(57)【要約】  本発明は目的の生体分子を含む生物医薬製品を生産する方法に関し、前記方法は（ａ）目的の生体分子の原薬を調製する第１相であって、前記第１相が（ａ１）採取、（ａ２）精製、（ａ３）再緩衝化、および（ａ４）濃縮から選択される少なくとも１つの処理ステップを含み、この第１相における前記少なくとも１つの処理ステップが、少なくとも３つのアミノ酸を含む組成物の存在下で行なわれ、前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せが、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧調整機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供する、第１相、および（ｂ）（ａ）で調製された原薬をさらに処理して生物医薬製品を得る第２相であって、前記第２相が（ｂ１）再緩衝化、（ｂ２）凍結、（ｂ３）解凍、および（ｂ４）充填から選択される少なくとも１つの処理ステップを含み、この第２相における前記少なくとも１つの処理ステップが、（ｉ）少なくとも３つのアミノ酸であって、前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せが、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧調整機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供する、少なくとも３つのアミノ酸、および（ｉｉ）１つまたは複数の糖を含み、アミノ酸と糖との比が１０：１〜１：１００（ｗ／ｗ）である組成物の存在下で行なわれる第２相を含む。本発明はさらに、本発明の方法によって得られた、または得られる生物医薬製品に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的の生体分子を含む生物医薬製品を生産する方法であって、前記方法が、
（ａ）目的の生体分子の原薬を調製する第１相であって、前記第１相が、
（ａ１）採取、
（ａ２）精製、
（ａ３）再緩衝化、および、
（ａ４）濃縮、
から選択される少なくとも１つの処理ステップを含み、
前記第１相における前記少なくとも１つの処理ステップが、少なくとも３つのアミノ酸を含む組成物の存在下で行なわれ、
前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せが、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧調整機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供するものであり、ならびに、
（ｂ）（ａ）で調製された前記原薬をさらに処理して生物医薬製品を得る第２相であって、前記第２相が、
（ｂ１）再緩衝化、
（ｂ２）凍結、
（ｂ３）解凍、および、
（ｂ４）充填
から選択される少なくとも１つの処理ステップを含み、
前記第２相における前記少なくとも１つの処理ステップが、
（ｉ）少なくとも３つのアミノ酸であって、前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せが、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧調整機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供する、少なくとも３つのアミノ酸、ならびに、
（ｉｉ）１つまたは複数の糖、
を含み、
アミノ酸と糖との比が１０：１〜１：１００（ｗ／ｗ）である組成物の存在下で行なわれる前記第２相を含む、
前記方法。
【請求項２】
（ｂ）で得られた前記生物医薬製品が、液体製剤としての保存および／または投与のためにさらに処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記液体製剤が、０．００１から１００ｍｇ／ｍｌ未満の濃度範囲における前記生物医薬製品の保存および／または投与のためのものであり、前記製剤が、
（ｉ）少なくとも３つのアミノ酸であって、前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せが、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧調整機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供する、少なくとも３つのアミノ酸、ならびに、
（ｉｉ）１つまたは複数の糖、
を含み、
前記アミノ酸と前記糖との比が４：１〜１：２（ｗ／ｗ）に調節されていることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記液体製剤が、１００〜５００ｍｇ／ｍｌの高濃度範囲における前記生物医薬製品の保存および／または投与のためのものであり、前記製剤が以下の賦形剤：
（ｉ）少なくとも３つのアミノ酸であって、前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せが、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧調整機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供する、少なくとも３つのアミノ酸、ならびに、
（ｉｉ）１つまたは複数の糖、
を含み、
前記アミノ酸と前記糖との比が４：１〜１：１（ｗ／ｗ）に調節されていることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記液体製剤が、前記目的の生体分子と前記（ｉ）の少なくとも３つのアミノ酸との比が３．５：１〜１：２（ｗ／ｗ）になるようにさらに調節される、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
（ｃ）（ｂ）で得られた前記生物医薬の原薬を乾燥して、乾燥された生物医薬製品を得る第３のステップをさらに含み、前記第３相における前記乾燥ステップが、
（ｉ）少なくとも３つのアミノ酸であって、前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せが、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧調整機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供する、少なくとも３つのアミノ酸、ならびに、
（ｉｉ）１つまたは複数の糖、
を含む組成物の存在下で行なわれ、
目的の生体分子と賦形剤の合計との比が１：１〜１：１０（ｗ／ｗ）に調節される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（ｂ）で得られた前記生物医薬製品の乾燥が、フリーズドライ、スプレー乾燥、またはスプレーフリーズドライによるものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）で得られた前記乾燥された生物医薬製品が滅菌され、好ましくは最後に滅菌される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）で得られた前記乾燥された生物医薬製品を再構成して液体製剤を得るステップをさらに含み、
前記乾燥された生物医薬製品を再構成して、
（ｉ）少なくとも３つのアミノ酸であって、前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せが、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧調整機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供する、少なくとも３つのアミノ酸、ならびに、
（ｉｉ）１つまたは複数の糖、
を含み、
前記アミノ酸と前記糖との比が４：１〜１：１（ｗ／ｗ）である組成物の中で液体の生物医薬製品を得ることを特徴とする、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）における前記組成物が０．５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌのトリプトファンおよび０．５ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌのヒスチジンを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記目的の生体分子がタンパク質およびペプチド、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記目的の生体分子が抗原である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法によって得られた、または得られる生物医薬製品。
【請求項１４】
ワクチン接種における使用のための、請求項１３に記載の生物医薬製品。
【請求項１５】
前記アミノ酸と前記糖との比が１０：１〜１００：１に調節される、請求項３、４、５、６、および９に記載の方法。
【請求項１６】
前記目的の生体分子と前記賦形剤の合計との比が１：１〜１：５００に調節される、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法によって得られた、または得られる生物医薬製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は目的の生体分子を含む生物医薬製品を生産する方法に関し、前記方法は（ａ）目的の生体分子の原薬を調製する第１相であって、前記第１相が、（ａ１）採取、（ａ２）精製、（ａ３）再緩衝化、および（ａ４）濃縮から選択される少なくとも１つの処理ステップを含み、この第１相における前記少なくとも１つの処理ステップが、少なくとも３つのアミノ酸を含む組成物の存在下で行なわれ、前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せが、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧調整機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供する、第１相、および（ｂ）（ａ）で調製された原薬をさらに処理して生物医薬製品を得る第２相であって、前記第２相が、（ｂ１）再緩衝化、（ｂ２）凍結、（ｂ３）解凍、および（ｂ４）充填から選択される少なくとも１つの処理ステップを含み、この第２相における前記少なくとも１つの処理ステップが、（ｉ）少なくとも３つのアミノ酸であって、前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せが、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧調整機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供する、少なくとも３つのアミノ酸、および（ｉｉ）１つまたは複数の糖を含み、アミノ酸と糖との比が１０：１〜１：１００（ｗ／ｗ）である組成物の存在下で行なわれる第２相を含む。本発明はさらに、本発明の方法によって得られた、または得られる生物医薬製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において、特許出願および製造元のマニュアルを含む多くの文献を引用する。これらの文献の開示は本発明の特許性に関連があるとは考えられないが、参照により全体として本明細書に組み込まれる。より具体的には、全ての参照した文献は、それぞれの個別の文献が具体的かつ個別に参照によって組み込まれると指示されているかのように同程度に参照により組み込まれる。
【０００３】
生物医薬製品の分野、ならびにそれらの生産方法の分野は、急速に拡大している。一般に、目的の生体分子のスケールアップした生産の後、生物医薬製品は２つの主要な後続の下流相によって得られる。早期の第１相では、いわゆる原薬（本明細書ではバルク薬またはバルク原薬とも称する）が製造される。したがって、本明細書における原薬という用語は活性医薬成分のみでなく、たとえば緩衝剤、塩および安定剤も含む処理されたバルクでもある。後期の第２相では、前記原薬がさらに処理されて生物医薬製品になる。
【０００４】
生物医薬製品の生産の間の１つの重要な観点は用いる生体分子の安定性である。医薬用のタンパク質およびペプチド、ならびに核酸、ポリペプチド、タンパク質、多糖、およびエンベロープされたウイルスまたはウイルス様粒子の場合にはリン脂質等の様々な種類の分子を含むより複雑な生体分子粒子は、それぞれの処理ステップの間に物理的および化学的なストレスを受けることが知られている。これらのストレスによって価値のない分子的変化が生じることがあり、それが次に機能の喪失、そして時にはさらに重大な安全性の問題を生じることが多い。最終の生物医薬製品の安定性には、それぞれの保存条件による老化プロセスによるさらなる問題もある。
【０００５】
製造プロセス全体の間の生物医薬製品において生じる分子的変化は累積的である。換言すれば、初期原薬を生産するための個別の製造ステップの変化の組合せ、その保存および出荷、充填および仕上げ手順を含む原薬の薬剤製品への後続の開発ステップ、それに続く薬剤製品の出荷および保存、ならびに適用のための最終調製物に必要なステップ−これらが全て足し合わされて薬剤製品内で多くの望ましくない分子的変化を生じる。したがって、そのような分子的変化を避けることが、最終薬剤製品を製剤化する段階のみでなく、原薬の製造における早期の下流相においても重要な目標である。
【０００６】
原薬の製造プロセスは、典型的には第１ステップとしての、たとえば生産細胞株からの、または分泌された生体分子の場合には増殖培地からの、目的の生体分子の採取から始まる。細胞培養または未精製の生体分子バルク原薬を含む培地から採取された生体分子は次いでさらに精製され、特徴付けされる。一般に、原薬を含む溶液は超遠心または標準的緩衝液中でのいくつかのクロマトグラフィーステップ等の処理ステップを受ける。これらの緩衝液は、典型的には条件を満たす密度勾配精製またはクロマトグラフィー精製が可能になるように最適化されるが、これらは通常、個別の生体分子につき具体的に選択されるいかなる安定化賦形剤も含まない。これらの手順により、生体分子または原薬は通常、生物医薬製造のこの早期相において既に物理的および化学的ストレスに曝される。特に、精製ステップには典型的には大きな物理的および化学的ストレスが付随する。したがって、できるだけ早期に、好ましくは採取および／または精製の間に、最大の安定化を引き起こす一般的なニーズが存在する。
【０００７】
採取された生体分子の特徴付けの以下のステップは、いくつかの可能な分析方法の１つ（または複数）によって行なうことができる。これらの分析方法を実施可能にするには、採取された生体分子または原薬がその中に存在する緩衝液が、分析手順に干渉して生体分子または原薬の分子の完全性および純度に関する誤った解釈に導く可能性のある成分を含まないことが重要である。したがって、薬剤製品の製造の間のさらなる下流プロセスステップに必要でない全ての賦形剤を避けながら同時に、採取、精製および／または特徴付けの間またはその後にできるだけ早く、原薬の最大の安定化を達成することが重要である。
【０００８】
原薬が分子の完全性および純度の要求を満たすことが確認されれば、精製され特徴付けられた原薬は次いで、濾過、充填、凍結乾燥、包装、保存および輸送等の原薬を処理する後続のステップの間の製品の品質および完全性を維持することを意図した賦形剤の中に調剤される。
【０００９】
典型的には、原薬は凍結材料として保存される。凍結の欠点は、これらの凍結解凍手順の間に低温変性（Ｐｒｉｖａｌｏｖ  ＰＬ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９０）およびタンパク質のアンフォールディング効果が生じ得ることである。バルク凍結解凍によって多くの操作上および製品品質上の利点が得られる一方、凍結濃縮機構のために原薬の安定性には不利であることも証明され得る。そのような機構には、ｐＨの変化（Ｐｉｋａｌ−Ｃｌｅｌａｎｄ  ＫＡら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、２００２）ならびに賦形剤および生体分子の制御されない進行性の濃縮が含まれ、これらは生体分子の構造の変性を生じることがある（Ｒａｔｈｏｒｅ  ＮおよびＲａｊａｎ  ＲＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、２００８：Ｗｅｂｂ  ＳＤら、ＢｉｏＰｈａｒｍ、２００２；Ｌａｓｈｍａｒ  ＵＴら、ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔ、２００７；Ｇｌａｓｅｒ  Ｖ．、Ｇｅｎ．Ｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｎｅｗｓ、２００５）。さらに、凍結されたバルク薬はさらに処理する前に解凍する必要が必然的にある。解凍は、たとえば氷と液体の界面において、および再結晶の間に、原薬に付加的なストレスおよび損傷を与えることがある。多くの場合には、解凍手順の間に付加的な混合プロセスが含まれる。これらの場合には、液体と空気の界面等における原薬の損傷をもたらす剪断応力、発泡、および／または気泡の発生によるさらなる生体分子の損傷を避けるために、混合パラメーターを注意深く調節しなければならない（Ｒａｔｈｏｒｅ  ＮおよびＲａｊａｎ  ＲＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、２００８）。
【００１０】
いずれの特定の製品に対する上記のバルク凍結解凍の影響も用いるそれぞれの生体分子に特有であり、したがっていくつかの原薬の調製についての製品品質には影響し得るが、他には影響しない。したがって、大スケールの処理に先立って、目的のそれぞれの個別の製品についての製品品質に対する多数の凍結解凍サイクルの影響を評価することが勧められる。これは典型的には大スケールのプロセスを模倣した標準化パラメーターを用いる小スケールの実験で行なわれ、最も好適な安定化賦形剤を同定するためのさらなる系統的選択ステップを含むことが多い。
【００１１】
いったん原薬が得られれば、これは薬剤製品へとさらに処理される。これらの後続の処理ステップはしばしば「製剤化ステップ」とも称され、たとえば選択された賦形剤の濃縮、ｐＨの調節、ならびに所望の電導性および生体分子の濃度の調節（すなわち生物医薬製品の濃縮）を含む（Ｓｃｏｔｔ  Ｃ．、ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔ．、２００６）。開発のこの段階の間に、さらなるプロセスは希釈ステップまたは緩衝液交換（再緩衝化）等のステップも含み得る。緩衝液交換については、生体分子−溶質の相互作用を制限するために選択され、表面への吸着事象およびそれに続く原薬の分子の完全性の喪失をもたらすことが知られている限外濾過または透析濾過が典型的には行なわれている（Ｓｔｏｎｅｒ  ＭＲら、Ｊ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、２００４）。したがって、たとえば透析によって再緩衝化し、または緩衝液交換を実施する場合のさらなる目的は、液体と膜との相互作用の間の分子の完全性の既知の喪失および原薬の吸着を低減しまたは避けることと予想される。
【００１２】
タンパク質の場合には、無菌濾過および薬剤製品の充填等のさらなる処理ステップは、原薬の生体分子を、タンパク質のアンフォールディングを引き起こすことがある高い剪断応力および表面への吸着に曝すことが多い（Ｍａａ  Ｙ、Ｈｓｕ  ＣＣ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、１９９７）。治療用抗体については、固液界面の存在下における剪断による顕著なレベルのタンパク質の凝集および沈殿が報告されている（Ｂｉｄｄｌｅｃｏｍｂｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、２００７）。さらに、充填プロセスを窒素下に行なわない場合には、このプロセスは生体分子の酸化および脱アミノ化を伴うことがある（Ｓｈａｒｍａ  Ｂ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．、２００７）。
【００１３】
保存を最適化し、許容できる保存期間を達成するために、生物医薬製品は凍  結乾燥されることが多い。凍結乾燥には３つの主なステップ、すなわち凍結、一次乾燥および二次乾燥が含まれる。これらのステップのそれぞれは、生物医薬製品の生体分子の構造の不可逆的な変化および／またはより大きなレベルの凝集を生じる不安定性につながることがある。たとえば、生体分子の周囲からのバルク水の除去は、正常では生体分子の構造を正しく折り畳まれた形態に保つ疎水性効果の程度を低減させることがある。さらに、生物医薬の原薬または薬剤製品における生体分子の氷／水界面への吸着は変性をもたらすことがある（Ｓｔｒａｍｂｉｎｉ  ＧＢおよびＧａｂｅｌｌｉｅｒｉ  Ｅ．、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．、１９９６）。したがって、生物医薬の原薬または薬剤製品中の生体分子への著しい損傷を避けるために、適切な医薬賦形剤および適切な凍結乾燥サイクルパラメーターを選択することが重要である。安定性の課題に加えて、薬剤製品を成功裡に創出するためにはケーキの形成および再構成が重要なパラメーターである（Ｒａｔｈｏｒｅ  Ｎ、Ｒａｊａｎ  ＲＳ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．、２００８）。
【００１４】
充填、包装およびラベル貼付け等の後続の取扱いの間、特に適切な温度制御なしにラベル貼付けを行なった場合、または試料がラベル貼付け、保存、輸送および対象者への送達／投与の間に機械的ストレスに曝された場合には、物理的なストレスが起こることもある。特に、保存および輸送の間の剪断応力、熱ストレスおよび限定された光安定性は、特に低温流通の課題を有する送達サイトにとって重大な物流および経済上の問題である。したがって、高い温度は生体分子をタンパク質に基づく生体分子の熱アンフォールディングおよび凝集をもたらす熱ストレスに曝すことがある。さらに、光の存在は溶存酸素と相まってペルオキシラジカルの形成を導き、これがペプチド骨格の光分解を導くことがある（Ｄａｖｉｅｓ  ＭＪ、Ｄｅａｎ  ＲＴ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７）。これらの取扱いステップの間に起こり得る物理的ストレスは、製剤が液体製剤か乾燥製剤かによって考慮しなければならない。典型的には、乾燥製剤は液体製剤よりも安定である。
【００１５】
最後に、生物医薬製品のヒトまたは動物の健康を含む医学における応用のためには、好適な賦形剤の選択を含んで最終の生物医薬製品の組成を選択する際に、意図された投与ルートを考慮に入れなければならない。たとえば、高濃縮治療用抗体の静脈内、経皮、皮内、皮下、または筋肉内投与には、容易で苦痛のない投与を可能にするために、十分なシリンジ通過性、注入性、好適なオスモル濃度および低い粘度等の適切な条件が必要である。一方、経口、経肺、または経鼻投与を意図する場合には、異なった要求が適用される。たとえば、経口投与には薬剤製品が消化性分子によって活性を失うことなしに胃腸管を通過することを可能にする製剤が必要であり、経肺投与には上気道および下気道の通過の間、および溶解した後にはそれぞれの粘膜の通過の間、安定である乾燥製剤が必要である。
【００１６】
国際出願ＷＯ２００５／００７１８５号は、しばしば用いられる安定剤であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の添加なしにタンパク質医薬を安定化させることを目的としている。その代わりに、安定化溶液は（ｉ）好ましくは非イオン性洗浄剤、すなわち界面活性剤である表面活性物質および（ｉｉ）少なくとも２つのアミノ酸の混合物を含み、少なくとも２つのアミノ酸はグルタミン酸塩とグルタミンまたはアスパラギン酸塩とアスパラギンのいずれかである。この出願の目的は、一次的には保存中の、特に高温における６か月を超える長期保存中の低濃縮医薬化合物の安定化にある。しかし、処理中および製造中の具体的な安定化については記載されていない。
【００１７】
国際出願ＷＯ２００８／０００７８０号には、タンパク質を含むスプレー乾燥粉末が少なくとも３０％または少なくとも４０％のフェニルアラニンを含む場合には安定化され、有利な空力学的挙動を有することが記載されている。粉末にフェニルアラニンを添加することにより、粉末の凝集および接着特性が粒子間の相互作用を低減させるように変化する。粉末粒子の表面をより疎水性にすることによって粉末の空力学的特性が改善され、したがって経肺適用のためにより好適になる。したがって、ＷＯ２００８／０００７８０号の目的は一次的には最終の「即投与」製品の調節であり、調製中の一般的な安定化および生産手順の改善については検討されていない。
【００１８】
欧州特許出願ＥＰ第１７８９０１９号は、新規のオリゴ糖混合物の添加によって安定化された経肺適用のためのタンパク質薬剤のスプレー乾燥粉末を記載している。処理中のアミノ酸の組合せの明示的な保護効果には対処していない。その代わり、この出願は前記スプレー乾燥粉末を経肺適用のために好適にするために安定化または最適化することを目的としている。
【００１９】
国際出願ＷＯ２０１０／１５１７０３号は、ペプチドまたはポリペプチドの安定性を増大させ、凝集を低減させ、または免疫原性を低減させるための、少なくとも１つのアルキルグリコシドを含む薬学的組成物を開示している。薬学的組成物の処理において用いるアミノ酸または特定のアミノ酸の組合せを含む組成物は記載されていない。
【００２０】
米国特許出願ＵＳ第２０１４／０１２７２２７号は、高濃縮製剤に対しても安定性および粘度に対処するための少なくとも１つのアミノ酸を含むタンパク質製剤について記載している。この出願は市販の生物医薬製品の製剤の安定性に焦点を当てており、早期の開発相の間および原薬の調製の間の生物医薬に対する賦形剤の効果には対処していない。
【００２１】
国際出願ＷＯ２０１３／００１０４４号は、ＩｇＭ抗体等の複雑な生体分子であっても、乾燥および再構成の間のアンフォールディングを防止し効率的なリフォールディングを可能にするためのアミノ酸に基づく組成物の利点を記載している。国際出願ＷＯ２０１０／１１５８３５号は、照射および最後の滅菌の間でさえも材料表面に固定化された生体物分子を保護するためのアミノ酸含有組成物の利点を記載している。ＷＯ２０１０／１１２５７６号においても、照射および最後の滅菌の間の生体分子、ここでは密閉容器中の生体分子の保護のためのアミノ酸含有組成物の利点が開示されている。国際出願ＷＯ２０１３／００１０３４号には、保存および輸送中の生きたウイルスの保護のためのアミノ酸含有組成物の利点が記載されている。最後に、ＷＯ２０１５／０５９２８４号には、熱ストレス、スプレー乾燥、および最後の滅菌の間の、たとえばインフルエンザに対する市販ワクチンの保護のためのアミノ酸含有組成物の利点が記載されている。しかし、これらの出願のいずれにおいても、早期処理ステップを含む抗体の生産の種々の処理ステップの間、および薬剤製品への最終製剤化の間の安定化には対処されていない。
【００２２】
まとめると、これまでに利用可能な大部分の安定化アプローチは生産プロセスにおける１つの特定のステップ、改善された保存条件、または意図された投与ルートのための最適化された製剤に焦点を当てている。これまでのところ、生物医薬の原薬および薬剤製品の製造の間の早期の分子の変化を避けること、およびさらなる処理の間のこれらの早期の不安定性が増大する可能性を避けることについては考慮が払われていない。さらに、これらのアプローチのいずれも、全体の調製プロセスを考慮して、すなわち大部分もしくは全ての生産、下流の処理、および製剤化ステップを通して改善された保護を提供することを目的とし、同時にこれらのステップに必要な種々の安定化組成物の量を最小化することを目的として開発されてはいない。したがって、生物医薬の原薬および薬剤製品の製造を改善するために現在存在する製剤設計を改善するニーズがいまだに存在する。
