(57)【要約】  本願は、化合物  ５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノン、その薬学的に許容される塩を含む、肝癌の予防および治療用薬学組成物に関し、本願の前記組成物は、ＲＯＳ−ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＴＥＲＴシグナル伝達を阻害することによって、前記シグナル伝達に関与するタンパク質が過発現される肝細胞癌、特に進行性肝細胞癌の治療に有用に用いられることができる。
2019510075.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化合物  ５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノン、その薬学的に許容される塩を含む、肝細胞癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項２】
前記肝細胞癌は、ＲＯＳレベルおよびＰＩ３Ｋアイソタイプ  ｐ１１０δ発現が増加している肝細胞癌である、請求項１に記載の肝細胞癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項３】
前記肝細胞癌は進行性肝細胞癌である、請求項１または２に記載の肝細胞癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項４】
前記進行性肝細胞癌は、腫瘍分化度に応じた組織学的グレード方法（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｒａｄｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）であるエドモンドソンシュタイナーグレードシステム（Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ  Ｓｔｅｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を基準にグレードＩＩ以上の肝細胞癌である、請求項３に記載の肝細胞癌の予防または治療用薬学組成物。
【請求項５】
前記肝細胞癌の治療は、ＲＯＳ−ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＴＥＲＴシグナル伝達の阻害によるものである、請求項１または２に記載の薬学組成物。
【請求項６】
肝癌細胞に５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノン、またはその塩を処理するステップを含む、前記肝癌細胞のＰＩ３Ｋアイソタイプ  ｐ１１０δ発現の抑制方法。
【請求項７】
前記肝癌細胞は、ＲＯＳレベルが増加しているものである。請求項６に記載の方法。
【請求項８】
肝癌細胞に５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノン、またはその塩を処理するステップを含む、前記肝癌細胞のＲＯＳ−ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＴＥＲＴシグナル伝達経路の阻害方法。
【請求項９】
肝細胞癌の治療が必要な対象体に薬学的に有効な量の化合物  ５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノンまたはその薬学的に許容される塩を投与するステップを含む、肝細胞癌の治療方法。
【請求項１０】
前記肝細胞癌は、ＲＯＳレベルおよびＰＩ３Ｋアイソタイプ  ｐ１１０δ発現が増加している肝細胞癌である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記肝細胞癌は進行性肝細胞癌である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記進行性肝細胞癌は、腫瘍分化度に応じた組織学的グレード方法（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｒａｄｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）であるエドモンドソンシュタイナーグレードシステム（Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ  Ｓｔｅｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を基準にグレードＩＩ以上の肝細胞癌である、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は肝癌の予防および治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝癌は全世界で癌関連死亡における二番目の原因となっており、その中でも肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ、ＨＣＣ）が肝癌の８５−９０％を占める。肝細胞癌の約７０−８０％は、進行性等級に進行した後になってこそ発見される。現在、進行性肝細胞癌の特異的治療剤として承認された薬物はソラフェニブが唯一なものである。
ＨＣＣの主な原因は肝硬変である。肝硬変を引き起こす原因には肝炎ウイルス（ＨＢＶまたはＨＣＶ）の肝炎、アルコールの摂取および非アルコール性脂肪肝などの種々のものがあり、肝硬変の病歴のみに基づいてＨＣＣ患者を治療する戦略を立てるには困難がある。
ＨＣＣの発生にはＷｎｔ−β−カテニン経路、ｐ５３−Ｒｂ経路、クロマチン再構築、およびホスファチジルイノシトール  ３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−ＡＫＴなどの様々な経路が関連していると知られているが（Ｅｌ−Ｓｅｒａｇ  ＨＢ、Ｒｕｄｏｌｐｈ  ＫＬ．Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００７；１３２：２５５７−７６；Ｓｃｈｕｌｚｅ  Ｋ、Ｉｍｂｅａｕｄ  Ｓ、Ｌｅｔｏｕｚｅ  Ｅ、Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ  ＬＢ、Ｃａｌｄｅｒａｒｏ  Ｊ、Ｒｅｂｏｕｉｓｓｏｕ  Ｓ、ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｎｅｗ  ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２０１５；４７：５０５−１１）、このような研究結果にもかかわらず、初期ＨＣＣから進行性ＨＣＣ（ＧＩＩおよびＧＩＩＩ  ＨＣＣ）への進行の主な決定因子は未だに確認されていない。
ＰＩ３Ｋ阻害剤であるイデラリシブは、米国ＦＤＡおよびヨーロッパ医薬品庁において、再発性遅発性非ホジキンＢ細胞悪性腫瘍の治療剤として承認を受けた薬物である。この阻害剤はｐ１１０δのＡＴＰ−結合部位に結合してＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達経路を不活性化させ、ＰＩ３Ｋ経路の活性化はクラスＩ  ＰＩ３Ｋ触媒的アイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）  ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δおよびｐ１１０γによって媒介される。造血幹細胞においてｐ１１０δは豊富に発現され、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達が根本的に免疫細胞の増殖および関連のサイトカインおよびケモカインの刺激に寄与している。そこで、今まで、イデラリシブは、細胞生存、特に免疫細胞の死滅に焦点を合わせている。
大韓民国公開特許公報第１０−２０１４−００２２８３６号は、血液悪性腫瘍に対する組み合わせ療法に関するものであり、イデラリシブをリンパ球性白血病の治療に用いることを開示する。イデラリシブが肝癌、特に進行性肝細胞癌においてどのような役割をするかについては知られたことがない。進行性肝細胞癌の特異的治療剤の開発が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本願においては、肝細胞癌細胞株においてＴＥＲＴ発現およびテロメラーゼを阻害することによって肝細胞癌の増殖を抑制する薬学組成物を提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一様態において、本願は、化合物  ５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノン、その薬学的に許容される塩を含む、肝細胞癌の予防および治療用薬学組成物を提供する。
本願による一実現例において、肝細胞癌は、ＲＯＳおよびそれにＰＩ３Ｋアイソタイプ  ｐ１１０δが過発現される肝細胞癌である。
本願による他の実現例において、本願に係る肝細胞癌は進行性肝細胞癌であり、進行性肝細胞癌は当業界で公知の数個の進行段階に応じた肝癌区分方法により決定され、例を挙げればこれらに制限されるものではないが、進行性肝細胞癌はＬＣＳＧＪ（Ｌｉｖｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）の肝細胞癌  ＴＮＭ（ｔｕｍｏｒ−ｎｏｄｅ−ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）を基準にＩＩ期以上の肝細胞癌である。または、前記進行性肝細胞癌は、腫瘍分化度に応じた組織学的グレード方法（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｒａｄｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）であるエドモンドソンシュタイナーグレードシステム（Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ  Ｓｔｅｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を基準にグレードＩＩ以上の肝細胞癌である。
