(57)【要約】  本発明は、研究及び治療において並びに特に他の方法では分からない対になった標的の相乗的生物学的機能を検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏ方法において使用するための、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異的タンパク質複合体（一般式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂに従えば）及びそのライブラリー／マルチプレックスに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂを有する二重特異性タンパク質複合体であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり、
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり、
：はＸとＹの間の結合相互作用であり、
Ａは、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む群から独立して選択される、二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質成分であり、
Ｂは一本鎖Ｆｖ又はｓｄＡｂであり、
Ｘは抗原、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ及びｓｄＡｂから独立して選択される、結合対の第１の結合パートナーであり、
Ｙは抗原、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ及びｓｄＡｂから独立して選択される、結合対の第２の結合パートナーであり、
ただし、Ｘが抗原である場合、Ｙは、Ｘにより表される抗原に対して特異的であるＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ又はｓｄＡｂであり、Ｙが抗原である場合、Ｘは、Ｙにより表される抗原に対して特異的であるＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ又はｓｄＡｂである、
上記二重特異性タンパク質複合体。
【請求項２】
Ｘが、Ｆａｂ断片若しくはＦａｂ’断片の重鎖などのＡのＣ末端に、又は前記ｓｃＦｖ若しくはｓｄＡｂのＣ末端に、場合によってリンカーを介して融合されている、請求項１に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項３】
Ｙが、前記ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂのＣ末端になどのＢのＣ末端に、場合によってリンカーを介して融合されている、請求項１又は２に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項４】
ＸとＹの間の結合親和性が５ｎＭ又はそれよりも強い、請求項１から３までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項５】
ＸとＹの間の結合親和性が９００ｐＭ又はそれよりも強い、例えば８００、７００、６００、５００、４００又は３００ｐＭなどである、請求項４に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項６】
Ａが、Ｆａｂ断片である、請求項１から５までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項７】
Ｘが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ及びペプチドなどの抗原から独立して選択され、ただし、ＸがＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである場合、Ｙはペプチドなどの抗原であり、Ｘがペプチドなどの抗原である場合、ＹはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである、請求項６に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項８】
Ｘが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである、請求項７に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項９】
Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂがペプチドＧＣＮ４（配列番号１又は配列番号１のアミノ酸１から３８）に対して特異的である、請求項８に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項１０】
ｓｃＦｖが、５２ＳＲ４（配列番号３、又は配列番号３のアミノ酸１〜２４３）である、請求項９に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項１１】
Ｙが、ペプチドである、請求項８から１０までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項１２】
Ｘが、ペプチドである、請求項７に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項１３】
ペプチドが、５から２５アミノ酸長の範囲である、請求項７、１１又は１２に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項１４】
Ｙが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである、請求項１２又は１３に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項１５】
Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂが、ペプチドＧＣＮ４（配列番号１又は配列番号１のアミノ酸１から３８）に対して特異的である、請求項１４に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項１６】
Ｙが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである、請求項１２から１５までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項１７】
Ｙが、Ｆａｂ断片である、請求項１２から１６までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項１８】
Ｙが、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである、請求項１２から１６までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項１９】
Ａが、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである、請求項１から５までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項２０】
Ｘが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ及びペプチドなどの抗原から独立して選択され、ただし、Ｘがペプチドである場合、ＹはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂであり、ＸがＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである場合、Ｙはペプチドなどの抗原である、請求項１９に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項２１】
Ｙが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ及びペプチドなどの抗原から独立して選択され、ただし、Ｙがペプチドである場合、ＸはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂであり、ＹがＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである場合、Ｘはペプチドなどの抗原である、請求項１９又は２０に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項２２】
Ｙが、Ｆａｂである、請求項２０又は２１に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項２３】
Ｙが、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである、請求項２０又は２１に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項２４】
Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂが、ペプチドＧＣＮ４（配列番号１又は配列番号１のアミノ酸１から３８）に対して特異的である、請求項２０から２３までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項２５】
ｓｃＦｖが５２ＳＲ４（配列番号３、又は配列番号３のアミノ酸１〜２４３）である、請求項２４に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項２６】
Ｘ又はＹが、ペプチド、例えば、ＧＣＮ４ペプチド（配列番号１又は配列番号１のアミノ酸１から３８）である、請求項２０又は２１に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項２７】
ペプチドが５から２５アミノ酸長の範囲である、請求項２６に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項２８】
２つ以下のｓｃＦｖを含む請求項１から２７までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項２９】
Ａ及び／又はＢが、Ｔ細胞又はＢ細胞シグナル伝達受容体などの細胞表面受容体、共刺激分子、チェックポイント阻害因子、ナチュラルキラー細胞受容体、免疫グロブリン受容体、ＴＮＦＲファミリー受容体、Ｂ７ファミリー受容体、接着分子、インテグリン、サイトカイン／ケモカイン受容体、ＧＰＣＲ、増殖因子受容体、キナーゼ受容体、組織特異的抗原、がん抗原、病原体認識受容体、補体受容体、ホルモン受容体又はサイトカイン、ケモカイン、ロイコトリエン、増殖因子、ホルモン、酵素、及びイオンチャネルなどの可溶性分子を含む群から選択される抗原に対して特異的である、請求項１から２８までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体。
【請求項３０】
請求項１から２９までのいずれか一項に定義される１つ又は複数の二重特異性タンパク質複合体を含む組成物。
【請求項３１】
治療において使用するための請求項１から２９までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体又は請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
請求項１から２９までのいずれか一項に記載の二重特異性タンパク質複合体における相乗的生物学的機能を検出する方法であって、１つ又は複数の機能アッセイにおいて二重特異性タンパク質複合体を試験することを含む、上記方法。
【請求項３３】
式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異的タンパク質複合体における相乗的生物学的機能を検出するための方法であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり、
