(57)【要約】  本発明は、（ａ）対象由来の試料を準備するステップであって、前記試料が、血液、血清及び血漿からなる群から選択されるステップ；（ｂ）次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０及びＶＥＧＦの前記試料中の濃度を決定するステップ；（ｃ）（ｂ）において決定された各バイオマーカー濃度を十分位値に変換するステップ；並びに（ｄ）（ｃ）の十分位値を次の特異的分位カットオフ値と比較することによって各十分位値をバイナリ存在又は非存在に変換するステップを含む、対象におけるＴＢの診断のための方法であって、特異的分位カットオフ値に合致する又は超えている十分位値がバイオマーカーのバイナリ存在に変換され、特異的分位カットオフ値より低い十分位値がバイオマーカーのバイナリ非存在に変換され；前記バイオマーカーそれぞれの存在を検出することが、対象がＴＢを有することを示す、方法に関する。本発明は、使用、キット及びデバイスにも関する。
2019510206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）対象由来の試料を準備するステップであって、前記試料が、血液、血清及び血漿からなる群から選択される、ステップ；
（ｂ）次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０、及びＶＥＧＦの前記試料中の濃度を決定するステップ；
（ｃ）（ｂ）において決定された各バイオマーカー濃度を十分位値に変換するステップ；並びに
（ｄ）（ｃ）の前記十分位値を次の特異的分位カットオフ値と比較することによって各十分位値をバイナリ存在又は非存在に変換するステップ：
【表１】
2019510206.tif 000014
を含む、対象におけるＴＢの診断のための方法であって、
前記特異的分位カットオフ値に合致する又は超えている十分位値が前記バイオマーカーの前記バイナリ存在に変換され、前記特異的分位カットオフ値より低い十分位値が前記バイオマーカーの前記バイナリ非存在に変換され；
前記バイオマーカーそれぞれの存在を検出することが、前記対象がＴＢを有することを示す、前記方法。
【請求項２】
（ｂ）において決定された各濃度を十分位値に変換するステップ（ｃ）が、
（ｃｉ）（ｂ）において決定された各バイオマーカーの濃度を前記バイオマーカーの濃度の基準度数分布と比較するステップ；及び
（ｃii）前記バイオマーカーの濃度についての前記度数分布から前記十分位値を読み出すステップ
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各バイオマーカーの濃度を決定するステップが、
（ｂｉ）試料を前記バイオマーカーに特異的に結合可能である抗体又はその抗原結合性断片と接触させることによる検出；及び
（ｂii）前記結合の定量
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
各バイオマーカーの濃度を決定するステップが、前記バイオマーカーについてのｍＲＮＡの検出を含み、前記ｍＲＮＡの検出が、
（ｂｉ）試料を前記バイオマーカーについての特異的核酸プローブ（複数可）又はプライマー（複数可）と接触させるステップ；及び
（ｂii）前記プローブ（複数可）又はプライマー（複数可）の定量
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
試料が血清又は血漿の試料である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
血清又は血漿が本質的に細胞不含有である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
対象が１６歳以下、好ましくは１５歳以下である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
対象が２歳以上、好ましくは５歳以上である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
対象が５〜１５歳である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
試料中のバイオマーカーＥＣ刺激ＶＥＧＦ（特異的分位カットオフ値２）の濃度を決定するステップをさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０、及びＶＥＧＦのそれぞれの特異的検出のための試薬（複数可）を含むキット。
【請求項１２】
次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０、及びＶＥＧＦのそれぞれをコードするｍＲＮＡの特異的検出のための試薬を含むキット。
【請求項１３】
次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０、及びＶＥＧＦのそれぞれに、一緒になって特異的に結合可能である物質のアレイを含むデバイスであって、前記アレイ内の各物質が前記バイオマーカーの１つに特異的に結合可能である、前記デバイス。
【請求項１４】
次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０、及びＶＥＧＦのそれぞれに特異的なｍＲＮＡを、一緒になって検出可能である物質のアレイを含むデバイスであって、前記アレイ内の各物質が前記ｍＲＮＡの１つを特異的に検出可能である、前記デバイス。
【請求項１５】
ラテラルフローデバイスである請求項１３又は１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法を実行するステップを含む、対象を治療する方法であって、前記対象がＴＢを有すると判定された場合、２ＨＲＺＥ／４ＨＲ（２カ月間のＨＲＺＥに続く４カ月間のＨＲ、ここでＨ＝イソニアジド、Ｒ＝リファンピシン、Ｚ＝ピラジナミド、Ｅ＝エタンブトール）のレジメンが前記対象に投与される、前記方法。
【請求項１７】
対象におけるＴＢの治療のためのＨＲＺＥの使用であって、Ｈ＝イソニアジド、Ｒ＝リファンピシン、Ｚ＝ピラジナミド、Ｅ＝エタンブトールであり、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法が前記対象に実行され、前記対象がＴＢを有すると判定された場合、ＨＲＺＥが前記対象に２カ月間投与され、次にＨＲが前記対象に４カ月間投与される、前記使用。
【請求項１８】
最初の２カ月間、対象に１週間に少なくとも３回投薬する治療レジメンが選択される、好ましくは最初の２カ月間、前記対象に毎日投薬する治療レジメンが選択される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
対象におけるＴＢの治療のための、Ｈ  ７５ｍｇ＋Ｒ  １５０ｍｇ＋Ｚ  ４００ｍｇ＋Ｅ  ２７５ｍｇの錠剤であって、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法が前記対象に実行され、前記対象がＴＢを有すると判定された場合、ＨＲＺＥが前記対象に２カ月間投与され、その後Ｈ  ７５ｍｇ  ３錠＋Ｒ  １５０ｍｇ  １．５錠を４カ月間が投与される、前記錠剤。
【請求項２０】
治療レジメンを選択するための方法であって、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法を実行するステップを含み、対象がＴＢを有すると判定された場合、２ＨＲＺＥ／４ＨＲ（２カ月間のＨＲＺＥの後、４カ月間のＨＲ、ここでＨ＝イソニアジド、Ｒ＝リファンピシン、Ｚ＝ピラジナミド、Ｅ＝エタンブトール）の治療レジメンが選択される、前記方法。
【請求項２１】
次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０、及びＶＥＧＦの１つを認識する、特異的に結合する又は親和性を有する各々の物質の組合せの使用であって、前記組合せが対象におけるＴＢの診断を補助するために前記バイオマーカーそれぞれに対する少なくとも１つのそのような物質を含む、前記使用。
【請求項２２】
物質が、抗体又はその抗原結合性断片を含む、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０、及びＶＥＧＦの１又は２以上のｍＲＮＡを認識する、前記ｍＲＮＡに特異的に結合する、又は前記ｍＲＮＡに親和性を有する各々の物質の組合せの、対象におけるＴＢの診断を補助するための使用。
【請求項２４】
物質が、核酸プライマー又はプローブを含む、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
請求項１〜１０のいずれかに記載の方法を実行するために構成された論理回路を含む装置。
【請求項２６】
コンピューター上で実行された場合、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法ステップを実施するために作動可能なコンピュータープログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＢ、具体的には小児ＴＢの検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＢの検出は、特に小児において、課題である。現在の代表的な方法は、細菌学的評価を含む。しかし、喀痰試料は得ることが困難である場合がある。良好に得られたとしても、小児からの喀痰試料は桿菌の不足を示す場合があり、試料での直接検出を困難又は不可能にしている。これらの状況では、試料中の少量の桿菌を検出可能なレベルに増やすために培養が実行されなければならない。このことは、労力を要し、費用がかかり、特殊な実験設備を必要とし、欠点になる。さらに重要なことに、培養は小児において感度を欠いてさえいる。さらに、培養はおよそ６週間かかり、このことは診断を得ることに臨床的に重要な遅延をもたらし、患者予後の深刻な課題である。加えて小児から喀痰試料を得ることは、実行及び量の両方において特に困難である。確定診断なく患者、特に小児を推測治療に置くことは、大きな費用負担であり、医学的危険性及びそのようなステップが伴う複雑な事態である。
【０００３】
Dhanasekaran et al 2013 (Genes and Immunity vol 14 pages 356-364)は、南インドでのＢＣＧワクチン接種幼児における結核菌（Ｍ．ｔｂ．、Mycobacterium tuberculosis）感染及び疾患に対するバイオマーカーの同定を記載している。１１個のバイオマーカーの組合せが、中程度の識別能力だけを有して記載されている。未刺激全血上清は、サイトカイン発現差異を同定しなかった（pages 359-360）。
【０００４】
国際公開第２０１４／０２０３４３号パンフレット（Proteinlogic社）は、結核を診断する及び／又はモニタリングするためのバイオマーカーを開示している。この文書は、成人に注目している。小児ＴＢは、１度だけ言及されており、対象の年齢は特定されていない。唯一の例示は成人に限定されている。
【０００５】
Kumar et al 2013 (Clinical and Vaccine Immunology vol 20 pages 704-711)は、小児における肺結核及び肺外結核の循環バイオマーカーを開示している。これは、小児科ＴＢが血漿ＴＧＦベータ、ＩＬ−２１及びＩＬ−２３レベルの上昇と関連したことを開示している。これは、サイトカインについて、大部分の１７型及び１型インターフェロンについて、又は免疫モジュレーションに関連する大部分のサイトカインについて顕著な差異が見出されなかったことを開示している。
【０００６】
Hur et al 2015 (Journal of Infection vol 70 pages 346-355)は、結核の診断を改善する及び治療効果をモニタリングするための補助的バイオマーカーを開示している。ＶＥＧＦが考察されている。小児ＴＢの開示はない。
【０００７】
Serene et al 2012 (Biomarkers vol 17 pages 1 - 8)は、結核に臨床的に関連する宿主バイオマーカー：遺伝子及びタンパク質発現研究の概説を開示している。ＩＬ−６、ＩＬ−２２及びＩＰ−１０が言及されている。小児ＴＢの開示はない。
【０００８】
Sutherland et al 2012 (PLoS ONE vol 7 epub number: e30324)は、胸膜滲出の免疫学的分析による胸膜結核の高度に正確な診断を開示している。ＩＬ−６及びＩＰ−１０が言及されている。この研究は成人に注目している。この研究は胸水に注目している。
【０００９】
国際公開第２０１５／０４０３７７号パンフレット（Medical Research Council）は、結核に関するバイオマーカーを開示している。ＩＬ−１ｒａ、ＦＧＦ及びＶＥＧＦが言及されている。研究は、成人に注目している。研究は、喀痰に注目している。
【００１０】
診断のための現在の代表的な方法は、喀痰などの臨床検体での感染性病原体結核菌（Ｍ．ｔｂ．）の直接検出である。
【００１１】
活動性結核（ＴＢ、tuberculosis）疾患を他の呼吸器感染（ＯＤ、other respiratory tract infection）から識別することは、胸郭内ＴＢ疾患が疑われる小児の管理における主要な課題となっている。
【００１２】
本発明は、先行技術に関連する課題（複数可）の克服を追求する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０２０３４３号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１５／０４０３７７号パンフレット
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Dhanasekaran et al 2013 (Genes and Immunity vol 14 pages 356-364)
【非特許文献２】Kumar et al 2013 (Clinical and Vaccine Immunology vol 20 pages 704-711)
【非特許文献３】Hur et al 2015 (Journal of Infection vol 70 pages 346-355)
【非特許文献４】Serene et al 2012 (Biomarkers vol 17 pages 1 - 8)
【非特許文献５】Sutherland et al 2012 (PLoS ONE vol 7 epub number: e30324)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
先行技術の方法は、喀痰の分析に基づいている、又は白血球細胞の抽出及び操作（刺激など）に基づいている。対照的に、本発明者らは、その検出を、患者から採取された試料中で直接見出すことができる指標に基づくものとした。具体的には、本発明者らはその検出を、血液試料、及び血液試料中に存在するマーカーの直接検出に基づくものとした。これには、ポイントオブケア検査の開発にそれを役立たせるという有利点がある。これは、先行技術の一部である操作及び刺激を回避する有利点を有する。具体的には、有利なことには本発明は未刺激血液上清に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
したがって、一態様では本発明は；
（ａ）対象由来の試料を準備するステップであって、前記試料が、血液、血清及び血漿からなる群から選択されるステップ；
（ｂ）次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０及びＶＥＧＦの前記試料中の濃度を決定するステップ；
（ｃ）（ｂ）において決定された各バイオマーカー濃度を十分位値（decile value）に変換するステップ；並びに
（ｄ）（ｃ）の前記十分位値を次の特異的分位カットオフ値と比較することによって各十分位値をバイナリ存在又は非存在に変換するステップ：