【０００５】
一実現例において、本願に係る薬学組成物は、ＲＯＳ−ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＴＥＲＴシグナル伝達の抑制によって肝細胞癌を治療する。
他の側面において、本願は、化合物  ５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノン、その薬学的に許容される塩を含む、インビボまたはインビトロで肝癌細胞または肝癌細胞株においてＰＩ３Ｋアイソタイプ  ｐ１１０δ発現抑制用キットを提供する。
一実現例において、本願に係るキットが効果のある肝癌細胞はＲＯＳレベルが高いものである。
また、他の側面において、本願は、化合物  ５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノン、その薬学的に許容される塩を含む、インビボまたはインビトロで肝癌細胞または肝癌細胞株においてＲＯＳ−ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＴＥＲＴシグナル伝達抑制用キットを提供する。
また、他の側面において、本願は、肝癌細胞に５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノン、またはその塩を処理するステップを含む、前記肝癌細胞のＰＩ３Ｋアイソタイプ  ｐ１１０δ発現の抑制方法に関するものである。
さらに、また他の側面において、本願は、肝癌細胞に５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノン、またはその塩を処理するステップを含む、前記肝癌細胞のＲＯＳ−ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＴＥＲＴシグナル伝達経路を阻害する方法を提供する。
【０００６】
一実現例において、前記肝癌細胞はＲＯＳレベルが増加した細胞であり、肝癌細胞株または肝癌細胞または組織を全て含むものである。
さらに、また他の側面において、本願は、肝細胞癌の治療が必要な対象体に薬学的に有効な量の化合物  ５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノンまたはその薬学的に許容される塩を投与するステップを含む、肝細胞癌の治療方法を提供する。
本願による一実現例において、肝細胞癌は、ＲＯＳおよびそれにＰＩ３Ｋアイソタイプ  ｐ１１０δが過発現される肝細胞癌である。
本願による他の実現例において、本願に係る肝細胞癌は進行性肝細胞癌であり、進行性肝細胞癌は当業界で公知の数個の進行段階に応じた肝癌区分方法により決定され、例を挙げればこれらに制限されるものではないが、進行性肝細胞癌はＬＣＳＧＪ（Ｌｉｖｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）の肝細胞癌  ＴＮＭ（ｔｕｍｏｒ−ｎｏｄｅ−ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）を基準にＩＩ期以上の肝細胞癌である。または、前記進行性肝細胞癌は、腫瘍分化度に応じた組織学的グレード方法（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｒａｄｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）であるエドモンドソンシュタイナーグレードシステム（Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ  Ｓｔｅｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）を基準にグレードＩＩ以上の肝細胞癌である。
【発明の効果】
【０００７】
本願に係る薬学組成物は、肝細胞癌（ＨＣＣ）においてＲＯＳによって活性化されるＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＴＥＲＴシグナル伝達活性化を阻害してＴＥＲＴ発現を減少させ、テロメア長を減少するようにすることによって腫瘍の増殖を抑制することができる。特に、ＲＯＳおよびそれに応じたＰＩＫ３アイソタイプであるｐ１１０δの発現が増加した進行性肝癌または悪性肝癌の治療に有用に用いられることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本願の一実現例によるイデラリシブがＨＣＣ細胞増殖、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＴＥＲＴシグナル伝達、およびテロメア長の維持を阻害することを示したものである。Ａ−Ｃ、ＡＫＴ活性化された二つのＨＣＣ細胞株（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達の活性化された）および正常の肝から由来した非肝癌細胞株（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達が不活性化された）におけるイデラリシブの容量−依存的阻害を示したものである。二つのＨＣＣ細胞株であるＨｕｈ７細胞（Ａ）およびＨｅｐ３Ｂ細胞（Ｂ）、および正常の肝から由来した非肝癌細胞株ＴＨＬＥ−３細胞（Ｃ）を一定容量範囲のイデラリシブで処理して、細胞増殖をＭＴＳ分析法により分析した。ボックス内の免疫染色イメージは、イデラリシブが選択的に標的するｐ１１０δの発現がＴＨＬＥ−３よりはＨＣＣ細胞においてさらに高いことを示す。スケールバー、１０μｍ。Ｄ−Ｆ、ＡＫＴ活性化されたＨＣＣ細胞株モデルおよびＡＫＴ不活性化された正常の肝から由来した非肝癌細胞株モデルいおけるイデラリシブ処理後の標的阻害およびダウンストリームシグナル伝達を示す。Ｇ−Ｉ、ＨＣＣ細胞株においてイデラリシブ処理後にテロメアが短くなったことを示す。テロメア長は、テロメアサザンブロット（Ｇ）、ｉｍｍｕｎｏＦＩＳＨ（Ｈ、Ｊ、およびＬ）、および定量的ＰＣＲ（Ｉ、Ｋ、およびＭ）により定量した。Ｔ／Ｓ比率は、テロメア反復コピー数と単一−コピー遺伝子コピー数の比率。ＰＯＣ、対照群パーセント。データに記載された数値は平均±ＳＥＭ（グループ当たりにｎ＝４）を示す；＊＊  ｔ−テストにおいてＰ＜０．０１。
【図２】ＨＣＣ細胞株において、ＲＯＳはＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＴＥＲＴシグナル伝達活性化およびテロメア伸長を促進し、イデラリシブはＲＯＳ−媒介ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＴＥＲＴシグナル伝達活性化を抑制することを示す。Ａ、Ｈｕｈ７、Ｈｅｐ３Ｂ、およびＴＨＬＥ−３細胞におけるｐ１１０アイソタイプのｍＲＮＡレベルを示したものである。Ｂ、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）処理後のＨｕｈ７、Ｈｅｐ３Ｂ、およびＴＨＬＥ−３細胞におけるｐ１１０アイソタイプのｍＲＮＡレベルを示したものである。Ｃ−Ｅ、様々な濃度のＨ2Ｏ2およびＲＯＳスカベンジャーＮＡＣ存在での細胞生存率（明るい青色）、テロメア蛍光（赤色）、およびＴＥＲＴ発現（黒色）およびＴＥＲＴタンパク質免疫分析のパーセントを示したものである。平均テロメア長はＦｌｏｗＦＩＳＨにより決定される。Ｈｕｈ７細胞（Ｃ）、Ｈｅｐ３Ｂ細胞（Ｄ）、およびＴＨＬＥ−３細胞（Ｅ）。ＰＯＣ、対照群パーセント。ＮＡＣ、Ｎ−アセチルシステイン。Ｆ−Ｈ、３００μｍｏｌ／Ｌ  Ｈ2Ｏ2−処理されたＨＣＣ細胞株および１５０μｍｏｌ／Ｌ  Ｈ2Ｏ2−処理されたＴＨＬＥ−３細胞におけるイデラリシブ処理後の標的阻害およびダウンストリームシグナル伝達を示したものである。ＴＥＲＴ発現はβ−アクチンのものに正規化した。ＰＯＣ、対照群パーセント。Ｉ−Ｋ、イデラリシブ処理の存在または不存在下の３００μｍｏｌ／Ｌ  Ｈ2Ｏ2−処理されたＨＣＣ細胞株および１５０μｍｏｌ／Ｌ  Ｈ2Ｏ2−処理されたＴＨＬＥ−３細胞におけるテロメア活性を示したものである。データに示された数値は平均±ＳＥＭ（グループ当たりにｎ＝４）。指示された処理群と対照群間の比較に対するＰ数値は、ｔ−テストにおいて＊＊  Ｐ＜０．０１、＊＊＊  Ｐ＜０．００１、および＊＊＊＊  Ｐ＜０．０００１に示した。
【図３】ＲＯＳ−ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−β−カテニン−ＴＥＲＴ活性化がＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ阻害剤によって阻害されることを示す。Ａ−Ｃ、ＰＩ３Ｋ阻害剤イデラリシブ（Ａ）、ＡＫＴ阻害剤ペリフォシン（Ｂ）、またはＧＳＫ３β阻害剤ＸＩ（Ｃ）の存在または不存在下の３００μｍｏｌ／Ｌ  Ｈ2Ｏ2−またはｍｏｃｋ−処理されたＨｕｈ７細胞におけるＴＥＲＴプロモーターのβ−カテニン相互作用部位を用いたＣｈＩＰを示す。数値は平均±ＳＥＭ（グループ当たりにｎ＝４）；ｔ−テストによって＊＊  Ｐ＜０．０１、および＊＊＊  Ｐ＜０．００１に示した。Ｄ、ｍｏｃｋ−処理されたＨｕｈ７細胞、３００μｍｏｌ／Ｌ  Ｈ2Ｏ2−処理されたＨｕｈ７細胞、および３００μｍｏｌ／Ｌ  Ｈ2Ｏ2および２５μｍｏｌ／Ｌ  イデラリシブの両方を処理したＨｕｈ７細胞を移植した後、６週目におけるヌードマウスの代表的なイメージを示したものである。点円は腫瘍を示す。スケールバー、１０ｃｍ。Ｅ、毎週測定したマウスの平均腫瘍サイズ（ｍｍ3）を示したグラフである。Ｈ2Ｏ2およびイデラリシブの両方を処理した細胞の同等な数を注入したマウスと比較して、片側（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ランクテストを用いてＰ数値を決定した。マウス数：ｍｏｃｋ処理では４、Ｈ2Ｏ2処理では５、そしてＨ2Ｏ2およびイデラリシブの両方の処理では４。
