(57)【要約】  本発明は、プライマー依存的核酸増幅法のためのマルチパートプライマーを開示する。このような方法のための、多重アッセイ方法、関連する試薬キットおよびオリゴヌクレオチドも開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０，０００コピーの関連野生型標的配列の存在下で少なくとも２つの異なる目的とする類縁希少突然変異体ＤＮＡ標的配列のそれぞれの僅か１０コピーを試料中で増幅および検出可能である多重アッセイ法において、前記突然変異体標的配列が、僅か一塩基多型により、互いに、および前記野生型配列とは異なり、
（ａ）非対称プライマー依存的増幅反応混合物を調製することであって、前記試料と、ＤＮＡポリメラーゼと、デオキシリボヌクレオシド三リン酸と、増幅に必要とされる他の試薬と、識別可能に標識される均一な蛍光検出プローブ、例えば各希少突然変異体標的配列の増幅産物に特異的である分子ビーコンプローブと、前記類縁突然変異体標的配列に対する過剰濃度の共通の従来のリバースプライマーと、各目的とする希少突然変異体標的配列に対する限定濃度のユニークなマルチパートプライマーと、を含み、各マルチパートプライマーの配列が、５’から３’方向に、前記リバースプライマーの伸長によりコピーされる次の４つの近接ＤＮＡ配列：
前記共通のリバースプライマーにより開始されるアンプリコン鎖における相補体が、前記プローブの標的であり、個別に同定しようとする各標的配列または標的配列群にユニークである、何れの標的配列にも相補的ではないタグ配列と；
プライマーアニーリング中に、前記類縁突然変異体標的配列および前記関連野生型標的配列とハイブリッド形成可能であるように十分に長いアンカー配列と；
プライマーアニーリング中に前記プライマーの目的とする標的配列と、何らかの他の類縁突然変異体標的配列と、またはプライマーアニーリング中に前記関連野生型標的配列とハイブリッド形成しない、少なくとも６ヌクレオチド長のユニークなブリッジ配列と；
７〜１４ヌクレオチド長であり、前記目的とする標的配列と完全に相補的であるが、他の各突然変異体標的配列および前記関連野生型配列と１個以上のヌクレオチドにより互いにミスマッチがあり、これらのうち少なくとも１個が３’末端ヌクレオチドまたは前記３’末端の最後から２番目のヌクレオチドである、ユニークなフット配列と、
を含み、
（ｉ）前記マルチパートプライマーのアンカー配列およびフット配列が両方ともその目的とする標的配列とハイブリッド形成する場合、その標的配列中に、プライマーアニーリング中に前記プライマーのブリッジ配列とハイブリッド形成しない少なくとも８ヌクレオチド長の介在配列があり、前記ブリッジ配列および前記介在配列が得られたハイブリッド中で１８〜４０ヌクレオチドの周縁を有するバブルを生成させ、
（ｉｉ）前記マルチパートプライマーのアンカー配列およびフット配列が両方とも前記目的とする標的配列とハイブリッド形成する場合、前記バブルが、前記アンカー配列のハイブリッドから前記フット配列のハイブリッドを分離し、分離されたフット配列ハイブリッドが、従来のプライマーを使用して生じるＣＴと比較した場合、閾値（ＣＴ）において少なくとも５サイクルの遅延により明らかにされるように、前記目的とする標的配列のコピーの可能性を低下させる弱いハイブリッドであり、
（ｉｉｉ）ＰＣＲ増幅中にその目的とする標的配列に対する前記マルチパートプライマーが何らかの類縁突然変異体標的配列または前記関連する野生型標的配列のコピーを開始する可能性が、少なくとも１０回の熱サイクルの閾値の差（ΔＣＴ）により明らかなるように、その目的とする標的配列のコピーを開始する可能性よりも少なくとも１，０００倍低く；
（ｉｖ）アンプリコン鎖を生じさせたマルチパートプライマーが、前記アンプリコン鎖の相補鎖と完全に相補的であるブリッジおよびフット配列を有し；
（ｖ）その目的とする標的配列の介在配列の長さと一緒に、各マルチパートプライマーのブリッジ配列の長さおよび配列によって、６０サイクルの指数関数的増幅内で生じ、コピーを含有しない試料から観察されるＣＴとは識別可能である、僅か１０コピーのその目的とする標的配列を含有する試料に対する閾値（ＣＴ）が観察される、
非対称プライマー依存的増幅反応混合物を調製することと；
（ｂ）前記試料中に存在する前記類縁希少突然変異体標的配列を増幅させるために、前記反応混合物を反復してサイクル化し、リアルタイムまたはエンドポイント検出により各識別可能に標識されるプローブからの蛍光強度を測定することによって、これらの配列の存在を検出することと、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、サイクル化が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法での温度サイクル化であることを特徴とする、方法。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の方法において、前記増幅反応混合物が、アレル選択性促進試薬を含有せず、各マルチパートプライマーのフット配列が７〜９ヌクレオチド長であることを特徴とする、方法。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載の方法において、前記増幅反応混合物が、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）または別のアレル選択性促進試薬を含有し、各マルチパートプライマーのフット配列が８〜１０ヌクレオチド長であることを特徴とする、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記フット配列が、１つ以上のヌクレオチドにより前記類縁野生型配列とミスマッチがあり、これらのうちの少なくとも１つが３’末端ヌクレオチドであることを特徴とする、方法。
【請求項６】
請求項２に記載の方法において、ある標的配列に対するＣＴ値が、何らかの他の標的配列に対する場合と同じ出発鋳型数に相当することを特徴とする、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、前記少なくとも２つの類縁突然変異体標的配列と類縁ではない参照野生型配列を増幅し、検出することを含み、前記プライマー依存的増幅反応混合物が、前記参照配列に対する、限定マルチパートプライマーと、過剰なリバースプライマーと、均一な蛍光検出プローブと、を含み、前記参照配列に対する前記マルチパートプライマーが、請求項１に記載の構造および機能的な制限を有し、前記参照配列に対する前記マルチパートプライマーのブリッジ配列の長さおよびヌクレオチド配列が前記突然変異体標的配列に対する前記マルチパートプライマーの配列と調和しており、各突然変異体標的配列に対して得られるＣＴ値と前記参照野生型配列に対して得られるＣＴ値との間の差が、前記試料中に存在するＤＮＡ量に関わりなく、前記参照野生型配列の存在量に対するその突然変異体標的配列の存在量を反映するようになることを特徴とする、方法。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか一項に記載の方法において、前記反応混合物のサイクル化が機器により行われ、標的配列の数が、前記機器が個別に検出し得る色の数を超え、複数の異なるプローブが、同じフルオロフォアを有するが異なる融解温度を有する温度特異的ハイブリッド形成プローブであることを特徴とする、方法。
【請求項９】
請求項１〜７の何れか一項に記載の高度多重アッセイ法において、増幅および検出がデジタルＰＣＲ法であり、前記プローブが、色分けされた分子ビーコンプローブであることを特徴とする、高度多重アッセイ法。
【請求項１０】
請求項１〜７の何れか一項に記載の高度多重スクリーニングアッセイ法において、増幅および検出が分光蛍光分析サーマルサイクラーにおいて行われ、前記プローブが色分けされた分子ビーコンプローブであることを特徴とする、高度多重スクリーニングアッセイ法。
【請求項１１】
前記少なくとも２つの類縁希少突然変異体標的配列のうち何れかの１０コピー未満を増幅および検出可能である請求項１に記載の方法において、マルチパートプライマーアンカー配列および前記突然変異体標的配列により形成されるハイブリッドが、前記共通のリバースプライマーおよび前記突然変異体標的配列により形成されるハイブリッドのＴｍよりも低い融解温度（Ｔｍ）を有し、段階（ｂ）の前に、前記リバースプライマーを利用した直線的増幅の多重サイクルが、前記共通のリバースプライマーはハイブリッド形成するが、前記マルチパートプライマーのハイブリッド形成の可能性が非常に低いプライマーアニーリング温度を使用して行われ、段階（ｂ）が、前記マルチパートプライマーおよび前記共通のリバースプライマーがハイブリッド形成する温度より低いプライマーアニーリング温度を使用して行われることを特徴とする、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか一項に記載の増幅および検出を行うのに十分な試薬を含むことを特徴とする、試薬キット。
【請求項１３】
請求項１〜１１の何れか一項に記載の増幅および検出を行うために必要とされるプライマーおよびプローブを含むことを特徴とする、オリゴヌクレオチドのセット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、２０１６年４月７日提出の米国特許仮出願第６２／３１９，３３２号明細書の優先権を主張する。この出願の内容はその全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、核酸増幅および検出アッセイ、例えばＰＣＲ増幅および検出方法およびプライマー、反応混合物およびこのような方法のためのキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
臨床試料中に存在することが癌診断、予後判定および有効な治療選択の指標に有用である非常に希少な突然変異を非常に早期のステージで検出することができることは、念願の医学的目標となっている。適切な体細胞突然変異の検出および定量的評価には複数の用途があり、これには、（ｉ）癌を生成させる可能性がより高い遺伝子を受け継ぐ患者における処置可能なステージでの癌の検出；（ｉｉ）それらが現在転移し得ることを示す良性癌細胞における突然変異の検出；（ｉｉｉ）処置中の癌細胞の存在量の測定；および（ｉｖ）処置中に薬物耐性癌細胞が生じたか否か、つまり治療が調整され得るか否か、に関する判定が含まれる。さらなる目標は、異なる希少突然変異の存在量を同時に測定し得る多重アッセイを可能とする方法を開発することである。このようなアッセイが利用可能となった場合、癌は、致死的であることが多い疾患から、治療調整の個別化と組み合わせて頻繁に検査することにより、管理可能な慢性状態へと変換され得る可能性がある。
【０００４】
これらの試みにおいて最優先されることは、癌細胞が、それらが身体のどこに位置するものでも、頻繁に分裂し、アポトーシスおよび壊死が起こり、その結果として、これらの癌細胞由来のゲノムＤＮＡ断片が各患者の血漿中に存在するようになることであるという理解である。この理解によって、血漿から単離されるＤＮＡを利用して、「液体生検」を行うことにより、癌診断、予後および処置の指標となる希少な突然変異の存在が非常に早期のステージで検出および定量され得る可能性が切り開かれる。アッセイ設計者が直面する難問は、全身の正常細胞由来の多量の関連野生型配列断片の存在にもかかわらず、および様々な細胞において生じるものの、様々な関連する突然変異が同じまたは隣接コドンにおいて生じることが多いという事実にもかかわらず、血漿ＤＮＡ中でこれらの希少な突然変異体配列断片を選択的に検出し、定量する手段を発見することである。血漿ＤＮＡ中の希少突然変異体配列断片の検出に対する「次世代」シーケンシングの成功は、複雑で高コストであるものの、このアプローチの価値を示している（例えばＭｕｒｔａｚａら（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  ４９７：１０８−１１２参照）。
【０００５】
ポリメラーゼ連鎖反応など、核酸標的配列の指数関数的増幅に基づく分子診断アッセイは安価であり、１つしかない鋳型分子からシグナルを生成させるのに十分感度が高い。従来から、増幅反応条件下で、プライマー−アニーリング段階中に最初に、プライマーが核酸鎖中の１カ所のみに行くように十分に長いプライマーを作製することによって特異性が得られる。標的配列間で区別するために、分子ビーコンプローブなどのアレル特異的なハイブリッド形成プローブが一般的に使用される。別のアレルとの混合物中に存在する一塩基多型（ＳＮＰ）、例えば野生型（ＷＴ）変異体など、調べている配列がアレルである場合、プローブの使用による識別は、高頻度アレルの増幅が希少アレルの増幅を圧倒する傾向ゆえに、実際的な検出限界は約３％（１０，０００分子の別のアレルの存在下で少なくとも約３００の標的アレル分子というアレル選択性）である。
【０００６】
研究者らは、増幅アッセイの選択性を改善するために増幅プライマーの改変にとりかかっている。アレル選択性が高いプライマーによって、それらの間の相違がＳＮＰである場合でさえも存在する、はるかに多量の野生型配列の増幅を同時に抑制しながら、突然変異体ＤＮＡ配列の指数関数的増幅が可能になる。従来の増幅プライマーを単純に短縮化することによって、そのアレル選択性が改善されるが、その改善は特異性を犠牲にするので、アレルの混合物を分析することについての価値は限られたものになる。プライマーの他の修飾は、特異性を保持しながらそれらの選択性を改善するために開発されてきた。このようなアプローチの１つはＡＲＭＳ（「増幅不応性突然変異系（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）」）である。ＡＲＭＳプライマーは、調べている配列変異体に対して相補的であるが、別の１つまたは複数のアレルに対してミスマッチがある３’末端ヌクレオチドを有する。Ｎｅｗｔｏｎら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：２５０３−２５１６；およびＦｅｒｒｉｅら（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．５１：２５１−２６２を参照のこと。ＡＲＭＳはある種のＤＮＡポリメラーゼの不応性に依存し、すなわち、このようなミスマッチがあるプライマー標的ハイブリッドを伸長させない傾向に依存する。ＡＲＭＳは、接合状態（ホモ接合ＷＴ、ヘテロ接合またはホモ接合突然変異体（ＭＵＴ））を判定するために有用であることが示されているが、他の使用に対して実際的な検出限界は約１％（１０，０００分子の別のアレルの存在下で少なくとも約１００個の標的アレル分子）である。
【０００７】
他のアプローチは、突然変異体配列に対するプライマーが突然変異体配列とハイブリッド形成し、その増幅につながるが、対応する野生型配列とはハイブリッド形成する可能性が低く、それによりその増幅を抑制する可能性を低下させようとするものである。いくつかのプライマー設計は、それらが、突然変異体標的と完全に相補的であるプライミング配列を保持するが、対応する野生型配列とミスマッチがある内部の照合ヌクレオチドを含有するという共通点がある。このような設計の中で特に、二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）プライマー、ＭｙＴプライマー、ヘアピンプライマーおよびＰＡＳＳプライマーがある。それらのプライミング配列の長さは、アニーリング条件下で完全に相補的な突然変異体ハイブリッドが形成される可能性が高く、したがってアンプリコンの生成につながる可能性が高くなるように選択され、一方でミスマッチがある野生型ハイブリッドが形成される可能性ははるかに低く、したがってアンプリコンの生成につながる可能性がかなり低い。ＰＣＲ−クランプまたはヘアピンオリゴヌクレオチドブロッカーの使用を含む代替的アプローチは、突然変異体配列に結合する従来のＤＮＡプライマーおよび野生型配列に選択的に結合するように設計されている「アンチプライマー」の両方を含有する混合物を利用し、それによって野生型アンプリコン合成開始が妨げられる。しかし、これらのアプローチは全て、一般に突然変異体配列の検出に適用可能であるものの、非常に希少な突然変異体を検出するには感度が十分ではなく、それらの配列中の非天然ヌクレオチドの存在ゆえにリアルタイムＰＣＲと適合性でないか、または異なる標的突然変異が同じコドン中に生じる場合、多重リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて定量的判定を可能にすることが示されていないかの何れかである。
【０００８】
発明者らは、ＰＣＲアッセイにおける構造および使用が国際公開第２０１４／１２４２９０Ａ１号明細書として２０１４年８月１４日に公開されている同時係属特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０１５３５１号明細書に記載されている、発明者らが「ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅ」プライマーと呼ぶマルチパートプライマーを開発した。発明者らは、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーが「特異的」（ゲノム中の適正な位置に行った）かつ非常に「選択的」（野生型または標的配列と類似の他の多量の配列を拒絶）であった、リアルタイムモノプレックスＰＣＲアッセイを記載した。発明者らは、プラスミドＤＮＡおよび１０００，０００個の野生型アレルを含有する混合物中で僅か１０個の突然変異体アレルの検出に成功したＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを利用したリアルタイムモノプレックスＰＣＲアッセイを記載し、発明者らは、ＣＴ値のプロット対突然変異体コピーの出発数（鋳型）の対数が１００コピーを下回る直線性から逸脱していたものの、１０，０００個の野生型アレルを含有する試料中で１０個の突然変異体アレルの検出に成功したヒトＤＮＡおよびＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを利用したリアルタイムモノプレックスＰＣＲアッセイを記載した。しかし、発明者らは、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー設計および方法が僅か１０個の突然変異体標的配列を検出可能であった、類縁希少突然変異体標的配列に対する多重アッセイを示さなかったか、または多重アッセイを記載しなかった。
【０００９】
本発明の目的は、例えば、１０，０００個の細胞からの消化済みヒトＤＮＡを含有する試料中で、僅か１０コピーの少なくとも２つの類縁希少突然変異体ＤＮＡ標的配列を検出可能である、例えばＰＣＲアッセイなど、プライマー依存的アッセイである。
【００１０】
本発明の別の目的は、突然変異体配列に関連する野生型配列であれ、または非関連野生型配列であれ、参照野生型標的配列の増幅および検出を含むこのようなアッセイである。
【００１１】
本発明の別の目的は、突然変異体標的配列が検出されるか否かにかかわらず、各標的配列に対して得られるＣＴ値が試料中に存在するそのコピー数を反映する、先行する段落の何れかで記載されるようなアッセイである。
【００１２】
本発明の別の目的は、例えば１０，０００個の細胞からの消化済みヒトＤＮＡを含有する試料中で、１０コピー未満、例えば５コピーまたはさらに３コピーの少なくとも２つの類縁希少突然変異体ＤＮＡ標的配列を検出可能であるＰＣＲアッセイなど、プライマー依存的アッセイである。
【００１３】
本発明の別の目的は、ＰＣＲ増幅、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーおよび均一な蛍光検出プローブ、例えば分子ビーコンプローブなどを使用する多重アッセイ法であり、この方法は、マルチカラーリアルタイム分光蛍光分析ＰＣＲサーマルサイクラーを使用して、一群の関連突然変異、例えば、２〜６群の関連癌突然変異を検出することが可能である。
【００１４】
本発明の別の目的は、マルチカラーリアルタイム分光蛍光分析ＰＣＲサーマルサイクラー、ＰＣＲ増幅、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーおよび温度特異的ハイブリッド形成プローブ、好ましくは均一なプローブおよび最も好ましくは分子ビーコンプローブを用いた定性的な多重アッセイ法であり、これは、色および融解温度の組み合わせに基づいて各標的配列を同定することによってサーマルサイクラーが区別し得る色の数より多くの標的配列（例えば、１２、２０または３５）を検出可能である。
【００１５】
本発明の別の目的は、検出機器が区別し得る色の数よりも多くの標的配列（例えば、１２、２０または３５）を検出可能である、色分けされた分子ビーコンプローブを使用した定量的多重ドロップレットデジタルＰＣＲアッセイ法である。
【００１６】
本発明のまた別の目的は、マルチカラーリアルタイム分光蛍光分析サーマルサイクラー、ＰＣＲ増幅、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーおよび試料中に存在する多くの（例えば１５または３５）の可能性のある標的配列のうち何れか１つの標的配列を検出可能である色分けされた分子ビーコンプローブを使用したスクリーニングアッセイである。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、突然変異体標的配列が互いにおよびそれらの関連する野生型配列と僅か一塩基多型により異なる、１０，０００コピーの関連野生型標的配列の存在下で、少なくとも２つの異なる類縁の目的とする希少突然変異体ＤＮＡ標的配列のそれぞれの僅か１０コピーを、ゲノムＤＮＡ断片含有試料中で検出可能である、多重アッセイ法を含む。突然変異は、それらが別個のプライマー対を用いたＰＣＲ増幅に適しておらず、それらの増幅産物（アンプリコン）が交差ハイブリッド形成しヘテロ２本鎖を形成可能である場合、「類縁」である。類縁突然変異は、異なる細胞でよく生じ得る一方で、同じコドンもしくは隣接コドンに位置するか、またはそれらは最大数個のコドンによって分離され得る突然変異を含む。類縁突然変異は、僅か一塩基によって、互いに、およびそれらの関連する野生型配列とは異なり得る。野生型配列と突然変異体配列との間の一塩基の相違は、一塩基多型（ＳＮＰ）と呼ばれることが多い。
【００１８】
本発明によるアッセイ法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法などの非対称プライマー依存的増幅法によって、試料中に存在するならば、各類縁突然変異体配列を選択的に増幅させることおよび、少なくとも１つの蛍光標識されるプローブを利用する蛍光検出によって各突然変異体標的配列から増幅産物（アンプリコン）を個別に検出することを含む。本発明による方法は、定性的または定量的であり得る。いくつかの定量的方法において、リアルタイムＰＣＲ閾値（または閾値サイクル数、ＣＴ）は、試料中に存在する突然変異体標的配列の量を反映する。ある種の実施形態は、参照野生型遺伝子配列を増幅させることをさらに含み、これは、検出しようとする突然変異体配列または試料中に存在するがこの突然変異体配列とは関連がない参照野生型配列に関連する野生型配列であり得る。
【００１９】
本発明によるアッセイ法は、蛍光標識されるハイブリッド形成プローブによる検出のための標的となる５’−タグ配列を有するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを利用する。異なるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーにおいてユニークな５’−タグ配列（特定のアッセイにおいてそれぞれ全ての他の５’タグ配列とは異なる）を含むことおよび各異なる５’−タグ配列の相補体を標的とする識別可能に標識されるプローブを含むことによって、プローブハイブリッド形成の検出は、どのタグ配列が、およびゆえにどのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーが増幅されたかを同定する。好ましいハイブリッド形成プローブは、未結合プローブを取り除くことなくハイブリッド形成が検出可能である均一な検出プローブである。好ましい蛍光標識はフルオロフォアである。発明者らの最も好ましい均一な検出プローブは、少なくとも１つのフルオロフォアで標識され、非蛍光クエンチャーでも標識される分子ビーコンプローブである。
【００２０】
本発明によるアッセイ法は、ゲノムＤＮＡ断片を含有する試料中で、多量の野生型配列の存在下で選択される野生型配列の少なくとも２つの類縁突然変異の存在を検出可能な多重アッセイである。実施形態によって様々な目的および特性を有する。
【００２１】
ある種の実施形態は、それらの目的として、試料中に存在し得るいくつかの類縁突然変異のうち何らかの１つ以上の検出を有する。このようなアッセイのための反応混合物は、各突然変異体標的配列に対する異なるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーおよび、任意選択により、定量目的の場合は非関連野生型遺伝子配列を含み、各ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーは、相補体が識別可能な蛍光プローブに対する標的である異なる５’−タグ配列を有する。多くのこのような実施形態は、各標的配列に対する、異なる均一な検出プローブ（アッセイにおけるその標的へのハイブリッド形成が検出可能なプローブ）、好ましくは異なる分子ビーコンプローブを利用した均一な検出を含む。発明者らにとって、異なる各分子ビーコンプローブが異なる５’−タグ配列の相補体に特異的であり、反応中で他の蛍光プローブと識別可能であるフルオロフォアで標識されることが好ましい。このような方法は一般的に、分光蛍光分析サーマルサイクラーにおいて行われ、これにより、識別可能な色の数が、最大８または時には１０に制限される（一般的に使用されるサーマルサイクラーは５色機器である）。他の実施形態は、それらの目的として、何れか１つ以上の群の突然変異の検出を有し、１つの群における１つ以上の突然変異の存在は、技術的に重要であり、例えば癌患者の処置に関して重要である。このような方法は、一般的には分光蛍光分析サーマルサイクラーにおいて行われ、これにより、識別可能な色の数が最大１０に制限される（一般的に使用されるサーマルサイクラーは５色機器である）。このようなアッセイのための反応混合物は、各突然変異体標的配列に対する異なるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーおよび、任意選択により定量目的の場合は非関連野生型遺伝子配列を含み、群中の各ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーは同じ５’−タグ配列を有し、各群は異なる５’−タグ配列を有し；反応混合物は、異なる各５’−タグ配列の相補体を標的とする、識別可能に異なるフルオロフォア標識ハイブリッド形成プローブ、好ましくは未結合プローブを取り除くことなくハイブリッド形成が検出可能である均一検出プローブ、最も好ましくは分子ビーコンプローブを含む。
【００２２】
また他の実施形態は、分光蛍光分析サーマルサイクラーの色の数を超える数の中から、何らかの１つ以上の突然変異体標的配列または一群の標的配列の検出能を有する多重アッセイである。これらの実施形態のうちある種のものは、発明者らが「温度特異的」ハイブリッド形成プローブ、好ましくは分子ビーコンプローブと呼ぶものを使用し、これらのプローブ標的ハイブリッドは異なる融解温度（Ｔｍ）を有する。例えば３５種類の異なる標的配列のうち１つ以上の存在について液体生検試料を５色分光蛍光分析サーマルサイクラー上で検査しようとする場合、異なる標的配列にそれぞれ特異的な３５種類の異なるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを７個ずつ５セットに分け得る。５セットのうちそれぞれの中の７個は全て、分子ビーコンプローブなど、相補性配列が７つの異なる温度特異的ハイブリッド形成プローブに対する標的である５’タグを有し、これらのうち全てが同じフルオロフォアで標識されるが、これらは全て、識別可能なＴｍを有するプローブ標的ハイブリッドを生成させる。したがって、３５種類の異なる標的配列のそれぞれ１つは、存在するならば、蛍光色および増幅後（エンドポイント）熱分析で決定されるＴｍの組み合わせによって同定され得る。
【００２３】
