(57)【要約】  本発明は、移植後に免疫寛容の（ＴＯＬ）対象と移植後に免疫寛容でない（ＳＴＡ）対象とを識別するための方法であって、  ｉ）前記対象から得た生体試料中の６種の遺伝子の発現レベル及び２種の臨床的パラメータによって複合寛容スコア（ｃＳｏＴ）を確立する段階であって、  前記６種の遺伝子はＩＤ３、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＴＣＬ１Ａ及びＭＺＢ１であり、  前記ｃＳｏＴは次式：  【数１】2019527062.tif 000011で確立される段階と、  ｉｉ）このｃＳｏＴを既定の基準値と比較する段階と、  ｉｉｉ）ｃＳｏＴが既定の基準値よりも高い場合には対象がＴＯＬであると結論を下し、又はｃＳｏＴが既定の基準値よりも低い場合には対象がＳＴＡであると結論を下す段階を含む方法に関する。【選択図】なし
2019527062.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植後に免疫寛容の（ＴＯＬ）対象と移植後に免疫寛容でない（ＳＴＡ）対象とを識別するための方法であって、
ｉ）前記対象から得た生体試料中の６種の遺伝子の発現レベル及び２種の臨床的パラメータによって複合寛容スコア（ｃＳｏＴ）を確立する段階であって、
前記６種の遺伝子はＩＤ３、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＴＣＬ１Ａ及びＭＺＢ１であり、
前記ｃＳｏＴは次式：
【数１】
2019527062.tif 000010
で確立される段階と、
ｉｉ）このｃＳｏＴを既定の基準値と比較する段階と、
ｉｉｉ）ｃＳｏＴが既定の基準値よりも高い場合には対象がＴＯＬであると結論を下し、又はｃＳｏＴが既定の基準値よりも低い場合には対象がＳＴＡであると結論を下す段階を含む方法。
【請求項２】
２種の臨床的パラメータは試験時の前記対象の年齢及び移植時の前記対象の年齢である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
既定の基準値はＴＯＬ対象のｃＳｏＴである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
既定の基準値はＳＴＡ対象のｃＳｏＴである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
対象は免疫抑制治療中である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記対象はヒトである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記対象は腎臓レシピエントである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記腎臓レシピエントは更に腎臓ドナーの膵臓が移植されており、任意選択で腎臓ドナーの十二指腸片が移植されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
移植された対象を免疫抑制療法で治療する方法であって、
ｉ）対象が請求項１に記載の移植後に免疫寛容の（ＴＯＬ）対象であるか又は移植後に免疫寛容でない（ＳＴＡ）対象であるかを決定する段階と、
ｉｉ）対象がＳＴＡである場合には対象を免疫抑制療法で治療する段階を含む方法。
【請求項１０】
免疫抑制療法中の移植された対象を免疫抑制療法の断薬又は最小化の候補として特定するための方法であって、
ｉ）対象が請求項１に記載の移植後に免疫寛容の（ＴＯＬ）対象であるか又は移植後に免疫寛容でない（ＳＴＡ）対象であるかを決定する段階と、
ｉｉ）対象がＴＯＬである場合には対象が免疫抑制療法の断薬又は最小化に適格であると結論を下す段階を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は移植の分野であり、特に、本発明は、免疫抑制治療で治療された対象のうち、どの対象が寛容であるかを特定することを可能にする。
【背景技術】
【０００２】
固形臓器移植は、移植片拒絶反応を予防するために免疫抑制治療（ＩＳ）の使用に依存している。しかし、癌、心血管疾患、感染症及び腎毒性等の長期に亘るＩＳ副作用［１〜３］のため、医師は、移植片を免疫学的攻撃から保護しながらＩＳ曝露を減らすよう推奨されている［４］。理想的には、固形臓器移植において同種移植片の免疫寛容を得ること、即ち、免疫抑制（ＩＳ）治療を行わずに同種移植片を許容することは、ＩＳ副作用の回避による大きい洞察となるであろう。また、これによって、移植の維持費用が削減され［５］、レシピエントの生活の質を改善しながら再移植の症例が減るであろう。この目的では、主に骨髄又は幹細胞移植を介した一過性のキメラ樹立を通じて、幾つかの寛容誘導のプロトコルが試みられて成功している［６〜１０］。しかし、これまでのところ、有効性は生体ドナー又はゼロミスマッチ死体ドナーに限られており、ＨＬＡミスマッチを伴う寛容誘導が成功した例は僅かしか報告されていない［６、１１］。興味深いことに、服薬不履行又は医学的判断、特に移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）のためにＩＳを中断した結果としての寛容も観察されている［１２、１３］。このような患者は何年間も安定且つ良好な移植片機能を示し、免疫学的攻撃に応答し［１２］、健常ボランティアと比較して多くの日和見感染を有しない［１２、１３］。臨床的観点から、主に偶然に発見されたこのような患者［１２、１４、１５］は、標準的なＩＳ（ＳＴＡ）により移植片機能が安定している腎臓レシピエントと同等であり、ごくわずかな違いは、生体ドナーからの移植片の割合の増加及びより低いＨＬＡミスマッチレベルである［１２］。
【０００３】
今まで、移植片機能が非常に安定な非感作性レシピエントの抜本的な選択に基づく治験においても、ＩＳを安全に断薬することができる臨床的パラメータはない［１６、１７］（Ｄｕｇａｓｔ  Ｅら、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０１６  Ｎｏｖ；１６（１１）：３２５５−３２６１）。従って、新しい治験における腎移植でのＩＳ中止の意図的な再現には臨床的パラメータだけでなく、最近の報告で道が開かれている新しい臨床検査も必要なのは明らかである。最近、これらの様々な研究の統合的メタ分析によって、ＴＯＬとＳＴＡの間で最も有意に差別的に発現する遺伝子として、主にＢ細胞に関連する２０個の遺伝子が更に強調された［１８］。興味深いことに、これらのレシピエント由来のＢ細胞は、抑制性受容体の発現を伴う特定の表現型［２４］、独特の分化プロファイル［２７］を有し、抑制特性を示す［２８］。まとめると、これらのデータは、Ｂ細胞が潜在的なバイオマーカーであるだけでなく、移植された腎臓に対する免疫応答を能動的に調節することもできることを示唆し、その誘導及び拡大は誘導療法によって都合がよい可能性が高い［２６］。
【０００４】
このようなシグネチャーの有用性は現在明らかに確立されており、過去数十年の科学界の努力によるものである［２９、３０］が、本発明者らは、ＩＳを最小限にした場合の安全性及び信頼性を証明し、移植患者を追跡調査する必要がある。第一に、より多くの患者に容易に適用可能でありながら最も信頼性が高いシグネチャーが必要である。第二に、移植患者の一生の間に生じる事象（例えば、悪性腫瘍又は免疫抑制）に影響を受けない安定なシグネチャーが必要である。第三に、寛容の誘導は有望な治療法であるが、このようなプロトコルが移植後に免疫寛容の患者で見られるものを再現するかどうか、又はいわゆる「寛容」に様々な状況が存在するかどうかについてはまだ解決されておらず、従って、この２つの状況に共通するシグネチャーはまだ実証されていない。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、移植後に免疫寛容の（ＴＯＬ）対象と移植後に免疫寛容でない（ＳＴＡ）対象とを識別するための方法であって、
ｉ）前記対象から得た生体試料中の６種の遺伝子の発現レベル及び２種の臨床的パラメータによって複合寛容スコア（ｃＳｏＴ）を確立する段階であって、
前記ｃＳｏＴが次式：
【数１】
2019527062.tif 000003
で確立される段階と、
ｉｉ）このｃＳｏＴを既定の基準値と比較する段階と、
ｉｉｉ）ｃＳｏＴが既定の基準値よりも高い場合には対象がＴＯＬであると結論を下し、又はｃＳｏＴが既定の基準値よりも低い場合には対象がＳＴＡであると結論を下す段階を含む方法に関する。
【０００６】
一実施形態では、６種の遺伝子はＩＤ３、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＴＣＬ１Ａ及びＭＺＢ１である。
【０００７】
一実施形態では、２種の臨床的パラメータは試験時の前記対象の年齢及び移植時の前記対象の年齢である。
【０００８】
一実施形態では、既定の基準値はＴＯＬ対象のｃＳｏＴである。他の実施形態では、既定の基準値はＳＴＡ対象のｃＳｏＴである。
【０００９】
一実施形態では、対象は免疫抑制治療中である。
【００１０】
一実施形態では、対象はヒトである。
【００１１】
一実施形態では、対象は腎臓レシピエントである。一実施形態では、前記腎臓レシピエントは更に腎臓ドナーの膵臓が移植されており、必要に応じて腎臓ドナーの十二指腸片が移植されている。
【００１２】
本発明は更に、移植された対象を免疫抑制療法で治療する方法であって、
ｉ）本発明に係る移植後に免疫寛容の（ＴＯＬ）対象と移植後に免疫寛容でない（ＳＴＡ）対象とを識別するための方法を用いて、対象がＴＯＬ対象であるか又はＳＴＡ対象であるかを決定する段階と、
ｉｉ）対象がＳＴＡである場合には対象を免疫抑制療法で治療する段階を含む方法に関する。
【００１３】
また、本発明は、免疫抑制療法中の移植された対象を免疫抑制療法の断薬又は最小化の候補として特定するための方法であって、
ｉ）本発明に係る移植後に免疫寛容の（ＴＯＬ）対象と移植後に免疫寛容でない（ＳＴＡ）対象とを識別するための方法を用いて、対象がＴＯＬ対象であるか又はＳＴＡ対象であるかを決定する段階と、
ｉｉ）対象がＴＯＬである場合には対象が免疫抑制療法の断薬又は最小化に適格であると結論を下す段階を含む方法にも関する。
【００１４】
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
【００１５】
本明細書で使用される「ＡＫＲ１Ｃ３」という用語は、アルド−ケトレダクターゼファミリー１メンバーＣ３を意味する。天然のヒトＡＫＲ１Ｃ３遺伝子はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２５３９０８．１に示されるヌクレオチド配列を有し、天然のヒトＡＫＲ１Ｃ３タンパク質はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２４０８３７．１に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１６】
本明細書で使用される「生体試料」という用語は、対象、好ましくは移植された対象から入手した任意の試料、例えば、血清試料、血漿試料、尿試料、血液試料、リンパ液試料、又は生検試料を意味する。特定の実施形態では、遺伝子発現レベルを決定するための生体試料としては、血液試料、リンパ液試料、又は生検試料等の試料が挙げられる。特定の実施形態では、生体試料は血液試料、より具体的には末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。典型的には、このような細胞はフィコール、即ち、血液層を分離する親水性多糖類を用いて全血から抽出することができ、ＰＢＭＣは血漿層の下に細胞環を形成する。更に、赤血球を優先的に溶解する低張溶解を用いて全血からＰＢＭＣを抽出することができる。このような処置は当業者に知られている。