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり、
：はＸとＹの間の結合相互作用であり、
Ａは、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ、及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む群から独立して選択される二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質成分であり、
Ｂは一本鎖Ｆｖ又はｓｄＡｂであり、
Ｘは抗原、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ及びｓｄＡｂから独立して選択される、結合対の第１の結合パートナーであり、並びに
Ｙは抗原、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ及びｓｄＡｂから独立して選択される、結合対の第２の結合パートナーであり、
ただし、Ｘが抗原である場合、Ｙは、Ｘにより表される抗原に対して特異的であるＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ又はｓｄＡｂであり、Ｙが抗原である場合、Ｘは、Ｙにより表される抗原に対して特異的であるＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ又はｓｄＡｂであり、
（ｉ）少なくとも１つのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異的タンパク質複合体を含むマルチプレックスの一部又はすべてについて機能アッセイにおいて活性を試験するステップと；
（ｉｉ）機能アッセイからの読み出し情報（単数又は複数）を解析して、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異的タンパク質複合体における相乗的生物学的機能を検出するステップと
を含む上記方法。
【請求項３４】
マルチプレックスが格子の形態である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
マルチプレックスが少なくとも２つのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体を含む、請求項３３又は請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体（単数又は複数）がＦｃ領域を含有しない、請求項３３から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
Ａが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ及びｓｃＦｖから独立して選択される、請求項３３又は３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ＡがＦａｂなどのＦａｂ又はＦａｂ’断片である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
Ｘが、抗体、Ｆａｂ又はＦａｂ’断片中の重鎖などのＡのＣ末端に、場合によってリンカーを介して融合されている、請求項３３から３８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
Ａが、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
Ｙが、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂのＣ末端に、場合によってリンカーを介して融合されている、請求項３３から４０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
Ｘが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ及びペプチドから独立して選択され、ただし、Ｘがペプチドである場合、ＹはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂであり、ＸがＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである場合、Ｙはペプチドなどの抗原である、請求項３３から４１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
Ｙが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ及びペプチドから独立して選択され、ただし、Ｙがペプチドである場合、ＸはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂであり、ＹがＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである場合、Ｘはペプチドなどの抗原である、請求項３３から４１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ペプチドが５から２５アミノ酸長の範囲である、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＸとＹの間の結合親和性が５ｎＭ又はそれよりも強い、請求項３２から４４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ＸとＹの間の結合親和性が９００ｐＭ又はそれよりも強い、例えば８００、７００、６００、５００、４００又は３００ｐＭなどである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
Ｘ又はＹが、ペプチドＧＣＮ４（配列番号１、又は配列番号１のアミノ酸１から３８）に特異的であるＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである、請求項３２から４６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ｓｃＦｖが５２ＳＲ４（配列番号３、又は配列番号３のアミノ酸１〜２４３）である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
Ｘ又はＹがペプチドＧＣＮ４（配列番号１、又は配列番号１のアミノ酸１〜３８）である、請求項３２から４８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
Ａ及び／又はＢが、Ｔ細胞又はＢ細胞シグナル伝達受容体などの細胞表面受容体、共刺激分子、チェックポイント阻害因子、ナチュラルキラー細胞受容体、免疫グロブリン受容体、ＴＮＦＲファミリー受容体、Ｂ７ファミリー受容体、接着分子、インテグリン、サイトカイン／ケモカイン受容体、ＧＰＣＲ、増殖因子受容体、キナーゼ受容体、組織特異的抗原、がん抗原、病原体認識受容体、補体受容体、ホルモン受容体又はサイトカイン、ケモカイン、ロイコトリエン、増殖因子、ホルモン若しくは酵素若しくはイオンチャネルなどの可溶性分子を含む群から選択される抗原に対して特異的である、請求項３２から４９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体が試験に先立って精製されない、請求項３２から５０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
Ａ−Ｘ及びＹ−Ｂ融合タンパク質が一過性に発現され、１対１モル比で混合されてヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体をそれぞれ生成する前に精製されない、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示はヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異的タンパク質複合体における相乗的な生物学的機能を検出する方法、特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏ方法、前記二重特異的タンパク質複合体のライブラリー／マルチプレックス、並びにそのキット及び組成物に関する。本開示は、前記新規二重特異性タンパク質複合体、並びに治療、研究及び実験目的における（特に、相乗的生物学的機能を探すアッセイにおける）前記新規二重特異性タンパク質複合体の使用にさらに関する。本開示は、前記二重特異性複合体を調製する方法にも及ぶ。
【背景技術】
【０００２】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物学的機構はシグナルの極端に複雑なカスケードであり、この絡まりを解いて理解するのは困難である。Ｔ細胞の活性化には少なくとも２つのシグナルが必要である。
【０００３】
Ｔ細胞受容体による抗原の認識は、第１のシグナルと見なされ、第２のシグナルは、Ｔ細胞上のさらなる表面分子と抗原提示細胞上のさらなる分子のライゲーションから生じる共刺激から発生する。
【０００４】
したがって、Ｔ細胞活性化を用いて、生物学的機能の調節が複数のシグナルを必要とすることがあることを説明することができる。他の生物学的過程は等しく複雑である又はもっと複雑である。細胞に基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーニングはｉｎ  ｖｉｖｏ機構についての洞察を有しており前記洞察を得るのに役立ち得るが、それでも生物学的機能を調節する適切なリガンド対をどのようにして同定するかという問題が生じる。
【０００５】
二重特異性抗体は次世代のバイオ薬物治療において大きな役割を果たすと広く予想されている（D. Holmes, Nature Rev Drug Disc Nov 2011:10; 798）。二重特異性抗体は、さらに大きな割合の患者において優れた長期にわたる広い効力をもたらす潜在力がある。これは、一般疾患経路内で異なる抗原に同時に共結合し、それによって多重度を減少させることにより、又は独立した経路由来の抗原を標的として相加的な若しくは相乗的な効果を提供することにより達成することが可能である。
【０００６】
二重特異性抗体は、
１）細胞上の受容体を架橋結合する、
２）細胞媒介効果を誘導する、
３）サイトカインを細胞に局在化してシグナル伝達を調節する又はサイトカイン機能を局所的に遮断する、
４）複数のエピトープに同時に結合して、単一のモノクローナル抗体も、実際、連結していない抗体の混合物（「ポリ−モノクローナル」）も示すことができない「新しい活性」を生み出し、機能又は特異性を増加させる、
などの新規の生物学の利用を促進する。
【０００７】
二重の標的に結合する現在の戦略は主に、既知の機構の合理的設計に基づいており、阻害性受容体を架橋結合すること、受容体の共結合／クラスター形成、複数の刺激性経路を遮断すること、阻害性受容体の選択的結合並びに共刺激及びサイトカインシグナル伝達などの個別の経路を遮断することが含まれる。しかし、既知の機構及び標的に関する技術の現状はこの分野の進歩にとって制限要因となっている。
【０００８】
二重特異性抗体は、生物学的治療法として極めて大きな潜在力を有するが、モノクローナル抗体と比べると発見と開発にはより多くの一連の難問がある。困難な、２つの鍵となる分野は、１）成功裏な二重特異性抗体フォーマットの開発、及び２）二重特異性抗体が架橋する又は共結合することになる対になった標的を選択することである。
【０００９】
ＤＶＤ−Ｉｇ（Ａｂｂｖｉｅ）、ＤｕｏＢｏｄｉｅｓ、（Ｇｅｎｍａｂ）、Ｋｎｏｂｓ−ｉｎ−Ｈｏｌｅｓ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｃｏｍｍｏｎ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ（Ｍｅｒｕｓ）を含む成功している治療薬として潜在的に機能することができると考えられる多くの有望な二重特異性抗体フォーマットが現在開発されている。しかし、こうした場合のそれぞれにおいて、これらのフォーマットは、二重特異性抗体と架橋結合するための新規の抗原対の発見を可能にするハイスループットな標的二重抗原発見スクリーニングに理想的には適していない。
