(57)【要約】  本発明は、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）に結合する、新規の抗原結合ドメインを含む抗体、およびヘテロ二量体抗体を対象とする。【選択図】図１Ａ−１Ｅ
2019527047.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘテロ二量体抗体であって、
ａ）第１の重鎖であって、
ｉ）第１の変異体Ｆｃドメインと、
ｉｉ）一本鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）であって、前記ｓｃＦｖ領域が、第１の可変重ドメイン、第１の可変軽ドメイン、および荷電ｓｃＦｖリンカーを含み、前記荷電ｓｃＦｖリンカーが、前記第１の可変重ドメインおよび前記第１の可変軽ドメインに共有結合する、一本鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）と、を含む、第１の重鎖と、
ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３単量体を含む第２の重鎖であって、ＶＨが、第２の可変重ドメインであり、ＣＨ２−ＣＨ３が、第２の変異体Ｆｃドメインである、第２の重鎖と、
ｃ）第２の可変軽ドメインおよび軽定常ドメインを含む軽鎖と、を含み、
前記第２の変異体Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含み、
前記第１および第２の変異体Ｆｃドメインがそれぞれ、アミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、
前記第１の変異体Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、前記第２の変異体Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、
前記第２の可変重ドメインが、配列番号１０７１を含み、前記第２の可変軽ドメインが、配列番号１０７６を含み、番号付けが、ＫａｂａｔにあるようにＥＵインデックスに従うものである、ヘテロ二量体抗体。
【請求項２】
前記ｓｃＦｖが、ＣＤ３に結合する、請求項１に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項３】
前記第１の可変重ドメインおよび前記第１の可変軽ドメインが、それぞれ、配列番号１および配列番号５、配列番号１０および配列番号１４、配列番号１９および配列番号２３、配列番号２８および配列番号３２、配列番号３７および配列番号４１、ならびに配列番号４６および配列番号５０を含むセットから選択される、請求項１に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項４】
前記第１の可変重ドメインが、配列番号１を含み、前記第１の可変軽ドメインが、配列番号５を含む、請求項３に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項５】
前記第２の重鎖の前記ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３構成要素が、配列番号１１０８を含み、前記第１の変異体Ｆｃドメインが、配列番号１１０９を含み、前記定常軽ドメインが、配列番号１１１０を含む、請求項１に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項６】
前記第１の重鎖が、配列番号１０８０を含み、前記第２の重鎖が、配列番号１０７０を含み、前記軽鎖が、配列番号１０７５を含む、請求項１に記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項７】
ａ）請求項１に記載の第１の重鎖をコードする第１の核酸と、
ｂ）請求項１に記載の第２の重鎖をコードする第２の核酸と、
ｃ）請求項１に記載の軽鎖をコードする第３の核酸と、を含む、核酸組成物。
【請求項８】
ａ）請求項７に記載の第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項７に記載の第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、
ｃ）請求項７に記載の第３の核酸を含む第３の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。
【請求項９】
請求項８に記載の発現ベクター組成物を含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１に記載のヘテロ二量体抗体を作製する方法であって、前記抗体が発現される条件下で請求項９に記載の宿主細胞を培養することと、前記抗体を回収することと、を含む、方法。
【請求項１１】
治療を必要とする対象において神経内分泌癌を治療する方法であって、請求項１に記載のヘテロ二量体抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１２】
ソマトスタチン受容体２型（ＳＳＴＲ２）結合ドメインを含む組成物であって、前記ＳＳＴＲ２結合ドメインが、配列番号９５８を含む可変重ドメインおよび配列番号９６２を含む可変軽ドメインを含む、組成物。
【請求項１３】
ａ）請求項１２に記載の可変重ドメインをコードする第１の核酸と、
ｂ）請求項１２に記載の可変軽ドメインをコードする第２の核酸と、を含む、核酸組成物。
【請求項１４】
ａ）請求項１３に記載の第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項１３に記載の第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクター組成物を含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１２に記載の組成物を作製する方法であって、前記抗体が発現される条件下で請求項１５に記載の宿主細胞を培養することと、前記抗体を回収することと、を含む、方法。
【請求項１７】
治療を必要とする対象において神経内分泌癌を治療する方法であって、請求項１２に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年４月３日に出願された米国仮出願第６２／４８１，０６５号、２０１６年９月２０日に出願された第６２／３９７，３２２号、２０１６年６月２８日に出願された第６２／３５５，８２１号、および２０１６年６月２８日に出願された第６２／３５５，８２０号の利益を主張し、それら内容がそれら全体において参照により明確に完全に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出されている配列表を含み、それらの全体において参照により本明細書によって組み込まれる。２０１７年６月２８日に作成された該ＡＳＣＩＩの複写は、０６７４６１−５１９４−ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、２，７７１，３４７バイトのサイズである。
【背景技術】
【０００３】
抗体に基づく治療法は、癌および自己免疫傷害／炎症性障害を含む様々な疾患を治療するために、成功裏に使用されてきた。しかしながら、このクラスの薬物には、依然として改善が必要であり、特に、その臨床的有効性の増進に関して改良が必要である。探索されている１つの手段は、単一イムノグロブリン分子が、２つの異なる抗原を共結合するように、追加かつ新規の抗原結合部位を抗体に基づく薬物に操作することである。２つの異なる抗原を結合するそのような非天然または代替の抗体形式は、二重特異性体と称されることが多い。抗体可変領域（Ｆｖ）の相当な多様性によって、実質的にいかなる分子でもそれを認識するＦｖを産生することが可能であるため、二重特異性の生成に対する典型的な手法は、新しい可変領域の抗体への導入である。
【０００４】
多くの代替抗体形式が、二重特異性ターゲティングに向けて探索されてきた（Ｃｈａｍｅｓ＆Ｂａｔｙ，２００９，ｍＡｂｓ  １［６］：１−９；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３［９］：１１２６−１１３６；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ｍＡｂｓ  ４（２）：１８２（２０１２）、これらのすべてが、参照によって本明細書に明確に組み込まれる）。初期には、二重特異性抗体は、それぞれが単一のモノクローナル抗体を産生する２つの細胞株を融合することによって作られた（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５４０）。得られたハイブリッドのハイブリドーマまたはクアドローマは、二重特異性抗体を確かに産生はしたが、少数集団にすぎず、望ましい抗体を単離するために広範な精製が必要であった。これに対する操作的な解決策は、二重特異性体を作るための抗体断片の使用であった。そのような断片は、全長抗体の複雑な四次構造を欠いているため、可変軽鎖および可変重鎖は、単一の遺伝子構築物において連結され得る。ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ、直列型ｓｃＦｖ、およびＦａｂ２の二重特異性体を含む、多くの異なる形態の抗体断片が生成されてきた（Ｃｈａｍｅｓ＆Ｂａｔｙ，２００９，ｍＡｂｓ  １［６］：１−９；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ＆Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３［９］：１１２６−１１３６が、参照によって本明細書に明確に組み込まれる）。これらの形式は、細菌において高水準で発現でき、サイズが小さいため、有利に浸透する利点を有し得るが、一方で、生体内において速やかに減失すると共に、生産および安定性に関して、製造性上の障壁が存在し得る。これらの弱点の主要な原因は、抗体断片が、それに関連する機能特性を有する抗体の定常領域を通常は欠いていることにあり、当該関連機能特性には、サイズの大型化、高安定性、ならびに血清における長期半減期の維持（すなわち、新生児型Ｆｃ受容体であるＦｃＲｎ）または精製のための結合部位として働く（すなわち、プロテインＡおよびプロテインＧ）様々なＦｃ受容体およびリガンドへの結合が含まれる。
【０００５】
より最新の研究では、二重結合を全長抗体様形式へと操作することによって、断片に基づく二重特異性体の欠点に対処することが試みられている（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２５［１１］：１２９０−１２９７；ＵＳＳＮ１２／４７７，７１１；Ｍｉｃｈａｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，ｍＡｂｓ  １［２］：１２８−１４１；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７４６９３；Ｚｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １３［５］：３６１−３６７；ＵＳＳＮ０９／８６５，１９８；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１［１６］：１０７０６−１０７１４；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０［２０］：１９６６５−１９６７２；  ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０２５４７２、これらはすべて、参照によって、本明細書に明確に組み込まれる）。これらの形式は、抗体断片二重特異性体の障壁のうちのいくつかを克服し、これは主に、それらがＦｃ領域を含むためである。これらの形式の１つの重大な弱点は、それらが、ホモ二量体定常鎖の上部に新しい抗原結合部位を構築するため、新しい抗原に対する結合が、常に二価であるということである。
【０００６】
治療用二重特異性形式において、共標的（ｃｏ−ｔａｒｇｅｔ）として注目される多くの抗原では、望ましい結合は、二価というよりもむしろ一価である。多くの免疫受容体では、細胞活性化は、一価の結合相互作用の架橋結合によって達成される。架橋結合の機構は、典型的には、抗体／抗原免疫複合体によって媒介されるか、またはエフェクター細胞から標的細胞への結合を介する。例えば、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、およびＦｃγＲＩＩＩａなどの低親和性Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）は、抗体Ｆｃ領域に一価で結合する。一価の結合は、これらのＦｃγＲを発現している細胞を活性化しないが、免疫複合体形成または細胞対細胞接触の際は、受容体は、架橋結合され、細胞表面上にクラスターを形成し、活性化を引き起こす。例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上のＦｃγＲＩＩＩａのような、細胞殺傷を媒介すること担う受容体では、エフェクター細胞が、非常に親和性が高い形式において標的細胞を結合するとき、受容体の架橋結合および細胞の活性化が起こる（Ｂｏｗｌｅｓ＆Ｗｅｉｎｅｒ，２００５，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ３０４：８８−９９が、参照によって明確に組み込まれる）。
同様に、Ｂ細胞上で、抑制性受容体であるＦｃγＲＩＩｂは、Ｂ細胞活性化の下方制御を行い、これは、ＦｃγＲＩＩｂが、細胞表面Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）との免疫複合体へと取り込まれるときのみに起こるものであり、ＢＣＲによって認識されるものと同一の抗原と、可溶性ＩｇＧのものとの免疫複合体形成によって媒介される機構である（Ｈｅｙｍａｎ  ２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８８［２］：１５７−１６１；Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｃｌａｔｗｏｒｔｈｙ，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０：３２８−３４３が、参照によって、本明細書に明確に組み込まれる）。別の例として、Ｔ細胞のＣＤ３活性化は、その関連するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が、非常に親和性が高い細胞対細胞シナプスにおいて、抗原提示細胞上の抗原負荷されたＭＨＣを結合するときのみに起こる（Ｋｕｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２４：１３３−１３９）。実際、抗ＣＤ３抗体を使用したＣＤ３の非特異的二価架橋結合は、サイトカインの急増および毒性を誘発する（Ｐｅｒｒｕｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８３［２］：９５３−６１；Ｃｈａｔｅｎｏｕｄ＆Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ，２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７：６２２−６３２が、参照によって明確に組み込まれる）。したがって、実践的な臨床使用では、標的細胞の再指示された殺傷（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ）のためのＣＤ３共結合の好ましい様式は、共結合される標的との結合時にのみ活性化をもたらす一価の結合である。
【０００７】
ソマトスタチンは、内因性抑制調整剤として作用する神経ペプチドである。ソマトスタチンは、多くの分泌物の抑制、細胞増殖、および細胞生存などの広範囲の細胞機能を有する（Ｐａｔｅｌ，１９９９，Ｆｒｏｎｔ  Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２０：１５７−１９８）。ソマトスタチンは、中枢神経系、末梢神経系、膵臓、消化管内に広く分布されている（例えば、Ｗａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２８６：２５１−２６１、Ｅｐｅｌｂａｕｍ，１９８６，Ｐｒｏｇ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．２７：６３−１００、およびＲａｙｎｏｒ，１９９２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．６：２７３−２８９を参照されたい）。ソマトスタチンはまた、髄様癌、甲状腺癌、神経芽細胞腫、神経節細胞腫、グルカゴン産生腫瘍、副腎皮質腫瘍、ならびに肺、傍神経節、     十二指腸、およびいくつかの他の非ＮＥＴに現れる腫瘍などの神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）中に発現される（Ｖｏｌａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２８６：２１９−２２９）。ソマトスタチンは、ソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ）を直接的に活性化することによって標的細胞への効果を誘発する（Ｗａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２８６：２５１−２６１、Ｐｙｒｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２８６：２３０−２３７）。
【０００８】
ソマトスタチン受容体（ＳＳＴＲ）は、細胞外／細胞内ドメインおよび７つの膜貫通ドメインからなる単一ポリペプチド鎖をそれぞれ含むＧプロテイン結合受容体（ＧＰＣＲ）のスーパーファミリーに属する。ＳＳＴＲは、ＮＥＴ（肺癌、胃腸癌、膵臓癌、下垂体癌、髄様癌、前立腺、膵臓肺カルチノイド、骨肉腫など）ならびに非ＮＥＴ（乳癌、肺癌、大腸癌、卵巣癌、子宮頸癌など）を含む様々な培養腫瘍細胞および主な腫瘍組織中に高度に発現される（Ｒｅｕｂｉ．，２００３，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．２４：３８９−４２７、Ｖｏｌａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２８６：２１９−２２９、およびＳｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．８９：３８５−３９０）。現在までに、５つのＳＳＴＲ受容体サブタイプが特定されている（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８：３９８−４０５）。特にＳＳＴＲ２は、多くの腫瘍細胞上に高濃度で発現され（Ｖｏｌａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２８６：２１９−２２９、およびＲｅｕｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ  ３０：７８１−７９３）、このようにして、それを二重特異性抗体癌標的治療法への候補の標的抗原にする。様々な腫瘍上に発現される高濃度のＳＳＴＲ２の観点において、抗ＳＳＴＲ２抗体が、例えば、抗腫瘍治療薬（例えば、化学療法剤およびＴ細胞）をそのようなＳＳＴＲ２発現腫瘍に局在化するために有用であると思われている。例えば、ＳＳＴＲ２発現腫瘍にＣＤ３＋エフェクターＴ細胞を局在化することができるＳＳＴＲ２およびＣＤ３に対する二重特異性抗体は、有用な癌治療法であると思われている。抗体断片から生成された二重特異性体が、生物物理学的および薬物動態学的なハードルに直面する一方で、全長抗体様形式で構築されたそれらの弱点は、一次標的抗原の不在下において、共標的抗原を多価で結合し、非特異的な活性化および潜在的毒性を引き起こすことである。本発明は、この問題を、ＳＳＴＲ２およびＣＤ３を対象とする新規の二重特異性抗体を導入することによって解決する。
【発明の概要】
【０００９】
したがって、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）抗原結合ドメインおよび抗ＳＳＴＲ２抗体（例えば、二重特異性抗体）が、本明細書に提供される。
【００１０】
一態様において、ａ）第１の重鎖であって、ｉ）第１の変異体Ｆｃドメインと、ｉｉ）一本鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）であって、ｓｃＦｖ領域が、第１の可変重ドメイン、第１の可変軽ドメイン、および荷電ｓｃＦｖリンカーを含み、荷電ｓｃＦｖリンカーが、第１の可変重ドメインおよび第１の可変軽ドメインを共有結合する、単一鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）と、を含む、第１の重鎖と、ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３単量体を含む第２の重鎖であって、ＶＨが、第２の可変重ドメインであり、ＣＨ２−ＣＨ３が、第２の変異体Ｆｃドメインである、第２の重鎖と、ｃ）第２の可変軽ドメインおよび軽定常ドメインを含む軽鎖と、を含む、ＳＳＴＲ２「栓抜き」形式抗体が本明細書に提供される。第２の変異体Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含み、第１および第２の変異体Ｆｃドメインはそれぞれ、アミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、第１の変異体Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、第２の変異体Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含む。さらに、第２の可変重ドメインは、配列番号１０７１を含み、第２の可変軽ドメインは、配列番号１０７６を含み、番号付けは、ＫａｂａｔにあるようにＥＵインデックスに従うものである。
【００１１】
ＳＳＴＲ２「栓抜き」形式抗体の特定の実施形態において、ｓｃＦｖはＣＤ３に結合する。いくつかの実施形態において、第１の可変重ドメインおよび第１の可変軽ドメインは、それぞれ、配列番号１および配列番号５、配列番号１０および配列番号１４、配列番号１９および配列番号２３、配列番号２８および配列番号３２、配列番号３７および配列番号４１、ならびに配列番号４６および配列番号５０を含むセットから選択される。いくつかの実施形態において、第１の可変重ドメインは、配列番号１を含み、第１の可変軽ドメインは、配列番号５を含む。
【００１２】
ＳＳＴＲ２「栓抜き」形式抗体の特定の実施形態において、第２の重鎖のＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３構成要素は、配列番号１１０８を含み、第１の変異体Ｆｃドメインは、配列番号１１０９を含み、定常軽ドメインは、配列番号１１１０を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、第１の重鎖は、配列番号１０８０を含み、第２の重鎖は、配列番号１０７０を含み、軽鎖は、配列番号１０７５を含む。
【００１４】
別の態様において、配列番号９５８を有する可変重ドメインおよび配列番号９６２を有する可変軽ドメインを含む、ソマトスタチン受容体２（ＳＳＴＲ２）抗原結合ドメインが本明細書に提供される。
【００１５】
別の態様において、本明細書に説明されるヘテロ二量体抗体または抗原結合ドメインのうちのいずれかをコードする核酸を含む核酸組成物が本明細書に提供される。
【００１６】
さらなる別の態様において、本明細書に説明される核酸のうちのいずれかを含む発現ベクターが本明細書に提供される。
【００１７】
一態様において、本明細書に説明される発現ベクターまたは核酸のうちのいずれかで転換された宿主細胞が本明細書に提供される。
【００１８】
別の態様において、本明細書に説明される主題のヘテロ二量体抗体または抗原結合ドメインを作製する方法が本明細書に説明される。方法は、抗体または抗原結合ドメインが発現される条件下で、本明細書に説明される発現ベクターまたは核酸のうちのいずれかで転換された宿主細胞を培養するステップ、および抗体または抗原結合ドメインを回収するステップを含む。
【００１９】
一態様において、治療を必要とする患者に本明細書に説明される主題の抗体のうちのいずれか１つを投与することを含む、癌を治療する方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、癌は、神経内分泌癌である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ−１Ｉ】本発明のいくつかの形式を示す。最初に、第１および第２の抗抗原結合ドメインを伴う、「栓抜き」形式である。さらに、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中心ｓｃＦｖ、中心Ｆｖ、ワンアーム化（ｏｎｅ−ａｒｍｅｄ）中心ｓｃＦｖ、１つのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、ｓｃＦｖ−ｍＡｂ、および二重ｓｃＦｖ形式がすべて示される。示されるすべてのｓｃＦｖドメインについて、それらはＮ末端〜Ｃ末端可変重−（任意のリンカー）−可変軽、またはその逆のいずれかであり得る。さらに、ワンアーム化ｓｃＦｖ−ｍＡｂについて、ｓｃＦｖは、重鎖単量体のＮ末端または軽鎖のＮ末端のいずれかに結合され得る。特定の実施形態において、図１の「抗抗原１」は、抗ＳＳＴＲ２結合ドメインを指す。特定の実施形態において、図１の「抗抗原１」は、抗ＣＤ３結合ドメインを指す。特定の実施形態において、図１の「抗抗原２」は、抗ＳＳＴＲ２結合ドメインを指す。特定の実施形態において、図１の「抗抗原２」は、抗ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態において、図１の「抗抗原１」は、抗ＳＳＴＲ２結合ドメインを指し、図１の「抗抗原２」は、抗ＣＤ３結合ドメインを指す。いくつかの実施形態において、図１の「抗抗原１」は、抗ＣＤ３結合ドメインを指し、図１の「抗抗原２」は、抗ＳＳＴＲ２結合ドメインを指す。
【図２】ヒトおよびカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＳＳＴＲ２タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図３Ａ−３Ｆ】ヘテロ二量体化変異体のセットの有用な対（歪曲およびｐＩ変異体を含む）を示す。図３Ｆにおいて、対応する「単量体２」変異体がない変異体があり、これらは、いずれかの単量体上で単独で使用され得るか、または栓抜きのＦａｂ側に含まれ得るｐＩ変異体であり、例えば、適切な荷電ｓｃＦｖリンカーは、第２の抗原結合ドメインとしてｓｃＦｖを利用する第２の単量体上で使用され得る。好適な荷電リンカーは、図７ＡおよびＢに示される。
【図４】等比体積変異体抗体定常領域およびそれらのそれぞれの置換を示す。ｐＩ＿（−）は、より低いｐＩ変異体を示すが、ｐＩ＿（＋）は、より高いｐＩ変異体を示す。これらは、本発明の他の二量体化変異体（および本明細書に概要が記載されるとおり、他の変異体の型）と、任意にかつ独立して組み合わされ得る。
【図５】ＦｃγＲ結合を消去する有用な消去変異体（時に、「ノックアウト」または「ＫＯ」変異体と称されることがある）を示す。
【図６】本発明の２つの特に有用な実施形態を示す。
【図７Ａ−７Ｂ】本明細書に説明されるように、構成要素として１つ以上のｓｃＦｖを利用する主題のヘテロ二量体抗体のｐＩを増加または減少させることにおいて用途を見出すいくつかの荷電ｓｃＦｖリンカーを示す。（＋Ｈ）正のリンカーは、本明細書において特定の使用、本明細書に示される特に抗ＣＤ３  ｖｌおよびｖｈ配列を有する用途を見出す。単一電荷を有する、単一の先行技術ｓｃＦｖリンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（８）：９８９−９９５（１９９３）にちなんで、「Ｗｈｉｔｌｏｗ」と称される。このリンカーは、ｓｃＦｖにおいて、凝集を低減するためおよびタンパク質分解安定性を増進するために使用されることに留意されたい。
【図８】本明細書に説明されるヘテロ二量体抗体と共に使用され得る様々なヘテロ二量体歪曲変異体アミノ酸置換を示す。
【図９Ａ−９Ｅ】Ｆｖ配列（例えば、ｓｃＦｖならびにＦａｂ側のｖｈおよびｖｌ）を有さない、ヒトＩｇＧ１に基づくいくつかの有用な栓抜き骨格の配列を示す。栓抜き骨格１は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ歪曲変異体、Ｆａｂ側のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ消去変異体を含む。栓抜き骨格２は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、異なる歪曲変異体、Ｆａｂ側のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ消去変異体を含む。栓抜き骨格３は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、異なる歪曲変異体、Ｆａｂ側のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ消去変異体を含む。栓抜き骨格４は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、異なる歪曲変異体、Ｆａｂ側のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ消去変異体を含む。栓抜き骨格５は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ歪曲変異体、Ｆａｂ側のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体、および両方の鎖上の２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ消去変異体を含む。栓抜き骨格６は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ歪曲変異体、Ｆａｂ側のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ消去変異体、ならびに両方の鎖上のＮ２９７Ａ変異体を含む。栓抜き骨格７は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて栓抜き骨格６と同一である。栓抜き骨格６および７の代替的な形式は、両方の鎖上の消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを除外し得る。栓抜き骨格８は、ヒトＩｇＧ４に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ歪曲変異体、Ｆａｂ側のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ消去変異体、ならびに当該技術分野で既知のようなＦａｂアーム交換を消去する両方の鎖上のＳ２２８Ｐ（ＥＵ番号付け、これはＫａｂａｔにおいてＳ２４１Ｐである）変異体を含む。栓抜き骨格８の代替的な形式は、両方の鎖上の消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを除外し得る栓抜き骨格９は、ヒトＩｇＧ２に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ���Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ歪曲変異体、Ｆａｂ側のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体を含む。栓抜き骨格１０は、ヒトＩｇＧ２に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ歪曲変異体、Ｆａｂ側のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体、および両方の鎖上のＳ２６７Ｋ変異体を含む。
【００２１】
当業者によって理解されることによっておよび以下に概説されるように、これらの配列は、ｓｃＦｖ（任意に荷電ｓｃＦｖリンカーを含む）を含む一方の単量体およびＦａｂ配列（例えば、「Ｆａｂ側重鎖」に結合されたｖｈおよび「定常軽鎖」に結合されたｖｌ）を含む他方の単量体を有する、本明細書に概要が記載される任意のｖｈおよびｖｌ対と共に使用され得る。すなわち、抗ＳＳＴＲ２および抗ＣＤ３の以下に概説される任意のＦｖ配列が、ｓｃＦｖ（さらに、任意に、荷電ｓｃＦｖリンカーを有する）としてまたはＦａｂとしてかは、任意の組み合わせでこれらの図９の骨格に組み込まれ得る。図９Ａに示される定常軽鎖は、図中のすべての構築物に使用され得るが、カッパ定常軽鎖もまた置換され得る。
【００２２】
これらの栓抜き骨格が、追加の、第１のＦａｂと同じ抗原結合を有する第２のＦａｂ（ｖｈ−ＣＨ１およびｖｌ定常軽）が、「栓抜き側」のｓｃＦｖのＮ末端に添加される図１Ｆの中心ｓｃＦｖ形式において用途を見出すことに留意されるべきである。
【００２３】
列挙される配列と、９０、９５、９８、および９９％同一（本明細書に定義されるように）であり、および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の追加のアミノ酸置換を含む（図の「親」と比較した場合）配列が、これらの骨格の各々の内に含まれ、追加のアミノ酸置換は、当業者に理解されるように、親ヒトＩｇＧ１（または、骨格に応じて、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４）と比較した場合にいくつかのアミノ酸修飾を既に含む。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれる歪曲、ｐＩ、および消去変異体に加えて、追加のアミノ酸修飾（概してアミノ酸置換）を含み得る。
【００２４】
【図１０Ａ−１０Ｄ】本発明における有用であるｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格の配列を示し、それに対して、本発明のＦｖ配列が添加される。ｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ歪曲変異体、Ｆａｂ側のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ消去変異体を含む。骨格２は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ歪曲変異体、Ｆａｂ側のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ消去変異体を含む。骨格３は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ歪曲変異体、Ｆａｂ側のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ去変異体、ならびに両方の鎖上のＮ２９７Ａ変異体を含む。骨格４は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて栓抜き骨格３と同一である。ｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格３および４の代替的な形式は、両方の鎖上の消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを除外し得る。骨格５は、ヒトＩｇＧ４に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ歪曲変異体、Ｆａｂ側のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体、および両方の鎖上のＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ消去変異体、ならびに当該技術分野で既知のようなＦａｂアーム交換を消去する両方の鎖上のＳ２２８Ｐ（ＥＵ番号付け、これはＫａｂａｔにおいてＳ２４１Ｐである）変異体を含む骨格６は、ヒトＩｇＧ２に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ歪曲変異体、Ｆａｂ側のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体を含む。骨格７は、ヒトＩｇＧ２に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ歪曲変異体、Ｆａｂ側のＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ  ｐＩ変異体、ならびに両方の鎖上のＳ２６７Ｋ変異体を含む。