【００１７】
本明細書で使用される「ＣＤ４０」という用語は、分化抗原群４０を意味する。ＣＤ４０は抗原提示細胞に見出される同時刺激タンパク質であり、その細胞の活性化に必要である。天然のヒトＣＤ４０遺伝子はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１２５０．５に示されるヌクレオチド配列を有し、天然のヒトＣＤ４０タンパク質はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１２４１．１に示されるアミノ酸配列を有する。マウスのヌクレオチド配列とアミノ酸配列も記載されている（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号はそれぞれＮＭ＿０１１６１１．２とＮＰ＿０３５７４１．２）。
【００１８】
本明細書で使用される「ＣＴＬＡ４」という用語は、ＣＤ１５２（分化抗原群１５２）としても知られる細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４を意味する。これは免疫チェックポイントとして機能し、免疫応答を下方制御するタンパク質受容体である。天然のヒトＣＴＬＡ４遺伝子はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０３７６３１．２に示されるヌクレオチド配列を有し、天然のヒトＣＴＬＡ４タンパク質はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０３２７２０．１に示されるアミノ酸配列を有する。マウスのヌクレオチド配列とアミノ酸配列も記載されている（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号はそれぞれＮＭ＿００１２８１９７６．１とＮＰ＿００１２６８９０５．１）。
【００１９】
本明細書で使用される「識別する」という用語は、相違を特定、観察すること、又は２種の群を区別することを意味する。典型的には、本発明に係る方法は、免疫抑制薬で治療した対象のうち、寛容である対象を特定又は区別するのに適している。
【００２０】
本明細書で使用される「ＩＤ３」という用語はＤＮＡ結合阻害剤３を意味する。天然のヒトＩＤ３遺伝子はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００２１６７．４に示されるヌクレオチド配列を有し、天然のヒトＩＤ３タンパク質はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００２１５８．３に示されるアミノ酸配列を有する。マウスのヌクレオチド配列とアミノ酸配列も記載されている（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号はそれぞれＮＭ＿００８３２１．２とＮＰ＿０３２３４７．１）。
【００２１】
本明細書で使用される「免疫抑制療法」又は「免疫抑制治療」という用語は、移植された対象へ１種以上の免疫抑制薬を投与することを意味する。移植手順で使用することができる免疫抑制薬としては、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロホスファミド、ＦＫ−５０６（タクロリムス）、シロリムス、エベロリムス、ラパマイシン、コルチコステロイド、シクロスポリン（例えば、シクロスポリンＡ）、ミコフェノール酸、レフルマシド、アスコマイシン及びヒドロキシウレアが挙げられるが、これらに限定されない。これらの薬物は単独療法又は併用療法で使用してもよい。
【００２２】
本明細書で使用される「免疫抑制療法の断薬又は最小化」という用語は、免疫抑制薬を投与している移植された対象における免疫抑制療法を漸減させ、必要に応じて最終的に中止することを意味する。
【００２３】
本明細書で使用される「ＭＺＢ１」という用語は、辺縁帯Ｂ細胞及びＢ１細胞特異的タンパク質１を意味する。天然のヒトＭＺＢ１遺伝子はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１６４５９．３に示されるヌクレオチド配列を有し、天然のヒトＴＣＬ１Ａタンパク質は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿０５７５４３．２に示されるアミノ酸配列を有する。マウスのヌクレオチド配列とアミノ酸配列も記載されている（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号はそれぞれＮＭ＿０２７２２２．３とＮＰ＿０８１４９８．２）。
【００２４】
本明細書で使用される「臓器移植」という用語は、疾患を有する臓器、臓器の一部又は組織を健康な臓器又は組織で置換する手順を意味する。移植される臓器又は組織は、対象自身（＝自家移植片）、他のヒトドナー（＝同種移植片）又は動物（＝異種移植片）のいずれかから得ることができる。移植される臓器は人工又は天然、全体（腎臓、心臓、肝臓等）又は一部（心臓弁、皮膚、骨等）であり得る。
【００２５】
本明細書で使用される「既定の基準値」という用語は閾値又はカットオフ値を意味する。典型的には、「閾値」又は「カットオフ値」は実験的に、経験的に又は理論的に決定することができる。当業者によって認識されるように、既存の実験及び／又は臨床条件に基づいて閾値を任意に選択することもできる。例えば、適切に保存された過去の対象試料における遡及的測定を用いて既定の基準値を確立することができる。閾値は、試験の機能と利益／リスクバランス（偽陽性及び偽陰性の臨床結果）に従って最適な感度と特異度を得るように決定しなければならない。典型的には、実験データに基づく受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を使用して最適な感度と特異度（ひいては閾値）を決定することができる。例えば、参照群において選択されたペプチドの発現レベルを決定した後、試験対象試料において決定した発現レベルの統計的処理を行うためにアルゴリズム解析を使用して、試料分類にとって重要な分類基準を得ることができる。ＲＯＣ曲線の正式名は受信者動作特性曲線であり、受信者操作特性曲線としても知られている。これは主に臨床生化学的診断検査に使用される。ＲＯＣ曲線は真陽性率（感度）と偽陽性率（１−特異度）の連続変数を反映する包括的な指標である。これによって感度と特異度との関係が画像合成法で明らかになる。一連の異なるカットオフ値（閾値又は臨界値、診断テストの正常結果と異常結果との間の境界値）を連続変数として設定して一連の感度値と特異度値を計算する。次に感度を垂直座標として使用し、特異度を水平座標として使用して曲線を描く。曲線下面積（ＡＵＣ）が大きいほど、診断の精度が高くなる。ＲＯＣ曲線上で、座標図の左上に最も近い点が高感度と高特異度の両方の値を有する臨界点である。ＲＯＣ曲線のＡＵＣ値は１．０〜０．５である。ＡＵＣ＞０．５の場合、ＡＵＣが１に近づくにつれて診断結果はますます良くなる。ＡＵＣが０．５〜０．７の場合、精度は低い。ＡＵＣが０．７〜０．９の場合、精度は中程度である。ＡＵＣが０．９より高い場合、精度は高い。このアルゴリズム法はコンピュータで行うのが好ましい。当技術分野で既存のソフトウェア又はシステムを使用してＲＯＣ曲線を描くことができ、このようなソフトウェア又はシステムとしては、ＭｅｄＣａｌｃ９．２．０．１医療統計ソフトウェア、ＳＰＳＳ９．０、ＲＯＣＰＯＷＥＲ．ＳＡＳ、ＤＥＳＩＧＮＲＯＣ．ＦＯＲ、ＭＵＬＴＩＲＥＡＤＥＲ  ＰＯＷＥＲ．ＳＡＳ、ＣＲＥＡＴＥ−ＲＯＣ．ＳＡＳ、ＧＢ  ＳＴＡＴ  ＶＩ０．０（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社、米国メリーランド州、シルバースプリング）等が挙げられる。
【００２６】
本明細書で使用される「遺伝子発現レベルを決定するための試薬」という用語は、前記遺伝子の発現レベルを特異的に決定することができる試薬、即ち、所定の遺伝子の発現レベル、例えば、ＩＤ３、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＴＣＬ１Ａ及び／又はＭＺＢ１遺伝子の発現レベルを特異的に決定することを具体的に意図した試薬を意味する。従って、この定義では任意の遺伝子の発現レベルを決定するのに有用な一般的な試薬、例えば、ｔａｑポリメラーゼ又は増幅緩衝剤が除外されるが、そのような一般的な試薬は、所定の遺伝子の発現レベルを決定するために十分ではないが必要であり得るため、本発明に係るキットに含めることもできる。
【００２７】
本明細書で使用される「ＳＴＡ」という用語は「移植後に免疫寛容でない対象」を意味し、即ち、対象は、免疫抑制中には機能が安定しているが、免疫抑制治療を中止すると移植片を拒絶するであろう。そのような対象は移植片に対して寛容ではないと考えられる。特定の実施形態では、対象「ＳＴＡ」は免疫学的リスクが高いと考えられ、即ち、前記対象は拒絶反応（急性又は慢性）及び／又は移植片に対する抗体を生じさせるリスクが高い。
【００２８】
本明細書で使用される「対象」という用語は、齧歯類、ネコ科、イヌ科、及び霊長類等の任意の哺乳動物を意味する。特に本発明では、対象は「患者」とも称されるヒトである。特定の実施形態では、対象は「レシピエント」又は「移植された被験者」とも称される移植された対象である。
【００２９】
本明細書で使用される「ＴＣＬ１Ａ」という用語は、Ｔ細胞白血病又はリンパ腫タンパク質１を意味する。天然のヒトＴＣＬ１Ａ遺伝子はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１０９８７２５．１に示されるヌクレオチド配列を有し、天然のヒトＴＣＬ１Ａタンパク質はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１０９２１９５．１に示されるアミノ酸配列を有する。
【００３０】
本明細書で使用される「ＴＯＬ」という用語は「移植後に免疫寛容の対象」を意味し、即ち、対象は、免疫抑制中に機能が安定しており、免疫抑制レジメンを安全に中止することができる。このことは、免疫抑制治療をしなくても対象はその移植片を拒絶せず、移植片が十分に機能していることを意味する。そのような対象は移植片に対して寛容であると考えられる。特定の実施形態では、対象「ＴＯＬ」は免疫学的リスクが低いと考えられ、即ち、前記対象は拒絶反応（急性又は慢性）及び／又は移植片に対する抗体を生じさせるリスクが低い。
【００３１】
本明細書で使用される「移植された対象」（「レシピエント」又は「移植された被験者」とも称される）という用語は臓器移植を受けた対象を意味する。
【００３２】
