(57)【要約】生細胞組成物及び関連の調製、維持、及び使用の方法が開示されている。生細胞組成物は、指定されたレベルの細胞、ヒドロキシエチルデンプン、及びジメチルスルホキシドを含有することができ、凍結保存することができる。凍結保存形態の組成物を解凍し、水性液体希釈媒質と組み合わせて、指定の又は引き下げられたレベルのジメチルスルホキシド及びヒドロキシエチルデンプンを含有する希釈生細胞組成物を調製することができる。希釈媒質はトレハロースを含有することができる。調製された希釈生細胞組成物は患者へ投与することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者を生細胞で治療するための方法であって、
生細胞及び水性凍結保存媒質を含んでいる凍結保存組成物であって、前記凍結保存媒質がジメチルスルホキシドを約１％乃至３％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２％乃至１０％の濃度で含有している凍結保存組成物を解凍して、水性液体中に懸濁した前記生細胞を有する解凍生細胞組成物を提供する段階と、
水性液体希釈媒質と前記解凍生細胞組成物とを、望ましくは少なくとも２：１の体積比で、なおいっそう望ましくは少なくとも５：１の体積比で組み合わせて、ヒドロキシエチルデンプン及びジメチルスルホキシドを含有する希釈生細胞組成物を提供する段階であって、前記ジメチルスルホキシドは前記希釈生細胞組成物中に約０．５％以下の濃度で存在している、希釈生細胞組成物を提供する段階と、
前記希釈生細胞組成物を患者へ投与する段階と、
を備えている、方法。
【請求項２】
患者を治療するための生細胞を調製するための方法であって、
生細胞及び水性凍結保存媒質を含んでいる凍結保存組成物であって、前記凍結保存媒質がジメチルスルホキシドを約１％乃至３％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２％乃至１０％の濃度で含有している凍結保存組成物を解凍して、水性液体中に懸濁した前記生細胞を有する解凍生細胞組成物を提供する段階と、
水性液体希釈媒質と前記解凍生細胞組成物とを、望ましくは少なくとも２：１の体積比で、なおいっそう望ましくは少なくとも５：１の体積比で組み合わせて、ヒドロキシエチルデンプン及びジメチルスルホキシドを含有する希釈生細胞組成物を提供する段階であって、前記ジメチルスルホキシドは前記希釈生細胞組成物中に約０．５％以下の濃度で存在している、希釈生細胞組成物を提供する段階と、
を備えている、方法。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の方法であって、更に、前記解凍の前に、
前記凍結保存組成物を収容している凍結保存容器を冷凍庫に約−６０℃乃至−１００℃の範囲の温度で貯蔵する段階、
を備えている方法。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法において、前記解凍生細胞組成物は約１００万細胞／ｍｌ乃至約２０００万細胞／ｍｌの範囲の前記生細胞の濃度を有しており、前記希釈生細胞組成物は約２０万細胞／ｍｌ乃至約５００万細胞／ｍｌの範囲の前記生細胞の濃度を有している、方法。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか１項に記載の方法であって、更に、前記希釈生細胞組成物を患者の血管の中へ送達することによって前記希釈生細胞組成物を前記患者へ投与する段階、を備えている方法。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法において、前記凍結保存組成物の前記凍結保存媒質は前記ジメチルスルホキシドを約１．５％乃至２．５％の濃度で含有している、方法。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の方法において、前記体積比は少なくとも８：１であり、前記ジメチルスルホキシドは前記希釈生細胞組成物中に約０．３％以下の濃度で存在している、方法。
【請求項８】
請求項１乃至７の何れか１項に記載の方法において、前記凍結保存組成物の前記凍結保存媒質は前記ジメチルスルホキシドを約１．７５％乃至２．２５％の濃度で含有している、方法。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか１項に記載の方法において、前記生細胞は生存能力のある間葉系幹細胞を備えている、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、前記生細胞は生存能力のあるイヌ科間葉系幹細胞を備えている、方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法において、前記生細胞は生存能力のあるネコ科間葉系幹細胞を備えている、方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法において、前記生細胞は生存能力のあるウマ科間葉系幹細胞を備えている、方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の方法において、前記生細胞は生存能力のあるヒト間葉系幹細胞を備えている、方法。
【請求項１４】
請求項１乃至１３の何れか１項に記載の方法において、前記生細胞は、歯系組織、睾丸組織、骨髄、末梢血、胎盤組織、子宮組織、臍帯血、臍帯組織、又は皮膚組織に由来する、方法。
【請求項１５】
請求項１乃至１４の何れか１項に記載の方法において、前記希釈生細胞組成物は前記ヒドロキシエチルデンプンを少なくとも約０．１％の濃度で、より望ましくは少なくとも約０．３％の濃度で含有している、方法。
【請求項１６】
請求項１乃至１５の何れか１項に記載の方法において、前記希釈生細胞組成物は前記ＤＭＳＯを約０．０５％乃至約０．５％の範囲の濃度で、及び前記ヒドロキシエチルデンプンを約０．１％乃至約６％の範囲の濃度で含有している、方法。
【請求項１７】
請求項１乃至１６の何れか１項に記載の方法において、前記水性液体希釈媒質はトレハロースを備えている、方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、前記トレハロースは前記水性液体希釈媒質中に約１％乃至約１０％の濃度で存在している、方法。
【請求項１９】
請求項１７又は請求項１８の方法において、前記トレハロースは前記希釈生細胞組成物中に約２％乃至約７％の濃度で存在している、方法。
【請求項２０】
請求項１乃至１９の何れか１項に記載の方法において、前記凍結保存組成物は前記ジメチルスルホキシドを約２％の濃度で、及び前記ヒドロキシエチルデンプンを約６％の濃度で含有している、方法。
【請求項２１】
生細胞を維持するための方法であって、
生細胞及び水性凍結保存媒質を含んでいる組成物であって、前記凍結保存媒質がジメチルスルホキシドを約１％乃至３％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２％乃至１０％の濃度で含有している組成物を凍結保存条件に維持する段階、
を備えている、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法において、前記維持する段階は前記組成物を約−６０℃乃至−１００℃の範囲の温度に維持する段階を備えている、方法。
【請求項２３】
請求項２１又は請求項２２に記載の方法において、前記維持する段階は前記組成物を機械式冷凍庫内で冷却する段階を備えている、方法。
【請求項２４】
請求項２１乃至２３の何れか１項に記載の方法において、前記組成物は約１００万細胞/ｍｌ乃至約２０００万細胞/ｍｌの範囲の前記生細胞の濃度を有している、方法。
【請求項２５】
請求項２１乃至２４の何れか１項に記載の方法において、前記組成物の前記凍結保存媒質は前記ジメチルスルホキシドを約１．５％乃至２．５％の濃度で含有している、方法。
【請求項２６】
請求項２１乃至２５の何れか１項に記載の方法において、前記組成物の前記凍結保存媒質は前記ジメチルスルホキシドを約１．７５％乃至２．２５％の濃度で含有している、方法。
【請求項２７】
請求項２１乃至２６の何れか１項に記載の方法において、前記生細胞は生存能力のある間葉系幹細胞を備えている、方法。
【請求項２８】
請求項２１乃至２７の何れか１項に記載の方法において、前記生細胞は、歯系組織、睾丸組織、骨髄、末梢血、胎盤組織、子宮組織、臍帯血、臍帯組織、又は皮膚組織に由来する、方法。
【請求項２９】
請求項２１乃至２８の何れか１項に記載の方法において、前記組成物は前記ジメチルスルホキシドを約２％の濃度で、及び前記ヒドロキシエチルデンプンを約６％の濃度で含有している、方法。
