(57)【要約】  本発明は、ドメイン抗体を含んでなるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）アンタゴニストと細胞免疫治療薬、特に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する免疫調節細胞である細胞免疫治療薬とを含んでなる併用療法を提供することにより、癌などの疾患を処置するための改良された組成物および方法に関する。本発明はさらに、前記併用療法を含んでなるポリヌクレオチド、発現ベクターおよび免疫調節細胞、ならびに前記免疫調節細胞を作出する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ドメイン抗体を含んでなるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）アンタゴニスト；および
（ｂ）細胞免疫治療薬
を含んでなる、医薬組成物。
【請求項２】
前記ＴＧＦβＲアンタゴニストが、ＴＧＦβＲまたはＴＧＦβと結合する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＴＧＦβＲアンタゴニストが、ＴＧＦβタイプＩＩ受容体（ＴＧＦβＲＩＩ）と結合する、請求項１または請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＴＧＦβＲアンタゴニストが、ドメイン抗体、二重ドメイン抗体、または抗体の単鎖Ｆｃ領域に結合したドメイン抗体から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記細胞免疫治療薬が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する免疫調節細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＣＡＲまたはＴＣＲが、腫瘍関連抗原または病原体抗原である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記免疫調節細胞が、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、ヘルパーＴリンパ球、ナチュラルキラー細胞、またはリンパ系細胞に分化し得る多能性幹細胞に由来する、請求項６〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
療法において使用するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
癌、自己免疫疾患、または感染症から選択される疾患の処置において使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ドメイン抗体を含んでなるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）アンタゴニストをコードする配列、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする配列を含んでなる、ポリヌクレオチド。
【請求項１１】
ＴＧＦβＲアンタゴニストをコードする前記配列およびＣＡＲまたはＴＣＲをコードする前記配列がそれぞれ、プロモーターエレメントに機能的に連結されている、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記ＣＡＲまたはＴＣＲが、腫瘍関連抗原または病原体抗原と結合する、請求項１０または請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記ＴＧＦβＲアンタゴニストが、ＴＧＦβＲまたはＴＧＦβと結合する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記ＴＧＦβＲアンタゴニストが、ＴＧＦβタイプＩＩ受容体（ＴＧＦβＲＩＩ）と結合する、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ＴＧＦβＲアンタゴニストが、ドメイン抗体、二重ドメイン抗体、または抗体の単鎖Ｆｃ領域に結合したドメイン抗体から選択される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
【請求項１７】
ウイルスベクターである、請求項１６に記載の発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１６もしくは請求項１７に記載の発現ベクターを含んでなる、免疫調節細胞。
【請求項１９】
炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球、ヘルパーＴリンパ球、ナチュラルキラー細胞、またはリンパ系細胞に分化し得る多能性幹細胞に由来する、請求項１８に記載の免疫調節細胞。
【請求項２０】
療法において使用するための、請求項１８〜１９のいずれか一項に記載の免疫調節細胞。
【請求項２１】
癌、自己免疫疾患、または感染症から選択される疾患の処置において使用するための、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の免疫調節細胞。
【請求項２２】
（１）複数の、請求項１８〜２１に記載の免疫調節細胞；および
（２）薬学上許容可能な担体
を含んでなる、医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１６もしくは請求項１７に記載の発現ベクターを免疫調節細胞に導入することを含んでなる、抗原特異的免疫調節細胞を生産するための方法。
【請求項２４】
請求項１６もしくは請求項１７に記載の発現ベクター、または請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の免疫調節細胞を対象に投与することを含んでなる、処置方法。
【請求項２５】
（ａ）細胞免疫治療薬、および
（ｂ）ドメイン抗体を含んでなるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）アンタゴニスト
を対象に投与することを含んでなる、処置方法。
【請求項２６】
前記細胞免疫治療薬が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する免疫調節細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、請求項１６もしくは請求項１７に記載の発現ベクター、または請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の免疫調節細胞を含んでなる、癌、自己免疫疾患または感染症から選択される疾患の処置のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年４月５日出願の米国仮出願第６２／３１８，４４１号の利益を主張するものであり、その開示の全内容は、引用により本明細書の一部とされる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、誘導された免疫応答を延長するために、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または遺伝的に改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）などの細胞免疫治療薬(cell immunotherapy)を、ＴＧＦβ受容体アンタゴニストと組み合わせて含んでなる併用療法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
免疫系のＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して特定の抗原を認識してそれと相互作用し、ＴＣＲはこのような抗原を認識してそれと結合した際に細胞の活性化を生じる。ＴＣＲは、Ｔ細胞表面で発現され、変動性の高いタンパク質鎖（例えば、アルファ（α）  およびベータ（β）鎖またはγ（γ）およびデルタ（δ）鎖）を含んでなり、これらはＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現される。ＣＤ３鎖分子は、不変構造を持ち、特に、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖は、ＴＣＲ：抗原の結合の際に細胞内シグナル伝達を担う。ＴＣＲは、総ての有核細胞、例えば抗原提示細胞および他のＴ細胞標的の表面に発現される主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のタンパク質によってそれに提示される抗原ペプチドを認識する。
【０００４】
免疫系のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、Ｔ細胞よりも進化上早くに発達し、自然免疫と適応免疫の橋渡しをする。Ｔ細胞と同様に、ＮＫ細胞は、自己細胞上の特定のリガンドを認識してそれと相互作用するが、ＮＫ細胞は、ＴＣＲを用いるのではなく、エフェクター機能の誘導または阻害をもたらすために組み込まれている過剰な活性化および阻害シグナルに頼る。ＮＫ細胞は、特定のウイルス感染および腫瘍に対する防護の第一線として働く自然エフェクター細胞である(Biron, et al., (1999) Annu. Rev. Immunol. 17:189-220; Trinchieri (1989) Adv. Immunol. 47:187-376)。自然エフェクター細胞は、事前の感作なく即座にそれらの標的を認識して排除し、従って、ＮＫ細胞は、異常組織と健常組織を識別するために、細胞が悪性化、感染、またはストレスを受けているかどうかを感知する必要がある。「ミッシングセルフ(missing self)」現象(Karre, et al., (1986) Nature 319:675-678)によれば、ＮＫ細胞は、クラスＩ主要組織遺伝子複合体（ＭＨＣ）を発現する細胞を探し出して排除することによりこれを達成する。
【０００５】
細胞免疫治療薬は、急速に成長している遺伝子療法の一分野であり、主として、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞により保持されている遺伝的に改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の使用に焦点が当てられてきた。
【０００６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、Ｔ細胞に新規な特異性を作り出すための人工免疫受容体として開発された。これらの合成受容体は、標的結合性ドメインが、単一の融合分子中にフレキシブルリンカーを介して１以上のシグナル伝達ドメインと会合されたものを含む。標的結合性ドメインは、Ｔ細胞を病的な細胞の表面の特異的標的に向けるために使用され、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞の活性化および増殖のための分子機構を含む。Ｔ細胞膜を貫通する（すなわち、膜貫通ドメインを形成する）フレキシブルリンカーは、ＣＡＲの標的結合性ドメインの細胞膜提示を可能とする。ＣＡＲは、Ｔ細胞をリンパ腫および固形腫瘍を含む種々の悪性腫瘍に由来する腫瘍細胞の表面で発現される抗原に向け直すことを首尾良く可能とした(Gross et al., (1989) Transplant Proc., 21(1 Pt 1): 127-30; Jena et al., (2010) Blood, 116(7):1035-44)。
【０００７】
ＣＡＲの開発は、これまでに３世代を含む。第一世代ＣＡＲは、ＣＤ３ζ鎖またはＦｃ受容体γ鎖の細胞質領域に由来するシグナル伝達ドメインに結合した標的結合性ドメインを含んでいた。第一世代ＣＡＲはＴ細胞を選択された標的に首尾良く向け直すことが示されたが、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて長期の拡大増殖および抗腫瘍活性を提供することはできなかった。第二世代および第三世代ＣＡＲでは、ＣＤ２８、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）などの補助刺激分子を含むことによる改変Ｔ細胞の生存の増進と増殖の増強に焦点が当てられた。
【０００８】
また、細胞免疫治療戦略では、抗原特異性を指示し、かつ／または抗原親和性を最適化するためにＴＣＲ  α鎖およびβ鎖を遺伝的に改変することに焦点が当てられた。
【０００９】
ＣＡＲまたは遺伝的に改変されたＴＣＲを保持するＴ細胞は、疾病状況で病的細胞を排除するために使用することができる。一つの臨床目的は、アフェレーシスおよびＴ細胞またはＮＫ細胞単離の後にベクター（例えば、レンチウイルスベクター）を介してＣＡＲまたはＴＣＲの発現構築物を含有する組換えＤＮＡで患者細胞を形質転換することであろう。Ｔ細胞またはＮＫ細胞の拡大培養の後、それらは病的標的細胞を標的とし死滅させる目的で患者に再導入される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、当技術分野では、細胞免疫治療薬の有効性を向上させる必要がなおある。特に、悪性癌細胞などの多くの疾患細胞は、一般に免疫応答をダウンレギュレートし、特に、腫瘍浸潤リンパ球に阻害シグナルを与える免疫抑制微小環境を生じる。よって、敵対する疾病微小環境により媒介される負の免疫調節に対して耐性となり得るように細胞免疫治療薬を改良する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
本発明の第１の態様によれば、
（ａ）ドメイン抗体を含んでなるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）アンタゴニスト；および
（ｂ）細胞免疫治療薬
を含んでなる医薬組成物が提供される。
【００１２】
本発明のさらなる態様によれば、ドメイン抗体を含んでなるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）アンタゴニストをコードする配列、およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする配列を含んでなるポリヌクレオチドが提供される。
【００１３】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書で定義されるポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターが提供される。
【００１４】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書で定義されるポリヌクレオチドまたは本明細書で定義される発現ベクターを含んでなる免疫調節細胞が提供される。
【００１５】
本発明のさらなる態様によれば、療法において使用するための本明細書で定義される免疫調節細胞が提供される。
【００１６】
本発明のさらなる態様によれば、
（１）本明細書で定義される複数の免疫調節細胞；および
（２）薬学上許容可能な担体
を含んでなる医薬組成物が提供される。
【００１７】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書で定義されるポリヌクレオチドまたは発現ベクターを免疫調節細胞に導入することを含んでなる抗原特異的免疫調節細胞を生産するための方法が提供される。
【００１８】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書で定義される発現ベクターまたは免疫調節細胞を対象に投与することを含んでなる処置方法が提供される。
【００１９】
本発明のさらなる態様によれば、
（ａ）細胞免疫治療薬、および
（ｂ）ドメイン抗体を含んでなるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）アンタゴニスト
を対象に投与することを含んでなる処置方法が提供される。
【００２０】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書で定義される医薬組成物、ポリヌクレオチド、発現ベクター、または免疫調節細胞を含んでなる、癌、自己免疫疾患または感染症から選択される疾患の処置のためのキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、種々の条件でヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球内のインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の発現を定量するためのＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）に基づくリガンド結合アッセイの結果を示す。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で活性化されたＴリンパ球を種々の濃度の、配列番号７２のアミノ酸配列を含んでなるＴＧＦβＲアンタゴニストｄＡｂ、および／またはヒトＴＧＦβとともに２４、４８、および７２時間インキュベートした。
