(57)【要約】  本発明は、イオン液体中のハイドロゲルを含むイオンゲル、及び亜硝酸との反応によって色が変化する反応システムに関する。本発明はまた、基板（１）が、互いに分離され、イオンゲルを含有する較正リザーバ（２）、イオン液体中のハイドロゲルの較正リザーバ（３）、分析するサンプルを保持し、還元剤を伴うマイクロ流体流路（５）を通じてイオンゲルを含む測定リザーバ（４）に連結されるリザーバ（６）、分析するサンプルを保持する本発明のイオンゲルを含む測定リザーバ（７）を有するマイクロ流体デバイスに関する。本発明は更に、汚染水中の亜硝酸及び硝酸をイオンゲル及びデバイスを用いて比色法的に決定及び検出する方法同様、イオンゲル及びデバイスを生成する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオンゲルであって、
−  イオン液体中のハイドロゲル；及び
−  亜硝酸と反応して色の変化を提供する反応システム、を含むイオンゲル。
【請求項２】
前記ハイドロゲルがポリアクリルアミドである、請求項１に記載のイオンゲル。
【請求項３】
ハイドロゲルが、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドモノマー及びＮ，Ｎ’−メチレン−ビス（アクリルアミド）モノマーの重合によって得られる、イオンゲル。
【請求項４】
反応システムがグリース試薬である、請求項１から３のいずれか1項に記載のイオンゲル。
【請求項５】
イオン液体が陽イオン及び陰イオンを含み、ここで少なくとも１つの陽イオンが、トリヘキシルテトラデシルホスホニウム、トリブチルテトラデシルホスホニウム、テトラブチルホスホニウム、トリイソブチルメチルホスホニウム、１−ブチル−１−メチルピロリジン、１−エチル−３−メチルイミダゾリウム、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、Ｎ−プロピルＮ−メチル−ピロリジニウム，Ｎ−ブチルＮ−メチル−ピロリジニウム、トリオクチルメチルアンモニウムから選択され、少なくとも１つの陰イオンが、トシラート、ドデシルベンゼンスルホナート、エチルスルファート、ビス（トリフルオロメタンスルホニル）アミド、ジシアナミド、テトラシアノボラート、ヘキサフルオロホスファート、テトラフルオロボラート、エチルスルファート、トリス（ペンタフルオロエチル）トリフルオロホスファート、塩化物、臭化物、ヨウ化物、フッ化物から選択される、請求項１から４のいずれか１項に記載のイオンゲル。
【請求項６】
イオン液体が、１−エチル−３−メチルイミダゾリウムエチルスルファート及びトリヘキシルテトラデシルホスホニウムジシアナミドから選択される、請求項５に記載のイオンゲル。
【請求項７】
ｂ）互いに分離され、イオンゲルを含む２以上の較正リザーバ（２）、
ｃ）イオン液体中にハイドロゲルを含む較正リザーバ（３）、
ｄ）還元剤を含むマイクロ流体流路（５）を通じてイオンゲルを含む測定リザーバ（４）と連結した分析するサンプルを保持するためのリザーバ（６）、
ｅ）分析するサンプルが保持されるイオンゲルを含む測定リザーバ（７）、を有する
ａ）基板（１）、
を含み、ここで、イオンゲル及びイオン液体中のハイドロゲルが、請求項１から６のいずれか１項に記載のゲルである、マイクロ流体デバイス。
【請求項８】
互いに分離された較正リザーバ（２）の数が少なくとも５つである、請求項７に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項９】
較正リザーバ（２）が異なる濃度の亜硝酸を含有し、ここで色の変化が、反応システムと亜硝酸の反応によって引き起こされ、色強度が亜硝酸の濃度に比例領域において比例する、請求項７又は８に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１０】
基板（１）がポリ（メチルメタクリラート）プレートである、請求項７から９のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１１】
マイクロ流体流路（５）がマイクロ流体紙を含む、請求項７から１０のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１２】
還元剤がマイクロ流体流路（５）に配置される、請求項７から１１のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１３】
還元剤がＺｎ（０）である、請求項１２に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項１４】
請求項１から６のいずれか１項に記載のイオンゲルを生成する方法であって、前記方法が以下のステップ：
Ａ）ハイドロゲルの前駆体モノマーと、必要に応じて、イオン液体中の重合開始剤との混合物を調製するステップと、
Ｂ）イオン液体中のハイドロゲルを得るために、イオン液体中で前記モノマーを重合するステップと、
Ｃ）イオン液体中のハイドロゲルの中の亜硝酸と反応して色の変化を提供する反応システムを組み込むステップ、を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載のイオンゲルを生成する方法であって、モノマーがＮ−イソプロピルアクリルアミド及びＮ，Ｎ’−メチレン−ビス（アクリルアミド）であり、それらが２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン及びＵＶ光により光重合する、方法。.
