(57)【要約】  分泌型モジュール式カルシウム結合タンパク質２（ＳＭＯＣ２）標的化する薬剤を使用して、線維症、例えば腎臓の線維症を治療するための方法が本明細書に記載される。
2019510009.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腎線維症を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の分泌型モジュール式カルシウム結合タンパク質２（ＳＭＯＣ２）の阻害剤を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２】
対象における腎線維症の治療における使用のための、分泌型モジュール式カルシウム結合タンパク質２（ＳＭＯＣ２）の阻害剤。
【請求項３】
前記阻害剤が、ＳＭＯＣ２に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分である、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の使用のための阻害剤。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合部分が、キメラであるか、ヒト化されているか、または完全にヒトである、請求項３に記載の方法または使用のための阻害剤。
【請求項５】
前記阻害剤が、ＳＭＯＣ２転写を標的化する抑制性核酸である、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の使用のための阻害剤。
【請求項６】
前記抑制性核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）からなる群から選択される、請求項３に記載の方法または使用のための阻害剤。
【請求項７】
前記抑制性核酸が、修飾されている、請求項６に記載の方法または使用のための阻害剤。
【請求項８】
前記抑制性核酸が、修飾された骨格を含む、請求項７に記載の方法または使用のための阻害剤。
【請求項９】
前記骨格が、アミドまたはモルホリノ骨格である、請求項８に記載の方法または使用のための阻害剤。
【請求項１０】
前記抑制性核酸が、１つまたは複数の修飾されたヌクレオシドを含む、請求項７に記載の方法または使用のための阻害剤。
【請求項１１】
少なくとも１つのロックトヌクレオシドを含む、請求項１０に記載の方法または使用のための阻害剤。
【請求項１２】
前記対象が、慢性腎疾患、代謝症候群、膀胱尿管逆流、尿細管間質性腎線維症、糖尿病（糖尿病性腎症を含む）、および糸球体腎炎（ＧＮ）を有する、請求項１に記載の方法または請求項２に記載の使用のための阻害剤。
【請求項１３】
前記ＧＮが、巣状分節性糸球体硬化症および膜性糸球体腎炎またはメサンギウム毛細管性ＧＮである、請求項８に記載の方法または使用のための阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１６年２月２５日付けで出願された米国仮出願第６２／２９９，６１８号の利益を主張する。前述のものの全内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発
本発明は、国立衛生研究所（National Institutes of Health）によって付与された認可番号ＥＳ０１７５４３に基づく政府支援を用いてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
分泌型モジュール式カルシウム結合タンパク質２（ＳＭＯＣ２）標的化する薬剤を使用して、線維症、例えば腎臓の線維症を治療するための方法が本明細書に記載される。
【背景技術】
【０００４】
線維症は、慢性的な組織傷害に対する異常な修復応答である（１）。修復メカニズムはかなり保存されているために、線維症は、先進工業国のおよそ半分の罹患率および死亡率に寄与するほぼ全ての慢性炎症性の臓器疾患に共通する最終的な特徴になっている（１）。腎臓は、腎臓における濾過された毒素の濃度上昇に一部関連する傷害に対して感受性が高いことが公知であり、さらに、虚血や敗血症になりやすい体質が特に腎臓を線維症に罹りやすくする（２）。
【発明の概要】
【０００５】
分泌型モジュール式カルシウム結合タンパク質２（ＳＭＯＣ２）は、マトリックス細胞タンパク質のＳＰＡＲＣ（分泌型酸性高システインタンパク質）ファミリーに属しており、このファミリーのメンバーは、細胞−マトリックス相互作用をモジュレートすることが公知である。本明細書で報告される通り、ＳＭＯＣ２は、線維症の後、マウスおよびヒトの腎臓の尿細管上皮細胞において上方調節される。ＳＭＯＣ２を過剰発現するかまたはＳＭＯＣ２がノックダウンされた遺伝子操作マウスを使用したところ、ＳＭＯＣ２は、腎線維症の進行に重大な関連があることが示された。理論に制限されることは望まないが、この結果から、ＳＭＯＣ２は、機構的に、線維芽細胞から筋線維芽細胞への転換（ＦＭＴ）を活性化して、ストレスファイバーの形成、増殖、移動および細胞外マトリックス産生を刺激することが示唆される。さらに、ｓｉＲＮＡによってＳＭＯＣ２を標的化することは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴＧＦβ１媒介ＦＭＴの弱化およびマウスにおける腎線維症の軽減をもたらす。これらの発見は、ＳＭＯＣ２が、傷害を受けた腎臓の病理学的なセクレトームにおける主要なシグナル伝達分子であることを立証するものであり、ＳＭＯＣ２を標的化することは、ＦＭＴ媒介腎線維症を阻害するための新規の治療戦略を提供する。
【０００６】
したがって、腎線維症を有する対象を治療するための方法であって、治療有効量の分泌型モジュール式カルシウム結合タンパク質２（ＳＭＯＣ２）の阻害剤を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供される。また、対象における腎線維症の治療における使用のための、分泌型モジュール式カルシウム結合タンパク質２（ＳＭＯＣ２）の阻害剤も提供される。
【０００７】
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＳＭＯＣ２に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分である。
【０００８】
いくつかの実施形態において、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分は、キメラであるか、ヒト化されているか、または完全にヒトである。
【０００９】
いくつかの実施形態において、阻害剤は、ＳＭＯＣ２転写を標的化する抑制性核酸である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、抑制性核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）からなる群から選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、抑制性核酸は、修飾されており、例えば修飾された骨格、例えばアミドまたはモルホリノ骨格を含むか、または１つまたは複数の修飾されたヌクレオシドを含み、例えば、少なくとも１つのロックトヌクレオシドを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、対象は、慢性腎疾患、代謝症候群、膀胱尿管逆流、尿細管間質性腎線維症、糖尿病（糖尿病性腎症を含む）、および糸球体腎炎（ＧＮ）を有する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＧＮは、巣状分節性糸球体硬化症および膜性糸球体腎炎またはメサンギウム毛細管性ＧＮである。
【００１４】
特に他の定義がない限り、本明細書において用いられる全ての専門用語や科学用語は、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書では、本発明で使用する方法および材料が説明されるが、当技術分野で公知の他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および例は単なる説明のためであり、限定を目的としない。本明細書で述べられた全ての公報、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、それら全体が参照により開示に組み込まれる。矛盾が生じる場合、定義を含めて本明細書に従うものとする。
【００１５】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図から、さらに特許請求の範囲から明らかであろうと予想される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１−１】ＳＭＯＣ２は腎線維症を有するマウスおよびヒトにおいて高度に上方調節されることを示す図である。（Ａ）片側尿管閉塞（ＵＵＯ）または（Ｂ）葉酸注射（ＦＡ）から７日目に、マウスから得られた腎臓切片でＳＭＯＣ２およびαＳＭＡに関する定量的な免疫染色を実行した（ｎ＝５；２０×の倍率）。ＵＵＯモデルの場合、１４日目からの対側腎（ＣｏＫ）組織も含めた。ＳＭＯＣ２およびαＳＭＡ免疫蛍光法の相対的な定量を、箱ひげ図に表されるように、分析された各組織につき５つの視野の代表的な画像を使用して実行した。（Ｃ、Ｄ）７および１４日のＵＵＯまたはＦＡに供されたマウスから得られた腎臓サンプルを使用した、ＳＭＯＣ２、αＳＭＡ、コラーゲン１α１およびフィブロネクチン発現の代表的なウェスタンブロット（ｎ＝５／条件；図７Ｃ（ＵＵＯ）および７Ｄ（ＦＡ）における濃度測定）。
【図１−２】ＳＭＯＣ２は腎線維症を有するマウスおよびヒトにおいて高度に上方調節されることを示す図である。（Ｅ）慢性腎疾患（ＣＫＤ）の原因となる病的な線維症を有するヒト腎臓（ｎ＝５）および線維化がない患者（ｎ＝５）におけるＳＭＯＣ２およびαＳＭＡに関する定量的な免疫染色。ＳＭＯＣ２およびαＳＭＡ免疫蛍光法の相対的な定量を、箱ひげ図に表されるように、分析された各組織につき５つの視野の代表的な画像を使用して実行した。（Ｆ）尿中クレアチニンに正規化したＳＭＯＣ２および腎臓傷害分子−１（ＫＩＭ−１）の尿レベルを、健康な志願者（ｎ＝１３）と比較して、ＣＫＤを有する患者（ｎ＝１３）で測定した。箱ひげ図は、中央値（箱中のライン）、上位および下位四分位点（箱の境界）、ならびに最小および最大値（バー）を記載している。ｔ検定によって決定された＊Ｐ＜０．０５。黄色の矢印、尿細管。白色の矢印、間質。
【図２−１】ＳＭＯＣ２を過剰発現するマウスは、野生型マウスと比べて腎線維症により罹りやすいことを示す図である。（Ａ）ＰＣＲ（上、Ｔｇインサートを認識するためのプライマー特異的な）およびウェスタンブロッティング（下）による、ＳＭＯＣ２トランスジェニック（ＳＭＯＣ２Ｔｇ）マウスにおけるＳＭＯＣ２過剰発現の確認。
【図２−２】ＳＭＯＣ２を過剰発現するマウスは、野生型マウスと比べて腎線維症により罹りやすいことを示す図である。（Ｂ）７および１４日の片側尿管閉塞（ＵＵＯ）に供されたＳＭＯＣ２Ｔｇおよび野生型（ＷＴ）マウスから得られた腎臓サンプルを使用した、αＳＭＡ、コラーゲン１α１、フィブロネクチンおよびＳＭＯＣ２発現の代表的なウェスタンブロット（ｎ＝５／条件；図１０Ｂにおける濃度測定）。（Ｃ）ＵＵＯから７日目におけるＷＴおよびＳＭＯＣ２ＴｇマウスからのＣｏＫおよび線維化した腎臓におけるαＳＭＡに関する免疫蛍光染色（ｎ＝５／条件、５つの視野／組織）。（Ｄ）７および１４日の葉酸（ＦＡ）に曝露されたＳＭＯＣ２Ｔｇおよび野生型（ＷＴ）マウスから得られた腎臓サンプルを使用した、αＳＭＡ、コラーゲン１α１、フィブロネクチンおよびＳＭＯＣ２発現のウェスタンブロット（ｎ＝５／条件；図１１Ｂにおける濃度測定）。（Ｅ）ＦＡから７日目におけるＷＴおよびＳＭＯＣ２Ｔｇマウスからの正常なおよび線維化した腎臓のαＳＭＡに関する免疫蛍光染色（ｎ＝５／条件、１０個の視野／組織）。
【図２−３】ＳＭＯＣ２を過剰発現するマウスは、野生型マウスと比べて腎線維症により罹りやすいことを示す図である。（Ｆ）ＣｏＫ対７および１４日のＵＵＯ処置腎臓のピクロシリウスレッド（ｎ＝５／条件、１０個の視野／組織）およびマッソントリクローム（ｎ＝５／条件、５つの視野／組織）染色。（Ｇ）正常対７および１４日のＦＡ処置腎臓（ｎ＝５／条件、５つの視野／組織）のピクロシリウスレッドおよびマッソントリクローム染色。共焦点および光学顕微鏡画像は２０×の倍率であった。画像の相対的定量は、中央値（箱中のライン）、上位および下位四分位点（箱の境界）、ならびに最小および最大値（バー）を記載している箱ひげ図として表される。テューキーの事後分析を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定された＊Ｐ＜０．０５（ＣｏＫ（ＵＵＯ）または正常（ＦＡ））および＃Ｐ＜０．０５（それぞれのタイムポイントにおけるＷＴ）。
【図３−１】ＳＭＯＣ２が線維芽細胞から筋線維芽細胞への転換を誘導することを示す図である。（Ａ）ＵＵＯ処置から７日目にＳＭＯＣ２ＴｇおよびＷＴマウスからの腎臓を使用してＲＮＡｓｅｑを実行した。濃縮された遺伝子オントロジー（ＧＯ）のカテゴリーに対するＲＥＶＩＧＯツリーマップの可視化を示す。「細胞要素」に対する高度に類似したＧＯタームは一緒に分類され、意味論上の類似性および濃縮ｐ値を使用して長方形の異なる色およびサイズによって可視化される。
【図３−２】ＳＭＯＣ２が線維芽細胞から筋線維芽細胞への転換を誘導することを示す図である。  ＴＧＦβ１含有／非含有の１０ｎｇ／ｍＬのＳＭＯＣ２で処置した無血清の初代ヒト腎臓線維芽細胞（Ｂ、ｎ＝３／条件；図１２Ｃにおける濃度測定）およびＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞（Ｃ、ｎ＝３／条件；図１２Ｄにおける濃度測定）からの、αＳＭＡ、コラーゲン１α１およびフィブロネクチンのウェスタンブロット。（Ｄ）抗体を１時間前処置した後、ＳＭＯＣ２またはＴＧＦβ１を無血清ＮＩＨ３Ｔ３細胞で２４時間処置し、次いで従来の線維化マーカーに関して試験し、一方でインテグリンβ１抗体をＮＩＨ３Ｔ３細胞で前処置し、次いでＳＭＯＣ２で処置した（ｎ＝３／条件；図１２Ｅにおける濃度測定）。
【図３−３】ＳＭＯＣ２が線維芽細胞から筋線維芽細胞への転換を誘導することを示す図である。（Ｅ）ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を、ＳＭＯＣ２−ＭＹＣ、空のベクター対照または陰性対照ＭＧＰ−ＭＹＣでトランスフェクトし、次いでＭＹＣ（上）またはインテグリン抗体（下）を用いて免疫沈降した。代表的な免疫沈降実験のウェスタンブロット。（Ｆ）１０ｎｇ／ｍＬのＳＭＯＣ２または５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１で６０分処置したＮＩＨ３Ｔ３細胞からの、ホスホ（Ｐ）−接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）Ｙ９２５、Ｐ−ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）Ｓｅｒ１９およびＰ−パキシリンＴｙｒ１１８の代表的なウェスタンブロット（ｎ＝５／条件；図１２Ｈにおける濃度測定）。（Ｇ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＳＭＯＣ２または５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１で２４時間処置した後のＦ−アクチンのファロイジン染色（ｎ＝３）。箱ひげ図は、中央値（箱中のライン）、上位および下位四分位点（箱の境界）、ならびに最小および最大値（バー）を記載している。ｔ検定によって決定された＊Ｐ＜０．０５。（Ｈ）ＳＭＯＣ２は筋線維芽細胞活性の特性を誘導することを示す図である。ＳＭＯＣ２ＴｇとＷＴマウスとで有意に異なる「生物学的プロセス」を説明する高度に類似したＧＯタームに対するＲＥＶＩＧＯツリーマップの可視化。
【図３−４】ＳＭＯＣ２は筋線維芽細胞活性の特性を誘導することを示す図である。（Ｉ）１０ｎｇ／ｍｌのＳＭＯＣ２で２４時間処置したＮＩＨ３Ｔ３細胞に実行されたスクラッチアッセイ。治癒のパーセンテージをグラフに表する（ｎ＝５、３つの視野／条件；１０×の倍率、５０μＭ）。（Ｊ）１０ｎｇ／ｍｌのＳＭＯＣ２で２４時間処置したＮＩＨ３Ｔ３細胞に実行されたボイデンチャンバーアッセイ。（Ｋ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞を１０ｎｇ／ｍＬのＳＭＯＣ２で２４時間処置するかまたは処置せず、次いでトリプシン処理し、再度植え付けた。１時間後、未付着の細胞を洗浄し、細胞数を接着に関して定量した（ｎ＝３）。
【図３−５】ＳＭＯＣ２は筋線維芽細胞活性の特性を誘導することを示す図である。（Ｌ）対照および１０ｎｇ／ｍＬのＳＭＯＣ２で処置したＮＩＨ３Ｔ３細胞の代謝活性をＭＴＴアッセイによって経時的に測定した（ｎ＝５）。（Ｍ）ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＳＭＯＣ２で２４時間処置するかまたは処置せず、細胞増殖をＥｄＵでの標識付けおよび蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）によって評価した（ｎ＝５）。箱ひげ図は、中央値（箱中のライン）、上位および下位四分位点（箱の境界）、ならびに最小および最大値（バー）を記載している。ｔ検定によって決定された＊Ｐ＜０．０５。
【図４−１】ＳＭＯＣ２の遺伝学的阻害はマウスにおける葉酸によって誘導された腎線維症を制限することを示す図である。（Ａ）ＰＣＲ（上、ノックインインサートを認識するためのＰＣＲプライマー特異的な）およびウェスタンブロッティング（下）によるＳＭＯＣ２ノックアウト（ＳＭＯＣ２ＫＯ）マウスにおけるＳＭＯＣ２欠失の確認。（Ｂ）葉酸（ＦＡ）処置に曝露されたＳＭＯＣ２ＫＯおよび野生型（ＷＴ）マウスから７日目に得られた腎臓サンプルを使用した、αＳＭＡ、コラーゲン１α１、フィブロネクチンおよびＳＭＯＣ２発現の代表的なウェスタンブロット（ｎ＝４／群；図１４における濃度測定）。
【図４−２】ＳＭＯＣ２の遺伝学的阻害はマウスにおける葉酸によって誘導された腎線維症を制限することを示す図である。（Ｃ）ＦＡ処置後のベースラインおよび７日目におけるＫＯおよびＷＴ腎臓の免疫蛍光αＳＭＡ染色（ｎ＝４／群）。（Ｄ）ＫＯおよびＷＴマウスから７日目に得られた正常およびＦＡ処置腎臓のマッソントリクローム染色。画像の定量は、中央値（箱中のライン）、上位および下位四分位点（箱の境界）、ならびに最小および最大値（バー）を記載している箱ひげ図として表される（ｎ＝４／条件、１０個の視野／マウス）。テューキーの事後分析を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定された＊Ｐ＜０．０５（ＷＴ正常）および＃Ｐ＜０．０５（それぞれの処置におけるＷＴ）。
【図５】ＳＭＯＣ２の遺伝学的阻害はＵＵＯによって誘導されたマウスにおける腎線維症を制限することを示す図である。（Ａ）ＵＵＯに供されたＳＭＯＣ２ＫＯおよび野生型（ＷＴ）マウスから７日目に得られた腎臓サンプルを使用した、αＳＭＡ、コラーゲン１α１、フィブロネクチンおよびＳＭＯＣ２発現の代表的なウェスタンブロット（ｎ＝５／群；図１５における濃度測定）。（Ｂ）正常なマウスおよび７日目のＵＵＯマウスからのＫＯおよびＷＴ腎臓の、免疫蛍光αＳＭＡ染色の画像（ｎ＝３／群；分析された各組織につき５つの視野）。相対的な定量は、任意単位として箱ひげ図に表される。（Ｃ）ＷＴおよびＫＯマウスからの正常な、および７日のＵＵＯの腎臓のマッソントリクローム染色。マッソントリクローム染色の画像は、分析された各組織につき５〜１０個の視野のうち代表的なものである。定量は、任意単位として箱ひげ図に表される（マウスｎ＝５〜６、５〜１０個の視野／マウス）。箱ひげ図は、中央値（箱中のライン）、上位および下位四分位点（箱の境界）、ならびに最小および最大値（バー）を記載している。テューキーの事後分析を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定された＊Ｐ＜０．０５（ＷＴＣｏＫ）および＃Ｐ＜０．０５（それぞれのＵＵＯにおけるＷＴ）。
【図６−１】ＳＭＯＣ２のサイレンシングは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴＧＦβ１によって誘導された線維化マーカーおよびマウスにおける葉酸によって誘導された腎線維症を低減することを示す図である。（Ａ）ＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞に関する実験手順のスキーム。ＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡまたはスクランブル化ｓｉＲＮＡ（ｓｓｉＲＮＡ）での処置の２４時間後、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を、ＴＧＦβ１で２４時間処置するかまたはＴＧＦβ１で処置しないかのいずれかとした。代表的なウェスタンブロット（ｎ＝３／条件；図１７における濃度測定）を、ＳＭＯＣ２、αＳＭＡ、コラーゲン１α１およびフィブロネクチン発現に関して実行した。（Ｂ）葉酸（ＦＡ）で処置された／処置されていない、ＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡまたはｓｓｉＲＮＡが注射されたＣ５７ＢＬ／６マウスに関する実験手順のスキーム。２５０ｍｇ／ｋｇのＦＡの腹膜内注射の４時間前ならびにその２、４および６日後に、マウスに３０μｇ／２００ｕＬのＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡまたはｓｓｉＲＮＡを静脈注射した。代表的なウェスタンブロット（ｎ＝５／群；図１９における濃度測定）を、ＳＭＯＣ２、αＳＭＡ、コラーゲン１α１およびフィブロネクチンに関して実行した。
【図６−２】ＳＭＯＣ２のサイレンシングは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＴＧＦβ１によって誘導された線維化マーカーおよびマウスにおける葉酸によって誘導された腎線維症を低減することを示す図である。（Ｃ）ｓｓｉＲＮＡまたはＳＭＯＣ２のｓｓｉＲＮＡのいずれかで処置した、ベースラインおよびＦＡから７日目におけるマウスから得られた腎臓の免疫蛍光αＳＭＡ染色（ｎ＝５）。（Ｄ）ｓｓｉＲＮＡまたはＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡ投与から７日目に得られた正常およびＦＡ処置腎臓のマッソントリクローム染色。共焦点および光学顕微鏡画像は、２０×の倍率である；スケールバー、５０μＭ。画像の定量は、中央値（箱中のライン）、上位および下位四分位点（箱の境界）、ならびに最小および最大値（バー）を記載している箱ひげ図として表される（ｎ＝５／条件、１０個の視野／マウス）。テューキーの事後分析を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定された＊Ｐ＜０．０５（ｓｓｉＲＮＡ＋ビヒクル）および＃Ｐ＜０．０５（それぞれの処置のｓｓｉＲＮＡ）。
【図７−１】線維化マーカーと併せたＳＭＯＣ２タンパク質発現の定量を示す図である。（Ａ）ｑＰＣＲおよび（Ｂ）ウェスタンブロットによる、ＦＡ処置したマウスのＳＭＯＣ２レベル。
