(57)【要約】  本発明は、ＯＰＮ発現を増加させることによって、アルツハイマー病および関係する疾病の症状を処置、予防、それらの可能性を減らす、または緩和する方法を記載する。本発明はさらに、必要とする被験体の認知機能を改善する方法を提供する。【選択図】図１１Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
必要とする被験体において、アルツハイマー病を処置、予防またはその可能性を減らし、アルツハイマー病の症状を緩和し、シナプスの構造および／または認知機能を救い、病的なアミロイドβ型の除去を増強し、またはニューロンの構造と機能の衰退を阻害する方法であって、該方法は：
被験体に投与された時に、正常な被験体と比較してオステオポンチン（ＯＰＮ）のレベルを増加させる組成物を提供する工程；
および前記ＯＰＮのレベルを増加させるのに十分な量の組成物を被験体に投与する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
組成物は、ＯＰＮを発現する生来の免疫細胞、組換えＯＰＮ、ＯＰＮフラグメント、ＯＰＮ派生物、ＯＰＮ模倣物、ＯＰＮ類似体、またはその組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組成物は生来の免疫細胞中のＯＰＮの発現を刺激する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生来の免疫細胞は単球、マクロファージまたはその組み合わせを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
単球は、骨髄由来の単球、脾臓由来の単球、ＣＤ１１５陽性の単球（ＣＤ１１５＋単球）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
単球は湿潤性の単球であり、および脳内でマクロファージを発現するＯＰＮになる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
生来の免疫細胞は食細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
組成物はグラチラマー酢酸塩（ＧＡ）を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
生来の免疫細胞はエクスビボまたはインビボで刺激される、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
ＯＰＮを発現する生来の免疫細胞は、養子細胞移入または骨髄移植によって被験体に投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
生来の免疫細胞はＯＰＮを過剰発現する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
組成物は、被験体への直接送達、ウイルスベクター送達、リポソーム送達システム、またはナノ薬物送達システムから成る群から選択された方法によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
アルツハイマー病の症状は、記憶喪失、認知の非記憶面の減少、推論または判断の低下、行動の変化、多段階の作業の実行不能、幻覚、妄想、パラノイア、およびその組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
組成物の投与はＭＭＰ−９の増加をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＯＰＮ発現が高まると、被験体のミスフォールドタンパク質のレベルが低下する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ミスフォールドタンパク質はアミロイドベータ（Ａβ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＡβはＡβ４０および／またはＡβ４２である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
必要とする被験体の認知機能を改善する方法であって、該方法は：
被験体に投与された時に、正常な被験体と比較してオステオポンチン（ＯＰＮ）のレベルを増加させる組成物を提供する工程；および
前記ＯＰＮのレベルを増加させるのに十分な量の組成物を被験体に投与する工程、
を含む、方法。
【請求項１９】
組成物は、ＯＰＮを発現する生来の免疫細胞、組換えＯＰＮ、ＯＰＮフラグメント、ＯＰＮ派生物、ＯＰＮ模倣物、ＯＰＮ類似体、またはその組み合わせを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
組成物は生来の免疫細胞中のＯＰＮの発現を刺激する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
生来の免疫細胞は単球、マクロファージまたはその組み合わせを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
単球は、骨髄由来の単球、脾臓由来の単球、ＣＤ１１５陽性の単球（ＣＤ１１５＋単球）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
単球は湿潤性の単球であり、および脳内でマクロファージを発現するＯＰＮになる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
生来の免疫細胞は食細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
組成物はグラチラマー酢酸塩（ＧＡ）を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
生来の免疫細胞はエクスビボまたはインビボで刺激される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
ＯＰＮを発現する生来の免疫細胞は、養子細胞移入または骨髄移植によって被験体に投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
生来の免疫細胞はＯＰＮを過剰発現する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
組成物は、被験体への直接送達、ウイルスベクター送達、リポソーム送達システム、またはナノ薬物送達システムから成る群から選択された方法によって投与される、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
組成物の投与はＭＭＰ−９の増加をもたらす、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
ＯＰＮのレベルが増加すると、被験体におけるミスフォールドタンパク質のレベルの減少、被験体の炎症の低減、被験体におけるシナプス再生の増加、被験体におけるアミロイドベータ（Ａβ）プラーク部位へのマクロファージの動員、またはそれらの組み合わせがもたらされる、請求項１８に記載の方法。
【請求項３２】
ミスフォールドタンパク質はＡβである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＡβはＡβ４０および／またはＡβ４２である、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病およびアルツハイマー病に関係する疾病の処置と予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書においてすべての刊行物は、個々の刊行物または特許出願がそれぞれ参照により組み込まれていることが具体的かつ個別に示されるかのように、同じ程度で参照により組み込まれる。以下の記述は、本発明を理解するのに有用であろう情報を含む。これは、本明細書において提供される任意の情報が先行技術または本請求の発明に関連するものであること、または、具体的または暗に参照された任意の刊行物が先行技術であることを認めるものではない
【０００３】
アルツハイマー病は、アミロイドβタンパク質、特に神経毒性可溶性アミロイドβ１−４２ペプチドの大脳蓄積、およびアミロイドβプラークの細胞外凝集に密に関係する。アミロイド形成的なアミロイドβ型の実質的増加は、神経炎症、および異常なタウタンパク質（ＭＡＰＴによってコードされる）を含む下流の細胞内神経原線維変化に関係している。これらは、認知力低下をもたらすシナプスとニューロンの減少の重要な要因と考えられる。散発性のアルツハイマー病における大脳のアミロイドβの年齢に依存した蓄積は、家族性アルツハイマー病を伴う事例で観察されたように、アミロイドβ１−４２の生産過剰ではなく、むしろその不十分な除去に起因すると思われる。
【０００４】
したがって、アルツハイマー病を処置、予防、またはその可能性を減らす、および関連する病理を処置する方法が、当該技術において必要とされる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
典型的な実施形態は参照された図面に例示される。本明細書に開示される実施形態と図面は、限定的であるよりもむしろ例示的であると見なされることを意図している。
【図１】図１のＡ−Ｄは、本発明の様々な実施形態に従って、Ａβ１−４２集合が、一次皮質ニューロンのシナプスの欠損を誘発することを描く。
【図２】図２のＡ−Ｅは、本発明の様々な実施形態に従って、一次皮質ニューロン（ＣＮ）におけるＡβ１−４２により誘発されたシナプスと神経突起の欠損に対して、ＧＡ処置ＭФが防御することを示す。
【図３】図３のＡ−Ｅは、本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤ＋脳におけるＧＡ免疫化および養子移入をされたＭｏ中のシナプス保存を描く。
【図４】図４のＡ−Ｄは、本発明の様々な実施形態に従って、十分に確定されたｆ／ｐｆ／ｏＡβ１−４２集合が、ＥＥＡ１＋エンドソーム中の細胞内６Ｅ１０＋−Ａβと共に、ＭФ（ＣＤ３６、スカベンジャー受容体）によって有意に貪食されることを示す。
【図５】図５のＡ−Ｄは、本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡが、ｆＡβ１−４２の細胞取込みの増加と共にＭФ中のＯＰＮ発現を誘発することを示す。
【図６】図６のＡ−Ｂは、本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡ免疫化ＡＤ＋マウス脳にＭΦを湿潤させることにより引き起こされたＯＰＮレベルの増加を描く。図６のＡは、ＰＢＳまたはＧＡ処置ＡＤマウス脳の代表的な蛍光性の顕微鏡写真図である。図６のＢでは、定量的多因子コレログラム分析（ピアソン検定；動物１匹ごと）が、ＧＡ免疫化およびＧＡ＋ＭｏＢＭ処置ＡＤｔｇマウスにおけるＯＰＮと単球湿潤の増加との間の有意な直線関係、およびＡβプラーク量との逆関係を実証した。
【図７】図７のＡ−Ｃは、本発明の様々な実施形態に従って、ＭФｆＡβ１−４２食作用に対するＯＰＮ阻害の効果を描く。
【図８】図８のＡ−Ｄは、本発明の様々な実施形態に従って、安定したＡβ集合の生成と精製を描く。
【図９】図９のＡ−Ｂは、本発明の様々な実施形態に従って、Ａ）インビトロ実験（タイムラインは日単位）、およびＢ）インビボ実験（タイムラインは月単位）を描く。
【図１０Ａ】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤｔｇ（ＡＤ）および野生型（ＷＴ）のマウスの脳におけるＯＰＮ発現パターンを描く。図１０Ａは、冠状の脳切片の定量化スキームである。前頂部−２．６５ｍｍのマウス脳の、代表的なニッスル染色画像である。規模：１ｍｍ。帯状回皮質（ＣＣ）（Ｃｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：２０１０  ＪＡＤ  １９：１１４３−１１４８）、海馬（ＨＣ）および嗅内皮質（ＥＣ）（Ｃｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：２０１０  ＪＡＤ  １９：１１４３−１１４８）が、続く定量分析に含まれた。
【図１０Ｂ】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤｔｇ（ＡＤ）および野生型（ＷＴ）のマウスの脳におけるＯＰＮ発現パターンを描く。図１０Ｂは、抗ＯＰＮと抗ヒトＡβ（６Ｅ１０）と核（ＤＡＰＩ）を免疫標識した、ＡＤｔｇおよび年齢の一致したＷＴマウスからの脳の、代表的な蛍光性の顕微鏡写真図である。ＯＰＮ免疫染色は、すべてのＡＤ関連脳領域（ＨＣ、ＣＣおよびＥＣ：矢印）において、ＡＤｔｇマウスのＡβプラーク内部とその周りで検出された。ＷＴ動物では、ＡβとＯＰＮの免疫標識はどちらも検出されなかった。
【図１０Ｃ】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤｔｇ（ＡＤ）および野生型（ＷＴ）のマウスの脳におけるＯＰＮ発現パターンを描く。図１０Ｃは、ＡＤｔｇマウスにおけるＯＰＮのペルオキシダーゼ標識である。ＡＤｔｇマウスのＨＣおよびＥＣ中のＯＰＮ免疫反応性（ＤＡＢ）は、ＥＣのＩＩ／ＩＩＩ層に豊富であり、プラークに似た構造を形成する。
【図１０Ｄ】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤｔｇ（ＡＤ）および野生型（ＷＴ）のマウスの脳におけるＯＰＮ発現パターンを描く。図１０Ｄは、ＣＣとＥＣにおけるＯＰＮ、ＮｅｕＮ、Ｔｕｊ１およびＧＦＡＰの発現である。
【図１０Ｅ】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤｔｇ（ＡＤ）および野生型（ＷＴ）のマウスの脳におけるＯＰＮ発現パターンを描く。図１１Ｅは、ＣＣおよびＨＣ中のＯＰＮ、Ｉｂａ１およびＤＡＰＩ発現である。
【図１０Ｆ】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤｔｇ（ＡＤ）および野生型（ＷＴ）のマウスの脳におけるＯＰＮ発現パターンを描く。図１０Ｆは、１３ヶ月齢と２４ヶ月齢のマウスの脳サンプルにおけるＯＰＮ  ＥＬＩＳＡである。規模：１００μｍ、描かれない場合；挿入：１０μｍ。
【図１１Ａ】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤｔｇマウスにおけるＧＡ免疫化がＡβプラーク量を減らしながらも、大脳のＯＰＮ発現を増加させることを描く。すべての実験群：ＧＡ、ＧＡ＋ＭｏＢＭおよびＰＢＳ対照ＡＤｔｇマウスに関する、ＯＰＮとＡβ（６Ｅ１０）の発現パターンを示す、ＨＣ（２０ｘ、上部の行）およびＣＣ（６３ｘ、中央の行）領域からの冠状の脳切片の蛍光性の顕微鏡写真図である。核を染色するためにＤＡＰＩを使用した。下の行は、ＯＰＮ（左下パネル）およびＡβ（右下パネル）の単一のチャネルを含む。ＰＢＳ対照と比較して、移植されたＭｏＢＭの有無に関わらずＧＡ免疫化群は、大脳のＯＰＮ発現の増加とプラーク量の減少を示した。規模：１００μｍ。
【図１１Ｂ】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤｔｇマウスにおけるＧＡ免疫化がＡβプラーク量を減らしながらも、大脳のＯＰＮ発現を増加させることを描く。各切片ごとの、全ＯＰＮ免疫反応性の（ＩＲ）面積の定量的ＩＨＣ分析である。
【図１１Ｃ】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤｔｇマウスにおけるＧＡ免疫化がＡβプラーク量を減らしながらも、大脳のＯＰＮ発現を増加させることを描く。各切片ごとの、６Ｅ１０＋−プラーク面積の定量的ＩＨＣ分析である。
【図１１Ｄ】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤｔｇマウスにおけるＧＡ免疫化がＡβプラーク量を減らしながらも、大脳のＯＰＮ発現を増加させることを描く。各切片ごとの、ＯＰＮ−ＩＲ面積と６Ｅ１０＋−プラーク面積の比率の定量的ＩＨＣ分析である。
【図１１Ｅ】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤｔｇマウスにおけるＧＡ免疫化がＡβプラーク量を減らしながらも、大脳のＯＰＮ発現を増加させることを描く。各切片ごとのＯＰＮと４Ｇ８の比率である。
【図１１Ｆ】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤｔｇマウスにおけるＧＡ免疫化がＡβプラーク量を減らしながらも、大脳のＯＰＮ発現を増加させることを描く。各切片ごとのＯＰＮとＡβ４２レベルの比率である。
【図１１Ｇ】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤｔｇマウスにおけるＧＡ免疫化がＡβプラーク量を減らしながらも、大脳のＯＰＮ発現を増加させることを描く。脳におけるＯＰＮ  ＥＬＩＳＡである。
【図１１Ｈ】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤｔｇマウスにおけるＧＡ免疫化がＡβプラーク量を減らしながらも、大脳のＯＰＮ発現を増加させることを描く。全脳領域における、全脳領域のＯＰＮ２５  ＩＲ面積とＡβプラーク量の相関分析である。
【図１１Ｉ】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤｔｇマウスにおけるＧＡ免疫化がＡβプラーク量を減らしながらも、大脳のＯＰＮ発現を増加させることを描く。皮質領域における、全脳領域のＯＰＮ２５  ＩＲ面積とＡβプラーク量の相関分析である。
【図１１Ｊ】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤｔｇマウスにおけるＧＡ免疫化がＡβプラーク量を減らしながらも、大脳のＯＰＮ発現を増加させることを描く。ＯＰＮ  ＥＬＩＳＡとＡβプラーク面積の相関分析である。
【図１１Ｋ】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤｔｇマウスにおけるＧＡ免疫化がＡβプラーク量を減らしながらも、大脳のＯＰＮ発現を増加させることを描く。ＯＰＮ  ＥＬＩＳＡと不溶性ＡβＥＬＩＳＡの相関分析である。ピアソン検定による相関分析を行った。
【図１１Ｌ】本発明の様々な実施形態に従って、ＡＤｔｇマウスにおけるＧＡ免疫化がＡβプラーク量を減らしながらも、大脳のＯＰＮ発現を増加させることを描く。ＷＴとＡＤのマウスの脳におけるＯＰＮ  ＥＬＩＳＡである。ＰＢＳ対照と比較した平均値の倍増またはパーセント減が示される。各群につきＮ＝４−８のマウス。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．００１，＊＊＊ｐ＜０．０００１，＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。
【図１２Ａ】本発明の様々な実施形態に従い、ＡＤｔｇマウスのＧＡ免疫化が血管の脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）の負荷を減少させることを描く。血管のＡβおよびＡβ１−４０の減少はＯＰＮと逆相関する。ＰＢＳおよびＧＡ免疫化ＡＤｔｇマウスにおけるチオ−Ｓ染色である。
【図１２Ｂ】本発明の様々な実施形態に従い、ＡＤｔｇマウスのＧＡ免疫化が血管の脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）の負荷を減少させることを描く。血管のＡβおよびＡβ１−４０の減少はＯＰＮと逆相関する。ＰＢＳ、ＧＡ処置、およびＧＡ−ＭｏＢＭ処置されたマウスにおけるＣＡＡスコアである。最後の３つのグラフは、可溶性Ａβ４０とＯＰＮ  ＥＬＩＳＡの相関、不溶性Ａβ４０とＯＰＮ  ＥＬＩＳＡの相関、およびＯＰＮ  ＥＬＩＳＡとＣＡＡスコアの相関を実証する。
【図１２Ｃ】本発明の様々な実施形態に従い、ＡＤｔｇマウスのＧＡ免疫化が血管の脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）の負荷を減少させることを描く。血管のＡβおよびＡβ１−４０の減少はＯＰＮと逆相関する。不溶性Ａβ４０とＣＡＡの相関分析である。
【図１２Ｄ】本発明の様々な実施形態に従い、ＡＤｔｇマウスのＧＡ免疫化が血管の脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）の負荷を減少させることを描く。血管のＡβおよびＡβ１−４０の減少はＯＰＮと逆相関する。可溶性Ａβ４０とＣＡＡスコアの相関分析である。
【図１２Ｅ】本発明の様々な実施形態に従い、ＡＤｔｇマウスのＧＡ免疫化が血管の脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）の負荷を減少させることを描く。血管のＡβおよびＡβ１−４０の減少はＯＰＮと逆相関する。ＥＬＩＳＡ不溶性Ａβ４２とＣＡＡスコアの相関分析である。
【図１２Ｆ】本発明の様々な実施形態に従い、ＡＤｔｇマウスのＧＡ免疫化が血管の脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）の負荷を減少させることを描く。血管のＡβおよびＡβ１−４０の減少はＯＰＮと逆相関する。可溶性Ａβ４２とＣＡＡスコアの相関分析である。
【図１３Ａ】本発明の様々な実施形態に従い、Ａβプラーク除去に関係する単球由来マクロファージを浸潤させることによる大脳のＯＰＮ発現を描く。ＧＡ免疫化ＡＤｔｇマウスのＣＣおよびＥＣ領域からの冠状の脳切片の蛍光性の顕微鏡写真図である。Ｍｏ由来マクロファージ（ＭФ）は、ＯＰＮ発現の主たる要因であり、Ａβプラークに密接に関係していた。ＧＡ免疫化ＡＤｔｇマウス脳において、Ｉｂａ１とＣＤ４５バイオマーカーの組み合わせで免疫染色して特定された湿潤性Ｍｏ／ＭФである。大脳のＯＰＮ、Ａβ（６Ｅ１０）および核（ＤＡＰＩ）がさらに示される。矢印は、浸潤性ＯＰＮを発現するＩｂａ１＋ＣＤ４５ｈｉｇｈ  ＭФがＡβを貪食しているのを示す。
【図１３Ｂ】本発明の様々な実施形態に従い、Ａβプラーク除去に関係する単球由来マクロファージを浸潤させることによる大脳のＯＰＮ発現を描く。ＧＡ免疫化ＡＤｔｇマウスのＣＣおよびＥＣ領域からの冠状の脳切片の蛍光性の顕微鏡写真図である。Ｍｏ由来マクロファージ（ＭФ）は、ＯＰＮ発現の主たる要因であり、Ａβプラークに密接に関係していた。ＯＰＮを発現するＥＣ湿潤性単球をさらに、第２のアプローチによってＧＡ＋ＭｏＢＭ処置されたＡＤｔｇマウス脳において特定した：症状のあるＡＤｔｇマウスの尾静脈に注入された、ＧＦＰ標識ＣＤ１１５＋単球サブセットの養子移入である。ＧＦＰ＋ＣＤ４５ｈｉｇｈを発現する単球は高いＯＰＮ発現を示し、および固有の小膠細胞（ＧＦＰ−ＣＤ４５ｉｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−ｌｏｗ）から判別可能であった。
【図１３Ｃ】本発明の様々な実施形態に従い、Ａβプラーク除去に関係する単球由来マクロファージを浸潤させることによる大脳のＯＰＮ発現を描く。ＧＡ免疫化ＡＤｔｇマウスのＣＣおよびＥＣ領域からの冠状の脳切片の蛍光性の顕微鏡写真図である。Ｍｏ由来マクロファージ（ＭФ）は、ＯＰＮ発現の主たる要因であり、Ａβプラークに密接に関係していた。ＯＰＮ発現Ｉｂａ−１＋骨髄単球性細胞は、特にＥＣの境界においてプラークに関係していた。
【図１３Ｄ】本発明の様々な実施形態に従い、Ａβプラーク除去に関係する単球由来マクロファージを浸潤させることによる大脳のＯＰＮ発現を描く。細胞体にわたり、かつＩｂａ１＋プロセスに沿った、小胞区画の細胞内ＯＰＮの点染色パターンである。シグナルは、核周囲のサブ領域において特に強かった。規模：１０μｍ。
【図１３Ｅ】本発明の様々な実施形態に従い、Ａβプラーク除去に関係する単球由来マクロファージを浸潤させることによる大脳のＯＰＮ発現を描く。細胞体にわたり、かつＩｂａ１＋プロセスに沿った、小胞区画の細胞内ＯＰＮの点染色パターンである。シグナルは、核周囲のサブ領域において特に強かった。規模：１０μｍ。
【図１３Ｆ】本発明の様々な実施形態に従い、Ａβプラーク除去に関係する単球由来マクロファージを浸潤させることによる大脳のＯＰＮ発現を描く。ＨＣ、ＣＣ、ＥＣおよび結合脳領域（脳）内のＯＰＮ＋ＣＤ４５＋細胞数である。ＧＡ免疫化群は、浸潤性ＯＰＮ＋骨髄単球性細胞の数が実質的に増加した。ＰＢＳ対照と比較した平均値の倍増が示される。
【図１３Ｇ】本発明の様々な実施形態に従い、Ａβプラーク除去に関係する単球由来マクロファージを浸潤させることによる大脳のＯＰＮ発現を描く。相関分析（ピアソン検定）は、ＯＰＮ発現と浸潤性Ｉｂａ１＋ＣＤ４５ｈｉｇｈマクロファージの、強く有意な線形関係を発見した。各群につきＮ＝５−８のマウス。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ  ＜０．００１，＊＊＊ｐ＜０．０００１，＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。
【図１４Ａ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡが、ＢＭ由来マクロファージの初代培養中のＯＰＮ発現をアップレギュレートすることを描く。インビトロ試験の実験手順：骨髄をＷＴマウス（８から１２週齢）から単離し、およびマクロファージ（ＭФＢＭ）へと分化させるためにＭＣＳＦ強化培地で６−７日間培養した。６日目に、細胞をＧＡ、ｓｉＲＮＡ、ミノサイクリンまたはｓｉＲＮＡを伴うＧＡで一晩処置した。７日目に、原線維性Ａβ（ｆＡβ１−４２）を実験のサブセットに加え、および食作用アッセイを実行した。ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）処置は食作用の３時間前に行なわれた。
【図１４Ｂ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡが、ＢＭ由来マクロファージの初代培養中のＯＰＮ発現をアップレギュレートすることを描く。Ａβへの暴露前の、ＭФＢＭおよびＧＡ−ＭФＢＭ細胞のインビトロの蛍光性の顕微鏡写真図であり、ＢＦＡ処置はされていない。ＯＰＮは抗ＯＰＮ抗体で免疫染色される。ＭФＢＭはＯＰＮを発現し、およびＧＡ処置はＯＰＮ発現を高めた。（図１４Ｂ：挿入）ＭФＢＭ中の輸送小胞内部に位置付けられた細胞内ＯＰＮ。
