(57)【要約】多特異性免疫調節抗原結合構築物（ＭＩＡＣ）及び当該構築物を含む組成物が本明細書で提供される。当該構築物を使用する方法及び該構築物を作製する方法も提供される。2019509055.tif 000030
2019509055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．癌細胞によって発現されるＨＥＲ２抗原に特異的に結合する抗原結合モジュール１（ＡＢＭ１）；
ｂ．エフェクター免疫細胞によって発現される活性化受容体に特異的に結合する抗原結合モジュール２（ＡＢＭ２）であって、前記活性化受容体へのＡＢＭ２の結合が前記活性化受容体を刺激し、前記活性化受容体がＣＤ３またはＣＤ１３７である、ＡＢＭ２；及び
ｃ．随意に、前記エフェクター免疫細胞によって発現される阻害性受容体に特異的に結合する抗原結合モジュール３（ＡＢＭ３）であって、前記阻害性受容体へのＡＢＭ３の前記結合が前記阻害性受容体に拮抗する、ＡＢＭ３
を含み、
ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３が互いに作動可能に連結され、
各抗原結合モジュールが、他の抗原結合モジュールのそれぞれがそのそれぞれの抗原または受容体に結合するのと同時に、そのそれぞれの抗原または受容体と結合することができる、多特異性免疫調節抗原結合構築物（ＭＩＡＣ）のポリペプチド。
【請求項２】
前記ＭＩＡＣがＦｃをさらに含み、ここで、ＡＢＭ１がｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ２がＦａｂフラグメントであり、ＡＢＭ２がＦｃのＮ末端に連結しており、かつＡＢＭ１がＦｃのＣ末端に連結している、請求項１に記載のＭＩＡＣ。
【請求項３】
前記ＭＩＡＣがＦｃをさらに含み、ここで、ＡＢＭ１がｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ２がＦａｂフラグメントであり、ＡＢＭ３がｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ２がＦｃのＮ末端に連結しており、ＡＢＭ１がＦｃのＣ末端に連結しており、ＡＢＭ３がＡＢＭ２のＣ末端に連結している、請求項１に記載のＭＩＡＣ。
【請求項４】
ａ．癌細胞によって発現されるＨＥＲ２抗原に特異的に結合する抗原結合モジュール１（ＡＢＭ１）；
ｂ．随意に、エフェクター免疫細胞によって発現される活性化受容体に特異的に結合する抗原結合モジュール２（ＡＢＭ２）であって、前記活性化受容体へのＡＢＭ２の結合が前記活性化受容体を刺激する、ＡＢＭ２；及び
ｃ．前記エフェクター免疫細胞によって発現される阻害性受容体に特異的に結合する抗原結合モジュール３（ＡＢＭ３）であって、前記阻害性受容体へのＡＢＭ３の前記結合が前記阻害性受容体に拮抗し、前記阻害性受容体がＰＤ１である、ＡＢＭ３
を含み、
ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３が互いに作動可能に連結され、
各抗原結合モジュールが、他の抗原結合モジュールのそれぞれがそのそれぞれの抗原または受容体に結合するのと同時に、そのそれぞれの抗原または受容体と結合することができる、多特異性免疫調節抗原結合構築物（ＭＩＡＣ）のポリペプチド。
【請求項５】
前記ＭＩＡＣがＦｃをさらに含み、ここで、ＡＢＭ１がｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ３がＦａｂフラグメントであり、ＡＢＭ３がＦｃのＮ末端に連結しており、ＡＢＭ１がＦｃのＣ末端に連結している、請求項４に記載のＭＩＡＣ。
【請求項６】
前記ＭＩＡＣがＦｃをさらに含み、ここで、ＡＢＭ１がｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ２がＦａｂフラグメントであり、ＡＢＭ３がｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ２がＦｃのＮ末端に連結しており、ＡＢＭ１がＦｃのＣ末端に連結しており、ＡＢＭ３がＡＢＭ２のＣ末端に連結している、請求項４に記載のＭＩＡＣ。
【請求項７】
前記ＭＩＡＣがＦｃをさらに含み、ここで、ＡＢＭ１がｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ２がＦａｂフラグメントであり、ＡＢＭ３がｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ２がＦｃに連結しており、ＡＢＭ３がＡＢＭ２に連結しており、ＡＢＭ１がＦｃに連結しており、ここで、前記ＭＩＡＣが、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の対照セットと比較して、より多くの量の、エフェクター免疫細胞によるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２及びグランザイムＢの分泌のうちの少なくとも１つを誘導し、ここで、抗体の前記対照セットが、全体としては前記ＭＩＡＣと同じ標的に特異的に結合する、等モル濃度で存在する別々の単一特異性抗体から成り、ここで、前記ＭＩＡＣが、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の前記対照セットと比較して、より高いレベルのエフェクター免疫細胞増殖を誘導し、かつここで、前記ＭＩＡＣが、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の前記対照セットと比較して、より高いレベルの、エフェクター免疫細胞のＣＤ２５細胞表面発現を誘導する、請求項１または４に記載のＭＩＡＣ。
【請求項８】
前記ＭＩＡＣが、一緒に連結しているＡＢＭ１、ＡＢＭ２、ＡＢＭ３及びＦｃから成り、ここで、ＡＢＭ１がｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ２がＦａｂフラグメントであり、ＡＢＭ３がｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ２の重鎖のＣ末端がＦｃのＮ末端に連結しており、ＡＢＭ１がＦｃのＣ末端に連結しており、ＡＢＭ３がＡＢＭ２の軽鎖のＣ末端に連結しており、ここで、前記ＭＩＡＣが、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の対照セットと比較して、より多くの量の、エフェクター免疫細胞によるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２及びグランザイムＢの分泌のうちの少なくとも１つを誘導し、ここで、抗体の前記対照セットが、全体としては前記ＭＩＡＣと同じ標的に特異的に結合する、等モル濃度で存在する別々の単一特異性抗体から成り、ここで、前記ＭＩＡＣが、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の前記対照セットと比較して、より高いレベルのエフェクター免疫細胞増殖を誘導し、かつここで、前記ＭＩＡＣが、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の前記対照セットと比較して、より高いレベルの、エフェクター免疫細胞のＣＤ２５細胞表面発現を誘導する、請求項１または４に記載のＭＩＡＣ。
【請求項９】
前記ＭＩＡＣが、一緒に連結しているＡＢＭ１、ＡＢＭ２、ＡＢＭ３及びＦｃから成り、ここで、ＡＢＭ１がｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ２がＦａｂフラグメントであり、ＡＢＭ３がｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ２の重鎖のＣ末端がＦｃのＮ末端に連結しており、ＡＢＭ１がＦｃのＣ末端に連結しており、ＡＢＭ３がＡＢＭ２の軽鎖のＣ末端に連結している、請求項１または４に記載のＭＩＡＣ。
【請求項１０】
前記ＭＩＡＣが足場をさらに含み、ここで、随意に、前記足場がＦｃであり、随意に、前記ＦｃがヒトＦｃであり、随意に、前記ＦｃがヒトＩｇＧのＦｃであり、随意に、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３のそれぞれが、リンカーを伴ってまたは伴わずに、直接的または間接的に前記足場に連結しており、随意に、前記リンカーがポリペプチドリンカーである、請求項１または４に記載のＭＩＡＣ。
【請求項１１】
足場がＦｃを含む、請求項１０に記載のＭＩＡＣ。
【請求項１２】
ＦｃがＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭであり、随意に、Ｆｃが改変され、随意に、前記改変がグリコシル化を低減し、随意に、前記改変がＡＤＣＣを低減し、随意に、前記改変がヒトＩｇＧ１のＦｃにおけるＮ２９７変異であり、随意に、前記Ｎ２９７変異がＮ２９７Ａ変異である、請求項１１に記載のＭＩＡＣ。
【請求項１３】
ＦｃがヒトＩｇＧ１のＦｃである、請求項１１に記載のＭＩＡＣ。
【請求項１４】
ＡＢＭ１及びＡＢＭ２がＦｃのＣ末端とは異なる位置に連結しており、ＡＢＭ３がＦｃのＣ末端に連結している、請求項１１に記載のＭＩＡＣ。
【請求項１５】
ＡＢＭ１及びＡＢＭ３がＦｃのＣ末端とは異なる位置に連結しており、ＡＢＭ２がＦｃのＣ末端に連結している、請求項１１に記載のＭＩＡＣ。
【請求項１６】
ＡＢＭ３がＦｃのＣ末端に連結している、請求項１１に記載のＭＩＡＣ。
【請求項１７】
ＡＢＭ２がＦｃのＣ末端に連結している、請求項１１に記載のＭＩＡＣ。
【請求項１８】
ＡＢＭ１がＦｃのＮ末端に連結している、請求項１１に記載のＭＩＡＣ。
【請求項１９】
ＡＢＭ１が、ＦｃのＮ末端に連結したＦａｂフラグメントである、請求項１１に記載のＭＩＡＣ。
【請求項２０】
ＡＢＭ及びＦｃが、癌細胞に対して向けられたＡＤＣＣを実質的に妨げない形式で連結している、請求項１１に記載のＭＩＡＣ。
【請求項２１】
ＡＢＭ３及びＡＢＭ２がＦｃのＣ末端とは異なる位置に連結しており、ＡＢＭ１がＦｃのＣ末端に連結している、請求項１１に記載のＭＩＡＣ。
【請求項２２】
ＡＢＭ３がＦｃのＮ末端に連結している、請求項１１に記載のＭＩＡＣ。
【請求項２３】
ＡＢＭ２がＦｃのＮ末端に連結している、請求項１１に記載のＭＩＡＣ。
【請求項２４】
ＡＢＭ１がＦｃのＣ末端に連結している、請求項１１に記載のＭＩＡＣ。
【請求項２５】
ＡＢＭ及びＦｃが、癌細胞に対して向けられたＡＤＣＣを実質的に妨げる形式で連結している、請求項１１に記載のＭＩＡＣ。
【請求項２６】
ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３のそれぞれが抗体またはその抗原結合性フラグメントである、上記請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項２７】
前記抗体またはその抗原結合性フラグメントがＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＤＶＤ−Ｉｇ及び／または重鎖抗体である、請求項２６に記載のＭＩＡＣ。
【請求項２８】
前記抗体またはその抗原結合性フラグメントがＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント及び／または単一ドメイン抗体もしくはその抗原結合性フラグメントである、請求項２６に記載のＭＩＡＣ。
【請求項２９】
前記抗体またはその抗原結合性フラグメントがモノクローナル、ヒト、ヒト化及び／またはキメラである、請求項２６に記載のＭＩＡＣ。
【請求項３０】
ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３の少なくとも１つが代替足場をさらに含むか、または前記ＭＩＡＣが代替足場をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項３１】
前記エフェクター免疫細胞がＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり、随意に、前記Ｔ細胞がＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞である、先行請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項３２】
前記癌細胞が、ＨＥＲ２＋癌、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、基底細胞癌、脳腫瘍、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、原発不明癌、心臓腫瘍、子宮頸癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腺管癌、胚芽腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、線維性組織球腫、ユーイング肉腫、眼癌、胚細胞腫瘍、胆嚢癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、頭頸部癌、ヘアリーセル白血病、肝細胞癌、組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病、唇及び口腔の癌、肝臓癌、非浸潤性小葉癌、肺癌、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、ＮＵＴ遺伝子関与正中管癌腫（ｍｉｄｌｉｎｅ  ｔｒａｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ＮＵＴ  ｇｅｎｅ）、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、鼻腔及び副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管の癌、網膜芽細胞腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、脊髄腫瘍、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、Ｔ細胞リンパ腫、奇形腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、腟癌、外陰癌ならびにウィルムス腫瘍に由来する細胞である、先行請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項３３】
ＡＢＭ２が４つの免疫グロブリン可変ドメインを含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項３４】
ＡＢＭ１が２つの免疫グロブリン可変ドメインを含む、請求項３３に記載のＭＩＡＣ。
【請求項３５】
ＡＢＭ３が２つの免疫グロブリン可変ドメインを含む、請求項３４に記載のＭＩＡＣ。
【請求項３６】
ＡＢＭ２がＦａｂフラグメントであり、ＡＢＭ１がｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ３がｓｃＦｖフラグメントである、請求項３５に記載のＭＩＡＣ。
【請求項３７】
前記ＭＩＡＣがＦｃをさらに含み、ＡＢＭ２がＦｃに連結しており、ＡＢＭ３がＡＢＭ２に連結しており、ＡＢＭ１がＦｃに連結している、上記請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項３８】
ＡＢＭ２の重鎖のＣ末端がＦｃのＮ末端に連結しており、ＡＢＭ１がＦｃのＣ末端に連結しており、ＡＢＭ３がＡＢＭ２の軽鎖のＣ末端に連結している、請求項３７に記載のＭＩＡＣ。
【請求項３９】
各連結が直接的であるかまたはリンカーを介しており、随意に、前記リンカーがポリペプチドリンカーであり、随意に、前記ポリペプチドリンカーがｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたは免疫グロブリンヒンジ領域もしくはその一部であり、随意に、前記リンカーが（Ｇ４Ｓ）３リンカーである、上記請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項４０】
前記ＭＩＡＣが二量体であり、随意に、前記二量体がホモ二量体である、上記請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項４１】
前記エフェクター免疫細胞によって発現されるさらなる分子と特異的に結合する抗原結合モジュール４（ＡＢＭ４）をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項４２】
前記エフェクター免疫細胞によって発現される前記さらなる分子が、ＣＤ１６（ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ）、ＣＤ３２ａ、ＣＤ６４及びＣＤ８９から選択される、請求項４１に記載のＭＩＡＣ。
【請求項４３】
ＡＢＭ４がＦｃである、請求項４１に記載のＭＩＡＣ。
【請求項４４】
ＡＢＭ２が抗ＣＤ１３７である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項４５】
ＡＢＭ２が抗ＣＤ３である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項４６】
ＡＢＭ３が抗ＰＤ１である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項４７】
ＡＢＭ１が抗ＨＥＲ２であり、ＡＢＭ２が抗ＣＤ３である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項４８】
ＡＢＭ１が抗ＨＥＲ２であり、ＡＢＭ２が抗ＣＤ１３７である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項４９】
ＡＢＭ１が抗ＨＥＲ２であり、ＡＢＭ３が抗ＰＤ１である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項５０】
ＡＢＭ１が抗ＨＥＲ２であり、ＡＢＭ２が抗ＣＤ３であり、ＡＢＭ３が抗ＰＤ−１である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項５１】
ＡＢＭ１が抗ＨＥＲ２であり、ＡＢＭ２が抗ＣＤ１３７であり、ＡＢＭ３が抗ＰＤ−１である、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項５２】
ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３のうちの少なくとも２つが互いに共有結合的に会合している、先行請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項５３】
前記共有結合的会合が融合タンパク質の形態である、請求項５２に記載のＭＩＡＣ。
【請求項５４】
ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３のうちの少なくとも２つが互いに非共有結合的に会合している、先行請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項５５】
前記ＭＩＡＣが、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の対照セットと比較して、より多くの量の、エフェクター免疫細胞によるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２及びグランザイムＢの分泌のうちの少なくとも１つを誘導し、ここで、抗体の前記対照セットが、全体としては前記ＭＩＡＣと同じ標的に特異的に結合する、等モル濃度で存在する別々の単一特異性抗体から成る、先行請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項５６】
前記ＭＩＡＣによって誘導されるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２及び／またはグランザイムＢの分泌の量が、抗体の前記対照セットによって誘導されるものより約２、３、４、５、６、７または８倍多い、請求項５５に記載のＭＩＡＣ。
【請求項５７】
前記ＭＩＡＣが、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の対照セットと比較して、より高いレベルのエフェクター免疫細胞増殖を誘導し、ここで、抗体の前記対照セットが、全体としては前記ＭＩＡＣと同じ標的に特異的に結合する、等モル濃度で存在する別々の単一特異性抗体から成る、先行請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項５８】
前記ＭＩＡＣによって誘導される増殖のレベルが、抗体の前記対照セットによって誘導されるものより約２、３、４、５、６、７または８倍高い、請求項５７に記載のＭＩＡＣ。
【請求項５９】
前記ＭＩＡＣが、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の対照セットと比較して、より高いレベルの、エフェクター免疫細胞のＣＤ２５細胞表面発現を誘導し、ここで、抗体の前記対照セットが、全体としては前記ＭＩＡＣと同じ標的に特異的に結合する、等モル濃度で存在する別々の単一特異性抗体から成る、先行請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項６０】
前記ＭＩＡＣによって誘導される前記ＣＤ２５の発現が、抗体の前記対照セットによって誘導されるものより約２、３、４、５、６、７または８倍多い、請求項５９に記載のＭＩＡＣ。
【請求項６１】
前記ＭＩＡＣが、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の対照セットと比較して、より高いレベルの癌細胞死を誘導し、ここで、抗体の前記対照セットが、全体としては前記ＭＩＡＣと同じ標的に特異的に結合する、等モル濃度で存在する別々の単一特異性抗体から成る、先行請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項６２】
各ＡＢＭが、他の抗原結合モジュールのそれぞれがそのそれぞれの抗原または受容体に結合するのと同時に、そのそれぞれの抗原または受容体と結合し、随意に、そのそれぞれの抗原または受容体に対する各結合モジュールの親和性が、各ＡＢＭがそのそれぞれの抗原または受容体に同時に結合する場合、約０．３ｎＭ〜約１．７ｎＭ、０．３７〜１．６６ｎＭ、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６または１．７ｎＭである、先行請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ。
【請求項６３】
先行請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ及び剤を含む、コンジュゲート。
【請求項６４】
前記剤が、治療剤、診断剤、マスキング部分、切断可能部分及びこれらの組み合わせから選択される、請求項６３に記載のコンジュゲート。
【請求項６５】
前記剤がリンカーによってＭＩＡＣに結合している、請求項６３に記載のコンジュゲート。
【請求項６６】
先行請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣまたはコンジュゲート及び賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項６７】
癌を有する対象を治療する方法であって、有効量の、先行請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣもしくはコンジュゲートまたは請求項６６に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項６８】
癌の成長を阻害するかまたは低減させる方法であって、前記癌を、有効量の前記対象に対する先行請求項のいずれか１項に記載のＭＩＡＣもしくはコンジュゲートまたは請求項６６に記載の医薬組成物に接触させることを含む、前記方法。
【請求項６９】
前記ＭＩＡＣが癌細胞及びエフェクター細胞と結合する、請求項６７または請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＭＩＡＣが２つ以上のエフェクター細胞と結合する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＭＩＡＣが前記エフェクター細胞の活性化受容体を刺激し、前記エフェクター細胞の阻害性受容体に拮抗する、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＭＩＡＣが前記エフェクター細胞を活性化する、請求項６７〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記活性化されたエフェクター細胞が、癌細胞に対する細胞傷害性、増殖、ＩＬ−２の分泌、インターフェロンガンマの分泌、ＬＡＭＰ−１のアップレギュレーション、ＣＤ１６のダウンレギュレーション、ＣＤ６９のアップレギュレーション及びＫＬＲＧ１のアップレギュレーションから選択される表現型を示す、請求項６７〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＭＩＡＣによって誘導される前記増殖が、ＡＢＭ３を含まないＭＩＡＣによって誘導される増殖を上回る、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記癌が、ＨＥＲ２＋癌、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、基底細胞癌、脳腫瘍、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、原発不明癌、心臓腫瘍、子宮頸癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腺管癌、胚芽腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、線維性組織球腫、ユーイング肉腫、眼癌、胚細胞腫瘍、胆嚢癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、頭頸部癌、ヘアリーセル白血病、肝細胞癌、組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病、唇及び口腔の癌、肝臓癌、非浸潤性小葉癌、肺癌、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、ＮＵＴ遺伝子関与正中管癌腫、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、鼻腔及び副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管の癌、網膜芽細胞腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、脊髄腫瘍、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、Ｔ細胞リンパ腫、奇形腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、腟癌、外陰癌ならびにウィルムス腫瘍から選択される、請求項６７〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
少なくとも１つのさらなる剤を前記対象に投与することをさらに含む、請求項６７〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
請求項１〜６２のいずれか１項に記載のＭＩＡＣをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドまたは一連のポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項７８】
請求項７７に記載の組成物を含む細胞。
【請求項７９】
請求項７８に記載の細胞で前記ＭＩＡＣを発現させることを含む、ＭＩＡＣを作製する方法。
【請求項８０】
請求項１〜６２のいずれか１項に記載のＭＩＡＣの前記ＡＢＭを発現させること、および、ＭＩＡＣを形成するために前記ＡＢＭをアセンブルすることを含む、ＭＩＡＣを作製する方法。
【請求項８１】
請求項１〜６２のいずれか１項に記載のＭＩＡＣをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドまたは一連のポリヌクレオチドを含む、ベクターまたは一連のベクター。
【請求項８２】
請求項１〜６２のいずれか１項に記載のＭＩＡＣ及び使用のための説明書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１月１３日に出願された米国特許仮出願第６２／２７８，３５９号、及び、２０１６年７月１３日に出願された米国特許仮出願第６２／３６１，８４２号の利益を主張し、当該仮出願は、すべての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、配列表を含む。２０１７年１月１１日に作製された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、３５８６８ＰＣＴ＿ＣＲＦ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名づけられ、９４，７３４バイトのサイズである。
【０００３】
分野
多特異性免疫調節抗原結合構築物（ＭＩＡＣ）及びＭＩＡＣを含む組成物が本明細書で提供される。該構築物を使用する方法及び該構築物を作製する方法も提供される。
【背景技術】
【０００４】
背景
同じエフェクター細胞上の活性化受容体及び阻害性受容体の同時調節
エフェクター細胞ベースの免疫調節抗体療法は抗体を利用して、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などのエフェクター細胞を腫瘍などの所望の作用部位に動員する。
【０００５】
エフェクター細胞ベースの免疫調節抗体療法の一例は、Ａｍｇｅｎ  ＩｎｃのＢｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ（ＢｉＴＥ（登録商標））免疫療法プラットフォームである。ＢｉＴＥ（登録商標）プラットフォームは、Ｔ細胞と癌細胞の間のブリッジとして機能するように設計されている。ＢｉＴＥ（登録商標）分子は、２つの抗原結合部位、すなわち、（１）腫瘍細胞の表面上の抗原と結合する結合部位、及び（２）Ｔ細胞の表面上のＣＤ３と結合するＣＤ３結合部位を有する。両方の抗原と結合することによって、ＢｉＴＥ（登録商標）分子は、Ｔ細胞の細胞傷害活性を活用して、特定の抗原を発現する癌細胞を破壊する。Ｎａｇｏｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，２０１１，３１７：１２５５−１２６０（非特許文献1）；及びＢａｅｕｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００９，１１：２２−３０（非特許文献2）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。
【０００６】
他のエフェクター細胞ベースの免疫調節抗体療法としては、癌細胞で発現される抗原及びＴ細胞の表面上で発現される共刺激（すなわち、活性化）受容体ＣＤ３及びＣＤ２８に結合する分子が挙げられる。全体が参照により組み込まれる、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００４，１３５：５５５−５６５（非特許文献3）を参照されたい。
【０００７】
しかし、標準的なシグナル１及び２（すなわち、それぞれＣＤ３及びＣＤ２８を介する）の供給だけでは、癌療法においてエフェクター細胞の治療的に適切な活性化を誘導するのに十分でない可能性があるという証拠が蓄積している。これについての１つの理由は、癌細胞の中には、エフェクター細胞によって発現される阻害性受容体に対するリガンドを発現するものがあるということである。例えば、癌細胞によるＰＤ−Ｌ１の発現は阻害性受容体ＰＤ−１を活性化する。阻害性受容体は、同じエフェクター細胞で共結合した活性化受容体からの刺激性シグナルを抑止する阻害性シグナルを伝達する。
【０００８】
さらに、癌細胞の中には、エフェクター細胞によって発現される活性化受容体に対してリガンドを提示できないものもある。例えば、ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢが脱落している癌細胞は、これらのリガンドが活性化受容体ＮＫＧ２Ｄを刺激できないことを意味する。
【０００９】
理論に拘束されないが、こうした反対のタイプの受容体（すなわち、活性化及び阻害）によって伝えられるシグナルが個々の細胞のレベルで統合され、次いで、各細胞が、その免疫シナプスにおいて伝達される活性化シグナル及び阻害性シグナルの統合（例えば総和）に従って、活性化される（または活性化されない）ように思われる。例えば、ＮＫ細胞の活性化は、数ある中でも、特に、ＮＫＧ２Ｄなどの活性化受容体と阻害型のＫＩＲ及びＰＤ−１などの阻害性受容体の両方を介するシグナリングの統合に依存している。全体が参照により組み込まれる、Ｐｅｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，８９：２１６−２２４（非特許文献4）を参照されたい。
【００１０】
現在のエフェクター細胞ベースの免疫調節抗体療法は、こうした統合的シグナリングメカニズムを考慮していない。したがって、現在の療法は、ある種の治療状況、例えばエフェクター細胞によって発現される阻害性受容体に対するリガンドを発現する悪性腫瘍において、エフェクター細胞を活性化する能力を欠く。
【００１１】
したがって、同じエフェクター細胞によって発現される活性化受容体と阻害性受容体の両方を介するシグナリングを同時に調節することによってエフェクター細胞の機能を至適化する、新規な癌細胞標的指向療法が必要である。したがって、いくつかの実施形態では、この機能を果たす分子が本明細書で提供される。例えば、エフェクター細胞を利用する治療適用における、そのような分子を使用する方法も提供される。これらの分子を作製する方法も提供される。
【００１２】
癌細胞に対する免疫調節構築物の特異的標的指向
ある種の癌細胞は、（ｉ）エフェクター細胞によって発現される活性化受容体に対するリガンドを発現することができない；または（ｉｉ）エフェクター細胞によって発現される阻害性受容体に対するリガンドを発現する。結果として生じる、癌細胞がエフェクター細胞において活性化シグナルを刺激することができないこと、または癌細胞がエフェクター細胞において阻害性シグナルを刺激することに成功することは、それぞれ、癌の進行を促進することもできる。
【００１３】
例えば、全体が参照により組み込まれる、Ｈｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ，２０１０，３６３：７１１−７２３）（非特許文献5）は、阻害性受容体に拮抗する抗ＣＴＬＡ−４抗体イピリムマブが与えられている転移性黒色腫患者の生存の向上を記載している。イピリムマブの投与は生存を延ばしたが、この抗体は癌細胞を特異的に標的とせず、したがって、広範に且つ非特異的に免疫系を活性化する。そのような広範な活性化の結果としては、重度の自己免疫毒性、例えば、大腸炎及び内分泌疾患が挙げられる。前掲誌を参照されたい。
【００１４】
したがって、現在のエフェクター細胞ベースの免疫調節療法は、しばしば効力があるが非特異的である。これに反して、癌細胞の細胞表面抗原を標的とする従来のモノクローナル抗体ベースの療法は、一般に非常に特異的であるが効力を欠く可能性がある。
【００１５】
したがって、多くのエフェクター細胞ベースの免疫調節抗体療法につきものの特異性の欠如及び多くの癌細胞標的指向モノクローナル抗体療法の効力の欠如に対処する新規な治療法も必要である。有用な分子は、癌細胞標的指向モノクローナル抗体の特異性とエフェクター細胞ベースの免疫調節療法の免疫調節能力を兼ね備えるであろう。したがって、いくつかの実施形態では、この機能を果たす分子が本明細書で提供される。例えば、エフェクター細胞を利用する治療適用における、そのような分子を使用する方法も提供される。これらの分子を作製する方法も提供される。
【００１６】
本出願は、共有する特許出願である、２０１６年１月１３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３２９１（特許文献1）に関し、当該出願は、すべての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０１３２９１
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｎａｇｏｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，２０１１，３１７：１２５５−１２６０
【非特許文献２】Ｂａｅｕｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００９，１１：２２−３０
【非特許文献３】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００４，１３５：５５５−５６５
【非特許文献４】Ｐｅｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，８９：２１６−２２４
【非特許文献５】Ｈｏｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ，２０１０，３６３：７１１−７２３
【発明の概要】
【００１９】
概要
癌細胞によって発現される抗原に特異的に結合する抗原結合モジュール１（ＡＢＭ１）；
エフェクター免疫細胞によって発現される活性化受容体に特異的に結合する抗原結合モジュール２（ＡＢＭ２）であって、活性化受容体へのＡＢＭ２の結合が活性化受容体を刺激するＡＢＭ２；及び
エフェクター免疫細胞によって発現される阻害性受容体に特異的に結合する抗原結合モジュール３（ＡＢＭ３）であって、阻害性受容体へのＡＢＭ３の結合が阻害性受容体に拮抗するＡＢＭ３
を含む多特異性免疫調節抗原結合構築物（ＭＩＡＣ）のポリペプチドが本明細書に記載され、ここで、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３は互いに作動可能に連結され、随意に、各抗原結合モジュールは、他の抗原結合モジュールのそれぞれが、そのそれぞれの抗原または受容体に結合するのと同時に、そのそれぞれの抗原または受容体と、結合することができる。
【００２０】
いくつかの態様では、ＭＩＡＣはさらにＦｃを含み、ここで、ＡＢＭ１はｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ２はＦａｂフラグメントであり、ＡＢＭ３はｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ２はＦｃに連結しており、ＡＢＭ３はＡＢＭ２に連結しており、ＡＢＭ１はＦｃに連結しており、ここで、ＭＩＡＣは、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の対照セットと比較して、より多くの量の、エフェクター免疫細胞によるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２及びグランザイムＢの分泌のうちの少なくとも１つを誘導し、ここで、抗体の対照セットは、全体としてはＭＩＡＣと同じ標的と特異的に結合する、等モル濃度で存在する別々の単一特異性抗体から成り、ここで、ＭＩＡＣは、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の対照セットと比較して、より高いレベルのエフェクター免疫細胞増殖を誘導し、ＭＩＡＣは、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の対照セットと比較して、より高いレベルの、エフェクター免疫細胞のＣＤ２５細胞表面発現を誘導する。
【００２１】
いくつかの態様では、ＭＩＡＣは、一緒に連結しているＡＢＭ１、ＡＢＭ２、ＡＢＭ３及びＦｃから成り、ここで、ＡＢＭ１はｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ２はＦａｂフラグメントであり、ＡＢＭ３はｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ２の重鎖のＣ末端はＦｃのＮ末端に連結しており、ＡＢＭ１はＦｃのＣ末端に連結しており、ＡＢＭ３はＡＢＭ２の軽鎖のＣ末端に連結しており、ここで、ＭＩＡＣは、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の対照セットと比較して、より多くの量の、エフェクター免疫細胞によるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２及びグランザイムＢの分泌のうちの少なくとも１つを誘導し、ここで、抗体の対照セットは、全体としてはＭＩＡＣと同じ標的に特異的に結合する、等モル濃度で存在する別々の単一特異性抗体から成り、ここで、ＭＩＡＣは、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の対照セットと比較して、より高いレベルのエフェクター免疫細胞増殖を誘導し、ＭＩＡＣは、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の対照セットと比較して、より高いレベルの、エフェクター免疫細胞のＣＤ２５細胞表面発現を誘導する。
【００２２】
いくつかの態様では、ＭＩＡＣは、一緒に連結しているＡＢＭ１、ＡＢＭ２、ＡＢＭ３及びＦｃから成り、ここで、ＡＢＭ１はｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ２はＦａｂフラグメントであり、ＡＢＭ３はｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ２の重鎖のＣ末端はＦｃのＮ末端に連結しており、ＡＢＭ１はＦｃのＣ末端に連結しており、ＡＢＭ３はＡＢＭ２の軽鎖のＣ末端に連結している。
【００２３】
ＭＩＡＣは、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２、及びＡＢＭ３、ならびに、Ｆｃである足場を含むことができる。
【００２４】
ＡＢＭ１及びＡＢＭ２はＦｃのＣ末端とは異なる位置に連結されることができ、ＡＢＭ３はＦｃのＣ末端に連結されることができる。ＡＢＭ１及びＡＢＭ３はＦｃのＣ末端とは異なる位置に連結されることができ、ＡＢＭ２はＦｃのＣ末端に連結されることができる。特定の態様では、ＡＢＭ３はＦｃのＣ末端に連結している。特定の態様では、ＡＢＭ２はＦｃのＣ末端に連結している。特定の態様では、ＡＢＭ１はＦｃのＮ末端に連結している。特定の態様では、ＡＢＭ１は、ＦｃのＮ末端に連結したＦａｂフラグメントである。ＡＢＭ及びＦｃは、癌細胞に対して向けられたＡＤＣＣを実質的に妨げない形式で連結されることができる。
【００２５】
ＡＢＭ３及びＡＢＭ２はＦｃのＣ末端とは異なる位置に連結されることができ、ＡＢＭ１はＦｃのＣ末端に連結されることができる。特定の態様では、ＡＢＭ３はＦｃのＮ末端に連結している。特定の態様では、ＡＢＭ２はＦｃのＮ末端に連結している。特定の態様では、ＡＢＭ１はＦｃのＣ末端に連結している。ＡＢＭ及びＦｃは、癌細胞に対して向けられたＡＤＣＣを実質的に妨げる形式で連結されることができる。
【００２６】
ＭＩＡＣは、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２、及びＡＢＭ３を含むことができ、ＡＢＭ１は抗ＥＧＦＲであり、ＡＢＭ２は抗ＣＤ１３７であり、ＡＢＭ３は抗ＰＤ−１である。
【００２７】
癌細胞によって発現される抗原に特異的に結合する抗原結合モジュール１（ＡＢＭ１）；及び
エフェクター免疫細胞によって発現される活性化受容体に特異的に結合する抗原結合モジュール２（ＡＢＭ２）であって、活性化受容体へのＡＢＭ２の結合が活性化受容体を刺激するＡＢＭ２
を含む多特異性免疫調節抗原結合構築物（ＭＩＡＣ）も本明細書に記載され、ここで、ＡＢＭ１及びＡＢＭ２は互いに作動可能に連結され、随意に、各抗原結合モジュールは、他の抗原結合モジュールのそれぞれがそのそれぞれの抗原または受容体に結合するのと同時に、そのそれぞれの抗原または受容体と結合することができる。いくつかの態様では、ＭＩＡＣはさらにＦｃを含み、随意に、ＡＢＭ２はＦａｂフラグメントであり、ＡＢＭ１はｓｃＦｖフラグメントであり、随意に、ＡＢＭ２の重鎖のＣ末端はＦｃのＮ末端に連結しており、ＡＢＭ１はＦｃのＣ末端に連結しており、随意に、ＭＩＡＣは二量体であり、随意に、二量体はホモ二量体である。
【００２８】
ＭＩＡＣはＡＢＭ１及びＡＢＭ２を含むことができ、ＡＢＭ１は抗ＣＤ１９であり、ＡＢＭ２は抗ＣＤ１３７である。
【００２９】
ＭＩＡＣはＡＢＭ１及びＡＢＭ２を含むことができ、ＡＢＭ１は抗ＥＧＦＲであり、ＡＢＭ２は抗ＣＤ１３７である。
【００３０】
ＡＢＭ１はＦｃのＮ末端に連結されることができ、ＡＢＭ２はＦｃのＣ末端に連結されることができる。いくつかの態様では、ＡＢＭ１は、ＦｃのＮ末端に連結したＦａｂフラグメントであり、ＡＢＭ２はＦｃのＣ末端に連結している。いくつかの態様では、ＡＢＭ２はＦｃのＣ末端に連結している。いくつかの態様では、ＡＢＭ１はＦｃのＮ末端に連結している。ＡＢＭ及びＦｃは、癌細胞に対して向けられたＡＤＣＣを実質的に妨げない形式で連結されることができる。
【００３１】
ＡＢＭ２はＦｃのＮ末端に連結されることができ、ＡＢＭ１はＦｃのＣ末端に連結されることができる。いくつかの態様では、ＡＢＭ２はＦｃのＮ末端に連結しており、ＡＢＭ１はｓｃＦｖフラグメントでありＦｃのＣ末端に連結している。いくつかの態様では、ＡＢＭ２はＦｃのＮ末端に連結している。いくつかの態様では、ＡＢＭ１はＦｃのＣ末端に連結している。ＡＢＭ及びＦｃは、癌細胞に対して向けられたＡＤＣＣを実質的に妨げる形式で連結されることができる。
【００３２】
癌細胞によって発現される抗原に特異的に結合する抗原結合モジュール１（ＡＢＭ１）；及び
エフェクター免疫細胞によって発現される阻害性受容体に特異的に結合する抗原結合モジュール３（ＡＢＭ３）であって、阻害性受容体へのＡＢＭ３の結合が阻害性受容体に拮抗するＡＢＭ３