また他の実施形態は、その目的が、多くの異なる突然変異体標的配列のリストからのどの突然変異体標的配列が試料中に存在するかを決定することまたはこれらの突然変異体標的配列のうちその試料中に存在するものがないことを決定することである、多重アッセイタイプのスクリーニングアッセイである。これらのアッセイにおいて、どの突然変異体標的配列が存在するにしても、指数関数的に、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応において増幅され、得られるアンプリコン（突然変異体標的配列が試料中に存在した場合にのみ生成）は蛍光標識されるハイブリッド形成プローブで検出される。このような実施形態において、可能性のある各突然変異体標的配列に対して、異なる５’−タグ配列を有するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーがある。通常、リスト上の突然変異体標的配列の数は、検出機器が区別し得る異なる蛍光色の数を超え、これが起こる場合、結果として生じるアンプリコンに組み込まれるようになり得る異なる５’−タグ配列相補体のそれぞれを検出するためのアッセイにおいて異なるように色分けされた分子ビーコンプローブが存在する（色分けされた分子ビーコンの記載については国際公開第２００４／０９９４３４Ａ３号パンフレットを参照）。これらのスクリーニングアッセイにおけるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの使用によって、多量にある関連野生型配列からの妨害なく、希少突然変異体標的配列が検出可能になる。
【００２４】
また他の実施形態は、デジタルＰＣＲアッセイ法であり、これには、サーマルサイクラーにおいて多くの異なる反応ウェル中で行われるアッセイおよびサーマルサイクラーにおいて多くの異なるドロップレットで行われるドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）アッセイが含まれ；両ケースにおいて、得られるアンプリコンの検出は、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  ＱＸ２００（商標）ドロップレットデジタルＰＣＲＳｙｓｔｅｍまたはＳｔｉｌｌａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｎａｉｃａ（商標）Ｓｙｓｔｅｍなど、別個の検出機器で行われることが多い。このような方法は、多くの、例えば１５または３５個の標的配列のそれぞれに対して、反応において全ての他の５’−タグ配列とは異なる５’−タグ配列を有するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを利用する。異なる標的配列のそれぞれに対して、その５’−タグ配列の相補体を標的とする色分けされた分子ビーコンプローブがある。デジタルＰＣＲは、反応混合物を非常に多くのウェルまたはドロップレットにさらに分けることを含むので、各ウェルまたはドロップレットは１つの標的分子のみを含有するかまたは標的分子を全く含有しない可能性が非常に高く、このような方法は定量的である。
【００２５】
（ｄｄＰＣＲの記載により本明細書で説明される）デジタルＰＣＲアッセイの基礎となる基本原理は、標的ＤＮＡ分子が１つだけドロップレット中に存在する（またはドロップレット中に標的分子が存在しない）ような程度に試料を希釈し得、多数のドロップレットがあるということである。次に、各ドロップレット中で同時ＰＣＲ増幅が行われ、各ドロップレット中に存在する蛍光標識プローブがそのドロップレットで生成されるアンプリコンに結合し（それが標的分子を含有する場合）、特定の色コードで鮮やかに蛍光性となり、これにより、両方、ドロップレットが標的分子を含有したことが示され、それがどの標的配列であったかが同定される。同じ色コードで光を発するドロップレットの数は、元の試料中の対応する標的分子の数の正確な目安を提供し；このアプローチは、試料中の１個の標的分子でさえ検出され得るほど感度が高い。
【００２６】
古典的なドロップレットデジタルＰＣＲは、癌診断、予後および治療に関連する希少体細胞突然変異を検出し、定量するために使用されてきた。Ｓａｎｍａｍｅｄら（２０１５）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．６１：２９７−３０４を参照。希少突然変異体標的分子をはるかに多くの関連野生型分子から分離するために、１００万を超えるドロップレットが必要となる。例えばＨｉｎｄｓｏｎら（２０１１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８３：８６０４−８６１０を参照。この多数のドロップレットが必要であるのは、試料中に（野生型標的との相違が僅かに一塩基多型によるものであることが多い）希少関連突然変異体標的の数よりもさらに多くの野生型標的があるから、および（突然変異を含有するアンプリコン内のサブ配列に結合するように設計される）プローブが関連野生型標的から生成されるアンプリコン中の対応する配列に結合することがあるので、突然変異体標的を含有するドロップレットが１つ以上の関連野生型標的も含有する可能性が極めて低くなるよう、非常に多くのドロップレットを有することが所望されるからである。これにより、ドロップレット中で生じるシグナル強度が、生じたとしたら突然変異体標的配列を含有したドロップレットで生じたシグナルの強度と同様となり、その結果、ドロップレットが誤って、関連突然変異体標的を含有するとみなされるということとなるように十分な野生型標的を含有するドロップレットがないことが確実になる。言い換えれば、元の試料が分割されているドロップレット数が少なすぎると、いくつかの野生型標的配列を含有し、関連突然変異体標的配列を含有しないドロップレットが、突然変異体標的を含有すると誤解される。
【００２７】
しかし、試料中で希少突然変異体標的分子を検出するためにＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを使用するデジタルＰＣＲ実施形態が行われる場合、必要とされるドロップレットははるかに少なく（例えば僅か２０，０００〜３０，０００個のドロップレット）、これは、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーがドロップレット中にまた存在し得る比較的少ない関連野生型ＤＮＡ分子から検出可能なアンプリコンを生成させないからである。このようなデジタルＰＣＲアッセイにおいて、検出は、サーマルサイクラーにおいて、フローサイトメトリーにおいて、または顕微鏡で行われ得る。
【００２８】
類縁突然変異体配列を選択的に増幅するために、本発明による方法は、発明者らが、突然変異体標的配列のそれぞれに対して、これを「ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅ」プライマーと呼んでいる様々なマルチパートプライマーおよび好ましくは従来のＰＣＲプライマーである共通リバースプライマーを利用する。関連野生型配列を増幅するためにも、本発明による方法は、その配列に対するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーおよび同じ共通リバースプライマーを利用する。例えば非関連突然変異体または野生型配列など、非関連配列を増幅するためにも、本発明による方法は、その配列に対するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーおよび個別のリバースプライマーを利用する。
【００２９】
ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーは、ＰＣＲ増幅における機能が２つの部分に分けられるマルチパートオリゴデオキシリボヌクレオチドである。関心のある遺伝子に効率的に結合する機能は、（発明者らが「アンカー配列」または「アンカー」と呼ぶ）比較的長い配列セグメントに割り当てられ、検出しようとする突然変異を含有するその遺伝子内の近くのサブ配列に選択的に結合し、次に、アンプリコンの合成を開始させる機能は、別個の短い３’配列セグメントに割り当てられる（発明者らはこれを「フット配列」または「フット」と呼ぶ）。その機能と一致して、アンカー配列は、ＰＣＲサイクルのプライマー−アニーリング段階中にプライマーの目的とする標的配列と強いハイブリッドを形成するように設計される。これに関連して、それは、機能および長さが従来のＰＣＲプライマーと同様である。フット配列は、プローブの目的とする標的配列と完全に相補的であるが、類縁突然変異体標的配列であれまたは関連野生型配列であれ、類縁標的配列とは１つ以上のヌクレオチドによりミスマッチがある短い配列セグメントである。類縁突然変異体標的配列または関連野生型配列とミスマッチがあるフットにおける各ヌクレオチドは「インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチド」である。ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーにおいて、アンカーがさらなる、多くの実施形態においては比較的長い、配列セグメント（発明者らは「ブリッジ配列」または「ブリッジ」と呼ぶ）によりフットから分離される。ブリッジは、二次構造を形成せず、フットに対する標的配列にアンカーに対する標的配列を連結する鋳型分子中の「介在配列」に相補的でないことを確実にするように選択される。結果的に、プライマーが鋳型分子とハイブリッド形成する場合、プライマー中のブリッジ配列および鋳型中の介在配列は、アンカーハイブリッドの効率的な形成をフットハイブリッドの形成から機能的に分ける１本鎖「バブル」を形成する。ヌクレオチドにおけるバブルの周縁は、ブリッジ配列の長さ＋介在配列の長さ＋４である。得られるプライマーは二機能性であり：プライマー−アニーリング条件下で、長い５’アンカー配列はプライマーを効率的におよび特異的に標的ＤＮＡ断片中に存在する関心のあるゲノム領域に結合させることが可能であり、一方で（１つまたは複数のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドを保持する）短い３’−フット配列は、ブリッジ配列によりアンカー配列へ係留されるので、その目的とする標的配列と、弱い、完全に相補的であるハイブリッドを形成可能である。その長さが短いがゆえに、フットは、それが関連野生型配列であれ、またはその配列の異なる突然変異であれ、類縁標的配列との、非常に弱い、ミスマッチがあるハイブリッドを形成する可能性が低い。
【００３０】
ＰＣＲアッセイにおいて、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーが、分析している元の試料に存在するＤＮＡ鋳型に結合する場合、選択的段階が行われる。ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのフット配列がアンプリコンの合成を開始したら、（「人工的」ブリッジ配列を含む）ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの配列全体が（＋）アンプリコンに組み込まれる。指数関数的増幅の続く熱サイクルにおいて、得られるアンプリコンは、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー配列全体または、（−）アンプリコンに完全に相補的である長い従来のプライマーとして働く、少なくともブリッジおよびフット配列を用いて、通常の方法で効率的に増幅される。
【００３１】
発明者らの同時係属特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０１５３５１号明細書（国際公開第２０１４／１２４２９０Ａ１号パンフレット、公開日２０１４年８月１４日）において、発明者らは、全般的にＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを開示し、ｄｓＤＮＡ結合色素であるＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎでの検出を使用した、モノプレックス対称ＰＣＲアッセイでのそれらの使用を例示する。そこに記載されるように、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーは、３個の近接するＤＮＡ配列（５’から３’方向）：アンカー配列、ブリッジ配列およびフット配列、を有し、次のようなある一定の構造および機能基準に合致するマルチパートプライマーである：
・アンカー配列は、プライマーアニーリング中に、検出しようとする突然変異体標的配列と、また対応する野生型配列とも、ハイブリッド形成し、一般的には１５〜４０ヌクレオチド長であるハイブリッドを形成する。
・少なくとも５ヌクレオチド長、好ましくは６〜７ヌクレオチド長であり、検出しようとする突然変異体標的配列と完全に相補的であるが、対応する野生型配列およびその野生型配列の別の突然変異と１個または２個のヌクレオチドによりミスマッチがあるフット配列である。
・ブリッジ配列は、少なくとも６ヌクレオチド長であり、プライマーアニーリング中に検出しようとする突然変異体標的配列とまたは対応する野生型配列と、またはその野生型配列の別の突然変異と、ハイブリッド形成しない。
・アンカーおよびフット配列が、検出しようとする突然変異体標的配列とハイブリッド形成する場合、標的配列において、プライマーアニーリング中にブリッジ配列とハイブリッド形成しない少なくとも８ヌクレオチド長の介在配列があり、ブリッジおよび介在配列が一緒に、１６〜５２ヌクレオチドの周縁を有するハイブリッド中のバブルを生成させる。
・バブルの周縁およびフットの長さにより、従来のＰＣＲプライマーを使用した場合と比較して、一般的には２〜１０の熱サイクルの閾値サイクル数（ＣＴ）における遅延により明らかになるように、目的とする標的配列のコピーを生じさせる可能性が低い弱いフット／標的配列ハイブリッドが生じる。
・１０６コピーの突然変異体標的配列または１０６コピーの対応する野生型配列の何れかで開始するＰＣＲ増幅中に、プライマー／野生型配列ハイブリッドが伸長される確率は、少なくとも１０サイクル、好ましくは少なくとも１２サイクルの閾値サイクル数の差異（ΔＣＴ）により明らかになるように、プライマー／標的配列ハイブリッドが伸長される確率よりも少なくとも１，０００倍低い。
【００３２】
１０，０００コピーの関連野生型標的配列の存在下で、ゲノムＤＮＡ断片を含有する試料中で、少なくとも２種類の異なる類縁の目的とする希少突然変異体ＤＮＡ標的配列のそれぞれの僅か１０コピーを検出可能である、以下の実施例６〜１０に記載のものなど、本発明による多重アッセイ法での使用の場合、各突然変異体標的配列に対するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーは、５’から３’方向でリバースプライマーの伸長によりコピーされる４つの近接するＤＮＡ配列を含むマルチパートプライマーである。実施例６〜１０で使用される場合、これらの配列は次のとおりである：
（１）マルチパートプライマー配列の５’セグメントは、プライマーアニーリング中に試料中の何れの標的配列ともハイブリッド形成しないテイルである。多重アッセイ中の各テイルはユニークである。共通のリバースプライマーの伸長により生成されるその相補体は、フルオロフォア標識プローブに対する標的となる。発明者らは、このテイルを「タグ配列」または「タグ」と呼ぶ。タグは、その相補体がプローブの標的となり得るように十分に長い。プローブは、そのハイブリッド形成が検出可能な蛍光シグナルにつながる、均一な検出プローブである。このようなプローブのタイプは周知である。これらは、フルオロフォアで標識される少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。プローブは、例えば分子ビーコンプローブ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、ＦＲＥＴプローブ（フルオロフォア標識ドナーオリゴヌクレオチドおよびフルオロフォア標識またはクエンチャー標識アクセプターオリゴヌクレオチド）、陰陽プローブ、ＲｅｓｏｎｓｅｎｓｅプローブまたはＥｃｌｉｐｓｅプローブであり得る。発明者らの好ましい検出プローブは分子ビーコンプローブである。
（２）タグ配列に直接隣接するのはアンカー配列であり、上で記載される。アンカー配列は、ＰＣＲ増幅中に、ＰＣＲサイクルのプライマーアニーリング段階中にそれがハイブリッド形成するように十分長い。アンカー配列は、それが従来のＰＣＲプライマーに関するものと類似であるプライマーアニーリング条件下で強いハイブリッドを形成するほど十分に長い。類縁突然変異体標的配列に対するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーは同じアンカー配列を含み得るか、またはそれらのアンカー配列は僅かに異なり得る。このようなプライマーが含まれる場合、同じものが関連野生型配列に対するプライマーに適用される。
（３）アンカー配列に直接隣接するのはブリッジ配列である。ブリッジ配列は、類縁突然変異体標的配列であれ、または関連野生型配列であれ、プライマーの突然変異体標的配列に対して、または何らかの類縁標的配列に対してハイブリッド形成しないユニークな配列である。本発明の方法で利用されるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーにおいて、ブリッジは少なくとも６ヌクレオチド長である。これは１８ヌクレオチド長を超えず、一般に１５ヌクレオチド長を超えず、ある一定の好ましい実施形態において９〜１３ヌクレオチド長である。アンカー配列が標的配列とハイブリッド形成する場合、ブリッジ配列は、発明者らが以下でさらに記載する「介在配列」と呼ぶ標的における配列と正反対であるがハイブリッド形成しない。
（４）ブリッジ配列に直接隣接し、プライマーの３’末端を構成するのはフット配列である。実施例６〜１０に記載のように本発明の方法で利用されるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーにおいて、フット配列は、６〜１０ヌクレオチド長、好ましくは７〜９ヌクレオチド長であり、プライマーの目的とする突然変異体標的配列と完全に相補的であるが、突然変異体標的配列であれ、または関連野生型標的配列であれ、発明者らが「インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチド」と呼ぶ１個以上のヌクレオチドにより類縁標的配列と互いにミスマッチがあるユニークな配列である。少なくとも１個のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドは、フット配列の３’末端ヌクレオチドまたはそれに隣接するヌクレオチド（３’末端の最後から２番目のヌクレオチド）である。ブリッジ配列およびフット配列は、プライマーアニーリング中に混合物中の何らかの他の類縁希少突然変異体標的配列、それらの対応する野生型標的配列またはあらゆる非標的配列を一緒にプライミングしない。
【００３３】
アレル選択性促進試薬の使用を含み、ゲノムＤＮＡ断片を含有する試料中で、１０，０００コピーの関連野生型標的配列の存在下で少なくとも２つの異なる類縁の目的とする希少突然変異体ＤＮＡ標的配列のそれぞれの１０コピー未満を検出可能である以下の実施例１１〜１５に記載のような本発明によるアッセイ法での使用の場合、驚くべきことにＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー配列は幾分異なる。５’−タグ配列およびアンカー配列が上記のままである一方で、ブリッジおよびフット配列の長さについてはより柔軟性がある。短いフット配列、例えば７〜８ヌクレオチド長は、長いブリッジ配列、例えば１８ヌクレオチド長および結果的により長いバブル周縁と組み合わせて使用され得、逆に、より長いフット配列、例えば９〜１０ヌクレオチド長は、短いブリッジ配列、例えば１０ヌクレオチド長および結果的により短いバブル周縁と組み合わせて使用され得る。発明者らは、アレル選択性促進試薬塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）の最適量がこれらのケースのそれぞれで異なることを発見した。ＴＭＡＣが使用される場合、フットの長さは、７〜１４ヌクレオチド長、周縁は２４〜４０ヌクレオチド長となるはずである。
【００３４】
本発明による方法は、少なくとも２つの類縁突然変異体ＤＮＡ標的配列；ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸および増幅に必要とされる他の試薬；増幅し、検出しようとする各類縁標的配列については、限定濃度の上記のようなユニークなＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー；過剰濃度の類縁標的配列に対する共通の従来のリバースプライマー；および増幅し、検出しようとする各類縁標的配列については、識別可能に標識される蛍光検出プローブ、好ましくは均一な蛍光検出プローブ、最も好ましくは、その標的配列に対するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのタグの相補体に特異的である、分子ビーコンプローブを含有するかまたは含有し得る試料を含むポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅混合物など、非対称プライマー依存的増幅混合物を調製することを含む。アレル選択性促進試薬、例えばＴＭＡＣを使用する実施形態の場合、増幅混合物は、その試薬の有効濃度、好ましくは最適濃度も含む。このような反応混合物の調製は、適切である場合は、逆転写ＲＮＡ鋳型を含み得る。本発明による方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅による目的とする標的配列の増幅のために反応混合物を複数の熱サイクルに供し、リアルタイム検出により各識別可能に標識されたプローブからの蛍光強度を測定することによって増幅産物（アンプリコン）の存在を検出することを含む。
【００３５】
リアルタイム検出を伴うＰＣＲ増幅において、プローブのフルオロフォアの蛍光強度を複数の熱サイクル中に、例えばプライマーアニーリング段階中に観察する。閾値サイクル数（ＣＴ）は、プローブからの蛍光強度がバックグラウンド蛍光を上回り検出可能になる指数関数的増幅のサイクル数である。各ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅ限定プライマーの濃度は、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーおよび共通のリバースプライマーの両方を利用して、指数関数的増幅中にＣＴを得るのに十分である。共通リバースプライマーは過剰濃度であり、各ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーが使い尽くされた後のさらなるＰＣＲ熱サイクルによって、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのタグの相補体を含有する１本鎖アンプリコンが生成されるようになる。同様に標識されるプローブ、例えば分子ビーコンプローブ間で、それらの融解温度（Ｔｍ）の相違によってさらに識別する本発明の方法において、増幅後融解分析が含まれる。
【００３６】
本発明の方法において、マルチパートプライマーのアンカー配列およびフット配列が両方とも試料中のプライマーの目的とする標的配列とハイブリッド形成する場合、バブルがフット配列ハイブリッドをアンカー配列ハイブリッドから分離し、分離されたフット配列ハイブリッドは、従来のプライマーを使用して生じるＣＴと比較した場合、閾値（ＣＴ）での少なくとも５サイクルの遅延により明らかにされるように、目的とする標的配列をコピーさせる可能性が低い弱いハイブリッドである。試料中のその目的とする標的配列の介在配列の長さと一緒に、各マルチパートプライマーのブリッジ配列の長さおよび配列によって、５０サイクルの指数関数的増幅内でその目的とする標的配列の僅か１０コピーを含有する試料に対して閾値（ＣＴ）が観察されるようになり、ＣＴはその目的とする標的のコピーを含有しない試料と観察されるＣＴと識別可能である。類縁突然変異体配列であれ、または関連野生型配列であれ、フット配列と別の類縁標的配列との間で形成され得るかまたは形成されるハイブリッドは極めて弱い。本発明の方法において、少なくとも１０の熱サイクルの閾値数の相違（ΔＣＴ）により明らかになるように、ＰＣＲ増幅中に１つの目的とする標的配列に対するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーが何らかの類縁突然変異体標的配列または関連野生型標的配列のコピーを開始する確率は、その目的とする標的配列のコピー開始の確率よりも少なくとも１，０００倍低い。
【００３７】
前述の本発明の方法のある一定の好ましい実施形態において、ある１つの標的配列に対するＣＴ値は、何らかの他の標的配列に対するものと同数の出発鋳型に相当する。
【００３８】
前述の本発明の方法のある一定の実施形態は、少なくとも２つの類縁突然変異体標的配列に関連する参照野生型配列を増幅し、検出することを含む。このような実施形態において、反応混合物、例えばＰＣＲアッセイ混合物は、関連する参照標的配列に対して限定濃度で（上記のような）本発明の方法で有用であるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを含む。参照配列の増幅は、類縁突然変異体標的配列の増幅と同じリバースプライマーを使用する。反応混合物は、標的が野生型配列に対するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのタグの相補体である（上記のような）均一な蛍光検出プローブをさらに含む。
【００３９】
前述の本発明の方法のある一定の好ましい実施形態は、少なくとも２つの類縁突然変異体標的配列と関連がない参照野生型配列を増幅し、検出することを含む。このような実施形態において、反応混合物は、限定濃度の（上記のような）本発明の方法において有用であるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーおよび非関連参照配列に対する過剰濃度の別個の従来のリバースプライマーを含む。
【００４０】
本発明は、上記の方法の実施形態のための反応混合物にアレル選択性促進試薬、例えば、ＴＭＡＣを添加することも含む。
【００４１】
前述の本発明の方法のある一定の実施形態は、１０コピー未満の少なくとも２つの類縁希少突然変異体標的配列を増幅および検出可能である。いくつかの実施形態において、マルチパートプライマーアンカー配列および突然変異体標的配列により形成されるハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）は、共通リバースプライマーおよび突然変異体標的配列により形成されるハイブリッドのＴｍよりも低い。ＰＣＲ増幅の前に、共通リバースプライマーがハイブリッド形成するがマルチパートプライマーのハイブリッド形成が稀であるプライマーアニーリング温度でリバースプライマーのみを利用して複数サイクルの直線的増幅が行われる。次に、マルチパートプライマーおよび共通リバースプライマーがハイブリッド形成する、より低いプライマーアニーリング温度を使用して指数関数的増幅の続くサイクルが行われる。
【００４２】
本発明は、前述の方法の何れかに従い増幅および検出を行うために十分な試薬を含む試薬キットも含む。
【００４３】
本発明は、前述の方法の何れかに従い増幅および検出を行うために必要とされるプライマーおよびプローブを含むオリゴヌクレオチドのセットも含む。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、本発明によるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーおよびＰＣＲ増幅中のそのコピーおよび検出の略図である。
【図２】図２は、異なる類縁アレル標的配列に対する２つのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの略図であり、ある標的配列に対する適正なプライマーのみがなぜコピーされるかを示す。
【図３】図３は、フット配列長さが異なるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを利用した、実施例１でのＰＣＲアッセイに対する、ＣＴ対標的配列出発数の対数のグラフである。
【図４】図４は、異なる周縁のバブルを形成するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを利用した、実施例２でのＰＣＲアッセイに対する、ＣＴ対標的配列出発数の対数のグラフである。
【図５】図５は、実施例５でのＰＣＲアッセイに対する、ＣＴ対標的配列出発数の対数のグラフである。