【図１４Ｃ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡが、ＢＭ由来マクロファージの初代培養中のＯＰＮ発現をアップレギュレートすることを描く。Ａβへの暴露前の、ＭФＢＭおよびＧＡ−ＭФＢＭ細胞のインビトロの蛍光性の顕微鏡写真図であり、ＢＦＡで前処置されている。ＯＰＮは抗ＯＰＮ抗体で免疫染色される。ＭФＢＭはＯＰＮを発現し、およびＧＡ処置はＯＰＮ発現を高めた。ＯＰＮ分泌のＢＦＡ阻害後の、円形のＭФＢＭ。
【図１４Ｄ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡが、ＢＭ由来マクロファージの初代培養中のＯＰＮ発現をアップレギュレートすることを描く。ＯＰＮ免疫反応性領域の定量的ＩＣＣは、ＢＦＡ阻害の有無に関わらず、Ａβへの暴露前の、ＧＡ処置に続くＭФＢＭ中のＯＰＮのアップレギュレーションを明らかにした。
【図１４Ｅ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡが、ＢＭ由来マクロファージの初代培養中のＯＰＮ発現をアップレギュレートすることを描く。ＧＡ処置されたおよび未処置のＭФＢＭからの細胞可溶化物におけるＯＰＮレベルの定量的ＥＬＩＳＡである。
【図１４Ｆ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡが、ＢＭ由来マクロファージの初代培養中のＯＰＮ発現をアップレギュレートすることを描く。ヤギのモノクローナル抗ＯＰＮ抗体を使用した、前記実験群からの細胞可溶化物の代表的なウェスタンブロット画像。
【図１４Ｇ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡが、ＢＭ由来マクロファージの初代培養中のＯＰＮ発現をアップレギュレートすることを描く。ウェスタンブロットの定量化。結果はＩＣＣとＥＬＩＳＡのデータを反映し、Ａβ暴露に関わらず、ＧＡがＭФＢＭ中のＯＰＮ発現を有意に誘発したことを示す。ＰＢＳ対照と比較した平均値における倍増が示される。ＢＦＡ処置細胞と未処置細胞の比較は、短い期間（１時間以内）でのＯＰＮの実質的な蓄積を示した。
【図１４Ｈ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡが、ＢＭ由来マクロファージの初代培養中のＯＰＮ発現をアップレギュレートすることを描く。ｇｏｌｇｉ、ＯＰＮおよびＤＡＰＩ染色の蛍光性の顕微鏡写真図。
【図１４Ｉ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡが、ＢＭ由来マクロファージの初代培養中のＯＰＮ発現をアップレギュレートすることを描く。ＯＰＮ、ＥＥＡ１およびＤＡＰＩ染色の蛍光性の顕微鏡写真図。
【図１４Ｊ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡが、ＢＭ由来マクロファージの初代培養中のＯＰＮ発現をアップレギュレートすることを描く。時点を変化させた、ＧＡで処置されたＷＴマウスのＯＰＮ  ＥＬＩＳＡ。＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．００１，＊＊＊ｐ＜０．０００１，＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。規模：２０μｍ、挿入規模（ｉｎｓｅｒｔ  ｓｃａｌｅ）５μｍ。
【図１５Ａ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡ処置されたマクロファージによるＡβ原線維の取込みのＯＰＮに依存した増加を描く。３０分間、ｆＡβ１−４２で刺激された初代培養中のＭФＢＭ中おけるＡβ取込みおよびＯＰＮ発現の代表的な蛍光性の顕微鏡写真図および定量分析である。細胞内ＯＰＮ発現パターンと共に６Ｅ１０＋−Ａβの細胞内取込みを示す、より高い倍率のＺスタック画像である。
【図１５Ｂ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡ処置されたマクロファージによるＡβ原線維の取込みのＯＰＮに依存した増加を描く。３０分間、ｆＡβ１−４２で刺激された初代培養中のＭФＢＭ中おけるＡβ取込みおよびＯＰＮ発現の代表的な蛍光性の顕微鏡写真図および定量分析である。ＧＡ処置ＭФＢＭ 対 未処置ＭФＢＭにおける、ＯＰＮ発現および細胞内Ａβの定量的ＩＣＣ。ＧＡ処置は２４時間続いた。ＯＰＮ発現の増加とｆＡβ１−４２の細胞取込みの増加が、ＧＡ処置後に見出された。
【図１５Ｃ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡ処置されたマクロファージによるＡβ原線維の取込みのＯＰＮに依存した増加を描く。３０分間、ｆＡβ１−４２で刺激された初代培養中のＭФＢＭ中おけるＡβ取込みおよびＯＰＮ発現の代表的な蛍光性の顕微鏡写真図および定量分析である。ＧＡ処置ＭФＢＭ 対 未処置ＭФＢＭにおける、ＯＰＮ発現および細胞内Ａβの定量的ＩＣＣ。ＧＡ処置は２４時間続いた。ＯＰＮ発現の増加とｆＡβ１−４２の細胞取込みの増加が、ＧＡ処置後に見出された。
【図１５Ｄ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡ処置されたマクロファージによるＡβ原線維の取込みのＯＰＮに依存した増加を描く。３０分間、ｆＡβ１−４２で刺激された初代培養中のＭФＢＭ中おけるＡβ取込みおよびＯＰＮ発現の代表的な蛍光性の顕微鏡写真図および定量分析である。ＧＡ処置ＭФＢＭ 対 未処置ＭФＢＭにおける、ＯＰＮレベルおよび細胞内Ａβ１−４２の定量的ＥＬＩＳＡである。
【図１５Ｅ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡ処置されたマクロファージによるＡβ原線維の取込みのＯＰＮに依存した増加を描く。３０分間、ｆＡβ１−４２で刺激された初代培養中のＭФＢＭ中おけるＡβ取込みおよびＯＰＮ発現の代表的な蛍光性の顕微鏡写真図および定量分析である。ＧＡ処置ＭФＢＭ 対 未処置ＭФＢＭにおける、ＯＰＮレベルおよび細胞内Ａβ１−４２の定量的ＥＬＩＳＡである。
【図１５Ｆ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡ処置されたマクロファージによるＡβ原線維の取込みのＯＰＮに依存した増加を描く。３０分間、ｆＡβ１−４２で刺激された初代培養中のＭФＢＭ中おけるＡβ取込みおよびＯＰＮ発現の代表的な蛍光性の顕微鏡写真図および定量分析である。ＫＯおよびＧＡ処置されたＷＴとＫＯマウスにおける、ＯＰＮ、ＣＤ３６、６Ｅ１０およびＤＡＰＩ染色の蛍光性の顕微鏡写真図である。
【図１５Ｇ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡ処置されたマクロファージによるＡβ原線維の取込みのＯＰＮに依存した増加を描く。３０分間、ｆＡβ１−４２で刺激された初代培養中のＭФＢＭ中おけるＡβ取込みおよびＯＰＮ発現の代表的な蛍光性の顕微鏡写真図および定量分析である。未処置であり、かつＯＰＮ、ＣＤ６８および６Ｅ１０に対する抗体で共標識された、ＭФＢＭの顕微鏡写真図である。
【図１５Ｈ】ＨおよびＨ‘は、本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡ処置されたマクロファージによるＡβ原線維の取込みのＯＰＮに依存した増加を描く。３０分間、ｆＡβ１−４２で刺激された初代培養中のＭФＢＭ中おけるＡβ取込みおよびＯＰＮ発現の代表的な蛍光性の顕微鏡写真図および定量分析である。ＧＡ処置され、かつＯＰＮ、ＣＤ６８および６Ｅ１０に対する抗体で共標識された、ＭФＢＭの顕微鏡写真図である。ＧＡで前処置されたＭФＢＭはｆＡβ１−４２取込みの増強を示した。
【図１５Ｉ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡ処置されたマクロファージによるＡβ原線維の取込みのＯＰＮに依存した増加を描く。３０分間、ｆＡβ１−４２で刺激された初代培養中のＭФＢＭ中おけるＡβ取込みおよびＯＰＮ発現の代表的な蛍光性の顕微鏡写真図および定量分析である。ＭФＢＭおよびＧＡ−ＭФＢＭからの細胞可溶化物のＥＬＩＳＡ分析である。
【図１５Ｊ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡ処置されたマクロファージによるＡβ原線維の取込みのＯＰＮに依存した増加を描く。３０分間、ｆＡβ１−４２で刺激された初代培養中のＭФＢＭ中おけるＡβ取込みおよびＯＰＮ発現の代表的な蛍光性の顕微鏡写真図および定量分析である。ＭФＢＭおよびＧＡ−ＭФＢＭからの細胞可溶化物のＥＬＩＳＡ分析である。
【図１５Ｋ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡ処置されたマクロファージによるＡβ原線維の取込みのＯＰＮに依存した増加を描く。３０分間、ｆＡβ１−４２で刺激された初代培養中のＭФＢＭ中おけるＡβ取込みおよびＯＰＮ発現の代表的な蛍光性の顕微鏡写真図および定量分析である。ＧＡ処置ＭФＢＭ 対 未処置ＭФＢＭにおける、Ａβ４０取込みの定量的ＩＣＣである。
【図１５Ｌ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡ処置されたマクロファージによるＡβ原線維の取込みのＯＰＮに依存した増加を描く。３０分間、ｆＡβ１−４２で刺激された初代培養中のＭФＢＭ中おけるＡβ取込みおよびＯＰＮ発現の代表的な蛍光性の顕微鏡写真図および定量分析である。未処置およびｓｉＲＮＡＯＰＮでトランスフェクトされたＭФＢＭ細胞の代表的な顕微鏡写真図であり、ｆＡβ１−４２食作用を示す。
【図１５Ｍ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡ処置されたマクロファージによるＡβ原線維の取込みのＯＰＮに依存した増加を描く。３０分間、ｆＡβ１−４２で刺激された初代培養中のＭФＢＭ中おけるＡβ取込みおよびＯＰＮ発現の代表的な蛍光性の顕微鏡写真図および定量分析である。定量的ＩＣＣは、ＭФＢＭおよびＧＡ−ＭФＢＭ中のＯＰＮのｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンに続く、ＯＰＮ発現の減少とｆＡβ１−４２食作用の欠損を明らかにした。負の対照のｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｉＲＮＡ（Ｆｒａｎｚｅｎ  ａｎｄ  Ｈｅｉｎｅｇａｒｄ）は、ＯＰＮ発現またはＡβ食作用に何の効果もなかった。ＧＡの付加はＯＰＮノックダウン後のＯＰＮ発現またはＡβ取込みにほとんど、または全く影響しなかった。
【図１５Ｎ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡ処置されたマクロファージによるＡβ原線維の取込みのＯＰＮに依存した増加を描く。３０分間、ｆＡβ１−４２で刺激された初代培養中のＭФＢＭ中おけるＡβ取込みおよびＯＰＮ発現の代表的な蛍光性の顕微鏡写真図および定量分析である。定量的ＩＣＣは、ＭФＢＭおよびＧＡ−ＭФＢＭ中のＯＰＮのｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンに続く、ＯＰＮ発現の減少とｆＡβ１−４２食作用の欠損を明らかにした。負の対照のｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｉＲＮＡ（Ｆｒａｎｚｅｎ  ａｎｄ  Ｈｅｉｎｅｇａｒｄ）は、ＯＰＮ発現またはＡβ食作用に何の効果もなかった。ＧＡの付加はＯＰＮノックダウン後のＯＰＮ発現またはＡβ取込みにほとんど、または全く影響しなかった。
【図１５Ｏ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡ処置されたマクロファージによるＡβ原線維の取込みのＯＰＮに依存した増加を描く。３０分間、ｆＡβ１−４２で刺激された初代培養中のＭФＢＭ中おけるＡβ取込みおよびＯＰＮ発現の代表的な蛍光性の顕微鏡写真図および定量分析である。未処置およびｓｉＲＮＡトランスフェクトされたもののＯＰＮ  ＥＬＩＳＡである。
【図１５Ｐ】本発明の様々な実施形態に従って、ＧＡ処置されたマクロファージによるＡβ原線維の取込みのＯＰＮに依存した増加を描く。３０分間、ｆＡβ１−４２で刺激された初代培養中のＭФＢＭ中おけるＡβ取込みおよびＯＰＮ発現の代表的な蛍光性の顕微鏡写真図および定量分析である。対照、ノックアウトおよびＧＡ処置ノックアウト内におけるＡβ取込みである。ＰＢＳ対照と比較した平均値における倍増またはパーセント減が示される。規模：１０μｍ。＊ｐ＜０．０５，＊＊＜０．００１，＊＊＊ｐ＜０．０００１，＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。
【図１６Ａ】本発明の様々な実施形態に従って、ＯＰＮがマクロファージ中のＧＡ獲得治癒促進性の表現型を媒介することを描く。未処置、または一晩ＧＡまたはｓｉＲＮＡＯＰＮで前処置され、およびＯＰＮに関して免疫染色された初代培養中のＭФＢＭの蛍光性の顕微鏡写真図である。下の列はＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを用いてＭФＢＭの細胞長さを示す。
【図１６Ｂ】本発明の様々な実施形態に従って、ＯＰＮがマクロファージ中のＧＡ獲得治癒促進性の表現型を媒介することを描く。細胞長さ測定の定量分析である。抗炎症性の、治癒促進性の表現型へのＭФＢＭの極性化は、増幅されたＯＰＮ発現でのＧＡ処置に起因する細長い細胞形に関係していた。ｓｉＲＮＡによるＯＰＮノックダウンはより短い細胞を産生した。
【図１６Ｃ】本発明の様々な実施形態に従って、ＯＰＮがマクロファージ中のＧＡ獲得治癒促進性の表現型を媒介することを描く。２４時間ＧＡまたはミノサイクリン（Ｍ）で処置され、次に３０分間ｆＡβ１−４２に暴露されたＭФＢＭの蛍光画像である。細胞はｉＮＯＳと６Ｅ１０に関して免疫染色された。
【図１６Ｄ】本発明の様々な実施形態に従って、ＯＰＮがマクロファージ中のＧＡ獲得治癒促進性の表現型を媒介することを描く。定量的ＩＣＣは、ミノサイクリン処置がｉＮＯＳ発現を増加させ、それは逆にｆＡβ１−４２食作用を減じることを明らかにした。
【図１６Ｅ】本発明の様々な実施形態に従って、ＯＰＮがマクロファージ中のＧＡ獲得治癒促進性の表現型を媒介することを描く。定量的ＩＣＣは、ミノサイクリン処置がｉＮＯＳ発現を増加させ、それは逆にｆＡβ１−４２食作用を減じることを明らかにした。
【図１６Ｆ】本発明の様々な実施形態に従って、ＯＰＮがマクロファージ中のＧＡ獲得治癒促進性の表現型を媒介することを描く。ＭＭＰ−９、６Ｅ１０およびＳＣＡＲＡ−１に関して免疫染色されたＭФＢＭの蛍光画像である。
【図１６Ｇ】本発明の様々な実施形態に従って、ＯＰＮがマクロファージ中のＧＡ獲得治癒促進性の表現型を媒介することを描く。定量的ＩＣＣは、ＧＡ処置がインビトロのＭＭＰ−９発現を増加させることを明らかにした。
【図１６Ｈ】本発明の様々な実施形態に従って、ＯＰＮがマクロファージ中のＧＡ獲得治癒促進性の表現型を媒介することを描く。ＷＴ、ＯＰＮ  ＫＯおよびＧＡ処置ＯＰＮ  ＫＯにおけるＭＭＰ９面積（μｍ２／細胞）である。
【図１６Ｉ】本発明の様々な実施形態に従って、ＯＰＮがマクロファージ中のＧＡ獲得治癒促進性の表現型を媒介することを描く。ウサギ抗ＯＰＮ抗体でのウェスタンブロット、およびその各定量的バンド密度分析は、メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）タンパク分解に由来するＯＰＮフラグメントが、ＧＡ処置により増加したことを示し、これはＭＭＰ−９産生の増加と矛盾しない。ＯＰＮ分泌、および抗炎症性表現型へのＭＭＰ媒介マクロファージ極性化によるそのタンパク分解は、ｆＡβ１−４２食作用の増幅に帰結する。ＰＢＳ対照と比較した平均値における倍増またはパーセント減が示される。規模：５０μｍ。＊ｐ＜０．０５，＊＊＜０．００１，＊＊＊ｐ＜０．０００１，＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。
【図１６Ｊ】本発明の様々な実施形態に従って、ＯＰＮがマクロファージ中のＧＡ獲得治癒促進性の表現型を媒介することを描く。ウサギ抗ＯＰＮ抗体でのウェスタンブロット、およびその各定量的バンド密度分析は、メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）タンパク分解に由来するＯＰＮフラグメントが、ＧＡ処置により増加したことを示し、これはＭＭＰ−９産生の増加と矛盾しない。ＯＰＮ分泌、および抗炎症性表現型へのＭＭＰ媒介マクロファージ極性化によるそのタンパク分解は、ｆＡβ１−４２食作用の増幅に帰結する。ＰＢＳ対照と比較した平均値における倍増またはパーセント減が示される。規模：５０μｍ。＊ｐ＜０．０５，＊＊＜０．００１，＊＊＊ｐ＜０．０００１，＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。
【図１７Ａ】本発明の様々な実施形態に従い、ＡＤ病理に関係しなかった脳領域のＯＰＮ発現パターンを描く。ＡＤｔｇおよび年齢の一致したＷＴマウス脳からの冠状切片の蛍光性の顕微鏡写真図であり、抗ＯＰＮ、Ｉｂａ１＋−小膠細胞とマクロファージ、および核（ＤＡＰＩ）に関して免疫標識されている。ＯＰＮ免疫染色のパターンを、ＷＴとＡＤｔｇのマウスの線条体で検出した。ＯＰＮは、Ｉｂａ１＋小膠細胞／マクロファージで共標識されないが、ニューロンを免疫標識する。
【図１７Ｂ】本発明の様々な実施形態に従い、ＡＤ病理に関係しなかった脳領域のＯＰＮ発現パターンを描く。ＷＴとＡＤｔｇマウスにおけるＯＰＮのペルオキシダーゼ画像化である。ＷＴとＡＤｔｇのマウスの線条体におけるＯＰＮ免疫反応性（ＤＡＢ）は、ニューロンに対して選択的であり、小膠細胞またはマクロファージでは検出されない。
【図１７Ｃ】本発明の様々な実施形態に従い、ＡＤ病理に関係しなかった脳領域のＯＰＮ発現パターンを描く。抗ＯＰＮ、Ｔｕｊ１−ニューロンおよび核（ＤＡＰＩ）に関して免疫標識されている、ＡＤｔｇおよび年齢の一致したＷＴマウス脳からの冠状切片の蛍光性の顕微鏡写真図である。規模：１００μｍ。
【図１８Ａ】本発明の様々な実施形態に従い、ＡＤｔｇマウスにおける免疫ベースの介入に続く、湿潤性単球によって増強された大脳のＯＰＮ発現を描く。脳切片（ＣＣ、ＥＣおよびＨＣ）の定量的ＩＨＣ分析を、ＯＰＮ陽性領域ごとに６Ｅ１０＋プラーク面積に対するＯＰＮ陽性面積の比率に関して評価した。ＰＢＳ対照と比較して、ＧＡとＧＡ＋ＭｏＢＭ群はすべての脳領域でＯＰＮ発現の増加を示した。結果は、ＧＡとＧＡ＋ＭｏＢＭ処置に続く、プラークごとの、有意により多くのＯＰＮ発現を示した。
【図１８Ｂ】本発明の様々な実施形態に従い、ＡＤｔｇマウスにおける免疫ベースの介入に続く、湿潤性単球によって増強された大脳のＯＰＮ発現を描く。脳切片（ＣＣ、ＥＣおよびＨＣ）の定量的ＩＨＣ分析を、各切片ごとに６Ｅ１０＋プラーク面積に対するＯＰＮ陽性面積の比率に関して評価した。ＰＢＳ対照と比較して、ＧＡとＧＡ＋ＭｏＢＭ群はすべての脳領域でＯＰＮ発現の増加を示した。結果は、ＧＡとＧＡ＋ＭｏＢＭ処置に続く、プラークごとの、有意により多くのＯＰＮ発現を示した。
【図１８Ｃ】本発明の様々な実施形態に従い、ＡＤｔｇマウスにおける免疫ベースの介入に続く、湿潤性単球によって増強された大脳のＯＰＮ発現を描く。ＣＡＡスコア、可溶性Ａβ４２  ＥＬＩＳＡに対するＯＰＮ  ＥＬＩＳＡの相関分析、ＯＰＮ  ＥＬＩＳＡに対するＨＣのＣＡＡスコアの相関分析、およびＯＰＮ  ＥＬＩＳＡに対するＣＣのＣＡＡスコアの相関である。
【図１８Ｄ】本発明の様々な実施形態に従い、ＡＤｔｇマウスにおける免疫ベースの介入に続く、湿潤性単球によって増強された大脳のＯＰＮ発現を描く。可溶性Ａβ４０に対するＨＣおよびＣＣのＣＡＡスコアの相関分析、および不溶性Ａβ４０に対するＨＣおよびＣＣのＣＡＡスコアの相関分析である。ＰＢＳ対照と比較した平均値における倍増が示される。各群につきＮ＝５−８のマウス。＊ｐ＜０．０５，＊＊＜０．００１，＊＊＊ｐ＜０．０００１，＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。
【図１９Ａ】本発明の様々な実施形態に従い、大脳のＯＰＮはプラーク量と逆相関し、浸潤性単球およびＭＭＰ−９と直接相関することを描く。高度な定量的多因子コレログラム分析は、ＧＡ免疫化ＧＡ＋ＭｏＢＭ処置がＡＤｔｇマウスにおけるＯＰＮと単球浸潤増加との間の、有意な線形関係を実証した。ＯＰＮとＡβプラーク量の間に逆相関が見つかった（相関分析は切片ごとに行われた）。
【図１９Ｂ】本発明の様々な実施形態に従い、大脳のＯＰＮはプラーク量と逆相関し、浸潤性単球およびＭＭＰ−９と直接相関することを描く。追加の相関分析は、ＯＰＮ：６Ｅ１０とＣＤ４５ｈｉ：６Ｅ１０（浸潤性単球）との間の有意な陽性の線形相関を確認した。
【図１９Ｃ】本発明の様々な実施形態に従い、大脳のＯＰＮはプラーク量と逆相関し、浸潤性単球およびＭＭＰ−９と直接相関することを描く。ＡＤｔｇマウスにおけるＯＰＮとＭＭＰ−９との間の有意な線形関係を実証する相関分析である。結果は、全脳ＭＭＰ−９とＯＰＮレベルの間の直接相関を明らかにした。ピアソン検定を使用して相関分析を行った。
【図１９Ｄ】本発明の様々な実施形態に従い、大脳のＯＰＮはプラーク量と逆相関し、浸潤性単球およびＭＭＰ−９と直接相関することを描く。ＡＤｔｇマウスにおけるＯＰＮ発現ＣＤ４５ｈｉ単球とＭＭＰ−９発現との間の有意な線形関係を実証する相関分析である。結果は、浸潤性ＯＰＮ発現単球と大脳のＭＭＰ−９レベルとの間のより強い相関を明らかにした。ピアソン検定を使用して相関分析を行った。
【図１９Ｅ】本発明の様々な実施形態に従い、大脳のＯＰＮはプラーク量と逆相関し、浸潤性単球およびＭＭＰ−９と直接相関することを描く。ＭＭＰ−９とＯＰＮ  ＥＬＩＳＡの相関分析である。
【図１９Ｆ】本発明の様々な実施形態に従い、大脳のＯＰＮはプラーク量と逆相関し、浸潤性単球およびＭＭＰ−９と直接相関することを描く。ＭＣＰ−１とＯＰＮ  ＥＬＩＳＡの相関分析である。
【図１９Ｇ】本発明の様々な実施形態に従い、大脳のＯＰＮはプラーク量と逆相関し、浸潤性単球およびＭＭＰ−９と直接相関することを描く。ＰＢＳ、ＧＡ処置、およびＧＡ処置ＭｏＢＭにおけるＣＡＡスコアの相関分析である。
【図１９Ｈ】本発明の様々な実施形態に従い、大脳のＯＰＮはプラーク量と逆相関し、浸潤性単球およびＭＭＰ−９と直接相関することを描く。大脳のＯＰＮ発現は、シナプス後部の密度と関連する。各群につきＮ＝５−８のマウス。＊ｐ＜０．０５，＊＊＜０．００１，＊＊＊ｐ＜０．０００１，＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。
【図１９Ｉ】本発明の様々な実施形態に従い、大脳のＯＰＮはプラーク量と逆相関し、浸潤性単球およびＭＭＰ−９と直接相関することを描く。大脳のＯＰＮ発現は、シナプス後部の密度と関連する。各群につきＮ＝５−８のマウス。＊ｐ＜０．０５，＊＊＜０．００１，＊＊＊ｐ＜０．０００１，＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。
【図１９Ｊ】本発明の様々な実施形態に従い、大脳のＯＰＮはプラーク量と逆相関し、浸潤性単球およびＭＭＰ−９と直接相関することを描く。大脳のＯＰＮ発現は、認知機能の減少と関連する。各群につきＮ＝５−８のマウス。＊ｐ＜０．０５，＊＊＜０．００１，＊＊＊ｐ＜０．０００１，＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。
【図１９Ｋ】本発明の様々な実施形態に従い、大脳のＯＰＮはプラーク量と逆相関し、浸潤性単球およびＭＭＰ−９と直接相関することを描く。大脳のＯＰＮ発現は、認知機能の減少と関連する。各群につきＮ＝５−８のマウス。＊ｐ＜０．０５，＊＊＜０．００１，＊＊＊ｐ＜０．０００１，＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。
【図２０】本発明の様々な実施形態に従い、ＧＡ免疫化およびＡＤｔｇマウスの単球による血液強化は、認識の沈殿を減らし、およびシナプス後部の保存を増強することを描く。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の様々な実施形態は、必要とする被験体において、アルツハイマー病を処置、予防またはその可能性を減らす方法、アルツハイマー病の症状を緩和する方法、シナプスの構造および／または認知機能を救う方法、病的なアミロイドβ型の除去を増強する方法、またはニューロンの構造と機能の衰退を阻害する方法を提供し、該方法は：被験体に投与された時に、正常な被験体と比較してオステオポンチン（ＯＰＮ）のレベルを増加させる組成物を提供する工程；および前記ＯＰＮのレベルを増加させるのに十分な量の組成物を被験体に投与する工程を含む。
【０００７】
様々な実施形態では、組成物は、ＯＰＮを発現する生来の免疫細胞、組換えＯＰＮ、ＯＰＮフラグメント、ＯＰＮ派生物、ＯＰＮ模倣物、ＯＰＮ類似体、またはその組み合わせを含む。
【０００８】
様々な実施形態では、組成物は、生来の免疫細胞におけるＯＰＮの発現を刺激する。様々な他の実施形態では、生来の免疫細胞は、単球、マクロファージ、またはその組み合わせを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、単球は、骨髄由来の単球、脾臓由来の単球、ＣＤ１１５陽性の単球（ＣＤ１１５＋単球）、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの他の実施形態では、単球は、湿潤性の単球であり、および脳内でマクロファージを発現するＯＰＮになる。さらに他の実施形態では、生来の免疫細胞は食細胞である。
【００１０】
様々な実施形態では、グラチラマー酢酸塩（ＧＡ）は、生来の免疫細胞におけるＯＰＮの発現を刺激するために投与される。いくつかの実施形態では、生来の免疫細胞はエクスビボまたはインビボで刺激される。
