(57)【要約】  本発明は、二重特異性のヘテロ二量体免疫調節抗体に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療のためのＴ細胞の活性化において使用するための、ヒト共刺激受容体に一価連結し、ヒトチェックポイント受容体に一価連結する二重特異性抗体。
【請求項２】
前記共刺激受容体が、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、および４−１ＢＢからなる群から選択される、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
前記チェックポイント受容体が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、およびＴＩＭ−３からなる群から選択される、請求項１または２に記載の二重特異性抗体。
【請求項４】
前記共刺激受容体がヒトＩＣＯＳである、請求項１、２または３に記載の二重特異性抗体。
【請求項５】
前記抗体がＩＣＯＳとＰＤ−１とに連結する、請求項４に記載の二重特異性抗体。
【請求項６】
前記抗体がＩＣＯＳとＰＤ−Ｌ１とに連結する、請求項４に記載の二重特異性抗体。
【請求項７】
前記抗体がＩＣＯＳとＣＴＬＡ−４とに連結する、請求項４に記載の二重特異性抗体。
【請求項８】
前記抗体がＩＣＯＳとＬＡＧ−３とに連結する、請求項４に記載の二重特異性抗体。
【請求項９】
前記抗体がＩＣＯＳとＴＩＭ−３とに連結する、請求項４に記載の二重特異性抗体。
【請求項１０】
前記抗体が図２Ａのフォーマットを有する、請求項１〜９のいずれかに記載の二重特異性抗体。
【請求項１１】
前記抗体が図２Ｅのフォーマットを有する、請求項１〜１０のいずれかに記載の二重特異性抗体。
【請求項１２】
前記抗体が図２Ｆのフォーマットを有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の二重特異性抗体。
【請求項１３】
前記抗体が図２Ｇのフォーマットを有する、請求項１〜１２のいずれかに記載の二重特異性抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、
ａ）配列番号２６６４２を有する第１の配列、
ｂ）配列番号２６６５７を有する第２の配列、および
ｃ）配列番号２６６４７を有する第３の配列を含む、請求項５に記載の二重特異性抗体。
【請求項１５】
ヘテロ二量体抗体であって、
ａ）第１のＦｃドメイン、任意選択のドメインリンカー、および第１の抗原に連結するｓｃＦｖを含む第１の抗原連結ドメインを含む第１の重鎖と、
ｂ）第２のＦｃドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ１ドメインを含む重鎖定常ドメイン、および可変重鎖ドメインを含む重鎖を含む第２の重鎖と、
ｃ）可変軽鎖ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む軽鎖と、を含み、
前記可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインが、第２の抗原に連結する第２の抗原連結ドメインを形成し、前記第１および第２の抗原連結ドメインのうちの一方はヒトＩＣＯＳに連結し、他方はヒトＰＤ−１に連結する、ヘテロ二量体抗体。
【請求項１６】
ヘテロ二量体抗体であって、
ａ）第１の重鎖であって、
ｉ）第１の変異型Ｆｃドメイン、および
ｉｉ）第１の抗原に連結する単鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）を含み、前記ｓｃＦｖ領域が、第１の可変重鎖、可変軽鎖、および荷電ｓｃＦｖリンカーを含み、前記荷電ｓｃＦｖリンカーが、前記第１の可変重鎖と前記可変軽鎖とを共有連結する、第１の重鎖と、
ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３単量体を含む第２の重鎖であって、ＶＨが第２の可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３が第２の変異型Ｆｃドメインである、第２の重鎖と、
ｃ）軽鎖と、を含み、
前記第２の変異型Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ２４１Ｄを含み、
前記第１および第２の変異型Ｆｃドメインが、それぞれアミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、
前記第１の変異型Ｆｃドメインがアミノ酸置換Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、第２の変異型Ｆｃドメインがアミノ酸置換Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、前記第１および第２の抗原連結ドメインのうちの一方がヒトＩＣＯＳに連結し、他方がヒトＰＤ−１に連結し、ナンバリングが、Ｋａｂａｔと同様のＥＵのインデックスに従う、ヘテロ二量体抗体。
【請求項１７】
前記第１および第２の変異型ＦｃドメインがそれぞれＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む、請求項１〜１６のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体。
【請求項１８】
ヘテロ二量体抗体であって、
ａ）第１の重鎖であって、
ｉ）第１の変異型Ｆｃドメイン、および
ｉｉ）第１の抗原に連結する単鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）を含み、前記ｓｃＦｖ領域が、第１の可変重鎖、可変軽鎖、および荷電ｓｃＦｖリンカーを含み、前記荷電ｓｃＦｖリンカーが、前記第１の可変重鎖と前記可変軽鎖とを共有連結する、第１の重鎖と、
ｂ）ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３単量体を含む第２の重鎖であって、ＶＨが第２の可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３が第２の変異型Ｆｃドメインである、第２の重鎖と、
ｃ）軽鎖と、を含み、
前記第１および第２の変異型Ｆｃドメインが、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗからなる群から選択されるヘテロ二量体化変異のセットを含み、前記第１および第２の抗原連結ドメインの一方がヒトＩＣＯＳに連結し、他方がヒトＰＤ−１に連結し、ナンバリングがＫａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従う、ヘテロ二量体抗体。
【請求項１９】
核酸組成物であって、
ａ）請求項１〜１８のいずれかに記載の第１の重鎖をコードする第１の核酸と、
ｂ）請求項１〜１８のいずれかに記載の第２の重鎖をそれぞれコードする第２の核酸と、
ｃ）請求項１〜１８のいずれかに記載の軽鎖をそれぞれコードする第３の核酸と、を含む、核酸組成物。
【請求項２０】
発現ベクター組成物であって、
ａ）請求項１９に記載の第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項１９に記載の第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、
ｃ）請求項１９に記載の第３の核酸を含む第３の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物。
【請求項２１】
請求項２０に記載の発現ベクター組成物を含む宿主細胞。
【請求項２２】
ヘテロ二量体抗体を作製する方法であって、前記ヘテロ二量体抗体が発現される条件下で請求項２１に記載の宿主細胞を培養することと、前記抗体を回収することとを含む、方法。
【請求項２３】
患者において細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化する方法であって、請求項１〜１８のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項２４】
患者においてＩＦＮγレベルを増加させる方法であって、請求項１〜１８のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体を前記患者に投与することを含む、方法。
【請求項２５】
患者においてＩＬ−２レベルを増加させる方法であって、請求項１〜１８のいずれかに記載のヘテロ二量体抗体を前記患者に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年８月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／３８１，２３９号、２０１７年２月７日に出願された米国仮特許出願第６２／４５６，０３３号、２０１７年３月３１日に出願された米国仮特許出願第６２／４７９，７２３号、２０１７年６月１４日に出願された米国特許出願第１５／６２３，３１４号の優先権を主張し、それらの内容は、その全体が参照により明示的に完全に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１７年８月２９日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーは０６７４６１＿５１９８−ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、サイズは２６，０６１，２８２キロバイトである。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍反応性Ｔ細胞は、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４などの抑制性免疫チェックポイントの上方制御のために、時間の経過とともにそれらの細胞傷害活性を失う。腫瘍反応性Ｔ細胞を抑制解除してそれらが腫瘍細胞を殺傷し続けることができるように、２つの並行した治療戦略が追求されている。
【０００４】
第１のアプローチは、免疫調節それ自体（ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４など）またはそのリガンド（ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ８０、ＣＤ８６など）のいずれかに連結する拮抗モノクローナル抗体で処理することによる免疫による免疫調節遮断であり、これによって、腫瘍反応性Ｔ細胞が腫瘍細胞を殺傷するのを阻止する抑制性シグナルを除去する。ＣＴＬＡ−１、ＰＤ−１（プログラム細胞死１）、ＴＩＭ−３（Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン３）、ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子３）、ＴＩＧＩＴ（ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを含むＴ細胞免疫受容体）、および他のもののような免疫調節受容体は、Ｔ細胞および他の細胞型の活性化、増殖、および／またはエフェクター活性を阻害する。免疫調節受容体が腫瘍細胞に対する内因性Ｔ細胞応答を抑制するという仮説に導かれて、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、およびトレメリムマブを含む抗ＣＴＬＡ４および抗ＰＤ１抗体の前臨床および臨床試験は、免疫調節遮断が優れた抗腫瘍応答をもたらし、内因性Ｔ細胞を刺激して腫瘍細胞を攻撃し、さまざまな悪性腫瘍を有する一部の患者に長期の癌寛解をもたらすことを実証した。残念なことに、これらの治療法に応答するのは一部の患者だけであり、適応症および他の要因により異なるが、奏効率は一般に１０〜３０％の範囲で、場合によっては単剤療法ごとに高くなる。
【０００５】
腫瘍反応性Ｔ細胞を抑制解除するための第２のアプローチは、ＩＣＯＳのような共刺激タンパク質に連結する拮抗抗体で処理し、それによって免疫チェックポイントの負のシグナル伝達を克服するために正のシグナルを加えることによるＴ細胞同時刺激である。
【０００６】
したがって、本発明は、共刺激受容体（例えば、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ）およびチェックポイント受容体（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、およびＴＩＧＩＴに連結する二重特異性抗体に関する。
【発明の概要】
【０００７】
したがって、一態様において、本発明は、癌の治療のためのＴ細胞の活性化において使用するための、ヒト共刺激受容体に一価連結し、ヒトチェックポイント受容体に一価連結する二重特異性抗体を提供する。
【０００８】
いくつかの態様において、共刺激受容体は、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、および４−１ＢＢからなる群から選択される。
【０００９】
さらなる態様において、チェックポイント受容体は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、およびＴＩＭ−３からなる群から選択される。
【００１０】
さらなる態様では、抗体は、ＩＣＯＳとＰＤ−１、ＩＣＯＳとＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳとＬＡＧ−３、ＩＣＯＳとＴＩＭ−３、ＩＣＯＳとＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳとＢＴＬＡ、ＩＣＯＳとＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲとＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲとＰＤ−１、ＧＩＴＲとＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲとＬＡＧ−３、ＧＩＴＲとＴＩＭ−３、ＧＩＴＲとＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲとＢＴＬＡ、ＯＸ４０とＰＤ−１、ＯＸ４０とＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０とＣＴＬＡ−４、ＩＣ  ＯＸ４０  ＯＳとＬＡＧ−３、ＯＸ４０とＴＩＭ−３、ＯＸ４０とＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０とＢＴＬＡ、４−１ＢＢとＰＤ−１、４−１ＢＢとＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢとＬＡＧ−３、４−１ＢＢとＴＩＭ−３、４−１ＢＢとＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴと４−１ＢＢ、および４−１ＢＢとＢＴＬＡから選択される抗原の対に連結する。
【００１１】
さらなる態様において、二重特異性抗体は、図２に概説されたものから選択されたフォーマットを有する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明はヘテロ二量体抗体であって、ａ）第１のＦｃドメインを含む第１の重鎖、任意選択のドメインリンカー、および第１の抗原に連結するｓｃＦｖを含む第１の抗原連結ドメインと、ｂ）第２のＦｃドメインを含む重鎖定常ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ１ドメインおよび可変重鎖ドメインを含む重鎖を含む第２の重鎖と、ｃ）可変軽鎖ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む軽鎖とを含み、ここで上記可変重鎖ドメインおよび前記可変軽鎖ドメインは、第２の抗原に連結する第２の抗原連結ドメインを形成し、前記第１および第２の抗原連結ドメインの一方はヒトＩＣＯＳに連結し、他方はヒトＰＤ−１に連結する、ヘテロ二量体抗体を提供する。
【００１３】
さらなる態様において、本発明は、ヘテロ二量体二重特異性抗体であって、ａ）第１の重鎖であって、ｉ）第１の変異型Ｆｃドメイン、およびｉｉ）第１の抗原に連結する単鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）を含み、上記ｓｃＦｖ領域が第１の可変重鎖、可変軽鎖、および荷電ｓｃＦｖリンカーを含み、上記荷電ｓｃＦｖリンカーが上記第１の可変重鎖と上記可変軽鎖とを共有連結する、第１の重鎖と、ｂ）第２の重鎖であって、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３単量体を含み、ＶＨが第２の可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３が第２の変異型Ｆｃドメインである第２の重鎖と、ｃ）軽鎖と、を含み、ここで上記第２の変異型Ｆｃドメインがアミノ酸置換Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ２４１Ｄを含み、上記第１および第２の変異型Ｆｃドメインがそれぞれアミノ酸置換Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、上記第１の変異型Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、第２の変異型Ｆｃドメインが、アミノ酸置換Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、上記第１および第２の抗原連結ドメインの一方はヒトＩＣＯＳに連結し、他方はヒトＰＤ−１に連結し、ここでナンバリングはＫａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従う、ヘテロ二量体二重特異性抗体を提供する。
【００１４】
いくつかの態様において、ヘテロ二量体抗体は、それぞれＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む第１および第２の変異型Ｆｃドメインを有する。
【００１５】
さらなる態様において、本発明は、ヘテロ二量体抗体であって、ａ）第１の重鎖であって、ｉ）第１の変異型Ｆｃドメイン、およびｉｉ）第１の抗原に連結する単鎖Ｆｖ領域（ｓｃＦｖ）を含み、上記ｓｃＦｖ領域が第１の可変重鎖、可変軽鎖、および荷電ｓｃＦｖリンカーを含み、上記荷電ｓｃＦｖリンカーが上記第１の可変重鎖と上記可変軽鎖とを共有連結する、第１の重鎖と、ｂ）第２の重鎖であって、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３単量体を含み、ＶＨが第２の可変重鎖であり、ＣＨ２−ＣＨ３が第２の変異型Ｆｃドメインである第２の重鎖と、ｃ）軽鎖と、を含み、ここで上記第１および第２の変異型Ｆｃドメインが、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｅ／Ｋ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗからなる群から選択されるヘテロ二量体化変異のセットを含み、上記第１および第２の抗原連結ドメインの一方はヒトＩＣＯＳに連結し、他方はヒトＰＤ−１に連結し、ここでナンバリングはＫａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従う、ヘテロ二量体抗体を提供する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、本発明のヘテロ二量体抗体をコードする核酸を含む核酸組成物、核酸を含む発現ベクター組成物、および発現ベクター組成物を含む宿主細胞を提供する。
【００１７】
さらなる態様において、本発明は、癌の治療のためのＴ細胞の活性化において使用するためのヘテロ二量体抗体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）から編集された、膀胱癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、腎癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、および黒色腫癌についてのＰＤ−１およびＴ細胞共刺激受容体の発現データ（ＲＮＡｓｅｑ  Ｖ２  ＲＳＥＭ）を提示する。ピアソン相関係数の二乗を、Ｔ細胞共刺激受容体に対するＰＤ−１について計算した。
【図２Ａ−Ｏ】本発明の二重特異性抗体のためのいくつかのフォーマットを示す。一番目は、第１および第２の抗抗原連結ドメインを有する「ボトルオープナー」フォーマットである。さらに、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、中央−Ｆｖ、１アームの中央−ｓｃＦｖ、１つのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、ｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖのフォーマットが全て示されている。図２Ｊは、Ｆａｂが第１の抗原に連結し、ｓｃＦｖが第２の抗原に連結する、２つのＦａｂ−ｓｃＦｖのアームを有する「中央−ｓｃＦｖ２」フォーマットを示す。図２Ｋは、第１の抗原に連結する第１のＦａｂアームと第２の抗原に連結する第２のＦａｂアームを有する、二重特異性ｍＡｂのフォーマットを示す。図２Ｌは、ＤＶＤ−ＩｇＧのフォーマット（例えば、参照により本明細書に明示的に組み込まれ、以下に論じられる、米国特許第７，６１２，１８１号を参照されたい）を示す。図２Ｍは、トライデントフォーマット（例えば、参照により本明細書に明示的に組み込まれ、以下に論じられる、ＷＯ２０１５／１８４２０３を参照されたい）を示す。示されている全てのｓｃＦｖドメインについて、それらは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、可変重鎖−（任意選択のリンカー）−可変軽鎖、またはその反対のいずれかであり得る。さらに、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂでは、ｓｃＦｖを重鎖単量体のＮ末端または軽鎖のＮ末端のいずれかに連結させることができる。
【図３】ＩＣＯＳをＦａｂ側（［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０）とし、ＰＤ−１をｓｃＦＶ（１Ｇ６＿Ｌ１．９４＿Ｈ１．２７９）として有し、血清半減期を延長するためのＭ４２８Ｌ／４３４Ｓ変異を含む、ボトルオープナーフォーマットであるＸＥＮＰ２３１０４の配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカーであるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図８に示されている無荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えることができる）、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。さらに、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端に向かうｓｃＦｖの配向を示し、本明細書の配列のいくつかは、ＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ（ＮからＣ末端に向かう）と配向され、一方でいくつかはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ（ＮからＣ末端に向かう）と配向されるが、当業者によって理解されるように、これらの配列はまた、本明細書中のそれらの描写とは反対の配向で使用され得る。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【図４Ａ−Ｅ】（スキューおよびｐＩ変異を含む）ヘテロ二量体化変異セットの有用な対を示す。図４ＣおよびＦには、対応する「単量体２」変異が存在しない変異が存在し、これらは、いずれかの単量体に単独で使用することができるか、または例えばボトルオープナーのＦａｂ側に含めることができるｐＩ変異であり、例えば、ｓｃＦｖを第２の抗原連結ドメインとして利用する第２の単量体に適切な荷電ｓｃＦｖリンカーを使用することができる。適切な荷電リンカーは、図８に示される。
【図５】等価変異型抗体定常領域とそれぞれの置換の一覧を示す。ｐＩ＿（−）は低いｐＩの変異を示し、ｐＩ＿（＋）は高いｐＩの変異を示す。これらは、任意にかつ独立して、本発明の他のヘテロ二量体化変異（および本明細書に概説されているように他の変異も）と組み合わせることができる。
【図６】ＦｃγＲ連結を除去した有用な除去変異を示す（しばしば「ノックアウト」または「ＫＯ」変異と呼ばれる。）。一般に、除去変異は両方の単量体に見られるが、いくつかの場合においてはそれらは一方の単量体のみにあってもよい。
【図７】本発明の２つの特に有用な実施形態を示す。本実施形態の「非Ｆｖ」構成要素が図９Ａに示されるが、図９の他のフォーマットも同様に使用することができる。
【図８Ａ−Ｂ】構成要素として、一つ以上のｓｃＦｖを利用するヘテロ二量体抗体のｐＩを増加または減少することにおいて使用されるいくつかの荷電ｓｃＦｖリンカーを示す。（＋Ｈ）正のリンカーは、本明細書において特に使用される。単一電荷を有する単一の先行技術のｓｃＦｖリンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（８）：９８９−９９５（１９９３）からの「Ｗｈｉｔｌｏｗ」としての参照である。このリンカーは、ｓｃＦｖにおける凝集を減少させ、タンパク質分解安定性を高めるために使用されたことに留意すべきである。
【図９】Ｆｖ配列（例えば、ｓｃＦｖおよびＦａｂ側のためのｖｈおよびｖｌ）含まずに、ヒトＩｇＧ１に基づいて、いくつかの有用なボトルオープナーフォーマットの骨格の配列を示す。ボトルオープナーの骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異を含む。ボトルオープナーの骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、異なるスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異を含む。ボトルオープナーの骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、異なるスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異を含む。ボトルオープナーの骨格４はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、異なるスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異を含む。ボトルオープナーの骨格５はヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異を含む。ボトルオープナーの骨格６はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異、ならびにＮ２９７Ａの両方の鎖の変異を含む。ボトルオープナーの骨格７は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて６と同一である。ボトルオープナーの骨格６および７の代替的なフォーマットは、両方の鎖の除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを除外できる。骨格８はヒトＩｇＧ４に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異、ならびに当該技術分野で知られているように、Ｆａｂアーム交換を除去するＳ２２８Ｐ（ＥＵナンバリング、これはＫａｂａｔではＳ２４１Ｐである）の両鎖の変異を含む。ボトルオープナーの骨格８の代替的なフォーマットでは、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異を除外でき、骨格９は、ヒトＩｇＧ２に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異を含む。骨格１０はヒトＩｇＧ２に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＳ２６７Ｋの両方の鎖の変異を含む。  当業者には理解され、以下に概説されるように、これらの配列は、ｓｃＦｖ（任意に荷電ｓｃＦｖリンカーを含む）を含む一つの単量体およびＦａｂ配列を含む他の単量体を含む、本明細書に概説される任意のｖｈとｖｌの対と共に使用できる（例えば、「Ｆａｂ側重鎖」に連結したｖｈ、および「定常軽鎖」に連結したｖｌ）。すなわち、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１、抗ＬＡＧ−３、抗ＴＩＭ−３、抗ＴＩＧＩＴ、および抗ＢＴＬＡについて本明細書で概説した任意のＦｖ配列は、ｓｃＦｖ（同様に、任意選択で荷電ｓｃＦｖリンカーを有する）またはＦａｂとしてであるかどうかにかかわらず、これらの図３７の骨格に任意の組み合わせで組み込むことができる。図９Ａに示されている定常軽鎖は、図中のコンストラクトの全てのために使用することができるが、カッパ定常軽鎖もまた置換されていてもよい。  これらのボトルオープナーの骨格は、図１Ｆの中心−ｓｃＦｖフォーマットに使用されることに注意すべきであり、そこでは、第１のＦａｂと同じ抗原連結を有する追加の第２のＦａｂ（ｖｈ−ＣＨ１およびｖｌ−定常軽鎖）が、「ボトルオープナー側」のｓｃＦｖのＮ末端に付加される。  これらの骨格の各々に含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書で定義されるように）９０、９５、９８、および９９％同一であり、および／または（当業者には理解されるように、親のヒトＩｇＧ１（または骨格に基づいてＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４）と比べていくつかのアミノ酸修飾を既に含む図の「親」と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加のアミノ酸置換を含む配列である。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキュー、ｐＩおよび除去変異に加えて、さらなるアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。
【図１０】選択された数の抗ＰＤ−１抗体の配列を示す。これらの配列は、図６Ａに示されている除去変異（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ」）を有するヒトＩｇＧ１に基づいて生成されたことに留意することが重要である。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【図１１】配列番号１〜２３９２、３１２５〜３１４４、４６９７〜７５９４、および４６９７〜２１８１０として列挙されている追加の抗ＰＤ−１  ＡＢＤと共に、選択された数のＰＤ−１  ＡＢＤを示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカーであるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図８に示されている無荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えることができる）、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。さらに、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端に向かうｓｃＦｖの配向を示し、この図中の配列のいくつかは、ＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ（ＮからＣ末端に向かう）と配向され、一方でいくつかはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ（ＮからＣ末端に向かう）と配向されるが、当業者によって理解されるように、これらの配列はまた、本明細書中のそれらの描写とは反対の配向で使用され得る。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中の全ての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれでも使用することができる。
【図１２】配列番号２３９３〜２４１４および３７３７〜３８１６として列挙されている追加の抗ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤと共に、選択された数のＣＴＬＡ−４  ＡＢＤを示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカーであるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図８に示されている無荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えることができる）、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。さらに、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端に向かうｓｃＦｖの配向を示し、この図中の配列のいくつかは、ＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ（ＮからＣ末端に向かう）と配向され、一方でいくつかはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ（ＮからＣ末端に向かう）と配向されるが、当業者によって理解されるように、これらの配列はまた、本明細書中のそれらの描写とは反対の配向で使用され得る。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中の全ての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれでも使用することができる。
【図１３】配列番号２４１５〜２６０４および３８１７〜３９６０として列挙されている追加の抗ＬＡＧ−３  ＡＢＤと共に、選択された数のＬＡＧ−３  ＡＢＤを示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカーであるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図８に示されている無荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えることができる）、そしてスラッシュは可変ドメイン＞の境界（単数または複数）を示す。さらに、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端に向かうｓｃＦｖの配向を示し、この図中の配列のいくつかは、ＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ（ＮからＣ末端に向かう）と配向され、一方でいくつかはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ（ＮからＣ末端に向かう）と配向されるが、当業者によって理解されるように、これらの配列はまた、本明細書中のそれらの描写とは反対の配向で使用され得る。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中の全ての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれでも使用することができる。
【図１４】選択された数の抗ＴＩＭ−３抗体の配列を示す。これらの配列は、除去変異（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ」）を有するヒトＩｇＧ１骨格に基づいて生成されたが、他のフォーマットも同様に使用することができることに留意することが重要である。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【図１５】選択された数の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の配列を示す。これらの配列は、本明細書において概説されている除去変異（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ」）を有するヒトＩｇＧ１骨格に基づいて生成されたが、他のフォーマットも同様に使用することができることに留意することが重要である。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【図１６】プロトタイプの抗４−１ＢＢ抗体の配列を示す。これらの配列は、除去変異（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ」）を有するヒトＩｇＧ１骨格に基づいて生成されたが、他のフォーマットも同様に使用することができることに留意することが重要である。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【図１７】プロトタイプの抗ＯＸ４０抗体の配列を示す。これらの配列は、除去変異（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ」）を有するヒトＩｇＧ１骨格に基づいて生成されたが、他のフォーマットも同様に使用することができることに留意することが重要である。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【図１８】プロトタイプの抗ＧＩＴＲ抗体の配列を示す。これらの配列は、除去変異（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ」）を有するヒトＩｇＧ１骨格に基づいて生成されたが、他のフォーマットも同様に使用することができることに留意することが重要である。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【図１９】プロトタイプの抗ＩＣＯＳ抗体の配列を示す。これらの配列は、除去変異（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ」）を有するヒトＩｇＧ１骨格に基づいて生成されたが、他のフォーマットも同様に使用することができることに留意することが重要である。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表Ｘに示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【図２０】例示的な抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂの配列を示す。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュ（／）は可変領域の境界を示す。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表Ｘに示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、下線を付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメインに含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中の全ての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれでも使用することができる。これらの配列は、除去されている重鎖のＣ末端における６−ヒスチジン（Ｈｉｓ６またはＨＨＨＨＨＨ）Ｃ末端タグを使用して生成されたことに注目することが重要である。
【図２１】融解温度（Ｔｍ）および安定性のために改変された変異型抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂの、ＤＳＦによって決定されたときの親Ｆａｂ（ＸＥＮＰ２２０５０）からの溶融温度の変化を示す。
【図２２】Ｏｃｔｅｔによって決定されたときの、ＡＭＣバイオセンサー上に捕捉されたヒトＩＣＯＳのマウスＦｃ融合物に対する変異型抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂの平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（Ｋａ）、および解離速度（Ｋｄ）を示す。
【図２３】Ｏｃｔｅｔによって決定されたときの、ＳＡバイオセンサー上に捕捉されたヒトＩＣＯＳのビオチン化ＩｇＧ１のＦｃ融合物に対する変異型抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂの平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（ＫＡ）、および解離速度（Ｋｄ）を示す。
【図２４】例示的な抗ＩＣＯＳのｓｃＦｖの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカーであるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図Ｘに示される非荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えられ得る）を含み、スラッシュ（／）は可変領域の境界を示す。命名規則は、Ｎ末端からＣ末端に向かうｓｃＦｖの配向を示し、この図中の配列のいくつかは、ＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ（ＮからＣ末端に向かう、図２４を参照）と配向され、一方でいくつかはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ（ＮからＣ末端に向かう、図２４Ｂを参照）と配向されるが、当業者によって理解されるように、これらの配列はまた、本明細書中のそれらの描写とは反対の配向で使用され得る。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表Ｘに示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中の全ての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれでも使用することができる。これらの配列は、除去されている重鎖のＣ末端におけるポリヒスチジン（Ｈｉｓ６またはＨＨＨＨＨＨ）Ｃ末端タグを使用して生成されたことに注目することが重要である。
【図２５】融解温度（Ｔｍ）および安定性のために改変された変異型抗ＩＣＯＳ  ｓｃＦｖの、ＤＳＦによって決定されたときの親ｓｃＦｖ（ＸＥＮＰ２４３５２、Ｎ末端からＣ末端に向けてＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬの配向）からの溶融温度の変化を示す。
【図２６】ボトルオープナーフォーマット（ＦＡＢ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）のプロトタイプの抗ｃｏｓｔｉｍ×抗チェックポイント抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。示されるように、ｓｃＦｖのドメインはＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬまたはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨのいずれかの異なる配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）が、これを逆にすることができる。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中のＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができ、これは血清中でより長い半減期をもたらす。
【図２７】ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて、プロトタイプのｃｏｓｔｉｍ／チェックポイントボトルオープナーによるサイトカイン分泌の誘導を示す。
【図２８】ナイーブ（非ＳＥＢ刺激）におけるＩＬ−２分泌の誘導と示される試験試料による処理後のＳＥＢ刺激ＰＢＭＣを示す。
【図２９】腫瘍のＴＩＬが免疫チェックポイント受容体と共刺激受容体を共発現するので、二重特異性抗体が、特異性を増加し、抗腫瘍活性を増強し、末梢の毒性を回避することを示す、ｃｏｓｔｉｍ×チェックポイント遮断二重特異性抗体の利益に関連した概略図を示す。
【図３０】１アームの抗ＰＤ−１抗体（ＸＥＮＰ２０１１１）および１アームの抗ＩＣＯＳ抗体（ＸＥＮＰ２０２６６）と比較して、二重陽性細胞が例示的な抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１抗体（ＸＥＮＰ２０８９６）によって選択的に占められている。
【図３１】ヒトＰＢＭＣのＳＥＢ刺激後の、Ａ）ＰＤ−１およびＩＣＯＳの二重陽性Ｔ細胞、ならびにＢ）ＰＤ−１およびＩＣＯＳの二重陰性Ｔ細胞に対する、抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体（ＸＥＮＰ２０８９６）、１アーム抗ＩＣＯＳ抗体（ＸＥＮＰ２０２６６）、および１アーム抗ＰＤ−１抗体（ＸＥＮＰ２０１１１）の受容体占有率を示す。
【図３２】ボトルオープナーフォーマット（ＦＡＢ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の例示的な抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。示されるように、ｓｃＦｖのドメインはＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬまたはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨのいずれかの異なる配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）を有するが、これを逆にすることができる。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【図３３】一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むボトルオープナーフォーマットの例示的抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。示されるように、ｓｃＦｖのドメインはＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬまたはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨのいずれかの異なる配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）を有するが、これを逆にすることができる。
【図３４】Ｏｃｔｅｔによって決定されたときの、ＡＭＣバイオセンサー上に捕捉されたヒトＩＣＯＳのマウスＦｃ融合物に対する変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体の平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（Ｋａ）、および解離速度（Ｋｄ）を示す。
【図３５】Ｏｃｔｅｔによって決定されたときの、ＳＡ／ＳＡＸバイオセンサー上に捕捉されたヒトおよびＩＣＯＳのビオチン化ＩｇＧ１のＦｃ融合物に対する変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体の平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（ＫＡ）、および解離速度（Ｋｄ）を示す。
【図３６】Ａ）およびＢ）に示される２つの別個の実験におけるＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいてヒトＴ細胞に対する変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体の細胞表面連結を示す。
【図３７】ヒトＰＢＭＣのＳＥＢ刺激後の、ＰＤ−１およびＩＣＯＳの二重陽性Ｔ細胞に対する、変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体、１アーム抗ＩＣＯＳ抗体、および１アーム抗ＰＤ−１抗体（ＸＥＮＰ２０１１１）の受容体占有率を示す。
【図３８】変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体がＳＥＢ刺激ＰＢＭＣから分泌されるＡ）ＩＬ−２およびＢ）ＩＦＮγの分泌を促進することを示す。
【図３９】変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体がＳＥＢ刺激ＰＢＭＣから分泌されるＡ）ＩＬ−２およびＢ）ＩＦＮγの分泌を促進することを示す。
【図４０】ヒトＰＢＭＣの移植および示された試験試料による処理の後Ａ）７日目およびＢ）１１日目におけるＩＦＮγの濃度を示す。
【図４１】ヒトＰＢＭＣの移植および示された試験試料による処理の後Ａ）１１日目およびＢ）１４日目における、フローサイトメトリーによって決定されたときのマウスにおけるＣＤ４５＋細胞数を示す。
【図４２】ヒトＰＢＭＣの移植および示された試験試料による処理の後１４日目におけるフローサイトメトリーによって決定されたときのマウスにおけるＡ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＢ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を示す（＊＊Ｐ≦０．０１）。
【図４３】ヒトＰＢＭＣの移植および示された試験試料による処理の後１４日目までのマウス体重の変化を示す（＊＊Ｐ≦０．０１）。
【図４４】ヒトＰＢＭＣの移植および示された試験試料による処理の後Ａ）７日目およびＢ）１４日目におけるＩＦＮγの濃度を示す
【図４５】ヒトＰＢＭＣの移植および示された試験試料による処理の後１４日目における、フローサイトメトリーによって決定されたときのマウスにおけるＣＤ４５＋細胞数を示す。
【図４６】ヒトＰＢＭＣの移植および示された試験試料による処理の後１４日目におけるフローサイトメトリーによって決定されたときのマウスにおけるＡ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＢ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を示す。
【図４７】ヒトＰＢＭＣの移植および示された試験試料による処理の後１２日目までおよび１５日目までのマウス体重の変化を示す。
【図４８】ボトルオープナーフォーマット（ＦＡＢ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の例示的な抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１抗体と代替的なＩＣＯＳ  ＡＢＤのアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。示されるように、ｓｃＦｖのドメインはＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬまたはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨのいずれかの異なる配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）を有するが、これを逆にすることができる。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【図４９】ヒトＰＢＭＣのＳＥＢ刺激および代替的な抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体による処理の後のＩＬ−２のサイトカイン放出アッセイを示す。
【図５０】ヒトＰＢＭＣのＳＥＢ刺激および代替的な抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体による処理の後のＩＬ−２のサイトカイン放出アッセイ（二価抗ＲＳＶ  ｍＡｂを超える誘導の倍率として）を示す。
【図５１】抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体による処理の後のＳＥＢ刺激精製ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＡＫＴリン酸化を示す。
【図５２】ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇによって決定されたときの、示された二価抗ＲＳＶによる誘導時の示された試験試料によるＡ）ＩＬ−１７Ａ、Ｂ）ＩＬ１７Ｆ、Ｃ）ＩＬ−２２、Ｄ）ＩＬ−１０、Ｅ）ＩＬ−９、およびＦ）ＩＦＮγの遺伝子発現の誘導の倍率を示す。
【図５３】ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇによって決定されたときの、二価抗ＲＳＶ  ｍＡｂによる処理時の示された試験試料による選択された免疫応答遺伝子の発現の平均の誘導の倍率を示す。シェーディング強度は、倍率変化の大きさに対応する。
【図５４】ヒトＰＢＭＣの移植および示された試験試料による処理の後１４日目における、フローサイトメトリーによって決定されたときのマウスにおけるＣＤ４５＋細胞数を示す。
【図５５】図９および図７５と同様に、図２Ｆの中心ｓｃＦｖ、図２Ｊの中心−ｓｃＦｖ２フォーマット、図２Ｋの二重特異性ｍＡｂ、図２ＬのＤＶＤ−Ｉｇ、および図２Ｍのトライデントフォーマットを含む、いくつかの追加のフォーマットの「骨格」位置（例えば、Ｆｖを含まない）の配列を示す。図２Ｌでは、ＤＶＤ−Ｉｇ（登録商標）リンカーは、ＷＯ２００７／０２４７１５に見られる他のリンカーと共に二重下線を付して示されており、その全体が、特にそれらの配列について、参照により本明細書に組み込まれる。トライデントフォーマットでは、他のトライデントリンカーおよびコイル−コイル配列は、ＷＯ２０１５／１８４２０３に示されており、その全体が、特にそれらの配列について、参照により本明細書に組み込まれる。当業者によって理解されるように、太字のドメイン（例えば、「ＶＨ１」、ＶＨ２−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ２」など）はスラッシュ「／」で分離され、そして必要に応じて任意のドメインリンカーを含み得る。これらの骨格の全ては、軽鎖にカッパ定常領域を利用するが、ラムダ鎖もまた使用され得る。本明細書で概説されるように、図９および図７５に関して、これらの骨格は、任意のＶＨおよびＶＬドメインと組み合わせることができる。
【図５６】ボトルオープナーフォーマット（ＦＡＢ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の例示的な抗ＰＤ−１×抗ＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。示されるように、ｓｃＦｖのドメインはＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬまたはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨのいずれかの異なる配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）を有するが、これを逆にすることができる。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【図５７】中心−ｓｃＦｖフォーマットの例示的な抗ＰＤ−１×抗ＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。示されるように、ｓｃＦｖのドメインはＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬまたはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨのいずれかの異なる配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）を有するが、これを逆にすることができる。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【図５８】中心−ｓｃＦｖ２フォーマットの例示的な抗ＰＤ−１×抗ＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。示されるように、ｓｃＦｖのドメインはＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬまたはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨのいずれかの異なる配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）を有するが、これを逆にすることができる。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【図５９】二重特異性ｍＡｂフォーマットで例示的な抗ＰＤ−１×抗ＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、第１の抗原に対する第１のＦａｂ可変領域と、第２の抗原に対する第２のＦａｂ可変領域を、その後に鎖の指定（第１の抗原に対する重鎖１または軽鎖１、第２の抗原に対する重鎖２または軽鎖２）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【図６０】ＤＶＤ−ＩｇＧフォーマットで例示的な抗ＰＤ−１×抗ＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、第１の抗原に対する第１の可変領域と、第２の抗原に対する第２のＦａｂ可変領域を、その後に鎖の指定（重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【図６１】トライデントフォーマットで例示的な抗ＰＤ−１×抗ＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、ＤＡＲＴを含む第１の抗原に対する第１のＶＬおよびＶＨと、第２の抗原に対するＦａｂ可変領域を、その後に鎖の指定（重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【図６２】ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて、代替的なフォーマットのｃｏｓｔｉｍ×チェックポイント遮断二重特異性抗体によるサイトカイン分泌（ＩＬ−２）の誘導を示す。
【図６３】ボトルオープナーフォーマット（ＦＡＢ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の例示的な抗ＩＣＯＳ×抗ＣＴＬＡ−４抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。示されるように、ｓｃＦｖのドメインはＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬまたはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨのいずれかの異なる配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）を有するが、これを逆にすることができる。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【図６４】二重特異性ｍＡｂフォーマットで例示的な抗ＬＡＧ−３×抗ＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、第１の抗原に対する第１のＦａｂ可変領域と、第２の抗原に対する第２のＦａｂ可変領域を、その後に鎖の指定（第１の抗原に対する重鎖１または軽鎖１、第２の抗原に対する重鎖２または軽鎖２）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【図６５】二重特異性ｍＡｂフォーマットで例示的な抗ＴＩＭ−３×抗ＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、第１の抗原に対する第１のＦａｂ可変領域と、第２の抗原に対する第２のＦａｂ可変領域を、その後に鎖の指定（第１の抗原に対する重鎖１または軽鎖１、第２の抗原に対する重鎖２または軽鎖２）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【図６６】ボトルオープナーフォーマット（ＦＡＢ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）および中心−ｓｃＦｖ２フォーマットの抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−Ｌ１抗体のアミノ酸配列を示す。ボトルオープナーは、ダッシュで区切られた、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖または軽鎖）を用いて命名される。中心−ｓｃＦｖ２は、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。示されるように、ｓｃＦｖのドメインはＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬまたはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨのいずれかの異なる配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）を有するが、これを逆にすることができる。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【図６７】ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて、さらなるｃｏｓｔｉｍ×チェックポイント遮断二重特異性抗体によるサイトカイン分泌（ＩＬ−２）の誘導を示す。
【図６８】例示的な１アーム抗ＩＣＯＳのＦａｂ−Ｆｃの抗体のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。一方のアミノ酸鎖はＦｃドメインのみであり、他方の側は抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂ側であるため、これらは「１アーム」または「１アームの」フォーマットと呼ばれる。Ｆｃドメインは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキュー変異、ならびに図Ｘに示されるｐＩ（−）−等価＿Ａ変異を含む。Ｆａｂ  Ｆｃドメインは、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキュー変異、および図Ｘに示されるｐＩ  ＩＳＯ（＋ＲＲ）変異を含む。両方のＦｃドメインは、除去変異（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ）を含む。
【図６９】Ｏｃｔｅｔによって決定されたときの、ＡＭＣバイオセンサー上に捕捉されたヒトＩＣＯＳのマウスＦｃ融合物に対する変異型１アーム抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂ−Ｆｃ抗体の平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（Ｋａ）、および解離速度（Ｋｄ）を示す。
【図７０】二価および一価の、抗ＰＤ−１抗体、および抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体による処理の後のＳＥＢ刺激精製ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＡＫＴリン酸化を示す。
【図７１】代替的な抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤと共に一価抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂ−Ｆｃ抗体によって処理した後の、精製ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＡＫＴリン酸化を示す。
【図７２】プロトタイプの二重特異性抗体（ＯＸ４０×ＰＤ−１、ＧＩＴＲ×ＰＤ−１、４−１ＢＢ×ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４×ＩＣＯＳ）を示す。
【図７３】いくつかのプロトタイプのｍＡｂｓ（４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−１）を示し、そのＦｖは本発明の他のＦｖと組み合わせて、そして任意のフォーマット（ボトルオープナー、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、二重特異性ｍＡｂ、中央−Ｆｖ、１アーム中央−ｓｃＦｖ、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、またはトライデント）で使用することができる。同様に、いくつかの追加のＩＣＯＳ×ＰＤ−Ｌ１ボトルオープナー配列も示されている。
【図７４】さらなるＰＤ−１×ＩＣＯＳボトルオープナーを示し、ある場合では、ＰＤ−１  ＦｖがＦａｂフォーマットであり、ＩＣＯＳ  ＦｖがｓｃＦｖフォーマットであり、他の場合では逆転している。
【図７５Ａ−Ｄ】本発明のＦｖ配列が付加されている、本発明における使用のｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格の配列を示す。ｍＡｂ−ｓｃＦｖの骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異を含む。骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異を含む。骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異、ならびにＮ２９７Ａの両方の鎖の変異を含む。骨格４は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて３と同一である。ｍＡｂ−ｓｃＦｖの骨格３および４の代替的なフォーマットは、両方の鎖の除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを除外できる。骨格５はヒトＩｇＧ４に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異、ならびに当該技術分野で知られているように、Ｆａｂアーム交換を除去するＳ２２８Ｐ（ＥＵナンバリング、これはＫａｂａｔではＳ２４１Ｐである）の両鎖の変異を含み、骨格６は、ヒトＩｇＧ２に基づき、Ｆａｂ側にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異を含む。骨格７はヒトＩｇＧ２に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＳ２６７Ｋの両方の鎖の変異を含む。  当業者には理解され、以下に概説されるように、これらの配列は、ＦａｂとｓｃＦｖ（任意に荷電ｓｃＦｖリンカーを含む）の両方を含む一つの単量体およびＦａｂ配列を含む他の単量体を含む、本明細書に概説される任意のｖｈとｖｌの対と共に使用できる（例えば、「Ｆａｂ側重鎖」に連結したｖｈ、および「定常軽鎖」に連結したｖｌ）。すなわち、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１、抗ＬＡＧ−３、抗ＴＩＭ−３、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＢＴＬＡ、抗ＩＣＯＳ、抗ＧＩＴＲ、国ＯＸ４０、および抗４−１ＢＢについて本明細書で概説した任意のＦｖ配列は、ｓｃＦｖ（同様に、任意選択で荷電ｓｃＦｖリンカーを有する）またはＦａｂとしてであるかどうかにかかわらず、この図７５の骨格に任意の組み合わせで組み込む���とができる。単量体１側はＦａｂ−ｓｃＦｖのｐＩ陰性側であり、ヘテロ二量体化変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、等価ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む（全てＩｇＧ１と比較したもの）。単量体２側はｓｃＦｖのｐＩ陽性側であり、ヘテロ二量体化変異３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む。ただし、他のスキュー変異の対、特に、［Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ］、［Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ］、［Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ］、［Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ］、［Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ］、［Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ］、［Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ］、および［Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３９４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ］で置換することができる。  図７５Ａに示されている定常軽鎖は、図中のコンストラクトの全てのために使用することができるが、カッパ定常軽鎖もまた置換されていてもよい。  これらのｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格は図１ＨのｍＡｂ−Ｆｖフォーマット（ここで一方の単量体はＣ末端にｖｌを含みそして他方はＣ末端にｖｈを含む）の両方において、同様にｓｃＦｖ−ｍＡｂフォーマット（単量体のうちの１つのＣ末端にｓｃＦｖドメインを付加したもの）において、使用されることに注目すべきである。  これらの骨格の各々に含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書で定義されるように）９０、９５、９８、および９９％同一であり、および／または（当業者には理解されるように、親のヒトＩｇＧ１（または骨格に基づいてＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４）と比べていくつかのアミノ酸修飾を既に含む図の「親」と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加のアミノ酸置換を含む配列である。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキュー、ｐＩおよび除去変異に加えて、さらなるアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。
【図７６】ＶＨおよびＶＬの配列として、ヒトＰＤ−１に連結するＦｖのいくつかの従来技術の配列を示す。当業者には理解されるように、これらのＦｖのいずれも、共刺激受容体（例えば、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、または４−１ＢＢ）に連結するＦｖ（本明細書に含まれるＦｖ配列を含む）と組み合わせることができ、任意のフォーマット（ボトルオープナー、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、二重特異性ｍＡｂ、中央−Ｆｖ、１アーム中央−ｓｃＦｖ、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、またはトライデント）であり得る。特にそれらはＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０と［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０  ＡＢＤと組み合わせることができる。
【図７７】ＶＨおよびＶＬの配列として、ヒトＩＣＯＳに連結するＦｖのいくつかの従来技術の配列を示す。当業者には理解されるように、これらのＦｖのいずれも、チェックポイント受容体（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、およびＢＴＬＡ）に連結するＦｖ（、本明細書に含まれるＦｖ配列を含む）と組み合わせることができ、任意のフォーマット（ボトルオープナー、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、二重特異性ｍＡｂ、中央−Ｆｖ、１アーム中央−ｓｃＦｖ、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、またはトライデント）であり得る。特に、それらは識別子１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１を有するＰＤ−１  ＡＢＤと組み合わせることができる。
【図７８】ＶＨおよびＶＬの配列として、ヒトＰＤ−Ｌ１に連結するＦｖのいくつかの従来技術の配列を示す。当業者には理解されるように、これらのＦｖのいずれも、共刺激受容体（例えば、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、または４−１ＢＢ）に連結するＦｖ（本明細書に含まれるＦｖ配列を含む）と組み合わせることができ、任意のフォーマット（ボトルオープナー、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、二重特異性ｍＡｂ、中央−Ｆｖ、１アーム中央−ｓｃＦｖ、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、またはトライデント）であり得る。特にそれらはＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０と［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０  ＡＢＤと組み合わせることができる。
【図７９】ＶＨおよびＶＬの配列として、ヒトＣＴＬＡ−４に連結するＦｖのいくつかの従来技術の配列を示す。当業者には理解されるように、これらのＦｖのいずれも、共刺激受容体（例えば、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、または４−１ＢＢ）に連結するＦｖ（本明細書に含まれるＦｖ配列を含む）と組み合わせることができ、任意のフォーマット（ボトルオープナー、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、二重特異性ｍＡｂ、中央−Ｆｖ、１アーム中央−ｓｃＦｖ、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、またはトライデント）であり得る。特にそれらはＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０と［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０  ＡＢＤと組み合わせることができる。