【００２５】
当業者によって理解されることによっておよび以下に概説されるように、これらの配列は、ＦａｂおよびｓｃＦｖ（任意に荷電ｓｃＦｖリンカーを含む）の両方を含む一方の単量体、ならびにＦａｂ配列（例えば、「Ｆａｂ側重鎖」に結合されたｖｈおよび「定常軽鎖」に結合されたｖｌ）を含む他方の単量体を有する、本明細書に概要が記載される任意のｖｈおよびｖｌ対と共に使用され得る。すなわち、抗ＳＳＴＲ２および抗ＣＤ３の以下に概説される任意のＦｖ配列が、ｓｃＦｖ（さらに、任意に、荷電ｓｃＦｖリンカーを有する）としてまたはＦａｂとしてかにかかわらず、任意の組み合わせでこの図１０の骨格に組み込まれ得る。単量体１側は、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ  ｐＩ負側であり、ヘテロ二量体化変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、等比体積ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む（すべてＩｇＧ１に対する）。単量体２側は、ｓｃＦｖ  ｐＩ正側であり、ヘテロ二量体化変異体３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む。しかしながら、他の歪曲変異体の対は、置換され得、特に［Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ］、［Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ］、［Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ］、［Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ］、［Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：  Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ］、［Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ］、［Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ］、および［Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３９４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ］である。
【００２６】
図１０Ａに示される定常軽鎖は、図中のすべての構築物に使用され得るが、カッパ定常軽鎖もまた置換され得る。
【００２７】
これらのｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格が、図１ＨのｍＡｂ−Ｆｖ形式（一方の単量体がＣ末端でｖｌを含み、他方の単量体がＣ末端でｖｈを含む）ならびに図１ＥのｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式（単量体のうちの１つのＣ末端に添加されたｓｃＦｖドメインを有する）の両方において用途を見出すことに留意されるべきである。
【００２８】
列挙される配列と、９０、９５、９８、および９９％同一（本明細書に定義されるように）であり、および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個の追加のアミノ酸置換を含む（図の「親」と比較した場合）配列が、これらの骨格の各々の内に含まれ、追加のアミノ酸置換は、当業者に理解されるように、親ヒトＩｇＧ１（または、骨格に応じて、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４）と比較した場合にいくつかのアミノ酸修飾を既に含む。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれる歪曲、ｐＩ、および消去変異体に加えて、追加のアミノ酸修飾（概してアミノ酸置換）を含み得る。
【００２９】
【図１１Ａ−１１Ｇ】抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１＿Ｌ１．１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０２、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０２、および抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０を含む、本明細書に説明される例示的な主題の抗ＳＳＴＲ２抗原結合ドメインのアミノ酸配列を示す。示される配列は、各抗原結合ドメインについて可変重（ｖｈ）ドメインおよび可変軽（ｖｌ）ドメイン配列を含む。各ｖｈ配列について、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３配列には、下線が引かれておりかつ青色である。各ｖｌ配列について、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３配列には、下線が引かれておりかつ青色である。本明細書において留意されるように、およびＣＤＲを含む本明細書の各配列と同様であるように、ＣＤＲ位置の正確な識別は、表１に示されるように、使用される番号付けに依存してわずかに異なる場合があり、したがって、下線がつけられたＣＤＲだけではなく、他の番号付けシステムを使用したｖｈおよびｖｌドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのｖｈおよびｖｌ配列は、ｓｃＦｖ形式またはＦａｂ形式のいずれかで使用され得る。
【００３０】
【図１２Ａ−１２Ｆ】本明細書に提供される主題の抗体において使用され得る様々な抗ＣＤ３抗原結合ドメイン（例えば、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ）を示す。ＣＤＲは、下線がつけられており、ｓｃＦｖリンカーは、二重下線が引かれており（配列において、ｓｃＦｖリンカーは、正荷電ｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカーであるが、当業者に理解されるように、このリンカーは、非荷電または負荷電リンカーを含む他のリンカーによって置き換えられ得、それらのうちのいくつかは、図７に示される。上記のように、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端へのｓｃＦｖの方向付けを表し、この図中に列挙される配列において、それらは、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌとしてすべて方向付けされている（Ｎ末端からＣ末端へ）が、これらの配列はまた、逆の方向付け、（Ｎ末端からＣ末端へ）ｖｌ−リンカー−ｖｈで使用され得る。本明細書において留意されるように、およびＣＤＲを含む本明細書の各配列と同様であるように、ＣＤＲ位置の正確な識別は、表１に示されるように、使用される番号付けに依存してわずかに異なる場合があり、したがって、下線が引かれたＣＤＲだけではなく、他の番号付けシステムを使用したｖｈおよびｖｌドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのｖｈおよびｖｌ配列は、ｓｃＦｖ形式またはＦａｂ形式のいずれかで使用され得る。
【００３１】
【図１２Ａ】可変重および軽ドメイン（ＣＤＲには下線が引かれている）、ならびに個々のｖｌおよびｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線が引かれている）を有するｓｃＦｖ構築物を含む「高ＣＤ３」抗ＣＤ３＿Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７構築物の配列を示す。図に示される配列のすべてにあてはまるように、この荷電リンカーは、必要に応じて、非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーによって置き換えられ得る。
【００３２】
【図１２Ｂ】可変重および軽ドメイン（ＣＤＲには下線が引かれている）、ならびに個々のｖｌおよびｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線が引かれている）を有するｓｃＦｖ構築物を含む「高中間（Ｈｉｇｈ−Ｉｎｔ）＃１」抗ＣＤ３＿Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７構築物の配列を示す。図に示す配列のすべてにあてはまるように、この荷電リンカーは、必要に応じて、非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーによって置き換えられ得る。
【００３３】
【図１２Ｃ】可変重および軽ドメイン（ＣＤＲには下線が引かれている）、ならびに個々のｖｌおよびｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線が引かれている）を有するｓｃＦｖ構築物を含む「高中間＃２」抗ＣＤ３＿Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７構築物の配列を示す。図に示す配列のすべてにあてはまるように、この荷電リンカーは、必要に応じて、非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーによって置き換えられ得る。
【００３４】
【図１２Ｄ】可変重および軽ドメイン（ＣＤＲには下線が引かれている）、ならびに個々のｖｌおよびｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線が引かれている）を有するｓｃＦｖ構築物を含む「高中間＃３」抗ＣＤ３＿Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７構築物の配列を示す。図に示す配列のすべてにあてはまるように、この荷電リンカーは、必要に応じて、非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーによって置き換えられ得る。
【００３５】
【図１２Ｅ】可変重および軽ドメイン（ＣＤＲには下線が引かれている）、ならびに個々のｖｌおよびｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線が引かれている）を有するｓｃＦｖ構築物を含む「中間」抗ＣＤ３＿Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７構築物の配列を示す。図に示す配列のすべてにあてはまるように、この荷電リンカーは、必要に応じて、非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーによって置き換えられ得る。
【００３６】
【図１２Ｆ】可変重および軽ドメイン（ＣＤＲには下線が引かれている）、ならびに個々のｖｌおよびｖｈＣＤＲ、ならびに荷電リンカー（二重下線が引かれている）を有するｓｃＦｖ構築物を含む「低」抗ＣＤ３＿Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７構築物の配列を示す。図に示す配列のすべてにあてはまるように、この荷電リンカーは、必要に応じて、非荷電リンカーまたは異なる荷電リンカーによって置き換えられ得る。
【００３７】
【図１３Ａ−１３Ｚ】本明細書に説明される主題の二重特異性抗体（例えば、抗ＳＳＴＲ２Ｘ抗ＣＤ３「栓抜き」抗体）と共に使用され得る安定性最適化、ヒト化抗ＣＤ３変異体ｓｃＦｖ変異体のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲには下線が引かれている。各重鎖／軽鎖の組み合わせでは、４つの配列が列挙される：（ｉ）Ｃ末端６ｘＨｉｓタグを有するｓｃＦｖ、（ｉｉ）単独のｓｃＦｖ、（ｉｉｉ）単独のＶＨ、（ｉｖ）単独のＶＬ。本明細書において留意されるように、およびＣＤＲを含む本明細書の各配列と同様であるように、ＣＤＲ位置の正確な識別は、表１に示されるように、使用される番号付けに依存してわずかに異なる場合があり、したがって、下線が引かれたＣＤＲだけではなく、他の番号付けシステムを使用したｖｈおよびｖｌドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中のすべての配列に関して、これらのｖｈおよびｖｌ配列は、ｓｃＦｖ形式またはＦａｂ形式のいずれかで使用され得る。
【００３８】
【図１４Ａ−１４Ｂ】本明細書に説明される例示的な抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３「栓抜き」二重特異性抗体、ＸＥＮＰ０１８０８７（ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０およびＣＤ３  Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７）のアミノ酸配列を示す。ＳＳＴＲ２  Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖配列について、ｖｈＣＤＲ１〜３には、下線が引かれておりかつ青色であり、可変重ドメインおよびＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３の間の境界は、「／」によって示されている。ＣＤ３  ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖配列について、様々なドメイン間の境界は、「／」を使用して示されており、以下のとおりである：ｓｃＦｖ可変重鎖ドメイン／ｓｃＦｖリンカー／ｓｃＦｖ軽鎖ドメイン／Ｆｃドメイン。ｖｈＣＤＲ１〜３およびｖｌＣＤＲ１〜３には、青色で下線が引かれている。各ｓｃＦｖ−Ｆｃドメインについて、ｖｈＣＤＲ１〜３およびｖｌＣＤＲ１〜３配列には、下線が引かれておりかつ青色である。ＣＤ３軽鎖配列について、ｖｌＣＤＲ１〜３には、下線が引かれておりかつ青色であり、可変軽鎖ドメインおよび軽鎖定常ドメインの間の境界は、「／」によって示されている。示される荷電リンカーは、（ＧＫＰＧＳ）４であるが、図７ＡおよびＢに示されるものなどの他の荷電または非荷電リンカーが使用され得る。さらに、以下に概説される各配列は、１つまたは好ましくは両方のｆｃドメインにおいてＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異体を含み得るか、または除外し得、それは血清においてより長い半減期をもたらす。
【００３９】
【図１５Ａ−１５Ｒ】ＸＥＮＰ０１８９０７（図１５ＡおよびＢ、ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０およびＣＤ３  Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７）を含む、本明細書に説明される例示的な抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３「栓抜き」二重特異性抗体のアミノ酸配列を示す。ＳＳＴＲ２  Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖配列について、ｖｈＣＤＲ１〜３には、下線が引かれておりかつ青色であり、可変重ドメインおよびＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３の間の境界は、「／」によって示されている。ＣＤ３  ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖配列について、様々なドメイン間の境界は、「／」を使用して示されており、以下のとおりである：ｓｃＦｖ可変重鎖ドメイン／ｓｃＦｖリンカー／ｓｃＦｖ軽鎖ドメイン／Ｆｃドメイン。ｖｈＣＤＲ１〜３およびｖｌＣＤＲ１〜３には、青色で下線が引かれている。各ｓｃＦｖ−Ｆｃドメインについて、ｖｈＣＤＲ１〜３およびｖｌＣＤＲ１〜３配列には、下線が引かれておりかつ青色である。ＣＤ３軽鎖配列について、ｖｌＣＤＲ１〜３には、下線が引かれておりかつ青色であり、可変軽鎖ドメインおよび軽鎖定常ドメインの間の境界は、「／」によって示されている。示される荷電リンカーは、（ＧＫＰＧＳ）４であるが、図７ＡおよびＢに示されるものなどの他の荷電または非荷電リンカーが使用され得る。さらに、本明細書に概説される各配列は、１つまたは好ましくは両方のｆｃドメインにおいてＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異体を含み得るか、または除外し得、それは血清においてより長い半減期をもたらす。
【００４０】
【図１６Ａ−１６Ｃ】本明細書に説明される例示的な二重特異性抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３抗体の可能な組み合わせのマトリックスを示す。「Ａ」は、マトリックスの上部の参照されるＣＤ３結合ドメイン配列のＣＤＲが、マトリックスの左側に列挙されるＳＳＴＲ２結合ドメイン配列のＣＤＲと組み合わされ得ることを意味する。例えば、「抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０」および「抗ＣＤ３  Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７」に関して、「Ａ」は、ａ）可変重鎖ＣＤ３  Ｈ１．３０配列からのｖｈＣＤＲおよび可変軽鎖ＣＤ３  Ｌ１．４７配列からのｖｌＣＤＲを有するＣＤ３結合ドメインと、ｂ）ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３配列からのｖｈＣＤＲおよびＳＳＴＲ２  Ｌ１．３０配列からのｖｌＣＤＲを有するＳＳＴＲ２結合ドメインとを含む二重特異性抗体を示す。「Ｂ」は、ＣＤ３結合ドメイン構築物からのＣＤＲが、ＳＳＴＲ２結合ドメイン構築物からの可変重および軽ドメインと組み合わされ得ることを意味する。例えば、「抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０」および「抗ＣＤ３  Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７」に関して、「Ｂ」は、ａ）可変重鎖ＣＤ３  Ｈ１．３０配列からのｖｈＣＤＲおよびＣＤ３  Ｌ１．４７配列の可変軽鎖からのｖｌＣＤＲを有するＣＤ３結合ドメインと、ｂ）可変重ドメインＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３配列および可変軽ドメインＳＳＴＲ２  Ｌ１．３０配列を有するＳＳＴＲ２結合ドメインとを含む二重特異性抗体を示す。「Ｃ」は、ａ）抗ＣＤ３配列からの可変重ドメインおよび可変軽ドメインを有するＣＤ３結合ドメインと、ｂ）抗ＳＳＴＲ２配列のＣＤＲを有するＳＳＴＲ２結合ドメインとを含む二重特異性抗体を示す。「Ｄ」は、示される抗ＳＳＴＲ２配列の可変重および可変軽鎖を有するＳＳＴＲ２結合ドメインと、示される抗ＣＤ３配列の可変重および可変軽鎖を有するＣＤ３結合ドメインとを含む二重特異性抗体を示す。「Ｅ」は、ｓｃＦｖを含む二重特異性抗体を示し、ＣＤ３のｓｃＦｖは、ＳＳＴＲ２のＣＤＲと共に使用される。「Ｆ」は、ｓｃＦｖを含む二重特異性抗体を示し、ＣＤ３のｓｃＦｖは、ＳＳＴＲ２抗原結合ドメインの可変重および可変軽ドメインと共に使用される。これらの組み合わせのすべては、栓抜き形式、例えば、図９に示される骨格形式のうちのいずれかで、または図２６に示される形式骨格を含む、図１のｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中心ｓｃＦｖ、中心Ｆｖ、または二重ｓｃＦｖ形式などの代替的な形式で行われる。例えば、「Ａ」（ＣＤ３  ＣＤＲおよびＳＳＴＲ２  ＣＤＲ）は、図９のものを含むか、もしくは異なるヘテロ二量体化変異体を含む栓抜き配列、または図１０のｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格、中心ｓｃＦｖ、ｍＡｂ−Ｆｖ形式、もしくは中心Ｆｖ形式に添加され得る。しかしながら、概して、ＣＤ３の二価結合を含むであろう形式は、好まれない。
【００４１】
【図１６Ｄ−１６Ｆ】本明細書に説明される例示的な二重特異性抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３栓抜き形式の可能な組み合わせのマトリックスを示す。これらのマトリックスにおいて、抗ＣＤ３ｓｃＦｖは、Ｘ軸に列挙されており、抗ＳＳＴＲ２Ｆａｂは、Ｙ軸に列挙されている。「Ａ」は、マトリックスの上部の参照されるＣＤ３結合ドメイン配列のＣＤＲが、マトリックスの左側に列挙されるＳＳＴＲ２結合ドメイン配列のＣＤＲと組み合わされ得ることを意味する。例えば、「抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０」および「抗ＣＤ３  Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７」に関して、「Ａ」は、ａ）可変重鎖ＣＤ３  Ｈ１．３０配列からのｖｈＣＤＲおよび可変軽鎖ＣＤ３  Ｌ１．４７配列からのｖｌＣＤＲを有する抗ＣＤ３ｓｃＦＶと、ｂ）ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３配列からのｖｈＣＤＲおよびＳＳＴＲ２  Ｌ１．３０配列からのｖｌＣＤＲを有する抗ＳＳＴＲ２Ｆａｂとを含む二重特異性栓抜き形式抗体を示す。「Ｂ」は、ＣＤ３結合ドメイン構築物からのＣＤＲが、ＳＳＴＲ２結合ドメイン構築物からの可変重および軽ドメインと組み合わされ得ることを意味する。例えば、「抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０」および「抗ＣＤ３  Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７」に関して、「Ｂ」は、ａ）可変重鎖ＣＤ３  Ｈ１．３０配列からのｖｈＣＤＲおよびＣＤ３  Ｌ１．４７配列の可変軽鎖からのｖｌＣＤＲを有する抗ＣＤ３ｓｃＦｖと、ｂ）可変重ドメインＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３配列および可変軽ドメインＳＳＴＲ２  Ｌ１．３０配列を有する抗ＳＳＴＲ２Ｆａｂとを含む二重特異性栓抜き抗体を示す。「Ｃ」は、ａ）抗ＣＤ３配列からの可変重ドメインおよび可変軽ドメインを有する抗ＣＤ３ｓｃＦｖと、ｂ）抗ＳＳＴＲ２配列のＣＤＲを有するＳＳＴＲ２Ｆａｂとを含む二重特異性栓抜き抗体を示す。「Ｄ」は、示されるＳＳＴＲ２配列の可変重および可変軽鎖を有する抗ＳＳＴＲ２Ｆａｂと、示される抗ＣＤ３配列の可変重および可変軽鎖を有する抗ＣＤ３ｓｃＦｖとを含む二重特異性栓抜き抗体を示す。
【００４２】
【図１７Ａ−１７Ｐ】ヒトＳＳＴＲ２トランスフェクトＣＨＯ細胞を使用した例示的な抗ＳＳＴＲ２抗体および抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体の細胞表面結合アッセイを示す。結合を、フィコエリトリン（ＰＥ）標識二次抗体を使用してフローサイトメトリーによって測定した。
【００４３】
【図１８Ａ−１８Ｄ】抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性およびヒトＳＳＴＲ２トランスフェクトＣＨＯ細胞を使用した、再指示されたＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）アッセイの結果を示す。
【００４４】
【図１９Ａ−１９Ｃ】ＴＴ細胞を有する抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性を使用した、再指示されたＴ細胞の細胞傷害性（ＲＴＣＣ）アッセイの結果を示す（ヒト甲状腺髄様癌細胞株、図１９Ａ〜１９Ｃ）。
【００４５】
【図２０Ａ−２０Ｂ】カニクイザルにおけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞活性化（図２０Ａ）ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞分布（図２０Ｂ）への抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体の効果の研究を示す。
【００４６】
【図２１Ａ−２１Ｄ】カニクイザルにおけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞活性化（図２１Ａ）ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞分布（図２１Ｂ）への抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体の効果の追加の研究を示す。さらに、ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）を行い（図２１Ｃおよび２１Ｄ）、試験された対象の能力を評価し、ブドウ糖を分解した。
【００４７】
【図２２Ａ−２２Ｆ】ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞活性化（図２２ＡおよびＢ）、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞分布（図２２ＣおよびＤ）、ならびに血清ＩＬ−６およびＴＮＦαの血清レベル（図２２ＥおよびＦ）の例示的な抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体の追加の研究を示す。
【００４８】
【図２３Ａ−２３Ｃ】ヒトＳＳＴＲ２トンスフェクトＣＨＯ細胞（図２２Ａ）、カニクイザルＳＳＴＲ２トランスフェクトＣＨＯ細胞（図２２Ｂ）、ならびに非トランスフェクト親ＣＨＯ細胞（図２２Ｃ）上のＸｍＡｂ１８０８７およびＸＥＮＰ１３２４５の細胞表面結合アッセイを示す。
【００４９】
【図２４Ａ−２４Ｃ】ヒトＳＳＴＲ２トランスフェクトＣＨＯ細胞（図２４Ａ）、ＴＴ細胞（ヒト甲状腺髄様癌細胞株、図２８Ｂ）、またはＡ５４８細胞（肺腺癌細胞株、図２４Ｃ）を有する、ＸｍＡｂ１８０８７（四角）およびＸＥＮＰ１３２４５（丸）を使用した再指示されたＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）アッセイの結果を示す。
【００５０】
【図２５】ＴＴ細胞（ヒト甲状腺髄様癌細胞株）またはＡ５４８細胞（肺癌）を有する抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性および制御抗ＳＳＴＲ２ｍＡｂ、ならびに抗ＲＳＶｘ抗ＣＤ３を使用した、再指示されたＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）アッセイの結果を示す。
【００５１】
【図２６Ａ−Ｂ】図２に説明される実験の２４時間後のヒトＳＳＴＲ２トランスフェクトＣＨＯ細胞（図２９Ａ）およびＴＴ細胞（図２９Ｂ）と共にインキュベートされたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ６９の上方調節を示す。記入されたデータ点は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ６９  ＭＦＩを示し、無記入のデータ点は、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ６９  ＭＦＩを示す。
【００５２】
【図２７】ＸｍＡｂ１８０８７の抗腫瘍活性を試験するためのマウスの研究の設計を示す。
【００５３】
【図２８Ａ−２８Ｂ】時間および治療の関数としてＩＶＩＳ（登録商標）によって測定された腫瘍サイズを示す。
【００５４】
【図２９】ＩＶＩＳ（登録商標）生物発光画像を示す（投与量＃１後２８日目）。
【００５５】
【図３０Ａ−３０Ｂ】カニクイザルにおけるＣＤ４＋（図３０Ａ）およびＣＤ８＋（図３０Ｂ）Ｔ細胞分布へのＸｍＡｂ１８０８７の効果の研究を示す。
【００５６】
【図３１Ａ−３１Ｂ】カニクイザルにおけるＣＤ４＋（図３１Ａ）およびＣＤ８＋（図３１Ｂ）Ｔ細胞活性化へのＸｍＡｂ１８０８７の効果の研究を示す。
【００５７】
【図３２Ａ−３２Ｂ】カニクイザルにおける血清ＩＬ−６およびＴＮＦのレベルのＸｍＡｂ１８０８７の効果を示す。
【００５８】
【図３３】ＸｍＡｂ１８０８７の様々な濃度を使用した時間および治療の関数としてＩＶＩＳ（登録商標）によって測定された場合のＡ５４９−ＲｅｄＦＬｕｃ腫瘍細胞およびヒトＰＢＭＣを生着されたＮＳＧマウスの腫瘍サイズを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
Ａ．材料の組み込み
図および説明
ＵＳＳＮ６２／４８１，０６５、６２／３９７，３２２、および６２／３５５，８２０のすべての図および添付の説明は、特にそこで示されるアミノ酸配列について、それらの全体において本明細書に参照によって明確におよび独立して組み込まれる。
【００６０】
配列
添付の配列表について以下のとおりに述べる。ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＳＳＴＲ２配列は、配列番号９５８〜１０６９（図１１）および可変重ドメイン、可変軽ドメイン、ならびに配列番号５８〜６５９の抗ＳＳＴＲ２重鎖および軽鎖配列のＣＤＲを含む。ＡＢＤとしての使用に好適な抗ＣＤ３配列は、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、ならびに配列番号１〜５４（図１２）および配列番号８３５〜９３８に含まれるＣＤＲを含む。可変重ドメイン、可変軽ドメイン、およびＣＤＲは、本明細書に説明される主題の抗体および抗原結合ドメインのｓｃＦｖまたはＦｖ形式に含まれ得る。
例示的な二重特異性ＳＳＴＲ２ｘＣＤ３抗体の配列は、配列番号１０７０〜１０８８（図１４）、ならびに配列番号１０８９〜１１０７および配列番号６６０〜８０６（図１５）に含まれる。
【００６１】
Ｂ．概要
癌の治療に好適である抗ＳＳＴＲ２抗体が本明細書に提供される。ＳＳＴＲ２が、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ、例えば、肺癌、胃腸癌、膵臓癌、下垂体癌、髄様癌、前立腺、膵臓肺カルチノイド、骨肉腫など）ならびに非ＮＥＴ（乳癌、肺癌、大腸癌、卵巣癌、子宮頸癌など）に高発現されるため、抗ＳＳＴＲ２抗体は、そのようなＳＳＴＲ２発現腫瘍に抗腫瘍治療薬（例えば、化学療法剤およびＴ細胞）を局在化するために有用であると思われる。具体的には、抗ＣＤ３、抗ＳＳＴＲ２二重特異性抗体が本明細書に提供される。そのような抗体は、ＣＤ３＋エフェクターＴ細胞をＳＳＴＲ２＋腫瘍に送るために使用され、それによって、ＣＤ３＋エフェクターＴ細胞がＳＳＴＲ２＋腫瘍を攻撃および溶解することを可能にする。
【００６２】
ＣＤ３および腫瘍抗原標的を共結合する抗二重特異性抗体は、Ｔ細胞を再指示して標的腫瘍細胞を攻撃および溶解するために設計され使用されてきた。例としては、ＣＤ３および腫瘍抗原を一価で結合するＢｉＴＥおよびＤＡＲＴ形式が挙げられる。ＣＤ３ターゲティング手法が相当な見込みを示した一方、そのような治療の共通の副作用は、サイトカインの関連する産生であり、毒性サイトカイン放出症候群につながることが多い。二重特異性抗体の抗ＣＤ３結合ドメインが、すべてのＴ細胞を結合するため、高サイトカイン産生ＣＤ４  Ｔ細胞サブセットが補充される。その上、ＣＤ４  Ｔ細胞サブセットは、制御性Ｔ細胞を含み、その補充および拡大は、免疫抑制に潜在的につながり、長期の腫瘍抑制に悪影響を有し得る。さらに、これらの形式は、Ｆｃドメインを含まず、患者において非常に短い血清半減期を示す。
【００６３】
ＣＤ３ターゲティング手法が相当な見込みを示した一方、そのような治療の共通の副作用は、サイトカインの関連する産生であり、毒性サイトカイン放出症候群につながることが多い。二重特異性抗体の抗ＣＤ３結合ドメインが、すべてのＴ細胞に捕捉するため、高サイトカイン産生ＣＤ４  Ｔ細胞サブセットが補充される。その上、ＣＤ４  Ｔ細胞サブセットは、制御性Ｔ細胞を含み、その補充および拡大は、免疫抑制に潜在的につながり、長期の腫瘍抑制に悪影響を有し得る。サイトカイン産生を低下させ、かつＣＤ４  Ｔ細胞の活性化をおそらく低下させる１つのそのような可能性のある方法は、ＣＤ３への抗ＣＤ３ドメインの親和性を低下させることによるものである。
【００６４】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＤ３に対する「強」または「高親和性」結合体（例えば、１つの例は、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７として示される重可変ドメイン、および軽可変ドメインである（任意に、適切な場合、荷電リンカーを含む））であり、またＳＳＴＲ２に結合する抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含む抗体構築物を提供する。他の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に対する「軽（ｌｉｔｅ）」または「低親和性」結合体である抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含む抗体構築物を提供する。追加の実施形態は、ＣＤ３に対して中間または「中」親和性を有し、またＣＤ３８に結合する抗ＣＤ３抗原結合ドメインを含む抗体構築物を提供する。親和性は、概して、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを使用して測定される。
【００６５】
本発明の「高、中、低」抗ＣＤ３配列が、様々なヘテロ二量体化形式において使用され得ることを理解されるべきである。本明細書において開示の大部分が、ヘテロ二量体の「栓抜き」形式を使用する一方で、これらの可変重および軽配列、ならびにｓｃＦｖ配列（ならびにこれらの可変重および軽配列を含むＦａｂ配列）は、ＷＯ公開第２０１４／１４５８０６号の図２に示されるもの、参照によって本明細書に明確に組み込まれる図、形式、および説明文などの他の形式で使用され得る。
【００６６】
したがって、一態様において、例えば、それらが２つの異なる標的抗原を結合するという点で抗体が「二重特異性」である、２つの異なる抗原に結合するヘテロ二量体抗体、概して以下に説明されるようなＳＳＴＲ２が本明細書に提供される。これらのヘテロ二量体抗体は、一価（例えば、可変重および可変軽ドメインの対などの単一抗原結合ドメインがある）または二価（それぞれが独立に抗原を結合する２つの抗原結合ドメインがある）のいずれかでこれらの標的抗原を結合し得る。本明細書に提供されるヘテロ二量体抗体は、以下により完全に概説されるように、ヘテロ二量体の形成をホモ二量体より「歪曲」させるアミノ酸置換を含み、以下に同様に概説されるように、ホモ二量体から離れたヘテロ二量体の単純な精製を可能にする「ｐＩ変異体」と共に結合される、異なる単量体を使用することに基づく。提供されるヘテロ二量体二重特異性抗体は、概して、ヘテロ二量体タンパク質を生成するために生成細胞において自己組織化し得る操作されたまたは変異体Ｆｃドメインの使用、およびそのようなヘテロ二量体タンパク質を生成し精製する方法に依存する。
【００６７】
Ｃ．命名法
本発明の二重特異性抗体は、いくつかの異なる形式で列挙される。各ポリペプチドは、唯一の「ＸＥＮＰ」番号で示されるが、当該技術分野で理解されるように、より長い配列がより短い配列を含み得る。例えば、所定の配列の栓抜き形式のｓｃＦｖ側単量体の重鎖は、第１のＸＥＮＰ番号を有する一方で、ｓｃＦｖドメインは、異なるＸＥＮＰ番号を有することになる。いくつかの分子は、３つのポリペプチドを有し、そのため、ＸＥＮＰ番号は、構成要素と共に、名前として使用される。したがって、栓抜き形式にある分子ＸＥＮＰ１８０８７は、３つの配列、「ＸＥＮＰ１８０８７  ＨＣ−Ｆａｂ」（図１４Ａ、名称「ＳＳＴＲ２  Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖）、「ＸＥＮＰ１８０８７  ＨＣ−ｓｃＦｖ」（図１４Ｂ、名称「ＣＤ３  ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖」）、および「ＸＥＮＰ１８０８７  ＬＣ」（図１４Ａ、名称「ＳＳＴＲ２軽鎖」）または等価物を含むが、当該技術分野の技術のうちの１つは、配列アラインメントを通してこれらを容易に特定することができるであろう。これらのＸＥＮＰ番号は、配列表、ならびに識別子中にあり、図中で使用される。さらに、３つの構成要素を含む１つの分子は、複数の配列識別子を引き起こす。例えば、Ｆａｂ単量体の一覧は、全長配列、可変重配列、および可変重配列の３つのＣＤＲを有し、軽鎖は、全長配列、可変軽配列、および可変軽配列の３つのＣＤＲを有し、ｓｃＦｖ−Ｆｃｓドメインは、全長配列、ｓｃＦｖ配列、可変軽配列、３つの軽ＣＤＲ、ｓｃＦｖリンカー、可変重配列、および３つの重ＣＤＲを有し、ｓｃＦｖドメインを有する本明細書のすべての分子が単一荷電ｓｃＦｖリンカー（＋Ｈ）を使用することを留意されたいが、他のものも使用され得る。さらに、特定の可変ドメインの命名法は、特定の可変鎖配列に対して唯一の識別子である番号を有する「Ｈｘ．ｘｘ＿Ｌｙ．ｙｙ」型の形式を使用する。したがって、ＸＥＮＰ１８０８７のＦａｂ側の可変ドメインは、「Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０」であり、それは、可変重ドメイン、Ｈ１．１４３が軽ドメインＬ１．３０と組み合わされたことを示す。これらの配列が、ｓｃＦｖとして使用される場合において、名称「Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０」は、可変重ドメイン、Ｈ１．１４３が、軽ドメイン、Ｌ１．３０と組み合わされ、Ｎ末端からＣ末端へのｖｈ−リンカー−ｖｌ方向付けにあることを示す。重および軽可変ドメインの同一の配列であるが、逆の順序の配列を有するこの分子は、「Ｌ１．３０＿Ｈ１．１４３」と名付けられる。同様に、異なる構築物は、配列表および図から明らかであるように、重および軽鎖を「ミックスアンドマッチ」し得る。
