(57)【要約】本発明は、一般に癌および中枢神経系における疾患の治療における改良に向けられる。新規な薬物送達系、それを生成する方法および医学的使用が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガス充填マイクロバブル、前記ガス充填マイクロバブルと結び付いた複数のナノ粒子、および少なくとも１つの前記ナノ粒子と結び付いた少なくとも１種の治療薬を含む、療法において使用するための薬物送達系であって、全身性で投与され、音場が標的部位への前記ナノ粒子および／または前記少なくとも１種の治療薬の送達を媒介するために放出部位で生成される薬物送達系。
【請求項２】
前記ナノ粒子は、前記ガス充填マイクロバブルに表面付着している、請求項１に記載の薬物送達系。
【請求項３】
前記少なくとも１種の治療薬は、前記ナノ粒子内に負荷されている、請求項１〜２のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項４】
少なくとも１つの遊離ナノ粒子、および前記少なくとも１つの遊離ナノ粒子と結び付いている少なくとも１種の治療薬をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項５】
前記ナノ粒子はポリマーである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項６】
少なくとも１つの前記ナノ粒子は、ポリ（アルキルシアノアクリレート）（ＰＡＣＡ）ナノ粒子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項７】
前記ガス充填マイクロバブルと結び付いている前記ナノ粒子は、前記マイクロバブルを安定化させている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項８】
前記ナノ粒子は、少なくとも１種の標的化剤をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項９】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項１０】
前記ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でさらにコーティングされている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項１１】
ナノ粒子と結び付いている前記ガス充填マイクロバブルの平均径は、０．５〜３０μｍの範囲内にある、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項１２】
前記治療薬は、化学療法薬もしくは化学増強剤である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項１３】
前記ガス充填マイクロバブルには、空気、パーフルオロカーボン、Ｎ２、Ｏ２、ＣＯ２からなる群から選択されるガスが充填されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項１４】
前記音場は、例えば焦点式超音波などの超音波によって生成される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項１５】
前記マイクロバブルは、それへの焦点式超音波の適用後に破壊され得る、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の療法において使用するための薬物送達系を調製するための方法であって、
ａ．  前記治療薬が負荷される前記ナノ粒子を合成する工程、
ｂ．  界面活性物質を含む溶液にナノ粒子を加える工程、
ｃ．  ガス充填バブルを得るために溶液とガスとを混合する工程を含む方法。
【請求項１７】
前記マイクロバブルは、気液界面中のナノ粒子の自己集合によって安定化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
所望のサイズのマイクロバブルを得るために、前記溶液がガスと所望の時間および／または所望の速度で混合される、請求項１６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ｃ）内の前記溶液が２秒間〜６０分間、優先的には１〜１０分間混合される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ｃ）内の前記溶液が５００〜５０，０００ｒｐｍ、優先的には１，０００〜３０，０００ｒｐｍで混合される、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記界面活性物質は、血清、タンパク質もしくは脂質または界面活性剤である、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ガス充填マイクロバブル、前記マイクロバブルと結び付いた複数のナノ粒子、および１つ以上のナノ粒子と結び付いた１種以上の治療薬を含む組成物であって、少なくとも１つの遊離ナノ粒子、および前記ナノ粒子と結び付いている１種以上の治療薬をさらに含む組成物。
【請求項２３】
前記マイクロバブルと結び付いている前記複数のナノ粒子は、前記ガス充填マイクロバブルに表面付着している、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記治療薬は、前記ナノ粒子内に負荷されている、請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ナノ粒子は、ポリマーである、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
少なくとも１つの前記ナノ粒子は、ポリ（アルキルシアノアクリレート）（ＰＡＣＡ）ナノ粒子、例えばポリ（エチルブチルシアノアクリレート）（ＰＥＢＣＡ）ナノ粒子である、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ガス充填マイクロバブルと結び付いている前記複数のナノ粒子は、前記マイクロバブルを安定化させている、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ナノ粒子は、少なくとも１種の標的化剤をさらに含む、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２２〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でさらにコーティングされている、請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
複数のナノ粒子と結び付いている前記ガス充填マイクロバブルの平均径は、０．５〜３０μｍの範囲内にある、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記治療薬は、化学療法薬もしくは化学増強剤である、請求項２２〜３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ガス充填マイクロバブルには、空気、パーフルオロカーボン、Ｎ２、Ｏ２、ＣＯ２からなる群から選択されるガスが充填されている、請求項２２〜３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３４】
必要とする患者に請求項１〜１４のいずれか一項に記載の薬物送達系を投与する工程を含む、癌または中枢神経系における疾患を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に癌、癌性腫瘍および中枢神経系における疾患の治療における改良に向けられる。新規な薬物送達系、それを生成する方法および医学的使用が提供される。
【背景技術】
【０００２】
癌は、身体の他の部分に侵襲する、もしくは拡がる可能性を伴う異常な細胞増殖を含む一群の疾患である。この悪性挙動は、第２の場所への侵襲および転移を誘発することが多い。癌は、ほとんどの先進工業国における死亡の主因である。標準治療には、単独でまたは組み合わせて、手術、化学療法、放射線、レーザおよび光線力学療法が含まれる。さらに、特定のタイプの癌については免疫療法やホルモン療法が承認されている。肉眼で見える腫瘍を除去するためには手術による介入が、および残留している肉眼で見える腫瘍を治療するためには腫瘍部位の照射が使用される。化学療法は、手術部位または身体内のどこかのいずれかで任意の残留性もしくは切除不能な疾患を攻撃するために使用される。様々な治療の成功率は、癌のタイプおよび病期に左右される。近年においては改良が進んでいるが、多数のタイプの癌患者の予後は、依然として不良である。
【０００３】
化学療法は、標準化レジメンの一部として１種以上の細胞傷害性新生物治療薬（化学療法薬）を用いる癌の治療であると定義することができる。この用語は、例えばアルキル化剤や代謝拮抗物質などの広範囲のカテゴリーに分類される多種多様な薬物を含んでいる。伝統的な化学療法薬は、大多数の癌細胞の決定的な特性である迅速に分裂する細胞を殺滅することによって作用する。これは、有糸分裂（細胞分裂）もしくはＤＮＡ合成を損傷させることによって達成される。
【０００４】
化学療法は一部の癌（例えば、白血病）にとっては治癒的であるが、一部の癌では依然として効果がなく、他の癌では無用である。
化学療法薬は、薬物および治療対象の癌のタイプに依存して、非経口送達されることが最も多い。伝統的な非経口化学療法を用いた場合、典型的には注射用量の０．００１〜０．０１％しか腫瘍に到達しない。多数の現代の化学療法薬はさらに、残念なことに健常組織への過度の傷害性を有し、転移を防止する能力は限定的である。
【０００５】
近年、腫瘍を標的とする新規な治療を見出すことに大変な努力が重ねられてきた。腫瘍血管構造は一般に、より「漏出性」であるが、腫瘍塊を通しての薬物の通過を妨害し得る多量の間質液や高い膠質浸透圧に苦しめられる。既成の化学療法薬の取り込みは、腫瘍タイプに依存して高度に可変性となる場合があり、そのような取り込みの差は、治療効果の可変性の性質の原因となる場合がある。
【０００６】
抗癌薬のための担体としてのナノ粒子（ＮＰ）は、強化された透過性および保持効果（ＥＰＲ効果）のために腫瘍内で一定の蓄積が観察されるので、そのような標的化癌療法にとっての大きな潜在能力を提供する。それでも、腫瘍内へのＮＰの取り込みは比較的低く、分布は不均一である。したがって、ナノ医学分野は、これまで限定的な影響しか示してこなかった。ナノ医学分野が大きく依拠する指摘されたＥＰＲ効果は、主として動物腫瘍モデルにおいて研究されており、患者からの実験データは限定されている。ＥＰＲ効果は、腫瘍タイプ内および腫瘍タイプ間で大きな不均一性を示し、現在は、ヒトにおけるＥＰＲ効果に関する腫瘍学およびナノ医学共同体内で議論が進行中である。ＥＰＲ効果を強化または迂回する新規な治療概念については、臨床的関心が高まっている。
【０００７】
治療用低周波数超音波（ＵＳ）と組み合わせて使用されるＵＳイメージングのための造影剤として現在臨床使用されているガス充填マイクロバブル（ＭＢ）が、血管透過性を局所的に増加させられることは公知である。これは、ソノポレーションに基づいた傍細胞取り込み、増加したエンドサイトーシスおよび／または経細胞輸送のため、密着帯を通る孔を緩めるまたは作成することによって「人工的ＥＰＲ効果」を誘導することによって達成される。しかし、ＵＳイメージングのために最適化された市販で入手できるＭＢは、外殻が極めて薄く（２〜２０ｎｍ）、脆弱で、血液循環時間が短い（およそ１分間）。そこで、癌性組織および腫瘍への化学療法薬の取り込みを強化するための薬物送達系におけるそれらの適用は限定されている。
【０００８】
したがって、血管透過性を上昇させ、腫瘍内への治療薬の取り込みを強化できる改良された薬物送達系が必要とされる。
近年の研究はさらに、中枢神経系における血液脳関門（ＢＢＢ）を越える標的部位への薬物送達の問題を解決することにも動機付けられてきた。組織間隙への巨大分子の通過を阻害する血管内皮密着帯は、血液脳関門を特徴とする。薬物の脳送達は脳内皮での界面であるＢＢＢによって妨害され、これは、脳を保護してその恒常性を維持し、さらに小分子および実質的に全部の巨大分子薬の９８％の通過も制限する。
【０００９】
ナノ粒子（ＮＰ）は、それらの高い薬物負荷能力、難溶性薬およびペプチドやオリゴヌクレオチドなどの新規な治療薬の組み込み、持続放出や制御放出のための機能化、および治療薬とイメージングとの組み合わせに起因して、薬物送達における数多くの利点を提供できる。固形腫瘍の症例では、ナノ粒子はさらに、強化された透過性および保持効果からも利益を得ることができ、それにより漏出性新血管構造や減少したリンパ排液に起因してＮＰが腫瘍内で保持される。しかしＢＢＢは、ＮＰにとっても同様に厄介な障害物であり、ＮＰの脳送達は、汎用的ＢＢＢ開口技術から利益を得ることができる。そこで、脳への薬物送達におけるナノ粒子の将来性のある使用の探索が必要とされる。
【００１０】
超音波／マイクロバブル媒介性薬物送達の最も基本的な形態は、全身性投与される薬物とマイクロバブル製剤を一緒に投与することである。そのようなアプローチの１つの例は、最近、膵臓癌を治療するために、市販のＵＳ造影剤であるソノビュー（Ｓｏｎｏ  Ｖｕｅ）（ブラッコ・エスピーエー（Ｂｒａｃｃｏ  Ｓｐａ．））がゲムシタビンと併用投与され、その後にＵＳ照射が実施される臨床試験に進んできた［コトポウリス（Ｋｏｔｏｐｏｕｌｉｓｌ）ら著、メディカルフィジックス（Ｍｅｄ  Ｐｈｙｓ．）、２０１３年、第４０巻、第７号］。
【００１１】
併用投与アプローチに加えて、薬物送達のために数種の他のマイクロバブルテクノロジーが探索されてきた［ゲールス（Ｇｅｅｒｓ）ら著、ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ）、２０１２年、第１６４号、ｐ．２４８〜２５５］。例は、薬物負荷マイクロバブル、ナノ液滴からｉｎ  ｓｉｔｕ形成されるマイクロバブルおよび標的化マイクロバブルである。手術不可能な局所性進行性膵臓癌を有する患者１０例がゲムシタビンの注入を受け、その後にＵＳ治療中にソノビュー（ＳｏｎｏＶｕｅ）が静脈内注射された、焦点式超音波（ＦＵＳ）およびＭＢと化学療法とを結び付けた最初の第Ｉ相臨床試験が既に報告されている（ゲオルグ・ディンセフスキー（Ｇｅｏｒｇ  Ｄｉｍｃｅｖｓｋｉ）ら著、２０１６年）。しかし長年にわたって、これら全てのアプローチは、臨床実践への移行を実際上妨害してきた本質的限界を有することが認識されてきた。おそらく、最大の限界は、マイクロバブル系に組み込める薬物の量である。さらに、マイクロバブル系内へ負荷される薬物の付着および／または組み込みのためには、生物活性への潜在的変化を伴う薬物の化学修飾が必要とされ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、新規な多機能薬物送達系が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、療法において、ナノ粒子と結び付いたガス充填マイクロバブルを含む新規な多機能薬物送達系の最初の成功した証明である。本明細書で証明したように、本系は、療法において、例えば癌および中枢神経系における疾患の治療において使用するためのものである。本送達系は、ナノ粒子の送達を促進するために超音波と組み合わせて使用される。標的部位（例えば腫瘍内もしくは脳内の標的部位）でのナノ粒子の強化された取り込みは、例えば焦点式超音波によって生成される音場を適用することによって達成される。
【００１４】
定義
用語「マイクロバブル（ＭＢ）」は、本明細書では、典型的には１〜６μｍ（マイクロメートル）の平均径を含む、０．５〜３０ミクロンの範囲内の直径を備えるマイクロバブルを記載するために使用される。
【００１５】
用語「ナノ粒子（ＮＰ）」は、本明細書では、８００ｎｍ未満の線寸法を備える粒子もしくはカプセルを記載するために使用される。
用語「ナノ粒子と結び付いたマイクロバブル」および「マイクロバブルと結び付いたナノ粒子」は、本明細書では、ナノ粒子がマイクロバブル界面とどのような方法で相互作用するのかを説明するために使用される。これに関連して使用される用語「〜と結び付いた」には、任意のタイプの化学結合、例えば共有結合、非共有結合、水素結合、イオン結合もしくは任意の他の表面−表面相互作用による結び付きが含まれる。
【００１６】
用語「全身性投与」および「全身性で投与される」は、当分野で認識された用語であり、全身が影響を受けるような循環系内への物質の投与経路が含まれる。
用語「非経口投与」および「非経口的に投与された」は、当分野において認識された用語であり、例えば注射などの腸内投与および局所投与以外の投与様式が含まれ、制限なく、静脈内、筋肉内、胸膜腔内、血管内、心膜内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｎｎａｌ）、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、皮膜下、クモ膜下、髄腔内および胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）注射および注入が含まれる。