【請求項１６】
イオン液体が、1-エチル-3-メチルイミダゾリウムエチルスルファート及びトリヘキシルテトラデシルホスホニウムジシアナミドから選択される、請求項１４又は１５に記載のイオンゲルを生成する方法。
【請求項１７】
−  基板（１）上に以下：
−  互いに分離された１以上の較正リザーバ（２）；
−  分析するサンプルを保持するためのリザーバ（６）；
−  イオン液体中のハイドロゲルを較正するための較正リザーバ（３）；
−  測定リザーバ（４）；
−  分析するサンプルを保持するための測定リザーバ（７）；
を提供するステップと；
−  リザーバ（６）とリザーバ（４）の間に還元剤を含むマイクロ流体流路（５）を設けるステップと、
−  リザーバ（２）、（３）、（４）及び（７）内のその場で液体中にハイドロゲルを得るステップと、続いて、請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法に従って反応システムを添加してリザーバ（２）、（４）及び（７）の中にイオンゲルを得るステップ、を含む、請求項７から１３のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイスを生成する方法。
【請求項１８】
前記方法が、較正リザーバ（２）の中のイオンゲルに異なる濃度の亜硝酸を有する較正溶液を混合する追加的なステップを含み、ここで、色強度が濃度に対して比例領域において比例する反応システムと亜硝酸の反応によって色の変化が引き起こされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
比色測定によってサンプル中の亜硝酸及び／又は硝酸濃度を決定及び検出する方法であって、前記方法が以下のステップ：
（ｉ）同量の分析するサンプルを、本発明のマイクロ流体デバイスのリザーバ（３）、（６）及び（７）に保持するステップ：
（ｉｉ）リザーバ（６）中に保持されたサンプル中に存在する硝酸を、還元剤の作用により、それがマイクロ流体流路（５）を通過するにあたり亜硝酸に還元するステップ；
（ｉｉｉ）比色測定によって較正リザーバ（２）中の亜硝酸濃度を決定し、較正曲線を確立するステップ；
（ｉｖ）比色測定によってリザーバ（７）中のサンプル中に存在する亜硝酸の濃度及びリザーバ（４）中のサンプル中の亜硝酸濃度を決定及び検出するステップ；及び
（ｖ）リザーバ（７）中の得られた濃度とリザーバ（４）中の得られた濃度との間の差によって、サンプル中の亜硝酸濃度を決定するステップ、を含む、方法。
【請求項２０】
濃度の決定が、リザーバ（２）、（４）及び（７）の色をカメラ又はビデオで撮影したマイクロ流体デバイス（１）の映像から解析し、濃度を決定するためにデバイスの異なるリザーバを処理することによって行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１から６のいずれか１項に記載のイオンゲル及び請求項７から１３のいずれか１項に記載のマイクロ流体デバイスの、比色測定によってサンプル中の亜硝酸及び／又は硝酸濃度を決定及び検出するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、多量の水の硝酸汚染を検出及び決定するための技術を含む。特に、ポータブルマイクロ流体デバイスであって、汚染水中の混合した亜硝酸−硝酸を速やかかつ効果的な方法で、及び汚染の現場で検出することができるものに関連する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
近年、様々な環境モニタリングデバイスが、例えば、有害化学薬品のような水を汚染する有害物質による天然、産業用及び都市用水の汚染の増加に対応して開発されている。環境モニタリング当局は、一般に手作業で、汚染サイトのサンプルを採取し、それらを高度な資格を有する者が高性能な装置を用いて対応する分析を行う施設に運搬することによって行っている。この方法は、例えば非常に精密かつ正確な結果を得ることや法規制手続きに従うというような利点を有するが、これらの施設、装置、及び有資格人材の維持に関連する高いコストのような欠点も有する。さらに、このタイプのプロトコルは、現地で作業する妨げとなり、それによって予期されない汚染が起こるような場合は応答期間が長くなる。その他のタイプの方法は、現地で情報を得ることを許容するが、用いられる設備は一般に高価で高性能であり、また、それを用いるためには有資格人材を必要とする。
【０００３】