【図８０】ＶＨおよびＶＬの配列として、ヒトＬＡＧ−３に連結するＦｖのいくつかの従来技術の配列を示す。当業者には理解されるように、これらのＦｖのいずれも、共刺激受容体（例えば、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、または４−１ＢＢ）に連結するＦｖ（本明細書に含まれるＦｖ配列を含む）と組み合わせることができ、任意のフォーマット（ボトルオープナー、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、二重特異性ｍＡｂ、中央−Ｆｖ、１アーム中央−ｓｃＦｖ、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、またはトライデント）であり得る。特にそれらはＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０と［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０  ＡＢＤと組み合わせることができる。
【図８１】ＶＨおよびＶＬの配列として、ヒトＴＩＭ−３に連結するＦｖのいくつかの従来技術の配列を示す。当業者には理解されるように、これらのＦｖのいずれも、共刺激受容体（例えば、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、または４−１ＢＢ）に連結するＦｖ（本明細書に含まれるＦｖ配列を含む）と組み合わせることができ、任意のフォーマット（ボトルオープナー、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、二重特異性ｍＡｂ、中央−Ｆｖ、１アーム中央−ｓｃＦｖ、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、またはトライデント）であり得る。特にそれらはＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０と［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０  ＡＢＤと組み合わせることができる。
【図８２】ＶＨおよびＶＬの配列として、ヒトＢＴＬＡに連結するＦｖのいくつかの従来技術の配列を示す。当業者には理解されるように、これらのＦｖのいずれも、共刺激受容体（例えば、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、または４−１ＢＢ）に連結するＦｖ（本明細書に含まれるＦｖ配列を含む）と組み合わせることができ、任意のフォーマット（ボトルオープナー、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、二重特異性ｍＡｂ、中央−Ｆｖ、１アーム中央−ｓｃＦｖ、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、またはトライデント）であり得る。特にそれらはＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０と［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０  ＡＢＤと組み合わせることができる。
【図８３】ＶＨおよびＶＬの配列として、ヒトＴＩＧＩＴに連結するＦｖのいくつかの従来技術の配列を示す。当業者には理解されるように、これらのＦｖのいずれも、共刺激受容体（例えば、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、または４−１ＢＢ）に連結するＦｖ（本明細書に含まれるＦｖ配列を含む）と組み合わせることができ、任意のフォーマット（ボトルオープナー、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、二重特異性ｍＡｂ、中央−Ｆｖ、１アーム中央−ｓｃＦｖ、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、またはトライデント）であり得る。特にそれらはＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０と［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０  ＡＢＤと組み合わせることができる。
【図８４Ａ−Ｃ】配列番号３７０５〜３７３６として列挙されている追加の抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤと共に、いくつかのＢＴＬＡ  ＡＢＤを示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカーであるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図８に示されている無荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えることができる）、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。上記のように、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端に向かうｓｃＦｖの配向を示し、この図に列挙されている配列においてそれらは全てｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ（Ｎ末端からＣ末端に向かう）であるが、これらの配列はまた、反対の配向（Ｎ末端からＣ末端に向かって）、ｖｌ−リンカー−ｖｈでも使用され得る。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたｖｈおよびｖｌドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中の全ての配列に関して、これらのｖｈおよびｖｌ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれでも使用することができる。
【図８５】可能な全ての可能な組み合わせによる、ｃｏｓｔｉｍとチェックポイントのＡＢＤの可能な組み合わせの行列である。ボックス内の「Ａ」はＰＤ−１  ＡＢＤが１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９であることを意味する。ボックス内の「Ｂ」は、ＩＣＯＳ  ＡＢＤが［ＩＣＯＳ］Ｈ．０６６＿Ｌ０であることを意味する。ボックス内の「Ｃ」は、ＰＤ−１が対のｓｃＦｖであることを意味する。ボックス内の「Ｄ」は、ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤがＦａｂであり、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２であることを意味する。ボックス内の「Ｅ」はＣＴＬＡ−４  ＡＢＤがｓｃＦｖであり、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．２２であることを意味する。ボックス内の「Ｆ」は、ＬＡＧ−３  ＡＢＤが７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４であることを意味する。ボックス内の「Ｇ」は、ＢＴＬＡ  ＡＢＤが９Ｃ６＿Ｈ１．１＿Ｌ１であることを意味する。ボックス内の「Ｈ」は、組み合わせがボトルオープナーであることを意味する。ボックス内の「Ｉ」は、組み合わせが中央−ｓｃＦｖフォーマットであることを意味する。
【図８６】２つのさらなるＩＣＯＳ×ＰＤ−１ボトルオープナーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
Ｉ．命名法
本発明の二重特異性抗体はいくつかの異なるフォーマットで列挙されている。当該技術分野で理解されるように、各ポリペプチドには固有の「ＸＥＮＰ」番号が与えられるが、より長い配列はより短いものを含み得る。例えば、所与の配列についてのボトルオープナーフォーマットのｓｃＦｖ側単量体の重鎖は第１のＸＥＮＰ番号を有するが、ｓｃＦｖドメインは異なるＸＥＮＰ番号を有し得る。いくつかの分子は３つのポリペプチドを有し、そのため、構成要素を伴うＸＥＮＰ番号は、名前として使われる。したがって、ボトルオープナーフォーマットの分子ＸＥＮＰは、一般に「ＸＥＮＰ２３１０４−ＨＣ−Ｆａｂ」、「ＸＥＮＰ２３１０４ＨＣ−ｓｃＦｖ」および「ＸＥＮＰ２３１０４ＬＣ」と呼ばれる３つの配列または同等物を含むが、当業者であれば、配列アラインメントを通してこれらを容易に同定することができる。これらのＸＥＮＰ番号は、識別子と同様に配列表にあり、そして図において使用される。さらに、３つの構成要素を含む１つの分子は複数の配列識別子を生じさせる。例えば、Ｆａｂ単量体のリストは全長配列、可変重鎖配列、および可変重鎖配列の３つのＣＤＲを有し、軽鎖は全長配列、可変軽鎖配列、および可変軽鎖配列の３つのＣＤＲを有し、ｓｃＦｖ−Ｆｃドメインは、全長配列、ｓｃＦｖ配列、可変軽鎖配列、３つの軽鎖ＣＤＲ、ｓｃＦｖリンカー、可変重鎖配列、および３つの重鎖ＣＤＲを有し、ｓｃＦｖドメインを有する本明細書中の全ての分子は単一の荷電ｓｃＦｖリンカー（＋Ｈ）を使用するが、他のものも使用できることに留意されたい。さらに、特定の可変ドメインの命名法は、「Ｈｘ．ｘｘ＿Ｌｙ．ｙｙ」タイプのフォーマットを使用し、数字は特定の可変鎖配列に対する固有の識別子である。したがって、（ＰＤ−１に連結する）ＸＥＮＰ２３１０４のｓｃＦｖ側の可変ドメインは「１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９」であり、これは可変重鎖ドメインＨ１．２７９が軽鎖ドメインＬ１．１９４と組み合されたことを示す。これらの配列がｓｃＦｖとして使用される場合、「１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９」という表示は、可変重鎖ドメインＨ１．２７９が軽鎖ドメインＬ１．１９４と組み合わされており、Ｎ末端からＣ末端に向けてｖｌ−リンカー−ｖｈ配向であることを示す。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの同一の配列を有するが逆の順序であるこの分子は、「１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４」と命名されるであろう。同様に、異なるコンストラクトは、配列表および図から明らかになるように、重鎖および軽鎖を「混合および適合させる」ことができる。
【００２０】
ＩＩ．材料の取り込み
Ａ．図および図説
参照により具体的に組み込まれるものは、ＵＳＳＮ６２／４７９，７２３からの図、図説および配列、ならびにＵＳＳＮ１５／６２３，３１４からの図、図説および配列である。さらに、ＵＳＳＮ６２／４７９，７２３からの特許請求の範囲がさらに具体的に組み込まれる。
【００２１】
Ｂ．配列
標的抗原：ヒトＰＤ−１の配列（ｓｐ｜Ｑ１５１１６）は、配列番号２６２２６である。ヒトＰＤ−１の細胞外ドメインの配列（ｓｐ｜Ｑ１５１１６｜２１−１７０）は、配列番号２６２２７である。Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＰＤ−１の配列（ｔｒ｜Ｂ０ＬＡＪ３）は、配列番号２６２２８である。Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＰＤ−１の細胞外ドメインの配列（予測）（ｔｒ｜Ｂ０ＬＡＪ３｜２１−１７０）は、配列番号２６２２９である。ヒトＣＴＬＡ−４の配列（ｓｐ｜Ｐ１６４１０）は、配列番号２６２３０である。ヒトＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインの配列（ｓｐ｜Ｐ１６４１０｜３６−１６１）は、配列番号２６２３１である。Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＣＴＬＡ−４の配列（ｔｒ｜Ｇ７ＰＬ８８）は、配列番号２６２３２である。Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインの配列（予測）（ｔｒ｜Ｇ７ＰＬ８８）は、配列番号２６２３３である。ヒトＬＡＧ−３の配列（ｓｐ｜Ｐ１８６２７）は、配列番号２６２３４である。ヒトＬＡＧ−３の細胞外ドメインの配列（ｓｐ｜Ｐ１８６２７｜２９−４５０）は、配列番号２６２３５である。Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＬＡＧ−３の配列（予測）（ｇｉ｜５４４４６７８１５｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿００５５７００１１．１）は、配列番号２６２３６である。Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＬＡＧ−３の細胞外ドメインの配列（予測）（ｇｉ｜５４４４６７８１５｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿００５５７００１１．１｜２９−４５０）は、配列番号２６２３７である。ヒトＴＩＭ−３の配列（ｓｐ｜Ｑ８ＴＤＱ０）は、配列番号２６２３８である。ヒトＴＩＭ−３の細胞外ドメインの配列（ｓｐ｜Ｑ８ＴＤＱ０｜２２−２０２）は、配列番号２６２３９である。Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＴＩＭ−３の配列（予測）（ｇｉ｜３５５７５０３６５｜ｇｂ｜ＥＨＨ５４７０３．１）は、配列番号２６２４０である。Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＴＩＭ−３の細胞外ドメインの配列（予測）（ｇｉ｜３５５７５０３６５｜ｇｂ｜ＥＨＨ５４７０３．１｜２２−２０３）は、配列番号２６２４１である。ヒトＰＤ−Ｌ１の配列（ｓｐ｜Ｑ９ＮＺＱ７）は、配列番号２６２４２である。ヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインの配列（ｓｐ｜Ｑ９ＮＺＱ７｜１９−２３８）は、配列番号２６２４３である。Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＰＤ−Ｌ１の配列（予測）（ｇｂ｜ＸＰ＿００５５８１８３６．１）は、配列番号２６２４４である。Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインの配列（予測）（ｇｂ｜ＸＰ＿００５５８１８３６．１｜１９−２３８）は、配列番号２６２４５である。ヒトＩＣＯＳの配列（ｓｐ｜Ｑ９Ｙ６Ｗ８）は、配列番号２６２４６である。ヒトＩＣＯＳの細胞外ドメインの配列（ｓｐ｜Ｑ９Ｙ６Ｗ８｜２１−１４０）は、配列番号２６２４７である。ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＩＣＯＳの配列（ｇｉ｜５４４４７７０５３｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿００５５７４０７５．１）は、配列番号２６２４８である。Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＩＣＯＳの細胞外ドメインの配列（予測）（ｇｉ｜５４４４７７０５３｜ｒｅｆ｜ＸＰ＿００５５７４０７５．１｜２１−１４０）は、配列番号２６２４９である。ヒトＧＩＴＲの配列（ｓｐ｜Ｑ９Ｙ５Ｕ５）は、配列番号２６２５０である。ヒトＧＩＴＲの細胞外ドメインの配列（ｓｐ｜Ｑ９Ｙ５Ｕ５｜２６−１６２）は、配列番号２６２５１である。Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＧＩＴＲの配列（予測）（ｒｅｆ｜ＸＰ＿００５５４５１８０．１）は、配列番号２６２５２である。Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＧＩＴＲの細胞外ドメインの配列（予測）（ｒｅｆ｜ＸＰ＿００５５４５１８０．１｜２６−１６２）は、配列番号２６２５３である。ヒトＯＸ４０の配列（ｓｐ｜Ｐ４３４８９）は、配列番号２６２５４である。ヒトＯＸ４０の細胞外ドメインの配列（ｓｐ｜Ｐ４３４８９｜２９−２１４）は、配列番号２６２５５である。Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＯＸ４０の配列（予測）（ｒｅｆ｜ＸＰ＿００５５４５１７９．１）は、配列番号２６２５６である。Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓのＯＸ４０の細胞外ドメインの配列（予測）（ｒｅｆ｜ＸＰ＿００５５４５１７９．１｜２９−２１４）は、配列番号２６２５７である。ヒト４−１ＢＢの配列（ｓｐ｜Ｑ０７０１１）は、配列番号２６２５８である。ヒト４−１ＢＢの細胞外ドメイン（ｓｐ｜Ｑ０７０１１｜２４−１８６）の配列は、配列番号２６２５９である。Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓの４−１ＢＢの配列（予測）（ｒｅｆ｜ＸＰ＿００５５４４９４５．１）は、配列番号２６２６０である。Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓの４−１ＢＢの細胞外ドメインの配列（予測）（ｒｅｆ｜ＸＰ＿００５５４４９４５．１｜２４−１８６）は、配列番号２６２６１である。
【００２２】
ＩＣＯＳ連結ドメイン：さらに図１９、図２０、および図２４に示される配列である配列番号２７８６９〜２８０８６は、命名法で示されるように、いくつかのＩＣＯＳ  Ｆａｂ配列（重鎖ＶＨ１−ＣＨ１および軽鎖ＶＬ１−ＣＬ）を含む。ＣＤＲおよび可変接合間の接合についての言及は、ＵＳＳＮ６２／４７９，７２３の図４０に示されている（参照により本明細書に組み入れられ、図説も同様である）が、当業者は配列表からもＣＤＲ（ナンバリングおよび／または配列アラインメントを通じて表１を参照）、および接合部（例えば、重鎖ＣＨ１は一般に「ＡＳＴＫ…」の配列で開始し、軽鎖定常ドメインは「ＲＴＶＡ…」で開始すること、を確認することができるであろう。命名法に示されるように、配列番号２８０８７〜２８２６９は、「１アームのｍＡｂ」（図２Ｎ；Ｆａｂ−Ｆｃ、Ｆｃのみ、および軽鎖）の３つの配列を示す。ＣＤＲおよび可変接合間の接合についての言及は、ＵＳＳＮ６２／４７９，７２３の図４１に示されている（参照により本明細書に組み入れられ、図説も同様である）が、当業者は配列表からもＣＤＲ（ナンバリングおよび／または配列アラインメントを通じて表１を参照）、および接合部（例えば、重鎖ＣＨ１は一般に「ＡＳＴＫ…」の配列で開始し、軽鎖定常ドメインは「ＲＴＶＡ…」で開始すること、を確認することができるであろう。追加の１アームのＩＣＯＳ分子は、図６８に示される。配列番号２８５４９〜２８５５６は、同様にＦｖをＩＣＯＳ  ＡＢＤとしても使用することができるいくつかの対照抗体（ＨＣおよびＬＣ）を示し、ＣＤＲおよび可変接合間の接合についての言及は、ＵＳＳＮ６２／４７９，７２３の図４４に示されている（参照により本明細書に組み入れられ、図説も同様である）が、当業者は配列表からもＣＤＲ（ナンバリングおよび／または配列アラインメントを通じて表１を参照）、および接合部（例えば、重鎖ＣＨ１は一般に「ＡＳＴＫ…」の配列で開始し、軽鎖定常ドメインは「ＲＴＶＡ…」で開始すること、を確認することができるであろう。配列番号２８５５７〜２８６６５は、本発明における組み合わせとして使用されるいくつかのＩＣＯＳ  ｓｃＦｖを示し、ＣＤＲおよび可変接合間の接合についての言及は、ＵＳＳＮ６２／４７９，７２３の図４５に示されている（参照により本明細書に組み入れられ、図説も同様である）が、当業者は配列表からもＣＤＲ（ナンバリングおよび／または配列アラインメントを通じて表１を参照）を確認することができ、ｓｃＦｖがｖｈとｖｌの間に荷電されたリンカー（ＧＫＰＧＳ）４を使用するので、接合部を確認することができるであろう。このように、チェックポイントの受容体に対するＡＢＤと組み合わせて使用するのに適したＩＣＯＳ  ＡＢＤは、図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５、ならびに［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０および［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０＿Ｌ０に示される。
【００２３】
さらに、適切なＩＣＯＳ×ＰＤ−１ボトルオープナー配列は、図３中のもの、およびＵＳＳＮ６２／４７９，７２３の図４２および４３（この両方は参照により本明細書に組み込まれ、同様にそれらの図説と配列も組み込まれる）に示される配列に対応する配列番号２８２７０〜２８５４８中のものを含み、同様にＣＤＲ、接合部などを示すために３つの図を用いる。
【００２４】
ＩＩＩ．概要
ＰＤ−１のような免疫の免疫調節阻害剤に対する治療用抗体は、癌治療のための診療所における限られた状況で非常に有望である。癌は、患者が癌性細胞を認識し排除する能力がないものと考えることができる。多くの場合、これらの形質転換した（例えば、癌性）細胞は、免疫監視に反作用する。体内でのＴ細胞活性化を制限して無制限なＴ細胞活性を予防する天然の制御機序が存在し、これを、癌性細胞が免疫応答を回避または抑制するために利用し得る。免疫エフェクター細胞、特にＴ細胞が癌を認識し排除する能力を回復させることが、免疫療法の目的である。「免疫療法」と称されることがある免疫腫瘍学の分野は、急速に進化しており、Ｙｅｒｖｏｙ、Ｋｅｙｔｒｕｄａ、およびＯｐｄｉｖｏ等のＴ細胞チェックポイント阻害抗体が、いくつかの最近承認されたものである。これらの抗体は、それらがＴ細胞性免疫の通常は負の調節因子を遮断するため、一般に「チェックポイント阻害剤」と称される。共刺激性と共抑制性の両方の種々の免疫調節シグナルを使用して、最適な抗原特異的免疫応答を統合することができると一般に理解されている。
【００２５】
チェックポイント阻害剤モノクローナル抗体は、通常の状況下では細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化を予防または抑制する、ＰＤ−１のような免疫調節阻害剤タンパク質に連結する。免疫調節タンパク質を、例えば、これらのタンパク質に連結する抗体の使用を介して、阻害することにより、腫瘍に対する増加したＴ細胞応答を達成することができる。つまり、これらのがん免疫調節タンパク質は免疫応答を抑制し、このタンパク質が、例えば免疫調節タンパク質に対する抗体を使用して遮断されるとき、免疫系が活性化され、免疫刺激を誘導し、その結果、癌および感染性疾患等の状態の治療をもたらす。ＰＤ−１タンパク質またはその連結パートナー、ＰＤ−Ｌ１のいずれかに対する抗体はＴ細胞活性化を誘導する。
【００２６】
患者の免疫系を利用して疾患と闘うことに対する現在の別の関心分野は、ＩＣＯＳ（誘導性Ｔ細胞共刺激剤、ＣＤ２７８とも呼ばれる）のような共刺激タンパク質に連結するアゴニスト抗体を用いたＴ細胞の共刺激を含み、これはＴ細胞上の免疫チェックポイントタンパク質の負のシグナル伝達を克服するために正のシグナルを加える。ＩＣＯＳは、細胞外（Ｉｇ）Ｖ様ドメインを含むＩ型膜貫通タンパク質であり、そしてＢ７ｈ共刺激分子の受容体として機能する。
【００２７】
最近の研究は、いくつかの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）がＰＤ−１とＩＣＯＳを共発現することを示している（Ｇｒｏｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔ．１２４（５）：２２４６（２０１４）を参照）。
【００２８】
２つの異なる標的に同時に連結することができる二重特異性抗体は、ＴＩＬ対末梢Ｔ細胞の標的化の選択性を向上させる可能性をもたらしながら、同時に治療費用をもまた削減する。細胞表面上の２つの標的と抗体との二価の相互作用は、場合によっては、一度に１つの標的との一価の相互作用と比較してより高い連結親和性をもたらすはずである。このため、通常の二価抗体は細胞表面上のそれらの標的に対して高い連結親和性を有する傾向がある。二重特異性抗体では、両方の標的への同時連結によってもたらされるより高い親和性を利用して、２つの異なる標的を同時に発現する細胞に対してより高い選択性を生み出す可能性が存在する。
【００２９】
したがって、本発明は、２つの抗原を発現する細胞に連結する二重特異性免疫調節抗体、ならびにＴ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化して癌および感染症などの疾患、および免疫活性の増加が治療をもたらす他の状態を治療する方法を提供する。
【００３０】
したがって、本発明は、ある場合には、単一細胞上の２つの異なる免疫調節分子（一方はチェックポイント受容体および他方は共刺激受容体）に連結する二重特異性抗体を提供すること、ならびに有利にも単一の治療物質のみの投与を必要とすることによって毒性および複数抗体投与の費用の問題を解決することに関する。
【００３１】
二重特異性抗体は、１分子内で、免疫免疫調節遮断を共刺激と組み合わせる機会を提供する。しかしながら、免疫の免疫調節と共刺激タンパク質のどの組み合わせ、またはどの連結化学量論（一価＋一価、一価＋二価など）が有効であるかは明らかではない。ここで本願発明者らは共刺激タンパク質（ＩＣＯＳなど）に一価連結し、かつチェックポイント受容体（ＰＤ−１など）に一価連結し、堅牢なＴ細胞活性化を誘導することができる二重特異性抗体を同定する。
【００３２】
驚くべきことに、従来の知識では一価抗体はアゴニズムを生じないと述べているが、本研究は、本発明の一価二重特異性抗体によるＩＣＯＳ受容体アゴニズムの予想外の結果を示す。Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｊｕｌｙ  ２３  ２０１３  Ｅ２９８７−Ｅ２９９６「［ｗ］ｈｉｌｅ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ＭＥＴ，ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｈｅｍ  ｉｎｔｏ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｉｎｓｔｅａｄ．」を参照されたい。ＩＣＯＳへの一価の連結のみによるこの肯定的な結果は、シグナル伝達を誘発するために細胞表面上に必要なレベルの受容体クラスタリングを提供する少なくとも共刺激タンパク質への二価の連結が必要であると考えられるために予想外である。Ｆｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８：１９６９−１９７７によって示されるように、ＩＣＯＳ連結はＡＫＴリン酸化を誘導する。ここでの研究は、ＩＣＯＳアゴニズムの指標としてＡＫＴリン酸化を使用し、そしてこの効果は、「１アームＩＣＯＳ」（実施例５Ａ（ａ）参照）とＩＣＯＳに一価連結する二重特異性抗体の両方について見られる。実施例７および図７０に示されるように、ＩＣＯＳに一価でのみ連結する１アームＸＥＮＰ２０２６６は、ＩＣＯＳに二価で連結するＸＥＮＰ１６４３５（例えば、従来のｍＡｂ）よりも多くのＡＫＴリン酸化を促進する。
【００３３】
したがって、本発明は、チェックポイント受容体およびヒトＩＣＯＳへの連結を可能にするヘテロ二量体二重特異性抗体を提供するための新規コンストラクトに関する。
【００３４】
一般に、これらの二重特異性抗体は「抗ＰＤ−１×抗ＩＣＯＳ」と呼ばれるか、または一般に単純にまたは簡単のために（したがって交換可能に）各対について「ＰＤ−１×ＩＣＯＳ」などと命名される。
【００３５】
本発明のヘテロ二量体二重特異性免疫調節抗体は、様々な種類の癌を治療するのに有用である。当業者には理解されるように、腫瘍抗原に連結する従来のモノクローナル抗体、または例えばＣＤ３および腫瘍抗原に連結するより新しいクラスの二重特異性抗体（例えばＵＳＳＮ１５／１４１，３５０に記載されるような）とは対照的に、免疫調節抗体が、免疫応答を高めるために使用されるが、それらは一般的にその作用において腫瘍特異的ではない。すなわち、本発明の二重特異性免疫調節抗体は免疫系の抑制を阻害し、一般にＴ細胞活性化を導き、それは次に癌性細胞に対するより大きな免疫応答、したがって治療を導く。
【００３６】
以下に論じるように、Ｔ細胞活性化を測定することができる様々な方法がある。ＮＫ細胞およびＴ細胞に対する二重特異性免疫調節抗体の機能的効果は、以下のパラメーター：増殖、サイトカイン放出および細胞表面マーカーの変化を測定することによってインビトロ（および場合によってはインビボ）で評価することができる。ＮＫ細胞に関して、細胞増殖、細胞傷害性（ＣＤ１０７ａ、グランザイム、およびパーフォリン発現の増加によって測定されるように、または標的細胞の死滅を直接測定することによって測定される標的細胞を死滅させる能力）、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ）、ならびに細胞表面受容体の発現（例えばＣＤ２５）における増加は、免疫調節、例えば、癌細胞の死滅の増強の指標となる。Ｔ細胞に関して、増殖の増加、活性化の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、およびＰＤ１）、細胞傷害性（標的細胞を殺傷する能力）、ならびにサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ）における増加は、免疫調節、例えば、癌細胞の死滅の増強の指標となる。したがって、治療の評価は、以下のうちの１つ以上を評価するアッセイを使用して実施することができる：（ｉ）免疫応答を増加させること、（ｉｉ）αβおよび／またはγδのＴ細胞の活性化を増加させること、（ｉｉｉ）細胞傷害性Ｔ細胞活性を増加させること、（ｉｖ）ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞活性を増加させること、（ｖ）αβおよび／またはγδのＴ細胞抑制を軽減させること、（ｖｉ）炎症促進性サイトカイン分泌を増加させること、（ｖｉｉ）ＩＬ−２分泌を増加させること、（ｖｉｉｉ）インターフェロン−γ産生を増加させること、（ｉｘ）Ｔｈ１応答を増加させること、（ｘ）Ｔｈ２応答を減少させること、（ｘｉ）制御性Ｔ細胞の少なくとも１つの細胞数および／または活性を減少させるかまたは排除すること、（ｘｉｉ）ＩＬ−２分泌を増加させること。
【００３７】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、それを必要とする対象において以下のうちの１つ以上を実施するための二重特異性免疫調節抗体の使用を提供する：（ａ）炎症促進性サイトカインを上方制御すること、（ｂ）Ｔ細胞の増殖および／または増加を増加させること、（ｃ）Ｔ細胞によるインターフェロン−γまたはＴＮＦ−α産生を増加させること、（ｄ）ＩＬ−２分泌を増加させること、（ｅ）抗体応答を刺激すること、（ｆ）癌細胞増殖を阻害すること、（ｇ）抗原特異的Ｔ細胞免疫を促進すること、（ｈ）ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を促進すること、（ｉ）Ｔ細胞抑制を軽減すること、（ｊ）ＮＫ細胞活性を促進すること、（ｋ）癌細胞のアポトーシスまたは溶解を促進すること、および／または（ｌ）癌細胞に対する細胞傷害性または細胞増殖抑制性の効果。
【００３８】
したがって、本発明は二重特異性免疫調節抗体を提供する。概して図２に示すような、本発明において用いることができるいくつかのフォーマットが存在し、その多くが（全てではないが例えばＤＶＤ−Ｉｇのような）ヘテロ二量体である。
【００３９】
ヘテロ二量体抗体コンストラクトは、例えば、「二量体」に集合する２つの「単量体」のような、抗体の重鎖の２つのＦｃドメインの自己集合性に基づく。ヘテロ二量体抗体は、以下により十分に議論されるように各単量体のアミノ酸配列を改変することによって作製される。したがって、本発明は一般に、ヘテロ二量体形成を促進するためにおよび／または、ホモ二量体からのヘテロ二量体の容易な精製を可能にするために各鎖上で異なる定常領域中のアミノ酸変異に依存する、いくつかの方法で２つの抗原に共連結することができるヘテロ二量体抗体の作製に関する。
【００４０】
したがって、本発明は二重特異性免疫調節抗体を提供する。抗体技術において進行中の問題は、２つ（またはそれ以上）の異なる抗原に同時に連結する「二重特異性」抗体に対する要求であり、それにより一般に異なる抗原を接近させそして新しい機能性および新しい治療法をもたらす。一般に、これらの抗体は、各重鎖および軽鎖に対する遺伝子を宿主細胞に含めることによって作製される（一般に、本発明においては、本明細書に概説するように２つの重鎖単量体および軽鎖に対する遺伝子）。これは一般に、所望のヘテロ二量体（Ａ−Ｂ）、ならびに２つのホモ二量体（Ａ−ＡおよびＢ−Ｂ）の形成をもたらす。しかしながら、二重特異性抗体の形成における主な障害は、ホモ二量体抗体からヘテロ二量体抗体を精製すること、および／またはホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成に偏らせることが困難であることである。
【００４１】
この問題を解決するために、本発明のヘテロ二量体を生成するために使用することができるいくつかの機構がある。さらに、当業者には理解されるように、これらの機構を組み合わせて高いヘテロ二量体化を確実にすることができる。したがって、ヘテロ二量体抗体の産生をもたらすアミノ酸変異は、「ヘテロ二量体化変異」と呼ばれる。後述するように、ヘテロ二量体化変異は、ヘテロ二量体からのホモ二量体の精製を可能にする立体変異（例えば、後述の「ノブアンドホール」または「スキュー」変異および「電荷対」変異）ならびに「ｐＩ変異」を含み得る。
【００４２】
１つの機構は、当該技術分野において一般的に「ノブアンドホール」（「ＫＩＨ」）またはしばしば本明細書において「スキュー」変異と呼ばれ、ヘテロ二量体形成を有利にし、ホモ二量体形成を不利にする立体効果をもたらすアミノ酸工学を指し、任意で使用することもでき、これはしばしば、「ノブアンドホール」と呼ばれ、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（７）：６１７（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７２７０：２６、米国特許第８，２１６，８０５号、ＵＳ２０１２／０１４９８７６に記載されるようなものであり、これらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの図は、「ノブアンドホール」のアミノ酸置換を含むいくつかの「単量体Ａ−単量体Ｂ」対を特定する。さらに、Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）に記載されているように、これらの「ノブアンドホール」変異は、ヘテロ二量体化に対するスキュー形成のためのジスルフィド連結と組み合わせることができる。Ｔ３６６Ｗと対をなすＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ、ならびに架橋ジスルフィドを有するこの変異である、Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃと対をなすＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃは、以下に概説するように、特にｐＩ変異を含む他のヘテロ二量体化変異と組み合わせて、本発明において有用である。
【００４３】
ヘテロ二量体抗体の生成に使用されるさらなる機構は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれるＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）に記載されているように、しばしば「静電ステアリング」または「電荷対」と呼ばれる。これは、本明細書において、しばしば「電荷対」と呼ばれる。この実施形態では、静電学を使用して、ヘテロ二量体化に向けて形成をスキューさせる。当業者には理解されるように、これらはまた、ｐＩ、したがって精製に影響を及ぼす可能性があり、したがって場合によってはｐＩ変異と見なすこともできる。しかしながら、これらはヘテロ二量体化を強制するために生成され、精製手段として使用されなかったので、それらは「立体変異」として分類される。これらには、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは「単量体の対応セット」である）、およびＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅ、ならびに図に示される他のものが含まれるがこれらに限定されない。
【００４４】
本発明において、いくつかの実施形態では、ｐＩ変異を使用して、単量体の一方または両方のｐＩを改変し、したがってＡ−Ａ、Ａ−ＢおよびＢ−Ｂ二量体タンパク質の等電点精製を可能にする。
【００４５】
本発明において、ヘテロ二量体タンパク質の精製を容易にすることができるいくつかの基本的な機構が存在し、一つはｐＩ変異の使用に依存し、各単量体が異なるｐＩを有するようになり、ＡＡ、ＡＢおよびＢＢ二量体タンパク質の等電点精製が可能になる。代替的に、「トリプルＦ」または「ボトルオープナー」フォーマットなどのいくつかの足場フォーマットもまた、サイズに基づく分離を可能にする。以下にさらに概説するように、ホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成を「スキューする」ことも可能である。したがって、立体的ヘテロ二量体化変異とｐＩまたは電荷対変異の組み合わせは、本発明において特に使用される。さらに、以下により完全に概説されるように、トリプルＦフォーマットなどのｓｃＦｖを利用する足場は、精製目的のためのさらなるｐＩブーストを与える荷電ｓｃＦｖリンカー（陽性または陰性のいずれか）を含み得る。当業者には理解されるように、本発明は、同様に荷電ｓｃＦｖリンカー（ならびに本明細書で論じられるＦｃ、ＦｃＲｎ、およびＫＯ変異の組み合わせ）を有するスキュー変異の使用も提供するが、いくつかのトリプルＦフォーマットは、単に荷電ｓｃＦｖリンカーを用い、さらなるｐＩ調整を用いない場合にも有用である。
【００４６】
ヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にするための分離機構としてｐＩを利用する本発明においては、アミノ酸変異を一方または両方の単量体のポリペプチドに導入することができ、すなわち、単量体の一方（本明細書では簡単のために「単量体Ａ」と呼ぶ）のｐＩを単量体Ｂと異なるように改変でき、または、単量体ＡとＢの両方の変化を、単量体ＡのｐＩを増加させ、単量体ＢのｐＩを減少させるように改変できる。下記により完全に概説されるように、いずれかまたは両方の単量体のｐＩ変化は、荷電残基を除去または付加することによって（例えば中性アミノ酸を正または負に荷電したアミノ酸残基で置換する、例えばグリシンからグルタミン酸）、正または負から反対の電荷への荷電残基の変更によって（アスパラギン酸からリジンへ）、または荷電残基の中性残基への変更によって（例えば電荷の消失、リジンからセリン）、実施することができる。いくつかのこれらの変異を図に示す。さらに、本明細書におけるヘテロ二量体抗体の作製に使用するのに適したｐＩ変異は、アイソタイプであるもの、例えば顕著な免疫原性を導入することなくｐＩが変化するように異なるＩｇＧアイソタイプからのｐＩ変異を移入するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／２８８２７５号の図２９を参照されたい。
【００４７】
したがって、本発明のこの実施形態では、ヘテロ二量体をホモ二量体から分離することができるように、少なくとも１つの単量体に十分なｐＩの変化を生じさせることを提供する。当業者には理解されるように、そして以下にさらに論じるように、これは、「野生型」重鎖定常領域およびそのｐＩ（ｗｔＡ−＋ＢまたはｗｔＡ−−Ｂ）を増加または減少させるように操作された変異領域を使用することによって、または一方の領域を増加して他方の領域を減少させることによって（Ａ＋−Ｂ−またはＡ−Ｂ＋）、実施できる。
【００４８】
したがって、一般に、本発明のいくつかの実施形態の構成要素は、二量体タンパク質の単量体の両方ではないにしても少なくとも１つの等電点（ｐＩ）を、アミノ酸置換（「ｐＩ変異」または「ｐＩ置換」）を単量体の一方または両方に組み込むことによって変化させて「ｐＩヘテロ二量体」（タンパク質が抗体であるとき、これらは「ｐＩ抗体」と呼ばれる）を形成することを目的とする抗体の定常領域におけるアミノ酸変異である。本明細書中に示されるように、２つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、２つの単量体のｐＩが０．１ｐＨ単位とわずかに異なる場合に達成でき、０．２、０．３、０．４、および０．５以上異なるものが全て本発明において使用される。
【００４９】
当業者には理解されるように、良好な分離を得るために各単量体または両方の単量体に含まれるべきｐＩ変異の数は、目的のｓｃＦｖおよびＦａｂの出発ｐＩに部分的に依存するであろう。すなわち、どの単量体を操作するか、またはどの「方向」（例えば、より陽性またはより陰性）かを決定するために、２つの標的抗原のＦｖ配列が計算され、そしてそこから決定がなされる。当該技術分野において知られているように、異なるＦｖは、本発明において利用される異なる出発ｐＩを有するであろう。概して、本明細書に概説されるように、ｐＩは、少なくとも約０．１ｌｏｇの各単量体の総ｐＩの差異を生じるように操作され、本明細書に概説されるように０．２〜０．５が好ましい。さらに、当業者には理解され、本明細書に概説されるように、場合によっては（フォーマットに応じて）、ヘテロ二量体はサイズ（例えば分子量）に基づいてホモ二量体から分離することができる。例えば、図２のいくつかの実施形態に示されるように、いくつかのフォーマットは、異なるサイズのホモ二量体およびヘテロ二量体をもたらす（例えば、ボトルオープナーに関して、一つのホモ二量体は、「デュアルｓｃＦｖ」フォーマットであり、１つのホモ二量体は、標準的な抗体であり、そしてヘテロ二量体は、一つのＦａｂと一つのｓｃＦｖを有する）。
【００５０】
重鎖の定常領域を使用することによって、ホモ二量体を上回って精製されたヘテロ二量体を達成するためにｐＩ変異が使用される場合、抗体を含む多重特異性タンパク質を設計および精製するためのよりモジュール方式のアプローチが提供される。したがって、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化変異（スキューおよび精製ヘテロ二量体化変異を含む）は可変領域に含まれず、そのため各個々の抗体を操作しなければならない。さらに、いくつかの実施形態において、ｐＩ変異から生じる免疫原性の可能性は、顕著な免疫原性を導入することなくｐＩが変化するように、異なるＩｇＧアイソタイプからのｐＩ変異を移入することによって顕著に低下する。したがって、解決されるべきさらなる問題は、高いヒト配列含有量を有する低ｐＩの定常ドメインの解明、例えば、任意の特定の位置における非ヒト残基の最小化または回避である。
【００５１】
このｐＩ工学で起こり得る副次的な利益はまた、血清半減期の延長およびＦｃＲｎ連結の増加である。すなわち、ＵＳＳＮ１３／１９４，９０４（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、抗体定常ドメイン（抗体およびＦｃ融合体に見られるものを含む）のｐＩを低下させるとインビボでより長い血清保持をもたらし得る。血清半減期を延長するためのこれらのｐＩ変異はまた、精製のためのｐＩ変化を促進する。
【００５２】
さらに、ヘテロ二量体化変異のｐＩ変異は、ホモ二量体が存在するときを排除、最小化、および区別する能力が顕著であるので、二重特異性抗体の分析および品質管理プロセスにさらなる利益を与える。同様に、ヘテロ二量体タンパク質産生の再現性を確実に試験する能力は重要である。
【００５３】
本発明の第１および第２の抗原は、本明細書においてそれぞれ抗原−１および抗原−２と呼ばれ、一方は共刺激受容体であり、他方はチェックポイント受容体である。本発明において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、「トリプルｆ」または「ボトルオープナー」の足場フォーマットである。この実施形態では、抗体の一方の重鎖は単鎖ｆｖ（以下に定義されるように「ｓｃｆｖ」）を含み、他方の重鎖は可変重鎖および軽鎖を含む「通常の」ｆａｂフォーマットである。この構造は、しばしばボトルオープナーへのおおまかな類似性（図２参照）のために、「トリプルｆ」フォーマット（ｓｃｆｖ−ｆａｂ−ｆｃ）または「ボトルオープナー」フォーマットと呼ばれる。２つの鎖は、以下により十分に記載されるように、ヘテロ二量体抗体の形成を促進する定常領域（例えば、Ｆｃドメインおよび／またはヒンジ領域）におけるアミノ酸変異の使用によって一緒にされる。
【００５４】
現在の「トリプルＦ」フォーマットにはいくつかの明確な利点が存在する。当該技術分野で知られているように、２つのｓｃＦｖコンストラクトに依存する抗体類似体はしばしば安定性および凝集の問題を有し、それは本発明において「通常の」重鎖および軽鎖の対形成の付加により軽減できる。さらに、２つの重鎖と２つの軽鎖に依存するフォーマットとは対照的に、重鎖と軽鎖の誤った対形成（例えば、軽鎖２と対形成する重鎖１など）の問題が存在しない。
【００５５】
さらに、本明細書に概説されるように、さらなる機能性を付加するために、さらなるアミノ酸変異が本発明の二重特異性抗体に導入され得る。例えば、Ｆｃ領域内にアミノ酸変化を付加し（一方の単量体または両方に）、得られる分子の、ＡＤＣＣまたはＣＤＣの増加（例えば、Ｆｃγ受容体への連結の変化）を促進し、ならびにＦｃＲｎへの連結を増加および／または血清半減期を増加させることができる。本明細書にさらに記載されるように、そして当業者によって理解されるように、本明細書に概説される変異のうちのいずれかおよび全ては、任意にかつ独立して他の変異と組み合わせることができる。
【００５６】
同様に、機能的変異の別のカテゴリーは「Ｆｃγ除去変異」または「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯまたはＫＯ）変異である。これらの実施形態では、いくつかの治療用途のために、さらなる作用機序を回避するために、１つ以上または全てのＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）へのＦｃドメインの正常な連結を低減または除去することが望ましい。すなわち、例えば、ＦＣγＲＩＩＩａ連結を除去してＡＤＣＣ活性を排除または顕著に低下させることが一般に望ましい。適切な除去変異は、図６に示される。
【００５７】
ＩＶ．定義
本発明をより完全に理解できるようにするため、いくつかの定義を以下に示す。かかる定義は、文法的同等物を包含することを意図する。
【００５８】
本明細書において「除去」とは、活性の低下または除去を意味する。したがって、例えば、「ＦｃγＲ連結を除去する」とは、Ｆｃ領域アミノ酸変異が、その特定の変異を含まないＦｃ領域と比較して５０％未満の出発連結を有することを意味し、７０−８０−９０−９５−９８％未満の活性喪失が好ましく、一般に、活性はＢｉａｃｏｒｅアッセイにおいて検出可能な活性のレベル未満である。ＦｃγＲ連結の除去において特に有用なものを、図６に示す。
【００５９】
本明細書で使用される「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」とは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の連結抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を意味する。ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａへの連結と相関し、ＦｃγＲＩＩＩａへの連結の増加はＡＤＣＣ活性の増加をもたらす。本明細書で論じるように、本発明の多くの実施形態はＡＤＣＣ活性を完全に除去する。
【００６０】
本明細書で用いられる「ＡＤＣＰ」または抗体依存性細胞媒介食作用とは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の連結抗体を認識し、続いて標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介反応を意味する。
【００６１】
本明細書において「抗原連結ドメイン」または「ＡＢＤ」とは、ポリペプチド配列の一部として存在する場合、本明細書で考察されるような標的抗原に特異的に連結する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを意味する。したがって、「免疫調節抗原連結ドメイン」は、本明細書に概説されるように標的免疫調節抗原に連結する。当該技術分野で知られているように、これらのＣＤＲは、可変重鎖ＣＤＲ（ｖｈＣＤＲまたはＶＨＣＤＲ）の第１のセットおよび可変軽鎖ＣＤＲの第２のセット（ｖｌＣＤＲまたはＶＬＣＤＲ）として一般に存在し、各々が３つのＣＤＲ、即ち重鎖についてｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３、軽鎖についてｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２およびｖｌＣＤＲ３を含む。ＣＤＲは、可変重鎖および可変軽鎖ドメインにそれぞれ存在し、一緒になってＦｖ領域を形成する。したがって、場合によっては、抗原連結ドメインの６つのＣＤＲには、可変重鎖および可変軽鎖が寄与する。「Ｆａｂ」フォーマットにおいて、６つのＣＤＲのセットには、２つの異なるポリペプチド配列、即ち可変重鎖ドメイン（ｖｈまたはＶＨ、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２およびｖｈＣＤＲ３を含む）および可変軽鎖ドメイン（ｖｌまたはＶＬ、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２およびｖｌＣＤＲ３を含む）が寄与し、このうちｖｈドメインのＣ末端が重鎖のＣＨ１ドメインのＮ末端に連結し、ｖｌドメインのＣ末端が定常軽鎖ドメインのＮ末端に連結している（したがって、軽鎖を形成する）。ｓｃＦｖフォーマットでは、ｖｈおよびｖｌドメインは、一般に本明細書に概説されているようなリンカーの使用によって、単一のポリペプチド配列に共有連結され、それは（Ｎ末端から開始して）ｖｈ−リンカー−ｖｌまたはｖｌ−リンカー−ｖｈのいずれかであり得、前者が一般的に好まれる（使用されるフォーマットに応じて、両側の任意のドメインリンカーを含む。
【００６２】
本明細書における「修飾」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、および／もしくは欠失、またはタンパク質に化学的に連結された部分に対する改変を意味する。例えば、改変は、タンパク質に連結した改変された炭水化物またはＰＥＧ構造であってもよい。本明細書における「アミノ酸修飾」は、ポリペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入、および／または欠失を意味する。明確にするために、特に明記しない限り、アミノ酸修飾は常に、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、例えばＤＮＡおよびＲＮＡ中にコドンを有する２０個のアミノ酸に対するものである。
【００６３】
本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することを意味する。特に、いくつかの実施形態では、置換は、特定の位置で天然に存在しない（生物内で天然に存在しないか、またはいずれの生物中にも存在しない）アミノ酸に対するものである。例えば、置換Ｅ２７２Ｙは、２７２位のグルタミン酸がチロシンで置換されている変異型ポリペプチド、この場合はＦｃ変異を指す。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、出発アミノ酸を変化させない（例えば、宿主生物発現レベルを上昇させるためにＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（アルギニンをなおコードする）に交換する）ように操作されたタンパク質は、「アミノ酸置換」ではない。即ち、同じタンパク質をコードする新たな遺伝子の創出にもかかわらず、タンパク質は、それが開始する特定の位置に同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。
【００６４】
「アミノ酸挿入」または「挿入」は、本明細書で使用されるとき、親ポリペプチド配列の特定の位置にアミノ酸配列を付加することを意味する。例えば、−２３３Ｅまたは２３３Ｅは、２３３位の後、かつ２３４位の前のグルタミン酸の挿入を示す。さらに、−２３３ＡＤＥまたはＡ２３３ＡＤＥは、２３３位の後、かつ２３４位の前のＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を示す。
【００６５】
「アミノ酸欠失」または「欠失」は、本明細書で使用されるとき、親ポリペプチド配列中の特定の位置でアミノ酸配列を除去することを意味する。例えば、Ｅ２３３−またはＥ２３３＃、Ｅ２３３（）またはＥ２３３ｄｅｌは、２３３位のグルタミン酸の欠失を示す。さらに、ＥＤＡ２３３−またはＥＤＡ２３３＃は、２３３位で始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を示す。
【００６６】
本明細書で使用される「変異型タンパク質」または「タンパク質変異体」または「変異体」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親タンパク質のそれとは異なるタンパク質を意味する。タンパク質変異体は、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物、またはそれをコードするアミノ配列を指し得る。好ましくは、タンパク質変異体は、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾、例えば、親と比較して約１〜約７０個のアミノ酸修飾、好ましくは約１〜約５個のアミノ酸修飾を有する。以下に記載するように、いくつかの実施形態では、親ポリペプチド、例えばＦｃ親ポリペプチドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４由来のＦｃ領域等のヒト野生型配列であるが、変異を有するヒト配列もまた、「親ポリペプチド」としての役割を果たすことができ、例えば、ＩｇＧ１／２ハイブリッドを含めることができる。本明細書のタンパク質変異体の配列は、好ましくは、親タンパク質配列と少なくとも約８０％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性、より好ましくは少なくとも約９５−９８−９９％の同一性を有する。変異型タンパク質は、変異型タンパク質それ自体、タンパク質変異を含む組成物、またはそれをコードするＤＮＡ配列を指すことができる。
【００６７】
したがって、本明細書で使用される「抗体変異体」または「変異型抗体」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親抗体とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される「ＩｇＧ変異体」または「変異型ＩｇＧ」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親ＩｇＧ（ここでも、多くの場合はヒトＩｇＧに由来）とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される「免疫グロブリン変異体」または「変異型免疫グロブリン」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親免疫グロブリン配列のそれとは異なる免疫グロブリン配列を意味する。本明細書で使用される「Ｆｃ変異体」または「変異型Ｆｃ」は、Ｆｃドメインにアミノ酸修飾を含むタンパク質を意味する。本発明のＦｃ変異は、それらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。したがって、例えば、Ｎ４３４Ｓまたは４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して４３４位に置換セリンを有するＦｃ変異であり、ここでナンバリングはＥＵインデックスに従う。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して置換Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを有するＦｃ変異を定義する。ＷＴアミノ酸の同一性は特定されていなくてもよく、その場合、前述の変異は４２８Ｌ／４３４Ｓと呼ばれる。置換が提供される順序は任意であり、すなわち、例えば４２８Ｌ／４３４ＳはＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓと同一のＦｃ変異などである。抗体に関連する本発明において論じられる全ての位置について、特に明記しない限り、アミノ酸位置のナンバリングはＥＵインデックスに従う。ＥＵインデックス、またはＫａｂａｔもしくはＥＵナンバリングスキームと同様のＥＵインデックスは、ＥＵ抗体のナンバリングを指す（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６３：７８−８５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。修飾は、付加、欠失、または置換であり得る。置換には、天然に存在するアミノ酸および場合によっては合成アミノ酸が含まれ得る。例としては、米国特許第６，５８６，２０７号、ＷＯ９８／４８０３２、ＷＯ０３／０７３２３８、ＵＳ２００４−０２１４９８８Ａ１、ＷＯ０５／３５７２７Ａ２、ＷＯ０５／７４５２４Ａ２、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２００２），ＰＩＣＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４、およびＬ．Ｗａｎｇ，＆  Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，（２００２），Ｃｈｅｍ．１−１０が含まれ、全て参照によりその全体が組み込まれる。
【００６８】
本明細書で使用されるとき、本明細書における「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドを含む、少なくとも２つの共有連結したアミノ酸を意味する。ペプチジル基は、天然に存在するアミノ酸およびペプチド連結、または合成ペプチド模倣構造、即ち、ペプトイド（全体が参照により組み込まれるＳｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８９（２０）：９３６７（１９９２）を参照）等の「類似体」を含んでもよい。アミノ酸は、当業者には理解されようが、天然に存在するものでも合成物（例えば、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸ではないもの）でもよい。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、オルニチン、およびノレオロイシンは、本発明の目的では合成アミノ酸と考えられ、Ｄ−とＬ−（ＲまたはＳ）の立体配置のアミノ酸の両方を利用することができる。本発明の変異は、例えば、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる、Ｃｒｏｐｐ  ＆  Ｓｈｕｌｔｚ，２００４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．２０（１２）：６２５−３０、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１（２）：７５６６−７１、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，３０３（５６５６）：３７１−３、およびＣｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１（５６３５）：９６４−７によって記載される方法を含むがこれらに限定されない、Ｓｃｈｕｌｔｚおよび同僚によって開発された技術を用いる組み込まれた合成アミノ酸の使用を含む修飾を含み得る。さらに、ポリペプチドには、１つ以上の側鎖または末端の合成誘導体化、グリコシル化、ＰＥＧ化、循環配列、環化、他の分子へのリンカー、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、およびペプチドタグまたは標識の付加が含まれ得る。
【００６９】
「残基」とは、本明細書で使用されるとき、タンパク質における位置およびその関連するアミノ酸同一性を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７またはＮ２９７とも称される）は、ヒト抗体ＩｇＧ１中の２９７位の残基である。
【００７０】
本明細書で使用されるとき、「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」とは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、およびＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、単離におけるこの領域、または、全長抗体に関連するこの領域、抗体断片、またはＦａｂ融合タンパク質を指し得る。
【００７１】
「Ｆｖ」または「Ｆｖ断片」または「Ｆｖ領域」は、本明細書で使用されるとき、単一ＡＢＤのＶＬおよびＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。当業者には理解されるように、これらは一般に、２つの鎖で構成されているか、または組み合わさって（一般に、本明細書で論じられるようなリンカーによって）、ｓｃＦｖを形成することができる。場合によっては、例えば「中心−Ｆｖ」および「ＤＶＤ−Ｉｇ」フォーマットでは、ｓｃＦｖとして機能する「追加の」ｖｈおよびｖｌドメインが付加されるが、ｖｈドメインとｖｌドメインはｓｃＦｖリンカーを使用して連結されない。
【００７２】
本明細書における「単一鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、一般に本明細書で考察されるようなｓｃＦｖリンカーを使用して可変軽鎖ドメインに共有連結し、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖドメインを形成する、可変重鎖ドメインを意味する。ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端（ｖｈ−リンカー−ｖｌまたはｖｌ−リンカー−ｖｈ）のいずれの配向にもあり得る。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、「ＩｇＧサブクラス修飾」または「アイソタイプ修飾」とは、１つのＩｇＧアイソタイプの１つのアミノ酸を、異なる、整合したＩｇＧアイソタイプの対応するアミノ酸に変換するアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＥＵ位置２９６においてＩｇＧ１はチロシンを含み、ＩｇＧ２はフェニルアラニンを含むので、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙ置換は、ＩｇＧサブクラス修飾であると考えられる。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、「天然に存在しない修飾」とは、アイソタイプではないアミノ酸修飾を意味する。例えば、ＩｇＧのうちのいずれも４３４位にセリンを含まないので、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４（またはそれらのハイブリッド）における置換４３４Ｓは、天然に存在しない修飾であると見なされる。
【００７５】
本明細書で使用されるとき、「アミノ酸」および「アミノ酸同一性」は、ＤＮＡおよびＲＮＡによってコードされている２０種の天然に存在するアミノ酸のうちの１つを意味する。
【００７６】
本明細書で使用されるとき、「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用から生じる生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣが含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
本明細書で使用されるとき、「ＩｇＧ  Ｆｃリガンド」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に連結してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン連結レクチン、マンノース受容体、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌプロテインＡ、ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌプロテインＧ、およびウイルスＦｃγＲが含まれるが、これらに限定されない。Ｆｃリガンドにはまた、ＦｃγＲと相同であるＦｃ受容体のファミリーである、Ｆｃ受容体ホモログ（ＦｃＲＨ）が含まれる（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １９０：１２３−１３６、参照により全体が組み込まれる）。Ｆｃリガンドは、Ｆｃに連結する未発見の分子を含み得る。特定のＩｇＧ  Ｆｃリガンドは、ＦｃＲｎおよびＦｃガンマ受容体である。本明細書で使用されるとき、「Ｆｃリガンド」とは、抗体のＦｃ領域に連結してＦｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する任意の生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。
【００７８】
本明細書で使用されるとき、「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」、または「ＦｃガンマＲ」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に連結し、かつＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトにおいて、このファミリーには、アイソフォームであるＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームであるＦｃγＲＩＩａ（アロタイプであるＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、ならびにＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；ならびにアイソフォームであるＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプであるＶ１５８およびＦ１５８を含む）、ならびにＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプであるＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（参照により全体が組み込まれるＪｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５）、ならびに任意の発見されていないヒトＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、これらに限定されない任意の生物由来であり得る。マウスＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ−１（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、ならびに任意の発見されていないマウスＦｃγＲまたはＦｃγＲアイソフォームもしくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
本明細書で使用される「ＦｃＲｎ」または「新生児Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に連結し、少なくとも部分的にＦｃＲｎ遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。ＦｃＲｎは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルを含むが、これらに限定されない任意の生物由来であり得る。当該技術分野において公知のように、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、しばしば重鎖および軽鎖と呼ばれる２つのポリペプチドを含む。軽鎖はβ−２−ミクログロブリンであり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によってコードされている。本明細書において別段の記載がない限り、ＦｃＲｎまたはＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖とβ−２−ミクログロブリンとの複合体を指す。ＦｃＲｎ受容体への連結を増加させるために、そしていくつかの場合には血清半減期を増加させるために使用される様々なＦｃＲｎ変異が図８３の図の説明文に示されている。
【００８０】
本明細書で使用される「親ポリペプチド」とは、変異体を生成するようにその後修飾される出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドの変異体もしくは操作されたバージョンであってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指してもよい。したがって、本明細書で使用される「親免疫グロブリン」は、変異体を生成するように修飾される非修飾免疫グロブリンポリペプチドを意味し、本明細書で使用される「親抗体」は、変異型抗体を生成するように修飾される非修飾抗体を意味する。「親抗体」には、以下に概説されるように、既知の市販の組換え産生抗体が含まれることに留意すべきである。
【００８１】
本明細書で使用される「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域、および場合によってはヒンジの一部を含む、ポリペプチドを意味する。このため、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、およびこれらのドメインに対する可動性ヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡおよびＩｇＭの場合、ＦｃはＪ鎖を含んでもよい。ＩｇＧの場合、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３（Ｃγ２およびＣγ３）、ならびにＣγ１（Ｃγ１）とＣγ２（Ｃγ２）との間の下部ヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシ末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むものと定義され、ここでのナンバリングはＫａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、以下でより詳細に説明されるように、例えば、１つ以上のＦｃγＲ受容体またはＦｃＲｎ受容体への連結を変化させるために、Ｆｃ領域に対してアミノ酸修飾が行われる。
【００８２】
本明細書における「重鎖定常領域」とは、抗体のＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分を意味する。
【００８３】
本明細書における「Ｆｃ融合タンパク質」または「イムノアドヘシン」とは、一般に（任意に本明細書に記載されるようなリンカー部分を介して）異なるタンパク質、例えば本明細書に記載されるような標的タンパク質への連結部分に連結したＦｃ領域を含むタンパク質を意味する。場合によっては、ヘテロ二量体抗体の一方の単量体は抗体重鎖（ｓｃＦｖを含むかまたはさらに軽鎖を含む）を含み、他方の単量体は変異型Ｆｃドメインおよびリガンドを含むＦｃ融合体である。いくつかの実施形態では、これらの「半抗体−半融合タンパク質」は「融合体」と呼ばれる。
【００８４】
本明細書で使用される「位置」は、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順次に、または確立されているフォーマット、例えば、抗体ナンバリングのためのＥＵインデックスに従って、ナンバリングされてもよい。
【００８５】
「標的抗原」は、本明細書で使用されるとき、所与の抗体の可変領域が特異的に連結する分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の化合物であってもよい。適切な標的抗原は以下に記載される。
【００８６】
本明細書中の本発明のヘテロ二量体抗体の単量体に牽連して「撚り度（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）」は、「マッチ」する２本鎖ＤＮＡと同様に、「マッチ」してヘテロ二量体を形成する能力を保持するようにヘテロ二量体化変異を各単量体に組み込むことを意味する。例えば、いくつかのｐＩ変異が単量体Ａへと操作される（例えば、ｐＩをより高くする）場合、同様に利用され得る「電荷対」である立体変異はｐＩ変異を妨害せず、例えば、ｐＩを高くした電荷変異が同一の「鎖」または「単量体」に置かれ、両方の機能を保持する。同様に、以下により詳細に概説されるように、対のセットになる「スキュー」変異について、当業者は、対の１つのセットを組み入れる鎖または単量体がどちらに入るかを決定する際にｐＩを考慮し、同様にスキューのｐＩを使用してｐＩ分離を最大化するようにする。
【００８７】
「標的細胞」は、本明細書で使用されるとき、標的抗原を発現する細胞を意味する。
【００８８】
「可変領域」は、本明細書で使用されるとき、実質的にＶκ（Ｖ．カッパ）またはＶλ（Ｖ．ラムダ）のいずれかでコードされる１つ以上のＩｇドメイン、ならびに／または、それぞれ、カッパ、ラムダ、および重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成するＶＨ遺伝子を含む、免疫グロブリンの領域を意味する。
【００８９】
本明細書における「野生型またはＷＴ」は、対立遺伝子変異を含む、自然界に見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【００９０】
本発明の抗体は一般に、単離されているか、または組換え体である。本明細書に開示される様々なポリペプチドを説明するために使用されるとき、「単離された」とは、それが発現された細胞または細胞培養物から特定および分離および／または回収されたポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製される。「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。「組換え体」は、外来性宿主細胞において組換え核酸技術を用いて抗体が生成されることを意味する。
【００９１】
タンパク質配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを達成するために配列をアラインメントし、必要ならギャップを導入した後の、特定の（親）配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義され、そして配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮しない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当該技術分野の範囲内である様々な方法で達成できる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。１つの特定のプログラムは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／０２４４５２５号の段落番号［０２７９］〜［０２８０］に概説されているＡＬＩＧＮ−２プログラムである。
【００９２】
