(57)【要約】種々の態様及び実施形態において、本発明は、ｓｉＲＮＡの細胞侵入または活性を増強する化合物または薬剤を提供し、また、かかる化合物または薬剤を特定するための方法を提供する。本明細書には、Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬として機能する例示的な薬剤が記述され、これらがｃｐ−ａｓｉＲＮＡを用いて遺伝子サイレンシングを増強することが示される。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬を含む、薬学的組成物。
【請求項２】
前記ｓｉＲＮＡが、非対称ｓｉＲＮＡ（ａｓｉＲＮＡ）である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡが、細胞透過性ａｓｉＲＮＡ（ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ）または長鎖アンチセンスａｓｉＲＮＡ（ｌａｓｉＲＮＡ）である、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬が、ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬が、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、イスラジピン、エホニジピン、フェロジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、及びプラニジピンから選択される、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬が、非ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記非ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬が、（ｉ）フェニルアルキルアミン及びベンゾチアゼピン系カルシウムチャネル遮断薬、（ｉｉ）ガバペンチン及びプレガバリンを含むガバペンチノイド、（ｉｉｉ）ジコノチド、ならびに（ｉｖ）ミベフラジル、ベプリジル、フルナリジン、及びフルスピリレンから選択される、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬が、ベラパミル、ジルチアゼム、ガロパミル、及びフェンジリンから選択される、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記組成物が、局所送達、肺送達、または非経口送達のために製剤化されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記ｓｉＲＮＡが、ＣＴＧＦコードｍＲＮＡとの配列相補性を有するアンチセンス鎖を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記ｓｉＲＮＡが、ＭｙＤ８８  ｍＲＮＡ配列またはＴＬＲ  ｍＲＮＡ配列との配列相補性を有するアンチセンス鎖を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記ｓｉＲＮＡが、チロシナーゼコードｍＲＮＡ配列との配列相補性を有するアンチセンス鎖を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
有効量の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬を対象に投与することを含む、前記対象における遺伝子サイレンシングの方法。
【請求項１４】
前記ｓｉＲＮＡ及び前記Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬が、単一の薬学的組成物として投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｓｉＲＮＡ及び前記Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬が、別々の薬学的組成物として投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｓｉＲＮＡが、非対称ｓｉＲＮＡ（ａｓｉＲＮＡ）である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ｓｉＲＮＡが、細胞透過性ａｓｉＲＮＡ（ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ）または長鎖アンチセンスａｓｉＲＮＡ（ｌａｓｉＲＮＡ）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬が、ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬が、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、イスラジピン、エホニジピン、フェロジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、及びプラニジピンから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬が、非ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬である、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記非ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬が、（ｉ）フェニルアルキルアミン及びベンゾチアゼピン系カルシウムチャネル遮断薬、（ｉｉ）ガバペンチン及びプレガバリンを含むガバペンチノイド、（ｉｉｉ）ジコノチド、ならびに（ｉｖ）ミベフラジル、ベプリジル、フルナリジン、及びフルスピリレンから選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬が、ベラパミル、ジルチアゼム、ガロパミル、及びフェンジリンから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｓｉＲＮＡ及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬のうちの一方または両方が、局所送達、肺送達、または非経口送達のために製剤化されている、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｓｉＲＮＡが、ＣＴＧＦコードｍＲＮＡとの配列相補性を有するアンチセンス鎖を含む、請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記対象が、ケロイド、腎線維症、皮膚肥厚症、肺線維症、肝線維症、関節炎、高血圧、腎不全、脈管形成関連障害、皮膚線維症、及び循環器障害から選択されるＣＴＧＦ関連疾患または障害を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ｓｉＲＮＡが、ＭｙＤ８８  ｍＲＮＡ配列またはＴＬＲ  ｍＲＮＡ配列との配列相補性を有するアンチセンス鎖を含む、請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｓｉＲＮＡが、チロシナーゼコードｍＲＮＡ配列との配列相補性を有するアンチセンス鎖を含む、請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ｓｉＲＮＡ組成物を作製する方法であって、
ｓｉＲＮＡ及び候補化合物に細胞を接触させることと、
前記細胞への前記ｓｉＲＮＡの透過を数量化すること、または標的ＲＮＡの発現低下を数量化することと、
前記ｓｉＲＮＡとの共製剤化のための、任意選択で誘導体化される候補化合物を選択することと
を含む、前記方法。
【請求項２９】
前記ｓｉＲＮＡが、非対称ｓｉＲＮＡ（ａｓｉＲＮＡ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ａｓｉＲＮＡが、細胞透過性ａｓｉＲＮＡ（ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ）または長鎖アンチセンスａｓｉＲＮＡ（ｌａｓｉＲＮＡ）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ａｓｉＲＮＡが蛍光色素で標識されている、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞がヒト細胞である、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
有効量の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬を対象に投与することを含む、ＣＴＧＦ関連疾患または障害を処置する方法。
【請求項３４】