【図７−２】線維化マーカーと併せたＳＭＯＣ２タンパク質発現の定量を示す図である。マウスを（Ｃ）片側尿管閉塞（ＵＵＯ）に供するか、または（Ｄ）葉酸（ＦＡ）で腹腔内処置し、次いで７日および１４日目に屠殺した。ウェスタンブロッティングを腎臓組織溶解産物で実行して、α−平滑筋のアクチン（αＳＭＡ）、コラーゲン１α１およびフィブロネクチンなどの確立された線維化マーカーを測定した。ＵＵＯモデルの場合、対側腎（ＣｏＫ）組織溶解産物も含めた。濃度測定データは、シャム／ビヒクルに正規化された図１Ｂ（ＵＵＯ）および図１Ｃ（ＦＡ）からのウェスタンブロット画像のうち代表的なものであり、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝５マウス／群／タイムポイント）。ｔ検定によって決定された＊Ｐ＜０．０５。
【図８】ＴＧＦβ１は、線維芽細胞および上皮細胞においてＳＭＯＣ２の発現を誘導する。ＮＩＨ３Ｔ３（Ａ、ｎ＝４）およびＨＰＴＥＣ細胞（Ｂ、ｎ＝３）を１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１と共に２４時間インキュベートした。列挙した標的のタンパク質発現を、ウェスタンブロットによって決定した。濃度測定データは、ＧＡＰＤＨによって正規化された対照レベルとの相対値であり、平均±ＳＥＭを表す。ｔ検定によって決定された＊Ｐ＜０．０５。
【図９】野生型およびＳＭＯＣ２トランスジェニックマウスにおける線維化マーカーと併せたＳＭＯＣ２タンパク質発現の定量を示す図である。（Ａ）ＳＭＯＣ２Ｔｇおよび野生型（ＷＴ）マウスにおけるＳＭＯＣ２発現に関する濃度測定（ｎ＝４）。（Ｂ）ＳＭＯＣ２Ｔｇおよび野生型（ＷＴ）マウスを、片側尿管閉塞（ＵＵＯ）に供し、ＵＵＯの７および１４日後に収集された腎臓組織サンプルからのタンパク質発現を、ＳＭＯＣ２についてはウェスタンブロットによって評価した。（Ｃ）ＳＭＯＣ２ＴｇおよびＷＴマウスを葉酸（ＦＡ）で処置し、ＦＡの７および１４日後に収集された腎臓組織サンプルからのαＳＭＡ、コラーゲン１α１、フィブロネクチンおよびＳＭＯＣ２のタンパク質発現を、ウェスタンブロットによって評価した。濃度測定は、シャム／ビヒクルに正規化された図２Ｂ（ＵＵＯ）および図２Ｄ（ＦＡ）からのウェスタンブロット画像のうち代表的なものであり、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３〜４マウス／群／タイムポイント）。ｔ検定によって決定された＊Ｐ＜０．０５。
【図１０】片側尿管閉塞後のマウスにおける線維化マーカーと併せたＳＭＯＣ２のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの定量を示す図である。ＳＭＯＣ２Ｔｇおよび野生型（ＷＴ）マウスを、片側尿管閉塞（ＵＵＯ）に供し、次いで７および１４日目に屠殺した。（Ａ）定量ｒｔＰＣＲおよび（Ｂ）ウェスタンブロット分析を腎臓組織溶解産物で実行して、αＳＭＡ、コラーゲン１α１、およびフィブロネクチンの発現を測定した（図２Ｂのウェスタンブロットからの濃度測定データ）。対側腎（ＣｏＫ）組織溶解産物も含めた。発現をハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに正規化した。値は、ＷＴ正常に対する倍率変化として表される。平均±ＳＥＭ（ｎ＝５マウス／群／タイムポイント）。テューキーの事後分析を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定された＊Ｐ＜０．０５（ＷＴ正常）および＃Ｐ＜０．０５（それぞれのタイムポイントにおけるＷＴ）。
【図１１】葉酸投与後のマウスにおける線維化マーカーと併せたＳＭＯＣ２のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの定量を示す図である。ＳＭＯＣ２Ｔｇおよび野生型（ＷＴ）マウスを葉酸（ＦＡ）の腹腔内処置に曝露し、次いで７および１４日目に屠殺した。（Ａ）定量ｒｔＰＣＲおよび（Ｂ）ウェスタンブロット分析を腎臓組織溶解産物で実行して、αＳＭＡ、コラーゲン１α１、およびフィブロネクチンの発現を測定した（図２Ｄのウェスタンブロットからの濃度測定データ）。定量的データは、ＧＡＰＤＨによって正規化したＷＴ正常レベルに相対的なものである。平均±ＳＥＭ（ｎ＝５マウス／群／タイムポイント）。テューキーの事後分析を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定された＊Ｐ＜０．０５（ＷＴ正常）および＃Ｐ＜０．０５（それぞれのタイムポイントにおけるＷＴ）。
【図１２−１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＩＨ３Ｔ３細胞における組換えＳＭＯＣ２のプロファイル。（Ａ）無血清ＮＩＨ３Ｔ３細胞を様々な濃度のＳＭＯＣ２で２４時間処置し、ウェスタンブロットによってαＳＭＡ、コラーゲン１α１およびフィブロネクチン発現に関して測定した。（Ｂ）それぞれの濃度測定を用いたウェスタンブロット画像（ｎ＝４）であり、１０ｎｇ／ｍＬのＳＭＯＣ２または５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１で２４時間処置した休止状態の初代ヒト腎臓線維芽細胞からの線維化マーカーを示す。（Ｃ）初代ヒト腎臓線維芽細胞に対する４８時間のＳＭＯＣ２処置を示す図３Ｂに関する濃度測定データ（ｎ＝３）。
【図１２−２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＩＨ３Ｔ３細胞における組換えＳＭＯＣ２のプロファイル。（Ｄ）線維化を促進するＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍＬ）と比較して、図３Ｃのウェスタンブロットに関する濃度測定データは、１０ｎｇ／ｍＬのＳＭＯＣ２で２４時間処置した無血清ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞からの筋線維芽細胞マーカーであるαＳＭＡ、コラーゲン１α１およびフィブロネクチンの発現レベルを示す（ｎ＝３）。（Ｅ）図３Ｄ（ｎ＝３）の抗体のブロックを代表する濃度測定データ。（Ｆ）ＳＭＯＣ２で処置したＮＩＨ３Ｔ３細胞の抗体ブロック滴定。（Ｇ）それぞれの濃度測定を用いたウェスタンブロット画像（Ｈ）
【図１２−３】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＩＨ３Ｔ３細胞における組換えＳＭＯＣ２のプロファイル。（Ｈ）１０ｎｇ／ｍＬのＳＭＯＣ２または５ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１で、４５分（Ｈの左、濃度測定；ｎ＝５）および６０分（Ｈの右、図３Ｆのウェスタンブロットからの濃度測定データ；ｎ＝５）処置した休止状態のＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞からの、線維化を促進するシグナルであるホスホ（Ｐ）−接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）Ｙ９２５、Ｐ−ミオシン軽鎖（ＭＬＣ）Ｓｅｒ１９およびＰ−パキシリンＴｙｒ１１８をリン酸活性化することを示す。
【図１２−４】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＩＨ３Ｔ３細胞における組換えＳＭＯＣ２のプロファイル。（Ｊ）時間経過にわたる移動アッセイの創傷領域へのＮＩＨ３Ｔ３細胞密度の定量。（Ｋ）時間経過にわたる様々な濃度のＳＭＯＣ２で処置したＮＩＨ３Ｔ３細胞の代謝活性をＭＴＴアッセイによって測定した（ｎ＝５）。濃度測定データは、ＧＡＰＤＨによって正規化された対照レベルとの相対値であり、平均±ＳＥＭを表す。ｔ検定によって決定された＊Ｐ＜０．０５。＃Ｐ＜０．０５（それぞれのタイムポイントにおける対照）。
【図１３−１】ＳＭＯＣ２でトランスフェクトされた線維芽細胞は活性表現型を獲得することを示す図である。ｐＣＭＶおよびｐＣＭＶ−ＳＭＯＣ２でトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞における、ｒｔＰＣＲおよびウェスタンブロットによるＳＭＯＣ２のＲＮＡ発現（Ａ）およびタンパク質発現（Ｂ）の定量。定量ｒｔＰＣＲおよび濃度測定データは、ＧＡＰＤＨによって正規化したｐＣＭＶ対照レベルに相対的なものであり、平均±ＳＥＭを表す（ＲＮＡ、ｎ＝３、２回の技術的反復；タンパク質、ｎ＝３）。
【図１３−２】ＳＭＯＣ２でトランスフェクトされた線維芽細胞は活性表現型を獲得することを示す図である。ｐＣＭＶおよびｐＣＭＶ−ＳＭＯＣ２でトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞における、ｒｔＰＣＲおよびウェスタンブロットによるＳＭＯＣ２のＲＮＡ発現（Ａ）およびタンパク質発現（Ｂ）の定量。定量ｒｔＰＣＲおよび濃度測定データは、ＧＡＰＤＨによって正規化したｐＣＭＶ対照レベルに相対的なものであり、平均±ＳＥＭを表す（ＲＮＡ、ｎ＝３、２回の技術的反復；タンパク質、ｎ＝３）。（Ｃ）ｐＣＭＶ対照およびｐＣＭＶ−ＳＭＯＣ２でトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞の代謝活性を、ＭＴＴアッセイによって列挙した日数にわたり測定した（ｎ＝１２／タイムポイント、１日目に対する％）。
【図１３−３】ＳＭＯＣ２でトランスフェクトされた線維芽細胞は活性表現型を獲得することを示す図である。（Ｄ）線維芽細胞に対するＳＭＯＣ２トランスフェクションの創傷治癒の影響をスクラッチアッセイによって分析した。等しく分散された細胞にスクラッチで傷付け、２４時間のＳＭＯＣ２でトランスフェクトした後のＮＩＨ３Ｔ３細胞とそのｐＣＭＶ対照との回復能力を評価した。治癒の差を、ｐＣＭＶでトランスフェクトされた細胞に対するｐＣＭＶ−ＳＭＯＣ２のパーセンテージとして計算した。代表的な画像（１０×；スケールバー＝５０μＭ）を、コントラスト増加のために２４時間でメチレンブルーで染色した。（Ｅ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ｐＣＭＶまたはｐＣＭＶ−ＳＭＯＣ２で２４時間トランスフェクトした。細胞増殖および細胞周期の進行をＥｄＵでの標識付けによって測定し、続いて蛍光活性化細胞分類法（ＦＡＣＳ）によって細胞周期分析を行った。
【図１３−４】ＳＭＯＣ２でトランスフェクトされた線維芽細胞は活性表現型を獲得することを示す図である。（Ｆ）ＳＭＯＣ２でトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞の移動可能性を、ボイデンチャンバーアッセイを使用して評価して、移動する細胞のパーセンテージを決定した。（Ｇ）ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ｐＣＭＶおよびｐＣＭＶ−ＳＭＯＣ２で２４時間トランスフェクトし、その後細胞をトリプシンによって回収し、再度植え付けた。１時間後、未付着の細胞を洗浄し、細胞数を接着に関して定量した（ｎ＝３）。ｔ検定によって決定された＊Ｐ＜０．０５。
【図１４】葉酸で処置したＳＭＯＣ２ノックアウト（ＫＯ）および野生型マウスにおける線維化マーカーのウェスタンブロットの定量を示す図である。ＧＡＰＤＨに正規化した正常野生型（ＷＴ）マウスに対する図５Ｂの代表する濃度測定データであり、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝４）。テューキーの事後分析を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定された＊Ｐ＜０．０５（正常ＷＴ）および＃Ｐ＜０．０５（それぞれの処置におけるＷＴ）。
【図１５】ＵＵＯ外科手術を受けたＳＭＯＣ２ノックアウト（ＫＯ）および野生型マウスにおけるＳＭＯＣ２および線維化マーカーのウェスタンブロットの定量を示す図である。ＧＡＰＤＨに正規化した野生型（ＷＴ）ＣｏＫマウスに対する図６Ａを代表する濃度測定データであり、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝５）。テューキーの事後分析を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定された＊Ｐ＜０．０５（ＷＴＣｏＫ）および＃Ｐ＜０．０５（それぞれの処置におけるＷＴ）。
【図１６】ＮＩＨ３Ｔ３細胞におけるＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡの性能を示す図である。ＮＩＨ３Ｔ３細胞を様々なＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡで２４時間処置し、ウェスタンブロットによってＳＭＯＣ２産生に関して測定した。
【図１７】線維芽細胞のＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡ処置のウェスタンブロットの定量を示す図である。ＧＡＰＤＨによって正規化した未処置のｓｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する図７Ａを代表する濃度測定データであり、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝３）。テューキーの事後分析を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定された＊Ｐ＜０．０５（未処置のｓｓｉＲＮＡ細胞）および＃Ｐ＜０．０５（それぞれの処置におけるｓｓｉＲＮＡ細胞）。
【図１８】尾静脈を介したｉｖ注射後のマウス腎臓におけるｓｉＲＮＡの濃縮を示す図である。４時間前ならびに２、４および６日目にマウスに３０μｇ／２００ｕＬのＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡまたはｓｓｉＲＮＡを静脈注射し、７日目に屠殺した。ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、フルオレセインコンジュゲートとして合成されたため、可視化して、４０×および２０×の共焦点顕微鏡法によってｓｉＲＮＡ送達を評価した。画像は、１０個の視野／マウス（ｎ＝５マウス／群）のうち代表的なものであった。定量を、任意単位として棒グラフに表する（平均±ＳＥＭ、ｎ＝５マウス／群、１０個の視野／マウス）。
【図１９】ＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡで処置し、続いて葉酸を投与したマウスのウェスタンブロットの定量を示す図である。ＧＡＰＤＨに正規化した未処置のｓｓｉＲＮＡが注射されたマウスに対する図７Ｂを代表する濃度測定データであり、平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝５）。テューキーの事後分析を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定された＊Ｐ＜０．０５（ｓｓｉＲＮＡ正常）および＃Ｐ＜０．０５（それぞれの処置におけるｓｓｉＲＮＡ）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
腎線維症は、ほとんどの進行性慢性腎疾患に共通する病態生理学的な現象である（３、４）。腎臓における線維化事象は、具体的には、尿細管と尿細管周囲毛細血管との間の間質腔に病的な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が過剰に堆積し、それらの正常な毒素と栄養素との交換が妨害されることと定義される（５）。筋線維芽細胞は、線維化を促進する因子、本質的にはＴＧＦβ１およびＥＣＭタンパク質への曝露による内在する線維芽細胞の活性化によって生じる優勢なＥＣＭ産生細胞とみなされているため、これは、線維症に関与するエフェクター細胞として広く認識されている（６〜９）。この無限に継続するＥＣＭ産生および筋線維芽細胞活性化のループを調節する阻害因子は、腎線維症を標的化するための論理的なアプローチの代表であるが、この医療上の要求は未だ満たされていない。
【００１８】
ＲＮＡシーケンシングを使用して、葉酸によって誘導された慢性進行性腎線維症に曝露されたマウスの腎臓において最も高度に上方調節された遺伝子のなかから分泌型モジュール式カルシウム結合タンパク質２（ＳＭＯＣ２）を同定したが（１０およびＷＯ２０１５／１３８５３２、２０１５年９月１７日公開）、この上方調節が有害であるかまたは保護的であるかは、これまで公知ではなかった。ＳＭＯＣ２は、マトリックス細胞タンパク質のＳＰＡＲＣ（分泌型酸性高システインタンパク質）ファミリーに属しており、そのメンバーは、それらの細胞外空間への分泌に関して、構造的なマトリックスタンパク質と相互作用するだけでなく、細胞表面受容体、増殖因子、プロテアーゼおよび他の生物活性エフェクターとも相互作用して、細胞−マトリックス相互作用と細胞の機能をモジュレートすることが公知である（１１）。細胞外マトリックス構築のシグナル伝達におけるその役割とは別に、機構的に、ＳＭＯＣ２は、腫瘍増殖および心筋虚血における血管新生を制御するための標的として役立つという仮説が立てられた（１２、１３）。腎臓へのダメージ後におけるＳＭＯＣ２上方調節の機能的な意味に関する情報がないことを考えれば、この研究の目的は、腎臓におけるＳＭＯＣ２の誘導が腎線維症の発症および進行を調節するかどうか、さらに、遺伝学的または薬理学的なＳＭＯＣ２のモジュレーションは線維症を予防することが可能であるかどうかを調査することであった。
【００１９】
間質の組成およびＥＣＭタンパク質の構成は、病的な線維症（１９）、さらに結果として正常な組織構造の継続的な損失の原因となる持続的な線維芽細胞の活性化の原因と結果を指令する一体化されたシグナル伝達機構である。本発明の研究から、マトリックス細胞因子であるＳＭＯＣ２は、標準状態下では最小であるが、腎臓傷害時に上方調節されて最終的に線維症の有害応答に参加するという概念が系統的に裏付けられる。本発明者らは、１）ＳＭＯＣ２発現は、線維症発症のメカニズムに関わりなく線維症後のマウスおよびヒトの腎臓において有意に誘導される；２）ＳＭＯＣ２を過剰発現するトランスジェニックマウスは、有意に強化された尿細管間質性線維症を呈示するが、それに対してＳＭＯＣ２ノックアウトマウスは、腎線維症の発症から保護されることから、ＳＭＯＣ２は、腎線維症の進行に重大な関連がある；３）ｓｉＲＮＡを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＳＭＯＣ２の阻害は、線維症の進行から保護することから、ＳＭＯＣ２が腎線維症のための可能性のある治療標的であることを示唆している；および４）ＳＭＯＣ２は、機構的に、線維芽細胞におけるマトリックス構築のシグナル伝達を活性化して、線維症におけるエフェクター細胞である筋線維芽細胞への転換に典型的な特徴であるストレスファイバーの形成、増殖、移動およびＥＣＭ産生を刺激するという証拠を提供する。
【００２０】
線維芽細胞から筋線維芽細胞への形質転換（ＦＭＴ）
線維芽細胞から筋線維芽細胞への形質転換（ＦＭＴ）は、コラーゲンおよびフィブロネクチンの産生において筋線維芽細胞が有する中心的な役割のために、線維症の発症における典型的な相である。本明細書において示した通り、ＳＭＯＣ２は、傷害を受けた腎臓の病理学的なセクレトームにおける主要なシグナル伝達分子であり、その継続的な存在により線維症が生じる。理論に制限されることは望まないが、ＴＧＦβ経路はＦＭＴにとって特徴的な経路であるため、本発明者らは最初に、ＦＭＴが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで線維芽細胞および上皮細胞においてＳＭＯＣ２を増加させることが可能であったことを見出し、加えて、ＳＭＯＣ２を除去すると、ＴＧＦβによって誘導されたＦＭＴが有意に弱化されたことから、ＳＭＯＣ２は、ＴＧＦβ下流の線維症への可能性のある病理学的な寄与因子であることを発見した。ＳＭＯＣ２はこれまでいかなる形態の線維症とも関連が示されていなかったが、そのファミリーメンバーのＳＰＡＲＣは、複数のタイプの線維症において広範囲にわたり研究されてきた。ＳＰＡＲＣ発現のレベルは、肺、腎臓、肝臓および皮膚の線維症を有する患者において増加することが見出された（２０）。さらに、ＳＰＡＲＣがないマウスは、線維化刺激を誘導すると、皮膚、心臓、肺および腎臓におけるコラーゲン堆積がより有意に少なかった（２０）。ＳＰＡＲＣとＳＭＯＣ２の両方が線維症を促進するが、これらはＥＣＭと細胞との相互作用を媒介するそれらの作用機序の点で異なっている可能性が高い。ＳＰＡＲＣは、そのコラーゲンへの結合、および合成後プロセシング、およびコラーゲンの一括構造への構築について公知である（２１、２２）。しかしながら、ＳＭＯＣ２の構造は、同じ作用を媒介するＳＰＡＲＣのようなコラーゲン結合部位を欠いている。これは、異なる作用機序を意味すると予想され、そのため各ＳＰＡＲＣメンバーは、線維症の発症においてそのそれぞれの役割を有する。
【００２１】
ＳＭＯＣ２
ヒトには、ＳＭＯＣ２の２つのアイソフォームが存在しており、アイソフォーム１前駆タンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいて、ＮＰ＿０７１４２１．１（ＮＭ＿０２２１３８．２によってコードされる）であり、アイソフォーム２前駆体の配列は、ＧｅｎＢａｎｋにおいてＮＰ＿００１１５９８８４．１（ＮＭ＿００１１６６４１２．１によってコードされる）で入手可能である。アイソフォーム２は、中央のコード領域におけるオルタナティブなフレーム内のスプライシング部位のためにアイソフォーム１より短い。ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ配列の識別子は、ＮＧ＿０３２７８１．１（５００１〜２３１８４４の範囲）である。
【００２２】
ＳＭＯＣ２は、心臓、筋肉、脾臓および卵巣で発現され（２３）、発達中のその発現パターンから、ＳＭＯＣ２が、性腺および生殖器官の発達中に細胞間シグナル伝達および細胞型特異的な分化を媒介する可能性があることが示唆される（２４）。本発明者らは同様に正常な腎臓でもＳＭＯＣ２発現を検出したが（２３）、ダメージの非存在下でのマウスにおけるＳＭＯＣ２の過剰発現は、マウス腎臓を自発的な線維症に移行させなかった。しかしながら、トランスジェニックマウスにおけるＳＭＯＣ２の過剰発現は、傷害を受けただけの野生型に比べて線維形成反応を促進した。機構的に、ＳＭＯＣ２は、例えば、インテグリン（αｖβ１およびαｖβ６）相互作用を介してケラチノサイトの移動および接着を刺激する細胞型（２３）；ＳＭＯＣ２がＶＥＧＦの応答ならびにＦＧＦによって誘導された有糸分裂誘発および血管新生を強化する内皮細胞（２５）；およびＳＭＯＣ２がインテグリンと連結したキナーゼの活性およびサイクリンＤ１発現を介して細胞周期の進行を調節する線維芽細胞（２６）などの多様な細胞型に作用することが示されている。マトリックス細胞タンパク質は、ＥＣＭ要素と細胞表面であるインテグリンとの相互作用の調節に関与する（２７）。インテグリンαβヘテロ二量体は、ＥＣＭシグナルの変化を線維芽細胞に翻訳して、ＦＭＴを受ける（６、２８）。このＦＭＴの基礎となる機械感受性経路は、以下の関連するマーカー（１４）：ＦＡＫ−Ｐ、ＭＬＣ−ＰおよびＰａｘ−Ｐを使用した３段のカスケードプロセスで要約することができる。
