(57)【要約】  本発明は、暗条件で固定炭素源としての有機酸を含む培養培地中で目的の生成物を生成する微細藻類細胞を培養することにより、目的の生成物を合成するための方法であって、微細藻類細胞は通性従属栄養生物である、方法に関する。目的の生成物は、微細藻類バイオマス、色素、テルペン、組換え分子、バイオガス、またはその前駆体でありうる。ある実施形態では、培養培地は、窒素の主要供給源として尿素を含む。一実施形態では、微細藻類細胞は、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）に属する。目的の生成物の合成に好適である好ましい特徴を有する微細藻類細胞を同定し、単離する方法であって、蛍光活性化細胞分取技術および／または走光性反応を使用して、微細藻類培養物から非突然変異誘発または組換え微細藻類細胞を同定し、単離することを含む、方法も提供される。
2019527052.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の生成物を合成するための方法であって、
固定炭素源としての有機酸を含む培養培地を提供するステップと；
前記目的の生成物を生成する微細藻類細胞を提供するステップであって、前記微細藻類細胞が通性従属栄養生物である、ステップと；
前記微細藻類細胞を前記培養培地中、暗条件で培養して、前記微細藻類細胞から微細藻類培養物を生成するステップと；
前記微細藻類培養物中の前記微細藻類細胞が細胞分化を受ける前に、前記微細藻類培養物から前記細胞を単離するステップと；
前記微細藻類細胞から前記目的の生成物を精製するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記微細藻類細胞が、偏性従属栄養生物にされた通性従属栄養生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記目的の生成物が、前記微細藻類細胞を含む微細藻類バイオマスである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記目的の生成物が、色素、テルペン、組換え分子、バイオガス、またはその前駆体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記色素が、カロテノイド、イソプレノイド、またはその前駆体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記色素またはその前駆体が、アスタキサンチン、ルテイン、リコペン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、カロテン、フィトフルエン、フィトエン、またはその任意の組合せである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記テルペンまたはその前駆体が、ピネン、リモネン、またはゲラニルゲラニルピロリン酸またはその任意の組合せである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記組換え分子が、ｄｓＲＮＡまたは異種タンパク質である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記微細藻類培養物が、少なくとも時間あたり０．０６３ｍｇ／Ｌの比生産性率、ｑｐで前記色素を生成する、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記培養のステップが、１週間未満の間、行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記目的の生成物の従属栄養成長および合成が、前記培養のステップの間に起こり、前記培養のステップが、フェドバッチ発酵下で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記目的の生成物の合成が、栄養豊富または枯渇条件下で起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記有機酸が、酢酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、プロピオン酸、ピルビン酸、コハク酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、ウロン酸、クロロゲン酸、またはリグノセルロース酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記培養培地が、窒素の主要供給源として尿素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記微細藻類細胞の乾燥、粉砕、溶解、または抽出のうちの１つまたは複数のステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記微細藻類細胞が、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記微細藻類細胞が、ヘマトコッカス属の種（Haematococcus spp.）、クラミドモナス属の種（Chlamydomonas spp.）、クロロモナス属の種（Chloromonas spp.）、ドナリエラ属の種（Dunaliella spp.）、または、クラミドカプサ属の種（Chlamydocapsa spp.）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記微細藻類細胞が、優先的に有機酸および尿素を代謝する微細藻類細胞型で置き換えられる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記微細藻類細胞が、第２の細胞と共培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の細胞が、その成長を支援するために、前記微細藻類細胞の成長を支援する有機酸と比べて異なる固定炭素源を使用する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の細胞が、窒素源としてアンモニウムを消費する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第２の細胞型が、セネデスムス属の種（Scenedesmus spp.）、クロレラ属の種（Chlorella spp.）、モノラフィディウム属の種（Monoraphidium spp.）、ロドトルラ属の種（Rhodotorula spp.）、珪藻植物、スラウストキトリッド（thraustochytrid）またはスラウストキトリッド（thraustochytrid）様微生物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記微細藻類細胞が、ヘマトコッカス種の属（Haematococcus spp.）に属し、前記第２の細胞がクラミドモナス種の属（Chlamydomonas spp.）に属する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
クラミドモナス目（Chlamydomonadales）由来の通性従属栄養微細藻類細胞であって、前記細胞が、炭素の主要供給源として有機酸のみを含有する培地中、暗条件で成長し、細胞分化が起こる前に、生成物を生成し；前記細胞が、ピネン、リモネン、アスタキサンチン、フィトエン、リコペン、ゲラニルゲラニルピロリン酸、バイオ水素、またはタウマチンを生成するための１つまたは複数のＲＮＡまたはタンパク質に関する核酸を発現する組換え細胞であるか；または前記細胞が、ｄｓＲＮＡ分子を発現する組換え細胞である、通性従属栄養微細藻類細胞。
【請求項２５】
クラミドモナス目（Chlamydomonadales）由来の通性従属栄養微細藻類細胞であって、前記細胞が、炭素の主要供給源として有機酸のみを含有する培地中、暗条件で成長し、細胞分化が起こる前に、生成物を生成し；前記細胞が、イソプレノイドの改変された産生を伴う突然変異体細胞であるか、または鞭毛性突然変異体である、通性従属栄養微細藻類細胞。
【請求項２６】
前記細胞が、もとの菌株に対して改変されたイソプレノイドまたは葉緑素生成を有する、請求項２４または２５に記載の通性従属栄養微細藻類細胞。
【請求項２７】
前記細胞が、蛍光活性化細胞分取を使用して、カロテノイドの改変された生成を直接的に選択する、請求項２４または２５に記載の通性従属栄養微細藻類細胞。
【請求項２８】
前記細胞が、蛍光活性化細胞分取を使用する、カロテノイドでないテルペンの改変された生成を間接的に選択する、請求項２４または２５に記載の通性従属栄養微細藻類細胞。
【請求項２９】
目的の生成物の合成に好適な微細藻類細胞を同定し、単離する方法であって：
ａ．少なくとも部分的な従属栄養条件下で微細藻類菌株を培養して、微細藻類細胞を生成するステップと；
ｂ．従属栄養条件下で成長させた場合、そこから前記微細藻類細胞が生成される前記微細藻類菌株に比べて好ましい特徴を有する非突然変異誘発微細藻類細胞を同定するステップであって、前記同定するステップが、蛍光活性化細胞分取技術および／または走光性反応を使用して実行される、ステップと；
ｃ．前記好ましい特徴を有する前記非突然変異誘発微細藻類細胞を単離するステップと
を含む、方法。
【請求項３０】
前記培養のステップが、少なくとも前記培養ステップの一部については、混合栄養条件下で実行される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記好ましい特徴が、目的の生成物の前記微細藻類細胞による合成の増加である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記好ましい特徴が、前記微細藻類細胞における鞭毛の欠如である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記非突然変異微細藻類細胞が、蛍光活性化細胞分取を使用して、カロテノイドでないテルペンの改変された生成を間接的に選択するか、またはカロテンの改変された生成を直接的に選択する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
乾燥重量０．７％超のカロテノイド、乾燥重量４０％超のタンパク質、乾燥重量１０％未満の灰分、および２種以上のカロテノイドの混合物を含む組成を有する、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）の従属栄養微細藻類バイオマスから得られた、着色剤、飼料添加物、ヒトの栄養素サプリメント、またはパーソナルケアもしくは化粧品成分。
【請求項３５】
カロテノイド含有ライセートまたは抽出物である、請求項３４に記載の着色剤、飼料添加物、ヒトの栄養素サプリメント、またはパーソナルケアもしくは化粧品成分。
【請求項３６】
微細藻類脂肪酸をさらに含有する、請求項３４に記載の着色剤、飼料添加物、ヒトの栄養素サプリメント、またはパーソナルケアもしくは化粧品成分。
【請求項３７】
前記栄養豊富または枯渇条件が、硫酸塩、リン酸塩または尿素枯渇、または２．５ｍＭを超えるアンモニウム蓄積のうちの１つまたは複数を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項３８】
前記栄養豊富または枯渇条件が、２．６ｇ／Ｌを超える浸透圧調節物質、４５ｍＭのＮａＣｌ、３ｇ／Ｌを超える乳酸、成長温度をセ氏２度超える温度増加、またはその任意の組合せから選択される１つまたは複数の外因性因子と組み合わされる、請求項１２に記載の方法。
【請求項３９】
前記微細藻類培養物が、１００ｒｐｍ以上の混合下で成長する、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
サケ科魚類飼料中で使用される、請求項３および３４に記載の微細藻類バイオマス。
【請求項４１】
幼虫駆除剤として使用される、請求項３に記載の微細藻類バイオマス。
【請求項４２】
香味料または香りの改変剤として使用される、請求項３に記載の微細藻類バイオマス。
【請求項４３】
そのプロフィールが、微細藻類培養条件により変化する、請求項３４に記載の着色剤、飼料添加物、ヒトの栄養素サプリメント、またはパーソナルケアもしくは化粧品成分。
【請求項４４】
その中で１種のカロテノイドが総カロテノイドの５０％超を構成する、請求項３４に記載の着色剤、飼料添加物、ヒトの栄養素サプリメント、またはパーソナルケアもしくは化粧品成分。
【請求項４５】
その中で１種のカロテノイドが総カロテノイドの８５％超を構成する、請求項３４に記載の着色剤、飼料添加物、ヒトの栄養素サプリメント、またはパーソナルケアもしくは化粧品成分。
【請求項４６】
１種のカロテノイドが、総カロテノイドの９８％超を構成する、請求項３４に記載の着色剤、飼料添加物、ヒトの栄養素サプリメント、またはパーソナルケアもしくは化粧品成分。
【請求項４７】
前記カロテノイドがアスタキサンチンである、請求項４４、４５および４６に記載の１種のカロテノイド。
【請求項４８】
前記ｄｓＲＮＡが、少なくとも時間あたり０．０４ｍｇ／Ｌの比生産性率、ｑｐで生成される、請求項８に記載の方法。
【請求項４９】
前記異種タンパク質が、少なくとも時間あたり０．０８ｍｇ／Ｌの比生産性率、ｑｐで生成される、請求項８に記載の方法。
【請求項５０】
シードトレインにおいて使用される、請求項３に記載の微細藻類バイオマス。
【請求項５１】
前記微細藻類培養物が、少なくとも０．２４／日の比成長速度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
前記微細藻類培養物が、少なくとも０．７７／日の比成長速度を有する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記微細藻類培養物が、少なくとも１．０／日の比成長速度を有する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記比成長速度が、９６時間以上の期間にわたる、請求項５１、５２および５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ｑｐが、少なくとも時間あたり１ｍｇ／Ｌである、請求項９に記載の方法。
【請求項５６】
前記ｑｐが、少なくとも時間あたり３．７５ｍｇ／Ｌである、請求項９に記載の方法。
【請求項５７】
前記培養のステップが、約４日〜約１週間の間、行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項５８】
前記比成長速度を有する微細藻類培養が、光の非存在下での細胞分化により、９６時間以上の期間にわたって進行する、請求項１および５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物からバイオマスおよびバイオ製品を生成するための改善された発酵方法に関する。一実施形態では、本発明は、光誘導および細胞分化を必要とせずに、例えば、より高い細胞密度まで延長された加速成長、および有用な化合物の生成のために、通性従属栄養微生物を従属栄養的に培養することを採用する発酵方法に関する。本発明の微生物は、本明細書に記載の本発明の方法または他の態様における使用のために選択され、突然変異させられ、または遺伝子操作されうる。
【背景技術】
【０００２】
環境を保護する一方、その長期の健康に影響を及ぼす手ごろな価格の天然で安全かつ有効な製品に対する世界的な消費者の要求が増している。微生物中で発現された組換え分子は、市場で現在使用されている持続不可能なまたは問題のある製品または成分の代用になりうる。イソプレノイド類は、そのような製品中の成分を含む化合物の別の大きなクラスを構成する。組換え技術およびイソプレノイド経路は、非限定的な例を挙げると、色素、テルペン、ゴム、ビタミン、芳香剤、香味料、溶媒、ステロイド／ステロール、ホルモン／成長調節因子、飼料添加物、栄養化合物、滑沢剤添加物およびさらに殺虫剤のような多数の商業的に有用な標的化合物を生み出す。次にこれらは、食品および飲料、香水、飼料、化粧品、ならびに化学薬品、栄養補給食品（neutraceuticals）、医薬品および他の工業応用のための製品において使用される。
【０００３】
そのようなイソプレノイドの１つは、抗酸化剤、抗炎症剤および着色剤として使用されるカロテノイド類と呼ばれる天然の色素性化合物のクラスである。ヒトは、その抗酸化剤の主要供給源としてカロテノイド類に依存している。橙赤色の色素であるアスタキサンチン（３，３’−ジヒドロキシ−ｂ，ｂ’−カロテン−４，４’−ジオン）は、多数の治療適用のある最も効能のある既存のカロテノイドであると考えられる。アスタキサンチンの適用に関する世界市場は、２０１４年における２８０メートルトンから２０２０年までに６７０メートルトンを超える。自然のアスタキサンチンの不十分な入手可能性と高価格は、市販のアスタキサンチンの約９７％が合成である（Ｅ１６１Ｊと称される）という結果をもたらす。化学合成されたアスタキサンチンは、エステル化されておらず、よって酸化に対して極めて感受性であるが、自然に微細藻類中に見出されるそのエステル化形態は、安定であってより高いバイオアベイラビリティと効能を示す。合成アスタキサンチンは、魚類および動物の飼料に広く使用されており、ヒトの栄養サプリメント、医療適用、化粧品およびスキンケアにある程度使用されている。これは、ピンク色の肉を発色させたり、養殖されたサケ科魚類（サケおよびマス）、マダイに加えて他の動物の成長を促進したりするために、飼料添加物として使用されている。これは、自然の藻類アスタキサンチンの約３分の１から６分の１の値段である。しかしながら、食品を着色するために石油由来の合成化学薬品を使用する慣行に異議が唱えられている。この理由により、米国食品医薬品局は、小売業者に養殖サケおよびマスに「色付けされている」と標識することを要求している。
【０００４】
合成色素使用の代用として、よりいっそう低価格の天然の同等物が必要とされる。赤色酵母（キサントフィロマイセス・デンドロラウス（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ））は、真核微生物様の微細藻類であるが、その好気性発酵により、微細藻類や野生のサケで見出される優勢で好ましい形態とは同一でなくそれらより劣る化学的形態の３Ｒ、３’Ｒ異性体として、エステル化されていない遊離のアスタキサンチンがもたらされる。後者に関しては、通常総アスタキサンチンの９５％超が、３Ｓ、３’Ｓ異性体としてのモノエステルおよびジエステルの形態である。赤色酵母アスタキサンチンの販売価格は、微細藻類アスタキサンチンのそれよりもずっと低いが、化学合成されたものよりもなお高い。不利なことに、赤色酵母は速い成長速度を有する一方、比較的低い色素含有量を有することから、低収率にもかかわらず持続不可能な高い生産コストをもたらす。
【０００５】
近年、赤色酵母由来のアスタキサンチンについての発酵生産目標は、すべてが１２０時間のサイクル時間内にある、以下のようなある特定の基準：時間あたり２ｍｇ／Ｌのカロテノイド類の生産性；６０ｇ／Ｌの収穫密度；および４ｍｇ／ｇ（０．４％）乾燥重量のアスタキサンチン収率を満たす場合に、合成アスタキサンチンとコスト競争力があるようにモデル化された。このフレームワークを１つの例として使用して、微細藻類のような他の微生物由来のアスタキサンチンのファーメンターベースの従属栄養生産のための競合的基準を設定するために、生産性基準が相対的に調整される場合もあり、さらに、価値の異なるカロテノイド前駆体および関連するイソプレノイド分子の生産のためにさらに調整される場合もある。経済および持続可能性の計算も、赤色酵母のために使用されるグルコースよりもむしろ有機酸の使用における要素として考慮に入れる場合もある。
【０００６】
これまで微細藻類由来のアスタキサンチンのすべての工業生産が、レースウェイ型培養槽／池および光バイオリアクター中での液内培養において、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）のヘマトコッカス（Haematococcus）由来の唯一の種類の微細藻類を培養する方法により、屋外または屋内で、太陽光の下または人工照明の下のいずれかで実行される光合成を採用することが問題である。最も一般的な工業用の種は、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）である。この藻類は、カロテノイド類の最も豊富な供給源であり、通常、アスタキサンチンをその乾燥重量の３％まで、または５％までもシストとして産生する（LorenzおよびCysewski、2000年；米国特許第６０２２７０１号）。アセチルＣｏＡに起源を有し、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）およびフィトエンを介して色素性前駆体および最終的にアスタキサンチンとなる、ベータカロテン、カンタキサンチンおよびルテインのような他のカロテノイド類も存在する。これらは一緒になって、合成アスタキサンチン中には提供されない有用で健康に良い分子カクテルを提供する。
【０００７】
別の問題は、ヘマトコッカス（Haematococcus）由来のアスタキサンチンの現在の生成が、供給を制限する難題をはらんでいることである。天然の色素の不足は、価格上昇を推し進める。結果として、合成アスタキサンチンは、高容量の水産養殖および動物飼料セクターにおける着色剤としての使用に追いやられ、一方で微細藻類アスタキサンチンが、食物サプリメントおよび化粧品のようなヒトへの適用のための主要供給源になる。不利なことに、天然の藻類アスタキサンチンが合成品と価格で対抗したとしても、約３００トンの色素に合う飼料体積は、今日光合成により生産されるものの１０倍を超える１０，０００トンの藻類バイオマス（３％の色素含有量と推定して）が抽出のために生産されることを必要とする。