【００１０】
典型的には、単一二重特異性抗体構築物では、少なくとも２つの可変領域を発見ベクターの元の供給源（例えば、ファージディスプレイ、ハイブリドーマ又は単一Ｂ細胞クローニング）から適切な二重特異性発現ベクターにサブクローニングする必要があり、二重特異性体のそれぞれのアームが発現され、こうして得られた二重特異性抗体は精製されなければならない。発見された可変領域の最も効果的な組合せを求めてスクリーニングする又は新規の抗原対を発見する試みにおいて多数の対になった可変領域を組み合わせるつもりであれば、このクローニング及びそれに続く発現努力はすぐに重大な実際上の障害になる。
【００１１】
例えば、５０の独特の抗体が５０の細胞表面標的のパネルに対して発見されたら、総数で２５００の二重特異性抗体が潜在的に産生されると考えられる（Ｘ−Ｙ格子として想定される）。上記の二重特異性抗体フォーマットを使えば、これは少なくとも１００の個々のクローニング反応（５０−Ｘと５０−Ｙ）と続いて２５００の抗体発現実験が必要になると考えられる。開始のモノクローナル抗体の数を１００まで増やせば、クローニング反応の最小数は２００（１００−Ｘと１００−Ｙ）まで、発現数は１０，０００まで増えることになる。
【００１２】
一般的に、この「発現障害」の根本原因は、上記のフォーマットは、最終二重特異性構築物の両方のタンパク質鎖「半分」が同じ細胞において単一発現実験内で同時に発現される必要があることである。したがって、多くのフォーマットでは、２５００の二重特異性抗体を産生するためには、２５００の発現実験が必要になる。
【００１３】
二重特異性抗体フォーマットがモノシストロン性（すなわち、単鎖タンパク質としてクローニングされ発現される）、例えば、単鎖ダイアボディである場合、クローニング実験の数が上に与えられた数についてそれぞれ２５００及び１０，０００になると考えられるので、「発現障害」はさらに悪化する。
【００１４】
さらに、発現後、所望の構築物を単離するためには大規模な精製が必要になる可能性がある。
【００１５】
一部の二重特異性アプローチはクローニングの量を減らすために二重特異性構築物に共通の軽鎖を用いるが、これでは発現実験の数は減らない。さらに、共通の軽鎖などの共通鎖を使用すれば、抗体は重鎖などの１つの鎖のみを通じて十分高い親和性でその抗原に結合する必要があるので開始抗体可変ドメインを見つけるのがより困難になるために、抗体発見という難問はさらに難しくなる。
【００１６】
したがって、現在の大規模な二重特異性フォーマット及び新規の抗原対を同定するハイスループットなスクリーニングの使用は非現実的であり、仮説駆動型アプローチのみを二重特異的抗原ターゲティングに使用し続けることになっていた。
【００１７】
２つの既知の標的上の所与のエピトープに結合する、限られた数の二重特異性抗体を設計し試験するよりむしろ、二重特異性抗体を用いた新規の生物学へのアクセスを利用する真の潜在力は、二重特異性抗体又はタンパク質リガンドの大きく多様なコンビナトリアルパネルを用いた広い機能スクリーニング努力を通じてのみ達成することが可能であることを提案する。このスクリーニングを促進するためには、容易に構築され種々の機能スクリーンにおいて機能的効果を求めてスクリーニングすることが可能な多数の多様な二重特異性タンパク質を産生することを可能にするフォーマット及び方法が必要である。このアプローチにより、相乗的対についての新発見をもたらす能力のある同定が可能になる。
【００１８】
したがって、種々の抗原特異性の組合せとして存在する多数の二重特異性タンパク質複合体を産生しスクリーニングするのは有用だと考えられる。特に、多数の異なる二重特異性抗体複合体を迅速に効率的に産生しスクリーニングすることができるのは有用だと考えられる。すでに上に記載されている二重特異性抗体を製造するための様々な既存の方法が存在する。しかし、これらの方法はそれぞれが不利な点があり、下でもっと詳細にさらに説明される別の方法も同じである。
【００１９】
二重特異性及び多特異性構築物の標的を効率よく同定する方法という問題は当技術分野では十分に取り組まれていない。例えば、ＷＯ２０１４／００１３２６は、タンパク質のＤＮＡ断片への化学的コンジュゲーションを用いており、ＤＮＡ断片は、２つのそのようなタンパク質を互いに連結している相補的ＤＮＡ配列にハイブリダイズして、少なくとも２つのターゲティング実体を含む個別化患者特異的多特異性分子を生ずる。このアプローチは、仮に新しい二重特異性組合せを同定することに用いられた場合、いくつかの困難が付随する。例えば、タンパク質をＤＮＡにコンジュゲートすると、タンパク質の活性及び／又は構造に損傷を与えることがある。特に、タンパク質−ＤＮＡハイブリッドは天然には存在しておらず、したがって干渉が起こる可能性がある。さらに、タンパク質とＤＮＡを結合させるのに必要とされる化学コンジュゲーションでは工程の複雑さ、時間、及び費用が増える。
【００２０】
カップリング及びコンジュゲーション技法は、抗体薬物コンジュゲートを作製すること及びｉｎ  ｖｉｖｏターゲティング技術のために存在している。従来の化学的架橋結合は、関連する化学種をホモ二量体及び他の望ましくない副産物から精製する必要がある場合があるために多くの労力を要する。さらに、化学修飾ステップはタンパク質の整合性を変化させ、したがって、安定性が不十分になる又は生物学的機能が変わってしまうことがある。その結果、化学的架橋結合による二重特異性抗体の産生は多くの場合非効率的であり、抗体活性も消失してしまうことがある。
【００２１】
二重特異性抗体を製造する別の方法は、工学的に操作された細胞が無作為に会合する２つの重抗体鎖及び２つの軽抗体鎖を発現する、細胞融合（例えば、ハイブリッドハイブリドーマ）によるものである。選択するのに４つの可能な変異体が存在するので、これにより１０の可能な二重特異性抗体組合せが作製され、そのうちのいくつか（多くの場合に、１つのみ）の組合せのみが望ましいと考えられる。したがって、細胞融合による二重特異性抗体の産生は、生産収率が低く、産生されたその他の二重特異性抗体から所望の二重特異性抗体を単離するためには追加の精製ステップも必要になる。これらの不利な点により製造時間及び経費が増加する。
【００２２】
組換えＤＮＡ技法も二重特異性抗体を産生するために用いられてきた。例えば、組換えＤＮＡ技法を使用して「ノブインツーホール（knob into hole）」二重特異性抗体も産生された。「ノブインツーホール」技法は、ＣＨ３ドメインインターフェイスで多量体化ドメインに立体的に相補的な突然変異を工学的に作製する（例えば、Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-621 (1996); Merchant et al., Nat. Biotechnol. 16(7): 677-81 (1998)参照; 米国特許第５，７３１，１６８号及び米国特許第７，１８３，０７６号も参照）。この戦略の１つの制約は、同じ細胞で発現される場合、誤対合並びに望ましくない及び／又は不活性な分子の形成を防ぐためには２つの親抗体の軽鎖は同一でなければならない点である。それぞれの二重特異性体（その重及び軽鎖）は単一細胞で発現されなければならず、タンパク質産物は一般に約２０％のホモ二量体を含有しており、これはその後に精製により取り除かれる。
【００２３】
他のアプローチは、完全長ＩｇＧ４分子における鎖の自然な交換に基づいている（Ｇｅｎｍａｂ  Ｄｕｏｂｏｄｙ）。しかし、このアプローチもＦｃ領域なしでは構築物を調製することができないので困難を抱えている。Ｆｃ領域は生物活性に寄与する可能性があるので、観察される活性がＦｃを含む二重特異性分子において可変領域、Ｆｃ又は両方の組合せに基づいているのかどうかを確証するのは困難な場合がある。さらに、交換は動力学的過程であり、このせいで試験されている実体が実際に何であるのかに関して困難が生じることがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
したがって、二重特異性抗体のもっと効率的でもっとハイスループットなスクリーニングを可能にする二重特異性タンパク質複合体を作製する新たな方法の必要性が存在する。特に、利用可能な抗体又は抗体断片のプールからの任意の２つの抗体又は抗体断片の選択を容易に組み合わせて、例えば、ホモ二量体の形成を回避する又は最小化しつつ、異なる二重特異性抗体のマルチプレックスを効率的に産生することが可能になるフォーマット及び方法の必要性が存在する。抗原特異性の新たな組合せを求めて相乗的生物学的機能についてスクリーニングするときには、特に、ヘテロ二量体がその機能の発見に欠かせない場合には、異なる二重特異性抗体を効率よく会合させることは特に重要である。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
一態様では、成分のすべてが基本的に凝集なしで個々のユニットとして細胞から発現されることが可能であり、コンジュゲーションもカップリング化学反応も用いず、ホモ二量体化は最小限であり、混合するだけでユニットを会合させることが可能であることにより、スクリーニングにおいて使用するのに特に適した新たな二重特異性フォーマットが提供される。
【００２６】
したがって、式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂを有する二重特異性タンパク質複合体であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり、
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり、
：はＸとＹの間の結合相互作用であり、
Ａは、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ、及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む群から独立して選択される、二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質成分であり、
Ｂは一本鎖Ｆｖ又はｓｄＡｂであり、
Ｘは抗原、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ及びｓｄＡｂから独立して選択される、結合対の第１の結合パートナーであり、
Ｙは抗原、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ及びｓｄＡｂから独立して選択される、結合対の第２の結合パートナーであり、
ただし、Ｘが抗原である場合、Ｙは、Ｘにより表される抗原に対して特異的であるＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ又はｓｄＡｂであり、Ｙが抗原である場合、Ｘは、Ｙにより表される抗原に対して特異的であるＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ又はｓｄＡｂである、
上記二重特異性タンパク質複合体が提供される。
【００２７】
Ｘ及びＹは、Ａ及びＢのＮ末端で又はＣ末端で、それぞれＡ及びＢに融合されてもよい。
【００２８】
本開示内では、融合タンパク質の用語「Ａ−Ｘ」及び「Ｙ−Ｂ」は「Ｘ−Ａ」又は「Ｂ−Ｙ」として類似的に示されることがある。ヘテロ二量体繋「Ｘ：Ｙ」を表す用語に同じことが当てはまり、この用語は「Ｙ：Ｘ」として本明細書で示すことも可能である。
【００２９】
一例では、式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂを有する二重特異性タンパク質複合体であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり、
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり、
：はＸとＹの間の結合相互作用であり、