【発明の概要】
【００２３】
このニーズは、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態を提供することによって対処される。
【００２４】
したがって、本発明は目的の生体分子を含む生物医薬製品を生産する方法に関し、前記方法は（ａ）目的の生体分子の原薬を調製する第１相であって、前記第１相が、（ａ１）採取、（ａ２）精製、（ａ３）再緩衝化、および（ａ４）濃縮から選択される少なくとも１つの処理ステップを含み、この第１相における前記少なくとも１つの処理ステップが、少なくとも３つのアミノ酸を含む組成物の存在下で行なわれ、前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せが、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧調整機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供する、第１相、および（ｂ）（ａ）で調製された原薬をさらに処理して生物医薬製品を得る第２相であって、前記第２相が、（ｂ１）再緩衝化、（ｂ２）凍結、（ｂ３）解凍、および（ｂ４）充填から選択される少なくとも１つの処理ステップを含み、この第２相における前記少なくとも１つの処理ステップが、（ｉ）少なくとも３つのアミノ酸であって、前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せが、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧調整機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供する、少なくとも３つのアミノ酸、および（ｉｉ）１つまたは複数の糖を含み、アミノ酸と糖の比が１０：１〜１：１００（ｗ／ｗ）である組成物の存在下で行なわれる第２相を含む。
【００２５】
本明細書で用いる用語「生物医薬製品」は周知であって医薬製品に関し、前記医薬製品は１つまたは複数の生体分子に基づいている（本明細書において生体分子に基づく医薬製品とも称する）。生物学的供給源から製造され、抽出され、もしくは半合成された、またはたとえば化学合成され、もしくはたとえばインビトロ翻訳タンパク質等のインビトロ系を介して合成された任意の生体分子に基づく医薬製品は、前記用語に包含される。「生物医薬製品」という用語はまた、「生物医薬」、「薬剤製品」、「生物学的医学製品」、「生物学的製剤」または「生物製剤」という用語と相互交換可能に用いられる。
【００２６】
生物医薬製品は目的の生体分子を含む。本明細書で用いる用語「生体分子」は、典型的には生体中に存在する任意の分子に関する。好ましい生体分子は、タンパク質、炭水化物、脂質、および核酸等の大きな高分子、ならびに一次代謝物、二次代謝物、および天然産生物等の小分子である。「生体分子」という用語は１種類の生体分子に限定されず、２つ以上の生体分子も包含し、すなわち「１つまたは複数の生体分子」も意味する。
【００２７】
本発明の方法はそのような生物医薬製品の生産に関し、生産は２つの相を含む。第１相では目的の生体分子の原薬が調製される。第２相では前記原薬がさらに処理されて生物医薬製品が得られる。
【００２８】
「原薬」という用語は本明細書において「バルク薬」または「バルク原薬」という用語と相互交換可能に用いられる。これらの用語は当技術分野で周知であり、薬剤における使用のために表され、薬剤の製造、処理、または包装の際に用いられて薬剤の活性成分または最終用量形態になる任意の物質を意味する。ＦＤＡの定義によれば、この用語はそのような物質の合成に用いられる中間体を含まない。
【００２９】
本発明の製造方法の前記第１相は、（ａ１）採取、（ａ２）精製、（ａ３）再緩衝化、および（ａ４）濃縮から選択される少なくとも１つの処理ステップを含む。
【００３０】
本明細書で用いる用語「含む」は、言及されたステップおよび／または成分に加えてさらなるステップおよび／または成分が含まれてもよいことを意味する。たとえば、好ましい実施形態では、この用語は、ステップ（ａ）の組成物等の組成物中に糖が存在することを包含する。しかし、この用語はまた、特許請求された主題が、言及されたステップおよび／または成分のみからなっていることも包含する。
【００３１】
本明細書で用いる用語「少なくとも」は、具体的に言及された量または数を意味するが、具体的に言及された量または数を超える量または数も意味する。たとえば、「少なくとも１つ」という用語は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０等、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０なども包含する。さらに、この用語は正確に１、正確に２、正確に３、正確に４、正確に５、正確に６、正確に７、正確に８、正確に９、正確に１０、正確に２０、正確に３０、正確に４０、正確に５０なども包含する。言及された処理ステップに関して、「〜から選択される少なくとも１つの処理ステップ」という用語は、前記処理ステップの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つが行なわれることを包含するが、６つの処理ステップの全てが行なわれることも包含する。これらの処理ステップを列挙する順序は特に制限されないが、２つ以上のステップが行なわれる場合には、前記ステップは言及された順序で行なわれることが好ましいことが理解されよう。たとえば再緩衝化等のある種の処理ステップが、本発明の方法の前記第１相で原薬を調製するプロセスにおいて２回以上行なわれてもよいことがさらに理解されよう。
【００３２】
本明細書で用いる用語「採取する」は、目的の生体分子を産生する供給源から目的の生体分子を得るプロセスステップに関する。たとえば組み換えヒトインスリン、ヒト成長ホルモン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、血液凝固因子、モノクローナル抗体およびインターフェロン等の市販の治療用タンパク質の大部分は、枯草菌および大腸菌、酵母およびその他の真菌等の微生物、または哺乳類細胞を供給源として用いる大スケール発酵によって生産される。治療用タンパク質の重要な供給源としての哺乳類細胞培養の顕著な例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞および幼児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞がある。前記供給源は培養培地中に生体分子を分泌し、または細胞内に生体分子を発現することができる。後者の場合には、タンパク質を採取するために細胞を破壊する追加的な要求があるので、採取手順は典型的にはより複雑である。さらに、生体分子は動物組織、体液、および植物等の供給源から採取することもできる。
【００３３】
採取のプロセスにおいて用いられる典型的な方法には、遠心、濾過およびミクロ濾過、ならびにクロマトグラフィーが含まれる。これらの方法は当技術分野で周知である。
【００３４】
本明細書で用いる用語「精製」は、目的の生体分子を単離するために用いられる手法に関する。精製は典型的にはさらなる処理のために高度に精製された原薬、すなわち目的の生体分子以外の他の物質を含まない、もしくは実質的に含まない生成物を回収するために生物医薬製造の早期の相において行なわれる。生体分子を精製するために典型的に実施される方法およびステップには、たとえば生体分子の濃縮および／またはたとえば遠心、沈殿、濾過／超遠心、またはイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーの方法による異物（宿主細胞）タンパク質を除去するための清浄化、ならびにたとえば分解生成物、生成物の酸化、脱アミド化、または分解形態等の生成物の誘導体、および発熱性物質等の夾雑物のたとえばサイズ排除クロマトグラフィーによる除去のためのさらなる仕上げステップが含まれる。
【００３５】
本明細書で用いる用語「再緩衝化」は、原薬または最終薬剤製品のための適合されたまたは最適化された環境を得るための存在する製剤の改質のための方法に関する。再緩衝化を行なう１つの可能は方法は、存在する製剤をたとえば水または緩衝液の添加によって希釈することである。あるいは、存在する製剤は、たとえば本明細書で以下に述べる賦形剤等の特定の賦形剤を添加することによって改質することができる。再緩衝化を行なう特に好ましい方法は透析によるものである。透析は当技術分野で周知の方法であり、膜を横切る小分子溶質の拡散を可能にするために半透過性透析膜が用いられ、液体の成分が交換されて生体分子は分子量および透析膜の適用した分子量カットオフに応じて透析カセットの中に保持される。
【００３６】
本明細書で用いる用語「濃縮」は、それぞれの分子（製造の段階に応じてたとえば生体分子、原薬もしくは生物医薬の原薬または薬剤製品）の濃度の増大に関する。好ましくは、濃度はそれぞれの濃縮された生成物が用いられる最終濃度および用量に対応するレベルに増大される。
【００３７】
本発明の生産方法のこの第１相は特定の組成物、すなわち少なくとも３つのアミノ酸を含む組成物の存在下で行なわれ、前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せは、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧調整機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供する。本明細書においてこの組成物は「第１相組成物」または「早期相組成物」とも称する。
【００３８】
前記組成物は少なくとも３つのアミノ酸の存在によって特徴付けられる。これらの３つのアミノ酸は、言及された４つの官能基を提供するように選択される。「少なくとも３つのアミノ酸」という用語は、３つの異なったアミノ酸を意味することが認識されよう。
【００３９】
本明細書で用いる用語「アミノ酸」は当技術分野で周知である。アミノ酸はタンパク質の本質的な構成要素である。本発明によれば、「アミノ酸」という用語は、相互に結合してジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド等のオリゴマーもしくはポリマーまたはタンパク質（本明細書ではポリペプチドとも称される）を形成しない遊離アミノ酸を意味する。これらは、非極性、脂肪族、極性、非荷電、正および／または負荷電、および／または芳香族Ｒ基を有する賦形剤の特徴的な群に分類することができる（Ｎｅｌｓｏｎ  Ｄ．Ｌ．、Ｃｏｘ  Ｍ．Ｍ．、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ（２００５）、１２２〜１２７頁）。
【００４０】
本発明によるアミノ酸は、天然産生アミノ酸ならびに人工アミノ酸またはこれらの天然産生アミノ酸もしくは人工アミノ酸の誘導体から選択することができる。天然産生アミノ酸は、たとえば２０個のタンパク源性アミノ酸、すなわちグリシン、プロリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、システイン、フェニルアラニン、リジン、ロイシン、イソロイシン、ヒスチジン、メチオニン、セリン、バリン、チロシン、スレオニン、およびトリプトファンである。その他の天然産生アミノ酸は、たとえばカルニチン、クレアチン、クレアチニン、グアニジノ酢酸、オルニチン、ヒドロキシプロリン、ホモシステイン、シトルリン、ヒドロキシリジン、またはβ−アラニンである。人工アミノ酸は、異なった側鎖長および／もしくは側鎖構造を有し、ならびに／またはα炭素原子と異なった部位にアミン基を有するアミノ酸である。アミノ酸の誘導体は、限定しないがＮ−アセチルトリプトファン、ホスホノセリン、ホスホノスレオニン、ホスホノチロシン、メラニン、アルギニノコハク酸およびそれらの塩ならびにＤＯＰＡである。本発明に関して、全ての用語はそれぞれのアミノ酸の塩も含む。
【００４１】
正に荷電した官能基をそれらの対応する側鎖を介して提供するアミノ酸は当技術分野で周知であり、たとえばリジン、アルギニン、ヒスチジン、およびたとえばオルニチン等の非タンパク源性アミノ酸が含まれる。
【００４２】
本明細書で用いる用語「浸透圧調整機能を提供するアミノ酸」は、浸透圧特性を提供するアミノ酸に関する。そのようなアミノ酸も当技術分野で周知であり、たとえばグリシン、アラニン、およびグルタミン酸、ならびにたとえばベタイン、カルニチン、クレアチン、クレアチニン、およびβ−アラニン等の、それぞれタンパク源性および非タンパク源性のアミノ酸の誘導体が含まれる。
【００４３】
本明細書で用いる用語「抗酸化官能基を提供するアミノ酸」は、その側鎖（の１つ）を介して抗酸化特性を提供するアミノ酸に関する。そのようなアミノ酸も当技術分野で周知であり、たとえばメチオニン、システイン、ヒスチジン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびチロシン、ならびにたとえばＮ−アセチルトリプトファン、Ｎ−アセチルヒスチジン、またはカルノシン等のタンパク源性および非タンパク源性のアミノ酸の誘導体が含まれる。
【００４４】
「緩衝機能を提供するアミノ酸」という用語は、その官能基の１つまたは複数を介して緩衝能を提供するアミノ酸に関する。そのようなアミノ酸は当技術分野で周知であり、たとえばグリシン、アルギニン、およびヒスチジンが含まれる。
【００４５】
１つのアミノ酸が前記官能基および／または機能のいくつか、たとえばそれぞれ２つ、３つ、または４つ全ての官能基および機能を組み合わせ得ることも認識されよう。本明細書においてはアミノ酸がそのような官能基および／または機能の提供において重複してもよいことも意図される。すなわち、たとえばヒスチジンのように、抗酸化官能基を提供するアミノ酸が緩衝機能を提供してもよい。
【００４６】
ある実施形態では、すなわち組成物が正確に３つのアミノ酸からなる場合には、４つ全ての官能性基および機能がそれぞれ前記３つのアミノ酸によって提供されることが必要である。換言すれば、アミノ酸の少なくとも１つはそれぞれ官能性基および機能の２つ（またはそれ以上）を提供する。たとえば、グリシンは浸透圧調整機能ならびに緩衝機能を提供し、ヒスチジンは抗酸化官能基ならびに緩衝機能を提供する。
【００４７】
好ましい実施形態では、この第１相組成物はアミノ酸のみからなる。すなわち、これは糖（糖アルコールを含む）、キレート化剤、およびアミノ酸以外の抗酸化剤、界面活性剤、安定化タンパク質またはペプチド等の他の賦形剤を含まない。さらにより好ましくは、第１相組成物はそれぞれ４つの言及された官能基および機能を提供する正確に３つのアミノ酸からなる。
【００４８】
代替の好ましい実施形態では、この第１相組成物は少なくとも１つの糖を含む。より好ましい実施形態では、第１相組成物は上で言及されたアミノ酸および少なくとも１つの糖からなる。
【００４９】
本発明による第１相組成物中に含ませる少なくとも３つのアミノ酸の好ましい量は５ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ〜７５ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは１５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくはその量は約２０ｍｇ／ｍｌである。これらの好ましい量は溶液中に存在する全てのアミノ酸の合計を意味することが認識されよう。
【００５０】
本明細書で用いる用語「約」は、明示的に言及された値ならびにそれからの小さな偏差を包含する。換言すれば、「約２０ｍｇ／ｍｌ」のアミノ酸の量は、正確でなくてもよいが言及された２０ｍｇ／ｍｌの量を含むが、数ｍｇ／ｍｌの相違があってもよく、したがってたとえば２１ｍｇ／ｍｌまたは１９ｍｇ／ｍｌを含む。
【００５１】
当業者であればそのような値は相対的な値で、その値が言及された値にほぼ対応している限り、完全な正確性を要求していないことを熟知している。したがって、言及された値からのたとえば１５％、より好ましくは１０％、最も好ましくは５％の偏差は「約」という用語に包含される。１５％、より好ましくは１０％、最も好ましくは５％のこれらの偏差は、「約」という用語を用いる本発明に関連する全ての実施形態にあてはまる。
【００５２】
本発明の方法は、第１相における言及された処理ステップが、この第１相組成物の「存在下で」行なわれることを必要とする。換言すれば、バルク原薬は第１相組成物と接触させられる。これは、たとえば目的の生体分子が、存在する溶媒を第１相組成物と交換することによって、またはたとえば抗体の場合には第１の精製カラムの間に、もしくはウイルスベクターの場合には超遠心の間に、存在する溶媒に少なくとも３つのアミノ酸を添加することによって、第１相組成物中に直接採取されるならば、達成される。
【００５３】
この第１相で得られた原薬は次いで、原薬を生物医薬製品に製剤化するために、さらなる処理ステップの第２相にさらに供される。この第２相では、（ｂ１）再緩衝化、（ｂ２）凍結、（ｂ３）解凍、および（ｂ４）充填から選択される少なくとも１つの処理ステップが行なわれる。
【００５４】
第１相に関して本明細書で上に提供した定義および好ましい実施形態は、他に定義しない限り準用される。たとえば、用語「含む」、「少なくとも」、「再緩衝化」、「透析」、「アミノ酸」、「〜の存在下で」等は上で定義した通りである。
【００５５】
本明細書で用いる用語「凍結」は、試料を固体の凍結状態に移すプロセスに関する。凍結は典型的には保存のための試料を調製するために利用される。それは、この状態ではたとえば汚染のリスクが低減されるためである。
【００５６】
本明細書で用いる用語「解凍」は、試料を固体の凍結状態から非凍結状態に移すプロセスに関する。大部分の場合には、解凍された試料は液相で存在することになるが、乾燥生成物が凍結された場合には、解凍された生成物はさらなる処理のために引き続いて再構成することができる乾燥した非凍結状態に戻ることになる。いったん解凍されれば、生成物はたとえば充填等のさらなる開発または製造プロセスに利用可能である。
【００５７】
本明細書で用いる用語「充填」は、液体または乾燥された生成物をさらなる処理のために、または最終製品として輸送、保存、および／または投与のために、特別の容器に移すプロセスに関する。
【００５８】
本発明の生産方法のこの第２相は、これも特定の組成物の存在下で行なわれ、この場合には組成物は少なくとも３つのアミノ酸および１つまたは複数の糖を含む。この組成物は本明細書において「第２相組成物」とも称する。
【００５９】
前記組成物は少なくとも３つのアミノ酸の存在によって特徴付けられ、必然的に存在する官能基および機能は、第１相組成物について定義した通りである。しかし、アミノ酸の実際の選択は第１相組成物におけるものと同じアミノ酸に限定されない。その代わりに、アミノ酸のいくつかまたは全ては、第１相組成物のアミノ酸と異なっていてもよい。本明細書においては、第２相組成物の少なくとも３つのアミノ酸は第１相組成物の少なくとも３つのアミノ酸と同一であることも包含される。
【００６０】
さらに、第２相組成物には１つまたは複数の糖が存在する。
【００６１】
本明細書で用いる用語「糖」は、任意の種類の糖、すなわち炭水化物の単糖、二糖、またはオリゴ糖の形態、ならびに糖アルコール、またはアミノ糖、たとえばグルコサミンもしくはＮ−アセチルグルコサミン等の糖誘導体を意味する。好適な糖の例には、限定しないがトレハロース、サッカロース、マンニトール、およびソルビトールが含まれる。
【００６２】
本発明による溶液中に含まれる糖の好ましい量は５〜２００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは１５〜８０ｍｇ／ｍｌであり、最も好ましくはその量は約３０ｍｇ／ｍｌである。異なった種類の糖の混合物を用いる場合は、これらの好ましい量は溶液中の全ての糖の合計を意味する。
【００６３】
本発明によれば、第２相組成物中に存在する前記アミノ酸と糖との比は、１０：１〜１：１００である。この比はアミノ酸と糖の濃度を意味し、典型的にはｍｇ／ｍｌで表される。好ましくは、比は５：１〜１：５０、より好ましくは２．５：１〜１：２５、最も好ましくは１：１〜１：２である。
【００６４】
本発明によれば、生物医薬製品の生産のための改善された方法が開発された。この方法は、支持組成物における繰り返しのステップに依存する変更の必要性の低減と組み合わせた、生産プロセス全体を通して単純であるが効率的な保護を提供することに焦点を当てて開発された。この目的のため、本方法の早期相において単純なアミノ酸組成物が用いられる。驚くべきことに、このアミノ酸組成物は採取の直後および初期の精製ステップの間に原薬を安定化させるために十分であることが見出された。さらに、この早い段階で既に原薬を安定化させることによって、全体の製造プロセス、保存および投与を通して製品の品質と安定性の改善が得られることが見出された。
【００６５】
本方法は、原薬の生産の間の本方法の早期相における安定化組成物は、少数のアミノ酸、すなわち３つ（または任意選択でそれ以上）のアミノ酸の存在のみを必要とし、したがって原薬の開発の間に典型的には必要とされる分析手順に支障をきたすことがないという、さらなる利点を提供する。
【００６６】
これらの知見は特に驚くべきものである。それは、たとえばＷＯ２０１３／００１０４４号、ＷＯ２０１０／１１５８３５号、ＷＯ２０１０／１１２５７６号、ＷＯ２０１３／００１０３４号またはＷＯ２０１５／０５９２８４号等の以前の研究によって、アミノ酸の種々の組合せが、さらなる安定化賦形剤の存在下または非存在下で、種々のストレス条件の下に特定の生体分子の三次元構造に保護効果を提供することが示されたからである。これらのストレス条件は、たとえば高温における保存の間、ならびに生体分子の滅菌の間の生体分子の乾燥および／または再構成であった。しかし、これらの組成物はこれらのストレス条件下では効果がある一方、本明細書では驚くべきことに、原薬調製の早期相で既に、たとえば細胞培養システムからの採取の際に直接、およびたとえば最初の超遠心ステップの後で用いた場合には、これらの組成物の全てが本発明による「早期相組成物」と同じ優れた効果を提供するわけではないことが見出された。
【００６７】
たとえば以下の実施例２に示すように、「早期相」安定化組成物を早期に添加することは、全体の調製手順の間の生物医薬製品の安定性に大きな影響を与え得る。したがって、本発明の安定化組成物の早期の適用は、全体の生産プロセスの間の特定の生体分子に対する顕著な安定化効果を有することが見出された。
【００６８】
これらの知見はたとえば実施例３〜５および実施例７でさらに実証される。これらは、たとえば最終の治療用抗体製剤の透析または濃縮による再緩衝化等の、生産プロセスの間の処理ステップに通常関与するストレスへの曝露に対する本発明のいくつかの組成物の安定化効果を示す。低濃度の治療用抗体製剤（実施例３および４）ならびに高濃縮治療用抗体製剤（実施例５）の両方は、本発明による種々の組成物中で調製すれば、もとの供給元の製剤における同様の調製ステップと比較して低減された凝集形成を示すことが見出された。
【００６９】
さらに、実施例７に示すように、高濃縮液体治療用抗体製剤を調製するために市販の液体トラスツズマブ製剤を濃度２００ｍｇ／ｍｌに濃縮すると、望ましくない凝集物の形成の増加が生じる。対照的に、本発明の組成物中における追加的な再緩衝化ステップに続くこの治療用抗体の濃縮は、この凝集物形成の増加を避けるために十分であった。実施例８、９および１０では、生物医薬の製造および処理ステップの間の本発明の組成物の安定化効果を確認するさらなるデータが示される。実施例は、モノクローナル抗体トラスツズマブが再緩衝化および後続の濃縮ステップならびに機械的ストレスのモデルとしての撹拌の間にストレスを受けた際に、本発明の組成物がもとの供給元液体製剤よりも優れていたことを示している。
【００７０】
原薬の種々の生産ステップの間の再緩衝化、透析および濃縮のモデルとしての上述の実施例は、この早期相の間の本発明の組成物の安定化効果はアミノ酸と糖の濃度比に特に依存しないことを示している。驚くべきことに、後の下流処理相において、アミノ酸と糖（または糖混合物）との濃度比、および／またはアミノ酸と原薬との濃度比は、たとえば液体の保存、高温での液体の保存（たとえば実施例３〜７を参照）の間、および特に高濃縮抗体製剤（たとえば実施例５および７を参照）の場合における粘度に対して強い医薬製品安定化効果を引き起こす。
【００７１】
本方法の早期相における安定化アミノ酸組成物が単純であることは、それぞれの薬剤製品を得るためのさらなる処理ステップの間の原薬の要求に容易に適応できるというさらなる利点を有する。たとえば糖および／または糖混合物等の他の賦形剤を添加することによる初期の単純な安定化製剤の改質により、追加の再緩衝化ステップを避けることまたは限定することによって、最終製剤に容易に適応できることが可能になる。したがって、全体の生産および製剤プロセスを通して、取扱いおよびストレスの多い処理ステップの必要が少なくなり、それにより適用されるストレスが少なくなり、生物医薬製品の安定性が増大し、また生物医薬の原薬および薬剤製品の製造に伴う仕事量とコストが低減される。
【００７２】
さらに、特許を請求する生産プロセスの間の本明細書に記載した組成物の使用により、最終生物医薬製品のオスモル濃度は４５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ未満になる。高いオスモル濃度は注射部位における疼痛および副作用に関連することが幾人かの研究者によって報告されている。したがって、非経口適用される溶液のオスモル濃度は４５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ未満、好ましくは生理学的範囲の２７５〜３２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇに近いことが一般に許容されている。本発明の方法によって得られた薬剤製品はヒトおよび動物への投与のための医薬製品に対するこの要求を満たす。
【００７３】
まとめると、本発明者らは驚くべきことに、極めて単純なアミノ酸組成に基づく本発明の早期相組成物を用いることによって、生物医薬の原薬および薬剤製品の調製において必要な後続の処理ステップのための理想的な出発点が提供されることを見出した。この初期相組成物を基礎として用いて、組成の最小の調節のみを必要とし、同時にバランスを取った安定化効果を達成するモジュール式で開発相に特化した製剤アプローチが可能である。このようにバランスを取った製剤は、特定の生物医薬製品の種々の保存および／または投与目的等の後続のステップの特定の要求に従って特に調整することができる。
【００７４】
本明細書に提供する本発明の方法の全ての実施形態によれば、本発明の方法による原薬生産の早期相の間で用いられるべき好ましい組成物は、アミノ酸、すなわちアルギニン、グリシン、トリプトファン、およびヒスチジンから選択される３つのアミノ酸、または前記４つのアミノ酸の組合せのいずれかを含む。さらに、本明細書に提供する本発明の方法の全ての実施形態によれば、好ましい後期相組成物は、アルギニン、グリシン、トリプトファン、およびヒスチジンから選択される３つのアミノ酸、または前記４つのアミノ酸の組合せのいずれかを含み、アミノ酸はトレハロースおよびサッカロース等の糖または糖の混合物との組合せである。任意選択でキレート化剤および／または抗酸化剤を添加してもよい。生産の後期相のためのより好ましい組成物は、キレート化剤ＥＤＴＡおよび／または抗酸化剤アスコルビン酸をさらに含む。
【００７５】
本発明の方法の好ましい実施形態では、（ｂ）で得られた生物医薬製品は、保存および／または投与のために液体製剤としてさらに処理される。
【００７６】