【００１７】
【表１】
2019510206.tif 000003
【００１８】
を含む、対象におけるＴＢの診断のための方法であって、
特異的分位カットオフ値に合致する又は超えている十分位値がバイオマーカーのバイナリ存在に変換され、特異的分位カットオフ値より低い十分位値がバイオマーカーのバイナリ非存在に変換され；
前記バイオマーカーそれぞれの存在を検出することが、対象がＴＢを有することを示す、方法を提供する。
【００１９】
適切には、（ｂ）において決定された各濃度を十分位値に変換するステップ（ｃ）は、
（ｃｉ）（ｂ）において決定された各バイオマーカーの濃度を前記バイオマーカーの濃度の基準度数分布と比較するステップ；及び
（ｃii）前記バイオマーカーの濃度についての度数分布から十分位値を読み出すステップ
を含む。
【００２０】
適切には、（ｂ）において決定された各濃度を十分位値に変換するステップ（ｃ）は、
（ｃｉ）（ｂ）において決定された各バイオマーカーの濃度を前記バイオマーカーの濃度のカーネル密度推定値と比較するステップ；及び
（ｃii）前記バイオマーカーの濃度についてのカーネル密度推定値から十分位値を読み出すステップ
を含む。
【００２１】
適切には、基準度数分布又はカーネル密度推定値は、いくつかの対象、例えば最小限１００名の対象におけるバイオマーカーの濃度を測定すること、及びこれらの測定値を度数分布／カーネル密度推定値にコンパイルすることよって作成される。代替的に本明細書、図２〜９に示す度数分布（カーネル密度推定値）を使用することができる。本実施形態では、（ｂ）において決定された各濃度を十分位値に変換するステップ（ｃ）は、
（ｃｉ）（ｂ）において決定された各バイオマーカーの濃度を図２〜９から選択される前記バイオマーカーの濃度の対応する基準度数分布／カーネル密度推定値と比較するステップ；及び
（ｃii）前記バイオマーカーの濃度についての度数分布／カーネル密度推定値から十分位値を読み出すステップ
を含む。
【００２２】
適切には、各バイオマーカーの濃度を決定するステップは、
（ｂｉ）試料をバイオマーカーに特異的に結合可能である抗体又はその抗原結合性断片と接触させることによる検出；及び
（ｂii）前記結合の定量
を含む。
【００２３】
適切には、各バイオマーカーの濃度を決定するステップは、バイオマーカーについてのｍＲＮＡの検出を含み、ｍＲＮＡの検出は、
（ｂｉ）試料をバイオマーカーについての特異的核酸プローブ（複数可）又はプライマー（複数可）と接触させるステップ；及び
（ｂii）前記プローブ（複数可）又はプライマー（複数可）の定量
を含む。
【００２４】
適切には、前記プローブ又はプライマーは天然に存在しない核酸配列である。適切には、前記プローブ又はプライマーは人工又は人造分子である。適切には、前記プローブ又はプライマーは単離及び／又は精製されている。適切には、前記プローブ又はプライマーは１本鎖核酸を含む。適切には、前記プローブ又はプライマーはそれに結合している標識部分を含む。適切には、前記標識は共有結合している。適切には、前記標識は蛍光若しくは放射性標識又はＱｄｏｔ、ナノクリスタル若しくはナノ粒子、最も適切には蛍光標識であってよい。
【００２５】
適切には、前記試料は、血清又は血漿の試料である。
【００２６】
適切には、前記血清又は血漿は、本質的に細胞不含有である。
【００２７】
適切には、対象は１６歳以下、好ましくは１５歳以下である。適切には、対象は２歳以上、好ましくは５歳以上である。適切には、対象は５〜１５歳である。
【００２８】
一実施形態では、適切には前記方法は、前記試料中のバイオマーカーＥＣ刺激ＶＥＧＦ（特異的分位カットオフ値２）の濃度を決定するステップをさらに含む。
【００２９】
一態様では、本発明は、次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０及びＶＥＧＦのそれぞれの特異的検出のための試薬（複数可）を含むキットに関する。
【００３０】
一態様では、本発明は、次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０及びＶＥＧＦのそれぞれをコードするｍＲＮＡの特異的検出のための試薬を含むキットに関する。
【００３１】
適切には、前記試薬それぞれは、抗体又はＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ及びダイアボディからなる群から選択されるその抗原結合性断片を含む。
【００３２】
一態様では、本発明は、次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０及びＶＥＧＦのそれぞれに、総体として特異的に結合可能である物質のアレイを含むデバイスであって、アレイ内の各物質が前記バイオマーカーの１つに特異的に結合可能であるデバイスに関する。
【００３３】
一態様では、本発明は、次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０及びＶＥＧＦのそれぞれに特異的なｍＲＮＡを、総体として検出可能である物質のアレイを含むデバイスであって、アレイ内の各物質が前記ｍＲＮＡの１つを特異的に検出可能であるデバイスに関する。
【００３４】
適切には、前記デバイスはラテラルフローデバイスである。
【００３５】
一態様では、本発明は、上に記載される方法を実行することを含む、対象を治療する方法であって、対象がＴＢを有すると判定された場合、２ＨＲＺＥ／４ＨＲ（２カ月間のＨＲＺＥに続く４カ月間のＨＲ、ここでＨ＝イソニアジド、Ｒ＝リファンピシン、Ｚ＝ピラジナミド、Ｅ＝エタンブトール）のレジメンが前記対象に投与される方法に関する。
【００３６】
一態様では、本発明は、対象におけるＴＢの治療のためのＨＲＺＥの使用であって、Ｈ＝イソニアジド、Ｒ＝リファンピシン、Ｚ＝ピラジナミド、Ｅ＝エタンブトールであり、上に記載される方法が前記対象に実行され、対象がＴＢを有すると判定された場合、ＨＲＺＥが前記対象に２カ月間投与され、次にＨＲが前記対象に４カ月間投与される使用に関する。適切には、最初の２カ月間、前記対象に１週間に少なくとも３回投薬する治療レジメンが選択される、好ましくは最初の２カ月間、前記対象に毎日投薬する治療レジメンが選択される。
【００３７】
一態様では、本発明は、対象におけるＴＢの治療のためのＨ  ７５ｍｇ＋Ｒ  １５０ｍｇ＋Ｚ  ４００ｍｇ＋Ｅ  ２７５ｍｇの錠剤であって、上に記載される方法が前記対象に実行され、対象がＴＢを有すると判定された場合、ＨＲＺＥが前記対象に２カ月間投与され、次にＨ  ７５ｍｇ  ３錠＋Ｒ  １５０ｍｇ  １．５錠を４カ月間が続く、錠剤に関する。
【００３８】
一態様では、本発明は、上に記載される方法を実行するステップを含み、対象がＴＢを有すると判定された場合、２ＨＲＺＥ／４ＨＲ（２カ月間のＨＲＺＥに続く４カ月間のＨＲ、ここでＨ＝イソニアジド、Ｒ＝リファンピシン、Ｚ＝ピラジナミド、Ｅ＝エタンブトール）の治療レジメンが選択される、治療レジメンを選択するための方法に関する。
【００３９】
一態様では、本発明は、次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０及びＶＥＧＦの１つを認識する、特異的に結合する又は親和性を有する物質それぞれの組合せの使用であって、前記組合せが対象におけるＴＢの診断を補助するために前記バイオマーカーそれぞれに対する少なくとも１つのそのような物質を含む、使用に関する。適切には、前記物質は抗体又はその抗原結合性断片を含む。
【００４０】
一態様では、本発明は、次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０及びＶＥＧＦの１又は２以上のｍＲＮＡを認識する、特異的に結合する又は親和性を有する物質それぞれの組合せの、対象におけるＴＢの診断を補助するための使用に関する。適切には、前記物質は核酸プライマー又はプローブを含む。
【００４１】
一態様では、本発明は、上に記載される方法を実行するために構成された論理回路を含む装置に関する。
【００４２】
一態様では、本発明は、コンピューター上で実行された場合、上に記載される方法ステップを実施するために作動可能なコンピュータープログラム製品に関する。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
本発明者らは、小児ＴＢのための新規宿主バイオマーカーの同定を教示する。本発明者らは、小児におけるＴＢ疾患のための独自のバイオシグネチャーを同定できることを仮定した。
【００４４】
「ＴＢ」は結核を意味する；これは結核菌（ＭＴＢとも称される）によって引き起こされる疾患である。
【００４５】
簡易な診断検査を提供することはＴＢの分野における課題であった。検査は、信頼できる必要がある。検査は、正確である必要がある。特にＴＢが実験設備が乏しい場合がある及び／又は検査される患者から地理的に離れている場合がある発展途上国においてしばしば課題であることから、検査は理想的には最小限のツール／装置を伴うべきである。
【００４６】
試料
試料は、対象由来であってよい。対象は、適切には哺乳動物、最も適切にはヒトである。
【００４７】
適切には、方法は試料の実際の回収は含まない。適切には、試料はインビトロの試料である。
【００４８】
本発明の方法は、調査される対象から単離された試料に適切には実施される。したがって、適切には方法は、対象が存在する必要がない実験室設定で実行することができる方法である。適切には、方法はインビトロで実行される、すなわち適切には方法はインビトロでの方法である。適切には、方法は体外での方法である。
【００４９】
適切には、本発明は核酸の分析に適用することができる。適切には、核酸は所望の対象から回収された試料から、例えば試料中の白血球細胞からの核酸の抽出によって調製される。適切には、試料は核酸を含む。適切には、試料は核酸からなる。適切には、核酸は、ｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ、適切にはｍＲＮＡを含む、又はｍＲＮＡ若しくはｃＤＮＡ、適切にはｍＲＮＡである。
【００５０】
最も適切には、本発明はタンパク質バイオマーカーの分析に適用することができる。最も適切には、試料中のタンパク質が分析される。
【００５１】
適切には、試料はインビトロの試料である。
適切には、試料は体外試料である。
【００５２】
適切には、試料は血液である。
【００５３】
適切には、試料は血液上清である。
【００５４】
適切には、試料は血清である。血清は、凝固された血液試料から回収された液体として得ることができる。
【００５５】
適切には、試料は血漿である。血漿は、存在する血液細胞を沈殿させるために遠心分離された血液試料から回収された液体として得ることができる。代替的に血漿は、存在する血液細胞を除去するためのろ過によって得ることができる。
【００５６】
適切には、血液又は血液上清／血清／血漿は未刺激である。
【００５７】
解析が測定された各バイオマーカーをバイナリ出力に変換することは本発明の有利点である。例えば、検討された各サイトカインバイオマーカーは、バイナリ有／無データポイントに変換される。対照的に既存の先行技術アプローチは、定量的読み取りを必要とする。
【００５８】
診断精度が細菌培養に匹敵するレベルを達成していることは本発明の有利点である。細菌培養で経験されるものに相当する時間遅延がないことは、本発明の有利点である。
【００５９】
先行技術は、細胞、細菌細胞又は単離された血液細胞のいずれかを使用する。細胞が培養される必要がないこと、及び細胞が単離される必要がないことは本発明の有利点である。
【００６０】
宿主応答／宿主シグネチャーが分析されることは本発明の有利点である。理論に束縛されることなく、ＴＢに対する血液検査を作製するための現在の試みは、対象由来の免疫細胞にチャレンジすること及び刺激すること並びに応答を研究することに注目している。しかし、原理的にこのアプローチは、常に「リコール応答」を検討している。これは、ＴＢ細菌に既に遭遇したことがある免疫系の「メモリー」に由来する応答である。第１にこれは、細菌を用いた又は抗原を用いた試料の刺激を必要とし、労力を要し、費用がかかる。しかし、より重要なことに、原理的には、この種類のアプローチは二次応答をアッセイ可能であるだけである。対照的に本発明は、一次応答の評価に関係する。このことは、明らかにそれぞれ個々の患者が彼らの人生のある時点でＴＢに初めて曝露されることから、小児に適用される場合に特に重要であり、有用である。先行技術方法などの方法が二次応答を評価することだけに注目する場合、そのような対象がＴＢに初めて遭遇した応答を検出することは可能にならない。直接一次応答を評価することは、本発明の有利点である。
【００６１】
適切には、試料は細胞不含有試料である。適切には、試料は細胞を含まない。
【００６２】
適切には、細胞は遠心分離及び上清の回収によって血液試料から除去される。
【００６３】
細胞は、当技術分野において公知の任意の方法によって試料から除去されてよい。例えばろ過。
【００６４】
分析から細胞を排除する重要な理由は、赤血球細胞の存在のために血液が深い赤色をしていることである。典型的には、バイオマーカーの存在又は非存在を評価するために使用される検出ステップは、光感受性である。したがって、有利には試料は、全血の赤色によって混乱されることを回避するために細胞不含有である。原理的は、全血の深い赤色を避ける任意のアプローチを用いることができる。適切には、これは細胞溶解によってであってよい。さらに適切には、細胞は分析前に血液から除去される。適切には、これは遠心分離によってである。適切には、これはろ過によってであってよい。適切には、これはラテラルフローによってであってよい。
【００６５】
一部の設定では、本発明の方法において例えばラテラルフローを使用することによって全血試料を使用することが可能なことがある。この場合では、全血試料はラテラルフローデバイスに置かれる。次いで血漿／血清などの液体構成成分は、移動し、評価の時点では細胞不含有である。
【００６６】
ラテラルフローアッセイ及び他のデバイス
ラテラルフロー免疫クロマトグラフィーアッセイとも称される、ラテラルフロー検査アッセイ（ＬＦＡ、Lateral flows test assays）は、最小限のインフラを必要とし、迅速な医学的診断及びスクリーニング、ポイントオブケア検査又は研究的使用のための安価で簡易なデバイスを開発するために使用されている。アッセイは、ほとんどは定性的及び時に定量的分析のための、試料中の特定の標的分析物の存在の検出に基づいている。ＬＦＡの一般的な適用として、家庭用妊娠検査、糖尿病のモニタリング並びにＨＩＶ又は寄生虫及び細菌感染の迅速診断におけるその使用が挙げられる。総説（Sajid M, Kawde A, Daud M. Designs, formats and applications of lateral flow assay: A literature review. Journal of Saudi Chemical Society. 2014など）において広く考察されている通り、典型的ＬＦＡストリップは４つの部分から作製されている：
−  試料添加パッド：試料が添加される、セルロース又はガラス繊維から作製された吸収パッドであり、その主な機能は、分析物を含有する試料（例えば血液）をＬＦＡストリップの他の部分「下流」に輸送することである。それは、その輸送前に血漿などの構成成分への分離を含め、試料を前処置することもできる。
−  コンジュゲートパッド：これは、標的分析物に特異的である固定され、標識された抗体を含有する。抗体は、ラテックス又はナノメートルサイズ粒子などの着色された粒子にコンジュゲートされており、標識抗体コンジュゲートは移動している液体試料との接触で遊離される。
−  ニトロセルロース又は反応膜：この膜は、毛細管作用下でコンジュゲートパッドからの生成された複合体の移動を可能にする。膜は、検査及び対照ラインにさらに分割される。