Ａは、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ、及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む群から独立して選択される、二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質成分であり、
Ｂは一本鎖Ｆｖ又はｓｄＡｂであり、
Ｘは抗原、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ及びｓｄＡｂから独立して選択される、結合対の第１の結合パートナーであり、
Ｙは抗原、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ及びｓｄＡｂから独立して選択される、結合対の第２の結合パートナーであり、
ただし、Ｘが抗原である場合、Ｙは、Ｘにより表される抗原に対して特異的であるＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ又はｓｄＡｂであり、Ｙが抗原である場合、Ｘは、Ｙにより表される抗原に対して特異的であるＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ又はｓｄＡｂである、
上記二重特異性タンパク質複合体が提供される。
【００３０】
一実施形態では、Ｘは、どちらでもＡにより表される、ｓｃＦｖのＣ末端又はＦａｂ断片若しくはＦａｂ’断片中の重鎖のＣ末端に、場合によってリンカーを介して融合されている。
【００３１】
一実施形態では、Ｙは、Ｂにより表されるｓｃＦｖのＣ末端に、場合によってリンカーを介して融合されている。
【００３２】
一実施形態では、Ｘは、どちらでもＡにより表される、ｓｃＦｖのＮ末端又はＦａｂ断片若しくはＦａｂ’断片中の重鎖のＮ末端に、場合によってリンカーを介して融合されている。
【００３３】
一実施形態では、Ｙは、Ｂにより表されるｓｃＦｖのＮ末端に、場合によってリンカーを介して融合されている。
【００３４】
一実施形態では、可変Ｘ又はＹは、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ、又はｓｄＡｂであり、もう一方の可変（Ｘ又はＹ）はペプチドである。
【００３５】
Ｘ又はＹがＦａｂ又はＦａｂ’分子である場合、重鎖ＣＨ１又は軽鎖ＣＬのＣ末端などの断片のＣ末端は一般に、抗体断片Ａ又はＢのＣ末端にリンカーを介して連結される。
【００３６】
一実施形態では、ＸとＹの間の結合親和性は５ｎＭ又はそれよりも強く、例えば、９００ｐＭ又はそれよりも強い、例えば８００、７００、６００、５００、４００又は３００ｐＭなどである。
【００３７】
一実施形態では、Ａ、Ｘ及び／又はＹのうちの少なくとも１つ（１つなどの）はＦａｂ又はＦａｂ’分子である。有利なことに、フォーマット中に少なくとも１つのＦａｂ又はＦａｂ’分子を有することは、フォーマットの安定性、例えば、物理的安定性にとり有利であり、凝集又は特にＦａｂ若しくはＦａｂ’断片の非存在下でフォーマットに影響を及ぼすことがある類似の望ましくない効果を最小限に抑えることができる。
【００３８】
一実施形態では、本開示の二重特異性複合体はＦａｂ断片を１つだけ又はＦａｂ’断片を１つだけ含む。
【００３９】
一実施形態では、本開示の二重特異性複合体はｓｃＦｖを１つ以下又は２つ以下含む。
【００４０】
一実施形態では、ＡはＦａｂ断片などのＦａｂ又はＦａｂ’断片である。
【００４１】
一実施形態では、ＡはｓｃＦｖである。
【００４２】
一実施形態では、ＡはｓｄＡｂである。
【００４３】
一実施形態では、ＡはｓｃＦｖであり、Ｘ又はＹはＦａｂ又はＦａｂ’断片である。
【００４４】
一実施形態では、ＢはｓｃＦｖである。
【００４５】
一実施形態では、ＢはｓｄＡｂである。
【００４６】
一実施形態では、ＢはｓｃＦｖであり、Ｘ又はＹはＦａｂ又はＦａｂ’断片である。
【００４７】
Ａ及び／又はＢとして１つ又は複数のｓｃＦｖを組み込むフォーマットはスクリーニングに有用である。なぜならば、そうすることでファージライブラリーなどのライブラリー由来のｓｃＦｖ分子は、Ｆａｂなどの他の抗体断片に再フォーマットする必要もなく迅速にスクリーニングすることが可能になるからである。
【００４８】
一実施形態では（特に、ＡがＦａｂ、Ｆａｂ’である場合）、ＸはｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ及びペプチドから独立して選択され、ただし、ＸがＦａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂの場合、Ｙはペプチドなどの抗原であり、Ｘがペプチドの場合、ＹはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである。
【００４９】
一実施形態では（特に、ＡがｓｃＦｖである場合）、ＸはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片及びペプチドから独立して選択され、ただし、ＸがＦａｂ又はＦａｂ’断片である場合、Ｙはペプチドなどの抗原であり、Ｘがペプチドの場合、ＹはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片である。
【００５０】
一実施形態では、ＸはＦａｂ断片などのＦａｂ断片又はＦａｂ’断片である。
【００５１】
一実施形態では、ＸはｓｃＦｖである。
【００５２】
一実施形態では、ＸはｓｄＡｂである。
【００５３】
一実施形態では、ＹはＦａｂ断片などのＦａｂ断片又はＦａｂ’断片である。
【００５４】
一実施形態では、ＹはｓｃＦｖである。
【００５５】
一実施形態では、ＹはｓｄＡｂである。
【００５６】
一実施形態では、ＢはｓｃＦｖであり、ＹはＦａｂ又はＦａｂ’断片である。
【００５７】
一実施形態では、Ｘはペプチドである。
【００５８】
一実施形態では、Ｙはペプチドである。
【００５９】
一実施形態では、Ｘ又はＹのペプチドは５から２５アミノ酸長の範囲であり、特にペプチドＧＣＮ４、その変異体、誘導体又は断片である。
【００６０】
一実施形態では、Ｘ又はＹは、ｓｃＦｖ  ５２ＳＲ４（配列番号３、９８若しくは９９又は配列番号３のアミノ酸１〜２４３）などの、ペプチドＧＣＮ４（配列番号１又は配列番号１のアミノ酸１〜３８）に対して特異的であるＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂを表す。Ｘ又はＹがＧＣＮ４に結合するＦａｂ又はＦａｂ’断片である場合、それはｓｃＦｖ  ５２ＳＲ４由来のＶＨ及びＶＬ領域を含んでいてもよい。Ｘ又はＹが、ペプチドＧＣＮ４、その変異体、誘導体又は断片（表１Ａ中の配列番号１又は配列番号１のアミノ酸１〜３８、ボールドのアミノ酸は任意であり、イタリック体のアミノ酸はリンカーの配列である）に対して特異的であるＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである場合、対応する可変Ｘ又はＹは、配列番号１のアミノ酸１〜３８又はその一部などの、対応するＧＣＮ４ペプチド又はその変異体、誘導体若しくは断片である必要がある。配列番号１に従ったＧＣＮ４ペプチドをコードするヌクレオチド配列は配列番号２として配列番号１に示されている。
【表１】
2019510732.tif 000002
【００６１】
ＧＣＮ４ペプチドの他の変異体は表Ｂ１に示されており（配列番号７５〜９７）、ボールドのアミノ酸は任意であり、イタリック体のアミノ酸はリンカーの配列を形成する。配列番号７５〜８２に示される配列に従った変異体は、４つのグリシン残基と１つのセリン（Ｇ４Ｓ）の４回の繰り返しのリンカーを含むが、もっと短い（１×Ｇ４Ｓ、２×Ｇ４Ｓ又は３×Ｇ４Ｓ）又はもっと長い（５×Ｇ４Ｓ、等）リンカーを有する変異体も本明細書では想定されていることに留意するべきである。
【表２】
2019510732.tif 000003
【００６２】
Ａ−ＸとＹ−Ｂ融合物は様々な配向で作製することができ、これはそのような融合物をコードするポリヌクレオチド構築物はＸ又はＡを両方の配向で発現するように設計することができる（ＡのＣ末端がＸのＮ末端に融合されているＡ−Ｘ又はＸのＣ末端がＡのＮ末端に融合されているＸ−Ａ）ことを意味すると理解されるべきである。Ｙ−Ｂ融合物にも同じことが当てはまる。Ａ、Ｘ、Ｙ又はＢが融合物のＮ末端にあるのかどうかにかかわらず、そのような融合物を作製するポリヌクレオチド配列は、細胞外放出を支援するために、融合物のまさしくＮ末端に、シグナルペプチド配列をコードするように設計されたヌクレオチド配列を含むことになる。シグナルペプチドは最終的には成熟融合物から切断される。好ましいシグナルペプチド配列は表１Ａの配列番号１００〜１０３に示されている。
【００６３】
一実施形態では（特に、ＡがＦａｂ、Ｆａｂ’である場合）、ＹはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ及びペプチドから独立して選択され、ただし、ＸがＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである場合、Ｙはペプチドなどの抗原であり、Ｘがペプチドなどの抗原である場合、ＹはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである。
【００６４】
一実施形態では（特に、ＡがＦａｂ、Ｆａｂ’である場合）、ＹはｓｃＦｖ、ｓｄＡｂから独立して選択され、ただし、Ｘがペプチドなどの抗原である場合である。
【００６５】
一実施形態では（特に、ＡがＦａｂ、Ｆａｂ’である場合）、Ｙはペプチドであり、ただしＸはｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである。
【００６６】
一実施形態では（特に、ＡがｓｃＦｖである場合）、ＹはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ及びペプチドから独立して選択され、ただし、ＸがＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂである場合、Ｙはペプチドであり、Ｘがペプチドの場合、ＹはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂである。
【００６７】
一実施形態では（特に、ＡがｓｃＦｖである場合）、ＹはｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ及びペプチドから独立して選択され、ただし、ＸがＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂである場合、Ｙはペプチドであり、Ｘがペプチドの場合、ＹはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片である。
【００６８】
一実施形態では（特に、Ａ又はＢがｓｃＦｖである場合）、ＹはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片から独立して選択され、ただし、Ｘはペプチドである。
【００６９】
一実施形態では（特に、Ａ又はＢがｓｃＦｖである場合）、ＸはＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片から独立して選択され、ただし、Ｙはペプチドである。
【００７０】
したがって、本開示の二重特異性フォーマットのＡ及びＢエレメントは、
Ｆａｂ若しくはＦａｂ’アーム及びｓｃＦｖ若しくはｓｄＡｂアーム、又は
２つのｓｃＦｖアーム、又は
２つのｓｄＡｂアーム、又は
ｓｃＦｖアーム及びｓｄＡｂアーム
を互いに独立して表し、並びに
Ｘ及びＹ成分は
ペプチド及びＦａｂ若しくはＦａｂ’断片、又は
ペプチド及びｓｃＦｖ、又は
ペプチド及びｓｄＡｂ
を互いに独立して表す。
【００７１】
一実施形態では、Ａ−Ｘは、
１．Ｆａｂ若しくはＦａｂ’リンカー及びペプチド、
２．Ｆａｂ若しくはＦａｂ’リンカー及びｓｃＦｖ、又は
３．Ｆａｂ若しくはＦａｂ’リンカー及びｓｄＡｂ
である。
【００７２】
一実施形態では、Ｂ−Ｙは、
４．ｓｃＦｖリンカー及びペプチド、
５．ｓｃＦｖリンカー及びｓｃＦｖ、又は
６．ｓｃＦｖリンカー及びｓｄＡｂ
である。
【００７３】
一実施形態では、本開示の二重特異性タンパク質複合体は、表１Ｃに示される上の番号に基づく組合せである。