【図２】図２は、種々の条件でヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球におけるＩＬ−２の発現を定量するためのＭＳＤに基づくリガンド結合アッセイの結果を示す。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で活性化されたＴリンパ球を、種々の濃度の、配列番号７２のアミノ酸配列を含んでなるＴＧＦβＲアンタゴニストｄＡｂ、および／またはヒトＴＧＦβとともに２４、４８、および７２時間インキュベートした。
【図３】図３は、種々の条件でヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球におけるＩＬ−６の発現を定量するためのＭＳＤに基づくリガンド結合アッセイの結果を示す。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で活性化されたＴリンパ球を、種々の濃度の、配列番号７２のアミノ酸配列を含んでなるＴＧＦβＲアンタゴニストｄＡｂ、および／またはヒトＴＧＦβとともに２４、４８、および７２時間インキュベートした。
【図４】図４は、種々の条件でヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球におけるＩＬ−１０の発現を定量するためのＭＳＤに基づくリガンド結合アッセイの結果を示す。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で活性化されたＴリンパ球を、種々の濃度の、配列番号７２のアミノ酸配列を含んでなるＴＧＦβＲアンタゴニストｄＡｂ、および／またはヒトＴＧＦβとともに２４、４８、および７２時間インキュベートした。
【図５】図５は、種々の条件でヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球におけるＩＬ−１７の発現を定量するためのＭＳＤに基づくリガンド結合アッセイの結果を示す。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で活性化されたＴリンパ球を、種々の濃度の、配列番号７２のアミノ酸配列を含んでなるＴＧＦβＲアンタゴニストｄＡｂ、および／またはヒトＴＧＦβとともに２４、４８、および７２時間インキュベートした。
【図６】図６は、種々の条件でヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球におけるＣＤ１０３の細胞表面発現を定量するためのフローサイトメトリーアッセイの結果を示す。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で活性化合物されたＴリンパ球を、種々の濃度の、配列番号７２のアミノ酸配列を含んでなるＴＧＦβＲアンタゴニストｄＡｂ、および／またはヒトＴＧＦβとともに２４、４８、および７２時間インキュベートした。
【図７】図７は、種々の条件でヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球におけるＣＸＣＲ４の細胞表面発現を定量するためのフローサイトメトリーアッセイの結果を示す。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で活性化されたＴリンパ球を、種々の濃度の、配列番号７２のアミノ酸配列を含んでなるＴＧＦβＲアンタゴニストｄＡｂ、および／またはヒトＴＧＦβとともに２４、４８、および７２時間インキュベートした。
【図８】図８は、種々の条件でヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球におけるＯＸ４０の細胞表面発現を定量するためのフローサイトメトリーアッセイの結果を示す。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で活性化されたＴリンパ球を、種々の濃度の、配列番号７２のアミノ酸配列を含んでなるＴＧＦβＲアンタゴニストｄＡｂ、および／またはヒトＴＧＦβとともに２４、４８、および７２時間インキュベートした。
【図９】図９は、種々の条件でヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球におけるＰＤ１の細胞表面発現を定量するためのフローサイトメトリーアッセイの結果を示す。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で活性化されたＴリンパ球を、種々の濃度の、配列番号７２のアミノ酸配列を含んでなるＴＧＦβＲアンタゴニストｄＡｂ、および／またはヒトＴＧＦβとともに２４、４８、および７２時間インキュベートした。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
定義
別段規定される場合を除き、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学）により一般に理解されているものと同じ意味を有する。分子的、遺伝学的および生化学的方法（一般に、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.およびAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 第4版, John Wiley & Sons, Inc.参照。これらの全内容は、引用により本明細書の一部とされる。）および化学的方法には標準的技術が使用される。
【００２３】
用語「含んでなる」は、「含む」または「からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含んでなる」組成物は、排他的にＸからなってもよく、または何かの付加を含んでもよい、例えばＸ＋Ｙ。
【００２４】
用語「から本質的になる」は、その特徴の範囲を明示された材料または工程と特許請求された特徴の基本的特性に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。
【００２５】
用語「からなる」は、いずれの付加的成分の存在も排除する。
【００２６】
用語「約」は、量、持続時間などに関して本明細書で使用される場合、明示された値から±２０％または±１０％（±５％、±１％、および±０．１％を含む）の変動を包含することを意味する。
【００２７】
用語「細胞免疫治療薬」は、本明細書で使用される場合、免疫調節細胞が疾患を標的とするように遺伝的に改変され、その後、患者に導入されるという種の治療薬を意味する。最重要分野は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または遺伝的に改変されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を免疫調節細胞に導入してそれらを標的特異性とすることである。
【００２８】
用語「養子細胞療法」または「養子免疫療法」は、本明細書で使用される場合、標的細胞で発現される表面抗原またはペプチドＭＨＣ複合体に特異的なＣＡＲまたは遺伝的に改変されたＴＣＲを発現するように遺伝子導入によって操作されたヒトＴリンパ球またはＮＫリンパ球の養子免疫細胞移入を意味する。これは、癌を治療するために選択された標的、例えば、腫瘍特異的抗原に応じて一定の範囲の疾患を治療するために使用することができる。養子細胞療法は、白血球アフェレーシスと呼ばれる方法を用いてドナーまたは患者の白血球細胞の一部を取り出すことを含む。次に、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を拡大培養し、ＣＡＲ／ＴＣＲ足場をＴ細胞またはＮＫ細胞に移入するために、ＣＡＲ／ＴＣＲポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターと混合することができる。これらのＴ細胞またはＮＫ細胞を再び拡大培養し、拡大培養の終了時に、操作済みのＴ細胞またはＮＫ細胞を洗浄し、濃縮し、次いで、試験、出荷および患者に操作済みの血球の注入の準備が整うまでの保存の時間を考慮して冷凍する。
【００２９】
用語「自己」は、本明細書で使用される場合、同じ対象に由来する細胞を意味する。用語「同種異系」は、本明細書で使用される場合、比較するとその細胞とは遺伝的に異なる同じ種の細胞を意味する。
【００３０】
用語「免疫調節細胞」は、本明細書で使用される場合、免疫応答において機能する細胞、またはその始原細胞または後代を意味する。免疫調節細胞の例としては、炎症性、細胞傷害性、制御性またはヘルパーＴ細胞であり得るＴ細胞（Ｔリンパ球としても知られる）；血漿または記憶Ｂ細胞であり得るＢ細胞（またはＢリンパ球）；ナチュラルキラー細胞；好中球；好酸球；好塩基球；肥満細胞；樹状細胞；またはマクロファージが挙げられる。
【００３１】
用語「Ｔ細胞受容体」（「ＴＣＲ」）は、本明細書で使用される場合、抗原の断片を主要組織遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と結合したペプチドとして認識するＴ細胞の表面に存在する受容体を意味する。天然ＴＣＲはαβ型およびγδ型で存在し、これらは構造的に類似するが異なる場所に存在し、異なる機能を有すると思われる。ＴＣＲの細胞外部分は、２つの定常ドメインと２つの可変ドメインを有する。可変ドメインは、ＣＲの結合部位を形成し、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）と類似にする多形ループを含む。細胞免疫治療薬に関して、ＴＣＲは通常、その抗原認識を変化または向上させるために遺伝的に改変されている。例えば、引用することにより本明細書の一部とされるＷＯ０１／０５５３６６およびＷＯ２００６／０００８３０はＴ細胞を異種ＴＣＲでトランスフェクトするためのレトロウイルスに基づく方法を記載する。
【００３２】
用語「キメラ抗原受容体」（「ＣＡＲ」）は、本明細書で使用される場合、細胞外標的結合性ドメイン（通常、モノクローナル抗体に由来する）、スペーサー領域、膜貫通領域、および１以上の細胞内エフェクタードメインからなる操作された受容体を意味する。ＣＡＲは、キメラＴ細胞受容体またはキメラ免疫受容体（ＣＩＲ）とも呼ばれてきた。ＣＡＲは、一般に、特異性を所望の細胞表面抗原またはＭＨＣ−ペプチド複合体に向け直すために、Ｔ細胞などの造血細胞に導入される。
【００３３】
用語「標的結合性ドメイン」は、本明細書で使用される場合、抗原またはリガンドなどの特異的標的と結合し得るオリゴペプチドまたはポリペプチドと定義される。特に、標的は、細胞表面分子であり得る。例えば、標的結合性ドメインは、特定の病状に関連する病的な細胞（病的なヒト細胞を含む）上の細胞表面マーカーとして働く標的を認識するように選択され得る。
【００３４】
用語「スペーサー領域」は、本明細書で使用される場合、膜貫通ドメインと標的結合性ドメインを連結する働きをするオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。この領域はまた、「ヒンジ領域」または「スターク領域」とも呼ばれることがある。
【００３５】
用語「ドメイン」は、タンパク質の残部に依存しないその三次構造を保持する折り畳まれたタンパク質構造を意味する。一般に、ドメインは、タンパク質の離散した機能的特性を担い、多くの場合、タンパク質の残部および／またはドメインの機能欠失なく他のタンパク質に付加、除去または移動可能である。
【００３６】
用語「膜貫通ドメイン」は、本明細書で使用される場合、ＣＡＲ分子の、細胞膜を横切る部分を意味する。
【００３７】
用語「細胞内エフェクタードメイン」（「シグナル伝達ドメイン」とも呼ばれる）は、本明細書で使用される場合、標的結合性ドメインと標的の結合の後に細胞内シグナル伝達を担うＣＡＲ内のドメインを意味する。細胞内エフェクタードメインは、ＣＡＲが発現される免疫細胞の通常のエフェクター機能のうちの少なくとも一つの活性化を担う。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。あるいは、細胞内エフェクタードメインは、ＮＫ細胞などの別種の免疫調節細胞に向けられてもよく、ＮＫＧ２Ｄ、ＤＡＰ１０、またはＤＡＰ１２またはそれらの機能的断片および／もしくは誘導体を含んでなり得る。
【００３８】
用語「ＴＧＦβＲアンタゴニスト」は、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）のシグナル伝達を妨げ得るアンタゴニスト（本明細書では抗原結合タンパク質とも呼ばれる）を意味する。当業者は、これはＴＧＦβＲのシグナル伝達を活性化するサイトカイン（すなわちＴＧＦβ）、またはその受容体自体に結合することによって達成され得ることを理解するであろう。よって、この用語は、ＴＧＦβに結合するアンタゴニストおよびＴＧＦβＲと結合するアンタゴニストの両方を包含する。一実施形態において、本開示のアンタゴニストは、ＴＧＦβＲＩＩを介してＴＧＦβシグナル伝達を中和することができる。「中和」とは、ＴＧＦβの存在がＴＧＦβＲＩＩシグナル伝達に対する中和効果を有するようにＴＧＦβの通常のシグナル伝達効果が遮断されることを意味する。
【００３９】
用語「ドメイン抗体」は、本明細書で使用される場合、抗体可変ドメインに特徴的な配列を含んでなる折り畳まれたポリペプチドドメインを意味する。よって、それは、完全な抗体可変ドメイン、例えば、ＶＨ、ＶＨＨおよびＶＬおよび改変抗体可変ドメイン、例えば、１以上のループが抗体可変ドメインに特徴的ではない配列に置き換えられたもの、あるいは末端切断型された、またはＮ末端もしくはＣ末端延長を含んでなる抗体可変ドメイン、ならびに全長ドメインの少なくとも結合活性と特異性を保持する可変ドメインの折り畳まれた断片を含む。ドメイン抗体は、可変領域またはドメインの違いに非依存的に抗原またはエピトープと結合し得る。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ（商標）」は、「単一可変ドメイン」と呼ばれることもある。ドメイン抗体はヒトドメイン抗体であってよいが、齧歯類（例えば、ＷＯ００／２９００４に開示）、テンジクザメおよびラクダ科動物ＶＨＨ  ｄＡｂなどの他種に由来するシングルドメイン抗体も含む。ラクダ科動物ＶＨＨは、天然に軽鎖を欠いた重鎖抗体を産生するラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコを含む種に由来する免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。このようなＶＨＨドメインは、当技術分野で利用可能な標準的な技術に従ってヒト化してもよく、このようなドメインは「ドメイン抗体」と見なされる。本明細書で使用される場合、ＶＨは、ラクダ科動物ＶＨＨドメインを含む。ＮＡＲＶは、テンジクザメを含む軟骨魚類で同定された別種の免疫グロブリンドメイン抗体である(Shao et al., (2006) Mol. Immunol. 44, 656-665)。これらのドメインはまた、新規な抗原受容体可変領域としても知られている（一般にＶ（ＮＡＲ）またはＮＡＲＶと略される）。
【００４０】
用語「二重ドメイン抗体」、「二重ｄＡｂ」または「二重特異的リガンド」は、本明細書で使用される場合、直接またはリンカーを介して接続された２つのドメイン抗体を含んでなる分子を意味する。一実施形態において、二重ドメイン抗体は、結合部位または可変ドメインが２つの抗原（例えば、異なる抗原または２コピーの同じ抗原）または同じ抗原上の、単一特異性免疫グロブリンにより通常結合されていない２つのエピトープと結合し得る、第１のドメイン抗体と第２のドメイン抗体を含んでなる。例えば、これらの２つのエピトープは、同じ抗原上にあってもよいが、同じエピトープではないか、または単一特異性リガンドにより結合されるように十分に隣接している。一実施形態において、二重ドメイン抗体は、同じ特異性を有する相補的可変ドメイン対（すなわち、ＶＨ／ＶＬ対）を含まない（すなわち、単一の結合部位を形成しない）２つのドメイン抗体を含んでなる。二重特異的リガンドの詳細は、ＷＯ２００３／００２６０９、ＷＯ２００４／００３０１９、ＷＯ２００８／０９６１５８、ＷＯ２００４／０５８８２１およびＷＯ２０１３／０１４２０８に見出され、これらは引用することにより本明細書の一部とされる。
【００４１】