本明細書で使用される「治療する」及び「治療」という用語は、予防的又は防止的治療と根治的又は疾患修飾治療の両方（例えば、疾患に罹患するリスクがあるか又は疾患に罹患した疑いのある対象の治療や、現在病気であるか又は疾患や病態に罹患していると診断された対象の治療）を意味し、臨床的再発の抑制を包含する。医学的障害を有する対象又は最終的に障害になり得る対象に対して治療を施すことができるが、これは障害又は再発性障害の１種以上の症状を予防、治癒、その発症を遅延、その重症度を軽減、又は改善するために行うか、或いは、そのような治療を行わない場合に予想される対象の生存期間を超えて生存期間を延ばすために行う。「治療レジメン」とは、病気の治療のパターン、例えば、治療中に使用される投薬のパターンを意味する。治療レジメンは、導入レジメン及び維持レジメンを含むことができる。「導入レジメン」又は「導入期間」という表現は、疾患の初期治療に用いられる治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を意味する。導入レジメンの一般的な目的は、治療レジメンの初期期間中に高レベルの薬物を対象に提供することである。導入レジメンは（一部又は全体として）「負荷レジメン」を用いることができ、これは、医師が維持レジメン中に使用するよりも多い用量の薬物を投与すること、医師が維持レジメン中に薬物を投与するよりも頻繁に薬物を投与すること、又はその両方を含み得る。「維持レジメン」又は「維持期間」という表現は、例えば、対象を長期間に亘って（数ヶ月又は数年）寛解に保つために、疾患の治療中に対象を維持するのに用いる治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を意味する。維持レジメンは、連続療法（例えば、毎週、毎月、毎年等の一定間隔で薬物を投与すること）又は間欠的療法（例えば、治療中止、間欠的治療、再発時の治療、又は特定の既定の基準［例えば、疼痛、疾患の徴候等］に達した際の治療）を用いることができる。
【００３３】
本明細書で使用される「２種の臨床的パラメータ」という用語は、試験時の対象の年齢及び移植時の対象の年齢を意味する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】複合寛容スコア（ｃＳｏＴ）。（Ａ）ｃＳｏＴモデル：左軸は選択した遺伝子及び臨床的パラメータの係数を示し（偽発見率［ｆｄｒ］＜０．０５）（黒色の棒グラフ）、右軸は１００回の１０分割交差検証における選択した遺伝子と臨床的パラメータの出現（即ち、出現率）を示す（灰色の棒グラフ）。（Ｂ）ｃＳｏＴ［ｃＳｏＴ］、６種の遺伝子（ＩＤ３、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＴＣＬ１Ａ及びＭＺＢ１）の組み合わせ［６遺伝子］、試験時の患者の年齢［採取時年齢］、移植時の患者の年齢［Ｔｘ時年齢］及びクレアチン血症［クレアチン血症］の受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。（Ｃ）２３１名の患者（４２名のＴＯＬ［灰色］及び１８９名のＳＴＡ［黒色］）のｃＳｏＴ値。破線はＲＯＣ曲線の中心化した最適閾値（ヨーデン指標）を示す。灰色領域（破線の両側）は特異度及び９０％未満の特異度の値で定められた不確定領域を示す。
【図２】ｑＰＣＲを用いて検証したｃＳｏＴ。（Ａ）ｑＰＣＲを使用しても、ｃＳｏＴは依然としてＴＯＬとＳＴＡとの間で差があり（それぞれｎ＝９及び１２、平均＝２．８９±５．４１及び−２．５８±２．３７）、（Ｂ）０．８６（ＩＣ９５％）［０．６６−１］のＡＵＣを示した。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
公表されたメタ分析由来の２０種の遺伝子シグネチャーに基づき、本発明者らはスパース方法論を用いて、いくつかの人口統計学的パラメータに関連して、臨床でのルーチンに適用可能な予測寛容スコアを構築できる最も有益な遺伝子を特定及び検証した［３１］。こうして本発明者らは、優れた精度でＳＴＡからＴＯＬを特定することができる２種の基本的な臨床的パラメータと組み合わせた６種の遺伝子のスコアを特定及び検証した。本発明者らは、この寛容のシグネチャーが、患者の悪性（ＰＴＬＤ）状態、中心起源又はＩＳ治療によっても損なわれないことを示した。寛容誘導プロトコルから恩恵を受ける、移植後に免疫寛容のレシピエント及び患者は、共通の「寛容シグネチャー」を共有しない。最終的に、本発明者らは、このスコアがＤＳＡを含むｄｅ  ｎｏｖｏ抗ＨＬＡ抗体及び寛容喪失によって影響を受けていることを示し、これによってこのスコアが腎移植患者を追跡調査する潜在性を補強した。
【００３６】
従って、第１の態様では、本発明は、移植後に免疫寛容の（ＴＯＬ）対象と移植後に免疫寛容でない（ＳＴＡ）対象とを識別するための方法であって、
ｉ）前記対象から得た生体試料中の少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種又はそれ以上の遺伝子の発現レベル、及び少なくとも１種、少なくとも２種又はそれ以上の臨床的パラメータによって複合寛容スコア（ｃＳｏＴ）を確立する段階であって、前記スコアが次式：
【数２】
2019527062.tif 000004
で確立される段階と、
ｉｉ）前記ｃＳｏＴを既定の基準値と比較する段階と、
ｉｉｉ）前記ｃＳｏＴが既定の基準値よりも高い場合には対象がＴＯＬであると結論を下し、又は前記ｃＳｏＴが既定の基準値よりも低い場合には対象がＳＴＡであると結論を下す段階を含む方法に関する。
【００３７】
一実施形態では、遺伝子は、ＩＤ３、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＴＣＬ１Ａ、ＭＺＢ１、ＣＤ２２、ＢＬＫ、ＭＳ４Ａ１、ＣＤ７９Ｂ、ＢＬＮＫ、ＦＣＲＬ２、ＩＲＦ４、ＨＩＮＴ１、ＲＦＣ４、ＡＮＸＡ２Ｒ、ＦＣＥＲ２、ＡＫＩＲＩＮ２、ＥＰＳ１５及びＰＬＢＤ１から成る群から選択される。遺伝子は、ＩＤ３、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＴＣＬ１Ａ及びＭＺＢ１から成る群から選択されることが好ましい。
【００３８】
一実施形態では、臨床的パラメータは、試験時の前記対象の年齢、移植時の対象の年齢、ドナーの年齢、レシピエントの性別、ドナーの性別、ドナーの種類、移植順序、ＨＬＡミスマッチの数、導入治療、レシピエントのクレアチン血症、レシピエントのタンパク尿、試験時のレシピエントにおける抗ＨＬＡ抗体の存在、及び試験時のレシピエントでのＤＳＡの存在から成る群から選択される。臨床的パラメータは、試験時の前記対象の年齢及び移植時の対象の年齢から成る群から選択されることが好ましい。
【００３９】
一実施形態では、対象ＴＯＬとＳＴＡを識別するための方法は、
ｉ）前記対象から得た生体試料中のＩＤ３、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＴＣＬ１Ａ及びＭＺＢ１から成る群から選択される、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種又はそれ以上の遺伝子の発現レベル、及び試験時の前記対象の年齢及び移植時の対象の年齢から成る群から選択される、少なくとも１種、少なくとも２種又はそれ以上の臨床的パラメータによって複合寛容スコア（ｃＳｏＴ）を確立する段階であって、前記スコアが次式：
【数３】
2019527062.tif 000005
で確立される段階と、
ｉｉ）前記ｃＳｏＴを既定の基準値と比較する段階と、
ｉｉｉ）前記ｃＳｏＴが既定の基準値よりも高い場合には対象がＴＯＬであると結論を下し、又は前記ｃＳｏＴが既定の基準値よりも低い場合には対象がＳＴＡであると結論を下す段階を含む。
【００４０】
一実施形態では、対象ＴＯＬとＳＴＡとを識別するための方法は、
ｉ）前記対象から得た生体試料中の６種の遺伝子ＩＤ３、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＴＣＬ１Ａ、ＭＺＢ１の発現レベル、及び試験時の前記対象の年齢及び移植時の対象の年齢から選択される２種の臨床的パラメータによって複合寛容スコア（ｃＳｏＴ）を確立する段階であって、前記スコアが次式：
【数４】
2019527062.tif 000006
で確立される段階と、
ｉｉ）前記ｃＳｏＴを既定の基準値と比較する段階と、
ｉｉｉ）前記ｃＳｏＴが既定の基準値よりも高い場合には対象がＴＯＬであると結論を下し、又は前記ｃＳｏＴが既定の基準値よりも低い場合には対象がＳＴＡであると結論を下す段階を含む。
【００４１】
一実施形態では、ＴＯＬ対象は免疫抑制薬がなくても安定な移植片機能を維持する。一実施形態では、ＳＴＡ対象は免疫抑制薬がないと安定な移植片機能を維持しない。
【００４２】
一実施形態では、対象は哺乳動物である。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００４３】
一実施形態では、対象は移植された対象である。特定の実施形態では、対象は腎移植された対象である。特に、前記腎移植された対象は更に腎臓ドナーの膵臓が移植されていてもよく、必要に応じて腎臓ドナーの十二指腸片が移植されていてもよい。
【００４４】
一実施形態では、対象は、免疫抑制薬又は当技術分野で現在知られているか又は将来特定されるであろう他の薬物で治療される。特定の実施形態では、対象は免疫抑制治療中である、即ち、対象には１種以上の免疫抑制薬が投与されている。
【００４５】
移植処置で使用することができる免疫抑制薬としては、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロホスファミド、ＦＫ−５０６（タクロリムス）、シロリムス、エベロリムス、ラパマイシン、コルチコステロイド、シクロスポリン（例えば、シクロスポリンＡ）、ミコフェノール酸、レフルマシド、アスコマイシン及びヒドロキシウレアが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
一実施形態では、免疫抑制薬を単独療法で使用する。他の実施形態では、免疫抑制薬を併用療法で使用する。
【００４７】
腎移植の場合、以下の免疫抑制プロトコルが通常用いられる。一次腎移植を受けた対象は、一般にバシリキシマブ（Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓにより市販されているキメラマウス／ヒトモノクローナル抗ＩＬ２−Ｒα抗体）の２回注射で構成される導入治療を受けると共に、タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ（商標）、Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、０．１ｍｇ）、ミコフェノール酸モフェチル（Ｃｅｌｌｃｅｐｔ（商標）、Ｓｙｎｔｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、２ｇ／日）及びコルチコイド（１ｍｇ／ｋｇ／日）による治療を受け、コルチコイド治療は治療終了（即ち、移植後３ヶ月）まで５日毎に１０ｍｇずつ漸減させる。二次又は三次腎移植を受けた対象又は免疫学的リスクがあると考えられる対象（抗Ｔパネル反応性抗体（ＰＲＡ）の割合が以前に２５％超に達したことがある、又は３６時間を超える冷阻血）には、一般に抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）の短期間投与（例えば、７日間）を行うと共に、０日目からミコフェノール酸モフェチル（Ｃｅｌｌｃｅｐｔ（商標）、Ｓｙｎｔｅｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、２ｇ／日）及びコルチコステロイド（１ｍｇ／ｋｇ／日）で治療を行った後、コルチコステロイドを治療終了まで５日毎に１０ｍｇずつ漸減させ、最終的に移植後約３ヶ月で終了させる。タクロリムス（Ｐｒｏｇｒａｆ（商標）、Ｆｕｊｉｓａｗａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）の導入は、遅らせて（６日目に導入）、０．１ｍｇ／ｋｇ／日の用量で行う。