【請求項３０】
患者を生細胞で治療するための方法であって、
ジメチルスルホキシドを０．５％以下の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを前記ジメチルスルホキシドの濃度より大きく且つ少なくとも０．１％の濃度で含有する水性液体中に懸濁した生細胞を含有している生細胞組成物を患者へ投与する段階、
を備えている方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法において、前記投与する段階は前記生細胞組成物を前記患者の血管の中へ送達する段階を備えている、方法。
【請求項３２】
請求項３０又は３１に記載の方法において、前記生細胞は生存能力のある間葉系幹細胞を備えている、方法。
【請求項３３】
請求項３０乃至３２の何れか１項に記載の方法において、前記患者は、ネコ科、イヌ科、ウマ科、又はヒトの患者である、方法。
【請求項３４】
請求項３０乃至３３の何れか１項に記載の方法において、前記生細胞組成物は更にトレハロースを備えている、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法において、前記トレハロースは前記生細胞組成物中に約２％乃至約７％の濃度で存在している、方法。
【請求項３６】
請求項３０乃至３５の何れか１項に記載の方法であって、更に、前記投与する段階の前に、水性液体希釈媒質を、ジメチルスルホキシドを約１乃至３％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２乃至１０％の濃度で含有する開始生細胞組成物と組み合わせることによって前記生細胞組成物を調製する段階、を備えている方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法において、前記組み合わせることは、前記水性液体希釈媒質と前記開始生細胞組成物を少なくとも５：１の体積比で用いて行われる、方法。
【請求項３８】
請求項３６又は３７に記載の方法において、前記水性液体希釈媒質はトレハロースを備えている、方法。
【請求項３９】
生細胞及び水性凍結保存媒質を含んでいる凍結保存組成物であって、前記凍結保存媒質がジメチルスルホキシドを約１％乃至３％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２％乃至１０％の濃度で含有している凍結保存組成物を収容している凍結保存容器、
を備えている製品。
【請求項４０】
請求項３９に記載の製品において、前記凍結保存組成物は約−６０℃乃至−１００℃の範囲の温度にある、製品。
【請求項４１】
請求項３９又は４０に記載の製品であって、更に、
前記凍結保存容器が受け入れられる機械式冷凍庫、
を備えている製品。
【請求項４２】
請求項４１に記載の製品において、前記機械式冷凍庫には複数の前記製品が受け入れられる、製品。
【請求項４３】
患者への投与のための生細胞組成物であって、
ジメチルスルホキシドを０．５％未満の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを少なくとも約０．１％の濃度で備えている水性媒質と、
前記水性媒質中に約２０万細胞/ｍｌ乃至約２０００万細胞/ｍｌの濃度で懸濁している生細胞と、
を備えている生細胞組成物。
【請求項４４】
請求項４３の生細胞組成物において、
前記水性媒質は更にトレハロースを備えている、
生細胞組成物。
【請求項４５】
請求項４３又は４４に記載の生細胞組成物において、前記生細胞は前記水性媒質中に約２０万細胞/ｍｌ乃至約５００万細胞／ｍｌの濃度で懸濁している、生細胞組成物。
【請求項４６】
請求項４３乃至４５の何れか１項に記載の生細胞組成物において、前記生細胞は生存能力のある間葉系幹細胞を備えている、生細胞組成物。
【請求項４７】
請求項４６に記載の生細胞組成物において、前記生細胞の９０％より多くがマーカーＣＤ９０及びＣＤ１０５を発現し、前記生細胞の５％未満がマーカーＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＭＨＣクラスＩＩを発現する、生細胞組成物。
【請求項４８】
請求項１又は２に記載の方法において、前記解凍生細胞組成物は約１００万細胞／ｍｌ乃至約２０００万細胞／ｍｌの範囲の前記生細胞の濃度を有しており、前記希釈生細胞組成物は約２０万細胞／ｍｌ乃至約５００万細胞／ｍｌの範囲の前記生細胞の濃度を有している、方法。
【請求項４９】
請求項１又は２に記載の方法であって、更に、前記希釈生細胞組成物を患者の血管の中へ送達することによって前記希釈生細胞組成物を前記患者へ投与する段階、を備えている方法。
【請求項５０】
請求項１又は２に記載の方法において、前記凍結保存組成物の前記凍結保存媒質は前記ジメチルスルホキシドを約１．５％乃至２．５％の濃度で含有している、方法。
【請求項５１】
請求項１又は２に記載の方法において、前記体積比は少なくとも８：１であり、前記ジメチルスルホキシドは前記希釈生細胞組成物中に約０．３％以下の濃度で存在している、方法。
【請求項５２】
請求項１又は２に記載の方法において、前記凍結保存組成物の前記凍結保存媒質は前記ジメチルスルホキシドを約１．７５％乃至２．２５％の濃度で含有している、方法。
【請求項５３】
請求項１又２に記載の方法において、前記生細胞は生存能力のある間葉系幹細胞を備えている、方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法において、前記生細胞は生存能力のあるイヌ科間葉系幹細胞を備えている、方法。
【請求項５５】
請求項５３に記載の方法において、前記生細胞は生存能力のあるネコ科間葉系幹細胞を備えている、方法。
【請求項５６】
請求項５３に記載の方法において、前記生細胞は生存能力のあるウマ科間葉系幹細胞を備えている、方法。
【請求項５７】
請求項５３に記載の方法において、前記生細胞は生存能力のあるヒト間葉系幹細胞を備えている、方法。
【請求項５８】
請求項１又は２に記載の方法において、前記生細胞は、歯系組織、睾丸組織、骨髄、末梢血、胎盤組織、子宮組織、臍帯血、臍帯組織、又は皮膚組織に由来する、方法。
【請求項５９】
請求項１又は２に記載の方法において、前記希釈生細胞組成物は前記ヒドロキシエチルデンプンを少なくとも約０．１％の濃度で、より望ましくは少なくとも約０．３％の濃度で含有している、方法。
【請求項６０】
請求項１又は２に記載の方法において、前記希釈生細胞組成物は前記ＤＭＳＯを約０．０５％乃至約０．５％の範囲の濃度で、及び前記ヒドロキシエチルデンプンを約０．１％乃至約６％の範囲の濃度で含有している、方法。
【請求項６１】
請求項１又は２に記載の方法において、前記水性液体希釈媒質はトレハロースを備えている、方法。
【請求項６２】
請求項６１に記載の方法において、前記トレハロースは前記水性液体希釈媒質中に約１％乃至約１０％の濃度で存在している、方法。
【請求項６３】
請求項６１に記載の方法において、前記トレハロースは前記希釈生細胞組成物中に約２％乃至約７％の濃度で存在している、方法。
【請求項６４】
請求項１又は２に記載の方法において、前記凍結保存組成物は前記ジメチルスルホキシドを約２％の濃度で、及び前記ヒドロキシエチルデンプンを約６％の濃度で含有している、方法。
【請求項６５】
請求項２１又は２２に記載の方法において、前記組成物は約１００万細胞／ｍｌ乃至約２０００万細胞／ｍｌの範囲の前記生細胞の濃度を有している、方法。
【請求項６６】
請求項２１又は２２に記載の方法において、前記組成物の前記凍結保存媒質は前記ジメチルスルホキシドを約１．５％乃至２．５％の濃度で含有している、方法。
【請求項６７】
請求項２１又は２２に記載の方法において、前記組成物の前記凍結保存媒質は前記ジメチルスルホキシドを約１．７５％乃至２．２５％の濃度で含有している、方法。
【請求項６８】
請求項２１又は２２に記載の方法において、前記生細胞は生存能力のある間葉系幹細胞を備えている、方法。
【請求項６９】
請求項２１又は２２に記載の方法において、前記生細胞は、歯系組織、睾丸組織、骨髄、末梢血、胎盤組織、子宮組織、臍帯血、臍帯組織、又は皮膚組織に由来する、方法。
【請求項７０】
請求項２１又は２２に記載の方法において、前記組成物は前記ジメチルスルホキシドを約２％の濃度で、及び前記ヒドロキシエチルデンプンを約６％の濃度で含有している、方法。
【請求項７１】
請求項３０又は３１に記載の方法において、前記患者は、ネコ科、イヌ科、ウマ科、又はヒトの患者である、方法。
【請求項７２】
請求項３０又は３１に記載の方法において、前記生細胞組成物は更にトレハロースを備えている、方法。
【請求項７３】
請求項７２に記載の方法において、前記トレハロースは前記生細胞組成物中に約２％乃至約７％の濃度で存在している、方法。