前記ｓｉＲＮＡ及び前記Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬が、単一の薬学的組成物として投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｓｉＲＮＡ及び前記Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬が、別々の薬学的組成物として投与される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記ｓｉＲＮＡが、非対称ｓｉＲＮＡ（ａｓｉＲＮＡ）である、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ｓｉＲＮＡが、細胞透過性ａｓｉＲＮＡ（ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ）または長鎖アンチセンスａｓｉＲＮＡ（ｌａｓｉＲＮＡ）である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬が、ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬である、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬が、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、イスラジピン、エホニジピン、フェロジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、及びプラニジピンから選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬が、非ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬である、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記非ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬が、（ｉ）フェニルアルキルアミン及びベンゾチアゼピン系カルシウムチャネル遮断薬、（ｉｉ）ガバペンチン及びプレガバリンを含むガバペンチノイド、（ｉｉｉ）ジコノチド、ならびに（ｉｖ）ミベフラジル、ベプリジル、フルナリジン、及びフルスピリレンから選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬が、ベラパミル、ジルチアゼム、ガロパミル、及びフェンジリンから選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＣＴＧＦ関連疾患または障害が、ケロイド、腎線維症、皮膚肥厚症、肺線維症、肝線維症、関節炎、高血圧、腎不全、脈管形成関連障害、皮膚線維症、及び循環器障害から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
ＣＴＧＦ関連疾患または障害の処置に使用するための、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬。
【請求項４５】
ＣＴＧＦ関連疾患もしくは障害を処置するため、またはＣＴＧＦ関連疾患もしくは障害の処置のための医薬を調製するための、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１６年６月２９日に出願された韓国特許出願第ＫＲ１０−２０１６−００８１９１４号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、ｓｉＲＮＡの細胞侵入または活性を増強する化合物または薬剤を提供する。本発明は、かかる化合物または薬剤を特定するための方法を更に提供する。 
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、特異性及び効率の高い様式で遺伝子発現を阻害する能力をもたらす。ＲＮＡｉは、標的遺伝子のｍＲＮＡと相同な配列を有するセンス鎖と、標的遺伝子のｍＲＮＡと相補的な配列を有するアンチセンス鎖とを含む二本鎖ＲＮＡを細胞に導入することにより、標的ｍＲＮＡの分解をもたらす。
【０００４】
ｓｉＲＮＡに基づく効果的な治療剤の開発のためには、例えば、安定性、細胞侵入、及びサイレンシング効率に関連する技術的問題を克服しなければならない。例えば、効果的なｉｎ  ｖｉｖｏ送達が困難であるのは、リン酸骨格構造の負電荷が原因でｓｉＲＮＡが細胞膜を通過することができないためである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達の場合は細胞透過を向上させるためにカチオン性脂質及びカチオン性ポリマーを用いる試薬が多く存在するものの、これらの試薬は、治療という観点からは使用に好適ではない。
【０００５】
この有望な技術の進展のためには、ｓｉＲＮＡの細胞侵入を向上させる組成物を含め、ｓｉＲＮＡ活性を改善または増強するための薬学的組成物及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
種々の態様及び実施形態において、本発明は、ｓｉＲＮＡの細胞侵入または活性を増強する化合物または薬剤を提供する。本発明は、かかる薬剤を特定するための方法を更に提供する。本明細書には、Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬として機能し、かつｓｉＲＮＡの細胞侵入を増強することが実証されている例示的な薬剤が記述される。
【０００７】
一態様において、本開示は、細胞透過性非対称低分子干渉ＲＮＡ（ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ）などのｓｉＲＮＡ及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬を含む薬学的組成物を提供する。Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬は、ｓｉＲＮＡの細胞透過を向上させ、遺伝子サイレンシングをより効率的にする。一部の実施形態では、Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬は、ジヒドロピリジンまたは非ジヒドロピリジンのＬ型カルシウムチャネル遮断薬である。薬学的組成物は、処置の方法において使用するため、局所、肺、及び非経口を含む種々の送達経路のために製剤化されていてよい。
【０００８】
他の態様では、本発明は、対象における遺伝子サイレンシングの方法を提供し、この方法は、有効量の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬を対象に投与することを含む。ｓｉＲＮＡ及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬は、単一の薬学的組成物として投与される場合があり、一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬は、別々の薬学的組成物として投与される。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、細胞透過性ａｓｉＲＮＡ（ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ）または長鎖アンチセンスａｓｉＲＮＡ（ｌａｓｉＲＮＡ）などの非対称ｓｉＲＮＡ（ａｓｉＲＮＡ）である。Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬は、ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬であっても、または非ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬であってもよい。種々の実施形態において、ｓｉＲＮＡ及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬のうちの一方または両方が、局所送達、肺送達、または非経口送達のために製剤化されている。
【０００９】
別の態様では、本開示は、細胞透過性非対称低分子干渉ＲＮＡ（ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ）または長鎖アンチセンスａｓｉＲＮＡ（ｌａｓｉＲＮＡ）などのｓｉＲＮＡの細胞侵入または遺伝子サイレンシング活性を改善する化合物のスクリーニング方法を提供する。この方法は、ｓｉＲＮＡを細胞に接触させること、及び候補化合物を細胞に接触させること、及び細胞内のｓｉＲＮＡを検出もしくは数量化すること、または一部の実施形態では、標的ＲＮＡの発現低下を数量化することを含み得る。ｓｉＲＮＡの透過または活性を対照と比較することにより、ｓｉＲＮＡの活性または細胞侵入を向上または増強する化合物または薬剤を特定し、任意選択で誘導体化し、薬学的組成物として製剤化することができる。一部の実施形態では、化合物は、活性の増強について高スループットでスクリーニングされ得る。
【００１０】
更なる実施形態では、この方法は、ｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉＲＮＡ、例えばｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）の細胞透過または活性を増大させる候補化合物を選択することを更に含む。これらの化合物は、ｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性を増強するために、ｓｉＲＮＡとともに製剤化されるか、または別々に製剤化され、患者に送達され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】高スループットスクリーニングの例示的なスキームを示す図である。パネル（Ａ）：高スループットスクリーニング方策の要旨。パネル（Ｂ）：高スループットスクリーニング結果及びヒット化合物。