一実施形態において、アンタゴニストは、本明細書に開示される二重ドメイン抗体の二量体を含んでなる。本明細書で使用される場合、用語「二量体」は、２つの抗原結合構築物、すなわち、互いに会合して二量体を形成する２鎖を含んでなるポリペプチド複合体を意味する。二量体は、本発明の２つの同一の抗原結合構築物を含んでなるホモ二量体または本発明の２つの異なる抗原結合構築物を含んでなるヘテロ二量体であり得る。本発明のホモ二量体およびヘテロ二量体は、標的分子に対する親和性などの改良された特性を持ち得る。
【００４２】
また、多重特異性ドメイン抗体（ｄＡｂ）多量体も提供される。これには抗ＴＧＦβＲＩＩ免疫グロブリンドメイン抗体およびそれぞれが異なる標的（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ以外の標的）と結合する１以上のドメイン抗体を含んでなるｄＡｂ多量体が含まれる。一実施形態において、二重特異性ｄＡｂ多量体、例えば、１以上の抗ＴＧＦβＲＩＩドメイン抗体を含んでなるｄａｂ多量体および第２の異なる標的と結合する１以上のドメイン抗体が提供される。一実施形態において、三重特異的ｄＡｂ多量体が提供される。
【００４３】
Ａｂ単量体、二量体および三量体を含む、本開示によるアンタゴニストは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの一方または両方、および場合によりヒンジ領域を含んでなる抗体Ｆｃ領域と連結させることができる。例えば、単一のヌクレオチド配列としてＦｃ領域と連結されたリガンドをコードするベクターを用いてこのようなポリペプチドを作製することができる。一実施形態において、抗体の単鎖Ｆｃ領域に結合したドメイン抗体を含んでなるｄＡｂ−Ｆｃ融合物が提供される。
【００４４】
用語「抗体の単鎖Ｆｃ領域」または「抗体Ｆｃ領域」は、本明細書で使用される場合、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４もしくはＩｇＧ４ＰＥ、またはＩｇＡ抗体の単一重鎖Ｆｃ領域を意味する。単一重鎖Ｆｃ領域は、ＣＨ２およびＣＨ３定常領域抗体ドメインのうち１以上を含んでなり得る。ＣＨ２および／またはＣＨ３定常領域抗体ドメインを含んでなることに加え、抗体の単一重鎖Ｆｃ領域は、抗体のヒンジ領域（このような領域は通常ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間に見られる）をさらに含んでなり得る。一実施形態において、抗体の単鎖Ｆｃ領域は、単一ＩｇＧ１重鎖、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３抗体定常ドメインを含んでなる単一ＩｇＧ１重鎖である。
【００４５】
抗体のＦｃ領域は、そのエフェクター機能に関して選択され得る。用語「エフェクター機能」は、本明細書で使用される場合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）により媒介される応答、Ｆｃ媒介性貪食作用およびＦｃＲｎ受容体を介した抗体リサイクリングのうち１以上を意味するものとする。ＩｇＧ抗体に関して、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを含むエフェクター機能は、重鎖定常領域と免疫細胞の表面に存在するＦｃγ受容体ファミリーとの相互作用によって媒介される。ヒトでは、これらにＦｃｙＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃｙＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃｙＲＩＩＩ（ＣＤ１６）が含まれる。抗原に結合した抗原結合タンパク質とＦｃ／Ｆｃγ複合体の形成の間の相互作用は、細胞傷害性、免疫細胞活性化、貪食作用および炎症性サイトカインの放出を含む一定範囲の効果を誘導する。
【００４６】
抗原結合タンパク質の定常領域と種々のＦｃ受容体（ＦｃＲ）の間の相互作用は、抗原結合タンパク質のエフェクター機能を媒介すると考えられる。有意な生物学的効果は、エフェクター機能、特に、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体の結合（補体依存性細胞傷害性またはＣＤＣ）、および抗原結合タンパク質の半減期／クリアランスの結果であり得る。通常、エフェクター機能媒介能には抗原結合タンパク質の抗原への結合を要し、総ての抗原結合タンパク質があらゆるエフェクター機能を媒介するわけではない。
【００４７】
エフェクター機能は、例えば、ＡＤＣＣエフェクター機能を測定するためのＦｃｙＲＩＩＩのナチュラルキラー細胞への結合またはＦｃｙＲＩの単球／マクロファージへの結合を介したものを含むいくつかの方法で測定することができる。例えば、本発明の抗原結合タンパク質は、ナチュラルキラー細胞アッセイにおいてＡＤＣＣエフェクター機能に関して評価可能である。このようなアッセイの例は、Shields et al., (2001) J. Biol. Chem., 276: 6591-6604; Chappel et al., (1993) J. Biol. Chem., 268: 25124-25131; Lazar et al., (2006) PNAS USA, 103: 4005-4010に見出すことができる。ＣＤＣ機能を決定するためのアッセイの例としては、Patel & Boyd (1995) J. Immunol. Methods, 184: 29-38に記載されているものが挙げられる。
【００４８】
ヒト定常領域のいつくかのアイソタイプ、特に、ＩｇＧ４およびＩｇＧ２アイソタイプは、（ａ）古典的経路による補体の活性化、および（ｂ）抗体依存性細胞傷害性の機能を本質的に欠いている。抗原結合タンパク質の重鎖定常領域に対する種々の改変は、所望のエフェクター特性に応じて行うことができる。また別に、特定の突然変異を含むＩｇＧ１定常領域は、Ｆｃ受容体との結合を低下させ、従って、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを低減することが記載されている(Duncan et al., (1988) Nature, 332: 563-564; Lund et al., (1991) J. Immunol. 147: 2657-2662; Chappel et al., (1991) PNAS USA 88: 9036-9040; Burton and Woof, (1992) Adv. Immunol. 51: 1-84; Morgan et al., (1995) Immunology 86: 319- 324; Hezareh et al., (2001) J. Virol. 75 (24): 12161-12168)。
【００４９】
また、例えば残基Ａｓｎ２９７に特定の突然変異またはグリコシル化の改変を含むヒトＩｇＧ１定常領域はＦｃ受容体との結合を増強することも記載されている。いくつかの場合では、これらの突然変異はまた、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを増強することも示されている(Lazar et al., (2006) PNAS USA 103: 4005-4010; Shields et al., (2001) J. Biol. Chem. 276: 6591-6604; Nechansky et al., (2007) Mol. Immunol. 44: 1815-1817)。
【００５０】
ヒトには、タンパク質と結合し得る天然自己抗体が存在する。従って、自己抗体は、内因性タンパク質（ナイーブ対象に存在する）ならびに治療のために対象に投与されるタンパク質またはペプチドに結合し得る。治療用のタンパク質結合自己抗体および薬物処置に応答して新たに形成される抗体は、抗薬物抗体（ＡＤＡ）と総称される。対象に投与された治療用タンパク質およびペプチドなどの分子に対する既存の抗体は、それらの有効性に影響を及ぼす可能性があり、処置された患者に投与反応、過敏症、臨床応答の変化、およびその分子を維持、除去または中和することによるバイオアベイラビリティの変化をもたらし得る。免疫原性が低減された（すなわち、対象、特に、ヒト対象に投与した際に既存のＡＤＡに対する結合能が低減された）ヒト免疫グロブリン（抗体）単一可変ドメインまたはｄＡｂ（商標）を含んでなる治療用分子を提供することが有利であり得る。
【００５１】
よって、本発明の一実施形態において、同等の非改変分子と比較して既存の抗体（ＡＤＡ）に対する結合能が低減された改変ドメイン抗体が提供される。結合能の低減とは、改変分子が既存のＡＤＡと低い親和性または低いアビディティーで結合することを意味する。前記改変ドメイン抗体は、（ａ）Ｃ末端付加、延長、欠失もしくはタグ、および／または（ｂ）１以上のアミノ酸フレームワーク置換から選択される１以上の改変を含んでなる。
【００５２】
一実施形態において、改変ドメイン抗体は、
ａ）配列ＶＴＶＳ（Ｓ）ｎＸ［ＶＨ  ｄＡｂ（商標）の場合］またはＶＥＩＫｐＲｑＸ［ＶＬ  ｄＡｂ（商標）の場合］からなるＣ末端配列；およびまた場合により、
ｂ）ヒト生殖細胞系フレームワーク配列に比べて１４、４１、１０８、１１０、または１１２番に１以上のアミノ酸置換
を含んでなり、
ここで、
ｎは、０または１から独立に選択される整数を表し；
ｐが１を表す場合にはｑは０または１であり得、ｐが０を表す場合には、ｑもまた０を表すように、ｐおよびｑはそれぞれ０または１を表し；
Ｘは、存在しても不在であってもよく、存在する場合には１〜８個のアミノ酸残基のアミノ酸延長を表し；
さらにただしＸが存在する場合、
ＶＨ  ｄＡｂ（商標）の場合には、ｎは０であり、かつ／またはＶＴＶＳ（Ｓ）ｎで終わるｄＡｂ（商標）［ＶＨ  ｄＡｂ（商標）の場合］は、前記アミノ酸置換のうち１以上を含んでなり；
ＶＬ  ｄＡｂ（商標）の場合には、ｐおよび／またはｑは０であり、かつ／またはＶＥＩＫｐＲｑＸで終わるｄＡｂ（商標）は、前記アミノ酸置換のうち１以上を含んでなる。
【００５３】
改変ｄＡｂがＡＤＡに対して所望の結合の低減を有することを確認するためには、当業者に周知のイムノアッセイを使用することができる。
【００５４】
本実施形態のさらなる態様において、既存のＡＤＡに対する結合が低減された前記改変ドメイン抗体は１以上のアミノ酸置換を有し、前記１以上のアミノ酸置換は、Ｐ１４Ａ置換、Ｐ４１Ａ置換、Ｌ１０８Ａ置換、Ｔ１１０Ａ置換、Ｓ１１２Ａ置換、Ｐ１４Ｋ置換、Ｐ１４Ｑ置換、およびＰ１４Ｔ置換からなる群から選択される。
【００５５】
本実施形態のさらなる態様において、Ｘは存在し、１〜８個のアミノ酸の延長、特に、アラニン残基を含んでなる１〜８個のアミノ酸の延長、例えば、単一のアラニンの延長、またはＡＳ、ＡＳＴ、ＡＳＴＫ、ＡＳＴＫＧ、ＡＳＴＫＧＰの延長である。
【００５６】
一実施形態において、改変ドメイン抗体は、Ｃ末端に存在するタグを含んでなり得る。タグは、例えば、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ｈｉｓタグなどの親和性タグ、ＰＥＧなどの化学的修飾、または抗体Ｆｃドメインなどのタンパク質ドメインなど、当技術分野で公知のいずれのタグであってもよい。Ｃ末端付加または延長またはタグは、直接的融合または分子のＣ末端とのコンジュゲートとして存在し得る。
【００５７】
「親和性」は、ある分子、例えば、本発明のＣＡＲ分子の標的結合性タンパク質の別の分子、例えば、その標的抗原との、単一の結合部位での結合の強度である。抗原結合タンパク質の、その標的に対する結合親和性は、平衡法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、または動態法（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）分析）によって決定され得る。
【００５８】
「アビディティー」は、例えば相互作用の価数を考慮した、複数部位における２分子の互いの結合の強度の合計である。
【００５９】
「半減期」（「ｔ１／２」）および「血清半減期」とは、本開示による抗原結合タンパク質の血清（または血漿）濃度がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、例えば、抗原結合タンパク質の分解および／または天然の機構による抗原結合タンパク質の排除もしくは隔離のために５０％低下するのに要する時間を意味する。
【００６０】
用語「エピトープ」は、本明細書で使用される場合、特定の結合ドメイン、例えば、ＣＡＲ分子の抗原結合タンパク質または標的結合性ドメインに接触する抗原の部分を意味する。エピトープは、アミノ酸残基の特定の配列もしくは確証または特定の糖残基などの他の分子構造の確証（例えば、硫酸化糖残基の特定のパターン）を含んでなり得る。エピトープは、直鎖または立体配座的／不連続であり得る。立体配座または不連続エピトープは、他の配列により分離された、すなわち、抗原の一次配列においては連続配列でないアミノ酸残基を含んでなり得る。残基はペプチド鎖の異なる領域に由来してよいが、それらはその抗原の三次構造では近接している。多重結合抗原の場合には、立体配座または不連続エピトープは、異なるペプチド鎖の由来する残基を含んでもよい。エピトープ内に含まれる特定の残基は、コンピューターモデリングプログラムまたはＸ線結晶学などの当技術分野で公知の方法により得られる三次元構造によって決定することができる。
【００６１】
用語「病原体」は、疾病を引き起こし得るウイルス、細菌、真菌、寄生虫または原虫を意味する。
【００６２】
用語「癌」（「新生物」と呼ばれることもある）は、身体の部分において異常な細胞の制御を欠いた分裂により引き起こされる疾患を意味する。制御を欠いた分裂は、多くの場合、「腫瘍」または「新生物」と一般に呼ばれる塊を生じ得る。
【００６３】
用語「腫瘍関連抗原」または「腫瘍抗原」は、本明細書で使用される場合、腫瘍細胞で発現される抗原を意味する。この抗原は、正常細胞、すなわち、非癌性細胞と比較した場合に腫瘍細胞でユニークにまたは差次的に発現され得る。
【００６４】
用語「医薬組成物」は、細胞または動物に投与するための薬学上許容可能なまたは生理学上許容可能な溶液中に処方された組成物を意味する。本発明の組成物は、付加的薬剤が意図される療法を送達する組成物の能力に悪影響を及ぼさない限り、他の薬剤と同様に組み合わせて投与することができる。
【００６５】
用語「ベクター」または「核酸ベクター」は、外来（すなわち、外因性）遺伝物質を別の細胞に人為的に運ぶことができ、そこでそれが複製および／または発現され得るビヒクルを意味する。ベクターの例としては、非哺乳動物核酸ベクター、例えば、プラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、Ｐ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、コスミドまたはフォスミドが挙げられる。
【００６６】
ベクターの他の例としては、本出願で特に注目するレトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターが挙げられる。ヒト免疫不全ウイルスタイプ１（ＨＩＶ−１）に基づくものなどのレンチウイルスベクターは、非増殖細胞に組み込むことができることから広く使用されている。ウイルスベクターは、ウイルスゲノムを、例えば別のプラスミドに置くことによって別個の部分に分割することにより、複製欠陥とすることができる。例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓにより開発されたいわゆる第１世代のレンチウイルスベクターは、パッケージング発現カセット、エンベロープ発現カセットおよびベクター発現カセットからなる３つのプラスミド発現系として構成された。「パッケージングプラスミド」は、全ｇａｇｐｏｌ配列、調節（ｔａｔおよびｒｅｖ）配列および付属（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ）配列を含む。「エンベローププラスミド」は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下、天然のＨＩＶ−１エンベロープタンパク質の代わりに水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶｇ）を保持する。第３のプラスミド（「トランスファープラスミド」）は、長い末端反復配列（ＬＴＲ）、カプセル封入配列（ψ）、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）配列および宿主細胞内で導入遺伝子を発現させるためのＣＭＶプロモーターを運ぶ。
【００６７】
第２のレンチウイルスベクター世代は、有毒配列ｖｐｒ、ｖｉｆ、ｖｐｕおよびｎｅｆの欠失を特徴とした。パッケージングベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔおよびｒｅｖ遺伝子に縮小されたのでこの系の安全性が高まった。