【０００８】
アスタキサンチン生成の難題のうちの１つは、緑色栄養マクロ独立細胞（ｇｒｅｅｎ  ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  ｍａｃｒｏｚｏｏｉｄｓ）から赤色不動胞子（ヘマトシスト（ｈａｅｍａｔｏｃｙｓｔｓ））への細胞分化を必要とする、ヘマトコッカス（Haematococcus）の複雑な生活環に関係する。約１０ｐｇ／細胞の栄養段階における基礎的アスタキサンチン含有量は、シスト形成プロセスの間、約３０ｐｇ／細胞を有する茶色から赤色の無鞭毛性で非運動性の未成熟シスト、次いで約６１３ｐｇ／細胞を有する成熟シストの形成とともに増加する。このプロセスは、シスト形成の誘導およびアスタキサンチンの蓄積に長期間を必要とし、これだけで、赤色酵母酵母のためのものを含む液内培養のバッチおよびフェドバッチ工業発酵に使用される合計サイクル時間、典型的に７〜１０日間（１６８〜２４０時間）を超える。
【０００９】
国際公開第２００３０２７２６７号パンフレットは、２つの段階：段階１、その間に、細胞が光合成独立栄養成長をすることができる緑色運動性二鞭毛性段階；および段階２、その間に、好ましくない条件下でこれらの細胞がその運動性を喪失することにより、大量のアスタキサンチンおよび他のカロテノイド類の合成を伴ってシストを形成するシスト形成段階、を介して、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）を培養することにより、アスタキサンチン富化バイオマスを生産するための光依存性プロセスを教示している。好ましくない条件は、強烈な光、栄養素の枯渇、または温度、ｐＨもしくは塩分濃度の変化うちの１つまたは複数であり、これらは、生物に防御反応としてシストを形成させる。国際公開第２００３０２７２６７号パンフレットに記載のプロセスは開放の池の系を使用し、米国特許第６，０２２，７０１号および同第５，８８２，８４９号は、多様な構成の光バイオリアクターおよび光バイオリアクターと池の組合せの使用によって可能になる類似した光依存性の２段階プロセスを教示している。米国特許第６，０２２，７０１号は、光の下での栄養成長のための栄養豊富な培地の使用、そして、その後に続く無機炭素（二酸化炭素）の存在下、光の下でのアスタキサンチンの蓄積を誘導するための栄養枯渇培地の使用をさらに教示している。
【００１０】
そのようなプロセスは、バイオマスを成長させるために光合成のための光に依存することにより、およびそこからアスタキサンチンに富むバイオマスを収穫する前に緑色運動性細胞を赤色のシストに変換するために、２段階プロセスの培養に依存することにより、不利となる。一般に光は太陽光により供給され、よって天気、季節性または成長度合いが荒れ模様の日々、光を減少させる公害、および地理的位置は、変りやすい生産性および減少した生産性も助長する。原生動物による捕食によるバイオマスの崩壊または喪失もさらに減少した生産性をもたらす。屋内のレースウェイ型培養槽または光バイオリアクターの場合、太陽光は人工照明に置換されうるが、光への曝露のための十分な表面積および適切な培養ハンドリングをなお必要とし、アスタキサンチン生成のための緑色および赤色相をなお必要とする。２段階培養法は、複雑な培養操作を含み、シスト形成段階だけでも収穫まで多くの日数、通常７〜１０日間を必要とし、よって、完全な生産および収穫周期の完了のために、バイオマス成長相を超えてかなりの時間が加わる。これらのシストは、厚く固い細胞壁のために消化不可能であり、抽出、生成物調合またはバイオアベイラビリティのための色素にアクセスするためにはこじ開けるかまたは細かく砕かなければならない。
【００１１】
２段階生産方法の例は、ヘマトコッカス（Haematococcus）に独特のものではない。例えば、米国特許第８，２０６，７２１号に記載の関連する分類群、クラミドモナス（Chlamydomonas）、クロロモナス（Chloromonas）、およびクラミドカプサ（Chlamydocapsa）からのもののような多様な種類の藻類の培養は、第１に光の下でバイオマスを生み出し、続いてシストまたは胞子に分化した細胞の第２のまたは赤色段階において行われる収穫のために、２段階の培養プロセスを進める。
【００１２】
有利なことに、数種の微細藻類が、光合成の間に炭素成長源として使用される二酸化炭素がそれによって栄養培地に溶解した他の何らかの炭素源に置き換えられる、暗条件での培養のための通性従属栄養生物であることが示されている。従属栄養藻類の好気性発酵は、一般に工業発酵施設における他の微生物について見られる類似した発酵タンクおよび操作を使用して実施される。一般に、発酵プロセスの使用は、はるかに高い生産性、他の土地使用と競合しないように低減された土地占有面積、混入物の管理、組換え生物の抑制の管理、大量生産をかなえるためのより少ない水使用、および任意の気候における通年生産により、光合成（光栄養）生産よりも顕著に有利であることができる。実際に、発酵は、藻類生産の最も経済的かつスケーラブルな方法と考えられる。
【００１３】
それにもかかわらず、数種の微細藻類は小さな実験室規模では従属栄養性を示しうるが、大多数が経済的製造に移行するためには開発を必要とするように、従属栄養的に藻類を生産する方法は日常的なものではない。緑色藻類の間では、クロレラ属（Chlorellales）のいくつかの種が暗条件での発酵を採用する工業規模の製造にうまく移行している。これらは、暗条件での従属栄養培養においてヘキソースおよびペントースをその固定炭素源として使用して培養される。一例は、クロレラである。ある時点で主要固定炭素源を提供する培地中の糖に加えて供給される場合、有機酸は、色素の形成を誘導するために役立つであろう。例えば、クロレラ・ゾフィンギエンシス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）においては、１０ｍＭを超える濃度のピルビン酸、クエン酸およびリンゴ酸のグルコースベースの培養培地への添加は、アスタキサンチンおよび他の二次カロテノイド類の生合成を刺激した。対照的に、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）のメンバーは、一般に、その主要固定炭素源としてヘキソースおよびペントースを利用できず、発酵単独による工業規模の製造はいまだ達成されていない。
【００１４】
上記クロレラとは異なり、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）は、栄養成長相を速やかに短縮することができ、シスト形成が後から起こって工業製造を妨害するような、環境および物理的条件に対して感受性である。この群の微細藻類の従属栄養培養に対する多くのさらなる障害がある。
【００１５】
米国特許出願公開第２００８００３８７７４号は、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）のための暗条件での従属栄養条件下の２段階培養を教示する。栄養成長は、酢酸ナトリウムおよび大豆粉末またはペプトンを補充した培地中、１００ｍＬ培養のフラスコ中の静置（撹拌なし）培養において、５または６日間、１６または２０℃の培養温度で成長させ、そして、８０ｐｇ／細胞に到達するまで、さらに８日間、高い塩分濃度および３０℃の高い培養温度で導入された高い酢酸ナトリウムを用いて誘導されたアスタキサンチン生成を伴うシスト形成期間が続く。不利なことに、アスタキサンチン生成のためのプロセスは、光栄養池または光バイオリアクターに類似して、アスタキサンチン蓄積相が非常に長く、光誘導されたシストに通常見られるアスタキサンチン含有量のごくわずかな一部を達成したのみであった、２つの形態学的段階を含む細胞分化を必要とする。不利なことに、このプロセスは、ファーメンターに合わせて調整されない撹拌なしプロセスである。
【００１６】
米国特許出願公開第２０１５０２５２３９１号は、ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）のための２段階培養であって、酢酸ナトリウムおよび硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、硝酸カリウム、および任意選択による植物成長調節因子を補充した培地における暗条件での従属栄養条件を使用し、最初の１２８または１６８時間までも（５〜７日間）の間の無視できるバイオマス成長を伴う、栄養細胞成長である第１の段階；それに続く、５〜７日間のシスト形成期間中の栄養枯渇を伴う、希釈した培養の照明による光誘導を使用する、シストの誘発およびアスタキサンチン蓄積を教示している。不利なことに、アスタキサンチン生成のためのこのプロセスは、２つの形態学的段階のために細胞分化を必要とし；相の組合せは非常に長く、２．２５％のアスタキサンチン含有量を有するバイオマスを生産するために４００時間（１６．７日間）プラス少なくとも７２時間（３日間）を必要とする。不利なことに、このプロセスは、培養が成長容器から微細藻類細胞の光誘導のための光誘導デバイスへ移されなければならないような、光を必要とするものである。さらに不利なことに、長いサイクル時間は、５〜７日間の遅滞期を含む。
【００１７】
同様に、光と暗条件段階の数種の組合せが、米国特許出願公開第２０１５０２３２８０２号に、暗条件における場合に色素蓄積のためにシスト形成をもたらす窒素制限または栄養枯渇条件とともに教示されている。不利なことに、このプロセスは、その相のうちの１つにおける光合成または光の使用に依存する、２つの栄養相（明および暗）の使用；シスト形成への依存；酢酸ナトリウムにおける持続的成長の阻害；栄養相のためならびに栄養成長相とシスト形成相の分離のための、別個の物理的装置または施設の使用ならびにシスト形成のためのＮ制限の使用によるさらなる成長の制限を必要とする。
【００１８】
ヘマトコッカス（Haematococcus）の従属栄養培養に対する他の障害は、非常に長い遅滞期を有する０．２１／日〜０．２４／日の低い比成長速度である。さらに、従属栄養性バイオマスの赤色化は、暗条件での細胞成長、そしてそれに続く暗条件での高い塩ストレスによるシスト形成およびカロテン生成；または１．８５％のアスタキサンチン含有量を産生する、２２〜２５℃から２８〜３０℃まで上昇した温度における８日間の光誘導後のシスト形成およびカロテン生成からなる２段階プロセスにおける細胞分化を必要とする。さらなる障害は、従属栄養発酵においてより密度の高い培養を支援するために当分野で公知であるような高い混合速度および酸素負荷速度に対する必要性である。クラミドモナス目（Chlamydomonadales）のメンバーにとって、鞭毛喪失および細胞破壊をもたらす流体せん断に対する高い感受性は、非フラスコバイオリアクター、すなわち、ファーメンターを使用して、高い細胞濃度を達成するには問題がある。欧州特許第２８７８６７６号（米国特許出願公開第２０１５０２５２３９１号）に記載のとおり、バイオマス蓄積のための従属栄養条件における非常に低い撹拌速度は、４０ｒｐｍと報告され、従属栄養段階が終わり、光誘導が起こり、細胞がよりこわれにくいシストに分化した後でのみ１００ｒｐｍまたは２００ｒｐｍ未満に到達した。不利なことに、低いバイオマス成長は、これを工業応用には実現困難なものとする。
【００１９】
酢酸ナトリウムにおける持続的成長の阻害は、固定炭素としての酢酸ナトリウムにより従属栄養的に培養された場合、様々なクラミドモナス目（Chlamydomonadales）、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）にとっても問題であった。１．７／日の適度に高い比成長速度が観察されたにもかかわらず、希釈培養および４０時間後の完全に近い成長阻害は、１週間の商業的発酵サイクルかつ望ましく、より高い培養密度で大量のバイオマスおよびバイオ製品を蓄積することへの大きな障害である。この作業は、低い開始および最終密度（それぞれ、０．０５ｇ／Ｌおよび１ｇ／Ｌ）で行われ、希釈液としての新たな培地の培養への添加を必要とした。より高い商業的に妥当な細胞密度においては、当分野で公知のとおり、阻害性の塩分濃度レベルおよびより早い栄養成長の停止さえももたらす、大量生成を支援するために十分な炭素を供給するための培養液量あたりの酢酸ナトリウムに対する要求は劇的に増加する。
【００２０】
これらの先の事例において、従属栄養性ヘマトコッカス（Haematococcus）またはクラミドモナス（Chlamydomonas）により代謝される炭素源は、より一般的な従属栄養性微細藻類の固定炭素源のグルコースよりも酢酸ナトリウムである。これは、硝酸塩、一般的には、尿素を含む最近試験された多くの窒素源の中でも、光合成性ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）の最良の成長を提供した、硝酸ナトリウムと組み合わせて供給される。一部の淡水種が培養ブロス中に蓄積された高いナトリウムおよび他の塩レベルにおいて増殖できないことは、実際の大量培養に必要な十分なバイオマス生産を妨害し、ヘマトコッカス（Haematococcus）および他のクラミドモナス目（Chlamydomonadales）の場合には、上記したように細胞増殖の停止によりシスト形成を誘発し、結果として生じるバイオマスを低下させるであろう。不利なことに、塩を低減させるための硝酸ナトリウムの適切なレベルの中断は、栄養が枯渇したブロスによる胞子形成を誘発するであろう。
【００２１】
栄養制限、特に窒素枯渇は、緑藻植物の緑色栄養成長細胞中に存在するベースラインを超えて色素蓄積を誘導するための一般的かつ有効な手段である。米国特許出願公開第２０１２０２６４１９５号は、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）のための窒素枯渇の使用に対する１つの大きな障害は、栄養成長が停止し、過酷な環境条件からそれを保護するためのその固い外壁を有する不動胞子および接合胞子のような胞子およびシストが形成するであろうということを教示している。不利なことに、窒素枯渇を介した成長の未熟な停止は、ある特定の望ましい最小生産サイクル時間を有する培養系の生産性を制限する。
【００２２】
まとめると、長い遅滞期、遅い成長速度、栄養成長を防ぎ、未熟なシスト形成を誘発する因子に対する感受性、アスタキサンチン蓄積のための長いシスト形成期間、およびシストの形成自体という障害が、栄養従属性を使用する典型的な工業生産サイクルにおける用途のための赤色酵母（Phaffia）に比べて高いアスタキサンチン含有量を有するヘマトコッカス（Haematococcus）細胞のいかなる利益も効果的に無効にする。これらの障害を悪化させることは、従属栄養生産方法が、光の非存在下で光栄養生産または光誘導により可能なものに比べて従属栄養性バイオマスにおけるアスタキサンチンの低い収率をもたらすということである。さらに、これらの問題を悪化させることは、当分野で公知のように、シストは、運動性のままである非剛体細胞に比べて抽出または食餌の一部として消化することがより困難になるということである。
【００２３】
理論的には、商業的な立場からは、従属栄養大量培養において使用される微生物の細胞型は、最適化条件下での単位時間および培養液量あたりの最大の比成長速度および最高のまたは好ましい組成含量を有するはずである。ヘマトコッカス（Haematococcus）およびクラミドモナス（Chlamydomonas）を含むクラミドモナス目（Chlamydomonadales）微細藻類のいずれの細胞または細胞株の改善も十分なバイオマスおよび１２０時間以内の生産サイクルのようなコンパクトな発酵サイクルに適した最短時間にわたる従属栄養生産のためになる標的化合物の蓄積のために行われていない。従属栄養生産のために選択された細胞株は、経済的に生産性を増加させ、コストを低下させるための利点を有するであろう。特に、改変されたレベルの標的化合物による細胞株の改善は、天気、気候、季節および地理に依存しない効率的な工業的従属栄養発酵を最適化するために望ましい。価値のある標的化合物は、テルペン、カロテノイドおよびそのイソプレノイド前駆体ならびに前駆体の誘導体を含むが、これらに限定されない。
【００２４】
突然変異誘発および寒天プレート上の個々のコロニーの選択を含む、細胞株の改善のための伝統的方法は、当分野で周知である。欧州特許第１９９５３２５号は、カロテノイド生合成阻害剤、ノルフルラゾン、ジフェニルアミンおよびニコチン、またはその混合物と突然変異誘発された緑藻綱の光独立栄養性藻類の使用を記載している。米国特許第８，４０４，４６８号は、ノルフルラゾンおよびヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）の使用を記載し、米国特許第８，９１１，９６６号は、Ｈ．プルビアリスとニコチン選択の使用を記載している。突然変異誘発された個体群を使用することは不利であり、なぜなら、突然変異誘発は無作為であり、他の意図されないまたは有害な結果を、色素蓄積以外の側面において生物に有しうるからである。そのような他の側面は、成長速度、無性生殖、および温度感受性を含むが、これらに限定されない。
【００２５】
互換的に使用される別の方法、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）または蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）は、カロテン生成酵母、赤色酵母（Phaffia）、葉緑素を有さない生物とともにアスタキサンチン過剰産生突然変異体の細胞株選択に有用であることが示されたが、葉緑素からの妨害自己蛍光によりヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）への適用はうまくいかなかった。
【００２６】
なお他の細胞株改善方法は、遺伝子工学を採用する。これは、組換えクラミドモナス（Chlamydomonas）、ヘマトコッカス（Haematococcus）およびドナリエラ（Dunaliella）を含む多くの例により、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）に関する方法に適している。
【００２７】
これは、例えば、炭素トランスポーターの導入により形質転換された組換え細胞の培養を含みうる。ヘキソースＨＵＰ１トランスポーターのコナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）菌株Ｓｔｍ６Ｇｌｃ４への挿入は、外因性グルコース供給を促進されたバイオ水素生産プロセスに効果的につなげた。この菌株はなお、暗条件で制限された従属栄養細胞成長を示し、グルコースがコナミドリムシ（C. reinhardtii）において炭素源として酢酸塩の代わりに用いることができないことを示している。
【００２８】
この表現型と本発明により提供される有機酸における従属栄養成長のための改善された方法との組合せは、改善された比生産性のために強力でありうる。
【発明の概要】
【００２９】
目的の生成物を合成するための方法が提供される。この方法は：
固定炭素源としての有機酸を含む培養培地を提供するステップと；
目的の生成物を生成する微細藻類細胞を提供するステップであって、微細藻類細胞が通性従属栄養生物である、ステップと；
微細藻類細胞を培養培地中、暗条件で培養して、微細藻類細胞から微細藻類培養物を生成するステップと；
微細藻類培養物中の微細藻類細胞が細胞分化を受ける前に、微細藻類培養物から細胞を単離するステップと；
微細藻類培養物から目的の生成物を精製するステップと
を含む。
【００３０】
目的の生成物は、微細藻類バイオマス、色素、テルペン、組換え分子、バイオガス、またはその前駆体であることができるが、これらに限定されない。
【００３１】
本明細書に記載の従属栄養条件において通性従属栄養生物を培養する方法は、バイオマスの活発な成長およびより高い速度での目的の生成物の合成の両方を提供する。一実施形態では、微細藻類バイオマスは、細胞分裂により０．２４／日超の比成長速度で蓄積し、培養の最初の９６時間以上にわたって持続される。一実施形態では、目的の生成物は色素であり、時間あたり０．０６３ｍｇ／Ｌ超の比生産性率で生成されうる。
【００３２】
培養のステップは、１週間未満の間、細胞分化を受けている微細藻類細胞を含まずに行われることができる。ある特定の実施形態では、微細藻類細胞は、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）に属し、例えば、微細藻類細胞は、ヘマトコッカス属の種（Haematococcus spp.）、クラミドモナス属の種（Chlamydomonas spp.）、クロロモナス属の種（Chloromonas spp.）、ドナリエラ属の種（Dunaliella spp.）、または、クラミドカプサ属の種（Chlamydocapsa spp.）であることができるが、これらに限定されない。
【００３３】
一実施形態では、微細藻類細胞は、その成長を支援するために、微細藻類細胞の成長を支援する有機酸と比べて異なる固定炭素源を使用する第２の細胞と共培養される。
【００３４】
別の実施形態では、微細藻類細胞は、その成長を支援するために、同じ有機酸固定炭素源を使用する第２の細胞と共培養される。
【００３５】
さらなる実施形態では、微細藻類細胞は、葉緑素を欠くか、非光合成的であるか、または無鞭毛性である。