【図２】スクリーニングにより特定された３つのヒット化合物によるｃｐ−ａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシングの有効性の向上を例示する図である。パネル（Ａ）：３つのヒット化合物による遺伝子サイレンシング効力の向上の妥当性検証。パネル（Ｂ）：シルニジピンによる遺伝子サイレンシング効力の向上の更なる解析。グラフ中のデータは全て、３つの独立した実験の平均±ＳＤを表す。
【図３】ＤＨＰ（ジヒドロピリジン）Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬の効果を例示する図である。パネル（Ａ）：ＤＨＰ  Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬に由来するアムロジピンによる遺伝子サイレンシング活性の解析。パネル（Ｂ）：ＤＨＰ  Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬による細胞取り込みのＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（ＮＣ−３０００）に基づく数量化。グラフ中のデータは全て、３つの独立した実験の平均±ＳＤを表す。
【図４】非ＤＨＰ  Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬によるｃｐ−ａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシングの有効性を例示する図である。グラフ中のデータは全て、３つの独立した実験の平均±ＳＤを表す。
【図５】Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬とＴ型カルシウムチャネル遮断薬の比較を例示する図である。パネル（Ａ）：定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して解析した相対ｍＲＮＡレベル。パネル（Ｂ）：Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬と比較したＴ型カルシウムチャネル遮断薬による細胞取り込みのＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（ＮＣ−３０００）に基づく数量化。グラフ中のデータは全て、３つの独立した実験の平均±ＳＤを表す。
【図６】Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬によるｃｐｌａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシングの有効性を示す図である。濃度別のアムロジピン及びシルニジピンを含むｃｐ−ｌａｓｉＣＴＧＦ（０．０１μＭ、０．０３μＭ、０．１μＭ）をＨｅＬａ細胞に処置した。２４時間後、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、相対ｍＲＮＡレベルを解析した。ＧＡＰＤＨレベル（内部対照）を分割することにより、ＣＴＧＦ  ｍＲＮＡレベルを測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
別途定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書において参照される全ての特許及び公開文献は、参照によりそれらの全体が援用される。
【００１３】
本開示は、ｓｉＲＮＡを用いる遺伝子サイレンシングを増強するための組成物及び方法のほか、かかる組成物を化合物のスクリーニングによって調製するための方法を提供する。本明細書に開示されるように、Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬は、ｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡの取り込みを増強する。
【００１４】
一態様において、本開示は、細胞透過性非対称低分子干渉ＲＮＡ（ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ）または長鎖アンチセンスａｓｉＲＮＡ（ｌａｓｉＲＮＡ）などのｓｉＲＮＡ及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬を含む薬学的組成物を提供する。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉ」（ＲＮＡ干渉）という用語は、標的遺伝子のｍＲＮＡと相補的な配列を有する第１の鎖と、第１の鎖と相補的な配列を有する第２の鎖とを含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、細胞に導入され、標的ｍＲＮＡの分解を誘導する機構を指す。第１の鎖はアンチセンス鎖であり得、アンチセンス鎖とは、標的ｍＲＮＡと実質的に相補的な、すなわち約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、アンチセンス鎖は、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）の分子、ｍＲＮＡではないＲＮＡ配列（例えば、マイクロＲＮＡ、ｐｉｗｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及びｈｎＲＮＡ）、またはコードもしくは非コードのいずれかのＤＮＡ配列と、全体的または部分的に相補的であり得る。「アンチセンス鎖」及び「ガイド鎖」という用語は、本明細書では互換的に使用される。種々の実施形態において、第１の鎖は、概して、約１６〜約５０ヌクレオチド長、例えば約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、及び２５ヌクレオチド長を有する。第１の鎖において、標的核酸と相補的な領域は、約１６〜約３１ヌクレオチド長、約１９〜約２５ヌクレオチド長、または約１９〜約２１ヌクレオチド長を有し得る。加えて、第２の鎖はセンス鎖であってもよく、センス鎖とは、標的核酸と全体的または部分的に同じヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを指す。第２の鎖は、約１３〜約２５ヌクレオチド長、約１３〜約２１ヌクレオチド長、または約１６〜約２１ヌクレオチド長を有し得る。種々の実施形態において、第２の鎖は、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のヌクレオチドを有し得る。
【００１６】
非対称ｓｉＲＮＡ（ａｓｉＲＮＡ）は、全体が参照により本明細書に援用されるＵＳ２０１２／０２３８０１７に記述されている。一部の実施形態では、ａｓｉＲＮＡは、「１７＋２Ａ」、「１６＋３Ａ」、及び「１５＋４Ａ」の構成を含む。１７＋２Ａ  ｓｉＲＮＡ構造とは、１９ヌクレオチドのアンチセンス鎖と、それと相補的な配列を有する１７ヌクレオチドのセンス鎖とを含む二本鎖ｓｉＲＮＡ分子で、アンチセンス鎖の５’末端が平滑末端であり、アンチセンス鎖の３’末端が２ヌクレオチドのオーバーハングを有するものを指す。同様に、１６＋３Ａ  ｓｉＲＮＡ構造という用語は、１９ヌクレオチドのアンチセンス鎖と、それと相補的な配列を有する１６ヌクレオチドのセンス鎖とを含む二本鎖ｓｉＲＮＡ分子で、アンチセンス鎖の５’末端が平滑末端であり、アンチセンス鎖の３’末端が３ヌクレオチドのオーバーハングを有するものである。１５＋４Ａ  ｓｉＲＮＡ構造は、１９ヌクレオチドのアンチセンス鎖と、それと相補的な配列を有する１５ヌクレオチドの鎖とを含む二本鎖ｓｉＲＮＡ分子で、アンチセンス鎖の５’末端が平滑末端であり、アンチセンス鎖の３’末端が４ヌクレオチドのオーバーハングを有するものである。ａｓｉＲＮＡは、センス鎖によるオフターゲット効果の低減とともに、遺伝子サイレンシング効率における利点を提供する。
【００１７】
一部の実施形態では、ａｓｉＲＮＡの一方または両方の末端が、３’末端のオーバーハングを含む。一部の実施形態では、このオーバーハングは、ジヌクレオチドオーバーハング（例えば、ｄＴｄＴ）である。
【００１８】
種々の実施形態において、ａｓｉＲＮＡは、細胞透過性非対称ｓｉＲＮＡすなわちｃｐ−ａｓｉＲＮＡである。Ｃｐ−ａｓｉＲＮＡは、例えば、全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１５／０１１１９４８号に記述されている。一部の実施形態では、ｃｐ−ａｓｉＲＮＡはいかなるトランスフェクション試薬も用いずに内部移行し、細胞内の標的遺伝子をサイレンシングし得る。
【００１９】