【００６８】
レンチウイルス系を改良するために、第３世代ベクターは、パッケージング構築物からｔａｔ遺伝子を除去し、ベクターカセットのＬＴＲを不活化し、従って、挿入突然変異誘発効果に関連する問題を軽減することによって設計された。
【００６９】
種々のレンチウイルス世代が、第１世代：Naldini et al., (1996) Science 272(5259): 263-7；第２世代：Zufferey et al., (1997) Nat. Biotechnol. 15(9): 871-5；第３世代：Dull et al., (1998) J. Virol. 72(11): 8463-7に記載され、それらは総てその全内容が引用することにより本明細書の一部とされる。レンチウイルスベクターの開発に関する総説は、Sakuma et al., (2012) Biochem. J. 443(3): 603-18 and Picanco-Castro et al., (2008) Exp. Opin. Therap. Patents 18(5):525-539に見出すことができる。
【００７０】
用語「プロモーター」は、遺伝子発現を駆動する配列を意味する。それらは誘導型（すなわち、発現を駆動するために外的な誘発因子を必要とする）または構成型（すなわち、それらは構成的に活性なので、絶えず発現を誘導している）であり得る。高レベル発現を駆動するためには、非レトロウイルス高効率プロモーターなどの高効率プロモーターを用いることが有益であり得る。好適なプロモーターの例としては、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、脾限局巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモーターまたはヒト延長因子１−α（ｐＥＦ）プロモーターなどのプロモーターが挙げられる。
【００７１】
用語「機能的に連結されている」は、成分が、それらが意図される様式で機能可能なように構成されている場合を意味する。例えば、この用語は、プロモーターとさらなるポリヌクレオチド配列（例えば、対象とするポリヌクレオチド）の間の、該プロモーターが該さらなるポリヌクレオチド配列の転写を指示するような機能的連結を意味する。
【００７２】
用語「発現カセット」は、ＲＮＡ、次いでタンパク質を発現することができるベクターの部分を意味する。カセットは、対象とする遺伝子を含む。一実施形態において、発現カセットは、ベクターに挿入するために適合されたその３’および５’末端を有し、例えば、ベクターは、各末端に制限酵素部位を有する。このカセットは、単一の単位としてプラスミドまたはウイルスベクターから除去し、また挿入することができる。
【００７３】
用語「個体」、「対象」および「患者」は、本明細書では互換的に使用される。一実施形態において、対象は、マウスなどの哺乳動物、マーモセットもしくはサルなどの霊長類、またはヒトである。さらなる実施形態において、対象はヒトである。
【００７４】
本明細書に記載の発明はまた、それを必要とする対象の処置方法において使用され得る。処置は、治療的、予防的または回避的であり得る。処置は、疾病の少なくとも一つの側面または症状の緩和、軽減、または回避を包含し、本明細書に記載の疾患の回避または治癒を包含する。
【００７５】
本明細書に記載の発明は、治療的、予防的または回避的処置のために「有効な量」で使用され得る。本明細書に記載の細胞免疫治療薬および／またはＴＧＦβＲアンタゴニストの治療上有効な量は、その疾患の１以上の症状を改善もしくは軽減する、または回避もしくは治癒するのに有効な量である。
【００７６】
医薬組成物
本発明の第１の態様によれば、
（ａ）ドメイン抗体を含んでなるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）アンタゴニスト；および
（ｂ）細胞免疫治療薬
を含んでなる医薬組成物が提供される。
【００７７】
悪性癌細胞などの多くの罹患細胞は、免疫応答をダウンレギュレートする免疫抑制微小環境を作り出す。細胞免疫治療薬の有効性を改善するために、本発明者らは、細胞免疫治療薬処置にＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）アンタゴニストを付加することが免疫応答の持続時間を延長する助けとなることを見出した。理論に縛られるものではないが、これは腫瘍微小環境において免疫抑制の役割を持つと理解されるＴＧＦβシグナル伝達の中和のよるものであると思われる。進行した腫瘍におけるＴＧＦβの過剰発現は、転移および不良な予後に関連付けられており、一部には、通常、炎症（免疫）反応を有する癌を攻撃するエフェクターＴ細胞を、炎症性反応を解除する、すなわち、免疫抑制をもたらす制御性（抑制性）Ｔ細胞に変換する際のＴＧＦβの役割のためであると思われる。ＴＧＦβシグナル伝達はまた、ＮＫ細胞の活性化および機能を阻害し、これは腫瘍免疫監視上、重要である。
【００７８】
さらに、ドメイン抗体を含んでなるＴＧＦβＲアンタゴニストの使用は、いくつかの利点を提供する。使用されるアンタゴニストの最適サイズは、望まない副作用を生じるほどには疾患部位から移動せずに、疾患部位内に効果を有するに十分な形質導入を有することを保証するようにバランスのとれたものである必要がある。小さなドメイン抗体（またはこのようなドメイン抗体を含んでなる小さな結合タンパク質）は、特にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）などのより大きな抗原結合タンパク質に比べて短いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有することを意味し、これはアンタゴニストのいずれの全身性副作用も軽減する助けとなる。ドメイン抗体はまたモノクローナル抗体よりも分布容積が大きく、これは固形腫瘍塊の浸透を容易にする助けをすると思われ、特に、免疫抑制性の腫瘍微小環境を克服するために有用である。よって、本発明は、確立された免疫抑制性の微小環境を有する大きな腫瘍を処置するために特によく適合されている。
【００７９】
より小さなアンタゴニストの使用も製造利点を持つ。例えば、必要とされる物品のコストおよびトランスフェクション工程の数を最小とするためには、同じ発現ベクターにコードされているＣＡＲ／ＴＣＲおよびＴＧＦβＲアンタゴニストを有することが有利であろう。しかしながら、ベクターはサイズが限定され、従って、それが大きなＣＡＲ／ＴＣＲ分子と同じベクター内にコードできることを保証するよう小さなＴＧＦβＲアンタゴニストを有することが有用である。
【００８０】
本発明の組成物は、遺伝的に改変された免疫調節細胞またはそれらの始原細胞と、ドメイン抗体を含んでなるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）アンタゴニストとを含んでなる医薬組成物を含む。投与は、自己または異種（すなわち、同種異系）であり得る。例えば、免疫調節細胞、または始原細胞をある対象から取得し、同じ対象（すなわち、自己）または異なる、適合する対象（すなわち、同種異系）に投与することができる。
【００８１】
付加的医薬組成物成分の例としては、限定されるものではないが、任意のアジュバント、担体、賦形剤、流動促進剤、甘味剤、希釈剤、保存剤、色素／着色剤、香味増強剤、界面活性剤、湿潤剤、分散剤、沈殿防止剤、安定剤、等張剤、溶媒、界面活性剤、乳化剤、バッファー（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、アミノ酸、抗酸化剤またはキレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）が挙げられる。
【００８２】
一実施形態において、医薬組成物は、薬学上許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤をさらに含んでなる。担体、賦形剤または希釈剤は、組成物の他の成分と適合し、かつ、そのレシピエントに有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。本発明によれば、使用されるいずれの賦形剤、ビヒクル、希釈剤または添加剤も、細胞免疫治療薬およびＴＧＦβＲアンタゴニストと適合しなければならない。引用することにより本明細書の一部とされる“Remington’s Pharmaceutical Science”, 第17版, 1985などの当技術分野で公知の標準的教本を、好適な調製物を作製するために参照することができる。
【００８３】
医薬組成物は、注射または持続注入（例としては、限定されるものではないが、静脈内、腫瘍内、腹腔内、皮内、皮下、筋肉内および門脈内を含む）によって投与してよい。一実施形態において、組成物は、静脈内投与に好適である。本発明の治療組成物（例えば、遺伝的に改変された免疫応答細胞と、ドメイン抗体を含んでなるＴＧＦβＲアンタゴニストとを含有する医薬組成物）を投与する場合、それは一般に単位用量注射形態（溶液、懸濁液、エマルション）で処方される。医薬組成物は、局所投与（限定されるものではないが、経皮、吸入、鼻腔内または眼内投与を含む）または経腸投与（限定されるものではないが、経口または直腸投与を含む）に好適であり得る。
【００８４】
このような医薬組成物の調製のための方法は当業者に周知である。他の賦形剤も与様式および使用する特定のタンパク質に適当であれば、組成物に加えてよい。
【００８５】
本発明の組成物の投与に有効な用量および処置計画は、患者の齢、体重および健康状態ならびに処置される疾患などの因子によって異なり得る。このような因子は主治医の範囲内にある。
【００８６】
トランスフォーミング増殖因子ＢＥＴＡ受容体アンタゴニスト
トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦベータ；ＴＧＦβ）は、ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦベータ受容体；ＴＧＦβＲ）との結合を介して細胞へのシグナル伝達を媒介するシグナル伝達分子である。ＴＧＦβシグナル伝達活性は細胞の分化および増殖を調節し、その作用（すなわち、細胞増殖促進因子、増殖抑制因子または他の細胞機能の誘導因子として）の性質は細胞種によって異なる（Roberts, et al., The transforming growth factor-betas, Peptide Growth Factors and Their Receptors, Part I, ed. by Sporn, M.B. & Roberts, A.B., Springer-Verlag, Berlin, (1990) 419-472参照）。
【００８７】
ＴＧＦβは広範な細胞種によって産生され、その同族受容体は広範な器官および細胞で発現される（Shi and Massague (2003) Cell, 113(6): 685-700参照）。ＴＧＦβ受容体は、ＴＧＦβＲＩ（ＴＧＦベータタイプＩ受容体；Franzen et al., (1993) Cell, 75(4): 681;およびGenBank Accession No: L11695参照）；ＴＧＦβＲＩＩ（ＴＧＦベータタイプＩＩ受容体；Herbert et al., (1992) Cell, 68(4): 775; GenBank Accession No: M85079参照）およびＴＧＦβＲＩＩＩ（ＴＧＦベータタイプＩＩＩ受容体；Lopez-Casillas (1991) Cell, 67(4): 785; GenBank Accession No: L07594参照）の、３つのタイプに入ることが確認されている。
【００８８】
ＴＧＦβシグナル伝達は、そのＴＧＦβＲＩおよびＲＩＩの両方との結合を介して媒介される。リガンドが細胞外リガンド結合ドメインと結合すると、これら２つの受容体は一体となり、ＲＩＩがＲＩをリン酸化し、Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化を介してシグナル伝達カスケードを開始することを可能とする（上記に引用したShi and Massague参照）。
【００８９】
哺乳動物では、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、およびＴＧＦβ３の、ＴＧＦβの３つのアイソフォームが確認されている。各アイソフォームは多機能であり、発生プロセスに関してバイオアベイラビリティを制御するため、および組織ホメオスタシスを維持するために自己調節フィードバック機構で働く（ten Dijke and Arthur (2007) Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 8: 857-869で総説されている通り）。
【００９０】
一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストはＴＧＦβＲまたはＴＧＦβと結合し、すなわち、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、抗ＴＧＦβＲ抗原結合タンパク質、または抗ＴＧＦβ抗原結合タンパク質である。さらなる実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストはＴＧＦβＲと結合する。
【００９１】
一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、ＴＧＦβタイプＩ受容体（ＴＧＦβＲＩ）、ＴＧＦβタイプＩＩ受容体（ＴＧＦβＲＩＩ）またはＴＧＦβタイプＩＩＩ受容体（ＴＧＦβＲＩＩＩ）と結合する。さらなる実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、ＴＧＦβタイプＩＩ受容体（ＴＧＦβＲＩＩ）と結合する。
【００９２】
別の実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、ＴＧＦβと結合する。さらなる実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３と結合する。
【００９３】
本発明のアンタゴニストは、少なくとも一つのドメイン抗体の存在を必要とする。ドメイン抗体は異なる可変領域またはドメインであっても抗原またはエピトープと結合することができるので、このようなアンタゴニストはモノクローナル抗体を含まないと理解される。
【００９４】
一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、ドメイン抗体（単一可変ドメインまたはｄＡｂとしても知られる）、二重ドメイン抗体（すなわち、二重ｄＡｂ）、または抗体の単鎖Ｆｃ領域に結合したドメイン抗体（すなわち、ｄＡｂ−Ｆｃ）から選択される。最適なサイズのアンタゴニストは、望ましくない全身性副作用を引き起こさずに疾患部位に十分な効果を持つ必要がある。分子サイズの選択は、効果が隣接環境（すなわち、投与または分泌の部位を密接に取り囲む環境）に必要とされるだけなのか、あるいはより浸透性の効果が必要とされるのかによって異なり得る。
【００９５】
さらなる実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストはドメイン抗体である。本発明に関してドメイン抗体の使用は、特にそれらのサイズが小さいために、本明細書に記載されるような複数の利点を有する。さらに、本発明に関して、アンタゴニストは、Ｔ細胞表面で発現される分子（例えば、ＴＧＦβ受容体）または近傍の相互作用分子（例えば、腫瘍微小環境内のＴＧＦβ）と結合することが必要とされるだけであり、従って、ドメイン抗体は、全身性の作用を生じることなく隣接環境に効果を有するので、アンタゴニストとして理想的なサイズである。
【００９６】
一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、抗体の単鎖Ｆｃ領域に結合したドメイン抗体（すなわち、ｄＡｂ−Ｆｃ）である。
【００９７】
一実施形態において、抗体のＦｃ領域のＮ末端に結合したドメイン抗体は重鎖または軽鎖ドメイン抗体であり、ここで、軽鎖ドメイン抗体はκまたはλ軽鎖であり得る。
【００９８】
一実施形態において、抗体のＦｃ領域のＣ末端に結合したドメイン抗体は重鎖または軽鎖ドメイン抗体であり、ここで、軽鎖ドメイン抗体はκまたはλ軽鎖であり得る。
【００９９】
