(57)【要約】本明細書に記載されているのは、炎症状態を有する対象への有効量の絹由来タンパク質（ＳＤＰ）又はその画分の投与によって炎症を軽減するための方法である。本方法は、本明細書に記載の有効量のＳＤＰ材料の局所投与を含む、炎症状態及び角膜創傷を含む創傷の治療を含む。
2019531334.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液中で増強された安定性を有するフィブロイン由来タンパク質組成物であって、
フィブロイン由来タンパク質組成物の一次アミノ酸配列は、セリン、グリシン、及びアラニンのアミノ酸含有量の合計差の絶対値に関して、天然のフィブロインと少なくとも４％異なり、
フィブロインのフィブロイン重鎖タンパク質鎖とフィブロイン軽鎖タンパク質鎖との間のシステインジスルフィド結合は、減少又は除去されており、
タンパク質組成物中の複数のペプチド鎖は、アミド（‐Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２）基で終わり、
該組成物は、天然フィブロインタンパク質と比較して２５％超減少したセリン含有量を有し、ここでセリン含有量は少なくとも約５％であり、
ここで、フィブロイン由来タンパク質組成物の平均分子量は、４０ｋＤａ未満かつ２ｋＤａより大きい、上記タンパク質組成物。
【請求項２】
タンパク質組成物のタンパク質鎖の５０％超が１０ｋＤａ〜６０ｋＤａの範囲内の分子量を有する、請求項１に記載のタンパク質組成物。
【請求項３】
タンパク質組成物が１０％ｗ／ｗまでの濃度のタンパク質組成物の水溶液の超音波処理でゲル化しない、請求項１に記載のタンパク質組成物。
【請求項４】
前記タンパク質組成物が８％未満のセリンアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のタンパク質組成物。
【請求項５】
前記タンパク質組成物が４６．５％を超えるグリシンアミノ酸を含む、請求項１に記載のタンパク質組成物。
【請求項６】
前記タンパク質組成物が３０．５％を超えるアラニンアミノ酸を含む、請求項１に記載のタンパク質組成物。
【請求項７】
前記タンパク質組成物が、乾燥して薄膜になった後に完全に水に再溶解する、請求項１に記載のタンパク質組成物。
【請求項８】
前記タンパク質組成物が水溶液中でβシートタンパク質構造を欠く、請求項１に記載のタンパク質組成物。
【請求項９】
前記タンパク質組成物が、少なくとも５秒間の超音波処理の後、５５０ｎｍで０．２５未満の水溶液中の吸光度を維持する、請求項１に記載のタンパク質組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質組成物及び水、ならびに必要に応じて１つ又は複数の緩衝媒体、塩、安定剤、保存剤、及び潤滑剤を含む眼科用製剤。
【請求項１１】
炎症組織にフィブロイン由来タンパク質組成物を投与することを含む炎症を軽減するための方法であって、
フィブロイン由来タンパク質組成物の一次アミノ酸配列は、セリン、グリシン、及びアラニンのアミノ酸含有量の合計差の絶対値に関して、天然フィブロインと少なくとも４％異なり、
フィブロインのフィブロイン重鎖タンパク質鎖とフィブロイン軽鎖タンパク質鎖との間のシステインジスルフィド結合は、減少又は除去されており、
タンパク質組成物中の複数のペプチド鎖は、アミド（‐Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２）基で終わり、
該組成物は、天然フィブロインタンパク質と比較して２５％超減少したセリン含有量を有し、ここでセリン含有量は少なくとも約５％であり、
フィブロイン由来タンパク質組成物の平均分子量は、６０ｋＤａ未満かつ１０ｋＤａ超であり、
それによって組織の細胞核内の転写因子シグナル伝達を減少させ、それによって炎症を減少させる、上記方法。
【請求項１２】
炎症組織への投与が、炎症性遺伝子ＴＮＦ‐α、ＭＭＰ‐９、ＩＬ‐１β、及びＩＬ‐６のうちの１つ以上の転写を減少させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
投与が角膜に対するものであり、投与が角膜におけるＭＭＰ‐９の存在を減少させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
投与が眼への投与であり、投与が眼表面の炎症を軽減する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
炎症の減少が、炎症の点で細胞移動速度の増加を伴う、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質組成物が４０ｋＤａ未満の平均分子量を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
タンパク質組成物が３５ｋＤａ未満の平均分子量を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記フィブロイン由来タンパク質組成物が、緩衝媒体、塩、安定剤、保存剤、及び潤滑剤のうちの１つ又は複数を含む眼科用製剤に溶解される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
炎症が眼の状態により引き起こされ、眼の状態が、ドライアイ症候群、角膜潰瘍、角膜糜爛、角膜剥離、角膜変性、角膜穿孔、角膜瘢痕化、上皮欠損、角結膜炎、特発性ぶどう膜炎、角膜移植、加齢黄斑変性症、糖尿病眼症、眼瞼炎、緑内障、高眼圧症、術後の眼の痛み及び炎症、後区血管新生、増殖性硝子体網膜症、サイトメガロウイルス網膜炎、眼内炎、脈絡膜血管新生膜、血管閉塞性疾患、アレルギー性眼疾患、腫瘍、網膜色素変性症、眼の感染症、強膜炎、眼瞼下垂、縮瞳、眼の痛み、散瞳、神経痛、瘢痕化眼球表面疾患、眼の感染症、炎症性眼疾患、眼の表面疾患、角膜の疾患、網膜疾患、全身性疾患の眼症状、遺伝性眼症状、眼球腫瘍、眼内圧上昇、ヘルペス性感染症、翼状片又は強膜腫瘍、眼表面に持続する創傷、光屈折角膜切開術後の眼の痛み及び炎症、角膜への熱的又は化学的熱傷、強膜創傷、又は円錐角膜及び結膜創傷である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
炎症がドライアイ症候群によって引き起こされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
炎症を治療するためのフィブロイン由来タンパク質組成物の使用であって、フィブロイン由来タンパク質組成物の一次アミノ酸配列が、天然フィブロインと、セリン、グリシン、及びアラニンのアミノ酸含有量の合計差の絶対値に関して少なくとも４％異なり、フィブロインのフィブロイン重鎖タンパク質鎖とフィブロイン軽鎖タンパク質鎖との間のシステインジスルフィド結合は、減少又は除去されており、タンパク質組成物中の複数のペプチド鎖は、アミド（‐Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２）基で終わり、該組成物は、天然フィブロインタンパク質と比較して２５％超減少したセリン含有量を有し、ここでセリン含有量は少なくとも約５％であり、フィブロイン由来タンパク質組成物の平均分子量は、６０ｋＤａ未満かつ１０ｋＤａ超である、上記使用。
【請求項２２】
タンパク質組成物が３５ｋＤａ未満の平均分子量を有する、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記組成物がドライアイ症候群の治療のための組成物である、請求項２２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は米国特許法§１１９（ｅ）に基づいて２０１６年８月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／３７４，５３２号、２０１６年１０月１３日に出願された６２／４０７，８６３号、及び２０１７年３月６日に出願された６２／４６７，６９７号への優先権を主張し、これらの出願は参照することにより本明細書中に取り込まれている。
【０００２】
政府サポート
本発明は、国立科学財団により授与された助成金番号１１５２５６１及び米国陸軍により授与された助成金番号Ａ１５１−０６１−０１０７の下での政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
炎症は、恒常性を回復させるための、有害な刺激（例えば、感染）又は局所的な組織損傷に対する罹患細胞の協調的応答を表す。これらの異常な状態への常在細胞の曝露は、炎症性メディエータの産生及び分泌をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードを開始させる。これらの炎症性実体の局在的沈着は、間質及び血管系から損傷又は傷害の部位まで免疫細胞（例えば、好中球）を動員するのに役立つ。刺激の除去に成功した後に、新しい免疫細胞型（例えば、マクロファージ）及びシグナル伝達中間体を導入し、急性炎症反応を終結させる組織修復が続く（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ、Ｎａｔｕｒｅ、２００８．４５４（７２０３）：４２８−４３５）。しかしながら、組織恒常性がこの期間内に達成されない場合、慢性炎症反応が起こり、それによってそれを封じ込もうとして追加の免疫細胞が損傷部位に導入される。それにもかかわらず、慢性的な炎症は健康な組織の状態を永久に損なう可能性がある。慢性炎症から生じる調節不全シグナル伝達経路は、ドライアイ、自己免疫疾患、心血管疾患、及び癌を含む多数の疾患に関係しているとされてきた。
【０００４】
免疫応答の刺激的な原因は宿主にとって外来性であり得るが、異常な細胞シグナル伝達による局部的組織恒常性の破壊はまた、免疫細胞の動員及び応答を駆動するシグナル伝達分子の濃度勾配を生じ得る。例えば、眼の頂端面における涙液膜組成の乱れは、急性及び慢性の両方で免疫カスケードを刺激する炎症誘発性サイトカインの産生の増加をもたらす（Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｙｅ＆Ｃｏｎｔａｃｔ  Ｌｅｎｓ、２００５．３１（５）：１８６−１９３）。乾性角結膜炎又はドライアイ症候群（ＤＥＳ）として知られるこの状態は、（細胞収縮を介した）細胞の機械的ストレスの変化及び遺伝子発現につながる恒常的な炎症刺激のために持続する（Ｂｒｏｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ、２０１２．３（４）：３４５〜３６４）。これはさらに、局所的微小環境に作用し、急性炎症反応のメディエータ細胞型を動員するサイトカインの産生に役立つ。次に、遊走性好中球は、眼の周辺部血管透過性を変化させ、それによって刺激された眼表面への活性化Ｔ細胞の流入を可能にするさらなる炎症誘発性モルフォゲンを分泌し、慢性炎症状態に移行する（Ｂａｕｄｏｕｉｎ、Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、２００１．４５（２））。：Ｓ２１１‐２２０）。
【０００５】
そのような刺激の１つの特定の例は、涙液層液の高浸透圧で起こり、これは涙液蒸発の促進又は涙腺低分泌によって引き起こされる。高浸透圧性刺激が免疫細胞メディエーターの作用によって対処されない場合、恒常性は達成されず、そして眼表面及び涙腺の破壊は、眼表面の異常調節された組織再構築機構を介して経時的に進展する。このカスケードは、組織再構築の暴走フィードフォワード機構において眼球表面を劣化させるマトリックスメタロプロテイナーゼ９（ＭＭＰ−９）の産生増加をもたらし得る。
【０００６】
炎症反応を軽減するためのアプローチは、典型的には炎症誘発性シグナル伝達分子の産生を標的とする。これらはグルココルチコイドステロイドの使用を含み、これはレシピエント細胞内の抗炎症性タンパク質の産生を増加させると同時に炎症誘発性タンパク質の産生を減少させるように機能する（Ｒｈｅｎら、Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００５、３５３（１６）：１７１１−１７２３）。しかしながら、グルココルチコイドシグナル伝達の効果は強力であり、そして免疫細胞シグナル伝達に限定されず、代謝及び体液恒常性、ニューロン機能、ならびに胎児発達に影響を与える。したがって、グルココルチコイドシグナル伝達は厳しく規制されており、一般的に慢性的な活動亢進免疫系障害に限定されている。逆に、アスピリン、イブプロフェン、及びナプロキセンを含む非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、炎症細胞において著しく増加するプロスタグランジン産生に先行するシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）酵素活性を阻害するように機能する（Ｒｉｃｃｉｏｔｔｉら、動脈硬化症、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ、ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０１１．３１（５）：９８６‐１０００）。ＮＳＡＩＤは炎症過程の効果的な対抗剤であるが、典型的には全身的に投与され、そして胃の潰瘍形成及び腎臓の機能不全の一因となり得る体内の他の場所のＣＯＸ酵素の機能を阻害する。上記の治療戦略の標的外の副作用を考えると、抗炎症剤は理想的には損傷した又は感染した組織（例えば、皮膚又は眼の表面）に局在化されるべきである。
【０００７】
標的抗炎症療法の適用は、最小限の副作用で免疫細胞応答を減弱させるという見込みを提供する。例えば、炎症誘発性メディエータ（例えば、ケモカイン）に対するアンタゴニスト抗体の開発は、有望な有効性を有する炎症性疾患のために採用されている（Ｓｋｏｖら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２００８．１８１（１）：６６９〜６７９）。しかしながら、これらのタンパク質の生産コストはかなりのものであり、抗体生産における変動は治療効果に影響を及ぼし得る。あるいは、ケモカイン産生及び／又は分泌の上流のシグナル伝達経路の薬理学的阻害剤は、急性及び最終的な慢性炎症反応に関与する免疫細胞型の動員を排除するので、理論的に理想的であろう。これらの理論的標的の中には、核因子−カッパＢ（ＮＦ−κＢ）転写因子ファミリーがあり、これは急性炎症誘発性モルフォゲンの産生に深く関係している（Ｈａｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１１．２１（２）：２２３−２４４）。本来、ＮＦ−κＢサブユニットは細胞質内に存在し、この領域への送達を標的とするタンパク質残基のマスキングによって核内移行を妨げられている。しかしながら、刺激されると、阻害性タンパク質は急速に分解され、それによってＮＦ−κＢタンパク質の転座及びＤＮＡ結合及びそれに続く遺伝子転写を可能にする。
【０００８】
多くの天然及び合成のＮＦ−κＢの阻害剤が存在する。前者の中には、カイコ繭から単離された重及び軽タンパク質鎖（それぞれ３９０ｋＤ及び２６ｋＤ）からなる二量体である絹フィブロインがある（Ａｌｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００３  ２４（３）：４０１−４１６によって概説されている。）。これらの球状タンパク質は、軽鎖と重鎖のジスルフィド結合によって原線維構造に集合し、βシート二次構造において顕著な均一性を示す。フィブロインは、ＮＦ‐κＢタンパク質サブユニットの転写及び上流活性化（すなわち、プロテインキナーゼの阻害を介して）を阻害することが示されている（Ｃｈｏｎら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１２、３０（５）：１２０３〜１２１０）。さらに、フィブロインの加水分解ペプチドフラグメントは、古典的にはＮＦ‐κＢの制御下にある炎症誘発性分子の転写を阻害することが示されている（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．、２０１１．１１４（２）：４８５‐９０；  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０１２．２２（４）：４９４‐５００）。しかしながら、絹フィブロインの使用は、炎症状態及び創傷に対する効果的な治療法をもたらさなかった。
【０００９】
さらに、眼の疾患及び傷害は、依然として世界の一般市民にとって持続的かつ深刻な問題である。眼の疾患及び外傷は、治癒過程全体に広がり、長期の感染、慢性的な炎症、及び瘢痕形成による永久的な障害又は失明の危険を冒すことによって、正常な視力に対する即時の脅威をもたらす。したがって、炎症を軽減し、損傷を受けた又は炎症を起こした眼組織の治癒を促進するための治療法が早急に必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、炎症の軽減、ならびに創傷治癒及び組織再生の促進などの治療用途のための修飾絹フィブロインタンパク質を提供する。修飾タンパク質は角膜上皮細胞の付着及び増殖を支持することが示されている。本明細書中に記載される絹由来タンパク質（ＳＤＰ）は、βシート活性が低下した、フィブロイン由来タンパク質組成物であり、その結果、高度に溶解性で水性安定性の材料が得られる。ＳＤＰは、高濃度で溶液ベースの製品配合物に容易に組み込むことができる。別の利点は、ＳＤＰが他の溶解成分、例えば眼科用製剤に典型的に含まれるものとの高レベルの混和性を有することである。ＳＤＰの１つの特定の用途は、眼表面上の溶液濡れ特性を向上させるための新規タンパク質成分としての眼科用製剤へのその包含である。ＳＤＰは分画することができ、驚くべきことにＳＤＰの低分子量画分は抗炎症特性を増強することが発見された。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は、水溶液中で安定性が向上したフィブロイン由来タンパク質組成物を提供し、ここで、フィブロイン由来タンパク質組成物の一次アミノ酸配列は、セリン、グリシン、及びアラニンのアミノ酸含有量の合計差の絶対値に関して、天然のフィブロインと少なくとも４％異なり、フィブロインのフィブロイン重鎖タンパク質鎖とフィブロイン軽鎖タンパク質鎖との間のシステインジスルフィド結合は、減少又は除去されており、タンパク質組成物中の複数のペプチド鎖は、アミド（‐Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２）基で終わり、該組成物は、天然フィブロインタンパク質と比較して２５％超減少したセリン含有量を有し、ここでセリン含有量は少なくとも約５％であり、フィブロイン由来タンパク質組成物の平均分子量は、４０ｋＤａ未満かつ２ｋＤａ超である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、タンパク質組成物のタンパク質鎖の５０％超が１０ｋＤａから６０ｋＤａの範囲内の分子量を有する。様々な実施形態において、タンパク質組成物は、１０％ｗ／ｗまでの濃度でタンパク質組成物の水溶液を超音波処理してもゲル化しない。