本発明のアミノ酸配列（「本発明の配列」）と親アミノ酸配列との間の同一性の程度は、「本発明の配列」の長さまたは親配列の長さの長さのうちの短い方で割った、２つの配列のアラインメントにおける正確な一致の数として計算される。結果は同一性パーセントで表される。
【００９３】
いくつかの実施形態において、２つ以上のアミノ酸配列は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％同一である。いくつかの実施形態では、２つ以上のアミノ酸配列は少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％、さらには１００％まで同一である。
【００９４】
特定の抗原またはエピトープへの「特異的連結」もしくはそれら「に特異的に連結する」またはそれら「に対して特異的である」とは、非特異的相互作用とは測定可能に異なる連結を意味する。特異的連結は、例えば、一般に連結活性を有しない類似の構造の分子である対照分子の連結と比較した分子の連結を決定することによって、測定することができる。例えば、特異的連結は、標的と類似の対照分子との競合によって決定することができる。
【００９５】
特定の抗原またはエピトープに対する特異的連結は、例えば、抗原またはエピトープに対して少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、代替的に少なくとも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２、またはそれ以上のＫＤを有する抗体によって示され得、ＫＤとは特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に連結する抗体は、抗原またはエピトープと比べて、対照分子に対して２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きいＫＤを有することになる。
【００９６】
また、特定の抗原またはエピトープへの特異的連結は、例えば、抗原またはエピトープに対するＫＡまたはＫａが、対照と比べて、そのエピトープに対して少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、またはそれを超えて大きい抗体によって示され得、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す。連結親和性は一般に、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイを用いて測定される。
【００９７】
Ｖ．抗体
本発明は、本明細書で論じられるように、２つの異なる免疫調節抗原に連結する二重特異性免疫調節抗体の作製に関する。以下で考察するように、「抗体」という用語は全般的に使用される。本発明で使用される抗体は、本明細書に記載されているようにいくつかのフォーマットをとることができる。
【００９８】
従来の抗体構造単位は、典型的には四量体を含む。各四量体は、典型的には、２本の同一のポリペプチド鎖対からなり、各対は、１本の「軽」鎖（典型的には、約２５ｋＤａの分子量）と、１本の「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量）とを有する。ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖として分類される。本発明は、一般にＩｇＧクラスに基づく二重特異性抗体を対象とし、これは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。一般に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４が、ＩｇＧ３よりも頻繁に使用される。ＩｇＧ１は、３５６（ＤまたはＥ）および３５８（ＬまたはＭ）で多型を有する異なるアロタイプを有することに留意すべきである。本明細書に図示される配列は３５６Ｄ／３５８Ｍアロタイプを使用するが、他のアロタイプが本明細書に含まれる。即ち、本明細書に含まれるＩｇＧ１  Ｆｃドメインを含む任意の配列は、３５６Ｄ／３５８Ｍアロタイプの代わりに３５６Ｅ／３５８Ｌを有することができる。
【００９９】
さらに、本明細書中の配列の多くは、位置２２０の少なくとも１つのシステインをセリンで置換したものであり、これは一般に、本明細書に記載の配列の大部分について「ｓｃＦｖ単量体」側にあるが、ジスルフィド形成を減少させるために「Ｆａｂ単量体」側、またはその両方にすることもできる。本明細書中の配列内に具体的に含まれるのは、これらのシステインの一方または両方が置換されたもの（Ｃ２２０Ｓ）である。
【０１００】
したがって、本明細書で使用されるとき、「アイソタイプ」は、それらの定常領域の化学的および抗原的特徴によって定義される免疫グロブリンの任意のサブクラスを意味する。治療用抗体は、アイソタイプおよび／またはサブクラスのハイブリッドも含み得ることを理解されたい。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９／０１６３６９９号に示されるように、本発明は、ＩｇＧ１／Ｇ２ハイブリッドのｐＩ工学を包含する。
【０１０１】
各鎖のアミノ末端部分は、「Ｆｖドメイン」または「Ｆｖ領域」として当該技術分野および本明細書では一般に称される、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。可変領域において、重鎖および軽鎖のＶドメインの各々について３つのループが集約されて、抗原連結部位を形成する。ループの各々は、相補性決定領域（これ以降「ＣＤＲ」と称される）と称され、ここではアミノ酸配列における変形が最も顕著である。「可変」は、可変領域のある特定のセグメントが抗体間で配列において大きく異なるという事実を指す。可変領域内の可変性は均一に分布していない。その代わり、Ｖ領域は、各々が９〜１５アミノ酸長またはそれ以上長い「超可変領域」と称される極可変性のより短い領域によって隔てられた１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と称される比較的不変の区間からなる。
【０１０２】
各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へとＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の順序で配列された３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）および４つのＦＲで構成される。
【０１０３】
超可変領域は、一般に、軽鎖可変領域においておよそ、アミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１、「Ｌ」は軽鎖を表す）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域においてはおよそ約３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１、「Ｈ」は重鎖を表す）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）からのアミノ酸残基（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））ならびに／または超可変ループを形成する残基（例えば、軽鎖可変領域における残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域における２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）、および９６−１０１（ＨＣＤＲ３）を包含する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  （１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７．）本発明の特定のＣＤＲを以下に記載する。
【０１０４】
当業者には理解されようが、ＣＤＲの正確なナンバリングおよび配置は、異なるナンバリング系間で異なり得る。しかしながら、可変重鎖および／または可変軽鎖の開示は、関連する（固有の）ＣＤＲの開示を含むことが理解されるべきである。したがって、各可変重鎖領域の開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３）の開示であり、各可変軽鎖領域の開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３）の開示である。
【０１０５】
ＣＤＲナンバリングの有用な比較は以下の通りであり、Ｌａｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５−７７（２００３）を参照できる。：
【表１】
2019529368.tif 000003
【０１０６】
本明細書全体を通して、Ｋａｂａｔナンバリング系は一般に、可変ドメイン内の残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７および重鎖可変領域の残基１〜１１３）を参照するときに使用され、ＥＵナンバリング系は、Ｆｃ領域に対するものである（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、上述（１９９１）を参照）。
【０１０７】
本発明は、多数の異なるＣＤＲセットを提供する。この場合、「完全ＣＤＲセット」は、３つの可変軽鎖および３つの可変重鎖ＣＤＲ、例えばｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３を含む。これらは、それぞれより大きな可変軽鎖または可変重鎖のドメインの一部であり得る。さらに、本明細書により完全に概説されているように、可変重鎖および可変軽鎖のドメインは、重鎖および軽鎖が使用されるとき（例えば、Ｆａｂが使用されるとき）には別個のポリペプチド鎖上に、またはｓｃＦｖ配列の場合には単一ポリペプチド鎖上にあり得る。
【０１０８】
ＣＤＲは、抗原連結の形成、またはより具体的には、抗体のエピトープ連結部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域内の特異的抗原連結部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖等の分子の分類であり、通常、特異的な構造特性、および特異的な電荷特性を有する。単一抗原が、２つ以上のエピトープを有してもよい。
【０１０９】
エピトープは、連結に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性構成要素とも称される）および連結に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的抗原連結ペプチドによって効果的に遮断されるアミノ酸残基、換言すると、特異的抗原連結ペプチドのフットプリント内にあるアミノ酸残基を含み得る。
【０１１０】
エピトープは、立体配座または直線状のいずれであってもよい。立体配座エピトープは、直線状のポリペプチド鎖の異なるセグメントからのアミノ酸の空間的な並置によって作り出される。直線状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基によって作り出されるものである。立体配座エピトープおよび非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への連結は失われるが、後者への連結は失われないという点で区別され得る。
【０１１１】
エピトープは、典型的には、固有の空間立体配座内に、少なくとも３個、より一般的には、少なくとも５個、または８〜１０個のアミノ酸を含む。同一のエピトープを認識する抗体は、ある抗体の別の抗体の標的抗原への連結を遮断する能力、例えば、「ビニング」を示す単純な免疫アッセイにおいて検証され得る。以下に概説するように、本発明は、列挙された抗原連結ドメインおよび本明細書の抗体を含むだけでなく、列挙された抗原連結ドメインによって連結されるエピトープとの連結について競合するものも含む。
【０１１２】
各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を定める。Ｋａｂａｔらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存の程度に基づき、Ｋａｂａｔらは、個々の一次配列をＣＤＲおよびフレームワークに分類し、そのリストを作成した（参照により全体が組み込まれるＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）。
【０１１３】
免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスには、重鎖中にいくつかの免疫グロブリンドメインがある。本明細書の「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、明確に異なる三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。定常重鎖（ＣＨ）ドメインおよびヒンジドメインを含む重鎖ドメインが本発明における関心対象である。ＩｇＧ抗体に関連して、ＩｇＧアイソタイプは、各々、３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧと関連して「ＣＨ」ドメインは以下の通りである。「ＣＨ１」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従って１１８〜２２０位を指す。「ＣＨ２」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従って２３７〜３４０位を指し、「ＣＨ３」は、Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックスに従って３４１〜４４７位を指す。本明細書において示され、以下に記載されるように、ｐＩ変異は、ＣＨ領域、および以下に論じられるように、ヒンジ領域のうちの１つ以上に存在し得る。
【０１１４】
重鎖のＩｇドメインの別の種類は、ヒンジ領域である。本明細書において、「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「免疫グロブリンヒンジ領域」とは、抗体の第１および第２の定常ドメイン間のアミノ酸を含む可動性ポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインはＥＵ位置２２０で終わり、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインは残基ＥＵ位置２３７で始まる。したがって、ＩｇＧについては、抗体ヒンジは、位置２２１（ＩｇＧ１中のＤ２２１）から２３６（ＩｇＧ１中のＧ２３６）を含むように本明細書で定義され、ナンバリングは、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域に関連して、下側ヒンジが含まれ、「下側ヒンジ」は一般に位置２２６または２３０を指す。本明細書に記載のように、ｐＩ変異はヒンジ領域にも同様に作製することができる。
【０１１５】
軽鎖は、一般に、可変軽鎖ドメイン（軽鎖ＣＤＲを含み、可変重鎖ドメインと一緒にＦｖ領域を形成する）、および定常軽鎖領域（しばしばＣＬまたはＣκと称される）の２つのドメインを含む。
【０１１６】
以下に概説される追加の置換のための別の目的とする領域は、Ｆｃ領域である。
【０１１７】
したがって、本発明は異なる抗体ドメインを提供する。本明細書中に記載され、そして当該技術分野において公知であるように、本発明のヘテロ二量体抗体は、重鎖および軽鎖内に異なるドメインを含み、これもまた重複し得る。これらのドメインは、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１−ヒンジ−ＦｃドメインまたはＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、Ｆａｂドメイン、およびｓｃＦｖドメインを含むが、これらに限定されない。
【０１１８】
したがって、「Ｆｃドメイン」は、−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、および場合によりヒンジドメインを含む。本明細書の実施形態では、ｓｃＦｖがＦｃドメインに連結しているとき、Ｆｃドメインのヒンジの全部または一部に連結しているのはｓｃＦｖコンストラクトのＣ末端であり、例えば、それは一般にヒンジの始まりである配列ＥＰＫＳに連結している。重鎖は、可変重鎖ドメインおよび定常ドメインを含み、これは、ＣＨ１−任意選択のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含むＦｃドメインを含む。軽鎖は、可変軽鎖および軽鎖定常ドメインを含む。ｓｃＦｖは、可変重鎖、ｓｃＦｖリンカー、および可変軽鎖ドメインを含む。本明細書に概説したコンストラクトおよび配列のほとんどにおいて、可変軽鎖のＣ末端はｓｃＦｖリンカーのＮ末端に連結し、そのＣ末端は可変重鎖のＮ末端に連結している（Ｎ−ｖｈ−リンカー−ｖｌ−Ｃ）が、これは切り替えることができる（Ｎ−ｖｌ−リンカー−ｖｈ−Ｃ）。本発明のいくつかの実施形態は、天然には存在しないが、ｓｃＦｖリンカーによって共に連結した可変重鎖ドメインと可変軽鎖ドメインとを一般に含む、少なくとも１つのｓｃＦｖドメインを含む。本明細書に概説されるように、ｓｃＦｖドメインは、一般に、ＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬとしてＮ末端からＣ末端まで配向されているが、これは、ｓｃＦｖドメイン（または、Ｆａｂ由来のＶＨおよびＶＬ配列を使用して構築されたドメイン）のいずれに関しても、フォーマットに応じて一方または両方の端部に任意のリンカーを用いて、ＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨへと逆転させることができる（全体的に図２を参照）。
【０１１９】
本明細書に示されるように、組換え技術によって生成される従来のペプチド連結を含めて、使用され得る適切ないくつかのｓｃＦｖリンカーが存在する。リンカーペプチドは、主に、以下のアミノ酸残基：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、またはＴｈｒを含み得る。リンカーペプチドは、それらが所望の活性を保持するように互いに対して正しい立体配座をとるような方法で２つの分子を連結させるのに十分な長さを有するべきである。一実施形態では、リンカーは、約１〜５０アミノ酸長、好ましくは約１〜３０アミノ酸長である。一実施形態では、１〜２０アミノ酸長のリンカーが使用されてもよく、いくつかの実施形態では、約５〜約１０アミノ酸が有用である。有用なリンカーには、例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎ（ｎは少なくとも１（および一般に３〜４）の整数である）を含むグリシン−セリンポリマー、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、ならびに他の可動性リンカーが含まれる。代替的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むがこれらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーが、リンカーとして有用であり得、すわなちリンカーとして有用であり得る。
【０１２０】
他のリンカー配列は、任意の長さのＣＬ／ＣＨ１ドメインの任意の配列を含むが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの全ての残基を含まない場合があり、例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５〜１２アミノ酸残基である。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えば、ＣκまたはＣλに由来し得る。リンカーは、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、およびＣμを含む任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来し得る。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来配列、および他のタンパク質由来の他の天然配列などの他のタンパク質に由来してもよい。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に概説される任意の２つのドメインを共に連結するために使用される「ドメインリンカー」である。任意の適切なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、ｎが少なくとも１（および一般に３〜４〜５）である、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎを含むグリシン−セリンポリマー、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持できるように十分な長さおよび柔軟性を有する２つのドメインの組換え連結を可能にする任意のペプチド配列を利用する。いくつかの場合において、以下に概説するように、「撚り度」に注意を払って、ｓｃＦｖリンカーのいくつかの実施形態において使用されるような荷電ドメインリンカーを使用することができる。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖリンカーは、荷電ｓｃＦｖリンカーであり、そのいくつかは図８に示されている。したがって、本発明はさらに、第１の単量体と第２の単量体との間のｐＩの分離を促進するための荷電ｓｃＦｖリンカーを提供する。すなわち、正または負の荷電ｓｃＦｖリンカー（または異なる単量体上にｓｃＦｖを使用する足場の場合は両方）を組み込むことによって、これは、Ｆｃドメインをさらに変化させることなく、荷電リンカーを含む単量体のｐＩを変えることを可能にする。これらの荷電リンカーは、標準的なリンカーを含む任意のｓｃＦｖ中に置換することができる。また、当業者には理解されるように、ｐＩの所望の変化に従って、荷電ｓｃＦｖリンカーが正しい「鎖」または単量体上に使用される。例えば、本明細書中で論じられるように、トリプルＦフォーマットヘテロ二量体抗体を作製するために、所望の抗原連結ドメインのそれぞれについてのＦｖ領域の元のｐＩが計算され、そしてｓｃＦｖを作製するために１つが選択され、ｐＩに応じて、正または負のリンカーのいずれかが選択される。
【０１２３】
荷電ドメインリンカーも同様に、本発明の単量体のｐＩ分離を増加させるために使用することができ、したがって、図８に含まれるものは、リンカーが利用される、本明細書の任意の実施形態で使用することができます。
【０１２４】
一実施形態では、抗体は、それがｐＩ工学などのヘテロ二量体を生成するように操作することができる少なくとも１つの定常ドメインを含む限り、抗体フラグメントである。使用され得る他の抗体フラグメントは、ｐＩ操作された本発明のＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジおよびＣＬドメインのうちの１つ以上を含むフラグメントを含む。特に、図１に示すフォーマットは、通常「ヘテロ二量体抗体」と呼ばれる抗体であり、タンパク質が、ヘテロ二量体Ｆｃドメインに自己集合した少なくとも２つの関連Ｆｃ配列、およびＦａｂとしてまたはｓｃＦｖとしてであれ少なくとも２つのＦｖ領域を有することを意味する。
【０１２５】
Ａ．キメラおよびヒト化抗体
いくつかの実施形態では、本明細書の抗体は、異なる種由来の混合物、例えばキメラ抗体および／またはヒト化抗体に由来し得る。一般に、「キメラ抗体」と「ヒト化抗体」の両方は、２つ以上の種由来の領域を組み合わせる抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は従来は、マウス（または場合によってはラット）由来の可変領域およびヒト由来の定常領域を含む。「ヒト化抗体」は一般に、可変ドメインフレームワーク領域がヒト抗体に見出される配列でスワップされた、非ヒト抗体を指す。一般に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体全体は、ヒト起源のポリヌクレオチドによってコードされるか、またはそのＣＤＲ内を除いてそのような抗体と同一である。非ヒト生物を起源とする核酸によって一部または全てがコードされるＣＤＲを、ヒト抗体可変領域のベータシートフレームワークに移植して、その特異性が移植されたＣＤＲによって決定される抗体を作製する。そのような抗体の作製は、例えば、ＷＯ９２／１１０１８、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６に記載され、全て参照により全体が組み込まれる。選択されたアクセプターフレームワーク残基の、対応するドナー残基への「逆変異」が、最初の移植されたコンストラクトにおいて失われた親和性を回復するためにしばしば必要とされる（ＵＳ５５３０１０１、ＵＳ５５８５０８９、ＵＳ５６９３７６１、ＵＳ５６９３７６２、ＵＳ６１８０３７０、ＵＳ５８５９２０５、ＵＳ５８２１３３７、ＵＳ６０５４２９７、ＵＳ６４０７２１３、全て参照により全体が組み込まれる）。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分、通常は全部を含み、したがって典型的にはヒトＦｃ領域を含むであろう。ヒト化抗体はまた、遺伝子操作された免疫系を有するマウスを用いて生成され得る。Ｒｏｑｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：６３９−６５４、参照により全体が組み込まれる。非ヒト抗体をヒト化および再形成するための様々な技法および方法は、当該技術分野で周知である（Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ  ＆  Ｖａｓｑｕｅｚ，２００４，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ，５３３−５４５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）、およびそこで引用される参考文献を参照されたく、全て参照により全体が組み込まれる）。ヒト化方法には、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ８６：１００２９−３３；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９−１０３５；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５−９，Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７（２０）：４５９３−９；Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４１８１−４１８５；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  １１：３２１−８に記載される方法が含まれるがこれらに限定されず、参照によりその全てが組み込まれる。ヒト化、または非ヒト抗体の可変領域の免疫原性を低下させる他の方法には、例えば、参照により全体が組み込まれるＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９６９−９７３に記載されているような表面再構成法が含まれ得る。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、特定の生殖細胞系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および／または特定の生殖細胞系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。例えば、そのような抗体は、特定の生殖細胞系列配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」重鎖または軽鎖可変領域を含むヒト抗体を含み得るかまたはそれからなり得る。ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖細胞系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較することと、ヒト抗体の配列に最も近い配列である（即ち、最も高い同一性％）ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列を選択することとによって、そのようなものとして特定され得る。特定のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列「の産物」であるまたはそれ「に由来する」ヒト抗体は、例えば、天然に存在する体細胞変異または部位特異的変異の意図的導入に起因して、生殖細胞系列配列と比較してアミノ酸の相違を含み得る。しかしながら、ヒト化抗体は、典型的には、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とアミノ酸配列において少なくとも９０％同一であり、他の種の生殖細胞系列免疫グロブリンアミノ酸配列（例えば、マウス生殖細胞系列配列）と比較したときに、抗体をヒト配列に由来するものとして特定するアミノ酸残基を含む。ある特定の場合には、ヒト化抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列において少なくとも９５、９６、９７、９８もしくは９９％、または少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％までも同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖細胞系配列に由来するヒト化抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と１０〜２０アミノ酸以下の相違しか示さない（本明細書中の任意のスキュー、ｐＩおよび除去変異の導入前、すなわち、本発明の変異の導入前は、変異の数は一般に少ない）。ある特定の場合には、ヒト化抗体は、生殖細胞系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列とは５アミノ酸以下、またはさらには４、３、２、もしくは１アミノ酸以下の相違しか示さない場合がある（同様に、本明細書における任意のスキュー、ｐＩ、および除去変異の導入前、すなわち、本発明の変異の導入前は、変異の数は一般に少ない）。
【０１２７】
一実施形態では、親抗体は、当該技術分野で知られているように、親和性成熟されたものである。構造に基づく方法が、例えば、ＵＳＳＮ１１／００４，５９０に記載されているように、ヒト化および親和性成熟のために用いられ得る。Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２；Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８−１０６８４；Ｒｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３７）：２２６１１−２２６１８；Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８９１０−８９１５；Ｋｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６（１０）：７５３−７５９に記載される方法を含むがこれらに限定されない選択に基づく方法が抗体可変領域のヒト化および／または親和性成熟のために使用でき、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。他のヒト化方法は、ＣＤＲの部分のみを移植することを含み得、これには、参照により全ての内容が組み込まれる、ＵＳＳＮ０９／８１０，５１０；Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−１１２５；Ｄｅ  Ｐａｓｃａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６−３０８４に記載される方法が含まれるがこれらに限定されない。
【０１２８】
ＶＩ．ヘテロ二量体抗体
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、自己集合してヘテロ二量体Ｆｃドメインおよびヘテロ二量体抗体を形成する、２つの異なる重鎖変異型Ｆｃ配列の使用に依存するヘテロ二量体免疫調節抗体を提供する。
【０１２９】
本発明は、例えば二重特異性連結を可能にするために、１つより多い免疫調節抗原またはリガンドへの連結を可能にするヘテロ二量体抗体を提供するための新規コンストラクトに関する。ヘテロ二量体抗体コンストラクトは、抗体の重鎖の２つのＦｃドメイン、例えば、「二量体」に組み立てられる２つの「単量体」の自己集合の性質に基づく。ヘテロ二量体抗体は、以下により完全に論じられるように各単量体のアミノ酸配列を変えることによって作製される。したがって、本発明は一般に、ヘテロ二量体形成を促進するためにおよび／またはホモ二量体よりもヘテロ二量体の精製を容易にするために、各鎖上で異なる定常領域中のアミノ酸変異に依存して、抗原をいくつかの方法で共連結することができるヘテロ二量体免疫調節抗体の作製に関する。
【０１３０】
したがって、本発明は二重特異性抗体を提供する。抗体技術において進行中の問題は、２つの異なる抗原に同時に連結する「二重特異性」抗体に対する要求であり、それにより一般に、異なる抗原を近接させ、新しい機能性および新しい治療法をもたらすことができる。一般に、これらの抗体は、各重鎖および軽鎖に対する遺伝子を宿主細胞に含めることによって作製される。これは一般に、所望のヘテロ二量体（Ａ−Ｂ）、ならびに２つのホモ二量体（Ａ−ＡおよびＢ−Ｂ（軽鎖ヘテロ二量体の問題は含まない））の形成をもたらす。しかしながら、二重特異性抗体の形成における主な障害は、ホモ二量体抗体からヘテロ二量体抗体を精製すること、および／またはホモ二量体の形成よりもヘテロ二量体の形成を偏らせることが困難であることである。
【０１３１】
本発明のヘテロ二量体を生成するために使用することができる多くの機構が存在する。さらに、当業者には理解されるように、これらの機構を組み合わせて高いヘテロ二量体化を確実にすることができる。したがって、ヘテロ二量体の産生をもたらすアミノ酸変異は、「ヘテロ二量体化変異」と呼ばれる。後述するように、ヘテロ二量体化変異は、ヘテロ二量体からのホモ二量体の精製を可能にする立体変異（例えば、後述の「ノブアンドホール」または「スキュー」変異および「電荷対」変異）ならびに「ｐＩ変異」を含み得る。その全体が参照により本明細書に組み込まれ、具体的には以下で「ヘテロ二量体化変異」の議論について本明細書に援用されるように、ヘテロ二量体化の有用な機構には「ノブアンドホール」（「ＫＩＨ」、本明細書においてしばしば「スキュー」変異として（ＷＯ２０１４／１４５８０６中の議論を参照）、「ＷＯ２０１４／１４５８０６に記載されているような「静電ステアリング」または「電荷対」、ＷＯ２０１４／１４５８０６に記載されるようなｐＩ変異、およびＷＯ２０１４／１４５８０６および以下に概説されているような一般的なさらなるＦｃ変異が含まれる。
【０１３２】
本発明において、ヘテロ二量体抗体の精製を容易にすることができるいくつかの基本的なメカニズムが存在し、その１つは、各単量体が異なるｐＩを有することによって、Ａ−Ａ、Ａ−ＢおよびＢ−Ｂ二量体タンパク質の等電点精製が可能になるｐＩ変異の使用に依存する。あるいは、「トリプルＦ」フォーマットなどのいくつかの足場フォーマットもまた、サイズに基づいた分離を可能にする。以下にさらに概説するように、ホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成を「スキュー」することも可能である。したがって、立体的ヘテロ二量体化変異とｐＩまたは電荷対変異の組み合わせは、本発明において特に使用される。
【０１３３】
一般に、本発明において特に使用される実施形態は、２つの単量体間のｐＩ差を増加させる、ｐＩ変異と組み合わせた、ホモ二量体形成に対するヘテロ二量体形成を促進するスキュー変異を含む変異のセットに依存する。
【０１３４】
さらに、以下により完全に概説されるように、ヘテロ二量体抗体のフォーマットに応じて、ｐＩ変異は単量体の定常および／またはＦｃドメイン内に含まれるか、または荷電リンカー、ドメインリンカーまたはｓｃＦｖリンカーのいずれかが使用され得る。すなわち、トリプルＦフォーマットなどのｓｃＦｖを利用する足場は、精製目的のためにさらなるｐＩブーストを与える荷電ｓｃＦｖリンカー（陽性または陰性のいずれか）を含み得る。当業者には理解されるように、本発明は単量体の一方または両方にあるｐＩ変異および／または同様に荷電ドメインリンカーを提供するが、いくつかのトリプルＦフォーマットは荷電したｓｃＦｖリンカーのみで有用であり追加のｐＩ調整はない。さらに、代替の機能性のためのさらなるアミノ酸操作もまた、Ｆｃ、ＦｃＲｎ、およびＫＯ変異などのｐＩ変化を付与し得る。
【０１３５】
ヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にするための分離機構としてｐＩを利用する本発明においては、アミノ酸変異を一方または両方の単量体のポリペプチドに導入することができ、すなわち、単量体の一方（本明細書では簡単のために「単量体Ａ」と呼ぶ）のｐＩを単量体Ｂと異なるように改変でき、または、単量体ＡとＢの両方の変化を、単量体ＡのｐＩを増加させ、単量体ＢのｐＩを減少させるように改変できる。論じられるように、いずれかまたは両方の単量体のｐＩ変化は、荷電残基を除去または付加することによって（例えば中性アミノ酸を正または負に荷電したアミノ酸残基で置換する、例えばグリシンからグルタミン酸）、正または負から反対の電荷への荷電残基の変更によって（例えばアスパラギン酸からリジンへ）、または荷電残基の中性残基への変更によって（例えば電荷の消失、リジンからセリン）、実施することができる。いくつかのこれらの変異を図に示す。
【０１３６】
したがって、本発明のこの実施形態は、ヘテロ二量体をホモ二量体から分離することができるように、少なくとも１つの単量体に十分なｐＩの変化を生じさせることを提供する。当業者には理解されるように、そして以下にさらに論じるように、これは、「野生型」重鎖定常領域およびそのｐＩ（ｗｔＡ−＋ＢまたはｗｔＡ−−Ｂ）を増加または減少させるように操作された変異領域を使用することによって、または一方の領域を増加して他方の領域を減少させることによって（Ａ＋−Ｂ−またはＡ−Ｂ＋）、実施できる。
【０１３７】
したがって、一般に、本発明のいくつかの実施形態の構成要素は、二量体タンパク質の単量体の両方ではないにしても少なくとも１つの等電点（ｐＩ）を、アミノ酸置換（「ｐＩ変異」または「ｐＩ置換」）を単量体の一方または両方に組み込むことによって変化させて「ｐＩ抗体」を形成することを目的とする抗体の定常領域におけるアミノ酸変異である。本明細書中に示されるように、２つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、２つの単量体のｐＩが０．１ｐＨ単位とわずかに異なる場合に達成でき、０．２、０．３、０．４、および０．５以上異なるものが全て本発明において使用される。
当業者には理解されるように、良好な分離を得るために各単量体または両方の単量体に含まれるべきｐＩ変異の数は、構成要素の出発ｐＩ、例えばトリプルＦフォーマットにおいて、目的のｓｃＦｖおよびＦａｂの出発ｐＩに部分的に依存するであろう。すなわち、どの単量体を操作するか、またはどの「方向」（例えば、より陽性またはより陰性）かを決定するために、２つの標的抗原のＦｖ配列が計算され、そしてそこから決定がなされる。当該技術分野において知られているように、異なるＦｖは、本発明において利用される異なる出発ｐＩを有するであろう。概して、本明細書に概説されるように、ｐＩは、少なくとも約０．１ｌｏｇの各単量体の総ｐＩの差異を生じるように操作され、本明細書に概説されるように０．２〜０．５が好ましい。さらに、当業者には理解され、本明細書に概説されるように、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体はサイズに基づいてホモ二量体から分離することができる。図２に示すように、例えば、フォーマットのいくつかは、サイズに基づいてヘテロ二量体およびホモ二量体の分離を可能にする。
【０１３８】
Ａ．ヘテロ二量体化変異
本発明は、ヘテロ二量体形成および／またはホモ二量体からの精製を可能にするためにヘテロ二量体化変異を利用する、様々なフォーマットのヘテロ二量体抗体を含む、ヘテロ二量体タンパク質を提供する。いくつかのヘテロ変異を、図４に示す。
【０１３９】
ヘテロ二量体化スキュー変異のセットのいくつかの適切な対がある。これらの変異は、「セット」の「対」になる。すなわち、一方のセットの対が第１の単量体に組み込まれ、他のセットの対が第２の単量体に組み込まれる。注目すべきは、これらのセットは、一方の単量体上の残基と他方の単量体上の残基との間で一対一の対応関係を有する「ノブインホール」変異として必ずしも振舞わないことであり、すなわち、これらのセットの対は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げる２つの単量体間の界面を形成し、生物学的条件下で自発的に形成するヘテロ二量体の割合を予想される５０％（２５％ホモ二量体Ａ／Ａ：５０％ヘテロ二量体Ａ／Ｂ：２５％ホモ二量体Ｂ／Ｂ）ではなく９０％以上にする。
【０１４０】
Ｂ．立体変異
いくつかの実施形態において、ヘテロ二量体の形成は、立体変異の付加によって促進され得る。すなわち、各重鎖中のアミノ酸を変えることによって、異なる重鎖が会合して同一のＦｃアミノ酸配列を有するホモ二量体を形成するよりもヘテロ二量体構造を形成する可能性が高い。適切な立体変異は図面に含まれる。
【０１４１】
１つの機構は、当該技術分野において一般的に「ノブアンドホール」と呼ばれ、ヘテロ二量体形成を有利にし、ホモ二量体形成を不利にする立体効果をもたらすアミノ酸工学を指し、任意で使用することもできる；これはしばしば、「ノブアンドホール」と呼ばれ、ＵＳＳＮ  ６１／５９６，８４６、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（７）：６１７（１９９６）、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７２７０：２６、米国特許第８，２１６，８０５号に記載されるようなものであり、これらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの図は、「ノブアンドホール」に依存するいくつかの「単量体Ａ−単量体Ｂ」対を特定する。さらに、Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）に記載されているように、これらの「ノブアンドホール」変異は、ヘテロ二量体化に対するスキュー形成のためのジスルフィド連結と組み合わせることができる。
【０１４２】
ヘテロ二量体の生成に使用されるさらなる機構は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれるＧｕｎａｓｅｋａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）に記載されているように、しばしば「静電ステアリング」と呼ばれる。これは、本明細書において、しばしば「電荷対」と呼ばれる。この実施形態では、静電学を使用して、ヘテロ二量体化に向けて形成をスキューさせる。当業者には理解されるように、これらはまた、ｐＩ、したがって精製に影響を及ぼす可能性を有し、したがって場合によってはｐＩ変異と見なすこともできる。しかしながら、これらはヘテロ二量体化を強制するために生成され、精製手段として使用されなかったので、それらは「立体変異」として分類される。これらには、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは「単量体の対応セット」である）、およびＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅが含まれるがこれらに限定されない。
【０１４３】
さらなる単量体Ａおよび単量体Ｂの変異は、本明細書に概説されるｐＩ変異または参照により本明細書に明確に組み込まれるＵＳ２０１２／０１４９８７６の図３７、図および図説および配列番号に示される他の立体変異などの他の変異と、任意の量で任意で独立に組み合わせることができる。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、本明細書に概説される立体変異は、任意で独立していずれかのｐＩ変異（またはＦｃ変異、ＦｃＲｎ変異などの他の変異）を一方または両方の単量体に組み込むことができ、独立して任意で本発明のタンパク質に含めるかまたは除外することができる。
【０１４５】
適切なスキュー変異のリストは、多くの実施形態において特に有用いくつかの対を示す図４に見られる。多くの実施形態において特に有用であるのは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ（任意で架橋ジスルフィドＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃを含む）を含むがこれらに限定されないセットの対である。命名法に関して、対「Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ」は、一方の単量体が二重変異セットＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを有し、他方が二重変異セットＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを有することを意味し、上述のように、これらの対の「撚り度」は出発ｐＩに依存する。
【０１４６】
Ｃ．ヘテロ二量体のｐＩ（等電点）変異
一般に、当業者には理解されるように、ｐＩ変異には２つの一般的なカテゴリーがある：タンパク質のｐＩを増加させるもの（塩基性変化）とタンパク質のｐＩを減少させるもの（酸性変化）。本明細書中に記載されるように、これらの変異の全ての組み合わせがなされ得る：一方の単量体は野生型、または野生型と顕著に異なるｐＩを示さない変異であり得、他方がより塩基性またはより酸性のいずれかであり得る。代替的に、各単量体は、１つがより塩基性に、１つがより酸性へと変化する。
【０１４７】
ｐＩ変異の好ましい組み合わせを、５に示す。本明細書に概説し、図に示すように、これらの変化はＩｇＧ１と比較して示されているが、全てのアイソタイプをこのように変更することができ、アイソタイプハイブリッドも同様である。重鎖定常ドメインがＩｇＧ２〜４に由来する場合、Ｒ１３３ＥおよびＲ１３３Ｑもまた使用され得る。
【０１４８】
一実施形態では、例えば、ボトルオープナーフォーマットにおいて、ｐＩ変異の好ましい組み合わせは、２０８Ｄ／２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄ変異（ヒトＩｇＧ１と比較するときＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む１つの単量体（負のＦａｂ側）と、（ＧＫＰＧＳ）４を含む正に荷電したｓｃＦｖリンカーを含む第２の単量体（正のｓｃＦｖ側）とを有する。しかしながら、当業者には理解されるように、第１の単量体は２０８位を含むＣＨ１ドメインを含む。したがって、ＣＨ１ドメインを含まないコンストラクト（例えば、デュアルｓｃＦｖフォーマットにおいて、ドメインの１つにＣＨ１ドメインを利用しないヘテロ二量体Ｆｃ融合タンパク質の場合）において、好ましい負のｐＩ変異Ｆｃセットは、２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄ変異（ヒトＩｇＧ１と比較するときＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む。
【０１４９】
したがって、いくつかの実施形態では、一方の単量体は図５からの置換のセットを有し、他方の単量体は荷電リンカー（フォーマットが指示するようにその単量体がｓｃＦｖまたは荷電ドメインリンカーを含むため、荷電ｓｃＦｖリンカーの形態のいずれかで）を有する。
【０１５０】
１．アイソタイプ変異
さらに、本発明の多くの実施形態は、あるＩｇＧアイソタイプから別のＩｇＧアイソタイプへの特定の位置でのｐＩアミノ酸の「移入」に依存し、したがって、変異体に望ましくない免疫原性が導入される可能性を低減または排除する。これらのいくつかは、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図２１に示されている。すなわち、ＩｇＧ１は、高いエフェクター機能を含む様々な理由から治療用抗体の一般的なアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重鎖定常領域は、ＩｇＧ２のそれよりも高いｐＩを有する（８．１０対７．３１）。特定の位置でＩｇＧ２残基をＩｇＧ１骨格に導入することによって、得られる単量体のｐＩは低下（または上昇）し、さらにより長い血清半減期を示す。例えば、ＩｇＧ１は１３７位にグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２はグルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有し、グルタミン酸を移入すると、得られるタンパク質のｐＩに影響を与える。以下に記載されるように、変異抗体のｐＩに顕著な影響を与えるためには、一般にいくつかのアミノ酸置換が必要とされる。しかしながら、ＩｇＧ２分子中の変化でさえも血清半減期の増加を可能にすることが以下に論じられるように留意されるべきである。
【０１５１】
他の実施形態では、得られるタンパク質の全体的な荷電状態を低下させるため（例えば、より高いｐＩアミノ酸からより低いｐＩアミノ酸へと変化させることによる）、または以下でより詳細に説明するように、安定性などのための構造調整を可能にするため、非アイソタイプのアミノ酸変化をなす。
【０１５２】
さらに、重鎖定常ドメインと軽鎖定常ドメインの両方をｐＩ操作することによって、ヘテロ二量体の各単量体における顕著な変化を見ることができる。本明細書で論じるように、２つの単量体のｐＩが少なくとも０．５だけ異なることは、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点に感受性の他の方法による分離を可能にし得る。
【０１５３】
Ｄ．ｐＩを計算する
各単量体のｐＩは、変異型重鎖定常ドメインのｐＩならびに変異型重鎖定常ドメインおよび融合パートナーを含む単量体全体のｐＩに依存し得る。したがって、いくつかの実施形態において、ｐＩの変化は、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図１９のチャートを用いて、変異型重鎖定常ドメインに基づいて計算される。本明細書で論じるように、どの単量体を操作するかは、一般に、Ｆｖ領域および足場領域の固有のｐＩによって決定される。代替的に、各単量体のｐＩを比較することができる。
【０１５４】
Ｅ．ｐＩ変異もまたインビボ連結においてより優れたＦｃＲｎを付与する
ｐＩ変異が単量体のｐＩを減少させる場合、それらはインビボでの血清保持を改善するというさらなる利点を有することができる。
【０１５５】
まだ検討中ではあるが、エンドソーム内のｐＨ６でＦｃＲｎに連結するとＦｃが隔離されるため、Ｆｃ領域はインビボでより長い半減期を有すると考えられている（Ｇｈｅｔｉｅ  ａｎｄ  Ｗａｒｄ，１９９７  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ．１８（１２）：５９２−５９８、全体が参照により組み込まれる）。次いでエンドソーム区画はＦｃを細胞表面にリサイクルする。区画が細胞外空間に開くと、約７．４のより高いｐＨが、血中へのＦｃの放出を誘導する。マウスにおいて、Ｄａｌｌ’  Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．は、ｐＨ６およびｐＨ７．４でのＦｃＲｎ連結が増加したＦｃ変異は実際に低下した血清濃度および野生型Ｆｃと同一の半減期を有することを示した（Ｄａｌｌ’  Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５１７１−５１８０、参照によりその全体が組み込まれる）。ｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対するＦｃの親和性の増加は、血中へのＦｃの放出を妨げると考えられる。したがって、インビボでのＦｃの半減期を増加させるＦｃ変異は、理想的には、より高いｐＨでのＦｃの放出をなお可能にしながら、より低いｐＨでのＦｃＲｎ連結を増加させる。アミノ酸ヒスチジンは、６．０〜７．４のｐＨ範囲でその荷電状態を変化させる。それ故、Ｆｃ／ＦｃＲｎ複合体中の重要な位置にＨｉｓ残基を見出すことは驚くべきことではない。
【０１５６】
最近、より低い等電点を有する可変領域を有する抗体もまたより長い血清半減期を有し得ることが示唆されている（Ｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０  ＰＥＤＳ．２３（５）：３８５−３９２、参照により全てが本明細書に組み込まれる）。しかしながら、この機構は未だよくわかっていない。さらに、可変領域は抗体ごとに異なる。本明細書中に記載されるように、ｐＩが減少しそして半減期が延長した定常領域変異は、抗体の薬物動態学的性質を改善するためのよりモジュール的なアプローチを提供するであろう。
【０１５７】
Ｆ．追加の機能性のための追加のＦｃ変異
ｐＩアミノ酸変異に加えて、１つ以上のＦｃγＲ受容体への連結の改変、ＦｃＲｎ受容体への連結の改変等を含むがこれらに限定されない、様々な理由で実施することができるいくつかの有用なＦｃアミノ酸改変が存在する。
【０１５８】
したがって、本発明のタンパク質は、ｐＩ変異および立体変異を含む、本明細書に概説したヘテロ二量体化変異を含むアミノ酸修飾を含むことができる。各組の変異は独立してそして任意で特定のヘテロ二量体タンパク質に含み得るかまたはそれから除外し得る。
【０１５９】
Ｇ．ＦｃγＲ変異
ＦｃγＲ受容体のうちの１つ以上への連結を改変するために実施され得るいくつかの有用なＦｃ置換が存在する。連結の増加および連結の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの連結の増加は、一般に、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性、すなわち、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の連結抗体を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応）の増加をもたらすことが知られている。同様に、いくつかの状況下では、ＦｃγＲＩＩｂ（抑制性受容体）への連結の減少も有益であり得る。本発明で有用なアミノ酸置換には、ＵＳＳＮ１１／１２４，６２０（特に図４１）、ＵＳＳＮ１１／１７４，２８７、ＵＳＳＮ１１／３９６，４９５、ＵＳＳＮ１１／５３８，４０６に列挙されるものが含まれ、これらの全ては、それらの全体が、具体的にはその中に開示される変異が参照により、明示的に本明細書に組み込まれる。使用される特定の変異には、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖ、および２９９Ｔが含まれるがこれらに限定されない。
【０１６０】
さらに、参照によりその全ての内容が本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１２／３４１，７６９に具体的に開示されているように、４３４Ｓ、４３４Ａ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６ＩまたはＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ、および２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌを含むがこれらに限定されない、ＦｃＲｎ受容体への連結の増加および血清半減期の増加に使用される追加のＦｃ置換が存在する。
【０１６１】
Ｈ．除去変異
同様に、機能的変異の別のカテゴリーは「ＦｃγＲ除去変異」または「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯまたはＫＯ）変異である。これらの実施形態では、いくつかの治療用途のために、さらなる作用機序を回避するために、１つ以上または全てのＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）へのＦｃドメインの正常な連結を低減または除去することが望ましい。これは、例えば、多くの実施形態において、特に、Ｆｃドメインのうちの１つが１つ以上のＦｃγ受容体除去変異を含むように、ＦＣγＲＩＩＩａ連結を除去してＡＤＣＣ活性を除去または顕著に減少させることが望ましい二重特異性免疫調節抗体の使用においてである。これらの除去変異は図６に示されており、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌからなる群から選択される除去変異を用いる好ましい態様で、各々が独立して任意で含まれるか除外することができる。本明細書で言及される除去変異は、ＦｃγＲ連結を除去するが、一般にはＦｃＲｎ連結を除去しないことに留意されたい。
【０１６２】
Ｉ．ヘテロ二量体とＦｃ変異の組み合わせ
当業者には理解されるように、列挙されたヘテロ二量体化変異（スキューおよび／またはｐＩ変異を含む）は全て、それらの「撚り度」または「単量体分配」を保持する限り任意の方法で任意で独立に組み合わせることができる。さらに、これらの変異は全て、ヘテロ二量体化フォーマットのいずれにも組み合わせることができる。
【０１６３】
ｐＩ変異の場合、特に使用される実施形態が図面に示されているが、精製を促進するために２つの単量体間のｐＩの差異を変えるという基本的な規則に従って、他の組み合わせを生成できる。
【０１６４】
さらに、ヘテロ二量体化変異、スキュー、およびｐＩのいずれも、本明細書で一般的に概説されるように、Ｆｃ除去変異、Ｆｃ変異、ＦｃＲｎ変異と独立して任意で組み合わせることができる。
【０１６５】
ＶＩＩ．本発明の有用なフォーマット
当業者によって理解および以下でより完全に説明するように、一般的に図２に示されているように、本発明の二重特異性のヘテロ二量体抗体は、多種多様な構成をとることができる。いくつかの図は、分子の一方の「アーム」に１つのタイプの特異性があり、他方の「アーム」に異なる特異性がある「シングルエンド」構成を示す。他の図は、分子の「上部」に少なくとも１つのタイプの特異性があり、分子の「下部」に１つ以上の異なる特異性がある「デュアルエンド」構成を示す。したがって、本発明は、異なる第１および第２の抗原と同時連結する新規な免疫グロブリン組成物に関する。
【０１６６】
当業者によって理解されるように、本発明のヘテロ二量体フォーマット（図２を参照されたい）は、異なる原子価を有することができ、かつ二重特異性である。すなわち、本発明の抗体は、チェックポイント標的が１つのＡＢＤによって連結され、そして共刺激標的が第２のＡＢＤによって連結される、二価および二重特異性であり得る（例えば、ヘテロ二量体であるボトルオープナー形式）、またはホモ二量体である二重特異性ｍＡｂを参照）。ヘテロ二量体抗体はまた、三価および二重特異性であり得、ここで、第１の抗原は２つのＡＢＤによって連結され、および第２の抗原は第２のＡＢＤによって連結される（例えば、中央−ｓｃＦｖフォーマットおよびトライデントフォーマットを参照）。ヘテロ二量体抗体はまた、二重特異性および四価（例えば、中央ｓｃＦｖ２フォーマットおよびＤＶＤ−Ｉｇフォーマットなど）であり得る。
【０１６７】
同様に、ＤＶＤ−Ｉｇフォーマットおよび中央−ｓｃＦｖ２フォーマットを除いて、抗体は一般に、共刺激標的が一価連結するようにフォーマットされている。
【０１６８】
Ａ．ボトルオープナーフォーマット
本発明において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、「トリプルＦ」または「ボトルオープナー」の足場フォーマットである。この実施形態では、抗体の一方の重鎖は単鎖Ｆｖ（以下に定義されるように「ｓｃＦｖ」）を含み、他方の重鎖は可変重鎖および軽鎖を含む「通常の」Ｆａｂフォーマットである。この構造は、ボトルオープナーと視覚的におおよその類似性があるため、本明細書ではしばしば「トリプルＦ」フォーマット（ｓｃＦｖ−Ｆａｂ−Ｆｃ）または「ボトルオープナー」フォーマットと呼ばれる。以下により十分に記載されるように、ヘテロ二量体抗体の形成を促進する定常領域（例えば、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメインおよび／またはヒンジ領域）におけるアミノ酸変異の使用によって２つの鎖は一緒にされる。
【０１６９】
現在の「トリプルＦ」フォーマットにはいくつかの明確な利点が存在する。当該技術分野で知られているように、２つのｓｃＦｖコンストラクトに依存する抗体類似体はしばしば安定性および凝集の問題を有し、それは本発明において「通常の」重鎖および軽鎖の対形成の付加により軽減できる。さらに、２つの重鎖と２つの軽鎖に依存するフォーマットとは対照的に、重鎖と軽鎖の誤った対形成（例えば、軽鎖２と対形成する重鎖１など）の問題が存在しない。
【０１７０】
本明細書に概説した実施形態の多くは、一般に、ｓｃＦｖリンカー（多くは荷電されているが、全ての場合ではない）を用いて共有連結した可変重鎖および可変軽鎖のドメインを含む、ｓｃＦｖを含む第１の単量体を含むボトルオープナーフォーマットに依存しており、ｓｃＦｖは、第１のＦｃドメインに通常ドメインリンカーを介して共有連結している（これは、本明細書に概説されるように、非荷電または荷電されていてもよく、外来性または内在性であってもよい（例えば、天然のヒンジドメインの全てまたは部分）。ボトルオープナーフォーマットの第２の単量体は重鎖であり、組成物はさらに軽鎖を含む。
【０１７１】
さらに、ボトルオープナーフォーマットのＦｃドメインは、一般にスキュー変異（例えば、図４に示されるような１セットのアミノ酸置換）を含み、特に有用なスキュー変異は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択され、任意で除去変異（図６に示すものを含む）を含み、任意で荷電ｓｃＦｖリンカー（図８に示すものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異（図５に示すものを含む）を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、ボトルオープナーフォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、および除去変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、以下を含むボトルオープナーフォーマットを含む：ａ）荷電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態で好ましい、図８の＋Ｈ配列を有する）、スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および本明細書に概説される一つの標的に連結するＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および、可変軽鎖ドメインと共に、本明細書に概説される第２の標的に連結するＦｖを作製する可変重鎖ドメインを含む、第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）、ｃ）軽鎖。この特定の実施形態では、適切な単量体Ｆｖ対には、ＩＣＯＳ×ＰＤ−１、ＩＣＯＳ×ＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳ×ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ×ＬＡＧ−３、ＩＣＯＳ×ＴＩＭ−３、ＩＣＯＳ×ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ×ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴ×ＩＣＯＳ、ＰＤ−１×ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｌ１×ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４×ＩＣＯＳ、ＬＡＧ−３×ＩＣＯＳ、ＴＩＭ−３×ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ×ＩＣＯＳ、ＯＸ４０×ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０×ＰＤ−１、ＯＸ４０×ＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０×ＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０×ＬＡＧ−３、ＯＸ４０×ＴＩＭ−３、ＯＸ４０×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×ＯＸ４０、ＰＤ−１×ＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１×ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４×ＯＸ４０、ＬＡＧ−３×ＯＸ４０、ＴＩＭ−３×ＯＸ４０、ＢＴＬＡ×ＯＸ４０、ＧＩＴＲ×ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ×ＰＤ−１、ＧＩＴＲ×ＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲ×ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ×ＬＡＧ−３、ＧＩＴＲ×ＴＩＭ−３、ＧＩＴＲ×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×ＧＩＴＲ、ＰＤ−１×ＧＩＴＲ、ＰＤ−Ｌ１×ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４×ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３×ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３×ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ×ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ×ＴＩＧＩＴ、４−１ＢＢ×ＰＤ−１、４−１ＢＢ×ＰＤ−Ｌ１、４−１ＢＢ×ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ×ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ×ＴＩＭ−３、４−１ＢＢ×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×４−１ＢＢ、ＰＤ−１×４−１ＢＢ、ＰＤ−Ｌ１×４−１ＢＢ、ＣＴＬＡ−４×４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３×４−１ＢＢ、ＴＩＭ−３×４−１ＢＢ、およびＢＴＬＡ×４−１ＢＢが含まれる（Ｆａｂを最初に列挙し、ｓｃＦｖを２番目に列挙する）。
【０１７３】
したがって、いくつかの実施形態では、以下を含むボトルオープナーフォーマットを含む：ａ）荷電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態で好ましい、図８の＋Ｈ配列を有する）、スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および本明細書に概説される一つの標的に連結するＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および、可変軽鎖ドメインと共に、本明細書に概説される第２の標的に連結するＦｖを作製する可変重鎖ドメインを含む、第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）、ｃ）軽鎖。このフォーマットのこれらの変異を有するいくつかの特定の実施形態において：
【０１７４】
（１）フォーマットが、［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤを有するＩＣＯＳに連結するＦａｂ  ＡＢＤを含む。
【０１７５】
（２）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖ  ＡＢＤと組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０１７６】
（３）フォーマットが、ＣＴＬＡ−４に連結するＡＢＤ  Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９を含むｓｃＦｖと組み合わせたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０１７７】
（４）フォーマットが、ＬＡＧ−３に連結するＡＢＤ  ７Ｇ８＿Ｈ．３０３＿Ｌ１．３４と組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０１７８】
（５）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＧＩＴＲに連結する。
【０１７９】
（６）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＯＸ４０に連結する。
【０１８０】
（７）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＩＣＯＳに連結する。
【０１８１】
８）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、Ｆａｂは４−１ＢＢに連結する。
【０１８２】
（９）フォーマットが、ＩＣＯＳに連結するＨ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤおよびＰＤ−Ｌ１に連結するＡＢＤを含む。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、ボトルオープナーフォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、除去変異、およびＦｃＲｎ変異を含む。したがって、いくつかの実施形態では、以下を含むボトルオープナーフォーマットを含む：ａ）荷電ｓｃＦｖリンカー（いくつかの実施形態で好ましい、図８の＋Ｈ配列を有する）、スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および本明細書に概説される第１の受容体（共刺激受容体またはチェックポイント受容体のいずれか）に連結するＦｖを含む第１の単量体（「ｓｃＦｖ単量体」）、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ、および、可変軽鎖ドメインと共に、本明細書に概説される第２の受容体（共刺激受容体またはチェックポイント受容体のうちの他方）に連結するＦｖを作製する可変重鎖ドメインを含む、第２の単量体（「Ｆａｂ単量体」）、ｃ）軽鎖。このフォーマットのこれらの変異を有するいくつかの特定の実施形態において：
【０１８４】
（１）フォーマットが、［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤを有するＩＣＯＳに連結するＦａｂ  ＡＢＤを含む。
【０１８５】
（２）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖ  ＡＢＤと組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０１８６】
（３）フォーマットが、ＣＴＬＡ−４に連結するＡＢＤ  Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９を含むｓｃＦｖと組み合わせたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０１８７】
（４）フォーマットが、ＬＡＧ−３に連結するＡＢＤ  ７Ｇ８＿Ｈ．３０３＿Ｌ１．３４と組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０１８８】
（５）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＧＩＴＲに連結する。
【０１８９】
（６）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＯＸ４０に連結する。
【０１９０】
（７）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＩＣＯＳに連結する。
【０１９１】
８）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、Ｆａｂは４−１ＢＢに連結する。
【０１９２】
（９）フォーマットが、ＩＣＯＳに連結するＨ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤおよびＰＤ−Ｌ１に連結するＡＢＤを含む。
【０１９３】
具体的には、図９は、本発明において使用され得るＦｖ配列を欠いているいくつかのボトルオープナー「骨格」配列を示す。すなわち、ｓｃＦｖ部分およびＦａｂ部分のＦｖ配列は、ＩＣＯＳとＰＤ−１、ＩＣＯＳとＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳとＬＡＧ−３、ＩＣＯＳとＴＩＭ−３、ＩＣＯＳとＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳとＢＴＬＡ、ＩＣＯＳとＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲとＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲとＰＤ−１、ＧＩＴＲとＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲとＬＡＧ−３、ＧＩＴＲとＴＩＭ−３、ＧＩＴＲとＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲとＢＴＬＡ、ＯＸ４０とＰＤ−１、ＯＸ４０とＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０とＣＴＬＡ−４、ＩＣ  ＯＸ４０  ＯＳとＬＡＧ−３、ＯＸ４０とＴＩＭ−３、ＯＸ４０とＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０とＢＴＬＡ、４−１ＢＢとＰＤ−１、４−１ＢＢとＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢとＬＡＧ−３、４−１ＢＢとＴＩＭ−３、４−１ＢＢとＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴと４−１ＢＢ、および４−１ＢＢとＢＴＬＡの任意の組み合わせから使用することができ、骨格１から１０のいずれかまたは全てと組み合わせられ、これらの組み合わせで特に骨格１が使用される。
【０１９４】
（任意で４２８Ｌ／４３４Ｓの変異を含む）図９からのボトルオープナー骨格１に関して、本発明における使用の具体的なＦｖの組合せには、ＩＣＯＳとＰＤ−１、ＩＣＯＳとＰＤ−Ｌ１、およびＩＣＯＳとＣＴＬＡ−４が含まれる。
【０１９５】
（任意で４２８Ｌ／４３４Ｓの変異を含む）図９からのボトルオープナー骨格１に関して、ヒトＩＣＯＳに連結する具体的なＡＢＤには、［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０および［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０、ならびに図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７に示されるもの、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５に示されるものが含まれるがこれらには限定されない。