一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、二重ドメイン抗体である。二重ドメイン抗体の各ドメイン抗体は同じであっても異なってもよく、このようなドメイン抗体は、標的または異なるエピトープ上の同じエピトープと結合し得る。一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、２つの抗ＴＧＦβＲ  ｄＡｂを含んでなる二重ドメイン抗体である。別の実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、ＴＧＦβＲＩＩと結合する抗ＴＧＦβＲ  ｄＡｂ（第１のｄＡｂ）と血清アルブミン（ＳＡ）と結合する第２のｄＡｂ、すなわち、第２のＳＡ結合ｄＡｂとを含んでなる二重ドメイン抗体である。
【０１００】
さらなる実施形態において、二重ドメイン抗体は、抗体の単鎖Ｆｃ領域により分離された２つのドメイン抗体を含んでなり、ここで、各ドメイン抗体は、標的に結合することができる（例えば、ｄＡｂ−Ｆｃ−ｄＡｂ）。分離されるとは、ドメイン抗体は互いに直接結合されていないことを意味する。一つの態様において、ドメイン抗体は、Ｆｃ領域の反対の末端に位置する。一方のドメイン抗体はＮ末端に結合され、他方はＣ末端に結合される。
【０１０１】
本明細書に記載のいずれの実施形態においても、ドメイン抗体は軽鎖ドメイン抗体または重鎖ドメイン抗体であり得ることが理解されるであろう。
【０１０２】
ドメイン抗体は、抗体のＦｃ領域に直接結合させることもできるし、またはリンカーを介して間接的に結合させることもできる。ドメイン抗体のＮ末端が抗体のＦｃ領域のＣ末端に融合されている構築物では、ペプチドリンカーは、ドメイン抗体の抗原結合を増強し得る。実際に、ドメイン抗体のＮ末端は、抗原結合活性に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）に近接して位置する。よって、ペプチドリンカーは、エピトープ結合とタンパク質足場の定常ドメインの間のスペーサーとして働くことができ、これにより、ドメイン抗体ＣＤＲが抗原により容易に達すること、および場合によっては、より高い親和性で結合することが可能となる。さらに、本明細書に記載のヘテロ二量体およびホモ二量体において、特定のペプチドリンカー、例えば、７アミノ酸長を超えるものは、抗体のＦｃ領域のＮ末端に結合した重鎖ドメイン抗体と抗体のＦｃ領域のＣ末端に結合した軽鎖ドメイン抗体の会合を促進し、可能とし得る。このような会合は、本発明のアンタゴニストの抗原結合および／または他の特性を増強し得る。
【０１０３】
抗体のＦｃ領域のＣ末端で融合させると、各ドメイン抗体は、Ｆｃ部分のＣＨ３ドメインの近傍に位置し得る。このことはＦｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＦｃＲｎ）に対するＦｃ結合特性に影響を及ぼすとは思われず、それはこれらの受容体はＣＨ２ドメインと（ＦｃγＲＩ、ＩＩおよびＩＩＩクラスの受容体の場合）またはＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの間のヒンジと（例えば、ＦｃＲｎ受容体）と結びつくからである。このようなアンタゴニストのもう一つの特徴は、両ドメイン抗体は互いに空間的に密接していると思われ、適当なリンカーの提供によってフレキシビリティが提供される限り、これらのドメイン抗体はホモ二量体種を形成しさえし、ゆえにＦｃ部分の「ジップを有する」四元構造を増やし、これがアンタゴニストの安定性を高め得る。
【０１０４】
好適なリンカーの例としては、１アミノ酸長〜５０アミノ酸長、または１アミノ酸長〜４０アミノ酸長、例えば、１アミノ酸長〜３０アミノ酸長、または１〜２０アミノ酸長、または１〜１０アミノ酸長、または１〜８アミノ酸長、または１〜５アミノ酸長、または１〜３アミノ酸長、または２〜２４アミノ酸長、または７を超え、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０アミノ酸長以下であり得るアミノ酸配列を含む。一実施形態において、リンカーは、７を超え、５０アミノ酸長未満である。一実施形態において、リンカーは、２５アミノ酸長未満である。このような配列は固有の三次構造を持ち得、例えば、本発明のリンカーはドメイン抗体を含んでなり得る。一実施形態におけるリンカーのサイズは、ドメイン抗体に等しい。好適なリンカーは、１〜１００オングストローム長のサイズであり得、例えば、２０〜８０オングストローム長のサイズであり得、または例えば２０〜６０オングストローム長、または例えば４０オングストローム長未満、または２０オングストローム長未満または５オングストローム長未満のサイズであり得る。アンタゴニストが２つのドメイン抗体（すなわち、二重ｄＡｂ）を含んでなる場合、これらのドメインは同じまたは異なるリンカーによって抗体のＦｃ領域と結合されてよい。
【０１０５】
抗体の単鎖Ｆｃ領域がアンタゴニストに存在する場合、一実施形態において、Ｆｃ領域はＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、特に、ＩｇＧ１に由来する。一実施形態において、Ｆｃ領域は突然変異を有する。このような突然変異は、２３９、３３２および３３０（ＩｇＧ１）、またはＩｇＧアイソタイプにおける同等の位置から選択される位置のうち１以上にあり得る。好適な突然変異の例は、Ｓ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌ（ＥＵインデックスナンバリング）である。別の実施形態において、アンタゴニストは、アンタゴニスト増強されたエフェクター機能（例えば、増強されたＡＤＣＣもしくは増強されたＣＤＣ、またはそれは増強されたＡＤＣＣ機能と増強されたＣＤＣエフェクター機能の両方を有する）を有するように変更されたグリコシル化プロフィールを有する重鎖定常領域を含んでなる。変更されたグリコシル化プロフィールを有する抗原結合タンパク質を産生するための好適な方法論の例は、ＷＯ２００３／０１１８７８、ＷＯ２００６／０１４６７９およびＥＰ１２２９１２５に記載されている、これらは総て、本発明のアンタゴニストに適用することができる。
【０１０６】
一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、本明細書に記載される二重ドメイン抗体の二量体を含んでなる。
【０１０７】
本発明のアンタゴニストがドメイン抗体に付加的成分を含んでなる場合（例えば、単鎖Ｆｃ領域および／またはリンカーおよび／またはさらなるドメイン抗体）、それらは融合タンパク質として発現させてもよいし、またはドメイン抗体は、別個に発現させ、当技術分野で周知の方法を用いた化学的共役などの別の方法によって接続してもよい。
【０１０８】
一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、１０ｐＭ〜５０ｎＭの範囲の解離定数（Ｋｄ）でＴＧＦβＲＩＩと結合する。さらなる実施形態において、解離定数は、１０ｐＭ〜１０ｎＭ、例えば２５０ｐＭ〜１０ｎＭの範囲である。一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、高い親和性（高い効力）でＴＧＦβＲＩＩと結合し、１０ｐＭ〜５００ｐＭの解離定数を有する。別の実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、中等度の親和性（低い効力）でＴＧＦβＲＩＩと結合し、５００ｐＭ〜５０ｎＭ、例えば５００ｐＭ〜１０ｎＭの解離定数を有する。
【０１０９】
一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストはまた、マウスＴＧＦβＲＩＩとも結合する。
【０１１０】
一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、引用により本明細書の一部とされるＷＯ２０１１／０１２６０９またはＷＯ２０１２／０９３１２５に記載されている抗ＴＧＦβＲＩＩ単一可変ドメインである。
【０１１１】
一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、配列番号８５〜１６８からなる群から選択される少なくとも一つのヌクレオチド配列と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のヌクレオチド配列を含んでなり、前記ＴＧＦβＲアンタゴニストはＴＧＦβＲＩＩと結合する。一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、配列番号９４および配列番号１５６からなる群から選択される少なくとも一つのヌクレオチド配列と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のヌクレオチド配列を含んでなり、前記ＴＧＦβＲアンタゴニストはＴＧＦβＲＩＩと結合する。
【０１１２】
一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、配列番号１〜８４からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含んでなり、前記ＴＧＦβＲアンタゴニストはＴＧＦβＲＩＩと結合する。一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、配列番号１０および配列番号７２からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列を含んでなり、前記ＴＧＦβＲアンタゴニストはＴＧＦβＲＩＩと結合する。
【０１１３】
さらなる実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、５個までのアミノ酸置換、欠失または付加を任意の組合せで有する配列番号１０を含んでなる。別の実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、５個までのアミノ酸置換、欠失または付加を任意の組合せで有する配列番号７２を含んでなる。
【０１１４】
一実施形態において、前記アミノ酸置換、欠失または付加は、ＣＤＲ３内にない。さらなる実施形態において、前記アミノ酸置換、欠失または付加は、いずれのＣＤＲ内にもない。一実施形態において、前記アミノ酸置換は、保存的置換、例えば、ある疎水性アミノ酸の別の疎水性アミノ酸での置換である。例えば、ロイシンは、バリン、またはイソロイシンで置換されてよい。
【０１１５】
一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、配列番号１０を含んでなる。別の実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、配列番号７２を含んでなる。
【０１１６】
Ｔ細胞受容体およびキメラ抗原受容体
一実施形態において、細胞免疫治療薬は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞受容体を発現する免疫調節細胞である。
【０１１７】
一実施形態において、細胞免疫治療薬は、改変ＴＣＲである。さらなる実施形態において、ＴＣＲは、αβヘテロ二量体ＴＣＲまたはγδヘテロ二量体ＴＣＲである。さらなる実施形態において、ＴＣＲは、すなわち天然ＴＣＲに比べて、遺伝的に改変されている。
【０１１８】
一実施形態において、細胞免疫治療薬は、ＣＡＲである。さらなる実施形態において、ＣＡＲは、標的結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内エフェクタードメインを含んでなる。なおさらなる実施形態において、ＣＡＲは、標的結合性ドメインと膜貫通ドメインの間にスペーサードメインをさらに含んでなる。なおさらなる実施形態において、細胞内エフェクタードメインは、補助刺激ドメインをさらに含んでなる。
【０１１９】
ＴＣＲまたはＣＡＲの標的結合性ドメインは標的と結合し、標的は、腫瘍特異的分子、病原体特異的分子（例えば、ウイルス分子）、またはリンパ球による認識および排除を媒介するのに好適な標的細胞集団で発現される他の任意の分子である。よって、一実施形態において、ＣＡＲまたはＴＣＲは、腫瘍関連抗原または病原体抗原と結合する。一実施形態において、標的結合性ドメインは、抗体、抗原結合フラグメントまたはリガンドを含んでなる。さらなる実施形態において、標的結合性ドメインは、リガンドである。別の実施形態において、標的結合性ドメインは、抗原結合フラグメントである。さらなる実施形態において、抗原結合フラグメントは、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）またはｄＡｂ（商標）である。なおさらなる実施形態において、前記ｓｃＦｖは、フレキシブルリンカーにより連結された標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）可変フラグメントを含んでなる。一実施形態において、標的結合性ドメインは、２つ以上の標的、例えば、２つの異なる標的と結合し得る。このような標的結合性ドメインは、二重特異性単鎖抗体に由来し得る。例えば、ブリナツモマブ(Blinatumomab)（ＡＭＧ１０３またはＭＴ１０３としても知られる）は、単一のポリペプチド鎖に組み立てられた４つの免疫グロブリン可変ドメインからなる組換えＣＤ１９およびＣＤ３二重特異性ｓｃＦｖ抗体である。可変ドメインのうち２つは、大部分の正常Ｂ細胞および悪性Ｂ細胞で発現される細胞表面抗原であるＣＤ１９に対する結合部位を形成する。他の２つの可変ドメインは、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体複合体の部分であるＣＤ３に対する結合部位を形成する。これらの可変ドメインは、ＣＡＲ内に直列で配置されてよく、すなわち、２つの単鎖抗体可変フラグメント（ｓｃＦｖ）はスペーサー、ならびに膜貫通およびシグナル伝達ドメインにつながれている。４つの可変ドメインは、ＣＡＲ分子内にいずれの特定の順序で配置することもできる（例えば、ＶＬ（第１標的）−ＶＨ（第１標的）−ＶＨ（第２標的）−ＶＬ（第２標的）またはＶＬ（第２標的）−ＶＨ（第２標的）−ＶＨ（第１標的）−ＶＬ（第１標的）など）。
【０１２０】
一実施形態において、標的結合性ドメインおよび／またはスペーサードメインは、例えば、ＷＯ２０１５／０１７２１４に記載されているような多量体形成ドメインを含んでなり得る。これは、ＣＡＲのシグナル伝達の、多量体形成ドメイン間の架橋因子として働く化学薬物などの外的薬剤を介した制御を可能とする。よって、一実施形態において、標的結合性ドメインおよび／またはスペーサードメインは、（ａ）第１の多量体形成ドメイン；および（ｂ）第２の多量体形成ドメインを含んでなり；ここで、第１の架橋因子は、第１の多量体形成と多量体形成ドメインに会合され、それらの間に配置された架橋因子とのポリペプチド複合体の形成を促す。
【０１２１】
標的結合性ドメインは多様な細胞表面抗原と結合し得るが、一実施形態において、標的結合性ドメインは、腫瘍関連抗原と結合する。さらなる実施形態において、腫瘍関連抗原は、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌抗原−１２５（ＣＡ１２５）、ＣＡ１９−９、ムチン１（ＭＵＣ−１）、チロシナーゼ、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、タンパク質メラン−Ａ、シナプトフィシス(synaptophysis)、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ガングリオシドＧ２（ＧＤ２）、上皮細胞増殖因子変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、メソテリン、前立腺酸性ホスファターゼ(acid phosphatise)（ＰＡＰ）、プロステイン、Ｔｒｐ−ｐ８、前立腺６回膜貫通上皮抗原Ｉ（ＳＴＥＡＰ１）から選択される。
【０１２２】
一実施形態において、標的結合性ドメインは、病原体抗原と結合する。さらなる実施形態において、病原体抗原は、細菌抗原、ウイルス抗原、寄生虫抗原、原虫抗原または真菌抗原である。さらなる実施形態において、病原体抗原は、細菌抗原またはウイルス抗原である。
【０１２３】
一実施形態において、膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。一実施形態において、膜貫通ドメインは、膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質のいずれに由来してもよい。あるいは、膜貫通ドメインは合成であり得、ロイシンおよびバリンなどの主として疎水性の残基を含んでなり得る。
【０１２４】