−  吸収パッド：このパッドは、ストリップの末端で「シンク」として働き、毛細管作用によってさらに試料を反応に導くように設計されている。
【００６７】
図１０は、ラテラルフローデバイスの標準的レイアウトを示す（Saied Assadollahi, Christiane Reininger, Roland Palkovits, Peter Pointl and Thomas Schalkhammer. ‘From Lateral Flow Devices to a Novel Nano-Color Microfluidic Assay.’ Sensors 2009(9);6084-6100; doi:10.3390/s90806084）。
【００６８】
ラテラルフローアッセイ検査は、サンドイッチ及び競合的アッセイである２つの主なフォーマットにおいて機能することができる。サンドイッチＬＦＡは、複数の抗原部位を有するタンパク質を含む高分子量分子（例えばＨＩＶ、ｈＣＧ）の検出のために設計される一方で、競合的アッセイは単一エピトープを有する小分子を検査するために設計される。サンドイッチＬＦＡでは、陽性検査は検査ラインに色付きバンドを示し、一方競合的ＬＦＡでは検査ラインは陰性試料において色付きバンドを示す。
【００６９】
多重検出フォーマット
臨床診断において、同じ条件下で同時に検出される複数の相互依存的な分析物のより高度な特異性又は予測精度が、１つより多い標的分析物の検出のために使用される多重ＬＦＡ検出フォーマットの開発を導いた（Panhotra BR, Hassan ZU, Joshi CS, Bahrani A. Visual detection of multiple viral amplicons by dipstick assay: its application in screening of blood donors a welcome tool for the limited resource settings. Journal of clinical microbiology. 2005 Dec;43(12):6218; author reply -9. PubMed PMID: 16333138. Pubmed Central PMCID: 1317223; Corstjens PL, de Dood CJ, van der Ploeg-van Schip JJ, Wiesmeijer KC, Riuttamaki T, van Meijgaarden KE, et al. Lateral flow assay for simultaneous detection of cellular- and humoral immune responses. Clinical biochemistry. 2011 Oct;44(14-15):1241-6. PubMed PMID: 21763300. Pubmed Central PMCID: 3177995）。このフォーマットでは、４つの一般的ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ、human papillomavirus）型の検出について近年記載された通り、アッセイは、標的分析物の数と等しい数の検査ラインを有するストリップで実施される（Xu Y, Liu Y, Wu Y, Xia X, Liao Y, Li Q. Fluorescent probe-based lateral flow assay for multiplex nucleic acid detection. Analytical chemistry. 2014 Jun 17;86(12):5611-4. PubMed PMID: 24892496）。
【００７０】
図１１は、ＬＦＡの多重検出フォーマットを示している（Ye Xu, Yinghua Liu, Yan Wu, Xiaohu Xia, Yiqun Liao and Qingge Li. ‘Flourescent Probe-Based Lateral Flow Assay for multiplex Nucleic Acid Detection.’ Anal Chem., 2014, 86(12), 5611-5614）。
【００７１】
臨床応用
ラテラルフローアッセイは、血漿、血清、尿及び他の臨床試料中の臨床分析物の検出を通じて臨床診断において及びポイントオブケア検査としての重要な使用を見出した。既製の例は、家庭用妊娠検査キットである。結核（ＴＢ）では、尿中リポアラビノマンナン（ＬＡＭ、lipoarabinomannan）検査は、低感度（５２〜５９％だが高特異性（９４％を超える）のＬＦＡ検査である（Lawn SD, Dheda K, Kerkhoff AD, Peter JG, Dorman S, Boehme CC, et al. Determine TB-LAM lateral flow urine antigen assay for HIV-associated tuberculosis: recommendations on the design and reporting of clinical studies. BMC infectious diseases. 2013;13:407. PubMed PMID: 24004840. Pubmed Central PMCID: 3846798）。本発明者らは、同じストリップ上で同時にＩＰ−１０及びＣＣＬ４を検出するためにＬＦＡと組み合わせた蛍光アップコンバートリン光体（ＵＣＰ、up-converting phosphor）レポーター技術の使用が、胸膜ＴＢのためのポイントオブケア検査として開発される可能性を有することも近年報告した（Sutherland JS, Mendy JF, Gindeh A, Walzl G, Togun T, Owolabi O, et al. Use of lateral flow assays to determine IP-10 and CCL4 levels in pleural effusions and whole blood for TB diagnosis. Tuberculosis (Edinb). 2015）。アフリカにおける多施設治験は、全血中の複数のケモカインの検出のための簡便な定量的アッセイとしてのローテクでロバストなＵＣＰ−ＬＦＡプラットホームの適用性を同様に報告した（Corstjens PL, Tjon Kon Fat EM, de Dood CJ, van der Ploeg-van Schip JJ, Franken KL, Chegou NN, et al. Multi-center evaluation of a user-friendly lateral flow assay to determine IP-10 and CCL4 levels in blood of TB and non-TB cases in Africa. Clinical biochemistry. 2015 Aug 15. PubMed PMID: 26285074）。
【００７２】
したがって本発明は、次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０及びＶＥＧＦのそれぞれに、総体として結合可能である物質のアレイを含むデバイスであって、アレイ内の各物質が前記バイオマーカーの１つに結合可能であり、ラテラルフローデバイスであるデバイスに関する。本実施形態では、物質のアレイは適切には、バイオマーカーの数と等しい数の検査ラインを含む。適切には、各検査ラインはそのようなバイオマーカーの１つに結合可能である物質を含む。適切には、各検査ラインは、異なるそのようなバイオマーカーに結合可能である物質を含む。
【００７３】
代替的に、デバイスが「チップ」又は「バイオチップ」を含む場合、アレイは、グリッド、又は幾何学的パターンなどの他の定義された配置などの物質の空間的配置を含むことができる。
【００７４】
適切には、前記バイオマーカーの１つに結合可能である各物質は、デバイス内に固定されている。
適切には、前記バイオマーカーの１つに結合可能である各物質は、修飾されている。
適切には、前記バイオマーカーの１つに結合可能である各物質は、標識されている。適切には、標識は共有結合されている。適切には、標識は色素である。
【００７５】
適切には、前記バイオマーカーの１つに結合可能である各物質は、異なる抗体又はその抗原結合性断片であり、その抗原結合性断片はＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ及びダイアボディからなる群から選択される。
適切には、抗体又はその抗原結合性断片は非ヒト抗体又はその抗原結合性断片である。適切には、抗体又はその抗原結合性断片は組換え体、例えば組換え核酸配列のインビトロでの発現によって作製される。適切には、抗体又はその抗原結合性断片は、精製及び／又は単離される。
【００７６】
検出のための非抗体試薬、例えば、上に記載されるタンパク質バイオマーカーも使用することができる（例えば、方法における検出のために、デバイス中の物質として、キット中の試薬として、又は他の本発明の適用）、例えば、特異的結合ペプチドを示すファージディスプレイ粒子、アフィマー、アプタマー、核酸結合特異的タンパク質若しくはペプチド配列、特異的結合特性を有する小分子又は記載されるバイオマーカーの他のそのような特異的結合パートナー（複数可）。
【００７７】
シグネチャー
先行技術アプローチは、５０個以上の個々のバイオマーカーの分析を必要とするなど極めて大きなシグネチャーを同定した。８個だけのバイオマーカーの分析をシグネチャーが必要とすることは、本発明の有利点である。
【００７８】
先行技術の試みは、フローサイトメトリーを含む。しかし、フローサイトメトリーは極めて労力を要し、高価であり、ベッドサイド／ポイントオブケア検査の提供のためには不適である。
【００７９】
先行技術アプローチは、トランスクリプトームの（すなわちｍＲＮＡの）分析を含む。しかし、これらのアプローチは、少なくとも５０個の遺伝子の評価も典型的には含み、課題である。
【００８０】
データは、本発明の方法のＡＵＣ／特異度／感度を支持して実施例セクションに示される。
【００８１】
最も重要なことに、陽性及び陰性予測値が提供される。ＴＢの分野では予測値は、方法の感度／特異度よりも重要であるとさえ考えられる場合がある。本発明が極めてロバストな陽性及び陰性予測値を提供することは有利である。このことは、下記の表題「方法の予測値／適用」のセクションにおいてさらに詳細に考察される。
【００８２】
本発明者は、８バイオマーカーシグネチャーに到達する多数の知的な選択を含む大規模で複雑な分析に取り組んだ。具体的には、この具体的なシグネチャーが特別な特性を有することに注目することは重要である。例えばそれは、適切でない７個のバイオマーカーシグネチャーとは顕著に異なっている。開示される８バイオマーカーのいずれかを外すことを試みるシグネチャーの分析は、特異度のおよそ５０％の降下及び／又は予測値のおよそ２５％の降下をもたらす。これらの図は、本発明による８バイオマーカーシグネチャーの教示が単なる反復又は無作為な選択ではなく、１つ少ないだけのマーカーを用いて得られるものから大きく変化している臨床的に有用な情報を示していることを明確に例示する。そのような鋭く劇的な効果がこの様式において観察できることは驚くべきことである。
【００８３】
適切には、シグネチャーは８個のバイオマーカーを含む。
【００８４】
適切には、バイオマーカーは下の表に記載されるものである。
【００８５】
参照配列
適切には、所望のバイオマーカーの参照配列は、次の表において定義される通りである：
【００８６】
【表２】
2019510206.tif 000004
2019510206.tif 000005
配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８７】
当業者は、分析において使用される正しい遺伝子／タンパク質を同定するだけでよい。提供されるガイドラインは、提供される具体的な単一の例示的配列に本発明を厳密に限定する意図はない。遺伝子配列（及びしたがってタンパク質配列）が、例えば対立遺伝子の変動又は個体間の変異のために、個体間で変動していることは公知である。提供される情報は、正しい遺伝子をアッセイすることによって本発明を実行する操作者を補助するためである。最終的には遺伝子産生物（ｍＲＮＡ又はさらに適切にはタンパク質など）は、実際にアッセイされる。したがってマイナーな若しくは最少の対立遺伝子又は個体間の変異による差異は重要ではなく、重要であるのは提供されるガイドラインを使用して正しい遺伝子（遺伝子産生物）がアッセイされることである。
【００８８】
適切には、バイオマーカー名が使用される場合、これは上記表からの対応するアミノ酸又は核酸配列を意味する。適切にはアミノ酸配列について、カノニカル配列は好ましい。適切には核酸配列について、最新（例えば高位番号）の核酸配列は好ましい。
【００８９】
本発明がこれらのバイオマーカーの断片（複数可）、バリアント（複数可）又はミュータント（複数可）の検出に同様に使用できることは理解される。適切には、任意のそのような断片（複数可）、バリアント（複数可）又はミュータント（複数可）は、参照配列に少なくとも８０％の配列同一性を前記断片（複数可）、バリアント（複数可）又はミュータント（複数可）の全長に沿って、適切には９０％、適切には９５％、適切には９８％の配列同一性を前記断片（複数可）、バリアント（複数可）又はミュータント（複数可）の全長に沿って有する。
【００９０】
データベースリリース
データベースに寄託された配列は、時間と共に変化する場合がある。適切には、配列データベース（複数可）の最新版が信頼される。代替的に、出願日に有効であるリリースが信頼される。
【００９１】
当業者に公知のとおり受託番号は、バージョン／日付受託番号である。最新のデータベース登録のための引用可能な受託番号は上記と同様であるが、小数点及びそれに続く数字を除外する、例えばＶＥＧＦについてのバージョン／日付受託番号はP15692-18であり；現在の登録事項はP15692を使用して得られるなど。
【００９２】
ＧｅｎＢａｎｋは、ＮＩＨ遺伝子配列データベース、公表されているすべてのＤＮＡ配列の注釈付き収集物であり（National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 USA; Nucleic Acids Research, 2013 Jan;41(D1):D36-42）、提供される受託番号は、他に明らかにしない限りこれに関する。適切には、参照されるＧｅｎＢａｎｋデータベースリリースは、15 October 2015, NCBI-GenBank Release 210.0である。
【００９３】
ＵｎｉＰｒｏｔ（Universal Protein Resource）は、タンパク質についての情報の包括的目録である（‘UniProt: a hub for protein information’Nucleic Acids Res. 43: D204-D212 (2015).）。誤解をさけるために、UniProt Release 2015_11は信頼される。
【００９４】
より詳細には、the UniProt consortium European Bioinformatics Institute (EBI), SIB Swiss Institute of Bioinformatics and Protein Information Resource (PIR)’s UniProt Knowledgebase (UniProtKB) Release 2015_11 (11-Nov-2015)は信頼される。
【００９５】
治療
ＴＢのための治療が薬物の最短６カ月間プログラムであることは注目されるべきである。これは、高価であり、患者に大きな努力を要求する場合がある。投薬は、１週間に複数回、理想的には毎日など極めて定期的でなければならず、医療提供者及び患者に重い負担となる。したがって患者の治療ミス、すなわち実際にはＴＢを有さない患者へのＴＢ薬の処方ミスを回避することは当技術分野における課題である。本発明は、診断のため（又は診断を補助するため）のロバストなツールを提供することによってこの課題を軽減する。