【表３】
2019510732.tif 000004
【００７４】
この種の配置は、発現させることが可能なユニットＡ−Ｘ及びユニットＢ−Ｙをスクリーニングに使用するのに理想的である。
【００７５】
表１Ｄは本発明の範囲に従ったあらゆる考えられる組合せの概要を与える。
【表４−１】
2019510732.tif 000005
【表４−２】
2019510732.tif 000006
【００７６】
一実施形態では、Ａ中のｓｃＦｖは内部可変ドメインジスルフィド結合を含む。
【００７７】
一実施形態では、Ｂ中のｓｃＦｖは内部可変ドメインジスルフィド結合を含む。
【００７８】
一実施形態では、Ｘ中のｓｃＦｖは内部可変ドメインジスルフィド結合を含む。
【００７９】
一実施形態では、Ｙ中のｓｃＦｖは内部可変ドメインジスルフィド結合を含む。
【００８０】
一実施形態では、ジスルフィド結合は間にある（文脈が別の方法で示していなければ、下の一覧表ではＫａｂａｔ番号付けが用いられている）。Ｋａｂａｔ番号付けに言及される場合はいつでも、関連する参考文献はKabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA)：
−  ＶＨ３７＋ＶＬ９５Ｃ  例えばProtein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)参照；
−  ＶＨ４４＋ＶＬ１００  例えば、Biochemistry 33 5451-5459 Reiter et al (1994); or Journal of Biological Chemistry Vol. 269 No. 28 pp.18327-18331 Reiter et al (1994); or Protein Engineering, vol.10 no.12 pp.1453-1459 Rajagopal et al (1997)参照；
−  ＶＨ４４＋ＶＬ１０５  例えば、J Biochem. 118, 825-831 Luo et al (1995)参照；
−  ＶＨ４５＋ＶＬ８７  例えば、Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)参照；
−  ＶＨ５５＋ＶＬ１０１  例えば、FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995)参照；
−  ＶＨ１００＋ＶＬ５０  例えば、Biochemistry 29 1362-1367 Glockshuber et al (1990)参照；
−  ＶＨ１００ｂ＋ＶＬ４９；
−  ＶＨ９８＋ＶＬ４６  例えば、Protein Science 6, 781-788 Zhu et al (1997)参照；
−  ＶＨ１０１＋ＶＬ４６
−  ＶＨ１０５＋ＶＬ４３  例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90 pp.7538-7542 Brinkmann et al (1993); or Proteins 19, 35-47 Jung et al (1994)又は 
−  ＶＨ１０６＋ＶＬ５７  例えば、FEBS Letters 377 135-139 Young et al (1995)参照。
【００８１】
上に収載されているアミノ酸対は、ジスルフィド結合を形成することが可能であるようにシステインによる置換の助けとなる位置にある。システインは公知の技法によりこれらの位置に操作することが可能である。
【００８２】
したがって、一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、１つはＶＨに１つはＶＬの２つのシステイン残基間のジスルフィド結合により連結することができ、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１００、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ１００ｂとＶＬ４９、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０１とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３及びＶＨ１０６とＶＬ５７からなる群から選択される。
【００８３】
一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、ＣＤＲの外側にある１つはＶＨに１つはＶＬの２つのシステイン残基間のジスルフィド結合により連結することができ、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１００、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３及びＶＨ１０６とＶＬ５７からなる群から選択される。
【００８４】
一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、ＣＤＲの外側にある１つはＶＨに１つはＶＬの２つのシステイン残基間のジスルフィド結合により連結することができ、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３及びＶＨ１０６とＶＬ５７からなる群から選択される。
【００８５】
一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、２つのシステイン残基間のジスルフィド結合により連結することができ、ＶＨのシステイン残基は４４位に、ＶＬのシステイン残基は１００位にある。
【００８６】
典型的には、システイン対はＶＨ及びＶＬ中のそれらの位置に操作されており、したがって、一実施形態では、本発明の可変ドメイン対（ＶＨ／ＶＬ）は、２つの操作されたシステイン間のジスルフィド結合により連結することができる。
【００８７】
したがって、それぞれのユニット（Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙ）の発現後に必要とされる精製の量は最小限である又は事実上不必要である。二重特異性複合体は、関連するユニットを混合するだけで、すなわち、コンジュゲーション及びカップリング化学反応に頼らずとも１対１のモル比で形成することが可能である。存在する場合、Ｆａｂ／Ｆａｂ’断片中の定常領域はＦａｂ／Ｆａｂ’成分（単数又は複数）の二量体化を推進し、結合パートナーのＸとＹは必要なヘテロ二量体二重特異性複合体を形成するのに有利になるようさらに平衡を推進する。さらに、ヘテロ二量体化後の複合体の形成の後には精製はほとんど必要としないか全く必要としない。したがって、多数のＡ−Ｘ及びＢ−Ｙを容易に調製し組み合わせることが可能である。
【００８８】
ＡとＢのうちの１つ又は両方がｓｃＦｖを表す場合、これは有利になることができる。なぜならば、これによりライブラリーに直接由来するｓｃＦｖを本開示のフォーマットで使用することが可能になり、迅速な試験が可能になり、可変領域をＦａｂなどの別のフォーマットに再フォーマットする必要がなくなるからである。
【００８９】
本発明に従った二重特異性タンパク質複合体の明らかな代替物を想定することができる。１つの例には、Ａ’−Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂ又はＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂ−Ｂ’などの１つよりも多いＡ又は１つよりも多いＢを含む分子が含まれ、Ａ’及びＢ’はそれぞれがｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、Ｆａｂ又は抗原から独立して選択することが可能であり、Ａに融合されている。例えば、分子のＡ’−Ａ部分は、それぞれが同じ標的上の異なるエピトープに対する２つのｓｃＦｖにより形成して、分子（ｓｃＦｖ）２−Ｘ：Ｙ−Ｂを形成してもよい。
【００９０】
別の例では、二重特異性複合体は非Ｉｇ様結合タンパク質により形成されてもよく、この結合タンパク質はアドネクチン、リポカリン、クニッツドメインベースのバインダー、アビマー（avimers）ノッチン、フィノマー（fynomers）、アトリマー（atrimers）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）ベースのバインダー、ダーピン（darpins）、アフィボディ（affibodies）、アフィリン（affilins）、アルマジロリピートタンパク質又はその組合せを含むがこれらに限定されない。
【００９１】
本発明に従った二重特異性タンパク質複合体はＦｃ断片を欠く。Ｆｃ断片ＣＨ２−ＣＨ３を欠く二重特異性複合体を調製しスクリーニングする能力は、観察される生物活性が実際に複合体中の可変領域対のみに起因することも保証する。本開示の二重特異性複合体の単純さ及びそれを調製する方法は、新たな標的抗原組合せを見つけるために、及び所与の組合せでの可変領域配列の最適化のために可変ドメイン対のハイスループットなスクリーニングを促進するという文脈では極めて有利である。
【００９２】
一実施形態では、Ａ及び／又はＢは、その翻訳後修飾バージョン、少なくとも１つのエピトープを含むその断片を含む、Ｔ細胞又はＢ細胞シグナル伝達受容体などの細胞表面受容体、共刺激分子、チェックポイント阻害因子、ナチュラルキラー細胞受容体、免疫グロブリン受容体、免疫グロブリン様受容体、メタロプロテアーゼのマトリックスメタロプロテアーゼ及び膜型マトリックスメタロプロテアーゼ組織阻害因子、ＴＮＦＲファミリー受容体、Ｂ７ファミリー受容体、接着分子、インテグリン、サイトカイン／ケモカイン受容体、ＧＰＣＲ、増殖因子受容体、キナーゼ受容体、組織特異的抗原、がん抗原（腫瘍関連抗原及びペプチド）、病原体認識受容体、補体受容体、ホルモン受容体、スカベンジャー受容体又はサイトカイン、ケモカイン、ロイコトリエン、増殖因子、ホルモン若しくは酵素若しくはイオンチャネルなどの可溶性分子を含む群から選択される抗原に特異的である。
【００９３】
一実施形態では、組成物、例えば、本開示に従った１つ又は複数の二重特異性複合体を含む医薬組成物が提供される。
【００９４】
さらに、本発明者らは、式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異的タンパク質複合体における相乗的機能を検出する方法であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり、
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり、
：はＸとＹの間の結合相互作用であり、
Ａは、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ、及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む群から独立して選択される、二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質成分であり、
Ｂは一本鎖Ｆｖ又はｓｄＡｂであり、
Ｘは抗原、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ及びｓｄＡｂから独立して選択される、結合対の第１の結合パートナーであり、
Ｙは抗原、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ及びｓｄＡｂから独立して選択される、結合対の第２の結合パートナーであり、
ただし、Ｘが抗原である場合、Ｙは、Ｘにより表される抗原に対して特異的であるＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ又はｓｄＡｂであり、Ｙが抗原である場合、Ｘは、Ｙにより表される抗原に対して特異的であるＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ又はｓｄＡｂであり、
（ｉ）少なくとも１つのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異的タンパク質複合体を含むマルチプレックスの一部又はすべてについての機能アッセイにおいて活性を試験するステップと、