例えば、膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３もしくはＣＤ２８などのＣＤタンパク質の膜貫通ドメイン、α、β、γもしくはδなどのＴ細胞受容体のサブユニット、ＩＬ−２受容体のサブユニット（α鎖）、低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲもしくはｐ７５）のサブユニット（β鎖もしくはγ鎖）、またはＦｃ受容体のサブユニット鎖であり得る。一実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ２８の膜貫通ドメインを含んでなる。さらなる実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ４またはＣＤ８の膜貫通ドメイン（例えば、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｎｏ．：ＮＰ＿００１１３９３４５．１に記載されているようなＣＤ８  α鎖またはそのフラグメント）を含んでなる。
【０１２５】
一実施形態において、ＣＡＲは、標的結合性ドメインと膜貫通ドメインの間にスペーサードメインをさらに含んでなる。さらなる実施形態において、スペーサードメインは、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８α）またはＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４のＣＨ２および／もしくはＣＨ３ドメインから選択される。
【０１２６】
ＣＡＲ足場に使用するためのエフェクタードメインの好ましい例は、天然Ｔ細胞受容体の細胞質配列および抗原結合後にシグナル伝達を誘導するように協調して働く補助受容体、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体および同じ機能的能力を有する任意の合成配列であり得る。エフェクタードメインは、抗原依存的な一次活性化を誘導するものと二次的または補助刺激シグナルを提供する抗原非依存的な様式で働くものの２種に分けることができる。一次活性化エフェクタードメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)（ＩＴＡＭ）としても知られるシグナル伝達モチーフを含んでなり得る。ＩＴＡＭは、十分に定義されたシグナル伝達モチーフであり、種々の受容体の細胞質内テールに共通に見られ、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスチロシンキナーゼの結合部位として機能する。本発明で使用されるＩＴＡＭの例には、限定されない例として、ＣＤ３ζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものを挙げることができる。一実施形態において、細胞内エフェクタードメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン（ＣＤ２４７としても知られる）を含んでなる。天然ＴＣＲはＣＤ３ζシグナル伝達分子を含むので、このエフェクタードメインの使用は、天然に存在するＴＣＲ構築物に最も近い。さらなる実施形態において、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインは、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｎｏ．：ＮＰ＿９３２１７０に記載されているような配列、または活性化もしくは刺激活性を有するそのフラグメントを含んでなる。
【０１２７】
古典的ＭＨＣクラスＩ分子、非古典的ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩ関連分子に特異的な活性化ＮＫ細胞受容体は、すでに記載されている(Bakker, et al., (2000) Hum. Immunol. 61:18-27)。一つのこのような受容体が、ＮＫ細胞、γδＴｃＲ＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋  αβ−ＴｃＲ＋  Ｔ細胞で発現されるＣ型レクチン様受容体であるＮＫＧ２Ｄ（ナチュラルキラー細胞群２Ｄ）である(Bauer, et al., (1999) Science 285:727-730)。ＮＫＧ２Ｄは、膜貫通アダプタータンパク質ＤＡＰ１０に関連し(Wu, et al., (1999) Science 285:730-732)、その細胞質ドメインはＰＩ−３キナーゼのｐ８５サブユニットと結合する。
【０１２８】
ＮＫ細胞が腫瘍細胞を死滅させる能力は、表面受容体を介して送達される阻害シグナルと刺激シグナルを合わせた効果に依存する。ＮＫ細胞上のキラー免疫グロブリン様受容体(killer immunoglobulin-like receptor)（ＫＩＲ）ファミリーのいくつかのメンバーと潜在的標的細胞上の同族ＨＬＡクラスＩ分子との間の相互作用が、阻害シグナル、すなわち、自己細胞の死滅を防ぐ機構を作り出す。活性化受容体からのシグナルは、主としてウイルス感染細胞および腫瘍細胞によって発現されるリガンドにより誘発されるので、これらの受容体は、ＮＫ細胞の、健康でない細胞を認識して溶解させる能力の中枢である。
【０１２９】
よって、ＣＡＲ足場において使用するためのエフェクタードメインの他の例は、ＮＫ細胞活性化受容体、ならびにこれらの配列の任意の誘導体または変異体および同じ機能的能力を有する合成配列に基づき得る。多くのＮＫ細胞活性化受容体は、Ｉｇスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）（このような受容体は本明細書ではＩｇ様受容体または「ＩＬＲ」とも呼ばれることがある）に属す。活性化ＩＬＲ  ＮＫ受容体（ＡＩＬＲ）としては、例えば、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ６９、ＤＮＡＸアクセサリー分子−１(DNAX accessory molecule-1)（ＤＮＡＭ−１）、２Ｂ４、ＮＫ１．１；キラー免疫グロブリン（Ｉｇ）様活性化受容体(killer immunoglobulin (Ig)-like activating receptor)（ＫＡＲ）；ＩＬＴ／ＬＩＲ；および天然細胞傷害性受容体(natural cytotoxicity receptor)（ＮＣＲ）、例えば、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫｐ３０が挙げられる。いくつかの他の活性化受容体は、ＣＬＴＲスーパーファミリー（例えば、ＮＫＲＰ−１、ＣＤ６９；ＣＤ９４／ＮＫＧ２ＣおよびＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｅヘテロ二量体、ＮＫＧ２Ｄホモ二量体、およびマウスでは、Ｌｙ４９の活性化アイソフォーム、例えば、Ｌｙ４９Ａ−Ｄ）に属す。さらに他の活性化受容体（例えば、ＬＦＡ−１およびＶＬＡ−４）は、インテグリンタンパク質スーパーファミリーに属し、他の活性化受容体は、なお他の識別可能な構造を持ち得る。多くの活性化受容体は、ＭＨＣ−Ｉ分子と結合する細胞外ドメイン、および比較的短く、阻害性ＮＫ受容体に特徴的な免疫受容体チロシン阻害モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif)（ＩＴＩＭ）シグナル伝達モチーフを欠く細胞質ドメインを有する。これらの受容体の膜貫通ドメインは一般に、シグナル伝達関連分子、例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃεＲＩγ、ＤＡＰ１２、およびＤＡＰ１０（２Ｂ４、しかしながら、この一般則には例外であると思われる）との会合を助長する荷電アミノ酸残基を含み、前記アミノ酸配列は、ＮＫ細胞活性化シグナルを伝達する「免疫受容体チロシン活性化モチーフ」(immunoreceptor tyrosine-based activating motif)（ＩＴＡＭ）と呼ばれる短いアミノ酸配列を含む。受容体２Ｂ４は、その細胞質テールに４つの免疫受容体チロシンスイッチモチーフ(Immunoreceptor Tyrosine-based Switch Motif)（ＩＴＳＭ）を含む。ＩＴＳＭモチーフはまた、ＮＫＣＡＲ  ＣＳ１／ＣＲＡＣＣおよびＮＴＢ−Ａにも見出すことができる。２Ｂ４およびＳＬＡＭの細胞質ドメインは、活性化阻害受容体に存在するモチーフに似たユニークな２つ以上のチロシンに基づくモチーフを含み、タンパク質ＳＨＰ−２およびＳＬＡＭ関連タンパク質（ＳＡＰ）を含むＳＨ２ドメインを動員することができる。
【０１３０】
本明細書に記載されるように、エフェクタードメインは、二次的または補助刺激シグナルも提供し得る。Ｔ細胞は、例えば増殖の活性化、分化などを増すことによってＴ細胞応答を増強するために、抗原提示細胞上の同族補助刺激リガンドと結合する補助刺激分子をさらに含んでなる。よって、一実施形態において、細胞内エフェクタードメインは、補助刺激ドメインをさらに含んでなる。さらなる実施形態において、補助刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１（ＣＤ２７９）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＮＫＧ２Ｃ（ＣＤ９４）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）から選択される補助刺激分子の細胞内ドメインまたはそれらの任意の組合せを含んでなる。なおさらなる実施形態において、補助刺激ドメインは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳから選択される補助刺激分子の細胞内ドメインまたはそれらの任意の組合せを含んでなる。なおさらなる実施形態において、補助刺激ドメインは、例えば、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｎｏ．：ＮＰ＿００６１３０に記載されているようなＣＤ２８、または活性化もしくは刺激活性を有するそのフラグメントを含んでなる。
【０１３１】
ポリヌクレオチドおよび発現ベクター
本発明のさらなる態様によれば、ドメイン抗体を含んでなるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）アンタゴニストをコードする配列と、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする配列とを含んでなるポリヌクレオチドが提供される。
【０１３２】
本発明のポリヌクレオチドは、プロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、シグナル配列、Ｋｏｚａｋ配列、ポリアデニル化配列、制限酵素部位、多重クローニング部位、内部リボゾーム進入部位(internal ribosomal entry sites)（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴおよびＡｔｔ部位）、終結コドン、転写終結シグナルおよび自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどの他のＤＮＡ配列と組み合わせてもよい。
【０１３３】
これらの配列は同じまたは異なる発現カセットの一部であり得る。例えば、一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストをコードする配列とＣＡＲまたはＴＣＲをコードする配列はそれぞれプロモーターエレメントに機能的に連結されている（すなわち、ＴＧＦβＲアンタゴニストおよびＣＡＲ／ＴＣＲは別個の発現カセットによりコードされる）。別の実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストをコードする配列とＣＡＲまたはＴＣＲをコードする配列は単一のプロモーターにより制御される（すなわち、それらは同じ発現カセットの一部である）。この実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストおよびＣＡＲ／ＴＣＲは一つの長い配列として発現されるので、各配列が別個に翻訳されることを保証するためには、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または自己切断ペプチド、例えば、Ｐ２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことが好適となることが理解されるであろう。
【０１３４】
一実施形態において、プロモーターエレメントは、誘導プロモーターまたは構成プロモーターである。これらの配列が別の発現カセットに存在する場合には、各発現カセットに使用されるプロモーターエレメントは異なっていてもよいことが理解されるであろう。
【０１３５】
ポリヌクレオチドは発現カセットまたは発現ベクターに存在し得る（例えば、細菌宿主細胞に導入するためにはプラスミド、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためにはレンチウイルスなどのウイルスベクター）。よって、本発明のさらなる態様によれば、本明細書に記載のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターが提供される。
【０１３６】
一実施形態において、発現ベクターはウイルスベクターである。さらなる実施形態において、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに由来する、またはそれから選択される。
【０１３７】
一実施形態において、レトロウイルスベクターは、レンチウイルス、アルファレトロウイルス、ガンマレトロウイルスまたはフォーミーレトロウイルス、例えば、レンチウイルスまたはガンマレトロウイルス、特に、レンチウイルスに由来する、またはそれから選択される。さらなる実施形態において、レトロウイルスベクター粒子は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＥＩＡＶおよびビスナからなる群から選択されるレンチウイルスである。レンチウイルスは、非分裂（すなわち、休止）細胞に感染することができ、これはそれらを遺伝子療法に有望なベクターとする。なおさらなる実施形態において、レトロウイルスベクター粒子は、ＨＩＶ−１であるか、またはＨＩＶ−１に由来する。当技術分野では、いくつかのレトロウイルスのゲノム構造を見出すことができる。例えば、ＨＩＶ−１の詳細はＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ（ゲノム受託番号ＡＦ０３３８１９）から見出すことができる。ＨＩＶ−１は、最もよく理解されているレトロウイルスの一つであり、従って、ウイルスベクターとしてよく使用される。
【０１３８】
限定されない例として、ＴＧＦβＲアンタゴニストおよびＣＡＲ／ＴＣＲは、本明細書に記載されるように発現ベクターによってコードされる導入遺伝子と理解することができる。発現ベクターはまた、そのベクターを受容した細胞の同定および／または選択を提供する選択マーカーも含み得る。
【０１３９】
免疫調節細胞
本発明のさらなる態様によれば、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたは発現ベクターを含んでなる免疫調節細胞が提供される。一実施形態において、免疫調節細胞は、ヒト免疫調節細胞であり得る。
【０１４０】
用語「免疫調節細胞」は、自然免疫応答および／または適応免疫応答の調節（例えば、誘導および／または実行）に機能的に関与する造血系起源の細胞を意味する。本発明による前記免疫調節細胞は、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より詳しくは、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。前記免疫調節細胞はまた、樹状細胞、キラー樹状細胞、肥満細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｂ細胞またはＴ細胞でもあり得る。Ｔ細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球もしくはヘルパーＴリンパ球、またはそれらの組合せからなる群から選択され得る。よって、一実施形態において、免疫調節細胞は、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球またはヘルパーＴリンパ球に由来する。別の実施形態において、前記細胞は、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球からなる群に由来し得る。一実施形態において、免疫調節細胞は、Ｔ細胞（例えば、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球またはヘルパーＴリンパ球）、ナチュラルキラー細胞、またはリンパ系細胞に分化し得る多能性幹細胞に由来する。さらなる実施形態において、免疫調節細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞に由来する。