【００３６】
さらなる実施形態は、目的の生成物の合成に好適な微細藻類細胞を同定し、単離する方法を提供する。この方法は：
少なくとも部分的な従属栄養条件下で微細藻類菌株を培養して、微細藻類細胞を生成するステップと；
従属栄養条件下で成長させた場合、そこから微細藻類細胞が生成される微細藻類菌株に比べて好ましい特徴を有する非突然変異誘発微細藻類細胞を同定するステップであって、同定するステップが、蛍光活性化細胞分取技術および／または走光性反応を使用して実行される、ステップと；
好ましい特徴を有する非突然変異誘発微細藻類細胞を単離するステップと
を含む。
【００３７】
一実施形態では、培養のステップは、少なくとも培養ステップの一部については、混合栄養条件下で実行される。好ましい特徴は、目的の生成物の微細藻類細胞による合成の増加または微細藻類細胞における鞭毛の欠如を含むが、これらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】微生物による生成物についての改善された従属栄養生産のための方法全体を概説するフローダイアグラム。プロセス中の主要構成要素は、強調されている。固定炭素源（２０）としての有機酸とともに微細藻類細胞（１０）が、暗条件での従属栄養成長のためのファーメンター（３０）中の培養培地に提供され、生成物形成は、光への曝露または第２の容器への移動に依存せずにファーメンター（３０）中で得られ、細胞分化に依存せず、藻類生成物（４０）のアウトプットをもたらす。アウトプットは、所望によりさらに処理されうる。
【図２】左図：選択された微細藻類単離菌のイソプレノイド蓄積曲線。栄養マクロ独立（運動性、二鞭毛性）細胞は、高レベルの色素性イソプレノイド、アスタキサンチンをわずか２、３日で蓄積することができる。ヘマトシストに分化することが可能であれば、これらはより大量の生成物を蓄積しうる。右上図：赤色運動性鞭毛性マクロ独立細胞および従属栄養培養中の蓄積した色素を含む個体群。右下図：光栄養培養中の典型的な赤色不動無鞭毛性ヘマトシスト。細胞分裂の停止による細胞量の増加を説明する、拡大した細胞サイズ。商業的生産者は、シストを得るためには、少なくとも７〜１０日間を超える明条件でのストレスを採用しなければならない。
【図３】総カロテノイド類のうちの各カロテノイドの相対量を示す、カロテン生成誘発３日後の変化する色素プロフィールの例。Ａ：ＳＯ４枯渇。Ｂ：尿素枯渇；カロテノイドプロフィールは、過剰のアンモニウム蓄積とも類似する。Ｃ：４５ｍＭ  ＮａＣｌを添加。
【図４】本発明の方法による、多様な比成長速度について０．２ｇ／Ｌの初期バイオマスを用いた有機酸における栄養成長中の従属栄養性バイオマスの経時的蓄積。Ａ：０．２４／日（菱形線、報告された先行技術の最高値）に比べた、本発明の方法による０．７７／日（四角線、実施例５に記載のステップから）および１．０／日（三角線、実施例６に記載のステップから）の比成長速度。Ｂ：先行技術の成長速度に比べた、本発明の方法を使用する栄養成長による経時的なバイオマス蓄積の倍率の差。比成長速度における小さな変化は、細胞密度に莫大な効果を有する。０．２４／日〜０．７７／日の比成長速度値は、比成長速度の３．２倍の増加を表し；９６時間で、収率は、８．１倍高い細胞密度である。０．２４／日〜１．０／日の比成長速度値は、比成長速度における４．２倍の増加を表し；９６時間で、収率は、２０．７５倍高い細胞密度である。
【図５】高速従属栄養成長に適したコナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）ＫＡＳ１４０２における二本鎖ＲＮＡ発現のために本発明において使用されるプラスミドベクター、Ｋ５８８の例。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本明細書中で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈が明らかに別の意味を有すると示さない限り、複数形も含むことが意図される。さらに、用語「含むこと（including）」、「含む（includes）」、「有すること（having）」、「有する（has）」、「有する（with）」、またはその変化形は、詳細な説明および／または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される範囲において、用語「含むこと（comprising）」と同様に包括的であることが意図される。移行用語／移行句（およびその任意の文法的変化形）「含むこと（comprising）」、「含む（comprises）」、「含む（comprise）」、「から本質的になる」、「から本質的になる」、「からなること」および「からなる」は、互換的に使用可能である。
【００４０】
用語「約」または「およそ」は、当業者により決定される具体値についての許容可能な誤差範囲内であることを意味し、これは、その値がどのようにして測定または決定されるか、すなわち、測定系の限界に一部依存する。具体値が出願および特許請求の範囲に記載される場合、別段の記載のない限り、その具体値についての許容可能な誤差範囲内を意味する用語「約」が推定されるべきである。用語「約」または「およそ」が使用される、成分量を含有する組成物の文脈において、これらの組成物は、その値の周囲の０〜１０％の変動（誤差範囲）（Ｘ±１０％）を有する、記載された量の成分を含有する。
【００４１】
本開示において、範囲は、冗長に範囲内の個々の値を記載しなければならないことを回避するために、簡略表記法で述べられる。範囲内の任意の適切な値が、適宜、範囲の上限値、下限値、または末端として選択されうる。例えば、０．１〜１．０の範囲は、０．１および１．０の末端値だけでなく、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９の中間値、および０．２〜０．５、０．２〜０．８、０．７〜１．０などのような０．１〜１．０内に包含されるすべての中間範囲を表す。本明細書中で範囲が使用される場合、範囲の組合せおよび部分的組合せ（例えば、開示された範囲内の部分範囲）、その中の特定の実施形態は、明示的に含まれることが意図される。
【００４２】
用語「光独立栄養生物」は、光をエネルギー源として使用して、自身の食料を無機物質から合成できる生物を指す。光独立栄養生物の例としては、緑色植物および光合成細菌が挙げられる。
【００４３】
用語「通性」は、特定の生活様式の状態であることが可能であるが、その様式に限定されない生物を指す。例えば、通性嫌気性生物は、酸素が存在する場合、好気呼吸によりＡＴＰを合成することができるが、酸素が存在しなければ、発酵または嫌気呼吸が可能である。
【００４４】
用語「通性従属栄養生物」は、光エネルギーが不十分であるかまたは欠如している場合に、成長および／または維持および／または生存のために有機化合物を利用することもできる光独立栄養生物を指す。この用語は、通性従属栄養生物および光合成を行う能力を喪失するか、または光栄養生物として成長することを不可能とする欠陥を得るか、または栄養転換のためもしくは好ましい炭素原料の利用のためを含めた遺伝子操作により暗条件において成長することができるその子孫も包含する。
【００４５】
炭素源としての酢酸塩の存在下で暗条件において成長することのできる一部の代表的な通性従属栄養生物は、コナミドリムシ（C. reinhardtii）およびＣ．ディソスモス（C. dysosmos）である。クラミドモナス（Chlamydomonas）としては、これらに限定されないが、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（http://www.chalamycollection.org/を参照されたい）の種および菌株ならびにＡｌｇａｅｂａｓｅに列挙されたものが挙げられる。
【００４６】
クラミドモナス・ニヴァーリス（Chlamydomonas nivalis）は、赤色／オレンジ色素性クラミドモナス（Chlamydomonas）およびクロロモナス（Chloromonas）の総称である。用語「クロロモナス（Chloromonas）」は、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）およびクラミドモナス科（Chlamydomonadaceae family）においても関連した分類群を指す。菌株保存機関において利用可能な多様な種は、クロロモナス・ロザエ（Chloromonas rosae）ＵＴＥＸ  ＳＮＯ４、クロロモナス・ブレビスピナ（Chloromonas brevispina）ＵＴＥＸ  Ｂ  ＳＮＯ１０３、およびクロロモナス・ツギレンシス（Chloromonas tughillensis）ＵＴＥＸ  ＳＮＯ９２である。
【００４７】
用語「クラミドカプサ（Chlamydocapsa）」は、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）およびパルメロプシス（Palmellopsidaceae）科においても関連した分類群を指す。菌株保存機関において利用可能な多様な種は、クラミドカプサ種（Chlamydocapsa sp.）ＣＣＣｒｙｏ  １０１−９９、ＩＢＭＴ菌株保存機関；Ｃ．アンプラ（C. ampla）（グロエオシスチス・ギガス（Gloeocystis gigas）として、ＵＴＥＸ  ２９１）；Ｃ．マキシマ（C. maxima）（ＵＴＥＸ  １６６）；およびＣ．ロバータ（C. lobata）（ＣＣＡＰ９／１）である。
【００４８】
用語「ドナリエラ（Dunaliella）」は、認められた多くの保存機関において利用可能なクラミドモナス目（Chlamydomonadales）における、ドナリエラ（Dunaliellaceae）科におけるなお別の関連した分類群（Tranら、2013年）を指す。
【００４９】
用語「純粋培養の」は、生物の単一の種、変種、または菌株のみが存在し、培養がすべての他の生物を含まない培養の状態を指す。
【００５０】
本明細書中で使用されるとき、用語「バイオマス」は、生きているまたは生きていない生物学的材料およびその派生物の集団を指し、天然のおよび加工されたもの、ならびにより広く天然の有機材料を含む集団を含む。よって、「微細藻類バイオマス」および「藻類バイオマス」は、微細藻類細胞の成長および／または繁殖により生成される材料を指す。
【００５１】
「バイオマス生産」または「バイオマス蓄積」は、培養中に存在する生物の細胞の総数または重量の経時的な増加を意味する。バイオマスは、典型的に細胞；細胞内内容物ならびに細胞により分泌されまたは放出されうるような細胞外材料からなり；バイオマスの一部が除去されて残留バイオマスを残すように処理されることもできる。
【００５２】
シストへの細胞分化の前の栄養細胞段階におけるバイオマス蓄積は、シストへの細胞分化後のバイオマス蓄積とは異なる。後者では、細胞個体群の一部またはすべてが分裂を停止し、細胞サイズが増加している。
【００５３】
用語「比成長速度」は、単位時間あたりの集団増加の量的尺度を指す。微細藻類種をまたぐおよび研究をまたぐ比較を容易化するために、その尺度がどの成長相を包含するかが限定されなければならない。
【００５４】
「対数」期または「対数成長」期または「活性成長」とも呼ばれる、細胞分化の前に起こる活性な細胞分裂の間に測定される比成長速度は、「静止」、個々の細胞は分裂を停止するが、集団が拡大し増加することができる「非栄養成長」シスト形成期の間に測定されものとは異なる。
【００５５】
「フェドバッチ発酵」は、１種または複数の栄養素が培養中にバイオリアクターに供給され、生成物が発酵ランの最後までバイオリアクター中に留まる発酵を指す。一部の場合では、揮発性または気体の生成物が一部、フェドバッチ発酵ランの間に除去されうる。
【００５６】
「目的の生成物」は、細胞により合成された物質である。目的の生成物の例としては、これらに限定されないが、タンパク質、脂質、炭化水素、バイオガス、揮発性材料、糖、アミノ酸、イソプレノイド類、テルペン類、またはその前駆体が挙げられる。そのような物質は、生物によってその成長を通じて構成的に合成することができ、培養中の物質の量は、生物の数の増加により単純に増加しうる。或いは、そのような物質の合成は、培養条件または他の環境因子、例えば、窒素飢餓もしくは上昇したアンモニウムレベルに応じて誘導されうる。
【００５７】
培養液量に対するおよびそのもとの量に対する、経時的に蓄積した目的の生成物の量は、比生産性により測定されうる「生成物蓄積」と考えられる。
【００５８】
用語「クラミドモナス目（Chlamydomonadales）」は、以前は団藻類およびドナリエラ目（Dunaliellales）に入れられていた分類群を含み、クラミドモナス（Chlamydomonas）に代表される緑藻類の目を指す（LewisおよびMcCourt、2004年）。クラミドモナス目（Chlamydomonadales）のメンバーは、栄養生殖、静止期および有性生殖について異なる細胞型を有する生活環を有する。
【００５９】
用語「ヘマトコッカス（Haematococcus）」は、一般に淡水に生息するか、またはより最近には、過酷な塩水環境から単離され（Chekanovら、2014年）、Ｈ．プルビアリス（H. pluvialis）およびＨ．ラクストリス（H.lacustris）ならびに公的および私的な菌株保存機関におけるものを含む、ａｌｇａｅｂａｓｅ（ワールドワイドウェブサイト：algaebase.org/を参照されたい）に列挙されたものにより代表される、一群の単細胞微細藻類を指す。ヘマトコッカス（Haematococcus）は、真核生物ドメイン、緑色植物界、緑藻植物門（phylum）または門（division）、緑藻綱、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）、およびヘマトコッカス科（Haematococcaceae family）に分類される微細藻類の属である。
【００６０】
用語「クラミドモナス（Chlamydomonas）」は、真核生物ドメイン、緑色植物界、緑藻植物門、または門、緑藻綱、およびクラミドモナス科（Chlamydomonadaceae family）に分類される微細藻類の属を指す。
【００６１】
用語「細胞分裂に好都合な条件」または「栄養成長に好都合な条件」は、工業生産ランが、約２４時間未満の遅滞時間を含んで約６０〜１６８時間、好ましくは１４４、１２０または９６時間未満で完了するようなペースで細胞が分裂する条件を意味する。
【００６２】
用語「細胞分化」または「細胞の分化」は、無性生殖における様々な形態変化、すなわち、栄養細胞からシスト細胞への転換を指す。遊走子またはマクロ独立細胞とも呼ばれる「栄養」細胞は、二鞭毛性で運動性であり、卵形の、楕円体の、楕円体〜桿体の、または球形に近い壁に包まれた細胞である。（ヘマトコッカス（Haematococcus）では「ヘマトシスト」とも呼ばれる）「シスト」細胞は、球形で不動性であって、鞭毛を欠き、球形で不動性であって、鞭毛を欠き、重い抵抗性のある細胞壁を有する静止細胞である「成熟シスト」または「不動胞子」となる、「未成熟なシスト」でありうる。これらは、細胞内娘細胞またはミクロ独立細胞の放出により、栄養細胞に成長することができる。
【００６３】
用語「共培養」および「共培養する」のようなその変化形は、同じファーメンターまたはバイオリアクター中に２種以上の細胞が存在することを指す。２種以上の細胞は、両方とも微細藻類のような微生物であってもよく、または異なる細胞型とともに培養される微細藻類細胞であってもよい。培養条件は、２種以上の細胞型の成長および／または増殖を促進するもの、あるいは残りものの細胞成長を維持する一方、２種以上の細胞型のうちの１種またはサブセットの成長および／または繁殖を促進するものであってもよい。
【００６４】
用語「培養された」または「培養」または「培養している」は、意図される培養条件の使用により、１種または複数の微生物または微細藻類の成長（細胞サイズ、細胞内容物、および／または細胞活性の増加）および／または繁殖（有糸分裂による細胞数の増加）の意図した育成を指す。
【００６５】
成長と繁殖の両方の組合せは、増殖と呼ばれる場合がある。意図される条件の例としては、これらに限定されないが、定義された培地（ｐＨ、イオン強度、および炭素源のような公知の特徴を有する）、ファーメンターまたはバイオリアクター中の特定の温度、酸素圧および成長が挙げられる。この用語は、自然におけるまたは生物の自然の成長のような、その他の意図した導入もしくはヒトの介入のない微生物の成長を意味しない。
【００６６】
用語「ファーメンター」または「バイオリアクター」または「発酵容器」または「発酵タンク」は、その中で、任意選択により液体懸濁液中で、細胞が培養され（cultivated）または培養される（cultured）、密閉容器または部分的に密閉された容器を意味する。本開示のファーメンターまたはバイオリアクターとしては、培養される細胞が光に曝露されることを許容するかまたは細胞が光に曝露されずに培養されることを可能とする密閉容器または部分的に密閉された容器のような非限定的な実施形態が挙げられる。ファーメンターまたはバイオリアクターである容器の文脈における用語「ポート」は、気体、液体および細胞のような材料の流入または流出を可能とする、容器の開口部を指す。ポートは、通常、ファーメンターまたはバイオリアクターからつながる配管に接続されている。
【００６７】
用語「ファーメンター」は、発酵を引き起こす生物を指す。
【００６８】
用語「固定炭素源」は、生物による炭素および／またはエネルギーの供給源として使用されうる、炭素を含有する化合物を意味する。典型的に、固定炭素源は、周囲温度および圧力において固体または液体形態で存在する。
【００６９】
用語「有機酸」は、酸性の性質を有する有機化合物である１種または複数の分子を指す。最も一般的な有機酸は、カルボン酸である。「カルボン酸」は、藻類の発酵に一般的に使用されるグルコースのような糖炭化水素とは異なるカルボキシル基を含有する。酢酸は、一般に化学的製造に使用される二炭素カルボン酸、ＣＨ３ＣＯＯＨである。対照的に、有機塩、酢酸ナトリウム、ＣＨ３ＣＯＯＮａは、酢酸の三水和ナトリウム塩である。プロピオン酸（プロパン酸）は、化学式ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯＨを有するカルボン酸である。アニオンＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯ−ならびにプロピオン酸の塩およびエステルは、プロピオン酸エステル（またはプロパン酸エステル）として公知である。他のそのような酸としては、これらに限定されないが、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、ピルビン酸およびコハク酸が挙げられる。
【００７０】
「糖酸」および「クロロゲン酸」も有機酸であり、これらに限定されないが、グルクロン酸、ガラクツロン酸および他のウロン酸、ならびにリグノセルロース誘導体において得られるようなカルボン酸官能基を有するフェルラ酸が挙げられる。有機酸は、単独でまたは自然にリグノセルロース誘導体において起こりうる組合せのような組合せで使用されうる。
【００７１】
用語「従属栄養条件」および「従属栄養発酵」および「暗条件での従属栄養培養（cultivation）」または「暗条件での従属栄養培養（culture）」は、少なくとも１つの固定炭素源の存在および発酵の間の光の非存在を指す。
【００７２】
用語「イソプレノイド」または「テルペノイド」または「テルペン」または「イソプレノイドの誘導体」は、任意の数の５−炭素イソプレン単位を有する、イソプレノイド経路に由来する任意の分子であって、これらに限定されないが、モノテルペノイドならびにカロテノイド類およびキサントフィルのようなその誘導体である化合物が挙げられる。イソプレノイド経路は、色素、テルペン、ビタミン、芳香剤、香味料、溶媒、ステロイドおよびホルモン、滑沢剤、添加剤および殺虫剤が挙げられるが、これらに限定されない、多数の商業的に有用な標的化合物を生み出す。これらの化合物は、食品および飲料のための製品、香料、飼料、化粧品、ならびに化学薬品、健康補助食品、および医薬のための原材料において使用される。
【００７３】
用語「カロテノイド」は、五炭素イソプレン単位から縮合されたポリエン骨格からなる化合物を指し、「カロテノイド」は、非環式、または一（単環式）もしくは二環式であることができ、その数の環状末端基（二環式）で終端されうる。用語「カロテノイド」は、カロテンおよびキサントフィルの両方を含みうる。
【００７４】
「カロテン」は、炭化水素カロテノイドを指す。「キサントフィル類」は、酸素化カロテノイド類である。イソプレン誘導体のピロリン酸およびリン酸基の修飾としては、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、またはセスキテルペンが挙げられるが、これらに限定されない非環式、単環式および二環式テルペンをもたらすための酸化または環化が挙げられる。
【００７５】
用語「カロテン生成に好都合な条件」または「カロテン生成トリガー」は、細胞がカロテノイド類を蓄積する条件を意味する。これらの条件は、単独でまたは条件の組合せとして発生することができ、互いに置換されることもできる。条件は、培養プロセス中に内因的に発生するものでもよく、または外因的に発生し、培養に供されるかまたは供給されてもよく、またはその組合せであってもよい。条件は、実際的には、化学的、生物学的、および物理学的であることができる。
【００７６】
