(57)【要約】  核酸のシークエンシング中に検出器から取得されたデータに基づいてヌクレオチドを同定するシステムと方法である。方法は、ヌクレオチド取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程を含む。特性は、各ヌクレオチド取り込みイベントについて光の時間特性と光の強度特性とを含む。時間特性は、励起後の蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す。方法は、ヌクレオチドの取り込みイベントの特性を示す点を点からなるグループにグループ分けする工程をさらに含む。各点は、対応するヌクレオチドの取り込みイベントについて少なくとも時間特性と強度特性とを表示する。方法は、点からなるグループを各ヌクレオチドに割り当てる工程をさらに含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１蛍光標識が第１蛍光標識の励起に応答して光を放出した時間に関する第１時間ビン情報を受信する工程と、
前記第１時間ビン情報に基づいて第１光強度情報を計算する工程と、  
第２蛍光標識が第２蛍光標識の励起に応答して光を放出した時間に関する第２時間ビン情報を受信する工程と、
前記第２時間ビン情報に基づいて第２光強度情報を計算する工程と、
前記第１光強度情報と前記第２光強度情報とを用いてヌクレオチドの取り込みイベントが生じた時間を計算する工程と、
からなる方法。
【請求項２】
前記ヌクレオチドの取り込みイベントが生じた時間を計算する工程は、パルス同定アルゴリズムを用いて実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記パルス同定アルゴリズムは、変化点アルゴリズム、活動平均／中間値及び分散アルゴリズム、又は状態機械アルゴリズムからなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第１光強度情報を計算する工程は、第１時間ビン情報を合計する工程からなり、第２光強度情報を計算する工程は、第２時間ビン情報を合計する工程からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第１蛍光標識が第１蛍光標識の励起に応答して第１光を放出した時間に関する第１時間ビン情報を受信する工程と、
前記第１時間ビン情報に基づいて前記第１光の第１時間特性を計算する工程であって、前記第１時間特性は、励起後の第１蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す、前記第１光の第１時間特性を計算する工程と、
第２蛍光標識が第２蛍光標識の励起に応答して第２光を放出する時間に関する第２時間ビン情報を受信する工程と、
前記第２時間ビン情報に基づいて前記第２光の第２時間特性を計算する工程であって、前記第２時間特性は、励起後の第２蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す、前記第２光の第２時間特性を計算する工程と、
前記第１時間特性と前記第２時間特性とを用いてヌクレオチドの取り込みイベントが生じた時間を計算する工程と、
からなる方法。
【請求項６】
前記ヌクレオチドの取り込みイベントが生じた時間を計算する工程は、パルス同定アルゴリズムを用いて実行される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記パルス同定アルゴリズムは、変化点アルゴリズム、活動平均／中央値及び分散アルゴリズム、又は状態機械アルゴリズムからなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
励起後の１つ以上の蛍光標識におけるフォトン放出の確率の減衰速度を示す１つ以上の時間特性を決定する工程と、
少なくとも１つの時間特性を用いてヌクレオチドの取り込みイベントが生じた時間を計算する工程と、
からなる方法。
【請求項９】
前記ヌクレオチドの取り込みイベントが生じた時間を計算する工程は、１つ以上の蛍光標識から放出された光の強度を用いて実施される、請求項８の方法。
【請求項１０】
蛍光標識が蛍光標識の励起に応答して光を放出した時間に関する時間ビン情報を受信する工程と、
前記時間ビン情報に基づいて光強度情報を計算する工程と、
前記光強度情報を用いて少なくとも１つのヌクレオチドの取り込みイベントが生じた時間を計算する工程と、
からなる方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのヌクレオチドの取り込みイベントが生じた時間は、光の時間特性を用いて実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ヌクレオチドの取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程であって、前記特性は、各ヌクレオチドの取り込みイベントについて、
ｉ）励起後の蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を示す光の時間特性と、
ｉｉ）光の強度特性と、を含む、ヌクレオチドの取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程と、
ヌクレオチドの取り込みイベントの特性を示す点をグループ分けする工程であって、各点は、対応するヌクレオチドの取り込みイベントに対する少なくとも前記時間特性と前記強度特性とを表す、ヌクレオチドの取り込みイベントの特性を示す点をグループ分けする工程と、
前記点からなるグループを各ヌクレオチドに割り当てる工程と、
からなる方法。
【請求項１３】
前記時間特性は、異なる時間ビンに検出された蛍光寿命又はフォトン比率からなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記点をグループ分けする工程は、クラスタリングアルゴリズムによって実行される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記クラスタリングアルゴリズムは、ｋが４以上のｋ−平均クラスタリングを実行する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
各前記点からなるグループは、前記蛍光標識の予め決められた光放出特性に基づいて各ヌクレオチドに割り当てられる、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ヌクレオチドの取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程であって、前記特性は、各ヌクレオチドの取り込みイベントについて、
ｉ）励起後の蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す光の時間特性と、
ｉｉ）光の強度特性と、を含む、ヌクレオチドの取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程と、
前記ヌクレオチドの取り込みイベントの特性を表す点をグループ分けする工程であって、各点は、対応するヌクレオチドの取り込みイベントについて少なくとも前記時間特性と前記強度特性とを表す、前記ヌクレオチドの取り込みイベントの特性を表す点をグループ分けする工程と、
各点からなるグループを各ヌクレオチドに割り当てる工程と、
前記点からなるグループを判別する１つ以上の基準を決める工程と、
前記１つ以上の基準を保存する工程と、
からなる方法。
【請求項１８】
前記１つ以上の基準は、前記点からなるグループ間の１つ以上の境界からなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上の基準は、前記点からなるグループの重心からなる、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の基準は、不揮発性メモリに保存される、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記点をグループ分けする工程は、前記点に対してクラスタリングアルゴリズムを実行する工程からなる、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ヌクレオチドを同定する方法において、
ヌクレオチドの取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程であって、前記特性は、各ヌクレオチドの取り込みイベントについて、
ｉ）励起後の蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す光の時間特性と、
ｉｉ）光の強度特性と、を含む、ヌクレオチドの取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程と、
前記蛍光標識について前記光の特性の間で判別を行うシークエンシング機器の為に保存された基準を考慮して前記時間特性と前記強度特性とを評価することによって前記ヌクレオチドの取り込みイベントにヌクレオチドを割り当てる工程と、
からなる方法。
【請求項２３】
前記保存された基準は、異なるヌクレオチドに対する前記蛍光標識の特性間の１つ以上の境界からなり、前記ヌクレオチドの取り込みイベントを割り当てる工程は、前記時間特性と前記強度特性とを表す点を前記１つ以上の境界と比較する工程からなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
１つ以上の前記保存された基準は、点からなるグループの重心からなり、各グループは、それぞれのヌクレオチドに対応し、前記ヌクレオチドの取り込みイベントを割り当てる工程は、
各取り込みイベントについて前記時間特性と前記強度特性とを表す点と重心との間の距離を決定する工程と、
前記ヌクレオチドの取り込みイベントを前記点に最も近い重心を有するヌクレオチドに割り当てる工程と、
からなる、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記保存された基準は、非揮発メモリに保存された較正基準である、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ヌクレオチドを同定する方法において、
ヌクレオチドの取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程であって、前記特性は、各ヌクレオチドの取り込みイベントについて、
ｉ）励起後の蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す光の時間特性と、
ｉｉ）光の第２特性と、を含む、ヌクレオチドの取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程と、