（ｉｉ）機能アッセイからの読み出し情報（単数又は複数）を解析して、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異的タンパク質複合体における相乗的生物学的機能を検出するステップと
を含む上記方法を考案した。
【００９５】
さらに、本発明者らは、式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異的タンパク質複合体における相乗的機能を検出する方法であって、
Ａ−Ｘは第１の融合タンパク質であり、
Ｙ−Ｂは第２の融合タンパク質であり、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり、
：はＸとＹの間の結合相互作用であり、
Ａは、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｄＡｂ、及び一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含む群から独立して選択される、二重特異性タンパク質複合体の第１のタンパク質成分であり、
Ｂは一本鎖Ｆｖ又はｓｄＡｂであり、
Ｘは抗原、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ及びｓｄＡｂから独立して選択される、結合対の第１の結合パートナーであり、
Ｙは抗原、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ及びｓｄＡｂから独立して選択される結合対の第２の結合パートナーであり、
ただし、Ｘが抗原である場合、Ｙは、Ｘにより表される抗原に対して特異的であるＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ又はｓｄＡｂであり、Ｙが抗原である場合、ＸはＹにより表される抗原に対して特異的であるＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、一本鎖Ｆｖ又はｓｄＡｂであり、
（ｉ）少なくとも１つのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異的タンパク質複合体を含むマルチプレックスの一部又はすべてについて機能アッセイにおいて活性を試験するステップと；
（ｉｉ）機能アッセイからの読み出し情報（単数又は複数）を解析して、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異的タンパク質複合体における相乗的生物学的機能を検出するステップと
を含む上記方法を考案した。
【００９６】
一実施形態では、マルチプレックスは格子の形態であり、例えば、マルチプレックスは少なくとも２つのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異的タンパク質複合体を含む。フォーマットについて上に提供される詳細は本開示の方法において用いられるフォーマットにも等しく当てはまる。
【００９７】
一実施形態では、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異的タンパク質複合体は試験に先立って精製されない。
【００９８】
一実施形態では、Ａ−Ｘ及びＹ−Ｂ融合タンパク質は一過性に発現され、１対１モル比で混合されてヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異的タンパク質複合体をそれぞれ生成する前に精製されない。
【００９９】
したがって、一般的に、融合タンパク質Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙは同じ細胞で同時発現されることはない。これは、そのおかげで、例えば、１００の融合タンパク質を発現し、場合によっては精製することが可能になり、１００の融合タンパク質を種々の並べ替えで続いて混合すれば１０，０００のヘテロ二量体的に繋がれた二重特異性タンパク質複合体を提供することが可能になり、そのうちの５，０００が類のない対であるので、有利である。
【０１００】
これとは対照的に、ある種の先行技術の方法では二重特異性の同時発現が必要であり、したがって、１０，０００の複合体では、１０，０００のトランスフェクション、発現及び精製が必要になる。
【０１０１】
しかし、必要に応じて、Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙは同じ細胞で発現することができる。
【０１０２】
結合パートナーＸ及びＹは互いに対して親和性を有し、ベルクロ（登録商標）の生物学的等価物又はバーと磁石として機能し、複合体を１つに保持する。有利なことに、これは、融合タンパク質Ａ−Ｘ及びＹ−ＹＢは、その融合タンパク質を互いに混ぜ合わせるだけで容易に会合して二重特異性タンパク質複合体になることが可能であることを意味する。したがって、本開示の二重特異性タンパク質複合体はモジュラー構造体を有し、これのおかげで２つの異なるタンパク質を、例えば、格子状の様式で抗原特異性の異なる組合せを用いた二重特異性タンパク質複合体の並べ替えの大きなパネルを作製するために容易に会合させることが可能になる。これのおかげで、相加的、相乗的又は新規の生物学的機能を検出するための多数の二重特異性タンパク質複合体の効率的で系統的なスクリーニングが可能になる。
【０１０３】
ＸとＹが互いに対して特異的であることを考慮すると、このせいで、ホモ二量体を形成する能力が著しく減少する。本明細書ではＸとＹは合わせて結合対又は結合パートナーと呼ばれる。一実施形態では、Ｘは他のＸに対して高い親和性を持たない。一実施形態では、Ｙは他のＹに対して高い親和性を持たない。有利なことに、ＸとＹがホモ二量体を形成しないとき、このことが望ましくない単一特異性タンパク質複合体の形成を妨げ、所望の二重特異性タンパク質複合体の収量を増やし、単一特異性タンパク質複合体を除去するための面倒な精製ステップの必要性をなくす。
【０１０４】
これにより、大半の先行技術の方法では効率的に得ることができない収量及び／又は精度を持つ二重特異性タンパク質複合体の迅速な会合が可能になり、特に、先行技術の方法では一般に大規模な精製ステップが必要になる。本発明では二重特異性複合体の収量は典型的には７５％又はそれよりも高い。
【０１０５】
さらに有利なことに、二重特異性タンパク質複合体は、その成分タンパク質（成分タンパク質が結合している抗原を含む）が既知の関係を持たない、又は異なる潜在的には無関係な経路に存在する複合体のスクリーニングを可能にする。例えば、２つの別々の経路で機能し、例えば、当業者が通常であれば互いに接触するとは予想しない２つのタンパク質を相加的、相乗的及び／又は新規の機能を同定するために二重特異性タンパク質複合体において試験することが可能である。
【０１０６】
さらに、所与の抗原又はエピトープに対する複数の結合領域（可変領域などの）を生物学的機能における微妙な差異を同定するために平行に調べることが可能である。これにより、所与の抗原対に対する可変領域配列の組合せを調査し最適化することが可能になる。
【０１０７】
本方法によればその科学はその結果を示すことができ、本方法は生物学的機能についての先入観及び技術的偏見に頼ってはいない。このアプローチは潜在的に極めて強力である。
【０１０８】
有利なことに、Ｘ及びＹ成分のせいで、融合タンパク質の異なる並べ替えから構成される二重特異性タンパク質複合体を含むマルチプレックスを迅速に容易に会合させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】本開示の二重特異性タンパク質複合体の構造と会合を示す模式図である。
【図２】本発明の二重特異性抗体を使用する機能スクリーニングのための例となる４×４格子を示す表である。この格子を使用すれば、１６の異なる二重特異性タンパク質複合体を会合させ相乗的機能について効率的にスクリーニングすることが可能である。
【図３】本発明に従った二重特異性タンパク質複合体の実施形態の模式図であり、Ａ及びＢはそれぞれＦａｂ、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂによって独立して表され；ＸはＦａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂなどの抗ＧＣＮ４ペプチドでありＹはＧＣＮ４ペプチドである。
【図４】本発明に従った二重特異性タンパク質複合体の実施形態の模式図であり、ＡはＦａｂによって表され；Ｘ、抗ＧＣＮ４ペプチドはＦａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂにより表され；ＹはＧＣＮ４ペプチドでありＢはＦａｂ、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂにより表される。
【図５】本発明に従った二重特異性タンパク質複合体の実施形態の模式図であり、ＡはｓｃＦｖによって表され；Ｘ、抗ＧＣＮ４ペプチドはＦａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂにより表され；ＹはＧＣＮ４ペプチドでありＢはＦａｂ、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂにより表される。
【図６】本発明に従った二重特異性タンパク質複合体の実施形態の模式図であり、ＡはｓｄＡｂによって表され；Ｘ、抗ＧＣＮ４ペプチドはＦａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂにより表され；ＹはＧＣＮ４ペプチドでありＢはＦａｂ、ｓｃＦｖ又はｓｄＡｂにより表される。
【図７】ｓｃＦｖ−Ｙフォーマットについての哺乳動物発現ベクターである。
【図８】ドナーＵＣＢ  Ｃｏｎｅ１３０由来のＩｇＭ刺激Ｂ細胞上でのＣＤ７９−ＣＤ２２及びＣＤ７９−ＣＤ４５  Ｆａｂ−Ｘ：Ｆａｂ−Ｙ及びＦａｂ−Ｘ：ｓｃＦｖ−Ｙ二重特異性組合せによるＰＬＣｇ２（＋／−ＳＤ）の阻害を示すグラフである。
【図９】ドナーＵＣＢ  Ｃｏｎｅ１３０由来のＩｇＭ刺激Ｂ細胞上でのＣＤ７９−ＣＤ２２及びＣＤ７９−ＣＤ４５  Ｆａｂ−Ｘ：Ｆａｂ−Ｙ及びＦａｂ−Ｘ：ｓｃＦｖ−Ｙ二重特異性組合せによるＡｋｔ（＋／−ＳＤ）の阻害を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０１１０】
本明細書で使用される「二重特異性タンパク質複合体」とは、ヘテロ二量体繋により一緒に保持される２つのタンパク質を含む分子（本明細書で二重特異性成分と呼ばれるＡ及びＢは本明細書では二重特異性のそれぞれ第１のタンパク質成分及び第２のタンパク質成分とも呼ばれる）のことである。一般にタンパク質のうちの１つ又は両方は結合ドメイン、好ましくは抗体ドメインを含むが、他の結合ドメインを用いてもよい。結合ドメインが抗体ドメインを含む場合、それぞれのドメインは少なくとも３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワークを含み、例えば、ＶＨＨは３つのＣＤＲを含むが、Ｆａｂは６つのＣＤＲを含む。
【０１１１】
本明細書で用いられる「融合タンパク質」は、結合パートナーＸ又はＹに融合しているタンパク質成分Ａ又はＢを含む（必要に応じて）。一実施形態では、融合タンパク質は、遺伝子構築物から組換え技法により発現される、例えば、ＤＮＡ構築物から宿主において発現される翻訳タンパク質である。本開示の文脈では、融合タンパク質の鍵となる特徴の１つは、このタンパク質が細胞から「単一タンパク質／ユニット」として発現することが可能であることである（当然のことながら、Ｆａｂ／Ｆａｂ’断片を含む融合タンパク質の場合では、２つの鎖が存在することになるが、これは本明細書の目的では、１つの鎖、好ましくは重鎖が、場合によって本明細書で下に記載されるリンカーを介して、必要に応じてそのＣ末端でＸ又はＹに融合されている単一タンパク質と見なすことになる；Ｘ及びＹのＮ末端への融合などの他の配向も考えられる）。
【０１１２】
ヘテロ二量体繋Ｘ：Ｙの機能は、ＡとＢの相乗的機能をもたらす、又は例えば、本明細書に記載される方法を用いて、同定することができるように、タンパク質ＡとＢを互いの近傍に保持することである。