【００１３】
タンパク質組成物は、８％未満のセリン、７％未満のセリン、又は６％未満のセリンアミノ酸残基を有することができる。タンパク質組成物は、４６％を超えるグリシンアミノ酸、４６．５％を超えるグリシンアミノ酸を有することができる。タンパク質は、３０％を超えるアラニンアミノ酸、又は３０．５％を超えるアラニンアミノ酸を有することができる。
【００１４】
タンパク質組成物は、乾燥して薄膜になった後に完全に水に再溶解することができる。ベータシートタンパク質構造は、水溶液中では最小限であるか又は存在しない。タンパク質組成物は、少なくとも５秒間の超音波処理の後、５５０ｎｍで０．２５未満の水溶液中の吸光度を維持することができる。
【００１５】
本発明はまた、本明細書に記載のタンパク質組成物、及び水、ならびに必要に応じて１つ又は複数の緩衝媒体、塩、安定剤、保存剤、及び潤滑剤を含む眼科用製剤を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、炎症組織にフィブロイン由来タンパク質組成物を投与することを含む、炎症を軽減するための方法を提供する。ここで、フィブロイン由来タンパク質組成物の一次アミノ酸配列は、セリン、グリシン、及びアラニンのアミノ酸含有量の合計差の絶対値に関して、天然フィブロインと少なくとも４％異なり、フィブロインのフィブロイン重鎖タンパク質鎖とフィブロイン軽鎖タンパク質鎖との間のシステインジスルフィド結合は、減少又は除去されており、タンパク質組成物中の複数のペプチド鎖は、アミド（‐Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２）基で終わり、該組成物は、天然フィブロインタンパク質と比較して２５％超減少したセリン含有量を有し、ここでセリン含有量は少なくとも約５％であり、フィブロイン由来タンパク質組成物の平均分子量は、６０ｋＤａ未満かつ２ｋＤａ超であり、そしてそれによって組織の細胞核内の転写因子シグナル伝達を減少させ、それによって炎症を減少させる。フィブロイン由来タンパク質組成物の平均分子量はまた、５５ｋＤａ未満、及び／又は約５ｋＤａ超、１０ｋＤａ超、１５ｋＤａ超、又は２０ｋＤａ超であり得る。
【００１７】
炎症組織への投与は、炎症性遺伝子ＴＮＦ−α、ＭＭＰ−９、ＩＬ−１β、及びＩＬ−６のうちの１つ以上の転写を減少させることができる。タンパク質組成物の非存在下と比較して、減少は２０％、４０％、５０％、又は６０％にもなり得る。投与は角膜に行うことができ、投与は角膜中のＭＭＰ−９の存在を減少させることができる。投与は眼に行うことができ、投与は、例えば涙液膜中の炎症誘発性マーカーのＥＬＩＳＡ測定によって決定されるように、眼球表面上の炎症を軽減する。炎症の減少は、ＭＴＴアッセイによって決定されるように、炎症の点での細胞移動速度の増加、例えば細胞増殖の増加を伴うことがある。
【００１８】
タンパク質組成物は、４０ｋＤａ未満、又は３５ｋＤａ未満の平均分子量を有し得る。フィブロイン由来タンパク質組成物は、緩衝媒体、塩、安定剤、保存剤、及び潤滑剤のうちの１つ又は複数を含む眼科用製剤に溶解することができる。
【００１９】
炎症は、ドライアイ症候群、角膜潰瘍、角膜糜爛、角膜剥離、角膜変性、角膜穿孔、角膜瘢痕化、上皮欠損、角結膜炎、特発性ブドウ膜炎、角膜移植、加齢黄斑変性症、糖尿病眼症、眼瞼炎、緑内障、高眼圧症、術後の眼の痛み及び炎症、後区血管新生、増殖性硝子体網膜症、サイトメガロウイルス網膜炎、眼内炎、脈絡膜血管新生血管膜、血管閉塞性疾患、アレルギー性眼疾患、腫瘍、網膜色素変性症、眼の感染症、強膜炎、眼瞼下垂、縮瞳、眼の痛み、散瞳、神経痛、瘢痕化眼球表面疾患、眼の感染症、炎症性眼疾患、眼の表面疾患、角膜の疾患、網膜疾患、全身性疾患の眼症状、遺伝性眼症状、眼球腫瘍、眼内圧上昇、ヘルペス性感染症、翼状片又は強膜腫瘍、眼表面に持続する創傷、光屈折角膜切開術後の眼の痛み及び炎症、角膜への熱的又は化学的熱傷、強膜創傷、又は円錐角膜及び結膜創傷であり得る。一実施形態では、炎症はドライアイ症候群によって引き起こされる。
【００２０】
本発明はさらに、炎症を治療するための本明細書に記載のフィブロイン由来タンパク質組成物の使用を提供し、ここでフィブロイン由来タンパク質組成物の一次アミノ酸配列は、天然のフィブロインと、セリン、グリシン、及びアラニンのアミノ酸含有量の合計差の絶対値に関して、少なくとも４％異なり、フィブロインのフィブロイン重鎖タンパク質鎖とフィブロイン軽鎖タンパク質鎖との間のシステインジスルフィド結合は、減少又は除去されており、タンパク質組成物中の複数のペプチド鎖は、アミド（‐Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２）基で終わり、該組成物は、天然フィブロインタンパク質と比較して２５％超減少したセリン含有量を有し、ここでセリン含有量は少なくとも約５％であり、フィブロイン由来タンパク質組成物の平均分子量は、６０ｋＤａ未満かつ１０ｋＤａ超である。タンパク質組成物は、３５ｋＤａ未満の平均分子量を有し得る。組成物は、ドライアイ症候群の治療のための組成物であり得る。
【００２１】
したがって、天然フィブロインの一次アミノ酸配列が天然絹フィブロインから修飾され、フィブロイン重鎖タンパク質鎖とフィブロイン軽鎖タンパク質鎖との間のシステインジスルフィド結合が減少又は除去されている水溶液中での安定性が高いＳＤＰ組成物が提供される。この組成物は、天然フィブロインタンパク質と比較して４０％超減少したセリン含有量を有し、ＳＤＰの平均分子量は、約６０ｋＤａ未満である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
以下の図面は本明細書の一部を構成し、本発明の特定の実施形態又は様々な態様をさらに実証するために含まれる。いくつかの例において、本発明の実施形態は、本明細書に提示された詳細な説明と組み合わせて添付の図面を参照することによって最もよく理解され得る。説明及び添付の図面は、本発明の特定の具体例又は特定の態様を強調し得る。しかしながら、当業者は、実施例又は態様の一部が本発明の他の実施例又は態様と組み合わせて使用されてもよいことを理解するであろう。
【図１】図１Ａ〜Ｄ。ＮＦ‐κＢ活性化のためのｈＣＬＥ培養物のｐ６５タンパク質免疫染色（白）。（Ａ）ＰＢＳで処理した陰性対照培養物は、細胞質ゾルｐ６５染色を示し、これは天然のＮＦ‐κＢ不活性を示している。（Ｂ）１ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−αを含有するＰＢＳで処理した陽性対照培養物は、タンパク質転座、したがって高レベルのＮＦ−κＢ活性化を示す点状のｐ６５核染色を示した。（Ｃ及びＤ）ＰＢＳ、ＴＮＦ−α、及び０．１％ＳＤＰ又は１％ＳＤＰで処理した培養物は、核ｐ６５染色において用量依存的な減少を示し、ＳＤＰ濃度が高いほどそれぞれＮＦ−κＢ活性化を抑制する程度が高いことを示す。（スケールバー＝  ２０μｍ）。
【図２】ＰＢＳ、ＰＢＳ＋０．５％ＳＤＰ、ＰＢＳ＋１ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ‐αサイトカイン、及びＰＢＳ＋１ｎｇ／ｍＬ  ＴＮＦ−αサイトカイン＋０．５％ＳＤＰで処理したｈＣＬＥ培養物についてのＴＮＦ‐α及びＭＭＰ‐９の相対倍率遺伝子発現のｑＰＣＲ結果のまとめ。ＴＮＦ−α及びＭＭＰ−９は、ＮＦ−κＢ活性化の既知の遺伝的マーカーである。ＴＮＦ−αで刺激し、０．５％ＳＤＰで処理した培養物は、ＴＮＦ−αサイトカイン刺激対照と比較して遺伝子発現の６倍の減少を示した（それぞれのＧＯＩについてＰＢＳと比較してΔｐ＜０．０１；それぞれのＧＯＩについてのＳＤＰに対してΘｐ＜０．０１；及び示された群に対して＃ｐ＜０．０５；ｎ＝３）。
【図３】図３Ａ〜Ｅ。（Ａ）ＭＭＰ‐９について免疫染色された未変性ウサギから得られた角膜組織の代表的な断面像。（Ｂ〜Ｄ）様々な治療群について手術後７２時間に採取したウサギから得た角膜断面の代表的な免疫組織化学的画像。ＰＢＳ処置動物（Ｂ）と比較した場合、ＭＭＰ−９染色は、ＳＤＰ処置群（Ｃ及びＤ）の両方について減少した。（スケールバー＝５０μｍ）。（Ｅ）ＰＢＳ、０．５％ＳＤＰ、又は２％ＳＤＰで処置した角膜におけるＭＭＰ‐９の測定染色強度（蛍光強度）の要約グラフ（対照に対して＊ｐ＜０．０１；０．５％ＳＤＰと比較して＃ｐ＜０．０１、ｎ＝３）。
【図４】上皮表面の外科的露出後７２時間にわたるＰＢＳ、ＰＢＳ＋０．５％ＳＤＰ、及びＰＢＳ＋２％ＳＤＰで処置したウサギ角膜についてのＩＬ‐１β及びＩＬ‐６の相対倍率遺伝子発現のｑＰＣＲ結果。。ＩＬ−１β及びＩＬ−６は角膜組織環境内の炎症の既知の遺伝的マーカーである。両方のマーカーの発現は、ＳＤＰ処理の存在下で有意に減少した（各ＧＯＩについてＰＢＳに対して＊ｐ＜０．０１；ｎ＝６）。
【図５】規定濃度の溶解タンパク質（ＰＡＳＦ、ＳＤＰ又はＳＤＰ−４）の存在下で電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法によって測定されたＨ２Ｏ２レベルの要約グラフ。Ｈ２Ｏ２（２０μＭ）をＰＡＳＦ、ＳＤＰ、又はＳＤＰ−４の非存在下（対照）又は存在下（それぞれ０．５％、１％、又は５％）でインキュベートし、次いでＨ２Ｏ２特異的スピンプローブに導入した。各試料について酸化スピンプローブによって生成されたＥＰＲシグナルを測定し、対照試料（すなわちタンパク質を欠いている）に対して正規化した。ＰＡＳＦは、タンパク質濃度の増加と共にＥＰＲシグナル振幅を増加させた。対照的に、ＳＤＰはＥＰＲシグナル振幅の濃度依存的な減少を引き起こし、ＳＤＰタンパク質がＨ２Ｏ２を除去することを実証した。Ｈ２Ｏ２掃去は、ＳＤＰ‐４タンパク質の存在下でさらにいっそう強固であった。エラーバーは標準偏差、Ｎ＝３として表される。
【図６】ＳＤＳ‐ＰＡＧＥレーン２〜５は、生物学的影響が評価されたＳＥＣ分画ＳＤＰ集団（ＳＤＰ‐１、ＳＤＰ‐２、ＳＤＰ‐３、ＳＤＰ‐４、及びＳＤＰ）のそれぞれの分子量（ＭＷ）分布を表す。レーン６は、画分が由来した非分画ＳＤＰ分布を示す。ＭＷ標準はレーン１に示されている。
【図７】インビトロ創傷治癒アッセイからの代表的な画像は、白で概説される細胞増殖及び無細胞領域（創傷）への移動が、５ｍｇ／ｍＬ  ＳＤＰ−３又はＳＤＰ−４の存在下で有意に加速されることを実証する。
【図８】スクラッチ創傷アッセイ中の示された時点での創傷閉鎖率（対照に対して＊ｐ＜０．０５）、（ＳＤＰ‐１に対して＃ｐ＜０．０５、ｎ＝３）、（ＳＤＰ−２に対して†ｐ＜０．０５、ｎ＝３）を示す要約棒グラフ。
【図９】５ｍｇ／ｍＬの分画ＳＤＰ又は（生理食塩水緩衝液）対照で処理したｈＣＬＥ培養物における上皮細胞生存率のＭＴＴ分析。ＳＤＰ−３及びＳＤＰ−４による処理は、対照細胞と比較して有意に増加した細胞増殖を示した。ＳＤＰ−１又はＳＤＰ−２による処理は、対照と比較して細胞増殖を変化させなかった（対照に対して＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３；ＳＤＰ−１に対して＃ｐ＜０．０５、ｎ＝３；ＳＤＰ‐２に対して†ｐ＜０．０５、ｎ＝３）。
【図１０】未処理（未変性）又は炎症性シグナル伝達を開始するためにＴＮＦ‐αで刺激し、そして１ｍｇ／ｍＬの分画ＳＤＰで処理したｈＣＬＥ細胞におけるＴＮＦ‐α、ＭＭＰ‐９、及びインターロイキン‐１α／β、‐６、及び‐８転写のｑＰＣＲ要約。ＳＤＰ−３及びＳＤＰ−４による処理は、ＰＢＳで処理した対照細胞と比較して、定義された炎症遺伝子の転写を有意に減少させた。（天然に対して†ｐ＜０．０５、ｎ＝３；対照に対して＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３）。
【図１１】未処理（天然）又は炎症シグナル伝達を開始するためにＴＮＦ‐αで刺激し、そして１ｍｇ／ｍＬのＳＤＰ画分で処理したｈＣＬＥ細胞によるＴＮＦ‐αサイトカイン分泌のＥＬＩＳＡ分析。ＳＤＰ‐３及びＳＤＰ‐４での処理は炎症誘発性サイトカインＴＮＦ‐αの分泌を有意に減少させたが、ＳＤＰ‐２はＰＢＳで処理した対照細胞と比較して有意に分泌を増加させた。（天然に対して†ｐ＜０．０５、ｎ＝３）、（対照に対して＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３）。
【図１２】ＴＮＦ−αによる処理が未処理の（天然の）培養物と比較してＨＬ−６０炎症性細胞の遊走を有意に増加させたことを示すトランスウェル遊走アッセイのまとめ。ＳＤＰ−４（１ｍｇ／ｍＬ）の添加は、ＴＮＦ−α駆動ＨＬ−６０細胞遊走の有意な減少をもたらした（対照に対して†ｐ＜０．０５、ｎ＝３；天然に対して＊ｐ＜０．０５、ｎ＝３）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、炎症を治療するための及び創傷を治療するためのＳＤＰ由来のタンパク質組成物を提供する。カイコ繭から単離されたタンパク質が角膜細胞の増殖を刺激し、創傷治癒及び炎症に関与する遺伝子の発現を変化させるという証拠が裏付けられている（図１〜５）。本明細書に記載のタンパク質組成物はまた、水溶液中で高い溶解性及び安定性を有する。タンパク質組成物を作製する方法は、フィブロイン重鎖タンパク質鎖とフィブロイン軽鎖タンパク質鎖との間のシステインジスルフィド結合が減少又は排除されるように、天然フィブロインの一次アミノ酸配列を修飾することを含む。さらに、タンパク質組成物のセリン含有量は、天然のフィブロインタンパク質と比較して４０％超減少し、そしてタンパク質の平均重量分子量は約６０ｋＤａ未満である。場合によっては、本明細書に記載のタンパク質組成物は、米国特許第９，３９４，３５５号に記載のタンパク質組成物を含むか、又はそれに由来し、その全開示は参照により本明細書に組み込まれる。より大きな平均分子量の画分又は全体としてのＳＤＰ組成物と比較して炎症誘発性遺伝子の発現を減少させるそれらの高められた能力のために高められた抗炎症活性を有する組成物を提供するために、より低い平均分子量画分を単離することもできる。
【００２４】
離散ＳＤＰ亜集団は、身体、特に角膜組織における治癒をさらに促進しそして炎症を軽減する。選択されたＳＤＰ画分は、細胞遊走応答及び炎症に対するＳＤＰの有効効力を増強することが示されている。ＳＤＰ画分は、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのカイコの繭繊維を９５℃の０．３％炭酸ナトリウム中で抽出することにより調製し、次にフィブロイン繊維を５４％ＬｉＢｒ溶液に溶解した。溶解した溶液をオートクレーブにかけ、粗濾過し、次いで透析濾過により精製した。次いで、材料を公称ポリプロピレンフィルターを通して濾過して最終ＳＤＰ溶液を製造した。次に、特定の実験に応じて２つの方法のうちの１つを使用することによってＳＤＰ溶液を分子量（ＭＷ）によって分離した。第一の方法では、分子量カットオフフィルターを用いた遠心分離を利用して、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）サイズによってＳＤＰタンパク質画分を分離した。例えば、試料が出発体積の１０％に減少するまでＳＤＰを５０００×ｇで遠心分離することができる（例えば、本明細書に記載の特定の実験では、１５ｍＬの初期体積を１．５ｍＬに濃縮）。フィルターを通してふるいにかけられたタンパク質は、特定のフィルターの分子量ＭＷＣＯよりも少なくなる。保持されているタンパク質は、一般に、同等以上の分子量を有する。第二の方法では、試料ＳＤＰ画分をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって単離して、別々のタンパク質亜集団又は画分を生成することもできる。平均分子量が減少する４つの画分が生成され、それらはＳＤＰ−１、ＳＤＰ−２、ＳＤＰ−３、及びＳＤＰ−４と呼ばれる（図６）。
【００２５】
２つの最小分子量のＳＤＰ画分、ＳＤＰ−３及びＳＤＰ−４は、細胞移動及び増殖効果の増加を通じて、炎症を有意に軽減し、ｈＣＬＥ培養物の創傷治癒をインビトロで増強する（図７−１２）。これらのＳＤＰ画分は炎症性シグナル伝達を阻害し、それは創傷治癒をさらに増強し、そして長期の患者の転帰を改善することができる。したがって、ＳＤＰ由来のタンパク質画分は、炎症及び関連状態を治療するために使用することができる。１つの具体的な治療用途は、部分的にはＳＤＰによって阻害されるＮＦ−κＢシグナル伝達経路によって引き起こされる炎症関連疾患であることが知られているドライアイ疾患の治療におけるものである。別の特定の治療用途では、ＳＤＰを利用して、屈折矯正手術又は白内障除去中に生じる傷害などの、炎症及び／又は細胞増殖の増加及び／又は遊走、及び／又は角膜上皮が損傷している場所での偶発的な怪我を軽減することによって治癒転帰の増強を誘導する。
【００２６】
定義
以下の定義は、明細書及び特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解を提供するために含まれる。本明細書で使用されるとき、列挙された用語は以下の意味を有する。本明細書で使用される他のすべての用語及び句は、当業者が理解するようにそれらの通常の意味を有する。このような通常の意味は、Ｒ．Ｊ．ルイス、ジョンワイリー＆サンズ、ニューヨーク、ＮＹ、２００１年によるＨａｗｌｅｙ’ｓ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  １４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎなどの技術辞書を参照することによって得られる。
【００２７】
本明細書中の「一実施形態」、「実施形態」などへの言及は、記載された実施形態が特定の態様、特徴、構造、部分、又は特性を含み得ることを示すが、必ずしもどの実施形態もがそのような態様、特徴、構造、部分、又は特性を含むわけではない。さらに、そのような語句は、必ずというわけではないが、本明細書の他の部分で参照されているのと同じ実施形態を指すことがある。さらに、特定の態様、特徴、構造、部分、又は特性が一実施形態に関連して説明されている場合、そのような態様、特徴、構造、部分、又は特性に影響を与える又は明示的に記載されているかどうかにかかわらず他の実施形態と関連付けることは、当業者の知識の範囲内である。