用語「微生物」は、顕微鏡的な単細胞生物を指し、例えば、これに限定されないが、微細藻類が挙げられる。本発明による発酵に使用可能な微生物としては、これらに限定されないが、特定の特徴について選択された突然変異体、自然起源の菌株、または自然起源の菌株の遺伝子操作された変異体が挙げられる。
【００７７】
用語「微細藻類」は、葉緑体を含有する真核微生物であり、任意選択により光合成的であるか、または光合成的でありうる原核微生物を指す。微細藻類としては、これらに限定されないが、エネルギーとして固定炭素源を代謝することができない、絶対光独立栄養生物、および固定炭素源を代謝することができる絶対もしくは通性従属栄養生物が挙げられるが。絶対従属栄養微生物としての微細藻類としては、光合成的である能力を喪失しており、葉緑体または葉緑体レムナントを持つかまたは持たないものが挙げられる。微細藻類は、分裂して細胞個体群を生成することができ、スケールアップするかまたは最大の生産性が達成されるまで無期限に持続しうるプロセスであるバイオマスを生産するための生産期に入ることができる。
【００７８】
用語「組換え」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターに関して使用される場合、その細胞、核酸、タンパク質またはベクターがその天然の状態から改変されていることを示す。例えば、組換え細胞は、外因性の核酸もしくはタンパク質または天然の核酸もしくはタンパク質の変更を含むか、あるいはそのようにして改変された細胞または生物または微生物に由来する。
【００７９】
種の選択された菌株または系統という文脈において、用語「ロバスト」または「ロバスト培養」は、所望の表現型および特に従属栄養下でもとの菌株に比べて等しいまたはより大きな成長特徴を含有する藻類個体群を指す。ロバストな成長特徴を維持することは、増加した色素含有量を有する突然変異体を得るために突然変異誘発および化学選択を使用する場合に、非常に問題になる。
【００８０】
本発明の一部の実施形態では、増加した色素含有量または他の生成物の収率とともにロバストな成長特徴を従属栄養下で保持するために、突然変異体を生み出すための突然変異誘発に依存しない方法に起因する新規選択および選択された亜集団が使用される。
【００８１】
これまで、典型的な商業的発酵サイクルに適した短い時間枠における持続的で迅速な従属栄養細胞成長の提供は、その固定炭素の単独の供給源として有機酸を使用する通性従属栄養微生物のための極めて重要な因子として認識されてきた。
【００８２】
本発明の好ましい実施形態は、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）の細胞からバイオマスを製造することを可能とする方法またはクラミドモナス目（Chlamydomonadales）の細胞により生成された目的の生成物を提供する。
【００８３】
ある特定の実施形態では、本発明は、胞子形成性クラミドモナス目（Chlamydomonadales）あるいは栄養成長の停止をもたらし、それにより生成物形成を制限する、暗条件での発酵培養の間の栄養枯渇に対する同様の形態学的もしくは生理学的反応または上昇した塩濃度に対する感受性を有する他の微生物とともに使用される方法を提供する。
【００８４】
有利なことに、本発明の方法は、従属栄養性のために有機酸を必要としないが、優先的に使用することができ、よって、迅速な栄養成長のために、高レベルのアンモニウムまたは他の代謝物の蓄積を軽減することができる、異なる微細藻類種を含みうる様々な細胞型との共培養をさらに可能とする。
【００８５】
好ましい実施形態では、本発明は、費用効果のある暗条件での改善された従属栄養発酵方法に関する。ある特定の実施形態では、本発明は、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）に属する細胞および他の有機酸要求性微生物細胞の使用を提供する。
【００８６】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、従属栄養細胞が、工業製造に適した期間にわたってある比成長速度を達成することを可能とすることを対象とする。有利なことに、本発明の方法は商業的に入手可能な装置を使用して実施することができる。
【００８７】
ある特定の実施形態では、本発明は、イソプレノイドまたはイソプレノイドの誘導体およびバイオ水素の工業生産のための従属栄養発酵を提供する、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）に属する細胞を提供する。本発明の方法により生成されるイソプレノイドとしては、これらに限定されないが、色素性イソプレノイド、無色のフィトエン、または炭素フラックスの中断もしくは再指示により生成可能なイソプレノイド誘導体が挙げられる。
【００８８】
好ましい実施形態では、本発明の細胞は、より速いバイオマス、色素またはイソプレノイド生成のようなより速い生成を提供する。別の実施形態では、本発明は、商業的規模のバイオガス生成および組換え分子生成を示す細胞であって、発酵条件下で効果的かつ経済的に機能する細胞を提供する。
【００８９】
ある特定の実施形態では、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）の従属栄養細胞が提供され、この細胞は、本明細書に開示された方法に従って培養された場合、細胞分化せずに栄養相において色素を蓄積し、活性な天然の非メバロン酸ＭＥＰ経路を示す。例えば、非制限的な有機酸とともに供給された場合、本発明により提供される細胞は、光合成による妨害がないという利益を受け、添加された吸収源（sink）への経路を通じた炭素フラックスが起こる寸前である。ある特定の実施形態では、本発明により提供される細胞は、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）に属し、葉緑素を欠く非光合成的従属栄養細胞である。
【００９０】
一部の実施形態では、本発明は、改変されたイソプレノイドプロフィールを有する通性従属栄養性クラミドモナス目（Chlamydomonadales）細胞からの従属栄養性バイオマスの作成を可能とする方法を提供する。ある特定の実施形態では、本発明の方法を使用して、高い成長速度においてファーメンター中で工業応用に有意義な比較的短期間にわたってバイオマスが生み出されうる。
【００９１】
改変されたイソプレノイド生成のための従属栄養細胞を操作するために、イソプレノイド合成のための組換え細胞を生成するために利用可能な多様な戦略が採用されうる。
【００９２】
本明細書に記載された本発明の細胞および方法は、
１）生成期間の間、高い比成長速度を提供し；
２）塩毒性を管理するために有機酸を使用して、栄養成長に好都合な条件の延長を可能とし；
３）塩毒性をさらに管理するために尿素を使用し；
４）細胞分化の要求を排除して、生成物の蓄積をもたらし；
５）光の非存在下で高い生成物収率を蓄積し；
６）栄養枯渇の非存在下で高い生成物収率を蓄積し；
７）この方法は、高収率、高品質および確実な発酵のための改善された菌株および細胞株を採用する。
【００９３】
抽出されたまたはバイオマスである従属栄養微細藻類は、動物飼料、ヒトの栄養および栄養サプリメント、パーソナルケア、着色剤、香味料もしくは芳香剤、バイオエネルギー、作物保護のため、または生成物形成の前もしくは後の化学修飾のために使用されうる。
【００９４】
本発明の方法を使用すれば、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）を介したイソプレノイド類、カロテノイド類、バイオガスおよび他の生成物の生成について、大規模発酵での藻類培養によって獲得される数え切れないほどの重要な利益が実現される可能性がある。
【００９５】
本明細書に記載の本発明の改善された方法は、阻害されない成長を、４８、７２、９６、１２０時間またはそれを超えるようなより長い期間、かつ高い細胞密度で可能とする。
【００９６】
本発明の方法は、培養の希釈への要求および炭素を供給するための酢酸ナトリウムへの要求を回避する。これらの「要求」は両方とも塩の蓄積および成長の阻害を引き起こし、本発明の方法において回避される。したがって、ある特定の実施形態では、本発明は、発酵の間を通じて炭素の主要供給源として有機酸を利用する。窒素源として硝酸塩を使用することを回避するため、および塩の添加を最小限にするために、一部の実施形態では、尿素が挙げられるが、これに限定されない有機窒素が使用される。ある特定の実施形態では、培養培地は、窒素源としての硝酸塩を欠いており、尿素を含む。
【００９７】
一部の実施形態では、培養ｐＨの増大が、余分の塩を培養培地へ導入せずに炭素源としての有機酸のフェドバッチ様式の添加により相殺される。したがって、好ましい実施形態では、培地は、固定炭素源として培地中で使用される有機酸の塩を欠いている。
【００９８】
有利なことに、本発明の方法は、現在使用されている方法により培養された培養に比べた場合、約１１０％〜約１５０％、または最大約２５０％またはそれを超える色素または前駆体含有量の収率を提供する。
【００９９】
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の従属栄養のための屋内発酵容器の使用であって、屋内発酵が、光栄養的におよび屋外で大容量で培養される菌株のための生物安全性の新しい解決法を提案する、使用が提供される。発酵タンク、特に屋内に位置するタンクの使用は、組換え生成物の工業規模の製造の規制上の承認を単純化することができる。
【０１００】
ある特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、これらに限定されないが、ヘマトコッカス属の種（Haematococcus spp.）、例えば、Ｈ．プルビアリス（H. pluvialis）；クラミドモナス属の種（Chlamydomonas spp.）、例えば、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）；またはドナリエラ属の種（Dunaliella spp.）などの微細藻類細胞を培養することによる、組換えタンパク質の発現のために使用されうる。
【０１０１】
工業応用における単一培養の使用は、特に発酵については標準的である。対照的に、自然においては群衆生態学が見出され、レースウェイポンド型培養槽における光合成的藻類生成の利益になる。従属栄養発酵の条件は、より速く成長する細菌の導入を強力に妨げうるが、不可能とはせず、それらの望ましくない優占を防止する一方、標的微細藻類により類似した細胞分裂頻度を有する真核生物の導入が有益でありうる。
【０１０２】
本発明の一部の実施形態では、共培養における個体群動態を改変する必要があるときに、保留または供給可能な代わりの炭素または窒素源を必要とする真核生物が提供される。したがって、本発明の一実施形態は、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）に属する細胞を第２の微生物と共培養する方法を提供する。
【０１０３】
したがって、本発明の特定の実施形態は、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）に属する細胞を培養して、十分なバイオマスおよび標的化合物を最短期間にわたって従属栄養的に蓄積することを提供する。
【０１０４】
好ましい実施形態では、遅滞期が効果的に最小化または排除される。本発明のある特定の実施形態では、比成長速度は、０．６／日以上であり、１．１／日以上まで増加し、成長をもたらすのに十分な時間、約２４時間超、約４８時間超、または約７２時間以上持続される。
【０１０５】
特別な実施形態では、色素についての比生産性（ｑｐ）は、時間あたり約１．４ｍｇ／Ｌであり、時間あたり約５．５ｍｇ／Ｌ以上まで増加される。別の実施形態では、総発酵サイクル時間は、約７２時間、約９６時間、もしくは約１２０時間、もしくは１４４時間であるか、または２４時間〜１４４時間の範囲内に収まる任意の持続時間により、または経済的に正当化された持続時間である。
【０１０６】
別の実施形態では、本発明は、酢酸ナトリウムのような有機塩の代わりに有機酸の使用を可能とし、よって、有機酸をその固定炭素源として必要とする微生物の従属栄養発酵の間に見られる塩毒性を回避する。一部の実施形態では、酢酸ナトリウムの使用は、微生物による代謝および成長のための代わりの固定炭素源による置換により最小化または排除される。したがって、本発明の方法において使用される固定炭素源としては、これらに限定されないが、カルボン酸、糖酸、またはクロロゲン酸が挙げられる。固定炭素源の非限定例としては、酢酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、リンゴ酸、ピルビン酸、グルクロン酸、ガラクツロン酸、またはプロピオン酸が挙げられる。ある特定の実施形態では、固定炭素源として使用される有機酸は、リグノセルロース性バイオマスに由来しうる。固定炭素源の追加の例は、当業者に公知であり、そのような実施形態は、本発明の範囲内にある。
【０１０７】
固定炭素源は、単独でまたは組合せで使用されうる。協調的に、特別な実施形態では、培養培地中の硝酸ナトリウムは、培養の前またはその間に複合窒素源と交換される。本発明において有用と考えられる代表的な複合窒素源としては、これらに限定されないが、尿素および加水分解されたカゼインが挙げられる。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、硝酸塩が、より耐塩性である菌株における窒素源として、またはある量で複合窒素源、または硝酸塩および複合窒素源の組合せとともに使用されうる。
【０１０９】
一部の実施形態では、培養培地は、酢酸ナトリウムを含有する。酢酸ナトリウムは、単独でまたは少なくとも１種の他の固定炭素源とともに使用されうる。好ましい実施形態では、少なくとも１種の他の炭素源は酢酸である。
【０１１０】
一部の実施形態では、酢酸ナトリウムのすべておよび少なくとも１種の他の固定炭素源のすべてが、発酵の開始時に微生物に提供される。
【０１１１】
他の実施形態では、酢酸ナトリウムが発酵プロセスの開始時に提供され、少なくとも１種の他の固定炭素源が所定の速度で発酵の経過にわたり、もしくはｐＨ設定ポイントにより誘発された速度で提供される。例えば、一実施形態では、少なくとも１種の他の固定炭素源は、発酵培地のｐＨが約７．５または約８．５に達したときに提供される。
【０１１２】
一部の実施形態では、酢酸ナトリウムは、第１の期間の間、少なくとも１種の他の固定炭素源の非存在下で提供され、少なくとも１種の他の固定炭素源は、第１の期間の最後に提供され、微生物は、第２の期間の間、少なくとも１種の他の固定炭素源の存在下で培養される。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、本発明は、従属栄養発酵の間に目的の生成物の蓄積のために細胞分化を必要としない方法を提供する。例えば、ある特定の実施形態では、マクロ独立細胞が、シスト形成が起こることなく、運動性で二鞭毛性のままである一方、カロテノイド類、イソプレノイド、またはテルペノイドを蓄積する。
【０１１４】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、光の非存在下で高い生成物収量の蓄積を可能とする。ある特定の実施形態では、ファーメンター内の条件は、微生物が一般に培養中に光合成せず、光への意図したもしくは適切な曝露により光誘導が可能とされる、いかなる運転段階もないようなものである。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、本発明は、栄養枯渇の非存在下における高い生成物収量の蓄積も可能とする。例えば、ある特定の実施形態では、マクロ独立細胞が、栄養枯渇の非存在下でカロテノイド類を蓄積し、運動性および二鞭毛性のままであり、シスト形成が起こらない。
【０１１６】
なおさらなる実施形態では、本発明は、少なくとも１種の他の微生物との従属栄養共培養を提供する。好ましい実施形態では、２種の微細藻類菌株の間の相利共生は、高レベルのアンモニウム（ＮＨ４＋、ＮＨ３）の蓄積またはそうでなければ、一方の菌株の細胞分裂を阻害しうる他の代謝物が、他方の菌株により軽減される、と説明される。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、共培養（co-culture）または共培養（co-cultivation）が、標的種の増殖を促進するための戦略として使用される。特別な実施形態では、共培養は、従属栄養性のためのその固定炭素源としての有機酸を必要とする菌株と従属栄養性のために有機酸を必要とせず、アンモニウムまたは低酸素下で蓄積しうるエタノール、乳酸塩、もしくはギ酸塩が挙げられるが、これらに限定されない他の代謝物を優先的に利用しうる別の菌株との間ものである。
【０１１８】
本発明は、バイオマスのために高収率のカロテノイド類およびイソプレノイド前駆体もしくは誘導体を従属栄養的に生成するのに適した微生物を生み出し、培養すること、ならびに上記微生物または上記カロテノイド類およびイソプレノイド前駆体もしくはその誘導体を含有する生成物にさらに関する。
【０１１９】
本発明の微生物は、本明細書に記載の方法における使用のために選択または遺伝子操作されうる。一部の実施形態では、以前には光独立栄養的にのみ培養されたクラミドモナス目（Chlamydomonadales）のメンバーの従属栄養発酵が提供される。
【０１２０】
さらなる実施形態では、本発明は、暗条件での従属栄養発酵下で高生産性を提供する、改善された菌株を提供する。
【０１２１】
一部の実施形態では、本発明は、遺伝子操作された生物の従属栄養培養を提供する。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、本発明は、選択された自然発生的変異体の従属栄養発酵を提供する。本発明の方法によれば、高生産性を有する自然発生的変異体の選択は、レーザーフローサイトメトリー（ＦＣＭ；蛍光活性化細胞分取、ＦＡＣＳと互換的に使用される）により実行されうる。本発明の方法を使用して、もとの個体群に比べてより高い色素含有量を有する藻類の亜集団が、標的色素をもとの個体群に比べてより迅速に蓄積するその能力に基づき、ＦＣＭを使用して選択され、単離されうる。繰り返し選択が、改善された経時的パフォーマンスを有する菌株を選択するために使用されうる。
【０１２３】
さらなる実施形態では、本発明は、生合成経路をさらに下った天然の最終化合物のレベルの低減を伴う、前駆体化合物を蓄積する藻類の、単離され、選択された亜集団を提供する。好ましい実施形態では、蓄積する化合物は、フィトエンおよびフィトフルエンが挙げられるが、これらに限定されない無色の抗酸化化合物である。一部の実施形態では、これらの亜集団は、フローサイトメトリーを使用して蛍光差異に基づいて選択される。色素生合成の化学的に誘導された封鎖を有する細胞において見られるように、そのような亜集団は、これらの無色の高価値生成物をその種が自然に蓄積する色素のレベルと同様のレベルで蓄積する。本発明の方法は、優れた工業パフォーマンスを有する改善された細胞株の回収効率を増加させるために、各種にとっての正しい段階で実行される直接選択を提供する。さらなる実施形態では、ナイルレッド、または脂質染色を使用する間接的な相関的選択（correlative selection）も提供される。
【０１２４】
一部の実施形態では、葉緑素を失い、色素を蓄積する変異体が、急速に蓄積し高度に蓄積する色素について選択される。他の実施形態では、細胞または個体群が利用され、この細胞および個体群は、走光性反応を欠いて、もはや鞭毛を有さないことにより同定され、よって非運動性であるが、なお栄養性である。そのような細胞は発酵システムにおいて有益であり、それは、その鞭毛を有する対応物のようにインペラーによる損傷の影響を受けやすくないからである。
【０１２５】
本発明のイソプレノイドとしては、これらに限定されないが、アスタキサンチンのようなカロテノイド／キサントフィル、または無色のフィトエンおよびフィトフルエンが挙げられる。
【０１２６】
一部の実施形態では、本発明の方法は、改変された生合成により特定の標的を蓄積する、高生産性の遺伝子改変された細胞を効率的に培養する。好ましい実施形態では、これらの標的としては、これらに限定されないが、リコペンまたはゼアキサンチンなどの二次代謝産物である。さらなる好ましい実施形態では、これらは、付加されたシンターゼ遺伝子／酵素の発現により得られたイソプレノイドである。
【０１２７】
本明細書に提供される方法は、容易に管理でき、より迅速な作物サイクル時間、一年中のあらゆる地形における生産により容易に培養でき、それから所望の生成物が経済的に高収率で得られうる細胞の使用を可能とする。
【０１２８】
収穫およびさらに目的の生成物を単離するためにバイオマスを処理することにおいて使用される方法は、当分野で周知である。例えば、一部の収穫の方法としては、これらに限定されないが、水切りのための遠心分離、凝集およびろ過、ならびに揮発性化合物およびバイオガスのための上部空間の捕捉およびスパージングまたは除去が挙げられる。
【０１２９】
本発明において有用な一部の抽出方法としては、これらに限定されないが、有機溶媒中、食用油中および加圧流体および気体による抽出が挙げられる。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、従属栄養的に生成されたバイオマスは、直接的にまたは動物および魚類飼料中の混合物として使用される。例えば、アスタキサンチン含有バイオマスは、魚類飼料のために使用され、組換えクラミドモナス（Chlamydomonas）バイオマスは、家禽飼料中で使用される。