本発明によれば、「保存」は後続の処理ステップまたは対象者への投与のために直ちに用いられない原薬または薬剤製品を規定の条件に保つことを意味する。したがって、本明細書で用いる用語「保存」は特に限定されず、たとえば製造現場、研究室、使用前の医療施設もしくは診療における原薬もしくは薬剤製品の保存、原薬もしくは薬剤製品の輸送／出荷、またたとえば生物医薬製品の分注等の調製ステップも包含する。
【００７７】
保存の条件は原薬または薬剤製品の種類、ならびに製品が投与のためのものであれば意図された投与経路に依存する。たとえば、薬剤製品の無菌性および安定性を考慮し、制御すべきである。多くの原薬は温度または紫外光による分解プロセスを防止するためにそれぞれ、低温および／または暗所に保たなければならない。さらに、液体製剤として投与されることになる薬剤製品は、適用の前に追加的な再構成ステップを行なう必要性を回避するために、使用まで好ましくは液体として保たれる。
【００７８】
生物医薬製品は、任意の好適な処理ステップで保存および／または投与のために処理することができる。そのような処理ステップの非限定的な例には、たとえば無菌充填、すなわち製剤が予め調製された無菌の容器に移される充填が含まれ、それにより生物医薬製品は後の投与手順に好適である。
【００７９】
液体製剤の場合には、たとえば充填の際の生物医薬製品の濃度は、これが投与に必要な最終濃度に対応するように選択されることが好ましい。さらに、製剤はこれが製品を安定化させ、したがって充填、保存および投与の間の分子の完全性および機能の喪失を避け、または最小化するように選択されることが特に好ましい。
【００８０】
乾燥製剤の場合には、保存および／または投与のための処理は、少量の再構成剤（たとえば注射用水、ＷＦＩ）による後の再構成に際して、好ましくは再緩衝化および／または追加の処理ステップによる濃度の調節をすることなく、簡単な手順によって最終用量が達成されるように薬剤製品の濃度を調節しなければならないということを含んでいる。
【００８１】
生物医薬製品が凍結製品として存在する場合には、前記凍結製品は充填前に解凍しなければならない。得られた液体は最終用量に分注しなければならない。この段階では凍結解凍が分子の完全性および機能の喪失をもたらし、したがって最終用量を調節しなければならないことを考慮しなければならない。
【００８２】
本発明の方法のこの好ましい実施形態によれば、生物医薬製品は処理されて液体製剤になる。前記液体製剤は、たとえば試験管または凍結管、シリンジ、マイクロニードル、ディスペンサー、経皮パッチ等の任意の好適なバイアルまたは容器またはキャリア内で保存し、および／または投与のために提供することができる。
【００８３】
典型的には、生物医薬製品の保存は規定の条件で行なわれる。そのような規定の条件には、たとえば米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の「ｇｏｏｄ  ｓｔｏｒａｇｅ  ｐｒａｃｔｉｃｅ」ガイドラインおよび医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）のガイドラインに規定されているように、特定の温度プロファイル、湿度およびその他の保存条件が含まれる。しかし、生物医薬製品の輸送／出荷の間、また投与の間に問題が生じ、常にそのような厳しい条件を遵守できないこともある。たとえば、特に第三世界の諸国への輸送において低温流通が妨げられることがあり、試料が光に曝されることや振盪による機械的ストレスに曝されることがある。これは、乾燥製剤よりもそのような不都合な条件による損傷に影響されやすい液体製剤に関して特に重要である。
【００８４】
生物医薬製品の保存中の安定性は、部分的には上記の保存条件の遵守によるが、適切な安定化賦形剤の存在、ならびに生物医薬製品それ自体の性質および濃度にも影響される。したがって、生物医薬製品を適切な液体製剤で供給することにより、生物医薬製品を不都合な条件から保護することができ、それによりその安定性を向上させることができる。
【００８５】
したがって、本発明の方法の好ましい実施形態では、液体製剤は０．００１から１００ｍｇ／ｍｌ未満の濃度範囲における生物医薬製品の保存および／または投与のためのものであり、製剤は、（ｉ）少なくとも３つのアミノ酸であって、前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せが、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧調整機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供する、少なくとも３つのアミノ酸、および（ｉｉ）１つまたは複数の糖を含み、アミノ酸と糖との比が４：１〜１：２（ｗ／ｗ）に調節されていることを特徴とする。
【００８６】
この好ましい実施形態は、低濃度の液体形態での生物医薬製品の保存に関する。本明細書で上に定義したように、そのような低濃度は１００ｍｇ／ｍｌ未満の生物医薬製品の濃度である。
【００８７】
そのような低濃度の液体製剤の安定性を改善するために、製剤は少なくとも３つのアミノ酸および１つまたは複数の糖を含むように調節される。「少なくとも３つのアミノ酸」および「糖」の定義および好ましい実施形態は、本発明の方法に関して本明細書で上に提供した通りである。しかし、アミノ酸の実際の選択は本明細書で上に定義した第１相および／または第２相組成物と同じアミノ酸に限定されず、その代わりにアミノ酸のいくつかまたは全ては、第１相および／または第２相組成物のアミノ酸と異なっていてもよい。この好ましい実施形態の少なくとも３つのアミノ酸が第１相および／または第２相組成物の少なくとも３つのアミノ酸と同一であることも、本明細書に包含される。糖に関しても同じことが適用される。
【００８８】
重要なことに、アミノ酸と糖との比は４：１〜１：２（ｗ／ｗ）に調節すべきである。いかにしてそのような調節が行なえるかは当技術分野で周知である。好ましくは、アミノ酸と糖との重量対重量比を調節することによって、調節が行なわれる。溶液中に既に存在する賦形剤の量の知識およびそれらの既知の分子量に基づいて、希釈に用いる上記の比を得るために添加が必要な賦形剤の追加量を計算することができる。
【００８９】
下記の低濃縮治療用抗体製剤に対応する実施例３および４に示すように、本発明の方法によって得られた原薬を、アミノ酸と糖との比を４：１〜１：２（ｗ／ｗ）として言及された少なくとも３つのアミノ酸および糖と組み合わせることによって、早期の生産プロセスおよび後続の高温での液体保存の両方において凝集および断片化に関して優れた結果が提供されることが、驚くべきことに見出された。生産プロセスの早期のプロセスステップの間、ならびに生産プロセスの種々の段階の間の凍結解凍事象を模倣する多数の凍結解凍サイクルの後の機能の喪失および分子の完全性の喪失を防止するためのこの安定化組成物も実施例２に示した。これらの処理ステップの間に糖と組み合わせたアミノ酸に基づく製剤を用いて製品の損失を避けることによって、さらなる再緩衝化および透析のステップを避けることができる。
【００９０】
本発明の方法の代替の好ましい実施形態では、液体製剤は１００〜５００ｍｇ／ｍｌの高濃度範囲における生物医薬製品の保存および／または投与のためのものであり、製剤は以下の賦形剤：（ｉ）少なくとも３つのアミノ酸であって、前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せが、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧調整機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供する、少なくとも３つのアミノ酸、および（ｉｉ）１つまたは複数の糖を含み、アミノ酸と糖との比が４：１〜１：１（ｗ／ｗ）に調節されていることを特徴とする。
【００９１】
この代替の好ましい実施形態は、高濃度の液体形態での生物医薬製品の保存に関する。本明細書で上に定義したように、そのような高濃度は１００〜５００ｍｇ／ｍｌの範囲の生物医薬製品の濃度である。
【００９２】
そのような高濃度の液体製剤の安定性を改善するために、製剤は少なくとも３つのアミノ酸および１つまたは複数の糖を含むように調節される。「少なくとも３つのアミノ酸」および「糖」の定義および好ましい実施形態は、本発明の方法に関して本明細書で上に提供した通りである。
【００９３】
この場合も、アミノ酸の実際の選択は本明細書で上に定義した組成物と同じアミノ酸に制限されず、その代わりにアミノ酸のいくつかまたは全ては、上に定義した組成のアミノ酸と異なっていてもよい。この好ましい実施形態の少なくとも３つのアミノ酸が上で定義した組成物の１つの少なくとも３つのアミノ酸と同一であることも、本明細書に包含される。糖に関しても同じことが適用される。
【００９４】
重要なことに、アミノ酸と糖との比は４：１〜１：１（ｗ／ｗ）、たとえば３：１〜２：１（ｗ／ｗ）に調節すべきである。最も好ましくは、比は１：１（ｗ／ｗ）である。上で考察したように、比を調節する方法は当技術分野で公知である。好ましくは、調節はアミノ酸と糖との重量対重量比を調節することによって行なわれる。溶液中に既に存在する賦形剤の量の知識およびそれらの既知の分子量に基づいて、希釈に用いる上記の比を得るために添加が必要な賦形剤の追加量を計算することができる。
【００９５】
本発明の方法のこの好ましい実施形態によって、液体製剤中に追加の賦形剤が含まれてもよいことも予想される。そのような追加の賦形剤は、好ましくはキレート化剤、追加の抗酸化剤、および界面活性剤から選択される。
【００９６】
本明細書で用いる用語「キレート化剤」は、たとえば製剤中の金属イオンで触媒される酸化反応を避けるために製剤中の金属イオンを捕捉する賦形剤に関する。キレート化剤の非限定的な例には、デスフェラール、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、またはデフェロキサミン（ＤＦＯ）が含まれる。そのようなキレート化剤は、水銀［Ｈｇ］、ヒ素［Ａｓ］、鉛［Ｐｂ］等の有毒な金属剤を生体とさらに相互作用させることなく排泄できる化学的に不活性な形態に変換することによって解毒するためのキレート化療法において一般に用いられている。本発明によれば、キレート化剤は低濃度、たとえば０．３〜０．５ｍｇ／ｍｌで用いられ、これは治療効果を引き起こさないが、むしろたとえば保存中の生物医薬製品を安定化させることになることが理解されよう。
【００９７】
本明細書で用いる用語「追加の抗酸化剤」は、限定しないがメチオニン、システイン、グルタチオン、トリプトファン、ヒスチジン、アスコルビン酸および本明細書に列挙した薬剤の任意の誘導体に関する。
【００９８】
本明細書で用いる用語「界面活性剤」は、表面活性薬剤に関する。この用語には、その特性および用途に応じて、湿潤化剤、乳化剤および懸濁剤も含まれる。表面活性薬剤は、低濃度でシステムの表面または界面に吸着されて表面または界面の自由エネルギーおよび表面または界面の張力を変化させる物質である。これらは有機溶媒と水の両方に溶解するので、これらは「両性」と呼ばれる。本発明による好ましい界面活性剤には、限定しないがポリソーベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）およびポリソーベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）が含まれる。
【００９９】
以下の実施例５〜７に示すように、生物医薬製品、たとえば本発明の方法によって得られた高濃縮治療用抗体製剤を、アミノ酸と糖との比を４：１〜１：１（ｗ／ｗ）として言及された少なくとも３つのアミノ酸および糖と組み合わせることによって、もとの供給元の製剤と比較して治療用抗体の処理の間、特に透析による再緩衝化および／または濃縮の間の凝集が少なくなることが、驚くべきことに見出された。さらに、この製剤によって、高温での後続の液体の保存中の凝集および分解が低減された。実施例８および９によってこの知見はさらに確認される。たとえば、米国特許第９３６４５４２号Ｂ２に概略が示された好ましい製剤と比較して、またもとの液体の供給元と比較して、本発明の製剤の優れた安定化効果が強調された。
【０１００】
さらに、保存中の液体保存時間動力学の定量的統計解析によって、本発明の組成物による安定化効果は統計的に有意であることが明らかになった。
【０１０１】
最も重要なことに、高濃縮生物医薬製品のそのような液体製剤は、驚くべきことにたとえば投与のための最終製品のシリンジ通過性のために重要な要素である、特に低い粘度を有することが、実施例５および７で見出された。特に実施例５は、本発明に対応し１２０ｍｇ／ｍｌの濃度でそれぞれの抗体を含む高濃縮治療用抗体製剤がもとの供給元の製剤の測定された粘度（約５ｍＰａｓ・秒）と比較して４ｍＰａｓ・秒未満の顕著に低い粘度を有していることを示している。さらに実施例７では、本発明に対応し２００および２２０ｍｇ／ｍｌの濃度で抗体を含む高濃縮治療用抗体製剤が２０ｍＰａｓ・秒よりも顕著に低い粘度を示した。全体として、全ての実施形態で粘度はもとの供給元の製剤よりも低いことが見出された。したがって、これらの値は対応する先行技術の製剤より低かった。
【０１０２】
したがって、高濃度の液体形態における生物医薬製品の保存のこの実施形態の特に好ましい実施形態では、高濃縮生物医薬製品の粘度は２０ｍＰａｓ・秒未満であり、高濃縮生物医薬製品の濃度が１００ｍｇ／ｍｌ〜１２０ｍｇ／ｍｌである場合には粘度は４未満である。高濃縮生物医薬製品の濃度が１２０ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌである場合には粘度は８ｍＰａｓ・秒未満であり、高濃縮生物医薬製品の濃度が１５０ｍｇ／ｍｌ〜２２０ｍｇ／ｍｌである場合には粘度は２０ｍＰａｓ・秒未満である
【０１０３】
本発明のこの方法のさらにより好ましい実施形態では、液体製剤は目的の生体分子と（ｉ）の少なくとも３つのアミノ酸との比が３．５：１〜１：２（ｗ／ｗ）になるようにさらに調節される。比の調節は好ましくは重量対重量比で行なわれる。目的の生体分子と糖との比の調節に関して本明細書で上に提供した詳細は、目的の生体分子と少なくとも３つのアミノ酸との比のさらなる調節に関するこの実施形態に準用される。
【０１０４】
本発明の方法の好ましい実施形態では、高濃縮原薬のための液体製剤はプロリンを含まない。実施例８は、本発明による安定化効果が米国特許第９３６４５４２号Ｂ２によるプロリンを含む製剤より優れていることを実証した。このことは、ＣＥＸ−ＨＰＬＣを用いて分析した制限された化学分解によって確認された。好ましい実施形態では、アミノ酸と糖との比は１０：１〜１：１００である。さらに、生体分子と賦形剤との好ましい比は１：１〜１：５００である。これらの比は他の実施形態でも好ましい。
【０１０５】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、本方法は、（ｃ）（ｂ）で得られた生物医薬の原薬を乾燥して、乾燥された生物医薬製品を得る第３のステップをさらに含み、この第３相における前記乾燥ステップは、（ｉ）少なくとも３つのアミノ酸であって、前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せが、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧調整機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供する、少なくとも３つのアミノ酸、および（ｉｉ）１つまたは複数の糖を含む組成物の存在下で行なわれ、目的の生体分子と賦形剤の合計との比は１：１〜１：１０（ｗ／ｗ）に調節される。
【０１０６】
この好ましい実施形態によれば、本発明の方法によって得られた生物医薬製品はさらに、乾燥された生物医薬製品を得るためのさらなる乾燥ステップに供される。生物医薬製品は、液体含量が体積の２０％未満、たとえば１０％未満、たとえば５％未満、より好ましくは体積の３％未満、２％未満、または１％未満に除去されまたは低減されれば乾燥していると考えられる。最も好ましくは、液体は０．５％またはそれ未満に低減される。乾燥のための好適な方法には、限定しないが凍結乾燥（フリーズドライ）、スプレー乾燥、凍結スプレー乾燥、対流乾燥、伝導乾燥、ガス流乾燥、ドラム乾燥、真空乾燥、誘電乾燥（たとえば高周波またはマイクロウェーブによる）、表面乾燥、空気乾燥または気泡乾燥が含まれる。
【０１０７】
本発明の方法のこの実施形態によれば、前記乾燥ステップは、（ｉ）少なくとも３つのアミノ酸および（ｉｉ）１つまたは複数の糖を含む組成物の存在下で行なわれる。この場合も、「少なくとも３つのアミノ酸」および「糖」の定義および好ましい実施形態は、本発明の方法に関して本明細書で上に提供した通りである。またアミノ酸の実際の選択は本明細書で上に定義した組成物中と同じアミノ酸に限定されず、その代わりにアミノ酸のいくつかまたは全ては、上に定義した組成物のアミノ酸と異なっていてもよい。この好ましい実施形態の少なくとも３つのアミノ酸が上で定義した組成物の１つの少なくとも３つのアミノ酸と同一であることも、本明細書に包含される。糖に関しても同じことが適用される。
【０１０８】
重要なことに、目的の生体分子と賦形剤の合計との比は１：１〜１：１０（ｗ／ｗ）、たとえば１：２、１：５、１：８（ｗ／ｗ）等の比に調節すべきである。最も好ましくは、比は１：２（ｗ／ｗ）である。上で考察したように、比を調節する方法は当技術分野で公知である。この好ましい実施形態に関しても、調節は目的の生体分子と賦形剤の合計との重量対重量比を調節することによって行なわれる。溶液中に既に存在する賦形剤の量の知識およびそれらの既知の分子量に基づいて、希釈に用いる上記の比を得るために添加が必要な賦形剤の追加量を計算することができる。
【０１０９】
本発明の方法のこの好ましい実施形態によって、乾燥ステップに用いる組成物中に追加の賦形剤が含まれてもよいことも予想される。そのような追加の賦形剤は、好ましくはキレート化剤、追加の抗酸化剤、および界面活性剤から選択される。前記追加の賦形剤について本明細書で上に提供した定義および好ましい実施形態が準用される。
【０１１０】
以下の実施例１に示すように、本発明の方法によって得られた生物医薬の原薬を、目的の生体分子と賦形剤の合計との比を１：１〜１：１０（ｗ／ｗ）として言及された少なくとも３つのアミノ酸および糖と組み合わせることによって、目的の乾燥した生体分子に優れた安定性が提供されることが、驚くべきことに見出された。実施例１において、アデノウイルスベクター調製物を本発明の組成物と組み合わせることによって、早期相の下流ステップおよび後続のフリーズドライの間で既に、ウイルス粒子の感染タイターおよび水力学的半径の完全な保持が得られた。対照的に、もとの供給元の製剤における対応するアデノウイルスベクター製剤のフリーズドライでは、感染性の顕著な喪失および粒子径の増大が生じた。一般的なリン酸塩緩衝食塩液（ＰＢＳ）と組み合わせた同様の手順では、フリーズドライの後で既に感染性の完全な喪失および粒子径の大きな増大が生じた。最も重要なことに、生物医薬の原薬または薬剤製品のそのような乾燥製剤は、分注、分配、出荷、保存等のさらなる種々の取扱いステップに好適である。
【０１１１】
本発明の方法のさらにより好ましい実施形態では、（ｂ）で得られた生物医薬製品の乾燥はフリーズドライ、スプレー乾燥、またはスプレーフリーズドライによる。
【０１１２】
フリーズドライは凍結乾燥とも称されるが、当技術分野で周知であり、試料を凍結し、引き続いて十分な熱を加えながら周囲の圧力を低下させ、材料中の凍結した水を固相から気相へ直接昇華させ、続いて二次の乾燥相を行なうステップを含む。好ましくは、湿気の再吸収を防ぐために、凍結乾燥された調製物を次にシールする。
【０１１３】
スプレー乾燥も当技術分野で周知であり、溶液、懸濁液またはエマルジョンを単一のプロセスステップで固体粉末に変換する方法である。一般に、液体製品の濃縮液は気化デバイスにポンプで送られ、そこで破壊されて小さな液滴になる。これらの液滴は熱気流に曝されて、乾燥空気中に懸濁したままで極めて急速にその湿気を失う。乾燥粉末はサイクロン中で遠心作用によって湿った空気から分離される。すなわち、高密度の粉末粒子はサイクロンの壁の方に押しやられ、軽い湿った空気は排気管を通して追い出される。
【０１１４】
スプレー乾燥は凍結ステップを必要とせず、凍結乾燥に比べて必要なエネルギーコストが低いので、しばしば選択される方法である。スプレー乾燥も、高温との短い接触時間と特別なプロセス制御のために、生体分子に適した特に有利な乾燥手順であることが示されている。したがって、スプレー乾燥によりただ１回のステップで分散可能な乾燥粉末が得られるので、生体分子の乾燥手法としてはフリーズドライより好まれることが多い。
【０１１５】
スプレーフリーズドライも当技術分野で周知であり、フリーズドライとスプレー乾燥に共通の処理ステップを組み合わせた方法である。提供された試料は低温媒体（たとえば液体窒素）中に霧化され、これが衝撃凍結された液滴の分散体を生成する。この分散体は次いでフリーズドライヤーで乾燥される。
【０１１６】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、ステップ（ｃ）で得られた乾燥した生物医薬製品は滅菌され、好ましくは最後に滅菌される。
【０１１７】
本明細書で用いる用語「最後の滅菌」は、ステップ（ｃ）で得られた製品を滅菌するプロセスに関し、前記滅菌プロセスは、たとえば本明細書で以下に考察する対象者への投与を可能にするための再構成等の意図された使用のための調製に先立つこの試料の取扱いにおける最後の（すなわち最終の）プロセスである。
【０１１８】
生物医薬製品を滅菌する手段および方法は、当技術分野で周知である。たとえば、乾燥された試料は容器またはバイアルの中に存在し、またはそれらに導入されることができ、容器またはバイアルは次いで閉鎖され、病原体、特に細菌およびウイルスを実質的に不活性化するために十分な時間、滅菌条件に曝される。滅菌条件の非限定的な例には、β線、Ｘ線、またはγ線等の照射、酸化エチレン処理、熱不活性化、オートクレーブ、またはプラズマ滅菌が含まれる。
【０１１９】
好ましくは、滅菌は照射または酸化エチレン処理によって行なわれる。
【０１２０】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、本方法はステップ（ｃ）で得られた乾燥された生物医薬製品を再構成して液体製剤を得るステップをさらに含み、このステップは、乾燥された生物医薬製品を再構成して、（ｉ）少なくとも３つのアミノ酸であって、前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せが、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧調整機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供する、少なくとも３つのアミノ酸、および（ｉｉ）１つまたは複数の糖を含み、アミノ酸と糖との比が４：１〜１：１（ｗ／ｗ）である組成物の中で液体の生物医薬製品を得ることを特徴としている。
【０１２１】
したがって、本発明の方法の好ましい実施形態に従って得られた乾燥された生物医薬製品は、液体製剤を得るために引き続いて再構成される。再構成は、少なくとも３つのアミノ酸および１つまたは複数の糖を含む組成物が得られる溶液中で行なわれる。この場合も、粘度の程度、「少なくとも３つのアミノ酸」および「糖」の定義および好ましい実施形態は、本発明の方法に関して本明細書で上に提供した通りであるが、アミノ酸の実際の選択は本明細書で上に定義した組成物中と同じアミノ酸に限定されず、その代わりにアミノ酸のいくつかまたは全ては、上に定義した組成物のアミノ酸と異なっていてもよい。この好ましい実施形態の少なくとも３つのアミノ酸が上で定義した組成物の１つの少なくとも３つのアミノ酸と同一であることも、本明細書に包含される。糖に関しても同じことが適用される。
【０１２２】
重要なことに、アミノ酸と糖との比は４：１〜１：１（ｗ／ｗ）であり、たとえば３：１または２：１（ｗ／ｗ）の間である。最も好ましくは、比は１：１（ｗ／ｗ）である。上で考察したように、比を調節する方法は当技術分野で公知である。この好ましい実施形態に関しても、調節はアミノ酸と糖との重量対重量比を調節することによって行なわれる。溶液中に既に存在する賦形剤の量の知識およびそれらの既知の分子量に基づいて、希釈に用いる上記の比を得るために添加が必要な賦形剤の追加量を計算することができる。
【０１２３】
本発明の方法のこの好ましい実施形態によって、乾燥ステップに用いる組成物中に追加の賦形剤が含まれてもよいことも予想される。そのような追加の賦形剤は、好ましくはキレート化剤、追加の抗酸化剤、および界面活性剤から選択される。前記追加の賦形剤について本明細書で上に提供した定義および好ましい実施形態が準用される。そのような追加の賦形剤は（もしあれば）その前のステップの１つにおいて用いた追加の賦形剤と同一であるように選択してもよいが、それとは異なるように独立に選択してもよい。
【０１２４】
本発明の方法の好ましい実施形態では、ステップ（ａ）における組成物は０．５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌのトリプトファンおよび０．５ｍｇ／ｍｌ〜３０ｍｇ／ｍｌのヒスチジンを含む。
【０１２５】
実施例２〜７に示すように、トリプトファンとヒスチジンのバランスを取った重量対重量比の溶液は、原薬の安定性を増大させ、糖との組合せにおいては薬剤製品の安定性を増大させる。
【０１２６】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、目的の生体分子はタンパク質およびペプチド、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される。
【０１２７】
本明細書で用いる用語「ペプチド」は、３０個までのアミノ酸からなる分子の群を表し、「タンパク質」は、３０個を超えるアミノ酸からなる。ペプチドおよびタンパク質はダイマー、トリマーおよびそれ以上のオリゴマーをさらに形成し、すなわち同一でもよく同一でなくてもよい２つ以上の分子からなっていてもよい。対応する高次構造はそれゆえ、ホモまたはヘテロダイマー、ホモまたはヘテロトリマー等と名付けられる。用語「ペプチド」および「タンパク質」（「タンパク質」は「ポリペプチド」と相互交換可能に用いられる）は天然に改質されたペプチド／タンパク質も意味し、改質はたとえばグリコシル化、アセチル化、ホスホリル化等によって達成される。そのような改質は当技術分野で周知である。さらに、アミノ酸および／またはペプチド結合が機能性アナログで置換されたそのようなペプチドおよびタンパク質のペプチド模倣体も本明細書に包含される。
【０１２８】
そのような機能性アナログには、セレノシステイン等の、２０個の遺伝子コードされたアミノ酸以外の全ての既知のアミノ酸が含まれる。好適なタンパク質またはペプチドの特定の好ましい例を本明細書で以下に詳細に述べる。
【０１２９】
タンパク質およびペプチドの好ましい例は、抗体およびホルモンである。
本発明による抗体は、たとえばポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。本明細書で用いる用語「抗体」には、キメラ（ヒト定常ドメイン、非ヒト可変ドメイン）、一本鎖およびヒト化（非ヒトＣＤＲの例外を有するヒト抗体）抗体、ならびに抗体断片等、とりわけＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｄ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖ断片またはナノ抗体、すなわち一本鎖モノマー可変抗体ドメイン等の実施形態も含まれる。たとえばＨａｒｌｏｗ、Ｌａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８およびＨａｒｌｏｗ、Ｌａｎｅ、「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９を参照されたい。
【０１３０】
