰＡは、ゲルろ過カラムにより予め精製したものであり、ＡＣＰＡ２．９３及び２．７７が精製された。
【０１２４】
ＰＴＭ改変ビメンチンペプチドへの反応性の検出には、オルゲンテック・ダイアグノスティカ（Ｏｒｇｅｎｔｅｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）のＥＬＩＳＡキットを用いた。このキットは、ＰＴＭ改変ビメンチンペプチド（ＨＣ５２−ホモシトルリン、Ｐ６２−アルギニン、Ｐ１８−シトルリン、ＨＣ５５−アセチル化リシン、ＨＣ５６−リシン、アセチル化オルニチン、及びオルニチン）を含有するコート済みマイクロプレートからなる。バッファーは、オルゲンテック・ダイアグノスティカのＥＬＩＳＡキットで提供され、サンプル希釈バッファー、コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ＋参照二次ＩｇＧコンジュゲート、ＴＭＢ基質、及び停止溶液からなる。精製ＡＣＰＡ及びモノクローナルＡＣＰＡを、オルゲンテック・ダイアグノスティカのサンプル希釈バッファーで所望の濃度（精製ＡＣＰＡ及びモノクローナルＡＣＰＡ  Ｅ４  ｍＡｂについて３０μｇ／ｍｌ）になるまで希釈し、ＥＬＩＳＡプレート上でインキュベートした。ＡＣＰＡ結合を、コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ及びＴＭＢにより検出した。光学濃度は４５０ｎｍで測定した（基準は６００〜６９０ｎｍ）。
【０１２５】
《結果》
モノクローナルＡＣＰＡ  Ｅ４は、シトルリン、アセチル化リシン、及びアセチル化オルニチンの翻訳後修飾を有する変異ビメンチンペプチドに対して反応性である。ＲＡ患者由来のポリクローナルＡＣＰＡ２．９３は、シトルリン及びアセチル化オルニチンの翻訳後修飾を有する変異ビメンチンペプチドに対して反応性である。ポリクローナルＡＣＰＡ２．９３は、より程度は低いものの、アセチル化リシン及びホモシトルリンにも反応性である。また、ＲＡ患者由来のポリクローナルＡＣＰＡ２．７７は、アセチル化オルニチン、アセチル化リシン、シトルリン、及び、より程度は低いものの、ホモシトルリンの翻訳後修飾を有する変異ビメンチンペプチドに対して反応性である（図１５）。
【０１２６】
（結論）
モノクローナルＡＣＰＡ  Ｅ４及びＲＡ患者から得たポリクローナルＡＣＰＡ（２．９３及び２．７７）は、シトルリン、アセチル化リシン、及びアセチル化オルニチンの翻訳後修飾を有する変異ビメンチンペプチドに対して反応性である。これらの異なるアミノ酸への結合は、ＡＣＰＡが異なるＰＴＭに対して交差反応性であることを示す。
【０１２７】
（引用文献）
１．Ｐｅｓｃｈｋｅｎ，Ｃ．Ａ．及びＪ．Ｍ．Ｅｓｄａｉｌｅ，Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ  ｉｎｄｉｇｅｎｏｕｓ  ｐｅｏｐｌｅｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ，１９９９．２８（６）：ｐ．３６８−９１。
２．Ｉｏａｎ−Ｆａｃｓｉｎａｙ，Ａ．等，Ｍａｒｋｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｆｉｎｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｓｏｔｙｐｅ  ｕｓａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ，２００８．５８（１０）：ｐ．３０００−８。
３．Ｒｏｍｂｏｕｔｓ，Ｙ．等，Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＣＰＡ−ＩｇＧ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ，２０１５。
４．Ｐｕｃｉｃ，Ｍ．等，Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＩｇＧ−ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｈｅｒｉｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩｇＧ  ｇｌｙｃｏｍｅ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１１．１０（１０）：ｐ．Ｍ１１１  ０１００９０。
５．Ｒｏｍｂｏｕｔｓ，Ｙ．等，Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＣＰＡ−ＩｇＧ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ，２０１６．７５（３）：ｐ．５７８−８５。
６．Ｓｔａｄｌｍａｎｎ，Ｊ．等，Ａ  ｃｌｏｓｅ  ｌｏｏｋ  ａｔ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｂｃｌａｓｓ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｌｅｃｔｉｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２００９．９（１７）：ｐ．４１４３−５３。
７．Ｄａｌｚｉｅｌ，Ｍ．，Ｉ．ＭｃＦａｒｌａｎｅ，ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．Ａｘｆｏｒｄ，Ｌｅｃｔｉｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  Ｎ−ｇｌｙｃａｎ  ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ，１９９９．１６（１２）：ｐ．８０１−７。