を含む多特異性免疫調節抗原結合構築物（ＭＩＡＣ）も本明細書に記載され、ここで、ＡＢＭ１及びＡＢＭ３は互いに作動可能に連結され、随意に、各抗原結合モジュールは、他の抗原結合モジュールのそれぞれがそのそれぞれの抗原または受容体に結合するのと同時に、そのそれぞれの抗原または受容体と結合することができる。いくつかの態様では、ＭＩＡＣはさらにＦｃを含み、随意に、ＡＢＭ３はＦａｂフラグメントであり、ＡＢＭ１はｓｃＦｖフラグメントであり、随意に、ＡＢＭ３の重鎖のＣ末端はＦｃのＮ末端に連結しており、ＡＢＭ１はＦｃのＣ末端に連結しており、随意に、ＭＩＡＣは二量体であり、随意に、二量体はホモ二量体である。
【００３３】
ＭＩＡＣはＡＢＭ１及びＡＢＭ３を含むことができ、ＡＢＭ１は抗ＣＤ２０であり、ＡＢＭ３は抗ＰＤ−１である。
【００３４】
ＭＩＡＣはＡＢＭ１及びＡＢＭ３を含むことができ、ＡＢＭ１は抗ＣＤ１９であり、ＡＢＭ３は抗ＰＤ−１である。
【００３５】
ＭＩＡＣはＡＢＭ１及びＡＢＭ３を含むことができ、ＡＢＭ１は抗ＥＧＦＲであり、ＡＢＭ３は抗ＰＤ−１である。
【００３６】
ＡＢＭ１はＦｃのＮ末端に連結されることができ、ＡＢＭ３はＦｃのＣ末端に連結されることができる。いくつかの態様では、ＡＢＭ１は、ＦｃのＮ末端に連結したＦａｂフラグメントであり、ＡＢＭ３はＦｃのＣ末端に連結している。いくつかの態様では、ＡＢＭ３はＦｃのＣ末端に連結している。いくつかの態様では、ＡＢＭ１はＦｃのＮ末端に連結している。ＡＢＭ及びＦｃは、癌細胞に対して向けられたＡＤＣＣを実質的に妨げない形式で連結されることができる。
【００３７】
ＡＢＭ３はＦｃのＮ末端に連結されることができ、ＡＢＭ１はＦｃのＣ末端に連結されることができる。いくつかの態様では、ＡＢＭ３はＦｃのＮ末端に連結しており、ＡＢＭ１はｓｃＦｖフラグメントでありＦｃのＣ末端に連結している。いくつかの態様では、ＡＢＭ３はＦｃのＮ末端に連結している。いくつかの態様では、ＡＢＭ１はＦｃのＣ末端に連結している。ＡＢＭ及びＦｃは、癌細胞に対して向けられたＡＤＣＣを実質的に妨げる形式で連結されることができる。
【００３８】
いくつかの態様では、ＭＩＡＣは足場をさらに含み、ここで、随意に、足場はＦｃであり、随意に、ＦｃはヒトＦｃであり、随意に、ＦｃはヒトＩｇＧのＦｃであり、随意に、各ＡＢＭは、直接的または間接的に、リンカーを伴ってまたは伴わずに足場に連結しており、随意に、リンカーはポリペプチドリンカーである。いくつかの態様では、ＦｃはＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭであり、随意に、Ｆｃは改変され、随意に、当該改変はグリコシル化を低減させ、随意に、当該改変はＡＤＣＣを低減させる。
【００３９】
いくつかの態様では、各ＡＢＭは抗体またはその抗原結合性フラグメントである。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合性フラグメントはＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＤＶＤ−Ｉｇ及び／または重鎖抗体である。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合性フラグメントはＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント及び／または単一ドメイン抗体もしくはその抗原結合性フラグメントである。いくつかの態様では、抗体またはその抗原結合性フラグメントはモノクローナル、ヒト、ヒト化及び／またはキメラである。
【００４０】
いくつかの態様では、少なくとも１つのＡＢＭは代替足場をさらに含み、またはＭＩＡＣの別の部分は代替足場をさらに含む。
【００４１】
いくつかの態様では、癌細胞によって発現される抗原は腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原である。いくつかの態様では、癌細胞によって発現される抗原は、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、βｈＣＧ、Ａ３３抗原、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカー、カルレティキュリン、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ６３、ＣＤ７０、ＣＣ１２３、ＣＤ１３８、癌胎児性抗原（ＣＥＡ；ＣＤ６６ｅ）、デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、エンドシアリン、エフリンＡ２（ＥｐｈＡ２）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥｒｂＢ２、胎児アセチルコリン受容体、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ガングリオシドＧＤ３、Ｇｌｏｂｏ  Ｈ、糖タンパク質１００、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、インスリン様増殖因子受容体１、ルイス−Ｙ、ＬＧ、Ｌｙ−６、黒色腫特異的コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＣＰ）、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６、ミューラー管抑制物質（ＭＩＳ）ＩＩ型受容体、形質細胞抗原、ポリＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＳＡＳ、ＳＴＥＡＰ、ｓＴｎ抗原、ＴＮＦ−アルファ前駆体及びこれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様では、癌細胞によって発現される抗原はＥＧＦＲである。いくつかの態様では、癌細胞によって発現される抗原は、ＣＤ１９である。いくつかの態様では、癌細胞によって発現される抗原は、ＣＤ２０である。
【００４２】
いくつかの態様では、活性化受容体は、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、α４β１インテグリン、β２インテグリン、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ９６、ＣＤ１００、ＣＤ１６０、ＣＤ１３７、ＣＥＡＣＡＭ１（ＣＤ６６）、ＣＲＴＡＭ、ＣＳ１（ＣＤ３１９）、ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、活性化型のＫＩＲ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、１種または複数種の天然の細胞傷害受容体（ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＮＴＢ−Ａ、ＰＥＮ−５及びこれらの組み合わせから選択され、随意に、β２インテグリンは、ＣＤ１１ａ−ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１８またはＣＤ１１ｃ−ＣＤ１８を含み、随意に、活性化型のＫＩＲはＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ４またはＫＩＲ−Ｓを含み、随意に、天然の細胞傷害受容体はＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６またはＮＫｐ８０を含む。いくつかの態様では、活性化受容体はＣＤ１３７である。
【００４３】
いくつかの態様では、阻害性受容体は、ＫＩＲ、ＩＬＴ２／ＬＩＲ−１／ＣＤ８５ｊ、阻害型のＫＩＲ、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ−１、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＲ−Ｐ１Ａ、Ｓｉｇｌｅｃ−３、Ｓｉｇｌｅｃ−７、Ｓｉｇｌｅｃ−９及びこれらの組み合わせから選択され、随意に、阻害型のＫＩＲはＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２またはＫＩＲ−Ｌを含む。
【００４４】
いくつかの態様では、活性化受容体は、ＣＤ３、ＣＤ２（ＬＦＡ２、ＯＸ３４）、ＣＤ５、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８４（ＳＬＡＭＦ５）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２２６、ＣＤ２２９（Ｌｙ９、ＳＬＡＭＦ３）、ＣＤ２４４（２Ｂ４、ＳＬＡＭＦ４）、ＣＤ３１９（ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥ）、ＣＤ３５２（Ｌｙ１０８、ＮＴＢＡ、ＳＬＡＭＦ６）、ＣＲＴＡＭ（ＣＤ３５５）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴβＲ（ＴＮＦＲＳＦ３）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０、ＳＬＡＭＦ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδγ、ＴＩＭ１（ＨＡＶＣＲ、ＫＩＭ１）及びこれらの組み合わせから選択される。
【００４５】
いくつかの態様では、阻害性受容体は、ＰＤ−１（ＣＤ２７９）、２Ｂ４（ＣＤ２４４、ＳＬＡＭＦ４）、Ｂ７１（ＣＤ８０）、Ｂ７Ｈ１（ＣＤ２７４、ＰＤ−Ｌ１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５、ＮＫ２８）、ＣＤ３５２（Ｌｙ１０８、ＮＴＢＡ、ＳＬＡＭＦ６）、ＣＤ３５８（ＤＲ６）、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ＬＡＧ３、ＬＡＩＲ１、ＰＤ−１Ｈ（ＶＩＳＴＡ）、ＴＩＧＩＴ（ＶＳＩＧ９、ＶＳＴＭ３）、ＴＩＭ２（ＴＩＭＤ２）、ＴＩＭ３（ＨＡＶＣＲ２、ＫＩＭ３）及びこれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様では、阻害性受容体はＰＤ−１である。
【００４６】
いくつかの態様では、エフェクター免疫細胞はＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であり、随意に、Ｔ細胞はＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞またはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞である。
【００４７】
いくつかの態様では、癌細胞は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、基底細胞癌、脳腫瘍、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、原発不明癌、心臓腫瘍、子宮頸癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腺管癌、胚芽腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、線維性組織球腫、ユーイング肉腫、眼癌、胚細胞腫瘍、胆嚢癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、頭頸部癌、ヘアリーセル白血病、肝細胞癌、組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病、唇及び口腔の癌、肝臓癌、非浸潤性小葉癌、肺癌、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、ＮＵＴ遺伝子関与正中管癌腫（ｍｉｄｌｉｎｅ  ｔｒａｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ＮＵＴ  ｇｅｎｅ）、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、鼻腔及び副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管の癌、網膜芽細胞腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、脊髄腫瘍、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、Ｔ細胞リンパ腫、奇形腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、腟癌、外陰癌ならびにウィルムス腫瘍に由来する細胞である。
【００４８】
いくつかの態様では、ＡＢＭ２は、存在する場合、４つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。いくつかの態様では、ＡＢＭ１は、存在する場合、２つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。いくつかの態様では、ＡＢＭ３は、存在する場合、２つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。いくつかの態様では、ＡＢＭ２は、存在する場合、Ｆａｂフラグメントであり、ＡＢＭ１は、存在する場合、ｓｃＦｖフラグメントであり、ＡＢＭ３は、存在する場合、ｓｃＦｖフラグメントである。
【００４９】
いくつかの態様では、ＭＩＡＣはＦｃをさらに含み、ＡＢＭ２は、存在する場合、Ｆｃに連結しており、ＡＢＭ３は、存在する場合、ＡＢＭ２に連結しており、ＡＢＭ１は、存在する場合、Ｆｃに連結している。いくつかの態様では、ＡＢＭ２の重鎖のＣ末端は、存在する場合、ＦｃのＮ末端に連結しており、ＡＢＭ１は、存在する場合、ＦｃのＣ末端に連結しており、ＡＢＭ３は、存在する場合、ＡＢＭ２の軽鎖のＣ末端に連結している。
【００５０】
いくつかの態様では、各連結は直接的であるか、またはリンカーを介しており、随意に、リンカーはポリペプチドリンカーであり、随意に、ポリペプチドリンカーはｇｌｙ−ｓｅｒリンカーまたは免疫グロブリンヒンジ領域もしくはその一部である。
【００５１】
いくつかの態様では、ＭＩＡＣは二量体であり、随意に、二量体はホモ二量体である。
【００５２】
いくつかの態様では、ＭＩＡＣは、エフェクター免疫細胞によって発現されるさらなる分子に特異的に結合する抗原結合モジュール４（ＡＢＭ４）をさらに含む。いくつかの態様では、エフェクター免疫細胞によって発現されるさらなる分子は、ＣＤ１６（ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ）、ＣＤ３２ａ、ＣＤ６４及びＣＤ８９から選択される。いくつかの態様では、ＡＢＭ４はＦｃである。
【００５３】
いくつかの態様では、少なくとも２つのＡＢＭは、互いに共有結合的に会合している。いくつかの態様では、共有結合的会合は融合タンパク質の形態である。いくつかの態様では、少なくとも２つのＡＢＭは、互いに非共有結合的に会合している。
【００５４】
いくつかの態様では、ＭＩＡＣは、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の対照セットと比較して、より多くの量の、エフェクター免疫細胞によるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２及びグランザイムＢの分泌のうちの少なくとも１つを誘導し、ここで、抗体の対照セットは、全体として、ＭＩＡＣと同じ標的に特異的に結合する、等モル濃度で存在する別々の単一特異性抗体から成る。いくつかの態様では、ＭＩＡＣによって誘導されるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２及び／またはグランザイムＢの分泌の量は、抗体の対照セットによって誘導されるものより約２、３、４、５、６、７または８倍多い。
【００５５】
いくつかの態様では、ＭＩＡＣは、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の対照セットと比較して、より高いレベルのエフェクター免疫細胞増殖を誘導し、ここで、抗体の対照セットは、全体としてはＭＩＡＣと同じ標的に特異的に結合する、等モル濃度で存在する別々の単一特異性抗体から成る。いくつかの態様では、ＭＩＡＣによって誘導される増殖のレベルは、抗体の対照セットによって誘導されるものより約２、３、４、５、６、７または８倍高い。
【００５６】
いくつかの態様では、ＭＩＡＣは、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の対照セットと比較して、より高いレベルの、エフェクター免疫細胞のＣＤ２５細胞表面発現を誘導し、ここで、抗体の対照セットは、全体としてはＭＩＡＣと同じ標的に特異的に結合する、等モル濃度で存在する別々の単一特異性抗体から成る。いくつかの態様では、ＭＩＡＣによって誘導されるＣＤ２５の発現は、抗体の対照セットによって誘導されるものより約２、３、４、５、６、７または８倍多い。
【００５７】
いくつかの態様では、ＭＩＡＣは、少なくとも１つのエフェクター免疫細胞及び少なくとも１つの癌細胞に結合する際に、抗体の対照セットと比較して、より高いレベルの癌細胞死を誘導し、ここで、抗体の対照セットは、全体としてはＭＩＡＣと同じ標的に特異的に結合する、等モル濃度で存在する別々の単一特異性抗体から成る。
【００５８】
いくつかの態様では、各ＡＢＭは、他の抗原結合モジュールのそれぞれがそのそれぞれの抗原または受容体に結合するのと同時に、そのそれぞれの抗原または受容体と結合し、随意に、そのそれぞれの抗原または受容体に対する各結合モジュールの親和性は、各ＡＢＭがそのそれぞれの抗原または受容体に同時に結合する場合、約０．３ｎＭ〜約１．７ｎＭ、０．３７〜１．６６ｎＭ、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６または１．７ｎＭである。
【００５９】
ＭＩＡＣ及び剤を含むコンジュゲートも本明細書に開示される。いくつかの態様では、剤は、治療剤、診断剤、マスキング部分、切断可能部分及びこれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様では、剤はリンカーによってＭＩＡＣに結合している。
【００６０】
本明細書に開示されるＭＩＡＣまたはコンジュゲート及び賦形剤を含む医薬組成物も本明細書に開示される。
【００６１】
有効量の、本明細書に開示されるＭＩＡＣまたはコンジュゲートまたは医薬組成物を対象に投与することを含む、癌を有する対象を治療する方法も本明細書に開示される。
【００６２】
有効量の、対象に対する本明細書に開示されるＭＩＡＣまたはコンジュゲートまたは医薬組成物と癌を接触させることを含む、癌の成長を阻害するかまたは低減させる方法も本明細書に開示される。
【００６３】
いくつかの態様では、ＭＩＡＣは癌細胞及びエフェクター細胞と結合する。いくつかの態様では、ＭＩＡＣは２つ以上のエフェクター細胞と結合する。いくつかの態様では、ＭＩＡＣはエフェクター細胞の活性化受容体を刺激し、エフェクター細胞の阻害性受容体に拮抗する。いくつかの態様では、ＭＩＡＣはエフェクター細胞を活性化する。いくつかの態様では、活性化されたエフェクター細胞は、癌細胞に対する細胞傷害性、増殖、ＩＬ−２の分泌、インターフェロンガンマの分泌、ＬＡＭＰ−１のアップレギュレーション、ＣＤ１６のダウンレギュレーション、ＣＤ６９のアップレギュレーション及びＫＬＲＧ１のアップレギュレーションから選択される表現型を示す。いくつかの態様では、ＭＩＡＣによって誘導される増殖は、ＡＢＭ３を含まないＭＩＡＣによって誘導される増殖を上回る。
【００６４】
いくつかの態様では、癌は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、基底細胞癌、脳腫瘍、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、原発不明癌、心臓腫瘍、子宮頸癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腺管癌、胚芽腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、線維性組織球腫、ユーイング肉腫、眼癌、胚細胞腫瘍、胆嚢癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、頭頸部癌、ヘアリーセル白血病、肝細胞癌、組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病、唇及び口腔の癌、肝臓癌、非浸潤性小葉癌、肺癌、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、ＮＵＴ遺伝子関与正中管癌腫、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、鼻腔及び副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管の癌、網膜芽細胞腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、脊髄腫瘍、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、Ｔ細胞リンパ腫、奇形腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、腟癌、外陰癌ならびにウィルムス腫瘍から選択される。
【００６５】
いくつかの態様では、本明細書に開示される方法は、少なくとも１つのさらなる剤を対象に投与することをさらに含む。
【００６６】
本明細書に開示されるＭＩＡＣをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドまたは一連のポリヌクレオチドを含む組成物も本明細書に開示される。
【００６７】
本明細書に開示されるＭＩＡＣをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドまたは一連のポリヌクレオチドを含む細胞も本明細書に開示される。
【００６８】
本明細書に開示されるＭＩＡＣをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドまたは一連のポリヌクレオチドを含む細胞でＭＩＡＣを発現させることを含むＭＩＡＣを作製する方法も本明細書に開示される。
【００６９】
本明細書に開示されるＭＩＡＣのＡＢＭを発現させること、および、ＭＩＡＣを形成するためにＡＢＭをアセンブルすることを含む、ＭＩＡＣを作製する方法も本明細書に開示される。
【００７０】
本明細書に開示されるＭＩＡＣをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドまたは一連のポリヌクレオチドを含むベクターまたは一連のベクターも本明細書に開示される。
【００７１】
本明細書に開示されるＭＩＡＣ及び使用のための説明書を含むキットも本明細書に開示され、随意に、使用のための説明書は、本明細書に開示される方法を実施するための説明書を含む。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本開示の多特異性免疫調節抗原結合構築物（すなわち、ＭＩＡＣ；１０１）の概略図である。ＭＩＡＣは、３つの抗原結合モジュール（ＡＢＭ；１０２、１０３及び１０４）を含む。抗原結合モジュール１（ＡＢＭ１；１０２）は、癌細胞特異的抗原結合部位を含む。抗原結合モジュール２（ＡＢＭ２；１０３）は、エフェクター細胞によって発現される活性化受容体に対してアゴニスト活性を有する結合部位を含む。抗原結合モジュール３（ＡＢＭ３；１０４）は、エフェクター細胞によって発現される阻害性受容体に対してアンタゴニスト活性を有する結合部位を含む。この概略図は、本明細書で提供されるＭＩＡＣの成分を例示することを目的とし、個々のＡＢＭの配置または数について制限することを目的とするものではない。より詳細に以下に記載するように、ＡＢＭ（例えば、免疫グロブリン、抗体フラグメント及び代替足場）を形成する分子の性質に応じて、ＡＢＭを様々に配置させることができる。ＡＢＭは、相互作用の結合価を変える及び／またはエフェクター細胞の活性化について改善された制御をもたらすために、異なる量で存在することもできる。
【図２Ａ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのある種の例示的実施形態の概略図である。この例示的実施形態は１つのＩｇＧ及び２つのｓｃＦｖから組み立てられる。２つのｓｃＦｖがＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合している一実施形態の概略図を提供する。ＡＢＭ１は２０１として指定され、ＡＢＭ２は２０２として指定され、ＡＢＭ３は２０３として指定される。
【図２Ｂ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのある種の例示的実施形態の概略図である。この例示的実施形態は１つのＩｇＧ及び２つのｓｃＦｖから組み立てられる。２つのｓｃＦｖがＩｇＧ軽鎖のＣ末端に結合している一実施形態の概略図を提供する。ＡＢＭ１は２０１として指定され、ＡＢＭ２は２０２として指定され、ＡＢＭ３は２０３として指定される。
【図２Ｃ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのある種の例示的実施形態の概略図である。この例示的実施形態は１つのＩｇＧ及び２つのｓｃＦｖから組み立てられる。１つのｓｃＦｖがＩｇＧ軽鎖のＣ末端に結合し、もう１つのｓｃＦｖがＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合している実施形態の概略図を提供する。ＡＢＭ１は２０１として指定され、ＡＢＭ２は２０２として指定され、ＡＢＭ３は２０３として指定される。
【図２Ｄ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのある種の例示的実施形態の概略図である。この例示的実施形態は１つのＩｇＧ及び２つのｓｃＦｖから組み立てられる。１つのｓｃＦｖがＩｇＧ軽鎖のＣ末端に結合し、もう１つのｓｃＦｖがＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合している実施形態の概略図を提供する。ＡＢＭ１は２０１として指定され、ＡＢＭ２は２０２として指定され、ＡＢＭ３は２０３として指定される。
【図３Ａ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。提供される例示的実施形態は、活性化受容体及び阻害性受容体に対する結合部位の数ならびにＭＩＡＣ内のそれらの位置を変えることによってエフェクター細胞の活性化を調節することができるＭＩＡＣを示す。この例示的実施形態は、１つのＩｇＧ及び３つのｓｃＦｖから組み立てられる。１つのＡＢＭ２（２０２）が１つのＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合し、１つのＡＢＭ３（２０３）がもう１つのＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合し、１つのＡＢＭ３（２０３）が１つのＩｇＧ軽鎖のＣ末端に結合している一実施形態の概略図を提供する。
【図３Ｂ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。提供される例示的実施形態は、活性化受容体及び阻害性受容体に対する結合部位の数ならびにＭＩＡＣ内のそれらの位置を変えることによってエフェクター細胞の活性化を調節することができるＭＩＡＣを示す。この例示的実施形態は、１つのＩｇＧ及び３つのｓｃＦｖから組み立てられる。１つのＡＢＭ２（２０２）が１つのＩｇＧ軽鎖のＣ末端に結合し、１つのＡＢＭ３（２０３）がもう１つのＩｇＧ軽鎖のＣ末端に結合し、１つのＡＢＭ３（２０３）が１つのＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合している一実施形態の概略図を提供する。
【図３Ｃ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。提供される例示的実施形態は、活性化受容体及び阻害性受容体に対する結合部位の数ならびにＭＩＡＣ内のそれらの位置を変えることによってエフェクター細胞の活性化を調節することができるＭＩＡＣを示す。この例示的実施形態は、１つのＩｇＧ及び３つのｓｃＦｖから組み立てられる。１つのＡＢＭ２（２０２）が１つのＩｇＧ軽鎖のＣ末端に結合し、１つのＡＢＭ２（２０２）が１つのＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合し、１つのＡＢＭ３（２０３）がもう１つのＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合している一実施形態の概略図を提供する。
【図３Ｄ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。提供される例示的実施形態は、活性化受容体及び阻害性受容体に対する結合部位の数ならびにＭＩＡＣ内のそれらの位置を変えることによってエフェクター細胞の活性化を調節することができるＭＩＡＣを示す。この例示的実施形態は、１つのＩｇＧ及び３つのｓｃＦｖから組み立てられる。１つのＡＢＭ２（２０２）が１つのＩｇＧ軽鎖のＣ末端に結合し、１つのＡＢＭ２（２０２）が１つのＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合し、１つのＡＢＭ３（２０３）がもう１つのＩｇＧ軽鎖のＣ末端に結合している一実施形態の概略図を提供する。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。これらの例示的実施形態は１つのＩｇＧ及び４つのｓｃＦｖから組み立てられる。図４Ａは、ＡＢＭ２（２０２）が半分のＩｇＧ分子の重鎖及び軽鎖のＣ末端に結合し、ＡＢＭ３（２０３）がもう半分のＩｇＧ分子の重鎖及び軽鎖のＣ末端に結合している一実施形態の概略図を提供する。図４Ｂは、ＡＢＭ２（２０２）が１つのＩｇＧ軽鎖のＣ末端及び１つのＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合し、一方で、ＡＢＭ３（２０３）がもう１つのＩｇＧ軽鎖のＣ末端及びもう１つのＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合している一実施形態の概略図を提供する。図４Ａ〜４Ｂにおいて、ＡＢＭ１は２０１として指定され、ＡＢＭ２は２０２として指定され、ＡＢＭ３は２０３として指定される。
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。ＡＢＭ２（図５Ａ）またはＡＢＭ３（図５Ｂ）はＩｇＧであり、残りのＡＢＭはＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合しているｓｃＦｖである。図５Ａおよび５Ｂにおいて、ＡＢＭ１は２０１として指定され、ＡＢＭ２は２０２として指定され、ＡＢＭ３は２０３として指定される。
【図６】本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３のそれぞれはｓｃＦｖである。ＡＢＭ１は２０１として指定され、ＡＢＭ２は２０２として指定され、ＡＢＭ３は２０３として指定される。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。１つのＡＢＭは他の２つのＡＢＭの両方に結合しているが、他の２つのＡＢＭは互いに結合していない。図７Ａ〜７Ｃにおいて、ＡＢＭ１は２０１として指定され、ＡＢＭ２は２０２として指定され、ＡＢＭ３は２０３として指定される。
【図８】本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。各ＡＢＭは２つの他のＡＢＭに結合している。ＡＢＭ１は２０１として指定され、ＡＢＭ２は２０２として指定され、ＡＢＭ３は２０３として指定される。
【図９】本開示の多特異性免疫調節抗原結合構築物（すなわち、ＭＩＡＣ；１０１）の概略図である。ＭＩＡＣは、２つの抗原結合モジュール（ＡＢＭ；１０２及び１０３）を含む。抗原結合モジュール１（ＡＢＭ１；１０２）は、癌細胞特異的抗原結合部位を含む。抗原結合モジュール２（ＡＢＭ２；１０３）は、エフェクター細胞によって発現される活性化受容体に対してアゴニスト活性を有する結合部位を含む。この概略図は、本明細書で提供されるＭＩＡＣの成分を例示することを目的とし、個々のＡＢＭの配置または数について制限することを目的とするものではない。より詳細に以下に記載するように、ＡＢＭ（例えば、免疫グロブリン、抗体フラグメント及び代替足場）を形成する分子の性質に応じて、ＡＢＭを様々に配置させることができる。ＡＢＭは、相互作用の結合価を変える及び／またはエフェクター細胞の活性化について改善された制御をもたらすために、異なる量で存在することもできる。
【図１０】本開示の多特異性免疫調節抗原結合構築物（すなわち、ＭＩＡＣ；１０１）の概略図である。ＭＩＡＣは、２つの抗原結合モジュール（ＡＢＭ；１０２及び１０４）を含む。抗原結合モジュール１（ＡＢＭ１；１０２）は、癌細胞特異的抗原結合部位を含む。抗原結合モジュール３（ＡＢＭ２；１０４）は、エフェクター細胞によって発現される阻害性受容体に対してアンタゴニスト活性を有する結合部位を含む。この概略図は、本明細書で提供されるＭＩＡＣの成分を例示することを目的とし、個々のＡＢＭの配置または数について制限することを目的とするものではない。より詳細に以下に記載するように、ＡＢＭ（例えば、免疫グロブリン、抗体フラグメント及び代替足場）を形成する分子の性質に応じて、ＡＢＭを様々に配置させることができる。ＡＢＭは、相互作用の結合価を変える及び／またはエフェクター細胞の活性化について改善された制御をもたらすために、異なる量で存在することもできる。
【図１１Ａ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのある種の例示的実施形態の概略図である。この例示的実施形態は１つのＩｇＧ及び２つのｓｃＦｖから組み立てられる。２つのｓｃＦｖがＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合している実施形態の概略図を提供する。ＡＢＭ１は２０１として指定され、ＡＢＭ２は２０２として指定され、ＡＢＭ３は２０３として指定される。
【図１１Ｂ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのある種の例示的実施形態の概略図である。この例示的実施形態は１つのＩｇＧ及び２つのｓｃＦｖから組み立てられる。２つのｓｃＦｖがＩｇＧ軽鎖のＣ末端に結合している実施形態の概略図を提供する。ＡＢＭ１は２０１として指定され、ＡＢＭ２は２０２として指定され、ＡＢＭ３は２０３として指定される。
【図１１Ｃ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのある種の例示的実施形態の概略図である。この例示的実施形態は１つのＩｇＧ及び２つのｓｃＦｖから組み立てられる。２つのｓｃＦｖがＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合している実施形態の概略図を提供する。ＡＢＭ１は２０１として指定され、ＡＢＭ２は２０２として指定され、ＡＢＭ３は２０３として指定される。
【図１１Ｄ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのある種の例示的実施形態の概略図である。この例示的実施形態は１つのＩｇＧ及び２つのｓｃＦｖから組み立てられる。２つのｓｃＦｖがＩｇＧ軽鎖のＣ末端に結合している実施形態の概略図を提供する。ＡＢＭ１は２０１として指定され、ＡＢＭ２は２０２として指定され、ＡＢＭ３は２０３として指定される。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、本明細書で提供されるＭＩＡＣのある種の例示的実施形態の概略図である。これらの例示的実施形態は１つのＩｇＧ及び２つのｓｃＦｖから組み立てられる。図１２Ａおよび図１２Ｂは、１つのｓｃＦｖがＩｇＧ軽鎖のＣ末端に結合し、もう１つのｓｃＦｖがＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合している実施形態の概略図を提供する。図１２Ａ〜図１２Ｂにおいて、ＡＢＭ１は２０１として指定され、ＡＢＭ２は２０２として指定され、ＡＢＭ３は２０３として指定される。
【図１３Ａ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。提供される例示的実施形態は、活性化受容体または阻害性受容体に対する結合部位の数を変えることによってエフェクター細胞の活性化を調節することができるＭＩＡＣを示す。この例示的実施形態は、１つのＩｇＧ及び３つのｓｃＦｖから組み立てられる。１つのＡＢＭ２（２０２）が１つのＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合し、１つのＡＢＭ２（２０２）がもう１つのＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合し、１つのＡＢＭ２（２０２）が１つのＩｇＧ軽鎖のＣ末端に結合している一実施形態の概略図を提供する。
【図１３Ｂ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。提供される例示的実施形態は、活性化受容体または阻害性受容体に対する結合部位の数を変えることによってエフェクター細胞の活性化を調節することができるＭＩＡＣを示す。この例示的実施形態は、１つのＩｇＧ及び３つのｓｃＦｖから組み立てられる。１つのＡＢＭ２（２０２）が１つのＩｇＧ軽鎖のＣ末端に結合し、１つのＡＢＭ２（２０２）がもう１つのＩｇＧ軽鎖のＣ末端に結合し、１つのＡＢＭ２（２０２）が１つのＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合している一実施形態の概略図を提供する。
【図１３Ｃ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。提供される例示的実施形態は、活性化受容体または阻害性受容体に対する結合部位の数を変えることによってエフェクター細胞の活性化を調節することができるＭＩＡＣを示す。この例示的実施形態は、１つのＩｇＧ及び３つのｓｃＦｖから組み立てられる。１つのＡＢＭ３（２０３）が１つのＩｇＧ軽鎖のＣ末端に結合し、１つのＡＢＭ３（２０３）が１つのＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合し、１つのＡＢＭ３（２０３）がもう１つのＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合している一実施形態の概略図を提供する。
【図１３Ｄ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である提供される例示的実施形態は、活性化受容体または阻害性受容体に対する結合部位の数を変えることによってエフェクター細胞の活性化を調節することができるＭＩＡＣを示す。この例示的実施形態は、１つのＩｇＧ及び３つのｓｃＦｖから組み立てられる。１つのＡＢＭ３（２０３）が１つのＩｇＧ軽鎖のＣ末端に結合し、１つのＡＢＭ３（２０３）が１つのＩｇＧ重鎖のＣ末端に結合し、１つのＡＢＭ３（２０３）がもう１つのＩｇＧ軽鎖のＣ末端に結合している一実施形態の概略図を提供する。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。これらの例示的実施形態は、１つのＩｇＧ及び４つのｓｃＦｖから組み立てられる。図１４Ａは、ＡＢＭ２（２０２）がＩｇＧ分子のすべての重鎖及び軽鎖のＣ末端に結合している一実施形態の概略図を提供する。図１４Ｂは、ＡＢＭ３（２０３）がＩｇＧ分子のすべての重鎖及び軽鎖のＣ末端に結合している一実施形態の概略図を提供する。図１４Ａ〜１４Ｂにおいて、ＡＢＭ１は２０１として指定され、ＡＢＭ２は２０２として指定され、ＡＢＭ３は２０３として指定される。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｂは、本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。ＡＢＭ１はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ２またはＡＢＭ３はそれぞれｓｃＦｖ及びＩｇＧである。図１５Ａ及び１５Ｂにおいて、ＡＢＭ１は２０１として指定され、ＡＢＭ２は２０２として指定され、ＡＢＭ３は２０３として指定される。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｂは、本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。ＡＢＭ１、ＡＢＭ２、及びＡＢＭ３のそれぞれはｓｃＦｖである。図１６Ａ〜１６Ｂにおいて、ＡＢＭ１は２０１として指定され、ＡＢＭ２は２０２として指定され、ＡＢＭ３は２０３として指定される。
【図１７Ａ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。２つのＡＢＭ１（２０１）ｓｃＦｖはＩｇＧ様分子の重鎖のＣ末端に結合している。ＩｇＧ様分子のＮ末端領域は、２つのＡＢＭ２結合部位（２０２）を形成するＶＨ−ＶＬ領域及び２つのＡＢＭ３結合部位（２０３）を形成するＶＨ−ＶＬ領域を含む。この実施形態では、ＡＢＭ３結合部位は、ＩｇＧ様分子によって形成される最もＮ末端のＡＢＭである。
【図１７Ｂ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。２つのＡＢＭ１（２０１）ｓｃＦｖはＩｇＧ様分子の重鎖のＣ末端に結合している。ＩｇＧ様分子のＮ末端領域は、２つのＡＢＭ２結合部位（２０２）を形成するＶＨ−ＶＬ領域及び２つのＡＢＭ３結合部位（２０３）を形成するＶＨ−ＶＬ領域を含む。この実施形態では、ＡＢＭ２結合部位は、ＩｇＧ様分子によって形成される最もＮ末端のＡＢＭである。
【図１８Ａ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。２つのＡＢＭ１（２０１）ｓｃＦｖはＩｇＧ様分子の重鎖のＣ末端に結合している。ＩｇＧ様分子のＮ末端領域は、４つのＡＢＭ２結合部位（２０２）を形成するＶＨ−ＶＬ領域を含む。
【図１８Ｂ】本明細書で提供されるＭＩＡＣのさらなる例示的実施形態の概略図である。２つのＡＢＭ１（２０１）ｓｃＦｖはＩｇＧ様分子の重鎖のＣ末端に結合している。ＩｇＧ様分子のＮ末端領域は、４つのＡＢＭ３結合部位（２０３）を形成するＶＨ−ＶＬ領域を含む。
【図１９】ＡＢＭ１がＣＤ３０に対する２つの結合部位を有するＩｇＧである一実施形態を示す図である。ＡＢＭ２はＣＤ１３７に対する刺激性結合部位を有するｓｃＦｖであり、ＡＢＭ３はＰＤ−１に対する拮抗性結合部位を有するｓｃＦｖである。ＡＢＭ２及び３のｓｃＦｖはＡＢＭ１を形成するＩｇＧの重鎖のＣ末端に結合している。しかし、本開示の全体を通して記載されるように、ｓｃＦｖの１つまたは複数は、重鎖のＮ末端及び／または軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に結合することもできる。
【図２０】２つのＡＢＭ１  ｓｃＦｖがＩｇＧ様分子の重鎖のＣ末端に結合している一実施形態を示す図である。ＩｇＧ様分子のＮ末端領域は、２つのＡＢＭ２結合部位を形成するＶＨ−ＶＬ領域及び２つのＡＢＭ３結合部位を形成するＶＨ−ＶＬ領域を含む。このＭＩＡＣでは、ＡＢＭ３結合部位は、ＩｇＧ様分子によって形成される最もＮ末端のＡＢＭである。
【図２１】図２１Ａ〜Ｃは、機能的インビトロアッセイで使用するために操作され、発現され、及び精製された４つの例示的ＭＩＡＣ構築物（ＰＩＤ７、ＰＩＤ９２、ＰＩＤ１２８及びＰＩＤ１３０）の概略図である。ＰＩＤ７（図２１Ａ）は、ＰＤ−１を認識するＩｇＧ１  ＡＢＭ３の重鎖Ｃ末端に融合した、Ｈｅｒ２腫瘍抗原に特異性を有する２つのＡＢＭ１  ｓｃＦｖから構成される、二重特異性ＭＩＡＣである。ＰＩＤ９２（図２１Ｂ）は、ＣＤ１３７に対するＩｇＧ１  ＡＢＭ２の重鎖Ｃ末端に融合した、Ｈｅｒ２に対する２つのＡＢＭ１  ｓｃＦｖから構成される、二重特異性ＭＩＡＣである。ＰＩＤ１２８（図２１Ｃ）は、ＣＤ３に対するＩｇＧ１  ＡＢＭ２の重鎖Ｃ末端に融合した、Ｈｅｒ２を認識する２つのＡＢＭ１  ｓｃＦｖから構成される二重特異性ＭＩＡＣである。ＰＩＤ１３０（図２１Ｄ）は、ＣＤ３に対するＩｇＧ１  ＡＢＭ２の重鎖Ｃ末端に融合した、Ｈｅｒ２に対する２つのＡＢＭ１  ｓｃＦｖ、及びＩｇＧの軽鎖Ｃ末端に融合した、ＰＤ−１を認識する２つのＡＢＭ３  ｓｃＦｖから構成される、三重特異性ＭＩＡＣである。これらの例示的ＭＩＡＣの配列情報を、セクション１６に提供する。
【図２２】例示的ＭＩＡＣタンパク質ＰＩＤ３（単一特異性α−ＣＤ３）、ＰＩＤ１２８（二重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３）及びＰＩＤ１３０（三重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３／α−ＰＤ−１）のＰＯＩ（目的のピーク）を示す３つのＳＥＣクロマトグラフである。
【図２３】２つの例示的ＭＩＡＣタンパク質、ＰＩＤ７（α−Ｈｅｒ２／α−ＰＤ−１）及びＰＩＤ９２（α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ１３７）のＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ（登録商標）結合センソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍｓ）である。これは、抗原結合活性がＭＩＡＣ型式で保持されることを実証する。これらの実施例及び他の例示的ＭＩＡＣから測定した親和性を表Ｅに示す。
【図２４】フローサイトメトリーを使用して測定した場合の、４つの異なる癌細胞株（Ａ４３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＪＩＭＴ１、ＮＣＩ−Ｈ４４１）の表面におけるＨｅｒ２腫瘍抗原及び免疫阻害性リガンドＰＤ−Ｌ１の発現を示す図である。
【図２５】例示的なＨｅｒ２標的指向ＭＩＡＣタンパク質の濃度依存的腫瘍細胞結合活性を示す図である。ＭＩＡＣの結合活性を、単一特異性抗Ｈｅｒ２（トラスツズマブ、陽性対照として）及び単一特異性抗ＣＤ３（陰性対照）と比較した。