【００４８】
本明細書で使用される「複合寛容スコア（ｃＳｏＴ）」という用語（「スコア」とも称される）は次式から得られる値を意味する。
【数５】
2019527062.tif 000007
【００４９】
この式はＢｏｌａｓｓｏアルゴリズム、即ち、ブートストラップ再サンプリング（１０，０００回）で実行するｌａｓｓｏ（Ｌｅａｓｔ  Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｈｒｉｎｋａｇｅ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ）解析とそれに続く複数の試験（偽発見率＜０．０５）によって得られ、これによって本発明の８種のパラメータ（６種の遺伝子と２種の臨床的パラメータ）を特定することができる。
【００５０】
本発明の意味の範囲内で、「β」という用語は本発明に係る各遺伝子の係数を意味する。
【００５１】
「βｉ」は各遺伝子の回帰β係数を表す。典型的には、回帰β係数は、Ｅｒｉｃｋｓｏｎ、Ｋ．Ｆ．ら、２０１６に記載されているＢｏｌａｓｓｏ法を用いて各遺伝子について当業者が決定する。典型的には、血液試料を、移植されてＩＳによって治療中の対象から得ることができ、６種の遺伝子の発現を通常の方法によって決定することができる。
【００５２】
２種の臨床的パラメータ（試験時の対象の年齢［年齢試験時］と移植時の対象の年齢［年齢移植時］）を考慮する。次にＴＯＬ又はＳＴＡを区別するカットオフ値とスコアを比較する。移植されていない対象と移植された対象において同じ解析方法によって同じ遺伝子の発現を解析することによってカットオフ値を決定することができる。例えば、移植されていない対象のスコアと移植された対象のスコアとの中間点をカットオフ値とすることができる。
【００５３】
本明細書で使用される「β試験時」という用語は、試験時の対象の年齢のβ係数を意味する。
【００５４】
本明細書で使用される「β移植時」という用語は、移植時の対象の年齢のβ係数を意味する。
【００５５】
本明細書で使用される「切片」という用語は、式を修正するのに使用する固定値を意味する（回帰曲線のＹ軸に対する切片を意味する）。
【００５６】
本明細書で使用される「スケーリング係数」という用語は、陽性スコアと陰性スコアをそれぞれＴＯＬ診断とＳＴＡ診断に関連付けるためにスコアを中心化するのに使用する値を意味する。
【００５７】
本明細書で使用される「Ｅｘｐｒｓ」という用語は各遺伝子の発現レベルを意味する。「遺伝子発現プロファイル」は、ＩＤ３、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＴＣＬ１Ａ、ＭＺＢ１、ＣＤ２２、ＢＬＫ、ＭＳ４Ａ１、ＣＤ７９Ｂ、ＢＬＮＫ、ＦＣＲＬ２、ＩＲＦ４、ＨＩＮＴ１、ＲＦＣ４、ＡＮＸＡ２Ｒ、ＦＣＥＲ２、ＡＫＩＲＩＮ２、ＥＰＳ１５及びＰＬＢＤ１から成る群から選択される少なくとも２種、３種、４種、５種、６種又はそれ以上の遺伝子の各々の遺伝子発現レベルに対応する少なくとも２種、３種、４種、５種、６種又はそれ以上の値の群に対応し、任意選択で臨床的パラメータに対応する更に他の値に対応する。好ましくは、遺伝子発現プロファイルは、ＩＤ３、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＴＣＬ１Ａ及びＭＺＢ１遺伝子の各々の遺伝子発現レベルに対応する６種の値の群に対応し、必要に応じて臨床的パラメータに対応する更に他の値に対応する。典型的には、遺伝子（好ましくは上述の６種の遺伝子）の発現レベルは当業者に公知の任意の技術によって決定することができる。特に、各遺伝子の発現レベルはゲノムレベル及び／又は核酸レベル及び／又はタンパク質レベルで測定することができる。特定の実施形態では、遺伝子の発現レベルは各遺伝子の核酸転写物の量を測定して決定する。他の実施形態では、遺伝子の発現レベルは各遺伝子に対応するタンパク質の量を測定して決定する。核酸転写物の量は当業者に既知の任意の技術によって測定することができる。特に、抽出されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）試料に対して直接測定を行ってもよく、又は当技術分野で周知の技術によって抽出ｍＲＮＡから調製された逆転写相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に対して測定を行ってもよい。ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ試料から、核酸マイクロアレイ、定量的ＰＣＲ、マイクロ流体カード、及び標識プローブとのハイブリダイゼーションを含む当業者に公知の任意の技術を用いて、核酸転写物の量を測定することができる。特定の実施形態では、定量的ＰＣＲを用いて遺伝子発現レベルを決定する。定量的又はリアルタイムＰＣＲは当業者には周知で容易に利用可能な技術であるため、詳細な説明を必要としない。ｍＲＮＡの量を決定するための方法は当技術分野で周知である。例えば、生体試料に含まれる核酸は、先ず標準的な方法に従って、例えば、溶解酵素又は化学溶液を用いて抽出するか、又は製造業者の指示に従って核酸結合樹脂によって抽出する。次に、抽出したｍＲＮＡをハイブリダイゼーション（例えば、ノーザンブロット解析）及び／又は増幅（例えばＲＴ−ＰＣＲ）によって検出する。好ましくは、定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲが好ましい。リアルタイム定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲが特に有利である。
【００５８】
他の増幅方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）及び核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。
【００５９】
少なくとも１０個のヌクレオチドを有し、本明細書中の目的のｍＲＮＡに対して配列相補性又は相同性を示す核酸は、ハイブリダイゼーションプローブ又は増幅プライマーとして有用である。そのような核酸は同等のサイズの相同領域と同一である必要はないが、典型的には少なくとも約８０％同一であり、より好ましくは同等のサイズの相同領域と８５％同一、更に好ましくは９０％同一、更に好ましくは９５％以上同一であることが理解されよう。ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションを検出するために、核酸を適切な手段、例えば、検出可能な標識と組み合わせて使用することが有利であろう。蛍光リガンド、放射性リガンド、酵素リガンド又は他のリガンド（例えば、アビジン／ビオチン）を含む、種々の適切な指示薬が当技術分野で公知である。
【００６０】
プローブは典型的には、長さが１０〜１０００ヌクレオチド、例えば、１０〜８００、より好ましくは１５〜７００、典型的には２０〜５００の一本鎖核酸を含む。プライマーは典型的には、増幅対象の目的の核酸と完全に又はほぼ完全にマッチするように設計された、長さが１０〜２５ヌクレオチドの短い一本鎖核酸である。プローブ及びプライマーは、それらがハイブリダイズする核酸に対して「特異的」であり、即ち、それらは、好ましくは高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下（最高融解温度Ｔｍ、例えば５０％ホルムアミド、５×又は６×ＳＣＣ緩衝液に対応し、１×ＳＣＣ緩衝液は、ＨＣｌでｐＨ７．０に調整した０．１５ＭのＮａＣｌ及び０．０１５Ｍのクエン酸Ｎａを含む）でハイブリダイズする。
【００６１】
上述の増幅及び検出方法で使用される核酸プライマー又はプローブをキットとして組み合わせることができる。このようなキットは、コンセンサスプライマー及び分子プローブを含む。キットはまた、増幅が起こったかどうかを決定するのに必要な構成要素も含む。キットは、例えば、ＰＣＲ緩衝液及び酵素、陽性対照配列、反応制御プライマー、並びに特定の配列を増幅及び検出するための説明書を含むこともできる。
【００６２】
特定の実施形態では、本発明の方法は、生体試料から抽出した全ＲＮＡを提供する段階、及びより具体的には定量的又は半定量的ＲＴ−ＰＣＲによってこのＲＮＡを増幅し特定のプローブとハイブリダイズさせる段階を含む。
【００６３】
他の実施形態では、遺伝子発現レベルを、ＤＮＡチップ解析によって決定する。このようなＤＮＡチップ又は核酸マイクロアレイは、マイクロチップ、スライドガラス又はミクロスフェアサイズのビーズであり得る基材に化学的に結合している様々な核酸プローブで構成される。マイクロチップは、ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカ若しくはシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、又はニトロセルロースで構成することができる。プローブは、約１０〜約６０塩基対であり得るｃＤＮＡ又はオリゴヌクレオチド等の核酸を含む。遺伝子発現レベルを決定するために、任意選択で最初に逆転写させた試験対象由来の生体試料を標識し、ハイブリダイゼーション条件下でマイクロアレイと接触させ、マイクロアレイ表面に結合したプローブ配列に相補的な標的核酸間で複合体を形成する。次に、標識されたハイブリダイズ複合体を検出し、定量化又は半定量化することができる。標識化は様々な方法、例えば、放射性標識化又は蛍光標識化を用いて行うことができる。マイクロアレイハイブリダイゼーション技術の多くの変形が当業者に利用可能である（例えば、Ｈｏｈｅｉｓｅｌによる検討、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００６，７：２００−２１０を参照）。
【００６４】
また、本発明は、移植された対象を免疫抑制療法で治療する方法であって、
ｉ）対象が本発明に係る移植後に免疫寛容の（ＴＯＬ）対象であるか又は移植後に免疫寛容でない（ＳＴＡ）対象であるかどうかを決定する段階と、
ｉｉ）対象がＳＴＡである場合には１種以上の免疫抑制薬で対象を治療する段階を含む方法にも関する。
【００６５】
また、本発明は、免疫抑制療法中の移植された対象を免疫抑制療法の断薬又は最小化の候補として特定するための方法であって、
ｉ）対象が本発明に係る移植後に免疫寛容の（ＴＯＬ）対象であるか又は移植後に免疫寛容でない（ＳＴＡ）対象であるかどうかを決定する段階と、
ｉｉ）対象がＴＯＬである場合には対象が免疫抑制療法の断薬又は最小化に適格であると結論を下す段階を含む方法にも関する。
【００６６】
他の態様では、本発明は、移植後に免疫寛容の（ＴＯＬ）対象と移植後に免疫寛容でない（ＳＴＡ）対象とを識別するためのキットであって、ＩＤ３、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＴＣＬ１Ａ、ＭＺＢ１、ＣＤ２２、ＢＬＫ、ＭＳ４Ａ１、ＣＤ７９Ｂ、ＢＬＮＫ、ＦＣＲＬ２、ＩＲＦ４、ＨＩＮＴ１、ＲＦＣ４、ＡＮＸＡ２Ｒ、ＦＣＥＲ２、ＡＫＩＲＩＮ２、ＥＰＳ１５及びＰＬＢＤ１から成る群から選択される少なくとも２種、３種、４種、５種、６種又はそれ以上の遺伝子の各々の遺伝子発現レベルに対応する少なくとも２種、３種、４種、５種、６種又はそれ以上の値の群に対応する遺伝子発現プロファイルを、任意選択で臨床的パラメータに対応する更に他の値と共に、決定するための少なくとも１種の試薬を含むキットにも関する。好ましくは、本発明に係るキットは、次の６種の遺伝子：ＩＤ３、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＴＣＬ１Ａ及びＭＺＢ１の各々の発現レベルに対応する６種の値の群に対応する遺伝子発現プロファイルを決定するための少なくとも１種の試薬を含む。