【００６８】
Ｄ．定義
本出願をより完全に理解し得るために、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義は、文法的に等価であるものを包含することを意味する。
【００６９】
本明細書において「消去」は、活性の低減または除去を意味する。したがって、例えば、「ＦｃγＲ結合を消去すること」は、特定の変異体を含まないＦｃ領域と比較して、Ｆｃ領域アミノ酸変異体が、出発結合の５０％未満を有することを意味し、活性を７０〜８０〜９０〜９５〜９８％喪失していることが好ましく、一般に、活性は、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＳＰＲ、またはＢＬＩアッセイにおいて、検出可能な結合のレベルを下回る。ＦｃγＲ結合の消去において特定の使用には、概して両方の単量体に添加される図５に示されるものがある。
【００７０】
本明細書で使用される「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞媒介細胞傷害性」は、細胞媒介反応であって、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上に結合された抗体を認識し、その後に標的細胞の溶解を引き起こすことを意味する。ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合と相関しており、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合の増加は、ＡＤＣＣ活性の増加につながる。
【００７１】
本明細書で使用される「ＡＤＣＰ」または抗体依存性細胞貪食は、細胞媒介反応であって、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上に結合された抗体を認識し、その後に標的細胞の貪食を引き起こすことを意味する。
【００７２】
本明細書において「抗原結合ドメイン」または「ＡＢＤ」は、ポリペプチド配列の一部として存在する場合に、本明細書に説明されるように標的抗原を特異的に結合する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットであることを意味する。したがって、「チェックポイント抗原結合ドメイン」は、本明細書に概説されるように標的チェックポイント抗原を結合する。当該技術分野で既知であるように、これらのＣＤＲは、概して、可変重ＣＤＲ（ｖｈＣＤＲまたはＶＨＣＤＲ）の第１のセットおよび可変軽ＣＤＲ（ｖｌＣＤＲまたはＶＬＣＤＲ）の第２のセットとして存在し、それぞれ、重鎖にはｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３、軽鎖にはｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３の３つのＣＤＲを含む。ＣＤＲは、それぞれ、可変重および可変軽ドメインに存在し、共にＦｖ領域を形成する。（表１およびＣＤＲ番号付けスキームについての上記の関連する議論を参照されたい）。したがって、いくつかの場合において、抗原結合ドメインの６つのＣＤＲは、可変重および可変軽ドメインによって寄与される。「Ｆａｂ」形式において、６つのＣＤＲのセットは、重鎖のＣＨ１ドメインのＮ末端に結合されているｖｈドメインのＣ末端および定常軽ドメインのＮ末端に結合されているｖｌドメインのＣ末端を有する、２つの異なるポリペプチド配列、可変重ドメイン（ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を含む、ｖｈまたはＶＨ）、および可変軽ドメイン（ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３を含む、ｖｌまたはＶＬ）によって寄与される（このようにして、軽鎖を形成する）。ｓｃＦｖ形式において、ｖｈおよびｖｌドメインは、本明細書に概説されるように、概してリンカー（「ｓｃＦｖリンカー」）の使用を通して、単一ポリペプチド配列に共有結合され、それは、（Ｎ末端から出発する）ｖｈ−リンカー−ｖｌまたはｖｌ−リンカー−ｖｈのいずれかであり得、前者が概して好まれている（使用される形式に応じて、各側で任意のドメインリンカーを含む（例えば、図１から）。概して、ｓｃＦｖドメインのＣ末端は、第２の単量体においてヒンジのＮ末端に結合される。
【００７３】
本明細書において「修飾」は、ポリペプチド配列における、アミノ酸の置換、挿入、および／もしくは欠失、またはタンパク質に化学的に連結された部分に対する変化を意味する。例えば、修飾は、変化された炭水化物またはタンパク質に結合されたＰＥＧ構造であってもよい。本明細書において「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列における、アミノ酸置換、挿入、および／または欠失を意味する。明確にするために、別段の記載がない限り、アミノ酸修飾は、常に、ＤＮＡよってコードされるアミノ酸に対するものであり、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいてコドンを有する２０個のアミノ酸である。
【００７４】
本明細書において「アミノ酸置換」または「置換」は、異なるアミノ酸を有する親ポリペプチド配列において特定の位置でのアミノ酸の置き換えを意味する。具体的には、いくつかの実施形態では、置換は、特定の位置で天然に発生しないアミノ酸に対するものであり、生物内において、または任意の生物において、いずれでも天然に発生しない。例えば、置換Ｅ２７２Ｙは、変異体ポリペプチドを指し、この場合、位置２７２でグルタミン酸がチロシンで置き換えられているＦｃ変異体である。明確にするために、配列をコードする核酸を変化させるが、出発アミノ酸（例えば、交換ＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（さらにアルギニンをコードする）に交換し、宿主生物の発現レベルを増加させる）は変化しないように操作されているタンパク質は、「アミノ酸置換」ではなく、すなわち、同じタンパク質をコードする新しい遺伝子の創造にもかかわらず、タンパク質が、それが出発する特定の位置で同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。
【００７５】
本明細書で使用される「アミノ酸置換」または「挿入」は、親ポリペプチド配列において特定の位置でのアミノ酸配列の追加を意味する。例えば、−２３３Ｅまたは２３３Ｅは、位置２３３の後かつ位置２３４の前でのグルタミン酸の挿入を指定する。さらに、−２３３ＡＤＥまたはＡ２３３ＡＤＥは、位置２３３の後かつ位置２３４の前でのＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を指定する。
【００７６】
本明細書で使用される「アミノ酸置換」または「欠失」は、親ポリペプチド配列において特定の位置でのアミノ酸配列の除去を意味する。例えば、Ｅ２３３−もしくはＥ２３３＃、Ｅ２３３（）、またはＥ２３３ｄｅｌは、位置２３３でのグルタミン酸の欠失を指定する。さらに、ＥＤＡ２３３−またはＥＤＡ２３３＃は、位置２３３から始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を指定する。
【００７７】
本明細書で使用される「変異体タンパク質」もしくは「タンパク質変異体、または「変異体」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾による親タンパク質のものとは異なるタンパク質を意味する。タンパク質変異体は、親タンパク質と比較して、少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するが、依然としてそれほど多くはないため、変異体タンパク質は、以下に説明されるようなものなどのアラインメントプログラムを使用して親タンパク質と整列しないであろう。概して、変異体タンパク質（本明細書に概説される、変異体Ｆｃドメインなどは、概して、ＢＬＡＳＴなどの、以下の説明されるアラインメントプログラムを使用して、親プロテインと少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である。
【００７８】
以下に説明されるように、いくつかの実施形態において、親ポリペプチドは、例えば、Ｆｃ親ポリペプチドは、重定常ドメインまたはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４からのＦｃ領域などのヒト野生型配列であるが、変異体を有するヒト配列はまた、「親ポリペプチド」として役立ち、例えばＵＳ公開２００６／０１３４１０５のＩｇＧ１／２ハイブリッドが含まれ得る。本明細書においてタンパク質変異体配列は、好ましくは、親タンパク質配列との比較で、少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは、少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは、少なくとも９５〜９８〜９９％の同一性を有する。したがって、本明細書で使用される「抗体変異体」または「変異体抗体」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾による親抗体とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される「ＩｇＧ変異体」または「変異体ＩｇＧ」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾による親ＩｇＧ（さらに、多くの場合において、ヒトＩｇＧ配列から）とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される「免疫グロブリン変異体」または「変異体免疫グロブリン」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾による親免疫グロブリン配列のものとは異なる免疫グロブリン配列を意味する。本明細書で使用される「Ｆｃ変異体」または「変異体Ｆｃ」は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４のＦｃドメインと比較した場合に、Ｆｃ領域においてアミノ酸修飾を含むタンパク質を意味する。
【００７９】
本発明のＦｃ変異体は、それを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。したがって、例えば、Ｎ４３４Ｓまたは４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して、位置４３４で置換セリンを有するＦｃ変異体であり、番号付けは、ＥＵインデックスに従うものである。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して、置換Ｍ４２８Ｌおよび置換Ｎ４３４Ｓを有するＦｃ変異体を定義する。ＷＴアミノ酸の同一性が、特定されていなくてもよく、その場合、先に記載した変異体は、４２８Ｌ／４３４Ｓと称される。置換が提供される規則は任意であることに留意されたい。つまり、例えば、Ｎ４３４Ｓ／Ｍ４２８Ｌは、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓと同一のＦｃ変異体である等である。抗体に関連する、本発明において論じられるすべての位置について、別段の記載がない限り、アミノ酸位置の番号付けは、ＥＵインデックスに従うものである。ＥＵインデックスもしくはＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス、またはＥＵ番号付けスキームは、ＥＵ抗体の番号付けを指す。Ｋａｂａｔらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存の程度に基づいて、それらは個々の一次配列をＣＤＲおよびフレームワークに分類し、それらの一覧を作製した（参照により全体に組み込まれる、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）。また、参照により本明細書によって全体に組み込まれる、Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５も参照されたい。修飾は、追加、欠失、または置換であり得る。
【００８０】
本明細書において「タンパク質」は、少なくとも２つの共有結合されたアミノ酸を意味し、それは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドを含む。さらに、本発明の抗体を作るポリペプチドは、１つ以上の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ＰＥＧ化、円順列、環化、他の分子に対するリンカー、タンパク質またはタンパク質ドメインに対する融合、およびペプチドタグまたは標識の追加を含み得る。
【００８１】
本明細書で使用される「残基」は、タンパク質における位置およびその関連するアミノ酸同一性を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７またはＮ２９７とも称される）は、ヒト抗体ＩｇＧ１における位置２９７の残基である。
【００８２】
本明細書で使用される「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」は、概して２つの異なるポリペプチド鎖（例えば、一方の鎖上のＶＨ−ＣＨ１および他方の鎖上のＶＬ−ＣＬ）上の、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、単離においてこの領域を指すか、または本発明の二重特異性抗体の文脈においてこの領域を指し得る。Ｆａｂの文脈において、Ｆａｂは、ＣＨ１およびＣＬドメインに加えてＦｖ領域を含む。
【００８３】
本明細書で使用される「Ｆｖ」または「Ｆｖ断片」または「Ｆｖ領域」は、ＡＢＤのＶＬおよびＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆｖ領域は、Ｆａｂ（上記に論じられるように、概して、上記に概説されるように定常領域も含む２つの異なるポリペプチド）およびｓｃＦｖの両方として形式化され得、ｖｌおよびｖｈドメインは、ｓｃＦｖを形成するように組み合わされる（概して、本明細書で論じられるようなリンカーを伴う）。
【００８４】
本明細書において「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、概してｓｃＦｖリンカーを使用して、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖドメインを形成する、可変軽ドメインに共有結合された可変重ドメインを意味する。ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ（ｖｈ−リンカー−ｖｌまたはｖｌ−リンカー−ｖｈ）のいずれかの方向付けであり得る。配列表および図に示される配列において、ｖｈおよびｖｌドメインの順序は、その名称において示されており、例えば、Ｈ．Ｘ＿Ｌ．Ｙは、Ｎ末端からＣ末端へはｖｈ−リンカー−ｖｌであり、Ｌ．Ｙ＿Ｈ．Ｘはｖｌ−リンカー−ｖｈであることを意味する。
【００８５】
本明細書で使用される「ＩｇＧサブクラス修飾」またはアイソタイプ修飾」は、１つのＩｇＧアイソタイプの１つのアミノ酸を、異なる、整列されたＩｇＧアイソタイプにおいて対応するアミノ酸に変換するアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＥＵ位置２９６に、ＩｇＧ１は、チロシンを含み、ＩｇＧ２は、フェニルアラニンを含むため、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙ置換は、ＩｇＧサブクラス改変であると考えられる。
【００８６】
本明細書で使用される「非天然型修飾」は、アイソタイプでないアミノ酸修飾を意味する。例えば、ヒトＩｇＧのいずれも位置４３４でセリンを含まないため、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４（またはそのハイブリッド）における置換４３４Ｓは、非天然型修飾であると考えられる。
【００８７】
本明細書で使用される「アミノ酸」および「アミノ酸同一性」は、ＤＮＡおよびＲＮＡによってコードされる２０個の天然型アミノ酸のうちの１つを意味する。
【００８８】
本明細書で使用される「エフェクター機能」は、抗体Ｆｃ領域のＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用に起因する生化学的事象を意味する。エフェクター機能は、これら限定されないが、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣを含む。
【００８９】
本明細書で使用される「ＩｇＧ  Ｆｃリガンド」は、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する、任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、限定はされないが、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌プロテインＡ、ブドウ球菌プロテインＧ、およびウイルスＦｃγＲが含まれる。Ｆｃリガンドはまた、Ｆｃ受容体ホモログ（ＦｃＲＨ）を含み、それは、ＦｃγＲに対して相同性であるＦｃ受容体のファミリーである（参照により全体に組み込まれる、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９０：１２３−１３６）。Ｆｃリガンドには、Ｆｃに結合する未発見分子を含まれてよい。特定のＩｇＧ  Ｆｃリガンドは、ＦｃＲｎおよびＦｃガンマ受容体である。本明細書で使用される「Ｆｃリガンド」は、抗体のＦｃ領域に結合し、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する、任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。
【００９０】
本明細書で使用される「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」、または「ＦｃガンマＲ」は、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合するタンパク質のファミリーの任意のメンバーを意味し、ＦｃγＲ遺伝子によってコードされる。ヒトにおいては、このファミリーとしては、これらに限定されないが、アイソフォームＦｃγＲＩａ、アイソフォームＦｃγＲＩｂ、およびアイソフォームＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびアロタイプＲ１３１を含む）、アイソフォームＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびアロタイプＦ１５８を含む）、およびアイソフォームＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ１およびアロタイプＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５の全体が、参照によって組み込まれる）、ならびに何らかの未発見のヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはＦｃγＲアロタイプが挙げられる。ＦｃγＲは、任意の生物由来であり得、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、これらに限定されない。マウスＦｃγＲには、これらに限定されないが、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに任意の未発見のマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはＦｃγＲアロタイプが挙げられる。
【００９１】
本明細書で使用される「ＦｃＲｎ」または「新生児型Ｆｃ受容体」は、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合するタンパク質を意味し、ＦｃＲｎ遺伝子によって少なくとも部分的にコードされる。ＦｃＲｎは、これらに限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含む、任意の生物由来であってもよい。当該技術分野で既知であるように、機能性ＦｃＲｎタンパク質は、２つのポリペプチドを含み、重鎖および軽鎖と称されることが多い。軽鎖は、ベータ−２−ミクログロブリンであり、重鎖は、ＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。別段の記載がない限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖のベータ−２−ミクログロブリンとの複合体を指す。様々なＦｃＲｎ変異体は、ＦｃＲｎ受容体への結合を増加させるため、いくつかの場合においては、血清半減期を増加させるために使用した。「ＦｃＲｎ変異体」は、ＦｃＲｎ受容体への結合を増加させるものであり、好適なＦｃＲｎ変異体は、以下に示される。
【００９２】
本明細書で使用される「親ポリペプチド」は、変異体を生成するように実質的に修飾されている出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、天然型ポリペプチド、または変異体、または天然型ポリペプチドの操作された型であってもよい。したがって、本明細書で使用される「親免疫グロブリン」は、変異体を生成するように修飾されている非修飾免疫グロブリンポリペプチドを意味し、本明細書で使用される「親抗体」は、変異体抗体を生成するように修飾されている非修飾抗体を意味する。「親抗体」が、以下に概説されるように、既知の商用の、組換え的に産生された抗体を含むことに留意されるべきである。この文脈において、「親Ｆｃドメイン」は、列挙された変異体に関連し、したがって、「変異体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン」は、ヒトＩｇＧ１の親Ｆｃドメインと比較され、「変異体ヒトＩｇＧ４  Ｆｃドメイン」は、親ドメインヒトＩｇＧ４などと比較される。
【００９３】
本明細書で使用される「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」は、ＩｇＧ分子のＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドを意味し、いくつかの場合において、ヒンジを含む。ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号付けにおいて、ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、アミノ酸２３１〜４４７を含み、ヒンジは２１６〜２３０である。したがって、「Ｆｃ領域」の定義は、アミノ酸２３１〜４４７（ＣＨ２−ＣＨ３）もしくは２１６〜４４７（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）の両方、またはそれらの断片を含む。この文脈において、「Ｆｃ断片」は、Ｎ末端およびＣ末端のいずれかまたは両方からより少ないアミノ酸を含み得るが、概してサイズに基づき、標準方法を使用して検出され得るように（例えば、非変性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど）、別のＦｃドメインまたはＦｃ断片を有する二量体を形成する能力を依然として保持するヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインは、本発明において特に有用であり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４からのＦｃドメインであり得る。
【００９４】
「変異体Ｆｃドメイン」は、親Ｆｃドメインと比較した場合、アミノ酸修飾を含む。したがって、「変異体ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン」は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインと比較した場合、アミノ酸修飾（概してアミノ酸置換であるが、消去変異体の場合においては、アミノ酸欠失が含まれる）を含むものである。概して、変異体Ｆｃドメインは、対応する親ヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインと少なくとも約８０、８５、９０、９５、９７、９８、または９９パーセントの同一性を有する（以下に議論される同一性アルゴリズムを使用し、一実施形態では、デフォルトのパラメータを使用して当該技術分野で既知のＢＬＡＳＴアルゴリズムを利用する）。代替的には、変異体Ｆｃドメインは、親Ｆｃドメインと比較した場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸修飾を有し得る。代替的には、変異体Ｆｃドメインは、親Ｆｃドメインと比較した場合、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸修飾を有し得る。さらに、本明細書で議論されるように、本明細書において変異体Ｆｃドメインは、非変性ゲル電気泳動法などの本明細書に説明されるような既知の技術を使用して測定した場合に、別のＦｃドメインを有する二量体を形成する能力を依然として保持する。
【００９５】
本明細書において「重鎖定常領域」は、可変重ドメインを除く、抗体（またはその断片）のＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分を意味し、ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号付けにおいて、これはアミノ酸１１８〜４４７である本明細書において「重鎖定常断片」は、Ｎ末端およびＣ末端のいずれかまたは両方からのより少ないアミノ酸を含むが、別の重鎖定常領域を有する二量体を形成する能力を依然として保持する重鎖定常領域を意味する。
【００９６】
本明細書で使用される「部分」は、タンパク質の配列において位置を意味する。位置は、連続して番号付けしてもよく、または確立された形式に従ってもよく、例えば、抗体の番号付けのためのＥＵインデックスに従ってもよい。
【００９７】
本明細書で使用される「標的抗原」は、所定の抗体の可変領域を含む抗体結合ドメインによって特異的に結合される分子を意味する。以下に論じられるように、この場合において、標的抗原は、チェックポイント阻害剤タンパク質である。
【００９８】
本明細書において本発明のヘテロ二量体抗体の単量体の文脈において「鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」は、「適合」するＤＮＡの２つの鎖（ｓｔｒａｎｄ）と同様に、ヘテロ二量体化変異体が、「適合」してヘテロ二量体を形成する能力を保つように、それぞれの単量体へ組み込まれることを意味する。例えば、いくつかのｐＩ変異体が、単量体Ａへと操作されている（例えば、ｐＩをより高くする）と、「電荷対」である立体変異体も利用することができ、ｐＩ変異体を妨害せず、例えば、ｐＩをより高くする電荷変異体は、同じ「鎖」または同じ「単量体」に加えられ、両機能性を保持する。同様に、以下により完全に概説されるように組の対で起こる「歪曲」変異体については、当業者は、ｐＩ分離も歪曲のｐＩを使用して最大化されるように、１組の対を組み込む鎖または単量体のどれが機能するか決定するときにｐＩを考慮する。
【００９９】
本明細書で使用される「標的細胞」は、標的抗原を発現する細胞を意味する。
【０１００】
本明細書において本発明に従う二量体特異性抗体を産生する文脈において「宿主細胞」は、二量体特異性抗体の構成要素をコードする外因性核酸を含む細胞を意味し、好適な条件下で二量体特異性抗体を発現することが可能である。好適な宿主細胞は、以下に論じられる。
【０１０１】
本明細書で使用される「可変領域」または「可変ドメイン」は、カッパ、ラムダ、および重鎖免疫グロブリン遺伝子座を作るＶκ、Ｖλ、および／またはＶＨ遺伝子のうちのいずれかによって実質的にコードされた１つ以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味し、抗原特異性を授与するＣＤＲを含む。したがって、「可変重ドメイン」は、「可変軽ドメイン」と一対にし、抗原結合ドメイン（「ＡＢＤ」）を形成する。さらに、各可変ドメインは、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）（可変重ドメインへのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３、可変軽ドメインへのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３）と、以下の順序：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に整列される４つのフレームワーク（ＦＲ）領域とを含む。
【０１０２】
本明細書において「野生型またはＷＴ」は、対立遺伝子変異を含む、天然に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【０１０３】
本発明は、ヒト抗体ドメインに対して配列同一性を有する多くの抗体ドメインを提供する。２つの類似の配列（例えば、抗体可変ドメイン）間の配列同一性は、Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）“Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  Ｏｆ  Ｂｉｏｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２［ｌｏｃａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，ＣＤ．（１９７０）“Ａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  Ｔｏ  Ｔｈｅ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｏｆ  Ｔｗｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ｊ．  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３［ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ］，Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８８）“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｏｏｌｓ  Ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４［ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍｅｔｈｏｄ］、またはＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）“Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０，ｔｈｅ“ＢＬＡＳＴ”ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉを参照されたい）などのアルゴリズムによって測定され得る。前述のアルゴリズムのうちのいずれかを使用する場合、デフォルトパラメータ（ウィンドウ長さ、ギャップペナルティなどの）が使用される。一実施形態において、配列同一性は、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して行われる。
【０１０４】
本発明の抗体は、概して、単離されているか、または組換え体である。
「単離された」が、本明細書に開示される様々なポリペプチド説明するために使用されるとき、それが発現される細胞または細胞培養から、同定され、分離され、および／または回収されたポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップによって調製されることになる。「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。「組換え体」は、外因性宿主細胞内で組換え核酸技術を使用して生成される抗体であり、それらもまた単離され得る。
【０１０５】
「特異的結合（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」、または特定の抗原もしくはエピトープ「に特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄ  ｔｏ）」、または特定の抗原もしくはエピトープ「に向けて特異的（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｏｒ）」は、非特異的相互作用とは、測定可能な程に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に、結合活性を有さない類似構造の分子である対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって、測定できる。例えば、特異的結合は、標的に類似した対照分子との競合によって決定できる。
【０１０６】
特定の抗原またはエピトープの特異的結合は、例えば、少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、代替的には少なくとも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれを超える抗原またはエピトープのＫＤを有する抗体によって示され得、ＫＤは、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープに対して、対照分子が、２０倍〜、５０倍〜、１００倍〜、５００倍〜、１０００倍〜、５，０００倍〜、１０，０００倍〜、またはそれを超える倍数のＫＤを有することになる。
【０１０７】
また、特定の抗原またはエピトープに向けた特異的結合は、例えば、対照に対して、抗体が、そのエピトープに向けて、少なくとも２０倍〜、５０倍〜、１００倍〜、５００倍〜、１０００倍〜、５，０００倍〜、１０，０００倍〜、またはこれらを上回る倍数の、抗原またはエピトープに向けたＫＡまたはＫａを有することによって示すことができ、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す。結合親和性は、概して、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＳＰＲ、またはＢＬＩアッセイを使用して測定される。
【０１０８】
Ｅ．抗体