【０１９６】
（任意で４２８Ｌ／４３４Ｓの変異を含む）図９からのボトルオープナー骨格１に関して、ヒトＧＩＴＲに連結する具体的なＡＢＤには、図１８、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２８２〜２６２９０に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０１９７】
（任意で４２８Ｌ／４３４Ｓの変異を含む）図９からのボトルオープナー骨格１に関して、ＯＸ４０に連結する具体的なＡＢＤには、図１７、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２７２〜２６２８１に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０１９８】
（任意で４２８Ｌ／４３４Ｓの変異を含む）図９からのボトルオープナー骨格１に関して、ヒト４−１ＢＢに連結する具体的なＡＢＤには、図１６、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２６２〜２６７１が含まれるがこれらには限定されない。
【０１９９】
（任意で４２８Ｌ／４３４Ｓの変異を含む）図９からのボトルオープナー骨格１に関して、ヒトＰＤ−Ｌ１に連結する具体的なＡＢＤには、図１５、図７３、および図７８、ならびに配列番号３９６１〜４４３２が含まれるがこれらには限定されない。
【０２００】
具体的なボトルオープナーの実施形態は以下に概説される。
【０２０１】
Ｂ．ｍＡｂ−Ｆｖフォーマット
本発明において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、ｍＡｂ−Ｆｖフォーマットである。この実施形態では、フォーマットは、一方の単量体への「追加の」可変重鎖ドメインのＣ末端連結および他方の単量体への「追加の」可変軽鎖ドメインのＣ末端連結の使用に依存し、したがって第３抗原連結ドメイン（すなわち「追加の」Ｆｖドメイン）を形成し、２つの単量体のＦａｂ部分が１つのチェックポイント標的に連結し、そして「追加の」Ｆｖドメインが共刺激標的に連結する。
【０２０２】
この態様において、第１の単量体は、第１の可変重鎖ドメインおよび第１のＦｃドメインを含む第１の定常重鎖ドメインを含む第１の重鎖を含み、第１の可変軽鎖ドメインはドメインリンカーを用いて第１のＦｃドメインのＣ末端に共有連結する（ｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意のリンカー］−ｖｌ２）。第２の単量体は、第２の可変重鎖ドメイン、第２のＦｃドメインを含む第２の定常重鎖ドメイン、およびドメインリンカーを用いて第２のＦｃドメインのＣ末端に共有連結する第３の可変重鎖ドメインを含む（ｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意のリンカー］−ｖｈ２）。この実施形態はさらに、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖を利用し、これらは重鎖と会合して２つの同一のＦｖを含む２つの同一のＦａｂを形成する。２つのＣ末端連結可変ドメインは、「追加の」第３のＦｖを構成する。本明細書中の多くの実施形態に関して、これらのコンストラクトは、本明細書中に所望され記載されるように、スキュー変異、ｐＩ変異、除去変異、さらなるＦｃ変異などを含む。この実施形態では、適切なＦｖ対には、ＩＣＯＳ×ＰＤ−１、ＩＣＯＳ×ＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳ×ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ×ＬＡＧ−３、ＩＣＯＳ×ＴＩＭ−３、ＩＣＯＳ×ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ×ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴ×ＩＣＯＳ、ＰＤ−１×ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｌ１×ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４×ＩＣＯＳ、ＬＡＧ−３×ＩＣＯＳ、ＴＩＭ−３×ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ×ＩＣＯＳ、ＯＸ４０×ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０×ＰＤ−１、ＯＸ４０×ＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０×ＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０×ＬＡＧ−３、ＯＸ４０×ＴＩＭ−３、ＯＸ４０×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×ＯＸ４０、ＰＤ−１×ＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１×ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４×ＯＸ４０、ＬＡＧ−３×ＯＸ４０、ＴＩＭ−３×ＯＸ４０、ＢＴＬＡ×ＯＸ４０、ＧＩＴＲ×ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ×ＰＤ−１、ＧＩＴＲ×ＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲ×ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ×ＬＡＧ−３、ＧＩＴＲ×ＴＩＭ−３、ＧＩＴＲ×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×ＧＩＴＲ、ＰＤ−１×ＧＩＴＲ、ＰＤ−Ｌ１×ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４×ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３×ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３×ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ×ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ×ＴＩＧＩＴ、４−１ＢＢ×ＰＤ−１、４−１ＢＢ×ＰＤ−Ｌ１、４−１ＢＢ×ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ×ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ×ＴＩＭ−３、４−１ＢＢ×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×４−１ＢＢ、ＰＤ−１×４−１ＢＢ、ＰＤ−Ｌ１×４−１ＢＢ、ＣＴＬＡ−４×４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３×４−１ＢＢ、ＴＩＭ−３×４−１ＢＢ、およびＢＴＬＡ×４−１ＢＢが含まれる（Ｆａｂを最初に列挙し、「追加の」Ｆｖを２番目に列挙する）。
【０２０３】
これらの組み合わせについてのＡＢＤ配列は、配列表に開示されている通りでも図に示されている通りでもよい。
【０２０４】
さらに、ｍＡｂ−ＦｖフォーマットのＦｃドメインは、スキュー変異（例えば、図４に示されるような１セットのアミノ酸置換）を含み、特に有用なスキュー変異は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択され、任意で除去変異（図６に示すものを含むエラー！参照元が見つかりません。）を含み、任意で荷電ｓｃＦｖリンカー（図８に示すものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異（図５に示すものを含むエラー！参照元が見つかりません。）を含む。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ−Ｆｖフォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、および除去変異を含む。したがって、いくつかの実施形態は、以下を含むｍＡｂ−Ｆｖフォーマットを含む：ａ）スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと共に、第１のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、第１の可変軽鎖ドメインと共に、本明細書で概説されるような第１の受容体（共刺激受容体またはチェックポイント受容体のいずれか）に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の可変重鎖と共に第２の受容体（共刺激またはチェックポイント受容体の他方）に連結するＦｖ（ＡＢＤ）を構成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体、ならびにｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖。このフォーマットのいくつかの実施形態において特に有用なものは、（Ｆａｂ−ｓｃＦｖの順で）ＩＣＯＳ×ＰＤ−１、ＰＤ−１×ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｌ１×ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ×ＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲ×ＰＤ−１、ＯＸ４０×ＰＤ−１および４−１ＢＢ×ＰＤ−１である。このフォーマットのこれらの変異を有するいくつかの特定の実施形態において：
【０２０６】
（１）フォーマットが、［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤを有するＩＣＯＳに連結するＦａｂ  ＡＢＤを含む。
【０２０７】
（２）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖ  ＡＢＤと組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０２０８】
（３）フォーマットが、ＣＴＬＡ−４に連結するＡＢＤ  Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９を含むｓｃＦｖと組み合わせたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０２０９】
（４）フォーマットが、ＬＡＧ−３に連結するＡＢＤ  ７Ｇ８＿Ｈ．３０３＿Ｌ１．３４と組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０２１０】
（５）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＧＩＴＲに連結する。
【０２１１】
（６）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＯＸ４０に連結する。
【０２１２】
（７）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＩＣＯＳに連結する。
【０２１３】
８）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、Ｆａｂは４−１ＢＢに連結する。
【０２１４】
（９）フォーマットが、ＩＣＯＳに連結するＨ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤおよびＰＤ−Ｌ１に連結するＡＢＤを含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ−Ｆｖフォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、除去変異、およびＦｃＲｎ変異を含む。したがって、いくつかの実施形態は、以下を含むｍＡｂ−Ｆｖフォーマットを含む：ａ）スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと共に、第１のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、第１の可変軽鎖ドメインと共に、本明細書で概説されるような第１のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の可変重鎖と共に第２のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖ（ＡＢＤ）を構成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体、ならびにｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖。このフォーマットのいくつかの実施形態において特に有用なものは、（Ｆａｂ−ｓｃＦｖの順で）ＩＣＯＳ×ＰＤ−１、ＩＣＯＳ×ＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲ×ＰＤ−１、ＯＸ４０×ＰＤ−１および４−１ＢＢ×ＰＤ−１である。
【０２１６】
（任意でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ含む）図７５からのｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１と類似するｍＡｂ−Ｆｖ配列に関して、ヒトＩＣＯＳに連結する具体的なＡＢＤは、［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０および［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０、ならびに図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７に示されるもの、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５に示されるものである。
【０２１７】
（任意でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ含む）図７５からのｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１と類似するｍＡｂ−のＦｖ配列に関して、ヒトＰＤ−Ｌ１に連結する具体的なＡＢＤは、図１５、図７３、および図７８に示されるもの、ならびに配列番号３９６１〜４４３２に示されるものである。
【０２１８】
（任意でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ含む）図７５からのｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１と類似するｍＡｂ−のＦｖ配列に関して、ヒトＧＩＴＲに連結する具体的なＡＢＤは、図１８、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２８２〜２６２９０に列挙されるものである。
【０２１９】
（任意でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ含む）図７５からのｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１と類似するｍＡｂ−のＦｖ配列に関して、ヒト４−１ＢＢに連結する具体的なＡＢＤは、図１６、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２６２〜２６７１中のものである。
【０２２０】
（任意でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ含む）図７５からのｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１と類似するｍＡｂ−のＦｖ配列に関して、ヒトＯＸ４０に連結する具体的なＡＢＤは、図１７、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２７２〜２６２８１に列挙されるものである。
【０２２１】
（任意でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ含む）図７５からのｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１と類似するｍＡｂ−のＦｖ配列に関して、ヒトＰＤ−Ｌ１に連結する具体的なＡＢＤは、図１５、図７３、および図７８からのもの、ならびに配列番号３９６１〜４４３２からのものである。
【０２２２】
Ｃ．ｍＡｂ−ｓｃＦｖ
本発明において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、ｍＡｂ−ｓｃＦｖフォーマットである。この実施形態では、フォーマットは、単量体の１つへのｓｃＦｖのＣ末端連結の使用に依存し、したがって第３の抗原連結ドメインを形成し、ここで、２つの単量体のＦａｂ部分は１つの受容体標的と連結し、「追加の」ｓｃＦｖドメインは他方の受容体標的（一般的に一価連結した共刺激受容体）に連結する。
【０２２３】
この実施形態では、第１の単量体は、いずれかの配向で、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むＣ末端共有連結ｓｃＦｖを有する第１の重鎖（可変重鎖ドメインおよび定常ドメインを含む）を含む（ｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意のリンカー］−ｖｈ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ２またはｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−［任意のリンカー］−ｖｌ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ２）。この実施形態はさらに、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖を利用し、これらは重鎖と会合して標的受容体の１つに連結する２つの同一のＦａｂを形成する。本明細書中の多くの実施形態に関して、これらのコンストラクトは、本明細書中に所望され記載されるように、スキュー変異、ｐＩ変異、除去変異、さらなるＦｃ変異などを含む。この実施形態では、適切なＦｖ対には、ＩＣＯＳ×ＰＤ−１、ＩＣＯＳ×ＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳ×ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ×ＬＡＧ−３、ＩＣＯＳ×ＴＩＭ−３、ＩＣＯＳ×ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ×ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴ×ＩＣＯＳ、ＰＤ−１×ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｌ１×ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４×ＩＣＯＳ、ＬＡＧ−３×ＩＣＯＳ、ＴＩＭ−３×ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ×ＩＣＯＳ、ＯＸ４０×ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０×ＰＤ−１、ＯＸ４０×ＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０×ＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０×ＬＡＧ−３、ＯＸ４０×ＴＩＭ−３、ＯＸ４０×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×ＯＸ４０、ＰＤ−１×ＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１×ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４×ＯＸ４０、ＬＡＧ−３×ＯＸ４０、ＴＩＭ−３×ＯＸ４０、ＢＴＬＡ×ＯＸ４０、ＧＩＴＲ×ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ×ＰＤ−１、ＧＩＴＲ×ＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲ×ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ×ＬＡＧ−３、ＧＩＴＲ×ＴＩＭ−３、ＧＩＴＲ×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×ＧＩＴＲ、ＰＤ−１×ＧＩＴＲ、ＰＤ−Ｌ１×ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４×ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３×ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３×ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ×ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ×ＴＩＧＩＴ、４−１ＢＢ×ＰＤ−１、４−１ＢＢ×ＰＤ−Ｌ１、４−１ＢＢ×ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ×ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ×ＴＩＭ−３、４−１ＢＢ×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×４−１ＢＢ、ＰＤ−１×４−１ＢＢ、ＰＤ−Ｌ１×４−１ＢＢ、ＣＴＬＡ−４×４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３×４−１ＢＢ、ＴＩＭ−３×４−１ＢＢ、およびＢＴＬＡ×４−１ＢＢが含まれる（Ｆａｂを最初に列挙し、ｓｃＦｖを２番目に列挙する）。
【０２２４】
これらの組み合わせについてのＡＢＤ配列は、配列表に開示されている通りでも図に示されている通りでもよい。
【０２２５】
さらに、ｍＡｂ−ｓｃＦｖフォーマットのＦｃドメインは、スキュー変異（例えば、図４に示されるような１セットのアミノ酸置換）を含み、特に有用なスキュー変異は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択され、任意で除去変異（図６に示すものを含む）を含み、任意で荷電ｓｃＦｖリンカー（図８に示すものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異（図５に示すものを含むエラー！参照元が見つかりません。）を含む。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ−ｓｃＦｖフォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、および除去変異を含む。したがって、いくつかの実施形態は、以下を含むボトルオープナーフォーマットを含む：ａ）スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと共に、第１の受容体に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の受容体に連結するｓｃＦｖを含む第１の単量体、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、第１の可変軽鎖ドメインと共に、本明細書で概説されるような第１の受容体に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメインを含む第２の単量体、ならびにｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖。このフォーマットのこれらの変異を有するいくつかの特定の実施形態において：
【０２２７】
（１）フォーマットが、［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤを有するＩＣＯＳに連結するＦａｂ  ＡＢＤを含む。
【０２２８】
（２）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖ  ＡＢＤと組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０２２９】
（３）フォーマットが、ＣＴＬＡ−４に連結するＡＢＤ  Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９を含むｓｃＦｖと組み合わせたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０２３０】
（４）フォーマットが、ＬＡＧ−３に連結するＡＢＤ  ７Ｇ８＿Ｈ．３０３＿Ｌ１．３４と組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０２３１】
（５）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＧＩＴＲに連結する。
【０２３２】
（６）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＯＸ４０に連結する。
【０２３３】
（７）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＩＣＯＳに連結する。
【０２３４】
８）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、Ｆａｂは４−１ＢＢに連結する。
【０２３５】
（９）フォーマットが、ＩＣＯＳに連結するＨ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤおよびＰＤ−Ｌ１に連結するＡＢＤを含む。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ−ｓｃＦｖフォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、除去変異、およびＦｃＲｎ変異を含む。したがって、いくつかの実施形態は、以下を含むｍＡｂ−ｓｃＦｖフォーマットを含む：ａ）スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと共に、第１の受容体に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の受容体に連結するｓｃＦｖを含む第１の単量体、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、第１の可変軽鎖ドメインと共に、本明細書で概説されるような第１のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメインを含む第２の単量体、ならびにｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖。
【０２３７】
（任意でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ含む）図７５からのｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１において、ヒトＩＣＯＳに連結する具体的なＡＢＤは、図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７に示されるもの、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５に示されるものである。
【０２３８】
（任意でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ含む）図７５からのｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１において、ヒトＧＩＴＲに連結する具体的なＡＢＤは、図１８、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２８２〜２６２９０に列挙されるものである。
【０２３９】
（任意でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ含む）図７５からのｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１において、ヒト４−１ＢＢに連結する具体的なＡＢＤは、図１６、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２６２〜２６７１中のものを含む。
【０２４０】
（任意でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ含む）図７５からのｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１において、ヒトＯＸ−４０に連結する具体的なＡＢＤは、図１７、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２７２〜２６２８１に列挙されるものである。
【０２４１】
（任意でＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ含む）図７５からのｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格１において、ヒトＰＤ−Ｌ１に連結する具体的なＡＢＤは、図１５、図７３、および図７８、ならびに配列番号３９６１〜４４３２を含む。
【０２４２】
Ｄ．中央ｓｃＦｖ
本発明において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、中央−ｓｃＦｖフォーマットである。この実施形態では、フォーマットは、挿入されたｓｃＦｖドメインの使用に依存し、したがって第３の抗原連結ドメインを形成し、ここで、２つの単量体のＦａｂ部分は１つの受容体標的と連結し、「追加の」ｓｃＦｖドメインは別のもの（同様に、一般的に一価連結した共刺激受容体）に連結する。ｓｃＦｖドメインは、Ｆｃドメインと単量体のうちの１つのＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入され、したがって第３の抗原連結ドメインを提供する。
【０２４３】
この実施形態では、１つの単量体は、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むｓｃＦｖと共に、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン（および任意のヒンジ）ならびにＦｃドメインを含む第１の重鎖を含む。ｓｃＦｖは、任意のドメインリンカーを使用して、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有連結している（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意のリンカー］−ｖｈ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ２−［ヒンジを含む任意のリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３、またはｓｃＦｖとは逆の配向、ｖｈ１−ＣＨ１−［任意のリンカー］−ｖｌ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ２−［ヒンジを含む任意のリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）。いくつかの実施形態では、任意選択のリンカーはヒンジまたはその断片である。他の単量体は標準的なＦａｂ側（例えば、ｖｈ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）である。この実施形態はさらに、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖を利用し、これらは重鎖と会合してチェックポイント阻害剤に連結する２つの同一のＦａｂを形成する。本明細書中の多くの実施形態に関して、これらのコンストラクトは、本明細書中に所望され記載されるように、スキュー変異、ｐＩ変異、除去変異、さらなるＦｃ変異などを含む。この実施形態では、適切なＦｖ対には、ＩＣＯＳ×ＰＤ−１、ＩＣＯＳ×ＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳ×ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ×ＬＡＧ−３、ＩＣＯＳ×ＴＩＭ−３、ＩＣＯＳ×ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ×ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴ×ＩＣＯＳ、ＰＤ−１×ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｌ１×ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４×ＩＣＯＳ、ＬＡＧ−３×ＩＣＯＳ、ＴＩＭ−３×ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ×ＩＣＯＳ、ＯＸ４０×ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０×ＰＤ−１、ＯＸ４０×ＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０×ＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０×ＬＡＧ−３、ＯＸ４０×ＴＩＭ−３、ＯＸ４０×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×ＯＸ４０、ＰＤ−１×ＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１×ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４×ＯＸ４０、ＬＡＧ−３×ＯＸ４０、ＴＩＭ−３×ＯＸ４０、ＢＴＬＡ×ＯＸ４０、ＧＩＴＲ×ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ×ＰＤ−１、ＧＩＴＲ×ＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲ×ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ×ＬＡＧ−３、ＧＩＴＲ×ＴＩＭ−３、ＧＩＴＲ×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×ＧＩＴＲ、ＰＤ−１×ＧＩＴＲ、ＰＤ−Ｌ１×ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４×ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３×ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３×ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ×ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ×ＴＩＧＩＴ、４−１ＢＢ×ＰＤ−１、４−１ＢＢ×ＰＤ−Ｌ１、４−１ＢＢ×ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ×ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ×ＴＩＭ−３、４−１ＢＢ×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×４−１ＢＢ、ＰＤ−１×４−１ＢＢ、ＰＤ−Ｌ１×４−１ＢＢ、ＣＴＬＡ−４×４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３×４−１ＢＢ、ＴＩＭ−３×４−１ＢＢ、およびＢＴＬＡ×４−１ＢＢが含まれる（Ｆａｂを最初に列挙し、ｓｃＦｖを２番目に列挙する）。
【０２４４】
これらの組み合わせについてのＡＢＤ配列は、配列表に開示されている通りでも図に示されている通りでもよい。
【０２４５】
さらに、中央ｓｃＦｖフォーマットのＦｃドメインは、一般にスキュー変異（例えば、図４に示されるような１セットのアミノ酸置換）を含み、特に有用なスキュー変異は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択され、任意で除去変異（図６に示すものを含む）を含み、任意で荷電ｓｃＦｖリンカー（図８に示すものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異（図５に示すものを含む）を含む。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、中央ｓｃＦｖフォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、および除去変異を含む。したがって、いくつかの実施形態は、以下を含む中央ｓｃＦｖフォーマットを含む：ａ）スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと共に、第１の受容体に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、第１の可変軽鎖ドメインと共に、本明細書で概説されるような第２の受容体に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメインを含む第２の単量体、ならびにｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖。このフォーマットのこれらの変異を有するいくつかの特定の実施形態において：
【０２４７】
（１）フォーマットが、［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤを有するＩＣＯＳに連結するＦａｂ  ＡＢＤを含む。
【０２４８】
（２）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖ  ＡＢＤと組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０２４９】
（３）フォーマットが、ＣＴＬＡ−４に連結するＡＢＤ  Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９を含むｓｃＦｖと組み合わせたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０２５０】
（４）フォーマットが、ＬＡＧ−３に連結するＡＢＤ  ７Ｇ８＿Ｈ．３０３＿Ｌ１．３４と組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０２５１】
（５）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＧＩＴＲに連結する。
【０２５２】
（６）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＯＸ４０に連結する。
【０２５３】
（７）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＩＣＯＳに連結する。
【０２５４】
８）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、Ｆａｂは４−１ＢＢに連結する。
【０２５５】
（９）フォーマットが、ＩＣＯＳに連結するＨ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤおよびＰＤ−Ｌ１に連結するＡＢＤを含む。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、中央ｓｃＦｖフォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、除去変異、およびＦｃＲｎ変異を含む。したがって、いくつかの実施形態は、以下を含む中央−ｓｃＦｖフォーマットを含む：ａ）スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと共に、第１の受容体に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の受容体に連結するｓｃＦｖドメインを含む第１の単量体、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、第１の可変軽鎖ドメインと共に、本明細書で概説されるような第１のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメインを含む第２の単量体、ならびにｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖。この実施形態では、適切なＦｖ対は、ＩＣＯＳ×ＰＤ−１、ＰＤ−１×ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ×ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ１×ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ×ＣＴＬＡ−４、およびＣＴＬＡ−４×ＩＣＯＳを含む（Ｆａｂを最初に列挙し、ｓｃＦｖを２番目に列挙する）。
【０２５７】
図５５の中央−ｓｃＦｖ配列を使用する中央−ｓｃＦｖ配列に関して、ＩＣＯＳに連結する適切なＦｖは、図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７に示されるもの、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５に示されるものを含むがこれらに限定されない。
【０２５８】
図５５の中央−ｓｃＦｖ配列を使用する中央−ｓｃＦｖ配列に関して、ＰＤ−Ｌ１に連結する適切なＦｖは、図１５、図７３、および図７８に示されるもの、ならびに配列番号３９６１〜４４３２に示されるものを含むがこれらに限定されない。
【０２５９】
図５５の中央−ｓｃＦｖ配列を使用する中央−ｓｃＦｖ配列に関して、ＧＩＴＲに連結する適切なＦｖは、図１８、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２８２〜２６２９０に列挙されるものを含むがこれらに限定されない。
【０２６０】
図５５の中央−ｓｃＦｖ配列を使用する中央−ｓｃＦｖ配列に関して、ＯＸ４０に連結する適切なＦｖは、図１７、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２７２〜２６２８１に列挙されるものを含むがこれらに限定されない。
【０２６１】
図５５の中央−ｓｃＦｖ配列を使用する中央−ｓｃＦｖ配列に関して、４−１ＢＢに連結する適切なＦｖは、図１６、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２６２〜２６７１を含むがこれらに限定されない。
【０２６２】
Ｅ．中央−ｓｃＦｖ２
本発明において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、二重特異性および三重特異性である、中央−ｓｃＦｖ２フォーマットである。この実施形態では、フォーマットは、２つの挿入されたｓｃＦｖドメインの使用に依存し、したがって第３および第４の抗原連結ドメインを形成し、ここで、２つの単量体のＦａｂ部分は１つの受容体標的と連結し、「追加の」ｓｃＦｖドメインは別のものに連結する。ｓｃＦｖドメインは、単量体のＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域の間に挿入されている。
【０２６３】
この実施形態では、両方の単量体は、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むｓｃＦｖと共に、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン（および任意のヒンジ）ならびにＦｃドメインを含む第１の重鎖を含む。ｓｃＦｖは、任意のドメインリンカーを使用して、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有連結している（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意のリンカー］−ｖｈ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ２−［ヒンジを含む任意のリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３、またはｓｃＦｖとは逆の配向、ｖｈ１−ＣＨ１−［任意のリンカー］−ｖｌ２−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ２−［ヒンジを含む任意のリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）。いくつかの実施形態では、任意選択のリンカーはヒンジまたはその断片である。この実施形態はさらに、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖を利用し、これらは重鎖と会合して受容体に連結する２つの同一のＦａｂを形成する。本明細書中の多くの実施形態に関して、これらのコンストラクトは、本明細書中に所望され記載されるように、スキュー変異、ｐＩ変異、除去変異、さらなるＦｃ変異などを含む。この実施形態では、適切なＦｖ対には、ＩＣＯＳ×ＰＤ−１、ＩＣＯＳ×ＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳ×ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ×ＬＡＧ−３、ＩＣＯＳ×ＴＩＭ−３、ＩＣＯＳ×ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ×ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴ×ＩＣＯＳ、ＰＤ−１×ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｌ１×ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４×ＩＣＯＳ、ＬＡＧ−３×ＩＣＯＳ、ＴＩＭ−３×ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ×ＩＣＯＳ、ＯＸ４０×ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０×ＰＤ−１、ＯＸ４０×ＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０×ＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０×ＬＡＧ−３、ＯＸ４０×ＴＩＭ−３、ＯＸ４０×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×ＯＸ４０、ＰＤ−１×ＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１×ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４×ＯＸ４０、ＬＡＧ−３×ＯＸ４０、ＴＩＭ−３×ＯＸ４０、ＢＴＬＡ×ＯＸ４０、ＧＩＴＲ×ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ×ＰＤ−１、ＧＩＴＲ×ＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲ×ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ×ＬＡＧ−３、ＧＩＴＲ×ＴＩＭ−３、ＧＩＴＲ×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×ＧＩＴＲ、ＰＤ−１×ＧＩＴＲ、ＰＤ−Ｌ１×ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４×ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３×ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３×ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ×ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ×ＴＩＧＩＴ、４−１ＢＢ×ＰＤ−１、４−１ＢＢ×ＰＤ−Ｌ１、４−１ＢＢ×ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ×ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ×ＴＩＭ−３、４−１ＢＢ×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×４−１ＢＢ、ＰＤ−１×４−１ＢＢ、ＰＤ−Ｌ１×４−１ＢＢ、ＣＴＬＡ−４×４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３×４−１ＢＢ、ＴＩＭ−３×４−１ＢＢ、およびＢＴＬＡ×４−１ＢＢが含まれる（Ｆａｂを最初に列挙し、ｓｃＦｖを２番目に列挙する）。
【０２６４】
これらの組み合わせについてのＡＢＤ配列は、配列表に開示されている通りでも図に示されている通りでもよい。
【０２６５】
さらに、中央ｓｃＦｖ２フォーマットのＦｃドメインは、一般にスキュー変異（例えば、図４に示されるような１セットのアミノ酸置換）を含み、特に有用なスキュー変異は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択され、任意で除去変異（図６に示すものを含む）を含み、任意で荷電ｓｃＦｖリンカー（図８に示すものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異（図５に示すものを含む）を含む。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、中央ｓｃＦｖ２フォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、および除去変異を含む。したがって、いくつかの実施形態は、以下を含む中央ｓｃＦｖフォーマットを含む：ａ）スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと共に、第１の受容体に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、第１の可変軽鎖ドメインと共に、本明細書で概説されるような第２の受容体に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメインを含む第２の単量体、ならびにｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖。このフォーマットのこれらの変異を有するいくつかの特定の実施形態において：
【０２６７】
（１）フォーマットが、［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤを有するＩＣＯＳに連結するＦａｂ  ＡＢＤを含む。
【０２６８】
（２）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖ  ＡＢＤと組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０２６９】
（３）フォーマットが、ＣＴＬＡ−４に連結するＡＢＤ  Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９を含むｓｃＦｖと組み合わせたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０２７０】
（４）フォーマットが、ＬＡＧ−３に連結するＡＢＤ  ７Ｇ８＿Ｈ．３０３＿Ｌ１．３４と組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０２７１】
（５）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＧＩＴＲに連結する。
【０２７２】
（６）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＯＸ４０に連結する。
【０２７３】
（７）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＩＣＯＳに連結する。
【０２７４】
８）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、Ｆａｂは４−１ＢＢに連結する。
【０２７５】
（９）フォーマットが、ＩＣＯＳに連結するＨ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤおよびＰＤ−Ｌ１に連結するＡＢＤを含む。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、中央ｓｃＦｖ２フォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、除去変異、およびＦｃＲｎ変異を含む。したがって、いくつかの実施形態は、以下を含む中央−ｓｃＦｖフォーマットを含む：ａ）スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと共に、第１の受容体に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の受容体に連結するｓｃＦｖドメインを含む第１の単量体、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、第１の可変軽鎖ドメインと共に、本明細書で概説されるような第１のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメインを含む第２の単量体、ならびにｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖。この実施形態では、適切なＦｖ対は、ＩＣＯＳ×ＰＤ−１、ＰＤ−１×ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ×ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ１×ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ×ＣＴＬＡ−４、およびＣＴＬＡ−４×ＩＣＯＳを含む（Ｆａｂを最初に列挙し、ｓｃＦｖを２番目に列挙する）。
【０２７７】
図５５の中央−ｓｃＦｖ２配列を使用する中央−ｓｃＦｖ２配列に関して、ＩＣＯＳに連結する適切なＦｖは、図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７に示されるもの、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５に示されるものを含むがこれらに限定されない。
【０２７８】
図５５の中央−ｓｃＦｖ２配列を使用する中央−ｓｃＦｖ２配列に関して、ＰＤ−Ｌ１に連結する適切なＦｖは、図１５、図７３、および図７８に示されるもの、ならびに配列番号３９６１〜４４３２に示されるものを含むがこれらに限定されない。
【０２７９】
図５５の中央−ｓｃＦｖ配列を使用する中央−ｓｃＦｖ２配列に関して、ＧＩＴＲに連結する適切なＦｖは、図１８、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２８２〜２６２９０に列挙されるものを含むがこれらに限定されない。
【０２８０】
図５５の中央−ｓｃＦｖ配列を使用する中央−ｓｃＦｖ２配列に関して、ＯＸ４０に連結する適切なＦｖは、図１７、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２７２〜２６２８１に列挙されるものを含むがこれらに限定されない。
【０２８１】
図５５の中央−ｓｃＦｖ配列を使用する中央−ｓｃＦｖ２配列に関して、４−１ＢＢに連結する適切なＦｖは、図１６、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２６２〜２６７１を含むがこれらに限定されない。
【０２８２】
Ｆ．１アームのｍＡｂ
上記のように、驚くべきことにそして予想外に、標的に対する単一のＡＢＤを含む一価の共刺激抗体は、Ｔ細胞を活性化するのに有効性を示す。
【０２８３】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、（安定性のために）ヘテロ二量体Ｆｃドメインを含む図の図２Ｎに示すような、一価の単一特異性抗体を提供する。この実施形態では、この実施形態では、一方の単量体はＦｃドメインのみを含み、他方の単量体はＨＣ（ＶＨ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）である。この実施形態はさらに、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を利用し、これらは重鎖と会合してＦａｂを形成する。本明細書中の多くの実施形態に関して、これらのコンストラクトは、本明細書中に所望され記載されるように、スキュー変異、ｐＩ変異、除去変異、さらなるＦｃ変異などを含む。この実施形態において、適切なＡＢＤは、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、または４−１ＢＢなどの共刺激受容体に連結する。
【０２８４】
これらの組み合わせについてのＡＢＤ配列は、配列表に開示されている通りでも図に示されている通りでもよい。
【０２８５】
さらに、Ｆｃドメインは、一般にスキュー変異（例えば、図４に示されるような１セットのアミノ酸置換）を含み、特に有用なスキュー変異は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択され、任意で除去変異（図６に示すものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異（図５に示すものを含む）を含む。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂフォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、および除去変異を含む。したがって、いくつかの実施形態は、以下を含むフォーマットを含む：ａ）スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む第１の（Ｆｃ）単量体、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、第１の可変軽鎖ドメインと共に、本明細書で概説されるような共刺激受容体に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメインを含む第２の単量体。
【０２８７】
このフォーマットにおいて、ヒトＩＣＯＳに連結する具体的なＡＢＤには、［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０および［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０、ならびに図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７に示されるもの、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５に示されるものが含まれるがこれらには限定されない。
【０２８８】
このフォーマットにおいて、ヒトＧＩＴＲに連結する具体的なＡＢＤには、図１８、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２８２〜２６２９０に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０２８９】
このフォーマットにおいて、ＯＸ４０に連結する具体的なＡＢＤには、図１７、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２７２〜２６２８１に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０２９０】
このフォーマットにおいて、ヒト４−１ＢＢに連結する具体的なＡＢＤには、図１６、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２６２〜２６７１が含まれるがこれらには限定されない。
【０２９１】
このフォーマットにおいて、ヒトＰＤ−Ｌ１に連結する具体的なＡＢＤには、図１５、図７３、および図７８、ならびに配列番号３９６１〜４４３２が含まれるがこれらには限定されない。
【０２９２】
具体的な「１アームのｍＡｂ」は、図面および配列表に示されている。
【０２９３】
Ｇ．二重特異性ｍＡｂ
本発明において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、二重特異性および三重特異性である、二重特異性ｍＡｂフォーマットである。この実施形態では、フォーマットは、その後組み換えられる別々のホモ二量体抗体の作製に依存する。このフォーマットでは、１つのＨＣ−ＬＣ対（ＶＨ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３およびＶＬ１−ＬＣ）と第２のＨｃ−ＬＣ対（ＶＨ２−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３およびＶＬ２−ＬＣ）、例えば２つの異なる重鎖と２つの異なる軽鎖が存在する。実施例５Ｉ（ｄ）を参照する。
【０２９４】
このフォーマットでは、適切な対は、ＩＣＯＳとＰＤ−１、ＩＣＯＳとＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳとＬＡＧ−３、ＩＣＯＳとＴＩＭ−３、ＩＣＯＳとＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳとＢＴＬＡ、ＩＣＯＳとＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲとＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲとＰＤ−１、ＧＩＴＲとＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲとＬＡＧ−３、ＧＩＴＲとＴＩＭ−３、ＧＩＴＲとＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲとＢＴＬＡ、ＯＸ４０とＰＤ−１、ＯＸ４０とＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０とＣＴＬＡ−４、ＩＣ  ＯＸ４０  ＯＳとＬＡＧ−３、ＯＸ４０とＴＩＭ−３、ＯＸ４０とＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０とＢＴＬＡ、４−１ＢＢとＰＤ−１、４−１ＢＢとＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢとＬＡＧ−３、４−１ＢＢとＴＩＭ−３、４−１ＢＢとＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴと４−１ＢＢ、および４−１ＢＢとＢＴＬＡを含む。
【０２９５】
このフォーマットのこれらの変異を有するいくつかの特定の実施形態において：
【０２９６】
（１）フォーマットが、［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤを有するＩＣＯＳに連結するＦａｂ  ＡＢＤを含む。
【０２９７】
（２）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むＡＢＤと組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０２９８】
（３）フォーマットが、ＣＴＬＡ−４に連結するＡＢＤ  Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９と組み合わせたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０２９９】
（４）フォーマットが、ＬＡＧ−３に連結するＡＢＤ  ７Ｇ８＿Ｈ．３０３＿Ｌ１．３４と組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０３００】
（５）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＧＩＴＲに連結する。
【０３０１】
（６）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＯＸ４０に連結する。
【０３０２】
（７）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＩＣＯＳに連結する。
【０３０３】
８）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、Ｆａｂは４−１ＢＢに連結する。
【０３０４】
（９）フォーマットが、ＩＣＯＳに連結するＨ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤおよびＰＤ−Ｌ１に連結するＡＢＤを含む。
【０３０５】
このフォーマットにおいて、ヒトＩＣＯＳに連結する具体的なＡＢＤには、［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０および［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０、ならびに図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７に示されるもの、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５に示されるものが含まれるがこれらには限定されない。
【０３０６】
このフォーマットにおいて、ヒトＧＩＴＲに連結する具体的なＡＢＤには、図１８、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２８２〜２６２９０に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０３０７】
このフォーマットにおいて、ＯＸ４０に連結する具体的なＡＢＤには、図１７、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２７２〜２６２８１に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０３０８】
このフォーマットにおいて、ヒト４−１ＢＢに連結する具体的なＡＢＤには、図１６、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２６２〜２６７１が含まれるがこれらには限定されない。
【０３０９】
このフォーマットにおいて、ヒトＰＤ−Ｌ１に連結する具体的なＡＢＤには、図１５、図７３、および図７８、ならびに配列番号３９６１〜４４３２が含まれるがこれらには限定されない。
【０３１０】
Ｈ．中央−Ｆｖフォーマット
本発明において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、図２に示される中央−Ｆｖフォーマットである。この実施形態では、フォーマットは、挿入されたＦｖドメインの使用に依存し、したがって「追加の」第３の抗原連結ドメインを形成し、ここで、２つの単量体のＦａｂ部分は１つの受容体と連結し、「追加の」中央−Ｆｖドメインは別のもの（一般的に、共刺激受容体）に連結する。Ｆｖドメインは、単量体のＦｃドメインとＣＨ１−Ｆｖ領域との間に挿入され、したがって第３の抗原連結ドメインを提供し、ここで各単量体はＦｖの構成要素を含む（例えば、一方の単量体は可変重鎖ドメインを含み、他方は「追加の」中央Ｆｖドメインのドメインの可変軽鎖を含む）。
【０３１１】
この実施形態において、１つの単量体は、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＦｃドメインを含む第１の重鎖、およびさらなる可変軽鎖ドメインを含む。さらなる可変軽鎖ドメインは、ドメインリンカーを用いて、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有連結している（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意のリンカー］−ｖｌ２−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）。他の単量体は、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＦｃドメインを含む第１の重鎖、およびさらなる可変重鎖ドメインを含む（ｖｈ１−ＣＨ１−［任意のリンカー］−ｖｈ２−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）。さらなる可変重鎖ドメインのドメインは、ドメインリンカーを用いて、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有連結している。この実施形態は、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖を利用し、これは重鎖と会合して各々が受容体に連結する２つの同一のＦａｂを形成する。さらなる可変重鎖ドメインおよびさらなる可変軽鎖ドメインは、第２の受容体に連結する「追加の」中央Ｆｖを形成する。本明細書中の多くの実施形態に関して、これらのコンストラクトは、本明細書中に所望され記載されるように、スキュー変異、ｐＩ変異、除去変異、さらなるＦｃ変異などを含む。この実施形態では、適切なＦｖ対には、ＩＣＯＳ×ＰＤ−１、ＩＣＯＳ×ＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳ×ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ×ＬＡＧ−３、ＩＣＯＳ×ＴＩＭ−３、ＩＣＯＳ×ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ×ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴ×ＩＣＯＳ、ＰＤ−１×ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｌ１×ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４×ＩＣＯＳ、ＬＡＧ−３×ＩＣＯＳ、ＴＩＭ−３×ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ×ＩＣＯＳ、ＯＸ４０×ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０×ＰＤ−１、ＯＸ４０×ＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０×ＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０×ＬＡＧ−３、ＯＸ４０×ＴＩＭ−３、ＯＸ４０×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×ＯＸ４０、ＰＤ−１×ＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１×ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４×ＯＸ４０、ＬＡＧ−３×ＯＸ４０、ＴＩＭ−３×ＯＸ４０、ＢＴＬＡ×ＯＸ４０、ＧＩＴＲ×ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ×ＰＤ−１、ＧＩＴＲ×ＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲ×ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ×ＬＡＧ−３、ＧＩＴＲ×ＴＩＭ−３、ＧＩＴＲ×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×ＧＩＴＲ、ＰＤ−１×ＧＩＴＲ、ＰＤ−Ｌ１×ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４×ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３×ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３×ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ×ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ×ＴＩＧＩＴ、４−１ＢＢ×ＰＤ−１、４−１ＢＢ×ＰＤ−Ｌ１、４−１ＢＢ×ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ×ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ×ＴＩＭ−３、４−１ＢＢ×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×４−１ＢＢ、ＰＤ−１×４−１ＢＢ、ＰＤ−Ｌ１×４−１ＢＢ、ＣＴＬＡ−４×４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３×４−１ＢＢ、ＴＩＭ−３×４−１ＢＢ、およびＢＴＬＡ×４−１ＢＢが含まれる（Ｆａｂを最初に列挙し、「追加の」中央Ｆｖを２番目に列挙する）。
【０３１２】
これらの組み合わせについてのＡＢＤ配列は、配列表に開示されている通りでも図に示されている通りでもよい。
【０３１３】