【００６７】
一実施形態では、本発明に係るキットは、少なくとも１種の参照遺伝子の遺伝子発現レベルを決定するための少なくとも１種の試薬を更に含むことができる。参照遺伝子の例としては、ＡＣＴＢ、Ｂ２Ｍ、ＧＡＰＤＨ及びＨＰＲＴ１が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、少なくとも１種の参照遺伝子の遺伝子発現レベルの決定を用いて本発明に係る各遺伝子の相対的発現を正規化及び／又は計算する。
【００６８】
一部の実施形態では、本発明に係るキットは、対象ＴＯＬとＳＴＡを識別するための説明書を更に含むことができる。対象ＴＯＬとＳＴＡを識別するための説明書は、少なくとも１種の参照遺伝子発現プロファイルを含むことができる。特定の実施形態では、少なくとも１種の参照遺伝子発現プロファイルは移植片寛容の発現プロファイル、即ち、移植後に免疫寛容の（ＴＯＬ）対象における次の６種の遺伝子：ＩＤ３、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＴＣＬ１Ａ及びＭＺＢ１の各々の発現レベルに対応する６種の値の群である。或いは、少なくとも１種の参照遺伝子発現プロファイルは移植片寛容でない発現プロファイル、即ち、移植後に免疫寛容でない（ＳＴＡ）対象における次の６種の遺伝子：ＩＤ３、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＴＣＬ１Ａ及びＭＺＢ１の各々の発現レベルに対応する６種の値の群であり得る。
【００６９】
本発明を以下の図面及び実施例によって更に説明する。しかし、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００７０】
実施例
材料＆方法
メタ分析データセット
遺伝子発現データセットは、既に記述されている遺伝子発現オムニバス（ＧＥＯ）データベース（受託番号ＧＳＥ２８４５６）から得た［１８］。このデータセットは５９６種の試料を収集した５つの独立した研究からのメタ分析の結果であった［１４、１５、２１、５０、５１］。
【００７１】
簡潔に言えば、データセットは、Ｌｏｗｅｓｓ手順を用いて再正規化され、対数変換され、既に記述されているようにＳＴＡ群に従って中央値中心化され、１，８４６種の混合遺伝子で構成されたものであった［１８］。ナントのコレクションに加え、欧州のＩｏＴと米国のＩＴＮネットワークのおかげで、様々な研究の中から３４４名の固有の重複しない患者、即ち、９６例のＴＯＬ試料のうち移植後に免疫寛容の個々の患者４６名（ＴＯＬ）及び３１１例のＳＴＡ試料のうち安定な移植片機能を有する患者２６６名（ＳＴＡ）を特定することができた。ＴＯＬ及びＳＴＡ患者から入手可能な臨床的パラメータの人口統計学的説明を表１と表２に示す。技術的反復実験（同一の血液採取時間）では、２０種の遺伝子の各々の平均発現を計算し、時間的反復実験では、最も早い時点を選択した。
【００７２】
【表１】
2019527062.tif 000008
【００７３】
【表２】
2019527062.tif 000009
【００７４】
追加のマイクロアレイデータセット
公的に入手可能な３種のマイクロアレイデータセットをＧＥＯ：ＧＳＥ１４６３０［３４］、ＧＳＥ２２２２４［３５］及びＧＳＥ４５５９３［８］から収集し、Ｒソフトウェアのａｆｆｙパッケージ［５２］を用いてロバストマルチアレイ平均法（ＲＭＡ）で正規化した。データセットＧＳＥ４５２１８［３３］から収集した正規化した発現値をコンピュータによる交差検証に使用した。全てのデータセットについて、目的の６種の遺伝子の遺伝子発現を中心化／スケーリングした後、ｃＳｏＴの係数を適用した。
【００７５】
検証コホート
ナントの病院からさらに２１名の腎臓レシピエント（９名のＴＯＬと１２名のＳＴＡを含む）を登録してｑＰＣＲ検証を行った。地域の倫理委員会は本研究の全ての側面を承認し、全ての患者から書面によるインフォームド・コンセントを得た。
【００７６】
ｑＰＣＲ検証
静脈血試料をＥＤＴＡバキュテナーに採取し、４時間以内に分析のために処理した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をフィコール層（Ｅｕｒｏｂｉｏ、フランス、レ・ジュリス）上で分離し、ＴＲＩｚｏｌ（受託商標）試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）にて−８０℃で凍結した。ＴＲＩｚｏｌ法（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて末梢血からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの質と量を、それぞれＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（米国カリフォルニア州パロアルト）とＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｌａｂｔｅｃｈ、フランス、パレゾー）を使用して決定した。ポリｄＴオリゴヌクレオチド及びモロニー白血病ウイルス逆転写（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＲＮＡを逆転写した。６種の試験遺伝子（ＡＫＲ１Ｃ３：Ｈｓ００３６６２６７＿ｍ１、ＣＤ４０：Ｈｓ００３７４１７６＿ｍ１、ＣＴＬＡ４：Ｈｓ００１７５４８０＿ｍ１、ＩＤ３：Ｈｓ００１７１４０９＿ｍ１、ＭＺＢ１（又はＭＧＣ２９５０６）：Ｈｓ００４１４９０７＿ｍ１、ＴＣＬ１Ａ：Ｈｓ００９５１３５０＿ｍ１）及び４種の参照遺伝子（ＡＣＴＢ：Ｈｓ９９９９９９０３＿ｍ１、Ｂ２Ｍ：Ｈｓ００９８４２３０＿ｍ１、ＧＡＰＤＨ：Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１、ＨＰＲＴ１：Ｈｓ９９９９９９０９＿ｍ１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））について市販のプライマーとプローブセット（Ｔａｑｍａｎ）を使用してＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ機器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でリアルタイム定量的ＰＣＲを行った。４種の参照遺伝子の幾何平均を用いてＲＮＡ量を正規化し、２−ΔΔＣｑ法［５３］に従って各遺伝子の相対的発現を計算した。
【００７７】
ｃＳｏＴの構築
ロジスティック単変量解析（Ｒでｇｌｍパッケージを使用）でＳＴＡと比較したＴＯＬに関連するパラメータを使用してｃＳｏＴを構築した。単変量解析において寛容に関連する２４種のパラメータ（２０種の遺伝子と４種の人口統計学的パラメータ）間で最も識別的な組み合わせを特定するため、Ｂｏｌａｓｓｏ法を使用した［５］。この方法では、ブートストラップ再サンプリング（１０，０００回）をｌａｓｓｏ（ｌｅａｓｔ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｓｈｒｉｎｋａｇｅ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｐｅｒａｔｏｒ）回帰分析と組み合わせて実施した後、Ｒのｍｈｔパッケージ（バージョン３．２．２）を用いて複数の試験を行ってモデルに関連する有意な変数（偽発見率（ＦＤＲ）＜０．０５）を選択する［２］。ｍｈｔパッケージによって行ったスケーリングの後、ｍｈｔから得た係数を使用して他のデータセットからスコアを計算した。ｑＰＣＲデータについては、スケーリングしたｄＣｑを使用した。
【００７８】
統計解析
統計解析はＲソフトウェアバージョン３．２．２又はＧｒａｐｈＰｒｉｓｍ  ｖ．４ソフトウェアを用いて行った。パラメトリックスチューデントＴ検定、ＡＮＯＶＡ検定又はＫｈｉ２検定を用いて群比較を行った。ｐ＜０．０５の場合に差異が統計学的に有意であると定義した。
【００７９】
結果
移植後の免疫寛容状態に関連する臨床的パラメータの選択
上述したメタデータセット［１８］から、ナントのコレクションに加え、欧州の寛容指数（ＩｏＴ）と米国の免疫寛容ネットワーク（ＩＴＮ）のおかげで、様々な研究の中から３１２名の重複しない患者、即ち、９６例のＴＯＬ試料のうち移植後に免疫寛容の個々の患者４６名（ＴＯＬ）及び３１１例のＳＴＡ試料のうち安定な移植片機能を有する患者２６６名（ＳＴＡ）を特定することができた。ＴＯＬ及びＳＴＡ患者から入手可能な臨床的パラメータの人口統計学的説明を表１及び表２に示す。予測スコアを構築するために、患者の人口統計学的臨床パラメータの中から、内因性で非変異の患者に関連しＴＯＬの少なくとも半分について知られているものだけを選択した（表１及び表２）。単変量ロジスティック回帰（ｐ＜０．２０）を用いて寛容状態に関連する４種のパラメータ、即ち、移植時の患者の年齢（ｐ＜０．０００１）、試験時の患者の年齢（ｐ＝０．１７６）（表１）、ＨＬＡミスマッチの数（ｐ＜０．０００１）及びドナーの性別（ｐ＝０．１５４）（表２）を複合スコアのために選択した。
【００８０】
遺伝子と臨床的パラメータを組み合わせた移植後の免疫寛容の複合スコア（ｃＳｏＴ）
技術的反復実験（同一の血液採取時間）では、２０種の遺伝子の各々についての平均発現を計算し、時間的反復実験では、最も早い時点を選択した。ＴＯＬとＳＴＡの差異として以前に報告した２０種の遺伝子の発現［１］は、この大きな３１２名の患者のコホート（４６名のＴＯＬと２６６名のＳＴＡ、ｐ＜０．０００１）における単変量解析で確認した。
【００８１】
２０種の当初の遺伝子と上で選択した４種の臨床的パラメータとの最も識別的な組み合わせを特定してｃＳｏＴに含めるため、本発明者らは、Ｂｏｌａｓｓｏ法を使用した［５］。この方法では、ブートストラップ再サンプリング（１０，０００倍）をｌａｓｓｏ（ｌｅａｓｔ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｓｈｒｉｎｋａｇｅ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｐｅｒａｔｏｒ）回帰分析と組み合わせて実施した後、複数の試験を行ってモデルに関連する有意な変数（偽発見率［ＦＤＲ］＜０．０５）を選択する［２］。
【００８２】
６種の遺伝子と２種の臨床的パラメータの組み合わせ、即ち、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＩＤ３、ＭＺＢ１、ＴＣＬ１Ａ、試験時の患者の年齢、及び移植時の患者の年齢を特定した（図１Ａと１Ｂ）が、これによって、ＡＵＣが０．９７３（ＩＣ９５％［０．９３９−１．００］）でＴＯＬとＳＴＡを識別するｃＳｏＴ（平均ｃＳｏＴが４２名のＴＯＬについて６．４３±４．７３（ＳＤ）、１８９名のＳＴＡについて−４．０４±２．８１、ｐ＜０．０００１）を確立することができ、陰性的中率及び陽性的中率はそれぞれ０．９８９及び０．８００であった（図１Ｂと１Ｃ）。
【００８３】