【００２８】
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「１つの構成要素」への言及は複数のそのような構成要素を含み、したがって構成要素Ｘは複数の構成要素Ｘを含む。特許請求の範囲は任意の要素を除外するように起草され得ることもさらに特筆される。このように、この記載は、本明細書に記載の任意の要素に関連して、「単独で」、「のみ」、「以外」などの排他的用語の、及び／又はクレーム要素の列挙又は「否定的な」制限の使用の先行する基礎として役立つことを意図する。
【００２９】
「及び／又は」という用語は、項目のうちの任意の１つ、項目の任意の組合せ、又はこの用語が関連付けられているすべての項目を意味する。句「１つ又は複数」及び「少なくとも１つ」は、特にその使用の文脈で読まれるときに、当業者によって容易に理解される。例えば、この語句は、１、２、３、４、５、６、１０、１００、又は列挙された下限より約１０、１００、又は１０００倍高い任意の上限を意味し得る。
【００３０】
用語「約」は、指定された値の±５％、±１０％、±２０％、又は±２５％の変動を指すことができる。例えば、「約５０」パーセントは、いくつかの実施形態において、４５から５５パーセントまでの変動をもたらすことができる。整数範囲については、「約」という用語は、範囲の両端に、列挙された整数より大きい及び／又は小さい１つ又は２つの整数を含むことができる。本明細書で別段の指定がない限り、「約」という用語は、個々の成分、要素、組成物、又は実施形態の機能に関して等価である、列挙された範囲に近い値、例えば重量パーセントを含むことを意図する。約という用語はまた、この段落で上述したように、列挙された範囲の終点を修正することもできる。
【００３１】
当業者によって理解されるように、成分の量、分子量などの特性、反応条件などを表すものを含むすべての数は近似値であり、すべての場合において「約」という用語によって任意に修飾されると理解される。「これらの値は、本明細書の説明の教示を利用して当業者によって得られることが求められる所望の特性に応じて変わり得る。そのような値は、それらのそれぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる変動を本質的に含むことも理解される。
【００３２】
当業者には理解されるように、特に書面による説明を提供することに関してあらゆる目的のために、本明細書に列挙されたすべての範囲はまた、そのすべての可能な部分範囲及び部分範囲の組合せを含むだけでなく、範囲を構成する個々の値、特に整数値も含む。列挙された範囲（例えば、重量パーセント又は炭素基）は、その範囲内のそれぞれの特定の値、整数、小数、又は同一性を含む。記載されている範囲はいずれも、少なくとも等しい、半分、３分の１、４分の１、５分の１、又は１０分の１に分割することができる同じ範囲を十分に記載し実施可能にするものとして容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で論じられている各範囲は、下３分の１、中３分の１及び上３分の１などに容易に分割することができる。「まで」、「少なくとも」、「より大きい」（「超」）、「より小さい」（「未満」）、「より大きい」、「又はそれ以上」などのすべての言葉は、列挙された数を含み、そのような用語は、上述のようにさらに部分的に細分することができる範囲を指す。同様に、本明細書に列挙されたすべての比率は、より広い比率に含まれるすべての下位比率も含む。したがって、ラジカル、置換基、及び範囲について列挙された具体的な値は例示のためだけのものである。それらは、他の定義された値、又はラジカル及び置換基について定義された範囲内の他の値を除外しない。
【００３３】
当業者はまた、Ｍａｒｋｕｓｈグループのようにメンバーが共通の方法で一緒にグループ化されている場合、発明は全体としてリストされたグループ全体だけでなく、グループの各メンバーを個々にそしてメイングループのすべての可能なサブグループを包含する。さらに、あらゆる目的のために、発明は、メイングループだけでなく、一つ以上のグループメンバーが存在しないメイングループも包含する。したがって、発明は、列挙されたグループのうちの任意の１つ又は複数のメンバーを明示的に除外することを想定している。したがって、但し書きは、開示されたカテゴリ又は実施形態のいずれにも適用することができ、それによって、列挙された要素、種、又は実施形態のうちの１つ又は複数は、例えば明示的で否定的な限定に使用するためにそのようなカテゴリ又は実施形態から除外され得る。
【００３４】
「接触する」という用語は、触れる、接触させる、又はすぐ近く又は近接近させる行為を指し、これらは細胞レベル又は分子レベルで、例えば生理学的反応、化学反応、又は物理的変化を、例えば、溶液中、反応混合物中、インビトロ又はインビボで引き起こすことを含む。
【００３５】
治療用途のために、「有効量」とは、疾患、障害、及び／又は状態を治療するために、又は列挙された効果をもたらすために有効な量をいう。例えば、有効量は、治療されている状態又は症状の進行又は重症度を軽減するのに有効な量であり得る。治療有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。「有効量」という用語は、本明細書に記載の組成物の量、又は本明細書に記載のペプチドの組み合わせの量を含むことを意図しており、例えば、疾患又は障害を治療又は予防するため、又は宿主における疾患又は障害の症状を治療するために有効である。したがって、「有効量」は一般に、所望の効果をもたらす量を意味する。
【００３６】
フィブロインは、カイコ繭に由来するタンパク質である（例えば、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）。フィブロインは、分子量が約３５０〜４００ｋＤａの重鎖及び分子量が約２４〜２７ｋＤａの軽鎖を含み、ここで重鎖及び軽鎖はジスルフィド結合によって互いに結合している。重鎖及び軽鎖の一次配列は当技術分野において公知である。フィブロインタンパク質鎖は、親水性Ｎ及びＣ末端ドメイン、ならびに溶液中の周囲の分子との立体的及び静電的相互作用の混合を可能にする疎水性／親水性アミノ酸配列の交互ブロックを有する。低濃度希釈（１％以下）では、フィブロインタンパク質分子は伸長したタンパク質鎖形態をとり、溶液中で直ちに凝集することはないことが知られている。フィブロインタンパク質は、ＨＡ、ＰＥＧ、グリセリン、及びＣＭＣなどの水和分子と高度に混和性であり、高度に生体適合性であることが見出されており、酵素作用によって体内で自然に統合又は分解する。天然フィブロイン、又は本明細書では従来技術の絹フィブロイン（ＰＡＳＦ）とも呼ばれ、当技術分野で公知であり、例えば、Ｄａｉｔｈａｎｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５，４，１１５‐１２１）及び国際公開番号ＷＯ２０１４／１４５００２（Ｋｌｕｇｅら）により記載されている。
【００３７】
「絹由来タンパク質」（ＳＤＰ）及び「フィブロイン由来タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらの材料は、熱、圧力、及び高濃度の重塩溶液を含む本明細書に記載の方法によって調製される。したがって、「絹由来」及び「フィブロイン由来」は、本明細書に記載の構造的、化学的及び物理的特性を有するタンパク質組成物（ＳＤＰ）に到達するように絹フィブロインタンパク質を構造的に修飾するプロセスの出発材料を指す。ＳＤＰ組成物は水溶液中で高い溶解度及び安定性を有する。ＳＤＰは、カイコシルク（例えば、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クモシルク、又は遺伝子操作されたシルクに由来し得る。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、用語「分子量」及び「平均分子量」は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（国立衛生研究所）との組み合わせ分析におけるＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４％−１２％ビス−Ｔｒｉｓタンパク質ゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて行われる、標準的なドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）電気泳動法によって決定される重量平均分子量を指す。ＩｍａｇｅＪは、試料中の所与の分子量のタンパク質の相対量を決定するために使用される。ソフトウェアは、ゲル上の染色（すなわち、タンパク質の量）を定量的シグナル強度に変換することによってこれを達成する。次に、ユーザーはこのシグナルを既知の分子量の種からなる標準（又はラダー）と比較する。ラダー上の各マーカー間のシグナル量はシグナル全体で除算される。本明細書では画分（フラクション）とも呼ばれ、互換的にフラグメントとも呼ばれる各タンパク質亜集団の累積合計により、使用者は中央分子量を決定することができ、これを本明細書では平均分子量と呼ぶ。実際には、電気泳動ゲルを染色してからグレースケール画像にスキャンし、ＩｍａｇｅＪを使用してヒストグラムに変換する。各ゲルレーン内の総ピクセル強度をＩｍａｇｅＪ（すなわちヒストグラムの下の総面積）によって定量し、続いてゲル上で染色されたタンパク質分子量標準によって画定された集団に分画する。任意の２つの分子量標準の間のヒストグラムピクセル面積は、タンパク質の全ヒストグラム面積で除算され、それによってこれらの分子量内に入る全タンパク質の割合が提供される。他の方法による分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法によって説明されない特定のペプチドを説明する異なる値を提供し得る。例えば、ＨＰＬＣを用いて平均分子量を分析することができ、この方法は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって決定されるよりも低い（分子量が減少するにつれて差が増大する）、典型的には約１０〜３０％の値を提供する。
【００３９】
ＳＤＰ組成物の調製
本明細書に記載のＳＤＰ組成物は、水溶液中で天然フィブロインと比較して安定性が向上している可能性がある。本明細書でＳＤＰとも呼ばれる、本明細書で提供されるＳＤＰ組成物によって達成される増強された安定性は、材料がネイティブ／  ＰＡＳＦタンパク質（本明細書ではＰＡＳＦと呼ばれる）よりも有意に長く溶液中に留まることを可能にする。本明細書で提供されるＳＤＰ材料の安定性の向上はまた、凝集、沈殿、又はゲル化なしに高濃度のＳＤＰ溶液を調製することを可能にする。点眼剤のような商業的用途又はタンパク質が溶液に可溶であることを必要とする用途では、安定性の向上は、タンパク質の凝集を減らすことによって適切に長い貯蔵寿命及び製品の品質の向上をもたらすことができる。溶液中のタンパク質の潜在的な凝集は、特定の用途に対する製品の望ましい性能に悪影響を及ぼす可能性がある。凝集物が眼球表面に研磨損傷を引き起こす可能性があることを考えると、これは特に点眼製剤に当てはまる。ＳＤＰを溶液中で高い構成（５０％ｗ／ｖ超又は＞５００ｍｇ／ｍＬ）に濃縮することができることは、そのまま使用することができ、又は任意の数の用途に対して希釈することができる有用な作業溶液を在庫するのに極めて有利である。そのような用途の例は、タンパク質のサプリメント又は添加剤としての、本明細書に提供されるものなどの眼科用製剤における成分としてのＳＤＰの使用である。
【００４０】
天然フィブロインタンパク質の一次アミノ酸配列をＳＤＰ材料に変換することは、凝集する分子の感受性を減少させることによって水溶液中でのその安定性を増強し得る。凝集は最終的にゲル形成をもたらす。天然フィブロインの変換では、セリン及びシステインアミノ酸の両方が高熱及び脱水条件の存在下で切断される。同様に、Ｐａｔｃｈｏｒｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６４、８６、１２０６）は、デヒドロアラニン（ＤＨＡ）中間体が溶液中のセリン及びシステインから形成されることを実証した。アミノ酸の分解は、本明細書に記載の５０〜５５％ｗ／ｖのＬｉＢｒ溶液のような強い脱水溶媒系の存在下でさらに促進され、ここで水素化物シフトが起こり、水の除去が誘導される。分解反応は水酸化物イオン（例えばｐＨ７．５〜ｐＨ１１）の存在下で起こり得、それはさらにＤＨＡ中間体の開裂を促進する。この開裂は、アミド、ピルボイルペプチド、及びＬｉＢｒを形成する。１つの実行可能な化学的メカニズムは、セリンアミノ酸についてスキーム１に概説されており、このスキームはシステインアミノ酸にも適用可能である。さらなる加水分解開裂を伴う、ＰＡＳＦタンパク質のセリン及びシステインアミノ酸のＤＨＡ中間体への化学的変化は、ＳＤＰ生成物の溶液安定性の向上をもたらす。
スキーム１。セリン及びシステイン分解のための基礎となる化学反応の概略図。
【化１】
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【００４１】
分解は、脱水性の高塩濃度環境の存在下でのヒドリドシフト反応から形成されるＤＨＡ中間体の生成によって促進される。次いで、ＤＨＡの分解は、塩基性溶媒環境内でのＳＮ２反応を通して達成される。
【００４２】
上記のこの開裂反応は、得られるペプチドの巨大分子特性に大きな影響を及ぼす可能性があり、それは安定化ＳＤＰ材料の水溶液をもたらす。フィブロインの最初のタンパク質凝集は、Ｇｒｅｖｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１２、１３（３）：６７６−６８２）によって記載されているように、システインアミノ酸における天然のフィブロイン重鎖及び軽鎖の相互作用によって引き起こされると考えられている。フィブロイン軽鎖タンパク質鎖及び重鎖タンパク質鎖内のシステインアミノ酸は、ジスルフィド結合を介して互いに相互作用する。これらのジスルフィド架橋は、フィブロインタンパク質凝集及びゲルネットワーク凝集に関与している。天然のフィブロイン軽鎖が存在しない場合、タンパク質は凝集に対して著しく感受性が低い。したがって、本明細書に記載の方法は、システイン含有量を減少させ、したがってジスルフィド結合形成能を減少又は排除することによって、天然フィブロイン軽鎖のジスルフィド結合を形成する能力を効果的に減少させることができる。このメカニズムを通して、本明細書に記載の変換プロセスは、システイン由来凝集体を形成する能力を低下させるか又は排除することによって、溶液中の得られたＳＤＰを機能的に安定化させる。
【００４３】
凝集誘導ジスルフィド架橋に加えて、絹フィブロインがさらに集まって凝集した構造になる感受性もまた、Ｍａｙｅｎら（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１５、１９７：１０−１７）によって記載されているようにタンパク質のアミノ酸化学によって促進される。絹フィブロインセリン、アラニン、及びグリシンアミノ酸配列の分子モデリングは、セリンの存在が、隣接するフィブロインタンパク質鎖部分間に水素結合を形成する傾向が大きいことにより、初期のタンパク質間相互作用を増強することを示した。モデルは、セリンの減少ならびにアラニン及びグリシンの増加がタンパク質凝集の初期傾向を減少させることを実証している。分子モデリングの観察は、フィブロインタンパク質の天然のアミノ酸化学を変えることによって、水溶液中でより高い安定性を有するであろう材料が生成され得ることを示す。
【００４４】
安定性の向上を達成するための１つの戦略は、タンパク質からヒドロキシルなどの荷電官能基を除去することである。ヒドロキシル基の比較的高い電気陰性度のために、この化学は、利用可能な水素原子との水素結合及び正に荷電したアミノ酸基との非特異的電荷相互作用の両方を推進することができる。天然のフィブロインタンパク質の含有量のほぼ１２％がセリンで構成されており、これはヒドロキシル官能基を持っている。それ故、水素結合を容易にするヒドロキシル基の利用可能性を減少させることによって、溶液中の全体的なタンパク質安定性が高められ得る。本明細書に記載の方法は、セリン含有量を効果的に減少させ、相対的なアラニン及びグリシン含有量を増加させ、それによって水素結合を生成するのに利用可能な利用可能なヒドロキシル基の数が排除される。このメカニズムを通して、本明細書に記載されるプロセスは、結果として生じるＳＤＰを溶液中で長期間（例えば、少なくとも数（６〜８）ヶ月間、及び／又は１．５年以上にわたって）機能的に安定化させる。拡張した研究は続いており、それによれば、２年超又は３年超、安定性が維持され得ることが示されている。
【００４５】
システイン及びセリン部分の還元に加えて、溶媒電荷相互作用はタンパク質溶液を安定化させるために重要である。初期タンパク質凝集後、ゲル化プロセスは、天然のフィブロイン重鎖間のより密接な会合を推進し続けると考えられており、これは重鎖の疎水性ブロック間の分子内及び分子間ベータシート形成の両方をもたらす。有意なβシート形成が起こると、フィブロイン溶液はゲルに転移する。溶液がゲルに転移すると、フィブロインは不溶性になり、もはや溶液系製品としては有用ではなくなる。ゲル化を防ぐために、ＳＤＰ溶液のｐＨを例えばｐＨ７．５を超える高アルカリ性に上げて安定性を高めることができる。結果として、増大したｐＨは、溶液中のＳＤＰ分子の周りに原子価シールドを形成する追加の遊離ヒドロキシル基を生成する。形成された原子価シールドは、水素結合又は非特異的荷電及び／又は疎水性相互作用に由来するタンパク質−タンパク質相互作用を減少させることによってタンパク質を安定化させるゼータ電位を生成するように作用する。フィブロイン変換プロセスは、このメカニズム及び他のメカニズムを介して溶液中の処理されたＳＤＰを機能的に安定化させる。ＳＤＰは、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのカイコフィブロイン又はＢｏｍｂｙｘ属の他のフィブロイン又は他の絹タンパク質から誘導することができる。
【００４６】
ＳＤＰ材料は以下の方法で調製することができる。
１．シルクの繭は、蛹の材料を取り除き、温水で事前にすすぐことによって調製される。