【図２６】漸増濃度の例示的な二重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ１３７  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ９２）の存在下でＨｅｒ２＋ＪＩＭＴ１腫瘍細胞と共培養したＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ２５の発現レベル（フローサイトメトリーによる）を示す２つのグラフである。ＭＩＡＣの効果を同等濃度の混合した単一特異性α−Ｈｅｒ２抗体及びα−ＣＤ１３７抗体と比較した。
【図２７】漸増濃度の例示的な二重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ１３７  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ９２）の存在下でＨｅｒ２＋ＪＩＭＴ１腫瘍細胞と共培養した（ＣＦＳＥ希釈法によって測定した場合の）ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を示す２つのグラフである。ＭＩＡＣの効果を同等濃度の混合した単一特異性α−Ｈｅｒ２抗体及びα−ＣＤ１３７抗体と比較した。
【図２８】漸増濃度の例示的な二重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ１３７  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ９２）の存在下でＨｅｒ２＋ＪＩＭＴ１腫瘍細胞と共培養したヒト一次Ｔ細胞の（Ｌｕｍｉｎｅｘで測定した場合の）ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αサイトカイン誘導を示す２つのグラフである。ＭＩＡＣの効果を同等濃度の混合した単一特異性α−Ｈｅｒ２抗体及びα−ＣＤ１３７抗体と比較した。
【図２９】図２９Ａ〜Ｂは、漸増濃度の例示的な二重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１２８）の存在下でＨｅｒ２＋ＪＩＭＴ１腫瘍細胞と共培養したヒト一次Ｔ細胞における、フローサイトメトリーで測定した場合の増殖（図２９Ａ）およびＣＤ２５発現の誘導（図２９Ｂ）を示す。ＭＩＡＣの効果を同等濃度の混合した単一特異性α−Ｈｅｒ２及びα−ＣＤ３と比較した。
【図３０】漸増濃度の例示的な二重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１２８）の存在下でＨｅｒ２＋ＪＩＭＴ１腫瘍細胞と共培養したヒト一次Ｔ細胞の（Ｌｕｍｉｎｅｘで測定した場合の）ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αサイトカイン誘導を示す２つのグラフである。ＭＩＡＣの効果を同等濃度の混合した単一特異性α−Ｈｅｒ２及びα−ＣＤ３と比較した。
【図３１】漸増濃度の例示的な二重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１２８）に曝露したヒト一次Ｔ細胞とＨｅｒ２＋ＪＩＭＴ１腫瘍細胞の共培養における（Ｌｕｍｉｎｅｘで測定した場合の）グランザイムＢのレベルを示グラフである。ＭＩＡＣの効果を同等濃度の混合した単一特異性α−Ｈｅｒ２及びα−ＣＤ３と比較した。
【図３２】図３２Ａ〜Ｂは、漸増濃度の例示的な三重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３／α−ＰＤ−１  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１３０）の存在下でＨｅｒ２＋ＪＩＭＴ１腫瘍細胞と共培養したヒト一次Ｔ細胞におけるフローサイトメトリーで測定した場合の増殖（図３２Ａ）およびＣＤ２５発現の誘導（図３２Ｂ）を示す図である。ＭＩＡＣの効果を同等濃度の混合した単一特異性α−Ｈｅｒ２、α−ＣＤ３及びα−ＰＤ−１と比較した。
【図３３】漸増濃度の例示的な三重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３／α−ＰＤ−１  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１３０）の存在下でＨｅｒ２＋ＪＩＭＴ１腫瘍細胞と共培養したヒト一次Ｔ細胞の（Ｌｕｍｉｎｅｘで測定した場合の）ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αサイトカイン誘導を示す２つのグラフである。ＭＩＡＣの効果を同等濃度の混合した単一特異性α−Ｈｅｒ２、α−ＣＤ３及びα−ＰＤ−１と比較した。
【図３４】漸増濃度の例示的な三重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３／α−ＰＤ−１  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１３０）に曝露したヒト一次Ｔ細胞とＨｅｒ２＋ＪＩＭＴ１腫瘍細胞の共培養における（Ｌｕｍｉｎｅｘで測定した場合の）グランザイムＢのレベルを示す図である。ＭＩＡＣの効果を同等濃度の混合した単一特異性α−Ｈｅｒ２、α−ＣＤ３及びα−ＰＤ−１と比較した。
【図３５】インビトロでの細胞の細胞傷害性アッセイの結果を示すグラフである。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、漸増濃度の例示的な二重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１２８）の存在下でＨｅｒ２＋ＢＴ４７４ヒト癌細胞と共培養した。ＭＩＡＣの効果を同等濃度の混合したα−Ｈｅｒ２及びα−ＣＤ３単一特異性抗体と比較した。溶解した細胞から放出される乳酸脱水素酵素を測定するためのＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、腫瘍細胞のＴ細胞による死滅をアッセイした。
【図３６】漸増濃度の例示的な二重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１２８）に曝露したＣＤ３＋Ｔ細胞／ＢＴ４７４腫瘍細胞の共培養における（Ｌｕｍｉｎｅｘで測定した場合の）ＩＦＮ−γ及びグランザイムＢの誘導を示す２つのグラフである。ＭＩＡＣの効果を同等濃度の混合したα−Ｈｅｒ２及びα−ＣＤ３単一特異性抗体と比較した。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
詳細な説明
１．定義
別段定義しない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記及び他の科学専門用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解される意味を有することが意図される。ある場合には、通常理解される意味を有する用語は、明確にするために及び／または容易に参照するために本明細書で定義され、本明細書におけるそのような定義の包含は、必ずしも当技術分野で一般に理解されるものと比較して相違を表すと解釈されるべきでない。本明細書で記載されるまたは言及される技法及び手順は、一般に十分理解されており、従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている、広範に利用されている分子クローニングの方法論などを使用して、当業者によって通常用いられる。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を含む手順は、特記しない限り、一般に、製造者が規定したプロトコール及び／またはパラメーターに従って行われる。
【００７４】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈において別段示さない限り、複数の指示物を含む。
【００７５】
「約」という用語は、示される値及びその値より上または下の範囲を示し且つ包含する。ある種の実施形態では、「約」という用語は、指定された値±１０％、±５％または±１％を示す。
【００７６】
「含む」という用語は、その最も包括的且つオープンエンドの意味で、本明細書で使用され、請求項に記載されるいかなる追加的な要素または方法ステップも除外しない。例えば、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３を含むＭＩＡＣは、任意の他のＡＢＭ（例えばＡＢＭ４）またはＡＢＭ１、ＡＢＭ２及び／もしくはＡＢＭ３の複数のコピーまたはバージョンを含むこともできる。ＭＩＡＣは、ＡＢＭではない任意の他の要素を含むこともできる。同様に、２つの免疫グロブリン可変ドメインを含むＡＢＭは、３、４、５、６、７、８個または８個より多い免疫グロブリンドメインを含むこともできる。
【００７７】
「から成る」という用語は、特許請求される主題に通常付随する不純物を除いては、この移行句の直後の条項に記載されない、いかなる要素、ステップまたは成分も除外するように、本明細書で使用される。
【００７８】
「から本質的に成る」という用語は、請求項の範囲を特定の材料またはステップ及び特許請求される発明の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定するように本明細書で使用される。
【００７９】
「抗原結合モジュール１」または「ＡＢＭ１」という用語は、癌細胞によって発現される抗原に特異的に結合する抗原結合モジュールを指す。
【００８０】
「抗原結合モジュール２」または「ＡＢＭ２」という用語は、エフェクター免疫細胞などのエフェクター細胞によって発現される活性化受容体に特異的に結合する抗原結合モジュールであって、エフェクター細胞の活性化受容体へのＡＢＭ２の結合が活性化受容体を刺激する、抗原結合モジュールを指す。
【００８１】
「抗原結合モジュール３」または「ＡＢＭ３」という用語は、エフェクター免疫細胞などのエフェクター細胞によって発現される阻害性受容体に特異的に結合する抗原結合モジュールであって、エフェクター細胞の阻害性受容体へのＡＢＭ３の結合が阻害性受容体に拮抗する、抗原結合モジュールを指す。
【００８２】
「抗原結合モジュール４」または「ＡＢＭ４」いう用語は、エフェクター細胞のＦｃ受容体に結合する抗原結合モジュールを指す。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ４はＦｃ受容体を刺激する。
【００８３】
ＡＢＭ２の生物活性を指すのに使用される場合、「アゴニスト」及び「を刺激する」という用語は、ＡＢＭ２がエフェクター細胞のその受容体標的と結合し、その受容体を活性化して、受容体を介してエフェクター細胞における生物学的反応を誘導することを示す。
【００８４】
ＡＢＭ３の生物活性を指すのに使用される場合、「アンタゴニスト」及び「に拮抗する」という用語は、ＡＢＭ３がエフェクター細胞のその受容体標的に結合し、（例えば、その内在性リガンドによる）その受容体の活性化を遮断または阻害して、エフェクター細胞における受容体を介する生物学的反応の誘導を防止することを示す。
【００８５】
「免疫グロブリン」という用語は、２対のポリペプチド鎖、すなわち１対の軽（Ｌ）鎖及び１対の重（Ｈ）鎖を一般に含む、構造的に関連したタンパク質のクラスを指す。「インタクトな免疫グロブリン」では、これらの鎖の４つすべてがジスルフィド結合によって相互につながっている。免疫グロブリンの構造は十分に特徴づけられている。例えば、Ｐａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｈ．５（２０１３）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡを参照されたい。手短に言えば、各重鎖は、典型的には、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、典型的には、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、典型的には、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、典型的には１つのドメイン、短縮ＣＬを含む。
【００８６】
「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のタイプを説明し、その最も広い意味において本明細書で使用される。抗体としては、特に、インタクトな抗体（例えば、インタクトな免疫グロブリン）及び抗体フラグメント、例えば抗体の抗原結合性フラグメントが挙げられる。抗体は少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。抗原結合ドメインの一例は、ＶＨ−ＶＬ二量体によって形成される抗原結合ドメインである。抗体は、抗体が特異的に結合する抗原によって説明することができる。例えば、ＮＫＧ２Ｄ抗体または抗ＮＫＧ２Ｄ抗体は、受容体ＮＫＧ２Ｄに特異的に結合する抗体である。抗体は、その活性によってさらに説明することができる。例えば、アゴナイズＮＫＧ２Ｄ抗体は、受容体ＮＫＧ２Ｄに結合し、それを刺激する抗体である。
【００８７】
ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存された領域が散在した、超可変性の領域（「超可変領域（ＨＶＲ）」；「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも呼ばれる）にさらに細分することができる。より保存された領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ＶＨ及びＶＬのそれぞれは、一般に３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含み、これらは以下の順序（Ｎ末端からＣ末端に向かって）で配置される：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。ＣＤＲは抗原結合に関与し、抗原特異性及び結合親和性を抗体に与える。全体が参照により組み込まれる、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  ５ｔｈ  ｅｄ．（１９９１）Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照されたい。
【００８８】
脊椎動物種由来の軽鎖は、定常ドメインの配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つのタイプのうちの１つに割り当てることができる。
【００８９】
脊椎動物種由来の重鎖は、５つ異なるクラス（またはアイソタイプ）、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭのうちの１つに割り当てることができる。これらのクラスは、それぞれα、δ、ε、γ及びμとも呼ばれる。ＩｇＧ及びＩｇＡのクラスは、配列及び機能の違いに基づいて、さらにサブクラスに分けられる。ヒトは、以下のサブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を発現する。
【００９０】
ＣＤＲのアミノ酸配列境界は、上掲のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（「Ｋａｂａｔ」付番方式）；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」付番方式）；ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（「Ｃｏｎｔａｃｔ」付番方式）；Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，２７：５５−７７（「ＩＭＧＴ」付番方式）；及びＨｏｎｅｇｇｅ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００１，３０９：６５７−７０（「ＡＨｏ」付番方式）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）によって記載されているものを含めた、いくつかの既知の付番方式のうちのいずれかを使用して、当業者が決定することができる。
【００９１】
表１は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａのスキームで特定した場合の、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３の位置を提供する。ＣＤＲ−Ｈ１については、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの付番方式の両方を使用して残基の付番を提供する。
【００９２】
別段の指定がない限り、本明細書で特定のＣＤＲの特定に使用される付番方式はＫａｂａｔ／Ｃｈｏｔｈｉａ付番方式である。これら２つの付番方式によってもたらされる残基が異なる場合、付番方式はＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａのいずれかとして指定される。
【００９３】
（表１）Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの付番方式による、ＣＤＲ中の残基
2019509055.tif 000003
＊Ｋａｂａｔ付番規則を使用して付番した場合、ＣＤＲ−Ｈ１のＣ末端は、ＣＤＲの長さに応じて、Ｈ３２とＨ３４の間で変動する。
【００９４】
「ＥＵ付番方式」は、一般に、（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａで報告されるように）抗体重鎖定常領域または抗体軽鎖定常領域中の残基を指す場合に使用される。別段の記載がない限り、ＥＵ付番方式が本明細書に記載の抗体重鎖定常領域及び軽鎖定常領域中の残基を指すのに使用される。
【００９５】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の一部、例えば、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓｃＦｖ（ｓＦｖ）フラグメント、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント及び単一ドメイン抗体が挙げられる。
【００９６】
「Ｆｖ」フラグメントは、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインの非共有結合的に連結した二量体を含む。
【００９７】
「Ｆａｂ」フラグメントは、Ｆｖフラグメントの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインに加えて、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂフラグメントは、例えば、組換えで、または全長抗体のパパイン消化によって、生成することができる。
【００９８】
「Ｆ（ａｂ’）２」フラグメントは、ヒンジ領域の近くでジスルフィド結合によって連結した２つのＦａｂフラグメントを含む。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、例えば、組換えで、またはＦｃ領域の大部分を除去するがヒンジ領域部分をインタクトなまま残す、インタクトな抗体のペプシン消化によって、生成することができる。β−メルカプトエタノールなどの還元剤で処理することによって、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを（２つのＦ（ａｂ’）分子に）分離することができる。
【００９９】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」フラグメントは、単一のポリペプチド鎖中にＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む。ＶＨ及びＶＬは、一般に、ペプチドリンカーによって連結される。全体が参照により組み込まれる、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．（１９９４）．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｉｎ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｍ．＆  Ｍｏｏｒｅ  Ｇ．Ｐ．（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｖｏｌ．１１３（ｐｐ．２６９−３１５）．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。いくつかの実施形態では、リンカーは単一アミノ酸でもよい。いくつかの実施形態では、リンカーは化学結合でもよい。「ｓｃＦｖ−Ｆｃ」フラグメントは、Ｆｃドメインに結合したｓｃＦｖを含む。例えば、ＦｃドメインはｓｃＦｖのＣ末端に結合していてもよい。Ｆｃドメインは、ｓｃＦｖ中の可変ドメインの配向（すなわち、ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）に応じて、ＶＨの次にきてもよいし、ＶＬの次にきてもよい。Ｆｃドメインは、当技術分野で既知のまたは本明細書に記載の任意の適切なＦｃドメインでもよい。ある場合には、ＦｃドメインはＩｇＧ１のＦｃドメインである。
【０１００】
「単一ドメイン抗体」は、単一の単量体免疫グロブリン可変ドメインを含む抗体フラグメントである。全体が参照により組み込まれる、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３，２１：４８４−４９０を参照されたい。単一ドメイン抗体は、単一の重鎖または単一の軽鎖のいずれかを含むことができる。単一軽鎖抗体の例は、Ｍａｓａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９４，９１：８９３−８９６に提供される。．
【０１０１】
「二重可変ドメイン免疫グロブリン」または「ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）」という用語は、例えば、ＤｉＧｉａｍｍａｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１２，８９９：１４５−１５６ならびに米国特許第７，６１２，１８１号；第８，２５８，２６８号；第８，５８６，７１４号；第８，７１６，４５０号；第８，７２２，８５５号；第８，７３５，５４６号；及び第８，８２２，６４５号（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に記載されるような、多価及び多特異性の結合タンパク質を指す。
【０１０２】
「重鎖抗体」という用語は、少なくとも２つの重鎖を含み、軽鎖を欠く抗体を指す。Ｈａｒｍｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７７：１３−２２，２００７；及びＨａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６３：４４６−４４８（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。
【０１０３】
「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団由来の抗体を指す。実質的に均一な抗体の集団は、モノクローナル抗体の産生の間に通常生じる変異体を除いて、実質的に同様であり且つ同じエピトープ（複数可）と結合する抗体を含む。そのような変異体は、一般にほんの少量でしか存在しない。モノクローナル抗体は、典型的には、複数の抗体からの単一の抗体の選択を含む方法によって得られる。例えば、選択方法は、複数のクローン、例えば、酵母クローン、ファージクローン、細菌クローン、哺乳動物細胞クローン、ハイブリドーマクローンまたは他の組換えＤＮＡクローンのプールからのユニークなクローンの選択でもよい。例えば、標的への親和性を向上させる（「親和性成熟」）ため、抗体をヒト化するため、細胞培養でその産生を向上させるため、及び／または対象におけるその免疫原性を低減させるために、選択した抗体をさらに変化させることができる。
【０１０４】
「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来するが、重鎖及び／または軽鎖の残部が異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
【０１０５】
非ヒト抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト抗体に由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、一般に、１つまたは複数のＣＤＲ由来の残基が非ヒト抗体（ドナー抗体）の１つまたは複数のＣＤＲ由来の残基に置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ドナー抗体は、所望の特異性、親和性または生物学的効果を有する、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリまたは非ヒト霊長類抗体などの任意の適切な非ヒト抗体でもよい。場合によっては、レシピエント抗体の選択されたフレームワーク領域残基は、ドナー抗体由来の対応するフレームワーク領域残基に置き換えられる。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含むこともできる。このような改変は、抗体機能をさらに改良するために行うことができる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３−３２９；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１９９２，２：５９３−５９６（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。
【０１０６】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された、またはヒト抗体レパートリーもしくはヒト抗体をコードする配列（例えば、ヒト供給源から得られるもしくは新規に設計される）を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のものと一致するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体は、ヒト化抗体を特に除外する。
【０１０７】
「代替足場」は、抗体のものと類似している特異性及び親和性を有する分子を生成するために１つまたは複数の領域が多様化され得る分子を指す。例示的代替足場としては、フィブロネクチン（例えば、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標））、β−サンドイッチ（例えば、ｉＭａｂ）、リポカリン（例えば、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標））、ＥＥＴＩ−ＩＩ／ＡＧＲＰ、ＢＰＴＩ／ＬＡＣＩ−Ｄ１／ＩＴＩ−Ｄ２（例えば、クニッツドメイン）、チオレドキシンペプチドアプタマー、プロテインＡ（例えば、アフィボディ）、アンキリンリピート（例えば、ＤＡＲＰｉｎ）、ガンマ−Ｂ−クリスタリン／ユビキチン（例えば、アフィリン）、ＣＴＬＤ３（例えば、テトラネクチン）及び（ＬＤＬＲ−Ａモジュール）（例えば、アビマー）に由来するものが挙げられる。代替足場に関するさらなる情報は、Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００５  ２３：１２５７−１２６８；及びＳｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００７  １８：２９５−３０４（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に提供されている。
【０１０８】
「作動可能に連結される」という用語は、ＭＩＡＣ部分（例えば、１つもしくは複数のＡＢＭ及び／またはＦｃ）が、その意図された目的のために協力して機能するように配置されることを示す。
【０１０９】
「単離されたＭＩＡＣ」は、その生成環境の成分から分離及び／または回収されたＭＩＡＣである。環境の成分としては、細胞、培地及び他のタンパク質性または非タンパク質性の物質、例えば核酸を挙げることができる。いくつかの実施形態では、単離されたＭＩＡＣは、例えばスピニングカップシーケネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ  ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）の使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで精製される。いくつかの実施形態では、単離されたＭＩＡＣは、クマシーブルーまたは銀染色によって検出する、還元または非還元条件下でのゲル電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した場合に、均一まで精製される。いくつかの実施形態では、単離されたＭＩＡＣは、ＭＩＡＣを生成する組換え細胞内においてインサイチュでＭＩＡＣを含む。いくつかの実施形態では、単離されたＭＩＡＣは少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、単離されたＭＩＡＣは、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９重量％まで精製される。いくつかの実施形態では、単離されたＭＩＡＣは、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％から１００重量％のＭＩＡＣを含む溶液として提供され、残りの重量は溶媒に溶解している他の溶質の重量を含む。
【０１１１】
「親和性」は、分子（例えば、ＭＩＡＣの抗原結合モジュール）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間の非共有結合的相互作用の総計の強度を指す。別段指示がない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗原結合モジュールと抗原）の間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、当技術分野で既知の方法によって、例えば、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）装置）またはバイオレイヤー干渉法（例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（登録商標）装置）を使用することによって、測定することができる。
【０１１２】
標的分子へのＡＢＭの結合に関して、特定の抗原（例えば、ポリペプチド標的）または特定の抗原上のエピトープに「特異的結合すること」、「特異的に結合する」、「特異的である」、「選択的に結合する」及び「選択的である」という用語は非特異的または非選択的な相互作用と測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、対照分子の結合と比較して分子の結合を決定することによって、測定することができる。特異的結合は、標的と類似している対照分子、例えば、過剰量の非標識標的との競合によっても決定することができる。この場合、プローブに対する標識された標的の結合が過剰な非標識標的によって競合的に阻害される場合に、特異的結合が示される。
【０１１３】
本明細書で使用する場合、「ｋｄ」（秒−１）という用語は、特定のＡＢＭ−抗原相互作用の解離速度定数を指す。この値はｋｏｆｆ値ともいわれる。
【０１１４】
本明細書で使用する場合、「ｋａ」（Ｍ−１×秒−１）という用語は、特定のＡＢＭ−抗原相互作用の会合速度定数を指す。この値はｋｏｎ値ともいわれる。
【０１１５】
本明細書で使用する場合、「ＫＤ」（Ｍ）という用語は、特定のＡＢＭ−抗原相互作用の解離平衡定数を指す。ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ。
【０１１６】
本明細書で使用する場合、「ＫＡ」（Ｍ−１）という用語は、特定のＡＢＭ−抗原相互作用の会合平衡定数を指す。ＫＡ＝ｋａ／ｋｄ。
【０１１７】
「親和性成熟」ＡＢＭは、変化（複数可）を有さない親ＡＢＭと比較してＡＢＭのその抗原に対する親和性の向上をもたらす、（例えば、１つまたは複数のＣＤＲまたはＦＲにおける）１つまたは複数の変化を有するＡＢＭである。一実施形態では、親和性成熟ＡＢＭは、標的抗原に対してナノモルまたはピコモルの親和性を有する。親和性成熟ＡＢＭは、当技術分野で既知の様々な方法を使用して生成することができる。例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：７７９−７８３（その全体が参照により組み込まれる））は、ＶＨ及びＶＬドメインのシャフリングによる親和性成熟を記載している。ＣＤＲ及び／またはフレームワーク残基のランダム変異誘発は、例えば、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９４，９１：３８０９−３８１３）；Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１９９５，１６９：１４７−１５５；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５，１５５：１９９４−２００４；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９５，１５４：３３１０−３３１９９；及びＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９２，２２６：８８９−８９６（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）によって記載されている。
【０１１８】
２つ以上のＡＢＭに関して本明細書で使用する場合、「と競合する）」または「と交差競合する」は、２つ以上のＡＢＭが抗原への結合について競合することを示す。１つの例示的アッセイでは、抗原をプレートにコーティングし、第１のＡＢＭと結合させ、その後、標識された第２のＡＢＭを加える。第１のＡＢＭの存在が第２のＡＢＭの結合を低減させるならば、これらのＡＢＭは競合する。「と競合する」という用語は、１つのＡＢＭが別のＡＢＭの結合を低減させるが、これらのＡＢＭが逆の順序で加えられたときに競合が観察されない場合のＡＢＭの組み合わせも含む。しかし、いくつかの実施形態では、第１及び第２のＡＢＭは、それらが加えられる順序にかかわらず互いの結合を阻害する。いくつかの実施形態では、１つのＡＢＭは別のＡＢＭのその抗原への結合を、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％または少なくとも９０％低減させる。
【０１１９】
「エピトープ」という用語は、ＡＢＭに特異的結合ができる、抗原の一部を意味する。エピトープは、しばしば、表面接触可能なアミノ酸残基及び／または糖側鎖から成り、特定の三次元構造特性及び特定の荷電特性を有し得る。立体構造エピトープ及び非立体構造エピトープは、前者への結合が変性溶媒の存在下で失われるが後者では失われないという点において区別される。エピトープは、結合に直接的に関与するアミノ酸残基及び結合に直接的に関与しない他のアミノ酸残基を含むことができる。ＡＢＭが結合するエピトープは、エピトープの決定に関する既知の技法、例えば、様々な点変異を有する抗原変異体へのＡＢＭの結合を試験することを使用して決定することができる。
【０１２０】
ＡＢＭを説明するのに使用される場合、「結合価」という用語は、ＡＢＭ中の抗原認識（結合）部位の数を指す。各抗原認識部位は、１つの抗原または抗原のエピトープを特異的に認識し、したがってそれと結合することができる。ＡＢＭが１つを超える抗原認識部位を含む場合（例えば、ＡＢＭがその可変領域に２つの抗原認識部位を有するＩｇＧである場合）、各抗原認識部位は同じまたは異なる抗原を特異的に認識することができる。しかし、いくつかの実施形態では、ＡＢＭの各抗原認識部位は同じ抗原を特異的に認識する。
【０１２１】
ポリペプチド配列と参照配列の間の「同一性」パーセントは、配列を整列させ、必要ならば、最大パーセントの配列同一性を得るためにギャップを導入した後の、ポリペプチド配列中の、参照配列中のアミノ酸残基と同一であるアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するための整列化は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）、ＣＬＵＳＴＡＬＷまたはＣＬＵＳＴＡＬ  ＯＭＥＧＡソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当技術分野の範囲内の様々な方法で達成することができる。いくつかの実施形態では、ＣＬＵＳＴＡＬ  ＯＭＥＧＡソフトウェアを使用して整列化を行う。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大限の整列化を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメーターを決定することができる。
【０１２２】
「保存的置換」または「保存的アミノ酸置換」は、１つまたは複数の化学的または機能的に類似したアミノ酸との１つまたは複数のアミノ酸の置換を指す。類似したアミノ酸を示す保存的置換表は当技術分野で周知である。そのような置換を有するポリペプチド配列は、「保存的に改変された変異体」として知られている。そのような保存的に改変された変異体は、多形変異体、種間相同体及びアレルに追加されるものであり、これらを除外するものではない。例として、表２〜４に示されるアミノ酸の群は、互いに保存的置換であるとみなされる。
【０１２３】
（表２）ある種の実施形態における、互いに保存的置換であるとみなされるアミノ酸の選択群。
2019509055.tif 000004
【０１２４】
（表３）ある種の実施形態における、互いに保存的置換であるとみなされるアミノ酸のさらなる選択群。
2019509055.tif 000005
【０１２５】
（表４）ある種の実施形態における、互いに保存的置換であるとみなされるアミノ酸のさらなる選択群。
2019509055.tif 000006
【０１２６】
さらなる保存的置換は、例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ２ｎｄ  ｅｄ．（１９９３）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹに見出すことができる。親ＡＢＭ中のアミノ酸残基の１つまたは複数の保存的置換を行うことによって作製されるＡＢＭは、「保存的に改変された変異体」といわれる。
【０１２７】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在する２０種の通常のアミノ酸を指す。天然に存在するアミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、「アミノ酸」という用語は、非天然アミノ酸も含む。任意の適切な非天然アミノ酸を使用することができる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、ＭＩＡＣへの剤のコンジュゲーションについての反応性部分を含む。
【０１２８】
ある種の実施形態では、任意の疾患または障害を「治療すること」または任意の疾患または障害の「治療」は、対象に存在する疾患または障害を好転させることを指す。別の実施形態では、「治療すること」または「治療」は、対象が識別することができない可能性がある少なくとも１つの身体的なパラメーターを好転させることを含む。さらに別の実施形態では、「治療すること」または「治療」は、身体的に（例えば、識別可能な症状の安定化）または生理的に（例えば、身体的なパラメーターの安定化）または両方で疾患または障害を調節することを含む。さらに別の実施形態では、「治療すること」または「治療」は、疾患または障害の発症を遅延させるまたは予防することを含む。
【０１２９】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」または「有効量」という用語は、対象に投与される場合に、疾患または障害を治療するのに有効なＭＩＡＣの量を指す。
【０１３０】
本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、哺乳類対象を意味する。例示的対象としては、限定されないが、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ラクダ、ヤギ及びヒツジが挙げられる。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、本明細書で提供されるＭＩＡＣで治療することができる疾患または状態を有するか、有することが疑われる。いくつかの態様では、疾患または状態は癌である。いくつかの実施形態では、対象は本明細書で提供されるＭＩＡＣで治療することができる癌を有するヒトである。いくつかの実施形態では、対象は本明細書で提供されるＭＩＡＣで治療することができる癌を有することが疑われるヒトである。
【０１３１】
２．多特異性免疫調節抗原結合構築物（ＭＩＡＣ）
２．１．癌細胞を標的にし、同時に同じエフェクター細胞の活性化受容体及び阻害性受容体を調節する、多特異性免疫調節抗原結合構築物（ＭＩＡＣ）
ＭＩＡＣのコンセプトの一態様を図１に図示する。これは、３つのＡＢＭを含む、３つのＡＢＭから本質的に成る、または３つのＡＢＭから成るＭＩＡＣを示す。ＡＢＭ１は癌細胞特異的抗原結合部位を含む。ＡＢＭ２はエフェクター細胞によって発現される活性化受容体に対してアゴニスト活性を有する結合部位を含む。ＡＢＭ３はエフェクター細胞によって発現される阻害性受容体に対してアンタゴニスト活性を有する結合部位を含む。
【０１３２】
図１に提供する例示的実施形態は、ＭＩＡＣが癌細胞を標的にし、同時に同じエフェクター細胞の活性化受容体及び阻害性受容体を調節する、ＭＩＡＣのコンセプトを提供する。本開示の他の個所でより詳細に記載されているようにＡＢＭを形成する分子のタイプを選択することによって、またはＭＩＡＣに含まれる各ＡＢＭの数を変えることによって、ＭＩＡＣの各成分に対する結合部位の数を変えることができる。例えば、ＡＢＭとして単一のＩｇＧを選択することは、標的抗原に対する２つの結合部位をもたらす。その一方で、ＡＢＭとして単一のｓｃＦｖを選択することは標的抗原に対する単一の結合部位をもたらす。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣは、以下を含む、以下から本質的に成る、または以下から成る：（ａ）癌細胞によって発現される抗原に特異的に結合する抗原結合モジュール１（ＡＢＭ１）；（ｂ）エフェクター細胞によって発現される活性化受容体に特異的に結合する抗原結合モジュール２（ＡＢＭ２）；及び（ｃ）エフェクター細胞によって発現される阻害性受容体に特異的に結合する抗原結合モジュール３（ＡＢＭ３）。
【０１３４】
エフェクター細胞の活性化受容体へのＡＢＭ２の結合は活性化受容体を刺激し、それによって、活性化受容体を介する活性化シグナルの伝達を促進することによって、エフェクター細胞の活性化を促進する。いくつかの実施形態では、活性化受容体を介する活性化シグナルの伝達は、増殖、癌細胞に対する細胞傷害活性、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２及びインターフェロンガンマ）の分泌、ＬＡＭＰ−１のアップレギュレーション、ＣＤ１６のダウンレギュレーション、ＣＤ６９のアップレギュレーション及びＫＬＲＧ１のアップレギュレーションから選択されるエフェクター細胞からの応答を誘導する。
【０１３５】
エフェクター細胞の阻害性受容体へのＡＢＭ３の結合は阻害性受容体に拮抗し、それによって、阻害性受容体を介する阻害性シグナリングの伝達を遮断することによって、エフェクター細胞の活性化を促進する。いくつかの実施形態では、阻害性受容体を介する阻害性シグナリングの伝達を遮断することは、増殖、癌細胞に対する細胞傷害活性、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２及びインターフェロンガンマ）の分泌、ＬＡＭＰ−１のアップレギュレーション、ＣＤ１６のダウンレギュレーション、ＣＤ６９のアップレギュレーション及びＫＬＲＧ１のアップレギュレーションから選択されるエフェクター細胞からの応答を誘導する。
【０１３６】
２．２．癌細胞を標的にし、エフェクター細胞によって発現される活性化受容体を刺激する、多特異性免疫調節抗原結合構築物（ＭＩＡＣ）
ＭＩＡＣのコンセプトの別の態様を図９に図示する。これは、２つのＡＢＭを含む、２つのＡＢＭから本質的に成る、または２つのＡＢＭから成るＭＩＡＣを示す。ＡＢＭ１は癌細胞特異的抗原結合部位を含む。ＡＢＭ２はエフェクター細胞によって発現される活性化受容体に対してアゴニスト活性を有する結合部位を含む。
【０１３７】
図９に提供する例示的実施形態は、ＭＩＡＣが癌細胞を標的にし、エフェクター細胞の活性化受容体を調節する、ＭＩＡＣのコンセプトを提供する。本開示の他の個所でより詳細に記載されているように、ＡＢＭを形成する分子のタイプを選択することによって、またはＭＩＡＣに含まれる各ＡＢＭの数を変えることによって、ＭＩＡＣの各成分に対する結合部位の数を変えることができる。例えば、ＡＢＭとして単一のＩｇＧを選択することは、標的抗原に対する２つの結合部位をもたらす。その一方で、ＡＢＭとして単一のｓｃＦｖを選択することは標的抗原に対する単一の結合部位をもたらす。
【０１３８】
いくつかの態様では、本明細書で提供されるＭＩＡＣは、以下を含む、以下から本質的に成る、または以下から成る：（ａ）癌細胞によって発現される抗原に特異的に結合する抗原結合モジュール１（ＡＢＭ１）；及び（ｂ）エフェクター細胞によって発現される活性化受容体に特異的に結合する抗原結合モジュール２（ＡＢＭ２）。本態様では、ＭＩＡＣはＡＢＭ３を含まない。
【０１３９】