【００１１】
様々な実施形態では、ＯＰＮを発現する生来の免疫細胞は、養子細胞移入または骨髄移植によって被験体に投与される。様々な実施形態では、生来の免疫細胞はＯＰＮを過剰発現する。
【００１２】
様々な実施形態では、組成物は、被験体への直接送達、ウイルスベクター送達、リポソーム送達システム、またはナノ薬物送達システムから成る群から選択された方法によって投与される。
【００１３】
様々な実施形態では、アルツハイマー病の症状は、記憶喪失、認知の非記憶面の減少、推論または判断の低下、行動の変化、多段階の作業の実行不能、幻覚、妄想、パラノイア、およびその組み合わせから成る群から選択される。
【００１４】
様々な実施形態では、組成物の投与はＭＭＰ−９の増加をもたらす。
【００１５】
様々な実施形態では、ＯＰＮ発現が高まると、被験体のミスフォールドタンパク質のレベルが低下する。様々な他の実施形態では、ミスフォールドタンパク質はアミロイドベータ（Ａβ）である。さらに他の実施形態では、ＡβはＡβ４０および／またはＡβ４２である。
【００１６】
本発明の様々な実施形態はさらに、必要とする被験体の認知機能を改善する方法を提供し、該方法は：被験体に投与された時に、正常な被験体と比較してオステオポンチン（ＯＰＮ）のレベルを増加させる組成物を提供する工程；および前記ＯＰＮのレベルを増加させるのに十分な量の組成物を被験体に投与する工程を含む。
【００１７】
様々な実施形態では、組成物は、ＯＰＮを発現する生来の免疫細胞、組換えＯＰＮ、ＯＰＮフラグメント、ＯＰＮ派生物、ＯＰＮ模倣物、ＯＰＮ類似体、またはその組み合わせを含む。
【００１８】
いくつかの実施形態では、組成物は、生来の免疫細胞におけるＯＰＮの発現を刺激する。様々な他の実施形態では、生来の免疫細胞は、単球、マクロファージ、またはその組み合わせを含む。他の実施形態では、単球は、骨髄由来の単球、脾臓由来の単球、ＣＤ１１５陽性の単球（ＣＤ１１５＋単球）、またはそれらの組み合わせを含む。さらに他の実施形態では、単球は、湿潤性の単球であり、および脳内でマクロファージを発現するＯＰＮになる。特定の実施形態では、生来の免疫細胞は食細胞である。
【００１９】
様々な実施形態では、組成物はグラチラマー酢酸塩（ＧＡ）を含む。様々な他の実施形態では、生来の免疫細胞はエクスビボまたはインビボで刺激される。
【００２０】
様々な実施形態では、ＯＰＮを発現する生来の免疫細胞は、養子細胞移入または骨髄移植によって被験体に投与される。様々な実施形態では、生来の免疫細胞はＯＰＮを過剰発現する。
【００２１】
様々な実施形態では、組成物は、被験体への直接送達、ウイルスベクター送達、リポソーム送達システム、またはナノ薬物送達システムから成る群から選択された方法によって投与される。
【００２２】
様々な実施形態では、アルツハイマー病の症状は、記憶喪失、認知の非記憶面の減少、推論または判断の低下、行動の変化、多段階の作業の実行不能、幻覚、妄想、パラノイア、およびその組み合わせから成る群から選択される。
【００２３】
様々な実施形態では、組成物の投与はＭＭＰ−９の増加をもたらす。様々な他の実施形態では、ＯＰＮのレベルが増加すると、被験体におけるミスフォールドタンパク質のレベルの減少、被験体の炎症の低減、被験体におけるシナプス再生の増加、被験体のアミロイドベータ（Ａβ）プラーク部位へのマクロファージの動員、またはそれらの組み合わせがもたらされる。
【００２４】
他の実施形態では、ミスフォールドタンパク質はＡβである。さらに他の実施形態では、ＡβはＡβ４０および／またはＡβ４２である。
【００２５】
様々な実施形態では、ＯＰＮ発現の増加を伴う生来の免疫細胞は、必要とする被験体の血液および／または脳に投与することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書で引用されるすべての参考文献は、あたかも完全に論述されているかのように、参照によってその全体が組み込まれる。別段の定義のない限り、本明細書で使用される技術的かつ科学的な用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常、理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｒｅｖｉｓｅｄ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００６）；Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ７ｔｈ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２０１３）；および、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２０１２）は、本出願において使用される多くの用語の一般的な指針を当業者に提供する。抗体を調製する方法についての参考文献として、以下を参照されたい：Ｄ．  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ，２０１３）；Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号；およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３（１９８８）；米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４（１９８９）；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  Ｉ．ａｎｄ  Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，３２６，４６１−４７９；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｓｅｐ；２３（９）：１１２６−３６）。
【００２７】
当業者は、本発明の実施において使用され得る、本明細書に記載されるものと類似または同等の多くの方法および物質を認識するだろう。実際に本発明は、記載される方法と物質に限定されることはない。
【００２８】
本明細書において使用されるように、「ＯＰＮ」はオステオポンチンを指し、その言及は、完全長、機能性フラグメント、生物学的活性フラグメントを包含する。いくつかの実施形態では、ＯＰＮ類似体、派生物および／または模倣物がさらに言及され得る。
【００２９】
本明細書において使用されるように、「養子細胞移入」は、被験体への細胞の移入を指す。細胞は、被験体または別の個体（ドナー）に由来するものであってもよい。
【００３０】
本明細書で使用されるように、「生来の免疫細胞」は、生来の免疫系の細胞を指し、限定されないが、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、および／またはナチュラルキラー細胞が含まれる。
【００３１】
本明細書で使用されるように、用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」は、疾患、障害または医学的状態に関して使用される場合、治療的処置と予防的方法または妨害的方法の両方を指し、その目的は、症状または疾病の進行または重症度を、予防する、逆転させる、緩和する、改善する、阻害する、低減する、遅らせる、または止めることである。用語「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾病の少なくとも１つの有害作用または症状を低減または緩和することを含む。１つ以上の症状または臨床マーカーが低減されるならば、処置は一般的には「効果的」である。あるいは、疾患、障害または医学的状態の進行が低減または停止されるならば、処置は「効果的」である。すなわち「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、症状またはマーカーの改善だけでなく、処置のない状況において予測され得る症状の進行または悪化を止める、または少なくとも遅らせることを含む。さらに「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、有益な結果を得るまたは追及すること、または処置が結局は失敗であったとしても、個体の疾病が進行する確率を下げることを意味し得る。処置を必要とするものには、既に疾病を有するもの、および疾病を有しやすいもの、または疾病が予防されているものが含まれる。
【００３２】
用語「治療上有効な量」は、細胞集団、刺激された細胞または遺伝子組換え細胞、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小さな有機分子、または被験体あるいは哺乳動物の疾患または障害を「処置する」のに効果的な他の薬物の量を指す。アルツハイマー病の場合、治療上有効な量のＯＰＮは、アルツハイマー病の症状の重症度を低減することができる。これらには、限定されないが、記憶喪失、認知の非記憶面の減少、推論または判断の低下、行動の変化、多段階の作業の実行不能、幻覚、妄想およびパラノイアが含まれる。
【００３３】
本明細書で使用されるように、「被験体」はヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長類、げっ歯動物、家畜または猟獣などの脊椎動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えばアカゲザルが含まれる。げっ歯動物には、マウス、ラット、ヤマネズミ、シロイタチ、ウサギおよびハムスターが含まれる。家畜と猟獣には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ科の種、例えばイエネコ、およびイヌの種、例えばイヌ、キツネ、オオカミが含まれる。用語「患者」、「個体」および「被験体」は、本明細書において区別なく使用される。実施形態では、被験体は哺乳動物である。本明細書において使用される「哺乳動物」は、以下を制限なく含む哺乳類の任意の構成員を指す：ヒト、およびチンパンジー、他の類人猿およびサル種などのヒト以外の霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマなどの家畜；イヌおよびネコなどの家畜哺乳類；マウス、ラットおよびモルモットなどのげっ歯動物。当該用語は、特定の年齢や性別を意味しない。したがって、成人と新生児の被験体、および胎児が、雌雄に関わらず、この用語の範囲内に含まれることが意図されている。
【００３４】
本明細書において記載されるように、発明者は、ＧＡ免疫化ＡＤｔｇマウスの嗅内皮質、帯状回皮質および海馬におけるアミロイドβタンパク質（Ａβ）プラークの減少と共に、オステオポンチンのアップレギュレーションを発見した。ＧＡとＣＤ１１５＋単球による末梢血強化を組み合わせる処置は、残存するＡβプラークを囲むオステオポンチンのレベルをさらに高めた。オステオポンチンは主として、Ａβプラーク取込みに含まれる、単球由来マクロファージを湿潤させることにより発現された。インビボでの発見を確証するインビトロ試験は、ＧＡが骨髄由来マクロファージにおけるオステオポンチン発現を直接アップレギュレートし、さらにＡβの高度な食作用の抗炎症性表現型を促進することを示した。特定の理論に縛られることなく、この試験は、ＡＤモデルにおけるＧＡ活性化マクロファージの治療効果の媒介物としての、オステオポンチンの新たな役割を示唆する。
【００３５】
本発明の様々な実施形態は、少なくとも部分的にこれらの発見に基づいており、および必要とする被験体においてＯＰＮを増加させる方法、アルツハイマー病を処置、予防、またはその可能性を減らす方法、および認知機能を改善する方法のための当該技術における要求を扱う。
【００３６】
＜アルツハイマー病の処置＞
本発明の様々な実施形態は、必要とする被験体において、アルツハイマー病を処置、予防またはその可能性を減らす方法、アルツハイマー病の症状を緩和する方法、シナプスの構造および／または認知機能を救う方法、病的なアミロイドβ型の除去を増強する方法、またはニューロンの構造と機能の衰退を阻害する方法を提供し、該方法は：被験体に投与された時に、正常な被験体と比較してオステオポンチン（ＯＰＮ）のレベルを増加させる組成物を提供する工程；および前記ＯＰＮのレベルを増加させるのに十分な量の組成物を被験体に投与する工程を含む。
【００３７】
本発明の様々な実施形態はさらに、アルツハイマー病を処置する方法を提供し、該方法は：被験体に投与された時に、正常な被験体と比較してオステオポンチン（ＯＰＮ）のレベルを増加させる組成物を提供する工程；および前記ＯＰＮのレベルを増加させるのに十分な量の組成物を被験体に投与する工程を含む。
【００３８】
本発明の様々な実施形態はさらに、アルツハイマー病を予防する方法を提供し、該方法は：被験体に投与された時に、正常な被験体と比較してオステオポンチン（ＯＰＮ）のレベルを増加させる組成物を提供する工程；および前記ＯＰＮのレベルを増加させるのに十分な量の組成物を被験体に投与する工程を含む。
【００３９】
本発明の様々な実施形態はさらに、アルツハイマー病の可能性を減らす方法を提供し、該方法は：被験体に投与された時に、正常な被験体と比較してオステオポンチン（ＯＰＮ）のレベルを増加させる組成物を提供する工程；および前記ＯＰＮのレベルを増加させるのに十分な量の組成物を被験体に投与する工程を含む。
【００４０】
本発明の様々な実施形態はさらに、アルツハイマー病の症状を緩和する方法を提供し、該方法は：被験体に投与された時に、正常な被験体と比較してオステオポンチン（ＯＰＮ）のレベルを増加させる組成物を提供する工程；および前記ＯＰＮのレベルを増加させるのに十分な量の組成物を被験体に投与する工程を含む。
【００４１】
本発明の様々な実施形態はさらに、アルツハイマー病においてシナプス構造を救う方法を提供し、該方法は：被験体に投与された時に、正常な被験体と比較してオステオポンチン（ＯＰＮ）のレベルを増加させる組成物を提供する工程；および前記ＯＰＮのレベルを増加させるのに十分な量の組成物を被験体に投与する工程を含む。
【００４２】
本発明の様々な実施形態はさらに、アルツハイマー病において認知機能を救う方法を提供し、該方法は：被験体に投与された時に、正常な被験体と比較してオステオポンチン（ＯＰＮ）のレベルを増加させる組成物を提供する工程；および前記ＯＰＮのレベルを増加させるのに十分な量の組成物を被験体に投与する工程を含む。
【００４３】
本発明の様々な実施形態は、病的なアミロイドβ型の除去を増強する方法を提供し、該方法は：被験体に投与された時に、正常な被験体と比較してオステオポンチン（ＯＰＮ）のレベルを増加させる組成物を提供する工程；および前記ＯＰＮのレベルを増加させるのに十分な量の組成物を被験体に投与する工程を含む。
【００４４】
本発明の様々な実施形態は、ニューロンの構造と機能の衰退を阻害する方法を提供し、該方法は：被験体に投与された時に、正常な被験体と比較してオステオポンチン（ＯＰＮ）のレベルを増加させる組成物を提供する工程；および前記ＯＰＮのレベルを増加させるのに十分な量の組成物を被験体に投与する工程を含む。
【００４５】
様々な実施形態では、組成物は、ＯＰＮを発現する生来の免疫細胞、組換えＯＰＮ、ＯＰＮフラグメント、ＯＰＮ派生物、ＯＰＮ模倣物、ＯＰＮ類似体、またはその組み合わせを含む。
【００４６】
様々な実施形態では、組成物は、生来の免疫細胞におけるＯＰＮの発現を刺激する。様々な他の実施形態では、生来の免疫細胞は、単球、マクロファージ、またはその組み合わせを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、単球は、骨髄由来の単球、脾臓由来の単球、ＣＤ１１５陽性の単球（ＣＤ１１５＋単球）、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの他の実施形態では、単球は湿潤性の単球であり、および脳内でマクロファージを発現するＯＰＮになる。いくつかの実施形態では、単球はＯＰＮを過剰発現する。他の実施形態では、マクロファージはＯＰＮを過剰発現する。さらに他の実施形態では、生来の免疫細胞は食細胞である。
【００４８】
様々な実施形態では、組成物はグラチラマー酢酸塩（ＧＡ）を含む。いくつかの実施形態では、生来の免疫細胞はエクスビボまたはインビボで刺激される。
【００４９】
様々な実施形態では、ＯＰＮを発現する生来の免疫細胞は、養子細胞移入または骨髄移植によって被験体に投与される。様々な実施形態では、生来の免疫細胞はＯＰＮを過剰発現する。
【００５０】
様々な実施形態では、組成物は、被験体への直接送達、ウイルスベクター送達、リポソーム送達システム、またはナノ薬物送達システムから成る群から選択された方法によって投与される。
【００５１】
様々な実施形態では、アルツハイマー病の症状は、記憶喪失、認知の非記憶面の減少、推論または判断の低下、行動の変化、多段階の作業の実行不能、幻覚、妄想、パラノイア、およびその組み合わせから成る群から選択される。
【００５２】
様々な実施形態では、組成物の投与はＭＭＰ−９の増加をもたらす。
【００５３】
様々な実施形態では、ＯＰＮ発現が高まると、被験体のミスフォールドタンパク質のレベルが低下する。他の実施形態では、ミスフォールドタンパク質はアミロイドベータ（Ａβ）である。さらに他の実施形態では、ＡβはＡβ４０および／またはＡβ４２である。様々な実施形態では、ミスフォールドＡβタンパク質は、プラークおよび／または血管のＡβ沈殿を含む。
【００５４】
本発明の様々な実施形態はさらに、アルツハイマー病を処置、予防またはその可能性を減らす、アルツハイマー病の症状を緩和する、シナプスの構造および／または認知機能を救う、病的なアミロイドβ型の除去を増強する、またはニューロンの構造と機能の衰退を阻害する方法を提供し、該方法は：単球で血液を強化する工程；および単球を刺激し、それによって脳内のオステオポンチン（ＯＰＮ）発現を増加させる工程を含む。
【００５５】
様々な実施形態では、養子細胞移入または骨髄移植は、単球を投与し、かつ単球で血液を強化するために行なわれる。様々な実施形態では、単球はＯＰＮを過剰発現する。いくつかの実施形態では、養子細胞移入を用いて投与された単球は、骨髄由来の単球、脾臓由来の単球、ＣＤ１１５陽性の単球（ＣＤ１１５＋単球）、またはそれらの組み合わせである。他の実施形態では、単球はグラチラマー酢酸塩（ＧＡ）で刺激される。様々な実施形態では、単球はエクスビボまたはインビボで刺激される。
【００５６】
様々な実施形態では、単球で血液を強化する工程は、骨髄および／または血液から採取された幹細胞を投与する工程を含む。様々な他の実施形態では、単球で血液を強化する工程は、ＣＤ１１５陽性の単球（ＣＤ１１５＋単球）を投与する工程を含む。さらに他の実施形態では、単球は湿潤性の単球であり、および脳内でマクロファージを発現するＯＰＮになる。いくつかの実施形態では、単球はＯＰＮを過剰発現する。他の実施形態では、マクロファージはＯＰＮを過剰発現する。
【００５７】
様々な実施形態では、アルツハイマー病の症状は、記憶喪失、認知の非記憶面の減少、推論または判断の低下、行動の変化、多段階の作業の実行不能、幻覚、妄想、パラノイア、およびその組み合わせから成る群から選択される。
【００５８】
様々な実施形態では、単球を刺激するとＭＭＰ−９の増加が引き起こされる。
【００５９】
本発明の様々な実施形態はさらに、アルツハイマー病を処置する方法を提供する。本発明の様々な実施形態は、アルツハイマー病の症状を緩和する方法を提供する。アルツハイマー病の症状には、限定されないが、記憶喪失、認知の非記憶面の減少（例えば、正しい単語を見つけること、視覚的／空間的な問題）、推論または判断の低下、行動の変化、多段階の作業の実行不能、幻覚、妄想、およびパラノイアが含まれる。本発明の様々な実施形態は、シナプスの構造および／または認知機能を救う方法を提供する。本発明の様々な実施形態は、病的なアミロイドβ型の除去を増強し、ニューロンの構造と機能の衰退を阻害する方法を提供する。
【００６０】
様々な実施形態では、該方法は被験体に骨髄移植を行なう工程を含む。さらなる実施形態では、該方法はさらに、グラチラマー酢酸塩（ＧＡ）を投与する工程を含む。ＧＡを投与する工程は、必ずしも骨髄移植の後に行われる必要はない。実際は、ＧＡは、骨髄移植の前、実質的に同時に、および／または後に投与されてもよい。
【００６１】
いくつかの実施形態では、骨髄移植は同種骨髄移植である。いくつかの実施形態では、骨髄移植は自家骨髄移植である。いくつかの実施形態では、骨髄移植を行なう工程は、骨髄から採取された幹細胞を投与する工程を含む。他の実施形態では、骨髄移植を行なう工程は、血液から採取された幹細胞を投与する工程を含む（例えば白血球除去によって）。
【００６２】
様々な実施形態では、該方法は被験体に養子細胞移入を行なう工程を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、養子細胞移入を行なう工程は、被験体にマクロファージを投与する工程を含む。さらなる実施形態では、該方法はさらに、グラチラマー酢酸塩（ＧＡ）を投与する工程を含む。ＧＡを投与する工程は、必ずしも養子細胞移入の後に行われる必要はない。実際は、ＧＡは、養子細胞移入の前、実質的に同時に、および／または後に投与されてもよい。
【００６４】
いくつかの実施形態では、マクロファージは自己マクロファージである。他の実施形態では、マクロファージは同種異系のマクロファージである。いくつかの実施形態では、マクロファージは単球由来マクロファージである。本明細書において使用される単球由来マクロファージは、単球から分化したマクロファージを指す。特定の実施形態では、養子細胞移入を行なう工程は、被験体に単球由来マクロファージを投与する工程を含み、ここで単球は骨髄から得られた。いくつかの実施形態では、マクロファージはグラチラマー酢酸塩（ＧＡ）で処置されている。特定の実施形態では、該方法は、ＧＡで処置された単球由来マクロファージを被験体に投与する工程を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、養子細胞移入を行なう工程は、被験体に骨髄由来単球を投与する工程を含む。さらなる実施形態では、該方法はさらに、グラチラマー酢酸塩（ＧＡ）を投与する工程を含む。ＧＡを投与する工程は、必ずしも養子細胞移入の後に行われる必要はない。実際は、ＧＡは、養子細胞移入の前、実質的に同時に、および／または後に投与されてもよい。
【００６６】
いくつかの実施形態では、骨髄由来単球は、自己骨髄に由来する単球である。本明細書において使用される骨髄由来単球は、骨髄から得られた単球を指す。他の実施形態では、骨髄由来単球は、同種骨髄由来の単球である。いくつかの実施形態では、骨髄由来単球は、ＣＤ１１５陽性の単球（ＣＤ１１５＋単球）である。いくつかの実施形態では、骨髄由来単球はグラチラマー酢酸塩（ＧＡ）で処置されている。特定の実施形態では、該方法は、ＧＡで処置されたＣＤ１１５＋骨髄由来単球を被験体に投与する工程を含む。
【００６７】
＜オステオポンチンを増加させる方法＞
本発明の様々な実施形態は、オステオポンチン（ＯＰＮ）を増加させる方法を提供し、該方法は生来の免疫細胞においてＯＰＮの発現の増加を刺激し、それによってＯＰＮを増加させる工程を含む。
【００６８】
本発明の様々な実施形態は、オステオポンチン（ＯＰＮ）を増加させる方法を提供し、該方法はＯＰＮを発現する生来の免疫細胞を投与し、それによってＯＰＮを増加させる工程を含む。
【００６９】
様々な実施形態では、ＯＰＮは、完全長のＯＰＮまたはその機能性フラグメントである。様々な実施形態では、ＯＰＮ発現は、グラチラマー酢酸塩（ＧＡ）で生来の免疫細胞を刺激することによって増加する。いくつかの実施形態では、生来の免疫細胞はエクスビボまたはインビボで刺激される。
【００７０】
様々な実施形態では、該方法はさらに、必要とする被験体に、ＯＰＮ発現の増加を伴う生来の免疫細胞を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、ＯＰＮ発現の増加を伴う生来の免疫細胞は、必要とする被験体の血液および／または脳に投与される。
【００７１】
様々な実施形態では、生来の免疫細胞は食細胞である。他の実施形態では、生来の免疫細胞は、単球、マクロファージ、またはその組み合わせを含む。さらに他の実施形態では、単球は、骨髄由来の単球、脾臓由来の単球、ＣＤ１１５陽性の単球（ＣＤ１１５＋単球）、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの他の実施形態では、単球は湿潤性の単球であり、および脳内でマクロファージを発現するＯＰＮになる。
【００７２】
様々な実施形態では、該方法はさらに、完全長のＯＰＮまたはその機能性フラグメントの標的化送達を含む。様々な実施形態では、完全長のＯＰＮまたはその機能性フラグメントの標的化送達のための方法は、組換えＯＰＮの送達、ウイルスベクター送達、リポソーム送達システム経由、ＯＰＮを含むエキソソーム送達、またはナノ薬物送達システムから成る群から選択される。
【００７３】
様々な実施形態では、ＯＰＮの増加は、被験体におけるアルツハイマー病の処置、予防、またはその可能性の低下、および／またはアルツハイマー病の症状の改善をもたらす。
【００７４】
本発明の様々な実施形態は、オステオポンチン（ＯＰＮ）を増加させる方法を提供し、該方法は生来の免疫細胞においてＯＰＮの発現の増加を刺激し、それによってＯＰＮを増加させる工程を含む。
【００７５】
本発明の様々な実施形態は、オステオポンチン（ＯＰＮ）を増加させる方法を提供し、該方法はＯＰＮを発現する生来の免疫細胞を投与し、それによってＯＰＮを増加させる工程を含む。
【００７６】
様々な実施形態では、ＯＰＮは、完全長のＯＰＮまたはその機能性フラグメントである。様々な実施形態では、ＯＰＮ発現はグラチラマー酢酸塩（ＧＡ）で生来の免疫細胞を刺激することにより増加する。いくつかの実施形態では、生来の免疫細胞はエクスビボまたはインビボで刺激される。
【００７７】
様々な実施形態では、該方法はさらに、必要とする被験体に、ＯＰＮ発現の増加を伴う生来の免疫細胞を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、ＯＰＮ発現の増加を伴う生来の免疫細胞は、必要とする被験体の血液および／または脳に投与される。
【００７８】