多量の水中の栄養分濃度を決定することは、栄養分濃度が水中の生命の平衡に影響し、修正するため、非常に重要である。水中の栄養分濃度の管理されていない増加は環境災害を導く可能性がある。特に、亜硝酸の増加は、人の健康にとって有害であり、動植物相の死をもたらす藻類の富栄養化のような水生生物の劣化を引き起こす。
硝酸及び亜硝酸を検出する現在の技術は、電流測定、電気化学、バイオセンシング又は分光光度法に基づいており、これらは優れた検出限界（ナノモル）、ダイナミックレンジ及びコスト効率性から最も人気のある方法である。
伝統的な比色法は、様々なマトリックス中の分析物の濃度を決定及び検出するための速やかなツールとして従来から適用されている。
【０００４】
比色法は、着色反応を生成する関心のある被検物質に試薬が結合する能力を用いる。この反応の強度は直接被検物質の濃度に依存する。特に、グリース試薬が知られており、水性マトリックス中の亜硝酸を決定及び検出するために用いられる。グリース試薬による亜硝酸の比色測定は化学的にしっかりしており、優れた分析性能を提供し、いくつかの分析プラットフォームの発達に適用されてきた。しかしながら、これらのシステムは、デバイス及び検出モジュール中の液体の流れを管理するため、試薬、ポンプ及びバルブを保持するための要素から成る一般に複雑なデバイスであり、それらは汚染現場で用いるには高価で適切ではない。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、技術の現状における必要性によるものであり、混合した亜硝酸／硝酸を検出するためのシステム、少なくとも今日の方法の上述の欠点のいくつかを克服する代替措置を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、基板（１）、５つの較正リザーバ（２）、分析するサンプルを保持するためのリザーバ（６）、「対象」を較正するための較正リザーバ（３）、測定リザーバ（４）、分析するサンプルを保持するための測定リザーバ（７）及びリザーバ（６）とリザーバ（４）を連結し還元剤を含むマイクロ流体流路（５）から成る本発明のマイクロ流体デバイスを描写したものである。
【図２Ａ】図２Ａは、グリース試薬を含むイオン液体中のハイドロゲル（１０）を含むイオンゲル１（ＩＯ−１）及びグリース試薬と亜硝酸を含むイオン液体中の前記ハイドロゲル（１１）を含むイオンゲル１（ＩＯ−１）のＵＶ／ＵＶ−可視スペクトルを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、グリース試薬を含む別のイオン液体中の別のハイドロゲル（１２）を含む別のイオンゲル２（ＩＯ−２）及びグリース試薬と亜硝酸を含む前記イオン液体中の前記ハイドロゲル（１３）を含む別のイオンゲル２（ＩＯ−２）のＵＶ／ＵＶ−可視スペクトルを示す。亜硝酸とのグリース反応の最大吸収はλ＝５３２ｎｍで認められた。これらの図２Ａと図２Ｂでは吸収に違いが観察された。
【図３】図３は、△（１５）によって形成された多変量較正曲線（１７）及び●（１４）によって形成された検証モデル（１６）を表し、分析後、濃度（０ｐｐｍ）、（２．５ｐｐｍ）、（５ｐｐｍ）、（７．５ｐｐｍ）及び（１０ｐｐｍ）を画像化して生成された。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
（発明の詳細な説明）
ある態様において、本発明は、イオンゲル（以後、本発明のイオンゲルという）であって以下を含むものに関連する。
−  イオン液体中のハイドロゲル、及び
−  亜硝酸との反応によって色の変化を提供する反応システム
前記ハイドロゲルは、重合し、架橋結合した多孔性構造であって、親水性の性質を伴い、その中に相当な割合の水を保持することが可能なものである。ハイドロゲルは一般に親水性モノマーから調製されるが、疎水性モノマーもまた特定の適用のための特性を調節するために用いることができる。
本発明に従うと、ハイドロゲルは、アクリル酸、アルカリ金属アクリラート、アクリルアミド及びそのアクリル酸誘導体、例えば当業者には公知のメチルアクリラート、メチルメタクリラート等から選択される２以上の前駆体モノマーの重合及び架橋結合によってイオン液体中で得られる。ある特定の実施形態において、ハイドロゲルはポリアクリルアミドである。
【０００８】
好ましい実施形態において、ハイドロゲルは、N-イソプロピルアクリルアミド及びN,N’-メチレンビス（アクリルアミド）（コモノマーであることに加え、架橋結合剤である）の重合によって得られる。最終ハイドロゲルポリマー中のモノマーの割合は、十分なマージンの間の範囲にあり、所望の堅さ及び架橋結合の程度によって、当業者により容易に決定される。例えば、N-イソプロピルアクリルアミド及び N,N’-メチレン-ビス(アクリルアミド)の場合、前記割合は、１００：１から１０：１の範囲、及び例えば、９０：１、７０：１、５０：１又は２０：１の範囲であることが可能である。