抗体産生の手法は当技術分野で周知であり、たとえばＨａｒｌｏｗ、Ｌａｎｅ（１９８８）および（１９９９）（同所）に記載されている。
【０１３１】
好ましくは、抗体は治療効果を引き起こす抗体である。好ましい抗体の非限定的な例には、インフリキシマブ、ベバシズマブ、ラニビズマブ、セツキシマブ、ラニビズマブ、パリビズマブ、アバゴボマブ、アブシキシマブ、アクトクスマブ、アダリムマブ、アフェリモマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アラシズマブペゴール、ＡＬＤ５１８、アレムツズマブ、アリロクマブ、アレムツズマブ、アルツモマブ、アマツキシマブ、アナツモマブマフェナトックス、アンルキンズマブ、アポリズマブ、アルシツモマブ、アセリズマブ、アルチヌマブ、アトリズマブ、アトロリミウマブ、トシリズマブ、バピネウムズマブ、バシリキシマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベンラリズマブ、ベルチリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ベズロトクスマブ、ビシロマブ、ビバツズマブ、ビバツズマブメルタンシン、ブリナツモマブ、ブロソツマブ、ブレンツキシマブベドチン、ブリアキヌマブ、ブロダルマブ、カナキヌマブ、カンツズマブメルタンシン、カンツズマブメルタンシン、カプラシズマブ、カプロマブペンデチド、カルルマブ、カツマキソマブ、ＣＣ４９、セデリズマブ、セルトリズマブペゴール、セツキシマブ、シタツズマブボガトックス、シクスツムマブ、クラザキズマブ、クレノリキシマブ、クリバツズマブテトラキセタン、コナツムマブ、クレネズマブ、ＣＲ６２６１、ダセツズマブ、ダクリズマブ、ダロツズマブ、ダラツムマブ、デムシズマブ、デノスマブ、デツモマブ、ドルリモマブアリトックス、ドロジツマブ、ヅリゴツマブ、ヅピルマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドバコマブ、エドレコロマブ、エファリズマブ、エフングマブ、エロツズマブ、エルシリモマブ、エナバツズマブ、エンリモマブペゴール、エノキズマブ、エノキズマブ、エノチクマブ、エノチクマブ、エンシツキシマブ、エピツモマブシツキセタン、エプラツズマブ、エルリズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、エトロリズマブ、エクスビビルマブ、エクスビビルマブ、ファノレソマブ、ファラリモマブ、ファルレツズマブ、ファシヌマブ、ＦＢＴＡ０５、フェルビズマブ、フェザキヌマブ、フィクラツズマブ、フィジツムマブ、フランボツマブ、フォントリズマブ、フォラルマブ、フォラビルマブ、フレソリムマブ、フルラヌマブ、フツキシマブ、ガリキシマブ、ガニツマブ、ガンテネルマブ、ガビリモマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゲボキズマブ、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブベドチン、ゴリムマブ、ゴミリキシマブ、ＧＳ６６２４、イバリズマブ、イブリツモマブチウキセタン、イクルクマブ、イゴボマブ、イムシロマブ、イムガツズマブ、インクラクマブ、インダツキシマブラブタンシン、インフリキシマブ、インテツムマブ、イノリモマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、イトリズマブ、イキセキズマブ、ケリキシマブ、ラベツズマブ、レブリキズマブ、レマレソマブ、レルデリムマブ、レキサツムマブ、リビビルマブ、リゲリズマブ、リンツズマブ、リリルマブ、ロルボツズマブメルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マスリモマブ、マブリリムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミンレツモマブ、ミツモマブ、モガムリズマブ、モロリムマブ、モタビズマブ、モキセツモマブパスドトックス、ムロモナブ−ＣＤ３、ナコロマブタフェナトックス、ナミルマブ、ナプツモマブエスタフェナトックス、ナルナツマブ、ナタリズマブ、ネバクマブ、ネシツムマブ、ネレリモマブ、ネスバクマブ、ニモツズマブ、ニボルマブ、ノフェツモマブメルペンタン、オカラツズマブ、オクレリズマブ、オヅリモマブ、オファツムマブ、オララツマブ、オロキズマブ、オマリズマブ、オナルツズマブ、オポルツズマブモナトックス、オレゴボマブ、オルチクマブ、オテリキシズマブ、オキセルマブ、オザネズマブ、オゾラリズマブ、パジバキシマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、パノバクマブ、パルサツズマブ、パスコリズマブ、パテクリズマブ、パトリツマブ、ペムツモマブ、ペラキズマブ、ペルツズマブ、ペキセリズマブ、ペジリズマブ、ピンツモマブ、プラクルマブ、ポネズマブ、プリリキシマブ、プリツムマブ、ＰＲＯ１４０、クイリズマブ、ラコツモマブ、ラドレツマブ、ラフィビルマブ、ラムシルマブ、ラニビズマブ、ラキシバクマブ、レガビルマブ、レスリズマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、ロレヅマブ、ロモソズマブ、ロンタリズマブ、ロベリズマブ、ルプリズマブ、サマリズマブ、サリルマブ、サツモマブペンデチド、セクキヌマブ、セビルマブ、シブロツズマブ、シファリムマブ、シルツキシマブ、シムツズマブ、シプリズマブ、シルクマブ、ソラネズマブ、ソリトマブ、ソネプシズマブ、ソンツズマブ、スタムルマブ、スレソマブ、スビズマブ、タバルマブ、タカツズマブテトラキセタン、タドシズマブ、タリズマブ、タネズマブ、タプリツモマブパプトックス、テフィバズマブ、テリモマブアリトックス、テナツモマブ、テフィバズマブ、テリモマブアリトックス、テナツモマブ、テネリキシマブ、テプリズマブ、テプロツムマブ、ＴＧＮ１４１２、トレメリムマブ、チシリムマブ、チルドラキズマブ、チガツズマブ、ＴＮＸ−６５０、トシリズマブ、トラリズマブ、トシツモマブ、トラロキヌマブ、トラスツズマブ、ＴＲＢＳ０７、トレガリズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン、ツビルマブ、ウブリツキシマブ、ウレルマブ、ウルトキサズマブ、ウステキヌマブ、バパリキシマブ、バテリズマブ、ベドリズマブ、ベルツズマブ、ベパリモマブ、ベセンクマブ、ビシリズマブ、ボロシキシマブ、ボルセツズマブマフォドチン、ボツムマブ、ザルツムマブ、ザノリムマブ、ザツキシマブ、ジラリムマブおよびゾリモマブアリトックスが含まれる。
【０１３２】
本明細書で用いる用語「ホルモン」は当技術分野で周知であり、代謝障害の治療に用いられる治療用生体分子の群に関する。非限定的な例にはテリパラチドおよびエストロゲンが含まれる。テリパラチドは成長ホルモンである副甲状腺ホルモンの組み換え形であり、骨粗鬆症等の骨代謝障害の治療に広く用いられている。エストロゲンは閉経後障害の治療に広く用いられており、子宮がんのリスクを低減するためにプロゲステロンと併用して投与される。
【０１３３】
本発明の方法のより好ましい実施形態では、目的の生体分子は抗原、たとえばワクチンとしての使用のための抗原である。
【０１３４】
本明細書で用いる場合、用語「抗原」は宿主の生体に免疫反応を誘起することができる分子を意味する。典型的には、抗原はタンパク質および多糖である。しかし、タンパク質および多糖と組み合わせると、脂質または核酸も抗原性となり得る。抗原は細菌、ウイルス、およびその他の微生物の部分、たとえばそれらの被覆、カプセル、細胞壁、鞭毛、線毛、または毒素等から誘導されることが多い。抗原は非微生物、たとえば自己抗原、または花粉、卵白、もしくは移植した組織／器官からの、もしくは輸血された血液細胞の表面等のタンパク質等の外来（非自己）抗原であってもよい。本発明によれば、用語「抗原」には、限定しないが（ｉ）１つの特定のタンパク質等の、１つの特定の抗原の分子種で代表される抗原、（ｉｉ）異なったタンパク質の混合物またはタンパク質と多糖の混合物等の、異なった抗原の分子種の抗原混合物、ならびに（ｉｉｉ）たとえばスプリットウイルス抗原におけるように、ウイルスがたとえば界面活性剤または別の方法によって破壊され、他のウイルス成分がさらに除去されていない調製物であるさらなる成分を含む抗原調製物が含まれる。
【０１３５】
好ましくは、抗原はワクチンとしての使用のためのものである。ワクチン調製のための好適な抗原は当技術分野で周知であり、当技術分野で一般に適用されるワクチン生産のための抗原を選択するための考慮は、本発明によるワクチンとしての使用のための好適な抗原の選択に関して準用される。したがって、当技術分野で既に利用可能な抗原、ならびに新規な抗原が用いられる。
【０１３６】
抗原の特に好ましい例は、たとえばウイルス様粒子およびライフウイルスを含むサブユニット抗原またはウイルスベクターである。
【０１３７】
「ウイルスベクター」は、製造、保存および流通に際して種々の化学的および物理的分解経路に曝されやすい高分子の複雑な超分子集合体である。本発明による用語「ウイルスベクター」はキャリア、すなわちウイルスから誘導される「ベクター」に関する。本発明による「ウイルスベクター」は、天然産生の、または改質されたウイルス、ならびにウイルス様粒子（ＶＬＰ）から誘導されたベクターを含む。ウイルスがベクターの開発のための出発材料である場合、動物またはヒト患者での臨床使用に適することを保証するため、安全性および特異性等のある種の要求を満たす必要がある。ウイルスベクターの制御されない複製を避けることは、１つの重要な視点である。これは通常、ウイルスの複製に重要なウイルスゲノムの一部を欠失させることによって達成される。そのようなウイルスは、続いて新規なビリオンを産生することなしに標的細胞に感染することができる。さらに、ウイルスベクターは標的細胞の生理機能に影響しないか最小の影響しかしない必要があり、ウイルスベクターゲノムの再配列は起こるべきでない。天然産生の、または改質されたウイルスから誘導されたそのようなウイルスベクターは当技術分野で周知であり、一般に用いられるウイルスベクターの非限定的な例には、たとえばＭｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）ウイルスまたはアデノウイルスが含まれる。
【０１３８】
ウイルス様粒子から誘導されたベクターも当技術分野で周知であり、たとえばＴｅｇｅｒｓｔｅｄｔら（Ｔｅｇｅｒｓｔｅｄｔら（２００５）、「Ｍｕｒｉｎｅ  ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ  ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＶＬＰｓ）ａｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ」Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２５（４）：２６０１−８）に記載されている。ＶＬＰの１つの主な利点は、弱毒化した生ウイルスをウイルスベクターとして用いた場合に起こり得る再アセンブリーのリスクを全く伴わないということである。したがって、これらは本発明による「複製欠損性ウイルスベクター」に相当する。ＶＬＰを用いる産生には、目的の特定のウイルス株の遺伝子配列が入手できれば、従来のワクチンの産生よりも早く開始できるというさらなる利点がある。ＶＬＰは、Ｔ細胞およびＢ細胞の強力な免疫応答を引き起こすことができる立体配座的ウイルスエピトープを提示するウイルス表面タンパク質の繰り返し高密度ディスプレイを含む。ＶＬＰは、ＦＤＡの承認を受けたＢ型肝炎およびヒトパピローマウイルス用のワクチンを開発するために既に用いられてきた。さらに、ＶＬＰはチクングンヤウイルスに対する前臨床ワクチンを開発するために用いられてきた。インフルエンザウイルスに対するＶＬＰワクチンがインフルエンザウイルスに対する保護において他のワクチンより優れているということが、証拠によってさらに示唆されている。早期の臨床試験において、インフルエンザに対するＶＬＰワクチンはインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ５Ｎ１と１９１８インフルエンザの両方に対して完全な保護を提供するようであった。
【０１３９】
本発明の方法の別の好ましい実施形態では、最終の生物医薬製剤は筋肉内、皮下、皮内、経皮、口腔、経口、経鼻、および／または吸入適用のためにさらに調節される。口腔、経肺、または鼻内投与を意図する場合には、異なった要求が適用される。たとえば口腔投与には薬剤製品が消化性分子によって活性を失うことなく胃腸管を通過することが可能な製剤が必要であり、経肺投与には上気道および下気道を通過する間、また溶解した場合にはそれぞれの粘膜を通過する間に安定な乾燥製剤が必要である。皮下または筋肉内注射等の他の投与ルートについては、オスモル濃度、粘度、注射性およびシリンジ通過性を考慮しなければならない。たとえば、注射部位における疼痛および有害事象を低減するために、賦形剤の数を少なくしてオスモル濃度および粘度を制限することが好ましい。
【０１４０】
本明細書で上に考察したように、特許を請求する生産プロセスの間の本明細書に記載した組成物の使用により、最終生物医薬製品のオスモル濃度は４５０ｍＯｓｍｌ／ｋｇ未満になる。高いオスモル濃度は注射部位における疼痛および副作用に関連することが幾人かの研究者によって報告されている。したがって、非経口適用される溶液のオスモル濃度は４５０ｍＯｓｍｌ／ｋｇ未満、好ましくは生理学的範囲の２７５〜３２０ｍＯｓｍｌ／ｋｇに近いことが一般に許容されている。本発明の方法によって得られた薬剤製品はヒトおよび動物への投与のための医薬製品に対するこの要求を満たす。
【０１４１】
本発明はさらに、本発明によって得られた、または得られる生物医薬製品に関する。
【０１４２】
本発明の生物医薬製品の好ましい実施形態では、前記製品は筋肉内、皮下、皮内、経皮、口腔、経口、経鼻、および／または吸入適用における使用のためのものである。本発明の生物医薬製品の別の好ましい実施形態では、前記製品は研究、治療および／または予防目的のためのものである。
【０１４３】
本発明の好ましい実施形態によれば、薬剤製品はワクチン接種における使用のためのものである。ワクチン接種における使用のための薬剤製品はそのまま、すなわちそれ自体で、または薬剤製品と同時にもしくは別に、すなわち薬剤製品の投与の前もしくは後に投与されるアジュバントと組み合わせて、用いることができることが認識されよう。本明細書で用いる用語「アジュバント」は、ワクチンに対する受容者の免疫応答を強化する１つまたは複数の化合物に関する。アジュバントはワクチンに対するより早期の、より強力な応答、および／またはより永続する免疫応答を促進するためにしばしば加えられ、それによりワクチン用量が低減されることが多い。アジュバントの非限定的な例には、たとえば水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、有機化合物であるスクアレンが含まれるが、たとえばＴｏｌｌ様レセプターのリガンド、ＱＳ２１、水酸化アルミニウム誘導体、オイル浸漬物、リピッドＡおよびその誘導体（たとえばモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬ）、ＣｐＧモチーフ、ポリＩ：Ｃ  ｄｓＲＮＡ、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ、非ヒト用のみ）、フロイント不完全アジュバント（ＦＩＡ、非ヒト用のみ）、またはＭＦ５９Ｃ等の化合物も含まれる。そのようなアジュバントは当技術分野で周知である。
【０１４４】
本発明によって製剤化された薬剤製品ワクチンは優れた熱安定性を有し、したがって低温流通が保証されない状況下であっても長期の保存および輸送に耐えることができる。さらに、薬剤製品ワクチンの高い安定性によって必要なアジュバントの量を低減することができ、またはアジュバントを不要にすることさえできる。アジュバントは当技術分野において典型的には十分なワクチン効果のために重要と考えられるが、しばしば重篤な副作用を引き起こすことが知られてもいるので、これはさらなる利点を提供するものである。
【０１４５】
本発明はある選択肢において目的の生体分子を含む生物医薬の原薬を生産する方法に関し、前記方法は（ａ１）採取、（ａ２）精製、（ａ３）再緩衝化、および（ａ４）濃縮から選択される少なくとも１つの処理ステップを含み、前記少なくとも１つの処理ステップは、少なくとも３つのアミノ酸を含む組成物の存在下で行なわれ、前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せは、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供する。
【０１４６】
本発明の方法に関して本明細書で上に提供した全ての定義および好ましい実施形態は、本発明のこの代替の方法に準用される。たとえば、組成物中に存在するアミノ酸の選択および／または量のための上述の好ましい実施形態、生体分子の好ましい選択等は、この代替の方法に等しく適用される。
【０１４７】
下流の処理における生体分子の安定化は、採取後の早期のステップではなく充填および仕上げステップで対処されることが一般的であるため、本発明のステップは、極めて興味深い。
【０１４８】
本発明のこの代替の方法によれば、本方法は好ましい実施形態において生物医薬製品を得るために原薬をさらに処理する第２のステップを含み、前記第２のステップは（ｂ１）再緩衝化、（ｂ２）凍結、（ｂ３）解凍、および（ｂ４）充填から選択される少なくとも１つの処理ステップを含み、前記少なくとも１つの処理ステップは、（ｉ）少なくとも３つのアミノ酸であって、前記少なくとも３つのアミノ酸の組合せが、少なくとも１つの正に荷電した官能基、少なくとも１つの抗酸化官能基、少なくとも１つの浸透圧調整機能、および少なくとも１つの緩衝機能を提供する、少なくとも３つのアミノ酸、および（ｉｉ）１つまたは複数の糖を含み、アミノ酸と糖の比が１０：１〜１：１００（ｗ／ｗ）である組成物の存在下で行なわれる。
【０１４９】
本発明の方法に関して本明細書で上に提供した全ての定義および好ましい実施形態は、本発明のこの代替の方法に準用される。たとえば、組成物中に存在するアミノ酸の選択および／または量のための上述の好ましい実施形態、生体分子の好ましい選択、好ましい比等は、この代替の方法に等しく適用される。
【０１５０】
他に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。不一致が生じた場合は、定義を含めて特許明細書が優越する。
【０１５１】
本明細書、特に特許請求の範囲で特徴付けた実施形態に関しては、従属請求項で述べたそれぞれの実施形態が、前記従属請求項が従属するそれぞれの（独立または従属）請求項のそれぞれの実施形態と組み合わせられることが意図されている。たとえば、３つの選択肢Ａ、ＢおよびＣに言及する独立請求項１、３つの選択肢Ｄ、ＥおよびＦに言及する従属請求項２、ならびに請求項１および２に従属し、３つの選択肢Ｇ、ＨおよびＩに言及する請求項３の場合には、具体的にそうではないことが述べられない限り、明細書は明らかに組合せＡ，Ｄ，Ｇ；Ａ，Ｄ，Ｈ；Ａ，Ｄ，Ｉ；Ａ，Ｅ，Ｇ；Ａ，Ｅ，Ｈ；Ａ，Ｅ，Ｉ；Ａ，Ｆ，Ｇ；Ａ，Ｆ，Ｈ；Ａ，Ｆ，Ｉ；Ｂ，Ｄ，Ｇ；Ｂ，Ｄ，Ｈ；Ｂ，Ｄ，Ｉ；Ｂ，Ｅ，Ｇ；Ｂ，Ｅ，Ｈ；Ｂ，Ｅ，Ｉ；Ｂ，Ｆ，Ｇ；Ｂ，Ｆ，Ｈ；Ｂ，Ｆ，Ｉ；Ｃ，Ｄ，Ｇ；Ｃ，Ｄ，Ｈ；Ｃ，Ｄ，Ｉ；Ｃ，Ｅ，Ｇ；Ｃ，Ｅ，Ｈ；Ｃ，Ｅ，Ｉ；Ｃ，Ｆ，Ｇ；Ｃ，Ｆ，Ｈ；Ｃ，Ｆ，Ｉに対応する実施形態を開示していることを理解されたい。
【０１５２】
同様に、また独立および／または従属請求項が選択肢に言及していない場合でも、従属請求項が先行する複数の請求項に遡って引用するならば、それに包含される主題の任意の組合せが明示的に開示されているとみなされることが理解される。たとえば、独立請求項１、遡って請求項１を引用する従属請求項２、および遡って請求項２および１を引用する従属請求項３の場合には、請求項３と１の主題の組合せは、請求項３、２および１の主題の組合せと同様に、はっきりとかつ明白に開示されているということになる。請求項１から３のいずれか一項を引用するさらなる従属請求項４が存在する場合には、請求項４および１、請求項４、２および１、請求項４、３および１、ならびに請求項４、３、２および１の主題の組合せは、はっきりとかつ明白に開示されているということになる。
【０１５３】
上記の考慮は添付した全ての請求項に準用される。非限定的な例を挙げれば、請求項１０、６および１の組合せは、請求項の構造に鑑みて、はっきりとかつ明白に予想される。たとえば、請求項１０、２および１の組合せ等についても同じことが適用される。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１−１】原薬の安定性の評価モデルとしてのフリーズドライ前のアデノウイルスベクター組成物の水力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：（Ａ）対照としてのアデノウイルスストック溶液のＤｙｎａＰｒｏ  ＤＬＳソフトウェアによる正則化フィットを用いるＤＬＳ実験で記録した相関関数の評価。（Ｂ）希釈により組成物１と混合した直後のアデノウイルスベクター調製物の相関関数の評価。（Ｃ）希釈により組成物２と混合した直後のアデノウイルスベクター調製物の相関関数の評価。組成物１および２におけるアデノウイルスベクター調製物の計算された水力学的半径は、未処理のストック溶液中のアデノウイルス粒子の測定された半径および文献から知られた値と一致する。
【図１−２】原薬の安定性の評価モデルとしてのフリーズドライ前のアデノウイルスベクター組成物の水力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：（Ａ）対照としてのアデノウイルスストック溶液のＤｙｎａＰｒｏ  ＤＬＳソフトウェアによる正則化フィットを用いるＤＬＳ実験で記録した相関関数の評価。（Ｂ）希釈により組成物１と混合した直後のアデノウイルスベクター調製物の相関関数の評価。（Ｃ）希釈により組成物２と混合した直後のアデノウイルスベクター調製物の相関関数の評価。組成物１および２におけるアデノウイルスベクター調製物の計算された水力学的半径は、未処理のストック溶液中のアデノウイルス粒子の測定された半径および文献から知られた値と一致する。
【図２】原薬の安定性の評価モデルとしてのフリーズドライ前のアデノウイルスベクター組成物の水力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：（Ａ）もとの供給元の製剤と混合した直後のアデノウイルスベクター調製物のＤｙｎａＰｒｏ  ＤＬＳソフトウェアによる正則化フィットを用いるＤＬＳ実験で記録した相関関数の評価。（Ｂ）ＰＢＳと混合した直後のアデノウイルスベクター調製物の相関関数の評価。前の図とは対照的に、もとの供給元の製剤およびＰＢＳと混合した後のアデノウイルス粒子の水力学的半径は、未処理のストック溶液と比較して増大している。
【図３】原薬の安定性の評価モデルとしての種々の製剤におけるフリーズドライ後のアデノウイルスベクターのインビトロ感染性：アデノウイルスベクター調製物を希釈によって製剤化し、続いて組成物１および２の中でフリーズドライした。フリーズドライしたベクターを再構成した後、アデノウイルスのＨｅｘｏｎタンパク質の抗体に基づく比色検出によって、ＨＥＫ２９３細胞におけるインビトロ感染性アッセイを行ない、感染細胞中でアデノウイルスが増幅に成功していることを示した。組成物１および２で製剤化したアデノウイルスベクター調製物の感染タイターが完全に保持されていることが観察された（破線で示す陽性対照と比較したｍｌあたりの感染ユニット）。対照的に、もとの供給元の製剤で希釈したアデノウイルスベクターのフリーズドライによって感染タイターの顕著な損失が生じ、ＰＢＳで希釈したアデノウイルスベクターのフリーズドライによって対応する感染タイターは完全に失われた。
【図４】原薬の安定性の評価モデルとしてのフリーズドライ後の対応するアデノウイルスベクター調製物中のアデノウイルス粒子の水力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：（Ａ）組成物１の中でフリーズドライした後のアデノウイルスベクター調製物のＤｙｎａＰｒｏ  ＤＬＳソフトウェアによる正則化フィットを用いるＤＬＳ実験で記録した相関関数の評価。（Ｂ）組成物２の中でフリーズドライした後のアデノウイルスベクター調製物の評価。組成物１および２におけるアデノウイルスベクター調製物の計算された水力学的半径は、未処理のストック溶液（図１Ａ）中のアデノウイルス粒子の測定された半径および文献から知られた値と一致する。
【図５】原薬の安定性の評価モデルとしてのフリーズドライ後の対応するアデノウイルスベクター調製物中のアデノウイルス粒子の水力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：（Ａ）もとの供給元の製剤中でフリーズドライした直後のアデノウイルスベクター調製物のＤｙｎａＰｒｏ  ＤＬＳソフトウェアによる正則化フィットを用いるＤＬＳ実験で記録した相関関数の評価。（Ｂ）ＰＢＳ中でフリーズドライした直後のアデノウイルスベクター調製物の相関関数の評価。前の図とは対照的に、もとの供給元の製剤中およびＰＢＳ中でフリーズドライした後のアデノウイルス粒子の水力学的半径は、未処理のストック溶液（図１Ａ）と比較して高次の凝集物の形成を伴って増大する。
【図６】原薬の安定性の評価モデルとしての種々の製剤中におけるフリーズドライおよび後続の乾燥製剤の高温での保存後におけるアデノウイルスベクターのインビトロ感染性：ｔ＝０ｄ（左の黒いバー）は、フリーズドライおよび保存前の再構成直後のインビトロ感染性を示す。破線は未処理陽性対照の対応する感染タイターを示す。（Ａ）もとの供給元緩衝液およびＰＢＳと比較した、組成物１および２における希釈によって再緩衝化し、フリーズドライした製剤を引き続いて２５℃および６０％の残存湿度で２１日（中央のバーの組）および４２日（右側のバーの組）保存した後のアデノウイルスベクター組成物のインビトロ感染性。（Ｂ）もとの供給元緩衝液およびＰＢＳと比較した、組成物１および２における希釈によって再緩衝化し、フリーズドライした製剤を引き続いて４０℃および７５％の残存湿度で７日（中央のバーの組）および２８日（右側のバーの組）保存した後のアデノウイルスベクター組成物のインビトロ感染性。組成物１および２の中で調製した試料ではアデノウイルスの感染性の完全な保持が観察された。一方、もとの供給元緩衝液中またはＰＢＳ中の保存では、アデノウイルスの感染性は完全に失われた。
【図７】原薬の安定性の評価モデルとしてのフリーズドライおよび後続の４０℃、１４日の保存後の対応するアデノウイルスベクター調製物中のアデノウイルス粒子の水力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：（Ａ）組成物１の中における乾燥製剤の４０℃、１４日の保存後のアデノウイルスベクター調製物のＤｙｎａＰｒｏ  ＤＬＳソフトウェアによる正則化フィットを用いるＤＬＳ実験で記録した相関関数の評価。（Ｂ）組成物２の中における乾燥製剤の４０℃、１４日の保存後のアデノウイルスベクター調製物の評価。組成物１および２におけるアデノウイルスベクター調製物の計算された水力学的半径は、未処理のストック溶液（図１Ａ）中のアデノウイルス粒子の測定された半径および文献から知られた値と一致する。
【図８】原薬の安定性の評価モデルとしてのフリーズドライおよび後続の４０℃、１４日の保存後の対応するアデノウイルスベクター調製物中のアデノウイルス粒子の水力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：（Ａ）もとの供給元の製剤中におけるフリーズドライおよび後続の４０℃、１４日の保存後のアデノウイルスベクター調製物のＤｙｎａＰｒｏ  ＤＬＳソフトウェアによる正則化フィットを用いるＤＬＳ実験で記録した相関関数の評価。（Ｂ）ＰＢＳ中におけるフリーズドライおよび後続の４０℃、１４日の保存後のアデノウイルスベクター調製物の相関関数の評価。前の図とは対照的に、もとの供給元の製剤中およびＰＢＳ中でフリーズドライし、引き続いて高温で保存した後のアデノウイルス粒子の水力学的半径は、未処理のストック溶液と比較して高次の凝集物の形成を伴って増大する。