前記ヌクレオチドの取り込みイベントの特性を表す点を点からなるグループにグループ分けする工程であって、各点は、対応するヌクレオチドの取り込みイベントの少なくとも前記時間特性と強度特性とを表す、前記ヌクレオチドの取り込みイベントの特性を表す点を点からなるグループにグループ分けする工程と、
前記点からなるグループを各ヌクレオチドに割り当てる工程と、
からなる方法。
【請求項２７】
シークエンシング機器を較正する方法において、
ヌクレオチドの取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程であって、前記特性は、各ヌクレオチドの取り込みイベントについて、
ｉ）励起後の蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す光の時間特性と、
ｉｉ）光の第２特性と、を含む、ヌクレオチドの取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程と、
前記ヌクレオチドの取り込みイベントの特性を示す点を点からなるグループにグループ分けする工程であって、各点は、対応するヌクレオチド取り込みイベントについて少なくとも前記時間特性と強度特性とを表す、前記ヌクレオチドの取り込みイベントの特性を示す点を点からなるグループにグループ分けする工程と、
各前記点からなるグループを各ヌクレオチドに割り当てる工程と、
前記点からなるグループを判別する１つ以上の基準を決定する工程と、
前記１つ以上の基準を保存する工程と、
からなる方法。
【請求項２８】
ヌクレオチド取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程であって、前記特性は、各ヌクレオチドの取り込みイベントについて、
ｉ）励起後の蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す光の時間特性と、
ｉｉ）光の強度特性と、を含む、ヌクレオチド取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程と、
前記蛍光標識の光の特性間で判別を行うシークエンシング機器の為に保存された基準を考慮して、前記時間特性と第２特性とを評価することによって前記ヌクレオチドの取り込みイベントをヌクレオチドに割り当てる工程と、
からなる方法。
【請求項２９】
ヌクレオチド取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出された光の特性を取得する工程であって、前記特性は、各ヌクレオチドの取り込みイベントについて、
ｉ）励起後の蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す光の時間特性と、
ｉｉ）光の強度特性と、を含む、ヌクレオチド取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出された光の特性を取得する工程と、
前記ヌクレオチドの取り込みイベントの特性を表す点のグループを区別する１つ以上の基準を決める工程であって、各点は、対応するヌクレオチド取り込みイベントについて前記時間特性と前記強度特性とを表示する、前記ヌクレオチドの取り込みイベントの特性を表す点のグループを区別する１つ以上の基準を決める工程と、
からなる方法。
【請求項３０】
前記グループにヌクレオチドを割り当てる為に前記グループを各ヌクレオチドに割り当てる工程をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記１つ以上の基準と、前記グループに対するヌクレオチドの割り当てとに基づいて、前記点をヌクレオチドに割り当てる工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ヌクレオチドの取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程であって、前記特性が、各ヌクレオチドの取り込みイベントについて、
ｉ）励起後の蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す光の時間特性と、
ｉｉ）光の第２特性と、を含む、ヌクレオチドの取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程と、
前記ヌクレオチドの取り込みイベントの前記特性を表す点からなるグループを区別する１つ以上の基準を決定する工程であって、各点は、対応するヌクレオチド取り込みイベントについて前記時間特性と前記第２特性とを表示する、前記ヌクレオチドの取り込みイベントの前記特性を表す点からなるグループを区別する１つ以上の基準を決定する工程と、
からなる方法。
【請求項３３】
処理装置によって実行された際に請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法を実施する命令を内部に保存した非一過性計算機可読記録媒体。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法を実施する処理装置からなる装置。
【請求項３５】
シークエンシング反応中に蛍光標識から光を受け取る光検出器と、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法を実施する処理装置と、
からなるシークエンシング機器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はパルス決定器及び塩基決定器、及び、核酸、例えばＤＮＡとＲＮＡのシークエンシングに関し、より詳細には、検出器から得られたデータに基づいてヌクレオチドを同定する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ），リボ核酸（ＲＮＡ））のシークエンシングには、標的である核酸の各ヌクレオチドを同定することが含まれる。いくつかの核酸のシークエンシング方法には、標的核酸の相補的な核酸鎖に取り込まれた時に各ヌクレオチドを同定する工程が含まれる。シークエンシングの工程で相補鎖の一連の核酸を同定することにより標的核酸鎖のヌクレオチド配列を同定することができる。
【発明の概要】
【０００３】
いくつかの実施形態は、第１蛍光標識が第１蛍光標識の励起に応答して光を放出する時間に関する第１時間ビン情報を受信する工程と、第１時間ビン情報に基づいて第１光強度情報を計算する工程と、第２蛍光標識が第２蛍光標識の励起に応答して光を放出する時間に関する第２時間ビン情報を受信する工程と、第２時間ビン情報に基づいて第２光強度情報を計算する工程と、第１光情報と第２光情報とを用いて核酸の取り込みが起きた時間を計算する工程とを含む方法に関する。
【０００４】
核酸の取り込みイベントが起きた時間を計算する工程は、パルス同定アルゴリズムを用いて実行しうる。パルス同定アルゴリズムは、変化点アルゴリズム（changepoint  algorism）、活動平均／中央値及び分散アルゴリズム、又は状態機械アルゴリズムを含む。第１光強度情報を計算する工程は、第１時間ビン情報を加算する工程を含み、第２光強度を計算する工程は、第２時間ビン情報を加算する工程を含む。
【０００５】
いくつかの実施形態は、第１蛍光標識が第１蛍光標識の励起に応答して第１光を放射する時間に関する第１時間ビン情報を受信する工程と、第１時間ビン情報に基づいて第１光の第１時間特性を計算する工程とを含む方法に関する。時間特性は、励起後の第１蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す。方法は、第２蛍光標識が第２蛍光標識の励起に応答して第２光を放出する時間に関する第２時間ビン情報を受信する工程と、第２時間ビン情報に基づいて第２光の第２時間特性を計算する工程と、をさらに含む。第２時間特性は、励起後の第２蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す。方法は、第１時間特性と第２時間特性とを用いてヌクレオチドの取り込みイベントが起きた時間を計算する工程がさらに含む。
【０００６】
ヌクレオチドの取り込みイベントが起きた時間を計算する工程は、パルス同定アルゴリズムを用いて実行される。パルス同定アルゴリズムは、変化点アルゴリズム、活動平均／中央値及び分散アルゴリズム、又は状態機械アルゴリズムを含み得る。
【０００７】
いくつかの実施形態は、励起後の１つ以上の蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す１つ以上の時間特性を決定する工程と、少なくとも１つの時間特性を用いてヌクレオチドの取り込みイベントが起きた時間を計算する工程とを含む方法に関する。
【０００８】
ヌクレオチドの取り込みイベントが起きた時間を計算する工程は、１つ以上の蛍光標識によって放出された光の強度を用いて実行することもできる。
いくつかの実施形態は、蛍光標識が蛍光標識の励起に応答して光を放出する時間に関する時間ビン情報を受信する工程と、時間ビン情報に基づいて光の強度情報を計算する工程と、光の強度情報を用いて少なくとも１回のヌクレオチド取り込みイベントが起きた時間を計算する工程と、を含む方法に関する。
【０００９】
少なくとも１回のヌクレオチド取り込みイベントが起きた時間の計算は、光の時間特性を用いて実行し得る。
いくつかの実施形態は、ヌクレオチドの取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光特性を取得する工程を含むヌクレオチドを同定する方法に関する。特性には、各ヌクレオチドの取り込みイベントについて、ｉ）励起後の蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す光の時間特性と、ｉｉ）光の強度特性と、が含まれる。方法は、ヌクレオチドの取り込みイベントの特性、つまり対応するヌクレオチド取り込みイベントの少なくとも時間特性と強度特性とを表示する点を、点からなるグループにグループ分けする工程と、点からなるグループを各ヌクレオチドに割り当てる工程と、をさらに含む。
【００１０】
時間特性には、異なる時間ビンで検出された蛍光寿命又はフォトンの比率が含まれ得る。点をグループ分けする工程は、クラスタリングアルゴリズムを用いて実行し得る。クラスタリングアルゴリズムは、ｋが４以上のｋ‐平均クラスタリングを実行し得る。点からなる各グループは、予め決められた蛍光標識の光放出特性に基づいて各ヌクレオチドに割り当てられる。
【００１１】
いくつかの実施形態は、シークエンシング機器を較正する方法に関し、方法は、ヌクレオチド取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程を含む。特性には、各ヌクレオチドの取り込みイベントについて、ｉ）励起後の蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す光の時間特性と、ｉｉ）光の強度特性と、が含まれる。方法は、ヌクレオチドの取り込みイベントの特性、つまり対応するヌクレオチドの取り込みイベントの少なくとも時間特性と強度特性とを表示する点をグループ分けする工程と、点からなる各グループを各ヌクレオチドに割り当てる工程と、点からなるグループを区別する１つ以上の基準を決定する工程と、１つ以上の基準を保存する工程と、をさらに含む。