８．Ｇｕｈｒ，Ｔ．等，Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ  ＩｇＧ  ｂｙ  ｌｅｃｔｉｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１１．６（６）：ｐ．ｅ２１２４６。
９．Ａｒｎｅｔｔ，Ｆ．Ｃ．等，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  １９８７  ｒｅｖｉｓｅｄ  ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ，１９８８．３１（３）：ｐ．３１５−２４。
１０．Ｓｅｌｍａｎ，Ｍ．Ｈ．等，Ｃｏｔｔｏｎ  ＨＩＬＩＣ  ＳＰＥ  ｍｉｃｒｏｔｉｐｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｌｙｃａｎｓ  ａｎｄ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，２０１１．８３（７）：ｐ．２４９２−９。
１１．Ｒｏｍｂｏｕｔｓ，Ｙ．等，Ａｎｔｉ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｃｑｕｉｒｅ  ａ  ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｆｃ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ，２０１５．７４（１）：ｐ．２３４−４１。
１２．Ｆａｌｃｋ，Ｄ．等，Ｇｌｙｃｏｆｏｒｍｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  Ｂａｓｅｄ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ａｒｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  Ｃｌｅａｖｅｄ  ｂｙ  Ｔｒｙｐｓｉｎ  Ｄｕｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈｉｇｈｅｒ−Ｏｒｄｅｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ，２０１５．１４（９）：ｐ．４０１９−２８。
１３．Ｒｕｈａａｋ，Ｌ．Ｒ．等，Ｇｌｙｃａｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏａｎａｌ  Ｃｈｅｍ，２０１０．３９７（８）：ｐ．３４５７−８１。
１４．Ｂｏｎｄｔ，Ａ．等，Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ）  Ｆａｂ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｅｗ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｐｒｅｇｎａｎｃｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１４．１３（１１）：ｐ．３０２９−３９。
１５．Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｈ．Ｕ．等，Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  １（ＩｇＧ１）  Ｆｃ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｐｌ，２００９．３（１）：ｐ．１０６−１５。
１６．Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｈ．Ｕ．等，Ｇｌｙｃａｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ，２０１０．６２（６）：ｐ．１６２０−９。
１７．ｖａｎ  ｄｅ  Ｓｔａｄｔ，Ｌ．Ａ．等，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｏｎ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ  ｈａｖｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｐａｔｔｅｒｎｓ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ），２０１３．５２（４）：ｐ．６３１−５。
【０１２８】
（実施例５）
（材料と方法）
〔患者及び健常個体〕
末梢血サンプルをＲＡ罹患ＡＣＰＡ陽性患者から得た。患者は、ライデン大学メディカルセンター（ＬＵＭＣ）のリウマチ科の外来診療室で募集され、書面によるインフォームドコンセントを受けた。健常提供者サンプルを、同種幹細胞移植のために収集された材料の残りから取得し、既述の通り［１］、シーケンシングした。
【０１２９】
〔抗原特異的Ｂ細胞の単離と培養〕
ＡＣＰＡ発現Ｂ細胞を、既述の通り［２］、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。破傷風毒素（ＴＴ）特異的Ｂ細胞を、ＡｎａＴａｇＴＭ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャー製）で調整した直接標識ＴＴ（スタテン・セラム・インスティチュート製）を用いて、単離した。細胞を、既述の通り［３］、１０個の細胞のプール内で、又は、単一細胞として、ソートした。１つの患者サンプルを、以下の方法の両方で処理した。培養上清でのＡＣＰＡ−ＩｇＧの存在をＥＬＩＳＡにより評価した［２］。
【０１３０】
〔ｍＲＮＡ単離及びｃＤＮＡ処理〕