【００２３】
まとめると、本発明者らは、マトリックス細胞タンパク質であるＳＭＯＣ２によって発症した腎線維症の病因における新規の経路を明らかにした。本発明者らは、マトリックス構築のシグナル伝達、走化性および筋線維芽細胞転換を刺激することによる腎線維症の発症にとって、ＳＭＯＣ２が重要であることを示す。本発明者らはまた、線維症の保持を制限するためのＳＭＯＣ２のサイレンシングが、まだ有望な結果をもたらしていない疾患の経過に対する治療アプローチとして可能性を有することを示唆する説得力のある証拠も提供する。
【００２４】
治療方法
本明細書に記載される方法は、腎線維症に関連する障害の治療のための方法を含む。腎線維症は、様々な疾患および腎臓への傷害に起因する可能性がある。このような疾患および傷害の例としては、慢性腎疾患、代謝症候群、膀胱尿管逆流、尿細管間質性腎線維症、糖尿病（糖尿病性腎症を含む）、および結果生じる糸球体腎炎（ＧＮ）、これらに限定されないが、巣状分節性糸球体硬化症および膜性糸球体腎炎、ならびにメサンギウム毛細管性ＧＮなどが挙げられる。腎線維症は血管の損失に関連するため、二次的な虚血を引き起こし、さらにこれが糸球体機能の損失を伴う糸球体疾患を引き起こす可能性もある。根本的な原因に関係なく、腎臓への傷害は、腎線維症および付随する腎臓機能の損失を引き起こす可能性がある。（Schena, F.およびGesualdo, L.、Pathogenic Mechanisms of Diabetic Nephropathy, J. Am. Soc. Nephrol, 16：S30〜33 （2005）； Whaley-Connell, A.およびSower, J R.、Chronic Kidney Disease and the Cardiometabolic Syndrome, J. Clin. Hypert.、8（4）：546〜48 （2006））。腎線維症に関連する状態としては、これらに限定されないが、糖尿病性腎症、慢性腎疾患、末期腎疾患、全身性エリテマトーデス、血管炎、ＩｇＡ腎症、他の自己免疫疾患、異常タンパク質疾患、糖尿病が挙げられる。腎線維症に関連する慢性腎疾患は、心臓血管疾患にとって非常に重要なリスク因子であることから、腎線維症を予防または低減した治療剤は、心臓病や全身にわたる血管疾患に有益な作用を有すると予想されることは、当業者には明らかであると予想される。腎線維症に関連する状態は、腎線維症それ自体も含めて、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば、クレアチニンおよび尿素などの老廃物のレベルを測定する血液試験、異常を探す尿試験、ＳＭＯＣ２遺伝子またはタンパク質の発現のレベルを測定する試験（例えば、ＷＯ２０１５／１３８５３２を参照）、腎臓の構造およびサイズを評価するための超音波を使用した画像化試験、または腎臓の生検によって診断することができる。
【００２５】
いくつかの実施形態において、障害は、慢性腎疾患である。本明細書で使用される場合、「慢性腎疾患」または「ＣＫＤ」は、長期にわたる腎臓の機能の進行性消失を指す。いくつかの実施形態において、ＣＫＤは、高リン酸塩血（すなわち、＞４．６ｍｇ／ｄｌ）または低い糸球体濾過率（すなわち、体表面１．７３ｍ２当たり＜９０ｍｌ／分）を特徴とする。しかしながら、多くのＣＫＤ患者は、３カ月以上、糸球体濾過率の持続的な低減と共に正常な血清リン酸塩レベルを有する場合があり、または構造的な腎臓の異常の持続的な証拠と共に正常なＧＦＲを有する場合がある。いくつかの実施形態において、ＣＫＤを有する対象は、ｉ）３カ月以上の体表面１．７３ｍ２当たり＜６０ｍｉ／分のＧＦＲの持続的な低減；またはｉｉ）低減したＧＦＲの非存在下における３カ月以上、構造的または機能的な腎機能の異常のいずれかを有する対象であり得る。構造的または解剖学的な腎臓の異常は、これらに限定されないが、持続的なミクロアルブミン尿症、またはタンパク尿、または血尿、または腎嚢胞の存在と定義することができる。
【００２６】
慢性腎疾患の一般的な症状としては、疲れ、吐き気、尿のような呼気、骨の痛み、異常に暗い色または明るい色の皮膚、痒み、下肢静止不能症候群、血便、あざになりやすいこと、足浮腫、および末梢性浮腫が挙げられる。慢性腎疾患は、例えば、病歴、全血球数、ＢＵＮレベル、またはクレアチニンレベルを測定する血液試験、腎臓のフローおよびスキャン、ならびに腎臓の超音波を介して診断することができる。いくつかの実施形態において、対象は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１５１３８５３２に記載される方法を使用して、上昇したＳＭＯＣ２のレベルを有すると同定される。
【００２７】
一般的に、本方法は、治療有効量の本明細書に記載されるＳＭＯＣ２の阻害剤を、このような治療が必要な、またはこのような治療が必要であると決定された対象に投与することを含む。ＳＭＯＣ２の阻害剤としては、ＳＭＯＣ２に結合してそれを阻害する抗体、加えてＳＭＯＣ２のｍＲＮＡを標的化する抑制性核酸が挙げられる。
【００２８】
「治療する」は、この文脈で使用される場合、腎線維症に関連する障害の少なくとも１つの症状を軽減することを意味する。しばしば腎線維症は、ＢＵＮまたはクレアチニンのレベルの増加、高リン酸塩血および／または低い糸球体濾過率を引き起こすことから、治療は、ＢＵＮ、リン酸、またはクレアチニンレベルの低減、および正常な腎臓の機能に戻すことまたはそれに近づくこと、例えば、体表面１．７３ｍ２当たり少なくとも９０ｍｌ／分の糸球体濾過率をもたらすことであり得る。腎線維症に関連する状態の治療のための治療有効量の本明細書に記載される化合物の投与は、超音波で検出可能な線維症の減少をもたらすと予想される。
【００２９】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法を使用して治療される対象は、結腸がん、加齢性黄斑変性症、白斑、または肺疾患を有さない。
【００３０】
抗体
本明細書に記載される方法は、Ｓｍｏｃ２タンパク質に対する抗体の使用を含んでいてもよい。用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン分子またはその抗原結合部位を指す。免疫グロブリン分子の抗原結合部位の例としては、Ｆ（ａｂ）および抗原に結合する能力を保持するＦ（ａｂ’）２フラグメントが挙げられる。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、またはヒト化抗体、完全ヒト抗体、ヒト以外（例えば、マウス）の抗体、または単鎖抗体であってもよい。いくつかの実施形態において、抗体は、エフェクター機能を有し、補体を固定することができる。いくつかの実施形態において、抗体は、Ｆｃ受容体と結合する能力が低減しているか、またはその能力がない。例えば、抗体は、Ｆｃ受容体への結合を支持しない、アイソタイプもしくはサブタイプ、フラグメントまたは他の突然変異体であってもよく、例えば、抗体は、変異誘発されたＦｃ受容体結合領域を有するか、またはＦｃ受容体結合領域が欠失している。抗体およびそれらのフラグメントを作製するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、Harlowら編、Antibodies：A Laboratory Manual （1988）；Goding、Monoclonal Antibodies：Principles and Practice、（N.Y. Academic Press 1983）；HowardおよびKaser、Making and Using Antibodies：A Practical Handbook （CRC Press；第1版、2006年12月13日）；KontermannおよびDubel、Antibody Engineering、1巻（Springer Protocols） （Springer；第2版、2010年5月21日）；Lo、Antibody Engineering：Methods and Protocols （Methods in Molecular Biology） （Humana Press；11月10日、2010年）；およびDubel、Handbook of Therapeutic Antibodies：Technologies, Emerging Developments and Approved Therapeutics、（Wiley-VCH；第1版、2010年9月7日）を参照されたい。本発明の方法において有用な抗体としては、Ｓｍｏｃ２に特異的に結合して（すなわち、Ｓｍｏｃ２以外の標的に結合せず）、線維芽細胞から筋線維芽細胞への活性化を阻害する抗体が挙げられる。
【００３１】
いくつかの実施形態において、抗体は、検出可能な薬剤または造影剤にカップリングされていてもよい。このような薬剤は当技術分野で周知であり、常磁性物質、生物発光または蛍光標識（例えば、ＧＦＰ、ＦＩＴＣ、ローダミン、またはテキサスレッド）、放射性同位体、および比色的／酵素的な薬剤（例えば、ＨＲＰ、Ｂ−ガラクトシダーゼ）が挙げられる。好ましい実施形態において、抗体は、常磁性物質、例えば、常磁性ナノ粒子、例えば、架橋酸化鉄（ＣＬＩＯ）ナノ粒子にカップリングされる。例えば、ＵＳ２０１１００４６００４；Josephsonら、Bioconjug. Chem.、10（2）：186〜91 （1999）を参照されたい。
【００３２】
抑制性核酸
本発明の方法および組成物において有用な抑制性核酸としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、外部ガイド配列（ＥＧＳ）オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ化合物、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）化合物、例えばｓｉＲＮＡ化合物、修飾された塩基／ロックト核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および他のオリゴマー化合物、または標的ＳＭＯＣ２核酸の少なくとも一部にハイブリダイズしてその機能を調節するオリゴヌクレオチド模倣体が挙げられる。いくつかの実施形態において、抑制性核酸としては、アンチセンスＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、キメラアンチセンスオリゴヌクレオチド、修飾された結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；マイクロ、干渉ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）；低分子一過性ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）；または低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；低分子ＲＮＡによって誘導された遺伝子の活性化（ＲＮＡａ）；低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、またはそれらの組合せが挙げられる。例えばＷＯ２０１０／０４０１１２を参照されたい。
【００３３】
いくつかの実施形態において、抑制性核酸は、１０〜５０、１０〜２０、１０〜２５、１３〜５０、または１３〜３０ヌクレオチド長である。当技術分野で通常の技術を有するものであれば当然のことながら、このようなものとしては、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチド長、またはそれらのいずれかの範囲のヌクレオチド長の相補的部分を有する抑制性核酸が挙げられる。いくつかの実施形態において、抑制性核酸は、１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、抑制性核酸は、１２または１３から、２０、２５、または３０ヌクレオチド長である。当技術分野で通常の技術を有するものであれば当然のことながら、このようなものとしては、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチド長、またはそれらのいずれかの範囲のヌクレオチド長の相補的部分を有する抑制性核酸が挙げられる（相補的部分は、標的配列に相補的な抑制性核酸の部分を指す）。
【００３４】
本発明の方法において有用な抑制性核酸は、標的ＲＮＡに対して十分な相補性を有しており、すなわちこのような抑制性核酸は、十分良好に十分高い特異性でハイブリダイズして、所望の効果をもたらすことができる。「相補的」とは、天然に存在するまたは天然に存在しない塩基またはそれらの類似体を含む２つの配列間で水素結合を介して対形成する能力を指す。例えば、抑制性核酸の１つの位置における塩基が、ＲＮＡのそれに対応する位置における塩基と水素結合することができる場合、それらの塩基は、その位置において互いに相補的であるとみなされる。１００％の相補性は必要ではない。
【００３５】
慣例的な方法を用いて、十分に高い特異性でＳＭＯＣ２配列に結合する抑制性核酸を設計することができる。いくつかの実施形態において、本方法は、当技術分野で公知のバイオインフォマティクス方法を使用して、二次構造、例えば１つ、２つ、またはそれより多くのステム−ループ構造、またはシュードノットの領域を同定すること、およびそのような領域を選択して、抑制性核酸で標的化することを含む。例えば、「ジーンウォーク（gene walk）」法は、核酸の阻害活性を最適化するのに使用することができ、例えば、標的ＲＮＡの長さにわたる１０〜３０個のヌクレオチドの一連のオリゴヌクレオチドを調製し、続いて活性に関して試験することができる。任意選択で、ギャップ、例えば５〜１０個のヌクレオチドまたはそれより多くのギャップが標的配列間に残っていてもよく、それにより合成および試験されるオリゴヌクレオチドの数を減らすことができる。ＧＣ含量は、好ましくは約３０〜６０％の間である。可能であれば、連続した３つ以上のＧまたはＣの並びは、回避されるべきである（例えば、極めて短い（例えば、約９〜１０ｎｔの）オリゴヌクレオチドの場合は、このようなことが不可能であり得る）。
【００３６】
いくつかの実施形態において、抑制性核酸分子は、ＲＮＡ配列の特異的な領域を標的化するように設計することができる。例えば、特異的な機能的領域を標的化することができ、このような領域としては、例えば、公知のＲＮＡ局在化モチーフを含む領域（すなわち、ＲＮＡが作用する標的核酸に相補的な領域）がある。その代わりに、またはそれに加えて、高度に保存された領域を標的化してもよく、このような領域としては、例えば、霊長類（例えばヒト）およびげっ歯類（例えばマウス）などの異種由来の配列を並べて高度な同一性を有する領域を探すことにより同定された領域がある。同一性のパーセントは、ベーシックローカルアライメントサーチツール（ＢＬＡＳＴプログラム）（Altschulら、J. Mol. Biol.、1990、215、403〜410；ZhangおよびMadden、Genome Res.、1997、7、649〜656）を使用して、例えば、デフォルトパラメーターを使用して慣例的操作で決定することができる。
【００３７】
例えば当技術分野で公知のまたは本明細書で提供されるＳＭＯＣ２配列内に１つまたは複数の標的領域、セグメントまたは部位が同定されれば、標的に十分に相補的な、すなわち、十分に高い特異性で十分良好にハイブリダイズする（すなわち、他の非標的ＲＮＡに実質的に結合しない）抑制性核酸化合物が選択され、所望の効果をもたらすことができる。
【００３８】
本発明に関して、ハイブリダイゼーションは、水素結合を意味し、この水素結合は、相補的ヌクレオシドまたはヌクレオチド塩基間のワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン型水素結合であってもよい。例えば、アデニンとチミンは、水素結合の形成を介して対をなす相補的核酸塩基である。相補的とは、本明細書で用いられる場合、２個のヌクレオチド間で正確に対を形成する能力を指す。例えば、オリゴヌクレオチドの特定の位置におけるヌクレオチドが、ＲＮＡ分子の同じ位置におけるヌクレオチドと水素結合が可能な場合、抑制性核酸およびＲＮＡは、その位置で互いに相補的であるとみなされる。抑制性核酸とＲＮＡとは、それぞれの分子において十分な数の対応する位置が互いに水素結合可能なヌクレオチドで占められている場合、互いに相補的である。従って、「特異的にハイブリダイゼーション可能な」および「相補的」は、抑制性核酸とＲＮＡ標的との間で安定で特異的な結合が生じるのに十分な相補性または正確な対形成の程度を示すのに用いられる用語である。例えば、抑制性核酸の１つの位置における塩基が、ＲＮＡのそれに対応する位置における塩基と水素結合が可能な場合、それらの塩基は、その位置において互いに相補的であるとみなされる。１００％の相補性は必要ではない。
【００３９】
当技術分野では当然のことながら、相補的核酸配列は、特異的にハイブリダイズ可能にするためにその標的核酸の配列に１００％相補的でなくてもよいことが理解される。本発明の方法のための相補的核酸配列は、特異的な結合が望ましい条件下で、例えばｉｎ  ｖｉｖｏでのアッセイまたは治療的処置の場合での生理学的条件下で、加えてｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイの場合ではアッセイが適切なストリンジェンシーの条件下で行われる条件下で、上記配列と標的ＲＮＡ分子との結合が標的ＲＮＡの正常な機能に干渉して、活性の損失を引き起こし、かつ上記配列と非標的ＲＮＡ配列との非特異的な結合を回避するのに十分な程度の相補性がある場合、特異的にハイブリダイズ可能である。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常は約７５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、好ましくは約５００ｍＭ未満のＮａＣｌおよび５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、より好ましくは約２５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび２５ｍＭのクエン酸三ナトリウムであろうと予想される。低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、例えばホルムアミドなどの有機溶媒の非存在下で達成することができ、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、少なくとも約３５％ホルムアミド、より好ましくは少なくとも約５０％ホルムアミドの存在下で達成することができる。ストリンジェントな温度条件は、通常は少なくとも約３０℃の温度、より好ましくは少なくとも約３７℃の温度、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含むであろうと予想される。ハイブリダイゼーション時間、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの洗浄剤の濃度、およびキャリアーＤＮＡを含むか含まないかなどの様々な追加のパラメーターは、当業者周知である。様々なレベルのストリンジェンシーは、これらの様々な条件を必要に応じて組み合わせることによって達成される。好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、３０℃で、７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および１％ＳＤＳで起こるであろうと予想される。より好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、３７℃で、５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミド、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）で起こるであろうと予想される。最も好ましい実施形態において、ハイブリダイゼーションは、４２℃で、２５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、および２００μｇ／ｍｌのｓｓＤＮＡで起こるであろうと予想される。これらの条件の有用なバリエーションは、当業者にとっては容易に理解されるであろうと予想される。
【００４０】
ほとんどの適用に関して、ハイブリダイゼーション後に行われる洗浄工程もストリンジェンシーの点で異なるであろうと予想される。洗浄のストリンジェンシー条件は、塩濃度と温度で定義することができる。上述したように、洗浄のストリンジェンシーは、塩濃度を減少させるか、または温度を上げることにより高めることができる。例えば、洗浄工程のストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、最も好ましくは約１５ｍＭ未満のＮａＣｌおよび１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウムであろうと予想される。洗浄工程のストリンジェントな温度条件は、通常は少なくとも約２５℃の温度、より好ましくは少なくとも約４２℃の温度、さらにより好ましくは少なくとも約６８℃の温度を含むであろうと予想される。好ましい実施形態において、洗浄工程は、２５℃で、３０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳで起こるであろうと予想される。より好ましい実施形態において、洗浄工程は、４２℃で、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳで起こるであろうと予想される。より好ましい実施形態において、洗浄工程は、６８℃で、１５ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、および０．１％ＳＤＳで起こるであろうと予想される。これらの条件の追加のバリエーションは、当業者にとっては容易に理解であろうと予想される。ハイブリダイゼーション技術は、当業者によく知られており、例えば、BentonおよびDavis（Science 196:180、1977）；GrunsteinおよびHogness（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72：3961、1975）；Ausubelら（Current Protocols in Molecular Biology、Wiley Interscience、New York、2001）；BergerおよびKimmel（Guide to Molecular Cloning Techniques、1987、Academic Press、New York）；およびSambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New Yorkに記載されている。
【００４１】