【図４】ＨＣＣ患者、ＨＣＣ腫瘍組織におけるＴＥＲＴ発現および低調な生存率がイデラリシブ特異的分子ｐ１１０δ発現と陽性連関していることを示したものである。Ａ、ＧＩ、ＧＩＩ、およびＧＩＩＩ  ＨＣＣ腫瘍組織（ｎ＝９８）におけるｐ１１０δ発現を示したものである。Ｂ、ｐ１１０δ  ｍＲＮＡが低レベルまたは高レベルであるＨＣＣ組織における平均ＴＥＲＴ発現（水平線）を示したものである（ｎ＝９８）。Ｃ、ｐ１１０δ発現に比例する再発のない生存率。ｎ＝８４。標本は平均ｐ１１０δ発現に基づいて二つのグループに分離した。生存率はＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ方法を用いて測定した；生存率における差はログ−ランクテストを用いて比較した。相応する危険率（ＨＲ）は生存プロットで示した。Ｄ、進行ＨＣＣでのＰＩ３ＫおよびＡＫＴに対する阻害剤およびＲＯＳの潜在的機能を示す分子モデルを示したものである。進行ＨＣＣにおいてＡＫＴシグナル伝達を活性化することによってＲＯＳレベルが上昇すれば、ＴＥＲＴが上昇調節されることを示したものである。ＡＫＴ活性化はＧＳＫ３β活性を抑制し；ＧＳＫ３β不活性化は連続してβ−カテニンタンパク質が核内に蓄積されるようにする。ＴＥＲＴプロモーターにおいてβ−カテニンが募集されれば、ＴＥＲＴ発現が増加して、テロメアが伸長する。ＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本願は、肝細胞癌、特に進行段階の肝細胞癌において、ＰＩＫ３アイソタイプのうちの特にｐ１１０δ型がＲＯＳによって過発現されるのを糾明し、それを抑制する場合、肝細胞癌、特に進行段階の肝細胞癌を効果的に治療することができるという発見に基づいたものである。
したがって、本願は、このような肝細胞癌の発病メカニズムの糾明に基づいた、化合物  ５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノン（イデラリシブ）の肝細胞癌の治療に対する新規用途に関するものである。
一様態において、本願は、化合物  ５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノン、その薬学的に許容される塩を含む、肝癌の予防および治療用薬学組成物に関するものである。
本願の前記化合物  ５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノンはイデラリシブ（ｉｄｅｌａｌｉｓｉｂ）とも呼ばれ、本願に参考として含まれた国際公開番号ＷＯ２０１２／１５２２１０号に化合物およびその製造方法が記載されている。
ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ阻害剤、特に選択的ｐ１１０δキナーゼ阻害剤である本願に係る化合物が、本願の一実施例において、ＨＣＣ細胞株であるＨｕｈ７細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞の増殖を阻害する（図１ＡおよびＢ）と共にＴＥＲＴ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）発現を阻害し、テロメア長が伸長するのを阻害する抗テロメラーゼ効能を有するということを本願で糾明した。
【００１０】
本願の組成物は、ｐ１１０δのＡＴＰ−結合部位に結合してＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達経路を不活性化させる。ＰＩ３ＫはＡＫＴのようなダウンストリームキナーゼを活性することによって細胞成長、増殖、および代謝を調節するのに必須的な役割をしており、ＰＩ３Ｋ経路の活性化はクラスＩ  ＰＩ３Ｋ触媒的アイソタイプ  ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δおよびｐ１１０γによって媒介され、前記部類の酵素がホスファチジルイノシトール  ４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）をリン酸化し、必須的な二番目のメッセンジャー物質であるホスファチジルイノシトール  ３，４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ３）が生成される。
本願の他の実現例において、本願の組成物がＲＯＳ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｏｘｙｇｅｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ）によって活性化されるＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＴＥＲＴシグナル伝達を抑制することを確認した（図２）。ＲＯＳは癌細胞においてＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達経路を過活性化させるが、本願の組成物によって前記経路活性化が阻害される。
また、本願の他の実現例において、本願の組成物がＲＯＳ−ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−βカテニン−ＴＥＲＴ活性化を抑制することを確認した（図３）。本願において、ＲＯＳによってＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達が過活性化されると、βカテニンの核内発現が増加してＴＥＲＴ発現が増加し、テロメアが伸長することを確認した（図３Ｃ、図４）。
【００１１】
テロメアを長くする酵素であるテロメラーゼが阻害されると、細胞が分裂するほどテロメアは短くなり、窮極的に細胞成長の停止、老衰、および死滅に導く。また、テロメア短縮は酸化的ストレスによって引き起こされ、これはインビボで活性酸素（ＲＯＳ）が細胞内増加することによって媒介される。しかし、初期ＨＣＣから進行ＨＣＣへの進行過程の間、ＲＯＳレベルが増加することによって、テロメアは短縮されることよりは長くなる。様々なヒト腫瘍の進行過程の間、ＴＥＲＴ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）−媒介活性はテロメア長を増加させて腫瘍細胞が無限増殖するようにしており、ＨＣＣ腫瘍においてこのような現象が保たれる。本願の一実現例においては、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達を阻害すれば、テロメラーゼ発現が阻害されてテロメア伸長が阻害されることを明らかにした。したがって、本願は、抗テロメラーゼである５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノンを含む肝癌の予防および治療用薬学組成物に関するものである。
本願で用いられた用語「肝細胞癌」は、アルコールの濫用、ウイルス性肝炎および代償性肝疾患のような危険因子を有する患者で発生する肝組織そのものから発生する原発性悪性腫瘍を称する。肝細胞癌は全体肝癌の９０％以上を占め、患者の４０〜８０％は再発し、大半は再び肝臓に再発するが、肺とリンパ節、腹腔を囲んでいる内側壁と縦隔洞に現れることもあり、このような癌も本願に含まれる。
【００１２】
本願による一実現例においては、特に進行性肝癌または悪性肝癌の治療に用いられる。本願において、肝癌の進行段階（ｇｒａｄｅ）に応じた区分は、当業界で公知のものとして、例えば、腫瘍分化度に応じた組織学的グレード方法（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｒａｄｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）であるエドモンドソンシュタイナーグレードシステム（Ｅｄｍｏｎｄｓｏｎ  Ｓｔｅｉｎｅｒ  ｇｒａｄｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｉｒｉｓｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．２０１０  Ｄｅｃ；１３４（１２）：１８１８−２２）を参照することができる。これによれば、本願による組成物が効果のある肝細胞癌は、進行段階に応じて１〜４段階に区分される肝細胞癌においてｇｒａｄｅ  ＩＩ以上の肝細胞癌である。また、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）  ＴＮＭ  Ｓｔａｇｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｌｉｖｅｒ  Ｔｕｍｏｒｓ（７ｔｈ  ｅｄ．、２０１０）やＬｉｖｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＬＣＳＧＪ）−Ｔの最近版  ＨＣＣ  ＴＮＭ（Ｔｕｍｏｒ  ｎｏｄｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）  ｓｔａｇｉｎｇを参考にすることもできる。これによれば、本願による組成物が効果のある肝細胞癌は、進行段階に応じて１〜４期に区分される肝細胞癌において２期（ｓｔａｇｅ  ＩＩ）以上の肝細胞癌であってもよい。
【００１３】
本願で用いられた用語「治療」、「緩和」、または「改善」とは、本願組成物の投与により代謝疾患の症状を好転させるかまたは有益に変更する全ての行為を意味する。本願が属する技術分野で通常の知識を有した者であれば、大韓医学協会などで提示された資料を参照して本願の組成物が効果のある疾患の正確な基準を知り、改善、向上および治療された程度を判断することができるであろう。