種々の実施形態において、ｃｐ−ａｓｉＲＮＡには、核酸分子内の少なくとも１つのヌクレオチドのリン酸骨格がホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートに置換されており、それにコンジュゲートされた細胞侵入を促進する親油性化合物を更に含む、ａｓｉＲＮＡが含まれる。種々の実施形態において、核酸分子のうち標的核酸と相補的な領域以外の領域内にあるヌクレオチドのリン酸骨格（複数可）が、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートに置換され得る。一部の実施形態では、核酸分子内の少なくとも１つのヌクレオチドのリン酸骨格が、ホスホロチオエートに置換され得る。一部の実施形態では、親油性化合物は、脂質、親油性ペプチド、及び親油性タンパク質から選択される。脂質は、コレステロール、トコフェロール、及び１０個以上の炭素原子を有する長鎖脂肪酸から選択される少なくとも１つであってよい。一部の実施形態では、親油性化合物は、コレステロール、コレステン、コレスタン、コレスタジエン、胆汁酸、コール酸、デオキシコール酸、またはデヒドロコール酸である。ある実施形態では、親油性化合物はコレステロールである。親油性化合物は、核酸分子の第１または第２の鎖の末端にコンジュゲートされていてもよい。
【００２０】
種々の実施形態において、ａｓｉＲＮＡは、長鎖アンチセンスａｓｉＲＮＡすなわちｌａｓｉＲＮＡである。ＬａｓｉＲＮＡは、例えば、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第９，６３７，７４２号に記述されている。
【００２１】
種々の実施形態において、ｌａｓｉＲＮＡには、標的核酸と１００％相補的な領域を含む約２１〜約１２１ｎｔ長（例えば約２０〜約１２５ｎｔ、または約２０〜約１１５ｎｔ、または約２０〜約１０５ｎｔ、または約２０〜約１００ｎｔ、または約２０〜約９０ｎｔ、または約２０〜約８０ｎｔ、または約２０〜約７０ｎｔ、または約２０〜約６０ｎｔ、または約２０〜約５０ｎｔ、または約２０〜約４０ｎｔ、または約２０〜約３０ｎｔ、または約３０〜約１２５ｎｔ、または約４０〜約１２５ｎｔ、または約５０〜約１２５ｎｔ、または約６０〜約１２５ｎｔ、または約７０〜約１２５ｎｔ、または約８０〜約１２５ｎｔ、または約９０〜約１２５ｎｔ、または約１００〜約１２５ｎｔ、または約２４〜約１１９ｎｔ長、または約２６〜３１ｎｔ長、または約２６、または約２７、または約２８、または約２９、または約３０、または約３１ｎｔ長）の第１の鎖と、標的核酸と１００％相補的な第１の鎖の領域に相補的に結合する１６ｎｔ長の第２の鎖とを有する、ａｓｉＲＮＡが含まれ、ここで、標的核酸と１００％相補的な領域は、第１の鎖の５’末端から１９個の核酸を含み、第２の鎖は、第２の鎖が結合する二本鎖領域と第２の鎖が結合しない一本鎖領域とを第１の鎖が有するように、第１の鎖に結合し、第１の鎖の５’末端及び第２の鎖の３’末端は、平滑末端を形成する。
【００２２】
種々の実施形態において、本明細書に記述されるｓｉＲＮＡは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはこれら両方から構成されていてもよく、また、ヌクレアーゼからの保護を行ったり、または塩基対合相互作用を強化したりする多様な修飾を含んでいてもよい。例えば、核酸分子は、ホスホロチオエート結合により結合された１つ以上のヌクレオチド、２’位に修飾を有するヌクレオチド、または多環式ヌクレオチドもしくはロックドヌクレオチドを含み得る。
【００２３】
一部の実施形態では、本明細書に記述されるｓｉＲＮＡは、多様なオリゴヌクレオチド化学構造を用いることができる。オリゴヌクレオチド化学の例としては、限定されないが、２’Ｏ−Ｍｅ−修飾オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート、及びモルホリノの各化学構造、ならびに前述のもののうちのいずれかの組み合わせが挙げられる。
【００２４】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉを誘導する二本鎖核酸分子（例えば、ａｓｉＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡ）に含まれる少なくとも１つのヌクレオチドのリボースの２’位におけるヒドロキシル基は、水素原子、フッ素原子、−Ｏ−アルキル基、−Ｏ−アシル基、及びアミノ基から選択される少なくとも１つに置換されている。一部の実施形態では、核酸分子に含まれる少なくとも１つのヌクレオチドのリン酸骨格は、アルキルホスホネート形態、ホスホロアミデート形態、及びボラノホスフェート形態から選択される少なくとも１つに置換されていてもよい。
【００２５】
一部の実施形態では、核酸分子に含まれる少なくとも１つのヌクレオチドは、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＵＮＡ（アンロックド核酸）、モルホリノ、及びＰＮＡ（ペプチド核酸）から選択される少なくとも１つに置換されていてもよい。一部の実施形態では、第１の鎖の一本鎖領域内のヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、嵩高な塩基類似体を含み得る。
【００２６】
例えば、ある実施形態では、核酸分子は、１つ以上の多環式核酸またはロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。ロックド核酸は、修飾されたＲＮＡヌクレオチドである。ロックド核酸ヌクレオチドのリボース部分は、２’の酸素及び４’の炭素をつなぐ追加の架橋で修飾されている。この架橋は、Ａ型二重鎖に見られることが多い３’−エンド（Ｎｏｒｔｈ）コンフォメーションにリボースを「ロック」する。ロックド核酸ヌクレオチドは、必要に応じて、ポリヌクレオチド中のＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混合し、ワトソン−クリック塩基対合則に従ってＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリダイズすることができる。ロックドリボースコンフォメーションは、塩基スタッキング及び骨格の事前構築を向上させる。これにより、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性（融解温度）が著しく高まる。ロックド核酸ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドには、それらの化学的安定性を増大させるヌクレアーゼ抵抗性がある。
【００２７】
一部の実施形態では、核酸分子は、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。例示的な修飾ヌクレオチドは、全体が参照により本明細書に援用される米国特許第８，２７８，０３６号に記述されている。例えば、修飾ヌクレオチドは、プソイドウリジン、Ｎ１−メチルプソイドウリジン、５−メチルシチジン、またはＮ６−メチルアデノシン、５−ヒドロキシシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、５−カルボキシシチジン、５−ホルミルシチジン、５−ヒドロキシウリジン、５−ヒドロキシメチルウリジン、５−カルボキシウリジン、５−ホルミルウリジン、プソイドウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−アザウリジン、５−アミノウリジン、５−メチルウリジン、２−チオプソイドウリジン、４−チオプソイドウリジン、５−ヒドロキシプソイドウリジン、５−メチルプソイドウリジン、５−アミノプソイドウリジン、プソイドイソシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、２−チオシチジン、５−アザシチジン、５−アミノシチジン、Ｎ４−メチルプソイドイソシチジン、２−チオプソイドイソシチジン、５−ヒドロキシプソイドイソシチジン、５−アミノプソイドイソシチジン、５−メチルプソイドイソシチジン、７−デアザアデノシン、６−チオグアノシン、７−デアザグアノシン、８−アザグアノシン、６−チオ−７−デアザグアノシン、６−チオ−８−アザグアノシン、７−デアザ−８−アザグアノシン、及び６−チオ−７−デアザ−８−アザグアノシンのうちの１つ以上から選択され得る。一部の実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドは、それらが核酸分子の２つの鎖の間の塩基対合に干渉しないように選択及び配置することができる。
【００２８】
種々の実施形態において、本発明は、細胞透過性非対称低分子干渉ＲＮＡ（ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ）または長鎖アンチセンスａｓｉＲＮＡ（ｌａｓｉＲＮＡ）などのｓｉＲＮＡと、ｓｉＲＮＡの細胞透過を向上させ、効率的な遺伝子サイレンシングをより効率的にすることができる、Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬とを含む、薬学的組成物を提供する。
【００２９】
種々の実施形態において、Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬は、ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬である。例示的なジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬としては、アムロジピン、アラニジピン、アゼルニジピン、バルニジピン、ベニジピン、シルニジピン、クレビジピン、イスラジピン、エホニジピン、フェロジピン、ラシジピン、レルカニジピン、マニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、及びプラニジピンが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬は、