本発明において用いることができる亜硝酸との反応に伴う色の変化を提供する反応システムは、理論的には当業者には公知の任意の従来の比色法反応システムであることが可能である。前記反応システムの非限定的な例としては、亜硝酸／硝酸還元酵素のような酵素であって、例えば、“Nitrite Biosensing via Selective Enzymes- A Long but Promising Route; M. Gabriela Almeida, Alexandra Serra, Celia M. Silveira及び Jose J.G. Moura; Sensors (Basel). 2010; 10(12): 11530-11555”に記載のもの、ジフェニルベンジジン、 ミノキキシジルであって“Detection of Nitrite in Water Using Minoxidil as a Reagent, Mario Gonzalez-Jimenez, Jorge Arenas-25 Valganon, Isaac F. Cespedes-Camacho, Juan Carlos Garefa-Prieto, Emillio Calle及び Julio Casado, J.Chem.Educ; 2013, 90, 1053-1056”に記載のもの又はグリース試薬がある。本発明の好ましい実施形態においては、グリース試薬が用いられる。
【０００９】
イオン液体は、室温に近い温度で液体である有機塩であって、有機陽イオン及び有機又は無機であることが可能な陰イオンを含むものである。それらは、触媒特性同様、例えばゼロ揮発性、高イオン電導性のような重要な特性を有している。それらは今日数多くの分野で用いられており、特に電解物として用いられている。本発明で用いることができる可能な有機陽イオンとしては、イミダゾリウム、ピリジニウム、ピロリジニウム、アンモニウム又は ホスホニウム誘導体が挙げられる。その他にも、1-アルキル-3-メチルイミダゾリウム、1-アルキルピリジニウム、N-メチル-N-アルキルピロリジニウム、アンモニウム塩、ホスホニウム塩等が優れている。陽イオンの非限定的な例としては、トリヘキシルテトラデシルホスホニウム[P6,6,6,14]+;トリブチルテトラデシルホスホニウム[P4,4,4,14]+;テトラブチルホスホニウム[P4,4,4]+（tretrabutyl phosphonium [P4,4,4]+）;トリイソブチルメチルホスホニウム[P1,4,4,4]+;1-ブチル-1-メチルピロリジン、1-エチル-3-メチルイミダゾリウム[emim]+、1-ブチル-3-メチルイミダゾリウム[bmim]+、N-プロピルN-メチル-ピロリジニウム[C3mpyr]+、N-ブチルN-メチル-ピロリジニウム[C4mpyr]+、トリオクチルメチルアンモニウム[Oct3NMe]+がある。
【００１０】
本発明において用いることができる可能な陰イオンの中には、スルホナート、ボラート、ホスファート、ハロゲン化物等が含まれる。陰イオンの非限定的な例としては、中でも、トシラート[tos]-ドデシルベンゼンスルホナート[dbsa]-、エチルスルファート、ビス(トリフルオロメタンスルホニル)アミド[NTf2]-、ジシアナミド[dca]-、テトラシアノボラート[BCN3]-、ヘキサフルオロホスファート[PF6]-テトラフルオロボラート[BF4]-、エチルスルファート、トリス(ペンタフルオロエチル)トリフルオロホスファート（tris(pentafluorethyl)trifluorophosphate）、塩化物、臭化物、ヨウ化物、フッ化物がある。
ある特定の実施形態において、イオン液体は、1-エチル-3-メチルイミダゾリウムエチルスルファート(ＩＯ−１)である。別の特定の実施形態において、イオン液体は、トリヘキシルテトラデシルホスホニウムジシアナミド（ＩＯ−２）である。
【００１１】
反応システムは、イオン液体中のハイドロゲルの中に埋め込まれ、その構造は、長期間それを劣化させることなく反応システムを収蔵することを許容し、同時にそれは以下に説明するように比色センサーとして作用する。
別の態様において、本発明は、以下を含むマイクロ流体デバイスに関する。
ａ）基板１であって、以下を含む：
ｂ）互い分離され、本発明のイオンゲルを含む２以上の較正リザーバ２、
ｃ）イオン液体中にハイドロゲル（「対象」）を含む較正リザーバ３
ｄ）分析するサンプルを保持し、還元剤を含むマイクロ流体流路を通じて本発明のイオンゲルを含む測定リザーバ４に連結されるリザーバ６