【００１２】
１つ以上の基準には、点からなるグループ間における１つ以上の境界が含まれる。１つ以上の基準には、点からなるグループの重心が含まれる。１つ以上の基準は、不揮発性メモリに保存される。点をグループ分けする工程には、点に対してクラスタリングアルゴリズムを実行する工程が含まれる。
【００１３】
いくつかの実施形態は、ヌクレオチドを同定する方法に関し、方法は、ヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程を含む。特性には、各ヌクレオチドの取り込みイベントについて、ｉ）励起後の蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す光の時間特性と、ｉｉ）光の強度特性と、が含まれる。方法は、蛍光標識の光の特性を判別するシークエンシング機器の為に保存された基準を考慮して時間特性と強度特性とを評価することによってヌクレオチドの取り込みイベントをヌクレオチドに割り当てる工程をさらに含む。
【００１４】
保存された基準は、異なるヌクレオチドに対する蛍光標識の特性間における１つ以上の境界を含む。ヌクレオチドの取り込みイベントを割り当てる工程は、時間特性と強度特性とを表示する点と１つ以上の境界とを比較する工程を含む。１つ以上の保存された基準は、点からなるグループの重心であってもよく、各グループは、それぞれのヌクレオチドに対応する。ヌクレオチドの取り込みイベントを割り当てる工程は、ヌクレオチドの取り込みイベントに対する時間特性と強度特性とを表示する点から重心までの距離を決定する工程と、ヌクレオチドの取り込みイベントにその点に最も近い重心を有するヌクレオチドを割り当てる工程と、を含み得る。保存された基準は、不揮発性メモリに保存された較正基準である。
【００１５】
いくつかの実施形態は、ヌクレオチドを同定する方法に関し、ヌクレオチドの取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程を含む。特性には、各ヌクレオチドの取り込みイベントについて、ｉ）励起後の蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す光の時間特性と、ｉｉ）光の第２特性と、が含まれる。方法は、ヌクレオチドの取り込みイベントの特性を示す点を点からなるグループにグループ分けする工程と、各点が対応するヌクレオチドの取り込みイベントに対する少なくとも時間特性と強度特性と表示することと、点からなるグループを各ヌクレオチドに割り当てる工程と、をさらに含む。
【００１６】
いくつかの実施形態は、シークエンシング機器を較正する方法に関し、ヌクレオチドの取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程を含む。特性には、各ヌクレオチドの取り込みイベントについて、ｉ）励起後の蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す光の時間特性と、ｉｉ）光の第２特性と、が含まれる。方法は、ヌクレオチドの取り込みイベントの特性を表示する点を点からなるグループにグループ分けする工程と、各点が対応するヌクレオチドの取り込みイベントについて少なくとも時間特性と強度特性とを示すことと、点からなるグループを各ヌクレオチドに割り当てる工程と、点からなるグループを区別する１つ以上の基準を決定する工程と、１つ以上の基準を保存する工程と、をさらに含む。
【００１７】
いくつかの実施形態は、ヌクレオチドを同定する方法に関し、ヌクレオチドの取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程を含む。特性には、各ヌクレオチドの取り込みイベントについて、ｉ）励起後の蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を示す光の時間特性と、ｉｉ）光の強度特性と、が含まれる。方法は、蛍光標識について光の特性を区別するシークエンシング機器の為に保存された基準を考慮して時間特性と第２特性とを評価することによりヌクレオチドの取り込みイベントをヌクレオチドに割り当てる工程をさらに含む。
【００１８】
いくつかの実施形態は、ヌクレオチドの取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程を含む方法に関する。特性には、各ヌクレオチド取り込みイベントについて、ｉ）励起後の蛍光標識によるフォトン放出の確率を表す光の時間特性と、ｉｉ）光の強度特性と、が含まれる。方法は、ヌクレオチドの取り込みイベントの特性を表示する点のグループを区別する１つ以上の基準を決定する工程をさらに含み、各点は、対応するヌクレオチドの取り込みイベントに対する時間特性と強度特性とを表す。
【００１９】
方法は、グループに対してヌクレオチド割り当てを作成する為に、グループを各ヌクレオチドに割り当てる工程をさらに含む。方法は、１つ以上の基準とグループに対するヌクレオチド割り当てに基づいて点をヌクレオチドに割り当てる工程がさらに含む。
【００２０】
いくつかの実施形態は、ヌクレオチドの取り込みイベント中にヌクレオチドに結合した蛍光標識から検出される光の特性を取得する工程を含む方法に関する。特性には、各ヌクレオチドの取り込みイベントについて、ｉ）励起後の蛍光標識によるフォトン放出の確率の減衰速度を表す光の時間特性と、ｉｉ）光の第２特性と、が含まれる。方法は、ヌクレオチドの取り込みイベントの特性を示す点からなるグループを区別する１つ以上の基準を決定する工程をさらに含み、各点は、対応するヌクレオチドの取り込みイベントの時間特性と第２特性とを表す。
【００２１】
いくつかの実施形態は、装置に保存された非一過性のコンピュータ可読記憶媒体に関し、処理装置で実行された場合には、この明細書で説明した方法を実施する。
いくつかの実施形態は、この明細書で説明した方法を実行する処理装置を備える装置に関する。
【００２２】
いくつかの実施形態は、シークエンシング機器に関し、シークエンシング反応中に蛍光標識から光を受け取る光検出器と、この明細書で説明した方法を実行する処理装置とを備える。
【００２３】
本願の態様及び実施形態は、以下の図面を参照して説明されている。図面は、必ずしも縮尺通りではないことを理解されたい。なお、複数の図面に表示されている部材は、全図面において同一の参照番号で示されている。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】いくつかの実施形態に係る、パルス決定器によって実行されるアルゴリズムを示すフローチャート。
【図１Ｂ】いくつかの実施形態に係る、励起後のフォトン放出の確率を示す図であって光検出器で検出した時間ビンのフォトン数の分布を示す図。
【図１Ｃ】いくつかの実施形態に係る、放出された光を用いてヌクレオチドの取り込みイベントを決定する方法を示すフローチャート。
【図１Ｄ】いくつかの実施形態に係る、放出された光の時間特性と強度特性とを用いてヌクレオチドの取り込みイベントを決定する方法を示すフローチャート。
【図２】いくつかの実施形態に係る、核酸のシークエンシング中に光検出器により検出された光強度を示す図。
【図２−１Ａ】いくつかの実施形態に係る、生物標本と化学標本の迅速且つ機動的な解析に使用される装置を示すブロック図。
【図２−１Ｂ】いくつかの実施形態に係る、組み込み装置と機器とを示すブロック図。
【図３】いくつかの実施形態に係る、塩基決定器によって実行されるアルゴリズムを示すフローチャート。
【図３−１Ａ】いくつかの実施形態に係る組み込み装置の略式図。
【図３−１Ｂ】いくつかの実施形態に係る、ピクセル列の試料ウェルに接続する励起エネルギーと、センサーに指向する各試料ウェルからの放出エネルギーとを示す図。
【図４】いくつかの実施形態に係る、ヌクレオチドの取り込みイベントの時間パラメータの強度対時間ビン比率を示す図であって異なるヌクレオチドに対する点のクラスターを示す図。
【図５】いくつかの実施形態に係る、図４に示されたクラスターの境界と重心の位置とを示す図。
【図６】いくつかの実施形態に係る、１つ以上の較正基準に基づいてヌクレオチドを同定する為に塩基決定器によって実行されるアルゴリズムを示すフローチャート。
【図７】いくつかの実施形態に係る、強度と時間パラメータとを示した図であってヌクレオチド取り込みイベントに対応する点と異なるヌクレオチドの重心の位置までの相対距離を示す図。
【図８】本明細書で開示されている技術のいくつかの実施形態の実施に用いられる例示の計算装置を示すブロック図。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書に開示されている技術は、核酸、例えばＤＮＡとＲＮＡのシークエンシングに関し、より詳細には、検出器から得られたデータに基づいてヌクレオチドを同定する技術に関する。核酸をシークエンシングすることにより、標的核酸のヌクレオチドの順番と位置とを決定することができる。核酸をシークエンシングする方法には、合成によりシークエンシングするものがあり、その方法では、標的核酸に相補的で新規に合成された核酸鎖の中にヌクレオチドが取り込まれた際にヌクレオチドが決定される。シークエンシング中には、重合酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）が標的の核酸分子の標識部位に結合して、重合酵素の活性を用いてプライマーにヌクレオチドを付加又は取り込ませる。これは、プライマー伸長反応と一般に呼ばれる。
【００２６】
各ヌクレオチドには、励起に応答して光を放出する蛍光分子（例えば、フルオロフォア）が結合され、異なる種類のヌクレオチド間でのヌクレオチドの各種類の判別に使用される。例えば、各標識を異なる１つの核酸塩基に対応するように、例えば第１標識はアデニン（Ａ）に、第２標識はシトシン（Ｃ）に、第３標識はグアニン（Ｇ）に、第４標識はチミン（Ｔ）に対応するように、４つの標識からなるセットがＤＮＡに存在する核酸塩基の標識に使用される。標識は、リンカー分子を介して直接又は間接的にヌクレオチドに化学結合させることによりヌクレオチドに結合される。
【００２７】
プライマー伸長反応中には、ヌクレオチドとそれに結合した蛍光標識は、合成された相補的な核酸の中にヌクレオチドが取り込まれる際に重合酵素によって担持される。蛍光標識は、ヌクレオチドが合成された核酸の中に取り込まれた時に光のパルスによって励起されて標識が備える特性の光を放出する。いくつかの実施形態では、標識は、リンカー分子を介して直接又は間接的にヌクレオチドの末端のリン酸基に結合しており、ヌクレオチドが取り込まれる過程で重合酵素の活性によってヌクレオチドから離脱または遊離される（例えば、リン酸基結合の切断）。励起に応答して蛍光標識により放出される光を検出して解析することによって、取り込まれた核酸を同定することができる。プライマー伸長反応が起きている間に、合成された核酸に追加された各ヌクレオチドに対して励起と検出と解析とが実施される。標的核酸の配列は、合成された核酸の相補的な配列から決定することができる。