【００１７】
用語「標的部位」および「疾患部位」は、本明細書では治療対象の組織を記載するために互換的に使用される。これらの用語は、独立して、癌性組織、例えば固形腫瘍などの腫瘍、例えば侵襲性膠芽細胞腫などの神経膠腫または中枢神経系における他の疾患であってよい。
【００１８】
用語「放出部位」は、本明細書では、ナノ粒子の放出、したがって標的部位へのナノ粒子および治療薬の送達を促進するために音場が生成される部位を記載するために使用される。
【００１９】
用語「遊離ナノ粒子」は、マイクロバブルと結び付いていないナノ粒子を説明する。
用語「界面活性剤」は、本明細書では、例えば、マイクロバブルの分散における安定剤として使用される、２種の液体間、またはガスと液体との間の表面張力を低下させる化合物に対して使用される。
【００２０】
「音場」は、焦点式超音波が適用される、したがって曝露もしくはＵＳ治療の領域である領域を説明するために使用される用語である。音場は、「熱的および非熱的メカニズム」を生成する。「非熱的メカニズム」には、キャビテーション（空洞形成）、動揺（ｖｉｂｒａｔｉｏｎ）および振動（ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）が含まれる。
【００２１】
「高強度焦点式超音波（ＨＩＦＵ）」もしくは「焦点式超音波（ＦＵＳ）」は、音響レンズを使用して標的上へ多数の交差する超音波ビームを集中させるための医療技術を意味する。各個別ビームは、エネルギーが有用な熱的もしくは機械的効果を有し得る、ビームが集束する焦点以外はほとんど作用を伴わずに組織を通過する。ＨＩＦＵもしくはＦＵＳは、典型的には、治療の標的化および監視（ＭＲＩを用いる熱的追跡を含む）を可能にするために、超音波もしくはＭＲＩを介してリアルタイムイメージングを用いて実施される。
【００２２】
用語「キャビテーション」は、音場内でのＵＳへの曝露後にＭＢが拡張し圧縮するプロセスを記載するために使用される。超音波は、高圧および低圧サイクルを通して伝播し、圧力差は、低圧期中にはＭＢ拡張を作り出し、高圧期中には圧縮する。圧力振幅および周波数に依存して、この振動は数サイクルにわたって安定であり得るが（安定性キャビテーション）（ｓｔａｂｌｅ  ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）、これは多かれ少なかれＭＢの強烈な崩壊で終了することもあり得る（慣性キャビテーション）（ｉｎｅｒｔｉａｌ  ｃａｖｉｔａｔｉｏｎ）。キャビテーション関連メカニズムには、マイクロストリーミング、衝撃波、フリーラジカル、マイクロジェットおよび歪みが含まれる。超音波によって生成される音響放射力は、血管壁に向かってＭＢを押すこともできる。
【００２３】
用語「ソノポレーション」もしくは「細胞音波処理」は、本明細書では、細胞原形質膜の透過性を改変するための音（典型的には超音波周波数）の使用を記載するために使用される。ソノポレーションは、マイクロバブルの音響キャビテーションを使用し、したがって腫瘍および／または放出部位へのナノ粒子の送達を強化する。本明細書で使用する用語「薬物送達」は、薬物分子、治療薬、診断薬、遺伝子および放射性同位体の送達を含むと理解されている。
【００２４】
本文で使用される用語「医薬組成物」は、その従来的意味を有しており、特に例えば注射などの非経口投与を介する哺乳動物投与のために適合する形態にある。
用語「治療薬」は、治療効果を生成できるあらゆる活性力もしくは活性物質を含むことが意図されている。用語「化学療法薬」および「抗癌薬」は、本明細書を通して互換的に使用される。
【００２５】
用語「診断薬」は、病理学的プロセスの局在化を解明する、正確に指摘する、および規定するために使用される物質を記載するために使用される。
本明細書で使用する用語「薬学的に許容される」は、本明細書では、本系もしくは組成物が、本明細書に記載した治療を疾患の重症度および治療の必要性を考慮に入れて過度に有害な副作用を生じさせずにヒト患者を含む対象に投与するために適合することを意味する。
【００２６】
用語「療法」、「治療する」、「治療する工程」および「治療」は、同意語として、疾患のリスクがある、もしくは疾患に罹患している患者に、少なくとも１つの症状の軽減、阻害、抑制もしくは排除、疾患の進行の遅延、予防、疾患が発病する可能性の遅延もしくは阻害を通しての状態の改善を含む利点を提供する任意の作用を意味するために使用される。
【００２７】
語句「強化された透過性および保持（ＥＰＲ）効果」および「人工的ＥＰＲ効果」は、本明細書では、それにより一定のサイズの分子（典型的にはリポソーム、ナノ粒子および高分子薬）が正常組織内よりはるかに多量に腫瘍組織内で蓄積する傾向がある特性を記載するために使用される。
【００２８】
本明細書で使用する用語「血液脳関門」は、中枢神経系（ＣＮＳ）内の脳細胞外液から循環血を分離する高度に選択的透過性の障壁を意味するために使用される。血液脳関門は、極めて高度の電気抵抗を備える密着帯によって接続されている脳内皮細胞によって形成される。
【００２９】
発明の概要
本発明は、一般に癌および癌性腫瘍、癌性組織および脳および／または中枢神経系における疾患の治療における改良に向けられる。記載した送達系は、固形腫瘍への治療薬の送達を強化することができ、ならびに血液脳関門を選択的および一時的に開くことができることが証明されている。
【００３０】
本発明は、治療薬、ガス充填マイクロバブルおよびこれら２つの組み合わせが充填（もしくは負荷）されたナノ粒子を含む。治療薬の疾患組織への送達を促進する薬物送達系が開示される。本系は、疾患領域全体を含む音場を誘導するために超音波を使用する。音場では、キャビテーションおよび／または振動が発生し得る。キャビテーションもしくは振動は、マイクロバブルの潜在的崩壊を誘発することがある。ガスマイクロバブルの崩壊はナノ粒子を放出する。音場内では、超音波によって生成される放射力がマイクロバブル上に作用し、それらを血管壁に向かって押してそれらを崩壊させ得る。キャビテーションおよび崩壊は、内皮細胞上に剪断応力およびジェット流を生成することができ、剪断応力およびジェット流はどちらも、一緒におよび独立して、ナノ粒子の毛細管壁を越える輸送を改善するであろう。
【００３１】
本発明の第１態様では、少なくとも１つのガス充填マイクロバブル、少なくとも１つのマイクロバブルと結び付いた複数のナノ粒子、および少なくとも１つのナノ粒子と結び付いた少なくとも１種の治療薬を含む、療法において使用するための薬物送達系であって、例えば非経口的などの全身性で投与され、音場が標的部位への前記ナノ粒子および／または少なくとも１種の治療薬の送達を媒介するために放出部位で生成される薬物送達系が開示される。
【００３２】
異なる実施形態では、音場は、例えば焦点式超音波（ＦＵＳ）などの超音波（ＵＳ）または当業者であれば公知である他の手段によって生成することができる。音場は、ガス充填マイクロバブルのキャビテーション、振動および／または崩壊を誘発し、それによりナノ粒子の放出を促進する。キャビテーションは、さらに毛細管壁を越えるナノ粒子の輸送を改善することができる。したがって、この新規な使用は、ＥＰＲ効果を強化する。
【００３３】
また別の実施形態では、送達は、さらに腫瘍組織内の細胞外マトリックス内へのナノ粒子および薬物の輸送の増加をもたらすことができる、放射力および／または加熱によって媒介される。
【００３４】
また別の実施形態では、送達は、マイクロバブルの超音波誘導性活性化および放射力および／または加熱の組み合わせによって媒介される。
また別の実施形態では、マイクロバブルは、それへの焦点式超音波の適用後には破壊可能である。
【００３５】
本発明の第１態様による１つの実施形態では、放出部位は、標的部位と同一である。そのような実施形態の１つの例は、薬物送達系が癌の治療に使用するためのものである場合である。この実施形態では、音場は、前記固形腫瘍もしくは腫瘍性組織であってよい標的部位へのナノ粒子および／または治療薬の送達を媒介するために、固形腫瘍もしくは腫瘍性組織であってよい放出部位で発生させられる。
【００３６】
また別の実施形態では、放出部位は、標的部位と同一ではない。これの１つの例は、薬物送達系が中枢神経系内の疾患の治療に使用するためのものである場合である。この実施形態では、音場は、例えば脳腫瘍（例えば、神経膠芽腫）もしくは脳内の他の疾患などの中枢神経系内の疾患部位であってよい標的部位へのナノ粒子および／または治療薬の送達を媒介するために血液脳関門であってよい放出部位で生成される。標的部位が固形腫瘍である症例では、放出部位は標的部位の一部であってよい。そのような実施形態では、標的部位の一部だけ（例えば、腫瘍）が、その上で標的部位への薬物負荷ＮＰの放出および強化された取り込みが促進される音場を生成する超音波に曝露させられる。したがって、本発明による薬物送達系は、多様式および多機能であり、癌、特に固形腫瘍、および脳腫瘍ならびに中枢神経系の他の疾患を治療するための新規な医学的使用を構成する。
【００３７】
所定の実施形態では、ナノ粒子は、マイクロバブルに表面付着しており、マイクロバブル表面の少なくとも一部を被覆する可能性があり、任意選択的にナノ粒子の少なくとも１つは、高分子の、例えばポリ（アルキルシアノアクリレート）（ＰＡＣＡ）ナノ粒子である。好ましい実施形態では、ＰＡＣＡ粒子は、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）もしくはポリ（エチルブチルシアノアクリレート）である。
【００３８】
本発明の第１態様による１つの実施形態によると、治療薬は、ナノ粒子内に負荷される。任意選択的に、ナノ粒子は、さらに補助安定剤を含有することができる。
また別の実施形態では、第１態様による薬物送達系は、さらに遊離ナノ粒子およびその遊離ナノ粒子と結び付いた１種以上の治療薬をさらに含む。所定の実施形態では、マイクロバブルと結び付いたナノ粒子は、遊離ナノ粒子と同一種類のナノ粒子であり、どちらにも少なくとも１種の治療薬が充填されてよい。
【００３９】
また別の実施形態によると、表面付着ポリマーナノ粒子は、マイクロバブルを安定化させる。ナノ粒子によるマイクロバブルの安定化は、血液中のマイクロバブルの考えられる循環時間に影響を及ぼすであろう。
【００４０】
所定の実施形態では、本発明による薬物送達系は、さらに任意選択的に、少なくとも１種以上の標的化剤、薬学的に許容される担体を含むことができ、ナノ粒子は、さらに例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーでコーティングされてよい。
【００４１】
所定の実施形態では、表面付着ポリマーナノ粒子を含むマイクロバブルの平均径は、０．５〜３０μｍの範囲内にある。
治療薬は、所定の実施形態では、化学療法薬もしくは化学増強剤である。
【００４２】
また別の実施形態によると、マイクロバブルには、パーフルオロカーボン、空気、Ｎ２、Ｏ２、ＣＯ２からなる群から選択されるガスが充填されてよい。
また別の態様では、第１態様による薬物送達系は、組成物である。
【００４３】
第２態様では、本発明には、さらに本発明の第１態様による療法において使用するための薬物送達系を調製するための方法であって：
ａ）治療薬および／または造影剤が負荷されるべきナノ粒子を合成する工程、
ｂ）界面活性物質を含む溶液にナノ粒子を加える工程、
ｃ）ガス充填バブルを得るために溶液とガスとを混合する工程を含む方法が含まれる。
【００４４】
本方法の１つの実施形態によると、マイクロバブルは、気液界面中のナノ粒子の自己集合によって安定化される。
本方法の所定の実施形態では、ｃ）における溶液は、所望のサイズのマイクロバブルを得るために、例えば約２秒間〜６０分間、優先的には１〜１０分間などの所望の時間にわたり、および／または例えばその間にウルトラタラックス（ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ）混合が使用される約５００〜５０，０００ｒｐｍ（毎分回数）、好ましくは１，０００〜３０，０００ｒｐｍなどの所望の速度でガスと混合される。
【００４５】
本方法の所定の実施形態によると、工程ｂ）における溶液中の界面活性物質は、タンパク質もしくは脂質もしくはポリマーもしくは界面活性剤からなる群から選択される。
本発明の第３態様は、ガス充填マイクロバブル、マイクロバブルと結び付いた複数のナノ粒子および１つ以上のナノ粒子と結び付いた１種以上の治療薬を含む組成物であって、遊離ナノ粒子、すなわち、マイクロバブルと結び付いていないナノ粒子をさらに含む組成物である。
【００４６】
この態様の所定の実施形態では、複数のナノ粒子は、ガス充填マイクロバブルに表面付着していてよい。また別の前記複数のナノ粒子は、マイクロバブルの表面の少なくとも一部を被覆していてよい。任意選択的に、複数のナノ粒子および／または遊離ナノ粒子は、ポリマーの、例えばポリ（アルキルシアノアクリレート）（ＰＡＣＡ）ナノ粒子である。１つの好ましい実施形態では、ＰＡＣＡ粒子は、ポリ（エチルブチルシアノアクリレート）ナノ粒子である。
【００４７】
本発明の第３態様による１つの実施形態によると、治療薬は、ナノ粒子内に負荷される。任意選択的に、ナノ粒子は、さらに補助安定剤を含有することができる。
また別の実施形態では、本発明の第３態様による組成物は、療法において使用するためのものである。これらの実施形態によると、組成物は、全身性で、例えば非経口的に投与され、前記ナノ粒子および／または少なくとも１種の治療薬の標的部位への送達を媒介するために音場が放出部位で生成される。本発明の第１態様による本明細書に記載した様々な特徴は、さらに療法において使用するために第３態様による組成物にも該当する。
【００４８】
本発明の最終態様には、癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に本発明の第１態様による薬物送達系を投与する工程を含む方法が含まれる。１つの実施形態では、中枢神経系における疾患を治療する方法であって、それを必要とする患者に本発明の第１態様による薬物送達系を投与する工程を含む方法が開示される。
【００４９】
治療薬は、少なくとも１つのナノ粒子内に負荷されてよく、任意選択的に、本発明の第１態様による系は、さらに診断薬が負荷されたナノ粒子を含むことができる。
本発明の所定の実施形態には、癌または中枢神経系の疾患を治療するための方法であって、患者の治療部位に結び付いたナノ粒子をマイクロバブルに送達する工程を含み、少なくとも１つのナノ粒子には１種の治療薬が充填される方法が含まれる。一部の実施形態では、本方法は、治療部位に超音波エネルギーを適用する工程が含まれる。一部の実施形態では、疾患は癌、例えば乳癌もしくは脳内の癌である。
【００５０】
本発明のまた別の態様は、下記の番号付した実施形態の中に見出される：
１．  ナノ粒子および／または少なくとも１種の治療薬の腫瘍組織への超音波媒介性送達のための、ガス充填マイクロバブル、ガス充填マイクロバブルと結び付いた複数のナノ粒子、および少なくとも１つのナノ粒子と結び付いた少なくとも１種の治療薬を含む薬物送達系。
【００５１】
２．  ナノ粒子がガス充填マイクロバブルに表面付着している、番号付した実施形態１による薬物送達系。
３．  少なくとも１種の治療薬にナノ粒子が負荷されている、番号付した実施形態１〜２のいずれか１つによる薬物送達系。
【００５２】
４．  少なくとも１つの遊離ナノ粒子、および少なくとも１つの遊離ナノ粒子と結び付いている少なくとも１種の治療薬をさらに含む、番号付した実施形態１〜３のいずれか１つによる薬物送達系。
【００５３】
５．  ナノ粒子がポリマーである、番号付した実施形態１〜４のいずれか１つによる薬物送達系。
６．  少なくとも１つのナノ粒子は、ポリ（アルキルシアノアクリレート）（ＰＡＣＡ）ナノ粒子である、番号付した実施形態１〜５のいずれか１つによる薬物送達系。
【００５４】
７．  ガス充填マイクロバブルと結び付いているナノ粒子は、マイクロバブルを安定化させている、番号付した実施形態１〜６のいずれか１つによる薬物送達系。
８．  ナノ粒子が少なくとも１種の標的化剤をさらに含む、番号付した実施形態１〜７による薬物送達系。
【００５５】
９．  薬学的に許容される担体をさらに含む、番号付した実施形態１〜８のいずれか１つによる使用のための薬物送達系。
１０．  ナノ粒子は、さらにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でコーティングされている、番号付した実施形態１〜９のいずれか１つによる薬物送達系。
【００５６】
１１．  ナノ粒子と結び付いているガス充填マイクロバブルの平均径は、０．５〜３０μｍの範囲内にある、番号付した実施形態１〜１０のいずれか１つによる薬物送達系。
１２．  治療薬は、化学療法薬もしくは化学増強剤である、番号付した実施形態１〜１１のいずれか１つによる薬物送達系。
【００５７】
１３．  ガス充填マイクロバブルには、空気、パーフルオロカーボン、Ｎ２、Ｏ２、ＣＯ２からなる群から選択されるガスが充填されている、番号付した実施形態１〜１２のいずれか１つによる薬物送達系。
【００５８】
１４．  超音波媒介性送達は、例えば焦点式超音波などの超音波によって媒介される、番号付した実施形態１〜１３のいずれか１つによる薬物送達系。