【０１１３】
本明細書で使用される用語「ヘテロ二量体繋」とは、２つの結合パートナーを一緒に保持するのに十分である全体的親和性を有する互いの間の相互作用：（結合などの）を形成する２つの異なる結合パートナーＸとＹを含む繋のことである。一実施形態では、Ｘ及び／又はＹはホモ二量体を形成するには不適切である。
【０１１４】
ヘテロ二量体的に繋がれたヘテロ二量体繋は本明細書では互換的に使用される。
【０１１５】
一実施形態では、本明細書で用いられる「ホモ二量体を形成するには不適切な」とは、ホモ二量体よりもＸ−Ｙのヘテロ二量体の形成のほうが好ましい、例えば、形成された後は、熱力学的に安定ななどのより安定している形態のことである。一実施形態では、ＸとＹの間の結合相互作用は一価である。
【０１１６】
一実施形態では、Ｘ−Ｙ相互作用はＸ−Ｘ又はＹ−Ｙ相互作用よりも都合がよい。このせいで、融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙが混合されると、ホモ二量体Ｘ−Ｘ又はＹ−Ｙの形成は減少する。典型的には、１対１モル比の混合に続いて７５％以上のヘテロ二量体が形成される。
【０１１７】
必要に応じて、例えば、本開示に従った融合タンパク質ユニット及び／又は二重特異性タンパク質複合体を精製するために、カラムクロマトグラフィーなどの精製ステップ（特に、１ステップ精製）を用いることができる。
【０１１８】
一実施形態では、精製ステップはそれぞれの融合タンパク質の発現後に提供されるが、典型的には凝集体レベルは低い。したがって、一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合に先立って、融合タンパク質（単数又は複数）は実質的に純粋な形態で提供される。本明細書で用いられる実質的に純粋な形態とは、融合タンパク質が９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％単量体である場合のことである。
【０１１９】
一実施形態では、融合タンパク質（単数又は複数）の精製は実施されない。
【０１２０】
一実施形態では、それぞれの融合タンパク質ユニットは異なる発現実験／実行で発現される。
【０１２１】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体を産生するために混合前には、融合タンパク質（単数又は複数）の精製は実施されない。一実施形態では、混合前及び／又は後には、融合タンパク質（単数又は複数）の精製は実施されない。
【０１２２】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体形成後には精製は必要ではない。一実施形態では、混合後及び一般には追加の精製なしで、組成物の少なくとも５０％は所望の二重特異性タンパク質複合体であり、例えば、組成物の少なくとも６０、６５、７０、７５、８０％は必要とされる二重特異性タンパク質複合体である。
【０１２３】
一実施形態では、本方法のｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合ステップにおいて用いられる融合タンパク質の比は、１．５対１又は２対１などのＡ−Ｘ対Ｂ−Ｙで０．８対１から３対１である。
【０１２４】
一実施形態では、本方法のｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合ステップにおいて用いられる融合タンパク質の比は、特にモル比で、１．５対１又は２対１などのＢ−Ｙ対Ａ−Ｘで０．８対１から３対１である。
【０１２５】
一実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ混合ステップにおいて用いられるＡ−Ｘ対Ｂ−Ｙの比は、１対１、特に１対１モル比である。
【０１２６】
本開示は、融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙを、例えば、１対１モル比で混合することを含む、本開示に従った二重特異性複合体を調製する方法までにも及ぶ。
【０１２７】
一実施形態では、混合はｉｎ  ｖｉｔｒｏで起こる。
【０１２８】
一実施形態では、混合は細胞、例えば、宿主細胞において起こる。
【０１２９】
一実施形態では、混合はｉｎ  ｖｉｖｏで起こり、すなわち、融合タンパク質Ａ−ＸとＢ−Ｙは対象の身体内で互いに相互作用してヘテロ二量体繋を、その結果、二重特異性タンパク質複合体を形成する。
【０１３０】
一実施形態では、ＸとＹは互いに完全に特異的であり、細胞内又は対象の身体内では他のいかなるペプチド／タンパク質とも結合しない。これは、例えば、ＸとＹが標的細胞中にも標的対象身体中にも天然に存在しないことを保証することによって達成することが可能である。これは、例えば、対象にとっては異なっている種又は実体（例えば、酵母タンパク質）由来であるＸ又はＹを選択し、それに対しもう１つの可変因子が特異的であることを保証することによって達成することが可能である。有利なことに、これにより融合タンパク質Ａ−Ｘ及び／又はＢ−Ｙが望ましくない標的へ結合して、それによって望まれない非特異的な効果を生じるのが妨げられる。
【０１３１】
一実施形態では、結合パートナーのうちの１つ（又は少なくとも１つ）はホモ二量体を形成することができず、例えば、結合パートナーのアミノ酸配列が突然変異してホモ二量体の形成を排除する又は最小化する。
【０１３２】
一実施形態では、結合パートナーの両方がホモ二量体を形成することができず、例えば、ペプチド結合パートナーのアミノ酸配列が突然変異してホモ二量体の形成を排除する又は最小化し、それに特異的なｓｄＡｂが用いられる。
【０１３３】
本明細書で用いられるホモ二量体も凝集体も形成することができないとは、ホモ二量体又は凝集体を形成する傾向が低い又はないことである。本明細書で用いられる低いとは、例えば、混合又は発現又は精製後、４、３、２、１、０．５％若しくはそれ未満の凝集体などの、５％又はそれ未満のことである。
【０１３４】
融合タンパク質中の少量の凝集体又はヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体中に残存するものは一般に本開示のスクリーニング法に最小限の効果を及ぼす。したがって、一実施形態では、融合タンパク質（単数又は複数）及び／又は二重特異性タンパク質複合体（単数又は複数）の精製は方法においては、特に混合ステップ後には用いない。
【０１３５】
一実施形態では、：は、水素結合及び静電気相互作用などの、引力、例えば、ファンデルワールス力に基づく、特に、抗原（ペプチドなどの）に対する抗体特異性に基づく結合相互作用である。
【０１３６】
一実施形態では、：は、クリックケミストリーなどの特定の化学的相互作用から形成される共有結合である。一実施形態では、：は共有結合ではない。一実施形態では、コンジュゲーション／カップリング化学反応は本開示の二重特異性タンパク質複合体を調製するのに用いられない。
【０１３７】
本明細書で用いられる「複合体を形成する」とは、結合相互作用又は化学反応を含む相互作用のことであり、この相互作用は複合体が会合し融合タンパク質が一緒に保持される適切な条件下で融合タンパク質成分Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙが接触するときには十分に特異的で強力である。
【０１３８】
本明細書で用いられる「一緒に保持される」とは、Ｘ：Ｙ結合後、複合体を１つの分子であるかのように取り扱うことができ、多くの場合に単一分子のように振る舞い機能するようにその成分（融合タンパク質）を互いに近傍に保持することである。一実施形態では、保持によって複合体は本明細書で開示される方法において使用するのに適したものになる、すなわち、少なくとも１つの機能スクリーニングにおいて使用するのに適したものになる。
【０１３９】
本明細書で用いられる特異性とは、例えば、相互作用におけるパートナー、例えば、Ｘ：Ｙ若しくはＡと抗原若しくはＢと抗原が互いのみを認識する又は非パートナーと比べて互いに対して有意に高い親和性、例えば、無関係の非パートナータンパク質への結合のバックグランドレベルと比べて、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍の親和性を有する場合のことである。
【０１４０】
本明細書で用いられるＸとＹに関する特異性とは、相互作用にある結合パートナーＸとＹが互いのみを認識する又は非パートナーと比べて互いに対して有意に高い親和性、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍の親和性を有する場合のことである。
【０１４１】
一実施形態では、結合相互作用は可逆的である。一実施形態では、結合相互作用は基本的に非可逆的である。
【０１４２】
本明細書で用いられる基本的に非可逆的であるとは、抗体又は結合断片の遅いオフレート（解離定数）のことである。
【０１４３】
一実施形態では、ＸとＹの間の結合相互作用は低い解離定数を有する。低い解離定数の例には、１〜９×１０−２ｓ−１又はそれよりも少ない、例えば、１〜９×１０−３ｓ−１、１〜９×１０−４ｓ−１、１〜９×１０−５ｓ−１、１〜９×１０−６ｓ−１、１〜９×１０−７ｓ−１が含まれる。特に適した解離定数には、２×１０−４ｓ−１又はそれよりも少ない、例えば、１×１０−５ｓ−１、１×１０−６ｓ−１又は１×１０−７ｓ−１が含まれる。
【０１４４】
理論に縛られたくはないが、低い解離定数（オフレートとも呼ばれる）であれば分子は、二重特異性タンパク質複合体が特に機能スクリーニングアッセイにおいて有用になるほど安定していることができると考えられる。
【０１４５】
一実施形態では、互いに対するＸとＹの親和性は５ｎＭ又はそれよりも強く、例えば、９００ｐＭ又はそれよりも強い、例えば８００、７００、６００、５００、４００又は３００ｐＭなどである。
【０１４６】
親和性は実体のオンレートとオフレートから計算される値である。本明細書で使用される用語「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、ペプチド）の間の非共有結合的相互作用の総計の強さのことである。その結合パートナーに対する分子の親和性は一般に解離定数（ＫＤ）により表すことが可能である。親和性は、表面プラズモン共鳴法、特にＢＩＡコアなどの本明細書に記載される方法を含む、当技術分野で公知の一般的方法により測定することが可能である。
【０１４７】
しかし、複合体を１つにまとめておく能力は親和性のことだけではない。理論に縛られたくはないが、実際に、３つの重大な成分：オンレート、オフレート及び親和性があると本発明者らは仮定している。親和性の計算はオンレートとオフレートに基づいている。したがって、オンレートが低くオフレートが速い場合には、親和性は低くなり、それでは二重特異性タンパク質複合体を１つにまとめておくのに十分ではなくなる。しかし、遅いオンレートは遅いオフレートにより埋め合わせされて、全体的に適切な親和性をもたらすことができると考えられる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、高いオンレートは複合体を１つにまとめておくのに十分である場合がある。
【０１４９】
複合体で用いられる結合パートナー（Ｘ及びＹ）が遅いオンレートを有する場合、成分を混合して複合体を形成させた後に追加の時間が必要になる可能性がある。
【０１５０】
結合パートナー間の親和性が十分に高い場合、二重特異性タンパク質複合体のタンパク質（Ａ及びＢ）の親和性がその標的に弱い結合しかしなくても、二重特異性タンパク質複合体は、その所望の生物学的機能を実施することが可能である場合がある。逆に、タンパク質（Ａ及びＢ）がその標的に強く結合することができる場合、結合パートナー（Ｘ及びＹ）の互いに対する親和性がさらに低くても同じ生物学的機能を達成することが可能である場合がある。言い換えると、結合パートナー間のさらに高い親和性が標的に対するもっと低い親和性の埋め合わせができる及び逆も同じであるように「三位一体」の関係が存在する。
【０１５１】