【００２８】
蛍光標識によって放出される光は、他の標識からその標識を判別することに使用しうるいくつかの特性を備える。これらの特性には、強度（例えば、光を放出する確率）、時間特性（例えば、励起後のフォトン放出の確率の減衰速度、取り込み時のパルス持続時間や取り込み前や取り込み後のパルス間隔持続時間）、スペクトル特性（例えば、放出された光の波長）、又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。蛍光標識から放出された光は、上記特性の１つ以上を検出することができる光検出器によって検出される。適切な光検出器の例は、米国特許出願公開第１４／８２１，６５６号明細書の「検出されたフォトンを時間ビニングする為の組み込み装置」に開示されており、引用によりここにその全てを援用する。上記文献に開示されているように、前記光検出器は、フォトンの到達時間を検出する性能を備え、標識によって放出される光の時間特性を決定することができる。放出された光の時間特性を検出することにより、異なる時間特性を有する光を放出する標識を判別することができる。時間特性の１例は、蛍光寿命である。蛍光分子、例えばフルオロフォアは、励起に応答してフォトンを放出しうる。蛍光分子がフォトンを放出する確率は、励起後の時間の経過と共に低下する。この確率の減衰速度は、指数関数的である。「寿命」は、この確率の減衰がどのくらい速く起こるかの特性である。減衰が速いことは、短寿命であると言え、減衰がゆっくりであることは、長寿命であると言える。蛍光分子から放出された光の時間特性を検出することにより異なる寿命を有する蛍光分子を区別することができる。異なる寿命を有する蛍光分子で異なるヌクレオチドを標識することによって、検出した光の時間特性に基づいてヌクレオチドを判別することが可能である。
【００２９】
米国特許出願公開第１４／８２１，６５６号明細書に開示されている光検出器は、ナノ秒又はピコ秒の分解能でフォトンの到着時間を検出することができ、且つ入射フォトンの到着時間を時間ビニングすることができる。フォトンの放出は確率的であるため、標識は複数回励起されて、放出されてきたフォトンは時間ビニングされる。複数回そのような計測を行うことによって、励起後にフォトンが到着した時間のヒストグラムを得ることができる。この情報は、放出された光の時間特性を計算する為に分析され、この時間特性に基づいてある標識を別の標識から判別することができる。
【００３０】
本明細書に開示される技術は、検出された光の特性に基づいて核酸の配列を決定する為に、光検出器からのデータストリームを分析することができる。このような技術は、「パルス決定器」、「塩基決定器」で実行され、それらは、ソフトウェアか、シークエンシング機器又は別の装置のハードウェアモジュールである。一般に、パルス決定器は、標識から蛍光パルスが生じた時間間隔を同定する為にデータストリームを分析して標識が結合しているヌクレオチドがポリメラーゼによってオリゴヌクレオチド鎖に取り込まれたことを知らせる。「塩基決定器」は、ヌクレオチドの種類を決定、又は「判定」する為にパルス決定器によって同定された時間間隔に検出された光特性を分析する。
【００３１】
図１Ａは、パルス決定器によって実行されるアルゴリズムのフローチャートを示す。工程Ｓ１では、受信した光の強度対時間が計算される。上述したように、光検出器は、励起源（例えば、レーザーパルス）に標識を暴露することに応答して標識からの入射フォトンの到達を時間ビニングする。標識は繰り返し励起されて、標識からの入射フォトンの到達が時間ビニングされる。例えば、１０ミリ秒（ｍｓ）の計測時間中に、レーザーの励起パルスが、標識を励起する為に１００メガヘルツ（ＭＨｚ）で放出される。標識は、低い確率でフォトンを放出しうる（例えば、１０，０００励起あたり１フォトン放出）。標識が、１０ミリ秒の間に多数回（例えば、１００万回）励起された場合には、約１００個のフォトンを検出し得る。いくつかの例では、標識は、励起源に暴露されても励起されずフォトンを放出しない場合があり、これは、放出確率が低い原因になり得る。上述したように、励起に対応する入射フォトンの到達時間は、時間ビニングされる。光検出器は、各時間ビンにおいて、フォトンの数を表す信号を生成することができる。
【００３２】
図１Ｂは、光検出器が、入射フォトンの到達時間を８個の時間ビンに時間ビニングした例を示す。上述したように、フォトン放出の確率は時間と共に減衰する為、より早い時間の時間ビンの方が、その後の時間ビンよりも多くのフォトンを含んでいる。標識を繰り返し励起して放出されるフォトンのタイミングを検出することによって、図１Ｂに示されているように、時間と共に減衰するフォトン放出の確率を概算するヒストグラムが得られる。
【００３３】
計測時間（例えば、１０ｍｓ）に検出された光の強度は、各時間ビンに検出されたフォトン数を表す値を合計することによってパルス決定器によって計算される。例えば、図１Ｂに示されているように、光検出器が、入射フォトンの到着を８つの時間ビンにビニングする場合には、８つの時間ビンに検出されたフォトン数が強度を求める為に合計される。しかしながら、任意の数の時間ビンを使用し得る。光検出器が２つの時間ビンを有する場合には、２つの時間ビンに検出されたフォトンの数を表す値が強度を決定する為に合計される。例えば、第１時間ビンが１００フォトン含み、第２時間ビンが５０フォトン含む場合には、これらの値は合計されて１５０フォトンの強度となる。代替的には、合計のフォトン強度を計測する目的で１つの独立した時間ビンが存在してもよい。
【００３４】
光検出器からのデータストリームの計測時間間隔について検出された光の強度が決定される。例えば、光検出器が１０ｍｓ間隔で計測を行う場合には、強度は、各計測間隔について１０ｍｓ毎に時間ビンを合計することによって決定される。その結果、時間の経過と共に検出された光の強度を表すデータが決定される。
【００３５】
図２は、検出された光の強度対時間を表示する数分間の例示のトレースを示す。トレースにはベースラインと分散が存在すること及び実際のパルスはシグナル対ノイズ比が低いことが多いことから取り込みイベントに対応するパルスを同定することは困難である。工程Ｓ２では、取り込みイベントに対応する光のバーストが放出された時間を同定する為に、強度対時間データに対してパルス発見アルゴリズムが実行される。
【００３６】
パルス発見アルゴリズムにおいて、１つの適切なアプローチは、信号の平均と分散とにシフトが生じた時、例えばバックグラウンド（つまり、パルス間）から信号（つまり、パルス）への変化及びその逆の変化が生じた時を決定するトレースデータ上で変化点アルゴリズムを実施することである。各変化点を同定した後には、変化点レベル（例えば、強度）に基づいて、閾値が、パルス領域からパルス間領域（パルスとパルスの間の領域）を分離する。この閾値は、ヒストグラム、カーネル密度推定、又はｋ−平均クラスタリングを用いて手動で決定される。
【００３７】
別の適切なアプローチは、トレースの平均／中央値及び分散を分析して、標準偏差の一定の値又は平均／中央値以上の数の増分としてパルスを定義することである。
さらに別の適切なアプローチは、パルス又はパルス間状態のいずれかで状態機械を使用して、両者間の行き来を判断することである。閾値は、２つの状態間の遷移を定義する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、（極端に短いパルスや極端に長いパルスは、偽陽性となることが多い為）最小又は最大持続時間閾値を満たさないパルスを取り除く等、パルスのフィルターリングが行われる。
【００３９】
後で述べた２つのアプローチは、取得したデータに対して実施する点でさらなる利点を有するが、変化点アルゴリズムは、実施する為には全てのデータが必要である。
放出された光の強度に基づいてヌクレオチドの取り込みイベントに対応するパルスを同定する技術について上述した。しかしながら、強度に加えて又は強度に代えて、パルスを同定する為に放出された光の強度とは別の特性を使用してもよい。いくつかの実施形態では、強度を使用することに代えて又は加えて放出された光の時間特性に基づいてパルスが同定される。異なるヌクレオチドは、異なる時間特性を備えた光を放出する分子で標識されて、取り込みイベントの開始時と終了時とを決定する為に時間特性が解析される。例として、異なる蛍光標識は、励起によるフォトン放出の確率が時間経過とともに減衰する、それぞれ異なる「寿命」又は速度を備える。計測された寿命の変化は、取り込みイベントの開始又は終了を示しうる。
【００４０】
図１Ｃは、取り込みイベントに対応するパルスが生じた時を決定する為に時間パラメータを使用する方法のフローチャートを示す。工程Ｓ３では、取り込みイベント中に放出された光の時間パラメータが決定される。例えば、以下で説明されているように、時間特性は、時間ビン情報（１つ以上の時間ビンからの、又は１つ以上の時間ビンに基づく情報）に基づいて決定しうる。いくつかの実施形態では、時間特性は、塩基決定器によって決定されて、パルス決定器に提供される。工程Ｓ４では、パルス発見アルゴリズムが、経時的に時間パラメータを示すデータ上で実行される。パルス発見アルゴリズムは、強度に関して上述したことと同様に実行される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、取り込みイベントが生じた時間を同定する為に、強度と時間特性の両方が使用される。例として、時間特性の変化は、強度に基づいてパルスを同定する精度を高める為に使用される。図１Ｄは、そのような方法のフローチャートを示す。工程Ｓ１では、各取り込みイベントについて強度が取得される。強度は、上述したように、時間ビンの各セットの時間ビンを合計することによって計算される。しかしながら、強度は、時間ビンを合計して取得する必要はなく異なる方法で計測したり決定することができる。工程Ｓ２では、取り込みイベントに対応して光のバーストが放出された時を同定する為に、強度対時間データ上でパルス発見アルゴリズムが実行される。工程Ｓ３では、取り込みイベント中に放出された光の時間パラメータが決定される。工程Ｓ５では、工程Ｓ２で同定されたパルスが評価されて、時間パラメータに基づいて改善される。例えば、長いパルス（例えば、閾値よりも長い長さを有する）が同定された場合には、パルス中に放出された光の時間特性が評価される。このパルスの間に時間パラメータが大きくシフトした場合（例えば、１つの閾値の量、又は異なるヌクレオチドを表す量より大きく変化した場合）には、最初のパルス判定は、１つの長いパルスではなく２つの分離したパルスを同定するように修正される。時間パラメータにシフトが生じた時間は、２つのパルス間の時間的な境界に対応している場合がある。時間パラメータが、このパルス間に大きくシフトしない場合（例えば、変化しないか、又は比較的少量しか変化しない場合）には、最初のパルス判定は、変更されない。よって、強度に基づく最初のパルス判定の結果は、時間パラメータを用いて評価されたり改善される。
【００４２】