プールとしてソートされた細胞を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（シグマ製）を用いて直に溶解させ、その後、ｍＲＮＡ単離を行った。単一細胞培養物由来のｍＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（サーモフィッシャー製）を用いて単離した。いずれの単離手法の場合も、その後、既述の通り［４］、ｃＤＮＡを合成した。
【０１３１】
〔ＡＲＴＩＳＡＮ  ＰＣＲとシーケンシング〕
修正［１］を加えた免疫グロブリン配列のアンカリングリバーストランスクリプション及びネステッドＰＣＲ増幅（Ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ；ＡＲＴＩＳＡＮ  ＰＣＲ）を用いてＩｇ転写物を増幅した。プールした細胞のＰＣＲ産物は、ＰａｃＢｉｏ  ＲＳＩＩ  ｓｙｓｔｅｍ（パシフィック・バイオサイエンス、米国、カリフォルニア、メンローパーク）でシーケンシングした。単一細胞培養物から得たＰＣＲ産物は、サンガーシークエンシング［５］でシーケンシングした。配列データを、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ  Ｒ９．１．５［６］及びＩＭＧＴ  （Ｈｉｇｈ）Ｖ−ＱＵＥＳＴ  ｔｏｏｌｓ［７］で分析した。
【０１３２】
《結果》
〔ＡＣＰＡ  ＢＣＲ配列でのＮグリコシル化部位の局在〕
シトルリン特異的Ｂ細胞のＢＣＲ配列は、Ｎグリコシル化部位の頻度が目覚ましいことを示す。それらがＳＨＭ割合から独立していることは、可変領域のＮ糖鎖が発生及び／又は成熟の際にＡＣＰＡ発現Ｂ細胞に選択的な利益を与えることを示唆する。この可能性への洞察をより深めるために、発明者等は、部位の分布を調べ、そのパターンを健常提供者Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）レパートリーで同定されたＮグリコシル化部位と比較した。ＡＣＰＡ−ＩｇＧ配列について、発明者等は、部位がＣＤＲ１領域で優勢であり、ＡＣＰＡ−ＩｇＧのＣＤＲ３領域では比較的に欠如しているという観察結果を得た。これらの結果は、ＡＣＰＡ−ＩｇＧのＮグリコシル化部位分布が、ＣＤＲ３領域を避け、ＣＤＲ１領域での糖鎖のいくらかの選好を示すことを示唆する［８］。より具体的には、ＩｇＧ重鎖、κ軽鎖、及びλ軽鎖のＶ遺伝子を詳細に評価することで、ＢＣＲ配列の特定の位置上での部位の富化、及び、他の位置上での部位の欠如をみることができる。ＩｇＧの重鎖及びκ軽鎖のＶ遺伝子を考慮すると、位置２９及び７７上での部位の富化及びＣＤＲ３領域のいくつかの位置での部位のより低い量という同様のパターンがみられる。λ軽鎖では、位置３７、５１、５６での部位の欠如があるようにみえるが、これらの位置は健常個体から得たＢＣＲ配列では高度に存在する（図１９）。
【０１３３】
（引用文献）（実施例５）
１  Ｋｏｎｉｎｇ，Ｍ．Ｔ．等，ＡＲＴＩＳＡＮ  ＰＣＲ：ｒａｐｉｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｒｉｍｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｉａｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｂｊｈ．１４１８０（２０１６）。
２  Ｋｅｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｆ．等，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ７５，１１７０−１１７６，ｄｏｉ：１０．１１３６／ａｎｎｒｈｅｕｍｄｉｓ−２０１４−２０７１８２（２０１６）。
３  Ｌｉｇｈａａｍ，Ｌ．Ｃ．等，Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＩｇＧ４＋  ａｎｄ  ＩｇＧ１＋  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｐｏｉｎｔ  ｔｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩｇＧ４  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３３，２６７−２７０．ｅ２６１−２６６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａｃｉ．２０１３．０７．０４４（２０１４）。
４  Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ，Ｊ．Ｊ．等，Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １０７，４  ２２  ２１−１７，ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１１４２７２７．ｍｂ０４２２ｓ１０７（２０１４）。
５  Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．＆  Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｐｒｉｍｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ９４，４４１−４４８（１９７５）。
６  Ｋｅａｒｓｅ，Ｍ．等，Ｇｅｎｅｉｏｕｓ  Ｂａｓｉｃ：ａｎ  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｄａｂｌｅ  ｄｅｓｋｔｏｐ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）  ２８，１６４７−１６４９，ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｓ１９９（２０１２）。