１５．  マイクロバブルは、それへの焦点式超音波の適用後に破壊され得る、番号付した実施形態１〜１４のいずれか１つによる薬物送達系。
【００５９】
１６．  番号付した実施形態１〜１５による薬物送達系を調製するための方法であって：
ａ．  治療薬が負荷されるナノ粒子を合成する工程、
ｂ．  界面活性物質を含む溶液にナノ粒子を加える工程、
ｃ．  ガス充填バブルを得るために溶液とガスとを混合する工程を含む方法。
【００６０】
１７．  マイクロバブルは、気液界面中のナノ粒子の自己集合によって安定化されている、番号付した実施形態１６による方法。
１８．  所望のサイズのマイクロバブルを得るために、溶液がガスと所望の時間および／または所望の速度で混合される、番号付した実施形態１６〜１７のいずれか１つによる方法。
【００６１】
１９．  ｃ）における溶液が２秒間〜６０分間、優先的には１〜１０分間混合される、番号付した実施形態１６〜１８のいずれか１つによる方法。
２０．  ｃ）における溶液が５００〜５０，０００ｒｐｍ、優先的には１，０００〜３０，０００ｒｐｍで混合される、番号付した実施形態１６〜１９のいずれか１つによる方法。
【００６２】
２１．  表面活性物質は、血清、タンパク質もしくは脂質または界面活性剤である、番号付した実施形態１６〜１９のいずれか１つによる方法。
２２．  癌の治療において使用するためにナノ粒子と結び付いているガス充填マイクロバブルであって、ナノ粒子の少なくとも１つには治療薬が負荷され、腫瘍性組織に対するナノ粒子および／または治療薬の送達は、音場、例えば超音波によって促進されるガス充填マイクロバブル。
【００６３】
２３．  ナノ粒子は、マイクロバブルに表面付着性しており、マイクロバブル表面の少なくとも一部を被覆する、番号付した実施形態２２による使用。
２４．  表面付着ナノ粒子は、マイクロバブルを安定化させている、番号付した実施形態２２〜２３のいずれか１つによる使用。
【００６４】
２５．  音場は、ガス充填マイクロバブルのキャビテーション、振動および／または崩壊を誘発する、番号付した実施形態２２〜２４のいずれか１つによる使用。
２６．  キャビテーションは、毛細管壁を越えるナノ粒子の輸送を改善する、番号付した実施形態２２〜２５のいずれか１つによる使用。
【００６５】
２７．  表面付着ナノ粒子は、少なくとも１種以上の標的化薬をさらに含む、番号付した実施形態２２〜２６による使用。
２８．  ガス充填マイクロバブル、マイクロバブルと結び付いている複数のナノ粒子、および１つ以上のナノ粒子と結び付いている１種以上の化学療法薬を含む、癌の治療において使用するための組成物。
【００６６】
２９．  組成物が少なくとも１つの遊離ナノ粒子および前記ナノ粒子と結び付いている１種以上の化学療法薬をさらに含む、番号付した実施形態２８による使用のための組成物。
【００６７】
３０．  組成物が、番号付した実施形態１〜１５のいずれか１つによる薬物送達系を含む、番号付した実施形態２８による使用のための組成物。
３１．  癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に番号付した実施形態１〜１４による薬物送達系を投与する工程を含む方法。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】動的光散乱法によって測定された、ＰＥＧ化カバジタキセル負荷ＰＩＨＣＡ  ＮＰのサイズ分布を示す図である。薬物負荷は、１０．７重量％である。
【図２】光学顕微鏡法および画像解析によって測定された、ＰＥＧ化カバジタキセル負荷ＰＩＨＣＡ  ＮＰによって安定化したＭＢのサイズ分布を示すヒストグラムである。
【図３】表面付着ナノ粒子を備えるマイクロバブルの電子顕微鏡画像を示す図である。
【図４】ＮＰのサイズおよびゼータ電位は、各々およそ１７０ｎｍおよび−１ｍＶであった。乳癌細胞系中への細胞取り込みは、ＣＬＳＭによって確証した（Ａ）。ＮＰは、蛍光染料（赤色）をカプセル封入することによってイメージングした。ＦＣＭによる定量から、細胞の９０％が３時間のインキュベーション後にエンドサイトーシスによってＮＰを取り込んでいた（Ｂ）。
【図５】ＰＥＧ化ＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期は、１３６分間であることが見出された（ｎ＝動物５匹）（Ａ）。２０６１６０．９ｅ−０．００５１ｘの形態への指数関数的減衰は、Ｒ２＝０．６７およびｐ値≦０．０００１を備えるデータと適合した。自己集合ＮＰにより安定化したＭＢはおよそ３μｍのサイズを有しており、ｉｎ  ｖｉｖｏコントラスト増強ＵＳイメージングおよび画像誘導薬物送達のために適合することが見出された。超音波によりイメージングした腫瘍内の気泡の流入および循環に起因するコントラスト増強（Ｂ）。
【図６】注射６時間後のＮＰの生体内分布を示す図。動物１匹からの臓器および腫瘍の１つの例が示されている（Ａ）。臓器および腫瘍内の蓄積の定量は、平均値および標準偏差として示されている（ｎ＝動物１０匹、脳についてはｎ＝５）（Ｂ）。未治療の臓器および腫瘍からの自己蛍光が、動物１匹から示されている。
【図７】これらの臓器、腫瘍および脳中では用量の８７％を見出すことができる。残りは、尿、大便、皮膚、筋肉および他の組織中で見出される可能性が高い。用量の大半は肝臓および脾臓内に所在し、用量の約１％は腫瘍内に所在する（報告されたメジアン値０．７％と良好に対応する）。
【図８】ＮＰを赤色で示している、全腫瘍切片からのＣＬＳＭタイル走査の１つの例を示す図である（Ａ）。ＮＰ由来の蛍光を伴うピクセル数は、各動物からのタイル走査で定量した（Ｂ）。ピクセル強度を測定すると類似の結果が見られた。安定性キャビテーションの効果は見出されなかったが、ＭＢの強烈な崩壊はＮＰの腫瘍への送達を増加させ、ＭＩの増加に伴って取り込みが増加した。
【図９】切片、ＰＩＨＣＡ  ＮＰの取り込みの分析を示す図である。
【図１０】実質的な目に見える出血を誘発した最高ＭＩ（Ｇ７）を除いて、ＨＥＳ染色腫瘍切片の評価は、全ＦＵＳ治療が安全と見なせることを示した。全体画像（Ａ）の例、ならびに未治療および治療組織の各画像を示している（各々、ＢおよびＣ）。
【図１１】治療２時間後の腫瘍内のＮＰの微細分布は、ＣＬＳＭを使用してイメージングした。超音波治療を全く受けなかったコントロール群（Ａ）および高圧を用いて治療された群（Ｂ）からの代表的な例を示す図である。血管は緑色、およびナノ粒子は赤色で示している。治療群（Ｇ６）では、コントロール群と比較してＮＰの増加した送達が観察される。超音波を適用した（ｂ）および適用していない（ａ）腫瘍内の蛍光染料の分布。ａ）よりもｂ）において２５０倍超の薬物が見られる。
【図１２】共焦点顕微鏡を使用するポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子の細胞内分解についてのプロービングを示す図である。細胞内での薬物放出の測定。
【図１３】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞内へのナノ粒子の取り込みを示す図である。
【図１４−１】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳房上皮細胞）の生存性を示す図である。
【図１４−２】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳房上皮細胞）の生存性を示す図である。
【図１５】脳内へのＭＲＩ造影剤の取り込み。この特定の物質は、通常はＢＢＢを通過しない。そこで、これらの結果は、一過性のＢＢＢ開口を例示している。
【図１６】ＢＢＢを越えるＮＰのＦＵＳ媒介性ＢＢＢ分布および輸送を示す図である。ａ）ＰＩＨＣＡ−ＭＢプラットフォームと組み合わせたＦＵＳによって媒介されたＢＢＢ開口。ｂ）ＦＵＳ曝露後のＢＢＢを越えるＰＩＨＣＡ  ＮＰの輸送。赤色−ＰＩＨＣＡ  ＮＰ、緑色−血管。
【図１７】時間の関数としての動物の体重は、３つの異なる治療群についての平均値と標準偏差として示している。ｎ＝動物４匹／群。第０日は、腫瘍細胞の移植日である。治療は第２１日および第２９日に実施した。
【図１８】時間の関数としての腫瘍の容積は、３つの異なる治療群についての平均値と標準偏差として示している。第１群：コントロール、生理的食塩水。第２群：ナノ粒子および細胞増殖抑制薬（カバジタキセル）と結び付いているマイクロバブル。第３群：超音波ならびにナノ粒子および細胞増殖抑制薬と結び付いているマイクロバブル。ｎ＝動物４匹／群。第０日は、腫瘍細胞の移植日である。治療は第２１日および第２９日に実施した。
【図１９】３つの異なる治療群についての腫瘍細胞移植後第３５日の腫瘍容積。ｎ＝動物４匹／群。平均値と標準偏差を示している。
【図２０】焦点式超音波およびナノ粒子安定化マイクロバブルの使用による腫瘍組織への強化された薬物送達を示している略図である。
【図２１】皮下乳癌を有するマウスにおける効果試験を示す図である。細胞の移植後（第０日）の時間の関数としての腫瘍容積。マウスは、生理的食塩水、カバジタキセルを含むナノ粒子安定化マイクロバブル（ＮＰＭＢ）またはカバジタキセルを含むＮＰＭＢおよびＵＳを用いて治療した。治療は第２１日および第２９日に実施した。データは、第３５日まではｎ＝４匹／群および第３７日からのｎ＝３匹／群からの平均値と標準偏差として示している。
【図２２】正所性乳癌を有するマウスにおける効果試験を示す図である。細胞の移植後（第０日）の時間の関数としての腫瘍容積。マウスは、生理的食塩水（コントロール）、ＦＵＳと組み合わせたカバジタキセルを含有するＮＰＭＢまたはＦＵＳと組み合わせたカバジタキセルを含有するＮＰと同時注射した市販のＭＢ（ソノビュー（ＳｏｎｏＶｕｅ））を用いて治療した。群各々についての平均腫瘍容積。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
本発明は、ＦＵＳ媒介性薬物送達とともに使用されるＭＢおよび複数のＮＰを含む多機能薬物送達系に向けられる。この多機能薬物送達系は、焦点式ＵＳ（ＦＵＳ）を活用して腫瘍への抗癌剤の制御送達および強化送達を可能にするための革新的な薬物送達系である。したがって、この薬物送達系は、療法において使用するためのものである。
【００７０】
本発明による薬物送達系は、ナノ粒子と結び付いているガス充填マイクロバブルであって、少なくとも１つのナノ粒子に治療薬が負荷されており、ナノ粒子の標的部位、例えば腫瘍への送達が超音波によって生成される音場によって促進される、ガス充填マイクロバブルを含む。この送達系は、全身投与のためのものである。したがって、この送達系は全身性で投与される一方、標的部位へのナノ粒子の送達は、ＦＵＳを活用することにより局所的に促進される。少なくとも１種の治療薬が負荷されたＮＰと結び付いているガス充填ＭＢは、癌の治療において使用され得る。特に、本発明によるＮＰと結び付いているＭＢは、脳内の腫瘍を含む固形腫瘍の治療において使用するためのものである。少なくとも１種の治療薬が負荷されたＮＰと結び付いているガス充填ＭＢは、例えば神経膠腫のような腫瘍を治療するためなどの、療法においても使用され得る。ＮＰをＭＢと結び付けることおよび本発明による系を使用することによって、治療薬の取り込みおよび効果を強化することが可能である。
【００７１】
１つの実施形態では、ガス充填ＭＢは、ＮＰによって安定化される。ＮＰは、ＭＢ界面での自己集合により気液界面を安定化させ、そこで極めて安定性のあるＭＢを生じさせる。そこで本発明の１つの実施形態によるナノ粒子安定化ＭＢの１つの利点は、増加した安定性および有効保持期間である。
【００７２】
理論によって拘束されるものではないが、ＮＰとＭＢとの結び付きは、いわゆるピッカリングエマルション（Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）の形成の結果であり得る。中間疎水性を備える固体粒子は、例えば油−水などの不混和性液体間の界面で強力に吸着することができ、ピッカリングエマルション、すなわちナノメートルもしくはマイクロメートルサイズの固体粒子によって安定化したエマルションの形成を可能にすることは公知である。同様の方法で、固体粒子は、気液界面を安定化させるために使用できる。しかし、粒子安定化作用にとって必須である疎水性と親水性の充分な平衡を本質的に有する物質は極めて少ない。本明細書において記載したように、本発明による送達系に含まれるようなＮＰは、ＭＢ表面での自己集合によって気液界面を安定化させるために使用できる。この実施形態によると、ＭＢは、ＮＰの自己集合によって外殻（ｓｈｅｌｌ）を形成する。その結果は、極めて安定性のあるＭＢである。そのようなナノ粒子安定化マイクロバブルは、長い有効保持期間を有することが証明されている。
【００７３】
標的部位へのナノ粒子および治療薬の送達は、超音波を適用することによって強化される。超音波は、疾患領域全体を含む音場を誘導する。超音波を放出部位（例えば、腫瘍もしくはＢＢＢ）で局所的に適用すると、血管内の小さな孔が一過性で形成されるであろう。超音波によって生成された音場は、バブルが振動して崩壊することを誘発し、個々のＮＰの放出をもたらすであろう。治療目的のＦＵＳが、組織内でのキャビテーションおよび放射力などの熱的もしくは機械的作用を作り出すために使用できることは、先行技術から公知である（ピットＷＧ（Ｐｉｔｔ  ＷＧ）、フセイニＧＡ（Ｈｕｓｓｅｉｎｉ  ＧＡ）、ステープルスＢＪ（Ｓｔａｐｌｅｓ  ＢＪ）：超音波薬物送達（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）−−一般評論。エキスパート・オピニオン・オン・ドラッグ・デリバリー（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ）、２００４年、１月、ｐ．３７〜５６。およびフレンケルＶ（Ｆｒｅｎｋｅｌ  Ｖ）：固形腫瘍への薬物および遺伝子の超音波媒介性送達（Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ）、アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ）、２００８年、第６０巻、ｐ．１１９３〜１２０８）。キャビテーションは、音場への曝露後の気泡の作成および振動である。比較的低圧では、音圧波は、ＭＢの安定性キャビテーション；超音波（ＵＳ）圧に反比例する膨張および圧縮を伴う連続的振動を誘発するであろう。これは、血管構造内のマイクロストリーミング、およびＭＢが内皮と接触した場合の血管壁上への剪断応力を生じさせ、これは小孔の形成を誘発し、血管透過性を増加させ、エンドサイトーシスを強化する。したがって、超音波を適用した場合は、血管透過性を強化するソノポレーションを誘発するであろう。もはやＭＢと結び付いていない薬物負荷ＮＰは、その後は強化された血管透過性のおかげで腫瘍組織内に蓄積することができる。
【００７４】
腫瘍組織および／または癌細胞へのナノ粒子および治療薬の送達は、超音波もしくは音響放射力を適用することによって強化される。超音波もしくは音響放射力は、疾患領域全体を含む音場を誘導する。超音波を腫瘍で局所的に適用すると、血管内の小孔が一過性で形成されるであろう。超音波によって生成された音場は、バブルが振動して（ｏｓｃｉｌｌｉｔｅ）崩壊することを誘発し、個々のＮＰの放出をもたらすであろう。超音波は、さらに血管透過性を強化するソノポレーションも誘発する。薬物負荷ＮＰは、その後は強化された血管透過性のおかげで腫瘍組織内に蓄積することができる。
【００７５】
本発明は、療法において使用するための送達系であり、これはｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおける治療効果の最初の証明である。薬物送達系を全身性で投与すると、ＵＳは、前記ナノ粒子および／または少なくとも１種の治療薬の標的部位への送達を媒介するために放出部位で適用される。
【００７６】
理論によって拘束されるものではないが、本明細書に記載した試験において観察された効果は、数種のメカニズムに起因する可能性がある：
１．  腫瘍が漏出性血管構造および非機能的リンパ管を有することは公知である。これは強化された透過性および保持（ＥＰＲ）効果を生じさせ、ＮＰが腫瘍内で選択的に溢出して蓄積することを許容する一方、健常組織はほとんど影響を受けない。したがって、ＮＰ内に薬物を単に組み込むことによって、従来型化学療法と比較して、薬物動態を潜在的に改善し、有効性を増加させ、薬物の毒性を低下させることができ、結果として用量を制限する副作用を減少させる。
【００７７】
２．  超音波が放出部位で適用されると、超音波は気泡の振動を誘発し、それによりＥＰＲ効果をさらにいっそう強化する。比較的低い圧力では、音圧波は、ＭＢの安定性キャビテーションを誘発するであろう。安定性キャビテーションは、その平衡状態の周囲での持続性気泡半径振動（ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｂｕｂｂｌｅ  ｒａｄｉｕｓ  ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）を特徴とする。これは、ＭＢの周囲での流体流であるマイクロストリーミングを生成する。ＭＢが内皮近くにある時または接触している時に結果として生じる血管壁上への剪断応力は、小孔の形成を誘発し、血管透過性を増加させ、エンドサイトーシスを強化する。