【００９６】
本発明の方法を考慮して対象がＴＢを有すると判定される場合、医師はＴＢのための治療を処方するべきである。一実施形態では本発明は、本明細書に記載される方法（複数可）によりＴＢを有するかどうかを判定することを含む、患者を治療する方法であって、患者がＴＢを有すると判定された場合、ＴＢのための治療が処方される、又はより適切には投与される方法を提供する。別の実施形態では本発明の方法は、診断ステップの際に厳密な意味で存在する必要がない患者の診断を補助するために使用され（すなわち、本実施形態では本発明は診断時に厳密な意味で治療を目的としたものではない）；次に医師は、前記対象を診断する及び／又は治療を計画する場合に本発明によって提供される情報を考慮することができる。
それにより、不必要な薬物を回避できることは本発明の有利点である。一実施形態では、本発明の検査は除外検査よりも確定診断検査としての適用を見出す。言い換えると、本発明の方法（複数可）が使用されて対象がＴＢを有すると判定される場合、彼らはＴＢについて確実に治療されるべきである。代替的に、本発明の方法が使用され、対象がＴＢを有すると判定されない場合、さらなる調査が有用である場合がある、つまり、本発明の方法によって、彼らがＴＢを有すると判定されない場合、適切なことには、対象がＴＢを有する可能性を「除外」しない。
「確定診断」検査に関して、本発明の方法は、当技術分野における代表的な方法（細菌培養）に匹敵する性能を有する。それにより、本発明の方法を使用して陽性を見出すことは、対象がＴＢを有し、ＴＢについて治療されるべきであることに非常に高レベルの信頼度を提供することは本発明の有利点である。
【００９７】
適切には、ＴＢ治療は、世界保健機関（ＷＨＯ、World Health Organisation）によって推奨されている。ＷＨＯは、時々にそのガイドラインを修正する場合がある、つまり、適切には治療は対象を治療するために本発明を実施する日のガイドラインのとおりである。さらに適切には、この治療は本文書の出願日のガイドラインのとおりである。さらなる助言が必要である場合、最も適切な治療は、WHO 2010 publication “Guidelines for national programmes、fourth edition” ISBN: 9789241547833（例えばhttp://www.who.int/tb/publications/9789241547833/en/））中のガイドラインの通りである。本文書は、特にＴＢのための具体的な治療レジメンの教示について、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９８】
例示的治療が下に示される。
【００９９】
適切には、ＴＢ治療は、ＷＨＯによって推奨される通り４種の抗菌薬の標準的６カ月間のコースを含む。
【０１００】
適切には、ＴＢ治療は６カ月間のリファンピシンを含む。
【０１０１】
適切には、ＴＢ治療は、特異的抗ＴＢ薬（最初の２カ月間のイソニアジド、リファンピシン、ピラジナミド及びエタンブトール、続いて４カ月間のイソニアジド及びリファンピシンだけ）を用いる六（６）カ月間の治療を含む。
【０１０２】
適切には、ＴＢを有する患者は、毎日の集中治療期に続く１週間に３回の維持治療期を受けることができる［２ＨＲＺＥ／４（ＨＲ）３］；適切には、各投薬は直接観察される。治療全体を通じた１週間に３回の投薬［２（ＨＲＺＥ）３／４（ＨＲ）３］は、すべての投薬が直接観察され、患者がＨＩＶを有していない又はＨＩＶが蔓延している設定で生活していない場合に限り、代替として使用することができる。
【０１０３】
適切には、投薬は１週間に少なくとも３回。適切には、投薬は１週間に３回以上である。最も適切には、投薬は毎日である。
【０１０４】
最も適切には、ＴＢを有する患者に対する投薬頻度は一連の治療［２ＨＲＺＥ／４ＨＲ］全体を通じて毎日である。
【０１０５】
適切には、患者がＨＩＶを有している又はＨＩＶが蔓延している設定で生活している場合、投薬は一連の治療全体を通じて毎日である。
【０１０６】
ＷＨＯ治療ガイドラインの概要（WHO 2010 publication “Guidelines for national programmes, fourth edition” page 5）：
【０１０７】
【表３】
2019510206.tif 000006
【０１０８】
使用される略号：
Ｈ＝イソニアジド、
Ｒ＝リファンピシン、
Ｚ＝ピラジナミド、
Ｅ＝エタンブトール、
Ｓ＝ストレプトマイシン
【０１０９】
上記標準治療は、多剤耐性ＴＢ（ＭＤＲ  ＴＢ、muti drug resistant TB）には適切には適用されない。適切には、薬剤感受性検査がＷＨＯガイドラインに従って治療前に行われる。治療が失敗したことがあるＴＢ患者又は多剤耐性ＴＢ（ＭＤＲ−ＴＢ）の可能性が高い他の患者を治療する場合、適切には治療は、ＷＨＯによって推奨される経験的ＭＤＲレジメンで開始するべきである。最も適切には本発明は、「新規」ＴＢ、すなわち本発明によって検査された新規患者に適用される。
【０１１０】
さらなる又は追加的治療は、どちらの診断がなされたかに依存する場合があり；細菌性呼吸器感染症の場合、通常は抗生物質治療。
【０１１１】
投与は、錠剤によって又は筋肉内注射などの注射によってであってよい。ＨＲＺＥ／ＨＲレジメンについて、適切には投与は、錠剤によってである。
典型的錠剤は次の用量を含む：
Ｈ  ７５ｍｇ＋Ｒ  １５０ｍｇ＋Ｚ  ４００ｍｇ＋Ｅ  ２７５ｍｇ錠剤。
対象は、正確な用量を達成するために彼らの体重（及び／又は必要に応じて任意の他の関連する要因）に応じた数の錠剤を投与される又は処方される。この数は、錠剤の一部を含むことができる。体重３０〜３９Ｋｇの対象のための典型的用量は、治療の最初の２カ月間はＨ  ７５ｍｇ＋Ｒ  １５０ｍｇ＋Ｚ  ４００ｍｇ＋Ｅ２７５ｍｇを毎日２錠であり、次の３〜６カ月間の治療は、Ｈ  １５０ｍｇ＋Ｒ  １５０ｍｇを１．５錠である。正確な用量の決定は、例えば体重に基づき、医師の裁量である。
【０１１２】
統計解析
本発明者らは、統計解析への標準的アプローチを検討した。しかし、本発明者らは、標準回帰モデルが過度な楽観論を導く傾向があるという見解を有した。これは、その一部が互いに高度に相関する多数のサイトカイン共変量から生じるデータの多次元性を考慮すると特に当てはまる。さまざまな理由から、本発明者らは異なるアプローチを使用し、マーカーセットを収縮する（すなわち次元を低減する）一方で同時に統計解析での収縮にペナルティを適用することを試みる。理論に束縛されることなく、本発明者らの根拠は、シグネチャーが同じ方向に移動する２つのマーカーを評価する場合、それにより定性的に同じ情報が２つの同等な供給源から得られることであった。これは、これらのマーカーの内の１つを除く機会を提供し、それにより得られる情報の品質を損なうことなくシグネチャーを単純化する。この結論は、２つの分析が２つの異なる方向に情報を提供する場合、それによりシグネチャーを改善するための追加の情報を提供すると考えられることである。このように、本発明者らは、統計的に互いに関連すると見なすことができる任意のマーカーを除くことに努め、それにより、優れた診断特徴を提供する改善された（低減した）経験的シグネチャーに到達した。
【０１１３】
マーカー選択
本発明者らは、不遍性のマーカー選択に取り組んだ。先行技術に基づくアプローチは、「症例対照」アプローチを使用する傾向がある。簡潔にはこれは、取り組む対象としてＴＢに決定すること、健康な患者を選択すること、ＴＢを有する患者を選択すること、及び健康な患者をＴＢを患っている患者と比較することによって特徴付けられる。対照的に本発明者らは、前向きコホート内症例対照研究（すなわちネスティド症例対照研究）アプローチを設計した。本発明者らは、地理的に異なる場所で小児を同定するための同じ選択工程を使用して小児のコホートを選択した。本発明者らが行ったのは、これらのコホート内でＴＢを有する患者及びＴＢを有さない患者を同定しただけであった。さらに重要なことに、本発明者らはＴＢをＯＤ（すなわち「ＴＢではない他の呼吸器疾患」）と比較することを選択した。このことは、ＴＢを有するこれらの患者をＴＢではない他の疾患を示す者と比較して同定することが重要な臨床決定であるためである。したがって、ＴＢ患者を「他の疾患」の患者から識別することが当技術分野における課題であると見なすことができる。
【０１１４】
先行技術研究に伴う別の欠点は、公表されている又はＴＢと関連するサイトカインなどのバイオマーカーに決まる傾向があることである。対照的に本発明者らは、完全に不偏性のアプローチを取り、ＴＢとの関連によってバイオマーカーを選定しなかった。本発明者らは、盲検分析に取り組み、８個のバイオマーカーのシグネチャーに、これらの個々のバイオマーカーが何であるかを知ることなく到達した。そのときに本発明者らは、本発明者らのシグネチャー中のバイオマーカーの同一性を分析する。このアプローチの驚くべき一例は、ＩＦＮ−γを検討することによる。当技術分野における見解はＩＦＮ−γはＴＢと関連しているということである。実際、先行技術アプローチはＴＢのためのバイオマーカーとしてＩＦＮ−γ及び／又はＩＰ−１０を使用することを試みた。本明細書で教示されるバイオマーカーシグネチャーがＩＦＮ−γを含まないことは非常に驚くべきことである。
【０１１５】
Quantiferon（「ＱＦＴ」、Qiagen社から市販で入手可能）は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ、interferon-gamma）遊離アッセイであり、ＩＧＲＡとして一般に公知であり、ツベルクリン検査（ＴＳＴ、tuberculin skin test又はＭａｎｔｏｕｘ）の現代の代替法である。概要では、ＱＦＴは、ＴＢ抗原に非常に特異的な細胞媒介免疫応答（サイトカイン）を測定する。検査は、３つの血液採取チューブそれぞれに全血（１ｍＬ）を採取することによって実施される。感染患者の血液がＱＦＴ中で結核菌特定抗原を用いて刺激されると、彼らのＴ細胞はＩＦＮ−γと呼ばれるサイトカインを分泌することによって応答する。血漿中のＩＦＮ−γ濃度は感応性ＥＬＩＳＡを使用して決定される。
【０１１６】
したがってQuantiferon（「ＱＦＴ」）は、Ｍ．ｔｂに特異的な抗原を用いる血液の刺激後にＩＦＮ−ガンマを測定する市販のアッセイである。一部のＩＰ−１０アッセイも先行技術において調査された。しかし、ＩＰ−１０はＩＦＮ−ガンマよりもさらにロバストであると報告された（すなわち、刺激後にさらに高度なレベルで遊離される）一方で、それ自体は、ＩＦＮ−ガンマと同様に当技術分野における課題であるＴＢ疾患とＴＢ感作とを識別できない。有利には本発明で教示されるのは、マーカーの組合せであり、個々にではなく合わせて使用される場合、ＴＢをＯＤから識別できる。これは、ＴＢ疾患の複雑さを考えると、単一のマーカーよりもマーカーの組合せがＴＢをＴＢ感作及び／又は他の疾患から識別するための高い能力及び特異性を有するという本発明者らの洞察に基づいている。
【０１１７】
より詳細には、本発明者らは種々のサイトカイン及びケモカインを分析し、それぞれの値を十分位に転換することによる独自のアプローチを取った。候補として２７個のサイトカイン／ケモカインを用いて開始し、それぞれを刺激された各患者について２７０及び未刺激の各患者について２７０を提供する１０分位に変換した。
【０１１８】
これは、それ自体が、採用された革新的アプローチの重要な部分である（連続的よりも）カテゴリー的なアプローチを示す。このアプローチは、これまでサイトカイン分析に適用されたことはなかった。これは、使用されるバイオマーカーの偏り又は選択の交絡効果を除くことを含む有利点を有する。
【０１１９】
２７個の初期候補のパネルは、これまでＴＢといかなる関連も有さなかった。例えば、それらはＴＢ特異的ではなかった。それらは、「免疫パネル」として見なされる場合があるだけである。それらは、ＴＢ用に市販されたりＴＢを対象としたりしていない市販のキットの一部としてリンパ球に関与する単なるマーカーである。発見がどれほど驚くべきことであるかを例示することには、本発明者らでさえこのアプローチを使用することによって見出したものを予測していなかった。
【０１２０】
一実施形態では分析は、次の通り実行することができる：
度数分布＞１０分位＞各バイナリ分位の作成
【０１２１】
一実施形態では分析は、次の通り実行することができる：
度数分布＞十分位＞１０個の等サイズ分位＞バイナリ変数を作成するためのカットオフとして各分位を使用
【０１２２】
各サイトカインがさまざまな範囲の濃度にわたって存在する場合があり、それにより各十分位が個々のバイオマーカー間で同じでない場合があることは注目されるべきである。しかし、それぞれ個々のバイオマーカーの分布は、存在する場合にそれ自体の濃度範囲に従って１０分位（すなわち１０個の等サイズ分位）に適切に分割され；患者について決定された各バイオマーカー値は、次にその度数分布から十分位に変換される。
【０１２３】
本発明が、対象がＴＢ又はＯＤを有するかどうかの臨床判断を得ることを対象としていることは注目されるべきである。
【０１２４】
集団検診などのスクリーニングツールとして本発明を使用することができる。
【０１２５】
患者がＴＢ又はＯＤを有するかどうかの臨床判断を補助することに役立つことは本発明の有利点である。
【０１２６】
十分位決定
十分位は、標準的統計技術に従って作成される。十分位の作成は、統計ソフトウェアによって導かれる又は作成できる数学的頻度論的手順である。数名の対象から測定される場合に定量値を含む具体的な変数（例えば測定されたサイトカイン）は、１０個の等サイズ分位からなる十分位を作成するために使用される度数分布を有する。
さらなる助言が必要である場合は、最も適切には十分位は、下記実施例セクションに記載の通り作成される。
【０１２７】
対象
本発明は、新生児からの任意の対象に適用することができる。
本発明は、成人又は小児に適用することができる。
【０１２８】
適切には、対象は１８歳以下、適切には、１６歳以下、適切には１５歳以下、適切には７歳以下、適切には６歳以下、適切には５歳以下、適切には２歳以下である。
【０１２９】
大部分の免疫系が２〜５歳以降に「成人」として機能することは注目されるべきである。したがって適切には、対象は少なくとも２〜５歳である。適切には、対象は少なくとも２歳である。適切には、対象は少なくとも３歳、適切には少なくとも４歳、最も適切には少なくとも５歳である
【０１３０】
適切には、対象は小児である。
【０１３１】
適切には、対象は１６歳以下である。
【０１３２】
適切には、対象は１５歳以下である。
【０１３３】
適切には、対象は２〜１６歳、適切には３〜１６歳、適切には４〜１６歳、適切には５〜１６歳である。
適切には、対象は２〜１５歳、適切には３〜１５歳、適切には４〜１５歳、適切には５〜１５歳である。
【０１３４】
適切には、検査される対象は、次の症状：咳嗽、体重減少、発汗、腺の腫れのうちの少なくとも１つを示し、敗血症を示してもよい。
【０１３５】
本発明は、胸腔内ＴＢに適用できる。
本発明は、肺ＴＢに適用できる。
本発明は、肺外ＴＢに適用できる。
【０１３６】
本発明は、ＨＩＶに感染していない患者に適用できる。
本発明は、ＨＩＶに感染している患者に適用できる。
【０１３７】
方法が免疫応答に基づいていることから、５０以下のＣＤ４数を有するいかなる対象も応答を示す可能性が低いことは注目されるべきである。したがって適切には、対象は５１以上のＣＤ４数を有する。参考までに、健康なヒトの正常ＣＤ４数は、およそ１０００である。
【０１３８】
検出
適切には、本明細書に記載されるバイオマーカーは、当技術分野における好適な手段によって検出される。例えばバイオマーカーは、前記バイオマーカーを特異的に認識する１又は２以上の抗体によって検出できる。