一般的に、本明細書において説明される方法で有用な抑制性核酸は、標的核酸内の標的領域に対して少なくとも８０％の配列相補性を有し、例えばＲＮＡ内の標的領域に対して９０％、９５％、または１００％の配列相補性を有する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドの２０個の核酸塩基のうち１８個が相補的であり、それゆえに標的領域に特異的にハイブリダイズするであろうと予想されるアンチセンス化合物は、９０パーセントの相補性を示すであろうと予想される。標的核酸のある領域に対する抑制性核酸の相補性のパーセントは、慣例的操作でベーシックローカルアライメントサーチツール（basic local alignment search tools）（ＢＬＡＳＴプログラム）（Altschulら、J.Mol.Biol.、1990、215、403〜410；ZhangおよびMadden、Genome Res.、1997、7、649〜656）を用いて決定することができる。ＲＮＡにハイブリダイズする抑制性核酸は、慣例的な実験を介して同定することができる。一般的に、抑制性核酸は、それらの標的に対する特異性を保持していなければならず、すなわち、対象の標的以外の転写物に直接結合してはならないか、あるいは対象の標的以外の転写物の発現レベルに直接的に有意な影響を与えてはならない。
【００４２】
抑制性核酸に関するさらなる開示については、ＵＳ２０１０／０３１７７１８（アンチセンスオリゴ）；ＵＳ２０１０／０２４９０５２（二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ））；ＵＳ２００９／０１８１９１４、およびＵＳ２０１０／０２３４４５１（ＬＮＡ）；ＵＳ２００７／０１９１２９４（ｓｉＲＮＡ類似体）；ＵＳ２００８／０２４９０３９（修飾されたｓｉＲＮＡ）；ならびにＷＯ２０１０／１２９７４６およびＷＯ２０１０／０４０１１２（抑制性核酸）を参照されたい。
【００４３】
アンチセンス
いくつかの実施形態において、抑制性核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、標的に結合して、転写、翻訳、またはスプライシングレベルで発現を中断させることによって、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的の発現をブロックするように設計される。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするように設計された相補的な核酸配列である。従って、標的に十分に相補的な、すなわち十分に高い特異性で十分良好にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが選択され、所望の効果をもたらすことができる。
【００４４】
ｓｉＲＮＡ/ｓｈＲＮＡ
いくつかの実施形態において、ＳＭＯＣ２ＲＮＡに相補的な核酸配列は、干渉ＲＮＡであってもよく、このような干渉ＲＮＡとしては、これらに限定されないが、低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）または低分子ヘアピンＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）が挙げられる。干渉ＲＮＡを構築する方法は当技術分野で周知である。例えば、干渉ＲＮＡは、２つの別個のオリゴヌクレオチドから組み立ててもよく、この場合、一方の鎖はセンス鎖であり、他方はアンチセンス鎖であり、アンチセンスおよびセンス鎖は、自己相補的である（すなわち、それぞれの鎖が、他方の鎖のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含む；例えば、アンチセンス鎖およびセンス鎖が二重鎖または二本鎖構造を形成する場合が挙げられる）。アンチセンス鎖は、標的核酸分子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列（すなわち望ましくない遺伝子）を含み、センス鎖は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を含む。あるいは、干渉ＲＮＡは、単一種のオリゴヌクレオチドから組み立てられ、この場合、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域は、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカー（複数可）によって連結される。干渉ＲＮＡは、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を有する二重鎖、非対称二重鎖、ヘアピンまたは非対称ヘアピン二次構造を有するポリヌクレオチドであってもよく、この場合、アンチセンス領域は、別の標的核酸分子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。干渉は、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含む２つ以上のループ構造およびステムを有する環状の一本鎖ポリヌクレオチドであってもよく、この場合、アンチセンス領域は、標的核酸分子のヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、センス領域は、標的核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有し、この場合、環状ポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかでプロセシングして、ＲＮＡ干渉を仲介することができる活性なｓｉＲＮＡ分子を作製してもよい。
【００４５】
いくつかの実施形態において、干渉ＲＮＡのコード領域は、センス領域、アンチセンス領域、およびループ領域を有する自己相補的なＲＮＡ分子をコードする。このようなＲＮＡ分子は、所望通りに発現される場合、「ヘアピン」構造を形成し、本明細書では「ｓｈＲＮＡ」と称される。ループ領域は、一般的に、約２〜約１０個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、ループ領域は、約６〜約９個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態において、センス領域およびアンチセンス領域は、約１５〜約２０個のヌクレオチドの長さである。転写後プロセシングがなされた後、低分子ヘアピンＲＮＡは、ＲＮアーゼＩＩＩファミリーのメンバーである酵素ダイサーが仲介する切断現象によってｓｉＲＮＡに変換される。続いてｓｉＲＮＡは、それと相同性を共有する遺伝子の発現を阻害することができる。詳細については、Brummelkampら、Science 296：550〜553、(2002)；Leeら、Nature Biotechnol.、20、500〜505、(2002)；Miyagishi and Taira、Nature Biotechnol 20：497〜500、(2002)；Paddisonら、Genes&Dev. 16：948〜958、(2002)；Paul、Nature Biotechnol、20、505〜508、(2002)；Sui、Proc.Natl.Acad.Sd.Sci.USA.、99（6）、5515〜5520、(2002)；Yuら、ProcNatlAcadSci USA.99：6047〜6052、(2002)を参照されたい。
【００４６】
ｓｉＲＮＡによってガイドされる標的ＲＮＡの切断反応は、高度な配列特異性を有する。一般的に、標的核酸の一部と同一なヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡが阻害に関して好ましい。しかしながら、本発明を実施するにあたりｓｉＲＮＡと標的遺伝子との１００％の配列同一性は必要ではない。従って、本発明は、遺伝学的突然変異、系統多型、または進化的分岐に起因するであろう予想される配列のバリエーションを許容することができるという利点を有する。例えば、標的配列と比較して挿入、欠失、および単一点突然変異を含むｓｉＲＮＡ配列も、阻害に関して有効であることが見出されている。あるいは、ヌクレオチド類似体の置換または挿入を含むｓｉＲＮＡ配列が、阻害に関して有効である可能性がある。一般的に、ｓｉＲＮＡは、その標的に対する特異性を保持していなければならず、すなわち、対象の標的以外の転写物に直接結合してはならないか、あるいは対象の標的以外の転写物の発現レベルに直接的に有意な影響を与えてはならない。
【００４７】
リボザイム
またトランス切断する酵素的な核酸分子も用いることができ、このような核酸分子は、ヒト疾患用の治療剤として見込みがあることが示されている（UsmanおよびMcSwiggen、1995 Ann.Rep.Med.Chem.30、285〜294；ChristoffersenおよびMarr、1995 J.Med.Chem.38、2023〜2037）。酵素的な核酸分子は、細胞ＲＮＡのバックグラウンド中の特異的なＲＮＡ標的を切断するように設計されていてもよい。このような切断現象により、ＲＮＡは機能しなくなる。
【００４８】
一般的に、ＲＮＡ切断活性を有する酵素的な核酸は、まず標的ＲＮＡに結合することによって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分の近傍に保持される酵素的な核酸の標的結合部分を介して起こる。従って、酵素的な核酸はまず標的ＲＮＡを認識して、その次に相補的塩基対形成によりそれと結合し、正しい部位に結合したら、酵素的に作用して標的ＲＮＡを切断する。このような標的ＲＮＡの戦略的な切断は、コードされたタンパク質の合成を指示するその能力を破壊すると予想される。酵素的な核酸が結合してそのＲＮＡ標的が切断された後、酵素的な核酸はそのＲＮＡから解離して他の標的を探索し、さらに新しい標的に繰り返して結合して切断することができる。
【００４９】
数種のアプローチ、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでの選択（進化）法（Orgel、1979、Proc.R.Soc.London、B 205、435）が、ホスホジエステル結合およびアミド結合の切断およびライゲーションなどの様々な反応を触媒することができる新しい核酸触媒を得るために用いられてきた（Joyce、1989、Gene、82、83〜87；Beaudryら、1992、Science 257、635〜641；Joyce、1992、Scientific American 267、90〜97；Breakerら、1994、TIBTECH 12、268；Bartelら、1993、Science 261：1411〜1418；Szostak、1993、TIBS 17、89〜93；Kumarら、1995、FASEB J.、9、1183；Breaker、1996、Curr.Op.Biotech.、1、442）。触媒活性に最適なリボザイムの開発は、遺伝子発現を調節する目的でＲＮＡ切断リボザイムを用いるあらゆる戦略に大いに貢献するであろうと予想される。ハンマーヘッド型リボザイムは、例えば、飽和（１０ｒｎＭ）濃度のＭｇ２＋補因子の存在下で約１分−１の触媒反応速度（ｋｃａｔ）で機能する。人工「ＲＮＡリガーゼ」リボザイムは、約１００分−１の速度で対応する自己修飾反応を触媒することが示されている。加えて、ＤＮＡで構成される基質結合アームを有する特定の修飾されたハンマーヘッド型リボザイムは、１００分−１に近い複合的な回転率でＲＮＡ切断を触媒することが知られている。
【００５０】
修飾された抑制性核酸
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法で使用される抑制性核酸は、修飾されており、例えば１つまたは複数の修飾された結合または塩基を含む。様々な修飾された塩基としては、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ペプチド核酸、またはロックト核酸（ＬＮＡ）分子が挙げられる。一部の抑制性核酸が完全に修飾されており、一方でそれ以外のものがキメラであり、それぞれ少なくとも１つのヌクレオチドで構成される２つ以上の化学的に別個の領域を含有する。これらの抑制性核酸は、典型的には、１つまたは複数の有益な特性（例えば、高いヌクレアーゼ耐性、細胞への取り込みの多さ、高い標的への結合親和性）を付与する修飾されたヌクレオチドの少なくとも１つの領域と、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断することができる酵素の基質である領域とを含む。本発明のキメラ抑制性核酸は、上述のような２つ以上のオリゴヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシドおよび／またはオリゴヌクレオチド模倣体の複合的な構造として形成されていてもよい。このような化合物はまた、当技術分野ではハイブリッドまたはギャップマーともいう。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ギャップマーである（ＬＮＡ修飾ヌクレオチドのブロックを端部に有する、ＲＮアーゼＨ切断を誘導するのに十分に長いＤＮＡ単量体の中央のストレッチ（ギャップ）を含有する；例えば、Stantonら、Nucleic Acid Ther. 2012. 22：344〜359；Nowotnyら、Cell、121：1005〜1016、2005；Kurreck、European Journal of Biochemistry 270：1628〜1644、2003；FLuiterら、Mol Biosyst. 5（8）：838〜43、2009を参照）。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、ミックスマー（mixmer）である（ＬＮＡおよびＤＮＡの交互の短いストレッチを含む；Naguibnevaら、Biomed Pharmacother. 2006年11月；60（9）：633〜8；Oromら、Gene. 2006年5月10日；372（）：137〜41）。このようなハイブリッド構造の製造を教示している代表的な米国特許は、これらに限定されないが、米国特許第５，０１３，８３０号；同第５，１４９，７９７号；同第５，２２０，００７号；同第５，２５６，７７５号；同第５，３６６，８７８号；同第５，４０３，７１１号；同第５，４９１，１３３号；同第５，５６５，３５０号；同第５，６２３，０６５号；同第５，６５２，３５５号；同第５，６５２，３５６号；および同第５，７００，９２２号を含み、これらはそれぞれ参照により本発明に組み込みこまれる。
【００５１】
いくつかの実施形態において、抑制性核酸は、糖の２’位で修飾された少なくとも１つのヌクレオチドを含み、最も好ましくは２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキルまたは２’−フルオロ−修飾ヌクレオチドを含む。他の好ましい実施形態において、ＲＮＡ修飾としては、ピリミジンのリボースにおける２’−フルオロ、２’−アミノおよび２’Ｏ−メチル修飾、脱塩基性残基またはＲＮＡの３’末端における逆向きの塩基が挙げられる。このような修飾は、慣例的操作でオリゴヌクレオチドに取り込まれ、これらのオリゴヌクレオチドは、所定の標的に対する２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（すなわち、それよりも高い標的との結合親和性）を有することが示されている。
【００５２】
多数のヌクレオチドおよびヌクレオシドの修飾は、それらが取り込まれているオリゴヌクレオチドに、ヌクレアーゼ消化に対して天然型のオリゴデオキシヌクレオチドよりも高い耐性を付与する（すなわちこれらの修飾されたオリゴは、修飾されていないオリゴヌクレオチドよりも長い時間無傷のままである）ことが示されている。修飾されたオリゴヌクレオチドの具体的な例としては、修飾された主鎖、例えばホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキルまたはシクロアルキル糖間結合、または短鎖ヘテロ原子または複素環式の糖間結合を含むものが挙げられる。最も好ましくは、ホスホロチオエート主鎖を有するオリゴヌクレオチドおよびヘテロ原子主鎖を有するオリゴヌクレオチドであり、特定には、ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ、〜Ｎ（ＣＨ３）〜Ｏ〜ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られている］、ＣＨ２−−Ｏ−−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、およびＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２主鎖、ここで天然型のホスホジエステル主鎖は、Ｏ−Ｐ−−Ｏ−ＣＨのように表される）；アミド主鎖（De Mesmaekerら、Ace.Chem.Res. 1995、28：366〜374を参照）；モルホリノ主鎖構造（SummertonおよびWeller、米国特許第５，０３４，５０６号を参照）；ペプチド核酸（ＰＮＡ）主鎖（この場合、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル主鎖は、ヌクレオチドが直接的または間接的にポリアミド主鎖のアザ窒素原子に結合したポリアミド主鎖で置き換えられる、Nielsenら、Science 1991、254、1497を参照）である。リン含有結合としては、これらに限定されないが、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルのホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常な３’−５’結合を有するボラノホスフェート、２’−５’結合したこれらの類似体、加えて、隣接するヌクレオシド単位対が３’−５’と５’−３’または２’−５’と５’−２’で連結している逆向きの極性を有するものが挙げられる。米国特許第３，６８７，８０８号；同第４，４６９，８６３号；同第４，４７６，３０１号；同第５，０２３，２４３号；同第５，１７７，１９６号；同第５，１８８，８９７号；同第５，２６４，４２３号；同第５，２７６，０１９号；同第５，２７８，３０２号；同第５，２８６，７１７号；同第５，３２１，１３１号；同第５，３９９，６７６号；同第５，４０５，９３９号；同第５，４５３，４９６号；同第５，４５５，２３３号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７６，９２５号；同第５，５１９，１２６号；同第５，５３６，８２１号；同第５，５４１，３０６号；同第５，５５０，１１１号；同第５，５６３，２５３号；同第５，５７１，７９９号；同第５，５８７，３６１号；および同第５，６２５，０５０号を参照されたい。
【００５３】
モルホリノベースのオリゴマーの化合物は、Dwaine A. BraaschおよびDavid R. Corey、Biochemistry、2002、41（14）、4503〜4510）；Genesis、30巻、3号、2001；Heasman, J.、Dev. Biol.、2002、243、209〜214；Naseviciusら、Nat. Genet.、2000、26、216〜220；Lacerraら、Proc. Natl. Acad. Sci.、2000、97、9591〜9596；および１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，５０６号で説明されている。
【００５４】
シクロヘキセニル核酸のオリゴヌクレオチド模倣体は、Wangら、J.Am.Chem.Soc.、2000、122、8595〜8602で説明されている。
【００５５】
リン原子非含有の修飾されたオリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混成のヘテロ原子とアルキルもしくはシクロアルキルとのヌクレオシド間結合、あるいは１つまたは複数の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式のヌクレオシド間結合によって形成される主鎖を有する。このような主鎖は、モルホリノ結合（部分的にヌクレオシドの糖の部分から形成された）を有するもの；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；および混成のＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成部分を有する他のものを含む。米国特許第５，０３４，５０６号；同第５，１６６，３１５号；同第５，１８５，４４４号；同第５，２１４，１３４号；同第５，２１６，１４１号；同第５，２３５，０３３号；同第５，２６４，５６２号；同第５，２６４，５６４号；同第５，４０５，９３８号；同第５，４３４，２５７号；同第５，４６６，６７７号；同第５，４７０，９６７号；同第５，４８９，６７７号；同第５，５４１，３０７号；同第５，５６１，２２５号；同第５，５９６，０８６号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６０２，２４０号；同第５，６０８，０４６号；同第５，６１０，２８９号；同第５，６１８，７０４号；同第５，６２３，０７０号；同第５，６６３，３１２号；同第５，６３３，３６０号；同第５，６７７，４３７号；および同第５，６７７，４３９号を参照されたい（これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５６】
また１つまたは複数の置換された糖部分が含まれていてもよく、例えば、２’位において以下に示すもののうち１つ：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２またはＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（式中ｎは、１〜約１０である）；Ｃｉ〜Ｃ１０低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリルまたはアラルキル；Ｃｌ；Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ３；ＯＣＦ３；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２；Ｎ３；ＮＨ２；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改善する基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、および他の類似の特性を有する置換基が含まれていてもよい。好ましい修飾としては、２’−メトキシエトキシ［２’−０−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、また２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても知られている］（Martinら、HeIv.Chim.Acta、1995、78、486）が挙げられる。他の好ましい修飾としては、２’−メトキシ（２’−０−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。また類似の修飾が、オリゴヌクレオチドの他の位置、特定には３’末端ヌクレオチドの糖の３’位および５’末端ヌクレオチドの５’位になされていてもよい。またオリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルなどの糖模倣体を有していてもよい。
【００５７】