ｅ）本発明のイオンゲルを含み、分析するサンプルを保持する測定リザーバ７。
【００１２】
特定のマイクロ流体デバイスで用いられる本発明のイオンゲルは、全てのリザーバで同じであり、このイオンゲルは、較正リザーバ３（「対象」）中で用いられる所与のハイドロゲルを所与のイオン液体中に含む。
デバイスの支持体として用いられる基板１はプラスチック板である。該板は、理論的には、それが接触する材料に対して不活性であれば、すなわちそれは反応せず、マイクロ流体デバイスセンサーの化学的性質に干渉せず、変わらないままであれば、任意の材料であることができる。
基板に適するプラスチックの例としては、中でも、高密度ポリエチレン、低密度ポリエチレン、エチレンポリテレフタレート、ポリビニルクロリド、ポリプロピレン、ポリスチレン又はポリカルボナート、環状オレフィンポリマー又はコポリマー又はアクリル酸樹脂である。特定の実施形態において、基板は、ポリメチルメタクリラートプレートである。これらのプレートは商業的に入手することができる。
【００１３】
基板の寸法は異なることが可能であり、この点において特に制限はない。デバイスサイズは、分析からくる要請、1つのデバイスで分析するサンプル数、所与のサンプルについて行う繰返し回数、あまたある中の変数によって変化してよい。理想的にはサイズは、片手で（ポータブルに）容易に取り扱うことができるように決められる。特定の実施形態において、デバイスは１ｍｍの厚さで、２２ｍｍ×１０ｍｍのサイズを有する。
同様に、リザーバの寸法及び形状はまたデバイス中で変わることが可能であり、この点において同様に特に制限はない。
サンプル中の亜硝酸含有量を決定及び定量するときのデバイスの精度は、多くの要素の中でも、互いに分離された較正リザーバ２の数に依存するであろう。この観点から、デバイスは好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つ、及びより好ましくは少なくとも５つの較正リザーバ２を有する、これらのリザーバは異なる濃度の亜硝酸（標準溶液）を含有し、色の変化は反応システムの亜硝酸との反応によって引き起こされ、亜硝酸濃度に対して色強度は比例領域において比例する。
【００１４】
特定の実施形態に従うと、マイクロ流体流路５は、マイクロ流体紙を含む。還元剤は、同様に前記流路に配置され、還元剤は、リザーバ６中に配置され分析するサンプル中に存在する硝酸を本発明のイオンゲルの反応システムが感度を示す分析物である亜硝酸に還元する。特定の実施形態において、還元剤は、Ｚｎ（０）を含み、例えば超純水中にＺｎ（０）のエマルジョンの形態で配置される。本発明に従って用いることができるその他の還元剤は硝酸還元酵素、酸媒体中の還元剤で例えば、ギ酸、Ｆｅ（０）及びアンモニウムイオンのようなものがあり、塩基媒体中の還元剤としては、多くの中から例えば、Ａｌ、Ｚｎ及びＦｅ（ＩＩ）の溶液及びヒドラジンがある。
【００１５】
追加的な別の態様において、本発明は、本発明のイオンゲルを生成する方法であって以下のステップを含むものに関する：
Ａ）ハイドロゲルの前駆体モノマー及び適切であれば重合開始剤の混合物をイオン液体中で調製するステップ；
Ｂ）イオン液体中でモノマーを重合して、イオン液体中にハイドロゲルを得るステップ；及び
Ｃ）亜硝酸と反応して色の変化を提供する反応システムをイオン液体中のハイドロゲルに組み込むステップ。
各特定の実施形態において重合のために選択されたモノマーに依って、当業者は、適切であれば、例えば、紫外光又は可視光、及び／又は温度のような重合条件及び特定のイオン液体と同様に適当な開始剤を選択することができる。上記説明のとおり、少なくとも１つのモノマーは又、反応中で架橋結合剤として作用する。ある特定の実施形態において、モノマーは、N-イソプロピルアクリルアミド及びN,N’-メチレンビス(アクリルアミド)であり、それらは例えば、2,2-ジメトキシ-2-フェニルアセトフェノンのような光重合開始剤とＵＶ光によって光重合する。ステップＢ）の重合はイオン液体中で上記定義されるとおり行われ、以下に説明するように、デバイスのリザーバ３の中の「対象」として機能する前記イオン液体中のハイドロゲルが結果として得られる。
【００１６】
好ましい実施形態において、前記イオン液体は、1-エチル-3-メチルイミダゾリウムエチルスルファート及びトリヘキシルテトラデシルホスホニウムジシアナミドから選択される。場合によっては、モノマーの溶解を円滑にするため反応混合物を加熱することが勧められ、あるいは必要でありさえする。