計算したｃＳｏＴスコアをＲＯＣ曲線の最良閾値（ヨーデン指標）によって中心化し、陽性スコアと陰性スコアをそれぞれＴＯＬ診断とＳＴＡ診断に関連付け、不確定領域（「グレーゾーン」とも称する）を特異度と９０％未満の特異度（予測許容誤差１０％）の値で定めて解釈を容易にした（図１）［３２］。これら８種のパラメータの選択の整合性を、１０分割交差検証（無作為にＴＯＬとＳＴＡの１０分の１）を１００回繰り返して検証した。選択した８種のパラメータは１，０００種のモデルのうち少なくとも８０％に存在することが分かった（図１Ａ）。
【００８４】
最後に１０分割交差検証を１００回行ってｃＳｏＴスコアのロバスト性を更に検証し、試験セットの平均ＡＵＣは０．９６７  ＩＣ９５％［０．９６６−０．９６８］であった。試みてきたように、ｃＳｏＴスコアによるＴＯＬとＳＴＡの識別は、２種の人口統計学的パラメータ、即ち、移植時の年齢（ＡＵＣ＝０．７３７、ＩＣ９５％［０．６５５−０．８１９］）及び試験時の年齢（ＡＵＣ＝０．５６４、ＩＣ９５％［０．４７４−０．６５５］、両方の比較についてｐ＜０．０００１）を別々に用いた場合（図１Ｃ）よりも良好であり、６種の遺伝子のみの組み合わせ（ＡＵＣ＝０．９４７、ＩＣ９５％［０．９０２−０．９９２］、ｐ＝０．３８）よりも良好であり、患者の機能（クレアチン血症のみ（ＡＵＣ＝０．６１５、ＩＣ９５％［０．５１９−０．７１１］、ｐ＜０．０００１）よりも良好であった。
【００８５】
最後に、交差検証に関して、１６名のＴＯＬ及び９名の慢性移植腎症（ＣＡＮ）患者について実施した最近のマイクロアレイデータセットを利用した［３３］。個々の臨床情報は提供されていないので、計算できたのは発現６種遺伝子の組み合わせのみであった。本発明者らの遺伝子の組み合わせはＴＯＬとＣＡＮを識別するのではなく、ＴＯＬとＳＴＡを識別するように設計されているにも関わらず、２つの集団間で有意に異なるスコア値（ｐ＝０．００６１）と良好な識別が見られた（ＡＵＣ＝０．８２５、ＩＣ９５％［０．６３６−０．１．０１４］）。
【００８６】
施設の起源、免疫抑制レジメン、ＰＴＬＤはｃＳｏＴに影響を及ぼさない
ＴＯＬ試料は３種の異なる起源（ナント、ＩｏＴ及びＩＴＮ）に由来したにも関わらず、ｃＳｏＴは患者起源と関連していなかった（ｐ＝０．１３）。移植片機能が安定した患者においてＩＳを中止した主な理由の１つは、ＰＴＬＤ等の重篤な副作用の出現である。しかし、ｃＳｏＴはＰＴＬＤの経験による影響を受けなかった（ＰＴＬＤ、ｎ＝４、ｐ＝０．１９）。
【００８７】
ｃＳｏＴの作成に用いた患者の２群は免疫抑制レジメンの状態が異なっており、ＳＴＡはＩＳ中であるのに対し、ＴＯＬはＩＳを受けていなかったため、ＩＳがｃＳｏＴの値に影響を及ぼす可能性があるかどうかを評価した。ＴＯＬ患者に関しては、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、アザチオプリン、ミコフェノール酸（ＭＰＡ）及び導入治療の使用を含むＩＳ中止前のＩＳレジメンはｃＳｏＴ値に影響を及ぼさないことが分かった（それぞれｐ＝０．７４、ｐ＝０．６１、ｐ＝０．８１及びｐ＝０．５１、２９名のＴＯＬ）。次に、ＳＴＡ集団（ｎ＝１８９）におけるｃＳｏＴに及ぼす現在のＩＳレジメンの影響について解析した。同様に、ｃＳｏＴは誘導療法（ｐ＝０．９７）、ＣｓＡ又はタクロリムス（ｐ＝０．６４）、コルチコステロイド（ｐ＝０．４２）及び代謝拮抗剤（ｐ＝０．９２）のいずれによっても影響を受けなかった。次に、移植片機能が安定していてマイクロアレイデータセットが利用可能な腎移植レシピエントの２種の独立したコホート：
１）ＣｓＡ（ｎ＝１４）又はラパマイシン（Ｒａｐａ、ｎ＝２３）単独療法中の患者の第１のコホート［７］、及び
２）アザチオプリンからＭＰＡに変更した後の患者の第２のコホート（ｎ＝５対、ＭＰＡ変更前又は変更３ヶ月後）［６］において、ｃＳｏＴ由来の６種の遺伝子の個々又はその組み合わせに及ぼすＩＳレジメンの影響について更に試験した［３４、３５］。
【００８８】
両方のコホートにおいて、６種の遺伝子の組み合わせも６種の遺伝子個々も（データは示さず）ＩＳレジメンによって改変されなかった（それぞれｐ＝０．９９及び０．７７）。
【００８９】
まとめると、これらのデータによって、ｃＳｏＴも遺伝子も以前のＩＳ治療又は維持ＩＳ治療によって独立して影響を受けないことが示された。
【００９０】
ｃＳｏＴは移植片機能不全と新たな抗体出現を予測する
主な問題の１つは経時的なｃＳｏＴの安定性及び結果である。本発明者らは、以前に、移植片機能喪失の幾つかの症例がこのＴＯＬのコホートで観察され［３６］、クレアチン血症（＞１５０μｍｏｌ／Ｌ）又はタンパク尿（＞１ｇ／２４時間）が増加し得ることを報告した。殆どの臨床情報が入手可能であったナントのコホート由来の１５名のＴＯＬのうち、９名では経時的に機能が低下した（移植後１７．０９±３．４６年）。更に、これらの１５名のＴＯＬのうち、８名では抗ＨＬＡ抗体が新たに生じ（移植後１４．６７±１．１３年）、そのうち、４名の患者ではドナー特異的抗体（ＤＳＡ）が生じた（移植後１３．４１±０．２１年）。また、新たな抗ＨＬＡ抗体の存在は寛容の喪失と関連していた（ｐ＝０．０３４）。
【００９１】
試験時に患者が良好な移植片機能を示した場合（クレアチン血症＜１５０μｍｏｌ／Ｌ及びタンパク尿＜１ｇ／２４時間）、ｃＳｏＴは機能が低下した患者（試験時から２．２９±２．７年後に機能低下）で有意に低く（ｐ＝０．０４７、ｃＳｏＴ＝３．７９±３．６６及び８．５２±４．６７）、抗ＨＬＡ抗体及びＤＳＡが生じた患者（それぞれｐ＝０．０１６及びｐ＝０．０１３）（試験時から１．１３±１．７８及び０．２１±１．１０年後に抗体検出）でも有意に低かったことを見出した。
【００９２】
ｃＳｏＴは移植後の免疫寛容状態に特異的である
移植後の免疫寛容プロファイル又はプロトコル誘導の寛容プロファイルに従ってｃＳｏＴの特異度を評価するため、寛容誘導の治験においてｃＳｏＴを試験し、生体ドナー同胞由来のＨＬＡが同一の腎臓レシピエントを移植後４年間追跡した［９］［８］。プロトコルは、早期のシロリムス変更及びドナー造血ＣＤ３４＋幹細胞の注入を伴う、タクロリムス及びＭＰＡによるリンパ球枯渇アレムツズマブ治療で構成される。免疫抑制を移植から２年後に中止した。これらの患者は、ＩＳを完全に中止してから少なくとも１年後には正常な生検（即ち、無症候性拒絶反応の徴候がない）と良好な腎機能を有していた。
【００９３】
１５名の患者のうち、９名に対して血液トランスクリプトームを最長４年間追跡したが、５名が寛容になり、４名は寛容にならなかった。移植後の時間に関わらず、ｃＳｏＴ又は６種の遺伝子がＩＳの停止の前後で５名の寛容患者をＴＯＬとして分類できなかったに過ぎない。従って、この結果が支持する事実は、この誘導プロトコルによる寛容が、移植後の免疫寛容及び自発的な寛容に関連するシグネチャーを共有しなかった（この２つの状況に関与する機序が異なると考えられるため）こと、並びにこのシグネチャーは移植後の免疫寛容状態のみに特異的であるということである。
【００９４】
臨床に適用可能なｑＰＣＲ  ｃＳｏＴ
ｃＳｏＴスコアは遺伝子マイクロアレイ手段に基づいているので、本発明者らはそれを検証し、そのルーチンでの潜在的使用を裏付けるために定量的ＰＣＲを用いてその有用性を確認した。メタデータセットに含まれていない５種の独立したＴＯＬ試料及びメタデータセット由来の４種のＴＯＬに対してｑＰＣＲを様々な時間で行った。
【００９５】
本発明者らは、ｃＳｏＴスコアがＴＯＬとＳＴＡを識別することを示した（ｐ＝０．００５４、それぞれｎ＝９及び１２、平均＝２．８９±５．４１及び−２．５８±２．３７）（ＡＵＣは０．８６１、ＩＣ９５％［０．６６−１］）（図２）。更に、ブートストラップ手順（１，０００回）によって、この検証のロバスト性が０．８５２の平均ＡＵＣ（ＩＣ９５％［０．８４５−０．８５９］）で確認された。
【００９６】
参考文献
本出願を通して、様々な参考文献が、本発明が関係する技術の最先端を説明している。これらの参考文献の開示は参照により本開示に組み込まれる。
１．    Ｄａｎｔａｌ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｋｉｄｎｅｙ−ｇｒａｆｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ：  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  ｒｅｇｉｍｅｎｓ．  Ｌａｎｃｅｔ，  １９９８．  ３５１（９１０３）：  ｐ．  ６２３−８．
２．    Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｌ．Ｗ．，  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ａｇｅｎｔｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  ２００２．  ２（９）：  ｐ．  ８０７−１８．
３．    Ｏｊｏ，  Ａ．Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎｒｅｎａｌ  ｏｒｇａｎ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ２００３．  ３４９（１０）：  ｐ．  ９３１−４０．
４．    Ｓａｗｉｎｓｋｉ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｍｉｎｉｍｉｚａｔｉｏｎ，  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ，  Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ，  ａｎｄ  Ａｖｏｉｄａｎｃｅ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｒｅｎａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  Ｍｅｔａ−Ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  ２０１６．
５．    Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，  Ｋ．Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  Ｃｏｓｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｗｏ−Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ  Ｍａｔｃｈ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  ２０１６．  １６（１）：  ｐ．  ３７１−３．
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７．    Ｃｉａｎｃｉｏ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｄｏｎｏｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｋｉｄｎｅｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，  ２０１３．  ９６（９）：  ｐ．  ８００−６．