また抑制性核酸は、それに加えて、またはその代わりに、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」ということが多い）の修飾または置換を含んでいてもよい。「修飾されていない」または「天然の」核酸塩基は、本明細書で用いられる場合、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基は、天然の核酸では希にまたは一時的にしか見られない核酸塩基、例えばヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特定には５−メチルシトシン（また５−メチル−２’デオキシシトシンとも称し、当技術分野では５−Ｍｅ−Ｃということが多い）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣおよびゲントビオシル（gentobiosyl）ＨＭＣ、加えて合成核酸塩基、例えば２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニン、または他のヘテロ置換されたアルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン、および２，６−ジアミノプリンを含む。Kornberg,A.、DNA Replication、W.H.Freeman&Co.、San Francisco、1980、75〜77ページ；Gebeyehu、Ｇ、ら、1987、Nucl.Acids Res.15：4513。また当技術分野で公知の「ユニバーサル」塩基、例えばイノシンが含まれていてもよい。５−Ｍｅ−Ｃ置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２＜０＞Ｃ．に高めることが示されており（Sanghvi,Y.S.、Crooke,S.T.、およびLebleu,B.編、Antisense Research and Applications、CRC Press、Boca Raton、1993、276〜278ページ）、目下好ましい塩基置換である。
【００５８】
所定のオリゴヌクレオチドの全ての位置を均一に修飾させることが必ずしも必要ではなく、実際には、単一のオリゴヌクレオチドに上述の修飾のうち１つより多くが取り込まれていてもよく、あるいはオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシド中にさえ取り込まれていればよい。
【００５９】
いくつかの実施形態において、糖とヌクレオシド間結合との両方、すなわちヌクレオチド単位の主鎖は、新規の基で置き換えられる。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このようなオリゴマー化合物の１種の、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖主鎖は、アミド含有主鎖、例えばアミノエチルグリシン主鎖で置き換えられる。核酸塩基は保持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を教示している代表的な米国特許は、これらに限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，７１４，３３１号；および同第５，７１９，２６２号を含み、これはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。さらなるＰＮＡ化合物の教示は、Nielsenら、Science、1991、254、1497〜1500で見ることができる。
【００６０】
抑制性核酸はまた、１つまたは複数の核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」ということが多い）の修飾または置換を含んでいてもよい。「修飾されていない」または「天然の」核酸塩基は、本明細書で用いられる場合、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基は、他の合成および天然核酸塩基、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチルならびに他のアデニンおよびグアニンのアルキル誘導体、２−プロピル、ならびに他のアデニンおよびグアニンのアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、ならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特定には５−ブロモ、５−トリフルオロメチル、ならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含む。
【００６１】
さらに、核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号で開示されたもの、「The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering」、858〜859ページ、Kroschwitz,J.I.編、John Wiley&Sons、1990で開示されたもの、Englischら、Angewandle Chemie、国際版、1991、30、613ページによって開示されたもの、およびSanghvi,Y.S.、15章、Antisense Research and Applications、289〜302ページ、それぞれCrooke,S.T.およびLebleu,B.、CRC Press、1993によって開示されたものを含む。これらの核酸塩基のうちある種のものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらの核酸塩基としては、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６、および０−６置換プリン類が挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２＜０＞Ｃに高めることが示されており（Sanghvi,Y.S.、Crooke,S.T.およびLebleu,B.編、「Antisense Research and Applications」、CRC Press、Boca Raton、1993、276〜278ページ）、目下好ましい塩基置換であり、２’−Ｏ−メトキシエチル糖の修飾と組み合わされる場合によりいっそう好ましい。修飾された核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号ならびに同第４，８４５，２０５号；同第５，１３０，３０２号；同第５，１３４，０６６号；同第５，１７５，２７３号；同第５，３６７，０６６号；同第５，４３２，２７２号；同第５，４５７，１８７号；同第５，４５９，２５５号；同第５，４８４，９０８号；同第５，５０２，１７７号；同第５，５２５，７１１号；同第５，５５２，５４０号；同第５，５８７，４６９号；同第５，５９６，０９１号；同第５，６１４，６１７号；同第５，７５０，６９２号、および同第５，６８１，９４１号に記載されている（これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６２】
いくつかの実施形態において、抑制性核酸は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞による取り込みを強化する１つまたは複数の部分または結合体と化学的に連結している。このような部分は、これらに限定されないが、脂質部分、例えばコレステロール部分（Letsingerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1989、86：6553〜6556）、コール酸（Manoharanら、Bioorg.Med.Chem.Let、1994、4、1053〜1060）、チオエーテル、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Manoharanら、Ann.N.Y.Acad.Sci.、1992、660、306〜309;Manoharanら、Bioorg.Med.Chem. Let、1993、3、2765〜2770）、チオコレステロール（Oberhauserら、Nucl.Acids Res.、1992、20、533〜538）、脂肪鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基（Kabanovら、FEBS Lett.、1990、259、327〜330;Svinarchukら、Biochimie、1993、75、49〜54）、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Manoharanら、Tetrahedron Lett.、1995、36：3651〜3654;Sheaら、Nucl.Acids Res.、1990、18：3777〜3783）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Mancharanら、Nucleosides&Nucleotides、1995、14：969〜973）、またはアダマンタン酢酸（Manoharanら、Tetrahedron Lett.、1995、36：3651〜3654）、パルミチル部分（Mishraら、Biochim.Biophys.Acta、1995、1264：229〜237）、またはオクタデシルアミン、あるいはヘキシルアミノ−カルボニル−ｔオキシコレステロール部分（Crookeら、J. Pharmacol. Exp. Ther.、1996、277、923〜937）を含む。また、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１、５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号���同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号も参照されたい（これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
【００６３】
これらの部分または結合体は、１級または２級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合した結合基を含んでいてもよい。本発明の結合基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を強化する基、およびオリゴマーの薬物動態学的特性を強化する基が挙げられる。典型的な結合基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素が挙げられる。薬力学的特性を強化する基としては、本発明に関して、取り込みを改善する、分解への耐性を強化する、および／または標的核酸との配列特異的なハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。薬物動態学的特性を強化する基としては、本発明に関して、本発明の化合物の取り込み、分布、代謝、または排出を改善する基が挙げられる。代表的な結合基は、１９９２年１０月２３日付けで出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号、および米国特許第６，２８７，８６０号に開示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。結合部分としては、これらに限定されないが、脂質部分、例えばコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、例えばヘキシル−５−トリチルチオール、チオコレステロール、脂肪鎖、例えばドデカンジオールまたはウンデシル残基、リン脂質、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖、またはアダマンタン酢酸、パルミチル部分、あるいはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分が挙げられる。例えば、米国特許第４，８２８，９７９号；同第４，９４８，８８２号；同第５，２１８，１０５号；同第５，５２５，４６５号；同第５，５４１，３１３号；同第５，５４５，７３０号；同第５，５５２，５３８号；同第５，５７８，７１７号、同第５，５８０，７３１号；同第５，５８０，７３１号；同第５，５９１，５８４号；同第５，１０９，１２４号；同第５，１１８，８０２号；同第５，１３８，０４５号；同第５，４１４，０７７号；同第５，４８６，６０３号；同第５，５１２，４３９号；同第５，５７８，７１８号；同第５，６０８，０４６号；同第４，５８７，０４４号；同第４，６０５，７３５号；同第４，６６７，０２５号；同第４，７６２，７７９号；同第４，７８９，７３７号；同第４，８２４，９４１号；同第４，８３５，２６３号；同第４，８７６，３３５号；同第４，９０４，５８２号；同第４，９５８，０１３号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，０８２，８３０号；同第５，１１２，９６３号；同第５，２１４，１３６号；同第５，２４５，０２２号；同第５，２５４，４６９号；同第５，２５８，５０６号；同第５，２６２，５３６号；同第５，２７２，２５０号；同第５，２９２，８７３号；同第５，３１７，０９８号；同第５，３７１，２４１号、同第５，３９１，７２３号；同第５，４１６，２０３号、同第５，４５１，４６３号；同第５，５１０，４７５号；同第５，５１２，６６７号；同第５，５１４，７８５号；同第５，５６５，５５２号；同第５，５６７，８１０号；同第５，５７４，１４２号；同第５，５８５，４８１号；同第５，５８７，３７１号；同第５，５９５，７２６号；同第５，５９７，６９６号；同第５，５９９，９２３号；同第５，５９９，９２８号および同第５，６８８，９４１号を参照されたい。
【００６４】
ロックト核酸（ＬＮＡ）
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法で使用される修飾された抑制性核酸は、ロックト核酸（ＬＮＡ）分子、例えば［アルファ］−Ｌ−ＬＮＡなどを含む。ＬＮＡは、リボース環が２’−酸素と４’−炭素との間のメチレン架橋によって「ロック」されたリボ核酸類似体、すなわち、少なくとも１つのＬＮＡ単量体、すなわち１つの２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボフラノシルヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む。ＬＮＡ塩基は、標準的なワトソン−クリック塩基対を形成するが、ロックされた配置は、塩基対形成反応の速度と安定性を高める（Jepsenら、Oligonucleotides、14、130〜146（2004））。またＬＮＡは、ＲＮＡとの塩基対に対して、ＤＮＡと比べて高い親和性も有する。これらの特性のために、ＬＮＡは、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および比較ゲノムハイブリダイゼーションのためのプローブとして、ｍｉＲＮＡのためのノックダウンツールとして、さらに標的ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ、例えば本明細書において説明されているようなＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドとして特に有用である。
【００６５】
ＬＮＡ分子としては、各鎖において１０〜３０、例えば１２〜２４、例えば１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のヌクレオチドを含む分子であって、一方の鎖が、ＲＮＡ中の標的領域に実質的に同一な、例えば少なくとも８０％（またはそれより高い割合で、例えば８５％、９０％、９５％、または１００％）同一な、例えば３、２、１、または０個のミスマッチヌクレオチド（複数可）を有する分子が挙げられる。ＬＮＡ分子は、当技術分野で公知の方法を用いて化学合成することができる。
【００６６】
ＬＮＡ分子は、当技術分野で公知のあらゆる方法を用いて設計することができ、多数のアルゴリズムが公知であり、（例えばインターネットで、例えばexiqon.comで）市販されている。例えば、Youら、Nuc.Acids.Res.34：e60（2006）；McTigueら、Biochemistry 43：5388〜405（2004）；およびLevinら、Nuc.Acids.Res.34：e142（2006）を参照されたい。例えば、アンチセンスオリゴの設計に用いられる方法と類似した「ジーンウォーク（gene walk）」法を用いて、ＬＮＡの阻害活性を最適化することができる。例えば、標的ＲＮＡの所定長さに及ぶ１０〜３０個のヌクレオチドの一続きのオリゴヌクレオチドを調製して、それに続いて活性に関して試験することができる。任意選択で、ギャップ、例えば５〜１０個またはそれより多くのヌクレオチドをＬＮＡ間に残して、合成および試験されるオリゴヌクレオチドの数を減らすことができる。ＧＣ含量は、好ましくは約３０〜６０％である。ＬＮＡ設計に関する一般的なガイドラインは当技術分野で公知である。例えば、ＬＮＡ配列は他のＬＮＡ配列と非常にきつく結合するであろうと予想されるため、ＬＮＡ内で有意な相補性を回避することが好ましい。可能であれば、連続した、４つより多くのＬＮＡ残基の並びは回避されるべきである（例えば、極めて短い（例えば約９〜１０ｎｔの）オリゴヌクレオチドの場合はこのようなことは不可能な可能性がある）。いくつかの実施形態において、ＬＮＡは、キシロ−ＬＮＡである。
【００６７】
ＬＮＡに関する追加の情報については、米国特許第６，２６８，４９０号；同第６，７３４，２９１号；同第６，７７０，７４８号；同第６，７９４，４９９号；同第７，０３４，１３３号；同第７，０５３，２０７号；同第７，０６０，８０９号；同第７，０８４，１２５号；および同第７，５７２，５８２号；および付与前の米国公開公報第２０１０／０２６７０１８号；同第２０１０／０２６１１７５号；および同第２０１０／００３５９６８号；Koshkinら、Tetrahedron 54、3607〜3630（1998）；Obikaら Tetrahedron Lett.39、5401〜5404（1998）；Jepsenら、Oligonucleotides 14：130〜146（2004）；Kauppinenら、Drug Disc.Today 2（3）：287〜290（2005）；およびPontingら、Cell 136（4）：629〜641（2009）、およびそこで引用された文献を参照されたい。
【００６８】
抑制性核酸の作製および使用
本明細書において説明される方法を実施するのに用いられる核酸配列は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルスまたはそれらのハイブリッドのいずれかにかかわらず、様々な源から単離し、遺伝操作し、増幅し、および／または組換えによって発現／生成することができる。組換え核酸配列は、個々に単離してもよいし、またはクローニングして所望の活性について試験してもよい。あらゆる組換え発現系を用いることができ、このような発現系としては、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ、細菌、真菌性、哺乳動物、酵母、昆虫または植物細胞の発現系などが挙げられる。
【００６９】
本発明の核酸配列は、送達用ベクターに挿入されて、ベクター内の転写単位から発現させてもよい。組換えベクターは、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターであってもよい。ベクターコンストラクトの作製は、当技術分野で周知のあらゆる適切な遺伝子操作技術を用いて達成することができ、このような技術としては、これらに限定されないが、例えばSambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Manual.（1989））、Coffinら、（Retroviruses.（1997））および「RNA Viruses：A Practical Approach」（Alan J.Cann編、Oxford University Press（2000））に記載されているような、標準的なＰＣＲ技術、オリゴヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、およびＤＮＡ配列決定が挙げられる。当業者には当然のことながら、本発明の核酸を細胞に移すために様々な適切なベクターが利用可能である。核酸を送達するのに適したベクターの選択、選択された発現ベクターを細胞に挿入する条件の最適化は当業者の技術範囲内であり、余計な実験を必要としない。ウイルスベクターは、パッケージング細胞中で組換えウイルスを生産するための配列を有するヌクレオチド配列を含む。本発明の核酸を発現するウイルスベクターは、これらに限定されないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、またはアルファウイルスなどのウイルス主鎖をベースとして構築してもよい。本発明の核酸を発現することができる組換えベクター（例えばウイルスベクター）は、本明細書において説明されているようにして送達して、標的細胞（例えば安定な形質転換体）で維持してもよい。
【００７０】
本発明を実施するのに用いられる核酸配列は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで周知の化学合成技術により合成することもでき、例えば、Adams（1983）J.Am.Chem.Soc.105：661；Belousov（1997）Nucleic Acids Res.25：3440〜3444；Frenkel（1995）Free Radic.Biol.Med.19：373〜380；Blommers（1994）Biochemistry 33：7886〜7896；Narang（1979）Meth.Enzymol.68：90；Brown（1979）Meth.Enzymol.68：109；Beaucage（1981）Tetra.Lett.22：1859；米国特許第４，４５８，０６６号に記載されているようにして合成することもできる。
【００７１】
本発明の核酸配列は、例えばヌクレオチド修飾などの修飾を取り入れることにより、核酸分解に対して安定化されていてもよい。例えば、本発明の核酸配列は、少なくともヌクレオチド配列の５’または３’末端における第１、第２、または第３のインターヌクレオチド結合にホスホロチオエートを含むことができる。別の例として、核酸配列は、２’位で修飾されたヌクレオチド、例えば２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、または２’−Ｏ−−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−−ＮＭＡ）を含んでいてもよい。別の例として、核酸配列は、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチル−修飾ヌクレオチドを含んでいてもよく、いくつかの実施形態において、全てのヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾を含む。いくつかの実施形態において、核酸は、「ロック」されており、すなわち、リボース環が２’−Ｏ原子と４’−Ｃ原子とを連結するメチレン架橋によって「ロック」された核酸類似体を含む（例えば、Kaupinnenら、Drug Disc.Today 2（3）：287〜290（2005）；Koshkinら、J.Am.Chem.Soc.、120（50）：13252〜13253（1998）を参照）。追加の修飾については、ＵＳ２０１００００４３２０、ＵＳ２００９０２９８９１６、およびＵＳ２００９０１４３３２６を参照されたい。