一度イオン液体中のハイドロゲルが得られると、未反応モノマーの残渣及びその他の試薬を除去するため超純水及び／又は適切な有機溶媒、例えばアルコールで洗浄してもよい。
続いてステップＣ）において、反応システムは、例えば、単なる配置又はその注入によって、イオン液体中のハイドロゲルに組み込まれる。特定の実施形態において、反応システムはグリース試薬である。結果として得られるイオンゲルは乾燥のため放置される。特定の実施形態において、イオンゲル混合物のμｌと同量のμｌのグリース試薬が、それに添加される。
【００１７】
別の追加的な態様において、本発明は、本発明のマイクロ流体デバイスを生成する方法に関する。該方法は以下のステップを含む：
−  基板１上に以下を提供するステップ；
−  互いに分離される１以上の較正リザーバ２；
−  分析するサンプルを保持するリザーバ６；
−  較正リザーバ３（「対象」）；
−  測定リザーバ４；
−  分析するサンプルを保持するための測定リザーバ７；
−  リザーバ６とリザーバ４の間に還元剤を含むマイクロ流体流路５を設けるステップ；及び
−  リザーバ２、４及び７中にその場でイオンゲルを、リザーバ３中にイオン液体中にハイドロゲルを、上記規定される製造方法に従って得るステップ。
【００１８】
マイクロ流体デバイスを製造するための従来の方法においてレーザを用いることができる。更に、リザーバ６及び４を連結するマイクロ流体流路５が配置される。前記流路は、特定の実施形態のマイクロ流体紙から成り、それは、リザーバ６に保持されているサンプルが、測定リザーバ４に向かって毛管現象によってそれを通じて移動することを許容する。前記マイクロ流体流路５は、サンプルの硝酸を亜硝酸に還元することができる還元剤を含み、亜硝酸が本発明において検出及び決定されるものである。ある特定の実施形態において、前記還元剤はＺｎ（０）であり、流路５に超純水中のエマルジョンの形態で組み込むことができる。組み込まれるエマルジョンの量は各ケースにおいて異なってよく、１から２０μＬ、特に５から１０μＬの還元剤の懸濁液が典型的には流路５に組み込まれる。
イオン液体中のハイドロゲルは、マイクロ流体デバイスの各リザーバ２、３、４、６及び７から、上述の本発明のイオンゲルを生成する方法に従って、その場で直接得られる（ステップＡ及びＢ）。リザーバ２、４、６及び７において反応システムを組み込むことによって、イオンゲルが得られる（ステップＣに従う）。
【００１９】
この観点から、イオン液体中のハイドロゲルを得るためには、最初に前駆体モノマー、及び適切であれば重合開始剤のイオン液体中の混合物が得られる。該混合物は、各リザーバにおいてその場で得ることが可能であり、又は別の容器中で得ることが可能であり、かつ対応するリザーバに保持されている混合物の一定量をそこから取り出すことが可能である。続いて重合がデバイス中でその場で行われる。ひとたび重合反応が終了すると、結果として得られる生成物は洗浄される。続いて反応システムがリザーバ２、４、６及び７に組み込まれ（しかしながらリザーバ３には組み込まれない）、乾燥のため放置される。対応するリザーバに保持される混合物の量は変化し得るものであり、各ケースにおけるマイクロ流体デバイスの設計に依存する。混合物の体積は、典型的には１μＬと２０μＬの間、例えば、５μＬと１０μＬの間である。
本発明のマイクロ流体デバイスを製造する方法は、較正リザーバ２の中のイオンゲルに異なる濃度の亜硝酸（標準溶液）を有する較正溶液を組み込む追加的なステップを更に含むことが可能であり、そこで、色の変化は反応システムと亜硝酸の反応によって引き起こされ、それは色の強度において各溶液の濃度に比例領域において比例する。以下に説明するように、較正リザーバ２の中の色の変化を処理して較正曲線が得られ、それは分析するサンプル中の亜硝酸の濃度を比色測定で決定するために用いられる。図３は、異なる濃度の亜硝酸を有する較正溶液を用い、例えば０ｐｐｍの亜硝酸が最初のリザーバ２に配置され、２．５ｐｐｍの亜硝酸が第２のリザーバ２に配置され、５ｐｐｍの亜硝酸が第３のリザーバ２に配置され、７．５ｐｐｍの亜硝酸が第４のリザーバ２に配置され、かつ１０ｐｐｍの亜硝酸が第５のリザーバ２に配置された、特定の実施形態を示す。
【００２０】
別の態様において、本発明は、比色測定でサンプル中の亜硝酸及び／又は硝酸の濃度を決定及び検出する方法に関し、以後、本発明の方法という。本発明の方法は、本発明のマイクロ流体デバイスの使用を含み、比色測定によってサンプル中の亜硝酸濃度及び／又はサンプル中の硝酸濃度を、決定及び検出することを許容する。
該方法は、上述のとおり製造されたマイクロ流体デバイスを参照して以下のとおり規定される。