様々な実施形態では、生来の免疫細胞は食細胞である。他の実施形態では、生来の免疫細胞は、単球、マクロファージ、またはその組み合わせを含む。さらに他の実施形態では、単球は、骨髄由来の単球、脾臓由来の単球、ＣＤ１１５陽性の単球（ＣＤ１１５＋単球）、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの他の実施形態では、単球は湿潤性の単球であり、および脳内でマクロファージを発現するＯＰＮになる。
【００７９】
様々な実施形態では、ＯＰＮの増加は、被験体におけるアルツハイマー病の処置、予防、またはその可能性の低下、および／またはアルツハイマー病の症状の改善をもたらす。
【００８０】
本発明の様々な実施形態は、オステオポンチン（ＯＰＮ）を増加させる方法を提供し、該方法は生来の免疫細胞においてＯＰＮ発現の増加を刺激し、それによってＯＰＮを増加させる工程を含む。
【００８１】
本発明の様々な実施形態は、オステオポンチン（ＯＰＮ）を増加させる方法を提供し、該方法はＯＰＮを発現する生来の免疫細胞を投与し、それによってＯＰＮを増加させる工程を含む。
【００８２】
様々な実施形態では、ＯＰＮは、完全長のＯＰＮまたはその機能性フラグメントである。
【００８３】
様々な実施形態では、ＯＰＮは、完全長のＯＰＮまたはその機能性フラグメントの標的化送達によって増加する。様々な実施形態では、完全長のＯＰＮまたはその機能性フラグメントの標的化送達のための方法は、組換えＯＰＮの送達、ウイルスベクター送達、リポソーム送達システム経由、ＯＰＮを含むエキソソーム送達、またはナノ薬物送達システムから成る群から選択される。
【００８４】
様々な実施形態では、ＯＰＮの増加は、被験体におけるアルツハイマー病の処置、予防、またはその可能性の低下、および／またはアルツハイマー病の症状の改善をもたらす。
【００８５】
様々な実施形態では、ＯＰＮの送達は脳内のＯＰＮを増加させ、結果として被験体におけるアルツハイマー病の処置および／または予防、またはアルツハイマー病の可能性の低下をもたらす。より具体的には、本発明は、哺乳動物にＯＰＮをベースにした治療薬の治療上有効な量を投与することによって、アルツハイマー病を治療し、およびアルツハイマー病の進行を低減する方法を含む。本発明はさらに、アルツハイマー病を有する哺乳動物の脳組織にＯＰＮを送達する方法を含む。様々な実施形態では、哺乳動物はヒトである。特定の理論に縛られることを望むものではないが、ＯＰＮベースの治療薬の投与は、脳内においてアミロイドプラークのレベルを調整し、および／またはそのさらなる形成を妨げることによってレベルを調整し、および循環する単球の表現型および／または単球由来マクロファージを有利に修飾することによって、アルツハイマー病の処置に効果的になりうると考えられている。本明細書に示されるように、ＯＰＮベースの治療薬の投与は、さらなる治癒促進性の、抗炎症性の、および高度な食作用の表現型へと分裂するマクロファージを介してＡβ除去を媒介する。当業者は、これらの効果がアルツハイマー病の処置に有益であることを容易に認識するだろう。
【００８６】
ＯＰＮを上昇させるための方法には、限定されないが以下が含まれる：１）結果として内因性ＯＰＮの上昇をもたらす、ＧＡを用いた皮下免疫処置、２）ウイルスベクター（すなわちＡＡＶ８またはＡＡＶ９）中に発現した組換えＯＰＮの末梢血への送達、または経鼻送達、３）ＯＰＮを含むエキソソームの末梢的注入、４）ＯＰＮを過剰発現するために、ＧＡであらかじめ処置された単球の末梢血への養子移入、および５）血液に末梢的に注入される、または経口投与される、リポソーム送達システムへのＯＰＮの封入。
【００８７】
様々な実施形態では、脳内で増加するＯＰＮは、組換えＯＰＮの送達、ウイルスベクター送達、リポソーム送達システム経由、ＯＰＮを含むエキソソームの送達、またはナノ薬物送達システムで行われる。
【００８８】
本発明の様々な実施形態は、治療上有効な量の組換えＯＰＮを投与することによって、被験体の脳にＯＰＮを送達してオステオポンチン（ＯＰＮ）を増加させる方法を提供する。
【００８９】
用語「組換えＤＮＡ分子」は、本明細書において使用されるように、限定されないが遺伝的組換え（すなわち分子クローニング）を含む当業者に既知の分子生物学的技術によって結合されたＤＮＡのセグメントから成るＤＮＡ分子を指す。
【００９０】
用語「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」は、本明細書において使用されるように、組換えＤＮＡ分子から発現するタンパク質分子を指す。
【００９１】
組換えＯＰＮは、組換え法と化学合成を含む周知の方法を使用して合成することができる。ペプチドをコードする核酸を含むベクターを適切な宿主細胞へと導入することでペプチドを生成する組換え法は、周知の技術であり、また当業者に周知の方法を使用して化学的に合成することもできる。例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）；Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄ．Ｗｈｉｔｅ（Ｅｄｓ．）Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｒｙ，ＮＣ（２０００）；Ｎ．Ｌ．Ｂｅｎｏｉｔｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（２００５）；Ｊ．Ｊｏｎｅｓ，Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｒｙ，ＮＣ（２００２）；およびＰ．Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｆ．Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，ａｎｄ  Ｅ．Ｇｉｒａｌｔ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９７）を参照されたい、これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。
【００９２】
本発明の組換えタンパク質／ポリペプチドをクローニングし、および発現させるためのシステムは、組換え技術において周知の様々な微生物と細胞を含む。これらには、例えば、大腸菌、バチルス、ストレプトマイシーズ、およびサッカロミケスの様々な株、および哺乳動物と酵母と昆虫の細胞が含まれる。ＯＰＮはポリペプチドまたは融合タンパク質として生成され得る。ペプチドを生成するのに適したベクターは既知であり、および民間・公的な研究所と保管所、および営利販売業者から入手可能である。そして、遺伝子産物を発現することができる受容細胞がトランスフェクトされる。トランスフェクトされた受容細胞は、組換え遺伝子産物の発現を可能にする条件下で培養され、培養から回収される。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ−１細胞などの宿主哺乳動物細胞を使用することができる。多くのそのような非病原性ウイルスは一般に、ヒト遺伝子治療のために使用され、および他のワクチン薬剤用の担体として使用され、かつ当業者に既知であり選択可能である。形質転換、培養、増幅、スクリーニング、および生成物の生成と精製のための、他の適切な宿主細胞と方法の選択は、既知の技術を参照することにより当業者によって実施され得る。
【００９３】
組換えＯＰＮは、完全長のＯＰＮまたはその機能性フラグメントから構成され得る。生成された組換えＯＰＮは、ウイルスベクター中で発現する、リポソーム内に封入される、エキソソーム上で発現される、またはナノ薬物送達システムに含まれ得る。
【００９４】
本発明の様々な実施形態は、ナノ薬物送達システムを使用して被験体の脳にＯＰＮを送達することにより、オステオポンチン（ＯＰＮ）を増加させる方法を提供する。様々な実施形態では、ＯＰＮウイルスベクターが被験体に投与される。
【００９５】
「ベクター」は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどの任意の遺伝要素を指し、これは適切な制御要素に関連付けられた時に複製可能であり、および細胞間の遺伝子配列を転写することができる。したがって、当該用語は、ウイルスベクターと共に、クローニングと発現の媒介物を含む。
【００９６】
様々な実施形態では、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、およびＡＡＶ−１０等を制限なく含む、任意のアデノ随伴ウイルスの血清型に由来する任意のベクターを指す。ＡＡＶベクターは、全体または部分的に欠失した１つ以上のＡＡＶの野生型遺伝子、好ましくはＲｅｐおよび／またはキャップ遺伝子を有し、ただし機能性フランキングＩＴＲ配列を保持することができる。機能性ＩＴＲ配列は一般的に、ＡＡＶゲノムの回復、複製、パッケージングおよび潜在的な染色体組込みに必要である。したがって、ＡＡＶベクターは、ウイルスの複製とパッケージングのためにｃｉｓで必要とされる少なくともそのような配列（例えば機能性ＩＴＲ）を含むものと、本明細書において定義される。ＩＴＲは野生型のヌクレオチド配列である必要はなく、および配列が機能回復、複製およびパッケージングを提供する限りは修正されてもよい（例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって）。
【００９７】
「組替えウイルス」は、遺伝子的に修正されたウイルスを指す（例えば粒子への異種の核酸構成物の付加または挿入によって）。
【００９８】
「ＡＡＶビリオン」は、野生型（“ｗｔ”）ＡＡＶウイルス粒子などの完全なウイルス粒子を指す（すなわち、ＡＡＶキャプシドタンパク膜に関係する単鎖のＡＡＶ核酸ゲノムを含む）。この点では、いずれかの相補性センス（すなわち「センス」または「アンチセンス」鎖）の単鎖のＡＡＶ核酸分子は、１つのＡＡＶビリオンへとパッケージングされ得る；両方の鎖は等しく伝染性である。加えて、ＡＡＶキャプシドタンパク膜は、ＡＡＶビリオンの標的に依存する様々なＡＡＶ血清型のいずれかからであり得る。
【００９９】
「組換えＡＡＶビリオン」または「ｒＡＡＶビリオン」は本明細書において、ＡＡＶ  ＩＴＲによって両側に隣接する対象の異種のＤＮＡ分子（例えばＯＰＮをコードする遺伝子）を封入する、ＡＡＶタンパク質の殻から構成される、伝染性の複製欠損ウイルスとして定義される。ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶベクター、ＡＡＶ  Ｒｅｐ、およびそこに導入されたキャップ機能とヘルパーウイルス機能を有する適切な宿主細胞中で生成され得る。このように、宿主細胞は、ＡＡＶベクター（すなわち、対象の組換えヌクレオチド配列を含む）を続く遺伝子送達のための組換えビリオン粒子へと複製しパッケージングするのに必要な、ＡＡＶ複製およびキャプシドタンパク質の生成が可能なものにされる。完全な遺伝子組換えは、プロモーター、コード配列、通常はｃＤＮＡおよびポリアデニル化シグナルから成る場合もある。
【０１００】
遺伝子組換えはさらに、調節配列とイントロン領域を含み得る。遺伝子組換え発現を調節するプロモーターは、構成型プロモーター、誘導性プロモーターおよび組織特異的なプロモーターを含み得る。用語「プロモーター領域」は、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指すその通常の意味で、本明細書において使用され、ここで調節配列はＲＮＡポリメラーゼを結合し、かつ下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができる遺伝子に由来する。
【０１０１】
「遺伝子」または「コード配列」、または特定のタンパク質を「コードする」配列は、適切な調節配列の制御下に置かれた特に、インビトロまたはインビボでポリペプチドへと転写され（ＤＮＡの場合）、および翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子である。
【０１０２】
用語「トランスフェクション」は、細胞によって外来のＤＮＡを取り込むことを指して、本明細書において使用される。外因性のＤＮＡが細胞膜内に導入された時に、細胞は「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技術が、当技術分野において一般的に知られている。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照されたい。そのような技術は、適切なホスト細胞に、プラスミドベクターおよび他の核酸分子などの１つ以上の外因性のＤＮＡ部分を導入するために使用することができる。当該用語は、遺伝物質の安定したかつ一時的な取込みを指す。
【０１０３】
用語「形質導入」は、ウイルスベクター送達を含む遺伝子送達の任意の方法を介して、インビボまたはインビトロのいずれかで受容細胞へとＤＮＡ分子を送達することを意味する。
【０１０４】
ＡＡＶベクターは、少なくとも転写の方向の構成要素、（ａ）転写開始領域を含む制御要素、（ｂ）対象のＯＰＮ  ＤＮＡ、および（ｃ）転写終了領域を提供するために、既知の技術を使用して構成される。さらに、ＯＰＮコード配列に実質的に類似する機能特性を示すような、ＯＰＮコード配列に実質的に相同する任意のコード配列は、本発明の代替的な実施形態と関連して使用され得る。制御要素は標的細胞において機能性であるように選択される。結果として得られる構成物は、構成要素を含み、機能性ＡＡＶ  ＩＴＲ配列と結合し得る（５’および３’）。本発明のベクターに使用されるＡＡＶ  ＩＴＲは、野生型のヌクレオチド配列を有する必要はなく、および修正されてもよい（例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって）。付加的に、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８、ＡＡＶ−９、およびＡＡＶ１０等を制限なく含む、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来してもよい。
【０１０５】
例えば、ＯＰＮコード配列に対応する異種のＤＮＡを含むＡＡＶベクターは、当該技術において既知の任意の従来技術によって生成されてもよい。様々な実施形態では、ＡＡＶベクターは以下のプロセスによって生成される：（ｉ）ＯＰＮまたはそのフラグメントを含む第１のプラスミド提供するプロセス、（ｉｉ）第１のプラスミドに相補的であり、および回復とパッケージングのための構成要素を含む第２のプラスミドを提供するプロセス、（ｉｉｉ）宿主細胞に第１と第２のプラスミドを同時にトランスフェクトするプロセス、および（ｉｖ）同時にトランスフェクトされた前記宿主細胞からある量の前記ＡＡＶベクターを生成するプロセスであって、ここで前記一対の第１と第２のプラスミドは、前記ｒＡＡＶベクターが特定の組織タイプへの送達を標的とするように選択される、プロセス。当業者によって容易に認識されるように、他の任意の数のアプローチを使用してもよい。
【０１０６】
ＯＰＮ遺伝子の活性フラグメントは、ＯＰＮのフラグメント、または同じないし実質的に同じＯＰＮタンパク質の生物学的活性を保持するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。様々な実施形態では、ＯＰＮタンパク質は、脳を標的とするプロモーターの制御下でウイルスベクターに装填される。
【０１０７】
本発明の様々な実施形態はさらに、リポソーム送達システムを使用して被験体の脳にＯＰＮを送達することにより、オステオポンチン（ＯＰＮ）を増加させる方法を提供する。
【０１０８】
リポソーム送達システムは、広範な薬物がリポソームによって封入されることを可能にする脂肪好性および親水性の化合物の両方を捕捉することができる。用語「リポソーム」は、本明細書で使用されるように、離散性の水性空間を囲む１つ以上の同心性の脂質二重層から成るリン脂質ベシクルを指す。大きな水性の中心部と生物学的適合性の脂質外部は、ＤＮＡ、タンパク質および造影剤などの様々な高分子の送達を可能にする。
【０１０９】
薬物送達システムとして、リポソームはしばしば、生物学的適合性、自己組織化の能力、大きな薬物負荷量を運ぶ能力、およびそれらの生物学的特性を制御するために修飾され得る広範な物理化学的・生物物理的特性を含むいくつかの有利性を提供する。リポソーム内への封入は、循環中の早すぎる不活性化、分解、および希釈から化合物を保護する。
【０１１０】
リポソームは様々な方法によって生成されてもよい。リポソーム送達システムを調製する方法は既知である。例えば以下を参照されたい：Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）４２：４７３４；Ｃａｆｉｓｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（１９８１）６４９：１２９；Ｓｚｏｋａ，Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｅｎｇ（１９８０）９：４６７；米国特許第４，８８２，１６５号、およびＤｅａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｕｓｅｒ，“Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，”ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｖ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８３）。
【０１１１】
多重層ベシクル（ＭＬＶ）は、乾燥した脂質粉末の水和によって形成される。プローブ型超音波処理ソニケーターまたはフレンチプレスを介した処理による超音波処理は、小さい単層のベシクル（ＳＵＶ）を生み出す。押し出し技術は、生成の容易さ、容易に選択可能な粒径、バッチ間の再現性、および溶剤および／または界面活性剤による汚染がないことにより、最も広範に使用されているインビトロおよびインビボ試験のためのＳＵＶリポソーム生成法である。リポソーム生成のための溶剤注入および浄化透析技術は、粒度の種々雑多な分配をもたらし、およびこれらの粒子における膜不純物の保持ゆえに生物物理的または生化学的な実験には一般に使用されない。封入される物質は、受動的に捕捉され得る、または「遠隔」装填され得る。
【０１１２】
リポソームに薬物を装填する方法は、当該技術において既知である。例えば、Ｏｓｔｒｏ  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｉｓ，Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．４５６：１５６７−１５８７（１９８９）およびＪｕｌｉａｎｏ，“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇｓ  ｗｉｔｈ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，”ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｉｂｉｄを参照されたい。ほとんどの薬物は、出発物質を用いて薬物を同時溶解することによりリポソームが形成された時に装填される。薬物が配置されるリポソームの部位（腔または細胞膜）は、薬物の特性に左右される。
【０１１３】
リポソーム送達システムは、診断薬、細胞機能を調整またはそうでなければ修正することのできる分子、および疾患の処置のための分子を含む細胞の細胞質に、様々な外因性の分子を送達するために利用することができる。これらの薬剤／分子は、それらの水性腔に水溶性化合物を封入することによって、または膜自体内で脂質可溶性化合物を運ぶことによってのいずれかによって、リポソームベシクルにより捕捉され得る。外因性の分子は、限定されないが以下を含み得る：ペプチド、オリゴペプチド、タンパク質、アポタンパク質、糖タンパク質、それに対する抗原および抗体、受容体および他の膜タンパク質、タンパク質類似体、酵素、補酵素、酵素抑制因子、アミノ酸およびその誘導体、ホルモン、脂質およびリン脂質。他の分子には以下が含まれる：ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、およびそれらの技術が認知されており、かつ生物学的に機能的な類似体と誘導体であって、例えばホスホロチオエート結合を有するメチル化されたポリヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含むもの、プラスミド、コスミド、人工染色体および他の核酸ベクター。
【０１１４】
様々な実施形態では、薬剤／分子はＯＰＮ、その機能性／生物学的活性フラグメントである。様々な実施形態では、薬剤／分子はアルツハイマー病の処置用である。アルツハイマー病治療には、限定されないが、ドネペジル（アリセプト）、ガランタミン（ラザダイン）およびリバスチグミン（エクセロン）などのコリンエステラーゼ阻害薬；メマンチン（ナメンダ）；クロナゼパム（クノロピン）とロラゼパム（アチバン）などの抗うつ薬と抗不安薬、が含まれる。さらに他の実施形態では、薬剤／分子はアルツハイマー病の処置とＯＰＮの組み合わせである。
【０１１５】
様々な実施形態では、ＯＰＮは、被験体の脳へのその送達を増強するために、リポソーム内に封入される。様々な他の実施形態では、脳へのリポソームＯＰＮの送達は、被験体におけるアルツハイマー病の処置および／または予防、またはアルツハイマー病の可能性の低下をもたらす。
【０１１６】
本発明の様々な実施形態は、ナノ薬物送達システムを使用して被験体の脳にＯＰＮを送達することにより、オステオポンチン（ＯＰＮ）を増加させる方法を提供する。
【０１１７】
ナノ薬物送達システムは、必要とする被験体を処置するために、血液脳関門を超えて治療作用のある分子を脳に送達するのに有用である。
【０１１８】
様々な実施形態では、ナノ薬物送達システムは、組換えＯＰＮまたはその機能性／生物学的活性フラグメントを含む。様々な実施形態では、ナノ薬物送達システムは、脳に達するために血液脳関門を通過することを目標とする。様々な他の実施形態では、ナノ薬物送達システムは、脳内のアミロイドプラーク部位において脳内で放出される。
【０１１９】
ナノ薬物送達の方法には、限定されないが、処置送達するためのエキソソーム、プロドラッグ、ペプチド遮蔽、受容体を媒介とした湿潤剤（ｐｅｒｍａｂｉｌｉｔｉｚｅｒ）またはナノ粒子の使用が含まれる。
【０１２０】
エキソソームは、組換えＯＰＮまたはその機能性／生物学的活性フラグメントを含むように修飾され得る。様々な実施形態では、ＯＰＮは、ＯＰＮを含むエキソソームの投与によって被験体の脳内で増加する。いくつかの実施形態では、ＯＰＮを含むエキソソームは全身に（すなわち静脈内で）注入される。
【０１２１】
プロドラッグは、血液脳関門を通り抜けることができるように脂肪好性の分子で偽装された治療用分子である。いったん脳に入ると、脂肪好性の分子は、酵素分解またはその活性型へと薬物を解き放つための他のいくつかのメカニズムのいずれかによって除去される。様々な実施形態では、ＯＰＮプロドラッグは、必要とする被験体の脳におけるＯＰＮ発現を増加させるために使用される。様々な実施形態では、ＯＰＮは、組換えＯＰＮまたはその機能性／生物学的活性フラグメントである。
【０１２２】
ペプチド遮蔽は、血液脳関門を通り抜ける可能性がより高い分子で治療用分子を遮蔽する手法である。血液脳関門を通り抜ける可能性のより高い分子の一例として、限定されないがコレステリルがあげられる。
【０１２３】
受容体を媒介とした湿潤剤は、血液脳関門の湿潤性を高めて、分子が通過しやすくする薬物化合物である。様々な実施形態では、必要とする被験体に受容体を媒介とした湿潤剤を投与し、それによって血液脳関門の湿潤性を高め、脳内のＯＰＮを許容することによって、脳内のＯＰＮが増加する。
【０１２４】
ナノ粒子は、血液脳関門を通過することができる治療用分子に結合した粒子である。使用可能なナノ粒子には様々な種類があり、限定されないが、脂質ベースのもの、カチオン性リポソーム、固体の脂質、ナノ乳剤、ポリマーベースのもの、またはポリマー分岐枝ナノ粒子が含まれる。一般的なポリマー物質には、限定されないが、ポリブチルシアノアクリレート（ＰＢＣＡ）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）（ＰＩＨＣＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、またはポリラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧＡ）が含まれる。
【０１２５】
様々な実施形態では、ナノ粒子は生分解性である。様々な他の実施形態では、ナノ粒子は、血液脳関門の通過を助けるために界面活性剤でコーティングされ得る。界面活性剤の例として、限定されないが、ポリソルベート８０、２０、４０、６０、およびポロキサマー１８８があげられる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は脳を標的とする。
【０１２６】
＜認知機能の改善＞
本発明の様々な実施形態はさらに、必要とする被験体の認知機能を改善する方法を提供し、該方法は：被験体に投与された時に、正常な被験体と比較してオステオポンチン（ＯＰＮ）のレベルを増加させる組成物を提供する工程；および前記ＯＰＮのレベルを増加させるのに十分な量の組成物を被験体に投与する工程を含む。
【０１２７】
様々な実施形態では、組成物は、ＯＰＮを発現する生来の免疫細胞、組換えＯＰＮ、ＯＰＮフラグメント、ＯＰＮ派生物、ＯＰＮ模倣物、ＯＰＮ類似体、またはその組み合わせを含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、組成物は、生来の免疫細胞におけるＯＰＮの発現を刺激する。様々な他の実施形態では、生来の免疫細胞は、単球、マクロファージ、またはその組み合わせを含む。他の実施形態では、単球は、骨髄由来の単球、脾臓由来の単球、ＣＤ１１５陽性の単球（ＣＤ１１５＋単球）、またはそれらの組み合わせを含む。さらに他の実施形態では、単球は湿潤性の単球であり、および脳内でマクロファージを発現するＯＰＮになる。特定の実施形態では、生来の免疫細胞は食細胞である。