【請求項７４】
請求項３０又は３１に記載の方法であって、更に、前記投与する段階の前に、水性液体希釈媒質を、ジメチルスルホキシドを約１乃至３％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２乃至１０％の濃度で含有する開始生細胞組成物と組み合わせることによって前記生細胞組成物を調製する段階、を備えている方法。
【請求項７５】
請求項７４に記載の方法において、前記組み合わせることは、前記水性液体希釈媒質と前記開始生細胞組成物を少なくとも５：１の体積比で用いて行われる、方法。
【請求項７６】
請求項７４に記載の方法において、前記水性液体希釈媒質はトレハロースを備えている、方法。
【請求項７７】
請求項４３又は４４に記載の生細胞組成物において、前記生細胞は生存可能な間葉系幹細胞を備えている、生細胞組成物。
【請求項７８】
請求項７７に記載の生細胞組成物において、前記生細胞の９０％より多くがマーカーＣＤ９０及びＣＤ１０５を発現し、前記生細胞の５％未満がマーカーＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＭＨＣクラスＩＩを発現する、生細胞組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１６年３月２８日出願の米国仮特許出願第６２／３１４，３１６号の恩典を主張し、同仮特許出願をこれにより参考文献としてそっくりそのまま援用する。
【０００２】
本開示の諸態様は、概括的には、生細胞組成物及びそれらの調製、貯蔵、及び使用の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
様々な病変又は障害の治療における細胞組成物のヒト及び動物への投与がいよいよ普及しつつあり、数多くの療法を改善する期待を担っている。生細胞を安定して貯蔵し、次いでそれらを調製し、そして患者へ送達することができるというのが重要である。凍結保存のための組成物への添加物は、生存性を温存するのに有効でなくてはならず、なおかつ最終的に患者へ送達されたときに生物学的に受容可能でなくてはならない。しかも組成物の広範な配給と使用を容易にするために、製造及び／又は配給のチェーンにおける過度な出資や他の出費無しに実現でき得る条件の或る範囲を通じて組成物を有効に貯蔵できるのであれば極めて好都合である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
当分野の背景に鑑み、貯蔵安定性のある細胞の調製、そしてそれらの配給、貯蔵、及び最終的使用に関連する改善された及び／又は代わりの方法及び組成物に対する必要性が以前より存在している。本開示の諸態様はこれらの必要性に取り組んでいる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
きわめて堅牢で、貯蔵可能、生存可能な細胞の調製は、凍結保存中には生存性を温存するが最終的には患者への投与のための療法用生細胞組成物への容易なアクセスを提供するのを支援する制御された濃度の添加物を組み入れた場合に、実現され得ることが発見されている。したがって、１つの態様では、本開示は、患者へ投与することのできる生細胞を作製し、貯蔵し、及び調製するための方法を提供している。この方法は、１ｍｌ当たり約５０万乃至約２０００万の生細胞と、ジメチルスルホキシドを約１乃至３％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２％乃至１０％の濃度で含む水性凍結保存媒質と、を含んでいる未凍結液体組成物を調製する段階を含んでいる。未凍結液体組成物は凍結保存容器に密封される。凍結保存容器は冷凍庫に約−６０℃乃至−１００℃の範囲の温度で貯蔵される。凍結保存容器は冷凍庫から取り出され解凍されて、水性凍結保存媒質中に懸濁した生細胞を有する解凍生細胞組成物が提供される。希釈用水性液体が解凍生細胞組成物と例えば少なくとも５：１の体積比で組み合わされて、ヒドロキシエチルデンプン及びジメチルスルホキシドを含有する希釈生細胞組成物中に約０．５％以下の濃度でジメチルスルホキシドを存在させた希釈生細胞組成物が提供される。希釈生細胞組成物は、更に、ヒドロキシエチルデンプンをジメチルスルホキシドの濃度より大きい濃度及び／又は少なくとも０．１％の濃度で含有することができる。希釈生細胞組成物は患者へ投与することができる。
【０００６】
別の態様では、患者を生細胞で治療するための方法が提供されている。この方法は、生細胞及び水性凍結保存媒質を含んでいる凍結保存組成物であって、凍結保存組成物の凍結保存媒質がジメチルスルホキシドを約１％乃至３％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２％乃至１０％の濃度で含有している、当該凍結保存組成物を解凍して、水性液体中に懸濁した生細胞を有する解凍生細胞組成物を提供する段階を含んでいる。方法は、更に、希釈用水性液体媒質を解凍生細胞組成物と組み合わせて、ヒドロキシエチルデンプン及びジメチルスルホキシドを含有する希釈生細胞組成物を提供する段階を含んでおり、ジメチルスルホキシドは希釈生細胞組成物中に約０．５％以下の濃度で存在している。方法は、更に、希釈生細胞組成物を患者へ投与する段階を含んでいる。
【０００７】
別の態様では、患者を治療するのに使用することのできる生細胞を調製するための方法が提供されている。この方法は、生細胞及び水性凍結保存媒質を含んでいる凍結保存組成物であって、凍結保存組成物の凍結保存媒質がジメチルスルホキシドを約１％乃至３％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２％乃至１０％の濃度で含有している、当該凍結保存組成物を解凍して、水性液体中に懸濁した生細胞を有する解凍生細胞組成物を提供する段階を含んでいる。この方法は、更に、希釈用水性液体媒質を解凍生細胞組成物と組み合わせて、ヒドロキシエチルデンプン及びジメチルスルホキシドを含有する希釈生細胞組成物を提供する段階を含んでおり、ジメチルスルホキシドは希釈生細胞組成物中に約０．５％以下の濃度で存在している。
【０００８】
別の態様では、患者を生細胞で治療するための方法が提供されている。方法は、凍結保存容器を冷凍庫に約−６０℃乃至−１００℃の範囲の温度で貯蔵する段階を含んでおり、凍結保存容器は生細胞及び水性凍結保存媒質を含んでいる凍結保存組成物を収容していて、凍結保存組成物の凍結保存媒質はジメチルスルホキシドを約１％乃至３％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２％乃至１０％の濃度で含有している。凍結保存組成物は解凍されて、ジメチルスルホキシドを約１％乃至３％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２％乃至１０％の濃度で有する水性液体中に懸濁した生細胞を有する解凍生細胞組成物が提供される。希釈用水性液体媒質が解凍生細胞組成物と組み合わされて、ヒドロキシエチルデンプン及びジメチルスルホキシドを含有する希釈生細胞組成物が提供され、ジメチルスルホキシドは希釈生細胞組成物中に約０．５％以下の濃度で存在している。希釈生細胞組成物は患者へ投与される。
【０００９】
更なる態様では、患者を生細胞で治療するための方法が提供されている。方法は、ジメチルスルホキシドを０．５％以下の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンをジメチルスルホキシドの濃度より大きい濃度及び／又は少なくとも０．１％の濃度で含有する水性液体中に懸濁した生細胞を含有している生細胞組成物を投与する段階を含んでいる。
【００１０】
別の態様では、生細胞及び水性凍結保存媒質を含んでいる凍結保存組成物を収容する凍結保存容器を含んでいる生細胞製品であって、凍結保存組成物の凍結保存媒質がジメチルスルホキシドを約１％乃至３％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２％乃至１０％の濃度で含有している、生細胞製品が提供されている。
【００１１】
別の態様では、生細胞を維持するための方法が提供されている。この方法は、生細胞及び水性凍結保存媒質を含む組成物を凍結保存条件に維持する段階を含んでおり、凍結保存媒質は、ジメチルスルホキシドを約１％乃至３％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２％乃至１０％の濃度で含有している。
【００１２】