【化１】
2019519565.tif 000003
2019519565.tif 000004
から選択され得る。
【００３０】
他の実施形態では、Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬は、非ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬である。例示的な非ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬としては、（ｉ）ベラパミル、ジルチアゼム、ガロパミル、及びフェンジリンを含む、フェニルアルキルアミン及びベンゾチアゼピン系カルシウムチャネル遮断薬、（ｉｉ）ガバペンチン及びプレガバリンを含むガバペンチノイド、（ｉｉｉ）ジコノチド（ｚｉｘｏｎｏｔｉｄｅ）、ならびに（ｉｖ）ミベフラジル、ベプリジル、フルナリジン、及びフルスピリレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３１】
他の態様では、本発明は、対象における遺伝子サイレンシングの方法を提供し、この方法は、有効量の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬を対象に投与することを含む。ｓｉＲＮＡ及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬は、単一の薬学的組成物として投与される場合があり、一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬は、別々の薬学的組成物として投与される。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、細胞透過性ａｓｉＲＮＡ（ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ）または長鎖アンチセンスａｓｉＲＮＡ（ｌａｓｉＲＮＡ）などの非対称ｓｉＲＮＡ（ａｓｉＲＮＡ）である。Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬は、ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬であっても、または非ジヒドロピリジンＬ型カルシウムチャネル遮断薬であってもよい。
【００３２】
本発明との関連で使用され得る例示的なａｓｉＲＮＡを以下の表１〜３に列記する。
【００３３】
【表１】
2019519565.tif 000005
2019519565.tif 000006
2019519565.tif 000007
【００３４】
【表２】
2019519565.tif 000008
2019519565.tif 000009
【００３５】
【表３】
2019519565.tif 000010
2019519565.tif 000011
【００３６】
種々の実施形態において、本発明は、標的遺伝子の遺伝子サイレンシングのための方法を提供する。種々の実施形態において、標的遺伝子は、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ（ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ）、コードＤＮＡ配列、及び非コードＤＮＡ配列から選択することができる。一部の実施形態では、標的遺伝子はｍＲＮＡである。更なる実施形態では、標的遺伝子は、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）をコードするｍＲＮＡである。
【００３７】
別の態様では、本開示は、ｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）の活性を改善、増大、または向上させる化合物のスクリーニング方法であって、ｓｉＲＮＡを細胞に接触させることと、候補化合物を細胞及び／またはｓｉＲＮＡに接触させることと、細胞内に透過したｓｉＲＮＡを検出することとを含む、スクリーニング方法を更に提供する。一部の実施形態では、この方法は、細胞内に透過したｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）の量を対照と比較して、候補化合物を用いた場合の細胞へのｓｉＲＮＡの透過が候補化合物を用いない場合と比較して増大するかどうかを判定することを更に含む。一部の実施形態では、対照は、ｓｉＲＮＡの細胞透過活性を改善、増大、または向上させるための二次的な化合物を一切用いずに透過したｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）の量の実測値、既知値、または推定値であり得る。対照は、過去の実験による既知値または所定値であってもよい。この方法は、細胞内へのｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）の透過を増大させる候補化合物を、ｓｉＲＮＡの活性を改善する化合物として選択することを更に含み得る。
【００３８】
更なる実施形態では、本明細書に記述される方法は、細胞におけるｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）の遺伝子サイレンシング活性を検出することを更に含む。細胞におけるｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）の遺伝子サイレンシング活性を増大させる候補化合物は、ｓｉＲＮＡの活性を改善する化合物として選択され得る。更なる実施形態では、この方法は、ｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）の遺伝子サイレンシング活性を対照と比較して、候補化合物を用いた場合のｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性が候補化合物を用いない場合と比較して増大するかどうかを判定することを更に含む。対照は、ｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性を改善、増大、または向上させるための二次的な化合物を一切用いないｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）の遺伝子サイレンシング活性の実測値、既知値、または推定値であり得る。対照は、過去の実験による既知値または所定値であってもよい。
【００３９】
種々の実施形態において、この方法は、基質上の細胞を含む細胞培養物を調製することを更に含む。一部の実施形態では、この方法は、複数の別個の基質上の細胞を含む細胞培養物を調製することを含む。一部の実施形態では、基質上の細胞をｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）またはｓｉＲＮＡの組み合わせに接触させる。例えば、基質上の細胞は、第１のｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）または第１の組み合わせのｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）、及び第２のｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）または第２の組み合わせのｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）に接触してもよい。一部の実施形態では、複数の別個の基質のうちの１つにある細胞に接触する第１のｓｉＲＮＡまたは第１の組み合わせのｓｉＲＮＡは、複数の別個の基質のうちの別の１つにある細胞に接触する第２のｓｉＲＮＡまたは第２の組み合わせのｓｉＲＮＡと異なっていてもよい。複数の別個の基質のそれぞれにある細胞は、異なるｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡの組み合わせに接触してもよい。一部の実施形態では、この方法は、複数の候補化合物を複数の基質上の細胞に接触させることと、細胞上の複数の候補化合物を同時にインキュベートすることとを含む。更なる実施形態では、この方法は、複数の候補化合物を複数の基質上の細胞に同時に接触させることを含む。一部の実施形態では、基質はウェルである。一部の実施形態では、細胞はヒト細胞である。
【００４０】
一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）は、例えば蛍光色素で標識されている。ｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）は、例えば、標識を検出することにより検出され得る。ｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）の量は、例えば、標識の量を測定することにより判定され得る。
【００４１】