７  Ａｌａｍｙａｒ，Ｅ．，Ｄｕｒｏｕｘ，Ｐ．，Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．＆  Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，Ｖ．ＩＭＧＴ（（Ｒ））  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＩＧ）  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲ）  Ｖ−（Ｄ）−Ｊ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ，ａｎｄ  ＩＧ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ  ａｎｄ  ＩＭＧＴ／ＨｉｇｈＶ−ＱＵＥＳＴ  ｆｏｒ  ＮＧＳ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）  ８８２，５６９−６０４，ｄｏｉ：１０．１００７／９７８−１−６１７７９−８４２−９＿３２（２０１２）。
８  Ｖｅｒｇｒｏｅｓｅｎ，Ｒ．Ｄ．等，Ｂ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＡＣＰＡ）  ＩｇＧ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｄｏｉ：１０．１１３６／ａｎｎｒｈｅｕｍｄｉｓ−２０１７−２１２０５２（２０１７）。
【０１３４】
（実施例６）
〔ＡＣＰＡ−Ｆａｂ糖鎖の検出方法〕
〔方法１〕
発明者等は、精製ＡＣＰＡ−ＩｇＧのハイエンドＵＨＰＬＣ及び質量分析を用いた（図２２）。
【０１３５】
ＡＣＰＡ−ＩｇＧを、既述の通り［１］、ＣＣＰ２マイクロビーズアッセイにより単離した。簡単に説明すると、ニュートラアビジンビーズをＣＣＰ２−ビオチン化ペプチドとともに８５０ｒｍｐで振盪しながら室温（ＲＴ）で１時間インキュベートすることにより、ＣＣＰ２−ビオチン化ペプチドをニュートラアビジンビーズに結合させた。インキュベーション後、ビーズをＰＢＳで洗浄し、未結合ペプチドを除去した。その後、ビーズスラリー（２５％ビーズ／ｍｌ）２５μｌをｏｒｏｃｈｅｍフィルタープレート上に載せた。その後、血清／血漿２５〜７５μｌを載せ、ＰＢＳを２００μｌ／ウェルの最終体積で加え、６００ｒｐｍで振盪しながら室温で２時間インキュベートした。プレートを５００ｇで１分回転させることでフォロースルーを収集した後、プレートを５００ｇで１分回転させることでビーズを再びＰＢＳにより３回洗浄した。ＡＣＰＡを、２×１００μｌ  １００ｍＭギ酸（ＦＡ）で溶出させ、２Ｍ  ＴｒｉｓでｐＨ７まで中和した。ＡＣＰＡ溶出物をさらに前述と同様の技術を用いて精製した。ただし、ＣＣＰ２ビーズの代わりに５０％スラリーｐｒｏｔ  Ｇビーズ２０μｌを用いた。ＡＣＰＡ溶出物を、９００ｒｐｍでＲＴで１時間インキュベートし、１００μｌ  １００ｍＭギ酸で再び溶出させた。いまやＡＣＰＡ−ＩｇＧを含有しないこの溶出物をＳｐｅｅｄｖａｃを用いて乾燥させた。糖鎖を、乾燥させたＡＣＰＡ−ＩｇＧを１０μｌ  ２％ＳＤＳ及び５μｌ  ＰＢＳで再可溶化させることにより遊離させ、６０℃、３０分で変性させた。その後、１０μｌ  ＰＮＧａｓｅＦ溶液（１：１  １％ＮＰ−４０／５×ＰＢＳ（０．５Ｕ  ＰＮＧａｓｅＦ含有））を加え、オーバーナイトにわたり３７℃でインキュベートした。翌日、１２．５μｌ  ２−ＰＢバッファー及び  １２．５μｌ  ２ＡＡ標識を加え、６０℃、２時間インキュベートし、遊離糖鎖を標識した［２、３］。２−ＡＡ標識糖鎖を、いくらかの修正を加えた上で既述の通り［４］、コットンチップを用いてＨＩＬＩＣ  ＳＰＥにより精製した。簡単に説明すると、各サンプルについて、コットン５００μｇを、２００μＬピペットチップ内に詰め、ＭＱ  １５０μＬを３回、その後、８５％ＡＣＮ  ０．１％ＴＦＡ  １５０μＬを１回、及び、８５％ＡＣＮ  １５０μＬを２回ピペッティングすることにより、調整した。サンプル（８５％ＡＣＮ溶液）を、２５回ピペッティングすることで、反応混合液内に載せた。チップを、８５％ＡＣＮ  ０．１％ＴＦＡ  １５０μＬを１回、及び、８５％ＡＣＮ  １５０μＬを２回の組み合わせ３回で、３回洗浄した。最終的に、２−ＡＡ標識糖鎖を、ＭＱ  ３０μＬでコットンから溶出させ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ及びＵＨＰＬＣで同定した。
【０１３６】
方法１に記載のプロトコルは、時間が掛かり、ハイエンドな質量分析機と専門技能を必要とする。そのため、日常的なルーチンで用いることのできるより便利な方法が好ましい。方法２及び３は好ましいものの、最適化実験が必要となる。レクチンＳＮＡ（セイヨウニワトコ凝集素）は、抗体（主に、Ｆａｂドメイン内に２つのシアル酸残基を持つもの）に結合する［５、６］。ＳＮＡは還元条件（これによりＣＨ２ドメイン間の接触面が開く）下でのみ抗体Ｆｃ尾部に結合する［７、８］。ＡＣＰＡのＦ（ａｂ）糖鎖はジシアル化糖鎖を高い程度で含有する。ジシアル化糖鎖は（ＡＣＰＡ）ＩｇＧのＦｃ尾部からは事実上欠如している。そのため、ＡＣＰＡのＦ（ａｂ）糖鎖を検出するためのＲＡ患者由来の血清抗体へのＳＮＡ結合は、グリコシル化抗体の存在を可視化するための有望な戦略といえる。方法２及び方法３はＳＮＡ検出に基づくハイスループット法を確立するための２つのアプローチを開示する。
【０１３７】
〔方法２〕