いくつかの実施形態では、最初のパルス判定は、時間パラメータを用いて実施され、パルスは、強度情報を用いて改善される。
パルス判定アルゴリズムを実行することにより、パルス決定器は、取り込みイベントに対応するパルスが生じた時を同定する。各パルスについて、パルス決定器は、開始時間と終了時間、開始時間と持続時間、又は終了時間と持続時間を同定する。そのようなパルスが生じた時間は、蛍光標識、つまりそれに結合したヌクレオチドを同定する為に解析される。
【００４３】
光検出器からの一連のデータに対してパルス決定器を実行した後、各取り込みイベントについて光の１つ以上の特性を解析する為に、塩基決定器が呼び出される。パルス決定器は、パルスが生じた時間を塩基決定器に伝達する。任意に、パルス決定器は、追加的な情報、例えば各時間ビンに受信したフォトンの数についての情報や、各計測間隔で計算された強度又は任意の他の適切な情報、を塩基決定器に伝達する。
【００４４】
図３は、ヌクレオチドを同定する為に塩基決定器によって実行されたりシークエンシング機器の較正に使用されるアゴリズムのフローチャートを示す。
工程Ｓ１１では、強度は、各取り込みイベントについて取得される。上述したように、強度は、時間ビンの各セットに含まれる時間ビンを合計することによって計算し得る。代替的には、塩基決定器は、パルス決定器から強度を受信することもできる。
【００４５】
強度は、パルス決定器によって同定された取り込みイベントの持続時間で正規化される。例えば、取り込みイベントが計測間隔の２倍以上の長さで続く場合には、強度は、２つの計測間隔における時間ビンを合計して２で割ることによって計算される。例えば、取り込みイベントが２０ミリ秒（ｍｓ）持続し、計測間隔が１０ｍｓであり且つフォトンが２つの時間ビンにグループ分けされている場合には、強度は、第１計測の２つの時間ビンで収集されたフォトンと、第２計測の２つの時間ビンで収集されたフォトンを合計した後２で割ることによって計算し得る。計算は、２０ｍｓの取り込みイベントにおける平均強度の計算であると考えられる。
【００４６】
工程Ｓ１２では、各取り込みイベントについて時間パラメータが決定される。時間パラメータは、励起の後、時間経過に伴う標識によるフォトン放出の確率の減衰を表す。任意の適切な時間パラメータを使用し得る。いくつかの実施形態では、蛍光寿命は、時間ビンに指数関数を当てはめることによって計算され（例えば、図１Ｂ参照）、蛍光寿命が、時間パラメータとして使用される。いくつかの実施形態では、時間経過に伴うフォトン放出の確率の減衰を表す時間パラメータを決定する為に、複数の異なる時間ビンのフォトン数（又はその代表値）が比較される。例えば、入射フォトンの到着が２つの時間ビンにビニングされた場合には、２つのビンについてフォトン数の比率が計算されてこの比率が時間パラメータとして使用される。いくつかの実施形態では、ビンの比率は、蛍光寿命を計算する代わりになる。この比率は、任意の適切な方法で計算し得る。いくつかの実施形態では、２つの時間ビンが使用される場合には、比率を求める為に、励起イベントに時間的に最も近い時間ビンのフォトン数が第２時間ビンのフォトン数で割り算される。いくつかの実施形態では、時間ビンのフォトン数又はその代表値は、（例えば、時間ビンのセットで合計された光強度によって）正規化され、正規化された値は、時間パラメータを決定する為に使用される。いくつかの実施形態では、最大フォトン数を有する時間ビンが、時間パラメータとして使用される。最大フォトン数を有する時間ビンを決定する為に、時間ビンに対するフォトン数が互いに比較される。２つの時間ビンが存在する例では、第１時間ビンのフォトン数が第２時間ビンのフォトン数と比較される。より高いフォトン数を有するビンが、時間パラメータとして選択されて、蛍光分子の判別に使用される。例えば、１の蛍光分子が比較的短い寿命を有する場合には、最大フォトン数を有する第１時間ビン（励起イベントに時間的に最も近い）に入り、もう一方の蛍光分子が比較的長い寿命を有する場合には、最大フォトン数を有する別の時間ビン（励起イベントから時間的に離間している）に入る。
【００４７】
図３は、工程Ｓ１１が、工程Ｓ１２の前に実施されるものとして示しているが、これは、単なる例示であり、工程Ｓ１２が工程Ｓ１１の前に実施されることもあれば、又は工程Ｓ１１と工程Ｓ１２とが同時に実施される場合もある。
【００４８】
図４は、各取り込みイベントについて強度と時間のパラメータとを２次元空間に点でプロットしたものであり、強度と時間のパラメータとが、それぞれの軸上に表示されている。この例では、時間パラメータは、水平（ｘ）軸にプロットされ、強度は、垂直（ｙ）軸にプロットされている。４つの異なる標識が、強度、時間パラメータ、又はその双方に基づいて互いに判別が可能なヌクレオチドに対して使用される。図４に示されているように、各取り込みイベントについて計測された強度と時間パラメータとをプロットすることによって、４つのヌクレオチドＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔに対応する点からなる４つのクラスターが得られる。
【００４９】
工程Ｓ１３では、点がグループに分けられる（本明細書では、「クラスター」と呼ぶ）。いくつかの実施形態では、４つのクラスターのうちの１つに各取り込みイベントに対する点を割り当てる為に、点に対してクラスタリングアルゴリズムが実行される。例えば、クラスタリングアルゴリズムは、ｎ次空間内でパルスのｋ−平均クラスタリングを実行する。ここで、ｋは、４（Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ）であり、ｎは、塩基決定に使用される基準の数である。しかしながら、いくつかの実施形態では、４つ以上のクラスターが割り当てられてもよい。４つ以上の集団が割り当てられる場合には、ｋが４より大きいクラスタリングが実行される。発明者は、いくつかのケースではクラスターを良好に分離することができず、点を４つ以上のクラスターにグループ分けすることが好適であると認識し理解した。そのような例では、同一のヌクレオチドに１つ以上のクラスターが割り当てられる場合がある。いくつかの実施形態では、外れ値である点を取り除くためにフィルターリングが実行される。例えば、点が、予測された範囲外の時間パラメータであったり強度である場合には、そのような点は、クラスタリングアルゴリズムから排除され、あるいはどのヌクレオチドグループにも割り当てられることはない。
【００５０】
任意の適切な点の数、例えば５０個以上、１００個以上、５００個以上の点が、クラスタリングアルゴリズムに提供される。クラスタリングアルゴリズムにより、各点は、４つの（又は、それ以上）クラスターのうちの１つにグループ分けされる。図４の例では、２つの基準、即ち強度と時間パラメータとが使用されているのでｎ＝２である。強度と時間パラメータとしての時間ビンとの比率を使用した２次元の例が、図４にプロットされている。しかしながら、他の基準も使用し得る。
【００５１】
別の２次元の例では、時間パラメータと空間パラメータの両方を取得することが含まれ、図４の垂直（ｙ）軸には強度ではなく空間パラメータが表される。この例では、各取り込みイベントについて放出された光に関してスペクトル情報が取得され、ヌクレオチドの判別に使用される。
【００５２】
しかしながら、基準の数は、いくつ使用してもよく２つに限定されない。例えば、いくつかの実施形態では、強度と時間パラメータに加えて取り込みイベントについてスペクトル情報が取得され、各軸に強度と時間パラメータとスペクトル情報とを有する３次元空間に点でプロットされる。
【００５３】
点をグループ分けした後、最初のグループ分けの工程に使用した数以上の基準を用いてグループ分けの精度を高めることは有利であり得る。この目的のために、サポートベクターマシーン（ＳＶＭ）やその他の監視した分類器が使用される。クラスタリング標識は、最初の訓練データとして使用され得る。この工程は、分類器の最新の反復結果を次の反復の訓練データとして用いて収束するまで繰り返される。
【００５４】
クラスタリングアルゴリズムは、点をクラスターに割り当てる為に使用されるが、いくつかの実施形態では、点は、クラスタリングアルゴリズムを用いずにグループ分けされる。いくつかの実施形態では、点からなるグループ間の境界は、クラスタリングアルゴリズムを実行しなくとも決定し得る。
【００５５】
工程Ｓ１４では、点からなるクラスターがヌクレオチドに割り当てられる。この割り当ては、標識の既知の特性に基づいて実行し得る。例えば、図４のプロットでは、Ｔに対する標識は強度が高く寿命が最も短いこと、Ａに対する標識は強度が低く寿命が中程度であること、Ｇに対する標識は強度が高く寿命が中程度であること、Ｃに対する標識は強度が高く寿命が最も長いことが分かっている。点からなるクラスターは、クラスターの相対位置を用いて塩基に割り当てられ得る。例えば、寿命が最も短いクラスターはＴに割り当てられ、寿命が最も長いクラスターはＣに割り当てられ、強度は最も低いクラスターは、Ａに割り当てられ、残りのクラスターは、Ｇに割り当てられる。各クラスター内の点は、それらのクラスターのヌクレオチドに割り当てられる。強度と時間特性の各計測の時間についての情報を記録することによりヌクレオチド鎖の配列を決定することができる。
【００５６】
この方法をシークエンシングの実施に使用する場合には、方法は、この時点で終了してよい。方法を較正に使用する場合には、方法は、工程Ｓ１５まで続けられる。発明者は、初期較正を行う場合には、全ての点をヌクレオチドに割り当てるべくクラスタリングアルゴリズムを実行する必要がないことを認識し理解した。いくつかの実施形態では、一定のヌクレオチドの種類に１つの点を割り当てる為に、較正基準が決定される。例として、工程Ｓ１３のクラスタリングする工程、又は工程Ｓ１４におけるヌクレオチドを割り当てる工程に続いて、異なる種類のヌクレオチド間の境界が決定される。境界は、図５に示されているように位相空間の領域を画定する機能である。位相空間の軸には、強度、時間パラメータ、放出波長、及びレーザーパルスの励起波長のうちの少なくともいずれか１つが含まれ得る。一例として、図５に示されているように、２次元空間において、異なるヌクレオチド間に境界５１を描く線部又は曲線が選択される。高次空間では、境界は、表面又はより高次の対象物（「超平面」と呼ばれる）であり得る。境界５１が決まれば、点は、境界に対してその位置を評価することによってヌクレオチドに割り当てられ、クラスタリングを実施する必要はない。したがって、いくつかの実施形態では、シークエンシング機器は、境界５１を描く為に較正される。較正の工程は、核酸のシークエンシングの工程と同様に標識の同じセットを用いて実施し得る。工程Ｓ１５の較正を実施する別例として、クラスターの重心が決定され、これにより、各点に最も近い重心を有するクラスターに基づいて点をヌクレオチドに割り当てることができる。決定された較正基準の種類に拘わらず、較正基準は、後に使用する為に保存される（装置のメモリ等に）。  
【００５７】