一態様において、ＳＳＴＲ２（例えば、抗ＳＳＴＲ２抗体）に結合する組成物が本明細書に提供される。特定の実施形態において、抗体は、ヒトＳＳＴＲ２に結合する（図１１）。主題の抗ＳＳＴＲ２抗体は、単一特異性ＳＳＴＲ２抗体、ならびに多特異性（例えば、二重特異性）抗ＳＳＴＲ２抗体を含む。特定の実施形態において、抗ＳＳＴＲ２抗体は、図１に示される抗体形式のうちのいずれか１つに従う形式を有する。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、主題の組成物は、ＳＳＴＲ２結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、ＳＳＴＲ２結合ドメインを有する抗体を含む。本明細書に提供される抗体は、１、２、３、４、および５個またはそれを超えるＳＳＴＲ２結合ドメインを含む。特定の実施形態において、ＳＳＴＲ２結合ドメインは、図１１に示されるものからなる群から選択されるＳＳＴＲ２結合ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態において、ＳＳＴＲ２結合ドメインは、図１１に示されるものから選択されるＳＳＴＲ２結合ドメインの、下線が引かれたｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３配列を含む。いくつかの実施形態において、ＳＳＴＲ２結合ドメインは、図１１に示されるものから選択されるＳＳＴＲ２結合ドメインの可変重ドメインおよび可変軽ドメインを含む。図１１に示されるＳＳＴＲ２結合ドメインは、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１＿Ｌ１．１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０２、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０２、および抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０を含む。例示的な実施形態において、抗体は、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０結合ドメインを含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、抗体は、ＳＳＴＲ２およびＣＤ３に結合する二重特性抗体を含む。そのような抗体は、ＣＤ３結合ドメインおよび少なくとも１つのＳＳＴＲ２結合ドメインを含む。任意の好適なＳＳＴＲ２結合ドメインは、抗ＳＳＴＲ２Ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体に含まれ得る。いくつかの実施形態において、抗ＳＳＴＲ２Ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体は、これらに限定されないが、図１１に示されるものを含む、１、２、３、４個、またはそれを超えるＳＳＴＲ２結合ドメインを含む。特定の実施形態において、抗ＳＳＴＲ２Ｘ抗ＣＤ３抗体は、図の図１１に示されるものからなる群から選択されるＳＳＴＲ２結合ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３配列を含むＳＳＴＲ２結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗ＳＳＴＲ２Ｘ抗ＣＤ３抗体は、図１１に示されるものからなる群から選択されるＳＳＴＲ２結合ドメインの、下線が引かれたｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３配列を含むＳＳＴＲ２結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗ＳＳＴＲ２Ｘ抗ＣＤ３抗体は、図１１に示されるものからなる群から選択されるＳＳＴＲ２結合ドメインの可変重ドメインおよび可変軽ドメインを含むＳＳＴＲ２結合ドメインを含む。例示的な実施形態において、抗ＳＳＴＲ２Ｘ抗ＣＤ３抗体は、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０結合ドメインを含む。
【０１１１】
本明細書に提供される抗ＳＳＴＲ２Ｘ抗ＣＤ３抗体は、任意の好適なＣＤ３結合ドメインを含み得る。特定の実施形態において、抗ＳＳＴＲ２Ｘ抗ＣＤ３抗体は、図１２および１３に示されるものからなる群から選択されるＣＤ３結合ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３配列を含むＣＤ３結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗ＳＳＴＲ２Ｘ抗ＣＤ３抗体は、図１２または１３に示されるものからなる群から選択されるＣＤ３結合ドメインの、下線が引かれたｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３配列を含むＣＤ３結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗ＳＳＴＲ２Ｘ抗ＣＤ３抗体は、図１２または１３に示されるものからなる群から選択されるＣＤ３結合ドメインの可変重ドメインおよび可変軽ドメインを含むＣＤ３結合ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３結合ドメインは、抗ＣＤ３  Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．８９＿Ｌ１．４８、抗ＣＤ３  Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、および抗ＣＤ３  Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７から選択される。
【０１１２】
本明細書において使用されるように、用語「抗体」は、概して使用される。本発明においての用途を見出す抗体は、本明細書で説明されるような多くの形式で使用でき、伝統的な抗体、ならびに以下に説明される抗体の誘導体、断片、および模倣体を含む。
【０１１３】
伝統的な抗体構造単位は、典型的には、四量体を含む。各四量体は、典型的には、ポリペプチド鎖の２つの同一対からなり、各対が、１つの「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量を有する）、および１つの「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖として分類される。本発明は、ＩｇＧクラスを対象とし、ＩｇＧクラスは、これらに限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む、いくつかのサブクラスを有する。ＩｇＧ１が、３５６（ＤまたはＥ）および３５８（ＬまたはＭ）で多型を有する異なるアロタイプを有することに留意されるべきである。本明細書に示される配列は、３５６Ｄ／３５８Ｍアロタイプを使用するが、他のアロタイプが帆明細書に含まれる。すなわち、本明細書に含まれるＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む任意の配列は、３５６Ｄ／３５８Ｍアロタイプを置き換える３５６Ｅ／３５８Ｌを有し得る。
【０１１４】
さらに、本明細書の抗体の多くは、セリンによって置き換えられた位置２２０で少なくとも１つのシステインを有し、概して、これは、本明細書に示される配列のうちの大半の「ｓｃＦｖ単量体」側であるが、それはまた、「Ｆａｂ単量体」側、または両方であり得、ジスルフィド形成を低減する。置き換えられたこれらのシステイン（Ｃ２２０Ｓ）のうちの１つまたは両方が、本明細書において配列内に特異的に含まれる。
【０１１５】
したがって、本明細書では、「アイソタイプ」は、それら定常領域の化学的特性および抗原特性によって定義される免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。治療用抗体が、アイソタイプおよび／またはサブクラスのハイブリッドも含み得ることを理解されるべきである。例えば、参照により組み込まれる、ＵＳ公開２００９／０１６３６９９に示されるように、本発明は、ヒトＩｇＧ１／Ｇ２ハイブリッドの使用を含む。
【０１１６】
超可変領域は、概して、軽鎖可変領域における約アミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１、  「Ｌ」は軽鎖を示す）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域における約３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１、「Ｈ」は重鎖を示す）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）前後；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）、かつ／または超可変ループを形成するそれらの残基（例えば、軽鎖可変領域における残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域における２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）、および９６〜１０１（ＨＣＤＲ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７からのアミノ酸残基を包含する。本発明の特定のＣＤＲは、以下に説明される。
【０１１７】
当業者によって理解されるように、ＣＤＲの正確な番号付けおよび配置は、異なる番号付けシステムの間で異なり得る。しかしながら、可変重および／または可変軽配列の開示が、関連する（固有）ＣＤＲの開示を含むことを理解されるべきである。したがって、各可変重領域の開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３）の開示であり、各可変軽領域の開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３）の開示である。ＣＤＲ番号付けの有用な比較は、以下のとおりであり、Ｌａｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（ｌ）：５５−７７（２００３）を参照されたい：
【表１】
2019527047.tif 000003
【０１１８】
本明細書を通して、可変ドメイン（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７、および重鎖可変領域の残基１〜１１３）における残基を指すときは、Ｋａｂａｔ番号付けシステム、Ｆｃ領域についてはＥＵ番号付けシステムが一般に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ（１９９１））。
【０１１９】
重鎖のＩｇドメインの別の型は、ヒンジ領域である。本明細書において「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」は、抗体の第１および第２の定常ドメインの間にアミノ酸を含む柔軟性のポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置２１５で終了し、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインは、残基ＥＵ位置２３１から始まる。したがって、本明細書においてＩｇＧについて、抗体ヒンジは、位置２１６（ＩｇＧ１におけるＥ２１６）〜位置２３０（ＩｇＧ１におけるｐ２３０）を含むと定義され、番号付けは、Ｋａｂａｔにあるように、ＥＵインデックスに従うものである。いくつかの場合において、「ヒンジ断片」が使用され、それは、ヒンジドメインのＮ末端およびＣ末端のいずれかまたは両方でより少ないアミノ酸を含む。本明細書に留意されるとおり、ｐＩ変異体は、ヒンジ領域においても作られ得る。
【０１２０】
軽鎖は、概して、２つのドメイン、可変軽ドメイン（Ｆｖ領域を形成する可変重ドメインと共に軽鎖ＣＤＲを含む）、および定常軽鎖領域（ＣＬまたはＣκと称されることが多い）を含む。
【０１２１】
以下に概説される、追加の置換への対象の別の領域は、Ｆｃ領域である。
【０１２２】
本発明は、多数の異なるＣＤＲの組を提供する。この場合において、「完全なＣＤＲのセット」は、３つの可変軽ＣＤＲおよび３つの可変重ＣＤＲ、例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を含む。これらは、それぞれより大きな可変軽または可変重ドメインの一部であり得る。さらに、本明細書により完全に概説されるとおり、可変重および可変軽ドメインは、重および軽鎖が使用される場合（例えば、Ｆａｂが使用される場合）、別々のポリペプチド鎖上に、またはｓｃＦｖ配列の場合は単一ポリペプチド鎖上にあり得る。
【０１２３】
ＣＤＲは、抗体結合の形成に寄与し、またはより具体的には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」は、パラトープとして既知の、抗体分子の可変領域における特異性抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の分類であり、通常、特定の構造特性、および特定の荷電特性を有する。単一抗原は、２つ以上のエピトープを有し得る。
【０１２４】
エピトープは、結合（エピトープの免疫優性構成要素とも称される）に直接的に含まれるアミノ酸残基と、特異的抗原結合ペプチドによって有効に阻止されるアミノ酸残基などの結合に直接的に含まれない他のアミノ酸残基とを含み得、言い換えると、アミノ酸残基は、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にある。
【０１２５】
エピトープは、立体構造的、または直線的のいずれかであってもよい。立体構造的エピトープは、空間的に並置されたアミノ酸によって、直線的ポリペプチド鎖の異なるセグメントから産生される。直線的エピトープは、ポリペプチド鎖における隣接アミノ酸残基によって産生されるものである。立体構造的および非立体構造的エピトープは、前者に対する結合であって、後者に対するものではない結合が、変性溶媒の存在下で消失するという点で区別され得る。
【０１２６】
エピトープは、特有の空間的立体構造において、典型的には少なくとも３個のアミノ酸を含み、より典型的には、少なくとも５または８〜１０個のアミノ酸を含む。同一エピトープを認識する抗体は、１つの抗体が、標的抗原に対する別の抗体の結合を遮断する能力を示す単純なイムノアッセイにおいて検証でき、例えば、「ビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）」である。以下に概説されるように、本発明は、本明細書の列挙された抗原結合ドメインおよび抗体を含むだけでなく、列挙された抗原結合ドメインによって結合されているエピトープと結合することを競うものも含む。
【０１２７】
したがって、本発明は、異なる抗体ドメインを提供する。本明細書で説明され、当該技術分野で既知であるように、本発明のヘテロ二量体抗体は、重鎖および軽鎖内に異なるドメインを含み、そのドメインはまた、重複し得る。これらのドメインとしては、これらに限定されないが、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、重定常ドメイン（ＣＨ１−ヒンジ−ＦｃドメインまたはＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、軽定常ドメイン、ＦＡｂドメイン、およびｓｃＦｖドメインが挙げられる。
【０１２８】
したがって、「Ｆｃドメイン」は、−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、任意に、ヒンジドメイン（−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。本明細書の実施形態において、ｓｃＦｖがＦｃドメインに結合されるとき、それは、Ｆｃドメインのヒンジのすべてまたは一部に結合されているｓｃＦｖ構築物のＣ末端であり、例えば、ヒンジの開始である配列ＥＰＫＳに概して結合されている。重鎖は、可変重ドメインおよび定常ドメインを含み、ＣＨ２−ＣＨ３を含むＣＨ１−任意のヒンジ−Ｆｃドメインを含む。軽鎖は、可変軽鎖および軽定常ドメインを含む。ｓｃＦｖは、可変重鎖、ｓｃＦｖリンカー、および可変軽ドメインを含む。本明細書に概説される構築物および配列の大半において、可変重鎖のＣ末端は、ｓｃＦｖリンカーのＮ末端に結合されており、そのＣ末端は、可変軽鎖（Ｎ−ｖｈ−リンカー−ｖｌ−Ｃ）のＮ末端に結合されているが、それは切り替えられ得る（Ｎ−ｖｌ−リンカー−ｖｈ−Ｃ）。
【０１２９】
本発明のいくつかの実施形態は、天然に発生しないが、概して、ｓｃＦｖリンカーによって一緒に連結される可変重ドメインおよび可変軽ドメインを含む少なくとも１つのｓｃＦｖドメインを含む。本明細書に概説されるように、ｓｃＦｖドメインは、概して、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌとしてＮ末端からＣ末端へ方向付けされているが、これは、形式に応じて一方または両方の端で任意のリンカーを伴って、ｓｃＦｖドメイン（またはＦａｂからｖｈおよびｖｌ配列を使用して構築されたもの）のうちのいずれかに関しても、ｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈへ逆転され得る（概して図１を参照されたい）。
【０１３０】
本明細書に示されるように、組換え技術によって生成された、伝統的なペプチド結合を含む、列挙されたドメインに共有結合するために使用され得る多くの好適なリンカー（ドメインリンカーまたはｓｃＦｖリンカーのいずれかとしての使用への）がある。いくつかの実施形態において、リンカーペプチドは、以下のアミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒを優性的に含み得る。リンカーペプチドは、２つの分子を連結するために適切な長さを有するべきであり、そのようにして、それらは、お互いに対して正しい立体構造をとり、その結果、それらは、望ましい活性を保持する。一実施形態において、リンカーは、長さが、約１〜５０個のアミノ酸、好ましくは、長さが、約１〜３０個のアミノ酸である。一実施形態において、長さが１〜２０個のアミノ酸のリンカーは、いくつかの実施形態において用途を見出す約５〜約１０個のアミノ酸と共に使用されてもよい。有用なリンカーは、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎを含む、グリシン−セリン重合体を含み、ｎは、少なくとも１（かつ概して３〜４）の整数であり、グリシン−アラニン重合体、アラニン−セリン重合体、および他の柔軟性リンカーを含む。代替的には、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールの共重合体を含む、様々な非タンパク質性重合体は、リンカーとして用途を見出され得る。
【０１３１】
他のリンカー配列は、ＣＬ／ＣＨ１ドメインのすべての残基ではないが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の長さの任意の配列、例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５〜１２個のアミノ酸残基を含み得る。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖由来であり得、例えば、ＣκまたはＣλである。リンカーは、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、およびＣμが含む、任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖由来であり得る。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来の配列、および他のタンパク質由来の他の天然の配列などの他のタンパク質由来であってもよい。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に一緒に概要が記載されるあらゆる２つのドメインを連結させるために使用される「ドメインリンカー」である。例えば、図１Ｆにおいて、ｓｃＦｖのＣ末端をＣＨ２ドメインに結合している別の任意のドメインリンカーを伴って、ＦａｂのＣＨ１ドメインのＣ末端をｓｃＦｖのＮ末端に結合するドメインリンカーがあり得る（しかし、多くの実施形態において、ヒンジは、このドメインリンカーとして使用される）。いずれの好適なリンカーも使用され得る一方で、多くの実施形態は、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎを含む、ドメインリンカーとしてグリシン−セリン重合体を利用し、ｎは、少なくとも１（かつ概して３〜４〜５）の整数、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持することを可能にするのに十分な長さおよび柔軟性を有する２つのドメインの組換え結合を可能にする任意のペプチド配列である。いくつかの場合において、以下に概説されるように、「鎖性」に注目すると、ｓｃＦｖリンカーのいくつかの実施形態において使用されるように、荷電ドメインリンカーは使用され得る。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、リンカーは、ｓｃＦｖリンカーであり、本明細書に論じられるようにｖｈおよびｖｌドメインに共有結合するために使用され得る。多くの場合において、ｓｃＦｖリンカーは、荷電ｓｃＦｖリンカーであり、多くのそれらは図７に示される。したがって、本発明は、第１の単量体と第２の単量体との間でｐＩにおける分離を容易にするために荷電ｓｃＦｖリンカーをさらに提供する。すなわち、荷電ｓｃＦｖリンカーを組み込むことによって、正であっても、負であっても（あるいは異なる単量体上でｓｃＦｖを使用する骨格の場合は両方）、これは、荷電リンカーを含む単量体が、Ｆｃドメインにおいてさらなる変化をすることなくｐＩを変えることを可能にする。これらの荷電リンカーは、標準リンカーを含む任意のｓｃＦｖに置換され得る。かさねて、当業者によって理解されるように、荷電ｓｃＦｖリンカーは、ｐＩにおける望ましい変化に従って、正しい「鎖」または単量体上に使用される。例えば、本明細書で論じられるように、三重Ｆ形式のヘテロ二量体抗体を作製するために、望ましい抗原結合ドメインの各々についてのＦｖ領域の初期のｐＩは計算され、１つがｓｃＦｖを作製するために選択され、ｐＩに応じて、正または負のリンカーのいずれかが選択される。
【０１３４】
荷電ドメインリンカーはまた、本発明の単量体のｐＩ分離を増加するためにも使用され得、したがって、図７に含まれるものは、リンカーが利用される本明細書の任意の実施形態において使用され得る。
【０１３５】
具体的には、図１に示される形式は抗体であり、通常、「ヘテロ二量体抗体」と称され、タンパク質が、ヘテロ二量体Ｆｃドメインに自己組織化した少なくとも２つの関連するＦｃ配列、および少なくとも２つのＦｖ領域を、ＦａｂとしてかまたはｓｃＦｖとしてかにかかわらず有することを意味する。
【０１３６】
Ｆ．キメラおよびヒト化抗体
特定の実施形態において、本発明の抗体は、特定の生殖細胞系重鎖免疫グロブリン遺伝子からの重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系軽鎖免疫グロブリン遺伝子からの軽鎖可変領域を含む。例えば、そのような抗体は、特定の生殖細胞系配列「の産生物」またはそれ「に由来する」重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むヒト抗体を含み得るか、またはそれらからなり得る。ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「の産生物」またはそれ「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト殖細胞系免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較することと、ヒト抗体の配列に対して配列において最も近い（すなわち、最良％の同一性）ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列を選択することとによるものとして特定され得る（本明細書に概説される方法を使用して）。特定のヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列「の産生物」またはそれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば、天然型体細胞突然変異または部位指示された変異の意図的導入に起因して、生殖細胞系配列と比較した場合にアミノ酸の差異を含み得る。しかしながら、ヒト化抗体は、典型的には、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他の種（例えば、マウス生殖細胞系列配列）の生殖細胞系免疫グロブリンアミノ酸配列と比較したときに、ヒト配列に由来しているような抗体を特定するアミノ酸残基を含む。特定の場合において、ヒト化抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９５、９６、９７、９８、もしくは９９％、またはさらに少なくとも９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖細胞系配列に由来するヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列から１０〜２０個以下のアミノ酸の差異を示すであろう（本明細書の任意の歪曲、ｐＩ、および消去変異体の導入の前、すなわち、本発明の変異体の導入の前に、変異体の数が、概して低い）。特定の場合において、ヒト化抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列から５個以下、またはさらに４、３、２、もしくは１個以下のアミノ酸の差異を示し得る（かさねて、本明細書の任意の歪曲、ｐＩ、および消去変異体の導入の前、すなわち、本発明の変異体の導入の前に、変異体の数が、概して低い）。
【０１３７】
一実施形態において、親抗体は、親和性が成熟しており、当該技術分野で既知のとおりである。構造に基づく方法は、例えば、ＵＳＳＮ１１／００４，５９０に記載されているように、ヒト化および親和性の成熟に用いられてもよい。選択に基づく方法は、これらに限定されないが、参照によりすべてが全体的に組み込まれる、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８−１０６８４、Ｒｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３７）：２２６１１−２２６１８、Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８９１０−８９１５、Ｋｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６（１０）：７５３−７５９に記載されている方法を含む、ヒト化および／または親和性成熟抗体可変領域に用いられ得る。他のヒト化方法は、これらに限定されないが、参照によりすべてが全体的に組み込まれる、ＵＳＳＮ０９／８１０，５１０、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−１１２５、Ｄｅ  Ｐａｓｃａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６−３０８４に記載されている方法を含む、ＣＤＲの部分のみの移植を含み得る。
【０１３８】
Ｇ．ヘテロ二量体抗体
したがって、いくつかの実施形態において、主題の抗体は、２つの異なる鎖変異体Ｆｃ配列の使用に依存するヘテロ二量体抗体である。そのような抗体は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインおよびヘテロ二量体抗体を形成するために自己組織化するであろう。
【０１３９】
本発明は、２つ以上の抗原またはリガンドに結合することを可能にする、例えば、二重特異的結合（例えば、抗ＳＳＴＲ２および抗ＣＤ３結合）を可能にするヘテロ二量体抗体を提供するための新規の構築物を対象とする。ヘテロ二量体抗体構築物は、抗体の重鎖の２つのＦｃドメイン、例えば、「二量体」に組織化する２つの「単量体」の自己組織化の性質に基づく。ヘテロ二量体抗体は、以下により完全に論じられるように各単量体のアミノ酸配列を変えることによって作製される。したがって、本発明は、概して、いくつかの方法で、抗原（例えば、ＳＳＴＲ２およびＣＤ３）を共結合できるヘテロ二量体抗体の創出を対象とし、それぞれの鎖で異なる定常領域のアミノ酸変異体に依存することで、ヘテロ二量体形成の促進し、および／またはホモ二量体を上回るヘテロ二量体の精製の容易化を可能にする。
【０１４０】
したがって、本発明は、二重特異性抗体を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＳＳＴＲ２結合ドメインを含む二重特異性抗体を提供する。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体である。抗体技術における継続問題は、２つの異なる抗原に同時に結合し、概して、そのようにして、異なる抗原を近接させることを可能にし、新しい機能性および新しい治療をもたらす「二重特異性」抗体への望みである。概して、これらの抗体は、重鎖および軽鎖それぞれの遺伝子を宿主細胞へと含めることによって作られる。これにより、概して、望ましいヘテロ二量体（Ａ−Ｂ）、ならびに２つのホモ二量体（Ａ−ＡおよびＢ−Ｂ（軽鎖ヘテロ二量体の問題を含まない））の形成がもたらされる。しかしながら、二重特異性抗体の形成における主な障壁は、ホモ二量体から離れたヘテロ二量体抗体を精製することおよび／またはホモ二量体の形成を上回るヘテロ二量体の形成を偏らせることの困難さである。
【０１４１】
本発明のヘテロ二量体を生成するために使用され得る多くの機構が存在する。さらに、当業者によって理解されるように、これらの機構は、高いヘテロ二量体化を確実にするために組み合わされ得る。したがって、ヘテロ二量体の産生につながるアミノ酸変異体は、「ヘテロ二量体化変異体」と称される。以下に論じられるように、ヘテロ二量体化変異体は、立体変異体（例えば、以下に説明される「ノブアンドホール」または「歪曲」変異体、および以下に説明される「荷電対」変異体）、ならびにヘテロ二量体から離れたホモ二量体の精製を可能にする「ｐＩ変異体」を含み得る。ＷＯ２０１４／１４５８０６に概して記載されており、その全体において参照により本明細書によって組み込まれ、特に「ヘテロ二量体化変異体」の議論について以下にあるように、ヘテロ二量体化に有用な機構としては、「ノブアンドホール」（「ＫＩＨ」、時に本明細書では「歪曲」変異体として（ＷＯ２０１４／１４５８０６の議論参照）、ＷＯ２０１４／１４５８０６に記載されている「静電操縦」または「電荷対」、ＷＯ２０１４／１４５８０６に記載されているｐＩ変異体、ならびにＷＯ２０１４／１４５８０６および以下に概説される一般的な追加のＦｃ変異体が挙げられる。
【０１４２】
本発明には、ヘテロ二量体抗体の精製を容易化できるいくつかの基礎的な機構が存在し、１つは、各単量体が異なるｐＩを有するようにｐＩ変異体の使用に依存し、そうすることで、Ａ−Ａ二量体タンパク質、Ａ−Ｂ二量体タンパク質、およびＢ−Ｂ二量体タンパク質の等電点精製を可能にする。代替的には、「三重Ｆ」形式などのいくつかの骨格形式はまた、サイズに基づいて分離も可能にする。以下にさらに概説されるとおり、ホモ二量体を上回るヘテロ二量体の形成を「歪曲」することも可能である。したがって、立体二量体化変異体、およびｐＩ変異体または電荷対変異体の組み合わせは、本発明において、特定の用途を見出す。
【０１４３】
概して、本発明における特定の使用の実施形態は、歪曲変異体を含む変異体のセットに依存し、それは、ｐＩ変異体で結合された、ホモ二量体化形成を上回るヘテロ二量体化形成を促進し、それは、２つの単量体の間のｐＩの差異を増加させて、ホモ二量体から離れたヘテロ二量体の精製を容易にする。
【０１４４】
さらに、以下により完全に概説されるとおり、ヘテロ二量体抗体の形式に応じて、ｐＩ変異体は、単量体の定常および／またはＦｃドメインのいずれかの内に含まれ得るか、あるいはドメインリンカーまたはｓｃＦｖリンカーのいずれかである荷電リンカーが使用され得る。すなわち、三重Ｆ、または「栓抜き」形式などのｓｃＦｖ（複数可）を利用する骨格は、精製の目的のためにさらなるｐＩブーストを与える荷電ｓｃＦｖリンカー（正または負のいずれか）を含み得る。当業者によって理解されるとおり、いくつかの三重Ｆ形式は、荷電ｓｃＦｖリンカーのみで、追加のｐＩ調整無しでも有用であるが、本発明は、単量体のうちの１つまたは両方にあるｐＩ変異体、および／または荷電ドメインリンカーも提供する。さらに、代替機能性のために操作する追加のアミノ酸はまた、Ｆｃ、ＦｃＲｎ、およびＫＯ変異体などのｐＩの変化を与え得る。
【０１４５】
ヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にする分離機構としてｐＩを利用する本発明において、アミノ酸変異体は、単量体ポリペプチドの１つまたは両方に導入され得、すなわち、単量体のうちの１つのｐＩ（本明細書において簡略化のために、「単量体Ａ」と称される）は、単量体Ｂから離れて操作され得るか、または単量体ＡおよびＢの両方の変化は、単量体ＡのｐＩが増加し、単量体ＢのｐＩが減少する状態で変化され得る。以下に、より完全に概説されるように、単量体のいずれかまたは両方のｐＩの変化は、荷電残基を除去もしくは追加（例えば、中性アミノ酸は、正または負に荷電したアミノ酸残基によって置き換えられ、例えば、グリシンからグルタミン酸への置き換えである）するか、荷電残基を正もしくは負から反対の電荷へと変化（アスパラギン酸からリジンへ）するか、または荷電残基を中性残基へと変化（例えば、リジンからセリンへであり、これにより荷電が消失する）することによって行われ得る。多くのこれらの変異体は、図に示される。
【０１４６】
したがって、本発明のこの実施形態は、ヘテロ二量体がホモ二量体から分離され得るように単量体のうちの少なくとも１つにおいてｐＩにおける十分な変化を創出することを提供する。当業者によって理解されるように、および以下にさらに論じられるように、これは、そのｐＩを増加または減少のいずれかをさせるように操作されている「野生型」重鎖定常領域を使用すること（ｗｔ  Ａ−＋Ｂまたはｗｔ  Ａ−−Ｂ）によって、または一方の領域を増加し、他方の領域を減少させること（Ａ＋−Ｂ−またはＡ−Ｂ＋）によって行われ得る。
【０１４７】
したがって、概して、本発明のいくつかの実施形態の構成要素は、アミノ酸置換（「ｐＩ変異体」または「ｐＩ置換」）を単量体のうちの１つまたは両方に組み込むことによって、二量体タンパク質の単量体のうち、両方ではない場合、少なくとも１つの等電点（ｐＩ）を変化させて、「ｐＩ抗体」を形成するように指示された抗体の定常領域におけるアミノ酸変異体である。本明細書で示されるように、２つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、２つの単量体のｐＩが、わずか０．１ｐＨ単位でも異なれば達成され得、０．２、０．３、０．４、および０．５、またはそれを超える差異はすべて本発明において用途を見出す。
【０１４８】
当業者によって理解されるように、良好な分離を得るためにそれぞれまたは両方の単量体に含まれるｐＩ変異体の数は、構成要素の出発ｐＩ、例えば、三重Ｆ形式で、対象のｓｃＦｖおよびＦａｂの出発ｐＩに依存する部分があるであろう。すなわち、どの単量体を操作するか、またはどの「方向」（例えば、より正またはより負）にするかを決定するために、２つの標的抗原のＦｖ配列が計算され、そこから決定が行われる。当該技術分野で既知であるように、異なるＦｖは、本発明で活用される異なる出発ｐＩを有する。概して、本明細書に概説されるように、ｐＩが操作されることにより、それぞれの単量体で、少なくとも約０．１ｌｏｇの総ｐＩ差異がもたらされ、本明細書に概説されるように当該総ｐＩ差異は、０．２〜０．５であることが好ましい。
【０１４９】
さらに、当業者によって理解されるように、本明細書に概説されるように、いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体は、サイズに基づいてホモ二量体から分離され得る。例えば図１に示されるように、形式のいくつかは、サイズに基づいてヘテロ二量体およびホモ二量体の分離を可能にする。
【０１５０】
ｐＩ変異体が、重鎖（複数可）の定常領域（複数可）を使用することによって、二量体化を達成するために使用される場合において、抗体を含む二重特異性タンパク質の設計および精製に対する、よりモジュール型の手法が提供される。したがって、いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体化変異体（歪曲ヘテロ二量体化変異体および精製ヘテロ二量体化変異体を含む）は、それぞれの個々の抗体が操作されなければならないために可変領域に含まれていない。さらに、いくつかの実施形態において、ｐＩ変異体からもたらされる免疫原性の可能性は、ｐＩが著しい免疫原性を導入することなく変化されるように異なるＩｇＧアイソタイプ由来のｐＩ変異体を移入することによって、著しく低減される。したがって、解決すべき追加の問題は、ヒト配列含量が高い低ｐＩ定常ドメインの解明であり、例えば、任意の特定位置における非ヒト残基の最小化または回避である。
【０１５１】
このｐＩ操作で起こり得る付帯利点は、血清半減期の延長およびＦｃＲｎ結合の増加でもある。すなわち、ＵＳＳＮ１３／１９４，９０４に記載されているように（その全体において参照により組み込まれる）、抗体定常ドメイン（抗体およびＦｃ融合体においてみられるものを含む）のｐＩを低下させることは、インビボでより長期の血清保持をもたらし得る。血清半減期の増加には、これらのｐＩ変異体は、精製のためのｐＩの変化も容易にする。