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１０．  Ｓｃａｎｄｌｉｎｇ，  Ｊ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｇｉｖｅｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ａｎｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  ２０１２．  １２（５）：  ｐ．  １１３３−４５．
１１．  Ｓｃａｎｄｌｉｎｇ，  Ｊ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ，  ｇｒａｆｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ，  ａｎｄ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  ＨＬＡ  ｍａｔｃｈｅｄ  ａｎｄ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｆｔｅｒ  ｌｉｖｉｎｇ  ｄｏｎｏｒ  ｋｉｄｎｅｙ  ａｎｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  ２０１５．  １５（３）：  ｐ．  ６９５−７０４．
１２．  Ｍａｓｓａｒｔ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ＤＥＳＣＡＲＴＥＳ−Ｎａｎｔｅｓ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｋｉｄｎｅｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ３５  ｎｅｗ  ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ３４  ａｌｍｏｓｔ  ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  ２０１６．
１３．  Ｒｏｕｓｓｅｙ−Ｋｅｓｌｅｒ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  ２００６．  ６（４）：  ｐ．  ７３６−４６．
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１５．  Ｓａｇｏｏ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｃｒｏｓｓ−ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｒｅｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ，  ２０１０．  １２０（６）：  ｐ．  １８４８−６１．
１６．  Ｈｒｉｃｉｋ，  Ｄ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｏｆ  Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ  Ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｅ−Ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，  ２０１５．
１７．  Ａｂｒａｍｏｗｉｃｚ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｆｒｏｍ  ａ  ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ  ｍｏｆｅｔｉｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｒｅｇｉｍｅｎ：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｆｉｖｅ−ｙｅａｒ，  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ，  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｓｔｕｄｙ．  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，  ２００５．  １６（７）：  ｐ．  ２２３４−４０．
１８．  Ｂａｒｏｎ，  Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｇｅｎｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ａｃｒｏｓｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｒｅｌａｔｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ｒｅｎａｌ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ．  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ，  ２０１５．  ８７（５）：  ｐ．  ９８４−９５．
１９．  Ｂｒａｕｄｅａｕ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＦＯＸＰ３＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｒｍａｌ  ｉｍｍｕｎｏ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｉｎ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｇｒａｆｔ  ｏｕｔｃｏｍｅ．  Ｔｒａｎｓｐｌ  Ｉｎｔ，  ２００７．  ２０（１０）：  ｐ．  ８４５−５５．
２０．  Ｂｒａｚａ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＤ４５ＲＡ−  Ｆｏｘｐ３ｈｉ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，  ２０１５．  ２６（８）：  ｐ．  １７９５−８０５．
２１．  Ｂｒｏｕａｒｄ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｐａｎｅｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｎａｌ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，  ２００７．  １０４（３９）：  ｐ．  １５４４８−５３．
２２．  Ｃｈｅｓｎｅａｕ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｌｅｒａｎｔ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｐｒｏｄｕｃｅ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，  ２０１５．
２３．  Ｄａｎｇｅｒ，  Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｒ−１４２−３ｐ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒｅｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，  ２０１２．  ２３（４）：  ｐ．  ５９７−６０６．
２４．  Ｐａｌｌｉｅｒ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｒｕｇ−ｆｒｅｅ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｇｒａｆｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ，  ２０１０．  ７８（５）：  ｐ．  ５０３−１３．
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２７．  Ｃｈｅｓｎｅａｕ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｎｉｑｕｅ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｉｎ  ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｋｉｄｎｅｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  ２０１４．  １４（１）：  ｐ．  １４４−５５．
２８．  Ｃｈｅｓｎｅａｕ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｋｉｄｎｅｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｐｒｏｄｕｃｅ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，  ２０１５．  ２６（１０）：  ｐ．  ２５８８−９８．
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３３．  Ｒｏｅｄｄｅｒ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｔｈｒｅｅ−ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，  ２０１５．  ２６（８）：  ｐ．  ２０４２−５３．
３４．  Ｄｅｌｌ’Ｏｇｌｉｏ，  Ｍ．Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｆｉｂｒｏｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｅｎｄｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ．  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，  ２０１０．  ２１（１２）：  ｐ．  ２１５７−６８．
３５．  Ｂｒｏｕａｒｄ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｋｉｄｎｅｙ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｕｎｄｅｒ  ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ  ｏｒ  ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ  ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  ２０１０．  １０（１２）：  ｐ．  ２６０４−１４．