方法２（図３）では、ＡＣＰＡを上述の通りＣＣＰ２コートマイクロビーズ（上）を用いて捕捉する。ＡＣＰＡ  ＩｇＧ分子上のＦ（ａｂ）糖鎖の存在を計算するために、２種の異なるＥＬＩＳＡを用いる。ＳＮＡベースレクチンによりシアル化ＡＣＰＡを可視化するための第１のＥＬＩＳＡを図３（下）に示す。第２のＥＬＩＳＡでは、ＡＣＰＡ  ＩｇＧの量を計算するために、ベシル（Ｂｅｔｈｙｌ）製のキットＨｕｍａｎ  ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、Ｅ８８−１０４）を用いる。両方のＥＬＩＳＡで、まず、プレートを１０μｇ／ｍｌ過ヨウ素酸処理ヤギ抗ヒトＩｇＧ捕捉抗体でコートする。２００ｍＭ過ヨウ素酸を、４℃、３０分間、インキュベートし、ＲＴ、１時間、ヤギ抗ヒト抗体上に存在するシアル酸を破壊した。プレートを、ＰＢＳ０．０５％ｔｗｅｅｎバッファーで３回洗浄し、その後、ＲＴ、１時間、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ（やはり２０ｍＭ過ヨウ素酸でオーバーナイトにわたり４℃で処理済み）でブロックした。プレートを洗浄したあと、溶出させたＡＣＰＡ溶出物（図３、上）を、両方のプレートに加え、ＲＴ、１時間、インキュベートした。インキュベーション及び洗浄の後、一方のプレートを、２μｇ／ｍｌのビオチン化ＳＮＡとともに、ＲＴで、１時間、インキュベートし、他方のプレートを、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰとともに、ＲＴで、１時間、インキュベートした。インキュベーション後、再び、プレートを洗浄した。その後、ＡＢＴＳをヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＨＲＰともに予めインキュベートしたプレートに加え、吸光度を４１５ｎｍで測定した。ＳＮＡとともに予めインキュベートしたプレートに、Ｓｔｒｅｐ−ＨＲＰを加え、ＲＴで、１時間、インキュベートした。インキュベート後、吸光度を同様のアプローチで測定した。結果の分析について、両方のプレートは標準曲線を含んでいた。
【０１３８】
ＳＮＡ結合／μｇ  ＡＣＰＡ−ＩｇＧを、プレート１上でのＡＣＰＡ−ＩｇＧへのＳＮＡ結合をプレート２上に捕捉されたＡＣＰＡ−ＩｇＧ（μｇ）で割ることで、計算した。ＳＮＡ結合／μｇ  ＡＣＰＡ−ＩｇＧが高いほど、ＡＣＰＡのＦａｂグリコシル化の量は高くなる。結果はＡＣＰＡ陽性サンプルでＳＮＡ対ＩｇＧが高いことを明白に示し、ＡＣＰＡ由来のＦａｂでの高度なグリコシル化量が可視化された。
【０１３９】
〔方法３〕
方法３では、反対の戦略を用いる。まず、血清又は血漿由来の全ＩｇＧを前に記載したマイクロビーズアッセイと同様のアプローチにより単離した。その後、ＳＮＡアガロースビーズによりＳＮＡ上にＩｇＧを固定する。最後に、ＳＮＡ溶出画分及びフロースルー画分でＣＣＰ  ＥＬＩＳＡを用いてＡＣＰＡ−ＩｇＧを検出する（図４）。ＡＣＰＡ−ＩｇＧ上に存在するジシアル化Ｆａｂ糖鎖の量が高いために、ＣＣＰ反応性の富化がＳＮＡ溶出画分では期待される。このアプローチは、ＡＣＰＡ−ＩｇＧについて実行可能であり、図４．２に示すように、ハイスループットなやり方で用いることができる。重要な点として、ＩＶＩＧサンプルのＵＨＰＬＣ分析からＳＮＡ溶出画分でＩＶＩＧに含有されるＦａｂグリコシル化ＩｇＧ分子を富化できたことが示されたことから（図２３）、ＳＮＡアガロースビーズが実際にこの構成でＦａｂグリコシル化ＩｇＧを捕捉することを発明者等は確かめた。また、図４に示すデータは、このアプローチの実現可能性を示し、ＡＣＰＡの存在又はＡＣＰＡの高度グリコシル化Ｆａｂドメインを可視化する。プロテインＧによるＩｇＧの事前単離が、シアル酸分子を持ち且つ血清中に存在する他の分子によるＳＮＡの『過剰充填』を防ぐために、重要であることに注意されたい。ただし、ＳＮＡ上の血清充填量を調整することで、この方法を反対に用いることもできる。
【０１４０】
方法２及び３の両方が、Ｆ（ａｂ）糖鎖を検出するための、堅牢性、特異性、及び信頼性を示す。まとめると、これらの実験は、発明者等がＡＣＰＡのＦ（ａｂ）糖鎖を迅速で信頼できるやり方で同定するアッセイシステムを確立したことを示す。
【０１４１】
（引用文献）（実施例６）
１  Ｈａｂｅｔｓ，Ｋ．Ｌ．等，Ａｎｔｉ−ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  ｔｈｅｒａｐｙ  １７，２０９，ｄｏｉ：１０．１１８６／ｓ１３０７５−０１５−０６６５−７（２０１５）。
２  Ｈａｆｋｅｎｓｃｈｅｉｄ，Ｌ．等，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ  Ｇｌｙｃａｎｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ：ＭＣＰ  １６，２７８−２８７，ｄｏｉ：１０．１０７４／ｍｃｐ．Ｍ１１６．０６２９１９（２０１７）。
３  Ｒｏｍｂｏｕｔｓ，Ｙ．等，Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＣＰＡ−ＩｇＧ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｃｉｔｒｕｌｌｉｎａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ７５，５７８−５８５，ｄｏｉ：１０．１１３６／ａｎｎｒｈｅｕｍｄｉｓ−２０１４−２０６５９８（２０１５）。
４  Ｓｅｌｍａｎ，Ｍ．Ｈ．等，Ｆｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＩｇＧ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒｏｂｕｓｔ  ｎａｎｏ−ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｈａｓｅ  ＨＰＬＣ−ＭＳ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｓｈｅａｔｈ−ｆｌｏｗ  ＥＳＩ  ｓｐｒａｙｅｒ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ７５，１３１８−１３２９，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｐｒｏｔ．２０１１．１１．００３（２０１２）。