別の態様では、患者への投与のための生細胞組成物が提供されている。生細胞組成物は、ジメチルスルホキシドを約０．５％未満の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンをジメチルスルホキシドの濃度より大きくてもよいとされる濃度で及び／又は少なくとも０．１％であってもよいとされる濃度で備える水性媒質を含んでいる。細胞組成物は、更に、水性媒質中に好適には約２０万細胞／ｍｌ乃至約１０００万細胞／ｍｌの濃度で懸濁した生細胞を含んでいる。
【００１３】
別の態様では、生細胞組成物が提供されている。組成物は生細胞及び水性凍結保存媒質を含んでいる。水性凍結保存媒質は、ジメチルスルホキシドを約１％乃至３％濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２％乃至１０％の濃度で含有している。様々な実施形態では、組成物は、液体形態であってもよいし、又は例えば約−６０℃以下の温度での、例えば一部の変形型では約−６０℃乃至−１００℃の温度での、凍結保存条件にあってもよい。
【００１４】
本開示の追加の実施形態並びにその特徴及び利点は明細書の説明から自明であろう。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
この詳細な説明では特定の実施形態を参照してゆくことにし、それら実施形態を説明するのに特定の用語遣いを用いることにする。この説明は例示を目的とするものであることを理解しておきたい。説明されている実施形態における何らかの改変及び更なる修正、並びにその原理の何らかの更なる適用が、この開示に関連する技術分野の当業者には普通に想起されるであろうと考えている。
【００１６】
以上に開示されている様に、特定の態様では、本開示は、生細胞組成物、及び関連の調製、貯蔵、及び使用の方法に関する。次に続く論考では、多数の見込まれる特徴又は特徴の組合せが開示されている。それぞれのその様な開示されている特徴又は特徴の組合せは以上の発明の概要に又は以下の特定の開示実施形態の一覧に論じられている一般化された特徴と組み合わされて本発明の一開示実施形態を形成することもできるものと理解されたい。加えて、ここに与えられている全てのパーセンテージは、別途記載されていない限り重量パーセンテージとして与えられている。
【００１７】
本開示の実施形態では、広範に様々な細胞型を使用することができる。例えば、細胞は、皮膚細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、肺細胞、腸間膜細胞、脂肪細胞、又は間葉系幹細胞の様な幹細胞、であってもよい。脂肪細胞は、大網脂肪、腹膜前脂肪、腎臓周囲脂肪、心膜脂肪、皮下脂肪、乳房脂肪、又は副睾丸脂肪に由来していてもよい。特定の実施形態では、細胞は、間質細胞、幹細胞、又はそれらの組合せを備えている。ここでの使用に際し、「幹細胞」という用語は、広義で使用されており、伝統的な幹細胞、脂肪由来幹細胞、始原細胞、前始原細胞（preprogenitor cells）、予備細胞、など、を含む。例示としての幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、多能性幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞、筋幹細胞、筋前駆幹細胞、内皮前駆細胞、骨髄幹細胞、軟骨形成幹細胞、リンパ球系幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、中枢神経系幹細胞、末梢神経系幹細胞、など、を含む。使用することのできる追加の例示としての細胞は、肝細胞、上皮細胞、クッパー細胞、線維芽細胞、神経細胞、心筋細胞、筋細胞、軟骨細胞、膵腺房細胞、ランゲルハンス島、骨細胞、筋芽細胞、衛星細胞、内皮細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、胆管上皮細胞、及びこれらの細胞型の何れかの始原細胞を含む。
【００１８】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が使用される場合、それは適したどのような組織から得られてもよい。これらは、一例として、歯系組織（例えば、歯髄、歯周靭帯、又は他の歯系組織から採取されたものなど）、睾丸組織、骨髄、末梢血、胎盤組織、子宮組織（子宮内膜再生細胞を含む）、臍帯血、臍帯組織、又は皮膚組織（全層皮膚組織を含む）、に由来するＭＳＣを含む。これら又は他のＭＳＣを本開示の諸態様で使用することができる。ＭＳＣは、概して、フローサイトメトリーによって検出されることとしてマーカーＣＤ９０及びＣＤ１０５を発現し（＞９０％）且つＣＤ３４及びＣＤ４５並びにＭＨＣクラスＩＩの発現を欠く（＜５％）付着性細胞集団であるとしてもよい。
【００１９】
ここでの実施形態に使用される細胞は、動物、例えば、ヒト、イヌ科（例えばイヌ）、ネコ科（例えばネコ）、ウマ科（例えばウマ）、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシの様な哺乳類、の何れかの適した種に由来していてもよい。
【００２０】
細胞は、生存可能な状態にて、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び炭水化物つまり好適な実施形態ではヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含んでいる水性凍結保存媒質と組み合わされることになる。ＨＥＳ及びＤＭＳＯは商業的に容易に入手可能である。細胞とＤＭＳＯ及びＨＥＳとの組み合わせは、生細胞をＤＭＳＯ及びＨＥＳの両方を含有する溶液と組み合わせることによる様式、又は細胞を別々の溶液、つまりどちらか一方の溶液がＤＭＳＯを含有し、もう一方の溶液がＨＥＳを含有する、という別々の溶液と組み合わせることによる様式を含め、何れの適した様式で行われてもよい。生細胞を水性凍結保存媒質中に提供するこれらのモード及び他のモードも適切であるだろう。また、凍結保存媒質は、他の凍結保存剤を含め、ＤＭＳＯ及びＨＥＳ以外の作用剤を含有することもできるものと理解しておきたい。但し、好適な形態では、ＤＭＳＯ及びＨＥＳが、凍結保存媒質の水以外の媒質の、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、実質的に全部（９８％以上）を構成する。
【００２１】
凍結保存されることになる好適な調製生細胞組成物中に、凍結保存媒質は、ＤＭＳＯを、約５％以下もしくは約３％以下の濃度、最も望ましくは約１％乃至３％の範囲又は約１．５％乃至約２．５％の範囲の濃度で含み、ＨＥＳを、約１２％以下又は約１０％以下の濃度、最も望ましくは約２％乃至１０％の範囲又は約４％乃至約８％の範囲の濃度で含むものとしたい。特定の好適な形態では、凍結保存媒質は、ＤＭＳＯを約２％の濃度で、及びＨＥＳを約６％の濃度で含んでいる。
【００２２】
凍結保存されることになる好適な調製生細胞組成物中に、生細胞は、少なくとも約２０万細胞／ｍｌ、少なくとも約５０万細胞／ｍｌ、少なくとも約１００万細胞／ｍｌ、少なくとも約５００万細胞／ｍｌ、又は少なくとも約１０００万細胞／ｍｌの濃度で存在し、及び／又は生細胞は、約５０００万細胞／ｍｌを超えない、約３０００万細胞／ｍｌを超えない、又は約２０００万細胞／ｍｌを超えない濃度で存在している。特定の変形型では、生細胞は、細胞組成物中に、約５０万乃至約２０００万細胞／ｍｌの範囲、又は約３００万乃至約２０００万細胞／ｍｌの範囲、又は約５００万乃至約１５００万細胞／ｍｌの範囲、又は約８００万乃至約１２００万細胞／ｍｌの範囲の濃度で存在しているだろう。一部の形態では、生細胞は、生細胞組成物中に、約１０００万細胞／ｍｌの濃度で存在しているだろう。
【００２３】
生細胞及び以上に開示されている凍結保存媒質を含む生細胞組成物は、未凍結（液体）形態にて、凍結保存バイアル又は凍結保存袋の様な凍結保存容器の中に調製され、又は凍結保存容器の中へ送達され、又はそれ以外のやり方で凍結保存容器に入って提供される。好適な形態では、細胞組成物は、２０１４年４月２９日発行の米国特許第８，７０９，７９７号に開示されている特徴を有する凍結保存バイアルに入って提供されており、前記特許をこれにより参考文献として援用する。従って、好適な凍結保存バイアルは、アクセスポート、望ましくは針隔壁、を含んでいて、バイアル内での（例えば凍結保存状態での）貯蔵期間の後はアクセスポートを通して針又は他のカニューレ型装置により無菌に生細胞にアクセスできるようにしておきたい。好適なバイアルは、更に、充填ポート及び脱気ポート（脱気ポートは無菌フィルタを含んでいるのが望ましい）として使用することのできる、バイアル内部への２つの追加的なポートを含む。これらの２つの追加的なポートはヒートシール可能な管材を装着されていて、充填後は管材をヒートシールすればバイアルを密封することができ、またその後、バイアル内の細胞にアクセスする前に管材を切れば、例えば針隔壁を通じての針ベースの細胞組成物取り出しのための脱気を提供することができる、というようになっていてもよい。好適な形態では、各凍結保存容器は、約１ｍｌ乃至約１０ｍｌの細胞組成物、より望ましくは約１ｍｌ乃至約５ｍｌの組成物、最も望ましくは約２ｍｌ乃至約３ｍｌの組成物を収容しているだろう。ここの実施形態での使用にとって好適な凍結保存バイアルは、ＣｅｌｌＳｅａｌ（登録商標）極低温バイアル（インディアナ州ブルーミントンのＣｏｏｋ  Ｒｅｇｅｎｅｔｅｃ  ＬＬＣ）として商業的に入手可能である。