【図９】原薬の安定性の評価モデルとしてのプロセスステップ１またはプロセスステップ２で調製された原薬安定化組成物１および２の中での製剤化の後のアデノウイルスベクター調製物のインビトロ感染性：アデノウイルス調製物を、それぞれＣｓＣｌ密度超遠心による精製ステップ（プロセスステップ１）の直後、または後の調製プロセス（プロセスステップ２）中で、それぞれ組成物１または２の中での透析によって再緩衝化した。プロセスステップ１では、両方の組成物中で陽性対照（破線で示す）と比較して透析後の感染タイターの完全な保持が観察された。対照的に、調製プロセス２での透析では、組成物２の中で行なった場合には感染タイターのほぼ２ログレベルの顕著な損失が生じた一方、組成物１の中での透析ではプロセスステップ１で得られた結果と同様に感染タイターの完全な保持が得られた。
【図１０−１】原薬の安定性の評価モデルとしてのプロセスステップ１またはプロセスステップ２の間の安定化組成物１および２の中での対応するアデノウイルスベクター原薬調製物中のアデノウイルス粒子の水力学的半径のＤＬＳ測定：プロセスステップ１または２における透析を用いる組成物１中のアデノウイルスベクター粒子調製物の再緩衝化によって、粒子（Ａ）および（Ｃ）の水力学的半径の保持が得られた。プロセスステップ１における調製の間の組成物２の中のアデノウイルス粒子の再緩衝化によって、アデノウイルスベクター（Ｂ）の水力学的半径の完全な保持が得られた。対照的に、プロセスステップ２における調製の間の組成物２の中のアデノウイルス粒子の再緩衝化では、粒子の水力学的半径の増大およびこれに伴う大きな凝集物の形成が生じた（Ｄ）。
【図１０−２】原薬の安定性の評価モデルとしてのプロセスステップ１またはプロセスステップ２の間の安定化組成物１および２の中での対応するアデノウイルスベクター原薬調製物中のアデノウイルス粒子の水力学的半径のＤＬＳ測定：プロセスステップ１または２における透析を用いる組成物１中のアデノウイルスベクター粒子調製物の再緩衝化によって、粒子（Ａ）および（Ｃ）の水力学的半径の保持が得られた。プロセスステップ１における調製の間の組成物２の中のアデノウイルス粒子の再緩衝化によって、アデノウイルスベクター（Ｂ）の水力学的半径の完全な保持が得られた。対照的に、プロセスステップ２における調製の間の組成物２の中のアデノウイルス粒子の再緩衝化では、粒子の水力学的半径の増大およびこれに伴う大きな凝集物の形成が生じた（Ｄ）。
【図１１】原薬の安定性の評価モデルとしての繰り返し適用した凍結解凍サイクルの後のアデノウイルスベクター調製物のインビトロ感染性：（Ａ）プロセスステップ１における調製の間の透析によるアデノウイルスベクター調製物の再緩衝化。（Ｂ）プロセスステップ２における調製の間の透析によるアデノウイルスベクター調製物の再緩衝化。両方の調製手順（プロセスステップ１および２）において、組成物１の中の再緩衝化により、破線で示す陽性対照と比較して、透析後（初期タイター）ならびに５回および１０回の凍結解凍サイクルの適用の後、感染性の完全な保持が得られた（（Ａ）および（Ｂ））。調製プロセスの早期のステップ（プロセスステップ１）の間の組成物２の中における再緩衝化でも、透析直後の感染性の完全な保持が得られ（初期タイター、Ａ、左のバーの組）、繰り返し凍結解凍サイクルの適用の後に、感染タイターの僅かな損失が生じた（Ａ）。対照的に、プロセスステップ２における調製の間の組成物２における再緩衝化では、透析直後で既に感染タイターの顕著な低減が生じた（Ｂ；左のバーの組）。繰り返し凍結解凍サイクルをさらに適用すると、感染タイターのさらに顕著な低減が生じた（Ｂ；中央および右のバーの組）。
【図１２】原薬の安定性の評価モデルとしての５回または１０回の凍結解凍サイクルの適用の後の安定化組成物１中におけるアデノウイルス粒子の水力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：プロセスステップ２における透析を用いた組成物１の中のアデノウイルスベクター粒子調製物の再緩衝化により、（Ａ）５回の凍結解凍サイクルの適用の後、および（Ｂ）１０回の凍結解凍サイクルの適用の後の、粒子の水力学的半径の保持が得られた。
【図１３−１】原薬の安定性の評価モデルとしての５回の凍結解凍サイクルの適用の後のプロセスステップ１またはプロセスステップ２の間の安定化組成物１および２の中におけるアデノウイルス粒子の水力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：プロセスステップ１または２における透析を用いた組成物１の中のアデノウイルスベクター粒子調製物の再緩衝化により、５回の凍結解凍サイクル（Ａ）および（Ｂ）の適用後の粒子の水力学的半径の保持が得られた。対照的に、プロセスステップ１または２における調製の間の組成物２の中のアデノウイルス粒子の再緩衝化では、５回の凍結解凍サイクル（Ｃ）および（Ｄ）の適用後、粒子の水力学的半径の増大およびこれに伴う高次の凝集物の形成が生じた。
【図１３−２】原薬の安定性の評価モデルとしての５回の凍結解凍サイクルの適用の後のプロセスステップ１またはプロセスステップ２の間の安定化組成物１および２の中におけるアデノウイルス粒子の水力学的半径の動的光散乱（ＤＬＳ）測定：プロセスステップ１または２における透析を用いた組成物１の中のアデノウイルスベクター粒子調製物の再緩衝化により、５回の凍結解凍サイクル（Ａ）および（Ｂ）の適用後の粒子の水力学的半径の保持が得られた。対照的に、プロセスステップ１または２における調製の間の組成物２の中のアデノウイルス粒子の再緩衝化では、５回の凍結解凍サイクル（Ｃ）および（Ｄ）の適用後、粒子の水力学的半径の増大およびこれに伴う高次の凝集物の形成が生じた。
【図１４】原薬の薬剤製品処理へのモデルとしての再緩衝化後の低濃縮トラスツズマブ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム：トラスツズマブのフリーズドライ調製物（ハーセプチン（登録商標））を再構成し、続いてフリーズドライ製品のもとの供給元の製剤の組成物、または本発明の組成物それぞれＨｅｒ＿１またはＨｅｒ＿９（Ａ）およびＨｅｒ−１またはＨｅｒ−２（Ｂ）の中での透析によって再緩衝化した（トラスツズマブ−２５ｍｇ／ｍｌ）。溶出時間約１６分の主ピークは抗体の構造的に不変のモノマー分子に対応し、より早く溶出時間１４分で溶出する小さなピークは凝集物、特にダイマーに対応し、もとの供給元の製剤中の１１分のより早いピーク（黒い線）は高次凝集物である。もとの供給元の製剤中における再緩衝化によって、ダイマーの形態の凝集物形成の増大およびさらに高次の凝集物が生じた。対照的に、本発明の組成物中における再緩衝化によって、トラスツズマブ標準品と同等の量の凝集物および抗体のダイマーピークとモノマーピークとの間の明確なベースラインの分離が得られた。
【図１５】原薬の薬剤製品処理へのモデルとしての再緩衝化後の低濃縮トラスツズマブ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラム：トラスツズマブのフリーズドライ調製物（ハーセプチン（登録商標））を再構成し、続いて液体のもとの供給元の製剤の組成物中での透析によって再緩衝化した。−８０℃で保存した、再構成したフリーズドライトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））のアリコートを、それぞれ本発明の組成物１１＿１および１１＿１＋トレハロース中での透析によって再緩衝化した（トラスツズマブ−２０ｍｇ／ｍｌ）。溶出時間約１７分の主ピークは抗体の構造的に不変のモノマー分子に対応し、より早く溶出時間１４．５分で溶出する小さなピークは凝集物、特にダイマーに対応する。液体のもとの製剤の適用によって一般に、フリーズドライ製品のもとの供給元の製剤と比較して、透析を用いる調製手順の間の抗体の凝集傾向が低減した（実施例３、図１４）。しかし、組成物１１＿１および１１＿１＋トレハロース中での抗体の再緩衝化により、凝集物の形成のさらに僅かな低減が得られた。
【図１６】原薬の薬剤製品処理へのモデルとしての再緩衝化後の高濃縮トラスツズマブ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル：もとの容器から直接取り出したトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、トラスツズマブ−１２０ｍｇ／ｍｌ）の液体調製物の未処理試料のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルは、組成物３および４の中の液体のもとのトラスツズマブ製剤の再緩衝化後の試料と比較して分析したところ、同等のピークプロファイルが得られた。溶出時間約１６．５分の主ピークは抗体の構造的に不変のモノマー分子に対応し、より早く溶出時間１４分で溶出する小さなピークは凝集物、特にダイマーに対応する。微量の断片が溶出時間２０分で溶出した。組成物３および４の中の抗体の得られたＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルは、未処理のもとの供給元の製剤中の抗体の対応するクロマトグラムと完全に同等である。
【図１７】原薬の薬剤製品処理へのモデルとしての再緩衝化後および／または濃縮後の高濃縮トラスツズマブ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル：市販の液体トラスツズマブ製剤（ハーセプチン（登録商標）、トラスツズマブ−１２０ｍｇ／ｍｌ）の濃度２００ｍｇ／ｍｌへの濃縮によって、１６．５分における主ピークの溶出の前の溶出時間１５分の顕著なショルダー溶出によって証明されるように、未処理の出発材料と比較して凝集物形成の顕著な増大が生じた。対照的に、本発明の３つの組成物（組成物４＿３、４＿４または４＿５）のいずれかによる液体トラスツズマブ製剤の再緩衝化、および後続の２００ｍｇ／ｍｌへの濃縮によって、未処理のもとの液体トラスツズマブ製剤のＳＥＣプロファイルの完全な保持（図８）および抗体のダイマーによる１３分のピークと溶出時間１６分のモノマーピークとの明確なベースラインの分離が得られた。微量の断片が溶出時間２０分で溶出した。
【図１８−１】薬剤製品の安定性のモデルとしての、透析直後の時点ｔ＝０、および続いて４５℃で２１日および２８日保存した後の低濃縮トラスツズマブ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル：（Ａ）もとの供給元の製剤、（Ｂ）組成物Ｈｅｒ＿１、（Ｃ）組成物Ｈｅｒ＿２、および（Ｄ）組成物Ｈｅｒ＿９中の透析を用いて再緩衝化した後の低濃縮液体治療用抗体製剤（トラスツズマブ−２５ｍｇ／ｍｌ）の保存。もとの供給元の製剤中の保存により、本発明の製剤中での抗体の保存と比較して、凝集物（１３分で溶出）および断片（２０分超で溶出）の形成の増大が生じた。
【図１８−２】薬剤製品の安定性のモデルとしての、透析直後の時点ｔ＝０、および続いて４５℃で２１日および２８日保存した後の低濃縮トラスツズマブ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル：（Ａ）もとの供給元の製剤、（Ｂ）組成物Ｈｅｒ＿１、（Ｃ）組成物Ｈｅｒ＿２、および（Ｄ）組成物Ｈｅｒ＿９中の透析を用いて再緩衝化した後の低濃縮液体治療用抗体製剤（トラスツズマブ−２５ｍｇ／ｍｌ）の保存。もとの供給元の製剤中の保存により、本発明の製剤中での抗体の保存と比較して、凝集物（１３分で溶出）および断片（２０分超で溶出）の形成の増大が生じた。
【図１９−１】薬剤製品の安定性のモデルとしての高濃縮トラスツズマブ製剤の時点ｔ＝０および指示された分析時点における高温での液体保存後のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル：未処理のもとの供給元の製剤（ハーセプチン（登録商標）、トラスツズマブ−１２０ｍｇ／ｍｌ）の並行した液体保存と比較した、安定化組成物３および４の中の透析を用いた再緩衝化後の、高濃縮トラスツズマブ−１２０ｍｇ／ｍｌの４０℃、１．５日（Ａ）、４０℃、１２日（Ｂ）、または３０℃、２１日（Ｃ）の液体保存。本発明の組成物中の保存により、抗体の凝集傾向が低減し（凝集物の溶出は１４分）、組成物４の場合には断片化の僅かな低減がさらに観察された（断片の溶出は２１分）。
【図１９−２】薬剤製品の安定性のモデルとしての高濃縮トラスツズマブ製剤の時点ｔ＝０および指示された分析時点における高温での液体保存後のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル：未処理のもとの供給元の製剤（ハーセプチン（登録商標）、トラスツズマブ−１２０ｍｇ／ｍｌ）の並行した液体保存と比較した、安定化組成物３および４の中の透析を用いた再緩衝化後の、高濃縮トラスツズマブ−１２０ｍｇ／ｍｌの４０℃、１．５日（Ａ）、４０℃、１２日（Ｂ）、または３０℃、２１日（Ｃ）の液体保存。本発明の組成物中の保存により、抗体の凝集傾向が低減し（凝集物の溶出は１４分）、組成物４の場合には断片化の僅かな低減がさらに観察された（断片の溶出は２１分）。
【図２０】薬剤製品の粘度のモデルとしての、未処理のもとの液体トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標）、１２０ｍｇ／ｍｌ）製剤と比較した、透析を用いた組成物３および４の中の再緩衝化の後の高濃縮トラスツズマブ製剤の動粘度：組成物３および４の中のもとの液体トラスツズマブ製剤（ハーセプチン（登録商標）、トラスツズマブ−１２０ｍｇ／ｍｌ）の再緩衝化（トラスツズマブ−１２０ｍｇ／ｍｌ）により、未処理のもとの液体の供給元の製剤中の高濃縮トラスツズマブの測定された粘度と比較して、特に組成物４で、また組成物３ではそれほどではないが、顕著に低減した粘度が得られた。
【図２１】薬剤製品の安定性のモデルとしての液体保存後の高濃縮トラスツズマブ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル：トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））のフリーズドライ調製物を再構成し、もとの液体の供給元の製剤の組成物およびそれぞれ組成物３、４＿１および４＿２の中での透析によって再緩衝化し、続いてもとの液体の供給元の製剤でトラスツズマブ−１３５ｍｇ／ｍｌに、組成物３でトラスツズマブ−１４５ｍｇ／ｍｌに、組成物４＿１でトラスツズマブ−１５０ｍｇ／ｍｌに、組成物４＿２でトラスツズマブ−１５１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。（Ａ）４０℃で８日液体保存した後、および（Ｂ）３０℃で１か月液体保存した後のトラスツズマブ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル。もとの液体の供給元の製剤中での３０℃および４０℃での指示された期間のトラスツズマブの液体保存により、凝集物ピークと１６分のモノマーピークとの間のショルダーの形成を伴う１４分で溶出する凝集物の形成の増大、およびモノマーピークと２０分で溶出するやや増大した断片ピークとの間のショルダーを伴う断片の形成が生じた。対照的に、組成物３、４＿１および４＿２の中での４０℃、８日および３０℃、１か月のそれぞれの抗体の保存により、凝集物ピークとモノマーピークとの間の明らかなベースラインの分離を伴う凝集の低減および断片化の低減が生じた。
【図２２】薬剤製品の安定性のモデルとしての液体保存後の高濃縮トラスツズマブ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル：トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））のフリーズドライ調製物を再構成し、もとの液体の供給元の製剤の組成物およびそれぞれ組成物３、４＿１および４＿２の中での透析によって再緩衝化し、続いてもとの液体の供給元の製剤でトラスツズマブ−１３５ｍｇ／ｍｌに、組成物３でトラスツズマブ−１４５ｍｇ／ｍｌに、組成物４＿１でトラスツズマブ−１５０ｍｇ／ｍｌに、組成物４＿２でトラスツズマブ−１５１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。（Ａ）２５℃で６か月液体保存した後、および（Ｂ）２〜８℃で６か月液体保存した後のトラスツズマブ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル。もとの液体の供給元の製剤中での２〜８℃および２５℃での指示された期間の抗体の液体保存により、組成物３、４＿１および４＿２の中での抗体の液体保存と比較して、特に２５℃の場合に、ダイマーとして１４分で、またダイマーピークと１６分のモノマーピークとの間のショルダーとして溶出する凝集物の形成の増大、および１７分のモノマーピークと２０分との間のショルダーとして溶出する断片の形成の増大が生じた。組成物３、４＿１および４＿２の中で製剤化した抗体のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルは、凝集物ピークとモノマーピークとの間の明らかなベースラインの分離を示した。２〜８℃で６か月の液体保存の場合には、全ての製剤において断片化は軽微な事象に過ぎなかった。
【図２３】薬剤製品の安定性のモデルとしての４０℃での液体保存後の高濃縮トラスツズマブ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル：液体の市販液体トラスツズマブ製剤（ハーセプチン（登録商標）、トラスツズマブ−１２０ｍｇ／ｍｌ）の濃度２００ｍｇ／ｍｌへの濃縮および本発明の３つの組成物（組成物４＿３、４＿４、または４＿５）のいずれかによる液体トラスツズマブ製剤（ハーセプチン（登録商標）、トラスツズマブ−１２０ｍｇ／ｍｌ）の再緩衝化、ならびに後続の２００ｍｇ／ｍｌへの濃縮。（Ａ）４０℃、３日の液体保存後、および（Ｂ）４０℃、１４日の液体保存後のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル。そのような高濃度の抗体の保存中の断片化は軽微な事象に過ぎなかった。本発明の組成物中では、凝集の傾向はもとの供給元の製剤と比較して大きく低減し、１４分で溶出する凝集物のピークと１６分で溶出するモノマーピークとの間の明らかなベースラインの分離がさらに観察された。
【図２４】薬剤製品の安定性のモデルとしての高温での液体保存後の高濃縮トラスツズマブ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル：液体の市販液体トラスツズマブ製剤（ハーセプチン（登録商標）、トラスツズマブ−１２０ｍｇ／ｍｌ）の濃度２００ｍｇ／ｍｌへの濃縮および本発明の３つの組成物（組成物４＿３、４＿４、または４＿５）のいずれかによる液体トラスツズマブ製剤（ハーセプチン（登録商標）、トラスツズマブ−１２０ｍｇ／ｍｌ）の再緩衝化、ならびに後続の２００ｍｇ／ｍｌへの濃縮。（Ａ）３０℃、４２日の液体保存後、および（Ｂ）２５℃、３か月の液体保存後のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル。そのような高濃度の抗体の保存中の断片化は軽微な事象に過ぎなかった。本発明の組成物中では、凝集の傾向はもとの供給元の製剤と比較して大きく低減し、１４分で溶出する凝集物のピークと１６分で溶出するモノマーピークとの間に明らかなベースラインの分離がさらに観察された。
【図２５】薬剤製品の粘度のモデルとしての、高濃縮トラスツズマブ製剤の動粘度：液体のもとの供給元のトラスツズマブ製剤（ハーセプチン（登録商標）、トラスツズマブ−１２０ｍｇ／ｍｌ）の濃度２２０ｍｇ／ｍｌへの濃縮、液体のもとの供給元のトラスツズマブ製剤（ハーセプチン（登録商標）、トラスツズマブ−１２０ｍｇ／ｍｌ）の透析による再緩衝化、および後続の組成物４＿３、４＿４および４＿５の中での２２０および２００ｍｇ／ｍｌへの濃縮。高濃縮トラスツズマブ製剤の動粘度を、２つの異なった濃度、２００ｍｇ／ｍｌ（白色のバー）および２２０ｍｇ／ｍｌ（灰色のバー）で測定した。もとの供給元の製剤については、濃度２２０ｍｇ／ｍｌの抗体製剤の粘度のみ測定した。抗体濃度２２０ｍｇ／ｍｌにおける組成物４＿３および４＿４に対応する抗体製剤の動粘度は、同じ濃度のもとの供給元の製剤の動粘度と比較して、顕著に低減していた。組成物４＿４では測定した動粘度は僅かに増大していた。抗体濃度２００ｍｇ／ｍｌの試料で評価した動粘度においても同様の傾向が示された。
【図２６−１】液体保存中の高濃縮トラスツズマブのＳＥ−ＨＰＬＣ分析：ＳＥ−ＨＰＬＣで得られた凝集物ピーク（上）、モノマーピーク（中）および断片ピーク（下）の相対ＡＵＣを示す。（Ａ）もとの製剤と比較した、Ｆ２−１およびＦ２−２中での３０℃、３か月の液体保存中の１２０ｍｇ／ｍｌトラスツズマブのＳＥ−ＨＰＬＣの相対ＡＵＣ。（Ｂ）もとの製剤と比較した、Ｆ２−３およびＦ２−４中での２５℃、６か月の液体保存中の１５０ｍｇ／ｍｌトラスツズマブのＳＥ−ＨＰＬＣピークの相対ＡＵＣ。（Ｃ）もとの液体製剤と比較した、Ｆ２−５、Ｆ２−６およびＦ２−７中での２５℃、３か月の液体保存中の２００ｍｇ／ｍｌトラスツズマブのＳＥ−ＨＰＬＣピークの相対ＡＵＣ。もと：（１２０ｍｇ／ｍｌ）Ｆ０製剤（Ｆ０）
【図２６−２】液体保存中の高濃縮トラスツズマブのＳＥ−ＨＰＬＣ分析：ＳＥ−ＨＰＬＣで得られた凝集物ピーク（上）、モノマーピーク（中）および断片ピーク（下）の相対ＡＵＣを示す。（Ａ）もとの製剤と比較した、Ｆ２−１およびＦ２−２中での３０℃、３か月の液体保存中の１２０ｍｇ／ｍｌトラスツズマブのＳＥ−ＨＰＬＣの相対ＡＵＣ。（Ｂ）もとの製剤と比較した、Ｆ２−３およびＦ２−４中での２５℃、６か月の液体保存中の１５０ｍｇ／ｍｌトラスツズマブのＳＥ−ＨＰＬＣピークの相対ＡＵＣ。（Ｃ）もとの液体製剤と比較した、Ｆ２−５、Ｆ２−６およびＦ２−７中での２５℃、３か月の液体保存中の２００ｍｇ／ｍｌトラスツズマブのＳＥ−ＨＰＬＣピークの相対ＡＵＣ。もと：（１２０ｍｇ／ｍｌ）Ｆ０製剤（Ｆ０）
【図２６−３】液体保存中の高濃縮トラスツズマブのＳＥ−ＨＰＬＣ分析：ＳＥ−ＨＰＬＣで得られた凝集物ピーク（上）、モノマーピーク（中）および断片ピーク（下）の相対ＡＵＣを示す。（Ａ）もとの製剤と比較した、Ｆ２−１およびＦ２−２中での３０℃、３か月の液体保存中の１２０ｍｇ／ｍｌトラスツズマブのＳＥ−ＨＰＬＣの相対ＡＵＣ。（Ｂ）もとの製剤と比較した、Ｆ２−３およびＦ２−４中での２５℃、６か月の液体保存中の１５０ｍｇ／ｍｌトラスツズマブのＳＥ−ＨＰＬＣピークの相対ＡＵＣ。（Ｃ）もとの液体製剤と比較した、Ｆ２−５、Ｆ２−６およびＦ２−７中での２５℃、３か月の液体保存中の２００ｍｇ／ｍｌトラスツズマブのＳＥ−ＨＰＬＣピークの相対ＡＵＣ。もと：（１２０ｍｇ／ｍｌ）Ｆ０製剤（Ｆ０）
【図２７−１】液体保存中のトラスツズマブのカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）分析：（Ａ）もとの製剤と比較した、Ｆ２−１およびＦ２−２中での３０℃、３か月の液体保存中の１２０ｍｇ／ｍｌトラスツズマブのＣＥＸ−ＨＰＬＣピークの相対ＡＵＣ。（Ｂ）もとの製剤と比較した、Ｆ２−３およびＦ２−４中での２５℃、６か月の液体保存中の１５０ｍｇ／ｍｌトラスツズマブのＣＥＸ−ＨＰＬＣピークの相対ＡＵＣ。（Ｃ）もとの液体製剤と比較した、Ｆ２−５、Ｆ２−６およびＦ２−７中での２５℃、３か月の液体保存中の２００ｍｇ／ｍｌトラスツズマブのＣＥＸ−ＨＰＬＣピークの相対ＡＵＣ。もと：（１２０ｍｇ／ｍｌ）Ｆ０製剤（Ｆ０）。（Ａ〜Ｃ）酸性種（上）、主ピーク種（中）および塩基性種（下）。
【図２７−２】液体保存中のトラスツズマブのカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）分析：（Ａ）もとの製剤と比較した、Ｆ２−１およびＦ２−２中での３０℃、３か月の液体保存中の１２０ｍｇ／ｍｌトラスツズマブのＣＥＸ−ＨＰＬＣピークの相対ＡＵＣ。（Ｂ）もとの製剤と比較した、Ｆ２−３およびＦ２−４中での２５℃、６か月の液体保存中の１５０ｍｇ／ｍｌトラスツズマブのＣＥＸ−ＨＰＬＣピークの相対ＡＵＣ。（Ｃ）もとの液体製剤と比較した、Ｆ２−５、Ｆ２−６およびＦ２−７中での２５℃、３か月の液体保存中の２００ｍｇ／ｍｌトラスツズマブのＣＥＸ−ＨＰＬＣピークの相対ＡＵＣ。もと：（１２０ｍｇ／ｍｌ）Ｆ０製剤（Ｆ０）。（Ａ〜Ｃ）酸性種（上）、主ピーク種（中）および塩基性種（下）。
【図２７−３】液体保存中のトラスツズマブのカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ−ＨＰＬＣ）分析：（Ａ）もとの製剤と比較した、Ｆ２−１およびＦ２−２中での３０℃、３か月の液体保存中の１２０ｍｇ／ｍｌトラスツズマブのＣＥＸ−ＨＰＬＣピークの相対ＡＵＣ。（Ｂ）もとの製剤と比較した、Ｆ２−３およびＦ２−４中での２５℃、６か月の液体保存中の１５０ｍｇ／ｍｌトラスツズマブのＣＥＸ−ＨＰＬＣピークの相対ＡＵＣ。（Ｃ）もとの液体製剤と比較した、Ｆ２−５、Ｆ２−６およびＦ２−７中での２５℃、３か月の液体保存中の２００ｍｇ／ｍｌトラスツズマブのＣＥＸ−ＨＰＬＣピークの相対ＡＵＣ。もと：（１２０ｍｇ／ｍｌ）Ｆ０製剤（Ｆ０）。（Ａ〜Ｃ）酸性種（上）、主ピーク種（中）および塩基性種（下）。
【図２８】原薬の薬剤製品処理へのモデルとしての再緩衝化および後続の抗体濃度２００ｍｇ／ｍｌへの濃縮後の高濃縮トラスツズマブ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル：フリーズドライしたトラスツズマブ調製物（ハーセプチン（登録商標））を再構成し、それぞれもとの液体の供給元の製剤の組成物ならびに組成物４＿１、４＿３および４＿５の中の透析によって再緩衝化し、続いてトラスツズマブ濃度２００ｍｇ／ｍｌに濃縮した。もとの液体の供給元の製剤中の抗体の濃縮によって、組成物４＿１、４＿３および４＿５の中で製剤化した抗体の濃縮と比較して、保持時間１４分で溶出する凝集物の形成の増大が生じた。
【図２９−１】薬剤製品の安定性のモデルとしての、液体保存後の高濃縮トラスツズマブ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル：フリーズドライしたトラスツズマブ調製物（ハーセプチン（登録商標））を再構成し、もとの液体の供給元の製剤の組成物中、ならびにフリーズドライ製品のもとの供給元の製剤であるが米国特許第９３６４５４２号Ｂ２に記載された濃度でアミノ酸グリシンおよびプロリンを追加的に含む製剤中の透析によって再緩衝化した（実施例１６）。比較のため、再構成したトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））を、それぞれ組成物４＿１、４＿３および４＿５の中の透析によって追加的に再緩衝化した。続いて全ての製剤をトラスツズマブ濃度２００ｍｇ／ｍｌに濃縮した。（Ａ）および（Ｂ）。組成物４＿１、４＿３および４＿５の中で製剤化したトラスツズマブの５５℃、２４時間の液体保存後のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを、それぞれもとの液体の供給元の製剤と比較し（Ａ）、グリシンおよびプロリンを加えたもとの液体の供給元の製剤と比較した（Ｂ）。（Ｃ）および（Ｄ）。組成物４＿１、４＿３および４＿５の中で製剤化したトラスツズマブの４０℃、１４日の液体保存後のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを、それぞれもとの液体の供給元の製剤と比較し（Ｃ）、グリシンおよびプロリンを加えたもとの液体の供給元の製剤と比較した（Ｄ）。（Ｅ）および（Ｆ）。組成物４＿１、４＿３および４＿５の中で製剤化したトラスツズマブの４０℃、２８日の液体保存後のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを、それぞれもとの液体の供給元の製剤と比較し（Ｅ）、グリシンおよびプロリンを加えたもとの液体の供給元の製剤と比較した（Ｆ）。高温で種々の時間、液体保存した後の図示したＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムによって、特に前記米国特許に従ってグリシンおよびプロリンを添加したフリーズドライ製品のもとの製剤と比較して、組成物４＿１、４＿３および４＿４は凝集物の形成を効果的に防止したことが示された。