５  Ｋａｓｅｒｍａｎｎ，Ｆ．等，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｆａｂ−ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ（ＩＶＩＧ）  ａｆｔｅｒ  ｌｅｃｔｉｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７，ｅ３７２４３，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００３７２４３（２０１２）。
６  Ｇｕｈｒ，Ｔ．等，Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ  ＩｇＧ  ｂｙ  ｌｅｃｔｉｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，ｅ２１２４６，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００２１２４６（２０１１）。
７  Ｓｔａｄｌｍａｎｎ，Ｊ．等，Ａ  ｃｌｏｓｅ  ｌｏｏｋ  ａｔ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｂｃｌａｓｓ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｌｅｃｔｉｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ９，４１４３−４１５３，ｄｏｉ：１０．１００２／ｐｍｉｃ．２００８００９３１（２００９）。
８  Ｄａｌｚｉｅｌ，Ｍ．，ＭｃＦａｒｌａｎｅ，Ｉ．＆  Ａｘｆｏｒｄ，Ｊ．Ｓ．Ｌｅｃｔｉｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  Ｎ−ｇｌｙｃａｎ  ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ．Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ  Ｊ  １６，８０１−８０７（１９９９）。
【０１４２】
［付記］
［付記１］
サンプリング時に、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又は抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連血管炎（ＡＡＶ）を有しない個体が前述の疾患を発症する危険性があるか否かを判定する方法であって、前記方法は、前記個体の抗体含有サンプルが前記疾患に関連する自己抗体を含むか否かを判定すること、及び、前記抗体が当該抗体のＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含むか否かを判定することを備え、前記方法は、前述の判定に基づき前記個体が前記疾患を発症する危険性を判定することをさらに備える、方法。
【０１４３】
［付記２］
個体の抗体含有サンプルを分析する方法であって、前記方法は、前記サンプルが、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶに関連する自己抗体であって、当該抗体のＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含む自己抗体を含むか否かを判定することを備え、前記方法は、前記サンプルが、サンプリング時に、関節リウマチの症状、シェーグレン症候群の症状、又はＡＡＶの症状を有しない個体のサンプルであることを特徴とする、方法。
【０１４４】
［付記３］
個体での、関節リウマチの症状、シェーグレン症候群の症状、又はＡＡＶの症状の発症を予防又は遅延する方法であって、
前記方法は、
前記個体のサンプルが、前述の疾患に関連する自己抗体を含有するか否かを判定すること、及び、
前記抗体が、Ｎ結合型グリコシル化Ｆａｂ部分を有するか否かを判定すること、
を備え、
前記サンプルは、前記個体の抗体含有サンプルであり、前記個体は、サンプリング時に、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶを有さず、及び、
前記方法は、
前記個体が前記疾患を示し始める前又は示し始めた時に、前記疾患用の薬剤で前記個体を治療すること、
を備える、方法。
【０１４５】
［付記４］
関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶを発症する危険性のある個体を監視する方法であって、前記方法は、個体の定期的抗体含有サンプルにおいて前述の疾患に関連する自己抗体の存在及び／又は発現を監視することを備え、前記方法は、前記疾患に関連する検出自己抗体が当該抗体のＦａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型糖鎖を含むか否かを判定することをさらに含むことを特徴とする、方法。
【０１４６】
［付記５］
関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶ薬剤であって、前述の疾患の１つ以上の発症の危険性のある個体の治療方法に使用するためのものであり、前記個体は、当該個体の抗体含有サンプルにおける、Ｆａｂ部分の１箇所以上にＮ結合型グリコシル化を含んでいる前記疾患に関連する自己抗体の検出により、危険性を判定される、薬剤。
【０１４７】
［付記６］
前記個体は、当該個体が関節炎症状を示し始める前又は示し初めた時に治療される、付記５に記載の薬剤。