２．天然のフィブロインタンパク質繊維は、高水温、典型的には９５℃以上の水中で、アルカリ性ｐＨで繭を洗浄することによりガム様セリシンタンパク質から抽出される。
３．抽出されたフィブロイン繊維を乾燥し、次いでベータシート間の水素結合を中和する溶媒系を用いて溶解する。２０％ｗ／ｖ絹フィブロインタンパク質の５４％ＬｉＢｒ水溶液がこの中和工程に有効である。
４．ＬｉＢｒ溶液に溶解したフィブロインタンパク質をオートクレーブ環境で処理する（〜１２１℃［〜２５０°Ｆ］、〜１５−１７ＰＳＩ圧力、温度で約３０分間）。
５．次いで、加熱処理したフィブロインタンパク質とＬｉＢｒ溶液を透析して、溶液からリチウムイオンと臭化物イオンを除去する。プロセスのこの時点で、材料はＳＤＰに化学的に変換されている。
６．次いで、透析したＳＤＰを濾過して、溶解していない凝集物と汚染バイオバーデンを除去する。
【００４７】
ＳＤＰ溶液は、現在の絹フィブロイン溶液製造に使用される方法とは明らかに異なる方法を使用して製造される。特に、絹フィブロインタンパク質を溶液中でＬｉＢｒと混合しながらオートクレーブ処理すると、化学的転移が開始されて安定化ＳＤＰ材料が生成される。フィブロインタンパク質は、可溶化された天然のフィブロインタンパク質の水素結合及び静電相互作用を中和するＬｉＢｒ溶液に溶解される。これは、溶液中に特定の二次構造の確認なしにタンパク質を残す。結果として、フィブロインタンパク質鎖内の共有結合を加水分解するのに必要とされる熱力学的エネルギーは、加水分解的開裂を開始するのに必要最低限のエネルギーである。
【００４８】
一実施形態では、１５〜１７ＰＳＩのオートクレーブ条件で３０分間、温度を１２１℃に設定する。しかしながら、様々な実施形態において、処理条件は、ＳＤＰ材料を様々な程度に安定化させるように修正されてもよい。他の実施形態では、塩化カルシウム及びチオシアン酸ナトリウムなどの他の又は追加のハロゲン化物塩、尿素、塩酸グアニジンなどの有機薬剤、及び１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロパノール、硝酸カルシウム及び１‐ブチル‐３‐メチルイミダゾリウムクロリドのような追加の強力なイオン液体溶液添加剤、又はそれらの組み合わせを含む、追加のタンパク質可溶化剤をプロセスに使用することができる。
【００４９】
ＳＤＰ組成物
本明細書に記載のタンパク質組成物は、絹フィブロインから誘導することができ、水溶液中で高い溶解度及び安定性を有する。組成物は炎症を治療及び軽減するために使用され得る。一実施形態では、ＳＤＰ及び／又はその画分は、セリン、グリシン、及びアラニンの合計アミノ酸含有量に関して、天然のフィブロインと少なくとも４％異なる（差異の絶対値の合計による）一次アミノ酸配列を有する。ＳＤＰの複数のタンパク質断片は、アミド（Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２）基で終結することができる。ＳＤＰは、天然フィブロインと比較して４０％超減少したセリン含有量を有することができ、ここでセリン含有量は少なくとも約５％である。フィブロインのフィブロイン重鎖タンパク質鎖とフィブロイン軽鎖タンパク質鎖との間のシステインジスルフィド結合は、減少又は排除され得る。本明細書で提供されるＳＤＰ組成物は水溶液中で増強された安定性を有する。特定の実施形態では、少なくとも７５パーセントのタンパク質フラグメントが約６０ｋＤａ未満の分子量を有し、そしてそれが組織中での細胞の移動及び増殖も促進して創傷を閉じる抗炎症剤として作用する。組成物は、８．５％未満のセリンアミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態では、ＳＤＰの平均分子量は５５ｋＤａ未満である。
【００５０】
場合によっては、本明細書で提供されるタンパク質組成物は、フィブロイン水溶液を高圧で加熱することを含む方法によって調製される。フィブロイン水溶液は、少なくとも８Ｍの濃度の臭化リチウムを含む。フィブロイン水溶液を少なくとも約２０分間、少なくとも約１０ＰＳＩの圧力下で少なくとも約１０５℃（２２１°Ｆ）に加熱してタンパク質組成物を得る。これらの処理条件の結果として、タンパク質組成物のポリペプチドは８．５％未満のセリンアミノ酸残基を含み、そして複数のタンパク質フラグメントはアミド（Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２）基で終結する。
【００５１】
いくつかの場合において、本明細書で提供されるタンパク質組成物は、フィブロイン水溶液を高圧で加熱することを含むプロセスによって調製され、ここで、フィブロイン水溶液は、９〜１０Ｍの濃度の臭化リチウムを含み、少なくとも約２０分間、約１５ＰＳＩから約２０ＰＳＩの圧力下で、約１１５℃（２３９°Ｆ）から約１２５℃（２５７°Ｆ）の範囲の温度に加熱され、タンパク質組成物を提供する。タンパク質組成物は、６．５％未満のセリンアミノ酸残基を含み得る。
【００５２】
本明細書で提供されるＳＤＰ組成物は、水溶液中での安定性の向上を有することができ、ここで、ＳＤＰ組成物の一次アミノ酸配列は、セリン、グリシン、及びアラニン含有量の合計（絶対値）差に関して天然フィブロインと少なくとも４％異なり（ＳＤＰとＰＡＳＦ）、フィブロイン重鎖タンパク質鎖とフィブロイン軽鎖タンパク質鎖との間のシステインジスルフィド結合は、減少又は除去されており、そして該組成物は、天然フィブロインタンパク質と比較して２５％超減少したセリン含有量を有する。ＳＤＰ組成物の平均分子量は、透析膜のＭＷＣＯ及びＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析によって決定されるように、約６０ｋＤａ未満及び約２ｋＤａ超、又は約１０ｋＤａ超であり得る。
【００５３】
場合によっては、本明細書で提供されるＳＤＰ組成物は、水溶液中で安定性が向上している。ここで、ＳＤＰ組成物の一次アミノ酸配列は、天然フィブロインと少なくとも６％、セリン、グリシン、及びアラニン含量の合計差に関して異なり、フィブロイン重鎖タンパク質鎖とフィブロイン軽鎖タンパク質鎖との間のシステインジスルフィド結合は、減少又は除去されており、そして該組成物は、天然のフィブロインタンパク質と比較して４０％超減少したセリン含有量を有する。ＳＤＰ組成物の平均分子量は、透析膜のＭＷＣＯ及びＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析によって決定されるように、約５５ｋＤａ未満及び約１０ｋＤａ超であり得る。
【００５４】
いくつかの場合において、本明細書で提供されるＳＤＰ組成物は水溶液中で高い安定性を有し、ここで、ＳＤＰ組成物の一次アミノ酸配列は天然絹フィブロインから修飾されており、フィブロイン重鎖タンパク質鎖とフィブロイン軽鎖タンパク質鎖との間のシステインジスルフィド結合は、減少又は除去されており、ＳＤＰ組成物の平均分子量は、約６０ｋＤａより小さく約１０ｋＤａより大きく、５秒間の超音波処理後、ＳＤＰ組成物の５％ｗ／ｗ水溶液は、５５０ｎｍで０．２５未満の吸光度を少なくとも２時間維持する。
【００５５】
場合によっては、本明細書で提供されるＳＤＰ組成物は、水溶液中で高い安定性を有し、ここで、ＳＤＰ組成物の一次アミノ酸配列は、セリン、グリシン、及びアラニン含有量の合計差（絶対値）に関して少なくとも５％、天然フィブロインとは異なるように、天然絹フィブロインから修飾されている。いくつかの実施形態では、の差は、天然フィブロインと比較して少なくとも６％、８％、１０％、１２％又は１４％である。フィブロイン重鎖タンパク質鎖とフィブロイン軽鎖タンパク質鎖との間のシステインジスルフィド結合は、減少又は排除されている。ＳＤＰ組成物の平均分子量は、約６０ｋＤａより小さく約１５ｋＤａより大きい。そしてＳＤＰ組成物は、５秒間の超音波処理後、少なくとも２時間にわたって５５０ｎｍで０．２未満の吸光度を維持する。
【００５６】
場合によっては、本明細書で提供されるＳＤＰ組成物は、例えば透析及び／又は濾過によって、乾燥粉末又はフィルムとして単離及び／又は精製することができる。あるいは、本明細書で提供されるＳＤＰ組成物は、眼科用製剤などの治療用製剤として使用するために修飾することができる安定な水溶液として単離及び／又は精製することができる。
【００５７】
様々な実施形態において、本明細書に提供されるタンパク質組成物中に見出されるＳＤＰのアミノ酸組成は、天然フィブロインのアミノ酸組成と、セリン、グリシン、及びアラニンの合計含有量に関して、少なくとも４％、少なくとも４．５％、少なくとも５％、又は少なくとも５．５％、又は少なくとも６％だけ異なり得る。
【００５８】
場合によっては、本明細書に記載のタンパク質組成物は、天然フィブロインタンパク質のセリン含有量と比較して、２５％超、３０％超、３５％超、４０％超、又は４５％超減少したセリン含有量を有する。
【００５９】
本明細書で提供されるＳＤＰ組成物の平均分子量は、約８０ｋＤａ未満、約７０ｋＤａ未満、約６０ｋＤａ未満、又は約５５ｋＤａ未満であり得るか、又は組成物は約５０〜６０ｋＤａ、又は約５１〜５５ｋＤａの平均分子量を有する。様々な実施形態では、ＳＤＰ組成物の平均分子量は、約２ｋＤａ超、約１０ｋＤａ超、約１５ｋＤａ超、約２０ｋＤａ超、約２５ｋＤａ超、約３０ｋＤａ超、約３５ｋＤａ超、約４０ｋＤａ超、又は約５０ｋＤａ超であり得る。したがって、本明細書で提供されるＳＤＰ組成物の（重量平均）平均分子量は、約５ｋＤａから約８０ｋＤａ、約１０ｋＤａから約６５ｋＤａ、約１５ｋＤａから約６０ｋＤａ、約１５ｋＤａから約６０ｋＤａ、２０ｋＤａから約６５ｋＤａ、約２０ｋＤａから約５５ｋＤａであり得る。様々な実施形態において、ＳＤＰ組成物の平均分子量は、約４５ｋＤａから約６５ｋＤａ、約４５ｋＤａから約６０ｋＤａ、約５０ｋＤａから約６５ｋＤａ、又は約５０ｋＤａから約６０ｋＤａである。
【００６０】
ＳＤＰタンパク質組成物は、目視検査によって観察可能ないかなる沈殿もなしに、４０％ｗ／ｗで水に可溶性であり得る。
【００６１】
いくつかの実施形態において、本明細書に提供されるタンパク質組成物は、８％未満のセリンアミノ酸残基を含む。場合によっては、本明細書で提供されるタンパク質組成物は、７．５％未満のセリンアミノ酸残基、７％未満のセリンアミノ酸残基、６．５％未満のセリンアミノ酸残基、又は６％未満のセリンアミノ酸残基を含む。ペプチド組成物のセリン含有量は一般に少なくとも約４％、又は少なくとも約５％、又は約４〜５％である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるタンパク質組成物は、タンパク質組成物の全アミノ酸含有量に対して４６．５％を超えるグリシンアミノ酸を含む。場合によっては、本明細書で提供されるタンパク質組成物は、４７％を超えるグリシンアミノ酸、４７．５％を超えるグリシンアミノ酸、又は４８％を超えるグリシンアミノ酸を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるタンパク質組成物は、タンパク質組成物の総アミノ酸含有量に対して３０％を超えるアラニンアミノ酸を含む。場合によっては、本明細書で提供されるタンパク質組成物は、３０．５％超のアラニン、３１％超のアラニン、又は３１．５％超のアラニンを含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるタンパク質組成物は、乾燥して薄膜になった後に完全に再溶解することができる。様々な実施形態において、本明細書に提供されるタンパク質組成物は、水溶液中でβシートタンパク質構造を欠く可能性がある。タンパク質組成物は、少なくとも５秒間の超音波処理の後、５５０ｎｍで０．２５未満の水溶液中の吸光度を維持することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるタンパク質組成物は水と組み合わせてもよい。場合によっては、本明細書で提供されるタンパク質組成物は、１０％ｗ／ｗの濃度、又は１５％ｗ／ｗ、２０％ｗ／ｗ、２５％ｗ／ｗ、３０％ｗ／ｗ、３５％ｗ／ｗ、又は４０％ｗ／ｗなどのさらに高い濃度で水に完全に溶解し得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるタンパク質組成物は、例えば透析、濾過、又はそれらの組み合わせによって単離及び精製することができる。
【００６６】
様々な実施形態において、本明細書で提供されるタンパク質組成物は、例えば、タンパク質組成物を含まない対応する組成物の拡散と比較して、タンパク質組成物及び眼科用製剤成分を含む水溶液の拡散を促進することができる。この高められた拡散は、水溶液の表面積を２倍より大きく、又は３倍より大きく増加させることができる。
【００６７】
様々な実施形態において、ＳＤＰタンパク質組成物は、水中で２０％ｗ／ｖまで、３０％ｗ／ｖまで、又は４０％ｗ／ｖまでの濃度でゲルを形成しない。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＳＤＰ組成物は、ＳＤＰ組成物の少なくとも約４７．５％のアミノ酸を含むアミノ酸のグリシン−アラニン−グリシン−アラニン（ＧＡＧＡ）（配列番号１）セグメントを有することができる。場合によっては、本明細書で提供されるＳＤＰ組成物は、タンパク質組成物のアミノ酸の少なくとも約４８％、少なくとも約４８．５％、少なくとも約４９％、少なくとも約４９．５％、又は少なくとも約５０％を含むアミノ酸のＧＡＧＡ（配列番号１）セグメントも有することができる。
【００６８】
様々な実施形態では、本明細書で提供されるＳＤＰ組成物は、ＳＤＰ組成物のアミノ酸の少なくとも約５９％を含むアミノ酸のグリシン−アラニン（ＧＡ）セグメントを有することができる。場合によっては、本明細書で提供されるＳＤＰ組成物はまた、タンパク質組成物のアミノ酸の少なくとも約５９．５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６０．５％、少なくとも約６１％、又は少なくとも約６１．５％を含むアミノ酸のＧＡセグメントを有することができる。
【００６９】
本明細書で提供されるタンパク質組成物は、フィブロイン水溶液を高圧で加熱することを含む方法によって調製することができ、ここで、フィブロイン水溶液は少なくとも８Ｍの濃度の臭化リチウムを含み、そしてフィブロイン水溶液は少なくとも約１０ＰＳＩの圧力下で少なくとも約２０分間、少なくとも約１０５℃（２２１°Ｆ）に加熱され、タンパク質組成物が８．５％未満のセリンアミノ酸残基を含むタンパク質組成物を提供する。したがって、ＳＤＰ組成物を調製する方法もまた本明細書中に提供される。本明細書で提供されるＳＤＰ組成物を調製する方法は、本明細書で説明されているプロセスステップのうちの１つ又は複数を含むことができる。
【００７０】
場合によっては、本明細書で提供される調製方法は、約８．０Ｍから約１１Ｍの間の濃度を有する臭化リチウムを使用することができる。いくつかの実施形態において、臭化リチウムの濃度は、約９Ｍから約１０Ｍ、又は約９．５Ｍから約１０Ｍである。
【００７１】
いくつかの実施形態において、臭化リチウムを含有するフィブロイン水溶液は、少なくとも約１０７℃（２２５°Ｆ）、少なくとも約１１０℃（２３０°Ｆ）、少なくとも約１１３℃（２３５°Ｆ）、少なくとも約１１５℃（２３９°Ｆ）、又は少なくとも約１２０℃（２４８°Ｆ）に加熱される。
【００７２】
いくつかの実施形態において、臭化リチウムを含有するフィブロイン水溶液は、少なくとも約１２ＰＳＩ、少なくとも約１４ＰＳＩ、少なくとも約１５ＰＳＩ、又は少なくとも約１６ＰＳＩ、約１８ＰＳＩまで、又は約２０ＰＳＩまでの圧力下で加熱される。
【００７３】
いくつかの実施形態において、臭化リチウムを含有するフィブロイン水溶液は、少なくとも約２０分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約４５分間、又は少なくとも約１時間、最大で数時間（例えば、１２〜２４時間）加熱される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、タンパク質組成物は、観察可能な沈殿なしに４０％ｗ／ｗで水に溶解することができる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、フィブロインはセリシンから分離されている。
【００７６】
いくつかの実施形態において、臭化リチウムはタンパク質組成物から除去されて精製タンパク質組成物を提供する。様々な実施形態において、タンパク質組成物は、例えば透析、濾過、又はそれらの組み合わせによって単離及び精製されている。
【００７７】
さらなる実施形態では、タンパク質組成物は、セリン、グリシン、及びアラニン含有量に関して、上記のような特性、及び上記のようなアミノ酸組成を有する。
【００７８】
様々な実施形態において、タンパク質組成物は、乾燥後、薄膜として再溶解するが、これは天然のフィブロインでは見られない性質である。タンパク質組成物は、溶液中のβシートタンパク質構造を欠く可能性がある。タンパク質組成物は、少なくとも５秒間の超音波処理後に５５０ｎｍで０．２５未満の溶液中の吸光度を維持することができる。
【００７９】
１つの特定の実施形態において、本発明は、フィブロイン水溶液を高圧で加熱することを含む方法によって調製されるタンパク質組成物を提供し、ここで、フィブロイン水溶液は、９〜１０Ｍの濃度の臭化リチウムを含み、そしてフィブロイン水溶液は、少なくとも約３０分間、約１５ＰＳＩから約２０ＰＳＩの圧力下で、約１１５℃（２３９°Ｆ）から約１２５℃（２５７°Ｆ）の範囲の温度に加熱され、タンパク質組成物は、６．５％未満のセリンアミノ酸残基を含み、そして、タンパク質組成物は、水中１５％ｗ／ｗ溶液として１０ｃＰ未満の水性粘度を有する。
【００８０】
ＳＤＰ組成物は、製造工程の結果として天然絹フィブロインタンパク質と化学的に異なり、アミノ酸含有量の変化及び末端アミド基の形成をもたらす。得られたＳＤＰは水溶液中で高い溶解度及び安定性を有する。ＳＤＰは、例えば、本明細書に記載のタンパク質組成物、例えばタンパク質組成物の水溶液を用いて眼科用製剤を形成するための方法において使用することができる。溶液は、約０．０１％から約９２％ｗ／ｖのＳＤＰを含み得る。溶液は、約８％から約９９．９％ｗ／ｖの水であり得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＳＤＰ材料について、タンパク質の平均分子量が、先行技術の方法を使用して製造される絹フィブロインについて約１００〜２００ｋＤａから約３０〜９０ｋＤａ、又は約３０〜５０ｋＤａに低減されるように、フィブロインタンパク質の加水分解、アミノ酸分解、又はその組み合わせを誘導する方法が提供される。本明細書に記載のＳＤＰ材料については、得られたポリペプチドは、平均して本明細書中に列挙された範囲に及ぶ様々な分子量のペプチドのランダムな組み合わせであり得る。