較正は、任意の適切な時に実施し得る。いくつかの実施形態では、較正は、機器を初めて使用する前、新しいセットの標識を用いる時、機器を使用する環境条件を変更する時、又は機器の構成要素の経年劣化する使用期間後、に行うことが望ましい。較正は、装置使用者からの要求に応じて、例えば機器のボタンを押すことによって、又は別の装置から当該機器に較正命令を送信することによって、又はスケジュールに基づいて自動的に、又は機器ソフトウェアの性能が次善であるとの判断に応答して、必要に応じて実施し得る。較正基準が得られたら、検出された点を較正基準に対して評価することによってシークエンシングをより迅速に実施することができる。
【００５８】
図６は、１つ以上の較正基準に基づいてヌクレオチドを同定する為に、塩基決定器によって使用されるアルゴリズムのフローチャートを示す。光のパラメータ（例えば、強度と時間パラメータ）は、工程Ｓ１１と工程Ｓ１２とで決定され、それらは、図３に示されているものと同一であり、工程Ｓ１１と工程Ｓ１２とは、上述したように任意の順序で実施し得る。工程Ｓ３３では、ヌクレオチドは、保存されている較正情報を用いて計測した光のパラメータ（例えば、強度と時間パラメータ）を評価することによって特定し得る。例えば、保存されている較正情報がヌクレオチドのクラスターの間にある１つ以上の境界を含む場合には、点を境界と比較することにより点をヌクレオチドに割り当てることができ、クラスタリングを実行するよりもより計算機的に効率的である。別例では、点は、ある点からヌクレオチドのクラスターの４つの重心の各重心までの距離を計算して点を最も近い重心を有するヌクレオチドに割り当てることによって、ヌクレオチドに割り当てられる。この技術は、図７に示されており、図は、計測した強度と時間パラメータとを表示する点６１を示す。図７には、４つのヌクレオチドに対応する標識の重心も示されている。最も近い重心を決定する為に、点６１と４つの各重心までの距離が計算されて、点６１から最も短い距離に重心を有するヌクレオチドが点６１に割り当てられる。図に示されているように、点６１は、ヌクレオチド「Ａ」に対応する標識の重心に最も近い。したがって、点６１は、ヌクレオチド「Ａ」に対応すると決定される。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチドを同定する工程は、取り込みイベントに対応する点の第１部分でクラスタリングを実行する工程と点の第２部分で塩基決定を行う為に較正基準を使用する工程とを含む。第１部分には、較正基準に必要とされる正確性を付与する為に、任意の適切な数の点が含まれる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、点がヌクレオチドの特定の種類に対応する信頼度が決定される。一例では、点の、領域の重心、例えば図５に示されている重心からの距離が、点の信頼度を決定する目的で使用される。重心までの距離が短い点は、その点が一定のヌクレオチドに対応していると正しく同定された可能性が非常に高いことを示す高い信頼度を有するが、重心からの距離が大きい場合には、他の点よりもある重心に単により近いというだけで、正しく同定された可能性は低い。この例では、信頼度は、点と重心間の距離、又は点と重心間の距離を点と１つ以上の重心間との距離とを比較することに基づいて定量化し得る。別例では、較正基準が集団間にある１つ以上の境界を含む場合には、信頼度は、点と１つ以上の境界との間の距離を決定することによって定量化し得る。ある境界により近い点には、より低い信頼度が付けられる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの同定に加えて各ヌクレオチドの同定についての信頼度も保存する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、信頼度は、較正基準と較正基準がどのくらいよく較正データに一致しているかどうかに依存する。較正基準が較正データによく一致していればしているほど、異なる点に対する信頼度は、より高くなり得る。
【００６２】
いくつかの実施形態では、信頼度は、パルス決定器で同定された信号対ノイズ比に依存する為、点に対応する取り込みイベントの持続時間に依存する。例として、持続時間が長いことは、パルス決定器が２つの連続した取り込みイベント、例えば同一種のヌクレオチドの複数の取り込みイベントを同定することができなかったことを表す。いくつかの実施形態では、塩基決定器は、パルス決定器に取り込みイベントの持続時間の再評価を要請する為にパルス決定器と通信し得る。
【００６３】
いくつかの実施形態では、各パルス決定イベントで取り込まれた適切なヌクレオチドを決定する為に、前回生成した境界（ＳＶＭモデル等）を新しいパルス決定に使用する。パルス決定基準がまず基準化され、その後、取り込みイベントを分類する為に前回生成した境界が適用される。
【００６４】
複数のピクセルからパルス決定データの全データを標準化する境界を導き出す為には、較正データセットにデータを含める前に、アレイの各ピクセルのパルス決定データの各データセットを基準化（正規化）することが必要である。強度基準を基準化すること、強度についてのみクラスタリングを行うこと、集団の１つ以上を強度の平均又は中間値として用いることにより、入ってくる全てのパルス決定の強度基準を正規化することができる。この基準化又は正規化は、較正の段階及び保存された較正データを用いて塩基決定する段階の双方に適用される。これは、アレイの各ピクセルについて境界を作成する必要がない点で有利であり、性能を高めて全データを一度にＲＡＭの中に一般に収容できないような非常に大きなアレイに対して基準化を実施することができる。さらなる利点は、強度で分離して較正データセットに対して基準化又は正規化することが必要なパルス数がより少なくて済むため、実施時間が短縮できる点である。このアプローチによれば、基準化又は正規化する係数を作成する前に保存してグループ化しておかなければならないパルスが少なくて済む為、ピクセルアレイからのデータを取得することとほぼ同時に塩基決定を出力することができる。
【００６５】
シークエンシングやシークエンシング機器の較正を実行する為に、パルス決定器と塩基決定器によって実施される技術について上述してきたが、これから適切なシークエンシング機器の例について説明する。いくつかの実施形態では、機器は、ピクセルアレイを含む組み込み装置とインターフェースで接続される。組み込み装置の表面には、複数個の試料ウェルがあり、試料ウェルは、組み込み装置の表面に配置された標本から試料を受け取る。標本には、多数の試料が含まれ、いくつかの実施形態では、異なる種類の試料が含まれる。複数個の試料ウェルは、試料ウェルの少なくとも一部が、１つの標本から１つの試料を受け取ることができるような適切な寸法と形状とを有する。いくつかの実施形態では、いくつかの試料ウェルは、１個の試料を含むが、別のウェルは０個、２個、又はそれ以上の試料を含むなど、試料ウェル内部の試料数は、試料ウェル間で異なってもよい。
【００６６】
いくつかの実施形態では、標本は、多数の１本鎖ＤＮＡ鋳型を含み、組み込み装置の表面上にある各試料ウェルは、１本鎖ＤＮＡ鋳型を受け取るような寸法と形状に形成される。１本鎖ＤＮＡ鋳型は、組み込み装置の試料ウェルの少なくとも一部が１本鎖ＤＮＡ鋳型を含むように複数の組み込み装置の試料ウェル間に分布し得る。標本には、タグ付ｄＮＴＰｓも含まれ、タグ付ｄＮＴＰｓは、試料ウェルの中に入って試料ウェル内の１本鎖ＤＮＡ鋳型に相補的なＤＮＡの鎖の中に取り込まれた際にヌクレオチドの同定を可能にする。そのような例では、「試料」とは、１本鎖ＤＮＡと、ポリメラーゼによって取り込まれるタグ付ｄＮＴＰｓの双方を指す。いくつかの実施形態では、標本には、１本鎖ＤＮＡ鋳型が含まれ、タグ付きｄＮＴＰｓは、ヌクレオチドが試料ウェル内部でＤＮＡの相補鎖に取り込まれる時に試料ウェルに導入される。この手法では、ヌクレオチドの取り込みのタイミングは、タグ付ｄＮＴＰｓを組み込み装置の試料ウェルに導入するタイミングによって制御し得る。  
【００６７】
励起エネルギーは、組み込み装置のピクセルアレイから離間して配置された励起源から付与される。励起エネルギーは、試料ウェル内部の照明領域を照明する為に１つ以上のピクセルに向かって組み込み装置の要素により少なくとも部分的に照射される。照明領域内部に位置して励起エネルギーにより照射された場合には、標識は、放射エネルギーを放出し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の励起源は、機器の構成要素と組み込み装置が１つ以上のピクセルに向かって励起エネルギーを指向させるように構成されたシステムの機器の一部である。
【００６８】
試料から放出された放射エネルギーは、次に、組み込み装置のピクセル内部にある１つ以上の検出器によって検出される。検出された放射エネルギーの特性は、放射エネルギーに対応する標識を同定する為の表示を提供する。そのような特性には、任意の適切な種類の特性が含まれ、例えば検出器によって検出されるフォトンの到着時間、検出器によって検出される時間経過とともに蓄積されるフォトンの量、及び２以上の検出器に亘るフォトンの分布のうちの少なくともいずれか１つが含まれる。いくつかの実施形態では、検出器は、試料の放射エネルギー（例えば、蛍光寿命）に対応する１つ以上の時間特性を検出しうる構成を有する。励起エネルギーのパルスが、組み込み装置を通過して伝搬した後、検出器が、フォトンの到着時間の分布を検出して、フォトンの到着時間の分布は、試料の放出エネルギーの時間特性の表示（例えば、蛍光寿命の代替物）を生成する。いくつかの実施形態では、１つ以上の検出器は、標識によって放出された放射エネルギーの確率の表示（例えば、蛍光強度）を生成する。いくつかの実施形態では、複数の検出器は、放射エネルギーの空間分布を得るような寸法と配置にされる。１つ以上の検出器からの出力シグナルは、次に、複数の標識間で標識を判別する為に使用され、複数の標識は、標本内の試料を同定する為に使用される。
【００６９】
システム２−１００の概略図が図２−１Ａと図２−１Ｂとに示されている。システムは、機器２−１０４とインターフェイス接続する組み込み装置２−１０２からなる。いくつかの実施形態では、機器２−１０４は、機器２−１０４の一部として組み込まれた１つ以上の励起源２−１０６を備える。いくつかの実施形態では、励起源は、機器２−１０４と組み込み装置２−１０２の双方の外部にあり、機器２−１０４は、励起源から励起エネルギーを受け取ってそれを組み込み装置に指向させるように構成されている。組み込み装置は、組み込み装置を受承して励起源に対して正確な光学的配置で固定する為の任意の適切なソケットを用いて機器にインターフェイス接続し得る。励起源２−１０６は、組み込み装置２−１０２に励起エネルギーを付与するように構成される。図２−１Ｂに模式的に示されているように、組み込み装置２−１０２は、多数のピクセルを備え、ピクセル２−１１２の少なくとも一部は、独立して試料の解析を実施し得る。そのようなピクセル２−１１２は、励起源２−１０６が励起する複数のピクセルのピクセルから別れた励起源２−１０６から励起エネルギーを受け取る為、「受動源ピクセル」と呼ばれる。ピクセル２−１１２は、試料を受容する試料ウェル２−１０８と、励起源２−１０６によって付与される励起エネルギーによる試料の照射に応答して試料から放出される発光エネルギーを検出する検出器２−１１０と、を備える。試料ウェル２−１０８は、試料への励起エネルギーの伝達と、試料からの発光エネルギーの検出とを容易にするために、組み込み装置２−１０２の表面近くに試料を保持し得る。