【０１２９】
様々な実施形態では、組成物はグラチラマー酢酸塩（ＧＡ）を含む。様々な他の実施形態では、生来の免疫細胞はエクスビボまたはインビボで刺激される。
【０１３０】
様々な実施形態では、ＯＰＮを発現する生来の免疫細胞は、養子細胞移入または骨髄移植によって被験体に投与される。
【０１３１】
様々な実施形態では、組成物は、被験体への直接送達、ウイルスベクター送達、リポソーム送達システム、またはナノ薬物送達システムから成る群から選択された方法によって投与される。
【０１３２】
様々な実施形態では、アルツハイマー病の症状は、記憶喪失、認知の非記憶面の減少、推論または判断の低下、行動の変化、多段階の作業の実行不能、幻覚、妄想、パラノイア、およびその組み合わせから成る群から選択される。
【０１３３】
様々な実施形態では、組成物の投与はＭＭＰ−９の増加をもたらす。様々な他の実施形態では、ＯＰＮのレベルが増加すると、被験体におけるミスフォールドタンパク質のレベルの減少、被験体の炎症の低減、被験体におけるシナプス再生の増加、被験体のアミロイドベータ（Ａβ）プラーク部位へのマクロファージの動員、またはそれらの組み合わせがもたらされる。
【０１３４】
他の実施形態では、ミスフォールドタンパク質はＡβである。さらに他の実施形態では、ＡβはＡβ４０および／またはＡβ４２である。
【０１３５】
本発明の様々な実施形態はさらに、必要とする被験体の認知機能を改善する方法を提供し、該方法は：被験体に投与された時に、正常な被験体と比較してオステオポンチン（ＯＰＮ）のレベルを増加させる組成物を提供する工程；および前記ＯＰＮのレベルを増加させるのに十分な量の組成物を被験体に投与する工程を含む。
【０１３６】
様々な実施形態では、組成物は、ＯＰＮを発現する生来の免疫細胞を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、組成物は、生来の免疫細胞におけるＯＰＮの発現を刺激する。様々な他の実施形態では、生来の免疫細胞は、単球、マクロファージ、またはその組み合わせを含む。他の実施形態では、単球は、骨髄由来の単球、脾臓由来の単球、ＣＤ１１５陽性の単球（ＣＤ１１５＋単球）、またはそれらの組み合わせを含む。さらに他の実施形態では、単球は、湿潤性の単球であり、および脳内でマクロファージを発現するＯＰＮになる。特定の実施形態では、生来の免疫細胞は食細胞である。
【０１３８】
様々な実施形態では、組成物はグラチラマー酢酸塩（ＧＡ）を含む。様々な他の実施形態では、生来の免疫細胞はエクスビボまたはインビボで刺激される。
【０１３９】
様々な実施形態では、ＯＰＮを発現する生来の免疫細胞は、養子細胞移入または骨髄移植によって被験体に投与される。
【０１４０】
様々な実施形態では、組成物の投与はＭＭＰ−９の増加をもたらす。様々な他の実施形態では、ＯＰＮのレベルが増加すると、被験体におけるミスフォールドタンパク質のレベルの減少、被験体の炎症の低減、被験体におけるシナプス再生の増加、被験体におけるアミロイドベータ（Ａβ）プラーク部位へのマクロファージの動員、またはそれらの組み合わせがもたらされる。
【０１４１】
他の実施形態では、ミスフォールドタンパク質はＡβである。さらに他の実施形態では、ＡβはＡβ４０および／またはＡβ４２である。
【０１４２】
本発明の様々な実施形態はさらに、必要とする被験体の認知機能を改善する方法を提供し、該方法は：被験体に投与された時に、正常な被験体と比較してオステオポンチン（ＯＰＮ）のレベルを増加させる組成物を提供する工程；および前記ＯＰＮのレベルを増加させるのに十分な量の組成物を被験体に投与する工程を含む。
【０１４３】
様々な実施形態では、組成物は、組換えＯＰＮ、ＯＰＮフラグメント、ＯＰＮ派生物、ＯＰＮ模倣物、ＯＰＮ類似体、またはその組み合わせを含む。
【０１４４】
様々な実施形態では、組成物は、被験体への直接送達、ウイルスベクター送達、リポソーム送達システム、またはナノ薬物送達システムから成る群から選択された方法によって投与される。
【０１４５】
様々な実施形態では、組成物の投与はＭＭＰ−９の増加をもたらす。様々な他の実施形態では、ＯＰＮのレベルが増加すると、被験体におけるミスフォールドタンパク質のレベルの減少、被験体の炎症の低減、被験体におけるシナプス再生の増加、被験体のアミロイドベータ（Ａβ）プラーク部位へのマクロファージの動員、またはそれらの組み合わせがもたらされる。他の実施形態では、ミスフォールドタンパク質はＡβである。さらに他の実施形態では、ＡβはＡβ４０および／またはＡβ４２である。
【０１４６】
＜単球濃縮＞
本発明の様々な実施形態は、単球濃縮の方法を提供し、該方法は：被験体から血液サンプルを得る工程、サンプルから血球を単離する工程、および血球を刺激することによってＯＰＮ発現を増強する工程を含む。様々な実施形態では、単離された血球は単球を含む。他の実施形態では、単球はグラチラマー酢酸塩（ＧＡ）で刺激される。他のいくつかの実施形態では、単球はエクスビボで刺激される。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、単球は、骨髄由来の単球、脾臓由来の単球、および／またはＣＤ１１５陽性の単球（ＣＤ１１５＋単球）を含む。他の実施形態では、単球は、脳内でマクロファージを発現するＯＰＮになる。
【０１４８】
様々な実施形態では、該方法はさらに、必要とする被験体に濃縮された単球を投与する工程を含む。様々な実施形態では、単球は養子細胞移入または骨髄移植手術によって投与される。ＧＡは、養子細胞移入または骨髄移植手術の前、実質的に同時に、および／または後に投与されてもよい。
【０１４９】
＜ＭＭＰ＞
本明細書で論じられるように、ＯＰＮはＭＭＰ（ＭＭＰ−９を含む）のための既知の基質である。ＭＭＰ−９は、瘢痕組織およびＡβ分解酵素である。ＯＰＮは免疫細胞の食作用をより高めると知られており、他方でＭＭＰ−９は、ＯＰＮを切断しかつＡβの分解を増強するプロテアーゼである。ＧＡの投与は、ＯＰＮ（完全長のＯＰＮとそのＭＭＰ切断フラグメント）およびＭＭＰ−９の増加をもたらし、かつＡβ分解をもたらす。
【０１５０】
本発明の様々な実施形態は、必要とする被験体の生来の免疫細胞を刺激する工程を含む方法を提供する。
【０１５１】
様々な実施形態では、生来の免疫細胞はグラチラマー酢酸塩（ＧＡ）で刺激される。いくつかの実施形態では、生来の免疫細胞はエクスビボまたはインビボで刺激される。
【０１５２】
様々な実施形態では、ＯＰＮはＧＡによる刺激で増加する。様々な実施形態では、ＭＭＰ−９はＧＡによる刺激で増加する。様々な実施形態では、ＯＰＮとＭＭＰ−９はＧＡによる刺激で増加する。
【０１５３】
様々な実施形態では、生来の免疫細胞は、単球、マクロファージ、またはその組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、単球は、骨髄由来の単球、脾臓由来の単球、ＣＤ１１５陽性の単球（ＣＤ１１５＋単球）、またはそれらの組み合わせを含む。他の実施形態では、単球は湿潤性の単球であり、および脳内でマクロファージを発現するＯＰＮになる。
【０１５４】
様々な実施形態では、被験体はアルツハイマー病を有する。
【０１５５】
様々な実施形態では、該方法はさらに、必要とする被験体を処置する工程を含む。様々な実施形態では、ＯＰＮおよび／またはＭＭＰ−９の増加は、被験体におけるアミロイドプラークの低下をもたらす。
【０１５６】
＜用量と用法＞
本発明の組成物は本明細書に記載されるように、限定されないが、脳内でＯＰＮを増加させる方法、およびアルツハイマー病の処置などの治療的処置の方法を含む様々な用途に有用である。使用方法は、インビトロまたはインビボの方法であり得る。
【０１５７】
様々な実施形態では、本発明に係る医薬組成物は、任意の投与経路を介した送達用に調剤され得る。「投与経路」は、限定されないが噴霧、経鼻、経口、経粘膜的、経皮的または非経口を含む、当該技術において既知の投与経路を指し得る。
【０１５８】
「経皮的」投与は、塗り薬または軟膏を使用して、または経皮パッチによって行われてもよい。
【０１５９】
「非経口」は、一般的に注入に関係した投与経路を指し、眼窩内、点滴、動脈内、嚢内、心臓内、皮内、筋肉内、腹腔内、肺内、脊髄内、腸内、くも膜下腔内、子宮内、静脈内、クモ膜下、被膜下、皮下、経粘膜、または経気管を含む。非経口の経路の場合、組成物は、点滴または注入用の溶剤または懸濁剤の形態、または凍結乾燥された散剤であり得る。
【０１６０】
腸を経由する場合、医薬組成物は、錠剤、ゲルカプセル剤、糖衣錠、シロップ剤、懸濁剤、液剤、粉末剤、果粒剤、乳剤、制御放出を可能にするミクロスフェアまたはナノスフェアまたは脂質ベシクルまたはポリマーベシクルの形態であり得る。
【０１６１】
局所的経路の場合、本発明に係る化合物に基づいた医薬組成物は、皮膚と粘膜の処置のために調剤され、軟膏剤、クリーム剤、乳剤、軟膏、粉末剤、湿潤性パッド、液剤、ゲル剤、スプレー、ローション剤または懸濁剤の形態であり得る。それらはさらに、制御放出を可能にする、ミクロスフェアまたはナノスフェア、または脂質ベシクルまたはポリマーベシクル、またはポリマー貼付剤およびヒドロゲルであり得る。これらの局所的経路用の組成物は、臨床的適応に応じて無水形態または水性形態であり得る。
【０１６２】
経眼の経路の場合、それらは点眼剤の形態であり得る。
【０１６３】
様々な実施形態では、薬剤は、注入によって、または経時的な漸進性の点滴によって、静脈内に投与することができる。所与の経路に適切な製剤を考慮すると、例えば、本明細書に記載の方法および組成物に有用な薬剤は、静脈内に、鼻腔内に、吸入によって、腹腔内に、筋肉内に、皮下に、窩内に投与することができ、および望まれる場合には、蠕動性の手法または当業者に既知の他の手法によって送達され得る。特定の実施形態では、本明細書において使用される化合物は、アルツハイマー病を有する患者に、経口で、静脈内に、または筋肉内に投与される。
【０１６４】
本発明に係る医薬組成物はさらに、任意の薬学的に許容可能な担体を含み得る。本明細書において使用されるように「薬学的に許容可能な担体」は、体内のある組織、器官または部分から体内の別の組織、器官または部分へと対象の化合物を運ぶまたは輸送するのに関係する、薬学的に許容可能な物質、組成物または媒介物を指す。例えば担体は、液体または固体の充填材、希釈剤、賦形剤、溶剤、またはカプセル化物質、またはその組み合わせであってもよい。担体の各構成要素は、製剤の他の成分と適合しなければならないという点において「薬学的に許容可能」でなければならない。それはさらに、それが接触するかもしれない組織または器官と接触させて使用するのに適していなければならず、すなわちその治療の有益性を過度に上回る毒性、炎症、アレルギー反応、免疫原性、または他の併発症のリスクをもたらしてはならない、
【０１６５】
様々な実施形態では、本発明は、治療上有効な量のＯＰＮと共に、薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。「薬学的に許容可能な賦形剤」は、一般的に安全で無毒かつ望ましい医薬組成物を調製するのに有用な賦形剤を意味し、およびヒトへの薬の使用と同様に家畜への使用にも許容される賦形剤を含む。有効成分は、薬学的に許容可能かつ有効成分と両立できる賦形剤と混合され、および本明細書に記載の治療法に使用するのに適した量であり得る。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアゾール組成物の場合にはガスでもよい。適切な賦形剤は、例えばデンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、水、食塩水、ブドウ糖、プロピレングリコール、グリセリン、エタノール、マンニトール、ポリソルベートなど、およびその組み合わせである。加えて、望まれる場合には、組成物は、有効成分の効果を高めるまたは保全する湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝薬などの小量の補助物質を含んでもよい。本明細書に記載の治療用組成物は、薬学的に許容可能な塩を含むことができる。薬学的に許容可能な塩は、例えば塩化水素またはリン酸などの無機酸、有機酸、例えば酢酸、酒石酸またはマンデル酸で形成された酸付加塩、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄などの無機塩から形成された塩、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩から形成された塩を含む。液体の組成物は、水に加えて、または水を除外して液相を、例えばグリセリン、綿実油などの植物油、および水油乳剤を含むことができる。生理的に容認可能な担体は当該技術において周知である。特定の障害または症状の処置に効果的であろう本発明で使用される活性薬剤の量は、障害または症状の性質に依存し、および標準的な臨床技術を用いて当業者により決定され得る。
【０１６６】
本発明に係る医薬組成物はさらに、経口投与用にカプセル化され、錠剤にされ、または乳剤ないしシロップとして調製され得る。薬学的に許容可能な固体または液体の担体は、組成物を増強または安定させるために、または組成物の調整を容易にするために加えられてもよい。液体の担体として、シロップ、落花生油、オリーブオイル、グリセリン、食塩水、アルコール、および水があげられる。固体の担体として、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム、二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸、タルク、ペクチン、アラビアゴム、寒天またはゼラチンがあげられる。担体はさらに、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの徐放性物質を、単独でまたはワックスと共に含んでもよい。
【０１６７】
医薬品は、必要な場合には、錠剤形態のための製粉、混合、造粒および圧縮、または硬カプセル形態のための製粉、混合および充填、を含む従来の調剤技術に従って作られる。液体の担体が使用される場合、製剤はシロップ、エリキシル剤、乳剤、または水性ないし非水性の懸濁剤の形態である。そのような液体製剤は、経口投与で直接投与されてもよく、または、柔らかいゼラチンカプセルに充填されてもよい。
【０１６８】
本発明に係る医薬組成物は治療上有効な量で送達され得る。正確な治療上有効な量は、所与の被験体への処置における有効性の観点から、最も効果的な結果を生み出す組成物の量である。この量は、限定されないが、治療用化合物の特性（作用、薬物動態、薬力学、およびバイオアベイラビリティを含む）、被験体の生理的状態（年齢、性別、疾患の種類とステージ、一般的な身体状況、所与の用量への反応性、およびと薬物治療のタイプを含む）、薬学的に許容可能な担体または製剤内の担体の性質、ならびに投与経路を含む様々な因子に依存して変化するだろう。臨床および薬学の技術の当業者は、慣例的な手順を通じて、例えば化合物の投与に対する被験体の反応をモニタリングし、それに応じて用量を調整することによって、治療上有効な量を決定することができるであろう。さらなる手引きについては、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄ．２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  ＰＡ，ＵＳＡ）（２０００）を参照されたい。
【０１６９】
典型的な用量は、インビトロ反応または動物モデルにおける反応によって、当業者に指示される通りのものであり得る。そのような用量は典型的に、関連する生物学的活性を失うことなく、濃度または量を約１桁まで減らすことができる。したがって実際の用量は、例えば関連する初代培養細胞または組織培養された組織サンプル、すなわち得られた生体サンプルなどのインビトロでの反応性に基づいて、または適切な動物モデルにおいて観察された反応に基づいて、医師の判断、患者の状態および治療方法の効果に左右されるだろう。
【０１７０】
疾患の処置に対して適切な用量は、処置される疾患の種類、疾患の重症度と経過、疾患の反応性、治療目的または予防目的で抗体が投与されたか否か、以前の治療、および患者の病歴に依存する。容量はさらに、何らかの併発症が起きた場合に個々の医師によって、および処置を行う医師の裁量で、調整することができる。投与する医師は、最適な用量、投薬法、および反復率を決定することができる。医薬組成物は、１回のみ、または数日から数ヶ月続く一連の処置を通じて、または治癒に達するまで、または疾患状態の低下が達成されるまで（例えばアルツハイマー病の処置または改善）、投与され得る。処置の期間は、被験体の臨床経過と治療への反応性に依存する。特定の実施形態では、用量は体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｍｇまでであり、および１日１回以上、週１回以上、月１回以上、または年１回以上与えられてもよい。
【０１７１】
様々な実施形態では、治療上有効な量の組換えＯＰＮは、当業者によって容易に理解されるであろう任意の適切な技術によって、被験体に投与される。いくつかの実施形態では、組換えＯＰＮは経鼻、非経口、または経眼経路で投与される。いくつかの実施形態では、非経口の経路は静脈内注射である。様々な実施形態では、経眼経路は点眼剤を介する。
【０１７２】
様々な実施形態では、ＯＰＮウイルスベクターは、当業者によって容易に理解されるような任意の適切な技術によって投与されてもよい。様々な実施形態では、組成物の投与は静脈内注射による投与を含む。様々な実施形態では、組成物は筋肉内注射によって投与される。様々な実施形態では、組成物は経鼻で投与される。これらの方法は、ＯＰＮ遺伝子またはＯＰＮの活性フラグメントをコードする遺伝子の、脳組織への送達に帰結する。これらの方法は、ＯＰＮまたはその活性フラグメントの、循環内への直接的分泌に帰結する。ＡＡＶベクター、ＡＡＶヘルパー構成物、およびヘルパーウイルス、または付属機能ベクターは、標準的なトランスフェクション技術を使用して、同時にまたは連続的に宿主細胞に導入することができる。さらに、当業者によって容易に認識されるように、ウイルスベクターは一回投与として、または処置レジメンとして、例えば１日１回、週１回、または他の任意の適切な時間間隔で、送達され得る。用量は、年齢、体重、血管症状の重症度、または医師が見極めるであろう他の因子などの様々な因子に左右される。
【０１７３】
様々な実施形態では、リポソームは、ＯＰＮまたはその機能性／生物学的活性ＯＰＮフラグメントを含むように修飾される。いくつかの実施形態では、修飾されたリポソームは、当業者によって容易に理解されるような任意の適切な技術によって投与されてもよい。様々な実施形態では、修飾されたリポソームは、血液への末梢注入を介して投与される。様々な他の実施形態では、修飾されたリポソームは経口で投与される。
【０１７４】
様々な実施形態では、共重合体ＧＡは血液由来の単球の自然な動員を増強するために投与される。様々な実施形態では、血液由来の単球が動員され、および病的な脳実質に浸潤する。他の実施形態では、浸潤する単球はマクロファージになる。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、共重合体ＧＡは週１回投与される。様々な実施形態では、共重合体は最大で１０週間まで投与される。様々な実施形態では、投与されるＧＡの用量は、約１０−１５０μｇの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ＧＡの用量は、約１０−２０μｇ、２０−３０μｇ、３０−４０μｇ、４０−５０μｇ、５０−６０μｇ、６０−７０μｇ、７０−８０μｇ、８０−９０μｇ、９０−１００μｇ、１００−１１０μｇ、１１０−１２０μｇ、１２０−１３０μｇ、１３０−１４０μｇ、または１４０−１５０μｇの範囲である。いくつかの実施形態では、ＧＡの用量は１００μｇである。さらに他の実施形態では、用量は３０μｇである。
【０１７６】
様々な実施形態では、ＧＡは６−４８時間の暴露で投与される。いくつかの実施形態では、ＧＡの暴露は、６−１２時間、１２−２４時間、２４−３６時間、または３６−４８時間である。他の実施形態では、ＧＡの暴露は１２−２４時間である。
【０１７７】
様々な他の実施形態では、骨髄由来ＣＤ１１５＋単球のサブセットが投与される。いくつかの実施形態では、骨髄由来ＣＤ１１５＋単球は毎月投与される。いくつかの実施形態では、末梢血は、骨髄由来ＣＤ１１５＋単球で強化される。様々な実施形態では、骨髄由来ＣＤ１１５＋単球の投与は、単球由来マクロファージの大脳動員を増加させる。
【０１７８】
さらに他の実施形態では、共重合体ＧＡと骨髄由来ＣＤ１１５＋単球のサブセットが投与される。他の実施形態では、併用投与は、被験体におけるより大きな単球動員をもたらす。
【０１７９】
様々な実施形態では、共重合体ＧＡおよび／または骨髄由来ＣＤ１１５＋単球のサブセットの投与は、認知機能の保持、シナプスの保存、プラークの除去、アストログリオーシスの制限、および免疫分子環境の調整をもたらす。当業者は、必要とする被験体に投与される生来の免疫細胞の適正量を決定することができる。
【０１８０】
＜実施例＞
以下の実施例は、請求される発明をよりよく例示するために提供され、および本発明の範囲を制限するものとして解釈されることはない。特定の物質が言及される範囲で、それは単に例示を目的としたものであり、本発明を制限することを意図していない。当業者は、創意に富んだ能力を発揮することなく、および本発明の範囲から逸脱することなく、同等の手法または反応物を作成するだろう。
【０１８１】
＜実施例１＞
＜マウス＞
Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（ＡＰＰｓｗｅ、ＰＳＥＮ１Ｅ９）８５Ｄｂｏ／Ｊ株からの、アルツハイマー病ダブルトランスジェニックＡＰＰＫ５９５Ｎ、Ｍ５９６Ｌ＋ＰＳ１ΔＥ９、ＡＰＰ／ＰＳ１（ＡＤｔｇ）マウス、およびそれらの年齢の一致する非遺伝子組換えの野生型の同腹子を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｔｏｃｋ  ＃００５８６４）から購入し、次にＣｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒで保存した。これらのＡＤｔｇマウスはヒト遺伝子組換えを伴い、それは抗ヒト抗体を使用してアミロイドβ型の検知を可能にする。この試験のマウスはすべて、Ｃ５７ＢＬ／６類遺伝子背景を有する。マウス（すべてオス）の２つのコホートを、行動分析、組織学的分析、および生化学的分析に使用した。追加のＡＤｔｇマウスのコホート（オスとメスが同数）を、フローサイトメトリーによって脳への先天性免疫の湿潤を評価するために使用した。ＭＡＣＳ（ｍａｇｎｅｔｉｃ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）カラム選別前後の、インビトロ試験、初代細胞培養、および単離されたＣＤ１１５＋単球の特性評価に関しては、骨髄ドナーのマウスは若く非遺伝子組換えの野生型の同腹子であった（８−１０週齢）。骨髄由来単球の養子移入に関しては、ドナーマウスは、若い（８−１０週齢）Ｃ５７ＢＬ／６遺伝子組換え（ＵＢＣ−ＧＦＰ）３０  Ｓｃｈａ／Ｊマウスであり、ヒトユビキチンＣプロモーター（Ｓｔｏｃｋ＃００４３５３）の命令のもとで緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現が増強されていた。ＡＤｔｇ脳への単球の浸潤を評価するフローサイトメトリー試験に関しては、ドナーは若い非遺伝子組換えの野生型マウス（８−１０週齢）であった。すべての実験は、認可されたプロトコルのもとで、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）の規則に従って行なわれた。加えてすべての実験は、マウスの遺伝子型を知らされていない研究者によって行われ、記録された。
【０１８２】
＜遺伝子型判定＞
ゲノムＤＮＡを、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、かつメーカーのプロトコルに従うことによって、マウスの後尾の先端から抽出した。ダブルトランスジェニックＡＰＰＳＷＥ／ＰＳ１ΔＥ９マウス、および非遺伝子組換えの野生型の同腹子を、先に記載されたように、ＰＣＲによって遺伝子組換えの存在を遺伝子型判定することによって識別した（Ｊａｎｋｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｏｌ  Ｅｎｇ  ２００１；１７：１５７−６５，Ｊａｎｋｏｗｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２００４；１３：１５９−７０．；Ｂｕｔｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ２００６  １０３：１１７８４−１１７８９）。
【０１８３】
＜グラチラマー酢酸塩免疫化＞
ＡＤｔｇマウス（生後１０ヶ月）は、ＧＡ［Ｃｏｐ−１およびＣｏｐａｘｏｎｅ（登録商標）としても知られる；リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に１００μｇ］またはＰＢＳのみ（対照群）の皮下注射を、１週間にわたって週２回受け、続いて８週間にわたって週１回受けた。フローサイトメトリーによる脳への先天性免疫の湿潤の評価に関しては、生後１０ヶ月のＡＤｔｇマウスは、ＧＡ（ＰＢＳ中に１００ｍｇ）またはＰＢＳのみの皮下注射を、１週間にわたって週２回受け、続いて３週間にわたって週１回受けた。試験の最後に、すべてのマウスに麻酔をかけ、次に０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて冷たいＰＢＳで潅流し、その後にそれらの器官を回収して分析し、または２．５％のパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中に固定し、そしてさらなる組織学的分析のために３０％のスクロースで生体組織の凍害を防いだ。
【０１８４】
＜骨髄由来ＣＤ１１５＋単球の単離および養子移入＞