エフェクター細胞の活性化受容体へのＡＢＭ２の結合は活性化受容体を刺激し、それによって、活性化受容体を介する活性化シグナルの伝達を促進することによって、エフェクター細胞の活性化を促進する。いくつかの実施形態では、活性化受容体を介する活性化シグナルの伝達は、増殖、癌細胞に対する細胞傷害活性、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２及びインターフェロンガンマ）の分泌、ＬＡＭＰ−１のアップレギュレーション、ＣＤ１６のダウンレギュレーション、ＣＤ６９のアップレギュレーション及びＫＬＲＧ１のアップレギュレーションから選択されるエフェクター細胞からの応答を誘導する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣが、ＡＢＭ１及びＡＢＭ２を含むがＡＢＭ３を含まない場合は、ＡＢＭ２は、特に、エフェクター細胞の活性化に関与するある種の標準的な受容体に結合しない。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２はＣＤ３と結合せず、且つＣＤ２８と結合しない。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２はＣＤ３と結合しない。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２はＣＤ２８と結合しない。
【０１４１】
２．３．癌細胞を標的にし、エフェクター細胞によって発現される阻害性受容体に拮抗する、多特異性免疫調節抗原結合構築物（ＭＩＡＣ）
ＭＩＡＣのコンセプトの別の態様を図１０に図示する。これは、２つのＡＢＭを含む、２つのＡＢＭから本質的に成る、または２つのＡＢＭから成るＭＩＡＣを示す。ＡＢＭ１は癌細胞特異的抗原結合部位を含む。ＡＢＭ３はエフェクター細胞によって発現される阻害性受容体に対してアンタゴニスト活性を有する結合部位を含む。
【０１４２】
図１０に提供する例示的実施形態は、ＭＩＡＣが癌細胞を標的にし、エフェクター細胞の阻害性受容体を調節する、ＭＩＡＣのコンセプトを提供する。本開示の他の個所でより詳細に記載されているように、ＡＢＭを形成する分子のタイプを選択することによって、またはＭＩＡＣに含まれる各ＡＢＭの数を変えることによって、ＭＩＡＣの各成分に対する結合部位の数を変えることができる。例えば、ＡＢＭとして単一のＩｇＧを選択することは、標的抗原に対する２つの結合部位をもたらす。その一方で、ＡＢＭとして単一のｓｃＦｖを選択することは、標的抗原に対する単一の結合部位をもたらす。
【０１４３】
いくつかの態様では、本明細書で提供されるＭＩＡＣは、以下を含む、以下から本質的に成る、または以下から成る：（ａ）癌細胞によって発現される抗原に特異的に結合する抗原結合モジュール１（ＡＢＭ１）；及び（ｂ）エフェクター細胞によって発現される阻害性受容体に特異的に結合する抗原結合モジュール３（ＡＢＭ３）。本態様では、ＭＩＡＣはＡＢＭ２を含まない。
【０１４４】
エフェクター細胞の阻害性受容体へのＡＢＭ３の結合は阻害性受容体に拮抗し、それによって、阻害性受容体を介する阻害性シグナリングの伝達を遮断することによって、エフェクター細胞の活性化を促進する。いくつかの実施形態では、阻害性受容体を介する阻害性シグナリングの伝達を遮断することは、増殖、癌細胞に対する細胞傷害活性、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２及びインターフェロンガンマ）の分泌、ＬＡＭＰ−１のアップレギュレーション、ＣＤ１６のダウンレギュレーション、ＣＤ６９のアップレギュレーション及びＫＬＲＧ１のアップレギュレーションから選択されるエフェクター細胞からの応答を誘導する。
【０１４５】
２．４．多特異性免疫調節抗原結合構築物（ＭＩＡＣ）は、Ｆｃなどの１つまたは複数の足場を含むことができる。
ＭＩＡＣは、Ｆｃなどの足場を含むことができる。そのような足場は、各ＡＢＭを互いに作動可能に連結するのに使用することができる。ある種の態様では、１つまたは複数のＡＢＭが、Ｆｃなどの足場を含むことができる。
【０１４６】
「Ｆｃ」または「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書で、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するのに使用される。この用語は、天然配列のＦｃ領域及び変異型Ｆｃ領域を含む。別段の指定がない限り、本明細書では、Ｆｃ領域または定常領域のアミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されているように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ付番システムに従う。本明細書で使用する場合、二量体Ｆｃの「Ｆｃポリペプチド」は、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定な自己会合が可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、二量体ＩｇＧ  ＦｃのＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ  ＣＨ２及びＩｇＧ  ＣＨ３定常ドメイン配列を含む。
【０１４７】
Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ３ドメイン及びＣＨ２ドメインのいずれかを含む。ＣＨ３ドメインは２つのＣＨ３配列を含み、二量体Ｆｃの２つのＦｃポリペプチドのそれぞれからのものである。ＣＨ２ドメインは２つのＣＨ２配列を含み、二量体Ｆｃ２つのＦｃポリペプチドのそれぞれからのものである。
【０１４８】
いくつかの態様では、Ｆｃは、少なくとも１つのまたは２つのＣＨ３配列を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、１つまたは複数のリンカーを伴ってまたは伴わずに、第１の抗原結合モジュール及び／または第２の抗原結合モジュールに結合している。いくつかの態様では、ＦｃはヒトＦｃである。いくつかの態様では、ＦｃはヒトＩｇＧまたはＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの態様では、Ｆｃはヘテロ二量体Ｆｃである。いくつかの態様では、Ｆｃは、少なくとも１つのまたは２つのＣＨ２配列を含む。
【０１４９】
いくつかの態様では、Ｆｃは、ＣＨ３配列の少なくとも１つに１つまたは複数の改変を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、ＣＨ２配列の少なくとも１つに１つまたは複数の改変を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは単一のポリペプチドである。いくつかの態様では、Ｆｃは複数のペプチド、例えば、２つのポリペプチドである。例えばＣＨ２ドメイン及び／またはＣＨ３ドメイン中に１つまたは複数の改変を含むように、Ｆｃを改変することができる。そのような改変は、Ｆｃの機能及び結合特性、例えばＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に影響を与え得る。ＦｃＲへの結合を遮断するようにＦｃを改変することができ、例えば、ＦｃＲ結合を遮断するための変異、例えばアミノ酸Ｎ２９７での変異を含むようにＦｃを改変することができる。Ｎ結合型グリコシル化を防止する及び／またはＡＤＣＣを低減するようにＦｃを改変することができる。以下の実施例セクションに例を示す。
【０１５０】
３．抗原結合モジュール（ＡＢＭ）
ＭＩＡＣのＡＢＭは、任意の適切な抗原結合分子を含むことができる。いくつかの実施形態では、ＡＢＭは、免疫グロブリン、抗体、抗体フラグメント及び／または代替足場から選択される分子を含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は抗体またはその抗原結合性フラグメントである。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭまたはこれらのフラグメントから選択される免疫グロブリン分子を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント及び単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１はＤＶＤ−Ｉｇ（商標）である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は重鎖抗体である。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）、ｉＭａｂ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）、ＥＥＴＩ−ＩＩ／ＡＧＲＰ、クニッツドメイン、チオレドキシンペプチドアプタマー、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アフィリン、テトラネクチン及びアビマーから選択される分子を含む代替足場を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は抗体である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭまたはこれらのフラグメントから選択される免疫グロブリン分子を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント及び単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２はＤＶＤ−Ｉｇ（商標）である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は重鎖抗体である。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）、ｉＭａｂ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）、ＥＥＴＩ−ＩＩ／ＡＧＲＰ、クニッツドメイン、チオレドキシンペプチドアプタマー、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アフィリン、テトラネクチン及びアビマーから選択される分子を含む代替足場を含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は抗体である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭまたはこれらのフラグメントから選択される免疫グロブリン分子を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント及び単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３はＤＶＤ−Ｉｇ（商標）である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は重鎖抗体である。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）、ｉＭａｂ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）、ＥＥＴＩ−ＩＩ／ＡＧＲＰ、クニッツドメイン、チオレドキシンペプチドアプタマー、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アフィリン、テトラネクチン及びアビマーから選択される分子を含む代替足場を含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ４は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭまたはこれらのフラグメントから選択される免疫グロブリン分子を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ４は、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ｓｃＦｖフラグメント、ｓｃＦｖ−Ｆｃフラグメント及び単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ４はＤＶＤ−Ｉｇ（商標）である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ４は重鎖抗体である。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ４は、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）、ｉＭａｂ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）、ＥＥＴＩ−ＩＩ／ＡＧＲＰ、クニッツドメイン、チオレドキシンペプチドアプタマー、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、アフィリン、テトラネクチン及びアビマーから選択される分子を含む代替足場を含む。
【０１５９】
本明細書で提供されるＡＢＭの組成物は例示であり、ＡＢＭとして機能することができる任意の適切な分子を本明細書で提供されるＭＩＡＣで使用することができる。ＡＢＭとして機能することができる分子としては、本明細書に記載のＡＢＭの結合特性及び機能的特性を有する、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、アプタマー（ペプチド及びオリゴヌクレオチド）などが挙げられる。
【０１６０】
３．１．結合価及び免疫グロブリン可変ドメイン
本明細書で提供されるＡＢＭを、抗原に対するその結合価の点から特徴づけることができる。ＡＢＭは任意の適切な結合価を有し得る。いくつかの実施形態では、ＡＢＭは、一価でも、二価でも、三価でも、四価でも、四価を超えてもよい。ＡＢＭを形成する分子の選択を介して結合価を制御することができることを当業者は認識するであろう。例えば、ｓｃＦｖ  ＡＢＭは一般に一価であるであろうし、ＩｇＧ  ＡＢＭは一般に二価であるであろう。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は一価である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は二価である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は三価である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は四価である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は四価より大きい結合価を有する。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は一価である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は二価である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は三価である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は四価である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は四価より大きい結合価を有する。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は一価である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は二価である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は三価である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は四価である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は四価より大きい結合価を有する。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ４は一価である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ４は二価である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ４は三価である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ４は四価である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ４は四価より大きい結合価を有する。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、すべてのＡＢＭは一価である。例えば、いくつかの態様では、ＡＢＭ１は一価であり、ＡＢＭ２は一価であり、ＡＢＭ３は一価である。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＡＢＭは二価である。例えば、いくつかの態様では、ＡＢＭ１は二価であり、ＡＢＭ２は二価であり、ＡＢＭ３は二価である。いくつかの態様では、ＡＢＭ１は二価であり、ＡＢＭ２は一価であり、ＡＢＭ３は一価である。いくつかの態様では、ＡＢＭ１は一価であり、ＡＢＭ２は二価であり、ＡＢＭ３は一価である。いくつかの態様では、ＡＢＭ１は一価であり、ＡＢＭ２は一価であり、ＡＢＭ３は二価である。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、特定の数の免疫グロブリン可変ドメインの存在によって、結合価を特徴づけることができる。いくつかの実施形態では、可変ドメインはＶＨドメイン及びＶＬドメインから選択される。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は１つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は２つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は３つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は４つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は４つより多い免疫グロブリン可変ドメインを含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は１つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は２つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は３つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は４つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は４つより多い免疫グロブリン可変ドメインを含む。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は１つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は２つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は３つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は４つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は４つより多い免疫グロブリン可変ドメインを含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、各ＡＢＭは２つの免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、２つのＶＨドメイン及びＶＬドメイン；２つのＶＨドメイン；または２つのＶＬドメイン）を含む。例えば、いくつかの態様では、ＡＢＭ１は２つの免疫グロブリン可変ドメインを含み、ＡＢＭ２は２つの免疫グロブリン可変ドメインを含み、ＡＢＭ３は２つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＡＢＭは４つの免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、２つのＶＨドメイン及び２つのＶＬドメイン）を含む。例えば、いくつかの態様では、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３はそれぞれ４つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。いくつかの態様では、ＡＢＭ１は４つの免疫グロブリン可変ドメインを含み、ＡＢＭ２は２つの免疫グロブリン可変ドメインを含み、ＡＢＭ３は２つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。いくつかの態様では、ＡＢＭ１は２つの免疫グロブリン可変ドメインを含み、ＡＢＭ２は４つの免疫グロブリン可変ドメインを含み、ＡＢＭ３は２つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。いくつかの態様では、ＡＢＭ１は２つの免疫グロブリン可変ドメインを含み、ＡＢＭ２は２つの免疫グロブリン可変ドメインを含み、ＡＢＭ３は４つの免疫グロブリン可変ドメインを含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、結合価は、あるＡＢＭの結合部位と別のＡＢＭの結合部位の数の比として表すことができる。この比を変えることは、例えばエフェクター細胞の活性化度の調整において、有利であり得る。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３の結合部位は２：１：１の比で存在する。図２Ａ〜２Ｄは、この比で存在する結合部位を有するＭＩＡＣの例を示す。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３の結合部位は２：１：２の比で存在する。図３Ａ〜３Ｂは、この比で存在する結合部位を有するＭＩＡＣの例を示す。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３の結合部位は２：２：１の比で存在する。図３Ｃ〜３Ｄは、この比で存在する結合部位を有するＭＩＡＣの例を示す。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３の結合部位は２：２：２の比で存在する。図４Ａ〜４Ｂは、この比で存在する結合部位を有するＭＩＡＣの例を示す。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３の結合部位は２：２：０の比で存在する。図１１Ａ〜Ｂ及び１２Ａは、この比で存在する結合部位を有するＭＩＡＣの例を示す。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３の結合部位は２：０：２の比で存在する。図１１Ｃ〜Ｄ及び１２Ｂは、この比で存在する結合部位を有するＭＩＡＣの例を示す。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３の結合部位は２：３：０の比で存在する。図１３Ａ〜Ｂは、この比で存在する結合部位を有するＭＩＡＣの例を示す。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３の結合部位は２：０：３の比で存在する。図１３Ｃ〜Ｄは、この比で存在する結合部位を有するＭＩＡＣの例を示す。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３の結合部位は２：４：０の比で存在する。図１４Ａは、この比で存在する結合部位を有するＭＩＡＣの例を示す。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３の結合部位は２：０：４の比で存在する。図１４Ｂは、この比で存在する結合部位を有するＭＩＡＣの例を示す。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３の結合部位は１：３：０の比で存在する。図１５Ａは、この比で存在する結合部位を有するＭＩＡＣの例を示す。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３の結合部位は１：０：３の比で存在する。図１５Ｂは、この比で存在する結合部位を有するＭＩＡＣの例を示す。
【０１８６】
ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３の結合部位に対する他の適切な比としては、１：１：１（例えば、図６）、１：２：１（例えば、図５Ａ）、１：１：２（例えば、図５Ｂ）、２：１：２、２：２：１などが挙げられる。異なるモジュールが寄与する結合部位の比は限定的でないこと、及びＭＩＡＣの意図された生物活性に基づいて適切な比を選択することができることを当業者は容易に認識するであろう。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、１〜１０：０〜１０：０〜１０の比でそれぞれ存在するＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３の結合部位を有するＭＩＡＣが、本明細書で提供される。特に、１〜５：０〜５：０〜５の比でそれぞれ存在するＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３の結合部位を有するＭＩＡＣが、本明細書で提供される。例えば、いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３は、１：０：１、１：０：２、１：０：３、１：０：４、１：０：５、１：１：０、１：１：１、１：１：２、１：１：３、１：１：４、１：１：５、１：２：０、１：２：１、１：２：２、１：２：３、１：２：４、１：２：５、１：３：０、１：３：１、１：３：２、１：３：３、１：３：４、１：３：５、１：４：０、１：４：１、１：４：２、１：４：３、１：４：４、１：４：５、１：５：０、１：５：１、１：５：２、１：５：３、１：５：４、１：５：５、２：０：１、２：０：２、２：０：３、２：０：４、２：０：５、２：１：０、２：１：１、２：１：２、２：１：３、２：１：４、２：１：５、２：２：０、２：２：１、２：２：２、２：２：３、２：２：４、２：２：５、２：３：０、２：３：１、２：３：２、２：３：３、２：３：４、２：３：５、２：４：０、２：４：１、２：４：２、２：４：３、２：４：４、２：４：５、２：５：０、２：５：１、２：５：２、２：５：３、２：５：４、２：５：５、３：０：１、３：０：２、３：０：３、３：０：４、３：０：５、３：１：０、３：１：１、３：１：２、３：１：３、３：１：４、３：１：５、３：２：０、３：２：１、３：２：２、３：２：３、３：２：４、３：２：５、３：３：０、３：３：１、３：３：２、３：３：３、３：３：４、３：３：５、３：４：０、３：４：１、３：４：２、３：４：３、３：４：４、３：４：５、３：５：０、３：５：１、３：５：２、３：５：３、３：５：４、３：５：５、４：０：１、４：０：２、４：０：３、４：０：４、４：０：５、４：１：０、４：１：１、４：１：２、４：１：３、４：１：４、４：１：５、４：２：０、４：２：１、４：２：２、４：２：３、４：２：４、４：２：５、４：３：０、４：３：１、４：３：２、４：３：３、４：３：４、４：３：５、４：４：０、４：４：１、４：４：２、４：４：３、４：４：４、４：４：５、４：５：０、４：５：１、４：５：２、４：５：３、４：５：４、４：５：５、４：０：１、５：０：２、５：０：３、５：０：４、５：０：５、５：１：０、５：１：１、５：１：２、５：１：３、５：１：４、５：１：５、５：２：０、５：２：１、５：２：２、５：２：３、５：２：４、５：２：５、５：３：０、５：３：１、５：３：２、５：３：３、５：３：４、５：３：５、５：４：０、５：４：１、５：４：２、５：４：３、５：４：４、５：４：５、５：５：０、５：５：１、５：５：２、５：５：３、５：５：４または５：５：５の比で存在する。
【０１８８】
同様に、ＭＩＡＣの標的（ＡＢＭ１）、刺激性（ＡＢＭ２）及びアンタゴニスト（ＡＢＭ３）効果に合うようにするために、各モジュールの親和性を調整することもできる。
【０１８９】
特に、ＡＢＭ２とＡＢＭ３の間の親和性の比は、エフェクター細胞の活性化度に影響を及ぼす。適切なＡＢＭ２：ＡＢＭ３の親和性の比は、例えば、１：１００〜１００：１の範囲に及び得る。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２：ＡＢＭ３の親和性の比は、約１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１または１００：１である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２：ＡＢＭ３の親和性の比は、少なくとも１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１または１００：１である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２：ＡＢＭ３の親和性の比は、最大で１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１または１００：１である。
【０１９０】
本明細書で提供されるＭＩＡＣは、任意の適切な数の、本明細書で提供されるＡＢＭのいずれをも含むことができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＡＢＭ１を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＡＢＭ２を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＡＢＭ３を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣは、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＡＢＭ４を含む。
【０１９１】
本明細書で提供されるＭＩＡＣは、ＡＢＭごとに任意の適切な数の結合部位を有するＡＢＭを含むこともできる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣで使用されるＡＢＭ１は、癌細胞抗原に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の結合部位を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣで使用されるＡＢＭ２は、エフェクター細胞の活性化受容体に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の結合部位を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣで使用されるＡＢＭ３は、エフェクター細胞の阻害性受容体に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の結合部位を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣで使用されるＡＢＭ４は、エフェクター細胞のＦｃ受容体に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の結合部位を含む。
【０１９２】
さらに、本明細書で提供されるＭＩＡＣは、異なる癌細胞抗原、異なる活性化受容体及び／または異なる阻害性受容体を標的にするＡＢＭを含むこともできる。
【０１９３】
例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣは、１種より多い癌細胞抗原を標的にするＡＢＭ１を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の異なる癌細胞抗原を標的にする。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣは、１つより多いＡＢＭ１を含み、各ＡＢＭ１は異なる癌細胞抗原を標的にする。いくつかの実施形態では、異なるＡＢＭ１が、全体として２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の異なる癌細胞抗原を標的にする。いくつかの実施形態では、いくつかのＡＢＭ１は同じ癌細胞抗原（複数可）を標的にし、いくつかのＡＢＭ１は異なる癌細胞抗原を標的にするが、ＡＢＭ１は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の異なる癌細胞抗原を全体として標的にする。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣは、１種より多い活性化受容体を標的にするＡＢＭ２を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の異なる活性化受容体を標的にする。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣは、１つより多いＡＢＭ２を含み、各ＡＢＭ２は異なる活性化受容体を標的にする。いくつかの実施形態では、異なるＡＢＭ２は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の異なる活性化受容体を全体として標的にする。いくつかの実施形態では、いくつかのＡＢＭ２は同じ活性化受容体（複数可）を標的にし、いくつかのＡＢＭ２は異なる活性化受容体を標的にするが、ＡＢＭ２は２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の異なる活性化受容体を全体として標的にする。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣは、１種より多い阻害性受容体を標的にするＡＢＭ３を含む。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の異なる阻害性受容体を標的にする。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣは、１つより多いＡＢＭ３を含み、各ＡＢＭ３は異なる阻害性受容体を標的にする。いくつかの実施形態では、異なるＡＢＭ３は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の異なる阻害性受容体を全体として標的にする。いくつかの実施形態では、いくつかのＡＢＭ３は同じ阻害性受容体（複数可）を標的にし、いくつかのＡＢＭ３は異なる阻害性受容体を標的にするが、ＡＢＭ３は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種またはそれ以上の異なる阻害性受容体を全体として標的にする。
【０１９９】
３．２．抗原結合モジュール１（ＡＢＭ１）：癌細胞抗原結合因子
本明細書で提供されるＭＩＡＣでは、ＡＢＭ１は癌細胞によって発現される抗原（「癌細胞抗原」）に特異的に結合する。ＡＢＭ１が結合する好ましい抗原としては、癌細胞によって発現されるが正常細胞によって発現されないもの、または正常細胞と比べると癌細胞でアップレギュレートされるものが挙げられる。抗原が細胞の表面で発現され、ここで抗原がＡＢＭ１に接触可能であることが好ましい。任意の適切な癌細胞抗原がＡＢＭ１によって標的にされ得、当業者は、ＡＢＭ１による結合に適切な抗原を選択することができるであろう。
【０２００】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１が結合する抗原は、対照細胞と比べて少なくともある程度の量、癌細胞でアップレギュレートされる。対照細胞は、同じ組織由来の細胞でもよい。同じ組織由来の細胞は、標的にされる癌細胞に発達することができる細胞のタイプの正常型でもよい。例えば、癌細胞がヒト結腸癌上皮細胞であるならば、対照細胞は、正常なヒト結腸上皮細胞でもよい。この例は例示目的で提供され、当業者は、癌細胞と比較するための適切な対照細胞を容易に選択することができる。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１が結合する抗原は、対照細胞と比べて少なくとも２倍アップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１が結合する抗原は、対照細胞と比べて少なくとも５倍アップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１が結合する抗原は、対照細胞と比べて少なくとも１０倍アップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１が結合する抗原は、対照細胞と比べて少なくとも１００倍アップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１が結合する抗原は対照細胞と比べて少なくとも１，０００倍アップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１が結合する抗原は、対照細胞と比べて少なくとも１０，０００倍アップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１が結合する抗原は、対照細胞と比べて少なくとも１００，０００倍アップレギュレートされる。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１が結合する抗原は、対照細胞と比べて少なくとも１，０００，０００倍アップレギュレートされる。
【０２０２】
ＡＢＭ１の役割は、悪性病変の部位、例えば癌細胞に対してＭＩＡＣを標的指向させることである。したがって、ＡＢＭ１がその抗原に結合した後に任意の特定の生物活性（すなわち、刺激または拮抗活性）を発揮することは必要とされない。しかし、ＡＢＭ１がその抗原への結合によって生物活性を発揮するＭＩＡＣも本開示の範囲内にある。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は受容体抗原を刺激する。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は受容体抗原に拮抗する。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は、刺激性作用または拮抗性作用なしで、（受容体抗原を含めた）抗原と結合する。
【０２０３】
ＡＢＭ１による結合についての例示的癌細胞抗原としては、例えば、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、βｈＣＧ、Ａ３３抗原、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカー、カルレティキュリン、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２（ＳＩＧＬＥＣ−２）、ＣＤ２５、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３（ＳＩＧＬＥＣ−３）、ＣＤ３８（サイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼ）、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ６３（ＬＡＭＰ−３）、ＣＤ６６ｅ（ＣＥＡＣＡＭ５）、ＣＤ７０、ＣＤ１２３（ＩＬ３ＲＡ）、ＣＤ１３８（シンデカン１）、ＣＤ２４８（エンドシアリン）癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、エフリンＡ２（ＥｐｈＡ２）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥｒｂＢ２、胎児アセチルコリン受容体、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ガングリオシドＧＤ３、グロボＨ、糖タンパク質１００（ｇｐ１００）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、インスリン様増殖因子受容体１、ルイス−Ｙ、ＬＧ、Ｌｙ−６、黒色腫特異的コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＣＰ）、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６、ミューラー管抑制物質（ＭＩＳ）ＩＩ型受容体、形質細胞抗原、ポリＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＳＡＳ、ＳＴＥＡＰ、ｓＴｎ抗原及びＴＮＦ−アルファ前駆体が挙げられる。ＡＢＭ１によって標的にされ得る癌抗原の例は、参照によりその全体が組み込まれる、米国特許第７，２３５，６４１号に提供される。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ１は多特異性抗原結合モジュールである。多特異性抗原結合モジュールは、当技術分野で既知のまたは本明細書に記載の任意の方法、例えば、ノブ及びホール（ｋｎｏｂｓ  ａｎｄ  ｈｏｌｅｓ）アプローチまたは異なる抗原に結合することが知られている単一ドメイン抗体を組みわせることによって調製することができる。いくつかの実施形態では、多特異性ＡＢＭ１は、２、３、４、５、６、７、８種またはそれ以上の異なる抗原と結合する。いくつかの実施形態では、異なる抗原のそれぞれは、ＡＢＭ１結合部位によって認識される異なる抗原である。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、１種類より多くのＡＢＭ結合部位を含むハイブリッド多特異性ＡＢＭを形成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ハイブリッド多特異性ＡＢＭは、ＡＢＭ１及びＡＢＭ２に対する結合部位を含む。そのようなハイブリッドＡＢＭの一例は、１つの結合部位がＡＢＭ１に対する結合部位を形成し、もう１つの結合部位がＡＢＭ２対する結合部位を形成する、二重特異性ＩｇＧである。ＡＢＭ１及び３；ＡＢＭ１及び４；ＡＢＭ１、２及び３；ＡＢＭ１、２及び４；ＡＢＭ１、３及び４；ならびにＡＢＭ１、２、３及び４に結合する多特異性ハイブリッドＡＢＭも本明細書で提供される。
【０２０６】
３．３．抗原結合モジュール２（ＡＢＭ２）：活性化受容体のアゴニスト
本明細書で提供されるＭＩＡＣでは、ＡＢＭ２はエフェクター細胞によって発現される活性化受容体に特異的に結合する。活性化受容体へのＡＢＭ２の結合が活性化受容体を刺激し、エフェクター細胞への活性化シグナルの伝達をもたらす。例えば、活性化受容体に対するＡＢＭ２の親和性、ＡＢＭ２の結合価またはＡＢＭ２の数を変え、それによって、活性化シグナルの強度を変えることによって、エフェクター細胞の活性を調整することができる。
【０２０７】