【０１５２】
さらに、ホモ二量体が存在する場合に、排除、最小化、および区別するいずれかの能力が顕著であるため、ヘテロ二量体化変異体のｐＩ変異体が、二重特異性抗体の分析論および品質管理工程のための追加の利点をもたらすことに留意されるべきである。同様に、ヘテロ二量体抗体産生の再現性を確実に試験する能力が重要である。
【０１５３】
ヘテロ二量体化変異体
本発明は、ホモ二量体から離れたヘテロ二量体形成および／または精製を可能にするためにヘテロ二量体変異体を利用する様々な形式でヘテロ二量体抗体を含む、ヘテロ二量体タンパク質を提供する。
【０１５４】
多くの好適なヘテロ二量体化歪曲変異体のセットの対がある。これらの変異体は、「セット」の「対」で起こる。すなわち、対の一方のセットは、第１の単量体に組み込まれ、対の他方のセットは、第２の単量体に組み込まれる。これらのセットは、一方の単量体上の残基と他方の単量体上の残基との間の１対１の対応を有する「ノブインホール」変異体として必ずしも作用せず、すなわち、これらの対のセットは、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を防止する２つの単量体の間で境界面を形成し、生物学的条件下で自発的に形成するヘテロ二量体の百分率が、予想された５０％よりもむしろ９０％を超えることを可能にする（２５％のホモ二量体Ａ／Ａ：５０％のヘテロ二量体Ａ／Ｂ：２５％のホモ二量体Ｂ／Ｂ）ことに留意されるべきである。
【０１５５】
立体変異体
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体の形成は、立体変異体の追加によって容易にされ得る。すなわち、それぞれの重鎖におけるアミノ酸を変化させることによって、異なる重鎖が、同じＦｃアミノ酸配列を有するホモ二量体を形成するよりも、ヘテロ二量体構造を形成することに関連する可能性が高くなる。好適な立体変異体は、図１２に含まれる。
【０１５６】
１つの機構は、概して、当該技術分野において「ノブアンドホール」と称され、有利なヘテロ二量体形成に対して立体影響を作り出すアミノ酸操作を指し、不利なホモ二量体形成はまた、任意に使用され得、これは、ＵＳＳＮ６１／５９６，８４６、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（７）：６１７（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７  ２７０：２６、米国特許第８，２１６，８０５号に記載されているように、時に、「ノブアンドホール」と称され、それらのすべてが、それらの全体において参照により本明細書によって組み込まれる。図によって「ノブアンドホール」に依存する多くの「単量体Ａ−単量体Ｂ」の対が特定されている。さらに、Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）に記載されているように、これらの「ノブアンドホール」変異は、ジスルフィド結合と組み合わされて、ヘテロ二量体化への形成を歪曲し得る。
【０１５７】
ヘテロ二量体の生成において用途を見出す追加の機構は、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）に記載されているように、時に、「静電ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ）」と称され、その全体において参照により本明細書によって組み込まれる。これは、時に本明細書で「電荷対」と称されることがある。この実施形態では、静電気が、形成をヘテロ二量体化へと歪曲するために使用される。当業者であれば、これらは、ｐＩに対しても効果を有し得、そうすることで、精製に対しても影響を有し得、したがって、場合によっては、ｐＩ変異体であり得るとも考えられることを理解されるであろう。しかしながら、これらは、ヘテロ二量体化を押し進めるために生成され、精製手段としては使用されなかったため、それらは、「立体変異体」として分類される。これらは、これらに限定されないが、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対であるＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは、「単量体が対応するセットである）およびＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対であるＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅを含む。
【０１５８】
追加の単量体Ａ変異体、および単量体Ｂ変異体を、本明細書に概要が記載されるｐＩ変異体または、ＵＳ２０１２／０１４９８７６の図３７に示される他の立体変異体などの他の変異体と、任意にかつ独立して、任意の量で、組み合わせることができ、それらの図および説明文ならびに配列番号が、参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に概要が記載される立体変異体を、何らかのｐＩ変異体（またはＦｃ変異体、ＦｃＲｎ変異体等の他の変異体）と共に１つまたは両方の単量体へ、任意選択かつ独立して、組み込むことができ、本発明のタンパク質を独立かつ任意選択で含む、または当該タンパク質から除外することができる。
【０１６０】
好適な歪曲変異体の一覧は、図３に見出され、併せて図８は、多くの実施形態において特定の利用性のいくつかの対を示す。多くの実施形態において特定の使用には、これらに限定されないが、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含むセットの対がある。命名法の用語において、対「Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ」は、単量体のうちの一方が、二重変異体セットＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを有し、他方が、二重変異体セットＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを有することを意味する。
【０１６１】
ヘテロ二量体のｐＩ（等電点）変異体
概して、当業者に理解されるように、ｐＩ変異体の２つの一般的な分類があり、タンパク質のｐＩを増加させるもの（塩基性の変化）およびタンパク質のｐＩを減少させるものである（酸性の変化）である。本明細書に説明されるように、これらの変異体のすべての組み合わせが行われ得、一方の単量体は、野生型か、または野生型と著しく異なるｐＩを示さない変異体であってもよく、他方は、より塩基性またはより酸性であり得る。代替的には、それぞれの単量体が、１つは、より塩基性へ、１つは、より酸性へと変化される。
【０１６２】
ｐＩ変異体の好ましい組み合わせは、図４に示される。本明細書に概説され、図に示されるとおり、これらの変化は、ＩｇＧ１に対して示されるが、すべてのアイソタイプおよびアイソタイプハイブリッドが、この方法で変化され得る。重鎖定常ドメインが、ＩｇＧ２〜４由来である場合において、Ｒ１３３ＥおよびＲ１３３Ｑもまた使用され得る。
【０１６３】
一実施形態において、例えば、図１Ａ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＩの形式において、ｐＩ変異体の好ましい組み合わせは、２０８Ｄ／２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄ変異体（ヒトＩｇＧ１に対するときは、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む１つの単量体（負のＦａｂ側）、および（ＧＫＰＧＳ）４（配列番号８１８）を含む、正に荷電されたｓｃＦｖリンカーを含む第２の単量体（正のｓｃＦｖ側）を有する。しかしながら、当業者に理解されるように、第１の単量体は、位置２０８を含むＣＨ１ドメインを含む。したがって、ＣＨ１ドメインを含まない構築物において（例えば、ドメインのうちの１つでＣＨ１ドメインを利用しない抗体について、例えば、図１Ｂ、Ｃ、もしくはＤに示されるものなどの二重ｓｃＦｖ形式または「ワンアーム」形式において）、好ましい負のＰｉ変異体Ｆｃセットは、２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄ変異体（ヒトＩｇＧ１に対するときは、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む。
【０１６４】
したがって、いくつかの実施形態において、一方の単量体は、図４の置換のセットを有し、他方の単量体は、荷電リンカー（単量体がｓｃＦｖを含むため荷電ｓｃＦｖリンカーの形式においてか、または、形式が指示される際、図７に示されるものから選択され得る、荷電ドメインリンカーのいずれか）を有する。
【０１６５】
アイソタイプ変異体
さらに、本発明の多くの実施形態が、１つのＩｇＧアイソタイプから別のものへの、特定位置でのｐＩアミノ酸の「取り込み」に依存しており、したがって、変異体へ導入される不要な免疫原性の可能性を低下または除去している。多くのこれらは、参照により本明細書によって組み込まれる、米国公開第２０１４／０３７００１３号の図２１に示される。すなわち、ＩｇＧ１は、高いエフェクター機能を含めて、様々な理由で、治療用抗体のための共通のアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重定常領域は、ＩｇＧ２のそれと比較して、より高いｐＩを有している（８．１０対７．３１）。特定位置で、ＩｇＧ２残基を、ＩｇＧ１主鎖へ導入することによって、得られる単量体のｐＩは低下（または増加）し、付加的に血清半減期の長期化を示す。例えば、ＩｇＧ１は、位置１３７にグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２は、グルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有している。つまり、グルタミン酸の取り込みは、得られるタンパク質のｐＩに影響を与えることになる。以下に説明されるとおり、多くのアミノ酸置換は、一般に、変異体抗体のｐＩに顕著な影響を与えることが必要とされている。しかしながら、以下に論じられるとおり、ＩｇＧ２分子における変化でさえ、血清半減期の増加を可能にすることに留意されるべきである。
【０１６６】
他の実施形態では、非アイソタイプアミノ酸の変化がなされ、得られるタンパク質の全体の電荷状態が低下（例えば、より高いｐＩアミノ酸を、より低いｐＩアミノ酸へと変化させることによって）するか、または安定に向けた構造の適応が可能になる等、以下にさらに説明されるとおりである。
【０１６７】
さらに、重定常ドメインおよび軽定常ドメインの両方のｐＩ操作によって、ヘテロ二量体のそれぞれの単量体において、顕著な変化をみることができる。本明細書で論じられるように、２つの単量体のｐＩを少なくとも０．５異なるようにすることで、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点感受性の他の方法による分離が可能になる。
【０１６８】
ｐＩの計算
それぞれの単量体のｐＩは、変異体重鎖定常ドメインおよび融合パートナーを含む、可変重鎖定常ドメインのｐＩおよび総単量体のｐＩに依存し得る。したがって、いくつかの実施形態において、米国公開第２０１４／０３７００１３号の図１９中の図表を使用して、変異体重鎖定常ドメインに基づいて、ｐＩの変化が計算される。本明細書で論じられるように、どの単量体を操作するかは、概して、Ｆｖおよび骨格領域の固有ｐＩによって決定される。代替的には、それぞれの単量体のｐＩが、比較され得る。
【０１６９】
より良好なＦｃＲｎインビボ結合も与えるｐＩ変異体
ｐＩ変異体が、単量体のｐＩを低減する場合において、それらは、インビボで血清保持を改善する追加された利点を有し得る。
【０１７０】
依然として試験下であるが、エンドソーム内でｐＨ６でのＦｃＲｎへの結合がＦｃを隔離するため、Ｆｃ領域は、インビボでより長期の半減期を有すると思われる（Ｇｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，１９９７  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ．１８（１２）：５９２−５９８、参照により全体に組み込まれる）。次いで、エンドソームの区画は、Ｆｃを細胞表面へと再循環させる。区画が、より高いｐＨである約７．４の細胞外空間へと一旦開くと、Ｆｃの放出が誘導され、血液へ戻る。マウスにおいて、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａらは、ｐＨ６およびｐＨ７．４で増加されたＦｃＲｎ結合を有するＦｃ変異体は、野生型Ｆｃとして実際に血清濃度および同じ半減期に低減していた（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５１７１−５１８０、参照により全体に組み込まれる）。ｐＨ７．４でのＦｃＲｎのＦｃの増加された親和性は、Ｆｃが放出されて血流へ戻ることを妨げると考えられる。それ故に、インビボでのＦｃの半減期を増加させるであろうＦｃ変異は、より高いｐＨでのＦｃの放出を、可能なままにしつつ、より低いｐＨでＦｃＲｎ結合を理想的に増加させることになる。アミノ酸であるヒスチジンは、６．０〜７．４のｐＨ範囲において、その荷電状態を変化させる。したがって、ヒスチジン残基を、Ｆｃ／ＦｃＲｎ複合体において、重要な位置で見出すことは驚くべきことではない。
【０１７１】
より低い等電点を有する可変領域を有する抗体が、より長期の血清半減期も有し得ることが最近提案されている（Ｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  ＰＥＤＳ．２３（５）：３８５−３９２、参照により全体に組み込まれる）。しかしながら、この機構の理解は、依然として不十分である。その上、可変領域は、抗体毎に異なる。低減されたｐＩ、および延長された半減期を有する定常領域変異体は、本明細書に説明されるように、抗体の薬物動態特性の改善に対する、よりモジュール型の手法を提供するであろう。
【０１７２】
追加の機能性のための追加のＦｃ変異体
ｐＩアミノ酸変異体に加えて、これらに限定されないが、１つ以上のＦｃγＲ受容体への結合を変化させること、ＦｃＲｎ受容体への変化された結合などを含む様々な理由から行われ得る多くの有用なＦｃアミノ酸修飾がある。
【０１７３】
したがって、本発明のタンパク質は、アミノ酸改変を含むことができ、アミノ酸改変には、ｐＩ変異体および立体変異体を含めて、本明細書に概要が記載されるヘテロ二量体化変異体が含まれる。変異体の各セットは、任意の特定のヘテロ二量体タンパク質を独立かつ任意選択で含む、または当該タンパク質から除外することができる。
【０１７４】
ＦｃγＲ変異体
したがって、１つ以上のＦｃγＲ受容体への結合を変化させるために作られ得る多くの有用なＦｃ置換がある。増加された結合、ならびに減少された結合をもたらす置換が有用であり得る。例えば、Ｆｃ  ＲＩＩＩａへの増加された結合は、概して、増加されたＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害；細胞媒介反応であって、ＦｃγＲを発現する非特異性細胞傷害性細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後に標的細胞の溶解を引き起こす反応である）をもたらすことが既知である。同様に、ＦｃγＲＩＩｂ（抑制性受容体）への減少された結合は、いくつかの状況において、有益であり得る。本発明において用途を見出すアミノ酸置換には、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０（特に図４１）、ＵＳＳＮ１１／１７４，２８７、ＵＳＳＮ１１／３９６，４９５、ＵＳＳＮ１１／５３８，４０６に列挙されるものを含み、これらのすべては、それらの全体において参照により本明細書に明確に組み込まれ、特に、そこで開示される変異体について組み込まれる。用途を見出す特定の変異体としては、これら限定されないが、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖ、および２９９Ｔが挙げられる。
【０１７５】
さらに、ＦｃＲｎ受容体への増加された結合、および増加された血清半減期において用途を見出す追加のＦｃ置換があり、これらに限定されないが、４３４Ｓ、４３４Ａ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６Ｉ、またはＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ、および２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌを含む、ＵＳＳＮ１２／３４１，７６９に具体的に開示されるとおりであって、その全体において参照により本明細書によって組み込まれる。
【０１７６】
消去変異体
同様に、機能性変異体の別のカテゴリーは、「Ｆｃγ消去変異体」または「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯもしくはＫＯ）」変異体である。これらの実施形態において、いくつかの治療応用には、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）のうちの１つ以上またはすべてへのＦｃドメインの通常の結合を低減または除去して、作用の追加の機構を回避することが望ましい。すなわち、例えば、多くの実施形態において、特にＣＤ３に一価に結合する二重特異性抗体の使用において、Ｆｃドメインのうちの１つがＦｃγ受容体消去変異体を含むＡＤＣＣ活性を除去または著しく低減するためにＦｃγＲＩＩＩａ結合を消去することが概して望ましい。これらの消去変異体は、図１４に示され、それぞれは独立してかつ任意に、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択される消去変異体を利用する好ましい態様と共に含まれ得るか、または除外され得る。本明細書において参照される消去変異体が、概して、ＦｃＲｎ結合ではなくＦｃγＲ結合を消去することに留意されるべきである。
【０１７７】
当業者に既知であるように、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインは、Ｆｃγ受容体への最も高い結合を有し、それによって、消去変異体が、ヘテロ二量体抗体の骨格内の定常ドメイン（またはＦｃドメイン）がＩｇＧ１であるときに、使用され得る。代替的には、またはＩｇｇ１骨格内の消去変異体に加えて、グリコシル化位置２９７（概して、ＡまたはＳに対する）における変異は、例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を著しく消去し得る。ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４は、Ｆｃγ受容体への天然に低減された結合を有し得、それによって、それらの骨格は、消去変異体と共に、またはなしで使用され得る。
【０１７８】
ヘテロ二量体およびＦｃ変異体の組み合わせ
当業者によって理解されるように、すべての列挙されたヘテロ二量体化変異体（歪曲および／またはｐＩ変異体を含む）は、それらがその「鎖性」または「単量体区分（ｍｏｎｏｍｅｒ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）」を保持する限り、任意にかつ独立して、任意の方法で組み合わされ得る。さらに、これらの変異体はすべて、ヘテロ二量体化形式のいずれかに組み合わされ得る。
【０１７９】
ｐＩ変異体の場合において、特定の用途を見出す実施形態は、図に示されているが、精製の容易にするために２つの単量体間のｐＩ差異を変化させる基礎的な規則に従って、他の組み合わせが生成され得る。
【０１８０】
さらに、ヘテロ二量体化変異体、歪曲、およびｐＩのうちのいずれかはまた、概して本明細書に概説されるとおり、Ｆｃ消去変異体、Ｆｃ変異体、ＦｃＲｎ変異体と独立してかつ任意に組み合わされ得る。
【０１８１】
Ｈ．本発明の有用な形式
当業者によって理解され、以下により完全に論じられるように、本発明のヘテロ二量体融合タンパク質は、概して図１に示されるように、幅広い様々な構造をとることができる。いくつかの図は、分子の一方の「アーム」上に１種類の特異性、および他方の「アーム」上に異なる特異性がある「シングルエンド化（ｓｉｎｇｌｅ  ｅｎｄｅｄ）」構造を示す。他の図は、分子の「上部」に少なくとも１種類の特異性、および分子の「下部」に１つ以上の異なる特異性がある「二重エンド化（ｄｕａｌ  ｅｎｄｅｄ）」構造を示す。したがって、本発明は、異なる第１の抗原および第２の抗原を共結合する新規の免疫グロブリン組成物を対象とする。
【０１８２】
当業者によって理解されるように、本発明のヘテロ二量体形式は、異なる結合価を有し得、かつ二重特異性であり得る。すなわち、本発明のヘテロ二量体抗体は、一方の標的腫瘍抗原（例えば、ＣＤ３）が１つの結合ドメインによって結合されており、他方の標的腫瘍抗原（例えば、ＳＳＴＲ２）が第２の結合ドメインによって結合されている二価および二重特異性であり得る。ヘテロ二量体抗体はまた、第１の抗原が２つの結合ドメインによって結合されており、第２の抗原が第２の結合ドメインによって結合されている三価および二重特異性であり得る。本明細書に概説されるように、ＣＤ３が標的抗原のうちの１つであるとき、ＣＤ３が一価のみに結合され、潜在的副作用を低減することが好ましい。
【０１８３】
本発明は、抗ＳＳＴＲ２結合ドメインと組み合わせて、抗ＣＤ３抗原結合ドメインを利用する。当業者によって理解されるように、いずれの図（特に図２〜７、および図１８参照）にも示される抗ＣＤ３  ＣＤＲ、抗ＣＤ３可変軽および可変重ドメイン、Ｆａｂ、およびｓｃＦｖのうちの任意の集合は、使用され得る。同様に、抗ＳＳＴＲ２抗原結合ドメインのうちのいずれも使用され得、ＣＤＲ、可変軽ドメインおよび可変重ドメインにかかわらず、図（例えば、図８および１０）のうちのいずれかに示されるように、ＦａｂおよびｓｃＦｖが、任意の組み合わせで、任意にかつ独立して使用され得る。
【０１８４】
栓抜き
本発明において特定の用途を見出す１つのヘテロ二量体骨格は、「三重Ｆ」または図１Ａに示される「栓抜き」骨格形式である。この実施形態において、抗体の一方の重鎖は、一本鎖Ｆｖ（以下に定義される「ｓｃＦｖ」）を含み、他方の重鎖は、「定型的な（ｒｅｇｕｌａｒ）」ＦＡｂ形式であって、可変重鎖および軽鎖を含む。この構造は、栓抜きに対する粗い視覚的類似性に起因して、時に、本明細書において「三重Ｆ」形式または「栓抜き」形式と称される。２つの鎖は、以下により完全に説明されるように、ヘテロ二量体抗体の形成を促進する定常領域（例えば、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、および／またはヒンジ領域）において、アミノ酸変異体の使用によって一緒にまとめられる。
【０１８５】
本発明の「三重Ｆ」形式には、いくつかの明確に異なる利点が存在する。当該技術分野で既知のとおり、２つのｓｃＦｖ構築物に依存する抗体アナログは、安定性および凝集の問題を有することが多いが、それは、本発明において、「定型的な」重鎖および軽鎖の対の追加によって、軽減され得る。さらに、２つの重鎖および２つの軽鎖に依存する形式とは対照的に、重鎖および軽鎖が、不正確に対になる（例えば、重１が、軽２と対になるなど）という問題は存在しない。
【０１８６】
本明細書に概説される多くの実施形態は、概して、ｓｃＦｖがドメインリンカー（本明細書に概要が記載されるとおり、非荷電または荷電であり得る）を通常通して第１のＦｃドメインのＮ末端に共有結合されるｓｃＦｖリンカー（多くの実施例において荷電）を使用して共有結合される可変重および可変軽ドメインを含むｓｃＦｖを含む第１の単量体を含む栓抜き形式に依存する。栓抜き形式の第２の単量体は重鎖であり、組成物は、軽鎖をさらに含む。
【０１８７】
概して、多くの好ましい実施形態において、ｓｃＦｖは、ＣＤ３に結合するドメインであり、Ｆａｂは、ＳＳＴＲ２結合ドメインを形成する。
【０１８８】
さらに、本発明のＦｃドメインは、概して、歪曲変異体（例えば、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、およびＫ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑからなる群から選択されている特に有用な歪曲変異体を有する、図３および８に示されるようなアミノ酸置換のセット）、任意に消去変異体（図５に示されるものを含む）、任意に荷電ｓｃＦｖリンカー（図７に示されるものを含む）を含み、重鎖は、ｐＩ変異体（図４に示されるものを含む）を含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、栓抜き形式は、歪曲変異体、ｐＩ変異体、および消去変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）荷電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態において好ましい図７の＋Ｈ配列を有する）を含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および本明細書で概説されるようにＣＤ３に結合するＦｖ；ｂ）歪曲変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、可変軽ドメインを有する可変重ドメインを含む第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）；ならびにｃ）軽鎖を含む栓抜き形式を含む。
【０１９０】
ＣＤ３に結合するｓｃＦｖの例示的な可変重ドメインおよび可変軽ドメインは、図１２および１３に含まれる。ＳＳＴＲ２に結合するＦｖの例示的な可変重ドメインおよび可変軽ドメインは、図１１に含まれる。例示的な実施形態において、ＳＳＴＲ２結合ドメインは、Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０  ＳＳＴＲ２結合ドメインであり、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖは、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７  ＣＤ３結合ドメインの可変重ドメインおよび可変軽ドメインを含む。他の特に有用なＳＳＴＲ２およびＣＤ３配列の組み合わせは、図１６に開示されている。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、栓抜き形式は、歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）荷電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態において好ましい図７の＋Ｈ配列を有する）を含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）、歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および本明細書で概説されるようにＣＤ３に結合するＦｖ；ｂ）歪曲変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、可変軽ドメインを有する可変重ドメインを含む第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）；ならびにｃ）軽鎖を含む栓抜き形式を含む。
【０１９２】
ＣＤ３に結合するｓｃＦｖの例示的な可変重ドメインおよび可変軽ドメインは、図１２および１３に含まれる。ＳＳＴＲ２に結合するＦｖの例示的な可変重ドメインおよび可変軽ドメインは、図１１に含まれる。例示的な実施形態において、ＳＳＴＲ２結合ドメインは、Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０  ＳＳＴＲ２結合ドメインの可変重ドメインおよび可変軽ドメインを含み、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖは、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７  ＣＤ３結合ドメインの可変重ドメインおよび可変軽ドメインを含む。他の特に有用なＳＳＴＲ２およびＣＤ３配列の組み合わせは、図１６に開示されている。
【０１９３】
図９は、本発明において使用され得るＦｖ配列を欠いているいくつかの例示的な栓抜き「骨格」配列を示す。いくつかの実施形態において、本明細書に示されるｖｈおよびｖｌ配列のうちのいずれか（ＳＳＴＲ２を対象とするものを含む、図および配列表に示されるすべてのｖｈおよびｖｌ配列を含む）は、図および配列表に示される抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ配列のうちのいずれかを使用して、「Ｆａｂ部位」として図９の栓抜き骨格形式に追加され得る。
【０１９４】
図９の栓抜き骨格１（任意に、４２８Ｌ／４３４Ｓ変異体を含む）について、これらの実施形態において特定の用途を見出すＣＤ結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、ＣＤ３結合ドメイン抗ＣＤ３  Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、および抗ＣＤ３  Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、ならびに図９に示される骨格のｓｃＦｖ側として結合される図１２および１３に示されるものを含む。
【０１９５】
図９の栓抜き骨格１（任意に、４２８Ｌ／４３４Ｓ変異体を含む）について、これらの実施形態において特定の使用のうちのＳＳＴＲ２結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１＿Ｌ１．１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０２、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０２、および抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０を含む。
【０１９６】
図９の栓抜き骨格１（任意に、４２８Ｌ／４３４Ｓ変異体を含む）と共に使用するのに特に有用なＳＳＴＲ２およびＣＤ３配列の組み合わせは、図１６に開示されている。
【０１９７】
１つの例示的な実施形態において、栓抜き抗体は、図９の栓抜き「骨格」１を含み、ＳＳＴＲ２結合ドメインは、Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０  ＳＳＴＲ２結合ドメインの可変重ドメインおよび可変軽ドメインを含み、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖは、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７  ＣＤ３結合ドメインの可変重ドメインおよび可変軽ドメインを含む。
【０１９８】
ｍＡｂ−Ｆｖ
本発明において特定の用途を見出す１つのヘテロ二量体骨格は、図１Ｈに示されるｍＡｂ−Ｆｖ形式である。この実施形態において、形式は、一方の単量体に対する「余分な」可変重ドメインのＣ末端結合、および他方の単量体に対する「余分な」可変軽ドメインのＣ末端結合の使用に依存し、したがって、第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、ＳＳＴＲ２に結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ３に結合する。
【０１９９】
この実施形態において、第１の単量体は、ドメインリンカー（ｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意のリンカー］−ｖｌ２）を使用して、第１のＦｃドメインのＣ末端に共有結合されている第１の可変軽ドメインを有する、Ｆｃドメインを含む第１の可変重ドメインおよび第１の定常重ドメインを含む第１の重鎖を含む。第２の単量体は、第２のＦｃドメインを含む第２の定常重ドメインの第２の可変重ドメイン、およびドメインリンカー（ｖｊ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意のリンカー］−ｖｈ２を使用して、第２のＦｃドメインのＣ末端に共有結合されている第３の可変重ドメインを含む。２つのＣ末端結合された可変ドメインは、ＣＤ３に結合するＦｖを作る（二価のＣＤ３結合を有することはあまり好ましくないため）。この実施形態は、ＳＳＴＲ２に結合する２つの同一Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用する。本明細書の実施形態の多くについて、これらの構築物は、本明細書において望ましくかつ説明される歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、追加のＦｃ変異体などを含む。
【０２００】
本発明は、ＣＤ結合ドメイン配列が、図１２および１３、ならびに配列表に示されるとおりであるｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。本発明は、ＳＳＴＲ２結合ドメイン配列が、図１１および配列表に示されるとおりであるｍＡｂ−Ｆｖ形式を提供する。ｍＡｂ−Ｆｖ形式と共に使用するための特に有用なＳＳＴＲ２およびＣＤ３配列の組み合わせは、図１６に開示されている。
【０２０１】
さらに、ｍＡｂ−Ｆｖ形式のＦｃドメインは、概して、歪曲変異体（例えば、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択されている特に有用な歪曲変異体を有する、図３および８に示されるようなアミノ酸置換のセット）、任意に消去変異体（図５に示されるものを含む）、任意に荷電ｓｃＦｖリンカー（図７に示されるものを含む）を含み、重鎖は、ｐＩ変異体（図４に示されるものを含む）を含む。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、ｍＡｂ−Ｆｖ形式は、歪曲変異体、ｐＩ変異体、および消去変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、およびＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、軽鎖の第１の可変軽ドメインと、第２の可変重ドメインとを有する第１の可変重ドメインを含む第１の単量体；ｂ）歪曲変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、第１の可変軽ドメインと、ＣＤ３に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第２の可変重ドメインを一緒に有する第２の可変軽鎖を有する第１の可変重ドメインを含む第２の単量体；ならびにｃ）第１の軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖を含むｍＡｂ−Ｆｖ形式を含む。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、ｍＡｂ−Ｆｖ形式は、歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、およびＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、軽鎖の第１の可変軽ドメインと、第２の可変重ドメインとを有する第１の可変重ドメインを含む第１の単量体；ｂ）歪曲変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、第１の可変軽ドメインと、ＣＤ３に結合するＦｖ（ＡＢＤ）を形成する第１の単量体の第２の可変重ドメインを一緒に有する第２の可変軽鎖とを有する第１の可変重ドメインを含む第２の単量体；ならびにｃ）第１の可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖を含むｍＡｂ−Ｆｖ形式を含む。
【０２０４】
図１０のｍＡｂ−Ｆｖ骨格１に類似するｍＡｂ−Ｆｖ配列（任意に、Ｍ４２８Ｌ／４３４Ｓ変異体を含む）について、これらの実施形態において特定の用途を見出すＣＤ３結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＣＤ３  Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、および抗ＣＤ３  Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、ならびに図１２および１３に示されるものを含む。
【０２０５】