【００２４】
生細胞組成物を収容している凍結保存容器は、組成物を凍結保存させるために凍結保存条件に曝すことができる。例えば、凍結保存条件は、凍結保存容器を生細胞が凍る温度で貯蔵することを含んでいてもよい。例えば、細胞組成物は、約−６０℃以下の範囲、例えば、約−６０℃乃至−１５０℃、より望ましくは約−６０℃乃至−１００℃、なおいっそう望ましくは約−７０℃乃至−９０℃の範囲の温度にて凍結保存状態に維持されることができる。特定の形態では、細胞組成物は、約−８０℃±５℃の温度にて凍結保存状態に維持されることができる。最も好適な形態では、細胞組成物を記載の温度にて凍結保存状態に維持するには凍結保存容器は機械式冷凍庫（典型的には電気により動力供給される冷凍庫であって、再循環式冷凍剤を空気冷却装置内に使用して冷凍庫内の循環する空気からの熱を交換して冷凍庫内の内容物の温度を下げるようになっている冷凍庫）に貯蔵される。好都合にも、これは、機械式冷凍庫（例えば、生細胞組成物が発送されてきて、機械式冷凍庫に貯蔵され、解凍されて、次いで例えば患者を治療するために使用されることになるケア拠点で稼働中の機械式冷凍庫）が使用される場合の少なくとも貯蔵段階においては凍結保存貯蔵のために液体窒素タンクを使用する必要性を回避する。こうして、幾つかの実施形態では、生細胞組成物を収容している凍結保存容器は、製造施設にて、流通施設にて、又はケア拠点施設から離れている別の施設にて、凍結保存条件下に貯蔵される（例えば、液体窒素に浸けられる及び／又はここに開示されている様に機械式冷凍庫に入れられる）ことができ、生細胞を収容している凍結保存容器は（液体窒素システム及び／又はドライアイス――凍らせた二酸化炭素――を入れた発送用梱包体の中で）凍結保存条件を維持したままケア拠点へ発送されることができ、生細胞を収容している凍結保存容器は、ケア拠点（獣医クリニック又は病院）にて投与のために必要とされるまで凍結保存条件下に、望ましくはここに開示されている機械式冷凍庫の中に、貯蔵されることができる。
【００２５】
細胞、ＨＥＳ、及びＤＭＳＯを含有する好適な生細胞組成物は、約−６０℃から−１００℃の範囲の温度での貯蔵中の細胞の生存性を維持する優れた能力を示す。例えば、好適な組成物は、−６０℃から−１００℃の範囲の温度で６カ月の期間に亘って貯蔵されたとき、またより好適には約−６０℃から−１００℃の範囲の温度で１年の期間に亘って貯蔵されたとき、それらの初期生細胞の２０％より多くを、それらの生細胞の１０％より多くを、又はそれらの生細胞の５％より多くを失うことはないだろう。比較的穏やかな冷却条件下でのその様な貯蔵安定性は、好都合な製品配給を可能にさせ、またここに説明されている様にそれぞれが細胞組成物を収容している複数の冷凍保存容器が貯蔵される機械式冷凍庫を、複数のケア拠点（例えば、１０カ所以上、又は２０カ所以上）が維持することのできる方法を使用する。これらの貯蔵条件下での細胞の生存性の安定性は、ケア拠点での受容できる保管寿命を提供することができる。投与直前（例えば、６時間内、２時間内、又は１時間内）に、凍結保存容器を冷凍庫から取り出し、中の組成物を更なる操作（例えば、以下に説明されている希釈）及び／又は投与に向けて解凍することができる。
【００２６】
ここで、細胞組成物を解凍するための一部の方法では、凍った細胞組成物が液体の形態へ戻る温度まで凍結保存容器を加温することができる。これは、何れの適した方式で実現されてもよい。例えば、無菌密封されたままの容器を室温（例えば約２０℃乃至２５℃）のガス性環境（例えば、ケア拠点での室内空気環境）に曝して細胞組成物を解凍させるようにしてもよい。別の形態では、容器を、例えば約３３℃乃至３７℃の範囲の温度、望ましくは約３７℃の温度へ加温された加温液体槽の中に定温放置して細胞組成物を解凍させるようにしてもよい。細胞組成物の凍結保存及びその後の解凍は、細胞生存性の高い持続性をもたらし、例えば、解凍された組成物が凍結保存前の初期細胞組成物の生細胞の少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を保っているというのが望ましい。
【００２７】
解凍後、生細胞組成物は、凍結保存容器から取り出すことができる。例えば、一部の実施形態では、凍結保存容器は隔壁を有していて、容器内部の無菌環境を維持しながら、隔壁を針又は他のカニューレ型装置が刺し貫いて容器内容物にアクセスするようになっていてもよい。次いで針又は他のカニューレ型装置を使用して細胞組成物を容器から無菌式に、例えばシリンジバレル又は他のバレルの中へ引き込むことができる。他の実施形態では、凍結保存容器内の細胞組成物にアクセスし生細胞組成物を凍結保存容器から取り出すための他の方法を使用することもできるものと理解しておきたい。
【００２８】
一部の形態では、生細胞組成物は、凍結保存容器から取り出され次第その組成から未修飾のまま、患者へ投与されるか又は研究或いは他の利用に供されてもよい。一部の実施形態では、生細胞組成物は、患者への投与での使用を含め、使用のために修飾される。修飾は、例えば、１つ又はそれ以上の物質の生細胞組成物への添加を含むことができる。
【００２９】
好適な方法では、生細胞組成物は、組成物の細胞濃度を希釈するため、また場合に依っては更に生細胞組成物のＨＥＳ及び／又はＤＭＳＯの様な他の成分の濃度を希釈するために、水性液体希釈媒質と組み合わされる。有益な態様では、希釈用水性液体媒質は、リン酸塩緩衝又はそれ以外の緩衝された生理食塩水の様な生理学的に受容され得る水性液体とすることができ、他の添加物を含んでいる水性液体ということもあり得る。更に、希釈用水性液体媒質は、所与の組成物の単一体積分としての又は同じ組成物又は異なる組成物の複数体積分としての生細胞組成物と組み合わせることができるものと理解しておきたい。
【００３０】
好適な方法では、患者への投与又は他の使用に向けて希釈生細胞組成物を調製するには、希釈用水性液体媒質が細胞組成物と、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも５：１、又は少なくとも８：１の体積比で組み合わされることになる。より好適な形態では、その様な体積比は、約３：１乃至約２０：１、又は約５：１乃至約１５：１の範囲であろう。調製された希釈組成物の細胞濃度、ＤＭＳＯ濃度、及びＨＥＳ濃度は、希釈前の開始細胞組成物に比して相応に下がるものと考えているが、一部の形態では、希釈用水性液体媒質そのものが或る程度の濃度の細胞、ＨＥＳ、及び／又はＤＭＳＯを含有していることもあり、それでもそれら濃度は希釈された細胞組成物中の細胞、ＨＥＳ、及びＤＭＳＯの或る程度の希釈をもたらすように開始細胞組成物中の濃度より低いのが典型的である。
【００３１】
解凍細胞組成物と希釈用水性液体媒質との組み合わせは、何れかの適した容器又は容れ物内で行うことができる。有益なモードでは、組み合わせは第２の容器（凍結保存容器以外又は細胞が貯蔵又は保持されていた他の容器以外）内で行われる。この第２の容器は、細胞組成物及び／又は希釈用水性液体媒質の様な材料の第２の容器内への無菌移送のための投入口又は他の投入部材、例えば隔壁、を含むことができる。一部の形態では、細胞組成物を希釈用水性液体媒質と組み合わせる段階は、これらの両方を第２の容器の中へ順に又は同時のどちらかで送達する段階を含むことができる。他の形態では、第２の容器は、希釈用水性液体媒質を無菌条件で既に収容している予め製造された容器として提供されていて、細胞組成物が予め製造された容器へ添加されるようになっていてもよい。これらの実施形態の何れにおいても、第２の容器は袋であってもよく、及び／又は第２の容器は投入ポートから離間した出口ポート又は調製された希釈細胞組成物を袋又は他の容器から送達するための、例えば患者の中へ送達するための、他の部材を有していてもよい。第２の容器は、例えば医学的ケアでの患者治療用の一般的な生理食塩水袋に見られる様に、材料の無菌投入のための隔壁と材料の出口用の弁付きポートとを有する袋であってもよい。解凍細胞組成物及び場合によりトレハロース含有媒質（袋に入って予め製造されていない場合）は、隔壁を貫く針によって袋の中へ無菌送達され、調製された希釈細胞組成物は弁付きポートを通って患者へ無菌送達されることができる。