【００７８】
３．  超音波は、それ自体がさらにＮＰを腫瘍内に押すであろう。
４．  強化されたＥＰＲ効果は、あらゆる遊離ＮＰが腫瘍組織内に蓄積する原因となるであろう。
【００７９】
より高圧では、振動は振幅を増加させ、非線形となり、気泡の強烈な崩壊を生じさせるであろう。この慣性キャビテーションは、血管構造内での衝撃波およびジェット気流の形成をもたらし、これは毛細管壁および細胞膜内で一時的孔を作成することができる（レンタッカーＩ（Ｌｅｎｔａｃｋｅｒ  Ｉ）、デ・コックＩ（Ｄｅ  Ｃｏｃｋ  Ｉ）、デッカースＲ（Ｄｅｃｋｅｒｓ  Ｒ）、デ・シュメットＳＣ（Ｄｅ  Ｓｍｅｄｔ  ＳＣ）、ムーネンＣＴ（Ｍｏｏｎｅｎ  ＣＴ）：超音波誘導性ソノポレーションを理解する（Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）：定義および基礎にあるメカニズム（ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）、アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビュー（Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ）、２０１４年、第７２号、ｐ．４９〜６４）。
【００８０】
媒体中で慣性キャビテーションが発生する確率は、ＵＳの周波数およびピーク負圧によって与えられるメカニカルインデックス（ＭＩ）によって決定される。中間圧力ではＮＰ安定化ＭＢが振動して崩壊するであろうが、これは慣性キャビテーションほど強烈ではないプロセスである。これらをまとめると、したがってＦＵＳは毛細管壁を越える溢出を局所的に増加させ、潜在的にＥＣＭを通じた透過を改善し、これにより標的部位でのＮＰおよび薬物の取り込みおよび分布を改善することができる。
【００８１】
本発明の１つの実施形態では、本送達系は、遊離ナノ粒子、すなわちマイクロバブルと結び付いていないナノ粒子および遊離ナノ粒子と結び付いている少なくとも１種の治療薬をさらに含んでいる。
【００８２】
理論によって拘束されるものではないが、本発明のこの実施形態の利点は、数種のメカニズムの結果である：
−  超音波と組み合わせたＭＢは、血管壁の透過性を一過性で増加させる人工的ＥＰＲ効果を作成する。これは、自由に循環するＮＰ、すなわち少なくとも１種の治療薬が負荷された遊離ＮＰの蓄積を強化する。
【００８３】
−  ＭＢと結び付いているＮＰ（ＮＰＭＢ）は、ＵＳによってバブルが破壊されると、ＮＰ（およびしたがって治療薬）の高度の局所沈着および腫瘍組織内へのより深度の透過をもたらす。
【００８４】
したがって、本発明のこの実施形態による薬物送達系は、単独のＮＰと結び付いているＭＢより高濃度の治療薬さえ沈着させることができる。
一般的原理は、本発明が薬物を送達するためにナノ粒子（ＮＰ）を利用することにある。ナノ粒子は、典型的には健常な血管に透過するには大き過ぎるが、強化された透過性および保持（ＥＰＲ）効果により、または超音波誘導性「人工的ＥＰＲ効果」により（腫瘍）血管から溢出するためには十分に小さい。本発明によるＮＰには、例えば抗癌薬などの治療薬および／または例えば造影剤などの診断薬が負荷されてよい。１つの実施形態では、ＮＰは、生分解性である。任意選択的に、ＮＰのモニタリングおよびフォローアップのためにさらにＮＰ内に造影剤を組み込むことができる。任意選択的に、ナノ粒子は、任意選択的に補助安定剤を含有していてよい。
【００８５】
ＮＰは、典型的には約１〜８００ｎｍ、例えば約１０〜５００、好ましくは約７０〜１５０ｎｍのサイズであってよい。
ＮＰは、さらに表面機能化されてよい。
【００８６】
ＮＰは、さらに免疫細胞による認識を回避するために、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーでコーティングされてよい。ＰＥＧを用いたコーティングは、さらに血液循環時間を増加させることができる。
【００８７】
また別の実施形態では、ＮＰは、標的化部分によって標的化される。特定細胞を標的とする分子は、任意選択的に、疾患部位でのＮＰの限局性沈着を増加させるためにＮＰ表面に付着させることができる。本発明によるＮＰは、抗癌薬をカプセル封入するために設計されている。さらに、それらは、本明細書に記載した安定性ＭＢを生成するために上首尾で使用することができる。所定の実施形態では、ＮＰは、広範に使用される生体適合性および生分解性ポリ（アルキルシアノアクリレート）（ＰＡＣＡ）ポリマーから構成されるポリマーベースＮＰである。本明細書で証明したように、本発明によるＮＰは、特にＢＢＢ透過のために適合する。１つの特定の実施形態では、薬物負荷生分解性ＮＰは、国際公開第２０１４／１９１５０２号に記載されているようにポリマーベースナノ粒子である。
【００８８】
ＮＰは、標的化部分を用いて、または用いずに国際公開第２０１４／１９１５０２号に記載された１段階合成で調製され得る。ＰＡＣＡは、高い負荷能力で、ある範囲の薬物をカプセル封入することができ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてさらに容易に機能化することができる。ＰＡＣＡ  ＮＰの外殻と結び付いているＭＢの平均径は、０．５〜３０μｍ、例えば１〜１０μｍの範囲内にある。
【００８９】
異なる実施形態では、ポリ（ブチルシアノアクリレート）（ＰＢＣＡ）ＮＰ、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）（ＰＩＨＣＡ）ＮＰおよび／またはポリ（２−エチル−ブチルシアノアクリレート）（ＰＥＢＣＡ）が使用されてよい。より長鎖の分岐状のアルキルモノマー鎖に起因して、ＰＥＢＣＡは、本試験では実施例６に記載したように適用した。ＰＥＢＣＡは、治療的に好都合な可能性がある、より緩徐な分解速度を有する。
【００９０】
ナノテクノロジーは、イメージングのための造影剤および療法のための薬物の両方をいわゆるセラノスティック（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ）ＮＰに組み込んで、様々な疾患の診断および療法を改善するための多機能ＮＰを設計するという新時代を開始した。癌療法では、薬物を例えば本明細書に記載したようなＮＰにカプセル封入することは、薬物動態を改善し、腫瘍内の漏出性毛細管に起因する全身性曝露を低下させる。本発明によるＮＰはさらに、それらがＢＢＢを通過できるので中枢神経系（ＣＮＳ）における疾患を治療する潜在能力を有することも証明されている。ＣＮＳへの分子の接近は、ＢＢＢを構成する血管を形成する内皮細胞間の特殊な密着帯によって厳密に制御される。
【００９１】
１つの実施形態では、本発明の系内に含まれるナノ粒子は、ポリ（アルキルシアノアクリレート）（ＰＡＣＡ）ＮＰである。ＰＡＣＡ  ＮＰは、固形腫瘍への薬物担体およびＢＢＢを横断する薬物担体の両方としての前途を証明してきた。これは、一部には１工程で表面機能化および薬物封入を可能にする系の柔軟性に起因する。さらに、これらのナノ粒子（ＮＰ）からの分解および薬物放出は、様々なモノマーを選択することによって調整することができる。１つの実施形態では、ＮＰは、国際公開第２０１４／１９１５０２号に記載された方法によって調製される。
【００９２】
本明細書に記載したように、ナノ粒子は、ＭＢと結び付けて使用される。所定の実施形態では、ＮＰは、ＭＢ気液界面での自己集合によってＭＢを安定化させ、したがって、ＭＢの周囲で安定化外殻を形成することができる。結果は、改良された技術的特徴を備える極めて安定性のあるマイクロバブルである。所定の実施形態では、ＭＢは、例えば界面活性剤などのまた別の安定化剤の添加によって生成される。安定化剤は、血清、タンパク質、ポリマー、脂質もしくは界面活性剤から選択された界面活性剤であってよい。ＭＢは、ウルトラタラックス（Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ）、撹拌、超音波または当業者には公知である他の手段を使用して、ナノ粒子を含む溶液をガスと混合することによって生成することができる。所定の実施形態では、ＮＰは、ＭＢ気液界面で自己集合し、ＭＢの周囲で安定化外殻を形成する。所定の実施形態では、ナノ粒子安定化ＭＢは、市販で入手できるＭＢと比較してＭＢの脆弱性を減少させる。
【００９３】
所望の組織内へのＮＰの取り込みおよび分布を改善するために、本発明によるＮＰの投与は、音場を確立するために超音波を適用することによるなどの、送達を容易にする治療と結び付けられる。理論によって拘束されるものではないが、仮説は、超音波が様々なメカニズムによって薬物送達を改善できることである。音場では、ガスマイクロ気泡の振動および可能性のある崩壊であるキャビテーションが発生し得る。キャビテーションは、内皮細胞上への剪断応力およびジェット気流を生成することができ、次にそれにより毛細管壁を越えるＮＰの輸送を改善する。所定の実施形態では、腫瘍内のＮＰの改善された溢出および分布は非熱的メカニズムによって達成され得るが、しかし加熱および放射力もまた送達をさらに強化することができる。
【００９４】
所定の実施形態では、本発明は、３つの要素を含む：
１．  治療薬および造影剤を単独でまたは組み合わせて含有するＮＰ。
２．  薬物負荷ＮＰによって安定化したガス充填ＭＢ。
【００９５】
３．  ＮＰ安定化ＭＢを使用する超音波媒介性薬物送達のための超音波テクノロジー。
本発明のこの実施形態によるこの新規な多様式多機能薬物送達系は、ＮＰの超音波媒介性送達による癌細胞への治療薬の送達を改善することが証明されている。これらのＮＰ付着ＭＢと焦点式超音波の組み合わせは、増殖している腫瘍内のＮＰのより高度の取り込みおよび改善された分布を生じさせ、したがって癌の改善された治療を生じさせる。実施例３および図１４で証明されたように、本発明は、コントロールと比較して減少した腫瘍増殖を生じさせる。
【００９６】
新規なＮＰ付着ＭＢは、さらに脳組織内での蛍光標識ＮＰの磁気共鳴イメージングおよび局在化によって証明されたように、ＢＢＢに透過するためにも使用できる（図１５、１６および１７を参照されたい）。したがって、新規なＮＰ付着ＭＢプラットフォームは、脳腫瘍の治療における前途有望な臨床的潜在能力を証明する。
【００９７】
超音波およびＭＢは、膵臓癌を治療するための超音波およびゲムシタビンと市販で入手できるＭＢの同時注射を結び付ける臨床試験において近年証明されたように、カプセル封入されていない薬物の送達を改善することができる。超音波とＭＢの結合は、さらに血液脳関門の一過性および限局性開口を促進し、それにより様々な薬物が脳に進入し、したがって中枢神経系（ＣＮＳ）障害を治療することを可能にする。超音波およびＭＢが血液脳関門破壊を誘発する正確なメカニズムは十分には理解されていないが、キャビテーション、すなわち超音波場におけるＭＢの体積振動が、重要な因子である可能性があることが推測される。
【００９８】
本発明の１つの実施形態によると、個々の薬物負荷ＮＰとＭＢと結び付いているＮＰの混合物が血流内に注射され、全循環系全体に迅速に分布されるであろう。これらのＭＢおよび遊離ＮＰは、健常組織の血管壁を横断するには大き過ぎる。腫瘍部位もしくは放出部位で局所的に適用される音場に進入するとき、ＭＢは大きな体積振動を受けるであろう。このプロセス中、血管透過性は血管壁内で小孔を形成する振動するＭＢからの機械的刺激に起因して一過性で増加するであろう。放出部位に集束したＵＳは、さらにまた高度に標的化された治療のためにＭＢ外殻から個々のＮＰを放出する、気泡の崩壊も誘発するであろう。ＭＢが崩壊すると、したがって薬物負荷ＮＰの極めて高い局所濃度が得られる。標的部位へのＮＰの送達は、それにより促進される。
【００９９】
ＮＰ付着ＭＢの音響活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で証明されている。したがって、それらは治療用途において大きな潜在能力を有する。さらに、ＵＳは、本明細書に記載したようにＭＢを破壊し、したがって個々のＮＰを放出させ、腫瘍担持マウスにおけるモデル薬物取り込みを強化することができる。モデル薬物の強化された取り込みもまた、細胞内で証明されている。
【０１００】
細胞内へのＮＰの取り込みが試験された実験では、本発明者らは、細胞内へのＰＡＣＡ  ＮＰの取り込みが、市販のＭＢおよびＰＡＣＡ  ＮＰの同時注射もしくはＰＡＣＡ  ＮＰ単独と比較して、ＮＰ安定化ＭＢ（ＮＰＭＢとも呼ばれる）が使用された場合に有意に増加することを見出した。これは、ＭＢ表面上のＮＰの存在はさらに疾患部位およびソノポレーションへのＮＰの効率的送達を改善することができ、したがって本発明による系の証明された強化された効果に寄与することを具体的に示した。
【０１０１】
さらに、ラット内のＢＢＢは、ＮＰおよびＵＳと一緒に新規なＭＢを使用すると安全におよび一過性に開口させられることが証明されている。最後に、ＮＰと結び付いているＭＢの効果は、実施例５、７および８に記載したｉｎ  ｖｉｖｏ試験によって、癌治療において証明されている。本試験は、結果がコントロールに比較して有意に腫瘍増殖を減少させる能力を証明しているので、癌治療における本明細書に記載した薬物送達系の適用可能性を初めて証明している。最後に、中枢神経系の疾患の治療において使用するための送達系の適用可能性は、実施例９において証明された。
【０１０２】
ＵＳ媒介性薬物送達用途のために特に設計された、高度の薬物正味重量を備えるＭＢおよびＮＰを含む新規な薬物送達系への明確な必要がある。現在、市場にそのような生成物は存在しない。本発明による系は、その欠如を埋めるので、したがって現行の化学療法テクノロジーを使用した場合は効果的に治療されない腫瘍にとって重要である。
【０１０３】
本発明の独創性は、その単純性および汎用性にあり、それにもかかわらず、ＵＳ媒介性癌療法のための高度に適合する音響的および生物学的特性をもたらす。現在記載された研究系と比較した本発明の利点は、次のとおりである：
・  本発明は、臨床用途のための革新的および有益な薬物送達系を構成する１つの単純な製剤に多機能性を提供する。
【０１０４】
・  本発明は、ＵＳイメージング、診断および療法のために、別個に、または同時に使用することができる。
・  本発明は、市販のＭＢより有意に長い循環時間を有する。
【０１０５】
・  本発明は、個々の遊離ＮＰおよびＮＰ付着ＭＢの組み合わせを含むので、したがって腫瘍組織への極めて高い薬物濃度の標的化送達を可能にする。
・  本発明は、高ペイロードの薬物を組み込んでいるＮＰおよびＭＢを１つの単一単位（ＮＰ付着ＭＢ）内に統合する。単一単位内へのＮＰおよびＭＢの統合は、ＮＰおよびＭＢの同時注射と比較してＵＳ強化腫瘍取り込みにおいて、はるかにより効率的である潜在性を有することが見出されている。これは、ＮＰおよびＭＢが静脈内に同時注射されてＮＰが血流内で全身に希釈される場合に比較して、ＭＢが破壊される超音波処理の領域内における局所的な高濃度のＮＰに、おそらく起因する。
【０１０６】
・  ＭＢは、気液相間でのＮＰの自己集合による１段階プロセスで調製される。
・  ＮＰもまた、１段階で有機溶媒を使用せずに調製される。これは、単純で、費用効果が高く、且つ、臨床へのおよび収益性の高い製品への容易な転換を提供する。
【０１０７】
ＭＢは、脂質、タンパク質もしくはポリマーの固体外殻から構成される、現在市場で販売されているＭＢとは反対に、何千個もの単一薬物負荷ＮＰと結び付いている。これは、柔軟性だが頑丈で安定性のある外殻および腫瘍標的および他の標的部位に到達するまで十分に小さい個別ＮＰを放出する能力を提供する。
【０１０８】
本発明による新規な薬物送達系は、抗癌薬の強化された送達のための新規な治療概念の必要を明確に解決する。さらに、本発明は、固形腫瘍ならびに中枢神経系の疾患のための治療を有意に改善する潜在能力を有する。固形腫瘍における低分子を用いて見られる典型的に不良な応答およびＥＰＲ効果への現在までのナノ薬物ベースを用いた場合の低い臨床的成功を前提にすると、本発明は、大きな社会的影響を有する可能性がある。生命を救い、救急および改善療法の事後費用は、潜在的に大きく低下させることができる。本発明により誘導される強化された薬物透過は、消耗性手術の必要に影響を及ぼすことができる。異なる実施形態では、本発明は特に、臨床重要性の高い数種の特定領域内で使用することができる：
−  手術不可能な癌を有する患者
−  脳内の原発性腫瘍もしくは転移を有する患者。この場合、ほとんどの抗癌薬はＢＢＢの密着帯に起因して腫瘍には到達しないであろうから、新規な送達技術に対する強固な必要がある。
【０１０９】
１つの実施形態によると、ＭＢは、コントラスト増強ＵＳイメージングのために使用できる。ＮＰは、薬物ならびに造影剤を含有することができ、任意選択的に標的化リガンドを用いてさらに官能化することができる。ＮＰは、さらに循環時間および生体内分布を改善するために、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの親水性ポリマーでコーティングされてよい。したがって、本発明は、高度に汎用性の系を開示する。
【０１１０】
ナノ粒子内に含まれる化学療法薬は、薬物クラス：アルキル化剤、代謝拮抗薬、細胞傷害性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、抗微小血管剤または当業者には公知の任意の他の公知の化学療法薬の群から選択されてよいが、それらに限定されない。