【図２９−２】薬剤製品の安定性のモデルとしての、液体保存後の高濃縮トラスツズマブ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル：フリーズドライしたトラスツズマブ調製物（ハーセプチン（登録商標））を再構成し、もとの液体の供給元の製剤の組成物中、ならびにフリーズドライ製品のもとの供給元の製剤であるが米国特許第９３６４５４２号Ｂ２に記載された濃度でアミノ酸グリシンおよびプロリンを追加的に含む製剤中の透析によって再緩衝化した（実施例１６）。比較のため、再構成したトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））を、それぞれ組成物４＿１、４＿３および４＿５の中の透析によって追加的に再緩衝化した。続いて全ての製剤をトラスツズマブ濃度２００ｍｇ／ｍｌに濃縮した。（Ａ）および（Ｂ）。組成物４＿１、４＿３および４＿５の中で製剤化したトラスツズマブの５５℃、２４時間の液体保存後のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを、それぞれもとの液体の供給元の製剤と比較し（Ａ）、グリシンおよびプロリンを加えたもとの液体の供給元の製剤と比較した（Ｂ）。（Ｃ）および（Ｄ）。組成物４＿１、４＿３および４＿５の中で製剤化したトラスツズマブの４０℃、１４日の液体保存後のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを、それぞれもとの液体の供給元の製剤と比較し（Ｃ）、グリシンおよびプロリンを加えたもとの液体の供給元の製剤と比較した（Ｄ）。（Ｅ）および（Ｆ）。組成物４＿１、４＿３および４＿５の中で製剤化したトラスツズマブの４０℃、２８日の液体保存後のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを、それぞれもとの液体の供給元の製剤と比較し（Ｅ）、グリシンおよびプロリンを加えたもとの液体の供給元の製剤と比較した（Ｆ）。高温で種々の時間、液体保存した後の図示したＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムによって、特に前記米国特許に従ってグリシンおよびプロリンを添加したフリーズドライ製品のもとの製剤と比較して、組成物４＿１、４＿３および４＿４は凝集物の形成を効果的に防止したことが示された。
【図２９−３】薬剤製品の安定性のモデルとしての、液体保存後の高濃縮トラスツズマブ製剤のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイル：フリーズドライしたトラスツズマブ調製物（ハーセプチン（登録商標））を再構成し、もとの液体の供給元の製剤の組成物中、ならびにフリーズドライ製品のもとの供給元の製剤であるが米国特許第９３６４５４２号Ｂ２に記載された濃度でアミノ酸グリシンおよびプロリンを追加的に含む製剤中の透析によって再緩衝化した（実施例１６）。比較のため、再構成したトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））を、それぞれ組成物４＿１、４＿３および４＿５の中の透析によって追加的に再緩衝化した。続いて全ての製剤をトラスツズマブ濃度２００ｍｇ／ｍｌに濃縮した。（Ａ）および（Ｂ）。組成物４＿１、４＿３および４＿５の中で製剤化したトラスツズマブの５５℃、２４時間の液体保存後のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを、それぞれもとの液体の供給元の製剤と比較し（Ａ）、グリシンおよびプロリンを加えたもとの液体の供給元の製剤と比較した（Ｂ）。（Ｃ）および（Ｄ）。組成物４＿１、４＿３および４＿５の中で製剤化したトラスツズマブの４０℃、１４日の液体保存後のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを、それぞれもとの液体の供給元の製剤と比較し（Ｃ）、グリシンおよびプロリンを加えたもとの液体の供給元の製剤と比較した（Ｄ）。（Ｅ）および（Ｆ）。組成物４＿１、４＿３および４＿５の中で製剤化したトラスツズマブの４０℃、２８日の液体保存後のＳＥ−ＨＰＬＣプロファイルを、それぞれもとの液体の供給元の製剤と比較し（Ｅ）、グリシンおよびプロリンを加えたもとの液体の供給元の製剤と比較した（Ｆ）。高温で種々の時間、液体保存した後の図示したＳＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムによって、特に前記米国特許に従ってグリシンおよびプロリンを添加したフリーズドライ製品のもとの製剤と比較して、組成物４＿１、４＿３および４＿４は凝集物の形成を効果的に防止したことが示された。
【図３０−１】薬剤製品の安定性のモデルとしての、液体保存後の高濃縮トラスツズマブ製剤のＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析：フリーズドライしたトラスツズマブ調製物（ハーセプチン（登録商標））を再構成し、もとの液体の供給元の製剤の組成物中、ならびにフリーズドライ製品のもとの供給元の製剤であるが米国特許第９３６４５４２号Ｂ２（実施例１６）に記載された濃度でアミノ酸グリシンおよびプロリンを追加的に含む製剤中の透析によって再緩衝化した。比較のため、再構成したトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））を、それぞれ組成物４＿１、４＿３および４＿５の中の透析によって追加的に再緩衝化した。続いて全ての製剤をトラスツズマブ濃度２００ｍｇ／ｍｌに濃縮した。（Ａ）５５℃での液体保存中の指示された分析時点における、（Ｂ）４０℃での液体保存中の指示された分析時点における、（Ｃ）２５℃での液体保存中の指示された分析時点における、酸性荷電バリアントの形成に対応するピークの相対的面積百分率の増大の経過。抗体分子の酸性荷電したバリアントの形成を図示した経過は、抗体分子の化学変化に対する組成物４＿１、４＿３および４＿５の安定化効果をさらに裏付けるものである。特に、酸性荷電バリアントの形成に対する安定化は、トラスツズマブ分子の主な化学変化として知られ、高温での液体保存中の酸性荷電バリアントの形成量に主に寄与する脱アミド化に対する、組成物４＿１、４＿３および４＿５の高い安定化効果を示唆している。対照的に、米国特許の実施例に従って添加剤としてアミノ酸グリシンおよびプロリンを添加したフリーズドライ製品のもとの供給元の製剤は、高い抗体濃度における高温での液体保存の経過中に酸性荷電バリアントが生成する顕著に高い傾向を示した。
【図３０−２】薬剤製品の安定性のモデルとしての、液体保存後の高濃縮トラスツズマブ製剤のＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析：フリーズドライしたトラスツズマブ調製物（ハーセプチン（登録商標））を再構成し、もとの液体の供給元の製剤の組成物中、ならびにフリーズドライ製品のもとの供給元の製剤であるが米国特許第９３６４５４２号Ｂ２（実施例１６）に記載された濃度でアミノ酸グリシンおよびプロリンを追加的に含む製剤中の透析によって再緩衝化した。比較のため、再構成したトラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））を、それぞれ組成物４＿１、４＿３および４＿５の中の透析によって追加的に再緩衝化した。続いて全ての製剤をトラスツズマブ濃度２００ｍｇ／ｍｌに濃縮した。（Ａ）５５℃での液体保存中の指示された分析時点における、（Ｂ）４０℃での液体保存中の指示された分析時点における、（Ｃ）２５℃での液体保存中の指示された分析時点における、酸性荷電バリアントの形成に対応するピークの相対的面積百分率の増大の経過。抗体分子の酸性荷電したバリアントの形成を図示した経過は、抗体分子の化学変化に対する組成物４＿１、４＿３および４＿５の安定化効果をさらに裏付けるものである。特に、酸性荷電バリアントの形成に対する安定化は、トラスツズマブ分子の主な化学変化として知られ、高温での液体保存中の酸性荷電バリアントの形成量に主に寄与する脱アミド化に対する、組成物４＿１、４＿３および４＿５の高い安定化効果を示唆している。対照的に、米国特許の実施例に従って添加剤としてアミノ酸グリシンおよびプロリンを添加したフリーズドライ製品のもとの供給元の製剤は、高い抗体濃度における高温での液体保存の経過中に酸性荷電バリアントが生成する顕著に高い傾向を示した。
【発明を実施するための形態】
【０１５５】
実施例によって本発明を説明する。
【実施例】
【０１５６】
実施例１
フリーズドライし、続いて保存したアデノウイルスベクターの機能的および構造的完全性のインビトロ研究により、アミノ酸および糖に基づく組成物が、下流処理の早期相における原薬の安定性を評価するためのモデルにおいてアデノウイルスベクターを安定化することが示された。
【０１５７】
１．１  材料および方法
組成物１および２は、アミノ酸の合計４０ｇ／ｌに対応する濃度で７つのアミノ酸、アラニン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、リジン、ヒスチジンおよびトリプトファンを含んでいた。しかし組成物１では、組成物２と比較して、トリプトファン濃度を５倍に増加し、ヒスチジンおよびグルタミン酸濃度を１．６６７倍に増加し、他のアミノ酸、アルギニン、グリシン、リジンの濃度を低減し、アラニン濃度を変更しなかった結果、アミノ酸全量を４０ｇ／ｌの同じ濃度とした。さらに、組成物２とは対照的に、組成物１に追加の界面活性剤ポリソーベート８０を０．０５ｇ／ｌの濃度で添加した。両方の組成物は対応する糖としてトレハロースを、アミノ酸／トレハロース比１：２（ｗ／ｗ）で含んでいた。全ての組成物でｐＨ値を７に調整した。
【０１５８】
もとの供給元の製剤（Ｆｉｒｍａ  Ｓｉｒｉｏｎ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ／Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の７．５×１０１０ＩＦＵ／ｍｌの濃度で、−８０℃で保存したアデノウイルスのストック溶液を用いた。
【０１５９】
１．１．１  試料調製およびフリーズドライ
組成物１または組成物２を用いてストック溶液を１×１０８ＩＦＵ／ｍｌの濃度に希釈することによって、アデノウイルスベクターストック溶液を再緩衝化した。比較のため、もとの供給元の製剤またはＰＢＳを用いて、ストック溶液を同じ濃度に希釈した。
【０１６０】
フリーズドライ用の試料を調製するため、種々のアデノウイルス製剤を２Ｒフリーズドライバイアル（Ｓｃｈｏｔｔ  ＡＧ、Ｍａｉｎｔｚ、Ｇｅｒａｍａｎｙ）中で体積５００μｌに分注し、続いて以下の乾燥パラメーターによってフリーズドライした。
【０１６１】
【表１】
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【０１６２】
フリーズドライの後、試料を目視で検査し、時点ｔ＝０における初期感染タイターの解析まで、試料の一部を２〜８℃で短期間保存した。試料の他の部分を医薬品規制調和国際会議（ＩＣＨ）のガイドラインに従って、残存湿度６０％の環境条件下、２５℃で２１日もしくは４２日、または残存湿度７５％の環境条件下、４０℃で７日もしくは２８日、保存した。
【０１６３】
１．１．２  細胞培養中のアデノウイルスベクターの感染タイターの測定
アデノウイルスベクター製剤の感染タイターを解析するため、感染細胞中のアデノウイルスの増幅に成功した後、アデノウイルスのヘキソンタンパク質の検出によって、ＨＥＫ２９３細胞培養における抗体に基づくウイルス滴定実験を適用した。２４ウェルのマイクロタイタープレートのウェルあたり２．５×１０５個のＨＥＫ２９３（ＣＣＳ）細胞（Ｆｉｒｍａ  Ｓｉｒｉｏｎ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ／Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を体積５００μｌで播種した。アデノウイルスベクター製剤を、フリーズドライの直後、または２５℃および４０℃で保存した後の指示された時点で再構成した。陽性対照として、もとの供給元の製剤（Ｆｉｒｍａ  Ｓｉｒｉｏｎ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ／Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中の濃度７．５×１０１０ＩＦＵ／ｍｌで、−８０℃で保存したアデノウイルスストック溶液のアリコートを用いた。続いて、アデノウイルス試料の連続希釈を調製し、得られた希釈物のウェルあたり５０μｌを細胞の感染に用いた。プレートを３７℃で４２時間インキュベートした。感染の後、細胞をメタノールで固定し、一次抗ヘキソンタンパク質抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘａｓ、ＵＳＡ）とインキュベートし、続いて一次抗体に特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗マウス抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）とインキュベートし、ジアミノベンジジン（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ  ａｎｄ  Ｃｏ．ＫＧ、Ｇｒａｆｒａｔｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）とのＨＲＰ酵素反応を行なった。褐色の着色は感染細胞を示す。顕微鏡下で褐色に着色した細胞を計数することによって、感染細胞の数を定量した。それぞれの感染細胞は１個の感染性ウイルス粒子として計数される。
【０１６４】
１．１．３  動的光散乱（ＤＬＳ）測定
−８０℃で保存したアデノウイルスストック溶液のアリコートに対応する未処理の陽性対照と比較した、再緩衝化直後でフリーズドライ前に採取した試料、ならびにアデノウイルスベクター製剤の再構成の後の試料について、ＤＬＳを行なった。後者の場合、ＤＬＳはフリーズドライの直後（ｔ＝０）または２５℃（２１日、４２日）および４０℃（７日、２８日）での保存の関連する時点で行なった。
【０１６５】
この目的のため、試料５μｌを特別のＤＬＳキュベットにピペットで入れ、ＤｙｎａＰｒｏ  Ｎａｎｏｓｔａｒ  ＤＬＳ装置（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｄｅｒｎｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。それぞれの実験製剤について、同じ条件でブランク測定を行なった。ＤＬＳ測定は１０または２０サイクルで、２０〜４０秒の取得時間で行なった。得られた相関曲線を、ＤｙｎａＰｒｏ  ＤＬＳソフトウェアで解析した。
【０１６６】
１．２  結果
興味あることに、アデノウイルスベクター調製物を本発明の溶液（組成物１または組成物２）と混合した直後のＤＬＳ実験で記録した相関関数の評価によって、もとのストック溶液中の未処理のアデノウイルス粒子の水力学的半径（図１Ａ）と比較して、アデノウイルスベクターの水力学的半径の完全な保持（図１Ｂおよび図１Ｃ）が示唆された。フリーズドライの前の試料の調製プロセスの間の、もとの供給元の製剤またはＰＢＳによる希釈によるアデノウイルスストック溶液の同様の混合によって既に、未処理のアデノウイルスベクター（図１Ａ）と比較して、アデノウイルスベクターの測定された水力学的半径の顕著な増大が生じた（図２Ａおよび図２Ｂ）。
【０１６７】
フリーズドライ後のインビトロ感染性アッセイによって、早期相のダウンスケールステップおよび後続のフリーズドライの間で既に、安定化組成物１および２の中でのアデノウイルスベクター調製物の製剤が、図１に破線で示した陽性対照の感染タイターに対応する感染タイターを生じることが明らかになった。したがって、フリーズドライ後の感染タイターの完全な保持が観察された。対照的に、もとの供給元の製剤中で再緩衝化したアデノウイルスベクターをフリーズドライした場合には、感染タイターの顕著な喪失が観察され、ＰＢＳ中でのフリーズドライでは対応する感染タイターは完全に喪失された（図３）。
【０１６８】
乾燥された製品を再構成した後のアデノウイルス調製物のインビトロ感染性の結果は、動的光散乱実験による水力学的半径の並行した測定の結果とよく一致した。早期相ダウンスケールステップと後続のフリーズドライの間で既に、アデノウイルスベクター調製物と本発明の組成物１および２との組合せにより、ウイルス粒子の水力学的半径の完全な保持が得られた（実施例１、図４Ａおよび４Ｂ）。対照的に、もとの供給元の製剤中での対応するアデノウイルスベクター調製物のフリーズドライでは、粒径の増大が生じた（実施例１、図５Ａ）。一般的なリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）と組み合わせた同様の試料調製手順では、フリーズドライ後で既に、粒径の大きな増大（実施例１、図５Ｂ）および顕著な量の高次凝集物の形成が生じた。
【０１６９】
これらの相違はフリーズドライ調製物の保存後で、より顕著であった。もとの供給元の製剤中でフリーズドライしたウイルスベクターの完全な機能の喪失（図６）が観察され、ＰＢＳ中で得られた結果と同様であった。対照的に、２５℃または４０℃での保存後でも、製造プロセスの早期に安定化組成物１および２の中で製剤化したフリーズドライアデノウイルスベクター組成物は、陽性対照、すなわちフリーズドライ前のアデノウイルスベクター（図６のダイアグラムに破線で示す）とほぼ同じウイルス活性を保持していた。
【０１７０】
インビトロ感染性実験のこれらの結果は、並行して行なったＤＬＳ実験とよく対応している。例として、本発明の組成物１および２の中での、またはもとの供給元の製剤およびＰＢＳの中での、乾燥されたアデノウイルスベクター組成物の保存後の記録されたＤＬＳ相関関数の評価を、それぞれ４０℃、１４日の保存後、図７および図８に示した。安定化組成物１および２の中での乾燥されたアデノウイルスベクター調製物の保存によって、もとの供給元の製剤中およびＰＢＳ中で保存されたアデノウイルス粒子（実施例１、図８Ａおよび図８Ｂ）とは対照的に、アデノウイルス粒子の測定された水力学的半径の保持が得られた（実施例１、図７Ａおよび図７Ｂ）。
【０１７１】
実施例２
凍結解凍ストレスの後の種々のアデノウイルスベクター調製物の機能的および構造的完全性のインビトロ研究により、特定のアミノ酸組成物が下流処理の早期相における原薬の安定性を評価するためのモデルにおいて他よりも優れた安定化効果を示すことが示された。
【０１７２】
２．１  材料および方法
２．１．１  試料調製およびさらなる処理
ｅＧＦＰタンパク質をコードするＤＮＡを含むアデノウイルスタイプ５ベクターの高タイターのアデノウイルスベクターストック。５×１０８個のＨＥＫ２９３細胞にアデノウイルス粒子を導入した。導入の４８時間後に細胞を採取し、Ｎａ−ＤｅｏｘｙｃｈｏｌａｔおよびＤＮａｓｅ  Ｉ処理によってウイルス粒子の放出を行なった。ＣｓＣｌ勾配超遠心および通常それに続くＰＤ１０カラム上のもとの供給元の製剤による緩衝液交換によってウイルス粒子を精製し、続いて感染タイターを測定した。得られた高タイターのアデノウイルスストックを続いて分注し、−８０℃で保存した。
【０１７３】
試料調製−プロセスステップ１：ＣｓＣｌ勾配超遠心の直後にアデノウイルスベクター調製物を再緩衝化することによって、アデノウイルスベクター製剤を調製した。得られたアデノウイルスベクターバンドを採取し、組成物１または２のいずれかで（１．１に記載したように）２〜８℃で透析した。得られた製剤を分注し、−８０℃で保存した。
【０１７４】
試料調製−プロセスステップ２：凍結された（−８０℃）アデノウイルスストック溶液（７．５×１０１０ＩＦＵ／ｍｌ、Ｓｉｒｉｏｎ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ／Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をもとの供給元緩衝液中で解凍し（室温、ＲＴ）、続いて組成物１および２の中で、２〜８℃で透析した。
【０１７５】
２．１．２  プロセスステップ１およびステップ２の調製物からのアデノウイルス試料の繰り返し凍結解凍サイクル
後続のストレス条件の間のアデノウイルスベクター調製物の安定性を解析するため、組成物１または２の中で製剤化したアデノウイルスベクター５０μｌを繰り返し凍結（−８０℃）解凍（ＲＴ）サイクルに供した。ＨＥＫ２９３細胞培養（１．１．２に記載）におけるウイルス滴定により、初期時点ｔ＝０ならびに５回および１０回の凍結解凍サイクルの後で、インビトロ感染性（１．１．２に記載）を測定した。並行して、アデノウイルス粒子の水力学的半径をＤＬＳ（１．１．３に記載）によって測定した。
【０１７６】
２．２  結果
インビトロ感染性アッセイにより、陽性対照（図９の破線）と比較して、組成物１はプロセスステップ１とステップ２の両方のアデノウイルスベクター調製物の感染タイターを完全に保持していることが明らかになった（図９）。超遠心ステップの直後（プロセスステップ１）の組成物２の中におけるアデノウイルスベクター調製物の再緩衝化も、アデノウイルスベクター調製物の感染性を完全に保持していた。興味あることに、プロセスステップ２の後で用いた組成物２は、初期タイターのほぼ２ログレベルの喪失を生じた（図９）。
【０１７７】
さらなる凍結解凍サイクル（５回および１０回）に際して、生産プロセスステップおよび再緩衝化の時点に関わらず、組成物１は完全な感染タイターを保持していた（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。対照的に、２つの異なったプロセスステップ１および２で調製した場合、組成物２は全く異なった効果を生じた。プロセスステップ２によって得られた組成物２の試料の感染タイターは、５回の凍結解凍サイクルの後で顕著に低減し、１０回のサイクルの後ではさらに大きく低減した（図１１Ｂ）。アデノウイルスベクターを早期のプロセスステップ１で組成物２の中で製剤化した場合には、５回の凍結解凍サイクルの後で僅かなタイターの喪失が観察された。１０回の凍結解凍サイクルではより大きな低減が生じたが、プロセスステップ２における調製と比較して僅かな程度であった（図１１Ａ）。
【０１７８】
繰り返し凍結解凍サイクルの前後の感染タイターの測定と並行して、対応するアデノウイルス粒子の水力学的半径を動的光散乱（ＤＬＳ）によって解析した（図１０、図１２および図１３）。超遠心による精製ステップの直後のアデノウイルスベクター調製物の再緩衝化（調製ステップ１）によって、両方の組成物においてウイルス粒子の水力学的半径の完全な保持が得られ（図１０Ａおよび図１０Ｂ）、対応するインビトロ感染性の完全な保持が確認された（図９）。組成物１の場合には、プロセスステップ２によってアデノウイルスベクター調製物を再緩衝化した後に水力学的粒子半径の僅かな増大が観察され（図１０Ｃ）、これは図９に示す感染性の結果と一致している。対照的に、処理ステップ２に対応する組成物２の中のアデノウイルスベクター調製物の再緩衝化によって、高次凝集物の形成を伴うアデノウイルス粒子の水力学的半径の顕著な増大が生じ（図１０Ｄ）、これはインビトロ感染性試験における機能の喪失（図９）を説明するものであろう。
【０１７９】
５回および１０回の繰り返し凍結解凍サイクルの後、特に組成物２におけるウイルス粒子の水力学的半径の変化をＤＬＳによって測定した。プロセスステップ１および２で調製した場合、組成物１では顕著な増大は観察されなかった。例として、５回および１０回の凍結解凍サイクルの適用後の組成物１の中におけるアデノウイルス粒子のサイズについてのＤＬＳの結果を図１２に示す。プロセスステップ１で組成物２を用いた場合、５回の凍結解凍サイクルの後で既に高次凝集物の形成を伴って水力学的半径が顕著に増大し、１０回の凍結解凍サイクルの後、およびプロセスステップ２で用いた場合には、半径のさらなる増大とＤＳＬ測定限界外の高次凝集物のために測定できなかった（図１３Ｃおよび図１３Ｄ）。５回の凍結解凍サイクルの適用の後の、プロセスステップ１および２のいずれかで調製した組成物１および２におけるアデノウイルス粒子サイズの挙動を図１３Ａ〜図１３Ｄに示す。
【０１８０】
要旨および結論として、組成物１は一般に、適用された両方の早期生産ステップにおいてアデノウイルスベクター粒子に対して優れた安定化効果を示した。対照的に、組成物２は超遠心直後に用いた場合には安定化効果を示したが、生産プロセスの後の方で用いた場合には組成物１と比較して低減した安定化効果が観察された。
【０１８１】
ＤＬＳデータは、実施例１で示されたインビトロ感染性データと相関している。これにより、ウイルスベクター組成物の生産プロセスの早期にアミノ酸に基づいて特に調整された安定化組成物を用いることが、生物医薬製造のさらなる処理ステップの間の安定性に重要であることが結論される。さらに、溶液の多分散性の低減の観点からのウイルスベクター系組成物の安定化により、高いインビトロ感染性を有する溶液が得られる。
【０１８２】
実施例３
低濃縮治療用抗体製剤の処理中および液体保存中の分子の完全性の解析により、特定のアミノ酸と糖の組成物によって、原薬の薬剤製品処理へのモデルにおいて抗体が凝集および特に断片化する傾向が低減されることが示された。
【０１８３】
３．１  材料および方法
組成物Ｈｅｒ＿１およびＨｅｒ＿２は、組成物Ｈｅｒ＿１の場合には９．４ｇ／ｌのトレハロース、組成物Ｈｅｒ＿２の場合には９．４ｇ／ｌのメチオニンとの組合せとして、７つのアミノ酸、アラニン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、リジン、ヒスチジンおよびトリプトファンをアミノ酸の合計濃度３０．６ｇ／ｌで含み、全賦形剤濃度４０ｇ／ｌとなっていた。アミノ酸の合計とトレハロースとの比は３．２５：１であった。組成物Ｈｅｒ＿９は、１０ｇ／ｌのトレハロースおよび１０ｇ／ｌのメチオニンとの組合せとして４つの塩基性アミノ酸、高濃度のアルギニン、グリシン、トリプトファンおよび緩衝液濃度のヒスチジンのみをアミノ酸の合計濃度２０ｇ／ｌで含んでいた。４つの塩基性アミノ酸の合計とトレハロースとの対応する比は２：１であった。全ての例においてＩｇＧと賦形剤との（重量：重量）比は１：１．６であった。もとの供給元の製剤の場合のＩｇＧと賦形剤との比は１：１であった。全ての組成物でｐＨ値を６に調整した。
【０１８４】
モデルタンパク質として、市販のフリーズドライハーセプチン（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、すなわち治療用ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体（トラスツズマブ）を用いた。所望の量の水によるフリーズドライ薬剤の再構成により、もとの供給元の製剤として抗体濃度ＩｇＧ１  ２５ｍｇ／ｍｌとなった（トレハロース２４ｇ／ｌ、ヒスチジン緩衝液０．９ｍｇ／ｍｌ、約５ｍＭ、ポリソーベート２０  ０．１ｇ／ｌ、ｐＨ６）。
【０１８５】
３．１．１  試料調製
得られた製剤を、もとの供給元の製剤の組成物ならびに種々のアミノ酸に基づく組成物Ｈｅｒ＿１、Ｈｅｒ＿２およびＨｅｒ＿９中、２〜８℃で透析した後、全ての製剤を無菌濾過し、液体保存のため無菌のバイアルに分注した。試料を３７℃および４５℃に保存し、保存前、試料調製直後、および指示された時点で、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってタンパク質の凝集および断片化を解析した。
【０１８６】