先に報告されたように、マウスのドナーからのＣＤ１１５＋単球を単離した（Ｋｏｒｏｎｙｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ：ａ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２０１５，１３８：２３９９−２４２２）。手短に言えば、骨髄細胞を大腿骨、脛骨および上腕骨から採取し、およびＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（登録商標）ＰＬＵＳ（１７−１４４０−０３，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度勾配において単核細胞に関して濃縮した。メーカーのプロトコルに従って、ビオチン化された抗ＣＤ１１５  ｍＡｂクローンＡＦＳ９８（＃１３−１１５２；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびストレプトアビジンを結合した磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用し、ＣＤ１１５＋単球集団をＭＡＣＳ濃縮カラムを介して単離した。この手順の後、単球（５−６×１０６細胞／マウス）を、２ヶ月間、月一回の頻度で、生後１０ヶ月のＡＤｔｇマウスの尾静脈に注入した。先天性免疫の脳への浸潤をフローサイトメトリーによって評価するために、生後１０ヶ月のＡＤｔｇマウスは、骨髄由来ＣＤ１１５＋単球の注入を１回受けた（上記と同じ用量）。
【０１８５】
＜骨髄由来ＣＤ１１５＋単球のフローサイトメトリーおよび免疫組織化学的特性評価＞
上記に詳述されるように、若い野生型マウスから骨髄細胞を採取した（１つの実験あたりｎ＝３−４マウス）。Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）勾配による単核細胞の濃縮後、上記に詳述されたＭＡＣＳ濃縮カラムを使用して、細胞の一部を採取し（ＣＤ１１５＋カラムの前に）、および細胞の第２の部分をＣＤ１１５＋単球集団ごとにさらに単離した （ＣＤ１１５＋カラムの後に）。両方の細胞部分を、ＣＤ１１５＋カラムの前後に、フローサイトメトリーによってただちに染色して分析し、またはさらなる免疫組織化学的解析のためのマクロファージ培養物を生成するために平板培養した。フローサイトメトリー分析のために、ＣＤ１１５＋カラム前の細胞を以下の抗体で染色した：ビオチン化抗ＣＤ１１５  ｍＡｂクローンＡＦＳ９８（＃１３−１１５２；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＡＰＣ結合抗ビオチンクローンＢｉｏ３１８Ｅ７（＃１３０−０９０−８５６；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、ＰＥ結合抗ＣＤ３６クローンＲＥＡ２６２（＃１３０−１０２−７６３；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、Ｖｉｏｂｒｉｇｈｔ、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ３６クローンＲＥＡ２６２（＃１３０−１０４−８８９；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、ＰＥ結合抗ＣＤ２０４クローンＲＥＡ１４８（＃１３０−１０２−３２８；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８結合抗ＭＭＰ９ポリクローナル抗体（＃ｂｓ−０３９７Ｒ−Ａ４８８；Ｂｉｏｓｓ）。ＣＤ１１５＋カラム後の細胞に関しては、上記で明示されたものと同一の１セットの染色抗体を使用したが、この単離手順は既にビオチン化抗ＣＤ１１５抗体を細胞に連結していたため、一次抗ＣＤ１１５  ｍＡｂを除外した。すべての抗体の希釈は１：１００であった。標識されたサンプルを、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを備えたＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＴＭ細胞アナライザーで分析した；ＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＸ．０．７ｒ２；Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いてデータをさらに分析した。
【０１８６】
ＣＤ１１５＋カラム選別前後の両細胞部分をさらに、初代マクロファージ培養物へと分化させ、免疫組織化学によって解析した。手短に言えば、細胞を、１０％の血清と２０ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦ（＃３１５−０２；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を用いて、完全なＲＰＭＩ−１６４０培地（＃２１８７０；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において７日間培養することによって、マクロファージへと分化させた。マクロファージの初代培養を、次に一晩、ガラスのカバーガラス上の２４ウェルの組織培養プレートにおいて、各ウェル（各条件ごとに３−４のウェル）につき１．２×１０５細胞で平板培養した。細胞の固定のためにメタノール（９９．８％）を−２０℃で２０分間使用し、続いてＰＢＳで繰り返し洗浄した。次に、ラットの抗ＣＤ３６  ｍＡｂクローンＭＦ３（１：２００；ａｂ８００８０；Ａｂｃａｍ）、ラットの抗ＣＤ２０４スカベンジャー受容体Ｉ／ＩＩ型（ＳＣＡＲＡ１）ｍＡｂ（１：１００；ＭＣＡ１３２２；ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）、およびヤギの抗ＭＭＰ９  ｐＡｂ（１：１００；ＡＦ９０９；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して細胞を染色した。第２のポリクローナル抗体は、Ｃｙ２、Ｃｙ３またはＣｙ５と結合したロバの抗ラットおよび抗ヤギを含んだ（１：２００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）を使用して細胞を固定した。Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｚ１  Ａｐｏｔｏｍｅ−ｅｑｕｉｐｐｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して、各ウェルからいくつかの領域（最小ｎ＝４、１つの群につき無作為に選択）を得た（各領域内に平均１２０個の細胞）。各事例に同じ露光時間を使用して画像を得た。ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェアと共にヒストグラムベースの閾値を使用して、個々の画像をグレースケールに変換し、およびベースラインに標準化することによって、蛍光性シグナルとその合計面積を判定および定量化した。「面積／細胞」は、同じ領域（画像）の細胞の総数（ＤＡＰＩ数）で割った全蛍光性シグナル（面積）を測るものである。すべての実験に関して、治験責任医師は治療条件を知らされていなかった。
【０１８７】
＜マウスにおけるバーンズ迷路行動試験＞
バーンズ迷路は、軽度の有害環境から逃れる手段を見つけるために被験体に空間的手がかりを使用させる空間学習作業である（光投影能を備えたオープンスペース）；マウスは、脱出位置を見つけるために空間的手がかりを使用するように要求される。バーンズ迷路装置で９日間にわたり、逃避箱の位置を学習する能力についてマウスを評価した。野生型とＰＢＳ群の有意差に基づいてこのタイミングを確立し、および我々の処置の効果を試験するのに適切であることが分かった。バーンズ迷路装置は、２０の穴が円周のまわりに等距離で配置された円テーブルである。試験中、逃避箱がこれらの穴の１つの下に配置され、小さすぎて入ることのできない穴が他の１９の穴の下に配置される。動物をまず、最初の空間識障害を促進するために３０秒間、迷路の中央にある不透明なシリンダに入れる。この後シリンダを取り除き、動物はホームケージへとつながる逃避箱を見つけてそこに入るまで、迷路を探索する。脱出潜在期は、シリンダの除去から、逃避箱に動物が進入するまでの時間である。エラー（不正確な進入）は、マウスが誤った箱に入る事象の数を表わす。２つの明るい光が、バーンズプラットフォームの中央を照らす。マウスが５分（３００秒）以内に逃避箱に入らない場合、実験者はマウスを逃避箱に導く。動物は、取り出されてホームケージに移される前に、さらに３０秒間逃避箱に留まる。すべての箱と迷路表面は、７０％のイソプロピルアルコールが吹きかけられており、および続く試験のために、匂いの手がかりを消すための非組織的な方法で拭き取られる。逃避箱の位置は、練習／習得段階のすべての試験の間、同じままであり、および意図しない迷路内の手がかりの可能性を減らすためにマウス間で変えられる。練習は、各試験を１５分間隔で分け、１日３回繰り返される。各試験からのデータは保持され、かつ平均化される。練習／習得段階は４日である。これに続いて、迷路に接触しない２日間の休みがある。７日目に、練習／習得段階と同じ逃避箱の位置と方法を使用し、３回の試験セッションを通じて各動物を再試験する。８日目に、記憶保持段階に続いて、逆転段階が始まる。逃避箱はもとの逃避箱位置から四分円異なる位置に配置される。上記に詳述された同じ手順を使用して、逆転試験を、２日連続（８日目と９日目）で１日３回繰り返す。マウスの第２のコホートに同じバーンズ迷路試験を行ったが、各セッション時間は最大で４分（２４０秒）に短縮され、この時間の長さはより長い期間（５分）と同じくらい効果的であることが示された。すべての治験責任医師はマウス群を知らされていなかった。データを手動で、デジタルで、および迷路上に設置したビデオカメラによって記録した。
【０１８８】
＜免疫組織化学＞
脳の冠状凍結切片（３０μｍの厚さ）を、血清なしのタンパク質遮断（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、または２０％の正常ウマ血清［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］と０．０５％のＴｒｉｔｏｎＴＭ  Ｘ−１００［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ］を含む透過遮断溶液）の適用に先立って、抗原賦活化溶液（ＤＡＫＯ）で３０分間処理した。次に、４℃で一晩、ＰＢＳ中の２％の遮断溶液中の以下の一次抗体と組み合わせて、切片をハイブリダイズして染色した：ヤギのポリクローナルＯＰＮ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、マウスの抗ヒトアミロイドβ［残留物１７−２４、ｍＡｂクローン４Ｇ８（１：１００；ＳＩＧ−３９２２０；Ｃｏｖａｎｃｅ）および残留物１−１６、ｍＡｂクローン６Ｅ１０（１：１００；ＳＩＧ−３９３２０；Ｃｏｖａｎｃｅ）］、ウサギの抗ＧＦＡＰ  ｐＡｂ（１：１００；Ｇ９２６；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウサギの抗Ｉｂａ１  ｐＡｂ（１：２５０；＃０１９−１９７４１；Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ウサギの抗ＧＦＰ  ｐＡｂ（１：５００；＃５９８；ＭＢＬ）、ラットの抗ＣＤ６８（１：１００；Ａｂｃａｍ）、ウサギの抗ｉＮＯＳ（１：１００；Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ラットの抗ＣＤ４５  ｍＡｂクローン３０−Ｆ１１（１：２５；＃５５０５３９；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ヤギの抗ＩＬ１０  ｐＡｂ（１：１００；ＡＦ５１９；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびヤギの抗ＭＭＰ９  ｐＡｂ（１：１００；ＡＦ９０９；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）。一次抗体でのハイブリダイゼーションに続いて、適切なホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、またはＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５またはＤｙＬｉｇｈｔＴＭ  ６４９と結合したフルオロフォア結合の二次抗体（ロバの抗マウス、抗ラット、抗ヤギ、および抗ウサギ；１：２００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で、３７℃で１時間インキュベートした。切片をＰＢＳ中で洗浄し、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）（Ｈ−１２００）を含むまたはＤＡＰＩ（Ｈ−１０００）を含まないＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、またはＤＡＰＩを有するＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して固定した。非特異性の標識を評価するために、一次抗体を省いた同じプロトコルを使用して負の対照を処理した。顕微鏡分析のために、ＡｐｏＴｏｍｅ（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＭｉｃｒｏＩｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．）を装備したＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｚ１蛍光顕微鏡を使用した。画像の処理と分析のために、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ（ｒｅｌｅａｓｅ  ４．６．３）ソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ）を使用した。
【０１８９】
＜海馬内のシナプス前部の標識付けとシナプス面積の定量化＞
ＡＤｔｇマウスおよび非遺伝子組換えの（野生型）マウスの海馬内のシナプス面積を画定するために、１匹の動物（１つの群当たりｎ＝６のマウス）につき、ブレグマ−２．５０、−２．６５および−２．８０ｍｍ（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）における３つの独立した冠状の脳切片を、シナプス前部マーカーＶＧｌｕＴ１（Ｓｌｃ１７ａ７によりコードされる）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、モルモット、１：６０００）で染色した。各海馬領域に関しては、高解像度スキャンを、ｘ１００オイル対物レンズおよびＺｅｉｓｓ  ＡｐｏＴｏｍモードを使用して得た。オプティカルセクショニングは、各々が０．２５ｍｍの幅で、かつ３．７５ｍｍの組織深度内の焦点面を覆う１５Ｚスタックの画像を含んだ。同じレベルで得られた５つの群すべてからの切片を、同一に免疫染色した。すべての実験中に、非一次および非二次抗体の対照を平行して実験（ｒｕｎ）した。これらの対照に特異的な染色はなかった。海馬領域を覆うために、１５の長方形領域（各９０μｍ×７０μｍ）を、アンモン角１（ＣＡ１）の網状分子層と放射状層と多形細胞層において、かつ歯状回の外側および内側ブレード分子（ｂｌａｄｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）層において正確に選択した。走査用のパラメータは処置条件を通じて同じままであった。単一の光切片画像を、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪマクロとバッチ操作を使用して分析し、シナプス面積を定量化した（１５光切片／領域、１５領域／脳切片、および合計６７５画像／脳）。平均のシナプス面積または１つの画像当たりの面積の割合を、各状態ごとに計算した。
【０１９０】
＜チオフラビン−Ｓアミロイドβプラーク染色＞
第２の抗体染色に続いて、脳切片をチオフラビン−Ｓ（チオ−Ｓ、７０％のエタノール中で１％ｗ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で室温で１０分間染色し、７０％のエタノール中で３回洗浄し、次に各々１分間、蒸留水で一回洗浄した。
【０１９１】
＜定量化および立体解析計数手順＞
ＯＰＮ＋細胞、Ｉｂａ１＋ＣＤ４５ｈｉ細胞、ＧＦＡＰ＋細胞、チオ−Ｓ＋アミロイドβプラーク、および４Ｇ８＋アミロイドβプラークの数と面積（μｍ２）を、海馬および皮質（嗅内皮質と帯状回皮質を含む）領域の両方をカバーする領域にわたって、１５０−μｍ間隔で、マウスごとに４から６の冠状切片を検査することによって判定した。Ｉｂａ１＋／ＣＤ４５ｈｉ定量化のために、ＣＤ４５抗体で強く標識されたＩｂａ１＋細胞のみを選択し、他方でＩｂａ１−細胞は除外した。ＣＤ４５＋細胞（Ｉｂａ１＋細胞からの）をグレースケール画像に変換し、および強い／高いシグナルに関する閾値をＩｍａｇｅＪソフトウェアで一旦決定し、ＣＤ４５ｈｉｇｈ定量化のためにすべての画像に適用した。特定のシグナルの蛍光を、同じ露光時間を各画像に使用して捕らえた。画像をグレースケールに変換し、ＰＣにデジタル化し、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェア（バージョン１．３８ｘおよび１．４６ｒ）を用いて、ヒストグラムベースの閾値を使用してベースラインに標準化した。加えて、「分析」グリッドを使用し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアの助けを得て、ＯＰＮ＋／ＣＤ４５ｈｉ細胞、Ｉｂａ１＋／ＣＤ４５ｈｉ細胞、ＧＦＡＰ＋細胞、およびアミロイドβプラークを手動で計算した。分析者はマウス群について知らされておらず、すべての計数を行なった。
【０１９２】
＜大脳の単球浸潤のフローサイトメトリー分析＞
実験用ＡＤｔｇマウス（ｎ＝４−６マウス／群）を、採取前に０．５のｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で補足された冷たい食塩水で潅流した。次に脳全体を、ＰＢＳ中の冷たい２％のウシ胎仔血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）と共に、７０ｍｍ細胞ストレーナ（Ｆａｌｃｏｎ；Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）内で機械的に刻んだ。遠心分離、均質化および洗浄の後、ペレット剤を４０％の無菌のパーコール（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に懸濁し、および８５０ｇで２５分間遠心分離にかけた。細胞ペレットを７０％のパーコールに再懸濁し、および８００ｇで２０分間、遠心分離にかけた。パーコール勾配の後に最上層にある細胞を採取して洗浄した。次に、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入した以下の抗体で細胞を染色した：ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１１ｂクローンＭ１／７０（１：１００、＃１０１２０６）；ＰＥ結合抗Ｌｙ−６ＣクローンＨＫ１．４（１：１００、＃１２８００７）；およびＰＥ／Ｃｙ７結合抗ＣＤ４５．２クローン１０４（１：１００、＃１０９８３０）。染色したサンプルを、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを装備したＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒで分析し、およびデータをさらにＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＸ．０．７ｒ２；Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）で分析した。
【０１９３】
＜アミロイドβ１−４０、アミロイドβ１−４２、ＭＣＰ１、ＩＬ１０、およびＭＭＰ９レベルの、サンドイッチＥＬＩＳＡによる生化学的判定＞
脳の可溶性と不溶性のＥＬＩＳＡ解析のために、脳組織を、０．５％のＴｒｉｔｏｎＴＭ  Ｘ−１００（Ｔ８７８７；Ｓｉｇｍａ）およびプロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩ（＃５３９１３１；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）と共にＰＢＳ緩衝液中で徹底的に均質化した（Ａｒｇｏｓホモジナイザー）。細胞片の除去後、ホモジネートを４℃で２５分間、１０，０００ｇで遠心分離にかけた。上清は「可溶性」フラクションと見なされ、および可溶性アミロイドβ１−４０、アミロイドβ１−４２、ＭＣＰ１（Ｃｃｌ２によってコードされる）、ＩＬ１０、およびＭＭＰ９レベルを評価するために使用した。次にペレット剤を希釈し、および上記のホモジネート緩衝液で均質化した。これは「不溶性」フラクションであり、および不溶性のアミロイドβ１−４０およびアミロイドβ１−４２を評価するために使用した。
【０１９４】
ＭФＢＭ細胞については、各ウェル内の細胞を２ｍＭのＥＤＴＡ−ＰＢＳによって取り出し、チューブに集め、そして遠心分離にかけた。細胞ペレットを、１％のプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補ったＲＩＰＡ緩衝液の混合物で溶解および再懸濁し、使用まで−８０℃で保管した。
【０１９５】
Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（＃２３２２７；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用したタンパク定量法の後に、メーカーの説明書に従って使用される、抗ヒトアミロイドβ１−４２末端特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡキット（ＫＨＢ３４４２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；これはマウスアミロイドβおよびヒトアミロイドβ４０／アミロイドβ４３を認識しない）、抗ヒトアミロイドβ１−４０末端特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡキット（ＫＨＢ３４８２，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；これはマウスアミロイドβ、およびヒトアミロイドβ４２／アミロイドβ４３を認識しない）、および抗マウスＯＰＮ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、可溶性と不溶性の遺伝子組換え由来アミロイドβ１−４２およびアミロイドβ１−４０レベル、およびＯＰＮを分析した。
【０１９６】
アミロイドβキットは、アミロイドβ１−４２またはアミロイドβ１−４０配列のＮおよびＣＯＯＨ末端に特異的な２つの抗体の組み合わせを使用する。結合ウサギ抗ＣＯＯＨ末端を、ホースラディシュペルオキシダーゼで標識された抗ウサギ抗体を使用して検出し、およびマイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ３８４  ｐｌｕｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４５０ｎｍで読み取った。Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  ＣＣＬ２／ＪＥ／ＭＣＰ１  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡキット（ＭＪＥ００）、Ｍｏｕｓｅ  ＩＬ１０  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡキット（Ｍ１０００Ｂ）、およびＭｏｕｓｅ  Ｔｏｔａｌ  ＭＭＰ−９  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡキット（ＭＭＰＴ９０）を、すべてメーカー（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）の説明書に従って使用し、可溶性ＭＣＰ１、ＩＬ１０およびＭＭＰ９レベルをそれぞれ測定した。各ウェルの光学濃度を、同じマイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ３８４  ｐｌｕｓ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、４５０ｎｍ（５４０ｎｍ補正）で読み取った。
【０１９７】
＜アミロイドβ１−４２原線維の調製＞
凍結乾燥させた非蛍光性アミロイドβ１−４２ペプチド（＃２０２７６；Ａｎａｓｐｅｃ）を最初に冷たいＨＦＩＰ（ヘキサフルオロイソプロパノール）（＃５２５１２；Ｓｉｇｍａ）中で溶解させることによって、１ｍＭの最終濃度へと単量体化させ、次に無菌のシリコン微量遠心機チューブに等分した。まずＨＦＩＰを、無菌のフード内で、次にＳｐｅｅｄＶａｃの真空下で２時間蒸発させ、ＨＦＩＰの痕跡を除去した；ペプチド膜を使用まで−２０℃で保管した。原線維形成を誘発するために、蛍光性（ＨｉＬｙｔｅ６４７；＃６４１６１；Ａｎａｓｐｅｃ）および非蛍光性のアミロイドβ１−４２膜を溶媒中で再懸濁し、それにまず１０％の無菌のＮａＯＨ  ６０ｍＭを加え、次に溶媒を３０秒間攪拌した。次に、無菌の４５％のＨ２Ｏおよび２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４＋Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．４）の無菌の４５％の溶液を加え、および溶媒を再度攪拌し、３７℃で２週間、撹拌器上でインキュベートした。あらかじめ形成されたアミロイドβ１−４２原線維を次に、食作用アッセイに先立って６０秒間、超音波処理し、および同じ溶媒を使用して１００ｎＭに希釈した。