さらに、中央−ＦｖフォーマットのＦｃドメインは、一般にスキュー変異（例えば、図４に示されるような１セットのアミノ酸置換）を含み、特に有用なスキュー変異は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択され、任意で除去変異（図６に示すものを含む）を含み、任意で荷電ｓｃＦｖリンカー（図８に示すものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異（図５に示すものを含む）を含む。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、中央−Ｆｖフォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、および除去変異を含む。したがって、いくつかの実施形態は、以下を含む中央ｓｃＦｖフォーマットを含む：ａ）スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと共に、第１の受容体に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、第１の可変軽鎖ドメインと共に、本明細書で概説されるような第２の受容体に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメインを含む第２の単量体、ならびにｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖。このフォーマットのこれらの変異を有するいくつかの特定の実施形態において：
【０３１５】
（１）フォーマットが、［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤを有するＩＣＯＳに連結するＦａｂ  ＡＢＤを含む。
【０３１６】
（２）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖ  ＡＢＤと組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０３１７】
（３）フォーマットが、ＣＴＬＡ−４に連結するＡＢＤ  Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９を含むｓｃＦｖと組み合わせたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０３１８】
（４）フォーマットが、ＬＡＧ−３に連結するＡＢＤ  ７Ｇ８＿Ｈ．３０３＿Ｌ１．３４と組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０３１９】
（５）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＧＩＴＲに連結する。
【０３２０】
（６）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＯＸ４０に連結する。
【０３２１】
（７）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＩＣＯＳに連結する。
【０３２２】
８）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、Ｆａｂは４−１ＢＢに連結する。
【０３２３】
（９）フォーマットが、ＩＣＯＳに連結するＨ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤおよびＰＤ−Ｌ１に連結するＡＢＤを含む。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、中央−Ｆｖフォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、除去変異、およびＦｃＲｎ変異を含む。したがって、いくつかの実施形態は、以下を含む中央−ｓｃＦｖフォーマットを含む：ａ）スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと共に、第１の受容体に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の受容体に連結するｓｃＦｖドメインを含む第１の単量体、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、第１の可変軽鎖ドメインと共に、本明細書で概説されるような第１のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメインを含む第２の単量体、ならびにｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖。この実施形態では、適切なＦｖ対は、ＩＣＯＳ×ＰＤ−１、ＰＤ−１×ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ×ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ１×ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ×ＣＴＬＡ−４、およびＣＴＬＡ−４×ＩＣＯＳを含む（Ｆａｂを最初に列挙し、ｓｃＦｖを２番目に列挙する）。
【０３２５】
中央−Ｆｖフォーマットに関して、ＩＣＯＳに連結する適切なＦｖは、図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７に示されるもの、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５に示されるものを含むがこれらに限定されない。
【０３２６】
中央−Ｆｖフォーマットに関して、ＰＤ−Ｌ１に連結する適切なＦｖは、図１５、図７３、および図７８に示されるもの、ならびに配列番号３９６１〜４４３２に示されるものを含むがこれらに限定されない。
【０３２７】
中央−Ｆｖフォーマットに関して、ＧＩＴＲに連結する適切なＦｖには、図１８、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２８２〜２６２９０に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０３２８】
中央−Ｆｖフォーマットに関して、ＯＸ４０に連結する適切なＦｖには、図１７、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２７２〜２６２８１に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０３２９】
中央−Ｆｖフォーマットに関して、４−１ＢＢに連結する適切なＦｖには、図１６、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２６２〜２６７１が含まれるがこれらには限定されない。
【０３３０】
中央−ＦＶフォーマットに関して、ＰＤ−Ｌ１に連結する適切なＦｖは、図１５、図７３、および図７８のもの、ならびに配列番号３９６１〜４４３２のものを含むがこれらに限定されない。
【０３３１】
Ｉ．１アームの中央−ｓｃＦｖ
本発明において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、図１Ｃに示される１アームの中央−ｓｃＦｖフォーマットである。この実施形態では、一方の単量体はＦｃドメインのみを含み、他方の単量体はＦａｂドメイン（第１の抗原連結ドメイン）、ｓｃＦｖドメイン（第２の抗原連結ドメイン）、およびＦｃドメインを含み、ここでｓｃＦｖドメインはＦｃドメインとＦｃドメインの間に挿入されている。このフォーマットでは、Ｆａｂ部分は１つの受容体標的に連結し、ｓｃＦｖは別のものに連結する。
【０３３２】
この実施形態では、１つの単量体は、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むｓｃＦｖと共に、第１の可変重鎖ドメイン、ＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含む第１の重鎖を含む。ｓｃＦｖは、ＶＨ１−ＣＨ１−［任意のドメインリンカー］−ＶＨ２−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ２−［任意のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３、または、ＶＨ１−ＣＨ１−［任意のドメインリンカー］−ＶＬ２−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ２−［任意のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３のいずれかの配向で、ドメインリンカーを使用して、重鎖定常ドメインのＣＨ１ドメインのＣ末端と第１のＦｃドメインのＮ末端との間に共有連結している。第２の単量体は、Ｆｃドメイン（ＣＨ２−ＣＨ３）を含む。この実施形態はさらに、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を利用し、これらは重鎖と会合してＦａｂを形成する。本明細書中の多くの実施形態に関して、これらのコンストラクトは、本明細書中に所望され記載されるように、スキュー変異、ｐＩ変異、除去変異、さらなるＦｃ変異などを含む。この実施形態では、適切なＦｖ対には、ＩＣＯＳ×ＰＤ−１、ＩＣＯＳ×ＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳ×ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ×ＬＡＧ−３、ＩＣＯＳ×ＴＩＭ−３、ＩＣＯＳ×ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ×ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴ×ＩＣＯＳ、ＰＤ−１×ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｌ１×ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４×ＩＣＯＳ、ＬＡＧ−３×ＩＣＯＳ、ＴＩＭ−３×ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ×ＩＣＯＳ、ＯＸ４０×ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０×ＰＤ−１、ＯＸ４０×ＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０×ＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０×ＬＡＧ−３、ＯＸ４０×ＴＩＭ−３、ＯＸ４０×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×ＯＸ４０、ＰＤ−１×ＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１×ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４×ＯＸ４０、ＬＡＧ−３×ＯＸ４０、ＴＩＭ−３×ＯＸ４０、ＢＴＬＡ×ＯＸ４０、ＧＩＴＲ×ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ×ＰＤ−１、ＧＩＴＲ×ＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲ×ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ×ＬＡＧ−３、ＧＩＴＲ×ＴＩＭ−３、ＧＩＴＲ×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×ＧＩＴＲ、ＰＤ−１×ＧＩＴＲ、ＰＤ−Ｌ１×ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４×ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３×ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３×ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ×ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ×ＴＩＧＩＴ、４−１ＢＢ×ＰＤ−１、４−１ＢＢ×ＰＤ−Ｌ１、４−１ＢＢ×ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ×ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ×ＴＩＭ−３、４−１ＢＢ×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×４−１ＢＢ、ＰＤ−１×４−１ＢＢ、ＰＤ−Ｌ１×４−１ＢＢ、ＣＴＬＡ−４×４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３×４−１ＢＢ、ＴＩＭ−３×４−１ＢＢ、およびＢＴＬＡ×４−１ＢＢが含まれる（Ｆａｂを最初に列挙し、ｓｃＦｖを２番目に列挙する）。
【０３３３】
これらの組み合わせについてのＡＢＤ配列は、配列表に開示されている通りでも図に示されている通りでもよい。
【０３３４】
さらに、１アームの中央−ｓｃＦｖフォーマットのＦｃドメインは、一般にスキュー変異（例えば、図４に示されるような１セットのアミノ酸置換）を含み、特に有用なスキュー変異は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択され、任意で除去変異（図６に示すものを含む）を含み、任意で荷電ｓｃＦｖリンカー（図８に示すものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異（図５に示すものを含む）を含む。
【０３３５】
いくつかの実施形態では、１アームの中央−ｓｃＦｖフォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、および除去変異を含む。したがって、いくつかの実施形態は、以下を含むフォーマットを含む：ａ）スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、軽鎖の可変軽鎖ドメインと共に、第１の受容体に連結するＦｖを構成する可変重鎖ドメイン、および他の受容体に連結するｓｃＦｖを含む第１の単量体、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む第２の単量体、ならびにｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖。このフォーマットのこれらの変異を有するいくつかの特定の実施形態において：
【０３３６】
（１）フォーマットが、［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤを有するＩＣＯＳに連結するＦａｂ  ＡＢＤを含む。
【０３３７】
（２）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖ  ＡＢＤと組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０３３８】
（３）フォーマットが、ＣＴＬＡ−４に連結するＡＢＤ  Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９を含むｓｃＦｖと組み合わせたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０３３９】
（４）フォーマットが、ＬＡＧ−３に連結するＡＢＤ  ７Ｇ８＿Ｈ．３０３＿Ｌ１．３４と組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０３４０】
（５）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＧＩＴＲに連結する。
【０３４１】
（６）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＯＸ４０に連結する。
【０３４２】
（７）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＩＣＯＳに連結する。
【０３４３】
８）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、Ｆａｂは４−１ＢＢに連結する。
【０３４４】
（９）フォーマットが、ＩＣＯＳに連結するＨ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤおよびＰＤ−Ｌ１に連結するＡＢＤを含む。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、１アームの中央−ｓｃＦｖフォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、除去変異、およびＦｃＲｎ変異を含む。したがって、いくつかの実施形態は、以下を含むフォーマットを含む：ａ）スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと共に、第１の受容体に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の受容体に連結するｓｃＦｖドメインを含む第１の単量体、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含む第２の単量体、ならびにｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖。
【０３４６】
このフォーマットにおいて、ヒトＩＣＯＳに連結する具体的なＡＢＤには、［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０および［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０、ならびに図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７に示されるもの、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５に示されるものが含まれるがこれらには限定されない。
【０３４７】
このフォーマットにおいて、ヒトＧＩＴＲに連結する具体的なＡＢＤには、図１８、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２８２〜２６２９０に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０３４８】
このフォーマットにおいて、ＯＸ４０に連結する具体的なＡＢＤには、図１７、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２７２〜２６２８１に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０３４９】
このフォーマットにおいて、ヒト４−１ＢＢに連結する具体的なＡＢＤには、図１６、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２６２〜２６７１が含まれるがこれらには限定されない。
【０３５０】
このフォーマットにおいて、ヒトＰＤ−Ｌ１に連結する具体的なＡＢＤには、図１５、図７３、および図７８、ならびに配列番号３９６１〜４４３２が含まれるがこれらには限定されない。
【０３５１】
Ｊ．１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ
本発明において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、図２Ｄに示される１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂフォーマットである。この実施形態では、一方の単量体はＦｃドメインのみを含み、他方の単量体は、一般にリンカーを使用することによって重鎖のＮ末端に連結したｓｃＦｖドメインを使用する：ｖｈ１−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ１−［任意のドメインリンカー］−ＶＨ２−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３または（反対の配向で）ｖｌ１−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ１−［任意のドメインリンカー］−ＶＨ２−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３。このフォーマットでは、いずれかのＦａｂ部分は１つの受容体標的に連結し、ｓｃＦｖは別のものに連結する。この実施形態はさらに、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖を利用し、これらは重鎖と会合してＦａｂを形成する。本明細書中の多くの実施形態に関して、これらのコンストラクトは、本明細書中に所望され記載されるように、スキュー変異、ｐＩ変異、除去変異、さらなるＦｃ変異などを含む。この実施形態では、適切なＦｖ対には、ＩＣＯＳ×ＰＤ−１、ＩＣＯＳ×ＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳ×ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ×ＬＡＧ−３、ＩＣＯＳ×ＴＩＭ−３、ＩＣＯＳ×ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ×ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴ×ＩＣＯＳ、ＰＤ−１×ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｌ１×ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４×ＩＣＯＳ、ＬＡＧ−３×ＩＣＯＳ、ＴＩＭ−３×ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ×ＩＣＯＳ、ＯＸ４０×ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０×ＰＤ−１、ＯＸ４０×ＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０×ＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０×ＬＡＧ−３、ＯＸ４０×ＴＩＭ−３、ＯＸ４０×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×ＯＸ４０、ＰＤ−１×ＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１×ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４×ＯＸ４０、ＬＡＧ−３×ＯＸ４０、ＴＩＭ−３×ＯＸ４０、ＢＴＬＡ×ＯＸ４０、ＧＩＴＲ×ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ×ＰＤ−１、ＧＩＴＲ×ＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲ×ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ×ＬＡＧ−３、ＧＩＴＲ×ＴＩＭ−３、ＧＩＴＲ×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×ＧＩＴＲ、ＰＤ−１×ＧＩＴＲ、ＰＤ−Ｌ１×ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４×ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３×ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３×ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ×ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ×ＴＩＧＩＴ、４−１ＢＢ×ＰＤ−１、４−１ＢＢ×ＰＤ−Ｌ１、４−１ＢＢ×ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ×ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ×ＴＩＭ−３、４−１ＢＢ×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×４−１ＢＢ、ＰＤ−１×４−１ＢＢ、ＰＤ−Ｌ１×４−１ＢＢ、ＣＴＬＡ−４×４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３×４−１ＢＢ、ＴＩＭ−３×４−１ＢＢ、およびＢＴＬＡ×４−１ＢＢが含まれる（Ｆａｂを最初に列挙し、ｓｃＦｖを２番目に列挙する）。
【０３５２】
これらの組み合わせについてのＡＢＤ配列は、配列表に開示されている通りでも図に示されている通りでもよい。
【０３５３】
さらに、Ｆｃドメインは、一般にスキュー変異（例えば、図４に示されるような１セットのアミノ酸置換）を含み、特に有用なスキュー変異は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択され、任意で除去変異（図６に示すものを含む）を含み、任意で荷電ｓｃＦｖリンカー（図８に示すものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異（図５に示すものを含む）を含む。
【０３５４】
いくつかの実施形態では、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂフォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、および除去変異を含む。したがって、いくつかの実施形態は、以下を含むフォーマットを含む：ａ）スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと共に、第１のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、第１の可変軽鎖ドメインと共に、本明細書で概説されるような第１のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の可変重鎖と共に第２のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖ（ＡＢＤ）を構成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体、ならびにｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖。このフォーマットのこれらの変異を有するいくつかの特定の実施形態において：
【０３５５】
（１）フォーマットが、［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤを有するＩＣＯＳに連結するＦａｂ  ＡＢＤを含む。
【０３５６】
（２）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖ  ＡＢＤと組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０３５７】
（３）フォーマットが、ＣＴＬＡ−４に連結するＡＢＤ  Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９を含むｓｃＦｖと組み合わせたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０３５８】
（４）フォーマットが、ＬＡＧ−３に連結するＡＢＤ  ７Ｇ８＿Ｈ．３０３＿Ｌ１．３４と組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０３５９】
（５）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＧＩＴＲに連結する。
【０３６０】
（６）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＯＸ４０に連結する。
【０３６１】
（７）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＩＣＯＳに連結する。
【０３６２】
８）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、Ｆａｂは４−１ＢＢに連結する。
【０３６３】
（９）フォーマットが、ＩＣＯＳに連結するＨ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤおよびＰＤ−Ｌ１に連結するＡＢＤを含む。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂフォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、除去変異、およびＦｃＲｎ変異を含む。したがって、いくつかの実施形態は、以下を含むボトルオープナーフォーマットを含む：ａ）スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと共に、第１のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、第１の可変軽鎖ドメインと共に、本明細書で概説されるような第１のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の可変重鎖と共に第２のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖ（ＡＢＤ）を構成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体、ならびにｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖。
【０３６５】
このフォーマットにおいて、ヒトＩＣＯＳに連結する具体的なＡＢＤには、［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０および［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０、ならびに図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７に示されるもの、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５に示されるものが含まれるがこれらには限定されない。
【０３６６】
このフォーマットにおいて、ヒトＧＩＴＲに連結する具体的なＡＢＤには、図１８、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２８２〜２６２９０に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０３６７】
このフォーマットにおいて、ＯＸ４０に連結する具体的なＡＢＤには、図１７、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２７２〜２６２８１に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０３６８】
このフォーマットにおいて、ヒト４−１ＢＢに連結する具体的なＡＢＤには、図１６、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２６２〜２６７１が含まれるがこれらには限定されない。
【０３６９】
このフォーマットにおいて、ヒトＰＤ−Ｌ１に連結する具体的なＡＢＤには、図１５、図７３、および図７８、ならびに配列番号３９６１〜４４３２が含まれるがこれらには限定されない。
【０３７０】
Ｋ．ｓｃＦｖ−ｍＡｂフォーマット
本発明において特に使用される１つのヘテロ二量体足場は、図２Ｅに示されるｍＡｂ−ｓｃＦｖフォーマットである。この実施形態では、フォーマットは、単量体の１つへのｓｃＦｖのＮ末端連結の使用に依存し、したがって第３の抗原連結ドメインを形成し、ここで、２つの単量体のＦａｂ部分は各々が１つの標的と連結し、「追加の」ｓｃＦｖドメインは異なる標的に連結する。
【０３７１】
この実施形態では、第１の単量体は、いずれかの配向で、ｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン、ｓｃＦｖリンカーおよびｓｃＦｖ可変重鎖ドメインを含むＮ末端共有連結ｓｃＦｖを有する第１の重鎖（可変重鎖ドメインおよび定常ドメインを含む）を含む（（ｖｈ１−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ１−［任意のドメインリンカー］−ｖｈ２−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）または（反対の配向のｓｃＦｖと共に）（（ｖｌ１−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ１−［任意のドメインリンカー］−ｖｈ２−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３））。第２の単量体は、重鎖ＶＨ２０ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む。この実施形態はさらに、可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む共通の軽鎖を利用し、これは重鎖と会合して標的抗原の１つに連結する２つの同一のＦａｂを形成する。本明細書中の多くの実施形態に関して、これらのコンストラクトは、本明細書中に所望され記載されるように、スキュー変異、ｐＩ変異、除去変異、さらなるＦｃ変異などを含む。この実施形態では、適切なＦｖ対には、ＩＣＯＳ×ＰＤ−１、ＩＣＯＳ×ＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳ×ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ×ＬＡＧ−３、ＩＣＯＳ×ＴＩＭ−３、ＩＣＯＳ×ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ×ＴＩＧＩＴ、ＴＩＧＩＴ×ＩＣＯＳ、ＰＤ−１×ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｌ１×ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４×ＩＣＯＳ、ＬＡＧ−３×ＩＣＯＳ、ＴＩＭ−３×ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ×ＩＣＯＳ、ＯＸ４０×ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０×ＰＤ−１、ＯＸ４０×ＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０×ＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０×ＬＡＧ−３、ＯＸ４０×ＴＩＭ−３、ＯＸ４０×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×ＯＸ４０、ＰＤ−１×ＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１×ＯＸ４０、ＣＴＬＡ−４×ＯＸ４０、ＬＡＧ−３×ＯＸ４０、ＴＩＭ−３×ＯＸ４０、ＢＴＬＡ×ＯＸ４０、ＧＩＴＲ×ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ×ＰＤ−１、ＧＩＴＲ×ＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲ×ＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲ×ＬＡＧ−３、ＧＩＴＲ×ＴＩＭ−３、ＧＩＴＲ×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×ＧＩＴＲ、ＰＤ−１×ＧＩＴＲ、ＰＤ−Ｌ１×ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４×ＧＩＴＲ、ＬＡＧ−３×ＧＩＴＲ、ＴＩＭ−３×ＧＩＴＲ、ＢＴＬＡ×ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ×ＴＩＧＩＴ、４−１ＢＢ×ＰＤ−１、４−１ＢＢ×ＰＤ−Ｌ１、４−１ＢＢ×ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ×ＬＡＧ−３、４−１ＢＢ×ＴＩＭ−３、４−１ＢＢ×ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ×４−１ＢＢ、ＰＤ−１×４−１ＢＢ、ＰＤ−Ｌ１×４−１ＢＢ、ＣＴＬＡ−４×４−１ＢＢ、ＬＡＧ−３×４−１ＢＢ、ＴＩＭ−３×４−１ＢＢ、およびＢＴＬＡ×４−１ＢＢが含まれる（Ｆａｂを最初に列挙し、ｓｃＦｖを２番目に列挙する）。
【０３７２】
これらの組み合わせについてのＡＢＤ配列は、配列表または図に開示されている通りでよい。
【０３７３】
さらに、ｓｃＦｖ−ｍＡｂフォーマットのＦｃドメインは、一般にスキュー変異（例えば、図４に示されるような１セットのアミノ酸置換）を含み、特に有用なスキュー変異は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択され、任意で除去変異（図６に示すものを含む）を含み、任意で荷電ｓｃＦｖリンカー（図８に示すものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異（図５に示すものを含む）を含む。
【０３７４】
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ−ｓｃＦｖフォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、および除去変異を含む。したがって、いくつかの実施形態は、以下を含むボトルオープナーフォーマットを含む：ａ）スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと共に、第１のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、第１の可変軽鎖ドメインと共に、本明細書で概説されるような第１のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の可変重鎖と共に第２のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖ（ＡＢＤ）を構成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体、ならびにｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖。このフォーマットのこれらの変異を有するいくつかの特定の実施形態において：
【０３７５】
（１）フォーマットが、［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤを有するＩＣＯＳに連結するＦａｂ  ＡＢＤを含む。
【０３７６】
（２）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖ  ＡＢＤと組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０３７７】
（３）フォーマットが、ＣＴＬＡ−４に連結するＡＢＤ  Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９を含むｓｃＦｖと組み合わせたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０３７８】
（４）フォーマットが、ＬＡＧ−３に連結するＡＢＤ  ７Ｇ８＿Ｈ．３０３＿Ｌ１．３４と組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０３７９】
（５）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＧＩＴＲに連結する。
【０３８０】
（６）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＯＸ４０に連結する。
【０３８１】
（７）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＩＣＯＳに連結する。
【０３８２】
８）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、Ｆａｂは４−１ＢＢに連結する。
【０３８３】
（９）フォーマットが、ＩＣＯＳに連結するＨ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤおよびＰＤ−Ｌ１に連結するＡＢＤを含む。
【０３８４】
いくつかの実施形態では、ｍＡｂ−ｓｃＦｖフォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、除去変異、およびＦｃＲｎ変異を含む。したがって、いくつかの実施形態は、以下を含むボトルオープナーフォーマットを含む：ａ）スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、軽鎖の第１の可変軽鎖ドメインと共に、第１のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の可変重鎖ドメインを含む第１の単量体、ｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、ＦｃＲｎ変異Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、第１の可変軽鎖ドメインと共に、本明細書で概説されるような第１のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖを構成する第１の可変重鎖ドメイン、および第２の可変重鎖と共に第２のチェックポイント阻害剤に連結するＦｖ（ＡＢＤ）を構成する第２の可変軽鎖を含む第２の単量体、ならびにｃ）第１の可変軽鎖ドメインおよび定常軽鎖ドメインを含む軽鎖。
【０３８５】
このフォーマットにおいて、ヒトＩＣＯＳに連結する具体的なＡＢＤには、［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０および［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０、ならびに図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７に示されるもの、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５に示されるものが含まれるがこれらには限定されない。
【０３８６】
このフォーマットにおいて、ヒトＧＩＴＲに連結する具体的なＡＢＤには、図１８、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２８２〜２６２９０に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０３８７】
このフォーマットにおいて、ＯＸ４０に連結する具体的なＡＢＤには、図１７、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２７２〜２６２８１に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０３８８】
このフォーマットにおいて、ヒト４−１ＢＢに連結する具体的なＡＢＤには、図１６、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２６２〜２６７１が含まれるがこれらには限定されない。
【０３８９】
このフォーマットにおいて、ヒトＰＤ−Ｌ１に連結する具体的なＡＢＤには、図１５、図７３、および図７８、ならびに配列番号３９６１〜４４３２が含まれるがこれらには限定されない。
【０３９０】
Ｌ．デュアルｓｃＦｖフォーマット
本発明はまた、当該技術分野で公知であり、図２Ｂに示されているようなデュアルｓｃＦｖフォーマットを提供する。この実施形態において、ヘテロ二量体二重特異性抗体は、２つのｓｃＦｖ−Ｆｃ単量体から作製される（両方ともが（ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ−［任意のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）フォーマットまたは（ｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈ−［任意のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）フォーマットであるか、または一方の単量体が一方の配向に、他方が他方の配向である。
【０３９１】
この場合、全てのＡＢＤはｓｃＦｖフォーマットであり、ＩＣＯＳとＰＤ−１、ＩＣＯＳとＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳとＬＡＧ−３、ＩＣＯＳとＴＩＭ−３、ＩＣＯＳとＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳとＢＴＬＡ、ＧＩＴＲとＰＤ−１、ＧＩＴＲとＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲとＬＡＧ−３、ＧＩＴＲとＴＩＭ−３、ＧＩＴＲとＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲとＢＴＬＡ、ＯＸ４０とＰＤ−１、ＯＸ４０とＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０とＬＡＧ−３、ＯＸ４０とＴＩＭ−３、ＯＸ４０とＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０とＢＴＬＡ、４−１ＢＢとＰＤ−１、４−１ＢＢとＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢとＬＡＧ−３、４−１ＢＢとＴＩＭ−３、４−１ＢＢとＰＤ−Ｌ１、および４−１ＢＢとＢＴＬＡのいずれかの組み合わせが有用である。これらの組み合わせについてのＡＢＤ配列は、配列表に開示されている通りでも図に示されている通りでもよい。
【０３９２】
さらに、デュアルｓｃＦｖフォーマットのＦｃドメインは、一般にスキュー変異（例えば、図４に示されるような１セットのアミノ酸置換）を含み、特に有用なスキュー変異は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ、およびＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃからなる群から選択され、任意で除去変異（図６に示すものを含む）を含み、任意で荷電ｓｃＦｖリンカー（図８に示すものを含む）を含み、重鎖はｐＩ変異（図５に示すものを含む）を含む。
【０３９３】
いくつかの実施形態では、デュアルｓｃＦｖフォーマットはスキュー変異、ｐＩ変異、および除去変異を含む。したがって、いくつかの実施形態は、以下を含むフォーマットを含む：ａ）スキュー変異Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および第１の受容体に連結するｓｃＦｖを含む第１の単量体（ＶＨ１−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ１−［任意のドメインリンカー−ＣＨ２−ＣＨ３またはＶＬ１−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ１−［任意のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）、ならびにｂ）スキュー変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、および第１の受容体に連結するｓｃＦｖを含む第１の単量体（ＶＨ１−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ１−［任意のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３またはＶＬ１−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ１−［任意のドメインリンカー］−ＣＨ２−ＣＨ３）。ｐＩ変異は、本明細書に概説されるようなものであり得るが、最も一般的なものは、各単量体が反対の電荷の荷電ｓｃＦｖリンカーである。ＦｃＲｎ変異、特に４２８Ｌ／４３４Ｓを任意に含めることができる。このフォーマットのこれらの変異を有するいくつかの特定の実施形態において：
【０３９４】
（１）フォーマットが、［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤを有するＩＣＯＳに連結するＡＢＤを含む。
【０３９５】
（２）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むＡＢＤと組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０３９６】
（３）フォーマットが、ＣＴＬＡ−４に連結するＡＢＤ  Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９と組み合わせたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０３９７】
（４）フォーマットが、ＬＡＧ−３に連結するＡＢＤ  ７Ｇ８＿Ｈ．３０３＿Ｌ１．３４と組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０３９８】
（５）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含み、ＦｖはＧＩＴＲに連結する。
【０３９９】
（６）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含み、ＦｖはＯＸ４０に連結する。
【０４００】
（７）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含み、ＡＢＤはＩＣＯＳに連結する。
【０４０１】
８）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含み、ＡＢＤは４−１ＢＢに連結する。
【０４０２】
（９）フォーマットが、ＩＣＯＳに連結するＨ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤおよびＰＤ−Ｌ１に連結するＡＢＤを含む。
【０４０３】
このフォーマットにおいて、ヒトＩＣＯＳに連結する具体的なＡＢＤには、［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０および［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０、ならびに図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７に示されるもの、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５に示されるものが含まれるがこれらには限定されない。
【０４０４】
このフォーマットにおいて、ヒトＧＩＴＲに連結する具体的なＡＢＤには、図１８、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２８２〜２６２９０に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０４０５】
このフォーマットにおいて、ＯＸ４０に連結する具体的なＡＢＤには、図１７、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２７２〜２６２８１に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０４０６】
このフォーマットにおいて、ヒト４−１ＢＢに連結する具体的なＡＢＤには、図１６、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２６２〜２６７１が含まれるがこれらには限定されない。
【０４０７】
このフォーマットにおいて、ヒトＰＤ−Ｌ１に連結する具体的なＡＢＤには、図１５、図７３、および図７８、ならびに配列番号３９６１〜４４３２が含まれるがこれらには限定されない。
【０４０８】
Ｍ．非ヘテロ二量体二重特異性抗体
当業者によって理解されるように、本明細書で概説のＦｖ配列はまた、単一特異性抗体（例えば、「従来のモノクローナル抗体」）または非ヘテロ二重特異性フォーマットの両方で使用することができる（図２Ｊ、Ｋ、およびＬを参照）。
【０４０９】
このフォーマットにおいて、ヒトＩＣＯＳに連結する具体的なＡＢＤには、［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０および［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０、ならびに図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７に示されるもの、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５に示されるものが含まれるがこれらには限定されない。
【０４１０】
このフォーマットにおいて、ヒトＧＩＴＲに連結する具体的なＡＢＤには、図１８、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２８２〜２６２９０に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０４１１】
このフォーマットにおいて、ＯＸ４０に連結する具体的なＡＢＤには、図１７、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２７２〜２６２８１に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０４１２】
このフォーマットにおいて、ヒト４−１ＢＢに連結する具体的なＡＢＤには、図１６、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２６２〜２６７１が含まれるがこれらには限定されない。
【０４１３】
このフォーマットにおいて、ヒトＰＤ−Ｌ１に連結する具体的なＡＢＤには、図１５、図７３、および図７８、ならびに配列番号３９６１〜４４３２が含まれるがこれらには限定されない。
【０４１４】
適切な非ヘテロ二量体二重特異性フォーマットは当該技術分野において公知であり、Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（６７）：９５−１０６  （２０１５）およびＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ，ｍＡｂｓ  ４：２，１８２−１９７（２０１２）に概して示されているようないくつかの異なるフォーマットを含み、これらの両方は、参照により、特にその中のフォーマットに対する図、図説および引用について、明示的に組み込まれる。
【０４１５】
Ｎ．ＤＶＤ−Ｉｇフォーマット
いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、一般に、米国特許第７，６１２，１８１号に記載されているような「二重可変ドメイン−Ｉｇ」または「ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）」フォーマットにあり（図２Ｌを参照）、その全ての内容は、特にその中の図および図説について、参照により本明細書に組み込まれる。ＤＶＤ−Ｉｇフォーマットでは、抗体は四価で二重特異性であり、４本の鎖、すなわち２本のホモ二量体重鎖および２本の同一軽鎖を含む。重鎖はそれぞれＶＨ１−（任意のリンカー）−ＶＨ２−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３構造を有し、２本の軽鎖はそれぞれＶＬ１−任意のリンカー−ＶＬ２−ＣＬ構造を有し、ＶＨ１およびＶＬ１は第１のＡＢＤを形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は第２のＡＢＤを形成し、ここで第１および第２のＡＢＤは共刺激受容体およびチェックポイント受容体に連結する。この実施形態では、適切な組み合わせは、ＩＣＯＳとＰＤ−１、ＩＣＯＳとＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳとＬＡＧ−３、ＩＣＯＳとＴＩＭ−３、ＩＣＯＳとＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳとＢＴＬＡ、ＧＩＴＲとＰＤ−１、ＧＩＴＲとＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲとＬＡＧ−３、ＧＩＴＲとＴＩＭ−３、ＧＩＴＲとＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲとＢＴＬＡ、ＯＸ４０とＰＤ−１、ＯＸ４０とＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０とＬＡＧ−３、ＯＸ４０とＴＩＭ−３、ＯＸ４０とＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０とＢＴＬＡ、４−１ＢＢとＰＤ−１、４−１ＢＢとＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢとＬＡＧ−３、４−１ＢＢとＴＩＭ−３、４−１ＢＢとＰＤ−Ｌ１、および４−１ＢＢとＢＴＬＡを含む。
【０４１６】
ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）および中央−ｓｃＦｖ２は、二重特異性および四価であり、したがって一価様式で共刺激受容体に連結しない２つのフォーマットである。例示的なＤＶＤ−Ｉｇ（商標）コンストラクトは、図６１に示される。
【０４１７】
このフォーマットのこれらの変異を有するいくつかの特定の実施形態において：
【０４１８】
（１）フォーマットが、［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤを含む。
【０４１９】
（２）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むＡＢＤと組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０４２０】
（３）フォーマットが、ＣＴＬＡ−４に連結するＡＢＤ  Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９と組み合わせたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０４２１】
（４）フォーマットが、ＬＡＧ−３に連結するＡＢＤ  ７Ｇ８＿Ｈ．３０３＿Ｌ１．３４と組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０４２２】
（５）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９およびＧＩＴＲに連結するＡＢＤを含む。
【０４２３】
（６）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９およびＯＸ４０に連結するＡＢＤを含む。
【０４２４】
（７）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９およびＩＣＯＳに連結するＡＢＤを含む。
【０４２５】
８）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９および４−１ＢＢに連結するＡＢＤを含む。
【０４２６】
（９）フォーマットが、ＩＣＯＳに連結するＨ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤおよびＰＤ−Ｌ１に連結するＡＢＤを含む。
【０４２７】
このフォーマットにおいて、ヒトＩＣＯＳに連結する具体的なＡＢＤには、［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０および［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０、ならびに図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７に示されるもの、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５に示されるものが含まれるがこれらには限定されない。
【０４２８】
このフォーマットにおいて、ヒトＧＩＴＲに連結する具体的なＡＢＤには、図１８、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２８２〜２６２９０に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０４２９】
このフォーマットにおいて、ＯＸ４０に連結する具体的なＡＢＤには、図１７、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２７２〜２６２８１に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０４３０】
このフォーマットにおいて、ヒト４−１ＢＢに連結する具体的なＡＢＤには、図１６、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２６２〜２６７１が含まれるがこれらには限定されない。
【０４３１】
このフォーマットにおいて、ヒトＰＤ−Ｌ１に連結する具体的なＡＢＤには、図１５、図７３、および図７８、ならびに配列番号３９６１〜４４３２が含まれるがこれらには限定されない。
【０４３２】
Ｏ．トライデントフォーマット
いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗体は、概してＷＯ２０１５／１８４２０３に記載されている「トライデント」フォーマットであり、その全ての内容、特に、図、図説、定義、ならびに「Ｋ−コイル」および「Ｅ−コイル」配列を含む「ヘテロ二量体促進ドメイン」または「ＨＰＤ」の配列は、参照により本明細書に組み込まれる。トライデントは、構造の構成要素として、会合してヘテロ二量体構造を形成する２つの異なるＨＰＤをし硫黄することに依存し、図２Ｍを参照できる。この実施形態において、トライデントフォーマットは、「従来の」重鎖および軽鎖（例えば、ＶＨ１−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３およびＶＬ１−ＣＬ）、第１の「ディアボディ型連結ドメイン」または「ＤＡＲＴ（登録商標）」を含む第３の鎖、ＶＨ２−（リンカー）−ＶＬ３−ＨＰＤ１、ならびに第２のＤＡＲＴ（登録商標）を含む第４の鎖、ＶＨ３−（リンカー）−（リンカー）−ＶＬ２−ＨＰＤ２を含む。ＶＨ１およびＶＬ１は第１のＡＢＤを形成し、ＶＨ２およびＶＬ２は第２のＡＢＤを形成し、そしてＶＨ３およびＶＬ３は第３のＡＢＤを形成する。図２Ｍに示されているように、いくつかのケースでは、第２および第３のＡＢＤは同一の抗原、この例では一般的にチェックポイント受容体に、例えば二価で連結し、第１のＡＢＤは、共刺激受容体に一価で連結する。この実施形態では、適切な組み合わせは、ＩＣＯＳとＰＤ−１、ＩＣＯＳとＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳとＬＡＧ−３、ＩＣＯＳとＴＩＭ−３、ＩＣＯＳとＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳとＢＴＬＡ、ＧＩＴＲとＰＤ−１、ＧＩＴＲとＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲとＬＡＧ−３、ＧＩＴＲとＴＩＭ−３、ＧＩＴＲとＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲとＢＴＬＡ、ＯＸ４０とＰＤ−１、ＯＸ４０とＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０とＬＡＧ−３、ＯＸ４０とＴＩＭ−３、ＯＸ４０とＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０とＢＴＬＡ、４−１ＢＢとＰＤ−１、４−１ＢＢとＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢとＬＡＧ−３、４−１ＢＢとＴＩＭ−３、４−１ＢＢとＰＤ−Ｌ１、および４−１ＢＢとＢＴＬＡを含む。
【０４３３】
このフォーマットのこれらの変異を有するいくつかの特定の実施形態において：
【０４３４】
（１）フォーマットが、［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤを有するＩＣＯＳに連結するＦａｂ  ＡＢＤを含む。
【０４３５】
（２）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖ  ＡＢＤと組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０４３６】
（３）フォーマットが、ＣＴＬＡ−４に連結するＡＢＤ  Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９を含むｓｃＦｖと組み合わせたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０４３７】
（４）フォーマットが、ＬＡＧ−３に連結するＡＢＤ  ７Ｇ８＿Ｈ．３０３＿Ｌ１．３４と組み合わされたＨ０．６６＿Ｌ０のＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む。
【０４３８】
（５）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＧＩＴＲに連結する。
【０４３９】
（６）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＯＸ４０に連結する。
【０４４０】
（７）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、ＦａｂはＩＣＯＳに連結する。
【０４４１】
８）フォーマットが、ＰＤ−１に連結するＡＢＤ  １Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９を含むｓｃＦｖを含み、Ｆａｂは４−１ＢＢに連結する。
【０４４２】
（９）フォーマットが、ＩＣＯＳに連結するＨ０．６６＿Ｌ０のＡＢＤおよびＰＤ−Ｌ１に連結するＡＢＤを含む。
【０４４３】
このフォーマットにおいて、ヒトＩＣＯＳに連結する具体的なＡＢＤには、［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０および［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０、ならびに図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７に示されるもの、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５に示されるものが含まれるがこれらには限定されない。
【０４４４】
このフォーマットにおいて、ヒトＧＩＴＲに連結する具体的なＡＢＤには、図１８、図７２、および図７３中のもの、ならびに配列番号２６２８２〜２６２９０に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０４４５】
このフォーマットにおいて、ＯＸ４０に連結する具体的なＡＢＤには、図１７、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２７２〜２６２８１に列挙されたものが含まれるがこれらには限定されない。
【０４４６】
このフォーマットにおいて、ヒト４−１ＢＢに連結する具体的なＡＢＤには、図１６、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２６２〜２６７１が含まれるがこれらには限定されない。
【０４４７】
このフォーマットにおいて、ヒトＰＤ−Ｌ１に連結する具体的なＡＢＤには、図１５、図７３、および図７８、ならびに配列番号３９６１〜４４３２が含まれるがこれらには限定されない。
【０４４８】
Ｐ．単一特異性、モノクローナル抗体
当業者によって理解されるように、本明細書で概説の新規のＦｖ配列はまた、単一特異性抗体（例えば、「従来のモノクローナル抗体」）または非ヘテロ二重特異性フォーマットの両方で使用することができる。したがって、本発明は、一般にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の定常領域、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐのアミノ酸置換を含むＩｇＧ４定常領域を含む）を有する、図からの６つのＣＤＲならびに／またはｖｈおよびｖｌ配列を含むモノクローナル（単一特異性）抗体を提供し、いくつかの実施形態において特に使用される。すなわち、「Ｈ＿Ｌ」指定を有する本明細書中の任意の配列は、ヒトＩｇＧ１抗体の定常領域に連結され得る。
【０４４９】
ＶＩＩＩ．標的抗原に対する抗原連結ドメイン（ＡＢＤ）
本発明の二重特異性抗体は、概して図２に示すように、二価二重特異性フォーマットまたは三価二重特異性フォーマットのいずれかで、２つの異なる標的受容体抗原（「標的対」）に連結する２つの異なる抗原連結ドメイン（ＡＢＤ）を有する。
【０４５０】
二重特異性抗体は、チェックポイント受容体を含む第１の標的抗原および共刺激受容体を含む第２の標的抗原に連結する。本明細書に概説される適切なチェックポイント受容体には、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、およびＴＩＧＩＴが含まれる。本明細書に概説される適切な共刺激受容体としては、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、および４−１ＢＢが含まれる。概説したように
【０４５１】
適切な標的チェックポイント抗原には、ヒト（および場合によってはカニクイザル）ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、およびＢＴＬＡ（配列表の配列）が含まれる。したがって、適切な二重特異性抗体は、ＩＣＯＳとＰＤ−１、ＩＣＯＳとＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳとＬＡＧ−３、ＩＣＯＳとＴＩＭ−３、ＩＣＯＳとＰＤ−Ｌ１、ＩＣＯＳとＢＴＬＡ、ＩＣＯＳとＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲとＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲとＰＤ−１、ＧＩＴＲとＣＴＬＡ−４、ＧＩＴＲとＬＡＧ−３、ＧＩＴＲとＴＩＭ−３、ＧＩＴＲとＰＤ−Ｌ１、ＧＩＴＲとＢＴＬＡ、ＯＸ４０とＰＤ−１、ＯＸ４０とＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０とＣＴＬＡ−４、ＩＣ  ＯＸ４０  ＯＳとＬＡＧ−３、ＯＸ４０とＴＩＭ−３、ＯＸ４０とＰＤ−Ｌ１、ＯＸ４０とＢＴＬＡ、４−１ＢＢとＰＤ−１、４−１ＢＢとＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢとＬＡＧ−３、４−１ＢＢとＴＩＭ−３、４−１ＢＢとＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴと４−１ＢＢ、および４−１ＢＢとＢＴＬＡに連結する。
【０４５２】
一般に、これらの二重特異性抗体は「抗ＰＤ−１×抗ＣＴＬＡ−４」と呼ばれるか、または一般に単純にまたは簡単のために（したがって交換可能に）各対について「ＰＤ−１×ＣＴＬＡ−４」などと命名される。本明細書で特定されない限り、名称における抗原の列挙の順序は構造を付与せず、すなわち、ＰＤ−１×ＣＴＬＡ−４ボトルオープナー抗体は、ｓｃＦｖをＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４に連結させることができるが、場合によっては、順序は示されている通りの構造を特定する。
【０４５３】
本明細書においてより十分に概説されるように、これらのＡＢＤの組み合わせは、以下に概説されるようにさまざまなフォーマットであり得、概して一方のＡＢＤがＦａｂフォーマットであり他方がｓｃＦｖフォーマットである組み合わせである。本明細書で論じられ、図２に示されるように、いくつかのフォーマットは単一のＦａｂおよび単一のｓｃＦｖ（Ａ、Ｃ、およびＤ）を使用し、いくつかのフォーマットは２つのＦａｂおよび単一のｓｃＦｖ（Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＩ）を使用する。
【０４５４】
Ａ．抗原連結ドメイン
本明細書で論じるように、本発明の二重特異性チェックポイントヘテロ二量体抗体は、それぞれが異なるチェックポイントタンパク質に連結する２つの抗原連結ドメイン（ＡＢＤ）を含む。本明細書に概説するように、これらのヘテロ二量体抗体は、二重特異性および二価であり得る（各抗原は、例えば図２に示されるフォーマットで単一のＡＢＤによって連結される。
図１は、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）から編集された、膀胱癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、腎癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、および黒色腫癌についてのＰＤ−１およびＴ細胞共刺激受容体の発現データ（ＲＮＡｓｅｑ  Ｖ２  ＲＳＥＭ）を提示する。ピアソン相関係数の二乗を、Ｔ細胞共刺激受容体に対するＰＤ−１について計算した。
【０４５５】
図２Ａ〜Ｏは、本発明の二重特異性抗体のためのいくつかのフォーマットを示す。一番目は、第１および第２の抗抗原連結ドメインを有する「ボトルオープナー」フォーマットである。さらに、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、中央−Ｆｖ、１アームの中央−ｓｃＦｖ、１つのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、ｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖのフォーマットが全て示されている。図２Ｊは、Ｆａｂが第１の抗原に連結し、ｓｃＦｖが第２の抗原に連結する、２つのＦａｂ−ｓｃＦｖのアームを有する「中央−ｓｃＦｖ２」フォーマットを示す。図２Ｋは、第１の抗原に連結する第１のＦａｂアームと第２の抗原に連結する第２のＦａｂアームを有する、二重特異性ｍＡｂのフォーマットを示す。図２Ｌは、ＤＶＤ−ＩｇＧのフォーマット（例えば、参照により本明細書に明示的に組み込まれ、以下に論じられる、米国特許第７，６１２，１８１号を参照されたい）を示す。図２Ｍは、トライデントフォーマット（例えば、参照により本明細書に明示的に組み込まれ、以下に論じられる、ＷＯ２０１５／１８４２０３を参照されたい）を示す。示されている全てのｓｃＦｖドメインについて、それらは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、可変重鎖−（任意選択のリンカー）−可変軽鎖、またはその反対のいずれかであり得る。さらに、１アームｓｃＦｖ−ｍＡｂでは、ｓｃＦｖを重鎖単量体のＮ末端または軽鎖のＮ末端のいずれかに連結させることができる。
【０４５６】