ＡＢＭ２に標的とされる活性化受容体は、例えば癌細胞に動員したいエフェクター細胞のタイプに基づいて、選択される。例えば、例示的一実施形態では、刺激活性を有するＣＤ１３７結合分子をＡＢＭ２として利用することによって、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を動員及び活性化することができる。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、エフェクター細胞はＮＫ細胞である。ＡＢＭ２による刺激に対する適切な例示的ＮＫ細胞受容体としては、例えば、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、α４β１インテグリン、β２インテグリン（例えば、ＣＤ１１ａ−ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１８、ＣＤ１１ｃ−ＣＤ１８）、ＣＤ２（ＬＦＡ２、ＯＸ３４）、ＣＤ１６、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ３８、ＣＤ９６、ＣＤ１００、ＣＤ１６０、ＣＤ１３７、ＣＥＡＣＡＭ１（ＣＤ６６）、ＣＲＴＡＭ、ＣＳ１（ＣＤ３１９）、ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、活性化型のＫＩＲ（例えば、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ−Ｓ）、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、天然の細胞傷害受容体（例えば、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ８０）、ＮＴＢ−Ａ及びＰＥＮ−５が挙げられる。ＡＢＭ２による刺激に対する適切なＮＫ細胞受容体についてのさらに多くの情報が、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１３、２０１３（１）：２４７−２５３；Ｍｅｎｔｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３，４：４８１（１−１２）；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０１２，１：８８−１２３；Ｐｅｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，８９：２１６−２２４；及びＶｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００８，９：５０３−５１０（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に提供される。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、エフェクター細胞はＴリンパ球である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球は細胞傷害性Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球はγδＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球はＮＫＴ細胞である。いくつかの実施形態では、ＮＫＴ細胞はｉＮＫＴ細胞である。ＡＢＭ２による刺激に対する適切な例示的Ｔリンパ球受容体としては、例えば、ＣＤ２（ＬＦＡ２、ＯＸ３４）、ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８４（ＳＬＡＭＦ５）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２２６、ＣＤ２２９（Ｌｙ９、ＳＬＡＭＦ３）、ＣＤ２４４（２Ｂ４、ＳＬＡＭＦ４）、ＣＤ３１９（ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥ）、ＣＤ３５２（Ｌｙ１０８、ＮＴＢＡ、ＳＬＡＭＦ６）、ＣＲＴＡＭ（ＣＤ３５５）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴβＲ（ＴＮＦＲＳＦ３）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０、ＳＬＡＭＦ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδγ及びＴＩＭ１（ＨＡＶＣＲ、ＫＩＭ１）が挙げられる。ＡＢＭ２による刺激に対する適切なＴ細胞受容体についてのさらに多くの情報が、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０１２，１：８８−１２３；Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｆｌｉｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３，１３：２２７−２４２；及びＰａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，１２：２５２−２６４（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に提供される。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は、特に、エフェクター細胞によって発現される活性化受容体に対する天然リガンドまたはその一部ではない。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は、エフェクター細胞によって発現される活性化受容体に対する天然リガンドまたはその一部である。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ２は多特異性抗原結合モジュールである。当技術分野で既知のまたは本明細書に記載の任意の方法、例えば、ノブ及びホールアプローチまたは異なる抗原に結合することが知られている単一ドメイン抗体を組みわせることによって、多特異性抗原結合モジュールを調製することができる。いくつかの実施形態では、多特異性ＡＢＭ２は、２、３、４、５、６、７、８種またはそれ以上の異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、異なる抗原のそれぞれは、ＡＢＭ２結合部位によって認識される異なる抗原である。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、１種類より多くのＡＢＭ結合部位を含むハイブリッド多特異性ＡＢＭを形成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ハイブリッド多特異性ＡＢＭは、ＡＢＭ２及びＡＢＭ１に対する結合部位を含む。そのようなハイブリッドＡＢＭの一例は、１つの結合部位がＡＢＭ２に対する結合部位を形成し、もう１つの結合部位がＡＢＭ１に対する結合部位を形成する、二重特異性ＩｇＧである。ＡＢＭ２及び３；ＡＢＭ２及び４；ＡＢＭ２、１及び３；ＡＢＭ２、１及び４；ＡＢＭ２、３及び４；ならびにＡＢＭ２、１、３及び４に結合する多特異性ハイブリッドＡＢＭも本明細書で提供される。
【０２１３】
３．４．抗原結合モジュール３（ＡＢＭ３）：阻害性受容体のアンタゴニスト
本明細書で提供されるＭＩＡＣでは、ＡＢＭ３は、エフェクター細胞によって発現される阻害性受容体に特異的に結合する。阻害性受容体へのＡＢＭ３の結合が阻害性受容体に拮抗し、エフェクター細胞に伝達される阻害性シグナルの遮断をもたらす。例えば、阻害性受容体に対するＡＢＭ３の親和性、ＡＢＭ３の結合価またはＡＢＭ３の数を変えて、それによって、阻害性シグナルの拮抗の程度を変えることによって、エフェクター細胞の活性をさらに調整することができる。
【０２１４】
ＡＢＭ３によって標的とされる阻害性受容体は、例えば癌細胞に動員したいエフェクター細胞のタイプに基づいて、選択される。例えば、エフェクター細胞がＮＫ細胞である場合の例示的実施形態では、ＡＢＭ３は、拮抗活性を有するＫＩＲ２ＤＬ１結合分子でもよい。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、エフェクター細胞はＮＫ細胞である。ＡＢＭ３による拮抗に対する適切な例示的ＮＫ細胞受容体としては、例えば、ＩＬＴ２／ＬＩＲ−１／ＣＤ８５ｊ、阻害型のＫＩＲ（例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ−Ｌ）、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ−１、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＲ−Ｐ１Ａ、Ｓｉｇｌｅｃ−３、Ｓｉｇｌｅｃ−７及びＳｉｇｌｅｃ−９が挙げられる。ＡＢＭ３によるアンタゴニズムに対するＮＫ細胞受容体についてのさらに多くの情報は、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１３、２０１３（１）：２４７−２５３；Ｍｅｎｔｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３，４：４８１（１−１２）；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０１２，１：８８−１２３；Ｐｅｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，８９：２１６−２２４；及びＶｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００８，９：５０３−５１０（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に提供される。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、エフェクター細胞はＴリンパ球である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球は細胞傷害性Ｔリンパ球である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球はγδＴ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球はＮＫＴ細胞である。いくつかの実施形態では、ＮＫＴ細胞はｉＮＫＴ細胞である。ＡＢＭ３による拮抗に適する例示的Ｔリンパ球受容体としては、例えば、２Ｂ４（ＣＤ２４４、ＳＬＡＭＦ４）、Ｂ７１（ＣＤ８０）、Ｂ７Ｈ１（ＣＤ２７４、ＰＤ−Ｌ１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５、ＮＫ２８）、ＣＤ３５２（Ｌｙ１０８、ＮＴＢＡ、ＳＬＡＭＦ６）、ＣＤ３５８（ＤＲ６）、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ＬＡＧ３、ＬＡＩＲ１、ＰＤ−１（ＣＤ２７９）、ＰＤ−１Ｈ（ＶＩＳＴＡ）、ＴＩＧＩＴ（ＶＳＩＧ９、ＶＳＴＭ３）、ＴＩＭ２（ＴＩＭＤ２）及びＴＩＭ３（ＨＡＶＣＲ２、ＫＩＭ３）が挙げられる。ＡＢＭ３によるアンタゴニズムに対するＴ細胞受容体についてのさらに多くの情報は、Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０１２，１：８８−１２３；Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｆｌｉｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３，１３：２２７−２４２；及びＰａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，１２：２５２−２６４（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に提供される。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は、特に、エフェクター細胞によって発現される阻害性受容体に対する天然リガンドまたはその一部ではない。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は、エフェクター細胞によって発現される阻害性受容体に対する天然リガンドまたはその一部である。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ３は多特異性抗原結合モジュールである。当技術分野で既知のまたは本明細書に記載の任意の方法、例えば、ノブ及びホールアプローチまたは異なる抗原に結合することが知られている単一ドメイン抗体を組みわせることによって、多特異性抗原結合モジュールを調製することができる。いくつかの実施形態では、多特異性ＡＢＭ３は、２、３、４、５、６、７、８種またはそれ以上の異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、異なる抗原のそれぞれは、ＡＢＭ３の結合部位によって認識される異なる抗原である。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、１種類より多くのＡＢＭ結合部位を含むハイブリッド多特異性ＡＢＭを形成することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ハイブリッド多特異性ＡＢＭは、ＡＢＭ３及びＡＢＭ１に対する結合部位を含む。そのようなハイブリッドＡＢＭの一例は、１つの結合部位がＡＢＭ３に対する結合部位を形成し、もう１つの結合部位がＡＢＭ１に対する結合部位を形成する、二重特異性ＩｇＧである。ＡＢＭ３及び２；ＡＢＭ３及び４；ＡＢＭ３、１及び２；ＡＢＭ３、１及び４；ＡＢＭ３、２及び４；ならびにＡＢＭ３、１、２及び４に結合する多特異性ハイブリッドＡＢＭも本明細書で提供される。
【０２２０】
３．５．ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３の組み合わせの実例
任意の適切なＡＢＭ１、ＡＢＭ２及び／またはＡＢＭ３を組み合わせて、本明細書のＭＩＡＣを作製することができる。以下の組み合わせは、単に例示目的で提供され、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３のいかなる特定の組み合わせにも本発明を限定することを意図するものではない。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣはＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３を含み、ここで、ＡＢＭ１はＣＤ３０と結合し、ＡＢＭ２はＣＤ１３７を刺激し、ＡＢＭ３はＰＤ−１に拮抗する。いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣはＡＢＭ１及びＡＢＭ２を含み、ここで、ＡＢＭ１はＣＤ３０と結合し、ＡＢＭ２はＣＤ１３７を刺激する。いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣはＡＢＭ１及びＡＢＭ３を含み、ＡＢＭ１はＣＤ３０と結合し、ＡＢＭ３はＰＤ−１に拮抗する。いくつかの実施形態では、本段落に記載されている構築物のうちのいずれも、ＣＤ６４と結合するＡＢＭ４を含む。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣはＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３を含み、ここで、ＡＢＭ１はＣＤ３０と結合し、ＡＢＭ２はＮＫＧ２Ｄを刺激し、ＡＢＭ３は阻害型のＫＩＲに拮抗する。いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣはＡＢＭ１及びＡＢＭ２を含み、ここで、ＡＢＭ１とＣＤ３０に結合し、ＡＢＭ２はＮＫＧ２Ｄを刺激する。いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣはＡＢＭ１及びＡＢＭ３を含み、ＡＢＭ１はＣＤ３０と結合し、ＡＢＭ３は阻害型のＫＩＲに拮抗する。いくつかの実施形態では、本段落に記載されている構築物のうちのいずれも、ＣＤ６４に結合するＡＢＭ４を含む。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣはＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３を含み、ここで、ＡＢＭ１はＣＤ３０と結合し、ＡＢＭ２はＣＤ１３７を刺激し、ＡＢＭ３は阻害型のＫＩＲに拮抗する。いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣはＡＢＭ１及びＡＢＭ２を含み、ここで、ＡＢＭ１はＣＤ３０と結合し、ＡＢＭ２はＣＤ１３７を刺激する。いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣはＡＢＭ１及びＡＢＭ３を含み、ＡＢＭ１はＣＤ３０と結合し、ＡＢＭ３は阻害型のＫＩＲに拮抗する。いくつかの実施形態では、本段落に記載されている構築物のうちのいずれも、ＣＤ６４に結合するＡＢＭ４を含む。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣはＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３を含み、ここで、ＡＢＭ１はＣＤ２０と結合し、ＡＢＭ２はＮＫＧ２Ｄを刺激し、ＡＢＭ３は阻害型のＫＩＲに拮抗する。いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣはＡＢＭ１及びＡＢＭ２を含み、ここで、ＡＢＭ１はＣＤ２０と結合し、ＡＢＭ２はＮＫＧ２Ｄを刺激する。いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣはＡＢＭ１及びＡＢＭ３を含み、ＡＢＭ１はＣＤ２０と結合し、ＡＢＭ３は阻害型のＫＩＲに拮抗する。いくつかの実施形態では、本段落に記載されている構築物のうちのいずれも、ＣＤ６４に結合するＡＢＭ４を含む。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣはＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３を含み、ここで、ＡＢＭ１はＣＤ３０と結合し、ＡＢＭ２はＮＫＧ２Ｄを刺激し、ＡＢＭ３はＮＫＧ２Ａに拮抗する。いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣはＡＢＭ１及びＡＢＭ２を含み、ここで、ＡＢＭ１はＣＤ３０と結合し、ＡＢＭ２はＮＫＧ２Ｄを刺激する。いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣはＡＢＭ１及びＡＢＭ３を含み、ＡＢＭ１はＣＤ３０と結合し、ＡＢＭ３はＮＫＧ２Ａに拮抗する。いくつかの実施形態では、本段落に記載されている構築物のうちのいずれも、ＣＤ６４に結合するＡＢＭ４を含む。
【０２２６】
３．６．抗原結合モジュール４（ＡＢＭ４）：Ｆｃ受容体−結合モジュール
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣは、エフェクター細胞のＦｃ受容体に結合する結合モジュールを含む。Ｆｃ受容体としては、例えば、ＣＤ１６（ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ）、ＣＤ３２ａ、ＣＤ６４及びＣＤ８９が挙げられる。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭ４は、Ｆｃ受容体と特異的に結合する、免疫グロブリン、抗体、抗体フラグメントまたは代替足場である。いくつかの実施形態では、ＡＢＭ４は免疫グロブリンのＦｃドメインである。
【０２２８】
免疫グロブリンのＦｃドメインは、「抗原結合」として本分野で一般に説明されていないが、本開示のＭＩＡＣのＡＢＭ４に対する目的では、Ｆｃドメインに対する受容体はＦｃドメインが結合する「抗原」とみなされる。言い換えれば、免疫グロブリンのＦｃドメインは、先行段落で及び本開示の全体を通して記載されている他のタイプのＡＢＭ４に混ざって、ＡＢＭ４の１種類である。
【０２２９】
例えば、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及び／またはＡＢＭ３がＦｃドメインを有する免疫グロブリンタンパク質を含む場合は、Ｆｃドメインが存在し得る。より詳細に、且つ例示として、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２またはＡＢＭ３のうちのいずれかがＩｇＧを含む場合は、ＡＢＭ４はＩｇＧのＦｃドメインであり得る。これらの実施形態では、当業者が容易に認識するように、単一のＩｇＧは、ＡＢＭ４ならびにＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３の少なくとも１つを形成することができる。エフェクター細胞でのＦｃＲの発現は、その全体が参照により組み込まれるＲａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，９：４５７−４９２に概説されている。
【０２３０】
ある種の実施形態では、Ｆｃ領域変異体を生成するために、Ｆｃ領域中に改変を導入ことができる。ある種の実施形態では、Ｆｃ領域変異体は増強したまたは変化したエフェクター機能を有する。変化したエフェクター機能をともなう多数の置換または置換もしくは欠失が当技術分野で既知である。Ｆｃ領域変異体の例としては、米国特許第８，８１５，２３７号；Ｌａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００６，１０３：４００５−４０１０；及びＳｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２０：６８５−６９１（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。
【０２３１】
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び／または抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の変化を、インビトロ及び／またはインビボアッセイを使用して確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体結合アッセイを行って、ＦｃγＲ結合を測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定例は、米国特許第５，５００，３６２号及び第５，８２１，３３７号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８６，８３：７０５９−７０６３；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８５，８２：１４９９−１５０２；及びＢｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９８７，１６６：１３５１−１３６１（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に提供される。あるいは、またはさらに、全体が参照により組み込まれる、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９８，９５：６５２−６５６に開示されているものなどの動物モデルを使用して、目的の分子のＡＤＣＣ活性をインビボで評価することができる。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣはＡＢＭ４を含まない。
【０２３３】
ＡＢＭ４に関して、例えばＣＨ２ドメイン及び／またはＣＨ３ドメイン中に１つまたは複数の改変を含むように、Ｆｃを改変することができる。そのような改変は、Ｆｃの機能及び結合特性、例えばＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に影響を与え得る。ＦｃＲへの結合を遮断するようにＦｃを改変することができ、例えば、ＦｃＲ結合を遮断するための変異、例えばアミノ酸Ｎ２９７での変異を含むようにＦｃを改変することができる。Ｎ結合型グリコシル化を防止する及び／またはＡＤＣＣを低減するようにＦｃを改変することができる。
【０２３４】
３．７．抗原結合モジュールのアセンブリ
本明細書で提供されるＭＩＡＣは、ＭＩＡＣを含むＡＢＭが、ＭＩＡＣを形成するために、共有結合的にまたは非共有結合的に互いに会合（または「結合」）することを特徴とする。当業者は、ＡＢＭの性質及び用途に基づいて、会合の種類を選択することができる。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、１つのＡＢＭは他の２つのＡＢＭの両方に結合しているが、他の２つのＡＢＭは互いに直接的に結合していない。例えば、図７Ａに示すように、いくつかの態様では、ＡＢＭ１はＡＢＭ２とＡＢＭ３の両方に結合しているが、ＡＢＭ２とＡＢＭ３は互いに結合していない。いくつかの態様では、図７Ｂに示すように、ＡＢＭ２はＡＢＭ１とＡＢＭ３の両方に結合しているが、ＡＢＭ１とＡＢＭ３は互いに直接的に結合していない。いくつかの態様では、図７Ｃに示すように、ＡＢＭ３はＡＢＭ１とＡＢＭ２の両方に結合しているが、ＡＢＭ１とＡＢＭ２は互いに直接的に結合していない。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、各ＡＢＭは２つの他のＡＢＭに結合している。例えば、いくつかの態様では、図８に示すように、ＡＢＭ１はＡＢＭ２とＡＢＭ３に結合しており、ＡＢＭ２はＡＢＭ１とＡＢＭ３に結合しており、ＡＢＭ３はＡＢＭ１とＡＢＭ２に結合している。
【０２３７】
ＭＩＡＣが２つのＡＢＭしか含まない実施形態では、ＡＢＭは、一般に、共有結合的にまたは非共有結合的に互いに会合する。しかし、いくつかの実施形態では、各ＡＢＭは、ＡＢＭではない第３の分子と会合することができる。
【０２３８】
３．７．１．共有結合的に会合したＡＢＭ
いくつかの実施形態では、ＡＢＭは、互いに共有結合的に会合している。共有結合的会合は、任意の適切な共有結合的連結でもよい。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、共有結合的会合は２つ以上のＡＢＭまたはそれらの一部を含む融合タンパク質の形態である。そのような融合タンパク質の例示的実施形態としては、図２Ａ〜５Ｂ及び１１Ａ−１５Ｂに例示するように、ｓｃＦｖ及びＩｇＧの重鎖または軽鎖を含む融合タンパク質が挙げられる。融合タンパク質のさらなる例示的実施形態は、図６及び１６Ａ〜１８Ｂに示されるＭＩＡＣである。
【０２４０】
本明細書で提供されるＭＩＡＣは任意の適切な融合タンパク質構造を含むことができ、適切な融合タンパク質の選択は、例えばＭＩＡＣの各ＡＢＭの所望の結合価及び分子量に応じて、当業者が行うことができる。適切な融合タンパク質構造の例は、本開示の全体を通して提供される。融合タンパク質を生成する方法は、本開示の他の個所で記載されている。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質はポリペプチドリンカーを含む。ポリペプチドリンカーは、融合タンパク質の少なくとも２つのタンパク質（例えば、ＡＢＭ）を互いに結合させる任意の適切なポリペプチドリンカーでもよい。当業者は、融合タンパク質の成分（例えば、ＡＢＭ）及びその用途に基づいて、適切なポリペプチドリンカーを選択することができる。適切なリンカーの例としては、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２０）、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２の残基２９７〜３２２由来のＦｃインターリンカー：ＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫ（配列番号２１）及びヒト血清アルブミンのＤ３ドメイン由来のＨＡＳインターリンカー：ＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳ（配列番号２２）が挙げられる。全体が参照により組み込まれる、Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｎｅｓ．Ｓｃｉ．Ｂｕｌｌ．，２００３，４８：１９１２−１９１８を参照されたい。いくつかの実施形態では、リンカーは（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号２３）である。他のリンカーは、例えば、米国特許第５，５２５，４９１号；Ａｌｆｔｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１９９５，８：７２５−７３１；Ｓｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９９，１６２：６５８９−６５９５；Ｎｅｗｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９６，３５：５４５−５５３；Ｍｅｇｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００６，７：９９９−１００４；及びＰｅｒｉｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９９４，１２：１２１７−１２２６（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に提供される。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭは化学的カップリングによって共有結合的に会合している。任意の適切な化学的リンカーを、本明細書で提供されるＡＢＭを共有結合的に会合させるのに使用することができる。抗体同士の化学的カップリングは、例えば、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，２０００，２９：２８２−２８７；Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，２１：２４３１−２４３５；Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，１４７：６０−６９；Ｆｒｅｎｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，８０：１２１−１３４；及びＧａｖｒｉｌｙｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００９，１９：３７１６−３７２０（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に記載されている。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、化学的カップリングはスペーサーを介する。いくつかの実施形態では、スペーサーは、ポリマー、ポリペプチド、炭水化物（例えば、デキストラン）などから選択される分子である。特定の実施形態では、スペーサーはポリ（エチレン）グリコール（ＰＥＧ）ポリマーである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、約２．５ｋＤａ〜約５０ｋＤａの範囲の分子量を有する。化学的カップリングのためのＰＥＧ試薬及びその使用方法は、例えば、全体が参照により組み込まれる、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０１３，３ｄ  ｅｄ．，ｃｈａｐｔｅｒ  １８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ，ａｎｄ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに記載されている。
【０２４４】
３．７．２．非共有結合的に会合しているＡＢＭ
いくつかの実施形態では、ＡＢＭは互いに非共有結合的に会合している。非共有会合的会合は、任意の適切な共有結合的連結でもよい。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、非共有結合的会合は、２分子間の特異的相互作用の形態である。例えば、いくつかの実施形態では、非共有会合的会合はアビジンとビオチンの間の相互作用である。いくつかの実施形態では、アビジンはストレプトアビジン及びニュートラアビジンから選択される。これらの実施形態では、アビジン分子は１つのＡＢＭに結合しており、ビオチン分子は別のＡＢＭに結合している。次いで、アビジンとビオチンの間の特異的な高親和性相互作用の結果として、ＡＢＭが会合する。アビジン−ビオチン系及びその使用方法は、例えば、全体が参照により組み込まれる、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０１３，３ｄ  ｅｄ．，ｃｈａｐｔｅｒ  １１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ，ａｎｄ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに記載されている。
【０２４６】
３．８．多特異性免疫調節構築物（ＭＩＡＣ）の例示的実施形態
図２Ａ〜６及び１１Ａ〜１８Ｂは、本明細書で提供されるＭＩＡＣの例示的非限定例を提供する。
【０２４７】
図２Ａでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ２（２０２）及びＡＢＭ３（２０３）がＩｇＧの重鎖のＣ末端に結合している。しかし、ＡＢＭ２（２０２）及びＡＢＭ３（２０３）の一方または両方をＩｇＧの重鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２４８】
図２Ｂでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ２（２０２）及びＡＢＭ３（２０３）がＩｇＧの軽鎖のＣ末端に結合している。しかし、ＡＢＭ２（２０２）及びＡＢＭ３（２０３）の一方または両方をＩｇＧの軽鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２４９】
図２Ｃでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ２（２０２）がＩｇＧの１つの軽鎖のＣ末端に結合している。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ３（２０３）がＩｇＧの１つの重鎖のＣ末端に結合している。しかし、ＡＢＭ２（２０２）及びＡＢＭ３（２０３）の一方または両方をそれぞれ軽鎖のＮ末端または重鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２５０】
図２Ｄでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ２（２０２）がＩｇＧの１つの重鎖のＣ末端に結合している。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ３（２０３）がＩｇＧの１つの軽鎖のＣ末端に結合している。しかし、ＡＢＭ２（２０２）及びＡＢＭ３（２０３）の一方または両方をそれぞれ重鎖のＮ末端または軽鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２５１】
図３Ａでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ２（２０２）がＩｇＧの１つの重鎖のＣ末端に結合している。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ３（２０３）がＩｇＧのもう１つの重鎖のＣ末端及びＩｇＧの１つの軽鎖に結合している。しかし、ＡＢＭ２（２０２）及びＡＢＭ３（２０３）の一方または両方を重鎖のＮ末端または軽鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２５２】
図３Ｂでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ２（２０２）がＩｇＧの１つの軽鎖のＣ末端に結合している。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ３（２０３）がＩｇＧのもう１つの軽鎖のＣ末端及びＩｇＧの１つの重鎖に結合している。しかし、ＡＢＭ２（２０２）及びＡＢＭ３（２０３）の一方または両方を軽鎖のＮ末端または重鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２５３】
図３Ｃでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ２（２０２）がＩｇＧの１つの重鎖のＣ末端及びＩｇＧの１つの軽鎖に結合している。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ３（２０３）がＩｇＧのもう１つの重鎖のＣ末端に結合している。しかし、ＡＢＭ２（２０２）及びＡＢＭ３（２０３）の一方または両方を重鎖のＮ末端または軽鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２５４】
図３Ｄでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ２（２０２）がＩｇＧの１つの重鎖のＣ末端及びＩｇＧの１つの軽鎖に結合している。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ３（２０３）がＩｇＧのもう１つの軽鎖のＣ末端に結合している。しかし、ＡＢＭ２（２０２）及びＡＢＭ３（２０３）の一方または両方を軽鎖のＮ末端または重鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２５５】
図４Ａでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。ＡＢＭ２（２０２）が、半分のＩｇＧの軽鎖のＣ末端及び同じ半分のＩｇＧの重鎖のＣ末端に結合している。ＡＢＭ３（２０３）が、もう半分のＩｇＧの軽鎖のＣ末端及びもう半分のＩｇＧの重鎖のＣ末端に結合している。しかし、ＡＢＭ２（２０２）及びＡＢＭ３（２０３）の１つまたは複数を軽鎖のＮ末端または重鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２５６】
図４Ｂでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。ＡＢＭ２（２０２）が、半分のＩｇＧの軽鎖のＣ末端及びもう半分のＩｇＧの重鎖のＣ末端に結合している。ＡＢＭ３（２０３）が、半分のＩｇＧの軽鎖のＣ末端及びもう半分のＩｇＧの重鎖のＣ末端に結合している。しかし、ＡＢＭ２（２０２）及びＡＢＭ３（２０３）の１つまたは複数を軽鎖のＮ末端または重鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２５７】
図５Ａでは、ＡＢＭ１（２０１）はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ２（２０２）はＩｇＧであり、ＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ１（２０１）及びＡＢＭ３（２０３）がＩｇＧの重鎖のＣ末端に結合している。しかし、ＡＢＭ１（２０１）及びＡＢＭ３（２０３）の一方または両方をＩｇＧの重鎖のＮ末端に結合させることが可能である。ＡＢＭ１（２０１）及びＡＢＭ３（２０３）を、軽鎖のＣ末端またはＮ末端を含めた、ＩｇＧの任意の他の適切な部位に結合させることも可能である。
【０２５８】
図５Ｂでは、ＡＢＭ１（２０１）はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ３（２０３）はＩｇＧである。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ１（２０１）及びＡＢＭ２（２０２）がＩｇＧの重鎖のＣ末端に結合している。しかし、ＡＢＭ１（２０１）及びＡＢＭ２（２０３）の一方または両方をＩｇＧの重鎖のＮ末端に、結合させることが可能である。ＡＢＭ１（２０１）及びＡＢＭ２（２０３）を、軽鎖のＣ末端またはＮ末端を含めた、ＩｇＧの任意の他の適切な部位に結合させることも可能である。
【０２５９】
図６では、ＡＢＭ１（２０１）はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。本例示的実施形態では、ポリペプチドリンカーを使用して、Ｎ末端からＣ末端に向かってＡＢＭ１−ＡＢＭ２−ＡＢＭ３の順序で、ｓｃＦｖをアセンブルする。しかし、Ｎ末端からＣ末端に向かって例えば、ＡＢＭ１−ＡＢＭ３−ＡＢＭ２、ＡＢＭ２−ＡＢＭ１−ＡＢＭ３、ＡＢＭ２−ＡＢＭ３−ＡＢＭ１、ＡＢＭ３−ＡＢＭ１−ＡＢＭ２及びＡＢＭ３−ＡＢＭ２−ＡＢＭ１を含めた任意の適切な順序で、ｓｃＦｖをアセンブルすることが可能である。
【０２６０】
図１１Ａでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、１つのＡＢＭ２（２０２）がＩｇＧの重鎖のＣ末端のそれぞれに結合している。しかし、一方または両方のＡＢＭ２（２０２）をＩｇＧの重鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２６１】
図１１Ｂでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、１つのＡＢＭ２（２０２）がＩｇＧの軽鎖のＣ末端のそれぞれに結合している。しかし、一方または両方のＡＢＭ２（２０２）をＩｇＧの軽鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２６２】
図１１Ｃでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、１つのＡＢＭ３（２０３）がＩｇＧの重鎖のＣ末端のそれぞれに結合している。しかし、一方または両方のＡＢＭ３（２０３）をＩｇＧの重鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２６３】
図１１Ｄでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、１つのＡＢＭ３（２０３）がＩｇＧの軽鎖のＣ末端のそれぞれに結合している。しかし、一方または両方のＡＢＭ３（２０３）をＩｇＧの軽鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２６４】
図１２Ａでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、１つのＡＢＭ２（２０２）がＩｇＧの１つの軽鎖のＣ末端に結合している。ポリペプチドリンカーを使用して、別のＡＢＭ２（２０２）がＩｇＧの１つの重鎖のＣ末端に結合している。しかし、一方または両方のＡＢＭ２（２０２）を、それぞれ軽鎖のＮ末端または重鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２６５】
図１２Ｂでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、１つのＡＢＭ３（２０３）がＩｇＧの１つの軽鎖のＣ末端に結合している。ポリペプチドリンカーを使用して、別のＡＢＭ３（２０３）がＩｇＧの１つの重鎖のＣ末端に結合している。しかし、一方または両方のＡＢＭ３（２０３）を、それぞれ軽鎖のＮ末端または重鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２６６】
図１３Ａでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ２（２０２）がＩｇＧの両方の重鎖及び１つの軽鎖のＣ末端に結合している。しかし、ＡＢＭ２（２０２）のいずれかを重鎖のＮ末端または軽鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２６７】
図１３Ｂでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ２（２０２）がＩｇＧの両方の軽鎖及び１つの重鎖のＣ末端に結合している。しかし、ＡＢＭ２（２０２）のいずれかを軽鎖のＮ末端または重鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２６８】
図１３Ｃでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ３（２０３）がＩｇＧの両方の重鎖及び１つの軽鎖のＣ末端に結合している。しかし、ＡＢＭ３（２０３）のいずれかを重鎖のＮ末端または軽鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２６９】
図１３Ｄでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ３（２０３）がＩｇＧの両方の軽鎖及び１つの重鎖のＣ末端に結合している。しかし、ＡＢＭ３（２０３）のいずれかを軽鎖のＮ末端または重鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２７０】
図１４Ａでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖである。ＡＢＭ２（２０２）は、両方の重鎖及び両方の軽鎖のＣ末端に結合している。しかし、ＡＢＭ２（２０２）の１つまたは複数を軽鎖のＮ末端または重鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２７１】
図１４Ｂでは、ＡＢＭ１（２０１）はＩｇＧであり、ＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。ＡＢＭ３（２０３）は、両方の重鎖及び両方の軽鎖のＣ末端に結合している。しかし、ＡＢＭ３（２０３）の１つまたは複数を軽鎖のＮ末端または重鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２７２】
図１５Ａでは、ＡＢＭ１（２０１）はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ２（２０２）はＩｇＧ及びｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ１（２０１）及びｓｃＦｖ  ＡＢＭ２（２０２）がＩｇＧの重鎖のＣ末端に結合している。しかし、ＡＢＭ１（２０１）及びｓｃＦｖ  ＡＢＭ２（２０２）の一方または両方をＩｇＧの重鎖のＮ末端に結合させることが可能である。ＡＢＭ１（２０１）及びｓｃＦｖ  ＡＢＭ２（２０２）を、軽鎖のＣ末端またはＮ末端を含めた、ＩｇＧの任意の他の適切な部位に結合させることも可能である。
【０２７３】
図１５Ｂでは、ＡＢＭ１（２０１）はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ３（２０３）はＩｇＧ及びｓｃＦｖである。ポリペプチドリンカーを使用して、ＡＢＭ１（２０１）及びｓｃＦｖ  ＡＢＭ３（２０３）がＩｇＧの重鎖のＣ末端に結合している。しかし、ＡＢＭ１（２０１）及びｓｃＦｖ  ＡＢＭ３（２０３）の一方または両方をＩｇＧの重鎖のＮ末端に結合させることが可能である。ＡＢＭ１（２０１）及びｓｃＦｖ  ＡＢＭ３（２０３）を、軽鎖のＣ末端またはＮ末端を含めた、ＩｇＧの任意の他の適切な部位に結合させることも可能である。
【０２７４】
図１６Ａでは、ＡＢＭ１（２０１）はｓｃＦｖであり、両方のＡＢＭ２（２０２）はｓｃＦｖである。本例示的実施形態では、ポリペプチドリンカーを使用して、Ｎ末端からＣ末端に向かってＡＢＭ１−ＡＢＭ２−ＡＢＭ２の順序で、ｓｃＦｖをアセンブルする。しかし、Ｎ末端からＣ末端に向かって例えば、ＡＢＭ２−ＡＢＭ１−ＡＢＭ２及びＡＢＭ２−ＡＢＭ２−ＡＢＭ１を含めた任意の適切な順序で、ｓｃＦｖをアセンブルすることが可能である。
【０２７５】
図１６Ｂでは、ＡＢＭ１（２０１）はｓｃＦｖであり、両方のＡＢＭ３（２０３）はｓｃＦｖである。本例示的実施形態では、ポリペプチドリンカーを使用して、Ｎ末端からＣ末端に向かってＡＢＭ１−ＡＢＭ３−ＡＢＭ３の順序で、ｓｃＦｖをアセンブルする。しかし、Ｎ末端からＣ末端に向かって、例えば、ＡＢＭ３−ＡＢＭ１−ＡＢＭ３及びＡＢＭ３−ＡＢＭ３−ＡＢＭ１を含めた任意の適切な順序で、ｓｃＦｖをアセンブルすることが可能である。
【０２７６】