種々の実施形態において、本発明は、直腸、頬側、鼻腔内、及び経皮の各経路、動脈内注射による送達、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、経口、局所、または吸入薬としての送達を含む種々の送達経路のために製剤化された薬学的組成物を提供する。一部の実施形態では、本明細書において他所に記述される種々の処置方法で使用するための送達経路は、局所、肺、または非経口である。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬のうちの一方または両方が、局所送達、肺送達、または非経口送達のために製剤化されている。一部の実施形態では、薬学的組成物は、皮膚、眼、肺への適用、または全身送達のために製剤化されている。種々の実施形態において、薬学的組成物は、限定されないが例えばリポソーム、カチオン性ポリマー、抗体、アプタマー、またはナノ粒子などの種々の送達ビヒクルとともにｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／またはｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために使用される。
【００４２】
一部の実施形態では、本明細書に記述される薬学的組成物は、ｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬と、任意選択で、経口投与に好適な薬学的賦形剤とを含有する、経口投与のための薬学的組成物であり得る。一部の実施形態では、薬学的組成物は、ｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）のための別々の送達ビヒクルを含まない場合がある。種々の実施形態において、薬学的組成物は、経口投与に好適な形態で、すなわち固体または液体調製物として製剤化されている。好適な固体経口製剤としては、錠剤、カプセル、丸剤、顆粒、ペレットなどが挙げられる。好適な液体経口製剤としては、溶液、懸濁液、分散液、エマルジョン、油類などが挙げられる。
【００４３】
一部の実施形態では、本明細書に記述される薬学的組成物は、本明細書に記述されるｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬と、任意選択で、注射に好適な薬学的賦形剤とを含有する、注射のための薬学的組成物であり得る。一部の実施形態では、薬学的組成物は、ｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）のための別々の送達ビヒクルを含まない場合がある。
【００４４】
一部の実施形態では、注射による投与のために本発明の薬学的組成物が組み込まれ得る形態としては、ゴマ油、トウモロコシ油、綿実油、またはピーナッツ油を含む水性懸濁液もしくは油懸濁液またはエマルジョン、ならびにエリキシル剤、マンニトール、デキストロース、または滅菌水溶液、及び同様の薬学的ビヒクルが挙げられる。一部の実施形態では、食塩水中の水溶液が注射のために使用される。エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール（及びそれらの好適な混合物）、シクロデキストリン誘導体、及び植物油を用いることもできる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合は界面活性剤の使用によって維持することができる。薬学的組成物は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、及びチメロサールを更に含んでいてもよい。
【００４５】
滅菌注射溶液は、適切な溶媒中で必要量の医薬品有効成分または医薬品有効成分の組み合わせを上記に列挙したような種々の他の成分と合わせ、続いて濾過滅菌を行うことによって調製される。一般に、分散液は、基礎分散媒及び上記に列挙したもののうち必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに種々の滅菌活性成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、ある特定の望ましい調製方法は、活性成分と任意の更なる望ましい成分の粉末が前もって滅菌濾過したそれらの溶液から得られる真空乾燥及びフリーズドライ技術である。
【００４６】
一部の実施形態では、薬学的組成物は体表面に局所的に投与されるため、局所投与に好適な形態で製剤化されている。好適な局所製剤としては、限定されないが、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、点滴薬などが挙げられる。
【００４７】
種々の実施形態において、本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体または希釈剤を更に含む。薬学的に許容される担体または希釈剤は当業者に周知である。担体または希釈剤は、種々の実施形態において、固体製剤のための固体担体もしくは希釈剤、液体製剤のための液体担体もしくは希釈剤、またはそれらの混合物であり得る。別の実施形態では、固体担体／希釈剤としては、ガム、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン、アルファ化デンプン）、糖（例えば、ラクトース、マンニトール、スクロース、デキストロース）、セルロース系材料（例えば、微結晶セルロース）、アクリレート（例えば、ポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
一部の実施形態では、薬学的組成物は制御放出組成物、すなわち、活性剤が投与後一定期間にわたって放出される組成物である。制御放出組成物または持続放出組成物としては、親油性デポ（例えば、脂肪酸、ワックス、油類）中の製剤が挙げられる。別の実施形態では、この組成物は即時放出組成物、すなわち、活性剤が投与後直ちに放出される組成物である。
【００４９】
種々の実施形態において、本明細書に記述されるｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）及びＬ型カルシウムチャネル遮断薬は、薬学的組成物として共投与される。本明細書で使用される「共投与」、「共投与すること」、「と組み合わせて投与される」、「と組み合わせて投与すること」、「同時」、及び「併用」という用語は、２種以上の医薬品有効成分を、両方の医薬品有効成分及び／またはそれらの代謝物がヒト対象において同時に存在するようにヒト対象に投与することを包含する。共投与は、異なる組成物の同時投与もしくは時間を隔てた投与、別々の組成物の異なる時点での投与、または２種以上の医薬品有効成分が存在する薬学的組成物の投与を含み得る。別々の組成物の同時投与及び両薬剤が存在する薬学的組成物の投与も、本発明の方法に包含される。
【００５０】
一部の実施形態では、薬学的組成物または医薬品有効成分は、単回用量で投与される。そのような投与は、医薬品有効成分を迅速に導入するために、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。しかしながら、必要に応じて経口経路を含む他の経路を使用してもよい。単回用量の薬学的組成物は、急性状態の処置のためにも使用され得る。一部の実施形態では、薬学的組成物または医薬品有効成分は、複数用量で投与される。ある実施形態では、薬学的組成物が複数用量で投与される。投薬は、１日に１回、２回、３回、４回、５回、６回、または７回以上であってもよい。投薬は、１か月に１回、２週間毎に１回、１週間に１回、または２日毎に１回であってもよい。他の実施形態では、薬学的組成物は、１日に約１回から１日に約６回投与される。一部の実施形態では、薬学的組成物は毎日１回投与され、他の実施形態では、薬学的組成物は、毎日２回投与され、他の実施形態では、薬学的組成物は、毎日３回投与される。
【００５１】
別の態様では、本開示は、本明細書に記述される薬学的組成物を有効量で対象に投与することを含む、対象における遺伝子サイレンシングの方法に関する。ｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）を使用した遺伝子サイレンシングの方法は、少なくとも米国特許出願公開第２０１７／０１３７８２８号及び同第２０１７／００２７８３７号に記述されており、これらは全て、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【００５２】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記述されるｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）及び／またはＬ型カルシウムチャネル遮断薬を含む有効量の薬学的組成物を対象に投与することを含む、対象の結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）関連疾患または障害を処置または防止する方法に関する。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）は、ＣＴＧＦコードｍＲＮＡとの配列相補性を有する少なくとも１９ヌクレオチド長のアンチセンス鎖と、アンチセンス鎖との配列相補性を有する１５〜１７ヌクレオチド長のセンス鎖とを含む。種々の実施形態において、ＣＴＧＦ関連疾患または障害は、ケロイド、腎線維症、皮膚肥厚症（ｐａｃｈｙ−ｄｅｒｍａｔｏｓｉｓ）、肺線維症、肝線維症、関節炎、高血圧、腎不全、脈管形成関連障害、皮膚線維症、及び循環器障害から選択され得る。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）は、親油性化合物にコンジュゲートされていてもよく、かつ、配列番号１及び２の一対のヌクレオチド配列、配列番号３及び４の一対のヌクレオチド配列、ならびに配列番号５及び６の一対のヌクレオチド配列から選択される一対の核酸配列を有する。ＣＴＧＦ関連疾患または障害を処置または防止するために利用され得る更なるｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）は、開示内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許公開第２０１５０１１１９４８号に記述されている。