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３７．  Ｂｒａｚａ，  Ｆ．，  Ｊ．Ｐ．  Ｓｏｕｌｉｌｌｏｕ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｂｒｏｕａｒｄ，  Ｒｅｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｏ−ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｒｅｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ，  ２０１３．  ４（１）：  ｐ．  １５−７．
３８．  Ｐｅｔｒａｒａ，  Ｍ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：  ｆｒｏｍ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ−ｄｒｉｖｅｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ，  ２０１５．  ３６９（１）：  ｐ．  ３７−４４．
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４３．  Ｒｏｅｄｄｅｒ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｋｓｏｒｔ  ａｓｓａｙ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｒｅｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｒｉｓｋ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ：  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ＡＡＲＴ  ｓｔｕｄｙ．  Ｐｌｏｓ  Ｍｅｄ，  ２０１４．  １１（１１）：  ｐ．  Ｅ１００１７５９．
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４５．  Ｆｏｕｃｈｅｒ，  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｋｉｄｎｅｙ  ｇｒａｆｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ，  ２０１０．  ７８（１２）：  ｐ．  １２８８−９４．
４６．  Ｌａｋｋｉｓ，  Ｆ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｍ．Ｈ．  Ｓａｙｅｇｈ，  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：  ａ  ｈｕｒｄｌｅ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ，  ２００３．  １４（９）：  ｐ．  ２４０２−１０．
４７．  Ｔｕｌｌｉｕｓ，  Ｓ．Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｎｏｒ  ａｎｄ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ  ａｇｅ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｈｏｓｔ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｒｅｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｏｕｔｃｏｍｅ．  Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ，  ２０１０．  ２５２（４）：  ｐ．  ６６２−７４．
４８．  Ｂｅｎｉｔｅｚ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｒｕｇ  ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ  ｉｎ  ｓｔａｂｌｅ  ａｄｕｌｔ  ｌｉｖｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  ２０１３．  ５８（５）：  ｐ．  １８２４−３５．
４９．  Ｈｅｉｄｔ，  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｃａｎ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ  ａｃｕｔｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｓｔａｂｌｅ  ｇｒａｆｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，  ２０１４．
５０．  Ｂｒａｕｄ，  Ｃ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｄｒｕｇ−ｆｒｅｅ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ：  Ｐａｒｔ  Ｉ．  Ｂｌｏｏｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ２００８．  １０３（６）：  ｐ．  １６８１−９２．
５１．  Ｌｏｚａｎｏ，  Ｊ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ−ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌｌｙ  ｔｏｌｅｒａｎｔ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｋｉｄｎｅｙ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，  ２０１１．  １１（９）：  ｐ．  １９１６−２６．
５２．  Ｇａｕｔｉｅｒ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ａｆｆｙ−−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｇｅｎｅｃｈｉｐ  ｄａｔａ  ａｔ  ｔｈｅ  ｐｒｏｂｅ  ｌｅｖｅｌ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，  ２００４．  ２０（３）：  ｐ．  ３０７−１５．
５３．  ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｆ．Ｃ．，  ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００  ｕｓｅｒ  ｂｕｌｌｅｔｉｎ，  １９９７．  ２：  ｐ．  １１−２４．
【図１−１】
2019527062.tif 000012
【図１−２】
2019527062.tif 000013
【図２】
2019527062.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月9日(2019.5.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植後に免疫寛容の（ＴＯＬ）対象と移植後に免疫寛容でない（ＳＴＡ）対象とを識別するための方法であって、
ｉ）前記対象から得た生体試料中の６種の遺伝子の発現レベル及び２種の臨床的パラメータによって複合寛容スコア（ｃＳｏＴ）を確立する段階であって、
前記６種の遺伝子はＩＤ３、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＴＣＬ１Ａ及びＭＺＢ１であり、
前記ｃＳｏＴは次式：
【数１】
2019527062.tif 000015
で確立される段階と、
ｉｉ）このｃＳｏＴを既定の基準値と比較する段階と、
ｉｉｉ）ｃＳｏＴが既定の基準値よりも高い場合には対象がＴＯＬであると結論を下し、又はｃＳｏＴが既定の基準値よりも低い場合には対象がＳＴＡであると結論を下す段階を含む方法。
【請求項２】
２種の臨床的パラメータは試験時の前記対象の年齢及び移植時の前記対象の年齢である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
既定の基準値はＴＯＬ対象のｃＳｏＴである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
既定の基準値はＳＴＡ対象のｃＳｏＴである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
対象は免疫抑制治療中である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記対象はヒトである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記対象は腎臓レシピエントである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記腎臓レシピエントは更に腎臓ドナーの膵臓が移植されており、任意選択で腎臓ドナーの十二指腸片が移植されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法に従って移植後に免疫寛容の（ＴＯＬ）対象と移植後に免疫寛容でない（ＳＴＡ）対象とを識別するためのバイオマーカーとしての遺伝子ＩＤ３、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＴＣＬ１Ａ及びＭＺＢ１の使用。
【請求項１０】
２種の臨床的パラメータを更に含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
２種の臨床的パラメータは、試験時の前記対象の年齢及び移植時の前記対象の年齢である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
移植後に免疫寛容の（ＴＯＬ）対象と移植後に免疫寛容でない（ＳＴＡ）対象とを識別するためのキットであって、少なくともＩＤ３、ＡＫＲ１Ｃ３、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、ＴＣＬ１Ａ及びＭＺＢ１の各々の遺伝子発現レベルに対応する少なくとも６種の値の群に対応する遺伝子発現プロファイルを決定するための少なくとも１種の試薬を含むキット。
【請求項１３】
移植された対象を免疫抑制療法で治療する方法であって、
ｉ）対象が請求項１〜８のいずれか一項に記載の移植後に免疫寛容の（ＴＯＬ）対象であるか又は移植後に免疫寛容でない（ＳＴＡ）対象であるかを決定する段階と、
ｉｉ）対象がＳＴＡである場合には対象を免疫抑制療法で治療する段階を含む方法。
【請求項１４】
免疫抑制療法中の移植された対象を免疫抑制療法の断薬又は最小化の候補として特定するための方法であって、
ｉ）対象が請求項１〜８のいずれか一項に記載の移植後に免疫寛容の（ＴＯＬ）対象であるか又は移植後に免疫寛容でない（ＳＴＡ）対象であるかを決定する段階と、
ｉｉ）対象がＴＯＬである場合には対象が免疫抑制療法の断薬又は最小化に適格であると結論を下す段階を含む方法。
【国際調査報告】
2019527062.tif 000016
2019527062.tif 000017
2019527062.tif 000018