３．１．２  サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
タンパク質の凝集および断片化をＳＥＣによって定量した。分析は、ＵＶ−２８０ｎｍ検出器およびＴＳＫ−ゲルＧ３０００ＳＷＸＬ７．８×３００ｍｍカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を備えたＵＨＰＬＣシステムＵｌｔｉＭａｔｅ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて３０℃、流量０．５ｍｌ／分で行なった。ＳＥＣ分析に先立って、２５ｍｇ／ｍｌの抗体または他の例によるより高い濃度を含む試料を、ＳＥＣ運転緩衝液ＰＢＳを用いてＩｇＧ濃度２．５ｍｇ／ｍｌになるように希釈し、特別のＨＰＬＣバイアルに分注した。注入量は２５μｌであった。ＳＥＣ用の運転緩衝液はＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ  ｐＨ７．１（ＰＡＡ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｓｃｈｉｎｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）であった。それぞれのシーケンスで分子量標準（ＢＳＡ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）およびプラセボ緩衝液を流した。
【０１８７】
凝集および断片化の％で表した定量は、Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ  ７  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｄａｔａ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、モノマーピーク、高分子量種の合計、および低分子量種の合計の曲線下面積を比較することによって測定した。
【０１８８】
３．２  結果
試料調製
透析直後のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）分析におけるピークパターンによって、もとの製剤中における約１．５５％の凝集ピークの面積百分率への凝集形成の増加、およびより高分子量の凝集物の形成さえも明らかになった。対応するトラスツズマブ標準品中の凝集物の通常の含量は約０．４％であった。無傷の抗体分子に対応するモノマーピークの面積百分率は、これに伴ってもとの製剤中で約９８．４４％に減少した。
【０１８９】
対照的に、それぞれ種々のアミノ酸に基づく組成物Ｈｅｒ＿１、Ｈｅｒ＿２およびＨｅｒ＿９における透析による最初のＩｇＧ１製剤の再緩衝化によって、未処理のトラスツズマブ標準製剤に対応する高分子量凝集物を形成することなく、約０．４％の凝集物量の保持が得られた。対応するモノマーピークの面積百分率はそれぞれ約９９．６％に保持された（図１４）。
【０１９０】
４５℃における液体保存
もとの供給元の製剤中における抗体の２１日間の液体保存の後、凝集物ピークの面積百分率の１．７６％への増大が見られ、２８日後には凝集物形成は約２．５３％にさらに増大した（比較のため、同じストック溶液の未処理トラスツズマブ標準品における凝集は、０．４％の凝集物を含んでいた）。さらに、断片化は２１日後に約１．９２％、２８日後に約２．７８％に増大した。凝集と断片化の速度は４５℃における保存の経過中、同様であった。アミノ酸に基づく全ての組成物、Ｈｅｒ＿１、Ｈｅｒ＿２およびＨｅｒ＿９は、４５℃における液体保存の間、抗体の凝集および断片化の程度を低減させたが、その程度は異なっていた。トレハロースおよび／またはメチオニンと組み合わせて７つのアミノ酸を含む組成物（組成物Ｈｅｒ＿１およびＨｅｒ＿２）は、４５℃における液体保存の間の抗体の凝集を顕著に低減した。たとえば、メチオニンと組み合わせて７つのアミノ酸を含む組成物Ｈｅｒ＿２は、２１日間の保存中の凝集物形成を約０．５６％（もとの製剤の１．７６％に対して）に低減した。４５℃、２１日の保存後の１．３２％の断片化はやや目立ったが、もとの製剤中の保存（１．９２％）と比較して顕著に低減した。２８日までのさらなる保存の後、凝集は変化せず（もとの製剤の２．５３％に対して０．５２％）、断片はもとの製剤の２．７８％に対して１．４９％にやや増大した。トレハロース（アミノ酸とトレハロースの比は２：１であった）およびメチオニンと組み合わせた緩衝液濃度中で４つの塩基性アミノ酸、アルギニン、グリシン、トリプトファン、およびヒスチジンにアミノ酸含量を減少すると、４５℃、２１日の保存後の凝集物の量は同程度になったが、抗体が断片化する傾向は低減した（１．０２％）。４５℃、２８日の保存後では、凝集物の含量は約０．３９％にさらに低減したが、断片化は約１．５６％に増大した（図１８）。
【０１９１】
したがって、７つのアミノ酸から４つのアミノ酸へのアミノ酸の量の減少、アミノ酸とトレハロースとの比の３．２５：１（７つのアミノ酸およびトレハロース）から２：１（４つのアミノ酸およびトレハロース）への調節、および抗酸化剤として作用するメチオニンの添加により、高温における保存中の抗体の凝集および特に断片化する傾向が低減された。
【０１９２】
実施例４
低濃縮治療用抗体製剤の処理中および液体保存中の分子の完全性の解析により、特に調整されたアミノ酸と糖の組成物によって、原薬の薬剤製品処理へのモデルにおいて抗体が凝集および特に断片化する傾向が低減されることが示された。
【０１９３】
４．１  材料および方法
組成物１１＿１は６つのアミノ酸、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、トリプトファン、メチオニンおよびβ−アラニンを対応するアミノ酸の合計濃度４８ｇ／ｌで、また組成物１１＿１＋トレハロースの場合には９６ｇ／ｌのトレハロースとの組合せで含んでいた。この組成物ではアミノ酸とトレハロースとの比は１：２であった。ｐＨ値は６に調節した。抗体と賦形剤との比は、トレハロースの添加がない場合には１：２．４（重量：重量）、トレハロースの添加後には１：７．２であった。もとの液体の供給元の組成物の場合には、抗体と賦形剤との比は１：３．４であった。
【０１９４】
モデルタンパク質として、市販のフリーズドライハーセプチン（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、すなわち治療用ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体（トラスツズマブ）を用いた。所望の量の水によるフリーズドライ薬剤の再構成により、もとの供給元の製剤中の抗体濃度はＩｇＧ１  ５０ｍｇ／ｍｌとなった（トレハロース４８ｇ／ｌ、ヒスチジン緩衝液１．８ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍＭ、ポリソーベート２０  ０．２ｇ／ｌ、ｐＨ６）。
【０１９５】
４．１．１  試料調製
得られた製剤を、もとの液体の供給元の製剤の組成物（トレハロース７９．４５ｇ／ｌ、ヒスチジン緩衝液３．１３ｇ／ｌ、２０ｍＭ、メチオニン１．４９ｇ／ｌ、ポリソーベート２０  ０．４ｇ／ｌ、ｐＨ６）中、２〜８℃での透析により再緩衝化し、続いて部分的に希釈することによって、抗体の最終濃度２５ｇ／ｌおよび５０ｇ／ｌの、もとの液体の供給元の製剤中の製剤を得た。
【０１９６】
並行して、抗体濃度２０ｍｇ／ｍｌの市販のハーセプチン（登録商標）をフリーズドライし、再構成し、分注して−８０℃に保存したアリコートを解凍した後、アミノ酸に基づく組成物１１＿１および１１＿１＋トレハロース中での透析による再緩衝化を行なった。
【０１９７】
試料調製直後に、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いてタンパク質の凝集および断片化を解析した。
【０１９８】
４．１．２  サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＳＥＣは段落３．１．２に従って行なった。
【０１９９】
４．２  結果
試料調製
もとの液体の供給元の組成物中での透析後、凝集形成は前の実施例と比較して低減した（凝集物０．４％）。しかし、トレハロースの添加なしの、およびアミノ酸とトレハロースとの比１：２でトレハロースを添加した、さらなるアミノ酸に基づく組成物１１＿１中で透析した後、凝集は約０．３％にさらに低減した（図１５）。
液体保存
【０２００】
全体の実施例の経過中、アミノ酸とトレハロースとの比１：２でアミノ酸に基づく製剤（組成物１１＿１）にトレハロースを添加すると、トレハロースを含まない対応する組成物と比較して、３７℃での保存の経過で断片の面積百分率の顕著な低減が生じ、トレハロースの存在下で凝集傾向が僅かに低減した（データは示していない）。
【０２０１】
したがって、最後の２つの実施例によって既に、アミノ酸とトレハロースとの組合せが明らかに高温での液体保存中の抗体の凝集形成および特に断片化を低減させるための必須要件であることが示された。
【０２０２】
抗体の凝集および断片化挙動に対する抗体と賦形剤との比の影響は、低濃縮トラスツズマブ製剤を用いた液体保存実験の経過で既に観察されていた。ＩｇＧ濃度５０ｍｇ／ｍｌで、また以前の実験の組成物Ｈｅｒ＿９と同程度の比でトレハロースおよび抗酸化剤と組み合わせた４つの塩基性アミノ酸を含むアミノ酸に基づく組成物中の製剤において、２５ｇ／ｌ、５０ｇ／ｌおよび７５ｇ／ｌの濃度で、ＳＥＣクロマトグラムにより、３７℃、４２日の保存後に、賦形剤濃度の増大によって凝集形成が低減し、賦形剤の濃度の増大によって断片化が増大することが明らかになった。抗体と賦形剤との最大の比２：１で、断片化は最小となり、凝集物は最大となった（データは示していない）。
【０２０３】
これらの実施例３および４の結果を併せると、トレハロースとのバランスを取った比と組み合わせた７つのアミノ酸から４つの塩基性アミノ酸へのアミノ酸の量の低減、抗酸化剤、たとえばメチオニンの添加、および抗体と賦形剤とのバランスを取った比は、高温での液体保存の経過中の抗体の凝集および断片化に影響を与えることが示される。
【０２０４】
実施例５
高濃縮治療用抗体製剤の処理中および液体保存中の分子の完全性および粘度の解析により、特定のアミノ酸と糖の組成物によって、原薬の薬剤製品処理へのモデルにおいて抗体が凝集および特に断片化する傾向が低減されることが示された。
【０２０５】
５．１  材料および方法
組成物３および４は、４つの塩基性アミノ酸、アルギニン、グリシン、トリプトファンおよびヒスチジンをアミノ酸の合計濃度５０ｇ／ｌで含んでいた。組成物３の場合にはアミノ酸組成物は８０ｇ／ｌのトレハロースとの組合せ、組成物４の場合には３２．２ｇ／ｌのトレハロースとの組合せであった。追加の化合物として組成物３および４は１．５ｇ／ｌのメチオニンおよび０．４ｇ／ｌのポリソーベート２０を含んでいた。組成物４は追加の２つの化合物、キレート化剤ＥＤＴＡおよび抗酸化剤アスコルビン酸を含んでいた。得られた賦形剤の合計は、組成物３の場合に１３１．５ｇ／ｌ、組成物４の場合に８５ｇ／ｌであった。組成物３で塩基性アミノ酸の合計とトレハロースとの比は１：１．５５（ｗ／ｗ）でトレハロース過剰、組成物４で塩基性アミノ酸とトレハロースとの比は１．６：１（ｗ／ｗ）でアミノ酸過剰であった。抗体と賦形剤の合計との比は組成物３で１：０．９（ｗ／ｗ）、組成物４で１：１．４（ｗ／ｗ）であった。ｐＨ値は５．５に調節した。
【０２０６】
モデルタンパク質として、もとの供給元の製剤中に濃度１２０ｍｇ／ｍｌでトラスツズマブを含む市販の液体治療用高濃縮抗体ハーセプチン（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（トレハロース７９．４５ｇ／ｌ、ヒスチジン緩衝液３．１３ｇ／ｌ、２０ｍＭ、メチオニン１．４９ｇ／ｌ、ポリソーベート２０  ０．４ｇ／ｌ、ｒＨｕＰｈ２０（組み換えヒトヒアルロニダーゼ）０．０２４ｇ／ｌ、ｐＨ５．５）を用いた。
【０２０７】
５．１．１  試料調製
２５℃、３０℃および４０℃での保存のため、もとの液体の供給元の製剤中の未処理の抗体製剤の試料を、もとの容器から直接、無菌のＨＰＬＣバイアルに分注した。抗体濃度１２０ｍｇ／ｍｌのトラスツズマブのもとの液体の供給元の製剤の別の一部を、本発明の組成物への２〜８℃での透析によって再緩衝化した。得られた製剤を無菌濾過し、無菌のＨＰＬＣバイアルに分注し、２５℃、３０℃および４０℃で保存した。保存前、試料調製直後、および保存中の指示された時点で、ＳＥＣによって凝集および断片化を解析した。
【０２０８】
５．１．２  サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＳＥＣは段落３．１．２に従って行なった。
【０２０９】
５．１．３  粘度測定
段落５．１．１による試料調製の後、アミノ酸組成物３および４に基づく高濃縮抗体製剤の粘度を、落球式粘度計（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ  ＧｍｂＨ、Ｏｓｔｆｉｌｄｅｒｎ−Ｓｃｈａｍｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、未処理のもとの液体の供給元の製剤の粘度と比較して測定した。高濃縮タンパク質試料（１２０ｍｇ／ｍｌ）の密度の測定および落下角７０°、２０℃での水によるキャピラリの較正の後、キャピラリに球を導入し、約５００μｌの抗体製剤をキャピラリに注意深く充填した。充填したキャピラリを装置のキャピラリブロックに挿入し、２０℃および落下角７０°で１０個の個別のアッセイとして試料を測定した。
【０２１０】
５．２  結果
試料調製
もとの容器からの未処理の液体トラスツズマブ製剤のＳＥＣプロファイルは、０．１９％の小さな凝集ピーク、９９．７７％のモノマーピークおよび０．０４％の断片のみを示した。段落５．１によるアミノ酸に基づく組成物３および４の中でこの製剤を再緩衝化した後、同様のＳＥＣプロファイルが解析され、再緩衝化のプロセスの間の抗体に対するアミノ酸に基づく製剤の安定化効果が示唆され（図１６）、これは後続の高温での保存中、より顕著であった（図１９および次の段落）。
【０２１１】
液体保存
もとの未処理液体の供給元の製剤中での４０℃、１．５日の保存後で既に、凝集形成の増大が測定され（０．２２％）、断片化の僅かな増大が見られた（０．０９％）。モノマーピークは９９．６９％に僅かに減少した。対照的に、段落５．１による２つの異なったアミノ酸に基づく組成物３および４の中における抗体の４０℃、１．５日の保存により、抗体の凝集傾向の低減およびそれほどではないが断片化傾向の低減が明らかになった（図１９Ａ）。組成物３ではアミノ酸とトレハロースとの比が１：１．５５（ｗ／ｗ）とアミノ酸に対してトレハロースが過剰で、４０℃、１．５日の保存後の凝集物含量は約０．１６％、断片は０．０６％となった。アミノ酸とトレハロースとの比が１．６：１とアミノ酸過剰の組成物４における４０℃、１．５日の保存では、凝集物０．１６％および断片０．０５％の形成となった。もとの液体の供給元の製剤中の４０℃、１２日の保存後には、凝集物および断片はさらに増大した（凝集物０．２６％、断片０．２７％）。組成物３では、４０℃、１２日の保存後に凝集物は僅か０．２０％に、断片は０．２９％に増大した。組成物４では、凝集物含量は僅か０．１８％であり、断片含量は僅か０．２０％に増大した（図１９Ｂ）。３０℃、２１日の保存後、もとの供給元の製剤中の凝集物含量も０．２６％に増大し、断片は０．１３％であった。組成物３ならびに組成物４の中における３０℃、２１日の保存では、抗体の凝集傾向の低減が明らかになった（組成物３で０．１８％、組成物４で０．１６％）。組成物３中における抗体の断片化の増大（０．１５％）は、もとの製剤および組成物４と同程度であり、組成物４中における断片含量は０．０９％に低減した（図１９Ｃ）。４０℃におけるより長期の保存後のデータにより、これらの観察が確認された。もとの製剤中の４０℃、４２日の保存後、凝集物は０．５３％に、断片は０．８％に増大した。対照的に、組成物３および組成物４では、この保存期間後の凝集物含量は０．３７％および０．３６％であった。さらに、断片はそれぞれ僅かに０．７２％および０．６６％であった。
【０２１２】
これらの結果より、アミノ酸に基づく製剤は、４０℃および３０℃での保存中に、凝集物の形成および特に組成物４では断片の形成に対して、もとの製剤より強い安定化効果を有していることが示唆される。結果はさらに、特にトレハロースに対してアミノ酸が過剰な組成物４が、凝集および断片化に対して組成物３と比較して良好な安定化を示すことを示している。この観察は３０℃、３か月の保存後に確認された。もとの製剤では凝集物含量は０．３５％であったが、組成物３では凝集物含量は０．２６％、組成物４では凝集物含量は０．２０％であった。もとの製剤中では断片は０．４０％、組成物３では０．４６％、組成物４では僅か０．３３％であった。３０℃、３か月の加速老化条件における高濃縮抗体製剤（１２０ｍｇ／ｍｌ）の液体保存経過の定量的統計解析により、上記の発見がさらに実証された。もとの液体製剤中の加速老化（図２６）は、組成物３および組成物４と比較して、有意に高い（ｐ＜０．０１）凝集度を示し、製剤の粘度と一致していた（下記および図２６を参照）。対照的に、保存中の断片形成はもとの製剤と組成物３とで同様であったが、組成物４では有意に低減した（ｐ＜０．０５）（図２６Ａ）。これに伴うモノマーピークの低減は組成物３では限定的（ｐ＜０．０１）であり、組成物４ではもっと少なかった（ｐ＜０．０１）（図２６Ａ）。
【０２１３】
アミノ酸とトレハロースとの比１．６：１（ｗ／ｗ）の組成物４の安定化効果は、以下の実施例で確認された。
【０２１４】
糖を含まず、ジペプチドと組み合わせた、アミノ酸、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、トリプトファン、メチオニンおよびβ−アラニンのみを含む、実施例４、段落４．１による組成物１１＿１から誘導されたさらなる組成物１の安定化効果を解析した。上記のそれぞれの分析時点で抗体の凝集は顕著に低減したが、段落５．１による組成物３および特に組成物４と比較して、抗体はより強い断片化の傾向を示し、アミノ酸とトレハロースとのバランスを取った比が凝集および断片化を低減させるという観察が支持された（データは示していない）。
【０２１５】
さらに、ＣＥＸ−ＨＰＬＣによってもとの製剤と比較した、組成物３および４の中の３０℃、３か月の加速老化条件での高濃縮抗体製剤（１２０ｍｇ／ｍＬ）の液体保存の経過における化学的分解パターンの解析により、たとえば好適な比の糖および１つまたは複数の抗酸化剤の添加による塩基性アミノ酸組成物の調節の有利な効果がさらに強調された。より高濃縮された（１２０ｍｇ／ｍｌ）トラスツズマブを用いた場合と同じく、組成物３によって塩基性種が低減する（図２７、ｐ＜０．０５）。したがって、アミノ酸と糖との比をバランスさせることによって、高濃縮トラスツズマブの液体保存中の塩基性化学的分解生成物を制限することが可能になった。
【０２１６】
このデータは、特定の生体分子の要求（たとえば薬剤製品の最終濃度および粘度）による早期の原薬処理ステップ中に用いる少なくとも３つのアミノ酸、アルギニン、グリシン、ヒスチジンおよび／またはトリプトファンを含む、適用される塩基性アミノ酸組成の調節によって、充填、フリーズドライ、乾燥されたまたは液体の製品の保存等のさらなる処理の間、生体分子が安定化されるという、特許を請求する発明をさらに実証するものである。
【０２１７】
粘度測定
アミノ酸に基づく高濃縮抗体製剤の測定された動粘度は、未処理の液体の供給元の製剤の対応する粘度と比較して顕著に低減していることが見出された。組成物３の中の動粘度は４ｍＰａ・秒、組成物４の中では３．５ｍＰａ・秒であった。対照的に、高濃縮の液体のもとの供給元の製剤の動粘度は４．８ｍＰａ・秒であった（図２０）。
【０２１８】
組成物４およびもとの供給元の製剤は、ほぼ同様の抗体と賦形剤との比１．４：１（ｗ／ｗ）で抗体を含んでいた。しかし、組成物４では、アミノ酸とトレハロースとの比およびそれに伴う対応する抗体と賦形剤との比の調節は、もとの製剤と比較して、高温での液体保存中の安定化効果と製剤の粘度の顕著な低下の両方で影響を及ぼした。組成物３におけるアミノ酸とトレハロースとの比の調節およびそれによる抗体と賦形剤との比は既に、もとの製剤と比較して安定化効果の増大および製剤粘度の低下を生じたが、組成物４の効果で生じたさらなる調節と比較するとそれほどではなかった。
【０２１９】
したがって、これらのデータは、バランスを取った比でのアミノ酸とトレハロースとの組合せおよび抗体と賦形剤の合計との比の同時の調節が、高温での液体保存中の抗体の凝集および特に断片化に関する製剤の安定化効果に強い影響を有するという発見をさらに実証するものである。さらに、上述の安定化効果の他に、このようにして組成物を調節することにより、高濃縮治療用抗体製剤の製剤粘度が顕著に低減する。
【０２２０】
実施例６
高濃縮治療用抗体製剤の処理中および液体保存中の分子の完全性の解析により、特定のアミノ酸と糖の組成物、ならびにアミノ酸と糖との比（ｗ／ｗ）によって、薬剤製品の安定性のモデルにおいて抗体が凝集および特に断片化する傾向が低減されることが示された。
【０２２１】
６．１  材料および方法
組成物３および４＿１は段落５．１による実施例５で適用した同様の組成物である。しかし組成物４＿１の場合には、ｐＨ５．５へのｐＨの調節はクエン酸の代わりにＨＣｌで行なった。両方の組成物は実施例５の段落５．１による同様のアミノ酸の合計とトレハロースとの比を含んでいた。組成物４＿２は実施例５の段落５．１による組成物４のバリアントでもある。組成物４＿２は４つの塩基性アミノ酸、アルギニン、グリシン、トリプトファンおよびヒスチジンを含み、さらにアミノ酸アラニンを添加した。組成物４＿２では糖分画はトレハロースとサッカロースの比３：１（ｗ／ｗ）の混合物であった。メチオニンの量は３．５ｇ／ｌに僅かに増加し、追加の賦形剤、たとえばキレート化剤ＥＤＴＡおよびアスコルビン酸をさらに供給した。
【０２２２】
組成物４＿２ではアミノ酸と糖との比を１：１（ｗ／ｗ）に僅かに減少させた。もとの製剤では、抗体と賦形剤との比は１．６：１（ｗ／ｗ）、組成物３では１：１．１（ｗ／ｗ）、組成物４＿１では１．７６：１（ｗ／ｗ）、組成物４＿２では１．１２：１（ｗ／ｗ）であった。
ｐＨは５．５に調節した。
モデルタンパク質として、段落３．１および４．１による市販のフリーズドライハーセプチン（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いた。試料の調製は、市販のフリーズドライハーセプチン（登録商標）を所望の量の水で再構成することによって行なった。
【０２２３】
６．１．１  試料の調製
得られた製剤を、もとの液体製剤の組成物（トレハロース７９．４５ｇ／ｌ、ヒスチジン緩衝液３．１３ｇ／ｌ（２０ｍＭ）、メチオニン１．４９ｇ／ｌ、ポリソーベート２０  ０．４ｇ／ｌ、ｐＨ５．５）に対して、および段落６．１によるアミノ酸に基づく組成物に対して、２〜８℃で透析した。続いて得られたＩｇＧ製剤を濃縮して、もとの製剤中で抗体１３５ｍｇ／ｍｌ、組成物３の中で抗体１４５ｍｇ／ｍｌ、組成物４＿１の中で抗体１５０ｍｇ／ｍｌ、組成物４＿２の中で抗体１５１ｍｇ／ｍｌを得た。続いて製剤を無菌濾過し、無菌のＨＰＬＣバイアルに分注し、５℃、２５℃、３０℃および４０℃に保存した。保存前、試料調製直後、および保存中の指示された時点で、ＳＥＣによって凝集および断片化を解析した。
【０２２４】
６．１．２  サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＥＣは段落３．１．２に従って行なった。
【０２２５】
６．２  結果
液体保存
もとの製剤中の４０℃、８日の初期保存期間の後で既に、凝集物および断片の形成は顕著に増大していた（液体保存の前の凝集物０．３５％および断片なしに対し、それぞれ凝集物０．７７％、断片０．７５％）。対照的に、試験した全てのアミノ酸に基づく製剤中、４０℃、８日の保存で凝集および断片化は明らかに制限された。組成物３では凝集は０．３９％、断片化は０．５１％であった。組成物４＿１では凝集は０．３８％で、興味あることに断片化は０．３１％にさらに低減した。組成物４＿２では、図２１Ａに示すように、凝集および断片化のさらなる僅かな低減が検出された（凝集物０．３６％、断片０．２８％）。
【０２２６】
このデータによって、組成物４（この実施例６における組成物４＿１）の液体保存中の特に断片の形成をさらに低減する効果に関する前の実験の結果が確認された。
【０２２７】
３０℃、１か月の保存後に同様の結果が見出された。もとの製剤中の保存により、０．５３％の凝集物および０．５０％の断片が生じた。組成物３についての対応するＳＥＣ分析では、０．４％の凝集物および０．５１％の断片が生じた。組成物４＿１の中の３０℃、１か月の液体保存では、凝集形成（０．３５％）および断片形成（０．３０％）の顕著な低減が生じた。組成物４＿２ででは凝集形成０．３２％および断片形成０．３１％の同様の結果が示された（図２１Ｂ）。
【０２２８】
２５℃、６か月の液体保存の後、もとの製剤中の抗体の凝集は０．９８％に増大し、断片化は１．００％に達した。組成物３では、凝集において０．７１％、断片化において０．９％への小さな増加が示された。両方の組成物、４＿１および４＿２で、もとの製剤と比較してわずか半分程度の凝集および断片化が見出された。組成物４＿１では凝集０．５８％、断片０．５３％、組成物４＿２では凝集０．５８％、断片０．５６％（図２２Ａ）。
【０２２９】
２〜８℃、６か月の液体保存後、２５℃での保存と比較して凝集および断片化の小さな変化を伴って同様の結果が見出された（図２２Ｂ）。
【０２３０】
組成物４＿１および４＿２の中における２５℃、６か月の高濃縮抗体製剤（１５０ｍｇ／ｍｌ）の保存の全経過の定量的統計解析によって、もとの製剤と比較して２５℃、６か月の保存中に有意に低減した凝集物および断片（ｐ＜０．０１）が明らかになり、安定なモノマーピークが保持されていた（図２６Ｂ）。
【０２３１】
ＣＥＸ  ＨＰＬＣを用いてもとの製剤と比較した組成物４＿１および４＿２の中での２５℃、６か月の保存中の高濃縮抗体製剤の化学的分解プロファイルのさらなる解析は、前のＳＥＣの結果および前の実施例の結果を強調するものであった。１５０ｍｇ／ｍＬのトラスツズマブの２５℃、６か月の保存後、もとの製剤と比較して少ない量の塩基性種が、組成物４＿１および４＿２で観察された（ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１）（図２７Ｂ）。興味あることに、塩基性種の増大が限られていることに関連して、同じ製剤、組成物４＿１および４＿２でも、実施例５に示すように組成物３および４と比較して酸性種の増大が限られていた。その結果、高濃縮トラスツズマブの保存中、主ピークの相対ＡＵＣは特に組成物４＿２によって安定化された。
【０２３２】
まとめると、これらの結果により、液体保存中の抗体の凝集および断片化の防止のためにバランスを取ったアミノ酸と糖の混合物が必要であり、少なくともアミノ酸過剰、より好ましくはアミノ酸と糖との比が約１：１（ｗ／ｗ）となるアミノ酸と糖との比の調節が安定化効果のさらなる増大を生じることが確認される。
【０２３３】
実施例７
高濃縮治療用抗体製剤の処理中および液体保存中の分子の完全性および粘度の解析により、特定のアミノ酸と糖の組成物ならびにアミノ酸と糖の比（ｗ／ｗ）ならびにトリプトファンとヒスチジンの濃度および比（ｗ／ｗ）の調節によって、薬剤製品の安定性のモデルにおいて抗体が凝集および特に断片化する傾向が低減されることが示された。
７．１  材料および方法
【０２３４】