【図６】図６は、実施例６に記載の多重アッセイに対するリアルタイム蛍光の結果（蛍光強度対熱サイクル数）を示す。
【図７】図７は、分子ビーコンプローブが実施例７Ａに記載のようなＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのブリッジ配列の相補体を標的とした、二重ＰＣＲアッセイに対するリアルタイム蛍光の結果を示す。
【図８】図８は、分子ビーコンプローブが実施例７Ｂに記載のようなＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの５’−タグ配列の相補体を標的とした、二重ＰＣＲアッセイに対するリアルタイム蛍光の結果を示す。
【図９】図９は、微調整前後の、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを利用した実施例８でのＰＣＲアッセイに対する、ＣＴ対標的配列出発数の対数のグラフを示す。
【図１０】図１０は、非関連野生型配列も増幅され、検出された、実施例９Ａに記載の多重ＰＣＲアッセイに対するリアルタイム蛍光の結果を示す。
【図１１】図１１は、非関連野生型配列も増幅され、検出された、実施例９Ｂに記載の多重ＰＣＲアッセイに対するリアルタイム蛍光の結果を示す。
【図１２】図１２は、関連野生型配列も増幅され、検出された、実施例１０ＡでのＰＣＲアッセイに対する、リアルタイム蛍光の結果およびＣＴ対標的配列出発数の対数のグラフを示す。
【図１３】図１３は、関連野生型配列も増幅され、検出された、実施例１０ＢでのＰＣＲアッセイに対する、リアルタイム蛍光の結果および実施例１０ＢでのＰＣＲアッセイに対する、ＣＴ対標的配列出発数の対数のグラフを示す。
【図１４】図１４は、６：１：１のフットを有するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーおよび異なる濃度のＴＭＡＣを用いた、実施例１１Ａに記載のＰＣＲアッセイのリアルタイム蛍光の結果を示す。
【図１５】図１５は、８：１：１のフットを有するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーおよび異なる濃度のＴＭＡＣを用いた、実施例１１Ｂに記載のＰＣＲアッセイのリアルタイム蛍光の結果を示す。
【図１６】図１６は、ＴＭＡＣありまたはなしでの、８：１：１のフットを有するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを用いた、実施例１２に記載のＰＣＲアッセイのリアルタイム蛍光の結果を示す。
【図１７】図１７は、実施例１３に記載のＰＣＲアッセイに対する、ＣＴ対標的配列出発数の片対数プロットである。
【図１８】図１８は、様々なサイズのバブルを生成させるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを用いた実施例１４に記載のＰＣＲアッセイに対する、ΔＣＴ対ＴＭＡＣ濃度のプロットである。
【図１９】図１９は、９：１：０フット配列を有するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーに対する実施例１５に記載のＰＣＲアッセイに対する、ＣＴ対ＴＭＡＣ濃度のプロットである。
【図２０】図２０は、８：１：１フット配列を有するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーに対する実施例１５に記載のＰＣＲアッセイに対する、ＣＴ対ＴＭＡＣ濃度のプロットである。
【図２１】図２１は、異なる位置でインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドを有するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを用いた実施例１５に記載のＰＣＲアッセイに対する、ΔＣＴ対ＴＭＡＣ濃度のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明によるアッセイは、プライマー依存的増幅および検出方法、例えばＰＣＲ増幅および検出方法などである。本発明による方法は、多量の関連野生型配列存在下において、ゲノムＤＮＡ断片を含有する試料中で選択される野生型配列の少なくとも２つの類縁突然変異の存在を検出可能である多重アッセイである。このような方法で利用される反応混合物は、各突然変異体標的配列に対するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを含む。
【００４６】
本発明の方法において有用なプライマー依存的増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写介在増幅（ＴＭＡ）およびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含む、何らかの適切な指数関数的増幅方法であり得る。好ましい方法はＰＣＲを利用する。非対称ＰＣＲ増幅法、例えば非対称ＰＣＲにおいて、増幅完了前に使い尽くされ、その後、残存プライマー、過剰プライマーを使用して直線的増幅が起こるように、１つのプライマー、限定プライマーが限定量で存在する。本発明において有用な非対称ＰＣＲ法は、ＬＡＴＥ−ＰＣＲである（例えば欧州特許第１，４６８，１１４号明細書；およびＰｉｅｒｃｅら（２００５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：８６０９−８６１４を参照）。本発明による非対称増幅法において、マルチパートプライマーは限定プライマーである。好ましい方法はデジタルＰＣＲも含み（例えばＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＫｉｎｚｌｅｒ（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：９２３６−９２４１を参照）、関連野生型分子を含有する反応において存在する単一の突然変異体鋳型分子からアンプリコンを検出することが所望される。
【００４７】
増幅反応がＲＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼを利用する場合（ＮＡＳＢＡである例）、増幅反応は等温性である。発明者らは、増幅産物の合成の反復ラウンドを「サイクル」と呼ぶが、これらは熱サイクルではない。このような増幅に対して、本発明によるマルチパートプライマーによってプライミングされる「目的とする標的配列」および「目的としない標的配列」は、元の試料中および増幅反応混合物中で生じるＲＮＡ配列であり、これらは、ＤＮＡポリメラーゼおよびマルチパートプライマーとともに存在する。
【００４８】
増幅反応がＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを利用する場合（ＰＣＲである例）、元の試料は、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的の何れかを含有し得る。このような増幅に対して、本発明の方法において有用であるマルチパートプライマーによりプライミングされる「目的とする標的配列」および「目的としない標的配列」は、元の試料中で生じるかまたは元の試料中で生じるＲＮＡ配列逆転写により生成されるかの何れかのＤＮＡ配列である。逆転写に対してマルチパートプライマーが使用される場合、「目的とする標的配列」および「目的としない標的配列」はＲＮＡならびにｃＤＮＡである。別個の外側のプライマーが逆転写のために使用される場合、「目的とする標的配列」および「目的としない標的配列」はｃＤＮＡである。どちらにせよ、「目的とする標的配列」および「目的としない標的配列」は、ＤＮＡポリメラーゼおよびマルチパートプライマーとともに増幅反応混合物中に存在する核酸配列である。プライマー依存的増幅反応は、プライマーアニーリング、プライマー伸長および鎖変性（鎖融解）の反復熱サイクルを含む。プライマーアニーリングは、プライマー−伸長温度（例えば３種類の温度のＰＣＲ）を下回る温度で行われ得るか、またはプライマーアニーリングおよびプライマー伸長は同じ温度（例えば２種類の温度のＰＣＲ）で行われ得る。本反応の全体的な熱プロファイルは、特定のサイクルの反復を含み得るか、または温度／時間を１つ以上のサイクル中で変動させ得る。例えば増幅が開始され、マルチパートプライマーのプライミング配列が伸長されたら、増幅反応を完了するために、より長いプライマーに適切なより高いアニーリング温度が使用され得る。
【００４９】
発明者らは、以下に示す実施例において、２つまたは３つの標的配列および２つまたは３つのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーがあるアッセイを記載するものの、本発明の多重アッセイ法は、より多くの標的配列およびより多くのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを含み得る。分光蛍光分析サーマルサイクラーが識別し得る色−最大１０であることがある−時には最大８であるがより一般的には５である−よりも多くの標的配列を含む多重性が高いアッセイに対して、本発明の方法は、アッセイ能を向上させるためのいくつかの方法の何れかを含む。ある方法は、例えばドロップレットに基づくエマルジョンＰＣＲが高度に多重化され得ようと、またはビーズに基づくエマルジョンＰＣＲが高度に多重化され得ようと、デジタルＰＣＲ法を利用することである。特定の増幅反応中（例えばドロップレット中）に標的配列が１つのみ存在することが予想される一方で、ＰＣＲ混合物は、可能性のある各プローブに対して、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーおよび別個の検出プローブ、例えば分子ビーコンプローブを含有する。多数の分子ビーコンプローブに対して、異なるプローブの数が、機器によりスペクトルが識別され得る異なる色のフルオロフォアの数（一般的には７または８を超えない）を超える場合、同定され得るプローブ数を増加させるための技術が使用され得る。例えば国際公開第２００２／０９９４３４号パンフレットおよび米国特許第７，３８５，０４３号明細書および同第７，７７１，９４９号明細書で開示されるように、各プローブは、プローブの定量を行い、それを複数のアリコートに分割し、各アリコートを異なるフルオロフォアで標識し、このアリコートを組み換えることによって２色以上の色でコードされ得、それによりプローブにユニークなマルチカラーコードが与えられる。発明者らは、この過程を「色分け」と呼び、得られるプローブを「色分け」分子ビーコンプローブと呼ぶ。例えば６個の識別可能なフルオロフォアのパネルで開始して、各プローブの量を２つのアリコートに分割し、この２つのアリコートを異なる色で標識して、１５種類の異なるプローブをユニークに色分けし得る（両方のアリコートが同じフルオロフォアで標識される６個のプローブを添加する場合、ユニークに色分けされるプローブの数が２１に増加する）。フローサイトメトリー検出法はデジタルＰＣＲドロップレットにおける検出によく適している。
【００５０】
別の技術は、「温度特異的」ハイブリッド形成プローブ、好ましくは分子ビーコンプローブを使用することであり、いくつかの異なるプローブが同じフルオロフォアを有するが、それらのＴｍにより識別可能である。分光蛍光分析サーマルサイクラーで行われ得る増幅後融解を行うことによって、どのプローブが蛍光を発するかを同定可能となるように、ある色のプローブがＴｍによって互いに識別され得る。
【００５１】
スクリーニングアッセイは、多くの可能な標的配列のうち１つだけが試料中に存在すると予想される多重アッセイである。分光蛍光分析サーマルサイクラーを使用する増幅および検出に対して、本発明によるスクリーニングアッセイは、多くの（例えば１５または３５）可能な標的のそれぞれに対するユニークな５’−タグ配列を有する異なるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを利用し、それらは異なる各５’−タグ配列に対する上記のユニークに色分けされた分子ビーコンプローブを使用する。
【００５２】
図１は、本発明の方法において有用なＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを図式化して示す。上のパネルにおいて、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー１０３はその目的とする標的配列１０１とハイブリッド形成することが示される。５’から３’方向で、プライマー１０３は、４つの近接するＤＮＡ配列：５’タグ１０７、アンカー配列１０４、ブリッジ配列１０５およびフット配列１０６を含むマルチパートプライマーである。タグ配列１０７は標的配列１０１に対して相補的ではない。プライマー１０３が標的配列１０１とハイブリッド形成する場合、タグ配列１０７は、標的配列１０８の反対であるが、それとはハイブリッド形成しない。むしろ、タグ１０７は１本鎖テイル（「５’テイル」）として存在する。アンカー配列１０４は十分に長いハイブリッドを形成し、一般的には１５〜４０ヌクレオチド長であり、標的配列１０１中の配列１０９は、アンカー配列１０４とその結合部位１０９との間の短い垂線（相補的ヌクレオチドの対形成を表す）により従来から示されるように、プライマーアニーリング中に標的配列１０１に効率的にプライマー１０３を効率的に結合させる。アンカー配列１０４は標的配列１０１に対して完全に相補的であり得る。その機能が維持される限り、これは完全に相補的である必要はない。プライマー１０３の３’末端のフット配列１０６は、目的とする標的配列１０１の配列１１１と完全に相補的である。アレル特異性促進試薬を使用しない場合、フット配列は、６〜１０ヌクレオチド長、好ましくは７〜９ヌクレオチド長、最も好ましくは７〜８ヌクレオチド長である。アレル特異性促進試薬を使用する場合、フット配列１０６は、７〜１４ヌクレオチド長、好ましくは一部のケースでは８〜１０ヌクレオチド長であり得る。アンカー配列１０４が、全ての標的配列中の関心のある配列への結合によりプライマー１０３に特異性を付与するのに対して、類縁突然変異体および関連野生型、フット配列１０６は、一塩基のみが異なる配列さえ選択して（アレル選択性）、プライマーアニーリング中にその目的とする標的配列と選択的にハイブリッド形成することにより選択性を付与する。アンカー配列１０４およびフット配列１０６を分離するのはブリッジ配列１０５であり、これは標的配列１０１とハイブリッド形成しない。ブリッジ配列１０５は、８〜２０ヌクレオチド長であるユニークな配列であり、二次構造を形成せず、標的配列１０１または何れの類縁標的配列にも、または関連野生型配列にも相補的ではない。アンカー配列１０４およびフット配列１０６は、鎖１０１とハイブリッド形成し、ブリッジ配列１０５は、標的配列１０１中の非ハイブリッド形成配列１１０の反対であり、発明者らは、これを「介在」配列と呼ぶ。介在配列１１０は少なくとも６ヌクレオチド長である。まとめると、ブリッジ配列１０５および介在配列１１０は、ヌクレオチドにおける周縁がブリッジ配列の長さ＋介在配列の長さ＋４である、１本鎖「バブル」を形成する。本発明による方法において、バブルの周縁は、１８〜３０ヌクレオチドの範囲であり、またはアレル選択性促進試薬が使用される場合は１８〜４０ヌクレオチドの範囲である。
【００５３】
ポリメラーゼ連鎖反応によるマルチパートプライマー１０３および従来のリバースプライマー２０３を用いたＰＣＲ増幅を図１の３つのパネルで示す。上のパネルは、伸長２０１を生成させるための鋳型として目的とする突然変異体標的鎖１０１を利用したＤＮＡポリメラーゼによるプライマー１０３の伸長を示す。これにより鎖２０２（中パネル）が生成される。図１の中のパネルは次の増幅サイクルで何が起こるかを示す。従来のリバースプライマー２０３は、増幅される産物鎖２０２とハイブリッド形成し、次いで鋳型として鎖２０２を用いてＤＮＡポリメラーゼにより伸長され、伸長２０４が生成する。プライマー２０３および伸長２０４はアンプリコン鎖２０５を含む（下パネル）。伸長２０４が、プライマー１０３の全ての４つの近接配列（タグ、アンカー、ブリッジおよびフット）に対して完全に相補的である配列を含むことが認められよう。アンプリコン鎖２０５中の配列２０６は、タグ配列１０７に相補的であり、均一な検出プローブ２１０に対する結合部位となる。タグ配列１０７はユニークな配列なので、その相補体、配列２０６もユニークな配列である。プローブ２１０は分子ビーコンプローブである。これは、１本鎖ループ２１１、ステムハイブリッド２１２、フルオロフォア２１３およびクエンチャー２１４を含む。ループ２１１は配列２０６と相補的である。次の増幅サイクルおよびＰＣＲ増幅の指数関数相のその後のサイクルにおいて、図１の下パネルで示されるように、アンプリコン鎖２０５はプライマー１０３の別のコピーの伸長（２１５）によりコピーされる。プライマー１０３の全体は、鎖２０５と完全に相補的であり；非ハイブリッド形成ブリッジ配列１０５およびバブルがないことが認められよう。プローブ２１０は、配列２０６とのハイブリッド形成について、プライマーセグメント１０７と競合する。プローブ２１０が競合に成功する鎖２０５の一部に対して、ループ２１１は配列２０６とハイブリッド形成し、プローブは蛍光性になる。図１で示されるように、プローブ２１０がハイブリッド形成する鎖２０５に対してでさえ、アンカー配列１０４、ブリッジ配列１０５およびフット配列１０６が全て鎖２０５とハイブリッド形成し、プライマー１０３は非常に効率的な従来のＰＣＲプライマーとして作用する。本発明による多重アッセイは、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーが限定プライマーであり、共通リバースプライマーが過剰プライマーである非対称ＰＣＲを利用するので、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーが使用し尽されると、増幅は指数関数的なものから線形的に変化する。図１を再び参照すると、この結果、２本鎖を形成するための相補的アンプリコン鎖２０２がないアンプリコン鎖２０５が産生される。分子ビーコンプローブ２１０または他の均一な検出プローブは、このような鎖およびシグナルへの結合についてアンプリコン鎖２０２と競合する必要はない。
【００５４】
ブリッジ配列１０５および介在配列１１０により形成されるバブルは対称であり得、ブリッジ配列および介在配列の長さが同じであることを意味するか、またはバブルが非対称であり得、ブリッジ配列および介在配列の長さが互いに異なることを意味する。何れの場合でも、ブリッジ配列は十分に長く、ブリッジ配列およびフット配列は一緒に、説明されるように、効率的なＰＣＲプライマーを含む。このため、バブルが非常に小さくかつ非対称である場合、発明者らは、介在配列１１０よりも長いブリッジ配列１０５を選択することが多い。
【００５５】
上で説明するように、本発明による多重反応混合物中の各ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーは、異なるユニークなタグ配列；異なるユニークなブリッジ配列；および異なるユニークなフット配列を有し得る。しかし、類縁突然変異に対する多重増幅反応における多重ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのアンカー配列は同一であり得るかまたは非常に類似し得る。これによりプライマーアニーリング中に不適切なプライマー（異なる類縁標的配列、突然変異体または野生型に対するプライマー）のアンカー配列が目的とする標的配列の産物鎖とハイブリッド形成し得る可能性が生じる。本発明による多重法において、図２で示されるように、不適切なコピーにつながらない。図２の上で示されるのは、目的とする標的配列１０１に対する、プライマー１０３および分子ビーコンプローブ２１０である（図１）。図２の中央で示されるのは、類縁標的配列に対する、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー３０３および分子ビーコンプローブ３１０（示さない）である。プライマー３０３は、５’から３’方向に、タグ配列３０７、アンカー配列３０４、ブリッジ配列３０５およびフット配列３０６を含む。プライマー１０３のフット１０６は、インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチド「ｒ」を３’末端の最後から２番目の位置に有することが示される。プライマー３０３のフット３０６は、異なるインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチド「ｓ」を３’末端の最後から２番目の位置に有することが示される。分子ビーコンプローブ３１０のループ３１１に対する標的はタグ配列３０７の相補体である。図２の下部の略図は、プライマー１０３が完全に相補的であるアンプリコン鎖２０５（図１）を示す。しかし、プライマー３０３のアンカー配列３０４はプライマー１０３のアンカー配列１０４と同じであるかまたは非常に類似しているので、これはプライマー１０３の伸長により生成される鎖（図１の鎖２０５）の相補体とハイブリッド形成し得る。アンカー配列３０４は、鎖２０５とハイブリッド形成することが示される。しかし、その他の配列の中で鎖２０５とハイブリッド形成するものはない。タグ３０７、ブリッジ３０５およびフット３０６は１本鎖テイルとして残留する。これにより、適正なプライマー１０３のブリッジ配列１０５およびフット配列１０６が鎖２０５とハイブリッド形成できるようになる。本発明の方法での使用のためのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーにおいて、ブリッジ配列１０５およびフット配列１０６は一緒に、下パネルで示されるように、鎖２０５に対する効率的な従来のＰＣＲプライマーを含む。したがって、増幅開始後のＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー１０３が効率的なＰＣＲプライマーとなるための機能は、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー全てが同じアンカー配列を有するとしても、満たされる。そのアンカー配列を通じた誤ったプライマー結合の影響は最小限であり、依然として効率的なコピーが起こり得る。
【００５６】
ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのモノプレックス研究
次のものは、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーに対する発明者らの命名法の説明である。フットが、１つまたは複数のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドに対するヌクレオチド５’の数、（例えば関連野生型配列と対比）インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドの数およびインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドに対する３’のヌクレオチドの数により定義されることを除き、５’−タグ配列を含有するプライマーは、４つのプライマーセグメントの長さ（ヌクレオチド）および介在配列の長さにより記載される。例えば、３２−３０−１０／９−６：１：１は、プライマーが、介在配列９ヌクレオチド長の反対側に、タグ３２ヌクレオチド長、アンカー３０ヌクレオチド長、ブリッジ１０ヌクレオチド長を有し、フットが単一のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドに対して５’に６ヌクレオチドおよびインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドに対して３’に１ヌクレオチドを含有することを示す。タグを含有しないプライマーは最初の記述子を欠く。例えば２４−１４／１２−５：１：１は、プライマーが、介在配列１２ヌクレオチド長の反対側に、アンカー２４ヌクレオチド長、ブリッジ１４ヌクレオチド長を有し、フットが、単一のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドに対して５’に５ヌクレオチドおよびインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドに対して３’に１ヌクレオチドを含有することを示す。
【００５７】
発明者らは、アレル選択性促進試薬を含有せず、１つのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのみおよび目的とする突然変異体標的配列および１ヌクレオチド異なる関連野生型配列の両方を含有するモノプレックス対称ＰＣＲアッセイを使用して、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの様々ないくつかの構造特性の選択性における影響（ΔＣＴ）を調べた。定量的であるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを用いるアッセイを有することが目的であり、ここでＰＣＲ閾値サイクル数（ＣＴ）は目的とする標的配列の出発数を反映する。試料中に元から存在する突然変異体標的の数の対数とその試料に対して観察されるＣＴ値との間の逆線形関係は定量的指数関数的増幅アッセイの特徴であるので、発明者らの研究には、直線性における影響も含まれた。この研究からの実験を以下の実施例１〜５で与える。これらの実施例における蛍光検出では、異なるアンプリコンの個別検出は必要なかったので、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ｄｙｅを利用した。
【００５８】
実施例１は、フット配列の長さの変化から生じる影響を調べるために制限酵素消化プラスミドＤＮＡを使用したモノプレックス実験を提示する。発明者らは、フットがＥＧＦＲ野生型標的配列中に存在するＧ−Ｃリッチ配列とハイブリッドを形成する可能性を打開するために、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ突然変異体配列のフットに対するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの長さの短縮の影響を調べた。発明者らは３セットの対称ＰＣＲアッセイを行い、各セットは、フット配列が６、７または８ヌクレオチド長のＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを利用した。全ての他の点で、プライマーの設計は同じであった：（ｉ）インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドを各フットの３’末端の最後から２番目の位置に置き；（ｉｉ）アンカー配列は２４ヌクレオチド長とし；（ｉｉｉ）ブリッジ配列および介在配列は両者とも１４ヌクレオチド長とした。ＰＣＲアッセイの各セットは、１０６コピーの野生型鋳型の存在下で異なる量の突然変異体鋳型（１０６、１０５、１０４、１０３、１０２および１０１コピー）を用いて開始した。図３において、得られた閾値を最初に存在した突然変異体鋳型の数の対数の関数としてプロットする。最短のフット長（６ヌクレオチド、４：１：１）を保持するプライマーで得られたＣＴ値は全て直線３１上にあり、このことから、ＥＧＦＲ標的配列がＧ−Ｃリッチであったとしても、僅か１０個の突然変異体鋳型が、存在した１，０００，０００個の野生型鋳型から妨害されずに定量され得たことが示される。しかし、より長いフット長を保持するプライマー（７ヌクレオチド、５：１：１；または８ヌクレオチド、６：１：１）は、発明者らが考えるに、多量の野生型鋳型におけるアンプリコン合成の不適当な抑制ゆえに、突然変異体標的が最も希少である場合、直線性からの逸脱につながった。これらの結果から、フット長が短いほど、フットのハイブリッドの平衡組成が低下し、その結果、閾値サイクル数が達成される前により長い遅延が起こるにもかかわらず、選択性の促進につながることが示される（すなわち「アレル選択性」がより少ない）。熱力学的な観点から、フット長が短いほど選択性が向上するのは、ミスマッチがある野生型フットハイブリッドの平衡組成と比較して、完全に相補的である突然変異体フットハイブリッドの平衡組成の比率がより高いからである。
【００５９】