図３は、ＩＣＯＳをＦａｂ側（［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０）とし、ＰＤ−１をｓｃＦＶ（１Ｇ６＿Ｌ１．９４＿Ｈ１．２７９）として有し、血清半減期を延長するためのＭ４２８Ｌ／４３４Ｓ変異を含む、ボトルオープナーフォーマットであるＸＥＮＰ２３１０４の配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカーであるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図８に示されている無荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えることができる）、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。さらに、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端に向かうｓｃＦｖの配向を示し、本明細書中の配列のいくつかは、ＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ（ＮからＣ末端に向かう）と配向され、一方でいくつかはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ（ＮからＣ末端に向かう）と配向されるが、当業者によって理解されるように、これらの配列はまた、本明細書中のそれらの描写とは反対の配向で使用され得る。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【０４５７】
図４Ａ〜Ｅは、（スキューおよびｐＩ変異を含む）ヘテロ二量体化変異セットの有用な対を示す。図４ＣおよびＦには、対応する「単量体２」変異が存在しない変異が存在し、これらは、いずれかの単量体に単独で使用することができるか、または例えばボトルオープナーのＦａｂ側に含めることができるｐＩ変異であり、例えば、ｓｃＦｖを第２の抗原連結ドメインとして利用する第２の単量体に適切な荷電ｓｃＦｖリンカーを使用することができる。適切な荷電リンカーは、図８に示される。
【０４５８】
図５は、等価変異の抗体定常領域とそれぞれの置換の一覧を示す。ｐＩ＿（−）は低いｐＩの変異を示し、ｐＩ＿（＋）は高いｐＩの変異を示す。これらは、任意にかつ独立して、本発明の他のヘテロ二量体化変異（および本明細書に概説されているように他の変異も）と組み合わせることができる。
【０４５９】
図６は、ＦｃγＲ連結を除去した有用な除去変異を示す（しばしば「ノックアウト」または「ＫＯ」変異と呼ばれる。）。一般に、除去変異は両方の単量体に見られるが、いくつかの場合においてはそれらは一方の単量体のみにあってもよい。
【０４６０】
図７は、本発明の２つの特に有用な実施形態を示す。本実施形態の「非Ｆｖ」構成要素が図９Ａに示されるが、図９の他のフォーマットも同様に使用することができる。
【０４６１】
図８ＡおよびＢは、構成要素として、一つ以上のｓｃＦｖを利用するヘテロ二量体抗体のｐＩを増加または減少することにおいて使用されるいくつかの荷電ｓｃＦｖリンカーを示す。（＋Ｈ）正のリンカーは、本明細書において特に使用される。単一電荷を有する単一の先行技術のｓｃＦｖリンカーは、Ｗｈｉｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（８）：９８９−９９５（１９９３）からの「Ｗｈｉｔｌｏｗ」としての参照である。このリンカーは、ｓｃＦｖにおける凝集を減少させ、タンパク質分解安定性を高めるために使用されたことに留意すべきである。
【０４６２】
図９は、Ｆｖ配列（例えば、ｓｃＦｖおよびＦａｂ側のためのｖｈおよびｖｌ）含まずに、ヒトＩｇＧ１に基づいて、いくつかの有用なボトルオープナーフォーマットの骨格の配列を示す。ボトルオープナーの骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異を含む。ボトルオープナーの骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、異なるスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異を含む。ボトルオープナーの骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、異なるスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異を含む。ボトルオープナーの骨格４はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、異なるスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異を含む。ボトルオープナーの骨格５はヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異を含む。ボトルオープナーの骨格６はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異、ならびにＮ２９７Ａの両方の鎖の変異を含む。ボトルオープナーの骨格７は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて６と同一である。ボトルオープナーの骨格６および７の代替的なフォーマットは、両方の鎖の除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを除外できる。骨格８はヒトＩｇＧ４に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異、ならびに当該技術分野で知られているように、Ｆａｂアーム交換を除去するＳ２２８Ｐ（ＥＵナンバリング、これはＫａｂａｔではＳ２４１Ｐである）の両鎖の変異を含む。ボトルオープナーの骨格８の代替的なフォーマットでは、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異を除外でき、骨格９は、ヒトＩｇＧ２に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異を含む。骨格１０はヒトＩｇＧ２に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＳ２６７Ｋの両方の鎖の変異を含む。
【０４６３】
当業者には理解され、以下に概説されるように、これらの配列は、ｓｃＦｖ（任意に荷電ｓｃＦｖリンカーを含む）を含む一つの単量体およびＦａｂ配列を含む他の単量体を含む、本明細書に概説される任意のｖｈとｖｌの対と共に使用できる（例えば、「Ｆａｂ側重鎖」に連結したｖｈ、および「定常軽鎖」に連結したｖｌ）。すなわち、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１、抗ＬＡＧ−３、抗ＴＩＭ−３、抗ＴＩＧＩＴ、および抗ＢＴＬＡについて本明細書で概説した任意のＦｖ配列は、ｓｃＦｖ（同様に、任意選択で荷電ｓｃＦｖリンカーを有する）またはＦａｂとしてであるかどうかにかかわらず、これらの図３７の骨格に任意の組み合わせで組み込むことができる。図９Ａに示されている定常軽鎖は、図中のコンストラクトの全てのために使用することができるが、カッパ定常軽鎖もまた置換されていてもよい。
【０４６４】
これらのボトルオープナーの骨格は、図１Ｆの中心−ｓｃＦｖフォーマットに使用されることに注意すべきであり、そこでは、第１のＦａｂと同じ抗原連結を有する追加の第２のＦａｂ（ｖｈ−ＣＨ１およびｖｌ−定常軽鎖）が、「ボトルオープナー側」のｓｃＦｖのＮ末端に付加される。
【０４６５】
これらの骨格の各々に含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書で定義されるように）９０、９５、９８、および９９％同一であり、および／または（当業者には理解されるように、親のヒトＩｇＧ１（または骨格に基づいてＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４）と比べていくつかのアミノ酸修飾を既に含む図の「親」と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加のアミノ酸置換を含む配列である。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキュー、ｐＩおよび除去変異に加えて、さらなるアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。
【０４６６】
図１０は、選択された数の抗ＰＤ−１抗体の配列を示す。これらの配列は、図６Ａに示されている除去変異（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ」）を有するヒトＩｇＧ１に基づいて生成されたことに留意することが重要である。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【０４６７】
図１１は、配列番号１〜２３９２、３１２５〜３１４４、４６９７〜７５９４、および４６９７〜２１８１０として列挙されている追加の抗ＰＤ−１  ＡＢＤと共に、選択された数のＰＤ−１  ＡＢＤを示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカーであるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図８に示されている無荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えることができる）、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。さらに、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端に向かうｓｃＦｖの配向を示し、この図中の配列のいくつかは、ＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ（ＮからＣ末端に向かう）と配向され、一方でいくつかはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ（ＮからＣ末端に向かう）と配向されるが、当業者によって理解されるように、これらの配列はまた、本明細書中のそれらの描写とは反対の配向で使用され得る。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中の全ての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれでも使用することができる。
【０４６８】
図１２は、配列番号２３９３〜２４１４および３７３７〜３８１６として列挙されている追加の抗ＣＴＬＡ−４ＡＢＤと共に、選択された数のＣＴＬＡ−４ＡＢＤを示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカーであるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図８に示されている無荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えることができる）、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。さらに、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端に向かうｓｃＦｖの配向を示し、この図中の配列のいくつかは、ＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ（ＮからＣ末端に向かう）と配向され、一方でいくつかはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ（ＮからＣ末端に向かう）と配向されるが、当業者によって理解されるように、これらの配列はまた、本明細書中のそれらの描写とは反対の配向で使用され得る。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中の全ての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれでも使用することができる。
【０４６９】
図１３は、配列番号２４１５〜２６０４および３８１７〜３９６０として列挙されている追加の抗ＬＡＧ−３  ＡＢＤと共に、選択された数のＬＡＧ−３  ＡＢＤを示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカーであるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図８に示されている無荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えることができる）、そしてスラッシュは可変ドメイン＞の境界（単数または複数）を示す。さらに、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端に向かうｓｃＦｖの配向を示し、この図中の配列のいくつかは、ＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ（ＮからＣ末端に向かう）と配向され、一方でいくつかはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ（ＮからＣ末端に向かう）と配向されるが、当業者によって理解されるように、これらの配列はまた、本明細書中のそれらの描写とは反対の配向で使用され得る。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中の全ての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれでも使用することができる。
【０４７０】
図１４は、選択された数の抗ＴＩＭ−３抗体の配列を示す。これらの配列は、除去変異（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ」）を有するヒトＩｇＧ１骨格に基づいて生成されたが、他のフォーマットも同様に使用することができることに留意することが重要である。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【０４７１】
図１５は、選択された数の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の配列を示す。これらの配列は、本明細書において概説されている除去変異（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ」）を有するヒトＩｇＧ１骨格に基づいて生成されたが、他のフォーマットも同様に使用することができることに留意することが重要である。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【０４７２】
図１６は、プロトタイプの抗４−１ＢＢ抗体の配列を示す。これらの配列は、除去変異（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ」）を有するヒトＩｇＧ１骨格に基づいて生成されたが、他のフォーマットも同様に使用することができることに留意することが重要である。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【０４７３】
図１７は、プロトタイプの抗ＯＸ４０抗体の配列を示す。これらの配列は、除去変異（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ」）を有するヒトＩｇＧ１骨格に基づいて生成されたが、他のフォーマットも同様に使用することができることに留意することが重要である。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【０４７４】
図１８は、プロトタイプの抗ＧＩＴＲ抗体の配列を示す。これらの配列は、除去変異（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ」）を有するヒトＩｇＧ１骨格に基づいて生成されたが、他のフォーマットも同様に使用することができることに留意することが重要である。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【０４７５】
図１９は、プロトタイプの抗ＩＣＯＳ抗体の配列を示す。これらの配列は、除去変異（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、「ＩｇＧ１＿ＰＶＡ＿／Ｓ２６７Ｋ」）を有するヒトＩｇＧ１骨格に基づいて生成されたが、他のフォーマットも同様に使用することができることに留意することが重要である。ＣＤＲには下線が付されている。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表Ｘに示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。
【０４７６】
図２０は、例示的な抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂの配列を示す。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュ（／）は可変領域の境界を示す。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表Ｘに示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、下線を付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメインに含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中の全ての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれでも使用することができる。これらの配列は、除去されている重鎖のＣ末端における６−ヒスチジン（Ｈｉｓ６またはＨＨＨＨＨＨ）Ｃ末端タグを使用して生成されたことに注目することが重要である。
【０４７７】
図２１は、融解温度（Ｔｍ）および安定性のために改変された変異型抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂの、ＤＳＦによって決定されたときの親Ｆａｂ（ＸＥＮＰ２２０５０）からの溶融温度の変化を示す。
【０４７８】
図２２は、Ｏｃｔｅｔによって決定されたときの、ＡＭＣバイオセンサー上に捕捉されたヒトＩＣＯＳのマウスＦｃ融合物に対する変異型抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂの平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（Ｋａ）、および解離速度（Ｋｄ）を示す。
【０４７９】
図２３は、Ｏｃｔｅｔによって決定されたときの、ＳＡバイオセンサー上に捕捉されたヒトＩＣＯＳのビオチン化ＩｇＧ１のＦｃ融合物に対する変異型抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂの平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（ＫＡ）、および解離速度（Ｋｄ）を示す。
【０４８０】
図２４は、例示的な抗ＩＣＯＳのｓｃＦｖの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカーであるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図Ｘに示される非荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えられ得る）を含み、スラッシュ（／）は可変領域の境界を示す。命名規則は、Ｎ末端からＣ末端に向かうｓｃＦｖの配向を示し、この図中の配列のいくつかは、ＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ（ＮからＣ末端に向かう、図２４を参照）と配向され、一方でいくつかはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨ（ＮからＣ末端に向かう、図２４Ｂを参照）と配向されるが、当業者によって理解されるように、これらの配列はまた、本明細書中のそれらの描写とは反対の配向で使用され得る。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表Ｘに示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、下線を付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたＶＨおよびＶＬドメインに含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中の全ての配列に関して、これらのＶＨおよびＶＬ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれでも使用することができる。これらの配列は、除去されている重鎖のＣ末端におけるポリヒスチジン（Ｈｉｓ６またはＨＨＨＨＨＨ）Ｃ末端タグを使用して生成されたことに注目することが重要である。
【０４８１】
図２５は、融解温度（Ｔｍ）および安定性のために改変された変異型抗ＩＣＯＳ  ｓｃＦｖの、ＤＳＦによって決定されたときの親ｓｃＦｖ（ＸＥＮＰ２４３５２、Ｎ末端からＣ末端に向けてＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬの配向）からの溶融温度の変化を示す。
【０４８２】
図２６は、ボトルオープナーフォーマット（ＦＡＢ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）のプロトタイプの抗ｃｏｓｔｉｍ×抗チェックポイント抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。示されるように、ｓｃＦｖのドメインはＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬまたはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨのいずれかの異なる配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）を有するが、これを逆にすることができる。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【０４８３】
図２７は、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて、プロトタイプのｃｏｓｔｉｍ／チェックポイントボトルオープナーによるサイトカイン分泌の誘導を示す。
【０４８４】
図２８は、ナイーブ（非ＳＥＢ刺激）におけるＩＬ−２分泌の誘導と示される試験試料による処理後のＳＥＢ刺激ＰＢＭＣを示す。
【０４８５】
図２９は、腫瘍のＴＩＬが免疫チェックポイント受容体と共刺激受容体を共発現するので、二重特異性抗体が、特異性を増加し、抗腫瘍活性を増強し、末梢の毒性を回避することを示す、ｃｏｓｔｉｍ×チェックポイント遮断二重特異性抗体の利益に関連した概略図を示す。
【０４８６】
図３０は、１アームの抗ＰＤ−１抗体（ＸＥＮＰ２０１１１）および１アームの抗ＩＣＯＳ抗体（ＸＥＮＰ２０２６６）と比較して、二重陽性細胞が例示的な抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１抗体（ＸＥＮＰ２０８９６）によって選択的に占められている。
【０４８７】
図３１は、ヒトＰＢＭＣのＳＥＢ刺激後の、Ａ）ＰＤ−１およびＩＣＯＳの二重陽性Ｔ細胞、ならびにＢ）ＰＤ−１およびＩＣＯＳの二重陰性Ｔ細胞に対する、抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体（ＸＥＮＰ２０８９６）、１アーム抗ＩＣＯＳ抗体（ＸＥＮＰ２０２６６）、および１アーム抗ＰＤ−１抗体（ＸＥＮＰ２０１１１）の受容体占有率を示す。
【０４８８】
図３２は、ボトルオープナーフォーマット（ＦＡＢ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の例示的な抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。示されるように、ｓｃＦｖのドメインはＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬまたはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨのいずれかの異なる配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）を有するが、これを逆にすることができる。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【０４８９】
図３３は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むボトルオープナーフォーマットの例示的抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。示されるように、ｓｃＦｖのドメインはＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬまたはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨのいずれかの異なる配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）を有するが、これを逆にすることができる。
【０４９０】
図３４は、Ｏｃｔｅｔによって決定されたときの、ＡＭＣバイオセンサー上に捕捉されたヒトＩＣＯＳのマウスＦｃ融合物に対する変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体の平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（Ｋａ）、および解離速度（Ｋｄ）を示す。
【０４９１】
図３５は、Ｏｃｔｅｔによって決定されたときの、ＳＡ／ＳＡＸバイオセンサー上に捕捉されたヒトおよびＩＣＯＳのビオチン化ＩｇＧ１のＦｃ融合物に対する変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体の平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（ＫＡ）、および解離速度（Ｋｄ）を示す。
【０４９２】
図３６は、Ａ）およびＢ）に示される２つの別個の実験におけるＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいてヒトＴ細胞に対する変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体の細胞表面連結を示す。
【０４９３】
図３７は、ヒトＰＢＭＣのＳＥＢ刺激後の、ＰＤ−１およびＩＣＯＳの二重陽性Ｔ細胞に対する、変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体、１アーム抗ＩＣＯＳ抗体、および１アーム抗ＰＤ−１抗体（ＸＥＮＰ２０１１１）の受容体占有率を示す。
【０４９４】
図３８は、変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体がＳＥＢ刺激ＰＢＭＣから分泌されるＡ）ＩＬ−２およびＢ）ＩＦＮγの分泌を促進することを示す。
【０４９５】
図３９は、変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体がＳＥＢ刺激ＰＢＭＣから分泌されるＡ）ＩＬ−２およびＢ）ＩＦＮγの分泌を促進することを示す。
【０４９６】
図４０は、ヒトＰＢＭＣの移植および示された試験試料による処理の後Ａ）７日目およびＢ）１１日目におけるＩＦＮγの濃度を示す。
【０４９７】
図４１は、ヒトＰＢＭＣの移植および示された試験試料による処理の後Ａ）１１日目およびＢ）１４日目における、フローサイトメトリーによって決定されたときのマウスにおけるＣＤ４５＋細胞数を示す。
【０４９８】
図４２は、ヒトＰＢＭＣの移植および示された試験試料による処理の後１４日目におけるフローサイトメトリーによって決定されたときのマウスにおけるＡ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＢ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を示す（＊＊Ｐ≦０．０１）。
【０４９９】
図４３は、ヒトＰＢＭＣの移植および示された試験試料による処理の後１４日目までのマウス体重の変化を示す（＊＊Ｐ≦０．０１）。
【０５００】
図４４は、ヒトＰＢＭＣの移植および示された試験試料による処理の後Ａ）７日目およびＢ）１４日目におけるＩＦＮγの濃度を示す
【０５０１】
図４５は、ヒトＰＢＭＣの移植および示された試験試料による処理の後１４日目における、フローサイトメトリーによって決定されたときのマウスにおけるＣＤ４５＋細胞数を示す。
【０５０２】
図４６は、ヒトＰＢＭＣの移植および示された試験試料による処理の後１４日目におけるフローサイトメトリーによって決定されたときのマウスにおけるＡ）ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＢ）ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を示す。
【０５０３】
図４７は、ヒトＰＢＭＣの移植および示された試験試料による処理の後１２日目までおよび１５日目までのマウス体重の変化を示す。
【０５０４】
図４８は、ボトルオープナーフォーマット（ＦＡＢ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の例示的な抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１抗体と代替的なＩＣＯＳ  ＡＢＤのアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。示されるように、ｓｃＦｖのドメインはＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬまたはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨのいずれかの異なる配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）を有するが、これを逆にすることができる。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【０５０５】
図４９は、ヒトＰＢＭＣのＳＥＢ刺激および代替的な抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体による処理の後のＩＬ−２のサイトカイン放出アッセイを示す。
【０５０６】
図５０は、ヒトＰＢＭＣのＳＥＢ刺激および代替的な抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体による処理の後のＩＬ−２のサイトカイン放出アッセイ（二価抗ＲＳＶ  ｍＡｂを超える誘導の倍率として）を示す。
【０５０７】
図５１は、抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体による処理の後のＳＥＢ刺激精製ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＡＫＴリン酸化を示す。
【０５０８】
図５２は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇによって決定されたときの、示された二価抗ＲＳＶによる誘導時の示された試験試料によるＡ）ＩＬ−１７Ａ、Ｂ）ＩＬ１７Ｆ、Ｃ）ＩＬ−２２、Ｄ）ＩＬ−１０、Ｅ）ＩＬ−９、およびＦ）ＩＦＮγの遺伝子発現の誘導の倍率を示す。
【０５０９】
図５３は、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇによって決定されたときの、二価抗ＲＳＶ  ｍＡｂによる処理時の示された試験試料による選択された免疫応答遺伝子の発現の平均の誘導の倍率を示す。シェーディング強度は、倍率変化の大きさに対応する。
【０５１０】
図５４は、ヒトＰＢＭＣの移植および示された試験試料による処理の後１４日目における、フローサイトメトリーによって決定されたときのマウスにおけるＣＤ４５＋細胞数を示す。
【０５１１】
図５５は、図９および図７５と同様に、図２Ｆの中心ｓｃＦｖ、図２Ｊの中心−ｓｃＦｖ２フォーマット、図２Ｋの二重特異性ｍＡｂ、図２ＬのＤＶＤ−Ｉｇ、および図２Ｍのトライデントフォーマットを含む、いくつかの追加のフォーマットの「骨格」位置（例えば、Ｆｖを含まない）の配列を示す。図２Ｌでは、ＤＶＤ−Ｉｇ（登録商標）リンカーは、ＷＯ２００７／０２４７１５に見られる他のリンカーと共に二重下線を付して示されており、その全体が、特にそれらの配列について、参照により本明細書に組み込まれる。トライデントフォーマットでは、他のトライデントリンカーおよびコイル−コイル配列は、ＷＯ  ２０１５／１８４２０３に示されており、その全体が、特にそれらの配列について、参照により本明細書に組み込まれる。当業者によって理解されるように、太字のドメイン（例えば、「ＶＨ１」、ＶＨ２−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬ２」など）はスラッシュ「／」で分離され、そして必要に応じて任意のドメインリンカーを含み得る。これらの骨格の全ては、軽鎖にカッパ定常領域を利用するが、ラムダ鎖もまた使用され得る。本明細書で概説されるように、図９および図７５に関して、これらの骨格は、任意のＶＨおよびＶＬドメインと組み合わせることができる。
【０５１２】
図５６は、ボトルオープナーフォーマット（ＦＡＢ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の例示的な抗ＰＤ−１×抗ＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。示されるように、ｓｃＦｖのドメインはＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬまたはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨのいずれかの異なる配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）を有するが、これを逆にすることができる。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【０５１３】
図５７は、中心−ｓｃＦｖフォーマットの例示的な抗ＰＤ−１×抗ＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。示されるように、ｓｃＦｖのドメインはＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬまたはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨのいずれかの異なる配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）を有するが、これを逆にすることができる。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【０５１４】
図５８は、中心−ｓｃＦｖ２フォーマットの例示的な抗ＰＤ−１×抗ＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。示されるように、ｓｃＦｖのドメインはＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬまたはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨのいずれかの異なる配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）を有するが、これを逆にすることができる。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【０５１５】
図５９は、二重特異性ｍＡｂフォーマットで例示的な抗ＰＤ−１×抗ＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、第１の抗原に対する第１のＦａｂ可変領域と、第２の抗原に対する第２のＦａｂ可変領域を、その後に鎖の指定（第１の抗原に対する重鎖１または軽鎖１、第２の抗原に対する重鎖２または軽鎖２）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【０５１６】
図６０は、ＤＶＤ−ＩｇＧフォーマットで例示的な抗ＰＤ−１×抗ＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、第１の抗原に対する第１の可変領域と、第２の抗原に対する第２のＦａｂ可変領域を、その後に鎖の指定（重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【０５１７】
図６１は、トライデントフォーマットで例示的な抗ＰＤ−１×抗ＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、ＤＡＲＴを含む第１の抗原に対する第１のＶＬおよびＶＨと、第２の抗原に対するＦａｂ可変領域を、その後に鎖の指定（重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【０５１８】
図６２は、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて、代替的なフォーマットのｃｏｓｔｉｍ×チェックポイント遮断二重特異性抗体によるサイトカイン分泌（ＩＬ−２）の誘導を示す。
【０５１９】
図６３は、ボトルオープナーフォーマット（ＦＡＢ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の例示的な抗ＩＣＯＳ×抗ＣＴＬＡ−４抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。示されるように、ｓｃＦｖのドメインはＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬまたはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨのいずれかの異なる配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）を有するが、これを逆にすることができる。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【０５２０】
図６４は、二重特異性ｍＡｂフォーマットで例示的な抗ＬＡＧ−３×抗ＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、第１の抗原に対する第１のＦａｂ可変領域と、第２の抗原に対する第２のＦａｂ可変領域を、その後に鎖の指定（第１の抗原に対する重鎖１または軽鎖１、第２の抗原に対する重鎖２または軽鎖２）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【０５２１】
図６５は、二重特異性ｍＡｂフォーマットで例示的な抗ＴＩＭ−３×抗ＩＣＯＳ抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、ダッシュで区切られた、第１の抗原に対する第１のＦａｂ可変領域と、第２の抗原に対する第２のＦａｂ可変領域を、その後に鎖の指定（第１の抗原に対する重鎖１または軽鎖１、第２の抗原に対する重鎖２または軽鎖２）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【０５２２】
図６６は、ボトルオープナーフォーマット（ＦＡＢ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）および中心−ｓｃＦｖ２フォーマットの抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−Ｌ１抗体のアミノ酸配列を示す。ボトルオープナーは、ダッシュで区切られた、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖、ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖または軽鎖）を用いて命名される。中心−ｓｃＦｖ２は、Ｆａｂ可変領域第１と、ｓｃＦｖ可変領域第２を、その後に鎖の指定（重鎖または軽鎖）を用いて命名される。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。示されるように、ｓｃＦｖのドメインはＶＨ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＬまたはＶＬ−ｓｃＦｖリンカー−ＶＨのいずれかの異なる配向（Ｎ末端からＣ末端に向かう）を有するが、これを逆にすることができる。さらに、本明細書に概説される各配列は、一方または好ましくは両方のＦｃドメイン中に、血清中でより長い半減期をもたらすＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓの変異を含むかまたは除外することができる。
【０５２３】
図６７は、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおいて、さらなるｃｏｓｔｉｍ×チェックポイント遮断二重特異性抗体によるサイトカイン分泌（ＩＬ−２）の誘導を示す。
【０５２４】
図６８は、例示的な１アーム抗ＩＣＯＳのＦａｂ−Ｆｃの抗体のアミノ酸配列を示す。ＣＤＲに下線が付され、スラッシュは可変領域の境界を示す。一方のアミノ酸鎖はＦｃドメインのみであり、他方の側は抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂ側であるため、これらは「１アーム」または「１アームの」フォーマットと呼ばれる。Ｆｃドメインは、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑスキュー変異、ならびに図Ｘに示されるｐＩ（−）−等価＿Ａ変異を含む。Ｆａｂ  Ｆｃドメインは、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓスキュー変異、および図Ｘに示されるｐＩ  ＩＳＯ（＋ＲＲ）変異を含む。両方のＦｃドメインは、除去変異（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ）を含む。
【０５２５】
図６９は、Ｏｃｔｅｔによって決定されたときの、ＡＭＣバイオセンサー上に捕捉されたヒトＩＣＯＳのマウスＦｃ融合物に対する変異型１アーム抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂ−Ｆｃ抗体の平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（Ｋａ）、および解離速度（Ｋｄ）を示す。
【０５２６】
図７０は、二価および一価の、抗ＰＤ−１抗体、および抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体による処理の後のＳＥＢ刺激精製ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＡＫＴリン酸化を示す。
【０５２７】
図７１は、代替的な抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤと共に一価抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂ−Ｆｃ抗体によって処理した後の、精製ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるＡＫＴリン酸化を示す。
【０５２８】
図７２は、プロトタイプの二重特異性抗体（ＯＸ４０×ＰＤ−１、ＧＩＴＲ×ＰＤ−１、４−１ＢＢ×ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４×ＩＣＯＳ）を示す。
【０５２９】
図７３は、いくつかのプロトタイプのｍＡｂｓ（４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−１）を示し、そのＦｖは本発明の他のＦｖと組み合わせて、そして任意のフォーマット（ボトルオープナー、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、二重特異性ｍＡｂ、中央−Ｆｖ、１アーム中央−ｓｃＦｖ、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、またはトライデント）で使用することができる。同様に、いくつかの追加のＩＣＯＳ×ＰＤ−Ｌ１ボトルオープナー配列も示されている。
【０５３０】
図７４は、さらなるＰＤ−１×ＩＣＯＳボトルオープナーを示し、ある場合では、ＰＤ−１ＦｖがＦａｂフォーマットであり、ＩＣＯＳ  ＦｖがｓｃＦｖフォーマットであり、他の場合では逆転している。
【０５３１】
図７５Ａ〜Ｄは、本発明のＦｖ配列が付加されている、本発明における使用のｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格の配列を示す。ｍＡｂ−ｓｃＦｖの骨格１はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異を含む。骨格２はヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異を含む。骨格３はヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異、ならびにＮ２９７Ａの両方の鎖の変異を含む。骨格４は、変異がＮ２９７Ｓであることを除いて３と同一である。ｍＡｂ−ｓｃＦｖの骨格３および４の代替的なフォーマットは、両方の鎖の除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを除外できる。骨格５はヒトＩｇＧ４に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの両方の鎖の除去変異、ならびに当該技術分野で知られているように、Ｆａｂアーム交換を除去するＳ２２８Ｐ（ＥＵナンバリング、これはＫａｂａｔではＳ２４１Ｐである）の両鎖の変異を含み、骨格６は、ヒトＩｇＧ２に基づき、Ｆａｂ側にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩ変異を含む。骨格７はヒトＩｇＧ２に基づき、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキュー変異、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのＦａｂ側のｐＩ変異、およびＳ２６７Ｋの両方の鎖の変異を含む。
【０５３２】
当業者には理解され、以下に概説されるように、これらの配列は、ＦａｂとｓｃＦｖ（任意に荷電ｓｃＦｖリンカーを含む）の両方を含む一つの単量体およびＦａｂ配列を含む他の単量体を含む、本明細書に概説される任意のｖｈとｖｌの対と共に使用できる（例えば、「Ｆａｂ側重鎖」に連結したｖｈ、および「定常軽鎖」に連結したｖｌ）。すなわち、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＰＤ−１、抗ＬＡＧ−３、抗ＴＩＭ−３、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＢＴＬＡ、抗ＩＣＯＳ、抗ＧＩＴＲ、国ＯＸ４０、および抗４−１ＢＢについて本明細書で概説した任意のＦｖ配列は、ｓｃＦｖ（同様に、任意選択で荷電ｓｃＦｖリンカーを有する）またはＦａｂとしてであるかどうかにかかわらず、この図７５の骨格に任意の組み合わせで組み込むことができる。単量体１側はＦａｂ−ｓｃＦｖのｐＩ陰性側であり、ヘテロ二量体化変異Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、等価ｐＩ変異Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ、除去変異Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含む（全てＩｇＧ１と比較したもの）。単量体２側はｓｃＦｖのｐＩ陽性側であり、ヘテロ二量体化変異３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含む。ただし、他のスキュー変異の対、特に、［Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ］、［Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ］、［Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ］、［Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ］、［Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ］、［Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ］、［Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ］、および［Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３９４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ］で置換することができる。
【０５３３】
図７５Ａに示されている定常軽鎖は、図中のコンストラクトの全てのために使用することができるが、カッパ定常軽鎖もまた置換されていてもよい。
【０５３４】
これらのｍＡｂ−ｓｃＦｖ骨格は図１ＨのｍＡｂ−Ｆｖフォーマット（ここで一方の単量体はＣ末端にｖｌを含みそして他方はＣ末端にｖｈを含む）の両方において、同様にｓｃＦｖ−ｍＡｂフォーマット（単量体のうちの１つのＣ末端にｓｃＦｖドメインを付加したもの）において、使用されることに注目すべきである。
【０５３５】
これらの骨格の各々に含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書で定義されるように）９０、９５、９８、および９９％同一であり、および／または（当業者には理解されるように、親のヒトＩｇＧ１（または骨格に基づいてＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４）と比べていくつかのアミノ酸修飾を既に含む図の「親」と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の追加のアミノ酸置換を含む配列である。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキュー、ｐＩおよび除去変異に加えて、さらなるアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。
【０５３６】
図７６は、ＶＨおよびＶＬの配列として、ヒトＰＤ−１に連結するＦｖのいくつかの従来技術の配列を示す。当業者には理解されるように、これらのＦｖのいずれも、共刺激受容体（例えば、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、または４−１ＢＢ）に連結するＦｖ（本明細書に含まれるＦｖ配列を含む）と組み合わせることができ、任意のフォーマット（ボトルオープナー、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、二重特異性ｍＡｂ、中央−Ｆｖ、１アーム中央−ｓｃＦｖ、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、またはトライデント）であり得る。特にそれらはＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０と［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０  ＡＢＤと組み合わせることができる。
【０５３７】
図７７は、ＶＨおよびＶＬの配列として、ヒトＩＣＯＳに連結するＦｖのいくつかの従来技術の配列を示す。当業者には理解されるように、これらのＦｖのいずれも、チェックポイント受容体（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、およびＢＴＬＡ）に連結するＦｖ（、本明細書に含まれるＦｖ配列を含む）と組み合わせることができ、任意のフォーマット（ボトルオープナー、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、二重特異性ｍＡｂ、中央−Ｆｖ、１アーム中央−ｓｃＦｖ、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、またはトライデント）であり得る。特に、それらは識別子１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１を有するＰＤ−１  ＡＢＤと組み合わせることができる。
【０５３８】
図７８は、ＶＨおよびＶＬの配列として、ヒトＰＤ−Ｌ１に連結するＦｖのいくつかの従来技術の配列を示す。当業者には理解されるように、これらのＦｖのいずれも、共刺激受容体（例えば、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、または４−１ＢＢ）に連結するＦｖ（本明細書に含まれるＦｖ配列を含む）と組み合わせることができ、任意のフォーマット（ボトルオープナー、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、二重特異性ｍＡｂ、中央−Ｆｖ、１アーム中央−ｓｃＦｖ、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、またはトライデント）であり得る。特にそれらはＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０と［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０  ＡＢＤと組み合わせることができる。
【０５３９】
図７９は、ＶＨおよびＶＬの配列として、ヒトＣＴＬＡ−４に連結するＦｖのいくつかの従来技術の配列を示す。当業者には理解されるように、これらのＦｖのいずれも、共刺激受容体（例えば、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、または４−１ＢＢ）に連結するＦｖ（本明細書に含まれるＦｖ配列を含む）と組み合わせることができ、任意のフォーマット（ボトルオープナー、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、二重特異性ｍＡｂ、中央−Ｆｖ、１アーム中央−ｓｃＦｖ、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、またはトライデント）であり得る。特にそれらはＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０と［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０  ＡＢＤと組み合わせることができる。
【０５４０】
図８０は、ＶＨおよびＶＬの配列として、ヒトＬＡＧ−３に連結するＦｖのいくつかの従来技術の配列を示す。当業者には理解されるように、これらのＦｖのいずれも、共刺激受容体（例えば、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、または４−１ＢＢ）に連結するＦｖ（本明細書に含まれるＦｖ配列を含む）と組み合わせることができ、任意のフォーマット（ボトルオープナー、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、二重特異性ｍＡｂ、中央−Ｆｖ、１アーム中央−ｓｃＦｖ、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、またはトライデント）であり得る。特にそれらはＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０と［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０  ＡＢＤと組み合わせることができる。
【０５４１】
図８１は、ＶＨおよびＶＬの配列として、ヒトＴＩＭ−３に連結するＦｖのいくつかの従来技術の配列を示す。当業者には理解されるように、これらのＦｖのいずれも、共刺激受容体（例えば、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、または４−１ＢＢ）に連結するＦｖ（本明細書に含まれるＦｖ配列を含む）と組み合わせることができ、任意のフォーマット（ボトルオープナー、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、二重特異性ｍＡｂ、中央−Ｆｖ、１アーム中央−ｓｃＦｖ、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、またはトライデント）であり得る。特にそれらはＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０と［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０  ＡＢＤと組み合わせることができる。
【０５４２】
図８２は、ＶＨおよびＶＬの配列として、ヒトＢＴＬＡに連結するＦｖのいくつかの従来技術の配列を示す。当業者には理解されるように、これらのＦｖのいずれも、共刺激受容体（例えば、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、または４−１ＢＢ）に連結するＦｖ（本明細書に含まれるＦｖ配列を含む）と組み合わせることができ、任意のフォーマット（ボトルオープナー、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、二重特異性ｍＡｂ、中央−Ｆｖ、１アーム中央−ｓｃＦｖ、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、またはトライデント）であり得る。特にそれらはＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０と［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０  ＡＢＤと組み合わせることができる。
【０５４３】
図８３は、ＶＨおよびＶＬの配列として、ヒトＴＩＧＩＴに連結するＦｖのいくつかの従来技術の配列を示す。当業者には理解されるように、これらのＦｖのいずれも、共刺激受容体（例えば、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、または４−１ＢＢ）に連結するＦｖ（本明細書に含まれるＦｖ配列を含む）と組み合わせることができ、任意のフォーマット（ボトルオープナー、ｍＡｂ−Ｆｖ、ｍＡｂ−ｓｃＦｖ、中央−ｓｃＦｖ、二重特異性ｍＡｂ、中央−Ｆｖ、１アーム中央−ｓｃＦｖ、１アームのｓｃＦｖ−ｍＡｂ、デュアルｓｃＦｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、またはトライデント）であり得る。特にそれらはＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０と［ＩＣＯＳ］Ｈ０．６６＿Ｌ０  ＡＢＤと組み合わせることができる。
【０５４４】
図８４Ａ〜Ｃは、配列番号３７０５〜３７３６として列挙されている追加の抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤと共に、いくつかのＢＴＬＡ  ＡＢＤを示す。ＣＤＲは下線が付され、ｓｃＦｖリンカーは二重下線が付され（配列中、ｓｃＦｖリンカーは正に荷電したｓｃＦｖ（ＧＫＰＧＳ）４リンカーであるが、当業者には理解されるように、このリンカーは、いくつかが図８に示されている無荷電または負に荷電したリンカーを含む他のリンカーによって置き換えることができる）、スラッシュは可変ドメインの境界を示す。上記のように、命名規則は、Ｎ末端からＣ末端に向かうｓｃＦｖの向きを示し、この図に列挙されている配列においてそれらは全てｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌ（Ｎ末端からＣ末端に向かう）であるが、これらの配列はまた、反対の向き（Ｎ末端からＣ末端に向かって）、ｖｌ−リンカー−ｖｈでも使用され得る。本明細書中に記されそして本明細書中のＣＤＲを含むあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は表１に示されるように用いられるナンバリングによってわずかに異なり得、したがって、下線が付されたＣＤＲのみならず、他のナンバリングシステムを用いたｖｈおよびｖｌドメイン内に含まれるＣＤＲもまた本明細書に含まれる。さらに、図中の全ての配列に関して、これらのｖｈおよびｖｌ配列はｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットのいずれでも使用することができる。
【０５４５】
図８５は、可能な全ての可能な組み合わせによる、ｃｏｓｔｉｍとチェックポイントのＡＢＤの可能な組み合わせの行列である。ボックス内の「Ａ」はＰＤ−１  ＡＢＤが１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９であることを意味する。ボックス内の「Ｂ」は、ＩＣＯＳ  ＡＢＤが［ＩＣＯＳ］Ｈ．０６６＿Ｌ０であることを意味する。ボックス内の「Ｃ」は、ＰＤ−１が対のｓｃＦｖであることを意味する。ボックス内の「Ｄ」は、ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤがＦａｂであり、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２であることを意味する。ボックス内の「Ｅ」はＣＴＬＡ−４  ＡＢＤがｓｃＦｖであり、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．２２であることを意味する。ボックス内の「Ｆ」は、ＬＡＧ−３  ＡＢＤが７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４であることを意味する。ボックス内の「Ｇ」は、ＢＴＬＡ  ＡＢＤが９Ｃ６＿Ｈ１．１＿Ｌ１であることを意味する。ボックス内の「Ｈ」は、組み合わせがボトルオープナーであることを意味する。ボックス内の「Ｉ」は、組み合わせが中央−ｓｃＦｖフォーマットであることを意味する。
【０５４６】
図８６は、２つのさらなるＩＣＯＳ×ＰＤ−１ボトルオープナーを示す。
【０５４７】
Ａ）、二重特異性三価（例えば図２Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、またはＭに描かれるように、１つの抗原が単一のＡＢＤによって連結され、他のものが２つのＡＢＤによって連結される）、または二重特異性四価（例えば、図２ＪおよびＬに描かれるように、両方の抗原が２つのＡＢＤによって連結される）。
【０５４８】
さらに、概して、ＡＢＤのうちの１つは、ｖｈ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｌまたはｖｌ−ｓｃＦｖリンカー−ｖｈのＮ末端からＣ末端への配向で、本明細書に概説されるようなｓｃＦｖを含む。フォーマットによれば、他のＡＢＤの一方または両方は、概して、一方のタンパク質鎖上にｖｈドメインを（概して重鎖の構成要素として）およびもう別のタンパク質鎖上にｖｌ（概して軽鎖の構成要素として）を含むＦａｂである。「トライデント」フォーマットではＤＡＲＴ（登録商標）が使用され、これは向きが異なることと、概してリンカーが少し長くなることがある点を除いてｓｃＦｖと類似する。
【０５４９】
本発明は、以下に概説するように、いくつかの異なる受容体タンパク質に連結するいくつかのＡＢＤを提供する。当業者には理解されるように、６個のＣＤＲまたはｖｈおよびｖｌドメインの任意のセットはｓｃＦｖフォーマットまたはＦａｂフォーマットにすることができ、次いでこれを重鎖および軽鎖の定常ドメインに付加し、ここで重鎖定常ドメインは変異（ＣＨ１ドメインおよびＦｃドメイン内を含む）を含む。配列表に含まれているｓｃＦｖ配列は、特定の荷電したリンカーを利用するが、本明細書に概説するように、図８に示したものを含む、非荷電または他の荷電リンカーを使用することができる。
【０５５０】
さらに、上記のように、ＣＤＲの同定のために配列表において使用されるナンバリングはＫａｂａｔであるが、異なるナンバリングを使用することができ、それは表１に示されるようにＣＤＲのアミノ酸配列を変化させるであろう。
【０５５１】
本明細書に記載の可変の重鎖および軽鎖のドメインの全てについて、さらなる変異を作製することができる。本明細書に概説するように、いくつかの実施形態では、６個のＣＤＲのセットは、０、１、２、３、４、または５個のアミノ酸改変（アミノ酸置換が特に使用される）、ならびにフレームワーク（ＣＤＲを除く）が、参照によりその図および図説の全ての内容が本明細書に組み込まれる米国特許第７，６５７，３８０号の図１に列挙されるものから選択されるヒト生殖細胞系列の配列に対して少なくとも約８０、８５、または９０％同一性を保持する限り、可変重鎖および軽鎖のフレームワーク領域における変化を有することができる。したがって、例えば、本明細書に記載の同一のＣＤＲは、フレームワーク領域が、米国特許第７，６５７，３８０号の図１に列挙されるものから選択されるヒト生殖細胞系列の配列に対して少なくとも８０、８５、または９０％同一性を保持する限り、ヒト生殖細胞系列の配列からの異なるフレームワークの配列と組み合わせることができる。代替的に、ＣＤＲは、アミノ酸改変（例えば、ＣＤＲのセットにおいて１、２、３、４、または５個のアミノ酸改変を有し得（すなわち、ＣＤＲは、６個のＣＤＲのセット中の変化の全数が６アミノ酸改変未満である限り、任意の組み合わせのＣＤＲが変更され、例えば、ｖｌＣＤＲ１において１つの変更、ｖｈＣＤＲ２において２つの変更、ｖｈＣＤＲ３において変更がないなどであり得る））、同様に、フレームワーク領域が、米国特許第７，６５７，３８０号の図１に列挙されるものから選択されるヒト生殖細胞系列の配列に対して少なくとも８０、８５、または９０％同一性を保持する限り、フレームワーク領域の変更を有する。
【０５５２】
Ｂ．ＰＤ−１抗原連結ドメイン
いくつかの実施形態において、ＡＢＤのうちの１つはＰＤ−１に連結する。６個のＣＤＲならびに／またはＶＨおよびＶＬドメイン、ならびにｓｃＦｖ配列の適切なセットは、図３、図１０、図１１、図７２、図７３、図７４、図７６、ならびに配列番号１〜２３９２、３１２５〜３１４４、４６９７〜７５９４、および４６９７〜２１８１０に示され、識別子１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１を有する配列表中のそれらの配列を含む。
【０５５３】
当業者には理解されるように、適切な抗ＰＤ−１  ＡＢＤは、下線が付されているものとしてか、または、本明細書において記載され表１に示されるような、異なるナンバリングスキームが使用される場合、これらの配列のｖｈおよびｖｌの配列内の他のアラインメントを使用して同定されるＣＤＲとして、これらの配列および図に描かれているような６個のＣＤＲのセットを含み得る。適切なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるようなｖｈおよびｖｌの全体の配列をも含み得る。ＰＤ−１に対するＦｖを含む本明細書中の実施形態の多くにおいて、ＰＤ−１に連結するのはｓｃＦｖ単量体である。本明細書で論じられるように、ＰＤ−１が抗原の１つであるとき、標的対の他のものは、ＩＣＯＳ（適切な配列は、図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５に示される（これらは、ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列のセット、またはｖｈおよびｖｌの配列であり得る））、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、および４−１ＢＢから選択される。
【０５５４】
ヒトＰＤ−１に連結する特に有用なＡＢＤには、１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１が含まれるがこれらに限定されない。
【０５５５】
さらに、ヒトＰＤ−１に連結する有用なＶＨおよびＶＬの配列を図７６に示す。
【０５５６】
ＰＤ−１に対するＡＢＤを形成する、配列表に開示された親ＣＤＲセットに加えて、本発明は変異型ＣＤＲセットを提供する。一実施形態において、６つのＣＤＲのセットは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親ＣＤＲから１、２、３、４または５のアミノ酸の変更を有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。
【０５５７】
ＰＤ−１に対するＡＢＤを形成する、本明細書に開示されている親の可変重鎖および可変軽鎖ドメインに加えて、本発明は変異型のｖｈおよびｖｌドメインを提供する。一実施形態において、変異型のｖｈおよびｖｌドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親のｖｈおよびｖｌドメインから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０からのアミノ酸の変更をそれぞれが有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。別の実施形態において、変異型のｖｈおよびｖｌドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１で測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、それぞれの親のｖｈおよびｖｌドメインに対し、少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であることができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。
【０５５８】
特定の好ましい実施形態は、ｓｃＦｖフォーマットの１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９抗ＰＤ−１のＦｖを含み、図９のボトルオープナーフォーマット骨格のいずれか内に含まれる。
【０５５９】
特定の好ましい実施形態は、ｓｃＦｖフォーマットの１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９抗ＰＤ−１のＦｖを含み、図５５のフォーマット骨格のいずれか内に含まれる。
【０５６０】
特定の好ましい実施形態は、ｓｃＦｖフォーマットの１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９抗ＰＤ−１のＦｖを含み、図７５のｍＡｂ−ｓｃＦｖフォーマット骨格のいずれか内に含まれる。
【０５６１】
図２に示す任意のフォーマットで図７６に示すように、他の実施形態は、任意の抗ＰＤ−１のＶＨおよびＶＬドメインの対（ｓｃＦｖまたはＦａｂのいずれかとして）を利用する。
【０５６２】
Ｃ．ＣＴＬＡ−４抗原連結ドメイン
いくつかの実施形態において、ＡＢＤのうちの１つはＣＴＬＡ−４に連結する。６個のＣＤＲおよび／またはｖｈおよびｖｌドメインの適切なセット、ならびにｓｃＦｖ配列は、配列番号２３９３〜２４１４および３７３７〜３８１６に示され、ならびにいくつかの実施形態において特に興味深い配列は、図１２および図７９に示され、また識別子［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２５＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２６＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２７＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．２９＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３８＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．３９＿Ｌ０、０［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．４０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０．７０＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ０＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ２＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２１＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２３＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．２５＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１１９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２５、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２６、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２７、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２８、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１２９、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．４＿Ｌ０．１３２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．１、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．５＿Ｌ２．３、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．２２、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．４４、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．６７、および［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３＿Ｌ０．７４を有する配列表中のそれらの配列をも含む。
【０５６３】
当業者には理解されるように、適切な抗ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤは、下線が付されているものとしてか、または、本明細書において記載され表１に示されるような、異なるナンバリングスキームが使用される場合、本明細書で概説されるｖｈおよびｖｌの配列内の他のアラインメントを使用して同定されるＣＤＲとして、これらの配列および図に描かれているような６個のＣＤＲのセットを含み得る。適切なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるようなｖｈおよびｖｌの全体の配列をも含み得る。ＣＴＬＡ−４に対するＦｖを含む本明細書中の実施形態の多くにおいて、ＣＴＬＡ−４に連結するのはｓｃＦｖ単量体である。