例えばバイオマーカーは、上に記載される抗体又はその抗原結合性断片によって検出でき、その抗原結合性断片はＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ及びダイアボディからなる群から選択される。
【０１３９】
マーカーを検出するための抗体又はその抗原結合性断片の結合を評価する様式は、操作者の選択による。助言が必要な場合は、ＥＬＩＳＡを同定された各サイトカインのために使用できる、例えば各バイオマーカーについて１つのＥＬＩＳＡ。以下は好適なＥＬＩＳＡ試薬の例である。
【０１４０】
本発明のシグネチャーに含まれるサイトカインについてのＥＬＩＳＡは、必要に応じて例示的製品名／詳細を伴う、次の企業から市販で得ることができる：
Quantikine sandwich Elisa、R&D Systems UK社製、19 Barton Lane、Abingdon Science Park、Abingdon、OX14 3NB、United Kingdom (Tel +44 (0)800 37 34 15)
Human Platinum Elisa又はhigh sensitivity Elisa、eBioscience社製(Ireland、United Kingdom)、2nd Floor、Titan Court、3 Bishop Square、Hatfield、AL10 9NA、United Kingdom
BD OptEIA kit、BD Biosciences社製、Edmund Halley Road、Oxford Science Park、Oxford、OX4 4DQ (Tel.: +44 1865 781 666; Fax: +44 1865 781 627)
【０１４１】
当業者が理解する通り、各サイトカインのための個々のＥＬＩＳＡは、労力を要する、及び／又は大きな試料サイズを必要とすることがある。したがって可能な場合は多重で又は単一の試料で検出を実行することは有利である。このことは、少量であること（少量の血液／血清が望ましい小児科の検査のために特に重要）、及びサイトカインが組合せになっていること（検査を完了するための労力が少ない）などの有利点を提供する。
【０１４２】
シグネチャーのバイオマーカーを検出するために有用である好適な多重化キット（複数可）の多数の商業的供給者がある、例えば：
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Immunology Multiplex Assay、カタログ番号：HCYTOMAG-60K、Merck-Millipore社、Suite 21、Building 6、Croxley Green Business Park、Watford、Hertfordshire WD18 8YH、United Kingdomから入手可能
Human Luminex Performance Assay Base Kit Panel A ［カタログ番号 LUH000］、R&D Systems UK社製、19 Barton Lane、Abingdon Science Park、Abingdon、OX14 3NB、United Kingdom (Tel: +44 (0) 800 37 34 15)
Human Cytokine/ Chemokine/ Growth Factor Panel 1 (45 plex)、（カタログ番号: EPX450-12171-901）、eBioscience社製、(Ireland、United Kingdom)、2nd Floor、Titan Court、3 Bishop Square、Hatfield、AL10 9NA、United Kingdom
【０１４３】
最も適切には、使用される抗体は、市販で入手できるBio- Rad Human cytokine Th-1/Th-2 27-plex kit（カタログ番号 ＃M500KCAF0Y、Bio-Rad Laboratories社、Bio-Rad House、Maxted Road、Hemel Hempstead、Hertfordshire、HP2 7DX、United Kingdom）であってよい。最も適切には、本発明のシグネチャーのサイトカインの検出は、このキットを使用して検出／アッセイされる。
【０１４４】
当技術分野における一般的見解は、細胞の刺激が分析のための使用に必要であるということに注目することは重要である。刺激は、細菌を用いる提示によってであってよい、又は抗原を用いる提示によって又は刺激の任意の他の適切な形態であってよい。しかし、これらの種類の刺激がすべてリコール応答を分析することを対象としていることは注目されるべきである。未刺激試料を分析することは本発明の有利点である。具体的には、試料が未刺激血液由来であることは有利点である。
【０１４５】
具体的には、８個のバイオマーカーの重要なパネルを研究する場合、適切には、本発明は刺激ステップを除く；適切には、本発明は刺激ステップを含まない；適切には、本発明は刺激ステップを除外する。
一部の実施形態では、９番目又はさらなるマーカーを使用することができ、刺激ステップを必要に応じてそのようなさらなるマーカー（複数可）のために使用することができる。
最も適切には、本発明は刺激ステップを除く。最も適切には、本発明は刺激ステップを含まない。最も適切には、本発明は刺激ステップを除外する。
【０１４６】
核酸検出
例えばバイオマーカーは、核酸形態で、例えばバイオマーカーをコードする１又は２以上のｍＲＮＡの検出によって検出することができる。
【０１４７】
当業者がマイクロアレイアプローチを介して核酸を読み出し／検出することを要求する場合、Anderson et al 2014 (N Engl J Med. 2014 May 1;370(18):1712-23 ‘Diagnosis of childhood tuberculosis and host RNA expression in Africa.’ ILULU Consortium; KIDS TB Study Group.)を参照。
【０１４８】
ｍＲＮＡ技術は、実験室設定に適切に配置される。
概略ではｍＲＮＡ検出は、次のステップを含むことができる：
−  ＲＮＡの安定化、これは特定の試薬を使用して行うことができる。
−  ＲＮＡの抽出、
−  ｃＤＮＡへの転写、
−  増幅、
−  アレイ、
−  データ読み出し。
【０１４９】
当然のことながら当業者は、一部のステップが任意である又は組み合わせられることを理解しており、例えば安定化／抽出は、転写が試料で直接実施できる場合は必要でない場合がある。例えば、増幅物質が直接アッセイされる場合、アレイは必要でない場合がある。
【０１５０】
それにより本質的に必要とされるステップは、
−  核酸の抽出
−  所望のマーカーのｍＲＮＡ発現レベルを決定するための核酸のアッセイ
−  データ読み出し
である。
【０１５１】
多重検出のために、適切には、標的遺伝子／増幅標的に特異的である蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブが使用される。Taqmanプローブは、多重化のために一般に使用されるが、多重化が必要でない場合にも使用することができる。プロトコールは、製造者によって示される通りである、例えばApplied Biosystems社(5791 Van Allen Way,Carlsbad,California 92008,US)。
さまざまな色素を蛍光発生プローブのために使用することができる；有用である例は、緩衝条件及びサーマルサイクラーの種類に依存し、下の表に示される（Qiagen社からの表）：
【０１５２】
【表４】
2019510206.tif 000007
【０１５３】
プロトコールは、当技術分野において周知であり、例えばStepOne and/or StepOne Plus Real Time PCR Systemsを製造者の使用説明書に従って使用する（Applied Biosystems社(5791 Van Allen Way,Carlsbad,California 92008,US）。
【０１５４】
多重化が望ましくない場合に他のアッセイを使用することができる、例えば逆転写後に、２本鎖ＤＮＡに結合し、蛍光性になる色素を使用する。例えばSYBR green 1（Qiagen社/Qiagen Ltd.Skelton House,Lloyd Street North,Manchester M15 6SH,UK）を使用することができる。
【０１５５】
本発明において有用であるプライマープローブアッセイを、所望の遺伝子標的、すなわち本発明のバイオマーカーのために設計する、又は予め設計されたものを購入することができる。例えば、SYBR green 1カスタム設計（「SYBR Greenアッセイの設計及び最適化」）のためのApplied Biosystem /ThermoFisher Scientific社(5791 Van Allen Way, Carlsbad, California 92008, US)のプロトコールを、そこで考察されている公表されたプライマー設計ツールを含めて使用することができる。この文書は、具体的にはプライマー／プローブ設計プロトコール及び核酸検出の教示について、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５６】
さらなる助言が必要である場合は、下記実施例セクションを参照。
【０１５７】
分位／十分位の決定
適切には、決定された各バイオマーカー濃度を十分位値に変換することは、
（ｃｉ）決定された各バイオマーカーの濃度を前記バイオマーカーの濃度の基準度数分布と比較するステップ；及び
（ｃii）前記バイオマーカーの濃度についての度数分布から十分位値を読み出すステップ
を含む。
【０１５８】
「度数分布」は、相互排他的なクラスに分割されたデータの要約グループ化及びクラスでの発生数を示している。それにより、３０個などの少数のデータ点（例えば、クラスの子ども３０名の試験の点数）を用いても度数分布を作成することが可能である。使用される対象の数（すなわちデータ点）が多ければ多いほど、分布は真の集団をさらに代表するものになる、すなわちさらに正規分布した度数分布になる。生物学的変数、例えば体重、身長、血圧、ヘモグロビン濃度、血中電解質、サイトカイン測定値などは通常非対称である。したがって、例えば通常のヒストグラムを使用してそのような生物学的変数について正規分布した曲線を得るためには、非常に多くのデータ点が必要であり、課題となる場合がある。したがって、データ平滑化密度推定量であるカーネルなどの非パラメトリック方法が使用される。これは、本発明者らが、例えば１００以上の妥当で良好な標本サイズを用いてそのようなデータの分布の表現を表そうとする場合に特に有用である。
【０１５９】
したがって、本明細書において「度数分布」が言及される場合、適切にはこれは、データ平滑化密度推定量、最も適切にはカーネル密度推定量などの非パラメトリック密度推定量などの非パラメトリック当量を含むことができる。
【０１６０】
図２〜９を考慮して、Ｙ軸は、それらがカーネル密度推定値を示すことから適切に標識された「密度」である。
【０１６１】
より詳細には、カーネル度数分布は、度数分布を示すためのデータ平滑化統計アプローチである。通常の「ヒストグラム」とは異なり、それは、大部分の生物学的データと同様に通常のガウス分布に従わない本発明者らの種類のデータに非常に適切である、非パラメトリック方法である。基本のヒストグラムは、頻度を数又は比率で示し、ヒストグラムに伴う課題は、それが平滑でなく、瓶の幅（すなわちバー）及び任意に選択することができる瓶のエンドポイントに依存するという事実を含む。しかし、カーネル密度推定値は、特定の範囲内のサイトカイン測定値の区間にギャップがないことを仮定することによって瓶のエンドポイントへの依存を除き、平滑な密度推定値を提供する。図２〜９のｙ軸は、「それぞれのマーカーの確率密度関数」として簡易に要約することができる。
【０１６２】
適切には、基準度数分布（又はカーネル密度推定値）は、多数の対象、例えば最少で１００名の対象においてバイオマーカーの濃度を測定すること及びこれらの測定値を度数分布（又はカーネル密度推定値）にコンパイルすることによって作成される。
【０１６３】
代替的に本明細書、図２〜９に示す度数分布（カーネル密度推定値）を使用することができる。
【０１６４】
適切には、（ｂ）において決定された各濃度を十分位値に変換するステップ（ｃ）は、
（ｃｉ）（ｂ）において決定された各バイオマーカーの濃度を図２〜９から選択される前記バイオマーカーの濃度の対応する基準度数分布又はカーネル密度推定値と比較するステップ；及び
（ｃii）前記バイオマーカーの濃度についての度数分布又はカーネル密度推定値から十分位値を読み出すステップ
を含む。
【０１６５】
一実施形態では、十分位／分位カットオフは、試料中のバイオマーカー（複数可）の絶対濃度として表される絶対カットオフによって増大される又は置き換えられる場合がある。例示的な絶対カットオフ値は、下の表に提供される：
【０１６６】
【表５】
2019510206.tif 000008
【０１６７】
一実施形態では、十分位／分位カットオフは、試料中のバイオマーカー（複数可）の絶対濃度範囲として表される所望の特異的分位についての濃度範囲によって増大される又は置き換えられる場合がある。例示的濃度範囲は上の表に提供される。
【０１６８】
ポイントオブケア検査
多数の実施形態では、熟練した操作者は、実験室又は試験施設においてマーカーの濃度を分析することを選択できる。
本発明は、ポイントオブケア検査としても適用することができる。適切には、本発明は、ベッドサイド検査としても適用することができる。
本発明がポイントオブケア／ベッドサイド検査である場合、適切には試料は血液又は血漿である。本発明がポイントオブケア／ベッドサイド検査である場合、適切にはマーカーはタンパク質形態で分析される。
本発明がポイントオブケア／ベッドサイド検査である場合、適切には検出は、免疫学的検出である。
本発明がポイントオブケア／ベッドサイド検査である場合、適切には検査は、ラテラルフローアッセイのフォーマットである。
【０１６９】
方法の予測値／適用
下の表は、バイオシグネチャーの予測値の追加結果を提供する。本発明者らは、バイオシグネチャーのＰＰＶ及びＮＰＶを示し、先行技術方法と比較する。本発明者らは、培養の代表的な方法に匹敵する性能を実証したことをさらに示す。本発明の高度な特異性及び陽性予測値は、それ自体で治療決定を変更させる。これは、本発明により検出されたＴＢのための正確な処方を可能にする。これは、不必要な薬物の処方での資源の浪費を回避する。これは、本発明の有用性をさらに実証している。
【０１７０】
【表６】
2019510206.tif 000009
【０１７１】
さらなる適用
８個のバイオマーカーの重要なセットは、有利なことには未刺激試料から評価される。しかし、一部の実施形態では９番目又はさらなるマーカーをさらに評価することが役立つ可能性がある；適切には、そのような９番目又はさらなるマーカーは、ＥＣ刺激ＶＥＧＦなどの刺激マーカーを含む。適切には、ＥＣ刺激ＶＥＧＦについてのカットオフは、十分位２である。誤解を避けるために、ＥＣ刺激ＶＥＧＦの「ＶＥＧＦ」バイオマーカーの詳細は、本発明の８個のバイオマーカーの重要なパネルにおいて上記の通り（「ＶＥＧＦ」）。
【０１７２】
（ａ）対象由来の試料を準備するステップであって、前記試料が、血液、血清及び血漿からなる群から選択されるステップ；
（ｂ）次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０及びＶＥＧＦの前記試料中の濃度を決定するステップ；
（ｃ）（ｂ）において決定された各バイオマーカー濃度を十分位値に変換するステップ；並びに
（ｄ）（ｃ）の十分位値を次の特異的分位カットオフ値と比較することによって各十分位値をバイナリ存在又は非存在に変換するステップ：
【０１７３】
【表７】
2019510206.tif 000010
【０１７４】
を含む、対象におけるＴＢの診断を補助するための方法であって、