【００７０】
試料ウェル２−１０８に励起エネルギーをガイドし且つカップリングするための光学要素は、組み込み装置２−１０２と機器２−１０４の両方に配置される。そのような励起源からウェルまでの要素は、励起エネルギーを組み込み装置に接続する為に組み込み装置２−１０２に配置された１つ以上の格子カプラーと、機器２−１０４からピクセル２−１１２の試料ウェルに励起エネルギーを伝達する導波管と、からなる。いくつかの実施形態では、組み込み装置に配置された要素は、試料ウェルから検出器に向かって放射エネルギーを指向させるように機能する。試料ウェル２−１０８と、励起源からウェルまでの光学系の部分と、試料ウェルから検出器までの光学系の部分とは、組み込み装置２−１０２に配置される。励起源２−１０６と、励起源からウェルまでの構成要素の部分は、機器２−１０４に配置される。いくつかの実施形態では、単一の構成要素が、励起エネルギーの試料ウェル２−１０８への接続と、試料ウェル２−１０８から検出器２−１１０への放射エネルギーの伝達の双方を行う。励起エネルギーを試料ウェルに接続したり放射エネルギーをセンサーに指向させたりする為に、組み込み装置に含まれる適切な構成要素の例は、米国特許出願公開第１４／８２１，６８８号明細書の「分子をプロービングし、検出し、且つ分析するための組み込み装置」、及び米国特許出願公開第１４／５４３，８６５号明細書の「分子をプロービングし、検出し、且つ分析するための外部光源を備えた組み込み装置」に開示されており、引用によりその全体を援用する。
【００７１】
図２−１Ｂに示されているように、組み込み装置は、複数のピクセルからなり、各ピクセル２−１１２は、自身の試料ウェル２−１０８と少なくとも１つの検出器２−１１０に対応する。複数のピクセルは、アレイ状に配置され、アレイ中のピクセル数は任意であってよい。組み込み装置２−１０２のピクセル数は、約１０，０００ピクセルから１，０００，０００ピクセルの範囲、又は任意の値、又は前記範囲の値の範囲であってよい。いくつかの実施形態では、ピクセルは、５１２ピクセル×５１２ピクセルのアレイで配置される。組み込み装置２−１０２と機器２−１０４とは、大きなピクセルアレイ（例えば、１０，０００ピクセル以上）に対応したデータを処理する為に、多数のチャネルと高速通信リンクとを備え得る。
【００７２】
機器２−１０４は、組み込み装置インターフェイス２−１１４を介して組み込み装置２−１０２に接続している。組み込み装置インターフェイス２−１１４は、励起源２−１０６から組み込み装置２−１０２への励起エネルギーのカップリングを向上させるために、組み込み装置２−１０２を機器２−１０４に配備及び位置合わせのうちの少なくとも一方を行う為の構成要素を備える。励起源２−１０６は、励起エネルギーを少なくとも１つの試料ウェルに伝達するように配置された任意の適切な光源である。適切な励起源の例は、米国特許出願公開第１４／８２１６８８号明細書の「分子をプロービングし、検出し、且つ解析するための組み込み装置」に開示され、引用によりその全体を援用する。いくつかの実施形態では、励起源２−１０６は、励起エネルギーを組み込み装置２−１０２に伝達する為に組み合わされた複数の励起源を備える。複数の励起源は、複数の励起エネルギー又は波長を生成するように構成され得る。組み込み装置インターフェイス２−１１４は、組み込み装置に配置されたピクセルの検出器から読み出し信号を受け取る。組み込み装置インターフェイス２−１１４は、組み込み装置を組み込み装置インターフェイス２−１１４に固定することによって機器に取り付けられる。
【００７３】
機器２−１０４は、機器２−１０４の操作を制御する為にユーザーインターフェイス２−１１６を備える。ユーザーインターフェイス２−１１６は、ユーザーが、機器に情報、例えば機器の機能を制御する為に使用されるコマンド及び設定のうちの少なくとも一方の入力を可能にする。いくつかの実施形態では、ユーザーインターフェイス２−１１６には、ボタンと、スイッチと、ダイアルと、及び声で命令する為のマイクロフォンと、が含まれる。加えて、ユーザーインターフェイス２−１１６は、ユーザーが、機器及び組み込み装置のうちの少なくともいずれか一方の動作についてのフィードバック、例えば、組み込み装置の検出器からの読み出し信号により得られる適切な位置合わせや情報についてのフィードバックを受け取られるようにし得る。いくつかの実施形態では、ユーザーインターフェイス２−１１６は、聴覚的なフィードバックを生成する為にスピーカーを用いたり視覚的なフィードバックを生成する為に光の表示やディスプレイスクリーンのうちのいずれか一方を用いてフィードバックを提供する。いくつかの実施形態では、機器２−１０４は、計算機２−１２０との接続に使用される計算機インターフェイス２‐１１８を備える。任意の適切な計算機インターフェイス２−１１８と計算機２−１２０とを使用し得る。例えば、計算機インターフェイス２−１１８は、ユーエスビー（ＵＳＢ）インターフェイス又はファイヤワイヤ（ＦｉｒｅＷｉｒｅ）インターフェイスである。計算機２−１２０は、任意の汎用計算機、例えば、ラップトップ又はデスクトップコンピュータである。計算機インターフェイス２−１１８は、機器２−１０４と計算機２−１２０との間の情報通信を促進する。機器２−１０４を制御したり構成するための入力情報は、機器の計算機インターフェイス２−１１８に接続された計算機２−１２０を介して提供し得る。出力情報は、計算機インターフェイス２−１１８を介して計算機２−１２０により受信される。出力情報には、機器２−１０４や組み込み装置２−１１２の動作や検出器２−１１０の読み出し信号からの情報についてフィードバックが含まれる。機器２−１０４は、検出器２−１１０から受け取ったデータを解析する為、及び／又は、励起源２−１０６に制御信号を送信する為に処理装置２−１２２も備え得る。いくつかの実施形態では、処理装置２−１２２は、汎用処理装置、特別に適合した処理装置（例えば、１つ以上のマイクロプロセッサ又はマイクロコントローラーコア等の中央処理装置（ＣＰＵ），フィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、カスタム組み込み回路、デジタルシグナルプロセッサ（ＤＳＰ）、又はそれらの組み合わせ）からなる。いくつかの実施形態では、検出器２−１１０からのデータの処理は、処理装置２−１２２と外部計算機２−１２０の双方により実行される。別の実施形態では、計算機２−１２０は、省略されて、検出器２−１１０からのデータの処理は、処理装置２−１２２のみによって実行される。
【００７４】
図３−１Ａには、ピクセル列を示す組み込み装置３−１０２の略式横断面図が示されている。各ピクセル３−１１２は、試料ウェル３−１０８と、検出器３−１１０と、を備える。検出器３−１１０は、検出器３−１１０が試料ウェル３−１１２の内部で試料によって放出された放射エネルギーを受け取るように試料ウェル３−１１２に整合して配置される。適切な検出器の例は、米国特許出願公開第１４／８２１，６５６号明細書の「検出したフォトンを時間ビニングするための組み込み装置」に開示されており、引用にその全体を援用する。
【００７５】
組み込み装置に接続された励起源は、組み込み装置３−１０２の１つ以上のピクセルに励起エネルギーを付与し得る。図３−１Ｂは、組み込み装置３−１０２に励起エネルギー３−１３０（破線で表示）を付与する為に、組み込み装置３−１０２に励起源３−１０６を接続することを示す略式図である。図３−１Ｂは、励起源からピクセル３−１１２の試料ウェル３−１０８までの励起エネルギーの経路を示す。励起源３−１０６を組み込み装置に配置して整合する為に、組み込み装置の外部に配置した構成要素を使用し得る。そのような構成要素には、レンズ、ミラー、プリズム、アパチャー、減衰器及び光ファイバーのうちの少なくともいずれか１つ等の光学要素が含まれ得る。１つ以上の整合の為の構成要素を制御可能にする為に、機器に、追加的な機械的構成要素を備えてよい。機械的な構成要素には、アクチュエーター、ステッピングモーター、及びノブのうちの少なくともいずれか１つが含まれ得る。
【００７６】
組み込み装置は、励起エネルギー３−１３０を組み込み装置のピクセルに向かって指向させる構成要素を備える。各ピクセル３−１１２内部では、励起エネルギーは、ピクセルに対応する試料ウェル３−１０８にカップリングされる。図３−１Ｂには、ピクセル列の各試料ウェルに励起エネルギーが接続される様子が示されているが、いくつかの実施形態では、励起エネルギーは、列の全てのピクセルにカップリングされなくともよい。いくつかの実施形態では、励起エネルギーは、組み込み装置のピクセル列のピクセル又は試料ウェルの一部にカップリングする。励起エネルギーは、試料ウェル内に配置された試料を照射する。試料は、励起エネルギーによって照明されると励起状態に達しうる。試料が励起状態にある時には、試料は、放射エネルギーを放出して、放射エネルギーは、検出器により検出される。図３−１Ｂには、試料ウェル３−１０８からピクセル３−１１２の検出器３−１１０までの放射エネルギー３−１４０の経路（実線で表示）が模式的に示されている。ピクセル３−１１２の検出器３−１１０は、試料ウェル３−１０８から放射エネルギーを検出するように構成されて配置される。いくつかの実施形態では、検出器３−１１０は、複数のサブ検出器を備え得る。
【００７７】
解析試料は、ピクセル３−１１２の試料ウェル３−１０８の中に導入される。試料は、生物試料又は任意の他の適切な試料、例えば、化学試料であってよい。試料は、複数の分子を含み、試料ウェルは、１個の分子を分離するように構成し得る。いくつかの例では、試料ウェルの大きさは、試料ウェル内に１個の分子を閉じ込めるように機能する為、１個の分子について計測を実施することが可能である。励起源３−１０６は、試料ウェル３−１０８内の照明領域に試料がある間に試料、又は試料に結合又は対応付けられた少なくとも１つの蛍光標識を励起する為に、励起エネルギーを試料ウェル３−１０８に伝達するように構成される。
【００７８】
励起源が試料ウェルに励起エネルギーを伝達した場合には、ウェル内の少なくとも１つの試料が蛍光を発し、得られた放射は、検出器で検出される。この明細書で使用されているように、「試料が蛍光を発する」又は「試料が放射線を放出する」又は「試料からの放出」という言い回しは、蛍光タグ、標識、又はレポーター、試料自体、又は試料に結合した反応産物が、放出放射線を生成することを意味する。
【００７９】
組み込み装置の１つ以上の構成要素は、検出器に向かって放射エネルギーを指向させ得る。放射エネルギーは、検出器で検出されて少なくとも１つの電気信号に変換される。電気信号は、組み込み装置インターフェイス、例えば図２−１Ｂに示されている機器２−１０４の組み込み装置インターフェイス２−１１４を介して機器に接続された組み込み装置の回路の導線に沿って伝達される。電気信号は、その後処理されたり分析される。電気信号の処理又は分析は、機器２−１０４上又は機器以外に配置された適切な計算機、例えば、図２−１Ｂに示されている計算機２−１２０等で行われる。