実施例２は、バブル周縁（ブリッジ配列の長さ＋介在配列の長さ＋４）の変化の影響を調べるために制限酵素消化プラスミドＤＮＡを使用したモノプレックス実験を提示する。１本鎖バブルは、アンカーハイブリッドをフットハイブリッドから機能的に分離する（図１参照）。発明者らは、その鋳型とハイブリッド形成したときにそれぞれが対称バブルを形成する、３つの異なるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを利用したことを除き、実施例１に記載の実験と同一であった３セットの対称ＰＣＲアッセイを行った。これらの３つのプライマーのそれぞれは同じ７ヌクレオチド長フット配列を保持し、インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドは３’末端の最後から２番目の位置にあり、プライマーのそれぞれにおけるアンカー配列の長さは２４ヌクレオチドに維持した。しかし、各プライマーにおけるブリッジ配列は、１０、１４または１８ヌクレオチド長となるように選択し、各プライマーにおけるアンカー配列の同一性は、ブリッジ配列と同じ長さであった鋳型において介在配列が生じるように選択した。結果的に、これらのプライマーのそれぞれにより形成されるバブルの周縁は、鋳型と完全にハイブリッド形成する場合（ブリッジ配列、介在配列、アンカーハイブリッドの末端の２個のヌクレオチドおよびフットハイブリッドの末端の２個のヌクレオチドからなる）は、２４、３２または４０ヌクレオチド長であった。ＰＣＲアッセイの各セットは、１０６コピーの野生型鋳型の存在下で、異なる量の突然変異体鋳型（１０６、１０５、１０４、１０３、１０２および１０１コピー）で開始した。図４において、得られた閾値を最初に存在する突然変異体鋳型数の対数の関数としてプロットする。最大バブル（４０ヌクレオチド）を形成するプライマーを用いて得られたＣＴ値は全て直線４１上にあり、このことから、ＥＧＦＲ標的配列がＧ−Ｃリッチであったとしても、僅か１０個の突然変異体鋳型が、存在した１，０００，０００個の野生型鋳型から妨害されずに定量され得たことが示される。しかし、より小さいバブル（３２ヌクレオチドおよび２４ヌクレオチド）を保持するプライマーは、発明者らが考えるに、多量の野生型鋳型におけるアンプリコン合成の不適当な抑制ゆえに、存在するのが僅か１０個の突然変異体標的である場合、直線性からの逸脱につながる。最大バブルを形成するプライマーを用いて得られたデータの優れた直線性は、閾値サイクル数が達成される前により長い遅延が生じるにもかかわらず、突然変異体ハイブリッドおよび野生型ハイブリッド両方の平衡組成の低下（その標的と比較して、フットのエントロピーの自由度がより大きくなる結果として）によって、アッセイの選択性が促進されることが示される。
【００６０】
実施例３は、野生型鋳型から突然変異体鋳型を区別するプライマーの能力を含め、フット配列内での単一インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドの位置の変化の影響を調べるために制限酵素消化プラスミドＤＮＡを使用したモノプレックス実験を提示する。発明者らは、それぞれが７ヌクレオチド長フット配列内に異なる位置でインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドを保持する６つの異なるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを利用し、一連の対称ＰＣＲアッセイを行った。アンカー配列、ブリッジ配列および介在配列の長さは、それぞれ２４、１４および１４ヌクレオチドに維持した。フットは、６：１：０、５：１：１、４：１：２、３：１：３、２：１：４および１：１：５であった。各プライマーで２つの反応を行い、一方は１０６コピーの突然変異体鋳型で開始し、一方は１０６コピーの野生型鋳型で開始した。観察された閾値サイクル数を実施例３の表４で列挙する。結果から、突然変異体に対する閾値サイクル数（ＣＴ）と野生型に対する閾値サイクル数（ＣＴ）との間の識別（ΔＣｔ）の枠は、インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドの位置がプライマーの３’末端に最も近い場合に最大となることが示される。インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドがフットの３’末端に置かれたプライマー（ΔＣｔ＝１８．８）とインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドがフットの３’末端の最後から２番目の位置に置かれたプライマー（ΔＣＴ＝１８．２）との間のΔＣｔの相違は小さいものしかないので、発明者らは、何れかの位置におけるインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドの配置がうまく機能すると結論付ける。ＰＣＲアニーリング条件下でフットの３’末端の最後から２番目の位置のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドは野生型配列中の対応するヌクレオチドと塩基対を形成しないので、フットの３’末端ヌクレオチドは、野生型配列中のその対応するヌクレオチドと塩基対を形成する可能性は非常に低い。
【００６１】
実施例４は、バブルの対称性の変化の影響を調べるために制限酵素消化プラスミドＤＮＡを使用した実験を提示する。発明者らは、野生型鋳型から突然変異体鋳型を識別するプライマーの能力におけるバブル対称性変化の影響を調べた。発明者らは、５つの異なるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのうち１つを利用して一連の対称ＰＣＲアッセイを行った。形成されたバブルは全て同じ周縁を有したが、これらは、異なる長さのブリッジ配列を保持した。これらのプライマーにおいて、全てのアンカー配列を同一に維持するのではなく、プライマー中のブリッジ配列の長さと組み合わせて、周縁が３２ヌクレオチドであるバブルが得られる長さの介在配列を鋳型中で生成させるように、アンカー配列の特性を選択した。各プライマーに対して２つの反応を行い、一方は１０６コピーの突然変異体鋳型で開始し、一方は１０６コピーの野生型鋳型で開始した。観察された閾値サイクル数を実施例４の表５で列挙する。結果から、突然変異体標的配列に対する閾値サイクル数と野生型配列に対する閾値サイクル数との間の識別（ΔＣｔ）の枠は、５つのプライマー間で変動し、対称バブルに対するΔＣＴが最大であったが、得られたΔＣＴ値間の相違はあまり大きくなかったことが示される。発明者らは、バブルの周縁（実施例２）がΔＣＴに対して幾分、より大きい影響があり、これが標的配列に遭遇するフット配列の平衡確率を反映することに留意した。
【００６２】
実施例５は、制限酵素消化ヒトゲノムＤＮＡを用いた実験を報告する。血漿試料中で生じる標的配列を模倣するために、制限エンドヌクレアーゼで消化したプラスミドから得られたＤＮＡ断片を用いて、実施例１〜４に記載のアッセイを行った。しかし、臨床血漿試料は、ヒトゲノム全体からのＤＮＡ断片を含有する。臨床試料中のＤＮＡ断片の数は個人によっておよび同一人物において時間によって変動が大きいものの、通常は１０ｍＬの血液から得られた試料中の各標的突然変異について、存在する野生型鋳型断片は１０，０００を超えない。血漿から単離されるＤＮＡ断片で開始されるアッセイを模倣するために、発明者らは、野生型ＥＧＦＲ遺伝子を含有する１０，０００個のヒト細胞から単離される制限酵素消化ゲノムＤＮＡ存在下で、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ突然変異を保持するヒト細胞株Ｈ１９７５から単離される様々な量の制限酵素消化ゲノムＤＮＡ（０；１０；３０；１００；３００；１，０００；３，０００；または１０，０００個のＨ１９７５細胞からのＤＮＡ）を含有した試料で開始した８セットのモノプレックス対称ＰＣＲアッセイにおいて、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ  ２４−１４／１４−５：１：１  ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを利用した。結果を図５で示す。各反応で最初に存在した突然変異体断片数の対数の関数としてのＣＴ値（線５１）のプロットの直線性から、試料がゲノムＤＮＡ断片を含有する場合の、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを利用するアッセイの特異性が確認される。さらに、野生型ＤＮＡのみで開始した反応のＣＴ値が高いことから（点線５２）、プライマーの選択性が、ゲノムＤＮＡ断片の存在により影響を受けないことが確認される。この実験の意義は、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーが、その２機能性（アンカーおよびフットは両方とも、合成しようとするアンプリコンに対してハイブリッドを形成しなければならない）の理由で、ヒトゲノムの残りの部分からのＤＮＡ断片の存在によりそれらが影響を受けないほど特異的であることである。
【００６３】
発明者らは、異なる量のアレル選択性促進試薬、単一のＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのみ、および目的とする突然変異体標的配列および１ヌクレオチド異なる関連野生型配列の両方を含有するモノプレックスＰＣＲアッセイを用いたＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのいくつかの構造特性の変化の選択性（ΔＣＴ）における影響を含め、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを用いたアッセイ法におけるアレル選択性促進試薬、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）の影響も調べた。この研究からの実験を以下、実施例１１〜１４で提示する。
【００６４】
ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを用いた多重化
多重増幅および検出アッセイは、少なくとも２つの核酸配列を増幅および検出可能なアッセイである。スクリーニングアッセイは、少なくとも２つの核酸配列を増幅および検出可能な多重アッセイの特別なケースであるが、多くの可能性のある標的配列のうち多くて１つの配列が生じると予想される。多重アッセイおよびアッセイ法を２つのタイプに分け得る。第１のタイプは、広く分離される非関連突然変異体標的配列の増幅および検出である。そのタイプの多重化のために、増幅および検出しようとする各非関連配列に対してユニークなプライマー対を使用する。第２のタイプは、類縁標的配列の増幅および検出である。そのタイプの多重化のために、各類縁配列に対して異なるフォワードプライマーが使用されるが、共通のリバースプライマーが使用される。２つの類縁配列に対する増幅および検出アッセイにおいて、増幅および検出しようとするさらなる配列も類縁であり得、ユニークなフォワードプライマーを使用するが、同じリバースプライマーを使用する。あるいは、またはさらに、増幅および検出しようとするさらなる配列は、この少なくとも２つの類縁配列と無関係であり得、増幅のためにユニークなプライマー対を使用する。以下の実施例において、発明者らは２つの類縁突然変異に対する二重アッセイを記載し、発明者らは２つの類縁突然変異＋それらの関連野生型配列または非関連野生型配列の何れかに対して三重アッセイを記載する。
【００６５】
多重リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、異なる標的配列が類縁である場合、それらが異なる細胞で生じ得るものの、同じまたは隣接コドンに位置する多数の突然変異の測定に対して起こるので、より多量の突然変異体から生成されるアンプリコンは、存在量がより低い突然変異体から生じる相補的アンプリコンとヘテロ２本鎖を形成し得、その結果、この存在量がより低い突然変異体の指数関数的増幅の抑制が早すぎて、それによりこの存在量がより低い突然変異体のＣＴ値が変化する。発明者らは、各ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー濃度が制限される非対称プライマー濃度の使用によって、各突然変異体標的配列のＣＴ値の独立性が保たれ、それが個別に決定されるようになることを発見した。明らかに、初期反応混合物中の各ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの濃度は非常に低く、より多量の突然変異体に対するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー全てが（＋）アンプリコンに組み込まれるとしても、ヘテロ２本鎖形成を通じた存在量がより低い突然変異体の指数関数的増幅を顕著に阻害するためには、存在するこれらの（＋）アンプリコンは決して十分ではない。さらに、ある突然変異体に対するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー全てが（＋）アンプリコンに組み込まれた後、過剰の共通の従来のリバースプライマーの存在によって、相補的（−）アンプリコンを合成し続けることが可能となる。この後者の増幅の「直線的な」相の間に、それらの（−）アンプリコンに結合する明確に色分けされた分子ビーコンは、存在量がより低い相補的（＋）アンプリコンからの競合には実質的に直面せず、これらの（−）アンプリコンの連続合成によって、元の試料中のその突然変異体の存在量に直線的に反比例する各突然変異体に対するＣＴ値が提供される。発明者らは、同じまたは隣接するコドンにおける異なる突然変異に対するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーにおいて、ブリッジの配列を互いに異なるようにすることによって、個々のアンプリコン間で形成する何らかのヘテロ２本鎖において非相補性領域が生成され、それにより、的確なアンプリコンにおいてのみ、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーが結合し、合成を開始するようになり、得られるＣｔ値がヘテロ２本鎖形成によって損なわれないことも発見した。
【００６６】
実施例６および図６は前者の発見を示す。これらは、関連ＢＲＡＦ野生型の存在下で、２つの類縁突然変異体標的配列、ＢＲＡＦ  Ｖ６００ＲおよびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを増幅し、検出することに対する、対称ＰＣＲと非対称ＰＣＲとの間の相違を示す。試料は、制限酵素消化プラスミドＤＮＡを含有し：固定量の野生型標的配列（１０，０００コピー）、固定量のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列（１，０００コピー）および様々な量のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ突然変異体標的配列（１０，０００コピー〜コピーなし）。この反応には、各突然変異体標的配列に対するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーおよびそれぞれのアンプリコンに対する分子ビーコンプローブが含まれた。リアルタイム蛍光測定（蛍光強度対熱サイクル数）を図６で提示する。左上パネルは、対称ＰＣＲでのＶ６００Ｒプローブからのリアルタイム曲線を示す。左下パネルは、非対称ＰＣＲでのＶ６００Ｒプローブからのリアルタイム曲線を示す。増幅が対称ＰＣＲによるものであった場合、異なる量のＶ６００Ｒ突然変異体鋳型で出発した試料は全て、同様のＣＴを有したが、その後の曲線の勾配は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ突然変異体標的配列の出発量の関数として異なった。一方で、増幅が非対称ＰＣＲによるものであった場合、その逆であった：ＣＴはＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ突然変異体標的配列の出発量とともに変動したが、その後の曲線の勾配は平行であった。図６で示される結果から、対称ＰＣＲ条件下での多重アッセイにおいて、存在量がより低いＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ標的配列からの産物鎖（アンプリコン）はより多量のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ標的配列からの相補的アンプリコン鎖とヘテロ２本鎖を形成し、その結果、存在量がより低いＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ標的配列のＣＴ値は、より多量のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅアンプリコンへのそれらの結合の理由で変化した。変化によって、鋳型の出発数によるＣＴの予想される変動が不明瞭になった。一方で、非対称ＰＣＲ条件下で、ヘテロ２本鎖はあまり多くなく、それにより、各試料中に存在するＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ標的配列の相対的存在量の独立した定量が可能になる。これらの結果から、同じコドンにおいて生じる異なる突然変異を同時に検出するにもかかわらず、非対称プライマー濃度を含有する多重リアルタイムＰＣＲアッセイで決定されるＣＴ値が、定量的結果を提供することが示される。
【００６７】
発明者らの同時係属特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０１５３５１号明細書（国際公開第２０１４／１２４２９０Ａ１号パンフレット、公開日２０１４年８月１４日）において、発明者らは、１本のチューブ中で複数の標的を検出し、識別するために、分子ビーコンなど、プローブの標的として長いブリッジ配列の相補体を使用し得る、多重化（同じ反応で２つ以上の標的を検出）の方法を開示した。実施例７は、複数の標的の多重検出がこのアプローチにより実現可能である一方で、検出の感度が限定的であることを示す。図７、グラフＧ０１およびＧ０２は、１８ヌクレオチド長ブリッジ配列を有するプライマーの対（ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ２５−１８／９−６：１：１およびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ  ２５−１８／９−５：２：１（配列番号３６および３７））を使用して２つの別の標的（ＢＲＡＦ  Ｖ６００ＥおよびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ）を検出した二重実験を述べる。標的１，０００分子が検出可能であった一方で５コピーでは検出可能なシグナルが生じなかった。ブリッジ配列の長さが比較的短い（１８ヌクレオチド）ため、これらの二重反応の感度は限定的であった。プローブ−標的ハイブリッドは、アニーリング温度で結合したままになるほど十分に安定ではなかった。この問題に対する解決策は、記載のように、ブリッジ長を延長することである。しかし、これもまた記載のように、ブリッジ長の延長はまた、シグナル出現の遅延につながる。ブリッジ長を１８ヌクレオチドから３２ヌクレオチドに延長した場合（プライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３０−３２／９−６：１：１およびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ  ３０−３２／９−５：２：１（配列番号３２および３２））、ＣＴ値は１，０００分子の突然変異体ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒが６０サイクル未満で検出され得るように大きく右に動いたが、突然変異体ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅの５分子は、６０サイクル内で検出可能なシグナルを生じさせなかった（図７、グラフＧ０３およびＧ０４）。
【００６８】
より短い１８ヌクレオチド長ブリッジから検出可能なシグナルを得るために発明者らが発明したある可能な方法は、ブリッジからアンカーおよびフット領域に、プローブ−結合領域を外側に伸ばすことである。図７、グラフＧ０５およびＧ０６は、プローブ結合領域がフットおよびアンカー領域からの数個のヌクレオチドも含んだＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの対から得られた結果を示す（プライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ２５−１８／９−７：１：０およびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ  ２４−１８／９−６：２：０（配列番号３４および３５））。これらのプライマーは、より高い蛍光強度を生じさせただけでなく、５コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体を検出し得た。有効ではあるが、この解決策はプライマー配列の設計を束縛する。
【００６９】
発明者らが発見したより良好なアプローチは、本発明による方法であり、ここでは、異なる増幅可能タグ配列を各プライマーの５’末端に導入する。次に相補体（アンプリコンの他方の鎖に存在）がプローブの標的となる。プローブ−標的ハイブリッドの長さは、ブリッジの長さとは独立に選択され得る。述べたように、これらのタグは増幅中にコピーされ、それらの相補体は他方の鎖に存在する。
【００７０】
このような５’タグの有効性を図８（グラフＧ０７〜Ｇ１４）で示す。グラフＧ０７〜Ｇ０８で示される実験は、プライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３２−３０−１８／９−６：１：１およびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ  ３２−３０−１８／９−５：２：１（配列番号２８および２９）を利用し、これらは、３２ヌクレオチドの５’タグおよび１８ヌクレオチドのブリッジを保持する。これらの実験から、５コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅで開始された殆どの反応が、全般的にＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅがなかった反応と識別され得ることが示される（しかし、５コピーを用いた１反応でシグナルを生じさせることができず、１つの陰性対照反応で検出可能なシグナルが生じた）。識別ヌクレオチドが最後から２番目の位置ではなく３’末端にあることを除き、前の対と同様であるプライマー、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３２−３０−１８／９−７：１：０およびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ  ３２−３０−１８／９−６：２：０（配列番号３０および３１）の結果、同様に高レベルの識別が得られる（グラフＧ０９〜Ｇ１０）。
【００７１】
発明者らは、ブリッジ配列の長さがさらに一層短縮される場合、二重アッセイの感度のさらなる改善が得られることを発見した。これはグラフＧ１１〜Ｇ１２およびＧ１３〜Ｇ１４で示される。より短いブリッジ配列（１８ヌクレオチドに対して、１０〜１２ヌクレオチド）を有するプライマー（プライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３２−２５−１０／９−６：１：１およびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ  ３２−２５−１２／９−５：２：１（配列番号１９および２０））を使用する場合、５分子のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ標的で開始される反応は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ標的の分子なしで開始された反応と明らかに識別され得る（グラフＧ１１〜Ｇ１２）。さらに、識別ヌクレオチドが最後から２番目の位置ではなく３’末端にあることを除き、全ての点でこの対と同様である別のプライマー対を使用した場合（プライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３２−２５−１０／９−７：１：０およびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ  ３２−２５−１２／９−６：２：０（配列番号２６および２７））、同様に高レベルの識別が達成され得る（グラフＧ１３〜Ｇ１４）。
【００７２】
ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを利用する多重リアルタイムＰＣＲアッセイの重要な臨床的目標は、癌に関連する突然変異を保持する異なる希少ＤＮＡ断片の存在量を測定することおよび試料中に存在するＤＮＡの量に対してそれらの存在量を決定することである。しかし、これらの多重アッセイにおいて、各ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーは幾分異なるフット配列を保持し、これはフットハイブリッドの強度（エンタルピー）に影響を及ぼし、各ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーは明確に異なるブリッジ配列を有し、バブルの一部としてのその長さおよび強剛性はフットハイブリッドが形成する可能性（エントロピー）に影響を及ぼす。結果として、特定の突然変異を含有するある数のＤＮＡ断片に対して多重ＰＣＲアッセイにおいてあるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーで観察されるＣＴ値は、異なる突然変異を含有する同じ数のＤＮＡ断片に対して観察されるＣＴ値よりも幾分早く、または幾分遅く生じ得、それにより、異なる突然変異体断片の存在量の相互比較が困難になる。これが起こる場合、ＣＴ値対出発鋳型数またはＣＴ値対最初に存在する鋳型数の対数の複数のグラフまたはチャートがユーザーに提供され、各ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーに対して異なるグラフまたはチャートが必要とされる。
【００７３】
発明者らは、（プライマー選択性に顕著な影響を与えることなく）ある数の標的配列に対して得られるＣＴ値を微調整するためにＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのブリッジ配列の長さを少し変化させることが可能であることを発見した。（ヌクレオチド数を変化させることなく）そのブリッジのヌクレオチド配列において少し変化させることによって、得られたＣＴ値を微調整することさえ可能であり、それによって、ブリッジの強剛性を変化させる。このようにして、１つの標的配列に対するＣＴ値が、何らかの他の標的配列に対する同じＣＴ値の場合と同じ数の出発鋳型に相当するように、（予備的な実験に基づき）多重ＰＣＲアッセイにおいて一緒に使用されるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーセットの各メンバーの設計を調整し得る。次に、全ての標的配列に対するＣＴ値は、ＣＴ値対鋳型の出発数の対数のグラフにおいて同じ線上に位置する。結果として、存在量が同じアッセイで測定される異なる標的配列全てに対するＣＴ値のセットは、直接的に相互比較可能である。ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのセットが微調整される場合、ユーザーが必要であるのは、ＣＴ値対出発鋳型数またはＣＴ値対最初に存在する鋳型数の対数の１つのグラフまたはチャートのみである。
【００７４】