【０１４１】
一実施形態において、免疫調節細胞は、ナチュラルキラー細胞に由来する。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、腫瘍細胞を標的として認識することができ、従って、癌の免疫療法に有用であり得る(Vivier et al., 2011, Science 331:44-49; Ruggeri et al., 2002, Science 295:2097-2100; Cooley et al., 2010, Blood 116:2411-2419; Miller et al., 2005, Blood 105:3051-3057; Rubnitz et al., 2010, J Clin Oncol. 28:955-959)。ＮＫ細胞の注入は、種々の形態の癌を有する患者を治療するために使用されてきた(Caligiuri, 2008, Blood 112(3):461-469)。非拡大培養ＮＫ細胞よりも高い抗腫瘍能を示す多量のヒトＮＫ細胞を得ることを可能とする方法が利用可能である（米国特許第７，４３５，５９６号；Imai et al., 2005, Blood 106:376-83; Fujisaki et al., 2009, Cancer Res. 69: 4010-4017; Cho et al., 2010, Clin Cancer Res. 16:3901-390参照）。
【０１４２】
本発明の細胞の拡大培養および遺伝的改変の前に、細胞の供給源は、種々の限定されない方法によって対象から得ることができる。細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含むいくつかの限定されない供給源から得ることができる。本発明の特定の実施形態において、当業者に入手可能で既知のいずれの数のＴ細胞株を用いてもよい。別の実施形態において、前記免疫調節細胞は、健康ドナーまたは罹患ドナー、例えば、癌または感染症を有すると診断された患者に由来し得る。別の実施形態において、前記免疫調節細胞は、異なる表現型の特徴を呈する細胞の混合集団の一部である。
【０１４３】
一実施形態において、免疫調節細胞は、アフェレーシス、遠心分離および／または沈降などの当業者に既知のいずれの数の技術を用いて対象から採取した血液単位に由来してもよい。次いで、採取した細胞は、遺伝的改変（すなわち、ＣＡＲ／ＴＣＲを発現させるため）の前または後に、例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２抗体および／またはタンパク質キナーゼＣアクチベーターと接触させるなどの当技術分野で公知の方法を用いて活性化および／または拡大培養することができる。
【０１４４】
一実施形態において、免疫調節細胞は、自己である（すなわち、患者自身の免疫細胞に由来する）。別の実施形態において、免疫調節細胞は、同種異系である（すなわち、別の個体に由来する）。同種異系細胞が患者に拒絶されないようにするために、それらは適合するドナーに由来するか、または望まない免疫応答を誘導する抗原が細胞表面に存在しないように改変することを必要とすることが理解されるであろう。
【０１４５】
免疫調節細胞はＴＧＦβＲアンタゴニストおよびキメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体を一過性にまたは安定に／恒久的に発現し得る（使用するトランスフェクション法およびそのポリヌクレオチドが免疫調節細胞ゲノムに組み込まれているかいないかによる）ことが理解されるであろう。ひと度ＣＡＲ／ＴＣＲが免疫調節細胞に導入されれば、前記細胞は「形質転換免疫調節細胞」と呼ぶことができる。
【０１４６】
使用
本発明のさらなる態様によれば、療法において使用するための本明細書に記載の医薬組成物が提供される。一実施形態において、医薬組成物は、癌、自己免疫疾患、または感染症から選択される疾患の処置において使用するためのものである。さらなる実施形態において、医薬組成物は、癌の処置において使用するためのものである。本発明の組成物は、ＴＧＦβＲアンタゴニストはＴＧＦβＲシグナル伝達を妨げ、従って、腫瘍微小環境の免疫抑制効果に打ち勝って細胞免疫治療薬の効果を延長することから、癌の処置に特によく適合される。
【０１４７】
本発明のさらなる態様によれば、療法において使用するための本明細書に記載の免疫調節細胞が提供される。一実施形態において、療法は、そのような療法得を必要とするヒト対象への免疫調節細胞の投与を含んでなる。
【０１４８】
一実施形態において、免疫調節細胞は、癌、自己免疫疾患または感染症から選択される疾患の処置において使用するためのものである。さらなる実施形態において、免疫調節細胞は、癌の処置において使用するためのものである。
【０１４９】
本発明のさらなる態様によれば、療法において使用するための薬剤の製造における、本明細書に記載の医薬組成物または本明細書に記載の免疫調節細胞が提供される。一実施形態において、薬剤の製造は、癌、自己免疫疾患、または感染症から選択される疾患の処置
において使用するためのものである。
【０１５０】
方法
本発明のさらなる態様によれば、抗原特異的免疫調節細胞を生産するための方法が提供され、該方法は、本明細書で定義されるポリヌクレオチドまたは発現ベクターを免疫調節細胞に導入することを含んでなる。本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターは、抗原特異的なＣＡＲ／ＴＣＲを含んでなり、従って、免疫調節細胞の表面でのこれらの分子の発現はその抗原特異性を細胞に付与することが当業者には理解されるであろう。
【０１５１】
ポリペプチドは、前記ＣＡＲ／ＴＣＲおよびＴＧＦβＲアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを細胞に導入する結果として細胞内でｉｎ  ｓｉｔｕ合成され得る。あるいは、前記ポリペプチドは、細胞外で生産した後に細胞に導入することもできる。ポリヌクレオチド構築物を細胞に導入するための方法は当技術分野で公知であり、限定されない例として、ポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムに組み込まれ安定形質転換法またはポリヌクレオチド構築物が細胞のゲノムに組み込まれない一過性形質転換法が含まれる。前記ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソームなどによって細胞に導入され得る。例えば、一過性形質転換法としては、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたは粒子衝撃が含まれる。ポリヌクレオチドは、細胞内で発現されるという点で、ベクター、より詳しくは、プラスミドまたはウイルス内に含まれてよい。
【０１５２】
本発明の方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施され得ることが理解されるであろう。
【０１５３】
本発明のさらなる態様によれば、抗原特異的免疫調節細胞を生産するための方法が提供され、該方法は、本明細書で定義される発現ベクターを免疫調節細胞に導入することを含んでなる。
【０１５４】
一実施形態において、本方法は、本明細書に記載される発現ベクターを免疫調節細胞にトランスフェクトすることを含んでなる。用語「トランスフェクション」、「形質転換」および「形質導入」とは、本明細書で使用される場合、発現ベクターの標的細胞への挿入を表して使用され得る。ベクターの挿入は、通常、細菌細胞に対しては形質転換、および真核細胞に対してはトランスフェクションと呼ばれるが、ウイルスベクターの挿入も形質導入と呼ばれ得る。当業者はまた、慣用される種々の非ウイルストランスフェクション法も知っており、これには限定されるものではないが、物理的方法（例えば、エレクトロポレーション、細胞スクイージング、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インパレフェクション(impalefection)、マグネトフェクション(magnetofection)、遺伝子銃または粒子衝撃）、化学試薬（例えば、リン酸カルシウム、高分岐有機化合物または陽イオンポリマー）または陽イオン脂質（例えば、リポフェクション）の使用が含まれる。多くのトランスフェクション法は、プラスミドＤＮＡ溶液と細胞の接触を必要とし、次にそれらを増殖させ、マーカー遺伝子発現に関して選択する。
【０１５５】
処置方法
本発明のさらなる態様によれば、本明細書で定義される発現ベクターを対象に投与することを含んでなる処置方法が提供される。
【０１５６】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書で定義される免疫調節細胞を対象に投与することを含んでなる処置方法が提供される。
【０１５７】
本発明のさらなる態様によれば、対象に
（ａ）細胞免疫治療薬、および
（ｂ）ドメイン抗体を含んでなるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）アンタゴニスト
を投与することを含んでなる処置方法が提供される。
【０１５８】
一実施形態において、細胞免疫治療薬は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または改変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する免疫調節細胞である。
【０１５９】
一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、免疫調節細胞から分泌される。この実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストをコードする配列は、分泌経路を介して（すなわち、小胞体、ゴルジ体を介して、また細胞原形質膜と融合し、従って、アンタゴニストを細胞外に放出する小胞として）免疫調節細胞から分泌されるように分泌リーダー配列と結合させることができる。さらに、この実施形態において、細胞免疫治療薬（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をコードする配列とＴＧＦβＲアンタゴニストは両方とも免疫調節細胞に導入され、すなわち、それらは免疫調節細胞によって同時発現される。免疫調節細胞は、ＣＡＲ／ＴＣＲの抗原特異性のために疾患部位に標的化され、従って、この実施形態の利点は、ＴＧＦβＲアンタゴニストが疾患部位でのみ発現されることを保証し、従って、いずれの有害な全身性作用も最小とすることである。
【０１６０】
別の実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストと細胞免疫治療薬は別に投与される。この実施形態において、ＣＡＲ／ＴＣＲをコードする配列のみが免疫調節細胞に導入／トランスフェクトされ、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、別の組成物の一部として投与される。この実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストと細胞免疫治療薬は、任意の好都合な経路によって、別個のまたは合わせた医薬製剤で逐次にまたは同時に投与してよい。
【０１６１】
投与が逐次である場合、ＴＧＦβＲアンタゴニストまたは細胞免疫治療薬のいずれを最初に投与してもよい。一実施形態において、細胞免疫治療薬が最初に投与される。別の実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストが最初に投与される。
【０１６２】
一実施形態において、ＴＧＦβＲアンタゴニストと細胞免疫治療薬は別に投与される場合、ＴＧＦβＲアンタゴニストは、疾患部位に直接投与、すなわち、局所投与される。例えば、処置される疾患が癌である場合、ＴＧＦβＲアンタゴニストは腫瘍に直接投与される。別の例では、処置される疾患が感染症であれば、ＴＧＦβＲアンタゴニストは感染部位に直接投与される。ＴＧＦβＲアンタゴニストを疾患部位に直接を投与することには、アンタゴニストの全身性作用を最小にするという利点がある。
【０１６３】
一実施形態において、本方法は、癌を処置するために使用される。さらなる実施形態において、癌は、血液癌、骨髄癌、リンパ癌、リンパ系癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮頸癌、食道癌、腎臓癌、大腸癌、肺癌、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、皮膚癌または胃癌から選択される。なおさらなる実施形態において、癌は、例えば、Ｂ細胞白血病、多発性骨髄腫（ＭＭ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）および非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される血液癌である。
【０１６４】
本明細書に記載の方法は癌を処置するために使用され、一実施形態において、本方法は、対象において腫瘍細胞数を低減し、腫瘍サイズを低減し、および／または腫瘍を根絶する。
【０１６５】
一実施形態において、本方法は、自己免疫疾患を処置するために使用される。自己免疫疾患は、体内に通常に存在する物質および組織に対する身体の異常な免疫応答から起こる。これは組織の損傷もしくは破壊、または器官の増殖もしくは機能の変化をもたらし得る。自己免疫疾患の例としては、限定されるものではないが、１型糖尿病、関節炎（若年性、乾癬性、反応性関節炎、および関節リウマチを含む）、乾癬、多発性硬化症、血管炎、円形脱毛症、悪性貧血、糸球体腎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性膵炎、潰瘍性大腸炎、全身性紅斑性狼瘡、グレーブス病、ギランバレー症候群、シェーグレン症候群、セリアック病、クローン病およびウェゲナー症候群が挙げられる。
【０１６６】
一実施形態において、本方法は、感染症を処置するために使用される。感染症は、細菌、ウイルス、寄生虫、原虫または真菌などの病原体によって引き起こされ得る。さらなる実施形態において、感染症はウイルスまたは細菌感染症である。
【０１６７】
一実施形態において、対象は哺乳動物である。さらなる実施形態において、哺乳動物は、ヒト、マウス、霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、およびイヌからなる群から選択される。なおさらなる実施形態において、対象はヒトである。
【０１６８】
本発明のさらなる態様によれば、癌を有する対象の生存を高める（または延長する）方法であって、対象に
（ａ）細胞免疫治療薬、および
（ｂ）ドメイン抗体を含んでなるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）アンタゴニスト
を投与することを含んでなる方法が提供される。
【０１６９】
本発明のさらなる態様によれば、対象において腫瘍量を低減する方法であって、対象に
（ａ）細胞免疫治療薬、および
（ｂ）ドメイン抗体を含んでなるＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲ）アンタゴニスト
を投与することを含んでなる方法が提供される。
【０１７０】
本明細書に記載の組成物および方法は疾患を緩和するためにさらなる処置または療法と併用可能であることが当業者には理解されるであろう。
【０１７１】
キット
本発明のさらなる態様によれば、本明細書で定義される医薬組成物を含んでなる、癌、自己免疫疾患または感染症から選択される疾患の処置のためのキットが提供される。
【０１７２】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書で定義されるポリヌクレオチドを含んでなる癌、自己免疫疾患または感染症の処置のためのキットが提供される。
【０１７３】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書で定義される発現ベクターを含んでなる、癌、自己免疫疾患または感染症から選択される疾患の処置のためのキットが提供される。
【０１７４】
本発明のさらなる態様によれば、本明細書で定義される免疫調節細胞を含んでなる、癌、自己免疫疾患または感染症から選択される疾患の処置のためのキットが提供される。
【０１７５】
一実施形態において、本明細書に記載のキットは、癌、自己免疫疾患または感染症を有する対象の処置のための前記組成物、ポリヌクレオチド、発現ベクターまたは免疫調節細胞の使用に関する説明文書をさらに含んでなる。
【０１７６】