本発明の方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）同量の分析するサンプルを、本発明のマイクロ流体デバイスのリザーバ３、６及び７に保持するステップ：
（ｉｉ）リザーバ６中に保持されたサンプル中に存在する硝酸を、還元剤の作用により、それがマイクロ流体流路５を通過するときに亜硝酸に還元するステップ；
（ｉｉｉ）比色測定によって較正リザーバ２中の亜硝酸濃度を決定し、較正曲線を確立するステップ；
（ｉｖ）比色測定によってリザーバ７のサンプル中に存在する亜硝酸の濃度及びリザーバ４中のサンプル中の亜硝酸濃度を決定及び検出するステップ；及び
（ｖ）リザーバ７中で得られた濃度とリザーバ４中で得られた濃度との間の差によって、サンプル中の硝酸濃度を決定するステップ。
【００２１】
特定の実施形態は、異なる亜硝酸濃度を有する較正溶液が較正リザーバ２に既に組み込まれているマイクロ流体デバイスに基づいており、したがって、このステップは本発明の方法のステップではない。別の特定の実施形態では、異なる亜硝酸濃度を有する較正溶液がまだ較正リザーバ２に組み込まれていないマイクロ流体デバイスに基づいており、したがって、このステップは、本発明の方法の追加的なステップとして規定され、理解される。
サンプル中の亜硝酸及び／又は硝酸の比色測定検出は、もしリザーバ４及び７が発色すれば、裸眼で行うことも可能である。特定の実施形態において、リザーバ３、６及び７に配置され、分析するサンプルの体積は同じである。
濃度の決定は、カメラ又はビデオによって撮られたマイクロ流体デバイス１の画像からリザーバ２、４及び７の色を分析し、濃度を決定するためデバイスの異なるリザーバを処理することによって行われる。ある特定の実施形態の決定方法において、本発明は、リザーバ３（「対象」）中で決定された値を考慮する。
分析するサンプルは液体であり、これら亜硝酸／硝酸汚染物を有し得る天然、産業用、又は都市用の液体の任意の源から採取することが可能である。
【００２２】
別の態様において、本発明は、本発明のイオンゲルの使用、及び／又は比色測定によってサンプル中の亜硝酸及び／又は硝酸濃度を決定及び検出するための本発明のマイクロ流体デバイスの使用に関する。
イオンゲルの及びデバイスの使用により、単一ユニットで、分析するサンプルの配置（例えば、注入）、化学反応及び分析物の検出及び決定を、単一工程で行うことが可能である。デバイスは、低コストな軟質材料の基板から製造され、所望の構造に依って容易に修正することが可能である。その使用は、貯蔵、運搬及び廃棄の容易さを含むその他の利点をまた有し、速やかで安価な未熟練者による現地での診断に非常に適し、エネルギー源又は電子部品を必要とすることなく、かつ写真撮影用カメラを用いて容易に調べることができる。さらに、以下の実施例で例示されるように、その使用は、高い感度及び信頼性を提供する。
【００２３】
デバイスは非常に小さな寸法であり、ポータブルで、少量のサンプル体積を用い、それによって試薬の量を減らしかつ短時間での応答を提供する。
較正点（リザーバ２の数）は変化し得るものであり、デバイスそれ自体に含まれる。取り扱いは単純で、実際のサンプル（例えば汚染水）から分析する分析物の現地での特徴づけのために最小限の操作を必要とする。
適用範囲は変化することが可能であり、それぞれのケースに応じて選択される。一般に１ｐｐｂから数ｐｐｍの範囲の典型的な硝酸による水汚染の範囲が決定される。
本発明の例示的な実施例が以下に提供され、それは如何なる場合であっても本発明の保護範囲を限定するものと理解されてはならない。
【実施例】
【００２４】
N-イソプロピルアクリルアミド、N,N'-メチレン-ビス(アクリルアミド)がイオンゲルを生成するために用いられ、2,2-ジメトキシ-2-フェニルアセトフェノンが光開始剤として用いられた。用いられたイオン液体は、エチルスルファート1-エチル-3-メチルイミダゾリウム及びトリヘキシルテトラデシル-ホスホニウムジシアナミド(Sigma-Aldrich社、スペイン)であった。
グリース試薬：グリース試薬は商業的に入手可能であるが、従来の方法によりスルファニルアミド、ナフチレンジアミンジヒドロクロリド及びリン酸を混合することによって調製することができる。
光重合のために用いられたＵＶ光源は、BONDwand UV-365 nm (Electrolyte Corporation社、米国)であった。
ＵＶ−可視スペクトルは、900UV-VIS-NIR Perkin-Elmer Lambda分光計で記録された。