【００７２】
本発明を実施するのに用いられる核酸の取り扱い技術、例えばサブクローニング、標識付けプローブ（例えば、クレノーポリメラーゼ、ニックトランスレーション、増幅を用いたランダムプライマーによる標識付け）、配列決定、ハイブリダイゼーションなどは、科学文献および特許文献でよく説明されており、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual 3版.（2001）；Current Protocols in Molecular Biology、Ausubelら編（John Wiley&Sons,Inc.、New York 2010）；Kriegler,Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual（1990）；Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology：Hybridization With Nucleic Acid Probes,PartI.Theory and Nucleic Acid Preparation、Tijssen編.Elsevier、N.Y.（1993）を参照されたい。
【００７３】
医薬組成物
本明細書に記載される方法は、ＳＭＯＣ２のＲＮＡを標的化するように設計された阻害性抗体または核酸配列を含む医薬組成物および製剤の投与を含んでいてもよい。
【００７４】
いくつかの実施形態において、本組成物は、医薬的に許容されるキャリアーと共に配合される。医薬組成物および製剤は、非経口投与、局所投与、経口投与してもよいし、あるいは例えばエアロゾルまたは経皮で局所投与してもよい。医薬組成物は、あらゆる方法で配合することができ、状態または疾患および疾病の程度、各患者の一般健康状態、その結果の好ましい投与方法などに応じて様々な単位剤形で投与することができる。医薬の配合および投与技術に関する詳細は、科学文献および特許文献でよく説明されており、例えば、Remington：The Science and Practice of Pharmacy、21版、2005を参照されたい。
【００７５】
抑制性核酸は、単独で投与してもよいし、または医薬製剤（組成物）の成分として投与してもよい。本化合物は、ヒトまたは獣医学に使用するのに便利なあらゆる方法で、投与用に配合することができる。また湿潤剤、乳化剤、および潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、加えて着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤および着香剤、保存剤、ならびに抗酸化剤も組成物中に存在していてもよい。
【００７６】
本発明の組成物の製剤は、皮内、吸入法、経口／経鼻、局所、非経口、直腸、および／または膣内投与に適した製剤を含む。このような製剤は、都合のよい形態としては単位剤形で提供することができ、当技術分野で周知のあらゆる薬学的方法で調製することができる。単一剤形を生産するのにキャリアー材料と組み合わせることができる活性成分（例えば本発明の核酸配列）の量は、治療を受ける宿主、例えば皮内または吸入法などの具体的な投与様式に応じて様々であろうと予想される。単一剤形を生産するのにキャリアー材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般的に、治療効果、例えば、抗原特異的なＴ細胞または体液性応答を生じさせる化合物の量と予想される。
【００７７】
医薬製剤は、医薬製造分野で公知のあらゆる方法に従って調製することができる。このような薬物は、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤および保存剤を含んでいてもよい。製剤は、製造に適した非毒性の医薬的に許容される賦形剤と混合されていてもよい。製剤は、１つまたは複数の希釈剤、乳化剤、保存剤、緩衝剤、賦形剤などを含んでもよく、さらに、液体、粉末、エマルジョン、凍結乾燥粉末、スプレー、クリーム、ローション、放出制御製剤、錠剤、丸剤、ゲルのような形態、パッチ上、インプラント中などで提供されてもよい。
【００７８】
経口投与用の医薬製剤は、当技術分野で周知の医薬的に許容されるキャリアーを用いて適切で都合のよい投与量で配合することができる。このようなキャリアーにより、患者による摂取に適した錠剤、丸剤、粉末、糖衣錠、カプセル、液体、ロゼンジ、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として医薬を単位剤形で配合できるようになる。経口で使用するための医薬調製物を固体賦形剤として配合し、任意選択で得られた混合物を磨り潰し、必要に応じて適切な追加の化合物を添加した後に顆粒の混合物を加工することにより、錠剤または糖衣錠コアを得てもよい。適切な固体賦形剤は、炭水化物またはタンパク質の充填剤であり、このようなものとしては、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールなどの糖類；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、またはナトリウムカルボキシ−メチルセルロースなどのセルロース；ならびにアラビアゴムおよびトラガカントゴムなどのゴム；ならびに例えばゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質が挙げられる。例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはそれらの塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤が添加されていてもよい。プッシュフィット式カプセルは、ラクトースまたはデンプンなどの充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意選択で安定剤と混合された活性物質を含んでいてもよい。ソフトカプセルの場合、活性物質は、脂肪油、流動パラフィン、または液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体に、安定剤と共に、または安定剤なしで溶解または懸濁させてもよい。
【００７９】
水性懸濁液は、活性物質（例えば、本発明の核酸配列）を、例えば水溶液の皮内注射のための水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合した状態で含有していてもよい。このような賦形剤としては、懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、およびアラビアゴム、および分散剤または湿潤剤、例えば天然に存在するホスファチド（例えばレシチン）、酸化アルキレンと脂肪酸（例えばステアリン酸ポリオキシエチレン）との縮合生成物、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコール（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）との縮合生成物、エチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール（例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート）から誘導された部分エステルとの縮合生成物、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール無水物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）から誘導された部分エステルとの縮合生成物が挙げられる。水性懸濁液はまた、１つまたは複数の保存剤、例えばエチルまたはｎ−ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、１つまたは複数の着色剤、１つまたは複数の香味剤および１つまたは複数の甘味剤、例えばスクロース、アスパルテームまたはサッカリンを含んでいてもよい。製剤の浸透圧モル濃度を調節することができる。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本発明の核酸配列を投与するためにオイルベースの医薬が用いられる。オイルベースの懸濁液は、落花生油、オリーブ油、ゴマ油もしくはヤシ油などの植物油、または流動パラフィンなどの鉱油；またはこれらの混合物中に活性物質を懸濁することによって配合されてもよい。例えば、生物学的利用率を高め、経口投与される疎水性医薬化合物の個体間および個体内での変動を減少させるために、エッセンシャルオイルまたはエッセンシャルオイル成分を用いることが説明されている米国特許第５，７１６，９２８号を参照されたい（また米国特許第５，８５８，４０１号も参照）。油懸濁液は、蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールなどの増粘剤を含んでいてもよい。口当たりのよい経口用調製物を提供するために、グリセロール、ソルビトールまたはスクロースなどの甘味剤が添加されていてもよい。これらの製剤は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加により保存することができる。注射用油性ビヒクルの例としては、Minto（1997）J.Pharmacol.Exp. Ther.281：93〜102を参照されたい。
【００８１】
また医薬製剤は、水中油型エマルジョンの形態であってもよい。油相は、上述された植物油もしくは鉱油、またはこれらの混合物であってもよい。適切な乳化剤としては、天然に存在するゴム、例えばアラビアゴムおよびトラガカントゴム、天然に存在するホスファチド、例えばダイズレシチン、脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導されたエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、ならびにこれらの部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられる。またエマルジョンは、例えばシロップやエリキシルの配合の場合、甘味剤や香味剤を含んでいてもよい。このような製剤はさらに、粘滑薬、保存剤、または着色剤を含んでいてもよい。その代わりの実施形態において、これらの本発明の注射用水中油型エマルジョンは、パラフィン油、モノオレイン酸ソルビタン、エトキシ化モノオレイン酸ソルビタン、および／またはエトキシ化トリオレイン酸ソルビタンを含む。
【００８２】
医薬化合物はまた、例えば坐剤、通気法、粉末、およびエアロゾル製剤（例えばステロイド吸入剤、例えば、Rohatagi（1995）J.Clin.Pharmacol. 35：1187〜1193；Tjwa（1995）Ann.Allergy Asthma Immunol.75：107〜111を参照）として、鼻腔内、眼球内、および膣内経路で投与されてもよい。坐剤の製剤は、薬物を、常温では固体であるが体温では液体の適切な非刺激性の賦形剤と混合することによって調製することができ、それゆえに体内で溶融して薬物を放出するであろうと予想される。このような材料は、カカオバターやポリエチレングリコールである。
【００８３】
いくつかの実施形態において、アプリケータースティック、溶液、懸濁液、エマルジョン、ゲル、クリーム、軟膏、ペースト、ゼリー、塗料、粉末、およびエアロゾルとして配合される医薬化合物は、局部経路により経皮送達することもできる。
【００８４】
いくつかの実施形態において、医薬化合物はまた、体内で遅延放出させるためのマイクロスフェアとして送達することもできる。例えば、マイクロスフェアは、皮下で徐放される薬物の皮内注射により投与してもよいし（Rao（1995）J.Biomater Sci.Polym.7版：623〜645を参照）；生分解性の注射用ゲル製剤として投与してもよいし（例えば、Gao（1995）Pharm.Res.12：857〜863（1995）を参照）；または経口投与用マイクロスフェアとして投与してもよい（例えば、Eyles（1997）J.Pharm.Pharmacol.49：669〜674を参照）。
【００８５】
いくつかの実施形態において、医薬化合物は、静脈内（ＩＶ）投与もしくは体腔内または臓器の内腔への投与などによって非経口投与されてもよい。これらの製剤は、医薬的に許容されるキャリアーに溶解させた活性物質溶液を含んでいてもよい。使用可能な、許容できるビヒクルおよび溶媒は、水およびリンゲル液、等張の食塩水である。加えて、溶媒または懸濁媒として滅菌した不揮発性油を使用することもできる。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドなどのあらゆる刺激の少ない不揮発性油を使用することができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸も同様に注射液調製物に使用することができる。これらの溶液は滅菌されており、通常は望ましくない物質を含まない。これらの製剤は、従来の周知の滅菌技術により滅菌することができる。このような製剤は、必要に応じて、生理学的条件に近づけるための医薬的に許容される補助剤を含んでいてもよく、このような補助剤としては、例えばｐＨ調節剤および緩衝剤、毒性を調節する作用物質、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどが挙げられる。これらの製剤中の活性物質濃度は、広範囲に様々であってよく、主として流体の体積、粘度、体重などに基づき、選択された特定の投与様式および患者の要求に従って選択されるであろうと予想される。ＩＶ投与の場合、製剤は、滅菌された注射用水性または油性懸濁液などの滅菌注射用調製物であってもよい。この懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤と懸濁化剤とを用いて配合することができる。また滅菌注射用調製物は、１，３−ブタンジオール溶液などの非毒性の非経口で許容できる希釈剤または溶媒中の懸濁液であってもよい。投与は、ボーラスまたは持続注入（例えば、特定の期間にわたり実質的に中断しないで血管に導入されること）によってなされてもよい。
【００８６】
いくつかの実施形態において、医薬化合物および製剤は、凍結乾燥することができる。抑制性核酸を含む安定な凍結乾燥製剤は、本発明の医薬と、充填剤、例えばマンニトール、トレハロース、ラフィノース、およびスクロースまたはそれらの混合物とを含む溶液を凍結乾燥することによって作製することができる。安定な凍結乾燥製剤の調製方法は、約２．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質、約１５ｍｇ／ｍＬのスクロース、約１９ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ、および５．５より高いが６．５より低いｐＨを有するクエン酸ナトリウム緩衝液の溶液を凍結乾燥することを含んでいてもよい。例えばＵ．Ｓ．２００４００２８６７０を参照されたい。
【００８７】
組成物および製剤は、リポソームの使用によって送達することができる。リポソームを用いれば、特にリポソーム表面が標的細胞に特異的なリガンドを有するか、あるいは別の方法で選択的に特定の臓器に向けられている場合、ｉｎ  ｖｉｖｏで集中的に標的細胞に活性物質を送達することができる。例えば、米国特許第６，０６３，４００号；同第６，００７，８３９号；Al-Muhammed（1996）J.Microencapsul.13：293〜306；Chonn（1995）Curr.Opin.Biotechnol.6：698〜708；Ostro（1989）Am.J.Hosp.Pharm.46：1576〜1587を参照されたい。本発明で使用される場合、用語「リポソーム」は、二分子層または二重層中に配置された両親媒性脂質で構成される小胞を意味する。リポソームは、親油性材料と、送達しようとする組成物を含有する水性の内部とから形成された膜を有する単層または多層小胞である。カチオン性リポソームは、負電荷を有するＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成すると考えられる正電荷を有するリポソームである。ｐＨ感受性であるかまたは負に荷電したリポソームは、それを有する複合体よりもＤＮＡを閉じ込めると考えられる。カチオン性および非カチオン性リポソームの両方が、ＤＮＡを細胞に送達するのに使用されてきた。
【００８８】
リポソームはまた、「空間配置的に安定化された」リポソーム、すなわち１つまたは複数の特殊化した脂質を含むリポソームを含んでいてもよい。これらの特殊化した脂質がリポソームに取り込まれると、このような特殊化した脂質を欠くリポソームに比べて循環中での寿命が強化されたリポソームが生じる。空間配置的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞を形成する脂質部分の一部が１つまたは複数のグリコリピドを含むか、または１つまたは複数の親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）成分などで誘導体化されているものである。リポソームおよびその使用は、米国特許第６，２８７，８６０号でさらに説明されている。
【００８９】
本発明の製剤は、予防的および／または治療的処置のために投与することができる。いくつかの実施形態において、治療用途の場合、組成物は、トリグリセリドレベルの低減を必要とする対象、または本明細書に記載される障害のリスクがあるかまたはそのような障害を有する対象に、障害またはその合併症の臨床症状を治癒する、緩和する、または部分的に抑えるのに十分な量で投与される。これは、治療有効量と呼ばれることもある。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、対象におけるトリグリセリドの血清レベルを減少させるのに十分な量で投与される。
【００９０】
これを達成するのに十分な医薬組成物の量は、治療上有効な用量である。この使用にとって有効な処方計画および量、すなわち投与計画は、疾患または状態の段階、疾患の重症度または状態、患者の健康状態の全身状態、患者の身体状態、年齢などの様々な因子によって決まるであろうと予想される。患者にあった計画を計算する際、投与様式も考慮に入れる。
【００９１】
また計画は、当技術分野で周知の薬物動態学的パラメーター、すなわち活性物質の吸収速度、生物学的利用率、代謝、クリアランスなども考慮に入れる（例えば、Hidalgo-Aragones（1996）J.Steroid Biochem.Mol.Biol.58：611〜617；Groning（1996）Pharmazie 51：337〜341；Fotherby（1996）Contraception 54：59〜69； Johnson（1995）J.Pharm.Sci.84：1144〜1146；Rohatagi（1995）Pharmazie 50：610〜613；Brophy（1983）Eur.J.Clin.Pharmacol.24：103〜108；Remington：The Science and Practice of Pharmacy、21版、2005を参照）。最先端技術により、臨床医は、それぞれ個々の患者、活性物質および治療される疾患または状態にあった計画を決定することが可能になる。医薬として用いられる類似の組成物のために提供されたガイドラインを指針として用いることにより、計画、すなわち本発明の方法の実施の際に投与される用量のスケジュールと投与量のレベルが、正しく適切であることを決定することができる。
【００９２】
単回または複数回の製剤の投与は、例えば、患者が必要とし許容される投与量および頻度、各投与後に生じる治療効果の程度および量（例えば、腫瘍のサイズまたは成長に対する作用）などに応じて与えることができる。製剤は、効果的に状態、疾患または症状を治療、予防または改善するのに十分な量の活性物質を提供すべきである。
【００９３】
その代わりの実施形態において、経口投与用の医薬製剤の１日の量は、約１〜１００ｍｇ／キログラム体重／日またはそれより多い量である。経口投与とは異なり、血流、体腔または臓器の内腔には、それよりも少ない投与量が用いられる可能性がある。局所もしくは経口投与、あるいは粉末、スプレーまたは吸入法での投与では、それよりも実質的に高い投与量が用いられる可能性がある。非経口投与または非経口ではない投与が可能な製剤を調製する実際の方法は、当業者にはよく知られており明白であると予想され、Remington：The Science and Practice of Pharmacy、21版、2005のような出版物でより詳細に説明されている。
【００９４】
様々な研究で、相補的核酸配列を用いた哺乳動物投与の成功が報告されている。例えば、Esau C.ら、（2006）Cell Metabolism、3（2）：87〜98；Krutzfeldt J.,ら、（2005）Nature 438、685〜689；Elmenら、（2008）Nature 452、896〜899を参照されたい。
【００９５】
併用治療
本明細書に記載される方法は、ＳＭＯＣ２の阻害剤に加えて標準的な治療の使用を含んでいてもよい。腎線維症および／または慢性腎疾患のための治療は、当技術分野で公知であり、非限定的な例によれば、透析；移植；低タンパク質食；ＡＣＥ阻害剤（例えばペリンドプリル、カプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、またはラミプリル）；アンギオテンシンＩＩ受容体ブロッカー（ＡＲＢ）（例えば、ロサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、フィマサルタン、またはテルミサルタン）；脂質の制御（例えば、スタチン）；ビタミンＤ補充；リン酸の制御；貧血の制御（例えば、赤血球刺激剤（erythroid stimulating agent））；アシドーシス予防（例えば、重炭酸ナトリウム）；および尿酸の制御（例えば、アロプリノール）が挙げられる。
【実施例】
【００９６】
以下の実施例において本発明をさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定するものではない。
【００９７】
方法
以下の実施例では、以下の材料および方法を使用した。
【００９８】
ヒトにおける研究