【００８２】
さらに、アミノ酸化学は、標準的なアッセイ手順によってシステイン含有量を検出不可能なレベルまで減少させることによって変えることができる。例えば、セリン含有量は、天然のフィブロインに見られるレベルから５０％以上減少させることができ、それは標準的なアッセイ手順により決定されるように、全体のアラニン及びグリシン含有量を５％増加させることができる。ＳＤＰ材料は、約８％未満の相対アミノ酸含有量のセリン含有量、又は約６％未満の相対アミノ酸含有量のセリンアミノ酸含有量を有することができる。ＳＤＰ材料は、約４６．５％を超えるグリシン含有量、及び／又は約３０％を超えるもしくは約３０．５％を超えるアラニン含有量を有することができる。ＳＤＰ材料は、例えば、タンパク質組成物の加水分解ポリペプチドのＨＰＬＣ分析によって決定されるように、検出可能なシステイン含有量を有し得ない。ＳＤＰ材料は、例えば、ＦＴＩＲ分析によって決定されるように、天然絹フィブロインタンパク質と比較して９０％少ない、９５％少ない、又は９８％少ないβシート二次タンパク質構造を形成することができる。
【００８３】
安定性評価。タンパク質溶液の安定性は、さまざまな方法で評価できる。１つの適切な評価は、以下の実施例１に記載されるローレンス安定性試験である。別の適切な評価は、タンパク質溶液への超音波処理の適用、続いて継続的な光学的透明度（及び凝集、βシート形成、及び／又はゲル化の欠如）を確認するための吸光度分析である。ＳＤＰ溶液の安定性をテストするには、標準の超音波処理、又は超音波処理（２０ｋＨｚを超える音の周波数）を使用できる。ＳＤＰの溶液は超音波処理を受けた後も安定している。ＳＤＰ組成物は、５秒間の超音波処理後少なくとも２時間にわたって５５０ｎｍで０．２５未満の吸光度を維持する。例えば、タンパク質組成物の５％ｗ／ｗ溶液は、〜２０ｋＨｚで５秒間の超音波処理後に５５０ｎｍで０．１未満の吸光度を維持することができ、これは本明細書に記載の超音波処理に使用される標準条件である。様々な実施形態において、ＳＤＰ組成物水溶液は、超音波処理時に１０％ｗ／ｗまでの濃度でゲル化しない。さらなる実施形態では、ＳＤＰ組成物水溶液は、１５％ｗ／ｗまで、２０％ｗ／ｗまで、２５％ｗ／ｗまで、３０％ｗ／ｗまで、３５％ｗ／ｗまで、又は４０％ｗ／ｗまでの濃度で超音波処理してもゲル化しない。
【００８４】
低粘度。その調製方法及びその結果として生じるそのペプチド鎖の化学構造の変化の結果として、ＳＤＰは天然絹フィブロイン（ＰＡＳＦ）よりも低い粘度を有する。５％ｗ／ｗ水溶液（２５．６℃）として、天然絹フィブロインは約５．８ｃＰの粘度を有するが、同じ条件下で、ＳＤＰは約１．８ｃＰの粘度を有し、ＳＤＰ‐４は約２．７ｃＰの粘度を有する。ＳＤＰは、より高い濃度でもＰＡＳＦと比較して低い粘度を維持する。ＳＤＰ組成物は、水中１０％ｗ／ｗ溶液として、５ｃＰ未満、又は４ｃＰ未満の水性粘度を有することができる。様々な実施形態において、ＳＤＰは少なくとも９．８ｃＰの粘度まで溶液中に留まる。ＳＤＰはまた、水中１５％ｗ／ｗ溶液として１０ｃＰ未満の水性粘度を有する。ＳＤＰはまた、水中２４％ｗ／ｗ溶液として１０ｃＰ未満の水性粘度を有し得る。
【００８５】
本明細書に記載の方法は、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）４％−１２％ビス−Ｔｒｉｓタンパク質ゲル（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて行われた標準的なドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）電気泳動法を用いて試料を泳動した場合にも処理後にフィブロイン軽鎖タンパク質が識別できないタンパク質組成物を提供する。例えば、一実施形態では、ＳＤＰ材料は、天然絹フィブロインタンパク質と比較した場合、５０％を超えるフィブロイン軽鎖を除去することができる。さらに、得られたＳＤＰ材料は、加工後のβシートタンパク質二次構造を最小限で形成ないしは全く形成しないが、先行技術の方法を使用して製造された絹フィブロイン溶液は、有意量のβシート二次構造を形成する。一実施形態では、ＳＤＰ材料は、４０〜６０％ｗ／ｖの臭化リチウム（ＬｉＢｒ）溶液存在下のオートクレーブ又はオートクレーブ様条件（すなわち、約１２０℃及び１４〜１８ＰＳＩ）下で絹フィブロイン繊維を加工することによって調製することができる。
【００８６】
ＳＤＰ組成物画分
Ｓｉｌｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌｔｄ．は、炎症を軽減し創傷治癒過程を促進するために眼科用製品製剤に容易に配合することができる絹由来タンパク質（ＳＤＰ）製品を開発した。ＳＤＰ生成物は、抗炎症性及び創傷治癒特性を増強するために分子量に基づいてより小さいタンパク質画分又は亜集団に分離することができる。画分（フラクション）又はフラグメントとも呼ばれるＳＤＰタンパク質亜集団は、任意の適切で効果的な方法、例えばサイズ排除クロマトグラフィー又は膜透析によって分離することができる。例えば、画分は、平均分子量の減少に基づいて、２〜４の異なるグループに分けることができる。実施例６は、同じ全アミノ酸含有量及び末端アミド含有量を有するが異なる平均分子量を有する４つの異なる画分を調製するための一方法を記載する。驚くべきことに、例えば、異なる画分の細胞取り込みの差の結果として、身体内及び様々な組織内の炎症を軽減するために、異なる画分も異なる生物学的特性を有することが発見された。
【００８７】
したがって、本開示は、ＳＤＰの低平均分子量画分を含む、ＳＤＰを使用して炎症を軽減する及び／又は創傷治癒を増強する方法を提供する。ドライアイ疾患、及び／又は角膜創傷を含む傷害などのような、しかしこれらに限定されない、眼の状態の治療における炎症を軽減するための組成物もまた記載されている。治療は、ＳＤＰ、又は低分子量ＳＤＰ亜集団を含む製剤の投与を含み得る。特定の実施形態において、本発明は、それを必要とする対象に低分子量ＳＤＰ（例えば、ＳＤＰ‐３又はＳＤＰ‐４）を含む組成物を投与することを含む、病状及び／又は創傷を治療する方法を提供する。
【００８８】
方法は、罹患組織又は損傷組織にＳＤＰ画分の組成物を適用することを含み得る。タンパク質画分は、セリン、グリシン、及びアラニンの合計アミノ酸含有量に関して、天然のフィブロインと（絶対値差の合計を介して）少なくとも４％異なる一次アミノ酸配列を有することができる。複数のタンパク質断片は、アミド（Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２）基で終結することができる。本明細書で提供される組成物は、天然フィブロインと比較して４０％超減少したセリン含有量を有してもよく、ここでセリン含有量は少なくとも約５％である。フィブロインのフィブロイン重鎖タンパク質鎖とフィブロイン軽鎖タンパク質鎖との間のシステインジスルフィド結合は、減少又は排除され得る。いくつかの実施形態において、少なくとも７５パーセントのタンパク質フラグメントが約１００ｋＤａ未満の分子量を有する。そのような組成物は、炎症を軽減し、そして組織中の細胞移動及び／又は増殖を促進して、病状を治療し、及び／又は創傷の閉鎖を増強する。ＳＤＰ組成物は水溶液中で高い溶解度及び安定性を有する。
【００８９】
ＳＤＰ組成物画分は、約２ｋＤａから６０ｋＤａの間の平均分子量を有することができる。一実施形態では、２５〜３８ｋＤａ、３２〜３５ｋＤａ、又は約３４ｋＤａ±５％の平均分子量を有する低分子量画分が単離され、その画分は本明細書ではＳＤＰ‐４と呼ばれる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、創傷を閉鎖するための組織内での細胞移動及び増殖を促進するために、タンパク質断片の少なくとも６０パーセントが約６０ｋＤａ未満、又は約５５ｋＤａ未満の分子量を有する。別の実施形態では、少なくとも９０パーセントのタンパク質フラグメントが約１００ｋＤａ未満の分子量を有し、そして細胞移動及び組織の増殖を促進して創傷を閉じる。
【００９１】
いくつかの実施形態において、少なくとも８０パーセントのタンパク質フラグメントは、約１０ｋＤａから８５ｋＤａの間の分子量を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも５０パーセントのタンパク質フラグメントが約２０ｋＤａと６０ｋＤａの間の分子量を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも８５パーセントのタンパク質断片が約１０ｋＤａより大きい分子量を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも９０パーセントのタンパク質断片は約５ｋＤａより大きい分子量を有する。
【００９２】
特定の実施形態において、本発明は、低分子量ＳＤＰと薬学的に許容される担体とを含むＳＤＰ組成物を提供する。低分子量ＳＤＰは、６０ｋＤａ未満の平均分子量を有し得る。いくつかの実施形態では、低分子量ＳＤＰは４０ｋＤａ未満であり、この画分は炎症を軽減し、及び／又は細胞移動及び／又は増殖を増強する。
【００９３】
一実施形態では、低分子量ＳＤＰ、例えばＳＤＰ−４は、組成物中全ＳＤＰの１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上である。いくつかの実施形態では、組成物は高分子量ＳＤＰを含まず、例えば試料は約３５ｋＤａ未満の平均分子量を有する。
【００９４】
一実施形態では、ＳＤＰ‐４画分は、それぞれ５０ｍｇ／ｍＬ水溶液として、前述のようにＳＤＳ‐ＰＡＧＥ／ＩｍａｇｅＪ分析によって決定されるように３３〜３５ｋＤａの平均分子量、及びｐＨ８．１−８．３、約２３ｍＯｓｍの浸透圧、及び２５℃で約１．５〜３ｃＰの粘度を有する。
【００９５】
低分子量タンパク質フラグメントもしくは高分子量タンパク質フラグメント又はそれらの組み合わせを含むように様々な組成物を調製することができる。低分子量タンパク質フラグメントは、炎症を軽減することができ、及び／又は罹患組織表面及び／又は創傷上の細胞移動及び／又は増殖を増強することができる。低分子量タンパク質フラグメントはまた、活動的な病状及び／又は創傷の存在のために炎症組織表面を治療するのにも有用である。場合によっては、創傷治癒過程を増強するために低分子量タンパク質フラグメントの組成物を適用することが有用であり得る。これらの場合には、戦時中に戦場で獲得した傷、例えば感染症の又は痛みの軽減のため、より速い治癒を望む人の外科的傷が含まれることがある。創傷治癒過程は、細胞数の増加、ＭＭＰ−９などの炎症性分子の減少、及び／又は上皮細胞増殖の増加によって増強される。
【００９６】
高分子量タンパク質フラグメントは、基底膜への細胞接着を増大させるか、又は基底膜形成を助けることができる。場合によっては、化膿する慢性創傷又は糖尿病性潰瘍又は皮膚火傷のような治癒困難な創傷に高分子量タンパク質フラグメントの組成物を適用することが有用であり得る。低分子量タンパク質フラグメントは創傷閉鎖速度に関与し得るが、高分子量タンパク質フラグメントは創傷閉鎖品質に関与し得る。いくつかの場合において、それは、最適な創傷治癒速度及び質のために、慎重に選択された量の低分子量タンパク質フラグメント及び高分子量タンパク質フラグメントの組成物を適用するために使用され得る。創傷治癒プロセスは、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）のような構造タンパク質及び／又は帯状小帯（ＺＯ‐１）構造のような細胞間の密着結合を増加させることによって増強される。
【００９７】
ＳＤＰー４のような低平均分子量画分は、ＳＤＰ及びより高い分子量の画分とは区別される特定の性質を有する。例えば、ＳＤＰ細胞取り込みはペプチド鎖の分子量に依存する。サイズが約６０ｋＤａより小さいＳＤＰペプチド分子は、培養中の細胞、より具体的にはヒト角膜輪部上皮（ｈＣＬＥ）細胞によって容易に吸収される。サイズが約６０ｋＤａより大きいＳＤＰ分子は、細胞培養によって吸収されることからほとんど排除される。ＳＤＰ分子は、リソソームエンドサイトーシス分解経路のマーカーであるリソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ−１）と共局在しないことに留意することもまた重要である。結果として、ＳＤＰ分子は、特定されていない細胞膜受容体と会合するように見え、ここではその後に約６０ｋＤａ未満の分子がｈＣＬＥ細胞によって吸収されるのである。さらに重要なことに、ＳＤＰ分子はリソソーム分解経路を介して吸収されないので、それらは生物学的に利用可能でありそして生物学的活性を引き出すことができる。
【００９８】
ＳＤＰ製剤
本明細書中に記載されるＳＤＰ組成物及びサブフラクションは、水及び／又は薬学的担体と共に処方され得る。医薬担体は、例えば、リン酸緩衝食塩水、フィルム、繊維、フォーム、ヒドロゲル、タンパク質又はポリマーマトリックス、三次元足場、微粒子、ナノ粒子、ポリマー、又はマットであり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質断片は、角膜移植片、創傷被覆材、コンタクトレンズ、組織、組織移植片、又は分解性材料などの基材に付着させることができる。特定の実施形態では、担体は、例えば眼科用製剤中のリン酸緩衝食塩水である。
【００９９】
いくつかの実施形態において、眼科用組成物は、ヒト又は哺乳動物におけるドライアイ症候群の治療のために提供される。本明細書で提供される組成物は、ドライアイ症候群を治療するのに有効な量のＳＤＰを含む水溶液であり得る。例えば、水溶液中のＳＤＰの有効量は、約０．０１重量％から約８０重量％のＳＤＰであり得る。他の実施形態では、水溶液は、約０．１重量％から約１０重量％、又は約０．５重量％から約２重量％のＳＤＰを含み得る。特定の実施形態では、眼科用組成物は、約０．０５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約０．１％ｗ／ｖのＳＤＰ、約０．２％ｗ／ｖのＳＤＰ、約０．２５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約０．５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約０．７５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約１％ｗ／ｖのＳＤＰ、約１．５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約２％ｗ／ｖのＳＤＰ、約２．５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約５％ｗ／ｖのＳＤＰ、約８％ｗ／ｖのＳＤＰ、又は約１０％ｗ／ｖのＳＤＰを含み得る。
【０１００】
様々な実施形態において、眼科用製剤は、粘滑剤、緩衝剤、及び／又は安定化剤などの追加の成分を水溶液中に含むことができる。粘滑剤は、例えば、ヒアルロン酸（ＨＡ）、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、デキストラン、ゼラチン、ポリオール、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール（ＰＧ）、ヒプロメロース、グリセリン、ポリソルベート８０、ポリビニルアルコール、又はポビドンであり得る。粘滑剤は、例えば、約０．０１重量％から約１０重量％、又は約０．２重量％から約２重量％で存在することができる。特定の一実施形態では、粘滑剤はＨＡである。様々な実施形態において、ＨＡは製剤の約０．２重量％で存在し得る。
【０１０１】
眼科用製剤の緩衝剤又は安定剤は、リン酸緩衝食塩水、ホウ酸緩衝食塩水、クエン酸緩衝食塩水、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、重炭酸ナトリウム、塩化亜鉛、塩酸、水酸化ナトリウム、エデト酸二ナトリウム又はそれらの組み合わせであり得る。
【０１０２】
眼科用製剤は、有効量の抗菌保存剤をさらに含み得る。抗菌保存剤は、例えば、過ホウ酸ナトリウム、ポリクアテリウム‐１（例えば、Ｐｏｌｙｑｕａｄ（登録商標）保存剤）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）、亜塩素酸ナトリウム、ブリモニジン、ブリモニジンピューライト、ポレキシトニウム、又はそれらの組み合わせであり得る。
【０１０３】
眼科用製剤はまた、有効量の血管収縮薬、抗ヒスタミン薬、又はそれらの組み合わせを含み得る。血管収縮薬又は抗ヒスタミン剤は、塩酸ナファゾリン、塩酸エフェドリン、塩酸フェニレフリン、塩酸テトラヒドロゾリン、マレイン酸フェニラミン、又はそれらの組み合わせであり得る。
【０１０４】
一実施形態では、眼科用製剤は、水及び１つ又は複数の眼科用成分と組み合わせて、本明細書に記載の有効量のＳＤＰを含むことができる。眼科成分は、例えば、ａ）ポリビニルアルコール、ｂ）ＰＥＧ及びヒアルロン酸。ｃ）ＰＥＧ及びプロピレングリコール、ｄ）ＣＭＣ及びグリセリン。ｅ）プロピレングリコール及びグリセリン、ｆ）グリセリン、ヒプロメロース、及びＰＥＧ、又は前述の成分のうちの任意の１つ以上の組合せであり得る。眼科用製剤は、ＨＰ‐グアー、ホウ酸塩、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化亜鉛などのような１種以上の不活性成分を含むことができる。眼科用製剤はまた、亜塩素酸ナトリウム（Ｐｕｒｉｔｅ（登録商標）保存剤（ＮａＣｌＯ２）、ポリクワッド、ＢＡＫ、ＥＤＴＡ、ソルビン酸、ベンジルアルコールなどの１つ以上の眼科用保存剤を含み得る。眼科用成分、不活性成分及び保存剤は、約０．１％〜約５％ｗ／ｖで、例えば約０．２５％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、２％、２．５％、もしくは５％、又は前述のいずれか２つの間の範囲で含まれ得る。
【０１０５】
ヒト又は哺乳動物における眼科的障害の治療のための眼科用製剤を調製することができ、ここで眼科用製剤は水及び上記のような有効量のＳＤＰを含む。眼科用組成物は、ヒト又は哺乳動物における眼科治療として使用することができ、ここで眼科用組成物は、水、緩衝剤及び安定化剤のうちの１つ以上、ならびに有効量のＳＤＰ又はそのサブフラクションを含む。