本発明で用いられた「薬学的に許容される付加塩」は、薬学的に許容される酸付加塩を含む。薬学的に許容可能な塩とは、患者に比較的に非毒性で無害な有効作用を有する濃度として、該塩に起因した副作用が化学式１の塩基化合物の有益な効能を落とさない化学式１の塩基化合物の或る有機または無機付加塩を意味する。例えば、酸は塩酸または臭素酸などのハロゲン酸；硫酸、硝酸およびリン酸などの無機酸；および、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロパン酸、ヒドロキシ酢酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸（すなわち、ブタン二酸）、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクラミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノ−サリチル酸およびパモ酸などの有機酸を含む。塩基塩の形態は、例えば、アンモニウム塩、アルカリおよびアルカリ土類金属塩として、例えば、リチウム、ナトリウム、ポタシウム、マグネシウムおよびカルシウム塩などであり、また、ベンザチン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ヒドラバミン塩のような有機塩基との塩、およびアルギニン、リジンなどのようなアミノ酸との塩を含む。
【００１４】
本願に係る治療剤または薬学的組成物は、一般的に用いられる薬学的に許容可能な担体と共に適宜な形態に剤形化できる。「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与される時、通常、胃腸障害、めまいなどのようなアレルギー反応またはそれと類似した反応を起こさない組成物をいう。薬学的に許容される担体としては、例えば、水、好適なオイル、食塩水、水性グルコースおよびグリコールなどのような非経口投与用担体などが挙げられ、安定化剤および保存剤をさらに含むことができる。好適な安定化剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸のような抗酸化剤が挙げられる。好適な保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、メチル−またはプロピル−パラベンおよびクロロブタノールが挙げられる。また、本発明に係る組成物は、その投与方法や剤形に応じて、必要な場合、懸濁剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、保存剤、吸着防止剤、界面活性化剤、希釈剤、賦形剤、ｐＨ調整剤、無痛化剤、緩衝剤、酸化防止剤などを適切に含むことができる。前記に例示されたものをはじめとして、本発明に好適な薬学的に許容される担体および製剤は、文献［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版］に詳細に記載されている。本願の組成物は、当該発明が属する技術分野で通常の知識を有した者が容易に実施できる方法に従い、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態に製造されるか、または多容量容器内に入れて製造できる。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液の形態であるか、または粉末、顆粒、錠剤またはカプセルの形態であってもよい。
【００１５】
本願の薬学組成物の投与方法は剤形に応じて容易に選択でき、家畜、ヒトなどの哺乳動物に様々な経路で投与できる。例えば、散剤、錠剤、丸剤、顆粒剤、糖衣錠、硬質または軟質のカプセル剤、液、エマルション、懸濁液、シロップ剤、エリキシル剤、外用剤、坐剤、滅菌注射溶液などの形態に剤形化され、全身または局所的に経口または非経口投与されてもよく、特に非経口投与が好ましい。
非経口投与のための剤形には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性オイル、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが用いられることができる。坐剤の基剤としてはウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチンなどが用いられることができる。
本願の薬学組成物は薬学的に有効な量をもって投与される。薬学的に有効な量は、本願に係る化合物を一定の投与量で一定期間投与した結果、目的とする効果、すなわち、肝細胞癌の治療または緩和効果をもたらすものである。投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などに応じてその範囲が様々であるが、有効投与量は、通常、成人（６０ｋｇ）の場合、一般には前記組成物１〜５００ｍｇ、好ましくは３０〜３００ｍｇを１日１回または数回分割して投与することができる。投与量は、既存の薬物の投与量を参考にすることができるが、投与量は、種々の条件に応じて変動可能であるため、前記投与量に加減がありうることは当業者に明らかなことであり、よって、前記投与量は、どの側面においても本発明の範囲を限定するものではない。投与回数は所望の範囲内で１日に１回、または数回に分けて投与してもよく、投与期間も特に限定されない。
【００１６】
他の側面において、本願は、化合物  ５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノン、その薬学的に許容される塩を用いて、インビボまたはインビトロで肝癌細胞または肝癌細胞株、特にＲＯＳが過発現される肝癌細胞株においてＰＩ３Ｋアイソタイプ  ｐ１１０δの発現を抑制するか、またはＲＯＳ−ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＴＥＲＴシグナル伝達を抑制する方法およびキットを提供する。前記方法およびキットに用いられる化合物およびそれによる前記生物学的現象の抑制と関連した事項は、前述したことを参考にすることができる。
上述したように、本願に係る化合物またはそれを含む組成物は、肝細胞癌の治療に効果的に用いられることができる。
したがって、また他の側面において、本願は、薬学的に有効な量の化合物  ５−フルオロ−３−フェニル−２−［（１Ｓ）−１−（７Ｈ−プリン−６−イルアミノ）プロピル］−４（３Ｈ）−キナゾリノンまたはその薬学的に許容される塩を肝細胞癌の治療が必要な対象体に投与するステップを含む、肝細胞癌の治療方法に関するものである。
薬学的に有効な量、投与方法、肝細胞癌の種類、治療メカニズムなどは、前述したことを参考にすることができる。
以下では本発明の理解を助けるために実施例を提示する。但し、下記の実施例は本発明をより容易に理解するために提供されるものであって、本発明が下記の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００１７】
方法および材料
腫瘍試料（Ｔｕｍｏｒ  Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ）
人体組職を用いる全ての実験は、ソウル大学校の臨床試験審査委員会の承認を受けた（ＳＮＵＩＲＢ  Ｎｏ．Ｅ１３０８／００１−０３５）。遺伝子発現の分析のために、８４個の外科的切除された冷凍ＨＣＣ腫瘍組織サンプルおよび非腫瘍肝組織サンプルを分析した。２００５年から２００９年の間（１３３個のパラフィン包埋サンプル）および２０１１年から２０１３年の間（２８個の冷凍組織サンプル）には韓国カトリック大学のソウル聖母病院において、２０１０年から２０１３年の間には高麗大学校クロ病院（ＫＵ  Ｇｕｒｏ  Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ  ２０１３−０２０）（５６個の冷凍組織サンプル）において、各ケースを前向き（ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）で且つ持続的に同定した。本発明に用いられたほぼ大半の組織サンプルは、本発明者の従前研究にも用いられた。ソウル聖母病院の１３３個のパラフィン包埋組織のうち９３個のサンプルおよび２８個の冷凍組織サンプルのうち１９個のサンプルおよびクロ病院の５６個の冷凍組織サンプルのうち５３個のサンプルが用いられた（Ｋｏ  Ｅ、ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｏ  ＨＷ、Ｊｕｎｇ  ＥＳ、Ｋｉｍ  ＢＨ、Ｊｕｎｇ  Ｇ．Ｔｈｅ  ＴＥＲＴ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ＳＮＰ  ｒｓ２８５３６６９  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  Ｅ２Ｆ１  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｒｉｓｋｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１５；Ｋｏ  Ｅ、ｅｔ  ａｌ．、Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ａ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１５）。ＨＣＣ  ＧＩ、ＧＩＩ、およびＧＩＩＩの各々において、ｐ１１０δ  ｍＲＮＡレベルの定量化のために用いられた９８個のサンプルのうち１４個の冷凍組織は、本発明者の他の研究（Ｌｉｍ  ＳＯ、ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１１；５３：１３５２−６２．）にも用いられた。腫瘍分化の組織学的グレード（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｒａｄｅ）は、最高等級を示す腫瘍部位に基づくＥｄｍｏｎｄｓｏｎ  Ｓｔｅｉｎｅｒ等級システムにより定義された。