【００８０】
動作時には、励起源を用いてウェル内の試料を励起して検出器で試料が放出した信号を検出することによって、試料ウェル内の試料は並行して解析される。試料からの放射エネルギーは、対応する検出器で検出されて、少なくとも１つの電気信号に変換される。いくつかの実施形態では、得られた信号は、組み込み装置で処理され、又は処理装置及び計算装置のうちの少なくともいずれか一方で処理する為に機器に送信し得る。試料ウェルからの信号は、別のピクセルに対応する信号とは別々に受信されて処理し得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、試料は、１つ以上の標識で標識されて、標識に対応する放射が機器によって判別される。例えば、検出器は、特定の標識からの放射エネルギーに依存する寿命を判別する為に使用される電気信号を形成する為に放射エネルギーから電子にフォトンを変換する。試料を標識する為に異なる寿命を有する標識を使用することにより、検出器で検出された電気信号に基づいて、試料を特定することができる。
【００８２】
試料は、複数種の分子を含み、異なる蛍光標識は、分子の種類に一義的に対応する。励起中又は励起後には、蛍光標識は、放射エネルギーを放出しうる。放射エネルギーの１つ以上の性質は、試料内の１つ以上の分子種を特定する為に使用し得る。複数種の分子を判別する為に使用される放射エネルギーの特徴には、蛍光寿命の値、強度、及び放射波長のうちの少なくともいずれか１つが含まれ得る。検出器は、フォトン、例えば放射エネルギーのフォトンを検出して、上記特徴の１つ以上を示す電気信号を生成する。いくつかの実施形態では、検出器からの電気信号は、１つ以上の時間間隔に亘ってフォトンの到着時間の分布についての情報を生成し得る。フォトンの到着時間の分布は、励起エネルギーのパルスが励起源によって放出されてからフォトンが検出された時までの時間に対応する。時間間隔の値は、その時間間隔に検出されたフォトンの数に対応する。複数の時間間隔の相対値は、放射エネルギー（例えば、寿命）の時間特性の表示となりうる。試料を解析する工程には、分布内の複数の異なる時間間隔に対する値を比較することによって標識を判別する工程が含まれる。いくつかの実施形態では、強度の表示は、分布内の全ての時間ビンに亘ってフォトンの数を決定することによって生成される。
【００８３】
この明細書で使用されている「核酸」という用語は、１つ以上の核酸サブユニットからなる分子を一般に指す。核酸には、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、又はその派生物から選択された１つ以上のサブユニットが含まれる。いくつかの例では、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ），又はそれらの派生物である。核酸は、１本鎖又は２本鎖である。核酸は、円形である場合もある。
【００８４】
この明細書で使用されている「ヌクレオチド」という用語は、核酸サブユニットを一般に指し、Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ、又はＵ、又はその異形体又はその類似体が含まれる。ヌクレオチドには、伸長する核酸鎖に取り込まれる任意のサブユニットが含まれる。そのようなサブユニットは、１つ以上の相補的なＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔ，又はＵに特異的な任意のサブユニット、又はプリン（Ａ又はＧ，又はそれらの異形体又は類似体）、又はピリミジン（Ｃ，Ｔ，Ｕ、又はその異形体又は類似体）である。
【００８５】
ヌクレオチドは、ヌクレオシドと少なくとも、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０個又はそれ以上のリン酸基を一般に含む。ヌクレオチドは、核酸塩基と、５炭糖（リボース又はデオキシリボース）、及び１つ以上のリン酸基を含む。リボヌクレオチドは、糖がリボースであるヌクレオチドである。デオキシリボヌクレオチドは、糖がデオキシリボースであるヌクレオチドである。ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸、又はヌクレオシドポリリン酸である。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシドポリリン酸、例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸であり、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）ｄＮＴＰｓであり、検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）を備える。
【００８６】
いくつかの実施形態では、この明細書で開示されている実施形態は、１つ以上の計算装置を用いて実施される。実施形態は、特定の種類の計算装置で実施することに限定されない。
【００８７】
図８は、例示の計算装置１０００を示すブロック図である。計算装置１０００は、１つ以上の処理装置１００１と、１つ以上の有体性非一過性の計算機可読記録媒体（例えば、メモリ１００３）を備え得る。メモリ１００３は、実施時に、上述した機能のいずれか１つを実行する計算機プログラム命令を、有体性非一過性計算機可読記録媒体に記録し得る。処理装置１００１は、メモリ１００３に接続されて、機能を具体化又は発揮させる為に、計算機プログラム命令を実行する。
【００８８】
計算機装置１０００は、ネットワーク入力／出力（Ｉ／Ｏ）インターフェイス１００５を備え、それを介して別の計算装置（例えば、ネットワークを介して）と通信し、且つ１つ以上のユーザーＩ／Ｏインターフェイス１００７を備えて、それを介してユーザーに出力を提供したりユーザーからの入力を受け取る。ユーザーＩ／Ｏインターフェイスは、キーボード、マウス、マイクロフォン、ディスプレイ装置（例えば、モニタ又はタッチスクリーン）、スピーカー、カメラ及び別の種類のＩ／Ｏ装置等の装置を含み得る。
【００８９】
上述した実施形態は、多くの方法で実施することができる。例えば、実施形態は、ハードウェア、ソフトウェア、又はそれらの組み合わせを用いて実施し得る。ソフトウェアを用いて実施する場合には、ソフトウェアコードは、１つの計算装置に搭載されるか複数の計算装置に搭載されるかに関わらず、任意の適切な処理装置（マイクロプロセッサ等）、又は処理装置集合体で実行することができる。上述した機能を実行する任意の構成要素又は構成要素の集合体は、上述の機能を制御する１つ以上の制御装置であると解さなければならない。１つ以上の制御装置は、上述した機能を実行する為に、専用のハードウェア、又はマイクロコード又はソフトウェアを用いてプログラミングされた汎用ハードウェア（１つ以上の処理装置等）を用いて、様々な方法で実行し得る。
【００９０】
この点に関して、この明細書で開示されている実施形態の１の実施は、１つ以上の処理装置で実行する場合には、少なくとも１つの計算機で読み取り可能な記憶媒体からなると解さなければならず（例えば、ＲＡＭ，ＲＯＭ，ＥＥＰＲＯＭ，フラッシュメモリ又はその他のメモリ技術、ＣＤ−ＲＯＭ，ディジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、又はその他の光学ディスク記憶装置、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶装置、又はその他の磁気記憶装置、又はその他の有体非一過性コンピュータ可読記憶装置媒体）、１つ以上の実施形態の上述した機能を実行するコンピュータプログラム（複数の実行可能な命令）にコードされる。計算機で読み取り可能な媒体は、この明細書に開示されている技術の態様を実施する為に、保存されているプログラムを任意の計算装置に読み込むませることができる。加えて、実行時に、上述した機能の任意の１つを実行する計算機プログラムの参照は、ホスト計算機上で動作するアプリケーションプログラムに限定されないと理解されたい。むしろ、この明細書で使用される計算機プログラム及びソフトウェアという用語は、この明細書に開示されている技術の態様を実施する為に１つ以上の処理装置をプログラムする為に用いられる計算機コードの任意の形式（アプリケーションソフトウェア、ファームウェア、マイクロコード、又はコンピュータの命令の他の形式等）を指して一般的な意味で用いられる。
【００９１】
本発明の態様は、単独でも、組み合わせても、又は上述した実施形態において具体的に開示されていない様々な構成においても使用し得る為、その適用は、上述の説明又は図面に示された構成要素の詳細及び構成に限定されない。例えば、一の実施形態で説明された態様は、別の実施形態で説明された態様と任意の方法で組み合わせることができる。
【００９２】
また、本発明は、実施例が提供されているように、方法として具体化されうる。方法の一部として実施される工程は、任意の適切な方法で順序が付けられてよい。したがって、実施形態は、例示的な実施形態では逐次的な工程として示されているが、図示されている順序とは異なる順序で工程を実施すること、及びいくつかの工程を同時に実施することも可能である。
【００９３】
請求項の要素を修飾する為に、請求項に「第１」、「第２」、「第３」等の順序を示す用語が使用されているが、これは、請求項のある１要素の優先度や、先行性や、順序を示したり、又はある方法を実施する時間的な順序を示すものではなく、単なるラベルとして同じ名前を有する（が序数を使用する）他の要素からある名前を有する別の請求項の要素を区別する為に使用されている。
【００９４】
また、この明細書で使用されている言い回しや用語は、説明を目的としたものであり、限定であると捉えてはならない。「備える」、「からなる」、「有する」、「含む」、「具備する」、及びこの明細書内の変化形は、その後に列記される要素やその均等物、及びさらなる要素を包含することが可能であることを意味する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図２−１Ａ】
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【図２−１Ｂ】
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【図３】
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【図３−１Ａ】
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【図３−１Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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