【０１３１】
他の実施形態では、イソプレノイドが抽出される。一部の実施形態では、米国特許第６，０２２，７０１号に記載のとおりにアスタキサンチンが抽出される。アスタキサンチンに関する数え切れないほどの出願としては、当分野で記載されたもの、例えば、Ambatiら、2014年、表４および５が挙げられる。
【０１３２】
本発明のさらなる実施形態では、混合栄養条件下での改善された細胞培養が提供される。一部の実施形態では、従属栄養条件のそれを超えて細胞の成長速度を増加させるために、光が供給されることが望ましい。例えば、Ｈ．プルビアリス（H. pluvialis）においては、混合栄養条件下での比成長速度は、従属栄養条件下での比成長速度よりも２．５倍高い。コナミドリムシ（C. reinhardtii）においては、混合栄養条件下での比成長速度は、従属栄養条件下での比成長速度よりも１．８倍高い。
【０１３３】
有利なことに、例えば、低減された塩の蓄積を介する本発明は、混合栄養系において延長された対数期成長を提供する。これは、従属栄養条件下で見られたすでに高いレベルを超えて細胞分化なしに色素蓄積を増加させるために、特に有利でありうる。混合栄養成長のさらなる利益は、細胞が光を用いてＣＯ２を固定するときに酸素を生成するため、培養培地中の溶解した酸素レベルを維持するのがより容易であるということである。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、本発明は、目的の生成物の大量蓄積のために培養細胞の分化を必要としない発酵方法を提供する。
【０１３５】
他の実施形態では、本発明は、測定可能な高い比成長速度および生産性率のための暗条件での顕著なバイオマス、カロテノイドおよびバイオガスの蓄積も可能として、短いサイクル時間を可能とする。さらなる実施形態では、本発明は、さらにより生産性の高い従属栄養生物を作り出すために選択された新しい菌株を提供して、最低の運転コストのための生成物レベルを最大化する。よって、細胞分化を必要としない暗条件での単純なプロセスによってより高い収率を提供する発酵方法および細胞が記載される。
【０１３６】
本発明の方法は、微細藻類細胞、例えば、遺伝子改変された藻類細胞を、顕著な経済拡大のために藻類の製造を一変させる確実な従属栄養プラットフォームにおいて培養することを提供する。
【０１３７】
本発明の方法は：
１）より迅速な製造サイクルと；
２）バイオマスまたは目的の生成物のためのより単純な生成ロジスティクスと；
３）化学合成と競合するために低減された運転コストと；
４）微生物発酵のための装置およびインフラ構造を使用する、より迅速な工業的規模拡張と；
５）地理的位置に関係ない屋内の、屋外または開放的運転に関連した問題のない、一年中の生産と；
６）顕著に増加した在庫およびもっと大きな市場へのアクセスと；
７）組換え分子の宿主として使用されるものを含む、複数の種のＧＭＰおよび規制による制限の下での大規模な経済的生産と
を提供する。
【０１３８】
純粋培養を確立すること、最終種菌の添加の前に複数の継代によるシードトレインを使用すること、微細藻類の照明を防止するファーメンターの設計、および収穫または部分的な収穫までの培養のような従属栄養藻類の培養のための一般原理および方法の例は、当分野で、例えば、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第８，２７８，０９０号に記載されている。
【０１３９】
特別な実施形態では、ファーメンターに添加される種菌は、ファーメンターへのその添加の前の少なくとも１継代の間の暗条件でのクラミドモナス目（Chlamydomonadales）の培養により、または複数の継代、例えば、２継代、３継代、４継代、または５継代の間の暗条件での先の培養により生成されうる。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、暗条件で一時期、ファーメンター中での微細藻類の培養後、微細藻類のすべてまたは一部がさらなる発酵容器に移されることができ、ここで、微細藻類はさらに一時期、培養されることができ、さらなる容器は、光への微細藻類の曝露を防止する。実際面で、先に暗条件での発酵で成長しないが、混合栄養的性質を有すると報告されたクラミドモナス目（Chlamydomonadales）のメンバー、例えば、多様な紅雪藻は、本発明を実践するための候補である。
【０１４１】
収穫または分離、バイオマス処理、生成物としての未処理バイオマスの取り扱い、細胞溶解、生成物抽出、超臨界流体処理、または生成物の他の単離および精製は、当業者に公知の任意の方法論を使用して行われうる。そのような技術の非限定例は、例えば、その両方が参照することにより組み込まれる、米国特許第８，２７８，０９０号および同第７，３２９，７８９号に記載されている。
【０１４２】
生成物回収の非限定例としては、分別蒸留カラムの使用により異なる標的化合物を分離することが挙げられる。抽出のための準備における濃縮、乾燥、粉末化、粉砕、または動物および魚類飼料のためのバイオマスとしての使用のためのさらなる非限定例は、例えば、その両方が参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０２２，７０１号および欧州特許出願公開第１５０１９３７号に記載されている。米国特許出願公開第２０１２０１７１７３３号は、参照することにより本明細書に組み込まれる、細胞溶解のための多様な手段を記載している。
【０１４３】
参照することにより本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９０２１４４７５号は、天然のアスタキサンチンの抽出性およびバイオアベイラビリティを改善するためのヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）の柔らかい細胞壁を有する変異体（soft wall mutant）菌株、ならびに動物飼料、ヒトの食物サプリメント、医薬品、および食品におけるその使用を記載している。
【０１４４】
本発明の方法は、ファーメンターを使用した典型的な微生物成長曲線または成長サイクルを提供する。例えば、本発明の方法を使用して、細胞の種菌は、培地に導入された場合に細胞成長または分裂が開始する前に遅滞期が続く。遅滞期に続いて、成長速度が着実に増加して、ログフェーズまたは対数期に入る。μ＝ｌｎ／（Ｘ／Ｘｉ）／ｔ、式中、Ｘは最終乾燥細胞濃度であり、Ｘｉは初期細胞乾燥濃度であり、ｔは培養時間である、と定義される比成長速度が、この期間中に測定される。栄養枯渇および／または阻害性物質の増加により、成長の緩慢化（細胞分裂）が対数期に続く。成長が停止すると、細胞は静止期または定常状態に入る。本発明の方法によれば、比生産性（ｑｐ）は、遅滞、対数および静止期の全時間経過にわたり、収穫まで測定される；ｑｐ＝（Ｘ）＊（Ｐ）／ｔ、式中、Ｘは収穫物乾燥重量であり、Ｐは乾燥重量に基づく生成物のパーセントであり、ｔは培養時間である。
【０１４５】
本発明の方法は、個々の細胞中の相対色素含有量のＦＣＭによる測定を提供する。本発明によれば、ＦＣＭは、もとの個体群に比べて平均を超える色素含有量を有する細胞を単離するためにも使用されて、新たに作り出された亜集団中に増加した色素含有量を含む細胞の個体群を生成することができる。さらに本発明の方法によれば、栄養細胞、未成熟シストおよび成熟シストを鑑別するためにフルオレセイン二酢酸（ＦＤＡ）染色を使用して、ＦＣＭは、色素を蓄積し、運動性のままである細胞を識別し、単離して、もとの個体群よりも速く色素を蓄積する新しい細胞亜集団を生み出すためにも使用されうる。これらの方法は、非限定的であり、従属栄養下での最終的な成長のための多様な色素特徴、例えば、高いアスタキサンチン、リコペン、フィトエンを有する任意の細胞型（運動性またはシスト）を選択するためにわずかに改変して応用されうる。
【０１４６】
本発明のある特定の実施形態では、遺伝子操作された微生物が、バイオ水素、イソプレノイド、または組換え分子の生成のような特性を強化して、微生物により生成される成分の性質もしくは割合を改変し、またはｄｅ  ｎｏｖｏ成長特徴を改善もしくは提供するために、従属栄養的に培養される。
【０１４７】
ヘマトコッカス属の種（Haematococcus spp.）（Sharon-Gojmanら、2015年）、ドナリエラ属の種（Dunaliella spp.）（Fengら、2014年）およびクラミドモナス属の種（Chlamydomonas spp.）（Lauersenら、2013年；Scaifeら、2015年；Scrantonら、2015年）の遺伝子操作は、よく記述されており、参照することにより本明細書に組み込まれる。プロモーター、ｃＤＮＡおよび３’ＵＴＲもベクターの他のエレメントも天然源から単離されたフラグメントを使用するクローニング技術により生み出されうる（例えば、Sambrookら、2001年；および米国特許第４，６８３，２０２号を参照されたい）。代わりに、エレメントは、公知の方法を使用して合成により生み出されうる（例えば、Stemmerら、（1995年）を参照されたい。）。選択マーカーおよびレポーターまたは導入遺伝子の挿入に際して回復された突然変異体も、当分野で周知である。藻類培養条件において有用なある特定のプロモーターは、アンモニウムまたは二酸化炭素のような刺激に対する反応のような誘導発現のための使用を含む、例えば、参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９０３１７８７８号に記載されている。
【０１４８】
組換え核酸分子またはポリヌクレオチドは、当分野で公知の任意の方法を使用して、植物葉緑体または核に導入されうる。ポリヌクレオチドは、当分野で周知の様々な方法により細胞に導入され、一部、特別な宿主細胞に基づいて決定される。参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９０３１７８７８号は、核酸導入遺伝子発現のための微細藻類中の遺伝子間のＩＧＳ配列の使用を記載している。さらに、遺伝子操作された微細藻類のような微生物は、１つ、２つまたはそれを超える外因性遺伝子、特にそれがトランスジェニックプラスチドであるとき、を含みうる。参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第７，１３５，６２０号および米国特許第７，６１８，８１９号は、葉緑体発現ベクターおよび関連する方法を記載している。
【０１４９】
そのようなものとして、目的の生成物を合成するための方法が本明細書に記載されている。その方法は：
固定炭素源としての有機酸を含む培養培地を提供するステップと；
目的の生成物を生成する微細藻類細胞を提供するステップであって、微細藻類細胞が通性従属栄養生物である、ステップと；
微細藻類細胞を培養培地中、暗条件で培養して、微細藻類細胞から微細藻類培養物を生成するステップと；
微細藻類培養物中の細胞が細胞分化を受ける前に、微細藻類培養から微細藻類細胞を単離するステップと；
微細藻類培養物から目的の生成物を精製するステップと
を含む。
【０１５０】
目的の生成物としては、微細藻類細胞、色素、テルペン、組換え分子、バイオガス、またはその前駆体を含む、微細藻類バイオマスが挙げられうるが、これらに限定されない。色素としては、カロテノイド、イソプレノイド、またはその前駆体、例えば、アスタキサンチン、ルテイン、リコペン、ゼアキサンチン、カンタキサンチン、ベータカロテン、フィトフルエン、またはフィトエンが挙げられうるが、これらに限定されない。
【０１５１】
テルペンまたはその前駆体としては、ピネン、リモネン、またはゲラニルゲラニルピロリン酸が挙げられうるが、これらに限定されない。
【０１５２】
目的の組換え分子は、異種タンパク質、またはｄｓＲＮＡが挙げられうるが、またはｄｓＲＮＡでありうる。
【０１５３】
好ましい実施形態では、本明細書に記載の方法は、通性従属栄養藻類細胞において色素を合成するために使用される場合、少なくとも時間あたり０．０６３ｍｇ／Ｌの比生産性率で色素を生成する。
【０１５４】
また、本明細書に記載の方法は、微細藻類細胞におけるより長期の栄養成長、例えば、４日から１週間までの間、特に、４８、７２、９６、１２０または１４４時間の栄養成長を提供する。本発明の方法は、培養のステップを通じて、例えば、４８、７２、９６、１２０または１４４時間にわたり、従属栄養成長および目的の生成物の合成を提供し、培養のステップはフェドバッチ発酵下で実行される。
【０１５５】
上記のとおり、栄養枯渇条件下で、細胞分化期の間に目的の生成物が合成される、従来方法とは異なり、本発明の方法は、栄養豊富な条件下で培養の栄養成長を通じて、目的の生成物の合成を提供する。
【０１５６】
また、栄養枯渇および地上型灯器の条件下で、細胞分化期の間に目的の生成物が合成される、従来方法とは異なり、本発明の方法は、栄養枯渇条件下で培養の栄養成長を通じて、光を必要とせずに目的の生成物の合成を提供する。
【０１５７】
本発明の方法は、混入物を排除するために閉鎖型培養システムにおいて生成され、したがって様々な動物およびヒトの新規使用に適した高品質を有する藻類を提供する。本発明の閉鎖型発酵システムはまた、より高密度、かつより速い成長速度でわずか数日の短いサイクル時間で大量のものをより低コストで提供する。本発明の好ましい実施形態では、藻類はシスト形成の前に収穫され、暗条件、かつ栄養豊富な条件下で生成される。したがって、その典型的な組成分析は、シスト形成し分化した細胞または色素形成のために光によりストレスを与えられた細胞とは実質的に異なる。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、動物およびヒトのための使用に栄養上または着色上の利益を与える生成物のための、高タンパク質かつ低灰分組成（バイオマス中のビタミンおよびミネラルとともに）を有する色素性バイオマスの実質的に新しいプロフィールを提供する。飼料着色剤または色素補助剤として働く一方、これらの栄養上の利益は、送達される魚類由来の成分により提供されるものに匹敵する。この組成のおかげで、本発明の方法を使用して生成される組成物も、食物の代用となる飲料またはカロテノイド添加剤として送達される栄養素サプリメントにおいても魅力的である。
【０１５９】
一部の実施形態では、これらの藻類が、混入物を排除するためかつ短期間で高密度を達成するために閉鎖型培養システムにおいて生成されるが、栄養状態では、本発明の藻類培養は、種子の光バイオリアクターまたはレースウェイ型培養槽に播種するために働きうるため、シードトレインまたは生産サイクルの一部として、太陽放射または人工照明により照らされる。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、本発明の方法は、その組成のおかげで色素性バイオマスの実質的に新しいプロフィールを提供し、このバイオマスは、例えば、カロテノイド含有ライセートまたは抽出物として送達されるパーソナルケアおよび化粧品成分として魅力的である。
【０１６１】
本発明のある特定の実施形態では、培養培地は、窒素の主要供給源として尿素を含む。
【０１６２】
目的の生成物を単離し、精製するステップは、微細藻類細胞の乾燥、粉砕、溶解または抽出のうちの１つまたは複数のステップを含みうる。
【０１６３】
本明細書にまた提供されるのは、目的の生成物の合成に好適な微細藻類細胞を同定し、単離する方法である。この方法は：
ａ．少なくとも部分的な従属栄養条件下で微細藻類菌株を培養して、微細藻類細胞を生成するステップと；
ｂ．従属栄養条件下で成長させた場合、そこから微細藻類細胞が生成される微細藻類菌株に比べて好ましい特徴を有する非突然変異誘発微細藻類細胞を同定するステップであって、同定するステップが、蛍光活性化細胞分取技術および／または走光性反応を使用して実行される、ステップと；
ｃ．好ましい特徴を有する非突然変異誘発微細藻類細胞を単離するステップと
を含む。
【０１６４】
培養のステップは、少なくとも培養ステップの一部については、混合栄養条件下で実行されうる。
【０１６５】
本発明の多くの実施形態では、細胞を同定するために、目的の生成物の微細藻類細胞による合成の増加または微細藻類細胞における鞭毛の欠如、葉緑素を欠くまたは非光合成変異体を含むが、これらに限定されない、多様な特徴が追求されうる。
【０１６６】
したがって、本発明は、親微細藻類培養物に比べて望ましい特徴を有する細胞を提供する。
【実施例】
【０１６７】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に記載するために提供される。これらの実施例は、例示としての役割を果たすものであり、本発明の限定は意図していない。
【０１６８】
[実施例１]
従属栄養菌株および培養の樹立
この実施例は、栄養成長に好ましい条件により培養される新規従属栄養細胞型および本発明の方法を使用して生成物を作製することを目的とする。ヘマトコッカス（Haematococcus）の細胞は、環境試料として単離するかまたはテキサス大学（Austin, Tex., USA）のＣｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｇａｅから入手したＵＴＥＸ２５０５のような菌株保存機関から得る。細胞は、光合成ヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）菌株ＢＭＩのようなより高い塩耐性を有する単離物を含みうる（Chekanovら、2014年）。細胞は、商業規模の光合成生産培養からも得られうる。存在する場合には、シストまたは胞子の発芽は、分画され、細分化されて、緑色運動性細胞を含有する培養を生成する運動性細胞を生成するのに好ましい条件下で起こる。倒立顕微鏡の使用は、生活環ステージを同定するために有効である（栄養性、未成熟シスト、シスト）。初期の混入物負荷を低減させるために、培養を２００ｇで１分間遠心分離して、藻類および混入物を含む重い細胞を選択的にペレット化する。遠心分離直後に、培地を除去し、滅菌培地で交換し、１０００ｇで１分間遠心分離し、運動性細胞を遠心管上部の光源にむかって泳動させる。運動性細胞を収集し、新しい管に移し、上清に含まれる標的生物以外の生物がわずかになるまで遠心分離を反復する。次いで、この混入物が低減された培養を、さらに細菌量を低減させるために抗生物質（アンピシリン５０ｍｇ／Ｌおよびセフォタキサミン２５０ｍｇ／Ｌ）で２４〜４８時間処理し、次いで、希釈し、ＦＣＭを使用して標的単一細胞を、２００μＬの当分野で公知の基本成長培地、例えば、同じ抗生物質を含むギリアードＦ／２培地（尿素で置換した硝酸塩でも改変した新鮮な水を）を含有する９６ウェルプレートにソーティングする。
【０１６９】
次に、菌株選択のための方法を実行する。光栄養条件、２５℃において２０μＥの光の下で９６ウェルプレートを１週間インキュベートし；１０μＬの培養を、２０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび０．１６ｇ／Ｌ酵母抽出物を補充した２００μＬの上記Ｆ／２基本培地（抗生物質を含まない）に移した。酢酸塩を含有するこの培養を、再度２０μＥの光の下（混合栄養的）で１週間インキュベートして、倒立顕微鏡を使用して純粋培養を同定する。純粋培養（１０μＬ）を、暗条件で２０ｍＭ酢酸ナトリウムおよび０．１６ｇ／Ｌ酵母抽出物を補充した２００μＬの上記Ｆ／２基本培地（抗生物質を含まない）に移して、他の生物のないことを確認し、従属栄養条件への適合を開始する。培養を純粋培養とした後、数週間、毎週の選択を５０ｍＬのフラスコ中５ｍＬの容量で実行して、非常に低い栄養条件における従属栄養性運動性細胞型の新規表現型を特異的に選択する。光源を容器の上に置いたときに走光性である能力に基づいて、運動性の細胞型をシストから単離する。この細胞型は、ロバストな成長とともに従属栄養条件下で多数の世代にわたってその変異体表現型を維持し、新しい菌株番号を割り当てられる。その後生み出される個体群は、ストレス下でシスト形成に強硬に抵抗する成長の急速な運動性細胞を特徴とする、改善された菌株である。他のクラミドモナス目（Chlamydomonadales）については、クラミドモナス（Chlamydomonas）およびクロロモナス（Chloromonas）の細胞は、当分野で公知のように、環境試料として単離するかあるいはＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ＣＣ−１２５もしくは１３７ｃ、またはＵＴＥＸ  ＳＮＯ４のような菌株保存機関から得る。これらは、もとの細胞型として使用可能であるかまたは従属栄養条件における好ましいパフォーマンスに好適な非突然変異誘発変異体の発生において（例えば、実施例１３を参照されたい）；またはドナリエラ（Dunaliella）に関するような栄養転換に関する組換え細胞型として（Chenら、2009年）使用可能である。同様に、先に光独立栄養的にのみ培養されてきたクラミドカプサ（Chlamydocapsa）の細胞（米国特許出願公開第２０１００３１６７２０号）は、ＣＣＣｒｙｏ１０１−９９、ＩＢＭＴ菌株保存機関などから得て、純粋培養とし、５．５のＰＨ、１４℃から１５℃までで対応する培養培地（３Ｎ−ＢＢＭ）を使用して、上記従属栄養条件に適合させる
【０１７０】
[実施例２]
従属栄養成長のための培地組成および温度