【０１０６】
ＳＤＰは水中で非常に安定であり、貯蔵寿命の溶液安定性は溶液中の天然絹フィブロインのそれの２倍を超える。例えば、ＳＤＰは水中で非常に安定であり、貯蔵寿命の溶液安定性は溶液中の天然絹フィブロインと比較して１０倍を超えて大きい。ＳＤＰ材料は、水溶液中にあるとき、５％（５０ｍｇ／ｍＬ）の濃度で溶液を超音波処理してもゲル化しない。他の実施形態では、ＳＤＰ材料は、水溶液中にあるとき、１０％（１００ｍｇ／ｍＬ）の濃度で溶液を超音波処理してもゲル化しない。
【０１０７】
治療法
本発明は、炎症、例えばヒト角膜上又はヒト角膜内の炎症を軽減するための製剤中のＳＤＰの使用を提供する。そのような炎症の減少は、インビトロ及びインビボの両方の実験モデルにおいて実証されている。具体的には、ＳＤＰが、体内の炎症の既知の推進因子であるＮＦ‐κＢ関連細胞シグナル伝達経路（図１及び図２参照）を阻害することによってヒト角膜モデルにおける炎症を軽減するように作用することを示すための研究が行われた。その具体的な例はドライアイ疾患である。これらの経路の阻害は、最終的にはドライアイ及び眼の炎症の既知の推進因子であるＭＭＰ−９の遺伝子発現及び組織滞留の減少をもたらすことが見出された（図４参照）。ここに挙げた研究は角膜の炎症に特有のものであるが、影響を受ける生物学的過程も身体のさまざまな組織全体に見られる。結果として、角膜に関して本明細書に開示された研究は、上皮表面を含む他の組織系に拡張することができ、そのような一例が皮膚である。
【０１０８】
したがって、本発明は、目的の部位へのＳＤＰの投与を含む、炎症を軽減し、角膜創傷を含む創傷を治療する方法を提供する。方法は、絹由来タンパク質（ＳＤＰ）、又はその分子画分の組成物を含む製剤を、炎症を起こした組織、例えば創傷中の生きた動物組織に投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、対象は、例えばドライアイ疾患の場合のように炎症組織をもたらす眼の症状を有する。いくつかの実施形態では、創傷は眼の創傷、外科的創傷、切開、又は擦過傷である。眼の創傷は、例えば、角膜創傷であり得る。
【０１０９】
したがって、ＳＤＰは、創傷、感染症、又は疾患などの状態によって引き起こされる炎症を治療及び／又は軽減するために使用することができる。そのような状態の例には、眼の創傷、外科的創傷、切開、又は擦過傷が含まれる。場合によっては、炎症は、ドライアイ疾患又は症候群、角膜潰瘍、角膜糜爛、角膜剥離、角膜変性、角膜穿孔、角膜瘢痕化、上皮欠損、角結膜炎、特発性ぶどう膜炎、角膜移植、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ、湿性又は乾性）、糖尿病性眼症、眼瞼炎、緑内障、高眼圧症、術後の眼の痛み及び炎症、後区血管新生（ＰＳＮＶ）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、サイトメガロウイルス網膜炎（ＣＭＶ）、眼内炎、脈絡膜血管新生膜（ＣＮＶＭ）、血管閉塞性疾患、アレルギー性眼疾患、腫瘍、網膜色素変性症、眼感染症、強膜炎、眼瞼下垂、縮瞳、眼の痛み、散瞳、神経痛、瘢痕化眼球表面疾患、眼の感染症、炎症性眼疾患、眼表面疾患、角膜疾患、網膜疾患、全身性疾患の眼症状、遺伝性眼症状、眼球腫瘍、眼内圧上昇、ヘルペス感染症、翼状片（強膜腫瘍）、眼表面に持続する創傷、光屈折角膜切開術後の眼の痛み及び炎症、角膜への熱的又は化学的熱傷、強膜創傷、円錐角膜及び結膜創傷などの眼症状によって引き起こされる。いくつかの実施形態において、炎症及び／又は眼の状態は、加齢、自己免疫状態、外傷、感染、変性疾患、内皮ジストロフィー、及び／又は手術によって引き起こされる。１つの特定の例において、ＳＤＰはドライアイ症候群を治療するための製剤中に使用される。
【０１１０】
したがって、様々な実施形態において、ＳＤＰ‐４などのＳＤＰ及び／又はその画分は、ドライアイ症候群を引き起こす炎症を軽減するために、眼環境の細胞内で、活性酸素種（ＲＯＳ）、例えば、過酸化水素の掃去を通して、標準的なＮＦ‐κＢ経路の酸化還元調節活性化のメディエータを阻害するために使用できる。ドライアイ症状の軽減の証拠は、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路の活性化によって引き起こされるＭＭＰ−９及びＴＮＦ−α遺伝子転写の減少であり得る。さらに、角膜組織中のＭＭＰ−９酵素の存在もまた減少するであろう。
【０１１１】
以下の実施例は上記発明を説明することを意図し、その範囲を狭めるように解釈されるべきではない。当業者は、実施例が本発明を実施することができる他の多くの方法を示唆することを容易に認識するであろう。本発明の範囲内に留まりながら、多数の変形及び修正がなされ得ることを理解されたい。
【実施例】
【０１１２】
実施例１  ＳＤＰ調製及びローレンス安定性試験
材料。カイコの繭は、但馬商事株式会社、日本から得た。臭化リチウム（ＬｉＢｒ）は、ノースカロライナ州のＦＭＣ  Ｌｉｔｈｉｕｍ，Ｉｎｃ．から入手した。オートクレーブはニューヨーク州Ｔｕｔｔｎａｕｅｒ  Ｌｔｄ．から入手した。３．５ｋＤａ分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）透析膜は、マサチューセッツ州のＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．から入手した。Ｏａｋｔｏｎ  Ｂｒｏｍｉｄｅ（Ｂｒ−）二重接合イオン選択性電極は、イリノイ州Ｏａｋｔｏｎ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＩＳＥから入手した。
【０１１３】
処理。ＳＤＰとＰＡＳＦの２つのサンプルを用意した。簡単に説明すると、ＳＤＰは、２３３ｍＬの水／１グラムの繭で０．３重量％のＮａＣＯ３を含有する９５℃に加熱された脱イオン水（ｄｉＨ２Ｏ）に、蛹のないカットカイコ繭（３〜５カット／繭）を浸漬することによって製造された。繭をこの溶液中で７５分間撹拌してセリシンを溶解させ、それによって絹繊維からそれを放出させた。続いて、繊維を一すすぎ当たり２０分間、ｄｉＨ２Ｏの同様の希釈液中で４回洗浄して、残留セリシンを除去した。次いで、繊維を対流式オーブン中で６０℃で２時間乾燥し、秤量し、そして抽出繊維１ｇ当たり４×ＬｉＢｒ体積の比で水中の５４重量％ＬｉＢｒに溶解した。この溶液を覆い、次いで対流式オーブン中で６０℃で２時間温めて抽出繊維の溶解を促進させた。次に溶液をオートクレーブに入れ、そしてフィブロイン変換を促進するために３０分間滅菌条件（１２１℃、１７ＰＳＩ、９７〜１００％湿度）に曝した。得られたフィブロイン溶液を室温に冷却させ、次いでｄｉＨ２Ｏで５％に希釈し、３，５００ＤａのＭＷＣＯ膜を用いて透析してＬｉＢｒ塩を除去した。オークトンブロマイド（Ｂｒ−）二重接合イオン選択性電極上で読み取った加水分解フィブロイン溶液中で測定してＢｒ−イオンが１ｐｐｍ未満になるまで、ｄｉＨ２Ｏ中で多重交換を行った。その後、溶液を１〜５μｍの多孔度フィルターを使用してさらにろ過し、続いて０．２μｍの研磨フィルターでろ過した。
【０１１４】
「対照」絹フィブロイン溶液を調製して「ＰＡＳＦ溶液」を得た。オートクレーブ工程を除いて、上記と同じプロセスを実施した。各サンプルからのサンプリング体積（５ｍＬ）を別々の２０ｍＬガラスビーカーに入れ、ビーカーをホイルで密封した。次に試料をローレンス安定性試験にかけた。
【０１１５】
ローレンス安定性試験は、タンパク質試験水溶液（５％ｗ／ｖ、５０ｍｇ／ｍＬ）をオートクレーブチャンバー内に入れることによって行われる。次いでオートクレーブを１２１℃、１７ＰＳＩ、３０分間、湿度９７〜１００％で１サイクル活性化する。サイクルが完了した後、溶液を冷却させ、次いでオートクレーブチャンバーから取り出す。次に溶液を振とうして溶液のゲル化挙動を観察する。溶液が〜１０秒間振盪してゲル化した場合、試料はローレンス安定性試験に不合格となる。試験に不合格であることは、その物質がタンパク質溶液として本質的に不安定であることを示している。
【０１１６】
ＳＤＰ溶液とＰＡＳＦ溶液の両方でローレンス安定性試験を実行した。ＰＡＳＦ溶液試料は直ちにゲル化したため、ローレンス安定性試験に不合格となった。逆に、ＳＤＰ溶液試料はいつまでも溶液のまま留まり、したがってローレンス安定性試験に合格した。ゲル化の欠如は、ＳＤＰ溶液製造が上記の条件下でオートクレーブ処理工程を組み込んでいるという事実に起因し得る。
【０１１７】
実施例２  ＳＤＰ分子量の特徴付け
可溶化タンパク質の分子量分布に対する処理の効果を評価するために、ＳＤＰ溶液及びＰＡＳＦ溶液を、タンパク質を分子量によって分離するポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にかけた。具体的には、各試料１５μｇを、ドデシル硫酸ナトリウム及びジチオトレイトール（Ｂｉｏｒａｄ  Ｉｎｃ．、ＣＡ）を含有するランニング緩衝液と混合して、二次折り畳み構造及びジスルフィド結合をそれぞれ除去した。混合物を次に７０℃に５分間加熱した。混合物を、２．５〜２００ｋＤａの分子量ラダー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）と共に、ビス−Ｔｒｉｓ緩衝塩を含有するプレキャスト４〜１２％ポリアクリルアミド勾配ゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ）上にロードし、次いでＢｉｏＲａｄ  ＰｏｗｅｒＰａｃ  Ｐｏｗｅｒ電源（ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｃ．、ＣＡ）により、１２０Ｖの電場に９０分間曝露した。次いで、ゲルを取り出し、タンパク質を染色するために１２時間クマシーブルー染色液に入れ、続いてｄｉＨ２Ｏ中で６時間洗浄した。次いでゲルをＢｉｏｒａｄ  ＧＳ−８００  Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  Ｄｅｓｉｔｏｍｅｔｅｒ（ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｃ．、ＣＡ）でスキャンした。
【０１１８】
結果は、ＳＤＰ溶液を調製するために使用された処理が、天然フィブロイン（ＰＡＳＦ）についての９７ｋＤａからＳＤＰについての約５３ｋＤａへと重量平均分子量を有意にシフトさせることを示す。分子量のシフトは、もとの天然のフィブロインの一次及び二次構造の変換及び末端アミド形成開裂によるペプチド鎖の分解を明らかに示している。加えて、フィブロインのフィブロイン軽鎖はオートクレーブ処理後にＳＤＰ中に存在せず（先行技術のフィブロインについてはレーン２において２３〜２６ｋＤａで可視）、これはタンパク質のフィブロイン軽鎖部分が処理によって分解され又は除去されたことを示す。これらの結果は、オートクレーブ処理が天然のフィブロインタンパク質を、天然のフィブロインタンパク質よりも小さいペプチドフラグメントを有する新しい材料に変換することを実証している。このプロセスはフィブロイン軽鎖をさらに分解／修飾する。これらの変換は、これらの化学変化の結果として、向上した溶液安定性を有するＳＤＰ材料をもたらす。
【０１１９】
ＳＤＰのさらなる分析は、組成物の平均分子量が約５３ｋＤａであることを示している。さらに、ＳＤＰのペプチド鎖の約７７％が１０〜１００ｋＤａの範囲内にあり、ＳＤＰのペプチド鎖の約７３％が１０〜８５ｋＤａの範囲内にあり、ＳＤＰのペプチド鎖の約６６％が１５〜８５ｋＤａの範囲内にあり、ＳＤＰのペプチド鎖の約４９％が２０〜６０ｋＤａの範囲内にあり、ＳＤＰのペプチド鎖の約３１％が２５〜５０ｋＤａの範囲内にあることを示している。
【０１２０】
実施例３  ＳＤＰ安定性試験
先行技術のフィブロインの安定性と比較して、得られたＳＤＰの安定性に対するオートクレーブプロセスの機能的影響をさらに決定するために、絹フィブロインタンパク質ゲル化の十分に特徴付けられたモデルを模倣するために、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２００８、２９（８）：１０５４〜１０６４）の方法を用いて試料を分析した。両方のサンプルの体積（０．５ｍＬ、ＳＤＰ及びＰＡＳＦ）を１．７ｍＬの透明遠心管に加え、超音波処理（２０ｋＨｚ、１５秒間）にかけた。次いで、溶液を含む透明な管をゲル化のスクリーニングとしてゲル形成について視覚的にモニターした。
【０１２１】
ＳＤＰ溶液試料はゲルを形成することができず、安定性が向上したことを実証した。超音波処理後３ヶ月でさえ、ＳＤＰ試料は溶液のままで、目視検査によって決定されるようにタンパク質凝集を欠いた。超音波処理後、ＰＡＳＦ溶液試料は急速に（２時間以内に）ゲル化した。これらの結果は、オートクレーブプロセスが天然の単離されたフィブロインを新しい材料に変換し、得られるＳＤＰ材料に対する安定性を誘導することをさらに示す。
【０１２２】
実施例４  ヒト角膜輪部上皮（ｈＣＬＥ）培養におけるＮＦ‐κＢ細胞シグナル伝達経路のインビトロ分析
Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｆａｃｔｏｒ−κＢ：Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｉｎ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（核因子−κＢ：眼表面炎症及び疾患における中心的調節因子）、Ｔｈｅ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ、１０、１３７〜１４８（２０１２））に記載されているｐ６５アッセイを用いて、ｈＣＬＥ細胞培養物に対するＳＤＰの潜在的な抗炎症活性を評価した。前述のように、核転写因子ｐ６５はＮＦ−κＢ複合体の一部であり、これは活性化の際に細胞核に転座してＴＮＦ−α及びＭＭＰ−９を含む炎症誘発性遺伝子発現を促進する。インビトロでｐ６５活性を評価するために、コンフルエントなｈＣＬＥ培養物を、ＰＢＳ又はＮＦ‐κＢ経路の自己分泌メディエータである強力な炎症性サイトカインＴＮＦ‐αを含有するＰＢＳのいずれかで処理した。次に細胞を、ＰＢＳ又は０．１％又は１．０％のＳＤＰを含有するＰＢＳでそれぞれ処理した。ｐ６５の染色は、未処置の対照については主に細胞質に局在していたが、これは非炎症状態の細胞について予想される（図１Ａ）。しかしながら、培地中のＴＮＦ−αで攻撃した細胞についてはｐ６５染色は核に限定された。これはＮＦ−κＢ炎症経路の活性化が起こったことを示している（図１Ｂ）。興味深いことに、ＳＤＰ処理細胞のｐ６５染色は細胞質に大部分限定され、用量依存的隔離を示し、それによってより高いＳＤＰ濃度を投与した細胞では核局在化がより少なく示された（図１Ｃ−Ｄ）。これらの結果は、ＳＤＰタンパク質がインビトロでヒト角膜上皮におけるＮＦ−κＢ炎症反応を阻害することを示している。
【０１２３】
ＳＤＰによるＮＦ‐κＢ炎症性シグナル伝達経路の阻害は、ＮＦ‐κＢ駆動炎症過程の間にアップレギュレートされることが知られているＴＮＦ‐α及びＭＭＰ‐９遺伝子発現を特徴付けることによってさらに調べられた。より具体的には、ＴＮＦ−α及びＭＭＰ−９の増大した遺伝子発現は、ＮＦ−κＢの活性化によって媒介され、そして炎症性細胞シグナル伝達経路についてのバイオマーカーである。ＰＢＳ及びＴＮＦ−αサイトカインの両方とプレインキュベートし、次いで上述の０．５重量／体積％ＳＤＰの存在下及び非存在下で処理したｈＣＬＥ培養物に対してｑＰＣＲを用いて遺伝子発現を測定した。ＳＤＰの添加がＴＮＦ−α及びＭＭＰ−９の基礎遺伝子発現に変化を引き起こさないことが観察された（図２）。しかしながら、ＴＮＦ−αによる刺激は両方の遺伝子の発現の有意な上昇を引き起こし（図２）、それはヒトＮＦ−κＢ駆動炎症カスケードを複製する。重要なことには、ＴＮＦ−α刺激時のＳＤＰによる処置は、ＴＮＦ−α及びＭＭＰ−９の両方の発現における〜６倍の減少を誘発し、それによってＴＮＦ−α媒介ＮＦ−κＢ遺伝子の発現に対するＳＤＰの強力な抗炎症効果を実証する。κＢ遺伝子の発現これらの結果は、ＳＤＰがＮＦ−κＢ活性化を阻害し、そしてその結果として炎症誘発性遺伝子発現を阻害する（すなわち、ＴＮＦ−α及びＭＭＰ−９）ことをまとめて支持する、以前のｐ６５アッセイ結果を裏付ける。
【０１２４】
次に、ウサギ角膜上皮損傷モデルにおいて研究を行い、ＳＤＰの抗炎症効果をインビボで延長することができるかどうかを評価した。ウサギを角膜上皮の外科的露出により急性炎症性カスケードを誘発させ、次いで７２時間かけてＰＢＳ、ＰＢＳ＋０．５％、又はＰＢＳ＋２％ＳＤＰの点眼剤で、完全な上皮の治癒が起こるまで約５０μＬの液滴量で６時間の投与頻度で処置した。次いで、移植した組織を凍結切片化し、そしてＭＭＰ−９タンパク質に対する抗体で免疫染色した。Ｋａｕｆｍａｎｎ（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＭＰ−９  Ｄｉａｇｎｏｓｅｓ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｍａｙ  Ｈｅｌｐ  Ｐｒｅｖｅｎｔ  Ｉｔｓ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＭＭＰ−９の実際的な検出は眼表面疾患を診断し、その合併症を予防するのを助ける可能性がある）、Ｃｏｒｎｅａ、３２（２）、ｐ２１１−２１６（２０１３））によって記載されているように、染色の存在の減少が最小限の炎症が起こっていることを示すので、天然の傷のないウサギ角膜は予想通り最小限のＭＭＰ‐９発現を示した（図３Ａ）。しかしながら、角膜露出、それに続くＰＢＳ処置は、上皮層全体にわたって強力なＭＭＰ−９発現を示し、高度の炎症が起こったことを示した（図３Ｂ）。
【０１２５】
興味深いことに、ウサギ角膜ＭＭＰ−９発現の用量依存的減少が、ＳＤＰを含有する点眼剤の使用により観察された（図３Ｃ及び３Ｄ）。具体的には、ＭＭＰ−９免疫染色は、２％ＳＤＰで処置した角膜について４倍まで有意に減少した（図３Ｅ）。重要なことには、弱毒化ＭＭＰ−９発現は、ＳＤＰ治療による頑健な層状角膜上皮によって証明されるように、保護角膜上皮層の完全性を損なわなかった。これらのデータは、ＳＤＰ濃度の増加に伴うＭＭＰ−９の減少によって証明される、損傷後の角膜上皮組織内の炎症をＳＤＰ治療が減少させなければならないという影響を示している。さらに、これらの結果は、生きている動物組織環境内でのＳＤＰの有効な抗炎症能力を実証し、以前のインビトロ研究を裏付けるものである。
【０１２６】