本明細書に記載の実施形態は本発明の総ての態様に適用され得ることが理解されるであろう。さらに、本明細書に引用される、限定されるものではないが、特許および特許出願を含む総ての刊行物は、全内容が示されるかのように引用することにより本明細書の一部とされる。
【実施例】
【０１７７】
本開示を、以下の実施例（実施例２）および仮説例（実施例１、３、４および５）を参照してさらに詳細に説明する。これらの例は単に説明のために示すものであり、本発明の範囲の限定と解釈されるべきではない。本発明は、以下の例に限定されると決して解釈されるべきでなく、本明細書に提供される教示の結果として明らかとなるいずれの、またあらゆる変形形態も包含すると解釈されるべきである。さらに述べなくとも、当業者は以上の記載および以下の例を用いて本発明の化合物を作製および使用し、また、特許請求された方法を実施することができると考えられる。
【０１７８】
実施例１：ＴＧＦβＲアンタゴニストの選択
抗ＴＧＦβＲドメイン抗体（単一可変ドメインまたはｄＡｂ（商標））の使用は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞に基づくものなど癌の免疫受容体トランスジェニック（または天然に生じる）養子細胞療法の有効性を高めるための利点を与える。これらはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）トランスジェニックＴまたはＮＫ細胞を含み得る。
【０１７９】
ＷＯ２０１１／０１２６０９およびＷＯ２０１２／０９３１２５は、ケロイド瘢痕を処置するために開発された抗ＴＧＦβＲＩＩドメイン抗体を記載している。配列番号７２のアミノ酸配列を含んでなるドメイン抗体は、ヒトおよびマカクザル細胞におけるＴＧＦβシグナル伝達の強力な阻害剤であることが証明されており、治療タンパク質として送達された際にＧＬＰ前臨床安全性評価を通過した。この単一可変ドメインはまた、リポーター遺伝子アッセイでＴＧＦβシグナル伝達に対してナノモル（ｎＭ）以下の範囲のＩＣ５０、また、ヒトＰＢＭＣで近位シグナル伝達イベント（ＳＭＡＤリン酸化）に対してｎＭ範囲のＩＣ５０を有することも示された。
【０１８０】
この単一可変ドメインを使用するさらなる利点は、糸球体濾過のために短いｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有することであり、チェックポイント抗体の副作用の多くがそれらの体中に拡がる活性およびＩＶ投与後の長い血清半減期からくるものなので、このことは本発明に有益である。
【０１８１】
ドメイン抗体の使用はまた、モノクローナル抗体よりも分布容積が大きく、特にＴ細胞ホーミングにより腫瘍部位に送達される場合に固形腫瘍塊の浸透を促す助けとなると思われるので有利である。
【０１８２】
アンタゴニストの抗原結合を確認するために、例えば、ＷＯ２０１１／０１２６０９およびＷＯ２０１２／０９３１２５に記載されるアッセイなど、当技術分野で公知のいずれの好適なアッセイも使用可能である。
【０１８３】
実施例２：ＧＦβシグナル伝達の妨害におけるＴＧＦβＲアンタゴニストの有効性
抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体で活性化されたヒトＣＤ４＋  Ｔリンパ球およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球においてサイトカイン生産および表面マーカー発現に対するＴＧＦβの効果を妨害する際のＴＧＦβＲアンタゴニストの有効性を決定するための実験を行った。
【０１８４】
プレートコーティング
抗ＣＤ３（ＯＫＴクローン）抗体および抗ＣＤ２８（ＣＤ２８．２クローン）抗体をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にそれぞれ終濃度１μｇ／ｍＬおよび３μｇ／ｍＬとなるように希釈した。平底９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ  ＃ＢＤ３５１１７２）をウェル当たり２００μＬの各抗体で同時コーティングし、４℃で一晩インキュベートした。これらのプレートを、活性化Ｔリンパ球を播種する前にＰＢＳで３回洗浄した。
【０１８５】
ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球の単離
健常個体の全血から免疫磁気陰性選択（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃１９６６２および＃１９６６３）によりＣＤ４＋  Ｔリンパ球およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球を個別に精製した。細胞ペレットを無血清培地（ＡＩＭ  Ｖ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）に再懸濁し、次に細胞を計数し、生存率を確認した。細胞を従前に記載したプレコーティング９６ウェルプレートに播種した（２×１０５細胞／ウェル／２００μＬ無血清培地）。
【０１８６】
Ｔ細胞刺激
細胞を、配列番号７２のアミノ酸配列を含んでなるＴＧＦβＲアンタゴニストｄＡｂ（５ｎＭまたは５０ｎＭ）とともに３７℃および５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。ヒトＴＧＦβ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＃１００−２１Ｃ）（１、１０、５０、または１００ｎｇ／ｍＬ）を加え、これらのプレートを３７℃および５％ＣＯ２で２４、４８、および７２時間インキュベートした。培地を各時点に関してヒトサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＬ１７）およびヒトインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）アッセイキット（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＭＳＤ））を用いたＭＳＤによる上清分析のために吸引した。フロー分析のため、各時点に関して３反復の培養物を１つのウェルに合わせ、次に必要なパネルに分割した。フロー染色およびＭＳＤ分析を行った。
【０１８７】
ベースライン特性決定のためのフローサイトメトリーおよびＴ細胞染色
およそ１×１０５  ＣＤ４＋またはＣＤ８＋細胞を９６ウェルの２ｍＬディープウェルプレート（Ａｘｙｇｅｎ）の各ウェルに加えた。プレートを１０μＬ／ウェルのヒトＦｃブロッキング溶液（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）とともに暗所、４℃で１０〜１５分間インキュベートした。ＣＤ１０３（ＰＥ−Ｃｙ７標識Ｂｅｒ−ＡＣＴ８）、ＣＸＣＲ４（ＰＥ標識１２Ｇ５）、ＯＸ４０（ＢＶ４２１標識Ｂｅｒ−ＡＣＴ３５）、およびＰＤ１（ＢＶ５１０標識ＥＨ１２．２Ｈ７）に関して表面発現をフローサイトメトリーによって評価した。
【０１８８】
ＭＳＤ分析
ＭＳＤヒトサイトカインキットおよびヒトインターフェロンγアッセイキットに関する標準的プロトコールに従った。
【０１８９】
結果
ＣＤ４＋  Ｔリンパ球およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球によるＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１７生産は、アイソタイプ対照に比べＣＤ３／ＣＤ２８によって時間依存的に誘導された。ＴＧＦβ（濃度範囲１〜１００ｎｇ／ｍＬ）の添加は、これらのサイトカインの生産をＣＤ３／ＣＤ２８に比べて低下させ、１ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ濃度が飽和であると見られた。５０ｎＭでのＴＧＦβＲアンタゴニストｄＡｂの添加は以下の効果を有した：ＣＤ４＋  Ｔリンパ球およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球の両方で４８および７２時間の時点で同等の有効性で、１ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβの存在下でＩＦＮ−γ生産を増強した；２．ＣＤ８＋  リンパ球では７２時間においてより強い有効性で、１ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβの存在下でＩＬ−２生産を増強したが、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球ではそうではなかった；３．ＣＤ４＋  Ｔリンパ球およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球の両方で３時点の総てで同等の有効性で、１ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβの存在下でＩＬ−６生産を増強した；４．ＣＤ４＋  Ｔリンパ球およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球の両方で４８時間においてより強い有効性で、１ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβの存在下でＩＬ−１０生産を増強した；および５．ＣＤ４＋  Ｔリンパ球およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球の両方で７２時間においてより強い有効性で、１ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβの存在下でＩＬ−１７生産を増強した。これらの結果を図１〜５に示す。
【０１９０】
ＣＤ１０３の細胞表面発現は、４８時間目に始まる時間依存的様式で特にＴＧＦβによって誘導された。５０ｎＭでのＴＧＦβＲアンタゴニストｄＡｂの添加は、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球では７２時間、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球では４８時間において強い有効性で、１ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβの存在下でＣＤ１０３発現を低下させた（図６）。
【０１９１】
ＣＸＣＲ４の細胞表面発現は、２４時間および４８時間の時点でＣＤ３／ＣＤ２８刺激の存在下で低下した。ＴＧＦβ（濃度範囲１〜１００ｎｇ／ｍＬ）の添加は、２４時間および４８時間の時点でＣＤ３／ＣＤ２８に比べてＣＸＣＲ４発現を増強した。５０ｎＭでのＴＧＦβＲアンタゴニストｄＡｂの添加は、ＣＤ４＋  Ｔリンパ球およびＣＤ８＋  Ｔリンパ球の両方で２４時間において最も強い有効性で、１ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβの存在下でＣＸＣＲ４発現を低下させた（図７）。
【０１９２】
ＯＸ４０の細胞表面発現は、３時点の総てでＣＤ３／ＣＤ２８刺激の存在下で劇的に誘導された。ＣＤ３／ＣＤ２８の存在下でのＴＧＦβ（濃度範囲１〜１００ｎｇ／ｍＬ）の添加は、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球でのみ、７２時間においてＣＤ３／ＣＤ２８単独に比べてＯＸ４０発現を低下させた。５０ｎＭでのＴＧＦβＲアンタゴニストｄＡｂの添加は、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球で７２時間において１ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβの存在下でＯＸ４０発現に対して若干の回復効果（増加）を示した（図８）。
【０１９３】
ＰＤ１の細胞表面発現は、３時点の総てでＣＤ３／ＣＤ２８刺激の存在下で誘導された。ＴＧＦβ（濃度範囲１〜１００ｎｇ／ｍＬ）の添加は、ＣＤ３／ＣＤ２８の存在下で、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球でのみ、２４時間および４８時間の時点でＣＤ３／ＣＤ２８単独に比べてＰＤ１を若干増強した。５０ｎＭでのＴＧＦβＲアンタゴニストｄＡｂの添加は、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球で２４時間および４８時間において１ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβの存在下でＰＤ１発現に最小の効果を示した（図９）。
【０１９４】
実施例３：ＣＡＲの構築
ＴＧＦβＲアンタゴニストをＣＡＲと併用する場合には、例えば、標的特異的ｓｃＦｖ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメインおよびＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含んでなる遺伝的ＣＡＲ構築物が使用可能である。この構築物全体は、ＣＡＲ分子の各成分の個々のＤＮＡフラグメントを合成し、ＤＮＡ配列中に適当な制限部位を組み込むことによって構築され得る。ＰＣＲ増幅、制限酵素消化、精製およびＤＮＡ断片の発現ベクターへの連結のためには標準的な分子生物学的プロトコールに従った。
【０１９５】
ＣＡＲ分子に使用されるｓｃＦｖの抗原結合を確認するために、哺乳動物発現系から生産および精製した可溶性ｓｃＦｖフラグメントに、それらの抗原に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ親和性決定を行うことができる。ＨＢＳ−ＥＰバッファー中のｓｃＦｖタンパク質希釈系を、適当な「応答単位密度(Response Unit Density)」で予め抗原をコーティングしたＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００チップ表面に注入し、センソグラムを記録した。結合動態の分析は、適当なフィッティングモデル（ほぼ１：１結合）を用いた特許ソフトウエアを助けとすることができる。この親和性データを用いてＣＡＲ構築物に使用されるｓｃＦｖフラグメントの適合性を確認することができる。
【０１９６】
実施例４：Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞におけるＣＡＲ／ＴＣＲおよびＴＧＦβＲアンタゴニストの発現
当技術分野で公知の標準的クローニングプロトコールを用い、分泌リーダー配列を有する抗ＴＧＦβＲＩＩ単一可変ドメインのコード配列（例えば、配列番号７２）を、対象とするＣＡＲまたはＴＣＲもコードするレンチウイルスベクターにクローニングする。単一可変ドメイン配列は、哺乳動物系での発現を増強するために当技術分野で公知の方法を用いてコドンが至適化されてもよい。これらの配列の発現を駆動するために使用されるプロモーターには当技術分野で周知の構成プロモーターおよび／または誘導プロモーターが含まれる。
【０１９７】
ヒトＰＢＭＣ、またはＴ細胞またはＮＫ細胞を含むその画分を、ＣＡＲ／ＴＣＲと単一可変ドメインを同時発現する免疫細胞が作出されるように上記の組換えレンチウイルスベクターにより形質導入する。トランスフェクションまたは形質導入法は当業者に周知である。
【０１９８】
実施例５：機能アッセイ
ＣＡＲ／ＴＣＲおよび抗ＴＧＦβＲＩＩ単一可変ドメインで改変された免疫細胞が抗原認識後の細胞増殖、サイトカイン生産および細胞傷害性を含むエフェクター機能に対するＴＧＦβの阻害効果に耐性があることを証明するためにアッセイを使用することができる。これらの実験は当技術分野で公知のアッセイを用い、培養培地への組換えＴＧＦβの補給および／またはＴＧＦβを生産することが知られるかまたはＴＧＦβ発現プラスミドでトランスフェクトされた腫瘍細胞株の使用を含む。
【０１９９】
マウス異種移植モデルなどの当技術分野で公知のｉｎ  ｖｉｖｏプロトコールを用いれば、抗ＴＧＦβＲＩＩ単一可変ドメインも発現するように改変されたＣＡＲ／ＴＣＲトランスジェニック免疫細胞が腫瘍増殖の制御および生存の延長にＣＡＲ／ＴＣＲ改変細胞単独よりも優れていることを証明することができる。これはこのようなモデルの結果を腹腔内（ＩＰ）注射または静脈内（ＩＶ）注射による一定範囲の用量の組換え抗ＴＧＦβＲＩＩ単一可変ドメイン単独を投与した結果と比較することによって達成することができる。これらのモデルでは、ＴＧＦβを生産することが知られているかまたはそのように操作された腫瘍を使用する。
【０２００】
配列対応表
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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