図１０のｍＡｂ−Ｆｖ骨格１に類似するｍＡｂ−Ｆｖ配列（任意に、Ｍ４２８Ｌ／４３４Ｓ変異体を含む）について、これらの実施形態において特定の使用のうちのＳＳＴＲ２結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１＿Ｌ１．１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０２、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０２、および抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０、ならびに図１１と１５および配列番号６８〜６５９に列挙されるものを含む。
【０２０６】
図１０のｍＡｂ−Ｆｖ骨格１に類似するｍＡｂ−Ｆｖ配列（任意に、４２８Ｌ／４３４Ｓ変異体を含む）と共に使用するために特に有用なＳＳＴＲ２およびＣＤ３配列の組み合わせは、図１６に開示されている。
【０２０７】
ｍＡｂ−ｓｃＦｖ
本発明において特定の用途を見出す１つのヘテロ二量体骨格は、図１に示されるｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式である。この実施形態では、形式は、単量体のうちの１つに対するｓｃＦｖのＣ末端付加の使用に依存し、したがって、第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、ＳＳＴＲ２に結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ３に結合する。したがって、第１の単量体は、いずれかの方向付け（ｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意のリンカー］−ｖｈ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ２またはｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意のリンカー］−ｖｌ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ２）においてｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、およびｓｃＦｖ可変重ドメインを含むＣ末端共有結合されたｓｃＦｖを有する、第１の重鎖（可変重ドメインおよび定常ドメインを含む）を含む。この実施形態は、ＳＳＴＲ２に結合する２つの同一Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、追加のＦｃ変異体などが含まれる。
【０２０８】
本発明は、ＣＤ結合ドメイン配列が、図１２および１３、ならびに配列表に示されるｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式を提供する。本発明は、ＳＳＴＲ２結合ドメイン配列が、図１１および配列表に示されるｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式を提供する。ｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式と共に使用するための特に有用なＳＳＴＲ２およびＣＤ３配列の組み合わせは、図１６に開示されている。
【０２０９】
さらに、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式のＦｃドメインは、概して、歪曲変異体（例えば、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択されている特に有用な歪曲変異体を有する、図３および８に示されるようなアミノ酸置換のセット）、任意に消去変異体（図５に示されるものを含む）、任意に荷電ｓｃＦｖリンカー（図７に示されるものを含む）を含み、重鎖は、ｐＩ変異体（図４に示されるものを含む）を含む。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式は、歪曲変異体、ｐＩ変異体、および消去変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、共通の軽鎖の可変軽ドメインと、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインとを有する可変重ドメインを含む第１の単量体；ｂ）歪曲変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、共通の軽鎖の可変軽ドメインを有する可変重ドメインを含む第２の単量体；ならびにｃ）可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む共通の軽鎖を含むｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式を含む。
【０２１１】
いくつかの実施形態において、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式は、歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、共通の軽鎖の第１の可変軽ドメインと、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインとを有する可変重ドメインを含む第１の単量体；ｂ）歪曲変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、共通の軽鎖の可変軽ドメインを有する可変重ドメインを含む第２の単量体；ならびにｃ）可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む共通の軽鎖を含むｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式を含む。
【０２１２】
図１０のｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１（任意に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）において（任意に、４２８Ｌ／４３４Ｓ変異体を含む、これらの実施形態において特定の用途を見出すＣＤ３結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＣＤ３  Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、および抗ＣＤ３  Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、ならびに図１２および１３に示されるものを含む。
【０２１３】
図１０のｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１（任意に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ含む）において（任意に、４２８Ｌ／４３４Ｓ変異体を含む）、これらの実施形態において特定の使用のうちのＳＳＴＲ２結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１＿Ｌ１．１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０２、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０２、および抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０、ならびに図１１と１５および配列番号６８〜６５９に列挙されるものを含む。
【０２１４】
中心ｓｃＦｖ
本発明において特定の用途を見出す１つのヘテロ二量体骨格は、図１に示される中心ｓｃＦｖ形式である。この実施形態において、形式は、挿入ｓｃＦｖドメインの使用に依存し、したがって、第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、ＳＳＴＲ２に結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ３に結合する。ｓｃＦｖドメインは、単量体のうちの１つのＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入され、したがって、第３の抗原結合ドメインを提供する。
【０２１５】
この実施形態において、一方の単量体は、ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、およびｓｃＦｖ可変重ドメインを含むｓｃＦｖを有する、第１の可変重ドメイン、ＣＨ１ドメイン（および任意のヒンジ）、およびＦｃドメインを含む第１の重鎖を含む。ｓｃＦｖは、任意のドメインリンカー（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意のリンカー］−ｖｈ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ２−［ヒンジを含む任意のリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３、またはｓｃＦｖへの逆の方向付けｖｈ１−ＣＨ１−［任意のリンカー］−ｖｌ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ２−［ヒンジを含む任意のリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）を使用して、重定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と、第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有結合されている。他方の単量体は、標準Ｆａｂ側である。この実施形態は、ＳＳＴＲ２に結合する２つの同一Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物は、本明細書において望ましくかつ説明される歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、追加のＦｃ変異体などを含む。
【０２１６】
本発明は、ＣＤ３結合ドメイン配列が、図１２および１３、ならびに配列表に示されるとおりである中心ｓｃＦｖ形式を提供する。本発明は、抗ＳＳＴＲ２配列が、図１１および配列表に示されるとおりである中心ｓｃＦｖ形式を提供する。中心ｓｃＦｖ形式と共に使用するための特に有用なＳＳＴＲ２およびＣＤ３配列の組み合わせは、図１６に開示されている。
【０２１７】
さらに、中心ｓｃＦｖ形式のＦｃドメインは、歪曲変異体（例えば、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択されている特に有用な歪曲変異体を有する、図３および８に示されるようなアミノ酸置換のセット）、任意に消去変異体（図５に示されるものを含む）、任意に荷電ｓｃＦｖリンカー（図７に示されるものを含む）を含み、重鎖は、ｐＩ変異体（図４に示されるものを含む）を含む。
【０２１８】
いくつかの実施形態において、中心ｓｃＦｖ形式は、歪曲変異体、ｐＩ変異体、および消去変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、軽鎖の可変軽ドメインと、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインとを有する可変重ドメインを含む第１の単量体；ｂ）歪曲変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、軽鎖の可変軽ドメインを有する可変重ドメインを含む第２の単量体；ならびにｃ）可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖を含む中心ｓｃＦｖ形式を含む。
【０２１９】
いくつかの実施形態において、中心ｓｃＦｖ形式は、歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、軽鎖の第１の可変軽ドメインと、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインとを有する可変重ドメインを含む第１の単量体；ｂ）歪曲変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、軽鎖の可変軽ドメインを有する可変重ドメインを含む第２の単量体；ならびにｃ）可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖を含む中心ｓｃＦｖ形式を含む。
【０２２０】
図９の栓抜き骨格１に類似かつそれを利用する中心ｓｃＦｖ配列について（任意に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）、これらの実施形態において特定の用途を見出すＣＤ３結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＣＤ３  Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、および抗ＣＤ３  Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、ならびに図１２および１３に示されるものを含む。
【０２２１】
図９の栓抜き骨格１に類似かつそれを利用する中心ｓｃＦｖ配列について（任意に、Ｍ４２８Ｌ／４３４Ｓ変異体を含む）、これらの実施形態において特定の使用のうちのＳＳＴＲ２結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１＿Ｌ１．１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０２、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０２、および抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０、ならびに図１１と１５および配列番号６８〜６５９に列挙されるものを含む。
【０２２２】
中心Ｆｖ
本発明において特定の用途を見出す１つのヘテロ二量体骨格は、図１Ｇに示される中心Ｆｖ形式である。この実施形態において、形式は、挿入Ｆｖドメイン（すなわち、中心Ｆｖドメイン）の使用に依存し、したがって、第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、ＳＳＴＲ２に結合し、「中心Ｆｖ」ドメインは、ＣＤ３に結合する。ｓｃＦｖドメインは、単量体のＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入され、したがって、第３の抗原結合ドメインを提供し、各単量体は、ｓｃＦｖの構成要素を含む（例えば、一方の単量体は、可変重ドメインを含み、他方は、可変軽ドメインを含む）。
【０２２３】
この実施形態において、一方の単量体は、第１の可変重ドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＦｃドメイン、ならびに追加の可変軽ドメインを含む第１の重鎖を含む。軽ドメインは、ドメインリンカー（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意のリンカー］−ｖｌ２−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を使用して、重定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と、第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有結合されている。この実施形態において、他方の単量体は、第１の可変重ドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＦｃドメイン、ならびに追加の可変重ドメイン（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意のリンカー］−ｖｈ２−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）を含む第１の重鎖を含む。軽ドメインは、ドメインリンカーを使用して重定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と、第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有結合されている。
【０２２４】
この実施形態は、ＳＳＴＲ２に結合する２つの同一Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物は、本明細書において望ましくかつ説明される歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、追加のＦｃ変異体などを含む。
【０２２５】
本発明は、ＣＤ３結合ドメイン配列が、図１２および１３、ならびに配列表に示されるとおりである中心Ｆｖ形式を提供する。本発明は、ＳＳＴＲ２結合ドメイン配列が、図１１および配列表に示されるとおりである中心Ｆｖ形式を提供する。中心Ｆｖ形式と共に使用するための特に有用なＳＳＴＲ２およびＣＤ３配列の組み合わせは、図１６に開示されている。
【０２２６】
中心Ｆｖ形式について、これらの実施形態において特定の用途を見出すＣＤ３結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＣＤ３  Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、および抗ＣＤ３  Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、ならびに図１２および１３に示されるものを含む。
【０２２７】
中心Ｆｖ形式について、これらの実施形態において特定の使用のうちのＳＳＴＲ２結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１＿Ｌ１．１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０２、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０２、および抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０、ならびに図１１と１５および配列番号６８〜６５９に列挙されるものを含む。
【０２２８】
ワンアーム化中心ｓｃＦｖ
本発明において特定の用途を見出す１つのヘテロ二量体骨格は、図１に示されるワンアーム化中心ｓｃＦｖ形式である。この実施形態では、一方の単量体は、Ｆｃドメインのみを含むが、他方の単量体は、挿入ｓｃＦｖドメインを使用し、したがって、第２の抗原結合ドメインを形成する。この形式において、Ｆａｂ部分が、ＳＳＴＲ２に結合し、ｓｃＦｖが、ＣＤ３に結合するか、またはその逆のいずれかである。ｓｃＦｖドメインは、単量体のうちの１つのＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入される。
【０２２９】
この実施形態において、一方の単量体は、ｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、およびｓｃＦｖ可変重ドメインを含むｓｃＦｖを有する、第１の可変重ドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＦｃドメインを含む第１の重鎖を含む。ｓｃＦｖは、ドメインリンカーを使用して重定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と、第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有結合されている。第２の単量体は、Ｆｃドメインを含む。この実施形態は、Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖をさらに利用する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物は、本明細書において望ましくかつ説明される歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、追加のＦｃ変異体などを含む。
【０２３０】
本発明は、ＣＤ３結合ドメイン配列が、図１２および１３、ならびに配列表に示されるとおりである中心Ｆｖ形式を提供する。本発明は、ＳＳＴＲ２結合ドメイン配列が、図１１および配列表に示されるとおりである中心Ｆｖ形式を提供する。中心Ｆｖ形式と共に使用するための特に有用なＳＳＴＲ２およびＣＤ３配列の組み合わせは、図１６に開示されている。
【０２３１】
さらに、ワンアーム化中心ｓｃＦｖ形式のＦｃドメインは、概して、歪曲変異体（例えば、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択されている特に有用な歪曲変異体を有する、図３および８に示されるようなアミノ酸置換のセット）、任意に消去変異体（図５に示されるものを含む）、任意に荷電ｓｃＦｖリンカー（図７に示されるものを含む）を含み、重鎖は、ｐＩ変異体（図４に示されるものを含む）を含む。
【０２３２】
いくつかの実施形態において、ワンアーム化中心ｓｃＦｖ形式は、歪曲変異体、ｐＩ変異体、および消去変異体を含む。したがって、ワンアーム化中心ｓｃＦｖ形式のいくつかの実施形態は、ａ）歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、軽鎖の可変軽ドメインと、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインとを有する可変重ドメインを含む第１の単量体；ｂ）歪曲変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ有するＦｃドメインを含む第２の単量体；ならびにｃ）可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖を含む。
【０２３３】
いくつかの実施形態において、ワンアーム化中心ｓｃＦｖ形式は、歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、ワンアーム化中心ｓｃＦｖ形式のいくつかの実施形態は、ａ）歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、軽鎖の可変軽ドメインと、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインとを有する、可変重ドメインを含む第１の単量体；ｂ）歪曲変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、およびＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを有するＦｃドメインを含む第２の単量体；ならびにｃ）可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖を含む。
【０２３４】
ワンアーム化中心ｓｃＦｖ形式について、特定の用途を見出すＣＤ３結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＣＤ３  Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、および抗ＣＤ３  Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、ならびに図１２および１３に示されるものを含む。
【０２３５】
ワンアーム化中心ｓｃＦｖ形式について、特定の使用のうちのＳＳＴＲ２結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１＿Ｌ１．１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０２、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０２、および抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０、ならびに図１１と１５および配列番号６８〜６５９に列挙されるものを含む。
【０２３６】
ワンアーム化ｓｃＦｖ−ｍＡｂ
本発明において特定の用途を見出す１つのヘテロ二量体骨格は、図１Ｄに示されるワンアーム化ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式である。この実施形態において、一方の単量体は、Ｆｃドメインのみを含むが、他方の単量体は、リンカー：ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−［任意のリンカー］−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３または（逆の方向付けにおいて）ｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−［任意のドメインリンカー］−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３の使用を通常通して、重鎖のＮ末端で結合されたｓｃＦｖドメインを使用する。この形式において、Ｆａｂ部分はそれぞれ、ＳＳＴＲ２に結合し、ｓｃＦｖは、ＣＤ３に結合する。この実施形態は、Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖をさらに利用する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物は、本明細書において望ましくかつ説明される歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、追加のＦｃ変異体などを含む。
【０２３７】
本発明は、ＣＤ３結合ドメイン配列が、図１２および１３、ならびに配列表に示されるとおりであるワンアーム化ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式を提供する。本発明は、ＳＳＴＲ２結合ドメイン配列が、図１１および配列表に示されるとおりであるワンアーム化ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式を提供する。ワンアーム化ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式と共に使用するための特に有用なＳＳＴＲ２およびＣＤ３配列の組み合わせは、図１６に開示されている。
【０２３８】
さらに、ワンアーム化ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式のＦｃドメインは、概して、歪曲変異体（例えば、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択されている特に有用な歪曲変異体を有する、図３および８に示されるようなアミノ酸置換のセット）、任意に消去変異体（図５に示されるものを含む）、任意に荷電ｓｃＦｖリンカー（図７に示されるものを含む）を含み、重鎖は、ｐＩ変異体（図４に示されるものを含む）を含む。
【０２３９】
いくつかの実施形態において、ワンアーム化ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式は、歪曲変異体、ｐＩ変異体、および消去変異体を含む。したがって、ワンアーム化ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式のいくつかの実施形態は、ａ）歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、軽鎖の可変軽ドメインと、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインとを有する可変重ドメインを含む第１の単量体；ｂ）歪曲変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ有するＦｃドメインを含む第２の単量体；ならびにｃ）可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖を含む。
【０２４０】
いくつかの実施形態において、ワンアーム化ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式は、歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、ワンアーム化ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式のいくつかの実施形態は、ａ）歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、軽鎖の可変軽ドメインと、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインとを有する、可変重ドメインを含む第１の単量体；ｂ）歪曲変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、およびＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを有するＦｃドメインを含む第２の単量体；ならびにｃ）可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む軽鎖を含む。
【０２４１】
ワンアーム化ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式について、特定の用途を見出すＣＤ３結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＣＤ３  Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、および抗ＣＤ３  Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、ならびに図１２および１３に示されるものを含む。
【０２４２】
ワンアーム化ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式について、特定の使用のうちのＳＳＴＲ２結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１＿Ｌ１．１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０２、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０２、および抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０、ならびに図１１と１５および配列番号６８〜６５９に列挙されるものを含む。
【０２４３】
ｓｃＦｖ−ｍＡｂ
本発明において特定の用途を見出す１つのヘテロ二量体骨格は、図１Ｅに示されるｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式である。この実施形態において、形式は、単量体のうちの１つに対するｓｃＦｖのＮ末端結合の使用に依存し、したがって、第３の抗原結合ドメインを形成し、２つの単量体のＦａｂ部分は、ＳＳＴＲ２に結合し、「余分な」ｓｃＦｖドメインは、ＣＤ３に結合する。
【０２４４】
この実施形態において、第１の単量体は、いずれかの方向付け（（ｖｈ１−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ１−［任意のドメインリンカー］−ｖｈ２−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）または（逆の方向付けにおいてｓｃＦｖを有する）（（ｖｌ１−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ１−［任意のドメインリンカー］−ｖｈ２−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３））においてｓｃＦｖ可変軽ドメイン、ｓｃＦｖリンカー、およびｓｃＦｖ可変重ドメインを含むＮ末端共有結合されたｓｃＦｖを有する、第１の重鎖（可変重ドメインおよび定常ドメインを含む）を含む。この実施形態は、ＳＳＴＲ２に結合する２つの同一Ｆａｂを形成するために重鎖に関連する、可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む共通の軽鎖をさらに利用する。本明細書の実施形態の多くについては、これらの構築物には、本明細書で所望され説明される歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、追加のＦｃ変異体などが含まれる。
【０２４５】
本発明は、ＣＤ３結合ドメイン配列が、図１２および１３、ならびに配列表に示されるとおりであるｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式を提供する。本発明は、ＳＳＴＲ２結合ドメイン配列が、図１１および配列表に示されるとおりであるｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式を提供する。ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式と共に使用するための特に有用なＳＳＴＲ２およびＣＤ３配列の組み合わせは、図１６に開示されている。
【０２４６】
さらに、ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式のＦｃドメインは、概して、歪曲変異体（例えば、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択されている特に有用な歪曲変異体を有する、図３および８に示されるようなアミノ酸置換のセット）、任意に消去変異体（図５に示されるものを含む）、任意に荷電ｓｃＦｖリンカー（図７に示されるものを含む）を含み、重鎖は、ｐＩ変異体（図４に示されるものを含む）を含む。
【０２４７】
いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式は、歪曲変異体、ｐＩ変異体、および消去変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、共通の軽鎖の可変軽ドメインと、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインとを有する可変重ドメインを含む第１の単量体；ｂ）歪曲変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、共通の軽鎖の可変軽ドメインを有する可変重ドメインを含む第２の単量体；ならびにｃ）可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む共通の軽鎖を含むｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式を含む。
【０２４８】
いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式は、歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、共通の軽鎖の可変軽ドメインと、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖドメインとを有する可変重ドメインを含む第１の単量体；ｂ）歪曲変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および本明細書に概説されるようにＳＳＴＲ２に結合するＦｖを作る、共通の軽鎖の可変軽ドメインを有する可変重ドメインを含む第２の単量体；およびｃ）可変軽ドメインおよび定常軽ドメインを含む共通の軽鎖を含むｓｃＦｖ−ｍＡｂ形式を含む。
【０２４９】
図１０のｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式骨格１（任意に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む）について、特定の用途を見出すＣＤ３結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＣＤ３  Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、および抗ＣＤ３  Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、ならびに図１２および１３に示されるものを含む。
【０２５０】
図１０のｍＡｂ−ｓｃＦｖ形式骨格１（任意に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ含む）について、特定の使用のうちのＳＳＴＲ２結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１＿Ｌ１．１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０２、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０２、および抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０、ならびに図１１と１５および配列番号６８〜６５９に列挙されるものを含む。