特異的分位カットオフ値に合致する又は超えている十分位値がバイオマーカーのバイナリ存在に変換され、特異的分位カットオフ値より低い十分位値がバイオマーカーのバイナリ非存在に変換され；
前記バイオマーカーそれぞれの存在を検出することが、対象がＴＢを有する可能性の増大を示す、方法。
上記ステップ（ａ）〜（ｄ）を実行することを含む、対象においてＴＢをＯＤから識別するための方法であって、
前記バイオマーカーのそれぞれの存在を検出することが対象がＴＢを有することを示す、方法。
上記ステップ（ａ）〜（ｄ）を実行することを含む、対象におけるＴＢの診断において有用な情報を回収する方法であって、
前記バイオマーカーのそれぞれの存在を検出することが、ＴＢを有するとして対象を同定する、方法。
上記ステップ（ａ）〜（ｄ）を実行することを含む、対象におけるＴＢの診断のための方法であって、
前記バイオマーカーのそれぞれの存在を検出することが、対象がＴＢを有するとの診断を提供する、方法。
上記ステップ（ａ）〜（ｄ）を実行することを含む、ＴＢについての治療を受ける対象を選択するための方法であって、
前記バイオマーカーのそれぞれの存在を検出することが、前記治療を受ける前記対象を選択する、方法。
上記ステップ（ａ）〜（ｄ）を実行することによって、ＴＢについての治療を受ける対象を選択するステップを含む方法であって、
前記バイオマーカーのそれぞれの存在を検出することが、前記治療を受ける前記対象を選択するステップ；及び前記対象に前記治療を投与するステップを含む、方法。
【０１７５】
２ＨＲＺＥ／４ＨＲ（２カ月間のＨＲＺＥに続く４カ月間のＨＲ、ここでＨ＝イソニアジド、Ｒ＝リファンピシン、Ｚ＝ピラジナミド、Ｅ＝エタンブトール）のレジメンを、次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０及びＶＥＧＦのそれぞれを有すると判定された対象に投与することを含む、対象におけるＴＢを治療する方法。本発明は、投与ステップの前に対象が次のバイオマーカー：ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＧＦベーシック、ＩＰ−１０及びＶＥＧＦを有することを判定するために対象を検査することをさらに含む前記方法にも関する。適切には、検査は、上記ステップ（ａ）〜（ｄ）を実行することによって実行される。
【０１７６】
少なくとも部分的にソフトウェア管理データ処理装置を使用して、上に記載の本発明の実施形態が実行される限りにおいて、そのようなソフトウェア管理を提供するコンピュータープログラム及びそのようなコンピュータープログラムが保存される保存媒体が、本発明の態様により予想されることは理解される。明らかに、本発明のいくつかの方法又は工程では、１つのステップ（典型的にはステップ（ａ））は、対象由来の試料を準備することを含み、明らかにステップは、典型的にはソフトウェア管理データ処理装置を使用して実施されず；ソフトウェア管理データ処理装置を使用して実行される実施形態において、適切には、そのステップは手作業で実行される又は除かれる。
したがって本発明は、上に記載される方法を実行するために構成された論理回路、電気回路又はコードを含むコンピューターなどの装置に関する。
したがって本発明は、コンピューター上で実行された場合、上に記載される方法を実施するために作動可能なコンピュータープログラム製品に関する。
【０１７７】
さらに具体的な及び好ましい態様は、添付の独立請求項及び従属請求項に記載される。従属請求項の特性は、適切に及び特許請求の範囲に明確に記載されたもの以外の組合せで、独立請求項の特性と組み合わせられてよい。
【０１７８】
装置特性が機能を提供するために作動可能であるとして記載される場合、これが、機能を提供する、又はその機能を提供するために採用される若しくは構成される装置特性を含むことは理解される。
【図面の簡単な説明】
【０１７９】
本発明の実施形態は、添付の図を参照して、例示としてここに記載される：
【図１】年齢及び出身について補正した、サイトカイン共変数を用いた最適ＬＡＳＳＯモデルを示す図である。パネルａ、ｂ、ｃ：最適ＬＡＳＳＯモデル、年齢及び出身について補正、訓練セットで５倍クロス確認によって決定された。パネルｄ、ｅ、ｆ：同定されたバイオシグネチャーによって予測された訓練セットでの、細菌学的に確認したＴＢ、臨床診断したＴＢ及びＯＤ対象におけるＴＢ疾患の確率を示すボックス及びウィスカープロット。パネルｇ、ｈ、ｉ：独立検査セットにおいて確認されたＴＢをＯＤから分類する同定されたバイオシグネチャーの識別能力を示すＡＵＣ。
【図２】ＩＬ−１ｒａについての度数分布を示すグラフである。
【図３】ＩＬ−６についての度数分布を示すグラフである。
【図４】ＩＬ−７についての度数分布を示すグラフである。
【図５】ＩＬ−８についての度数分布を示すグラフである。
【図６】ＩＬ−１２ｐ７０についての度数分布を示すグラフである。
【図７】ＦＧＦベーシックについての度数分布を示すグラフである。
【図８】ＩＰ−１０についての度数分布を示すグラフである。
【図９】ＶＥＧＦについての度数分布を示すグラフである。
【図１０】ラテラルフローデバイスを示す図である。
【図１１】ラテラルフローデバイスの多重検出フォーマットを示す図である。［実施例］
【０１８０】
方法
簡単なコホート記述
家庭環境で成人感染性ＴＢ症例に曝露された１５歳未満の小児は、ＴＢ疾患を示唆する症状についてそれぞれの家庭で積極的に追跡及びスクリーニングされた。その後、胸腔内ＴＢ疾患の疑いのある者は、彼らのＴＢ疾患状態を確定するためにさらに詳細な臨床評価及び調査を受けた。合計１７３名の小児ＴＢが胸腔内ＴＢ疾患の疑いと関連し、ガンビア（ｎ＝１５０）及び英国（ｎ＝２３）の両方で前向きにリクルートされ、免疫疫学的アプローチを使用するバイオシグネチャー発見実験に含まれた。
【０１８１】
全血刺激アッセイ（ＷＢＡ、Whole blood stimulation assay）
ガンビアコホートについて、ＷＢＡを静脈穿刺の４時間以内の採用で設定した。１００μｌの未希釈ヘパリン化全血を、Ｍ．ｔｂ抗原ＥＳＡＴ−６／ＣＦＰ−１０融合タンパク質（ＥＣ；最終濃度１０μｇ／ｍｌ；Professor Tom Ottenhoff、Leiden University Medical Center、The Netherlandsから好意により提供）並びに陽性（ＰＨＡ−Ｌ、Sigma Chemicals社製、UK；最終濃度１０μｇ／ｍｌ）及び陰性（RPMI 1640 medium; BioWittaker社製、Verviers、Belgium）対照を用いて２回反復でインキュベートした。３７℃、５％  ＣＯ２での終夜インキュベーション後、上清を採取し、２回反復でプールし、分析まで−２０℃で保存した。試料をＢＫによって実施された英国における家庭内接触研究の同等の設定由来の本コホートに加えた。英国コホートからの小児について本発明者らは、関連する人口動態及び臨床データ並びにＩＧＲＡ（Quantiferon-TB Gold In-Tube（ＱＦＴ−Ｇ）検査（Cellestis、Australia）からの上清も得た。本発明者らの家庭内アッセイと同様に、この市販で入手できるインビトロＩＦＮ−γ遊離アッセイは、Ｍ．ｔｂ抗原（ＥＳＡＴ−６、ＣＦＰ１０及びＴＢ７．７）、陽性（フィトヘマグルチニン−Ｌ）及び陰性（Ｎｉｌ）対照をそれぞれ含有する３つの別々のチューブでの新鮮全血の刺激を使用する。これらの試料は、共同解析のためにガンビアに凍結輸送した。
【０１８２】
ガンビアの小児からのＷＢＡ上清及び英国コホートの小児からのＱＦＴ上清を多重サイトカイン検出アッセイ（ＭＣＡ、multiplex cytokine detection assay）のために使用した。ＭＣＡをガンビアのMRC TB Immunology laboratoryの施設内でガンビア及び英国の試料を多重プレートに無作為に分布させて実行した。
【０１８３】
多重サイトカイン検出アッセイ（ＭＣＡ）
本発明者らは、ガンビアの小児の未刺激及びＥＣ刺激ＷＢＡ上清並びに英国コホートからの小児のＱＦＴ上清（抗原及びｎｉｌ  ＱＦＴチューブから）を使用してLuminexによって包括的なＭＣＡを実行した。培養上清をBio-Rad Human cytokine Th-1/Th-2 27-plex kitを製造者の使用説明書に従って使用して、以前記載のとおり分析した（Sutherland JS, de Jong BC, Jeffries DJ, Adetifa IM, Ota MO. Production of TNF- alpha, IL-12(p40) and IL-17 can discriminate between active TB disease and latent infection in a West African cohort. PloS one 2010: 5(8): e12365）。評価したサイトカインは、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、エオタキシン、ＦＧＦベーシック、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｂ、ＰＤＧＦ−ｂｂ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦα及びＶＥＧＦであった。フィルタープレートを予め湿らせた後に、５０μｌのビーズ懸濁物を各ウエルに加え、２回洗浄した。次いで単独及び２回反復でそれぞれ検査される試料５０μｌ及び標準物を加え、プレートを密封し、３０秒間、１１００ｒｐｍで振盪し、次いで１時間、３００ｒｐｍでインキュベートした。プレートを３回洗浄し、２５μｌの予め希釈した検出抗体を加え、プレートを振盪し、３０分間、３００ｒｐｍ、暗所でインキュベートした。洗浄後、５０μｌの１ｘストレプトアビジン−ＰＥを各ウエルに加え、１０分間、３００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。再度プレートを洗浄し、１２５μｌのアッセイ緩衝液に再懸濁し、密封し、混合し、直ちにBioplex manager software(version 4.0; Bio-Rad社製、USA)及び低光電子増倍管（ＰＭＴ、photomultiplier tube）設定を使用してBio-plex analyserで読み出した。検出レベルを下回るサイトカイン濃度は、Bioplex softwareにおいて「ＯＯＲ」と報告され、分析においてゼロとして計算した。
【０１８４】
統計解析
本発明者らは、小児におけるＴＢと関連する宿主特異的マルチサイトカインバイオシグネチャーの同定のための未刺激及びＥＣ刺激全血培養上清の多重サイトカインアッセイ（ＭＣＡ、multiplex cytokine assay）から得られたデータを分析した。この分析のために、２７プレックスＭＣＡからの未刺激及び抗原特異的サイトカイン応答を別々の変数として分析した。本発明者らは、研究対象を訓練セット（対象の８０％）及び独立検査セット（２０％）に無作為に割り当てた。次いで本発明者らは、試料の年齢及び出身について補正した訓練セットにおいてロジスティック回帰モデルをフィットさせる最小絶対値縮小選択演算子（ＬＡＳＳＯ、Least Absolute Shrinkage and Selection Operator）ペナルティを適用する一般化線形モデル（ＧＬＭ、Generalized Linear Model）を、最初にバイナリ結果変数として、ＴＢに類似しているがＴＢではない他の呼吸器疾患（ＯＤ群）と比較した、細菌学的に確認されたＴＢ（代表的な方法）を用いて使用した。ＬＡＳＳＯモデルは、最大ペナルティ尤度を回帰係数の絶対サイズに適用し、それらをゼロに収縮する、すなわちＬ１ノルムペナルティが回帰係数に適用される。この手順は、変数選択（一部の回帰係数はゼロに等しい）及びゼロに収縮するゼロでない回帰係数の推定の両方をもたらす。この方法は、非常に多くの測定値があり、その多くが高度に関連している可能性がある本発明者らのサイトカインデータに好適である。
【０１８５】
本発明者らは、カテゴリー的及び連続的変数として、及び両方の組合せとしてサイトカイン共変数をフィットさせた。カテゴリー的サイトカイン共変数を、各サイトカイン値の度数分布を１０個の等サイズ分位に分割することによる十分位へのサイトカイン値の分割によって構築し、次いで１０個の分位それぞれをカットオフとして使用して各サイトカインについての１０個のバイナリ変数としてモデルにフィットさせた。最適ＬＡＳＳＯモデルを訓練セットで５倍クロス確認を使用して決定し、続いて出身について未処置の独立検査セットで細菌学的に確認されたＴＢをＯＤから分類するために適用した。最適モデルは、最小の予測誤差及び最良の平均クロス確認ＡＵＣをもたらす最も高いペナルティパラメーター（ラムダ）を有するモデルとして定義された。クロス確認工程は、複数の検査の補正を担い、古典的方法に取って代わる。加えてそれは必然的に、過剰適合から保護し、モデルが独立データセットにどの程度一般化しているかを評価する手段である。最適ＬＡＳＳＯモデルの予測性能をＴＢについての予測可能性及び受診者動作特性曲線下面積（ＡＵＣ、area under the receiver operating characteristics curve）を推定することによって評価した。
【０１８６】
結果
全体として、合わせたコホートからの５３名の小児がＴＢを有すると診断され、標準的ＴＢ治療を開始した；２４名は細菌学的に確認されたＴＢを有し、２９名は、微生物学的検査陽性を有さずに臨床的及び放射線学的特性に基づいて診断されたＴＢを有した。１２０名は、ＯＤについて診断及び治療された。詳細には、１５０名のガンビアの小児の内３５名は、細菌学的に確認された１６名及び臨床的に診断されたＴＢ症例１９名を含め、ＴＢを有し、一方１１５名はＯＤを有した。英国からの２３名の小児の内、１８名はＴＢを有すると診断された（８名は確認され、１０名は臨床的に診断されたＴＢ）一方で、５名はＯＤを有した。ガンビア及び英国から採用された小児にＨＩＶに感染している者はいなかった。表１は、ガンビア又は英国からの小児のベースラインプロファイルの分布が同様であったことを示している。
【０１８７】
【表８】
2019510206.tif 000011
【０１８８】
確認されたＴＢ対ＯＤでのサイトカイン及びケモカイン産生のパターン
細菌学的に確認されたＴＢを有する小児由来の未刺激上清及びＥＣ刺激上清の２７プレックス多重サイトカイン分析によって得られたサイトカイン及びケモカインの濃度をＯＤを有する小児におけるレベルと、年齢及び出身について補正して、多変量線形回帰分析によって比較した。各サイトカイン又はケモカインについての未刺激及びＥＣ特異的値（すなわちＥＣ刺激から未刺激陰性対照値を引いた）を別々の変数として分析した。
【０１８９】
【表９】
2019510206.tif 000012
【０１９０】
表２に示す通り、分析した２７個のサイトカイン及びケモカインの内、ＩＬ１ｒａ、ＩＬ７、ＩＬ１２ｐ７０、ＩＬ１３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、エオタキシン、ベーシックＦＧＦ、ＧＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＰ１０、ＭＩＰ１ｂ及びＶＥＧＦの未刺激濃度は、ＯＤを有する小児と比較して確認されたＴＢを有する小児において有意に高かった。すべての分析物のＥＣ特異的濃度の内、ＩＬ２及びＩＬ７だけは２群間で有意に異なっていた。さらに、本発明者らは、未刺激試料中の濃度が、有意な差異が無かった未刺激ＩＬ７値（データ未記載）を除いて、年齢又は診断に関わらずガンビアの小児と比較して英国の小児においてすべての分析物について有意に高かった（すべてについて、Ｐ値０．００１未満）ことを見出した。反対に、分析物のＥＣ特異的濃度は、有意な差異が無かったＩＬ２、ＩＬ５、ＩＬ７、ＩＬ１３、ＩＦＮ−γ及びＲＡＮＴＥＳのＥＣ特異的濃度を除いて、年齢又は診断に関わらずガンビアの小児と比較して英国の小児において有意に低かった（すべてについて、Ｐ値０．００１未満）。
【０１９１】
小児ＴＢの診断のための宿主特異的バイオシグネチャーの同定