ＳＤＰのインビボ抗炎症作用をさらに強化するために、損傷の７２時間後にウサギ角膜上皮から抽出した逆転写全ＲＮＡに対してｑＰＣＲを実施した。具体的には、炎症性シグナル伝達の２つの重要なバイオマーカー、サイトカインインターロイキン（ＩＬ）−１β及びＩＬ−６を評価した。ＳＤＰ処理の存在下では、ＩＬ−１β及びＩＬ−６の両方の発現が有意に減少した（図４）。ＰＢＳ処置対照動物と比較した場合、両方のＳＤＰ濃度について遺伝子発現においてそれぞれ７５％及び９５％の減少があった。これらの知見は、インビボで炎症性遺伝子発現を阻害するＳＤＰの能力を実証し、さらに上記のインビボ及びインビトロのデータを実証する。まとめると、実験的証拠は、ＳＤＰがインビボで炎症過程を阻害することを示し、これはＳＤＰの存在によるＮＦ‐κＢ炎症性シグナル伝達経路活性化の阻害に直接関係しているように思われる。
【０１２７】
材料及び方法。
ＳＤＰの生産。Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉカイコの繭は、但馬商事株式会社（横浜、日本）から購入した。絹溶液は、それぞれ３片に切断された５ｇの繭のバッチから調製された。繭を２Ｌの０．０３Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）中で４５分間煮沸してセリシンタンパク質を除去した。脱イオン水中で４回すすいだ後、抽出された絹フィブロイン繊維を室温で一晩乾燥させた。乾燥した絹フィブロイン繊維を次に９．７Ｍ  ＬｉＢｒ溶液（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）の濃縮溶液に６０℃で２時間溶解した。その後、溶液を１５ＰＳＩ下、１２１℃で３０分間オートクレーブしてＳＤＰ化学変換を行った。次いで、オートクレーブ処理したＳＤＰ溶液を、３，５００の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有するスネーク−スキン透析チューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）を用いて約２００倍体積の水に対して４８時間透析し、１、４、８、１２、１２、及び１２時間間隔で６回水交換した。透析した溶液を次に１０，０００×ｇで２０分間２回遠心分離して、毎回上清をデカントすることによって不純物を除去した。次に、ＳＤＰ溶液の試料１ｍＬ（ｎ＝３）の乾燥減量を測定することによってタンパク質濃度を計算した。溶液を最後に滅菌水を使用して５重量／体積％（５０ｍｇ／ｍＬ）濃度に希釈し、使用するまで４℃で保存した。
【０１２８】
ヒト角膜上皮細胞培養物。ヒト角膜輪部上皮（ｈＣＬＥ）細胞を液体窒素中での保存から解凍し、０．２ｎｇ／ｍＬのマウス上皮成長因子（ＥＧＦ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）、ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、ＶＷＲ、Ｉｎｃ．）及び０．１％ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）を添加したケラチノサイト‐ＳＦＭ培地（Ｋ‐ＳＦＭ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）中で７２時間培養した。通常の継代の間、標準的な細胞培養条件（３７℃、５％ＣＯ２、＞９５％湿度）を使用した。
【０１２９】
ＮＦ−κＢ活性化のためのｈＣＬＥｐ６５染色及び蛍光顕微鏡分析。
ｈＣＬＥ細胞を、１ウェルあたり２５，０００細胞の播種密度で約８０％の密集度まで増殖させた。ｈＣＬＥをガラス底２４ウェルプレート中でＤＭＥＭ／Ｆ１２培地と共に培養した。ヒト組換えＴＮＦ−α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ロンドン、英国）を、刺激培養のために１２時間のチャレンジにわたって１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ｎｇ／ｍＬで補った。ＳＤＰを１ｍｇ／ｍＬ及び１０ｍｇ／ｍＬの濃度で選択した培養物に添加した。実験の完了時に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の新たに作製した４％パラホルムアルデヒドを使用して培養物を固定した。ヒトｐ６５抗体（Ａｎｔｉ−ＮＦ−κＢｐ６５、ａｂ１６５０２、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）をＰＢＳ中１％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ中に１：２００希釈で添加し、４℃で一晩インキュベートした。抗ウサギに反応性の二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）をＰＢＳ中１：５００希釈で添加した。さらに、ＤＡＰＩ核染色剤（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）をＰＢＳ中１：１０，０００希釈で添加した。
【０１３０】
１．６  Ｏｐｔｉｖａｒ光学系を利用する６３倍対物レンズを使用して蛍光画像を撮影した。テキサスレッドフィルタチャンネルを使用して、Ｚスタック画像（１０〜２５層の範囲）を０．２５μｍのスライスで撮影した。バックグラウンド蛍光の低減を補助するために、３Ｄ  Ｈｕｙｇｅｎｓ  Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＢＶ、オランダ）を使用して、各ｚスタックに対して画像デコンボリューションを行った。反復回数を増やしても画質の向上にはほとんど影響がないことがわかったため、各ｚスタックに対してソフトウェアの従来の最尤推定アルゴリズムを使用して、合計４０回の反復を実行した。他のすべての設定は製造元のデフォルト設定のままにした。ソフトウェアに含まれる最大強度投影（ＭＩＰ）アルゴリズムを使用して画像を生成した。ここで、ＭＩＰ閾値レベルは、各チャネルについて相対蛍光強度閾値を確立するために、対照角膜組織に対するデフォルト製造業者の設定によって最初に決定された。
【０１３１】
定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によるＴＮＦ−α刺激炎症アッセイ及び遺伝子発現分析。ｈＣＬＥ細胞を３５ｍｍ皿に播種し、ＰＢＳ又はＰＢＳ＋１ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＴＮＦ−αのいずれかを投与する前に、〜８０％の密集度まで増殖させた。次に培養物を３７℃で６時間インキュベートした。次いで培地を吸引し、細胞を温かい１×ＰＢＳで洗浄した後、それらを５ｍｇ／ｍＬ濃度で濃度が一致したＳＤＰ画分で６時間処理し、一方対照群には同量のＰＢＳを投与した。規定時間経過後、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、バレンシア、カリフォルニア州、米国）を用いて細胞から全ＲＮＡを回収し、ＲＮＡの完全性及び量を電気泳動及びフローサイトメトリー（２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）及びＵＶ吸収（ナノドロップ分光光度計、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて検証した。その後、各試料からの４５０ｎｇの全ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。
【０１３２】
ＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）を使用して、ＳｔｅｐＯｎｅ  ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）で定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った。炎症性刺激（天然）に対する陰性対照として、ＴＮＦ−αで刺激しなかった細胞から採取した全ＲＮＡで遺伝子発現を行った。候補遺伝子の発現は、内因性対照遺伝子β−アクチンに対して正規化した。２（‐ΔΔＣｔ）法を使用して相対的定量を行い、条件ごとに３つの生物学的３連（Ｎ＝３、ｎ＝３）を含む各条件について３つの実験を実行した。母集団の平均は各実験からの平均値を平均することによって得られ、プールされた標準偏差が各群について計算された。最初に一方向ＡＮＯＶＡを実行し、続いて事後ｔ検定を行って、エクセルソフトウェア（Ｖｅｒ．１４．６．７、マイクロソフト社）及びＳｔａｔＰｌｕｓ：ｍａｃ  ＬＥソフトウェア（Ｖｅｒ６．１．５．１、ＡｎａｌｙｓｔＳｏｆｔ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ウォルナット）を使用してｐ値を決定することにより、ｄＣｔ値を使用して、群間で統計的比較を行った。以下の特異的プライマーセットを、β−アクチン、ＴＮＦ−α及びＭＭＰ−９（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡから入手）に使用した。
【表１】
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【０１３３】
ウサギ角膜損傷モデル、免疫組織化学的蛍光画像解析、及びｑＰＣＲ遺伝子転写解析。すべての動物は、施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルの下で、眼科及び視覚研究における動物の使用に関するＡＲＶＯ声明に従って取り扱われた。１２匹の８〜１０週齢のニュージーランド白ウサギを用いて、インビボでのＭＭＰ−９産生を減少させるＳＤＰの能力を評価した。ウサギを、３５〜５０ｍｇ／ｋｇのケタミン、５〜７．５ｍｇ／ｋｇのキシラジン、及び０．７５ｍｇ／ｋｇのアセプロマジンの筋肉内注射で麻酔した。局所用プロパラカイン０．５重量／体積％点眼薬も補助麻酔薬として使用した。次いで、＃１５バード−パーカーブレードを使用して、７ｍｍの中心角膜上皮を除去して上皮表面に空隙を作り出した。
【０１３４】
続いて、ウサギを３つの処置群に分け、そこで創傷角膜表面を２００μＬの滅菌リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、ビヒクル処置）、５ｍｇ／ｍＬ（すなわち０．５％）又は２０ｍｇ／ｍＬ（すなわち、２％）ＰＢＳ中ＳＤＰ溶液のいずれかで処置した。手術の直後に、その後完全な上皮閉鎖が起こるまで６時間の間隔で、局所モキシフロキサシン抗生物質滴剤（Ｖｉｇａｍｏｘ、Ａｌｃｏｎ、Ｉｎｃ．）と共に、処置を創傷眼に局所投与した。治癒過程全体を通して、ウサギを苦痛又は感染の証拠について厳密にモニターし、そして５０μＬの局所フルオレセイン溶液（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）を損傷角膜に適用し、コバルトブルー照明下細隙灯写真撮影を用いて創傷を画像化することにより６時間毎に上皮創傷閉鎖を調べた。
【０１３５】
過量のペントバルビタール（１５０ｍｇ／ｋｇ）を耳静脈に投与して、創傷治癒が完了した直後（術後７２時間）に各処置群からの動物を屠殺し、各処置群からの角膜を摘出し、切除した。最初の３匹のウサギについては、治癒した上皮表面を除去し、そしてトリゾール−クロロホルム法（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）を用いて全ＲＮＡを抽出した。各試料からの全ＲＮＡを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。次いでｃＤＮＡを使用するまで−８０℃で凍結した。
【０１３６】
残りの３匹のウサギは、４０分間、２重量／体積％のパラホルムアルデヒド中で直ちに固定した角膜を摘出した（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）。外科的露出を受けなかった反対側の眼からの角膜もまた収穫されそして固定され、創傷治癒過程のためのネガティブコントロールとして役立った。続いて、固定された角膜をＰＢＳ中で５分間ずつ３回洗浄し、次いで、Ｔｉｓｓｕｅ−ＴＥＫ  Ｏ．Ｃ．Ｔ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．、トーランス、カリフォルニア州、米国）に埋め込む前に４℃で一晩３０重量／体積％のスクロースに入れ、低温切片化のために−８０℃で凍結した。免疫組織化学的染色及び分析のために、角膜の中心を通る厚さ１０ミクロンの断面を得て、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ−ｐｌｕｓガラススライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）上に載せた。サンプルをＰＢＳ中で３回洗浄し、次いで１重量／体積％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．２５重量／体積％Ｔｒｉｔｏｎ‐Ｘ‐１００（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び２．５重量／体積％の１×ＰＢＳ中ヤギ血清を含有するブロッキング緩衝液中、室温で１時間、インキュベートした。ブロッキング後、サンプルをＭＭＰ−９用ネズミ一次抗体溶液（１：１００）（ａｂ５８８０３、Ａｂｃａｍ  ＰＬＣ、ケンブリッジ、英国）と共に４℃で一晩インキュベートした。
【０１３７】
続いて、サンプルをＰＢＳで十分にすすぎ、次いで、光から保護しながら、１：５００希釈で、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８グリーンヤギ抗マウス二次抗体（ａｂ１５０１１３、Ａｂｃａｍ  ＰＬＣ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）と共に室温で1時間インキュベートした。試料はまた、１：２００希釈のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８ファロイジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）を用いて室温で２０分間染色し、アクチン細胞骨格構造を染色するために光から保護した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞核を染色するために、サンプルをＤＡＰＩを含むＶＥＣＴＡＳＨＩＬＤマウント媒体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてマウントし、イメージングの前にガラス製のカバーガラスで覆った。
【０１３８】
１．６  Ｏｐｔｉｖａｒ光学系を利用する６３倍対物レンズを使用して蛍光画像を撮影した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）フィルターチャネルを使用して、Ｚ−スタック画像（１０〜２５層の範囲）を０．２５μｍのスライスで捕捉した。バックグラウンド蛍光の低減を補助するために、３Ｄ  Ｈｕｙｇｅｎｓ  Ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎソフトウェア（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＢＶ、オランダ）を使用して、各ｚスタックに対して画像デコンボリューションを行った。反復回数を増やしても画質の向上にはほとんど影響がないことがわかったため、各ｚスタックに対してソフトウェアの従来の最尤推定アルゴリズムを使用して、合計４０回の反復を実行した。他のすべての設定は製造元のデフォルト設定のままにした。ソフトウェアに含まれる最大強度投影（ＭＩＰ）アルゴリズムを使用して画像を生成した。ここで、ＭＩＰ閾値レベルは、各チャネルについて相対蛍光強度閾値を確立するために、対照角膜組織に対するデフォルト製造業者の設定によって最初に決定された。次に、これらの同じ閾値設定を使用してネイティブ及びＳＤＰ処置角膜群を撮像して、蛍光画像強度の群比較（Ｎ＝３、ｎ＝３）を可能にした。
【０１３９】
次に、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、Ｖｅｒ．１．４８、ＮＩＨ）を用いて、追跡した蛍光領域から非蛍光領域の平均積分色濃度を差し引いてバックグラウンドを除去することにより、各画像の蛍光強度を測定した。次いで、異なる群間の蛍光強度値を計算した。次いで、群を一元配置ＡＮＯＶＡ分析とそれに続くアドホックｔ検定によって統計的に比較して、エクセルソフトウェア（マイクロソフト社、バージョン１４．６．７）及びＳｔａｔＰｌｕｓ：ｍａｃＬＥソフトウェア（アナリストソフト社、  Ｖｅｒ．６．１．５．１）を用いてｐ値を決定した。
【０１４０】
ＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＡＢＩ  ７０００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施した。ウサギ角膜上皮から採取したものから産生されたｃＤＮＡについて遺伝子発現を実施した。候補遺伝子の発現は、内因性対照遺伝子β−アクチンに対して正規化した。相対定量は２（‐ΔΔＣｔ）法を用いて行った。最初に一元配置ＡＮＯＶＡを行い、続いてエクセルソフトウェア（マイクロソフト社、Ｖｅｒ．１４．６．７）及びＳｔａｔＰｌｕｓ：ｍａｃ  ＬＥソフトウェア（ＡｎａｌｙｓｔＳｏｆｔ、Ｉｎｃ．、Ｖｅｒ．６．１．５．１）を用いてｐ値を決定するための事後ｔ検定を行うことにより、ｄＣｔ値を用いて群間で統計的比較を行った。。以下の特異的プライマーセットをβ−アクチン、ＩＬ−１β及びＩＬ−６遺伝子（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡから入手）に使用した。
【表２】
2019531334.tif 000005
【０１４１】
実施例５  ＳＤＰ及びＳＤＰ‐４は過酸化水素媒介酸化還元シグナル伝達を阻害する