【０１４８】
［付記７］
Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を含む抗体の測定のための抗体を精製する方法であって、
抗体サンプルを準備すること、
修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む固体表面に前記サンプルを接触させること、
未結合抗体を除去し、結合抗体を前記固体表面から溶出させること、
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子を含む固体表面とともに溶出抗体をインキュベートすること、
未結合分子を除去すること、及び、
結合抗体が前記サンプルにおける抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖の存在を示す、抗体が前記固体表面に結合したか否かを判定すること、
を備える、方法。
【０１４９】
［付記８］
Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する抗体の測定のための抗体を精製する方法であって、
抗体サンプルを準備すること、
修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む固体表面に前記サンプルを接触させること、
未結合抗体を除去すること、
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子とともに固体表面をインキュベートすること、
未結合分子を除去すること、及び、
結合分子が前記サンプルにおける抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖の存在を示す、分子が前記固体表面に結合したか否かを判定すること、
を備える、方法。
【０１５０】
［付記９］
Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する抗体の測定のための抗体を精製する方法であって、
抗体サンプルを準備すること、
修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む固体表面に前記サンプルを接触させること、
未結合抗体を除去すること、
前記抗体から糖鎖を分離する酵素とともに結合抗体をインキュベートすること、
糖鎖を収集すること、及び、
収集糖鎖がＦａｂ部分特異的糖鎖を含むか否かを判定すること、
を備え、
前記サンプルは、ＲＡ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶを発症する危険性のある個体の抗体サンプルであることを特徴とする、方法。
【０１５１】
［付記１０］
Ｆａｂ部分上にＮ結合型グリコシル化を有する抗体を精製する方法であって、
抗体サンプルを準備すること、
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子を含む固体表面とともに前記サンプルをインキュベートすること、
前記固体表面を洗浄し、結合抗体を収集すること、
修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質とともに収集抗体をインキュベートすること、
未結合抗体を除去すること、及び、
前記ペプチド又はタンパク質が結合抗体を有していたか否かを判定すること、
を備える、方法。
【０１５２】
［付記１１］
前記サンプルは精製抗体を含む、付記１０に記載の方法。
【０１５３】
［付記１２］
抗体サンプルを準備すること、
修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質を含む固体表面に前記サンプルを接触させること、
未結合抗体を除去すること、
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子とともに前記固体表面をインキュベートすること、
未結合分子を除去すること、及び、
分子が前記固体表面に結合したか否かを判定すること、
を備える、方法。
【０１５４】
［付記１３］
前記サンプルは、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶを発症する危険性のある個体の抗体サンプルである、付記１から１２のいずれか１つに記載の方法。
【０１５５】
［付記１４］
前記サンプルは、早期抗体サンプルが自己抗体の検査で陽性であった個体の抗体サンプルである、付記１から１３のいずれか１つに記載の方法。
【０１５６】
［付記１５］
前記早期抗体サンプルの前記自己抗体の１０％以下がそのＦａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を含む、付記１４に記載の方法。
【０１５７】
［付記１６］
前記自己抗体は、抗修飾タンパク質抗体（ＡＭＰＡ）である、付記１４又は１５に記載の方法。
【０１５８】
［付記１７］
前記抗体は、Ｆａｂ及びＦｃ断片を生産するために、切断される、付記１から１６のいずれか１つに記載の方法。
【０１５９】
［付記１８］
抗体サンプルが、抗修飾タンパク質抗体（ＡＭＰＡ）を、好ましくは、シトルリン、ホモシトルリン、及び／又はアセチル化リシンに結合するＡＭＰＡを含むか否かを判定する方法であって、
修飾タンパク質エピトープを、好ましくは、シトルリン、ホモシトルリン、又はアセチル化リシンを含む修飾タンパク質エピトープを含むペプチド又はタンパク質に前記サンプルの抗体を接触させること、
抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子に前記サンプルの抗体を接触させること、及び、
Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する抗体が前記ペプチド又はタンパク質内の前記修飾タンパク質エピトープに、好ましくは、シトルリン、ホモシトルリン、又はアセチル化リシンを含む前記修飾タンパク質エピトープに結合したか否かを判定すること、