【０１１１】
ナノ粒子で治療される癌は、固形腫瘍もしくは癌性細胞であってよい。特に好ましい実施形態では、癌は、乳癌である。
本明細書に記載した薬物送達系は、全身投与のためのものである。本明細書に記載した薬物送達系の全身性投与は、好ましくは血流中への投与、例えば非経口投与、注射、静脈内もしくは動脈内投与によって達成されてよい。
【０１１２】
標的部位へのＮＰの上首尾で十分な送達を達成するために、ＮＰは十分な時間量にわたり血液中を循環しなければならない。本明細書に記載した発明を用いた場合の１つの特定の利点は、ＭＢが市販で入手できる例えばアルブネックス（Ａｌｂｕｎｅｘ）（ＧＥヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社）、オプチゾン（Ｏｐｔｉｓｏｎ）（ＧＥヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社）、ソナゾイド（Ｓｏｎａｚｏｉｄ）（ＧＥヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社）、ソノビュー（ＳｏｎｏＶｕｅ）（ブラッコ（Ｂｒａｃｃｏ）社）などのマイクロバブルと比較してＮＰによって安定化される送達系の改良された循環時間である。本発明者らは、本明細書に記載した発明の特定の実施形態が、１３６分までの動物モデル（マウス）におけるＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ循環中半減期を達成することを見出した。これは、例えばＰＥＧ化ＰＥＢＣＡを使用することで証明された。
【０１１３】
ＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ循環は、粒子の材料、形状、サイズ、表面化学および電荷に左右され、循環時間は様々なＮＰ製剤間で有意に異なる可能性があることが証明されている（アレクシス（Ａｌｅｘｉｓ）ら著、２００８年、ロングマイヤー（Ｌｏｎｇｍｉｒｅ）ら著、２００８年）。血液中でのペイロードの永久的分解および放出を回避するために、標的に送達されないＮＰは、粒子が薬物を放出する前に排出されなければならない。循環を増加させるための一般的戦略は、凝集を防止してＮＰの周囲で水冠を作り出すＰＥＧ化である。一般に、水冠は、タンパク質の吸着およびオプソニン化を減少させるので、そこで肝臓および脾臓内での細胞内皮系による認識を防止する。以前の試験では、オプソニン化粒子の大多数は肝臓および脾臓内の食細胞の高濃度に起因して数分間以内に排出される、またはそれらは排泄されることが証明されている（アレクシス（Ａｌｅｘｉｓ）ら著、２００８年）。しかし、近年はさらに、ＰＥＧがナノ担体の周囲で形成するタンパク質冠の組成に影響を及ぼし得ること、および非特異的細胞取り込みを防止するには別個のタンパク質の存在が不可欠であることも報告されている（スコットラー（Ｓｃｈｏｔｔｌｅｒ）ら著、２０１６年）。本発明において使用される様々なＮＰは、４５分間（ＰＢＣＡ）〜１３６分間（ＰＥＢＣＡ）の循環半減期を有することが証明されている。したがって、本発明の様々な実施形態は、以前の試験と比較してはるかに強化された、循環時間における多様性を提供する。増加した循環は、ＰＡＣＡ  ＮＰが国際公開第２０１４／１９１５０２号に記載されたように生成された場合に達成される増加したＰＥＧ化に起因する可能性がある。本発明において使用されるＮＰは、さらに減少した分解速度およびおそらく粒子表面からのＰＥＧの緩徐な解離／放出を有する。より多くの疎水性ポリマー（ＰＥＢＣＡ対ＰＢＣＡ）もまた、疎水性相互作用によって付着させられるＰＥＧのより強力な固定を与えることができよう。他の研究者によっても、ドキソルビシンが負荷されたＰＢＣＡ  ＮＰ（レディーおよびマースィ（Ｒｅｄｄｙ  ａｎｄ  Ｍｕｒｔｈｙ）、２００４年）およびヘキサデシルシアノアクリレート（ＰＨＤＣＡ）ＮＰ（ファング（Ｆａｎｇ）ら著、２００６年）についてほぼ数時間の類似の半減期が報告されている。
【０１１４】
さらに、ＮＰは、血管構造から溢出して、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に透過し、それらのペイロードを細胞内標的に送達しなければならない。本発明によって使用されるＮＰについての幾つかの利点が証明されている。漏出性腫瘍血管構造および非機能的リンパ管は、強化された透過性および保持（ＥＰＲ）効果を生じさせ、ＮＰが腫瘍内で選択的に溢出して蓄積することを許容する一方、健常組織はほとんど影響を受けない。
【０１１５】
ＮＰの生体内分布は、マウスに染料を含有するＮＰが静脈内注射された、動物モデルにおいて証明された。腫瘍内に蓄積するＮＰの量は、ＮＰが循環からほとんど全て排出された時点（注射６時間後）に測定され、注射されたＮＰ用量の１％が、腫瘍内に所在することが見出された。これは、注射された薬物の０．０１〜０．００１％が腫瘍に達した化学療法薬について報告されたもの（ガーバー（Ｇｅｒｂｅｒ）ら著、２００９年、クルドツィール（Ｋｕｒｄｚｉｅｌ）ら著、２０１１年）に比較して明白な改善である。ＮＰの大多数は肝臓および脾臓内で見出されたが、腎臓に所在したＮＰはより少数であった。これは、ＮＰがこの期間中には大きく分解しないことを証明している。
【０１１６】
ＮＰの細胞取り込みは、ＣＬＳＭおよびフローサイトメトリを使用することによって決定した。取り込みを決定するために使用されたモデルは、乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）および蛍光染料をカプセル封入しているＮＰを利用した。ＣＬＳＭ画像は、細胞内の蛍光染料を確証した。蛍光染料が負荷されたＰＥＢＣＡを用いた１つの実験では、ＦＣＭによる定量は、細胞の９０％が３時間後にエンドサイトーシスによるＮＰを取り込んだことを明らかにした。
【０１１７】
ＰＡＣＡ  ＮＰの取り込みは、様々な細胞系間および異なるポリマーのＮＰについて変動することが観察されている。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞系について観察されたＰＥＢＣＡ  ＮＰの効率的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ取り込みは、ＮＰが腫瘍間質に達すると、それらがエンドサイトーシスにより乳癌細胞によって効果的に取り込まれ得ることを示している。ＮＰが内在化されると、それらは細胞増殖抑制性の積荷（ｃａｒｇｏ）を放出するために分解するであろう。薬物としてのカバジタキセルを用いた場合のｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性は、細胞系がこの薬物に良好に応答すること、および封入薬物が効率的であることを確証している。ＮＰが内在化されなかった場合、代替メカニズムは、ＮＰが分解して薬物を細胞外に放出し、その後に遊離薬の細胞取り込みが続くこと、または薬物が直接接触媒介性移動によって細胞内に送達されるということであり、これはまた別の疎水性モデル薬物について観察されている。ＰＡＣＡナノ粒子の分解は特徴付けられており、主としてポリマーのアルキル側鎖のエステル結合の加水分解後の表面浸食によって発生し、腎臓によって排出されるアルキルアルコールおよびポリ（シアノアクリル酸）の分解生成物を生じさせる。
【０１１８】
ＭＢ、特に表面上の外殻としてＮＰと結び付いている本明細書に記載したＭＢのｉｎ  ｖｉｖｏ循環を証明するための試験も実施されてきた。動物モデルを使用することによって、ＮＰ付着ＭＢをマウスに静脈内注射した。生体内分布は、ＵＳによってイメージングした腫瘍内でのコントラスト増強によって証明した。
【０１１９】
ＭＢは静脈内注射され、前臨床ＵＳスキャナーを使用して静脈および動脈循環の両方においてイメージングすることができた。腫瘍組織内では、ＮＰ安定化ＭＢは、他の市販のＭＢと匹敵する、およそ４〜５分間にわたり検出することができた。
【０１２０】
腫瘍内のＮＰの微細分布もまた、ＣＬＳＭイメージングによって調査され、様々なＭＩが腫瘍内のＮＰの微細分布に影響を及ぼすことを証明した。結果は、ＵＳが使用されていないコントロール腫瘍と比較して、ＵＳを用いて治療された腫瘍内でＮＰの増加した送達が観察されることを証明された。
【０１２１】
本発明の送達系のためのモデルに含まれた動物の最適治療を決定するため、および腫瘍組織内へのＮＰの増加した送達を達成するために、様々なＵＳ治療が調査された。キャビテーションプロセスを理解することは、ＵＳ媒介性薬物送達における効率および安全性を最大化するために極めて重要である。ＭＢのＵＳへの応答は、周波数、圧力レベルおよびパルス持続時間ならびに例えばサイズ、外殻厚さおよび剛性などのＭＢの特性に高度に左右される。ＮＰのＵＳ媒介性送達の作用はさらに、ナノ医学の送達のための障壁が腫瘍タイプ間で大きく変動する可能性があるので、腫瘍特性にも左右される。
【０１２２】
実施例７に記載した皮下乳癌モデルでは、低い音圧（０．１もしくは０．２５のＭＩ）は、ＰＥＢＣＡ  ＮＰの腫瘍取り込みを強化しなかった。ＮＰ安定化ＭＢの音響的特性解析およびｉｎ  ｖｉｔｒｏＵＳコントラストイメージングは、ＮＰ安定化ＭＢがこれらの圧力レベルで音響的に活性であって振動すること、および０．２５のＭＩで部分的崩壊が生じることを証明している。それでも、これらの低い圧力は、実施例９に記載したモデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏのＮＰの溢出を可能にするほど十分には血管透過性に影響を及ぼさなかった。例えばＮＰなどのより大きな作用物質の送達は、低分子量薬物の送達と比較してより高いＵＳ圧を必要とする可能性があるので、したがって、ＵＳ強度は薬物サイズと相関する孔径を作り出せるように適合させることができる。
【０１２３】
より高い音響圧（０．５および１のＭＩ）では、本明細書に記載した乳癌モデルにおける腫瘍へのＮＰの送達が改善された。理論によって拘束されるものではないが、これは透過性増強のためにはＮＰ安定化ＭＢの完全破壊が必要であることを示す可能性がある。０．５のＭＩでは、有意に改善された腫瘍蓄積が見られた；送達されたＮＰの数は、平均すると非治療群より２．３倍高かった。ＭＢが毛細管壁に十分に近く所在する場合は、振動して崩壊するＭＢは、剪断応力、流体ストリーミング、衝撃波およびジェット気流を通して、内皮細胞への力を誘導するであろう。そのＮＰの増加した溢出および分布は、下記の：増加した数の開窓を通しての増加した血管透過性、内皮細胞内のＮＰの増加したエンドサイトーシス／エキソサイトーシスまたは血管構造および間質内の増加した流体対流の１つもしくは組み合わせに起因する可能性が高い。治療群内のＮＰ蓄積における変動は、様々な腫瘍間の様々な量の血管構造ならびに血管構造の漏出性における変動、および壊死性コアの様々なサイズに起因する可能性が高い。実施例９では、１のＭＩの短時間のフラッシュはＮＰの取り込みを改善しなかったが、これはより長いパルスが必要とされることを証明している。より長いパルスは、ＭＢを血管壁に向けて押し、おそらくはＭＢのバースト時に内皮細胞への近接近を生じさせるであろう。長いパルス中、ＮＰ安定化ＭＢは破裂し、放出されたガスは新規のおそらくより小さいＭＢを形成することができ、これらのＭＢは再び振動して潜在的に融合するであろう。これらをまとめると、本明細書で証明したように、長いパルスは振動するバブルからの持続性の生体内効果を促進する。
【０１２４】
ＮＰとＭＢとの間の直接付着は、ＭＢが崩壊した場合に、ＮＰとＭＢの同時注射と比較して、おそらくより高濃度のＮＰを生じさせるであろう。したがって、本発明は、ＮＰとＭＢの同時注射と比較してより効率的な送達を表す。
【０１２５】
以下では、本発明を下記の非限定的実施例によって例示する。
（実施例）
実施例１
薬物負荷ＰＡＣＡ  ＮＰおよびＮＰ安定化マイクロバブルの生成
材料および方法：
薬物負荷ＰＡＣＡ  ＮＰの合成および物理化学的特性解析：
ＰＥＧ被覆およびカバジタキセル負荷ＰＩＨＣＡ  ＮＰは、下記のようなミニエマルション法によって調製した：１．５０ｇのイソヘキシルシアノアクリレート（モノマー）、０．０３ｇのミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１２（補助安定剤、不活性油）および０．１８ｇのカバジタキセル（細胞傷害薬）を含有する油相は、ガラスバイアル中での完全な混合によって調製した。１２ｍＬの０．１ＭのＨＣｌ中に溶解させた、０．０９ｇのブリッジ（Ｂｒｉｊ）Ｌ２３（２３ＰＥＧ単位、ＭＷ１２２５）および０．０９ｇのコリフォール（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ）ＨＳ１５（１５ＰＥＧ単位、ＭＷ９６０）を含有する水相を調製した。水中油型エマルションは、油および水相を混合し、直ちにこの混合液を氷上で２分間にわたり超音波処理し（ブランソン（Ｂｒａｎｓｏｎ）製デジタルソニファイヤー（ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ）４５０）（４×３０秒間の間隔、６０％の振幅）、その後にさらに３分間（６×３０秒間の間隔、３０％の振幅）超音波処理することによって調製した。超音波処理後、溶液は室温で一晩にわたり１５ｒｐｍで回転させ、その後に０．１ＭのＮａＯＨを使用してｐＨを５に調整した。重合は、回転させながら（１５ｒｐｍ）室温で５時間継続した。分散液は、未反応ＰＥＧを除去するために、室温で１ｍＭのＨＣｌ（ｐＨ３）に対して広範に透析した（透析膜、ＭＷＣＯ（分画分子量）１００，０００Ｄａ）。透析液は、３回交換した。粒子は、４℃の酸性溶液中に保管した。上述した方法は、透析後には７５ｍｇのＮＰ／ｍＬの濃度を有するＰＥＧ化された薬物負荷および非標的化ＮＰ分散液を生じさせた。酸性条件下で保存すると、粒子分散液は数カ月間にわたり安定であり、凝集は全く観察されなかった。
【０１２６】
ゼータサイザ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）（動的光散乱法）を使用してＰＡＣＡナノ粒子の流体力学的サイズ、サイズ分布および表面電荷を決定した。カプセル封入薬物の量を計算するために、薬物含量を粒子から抽出し、カバジタキセルの抽出量は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を使用することによって定量した。
【０１２７】
ＮＰ安定化ＭＢの生成および特性解析：
ＰＡＣＡ  ＮＰと結び付いているガス充填ＭＢは、下記のように生成した：２重量％のカゼイン（ｐＨ７）を含有する溶液を調製し、０．２２μｍのシリンジフィルターに通して濾過した。上記に記載したカバジタキセル負荷ＰＥＧ化ＰＩＨＣＡ  ＮＰは、カゼイン溶液および蒸留水と混合して、総容積４ｍＬを有する、最終濃度が０．５重量％のカゼインおよび１重量％のＮＰの溶液にした。混合液は、１０分間にわたり超音波処理バッチ内に（周囲温度で）置き、その後にこの溶液をパーフルオロプロパンガスで飽和させ（およそ１０秒間）、バイアルはパラフィンで部分的に密封した。次にウルトラタラックス（Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘ）（２５，０００ｒｐｍ）を直ちに２分間にわたり適用してパーフルオロプロパン充填ＮＰ安定化ＭＢを生成した。バイアルは、パーフルオロプロパン雰囲気下でセプタムを使用して直ちに密封した。
【０１２８】
結果として生じたＮＰ安定化ＭＢのサイズおよび濃度は、２０×の位相コントラスト対物レンズを使用する光学顕微鏡画像および細胞計数器から決定した。ＭＢを計数し、サイズは画像を分析することによって計算した。
【０１２９】
結果：
上述した方法は、透析後には７５ｍｇのＮＰ／ｍＬの濃度を有するＰＥＧ化された薬物負荷および非標的化ＮＰ分散液を生じさせた。酸性条件下で保存すると、粒子分散液は数カ月間にわたり安定であり、凝集は全く観察されなかった。
【０１３０】
動的光散乱法は、０．１８の多分散性指数を有する１４２ｎｍ（ｚ平均値）のＮＰサイズを示した（図１を参照）。測定ゼータ電位は、−１ｍＶであった。決定した薬物負荷効率は７２％であり、薬物ペイロードは１０．７％（カバジタキセルの重量％／ＮＰ重量）であった。
【０１３１】
結果として生じたＮＰ安定化ＭＢは、光学顕微鏡および画像解析によって測定して、２．３μｍの平均径（図２を参照）および５．６２Ｅ＋０８ＭＢ／ｍＬの濃度を有した。ＮＰが安定化（単）層を形成するＭＢと結び付いていることを確証するために、蛍光顕微鏡（薬物の代わりに蛍光染料だけをカプセル封入している同一タイプのＮＰを使用する）および電子顕微鏡（図３）を使用した。４℃で保管した場合、マイクロバブルは数カ月間まで安定であった。
【０１３２】
実施例２
乳癌細胞中のナノ粒子（ＰＩＨＣＡ）内にカプセル封入された蛍光染料（「モデル薬物」）の細胞取り込み
本試験の目的は、超音波媒介性送達のメカニズムを調査すること、安定性もしくは慣性キャビテーションが改善された溢出および強化されたＮＰ送達についての主要なメカニズムであるかどうかを決定することであった。送達の成功を達成するためには、ＮＰは十分な時間量にわたり血液中を循環し、血管構造から溢出し、細胞外マトリックスを透過し、それらのペイロードを細胞内標的に送達しなければならない。