成長の最大の増加をもたらす培地構成要素は、多様な種について同定されている。これは、最初は、開始基本培地を用いてフラスコレベルで実行し、固定炭素源として酢酸塩を使用し、それは、頻繁な（時間ごと）手動の酢酸添加が過度に労働集約的であり、２４時間ひっきりなしのケアを必要とすると予想されるからである。Ｈ．プルビアリス（H. pluvialis）ＫＡＳ１６０１を一例として使用して、窒素源としての尿素の使用は、ＫＮＯ３に対して４０％の成長増加をもたらし、２８℃の温度は、２５℃に対して５７％の増加をもたらし、静止期が開始する前の同じ時点の後に、全体として２．２倍のＯＤ７５０の増加をもたらした。特に、好ましい窒素源を、２５℃の酢酸ナトリウム１．６ｇ／Ｌ、酵母抽出物０．１６ｇ／Ｌ、窒素１．７６ｍＭ（尿素０．８８ｍＭまたはＫＮＯ３１．７６ｍＭ）、硫酸マグネシウム七水和物０．０５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水和物０．０５ｇ／Ｌ、リン酸カリウム０．０２ｇ／Ｌ、鉄−ＥＤＴＡ０．０１ｇ／Ｌ、塩化鉄六水和物０．００６３ｇ／Ｌ、四ナトリウムＥＤＴＡ２２ｍｇ／Ｌ、硫酸コバルト０．３ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン６ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛０．８ｍｇ／Ｌ、硫酸銅０．２ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸アンモニウム０．７ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン０．４ｍｇ／Ｌ、ビオチン２μｇ／Ｌ、およびビタミンＢ１２、２μｇ／Ｌのベースライン培地からなる従属栄養フラスコ成長培地を使用して決定する。分光光度計を使用してＯＤ７５０測定値をとる。２日目には、尿素とＫＮＯ３成長培地のＯＤ７５０に差はないが、４日目までに尿素を使用する培養はＫＮＯ３培養に比べて４０％高いＯＤ７５０を有する。好ましい温度は、２５℃、２８℃および３１℃で好ましい窒素源（尿素）を使用して決定する。２５℃から直接的にすすめ、適合を含まないこれらの条件下では、運動性細胞は、３１℃で増殖しない。成長をモニターするために、分光光度計を使用してＯＤ７５０測定値をとる。３日目には、２５℃と２８℃の成長した培養に差はないが、５日目までに、２８℃の培養は２５℃の培養に比べて５７％高いＯＤ７５０を有する。他の菌株の従属栄養成長に適した培地組成の決定のための同様の方法を、当分野で公知のとおりに行う。クラミドモナス（Chlamydomonas）について、同じ温度を、酢酸ナトリウム１．６ｇ／Ｌを酢酸ナトリウム０．４ｇ／Ｌおよび上記のとおりに決定した好ましい窒素源（尿素）に交換してフラスコ中で試験する。他の培地構成要素が、当分野で公知のとおりに標準的な多変量成長研究を使用して、修飾されまたは除外されまたは添加されうる。これは、炭素源としての多様な有機酸の使用を含み、有機酸は、１つのタイプまたはリグノセルロース誘導体において起こりうるように組み合わされた１つ超のタイプでありうる。
【０１７１】
[実施例３]
従属栄養培地組成およびマクロ独立細胞による色素生成
この実施例は、従属栄養条件下での好ましい成長のために選択した菌株を採用する。シードトレインを記載するための例としてヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）ＫＡＳ１６０１を使用して、９個の５００ｍＬのＨ．プルビアリス（H. pluvialis）の栄養従属栄養培養を、２５℃で１Ｌフラスコのバッチ培養中、早期成長期に０．１５のＯＤ７５０を有し、後期成長期には約０．６のＯＤ７５０まで増加する細胞密度により測定して、うまく成長期に入ってから静止期に入る前までの十分な時間、１００ｒｐｍで振とうした。フラスコ成長培地は、酵母抽出物０．１６ｇ／Ｌ、尿素０．１１ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．０５ｇ／Ｌ、塩化カルシウム二水和物０．０５ｇ／Ｌ、リン酸カリウム０．０２ｇ／Ｌ、鉄−ＥＤＴＡ０．０１ｇ／Ｌ、塩化鉄六水和物０．００６３ｇ／Ｌ、四ナトリウムＥＤＴＡ２２ｍｇ／Ｌ、硫酸コバルト０．３ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン６ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛０．８ｍｇ／Ｌ、硫酸銅０．２ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸アンモニウム０．７ｍｇ／Ｌ、ホウ酸０．４ｍｇ／Ｌ、塩酸チアミン０．４ｍｇ／Ｌ、ビオチン２μｇ／Ｌ、およびビタミンＢ１２、２μｇ／Ｌからなる。加えて、フラスコ培地は、酢酸１．１５ｍＬ／Ｌを含むＴｒｉｓ塩基２．７８ｇ／Ｌを含有するかまたは低密度のフラスコ培養の手間のかからない成長を可能とするために、最初に酢酸ナトリウム１．６ｇ／Ｌを含有してもよい。培養は、３０００ｇで５分間の遠心分離により濃縮されるかまたはそのまま使用される。微細藻類細胞（図１〜１０）を、０．２ｇ／Ｌの最初のバイオマス密度で、１４Ｌの発酵容器（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  ＢｉｏＦｌｏ３０００；図１〜３０）中の３Ｌのファーメンター従属栄養成長培地（Ｔｒｉｓ塩基０．７ｇ／Ｌおよび最初の酢酸０．２９ｍＬ／Ｌまたは任意選択により１回の酢酸ナトリウム０．４ｇ／Ｌとともに供給したフラスコ従属栄養培地と同じ）に移す。３Ｌ発酵培養を、３Ｌ／分の注入空気および１００〜１５０ｒｐｍの傾斜ブレードインペラーによりｐＨ７．８でもたらされるガス交換とともに２８℃でインキュベートする。ＢｉｏＣｏｍｍａｎｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ペリスタポンプおよびヘッドプレートポートを使用して、５％のポンプスピードで供給する１０％酢酸（図１、実施形態２０）のｐＨトリガー添加を含むフェドバッチ発酵の持続時間の間中、ｐＨをＨ７．８〜７．３に維持し、窒素およびリン（ｍＭベースで９：１の割合）を発酵の間中、１０％のポンプスピードで頻繁に（４〜２時間ごと）供給して、ファーメンター従属栄養成長培地の開始濃度の近くに窒素およびリンのレベルを保つ。（酵母抽出物を除く）培地からの残りの栄養素を、１０％スピードのペリスタポンプを使用して発酵の２４時間ごとに１回、供給する。容器への注入空気の量を４Ｌ／分最大、撹拌を３００ｒｐｍまで増加させることによって、溶解酸素を３０％超に維持する。１０Ｌ体積の非トリガー細胞からの細胞を、９０Ｌ体積（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＢｉｏＦｌｏ  ６１０ファーメンター中の培養１０Ｌ＋ファーメンター従属栄養培地８０Ｌ）に直接播種するために使用可能である。９０Ｌの培養に、注入空気を５０〜１００ＬＰＭおよび３５０ｒｐｍまでの傾斜ブ��ードによる撹拌で上記のように供給する。この方法により、結果として生じるバイオマス（最初の０．２ｇ／Ｌから６ｇ／Ｌ）を、遅滞時間を含まず、０．７／日の高い比成長の９６時間の延長された対数期を含む、１２０時間にわたって生産する。これらの構成要素の使用は、急速に成長する細胞の生理学により現行の実践よりも有利であり、窒素代謝からの培養ｐＨシフトは有機酸の添加、炭素源としての倍加、により対処して、余分の塩を培地に添加することなく培養ｐＨの釣り合いをとる。乾燥重量分析のために２４時間ごとに試料（１０ｍＬ）を収集して、比成長速度および藻類生成物の色素含有量を決定する（図１、実施形態４０）。１０ｍＬの試料を直ちに３０００ｇで５分間、遠心分離し、上清を除去し、細胞ペレットを−８０℃で凍結し凍結乾燥して、乾燥重量を決定する。バイオマス１ｍｇあたり５０μＬのアセトンを用いて粉砕した凍結乾燥バイオマスから、室温で５分間、色素を抽出する。分光光度計を使用して（ＢｉｏＲａｄ  Ｓｍａｒｔ  Ｓｐｅｃ）、清澄化した抽出物の吸収を４７６ｎｍで読み取る。以下の式［Ａ４７６／２１７］×［抽出体積（ｍＬ）］×［希釈因子］を使用して総色素（ｍｇ）を計算し、式中、２１７は、アセトン中のアスタキサンチンの吸光計数である。色素パーセントを、抽出中の１ｍｇのバイオマス当量あたりの色素のｍｇから計算する。９６時間で、バイオマスは赤色マクロ独立細胞中１．５％の色素含有量を有する２．１ｇ／Ｌに達し（図２−右上）；体積ベースで、これは３１．５ｍｇ／Ｌに等しい。これは、Hataら（2001年）における、時間あたり０．０６３ｍｇ／Ｌに比べて顕著に高い速度である時間あたり０．３３ｍｇ／Ｌの生成物形成（ｑｐ）に相当する。これは、Hataら（2001年）における、０．２１／日（０．００９／時間）に比べて、２４時間において検出可能な遅滞期を含まない７２時間にわたり、０．６８／日（０．０２８／時間）の比成長速度に相当する。特に、細胞拡大よりも細胞分裂による、延長された持続時間にわたる高い比成長速度の従属栄養生産システムに関する顕著な改善を図４に示す。同様の比成長速度およびより高い内在性色素含有量を有する細胞株は、２．３％の色素含有量が、時間あたり０．５ｍｇ／Ｌの速度をもたらすように、本発明の方法によりより高いｑｐ値をもたらす。生産性は、細胞型選択または適合、共培養、ファーメンター播種および操作、ならびに例示されたような他の手段により、さらに増加可能である。
【０１７２】
アンモニウム濃度が増加すると（２．５ｍＭ以上）、尿素およびリン酸塩が過剰であり固定炭素源が制限されない場合でさえ、細胞は赤色化する。このプロセスは、生成サイクルが数日間持続するため（例えば、アスタキサンチン生成物形成データについては、図２−左図を参照されたい）、生成物形成を達成しつつ生成サイクルの好ましい持続時間を選択するために、各細胞型について最適化可能であると理解される。この方法は、Ｈ．プルビアリス（H. pluvialis）菌株ＢＭＩ（Chekanovら、2014年）の細胞のようないくらかより高い塩耐性を有しうる細胞型にもあてはまり、暗条件で細胞分化せずに、光合成およびアスタキサンチン形成の下で報告された０．０９５／日を十分に超える成長を達成する。そのような細胞型については、尿素および硝酸塩が両方とも使用可能である。赤色化のための他の方法としては、ファーメンタープログラミングによる昇温が挙げられるが、これに限定されず、当分野で公知である。これは最終的に、一部の適用には望ましい可能性がある細胞分化を引き起こすと予想される。例えば、栄養細胞に比べてシストは容易にペレット化し、水切りのために好ましい可能性がある。本明細書には、延長した期間にわたりシスト形成をもたらし、ある特定の生産スケジュールには許容可能な他の条件が含まれる。本発明の方法により従属栄養的に生成された色素の工業応用に許容可能な所望の品質は、ＨＰＬＣにより光合成により生成された生成物に化学的に等価であると証明される。
【０１７３】
微細藻類培養物が混入物を除外するためおよび栄養状態にある間に短期間で高い密度を達成するために閉鎖型培養システムにおいて生成されているので、これらの藻類培養は、シードトレインまたは生産サイクルの一部として太陽放射または人工照明により照らされた、光バイオリアクターまたはレースウェイ型培養槽に効率的に播種するために働くことができる。本発明の方法により成長させた、１０ｇ／Ｌの細胞密度の２００Ｌのファーメンターは、０．２ｇ／Ｌの細胞を１０，０００のレースウェイ型培養槽に供給することができる。本発明の方法に従って、多くの変更が可能である。よって、本発明の方法により生成された生成物は、次いで従来の微細藻類生産システムにおいて使用される、高密度のバイオマスである。本発明の方法は、土地占有面積を低減させ、従来の生産において経験した一般的な混入物および捕食者を排除することもできる。
【０１７４】
[実施例４]
改善された従属栄養培地組成およびクラミドモナス（Chlamydomonas）細胞によるバイオマス生産
２Ｌフラスコ中の１Ｌの培養物６個を、フラスコ従属栄養培地中で実施例３に記載のとおりに成長させた。実施例３のとおりに培養を濃縮し、１４Ｌ発酵容器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  ＢｉｏＦｌｏ  ３０００）中の（フラスコ従属栄養培地と同じであるが、最初に０．２５ｇ／Ｌだけ酢酸ナトリウムを供給する）３Ｌのファーメンター従属栄養成長培地中に０．０５ｇ／Ｌの最初のバイオマス密度で合わせた。３Ｌの発酵培養を、５Ｌ／分の注入空気および１００〜２５０ｒｐｍの傾斜ブレードインペラーによりｐＨ７．８でもたらされるガス交換とともに２８℃でインキュベートする。発酵培養を維持し、実施例３のとおりに栄養素および固定炭素源としての有機酸をフェドバッチ様式で供給する。当分野で周知の方法を使用して、成長曲線を作成し、栄養培地中の尿素、リン酸塩およびアンモニウムのレベルを測定するために、試料（１０ｍＬ）を２４時間ごとに収集する。コナミドリムシ（C. reinhardtii）ＫＡＳ１００１を使用して、８．２５ｇ／Ｌのバイオマスに到達する、７２時間にわたる１．７／日（０．０７／時間）の比成長速度を達成し；これは、成長停止の前にわずか約１．４ｇ／Ｌに到達するバイオマス収率を伴う４０時間のみの持続時間についての先の最高速度１．７／日（０．０７／時間）（Zhangら、1999年）に比べて、ほとんど２倍の発酵持続時間を伴う顕著に高い収率および延長した加速成長である。この約１．４ｇ／Ｌのバイオマスは、塩毒性による成長阻害、よって比成長速度における短い持続時間と低い細胞密度のみをもたらす、少なくとも２．８ｇ／Ｌまたは３４ｍＭの酢酸ナトリウムを必要とする。実施例３に記載のとおりに１００Ｌのバイオリアクターに移したクラミドモナス（Chlamydomonas）培養は、４日間にわたって少なくとも１．０／日の比成長速度を維持する（生産サイクル：１２０時間）。０．２ｇ／Ｌの最初の細胞密度は、溶解酸素を必要に応じて増加させるために加えた５ｐｓｉの容器圧力とともに実施例３においてＨ．プルビアリス（H. pluvialis）について記載した条件下で成長させた場合、２０〜３０ｇ／Ｌを超える最終細胞密度を生み出し、成長が阻害されない、高い速度の活性な細胞分裂の延長された期間を実証している。当分野で公知のとおりの温度および培地構成要素の調整とともに、同様のプロセスをクラミドカプサ（Chlamydocapsa）およびクロロモナス（Chloromonas）に適用する。
【０１７５】
[実施例５]
セネデスムス・オブリカス（Scenedesmus obliquus）を使用する、Ｈ．プルビアリス（H. pluvialis）の共培養におけるアンモニウム制御
２．５Ｌ体積のＨ．プルビアリス（H. pluvialis）ＫＡＳ１６０１を実施例３のとおりに従属栄養フラスコ培地中で成長させた。１リッターのＳ．オブリカス（S. obliquus）ＫＡＳ１００３を非有機酸炭素源（グルコース３．６ｇ／Ｌ）および代替窒素源（塩化アンモニウム０．０９ｇ／Ｌ）とともに、実施例３に記載のとおりに従属栄養フラスコ培地中で成長させた。実施例３に記載のとおりに培養を遠心分離し、３．６ｇ／Ｌのグルコースを補充した実施例３に記載の従属栄養発酵培地中、３Ｌ体積のＨ．プルビアリス（H. pluvialis）とＳ．オブリカス（S. obliquus）の共培養に濃縮した。或いは、Ｓ．オブリカス（S. obliquus）を、当分野で公知のとおりにアルギン酸または多孔質ビーズ中に包埋し、ろ過、磁力または他の手段を使用するエンドポイント除去を可能とした。この３Ｌの発酵培養を実施例３に記載のとおりに維持した。試料を２４時間間隔で採取して、バイオマス乾燥重量を得て、アンモニウム濃度を測定した。９６時間で、アンモニウム濃度は、わずか１．４ｍＭアンモニウムに到達したにもかかわらず、実施例３からのＨ．プルビアリス（H. pluvialis）の３Ｌ発酵培養中では４５ｍＭのアンモニウムを観察した。この３Ｌ発酵は、０．７７／日（０．０３２／時間）の比成長速度をもたらす。最終バイオマスは、混合微生物を含む開放の池で自然に発生しうるものと同等かまたは優れる、約９９％以上のＨ．プルビアリス（H. pluvialis）バイオマスからなる。細胞型または固定炭素源としてのグルコースの投与のような共培養パラメータの調整は、約２．５ｍＭアンモニウムのカロテン生成トリガーに対して異なる標的成長速度および生産性に到達することを可能とする。適切なアンモニウム制御を伴う０．２ｇ／ＬのＨ．プルビアリス（H. pluvialis）バイオマスで開始する発酵培養は、１２０時間で０．７７／日の比成長速度および４．３ｇ／Ｌのバイオマス収率を伴う少なくとも９６時間の延長された対数期を経験する。適切なアンモニウム制御を伴う１ｇ／ＬのＨ．プルビアリス（H. pluvialis）バイオマスで開始する発酵培養は、１２０時間で０．７７／日の比成長速度および２２ｇ／Ｌのバイオマス収率を伴う９６時間の延長された対数期を有する。最後の４８時間は、アンモニウムストレスを伴い、その最初の２４時間（７２〜９６時間）は、対数期としてバイオマスが同じ比成長速度でなお蓄積し、その２番目の２４時間（９６〜１２０時間）は、アスタキサンチンが運動性細胞の乾燥重量の１．５％まで蓄積した。この１２０時間の発酵ランは、時間あたり０．０６３ｍｇ／Ｌの顕著に低い収率を示したHataら、（2001年）に比べて、時間あたり５．５ｍｇ／Ｌのかなり優れた色素のｑｐをもたらした。バイオマスが蓄積し、色素生成中に細胞分裂が停止するために高い成長速度が短時間しか持続しない先行技術とは異なり、本発明の方法は、必要に応じて７日超を含む、何日にもわたり延長された高い比成長速度を可能とする。この実施例では、Ｓ．オブリカス（S. obliquus）が、多くのそのような細胞型について当分野で公知のとおり、それがなお有機酸でない固定炭素源を好み、窒素源として優先的にアンモニウムを消費する限り、従属栄養成長に適した異なる微生物細胞型で交換可能であると理解される。アスタ��サンチンまたは他の色素生成細胞型または油生成細胞型の中の選択肢は、当分野で公知のとおり、セネデスムス（Scenedesmus）、クロレラ（Chlorella）、モノラフィディウム（Monoraphidium）、ロドトルラ（Rhodotorula）（赤色酵母）の他の種ならびにフェオダクチラム（Phaeodactylum）およびシクロテラ（Cyclotella）のような多くの様々な珪藻植物、ならびにスラウストキトリッド（thraustochytrids）およびスラウストキトリッド（thraustochytrid）様の細胞型である。共培養からのバイオマスは、特に、細胞の割合が好都合に操作される場合、１つの生物由来の価値ある生成物が第２の生物のそれを補完することに寄与できる。例えば、珪藻植物は、フコキサンチンを含有し、セネデスムス・オブリカス（Scenedesmus obliquus）は水溶性のカロテノタンパク質を含有し、スラウストキトリッド（thraustochytrids）は、ＤＨＡ脂肪酸を含有する。
【０１７６】
[実施例６]
コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）を使用するＨ．プルビアリス（H. pluvialis）の共培養におけるアンモニウム制御：およびカロテン生成に好都合な条件
３ＬのＨ．プルビアリス（H. pluvialis）ＫＡＳ１６０１を実施例３のとおりに従属栄養フラスコ培地中で成長させた。１リッターのコナミドリムシ（C. reinhardtii）ＫＡＳ１００１を実施例３に記載のとおりに従属栄養フラスコ培地中で成長させた。培養を、５ｍＭから２０ｍＭまでの間の酢酸ナトリウムとともに実施例３に記載の従属栄養フラスコ培地中のＨ．プルビアリス（H.pluvialis）とコナミドリムシ（C. reinhardtii）の共培養に混合した。３Ｌの発酵培養を実施例３に記載のとおりに維持した。試料を２４時間間隔で採取して、バイオマス乾燥重量を得て、アンモニウム濃度を測定した。１２０時間の発酵の間、アンモニウム濃度は効果的に１ｍＭ未満に維持したが、実施例１におけるＨ．プルビアリス（H. pluvialis）の単独培養は、４５ｍＭアンモニウムに到達する。この３Ｌ発酵は、９６時間にわたって０．９０／日（０．０３８／時間）の比成長速度をもたらした。最終バイオマスは、混合微生物を含む開放の池で自然に発生しうるものと同様の約９９％のＨ．プルビアリス（H. pluvialis）バイオマスからなるものであった。発酵システムに典型的な細胞型の投与のような共培養パラメータまたはｒｐｍおよび酸素負荷のような操作パラメータの調整は、Ｈ．プルビアリス（H. pluvialis）のための約２．５ｍＭアンモニウムのカロテン生成トリガーに対して異なる標的成長速度および生産性に到達することを可能とする。発明者らは、微細藻類培養物が時間あたり０．０６３ｍｇ／Ｌの先に報告された値をはるかに超える比生産性率でアスタキサンチンを生成することを観察し、すなわち、発明者らは、１．５％のアスタキサンチンにおける１５ｇ／Ｌのバイオマスにより、時間あたり１．０ｍｇ／Ｌ、好ましくはより高い時間あたり１．８７５ｍｇ／Ｌを、３％のアスタキサンチンにおける１５ｇ／Ｌのバイオマスにより、さらにより高い時間あたり３．７５ｍｇ／Ｌを５日間で得ており；とりわけ、これは従属栄養成長における時間あたり０．０６３ｍｇ／Ｌ（Hata、2001年より）よりも３０〜６０倍高い。
【０１７７】
追加の内在性または外因性トリガーは、培養の栄養成長を通じ、完全な暗条件で生成物形成において有効である。イソプレノイド生成のために、これらは「カロテン生成に好都合な条件」と呼ばれることができ、例えば、図３および実施例９に記載されている。例が好都合な条件としてアンモニウム蓄積を提供するが、アンモニウムが参照されるいかなるところでもカロテン生成に好都合な他の条件が置き換え可能であると理解される。これらのカロテン生成に好都合な条件としては、過剰のアンモニウム（＞２．５ｍＭ）、リン酸塩枯渇、硫酸塩枯渇、尿素枯渇、２．６ｇ／Ｌよりも高いＮａＣｌまたは浸透圧寄与体に貢献する他のもの、３ｇ／Ｌを超える乳酸、成長温度をセ氏２度超える温度増加、またはその任意の組合せもしくは置き換えが挙げられる。条件は、特にイソプレノイド経路において炭素フラックスに影響を与える前駆体化合物の追加の供給が挙げられうる。例示されたが、実施例５および６に限定されない請求項１の方法を使用して、これらの好都合な条件下で細胞分裂は停止せず、細胞は、長さが（鞭毛を除いて）１０〜１２ミクロンの緑色マクロ独立細胞と同じサイズまたはさらにわずかに小さいままであり、運動性であり、その鞭毛を維持し、有機酸の供給は無制限である。