バイナリロジスティック回帰モデルにフィットさせるためにＬＡＳＳＯペナルティを用いるＧＬＭを使用し、年齢及び出身について補正し、訓練セットでの５倍クロス確認を用い、サイトカインの９個のカテゴリーの組合せは、０．８２の平均クロス確認ＡＵＣを有してＴＢ又はＯＤを最適に予測した。９個のサイトカインそれぞれは、カットオフ値を有するバイナリ変数である。
【０１９２】
サイトカイン（それぞれについての特異的分位カットオフ値は括弧内）は、未刺激ＩＬ−１ｒａ（３）、ＩＬ６（６）、ＩＬ−７（８）、ＩＬ−８（９）、ＩＬ−１２ｐ７０（９）、ＦＧＦベーシック（３）、ＩＰ−１０（４）、ＶＥＧＦ（９）及びＥＣ刺激ＶＥＧＦ（２）であった。独立セットに適用される場合、このモデルは、図１にグラフで示す通り、０．９１（９５％ＣＩ  ０．８０〜１．０）のＡＵＣで確認されたＴＢをＯＤから確実に分類した。
【０１９３】
マルチサイトカインバイオシグネチャーの診断精度及び付加価値
バイオシグネチャーにおける各サイトカインについての分位特異的カットオフ値は、バイオシグネチャーをバイナリ、つまり陽性か又は陰性かの検査に変換できるようにする。本発明者らは、２つの別々の変数、すなわち「バイオシグネチャー１」（同定されたサイトカイン９個すべての組合せ）及び「バイオシグネチャー２」（未刺激上清からの８個だけのサイトカインの組合せ）としてのバイオシグネチャーの診断精度を調査した。本発明者らが、新規マルチサイトカインバイオシグネチャーの結果を、疾患確実性分類（すなわち細菌学的に確認されたＴＢ（＝確認されたＴＢ）、臨床診断されたＴＢ（＝ＴＢ可能性）及び他の呼吸器疾患だがＷＨＯによって定義された（W.H.O. Definitions and reporting framework for Tuberculosis - 2013 revision., Geneva, Switzerland.  www.who.int/iris/bitstream/10665/79199/1/9789241505345_eng.pdf [Accessed 03 December 2014], 2013）ＴＢではない（ＯＤ）、と比較し、「バイオシグネチャー１」は、確認されたＴＢの８％、臨床診断されたＴＢ症例の７％で陽性であった。しかし「バイオシグネチャー２」は、比較的高い感度を有し、確認された及び臨床診断されたＴＢ症例でそれぞれ２１％及び２４％の陽性をもたらした。両方のバイオシグネチャーバージョンは、１２０例のＯＤ症例の１１９例で陰性であり、９９．２％の非常に高い特異度をもたらした（表３）。
【０１９４】
【表１０】
2019510206.tif 000013
【０１９５】
活動性ＴＢ疾患を有すると診断されたすべての小児の複合標準を使用して、未刺激上清中のマーカーだけに由来する「バイオシグネチャー２」は、活動性ＴＢ疾患を有すると診断された５３名すべての小児の内１２名が陽性であり、２３％（９５％ＣＩ  １２−３６）の感度をもたらした。個別検査として、「バイオシグネチャー２」の感度は、スメア顕微鏡（５．７％；Ｐ値＝０．０２０）のものより有意に高かったが、Ｍ．ｔｂ培養（３５．９％；Ｐ値＝０．１２７）のものと同程度であった。「バイオシグネチャー２」とスメア顕微鏡との組合せは、活動性ＴＢ疾患を有する小児５３名の内１５名陽性で、２８．３％の感度をもたらし、スメア顕微鏡単独の感度（５．７％；ｐ  ０．００１未満）よりも有意に高かった。同様にＭ．ｔｂ培養と組み合わせた「バイオシグネチャー２」は４９．１％の感度を有し、Ｍ．ｔｂ培養を単独で使用した感度（３５．９％；ｐ  ０．００１未満）より有意に高かった。Ｍ．ｔｂ培養と組み合わせた「バイオシグネチャー２」の感度は、顕微鏡と組み合わせた「バイオシグネチャー２」のもの（ｐ  ０．００１未満）より有意に高かったが、「バイオシグネチャー２」、顕微鏡及びＭ．ｔｂ培養の組合せの感度と同程度であった（ｐ＝０．３２０）。これらの診断検査との組合せでの「バイオシグネチャー２」の使用は、検査の特異度にいかなる変化ももたらさなかった。
【０１９６】
要旨
ＩＦＮ−γなどの宿主免疫因子は重要であると示されてきたが、ＴＢを確認する又は除外するために不十分であることから（Kaufmann SH. Fact and fiction in tuberculosis vaccine research: 10 years later. The Lancet infectious diseases 2011: 11(8): 633-640、Flynn JL, Chan J, Triebold KJ, Dalton DK, Stewart TA, Bloom BR. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. The Journal of experimental medicine 1993: 178(6): 2249-2254）、本研究の目的は、これら２つの臨床所見の区別が正しい治療を開始するために重要であることから、ＴＢをＯＤからガンビア及び英国の小児において識別する助けとなる可能性があるＩＦＮ−γ以外のサイトカインを調査することであった。先行研究は、Ｍ．ｔｂに対する免疫応答において及び／又はＴＢをＯＤから識別することにおいて重要であることが見出されたＴＮＦ−α、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８及びＩＬ−１７、ＦＧＦ及びＶＥＧＦなどの他のサイトカインを報告している（Sutherland JS, de Jong BC, Jeffries DJ, Adetifa IM, Ota MO. Production of TNF- alpha, IL-12(p40) and IL-17 can discriminate between active TB disease and latent infection in a West African cohort. PloS one 2010: 5(8): e12365、Algood HM, Chan J, Flynn JL. Chemokines and tuberculosis. Cytokine Growth Factor Rev 2003: 14(6): 467-477、Ota MO, Mendy JF, Donkor S, Togun T, Daramy M, Gomez MP, Chegou NN, Sillah AK, Owolabi O, Kampmann B, Walzl G, Sutherland JS. Rapid diagnosis of tuberculosis using ex vivo host biomarkers in sputum. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology 2014: 44(1): 254-257）。
【０１９７】
本発明者らは、小児の年齢及び出身に関わらず、細菌学的に確認されたＴＢをＯＤから最適に識別した独自の、分位特異的な９サイトカインバイオシグネチャーを同定した。バイオシグネチャーは、臨床的に診断されたＴＢを有する小児における活動性ＴＢ疾患の可能性も予測し、それは細菌学的に確認されたＴＢ症例のものと同程度であった。詳細には本発明者らは、年齢及び出身を補正したＬＡＳＳＯ回帰モデルを、細菌学的に確認されたＴＢとＯＤとを独立検査セットにおいて０．９１のＡＵＣを有して最適に識別する未刺激ＩＬ−１ｒａ、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１２ｐ７０、ベーシックＦＧＦ、ＩＰ−１０、ＶＥＧＦ及びＥＣ刺激ＶＥＧＦの分位特異的組合せを同定するために使用した。このバイオシグネチャーの性能は、臨床結果群においてＭ．ｔｂへの感作に無関係であった、一方でバイオシグネチャー中の９個のサイトカインの内の８個は未刺激上清由来であった。本発明者らの研究の主な長所は、独占的に小児科の活動性症例調査研究において使用される前向きアプローチである一方で、本発明者らのコホートで同定されたバイオシグネチャーはＴＢ免疫に密接に関連することが公知であるサイトカインを含有している。
【０１９８】
本発明者らは、未刺激上清由来のマーカーだけを含む８サイトカインバイオシグネチャー、及び本発明者らの全９サイトカインバイオシグネチャーの診断精度を、それらの結果をＷＨＯ症例定義による疾患確実性分類及び活動性ＴＢ疾患を有すると診断されたすべての小児の複合標準と比較することによって別々に調査した。本発明者らは、未刺激８サイトカインバイオシグネチャーが全９サイトカインバイオシグネチャーよりも比較的高い感度を有した一方で、両方のバイオシグネチャーバージョンは、活動性ＴＢ疾患をＯＤから９９．２％の非常に高い特異度で識別したことを見出した。未刺激８サイトカインバイオシグネチャーは、Ｍ．ｔｂ培養と比較して、本発明者らの研究で活動性ＴＢ疾患を有すると診断されたすべての小児において同等の数のＴＢ症例を検出し、日常的なＴＢ診断検査と組み合わせた場合の実質的な付加価値を実証した。それは、比較的高い特異度を示したが、南東アフリカでの多国間小児ＴＢバイオマーカー研究において同定された５１個の全血遺伝子転写物に基づくリスクスコア、並びに成人ガンビア人での、抗原刺激全血上清中の３つのマーカーＴＮＦ−α、ＩＬ−１２（ｐ４０）及びＩＬ−１７の組合せ（Sutherland JS, de Jong BC, Jeffries DJ, Adetifa IM, Ota MO. Production of TNF- alpha, IL-12(p40) and IL-17 can discriminate between active TB disease and latent infection in a West African cohort. PloS one 2010: 5(8): e12365、Anderson ST, Kaforou M, Brent AJ, Wright VJ, Banwell CM, Chagaluka G, Crampin AC, Dockrell HM, French N, Hamilton MS, Hibberd ML, Kern F, Langford PR, Ling L, Mlotha R, Ottenhoff TH, Pienaar S, Pillay V, Scott JA, Twahir H, Wilkinson RJ, Coin LJ, Heyderman RS, Levin M, Eley B. Diagnosis of childhood tuberculosis and host RNA expression in Africa. The New England journal of medicine 2014: 370(18): 1712-1723）と比較して低い感度を示した。しかし、この小児科バイオシグネチャーの特異度は、ガンビアの成人での別の研究におけるエクスビボ喀痰試料におけるＩＬ−１３、ＦＧＦ及びＩＦＮ−γの組合せと同等であり、感度、８５％及び特異度、９６％で、連続して採用された培養確認されたＴＢ症例のＯＤからの９６％正しい分類をもたらした（Ota MO, Mendy JF, Donkor S, Togun T, Daramy M, Gomez MP, Chegou NN, Sillah AK, Owolabi O, Kampmann B, Walzl G, Sutherland JS. Rapid diagnosis of tuberculosis using ex vivo host biomarkers in sputum. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology 2014: 44(1): 254-257）。
【０１９９】
いくつかの要因が、この未刺激マルチサイトカインバイオシグネチャーを、高ＴＢ負荷国における使用のための特に有望なアプローチにしている。第１に、構成成分サイトカインのそれぞれについての分位特異的カットオフ値は、読み出しが陽性又は陰性結果のいずれかを有するバイナリ検査に容易に変換できることを意味しており、より容易に説明可能になる。第２に、未刺激上清中のマーカーだけに由来するこのマルチサイトカインバイオシグネチャーは、Ｍ．ｔｂ培養に類似する疫学的特性を有するが、培養のときの遅延又は混入のリスクのために同時には供されない可能性がある。第３に、ＴＢ診断が主にスメア顕微鏡の使用に基づいている発展途上国並びにＸ線、Ｘｐｅｒｔ及び／又は培養設備を有する医療機関での初期治療における小児のＴＢ疾患での推定治療を低減する実証可能な将来性を有する。これは、日常的な診断検査との組合せで使用される場合の、活動性ＴＢ疾患を有すると見なされる小児の数の実質的増加のためである。第４に、この未刺激マルチサイトカインバイオシグネチャーは、抗原刺激及び実験室でのインキュベーションのために必要な追加的費用、訓練又は設備を用いずに、血清又は血漿試料において直接測定できる可能性がある。したがって、８サイトカインバイオシグネチャーは、本発明の最も好ましい実施形態である。
【０２００】
実施例２：核酸に基づく検出
本実施例では本発明者らは、ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）検出などの核酸検出を介して、ＴＢ（小児ＴＢなど）の診断を補助する本発明の適用／遺伝子シグネチャーを例示する試料の処理を記載する。
【０２０１】
１．試料採取：
血液試料をPaxGeneチューブ又はテンプスチューブなどのＲＮＡのための安定化剤を含有するチューブに採取する。
代替的にトリゾールが試料に加えられる。
【０２０２】
そのような試料は処理まで冷蔵庫又は冷凍庫に保存することができる。
冷蔵庫に保存する場合は保存期間は数日であり、冷凍庫に保存する場合は保存期間は数カ月であってよい。
【０２０３】
２．試料処理
採取チューブ及び安定化剤に応じて、好適な市販で入手できるＲＮＡ抽出キット（複数可）を選択し、製造者の使用説明書に従って使用する。
本実施例では、ＲＮＡ抽出のためのスピンカラム及び洗浄緩衝液を含むQiagenキットを使用する。
マイクロＲＮＡを含む全ＲＮＡをこれらの確立された方法を使用して抽出する。
【０２０４】
３．逆転写
増幅できるＤＮＡを得るために転写反応は、最初にｍＲＮＡからｃＤＮＡへの変換を必要とする。これは、適切な量のＲＴランダムプライマー、ｄＮＴＰ、逆転写酵素及びＲＴ緩衝液の添加に続く、当技術分野において公知であるサーマルサイクリングインキュベーションによって行われる。
このようにＲＮＡはＤＮＡに逆転写される。
【０２０５】
４．増幅
次いでｃＤＮＡは、適切には標準化のために参照遺伝子に特異的なプライマー及び／又はプローブと共に、上に記載されるバイオマーカーの所望の転写物に対して特異的なプライマー及び／又はプローブを使用して増幅することができる。
利便性のために、本実施例では、問題の各サイトカインについてのプライマー及び／又はプローブ、内部標準及び内在性対照遺伝子をｃＤＮＡ鋳型と主にマスターミックスに加え、リアルタイムＰＣＲ装置を使用して、三回反復ＰＣＲ反応を単一プレックス又は多重で実行した。
【０２０６】
（参考文献）
1. Sutherland JS, de Jong BC, Jeffries DJ, Adetifa IM, Ota MO. Production of TNF- alpha, IL-12(p40) and IL-17 can discriminate between active TB disease and latent infection in a West African cohort. PloS one 2010: 5(8): e12365.
2. W.H.O. Definitions and reporting framework for Tuberculosis - 2013 revision., Geneva, Switzerland.  www.who.int/iris/bitstream/10665/79199/1/9789241505345_eng.pdf [Accessed 03 December 2014], 2013.