【０１３３】
生体適合性および生分解性ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）ＮＰのサイズおよびゼータ電位は、ゼータサイザ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）によって決定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞取り込みは、蛍光染料をカプセル封入することによって共焦点レーザ走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）およびフローサイトメトリ（ＦＣＭ）を使用して乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）中で試験した。
【０１３４】
図４は、ＮＰのサイズおよびゼータ電位が、各々およそ１７０ｎｍおよび−１ｍＶであったことを示している。乳癌細胞系における細胞取り込みは、ＣＬＳＭによって確証した（Ａを参照）。ＮＰは、蛍光染料をカプセル封入することによってイメージングした。ＦＣＭによる定量から、細胞の９０％が３時間のインキュベーション後にエンドサイトーシスによってＮＰを取り込んでいた（Ｂ）。
【０１３５】
ＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ循環は、注射の１０分間後、３０分間後、１、２、４、６および２４時間後にマウスの伏在静脈からの血液採取によって決定した。
図５は、ＰＥＧ化ＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期を示している。ｉｎ  ｖｉｖｏ循環半減期は、１３６分間であることが見出された（ｎ＝動物５匹）（Ａ）。２０６１６０．９ｅ−０．００５１ｘの形態への指数関数的減衰は、Ｒ２＝０．６７およびｐ値≦０．０００１を備えるデータと適合した。自己集合ＮＰにより安定化したＭＢはおよそ３μｍのサイズを有しており、ｉｎ  ｖｉｖｏコントラスト増強ＵＳイメージングおよび画像誘導薬物送達のために適合することが見出された。超音波によりイメージングした腫瘍内への気泡の流入および循環に起因するコントラスト増強（図５参照、Ｂ）。
【０１３６】
パーフルオロプロパンＭＢは、気液界面での強力な攪拌およびＮＰの自己集合によって作成した。腫瘍内のマイクロバブルの流入および循環は、１８ＭＨｚでの超音波によってイメージングした。
【０１３７】
近赤外線染料をカプセル封入しているＮＰの生体内分布は、注射６時間後にイメージングした。
ＮＰの生体内分布は、近赤外線動物全身走査装置を使用するイメージング、および切除した臓器および腫瘍内の蓄積のｅｘ  ｖｉｖｏ定量によって決定した。これは、図６および７に提示した。
【０１３８】
図６は、注射６時間後のＮＰの生体内分布を示している。動物１匹からの臓器および腫瘍の１つの例が示されている（Ａ）。臓器内および腫瘍内の蓄積の定量は、平均値および標準偏差として示されている（ｎ＝動物１０匹、脳についてはｎ＝５）（Ｂ）。未治療臓器および腫瘍からの自己蛍光が動物１匹から示されている。
【０１３９】
図７は、用量の８７％がこれらの臓器、腫瘍および脳中で見出せることを示している。残りは、尿、大便、皮膚、筋肉および他の組織中で見出される可能性が高い。用量の大半は肝臓および脾臓内に所在し、用量の約１％は腫瘍内に所在する（報告されたメジアン値０．７％と良好に対応する）。
【０１４０】
ＭＢの安定性対慣性キャビテーションが腫瘍組織内へのＮＰ取り込みにどのように影響を及ぼすのかを試験するために、皮下乳癌異種移植片（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を無胸腺マウス中で増殖させた。腫瘍の長さが７〜８ｍｍに達したときに、ＮＰによって安定化したＭＢを静脈内注射し、その後に１ＭＨｚのＦＵＳトランスデューサおよび０．１〜１の範囲内のＭＩを使用して、腫瘍を６種中１種のＦＵＳ治療で治療した。血管は、ＦＩＴＣ標識トマトレクチンを注射することによって染色した。ＮＰの微細分布は、凍結腫瘍切片上でＣＬＳＭによってイメージングした。実験的セットアップおよび様々な治療群は、下記に示した：
・  Ｇ１：コントロール群、超音波なし。
【０１４１】
・  Ｇ２：０．５秒間の治療、１．５秒間（ｓｅｋ）の中断（包括的ＰＲＦ＝０．５Ｈｚ）、１００ミリ秒（ｍｓ）毎に１０，０００サイクル（１０ミリ秒）、（局所的ＰＲＦ＝１０Ｈｚ）、総負荷サイクル２．５％、ＭＩ  ０．１（Ａ）。
【０１４２】
・  Ｇ３：Ｇ２と同様に、各治療後の１のＭＩの３回の追加のサイクルフラッシュを用いて（Ｂ）。
・  Ｇ４：Ｇ３と同様に、しかしＭＩ  １のフラッシュのみ（Ｃ）。
【０１４３】
・  Ｇ５：Ｇ２と同様に、しかしＭＩ  ０．２５を用いて。
・  Ｇ６：Ｇ２と同様に、しかしＭＩ  ０．５を用いて（Ｄ）。
・  Ｇ７：Ｇ２と同様に、しかしＭＩ  １を用いて。
【０１４４】
結果
結果は、図８、９、１０および１１に提示する。
図８は、赤色でＮＰを示している、全腫瘍切片からのＣＬＳＭタイル走査の１つの例を示している（Ａ）。ＮＰ由来の蛍光を伴うピクセル数を、各動物からのタイル走査で定量した（Ｂ）。ピクセル強度を測定した場合に類似の結果が見られた。安定性キャビテーションの効果は見出されなかったが、ＭＢの強烈な崩壊は、ＮＰの腫瘍への送達を増加させ、ＭＩの増加に伴って取り込みが増加した。
【０１４５】
図９は、切片およびＰＩＨＣＡ  ＮＰの取り込みの分析を示している。Ｇ１の結果がＧ６と比較されている。
Ｇ１（コントロール群）の平均値への正規化：
・  第１群（動物３匹からのｎ＝６切片）ＣＴＲＬ（コントロール）
・  第６群（動物３匹からのｎ＝６切片）ＭＩ  ０．５
第６群の平均値は、２．５である。
【０１４６】
治療の安全性を評価するために、ヘマトキシリン・エリスロシン・サフラン（ＨＥＳ）染色切片をイメージングした。図１０は、安全性分析の評価を示した。実質的な目に見える出血を誘発した最高ＭＩ（Ｇ７）を除いて分析した。ＨＥＳ染色腫瘍切片の評価は、全ＦＵＳ治療が安全であると見なされることを示した。全体画像（Ａ）、および未治療および治療組織の各画像の例を示している（各々、ＢおよびＣ）。
【０１４７】
ＮＰの微細分布は、共焦点レーザ走査型顕微鏡を使用して凍結腫瘍切片を対象にイメージングした。これは、ＣＬＳＭを使用してイメージングした治療２時間後の腫瘍内のＮＰの微細分布を示している図１１に提示している。何の超音波治療も受けなかったコントロール群（Ａ）および高圧を用いて治療された群（Ｂ）からの代表的な例。血管は緑色、およびナノ粒子は赤色で示している。治療群（Ｇ６）では、コントロール群と比較してＮＰの増加した送達が観察される。超音波を適用した（ｂ）および適用していない（ａ）腫瘍内の蛍光染料の分布。この画像は、ａ）超音波を用いない場合に比較して、ｂ）超音波を使用した場合における方がおよそ２５０倍高い薬物を示している。
【０１４８】
結論
高圧超音波処理およびしたがってＭＢの強烈な崩壊は、腫瘍へのＮＰの送達を改善することが見出され、ＭＩの増加に伴って取り込みの増加が観察された。しかし、使用した最高ＭＩで出血が観察されたが、これはＭＢと組み合わせた高ＭＩが薬物送達目的のために慎重に使用しなければならないことを示している。
【０１４９】
結果は、このＮＰ−ＭＢプラットフォームが制御された薬物送達のために高度に有用であることを示している。
実施例３
細胞内への薬物の取り込みおよび空および薬物負荷ＰＡＣＡ  ＮＰの細胞傷害性
内在化後の癌細胞への影響を理解するためには、薬物放出を細胞内で測定することが必要である。本発明者らは、ＮＰが同様に内在化後に様々な薬物遊離動態を有することを証明するために、ポリ（ブチルシアノアクリレート）（ＰＢＣＡ）およびポリ（オクチルシアノアクリレート）（ＰＯＣＡ）内にカプセル封入されたモデル薬物ＮＲ６６８（修飾ナイルレッド）を使用した。通常の蛍光イメージングは分解に関する情報をほとんどもたらさないが、（図１２に示したような）蛍光寿命イメージング（ＦＬＩＭ）、フェルスター（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ）磁気共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、発光スペクトル（ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｅｒ）分析および細胞溶解後の経時的イメージング（ｔｉｍｅ−ｌａｐｓ  ｉｍａｇｉｎｇ）は価値のある情報を提供する。
【０１５０】
図１３は、乳癌細胞内へのＮＰの細胞取り込みを証明する。
空ＰＢＣＡ  ＮＰ、カプセル封入カバジタキセルを備えるＰＢＣＡ  ＮＰ、および遊離カバジタキセルの細胞傷害性作用は、乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞＝ヒト上皮乳腺腺癌細胞系）で試験した。細胞生存性を評価するためには、アラマー・ブルーＲ（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅＲ）細胞生存性アッセイを使用した。細胞は、細胞５，０００個／２００μＬ（各ウエルに対する培地）の密度で播種した。３日後、古い培地をウエルから除去し、カプセル封入カバジタキセルおよび遊離カバジタキセルの両方を培地中で希釈し、ウエルに添加した。ＮＰの濃度は、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１，０００ｎｇ／ｍＬの範囲内であった。遊離カバジタキセルの濃度は、ＮＰ中のカバジタキセルの濃度に適合するように選択した。コントロールウエルは、増殖培地中に細胞を含有していた。粒径は空ＮＰについておよそ１２５ｎｍおよび両方の薬物負荷ＮＰについておよそ１６０ｎｍであった。
【０１５１】
ウエルプレートは、３７℃および５％のＣＯ２で２４、４８および７２時間にわたりインキュベートし、その後に培地をウエルから除去し、新鮮増殖培地を用いて３回洗浄した。１０％のアラマー・ブルー（ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ）アッセイを含有する増殖培地を各ウエルに添加し、プレートをさらに３７℃および５％のＣＯ２でさらに３時間インキュベートし、蛍光強度をマイクロプレートリーダーによって測定した（５５０／５９０ｎｍでの励起／発光）。
【０１５２】
結果：
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、用量反応的に、様々な濃度にあるＰＢＣＡ中カプセル封入カバジタキセルおよび遊離カバジタキセルを用いる治療に応答した（図１４）。カプセル封入カバジタキセルの細胞傷害性作用は、遊離カバジタキセルに類似し、粒子からの薬物の遊離の成功を証明している。
【０１５３】
類似の効果は、他のＰＡＣＡ  ＮＰ（ＰＩＨＣＡおよびＰＯＣＡ）および他の細胞系（Ｐ３神経膠腫およびＨｅＬａ細胞）を用いた場合にも見られた。
実施例４
ＦＵＳ媒介性のＢＢＢの開口
方法
ＦＵＳ媒介性のＢＢＢの開口のために、本発明者らは、同一実験中の１．１ＭＨｚおよび７．８ＭＨｚでのＦＵＳを生成でき、ＦＵＳに曝露させた領域の超精細磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）誘導選択を可能にする、最新技術の超音波システムを使用した。ＢＢＢを崩壊させるために、低周波数でのＦＵＳ曝露を使用した。音響放射力の効果を可能にするために、７．８ＭＨｚのより高い周波数でのＦＵＳを使用した。この力は、超音波と伝播組織との間の運動量の移動によって誘発され、この力が細胞外マトリックス内のＮＰ輸送を促進できるという仮説が立てられている。実験は、患者由来ヒト黒色腫細胞の心臓内注射の４週間後に発生した黒色腫脳転移を有する免疫欠損マウスで実施した。ＦＵＳ媒介性のＢＢＢの開口のためには、パーフルオロカーボンＭＢ周りで外殻を形成するＰＩＨＣＡ  ＮＰをベースとするＮＰ−ＭＢプラットフォームを使用した。ＰＩＨＣＡ  ＮＰ−ＭＢは、ＦＵＳ曝露の直前に注射した。ＢＢＢ開口は、ガドリニウムベースの造影剤を使用して評価した。実験後、脳は、凍結、またはホルマリン中に固定した。ＢＢＢを横断するＮＰの輸送および脳組織内の分布は、共焦点顕微鏡を使用して低温切開片で評価した一方（図１７を参照）、組織病理学的変化およびＦＵＳによって誘発される細胞変化は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を使用して評価した。
【０１５４】
結果および結論
図１５は、脳中のＭＲＩ造影剤染料の取り込みを示している。この特異的物質は、通常はＢＢＢを通過しない。そこで、結果は、一過性ＢＢＢ開口を例示している。
【０１５５】
図１６は、ＦＵＳ媒介性ＢＢＢ分布およびＮＰのＢＢＢを越える輸送を示している。ａ）では、ＰＩＨＣＡ−ＭＢプラットフォームと組み合わせたＦＵＳによって媒介されるＢＢＢ開口を見ることができる。ｂ）では、ＦＵＳ曝露後のＢＢＢを越えるＰＩＨＣＡ  ＮＰの輸送を見ることができる。赤色−ＰＩＨＣＡ  ＮＰ、緑色−血管。
【０１５６】
ＢＢＢ開口の成功は、ＭＲＩによって（図１５において示したように）検証した。本発明者らのＮＰ−ＭＢプラットフォームを使用するＦＵＳ媒介性のＢＢＢの崩壊についての最適な窓は、０．３１のメカニカルインデックスの周囲であることが見出された。低温切開片の分析は、ＦＵＳと本発明者らのＮＰ−ＭＢプラットフォームとの組み合わせが÷開口依存的に、ＢＢＢを越えるＮＰの輸送を可能にすることを証明した。組織学的評価は、ＦＵＳ曝露後のある程度の赤血球溢出を示した。血管から離れて脳実質におけるＮＰ分布についての音響放射力の作用、およびＢＢＢの不可欠の部分である流出トランスポーターであるＰ−糖タンパク質へＦＵＳ曝露が及ぼす作用は、現在分析中である。これらをまとめると、本発明者らの結果は、ＰＩＨＣＡ  ＮＰおよびＭＢに基づく本発明者らのプラットフォームを使用して、ＢＢＢを越えて相当量のＮＰを送達することができることを示しており、これは、脳へのＮＰ補助薬物送達における潜在能力を示している。
【０１５７】
実施例５
治療効果のｉｎ  ｖｉｖｏ証明
腫瘍の治療における抗癌薬が負荷されたＮＰと結び付いているＭＢの超音波媒介性薬物送達の効果についてのｉｎ  ｖｉｖｏ試験。
【０１５８】
本試験の目的は、本明細書に記載した薬物送達系が癌を治療する能力、すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて異常な細胞増殖および腫瘍の収縮を停止させることを調査することであった。本発明の潜在能力を証明するために使用した癌細胞は、乳癌細胞であり、治療薬はカバジタキセルであった。
【０１５９】
・  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞が、第０日にヌードマウスに皮下移植された。
・  腫瘍は、最長方向に径が４ｍｍに達するまで増殖させた（一部は４よりわずかに長く、一部は４よりわずかに短い）。
【０１６０】
・  各群には、動物４匹を含めた。第１群：生理的食塩水。第２群：カバジタキセルが負荷されたＮＰと結び付いているマイクロバブル。第３群：カバジタキセルが負荷されたＮＰと結び付いているマイクロバブルおよび超音波。
【０１６１】
・  注射した用量は静脈内で２００μＬ、動物１匹当たり計２ｍｇのナノ粒子、およびおよそ１０ｍｇ／ｋｇのカバジタキセルであった。
・  超音波治療を事前に最適化し、０．５のＭＩを使用した。
【０１６２】
・  マウスは、第２１日および第２９日に治療した。
・  イマソニック（ｉｍａｓｏｎｉｃ）１ＭＨｚトランスデューサが作動を停止したので、第２回超音波治療はＦＵＳ装置とともに実施しなければならなかった。腫瘍領域をカバーするために、１６（４×４）カ所のスポットを走査した。小さな焦点のために、トランスデューサを走査しなければならなかった。各スポット内では、１０，０００サイクルが与えられ、３．５秒間中に１６カ所のスポットを走査した。全治療時間は、以前のイマソニック（ｉｍａｓｏｎｉｃ）を用いた２分間から、ＦＵＳ装置を用いた場合には３．５分間に増加した。
【０１６３】
・  腫瘍増殖は、カリパスを使用して測定した。
試験の結果は図１７〜１９に提示している。
結論
本試験は、腫瘍への治療薬の強化された送達を証明し、本発明による薬物送達系の治療効果を示している。
【０１６４】
コントロール群（生理的食塩水）の腫瘍は、図１８における上方（＝青色）曲線を用いて例示したある速度で増殖する。ナノ粒子および細胞増殖抑制薬（カバジタキセル）を含有するマイクロバブルを用いて治療された動物は、減少した腫瘍増殖を示す（中央の曲線＝赤色曲線）。マイクロバブルおよび細胞増殖抑制薬が充填されたナノ粒子に加えて超音波を用いて治療された動物は、腫瘍増殖が停止し、腫瘍が収縮し、動物４匹中２匹がこの時点に治癒されている（下方曲線＝緑色曲線）ことを示している。図１８および１９は、この治療を用いて達成された効果を示している。動物の体重は全３群について治療中および治療後に安定であり（図１７を参照）、治療が良好に忍容されることを証明した。
【０１６５】