溶液中の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の濃度を選択的に定量するために、電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法を使用した。具体的には、２０μＭのＨ２Ｏ２を、０、０．５、１．０、又は５．０％のＰＡＳＦ、ＳＤＰ、又はＳＤＰ−４を含有する水溶液に添加し、室温で２４時間インキュベートした。インキュベーション後の残存Ｈ２Ｏ２レベルを定量するために、次いで２００μＭのＨ２Ｏ２特異的スピンプローブ１‐ヒドロキシ‐３‐メトキシカルボニル‐２，２，５，５‐テトラメチルピロリジン（ＣＭＨ）を、アッセイ試薬４‐アセトアミドフェノール（ＡＡＰ、Ａ．１ｍＭ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ、２００μＭ）、及び西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、１Ｕ／ｍＬ）とともに添加した。次にこの混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、その間にＡＡＰはＨＲＰの存在下でＨ２Ｏ２により酸化されてフェノキシラジカルを生成し、次いでこれはＣＭＨスピンプローブと反応してＣＭラジカルを生成し、これがＥＰＲによって検出され定量される。
【０１４２】
結果：ＰＡＳＦは、タンパク質濃度の増加とともにＥＰＲシグナル振幅を対照レベルを超えて上昇させ、ＰＡＳＦがＨ２Ｏ２スピンプローブを直接酸化することを示した。対照的に、ＳＤＰの添加はＥＰＲシグナル振幅の濃度依存的減少を誘発し、ＳＤＰタンパク質は５．０％ＳＤＰでＨ２Ｏ２を４０％捕捉することを実証した。これらの減少は、ＳＤＰ‐４タンパク質の存在下でなおさらに強固であり、それによって５．０％のＳＤＰ‐４は８０％以上Ｈ２Ｏ２レベルを減少させた。図５を参照のこと。
【０１４３】
Ｈ２Ｏ２を掃去しそして酸化還元シグナル伝達を阻害するＳＤＰそしてさらにＳＤＰ‐４の能力はチロシン主導である。チロシンは、酸化還元シグナル伝達に固有の電子シャッフリングを容易にする芳香族及びヒドロキシル含有官能基のために、既知の長期作用性抗酸化剤である（Ｖａｎ  Ｏｖｅｒｖｅｌｄら、Ｃｈｅｍｉｃｏ−Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ、１２７（２０００）、１５１−１６１を参照）。ＳＤＰ及びＳＤＰ−４は、高いチロシン組成（約１３重量／重量％以上）を有し、これらのタンパク質は眼表面へのチロシン送達を増強する。チロシンの生理学的溶解度は０．４ｍｇ／ｍＬであるが、チロシン溶解度は１重量／体積％である。３倍を超えるＳＤＰ（１．３ｍｇ／ｍＬ）、したがってＳＤＰの１重量／体積％当たりの比例的増加を提供する。さらに、ＳＤＰ及びＳＤＰ‐４の水溶性は８０重量／体積％を超え、他の既知のタンパク質よりはるかに大きい。
【０１４４】
実施例６  ＳＤＰタンパク質溶液の分画及び分子量分布
再生されたＳＤＰ溶液の分画は、１００、５０、３０、及び１０ｋＤａのＭＷカットオフのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５ｍＬ遠心分離フィルター（ＥＭＤ‐Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を利用する一連の遠心分離工程を通して達成された。分画されたＳＤＰ溶液の分子量範囲を評価するために、ＳＤＰ‐ＰＡＧＥを用いてＳＤＰタンパク質の電気泳動移動度を視覚化し、そして未分画ＳＤＰ溶液のそれと比較した。未分画ＳＤＰのＳＤＳ‐ＰＡＧＥは、およそ３００ｋＤａ〜３０ｋＤａの分子量範囲の間に位置する大きな染色によって証明されるように、溶液中のＳＤＰタンパク質の広い分子量分布を示した。
【０１４５】
再生されたＳＤＰ溶液の分画は、高分子量から低分子量のＳＤＰタンパク質（それぞれＳＤＰ‐１、ＳＤＰ‐２、ＳＤＰ‐３、及びＳＤＰ‐４）の範囲の４つの画分を生じた。図６を参照のこと。未分画ＳＤＰ溶液と比較すると、高分子量溶液のＳＤＳ‐ＰＡＧＥは、３００ｋＤａ〜１００ｋＤａの範囲（ＳＤＰ‐１及びＳＤＰ‐２）の間のおおよその分子量分布を示す染色を生成したが、低分子量溶液は、主に３０ｋＤａの範囲（ＳＤＰ‐３及びＳＤＰ‐４）に分子量分布を示す染色を生成し、したがってＳＤＰの高分子量及び低分子量ＳＤＰタンパク質溶液への分画を確認した。
【０１４６】
例えば、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのカイコの繭由来の５０ｍｇ／ｍＬのＳＤＰ水溶液を以下の研究に使用した。ＳＤＰタンパク質断片の分画は、１００、５０、３０、及び１０ｋＤａのＭＷカットオフのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １５ｍＬ遠心分離フィルター（ＥＭＤ‐Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して達成した。手短に言えば、１５ｍｇの４０ｍｇ／ｍＬ  ＳＤＰストック溶液を１００  ｋＤａ  ＭＷカットオフの遠心フィルターに添加し、１００ｋＤａ  ＭＷ以上のＳＤＰタンパク質断片の単離のために４，０００×ｇで３０分間遠沈した。単離した濃縮物を集め、続いて濾液を５０ｋＤａ  ＭＷカットオフの遠心フィルターに移し、再び４，０００×ｇで３０分間遠沈して約５０ｋＤａ  ＭＷのＳＤＰタンパク質断片を単離した。単離した濃縮物を集め、次いで濾液を３０ｋＤａのＭＷカットオフを有する遠心分離フィルターに移し、そして再び４，０００×ｇで３０分間遠沈して約３０ｋＤａのＭＷのＳＤＰタンパク質フラグメントを単離した。単離した濃縮物を回収し、次いで濾液を１０ｋＤａ  ＭＷのカットオフを有する遠心分離フィルターに移し、再び４，０００×ｇで３０分間遠沈して約１０ｋＤａ  ＭＷのＳＤＰタンパク質断片を単離した。各ＭＷカットオフから収集した濃縮物を５ｍＬのｄＨ２Ｏで６回個別に洗浄し、各濃縮物についてそれぞれのＭＷカットオフフィルターサイズを有する遠心分離フィルターを用いて４，０００×ｇで３０分間再度遠沈した。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ（図６）及びクマシーブルーＲ‐２５０染色（Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州グランドアイランド）を用いてＳＤＰタンパク質断片の分画を確認した。
【０１４７】
ＳＤＰ‐４画分のＩｍａｇｅＪ分析は、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによって決定されるように、ＳＤＰ‐４が３４ｋＤａの平均分子量を有することを示した。ＰＡＳＦ（３０ｋＤａ  ＭＷＣＯフィルター）の同様の濾過により、５１ｋＤａの平均分子量を有する低分子量画分、及び別のより高い平均分子量画分（９０ｋＤａ）が得られた。ＳＤＰ画分及びＰＡＳＦ画分のさらなる分析は以下の表に要約されている。
【表３】
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【０１４８】
１０ｋＤａ未満の平均分子量を有する画分は溶液中で不安定でありそして１〜２時間以内にゲルを形成し、それ故典型的にはＳＤＰ組成物及び画分から除去される。
【０１４９】
実施例７  ＳＤＰ‐４及びＳＤＰ‐１‐３のＳＤＰ安定性試験
実施例３に記載された安定性試験はまた、ＳＤＰ‐４及び単離された天然のフィブロイン（ＰＡＳＦ‐４）の低平均分子量画分に対しても行われた。超音波処理後のＳＤＰ−４溶液中に超音波処理誘導二次構造形成及びゲル化は存在しないことが見出された。ＳＤＰ−４溶液は透明で自由流動性を維持した。ゲル化がないことは、ＳＤＰ−４のタンパク質安定性が著しく大きいことを示しているのに対して、ＰＡＳＦ−４溶液は超音波処理後２時間以内にゲル化し、溶液中での不安定性を示した。ＳＤＰ−４は実験の時間経過（９６時間）を通して溶液のままであった。
【０１５０】
安定性試験は、ＳＤＰのより高分子量の画分（ＳＤＰ‐１、ＳＤＰ‐２、及びＳＤＰ‐３の組み合わせに相当；ＳＤＰ‐１‐３と呼ばれる）についても実施された。ＳＤＰ‐１‐３の水溶液は、実験の時間経過を通して（２４時間超）自由流動性溶液のままであった。しかしながら、単離された天然フィブロイン（ＰＡＳＦ−１−３）の高分子量画分は１５分以内にゲル化し、これは二次タンパク質構造形成、従って不安定性を示している。
【０１５１】
実験条件：ＳＤＰ‐４、ＳＤＰ‐１‐３、ＰＡＳＦ‐４、及びＰＡＳＦ‐１‐３の１ｍＬの４重量／重量％溶液を、６０％振幅、２０Ｈｚのパルス周波数で３分間超音波処理した。次いで、ＰＡＳＦ−４及びＰＡＳＦ−１−３についてゲル化が起こるまで溶液を室温でモニターした。ＳＤＰ−４及びＳＤＰ−１−３は、それぞれ９６時間及び２４時間を超えて溶液のままであった（この研究の時間経過）。
【０１５２】
実施例８  ＳＤＰ‐１及びＳＤＰ‐２の増強された創傷治癒特性
創傷治癒は、ＳＤＰ画分（１０ｍｇ／ｍＬ）の非存在下又は存在下でスクラッチアッセイを受けたコンフルエントなｈＣＬＥ単層で評価した。創傷閉鎖率は、タイムラプス顕微鏡を用いて評価した。ＳＤＰ又はＰＢＳ対照で処理したｈＣＬＥの増殖をＭＴＴアッセイによって評価した。
【０１５３】
ＳＤＰ  ＭＷは、損傷を受けたｈＣＬＥ培養物の行動に重大な影響を及ぼした。＜１００ｋＤａの低い平均ＭＷ画分（すなわち、ＳＤＰ‐３及びＳＤＰ‐４）は、ＰＢＳ処理対照培養物に対して剥がれた（引っ掻かれた）ｈＣＬＥ細胞の再増殖を６時間有意に加速し、それは密集するまで持続した（対照の２０時間に対して１６時間）。（図７及び８）。ＭＴＴアッセイ結果による代謝活性の増加（＞５０％）によって証明されるように、ＳＤＰ‐３及びＳＤＰ‐４は、ＰＢＳで処理した対照培養物に対してｈＣＬＥ増殖を有意に増加させた。逆に、＞１００ｋＤａの高ＭＷ画分（すなわち、ＳＤＰ‐１及びＳＤＰ‐２）は再増殖を阻害したが、ＳＤＰの増殖促進効果は依然として観察された（図９）。これらの結果は、ＳＤＰ‐３及びＳＤＰ‐４画分がインビトロでｈＣＬＥ細胞遊走結果に及ぼす増強された効力効果を実証する。
【０１５４】
実施例９  抗炎症特性
ＳＤＰ画分１〜４の炎症性は、ＳＤＰ画分の存在下又は非存在下で炎症誘発性サイトカイン腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ‐α、１ｎｇ／ｍＬ）で刺激したｈＣＬＥ培養物について評価した。その後の炎症性遺伝子の発現を定量するためにｑＰＣＲを使用した。ｈＣＬＥ細胞によるこれらのタンパク質の分泌をＥＬＩＳＡにより評価した。ＳＤＰ画分の存在下又は非存在下で実施した、ＴＮＦ‐α刺激ｈＣＬＥ培養物及び前骨髄球性免疫細胞株（ＨＬ‐６０）とのＴｒａｎｓｗｅｌｌ共培養アッセイを使用して、変化した炎症性遺伝子発現の機能的意義を評価した。
【０１５５】
ＴＮＦ‐αチャレンジしたｈＣＬＥ培養物は、炎症性遺伝子ＴＮＦ‐α、インターロイキン６及び１α／β、ならびにプロテアーゼＭＭＰ‐９の発現を確実に増加させ、その発現は低ＭＷ  ＳＤＰで有意に減弱した（図１０）。これは、８時間でＥＬＩＳＡによって測定されるように、刺激されたｈＣＬＥによるＴＮＦ−α及びＭＭＰ−９の分泌の有意な減少をもたらした（図１１）。ＴＮＦ−αでチャレンジしたｈＣＬＥは、ＳＤＰ−４の添加によって正常化されたＨＬ−６０細胞の有意な動員を誘発し、これはインビトロでの炎症性シグナル伝達の障害と下流の免疫応答との間の機能的関係を実証する（図１２）。
【０１５６】
実施例１０  ＯＴＣ及び抗炎症点眼剤の調製
点眼剤組成物は、疾患又は傷害のためにＳＤＰの治療特性を利用して眼球系を治療するように調製することができる。ＳＤＰ分子は、分子量（例えば、ＳＤＰ‐１、ＳＤＰ‐２、ＳＤＰ‐３、ＳＤＰ‐４、又はそれらの組み合わせ）に基づいて任意に単離され得るか、又は全組成物（例えば、ＳＤＰ）として使用され得る。約４０ｋＤａ未満などの平均分子量が低いタンパク質分子の組成物を調製することができ、これをＳＤＰ−４と呼ぶ。ＳＤＰ組成物の全分子量又は約４０ｋＤａを超える分子を含むタンパク質分子の第二の組成物も調製することができる。各組成物は、水、少なくとも１つの緩衝液又は緩衝液系（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、クエン酸塩、ホウ酸塩、Ｔｒｉｓ、４‐（２‐ヒドロキシエチル）‐１‐ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ））、場合により少なくとも１種の保存剤（例えば過ホウ酸塩、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ））及び場合により少なくとも１種の追加の賦形剤、界面活性剤、安定剤又は塩（例えばスルファニル酸、トレハロース、グリセリン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、マンニトール、ポリソルベート、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、又は臭化リチウム（ＬｉＢｒ））を含み得る。
【０１５７】
上記の第１の組成物を含有する眼科用製剤は、ドライアイ病患者、創傷患者、又はその他の点では健康な患者の外科的創傷（例えば、屈折矯正手術又は白内障手術）に治療用製品として適用することができる。疾患又は損傷は、炎症及び創傷閉鎖率について、ならびに患者の快適さ及び疼痛評価について経時的にモニターすることができる。第２の組成物は、処方物の濡れ性、広がり、及び患者の快適性を高めるのを助けるためのタンパク質賦形剤として、人工涙点眼薬などの市販薬に使用することができる。
【０１５８】
点眼剤処方物の例は、０．１重量／体積％もの低いＳＤＰ−４又はＳＤＰから１０重量／体積％もの高いＳＤＰ−４又はＳＤＰを含む。ＳＤＰ‐４又はＳＤＰ材料を精製水に溶解すると、クエン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＰＢＳ緩衝液、又はホウ酸緩衝液などの緩衝液系が１ｍｍｏｌ〜１，０００ｍｍｏｌの濃度で作製されるであろう。追加の賦形剤成分を製剤に添加してもよい。ポリソルベートなどの界面活性剤は、０．０１重量／体積％〜０．１重量／体積％の濃度の範囲で添加することができる。トレハロース、デキストロース、又はスクロースなどの安定化糖分子を、１０ｍｍｏｌ〜５００ｍｍｏｌの範囲の濃度で添加することができる。粘滑剤分子は、０．１重量／体積％〜２．０重量／体積％の範囲の濃度で、ＰＥＧ、カルボキシメチルセルロース、ヒプロメロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、又はグリセリンなどの眼用潤滑剤として添加することができる。分子相互作用を低減し、製剤を安定化させるために、１０ｍｍｏｌ〜５００ｍｍｏｌの範囲の濃度で、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、又はＬｉＢｒなどの塩を添加することもできる。Ｌ‐グルタミン又はＬ‐アルギニンなどのアミノ酸分子は、安定剤として、１０ｍｍｏｌ〜５００ｍｍｏｌの範囲の濃度で添加することができる。ＥＤＴＡなどのキレート剤は、０．０１重量／体積％〜０．１重量／体積％の範囲の濃度で、安定剤として添加することができる。過ホウ酸塩又はＢＡＫなどの抗菌剤を、最大０．０１５重量／体積％の濃度で製剤に添加することができる。
【０１５９】
下記は、ＳＤＰ‐４及び／又はＳＤＰ分子を含有する、製造されたいくつかの基本製剤例の表であり、追加の添加剤又は賦形剤を添加して上記の製剤用途を向上させることができる。
【表４】
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【０１６０】
ＳＤＰ、又はＳＤＰ−４などのＳＤＰ画分は、濡れ性及び患者の快適さを改善するために、市販及び処方の点眼剤及び軟膏などの公知の眼科用製剤に添加することもできる。ＳＤＰ又はＳＤＰ‐４を添加することができる点眼剤溶液の例は、ブリモニジンタートレート、ブリモニジンタートレート／チモロールマレエート、アルカフタジン、ビマトプロスト、シクロスポリン、ガチフロキサシン、ケトロラックトロメタミン、又はリフィテグラスト点眼溶液を含む。ＳＤＰ又はＳＤＰ‐４を添加することができる他の配合物の例は、米国特許５，４６８，７４３；５，８８０，２８３；６，３３３，０４５；６，５６２，８７３；６，６２７，２１０；６，６４１，８３４；６，６７３，３３７；７，０３０，１４９；７，３２０，９７６；７，３２３，４６３；７，３５１，４０４；７，３８８，０２９；７，６４２，２５８；７，８４２，７１４；７，８５１，５０４；８，００８，３３８；８，０３８，９８８；８，１０１，１６１；８，１３３，８９０；８，２０７，２１５；８，２６３，０５４；８，２７８，３５３；８，２９９，１１８；８，３０９，６０５；８，３３８，４７９；８，３５４，４０９；８，３７７，９８２；８，５１２，７１７；８，５２４，７７７；８，５４１，４６３；８，５４１，４６６；８，５６９，３６７；８，５６９，３７０；８，５６９，７３０；８，５８６，６３０；８，６２９，１１１；８，６３２，７６０；８，６３３，１６２；８，６４２，５５６；８，６４８，０４８；８，６４８，１０７；８，６６４，２１５；８，６８５，９３０；８，７４８，４２５；８，７７２，３３８；８，８５８，９６１；８，９０６，９６２；及び９，２４８，１９１、及び米国特許７，３１４，９３８；７，７４５，４６０；７，７９０，７４３；７，９２８，１２２；８，０８４，０４７；８，１６８，６５５；８，３６７，７０１；８，５９２，４５０；８，９２７，５７４；９，０４５，４５７；９，０８５，５５３；９，２１６，１７４；９，３５３，０８８；及び９，４４７，０７７に記載されている。
【０１６１】
開示された実施形態及び実施例を参照して特定の実施形態が上記に説明されたが、そのような実施形態は単なる例示であり、本発明の範囲を限定しない。添付の特許請求の範囲に規定されるより広い態様において本発明から逸脱することなく、当業者によって変更及び修正がなされ得る。
【０１６２】
全ての刊行物、特許、及び特許文書は、あたかも個々に参照することにより取り込まれるかのように、本明細書中で参照することにより取り込まれる。本開示と矛盾する制限はそれから理解されるべきではない。本発明は、様々な具体的かつ好ましい実施形態及び技術を参照して説明されてきた。しかしながら、本発明の精神及び範囲内にとどまりながら、多くの変形及び修正が可能であることを理解されたい。
【配列表フリーテキスト】
【０１６３】
配列番号１  ＜２２３＞人工配列の説明：合成ペプチド
配列番号２〜１３  ＜２２３＞人工配列の説明：合成プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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