3. Kaufmann SH. Fact and fiction in tuberculosis vaccine research: 10 years later. The Lancet infectious diseases 2011: 11(8): 633-640.
4. Flynn JL, Chan J, Triebold KJ, Dalton DK, Stewart TA, Bloom BR. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. The Journal of experimental medicine 1993: 178(6): 2249-2254.
5. Algood HM, Chan J, Flynn JL. Chemokines and tuberculosis. Cytokine Growth Factor Rev 2003: 14(6): 467-477.
6. Ota MO, Mendy JF, Donkor S, Togun T, Daramy M, Gomez MP, Chegou NN, Sillah AK, Owolabi O, Kampmann B, Walzl G, Sutherland JS. Rapid diagnosis of tuberculosis using ex vivo host biomarkers in sputum. The European respiratory journal : official journal of the European Society for Clinical Respiratory Physiology 2014: 44(1): 254-257.
7. Anderson ST, Kaforou M, Brent AJ, Wright VJ, Banwell CM, Chagaluka G, Crampin AC, Dockrell HM, French N, Hamilton MS, Hibberd ML, Kern F, Langford PR, Ling L, Mlotha R, Ottenhoff TH, Pienaar S, Pillay V, Scott JA, Twahir H, Wilkinson RJ, Coin LJ, Heyderman RS, Levin M, Eley B. Diagnosis of childhood tuberculosis and host RNA expression in Africa. The New England journal of medicine 2014: 370(18): 1712-1723.
[配列表]
【０２０７】
>sp|P05231|IL6_HUMAN Interleukin-6 OS=Homo sapiens GN=IL6 PE=1 SV=1
MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRKETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPKMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKEFLQSSLRALRQM
>sp|P18510|IL1RA_HUMAN Interleukin-1 receptor antagonist protein OS=Homo sapiens GN=IL1RN PE=1 SV=1
MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETICRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE
>sp|P18510-2|IL1RA_HUMAN Isoform 2 of Interleukin-1 receptor antagonist protein OS=Homo sapiens GN=IL1RN
MALETICRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE
>sp|P18510-3|IL1RA_HUMAN Isoform 3 of Interleukin-1 receptor antagonist protein OS=Homo sapiens GN=IL1RN
MALADLYEEGGGGGGEGEDNADSKETICRPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE
>sp|P18510-4|IL1RA_HUMAN Isoform 4 of Interleukin-1 receptor antagonist protein OS=Homo sapiens GN=IL1RN
MQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETRLQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQEDE
>sp|P13232|IL7_HUMAN Interleukin-7 OS=Homo sapiens GN=IL7 PE=1 SV=1
MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
>sp|P13232-2|IL7_HUMAN Isoform 2 of Interleukin-7 OS=Homo sapiens GN=IL7
MFHVSFRYIFGLPPLILVLLPVASSDCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
>sp|P13232-3|IL7_HUMAN Isoform 3 of Interleukin-7 OS=Homo sapiens GN=IL7
MKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH
>sp|P10145|IL8_HUMAN Interleukin-8 OS=Homo sapiens GN=CXCL8 PE=1 SV=1
MTSKLAVALLAAFLISAALCEGAVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS
>sp|P10145-2|IL8_HUMAN Isoform 2 of Interleukin-8 OS=Homo sapiens GN=CXCL8
MTSKLAVALLAAFLISAALCEGAVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKAEVPENRGMDS
>sp|P29460|IL12B_HUMAN Interleukin-12 subunit beta OS=Homo sapiens GN=IL12B PE=1 SV=1
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
FGF-basic; P09038; FGF2
MVGVGGGDVE DVTPRPGGCQ ISGRGARGCN GIPGAAAWEA ALPRRRPRRH PSVNPRSRAA GSPRTRGRRT EERPSGSRLG DRGRGRALPG GRLGGRGRGR APERVGGRGR GRGTAAPRAA PAARGSRPGP AGTMAAGSIT TLPALPEDGG SGAFPPGHFK DPKRLYCKNG GFFLRIHPDG RVDGVREKSD PHIKLQLQAE ERGVVSIKGV CANRYLAMKE DGRLLASKCV TDECFFFERL ESNNYNTYRS RKYTSWYVAL KRTGQYKLGS KTGPGQKAIL FLPMSAKS
>sp|P02778|CXL10_HUMAN C-X-C motif chemokine 10 OS=Homo sapiens GN=CXCL10 PE=1 SV=2
MNQTAILICCLIFLTLSGIQGVPLSRTVRCTCISISNQPVNPRSLEKLEIIPASQFCPRVEIIATMKKKGEKRCLNPESKAIKNLLKAVSKERSKRSP
>sp|P15692|VEGFA_HUMAN Vascular endothelial growth factor A OS=Homo sapiens GN=VEGFA PE=1 SV=2
MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVYVGARCCLMPWSLPGPHPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
>sp|P15692-2|VEGFA_HUMAN Isoform VEGF189 of Vascular endothelial growth factor A OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRYKSWSVPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
>sp|P15692-3|VEGFA_HUMAN Isoform VEGF183 of Vascular endothelial growth factor A OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQEKKSVRGKGKGQKRKRKKSRPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
>sp|P15692-4|VEGFA_HUMAN Isoform VEGF165 of Vascular endothelial growth factor A OS=Homo sapiens GN=VEGFA
MNFLLSWVHWSLALLLYLHHAKWSQAAPMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIEYIFKPSCVPLMRCGGCCNDEGLECVPTEESNITMQIMRIKPHQGQHIGEMSFLQHNKCECRPKKDRARQENPCGPCSERRKHLFVQDPQTCKCSCKNTDSRCKARQLELNERTCRCDKPRR
>sp|P15692-5|VEGFA_HUMAN Isoform VEGF148 of Vascular endothelial growth factor A OS=Homo sapiens GN=VEGFA
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>sp|P15692-6|VEGFA_HUMAN Isoform VEGF145 of Vascular endothelial growth factor A OS=Homo sapiens GN=VEGFA
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>sp|P15692-8|VEGFA_HUMAN Isoform VEGF165B of Vascular endothelial growth factor A OS=Homo sapiens GN=VEGFA
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>sp|P15692-9|VEGFA_HUMAN Isoform VEGF121 of Vascular endothelial growth factor A OS=Homo sapiens GN=VEGFA
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>sp|P15692-10|VEGFA_HUMAN Isoform VEGF111 of Vascular endothelial growth factor A OS=Homo sapiens GN=VEGFA
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>sp|P15692-11|VEGFA_HUMAN Isoform L-VEGF165 of Vascular endothelial growth factor A OS=Homo sapiens GN=VEGFA
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>sp|P15692-12|VEGFA_HUMAN Isoform L-VEGF121 of Vascular endothelial growth factor A OS=Homo sapiens GN=VEGFA
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>sp|P15692-13|VEGFA_HUMAN Isoform L-VEGF189 of Vascular endothelial growth factor A OS=Homo sapiens GN=VEGFA
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>sp|P15692-14|VEGFA_HUMAN Isoform L-VEGF206 of Vascular endothelial growth factor A OS=Homo sapiens GN=VEGFA
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>sp|P15692-15|VEGFA_HUMAN Isoform 15 of Vascular endothelial growth factor A OS=Homo sapiens GN=VEGFA
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>sp|P15692-16|VEGFA_HUMAN Isoform 16 of Vascular endothelial growth factor A OS=Homo sapiens GN=VEGFA
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>sp|P15692-17|VEGFA_HUMAN Isoform 17 of Vascular endothelial growth factor A OS=Homo sapiens GN=VEGFA
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>sp|P15692-18|VEGFA_HUMAN Isoform 18 of Vascular endothelial growth factor A OS=Homo sapiens GN=VEGFA
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【図１−１】
2019510206.tif 000015
【図１−２】
2019510206.tif 000016
【図１−３】
2019510206.tif 000017
【図２】
2019510206.tif 000018
【図３】
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【図４】
2019510206.tif 000020
【図５】
2019510206.tif 000021
【図６】
2019510206.tif 000022
【図７】
2019510206.tif 000023
【図８】
2019510206.tif 000024
【図９】
2019510206.tif 000025
【図１０】
2019510206.tif 000026
【図１１】
2019510206.tif 000027
【配列表】
2019510206000001.app
【国際調査報告】
2019510206.tif 000028
2019510206.tif 000029