図１７：時間の関数としての動物の体重は、３つの異なる治療群についての平均値と標準偏差として示している。ｎ＝動物４匹／群。第０日は、腫瘍細胞の移植日である。治療は第２１日および第２９日に実施した。
【０１６６】
図１８：時間の関数としての腫瘍容積は、３つの異なる治療群についての平均値と標準偏差として示している。第１群：コントロール、生理的食塩水。第２群：ナノ粒子および細胞増殖抑制薬（カバジタキセル）と結び付いているマイクロバブル。第３群：超音波ならびにナノ粒子および細胞増殖抑制薬と結び付いているマイクロバブル。ｎ＝動物４匹／群。第０日は、腫瘍細胞の移植日である。治療は第２１日および第２９日に実施した。
【０１６７】
図１９：３つの異なる治療群についての腫瘍細胞移植後第３５日の腫瘍容積。ｎ＝動物４匹／群。平均値と標準偏差を示している。
実施例６：薬物負荷ＰＥＢＣＡ  ＮＰおよびＰＥＢＣＡ安定化マイクロバブルの生成
ナノ粒子およびマイクロバブルの合成および特性解析
ＰＥＧ化ＰＥＢＣＡ  ＮＰは、以前に記載されたミニエマルション重合によって合成した（メルヒ（Ｍｏｒｃｈ）ら著、２０１５年）。簡潔に述べると、０．１重量％のメタンスルホン酸（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社、セントルイス、ミズーリ州、米国）、２重量％のミグリオール（Ｍｉｇｌｙｏｌ）８１２（補助安定剤、クレマー（Ｃｒｅｍｅｒ）社、シンシナティ、オハイオ州、米国）および０．８重量％のアゾビス−ジメチルバレロニトリル（Ｖ６５、油溶性ラジカル開始剤、和光、大阪府、日本国）を含有する２−エチル−ブチルシアノアクリレート（モノマー、ヘンケルロックタイト（Ｈｅｎｋｅｌ  Ｌｏｃｔｉｔｅ）、デュッセルドルフ、独国）からなる油相を調製した。光学イメージングのための蛍光粒子は、油相にＮＲ６６８（改質ナイルレッド（ＮｉｌｅＲｅｄ）（クリムチェンコ（Ｋｌｙｍｃｈｅｎｋｏ）ら著、２０１２年）、カスタム合成、０．５重量％）もしくはＩＲ−７８０脂質（近赤外線染料、カスタム合成、ＣＥＡ社、グルノーブル、フランス、０．５重量％）のいずれかを加えることによって調製した。治療のための細胞増殖抑制薬を含有する粒子は、油相にカバジタキセル（１０重量％、バイオケムパートナー（Ｂｉｏｃｈｅｍｐａｒｔｎｅｒ）社、武漢市、湖北省、中国）を加えることによって調製した。
【０１６８】
ブリッジ（Ｂｒｉｊ）Ｌ２３（１０ｍＭ、２３ＰＥＧ単位、ＭＷ１２２５、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社）およびコリフォール（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ）ＨＳ１５（１０ｍＭ、１５ＰＥＧ単位、ＭＷ９６０、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）社）を含有する０．１ＭのＨＣｌからなる水相を油相に加え、直ちに氷上で３分間にわたり超音波処理した（６×３０秒間の間隔、６０％の振幅、ブランソン・ウルトラソニックス（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ）デジタルソニファイヤー（ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ）４５０、ダンベリー、コネティカット州、米国）。この溶液は室温で１時間にわたり磁気攪拌を持続し、その後に０．１ＭのＮａＯＨを使用してｐＨを５に調整した。重合は室温で２時間継続し、その後に溶液を回転させながら（１５ｒｐｍ）、８時間にわたり温度を５０℃へ上昇させた。分散液は、未反応ＰＥＧを除去するために１ｍＭのＨＣｌに対して透析した（スペクトル／ポア（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ）透析膜、ＭＷＣＯ  １００，０００Ｄａ、スペクトラム・ラブズ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ）、ランチョ・ドミンゲス（Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ）、カリフォルニア州、米国）。透析液は、３回交換した。ＮＰプラットフォームのＰＥＧ化に関する詳細は、以前に公表されている（バグヒロフ（Ｂａｇｈｉｒｏｖ）ら著、２０１７年、メルヒ（Ｍｏｒｃｈ）ら著、２０１５年、エースルント（Ａｓｌｕｎｄ）ら著、２０１７年）。ＮＰのサイズ、多分散性指数（ＰＤＩ）およびゼータ電位は、ゼータサイザ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ）ナノＺＳ（マルヴァーン・インスツルメンツ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）社、マルヴァーン、英国）を使用して動的光散乱法によって測定した。カプセル封入薬物の量を計算するために、薬物は、薬物をアセトン中に溶解させる（１：１０）ことによって抽出し、質量分析計と結合した液体クロマトグラフィ（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１２９０  ＨＰＬＣと結合されたアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）６４９０トリプル四重極、アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国）によって定量した。
【０１６９】
ＮＰ安定化ＭＢ（ＮＰＭＢとも呼ばれる）は、上述したようにリン酸緩衝生理的食塩水中の０．５％のカゼインの添加およびウルトラ−タラックス（Ｕｌｔｒａ−ｔｕｒｒａｘ）（Ｔ−２５、ＩＫＡＷｅｒｋｅ社、シュタウフェン、独国）を使用した強力な攪拌によって気液界面でのＮＰ（１重量％、１０ｍｇ／ｍＬ）の自己集合によって調製した（メルヒ（Ｍｏｒｃｈ）ら著、２０１５年）。循環時間を増加させるために、空気の代わりにパーフルオロプロパン（Ｆ２ケミカルズ（Ｆ２  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社、プレストン、ランカシャー州、英国）を使用した。平均ＭＢ径、サイズ分布および濃度は、光学顕微鏡および画像分析（イメージＪ（ＩｍａｇｅＪ）１．４８ｖ、国立衛生研究所、ベテスダ、マサチューセッツ州、米国）を使用して決定した。ＮＰＭＢ溶液は、遊離ＮＰおよびＮＰＭＢの組み合わせであり、わずかなパーセンテージのＮＰのみがＭＢに所在している。ＭＢは、下記に記載するように音響的破壊に関して特性解析した（実施例８）。
【０１７０】
結果：
ナノ粒子およびマイクロバブルの特性解析
ＮＰは、１４０〜１９５ｎｍの範囲内の径（ｚ平均）、０．２未満のＰＤＩ、−１〜−２．５ｍＶの範囲内にあるゼータ電位を有していた。決定されたカバジタキセルの負荷効率は、１００％に近く、薬物ペイロードは１０重量％であった。
【０１７１】
自己集合ＭＢは、２．６±１．３μｍの平均径を有していた。ＭＢの濃度は、およそ５＊１０８ＭＢ／ｍＬであった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ流動ファントムにおける特性解析から、ＭＢは、０．１のＭＩでは崩壊を示さず、０．２のＭＩでは部分崩壊および０．５のＭＩでは完全崩壊を示した。
【０１７２】
実施例７：皮下異種移植片腫瘍の治療
動物および腫瘍
全実験手法は、ノルウェー動物研究委員会（Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）によって承認された。雌性Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（エンビゴ（Ｅｎｖｉｇｏ）社、ケンブリッジシャー、英国）は、体重１６〜２１ｇの７〜８週齢の時点に購入した。それらは特定病原体無含有条件下で、２２〜２３℃の温度、５０〜６０％の相対湿度、１時間当たり７０回空気交換され、飼料および無菌水に随意に接近できる、個別の換気装置付きケージ（１２８４Ｌ型、テクニプラスト（Ｔｅｃｎｉｐｌａｓｔ）社、リオン、仏国）内に１群４〜５匹ずつで収容した。
【０１７３】
皮下異種移植片腫瘍は乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から増殖させた。動物には、Ｏ２およびＮＯ２中の２〜３％のイソフルラン（バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）社、ディアフィールド、イリノイ州、米国）の吸入によって麻酔をかけ、その後に細胞３×１０６個を含有する培地５０μＬを膝と股関節の間で左後肢の左側面上に緩徐に皮下注射した。続く数週間中、週に２〜３回、動物の体重を計量し、腫瘍はカリパスを用いて測定した。腫瘍容積は、πｌｗ２／６（式中、ｌおよびｗは、各々腫瘍の長さおよび幅である）で計算した。腫瘍増殖は、動物の体重に影響を及ぼさなかった。
【０１７４】
実験中、動物は、体重１０ｇ当たり０．１ｍＬの用量でのフェンタニル（０．０５ｍｇ／ｋｇ、アクタヴィス・グループＨＦ（Ａｃｔａｖｉｓ  Ｇｒｏｕｐ  ＨＦ）、ハーフナルファーディ（Ｈａｆｎａｒｆｉｒｄｉ）、アイスランド）、メデトミジン（０．５ｍｇ／ｋｇ、オリオンファルマ（Ｏｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ）社、オスロ、ノルウェー）、ミダゾラム（５ｍｇ／ｋｇ、アコード・ヘルスケア・リミテッド（Ａｃｃｏｒｄ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、ノースハーロウ（Ｎｏｒｔｈ  Ｈａｒｒｏｗ）、英国）、水（２：１：２：５）の皮下注射によって麻酔をかけた。必要な場合は、体重１０ｇ当たり０．１ｍＬの用量でアチペマゾール（ａｔｉｐｅｍａｚｏｌ）（２．５ｍｇ／ｋｇ、オリオンファルマ（Ｏｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ）社、オスロ、ノルウェー）、フルマゼニル（０．５ｍｇ／ｋｇ、フレゼニウス・カービ（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ）、バート・ホムブルク・フォア・デア・ヘーエ（Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ  ｖｏｒ  ｄｅｒ  Ｈｏｅｈｅ）、独国）、水（１：１：８）の皮下注射を解毒剤として使用することによって麻酔を終了させた。全実験中、動物の体温は外部加熱によって維持し、眼はヴィスコティアーズ（Ｖｉｓｃｏｔｅａｒｓ）液体ゲル（アルコン（Ａｌｃｏｎ）社、フォートワース（Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈ）、テキサス州、米国）を用いて湿潤状態を維持した。実験の終了時に、麻酔をかけた動物は、頸椎脱臼によって安楽死させた。
【０１７５】
超音波の構成
１ＭＨｚの中心周波数を備える特注の単一要素集束トランスデューサ（イマソニック（Ｉｍａｓｏｎｉｃ）社、ブザンソン、仏国）を使用した。信号は、波形発生装置（３３５００Ｂ、アジレント・テクノロジーズ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社、サンタクララ、カリフォルニア州、米国）によって生成し、５０ｄＢの電力増幅器（２１００Ｌ、Ｅ＆Ｉ社、ロチェスター、ニューヨーク州、米国）によって増幅させた。トランスデューサは水室の底部に取り付け、吸収材を備えた蓋を水面に配置した。動物を蓋の上に配置し、１０ｍｍの開口部に通して腫瘍担持脚を水中に下げた。腫瘍は、腫瘍全体を被覆するために１９０ｍｍの距離をあけてＦＵＳビームの遠距離場に配置した。タンク内の水は、低体温症およびマウス脚中の血流の変化を回避するために、３４℃に加熱した（トリクシー（Ｔｒｉｘｉｅ）アクアプロヒータ、ズーペルマークド（Ｚｏｏｐｅｒｍａｒｋｅｄ）、ホイビュルク、デンマーク）（ヒヴェリン（Ｈｙｖｅｌｉｎ）ら著、２０１３年）。トランスデューサは、５０ｍｍの径および１２５ｍｍの焦点距離を有していた。トランスデューサは、ハイドロフォン（ＨＧＬ−０２００、オンダ（Ｏｎｄａ）社、サニーベール、カリフォルニア州、米国）を使用して水タンク内で解析した。１９０ｍｍでの側方３ｄＢおよび６ｄＢビーム幅は、各々６ｍｍおよび１０ｍｍの径を有していた。軸方向においては、２１０ｍｍでは圧力の３ｄＢの減少が測定された。
【０１７６】
マイクロバブル崩壊の特性解析
ＮＰＭＢの崩壊は、流動を蠕動式ポンプによって駆動させたｉｎ  ｖｉｔｒｏ流動ファントム（モデル５２４、ＡＴＳラボラトリーズ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ブリッジポート（Ｂｒｉｄｇｅｐｏｒｔ）、コネティカット州、米国）内でＮＰＭＢをイメージングすることによって評価した。ＮＰＭＢは、０．１、０．２および０．５のＭＩで１ＭＨｚのトランスデューサ（イマソニック（Ｉｍａｓｏｎｉｃ））を使用して、ファントムのチューブに通して流動させながら超音波処理した（１，０００サイクル、ＰＲＦ＝１００Ｈｚ）。同時に、超音波処理領域から下流のチューブの区間は、臨床的ＵＳスキャナーによってコントラストモードで０．０７のＭＩでパルス反転を使用してイメージングした（Ｖｉｖｉｄ  Ｅ９スキャナーおよび９Ｌトランスデューサ、ＧＥヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、シカゴ、イリノイ州、米国）。ＭＢの崩壊は、目視検査によって決定した。
【０１７７】
超音波曝露の最適化
上述したＭＢと組み合わせた様々な音響的設定が腫瘍組織内でのＮＰ蓄積にどのような影響を及ぼすかを調査するために、マウス１８匹における皮下腫瘍は、最長方向におよそ７〜８ｍｍおよびおよそ１２０〜２５０ｍｍ３の容積に達するまで４〜８週間増殖するに任せた。動物に麻酔をかけ、外側尾静脈にカニューレ穿刺し、ＮＲ６６８を含有するＮＰＭＢは、１０ｍｇ／ｍＬのＮＰ（１００ｍｇ／ｋｇ）を備える２００μＬの用量で静脈内注射した。ＵＳ治療は、注射を開始した時点に開始した。マウスは、様々な群に無作為に分配し、腫瘍は様々なＦＵＳ治療により治療された。音響圧は、０．１〜１ＭＰａ（０．１〜１の範囲に及ぶＭＩ）の範囲に及んだ。全腫瘍（第４群を除く）は０．５秒間の治療について１００ミリ秒毎に（局所的ＰＲＦ  １０Ｈｚ）１０，０００サイクル（１０ミリ秒）のバーストを受け、その後に１．５秒間の中断を続けた（包括的ＰＲＦ、０．５Ｈｚ、および全デューティサイクル２．５％）。ＭＢ崩壊が予想された群では、新規なＭＢが腫瘍に到達することを許容するためには超音波処理領域内でのＭＢの再潅流が重要であったので、０．５ＨｚのＰＲＦを使用した。最高圧に対しては、３サイクルの短いフラッシュについても調査した。全処理時間は、２分間であった。
【０１７８】
カバジタキセルをカプセル封入したナノ粒子−マイクロバブルを用いたトリプルネガティブ乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片の治療
腫瘍は、それらが最長方向におよそ４ｍｍに達するまで３週間にわたり増殖するに任せた。動物群およびコントロール群の数は、「３Ｒ」（置き換え、削減、純化）にしたがって、本パイロット試験において少数で維持した。動物１２匹を３群に無作為に分配した：
１．  生理的食塩水が注射された動物、コントロール群
２．  カバジタキセルを含有するＭＰＭＢが注射された動物
３．  カバジタキセルを含有するＭＰＭＢが注射された動物および以前に記載したＵＳ治療に曝露された腫瘍（ＭＩ＝０．５）。
【０１７９】
マウスは、２週間にわたって続けて治療した（細胞の移植後第２１日および第２９日）。治療当日、動物には麻酔をかけ、尾静脈にカニューレ穿刺した。実施例６に記載したように生成した２００μＬの生理的食塩水もしくはＮＰＭＢの静脈内ボーラスを投与した。バブル溶液中のＮＰの濃度は１０ｍｇ／ｍＬであり、動物１匹当たり２ｍｇのＮＰの総用量、したがって１０ｍｇ／ｋｇのカバジタキセルを生じさせた。この用量は、文献（ｌｉｔｔｅｒａｔｕｒｅｓ）（セミオンド（Ｓｅｍｉｏｎｄ）ら著、２０１３年、ブリグノウド（Ｖｒｉｇｎａｕｄ）ら著、２０１４年、ブリグノウド（Ｖｒｉｇｎａｕｄ）ら著、２０１３年）に基づいて選択した。最初の治療のために、様々なＭＩの最適化からの最適ＵＳ治療を使用した（実施例８に記載したように０．５のＭＩを備える群）。第２治療は、１．１ＭＨｚの周波数を備えるまた別のトランスデューサ（ＲＫ−１００システム、アパーチャ５２ｍｍおよび焦点距離６０ｍｍ、ＦＵＳインスツルメンツ（Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、トロント、オンタリオ州、カナダ）を用いて実施した。焦点径がより小さいために、腫瘍領域を被覆するトランスデューサを走査した。１６スポット（４×４）を３．５秒間中で走査した。各スポット内で、１０，０００サイクルのバーストを送信した。第２治療時間の全治療は、この治療をイマソニック（Ｉｍａｓｏｎｉｃ）トランスデューサを用いた初回治療とできる限り類似させるように、６０回の超音波処理を達成するために２分間から３．５分間へ増加させた。側方３ｄＢおよび６ｄＢビーム幅は、各々１．３および１．６ｍｍであったが、軸方向では４ｃｍが３ｄＢ限度内の圧力を有している。