【００３２】
特定の実施形態では、希釈用水性液体媒質が生細胞組成物と組み合わされると、調製された希釈細胞組成物は、ＤＭＳＯ濃度が、その初期レベル（凍結保存細胞組成物について以上に指示されているレベルのうちの何れか）から約０．５％以下、より望ましくは約０．３％以下の希釈濃度へ下がっており、一部の実施形態では、約０．０５％乃至約０．５％の範囲、又は約０．１％乃至約０．３％の範囲の希釈濃度へ下がったＤＭＳＯ濃度を有しているであろう。追加的又は代替的に、希釈用水性液体媒質が生細胞組成物と組み合わされると、調製された希釈細胞組成物は、ＤＭＳＯの濃度より大きい及び／又は少なくとも約０．１％、より望ましくは少なくとも約０．３％であるＨＥＳ濃度を有し、一部の実施形態では、約０．１％乃至約６％の範囲、又は約０．３％乃至約２％の範囲のＨＥＳ濃度を有しているであろう。ＨＥＳ（濃度６％）は血流への投与の場合の既知の増量剤であり、従って、ヒト又は他の動物の患者の血流への投与にとって適切な希釈細胞組成物を調製するとはいえ、希釈用水性液体媒質は一部の実施形態では有意レベルのＨＥＳを含有することもあり得るものと考えている。従って、一部の作用モードでは、希釈組成物は、希釈前の開始細胞組成物に比較すると、ＨＥＳ濃度に低下があるならそのＨＥＳの低下分より大きく下げたＤＭＳＯ濃度を有することができる。希釈細胞組成物中の細胞濃度に関して、希釈用水性液体媒質は、典型的には、細胞を一切含有しないものとしており、希釈生細胞組成物の細胞濃度は開始細胞組成物の濃度より低く、例えば、約１０万細胞／ｍｌ乃至約２０００万細胞／ｍｌの範囲、又は約２５万細胞／ｍｌ乃至約５００万細胞／ｍｌの範囲、又は約５０万細胞／ｍｌ乃至約２００万細胞／ｍｌの範囲の濃度になるだろう。特定の形態では、調製された希釈細胞組成物の細胞濃度は約１００万細胞／ｍｌになるだろう。
【００３３】
ここの特定の実施形態では、希釈用水性液体媒質はトレハロースを含有しているだろう。トレハロースはミコース又はトレマロース（tremalose）としても知られているものであって、２つのα−グルコース単位間のα，α−１，１−グルコシド結合によって形成されるアルファ結合二糖類である。それは、（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−６−［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ，６Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）オキサン−２−イル］オキシオキサン−３，４，５−トリオルの化学名（ＩＵＰＡＣ命名法）を有している。希釈用水性液体媒質は、これらの目的に適った適切な如何なる濃度のトレハロースを含有していてもよい。特定の態様では、希釈用水性液体媒質は、トレハロースを、約１重量％乃至約２０重量％、又は約１重量％乃至約１０重量％、又は約２重量％乃至約７重量％、又は約２．５重量％乃至約５重量％、又は約３重量％乃至約４重量％の濃度で含有しているだろう。希釈用水性液体媒質は、ここに指定されている様にトレハロースを含有しているにせよいないにせよ、更に、他の成分を含むことができ、及び／又は指定されたオスモル濃度を有することができる。例えば、それは、塩化ナトリウムを、生理学的に受容可能なレベルで、例えば約０．５％乃至約１．５％の範囲のレベル、例えば約０．９％（等張性）のレベルで含むことができる。希釈用水性液体媒質は、更に、緩衝液、例えばリン酸塩緩衝液、を含むことができ、約６乃至８、又は約６．８乃至７．８、又は約７乃至７．５の範囲のｐＨを有することができる。希釈用水性液体媒質は、更に、２００ミリオスモル毎キログラム（ｍｏｓｍ／ｋｇ）乃至６００ｍｏｓｍ／ｋｇ、又は２５０ｍｏｓｍ／ｋｇ乃至５００ｍｏｓｍ／ｋｇ、又は２５０ｍｏｓｍ／ｋｇ乃至４００ｍｏｓｍ／ｋｇ、の範囲のオスモル濃度を有することができる。
【００３４】
トレハロースを含有する希釈用水性液体媒質を、ＤＭＳＯ及びＨＥＳを含有する細胞組成物と組み合わせて、適切な濃度のトレハロースをＨＥＳ及びＤＭＳＯ（例えば、以上に指定されている希釈細胞組成物についての濃度でのＨＥＳ及びＤＭＳＯ）と共に有するトレハロース含有希釈細胞組成物を調製することができる。調製された希釈生細胞組成物中のトレハロースの濃度は、特定の実施形態では、約１重量％乃至約１０重量％トレハロース、又は約２重量％乃至約７重量％、又は約２．５重量％乃至約５重量％、又は約３重量％乃至約４重量％、の範囲にある。追加的又は代替的に、トレハロースの濃度は、トレハロース不含有の対応する細胞組成物に比較して、細胞の集塊化を阻害するのに有効なものとすることができる。集塊化の阻害は、例えば細胞組成物の調製後少なくとも１０分の時点、細胞組成物の調製後少なくとも２０分の時点、又は細胞組成物の調製後少なくとも６０分の時点での、調製された細胞組成物中のより少ない集塊の形成及び／又はより小さい集塊の形成によって観察できる。細胞組成物の調製以後の相当な時間の期間に亘って集塊化を阻害するトレハロースの能力は、一例として、調製された細胞組成物を患者へ投与する場合の時間について、例えば細胞組成物を患者の血流の中へ静脈又は動脈アクセスにより注入又は輸注することによって、及び／又は細胞組成物の局所移植によって、投与するのに十分な時間を提供することができる。細胞組成物の療法的用途では、組成物は、患者へ、比較的長い時間の期間、例えば、少なくとも１０分、少なくとも２０分、又は少なくとも６０分、の期間に亘って投与することができる。
【００３５】
ここに開示されている様に、調製された希釈生細胞組成物は、指定された濃度の細胞、ＤＭＳＯ、ＨＥＳ、及び／又はトレハロースを有することができる。最大又は最小の濃度又は濃度範囲が記載されている場合、開始生細胞組成物の希釈の条件は、調製された希釈生細胞組成物中に記載された量を実現するべく制御されればよいということが理解されるであろう。これらの条件には、例えば、希釈前の開始生細胞組成物中の諸成分の濃度、使用される希釈用水性液体媒質の開始生細胞組成物に対する体積比、及び希釈用水性液体媒質中の識別される諸成分（含まれている場合）の濃度、が含められる。
【００３６】
調製された希釈細胞組成物は、例えば研究使用又は療法使用を含め、何れの適切な使用に供することもできる。療法使用については、細胞組成物は、実例として、ヒト又は動物の患者へ疾病又は病態を治療する又は予防するために投与することができ、例えば、変性性骨疾患、変形性関節症、関節リューマチ、多発性関節炎、全身性エリテマトーデス、炎症性腸疾患、アトピー、肝炎、慢性ステロイド応答性髄膜炎動脈炎、ビーグル疼痛症候群、変性性脊髄症、慢性腎不全、拡張型及び僧房弁型心筋症、乾性角結膜炎、免疫介在性非びらん性関節炎、免疫介在性溶血性貧血、免疫介在性血小板減少症、エヴァンズ症候群、椎間板疾患、病気又は外傷に続発する筋線維症、難治性角膜潰瘍、真性糖尿病、脊椎外傷、好酸球性肉芽腫群、肥大型心筋症、胆管炎、脊髄損傷、運動誘発性肺出血、横紋筋融解症、角膜潰瘍、湿疹、多発性硬化症、筋ジストロフィー、脊髄損傷、真性糖尿病、肝炎、心筋梗塞、うっ血性心不全、又は筋線維症など、を治療する又は予防するために投与することができる。
【００３７】
調製された希釈細胞組成物は、如何なる適切な方式で患者へ投与されてもよい。特定の形態では、細胞組成物は全身的に患者の血流の中へ、例えば静脈又は動脈への送達によって、送達される。他の形態では、細胞組成物は、患者へ（例えば、アトピー又は他の皮膚障害の治療では）局所的に送達される。更に他の形態では、細胞組成物は患者の局所移植部位へ送達される。これらの投与モードの何れか又は何れかの組合せを患者の治療で使用することもできる。特定の組合せ治療では、本明細書の調製された細胞組成物の第１の量を全身的に患者の血流の中へ送達し、本明細書の調製された細胞組成物の第２の量（例えば、第１の量と共に又は別に調製されていて同じ（単数又は複数の）型又は異なる（単数又は複数の）型の細胞を含んでいる）を患者体内で局所的に１つ又はそれ以上の骨格関節に又はその付近に移植して、関節炎病態、例えばここに識別されている関節炎病態の何れか、を治療することもできる。更に、ここでの患者治療では、ここに説明されている調製された細胞組成物の単回投与が一部の実施形態ではなされている一方、他ではここに説明されている調製された細胞組成物の多回独立投与が経時的になされてもよい（例えば、週単位投与又は月単位投与）。更なる実施形態では、調製された希釈細胞組成物は、例えば存在しているかもしれない何らかの細胞集塊を除去するために、患者への投与に先立って濾過されてもよい。特定の形態では、細胞組成物を通過させて患者の血流の中へ、例えば患者の静脈又は動脈の中へ、送り込む管材内に配置されたインラインフィルタに細胞組成物を通すようにすることもできる。その様なフィルタは、特定の変形型では、単独に懸濁している細胞がフィルタを通過するのを許容しながらも、約２００マイクロメートル以下の粒径カットオフ（即ち、約２００マイクロメートルより大きい最大断面寸法を有する粒子を通過から除外する）、又は約１７０マイクロメートル以下の粒径カットオフ、又は約１００マイクロメートル以下の粒径カットオフを有していてもよい。