【００５３】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記述される薬学的組成物を有効量で対象に投与することを含む、眼の状態、例えば加齢黄斑変性（ＡＭＤ；例えば、非滲出型（ｄｒｙ）または滲出型（ｗｅｔ）ＡＭＤ）の処置を必要とする対象においてそれを行う方法に関し、ここで、ｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）は、ＭｙＤ８８  ｍＲＮＡ配列またはＴＬＲ３  ｍＲＮＡ配列との配列相補性を有する少なくとも１９ヌクレオチド長のアンチセンス鎖と、アンチセンス鎖との配列相補性を有する１５〜１７ヌクレオチド長のセンス鎖とを含み、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が平滑末端を形成する複合体を形成する。ＡＭＤを処置または防止するために利用され得る例示的なｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）は、開示内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許公開第２０１７０１３７８２８号に記述されている。
【００５４】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記述される薬学的組成物を有効量で対象に投与することを含む、対象のメラニン産生を阻害及び／または低減する方法に関し、ここで、ｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡ）は、チロシナーゼｍＲＮＡ配列との配列相補性を有する少なくとも１９ヌクレオチド長のアンチセンス鎖と、アンチセンス鎖との配列相補性を有する１５〜１７ヌクレオチド長のセンス鎖とを含み、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端が平滑末端を形成する複合体を形成する。メラニン産生の阻害及び／または低減のために利用され得る例示的なｓｉＲＮＡ（例えば、ａｓｉ−ＲＮＡまたはｃｐ−ａｓｉＲＮＡまたはｌａｓｉＲＮＡ）は、開示内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許公開第２０１７００２７８３７号に記述されている。一部の実施形態では、本開示は、皮膚の白化、黒化、もしくは瘢痕、アトピー性皮膚炎、乾癬、強皮症、脱毛症、または皮膚のしわを含むがこれらに限定されない、皮膚疾患または状態を処置する方法を更に提供する。
【００５５】
種々の実施形態において、本発明の方法により処置される対象はヒトである。
【００５６】
発明の形態
これより、以下の実施例を参照して、本明細書に包含される実施形態について記述する。これらの実施例は例示を目的として提供されるに過ぎず、本開示は決してこれらの実施例に限定されるものと解釈されるべきではない。むしろ本開示は、本明細書において提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形形態を包含するものと解釈されるべきである。
【００５７】
実施例１  ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ遺伝子サイレンシング活性の改善のための高スループットスクリーニング。
【００５８】
ＤＭＳＯ毒性試験後、Ｋｏｒｅａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂａｎｋの化合物ライブラリから２３５４種の臨床的に活性な候補化合物を蒸留水で希釈し、密閉した９６ウェルプレートに保存した。ｃｐ−ａｓｉＧＦＰ及び化学物質のインキュベーションの前に、ＨｅＬａ／ＧＦＰ安定細胞株の細胞４，０００個を９６ウェルプレートに播種した。播種の２４時間後、ｃｐ−ａｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。リポフェクタミンまたはリポフェクタミン２０００などのトランスフェクション試薬を一切用いずに行ったトランスフェクションの２４時間後、培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）から１０％  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に交換した。マルチウェルプレートリーダーを使用して、化学物質を含むｃｐ−ａｓｉＲＮＡの相対蛍光強度を測定した（図１）。第１のスクリーニングでは、相対蛍光強度は各化学物質につき２回測定した。第１のスクリーニングに基づき、各プレートにおいて最も強度の高い５つの候補化学物質を選択し、第２のスクリーニングを行った。二次的なスクリーニングは１０種のヒット化合物をもたらした。１０種の化合物の構造を解析した後、ヒット化合物のうちの３つはコア構造を共有しており、Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬として機能する。
【００５９】
実施例２  スクリーニングにより特定された小分子はｃｐ−ａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシングを改善する。
【００６０】
スクリーニングにより確認された３つのヒット化合物を再試験して、ｃｐ−ａｓｉＲＮＡに対するＲＮＡ干渉効果を検証した。細胞毒性による影響を受けない最適な範囲を設定するため、ＭＴＴアッセイを行った。この範囲（５０％致死量）に基づいて、３つのヒット化合物の濃度を選択し、選択された範囲内で化合物を再試験した。ＨｅＬａ／ＧＦＰ細胞をＣｐ−ａｓｉＧＦＰ（１００ｎＭ）及び３つの候補化学物質で処置した。インキュベーションの２４時間後、培地をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）から１０％  ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に交換した。培地交換の２４時間後、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して相対ＧＦＰ  ｍＲＮＡレベルを測定した（図２のパネルＡ）。これら３つの化学物質で処置したとき、ｃｐ−ａｓｉＧＦＰ単独と比較してｃｐ−ａｓｉＧＦＰ活性の向上が観察された。ｃｐ−ａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性が配列特異的であるかどうかを試験するため、サバイビンを標的とする別のｃｐ−ａｓｉＲＮＡ（０．３μＭ）も試験した。３つの候補化学物質を含むＣｐ−ａｓｉサバイビンをＨｅＬａ細胞に加え、標的ｍＲＮＡレベルをｑＲＴ−ＰＣＲにより解析した（図２のパネルＡ）。内部対照としてのチューブリンレベルで除算することにより、ＧＦＰ  ｍＲＮＡレベル及びサバイビンｍＲＮＡレベルを計算した。この結果は、３つの候補化合物で処置することによりｃｐ−ａｓｉサバイビンの遺伝子サイレンシング活性が向上したことを示した。
【００６１】
ｃｐ−ａｓｉＲＮＡに対して最も高い遺伝子サイレンシング効果を示したシルニジピンを選択した。様々な濃度のシルニジピンを含む、ＧＦＰを標的とするｃｐ−ａｓｉＲＮＡ（５０ｎＭ及び２５０ｎＭ）及びサバイビンを標的とするｃｐ−ａｓｉＲＮＡ（０．５μＭ及び１μＭ）を、ＨｅＬａ／ＧＦＰ細胞及びＨｅＬａ細胞に加えた。４８時間後、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、シルニジピンを含むｃｐ−ａｓｉＲＮＡの活性を解析した。チューブリンレベル（内部対照）を分割することにより、相対的なＧＦＰ  ｍＲＮＡレベル及びサバイビンｍＲＮＡレベルを測定した（図２のパネルＢ）。ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ活性の濃度依存的向上が観察された。これらの結果は、スクリーニングにより特定された３つのヒット化合物がｃｐ−ａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング活性を向上させることを実証する。
【００６２】
実施例３  ジヒドロピリジン（ＤＨＰ）Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬はｃｐ−ａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシングを改善する。
【００６３】