前の実施例からの組成物４＿２を濃縮することによって、組成物４＿３、４＿４および４＿５を得た。組成物４＿３は実施例６の段落６．１による組成物４＿２と同様であるが、組成物４＿３では賦形剤の合計を１３５ｇ／ｌから９０ｇ／ｌに減少させた。アミノ酸と糖の混合物との比は１：１（ｗ／ｗ）に保ち、抗体と賦形剤との比は２．２２：１（ｗ／ｗ）とした。組成物４＿４では実施例６の段落６．１の組成物４＿２およびこの実施例７の組成物４＿３と比較して同様のアミノ酸と糖混合物との混合物を用いたが、アミノ酸と糖との比を３．４：１（ｗ／ｗ）に増加し、抗体と賦形剤との比を３．３３：１（ｗ／ｗ）と増加した。組成物４＿５でも同じ賦形剤の混合物を用いたが、ヒスチジンのアミノ酸濃度を増加し、トリプトファンの濃度を減少させた。トレハロースとサッカロースとの比は前の実験における３：１（ｗ／ｗ）と比較して２：１（ｗ／ｗ）に低減し、アミノ酸と糖との比を１．５：１（ｗ／ｗ）に低減させた。抗体と賦形剤との比は組成物４＿３と同様に２．２２：１（ｗ／ｗ）に調節した。もとの液体の供給元の製剤の場合には抗体と賦形剤との比は２．４：１（ｗ／ｗ）であった。ｐＨ値は５．５に調節した。
【０２３５】
モデルタンパク質として、実施例５の段落５．１による市販の液体治療用高濃縮抗体ハーセプチン（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いた。
【０２３６】
７．１．１  試料調製
実施例５および６と比較してより高く濃縮されたトラスツズマブ調製物を得るために、もとの液体の供給元の製剤中の抗体を濃縮して２００ｍｇ／ｍｌとし、組成物４＿３、４＿４および４＿５の中の抗体を２〜８℃でのさらなる透析ステップの後で濃縮した。後続の保存実験のため、無菌濾過および後続の無菌ＨＰＬＣバイアルへの分注によって高濃縮製剤を調製した。高濃縮試料を５℃、２５℃、３０℃および４０℃に保存した。保存前、試料調製直後、および保存中の指示された時点で、ＳＥＣによって凝集および断片化を解析した。
【０２３７】
７．１．２  サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＥＣは段落３．１．２に従って行なった。
【０２３８】
７．１．３  高濃縮抗体製剤の粘度の測定
この実施例による高濃縮抗体製剤の粘度を、実施例５の段落５．１．３による落球式粘度計を用いて測定した。
【０２３９】
７．２  結果
試料調製
もとの容器からの未処理の液体トラスツズマブ製剤のＳＥＣプロファイルは、０．１９％の小さな凝集ピーク、９９．７７％のモノマーピークおよび０．０４％の断片のみを示した（実施例５、図１６）。対照的に、この市販の液体治療用高濃縮ハーセプチン（登録商標）の抗体濃度約２００ｍｇ／ｍｌ（０．０４ｍｇ／ｍｌのｒＨｕＰＨ２０）への濃縮の後の対応するＳＥＣプロファイルは、濃縮試料の顕著に異なったＳＥＣプロファイルを生じた。凝集物の形成は、凝集物に対応するピークの約１．９％の面積百分率に増大した。したがって対応するモノマーピークの面積百分率は９８．０７％に減少した。断片化は変化しなかった。透析によるさらなる再緩衝化ステップの後でアミノ酸に基づく安定化組成物中で製剤化した抗体の同様の濃縮により、未処理のもとの液体トラスツズマブ製剤と同様のＳＥＣプロファイルが得られ、凝集物は０．１６〜０．１９％であり、断片化には変化がなかった。モノマーピークの面積百分率は約９９．８％であった。さらに、対応するＳＥＣクロマトグラムは、抗体の凝集物（ダイマー）に対応する溶出時間１４分のピークと構造的に不変の抗体モノマーに対応する溶出時間約１６．５分の主ピークとの間に明らかなベースラインの分離を示した（図１７）。
【０２４０】
液体保存
興味あることに、種々の温度におけるこれらの特定の高濃縮製剤の液体保存の全経過の間、もとの製剤中ならびに本発明のアミノ酸に基づく組成物中で、抗体の断片化は軽微な事象に過ぎなかった。この効果は抗体と賦形剤との比を増大させた結果である可能性があり、低濃縮トラスツズマブ製剤を用いた以前の実験で既に観察されていた（実施例４、データは示していない）。
【０２４１】
４０℃、３日の液体保存は、もとの製剤中では凝集物２．１１％への凝集の増大および０．１％の断片を生じた。組成物４＿３ではこの保存期間で約０．２２％の凝集および約０．０７％の断片化を生じた。組成物４＿４での４０℃、３日の保存は、約０．２６％の凝集物の形成および約０．０６％の断片の形成を生じた。組成物４＿５では、凝集物含量は僅か０．１８％、断片化は約０．０８％と分析された（図２３Ａ）。
【０２４２】
４０℃、１４日のさらなる液体保存では、もとの製剤中で約２．２８％の凝集物含量および０．３３％の断片化が生じた。組成物４＿３では凝集は僅か０．４３％で、断片化は０．３３％と同様であった。組成物４＿４でも同様の結果が得られ、凝集は約０．４０％、断片化は約０．３３％であった。組成物４＿５でも凝集形成（０．２７％）および断片形成０．３４％と同様の結果が見られた（図２３Ｂ）。
【０２４３】
もとの製剤中の３０℃、１か月半の長期液体保存の後、凝集形成は１．８４％、断片形成は０．２５％であった。組成物４＿３では凝集は僅か０．２８％、断片化はもとの製剤と同じく０．２３％であった。組成物４＿４では、凝集形成は０．３８％に僅かに増加し、断片形成は約０．２２％であった。組成物４＿５では、３０℃、１か月半の保存後の凝集は僅か０．２２％で、断片化は０．２５％に達した（図２４Ａ）。
【０２４４】
２５℃、３か月の実時間液体保存は、もとの製剤中で約１．８９％の凝集形成および０．２５％の断片化を生じた。組成物４＿３では、２５℃での長期保存により０．３５％の凝集物と０．２２％の断片が生じた。２５℃、３か月の保存後、組成物４＿４では凝集が０．４０％に僅かに増加し、断片形成は０．２２％を保っていた。組成物４＿５では０．２７％と最小の凝集が見られ、０．２５％と同様の断片化が達成された（図２４Ｂ）。
【０２４５】
種々の温度における抗体の液体保存の間の全ての分析時点で、組成物４＿５は凝集に対して最良の安定化効果を示した。組成物４＿３および組成物４＿４では、種々の温度における液体保存中の抗体の凝集傾向はおおよそ同様であったが、組成物４＿５では指示された分析時点で抗体は最小の凝集形成を示した。組成物４＿３と組成物４＿４の間では、前者の方が僅かに優れた安定化効果を示した。
【０２４６】
２５℃、３か月でのもとの製剤と比較した組成物４＿３、４＿４および４＿５の中における高濃縮抗体製剤（２００ｍｇ／ｍｌ）の液体保存中の抗体の凝集および断片化の傾向ならびにこれに伴うモノマーピークの喪失の評価により、上記の詳細な結果がさらに確認された。
【０２４７】
抗体ダイマーに対応する凝集ピーク（溶出時間約１４分）は、もとの製剤と比較して組成物４＿５で有意に（ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０００１）、また組成物４＿３および組成物４＿４ではそれほどではないが（ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１）低減した（図２６Ｃ）。組成物４＿４（最大の抗体：賦形剤比３．３３：１）では、組成物４＿３および特に組成物４＿５と比較して、製剤粘度の増大を伴う僅かに強い凝集が見られた（図２６Ｃ、図４）。２００ｍｇ／ｍＬでは関連する断片化は観察されず（図２６Ｃ）、これは低濃縮製剤で既に観察された抗体と賦形剤との比の増大によるものであろう（以下および図２５を参照）。アミノ酸に基づく製剤中のモノマーピークは２５℃の液体保存中にほぼ完全に保持されていた。組成物４＿３および４＿４は、もとの製剤および組成物４＿５と比較して断片化の増大が最小であることが示された（ｐ＞０．０５、図２６Ｃ）。
【０２４８】
これらの結果は、組成における両方の変化、すなわちヒスチジンとトリプトファンの濃度の変化およびトレハロースとサッカロースとの比の変化が、特に凝集に対する安定化効果に好ましい影響を有していることを示唆している。緩衝液濃度中に高濃度のトリプトファンおよびヒスチジンを含むアミノ酸に基づく組成物中で断片化は僅かに多く低減される（前の実施例ならびに組成物４＿５と比較した組成物４＿３および４＿４を参照）。アミノ酸とトレハロース／サッカロース混合物との比は、前の実験の組成物４＿２から誘導された組成物４＿３における１：１（ｗ／ｗ）と比較して組成物４＿４では僅かに増加していた（１．５：１（ｗ／ｗ））。
【０２４９】
したがって、アミノ酸と糖との比の調節と一致したトリプトファンおよびヒスチジンの濃度の調節は、抗体の液体保存中の凝集と断片化を併せて防止するために重要である。さらに、組成物４＿４中の抗体と賦形剤との比の３．３：１（ｗ／ｗ）への大きな増大により、液体保存中の抗体の凝集傾向の僅かな増大が生じた。抗体と賦形剤との比を並行して調節することが、本発明によるアミノ酸に基づく組成物の安定化効果に影響することが示された。
【０２５０】
高温での液体保存中の抗体の化学的分解を解析することによって、同様の観察を行なった。この目的のため、試料を２５℃で３か月保存し、ＣＥＸで分析した。組成物４＿４および４＿５は酸性荷電バリアントの形成の有意でない増大（組成物４＿５で最小の程度）を生じたが、もとの製剤と比較して特に組成物４＿３および４＿４の場合に塩基性荷電バリアントの形成の低減を生じた（ｐ＜０．０５）。主ピーク面積の喪失は組成物４＿３および４＿４によって部分的に防止され（ｐ＞０．０５）、組成物４＿５ではもとの製剤と同程度であった（図２７Ｃ）。選択した２つのアミノ酸、ヒスチジンとトリプトファンのｗ／ｗ比を繰り返して変化させ、酸性および塩基性荷電バリアントの形成の改変を得た（図２７Ｃ）。
【０２５１】
粘度測定
実施例５と比較した高濃縮抗体製剤の動粘度の解析のため、この実施例の段落７．１．１の試料調製法に従って製剤の濃度を２００ｍｇ／ｍｌと２２０ｍｇ／ｍｌに調節した（図２５）。もとの液体の供給元の製剤中の高濃縮抗体製剤（２２０ｍｇ／ｍｌ）の動粘度を２０．５３ｍＰａ・秒と評価した。２２０ｍｇ／ｍｌの抗体濃度を含む本発明の組成物４＿３および４＿５において、測定した動粘度は組成物４＿３で１５．２ｍＰａ・秒、組成物４＿５で１７．６ｍＰａ・秒と顕著に低減した。組成物４＿４の場合には２２．４ｍＰａ・秒と僅かな粘度の増大を評価した。これは、組成物４＿３および４＿５と比較したこの組成物中の抗体と賦形剤との３．７：１と高い比の結果であろう。抗体濃度２００ｍｇ／ｍｌの対応する製剤の粘度測定も、組成物４＿３で１１．２ｍＰａ・秒、組成物４＿４で１５．４ｍＰａ・秒、組成物４＿５で１１．６ｍＰａ・秒と明らかに低減した粘度を生じた。抗体濃度２００ｍｇ／ｍｌの場合には、組成物４＿４も他の製剤と比較して僅かに増大した粘度を示し、抗体濃度２２０ｍｇ／ｍｌの組成物４＿４で評価した同じ傾向を示唆していた。高濃縮抗体（２００ｍｇ／ｍｌ）の液体保存中の組成物４＿４の僅かに低減した安定化効果と併せて、これらのデータは、アミノ酸と糖との比のバランスを取った調節の他に抗体と賦形剤との比のバランスを取った調節も安定化効果と製剤粘度の両方に対して顕著な効果を有しているという知見をさらに実証するものである。
【０２５２】
実施例８
高濃縮抗体製剤の処理中および後続の液体保存中の分子の完全性ならびに化学的安定性の解析により、プロリンを含まない特定のアミノ酸と糖の組成物によって、処理中ならびに後続の液体保存中の凝集傾向を低減できることが示された。特に、グリシンおよびプロリンを含むフリーズドライ製品のもとのトラスツズマブ製剤と比較して、化学的変化は顕著に低減した。
【０２５３】
８．１  材料および方法
組成物４＿１は実施例６で適用した製剤に対応し、組成物４＿３および４＿５は実施例７で適用した製剤に対応する。これらの製剤の安定化効果を、もとの液体の供給元の製剤（トレハロース７９．４５ｇ／ｌ、ヒスチジン緩衝液３．１３ｇ／ｌ、２０ｍＭ、メチオニン１．４９ｇ／ｌ、ポリソーベート２０  ０．４ｇ／ｌ、ｐＨ５．５）と比較した。これらの製剤中ではｐＨを５．５に調節した。さらに、本発明の組成物の安定化効果を、米国特許第９３６４５４２号Ｂ２（実施例１６、図２９および図３０）の教示に従ってアミノ酸グリシンおよびプロリンを添加したフリーズドライ製品のもとの供給元の製剤（トレハロース２０ｇ／ｌ、ヒスチジン緩衝液０．９ｍｇ／ｍｌ、約５ｍＭ、ポリソーベート２０  ０．１ｇ／ｌ、ｐＨ６）と比較した。
【０２５４】
モデル薬剤として、市販のフリーズドライハーセプチン（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、すなわち治療用ヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体（トラスツズマブ）を用いた。所望の量の水によるフリーズドライ薬剤の再構成により、もとの供給元の製剤（トレハロース２０ｇ／ｌ、ヒスチジン緩衝液０．９ｍｇ／ｍｌ、約５ｍＭ、ポリソーベート２０  ０．１ｇ／ｌ、ｐＨ６）中の抗体濃度２１ｍｇ／ｍＬとなった。
【０２５５】
８．１．１  試料調製
得られた製剤を、もとの液体製剤の組成物（トレハロース７９．４５ｇ／ｌ、ヒスチジン緩衝液３．１３ｇ／ｌ、約２０ｍＭ、メチオニン１．４９ｇ／ｌ、ポリソーベート２０  ０．４ｇ／ｌ、ｐＨ５．５）およびフリーズドライ製品のもとの供給元の製剤（トレハロース２０ｇ／ｌ、ヒスチジン緩衝液０．９ｍｇ／ｍｌ、約５ｍＭ、ポリソーベート２０  ０．１ｇ／ｌ、ｐＨ６）に対して２〜８℃で透析した。ここでこの組成物は米国特許第９３６４５４２号Ｂ２（実施例１６）に記載された濃度でアミノ酸、グリシンおよびプロリンをさらに含んでいた。
【０２５６】
並行して、段落８．１に詳細を記載したように本発明のアミノ酸に基づく組成物に対して透析を行なった。得られたＩｇＧ製剤を続いて濃縮して２００ｍｇ／ｍｌの抗体を得た。続いて製剤を無菌濾過し、無菌のＨＰＬＣバイアルに分注し、米国特許第９３６４５４２号Ｂ２（実施例１６、図２９および図３０）に記載されているように２５℃もしくは４０℃、または短期の保存のために５５℃に保存した。保存前、試料調製直後、および保存中の指示された時点で、ＳＥ−ＨＰＬＣによって凝集および断片化を解析した。液体保存に際してのタンパク質分子の化学的変化を、ＣＥＸ−ＨＰＬＣで解析した。
【０２５７】
８．１．２  サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＥＣは上記の３．１．２節に記載したように行なった。
【０２５８】
８．１．３  カチオン交換クロマトグラフィー
ＣＥＸ−ＨＰＬＣ（ＵＶ−２８０ｎｍ検出器、ＵＨＰＬＣ  ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびカチオン交換カラムＴＳＫ−ｇｅｌ  ＣＭ−ＳＴＡＴ  ４．５×１００ｎｍ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を、４５℃、流量０．８ｍｌ／分（注入量２５μｌ）で用いた。ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析に先立って、試料を運転緩衝液Ａ（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）で２．５ｍｇ／ｍＬのＩｇＧに希釈した。固定化されたトラスツズマブ分子を、０％〜３０％の緩衝液Ｂ（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５、１００ｍＭ塩化ナトリウム）を用いた塩化ナトリウム勾配で溶出させた。相対曲線下面積（％ＡＵＣ）をＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎ  ７クロマトグラフィーデータソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で決定した。
【０２５９】
８．２  結果
試料調製
抗体濃度２００ｍｇ／ｍＬを得るための透析および後続の濃縮による試料調製の経過の間に、実施例３、５および７の既に得られた結果が確認された。具体的には、本発明の組成物（組成物＿４＿１、組成物＿４＿３または組成物＿４＿５）の１つの中で調製プロセスを行なった場合、トラスツズマブ標準品と同程度の凝集物およびモノマーの量の保持が得られた（凝集物０．６５〜０．７０％、モノマー９９．３０〜９９．３５％）。これらの結果は、本発明の組成物中で調製した抗体の構造的完全性の保持が調製前の構造的に不変の抗体のレベルと同程度であることを示唆している（図２８）。
【０２６０】
一方、もとの液体の供給元の製剤中で高濃縮抗体を調製するプロセスにより、抗体ダイマーに対応するピーク（保持時間１４分）の面積百分率の約０．８４％への増大および対応するモノマーピークの約９９．１６％への低減が生じた。さらに、追加のアミノ酸グリシンおよびプロリンと組み合わせたフリーズドライ製品のもとの供給元の製剤中における高濃縮トラスツズマブの対応する調製プロセスによっても、凝集物の形成の約０．７９％への大きな増大およびその結果としてモノマーピークの９９．２１％への低減が生じた。
【０２６１】
液体保存−ＳＥ−ＨＰＬＣ
米国特許第９３６４５４２号Ｂ２で行なわれたような厳しい（すなわち生理学的および薬学的に不適切な高い）温度条件（５５℃、２４時間）下での抗体の短期液体保存により、もとの液体の供給元の製剤ならびに添加物としてグリシンおよびプロリンを加えたフリーズドライ製品のもとの供給元の製剤と比較して、凝集および断片化に対する本発明の組成物の効率的な安定化効果が明らかになった。凝集物の形成に対応するピークの面積百分率は、本発明の組成物、特に組成物＿４＿３および組成物＿４＿５でほぼ完全に保持され、−８０℃で保存したトラスツズマブ標準品と同程度であった（凝集物０．６５〜０．７０％、モノマー９９．３０〜９９．３５％）。
【０２６２】
対照的に、添加物グリシンおよびプロリンを加えたもとの供給元の製剤中、およびより顕著にもとの液体の供給元の製剤中における５５℃、２４時間の短期保存で、凝集の顕著な増大およびモノマーピークの面積百分率のより顕著な低減が生じた（図２９、表１、表２、ｔ＝０）。５５℃、２４時間の短期保存の結果として、もとの液体の供給元の製剤中ならびに添加物としてグリシンおよびプロリンを加えたフリーズドライ製品のもとの供給元の製剤中における断片化も、本発明の組成物中で製剤化した抗体と比較して、僅かに増大した（表１）。
【０２６３】
４０℃／７５％ＲＨでのそれぞれ７日、１４日、２８日および４２日の液体保存によって、全ての製剤で抗体の凝集ならびに断片化の傾向が増大していることが明らかになったが、その程度は異なっていた。最も特筆すべきことに、本発明の組成物（組成物＿４＿１、組成物＿４＿３および組成物＿４＿５）の中での抗体の製剤化によって、もとの液体の供給元の製剤ならびにアミノ酸グリシンおよびプロリンと組み合わせたもとの供給元の製剤と比較して、凝集および断片化の顕著な低減が生じた（図２９Ｃおよび図２９Ｄ、表１および表２）。
【０２６４】
さらに、２５℃における１４日および２８日の液体保存によって、本発明の溶液が周囲温度および高温ならびに５５℃のような極端な温度条件における保存の経過においても凝集および断片化を防止することができるという見解がさらに実証された（表３、表４）。
【０２６５】
液体保存−ＣＥＸ−ＨＰＬＣ
米国特許第９３６４５４２号Ｂ２では、５５℃のような生理学的および薬学的に不適切な高い温度条件下での短期保存の間の、濁度測定による抗体の巨視的な不溶性凝集物の形成およびある例ではＳＥ−ＨＰＬＣによる可溶性凝集物の形成の分析のみが解析されていた。ここでは、５５℃における短期保存の間ならびに４０℃および２５℃における長期保存の間の、抗体分子における化学変化の程度をさらに解析した。５５℃、２４時間のトラスツズマブの短期保存で既に、全ての製剤において種々の程度の化学変化が誘発されていた。
【０２６６】
アミノ酸グリシンおよびプロリンを加えたフリーズドライ製品のもとの供給元の製剤（オリジナル＋Ｇ／Ｐ）において、５５℃での短期保存の間に、抗体の酸性荷電バリアントの百分率の顕著な増大（＞３０％）が観察された。表５に示すように、この観察は結果として主ピークの面積百分率の顕著な減少（５３．２３％）を伴っていた。
【０２６７】
対照的に、本発明の組成物中での抗体の短期保存では、酸性荷電バリアントの形成が顕著に低減した（たとえば組成物＿４＿５で＜２３％）。酸性荷電バリアントの増加はタンパク質の脱アミド化または糖化の証拠を提供するものであり、工業的製造標準における試験製剤のネガティブ選択の重要な基準である。したがって、本発明による種々の組成物をオリジナル＋Ｇ／Ｐと比較して試験し、５５℃での３日、４０℃で２１日まで、および２５℃で２か月までの保存中の酸性荷電バリアントの改質を検討した（図３０）。試験した全ての本発明の組成物は一般に、全ての分析時点および全ての保存温度で、オリジナル＋Ｇ／Ｐよりも有意に低い酸性荷電バリアントを生じた。結果として、それゆえ全ての分析時点および温度で、全ての本発明の製剤中で主ピークが大きかった（表５）。
【０２６８】
実施例９
高濃縮抗体製剤（２００ｍｇ／ｍＬ）の透析、濃縮、および後続の保存の後の分子の完全性のＳＥ−ＨＰＬＣによる解析は、製造に関連する処理ステップおよび後続の保存における凝集物の増大を制限するための少なくとも３つのアミノ酸の単独の組合せまたはトレハロースとの組合せの妥当性を示している。
【０２６９】
９．１  材料および方法
組成物５は２つの塩基性アミノ酸、ヒスチジンおよびメチオニンを含み、これは糖を全く含まないことを除いて、もとの供給元の製剤（ヒスチジン、メチオニン、トレハロース）に対応する組成物８と同様である。組成物６は糖を含まず、３つのアミノ酸、ヒスチジン、メチオニンおよびグリシンを含む。組成物９は同様であるがトレハロースを含む。組成物７は５つのアミノ酸、ヒスチジン、メチオニン、アラニン、アルギニンおよびトリプトファンを含み、組成物１０は同様であるがトレハロースを含む。
【０２７０】
モデルタンパク質として、もとの供給元の製剤中に濃度１２０ｍｇ／ｍｌでトラスツズマブを含む市販の液体治療用高濃縮抗体ハーセプチン（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（トレハロース７９．４５ｇ／ｌ、ヒスチジン緩衝液３．１３ｇ／ｌ、２０ｍＭ、メチオニン１．４９ｇ／ｌ、ポリソーベート２０  ０．４ｇ／ｌ、ｒＨｕＰｈ２０（組み換えヒトヒアルロニダーゼ）０．０２４ｇ／ｌ、ｐＨ５．５）を用いた。
【０２７１】
９．１．１  試料調製
液体治療用高濃縮抗体ハーセプチン（登録商標）を５ｍＭのヒスチジン緩衝液ｐＨ５．５に対して２〜８℃で透析した。タンパク質濃度の測定および後続の１００ｍｇ／ｍｌへのタンパク質濃度の調節の後、１．２５倍濃縮製剤を用いて、透析された高濃縮抗体の１／５希釈により、抗体を段落９．１の組成物ならびにもとの液体の供給元の製剤中に製剤化して抗体濃度２０ｍｇ／ｍｌとした。高濃縮抗体製剤を用いた実験のため、選択された組成物およびもとの液体の供給元の製剤中で製剤化した抗体を２００ｍｇ／ｍｌまでに濃縮した。続いて製剤を無菌濾過し、無菌のＨＰＬＣバイアル中に分注して、４５℃で１４日まで保存した。保存前、透析直後、濃縮ステップの直後、および液体保存中の７日および１４日の保存後の凝集および断片化をＳＥ−ＨＰＬＣで解析した。
【０２７２】
９．１．２  サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＥＣは段落３．１．２に従って行なった。
【０２７３】
９．２  結果
液体保存−ＳＥ−ＨＰＬＣ
表６に示すように、前の透析および濃縮ステップに続く４５℃、７日の保存の後、凝集の増大が観察された。驚くべきことに、２つのアミノ酸を含み糖を含まない製剤が一般に、３つのアミノ酸を含む組成物（７日後０．５３％、１４日後１．１１）と比較して、また５つのアミノ酸を含む組成物（７日後０．４％、１４日後０．８８％）と比較して、最も高い値（たとえば７日後０．６５％、１４日後１．２９％）を示すことが見出された。したがって主ピークは安定化されていた（表６）。同じアミノ酸の組合せにトレハロースを添加した場合に、この観察が確認された。具体的には、（もとの製剤に対応する）２つのアミノ酸とトレハロースを含む製剤は一般に、３つのアミノ酸を含む組成物（７日後０．４３％、１４日後０．９３）と比較して、また５つのアミノ酸を含む組成物（７日後０．３４％、１４日後０．８％）と比較して、最も高い値（たとえば７日後０．５７％、１４日後１．０７％）を示した。したがって主ピークは安定化されていた（表６）。
【０２７４】
実施例１０
１４日までの定常撹拌のモデルにおける機械的ストレスの後のトラスツズマブ（２０ｍｇ／ｍｌ）の分子の完全性のＳＥ−ＨＰＬＣによる解析は、製造に関連する処理ステップにおける凝集物の増大を制限するための少なくとも３つの調整されたアミノ酸の組合せの妥当性を示しており、もとの供給元の製剤よりも優れていた。
【０２７５】
１０．１  材料および方法
もとの供給元の製剤はヒスチジン、メチオニン、およびトレハロースを含んでいた。組成物１１はトレハロースを含まず、２つの塩基性アミノ酸、ヒスチジンおよびメチオニンを含んでいた。組成物１２は３つのアミノ酸、ヒスチジン、メチオニンおよびアラニンを含んでいた。組成物１３は５つのアミノ酸、ヒスチジン、メチオニン、アラニン、アルギニンおよびトリプトファンを含んでいた。
【０２７６】
抗体製剤に定義された撹拌モデルで機械的ストレスを加えた。このモデルでは試料を無菌ＰＣＲバイアルに移し、暗所で、７５０回転／分で１４日まで撹拌した。
【０２７７】
モデルタンパク質として、もとの供給元の製剤中に濃度１２０ｍｇ／ｍｌでトラスツズマブを含む市販の液体治療用高濃縮抗体ハーセプチン（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（トレハロース７９．４５ｇ／ｌ、ヒスチジン緩衝液３．１３ｇ／ｌ、２０ｍＭ、メチオニン１．４９ｇ／ｌ、ポリソーベート２０  ０．４ｇ／ｌ、ｒＨｕＰｈ２０（組み換えヒトヒアルロニダーゼ）０．０２４ｇ／ｌ、ｐＨ５．５）を用いた。
【０２７８】
１０．１．１  試料調製
液体治療用高濃縮抗体ハーセプチン（登録商標）をもとの液体製剤の組成物（トレハロース７９．４５ｇ／ｌ、ヒスチジン緩衝液３．１３ｇ／ｌ（２０ｍＭ）、メチオニン１．４９ｇ／ｌ、ポリソーベート２０  ０．４ｇ／ｌ、ｐＨ５．５）に対して、また５ｍＭのヒスチジン緩衝液ｐＨ５．５に対して２〜８℃で透析した。タンパク質濃度の測定および後続の２０ｍｇ／ｍｌへのタンパク質濃度の調節の後、段落１０．１に従って抗体を組成物中に製剤化した。続いて製剤をＰＣＲバイアルに移し、１０．１に概要を記載した方法で撹拌した。撹拌前および１４日撹拌した後のＳＥ−ＨＰＬＣで解析した凝集および断片化の値を表７に示す。
【０２７９】
１０．１．２  サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＥ−ＨＰＬＣＣは段落３．１．２に従って行なった。
【０２８０】
１０．２  結果
液体保存−ＳＥ−ＨＰＬＣ
表７に示すように、１４日の撹拌の後、凝集の増大が観察された。驚くべきことに、１つまたは２つのアミノ酸を含み糖を含まない製剤が一般に、最も高い値を示すことが見出された（たとえばヒスチジン、メチオニンおよびトレハロースを含むもとの製剤で０．３２％、トレハロースを含まずヒスチジンおよびメチオニンを含む組成物ｘで０．３６％）。
【０２８１】
３つのアミノ酸を含む組成物は２つのアミノ酸を含む組成物よりも低い凝集値を示した。表７に代表的に示すように、ヒスチジン、メチオニンおよびアラニンを含む組成物＃ｘは０．６２％の凝集値を生じた。５つのアミノ酸を含む組成物は０．２４％の凝集値を生じた。したがって主ピークは安定化されていた（表７）。
【０２８２】
【表２】
2019537552.tif 000003
【０２８３】
【表３】
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【０２８４】
【表４】
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【０２８５】
【表５】
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【０２８６】
【表６】
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【０２８７】
【表７】
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【０２８８】
【表８】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図２９−３】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【国際調査報告】
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