【００３８】
ここでの追加の実施形態は、ここに説明されている希釈細胞組成物を調製する場合に有用な製品を含んでいる。１つの実施形態では、希釈細胞組成物を調製するのに有用な、希釈用水性液体媒質が提供されている。希釈用水性液体媒質は、ここに指定されている成分を、ここに指定されている量で含有することができる。そのうえ、希釈細胞組成物は、キットに含まれている容器に入って無菌形態で提供されていてもよい。当該容器は、バイアル、袋、又は他の容器であってもよい。特定の形態では、容器は、希釈細胞組成物を調製することのできる以上に論じられている「第２の容器」の特徴を有しており、それら特徴には、例えば以上に論じられている入口ポート又は他の部材（例えば針隔壁）及び別になっている出口ポートを有していることが含められる。ここに開示されているキットは、希釈用水性液体媒質を収容している容器を、１つ又はそれ以上の追加の構成要素と併せて含んでいてもよく、その様な追加の構成要素には、限定するわけではないが例えば、シリンジの様な液体移送装置及び付着済みの又は付着可能な針、そしておそらくは希釈細胞組成物を調製するのに使用されることになる開始細胞組成物を収容している容器も含まれる。開始細胞組成物を収容している容器は、凍結保存細胞組成物がＨＥＳ及びＤＭＳＯを以上に指定されているそれらについての量のうちの何れかの量で含有しているという実施形態を含め、細胞組成物を凍結保存状態で含んでいてもよく（例えばキットと共に冷凍されて発送）、又は組成物を非凍結保存（例えば、細胞が既に凍結保存されている場合に解凍させた）状態で含んでいてもよい。ここに開示されているキットは、更に、少なくとも１つのフィルタ、例えば以上に説明されているフィルタであって調製された希釈細胞組成物を患者への投与に先立って通過させることのできるフィルタ、及び／又は患者への投与時に希釈細胞組成物を通過させることのできる管材、を含んでいてもよい。
【００３９】
次に続く具体的な実験は本開示の諸態様の更なる理解を促すために提供されている。この実験は本質的に説明目的であり限定を課すものではないことを理解しておきたい。
【００４０】
実施例１
Ｃ−ＵＲＣｓの単離及び培養
地元の低費用卵巣除去手術クリニックから、卵巣子宮摘出術のために現れた複数の雌イヌからの完全に無傷の子宮を得る。試料がラボラトリに到着次第、卵巣を除去し廃棄したうえで、子宮を大凡１グラムの全層区分へ分離する。
【００４１】
次いで、無菌メスを使用して、１グラム試料を≦１ｍｍ３の断片に分断する。細断された組織を酵素槽に入れ、３７℃で３０分間に亘って消化させる。消化が完了し次第、酵素を培養媒質（ＤＭＥＭ−ＨＧに１０％ウシ胎仔血清、及び、０．２５ｍｇ／ｍＬアンフォテリシンＢ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリンＧ、及び１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを加えたもの）で中和させ、３００×ｇにて５分間に亘って遠心分離させ、新鮮な培養媒質中に再懸濁させる。次いで内容物を２００μｍ無菌膜に通して漉し、２５ｃｍ２フラスコに入れる。１４日間の培養後、ＴｒｙｐＺｅａｎ（商標）溶液を使用して細胞を継代０（Ｐ０）として分割し、標準的なトリパンブルー色素排除検定及び血球計算板を使用して細胞数と生存性を評定する。結果として得られる細胞をイヌ子宮再生細胞（Ｃ−ＵＲＣｓ）と呼称する。
【００４２】
実施例２
Ｃ−ＵＲＣｓの凍結保存、解凍、及び希釈
実施例１の様に調製された又は実施例１の様に調製された培養物をバイオリアクター内で拡張することによって調製されたＣ−ＵＲＣｓを、２％ＤＭＳＯ及び６％ＨＥＳを含有する凍結保存液中に１０００万細胞／ｍｌの濃度で懸濁させ、この細胞組成物を３ｍｌアリコートとして各々の凍結保存バイアル（インディアナ州ブルーミントンのＣｏｏｋ  Ｒｅｇｅｎｅｔｅｃ  ＬＬＣから５ｍｌ容量のＣｅｌｌＳｅａｌ（登録商標）極低温バイアルとして入手可能）へ無菌充填する。バイアルを密封したうえで凍らせ、機械式冷凍庫に−８０℃で１乃至１２カ月間貯蔵する。
【００４３】
その貯蔵期間の後、バイアルを冷凍庫から取り出し、３７℃の水に数分間浸すことによってバイアルを解凍する。解凍後、バイアルの無菌フィルタを含んでいる脱気管を切って脱気口を開放したうえで無菌のシリンジ針を使用してバイアルの針隔壁を穿通し、細胞組成物をシリンジバレルの中へ引き入れる。次いで針をバイアル隔壁から抜き、針を使って３．６７％トレハロースを含有する緩衝された生理食塩水溶液２７ｍｌを収容している無菌袋の隔壁投入口を穿通する。調製された希釈細胞組成物は、１００万細胞／ｍｌの細胞濃度と、０．２％のＤＭＳＯ濃度、０．６％のＨＥＳ濃度、３．３％のトレハロース濃度と、を有する。調製された希釈細胞組成物は、袋の弁付き排出口から、例えば集塊化した細胞を除去するインラインフィルタを有する医療用管材を通して、患者へ投与することができる。投与は静脈内投与とすることができる。
【００４４】
特定の開示実施形態の一覧
以下はここに開示される特定の実施形態を列挙した非限定的な一覧を提供している。
【００４５】
（実施形態１）
患者を生細胞で治療するための方法であって、
生細胞及び水性凍結保存媒質を含んでいる凍結保存組成物であって、凍結保存媒質がジメチルスルホキシドを約１％乃至３％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２％乃至１０％の濃度で含有している、凍結保存組成物を解凍して水性液体中に懸濁した生細胞を有する解凍生細胞組成物を提供する段階と、
水性液体希釈媒質を解凍生細胞組成物と望ましくは少なくとも２：１の体積比で、なおいっそう望ましくは少なくとも５：１の体積比で組み合わせて、ヒドロキシエチルデンプン及びジメチルスルホキシドを含有する希釈生細胞組成物を提供する段階であって、ジメチルスルホキシドは希釈生細胞組成物中に約０．５％以下の濃度で存在している、希釈生細胞組成物を提供する段階と、
希釈生細胞組成物を患者へ投与する段階と、
を備えている、方法。
【００４６】
（実施形態２）
患者を治療するための生細胞を調製するための方法であって、
生細胞及び水性凍結保存媒質を含んでいる凍結保存組成物であって、凍結保存媒質がジメチルスルホキシドを約１％乃至３％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２％乃至１０％の濃度で含有している凍結保存組成物を解凍して、水性液体中に懸濁した生細胞を有する解凍生細胞組成物を提供する段階と、
水性液体希釈媒質を解凍生細胞組成物と望ましくは少なくとも２：１の体積比で、なおいっそう望ましくは少なくとも５：１の体積比で組み合わせて、ヒドロキシエチルデンプン及びジメチルスルホキシドを含有する希釈生細胞組成物を提供する段階であって、ジメチルスルホキシドは希釈生細胞組成物中に約０．５％以下の濃度で存在している、希釈生細胞組成物を提供する段階と、
を備えている、方法。
【００４７】
（実施形態３）
実施形態１又は実施形態２の方法であって、更に、解凍の前に、
凍結保存組成物を収容している凍結保存容器を冷凍庫に約−６０℃乃至−１００℃の範囲の温度で貯蔵する段階、
を備えている方法。
【００４８】
（実施形態４）
上記実施形態の何れか１つの方法において、解凍生細胞組成物は約１００万細胞／ｍｌ乃至約２０００万細胞／ｍｌの範囲の生細胞の濃度を有しており、希釈生細胞組成物は約２０万細胞／ｍｌ乃至約５００万細胞／ｍｌの範囲の生細胞の濃度を有している、方法。
【００４９】
（実施形態５）
上記実施形態の何れか１つの方法であって、更に、希釈生細胞組成物を患者の血管の中へ送達することによって希釈生細胞組成物を患者へ投与する段階、を備えている方法。
【００５０】
（実施形態６）
上記実施形態の何れか１つの方法において、凍結保存組成物の凍結保存媒質はジメチルスルホキシドを約１．５％乃至２．５％の濃度で含有している、方法。
【００５１】
（実施形態７）
上記実施形態の何れか１つの方法において、前記体積比は少なくとも８：１であり、ジメチルスルホキシドは希釈生細胞組成物中に約０．３％以下の濃度で存在している、方法。
【００５２】
（実施形態８）