化合物ライブラリには含まれていなかったアムロジピンも試験した。この化合物はＤＨＰと共通の構造を有し、Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬として機能する。アムロジピンを含むＣｐ−ａｓｉＧＦＰ及びｃｐ−ａｓｉサバイビンをＨｅＬａ／ＧＦＰ細胞及びＨｅＬａ細胞に処置した。それらの遺伝子サイレンシング効果を４８時間のインキュベーション後にｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した（図３のパネルＡ）。チューブリンレベル（内部対照）で除算することにより、ＧＦＰ  ｍＲＮＡレベル及びサバイビンｍＲＮＡレベルを計算した。様々な濃度のアムロジピンを含むｃｐ−ａｓｉＧＦＰ（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ）及びｃｐ−ａｓｉサバイビン（０．３μＭ、０．５μＭ、１μＭ）とのインキュベーションにより、ＧＦＰ及びサバイビンｍＲＮＡの発現レベルの低下が示された。これらの結果は、アムロジピンも相対的な標的ｍＲＮＡレベルを低下させ、またｃｐ−ａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング効果を用量依存的様式で向上させることを示す。こうした結果は、スクリーニングにより特定された３つの化学化合物のみならず、ＤＨＰ  Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬によってもｃｐ−ａｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ有効性が向上することを裏付ける。連続して、Ｃｙ３標識ｃｐ−ａｓｉＧＦＰを使用したＮｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（ＮＣ３０００）に基づく技術を用い、ＤＨＰ  Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬が細胞取り込みに影響するかどうかを判定した（図３のパネルＢ）。ＤＨＰ  Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬を含む１００ｎＭのＣｙ３標識ｃｐ−ａｓｉＧＦＰでＨｅＬａ細胞を処置した。８時間のインキュベーションの後、固定細胞及び生細胞を用いたＤＮＡ及び核の蛍光染色のためにＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を使用した。ゲーティングした細胞集団の細胞内蛍光強度と比較して相対蛍光強度を数量化した。蛍光強度は、細胞内Ｃｙ３シグナルに基づき、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ法によって数量化した。１として示されるＣｙ３標識ｃｐ−ａｓｉＧＦＰ発現に対して正規化された蛍光強度を計算した。ＤＨＰ  Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬を用いたｃｐ−ａｓｉＧＦＰの細胞取り込みは、ｃｐ−ａｓｉＧＦＰ単独によるものよりも高かった。こうした結果は、ＤＨＰ  Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬が細胞取り込みを向上させ、ｃｐ−ａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシングの有効性増大をもたらすことを裏付ける。
【００６４】
実施例４  非ジヒドロピリジン（非ＤＨＰ）Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬もｃｐ−ａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシングを改善する。
【００６５】
非ＤＨＰ  Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬のような別のタイプのカルシウムチャネル遮断薬を試験のために選択する。ジルチアゼム及びベラパミルを含むＣｐ−ａｓｉＧＦＰ及びｃｐ−ａｓｉサバイビンをＨｅＬａ／ＧＦＰ細胞及びＨｅＬａ細胞に処置した。濃度別のジルチアゼム及びベラパミルを含むｃｐ−ａｓｉＧＦＰ（５０ｎＭ、１００ｎＭ）及びｃｐ−ａｓｉサバイビン（０．３μＭ、０．５μＭ、１μＭ）で処置した４８時間後、ＧＦＰ  ｍＲＮＡレベル及びサバイビンｍＲＮＡレベルの低下が、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して観察された。ＧＦＰ  ｍＲＮＡレベル及びサバイビンｍＲＮＡレベルは、内部対照としてのチューブリンレベルで除算して計算した。図４に見られるように、ジルチアゼム及びベラパミルで処置したとき、ｃｐ−ａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシングの有効性は、ｃｐ−ａｓｉＲＮＡ単独での処置と比べてより効率的であった。したがって、これら２つの化合物もまた、ＤＨＰ  Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬と比較して同様のｃｐ−ａｓｉＲＮＡ対する効果を示し、遺伝子サイレンシング効果の向上がＬ型カルシウムチャネル遮断薬による影響を受けていることが確認される。
【００６６】
実施例５  ｃｐ−ａｓｉＲＮＡに対するＬ型カルシウムチャネル遮断薬の効果の検証。
【００６７】
Ｔ型カルシウムチャネル遮断薬などの別のタイプのカルシウムチャネル遮断薬の効果を試験した。濃度別のペンフルリドール及びエトスクシミドを含むｃｐ−ａｓｉＧＦＰ（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ）及びｃｐ−ａｓｉサバイビン（０．３μＭ、０．５μＭ、１μＭ）をＨｅＬａ／ＧＦＰ細胞及びＨｅＬａ細胞に加えた。４８時間後、定量的リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、相対ｍＲＮＡレベルを解析した。チューブリンレベル（内部対照）を分割することにより、ＧＦＰ  ｍＲＮＡレベル及びサバイビンｍＲＮＡレベルを測定した（図５のパネルＡ）。Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬とは異なり、Ｔ型カルシウムチャネル遮断薬は、ｃｐ−ａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシングの有効性を改善しなかった。更に、Ｎｕｃｌｅｏｃｏｕｎｔｅｒ（ＮＣ３０００）に基づく技術を使用し、細胞取り込みを解析した。非ＤＨＰ  Ｌ型及びＴ型のカルシウムチャネル遮断薬を含むＣｙ３標識ｃｐ−ａｓｉＧＦＰをＨｅＬａ細胞に処置した。非ＤＨＰ  Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬及びＴ型カルシウムチャネル遮断薬を含むＣｙ３標識ｃｐ−ａｓｉＧＦＰ（１００ｎＭ）とともにＨｅＬａ細胞をインキュベートした。８時間のインキュベーション後、ゲーティングした細胞集団の細胞内蛍光強度を数量化した。細胞内Ｃｙ３シグナルをＮＣ−３０００により測定し、Ｃｙ３標識ｃｐ−ａｓｉＧＦＰ発現に対して正規化した。図５のパネルＢに見られるように、ｃｐ−ａｓｉＧＦＰの細胞取り込みの向上は、非ＤＨＰ  Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬で処置したときにのみ検出され、Ｔ型カルシウムチャネル遮断薬で処置したときには検出されない。
【００６８】
実施例６。種々の形態のｃｐ−ａｓｉＲＮＡに対するＬ型カルシウムチャネル遮断薬の効果。
【００６９】
種々の形態のｃｐ−ａｓｉＲＮＡに対するＬ型カルシウムチャネル遮断薬の効果を特定するため、構造変化及びいくつかの化学修飾をｃｐ−ａｓｉＲＮＡに適用した。結果として得られたＲＮＡ分子（細胞透過性長鎖非対称ｓｉＲＮＡ（ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ）と呼ぶ）は、効率的な標的遺伝子サイレンシングを示した。アムロジピン及びシルニジピンを含むＣＴＧＦ（ｃｐ−ｌａｓｉＣＴＧＦ）を標的とするｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡをＨｅＬａ細胞に処置した。それらの遺伝子サイレンシング活性をｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した（図６）。アムロジピン及びシルニジピンなどのＬ型カルシウムチャネル遮断薬は、用量依存的様式でｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡの遺伝子サイレンシング効果を向上させるのに役立つ。これらの結果は、Ｌ型カルシウムチャネル遮断薬が種々の形態のｃｐ−ａｓｉＲＮＡに作用して標的遺伝子サイレンシングの有効性を改善することを裏付ける。
【００７０】
ｃｐ−ｌａｓｉＲＮＡ配列情報（配列番号１４５及び１４６、「ｍ」：ＯＭｅ修飾、「＊」：ホスホロチオエート（ＰＳ）修飾、及び「ｃｈｏｌ」：コレステロール修飾）。
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【００７１】
ＣＴＧＦ及びＧＡＰＤＨプライマー配列情報（配列番号１４７〜１５０）
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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