本明細書で論じられるように、ＣＴＬＡ−４が抗原の１つであるとき、標的対の他のものは、ＩＣＯＳ（適切な配列は、図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５、ならびに識別子［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０および［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０を有するものに示される）、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、および４−１ＢＢから選択される。
【０５６４】
ＣＴＬＡ−４に対するＡＢＤを形成する、配列表に開示された親ＣＤＲセットに加えて、本発明は変異型ＣＤＲセットを提供する。一実施形態において、６つのＣＤＲのセットは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親ＣＤＲから１、２、３、４または５のアミノ酸の変更を有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。
【０５６５】
ＣＴＬＡ−４に対するＡＢＤを形成する、本明細書に開示されている親の可変重鎖および可変軽鎖ドメインに加えて、本発明は変異型のｖｈおよびｖｌドメインを提供する。一実施形態において、変異型のｖｈおよびｖｌドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親のｖｈおよびｖｌドメインから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０からのアミノ酸の変更をそれぞれが有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。別の実施形態において、変異型のｖｈおよびｖｌドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、それぞれの親のｖｈおよびｖｌドメインに対し、少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であることができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。
【０５６６】
Ｄ．ＴＩＭ−３抗原連結ドメイン
いくつかの実施形態において、ＡＢＤのうちの１つはＴＩＭ−３に連結する。６つのＣＤＲおよび／またはＶＨおよびＶＬドメインの適切なセット、ならびにｓｃＦｖ配列は、図１４および図８１および配列番号３３４５〜３７０４、４５８５〜４６９６に示される。いくつかの実施形態において特に興味深いＡＢＤ配列は、識別子１Ｄ１０＿Ｈ０Ｌ０、１Ｄ１２＿Ｈ０Ｌ０、３Ｈ３＿Ｈ１＿Ｌ２．１、６Ｃ８＿Ｈ０Ｌ０、６Ｄ９＿Ｈ０＿１Ｄ１２＿Ｌ０、７Ａ９＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１＿Ｈ０Ｌ０、７Ｂ１１ｖａｒ＿Ｈ０Ｌ０、および７Ｃ２＿Ｈ０Ｌ０を有する配列表中のそれらの配列を含む。
【０５６７】
当業者には理解されるように、適切な抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤは、下線が付されているものとしてか、または、本明細書において記載され表１に示されるような、異なるナンバリングスキームが使用される場合、本明細書で示されるもののｖｈおよびｖｌの配列内の他のアラインメントを使用して同定されるＣＤＲとして、これらの配列および図に描かれているような６個のＣＤＲのセットを含み得る。適切なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるようなｖｈおよびｖｌの全体の配列をも含み得る。ＴＩＭ−３に対するＦｖを含む本明細書中の実施形態の多くにおいて、ＴＩＭ−３に連結するのはＦａｂ単量体である。本明細書で論じられるように、ＴＩＭ−３が抗原の１つであるとき、標的対の他のものは、選択されたＩＣＯＳ（適切な配列は、図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５、ならびに識別子［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０および［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０を有するものに示される）、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、および４−１ＢＢである。
【０５６８】
ＴＩＭ−３に対するＡＢＤを形成する、配列表に開示された親ＣＤＲセットに加えて、本発明は変異型ＣＤＲセットを提供する。一実施形態において、６つのＣＤＲのセットは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親ＣＤＲから１、２、３、４または５のアミノ酸の変更を有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。
【０５６９】
ＴＩＭ−３に対するＡＢＤを形成する、本明細書に開示されている親の可変重鎖および可変軽鎖ドメインに加えて、本発明は変異型のｖｈおよびｖｌドメインを提供する。一実施形態において、変異型のｖｈおよびｖｌドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親のｖｈおよびｖｌドメインから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０からのアミノ酸の変更をそれぞれが有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。別の実施形態において、変異型のｖｈおよびｖｌドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１で測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、それぞれの親のｖｈおよびｖｌドメインに対し、少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であることができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。
【０５７０】
ＬＡＧ−３抗原連結ドメイン
いくつかの実施形態において、ＡＢＤのうちの１つはＬＡＧ−３に連結する。６個のＣＤＲおよび／またはｖｈおよびｖｌドメインの適切なセット、ならびにｓｃＦｖ配列は、図１３、図８０および配列番号２４１５〜２６０４、３８１７〜３９６０に示され、識別子２Ａ１１＿Ｈ０Ｌ０、２Ａ１１＿Ｈ１．１２５＿Ｌ２．１１３、２Ａ１１＿Ｈ１．１４４＿Ｌ２．１４２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２２、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．１２４、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．２５、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．４７、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．５０、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９１、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９３、２Ａ１１＿Ｈ１＿Ｌ２．９７、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ１Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ２Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ３Ｌ２、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ１、２Ａ１１＿Ｈ４Ｌ２、７Ｇ８＿Ｈ０Ｌ０、７Ｇ８＿Ｈ１Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．１８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２３＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１１、７Ｇ８＿Ｈ３．２８＿Ｌ１．１３、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、７Ｇ８＿Ｈ３．３０＿Ｌ１．３４、および７Ｇ８＿Ｈ３Ｌ１を有する配列表中のそれらの配列をも含む。
【０５７１】
当業者には理解されるように、適切な抗ＬＡＧ−３  ＡＢＤは、下線が付されているものとしてか、または、本明細書において記載され表１に示されるような、異なるナンバリングスキームが使用される場合、本明細書での配列のｖｈおよびｖｌの配列内の他のアラインメントを使用して同定されるＣＤＲとして、これらの配列および図に描かれているような６個のＣＤＲのセットを含み得る。適切なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるようなｖｈおよびｖｌの全体の配列をも含み得る。ＬＡＧ−３に対するＦｖを含む本明細書中の実施形態の多くにおいて、ＬＡＧ−３に連結するのはＦａｂ単量体である。本明細書で論じられるように、ＬＡＧ−３が抗原の１つであるとき、標的対の他のものは、ＩＣＯＳ（適切な配列は、図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５、ならびに識別子［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０および［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０を有するものに示される）、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、および４−１ＢＢから選択される。
【０５７２】
ＬＡＧ−３に対するＡＢＤを形成する、配列表に開示された親ＣＤＲセットに加えて、本発明は変異型ＣＤＲセットを提供する。一実施形態において、６つのＣＤＲのセットは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親ＣＤＲから１、２、３、４または５のアミノ酸の変更を有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。
【０５７３】
ＬＡＧ−３に対するＡＢＤを形成する、本明細書に開示されている親の可変重鎖および可変軽鎖ドメインに加えて、本発明は変異型のｖｈおよびｖｌドメインを提供する。一実施形態において、変異型のｖｈおよびｖｌドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親のｖｈおよびｖｌドメインから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０からのアミノ酸の変更をそれぞれが有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。別の実施形態において、変異型のｖｈおよびｖｌドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、それぞれの親のｖｈおよびｖｌドメインに対し、少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であることができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。
【０５７４】
Ｅ．ＢＴＬＡ抗原連結ドメイン
いくつかの実施形態において、ＡＢＤのうちの１つはＢＴＬＡに連結する。６個のＣＤＲならびに／またはＶＨおよびＶＬドメイン、ならびにｓｃＦｖ配列の適切なセットは、図８２、図８４、および配列番号３７０５〜３７３６に示され、識別子９Ｃ６＿Ｈ０Ｌ０、９Ｃ６＿Ｈ１．１＿Ｌ１、および９Ｃ６＿Ｈ１．１１＿Ｌ１を有する配列表中のそれらの配列をも含む。
【０５７５】
当業者には理解されるように、適切な抗ＢＴＬＡ  ＡＢＤは、下線が付されているものとしてか、または、本明細書において記載され表１に示されるような、異なるナンバリングスキームが使用される場合、本明細書で示されるｖｈおよびｖｌの配列内の他のアラインメントを使用して同定されるＣＤＲとして、これらの配列および図に描かれているような６個のＣＤＲのセットを含み得る。適切なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるようなｖｈおよびｖｌの全体の配列をも含み得る。ＢＴＬＡに対するＦｖを含む本明細書中の実施形態の多くにおいて、ＢＴＬＡに連結するのはＦａｂ単量体である。本明細書で論じられるように、ＢＴＬＡが抗原の１つであるとき、標的対の他のものは、ＩＣＯＳ（適切な配列は、図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５、ならびに識別子［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０および［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０を有するものに示される）、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、および４−１ＢＢから選択される。
【０５７６】
ＢＴＬＡに対するＡＢＤを形成する、配列表に開示された親ＣＤＲセットに加えて、本発明は変異型ＣＤＲセットを提供する。一実施形態において、６つのＣＤＲのセットは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親ＣＤＲから１、２、３、４または５のアミノ酸の変更を有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。
【０５７７】
ＢＴＬＡに対するＡＢＤを形成する、本明細書に開示されている親の可変重鎖および可変軽鎖ドメインに加えて、本発明は変異型のｖｈおよびｖｌドメインを提供する。一実施形態において、変異型のｖｈおよびｖｌドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親のｖｈおよびｖｌドメインから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０からのアミノ酸の変更をそれぞれが有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。別の実施形態において、変異型のｖｈおよびｖｌドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、それぞれの親のｖｈおよびｖｌドメインに対し、少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であることができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。
【０５７８】
Ｆ．ＴＩＧＩＴ抗原連結ドメイン
いくつかの実施形態において、ＡＢＤのうちの１つはＴＩＧＩＴに連結する。６つのＣＤＲおよび／またはＶＨおよびＶＬドメインの適切なセット、ならびにｓｃＦｖ配列は、図８？および配列番号４４３３〜４５８５に示される。
【０５７９】
当業者には理解されるように、適切な抗ＴＩＧＩＴ  ＡＢＤは、下線が付されているものとしてか、または、本明細書において記載され表１に示されるような、異なるナンバリングスキームが使用される場合、本明細書で示されるｖｈおよびｖｌの配列内の他のアラインメントを使用して同定されるＣＤＲとして、これらの配列および図に描かれているような６個のＣＤＲのセットを含み得る。適切なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるようなｖｈおよびｖｌの全体の配列をも含み得る。ＴＩＧＩＴに対するＦｖを含む本明細書中の実施形態の多くにおいて、ＴＩＧＩＴに連結するのはＦａｂ単量体である。本明細書で論じられるように、ＴＩＧＩＴが抗原の１つであるとき、標的対の他のものは、選択されたＩＣＯＳ（適切な配列は、図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５、ならびに識別子［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０および［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０を有するものに示される）、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、および４−１ＢＢである。
【０５８０】
Ｇ．ＰＤ−Ｌ１抗原連結ドメイン
いくつかの実施形態において、ＡＢＤのうちの１つはＰＤ−Ｌ１に連結する。６つのＣＤＲおよび／またはＶＨおよびＶＬドメインの適切なセット、ならびにｓｃＦｖ配列は、図１５、図７３、および図７８および配列番号３９６１〜４４３２に示される。
【０５８１】
当業者には理解されるように、適切な抗ＴＩＧＩＴ  ＡＢＤは、下線が付されているものとしてか、または、本明細書において記載され表１に示されるような、異なるナンバリングスキームが使用される場合、本明細書で示されるｖｈおよびｖｌの配列内の他のアラインメントを使用して同定されるＣＤＲとして、これらの配列および図に描かれているような６個のＣＤＲのセットを含み得る。適切なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるようなｖｈおよびｖｌの全体の配列をも含み得る。ＴＩＧＩＴに対するＦｖを含む本明細書中の実施形態の多くにおいて、ＴＩＧＩＴに連結するのはＦａｂ単量体である。本明細書で論じられるように、ＴＩＧＩＴが抗原の１つであるとき、標的対の他のものは、選択されたＩＣＯＳ（適切な配列は、図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５、ならびに識別子［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０および［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０を有するものに示される）、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、および４−１ＢＢである。
【０５８２】
Ｈ．ＩＣＯＳ抗原連結ドメイン
いくつかの実施形態において、ＡＢＤのうちの１つはＩＣＯＳに連結する。６個のＣＤＲおよび／またはｖｈおよびｖｌドメインの適切なセット、ならびにｓｃＦｖ配列ＩＣＯＳ（適切な配列は、図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５、ならびに識別子［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０および［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０を有するものに示される。
【０５８３】
当業者には理解されるように、適切な抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤは、下線が付されているものとしてか、または、本明細書において記載され表１に示されるような、異なるナンバリングスキームが使用される場合、本明細書で開示される配列内の他のアラインメントを使用して同定されるＣＤＲとして、これらの配列および図に描かれているような６個のＣＤＲのセットを含み得る。適切なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるようなｖｈおよびｖｌの全体の配列をも含み得る。ＩＣＯＳに対するＦｖを含む本明細書中の実施形態の多くにおいて、ＩＣＯＳに連結するのはＦａｂ単量体である。本明細書で論じられるように、ＩＣＯＳが抗原の１つであるとき、標的対の他のものは、ＰＤ−１、図３、図１０、図１１、図７２、図７３、図７４、図７６、および配列番号１〜２３９２、３１２５〜３１４４、４６９７〜７５９４、および４６９７〜２１８１０に示され、および識別子１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１（これはｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セットまたはｖｈおよびｖｌ配列であり得る）を有する配列表中のそれらの配列を含む）、ＣＴＬＡ−４（適切な配列は図１２、７２、および７９、ならびに配列番号２３９３〜２４１４および３７３７〜３８１６に示される（これはｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セットまたはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＴＩＭ−３（適切な配列は図１４、図８１、および配列番号３３４５〜３７０４、４５８５〜４６９６に示される（これはｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セットまたはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＬＡＧ−３（適切な配列は、図１３、図８０、および配列番号２４１５〜２６０４、３８１７〜３９６０に示される（これはｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セットまたはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＢＴＬＡ（適切な配列は、図８２および８４ならびに配列番号？３７０５〜３７３６に示される（これは、ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ならびにＴＩＧＩＴ（適切な配列は、図ＸＸおよび配列番号４４３３〜４５８５に示される（これは、ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））から選択される。
【０５８４】
ＩＣＯＳに対するＡＢＤを形成する、配列表に開示された親ＣＤＲセットに加えて、本発明は変異型ＣＤＲセットを提供する。一実施形態において、６つのＣＤＲのセットは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親ＣＤＲから１、２、３、４または５のアミノ酸の変更を有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。
【０５８５】
ＩＣＯＳに対するＡＢＤを形成する、本明細書に開示されている親の可変重鎖および可変軽鎖ドメインに加えて、本発明は変異型のｖｈおよびｖｌドメインを提供する。一実施形態において、変異型のｖｈおよびｖｌドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親のｖｈおよびｖｌドメインから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０からのアミノ酸の変更をそれぞれが有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。別の実施形態において、変異型のｖｈおよびｖｌドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、それぞれの親のｖｈおよびｖｌドメインに対し、少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であることができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。
【０５８６】
特定の好ましい実施形態は、Ｆａｂフォーマットの［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０抗ＩＣＯＳのＦｖを含み、図９のボトルオープナーフォーマット骨格のいずれか内に含まれる。
【０５８７】
特定の好ましい実施形態は、ｓｃＦｖフォーマットの［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０＿Ｌ０抗ＩＣＯＳのＦｖを含み、図９のボトルオープナーフォーマット骨格のいずれか内に含まれる。
【０５８８】
特定の好ましい実施形態は、ｓｃＦｖフォーマットの［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０抗ＩＣＯＳのＦｖを含み、図７５のｍＡｂ−ｓｃＦｖフォーマット骨格のいずれか内に含まれる。
【０５８９】
特定の好ましい実施形態は、Ｆａｂフォーマットの［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０抗ＩＣＯＳのＦｖを含み、図７５のｍＡｂ−ｓｃＦｖフォーマット骨格のいずれか内に含まれる。
【０５９０】
特定の好ましい実施形態は、Ｆａｂフォーマットの［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０抗ＩＣＯＳのＦｖを含み、図５５のフォーマット骨格のいずれか内に含まれる。
【０５９１】
Ｉ．ＧＩＴＲ抗原連結ドメイン
いくつかの実施形態において、ＡＢＤのうちの１つはＧＩＴＲに連結する。６個のＣＤＲおよび／またはｖｈおよびｖｌドメインの適切なセット、ならびにｓｃＦｖ配列ＦＩＴＲ（適切な配列は、図１８、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２８２〜２６２９０に示される。
【０５９２】
当業者には理解されるように、適切な抗ＧＩＴＲ  ＡＢＤは、下線が付されているものとしてか、または、本明細書において記載され表１に示されるような、異なるナンバリングスキームが使用される場合、本明細書で開示される配列内の他のアラインメントを使用して同定されるＣＤＲとして、これらの配列および図に描かれているような６個のＣＤＲのセットを含み得る。適切なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるようなｖｈおよびｖｌの全体の配列をも含み得る。ＧＩＴＲに対するＦｖを含む本明細書中の実施形態の多くにおいて、ＧＩＴＲに連結するのはＦａｂ単量体である。本明細書で論じられるように、ＧＩＴＲが抗原の１つであるとき、標的対の他のものは、ＰＤ−１、図３、図１０、図１１、図７２、図７３、図７４、図７６、および配列番号１〜２３９２、３１２５〜３１４４、４６９７〜７５９４、および４６９７〜２１８１０に示され、および識別子１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１（これはｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セットまたはｖｈおよびｖｌ配列であり得る）を有する配列表中のそれらの配列を含む）、ＣＴＬＡ−４（適切な配列は図１２、７２、および７９、ならびに配列番号２３９３〜２４１４および３７３７〜３８１６に示される（これはｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セットまたはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＴＩＭ−３（適切な配列は図１４、図８１、および配列番号３３４５〜３７０４、４５８５〜４６９６に示される（これはｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セットまたはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＬＡＧ−３（適切な配列は、図１３、図８０、および配列番号２４１５〜２６０４、３８１７〜３９６０に示される（これはｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セットまたはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＢＴＬＡ（適切な配列は、図８２および８４ならびに配列番号？３７０５〜３７３６に示される（これは、ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ならびにＴＩＧＩＴ（適切な配列は、図ＸＸおよび配列番号４４３３〜４５８５に示される（これは、ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））から選択される。
【０５９３】
ＧＩＴＲに対するＡＢＤを形成する、配列表に開示された親ＣＤＲセットに加えて、本発明は変異型ＣＤＲセットを提供する。一実施形態において、６つのＣＤＲのセットは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親ＣＤＲから１、２、３、４または５のアミノ酸の変更を有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。
【０５９４】
ＧＩＴＲに対するＡＢＤを形成する、本明細書に開示されている親の可変重鎖および可変軽鎖ドメインに加えて、本発明は変異型のｖｈおよびｖｌドメインを提供する。一実施形態において、変異型のｖｈおよびｖｌドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親のｖｈおよびｖｌドメインから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０からのアミノ酸の変更をそれぞれが有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。別の実施形態において、変異型のｖｈおよびｖｌドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、それぞれの親のｖｈおよびｖｌドメインに対し、少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であることができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。
【０５９５】
Ｊ．ＯＸ４０抗原連結ドメイン
いくつかの実施形態において、ＡＢＤのうちの１つはＯＸ４０に連結する。ＯＸ４０に対する、６個のＣＤＲおよび／またはｖｈおよびｖｌドメインの適切なセット、ならびにｓｃＦｖ配列が提供される（適切な配列は、図１７、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２７２〜２６２８１に示される。
【０５９６】
当業者には理解されるように、適切な抗ＯＸ４０  ＡＢＤは、下線が付されているものとしてか、または、本明細書において記載され表１に示されるような、異なるナンバリングスキームが使用される場合、本明細書で開示される配列内の他のアラインメントを使用して同定されるＣＤＲとして、これらの配列および図に描かれているような６個のＣＤＲのセットを含み得る。適切なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるようなｖｈおよびｖｌの全体の配列をも含み得る。ＯＸ４０に対するＦｖを含む本明細書中の実施形態の多くにおいて、ＧＩＴＲに連結するのはＦａｂ単量体である。本明細書で論じられるように、ＯＸ４０が抗原の１つであるとき、標的対の他のものは、ＰＤ−１、図３、図１０、図１１、図７２、図７３、図７４、図７６、および配列番号１〜２３９２、３１２５〜３１４４、４６９７〜７５９４、および４６９７〜２１８１０に示され、および識別子１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１（これはｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セットまたはｖｈおよびｖｌ配列であり得る）を有する配列表中のそれらの配列を含む）、ＣＴＬＡ−４（適切な配列は図１２、７２、および７９、ならびに配列番号２３９３〜２４１４および３７３７〜３８１６に示される（これはｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セットまたはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＴＩＭ−３（適切な配列は図１４、図８１、および配列番号３３４５〜３７０４、４５８５〜４６９６に示される（これはｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セットまたはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＬＡＧ−３（適切な配列は、図１３、図８０、および配列番号２４１５〜２６０４、３８１７〜３９６０に示される（これはｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セットまたはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＢＴＬＡ（適切な配列は、図８２および８４ならびに配列番号？３７０５〜３７３６に示される（これは、ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ならびにＴＩＧＩＴ（適切な配列は、図ＸＸおよび配列番号４４３３〜４５８５に示される（これは、ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））から選択される。
【０５９７】
ＯＸ４０に対するＡＢＤを形成する、配列表に開示された親ＣＤＲセットに加えて、本発明は変異型ＣＤＲセットを提供する。一実施形態において、６つのＣＤＲのセットは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親ＣＤＲから１、２、３、４または５のアミノ酸の変更を有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。
【０５９８】
ＯＸ４０に対するＡＢＤを形成する、本明細書に開示されている親の可変重鎖および可変軽鎖ドメインに加えて、本発明は変異型のｖｈおよびｖｌドメインを提供する。一実施形態において、変異型のｖｈおよびｖｌドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親のｖｈおよびｖｌドメインから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０からのアミノ酸の変更をそれぞれが有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。別の実施形態において、変異型のｖｈおよびｖｌドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、それぞれの親のｖｈおよびｖｌドメインに対し、少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であることができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。
【０５９９】
Ｋ．４−１ＢＢ抗原連結ドメイン
いくつかの実施形態において、ＡＢＤのうちの１つは４−１ＢＢに連結する。６個のＣＤＲおよび／またはｖｈおよびｖｌドメインの適切なセット、ならびにｓｃＦｖ配列４−１ＢＢ（適切な配列は、図１６、図７２、および図７３、ならびに配列番号２６２６２〜２６７１に示される。
【０６００】
当業者には理解されるように、適切な抗４−１ＢＢ  ＡＢＤは、下線が付されているものとしてか、または、本明細書において記載され表１に示されるような、異なるナンバリングスキームが使用される場合、本明細書で開示される配列内の他のアラインメントを使用して同定されるＣＤＲとして、これらの配列および図に描かれているような６個のＣＤＲのセットを含み得る。適切なＡＢＤはまた、ｓｃＦｖまたはＦａｂとして使用される、これらの配列および図に示されるようなｖｈおよびｖｌの全体の配列をも含み得る。４−１ＢＢに対するＦｖを含む本明細書中の実施形態の多くにおいて、４−１ＢＢに連結するのはＦａｂ単量体である。本明細書で論じられるように、ＩＣＯＳが抗原の１つであるとき、標的対の他のものは、ＰＤ−１、図３、図１０、図１１、図７２、図７３、図７４、図７６、および配列番号１〜２３９２、３１２５〜３１４４、４６９７〜７５９４、および４６９７〜２１８１０に示され、および識別子１Ｇ６＿Ｈ１．２７９＿Ｌ１．１９４、１Ｇ６＿Ｈ１．２８０＿Ｌ１．２２４、１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９、１Ｇ６＿Ｌ１．２１０＿Ｈ１．２８８、および２Ｅ９＿Ｈ１Ｌ１（これはｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セットまたはｖｈおよびｖｌ配列であり得る）を有する配列表中のそれらの配列を含む）、ＣＴＬＡ−４（適切な配列は図１２、７２、および７９、ならびに配列番号２３９３〜２４１４および３７３７〜３８１６に示される（これはｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セットまたはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＴＩＭ−３（適切な配列は図１４、図８１、および配列番号３３４５〜３７０４、４５８５〜４６９６に示される（これはｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セットまたはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＬＡＧ−３（適切な配列は、図１３、図８０、および配列番号２４１５〜２６０４、３８１７〜３９６０に示される（これはｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セットまたはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ＢＴＬＡ（適切な配列は、図８２および８４ならびに配列番号？３７０５〜３７３６に示される（これは、ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））、ならびにＴＩＧＩＴ（適切な配列は、図ＸＸおよび配列番号４４３３〜４５８５に示される（これは、ｓｃＦｖ配列、ＣＤＲ配列セット、またはｖｈおよびｖｌ配列であり得る））から選択される。
【０６０１】
４−１ＢＢに対するＡＢＤを形成する、配列表に開示された親ＣＤＲセットに加えて、本発明は変異型ＣＤＲセットを提供する。一実施形態において、６つのＣＤＲのセットは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親ＣＤＲから１、２、３、４または５のアミノ酸の変更を有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。
【０６０２】
４−１ＢＢに対するＡＢＤを形成する、本明細書に開示されている親の可変重鎖および可変軽鎖ドメインに加えて、本発明は変異型のｖｈおよびｖｌドメインを提供する。一実施形態において、変異型のｖｈおよびｖｌドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、親のｖｈおよびｖｌドメインから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０からのアミノ酸の変更をそれぞれが有することができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。別の実施形態において、変異型のｖｈおよびｖｌドメインは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）および／またはＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えばＯｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つで測定されるときにＡＢＤが依然として標的抗原に連結することができる限り、それぞれの親のｖｈおよびｖｌドメインに対し、少なくとも９０、９５、９７、９８、または９９％同一であることができ、後者は多くの実施形態において特に使用される。
【０６０３】
Ｌ．特定の二重特異性実施形態
本発明は、以下に概説するようにいくつかの特定の二重特異性抗体を提供する。
【０６０４】
１．ＩＣＯＳ×ＰＤ−１
本発明は、ＩＣＯＳおよびＰＤ−１をそれぞれ一価で、場合によっては本明細書で概説したように、両方とも二価で連結する二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供する。
【０６０５】
一実施形態において、ＰＤ−１  ＡＢＤは１Ｇ６＿Ｌ１．１９４＿Ｈ１．２７９であり、ＩＣＯＳ  ＡＢＤは、図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５、ならびに識別子［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０および［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０を有するものに示される。
【０６０６】
一実施形態において、ＩＣＯＳ×ＰＤ−１二重特異性抗体は、ＸＥＮＰ番号２０２６１、２０７３０、２０８９６、２２４３２〜２２４３８、２２７３１〜２２７４８、２２８７８〜２２８９４、２２９３１〜２２９３２、２２９５０〜２２９６１、２３０９０〜２３０９３、２３２９５〜２３２９６、２３３０１、２３４０５、２３４０８、２３４１０（全て４２８Ｌ／４３４Ｓを有さないが、それらはそれらの置換を有することができる）、ＸＥＮＰ番号２２７３０、２２９１７〜２２９２８、２２９３５〜２２９３７、２２９７４〜２２９７９、２２９９５〜２２９９６、２３００１、２３１０３、２３１０４（全て４２８Ｌ／４３４Ｓを有するが、それらはそれらの置換を有さないことができる）、ＸＥＮＰ番号２３４１１、２１８２８、２１８２９、２１８３０、２１８３１、２２３４８、２３０５９（従来技術のＩＣＯＳ配列を使用）、ＸＥＮＰ番号１８９２０、２４１２５、２４１３０（追加のボトルオープナー）、ＸＥＮＰ２３４０６、２３４０７、２４１２８（ＩＣＯＳ×ＰＤ−１中央−ｓｃＦｖ）、ＸＥＮＰ２４１２３（ＩＣＯＳ×ＰＤ−１中央ｓｃＦｖ２）、ＸＥＮＰ２４１３４（ＩＣＯＳ×ＰＤ−１二重特異性ｍＡｂ）、２４１２２（ＩＣＯＳ×ＰＤ−１  ＤＶＤ−Ｉｇ）、ＸＥＮＰ２４１３２、２４１３３（ＩＣＯＳ×ＰＤ−１トライデント）から選択される。
【０６０７】
２．ＩＣＯＳ×ＰＤ−Ｌ１
この実施形態において、ＩＣＯＳ  ＡＢＤは、図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５、ならびに識別子［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０および［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０を有するものに示される。
【０６０８】
３．ＩＣＯＳ×ＣＴＬＡ−４
この実施形態において、ＩＣＯＳ  ＡＢＤは、図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５、ならびに識別子［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０および［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０を有するものに示される。
【０６０９】
一実施形態では、［ＩＣＯＳ］Ｈ  ０．６６＿Ｌ０のＦａｂ  ＩＣＯＳ  ＡＢＤを有するボトルオープナーフォーマットは、特に図９のボトルオープナー骨格１において、［ＣＴＬＡ−４］＿Ｈ３．３２＿Ｌ０．１２９のｓｃＦｖ  ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤと対となる。
【０６１０】
４．ＩＣＯＳ×ＬＡＧ−３
この実施形態において、ＩＣＯＳ  ＡＢＤは、図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５、ならびに識別子［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０および［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０を有するものに示される。
【０６１１】
５．ＩＣＯＳ×ＴＩＭ−３
この実施形態は、ＩＣＯＳ  ＡＢＤが、図１９、図２０、図２４、図６８、および図７７、ならびに配列番号２７８６９〜２８０８６、２８０８７〜２８２６９、２７１９３〜２７３３５、２８５４９〜２８５５６、および２８５５７〜２８６６５、ならびに識別子［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０．６６＿Ｌ０および［ＩＣＯＳ］＿Ｈ０Ｌ０を有するものに示される。
【０６１２】
Ｍ．同種抗体
本発明はさらに、本明細書に概説した抗体とアミノ酸配列同一性を共有する抗体を提供する。
【０６１３】
一実施形態では、本明細書および図に概説されているＶｈおよびＶｌ配列の１つ以上のＣＤＲにアミノ酸変異を有する二重特異性抗体が作製される。一実施形態では、本明細書に概説されているｖｈおよびｖｌ鎖の１つ以上のＣＤＲに、１、２、３、４、または５のアミノ酸の相違を有する抗体が提供される。これらのアミノ酸変異は、１つのＣＤＲ中に存在してもよく、または１つを超えるＣＤＲの間に広がってもよい。これらのアミノ酸変異はまた、二重特異性抗体のＦｖの一方または両方に存在し得、例えば、ＩＣＯＳ  Ｆｖ側（一般にＦａｂであるが、本明細書に概説されるようにｓｃＦｖであり得る）のＣＤＲ中に２個のアミノ酸変異およびＰＤ−１側に１個などで存在し得る。
【０６１４】
同様に、本発明は、本明細書に概説した配列に対して、特に可変重鎖および／または可変軽鎖ドメインに対して少なくとも９５、９６、９７、９８、または９９％のアミノ酸同一性を有する抗体を提供する。この配列同一性はまた、二重特異性抗体の一方のＦｖまたは両方のＦｖに存在し得る。すなわち、図面に概説されている可変重鎖および／または可変軽鎖ドメインと９５〜９９％同一である二重特異性抗体が提供される。
【０６１５】
ＩＸ．本発明の核酸
本発明はさらに、本発明の二重特異性抗体をコードする核酸組成物（または「単一特異的」抗体の場合は同様にそれらをコードする核酸）も提供する。
【０６１６】
当業者には理解されるように、核酸組成物は、ヘテロ二量体タンパク質のフォーマットおよび足場に依存するであろう。したがって、例えば、フォーマットが３つのアミノ酸配列を必要とするとき、３つの核酸配列を発現のために１つ以上の発現ベクターに組み込むことができる。同様に、いくつかのフォーマット（例えば、図２に開示されているようなデュアルｓｃＦｖフォーマット）は２つの核酸のみを必要とし、同様に、それらを１つまたは２つの発現ベクターに組み込むことができる。いくつかのフォーマットは４つのアミノ酸（二重特異性ｍＡｂ）を必要とする。
【０６１７】
当該技術分野において公知であるように、本発明の構成要素をコードする核酸は、当該技術分野において公知であるように、そして本発明のヘテロ二量体抗体を産生するために使用される宿主細胞に応じた発現ベクターに組み込まれ得る。一般に、核酸は任意の数の調節エレメント（プロモーター、複製起点、選択可能マーカー、リボソーム連結部位、インデューサーなど）に作動可能に連結されている。発現ベクターは、染色体外ベクターまたは組み込みベクターであり得る。
【０６１８】
次いで、本発明の核酸および／または発現ベクターを、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および／または真菌細胞を含む当該技術分野で周知の任意の数の異なる種類の宿主細胞に形質転換するが、哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）が、多くの実施形態において使用される。
【０６１９】
いくつかの実施形態では、各単量体をコードする核酸および軽鎖をコードする任意の核酸は、フォーマットに応じて適用可能なように、それぞれ一般に異なるまたは同じプロモーター制御下で単一の発現ベクター内に含まれる。本発明において特に使用される実施形態では、これら２つまたは３つの核酸のそれぞれは異なる発現ベクターに含まれる。本明細書および参照により本明細書に組み込まれる６２／０２５，９３１に示されるように、ヘテロ二量体形成を推進するために異なるベクター比を使用することができる。すなわち、驚くべきことに、タンパク質は第１の単量体：第２の単量体：軽鎖（ヘテロ二量体抗体を含む３つのポリペプチドを有する本明細書の多くの実施形態の場合）を１：１：２の比率で含むが、これらは最良の結果をもたらす比率ではない。
【０６２０】
本発明のヘテロ二量体抗体は、当該技術分野において周知のように、発現ベクターを含む宿主細胞を培養することによって作製される。一旦製造されると、イオン交換クロマトグラフィー工程を含む従来の抗体精製工程が実施される。本明細書で論じるように、２つの単量体のｐＩが少なくとも０．５だけ異なることは、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点に感受性の他の方法による分離を可能にし得る。すなわち、各単量体の等電点（ｐＩ）が異なるｐＩを有し、かつヘテロ二量体も異なるｐＩを有するようになるように各単量体の等電点（ｐＩ）を変化させるｐＩ置換を含むことによって、「トリプルＦ」ヘテロ二量体の等電点精製（例えば、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム）を促進する。これらの置換はまた、精製後の任意の混入したデュアルｓｃＦｖ−ＦｃおよびｍＡｂホモ二量体の特定およびモニタリングにも役立つ（例えば、ＩＥＦゲル、ｃＩＥＦ、および分析用ＩＥＸカラム）。
【０６２１】
Ｘ．ヘテロ二量体免疫調節抗体の生物学的および生化学的機能性
一般に、本発明の二重特異性免疫調節抗体は、癌を有する患者に投与され、そして有効性は、本明細書中に記載されるようないくつかの方法で評価される。このため、癌量、腫瘍のサイズ、転移の存在または程度の評価等の、有効性の標準的なアッセイを実行し得るが、免疫腫瘍学的治療もまた免疫状態評価に基づいて同様に評価され得る。これは、インビトロアッセイおよびインビボアッセイの両方を含むいくつかの方法で実施することができる。例えば、腫瘍量、サイズ、侵襲性、ＬＮ関与、転移等といった「古典的な」測定と併せて、免疫状態（例えば、ｉｐｉ治療後のＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の存在）の変化の評価を実施することができる。このため、以下のいずれかまたは全てを評価することができる：ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化もしくは増殖、ＣＤ８＋Ｔ（ＣＴＬ）細胞活性化もしくは増殖、ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性細胞傷害性活性および／もしくはＣＴＬ媒介性細胞枯渇、ＮＫ細胞活性およびＮＫ媒介性細胞枯渇に対するＰＶＲＩＧの抑制効果、Ｔｒｅｇ細胞分化および増殖ならびにＴｒｅｇ細胞もしくは骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）媒介性免疫抑制もしくは免疫耐性に対するＰＶＲＩＧの増強効果、ならびに／または免疫細胞による炎症性サイトカイン産生、例えば、Ｔ細胞もしくは他の免疫細胞によるＩＬ−２、ＩＦＮ−γもしくはＴＮＦ−α産生に対するＰＶＲＩＧの影響。
【０６２２】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、例えば、ＣＦＳＥ希釈法、免疫エフェクター細胞のＫｉ６７細胞内染色、および３Ｈ−チミジン取り込み法を使用して、免疫細胞増殖を評価することによって実施される。
【０６２３】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＰＤ１、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、およびＣＤ１０７Ａの表面発現によって測定される細胞脱顆粒のうちの１つ以上を含む、遺伝子発現の増加または活性化関連マーカーの増加したタンパク質レベルを評価することによって実施される。
【０６２４】
一般に、遺伝子発現アッセイは、当該技術分野で知られているように実施される。
【０６２５】
一般に、タンパク質発現測定も同様に、当該技術分野で知られているように実施される。
【０６２６】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、酵素活性（プロテアーゼ活性を含む）、細胞膜透過性、細胞接着、ＡＴＰ産生、補酵素産生、およびヌクレオチド取り込み活性等の多数の細胞パラメーターを推測することを通した標的細胞生存検出によって測定される細胞傷害性活性を評価することによって実施される。これらのアッセイの具体的な例としては、トリパンブルーまたはＰＩ染色、５１Ｃｒまたは３５Ｓ放出法、ＬＤＨ活性、ＭＴＴおよび／またはＷＳＴアッセイ、カルセイン−ＡＭアッセイ、発光系アッセイ、ならびに他のものが含まれるが、これらに限定されない。
【０６２７】
いくつかの実施形態では、治療の評価は、サイトカイン産生によって測定されるＴ細胞活性を評価することによって行われ、周知の技法を使用して、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１０、ＩＬ１３を含むがこれらに限定されないサイトカインを使用して、細胞内、培養上清液中のいずれかで測定する。
【０６２８】
したがって、治療の評価は、以下のうちの１つ以上を評価するアッセイを使用して実施することができる：（ｉ）免疫応答を増加させること、（ｉｉ）αβおよび／またはγδのＴ細胞の活性化を増加させること、（ｉｉｉ）細胞傷害性Ｔ細胞活性を増加させること、（ｉｖ）ＮＫおよび／またはＮＫＴ細胞活性を増加させること、（ｖ）αβおよび／またはγδのＴ細胞抑制を軽減させること、（ｖｉ）炎症誘発性サイトカイン分泌を増加させること、（ｖｉｉ）ＩＬ−２分泌を増加させること、（ｖｉｉｉ）インターフェロン−γ産生を増加させること、（ｉｘ）Ｔｈ１応答を増加させること、（ｘ）Ｔｈ２応答を減少させること、（ｘｉ）制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇの少なくとも１つの細胞数および／または活性を減少させるかまたは排除すること。
【０６２９】
有効性を測定するためのアッセイ
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化は、当該技術分野において公知のように、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを使用して評価される。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６３０】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、異なる因子のリン酸化または脱リン酸化によって、または他の翻訳後修飾を測定することによって測定される免疫応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６３１】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδのＴ細胞の活性化の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６３２】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、標的細胞、例えばがん細胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、細胞傷害性Ｔ細胞活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６３３】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、標的細胞、例えばがん細胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または例えば、ＣＤ１０７ａ等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、ＮＫおよび／またはＮＫＴの細胞活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６３４】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδのＴ細胞の抑制の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６３５】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、またはＬｕｍｉｎｅｘによって、またはＭｕｌｔｉｐｌｅｘビーズに基づく方法によって、または細胞内染色およびＦＡＣＳ解析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔ等によって測定される炎症促進性サイトカイン分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６３６】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、またはＬｕｍｉｎｅｘによって、またはＭｕｌｔｉｐｌｅｘビーズに基づく方法によって、または細胞内染色およびＦＡＣＳ解析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔ等によって測定されるＩＬ−２分泌の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６３７】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡによって、またはＬｕｍｉｎｅｘによって、またはＭｕｌｔｉｐｌｅｘビーズに基づく方法によって、または細胞内染色およびＦＡＣＳ解析によって、またはＡｌｉｓｐｏｔ等によって測定されるインターフェロンγ産生の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６３８】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＴｈ１応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６３９】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＴｈ２応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６４０】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定される調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の少なくとも１つの細胞数および／または活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。
【０６４１】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定されるＭ２マクロファージ細胞数の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。
【０６４２】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＭ２マクロファージ腫瘍形成促進活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。
【０６４３】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、フローサイトメトリーによって、またはＩＨＣによって測定されるＮ２好中球増加の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。
【０６４４】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＮ２好中球腫瘍形成促進活性の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。
【０６４５】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、Ｔ細胞活性化の阻害の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６４６】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、標的細胞、例えばがん細胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、ＣＴＬ活性化の阻害の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６４７】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例として活性化マーカーの発現の変化によって測定されるαβおよび／またはγδのＴ細胞枯渇の増加または減少を測定する。応答の減少は免疫刺激活性を示す。適切な減少は、以下に概説する増加の場合と同じである。
【０６４８】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、αβおよび／またはγδのＴ細胞の応答の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６４９】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される、抗原特異的メモリー応答の刺激の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６５０】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルサインＡＭ等の細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリーに基づくアッセイによって測定される、癌細胞のアポトーシスまたは溶解の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６５１】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルサインＡＭ等の細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリーに基づくアッセイによって測定される、癌細胞の細胞傷害性または細胞増殖抑制性の効果の刺激の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６５２】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルサインＡＭ等の細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリーに基づくアッセイによって測定される、癌細胞の直接的な殺傷の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６５３】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定されるＴｈ１７活性の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６５４】
一実施形態では、シグナル伝達経路アッセイは、例えば、例えばＭＴＴ、Ｃｒ放出、カルサインＡＭ等の細胞傷害性アッセイによって、または例えばＣＦＳＥ希釈もしくはヨウ化プロピジウム染色等のようなフローサイトメトリーに基づくアッセイによって測定される、補体依存性細胞傷害性および／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性の誘導の増加または減少を測定する。活性の増加は免疫刺激活性を示す。活性の適切な増加を以下に概説する。
【０６５５】
一実施形態では、Ｔ細胞活性化は、例えば、標的細胞、例えばがん細胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または増殖によって、または例えば、ＣＤ１３７、ＣＤ１０７ａ、ＰＤ１等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される。Ｔ細胞については、増殖、活性化の細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＰＤ１）、細胞傷害性（標的細胞を殺傷する能力）、およびサイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＴＮＦ−ａ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ）の増加が、癌細胞の強化された殺傷と一致する免疫調節の指標となり得る。
【０６５６】
一実施形態では、ＮＫ細胞活性化は、例えば、標的細胞、例えばがん細胞の直接的な殺傷によって、またはサイトカイン分泌によって、または例えばＣＤ１０７ａ等のような活性化マーカーの発現の変化によって測定される。ＮＫ細胞については、増殖、細胞傷害性（標的細胞を殺傷し、ＣＤ１０７ａ、グランザイム、およびパーフォリン発現を増加させる能力）、サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮγおよびＴＮＦ）、および細胞表面受容体発現（例えば、ＣＤ２５）の増加が、癌細胞の強化された殺傷と一致する免疫調節の指標となり得る。
【０６５７】
一実施形態では、γδのＴ細胞活性化は、例えば、サイトカイン分泌によって、または増殖によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される。
【０６５８】
一実施形態では、Ｔｈ１細胞活性化は、例えば、サイトカイン分泌によって、または活性化マーカーの発現の変化によって測定される。
【０６５９】
活性または応答の適切な増加（または減少、上で概説したように適切なもの）は、基準試料または対照試料のいずれか、例えば、本発明の抗ＰＶＲＩＧ抗体を含まない試験試料におけるシグナルと比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８〜９９％パーセントの増加である。同様に、基準対象または対照試料と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍または５倍の増加が有効性を示す。
【０６６０】
ＸＩ．治療
一旦製造されると、本発明の組成物は、一般に本発明の二重特異性免疫調節抗体の連結によって、一般にＴ細胞活性化の抑制を阻害すること（例えば、Ｔ細胞はもはや抑制されない）によって癌を治療することによって、いくつかの腫瘍学用途に使用される。
【０６６１】
したがって、本発明のヘテロ二量体組成物はこれらの癌の治療に使用される。
【０６６２】
ＸＩＩ．インビボ投与のための抗体組成物
本発明に従って使用される抗体の製剤は、所望の純度の抗体を任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］に一般に概説されるような）と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、保存用に調製される。許容される担体、緩衝剤、賦形剤、または安定剤は、使用される用量及び濃度において、レシピエントに対して非毒性でありリン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０６６３】
投与様式
本発明の抗体および化学療法剤は、ボーラスとしての静脈内投与またはある期間にわたる持続注入などの公知の方法に従って対象に投与される。
【０６６４】
治療法
本発明の方法において、治療は、疾患または病状に関して肯定的な治療応答を提供するために使用される。「肯定的な治療応答」は、疾患もしくは病状の改善、および／または疾患または病状に関連する症状の改善を意図する。例えば、肯定的な治療応答は、疾患における以下の改善のうちの１つ以上を指し得る：（１）腫瘍細胞の数の減少、（２）腫瘍細胞死の増加、（３）腫瘍細胞の生存の阻害、（５）腫瘍増殖の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）、（６）患者生存率の増加、および（７）疾患または病状に関連する１つ以上の症状からのいくらかの解放。
【０６６５】
任意の所与の疾患または病状における肯定的な治療応答は、その疾患または病状に特有の標準化された応答基準によって決定され得る。腫瘍応答は、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線撮影、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャン撮影、内視鏡検査、ならびに骨髄穿刺（ＢＭＡ）および循環中の腫瘍細胞の計数を含む腫瘍生検サンプリングなどのスクリーニング技法を使用して、腫瘍形態（すなわち、全身腫瘍組織量、腫瘍サイズなど）の変化について評定され得る。
【０６６６】
これらの肯定的な治療応答に加えて、治療を受けている対象は、疾患に関連する症状の改善の有益な効果を経験し得る。
【０６６７】
本発明に従う治療には、使用される医薬品の「治療有効量」が含まれる。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために、必要な用量および期間で有効な量をいう。
【０６６８】
治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する薬剤の能力などの因子によって異なり得る。治療有効量はまた、抗体または抗体部分のいずれの毒性または有害な効果よりも治療上有益な効果が勝る量である。
【０６６９】
腫瘍療法のための「治療有効量」は、疾患の進行を安定化する能力によっても測定することができる。癌を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価してもよい。
【０６７０】
あるいは、組成物のこの特性は、当業者に知られているインビトロアッセイによって、化合物が細胞増殖を阻害するか、またはアポトーシスを誘導する能力を検査することによって評価してもよい。治療有効量の治療用化合物は、腫瘍サイズを減少させるか、さもなければ対象の症状を軽減し得る。当業者であれば、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および選択される特定の組成物または投与経路などの因子に基づいて、そのような量を決定することができるであろう。
【０６７１】
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調節される。例えば、単回のボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例して減少または増加させてもよい。非経口組成物は、投与の容易性および投与量の均一性のために、単位剤形で処方され得る。本明細書で使用される単位剤形は、処置される対象のための単一用量として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。
【０６７２】
本発明の単位剤形形態の仕様は、（ａ）活性化合物の固有の特徴および達成すべき特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の治療に対してそのような活性化合物を調合する分野に付いて回る制限に影響され、またそれらに直接的に依存する。
【０６７３】
本発明で使用される二重特異性抗体の効率的な投薬量および投薬レジメンは、治療される疾患または病状に依存し、当業者によって決定され得る。
【０６７４】
本発明で使用される二重特異性抗体の治療有効量の例示的かつ非限定的な範囲は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇである。
【０６７５】
全ての引用文献は、本明細書にそれらの全体が参考として明示的に組み込まれる。
【０６７６】
本発明の特定の実施形態を例示の目的で上述のように説明したが、添付の特許請求の範囲に記載の本発明から逸脱することなく詳細の多数の変形をなし得ることが当業者には理解されよう。
【０６７７】
ＶＩＩＩ．実施例
本発明を説明するために実施例を以下に提供する。これらの実施例は、本発明を任意の特定の用途または動作理論に限定することを意味するものではない。本発明で論じられる全ての定常領域位置について、ナンバリングは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、参照により完全に組み込まれる）と同様のＥＵインデックスに従う。抗体の当業者は、この規則が免疫グロブリン配列の特定の領域における非連続的なナンバリングからなり、免疫グロブリンファミリーにおける保存された位置への標準的な基準を可能にすることを理解するであろう。したがって、ＥＵインデックスによって定義されるような任意の所与の免疫グロブリンの位置は必ずしもその連続配列に対応しない。
【０６７８】
一般的および具体的な科学技術は、米国特許出願公開第２０１５／０３０７６２９号、第２０１４／０２８８２７５号、およびＷＯ２０１４／１４５８０６に概説されており、これらは全て、特にその中に概説されている技術に関して、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。
【０６７９】
Ａ．実施例１：複数の癌型からのＴＩＬがＰＤ−１およびＴ細胞共刺激受容体を同時発現する
ＰＤ−１と様々なＴ細胞共刺激受容体との間の潜在的な関連性を調べるために、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓプロジェクト（ＴＣＧＡ）からのＲＮＡシーケンシングデータを分析に使用した。Ｖ２  ＲＳＥＭデータはＦｉｒｅＢｒｏｗｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｆｉｒｅｂｒｏｗｓｅ．ｏｒｇ／）からダウンロードした。慣例的なルーチンによってＲを用いて分析を行った。ＰＤ−１の発現と８つの共刺激受容体との間の相関を、計算されたＲ２値（ピアソン相関係数の二乗）と共に図１に示す。データは、ＰＤ−１およびいくつかの共刺激受容体が、膀胱癌、乳癌、結腸癌、頭頸部癌、腎臓癌、肺腺腫、肺扁平上皮癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、および黒色腫を含む癌において共発現したことを示す。特に、ＴＩＬ上のＩＣＯＳの発現は、他のいくつかのｃｏｓｔｉｍよりもＰＤ−１の発現とよりよく相関している。
【０６８０】
Ｂ．実施例２：免疫チェックポイント抗原連結ドメイン
１．２Ａ：抗ＰＤ−１  ＡＢＤ
ＰＤ−１に連結する抗体の例は、その例示的な配列が図１０に示されるＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有する二価のＩｇＧ１フォーマットで生成された。可変領域をコードするＤＮＡを遺伝子合成によって生成し、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ法によって哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５に挿入した。重鎖ＶＨ遺伝子を、上記の置換を有するヒトＩｇＧ１定常領域をコードするｐＴＴ５にギブソンアセンブリを介して挿入した。軽鎖ＶＬ遺伝子を、ヒトＣ？定常領域をコードするｐＴＴ５に挿入した。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした。追加のＰＤ−１  ＡＢＤ（上記の抗体由来のものを含む）をｃｏｓｔｉｍ／チェックポイント二重特異性抗体に使用するためにＦａｂおよびｓｃＦｖとしてフォーマットし、その例示的な配列をそれぞれ図１１および配列表に示す。
【０６８１】
２．２Ｂ：抗ＣＴＬＡ−４  ＡＢＤ