図１７Ａ〜１７Ｂでは、２つのＡＢＭ１（２０１）ｓｃＦｖがＩｇＧ様分子の重鎖のＣ末端に結合している。ＩｇＧ様分子のＮ末端領域は、２つのＡＢＭ２結合部位（２０２）を形成するＶＨ−ＶＬ領域及び２つのＡＢＭ３結合部位（２０３）を形成するＶＨ−ＶＬ領域を含む。図１７Ａで示される実施形態では、ＡＢＭ３結合部位は、ＩｇＧ様分子によって形成される最もＮ末端のＡＢＭ結合部位である。図１７Ｂで示される実施形態では、ＡＢＭ２結合部位は、ＩｇＧ様分子によって形成される最もＮ末端のＡＢＭ結合部位である。１つまたは複数のｓｃＦｖ  ＡＢＭ１（２０１）を、ＩｇＧ様分子の軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に、または重鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２７７】
図１８Ａ〜１８Ｂでは、２つのＡＢＭ１（２０１）ｓｃＦｖがＩｇＧ様分子の重鎖のＣ末端に結合している。ＩｇＧ様分子のＮ末端領域は、４つのＡＢＭ２結合部位（２０２；図１８Ａ）または４つのＡＢＭ３結合部位（２０３；図１８Ｂ）を形成するＶＨ−ＶＬ領域を含む。１つまたは複数のｓｃＦｖ  ＡＢＭ１（２０１）を、ＩｇＧ様分子の軽鎖のＣ末端もしくはＮ末端に、または重鎖のＮ末端に結合させることも可能である。
【０２７８】
４．多特異性免疫調節抗原結合構築物（ＭＩＡＣ）の調製
ＭＩＡＣは、当技術分野で既知であり且つ以下により詳細に記載されている、核酸クローニング、タンパク質発現及びタンパク質アセンブリの技法を使用して調製することができる。本開示の他の個所で記載するように、ＭＩＡＣを形成するＡＢＭは、複数のサブユニットを有するタンパク質（及び融合タンパク質）からアセンブルすることができる。ＭＩＡＣが複数のサブユニットから形成される場合は、ＭＩＡＣの最終的なアセンブリは、組換え細胞の内部で行ってもよいし、組換え細胞の外部で行ってもよい。
【０２７９】
４．１．抗原の調製
ＡＢＭの生成に使用される抗原は、細胞によって発現されるインタクトな分子（例えば、癌細胞特異的抗原、活性化受容体及び／もしくは阻害性受容体）またはこれらの分子のフラグメントでもよい。抗原は、単離タンパク質の形態でもよし、当該タンパク質を発現する細胞の形態でもよい。ＡＢＭを生成するのに有用な抗原の他の形態は当業者に明らかである。
【０２８０】
４．２．抗体
抗体は、例えば、全体が参照により組み込まれる、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９７５，２５６：４９５−４９７によって最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して、及び／または組換えＤＮＡ法（例えば、全体が参照により組み込まれる、米国特許第４，８１６，５６７を参照されたい）によって、得ることができる。例えば、ファージまたは酵母ベースのライブラリーを使用して、モノクローナル抗体を得ることもできる。例えば、米国特許第８，２５８，０８２号及び第８，６９１，７３０号（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。
【０２８１】
ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物を免疫化して、免疫化に使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、または産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、インビトロでリンパ球を免疫化することができる。次いで、ハイブリドーマ細胞を形成するために、ポリエチレングリコールなどの適切な融合剤を使用してリンパ球を骨髄腫細胞と融合する。全体が参照により組み込まれる、Ｇｏｄｉｎｇ  Ｊ．Ｗ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ  ｅｄ．（１９８６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照されたい。
【０２８２】
未融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１種または複数種の物質を含む適切な培養培地にハイブリドーマ細胞を播種し、成長させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合は、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む（ＨＡＴ培地）。
【０２８３】
有用な骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定的な高レベル産生を支持し、且つＨＡＴ培地の有無などの培地条件に感受性があるものである。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫系統、例えば、ＭＯＰ−２１及びＭＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの（Ｓａｌｋ研究所細胞分配センター（Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能）及びＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手可能）である。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞の細胞株もヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている。例えば、全体が参照により組み込まれる、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８４，１３３：３００１を参照されたい。
【０２８４】
所望の特異性、親和性及び／または生物活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、選択したクローンを限界希釈法によってサブクローニングすることができ、標準的な方法によって成長させることができる。上掲のＧｏｄｉｎｇを参照されたい。この目的に適した培養培地としては、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、動物中の腹水腫瘍として、ハイブリドーマ細胞をインビボで成長させることができる。
【０２８５】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離及び配列決定することができる。したがって、ハイブリドーマ細胞は、所望の特性を有する抗体をコードするＤＮＡの有用な供給源として働き得る。一旦単離すれば、ＤＮＡを発現ベクター中に配置することができ、次いで、これを、そうでなければ抗体を産生しない、細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）もしくはコマタガエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）（ピキア（Ｐｉｃｈｉａ））属）、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞宿主細胞にトランスフェクトして、モノクローナル抗体を産生する。
【０２８６】
４．２．１．ヒト化抗体
ヒト化抗体は、モノクローナル抗体の構造部分の大部分またはすべてを対応するヒト抗体配列と置き換えることによって生成することができる。したがって、抗原特異的な可変領域またはＣＤＲのみが非ヒト配列から構成されるハイブリッド分子が生成される。ヒト化抗体を得るための方法としては、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３４９：２９３−２９９；Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９８，９５：８９１０−８９１５；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００，２７５：３６０７３−３６０７８；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８９，８６：１００２９−１００３３；ならびに米国特許第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６１号；第５，６９３，７６２号；及び第６，１８０，３７０号（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。
【０２８７】
４．２．２．ヒト抗体
ヒト抗体は、当技術分野で既知の様々な技法によって、例えば、トランスジェニック動物（例えば、ヒト化マウス）を使用することによって、生成することができる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９３，９０：２５５１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６２：２５５−２５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，１９９３，７：３３；ならびに米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５８９，３６９号及び第５，５４５，８０７号（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリーに由来してもよい（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，２２７：３８１−３８８；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，２２２：５８１−５９７；ならびに米国特許第５，５６５，３３２号及び第５，５７３，９０５号）（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）を参照されたい）。ヒト抗体は、インビトロ活性化Ｂ細胞によっても生成することができる（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号及び第５，２２９，２７５号（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）を参照されたい）。ヒト抗体はまた、酵母ベースのライブラリーに由来してもよい（例えば、全体が参照により組み込まれる、米国特許第８，６９１，７３０号を参照されたい）。
【０２８８】
４．３．  代替足場
代替足場は、当技術分野で既知の任意の方法によって調製することができる。
【０２８９】
例えば、Ａｄｎｅｃｔｉｎ（商標）を調製する方法は、全体が参照により組み込まれる、Ｅｍａｎｕｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ，２０１１，３：３８−４８に記載されている。ｉＭａｂを調製する方法は、全体が参照により組み込まれる、米国特許公開第２００３／０２１５９１４号に記載されている。Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（登録商標）を調製する方法は、全体が参照により組み込まれる、Ｖｏｇｔ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００４，５：１９１−１９９に記載されている。クニッツドメインを調製する方法は、全体が参照により組み込まれる、Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１９９２，１８６：１１８−１１４５に記載されている。チオレドキシンペプチドアプタマーを調製する方法は、全体が参照により組み込まれる、Ｇｅｙｅｒ  ａｎｄ  Ｂｒｅｎｔ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０００，３２８：１７１−２０８に提供される。アフィボディを調製する方法は、全体が参照により組み込まれる、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００４，１５：３６４−３７３に提供される。ＤＡＲＰｉｎを調製する方法は、全体が参照により組み込まれる、Ｚａｈｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００７，３６９：１０１５−１０２８に提供される。アフィリンを調製する方法は、全体が参照により組み込まれる、Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００７，３７２：１７２−１８５に提供される。テトラネクチンを調製する方法は、全体が参照により組み込まれる、Ｇｒａｖｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０００，２７５：３７３９０−３７３９６に提供される。アビマーを調製する方法は、全体が参照により組み込まれる、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００５，２３：１５５６−１５６１に提供される。
【０２９０】
代替足場に関するさらなる情報は、Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００５  ２３：１２５７−１２６８；及びＳｋｅｒｒａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００７  １８：２９５−３０４（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に提供される。
【０２９１】
４．４．融合タンパク質
融合タンパク質は、当技術分野で既知の標準的な分子生物学的方法を使用して生成することができる。一般に、融合される２種以上のタンパク質、例えば２種以上のＡＢＭをコードするポリヌクレオチド配列を合成する。ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列の転写及び翻訳が２種以上のタンパク質（例えば、ＡＢＭ）を含むポリペプチド鎖の発現をもたらすように設計する。このポリペプチド鎖は「融合タンパク質」といわれる。融合タンパク質の１つの実例はｓｃＦｖに融合したＩｇＧ重鎖である。
【０２９２】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、融合されるタンパク質が直接的に互いに結合するように、またはアミノ酸もしくはポリペプチドリンカーを介して互いに結合するように設計することができる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質中の１つのタンパク質のＮ末端が、融合タンパク質中の別のタンパク質のＣ末端に直接続く。いくつかの実施形態では、融合タンパク質に含まれる少なくとも２つのタンパク質の間に単一アミノ酸が存在する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質に含まれる少なくとも２つのタンパク質の間にポリペプチドリンカーが存在する。
【０２９３】
重鎖に融合したｓｃＦｖを有する免疫グロブリンを調製する方法は、例えば、全体が参照により組み込まれる、Ｃｏｌｏｍａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，１５：１５９−１６３に提供される。軽鎖に融合したｓｃＦｖを有する免疫グロブリンを調製する方法は、例えば、全体が参照により組み込まれる、Ｏｒｃｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，２０１０，２３：２２１−２２８に提供される。
【０２９４】
酵母及び糸状菌で抗体融合タンパク質を生成する方法は、例えば、Ｊｏｏｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｃｅｌｌ．Ｆａｃｔｏｒｉｅｓ，２００３，２：１；及びＰｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，２００１，２５１：１２３−１３６（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に提供される。ｓｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質を生成する方法は、例えば、Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．＆  Ｂｉｏｅｎｇ．，２００３，９５：２３１−２３８；及びＫａｍｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００５，７９：１０８６４−１０８７４（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に記載されている。ｓｃＦｖ融合タンパク質の生成のための無細胞方法は、例えば、全体が参照により組み込まれる、Ｋａｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００７，１０９：３３９３−３３９９に記載されている。
【０２９５】
４．５．ポリペプチドリンカー
任意の適切なポリペプチドリンカーを使用して、ＭＩＡＣのＡＢＭを互いに結合させることができ、当業者は、ＡＢＭの性質及びＭＩＡＣの用途に基づいて、適切なポリペプチドリンカーを選択することができる。適切なリンカー組成物は当技術分野で既知であり、本開示の他の個所で記載される。ＡＢＭの親和性及びＭＩＡＣの生物活性に対する様々なリンカー長の効果を評価することによって、適切なリンカー長を選択することができる。適切なリンカー長の決定は、十分、当業者の能力内である。
【０２９６】
１つの実例として、いくつかの実施形態では、次の組成物及び長さを有する５種のリンカーを試験することによって適切なリンカー長を決定することができる：（２）（ＧＧＧＧＳ）（配列番号２５）；（２）（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号２６）；（３）（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号２３）；（４）（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号２４）；及び（５）（ＧＧＧＧＳ）５（配列番号２７）。５種のリンカーのそれぞれをＭＩＡＣの各ＡＢＭ間の連結として評価することができ、ＭＩＡＣに含めるために、最も良いＡＢＭの親和性、ＭＩＡＣの生物活性、収率などをもたらす連結を選択することができる。前述のリンカーは例示のためだけに提供され、当業者なら認識するように、評価されるリンカーの組成物及び長さは任意の適切な様式で変動し得る。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ポリペプチドリンカーによって連結される２つ以上のＡＢＭもコードするポリヌクレオチドにコードされる（例えば、融合タンパク質）。そのようなポリヌクレオチドは、第１のＡＢＭ、第１のポリペプチドリンカー及び第２のＡＢＭをコードするポリヌクレオチドをアセンブルするまたは合成することによって生成することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、第２のポリペプチドリンカー及び第３のＡＢＭをさらにコードすることができる。次いで、本明細書に提供され且つ当技術分野で既知の方法に従ってポリヌクレオチドを発現させて、リンカーによって結合した２つ以上のＡＢＭを含む融合タンパク質を生成することができる。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、ＡＢＭを別々に発現させ、ポリペプチドリンカーを使用して、発現後に２つ以上のＡＢＭを互いに結合させる。そのような実施形態では、第１のＡＢＭと第１のポリペプチドリンカーの間の化学結合の形成に適した条件下で、第１のＡＢＭが第１のポリペプチドリンカーと接触する。次いで、第１のポリペプチドリンカーと第２のＡＢＭの間の化学結合の形成に適した条件下で、第２のＡＢＭが第１のＡＢＭと第１のポリペプチドリンカーによって形成されるコンジュゲートと接触する。同様の技法を利用することによって、さらなるＡＢＭを第１及び／もしくは第２のＡＢＭに、または第１のリンカーにコンジュゲートすることができる。ポリペプチドリンカーとＡＢＭの間の化学結合の形成に適した条件は、例えば、全体が参照により組み込まれる、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０１３，３ｄ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ，ａｎｄ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに提供される。
【０２９９】
４．６．化学的カップリング
いくつかの実施形態では、ＡＢＭを別々に発現させ、ポリペプチドリンカー以外の化学的カップリング試薬を使用して、発現後に、２つ以上のＡＢＭを互いに結合させる。そのような実施形態では、第１のＡＢＭと第１の化学的カップリング試薬の間の化学結合の形成に適した条件下で、第１のＡＢＭが第１の化学的カップリング試薬と接触する。次いで、第１の化学的カップリング試薬と第２のＡＢＭの間の化学結合の形成に適した条件下で、第２のＡＢＭが第１のＡＢＭ及び第１の化学的カップリング試薬によって形成されるコンジュゲートと接触する。同様の技法を利用することによって、さらなるＡＢＭを第１及び／もしくは第２のＡＢＭに、または第１の化学的カップリング試薬にコンジュゲートすることができる。化学的カップリング試薬とＡＢＭの間の化学結合の形成に適した条件は、例えば、全体が参照により組み込まれる、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０１３，３ｄ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ，ａｎｄ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに提供される。
【０３００】
ＭＩＡＣを化学的にカップリングする場合、任意の適切なカップリング試薬を使用することができる。カップリング試薬としては、ゼロレングスクロスリンカー、ホモ二官能性クロスリンカー、ヘテロ二官能性クロスリンカー、三官能性クロスリンカー、デンドリマー及びデンドロン、化学選択的及びバイオ直交型試薬などが挙げられる。例示的な適切なカップリング試薬としては、例えば、ｍ−マレイミド安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒド及びカルボジイミドが挙げられる。化学的カップリングの他の適切な試薬及びそれらの使用方法は、例えば、全体が参照により組み込まれる、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２０１３，３ｄ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ，ａｎｄ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに記載されている。抗体同士の化学的カップリングは、例えば、Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，２０００，２９：２８２−２８７；Ｊｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，２１：２４３１−２４３５；Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，１４７：６０−６９；Ｆｒｅｎｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，８０：１２１−１３４；及びＧａｖｒｉｌｙｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２００９，１９：３７１６−３７２０（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に記載されている。
【０３０１】
５．ＭＩＡＣを生成するためのベクター、宿主細胞及び方法
５．１ベクター
本発明は、ＭＩＡＣをコードする単離核酸、その核酸を含むベクター及び宿主細胞ならびにＭＩＡＣを生成するための組換え技法も提供する。
【０３０２】
本明細書で提供されるＭＩＡＣの組換え体生成については、ＭＩＡＣをコードする核酸（複数可）を単離し、さらなるクローニング（すなわち、ＤＮＡの増幅）または発現のための複製可能なベクターに挿入することができる。いくつかの態様では、核酸は、例えば、全体が参照により組み込まれる、米国特許第５，２０４，２４４号に記載されているように、相同組換えによって生成することができる。
【０３０３】
多くの異なるベクターが当技術分野で既知である。ベクター成分としては、例えば、全体が参照により組み込まれる、米国特許第５，５３４，６１５号に記載されているように、一般に、限定されないが、以下の１つまたは複数が挙げられる：シグナル配列、複製開始点、１種または複数種のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター及び転写終結配列。
【０３０４】
５．２．宿主細胞
任意の適切な宿主細胞を使用して、本明細書で提供されるＭＩＡＣを生成することができる。適切な宿主細胞の実例を以下に提供する。これらの宿主細胞は、限定することを意図するものではない。
【０３０５】
適切な宿主細胞としては、任意の原核生物（例えば、細菌）、下等真核生物（例えば、酵母）または高等真核生物（例えば、哺乳類）の細胞が挙げられる。適切な原核生物としては、グラム陰性生物またはグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）（霊菌（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ））、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）（枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））ならびに、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などの腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）が挙げられる。１つの有用なＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主はＥ．ｃｏｌｉ  ２９４であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０などの他の系統も適切である。
【０３０６】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生も、ＭＩＡＣをコードするベクターに適したクローニング用または発現用宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または一般的なパン酵母は、一般に使用される下等真核生物の宿主微生物である。しかし、いくつかの他の属、種及び系統が利用可能且つ有用であり、例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）（Ｋ．ラクチス（ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラジリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｋ．ブルガリクス（ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、Ｋ．ウィッケラミイ（ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）、Ｋ．ワルティイ（ｗａｌｔｉｉ）、Ｋ．ドロソフィラウム（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）、Ｋ．サーモトレランス（ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、及びＫ．マルキシャヌス（ｍａｒｘｉａｎｕｓ））、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、コマガタエラ（ピキア）・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ（Ｐｉｃｈｉａ）ｐａｓｔｏｒｉｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）（Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ））、トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、シュワニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）（Ｓ．オクシデンタリス（ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ））ならびに、例えば、青カビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）及びＡ．ニガー（ｎｉｇｅｒ））などの糸状菌である。
【０３０７】
有用な哺乳類宿主細胞としては、ＣＯＳ−７細胞、ＨＥＫ２９３細胞；ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）；マウスセルトリ細胞；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）などが挙げられる。
【０３０８】
本明細書で提供されるＭＩＡＣを生成するのに使用する宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。例えば、ハムＦ１０、最少必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０及びダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）などの市販培地は、宿主細胞を培養するのに適する。さらに、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１９７９，５８：４４；Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８０，１０２：２５５；ならびに米国特許第４，７６７，７０４号、第４，６５７，８６６号、第４，９２７，７６２号、第４，５６０，６５５号及び第５，１２２，４６９号またはＷＯ９０／０３４３０及びＷＯ８７／００１９５に記載されている培地のうちのいずれかを使用することができる。本段落で引用する参考文献のそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる。
【０３０９】
これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモン及び／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリンまたは上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシン及びチミジン）、抗生物質、微量元素（マイクロモル濃度範囲の終濃度で通常存在する無機化合物と定義される）及びグルコースまたは同等のエネルギー源を補充することができる。任意の他の必要な補充物も当業者に知られるであろう適切な濃度で含めることができる。
【０３１０】
培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、発現用に選択された宿主細胞とともに以前に使用されたものであり、当業者に明らかであろう。
【０３１１】
５．３．ＭＩＡＣの生成
組換えタンパク質生成の一般的な方法、特に、抗体の生成方法を、本明細書で提供されるＭＩＡＣの生成に適用することができる。抗体の生成方法のさらなる詳細は、Ａｌ−Ｒｕｂｅａｉ，ｅｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２０１１，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに提供される。
【０３１２】
例えば、いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣは、ペリプラズム空間において細胞内に生成されるか、培地に直接分泌される。ＭＩＡＣが細胞内に生成される場合は、第１ステップとして、粒子状の残屑、すなわち宿主細胞または溶解された断片のいずれかを、例えば遠心分離または限外濾過によって除去する。例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：１６３−１６７；その全体が参照により組み込まれる）は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間に分泌されたＡＢＭを単離する手順を記載している。手短に言えば、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ及びフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で、約３０分にわたって解かす。遠心分離によって、細胞残屑を除去することができる。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣは無細胞系で生成される。いくつかの態様では、その全体が参照により組み込まれるＹｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ，２０１２，４：２１７−２２５に記載されているように、無細胞系はインビトロ転写及び翻訳系である。いくつかの態様では、無細胞系は真核細胞または原核細胞からの無細胞抽出物を利用する。いくつかの態様では、原核細胞はＥ．ｃｏｌｉである。ＭＩＡＣの無細胞発現は、例えば、ＭＩＡＣが不溶性凝集物として細胞中に蓄積する場合、またはペリプラズム発現からの収率が低い場合に、有用であり得る。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣは、細胞によって発現され、アセンブルする。いくつかの実施形態では、細胞は、完全に形成され、適切にアセンブルされたＭＩＡＣを分泌することができる、酵母細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣは、アセンブリを完了するために、さらなる処理（例えば、重鎖及び／または軽鎖の間のジスルフィド結合の形成）を必要とする。組換えで発現され、精製された免疫グロブリン重鎖及び軽鎖からの機能的ＡＢＭのアセンブリは、例えば、全体が参照により組み込まれる、Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９８４，１２：３７９１−３８０６に記載されている。そのような技法は、本開示で記載されるものの中でも、免疫グロブリン重鎖を含む融合タンパク質及び／または免疫グロブリン軽鎖を含む融合タンパク質をアセンブルするために容易に適合させることができることを当業者は認識するであろう。
【０３１５】
ＭＩＡＣが培地中に分泌される場合は、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｐｅｌｌｃｏｎ（登録商標）限外濾過ユニットを使用して、そのような発現系由来の上清を最初に濃縮する。タンパク質分解を阻害するために、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を前述のステップのいずれかに含めることができ、外来性汚染物の増殖を防止するために、抗生物質を含めることができる。
【０３１６】
細胞から調製したＭＩＡＣ組成物を、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが特に有用な精製技法である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、ＭＩＡＣ中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づくＭＩＡＣを精製することができる（全体が参照により組み込まれる、Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１９８３，６２：１−１３）。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に有用である（全体が参照により組み込まれる、Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９８６，５：１５６７−１５７５）。
【０３１７】
親和性リガンドが結合するマトリックスは大抵の場合アガロースであるが、他のマトリックスが利用可能である。制御細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースによって達成されるよりも速い流速及び短い処理時間を可能にする。ＭＩＡＣがＣＨ３ドメインを含む場合は、ＢａｋｅｒＢｏｎｄ  ＡＢＸ（登録商標）樹脂が精製に有用である。
【０３１８】
タンパク質精製に関する他の技法、例えば、イオン交換カラムによる分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカによるクロマトグラフィー、ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）によるクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び硫酸アンモニウム沈殿も利用可能であり、当業者によって適用され得る。
【０３１９】
任意の予備的な精製ステップ（複数可）に続いて、目的のＭＩＡＣ及び夾雑物を含む混合物を、約２．５〜約４．５の間のｐＨの溶出緩衝液を使用して、一般に低塩濃度（例えば、約０〜約０．２５Ｍの塩）で行われる、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することができる。
【０３２０】
ある場合には、複数の分子種を形成するために、本明細書に記載のＭＩＡＣの個々の成分をアセンブルすることができる。この場合は、クロマトグラフィーなどの標準的な技法を使用して、所望の分子種を複数種から精製することができる。
【０３２１】
さらに、「ノブ及びホール」アプローチなどの技法を使用して、適切にアセンブルされたＭＩＡＣの生成を支持することができ、これによって、望まれない分子種を除去する必要性が低減また排除される。米国特許第５，７３１，１６８号；第７，６９５９３６号；第８，６４２，７４５号；及び第８，６７９，７８５号（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、１つより多い抗原を認識するＡＢＭを生成することが有用であり得る。そのようなＡＢＭを生成するために、上記のノブ及びホールアプローチを含めた任意の適切な技法を使用することができる。いくつかの実施形態では、１つより多い抗原を認識するＡＢＭは、異なる抗原を認識する単一ドメイン抗体を単離し、次いでそれらを、単一ドメイン抗体によって認識される異なる抗原のそれぞれを認識する分子中に組み合わせることによって開発される。例えば、いくつかの実施形態では、１つの抗原と結合する単一軽鎖抗体と、別の抗原と結合する単一の重鎖抗体を組み合わせて、両方の抗原に結合するインタクトな免疫グロブリンまたはそのフラグメントを形成する。
【０３２３】
多特異性ＡＢＭは、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ  ＩｎｃのＡｚｙｍｅｔｒｉｃ（商標）プラットフォームを使用して生成することもできる。そのような多特異性ＡＢＭ及びその作製方法は、例えば、米国特許公開第２０１２／０１４９８７６号；第２０１２／０２４４５７７号；第２０１３／０１９５８４９号；第２０１３／０３３６９７３号；第２０１４／００５１８３５号；第２０１４／００６６３７８号；第２０１４／００７２５８１号；及び第２０１４／０２００３３１号（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に記載されている。
【０３２４】
６．コンジュゲート
いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣを剤にコンジュゲートすることができる。有用な剤としては、例えば、治療剤及び診断剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、剤は、リンカーを用いてＭＩＡＣにコンジュゲートされる。いくつかの態様では、リンカーは生分解性リンカーである。
【０３２５】
適切な剤及びリンカーを当業者は選択することができる。リンカー及び剤についてのさらに多くの情報は、例えば、Ｇｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．，２０１３，３０：６２５−６３９；Ａｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，１４：５２９−５３７；及び米国特許第５，０１０，１７６号（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に見出すことができる。さらなる治療剤は以下に記載され、これらを、本明細書で提供されるＭＩＡＣにコンジュゲートすることもできる。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣのＡＢＭは、マスキング部分及び切断可能部分を含む。マスキング部分は、ＡＢＭのその標的への結合を阻害する。マスキング部分の阻害活性は、切断可能部分の切断後に低減または排除される。そのようなＡＢＭは、切断可能部分が未切断である場合ＡＢＭが標的に接近しにくく、且つ切断剤の存在下で切断可能部分が切断された後に標的により接触しやすくになるように、「活性化可能な」コンフォメーションを示す。マスキング部分及び切断可能部分を利用する活性化可能な結合ポリペプチドの例及びそれを得る方法は、米国特許公開第２０１０／０１８９６５１；第２０１０／０２２１２１２号；第２０１３／０１０１５５５号；第２０１３／０３０９２３０号；第２０１３／０３１５９０６号；第２０１４／００２３６６４号；第２０１４／００４５１９５号；第２０１４／００２４８１０号；第２０１４；０２３５４６７号；第２０１４／０２５５３１３号；及び米国特許第８，３９９，２１９号；第８，５１３，３９０号；第８，５１８，４０４号；第８，５４１，２０３号；第８，５２９，８９８号；第８，５６３，２６９号（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）に提供される。
【０３２７】
７．医薬組成物及び投与方法
本明細書で提供されるＭＩＡＣは、任意の適切な医薬組成物中に提供することができ、任意の適切な投与経路で投与することができる。適切な投与経路としては、限定されないが非経口、吸入、動脈内、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、経鼻、肺及び皮下経路が挙げられる。
【０３２８】
医薬組成物は、１種または複数種の医薬品賦形剤を含むことができる。任意の適切な医薬品賦形剤を使用することができ、当業者は適切な医薬品賦形剤を選択することができる。したがって、以下に提供される医薬品賦形剤は例示を意図し、限定することを意図するものではない。さらなる医薬品賦形剤としては、例えば、全体が参照により組み込まれる、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），６ｔｈ  Ｅｄ．（２００９）に記載されているものが挙げられる。
【０３２９】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は溶媒を含む。いくつかの態様では、溶媒は、生理食塩水、例えば無菌の等張生理食塩水、またはデキストロース溶液である。いくつかの態様では、溶媒は注射用水である。
【０３３０】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は消泡剤を含む。任意の適切な消泡剤を使用することができる。いくつかの態様では、消泡剤はアルコール、エーテル、油、ワックス、シリコーン、界面活性剤及びこれらの組み合わせから選択される。いくつかの態様では、消泡剤は、鉱物油、植物油、エチレンビスステアロアミド、パラフィンワックス、エステルワックス、脂肪アルコールワックス、長鎖脂肪アルコール、脂肪酸石鹸、脂肪酸エステル、シリコングリコール、フルオロシリコーン、ポリエチレングリコール−ポリプロピレングリコールコポリマー、ポリジメチルシロキサン−二酸化ケイ素、エーテル、オクチルアルコール、カプリルアルコール、ソルビタントリオレート、エチルアルコール、２−エチル−ヘキサノール、ジメチコン、オレイルアルコール、シメチコン及びこれらの組み合わせから選択される。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は共溶媒を含む。共溶媒の実例としては、エタノール、ポリ（エチレン）グリコール、ブチレングリコール、ジメチルアセトアミド、グリセリン及びプロピレングリコールが挙げられる。
【０３３２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は緩衝剤を含む。緩衝剤の実例としては、酢酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、水酸化物、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、グリシン、メチオニン、グアーガム及びグルタミン酸モノナトリウムが挙げられる。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は担体または充填剤を含む。担体または充填剤の実例としては、ラクトース、マルトデキストリン、マンニトール、ソルビトール、キトサン、ステアリン酸、キサンタンガム及びグアーガムが挙げられる。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は界面活性剤を含む。界面活性剤の実例としては、ｄ−アルファトコフェロール、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、ドクサートナトリウム、ベヘン酸グリセリル、モノオレイン酸グリセリル、ラウリン酸、マクロゴール１５ヒドロキシステアレート、ミリスチルアルコール、リン脂質、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ステアリン酸ポリオキシエチレン、ポリオキシルグリセリド、ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタンエステル及びビタミンＥポリエチレン（グリコール）スクシネートが挙げられる。