【０２５１】
二重ｓｃＦｖ形式
本発明はまた、当該技術分野で既知であり、図１Ｂに示されるような二重ｓｃＦｖ形式を提供する。この実施形態において、ＳＳＴＲ２ｘＣＤ３ヘテロ二量体二重特異性抗体は、２つのｓｃＦｖ−Ｆｃ単量体から構成されている（両方が、（ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−［任意のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）形式もしくは（ｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−［任意のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）形式のいずれかであるか、または一方の単量体が一方の方向付けにあり、他方の単量体がもう一方の方向付けにある。
【０２５２】
本発明は、ＣＤ３結合ドメイン配列が、図１２および１３、ならびに配列表に示されるとおりである二重ｓｃＦｖ形式を提供する。本発明は、ＳＳＴＲ２結合ドメイン配列が、図１１および配列表に示される二重ｓｃＦｖ形式を提供する。二重ｓｃＦｖ形式と共に使用するための特に有用なＳＳＴＲ２およびＣＤ３配列の組み合わせは、図１６に開示されている。
【０２５３】
いくつかの実施形態において、二重ｓｃＦｖ形式は、歪曲変異体、ｐＩ変異体、および消去変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、およびＣＤ３またはＳＳＴＲ２のいずれかに結合する第１のｓｃＦｖを含む第１の単量体；ならびにｂ）歪曲変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、およびＣＤ３またはＳＳＴＲ２のいずれかに結合する第２のｓｃＦｖを含む第２の単量体を含む二重ｓｃＦｖ形式を含む。
【０２５４】
いくつかの実施形態において、二重ｓｃＦｖ形式は、歪曲変異体、ｐＩ変異体、消去変異体、およびＦｃＲｎ変異体を含む。いくつかの実施形態において、二重ｓｃＦｖ形式は、歪曲変異体、ｐＩ変異体、および消去変異体を含む。したがって、いくつかの実施形態は、ａ）歪曲変異体Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、およびＣＤ３またはＳＳＴＲ２のいずれかに結合する第１のｓｃＦｖを含む第１の単量体；ならびにｂ）歪曲変異体Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異体Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、消去変異体Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異体Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、およびＣＤ３またはＳＳＴＲ２のいずれかに結合する第２のｓｃＦｖを含む第２の単量体を含む二重ｓｃＦｖ形式を含む。
【０２５５】
二重ｓｃＦｖ形式について、特定の用途を見出すＣＤ３結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＣＤ３  Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、および抗ＣＤ３  Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、ならびに図１２および１３に示されるものを含む。
【０２５６】
二重ｓｃＦｖ形式について、特定の使用のうちのＳＳＴＲ２結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１＿Ｌ１．１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０２、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０２、および抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０、ならびに図１１と１５および配列番号６８〜６５９に列挙されるものを含む。
【０２５７】
単一特異性、モノクローナル抗体
当業者によって理解されるように、本明細書に概説される新規のＦｖ配列はまた、単一特異性抗体（例えば、「伝統的なモノクローナル抗体」）または非ヘテロ二量体二重特異性形式の両方において使用され得る。したがって、本発明は、概してＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４定常領域を有する、６つのＣＤＲならびに／またはｖｈおよびｖｌ配列を含むモノクローナル（単一特異性）抗体を提供し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐアミノ酸置換を含むＩｇＧ４定常領域を含む）は、いくつかの実施形態において特定の用途を見出す。すなわち、「Ｈ＿Ｌ」名称を有する本明細書における任意の配列は、ヒトＩｇＧ１抗体の定常領域に連結され得る。
【０２５８】
Ｉ．標的抗原に対する抗原結合ドメイン
本発明の二重特異性抗体は、概して図１に示されるように、２価の、二重特異性形式または３価の、二重特異性形式のいずれかにおいて、２つの異なる標的チェックポイント抗原（「標的対」）に結合する２つの異なる抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）を有する。概して、これらの二重特異性抗体が、各対について「抗ＳＳＴＲ２Ｘ抗ＣＤ３」、または概して単純化してもしくは簡略化のために（およびしたがって交換可能に）「ＳＳＴＲ２ＸＣＤ３」などとして名付けられることに留意されたい。本明細書において特に指定のない限り、名称における抗原の一覧の順序は、構造を授与せず、すなわち、ＳＳＴＲ２ＸＣＤ３栓抜き抗体は、ＳＳＴＲ２またはＣＤ３に結合するｓｃＦｖを有し得るが、いくつかの場合において、順序は示されるように構造を指定する。
【０２５９】
本明細書により完全に概説されるように、ＡＢＤのこれらの組み合わせは、様々な形式内にあり得、以下に概説されるように、概して、一方のＡＢＤがＦａｂ形式にあり、他方がｓｃＦｖ形式にある組み合わせである。本明細書に論じられ、図１に示されるように、いくつかの形式は、単一のＦａｂおよび単一のｓｃＦｖ（図１Ａ、Ｃ、およびＤ）を使用し、いくつかの形式は、２つのＦａｂおよび単一のｓｃＦｖ（図１Ｅ、Ｆ、およびＩ）を使用する。
【０２６０】
抗原結合ドメイン
本明細書に論じられるように、主題のヘテロ二量体抗体は、２つの抗原結合ドメインを（ＡＢＤ）を含み、それら各々は、ＳＳＴＲ２またはＣＤ３に結合する。本明細書に概説されるように、これらのヘテロ二量体抗体は、二重特異性および２価（各抗原は、例えば、図１Ａに示される形式において、単一のＡＢＤによって結合される）、または二重特異性および３価（一方の抗原は、例えば、図１Ｆに示されるように、単一のＡＢＤによって結合され、他方は、２つのＡＢＤによって結合される）であり得る。
【０２６１】
さらに、概して、ＡＢＤのうちの一方は、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌまたはｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈのＮ末端からＣ末端への方向付けにおいて、本明細書に概説されるようにｓｃＦｖを含む。他方のＡＢＤのうちの一方または両方は、形式に従って、概して、１つのタンパク質鎖（概して、重鎖の構成要素として）上のｖｈドメインと、別のタンパク質鎖（概して、軽鎖の構成要素として）上のｖｌとを含むＦａｂである。
【０２６２】
本発明は、以下に概説されるとおり、多くの異なるチェックポイントタンパク質に結合する多くのＡＢＤを提供する。当業者に理解されるように、６つのＣＤＲまたはｖｈおよびｖｌドメインの任意のセットは、ｓｃＦｖ形式またはＦａｂ形式にあり得、それは、次いで、重定常ドメインが変異体（ＣＨ１ドメインおよびＦｃドメイン内に含む）を含む重定常ドメインおよび軽定常ドメインに追加される。配列表中に含まれるｓｃＦｖ配列は、特定の荷電リンカーを利用するが、本明細書に概説されるように、非荷電または他の荷電リンカーが使用され得、図７に示されるものを含む。
【０２６３】
さらに、上記に論じられるように、ＣＤＲの識別のために配列表中で使用される番号付けは、Ｋａｂａｔであるが、しかしながら、異なる番号付けが使用され得、それは、表１に示されるようにＣＤＲのアミノ酸配列を変更するであろう。
【０２６４】
本明細書に列挙されるすべての可変重ドメインおよび可変軽ドメインについて、さらなる変異体が作製され得る。本明細書に概説されるように、いくつかの実施形態において、６つのＣＤＲのセットは、０、１、２、３、４、または５つのアミノ酸修飾（特定の用途を見出すアミノ酸置換を有する）、ならびにフレームワーク（ＣＤＲを除く）が、米国特許第７，６５７，３８０号の図１に列挙されるものから選択されたヒト生殖細胞系配列に対して少なくとも約８０、８５、または９０％の同一性を保持する限り、可変重ドメインおよび可変軽ドメインのフレームワーク領域において変化を有し得、当該参考文献のその図および説明文は、本明細書にその全体において参照により組み込まれる。したがって、例えば、本明細書に説明されるように同一ＣＤＲは、フレームワーク領域が、米国特許第７，６５７，３８０号の図１に列挙されるものから選択されたヒト生殖細胞系配列に対して少なくとも約８０、８５、または９０％の同一性を保持する限り、ヒト生殖細胞系配列とは異なるフレームワーク配列と組み合わされ得る。代替的に、ＣＤＲは、アミノ酸修飾（例えば、ＣＤＲのセットにおいて１、２、３、４、または５つのアミノ酸修飾（すなわち、ＣＤＲは、６つのＣＤＲのセットにおける変化の総数が６つ未満のアミノ酸修飾である限り修飾され得、ＣＤＲの任意の組み合わせが変化され、例えば、ｖｌＣＤＲ１に１つの変化、ｖｈＣＤＲ２に２つの変化があり得、ｖｈＣＤＲ３には存在しないなど））を有し得、ならびにフレームワーク領域が、米国特許第７，６５７，３８０号の図１に列挙されるものから選択されたヒト生殖細胞系配列に対して少なくとも約８０、８５、または９０％の同一性を保持する限り、フレームワーク領域の変化を有する。
【０２６５】
ＳＳＴＲ２抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態において、ＡＢＤのうちの１つは、ＳＳＴＲ２に結合する。６つのＣＤＲならびに／またはｖｈおよびｖｌドメイン、ならびにｓｃＦｖ配列の好適なセットは、図１１および配列表に示される。特定の使用のうちのＳＳＴＲ２結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１＿Ｌ１．１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１０２、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１０７＿Ｌ１．１１０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．３０、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．６７、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０８、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１１、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１１４、抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０２、および抗ＳＳＴＲ２  Ｈ１．１２５＿Ｌ１．１０、ならびに図１１と１５および配列番号６８〜６５９に列挙されるものを含む。
【０２６６】
当業者によって理解されるように、好適なＳＳＴＲ２結合ドメインは、配列表および図に示されるように６つのＣＤＲのセットを含み得、それらは下線が引かれてあるか、または、異なる番号付けスキームが、本明細書に説明され、表１に示されるように使用される場合、図１１に示されるもののｖｈおよびｖｌ配列内で他のアラインメントを使用して識別されるＣＤＲとしてのいずれかである。好適なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖとしてまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるように、ｖｈおよびｖｌ配列全体を含み得る。ＦｖをＳＳＴＲ２に含む本明細書の実施形態の多くにおいて、ＳＳＴＲ２に結合するのは、Ｆａｂ単量体である。
【０２６７】
ＡＢＤをＳＳＴＲ２に形成する図および配列表に開示される親ＣＤＲセットに加えて、本発明は、変異体ＣＤＲセットを提供する。一実施形態において、６つのＣＤＲのセットは、ＳＳＴＲ２  ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えば、オクテット（Ｏｃｔｅｔ）アッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つによって測定される場合、親ＣＤＲからの１、２、３、４、または５つのアミノ酸変化を有し得、ＢＬＩでは多くの実施形態において特定の用途を見出す。
【０２６８】
ＡＢＤをＳＳＴＲ２に形成する、本明細書に開示される親可変重および可変軽ドメインに加えて、本発明は、変異体ｖｈおよびｖｌドメインを提供する。一実施形態において、変異体ｖｈおよびｖｌドメインそれぞれは、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えば、オクテット（Ｏｃｔｅｔ）アッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つによって測定される場合、親ｖｈおよびｖｌドメインからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸変化を有し得、ＢＬＩでは多くの実施形態において特定の用途を見出す。別の実施形態において、変異体ｖｈおよびｖｌは、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えば、オクテット（Ｏｃｔｅｔ）アッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つによって測定される場合、それぞれの親ｖｈまたはｖｌと少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であり、ＢＬＩでは多くの実施形態において特定の用途を見出す。
【０２６９】
特定の好ましい実施形態は、「Ｆａｂ」として、図９の栓抜き形式骨格のうちのいずれかに含まれる、Ｈ１．１４３＿Ｌ１．３０  ＳＳＴＲ２抗原結合ドメインを含む。
【０２７０】
ＣＤ３抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態において、ＡＢＤのうちの１つは、ＣＤ３に結合する。６つのＣＤＲならびに／またはｖｈおよびｖｌドメイン、ならびにｓｃＦｖ配列の好適なセットは、図１２および１３、ならびに配列表に示される。特定の使用のうちのＣＤ３結合ドメイン配列は、これらに限定されないが、抗ＣＤ３  Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３２＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．８９＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．９０＿Ｌ１．４７、抗ＣＤ３  Ｈ１．３３＿Ｌ１．４７、および抗ＣＤ３  Ｈ１．３１＿Ｌ１．４７、ならびに図１２および１３に示されるものを含む。
【０２７１】
当業者によって理解されるように、好適なＣＤ３結合ドメインは、配列表および図に示されるように６つのＣＤＲのセットを含み得、それらは下線が引かれてあるか、または図１１に示されるもののｖｈおよびｖｌ配列内で他のアラインメントを使用して識別されるＣＤＲとして、異なる番号付けスキームが、本明細書に説明され、表１に示されるように使用される場合においてのいずれかである。好適なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖとしてまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるように、ｖｈおよびｖｌ配列全体を含み得る。ＦｖをＣＤ３に含む本明細書の実施形態の多くにおいて、ＣＤ３に結合するのは、Ｆａｂ単量体である。
【０２７２】
ＡＢＤをＣＤ３に形成する図および配列表に開示される親ＣＤＲセットに加えて、本発明は、変異体ＣＤＲセットを提供する。一実施形態において、６つのＣＤＲのセットは、ＣＤ３  ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えば、オクテット（Ｏｃｔｅｔ）アッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つによって測定される場合、親ＣＤＲからの１、２、３、４、または５つのアミノ酸変化を有し得、ＢＬＩでは多くの実施形態において特定の用途を見出す。
【０２７３】
ＡＢＤをＣＤ３に形成する、本明細書に開示される親可変重および可変軽ドメインに加えて、本発明は、変異体ｖｈおよびｖｌドメインを提供する。一実施形態において、変異体ｖｈおよびｖｌドメインそれぞれは、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えば、オクテット（Ｏｃｔｅｔ）アッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つによって測定される場合、親ｖｈおよびｖｌドメインからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸変化を有し得、ＢＬＩでは多くの実施形態において特定の用途を見出す。別の実施形態において、変異体ｖｈおよびｖｌは、ＡＢＤが依然として標的抗原に結合することができる限り、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えば、オクテット（Ｏｃｔｅｔ）アッセイ）アッセイのうちの少なくとも１つによって測定される場合、それぞれの親ｖｈまたはｖｌと少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であり、ＢＬＩでは多くの実施形態において特定の用途を見出す。
【０２７４】
特定の好ましい実施形態は、「Ｆａｂ」として、図９の栓抜き形式骨格のうちのいずれかに含まれる、Ｈ１．３０＿Ｌ１．４７  ＣＤ３抗原結合ドメインを含む。
【０２７５】
Ｊ．有用な実施形態
一実施形態において、本発明において用途を見出す歪曲変異体およびｐＩ変異体の特定の組み合わせは、一方の単量体が、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４８１Ｄを含み、他方が、正に荷電されたｓｃＦｖリンカーを含む（形式がｓｃＦｖドメインを含むとき）、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ（任意に、結合ジスルフィド、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃを含む）。当業者に理解されるように、「ノブインホール」変異体は、ｐＩを変化させず、したがって、いずれかの単量体上で使用され得る。
【０２７６】
Ｋ．本発明の核酸
本発明は、これらに限定されないが、抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体およびＳＳＴＲ２単一特異性抗体を含む、本明細書に提供される抗ＳＳＴＲ２抗体をコードする核酸組成物をさらに含む。
【０２７７】
当業者によって理解されるように、核酸組成物は、ヘテロ二量体タンパク質の形式および骨格に依存するであろう。したがって、例えば、形式が、三重Ｆ形式などのために３つのアミノ酸配列を必要とするとき（例えば、ＦｃドメインおよびｓｃＦｖを含む第１のアミノ酸単量体、重鎖および軽鎖を含む第２のアミノ酸単量体）、３つの核酸配列は、発現のための１つ以上の発現ベクターに組み込まれ得る。同様に、いくつかの形式（例えば、図１に開示されるものなどの二重ｓｃＦｖ形式）２つの核酸のみが必要とされ、さらに、それらは、１つまたは２つの発現ベクターに加えられ得る。
【０２７８】
当該技術分野で既知であるように、本発明の構成要素をコードする核酸は、本発明のヘテロ二量体抗体を産生するために使用される宿主細胞に依存して、当該技術分野で既知のような発現ベクターに組み込まれ得る。概して、核酸は、任意の数の制御要素（プロモーター、複製の起源、選択可能なマーカー、リボソーム結合部位、誘導物質など）に操作可能に連結される。発現ベクターは、外部染色体または組み込みベクターであり得る。
【０２７９】
本発明の核酸および／または発現ベクターは、次いで、哺乳類、細菌、酵母菌、昆虫、および／または真菌細胞を含む当該技術分野で周知のような任意の数の異なる型の宿主細胞に転換され、哺乳細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）は、多くの実施形態において用途を見出す。
【０２８０】
いくつかの実施形態において、形式に応じて適用可能であるように、各単量体をコードする核酸および軽鎖をコードする任意の核酸は、概して、異なるまたは同一のプロモーター制御下で、単一の発現ベクター内でそれぞれ含まれる。本発明の特定使用の実施形態では、これらの２つまたは３つの核酸のそれぞれは、異なる発現ベクター上に含有される。本明細書におよび参照により本明細書によって組み込まれる第６２／０２５，９３１号に示されるように、異なるベクターの比は、ヘテロ二量体形成を誘起するために使用され得る。すなわち、驚くべきことに、タンパク質が、１：１：２の比で第１の単量体：第２の単量体：軽鎖（ヘテロ二量体抗体を含む３つのポリペプチドを有する本明細書の実施形態の多くの場合において）を含むが、これらは、最良の結果をもたらす比ではない。
【０２８１】
本発明のヘテロ二量体抗体は、当該技術分野において周知である発現ベクター（複数可）を含む宿主細胞を培養することによって作製される。一旦産生されると、イオン交換クロマトグラフィーステップを含む伝統的な抗体精製ステップが行われる。本明細書に論じられるように、２つの単量体のｐＩを少なくとも０．５異なるようにすることで、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点感受性の他の方法によっての分離が可能にし得る。すなわち、各単量体の等電点（ｐＩ）を変化させるｐＩ置換の包含は、そのため、各単量体が異なるｐＩを有し、ヘテロ二量体もまた異なるｐＩを有するように、したがって、「三重Ｆ」ヘテロ二量体の等電精製を容易にする（例えば、アニオン性交換カラム、カチオン性交換カラム）。これらの置換はまた、任意の混入二重ｓｃＦｖ−Ｆｃホモ二量体およびｍＡｂホモ二量体の、精製後の判定および監視においても役に立つ（例えば、ＩＥＦゲル、ｃＩＥＦ、および分析ＩＥＸカラム）。
【０２８２】
Ｌ．ヘテロ二量体チェックポイント抗体の生物学的および生化学的機能性
概して、本発明の二重特異性ＳＳＴＲ２ｘＣＤ３抗体は、癌を有する患者に等投与され、本明細書に説明されるような多くの方法で、有効性が評価される。したがって、癌負荷、腫瘍のサイズ、転移の存在または範囲の評価など、有効性の標準アッセイが行われうる一方で、癌免疫治療法もまた、免疫状態の評価に基づいて評価され得る。これは、インビトロおよびインビボアッセイの両方を含む多くの方法で行われ得る。例えば、腫瘍量、腫瘍サイズ、侵襲性、リンパ節転移、転移などの「旧式」の測定法に沿った免疫状態（例えば、ｉｐｉ治療後のＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋  Ｔ細胞の存在）における変化の評価は、行われ得る。したがって、以下のうちのいずれかまたはすべては評価され得る：ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化もしくは増殖、ＣＤ８＋Ｔ（ＣＴＬ）細胞活性化もしくは増殖、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介細胞傷害性活性、ならびに／またはＣＴＬ媒介細胞の欠乏、ＮＫ細胞活性およびＮＫ媒介細胞の欠乏におけるチェックポイントの抑制性効果。
【０２８３】
いくつかの実施形態において、治療の評価は、例えば、ＣＦＳＥ希釈法、免疫エフェクター細胞のＫｉ６７細胞内染色、および３Ｈ−チミジン取り込み法を使用して、免疫細胞増殖を評価することによって行われる。
【０２８４】
いくつかの実施形態において、治療の評価は、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＰＤ１、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０のうちの１つ以上、およびＣＤ１０７Ａの表面発現によって測定される細胞脱顆粒を含む、遺伝子発現の増加または活性か関連マーカーのタンパク質レベルの増加を評価することによって行われる。
【０２８５】
概して、遺伝子発現アッセイは、当該技術分野において既知のとおりに行われる。
【０２８６】
概して、遺伝子発現測定はまた、当該技術分野において既知のとおりに同様に行われる。
【０２８７】
いくつかの実施形態において、治療の評価は、酵素活性（プロテアーゼ活性を含む）、細胞膜透過性、細胞接着、ＡＴＰ産生、共酵素生成、およびヌクレオチド取り込み活性などの多数の細胞パラメータを推定することを介して、標的細胞生存率検出により測定される細胞傷害性活性を評価することによって行われる。これらのアッセイの特定の例には、これらに限定されないが、トリパンブルーまたはＰＩ染色、５１Ｃｒまたは３５Ｓ放出方法、ＬＤＨ活性、ＭＴＴおよび／またはＷＳＴアッセイ、カルセインＡＭアッセイ、発光に基づくアッセイなどが挙げられる。
【０２８８】
いくつかの実施形態において、治療の評価は、周知の技術を使用して、これらに限定されないが、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１０、ＩＬ１３を含むサイトカインを使用して培養上清中に細胞内にいずれかを測定する、サイトカイン産生によって測定されるＴ細胞活性を評価することによって行われる。
【０２８９】
したがって、治療の評価は、以下、（ｉ）免疫反応の増加、（ｉｉ）αβおよび／またはγδ  Ｔ細胞の活性化の増加、（ｉｉｉ）細胞傷害性Ｔ細胞活性の増加、（ｉｖ）ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞活性の増加、（ｖ）αβおよび／またはγδ  Ｔ細胞抑制の緩和、（ｖｉ）炎症誘発性サイトカイン分泌の増加、（ｖｉｉ）ＩＬ−２分泌の増加、（ｖｉｉｉ）インターフェロン
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産生の増加、（ｉｘ）Ｔｈ１反応の増加、（ｘ）Ｔｈ２反応の減少、（ｘｉ）制御Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓのうちの少なくとも１つの細胞数および／または活性の減少または除去のうちの１つ以上を評価するアッセイを使用して行われ得る。
【０２９０】
有効性を測定するためのアッセイ
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、当該技術分野で既知のような混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを使用して評価される。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０２９１】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、異なる要因のリン酸化もしくは脱リン酸化による、または他の翻訳修飾後に測定することによる例のために測定されるように、免疫反応の増加または減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０２９２】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例としてサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例としてＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などの活性化マーカーの発現における変化によって測定されるようにαβおよび／またはγδＴ細胞の活性化の増加もしくは減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０２９３】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例として癌細胞などの標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例としてＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などの活性化マーカーの発現における変化によって測定されるように、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化の増加または減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０２９４】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例として癌細胞などの標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または例としてＣＤ１０７ａなどの活性化マーカーの発現における変化によって測定されるように、ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞活性の増加もしくは減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０２９５】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例としてサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例としてＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などの活性化マーカーの発現における変化によって測定されるように、αβおよび／またはγδＴ細胞抑制の増加もしくは減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０２９６】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、またはルミネックスによって、または多重ビーズに基づく方法によって、または細胞内染色およびＦＡＣＳ分析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔなどによって測定されるように、炎症誘発性サイトカイン分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０２９７】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、またはルミネックスによって、または多重ビーズに基づく方法によって、または細胞内染色およびＦＡＣＳ分析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔなどによって測定されるように、ＩＬ−２分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０２９８】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、またはルミネックスによって、または多重ビーズに基づく方法、または細胞内染色およびＦＡＣＳ分析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔなどによって測定されるように、インターフェロンγ産生の増加または減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０２９９】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例としてサイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現における変化によって測定されるように、Ｔｈ１反応の増加もしくは減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０３００】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例としてサイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現における変化によって測定されるように、Ｔｈ２反応の増加もしくは減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０３０１】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定されるように、抑制Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のうちの少なくとも１つの細胞数および／もしくは活性の増加または減少を測定する。反応の減少は、免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説される、増加と同じである。
【０３０２】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定されるように、Ｍ２マクロファージ細胞数の増加または減少を測定する。反応の減少は、免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説される、増加と同じである。
【０３０３】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例としてサイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現における変化によって測定されるように、Ｍ２マクロファージ腫瘍形成促進活性の増加または減少を測定する。反応の減少は、免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説される、増加と同じである。
【０３０４】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定されるように、Ｎ２好中球増加の増加または減少を測定する。反応の減少は、免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説される、増加と同じである。
【０３０５】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例としてサイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現における変化によって測定されるように、Ｎ２好中球腫瘍形成促進活性の増加または減少を測定する。反応の減少は、免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説される、増加と同じである。
【０３０６】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例としてサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例としてＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などの活性化マーカーの発現における変化によって測定されるように、Ｔ細胞活性化の抑制の増加もしくは減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０３０７】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例として癌細胞などの標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例としてＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などの活性化マーカーの発現における変化によって測定されるように、ＣＴＬ活性化の抑制の増加または減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０３０８】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例として活性化マーカーの発現における変化によって測定されるように、αβおよび／もしくはγδＴ細胞の疲弊の増加または減少を測定する。反応の減少は、免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説される、増加と同じである。