実施例８および図９は、２つの類縁突然変異体配列を検出するための、二重アッセイで使用される２つのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのセットの微調整を示す。発明者らは、微調整しなかったＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーで出発した。非対称ＰＣＲを行い、リアルタイム蛍光測定を行った。図９の上のパネルで示されるように、ＣＴ対標的配列の出発数の得られたプロットは、同じ線ではなく異なる線上に位置した。発明者らは、それを補正するための、発明者らが微調整と呼ぶ方法を見出した。プライマーのセットを微調整するために、１つ以上のプライマーが修飾され得ることも理解されよう。実施例８の場合、発明者らは、１つのプライマーを同じものに維持し、標的配列のある出発数に対する修飾プライマーで得られるＣＴ値を低くするために、他方のプライマーのみを修飾した。何回かの試行が必要となり得るものの、実施例２で提供されるバブルの周縁の変化の影響および実施例４で提供されるバブル対称性の変化の影響は、微調整のためにブリッジを修飾することに対する指針となる。表３および図４で結果が示される実施例２の実験で示されるように、バブル周縁の比較的大きな変化によって、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーで得られるＣＴ値の比較的小さな変化が生じる。実施例８で報告される実験において、発明者らが行ったことは、介在配列の長さを変化させることなく、ブリッジ配列を５ヌクレオチド短縮することであった。図９の下のパネルで示されるように、一方のＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーにおけるこの変化の結果、２つのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーが微調整された。ＣＴ値対出発鋳型数の対数のプロットは同じ線上になった。実施例９および１０で報告されるように、２つの類縁突然変異体配列だけでなく参照野生型配列も増幅し検出するための三重アッセイのために、発明者らが使用した３個のＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのセットを図１０〜１３で示されるように微調整した。
【００７５】
リアルタイム多重アッセイ中に存在する各ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのブリッジに対する長さおよびヌクレオチド配列を選択するためのユニークな能力によって、参照野生型配列、非関連野生型配列または関連野生型配列の何れかの増幅のためのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー（好ましくは微調整）を含むことが可能になる。非関連野生型配列の使用の場合、ＰＣＲアッセイ混合物は、試料中に存在する参照野生型配列の増幅に特異的である、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーおよび従来のリバースプライマーを含む。関連野生型配列の使用の場合、ＰＣＲアッセイ混合物は、試料中に存在する参照野生型配列に特異的であるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを含むが、さらなるリバースプライマーは必要ない。何れにせよ、参照配列からのアンプリコンの生成（明確に色分けされた分子ビーコンの蛍光により反映）は、ＰＣＲアッセイがよく機能していることを確実にするための内部対照となる。さらに、野生型アンプリコンのＣＴ値は、試料中に存在するＤＮＡ量を反映し、ＣＴ値が所定の値よりも高いことが判明したとき、それらが存在する場合、存在するとするには希少標的突然変異に対する試料中のＤＮＡが少なすぎるがゆえに、アッセイ結果は無視される。重大なこととして、試料中のＤＮＡ量を反映するＣＴ値を生成させる微調整されたＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの使用によって、直接的に相互比較しようとする突然変異体標的配列に対する同様に微調整されたＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーによるＣＴ値の生成が可能になる。希少突然変異体のＣＴ値と参照遺伝子のＣＴ値との間の相違は、それらの相対的存在量の直接的な反映であり、この比較には、試料中のＤＮＡ量を予め決定することは必要ない。
【００７６】
実施例９および１０は、微調整ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを使用した非対称多重アッセイにおいて参照野生型遺伝子に対するプライマーを含むことの価値を示す。実施例９において、野生型参照は非関連であり；実施例１０において関連する。三重リアルタイム非対称ＰＣＲアッセイは同時にＢＲＡＦ  Ｖ６００ＥおよびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ突然変異体配列および非関連参照ＥＧＦＲ野生型配列（実施例９）または関連ＢＲＡＦ野生型配列（実施例１０）の何れかを増幅した。各反応は、得られたアンプリコンを検出するための３色に異なって色分けされた分子ビーコンプローブを含有した。各実施例において、２セットの反応を行った。第１のセットは、固定量の野生型断片およびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ断片（それぞれ１０，０００コピーおよび１，０００コピー）および異なる量のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ断片（０；１０、３９；１５６；６２５；および２，５００コピー）を含有した。第２のセットは、固定量の野生型断片およびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ断片（それぞれ１０，０００コピーおよび１，０００コピー）および異なる量のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ断片（０；１０、３９；１５６；６２５；および２，５００）を含有した。実施例９での両セットは、実際の試料を模倣するために１０，０００個のＢＲＡＦ野生型断片を含有したが、反応にはＢＲＡＦ野生型配列の指数関数的増幅のためのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーは含まれなかった。
【００７７】
（図１０〜１３で示される）結果から、各標的配列に対して決定されたＣＴ値は、試料中に存在するそれらの標的配列数の対数に対してプロットされる場合、全て直線上にあることが示され、これにより、これらの多重アッセイで使用されるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの設計が微調整され、異なるＣＴ値が直接相互比較され得るようになったことが確認される。結果的に、試料中の各突然変異体標的配列に対して得られたＣＴ値と参照野生型標的配列に対して得られたＣｔ値との間の差（ΔＣｔ）は、試料中に存在するＤＮＡ量にかかわらず、参照野生型標的配列の存在量に対する突然変異体標的配列の存在量を反映する。個体から採取された液体生検試料中のＤＮＡ量は、１日の流れでかなり変動する可能性が高い。しかし、参照遺伝子の存在量に対する各標的突然変異の存在量は、基礎をなす臨床状況の信頼できる指標となる可能性が高い。実施例９および１０の結果の比較、特に、１０コピーの突然変異体標的配列とその配列のコピーなしとの間のＣＴ値の識別可能な差の比較に基づいて、発明者らは非関連野生型配列の使用を選択する。
【００７８】
アレル選択性促進試薬を用いた多重アッセイ
スクリーニングアッセイを含むある一定の多重アッセイは、液体生検試料中のＤＮＡ断片中で非常に少ないコピー数、例えば１０コピー未満で試料中に存在する突然変異を検出する能力を必要とする。液体生検試料中に存在する突然変異体ＤＮＡ断片数は極めて少なく、例えば、症状がまだ出ていないときまたは早期に検出されることが最良である新しい突然変異が生じる場合（薬物耐性突然変異が最初に現れる場合など）は１０未満であることが多い。１０，０００コピーの関連野生型配列の存在下で１０コピー未満、さらには１コピーの突然変異体標的アレル配列を検出することは、非常に高いアレル選択性を必要とする。記載のように、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを利用したアッセイ法においてアレル感度を向上させるための２つの方法は、フット配列の長さを短縮することおよびブリッジおよび介在配列により形成されるバブルの周縁を長くすることである。発明者らは、このようなことを行うのにはいくつかの欠点があることを見出した。第一に、１０コピー未満の突然変異体標的配列に対するＣＴ値は不必要に高い。第二に、そのＣＴ値は、反復試料間で実質的な可変性を有する（例えばこの可変性は、４つの標的断片を名目上保持する多重試料が試験される場合に生じることが観察される）。第３に、この固有の可変性ゆえに、野生型標的断片のみを保持する対照試料は、不可能でない場合、類似しており、区別困難なＣＴを生成させ得る。
【００７９】
発明者らは、ホフマイスター塩および特に塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を含むある一定の試薬が、例えば突然変異体アレルと野生型アレルとの間で、または異なる突然変異体アレルの間で、または複数の突然変異体アレルおよびそれらの関連野生型アレルの中で、類縁配列間で区別するためにＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのアレル選択性を向上させることを発見した。発明者らは、異なる濃度のＴＭＡＣを用いて様々な構成のＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの使用を調べた。この研究からの実験を以下の実施例１１〜１４で提示する。
【００８０】
実施例１１はいくつかのことを示す：
・図１４および１５の上のパネルを比較すると、予想されるように、ＴＭＡＣなしで、より短い６：１：１フットを用いたアッセイは、多数の関連野生型配列の存在下で突然変異体標的配列を含有する試料と多数の関連野生型配列のみを含有する試料との間でより良好なΔＣＴを与えたことが分かり得る。
・図１４および１５の下のパネルから、ＴＭＡＣの濃度が高すぎると（これらの反応において１００ｍＭ）、６０サイクルのＰＣＲ増幅後にＣＴが得られなかった点まで、突然変異体配列の増幅を抑制することが分かり得る。
・図１４および１５のそれぞれから、各プライマーを用いて得られるΔＣＴがＴＭＡＣ濃度とともに変動したことが分かり得る。６０ＰＣＲサイクルによるΔＣＴは最大値まで上昇し（６：１：１フットに対して５０ｍＭ  ＴＭＡＣおよび８：１：１フットに対して７０ｍＭ  ＴＭＡＣ）、その後突然変異体配列の増幅が全体的に抑制されたので計算できなかった。
・図１４および１５を比較したところ、８：１：１フットを用いた場合、最大７０ｍＭまでのＴＭＡＣ濃度上昇は突然変異体標的配列のＣＴに対して基本的に影響がなく、その一方で、より短い６：１：１フットを用いた場合、約５サイクルの遅延の影響があったことが分かり得る。
【００８１】
実施例１２は、ＴＭＡＣが実際上、関連野生型配列の多数のコピーの存在下で突然変異体標的配列のコピーを含有しない試料からバックグラウンドシグナルを除去し得ることを示す。実施例１１で使用したものと同じ３２−２４／１４／１４−８：１：１  ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅフォワードプライマーおよび最適であることが分かった７０ｍＭ  ＴＭＡＣを使用して（図１５、曲線１５０７および１５０８）、発明者らは、４０，０００コピーの野生型配列（液体生検試料中で見出され得る量）および１０，０００；１，０００；１００；１０または０コピーの関連突然変異体標的配列の何れかを用いて一連のＰＣＲアッセイを行った。比較のために、発明者らはＴＭＡＣなしで同様のシリーズを行った。上記で説明したように、ポアソン因子が有意になるほど標的配列の数が少ない場合、可変性を評価するために、１０コピーの突然変異体標的配列を用いた５つの反応を行った。発明者らは、突然変異体コピーなしの試料に対して同じことを行った。図１５のように、図１６は、突然変異体標的配列のコピーなしの試料が６５サイクルのＰＣＲ増幅中にＣＴがなかったことを示す。図１６は、突然変異体標的配列濃度のうち５レベル全てをＣＴにより識別可能であったことも示す。特に、幾分かの可変性にもかかわらず、１０コピーからのＣＴは、１００コピーから、およびコピーなしからのＣＴとは識別可能であり、その曲線にはＣＴがなかった。対照的に、ＴＭＡＣなしで、１０コピーからのＣＴの範囲およびコピーなしからの範囲において重複があった。
【００８２】
実施例１３および図１７は、閾値サイクル数（ＣＴ）対試料中の突然変異体標的配列の出発数（４〜４０，０００）の対数のプロットは、液体生検試料（４０，０００コピーの野生型配列）中で起こり得るように、データに対する直線フィットに極めて近くなり（図１７、線１７０１）；４個の突然変異体標的配列に対するＣＴ（４８．７）が野生型配列のみに対する非常に抑制されたＣＴ（５４．９）とは識別可能であることを示す。この実施例において、発明者らは３２−２４−１８／１４−７：１：０  ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅフォワードプライマーおよび５０ｍＭ  ＴＭＡＣを使用し、これについて、発明者らは、８ヌクレオチドのフットを有するプライマーに対して最適により近いと考える。
【００８３】
実施例１４および図１８は、同じ長さのフット配列（８：１：１）を有するが異なるブリッジ配列を有し、異なるバブルを形成するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー：周縁において対称バブル４０ヌクレオチドを形成する１８ヌクレオチド長ブリッジまたは対称バブル２８ヌクレオチド長を形成する１０−ヌクレオチドブリッジを利用するアッセイにおける異なるＴＭＡＣ濃度の影響を比較する。図１８は、ＴＭＡＣ濃度の上昇が、後者の（１０／１４ブリッジ）プライマーよりも前者の（１８／１８ブリッジ）プライマーに対して、ΔＣＴにより大きい影響があったことを示す。結果として、より小さいバブルを形成したＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー（１０／１４ブリッジを有するプライマー）を使用して約１５のΔＣＴを達成するために５０ｍＭ  ＴＭＡＣを幾分上回ることが必要とされた一方で、より大きいバブルを形成したＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー（１８／１８ブリッジを有するプライマー）を用いて同じΔＣＴを達成するために必要なＴＭＡＣは２０ｍＭ未満であった。
【００８４】
実施例１５および図１９〜２１は、同じ１０ヌクレオチド長のフットを有するが、フット配列における単一のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドの位置が異なる：３’末端インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチド（９：１：０フット）または３’−末端の最後から２番目のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチド（８：１：１フット）の何れかである、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを利用するアッセイにおいて異なるＴＭＡＣ濃度（０〜５０ｍＭ）の影響を比較する。ＰＣＲアッセイ混合物は、０または４，０００コピーの何れかの突然変異体標的配列＋各ケースにおいて４００，０００コピーの類縁野生型配列を含有した。実施例１５の表８中のＣＴの値を図１９〜２０でプロットする。図１９の線１９０２および図２０の線２００２は、ＴＭＡＣ濃度上昇に従い、どのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーが使用されたとしても、突然変異体標的配列を含む試料のＣＴが僅かに低下したことを示す。図１９の線１９０１および図２０の線２００１は、ＴＭＡＣ濃度上昇に従い、野生型のみを有する試料のＣＴが、様々な比率にもかかわらず上昇し；９：１：０フットを有するプライマーを用いた試料のＣＴが、８：１：１フットを有するプライマーを用いた試料のＣＴの場合よりもＴＭＡＣ濃度とともにより速く上昇し、９：１：０フットがあるプライマーに対する６５サイクルの増幅後、５０ｍＭ  ＴＭＡＣの存在下でもＣＴが生じなかったことを示す。図２１は、両方のＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーに対して、ΔＣＴ（野生型標的配列のみに対するＣＴ−突然変異体標的配列＋野生型標的配列に対するＣＴ）がＴＭＡＣ濃度上昇とともに上昇したが、野生型のみがある試料に対するＴＭＡＣ濃度上昇の影響が異なるがゆえに、ＴＭＡＣ濃度上昇に伴うΔＣＴの上昇は、３’末端の最後から２番目のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドを有するプライマー（線２１０２）に対するものよりも、３’末端インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドを有するヌクレオチド（線２１０１）に対して大きく；すなわち線２１０１の勾配は線２１０２の勾配よりも大きいことを示す。
【００８５】
発明者らの実験の結果から、発明者らがＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを含有するＰＣＲアッセイに異なる濃度のＴＭＡＣ（０〜１００ｍＭ）を添加した場合、野生型ＤＮＡのみを保持する試料のＣＴ値が顕著に劇的に上昇するという影響があり、一方で野生型ＤＮＡ断片および突然変異体ＤＮＡ断片の両方を保持する試料のＣＴ値を僅かに低下させることが示される。熱力学的および結果として生じるカイネティクスの組み合わせにより、アレル選択性が顕著に向上すると発明者らは結論付けた。
【００８６】
図１４〜１６は、ＴＭＡＣ濃度が上昇するにつれて、突然変異体ＤＮＡ断片ありおよびなしで試料のＣＴ値の分離が最大となることを示す。さらに高いＴＭＡＣ濃度では、突然変異体ＤＮＡ断片を含有する試料のＣＴ値が上昇し、その結果、突然変異体ＤＮＡ断片ありおよびなしで試料のＣＴ値の分離が小さくなる。この驚くべき結果から、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＰＣＲアッセイの選択性を向上させるための最適ＴＭＡＣ濃度があることが示される。今までの発明者らの研究において、発明者らが１０ｍＭの傾斜で変動するＴＭＡＣ濃度と比較しておおよそ最適化したが、必要に応じて、より小さい傾斜を使用することにより、より的確な最適化が可能になることが認められよう。
【００８７】
ＴＭＡＣの影響は、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのフットの長さに依存する。比較的短いフット（およそ７または８ヌクレオチド長）を保持するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーに対する最適ＴＭＡＣ濃度は、比較的より長いフット（およそ９または１０ヌクレオチド長）を保持するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーに対する最適ＴＭＡＣ濃度よりも低い。
【００８８】
ＴＭＡＣの前述の影響は、フットのＧ−Ｃ含量に依存する。フットが高Ｇ−Ｃである場合、フットは、フットが高Ａ−Ｔである場合よりも短いはずであり、より短いフットが必要とするＴＭＡＣ濃度はより低い。ＴＭＡＣの影響は、フットにおける「インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチド」の位置にも依存し（突然変異体における対応するヌクレオチドに相補的であるが、野生型における対応するヌクレオチドに相補的ではないヌクレオチドである）：ＴＭＡＣは、インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドがフット配列の３’末端ヌクレオチドである場合、ΔＣＴに対してより大きい影響がある。
【００８９】
発明者らはこれらの観察からの次の推論を引き出した：
・ＴＭＡＣがミスマッチのあるハイブリッド（未知であるが）を弱める機序は、ハイブリッド中のヌクレオチド数に依存する。
・ＴＭＡＣは、低Ｇ−Ｃ含量を有するミスマッチのあるフットハイブリッドに対してより大きい弱化効果があり；フットハイブリッドに対するＴＭＡＣの相対的影響はフットの長さに依存し、より短い完全に相補的なフットハイブリッドが既に非常に弱いという意味では、それらを顕著に不安定化させるためにより少ないＴＭＡＣをとり、ミスマッチのある短いフットハイブリッドが全ての中で最弱であり、したがって最も容易に影響を受け、これによりＣＴ値がかなり後になる。
・フットハイブリッドに対するＴＭＡＣの相対的影響はインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドの位置に依存し、３’末端ミスマッチを含有するハイブリッドにおいて影響がより大きい。
【００９０】
何らかの理論に縛られることを望むものではないが、発明者らは、ＴＭＡＣが対応する完全に相補的であるフットハイブリッドと比較してミスマッチのあるフットハイブリッドを弱化し、それにより平衡状態でそれらの熱力学的比率を低下させるだけでなく、それらの相対的な固有の安定性を低下させることによって、ＴＭＡＣが同等の完全に相補的なハイブリッドの平均持続時間と比較してミスマッチのあるフットハイブリッドの平均持続時間を異なるように短縮し、それによりＰＣＲアッセイのアレル選択性を促進するという理論を立てる。再び何らかの理論に縛られることを望むものではないが、発明者らは、今回、ＴＭＡＣがケト−エノール互変異性が起こることを防ぐという理論を立てる。ＴＭＡＣが多いほど、ケト−エノール互変異性が起こりにくくなる。ケト−エノール互変異性により、ミスマッチのある塩基対が一時的に対形成し得；ケト−エノール互変異性により、相補的塩基対が一時的に対形成しなくなり得る。発明者らの今回の理論によれば、次のようになる：
（ｉ）３’末端インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドを保持するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの場合、ケト−エノール互変異性は、フットハイブリッド中の末端のミスマッチがあるヌクレオチドが時折、３’末端塩基対を形成できるようにする（結果的に、ポリメラーゼはアンプリコンを生成させる可能性を有する）。ＴＭＡＣが多いほど、ケト−エノール互変異性が少なく、３’末端（ミスマッチあり）塩基対が起こりにくくなり、ポリメラーゼがアンプリコンを生成し得る可能性が低くなり、ＣＴ値がより高くなる。
（ｉｉ）３’末端の最後から２番目のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドを保持するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの場合、発明者らは、ミスマッチのある最後から２番目の塩基対が３’末端（合致）塩基対形成を防ぐ傾向があると考える。しかし、ケト−エノール互変異性ゆえに、ミスマッチのある最後から２番目の塩基対が時折生じ、それが、ミスマッチがある場合でも、時折完全に合致したフットハイブリッドにつながる。ＴＭＡＣが多いほど、ケト−エノール互変異性が少なく、最後から２番目の（ミスマッチがある）塩基対が起こりにくく、ポリメラーゼがアンプリコンを生成し得る確率が低くなり、ＣＴ値が高くなる。
（ｉｉｉ）ミスマッチのあるフットハイブリッドでのＣｔ値上昇に対するＴＭＡＣの影響は、最後から２番目のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドを保持するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーにより形成されるミスマッチのあるフットハイブリッドでのＣＴ値上昇に対するＴＭＡＣの影響よりも、３’末端インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドを保持するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの場合に大きく、これは、３’末端の最後から２番目の塩基対に１個のミスマッチのある塩基対の形成ならびに実際上同時に起こるフットハイブリッドの３’末端での相補的（合致）塩基対の形成の両方に対するものよりも、フットハイブリッドの３’末端で１つのミスマッチのある塩基対の形成を防ぐことがかなり容易であるからである。
（ｉｖ）何れかのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーにより形成される完全に相補的であるフットハイブリッドに関しては、発明者らは、完全に相補的なハイブリッドが同時に生じることが、（通常は相補的な）塩基対の一方でのケト−エノール互変異性の瞬間的な存在により妨げられることがあるという仮説を立てる。しかし、存在するＴＭＡＣが多いほど、ケト−エノール互変異性体形成の可能性が低くなり、したがって、フットハイブリッド形成の可能性が高くなり、これはＣＴ値がより早くなることにつながる。
【００９１】
多重アッセイでの使用のためのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのセットを設計するために、発明者らは、各ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーが３’末端インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドおよび１４／１４ブリッジ／介在配列（３２−ヌクレオチドバブル）を含有するモノプレックス非対称ＰＣＲアッセイにおいて候補ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを試験することから開始する。アッセイが類縁野生型配列に対する識別を目的とする場合、発明者らは最初に、形成される場合、プライマー／野生型ハイブリッドにおいて、インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドがＧ−Ｔ塩基対を形成しないことが確実であることをチェックし−形成する場合、発明者らは他の標的鎖に変える。発明者らは、完全に野生型配列の増幅を排除するＴＭＡＣの最低濃度（６５サイクル後にＣＴなし）および目的とする標的配列のＣＴに悪影響を及ぼさない最高濃度を突き止めるために、異なるフット長（例えば、７：１：０、８：１：０および９：１：０）および異なるＴＭＡＣ濃度（２０ｍＭ〜５０ｍＭ）を試験する。発明者らは、使用するためのＴＭＡＣ濃度を選択する。多重アッセイにおける増幅は全て１つのＴＭＡＣ濃度を含んだので、発明者らは、必要に応じて、どのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーが実測ＣＴ値を生成させるかにかかわらず、ブリッジおよび介在配列の長さを変化させ、および／またはＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの何れかで得られたＣＴ値が試料中の突然変異体ＤＮＡ断片の数を反映するようにインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドの位置を変化させることによって、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの１つ以上の「微調整」を進める。
【００９２】
特に図１６および１７で示されるように、ＰＣＲアッセイ混合物中に最適濃度のＴＭＡＣを含むことによって、より長いフット配列およびより小さいバブルを保持するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを使用し得、それによって少数の突然変異体ＤＮＡ断片（一般に１０未満）を含有する試料を増幅した場合に得られるＣＴ値の変動性が小さくなり、また、得られるＣＴ値が、突然変異体ＤＮＡ断片を含有しない試料から得られるＣＴ値と識別可能になると思われる。
【００９３】
プレ増幅を伴う多重アッセイ