上記実施形態の何れか１つの方法において、凍結保存組成物の凍結保存媒質はジメチルスルホキシドを約１．７５％乃至２．２５％の濃度で含有している、方法。
【００５３】
（実施形態９）
上記実施形態の何れか１つの方法において、生細胞は生存能力のある間葉系幹細胞を備えている、方法。
【００５４】
（実施形態１０）
実施形態９の方法において、生細胞は生存能力のあるイヌ科間葉系幹細胞を備えている、方法。
【００５５】
（実施形態１１）
実施形態９の方法において、生細胞は生存能力のあるネコ科間葉系幹細胞を備えている、方法。
【００５６】
（実施形態１２）
実施形態９の方法において、生細胞は生存能力のあるウマ科間葉系幹細胞を備えている、方法。
【００５７】
（実施形態１３）
実施形態９の方法において、生細胞は生存能力のあるヒト間葉系幹細胞を備えている、方法。
【００５８】
（実施形態１４）
上記実施形態の何れか１つの方法において、生細胞は、歯系組織、睾丸組織、骨髄、末梢血、胎盤組織、子宮組織、臍帯血、臍帯組織、又は皮膚組織に由来する、方法。
【００５９】
（実施形態１５）
上記実施形態の何れか１つの方法において、希釈生細胞組成物はヒドロキシエチルデンプンを少なくとも約０．１％の濃度で、より望ましくは少なくとも約０．３％の濃度で含有している、方法。
【００６０】
（実施形態１６）
上記実施形態の何れか１つの方法において、希釈生細胞組成物はＤＭＳＯを約０．０５％乃至約０．５％の範囲の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約０．１％乃至約６％の範囲の濃度で含有している、方法。
【００６１】
（実施形態１７）
上記実施形態の何れか１つの方法において、水性液体希釈媒質はトレハロースを備えている、方法。
【００６２】
（実施形態１８）
実施形態１７の方法において、トレハロースは水性液体希釈媒質中に約１％乃至約１０％の濃度で存在している、方法。
【００６３】
（実施形態１９）
実施形態１７又は実施形態１８の方法において、トレハロースは希釈生細胞組成物中に約２％乃至約７％の濃度で存在している、方法。
【００６４】
（実施形態２０）
上記実施形態の何れか１つの方法において、凍結保存組成物はジメチルスルホキシドを約２％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約６％の濃度で含有している、方法。
【００６５】
（実施形態２１）
生細胞を維持するための方法であって、
生細胞及び水性凍結保存媒質を含んでいる組成物であって、凍結保存媒質がジメチルスルホキシドを約１％乃至３％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２％乃至１０％の濃度で含有している組成物を凍結保存条件に維持する段階、
を備えている、方法。
【００６６】
（実施形態２２）
実施形態２１の方法において、前記維持する段階は組成物を約−６０℃乃至−１００℃の範囲の温度に維持する段階を備えている、方法。
【００６７】
（実施形態２３）
実施形態２１又は実施形態２２の方法において、前記維持する段階は組成物を機械式冷凍庫内で冷却する段階を備えている、方法。
【００６８】
（実施形態２４）
実施形態２１から実施形態２３の何れか１つの方法において、組成物は約１００万細胞/ｍｌ乃至約２０００万細胞/ｍｌの範囲の生細胞の濃度を有している、方法。
【００６９】
（実施形態２５）
実施形態２１から実施形態２４の何れか１つの方法において、組成物の凍結保存媒質はジメチルスルホキシドを約１．５％乃至２．５％の濃度で含有している、方法。
【００７０】
（実施形態２６）
実施形態２１から実施形態２５の何れか１つの方法において、組成物の凍結保存媒質はジメチルスルホキシドを約１．７５％乃至２．２５％の濃度で含有している、方法。
【００７１】
（実施形態２７）
実施形態２１から実施形態２６の何れか１つの方法において、生細胞は生存能力のある間葉系幹細胞を備えている、方法。
【００７２】
（実施形態２８）
実施形態２１から実施形態２７の何れか１つの方法において、生細胞は、歯系組織、睾丸組織、骨髄、末梢血、胎盤組織、子宮組織、臍帯血、臍帯組織、又は皮膚組織に由来する、方法。
【００７３】
（実施形態２９）
実施形態２１から実施形態２８の何れか１つの方法において、組成物はジメチルスルホキシドを約２％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約６％の濃度で含有している、方法。
【００７４】
（実施形態３０）
患者を生細胞で治療するための方法であって、
ジメチルスルホキシドを０．５％以下の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンをジメチルスルホキシドの濃度より大きく且つ少なくとも０．１％の濃度で含有する水性液体中に懸濁した生細胞を含有している生細胞組成物を患者へ投与する段階、
を備えている方法。
【００７５】
（実施形態３１）
実施形態３０の方法において、前記投与する段階は生細胞組成物を患者の血管の中へ送達する段階を備えている、方法。
【００７６】
（実施形態３２）
実施形態３０又は実施形態３１の方法において、生細胞は生存能力のある間葉系幹細胞を備えている、方法。
【００７７】
（実施形態３３）
実施形態３０から実施形態３２の何れか１つの方法において、患者は、ネコ科、イヌ科、ウマ科、又はヒトの患者である、方法。
【００７８】
（実施形態３４）
実施形態３０から実施形態３３の何れか１つの方法において、生細胞組成物は更にトレハロースを備えている、方法。
【００７９】
（実施形態３５）
実施形態３４の方法において、トレハロースは生細胞組成物中に約２％乃至約７％の濃度で存在している、方法。
【００８０】
（実施形態３６）
実施形態３０から実施形態３５の何れか１つの方法であって、更に、前記投与する段階の前に、水性液体希釈媒質を、ジメチルスルホキシドを約１乃至３％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２乃至１０％の濃度で含有する開始生細胞組成物と組み合わせることによって生細胞組成物を調製する段階、を備えている方法。
【００８１】
（実施形態３７）
実施形態３６の方法において、前記組み合わせることは、水性液体希釈媒質と開始生細胞組成物を少なくとも５：１の体積比で用いて行われる、方法。
【００８２】
（実施形態３８）
実施形態３６又は実施形態３７の方法において、水性液体希釈媒質はトレハロースを備えている、方法。
【００８３】
（実施形態３９）
生細胞及び水性凍結保存媒質を含んでいる凍結保存組成物であって、凍結保存媒質がジメチルスルホキシドを約１％乃至３％の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを約２％乃至１０％の濃度で含有している凍結保存組成物を収容している凍結保存容器、
を備えている製品。
【００８４】
（実施形態４０）
実施形態３９の製品において、凍結保存組成物は約−６０℃乃至−１００℃の範囲の温度にある、製品。
【００８５】
（実施形態４１）
実施形態３９又は実施形態４０の製品であって、更に、
凍結保存容器が受け入れられる機械式冷凍庫、
を備えている製品。
【００８６】
（実施形態４２）
実施形態４１の製品において、機械式冷凍庫には複数の前記製品が受け入れられる、製品。
【００８７】
（実施形態４３）
患者への投与のための生細胞組成物であって、
ジメチルスルホキシドを０．５％未満の濃度で、及びヒドロキシエチルデンプンを少なくとも約０．１％の濃度で備えている水性媒質と、
水性媒質中に約２０万細胞/ｍｌ乃至約２０００万細胞/ｍｌの濃度で懸濁している生細胞と、
を備えている生細胞組成物。
【００８８】
（実施形態４４）
実施形態４３の生細胞組成物において、水性媒質は更にトレハロースを備えている、生細胞組成物。
【００８９】
（実施形態４５）
実施形態４３又は実施形態４４の生細胞組成物において、生細胞は水性媒質中に約２０万細胞/ｍｌ乃至約５００万細胞／ｍｌの濃度で懸濁している、生細胞組成物。
【００９０】
（実施形態４６）
実施形態４３から実施形態４５の何れか１つの生細胞組成物において、生細胞は生存能力のある間葉系幹細胞を備えている、生細胞組成物。
【００９１】
（実施形態４７）
実施形態４６の生細胞組成物において、生細胞の９０％より多くがマーカーＣＤ９０及びＣＤ１０５を発現し、生細胞の５％未満がマーカーＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＭＨＣクラスＩＩを発現する、生細胞組成物。
【国際調査報告】
2019510042.tif 000002
2019510042.tif 000003
2019510042.tif 000004