ＣＴＬＡ−４に連結する抗体は、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有する二価ＩｇＧ１フォーマットで生成された。可変領域をコードするＤＮＡを遺伝子合成によって生成し、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ法によって哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５に挿入した。重鎖ＶＨ遺伝子を、上記の置換を有するヒトＩｇＧ１定常領域をコードするｐＴＴ５にギブソンアセンブリを介して挿入した。軽鎖ＶＬ遺伝子を、ヒトＣ？定常領域をコードするｐＴＴ５に挿入した。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした。追加のＣＴＬＡ−４  ＡＢＤ（上記の抗体由来のものを含む）をｃｏｓｔｉｍ／チェックポイント二重特異性抗体に使用するためにｓｃＦｖとしてフォーマットし、その例示的な配列を図１２および配列表に示す。
【０６８２】
３．２Ｃ：抗ＬＡＧ−３  ＡＢＤ
ＬＡＧ−３に連結する抗体の例は、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有する二価ＩｇＧ１フォーマットで生成された。可変領域をコードするＤＮＡを遺伝子合成によって生成し、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ法によって哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５に挿入した。重鎖ＶＨ遺伝子を、上記の置換を有するヒトＩｇＧ１定常領域をコードするｐＴＴ５にギブソンアセンブリを介して挿入した。軽鎖ＶＬ遺伝子を、ヒトＣ？定常領域をコードするｐＴＴ５に挿入した。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした。追加のＬＡＧ−３  ＡＢＤ（上記の抗体由来のものを含む）をｃｏｓｔｉｍ／チェックポイント二重特異性抗体に使用するためにＦａｂとしてフォーマットし、その例示的な配列を図１３および配列表に示す。
【０６８３】
４．２Ｄ：抗ＴＩＭ−３  ＡＢＤ
ＴＩＭ−３に連結する抗体の例は、その例示的な配列が図１４に示されるＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有する二価のＩｇＧ１フォーマットで生成された。可変領域をコードするＤＮＡを遺伝子合成によって生成し、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ法によって哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５に挿入した。重鎖ＶＨ遺伝子を、上記の置換を有するヒトＩｇＧ１定常領域をコードするｐＴＴ５にギブソンアセンブリを介して挿入した。軽鎖ＶＬ遺伝子を、ヒトＣ？定常領域をコードするｐＴＴ５に挿入した。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした。上述の抗体は、ｃｏｓｔｉｍ／チェックポイント二重特異性抗体に使用するためのＦａｂとしてフォーマットされた。
【０６８４】
５．２Ｅ：抗ＰＤ−Ｌ１  ＡＢＤ
ＰＤ−Ｌ１に連結するプロトタイプ抗体は、その例示的な配列が図１５に示されるＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有する二価のＩｇＧ１フォーマットで生成された。可変領域をコードするＤＮＡを遺伝子合成によって生成し、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ法によって哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５に挿入した。重鎖ＶＨ遺伝子を、上記の置換を有するヒトＩｇＧ１定常領域をコードするｐＴＴ５にギブソンアセンブリを介して挿入した。軽鎖ＶＬ遺伝子を、ヒトＣ？定常領域をコードするｐＴＴ５に挿入した。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした。上述の抗体は、ｃｏｓｔｉｍ／チェックポイント二重特異性抗体に使用するためのＦａｂおよびｓｃＦｖとしてフォーマットされた。
【０６８５】
Ｃ．実施例３：共刺激受容体抗原連結ドメイン
ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、および４−１ＢＢに連結するプロトタイプの共刺激受容体抗体を、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有する二価ＩｇＧ１フォーマットで生成し、それらの配列を図１６〜１９に示す。可変領域をコードするＤＮＡを遺伝子合成によって生成し、Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ法によって哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５に挿入した。重鎖ＶＨ遺伝子を、上記の置換を有するヒトＩｇＧ１定常領域をコードするｐＴＴ５にギブソンアセンブリを介して挿入した。軽鎖ＶＬ遺伝子を、ヒトＣ？定常領域をコードするｐＴＴ５に挿入した。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした。上述の抗体は、ｃｏｓｔｉｍ／チェックポイント二重特異性抗体に使用するためのＦａｂまたはｓｃＦｖとしてフォーマットされた。
【０６８６】
Ｄ．実施例４：安定性および親和性のための抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤの操作
抗ＩＣＯＳ抗体の親可変領域（ＸＥＮＰ１６４３５；図１９に示す）は、ＩＣＯＳ×チェックポイント二重特異性抗体における構成要素として使用するために操作された。最適な親和性および安定性を有するように操作されたＦｖ変異のライブラリーを部位特異的変異導入（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃｅｄａｒ  Ｃｒｅｅｋ，Ｔｘ）またはさらなる遺伝子合成およびＦａｂ−ＨｉｓおよびｓｃＦｖ−Ｈｉｓフォーマットでのサブクローニングによって構築し、下記のように作製した。
【０６８７】
１．４Ａ：抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂ
変異型抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂのアミノ酸配列を図２０に列挙する（ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグはＦａｂ重鎖のＣ末端から除去されている）。Ｆａｂ発現に必要な２本の鎖をコードするＤＮＡを遺伝子合成によって生成し、そして標準的な分子生物学技術を用いて発現ベクターｐＴＴ５にサブクローニングした。Ｆａｂ重鎖はＣ末端ポリヒスチジンタグを含んでいた。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトし、得られたタンパク質をＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーを用いて上清から精製した。得られた抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂを安定性および親和性について分析した。
【０６８８】
示差走査蛍光分析（ＤＳＦ）実験は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣＦＸ  ＣｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲ検出システムを用いて実施した。タンパク質をＳＹＰＲＯオレンジ蛍光色素と混合し、ＰＢＳで０．２ｍｇ／ｍＬに希釈した。ＳＹＰＲＯオレンジの最終濃度は１０倍であった。２５℃で最初の１０分間のインキュベーション期間の後、タンパク質を１℃／分の加熱速度で２５℃から９５℃に加熱した。３０秒ごとに蛍光測定を実施した。溶融温度（Ｔｍ）は機器のソフトウェアを用いて計算した。結果を図２１に示す。
【０６８９】
ヒトＩＣＯＳに対する抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂの一連のアフィニティースクリーニングを、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法（ＢＬＩ）に基づく方法であるＯｃｔｅｔを用いて実施した。Ｏｃｔｅｔの実験工程は、一般的に以下を含んでいた：固定化（バイオセンサー上へのリガンドまたは試験試料の捕捉）、会合（対応する試験試料またはリガンドの連続希釈物を含むウェルへのリガンドまたは試験試料をコーティングしたバイオセンサーの浸漬）、試験試料の一価の親和性を決定するための解離（緩衝液を含むウェルにバイオセンサーを戻すこと）。具体的には、抗マウスＦｃ（ＡＭＣ）バイオセンサーを使用して、ＩＣＯＳのマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ融合体を捕捉し、そして複数濃度の試験試料に浸漬した。得られた平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）を図２２〜２３に提示する。連結親和性および動的速度定数は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて１：１連結モデルを用いて処理データを分析することによって取得した。２つの別々の実験からのデータを図２２Ａ〜Ｂに示す。さらなる実験では、ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーを使用してＩＣＯＳ−ＴＥＶ−Ｆｃ−Ａｖｉを捕捉し、試験試料に浸漬した。データを図２３に示す。ＸＥＮＰ２２７８０、ＸＥＮＰ２２７８２、ＸＥＮＰ２２７８３、およびＸＥＮＰ２２７８４を含むいくつかの変異型抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂは、親の可変領域を含むＦａｂ（ＸＥＮＰ２２０５０）と同様の親和性特性を維持しながら安定性が改善されていた。
【０６９０】
２．４Ｂ：抗ＩＣＯＳ  ｓｃＦｖ
抗ＩＣＯＳ  ｓｃＦｖのアミノ酸配列を図２４に列挙する（ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６）タグはｓｃＦｖのＣ末端から除去されている）。ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを遺伝子合成によって生成し、そして標準的な分子生物学的技術を用いて発現ベクターｐＴＴ５にサブクローニングした。ｓｃＦｖはＣ末端ポリヒスチジンタグを含んでいた。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトし、得られたタンパク質をＮｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーを用いて上清から精製した。得られた抗ＩＣＯＳ  ｓｃＦｖを上記のようにＤＳＦ実験において安定性について分析した。データを図２５に示す。
【０６９１】
Ｅ．実施例５：抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ  −１二重特異性抗体
１．５Ａ：プロトタイプのｃｏｓｔｉｍ／チェックポイントボトルオープナー
ボトルオープナーフォーマットにおけるｃｏｓｔｉｍ／チェックポイント二重特異性抗体の模式図を図２Ａに示す。プロトタイプの抗ＧＩＴＲ  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１６４３８）、抗ＯＸ４０  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１６４３７）、抗４−１ＢＢ  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１４４１０）、および抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１６４３５）に基づく共刺激受容体連結Ｆａｂアーム、ならびに例示的な抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖ（ＸＥＮＰ１９６９２）アームを有するプロトタイプボトルオープナーは、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイにおけるサイトカイン分泌に対するそれらの効果を調査するために産生された。配列を図２６に示す。ボトルオープナー発現に必要な３本の鎖をコードするＤＮＡを遺伝子合成によって生成し、そして標準的な分子生物学的技術を用いて発現ベクターｐＴＴ５にサブクローニングした。発現のためにＨＥＫ２９３Ｅ細胞にＤＮＡトランスフェクトし、得られたタンパク質を標準的な技術を用いて精製した。
【０６９２】
ａ．５Ａ（ａ）：プロトタイプ抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーはサイトカイン分泌を増強する
ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した活性化によって達成されるのと同様にＴ細胞の活性化および増殖を引き起こす超抗原である。ＳＥＢを用いたヒトＰＢＭＣの刺激は、Ｔ細胞活性化および増殖をアッセイするための一般的な方法である。ＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間シミュレートした。細胞を２回洗浄し、そして２０μｇ／ｍＬの示された試験試料と組み合わせて１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで再刺激した。ニボルマブに基づく第１の二価抗ＰＤ−１抗体（ＸＥＮＰ１６４３２）、第２の二価抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１９６８６）、および二価抗ＲＳＶ  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１５０７４）を対照として用いた。処理の２４時間後、上清をＩＬ−２についてアッセイした。図２７に示すデータは、各ｃｏｓｔｉｍ／チェックポイントボトルオープナーが、二価の抗ＲＳＶ抗体と比較してサイトカイン分泌を増強したことを示している。驚くべきことに、ＸＥＮＰ２２７３０によるサイトカイン分泌の誘導は、二価の抗ＰＤ−１抗体単独ならびに他のプロトタイプのｃｏｓｔｉｍ／チェックポイントボトルオープナーによるサイトカイン分泌よりもはるかに優れており、ＩＣＯＳ連結の追加がサイトカイン産生を増強すること、およびＩＣＯＳが、二重特異性抗体に対する他の共刺激受容体よりも優れたＰＤ−１のパートナーであることを示す。
【０６９３】
別の実験では、２０μｇ／ｍＬの示された試験試料と共に０．０１μｇ／ｍＬのＳＥＢで３日間、ＰＢＭＣを刺激した。対照として、試験試料も未処理（非ＳＥＢ刺激）ＰＢＭＣと共にインキュベートした。処理３日後、上清をＴ細胞活性化の指標としてのＩＬ−２分泌について評価した（図２８に示す）。データは、抗ＰＤ−１二価抗体も抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーもナイーブ細胞におけるＩＬ−２分泌を刺激しないことを示している。さらに、データは同様に、ＸＥＮＰ２０８９６が２価の抗ＰＤ−１抗体単独よりもＩＬ−２分泌を増強すること、およびＸＥＮＰ２０８９６が２価の組合せ（ＸＥＮＰ１６４３２およびＸＥＮＰ１６４３５）、ならびに１アームの組み合わせ（ＸＥＮＰ２０１１１およびＸＥＮＰ２０２６６）よりもＩＬ−２分泌を増強することを示す。
【０６９４】
ＩＣＯＳなどの共刺激受容体は、二価抗体または多量体化リガンドによる架橋後にのみサイトカイン産生を誘導することが以前に見出されている（Ｖｉｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００４、Ｓａｎｍａｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。架橋機構を考慮すると、ｃｏｓｔｉｍ×チェックポイント遮断二重特異性抗体における単一アームによる一価ＩＣＯＳ連結がサイトカイン産生を増強することができたことは驚くべきことである。さらに、二重特異性抗体は、二価抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂと組み合わせた二価抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１６４３２＋ＸＥＮＰ１６４３５）よりもサイトカイン分泌を増強することができたことは注目に値する。
【０６９５】
ｂ．５Ａ（ｂ）：ＰＤ−１およびＩＣＯＳ二重陽性細胞がプロトタイプ抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーにより選択的に占められている
免疫チェックポイント受容体または共刺激受容体のみを発現する非腫瘍反応性Ｔ細胞に対する、実施例１に示されるような免疫チェックポイント受容体（例えばＰＤ−１）および共刺激受容体を同時発現する腫瘍反応性ＴＩＬの選択的標的化は、抗腫瘍活性を高めつつ、一方で局所毒性を回避する（図２９に示すとおり）。
【０６９６】
ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイを用いて、抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーのＴ細胞への連結を調べた。ＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）で３日間刺激し、その後、ＰＢＭＣを示された試験試料で４℃で３０分間処理した。次いで、ＰＢＭＣをＡＰＣ標識１アーム抗ＩＣＯＳ抗体およびＦＩＴＣ標識１アーム抗ＰＤ−１抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。図３０および３１は、プロトタイプ抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナー（ＸＥＮＰ２０８９６）、１アーム抗ＩＣＯＳ抗体（ＸＥＮＰ２０２６６）、および１アーム抗ＰＤ−１抗体（ＸＥＮＰ２０１１１）の受容体の占有を示す。
【０６９７】
データは、二重陽性細胞（ＰＤ−１およびＩＣＯＳの両方を発現する）が、図３０に示すように、抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナー（ＸＥＮＰ２０８９６）によって選択的に占有されることを示し、一価のＩＣＯＳおよびＰＤ−１連結が選択的標的化に有用であることを示す。さらに、抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナー（例えば、ＸＥＮＰ２０８９６）は、図３１Ａに示されるように、一価の単一特異的１アーム抗ＰＤ−１および抗ＩＣＯＳよりも二重陽性細胞により強く連結する。
【０６９８】
ｃ．５Ａ（ｃ）：プロトタイプ抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーはＧＶＨＤマウス試験において生着を促進する
プロトタイプの抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーを、ＮＳＧ（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ガンマ）免疫不全マウスで実施された移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）モデルにおいて評価した。マウスにヒトＰＢＭＣを移植した。ＮＳＧマウスにヒトＰＢＭＣを注射すると、それらはヒトＰＢＭＣに対する自己免疫応答を発症する。免疫チェックポイント抗体（例えば抗ＰＤ−１）と共にヒトＰＢＭＣを注射したＮＳＧマウスの処理は、生着を促進する。したがって、生着の増加は抗体の有効性を示す。
【０６９９】
１０００万個のヒトＰＢＭＣを、０日目にＩＶ−ＯＳＰを介してＮＳＧマウスに移植し、続いて１、８、１５、および２２日目に示された試験試料を投与した。ヒトＣＤ４５＋細胞数を１４日目に疾患の指標として測定した。
【０７００】
図Ａに示されるデータは、抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーが、対照（ＰＢＳおよびＰＢＳ＋ＰＢＭＣ）と比較して、ヒトＰＢＭＣ移植ＮＳＧマウスにおけるＣＤ４５＋細胞の増殖を増強することを示す。さらに、本発明の抗体を用いると、二価の抗ＰＤ−１抗体で見られるものよりも増強が大きい。
【０７０１】
２．５Ｂ：最適化された抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂアームを有する変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーの産生
実施例４Ａに記載されているように操作された抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂを含む変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーを、概して上記のように産生した。変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーのアミノ酸配列を図３２に列挙する。ＦｃＲｎ  ｐＨ６．０の親和性増強置換を有する変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１のアミノ酸配列を図３３に列挙する。
【０７０２】
得られた抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体を、一般に上記のようにＯｃｔｅｔを用いてヒトおよびカニクイザルのＩＣＯＳに対する親和性について分析した。第１セットの実験では、ＡＭＣバイオセンサーを用いてＩＣＯＳのマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ融合体を捕捉し、そして複数濃度の試験試料に浸漬した（データを図３４に示す）。さらなる実験では、ストレプトアビジン（ＳＡまたはＳＡＸ）バイオセンサーを使用して、ヒトおよびカニクイザルＩＣＯＳのビオチン化のヒトおよびカニクイザルＩｇＧ１  Ｆｃ融合物を捕捉し、複数濃度の試験試料に浸漬した（データを図３５に示す）。
【０７０３】
３．５Ｃ：変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーのＴ細胞表面連結
Ｔ細胞への抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性の連結を、ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイで測定した。ヒトＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで３日間刺激した。次いでＰＢＭＣを示された試験物試料で処理し、そして４℃で３０分間インキュベートした。処理後、細胞をＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３抗体およびＡＰＣ標識抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ二次抗体と共にインキュベートした。ＣＤ３＋細胞上のＭＦＩを図３６Ａ〜Ｂに示す。
【０７０４】
４．５Ｄ：Ｔ細胞上の変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーの受容体占有
Ｔ細胞上の変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーの受容体占有をＳＥＢ刺激ＰＢＭＣアッセイで測定した。ＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）で３日間刺激し、その後、ＰＢＭＣを示された試験試料で４℃で３０分間処理した。次いで、ＰＢＭＣをＡＰＣ標識１アーム抗ＩＣＯＳ抗体およびＦＩＴＣ標識１アーム抗ＰＤ−１抗体と共に４℃で３０分間インキュベートした。図３７は、ＰＤ−１およびＩＣＯＳ二重陽性Ｔ細胞における、変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体、対応する１アーム抗ＩＣＯＳ抗体および１アーム抗ＰＤ−１抗体（ＸＥＮＰ２０１１１）の受容体占有を示す。実施例１Ａで調べたプロトタイプ抗体と一致して、ボトルオープナーの各々は、一価の単一特異性１アーム抗ＰＤ−１抗体および１アーム抗ＩＣＯＳ抗体よりも二重陽性細胞により強く連結する。
【０７０５】
５．５Ｅ：サイトカイン放出アッセイにおける変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーのインビトロ活性
ヒトＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。細胞を洗浄し、そして２０μｇ／ｍＬの示された試験試料と組み合わせて１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで再刺激した。処理の２４時間後、細胞をＩＬ−２（図３８Ａ）およびＩＦＮ？についてアッセイした。（図３８Ｂ）。データは、抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーが、二価抗ＰＤ−１抗体（ＸＥＮＰ１６４３２）単独、二価抗ＩＣＯＳ抗体（ＸＥＮＰ１６４３５）単独、または二価抗ＰＤ−１抗体と２価の抗ＩＣＯＳ抗体を組み合わせたものよりも顕著により多くのサイトカイン放出を刺激したことを示す。
【０７０６】
さらなる実験において、ヒトＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。細胞を洗浄し、そして２０μｇ／ｍＬの示された試験試料と組み合わせて１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで再刺激した。処理の２４時間後、細胞をＩＬ−２（図３９Ａ）およびＩＦＮ？についてアッセイした。（図３９Ｂ）。
【０７０７】
６．５Ｆ：ＧＶＨＤマウス試験における変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーのインビボ活性
最初の試験では、１０００万個のヒトＰＢＭＣを、０日目にＩＶ−ＯＳＰを介してＮＳＧマウスに移植し、続いて１日目に示された試験試料を投与した。７日目、１１日目および１４日目に、ＩＦＮ？レベル、ならびにヒトＣＤ４５＋、ＣＤ８＋のＴ細胞およびＣＤ４＋のＴ細胞数を測定した。図４０Ａ〜Ｂはそれぞれ７日目および１１日目のＩＦＮ？レベルを示す。図４１Ａ〜Ｂはそれぞれ、１１日目および１４日目のＣＤ４５＋細胞数を示す。図４２Ａ〜Ｂはそれぞれ、１４日目のＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞数を示す。図４３は、Ｔ細胞増殖およびＩＦＮ？産生に起因するＧＶＨＤの悪化から生じる１４日目までのマウスの体重の変化を示す。
【０７０８】
追加の変異型抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーを用いたさらなる試験では、０日目に１０００万個のヒトＰＢＭＣをＩＶ−ＯＳＰを介してＮＳＧマウスに移植し、続いて１日目に示された濃度で示された試験試料を投与した。７日目および１４日目に、ＩＦＮγレベル、ならびにヒトＣＤ４５＋、ＣＤ８＋のＴ細胞およびＣＤ４＋のＴ細胞数を測定した。図４４Ａ〜Ｂはそれぞれ７日目および１４日目のＩＦＮ？レベルを示す。図４５は、１４日目のＣＤ４５＋細胞数を示す。図４６Ａ〜Ｃはそれぞれ、１４日目のＣＤ８＋Ｔ細胞数、ＣＤ４＋Ｔ細胞数、およびＣＤ８＋／ＣＤ４＋の比率を示す。マウスの体重もまた、１２日目および１５日目に測定し、それぞれ図４７Ａ〜Ｂに初期体重の割合として示した。
【０７０９】
図は、抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーが生着を増強することを示す（ＣＤ４５＋細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖およびマウスの体重の減少によって示されるように）。観察された活性は各変異のインビトロ効力と相関している。さらに、ＸＥＮＰ２０８９６、ＸＥＮＰ２２７４４、ＸＥＮＰ２３０９２、ＸＥＮＰ２２７３０、ＸＥＮＰ２３１０４、ＸＥＮＰ２２９７４、およびＸＥＮＰ２３４１１を含むいくつかのボトルオープナーは、対照の二価抗ＰＤ−１抗体（ＸＥＮＰ１６４３２）よりもはるかに生着を増強する。
【０７１０】
７．５Ｇ：さらなる抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤが抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーで機能する
概して上記のように実施例３に記載の他の抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤに基づく抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂを含むさらなる抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーを産生した。さらなるボトルオープナーのための配列を図４８に示す。
【０７１１】
最初の実験では、ＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。細胞を２回洗浄し、そして２０μｇ／ｍＬの示された試験試料（対照としてのＰＢＳ）と組み合わせて１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで再刺激した。処理の２４時間後、図４９に示されるように、上清をＩＬ−２濃度についてアッセイした。第２の実験では、ＰＢＭＣを１０ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで刺激し、２０μｇ／ｍＬの示された試験試料で３日間処理した（対照として二価抗ＰＤ−１ＸＥＮＰ１６４３２）。上清を回収し、そしてＩＬ−２についてアッセイした。図５０は、二価抗ＲＳＶ  ｍＡｂに対するＩＬ−２の誘導倍率を示す。
【０７１２】
実施例５Ａ（ａ）のデータと一致して、ＸＥＮＰ２０８９６はＩＬ−２の分泌を刺激した。特に、代替の抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤを含むさらなるボトルオープナーはまた、ＩＬ−２の分泌を刺激することができ、抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーによるサイトカイン分泌の増強は、実施例４に記載の親の抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤに由来するＡＢＤに特有ではないことを実証する。
【０７１３】
８．５Ｈ：抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーにより明確なＩＣＯＳの徴候が示される
ａ．５Ｈ（ａ）：抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体はＡＫＴリン酸化を誘導する
ＩＣＯＳ連結は活性化Ｔ細胞においてＡＫＴリン酸化を誘導し（Ｆｏｓ，Ｃ  ｅｔ  ａｌ．２００８）、そしてそれ自体、ＡＫＴリン酸化は本発明の抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体によるＩＣＯＳアゴニズムの指標となるであろう。
【０７１４】
ヒトＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。刺激後、ＣＤ３＋細胞をＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＴ細胞濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いたネガティブセレクションにより単離し、次いでプレート連結抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、５００ｎｇ／ｍＬ）と組み合わせて示された試験試料で処理した。細胞を処理の３０分後に溶解し、ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ  ３８４ウェルスポットプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）上の多重リン酸化タンパク質アッセイによって総ＡＫＴおよびリン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）についてアッセイした。処理後にリン酸化されたＡＫＴの百分率としてデータを図５１に示す。
【０７１５】
データは、陰性対照二価抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（ＸＥＮＰ１６４３２）による処理後のＡＫＴリン酸化の増加を示さない。二価抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂ単独（ＸＥＮＰ１６４３５）およびＸＥＮＰ１６４３２と組み合わせたＸＥＮＰ１６４３５の両方がＡＫＴリン酸化を増加させ、これはＩＣＯＳ連結およびＸＥＮＰ１６４３５によるアゴニズムを実証する。驚くべきことに、ＩＣＯＳの一価の連結のみにもかかわらず、抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体による処理は、ＸＥＮＰ１６４３５単独およびＸＥＮＰ１６４３５とＸＥＮＰ１６４３２との組み合わせによる処理よりも多くのＡＫＴリン酸化を誘導する。正のＡＫＴリン酸化データは、ＩＣＯＳの一価の連結にもかかわらず、二重特異性抗体とのＩＣＯＳ活性の明確な徴候を実証する。
【０７１６】
ｂ．５Ｈ（ｂ）：抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーにより上方制御された活性化Ｔヘルパー細胞関連遺伝子
Ｇｕｅｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）は、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメインに基づくＣＡＲ−Ｔｓの活性化後の活性化ヘルパーＴ細胞（すなわちＴｈ１、Ｔｈ２、およびＴｈ１７）および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の遺伝子発現プロファイルを記載している。彼らは、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ２２、ＩＦＮ？、ＴＮＦ、およびＩＬ−１３などの活性化Ｔヘルパー細胞に関連する遺伝子が上方制御されたのに対して、ＴＧＦβ１、ＳＭＡＤ３、およびＦＯＸＰ３などのＴｒｅｇ関連遺伝子は不変または下方制御されたことを見出した。
【０７１７】
Ｔ細胞と本発明の抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体との連結が同様の徴候をもたらしたかどうかを調べるために、我々はＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ技術を使用した。ＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。細胞を２回洗浄し、そして１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで再刺激し、そして示された試験試料で２４時間処理した。ＲＮＡを細胞から抽出し、免疫応答を包含する７７０個の標的遺伝子をアッセイするｎＣｏｕｎｔｅｒ（登録商標）ＰａｎＣａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｐａｎｅｌ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）によってアッセイした。図５２は、二価抗ＲＳＶ抗体に対する、いくつかのＴｈ関連遺伝子およびＴｒｅｇ関連遺伝子の発現における平均誘導倍率を示す。図５３Ａ〜Ｆはそれぞれ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２２、ＩＬ−１０、ＩＬ−９、およびＩＦＮ？の、二価抗ＲＳＶ  ｍＡｂによる誘導を超える、示された試験試料による遺伝子発現の誘導倍率を示す。
【０７１８】
図５２〜５３に示すように、そしてＧｕｅｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．による観察と一致して、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２２、ＩＬ−９、およびＩＦＮ？のようなＩＣＯＳシグナル伝達に関連するＴｈ関連遺伝子は、二価抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂならびに抗ＩＣＯＳおよび抗ＰＤ−１  ｍＡｂの組合せでの処理後に上方制御される。特に、ＩＣＯＳシグナル伝達に関連するＴｈ関連遺伝子の発現は、抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１抗体での処理後にさらに上方制御され、これもまた、明らかなＩＣＯＳ共刺激徴候および二重特異性抗体による抗ＩＣＯＳおよび抗ＰＤ−１の連結の劇的な相乗作用を示す。
【０７１９】
９．５Ｉ：代替的なフォーマットの抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体
抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１ボトルオープナーの効果がボトルオープナーフォーマットに固有のものであるか、または抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体に広く適用可能であるかを調べるために、代替的なフォーマットのｃｏｓｔｉｍ／チェックポイント二重特異性抗体を産生した。
【０７２０】
ａ．５Ｉ（ａ）：抗ＰＤ−１×抗ＩＣＯＳボトルオープナー
実施例２Ａに記載の抗ＰＤ−１  ｍＡｂ（例えばＸＥＮＰ１６４３２およびＸＥＮＰ２９１２０）および実施例４Ｂに記載の抗ＩＣＯＳ  ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを用いて生成した抗ＰＤ−１  Ｆａｂを有する抗ＰＤ−１×抗ＩＣＯＳボトルオープナーを生成した。実施例５Ａに概して記載されているようにボトルオープナーを産生した。例示的な抗ＰＤ−１×抗ＩＣＯＳボトルオープナーの配列を図５６に示す。
【０７２１】
ｂ．５Ｉ（ｂ）：中央−ｓｃＦｖ
中央−ｓｃＦｖフォーマットの概略図は図５５Ａ〜Ｂに示される。抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂ−Ｆｃ重鎖をコードするＤＮＡは、実施例４Ａに記載の抗ＩＣＯＳ  ＦａｂをコードするＤＮＡを用いて、発現ベクターｐＴＴ５への標準的なサブクローニングによって生成した。実施例４Ａに記載の抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂおよび実施例２Ａに記載の抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを遺伝子合成および標準的な発現ベクターｐＴＴ５へのサブクローニングの組み合わせによって使用して、抗ＩＣＯＳ−抗ＰＤ−１  Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖をコードするＤＮＡを生成した。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした。例示的な抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１中央−ｓｃＦｖ抗体の配列を図５７に示す。
【０７２２】
ｃ．５Ｉ（ｃ）：中央−ｓｃＦｖ２
中央−ｓｃＦｖ２フォーマットの概略図を図５５Ｃに示す。実施例４Ａに記載の抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂおよび実施例２Ａに記載の抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを用いて、遺伝子合成および標準的な発現ベクターｐＴＴ５へのサブクローニングの組み合わせによって、抗ＩＣＯＳ−抗ＰＤ−１  Ｆａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ重鎖をコードするＤＮＡを生成した。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした。例示的な抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１中央−ｓｃＦｖ２抗体の配列を図５８に示す。
【０７２３】
ｄ．５Ｉ（ｄ）：二重特異性ｍＡｂ
二重特異性ｍＡｂフォーマットの模式図は図２Ｋとして示される。抗ＩＣＯＳ重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡは、実施例に記載の抗ＩＣＯＳ  ＦａｂをコードするＤＮＡに基づいて生成され、抗ＰＤ−１重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡは、実施例２Ａに記載の抗ＰＤ−１  ｍＡｂをコードするＤＮＡに基づいて生成された。重鎖ＶＨ遺伝子を、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ置換を有するヒトＩｇＧ１定常領域をコードするｐＴＴ５にギブソンアセンブリを介して挿入した。軽鎖ＶＬ遺伝子を、ヒトＣ？定常領域をコードするｐＴＴ５に挿入した。
【０７２４】
２つの別個の抗体としての発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトし、プロテインＡアフィニティー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。これらの抗体は、ＣＨ３：ＣＨ３界面にヘテロ二量体化−スキュー置換を含む。２−メルカプトエチルアミン−ＨＣｌ（２−ＭＥＡ）を用いて、２つの親ＩｇＧにおける鎖間ジスルフィド連結の制御された還元を誘導した。次いで、２−ＭＥＡを除去して鎖間ジスルフィド連結の再酸化を生じさせ、ＨＣ−ＬＣ対の再連結を可能にした（ヘテロ二量体化変異によって駆動された）。最後に、三重特異性抗体を陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。そのような方法は当該技術分野において一般的である（例えば、Ｌａｂｒｉｊｎ（２０１３）ＰＮＡＳ１１０（１３）：５１４５−５０またはＳｔｒｏｐ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４２０（３）：２０４−１９を参照されたい）。当該分野で公知の他の設計および精製方法を使用して、二重特異性ｍＡｂ産生、例えば、一般的な軽鎖抗体（Ｍｅｒｃｈａｎｔ（１９９８）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６（７）：６７７〜８１）またはヘテロ二量体Ｆａｂドメイン（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３２（２）：１９１−８）の産生を促進できる。例示的な抗ＰＤ−１×抗ＩＣＯＳ二重特異性ｍＡｂの配列を図５９に示す。
【０７２５】
ｅ．５Ｉ（ｅ）：ＤＶＤ−ＩｇＧ
ＤＶＤ−ＩｇＧフォーマットの概略図は図５５Ｅに示す。抗ＰＤ−１−抗ＩＣＯＳ  ＶＨ−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ重鎖およびＶＬ−ＶＬ−Ｃ？軽鎖をコードするＤＮＡは、実施例４Ａに記載の抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂおよび実施例２Ａに記載の抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを用いて、遺伝子合成および発現ベクターｐＴＴ５への標準的なサブクローニングの組み合わせにより生成した。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした。例示的な抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１  ＤＶＤ−ＩｇＧの配列を図６０に示す。
【０７２６】
ｆ．５Ｉ（ｆ）：トライデント
トライデントフォーマットの概略図を図５５Ｆに示す。抗ＰＤ−１  ＶＬ−ＶＨ−Ｆｃ重鎖およびＶＬ−ＶＨ軽鎖をコードするＤＮＡは、実施例４Ａに記載の抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂおよび実施例２Ａに記載の抗ＰＤ−１  ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを用いて、遺伝子合成および発現ベクターｐＴＴ５への標準的なサブクローニングの組み合わせにより生成した。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクトした。例示的な抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１トライデントの配列を図６１に示す。
【０７２７】
ｇ．５Ｉ（ｇ）：代替的なフォーマットの抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体はサイトカイン分泌を増強する
ヒトＰＢＭＣを２００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。細胞を２回洗浄し、そして示された濃度の示された試験試料と組み合わせて１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで再刺激した。処理の２４時間後、上清をＩＬ−２についてアッセイした。データを図６２に示しており、代替的なフォーマットの二重特異性抗体の各々は二価の抗ＲＳＶ（ＸＥＮＰ１５０７４）対照と比較してＩＬ−２分泌を増強することを示している。特に、これらの代替的なフォーマットの抗体の大部分は、二価の抗ＰＤ−１抗体と比較してＩＬ−２分泌を増強する。
【０７２８】
Ｆ．実施例６：異なる免疫チェックポイント抗原を標的とするＣｏｓｔｉｍ／チェックポイント二重特異性抗体
１．６Ａ：抗ＣＴＬＡ−４×抗ＩＣＯＳ
ＸＥＮＰ１６４３５由来の抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂおよび実施例２Ｂに記載のＡＢＤ由来の抗ＣＴＬＡ−４  ｓｃＦｖを用いて抗ＣＴＬＡ−４×抗ＩＣＯＳボトルオープナーを産生した。例示的な抗ＩＣＯＳ×抗ＣＴＬＡ−４ボトルオープナーの配列を図６３に示す。実施例５Ｉ（ｃ）に概して記載されているように二重特異性ｍＡｂを産生した。
【０７２９】
２．６Ｂ：抗ＬＡＧ−３×抗ＩＣＯＳ
実施例２Ｃに記載のＡＢＤ由来の抗ＬＡＧ−３  ＦａｂおよびＸＥＮＰ１６４３５由来の抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂを用いて、抗ＬＡＧ−３×抗ＩＣＯＳ二重特異性抗体を産生した。例示的な抗ＬＡＧ−３×抗ＩＣＯＳ二重特異性抗体の配列は図６４に描かれている。実施例５Ｉ（ｃ）に概して記載されているように二重特異性ｍＡｂを製造した。
【０７３０】
３．６Ｃ：抗ＴＩＭ−３×抗ＩＣＯＳ
実施例２Ｄに記載のＡＢＤ由来の抗ＴＩＭ−３  ＦａｂおよびＸＥＮＰ１６４３５由来の抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂを用いて、抗ＴＩＭ−３×抗ＩＣＯＳ二重特異性抗体を産生した。例示的な抗ＴＩＭ−３×抗ＩＣＯＳ二重特異性抗体の配列を図６５に示す。実施例５Ｉ（ｃ）に概して記載されているように二重特異性ｍＡｂを産生した。
【０７３１】
４．６Ｄ：抗ＰＤ−Ｌ１×抗ＩＣＯＳ
実施例２Ｅに記載のＡＢＤ由来の抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆａｂおよび実施例４Ｂに記載の抗ＩＣＯＳ  ｓｃＦｖを用いて抗ＰＤ−Ｌ１×抗ＩＣＯＳボトルオープナーを産生した。例示的な抗ＰＤ−Ｌ１×抗ＩＣＯＳ二重特異性抗体の配列を図６６に示す。実施例５Ａに概して記載されているようにボトルオープナーを産生した。
【０７３２】
５．６Ｅ：さらなるｃｏｓｔｉｍ×チェックポイント遮断二重特異性抗体はサイトカイン分泌を増強するように機能する
ヒトＰＢＭＣを２００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。細胞を２回洗浄し、そして示された濃度の示された試験試料と組み合わせて１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで再刺激した（上述のように）。処理の２４時間後、上清をＩＬ−２についてアッセイした。データを図６７に示しており、さらなるｃｏｓｔｉｍ×チェックポイント遮断二重特異性抗体の各々が、二価抗ＲＳＶ（ＸＥＮＰ  １５０７４）対照と比較してＩＬ−２分泌を増強することを示している。特に、これらの代替的なチェックポイント遮断抗体の大部分（全てではないが、例えばＴＩＭ−３遮断）は、二価の抗ＰＤ−１抗体（ＸＥＮＰ１６４３２）と比較してＩＬ−２分泌を増強する。
【０７３３】
Ｇ．実施例７：ＩＣＯＳの一価連結は二価架橋より優れている
実施例５Ａ（ａ）において、驚くべきことに、抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１抗体が、サイトカイン産生の刺激のために必要であると考えられているＩＣＯＳのような共刺激受容体の架橋とは反対のＩＣＯＳの一価連結にもかかわらずサイトカイン分泌を高めるように働くことが見出された。実施例５Ｈ（ａ）において、驚くべきことに、抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１抗体は、二価の抗ＩＣＯＳ  ｍＡｂよりもＡＫＴリン酸化（ＩＣＯＳアゴニズムのサイン）を増強することが見出された。この章では、ＩＣＯＳの一価の連結がＩＣＯＳの二価の連結よりも優れているように見えるこの傾向をさらに調査する。
【０７３４】
１．７Ａ：１アーム抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂ−Ｆｃ抗体の産生
例示的な１アーム抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂ−Ｆｃ抗体のアミノ酸配列を図６８に列挙する。抗体発現に必要な３本の鎖をコードするＤＮＡを遺伝子合成によって生成し、そして標準的な分子生物学的技術を用いて発現ベクターｐＴＴ５にサブクローニングした。発現のためにＨＥＫ２９３Ｅ細胞にＤＮＡトランスフェクトし、得られたタンパク質を標準的な技術を用いて精製した。
【０７３５】
得られた１アーム抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂ−Ｆｃ抗体を、Ｏｃｔｅｔを用いてヒトＩＣＯＳに対する親和性について分析した。抗マウスＦｃ（ＡＭＣ）バイオセンサーを使用して、ＩＣＯＳのマウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ融合体を捕捉し、そして複数濃度の試験試料に浸漬した。得られた平衡解離定数（ＫＤ）、会合速度（ｋａ）、および解離速度（ｋｄ）を図６９に提示する。連結親和性および動的速度定数は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて１：１連結モデルを用いて処理データを分析することによって取得した。
【０７３６】
２．７Ｂ：一価１アーム抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂ−Ｆｃ抗体は、二価抗ＩＣＯＳ抗体よりもＰＢＭＣにおいてより大きいＡＫＴ活性化を促進する
ＰＢＭＣを１００ｎｇ／ｍＬのＳＥＢで２日間刺激した。刺激後、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＴ細胞濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いたネガティブセレクションにより単離し、次いでプレート連結抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、５００ｎｇ／ｍＬ）と組み合わせて示された試験試料で処理した。細胞を処理の３０分後に溶解し、ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ  ３８４ウェルスポットプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）上の多重リン酸化タンパク質アッセイによって総ＡＫＴおよびリン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）についてアッセイした。処理後にリン酸化されたＡＫＴの百分率としてデータを図７０に示す。
【０７３７】
実施例Ｘと一致して、抗ＩＣＯＳ×抗ＰＤ−１二重特異性抗体は、二価抗ＩＣＯＳ抗体よりも顕著に高いＡＫＴ活性化を促進した。驚くべきことに、増強された一価の１アーム抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂ−Ｆｃ抗体はまた、二価の抗ＩＣＯＳ抗体よりも顕著に高く、二重特異性抗体に匹敵するレベルまでＡＫＴ活性化を促進した。
【０７３８】
３．７Ｃ：ＩＣＯＳの一価アゴニズムは複数の抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤと協調する
ＣＤ３＋Ｔ細胞をＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＴ細胞濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いたネガティブセレクションにより単離し、次いでプレート連結抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３、５００ｎｇ／ｍＬ）と組み合わせて示された試験試料で処理した。細胞を処理の３０分後に溶解し、ＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ  ３８４ウェルスポットプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）上の多重リン酸化タンパク質アッセイによって総ＡＫＴおよびリン酸化ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）についてアッセイした。データを図７４に示し、そしてこれは様々な抗ＩＣＯＳ  ＡＢＤを含む一価抗ＩＣＯＳ  Ｆａｂ−Ｆｃ抗体がＡＫＴリン酸化を誘導することができたことを示す。
【図１】
2019529368.tif 000004
【図２Ａ】
2019529368.tif 000005
【図２Ｂ】
2019529368.tif 000006
【図２Ｃ】
2019529368.tif 000007
【図２Ｄ】
2019529368.tif 000008
【図２Ｅ】
2019529368.tif 000009
【図２Ｆ】
2019529368.tif 000010
【図２Ｇ】
2019529368.tif 000011
【図２Ｈ】
2019529368.tif 000012
【図２Ｉ】
2019529368.tif 000013
【図２Ｊ】
2019529368.tif 000014
【図２Ｋ】
2019529368.tif 000015
【図２Ｌ】
2019529368.tif 000016
【図２Ｍ】
2019529368.tif 000017
【図２Ｎ】
2019529368.tif 000018
【図３Ａ】
2019529368.tif 000019
【図３Ｂ】
2019529368.tif 000020
【図４Ａ】
2019529368.tif 000021
【図４Ｂ】
2019529368.tif 000022
【図４Ｃ】
2019529368.tif 000023
【図４Ｄ】
2019529368.tif 000024
【図４Ｅ】
2019529368.tif 000025
【図４Ｆ】
2019529368.tif 000026
【図５】
2019529368.tif 000027
【図６】
2019529368.tif 000028
【図７Ａ】
2019529368.tif 000029
【図７Ｂ】
2019529368.tif 000030
【図８Ａ】
2019529368.tif 000031
【図８Ｂ】
2019529368.tif 000032
【図９Ａ】
2019529368.tif 000033
【図９Ｂ】
2019529368.tif 000034
【図９Ｃ】
2019529368.tif 000035
【図９Ｄ】
2019529368.tif 000036
【図１０Ａ】
2019529368.tif 000037
【図１０Ｂ】
2019529368.tif 000038
【図１０Ｃ】
2019529368.tif 000039
【図１０Ｄ】
2019529368.tif 000040
【図１０Ｅ】
2019529368.tif 000041
【図１１Ａ】
2019529368.tif 000042
【図１１Ｂ】
2019529368.tif 000043
【図１１Ｃ】
2019529368.tif 000044
【図１１Ｄ】
2019529368.tif 000045
【図１１Ｅ】
2019529368.tif 000046
【図１２Ａ】
2019529368.tif 000047
【図１２Ｂ】
2019529368.tif 000048
【図１２Ｃ】
2019529368.tif 000049
【図１２Ｄ】
2019529368.tif 000050
【図１２Ｅ】
2019529368.tif 000051
【図１２Ｆ】
2019529368.tif 000052
【図１２Ｇ】
2019529368.tif 000053
【図１２Ｈ】
2019529368.tif 000054
【図１２Ｉ】
2019529368.tif 000055
【図１２Ｊ】
2019529368.tif 000056
【図１２Ｋ】
2019529368.tif 000057
【図１２Ｌ】
2019529368.tif 000058
【図１２Ｍ】
2019529368.tif 000059
【図１２Ｎ】
2019529368.tif 000060
【図１２Ｏ】
2019529368.tif 000061
【図１２Ｐ】
2019529368.tif 000062
【図１２Ｑ】
2019529368.tif 000063
【図１２Ｒ】
2019529368.tif 000064
【図１２Ｓ】
2019529368.tif 000065
【図１２Ｔ】
2019529368.tif 000066
【図１２Ｕ】
2019529368.tif 000067
【図１２Ｖ】
2019529368.tif 000068
【図１２Ｗ】
2019529368.tif 000069
【図１２Ｘ】
2019529368.tif 000070
【図１２Ｙ】
2019529368.tif 000071
【図１２Ｚ】
2019529368.tif 000072
【図１２ＡＡ】
2019529368.tif 000073
【図１２ＢＢ】
2019529368.tif 000074
【図１２ＣＣ】
2019529368.tif 000075
【図１２ＤＤ】
2019529368.tif 000076
【図１２ＥＥ】
2019529368.tif 000077
【図１２ＦＦ】
2019529368.tif 000078
【図１２ＧＧ】
2019529368.tif 000079
【図１２ＨＨ】
2019529368.tif 000080
【図１２ＩＩ】
2019529368.tif 000081
【図１２ＪＪ】
2019529368.tif 000082
【図１２ＫＫ】
2019529368.tif 000083
【図１２ＬＬ】
2019529368.tif 000084
【図１２ＭＭ】
2019529368.tif 000085
【図１２ＮＮ】
2019529368.tif 000086
【図１２ＯＯ】
2019529368.tif 000087
【図１２ＰＰ】
2019529368.tif 000088
【図１３Ａ】
2019529368.tif 000089
【図１３Ｂ】
2019529368.tif 000090
【図１３Ｃ】
2019529368.tif 000091
【図１３Ｄ】
2019529368.tif 000092
【図１３Ｅ】
2019529368.tif 000093
【図１３Ｆ】
2019529368.tif 000094
【図１３Ｇ】
2019529368.tif 000095
【図１３Ｈ】
2019529368.tif 000096
【図１３Ｉ】
2019529368.tif 000097
【図１３Ｊ】
2019529368.tif 000098
【図１３Ｋ】
2019529368.tif 000099
【図１３Ｌ】
2019529368.tif 000100
【図１３Ｍ】
2019529368.tif 000101
【図１３Ｎ】
2019529368.tif 000102
【図１４Ａ】
2019529368.tif 000103
【図１４Ｂ】
2019529368.tif 000104
【図１４Ｃ】
2019529368.tif 000105
【図１４Ｄ】
2019529368.tif 000106
【図１４Ｅ】
2019529368.tif 000107
【図１４Ｆ】
2019529368.tif 000108
【図１４Ｇ】
2019529368.tif 000109
【図１４Ｈ】
2019529368.tif 000110
【図１４Ｉ】
2019529368.tif 000111
【図１５Ａ】
2019529368.tif 000112
【図１５Ｂ】
2019529368.tif 000113
【図１５Ｃ】
2019529368.tif 000114
【図１６】
2019529368.tif 000115
【図１７】
2019529368.tif 000116
【図１８】
2019529368.tif 000117
【図１９Ａ】
2019529368.tif 000118
【図１９Ｂ】
2019529368.tif 000119
【図１９Ｃ】
2019529368.tif 000120
【図１９Ｄ】
2019529368.tif 000121
【図１９Ｅ】
2019529368.tif 000122
【図１９Ｆ】
2019529368.tif 000123
【図１９Ｇ】
2019529368.tif 000124
【図２０Ａ】
2019529368.tif 000125
【図２０Ｂ】
2019529368.tif 000126
【図２０Ｃ】
2019529368.tif 000127
【図２０Ｄ】
2019529368.tif 000128
【図２０Ｅ】
2019529368.tif 000129
【図２０Ｆ】
2019529368.tif 000130
【図２０Ｇ】
2019529368.tif 000131
【図２１Ａ】
2019529368.tif 000132
【図２１Ｂ】
2019529368.tif 000133
【図２２】
2019529368.tif 000134
【図２２Ａ】
2019529368.tif 000135
【図２２Ｂ】
2019529368.tif 000136
【図２２Ｃ】
2019529368.tif 000137
【図２３】
2019529368.tif 000138
【図２４Ａ】
2019529368.tif 000139
【図２４Ｂ】
2019529368.tif 000140
【図２４Ｃ】
2019529368.tif 000141
【図２４Ｄ】
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【図２４Ｅ】
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【図２４Ｆ】
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【図２４Ｇ】
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【図２４Ｈ】
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【図２４Ｉ】
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【図２４Ｊ】
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【図２４Ｋ】
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【図２４Ｌ】
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【図２４Ｍ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４８Ｃ】
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【図４８Ｄ】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３Ａ】
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【図５３Ｂ】
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【図５３Ｃ】
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【図５３Ｄ】
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【図５３Ｅ】
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【図５３Ｆ】
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【図５４】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５５Ｃ】
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【図５５Ｄ】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５７Ａ】
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【図５７Ｂ】
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【図５７Ｃ】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１Ａ】
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【図６１Ｂ】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ】
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【図６５】
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【図６６Ａ】
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【図６６Ｂ】
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【図６６Ｃ】
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【図６７】
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【図６８Ａ】
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【図６８Ｂ】
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【図６８Ｃ】
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【図６８Ｅ】
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【図６８Ｆ】
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【図６８Ｇ】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２Ａ】
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【図７２Ｂ】
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【図７２Ｃ】
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【図７３Ａ】
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【図７３Ｂ】
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【図７３Ｃ】
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【図７３Ｄ】
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【図７３Ｅ】
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【図７３Ｆ】
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【図７３Ｇ】
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【図７３Ｈ】
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【図７４Ａ】
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【図７４Ｂ】
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【図７４Ｃ】
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【図７４Ｄ】
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【図７４Ｅ】
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【図７４Ｆ】
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【図７５Ａ】
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【図７５Ｂ】
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【図７５Ｃ】
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【図７５Ｄ】
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【図７６Ａ】
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【図７６Ｂ】
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【図７６Ｃ】
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【図７６Ｄ】
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【図７６Ｅ】
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【図７６Ｆ】
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【図７７Ａ】
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【図７７Ｂ】
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【図７８Ａ】
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【図７８Ｂ】
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【図７８Ｃ】
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【図７８Ｄ】
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【図７８Ｅ】
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【図７８Ｆ】
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【図７８Ｇ】
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【図７８Ｈ】
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【図７８Ｉ】
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【図７８Ｊ】
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【図７９Ａ】
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【図７９Ｂ】
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【図８０Ａ】
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【図８０Ｂ】
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【図８０Ｃ】
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【図８１Ａ】
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【図８１Ｂ】
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【図８１Ｃ】
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【図８２】
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【図８３Ａ】
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【図８３Ｂ】
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【図８３Ｃ】
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【図８３Ｄ】
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【図８４Ａ】
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【図８４Ｂ】
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【図８４Ｃ】
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【図８５】
2019529368.tif 000299
【図８６】
2019529368.tif 000300
【配列表】
2019529368000001.app
【国際調査報告】
2019529368.tif 000301
2019529368.tif 000302
2019529368.tif 000303
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