【０３３５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は固化防止剤を含む。固化防止剤の実例としては、リン酸カルシウム（三塩基性）、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース及び酸化マグネシウムが挙げられる。
【０３３６】
医薬組成物とともに使用することができる他の賦形剤としては、例えば、アルブミン、抗酸化剤、抗菌剤、抗真菌剤、生体吸収性ポリマー、キレート剤、制御放出剤、希釈剤、分散剤、溶解増強剤、乳化剤、ゲル化剤、軟膏基剤、浸透促進剤、防腐剤、可溶化剤、溶媒、安定化剤及び糖が挙げられる。これらの剤のそれぞれの具体例は、例えば、全体が参照により組み込まれる、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．）６ｔｈ  Ｅｄ．（２００９），Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【０３３７】
いくつかの実施形態では、医薬組成物はマイクロ粒子またはナノ粒子などの粒子形態である。マイクロ粒子及びナノ粒子は、任意の適切な材料、例えば、ポリマーまたは脂質から形成することができる。いくつかの態様では、マイクロ粒子またはナノ粒子はミセル、リポソームまたはポリマーソームである。ある種の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、医薬組成物または単一単位剤形である。本明細書で提供される医薬組成物及び単一単位剤形は、予防的または治療的有効量の１種または複数種の予防的または治療的ＭＩＡＣを含む。
【０３３８】
水がいくつかのＭＩＡＣの分解を促進する可能性があるので、ＭＩＡＣを含む無水の医薬組成物及び剤形が本明細書にさらに包含される。
【０３３９】
本明細書で提供される無水の医薬組成物及び剤形は、無水成分または低水分含有成分及び低水分または低湿度条件を使用して調製することができる。製造、包装及び／または貯蔵中に水分及び／または湿度との実質的な接触が予想される場合、ラクトース及び一級または二級アミンを含む少なくとも１つの活性成分を含む医薬組成物及び剤形は無水であり得る。
【０３４０】
無水の医薬組成物は、その無水性が維持されるように調製及び貯蔵されるべきである。したがって、無水組成物を適切な製剤用キット中に含めることができるように、水への暴露を防止することが知られている材料を使用して無水組成物を包装することができる。適切な包装の例としては、限定されないが、密封されたホイル、プラスチック、単位用量容器（例えば、バイアル）、ブリスターパック及びストリップパックが挙げられる。
【０３４１】
７．１．非経口剤形
ある種の実施形態では、ＭＩＡＣを含む非経口剤形が提供される。非経口剤形は、限定されないが、皮下、静脈内（ボーラス注射を含める）、筋肉内及び動脈内を含めた、様々な経路で対象に投与することができる。それらの投与は、典型的には汚染物に対する対象の自然防御を迂回するので、非経口剤形は、典型的には、無菌であるか、対象への投与に先立って無菌化することができる。非経口剤形の例としては、限定されないが、注射用液剤、注射用の医薬的に許容可能なビヒクルに容易に溶解または懸濁される乾燥製品、注射用懸濁剤及び乳剤が挙げられる。
【０３４２】
非経口剤形を提供するのに使用することができる適切なビヒクルは当業者に周知である。例としては、限定されないが、以下が挙げられる：注射用水ＵＳＰ；水性ビヒクル、例えば、限定されないが、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、デキストロース注射液、デキストロースと塩化ナトリウムの注射液及び乳酸化リンガー注射液；水混和性ビヒクル、例えば限定されないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコール；ならびに非水性ビヒクル、例えば限定されないが、トウモロコシ油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、イソプロピルミリステート及びベンジル安息香酸。
【０３４３】
本明細書に開示されるＭＩＡＣの１つまたは複数の溶解度を増大させる賦形剤を非経口剤形に組み入れることもできる。
【０３４４】
８．アッセイ
活性用の任意の適切なインビトロまたはインビボアッセイを使用して、本明細書で提供されるＭＩＡＣの活性を評価することができる。いくつかの実施形態では、多数のＭＩＡＣ構築物を効率的に調べることを可能にするために、これらのアッセイをハイスループットアプローチに適合させることができる。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、アッセイはエフェクター細胞の増殖を測定する。任意の適切なアッセイを使用して、エフェクター細胞の増殖を測定することができる。エフェクター細胞の増殖を測定するのに適したアッセイとしては、例えば、３Ｈ−チミジンの取り込み、ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）希釈アッセイ及びＫｉ６７抗原発現の抗体検出が挙げられる。Ｇｏｎｇ  ａｎｄ  Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ，，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１９９４，８：６５２−６５８；Ｐａｒｉｓｈ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９９９，７７：４９９−５０８；ならびにＬｙｏｎｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０００，２４３：１４７−１５４、及びＳｏａｒｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１０，３６２（１−２）：４３−５０（これらのそれぞれは、その全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。
【０３４６】
いくつかの実施形態では、アッセイは、エフェクター細胞の刺激及び／または抑制を測定する。いくつかの実施形態では、サイトカイン及び／またはケモカインの生成を測定することによって、エフェクター細胞の活性化及び／または抑制を評価することができる。任意の適切なサイトカイン及び／またはケモカインの生成を測定することができる。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１５、ＭＩＰ−アルファ／ベータ、ＲＡＮＴＥＳから選択される１種または複数種のサイトカイン及び／またはケモカインの生成を測定する。任意の適切なアッセイを使用して、サイトカイン及び／またはケモカインの生成を測定することができる。適切なアッセイとしては、例えば、ＢＤ（商標）サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）アッセイ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）ｘＭＡＰ（登録商標）技術（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及びＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（例えば、Ｍａｂｔｅｃｈ、ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ）が挙げられる。
【０３４７】
いくつかの実施形態では、アッセイは、エフェクター細胞の細胞傷害活性を測定する。任意の適切なアッセイを使用して、エフェクター細胞の細胞傷害活性を測定することができる。エフェクター細胞の細胞傷害活性の測定に適したアッセイとしては、例えば、クロム５１放出アッセイ、グランザイムＢ  ＥＬＩＳｐｏｔまたはＬｕｍｉｎｅｘアースのアッセイ、ＣＤ１０７ａの細胞表面動員の測定、カスパーゼ−３アッセイ、フルオロフォアＰＫＨ−２６及びＴＯ−ＰＲＯ−３ヨウ化物を用いるフローサイトメトリーアッセイならびにＡＤＣＣアッセイ、例えば、ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が挙げられる。Ｓｈａｆｅｒ−Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，２００３，１：１４；Ｒｉｎｉｎｓｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０００，２４０：１４３−１５５；Ｂｅｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００３、２８：６５−７８；Ｊｅｒｏｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，２００３，８：５６３−５７１；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００５，３０４：４３−５９；Ｌｅｅ−ＭａｃＡｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，２５２：８３−９２；ａｎｄ  Ａｋｔａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００９，２５４：１４９−１５４を参照されたい。
【０３４８】
いくつかの実施形態では、アッセイはエフェクター細胞の健全性を測定する。任意の適切なアッセイを使用して、エフェクター細胞の健全性を測定することができる。エフェクター細胞の健全性を測定するのに適したアッセイとしては、例えば、アポトーシスについてのアッセイが挙げられる。アネキシンＶアッセイ及びアネキシンＶ  ＦＩＴＣアッセイ（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含めた任意の適切なアッセイを使用して、アポトーシスを測定することができる。Ｖｅｒｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５，８４：３９−５１；及びＰｏｇｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００５，１７：２６５３−２６６０を参照されたい。
【０３４９】
９．投薬量及び単位剤形
ヒトの治療法では、医師は、予防的または治癒的治療に従って、ならびに年齢、体重、状態及び治療される対象に特異的な他の要因に従って、最も適切だと考える薬量を決定する。
【０３５０】
障害またはその１つもしくは複数の症状の予防または治療に有効であろうＭＩＡＣの量は、疾患または状態の性質及び重症度ならびにＭＩＡＣが投与される経路によって変化する。頻度及び投薬量も、施される特定の療法（例えば、治療剤または予防剤）、障害、疾患または状態の重症度、投与経路ならびに対象の年齢、身体、体重、応答及び既往歴に応じて、各対象に特異的な要因によって変動する。インビトロまたは動物モデルの試験系に由来する用量応答曲線から、有効量を外挿することができる。
【０３５１】
ある種の実施形態では、組成物の例示的用量としては、対象または試料の重量のキログラムあたりでミリグラムまたはマイクログラム量のＭＩＡＣ（例えば、キログラムあたり約１０マイクログラム〜キログラムあたり約５０ミリグラム、キログラムあたり約１００マイクログラム〜キログラムあたり約２５ミリグラム、またはキログラムあたり約１００マイクログラム〜キログラムあたり約１０ミリグラム）が挙げられる。ある種の実施形態では、対象の障害またはその１つもしくは複数の症状を予防する、治療する、管理する、または好転させるために投与されるＭＩＡＣの重量に基づく、本明細書で提供されるＭＩＡＣの投薬量は、対象の体重について０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上である。別の実施形態では、対象の障害またはその１つもしくは複数の症状を予防する、治療する、管理する、または好転させるために投与される、本明細書で提供されるＭＩＡＣの投薬量は、０．１ｍｇ〜２００ｍｇ、０．１ｍｇ〜１００ｍｇ、０．１ｍｇ〜５０ｍｇ、０．１ｍｇ〜２５ｍｇ、０．１ｍｇ〜２０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１５ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．１ｍｇ〜７．５ｍｇ、０．１ｍｇ〜５ｍｇ、０．１〜２．５ｍｇ、０．２５ｍｇ〜２０ｍｇ、０．２５〜１５ｍｇ、０．２５〜１２ｍｇ、０．２５〜１０ｍｇ、０．２５ｍｇ〜７．５ｍｇ、０．２５ｍｇ〜５ｍｇ、０．２５ｍｇ〜２．５ｍｇ、０．５ｍｇ〜２０ｍｇ、０．５〜１５ｍｇ、０．５〜１２ｍｇ、０．５〜１０ｍｇ、０．５ｍｇ〜７．５ｍｇ、０．５ｍｇ〜５ｍｇ、０．５ｍｇ〜２．５ｍｇ、１ｍｇ〜２０ｍｇ、１ｍｇ〜１５ｍｇ、１ｍｇ〜１２ｍｇ、１ｍｇ〜１０ｍｇ、１ｍｇ〜７．５ｍｇ、１ｍｇ〜５ｍｇまたは１ｍｇ〜２．５ｍｇである。
【０３５２】
用量は、適切なスケジュールに従って、例えば、毎週１回、２回、３回もしくは４回；毎月１回、２回、３回もしくは４回；または毎年１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回もしくは１２回投与することができる。当業者に明らかなように、ある場合には、本明細書に開示される範囲を外れたＭＩＡＣの投薬量を使用することが必要であり得る。さらに、臨床医または治療担当医師が、対象の応答に関連して、療法を中断する、調整するまたは終了する方法及び時期を知ることに留意されたい。
【０３５３】
当業者なら容易に分かるように、異なる疾患及び状態に対して異なる治療有効量が適用可能である。同様に、そのような障害を予防する、管理する、治療する、または好転させるのに十分であるが、本明細書で提供されるＭＩＡＣに付随する有害作用を引き起こすのには不十分であるか、そうした有害作用を低減させるのに十分である量も、本明細書に記載される投薬量及び投与頻度スケジュールに包含される。さらに、対象が本明細書で提供される組成物の複数の投薬量を投与される場合は、投薬量のすべてが同じである必要はない。例えば、対象に投与される投薬量は、組成物の予防的または治療的効果を向上させるために増大させることができ、または特定の対象が経験する１種または複数種の副作用を低減させるために低下させることができる。
【０３５４】
ある種の実施形態では、治療または予防は、本明細書で提供されるＭＩＡＣまたは組成物の１種または複数種の負荷量で開始し、その後に１種または複数種の維持量を続けることができる。
【０３５５】
ある種の実施形態では、対象の血液または血清においてＭＩＡＣの定常状態濃度を達成するように、本明細書で提供されるＭＩＡＣまたは組成物の用量を投与することができる。定常状態濃度は、当業者が利用可能な技法に従って測定することによって決定することができ、または対象の身体的特徴、例えば、身長、体重及び年齢に基づき得る。
【０３５６】
ある種の実施形態では、同じ組成物の投与を繰り返すことができ、少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２か月、７５日、３か月または６か月、投与を離すことができる。他の実施形態では、同じ予防剤または治療剤の投与を繰り返すことができ、少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２か月、７５日、３か月または６か月、投与を離すことができる。
【０３５７】
ある種の実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣをさらなる治療剤と同時に投与することができる。さらなる治療剤の例示としては、例えば、アルキル化剤（例えば、ベンダムスチン、ブスルファン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、ダカルバジン、イホスファミド、メルファラン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、テモゾロミド）；代謝拮抗薬（例えば、アスパラギナーゼ、カペシタビン、シタラビン、５−フルオロウラシル、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド）；抗腫瘍抗生物質（例えば、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン、ミトキサントロン）；微小管阻害剤（例えば、エトポシド、ドセタキセル、イリノテカン、パクリタキセル、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン）；ＤＮＡ結合剤（例えば、カルボプラチン、シスプラチン、オキサリプラチン）；生物学的剤（例えば、アレムツズマブ、ベバシズマブ、ブレンツキシマブ、セツキシマブ、デノスマブ、イブリツモマブ、インターフェロン、イピリムマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、ラムシルマブ、リツキシマブ、ルクソリチニブ、シルツキシマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ）；キナーゼ阻害剤（例えば、アファチニブ、アキシチニブ、ボスチニブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イブルチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、パゾパニブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、ルクソリチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、トラメチニブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ）；ラパマイシン誘導体（例えば、ラパマイシン、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、デフォロリムス）；ビスホスホネート（例えば、クロドロネート、イバンドロン酸、パミドロネート、ゾレドロン酸）；ならびにホルモン及び他の薬物（例えば、アナストロゾール、アビラテロン、アミホスチン、ベキサロテン、ビカルタミド、ブセレリン、シプロテロン、デガレリクス、エキセメスタン、フルタミド、フォリン酸、フルベストラント、ゴセレリン、ランレオチド、レナリドマイド、レトロゾール、リュープロレリン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メスナ、オクトレオチド、スチルベストロール、タモキシフェン、サリドマイド、トリプトレリン）が挙げられる。
【０３５８】
本明細書で提供されるＭＩＡＣとともに有用なさらなる治療剤の追加例としては、アビラテロン、アルデスロイキン、アミノレブリン酸、アプレピタント、アナストロゾール、ベンダムスチン、ベキサロテン、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カバジタキセル、カボザンチニブ−Ｓ−リンゴ酸塩、カペシタビン、カルボプラチン、カルフィルゾミブ、クロラムブシル、クロファラビン、シスプラチン、シタラビン、ダクチノマイシン、ダブラフェニブ、ダカルバジン、ダサチニブ、デシタビン、デガレリクス、デニロイキンジフチトクス、デキスラゾキサン、ドセタキセル、エルトロンボパグ、エンザルタミド、エピルビシン、エリブリン、エルロチニブ、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルオロウラシル、フルベストラント、ゲムシタビン、グルカルピダーゼ、ゴセレリン、イホスファミド、イミキモド、インターフェロンアルファ−２ｂ、イリノテカン、イキサベピロン、レナリドマイド、レトロゾール、ロイコボリン、リュープロリド、ロムスチン、メクロレタミン、メゲストロール、メルカプトプリン、メシレート、マイトマイシンＣ、ナベルビン、ネララビン、オマセタキシン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パリフェルミン、パロノセトロン、パミドロネート、ペメトレキセド、プレリキサホル、ポマリドミド、ポナチニブ、プララトレキサート、プロカルバジン、ラロキシフェン、ラスブリカーゼ、ロミデプシン、ロミプロスチム、テモゾロミド、トポテカン、トレミフェン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、ボリノスタット、ビスモデギブ及びゾレドロン酸が挙げられる。
【０３５９】
これらの剤は、本明細書で提供されるＭＩＡＣと同時投与することができ、または任意の適切なスケジュールに従って投与することができる。いくつかの実施形態では、剤は本明細書で提供されるＭＩＡＣとともに単位剤形中に製剤化される。いくつかの実施形態では、剤は本明細書で提供されるＭＩＡＣにコンジュゲートされる。
【０３６０】
１０．治療適用
治療適用については、本発明のＭＩＡＣは、当技術分野で既知のもの及び上述のものなどの医薬的に許容可能な剤形で、哺乳動物、一般にヒトに投与される。例えば、本発明のＭＩＡＣは、ヒトに対して、ボーラスとしてまたはある期間にわたる持続注入によって静脈内に、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、髄腔内または腫瘍内の経路によって、投与することができる。ＭＩＡＣはまた、局部的及び全身的な治療効果を発揮するために、腫瘍周囲、病巣内または病変周囲経路によって適切に投与される。腹腔内経路は、例えば卵巣腫瘍の治療において、特に有用であり得る。
【０３６１】
本明細書で提供されるＭＩＡＣは、標的エフェクター細胞の活性化が治療上有効である任意の疾患または状態、例えば癌の治療に有用であり得る。
【０３６２】
任意の適切な癌を本明細書で提供されるＭＩＡＣで治療することができる。例示的な適切な癌としては、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、基底細胞癌、脳腫瘍、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、原発不明癌、心臓腫瘍、子宮頸癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性新生物、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、腺管癌、胚芽腫、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、線維性組織球腫、ユーイング肉腫、眼癌、胚細胞腫瘍、胆嚢癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、頭頸部癌、ヘアリーセル白血病、肝細胞癌、組織球増殖症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病、唇及び口腔の癌、肝臓癌、非浸潤性小葉癌、肺癌、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、ＮＵＴ遺伝子関与正中管癌腫、口腔癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性新生物、鼻腔及び副鼻腔の癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂及び尿管の癌、網膜芽細胞腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺癌、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、脊髄腫瘍、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、Ｔ細胞リンパ腫、奇形腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、腟癌、外陰癌ならびにウィルムス腫瘍が挙げられる。
【０３６３】
いくつかの実施形態では、有効量のＭＩＡＣを対象に投与することを含む、疾患を有する対象を治療する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、有効量のＭＩＡＣ含有医薬組成物を対象に投与することを含む、疾患を有する対象を治療する方法が本明細書で提供される。いくつかの態様では、疾患は癌である。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、癌細胞をＭＩＡＣと接触させることを含む癌細胞を死滅させる方法であって、ＭＩＡＣが癌細胞を死滅させるエフェクター細胞を活性化する方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。いくつかの実施形態では、方法はインビボ法である。
【０３６５】
エフェクター細胞をＭＩＡＣと接触させることを含むエフェクター細胞を活性化する方法であって、ＭＩＡＣがエフェクター細胞を活性化する方法も提供される。いくつかの実施形態では、方法はインビトロ法である。いくつかの実施形態では、方法はインビボ法である。いくつかの態様では、方法は癌細胞に近接して行われる。いくつかの態様では、近接は、エフェクター細胞が癌細胞に対して細胞傷害活性を発揮するほど十分に近いものである。
【０３６６】
１１．診断適用
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣは診断適用で使用される。例えば、検出可能な部分でＭＩＡＣを標識することができる。適切な検出可能な部分としては、限定されないが、放射性同位体、蛍光標識及び酵素−基盤標識が挙げられる。
【０３６７】
１２．キット
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＭＩＡＣは、キットの形態で提供される。いくつかの実施形態では、キットは、手順を実施ための説明書とともに、所定量の試薬のパッケージ化された組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、手順は治療手順である。他の実施形態では、手順は診断アッセイである。さらに他の実施形態では、手順は研究アッセイである。
【０３６８】
いくつかの実施形態では、キットはＭＩＡＣを再構成するための溶媒をさらに含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＡＣは医薬組成物の形態で提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は凍結乾燥した医薬組成物である。
【実施例】
【０３６９】
実施例１：ＭＩＡＣ１：ＣＤ３０、ＣＤ１３７及び阻害性ＫＩＲを標的とするＩｇＧ−ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ  ＭＩＡＣ
本明細書に記載のＭＩＡＣを以下の抗原結合モジュールで作製する。ＡＢＭ１は古典的ホジキンリンパ腫及び全身性未分化大細胞型リンパ腫で発現されるタンパク質であるＣＤ３０と結合する。ＡＢＭ２は、エフェクター細胞によって発現される活性化受容体であるＣＤ１３７と結合し、これを刺激する。ＡＢＭ３は、エフェクター細胞によって発現される阻害性ＫＩＲ受容体と結合し、これに拮抗する。
【０３７０】
本実施例では、ＡＢＭ１はブレンツキシマブ（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標））由来のＩｇＧである。ＡＢＭ２は、ウレルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）から生成したｓｃＦｖであるである。ＡＢＭ３はリリルマブ（Ｉｎｎａｔｅ  Ｐｈａｒｍａ）から生成したｓｃＦｖである。重鎖と軽鎖の間に（ＧＧＧＧＳ）４（配列番号２４）リンカーを使用して、標準的な技法によって、ｓｃＦｖをアセンブルする。両方の順序（すなわち、ＶＨ−リンカー−ＶＬ及びＶＬ−リンカー−ＶＨ）でｓｃＦｖをアセンブルする。Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．（１９９４）．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｉｎ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  Ｍ．＆  Ｍｏｏｒｅ  Ｇ．Ｐ．（Ｅｄｓ．），Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｖｏｌ．１１３（ｐｐ．２６９−３１５）を参照されたい。
【０３７１】
標準的な分子生物学的技法を使用して、３つのＡＢＭ及び適切な融合タンパク質をコードする核酸をアセンブルする。本実施例で使用する融合タンパク質は、（１）ＶＨ−ＡＢＭ２融合、（２）ＶＨ−ＡＢＭ３融合、（３）ＶＬ−ＡＢＭ２融合及び（４）ＶＬ−ＡＢＭ３融合を含む。
【０３７２】
本実施例では、２つのＡＢＭ１部位が存在し、これらは、ＩｇＧの４つの可変ドメイン（２つのＶＨ及び２つのＶＬ）によって形成される。以下に記載のように、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３部位の数は変動する。本実施例のＭＩＡＣは、ＩｇＧのＦｃ領域によって形成されるＡＢＭ４も含む。本開示の他の個所で記載するように、このドメインは、Ｆｃ受容体を発現するエフェクター細胞、例えばＮＫ細胞に結合することができる。
【０３７３】
１０の異なるタイプのＭＩＡＣ（１．１〜１．１０として指定される）をコードする核酸を合成し、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトする。ＭＩＡＣを発現させ、プロテインＡカラムを使用して精製する。ＭＩＡＣ１．１を図２Ａに示す。ＭＩＡＣ１．２を図２Ｂに示す。ＭＩＡＣ１．３を図２Ｃに示す。ＭＩＡＣ１．４を図２Ｄに示す。ＭＩＡＣ１．５を図３Ａに示す。ＭＩＡＣ１．６を図３Ｂに示す。ＭＩＡＣ１．７を図３Ｃに示す。ＭＩＡＣ１．８を図３Ｄに示す。ＭＩＡＣ１．９を図４Ａに示す。ＭＩＡＣ１．１０を図４Ｂに示す。
【０３７４】
ＮＫ細胞を活性化する能力ならびに癌細胞及び腫瘍を破壊する能力について、インビトロ及びインビボでＭＩＡＣを試験する。インビトロアッセイは、ＭＩＡＣに暴露した後のＣＤ１６のダウンレギュレーション、ＣＤ６９のアップレギュレーション、ＬＡＭＰ１＋細胞のパーセンテージ、インターフェロンガンマ放出、７−ＡＡＤ陽性細胞のパーセンテージ及び増殖ならびにＭＩＡＣの存在下でエフェクター細胞に曝露したラージ細胞の死滅を測定することによってＮＫ細胞の活性化をモニタリングすることを含む。インビボアッセイは、誘導した腫瘍または腫瘍異種移植片を有する動物を本明細書で提供されるＭＩＡＣで処置することによって実施する。
【０３７５】
エフェクター細胞の増殖は、３Ｈ−チミジンによって評価する。エフェクター細胞の刺激は、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１５、ＭＩＰ−アルファ／ベータ及びＲＡＮＴＥＳの濃度を測定するためのＢＤ（商標）サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）アッセイを使用してサイトカイン及びケモカイン分泌を測定することによって測定する。細胞傷害活性は、クロム５１放出アッセイ、グランザイムＢ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ、ＣＤ１０７ａの細胞表面動員の測定、カスパーゼ−３アッセイならびにフルオロフォアＰＫＨ−２６及びＴＯ−ＰＲＯ−３ヨウ化物を用いるフローサイトメトリーアッセイによって測定する。エフェクター細胞の健全性は、アネキシンＶ  ＦＩＴＣアッセイによって測定する。
【０３７６】
実施例２：ＭＩＡＣ２：ＣＤ２０、ＮＫＧ２Ｄ及び阻害性ＫＩＲを標的とするＩｇＧ−ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ  ＭＩＡＣ
本明細書に記載のＭＩＡＣを以下の抗原結合モジュールで作製する。ＡＢＭ１は、Ｂ細胞の表面で発現され、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病の治療に関連するタンパク質である、ＣＤ２０と結合する。ＣＤ２０に対するＡＢＭの例はリツキシマブである。ＡＢＭ２は、エフェクター細胞によって発現される活性化受容体であるＮＫＧ２Ｄと結合し、これを刺激する。ＡＢＭ３は、エフェクター細胞によって発現される阻害性ＫＩＲ受容体と結合し、これに拮抗する。
【０３７７】
ＭＩＡＣ２．１〜２．１０（図２Ａ〜４Ｂに提供されるＭＩＡＣに対応する）を、実施例１に記載されているように合成し、特徴づけする。
【０３７８】
実施例３：ＭＩＡＣ３：ＣＤ２０、ＮＫＧ２Ｄ及び阻害性ＫＩＲを標的とするｓｃＦｖ−ＩｇＧ−ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ−ＩｇＧ  ＭＩＡＣ
本明細書に記載のＭＩＡＣを以下の抗原結合モジュールで作製する。ＡＢＭ１は、Ｂ細胞の表面で発現され、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病の治療に関連するタンパク質である、ＣＤ２０と結合する。ＡＢＭ２は、エフェクター細胞によって発現される活性化受容体であるＮＫＧ２Ｄと結合し、これを刺激する。ＡＢＭ３は、エフェクター細胞によって発現される阻害性ＫＩＲ受容体と結合し、これに拮抗する。
【０３７９】
このＭＩＡＣの２つの構成を生成する。第１の構成では、ＡＢＭ１はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ２はＩｇＧであり、ＡＢＭ３はｓｃＦｖである（ＭＩＡＣ３．１）。このＭＩＡＣの例を図５Ａに示す。第２の構成では、ＡＢＭ１はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ２はｓｃＦｖであり、ＡＢＭ３はＩｇＧである（ＭＩＡＣ３．２）。このＭＩＡＣの例を図５Ｂに示す。
【０３８０】
実施例４：ＭＩＡＣ４：ＣＤ２０、ＮＫＧ２Ｄ及び阻害性ＫＩＲを標的とするｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ  ＭＩＡＣ
本明細書に記載のＭＩＡＣを以下の抗原結合モジュールで作製する。ＡＢＭ１は、Ｂ細胞の表面で発現され、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病の治療に関連するタンパク質である、ＣＤ２０と結合する。ＡＢＭ２は、エフェクター細胞によって発現される活性化受容体であるＮＫＧ２Ｄと結合し、これを刺激する。ＡＢＭ３は、エフェクター細胞によって発現される阻害性ＫＩＲ受容体と結合し、これに拮抗する。
【０３８１】
このＭＩＡＣでは、ＡＢＭ１、ＡＢＭ２及びＡＢＭ３のそれぞれはｓｃＦｖである。ＭＩＡＣは、Ｎ末端のＡＢＭ１、中央のＡＢＭ２及びＣ末端のＡＢＭ３との融合タンパク質として発現される。このＭＩＡＣの例を図６に示す。
【０３８２】
実施例５：ＭＩＡＣ５：ＣＤ２０及びＮＫＧ２Ｄを標的とするＩｇＧ−ｓｃＦｖ  ＭＩＡＣ
本明細書に記載のＭＩＡＣを以下の抗原結合モジュールで作製する。ＡＢＭ１は、Ｂ細胞の表面で発現され、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病の治療に関連するタンパク質である、ＣＤ２０と結合する。ＡＢＭ２は、エフェクター細胞によって発現される活性化受容体であるＮＫＧ２Ｄと結合し、これを刺激する。
【０３８３】
ＭＩＡＣ５．１〜５．６（図１１Ａ〜Ｂ、１２Ａ、１３Ａ〜Ｂ及び１４Ａに提供されるＭＩＡＣに対応する）を、実施例１に記載されているように合成し、特徴づけする。
【０３８４】
実施例６：ＭＩＡＣ６：ＣＤ２０及び阻害性ＫＩＲを標的とするＩｇＧ−ｓｃＦｖ  ＭＩＡＣ
本明細書に記載のＭＩＡＣを以下の抗原結合モジュールで作製する。ＡＢＭ１は、Ｂ細胞の表面で発現され、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病の治療に関連するタンパク質である、ＣＤ２０と結合する。ＡＢＭ３は、エフェクター細胞によって発現される阻害性受容体である阻害性ＫＩＲと結合し、これに拮抗する。
【０３８５】
ＭＩＡＣ６．１〜６．６（図１１Ｃ〜Ｄ、１２Ｂ、１３Ｃ〜Ｄ及び１４Ｂに提供されるＭＩＡＣに対応する）を実施例１に記載されているように合成し、特徴づけする。
【０３８６】
実施例７：ＭＩＡＣ７：ＣＤ２０及びＮＫＧ２Ｄを標的とするｓｃＦｖ−ＩｇＧ  ＭＩＡＣ
本明細書に記載のＭＩＡＣを以下の抗原結合モジュールで作製する。ＡＢＭ１は、Ｂ細胞の表面で発現され、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病の治療に関連するタンパク質である、ＣＤ２０と結合する。ＡＢＭ２は、エフェクター細胞によって発現される活性化受容体であるＮＫＧ２Ｄと結合し、これを刺激する。
【０３８７】
ＡＢＭ１はｓｃＦｖであり、１つのＡＢＭ２はＩｇＧであり、第２のＡＢＭ２はｓｃＦｖである（ＭＩＡＣ７．１）。このＭＩＡＣの例を図１５Ａに示す。このＭＩＡＣを実施例１に記載されているように合成し、特徴づけする。
【０３８８】
実施例８：ＭＩＡＣ８：ＣＤ２０及び阻害性ＫＩＲを標的とするｓｃＦｖ−ＩｇＧ  ＭＩＡＣ
本明細書に記載のＭＩＡＣを以下の抗原結合モジュールで作製する。ＡＢＭ１は、Ｂ細胞の表面で発現され、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病の治療に関連するタンパク質である、ＣＤ２０と結合する。ＡＢＭ３は、エフェクター細胞によって発現される阻害性受容体である阻害性ＫＩＲと結合し、これに拮抗する。
【０３８９】
ＡＢＭ１はｓｃＦｖであり、１つのＡＢＭ３はＩｇＧであり、第２のＡＢＭ３はｓｃＦｖである（ＭＩＡＣ７．１）。このＭＩＡＣの例を図１５Ｂに示す。このＭＩＡＣを実施例１に記載されているように合成し、特徴づけする。
【０３９０】
実施例９：ＭＩＡＣ９：ＣＤ２０及びＮＫＧ２Ｄを標的とするｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ  ＭＩＡＣ
本明細書に記載のＭＩＡＣを以下の抗原結合モジュールで作製する。ＡＢＭ１は、Ｂ細胞の表面で発現され、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病の治療に関連するタンパク質である、ＣＤ２０と結合する。ＡＢＭ２は、エフェクター細胞によって発現される活性化受容体であるＮＫＧ２Ｄと結合し、これを刺激する。
【０３９１】
このＭＩＡＣでは、ＡＢＭ１及びＡＢＭ２のそれぞれはｓｃＦｖである。ＭＩＡＣは、Ｎ末端のＡＢＭ１、中央のＡＢＭ２及びＣ末端のＡＢＭ２との融合タンパク質として発現される。このＭＩＡＣの例（ＭＩＡＣ９．１）を図１６Ａに示す。このＭＩＡＣを実施例１に記載されているように合成し、特徴づけする。
【０３９２】
実施例１０：ＭＩＡＣ１０：ＣＤ２０及び阻害性ＫＩＲを標的とするｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ  ＭＩＡＣ
本明細書に記載のＭＩＡＣを以下の抗原結合モジュールで作製する。ＡＢＭ１は、Ｂ細胞の表面で発現され、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病の治療に関連するタンパク質である、ＣＤ２０と結合する。ＡＢＭ３は、エフェクター細胞によって発現される阻害性受容体である阻害性ＫＩＲと結合し、これに拮抗する。
【０３９３】
このＭＩＡＣでは、ＡＢＭ１及びＡＢＭ３のそれぞれはｓｃＦｖである。ＭＩＡＣは、Ｎ末端のＡＢＭ１、中央のＡＢＭ３及びＣ末端のＡＢＭ３との融合タンパク質として発現される。このＭＩＡＣの例（ＭＩＡＣ１０．１）を図１６Ｂに示す。このＭＩＡＣを実施例１に記載されているように合成し、特徴づけする。
【０３９４】
実施例１１：ＭＩＡＣ１１：ＣＤ２０、ＮＫＧ２Ｄ及び阻害性ＫＩＲを標的とするｓｃＦｖ−ＩｇＧベースのＭＩＡＣ
本明細書に記載のＭＩＡＣを以下の抗原結合モジュールで作製する。ＡＢＭ１は、Ｂ細胞の表面で発現され、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病の治療に関連するタンパク質である、ＣＤ２０と結合する。ＡＢＭ２は、エフェクター細胞によって発現される活性化受容体であるＮＫＧ２Ｄと結合し、これを刺激する。ＡＢＭ３は、エフェクター細胞によって発現される阻害性受容体である阻害性ＫＩＲと結合し、これに拮抗する。
【０３９５】
このＭＩＡＣでは、ＡＢＭ１はｓｃＦｖである。ＡＢＭ２及び３はＩｇＧベースの分子の可変ドメインである。一実施形態（図１７Ａ；ＭＩＡＣ１１．１）では、ＡＢＭ３結合部位はＩｇＧベースの分子の最もＮ末端の結合部位である。別の実施形態（図１７Ｂ；ＭＩＡＣ１１．２）では、ＡＢＭ２結合部位はＩｇＧベースの分子の最もＮ末端の結合部位である。このＭＩＡＣを実施例１に記載されているように合成し、特徴づけする。
【０３９６】
実施例１２：ＭＩＡＣ１２：ＣＤ２０及びＮＫＧ２Ｄまたは阻害性ＫＩＲを標的とするｓｃＦｖ−ＩｇＧベースのＭＩＡＣ
本明細書に記載のＭＩＡＣを以下の抗原結合モジュールで作製する。ＡＢＭ１は、Ｂ細胞の表面で発現され、Ｂ細胞リンパ腫及び白血病の治療に関連するタンパク質である、ＣＤ２０と結合する。ＡＢＭ２は、エフェクター細胞によって発現される活性化受容体であるＮＫＧ２Ｄと結合し、これを刺激する。ＡＢＭ３は、エフェクター細胞によって発現される阻害性受容体である阻害性ＫＩＲと結合し、これに拮抗する。このＭＩＡＣは、ＡＢＭ２またはＡＢＭ３のいずれかを含むが、両方は含まない。
【０３９７】
このＭＩＡＣでは、ＡＢＭ１はｓｃＦｖである。ＡＢＭ２及び３はＩｇＧベースの分子の可変ドメインである。一実施形態（図１８Ａ；ＭＩＡＣ１２．１）では、ＡＢＭ２結合部位はＩｇＧベースの分子によって形成される。別の実施形態（図１８Ｂ；ＭＩＡＣ１２．２）では、ＡＢＭ３結合部位はＩｇＧベースの分子によって形成される。このＭＩＡＣを実施例１に記載されているように合成し、特徴づけする。
【０３９８】
実施例１３：ＣＤ３０、ＣＤ１３７及びＰＤ−１を標的とするＭＩＡＣ１３：ｓｃＦｖ−ＩｇＧ  ＭＩＡＣ
本明細書に記載のＭＩＡＣを以下の抗原結合モジュールで作製する。ＡＢＭ１は、古典的ホジキンリンパ腫及び全身性未分化大細胞型リンパ腫で発現されるタンパク質である、ＣＤ３０と結合する。ＡＢＭ２は、エフェクター細胞によって発現される活性化受容体であるＣＤ１３７と結合し、これを刺激する。ＡＢＭ３は、エフェクター細胞によって発現される阻害性受容体である阻害性ＫＩＲであるＰＤ−１と結合し、これに拮抗する。
【０３９９】
このＭＩＡＣでは、ＡＢＭ１はＩｇＧである。ＡＢＭ２及び３はｓｃＦｖである。図１９に例示するように、ＡＢＭ２及び３ｓｃＦｖはＡＢＭ１を形成するＩｇＧの重鎖のＣ末端に結合している。２つの重鎖及び軽鎖の配列を配列番号１〜３に提供する。
【０４００】
このＭＩＡＣを実施例１に記載されているように合成し、特徴づけする。
【０４０１】
実施例１４：ＭＩＡＣ１４：ＣＤ３０、ＣＤ１３７及びＰＤ−１を標的とするｓｃＦｖ−ＩｇＧベースのＭＩＡＣ
本明細書に記載のＭＩＡＣを以下の抗原結合モジュールで作製する。ＡＢＭ１は古典的ホジキンリンパ腫及び全身性未分化大細胞型リンパ腫で発現されるタンパク質である、ＣＤ３０と結合する。ＡＢＭ２は、エフェクター細胞によって発現される活性化受容体であるＣＤ１３７と結合し、これを刺激する。ＡＢＭ３は、エフェクター細胞によって発現される阻害性受容体である阻害性ＫＩＲであるＰＤ−１と結合し、これに拮抗する。
【０４０２】
図２０に示すように、このＭＩＡＣでは、２つのＡＢＭ１  ｓｃＦｖはＩｇＧ様分子の重鎖のＣ末端に結合している。ＩｇＧ様分子のＮ末端領域は、２つのＡＢＭ２結合部位を形成するＶＨ−ＶＬ領域及び２つのＡＢＭ３結合部位を形成するＶＨ−ＶＬ領域を含む。このＭＩＡＣでは、ＡＢＭ３結合部位は、ＩｇＧ様分子によって形成される最もＮ末端のＡＢＭである。重鎖及び軽鎖の配列を配列番号５〜６に提供する。
【０４０３】
このＭＩＡＣを実施例１に記載されているように合成し、特徴づけする。
【０４０４】
実施例１５：例示的な単一特異性、二重特異性及び三重特異性ＭＩＡＣ構築物の調製
以下に記載のように、個別の腫瘍関連抗原、チェックポイント受容体及び活性化受容体、またはこれらの組み合わせを標的とするいくつかの例示的な単一特異性、二重特異性及び三重特異性ＭＩＡＣ構築物を調製した。例示的抗体型式の代表を図２１に示す。二重特異性構築物については、標的１に対するｓｃＦｖを、標的２に対する全長ＩｇＧ１抗体の重鎖のＣ末端に（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号２３）を介して遺伝学的に融合した。三重特異性構築物については、標的１及び２に対するｓｃＦｖを、それぞれ、標的３に対する全長ＩｇＧ１抗体の重鎖及び軽鎖のＣ末端に（Ｇ４Ｓ）３リンカー（配列番号２３）を介して遺伝学的に融合した。抗ＣＤ３結合ドメインを含む構築物については、Ｎ結合型グリコシル化を防止する及びＡＤＣＣを低減するために、Ｆｃドメインのアミノ酸Ｎ２９７をアラニンに変異させた。
【０４０５】
例示的な単一特異性、二重特異性及び三重特異性構築物
表Ａ〜Ｃに示すように、例示的な単一特異性、二重特異性及び三重特異性抗体構築物を調製した。
【０４０６】
（表Ａ）例示的単一特異性タンパク質
2019509055.tif 000007
【０４０７】
（表Ｂ）例示的二重特異性タンパク質
2019509055.tif 000008
【０４０８】
（表Ｃ）例示的三重特異性タンパク質
2019509055.tif 000009
【０４０９】
各単一特異性、二重特異性及び三重特異性構築物の軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子をＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって合成し、それらのｐＤ２６１０．ｖ１０発現ベクターにクローニングした。製造者の指示書に従ってＱｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｐｌｕｓキットを使用して、プラスミドをスケールアップし、精製した。