【０１９８】
＜骨髄由来マクロファージの初代培養および食作用アッセイ＞
マクロファージによるアミロイドβ食作用を試験するために、繰り返しの実験で、単球を野生型マウス（ｎ＝１８マウス）の骨髄から単離し、および１０％の血清および２０ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦ（＃３１５−０２；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）と共に完全なＲＰＭＩ−１６４０培地（＃２１８７０；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において７日間の培養によりマクロファージへと分化させた。骨髄由来マクロファージ（ＭФＢＭ）を、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンおよび２０ｎｇ／ｍｌのＭＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）と共に完全なＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において６−７日間培養した大腿骨と脛骨から生成した。マクロファージの初代培養を次に一晩、カバーガラス上の２４ウェルの組織培養プレートにおいて、各ウェル（各条件ごとに３−４のウェル）につき１．２×１０５細胞で平板培養した。次にマクロファージを、１、３または２４時間、３０μｇ／ｍｌのＧＡ（Ｃｏｐａｘｏｎｅョ；ＴＥＶＡＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ；Ｓｉｇｍａ、１Ｘ）、または１０μＭのミノサイクリン（Ｓｉｇｍａ）で処理し、または処理しなかった（対照群）。原線維性アミロイドβ１−４２を加える前に、細胞を５分間、４℃の氷風呂で冷やした；あらかじめ形成された原線維性アミロイドβ１−４２（１００ｎＭ）を加えた直後に、プレートを２５℃、５１５ｇで遠心分離にかけ、続いて３０分間または６０分間、３７℃でインキュベートした。次に細胞をアミロイドβのない培地ですすぎ、取り込まれていないアミロイドβを除去し、その後ＰＢＳで２度洗浄した。細胞の固定のために、メタノール（９９．８％）を−２０℃で２０分間、または４％のパラホルムアルデヒドを室温で１２分間使用し、続いてＰＢＳで繰り返し洗浄した。免疫染色のためにまず、マウスの抗ヒトアミロイドβｍＡｂクローン６Ｅ１０（１：１００；ＳＩＧ−３９３２０；Ｃｏｖａｎｃｅ）、ラットの抗ＣＤ６８  ｍＡｂクローンＦＡ−１１（１：１００；ａｂ５３４４４；Ａｂｃａｍ）、ラットの抗ＣＤ３６  ｍＡｂクローンＭＦ３（１：２００；ａｂ８００８０；Ａｂｃａｍ）、ラットの抗ＣＤ２０４スカベンジャー受容体Ｉ／ＩＩ型（ＳＣＡＲＡ１）ｍＡｂ（１：１００；ＭＣＡ１３２２；ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ウサギの抗ＣＤ１６３  ｐＡｂ（１：１００；ｏｒｂ１３３０３；Ｂｉｏｒｂｙｔ）、およびヤギの抗ＭＭＰ−９  ｐＡｂ（１：１００；ＡＦ９０９；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して細胞を染色した。第２のポリクローナル抗体は、Ｃｙ２、Ｃｙ３またはＣｙ５と結合したロバの抗マウス、抗ラットおよび抗ヤギを含んだ（１：２００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）を使用して細胞を固定した。Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｚ１  Ａｐｏｔｏｍｅ−ｅｑｕｉｐｐｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して、各ウェルからいくつかの領域（最小ｎ＝５、１つの群につき無作為に選択）を得た（各領域内に平均１２０個の細胞）。各事例に同じ露光時間を使用して画像を得た。ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェアと共にヒストグラムベースの閾値を使用して、個々の画像をグレースケールに変換し、およびベースラインに標準化することによって、蛍光性シグナルとその合計面積を判定および定量化した。「１つの細胞当たりの平均占有面積」は、各フィールドに対する個々の細胞の免疫反応性の領域の数的平均の成果であった。「領域／細胞」は、同じ領域（画像）の細胞（ＤＡＰＩ数）の総数で割った全蛍光性シグナル（領域）を測るものである。すべての実験に関して、治験責任医師は治療条件を知らされていなかった。
【０１９９】
＜ウェスタンブロッティング＞
ＭФＢＭを２ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＰＢＳによって各細胞から取り出し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに集め、そして遠心分離にかけた。細胞ペレットを、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で溶解し、そしてプロテアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の混合物を補った。タンパク濃度を、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して判定した。タンパク質サンプルのアリコートを、４−１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して電気泳動的に分離させ、次にニトロセルロース膜に移し、５％（ｗ／ｖ）の無脂肪の粉ミルクを含むトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）中に遮断し、そしてウサギのポリクローナルＯＰＮ（Ａｂｃａｍ）、ヤギのポリクローナルＯＰＮ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびアクチン（Ａｂｃａｍ）を含む適切な一次抗体とハイブリダイズさせた。次に、化学発光基質の発達に先立って、適切なＨＲＰ結合二次抗体で膜をインキュベートした。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してブロットの濃度測定解析を行い、そして各実験サンプルをアクチンへと標準化させた。
【０２００】
＜インビトロでのｓｉＲＮＡによるＯＰＮノックアウト＞
それぞれ２５−ｂｐの二本鎖オリゴリボヌクレオチドから構成された１セットの３つのＳｔｅａｌｔｈ  ＯＰＮ  ｓｉＲＮＡを、ＯＰＮ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のセンス鎖とアンチセンス鎖に対応する配列と共に使用した。等しい量（各１００ｎＭ）のｓｉＲＮＡを混合し、およびＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で１００ｎｍｏｌ／Ｌの最終濃度に希釈し、メーカーのプロトコルにより、次にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して一時的にＭФＢＭにトランスフェクトした。対照のマクロファージを、Ｓｔｅａｌｔｈ  ＲＮＡｉ（商標）ｓｉＲＮＡの負の対照でトランスフェクトした。トランスフェクション後に４８時間ＭФＢＭをインキュベートし、そして続く実験に使用した。
【０２０１】
＜細胞の長さの測定＞
細胞の長軸と短軸を、Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｌ．４．８ソフトウェアパッケージの長さツールを使用して、μｍ単位で微視的画像から手動で測定した（ＭｃＷｈｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ２０１３，１１０：１７２５３−１７２５８）。
少なくとも１００の細胞を各事件において検査し、各細胞を顕微鏡検査によって分析した。
＜統計的分析＞
【０２０２】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用してデータを分析した。数日間の２つ以上の群の比較（バーンズ迷路試験）を、二元配置分散分析を使用して行い、続いて対応のある群のボンフェローニ多重比較事後検定を行った。３つ以上の群の比較を、一元配置分散分析を使用して行ない、続いて対応のある群のテューキーまたはボンフェローニ多重比較検定を行った。２つの群の比較を、スチューデントの両側独立ｔ検定を使用して分析した。テューキー事後比較と共に、ＳｔａｔＰｌｕｓ対応のあるｔ検定および一元配置分散分析を、シナプス面積の定量化のために行なった。相関分析を、プリズム・ピアソン検定を使用して行った。指示されたように、平均値±標準偏差（ＳＤ）または平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として結果を表す。Ｐ値＜０．０５は、有意とみなされた。群と群の間の有意度は以下のように表わされる：＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．００１，＊＊＊ｐ＜０．０００１，および＊＊＊＊ｐ＜０．００００１。０．０５より低いｐ値は有意であるとみなした。すべてのデータ分析は、すべて盲検化された試験官によって統率された；予測解析を終えた時にコードが明らかにされた。
【０２０３】
＜実施例１＞
発明者は、アルツハイマー病（ＡＤ）のマウスモデルにおいて、グラチラマー酢酸塩（ＧＡ）またはＢＭ−ＣＤ１１５＋単球（Ｍｏ）の移植によって達成された免疫調節が、シナプス形成と神経突起の形成および認知機能を維持することができるか否か、およびどのように維持するかを調査した。ＡＤ神経病理は、認知力低下を引き起こすと考えられる、アミロイドβタンパク質（Ａβ）の増加、特にシナプスに非常に有毒なＡβ１−４２アロフォーム（ａｌｌｏｆｏｒｍ）と密接に関連する。初代培養における骨髄（ＢＭ）由来ＭΦのＧＡ処置は、スカベンジャー受容体とＡβ分解酵素のアップレギュレーションを通じて、ｆＡβ１−４２の食作用および分解を実質的に高めた。最も神経毒性の種であると考えられている、非原線維性Ａβ型、主にオリゴマー（ｏ）Ａβ１−４２を検査した。しかしながら、細胞に対するそれらの効果は、それらの高度な準安定的性質、およびそれらが力学的に変化する混合物中に存在しているがゆえに、大部分が不明のままである。これらの困難を克服するために、特定のサイズ（モノマー数）の構造的特徴を備えたオリゴマーの安定個体群、および純粋な原始原線維性（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ）および原線維性の種を準備するために、技術が開発されてきた。これはユニークにも、シナプスと神経突起の完全性およびニューロンの機能に対する非原線維性Ａβ１−４２集合の影響を判定し、かつ脳からそのような集合を排除するＭｏ／ＭΦの能力を探求することを可能にする。いかなる特定の理論にも縛られることなく、ＡＤ＋マウスにおけるデータは、大脳のＡβ１−４２の蓄積にシナプスの減少と認知力低下が伴うことを示唆する。ＧＡまたは移植されたＭｏは、保持された認知に関係するシナプシスの保存をもたらした。この試験はさらに、構造上安定して画定されたｆ／ｏＡβ１−４２に反応して、ＭΦとニューロンの初代共培養中のＧＡ処置されたＭΦによる、シナプスの密度および神経突起の長さの保存を示す。発明者は、ＧＡ処置されたＭΦの免疫調節成分オステオポンチン（ＯＰＮ）のアップレギュレーションが、ｆＡβ１−４２食作用の増加に関係することを特定した；ＯＰＮ阻害は、食作用を損なうと思われる。いかなる特定の理論にも縛られることを望むものではないが、我々は、シナプシスおよびニューロンの作用の保存が、病原性のＡβ種を排除し、有害な炎症を調整し、および神経栄養因子を分泌する脳浸潤Ｍｏ／ＭΦ（ＧＡまたは移植されたＭｏによって誘発）によって増強されると考える。
【０２０４】
本明細書において発明者は、ＡＤに関係する安定して構造的に画定されたＡβ集合に反応した、ＭΦとニューロンの初代共培養におけるＧＡ処置したＭΦによる、シナプスの構造と機能の保存を試験する。いかなる特定の理論にも縛られることを望むものではないが、発明者は、ＧＡ処置されたＭΦが免疫調節成分ＯＰＮのアップレギュレーションを通じて神経保護表現型を示し、結果として病的なＡβ型を効果的に除去し、かつニューロンの構造と機能の保存を高めると考える。
【０２０５】
シナプス前部、シナプス後部、および神経突起の長さの減少の重要度を、ｏ／ｐｆ／ｆＡβ１−４２集合によって誘発されたニューロンの機能不全と同様に判定した。Ａβ１−４２集合に応じたＧＡ処置ＭΦによるシナプスと神経突起の保護を評価した。発明者は、神経毒性のＡβ１−４２集合に応じたシナプスの減少およびニューロンの機能不全を防ぐＧＡ処置ＭΦのメカニズムを判定し、かつＡβ１−４２集合を吸収分解する際のＭΦの有効性を評価する。発明者は、免疫調節および神経組織栄養の支持等の機能に関連するＭΦ神経保護表現型を、これらの機能に関係する免疫調節成分、ＯＰＮの役割に焦点を置いて判定した。
【０２０６】
発明者はさらに、マウスモデルにおいて、ＧＡまたは移植ＢＭ−ＣＤ１１５＋Ｍｏによって達成される、免疫調節によるシナプスと認知機能の保存を、潜在的可能性のあるＡＤ治療として調査する。いかなる特定の理論にも縛られることを望むものではないが、我々は、ＡＤのマウスモデルにおいて、ＧＡ免疫化または移植されたＭｏが、毒性のＡβ１−４２によって誘発された欠失後に、ＯＰＮを発現し、シナプスの構造を回復させ、認知機能を保存する大脳のＭΦを増加させるだろうと考える。
【０２０７】
ＡＤ＋マウスモデルにおける、疾患に関連する脳領域でのエクスビボシナプス前部および後部のマーカーと、神経突起の長さの欠失を、認知障害の作用として測定した。ＧＡ、または移植されたＷＴ  ｖｓ．ＯＰＮＫＯ  ＣＤ１１５＋−Ｍｏのいずれかを用いた免疫調節後に、シナプスと認知力の保存を評価した。保存されたシナプスに関係する大脳のＭΦ獲得表現型の検査を通じて、ＡＤ＋マウスにおけるシナプスの保存の免疫調節メカニズムを特定した。
【０２０８】
最初に、初代皮質ニューロン（ＣＮ）における、安定しており構造的に画定されたｆＡβ１−４２型とｏＡβ１−４２型によって誘発されたシナプスの毒性を試験した。培養の８日目の間中、ニューロンを１２時間、２５０ｎＭのＡβ集合、または培地のみ（媒介物）でインキュベートした。シナプス前部および後部（それぞれＶＧｌｕＴ１＆ＰＳＤ−９５）の面積と数の大規模な喪失は、両ｆ／ｏＡβ１−４２型によって誘発され、明確に検出された（図１Ａ−Ｃ）。シナプス密度の定量化は、ｆＡβ１−４２に続く共存下のＶＧｌｕＴ１／ＰＳＤ９５＋点数の有意な５０％の減少を示した。さらに我々は、培地のみのＣＮと比較した場合に、ｏＡβ１−４２によって点数が７０％減少したことを検出した（図１Ｄ；ｐ＜０．０００１）。ｆＡβ１−４２とｏＡβ１−４２の間の共存下のシナプス点数の統計的な違いは、ｏＡβ１−４２によって増加したシナプス毒性（ｓｙｎａｐｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を示唆する（図１Ｄ）。次にＡβ誘発神経突起退縮を評価した。ＣＮを抗Ｔｕｊ１で免疫標識し、およびニューロン当たりの全神経突起の長さを正確に定量化した（図２Ａ−Ｄ）。対照のＣＮ群と比較して、ｆ／ｏＡβ１−４２の一晩のインキュベーションは、大規模な神経突起退縮をもたらした（図２Ｂ対２Ａ）。次に、未処置およびＧＡ処置されたＢＭ由来ＭΦ（ＣＤ６８＋細胞）が、シナプスと神経突起の欠損を防ぐことができるか否かを試験した。初代のＣＮおよびＭΦを４８時間共培養し、そして共培養の最後の１２時間の間にＡβ１−４２型を導入した。データは、ＧＡ処置されたＭΦがＣＮ中のＴｕｊ１＋神経突起を、ｆ／ｏＡβ１−４２によって誘発される欠失から広範に保護したことを示す（図２Ｄ）。共存下ＶＧｌｕＴ１／ＰＳＤ９５＋点シナプス数の定量分析は、ｆＡβ１−４２またはｏＡβ１−４２への一晩の暴露後に、それぞれ３２％と６５％の減少を確認した（図２Ｅ）。興味深いことに、ＧＡ処置されたＭΦとＭΦ単独の両方が、ｆＡβ１−４２によって誘発されるシナプスの減少を完全に防いだ一方で、ＧＡ処置されたＭΦは、ｏＡβ１−４２によって誘発されるシナプスの欠損を防ぐのに有意により効果的であった（図２Ｅ；ｐ＜０．０００１）。シナプス変性症に対するＡβ蓄積のインビボ効果と、ＧＡ免疫化または移植されたＢＭ−ＣＤ１１５＋−Ｍｏによるシナプス回復の可能性を評価した。これらの免疫調節の介入を受けた、１３ヶ月齢のＡＤ＋（ＡＤｔｇ）マウスの冠状の脳切片のシナプス前部と後部の変質を定量した（図３Ａ−Ｄ）。海馬と嗅内皮質内の、１９のあらかじめ定められた領域から得られた高倍率ｚスタック画像を、それぞれのブレグマ領域で取り込んだ（図３Ａ−Ｄ）。データは、対応するＷＴ同腹子と比較して、ＡＤ＋マウス（ＰＢＳ対照）の脳における、シナプス前部と後部の密度の有意な欠失を示す（図３Ｅ）。顕著にも、免疫調節治療は、シナプスの形成を有意に回復させた（図３Ｅ；ｐ＜０．００１）。１３ヶ月齢のＡＤ＋マウスの脳から得たインビトロのデータは、Ａβ１−４２に誘発されたシナプス前部と後部の領域の有意な欠失を示唆し、およびＧＡ免疫化または移植されたＭｏを受けたマウスにおけるシナプスの著しい回復を示唆する（図３Ｅ）。これらの結���は、Ａβ１−４２集合によって誘発されるシナプスの欠失が、ニューロンの機能不全をもたらすか否か、およびＧＡ処置されたＭΦによるシナプスの回復がニューロンの機能保存に影響を与えるか否かという問題を提起する。
【０２０９】
ＭΦがシナプス保護効果を発揮し得る可能性のあるメカニズムを解明するために、結合、吸収、およびエンドソームへの転写を介してＡβ１−４２集合を除去するＭΦの能力を評価した（図４）。１５分間のＭΦの取込み後の、初期のエンドソーム（ＥＥＡ１＋ベシクル）内に共存したＡβの定量化は、ｆＡβ１−４２対ｏＡβ１−４２の有意により高いエンドソームの存在を示し（図４Ｄ）、おそらくはＭΦのｆＡβ１−４２除去メカニズムの増強を示している。ＧＡ処置後のＭΦ中の免疫調節成分ＯＰＮのアップレギュレーションをさらに特定した（図５Ａ−Ｄ）。ＧＡ処置されたＭΦ中のＯＰＮの２倍の増加は、ｆＡβ１−４２取込みの２．８倍の増加に関係していた（図５Ｄ）。ＧＡ免疫化または移植されたＭｏを受けたＡＤ＋マウスからの脳組織の検査はさらに、特にＡβプラークにおける、かつＭΦによって発現された、ＯＰＮのアップレギュレーションを明らかにした。大脳のＯＰＮ発現は６Ｅ１０＋プラーク面積と逆相関し、および浸潤性Ｍｏ／ＭΦと明確に相関した；コレログラムは、ＯＰＮレベルとＡβプラーク量の関係（Ｒ２＝−０．５８；ｐ＝０．０２）、およびＯＰＮと浸潤性Ｍｏ／ＭΦ（Ｒ２＝０．５４；ｐ＝０．０４）の関係を実証する（図６Ｂ）。ｓｉＲＮＡを介したＯＰＮノックダウンは、ＧＡ処置されたＭΦによるｆＡβ１−４２食作用の減少をもたらし、ＧＡ増強Ａβ食作用を媒介する際のＯＰＮに関するメカニズムを示唆する（図７Ａ−Ｃ）。
【０２１０】
いかなる特定の理論にも縛られることを望むものではないが、我々は、ＧＡで処置されたマクロファージ（ＭΦ）が、免疫調節成分ＯＰＮのＧＡ発現を増加させ、結果として病的なＡβ型および免疫プロフィールの除去を増強し、ニューロンの構造と機能の保存を支持すると信じる。インビトロ実験計画の概観については表１を参照されたい。
【０２１１】
【表１】
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【０２１２】
先に報告されたように、Ｐ１ニューロンを調製する。手短に言えば、皮質ニューロン（ＣＮ）を生後１日の新生児マウスから得て分離し、再懸濁し、および５×１０４／ｍｌ細胞で２４ウェルの培養プレートで平板培養する。ＢＭ−ＭΦを、本明細書に記載されるようにして得る。つまり、単核の濃縮されたＢＭ由来細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離し、および７日間ＭΦへと分化させる。ニューロンとＭΦの共培養を、４８時間、初代ＣＮ培養（１：１の比率）へと初代ＭΦを懸濁することによって調製する。ＣＮのみ、またはＣＮとＭΦの共培養を、予め形成された（精製し安定させた）ｆ−、ｐｆ−またはｏＡβ１−４２で一晩インキュベートする（図８）。ＧＡの効果とＯＰＮ阻害を評価するために、共培養前に２４時間、ＯＰＮ  ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ−ｓｉＲＮＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓｔｅａｌｔｈ  Ｓｅｌｅｃｔ）の有無ごとに、ＭΦをＧＡ（３０ｍｇ／ｍｌ、ＴＥＶＡ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）で処置する。実験を、ＣＮの播種の９日間後に実行した。シナプスの密度と神経突起の長さを定量化するために培養物を処置する。初代培養を、シナプス前部ＶＧｌｕＴ１（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、１：６，０００）、シナプス後部ＰＳＤ９５（Ａｂｃａｍ、１：６００）（シナプシス用）またはＴｕｊ１（神経突起用）で同一に染色する。負の対照を同様に処置し、一次抗体または二次抗体のいずれかを省いた。マイクロ写真を、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡｐｏＴｏｍｅを装備したＡｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｚ１蛍光顕微鏡を使用して撮影する。シナプスの点数およびシナプスの免疫反応面積を、Ｐｕｎｃｔａ  Ａｎａｌｙｚｅｒで定量する。合計の神経突起長さを、ＮｅｕｒｉｔｅＴｒａｃｅｒを使用して測定する。各条件につき、少なくとも３つのカバーガラス、３６の画像および１５０のニューロンを分析した。平均点数、画像またはニューロンあたりのシナプス面積を計算する。微小電極列（ＥＭＡ）を使用したＣＮの自発的ネットワーク作用を、Ｃｌｉｖｅ  Ｓｖｅｎｄｓｅｎ博士のラボで行う。発表されているようにＭＥＡ記録プロトコルを実行する。手短に言えば、培養の９日目に、ベースラインを得るためにＣＮの自発的なネットワーク作用を６０分間記録する。次に、ｆ／ｐｆ／ｏＡβ１−４２でインキュベートされ、かつ、ＧＡ処置されたＭΦｗ／またはｗ／ｏ  ＯＰＮ  ｓｉＲＮＡまたはＭΦのみで共培養されたニューロンを、Ａｘｉｏｎ  Ｍａｅｓｔｒｏ  ＭＥＡデバイスを使用して記録する。次に、全活動電位発火率および平均ニューロン発火頻度を判定し、かつプロットする。ＭΦによる細胞内のＡβ１−４２取込みを、本明細書に記載されるように、細胞可溶化物中でＡβ１−４０／Ａβ１−４２レベルのＥＬＩＳＡによって、およびＩＣＣによって定量的に評価する。インビトロ試験の概要については、図９Ａを参照されたい。
【０２１３】
いかなる特定の理論にも縛られることを望むものではないが、我々は、ＧＡ免疫化またはＢＭ−ＣＤ１１５＋−Ｍｏを用いた血液強化が、プラーク病変においてＯＰＮを発現するＭΦの大脳動員を増加させることで、およびＡβ１−４２の除去を増強することで、ＡＤ＋マウスにおいてシナプス構造と認知機能を回復させると信じる。インビボ実験計画の概観については表２を参照されたい。
【０２１４】
【表２】
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【０２１５】
ＡＤ＋、ＯＰＮノックアウト（ＯＰＮＫＯ）およびＧＦＰ系統マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）を使用する実験はすべて、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ＩＡＣＵＣの規則に従って行なわれる。マウス組織を、本明細書に記載されるように処置する。脳切片を、ＶＧｌｕＴ１およびＰＳＤ９５（対合用）、またはＴｕｊ１（神経突起用）で同一に染色し、および上記のように画像を捕らえる。海馬領域を覆うために、１００倍の対物鏡の下の１５の同一の長方形領域（９０μｍ×７０μｍ）を、それぞれＤＧのＭＬ、およびＣＡ１のＳＬＭとＳＲとＳＯ内で正確に選択する。加えて、４つの同一の領域を、嗅内皮質層２と３内で注意深く選択する。０．２５μｍ間隔での単一の光切片画像、および３．７５μｍのＺｅｉｓｓ  ＡｐｏＴｏｍｍ高解像度スキャンを行う（図３Ａ−Ｄ）。シナプスの点数／面積および全神経突起長さを、Ｐｕｎｃｔａ  ＡｎａｌｙｚｅｒとＮｅｕｒｉｔｅＴｒａｃｅｒで定量する。平均点数、画像またはニューロンあたりのシナプス面積を、各条件ごとに計算する。我々が前述したように、バーンズ迷路行動試験を行う。インビボ試験の概要については、図９Ｂを参照されたい。作用機序を調査するために、我々は前記のように、Ａβ１−４２集合除去の有効性を評価し、かつ免疫調節神経組織栄養の支持などの機能に関係するＭΦの神経保護表現型を判定することを提案する。我々は特に、これらの機能における免疫調節成分ＯＰＮの役割を調査する。インビトロおよびインビボのメカニズムの両方に関する、表３の実験計画法の概観を参照されたい。スカベンジャー受容体（Ｓｃａｒａ−１、ＣＤ３６、ＣＤ１６３）のレベルおよび分解酵素（ＭＭＰ−９、ＡＣＥ、ネプリライシン）をさらに、メーカーのプロトコル（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）に従い、サンドイッチＥＬＩＳＡによって判定する。炎症促進性および抗炎症性のサイトカイン、ＯＰＮ、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ１、ｉＮＯＳおよびＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）の発現を、ＥＬＩＳＡおよび／またはＩＨＣによって検査する。ＴＧＦβ１およびＯＰＮに加えて、ＩＧＦ−１による神経組織栄養の支持の測定をさらに行う。ＧＦＰ標識、Ｉｂａ−１、ＣＤ１１ｂ、Ｌｙ６Ｃおよび／またはＣＤ４５を含むマーカーを使用して、Ｍｏ／ＭΦ集団の大脳浸潤をＦＡＣＳとＩＨＣによって判定する。