記載したように、試料ソース、例えば対象の血液中に存在する突然変異体標的分子の数が１０未満、例えば５以下である場合、問題が生じる可能性がある。ある問題は、試料と試料との間の変動である。試料ソースが平均３コピーの突然変異体標的配列を有する場合、細胞１０，０００個からのＤＮＡの一部の試料は、正確に３コピーを含有し、一方で他方は、より少ないコピー（さらには０）またはより多くのコピーを含有すると予想され得る。別の問題は、類縁標的配列に対する２つ以上の異なるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの存在から生じ、これらのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーは、それらの同一またはほぼ同一であるアンカー配列を通じたこれらの希少標的への結合について競合し、またこれらのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのうち１つのみが特定の希少標的分子をコピーするように設計され、これによって初期の変動性の別の発生源が導入される。そして最後に、さらなる問題は、何らかのＰＣＲ熱サイクルにおいてＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーがその目的とする標的配列のコピーを開始する可能性が低いことから生じる。出発鋳型が殆どない場合、指数関数的増幅が始まる熱サイクルが変動し得、それとともに閾値サイクル数（ＣＴ）も変動し得る。結果として、ＣＴ値は、ポアソン因子に供され、その結果、実測ＣＴ値が時折、予想ＣＴ値から変動し、突然変異体標的断片を含有しない試料のＣＴ値とは高い信頼性で識別可能ではない。このような偽陰性の結果は、最大感度を要するアッセイの有用性を低下させる。
【００９４】
これらの問題は、上記で論じるように、ＴＭＡＣ、別の有効なホフマイスター塩または別のアレル選択性促進試薬を含むことによって対処される。このような添加物なくこれらの問題に対処するために、発明者らの解決策は、線形的プレ増幅の使用を通じて、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーが結合し得る試料中の標的鋳型の数を増加させることである。指数関数的ＰＣＲ増幅を開始する前に、発明者らは、従来のリバースプライマーのみを利用して直線的増幅の多重サイクルを行う。プレ増幅のサイクル数は、３〜４０、好ましくは５〜３０であり得る。発明者らは、ここで線形的プレ増幅を行うための２つの方法を記載する。
【００９５】
第１の方法は、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーではなく増幅法のみを改変することを含む。この方法において、増幅および検出はマルチチャンバーカセットにおいて行われる。線形的プレ増幅は、反応混合物がＰＣＲアッセイ混合物−ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーである第１のチャンバーで行われる。プレ増幅後、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを含有する第二のチャンバーに得られた反応混合物を移し、それによって指数関数的増幅のための反応混合物を生成させる。反応チューブを使用して同じことを遂行し得る一方で、このチューブは、発明者らが推奨した段階である線形的プレ増幅後にＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを添加するために開口していなければならない。
【００９６】
第２の方法は、増幅法およびＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの両方を改変することを含む。この方法に対して、使用されるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーは、短いアンカー配列を有する本発明の方法において有用なＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーである。これらは、アンカー配列のＴｍを共通リバースプライマーのＴｍよりも８〜１５℃下回るように低下させるためにアンカー配列を短縮する、本発明の方法のために設計されたプライマーであり得る。増幅は、全てのプライマーを含む完全なＰＣＲアッセイ混合物を用いて開始されるが、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのＴｍを少なくとも４℃上回るがリバースプライマーのＴｍを下回るプライマーアニーリング温度を使用してプレ増幅のサイクルを行い、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのアニーリングが起こる可能性が極めて低いがリバースプライマーのアニーリングが起こる可能性が非常に高くなるようにする。規定数のプレ増幅サイクル後、全てのプライマーがそれらの標的とハイブリッド形成するものより低いプライマーアニーリング温度を使用して本発明の方法に従いＰＣＲ増幅を行う。例えば、リバースプライマーは、７０〜７５℃のＴｍを有するように構築され得、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーは、Ｔｍが６０〜６２℃である比較的短いアンカー配列を有し得る。７２℃のプライマーアニーリングを使用して、それらのプライマーを用いた多重サイクルのプレ増幅を行い得るが、これはＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのＴｍを少なくとも１０℃上回り、その後、６０℃のプライマーアニーリング温度を使用してＰＣＲ増幅が行われ得る。プライマーＴｍは、濃度により調整されたＴｍを得るために公知のように測定または計算し得る。
【００９７】
プレ増幅の各サイクルにより、出発数と等しい各標的配列（突然変異体および野生型）の新しいコピー数が生じる。５コピーの出発数の場合、例えば１０サイクルのプレ増幅の結果、ＰＣＲ増幅の開始時に５５コピーが得られ；２５サイクルのプレ増幅の結果、１３０コピーが得られるなどである。ＰＣＲ開始時のこれらのコピー数によって、コピーが実際に始まるサイクルの変動性が低下し、本発明による多重アッセイの検出限界内に十分に入る。元の試料が非常に少数の突然変異体標的鎖を含有した場合でも、得られるＣＴ値は、突然変異体標的鎖を含有しない試料から得られるＣＴ値よりも識別可能に大きいと思われ、したがって、偽陰性の結果が生じる可能性は極めて低い。
【実施例】
【００９８】
以下表１で与えるのは、実施例１〜５のＥＧＦＲ突然変異Ｌ８５８Ｒに対するモノプレックスＰＣＲアッセイで使用されるプライマーの配列である。
2019510501.tif 000003
【００９９】
各ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー内のブリッジ配列に下線を付し、そのフット配列中のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドを太字で示す。比較実験におけるそれらの使用を反映する群にプライマーを編成する。
【０１００】
表１におけるプライマーに対する標的であったＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ配列は下記の通りであった：
2019510501.tif 000004
【０１０１】
説明のために、リバースプライマーの配列（配列番号１５）のように、２４−１４／１４−５：１：１プライマー（配列番号２）のアンカーおよびフット配列に対する結合部位に下線を付す。
【０１０２】
実施例１．ＥＧＦＲ突然変異Ｌ８５８ＲおよびＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーフット長短縮の影響
選択性および遅延に対するフット配列の長さの影響を調べるために、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ色素を用いた検出を伴うモノプレックス、対称ＰＣＲアッセイにおいて３つのプライマーの性能を比較した。プライマー（表１）は、２４−１４／１４−４：１：１（配列番号１）、２４−１４／１４−５：１：１（配列番号２）および２４−１４／１４−６：１：１（配列番号３）であった。３つのプライマー全てに対して、アンカー配列は２４ヌクレオチド長であり、ブリッジ配列は１４ヌクレオチド長であり、バブルは周縁が３２ヌクレオチドで対称であった（介在配列はブリッジ配列と同じ長さであった）。さらに、３つのケース全てにおいて、１個のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドがプライマーのフットの３’末端の最後から２番目の位置に位置した。ＤＮＡハイブリッドの融解温度を計算するためのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＳｃｉＴｏｏｌｓプログラムを使用して（指定パラメーター：それぞれ［オリゴ］＝０．１２μＭ；［Ｎａ＋］＝６０ｍＭ；［Ｍｇ２＋］＝３ｍＭ；［ｄＮＴＰｓ］＝０．２５ｍＭ）；鋳型への２４−１４／１４−４：１：１アンカー配列の結合に対するＴｍは６８．９℃であり、得られる相補的アンプリコンへのマルチパートプライマー全体の結合に対するＴｍは８０．８℃であり；鋳型への２４−１４／１４−５：１：１アンカー配列の結合に対するＴｍは６７．８℃であり、得られる相補的アンプリコンへのマルチパートプライマー全体の結合に対するＴｍは８０．４℃であり；鋳型への２４−１４／１４−６：１：１アンカー配列の結合に対するＴｍは６９．０℃であり、得られる相補的アンプリコンへのマルチパートプライマー全体の結合に対するＴｍは７９．９℃であった。
【０１０３】
ｐＧＥＭ−１１Ｚｆ（＋）ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ突然変異または対応するＥＧＦＲ野生型配列の何れかを含有する１１５塩基対ＥＧＦＲ遺伝子断片を挿入することによって、プライマー配列およびそれらの目的とする標的プラスミドを調製した。制限エンドヌクレアーゼＭｓｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で突然変異体および野生型プラスミドＤＮＡを消化した。消化混合物は、５ｍＭ  ＫＡｃ、２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ａｃ（ｐＨ７．９）、１ｍＭ  ＭｇＡｃ、１％ウシ血清アルブミンおよび１００μＭジチオスレイトールを含有する２０μＬ体積中に１０単位のＭｓｅＩおよび４μｇの突然変異体または野生型ゲノムＤＮＡを含有した。この反応を３７℃で１２０分間温置し、続いて酵素を不活性化するために６５℃で２０分間温置した。
【０１０４】
５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、各２５０μＭの４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、１２０ｎＭの各プライマーおよび１ｘＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含有する３０μＬ体積中でＰＣＲ増幅を行った。このシリーズにおいて、反応混合物は、１０６コピーの関連野生型（ＷＴ）配列および突然変異体（ＭＵＴ）目的標的配列の希釈系列を含有した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＩＱ５分光蛍光分析サーマルサイクラーにおいて０．２ｍＬポリプロピレンＰＣＲチューブ（白色）を使用して増幅を行った。熱サイクリングプロファイルは、９５℃で１０分間、続いて、９５℃で２０秒、６０℃で２０秒および７２℃で２０秒を６０サイクルであった。各熱サイクルの鎖伸長段階（７２℃）の終了時にＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ蛍光強度を測定した。
【０１０５】
リアルタイム蛍光測定（示さない）から、アッセイ機器が各反応に対する閾値サイクル数（ＣＴ）を自動的に計算した。ＣＴ値を表２で列挙する。
2019510501.tif 000005
【０１０６】
図３は、各反応中に存在するＭＵＴ鋳型数の対数の関数として（同じプライマーを含有する反応の各セットに対して）観察されるＣＴ値を示す一連のグラフである。線３１は、６ヌクレオチド長のフット配列（４：１：１）を保持するプライマーに対するＣＴ値に対する線形相関フィットであり；線３２は、７ヌクレオチド長フット配列（５：１：１）を保持するプライマーに対するＣＴ値に対する線形相関フィットであり；線３３は、８ヌクレオチド長フット配列（６：１：１）を保持するプライマーに対するＣＴ値に対する線形相関曲線フィットである。
【０１０７】
実施例２．ＥＧＦＲ突然変異Ｌ８５８Ｒおよびバブルの周縁を大きくする効果
プライマー（表１）２４−１０／１０−５：１：１（配列番号９）、２４−１４／１４−５：１：１（配列番号２）および２４−１８／１８−５：１：１（配列番号１０）を使用して、実施例１に記載の実験を反復した。３つのケース全てにおいて、アンカー配列は２４ヌクレオチド長であり、フット配列は５：１：１であるので、１個のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドが各プライマーのフットの３’末端の最後から２番目の位置に位置した。アンカー配列の選択は、プライマーがその鋳型に結合する際に生成される介在配列が、プライマーのブリッジ配列と同じ長さになり、その結果対称バブルとなるようなものであった。この一連の３つのマルチパートプライマーにより形成されたバブル周縁はそれぞれ２４、３２および４０ヌクレオチド長であった。
【０１０８】
ＤＮＡハイブリッドの融解温度を計算するためにＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’ＳｃｉＴｏｏｌｓプログラムを使用して（指定パラメーター：それぞれ［オリゴ］＝０．１２μＭ；［Ｎａ＋］＝６０ｍＭ；［Ｍｇ２＋］＝３ｍＭ；［ｄＮＴＰｓ］＝０．２５ｍＭ）；鋳型への２４−１０／１０−５：１：１アンカー配列の結合に対するＴｍは６７．２℃であり、得られた相補的アンプリコンへのマルチパートプライマー全体の結合に対するＴｍは７８．５℃であり；鋳型への２４−１４／１４−５：１：１アンカー配列の結合に対するＴｍは６７．８℃であり、得られた相補的アンプリコンへのマルチパートプライマー全体の結合に対するＴｍは８０．４℃であり；鋳型への２４−１８／１８−５：１：１アンカー配列の結合に対するＴｍは６８．７℃であり、得られた相補的アンプリコンへのマルチパートプライマー全体の結合に対するＴｍは７９．７℃であった。
【０１０９】
この３つのマルチパートプライマー設計のそれぞれに対して、ＷＴ鋳型１０６コピー＋ＭＵＴ鋳型１０６、１０５、１０４、１０３、１０２または１０１コピーそれぞれで開始する希釈系列を利用して、実施例１に記載のように一連のＰＣＲ増幅および検出アッセイを行った。アッセイ機器は各反応に対する閾値サイクル数（ＣＴ）を自動的に計算した。各反応に対するリアルタイムデータ（示さない）から計算されたＣＴ値を表３に列挙する。
2019510501.tif 000006
【０１１０】
図４は、各反応に存在するＭＵＴ鋳型数の対数の関数としての（同じプライマーを含有する各反応セットに対して）観察されるＣＴ値を示す一連のグラフである。線４３は、周縁が２４ヌクレオチド長であったバブルを形成したプライマーに対するＣＴ値に対する線形相関フィットであり；線４２は、周縁が３２ヌクレオチド長であったバブルを形成したプライマーに対するＣＴ値に対する線形相関フィットであり；線４１は、周縁が４０ヌクレオチド長であったバブルを形成したプライマーに対するＣＴ値に対する線形相関フィットである。
【０１１１】
実施例３．ＥＧＦＲ突然変異Ｌ８５８Ｒおよびフット配列内での１個のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドの位置変動の影響
プライマー（表１）２４−１４／１４−６：１：０（配列番号４）、２４−１４／１４−５：１：１（配列番号２）、２４−１４／１４−４：１：２（配列番号５）、２４−１４／１４−３：１：３（配列番号６）、２４−１４／１４−２：１：４（配列番号７）および２４−１４／１４−１：１：５（配列番号８）を使用して、実施例２に記載の実験を反復した。プライマー全てにおいて、アンカー、ブリッジ、介入およびフット配列の長さは一定に保持した。フットにおける１個のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドの位置を変動させた。
【０１１２】
ＤＮＡハイブリッドの融解温度を計算するためにＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’ＳｃｉＴｏｏｌｓプログラムを使用して（指定パラメーター：それぞれ［オリゴ］＝０．０６μＭ；［Ｎａ＋］＝６０ｍＭ；［Ｍｇ２＋］＝３ｍＭ；［ｄＮＴＰｓ］＝０．２５ｍＭ）；鋳型への２４−１４／１４−６：１：０アンカー配列の結合に対するＴｍは６９．０℃であり、得られた相補的アンプリコンへのマルチパートプライマー全体の結合に対するＴｍは７９．５℃であり；鋳型への２４−１４／１４−５：１：１アンカー配列の結合に対するＴｍは６７．８℃であり、得られた相補的アンプリコンへのマルチパートプライマー全体の結合に対するＴｍは８０．４℃であり；鋳型への２４−１４／１４−４：１：２アンカー配列の結合に対するＴｍは６７．８℃であり、得られた相補的アンプリコンへのマルチパートプライマー全体の結合に対するＴｍは７９．３℃であり；鋳型への２４−１４／１４−３：１：３アンカー配列の結合に対するＴｍは６６．４℃であり、得られた相補的アンプリコンへのマルチパートプライマー全体の結合に対するＴｍは７８．７℃であり；鋳型への２４−１４／１４−２：１：４アンカー配列の結合に対するＴｍは６５．６℃であり、得られた相補的アンプリコンへのマルチパートプライマー全体の結合に対するＴｍは７８．２℃であり；鋳型への２４−１４／１４−１：１：５アンカー配列の結合に対するＴｍは６７．２℃であり、得られた相補的アンプリコンへのマルチパートプライマー全体の結合に対するＴｍは７８．５℃であった。
【０１１３】
実施例１に記載のようにＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ混合物は１０６コピーの野生型（ＷＴ）配列または１０６コピーの関連突然変異体標的（ＭＵＴ）配列の何れかを含有した。表４は、各プライマーを用いた両標的に対する機器により計算したＣＴ値を列挙し、差（ΔＣＴ）も示す。
2019510501.tif 000007
【０１１４】
実施例４．ＥＧＦＲ突然変異Ｌ８５８Ｒおよびバブル対称性の変化の影響
プライマー（表１）２４−１８／１０−５：１：１（配列番号１１）、２４−１６／１２−５：１：１（配列番号１２）、２４−１４／１４−５：１：１（配列番号２）、２４−１２／１６−５：１：１（配列番号１３）および２４−１０／１８−５：１：１（配列番号１４）を使用して実施例３に記載の実験を反復した。２４−１４／１４−５：１：１プライマーは、鋳型からその１４ヌクレオチド長ブリッジ配列および１４ヌクレオチド長介在配列を含む「対称的」バブルを形成する。他方のプライマーは、鋳型中のブリッジ配列および介在配列の長さが異なる「非対称的」バブルを形成する。この実験において、比較したマルチパートプライマーは全て、アンカー配列２４ヌクレオチド長および５：１：１フット配列を有した。各マルチパートプライマーに対して、ブリッジ配列の長さ＋介在配列の長さ（鋳型へのアンカー配列およびフット配列両方の結合により形成）の合計が２８になるように、アンカー配列の特性を選択した。結果的に、これらの５つのマルチパートプライマーのそれぞれにより形成されるバブルの周縁は常に同じであった。
【０１１５】
ＤＮＡハイブリッドの融解温度を計算するためにＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ’  ＳｃｉＴｏｏｌｓプログラムを使用して（指定パラメーター：それぞれ［オリゴ］＝０．１２μＭ；［Ｎａ＋］＝６０ｍＭ；［Ｍｇ２＋］＝３ｍＭ；［ｄＮＴＰｓ］＝０．２５ｍＭ）；鋳型への２４−１８／１０−５：１：１アンカー配列の結合に対するＴｍは６７．２℃であり、得られた相補的アンプリコンへのマルチパートプライマー全体の結合に対するＴｍは７９．６℃であり；鋳型への２４−１６／１２−５：１：１アンカー配列の結合に対するＴｍは６７．８℃であり、得られた相補的アンプリコンへのマルチパートプライマー全体の結合に対するＴｍは７９．０℃であり；鋳型への２４−１４／１４−５：１：１アンカー配列の結合に対するＴｍは６７．８℃であり、得られた相補的アンプリコンへのマルチパートプライマー全体の結合に対するＴｍは８０．４℃であり；鋳型への２４−１２／１６−５：１：１アンカー配列の結合に対するＴｍは６７．２℃であり、得られた相補的アンプリコンへのマルチパートプライマー全体の結合に対するＴｍは７９．９℃であり；鋳型への２４−１０／１８−５：１：１アンカー配列の結合に対するＴｍは６８．７℃であり、得られた相補的アンプリコンへのマルチパートプライマー全体の結合に対するＴｍは７９．８℃であった。
【０１１６】
実施例１に記載のようにＰＣＲ増幅を行った。各プライマー入りの試料は、１０６コピーの突然変異体（ＭＵＴ）標的配列または１０６コピーの関連野生型（ＷＴ）配列の何れかを含有した。リアルタイム蛍光の結果、すなわち増幅サイクル数の関数としてのＳＹＢＲＧｒｅｅｎ（登録商標）蛍光強度（示さない）から、各プライマーでの両標的に対する機器により計算されたＣＴ値を得て、差（ΔＣＴ）を計算した。結果を表５で示す。
2019510501.tif 000008
【０１１７】
実施例５．ヒトゲノムＤＮＡを含有する試料中でのＬ８５８Ｒ突然変異体配列の選択的増幅
血漿から単離されるＤＮＡ断片で開始されるアッセイを模倣するために、発明者らは、野生型ＥＧＦＲ遺伝子を含有する１０，０００個のヒト細胞から単離される制限酵素消化ゲノムＤＮＡの存在下で、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ突然変異を保有するヒト細胞株Ｈ１９７５から単離される異なる量の制限酵素消化ゲノムＤＮＡ（０；１０；３０；１００；３００；１，０００；３，０００；または１０，０００個の細胞からのＤＮＡ）を含有する試料を用いて開始した一連の８回のＰＣＲアッセイにおいてＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ  ２４−１４／１４−５：１：１（配列番号２）プライマーを利用した。
【０１１８】
５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５単位ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ、２５０μＭの各デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、６０ｎＭの各プライマーおよび１ｘＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎを含有する３０μＬの体積中でＰＣＲ増幅を行った。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＩＱ５分光蛍光分析サーマルサイクラー上で０．２ｍＬポリプロピレンＰＣＲチューブ（白色）を使用して増幅を行った。熱サイクリングプロファイルは、９５℃で１０分間、続いて９５℃で２０秒、６０℃で１５秒および７２℃で２０秒を６０サイクルであった。各鎖伸長段階（７２℃）の終了時にＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ蛍光強度を測定した。結果を図５で示す。突然変異体鋳型を含有した各反応に対して測定した閾値サイクル数を各反応中に最初に存在する突然変異体鋳型数の対数の関数としてプロットする。線５１は、データポイントに対する線形相関フィットである。点線５２は、野生型鋳型のみで開始した増幅に対するＣＴ値を特定する。
【０１１９】
以下の実施例６〜１０において、発明者らは、２つの類縁突然変異に対する二重アッセイを記載し、発明者らは、２つの類縁突然変異＋異なるプライマー対により増幅されるそれらの対応する野生型配列または非関連配列の何れかに対する三重アッセイを記載する。表６で、これらの多重ＰＣＲアッセイで使用したプライマーおよびプローブの配列を示す。
2019510501.tif 000009
2019510501.tif 000010
【０１２０】
各ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー内の５’−タグ配列（タグがある）およびブリッジ配列に下線を付し、フット配列中の１つまたは複数のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドを太字で示す。比較実験におけるそれらの使用を反映する群にプライマーを編成する。分子ビーコンプローブに対して１本鎖ループに下線を付す。
【０１２１】
表６中のＢＲＡＦプライマーに対する標的であるＢＲＡＦ配列は次のとおりである：
ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ＭＵＴ：
2019510501.tif 000011
説明のために、リバースプライマーの配列（配列番号２３）のように、３２−３０−１０／９−６：１：１プライマー（配列番号１７）のアンカーおよびフット配列に対する結合部位に下線を付す。
【０１２２】
ＢＲＡＦ  Ｖ６００  ＲＭＵＴ：
2019510501.tif 000012
説明のために、リバースプライマーの配列（配列番号２３）のように、３２−３０−１２／９−５：２：１プライマー（配列番号２０）のアンカーおよびフット配列に対する結合部位に下線を付す。
【０１２３】
ＢＲＡＦ  ＷＴ：
2019510501.tif 000013
説明のために、リバースプライマーの配列（配列番号２３）のように、３２−３０−１０／９−８：０：０プライマー（配列番号２２）のアンカーおよびフット配列に対する結合部位に下線を付す。
【０１２４】
ＥＧＦＲ  ＷＴ：
2019510501.tif 000014
説明のために、リバースプライマーの配列（配列番号２５）のように、３２−２５−１４／９−８：０：０プライマー（配列番号２４）のアンカーおよびフット配列に対する結合部位に下線を付す。
【０１２５】
実施例６．対称対非対称ＰＣＲ増幅
平行する反応セットによって、ＰＣＲ増幅のタイプ、対称対非対称の影響を調べた。各試料は、１０，０００コピーのＢＲＡＦ野生型標的配列（配列番号３４）、１，０００コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列（配列番号３２）および異なる量（１０，０００；２，５００；６２５；１５６；３９；１０；または０コピー）のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ突然変異体標的配列（配列番号３３）を含有した。ＢＲＡＦ配列（Ｖ６００Ｅ突然変異体配列、Ｖ６００Ｒ突然変異体配列または野生型配列の何れか）を含有するプラスミドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、２００塩基対遺伝子断片をｐＩＤＴＳｍａｒｔ  Ａｍｐベクターに挿入することによって調製した。突然変異体および野生型プラスミドＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＳｃａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化した。消化混合物は、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトールおよび５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）を含有した２０μＬ体積中、１０単位のＳｃａＩおよび４μｇの突然変異体または野生型ゲノムＤＮＡを含有した。この反応を３７℃で１２０分間温置し、続いて酵素を不活性化するために８０℃で２０分間温置した。
【０１２６】
前述の量の標的配列に加えて、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５単位Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、各２５０μＭの４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、５００ｎＭ（対称ＰＣＲ）または各６０ｎＭ（非対称ＰＣＲ）の何れかのＢＲＡＦ  ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３２−３０−１０／９−６：１：１（配列番号１７）およびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ  ３２−３０−１２／９−５：２：１（配列番号２０）、１，０００ｎＭのＢＲＡＦリバースプライマー（配列番号２３）、３００ｎＭの分子ビーコンＶ６００Ｅ（配列番号２９）および３００ｎＭの分子ビーコンＶ６００Ｒ（配列番号３０）を含有する３０μＬ体積でＰＣＲ増幅を行った。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＩＱ５分光蛍光分析サーマルサイクラーにおいて０．２ｍＬポリプロピレンＰＣＲチューブ（白色）を使用して増幅を行った。熱サイクリングプロファイルは、９５℃で２分間、続いて９５℃で２０秒、６０℃で２０秒および７２℃で２０秒を６０サイクルであった。各アニーリング段階（６０℃）の終了時に分子ビーコン蛍光強度を測定した。