【００１８】
細胞培養
ＨＣＣ細胞株（Ｈｕｈ７およびＨｅｐ３Ｂ）は、韓国細胞株銀行（ＫＣＬＢ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）から得た。ＴＨＬＥ−３細胞株（ＳＶ４０大型Ｔ抗原と共に感染させて生産した不死化（ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ）ヒト肝上皮細胞株）は、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から求めた。ＫＣＬＢおよびＡＴＣＣは、ｓｈｏｒｔ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ  ａｎａｌｙｓｉｓとしてＤＮＡフィンガープリンティングを用いて細胞株の認証（ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｉｏｎ）を行った。全ての細胞株は、マイコプラズマ汚染を調査した。１０％牛胎児血清（ＧｅｎＤｅｐｏｔ、Ｂａｒｋｅｒ、ＴＸ、ＵＳＡ）で補充されたＤＭＥＭ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｇｙｅｏｎｇｓａｎ−ｓｉ、Ｋｏｒｅａ）においてｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ  ５％  ＣＯ2インキュベータ、３７℃でＨＣＣ細胞株を培養した。ＡＴＣＣマニュアルに推薦されたとおり、１０％牛胎児血清で補充されたＢＥＧＭ（Ｌｏｎｚａ）においてｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ  ５％  ＣＯ2インキュベータ、３７℃でＴＨＬＥ−３を培養した。
【００１９】
ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、およびＧＳＫ３βに対するＲＯＳ誘導剤、ＲＯＳスカベンジャー、および阻害剤の処理
培地は毎日交替し、前記細胞は３００μｍｏｌ／Ｌ  過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ；Ｈ１００９）において４日間培養した。幾つかの実験において、前記細胞は、Ｈ2Ｏ2を添加する前に、５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ；Ａ７２５０）、２５μｍｏｌ／Ｌ  イデラリシブ（ｉｄｅｌａｌｉｓｉｂ）（ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｔｉｅｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、ＵＳＡ；Ｉ−７４４７）、２５μｍｏｌ／Ｌ  ペリフォシン（ｐｅｒｉｆｏｓｉｎｅ）（ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｔｉｅｓ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ、ＵＳＡ；Ｐ−６５２２）または３０μｍｏｌ／Ｌ  ＧＳＫ３β阻害剤（ＧＳＫ３β  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＸＩ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；ｓｃ−２０４７７０）（３１）で１時間予め処理した。陰性対照群として滅菌蒸留水（ｐＨ  ７．０）を用いた（ｍｏｃｋ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）。
【００２０】
Ｆｌｏｗ  ＦＩＳＨ
幾つかの変形をして、既に記載したとおり（Ｒｕｆｅｒ  Ｎ、ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８；１６：７４３−７）にＦｌｏｗ  ＦＩＳＨを行った。０．１％  ｗ／ｖの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する冷たいＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎ）溶液で前記細胞を２回洗浄した。その次に、前記細胞をハイブリダイゼーションバッファ（７０％脱イオン化ホルムアミド（Ａｍｒｅｓｃｏ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ、ＵＳＡ）、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴｒｉｓＨＣｌ［ｐＨ  ６．８］、１％  ＢＳＡ、および１ｎｍｏｌ／Ｌ  ＦＡＭ−ｌａｂｅｌｅｄ  テロメアＰＮＡ（ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）プローブ（ＴｅｌＧＦＡＭ：ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ）（Ｐａｎａｇｅｎｅ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）または１ｎｍｏｌ／Ｌ  ＦＡＭ−ｌａｂｅｌｅｄ  セントロメアＰＮＡプローブ（ＣｅｎｔＦＡＭ：ＡＡＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＴＴ）（Ｐａｎａｇｅｎｅ）に再サスペンションした。ハイブリダイゼーションバッファの体積は、１０5細胞当たり１００μｌに調整した。次に、各サンプルを８５℃の水槽で１０分間培養した。テロメアプローブを室温、雌牛で３時間ハイブリダイゼーションした後、各サンプルを各々の洗浄溶液（洗浄溶液Ｉ：７０％脱イオン化ホルムアミド、１０ｍＭ  ｒｉｓＨＣｌ［ｐＨ  ６．８］、０．１％  ＢＳＡ、および０．１％  ツイン２０；洗浄溶液ＩＩ：０．１％  ＢＳＡおよび０．１％ツイン２０  ｉｎ  ＰＢＳ）で洗浄し、溶液（０．１％  ＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ  Ａ、および０．０６μｇ／ｍＬの７−ＡＡＤ  ｉｎ  ＰＢＳ）内で３７℃で１時間培養した。各個別の培養において総１５，０００２０，０００核を分析した。Ｇ１Ｇ０細胞周期段階で全ての核のテロメア蛍光強度は、ＣＥＬＬＱＵＥＳＴ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いたＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて測定した。
【００２１】
ＩｍｍｕｎｏＦＩＳＨ
確立されたＩｍｍｕｎｏＦＩＳＨプロトコル（Ｐｌｅｎｔｚ  ＲＲ、ｅｔ  ａｌ．、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２００７；４５：９６８−７６）を若干変形させて用いた。パラフィン包埋セクションをキシレンで脱パラフィンさせ、エタノール  ｇｒａｄｉｅｎｔを用いて再水和させた。抗原復旧（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）は、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ナトリウムシトレート（ｐＨ  ６．０）内でマイクロウェーブにおいて１０分間沸かして行った。プロテイナーゼＫ（１５μｇ／ｍＬ  ｉｎ  ＰＢＳ［ｐＨ  ７．４］）で３７℃で２０分間浸透させた後、８−オキソ−ｄＧ−特異性抗体（１：１００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ；ａｂ６２６２３）をＰＢＳ  ０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００内１％  ＢＳＡｄｐ希釈して室温で一晩中培養した。スライドを洗浄した後、Ａｌｅｘａ  ６４７  ２次抗体で１時間処理した。４％ホルムアルデヒドを用いてサンプルを固定させた後にエアードライをした。前記サンプルを９０℃で６分間変性させた後、雌牛で２時間ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション溶液には、７０％ホルムアルデヒドｉｎ  ２×ＳＳＣ、５％  ＭｇＣｌ2、０．２５％ブロッキング試薬（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、１５．４ｎｍｏｌ／Ｌ  ｏｆ  Ｃｙ３−ラベルのテロメアＰＮＡプローブ（ＴｅｌＣＣｙ３：ＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡ）（Ｐａｎａｇｅｎｅ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）、および１８．４ｎｍｏｌ／ＬのＦＡＭ−ラベルのセントロメアＰＮＡプローブ（ＣｅｎｔＦＡＭ：ＡＡＡＣＴＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＴＴ）（Ｐａｎａｇｅｎｅ）が含まれている。スライドを洗浄した後、ＤＡＰＩを含有するＰＢＳでリンスし、その後、ＤＡＰＩ封入剤（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で封入した。本発明者は、同時にテロメア染色および８−オキソ−ｄＧ染色に対する内部対照群としてセントロメアを染色した。分子ＲＯＳマーカーである酸化的ＤＮＡ付加（ａｄｄｕｃｔ）  ８−オキソ−２’−デオキシグアノシン（８−オキソ−ｄＧ）のレベルは、ＨＣＣを含む様々な腫瘍タイプにおいて増加すると報告されている。テロメア蛍光レベルおよび８−オキソ−ｄＧ蛍光レベルは、各々、テロメア蛍光強度に対するセントロメア蛍光光度の比、および８−オキソ−ｄＧ蛍光強度に対するセントロメア蛍光強度の比をいう。テロメア蛍光強度、セントロメア蛍光強度、および８−オキソ−ｄＧ蛍光強度の定量には同一の露出時間が用いられた。腫瘍組織のテロメア蛍光レベルおよび８−オキソ−ｄＧ蛍光レベルは、５ランダムフィールドに相応する非腫瘍組織の蛍光レベルを分けて計算した。イメージ分析は、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  ｐｌｕｓ  ６．０  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて行った。