【０３０９】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例としてサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例としてＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などの活性化マーカーの発現における変化によって測定されるように、αβおよび／またはγδＴ細胞反応の増加もしくは減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０３１０】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例としてサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例としてＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７などの活性化マーカーの発現における変化によって測定されるように、抗原特異性メモリー反応の刺激の増加もしくは減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０３１１】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例として、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルセインＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、または例としてＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色などのフローサイトメトリーに基づくアッセイによって測定されるように、癌細胞の細胞死もしくは溶解の増加または減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０３１２】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例として、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルセインＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、または例としてＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色などのフローサイトメトリーに基づくアッセイによって測定されるように、癌細胞への細胞傷害性もしくは細胞増殖抑止効果の刺激の増加または減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０３１３】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例として、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルセインＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、または例としてＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色などのフローサイトメトリーに基づくアッセイによって測定されるように、癌細胞の直接殺傷の増加または減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０３１４】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例としてサイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現における変化によって測定されるように、Ｔｈ１７活性の増加または減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０３１５】
一実施形態において、シグナル経路アッセイは、例として、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルセインＡＭなどの細胞傷害性アッセイによって、または例としてＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色などのフローサイトメトリーに基づくアッセイによって測定されるように、保体依存性細胞傷害性および／もしくは抗体依存性細胞媒介細胞傷害性の導入の増加または減少を測定する。活性の増加は、免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加は、以下に概説される。
【０３１６】
一実施形態において、Ｔ細胞活性化は、例として、例えば癌細胞などの標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例としてＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１などの活性化マーカーの発現における変化によって測定される。Ｔ細胞について、増殖の増加、活性化の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＰＤ１）、細胞傷害性（標的細胞を殺傷する能力）、およびサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ）は、癌細胞の高められた殺傷と一貫する免疫調節を示す。
【０３１７】
一実施形態において、ＮＫ細胞活性化は、例えば、例として癌細胞などの標的細胞の直接殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または例としてＣＤ１０７ａなどの活性化マーカーの発現における変化によって測定される。ＮＫ細胞について、増殖の増加、細胞傷害性（標的細胞を殺傷する能力、ならびにＣＤ１０７ａ、グランザイム、およびパーフォリン発現を増加させる）、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮγおよびＴＮＦ）、および細胞表面受容体発現（例えば、ＣＤ２５）は、癌細胞の高められた殺傷と一貫する免疫調節を示す。
【０３１８】
一実施形態において、γδＴ細胞活性化は、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現における変化によって測定される。
【０３１９】
一実施形態において、Ｔｈ１細胞活性化は、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現における変化によって測定される。
【０３２０】
活性または反応（または、上記に概説されるとおり適切であるような、減少）の適切な増加は、参照試料または制御試料のいずれか、例えば、本発明の抗体を含まない試験試料のシグナルにわたって、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８〜９９％パーセントの増加である。同様に、少なくとも１、２、３、４、または５倍の増加は、参照もしくは制御試料と比較した場合に、有効性を示す。
【０３２１】
Ｍ．治療
一旦作製されると、本発明の組成物は、多くの応用において用途を見出す。ＳＳＴＲ２は、神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ、例えば、肺癌、胃腸癌、膵臓癌、下垂体癌、髄様癌、前立腺、膵臓肺カルチノイド、骨肉腫、気管支、胸腺）ならびに非ＮＥＴ（乳癌、肺癌、大腸癌、卵巣癌、子宮頸癌など）に高発現される。
【０３２２】
したがって、本発明のヘテロ二量体組成物は、そのようなＳＳＴＲ２陽性癌の治療において用途を見出す。
【０３２３】
生体内投与用の抗体組成物
本発明に従って使用される抗体の製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、任意の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］）と共に望ましい程度の純度を有する抗体を混合することによって保管のために調製される。許容可能な担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投与量および濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤、保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール、メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、もしくはイムノグロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸、単糖、二糖、およびブドウ糖、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の糖質、ＥＤＴＡなどのキレート物質、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属複合体（例えば、亜鉛−タンパク質複合体）、ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０３２４】
投与様式
本発明の抗体および化学療法剤は、ボーラスとしてまたはある期間にわたる連続注入によって静脈内投与などの既知の方法に対象に従って投与される。
【０３２５】
治療様式
本発明の方法において、治療は、疾患または状態に関する有益な治療反応を提供するために使用される。「有益な治療反応」は、疾患もしくは状態における改善、および／または疾患もしくは状態と関連する症状における改善を意図する。例えば、有益な治療応答は、病気における下記の改善の１つまたは複数を指すことになる。（１）新生細胞数の減少、（２）新生細胞死の増加、（３）新生細胞の生存阻害、（５）腫瘍成長の阻害（例えば、ある程度の鈍化、好ましくは停止）、（６）患者生存率の増加、および（７）疾患または状態と関連する１つ以上の症状のいくらかの緩和。
【０３２６】
任意の所与の疾患または状態における有益な治療反応は、疾患または状態に特異的な標準化された反応の基準によって決定され得る。腫瘍反応は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線画像法、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャン画像法、内視鏡検査、ならびに骨髄穿刺（ＢＭＡ）および循環における腫瘍細胞の計数を含む腫瘍生検試料採取などの選別技術を使用して、腫瘍形態学（すなわち、全体的な腫瘍量、腫瘍サイズなど）における変化で評価され得る。
【０３２７】
これらの有益な治療反応に加えて、治療が進行中の対象は、疾患に関連する症状において改善の有利な効果を経験し得る。
【０３２８】
本発明による治療は、使用する薬剤の「治療有効量」を含む。「治療有効量」は、必要な投与量および期間で、望ましい治療結果を達成するために有効である量を指す。
【０３２９】
治療有効量は、個体の疾患の状況、年齢、性別、および体重などの要因、ならびに個体における、薬剤の望ましい反応を引き出す能力に応じて変化し得る。治療有効量は、抗体または抗体部分の治療上有利な効果が、任意の毒性作用または有害作用を上回る量でもある。
【０３３０】
腫瘍治療に向けた「治療有効量」は、病気の進行を安定化させる能力によって測定されてもよい。癌を抑制する化合物の能力を、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価してよい。
【０３３１】
代替的には、組成物のこの特性は、熟練実践者に既知であるインビトロアッセイによって、化合物が、細胞の成長を抑制する能力、またはアポトーシスを誘導する能力を試験することによって評価され得る。治療用化合物の治療有効量は、対象の腫瘍サイズを減少させ得、またはそうでなければ、対象の症状を回復させ得る。当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および特定の組成物、または選択される投与経路などの要因に基づいてそのような量を決定することができるであろう。
【０３３２】
投与レジメンは、最適な望ましい反応を提供するように調整される（例えば、治療反応）。例えば、単回ボーラス投与をしてもよく、いくつかに分割された用量を、長時間にわたって投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示されるように、比例的に用量を減少または増加してもよい。非経口組成物は、投与の容易化、および投与量の均一性のために投与量単位形態において製剤化され得る。本明細書で使用されるような投与単位形態は、物理的には、治療される対象のために単位用量として適した離散単位を指し、各単位は、必要とされる治療担体に関連して、望ましい治療効果を生じるように計算された活性化合物の所定の量を含む。
【０３３３】
本発明の投与量単位形態の規格は、（ａ）活性化合物の特有の特性、および達成される特定の治療効果、ならびに（ｂ）そのような活性化合物を、個体の感受性の治療に化合する技術分野での固有の制限、によって決定されると共に、直接的にそれらに応じて、決定される。
【０３３４】
本発明において使用される二重特異性抗体の効率的な投与量および投与レジメンは、治療される疾患または状態に依存し、当業者によって決定され得る。
【０３３５】
本発明において使用される二重特異性抗体の治療有効量の例示的な、非限定的範囲は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。
【０３３６】
すべての引用文献は、それらの全体において参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【０３３７】
例示目的のために、本発明の特定の実施形態は、上記に説明されているが、詳細の数多くの変化が、添付の特許請求の範囲において説明される本発明から逸脱することなく行われ得ることが、当業者によって理解されるであろう。
【実施例】
【０３３８】
実施例は、本発明を示すために以下に提供される。これらの実施例は、本発明を任意の特定の応用、または実施理論に限定しようと意図するものではない。本発明において論じられるすべての定常領域の位置について、番号付けは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ。参照により全体が組み込まれる）にあるように、ＥＵインデックスに従う。抗体技術分野の当業者であれば、この慣習が、イムノグロブリン配列の特定領域における、非連続的な番号付けからなっており、イムノグロブリンファミリーにおける保存位置への標準化された参照が可能になっていることを理解されるであろう。したがって、ＥＵインデックスによって定義される、任意の所与の免疫グロブリンの位置は、その連続配列に必ずしも対応していないことになる。
【０３３９】
一般的かつ特定の科学技術は、米国公開第２０１５／０３０７６２９号、第２０１４／０２８８２７５号、およびＷＯ２０１４／１４５８０６に概説され、これらはすべて、それらの全体において参照により明確に組み込まれ、特に、本明細書に概説される技術に関して組み込まれる。
【０３４０】
実施例１：抗ＳＳＴＲ２Ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体の世代
１Ａ：抗ＳＳＴＲ２Ｆａｂアームの世代
抗ＳＳＴＲ２抗体の親可変領域を、本発明の抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体の組成物の使用のために操作した。マウスＶＨおよびＶＬ領域のヒト化を、２０１０年２月２日に発行された米国特許第７，６５７，３８０号に以前に説明されているように行った。アミノ酸置換を、改善された特性を有する変異体を識別することを試みるために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃｅｄａｒ  Ｃｒｅｅｋ，Ｔｘ）変異原性を介して行った。
【０３４１】
１Ｂ：二重特異性抗体産生
抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性形式の風刺画概略図は、図に示される。例示的な抗体を、上記に説明されるように、かつ抗ＣＤ３  ｓｃＦｖアームとして操作された抗ＳＳＴＲ２抗体に由来する抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３Ｆａｂアームによって精製した。例示的な抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３栓抜き抗体ＸＥＮＰ０１８０８７およびＸＥＮＰ０１８９０７は、それぞれ図１４および１５に示される。二重特異性発現へ必要とされる３つ鎖をコードするＤＮＡを、遺伝子合成（Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，Ｗａｓｈ）および発現ベクターｐＴＴ５技術への標準サブクローニングのいずれかによって、またはＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ変異原性によって生成した。ＤＮＡを、発現のためのＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトし、得られたタンパク質を、タンパク質Ａ親和性（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して上清から精製した。陽イオン交換クロマトグラフィー精製を、５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０の洗浄／平衡化緩衝剤および５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０＋  １Ｍ  ＮａＣｌ直線勾配の溶出緩衝剤と共にＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った。
【０３４２】
１Ｃ：抗ＳＳＴＲ２抗体二重特異的結合。
抗ＳＳＴＲ２の細胞表面結合および例示的な抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体を、ヒトＳＳＴＲ２トランスフェクトＣＨＯ細胞を使用して評価した。細胞を、氷上で４５分間、示される試験物と共にインキュベートし、遠心分離した。細胞を、フィコエリトリン（ＰＥ）標識二次抗体（２μｇ／ｍＬ、ヤギ抗ヒトＩｇＧ）を含む染色緩衝剤で再懸濁し、次いで、氷上で４５分間インキュベートした。細胞を、２回遠心分離し、次いで、染色緩衝剤で再懸濁した。結合を、フローサイトメトリーによって測定した（図１７Ａ〜Ｐ）。
【０３４３】
実施例２：例示的な抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体の特徴付け
２Ａ：例示的な抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体のインビボでの特徴付け
例示的な抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３  Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異性を、ＳＳＴＲ２トランスフェクトＣＨＯ細胞（図１８Ａ〜Ｄ）およびＳＳＴＲ２陽性ＴＴ細胞（ヒト甲状腺髄様癌細胞株、図１９Ａ〜Ｃ）上で再指示されたＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）についてインビトロで特徴付けした。ＲＴＣＣを、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）レベルを測定することによって決定した。これらの図に示されるように、抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３  Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ二重特異性は、対照と比較した場合に、ＳＳＴＲ２トランスフェクトＣＨＯ細胞、ならびにヒト癌細胞株においてＲＴＣＣの高い百分率を示した。
【０３４４】
２Ｂ：例示的な抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体のインビボでの特徴付け
第１の研究において、カニクイザル（ｎ＝３）に、０．０３ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ１８０８７または１ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ１８０８８のいずれかの２つ（０で、３週間）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与量を投与した。ＣＤ６９発現（図２０Ａ）、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞分布（図２０Ｂ）によって示されるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞活性化へのこれらの抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体の効果を、その後に評価した。
【０３４５】
第２の研究において、カニクイザル（ｎ＝３）に、抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体：０．０６ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ１８０８７、０．１ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ１８９０７、０．５ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ１８９０７、または２ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ１８９０７の単回静脈内（ｉ．ｖ．）投与量を投与した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞活性化（ＣＤ６９上方調節、図２１Ａ）、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞分布（細胞数、図２１Ｂ）へのこれらの抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体の効果を評価した。さらに、ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）を行い（図２１Ｃおよび２１Ｄ）、試験された対象の能力を評価し、ブドウ糖を分解した。ＧＴＴについて、血液試料を、８つの異なる時間点：前投与、デキストロ−ス投与後の５、１０、２０、３０、４０、６０、および９０分で収集した。これらの研究において示されるように、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋を、投与後のその後の回復および正常化を伴う各治療の間に血液から素早く再分布した（図２１Ｂ）。Ｔ細胞を、投与する際に直ちに活性化し（図２１Ａ）、次いで、Ｔ細胞再分布と一致して、低下させた。
【０３４６】
第３の研究において、カニクイザル（ｎ＝３）に、０．００１または０．０１ｍｇ／ｋｇのＸＥＮＰ１８０８７のいずれかの２つ（０で、１週間）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与量を投与した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞活性化（図２２Ａ〜Ｂ）、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞分布（図２２Ｃ〜Ｄ）へのこれらの抗ＳＳＴＲ２ｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体の効果を、ＣＤ６９発現、Ｔ細胞活性化のマーカーを使用して、その後に評価した。これらのサルから、血清ＩＬ−６およびＴＮＦレベルを評価した（図２２Ｅ〜Ｆ）。これらの研究において示されるように、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋を、投与後のその後の回復および正常化を伴う各治療の間に血液から素早く再分布した。Ｔ細胞を、用量依存的様式において各投与の際に直ちに活性化し、次いで、Ｔ細胞再分布と一致して、その後に低下させた。ＩＬ−６およびＴＮＦサイトカイン放出は、Ｔ細胞活性化と相関があった。
【０３４７】
実施例３：ＸｍＡｂ１８０８７の評価
３Ａ：ヒトおよびカニクイザルＳＳＴＲ２へのＸｍＡｂ１８０８７の特異的結合
ＸｍＡｂ１８０８７の細胞表面結合および制御抗ＲＳＶｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）を、ヒトＳＳＴＲ２トランスフェクトＣＨＯ細胞およびカニクイザルＳＳＴＲ２トランスフェクトＣＨＯ細胞を使用して評価した。細胞表面結合をまた、対照として親ＣＨＯ細胞を使用して評価した。結合を、実施例１Ｃに概して説明されるとおり、フィコエリトリン（ＰＥ）標識二次抗体を使用してフローサイトメトリーによって測定した。
【０３４８】
制御抗ＲＳＶＸｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体ＸＥＮＰ１３２４５が、ヒトＳＳＴＲ２またはカニクイザルＳＳＴＲ２トランスフェクトＣＨＯ細胞のいずれかに結合しなかった一方で、ｍＡｂ１８０８７は、細胞表面ヒトＳＳＴＲ２（図２３Ａ）に結合しただけでなく、カニクイザルＳＳＴＲ２（図２３Ｂ）と交差反応性でもあった。データは、ＸｍＡｂ１８０８７が、ＸｍＡｂ１８０８７の特異性を示す非トランスフェクト親ＣＨＯ細胞（図２３Ｃ）に結合しなかったことをさらに示す。
【０３４９】
３Ｂ：ＸｍＡｂ１８０８７による再指示されたＴ細胞細胞傷害性
ＸｍＡｂ１８０８７を、ＳＳＴＲ２トランスフェクトＣＨＯ細胞（図２４Ａ）、ＳＳＴＲ２陽性ＴＴ細胞（甲状腺髄様癌細胞株、図２４Ｂおよび２５）、Ａ５４９細胞（肺腺癌細胞株、図２４Ｃおよび２５）、および対照として非トランスフェクト親ＣＨＯ細胞（図２４Ａ）の再指示されたＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）についてインビトロで特徴付けした。抗ＲＳＶｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）および２価抗ＳＳＴＲ２  ｍＡｂを対照として含んだ（図２４Ｄ）。
【０３５０】
標的細胞およびヒトＰＢＭＣを、１０または２０：１のＥ：Ｔ比で２４時間、ＸｍＡｂ１８０８７またはＸＥＮＰ１３２４５と共にインキュベートした。ＲＴＣＣを、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）レベルを測定することによって決定した。
【０３５１】
これらの図に示されるように、ＸｍＡｂ１８０８７は、制御抗ＣＤ３二重特異性抗体ＸＥＮＰ１３２４５および制御２価抗ＳＳＴＲ２  ｍＡｂ（図２５）と比較した場合に、ＳＳＴＲ２トランスフェクトＣＨＯ細胞（図２４Ａ）、ならびにヒト癌細胞株（図２８Ｂ〜Ｃおよび２４Ｄ）におけるＲＴＣＣの高百分率を示した。さらに、データは、ＸｍＡｂ１８０８７が、非トランスフェクト親ＣＨＯ細胞においてＲＴＣＣを示さなかったことを示した（図２４Ａ）。
【０３５２】
ＸｍＡｂ１８０８７によるＴ細胞活性化をまた、フローサイトメトリーによってＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ６９の表面発現（図２６Ａ〜Ｂ）を評価することによって、ＳＳＴＲ２トランスフェクトＣＨＯ細胞およびＴＴ細胞を伴う実験において調査した。図に示されるように、ＸｍＡｂ１８０８７は、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞を、制御抗ＣＤ３二重特異性抗体ＸＥＮＰ１３２４５よりはるかに高いレベルに活性化する。これは、ＸｍＡｂ１８０８７が、Ｔ細胞活性化を誘導することによってＳＳＴＲ２＋標的細胞を除去することを示す。
【０３５３】
３Ｃ：ＸｍＡｂ１８０８７は、Ａ５４９肺癌細胞およびヒトＰＢＭＣを生着されたＮＳＧマウスにおける抗腫瘍活性を示す。
２５匹のＮＯＤ  ｓｃｉｄガンマ（ＮＳＧ）マウスにそれぞれ、−７日目に１ｘ１０６Ａ５４９−ＲｅｄＦＬｕｃ腫瘍細胞（０．１ｍＬ容量皮下注射）を生着した。０日目に、マウスに、１０ｘ１０６ヒトＰＢＭＣを腹腔内に生着した。０日目のＰＢＭＣ生着の後、ＸｍＡｂ１８０８７を、３．０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射によって毎週（０、７、および１４日目）投与した（対照マウスにはＰＢＳを投与した）。研究設計は、図２７にさらに要約される。腫瘍成長を、インビトロ画像システム（ＩＶＩＳ（登録商標）Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩＩ）を使用して、マウス毎に合計溶剤を測定することによって監視した。図２８および２９に示されるように、３ｍｇ／ｋｇのＸｍＡｂ１８０８７での治療は、実質的には、ＰＢＳでの治療と比較して、Ａ５４９局所腫瘍成長を抑制する。
【０３５４】
３Ｄ：カニクイザルにおけるＸｍＡｂ１８０８７の特徴付け
さらなる研究において、カニクイザル（ｎ＝３）に、ＸｍＡｂ１８０８７または制御抗ＲＳＶｘ抗ＣＤ３二重特異性抗体（ＸＥＮＰ１３２４５）の単回静脈内（ｉ．ｖ．）容量を投与した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞活性化（ＣＤ６９上方調節、図３１Ａ〜Ｂ）、ならびにサイトカイン（ＩＬ−６およびＴＮＦ）放出（図３２Ａ〜Ｂ）へのこれらの二重特異性抗体の効果を評価した。
【０３５５】
図に示されるように、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、投与後のその後の回復および正常化を伴うＸｍＡｂ１８０８７での治療（図３０ＡおよびＢ、ＸＥＮＰ１３２４５での治療と比較した場合）の後に血液から素早く再分布した。Ｔ細胞を、ＸｍＡｂ１８０８７と共に投与する際に直ちに活性化し（ＸＥＮＰ１３２４５と共に投与と比較した場合）、次いで、Ｔ細胞再分布と一致して、低下させた。さらに、ＩＬ−６およびＴＮＦサイトカイン放出は、Ｔ細胞活性化と相関があった（図３２Ａ〜Ｂ）。
【０３５６】
３Ｅ：ＮＳＧマウスにおけるＸｍＡｂ１８０８７の特徴付け
投与反応を調査するための別の研究において、６０匹のＮＳＧマウスに、−７日目に１ｘ１０６  Ａ５４９−ＲｅｄＦＬｕｃ腫瘍細胞（０．１  ｍＬ容積皮下注射）を生着した。０日目に、マウスを合計溶剤に基づいて分類し、マウスに１０ｘ１０６ヒトＰＢＭＣを生着し、示された濃度（各濃度に１２匹のマウス）で、試験物の投与量＃１を投与した。投与量＃２および＃３を、８日目および１５日目に投与した。上記のとおり、腫瘍成長を、図３３に示されるように１週間に２〜３回、インビトロ画像システムを使用してマウス毎に合計溶剤を測定することによって監視した。さらに、腫瘍体積を、投与量＃１後１８日目および２２日目について、図Ｘに示されるように１週間に１〜２回キャリパーによって測定した。
【図１Ａ−１Ｅ】
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【図１Ｆ−１Ｉ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
2019527047.tif 000014
【図５】
2019527047.tif 000015
【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
2019527047.tif 000020
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１３Ｊ】
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【図１３Ｋ】
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【図１３Ｌ】
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【図１３Ｍ】
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【図１３Ｎ】
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【図１３Ｏ】
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【図１３Ｐ】
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【図１３Ｑ】
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【図１３Ｒ】
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【図１３Ｓ】
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【図１３Ｔ】
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【図１３Ｕ】
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【図１３Ｖ】
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【図１３Ｗ】
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【図１３Ｘ】
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【図１３Ｙ】
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【図１３Ｚ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【図１５Ｉ】
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【図１５Ｊ】
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【図１５Ｋ】
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【図１５Ｌ】
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【図１５Ｍ】
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【図１５Ｎ】
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【図１５Ｏ】
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【図１５Ｐ】
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【図１５Ｑ】
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【図１５Ｒ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１７Ｊ】
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【図１７Ｋ】
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【図１７Ｌ】
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【図１７Ｍ】
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【図１７Ｎ】
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【図１７Ｏ】
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【図１７Ｐ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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