【０１２７】
結果を図６で示す。上パネルは、対称ＰＣＲ増幅に対する、リアルタイム蛍光曲線、蛍光強度対完了した熱サイクル数、のグラフである。左のグラフは、異なる量のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ突然変異体標的配列を含有する７つの試料のそれぞれに対する分子ビーコンＶ６００Ｒからの蛍光強度を与える。右のグラフは、同じ７試料に対する分子ビーコンＶ６００Ｅからの蛍光強度を与える（これらは全て１，０００コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列を含有した）。下パネルは非対称ＰＣＲ増幅に対する対応するグラフである。
【０１２８】
実施例７．ブリッジ配列の相補体または５’−タグ配列の相補体がプローブの標的である二重アッセイ
様々なブリッジ配列および様々なタグ配列の性能を比較するために、発明者らは一連の二重反応を行った。二重反応は全て、１０，０００分子のＢＲＡＦ野生型標的（配列番号４５）、１，０００分子のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ標的配列番号４４）および５または０分子の何れかのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的（配列番号４３）を含有した。これらの増幅反応の標的は、実施例６に記載のように、調製され、制限酵素により断片化されたプラスミドであった。実施例１に記載のようにプライマーを設計し、分子ビーコンウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｂｅａｃｏｎｓ．ｏｒｇ／ＭＢ＿ＳＣ＿ｄｅｓｉｇｎ．ｈｔｍｌ）に記載のように分子ビーコンを設計した。タグ配列は任意であり、それらが反応中に存在する何れのプライマーの３’末端とも相互作用しないように設計した。
【０１２９】
Ａ．プローブの標的としてのブリッジの相補体
発明者らは、プローブがブリッジの相補体を標的とした３つの実験を行った。第１の実験において、非対称ＰＣＲ混合物は、標的配列に加えて、６０ｎＭのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ２５−１８／９−６：１：１（配列番号３６）、６０ｎＭのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ  ２５−１８／９−５：２：１（配列番号３７）、１，０００ｎＭのＢＲＡＦ共通リバースプライマー（配列番号２３）、３００ｎＭのＱｕａｓａｒ６７０−標識分子ビーコンＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ２（配列番号４１）、３００ｎＭのフルオレセイン−標識分子ビーコンＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ２（配列番号４２）および実施例６に記載のようなさらなる増幅試薬を含有した。第２の実験において、非対称ＰＣＲ混合物は、標的配列に加えて、６０ｎＭのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３０−３２／９−６：１：１（配列番号３２）、６０ｎＭのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ  ３０−３２／９−５：２：１（配列番号３３）、１，０００ｎＭのＢＲＡＦ共通リバースプライマー（配列番号２３）、３００ｎＭのＱｕａｓａｒ６７０−標識分子ビーコンＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ（配列番号３８）、３００ｎＭのフルオレセイン標識分子ビーコンＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ（配列番号３９）および実施例６に記載のようなさらなる増幅試薬を含有した。第３の実験において、非対称ＰＣＲ混合物は、標的配列に加えて、６０ｎＭのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ２５−１８／９−７：１：０（配列番号３４）、６０ｎＭのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ  ２４−１８／９−６：２：０（配列番号３５）、１，０００ｎＭのＢＲＡＦ共通リバースプライマー（配列番号２３）、３００ｎＭのＱｕａｓａｒ６７０−標識分子ビーコンＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ２（配列番号４１）、３００ｎＭのフルオレセイン−標識分子ビーコンＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ２（配列番号４２）および実施例６に記載のようなさらなる増幅試薬を含有した。
【０１３０】
実施例６に記載のように増幅およびリアルタイム検出を行った。各実験を５回反復した。結果を図７で示し、これには、蛍光強度対完了した熱サイクル数の３対のグラフが含まれる。各パネル対において、左グラフはＱｕａｓａｒ６７０（Ｖ６００Ｅ分子ビーコン）に対するものであり、右グラフはフルオレセイン（Ｖ６００Ｒ分子ビーコン）に対するものである。５コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列で開始した反復反応を連続的な線により提示し、０コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列で開始した反応における蛍光変化を破線により提示する。上のグラフ対、Ｇ０１およびＧ０２は、ブリッジ長が１８ヌクレオチドでありバブル周縁が３１ヌクレオチドであった第１の実験の結果を示す。中のグラフ対、Ｇ０３およびＧ０４は、ブリッジ長が３２ヌクレオチドであり、バブル周縁が４５ヌクレオチドであった第２の実験の結果を示す。下のグラフ対、Ｇ０５およびＧ０６は、ブリッジ長およびバブル周縁が第１の実験と同じであったが、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのフットが異なった、第３の実験の結果を示す。
【０１３１】
Ｂ．プローブの標的としてのタグの相補体
発明者らは、プローブが５’タグの相補体を標的とした４つの実験を行った。第１の実験において、非対称ＰＣＲ混合物は、標的配列に加えて、６０ｎＭのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３２−３０−１８／９−６：１：１（配列番号２８）、６０ｎＭのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ３２−３０−１８／９−５：２：１（配列番号２９）、１，０００ｎＭのＢＲＡＦ共通リバースプライマー（配列番号２３）、３００ｎＭのＱｕａｓａｒ６７０−標識分子ビーコンＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ（配列番号３８）、３００ｎＭのフルオレセイン−標識分子ビーコンＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ（配列番号３９）および実施例６に記載のようなさらなる増幅試薬を含有した。第２の実験において、非対称ＰＣＲ混合物は、標的配列に加えて、６０ｎＭのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３２−３０−１８／９−７：１：０（配列番号３０）、６０ｎＭのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ  ３２−３０−１８／９−６：２：０（配列番号３１）、１，０００ｎＭのＢＲＡＦ共通リバースプライマー（配列番号２３）、３００ｎＭのＱｕａｓａｒ６７０−標識分子ビーコンＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ（配列番号３８）、３００ｎＭのフルオレセイン−標識分子ビーコンＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ（配列番号３９）および実施例６に記載のようなさらなる増幅試薬を含有した。第３の実験において、非対称ＰＣＲ混合物は、標的配列に加えて、６０ｎＭのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３２−２５−１０／９−６：１：１（配列番号１９）、６０ｎＭのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ  ３２−２５−１２／９−５：２：１（配列番号２０）、１，０００ｎＭのＢＲＡＦ共通リバースプライマー（配列番号２３）、３００ｎＭのＱｕａｓａｒ６７０−標識分子ビーコンＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ（配列番号３８）、３００ｎＭのフルオレセイン−標識分子ビーコンＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ（配列番号３９）および実施例６に記載のようなさらなる増幅試薬を含有した。第４の実験において、非対称ＰＣＲ混合物は、標的配列に加えて、６０ｎＭのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３２−２５−１０／９−７：１：０（配列番号２６）、６０ｎＭのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ  ３２−２５−１２／９−６：２：０（配列番号２７）、１，０００ｎＭのＢＲＡＦ共通リバースプライマー（配列番号２３）、３００ｎＭのＱｕａｓａｒ６７０−標識分子ビーコンＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ（配列番号３８）、３００ｎＭのフルオレセイン−標識分子ビーコンＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ（配列番号３９）および実施例６に記載のようなさらなる増幅試薬を含有した。
【０１３２】
実施例６に記載のように増幅およびリアルタイム検出を行った。各実験を５回反復した。結果を図８で報告し、これには蛍光強度対完了した熱サイクル数の４つのグラフ対が含まれる。各パネル対において、左グラフはＱｕａｓａｒ６７０（Ｖ６００Ｅ分子ビーコン）に対するものであり、右グラフはフルオレセイン（Ｖ６００Ｒ分子ビーコン）に対するものである。５コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列で開始した反復反応を連続的な線により提示し、０コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列で開始した反応における蛍光変化を破線により提示する。上のグラフ対、Ｇ０７およびＧ０８は、ブリッジ長が１８ヌクレオチドであり、バブル周縁が３１ヌクレオチドであった第１の実験からのものである。第２のグラフ対、Ｇ０９およびＧ１０は、ブリッジ長およびバブル周縁が不変であったが、Ｖ６００Ｅ  ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのフット中のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドが３’末端の最後から２番目のヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドに変化した第２の実験からのものである。第３のグラフ対、Ｇ１１およびＧ１２は、ブリッジ長およびバブル周縁が短かった第３の実験からのものである。第４の（下の）グラフのセット、Ｇ１３およびＧ１４は、ブリッジ長がまた短かったが、Ｖ６００Ｅ  ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドが３’末端の最後から２番目のヌクレオチドから３’末端ヌクレオチドに変化した、第４の実験からのものである。
【０１３３】
実施例８．多重アッセイのためのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの微調整
多重反応における異なるＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのセットに対する反応に存在する鋳型数の対数の関数としてのＣＴ値のプロットが異なる線上になる場合、発明者らは、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのそのセットを微調整されていないものとして記載する。一方で、これらのプロットが同じ線上にある場合、発明者らは、微調整されたものとしてＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーのそのセットを記載する。多重アッセイのためのＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーの設計において、最初の設計では、ほぼいつも、微調整されていないプライマーが生じる。ブリッジの長さおよび特性（ヌクレオチド配列）を調整することによって、発明者らはプライマーを微調整し得る。この実施例において、発明者らは、最初に、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーが微調整されていなかった多重アッセイを記載し；次に発明者らは、発明者らが一連のＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを微調整した後の同じ多重アッセイを記載する。突然変異体ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、突然変異体ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒおよび野生型ＢＲＡＦプラスミドＤＮＡを実施例６に記載のように調製した。
【０１３４】
Ａ．微調整前のプライマー
２つのシリーズの反応を調製した。第１のシリーズの反応に対して、各試料は、１００，０００コピーのＢＲＡＦ野生型標的配列（配列番号４５）、１０，０００コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列（配列番号４３）および異なる量（１００，０００；１０，０００；または１，０００コピー）のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ突然変異体標的配列（配列番号４４）を含有した。第２のシリーズの反応に対して、各試料は、１００，０００コピーのＢＲＡＦ野生型標的配列（配列番号４５）、１０，０００コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ突然変異体標的配列（配列番号４４）および異なる量（１００，０００；１０，０００；または１，０００コピー）のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列（配列番号４３）を含有した。
【０１３５】
使用したプライマーおよび分子ビーコンプローブに対して次の改変を行って、実施例６に記載のようにＰＣＲ増幅を行った。この反応は、各６０ｎＭのＢＲＡＦ  ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３２−３０−１５／９−６：１：１（配列番号１８）およびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ  ３２−３０−１２／９−５：２：１（配列番号２０）、１，０００ｎＭのＢＲＡＦリバースプライマー（配列番号２３）、３００ｎＭの分子ビーコンＶ６００Ｅ（配列番号３８）および３００ｎＭの分子ビーコンＶ６００Ｒ（配列番号３９）を含有した。各反応に存在する不定鋳型数の対数の関数として観察されるＣＴ値のグラフである、図９の上のパネルで結果を示す。黒丸は異なる量のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒを用いた反応を表し、黒三角は異なる量のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを用いた反応を表す。線Ｆ０１はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒデータに対する線形相関フィットであり、線Ｆ０２はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅデータに対する線形相関フィットである。
【０１３６】
Ｂ．微調整後のプライマー
微調整したプライマーを用いたアッセイについて、反応は、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーがＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３２−３０−１０／９−６：１：１（配列番号１７）およびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ  ３２−３０−１２／９−５：２：１（配列番号２０）であったことを除き、パートＡに記載のとおりであった。各反応に存在する不定鋳型の数の対数の関数として観察されるＣＴ値のグラフである図９の下のパネルで結果を示す。黒丸は、異なる量のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒを用いた反応を表し、黒三角は異なる量のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅを用いた反応を表す。線Ｆ０３はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒデータに対する線形相関フィットであり、線Ｆ０４は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅデータに対する線形相関フィットである。
【０１３７】
示されるように、プライマーの微調整において、発明者らは、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒプライマー（配列番号２０）を同じに維持し、線Ｆ０４が線Ｆ０３上になるようにＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅプライマーのみを改変した。配列が表６で与えられる、未調整プライマー（配列番号１８）を調整済みプライマー（配列番号１７）と比較すると、この例において、発明者らがブリッジ配列の５’末端ヌクレオチドを維持したが、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅプライマーのブリッジ配列から次の５ヌクレオチド（ＴＴＡＴＴ）を除去し、発明者らの微調整の目的が達成されたことが分かり得る。
【０１３８】
実施例９．非関連参照野生型配列を増幅し、検出する多重ＰＣＲアッセイ
２つの類縁突然変異体標的配列（ＢＲＡＦ  Ｖ６００ＲおよびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ）およびまた非関連野生型配列（ＥＧＦＲ）をも、増幅し、検出するために、三重アッセイを行った。第１のシリーズにおいて、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ突然変異体標的配列の出発量を変動させた。第２のシリーズにおいて、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列の出発量を変動させた。
【０１３９】
実施例６に記載のように突然変異体ＢＲＡＦ  Ｖ６００ＥおよびＢＲＡＦ  Ｖ６００ＲプラスミドＤＮＡを調製し、実施例１に記載のように野生型ＥＧＦＲプラスミドＤＮＡを調製した。
【０１４０】
Ａ．ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒの変動
６試料のそれぞれが、１０，０００コピーのＥＧＦＲ野生型標的配列（配列番号４６）、１０，０００コピーのＢＲＡＦ野生型配列（配列番号４５）、１，０００コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列（配列番号４３）および異なる量（２，５００；６２５；１５６；３９；１０；または０コピー）のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ突然変異体標的配列（配列番号４４）を含有した。
【０１４１】
前述の量の標的配列に加えて、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．５単位Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、各２５０μＭの４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、６０ｎＭのプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３２−３０−１０／９−６：１：１（配列番号１７）、６０ｎＭのプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ  ３２−３０−１２／９−５：２：１（配列番号２０）、６０ｎＭのプライマーＥＧＦＲ野生型３２−２５−１４／９−８：０：０（配列番号２４）、１，０００ｎＭのＢＲＡＦリバースプライマー（配列番号２３）、５００ｎＭのＥＧＦＲリバースプライマー（配列番号２５）、３００ｎＭの分子ビーコンＶ６００Ｅ（配列番号３８）、３００ｎＭの分子ビーコンＶ６００Ｒ（配列番号３９）および３００ｎＭの分子ビーコン野生型（配列番号４０）を含有する３０μＬの体積中でＰＣＲ増幅を行った。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＩＱ５分光蛍光分析サーマルサイクラーにおいて０．２ｍＬポリプロピレンチューブ（白色）を使用して増幅を行った。熱サイクリングプロファイルは、９５℃で２分間、続いて、９５℃で２０秒、６０℃で２０秒および７２℃で２０秒を５５サイクルであった。各アニーリング段階（６０℃）の終了時に分子ビーコン蛍光強度を測定した。
【０１４２】
結果を図１０で示す。３つのパネルは、リアルタイム蛍光曲線、蛍光強度対完了した熱サイクル数のグラフである。左上のグラフは、異なる量のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ突然変異体標的配列を含有した６試料に対する分子ビーコンＶ６００Ｒからの蛍光の曲線を示す。右上のグラフは、これらの６試料のそれぞれに含有される１，０００コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ標的配列に対する分子ビーコンＶ６００Ｅからの蛍光の曲線を示す。左下のグラフは、これらの６試料のそれぞれに含有される１０，０００コピーのＥＧＦＲ野生型配列に対する分子ビーコン野生型からの蛍光の曲線を示す。右下のパネルは、各反応に存在する鋳型数の対数の関数としてのリアルタイム曲線から得られたＣＴ値のグラフである。黒丸はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒに対するＣＴ値であり；黒三角、Ｂ０２はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅに対するＣＴ値であり；黒菱形、Ｂ０３はＥＧＦＲ野生型に対するＣＴ値である。線Ｂ０１は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒデータに対する線形相関フィットである。点線Ｂ０４は、１０，０００個のＥＧＦＲ野生型鋳型、１０，０００個のＢＲＡＦ野生型鋳型、１，０００個のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ鋳型を使用し、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ鋳型なしで開始される増幅に対するＣＴ値を特定する。
【０１４３】
Ｂ．ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅの変動
６試料のそれぞれは、１０，０００コピーのＥＧＦＲ野生型標的配列（配列番号４６）、１０，０００コピーのＢＲＡＦ野生型配列（配列番号４５）、１，０００コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ突然変異体標的配列（配列番号４４）および異なる量（２，５００；６２５；１５６；３９；１０；または０コピー）のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列（配列番号４３）を含有した。増幅反応混合物およびＰＣＲ増幅は上のパートＡで報告したとおりであった。
【０１４４】
結果を図１１で示す。３つのパネルは、リアルタイム蛍光曲線、蛍光強度対完了した熱サイクル数のグラフである。右上のグラフは、異なる量のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列を含有した６試料に対する分子ビーコンＶ６００Ｅからの蛍光の曲線を示す。左上のグラフは、これらの６試料のそれぞれに含有される１，０００コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ標的配列に対する分子ビーコンＶ６００Ｒからの蛍光の曲線を示す。左下のグラフは、これらの６試料のそれぞれに含有される１０，０００コピーのＥＧＦＲ野生型配列に対する分子ビーコン野生型からの蛍光の曲線を示す。右下のパネルは、各反応に存在する鋳型数の対数の関数としてのリアルタイム曲線から得られたＣＴ値のグラフである。黒三角はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅに対するＣＴ値であり；黒丸、Ｃ０２は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒに対するＣＴ値であり；黒菱形、Ｃ０３は、ＥＧＦＲ野生型に対するＣＴ値である。線Ｃ０１は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅデータに対する線形相関フィットである。点線Ｃ０４は、１０，０００個のＥＧＦＲ野生型鋳型、１０，０００個のＢＲＡＦ野生型鋳型、１，０００個のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ鋳型を使用し、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ鋳型なしで開始される増幅に対するＣＴ値を特定する。
【０１４５】
実施例１０．関連参照野生型配列を増幅し、検出する多重ＰＣＲアッセイ
２つの類縁突然変異体標的配列（ＢＲＡＦ  Ｖ６００ＲおよびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ）およびまたそれらの関連野生型配列（ＢＲＡＦ野生型）をも増幅し、検出するために三重アッセイを行った。第１のシリーズにおいて、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ突然変異体標的配列の出発量を変動させた。第２のシリーズにおいて、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列の出発量を変動させた。
【０１４６】
実施例６に記載のように突然変異体ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、突然変異体ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒおよび野生型ＢＲＡＦプラスミドＤＮＡを調製した。
【０１４７】
Ａ．ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒの変動