【００２２】
テロメアサザンブロット
テロメア長は、非放射性の化学蛍光ＴｅｌｏＴＡＧＧＧテロメア長アッセイ（Ｒｏｃｈｅ；Ｃａｔ．Ｎｏ．１２  ２０９  １３６  ００１）をマニュアルに従って用いて決定した。ＧｅｎｅＪＥＴ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；＃Ｋ０７２１）を用いてＨＣＣ細胞からゲノムＤＮＡを分離した後、４μｇのゲノムＤＮＡを２０ユニットのＨｉｎｆ  １（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）およびＲｓａ  １（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）で３７℃で１６時間ダイジェストした。前記ダイジェストされたＤＮＡを０．８％アガロースゲル電気泳動により分離した後、キャピラリートランスファーを用いて陽電荷ナイロン膜に移した。ブロットされたＤＮＡは、４２℃で１６時間テロメア反復に特異的なジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ラベルされたプローブでハイブリダイゼーションした後、アルカリ性ホスファターゼに接合されたＤＩＧ−特異的抗体と共に室温で３０分間培養した。
【００２３】
定量的リアルタイム−ＰＣＲを介した相対的テロメア長の測定
細胞から抽出したゲノムＤＮＡを用いて定量的ＰＣＲ分析を通じて相対的テロメア反復コピーナンバー（Ｔ）およびシングルコピーナンバー（Ｓ）を決定し、連続してＴ／Ｓ比率を変形させた従来の方法（Ｃａｗｔｈｏｎ  ＲＭ．Ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｎｏｃｈｒｏｍｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００９；３７：ｅ２１）のとおりに計算した。
【００２４】
免疫蛍光分析法
ｐ１１０δ発現レベルを可視化するために、ｐ１１０δ−特異的（１：５００、Ａｂｃａｍ；ａｂ３２４０１）抗体を用いた。スライドを洗浄してＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有する培地を用いて封入した。共焦点顕微鏡（ＬＳＭ  ７００；Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてイメージを得た。イメージ分析は、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  ｐｌｕｓ  ６．０  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｉｎｃ．）を用いて行った。
【００２５】
ＴＲＡＰ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｅａｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）分析
テロメラーゼ活性を定量的に決定するために、ＴＲＡＰＥＺＥ  ＲＴ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ；Ｓ７７１０）を用いてＴＲＡＰを行った。マニュアルに従って総タンパク質抽出物（１００ｎｇ）を各反応に用いた。
【００２６】
定量的リアルタイム−ＰＣＲで遺伝子発現レベルの決定
ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＴｒｉＰｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ；７４０９６６．２５０）を用いて総ＲＮＡを分離し、ＴＯＰｓｃｒｉｐｔTM  ＲＴ  Ｄｒｙｍｉｘ（ｄＴ１８）（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ；ＲＴ２００）を用いてｍｏｃｋ−または指示された試薬が処理された細胞の総ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。ＴＯＰｒｅａｌTM  ｑＰＣＲ  ２×ＰｒｅＭＩＸ（ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ＲＯＸ）（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ；ＲＴ５０１Ｍ）およびＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７３００  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＰＣＲを行った。β−アクチンで遺伝子発現をノーマライズした：ＴＥＲＴ（順方向プライマー：ＧＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＣＡＣＧＴＣ；逆方向プライマー：ＣＣＡＣＧＡＡＣＴＧＴＣＧＣＡＴＧＴ）（２６）およびβ−Ａｃｔｉｎ（順方向プライマー：ＧＣＡＡＡＧＡＣＣＴＧＴＡＣＧＣＣＡＡＣＡ；逆方向プライマー：ＴＧＣＡＴＣＣＴＧＴＣＧＧＣＡＡＴＧ）。プライマー特異性をチェックするために解離段階を追加した。
【００２７】
免疫ブロット分析
総２×１０5細胞を２×ＳＤＳサンプルバッファ（１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴｒｉｓＨＣｌ［ｐＨ  ６．８］、４％  ＳＤＳ、０．２％ブロモフェノールブルー、２０％グリセロール、および２００ｍｍｏｌ／Ｌ  β−メルカプトエタノール）で５分間沸かしてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットをした。ＴＥＲＴを探知するために、細胞を２×ＳＤＳサンプルバッファにおいて５５℃で１５分間培養した。ＴＥＲＴ−特異的（１：３００、Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ、ＵＳＡ；６００−４０１−２５２）、ＡＫＴ−特異的（１：１０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；＃９２７２）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＡＫＴ−特異的（１：２０００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；＃４０６０）、ＧＡＰＤＨ−特異的（１：２０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ｓｃ−４７７２４）、またはβ−アクチン−特異的（１：２０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ；Ａ５４４１）抗体を５％スキムミルクまたは牛血清アルブミンにおいてＴＢＳ−ツイン２０と共に希釈して一晩中４℃で培養した後に洗浄し、ＨＲＰ−接合二次抗体（１：１０００、Ａｂｃａｍ；ａｂ１３１３６８またはａｂ１３１３６６）において培養した。ＦＵＳＩＯＮ−ＳＯＬＯ  ｉｍａｇｅｒ（ＶｉｌｂｅｒＬｏｕｒｍａｔ、Ｍａｒｎｅ  Ｌａ  Ｖａｌｌｅｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて化学蛍光イメージを得た。
【００２８】
細胞生存力の測定
従来に記載されたとおり（１０）  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  ＭＴＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞生存力を測定した。ウェル当たりに５００−１０００細胞をシードして各グラフに記載されたような薬物濃度で９６時間処理した。各分析法は少なくとも３回繰り返し行った。データをプロットして、ＧｒａｐｈＰａｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いてＩＣ50数値を遂行した。Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ  ３  ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４９０ｎｍにおいてホルマザン生産の光学密度を測定した。
【００２９】
クロマチン免疫沈降