施設内倫理審査委員会は、補充および尿サンプル収集のためのプロトコールを承認し、これを、参加者の書面によるインフォームドコンセントと共に実行した。慢性腎疾患（ＣＫＤ）を有する患者からの尿サンプルを、Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（ＢＷＨ）外来腎臓病診療施設から得た。この研究のために、本発明者らは、段階４または５のＣＫＤを有する患者を組み入れた（推測された糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）＜３０ｍｌ／分／１．７３ｍ２）。患者が、近年の入院もしくは３カ月以内のＡＫＩのエピソード（１週間を超える血清クレアチニンの＞５０％上昇）、または過去３週間以内の尿路感染の報告もしくは尿路感染の疑いを有する場合、その患者を排除した。健康な志願者からの尿サンプルを、健康な個体における遺伝学的変異の影響の研究であるＰｈｅｎｏＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔから得た。ローカルメディアやチラシでの広告を介してボストン地域から１９から７５歳の参加者を採用した。試験対象患者基準は、１２０ｍＬの血液を５年にわたり年４回を提供する意志であった。除外基準は、自己報告された炎症性疾患（例えば、喘息または乾癬）、自己免疫疾患（例えば、狼瘡または多発性硬化症）、慢性代謝性疾患（例えば、甲状腺疾患または糖尿病）、または慢性感染（例えば、Ｂ型またはＣ型肝炎；ＨＩＶ）の存在であった。尿を収集し、３２００Ｇで５分遠心分離し、上清を収集し、収集の４時間以内に−８０Ｃで貯蔵した。重度の腎線維症を有するまたは有さない患者からの非特定化されたヒト腎臓組織サンプル（ｎ＝１０）を、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｔ  Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから得た。
【００９９】
動物実験
遺伝学的マウスモデル：ＳＭＯＣ２を過剰発現するトランスジェニック（Ｔｇ（Ｓｍｏｃ２−ＥＧＦＰ）ＨＹ１９４Ｇｓａｔ／Ｍｍｕｃｄ）（ＳＭＯＣ２Ｔｇ）マウスを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａにより購入し、標的化されるＳＭＯＣ２遺伝子の上流に挿入されたＥＧＦＰを含有する修飾ＢＡＣを使用して発生させて、これをＦＶＢ／Ｎ受精卵母細胞の前核に注射した。半接合体の後代をＩｃｒＴａｃ：ＩＣＲマウスと交配し、その後それぞれを発生させた。Ｓｍｏｃ２ｔｍ１．１（ＫＯＭＰ）Ｖｌｃｇを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおけるノックアウトマウス表現型解析プログラム（ＫＯＭＰ２）により、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍによって提供された胚幹細胞を使用して発生させた。ＺＥＮ−ＵＢ１  Ｖｅｌｏｃｉｇｅｎｅカセットを遺伝子に挿入し、全てのコード化エクソンおよび介在配列を置き換えた。コンストラクトをＣ５７ＢＬ／６Ｎ由来ＶＧＢ６胚幹（ＥＳ）細胞に導入し、正確に標的化したＥＳ細胞をＢ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ（ストック番号５８）胚盤胞に注射した。得られたキメラ雄をＣ５７ＢＬ／６Ｊ雌に育て、次いでＢ６Ｎ．Ｃｇ−Ｔｇ（Ｓｏｘ２−ｃｒｅ）１Ａｍｃ／Ｊ（ストック番号０１４０９４）に育てて、ｎｅｏカセットを除去した。得られた子孫を交雑して、ｃｒｅ発現導入遺伝子を除去した。適切なプライマーを使用して遺伝子型解析を実行した（表１）。遺伝学的マウスモデルをそれらそれぞれの野生型同腹子と比較した。実験に使用した全てのＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。全ての動物の維持および処置プロトコールは、国立衛生研究所によって採用され公表された実験動物のケアおよび使用のためのガイドに従っており、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓによって承認された。
【０１００】
【表１】
2019510009.tif 000003
【０１０１】
線維症の実験モデル：腎線維症のマウスモデルを、これまで本発明者らのグループによって詳細に記載されたようにして使用した（２９）。以下のモデルを簡単に説明する：
【０１０２】
葉酸（ＦＡ）モデル。同じ飼育／食物条件下で、雄ＳＭＯＣ２Ｔｇとその系統を一致させた対照（ＦＶＢ／ＮおよびＩｃｒＴａｃ：ＩＣＲ）（２５〜２９ｇ）、雄ＳＭＯＣ２ＫＯマウスとその系統を一致させた対照（Ｃ５７ＢＬ／６）（２１〜２４ｇ）、および８から１２週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（２５−２９ｇ）に、０．３Ｍ重炭酸ナトリウム溶液中に溶解させた２５０ｍｇ／ｋｇ  ＦＡの単回の腹膜内（ｉｐ）注射を与えた（２９）。投与７および１４日後にマウスを安楽死させた。安楽死は、イソフルラン麻酔下で実行された。
【０１０３】
片側尿管閉塞（ＵＵＯ）モデル。雌ＳＭＯＣ２Ｔｇマウスとその系統を一致させた対照（ＦＶＢ／ＮおよびＩｃｒＴａｃ：ＩＣＲ）（２５〜２９ｇ）、および８から１２週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（２５〜２９ｇ）を麻酔し（５０ｍｇ／ｋｇペントバルビタールナトリウム、ｉｐ）、側腹切開によってそれらの左の腎臓を露出させた。腎臓近位の２地点で尿管を６−０縫合糸で結紮した。シャムマウスの腎臓を露出させたが、その尿管は縛らなかった。ＳＭＯＣ２Ｔｇおよび野生型のＵＵＯ処置の１４日後に対側腎（ＣｏＫ）組織を単離した。外科手術の直後に、マウスは失われた体液の補充（３７℃に加熱した１ｍＬ規定食塩液、皮下）を受けた。動物を外科手術の７および１４日後に屠殺した。安楽死は、イソフルラン麻酔下で実行された。
【０１０４】
ｓｉＲＮＡ投与。８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（２１〜２４ｇ）は、ＲＮアーゼ非含有のリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）保有培地中のｓｉＲＮＡ  ＳＭＯＣ２（３０μｇ／２００μＬ）または対照スクランブル化ｓｉＲＮＡ（３０μｇ／２００μＬ）を、葉酸／ビヒクル処置から−４時間、＋２日、＋４日、および＋６日の静脈注射によって受けた。
【０１０５】
病理および免疫染色
全身の病理：全体のマウスの剖検を、全４群（ＳＭＯＣ２−ＫＯ、ＳＭＯＣ２−Ｔｇ、およびそれらそれぞれの同腹子対照）の雄および雌マウス（それぞれｎ＝６）で実行して、群間の病理学的な差を調査した。臓器をホルマリン固定し、７０％ＥｔＯＨ中で脱水し、パラフィン包埋し、Ｈ＆Ｅ染色した。Ｐｅｔｅｒ  Ｈｏｗｌｅｙ博士を筆頭とするＤａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ／Ｈａｒｖａｒｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ病理学研究拠点が、全ての臓器の組織学的分析の詳細な保証された報告を提供した。
【０１０６】
組織学および染色：組織学的評価のため、腎臓組織を回収の前に冷ＰＢＳで灌流した。免疫蛍光法のためのサンプルを、４％パラホルムアルデヒド中、４℃で２４時間固定し、次いで３０％スクロース溶液中で終夜洗浄し、その後、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｏ．Ｃ．Ｔ．（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、ＰＡ）中で低温保存した。組織染色のためのサンプルをホルマリン中で２４時間固定し、次いで７０％エタノール中で貯蔵し、その後パラフィン包埋した。ヒト腎臓サンプルをパラフィン包埋した。パラフィン包埋組織を４から６μｍの切片に切断し、マッソントリクロームおよびピクロシリウスレッドで染色した。画像を、Ｐｌａｎ  Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ２０×／０．８対物により、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  ＳＥ６４ソフトウェアを使用してＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒ．Ｍ２で捕獲した。全ての画像を、ｄｅｎｔｉｓｔｒｙ．ｂｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｌａｎｄｉｎｉｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｈｔｍｌで入手可能なＧ．Ｌａｎｄｉｎｉによって書かれた色閾値アルゴリズム（比較画像セットにも同一な閾値設定）（バージョンｖ１．８）を使用して、ＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪにより分析した。
【０１０７】
免疫蛍光法および定量的な顕微鏡法：ＯＣＴ包埋マウス腎臓およびパラフィン包埋ヒト腎臓を４から６μｍの切片に切断し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（０．１％）を含有する１×ＰＢＳ中で１０分透過化した。次いで切片を、Ｃｙ３−αＳＭＡ（１：５００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｃ６１９８）、αＳＭＡ−ＦＩＴＣ（１：５００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ３７７７）および抗ＳＭＯＣ２（１／２５０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＳＣ−６７３９６）で標識した。その後、抗ＳＭＯＣ２を含むスライドを、ロバ抗ウサギ特異的Ｃｙ３コンジュゲート二次抗体（１：５００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、７１１−１６５−１５２）に曝露した。４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を核染色（青色）に使用した。共焦点像を、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌのＮｉｋｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒで獲得した。２０×／０．７５Ｐｌａｎ  Ａｐｏ、４０×／１．３Ｐｌａｎ  Ｆｌｕｏｒ、６０×／１．４Ｐｌａｎ  Ａｐｏ対物レンズ、Ｐｒｉｏｒ  Ｐｒｏｓｃａｎ  ＩＩ電動ステージ、および連続的な焦点の維持のためのＮｉｋｏｎ  Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｆｏｃｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍを備えた、Ｎｉｋｏｎ  Ｔｉ倒立顕微鏡にマウントしたＢｏｒｅａｌｉｓ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎを用いるＹｏｋｏｇａｗａ  ＣＳＵ−Ｘ１スピニングディスク共焦点で画像を収集した。ＡＯＴＦ制御された４８８ｎｍ固体レーザーを用いてＦＩＴＣ蛍光を励起し、５２５／５０放出フィルター（Ｃｈｒｏｍａ）を用いて収集した。ＡＯＴＦ制御された５６１ｎｍ固体レーザーを用いてＣｙ３蛍光を励起し、６２０／６０放出フィルター（Ｃｈｒｏｍａ）を用いて収集した。ＦＩＴＣおよびＣｙ３の両方に、Ｑｕａｄ４０５／４９１／５６１／６４２ダイクロイックミラーを使用した（Ｓｅｍｒｏｃｋ）。３９５／２５励起フィルターを備えたＬｕｍｅｎｃｏｒ  ＳＯＬＡを使用してＤＡＰＩを励起し、４６０／２５放出フィルターを使用してスピニングディスクヘッドを介して放出を収集した。ＭｅｔａＭｏｒｐｈ７ソフトウェアで制御されたＨａｍａｍａｔｓｕ  ＯＲＣＡＡＧ冷却ＣＣＤカメラを用いて画像を獲得した。表示された画像上で白色度およびコントラストを調整し（比較画像セットも同様）、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ７ソフトウェアを使用して定量した（比較画像セットと同一な閾値設定）。
【０１０８】
ウェスタンブロット分析
腎臓組織および細胞培養を、１×プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を含有するＲＩＰＡ緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ４０）中でホモジナイズした。ＢＣＡタンパク質推測キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してタンパク質濃度を決定し、等量のタンパク質（２５μｇ）を、１０％または１２％ポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧＥ）のいずれかにローディングした。ニトロセルロースメンブレンを使用してタンパク質転移を実行した。以下の一次抗体を使用して、特異的なタンパク質を検出した：抗ＳＭＯＣ２（１／２５０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＳＣ−６７３９６）、抗αＳＭＡ（１／１０００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ２５４７）、抗コラーゲン１α１（１：２５０；Ｎｏｖｕｓ、ＮＢ６００−４０８）、抗フィブロネクチン（１：２５０；Ａｂｃａｍ、ａｂ２３７５０）、抗ＧＡＰＤＨ（１／５０００；Ａｂｃａｍ、ａｂ１８１６０２）、抗リン酸−ミオシン軽鎖２（Ｔｈｒ１８／Ｓｅｒ１９）（１／１０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、番号３６７４）、抗リン酸−パキシリン（Ｔｙｒ１１８）（１／１０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、番号２５４１）、抗リン酸−ＦＡＫ（Ｔｙｒ９２５）（１／１０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、番号３２８４）。マウス（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、番号７０７６）およびウサギ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、番号７０７４）に対するホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体を使用して、適切な一次抗体を検出した。強化された化学発光（ＥＣＬ）方法（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてバンドを検出し、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ（商標）ＸＲ＋システム（ＢｉｏＲａｄ）を用いて捕獲した。
【０１０９】
定量リアルタイムＰＣＲ
ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を製造元のプロトコールに従って使用して、全ＲＮＡを細胞培養物または組織サンプルから単離した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を使用してＲＮＡ濃度を測定した。Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）からのＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キットを使用して、単離したＲＮＡ（１ｕｇ）をｃＤＮＡに逆転写した。ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ７（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でＱｕａｎｔｉＦａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、以下の熱プロファイル：９５℃で１５秒の活性化；９４℃で１５秒、６０℃で３０秒のアニーリング／伸長を４０サイクル；７２℃で３０秒の伸長を用いて定量リアルタイムＰＣＲを実行した。全てのサンプルを技術的に重複して測定し、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。対照に対するｍＲＮＡ発現の変化をΔΔＣｔ方法を使用して計算した。表２に、マウス特異的遺伝子のフォワードおよびリバースプライマー配列を列挙する。
【０１１０】
【表２】
2019510009.tif 000004
【０１１１】
ＲＮＡシーケンシング
ライブラリー調製物：ＲＮＡサンプル（ｎ＝３〜４匹のマウス／タイムポイント／群）を、ｎａｎｏｄｒｏｐおよびＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザー機器を使用して品質および量に関してチェックした。全てのＲＮＡサンプルは、７より高いＲＩＮ数を有していた。ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡライブラリープレップキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を以下のように改変された製造元のプロトコールに従って使用して、ライブラリーを調製した：各サンプルにつき３３０ｎｇのＲＮＡを、６．６７ｕｌの１：１０００のＥＲＣＣ  ｓｐｉｋｅ−ｉｎ  Ｍｉｘ  ２（Ａｍｂｉｏｎ）と共に入れ、断片化を８分行い、最終的なライブラリー増幅のために１３回のＰＣＲサイクルを使用した。完成したｄｓＤＮＡライブラリーを、Ｑｕｂｉｔ蛍光測定器、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ２２００、およびＫａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓライブラリー定量キットを製造元のプロトコールに従って使用したＲＴ−ｑＰＣＲによって定量した。個別にインデックスを付けたライブラリーを等モル比でプールし、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ拠点施設によって単一の末端の７５ｂｐのリードを用いて試行された単一のＩｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ５００で配列決定した。ＳＴＡＲアライナーを使用して、配列決定したリードをｍｍ９のゲノムアセンブリにマッピングし、遺伝子レベルの発現を定量した。ＮＣＢＩ  ＧＥＯデータベースで受託番号ＧＳＥ８５２０９により全データセットが入手可能である。
【０１１２】
バイオインフォマティクス分析：全てのサンプルを、ｂｃｂｉｏ−ｎｅｘｔｇｅｎ  ｐｒｏｊｅｃｔ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｃｂｉｏ−ｎｅｘｔｇｅｎ．ｒｅａｄｔｈｅｄｏｃｓ．ｏｒｇ／ｅｎ／ｌａｔｅｓｔ／）で実行されるＲＮＡ−ｓｅｑパイプラインを使用して加工した。未加工のリードを、ＦａｓｔＱＣ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｂａｂｒａｈａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｆａｓｔｑｃ／）を使用して品質の点で検査して、ライブラリーの生成を確認し、さらなる分析にはシーケンシングが適していた。アダプター配列、他の汚染配列、例えばポリＡテールやＰＨＲＥＤ品質スコアが５未満の低品質の配列などを、ｃｕｔａｄａｐｔを使用してリードからトリミングした（３０）。ＳＴＡＲアライナーを使用してトリミングしたリードをハツカネズミゲノムのＵＣＳＣ  ｂｕｉｌｄ１０（ｍｍ１０）に並べ、ＥｎｓｅｍｂｌリリースＧＲＣｍ３８からの転写情報を増大させた（３１）。アライメントを、被覆率の均一さ、ｒＲＮＡ含量、アライメント（例えば、公知の転写物およびイントロンにおけるアライメント）のゲノムのコンテクスト、複雑さおよび他の品質チェックに関して、ＦａｓｔＱＣ、Ｑｕａｌｉｍａｐ（３２）および特注のスクリプトの組合せを使用してチェックした。公知の遺伝子に並べるリードの数は、ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓから得た（３３）。遺伝子レベルでの差次的な発現をＤＥＳｅｑ２と称した（３４）。ＤＥＳｅｑ２を使用して、ワルドの有意性試験および「差分の差分法」を発見するように設計された式、または遺伝子型とこのＤＥＳｅｑ２設計の式：遺伝子型＋処置＋遺伝子型：処置における処置との交差タームを使用して、どのように２つの遺伝子型が処置に対して異なって反応したかを発見した。このアプローチの結果として、倍率変化値は、２つのサンプルクラス間で直接観察されたと予想される直接の遺伝子発現ではなく、処置後の発現変化に対する遺伝子型の差次的な作用を説明する。ＰＣＡ分析を、ＤＥＳｅｑ２で正規化したｒｌｏｇ分散の安定化されたリードで実行した。遺伝子オントロジー（ＧＯ）のためのカットオフなしの遺伝子セットの濃縮分析（ＧＳＥＡ）およびＫＥＧＧタームを、ＧＡＧＥ（３５）を使用してＤＥＳｅｑ２から得られた倍率変化値で実行し、ＲＥＶＩＧＯ（３６）ツリーマップで可視化した。各遺伝子型の発現値をそれらそれぞれの未処置サンプルの平均発現値にセンタリングおよびスケーリングした後（すなわち各サンプルの発現値を遺伝子型の未処置サンプルの平均発現値から引いて、平均の関連する標準偏差で割る）、濃縮されたＧＯターム中の遺伝子の発現パターンをヒートマップによって可視化した。
【０１１３】
細胞培養、試薬およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養：ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＡＴＣＣから購入し、ダルベッコ改変イーグル培地：１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が補充された栄養素混合物Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有するポリスチレン培養皿中で単分子層として成長させた。継代の前に８０％の密集度になるまで細胞を成長させた。ＨＰＴＥＣをＢｉｏｐｒｅｄｉｃ（Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、ヒドロコルチゾン、ＥＧＦ、インスリン、トランスフェリン、および亜セレン酸ナトリウムが補充されたＤＭＥＭ／Ｆ１２中で培養した。細胞を、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で維持した。線維芽細胞から筋線維芽細胞への転換（３７）を研究する実験のために、線維芽細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２  １０％ＦＢＳ中、低密度で２４時間培養し、次いでＳＭＯＣ２（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ）および／またはＴＧＦβ１（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ）での処置の４時間前に、４０〜５０％の密集度で培地をＤＭＥＭ／Ｆ１２  １％ＦＢＳに変更した。細胞株は、一般的に誤認される細胞株のＩＣＬＡＣデータベースで報告されていなかった。