写真をCanon EOS 1000Dカメラで撮影し、X-Riteカード(X-Rite Inc.、米国)をColor Checker Passport v. 1.0.2 プログラム(X-Rite Inc.、米国)とともに用い、続いてPhotoshop CC プログラム (Adobe Photoshop CS5 Extended, Adobe Systems Inc.、米国)を用いる方法によって較正した。
イオンゲル及び亜硝酸を含むもののスペクトルを、イオンゲル中のグリース試薬の収蔵を特徴づけるために取った。グリース試薬の最大吸収は、λ＝５３２ｎｍであった。図２Ａ及び２Ｂは、イオンゲルと亜硝酸を含むイオンゲルの吸収の違いを示す。
【００２５】
（実施例１：デバイスの製造（図１参照））
厚さ１ｍｍのポリ（メチル）メタクリラート（ＰＭＭＡ）プレート（Goodfellow社、英国)からセンサーを製造し、それをＣＯ２レーザーアブレーションシステム（Universal Laser Systems、オーストリア）で切断し、異なるレーザーエネルギーを用いて、デバイスのサイズ（長方形）及び前記デバイスの異なる構成要素（リザーバ）の両方を確立した。
それぞれのデバイスは、５つの較正リザーバ２、イオン液体中のハイドロゲルをサンプル（「対象」）と接触させて較正するためのリザーバ３、分析するサンプルを保持するためのリザーバ６、測定リザーバ４並びに測定及び分析するサンプルをまた保持するための測定リザーバ７を伴うよう設計された。デバイスは厚さ１ｍｍでサイズが２２ｍｍ×１０ｍｍであった。
リザーバ６及び４を互いに連結するマイクロ流体流路５をグレード５９５Whatmanろ紙から製造し、超純水中の金属Ｚｎ懸濁液（Sigma-Aldrich社、スペイン）をそれに配置した。
【００２６】
（ハイドロゲル及びイオンゲルの調製）
イオン液体中の２つのハイドロゲルを、N-イソプロピルアクリルアミド、N,N'-メチレン-ビス(アクリルアミド)及び光開始剤(2,2-ジメトキシ-2-フェニルアセトフェノン)の混合物をイオン液体（ＩＬ）：1-エチル-3-メチルイミダゾリウムスルファートアセタート又はトリヘキシルテトラデシルホスホニウムジシアナミドにそれぞれ溶解し、４５℃で１０分間加熱することによって合成した。
５μｌの先の混合物をデバイスのリザーバに保持し、その場で光重合（1600 mW cm-2）をそれぞれ２０分及び３０分行って、ドロップキャストを行う。
ＩＬ中のハイドロゲルを超純水及びエタノールで徹底的に洗浄し、リザーバ３を除くすべてにグリース試薬を埋込み、１２時間放置して乾燥させ、２つのイオンゲル（ＩＯ−１及びＩＯ−２）を得た。
３μＬの亜硝酸標準溶液を、較正リザーバ２のイオンゲルに添加し、前記溶液は０−１０ｐｐｍの比例領域中の以下の濃度に調整した：（図３を参照）：（０ｐｐｍ）、（２．５ｐｐｍ）、（５ｐｐｍ）、（７．５ｐｐｍ）及び（１０ｐｐｍ）。
数分後、各較正リザーバ２において異なる色強度が発現し、各亜硝酸濃度に強度が比例した。同量のμｌの分析する液体サンプルが、２．５ｐｐｍの量の硝酸及び２．５ｐｐｍの亜硝酸とともにリザーバ３及び６及び７に保持された。
６に保持されたサンプルは、毛管現象により、Ｚｎ（０）がサンプル中に存在する全ての硝酸をその通過に際し亜硝酸に還元するマイクロ流体流路５を経由して、リザーバ４に移動した。
リザーバ４及び７において発現した色強度が平均として与えられた。
そこで、デバイスの写真をカメラで撮影し、画像解析で処理した。
輝度値（Ｌ）、色度（Ｃ）及び色調（Ｈ）の変数をPhotoShop CCの方法によって、各リザーバをピクセル化することによって取得し、サンプルの硝酸濃度を多変量較正モデルを用いて計算した（図３を参照）。
【００２７】
特に、亜硝酸濃度（リザーバ７で決定された）、亜硝酸濃度＋亜硝酸に還元された硝酸濃度（リザーバ４で決定された）が決定され、その差から硝酸濃度が決定された。リザーバ３のイオン液体中のハイドロゲル（「対象」）に対するサンプルの効果がまた評価された。
得られた結果は、亜硝酸濃度５±０．５ｐｐｍ（リザーバ４中）が、リザーバ６に添加されたサンプルの亜硝酸＋硝酸濃度に対応することを示した。
リザーバ７中で決定された亜硝酸濃度は、２．５±０．５ｐｐｍであった。
したがって、両者の差（リザーバ４−リザーバ７）から、サンプル中の硝酸濃度は、２．５±０．６ｐｐｍであるとの結果が得られた。
本発明は、既述された特定の実施形態に限定されず、それはまた、例えば、特許請求の範囲から推論される内容に基づいて当業者が実施することができる変形をもカバーするものである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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