従来に記載されたとおり（Ｌｉｍ  ＳＯ、ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００８；１３５：２１２８−４０、４０  ｅ１−８．；Ｈｏｆｆｍｅｙｅｒ  Ｋ、ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２；３３６：１５４９−５４）、幾つかの変形させたＣｈＩＰ（クロマチン免疫沈降）実験を行った。ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、またはＧＳＫ３β阻害剤の存在または不存在下で３００μｍｏｌ／Ｌ  Ｈ2Ｏ2処理するかまたは処理せずにＨｕｈ７細胞を４日間培養した。室温で２０分間徐々に揺しながら、前記細胞を１％パラホルムアルデヒドを用いて固定した。その後、前記細胞を氷で冷たくしたＰＢＳで２回リンスし；４００μＬのミクロコッカルヌクレアーゼバッファ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴｒｉｓＨＣｌ［ｐＨ８．０］、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ、１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＫＣｌ、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル［Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ；４６９３１５９００１］）に再サスペンションし；２−ｍｍ−直径のジルコニウムビーズ（Ｗａｔｓｏｎ）でディスラプト（ｄｉｓｒｕｐｔ）して；ミクロコッカルヌクレアーゼダイジェスチョンになるようにした（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ；Ｍ０２４７Ｓ）。Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ（１５０μｇ）を収集して希釈バッファ０．１％  ＮＰ−４０、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴｒｉｓＨＣｌ［ｐＨ  ８．０］、プロテアーゼ阻害剤カクテル［Ｒｏｃｈｅ］、およびフォスファターゼ阻害剤カクテル［Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ］）で希釈した後、２μｇ切断された鮭精子ＤＮＡ、１０μＬの免疫前（ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ）血清（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ｓｃ−２０２７）、およびＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１００４Ｄ）で２時間４℃でプレクリアー（ｐｒｅ−ｃｌｅａｒｉｎｇ）した。免疫沈降後、２０μｌ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇを添加し、２時間培養を持続した。前記Ｄｙｎａｂｅａｄｓを各々ＴＳＥ  １（０．１％  ＳＤＳ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴｒｉｓＨＣｌ、および１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ）、ＴＳＥ  ＩＩ（０．１％  ＳＤＳ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴｒｉｓＨＣｌ、および５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ）、およびバッファＩＩＩ（０．２５ｍｏｌ／Ｌ  ＬｉＣｌ、１％  ＮＰ−４０、１％  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、および１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＴｒｉｓＨＣｌ）で１０分間連続して洗浄した。前記ビーズは、その後ＴＥバッファで３回洗浄し、１％  ＳＤＳおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＨＣＯ3を用いて抽出した。ホルムアルデヒド交差結合を逆にするために、前記溶出液を一晩中６５℃に加熱した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｋｉｔを用いてＤＮＡ断片を精製した。ＴＥＲＴプロモーター部位に特異的なプライマーを用いてｑＰＣＲ（ＡＢＩ  ７３００；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）でＰＣＲ増幅生成物を定量した。ＴＥＲＴイントロンでＰＣＲ増幅をノーマライズした。プライマー配列は下記のとおりである：ＣｈＩＰに対するβ−カテニン相互作用部位（順方向プライマー：ＴＣＣＣＧＧＧＴＣＣＣＣＧＧＣＣＣＡ；逆方向プライマー：ＣＣＴＣＧＣＧＧＴＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＣ）およびＣｈＩＰに対するＴＥＲＴイントロン（順方向プライマー：ＴＧＡＧＧＧＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＧＴＧＴ；逆方向プライマー：ＣＡＣＧＡＴＡＧＡＣＧＡＣＧＡＣＣＴＣＡ）。既に記録されたβ−カテニン相互作用部位の各面には、２０−２２ｂｐが添加された。用いられた抗体は下記のとおりである：ウサギポリクローナル抗−β−カテニン（１：２００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ；ａｂ６３０２）、マウスモノクローナル抗−ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（１：５０、Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ；ＭＭＳ−１２６Ｒ）、およびウサギポリクローナル抗−ＳＥＴＤ１Ａ（１：１００、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ、ＣＯ、ＵＳＡ；ＮＢＰ１−８１５１３）。
【００３０】
インビボ腫瘍形成（Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ）の分析
ソウル大学校動物実験倫理委員会の承認を受けたプロトコルに従って動物実験を行った（Ａｐｐｒｏｖａｌ  ｎｕｍｂｅｒ：ＳＮＵ−１３０２２５−６）。マウスを通常の条件（セミ−特定病原菌の不在状態）に置いておき、任意に食べ物と水を提供した。全ての異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔｉｎｇ）の研究に５週齢のＫＳＮ／Ｓｌｃヌードマウスを用いた。１８ｇから２０ｇの間の重さのマウスを実験に用いた。異種移植分析法のために、ｍｏｃｋ処理をした１×１０5Ｈｕｈ７、３００μｍｏｌ／Ｌ  Ｈ2Ｏ2を単独で処理した１×１０5Ｈｕｈ７、または２５μｍｏｌ／Ｌ  イデラリシブおよび３００μｍｏｌ／Ｌ  Ｈ2Ｏ2の両方を処理した１×１０5Ｈｕｈ７を洗浄してＣａ2+ｏｒ  Ｍｇ2+のないＰＢＳにおいてハーベストし、連続して０．２ｍＬ体積で背中の皮下組織に注入した。腫瘍の二つの垂直直径（最も大きい直径Ｄ１、および最も小さい直径Ｄ２）のキャリパー（ｃａｌｉｐｅｒ）測定を通じて腫瘍生成物を毎週モニターした。腫瘍の体積はπ×Ｄ１×Ｄ２2／６のものとして計算された。
【００３１】
統計分析
テロメア長の測定および生存率の統計的有意性は、各々、フィッシャーの正確検定およびログ・ランク検定を用いて評価した。ｍｏｃｋおよびＲＯＳまたはＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ阻害剤の処理の間のテロメア活性およびメッセンジャーＲＮＡ発現レベル比較におけるＰ数値は、両検定を用いて計算した。頻度分布の正常性（ｎｏｒｍａｌｉｔｙ）は、Ｓｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｌｋ検定を用いてテストした。統計的分析は、Ｒ  ソフトウェア（ｗｗｗ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）またはＰｒｉｓｍ  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。全ての実験は、独立に少なくとも３回繰り返し行った。有意性の数値は＊  Ｐ＜０．０５、＊＊  Ｐ＜０．０１、および＊＊＊  Ｐ＜０．００１に合わせた。
【００３２】
実施例１．  ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ阻害剤であるイデラリシブがＨＣＣ細胞増殖、ＴＥＲＴ発現、およびテロメア長の維持阻害を糾明
選択的ｐ１１０δキナーゼ阻害剤であるイデラリシブは、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達をブロックする活性により、慢性リンパ球性白血病患者の治療に用いられてきた（Ｙａｎｇ  Ｑ、ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１５；２１：１５３７−４２；Ｆｒｕｍａｎ  ＤＡ、ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１４；１３：１４０−５６）。ｐ１１０δが互いに異なるレベルで潜伏している肝細胞におけるイデラリシブの活性を測定するために、本発明者は、３個の肝細胞株を用いて増殖分析を行った。前記肝細胞株には、初期ＨＣＣ患者から由来し、高レベルのｐ１１０δを示すＨＣＣ細胞株であるＨｕｈ７細胞およびＨｅｐ３Ｂ細胞が含まれ（図１ＡおよびＢ）、正常な成人の肝上皮細胞に現れる正常一次細胞から由来し、低レベルのｐ１１０δを示す不死化内皮細胞であるＴＨＬＥ−３細胞株が含まれた（図１Ｃ）。
イデラリシブが濃度−依存的方式で二つのＨＣＣ細胞株の細胞増殖を阻害するのかについて調査し、その結果、前記細胞株の細胞増殖を阻害した（図１ＡおよびＢ）。Ｈｕｈ７およびＨｅｐ３ＢのＩＣ50は３０μｍｏｌ／Ｌより小さく（図１ＡおよびＢ）、ＴＨＬＥ−３細胞のＩＣ50は２００μｍｏｌ／Ｌより大きかった（図１Ｃ）。細胞増殖の阻害と共に、さらに、本発明者は、二つのＨＣＣ細胞株におけるＡＫＴリン酸化阻害を探索した（図１ＤおよびＥ）。ＡＫＴリン酸化の基底レベル（ｂａｓａｌ  ｌｅｖｅｌ）は、ＴＨＬＥ−３において低く、２５μｍｏｌ／Ｌ濃度においてイデラリシブによって減少しなかったが（図１Ｆ）、これはＡＫＴシグナル伝達がこれらの細胞において不活性化されることをいう。