【０１１４】
トランスフェクション：ＳＭＯＣ２ノックダウン実験のために、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を、１００ｎＭスクランブルまたはＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）で、ｓｉＰＯＲＴ  ＮｅｏＦＸトランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を製造元のプロトコールに従って用いてトランスフェクトした。ＤＭＥＭ／Ｆ１２  １０％ＦＢＳ中で２４時間後、ウェスタンブロット分析のために細胞を回収するか、またはＴＧＦβ１刺激のケースにおいて、トリプシンで処置し、４０％密集度で再度植え付けた。ＳＭＯＣ２過剰発現のために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を、ｐＣＭＶ  Ｍｙｃ（ｐＣＭＶ）またはＳＭＯＣ２（Ｍｙｃ−ＤＤＫ−タグ含有）−ヒトＳＰＡＲＣ（ｐＣＭＶ−ＳＭＯＣ２）プラスミド（Ｏｒｉｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）のいずれかで、リポフェクトアミン２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を製造元のプロトコールに従って用いてトランスフェクトした。ＤＭＥＭ／Ｆ１２  １０％ＦＢＳ中で２４時間後、ウェスタンブロットおよびＲＴ−ＰＣＲ分析のために細胞を回収するか、または様々なアッセイのために、トリプシンで処置し、４０％密集度で再度植え付けた。
【０１１５】
免疫蛍光法：ＮＩＨ３Ｔ３細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（Ｆｉｓｈｅｒ）で固定した、ＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｆｉｓｈｅｒ）で透過化し、次いで３％ウシ−血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）中でブロックした。ＰＢＳ中で１時間、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６４コンジュゲートローダミンファロイジン（Ｔｈｅｒｍｏ）を１：５００で使用して細胞骨格のＦ−アクチンを可視化した。４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を核染色（青色）に使用した。共焦点像を、上述したようにＨａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌのＮｉｋｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒで獲得した。
【０１１６】
スクラッチアッセイ：線維芽細胞を半密集化した単分子層まで成長させ、次いでＤＭＥＭ／Ｆ１２  １％ＦＢＳ中で標準的な２００μＬピペットチップを使用して機械的にスクラッチを与えた（創傷を与えた）。懸濁細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２  １％ＦＢＳで洗浄して除いた。スクラッチに沿って、位相差顕微鏡を使用した創傷の初期化の０時間および２４時間後における代表的な写真のために予め固定したポイントを選択した。創傷の閉鎖は、２４時間の間にＳＭＯＣ２処置線維芽細胞の新たにカバーされた領域の正常に対するパーセンテージによって計算された（サンプル１つ当たりｎ＝５、３枚の画像）。未処置細胞からの移動距離を１００％とした。代表的な画像を、コントラスト増加のために２４時間でメチレンブルーで染色した。
【０１１７】
ＭＴＴアッセイ：７５００個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を９６−ウェルプレートで２４時間平板培養し、その後ＤＭＥＭ／Ｆ１２  ０．５％ＦＢＳ中でそれらの血清を枯渇させた。次いで線維芽細胞を、０．２％ＦＢＳ中の異なる濃度のＳＭＯＣ２で２４、４８、７２および９６時間で処置した。各サンプルに、１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを各タイムポイントの２時間前に添加した。培地を吸引し、１００ｍｌのイソプロパノールを添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐａｒａｄｉｇｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、吸光度を、６３０ｎｍを参照として、５７０ｎｍで測定した。未処置細胞から得られた吸光度を１００％とした（ｎ＝５／濃度／タイムポイント）。
【０１１８】
ボイデンチャンバーアッセイ：処置の存在および非存在下における血清非含有の培地を、走化性細胞移動アッセイの下のチャンバー、９６−ウェル（８μｍ）プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に添加した。１０％ＦＢＳ中でＮＩＨ３Ｔ３細胞を成長させ、その２４時間後に、８μＭ９６−ウェルプレートの上の移動チャンバーの０．２％ＦＢＳ中で２４時間平板培養した。移動アッセイを製造元のプロトコールに従って実行した。
【０１１９】
細胞接着アッセイ：７５００個のＮＩＨ３Ｔ３細胞を９６−ウェルプレートで２４時間平板培養した。トリプシンを用いて細胞を回収し、３７℃で９６−ウェルプレートに再度植え付けた。１時間インキュベートした後、２×ＰＢＳでの洗浄によって未付着の細胞を除去した。接着性の線維芽細胞をメタノールで固定し、１％クリスタルバイオレットで染色した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐａｒａｄｉｇｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して吸光度を測定した。未処置細胞から得られた吸光度を１００％とした（ｎ＝３）。
【０１２０】
統計的分析
データは、平均±標準誤差として表される。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を使用して、テューキーの事後分析を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）（Ｐ＜０．０５）により多重比較に関する統計的有意性を評価した。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社）を使用して、両側スチューデントｔ検定（Ｐ＜０．０５）によって単一比較に関する統計的有意性を計算した。本発明者らの実験室で類似のリードアウトからこれまでに観察された作用のサイズおよびばらつきに基づきサンプルサイズを予め決定した。
【０１２１】
[実施例１]
ＳＭＯＣ２は、線維症後のマウスおよびヒトの腎臓において高度に誘導される
結果的に進行性の線維症を発症させた２つの機構的に別個の腎臓傷害マウスモデルである片側尿管閉塞（ＵＵＯ）に供されたマウスまたは葉酸（ＦＡ、２５０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ）で処置したマウスにおいて、ＳＭＯＣ２は有意に（Ｐ＜０．０５）誘導された（図１Ａ〜Ｄ、７ＡおよびＢ）（UUO Craciunら、J Am Soc Nephrol. 2016；27（6）：1702〜13； Craciunら、Am J Physiol Renal Physiol. 2014；307（4）：F471-84；Yuanら、Am J Pathol. 2003；163（6）：2289〜301；Longら、J Am Soc Nephrol. 2001；12（12）：2721〜31；Surendranら、Kidney Int. 2004；65（6）：2212〜22；Kangら、Nat Med. 2015；21（1）：37〜46；Kangら、Cell Rep. 2016；14（4）：861〜71；Chevalierら、Kidney Int. 2009；75（11）：1145〜52；Yangら、Nat Med. 2010；16（5）：535〜43, 143の後の1p）。７日目におけるＵＵＯまたはＦＡに供されたマウスの腎臓におけるＳＭＯＣ２とαＳＭＡの共染色から、腎臓全体で広範にわたるＳＭＯＣ２の上方調節が確認され、線維症の領域周辺の近位および遠位尿細管上皮細胞において優勢であった（図１Ａおよび１Ｂ）。αＳＭＡに関して（図１Ａ、下のパネル）、ＳＭＯＣ２は、筋線維芽細胞と共に局在しておらず、むしろ線維症のエフェクター細胞である筋線維芽細胞の周辺で発現されていたが、これはＳＭＯＣ２の細胞外発現と合致している。ＵＵＯおよびＦＡモデルの両方において、ＳＭＯＣ２発現は、＋αＳＭＡ−筋線維芽細胞、コラーゲン、およびフィブロネクチンの発現を特徴とする線維症の進行と相関していた（図１Ｃおよび１Ｄ、濃度測定は図７ＣおよびＤ）。これまでに本発明者らは、葉酸の腎機能に対する組織学的作用も調べており（Craciunら、J Am Soc Nephrol. 2016；27（6）：1702〜13）、それによればＦＡによって誘導された尿細管間質性の線維症（組織学的分析および線維化マーカー発現）は、腎機能低下と相関していた。ヒト疾患におけるＳＭＯＣ２発現の翻訳可能性は、病的な線維症を有する患者からのヒト腎臓生検切片の尿細管上皮細胞における有意なＳＭＯＣ２の誘導を観察することによって確認された（図１Ｅおよび図７Ｃ）。分泌型タンパク質であるＳＭＯＣ２も、健康な志願者（ｎ＝１３）と比較して、慢性腎疾患を有する患者（ＣＫＤ、表３、ｎ＝１３）の尿中で有意に上昇した（２．５倍、ｐ＜０．０５）。この増加は、尿細管のダメージのバイオマーカーである腎臓傷害分子−１の増加と相関していた（図１Ｆ）。これらのｉｎ  ｖｉｖｏでの発見と一致して、線維化促進性のサイトカインＴＧＦβ１（１０ｎｇ／ｍｌ）で処置したところ、マウス胚性線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）および初代ヒト近位尿細管上皮細胞（ＨＰＴＥＣ）でもＳＭＯＣ２発現が有意に増加した（図８Ａ〜Ｂ）。
【０１２２】
【表３】
2019510009.tif 000005
【０１２３】
[実施例２]
ＳＭＯＣ２を過剰発現するマウスは強化された腎線維症を呈示する
ＳＭＯＣ２を過剰発現するトランスジェニックマウス（ＳＭＯＣ２Ｔｇ）は著しく高いＳＭＯＣ２レベルを有していたが（図２Ａ）、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓、卵巣、および精巣の正常な組織学的特徴を有していた。ＵＵＯに供した場合、ＳＭＯＣ２Ｔｇは、傷害後７および１４日目に腎臓におけるαＳＭＡ、コラーゲンおよびフィブロネクチンのｍＲＮＡ（図１０Ａ）およびタンパク質レベル（図２Ｂ、濃度測定は図１０Ｂ）によって測定した場合、野生型同腹子と比較してより有意に大きい線維症を示した。これは、間質中のαＳＭＡ陽性筋線維芽細胞の存在がそれより約２倍多いことと相関していた（図２Ｃ）。同様に、ＳＭＯＣ２Ｔｇマウスはまた、ＦＡ（２５０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ）で処置した場合、ｍＲＮＡ（図１１Ａ）およびタンパク質（図２Ｄ、濃度測定は図１１Ｂ）レベルの両方において強化された線維症も実証された。さらに、間質中のαＳＭＡ陽性筋線維芽細胞（図２Ｅ）は、ＦＡ処置後の野生型マウスと比較して、ＳＭＯＣ２Ｔｇマウスにおいて有意に上昇した。ＳＭＯＣ２Ｔｇマウスはまた、ＵＵＯ（図２Ｆ）またはＦＡ（図２Ｇ）後の７および１４日目に腎臓のピクロシリウスレッドおよびのマッソントリクローム染色の両方で検出した場合、野生型マウスより一貫してより多い量の病的な尿細管間質性線維症も示した。
【０１２４】
[実施例３]
ＳＭＯＣ２は線維芽細胞から筋線維芽細胞への転換を促進する
本発明者らは、ＵＵＯから７日目にＳＭＯＣ２Ｔｇおよび野生型マウス腎臓においてＲＮＡシーケンシングを実行して、ＳＭＯＣ２Ｔｇマウスにおける線維症を発症させる感受性の増加に関与するメカニズムを調査した。細胞要素ごとの遺伝子オントロジーのための（ＧＯ）遺伝子セットの濃縮分析（ＧＳＥＡ）およびＫＥＧＧタームから、ＥＣＭカテゴリー中の遺伝子は、ＳＭＯＣ２Ｔｇと野生型マウスとの間に高度に統計学的に有意な差を表することが解明された（図３Ａ）。それゆえに本発明者らは、線維芽細胞（ヒト初代腎臓線維芽細胞およびＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞）を、ＥＣＭ産生に関与する主要な細胞型である筋線維芽細胞に形質転換させるＳＭＯＣ２の可能性を調査した。ＴＧＦβ１による線維芽細胞から筋線維芽細胞への転換（ＦＭＴ）の誘導と比較して、ＳＭＯＣ２（１０ｎｇ／ｍＬ、図１２Ａ）もαＳＭＡ、コラーゲン１α１およびフィブロネクチンの上方調節によって特徴付けられるようにＦＭＴを誘導することが可能であった（図３Ｂ、Ｃおよび１２Ｂ〜Ｄ）。ＦＭＴを誘導するＳＭＯＣ２の特異性は、ＳＭＯＣ２をＳＭＯＣ２特異的抗体と共にプレインキュベートして、線維芽細胞においてＳＭＯＣ２のシグナル伝達作用をブロックさせることによって確認された（図３Ｄおよび図１２Ｅ〜Ｆ）。
【０１２５】
ＳＭＯＣ２は、インテグリンβ１を介してケラチノサイトと結合することがこれまでに示されている（Maierら、Exp Cell Res. 2008年8月1日；314（13）：2477〜87）。同じことが線維芽細胞にも当てはまるか、さらにＳＭＯＣ２の作用機序である可能性があるのかを検証するために、本発明者らはまず、ＳＭＯＣ２処置の前に、線維芽細胞をインテグリンβ１抗体で処置した。インテグリンβ１抗体は、ＳＭＯＣ２によるＦＭＴマーカーの誘導を防ぐことにおいて有効であった（図３Ｅ）。それらの相互作用を確認するために、本発明者らは、ＳＭＯＣ２を免疫沈降し、次いでインテグリンβ１に対して沈殿物をブロットし、逆もまた同様とした。結果から、双方向分析で、線維芽細胞型中でＳＭＯＣ２もインテグリンβ１と結合することが確認された。
【０１２６】
また静止期の線維芽細胞のＳＭＯＣ２（１０ｎｇ／ｍｌ）処置も、４５分で、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ−Ｐ）（１５、１６）、ミオシン軽鎖（ＭＬＣ−Ｐ）（１７）、およびパキシリン（Ｐａｘ−Ｐ）（１７）のリン酸化を包含するＦＭＴに関するインテグリンシグナル伝達事象の初期カスケード（１４）の引き金になり（図１２Ｇ〜Ｈ）、６０分で作用がほぼ２倍になった（図３Ｆ、濃度測定は図１２Ｈ）。αＳＭＡ発現が最終的にストレスファイバーの構築に至ることから、本発明者らは次に、線維芽細胞のＳＭＯＣ２処置後におけるこの構造的な形成を検証した（図３Ｇ）。ＲＮＡシーケンシングからも、ＵＵＯ７日後におけるＳＭＯＣ２Ｔｇと野生型マウスとの間の高度に有意な生物学的プロセスとして「走化性」が解明されたことから（図３Ｈ）、本発明者らは、スクラッチアッセイおよびボイデンチャンバーベースの移動アッセイを実行することによって線維芽細胞におけるＳＭＯＣ２の走化性特性を調査した。ＳＭＯＣ２（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処置した線維芽細胞は、半密集化したＮＩＨ３Ｔ３の単分子層上に直線的なスクレーピングにより作り出された創傷の閉鎖が有意に促進されたことを示し（図３Ｉ）、時間経過と共に傷付けられた領域の有意な再増殖も示された（図１２Ｉ）。ＳＭＯＣ２はまた、線維芽細胞の移動も約５０％強化した（図１２Ｉ）。線維芽細胞のＳＭＯＣ２処置後に接着の約３倍の増加もみられた（図３Ｋ）。さらに、ＳＭＯＣ２は、９６時間の経過にわたり２４時間ごとに線維芽細胞の代謝活性および生存率を次第に増加させた（図３ｌ、図１２Ｊ）。またＳＭＯＣ２は、ＥｄＵ陽性細胞の数によって評価したところ、線維芽細胞増殖を刺激することによって分裂促進性の特性も示した（ｐ＜０．０５）（図３Ｍ）。線維芽細胞に対する組換えＳＭＯＣ２のこれらの作用を検証するために、本発明者らはまた、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をｐＣＭＶ−ＳＭＯＣ２でトランスフェクトすることによってＳＭＯＣ２を過剰発現する線維芽細胞も作り出し、類似の表現型変化を観察した（図１３Ａ〜Ｇ）。総合すると、これらの結果から、ＳＭＯＣ２は、代謝活性、増殖、移動、および接着を含むその特徴的な機構の活性化により線維芽細胞から筋線維芽細胞への（ＦＭＴ）シグナル伝達を刺激することが示唆される。
【０１２７】
[実施例４]
ＳＭＯＣ２ノックアウトマウスは腎線維症から保護される
ＳＭＯＣ２の線維症の進行に対する阻害の作用を調査するために、まず本発明者らは、遺伝子操作アプローチを使用し、ＳＭＯＣ２ノックアウト（ＫＯ）マウス（図４Ａ）が組織学的に正常であったことを確認した。ＳＭＯＣ２ＫＯマウスをＦＡおよびＵＵＯに供したとき、野生型マウスと比較して、７日目に線維化マーカーが著しく弱化した（図４Ｂ、濃度測定は図１４；図５Ａ、濃度測定は図１８）。これは、間質中のαＳＭＡ陽性細胞における有意な減少（図４Ｃおよび図５Ｂ）、それと共にマッソントリクローム染色によって可視化されたＥＣＭの堆積および累積の有意な低減（図４Ｄ）によって確認された。
【０１２８】
[実施例５]
ＲＮＡ干渉を使用したＳＭＯＣ２の標的化は線維症の発症を予防する
次に、本発明者らは薬理学的な阻害アプローチを使用して、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を合成することによってＳＭＯＣ２を阻害した。本発明者らは４種のｓｉＲＮＡの効能を試験し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで約９０％のサイレンシングをもたらすもの（標的配列：ＵＣＵＧＡＡＣＵＣＵＧＡＡＵＵＵＡＡ；配列番号１７；マウス研究で使用されるＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡ：センス（５’から３’）：ＵＵＣＵＧＡＡＣＵＣＵＧＡＡＵＵＵＡＡＵＵ（配列番号１８）；アンチセンス（５’から３’）：ＵＵＡＡＡＵＵＣＡＧＡＧＵＵＣＡＧＡＡＵＵ（配列番号１９））を見出した（図１６において、ＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡ番号１６）；ヒト配列とマウス配列との間の高いレベルの相同性のために、同じ配列を使用してヒトＳＭＯＣ２を標的化することができた。ＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ＳＭＯＣ２、αＳＭＡ、コラーゲン１α１およびフィブロネクチン発現の有意な減少によって測定されたように、ＴＧＦβ１によって媒介される線維芽細胞から筋線維芽細胞への転換およびシグナル伝達の有意な弱化をもたらした（図６Ａ、濃度測定は図１７）。次いで本発明者らは、同じＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡ配列を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏでの劣化に耐性を有し、腎臓中に局在する内毒素非含有の化学修飾されたＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡを合成した（１８）（図１８）。ＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡがマウス静脈内に注射された場合も、ＦＡ投与後の腎臓のＳＭＯＣ２タンパク質発現において約５０％の低減をもたらし（図６Ｂ、濃度測定は図１９）、それによって送達の証明が確立された。より重要なことに、ＦＡ処置から７日目に、スクランブル化ｓｉＲＮＡ（ｓｓｉＲＮＡ）と比較してＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡで処置したマウスにおいて、腎線維症の有意な軽減が観察された（図６Ｂ、濃度測定は図１９）。筋線維芽細胞の形質転換およびコラーゲン累積は、それぞれαＳＭＡ染色およびマッソントリクローム染色によって評価したところ、ｓｓｉＲＮＡで処置されたマウスと比較して、ＳＭＯＣ２のｓｉＲＮＡで処置されたＦＡが注射されたマウスにおいてより有意に少なかった（図６ｃおよび６ｄ）。
【０１２９】
参考文献
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【０１３０】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に説明したが、当然のことながら前述の記載は説明のためであり、本発明の範囲を限定せず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって定義されることが理解されよう。他の態様、利点、および変形形態も以下の特許請求の範囲である。
【図１−１】
2019510009.tif 000006
【図１−２】
2019510009.tif 000007
【図２−１】
2019510009.tif 000008
【図２−２】
2019510009.tif 000009
【図２−３】
2019510009.tif 000010
【図３−１】
2019510009.tif 000011
【図３−２】
2019510009.tif 000012
【図３−３】
2019510009.tif 000013
【図３−４】
2019510009.tif 000014
【図３−５】
2019510009.tif 000015
【図４−１】
2019510009.tif 000016
【図４−２】
2019510009.tif 000017
【図５】
2019510009.tif 000018
【図６−１】
2019510009.tif 000019
【図６−２】
2019510009.tif 000020
【図７−１】
2019510009.tif 000021
【図７−２】
2019510009.tif 000022
【図８】
2019510009.tif 000023
【図９】
2019510009.tif 000024
【図１０】
2019510009.tif 000025
【図１１】
2019510009.tif 000026
【図１２−１】
2019510009.tif 000027
【図１２−２】
2019510009.tif 000028
【図１２−３】
2019510009.tif 000029
【図１２−４】
2019510009.tif 000030
【図１３−１】
2019510009.tif 000031
【図１３−２】
2019510009.tif 000032
【図１３−３】
2019510009.tif 000033
【図１３−４】
2019510009.tif 000034
【図１４】
2019510009.tif 000035
【図１５】
2019510009.tif 000036
【図１６】
2019510009.tif 000037
【図１７】
2019510009.tif 000038
【図１８】
2019510009.tif 000039
【図１９】
2019510009.tif 000040
【配列表】
2019510009000001.app
【国際調査報告】
2019510009.tif 000041
2019510009.tif 000042
2019510009.tif 000043