【０１８０】
治療後、麻酔を終了させるために解毒剤を投与し、動物は、回復期間中の低体温症を回避するために翌朝まで回復ラック内に配置した。ラックは、２８℃の温度を維持した。治療後の数日間に、動物には固形食品への補助食品としてダイエット・ゲル（Ｄｉｅｔ  ｇｅｌ）ブースト（ｂｏｏｓｔ）、（クリアＨ２Ｏ（ＣｌｅａｒＨ２Ｏ）社、ウェストブルック、メイン州、米国）を与えた。腫瘍増殖はカリパスを使用して測定し、動物の体重は治療終了後の１４週間にわたり１週間当たり２回計量した。動物が安楽死させられる人道的終点の基準は、１５ｍｍ径の腫瘍サイズもしくは１５％の体重低下であった。
【０１８１】
統計解析
対応のない両側ｔ検定を使用して、第１群と第６群との間のＮＰ取り込みにおける差が統計的有意であるかどうかを評価した（エクセル（Ｅｘｃｅｌ）２０１０、マイクロソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）社、レッドモンド、ワシントン州、米国）。０．０５未満のｐ値は、統計的有意であると見なした。
【０１８２】
結果：
カバジタキセルを含有するナノ粒子−マイクロバブルを用いた腫瘍の治療
本試験は、原理証明として、腫瘍組織へのＮＰの増加した送達がカプセル封入細胞増殖抑制薬による治療を改良するために十分であるかどうかを評価するために実施した。
【０１８３】
３群の治療群についての平均腫瘍増殖は、図２１に示している。
未治療動物（生理的食塩水）は、連続的腫瘍増殖を示し、移植後第６２日、第６９日および第７２日に腫瘍が１５ｍｍに達した時点に犠死させた。カバジタキセルをカプセル封入しているＮＰＭＢを用いて治療された群は、未治療動物に比較して減少した腫瘍増殖を示し、全動物が治療に応答したが、動物間の腫瘍容積には大きな変動が見られた。腫瘍は、移植後およそ８０日後には再増殖し始めた（治療終了後５０日）。動物１匹は、腫瘍が１５ｍｍに達した時点の第１２０日に犠死させたが、別の２匹は試験終了時にまだ生存しており、腫瘍の長さは１３ｍｍおよび４．５ｍｍであった。カバジタキセルを含むＮＰＭＢに加えてＦＵＳを用いて治療された群は、腫瘍増殖においてより大きな減少を示し、および第４８日から、全動物は完全緩解した。治療終了後約１００日である試験の終了時に、全動物は依然として生存しており、完全緩解していた（図２１参照）。
【０１８４】
動物は、コントロール群動物もカプセル封入されたカバジタキセルおよびＦＵＳを用いて治療された動物も、治療を原因とする体重減少を全く示さなかった。
実施例８：同所性乳癌（６７ＮＲ細胞）の治療
ＮＰおよびソノビュー（ＳｏｎｏＶｕｅ）の同時注射ならびに超音波媒介性送達と比較して、ＮＰの超音波媒介性送達とともにＮＰ安定化ＭＢを含む送達系を用いて達成された本質的な差を探索するために、概念実証実験を設計した。この実験では、実施例６で記載したように生成したカバジタキセル負荷ＰＥＢＣＡ安定化ＭＢを使用した。
【０１８５】
反復治療を受けていたマウスについて時間の関数としての腫瘍増殖を比較し、腫瘍内のカバジタキセル取り込みについては単回治療を受けていたマウスと比較し、治療の６時間後に犠死させた。
【０１８６】
ＮＰ安定化ＭＢの組成物は、５．６５Ｅ＋０８（平均サイズ２．９１）の濃度で投与した。
計３０匹の雌性ｂａｌｂ／ｃマウスに、第１日に乳腺脂肪体内の２０μＬの６７ＮＲ腫瘍細胞（細胞５００，０００個）の注射を投与した。細胞は、シャリニ・ラオ（Ｓｈａｌｉｎｉ  Ｒａｏ）によって増殖および調製され、注射はトンジェ・スタイゲダール（Ｔｏｎｊｅ  Ｓｔｅｉｇｅｄａｌ）によって与えられた。治療試験には１６匹のマウスを含んでおり、様々な日にカバジタキセルを含有するＮＰ／ＮＰＭＢの３回の注射を投与し、８匹には１回だけＮＰおよびＮＰＭＢを投与し、注射の６時間後に犠死させ、５匹は様々なＭＩでの超音波の試験のために使用し、１匹は不良な健康状態のために第７日に犠死させなければならなかった（ストレスおよび低体重）。
【０１８７】
治療試験
【０１８８】
【表１】
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【０１８９】
治療試験に含めたマウスには３回の機会である腫瘍細胞の接種後第８日、第１２日および第１６日に同一治療を与えた。第７日および第８日に全マウスを試験し、治療試験のためには最大腫瘍を有していたマウスを選択した。
【０１９０】
超音波
本発明者らは、新規なＥ＆Ｉ  ５０ｄＢ増幅器およびアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）信号発生器と組み合わせてイマソニックス（Ｉｍａｓｏｎｉｃｓ）１ＭＨｚトランスデューサを使用した。マウスはトランスデューサ表面から２０ｃｍ離して配置し（遠距離場）、３ｄＢビーム幅は９〜１０ｍｍであった。０．５のメカニカルインデックス（ＭＩ）を達成するために、本発明者らは、５０ｄＢ増幅器への入力として２７０ｍＶｐｐを使用した。
【０１９１】
ＭＩ＝０．５
バースト：１０，０００サイクル
ＰＲＦ＝０．５Ｈｚ
持続時間：４分間
カバジタキセルの用量
本実験のために、カバジタキセルを含むナノ粒子を用いたバッチＢＣ−１を使用した。ＮＰＭＢ溶液中のＮＰの量は、１ｍＬのＮＰＭＢ当たり１ｍｇのカバジタキセルの濃度に対応した。これは、２００μＬのＮＰＭＢの注射中の０．２ｍｇの用量、したがって体重２０ｇのマウスにおいて１０ｍｇ／ｋｇを生じさせるであろう。ＮＰＭＢのバブル濃度は極めて高いので（ソノビュー（ＳｏｎｏＶｕｅ）と類似もしくはより高い）、本発明者らは、注射された気泡の総数が第２群および第３群と同一になるようにＮＰＭＢの量を１５０μＬに減少させることを決定した。したがって、各実験において投与されたカバジタキセルの総用量は、２０ｇのマウスに対して７．５ｍｇ／ｋｇの用量に対応する０．１５ｍｇであった。ＢＣ−１溶液を１：３に希釈し、１ｍＬの生理的食塩水は０．５ｍＬのＢＣ−１を含有するバイアルに加えた。これは、３ｍｇ／ｍＬの濃度を生じさせたので、５０μＬの注射は０．１５ｍｇのカバジタキセルを含有していた。
【０１９２】
治療
コントロール：マウスは２００μＬの注射麻酔薬（ｓｃ）によって麻酔をかけ、２００μＬの解毒剤によって覚醒させ、翌朝まで回復ラック内に配置した。注射は投与しなかった。
【０１９３】
ＮＰ＋ソノビュー（ＳｏｎｏＶｕｅ）＋ＵＳ：マウスは、２００μＬの注射麻酔薬（ｓｃ）によって麻酔をかけた。ベンフロン（Ｖｅｎｆｌｏｎ）は外側尾静脈に配置し、マウスを水タンクの上に置いた。５０μＬのＮＰを注射し、その後に１５０μＬのソノビュー（ＳｏｎｏＶｕｅ）を注射した（５〜７秒間中に注射した）。ソノビュー（ＳｏｎｏＶｕｅ）注射を開始する直前に超音波のスイッチを入れ、注射が終了した時にタイマーをスタートさせた。
【０１９４】
マウスは治療後間もなく２００μＬの解毒剤（ｓｃ）によって覚醒させ、翌朝まで回復ラック内に配置した。
ＮＰＭＢ＋ＵＬ：マウスは、２００μＬの注射麻酔薬（ｓｃ）によって麻酔をかけた。ベンフロン（Ｖｅｎｆｌｏｎ）は外側尾静脈に配置し、マウスは水タンクの上に置いた。１５０μＬのＮＰＭＢを５〜７秒間中に注射した。超音波のスイッチをＮＰＭＢ注射を開始する直前に入れ、注射が終了した時にタイマーをスタートさせた。
【０１９５】
マウスは治療後間もなく２００μＬの解毒剤（ｓｃ）によって覚醒させ、翌朝まで回復ラック内に配置した。
腫瘍増殖および重量
腫瘍は、第８、１０、１２、１６、１９、２２および２４日にカリパスを用いて測定した。結果は図２２に示している。
【０１９６】
４つの最大腫瘍は全部がコントロール群に含まれ、３つの最小腫瘍はＮＰＭＢ群にある。最小コントロール腫瘍と比較すると、ＮＰ＋ソノビュー（ＳｏｎｏＶｕｅ）群およびＮＰＭＢ群にある腫瘍は、サイズが類似している。
【０１９７】
第２４日に、全マウスを犠死させ、腫瘍を切除して計量した。結果は、ＮＰＭＢ群の平均はソノビュー（ＳｏｎｏＶｕｅ）群より小さいが、様々な群間で一部の重複が見られることを示した。
【０１９８】
実施例９：神経膠腫を治療するためのＮＰ安定化ＭＢ
神経膠腫細胞系は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの頭蓋内に注射した。神経膠腫は侵襲性であることが証明され、マウスは無傷ＢＢＢを有していたが、これは薬物送達系がＢＢＢ中を横断する能力および中枢神経系内の腫瘍増殖にＮＰＭＢおよびＵＳが及ぼす作用を評価するための優れたモデルにさせた。
【０１９９】
腫瘍増殖は、ＭＲＩを用いて週１回監視した。腫瘍は移植４週間後からイメージングし、治療は移植のおよそ６週間後に開始した。３週間にわたりマウスを３回治療するためにＭＲ−ＦＵＳシステムを使用した。治療前に、ＭＲ−ＦＵＳシステムの設定を最適化した。
【０２００】
マウスは４群に分けた：第１群はコントロールであり、いずれの治療も受けず、第２群にはカバジタキセル単独を注射し、第３群にはカバジタキセルをＮＰＭＢと一緒に注射し、第４群にはカバジタキセル負荷ＮＰＭＢを注射した。実施例６に記載したように生成したカバジタキセル負荷ＰＥＢＣＡ安定化ＭＢを使用し、第３群および第４群には腫瘍を被覆する領域（モータ駆動ステージ上で移動する１．２ｍｍ離れた４カ所の位置）にＵＳを適用した。使用した超音波設定は：１．２ＭＨｚ、０．３８ＭＰａ、１０ミリ秒バースト、４分間であり、各位置は毎秒１回超音波処理した。ＮＰＭＢは、１回目は治療開始時に、および２回目は治療の２分間後に、２回のボーラスで注射した。ナノ粒子は、蛍光顕微鏡によってそれらを追跡できるように蛍光標識した。
【０２０１】
治療を評価するために４つの読み出しを使用した：１）腫瘍増殖；２）腫瘍内でのカバジタキセルの定量（質量分析法によって）、３）腫瘍内へのＮＰ取り込み（腫瘍切片の共焦点レーザス走査型顕微鏡法によって）；４）腫瘍組織の組織学検査。
【０２０２】
結果：
治療試験が完了した後、様々な群における腫瘍サイズが観察された。観察所見は、コントロール群と比較して、ＵＳとともにカバジタキセル負荷ＮＰＭＢを用いて治療した群では有意に減少した腫瘍増殖を明らかにした。結果は、カバジタキセル負荷ＮＰが本発明による送達系において使用しされた場合にＢＢＢを透過する能力、ならびに頭蓋内神経膠腫に及ぼす当該送達系の治療効果を証明している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年7月11日(2018.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガス充填マイクロバブル、前記ガス充填マイクロバブルと結び付いた複数のナノ粒子、および少なくとも１つの前記ナノ粒子と結び付いた少なくとも１種の治療薬を含む、療法において使用するための薬物送達系であって、
前記薬物送達系は、遊離ナノ粒子、および少なくとも１つの遊離ナノ粒子と結び付いている少なくとも１種の治療薬をさらに含み、
前記ナノ粒子は、ポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）ナノ粒子であり、
前記薬物送達系は、全身性で投与され、音場が標的部位への前記ナノ粒子および／または前記少なくとも１種の治療薬の送達を媒介するために放出部位で生成される薬物送達系。
【請求項２】
前記ガス充填マイクロバブルと結び付いた前記ナノ粒子は、前記ガス充填マイクロバブルに表面付着している、請求項１に記載の薬物送達系。
【請求項３】
前記少なくとも１種の治療薬は、前記ナノ粒子内に負荷されている、請求項１〜２のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項４】
前記ガス充填マイクロバブルと結び付いている前記ナノ粒子は、前記マイクロバブルを安定化させている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項５】
前記ナノ粒子は、少なくとも１種の標的化剤をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項６】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項７】
前記ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でさらにコーティングされている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項８】
ナノ粒子と結び付いている前記ガス充填マイクロバブルの平均径は、０．５〜３０μｍの範囲内にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項９】
前記治療薬は、化学療法薬もしくは化学増強剤である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項１０】
前記ガス充填マイクロバブルには、空気、パーフルオロカーボン、Ｎ２、Ｏ２、ＣＯ２からなる群から選択されるガスが充填されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項１１】
前記音場は、例えば焦点式超音波などの超音波によって生成される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項１２】
前記マイクロバブルは、それへの焦点式超音波の適用後に破壊され得る、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の薬物送達系。
【請求項１３】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の療法において使用するための薬物送達系を調製するための方法であって、
ａ．  前記治療薬が負荷される前記ナノ粒子を合成する工程、
ｂ．  界面活性物質を含む溶液にナノ粒子を加える工程、
ｃ．  ガス充填バブルを得るために溶液とガスとを混合する工程を含む方法。
【請求項１４】
前記マイクロバブルは、気液界面中のナノ粒子の自己集合によって安定化される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１５】
所望のサイズのマイクロバブルを得るために、前記溶液がガスと所望の時間および／または所望の速度で混合される、請求項１４〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ｃ）内の前記溶液が２秒間〜６０分間、優先的には１〜１０分間混合される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ｃ）内の前記溶液が５００〜５０，０００ｒｐｍ、優先的には１，０００〜３０，０００ｒｐｍで混合される、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記界面活性物質は、血清、タンパク質もしくは脂質または界面活性剤である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ガス充填マイクロバブル、前記マイクロバブルと結び付いた複数のナノ粒子、および１つ以上のナノ粒子と結び付いた１種以上の治療薬を含む、療法において使用するための組成物であって、
前記組成物は、少なくとも１つの遊離ナノ粒子、および前記ナノ粒子と結び付いている１種以上の治療薬をさらに含み、
前記ナノ粒子は、ポリ（アルキルシアノアクリレート）（ＰＡＣＡ）ナノ粒子、例えばポリ（エチルブチルシアノアクリレート）（ＰＥＢＣＡ）ナノ粒子である、組成物。
【請求項２０】
前記マイクロバブルと結び付いている前記複数のナノ粒子は、前記ガス充填マイクロバブルに表面付着している、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２１】
前記治療薬は、前記ナノ粒子内に負荷されている、請求項２０〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ガス充填マイクロバブルと結び付いている前記複数のナノ粒子は、前記マイクロバブルを安定化させている、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ナノ粒子は、少なくとも１種の標的化剤をさらに含む、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でさらにコーティングされている、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
複数のナノ粒子と結び付いている前記ガス充填マイクロバブルの平均径は、０．５〜３０μｍの範囲内にある、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記治療薬は、化学療法薬もしくは化学増強剤である、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ガス充填マイクロバブルには、空気、パーフルオロカーボン、Ｎ２、Ｏ２、ＣＯ２からなる群から選択されるガスが充填されている、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の組成物。
【国際調査報告】
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