６試料のそれぞれは、１０，０００コピーのＢＲＡＦ野生型標的配列（配列番号４５）、１，０００コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列（配列番号４３）および異なる量（２，５００；６２５；１５６；３９；１０；または０コピー）のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ突然変異体標的配列（配列番号４４）を含有した。
【０１４８】
プライマーおよび分子ビーコンプローブに対して次の改変を行って、実施例９に記載のとおりＰＣＲ増幅を行った。この反応は、各６０ｎＭのＢＲＡＦＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３２−３０−１０／９−６：１：１（配列番号１７）、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ  ３２−３０−１２／９−５：２：１（配列番号２０）、ＢＲＡＦ野生型３２−３０−１０／９−８：０：０（配列番号２２）、１，５００ｎＭのＢＲＡＦリバースプライマー（配列番号２３）、３００ｎＭの分子ビーコンＶ６００Ｅ（配列番号３８）、３００ｎＭの分子ビーコンＶ６００Ｒ（配列番号３９）および３００ｎＭの分子ビーコン野生型（配列番号４０）を含有した。
【０１４９】
結果を図１２で示す。３つのパネルは、リアルタイム蛍光曲線、蛍光強度対完了した熱サイクル数のグラフである。左上のグラフは、異なる量のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ突然変異体標的配列を含有した６試料に対する分子ビーコンＶ６００Ｒからの蛍光の曲線を示す。右上のグラフは、これらの６試料のそれぞれに含有される１，０００コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ標的配列に対する分子ビーコンＶ６００Ｅからの蛍光の曲線を示す。左下のグラフは、これらの６試料のそれぞれに含有される１０，０００コピーのＢＲＡＦ野生型配列に対する分子ビーコン野生型からの蛍光の曲線を示す。右下のパネルは、各反応に存在する鋳型数の対数の関数としてのリアルタイム曲線から得られたＣＴ値のグラフである。黒丸はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒに対するＣＴ値であり；黒三角、Ｄ０２は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅに対するＣＴ値であり；黒菱形、Ｄ０３はＢＲＡＦ野生型に対するＣＴ値である。線Ｄ０１はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒデータに対する線形相関フィットである。点線Ｄ０４は、１０，０００個のＢＲＡＦ野生型鋳型、１，０００個のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ鋳型を使用し、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ鋳型なしで開始した増幅に対するＣＴ値を特定する。
【０１５０】
Ｂ．ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅの変動
６試料のそれぞれは、１０，０００コピーのＢＲＡＦ野生型標的配列（配列番号４５）、１，０００コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ突然変異体標的配列（配列番号４４）および異なる量（２，５００；６２５；１５６；３９；１０；または０コピー）のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列（配列番号４３）を含有した。増幅反応混合物およびＰＣＲ増幅は上のパートＡで報告したとおりであった。
【０１５１】
結果を図１３で示す。３つのパネルは、リアルタイム蛍光曲線、蛍光強度対完了した熱サイクル数のグラフである。右上のグラフは、異なる量のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列を含有した６試料に対する分子ビーコンＶ６００Ｅからの蛍光の曲線を示す。左上のグラフは、これらの６試料のそれぞれに含有される１，０００コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ標的配列に対する分子ビーコンＶ６００Ｒからの蛍光の曲線を示す。左下のグラフは、これらの６試料のそれぞれに含有される１０，０００コピーのＢＲＡＦ野生型配列に対する分子ビーコン野生型からの蛍光の曲線を示す。右下のパネルは、各反応に存在する鋳型数の対数の関数としてのリアルタイム曲線から得られるＣＴ値のグラフである。黒三角はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅに対するＣＴ値であり；黒丸、Ｅ０２は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒに対するＣＴ値であり；黒菱形、Ｅ０３は、ＢＲＡＦ野生型に対するＣＴ値である。線Ｅ０１は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅデータに対する線形相関フィットである。点線Ｅ０４は、１０，０００個のＢＲＡＦ野生型鋳型、１，０００個のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｒ鋳型を使用し、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ鋳型なしで開始した増幅に対するＣＴ値を特定する。
【０１５２】
実施例１１．異なる濃度のＴＭＡＣでのフットの長さ
発明者らは、ＴＭＡＣなしでのアッセイに対する好ましい設計を有するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー（３２−２４−１４／１４−６：１：１）およびより長いフット配列を有するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー（３２−２４−１４／１４−８：１：１）を利用した突然変異ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅに対するアッセイにおける異なる濃度のＴＭＡＣの影響を調べた。
【０１５３】
Ａ．ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー３２−２４−１４／１４−６：１：１
反応は全て、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２５０μＭ  ｄＡＴＰ、２５０μＭ  ｄＣＴＰ、２５０μＭ  ｄＧＴＰ、２５０μＭ  ｄＴＴＰ、１．５単位のＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）、各熱サイクルのアニーリング段階中にアンプリコン存在量を監視するための３００ｎＭのＱｕａｓａｒ（登録商標）６７０−標識ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ−特異的な分子ビーコン（配列番号３８）を含有する３０μＬ体積中で行った。最初の９５℃で２分間の後の熱サイクリングプログラムは、９５℃で１５秒、６０℃で２０秒および７２℃で２０秒の６５回反復であった。
【０１５４】
反応混合物は、１，０００コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列および１，０００，０００コピーの関連ＢＲＡＦ野生型配列または１，０００，０００コピーの関連ＢＲＡＦ野生型配列のみの何れかを含有した。異なる反応混合物において、ＴＭＡＣの量は次のように変動した：０ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ、７０ｍＭまたは１００ｍＭ。プライマー濃度は、６０ｎＭ  ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅフォワードプライマーおよび５００ｎＭ  ＢＲＡＦ従来型リバースプライマーであった。
【０１５５】
プライマー配列（５’−タグ配列およびブリッジ配列に下線を付し；インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドを太字で示す）：
ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅフォワードプライマー３２−２４−１４／１４−６：１：１
2019510501.tif 000015
ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ従来型リバースプライマー
５’−ＡＴＡＧＧＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＴＡＧＣ−３’（配列番号４４）
【０１５６】
結果を図１４で示す。５つのパネルのそれぞれは、使用したＴＭＡＣの量を示し、蛍光強度対ＰＣＲサイクル数の２つのリアルタイム曲線を提示する。曲線１４０１、１４０３、１４０５、１４０７および１４０９は、１，０００コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的および１，０００，０００コピーのＢＲＡＦ野生型標的で開始したアッセイであり；曲線１４０２、１４０４、１４０６、１４０８および１４１０は、１，０００，０００コピーのＢＲＡＦ野生型標的のみで開始したアッセイである。曲線に対する機器により計算されたＣｔ値は、曲線１４０１、４０．６；曲線１４０２、５２．１；曲線１４０３、３９．３；曲線１４０４、５６．３；曲線１４０５、４０．０；曲線１４０６、Ｎ／Ａ；曲線１４０７、４５．１；曲線１４０８、Ｎ／Ａ；曲線１４０９、Ｎ／Ａおよび曲線１４１０、Ｎ／Ａであった。これらの値に基づいて、６５回のＰＣＲサイクルを通じたΔＣＴに対する計算値（野生型のみでのＣＴ−突然変異体も存在したＣＴ）は、ＴＭＡＣ濃度に伴い変動した：曲線１４０１および１４０２、１１．５；曲線１４０３および１４０４、１７．０。曲線１４０５および１４０６に対して、および曲線１４０７および１４０８に対して、各対のうち少なくとも１つの曲線はＣＴがなかったので、ΔＣＴはない。
【０１５７】
Ｂ．ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー３２−２４−１４／１４−８：１：１
反応混合物およびＰＣＲサイクリングは、リバースプライマーおよび分子ビーコンプローブのように、上のパートＡで示すとおりであった。ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅフォワードプライマーの配列は異なった。その配列（５’−タグ配列およびブリッジ配列に下線を付し；インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドは太字で示す）は次のとおりであった：
2019510501.tif 000016
【０１５８】
結果を図１５で示す。５つのパネルのそれぞれは、使用したＴＭＡＣの量を示し、蛍光強度対ＰＣＲサイクル数の２つのリアルタイム曲線を提示する。曲線１５０１、１５０３、１５０５、１５０７および１５０９は、１，０００コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的および１，０００，０００コピーのＢＲＡＦ野生型標的で開始したアッセイであり；曲線１５０２、１５０４、１５０６、１５０８および１５１０は、１，０００，０００コピーのＢＲＡＦ野生型標的のみで開始したアッセイである。曲線に対する機器により計算されたＣｔ値は：曲線１５０１、４４．９；曲線１５０２、４７．１；曲線１５０３、４２．７；曲線１５０４、４７．９；曲線１５０５、４１．６；曲線１５０６、５２．９；曲線１５０７、４２．６；曲線１５０８、５９．０；曲線１５０９、Ｎ／Ａおよび曲線１５１０、Ｎ／Ａであった。これらの値に基づき、６５回のＰＣＲサイクルを通じたΔＣＴに対する計算値（野生型のみでのＣＴ−突然変異体も存在したＣＴ）は、ＴＭＡＣ濃度に従い変動し：曲線１５０１および１５０２、２．２；曲線１５０３および１５０４、５．２；曲線１５０５および１５０６、１１．３；曲線１５０７および１５０８、１６．４であった。
【０１５９】
実施例１２．８：１：１フット配列および偽液体生検試料中での異なる標的配列濃度
発明者らは、８：１：１フット配列（配列番号４５）および同じ従来のリバースプライマー（配列番号４４）を有する実施例１１に記載のＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを使用して一連のアッセイを行った。反応混合物は、４０，０００コピーのＢＲＡＦ野生型配列および異なる量のＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列：０；１０；１００；１，０００；または１０，０００コピーを含有した。反応混合物は、その他の点では実施例１１に記載のとおりであった。ＰＣＲ増幅および検出は実施例１１に記載のとおりであった。
【０１６０】
結果を図１６で示す。ＴＭＡＣの濃度をパネル−ＴＭＡＣなし（３つの左パネル）または７０ｍＭ  ＴＭＡＣ（３つの右パネル）の何れか−で示す。各パネルは、分子ビーコンプローブからのリアルタイム蛍光読み取りデータ、すなわちＰＣＲ熱サイクルの関数としての蛍光強度を提示する。曲線１６０１、１６０２および１６０３は、ＴＭＡＣなしおよびそれぞれ１０，０００、１，０００および１００コピーの突然変異体標的配列を用いた反応からのものである。多重曲線１６０４は、ＴＭＡＣなしで、１０コピーの突然変異体標的配列を用いた反復反応からのものである。多重曲線１６０５は、ＴＭＡＣなしで突然変異体標的配列のコピーなしでの反復反応からのものである。曲線１６０６、１６０７および１６０８は、７０ｍＭ  ＴＭＡＣおよびそれぞれ１０，０００、１，０００および１００コピーの突然変異体標的配列を用いた反応からのものである。多重曲線１６０９は、７０ｍＭ  ＴＭＡＣおよび１０コピーの突然変異体標的配列を用いた反復反応からのものである。多重曲線１６１０は、７０ｍＭ  ＴＭＡＣを用い、突然変異体標的配列のコピーなしの反復反応からのものである。
【０１６１】
左列のパネルに対する機器により計算されたＣＴ値は次のとおりであった：曲線１６０１、４０．２；曲線１６０２、４４．７；曲線１６０３、４８．６；５つの個別の曲線１６０４：５３．６、５０．０、５２．４、５０．９および５０．１；５つの個別の曲線１６０５：５２．９、５３．８、６１．０、６１．７および５６．３。右列におけるパネルに対する値は次のとおりであった：曲線１６０６、３７．８；曲線１６０７、４２．４；曲線１６０８、４７．２；５つの個別の曲線１６０９：５１．１、５１．５、５４．５、５２．４および５０．３；５つの個別の曲線１６１０：全てＮ／Ａ。ＴＭＡＣなしで、１０個の突然変異体コピーを用いた反応に対する最大ＣＴは５３．６であり、突然変異体コピーなしでの反応に対する最低ＣＴは５２．９であった。７０ｍＭ  ＴＭＡＣを用いて、１０個の突然変異体コピーを用いた反応に対する最大ＣＴは５４．５であり、突然変異体コピーなしでの反応に対する最低ＣＴはＮ／Ａ、すなわち６５サイクルのハイブリッド形成および伸長内で測定可能ではなかった。
【０１６２】
実施例１３．偽液体生検試料中の突然変異体の検出
発明者らは、ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＥＧＦＲ  Ｇ７１９Ｓ  ３２−２４−１８／１４−７：１：０、従来のリバースプライマーＥＧＦＲ  Ｇ７１９Ｓおよび分子ビーコン配列番号３８を用いて一連のアッセイを行った。反応混合物は、４０，０００コピーのＥＧＦＲ野生型配列および異なる量のＥＧＦＲ  Ｇ７１９Ｓ突然変異体標的配列：０；４；４０；４００；４，０００；または４０，０００コピーを含有した。反応混合物は、ＴＭＡＣ濃度が７０ｍＭではなく５０ｍＭであったことを除き、その他の点では実施例１１に記載のとおりであった。ＰＣＲ増幅および検出は実施例１１に記載のとおりであった。
【０１６３】
プライマー配列（５’−タグ配列およびブリッジ配列に下線を付し；インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドは太字で示す）：
ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅフォワードプライマー３２−２４−１８／１４−７：１：０
2019510501.tif 000017
ＥＧＦＲ  Ｇ７１９Ｓ従来型リバースプライマー
５’−ＣＡＣＣＧＴＧＣＣＧＡＡＣＧＣＡ−３’（配列番号４７）
【０１６４】
図１７で示すように、閾値サイクル数（ＣＴ）対反応混合物中の突然変異体標的配列の出発数（この軸は対数）のグラフとして結果をプロットする。線１７０１は、示される量で突然変異体標的配列を含有する反応混合物からのＣＴ値に対する直線フィットである。これらの機器により計算されたＣＴは、４０，０００コピーの場合、３４．６；４，０００コピーの場合、３７．６；４００コピーの場合、４０．９；４０コピーの場合、４６．８；および４コピーの場合、４８．７であった。点線１７０２は、対応する野生型配列のみを含有する反応混合物に対するＣＴ値（５４．９）である。
【０１６５】
実施例１４．異なるバブルでのＴＭＡＣ濃度の影響
発明者らは、（大きな１８ヌクレオチド長介在配列と組み合わせて）大きな４０ヌクレオチド周縁の対称バブルを生成させた大きな１８ヌクレオチド長ブリッジ配列を伴うＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー：ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３２−２４−１８／１８−８：１：１および異なる濃度のＴＭＡＣ（０ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭおよび６０ｍＭ）を用いて、一連のリアルタイムＰＣＲアッセイを行った。発明者らはまた、（より小さい１４ヌクレオチド長の介在配列と組み合わせて）より小さい２８ヌクレオチド長の周縁の非対称バブルを生成させたより小さい１０ヌクレオチド長のブリッジ配列を有するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー：ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３２−２４−１０／１４−８：１：１を用いて、平行した一連のリアルタイムＰＣＲアッセイも行った。各ＴＭＡＣ濃度に対して、各プライマーを用いた２つのアッセイがあった：１つは１００，０００コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列を用いて開始し、１つは１００，０００コピーの対応するＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ野生型配列を用いて開始した。プライマー配列および規定されたＴＭＡＣおよびＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ濃度を除き、反応混合物は実施例１１に記載のとおりであった。ＰＣＲ増幅および検出は実施例１１に記載のとおりであった。プライマー配列（５’−タグ配列およびブリッジ配列に下線を付し；インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドは太字で提示）は次のとおりであった：
ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅフォワードプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３２−２４−１８／１８−８：１：１
2019510501.tif 000018
ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅフォワードプライマーＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ３２−２４−１０／１４−８：１：１
2019510501.tif 000019
ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ従来型リバースプライマー
５’−ＴＴＣＴＴＣＡＴＧＡＡＧＡＣＣＴＣＡＣＡ−３’（配列番号５０）
【０１６６】
次のＣＴおよびΔＣＴを得た：
2019510501.tif 000020
【０１６７】
図１８においてＴＭＡＣ濃度に対して表７中のΔＣＴの値をプロットし、線１８０１はプライマー３２−２４−１８／１８−８：１：１により得られたΔＣＴ値にフィットさせ、線１８０２はプライマー３２−２４−１０／１４−８：１：１により得られたΔＣＴ値にフィットさせる。
【０１６８】
実施例１５．異なる濃度のＴＭＡＣを伴う、インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドの位置
発明者らは、フット配列１０ヌクレオチド長および３’末端インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチド（９：１：０）を有するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを利用した突然変異ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅに対するアッセイにおいて異なる濃度のＴＭＡＣの影響を調べ、フット配列１０ヌクレオチド長も有するが、３’末端の最後から２番目のインテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチド（８：１：１）を有するＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマーを代わりに使用した影響と比較した。
【０１６９】
Ａ．ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー３２−２４−１４／１４−９：１：０
反応は全て、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２５０μＭ  ｄＡＴＰ、２５０μＭ  ｄＣＴＰ、２５０μＭ  ｄＧＴＰ、２５０μＭ  ｄＴＴＰ、１．５単位のＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ）、各熱サイクルのアニーリング段階中にアンプリコン存在量を監視するための３００ｎＭのＱｕａｓａｒ（登録商標）６７０−標識ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ−特異的分子ビーコン（配列番号３８）を含有する３０μＬ体積中で行った。最初の９５℃で２分間の後の熱サイクルプログラムは、９５℃で１５秒、６０℃で２０秒および７２℃で２０秒を６５回反復であった。
【０１７０】
反応混合物は、４，０００コピーのＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列および４００，０００コピーの関連ＢＲＡＦ野生型配列または４００，０００コピーの関連ＢＲＡＦ野生型配列のみの何れかを含有した。異なる反応混合物において、ＴＭＡＣ量は次のように変動した：０ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭまたは５０ｍＭ。プライマー濃度は、６０ｎＭ  ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅフォワードプライマーおよび５００ｎＭ  ＢＲＡＦ従来型リバースプライマーであった。
【０１７１】
プライマー配列（５’−タグ配列およびブリッジ配列に下線を付し；インテロゲーティング（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）ヌクレオチドを太字で示した）：
ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅフォワードプライマー３２−２４−１４／１４−９：１：０
2019510501.tif 000021
ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ従来のリバースプライマー
５’−ＴＴＣＴＴＣＡＴＧＡＡＧＡＣＣＴＣＡＣＡ−３’（配列番号５０）
【０１７２】
Ｂ．ＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー３２−２４−１４／１４−８：１：１（配列番号４５）
反応混合物およびＰＣＲサイクルは、配列番号４５であったＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅフォワードプライマーを除き、上記パートＡで示すとおりであった。
【０１７３】
次のＣＴおよびΔＣＴを得た。
2019510501.tif 000022
【０１７４】
表８中のＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー３２−２４−１４／１４−９：１：０を用いたアッセイに対するＣＴの値を図１９においてＴＭＡＣ濃度に対してプロットし、線１９０１はＢＲＡＦ野生型配列のみを含有する試料に対するものであり、線１９０２はＢＲＡＦ野生型配列＋ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列を含有する試料に対するものである。表８中のＳｕｐｅｒＳｅｌｅｃｔｉｖｅプライマー３２−２４−１４／１４−８：１：１を用いたアッセイに対するＣＴの値を図２０においてＴＭＡＣ濃度に対してプロットし、線２００１はＢＲＡＦ野生型配列のみを含有する試料に対するものであり、線２００２は、ＢＲＡＦ野生型配列＋ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異体標的配列を含有する試料に対するものである。表８中のΔＣＴの値を図２１においてＴＭＡＣ濃度に対してプロットし、線２１０１はプライマー３２−２４−１４／１４−９：１：０で得られたΔＣＴ値にフィットさせ、線２１０２はプライマー３２−２４−１４／１４−８：１：１で得られたΔＣＴ値にフィットさせる。
【０１７５】
前述の実施例および好ましい実施形態の記載は、特許請求の範囲により定められるように、本発明を限定するものではなく、説明と解釈すべきものである。容易に認められるように、特許請求の範囲で示されるような本発明から逸脱することなく、上記で示される特性の多くの変更および組み合わせが利用され得る。このような変更は、本発明の範囲からの逸脱とはみなされず、このような変更は全て、次の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。本明細書中で引用される参考文献は全て、それらの全体において参照により組み込まれる。
【図１】
2019510501.tif 000023
【図２】
2019510501.tif 000024
【図３】
2019510501.tif 000025
【図４】
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【図５】
2019510501.tif 000027
【図６】
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【図７】
2019510501.tif 000029
【図８】
2019510501.tif 000030
【図９】
2019510501.tif 000031
【図１０】
2019510501.tif 000032
【図１１】
2019510501.tif 000033
【図１２】
2019510501.tif 000034
【図１３】
2019510501.tif 000035
【図１４】
2019510501.tif 000036
【図１５】
2019510501.tif 000037
【図１６】
2019510501.tif 000038
【図１７】
2019510501.tif 000039
【図１８】
2019510501.tif 000040
【図１９】
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【図２０】
2019510501.tif 000042
【図２１】
2019510501.tif 000043
【配列表】
2019510501000001.app
【国際調査報告】
2019510501.tif 000044
2019510501.tif 000045