【０４１０】
実施例１６：例示的な単一特異性、二重特異性及び三重特異性ＭＩＡＣ構築物のベンチスケールの発現及び精製
ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）によって、最終的な遺伝子産物を市販の哺乳類発現ベクターｐＤ２６１０−ｖ１またはｐＤ２６１０−ｖ１０（ＤＮＡ２．０、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）のいずれかにサブクローニングし、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ−２９３）細胞株において、一過的トランスフェクションによって発現させた。
【０４１１】
タンパク質の発現に使用したＨＥＫ−２９３細胞は、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている「Ｅｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」に提供されるものであった。トランスフェクション及び発現は製造者の推奨のように行った。手短に言えば、指数増殖期に２〜３百万細胞／ｍｌで、脂質−ＤＮＡ複合混合物をＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。使用した脂質トランスフェクション試薬は、「Ｅｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍキット」中に提供され、「ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３  Ｒｅａｇｅｎｔ」という商品名で知られている。トランスフェクションに使用したＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏ−ｆｒｅｅ  ＭａｘｉキットなどのエンドトキシンフリーＤＮＡ調製キットを使用して調製した。トランスフェクションに使用するＤＮＡの最終的な量は、トランスフェクション培養容積１ｍｌあたり１ｕｇ  ＤＮＡ、すなわち３０ｍｌの発現容積に対して３０ｕｇの全ＤＮＡを使用した。最終的なタンパク質は、別々のプラスミドから個々に発現される少なくとも２つのタンパク質配列（すなわち、最小限で重鎖及び軽鎖）から構成されたので、プラスミドの組み合わせの最適な比を決定した。例えば、ヘテロ二量体の形成にとって最適な濃度範囲を決定するために、ヘテロ二量体形成を可能にする重鎖Ａ（ＨＣ−Ａ）、軽鎖（ＬＣ）及び重鎖Ｂ（ＨＣ−Ｂ）の最適なＤＮＡ比（例えば、ＨＣ−Ａ／ＨＣ−Ｂ／ＬＣ比＝４０：４０：２０（ＰＩＤ９４の場合と同様）でＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を４〜５日後に回収し、培養培地を４０００ｒｐｍで遠心分離してから収集し、０．４５μｍフィルターを使用して清澄化した。
【０４１２】
清澄化した培養培地をＰｉｅｒｃｅプロテインＡアガロース充填カラム（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）にロードし、１０カラム体積のｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液で洗浄した。１０カラム体積のｐＨ３．６のクエン酸緩衝液で抗体を溶出し、抗体を含むプールした画分をｐＨ８．０のＴＲＩＳで中和した。
【０４１３】
プロテインＡ溶出抗体試薬の品質を特徴づけるために、分析スケールのゲル濾過（ＳＥＣ）によって試料を分析した。このために、移動相として２０ｍＭリン酸ナトリウム、４００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０を使用するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓシリーズ１２００ＨＰＬＣによって、ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｄｉｏｌ−２００カラム（ＹＭＣ  Ｌｔｄ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）に５〜２０μｇのタンパク質を流した。得られたクロマトグラムを使用して、アセンブルされた単一、二重及び三重特異性抗体試薬の目的のピーク（ＰＯＩ）のパーセンテージを計算した。
【０４１４】
必要に応じて、ゲル濾過（ＳＥＣ）によってプロテインＡ抗体溶出液をさらに精製した。ゲル濾過については、およそ１ｍｇの抗体混合液を１ｍＬに濃縮し、１ｍＬ／分の流速のＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ  ＦＰＬＣによって、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ  ６  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を１ｍＬ／分の流速で使用した。精製された抗体に対応する画分を収集し、約１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．２μｍフィルターを通して濾過滅菌した。前の段落に記載されているように、得られた物質を分析的ゲル濾過によって特徴づけした。以下の表Ｄは、いくつかの生成された最終的抗体試薬についてのＰＯＩのパーセンテージを例証する。図２２は、単一（ＰＩＤ３）、二重（ＰＩＤ１２８）及び三重（ＰＩＤ１３０）特異性抗体試薬についての分析的ゲル濾過クロマトグラフを示す。
【０４１５】
（表Ｄ）分析的ゲル濾過による特徴づけ
2019509055.tif 000010
【０４１６】
実施例１７：ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ（登録商標）による、例示的な単一特異性、二重特異性及び三重特異性ＭＩＡＣ構築物の抗原結合解析
個々の抗原結合
ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔを使用してＭＩＡＣ構築物の抗原結合を解析した。組換えのヒトＰＤ−１  Ｆｃ、Ｈｅｒ２  Ｆｃ、ＣＤ１３７  Ｆｃ融合タンパク質をＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入し、組換えのＨｉｓタグ付きヒトＣＤ３イプシロンをＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。すべての抗原を０．２５ｕｇ／ｕｌの終濃度でＰＢＳ中に再構成した。ＰＤ−１、Ｈｅｒ２及びＣＤ１３７結合の解析については、抗原（Ｆｏｒｔｅｂｉｏキネティクス緩衝液中に１００ｎＭ）をプロテインＡセンサーに３分間固定化し、続いて、センサーを３００ｎＭリツキシマブに１０分間浸漬することによって、センサーの電位フリー結合部位を遮断した。１００ｎＭ  ＭＩＡＣ構築物に５分間センサーを浸漬することによって会合が進み、ブランクのキネティクス緩衝液中に５分間で解離が生じた。ＣＤ３イプシロン結合については、抗原をＮｉ−ＮＴＡセンサーに固定化し、５０ｎＭ  ＭＩＡＣ構築物中で会合を行った。ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ解析９．０ソフトウェアを使用して、結合データを解析した。代表的な結合センソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍｓ）を図２３に示す。測定した親和性を表Ｅにまとめる。このデータは、１つより多い標的に結合する試験した４つのＭＩＡＣのそれぞれが、各標的に同時に結合することができることを示す。このデータは、ＭＩＡＣの結合親和性が同時結合条件下で０．１２〜１．６６ｎＭの範囲にわたることも示す。
【０４１７】
（表Ｅ）結合親和性
2019509055.tif 000011
【０４１８】
実施例１８：フローサイトメトリーによる、ヒト乳癌細胞株におけるＨｅｒ２及びＰＤ−Ｌ１の発現解析
例示的なＨｅｒ２標的指向ＭＩＡＣの生物活性を評価するための適切な細胞株を同定するために、Ｈｅｒ２及びＰＤ−Ｌ１（プログラム死リガンド−１）の表面発現についてフローサイトメトリーによって癌細胞株パネルをスクリーニングした。図２４の結果は、ＪＩＭＴ１細胞株が高いＨｅｒ２発現を有し、免疫阻害分子、すなわちプログラム死リガンド−１（ＰＤ−Ｌ１；ＣＤ２７４）をその表面で発現したことを示す。これらの発見に基づいて、例示的なＨｅｒ２標的指向ＭＩＡＣのインビトロでの機能性評価のために、ＪＩＭＴ１細胞を選択した。
【０４１９】
実施例１９：フローサイトメトリーによる腫瘍細胞に対する例示的なＨｅｒ２標的指向ＭＩＡＣの結合解析
Ｈｅｒ２＋ＪＩＭＴ１細胞の表面への例示的ＭＩＡＣ構築物の結合をフローサイトメトリーによって解析した。以下のように実験を行った。
【０４２０】
漸増濃度（０、０．０１、０．１、１．０ｎＭ）の二重特異性及び三重特異性Ｈｅｒ２ＭＩＡＣ（ＰＩＤ９２［Ｈｅｒ２／ＣＤ１３７］、ＰＩＤ１２８［Ｈｅｒ２／ＣＤ３］、ＰＩＤ１３０［Ｈｅｒ２／ＣＤ３／ＰＤ−１］）またはＨｅｒ２（陽性対照）またはＣＤ３（陰性対照）に対する対照抗体の存在下で３０分間、懸濁液中のＪＩＭＴ１細胞をインキュベートした。細胞を洗浄し、次いで、第２のフルオロフォア標識検出抗体（抗ヒトＩｇＧ１−ＡＦ４８８）とともに２０分間インキュベートした。最終的な洗浄後、ＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターを使用して、平均蛍光強度（ＭＦＩ）によってタンパク質の結合を解析した。
【０４２１】
図２５に示すように、例示的ＭＩＡＣの３つすべてが、検出可能な、ＪＩＭＴ１細胞に対する濃度依存的結合を示した。ＭＩＡＣの結合のレベルは抗Ｈｅｒ２陽性対照抗体で観察されるものより低く、これは、抗体重鎖のＣ末端へのＨｅｒ２結合ｓｃＦｖの連結がＨｅｒ２抗原結合親和性／結合活性の低減をもたらした可能性があることを示唆するものである。ＭＩＡＣによって示された細胞結合活性のレベルは、インビトロで生物活性を評価するのに十分であると考えられる。
【０４２２】
実施例２０：ヒトＴ細胞／ＪＩＭＴ１腫瘍細胞の共培養における、増殖及びＣＤ２５活性化マーカーの発現に対する例示的な二重特異性抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ１３７ＭＩＡＣ（ＰＩＤ９２）の効果
本実験を、Ｈｅｒ２及びＣＤ１３７を標的とする例示的な二重特異性ＭＩＡＣ１の、ＪＩＭＴ１腫瘍細胞と共培養されるヒト一次Ｔ細胞の増殖及び活性化を増強する能力を判定するために行った。α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ１３７ＭＩＡＣ（ＰＩＤ９２）の応答を、等モル濃度の、ＭＩＡＣと同一のＦａｂ配列を有する混合した単一特異性α−Ｈｅｒ２抗体及びα−ＣＤ１３７抗体と比較した。以下のように実験を行った。
【０４２３】
フィコール勾配遠心分離、それに続く磁気ビーズ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって、ＣＤ３＋Ｔ細胞を単離した。Ｔ細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）色素で標識してから、１０：１の比でＪＩＭＴ１乳癌細胞との共培養に供した。共培養物を１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（クローンＯＫＴ３）で予めコーティングした９６ウェルマイクロプレートに播種し、続いて、漸増濃度（０．０２〜２０．０ｎＭ）の二重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ１３７ＭＩＡＣ（ＰＩＤ９２）または等モル濃度の混合したα−Ｈｅｒ２及びα−ＣＤ１３７モノクローナル抗体の存在下で、７２時間インキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、ＣＤ４、ＣＤ８及びＣＤ２５に対するフルオロフォア標識抗体で染色後に、フローサイトメトリーによって増殖及びＣＤ２５の発現についてＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を解析した。増殖パーセントは、ＣＦＳＥシグナル希釈法によって決定した場合の、少なくとも１ラウンドの細胞分裂を経験する細胞の割合と定義した。
【０４２４】
ＣＤ２５の発現解析の結果を図２６に示す。単一特異性のα−Ｈｅｒ２及びα−ＣＤ１３７抗体の組み合わせと比較して、二重特異性ＭＩＡＣは、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットの両方でＣＤ２５のより高い表面発現を刺激した。ＣＤ２５の発現に対するα−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ１３７ＭＩＡＣ（ＰＩＤ９２）の増強効果は、ＭＩＡＣと組み合わせ処理の両方について同様の発現レベルを示した最低試験濃度及び最高試験濃度を除いては、試験した濃度範囲の全体にわたって明らかであった。
【０４２５】
増殖解析の結果を図２７に示す。増殖の濃度依存的増大は、ＣＤ４＋Ｔ細胞と比較してＣＤ８＋Ｔ細胞においてより顕著であった。α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ１３７ＭＩＡＣ（ＰＩＤ９２）によって誘導される増殖の全体的な規模は抗体の組み合わせと類似していたが、２ｎＭで応答曲線の明白な分離があり、これは、ＭＩＡＣの効力の増強を示唆するものである。
【０４２６】
実施例２１：ヒトＴ細胞／ＪＩＭＴ１腫瘍細胞の共培養における、サイトカイン産生に対する例示的な二重特異性抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ１３７ＭＩＡＣ（ＰＩＤ９２）の効果
本実験を、Ｈｅｒ２及びＣＤ１３７を標的とする例示的な二重特異性ＭＩＡＣの、ＪＩＭＴ１腫瘍細胞と共培養されるヒト一次Ｔ細胞からのサイトカイン産生を増強する能力を判定するために行った。対照として、α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ１３７ＭＩＡＣ（ＰＩＤ９２）ＭＩＡＣの効果を、等モル濃度の、ＭＩＡＣと同じＦａｂ配列を有する混合した単一特異性α−Ｈｅｒ２及びα−ＣＤ１３７抗体と比較した。
【０４２７】
実施例６に記載されている同じ共培養実験から収集した細胞培養上清において、サイトカイン産生を測定した。７２時間のインキュベーション期間の終わりに、上清を収集し、Ｌｕｍｉｎｅｘキット（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αのレベルを測定した。
【０４２８】
図２８に結果を示す。ＩＦＮ−γとＴＮＦ−αの両方で確固たる濃度依存的増大が観察され、二重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ１３７ＭＩＡＣ（ＰＩＤ９２）は、単一特異性抗体の組み合わせと比較して劇的な活性増強を示した。
【０４２９】
さらに、類似の実験を実行して、Ｈｅｒ２＋ＳＫＢＲ３細胞との共培養におけるＴ細胞からのＩＬ−２産生を測定した。１００ｎＭのＰＩＤ９２は等モル濃度のＰＩＤ９０に対してＩＬ−２産生を約４倍増加させることが見出された。
【０４３０】
実施例２２：ヒトＴ細胞／ＪＩＭＴ１腫瘍細胞の共培養における、増殖及びＣＤ２５活性化マーカーの発現に対する例示的な二重特異性抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１２８）の効果
本実験を、Ｈｅｒ２及びＣＤ３を標的とする例示的な二重特異性ＭＩＡＣの、ＪＩＭＴ１腫瘍細胞と共培養されるヒト一次Ｔ細胞の増殖及び活性化を増強する能力を判定するために行った。対照として、α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１２８）ＭＩＡＣの効果を、等モル濃度の、ＭＩＡＣ中に含まれる同じＦａｂ配列を有するＣＤ３標的抗体と比較した。以下のように実験を行った。
【０４３１】
フィコール勾配遠心分離、それに続く磁気ビーズ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によってＣＤ３＋Ｔ細胞を単離し、１０：１の比でＪＩＭＴ１乳癌細胞との共培養に供した。共培養物を９６ウェルマイクロプレートに播種し、続いて、漸増濃度（０．０２〜２０．０ｎＭ）の二重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１２８）ＭＩＡＣまたは等モル濃度の抗ＣＤ３モノクローナル抗体の存在下で、７２時間インキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、Ｋｉ６７（細胞内増殖マーカー）、ＣＤ８及びＣＤ２５に対するフルオロフォア標識抗体で染色後に、増殖及びＣＤ２５の表面発現について、フローサイトメトリーによってＴ細胞を解析した。
【０４３２】
増殖及びＣＤ２５の発現解析の結果を図２９に示す。二重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１２８）ＭＩＡＣは、Ｔ細胞増殖及びＣＤ２５の表面発現の両方を劇的にアップレギュレートし、最大の誘導がすべての試験濃度で観察された。比較すると、抗ＣＤ３抗体の効果ははるかに弱く、濃度依存的であった。
【０４３３】
実施例２３：ヒトＴ細胞／ＪＩＭＴ１腫瘍細胞の共培養における、サイトカイン及びグランザイムＢの産生に対する例示的な二重特異性抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１２８）の効果
本実験を、Ｈｅｒ２及びＣＤ３を標的とする例示的な二重特異性ＭＩＡＣの、ＪＩＭＴ１腫瘍細胞と共培養されるヒト一次Ｔ細胞からのサイトカイン産生を増強する能力を判定するために行った。対照として、α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１２８）ＭＩＡＣを等モル濃度の、ＭＩＡＣと同じＦａｂ配列を有する単一特異性抗ＣＤ３抗体と比較した。
【０４３４】
実施例８に記載されている同じ共培養実験から収集した細胞培養上清において、サイトカイン産生を測定した。７２時間のインキュベーション期間の終わりに、上清を収集し、Ｌｕｍｉｎｅｘキット（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びグランザイムＢのレベルを測定した。
【０４３５】
ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの両方で確固たる濃度依存的増大が観察され（図３０）、二重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１２８）ＭＩＡＣは、単一特異性ＣＤ３抗体と比較して劇的に増強された効力を示した。
【０４３６】
標的細胞の死滅を媒介するＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性顆粒に見られるプロテアーゼであるグランザイムＢも、α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１２８）ＭＩＡＣでの処理によって強く誘導され（図３１）、単一特異性抗ＣＤ３と比較して劇的に増大した効力を示した。ＭＩＡＣは、最低濃度の０．０２ｎＭを含めて、試験した全濃度範囲にわたって、グランザイムＢの最大の産生を達成した。
【０４３７】
実施例２４：ヒトＴ細胞／ＪＩＭＴ１腫瘍細胞の共培養における、増殖及びＣＤ２５活性化マーカーの発現に対する例示的な三重特異性抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３／抗ＰＤ−１  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１３０）の効果
本実験を、Ｈｅｒ２、ＣＤ３及びＰＤ−１（プログラム死受容体−１）を標的とする例示的な三重特異性ＭＩＡＣの、ＪＩＭＴ１腫瘍細胞と共培養されるヒト一次Ｔ細胞の増殖及び活性化を増強する能力を判定するために行った。対照として、ＭＩＡＣの効果を、等モル濃度の、三重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３／α−ＰＤ−１  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１３０）と同一のＦａｂ配列を有する混合した単一特異性抗Ｈｅｒ２、抗ＣＤ３及び抗ＰＤ−１抗体と比較した。以下のように実験を行った。
【０４３８】
フィコール勾配遠心分離、それに続く磁気ビーズ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によってＣＤ３＋Ｔ細胞を単離し、１０：１の比でＪＩＭＴ１乳癌細胞との共培養に供した。共培養物を９６ウェルマイクロプレートに播種し、続いて、漸増濃度（０．０２〜２０．０ｎＭ）のα−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３／α−ＰＤ−１  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１３０）または等モル濃度の、混合した単一特異性抗Ｈｅｒ２、抗ＣＤ３及び抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の存在下で、７２時間インキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、Ｋｉ６７（細胞内増殖マーカー）、ＣＤ８及びＣＤ２５に対するフルオロフォア標識抗体で染色後に、増殖及びＣＤ２５の表面発現について、フローサイトメトリーによってＴ細胞を解析した。
【０４３９】
増殖及びＣＤ２５の発現解析の結果を図３２に示す。三重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３／α−ＰＤ−１  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１３０）はＴ細胞増殖及びＣＤ２５の表面発現の両方を劇的にアップレギュレートし、ほぼ最大の誘導がすべての試験濃度にわたって観察された。比較すると、単一特異性抗体の３重組み合わせは、ＭＩＡＣよりずっと弱い濃度依存的応答を示した。
【０４４０】
実施例２５：ヒトＴ細胞／ＪＩＭＴ１腫瘍細胞の共培養における、サイトカイン及びグランザイムＢの産生に対する例示的な三重特異性抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３／抗ＰＤ−１  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１３０）の効果
本実験を、Ｈｅｒ２、ＣＤ３及びＰＤ−１を標的とする例示的な三重特異性ＭＩＡＣの、ＪＩＭＴ１腫瘍細胞と共培養されるヒト一次Ｔ細胞からのサイトカイン産生を増強する能力を判定するために行った。対照として、α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３／α−ＰＤ−１  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１３０）を、等モル濃度の、ＭＩＡＣと同一のＦａｂ配列を有するＨｅｒ２、ＣＤ３及びＰＤ−１に対する混合した単一特異性抗体と比較した。
【０４４１】
実施例１０に記載されている同じ共培養実験から収集した細胞培養上清において、サイトカイン産生を測定した。７２時間のインキュベーション期間の終わりに、上清を収集し、Ｌｕｍｉｎｅｘキット（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及びグランザイムＢのレベルを測定した。
【０４４２】
図３３に示すように、三重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３／α−ＰＤ−１  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１３０）は、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの両方の産生を劇的に増大させ、ほぼ最大の効果が試験した全濃度範囲にわたって観察された。これに対して、単一特異性抗体の組み合わせ効果はずっと弱く、濃度依存的であり、サイトカイン産生の増大は、濃度反応曲線の上端で観察されただけであった。
【０４４３】
標的細胞の死滅を媒介するＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性顆粒に見られるプロテアーゼであるグランザイムＢも、α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３／α−ＰＤ−１  ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１３０）での処理によって、高レベルで誘導され（図３４）、サイトカイン産生と同様に、最低試験濃度においてでさえも最大効果が見られた。比較すると、単一特異性抗体の組み合わせは、グランザイムＢを実際に濃度依存的様式で増大させたが、三重特異性ＭＩＡＣよりもはるかに低い効力を示した。
【０４４４】
実施例２６：ヒトＴ細胞／ＢＴ４７４腫瘍細胞の共培養における、Ｔ細胞媒介性腫瘍死滅、グランザイムＢ誘導及びＩＦＮ−γ産生に対する例示的な二重特異性抗Ｈｅｒ２／抗ＣＤ３ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１２８）の効果
本実験を、Ｈｅｒ２及びＣＤ３を標的とする例示的な二重特異性ＭＩＡＣの、ガンマインターフェロンの産生を増強し、ヒトＢＴ４７４乳房細胞株の死滅を促進する能力を判定するために行った。α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１２８）の応答を、等モル濃度の、ＭＩＡＣと同一のＦａｂ配列を有する混合した単一特異性α−Ｈｅｒ２及びα−ＣＤ３抗体と比較した。以下のように実験を行った。
【０４４５】
フィコール勾配遠心分離、それに続く磁気ビーズ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によってＣＤ３＋Ｔ細胞を単離し、９６ウェル培養プレート中でＢＴ４７４乳癌細胞と１５：１の比で共培養した。細胞をプレーティングする前に、漸増濃度（０．０１ｎＭ〜１．０ｎＭ）の二重特異性α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１２８）または混合したα−Ｈｅｒ２及びα−ＣＤ３モノクローナル抗体をプレートの適切なウェルに加えた。このプレートを２４時間インキュベートし、上清を収集し、製造者のプロトコールに従って、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ及びＬｕｍｉｎｅｘサイトカインアッセイに使用した。
【０４４６】
腫瘍細胞死滅解析の結果を図３５に示す。単一特異性α−Ｈｅｒ２及びα−ＣＤ３抗体の組み合わせと比較して、二重特異性ＭＩＡＣは、２つのモノクローナル抗体の組み合わせよりも多くの細胞死滅を媒介した。
【０４４７】
ＩＦＮ−γ及びグランザイムＢの産生解析の結果を図３６に示す。ＩＦＮ−γ及びグランザイムＢの産生の濃度依存的増大は、モノクローナル抗体の組み合わせと比較して、α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３ＭＩＡＣ（ＰＩＤ１２８）の存在下で有意に顕著であった。合わせると、これらの結果は、α−Ｈｅｒ２／α−ＣＤ３ＭＩＡＣ（ＰＩＤ２１８）が、サイトカイン産生誘導及び腫瘍細胞死滅促進で、モノクローナル抗体の組み合わせより効力があることを示す。
【０４４８】
他の実施形態、参照による組み込み
本明細書に記載される開示は、独立した有用性を有する複数の別個の発明を包含することができる。これらの発明のそれぞれをその好ましい形態（複数可）で開示してきたが、本明細書で開示及び例示するそれらの特定の実施形態は、多数の変形形態が可能であるので、限定的な意味で考えられるべきでない。本発明の主題は、本明細書に開示される様々な要素、特色、機能及び／または特性の新規且つ自明でない組み合わせ及び部分組み合わせを含む。以下の特許請求の範囲は、新規且つ自明でないと見なされるある特定の組み合わせ及び部分組み合わせを特に示す。特長、機能、要素及び／または特性の他の組み合わせ及び部分組み合わせにおいて具体化される発明を、本出願、本出願から優先権を主張する出願または関連出願において請求することができる。そのような特許請求の範囲も、異なる発明に向けられてものであろうと、同じ発明に向けられたものであろうと、及び元の特許請求の範囲と比べて範囲が広い、狭い、等しいまたは異なるものであろうとなかろうと、本開示の本発明の主題内に含まれる。
【０４４９】
本開示で引用されるすべての参考文献、刊行物及び特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０４５０】
配列
配列番号１−実施例１３由来の重鎖＃１
ブレンツキシマブＶＨ＿ヒトＩｇＧ１  ＨＣ定常＿（ＧＧＧＧＳ）３＿ウレルマブＶＨ＿（ＧＧＧＧＳ）７＿ウレルマブ＿ＶＫ（「（ＧＧＧＧＳ）３」及び「（ＧＧＧＧＳ）７」は、それぞれ配列番号２３及び９７として開示されている）
2019509055.tif 000012
配列番号２−実施例１３由来の重鎖＃２
ブレンツキシマブＶＨ＿ヒトＩｇＧ１定常＿（ＧＧＧＧＳ）３＿ペンブロリズマブＶＨ＿（ＧＧＧＧＳ）７＿ペンブロリズマブ＿ＶＫ（「（ＧＧＧＧＳ）３」及び「（ＧＧＧＧＳ）７」は、それぞれ配列番号２３及び９７として開示されている）
2019509055.tif 000013
配列番号３−実施例１３由来の軽鎖
ブレンツキシマブＶＬ＿ヒトＩｇＧ１  ＬＣ定常
2019509055.tif 000014
配列番号５−実施例１４由来の重鎖
ペンブロリズマブＶＨ＿（ＧＧＧＧＳ）２＿ウレルマブＶＨ＿ヒトＩｇＧ１  ＨＣ定常＿（ＧＧＧＧＳ）３＿ブレンツキシマブＶＨ＿（ＧＧＧＧＳ）７＿ブレンツキシマブ＿ＶＫ（「（ＧＧＧＧＳ）２」、「（ＧＧＧＧＳ）３」、及び「（ＧＧＧＧＳ）７」は、それぞれ配列番号２６、２３、及び９７として開示されている）
2019509055.tif 000015
配列番号６−実施例１４由来の軽鎖
ペンブロリズマブＶＬ＿（ＧＧＧＧＳ）２＿ウレルマブＶＬ＿ヒトＩｇＧ１  ＬＣ定常（「（ＧＧＧＧＳ）２」は配列番号２６として開示されている）
2019509055.tif 000016
配列番号７−重鎖（ＤＩＤ−１）
トラスツズマブＶＨ＿ヒトＩｇＧ１  ＨＣ定常
2019509055.tif 000017
配列番号８−軽鎖（ＤＩＤ−２）
トラスツズマブＶＬ＿ヒトカッパＬＣ定常
2019509055.tif 000018
トラスツズマブ重鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＦＮＩＫＤＴ（配列番号２８）
ＣＤＲ−Ｈ２：ＹＰＴＮＧＹ（配列番号２９）
ＣＤＲ−Ｈ３：ＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ（配列番号３０）
トラスツズマブ軽鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｌ１：ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号３１）
ＣＤＲ−Ｌ２：ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号３２）
ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ（配列番号３３）
配列番号９−重鎖（ＤＩＤ−３６５）
ブリナツモマブ＿ＣＤ３  ＶＨ＿ヒト非グリコシル化ＩｇＧ１定常
2019509055.tif 000019
配列番号１０−軽鎖（ＤＩＤ−８）
ブリナツモマブ＿ＣＤ３ＶＬ＿ヒトカッパＬＣ定常
2019509055.tif 000020
ブリナツモマブ重鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨ（配列番号３４）
ＣＤＲ−Ｈ２：ＹＩＮＰＳＲＧＹＴ（配列番号３５）
ＣＤＲ−Ｈ３：ＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹ（配列番号３６）
ブリナツモマブ軽鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｌ１：ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮ（配列番号３７）
ＣＤＲ−Ｌ２：ＤＴＳＫＶＡＳ（配列番号３８）
ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号３９）
配列番号１１−重鎖（ＤＩＤ−９）
ウレルマブＶＨ＿ヒトＩｇＧ１定常
2019509055.tif 000021
配列番号１２−軽鎖（ＤＩＤ−３０９）
ウレルマブＶＬ＿ヒトカッパＬＣ定常
2019509055.tif 000022
ウレルマブ重鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＧＳＦＳＧＹＹ（配列番号４０）
ＣＤＲ−Ｈ２：ＮＨＧＧＹ（配列番号４１）
ＣＤＲ−Ｈ３：ＤＹＧＰＧＮＹＤＷＹＦＤＬ（配列番号４２）
ウレルマブ軽鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｌ１：ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号４３）
ＣＤＲ−Ｌ２：ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号４４）
ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＱＲＳＮＷＰＰＡＬＴ（配列番号４５）
配列番号１３−重鎖（ＤＩＤ−１５）
ペンブロリズマブＶＨ＿ヒトＩｇＧ１定常
2019509055.tif 000023
配列番号１４−軽鎖（ＤＩＤ−１６）
ペンブロリズマブＶＬ＿ヒトカッパＬＣ定常
2019509055.tif 000024
ペンブロリズマブ重鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＹＴＦＴＮＹＹＭＹ（配列番号４６）
ＣＤＲ−Ｈ２：ＮＰＳＮＧＧ（配列番号４７）
ＣＤＲ−Ｈ３：ＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹ（配列番号４８）
ペンブロリズマブ軽鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｌ１：ＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨ（配列番号４９）
ＣＤＲ−Ｌ２：ＬＡＳＹＬＥＳ（配列番号５０）
ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＨＳＲＤＬＰＬＴ（配列番号５１）
配列番号１５−重鎖（ＤＩＤ−３６６）
ブリナツモマブ＿ＣＤ３  ＶＨ＿ヒト非グリコシル化ＩｇＧ１  ＨＣ定常＿（ＧＧＧＧＳ）３＿トラスツズマブＶＨ＿（ＧＧＧＧＳ）４＿トラスツズマブＶＬ（「（ＧＧＧＧＳ）３」及び「（ＧＧＧＧＳ）４」は、それぞれ配列番号２３及び２４として開示されている）
2019509055.tif 000025
ブリナツモマブ重鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨ（配列番号５２）
ＣＤＲ−Ｈ２：ＹＩＮＰＳＲＧＹＴ（配列番号５３）
ＣＤＲ−Ｈ３：ＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹ（配列番号５４）
トラスツズマブ重鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＦＮＩＫＤＴ（配列番号５５）
ＣＤＲ−Ｈ２：ＹＰＴＮＧＹ（配列番号５６）
ＣＤＲ−Ｈ３：ＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ（配列番号５７）
トラスツズマブ軽鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｌ１：ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号５８）
ＣＤＲ−Ｌ２：ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号５９）
ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ（配列番号６０）
配列番号１６−重鎖（ＤＩＤ−２６）
ウレルマブＶＨ＿ヒトＩｇＧ１  ＨＣ定常＿（ＧＧＧＧＳ）３＿トラスツズマブＶＨ＿（ＧＧＧＧＳ）４＿トラスツズマブＶＬ（「（ＧＧＧＧＳ）３」及び「（ＧＧＧＧＳ）４」は、それぞれ配列番号２３及び２４として開示されている）
2019509055.tif 000026
ウレルマブ重鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＧＳＦＳＧＹＹ（配列番号６１）
ＣＤＲ−Ｈ２：ＮＨＧＧＹ（配列番号６２）
ＣＤＲ−Ｈ３：ＤＹＧＰＧＮＹＤＷＹＦＤＬ（配列番号６３）
トラスツズマブ重鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＦＮＩＫＤＴ（配列番号６４）
ＣＤＲ−Ｈ２：ＹＰＴＮＧＹ（配列番号６５）
ＣＤＲ−Ｈ３：ＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ（配列番号６６）
トラスツズマブ軽鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｌ１：ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号６７）
ＣＤＲ−Ｌ２：ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号６８）
ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ（配列番号６９）
配列番号１７−重鎖（ＤＩＤ−２７）
ペンブロリズマブＶＨ＿ヒトＩｇＧ１  ＨＣ定常＿（ＧＧＧＧＳ）３＿トラスツズマブＶＨ＿（ＧＧＧＧＳ）４＿トラスツズマブＶＬ（「（ＧＧＧＧＳ）３」及び「（ＧＧＧＧＳ）４」は、それぞれ配列番号２３及び２４として開示されている）
2019509055.tif 000027
ペンブロリズマブ重鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＹＴＦＴＮＹＹＭＹ（配列番号７０）
ＣＤＲ−Ｈ２：ＮＰＳＮＧＧ（配列番号７１）
ＣＤＲ−Ｈ３：ＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹ（配列番号７２）
トラスツズマブ重鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＦＮＩＫＤＴ（配列番号７３）
ＣＤＲ−Ｈ２：ＹＰＴＮＧＹ（配列番号７４）
ＣＤＲ−Ｈ３：ＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ（配列番号７５）
トラスツズマブ軽鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｌ１：ＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡ（配列番号７６）
ＣＤＲ−Ｌ２：ＳＡＳＦＬＹＳ（配列番号７７）
ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ（配列番号７８）
配列番号１８−軽鎖（ＤＩＤ−５０）
ブリナツモマブ＿ＣＤ３  ＶＬ＿ヒトカッパＬＣ定常＿（ＧＧＧＧＳ）３＿ペンブロリズマブＶＨ＿（ＧＧＧＧＳ）４＿ペンブロリズマブＶＬ（「（ＧＧＧＧＳ）３」及び「（ＧＧＧＧＳ）４」は、それぞれ配列番号２３及び２４として開示されている）
2019509055.tif 000028
ブリナツモマブ軽鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｌ１：ＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮ（配列番号７９）
ＣＤＲ−Ｌ２：ＤＴＳＫＶＡＳ（配列番号８０）
ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＱＷＳＳＮＰＬＴ（配列番号８１）
ペンブロリズマブ重鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＹＴＦＴＮＹＹＭＹ（配列番号８２）
ＣＤＲ−Ｈ２：ＮＰＳＮＧＧ（配列番号８３）
ＣＤＲ−Ｈ３：ＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹ（配列番号８４）
ペンブロリズマブ軽鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｌ１：ＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨ（配列番号８５）
ＣＤＲ−Ｌ２：ＬＡＳＹＬＥＳ（配列番号８６）
ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＨＳＲＤＬＰＬＴ（配列番号８７）
配列番号１９−軽鎖（ＤＩＤ−３１０）
ウレルマブＶＬ＿ヒトカッパＬＣ定常＿（ＧＧＧＧＳ）３＿ペンブロリズマブＶＨ＿（ＧＧＧＧＳ）４＿ペンブロリズマブＶＬ（「（ＧＧＧＧＳ）３」及び「（ＧＧＧＧＳ）４」は、それぞれ配列番号２３及び２４として開示されている）
2019509055.tif 000029
ウレルマブ軽鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｌ１：ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号８８）
ＣＤＲ−Ｌ２：ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号８９）
ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＱＲＳＮＷＰＰＡＬＴ（配列番号９０）
ペンブロリズマブ重鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＹＴＦＴＮＹＹＭＹ（配列番号９１）
ＣＤＲ−Ｈ２：ＮＰＳＮＧＧ（配列番号９２）
ＣＤＲ−Ｈ３：ＲＤＹＲＦＤＭＧＦＤＹ（配列番号９３）
ペンブロリズマブ軽鎖ＣＤＲ
ＣＤＲ−Ｌ１：ＲＡＳＫＧＶＳＴＳＧＹＳＹＬＨ（配列番号９４）
ＣＤＲ−Ｌ２：ＬＡＳＹＬＥＳ（配列番号９５）
ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＨＳＲＤＬＰＬＴ（配列番号９６）
【図１】
2019509055.tif 000031
【図２Ａ】
2019509055.tif 000032
【図２Ｂ】
2019509055.tif 000033
【図２Ｃ】
2019509055.tif 000034
【図２Ｄ】
2019509055.tif 000035
【図３Ａ】
2019509055.tif 000036
【図３Ｂ】
2019509055.tif 000037
【図３Ｃ】
2019509055.tif 000038
【図３Ｄ】
2019509055.tif 000039
【図４】
2019509055.tif 000040
【図５】
2019509055.tif 000041
【図６】
2019509055.tif 000042
【図７】
2019509055.tif 000043
【図８】
2019509055.tif 000044
【図９】
2019509055.tif 000045
【図１０】
2019509055.tif 000046
【図１１Ａ】
2019509055.tif 000047
【図１１Ｂ】
2019509055.tif 000048
【図１１Ｃ】
2019509055.tif 000049
【図１１Ｄ】
2019509055.tif 000050
【図１２】
2019509055.tif 000051
【図１３Ａ】
2019509055.tif 000052
【図１３Ｂ】
2019509055.tif 000053
【図１３Ｃ】
2019509055.tif 000054
【図１３Ｄ】
2019509055.tif 000055
【図１４】
2019509055.tif 000056
【図１５】
2019509055.tif 000057
【図１６】
2019509055.tif 000058
【図１７Ａ】
2019509055.tif 000059
【図１７Ｂ】
2019509055.tif 000060
【図１８Ａ】
2019509055.tif 000061
【図１８Ｂ】
2019509055.tif 000062
【図１９】
2019509055.tif 000063
【図２０】
2019509055.tif 000064
【図２１】
2019509055.tif 000065
【図２２】
2019509055.tif 000066
【図２３】
2019509055.tif 000067
【図２４】
2019509055.tif 000068
【図２５】
2019509055.tif 000069
【図２６】
2019509055.tif 000070
【図２７】
2019509055.tif 000071
【図２８】
2019509055.tif 000072
【図２９】
2019509055.tif 000073
【図３０】
2019509055.tif 000074
【図３１】
2019509055.tif 000075
【図３２】
2019509055.tif 000076
【図３３】
2019509055.tif 000077
【図３４】
2019509055.tif 000078
【図３５】
2019509055.tif 000079
【図３６】
2019509055.tif 000080
【配列表】
2019509055000001.app
【国際調査報告】
2019509055.tif 000081
2019509055.tif 000082