【０１７８】
[実施例７]
突然変異体または遺伝子操作された生物における改変されたイソプレノイド生成を有する従属栄養細胞
この実施例は、フィトエン、ゲラニルゲラニルピロリン酸、フィトフルエンおよび他の上流の蓄積性色素または色素前駆体ならびにテルペンのような他の吸収源（sink）の改変された発現を有する従属栄養細胞に関する。そのような従属栄養的に成長した細胞は、本発明の方法において使用されうる。例えば、フィトエン（無色）およびフィトフルエン（色素性）は、化粧品におけるＵＶ吸収において並外れた価値を有する。高い色素蓄積を含む従属栄養細胞は、もとのエンドポイント色素へのフラックスを停止または遅延させることにより、フィトエン（または他の化合物）の高い細胞および細胞株を作り出すための突然変異誘発または遺伝子操作による処理のための理想的な出発材料を作製する。実施例３におけるような従属栄養フラスコ培地中の５ｍＬのＨ．プルビアリス（H. pluvialis）の従属栄養性の栄養培養を、それが０．１５のＯＤ７５０に達したときにＣＬ−１０００ＵＶ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｒ（２５４ｎｍのＵＶ−Ｃ光）を１分間、５０％の細胞死が起こるように光源から１３ｃｍにおいて使用して、突然変異誘発した。振とうしない暗条件で室温における１２０時間の回収後、カロテン生成が開始するような十分のアンモニアが培地中に蓄積した。５ｍＬの細胞を遠心分離し、４ｍＬの培地を除去した。流動選別の前に５０μｍのメンブレンを通して細胞をろ過する直前に、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を添加した（１μｇ／ｍＬ）。フローサイトメトリーを使用して、アスタキサンチンまたは他の有色色素を生成しない細胞を単離した。４８８ｎｍの光源を使用した場合に、自己蛍光が５３０ｎｍでは高く、６９５ｎｍにおいて低い、微分蛍光分析に基づいて単離および選択を実行した。フィトエン含有量の定量化のために、単離物を実施例３のフラスコ従属栄養培地中、５ｍＬ体積まで１２０時間、成長させた。１ｍＬのアセトンをバイオマス１ｍｇあたりで使用して、凍結乾燥し、粉砕したバイオマスからフィトエンを抽出した。同じ突然変異体単離物からのフィトエン含有量分析を、異なる栄養成長物（vegetative grow out）およびカロテン生成シスト形成サイクルについて実行して、再現性を確実にした。フィトエン蓄積性突然変異体を単離するプロセスにおいて、（正常な野生型におけるような）アスタキサンチン以外の化合物を差次的に蓄積する細胞は、ルテイン、リコペン、ベータカロテン、カンタンキサンチン、またはフィトフルエンまたはさらに新しく異なる自己蛍光特性に基づいて同定可能であるような関連するゲラニルゲラニルピロリン酸を蓄積した。外因性の有機酸を供給される一方、暗条件で培養されるおかげで、この従属栄養細胞は、有害な成長効果のない別の表現型を発現する。これは、フィトエン突然変異体にとって特に有益である。この実施例は、ルテイン特性の変化を含む、葉緑素を欠く表現型の使用にもあてはまる。当分野で公知のとおり、色素をＨＰＬＣにより確認した。この従属栄養細胞由来のバイオマスは、ホスファターゼのような外因性酵素の導入のための、または化学修飾における使用のための蓄積された前駆体の単離のための標的となりうる。この細胞は、フィトエンデサチュラーゼノックアウトもしくはノックダウン、またはリ���ペンシクラーゼおよび下流のノックアウトもしくはノックダウンのような生合成経路中の酵素に影響を与える突然変異誘発されたまたは遺伝子操作された材料に起源を有しうる。
【０１７９】
同様に、ピネンおよびリモネンなどのための添加されたイソプレノイドまたはテルペンシンターゼを含む従属栄養組換え細胞は、多数あり当分野で周知であって最適化されうるイソプレノイドシンターゼ、または修飾されたゲラニルゲラニルピロリン酸もしくは当分野で公知の他の前駆体とともに、最初に上記ＦＣＭベースのステップを使用して間接的に選択されることができ、それは、これらの分子への切り替えがもとの吸収源であるカロテノイド類に検出可能な減少をもたらし（Wangら、2015年）、野生型またはもとの未処理対照に比べて５３０ｎｍにおける自己蛍光をより低下させうるからである。多くのテルペンが消費財において機能を果たすが、燃料添加物としてのリモネンにおけるようなバイオエネルギーのためにも機能を果たす。リモネンシンターゼ発現に関する核性従属栄養クラミドモナス（Chlamydomonas）細胞組換え体を、米国特許出願公開第２００９０３１７８７８号に従ってｒＤＮＡ  ＩＧＳへの挿入のためにまたはリモネンシンターゼ、プラスチドターゲティングおよび発現エレメントを含むＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）との使用のために、当業者に理解される方法を使用して改変したベクターを使用して作成した（SyrenneおよびYuan、2014年）。特に、リモネンは、その後の分離のために微細藻類から液体培養の上部空間に揮発する。或いは、リモネン発現に関するプラスチドの従属栄養クラミドモナス（Chlamydomonas）細胞組換え体を、当分野で公知の方法または組換えクラミドモナス（Chlamydomonas）葉緑体について実施例１２に記載したものを使用する、スペアミント（Mentha spicta）由来のリモネンシンターゼの相同組換えを介する挿入により作成した。同様に、リモネン発現に関する核性またはプラスチド性従属栄養ヘマトコッカス（Haematococcus）細胞組換え体を、Alonso-Gutierrezら、2013年（プラスチドに関して）、またはSharon-Gojman、2015年（核およびプラスチドに関して）の方法を使用して作成し、上記例に記載のＦＣＭ選択を使用して選択した。次いで、これらを発酵培養に供して、上記例に従って７２時間の間、１日あたり０．７超の比成長速度を達成した。
【０１８０】
[実施例８]
速い色素蓄積を伴う、アンモニウム耐性またはカロテン生成誘発された従属栄養細胞を単離すること
任意のカロテン生成トリガーまたはトリガーの組合せが、流動選別のための細胞を作成するために使用されうる。過剰のアンモニウムを使用する例として、実施例３におけるとおりの従属栄養フラスコ培地中のＨ．プルビアリス（H. pluvialis）の栄養培養５ｍＬを、成長培地中のアンモニウムを例えば２．５ｍＭ以上まで蓄積させることにより、カロテノイド類を形成するように誘導した。アンモニウムストレスの８〜４８時間後に、カロテノイド含有量が上昇した（低減された葉緑素）運動性細胞を、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａフローソーターを使用するフローサイトメトリーにより単離する。運動性性細胞の単離を確実にするために、ＤＡＰＩを分別培地に添加して、運動性細胞（ＤＡＰＩ陽性）およびシスト（ＤＡＰＩ陰性）を識別し；６９５ｎｍからの低い自己蛍光を有するＤＡＰＩ陽性細胞は低レベルの葉緑素を有し、５３０ｎｍからの高い自己蛍光を有するＤＡＰＩ陽性細胞は、ベータカロテンが上昇した（最終的なアスタキサンチン蓄積の代理）。実施例１に記載の方法を使用して、９６ウェルプレートからの単一細胞単離物を実施例３のとおりに５ｍＬ体積まで成長させ、アスタキサンチン含有量定量化のためにカロテン生成形成条件に移した。１ｍｇのバイオマスあたり１ｍＬのアセトンを使用して、凍結乾燥し粉砕したバイオマスからアスタキサンチンを抽出した。同じ単離物からのアスタキサンチン含有量分析を、異なる栄養性成長物およびカロテン生成サイクルについても実行して、再現性を確実にした。アンモニウムストレスの期間を４８時間を越えて延長することは、特に、ストレス状態が延長された後であっても、すぐに分化およびシスト形成せずに、カロテノイド類を蓄積してマクロ独立細胞のように運動性のままでいる亜集団を生成する１種または複数の細胞を選択する。この方法によって選択された細胞は、無色であること、またはアスタキサンチンに限らず前駆体または他のイソプレノイドの蓄積を示すことなどの様々な色素の特性を有する可能性がある。
【０１８１】
カロテン生成のための特定の条件下で選択した細胞についての第１の色素蓄積表現型は、遺伝性が高いかまたはこれらの特定の条件に特有であるように見える。言い換えれば、遺伝子型ｘの環境応答は、もとの個体群より１０％増加したアスタキサンチン含有量を有する硫酸塩枯渇応答性細胞が、カロテン生成誘発についての異なる条件としての尿素枯渇下で同じ応答を示さないような、強力なものに見える。例として、カロテン生成に好都合な条件としての硫酸塩枯渇後に、色素蓄積の速いカロテノイド類に富む従属栄養細胞をどのように単離するかは、実施例３におけるとおりの従属栄養フラスコ培地中のＨ．プルビアリス（H. pluvialis）の栄養培養５ｍＬを、硫酸塩を欠く成長培地に細胞を移すことによってカロテノイド類を形成するように誘導した。カロテン生成トリガーの８〜４８時間後に、カロテノイド含有量が上昇した運動性細胞（低減された葉緑素）を、選別し、フローサイトメトリーにより単離する。ＨＰＬＣによりカロテノイドプロフィールを分析して、存在する色素の割合（図３）を決定し、各トリガーおよびトリガーの組合せが異なるカロテノイドプロフィールをもたらしうる。
【０１８２】
[実施例９]
藻類生成物の使用
多くの飼料、食品、栄養補給食品、医薬品、化粧品および作物保護への適用、ならびに多くの他の適用において、無処置のバイオマスまたは抽出した構成要素を利用するための多くの異なる方法がある。望ましい構成要素としてカロテノイド類を使用する、一部の非限定例を本明細書に提供する。例えば、本発明の方法により得られたアスタキサンチン含有生成物は、抽出されまたはバイオマス全体中に保持されるか、あるいは動物飼料、ヒトの栄養および栄養サプリメント、パーソナルケアおよび化粧品、ならびに着色剤のために使用される、脱脂した食物のような処理されたバイオマス中の残留物である。ヘマトコッカス（Haematococcus）藻類バイオマスまたは食物の一般的組成は、一般的なカロテノイド類、脂肪酸、タンパク質、炭化水素、およびミネラルからなる。ヘマトコッカス（Haematococcus）中のアスタキサンチンは、およそ７０％の（１６：０、１８：１および１８：２の脂肪酸に連結された）モノエステル、２５％のジエステルおよび５％の遊離色素である。このエステル化された組成は、サケ科の魚類の天然の食餌供給源である甲殻類のそれに類似しており、容易に代謝される。１．５％のアスタキサンチン含有量において、約５．３３ｋｇのヘマトコッカス（Haematococcus）藻類バイオマスまたは食物が、この着色剤が飼料用に承認された典型である８０ｐｐｍのアスタキサンチン濃度を達成するために、飼料１トンあたりに添加される。無処置のバイオマスのタンパク質および他の分画は、特に（化学合成され、持続可能でない）人工アスタキサンチンによってはもたらされない追加の飼料価値を提供する。本発明の方法により生成された壁の薄い藻類全体の相対的なもろさは、魚類の幼魚の健康および成長に影響を与えるための、消化性および栄養素利用可能性に関連する、当分野で公知の資格を与えられうる利益とともに、細胞破壊の容易さに関して、代わりの壁の厚い不動胞子よりも有益である。
【０１８３】
本発明の方法由来の色素抽出物は、産業において実践されるように光栄養的に生成された材料からの色素抽出物と同様に取り扱い、加工し、使用される。例えば、エタノール性抽出、超臨界流体抽出、および加圧液体抽出は、パーソナルケアおよび化粧品成分産業において許容可能な実践である。光合成的に成長し、明条件でカロテノイド類を蓄積するように誘導されたヘマトコッカス（Haematococcus）バイオマスからの抽出物は、圧倒的にアスタキサンチンのみからなる（総カロテノイド類の約８５％から９９％まで）ことが周知であり、本発明の方法を使用して従属栄養的に成長したヘマトコッカス（Haematococcus）からの色素性バイオマスの抽出物は、圧倒的なアスタキサンチンプロフィールをもたらすだけでなく、パーソナルケア特性を有する多様な自然でかつ有用な色素の独特の混合物ももたらすことができる。そのような数種の新規混合物は図３に示され、非限定的である。生産ランの経過中の細胞成長および栄養素消費による計算された枯渇キネティクスにより内在的に起こりうる、従属栄養的硫酸塩枯渇（図３Ａ）は、例えば、独特のルテイン豊富でアスタキサンチン豊富なカロテノイド組成物をもたらし、ここで、ルテインはアスタキサンチンの量の半分を構成することができ；カロテンとルテインは総カロテノイド類の３分の１超（３７％）を構成し；アスタキサンチンは半分超（５７％）を構成する。これは、ルテインによる（太陽放射または電子デバイスのスクリーンからの人工光からの高エネルギーの可視ブルーライトを含む）ブルーライトのフィルトレーション、ＵＶ損傷、酸化的ストレスおよびアスタキサンチンによる炎症からのさらなる保護に有用である。この新規抽出物は、眼の網膜の健康、さらに皮膚の着色に利益をもたらすために現在個別に消費または適用されている化合物を併せて送達する役割を果たす。生物活性化合物のこの天然の融合は、第２の細胞型、例えば、いくらか異なる波長（ルテインについては約４２０〜５２０ｎｍ、フコキサンチンについては３８０〜４８０ｎｍ）における追加のブルーライト保護のためのフコキサンチンおよびジアジノキサンチンを自然に含有する珪藻植物、をさらに含みうる。スキンケアならびに飼料適用において価値のあることが認められているカロテノイドである、カンタキサンチン（５％まで）も色素混合物を構成することができる（図３）。
【０１８４】
不動胞子シストに分化しない従属栄養細胞の順応的な色素プロフィールは、尿素枯渇（図３Ｂ）または色素プロフィールが類似したアンモニウム蓄積、リン酸塩枯渇、もしくは外因的に与えられた浸透圧ストレス（図３Ｃ）について計算されたキネティクスを採用することにより、藻類生成物の他の用途のために改変し、または個別化することができる。通常、抽出された樹脂は、尿素ストレスによるなど顕著に油性であるか、または硫酸塩ストレスによるなど比較的油性でなくてもよく、フィトステロールを含む。例として、微細藻類バイオマスの抽出により生成されたオレオ樹脂は、Ｃ１６：０（２９％）、Ｃ１８：１ω９（２０％）、Ｃ１８：１ω７（３．５％；皮膚の健康をサポートすると言われているオメガ７脂肪酸を含む）、Ｃ１８：２ω６（２１％；有益な皮膚細胞オートファジーを誘導することが報告されているリノレン酸を含む）、Ｃ１８：３ω３（７％）およびＣ２０：４ω６＋Ｃ２０：５ω３（１．５％）からなる脂肪酸を含有する。
【０１８５】
本発明の方法により生成された化粧品原料の一例は、Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ  Ｐｌｕｖｉａｌｉｓ  ＥｘｔａｃｔというＩＮＣＩ名称を有するＡｓｔａＦｕｓｉｏｎ（ＣＡＳ登録番号１１７４７５６−７８−５）である。抽出された樹脂は、アスタキサンチンとカロテン、ルテイン／ゼアキサンチン、およびカンタキサンチンと天然の琥珀中の微量カロテノイド類を結合して、市場における現行の藻類アスタキサンチン原材料中には見出されないオレンジ色のブレンドとする。
【０１８６】
色素の融合物は、数多くのより広いパーソナルケアの健康効果に相乗的に働きうる。例えば、局所的スキンケア製品におけるブルーライトフィルターとして、エタノールによりバイオマスから抽出したＡｓｔａＦｕｓｉｏｎ樹脂は、主成分ルテイン＋カロテン（またはルテインのみ）が、ブチレングリコール、スクアランまたはオイル中に最終的な内包率０．００５〜０．０５％で分散されている。樹脂は容易に溶解して、例えば、１％のアルファトコフェロールにより保存された体積で４０％のスクアラン中、５０〜６０％の藻類オレオ樹脂、または７０％の植物油中３０％の藻類オレオ樹脂を生成する。パフォーマンスデータのために、光防護活性値は、当分野で公知のとおり、Ｍｉｎｏｌｔａ  Ｃｈｒｏｍａ  Ｍｅｔｅｒにより皮膚表面の赤みを測定することにより決定可能である。広く作用するスキンセラム、クリームおよびオイルにおいて、遺伝的、生化学的および生理学的、ならびにインビボの効果を達成するために、内包率は、アスタキサンチンをベースとして、最小で約１．５〜３μｇ／ｍｌのアスタキサンチン（５〜１０μＭ）から、より好ましくは６μｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは約３０μｇ／ｍｌ（約５０μＭ）に及ぶと計算されうる。例えば、ＡｓｔａＦｕｓｉｏｎは、１．０ｍＬの反応あたり４．８μｇのアスタキサンチンを含有するヘマトコッカス・プルビアリス（Haematococcus pluvialis）ＫＡＳ１６０１からの乾燥エタノール抽出物由来の約３５％のコラゲナーゼ阻害についての能力を示した。
【０１８７】
別の例として、当分野で公知のとおり、正常なヒト線維芽細胞株中で差次的に発現された遺伝子を同定するためのＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨＴ−１２遺伝子チップを使用する予備的なトランスクリプトーム−ワイドマイクロアレイ研究に基づいて、ＡｓｔａＦｕｓｉｏｎによる処置後のさらなる研究の標的は、皮膚マトリックス分解性ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９）の発現を、ＴＦＰ１２遺伝子の活性により低減させること；Ｅ２Ｆ７およびＩＲＦ１の高発現を介して主要な制御ポイント転写因子ｐ５３／ＴＰ５３を活性化すること；および減少したＴＸＮＩＰの遺伝子発現による酸化的ストレスからの細胞の改善された保護のための能力を含みうる。
【０１８８】
皮膚の弾力性、皮膚の水和、皮膚表面の脂質レベル、皮膚脂質の過酸化、しわの出現が挙げられるが、これらに限定されない他の効果も、当分野で公知であるとおりに測定可能であり、フリーラジカルクエンチング、抗酸化剤の能力、オートファジー、ＤＮＡ保護、テロメアサポート、および抗炎症効果ならびにＮＯ、ＴＮＦ−αおよびＰＧＥ２、ＣＯＸ２などの生成が挙げられるが、これらに限定されないサイトカイン調節測定因子が挙げられるが、これらに限定されない実験室試験において測定可能である。
【０１８９】
経口摂取される栄養素サプリメントとして、アスタキサンチンおよび他の抗酸化剤および抗炎症性色素が、皮膚のサポート、ならびに関節の健康、ＵＶ保護、スポーツパフォーマンスの回復、ロバストな免疫機能、アンチエイジング、エネルギー増加、認知的健康、ならびに向知性および心血管サポートについて公知である。粉砕されたバイオマスからの超臨界流体により抽出されたＡｓｔａＦｕｓｉｏｎ樹脂は、サフラワーの食用油中に分散されたアスタキサンチンを主成分として調製される。或いは、当分野で公知であるとおり、原料がビーズレットおよび粉末に製剤化される。これらは、マーガリン、食用油およびスナック、飲料、スープ、ソースおよびドレッシング、シリアル、および菓子のような形態にあることのできる食品およびサプリメントの栄養価を高め、着色するために使用され；８０μＭ以下の経口用量が顔のしわに対して有益な効果を有することが公知である。実証されたヒトの栄養素サプリメントは、ペットフードに含めることまたはペットのおやつへの入り口としての役割を果たしうる。化粧品原料としての使用のための別の例として、クラミドカプサ（Clamydocapsa）の従属栄養成長した色素性バイオマス全体が、リポソームまたはリン脂質キャリアの存在下で溶解され、またはマルトデキストロースで処理されて、スキンケア製剤のための生物活性材料を生成した。
【０１９０】
[実施例１０]
クラミドモナス（Chlamydomonas）、クラミドカプサ（Clamydocapsa）およびクロロモナス（Chloromonas）由来のトランスジェニック従属栄養色素性細胞
この実施例は、細胞分裂せずに所望の成長速度において色素を生成する、クラミドモナス（Chlamydomonas）、クラミドカプサ（Clamydocapsa）およびクロロモナス（Chloromonas）を対象とする。コナミドリムシ（C. reinhardtii）を使用する１つの明示において、Ｈ．プルビアリス（H. pluvialis）由来のベータカロテンケトラーゼおよびカロテノイドヒドロキシラーゼを、米国特許出願公開第２００９０３１７８７８号に記載のようにＣＯ２誘導性発現のためのプロモーターおよび当分野で公知のとおりＨ．プルビアリス（H. pluvialis）またはコナミドリムシ（C. reinhardtii）由来の任意選択の内因性制御エレメントを含有するプラスミドにクローニングした。さらに、例えば、米国特許第７，１２９，３９２号に記載のとおり、ＩＰＰイソメラーゼおよびメバロン酸経路の使用は、イソプレノイド生成を高める。プラスミドをコナミドリムシ（C. reinhardtii）の核に形質転換し、遺伝子導入系を当分野で公知のとおりに選択した。遺伝子導入系を色素含有量、実施例８および実施例４に記載の従属栄養成長についてそれぞれスクリーニングした。バイオ水素の副産物が、実施例１１に記載の方法を使用する発酵の最後の数時間の間に生み出される。別の明示においては、通常は栄養枯渇およびハイライト（クラミドモナス目（Chlamydomonadales）の２段階プロセス）に曝露された後、細胞分裂を受けることによって、色素の蓄積が高まる、クラミドモナス（Chlamydomonas）、クラミドカプサ（Chlamydocapsa）またはクロロモナス（Chloromonas）の細胞を、実施例３に記載のとおりに培養して、光、栄養枯渇および細胞分裂の非存在下で色素性栄養細胞を得た。