【０２１６】
【表３】
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【０２１７】
＜実施例３＞
＜ＯＰＮ発現パターンはＡＤ関連の脳領域にあるアミロイドプラークに関係している＞
ＡＤｔｇ、年齢と性別の一致した非Ｔｇ、野生型（ＷＴ）のマウスの様々な脳領域におけるＯＰＮ発現パターン分析した（図１０）。免疫組織化学（ＩＨＣ）は、Ａβプラーク内部またはそれに近接するすべてのＡＤ関連脳領域（海馬、帯状回皮質および嗅内皮質；図１０Ａ）個別のＯＰＮ発現パターンを明らかにした。ＯＰＮ免疫標識は、対照のＷＴマウスでは大部分が検出不可能であった。ＯＰＮ発現の類似するパターンを、ペルオキシダーゼ標識を用いてＡＤｔｇマウスの脳で観察した（図１０Ｃ）。典型的にＡＤに関係しない脳領域（すなわち線条体）では、ＡＤｔｇマウスおよびＷＴマウスの両方おいてＯＰＮ免疫染色を主としてニューロンに制限した。いかなる特定の理論にも縛られることなく、これらの結果は、ＡＤｔｇマウスのＡＤ関連脳領域では、ＯＰＮが、Ａβプラークに関係する骨髄性細胞によって選択的に発現されたことを実証する。ＧＡ免疫化による大脳のＯＰＮ発現のアップレギュレーションは、Ａβプラーク量と逆相関している。
【０２１８】
脳におけるＯＰＮ発現に対するＧＡ免疫化の効果を試験するために、症状のあるＡＤｔｇマウス３つの処置群：ＧＡ免疫化（２ヶ月にわたり週一回の皮下注射）、ＧＡ＋ＭｏＢＭ併用治療（２ヶ月にわたり、週一回のＧＡの皮下注射、かつ月１回のＭｏＢＭサブセットの静脈内注射）、およびＰＢＳ対照群（２ヶ月にわたり月１回のＰＢＳの静脈内注射）を分析した。海馬（ＨＣ）と帯状模様のある皮質領域を包含する冠状の脳切片の代表的な顕微鏡写真図は、ＰＢＳ対照と比較して、ＧＡ免疫化およびＧＡ＋ＭｏＢＭ免疫化マウスにおける６Ｅ１０＋Ａβプラーク量の減少と共に、ＯＰＮ免疫反応性の増加を明らかにした（図１０Ａ）。類似する結果が嗅内皮質で観察された（ＥＣ；図示せず）。
【０２１９】
定量的免疫組織化学（ＩＨＣ）は、両方のＧＡ免疫化ＡＤｔｇマウス群における有意な増加を確認した（図１１Ｂおよび図１８Ａ）。ＰＢＳ対照と比較すると、ＧＡで処置されたマウスにおけるＯＰＮ発現は１．５倍高く、およびＥＣでは一貫して最も高く、ＨＣでは最低であった。この差異は、ＧＡ＋ＭｏＢＭ群ではさらに大きく、大脳のＯＰＮはＰＢＳ対照の１．７倍であった（図１１Ｂ）。同じ脳切片における６Ｅ１０＋Ａβプラーク量の評価は、ＰＢＳ対照と比較して、ＧＡ免疫化群（ＧＡおよびＧＡ＋ＭｏＢＭ）における大幅な減少を示した（図１１Ｃ）。
【０２２０】
次に、ＯＰＮ発現レベルを、プラーク量の面積に関して測定した。全脳領域における全ＯＰＮ面積とプラーク面積の比率を定量した（図１１Ｄおよび図１９Ｂ）。ＧＡ免疫化群は両方とも、Ａβプラーク面積ごとの全ＯＰＮ発現の有意な増加（それぞれ２．６倍と３．６倍）を示した。個別の皮質と海馬の分析は類似する結果を示した（図１８Ｂ）。Ａβプラーク内のＯＰＮ発現の増加に対するこれらの効果は、ＧＡ＋ＭｏＢＭの併用群に関してより大きかった（図１１Ｄ）。ピアソン検定を使用した相関分析は、ＯＰＮ発現と６Ｅ１０プラーク量（図１１Ｈ）の有意な逆相関を示し、皮質領域ではより強い相関がみられた（図１１Ｉ）。いかなる特定の理論にも縛られることなく、これらの結果は、ＡＤｔｇマウスにおけるＧＡ免疫化が、アミロイドプラーク量の減少を伴う、大脳のＯＰＮ発現のアップレギュレーションをもたらすことを、まとめて示す。ＯＰＮは主として、Ａβ除去に関係する単球由来マクロファージを湿潤させることによって発現される。
【０２２１】
ＡＤｔｇマウスの脳においてＯＰＮ発現細胞を特定するために、２つの異なるアプローチを使用した。湿潤性単球／マクロファージ（Ｍｏ／ＭФ）を小膠細胞と区別するために、混合性のＩｂａ−１およびＣＤ４５マーカーをまず使用した（図１３Ａ）。代表的な蛍光性の顕微鏡写真図は、固有のＩｂａ１＋ＣＤ４５ｉｎｔ−ｌｏｗ小膠細胞と比較して、大脳の浸潤性Ｉｂａ１＋ＣＤ４５ｈｉｇｈ  Ｍｏ／ＭФによるＯＰＮの選択的発現を明らかにした（図１３Ａ）。これらの湿潤性のＯＰＮ発現Ｉｂａ１＋ＣＤ４５ｈｉｇｈ  Ｍｏ／ＭФは、プラーク病変部位に、およびその周辺に蓄積され、かつＡβを直接貪食した（図１３Ａ、矢印）。第２のアプローチでは、ＧＦＰ標識ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１５＋−ＭｏＢＭを、若いドナーＷＴマウスから単離し、および症状のある１０ヶ月齢のＡＤｔｇマウスの尾静脈に注入した（図１３Ｂ）。これらのＧＦＰ＋ＣＤ４５ｈｉｇｈ発現Ｍｏ／ＭФは、ＧＦＰ小膠細胞から判別可能であり、およびＯＰＮで強度に共標識された。高いＯＰＮを発現するＭｏ／ＭФを、プラーク病変部位の周囲の脳実質にある（ｈｏｍｉｎｇ  ｔｏ）ＥＣ内でしばしば濃縮した（図１３Ｂ−１３Ｃ）。ＡＤｔｇマウスの脳における湿潤性Ｍｏ／ＭФ内部のＯＰＮの細胞内局在性をさらに検査した。ＯＰＮは、小胞区画に、および細胞体および細胞突起にわたって発見された（図１３Ｄ−１３Ｅ）。ＯＰＮ発現は、核周囲の区域において特に強かった。
【０２２２】
次に、前述の脳領域にわたる切片当たりのＯＰＮ＋ＣＤ４５ｈｉｇｈ細胞数を定量した。浸潤性ＯＰＮ＋ＣＤ４５ｈｉｇｈ細胞の数における１．５倍および２．２倍の実質的増加は、ＰＢＳ対照と比較して、それぞれＧＡおよびＧＡ＋ＭｏＢＭ群において検出された（図１３Ｆ）。ＡＤｔｇマウスにおいて、相関分析は、ＯＰＮ発現と、Ｉｂａ１＋ＣＤ４５ｈｉｇｈ  Ｍｏ／ＭФによる浸潤との間の有意な線形関係を実証した（図１３Ｇ）。ＯＰＮサイトカインの発現とプラークのまわりに動員された骨髄性細胞との間のより緊密な関連性は、６Ｅ１０の免疫反応性領域ごとのＣＤ４５ｈｉｇｈの比率とＯＰＮ発現によって示された。多因子コレログラム分析は、浸潤性Ｍｏ／ＭФとＯＰＮ発現の直接的関係に加えて、ＯＰＮ発現とＡβプラーク量の逆相関を確認した。いかなる特定の理論にも縛られることなく、これらの結果により、主に大脳のＡβプラーク除去に直接関係する湿潤性Ｍｏ／ＭФにおいて、ＧＡがＡＤｔｇマウスにおいてＯＰＮを発現するＭｏ／ＭФの大脳動員を誘発し、これはＡＤｔｇマウスにおいてＧＡの免疫化によりＯＰＮ発現が増加したことを示すことが示唆される。ＧＡは、ＢＭ由来マクロファージの初代培養においてＯＰＮ発現をアップレギュレートする。
【０２２３】
マクロファージ中のＯＰＮ発現に対するＧＡの影響を調査するために、初代ＭФＢＭを使用して一連のインビトロ試験を行った。ＢＭを若いＷＴドナーマウスから単離し、成熟したマクロファージへと分化させ、ＧＡ（３０μｇ／ｍｌ；ＧＡ−ＭФＢＭ）で一晩前処理し、そしてあらかじめ形成されたＡβ１−４２筋原線維に暴露した。代表的な蛍光画像は、Ａβのない最初の試験では、ＯＰＮは培養中のＭФＢＭによって恒常的に発現され、およびＧＡへの暴露に際し過剰発現されたことを示す（図１４Ｂ）。ＭФＢＭが恒常的にＯＰＮを発現し、かつ細胞外マトリックスへと分泌するため、ブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）前治療での分泌の阻害によるＯＰＮ産生を評価した（図１４Ｃ）。実際に、新しく産生されたＯＰＮは、ＢＦＡによって捕捉され、その細胞内蓄積が増加した。続いて、これらの細胞は細胞粘着の減少を示し、および変質した円形態を示した。ＧＡはさらに、ＢＦＡで前処理されたＭФＢＭにおけるＯＰＮ産生を増加させた（図１４Ｃ）。定量的な免疫細胞化学（ｑＩＣＣ）は、ＧＡＭФＢＭ 対 未処置ＭФＢＭにおいて、ＯＰＮ産生／発現における１．６倍および２．５倍（それぞれＢＦＡ有りと無し）の有意な増加を確認した（図１４Ｄ）。細胞可溶化物の定量的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）分析は、これらの結果を確認し、ＧＡ処置後のＯＰＮレベルの増加を示した（ＢＦＡがある場合は１．４倍、ない場合は２．３倍）（図１４Ｅ）。ＢＦＡの状態は、短い期間（すなわち１−３時間以内）での、ＭФＢＭ中のＯＰＮの実質的な蓄積を示唆した。まとめると、ＥＬＩＳＡ、ｑＩＣＣおよびウェスタンブロットによるＯＰＮの評価（図１４Ｄ−１４Ｇ）は、我々のインビボでの結果を反映し、ＧＡがＭФＢＭ中のＯＰＮ発現と産生を著しく誘発することを示している。ＯＰＮは、ＧＡ活性化マクロファージ中のＡβ食作用を明確に調節する。
【０２２４】
次に、ＧＡ活性化に起因するＯＰＮ発現の増加が、病原性のＡβ集団を食べるマクロファージの能力に関係しているかどうかを検査した。先に記載されたように、ＭФＢＭをＧＡで前処置し、３０分間１００ｎＭの原線維性Ａβ１−４２で刺激した。代表的な高倍率Ｚスタック画像は、ＭФＢＭ中の細胞内ＯＰＮ発現には原線維性Ａβ１−４２の食作用が伴うことを実証した（図１５Ａ）。Ａβの取込みの増強は、ｑＩＣＣ分析によって検出されたように、ＧＡ処置されたＭФＢＭにおけるＯＰＮ発現の増加に関係していた（図１５Ｂ−１５Ｃ）。代表的な画像は、点状のＡβ標識付けに伴って、強い核周囲性かつ均一に分配されたベシクルのシグナルと共に、細胞体内部でかつＣＤ６８＋食細胞のプロセスに沿って、ＯＰＮ免疫反応性の明瞭なパターンを示す。この染色は、ＧＡ処置後に実質的に増加した（図１５Ｇ−１５Ｈ’）。細胞可溶化物の定量的ＥＬＩＳＡ分析は上記のｑＩＣＣ結果を確認し、ＧＡ処置 対 未処置のＭФＢＭにおいて、細胞内ＯＰＮおよびＡβ１−４２の増加を示した（図１５Ｉ−１５Ｊ）。これらの結果は、ＧＡがＯＰＮ発現（２．３倍から２．７倍）とＭФＢＭ中の原線維性Ａβ１−４２取込み（２．５倍から２．８５倍）の両方を高めることを示す。
【０２２５】
従来の研究は、マクロファージ中の細胞内ＯＰＮ欠失が食細胞作用を損なうことを示唆した。ここで、Ａβの特異的な食作用へのＯＰＮの関与を評価するために、ＯＰＮ発現を、ｓｉＲＮＡを使用してノックダウンした（図１５Ｌ−１５Ｎ）。ＭФＢＭ細胞をｓｉＲＮＡＯＰＮまたは対照ｓｉＲＮＡＮｅｇのいずれかでトランスフェクトし、および４８時間後に原線維性Ａβ１−４２を加え、続いて食作用アッセイを行った。代表的な蛍光画像は、ｓｉＲＮＡ−ＯＰＮ阻害後の、ＣＤ６８＋ＭФＢＭによる原線維性Ａβ１−４２の取込みの大幅な減少を明らかにした（図１５Ｌ）。定量的ＩＣＣ分析は、所見を確認し、および８２−８５％のＯＰＮ阻害が、Ａβ１−４２原線維の細胞内取込みを５６−６３％減少させることに関与したことを示した（図１５Ｍ−１５Ｎ）。これらの結果は、原線維性Ａβ１−４２の食作用がＯＰＮの欠如下において損なわれたことを実証する（図１５Ｎ）。負の対照のｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｉＲＮＡは、ＯＰＮ発現とＡβ食作用に影響を与えなかった。さらに、ＯＰＮが阻害された時、Ａβを取り込むＭФＢＭの能力にＧＡはほとんどあるいはまったく影響を与えなかった。いかなる特定の理論にも縛られることなく、データは総体として、マクロファージの原線維性Ａβ１−４２を食べる能力、ＧＡを媒介としたＯＰＮ誘発によって機能を獲得し、およびＯＰＮ阻害に際して機能を失う活性、をＯＰＮが媒介することを示唆する。ＧＡはＯＰＮとその活性断片の誘発によりマクロファージ極性化を促進する。
【０２２６】
マクロファージは、その微小環境に応じて明瞭な表現型と生物学的機能を獲得することができる。過去の研究は、ＯＰＮがマクロファージを抗炎症性Ｍ２表現型へと切り替えるのを促すと報告した。細長い細胞の形に関係している、抗炎症性表現型に対する、マクロファージ極性化におけるＯＰＮの有望な役割を探究した。様々な処置条件下での細胞長さを分析し、増幅されたＯＰＮ発現でのＧＡ処置を受けた細胞では、長さが１．３倍に増加することを発見した。対照的に、ｓｉＲＮＡＯＰＮノックダウンはＧＡの効果を逆転させ、さらに細胞長さを〜３０−４０％まで減少させた（図１６Ａ−１６Ｂ）。ＯＰＮの欠如下では、ＧＡはマクロファージ細胞の伸長に影響せず（図１６Ｂ）、ｓｉＲＮＡＯＰＮノックダウンに続くＡβ食作用についての我々の結果に類似する。
【０２２７】
次に、種々の処置群における、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現、炎症誘発性のＭ１マクロファージ表現型の特徴を評価した（図１６Ｃ−１６Ｄ）。三周期の抗生ミノサイクリンを、ＯＰＮ発現を抑制するために使用した。ミノサイクリンは、炎症性反応を調整し、かつマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）−９活性およびタンパク分解性ＯＰＮフラグメントの産生を減らすことが示された。ＭФＢＭに、ＧＡによるＯＰＮ活性化、またはミノサイクリンによるＯＰＮ阻害のいずれかを行い、次に３０分間原線維性Ａβに暴露した。蛍光性の顕微鏡写真図は、ＧＡがｉＮＯＳ発現を減じ、および原線維性Ａβ１−４２食作用を増強し、他方でミノサイクリンは逆の効果を有したことを実証した。定量的ＩＣＣアッセイは、ミノサイクリンで処置されたマクロファージによるｉＮＯＳ発現の有意な〜１．３倍の増加、およびＡβ１−４２食作用の４８％の実質的減少を確認した。最も重要なことに、ＧＡ処置はｉＮＯＳ産生を２８％まで減じ、かつＡβ食作用を２．５倍に増加させた（図１６Ｄ−１６Ｅ）。これらの試験は、治癒を支持する細長い細胞形態、ｉＮＯＳ産生の減少、およびＡβ１−４２食作用の増加をもたらすＯＰＮ発現をＧＡが誘発したことを実証した。いかなる特定の理論にも縛られることなく、これらの変化は、ＡＤモデルにおいて神経保護に関係している、抗炎症性の高度な食作用のマクロファージ表現型への切り替えを支持し得る。
【０２２８】
次に、ＭＭＰ−９発現とＯＰＮタンパク質分解フラグメントを分析した。発明者の先の結果と矛盾することなく、ＧＡ処置は、マクロファージにおいてＭＭＰ−９発現を２．７倍、有意に増加させた（図１６Ｆ−１６Ｇ）。ＯＰＮはＭＭＰ（ＭＭＰ−９を含む）のための既知の基質である。マクロファージ中のＯＰＮ発現の詳細な分析を、３２ｋＤ型を含む、完全長のＯＰＮおよびそのＭＭＰ切断フラグメントを認識するポリクローナル抗体を使用して行なった。ウェスタンブロット解析および続くバンド密度の定量化は、ＭＭＰタンパク分解から得られるフラグメントを含むすべてのＯＰＮ型が、ＭＭＰ−９産生の増加と共に、ＧＡ処置によって増加することを明らかにした（図１６Ｉ−１６Ｊ）。驚くべきことに、ＭＭＰ産生３２ｋＤのＣ末端含有ペプチドは、ＧＡ処置後に１２倍に増加した。このフラグメントの基礎レベルは、未処置のマクロファージにおいて非常に低かったが、ＧＡの活性化後には非常に突出するようになった（図１６Ｉ−１６Ｊ）。
【０２２９】
最後に、ＡＤｔｇマウス脳におけるＭＭＰ−９とＯＰＮ発現の分析は、大脳のＯＰＮの免疫反応性領域とＭＭＰ−９タンパク質との間の正相関を示した（図１９Ｃ）。大脳の浸潤性ＣＤ４５ｈｉマクロファージにおけるＯＰＮ発現は、ＭＭＰ−９レベルとより強い相関を示した（図１９Ｄ）。いかなる特定の理論にも縛られることなく、組み合わせたデータは、そのＭＭＰ切断活性化フラグメントを含むＯＰＮ発現をＧＡが誘発し、および治癒促進性、抗炎症性、高度な食作用の表現型へと、マクロファージの極性化を媒介したことを示唆し、神経保護におけるその新規な役割を示唆している。
【０２３０】
この試験では、ＡＤにおけるＯＰＮに関する新規な免疫調節の役割を、インビボとインビトロの両方のモデルを使用して特定した。さらに、ＦＤＡに認可された薬物、ＧＡは、マクロファージ中のその発現をアップレギュレートする効果的な手段であった。第１の主要な所見は、ＡＤｔｇマウス脳におけるＯＰＮパターンが、ＡＤに関係する領域、海馬および皮質で検出されたことであった。Ａβ病変部位を囲む炎症細胞にＯＰＮが豊富に発現された一方で、非罹患脳領域の多くはニューロン中にこのサイトカインを示した。炎症細胞の中でも、ＯＰＮは主として、Ｉｂａ１＋ＣＤ４５ｈｉｇｈまたはＧＦＰ標識単球由来マクロファージを湿潤させることによって発現した。ＡＤにおけるこのサイトカインに関する有望な免疫調節の役割は、ＯＰＮが単球浸潤およびＡβプラーク除去と密接に関連するという発見から明らかになる。Ａβ取込みに直接関与する湿潤性Ｍｏ／ＭФに豊富な脳領域（すなわち嗅内皮質）におけるＯＰＮ発現の増加は、ＯＰＮがＡβのマクロファージを媒介とした除去に寄与するという概念をさらに支持する。
【０２３１】
ＯＰＮ発現の増加は、外傷性脳損傷後の反応的な小膠細胞に報告されたが、ここでＡＤｔｇマウス脳におけるＯＰＮ発現がマクロファージに選択的に生じたことが認められる。この所見は、末梢のマクロファージが固有の小膠細胞よりもはるかに効率的にＡβプラークを食べることを実証する研究と矛盾しない。様々な表面インテグリンおよびスカベンジャー受容体とのＯＰＮの既知の相互作用はさらに、これらの炎症細胞の食細胞作用に対するその直接効果を支持する。
【０２３２】
静脈内の単球濃縮と併用した場合、ＧＡ免疫化に続く大脳のＯＰＮの著しいアップレギュレーションはより大きかったことをさらに留意されたい。これらの結果は、同じ併用免疫調節アプローチによって相乗的にもたらされた、発明者が先に報告した脳への単球動員の増加パターンに類似した。ＯＰＮがマクロファージによって発現されたインテグリン結合タンパク質であるとすれば、これらの発見はオプソニン作用および炎症性部位への免疫細胞の動員におけるその作用を説明することができるだろう。したがって、いかなる特定の理論にも縛られることなく、アミロイドプラークへの末梢食細胞の動員をＧＡが誘発する場合、この免疫調節現象はＯＰＮによって媒介されると結論付けられ得る。
【０２３３】
さらに、本試験は、ＡＤｔｇマウスの脳で観察されたものに類似する方法で、ＧＡがＢＭ由来マクロファージ中のＯＰＮ発現を実質的に誘発することを示す。発明者は、これらのＧＡ刺激された初代培養によって、ＯＰＮの増加とその後のあらかじめ形成された原線維性Ａβ１−４２の細胞内取込みを立証する一貫した証拠を明示する。ＯＰＮ発現（ｓｉＲＮＡまたはミノサイクリン）を消極的に調節するシステムを利用することによって、または積極的にそれ（ＧＡ）を誘発することによって、マクロファージを媒介としたＡβ食作用におけるＯＰＮの重大な役割が実証された。これらの結果は、ＯＰＮの他の食細胞作用への関与を記載する文献と共に、原線維性Ａβ１−４２食作用が直接ＯＰＮ発現に依存することを明らかにする。
【０２３４】
ＯＰＮの種々の機能は、多様な細胞相互作用を可能にする、ＭＭＰによる切断などのその複雑なタンパク分解処理によって達成され得る。具体的には、ＭＭＰ−９は、機能性のより神経保護的なＯＰＮ型の産生に関係している。データは、ＧＡがＭＭＰ−９発現を誘発しただけでなく、完全長のＯＰＮおよびそのＭＭＰ切断フラグメントの豊富量を有意に増加させたことを示す。特に、ＧＡ活性化マクロファージ培養物は、３２ｋＤ  ＯＰＮフラグメント、神経保護に関係するＯＰＮの産生物のレベルの１２倍という大きな増加を示す。ＡＤｔｇマウス脳中の湿潤性Ｍｏ／ＭФの検査はさらに、ＭＭＰ−９とＯＰＮの十分な相関およびＧＡ免疫化に続く発現の増加によって証明された、ＭＭＰ−９とＯＰＮの関係に関するさらなる支持を提供した。これらの発見は先の報告に合致し、ＯＰＮの機能性形態の産生におけるＭＭＰ−９の役割を示している。将来の研究は、各ＯＰＮフラグメントが、特定の理論に縛られることなく、ＡＤの文脈においてどのようにマクロファージ表現型に影響を与えるかを確認するべきであり、治療用のマクロファージ表現型のＧＡ誘発が、これらのＭＭＰ切断神経保護フラグメントを増加させることによって媒介されたと仮定することができる。
【０２３５】
一般的には抗炎症性サイトカインと見なされるが、最近の研究は、ＯＰＮが脳における修復・促進プロセスに寄与し得ることを示している。本試験は予想外に、ＯＰＮ発現に依存する、高い食作用の（原線維性Ａβ１−４２の取込みの増強）、抗炎症性の（ｉＮＯＳの減少とＭＭＰ−９の増加）、治癒促進性の（細長い）表現型に、ＧＡがマクロファージを分極化することを実証した。ＯＰＮ阻害に際して、この表現型の転換は逆転された。いかなる特定の理論にも縛られることなく、データは総体として、ＡＤモデルにおけるマクロファージ表現型およびＡβ除去の中心的な免疫調節者としてのＯＰＮに関する新規な役割を実証する。ＧＡによるマクロファージの極性化はＯＰＮによって特異的に媒介され、ＡＤ関連の病理に抵抗し、かつ組織修復を促進する際の、ＯＰＮの有望な神経保護作用を示唆している。
【０２３６】
本発明の様々な実施形態が、上記の発明を実施するための形態に述べられている。これらの記載が直接上記の実施形態を記載する一方で、当業者が本明細書に示され記載された特定の実施形態への修正および／または変形を考えてもよいことが理解される。本記載の範囲内に属するそのようないかなる修正または変形も、同様に本明細書に含まれることが意図される。具体的に言及されない限り、発明者は、明細書および特許請求の範囲に含まれる単語と句が、当業者にとって通常の慣れ親しんだ意味を提供することを意図している。
【０２３７】
本出願時において出願人に既知の本発明の様々な実施形態の先の記述が提示され、および例示と記述が意図される。本記載は、徹底されたものであることも、開示される形態のみに本発明が限定されることも意図しておらず、多くの修正と変形が上記の教示に照らして可能である。記載された実施形態は、本発明とその実用化の原理を説明し、かつ他の当業者が本発明を様々な実施形態で使用し、および熟慮された特定の使用に適合するように様々な修正を加えて使用することを可能にするためのものである。したがって、本発明の実施のために開示された特定の実施形態に本発明が限定されることを意図していない。
【０２３８】
本発明の特定の実施形態が示され記載されたが、本明細書の技術に基づいて、本発明およびそのより広範な態様から逸脱することなく変更と修正が行われ得ること、したがって添付の特許請求の範囲は、そのようなすべての変更と修正が本発明の真の精神および範囲内にあるようなその範囲を包含することが、当業者にとって明白であろう。一般に、本明細書で使用される用語が概して「開かれた」用語であるように意図されていることを、当業者は理解するだろう（例えば、用語「含んでいる」は「限定されないが含んでいる」と解釈され、用語「有する」は「少なくとも有する」と解釈され、用語「含む」は「限定されないが含む」と解釈されるべきである、等々）。
【０２３９】
本明細書で使用されるように、用語「含んでいる」または「含む」は、ある実施形態にとって有用であり、さらに有用であるか否かに関わらず非特定の実施形態を含んでもよい、組成物、方法、およびそれぞれの構成要素を指して使用される。一般に、本明細書で使用される用語が概して「開かれた」用語であることを意図されていることを、当業者は理解するだろう（例えば、用語「含んでいる」は「限定されないが含んでいる」と解釈され、用語「有する」は「少なくとも有する」と解釈され、用語「含む」は「限定されないが含む」と解釈されるべきである、等々）。無制限の用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または「有している（ｈａｖｉｎｇ）」等の用語と同義語であり、本発明を記載し請求するために本明細書で使用されるが、本発明またはその実施形態は代替的に、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」等の代替的な用語を使用して記載されてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１１Ｊ】
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【図１１Ｋ】
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【図１１Ｌ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｉ】
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【図１４Ｊ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【図１５Ｉ】
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【図１５Ｊ】
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【図１５Ｋ】
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【図１５Ｌ】
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【図１５Ｍ】
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【図１５Ｎ】
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【図１５Ｏ】
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【図１５Ｐ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１６Ｈ】
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【図１６Ｉ】
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【図１６Ｊ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図１９Ｈ】
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【図１９Ｉ】
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【図１９Ｊ】
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【図１９Ｋ】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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