を含む、方法。
【０１６０】
［付記１９］
前記サンプルは、サンプリング時に関節リウマチを有しない個体のサンプルである、付記１８に記載の方法。
【０１６１】
［付記２０］
ＡＭＰＡが、好ましくは、シトルリン化タンパク質抗原抗体（ＡＣＰＡ）、リシンアセチル化タンパク質抗原抗体（ＡＡＰＡ）、及び／又は抗ＣａｒＰ抗体が、前記個体の類似早期サンプルで検出されたことを特徴とする、付記１８又は１９に記載の方法。
【０１６２】
［付記２１］
前記早期サンプル内の前記ＡＭＰＡは、前記抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型グリコシル化の存在の検査で陰性であった、付記２０に記載の方法。
【０１６３】
［付記２２］
前記個体は、関節炎、好ましくは、関節リウマチを発症する危険性がある、付記１８から２１のいずれか１つに記載の方法。
【０１６４】
［付記２３］
糖鎖結合分子が、レクチン、好ましくは、シアル酸残基結合レクチン、好ましくは、ＳＩＧＬＥＣファミリーの一員、好ましくは、ＣＤ２２又は前記レクチンのシアル酸結合部分である、付記１８から２２のいずれか１つに記載の方法。
【０１６５】
［付記２４］
前記レクチンは、２箇所のシアル酸残基、好ましくは、セイヨウニワトコ凝集素（ＳＮＡ）に同時に結合し得る、付記２３に記載の方法。
【０１６６】
［付記２５］
サンプル中での、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶに関連する自己抗体、ＡＭＰＡなど、の検出に有用なパーツのキットであって、前記キットは、前記自己抗体に結合し得るペプチド又はタンパク質、翻訳後修飾を含むペプチド又はタンパク質など、と、抗体のＦａｂ部分上のＮ結合型糖鎖に結合し得る分子とを含む、キット。
【０１６７】
［付記２６］
前記ペプチド、前記タンパク質、又は、Ｎ結合型糖鎖に結合し得る前記分子は、固体表面に結合している、付記２５に記載のパーツのキット。
【０１６８】
［付記２７］
個体が、Ｆａｂ部分上にＮ結合型糖鎖を有する、関節リウマチ、シェーグレン症候群、又はＡＡＶに関連する自己抗体を含むか否かを判定する方法であって、前記方法は、
前記自己抗体に結合し得るペプチド又はタンパク質に前記個体のサンプルを含むＢ細胞を接触させることと、
前記ペプチド又はタンパク質に結合したＢ細胞を未結合Ｂ細胞から分離すること、
少なくとも、結合Ｂ細胞のＢ細胞受容体の、重鎖可変領域のＣＤＲ１及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１をコードする核酸をシーケンシングすること、及び、
前記核酸配列がＮ結合型グリコシル化コンセンサスアミノ酸配列をコードしているか否かを判定すること、
を含む、方法。
【０１６９】
［付記２８］
少なくとも重鎖可変領域の複数のＣＤＲ及び／又は軽鎖可変領域の複数のＣＤＲをシーケンシングすることを含む、付記２７に記載の方法。
【図１】
2019537017.tif 000003
【図２Ａ】
2019537017.tif 000004
【図２Ｂ】
2019537017.tif 000005
【図３Ａ】
2019537017.tif 000006
【図３Ｂ】
2019537017.tif 000007
【図３Ｃ】
2019537017.tif 000008
【図４Ａ１】
2019537017.tif 000009
【図４Ａ２】
2019537017.tif 000010
【図４Ｂ】
2019537017.tif 000011
【図５】
2019537017.tif 000012
【図６】
2019537017.tif 000013
【図７】
2019537017.tif 000014
【図８】
2019537017.tif 000015
【図９】
2019537017.tif 000016
【図１０Ａ】
2019537017.tif 000017
【図１０Ｂ】
2019537017.tif 000018
【図１１Ａ】
2019537017.tif 000019
【図１１Ｂ】
2019537017.tif 000020
【図１２Ａ】
2019537017.tif 000021
【図１２Ｂ】
2019537017.tif 000022
【図１３Ａ】
2019537017.tif 000023
【図１３Ｂ】
2019537017.tif 000024
【図１３Ｃ】
2019537017.tif 000025
【図１４】
2019537017.tif 000026
【図１５】
2019537017.tif 000027
【図１６】
2019537017.tif 000028
【図１７】
2019537017.tif 000029
【図１８Ａ】
2019537017.tif 000030
【図１８Ｂ】
2019537017.tif 000031
【図１９Ａ】
2019537017.tif 000032
【図１９Ｂ】
2019537017.tif 000033
【図１９Ｃ】
2019537017.tif 000034
【図２０】
2019537017.tif 000035
【図２１Ａ】
2019537017.tif 000036
【図２１Ｂ】
2019537017.tif 000037
【図２１Ｃ】
2019537017.tif 000038
【図２２】
2019537017.tif 000039
【図２３】
2019537017.tif 000040
【図２４Ａ】
2019537017.tif 000041
【図２４Ｂ】
2019537017.tif 000042
【配列表】
2019537017000001.app
【国際調査報告】
2019537017.tif 000043
2019537017.tif 000044
2019537017.tif 000045
2019537017.tif 000046