【０１９１】
[実施例１１]
バイオ水素生成物を生成するように改変されたＨ．プルビアリス（H. pluvialis）のトランスジェニック従属栄養細胞
この実施例は、独立型の生成物としてのまたは色素もしくは他の蓄積する化合物の副産物としてのバイオガスを記載する。コナミドリムシ（C. reinhardtii）由来のヒドロゲナーゼＡ１およびＡ２（ＨＹＤＡ１およびＨＹＤＡ２）を（ＨＹＤＥＦとしてコナミドリムシ（C. reinhardtii）中で融合された）補助タンパク質ＨＹＤＥ、ＨＹＤＦおよびＨＹＤＧとともにプラスミドにそれぞれの内因性制御エレメント（または任意選択のアンモニウム誘導性プロモーター）とともに当分野で公知のとおりにクローニングした。当分野で公知のとおり、プラスミドをＨ．プルビアリス（H. pluvialis）の核に形質転換した（Sharon-Gojmanら、2015年）。実施例８に記載のような好ましい菌株を選択するために、遺伝子導入系を色素含有量、従属栄養成長についてスクリーニングした。好気性条件下で高レベルの内部デンプンを含む十分な色素性バイオマスが生成した後に、副産物（バイオ水素）および導入遺伝子のｍＲＮＡレベルを、無酸素条件（嫌気性発酵）下でスクリーニングした。Ｈ２発生の持続時間は、デンプン異化が暗条件での発酵条件下でヒドロゲナーゼに電子を供与するときに細胞内に貯蔵された炭化水素の量に比例する。色素またはアスタキサンチンが、（形成したエタノール、乳酸塩、またはギ酸塩によるストレスとともに）溶解酸素が非常に低度である発酵によりストレス負荷された細胞中に蓄積するため、これは特に有利なプロセスである。こうして、発酵の最後の数時間は、必要に応じて、２つの生成物（１つは高価値および１つは低価値）を生成するために使用されうる。有利なことに、抽出により、このバイオマスは、内部貯蔵されたデンプン（重量）が細胞外生成物に転換されたため、より高い色素含有量を有するように見える。野生型または遺伝子改変されたクラミドモナス（Chlamydomonas）種も、当分野で公知のとおり、バイオガスのために使用されうる。本発明の方法は、体積基準でのより高いバイオマス収穫量、より高いバイオガス生産性とともに、以前にはこれらのクラミドモナス目（Chlamydomonadales）についての塩阻害により可能でなかった短期間でのより高いバイオマス密度を可能とする。４．３ｇ／Ｌのバイオマス培養からの嫌気性条件下で時間あたり約０．９６ｍｍｏｌＨ２／ｇ乾燥重量の生産性率は、例えば、YuおよびTakahashi、2007年により示されたコナミドリムシ（C. reinhardtii）における時間あたり０．１３ｍｍｏｌＨ２／Ｌからは著しい改善である、体積基準で時間あたり４．１３ｍｍｏｌＨ２／Ｌまでの水素を０．１３５ｇ／Ｌの計算された低い細胞密度で発生させる。
【０１９２】
[実施例１２]
目的の組換え生成物を生成するために改変された従属栄養細胞
この実施例は、好ましい成長速度および比生産性により培養されて、本発明の方法を使用するフェドバッチ発酵を使用して組換え生成物を生成する、従属栄養細胞を対象とする。（色素、テルペン、バイオ水素のような）すでに例示した分子に加えて、本発明に有用な組換え細胞は、目的の（ｄｓＲＮＡを含む）異種ＲＮＡまたは異種タンパク質を生成する。そのような組換え細胞は、当分野で公知のとおりに遺伝子操作され、水産養殖および畜産における経口療法、作物保護、病害防除および健康増進、香味料および芳香剤が挙げられるが、これらに限定されない多くの分野における適用を有する（Somchaiら、2016年；Ceruttiら、2011年；Machadoら、2014年；Kumarら、2013年；Gimpelら、2015年）。本明細書では明示は、コナミドリムシ（C. reinhardtii）におけるプラスチドのタウマチン遺伝子発現について（タウマチンは、香味付けおよび香味マスキングのために使用されるタンパク質である）、およびｄｓＲＮＡ発現について与えられる。プラスチド発現は、複雑なタンパク質を発現することが周知であり、プラスチドとしてのｄｓＲＮＡはＤＩＣＥＲ／ＲＩＳＣ複合体のＲＮＡｉプロセシングを欠く。コナミドリムシ（C. reinhardtii）ＫＡＳ１４０２のａｔｐＢ欠損突然変異体を、ｒｐｓ１４プロモーターにより制御された葉緑体コドンが最適化されたタウマチンとともにａｔｐＢおよび制御エレメントを含有するベクターＫ４９７でコーティングした０．６ミクロンの金微粒子を用いる微粒子銃（１１００ｐｓｉ、標的距離６ｃｍ）により、形質転換した。固定炭素源を欠く培地において、光合成的に遺伝子導入系を選択した。３回の単一コロニー選択および酢酸を欠く培地における単離（光合成的）の後、遺伝子導入系を実施例３におけるとおりの従属栄養成長条件に移動した。発現解析を、製造者の指示に従ってプライマー５８５：ＣＴＧＣＴＡＴＴＴＣＧＡＣＧＡＣＡＧＴＧおよび５８６：ＡＣＧＡＧＡＡＣＴＣＣＧＣＴＡＡＡＧＴＧを使用して、ｑＲＴ−ＰＣＲにより進める（ｉＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  Ｗｉｔｈ  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  １７０−８８９２）。遺伝子導入系におけるタウマチンｍＲＮＡレベルは、葉緑体ハウスキーピング遺伝子、Ｒｐｌ１４レベルと同様であったが、野生型において発現は見られなかった。１２０時間、１０ｇ／Ｌの細胞密度において０．１％で収穫した組換えタンパク質は、時間あたり０．０８ｍｇ／Ｌのｑｐをもたらし、より高い収穫密度では、これは時間あたり０．０８ｍｇ／Ｌを超えるであろう。コナミドリムシ（C. reinhardtii）ＫＡＳ１４０２におけるｄｓＲＮＡ発現については、タウマチンを発現ベクター中で、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔにより合成され、ベクターＫ５８８（図５）中に示される（Kumarら、2013年から改作した）３−ＨＫＴ遺伝子断片のための７８９ｂｐ配列の逆方向反復コンストラクトで置換する。当分野で公知のとおり、対抗プロモーターを使用することにより、代わりのベクター構成が転写後に生成されるｄｓＲＮＡについて可能である。選択されたコロニーを、実施例３および４に従って従属栄養的に成長させる。１日あたり０．７を超える７２時間の最初の比成長速度の証明は、工業製造への規模拡張のための適合性��示している。実施例３および４に従って、４日間にわたる持続的な１．０／日の比成長速度のために、フェドバッチ発酵を使用して、１００Ｌリアクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＢｉｏＦｌｏ６１０）中で培養を５０Ｌに規模拡張する。分析目的のためおよびキネティクスを確立するために、連続的遠心分離（ＷＶＯ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  Ｐｏｗｅｒ  Ｂｅａｓｔ  ３５００ｒｐｍ遠心分離機）を使用してバイオマスを水切りし、凍結乾燥した（１２Ｌ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  ２３０−６０  ＦｒｅｅＺｏｎｅ  ＬａｂＣｏｎｃｏ凍結乾燥機アセンブリ）。
【０１９３】
より小さな規模では、ｄｓＲＮＡ発現および蓄積を、ＲＮＡａｓＡ処理した総ＲＮＡの標準物質に対するゲル電気泳動により試験する。密度測定は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）による。最初のｄｓＲＮＡ値は、これらが、１２０時間以上で、細菌において報告されたもの、すなわち、１０８細胞個あたり４００ｎｇ（Kimら、2015年）；または葉緑体を形質転換した植物（transplastomic plant）について報告された総細胞ＲＮＡの０．０５％〜０．４％（Zhangら、2015年）を超えた場合にうまくいったと考えられる。１２０時間における１０ｇ／Ｌの細胞集団からの０．０５％の組換えＲＮＡは、時間あたり０．０４ｍｇ／Ｌのｑｐをもたらす。ｑｐは、例えば、０．２ｇ／Ｌよりも多いより大量の種菌によるより高い開始細胞密度、１．７／日以上のようなより高い比成長速度、および１２０時間を超えて延長するより長いサイクル時間を含む、培養条件の改善によりベースラインを少なくとも１５％超えて増加すると予想される。
【０１９４】
核遺伝子組換えおよび誘導性プロモーターを使用して遺伝子改変された細胞も、本発明の方法により従属栄養的に培養されるのに適している。例えば、ｒＲＮＡ遺伝子座の遺伝子間配列ＩＧＳスペーサー領域プラスプロモーターおよび隣接配列を含む核ベクターの使用は、挿入配列の発現を可能とする。核誘導性プロモーターＡＭＴ１；２  ５’ＵＴＲ（米国特許第９，４８７，７９０号）は、培養培地中の低硝酸塩（＜０．１ｍＭ）、高アンモニウム（７．５ｍＭ）に反応性である藻類において導入遺伝子発現システムを提供する。本発明の方法を使用して、初期バイオマス蓄積のために最初に実施例３におけるとおりに維持された尿素を含み硝酸塩を欠く培地中で従属栄養的に成長したクラミドモナス（Chlamydomonas）細胞および細胞培養は、最後の３６時間の培養に高められたアンモニウム（７．５ｍＭに維持される）が提供された場合、誘導された遺伝子発現を経験する。これは、誘導性Ｄｉｃｅｒ抑制を使用して加えられた核発現によりｄｓＲＮＡのレベルを増加するための戦略にとって、または核発現に適した他の配列にとって有用である。ＡＭＴ１；２アンモニウムトランスポーター遺伝子プロモーターを使用する導入遺伝子転写は、アンモニウムまたは硝酸塩の存在下で強く抑制され、その非存在下で急速に誘導される。初期ｄｓＲＮＡ値は、当分野において公知であるとおりに測定された１０８細胞個あたり４０ｎｇの核トランスジェニック藻類において報告されたものを超える（Somchaiら、2016年）。
【０１９５】
スケールアップ目的のために、任意の数の手段による−内部ペイロードのバイオアベイラビリティを促進するための−バイオマス微粉砕が、当フィールドでの適用の前の下流のプロセシングの一部として使用されることができ；微細藻類のビーズ粉砕またはドライピン粉砕が細胞をクラッキングすることにおいて有効である。ＵＶ曝露された藻類内部のｄｓＲＮＡの半減期は、アガロースゲル電気泳動およびゲル分析ソフトウェアによる染色されたバンドの定量化により経時的にｄｓＲＮＡの完全性についてモニターしたとおり、粉砕により影響されない。しかしながら、細胞破壊は、水塊中または植物部位上の摂食中の幼生への藻類の被包性ｄｓＲＮＡの曝露には必要でなく、湿ったバイオマスも利用可能である。葉上での幼生への給餌は体重増加または５０％の水制御における７日後の死亡率を示し；幼虫の重量、齢期および死亡率（不動性）は、当分野で公知のとおり、葉片および全植物を使用して分析される（例えば、Zhangら、2015年）。無処置のおよび粉砕された細胞について、幼生の健康に対する濃度−応答が（葉または水体積あたりのμｇ等量のｄｓＲＮＡとして測定した）藻類用量について見られる。
【０１９６】
一般に安全であると考えられているため、動物飼料における嗜好性を促進するために適切なレベルのタウマチンを送達するため、あるいは家禽飼料において乳タンパク質を使用する抗生物質補充などのために同じ方法で生成されうる他の組換え分子、または蚊もしくは他の昆虫および線形動物を防除するためのｄｓＲＮＡベースの微細藻類性幼虫駆除剤も送達するためにクラミドモナス（Clamydomonas）バイオマスが用量設定されうる。
【０１９７】
[実施例１３]
多様な表現型の従属栄養培養
この実施例は、栄養成長に好都合な条件により培養される新規従属栄養細胞型および本発明の方法を使用して生成物を作製することを対象とする。コナミドリムシ（C. reinhardtii）を例として用いて、菌株ＫＡＳ１６０２（ＣＣ−１２５または１３７ｃに由来する変異体）を実施例３におけるとおりに従属栄養フラスコ培地中で成長させた。この細胞型は、無鞭毛性で葉緑素を欠き、栄養細胞としての緑色の概観よりも（一部、ルテイン／ゼアキサンチンに由来する）黄色であると特徴付けられる。これは、３０μＥの光とともに振とうフラスコ中で１週間、細胞を成長させ、次いで、（暗条件での静止フラスコとして）実施例３のフラスコ培地における従属栄養成長に資する条件で２週間、継代培養し、光源を容器上部に提供したときに走光性である能力のないことに基づいて鞭毛性細胞から単離するために、混合栄養条件下で蘇生された、先に凍結保存された細胞の個体群に由来した。これは、従属栄養下でロバストな成長により多くの世代の間、その表現型を保持した。この実施例は、例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒから得た突然変異体菌株ｌｔｓ１−３０ｍｔ−（ＣＣ−２３５９）または当分野で記載された（例えば、色素突然変異体に関するMcCarthyら、2004年および鞭毛突然変異体に関するMcVittie、1972年）とおりに生み出されたようなフィトエンシンターゼ遺伝子の突然変異によってカロテノイド類を欠くかまたは無鞭毛であるか、あるいは光合成または鞭毛突然変異体としての他の欠損を有する、ＵＶ光誘導性および化学的に誘導されたクラミドモナス（Chlamydomonas）突然変異体にも関する。さらに、この実施例は、暗条件での成長を可能とするための遺伝子操作を受ける藻類にもあてはまる。これは、制限なく、栄養転換のためまたは当分野で公知の好ましい炭素原料の利用のためのものを含む通性従属栄養生物に遺伝子操作された偏性光栄養生物を含みうる。これは、変異体、突然変異体および遺伝子工学を通じて達成されたような、偏性従属栄養生物にされたまたは光合成能力が弱められた通性従属栄養生物も制限なく含む。発酵においては、無鞭毛性細胞型は、それがインペラー（傾斜ブレードまたはＲｕｓｈｔｏｎインペラー）からの機械的損傷を受けにくく、改善されたガス交換および栄養素の混合のための３５０ｒｐｍよりも高いｒｐｍでのファーメンター運転を可能とすることにおいて有利である。加えて、これは、暗条件において不必要な葉緑素を生成しないことにより低減された代謝負担からの利益を得る。結果として生じる、緑色または他の色素を欠くＫＡＳ１６０２および突然変異体菌株ｌｔｓ１−３０ｍｔ−（ＣＣ−２３５９）のバイオマスは、化粧品、飼料などにおける使用に望ましい。
【０１９８】
[実施例１４]
混合栄養培地組成およびマクロ独立細胞Ｈ．プルビアリス（H. pluvialis）による色素生成
この実施例は、従属栄養成長が３０μＥの光の下での混合栄養成長により置換されたような、有機酸および尿素を含む栄養培地を含む実施例３の変更である。Ｈ．プルビアリス（H. pluvialis）ＫＡＳ１６０１の比成長速度は、０．０５ｇ／Ｌで開始した培養のバイオマスが９６時間で９．０ｇ／Ｌに達するような、１．５／日に達した。バイオマスの色素含有量は、２．２ｍｇ／Ｌ／時間のｑｐに相当する２．３％に達する。任意選択により、本発明の方法は、（話の中で議論されるような）当分野で公知のとおり、追加の仕上げステップにより藻類生成物を得るために実践されうる。例えば、加えられたストレスまたは光または誘導物質は、生成物収率を高めるためまたは高められた生成物含有量を有するシストを形成するために供給されうる（例えば、アスタキサンチン豊富なシストについては図２右下を参照されたい）。
【０１９９】
[実施例１５]
非シスト形成微細藻類由来の着色補助剤および栄養素サプリメント
新しいプロセスは、ビタミンおよびミネラルとともに高タンパク質、低灰分を含み、栄養的、健康または着色の利益を付与する新しい生成物組成をもたらす、クラミドモナス目（Chlamydomonadales）からの色素性バイオマスの実質的に新しいプロフィールを提供する。家禽および魚類などのための飼料添加物のために、これらの利益は、魚類由来の成分により提供されるものに匹敵するが、着色のための色素沈着を提供する目的に役立つ。食物の代用となる飲料または栄養サプリメントのために、組成物は、栄養素添加の目的に役立つ。供給源である微細藻類次第で、食品としての組成物は、付随すると考えられる着色剤の任意の性質を有する、食事中のカロテノイド源であることができ、またはベータカロテンの場合のように、この材料は栄養素サプリメントおよび色添加物の両方として使用されうる。上記のように成長したバイオマスは、ファーメンターから収穫され、凍結乾燥され、次いで、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  Ｆｅｅｄ  Ｌａｂ（Ｔｒｅｎｔｏｎ  ＮＪ）などにより実行されるＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｎｓｔｓ（ＡＯＡＣ）の方法に従って、その主要構成要素について分析される。シスト形成していないバイオマスは次いで、当分野で公知のとおり、飼料配合物および着色または食品添加に適した形態に加工される。色素性の栄養細胞のタンパク質含有量は、本質的にシスト形成細胞または光誘導性細胞のそれの２倍であり、ヘマトコッカス属の種（Haematococcus spp.）またはドナリエラ属の種（Dunaliella spp.）のような飼料または食材において使用される商業的な色素性バイオマス全体における０．１９〜０．２４ｇ／ｇ  ＤＷタンパク質に比べて０．４〜０．５ｇ／ｇ  ＤＷタンパク質からなる（Lorenz、1999年；GRAS Notice grn000356；GRAS Notice grn000276；MuhaeminおよびKaswadji、2010年)。灰分は、０．１６〜０．１８ｇ／ｇ  ＤＷ灰分から約０．０３〜０．０９ｇ／ｇ  ＤＷ灰分まで約５０〜８０％低減される。よって、低灰分含有量とともに高タンパク質を含む新しい組成物は、重量ベースでより高い総合的な栄養価値を有し；魚類タンパク質は現在、価格が１５００ドル／トンを超え、よって、一方で着色添加物（すなわち、着色剤）を送達する藻類タンパク質に置き換えられることが好ましい可能性のある飼料への実質的な投入原価を表す。これはまた、（アスタキサンチン抽出後に残るような）シスト形成バイオマス由来の脱脂ヘマトコッカス（Haematococcus）食物と比べて、かなり低量の繊維を有することにより異なることが好都合である：シスト形成バイオマス由来の脱脂された食物は、０．４ｇ／ｇ  ＤＷタンパク質により、タンパク質含有量はほぼ同様に等しいが、望ましくなく高い量の０．４ｇ／ｇ  ＤＷ繊維も有する。アスタキサンチンは、サケ飼料１ｋｇあたり８０ｍｇまでを構成する（WrolstadおよびCulver、2012年）が、タンパク質豊富なフィッシュミールは飼料１ｋｇあたり２００ｇを構成しうる（Hatlenら、2013年）。飼料１ｋｇあたり８０ｍｇのアスタキサンチンでは、０．７％の色素含有量を有する１１．４ｇ藻類／ｋｇ飼料が必要であり；これは、収益化されうるタンパク質としての藻類バイオマスの５０％を含み、３％のフィッシュミール置換率を提供する。
【０２００】
すべての図面および表を含む、本明細書において参照され、または引用されるすべての特許、特許出願、仮出願および公開は、本明細書の明示的教示と矛盾しない範囲まで、参照することによりその全体が組み込まれる。
【０２０１】
本明細書に記載の例および実施形態は、例示目的のみのためであり、それに照らした多様な改変または変更が当業者に示唆され、本願および添付された特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれることは理解されなければならない。加えて、本明細書に開示される任意の発明またはその実施形態の任意の要素または限界は、（個別にまたは任意の組合せで）すべての他の要素または限界あるいは本明細書に開示された任意の他の発明またはその実施形態と併合されることができ、そのようなすべての組合せは、それに対する制限なく、本発明の範囲から想定される。
【０２０２】
【表１】
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【０２０３】
特許および特許出願公開
１．米国特許第６０２２７０１号
２．米国特許第５８８２８４９号
３．米国特許第８２０６７２１号
４．欧州特許第１７２４３５７号（米国特許出願公開第２００８００３８７７４号）
５．欧州特許第２８７８６７６号（米国特許出願公開第２０１５０２５２３９１号）
６．米国特許出願公開第２０１２０２６４１９５号
７．欧州特許第１９９５３２５号
８．米国特許第８４０４４６８号
９．米国特許第８９１１９６６号
１０．米国特許第８２７８０９０号
１１．米国特許第７３２９７８９号
１２．欧州特許出願第２００３０７２１１７５号
１３．米国特許出願第２００９０２１４４７５号
１４．米国特許出願公開第２００９０３１７８７８号
１５．米国特許出願公開第２０１２０１７１７３３号
１６．米国特許第４６８３２０２号
１７．米国特許出願公開第２００９０３１７８７８号
１８．米国特許第７１３５６２０号
１９．米国特許第７６１８８１９号
２０．米国特許第７１２９３９２号
２１．国際公開第２００３０２７２６７号パンフレット
２２．米国特許第９４８７７９０号
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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