また、イデラリシブがＨＣＣ細胞においてＴＥＲＴ発現およびテロメア長を減少させるのかについて調査した。イデラリシブは、二つのＨＣＣ細胞株においてＴＥＲＴ発現を減少させたが（図１ＤおよびＥ）、ＴＨＬＥ−３細胞ではそうではなかった（図１Ｆ）。ＴＥＲＴ発現が減少する結果と一致するように、イデラリシブによってＨＣＣ細胞のテロメア長が減少した（図１Ｇ−Ｋ）。ＴＨＬＥ−３細胞においてＴＥＲＴ発現の基底レベルは低く、イデラリシブによってＴＨＬＥ−３細胞におけるＴＥＲＴ発現またはテロメア長の両方とも減少することはなかった（図１Ｆ、ＬおよびＭ）。このような結果はＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達が活性化されるとＴＥＲＴ発現が調節され、ＨＣＣ細胞ではイデラリシブによって阻害されるが、ＴＨＬＥ−３細胞ではそうではなかった。これは、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達が活性化された細胞は、ＰＩ３Ｋ阻害剤の存在時にＴＥＲＴ発現およびテロメア長が減少するようにする適宜なターゲットになることを意味する。
【００３３】
実施例２．  イデラリシブがＲＯＳにより誘導されたＴＥＲＴ上向き調節およびＨＣＣ細胞のテロメア伸長阻害の糾明
従来、ＲＯＳは癌細胞においてＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達経路を過活性化させることが確認されたが（Ｂｒａｚｉｌ  ＤＰ、ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２００２；１１１：２９３−３０３；Ｌｉ  ＶＳ、ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１２；１４９：１２４５−５６）、ＲＯＳがＰＩ３Ｋアイソタイプを増加させるのか、そのためにＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ活性化をもたらすのかについては知られていなかった。ＰＩ３Ｋアイソタイプ  ｐ１１０δ発現がＴＨＬＥ−３細胞よりはＨＣＣ細胞においてより高く（図１および図２Ａ）、ｐ１１０δ選択的阻害剤であるイデラリシブがＨＣＣ細胞においてのみｐＡＫＴおよびＴＥＲＴ発現、およびテロメア維持を阻害するため、本発明者は、ＲＯＳがＨＣＣ細胞においてｐ１１０δ発現を増加させるのかについて実験した。クラスＩ  ＰＩ３Ｋアイソタイプ（ｐ１１０α、ｐ１１０β、ｐ１１０δ、およびｐ１１０γ）のうち、ＲＯＳ誘導剤である過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）処理後のＨＣＣ細胞においてｐ１１０δ発現のみが増加した（図２Ｂ）。これは、ＲＯＳがｐ１１０δ発現の上向き調節を通じてＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達を特に過活性化させることをいう。
次に、ＲＯＳがＡＫＴ活性化を通じてＴＥＲＴ発現およびテロメア長を増加させるのかについて調査するために、本発明者は、様々な濃度（０−３００μｍｏｌ／Ｌ）のＨ2Ｏ2を処理した時、ＲＯＳレベルが増加する細胞におけるＴＥＲＴメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびタンパク質のレベルおよびテロメア長を比較した。Ｈ2Ｏ2に露出していない対照群のＨＣＣ細胞と比較した時、ＴＥＲＴ発現およびテロメア長は、３００μｍｏｌ／Ｌ  Ｈ2Ｏ2を処理したＨＣＣ細胞において増加した（テロメア長は２５％−３０％増加し、ＴＥＲＴ発現は４０％−４５％増加した；図２ＣおよびＤ）。ＲＯＳスカベンジャーであるＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）およびＨ2Ｏ2で細胞を同時に処理すれば、ＨＣＣ細胞においてＨ2Ｏ2−誘導によるＴＥＲＴ発現とテロメア長の増加現象が無くなった（図２ＣおよびＤ）。ＴＨＬＥ−３細胞では、１５０μｍｏｌ／Ｌ  Ｈ2Ｏ2に露出されると、大半の細胞（８５％）が生存することができなかった。前記濃度において、テロメア長は減少した（図２Ｅ）。しかし、ＴＥＲＴ発現レベルは変わらず、Ｈ2Ｏ2処理後のＡＫＴリン酸化レベルの変化がないことと一致した（図２Ｅ）。このような結果は、ＨＣＣ細胞においてＡＫＴリン酸化およびＴＥＲＴ発現を上向き調節することによってＲＯＳがテロメアを長くできることをいう。
ＲＯＳ−誘導ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達の過活性化に対するイデラリシブの効果を研究するために、本発明者は、イデラリシブに露出されたＨ2Ｏ2−処理されたＨＣＣ細胞におけるＴＥＲＴ発現、テロメア長およびテロメラーゼ活性を測定した。ＴＥＲＴ発現レベルおよびテロメア長は、Ｈ2Ｏ2を単独で処理したＨＣＣ細胞よりイデラリシブ処理後のＨ2Ｏ2−処理されたＨＣＣ細胞において顕著に低かった（テロメア長は４０−４５％減少し、ＴＥＲＴ発現は６５−７０％減少；図２ＦおよびＧ）。このような結果は、イデラリシブがＲＯＳ−誘導ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達の過活性化を阻害することをいう。ＴＥＲＴ発現およびテロメア長の結果（図２Ｆ−Ｈ）と類似するように、イデラリシブは、二つのＨＣＣ細胞株においてテロメラーゼ活性を減少させたが（図２ＩおよびＪ）、ＴＨＬＥ−３細胞ではそうではない（図２Ｋ）。本発明者は、ＴＥＲＴ発現、テロメラーゼ活性およびテロメア長においてＲＯＳ媒介で増加するのがイデラリシブによってほぼ全部阻害されたことを明らかにした（図２Ｆ−Ｋ）。
【００３４】
実施例３．  インビボでＰＩ３Ｋ阻害剤であるイデラリシブがＨＣＣ腫瘍成長の促進に対するＲＯＳ作用阻害の糾明
本発明者は、ＴＥＲＴ転写の間、ＴＥＲＴプロモーターにおいてクロマチン接近性が増加することがβ−カテニンと関わっているのかについて調査した。このために、本発明者は、内因性β−カテニンおよびクロマチン再構築によってＴＥＲＴ転写を促進すると報告されたヒストン・メチルトランスフェラーゼＳｅｔＤ１Ａに対する抗体を用いてクロマチン免疫沈降を行った。クロマチン免疫沈降分析法においてＰＩ３ＫまたはＡＫＴ阻害剤を共に処理すれば、Ｈ2Ｏ2が存在してもＨＣＣ細胞においてＴＥＲＴプロモーターに結合するβ−カテニンおよびＳｅｔＤ１Ａが減少した反面（図３ＡおよびＢ）、ＧＳＫ３β阻害剤を共に処理すれば、Ｈ2Ｏ2処理と関係なくβ−カテニンおよびＳｅｔＤ１Ａ結合が増加した（図３Ｃ）。このような結果は、ＲＯＳがＰＩ３Ｋ−Ａｋｔシグナル伝達カスケードの過活性化を通じてβ−カテニンの核発現を増加させることによって、ＴＥＲＴプロモーターへのＳｅｔＤ１Ａの募集を促進させることをいう。
次に、イデラリシブがインビボで腫瘍成長を阻害できるのかについて調査した。先ず、Ｈ2Ｏ2処理後、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達過活性化されたＨＣＣ細胞が注入されたヌードマウスにおいて腫瘍の外観に対する遅延時間（ｌａｔｅｎｃｙ  ｔｉｍｅ）を調査した。Ｈ2Ｏ2処理された１×１０5ＨＣＣ細胞と共に注入されたヌードマウスにおいて腫瘍発病（ｔｕｍｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）までかかった遅延時間は２８日であった（図３ＤおよびＥ）。Ｈ2Ｏ2処理していない１×１０5ＨＣＣ細胞を注入したヌードマウスにおいて腫瘍が現れるのにかかった平均時間は７０日であった（図３Ｅ）。それに対し、Ｈ2Ｏ2およびイデラリシブの両方を処理したＨＣＣ細胞と共に注入してから７０日が過ぎても腫瘍は形成されなかった（図３Ｄ）。このような結果は、ＲＯＳが腫瘍成長を促進し、腫瘍成長の促進に対するＲＯＳ作用は、インビボでＰＩ３Ｋ阻害剤であるイデラリシブによって阻害されることをいう。
【００３５】
実施例４．  ＨＣＣ組織においてｐ１１０δ発現レベルが高くなればＴＥＲＴ発現レベルが高くなる現象およびその低調な肝癌患者生存率との関連性の糾明
本願では、ｐ１１０δのｍＲＮＡレベルは初期ＨＣＣ組織から進行性ＨＣＣ組織（２期以上）まで増加し（図４Ａ）、ＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ発現と陽性的に関わっていることを糾明した（図４Ｂ）。これは、同一な一次シグナルがｐ１１０δおよびＴＥＲＴ発現が増加する原因となることをいう。ｐ１１０δのｍＲＮＡレベルが高いことが無再発生存率が低いことと関わっているが（図４Ｃ）、これは、ｐ１１０δのｍＲＮＡレベルが高く発現されることが高レベルのＴＥＲＴ  ｍＲＮＡ、高レベルのＲＯＳ、または長いテロメア長のようなＨＣＣ予後マーカーであることができることをいう。これは、本願の薬学組成物がｐ１１０δキナーゼを阻害することでｐ１１０δのｍＲＮＡが高レベルに発現されるのを遮断することによってＨＣＣ腫瘍増殖を阻害できることを示し、特に進行性肝細胞癌の治療に効果的に使用できることを示す。また、ＲＯＳ−ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ＴＥＲＴシグナル伝達過活性化を特異的に遮断することによって肝癌を治療するのに有用であることが分かる（図４Ｄ）。
【００３６】
以上、本願の例示的な実施例について詳細に説明したが、本願の権利範囲はこれらに限定されず、下記の請求範囲で定義している本願の基本概念を用いた当業者の種々の変形および改良形態も本願の権利範囲に属するものである。
本発明で用いられた全ての技術用語は、特に定義しない限り、本発明の関連分野で通常の当業者が一般的に理解するものと同様の意味として用いられる。本明細書に参考文献として記載される全ての刊行物の内容は本発明に導入される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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