一実施形態では、本明細書での方法は、ライブラリーから本開示の融合タンパク質を調製することにより、ナイーブファージライブラリーを含むファージディスプレイライブラリーをスクリーニングするのに用いられる。
【０１５２】
本発明の二重特異性タンパク質複合体は、機能スクリーニングを含むいかなる適切な用途においても使用することができる。この新規のフォーマットは、機能に基づいてタンパク質標的及びその標的タンパク質上の最適エピトープを同定するための多重機能スクリーニングに特に有用であり、この標的タンパク質は二重特異性療法が標的とすることができると考えられる。さらに、タンパク質Ａ及びＢが抗体又はその結合断片である場合、二重特異性タンパク質複合体は、二重特異性抗体療法において使用するための最適の可変領域対を同定する多重機能スクリーニングのためにも使用することができる。
【０１５３】
本明細書で用いる「マルチプレックス」は、
少なくとも１つのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体及び少なくとも１つの関連する生物学的コンパレーターを同じ若しくは異なるフォーマットで作製するよう組み合わされた少なくとも２つの成分融合タンパク質（Ａ−Ｘ及びＹ−Ｂ）、又は
場合によって少なくとも１つの関連する生物学的コンパレーターを同じ若しくは異なるフォーマットで有する少なくとも２つのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体
を含む試験のための実体の集団である。
【０１５４】
明らかに有用であるためには、コンパレーターとして用いられる異なるフォーマットは、本開示で用いられる機能ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて試験するのに適していなければならない。一例では、マルチプレックス中のコンパレーターは、Ａ−ＸとＢ−Ｘの一価混合物又はＡ−Ｘ  −  Ｙ−Ａの二価単一特異性複合体である。
【０１５５】
一実施形態では、マルチプレックスは、特に、格子２から１００の第１及び第２の融合タンパク質（Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙ）において混合することから作製される、１から数十万のヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体、例えば、２から１００，０００又は２から１０，０００などの２から５００，０００の前記複合体を含む。一実施形態では、マルチプレックスは、例えば、２から９００、２から８００、２から７００、２から６００、２から５００、２から４００、２から３００、２から２００、２から１００、２から９０、３から８０、４から７０、５から６０、６から５０、７から４０、８から３０、９から２５、１０から２０又は１５などの２から１０００の二重特異性タンパク質複合体を含む。そのような格子の例は図２を参照されたい。
【０１５６】
一実施形態では、このマルチプレックス中のヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質の数はｎ２であり、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれよりも多い。
【０１５７】
マルチプレックスはアレイ、例えば、マイクロタイタープレートの形態でもよく、マイクロプレートのそれぞれのウェルが異なった二重特異性タンパク質複合体を含有することができる。二重特異性タンパク質複合体は固体基材表面、例えば、ビーズに繋ぎ留めることができる、又は二重特異性タンパク質複合体は、例えば、ウェル内で若しくは液滴内で液体（例えば、溶液又は培養液）の形態で懸濁されることもできる。
【０１５８】
一実施形態では、マルチプレックス中のすべての「Ａ」は異なるタンパク質であり、好ましくは標的抗原に結合する抗体若しくはその結合断片であり、すべての「Ｂ」は異なるタンパク質であり、好ましくは標的抗原に結合する抗体若しくはその結合断片である。
【０１５９】
一実施形態では、マルチプレックスは下で考察される格子、例えば、８×８、１６×１６又は１６×２０で提供され、これはそれぞれ６４、２５６又は３２０試料に等しい。
【０１６０】
本明細書で用いられる「格子」とは、タンパク質Ａ（Ａ−Ｘで）などの１つの可変因子はＸ軸（水平軸）などの１つの軸に沿って変え、タンパク質Ｂ（Ｂ−Ｙで）などの別の可変因子はＹ軸（垂直軸）などのもう１つの軸に沿って変える２次元プロット又はアレイのことである。この配置は可変因子の種々の組合せ（並べ替え）を系統的に評価することを支援する。
【０１６１】
一実施形態では、マルチプレックスは９６ウェルプレート上で提供され、分析される試料はその倍数、すなわち、９６、１９２、３８４、等でもよい。
【０１６２】
有利なことに、格子配置は、本開示に従った二重特異性タンパク質複合体の生物学的機能を効率的にスクリーニングするのに特に有利である。図２はそのような格子の例を示しており、４つの第１の融合タンパク質は４つの第２の融合タンパク質と容易に組み合わせて１６の二重特異性タンパク質複合体を産生することが可能である。
【０１６３】
スクリーニング格子の他の変動は当業者には明らかであり、例えば、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）中の第１のタンパク質（Ａ）は一定に保ち、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）中の第２のタンパク質（Ｂ）は変化させる。これは、予め選択された第１のタンパク質との相乗的機能について多数の異なる第２のタンパク質を迅速にスクリーニングするために有用であり得る。
【０１６４】
別の実施形態では、タンパク質Ａは、それぞれの抗体変異体が同じ抗原に特異的であるが可変領域の異なる組合せを有するように、タンパク質Ａの抗体可変領域を変えることにより１つの軸に沿って変化する。タンパク質Ｂは一定に保つことができる又は同じ様式で変化する若しくは抗原特異性がＢタンパク質について変化する（格子を横切る又は下る）ように変化することもできる。
【０１６５】
有利なことに、そのようなスクリーニング格子であれば、二重特異性タンパク質複合体が同じ抗原に特異的であるが可変領域の異なる組合せを有するときは、相乗的機能のわずかな違いの検出が潜在的に可能になる場合がある。
【０１６６】
一実施形態では、本開示に従った「共通の」第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）がそれぞれのウェル内に存在することができる。次に、本開示に従った一定範囲の異なる第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）をそれぞれのウェル内に分注することができる。それに続いて、２つの結合パートナー（Ｘ及びＹ）の特異的な結合相互作用は２つの融合タンパク質を物理的に近づけて二重特異性タンパク質複合体を形成させる。このために、すべて共通の第１の標的抗原（Ａが結合している）に結合するが、二重特異性タンパク質複合体ごとに異なる可能性がある第２の標的抗原（Ｂが結合している）にも結合することができる二重特異性タンパク質複合体を含むマルチプレックスが生じる。
【０１６７】
一実施形態では、Ｂ−Ｙ融合タンパク質は、Ａ−Ｘ中の可変領域と組み合わされた場合、可変領域及び／又はＢが結合している所与の標的抗原のエピトープの最適化を可能にするために、同じ標的抗原に対して異なる可変領域を含む。
【０１６８】
本明細書で用いられる「共通の」第１融合タンパク質とは、そのＡ又はＢ成分が同じタンパク質又はエピトープに結合する、特にＡ又はＢ成分が共通の融合タンパク質において完全な同一性を有する融合タンパク質のことであり、すなわち、共通の第１融合タンパク質は常に同じ可変領域配列を含む。
【０１６９】
当業者であれば、マルチプレックス中のそれぞれの位置の二重特異性タンパク質複合体の所望の特異性を容易に制御することが可能であるように、上記の異なる変動も認識している。これにより、そのようなマルチプレックスを機能アッセイにおいて使用すると二重特異的タンパク質複合体の異なる組合せの効率的スクリーニングが可能になる。一実施形態では、要因計画を用いて格子で用いられる可変因子を定義する。
【０１７０】
一実施形態では、本開示の方法はハイスループット分析に貢献する。
【０１７１】
一実施形態では、複数の二重特異性タンパク質複合体は平行して又は基本的の同時に試験される。
【０１７２】
本明細書で用いられる同時にとは、試料／分子／複合体が同じ分析で、例えば、同じ「ラン」で分析されることである。一般に所与の試料ランに用いられる試薬は同じバッチ、濃度、細胞源、等になり、したがって、同じ特性を有するので、これは有利になれる。さらに、温度及び湿度などの分析を実施する環境条件は類似する可能性がある。
【０１７３】
一実施形態では、同時にとは、シグナル出力が基本的に同時刻に機器により分析される共存分析のことである。このシグナルは得られた結果を解釈するのにデコンボリューションが必要になる場合がある。
【０１７４】
有利なことに、複数の二重特異性タンパク質複合体を試験すれば、多数の二重特異性タンパク質複合体のより効率的なスクリーニング及び新たな興味深い関係の同定が可能になる。
【０１７５】
一実施形態では、複数の二重特異性タンパク質複合体は、上記のマルチプレックスを使用し同じものを１つ又は複数の機能アッセイに供することにより試験する。したがって、本発明は、式Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的生物学的機能を検出するための方法であって、
Ｘ：Ｙはヘテロ二量体繋であり、
：はＸとＹの間の結合相互作用であり、
前記方法は、
Ａ及びＢはそれぞれＸ及びＹとの融合タンパク質の形態の二重特異性のタンパク質成分であり、
（ｉ）少なくとも１つのヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体を含むマルチプレックスの一部又はすべてについて機能アッセイにおいて活性を試験するステップと、
（ｉｉ）機能アッセイからの読み出し情報（単数又は複数）を解析して、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体における相乗的生物学的機能を同定する又は検出するステップと
を含み、
Ｙは抗原でありＸはＹに特異的である抗体若しくはその結合断片である、又はＸは抗原でありＹはＸに特異的である抗体若しくはその結合断片である、
上記方法を提供する。
【０１７６】
本明細書で使用される用語「生物学的機能」とは、試験されている生物学的実体にとっては天然の又は目的とする活性、例えば、細胞、タンパク質若しくは類似のものの天然の活性のことである。理想的には、生物学的機能の存在は、Ｂ細胞若しくはＴ細胞などの生細胞などの哺乳動物細胞、又は組織をｅｘ  ｖｉｖｏで用いるアッセイを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能アッセイを使用して試験することが可能である。本明細書で用いられる天然の機能には、がんなどの疾患に関連する機能などの異常な機能も含まれる。
【０１７７】
本明細書で用いられる関連する「生物学的コンパレーター」とは、ある変化又は新規の活性若しくは機能が存在するかどうかを確証するために二重特異性タンパク質複合体について用いられるのと同じアッセイにおいて活性を評価するのに適した実体のことである。Ａ−Ｘ：Ｙ−Ｂに適したコンパレーターには、天然の形態の又は二重特異性体と同じフォーマットで示される精製されたタンパク質（組換えタンパク質を含む）、例えば、ＡとＢがＡ−Ｘ：Ｙ−Ａ若しくはＢ−Ｘ：Ｙ−Ｂなどの同じ実体、すなわち二価単一特異性複合体である場合が含まれることがある。代わりに、複合体化されていない形態の融合タンパク質Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙは、コンパレーターとして単独で又はＡ−ＸとＢ−Ｘを一緒に若しくはＡ−ＹとＢ−Ｙを一緒になどの複合体化されていない混合物として用いることができる。代わりに、異なるフォーマットの複数のコンパレーター（特に本明細書に記載される）を用いることができる。当業者であれば、共通の一般的知識又は文献に見出される情報に基づいて適切な対照／コンパレーターを同定し含むことができる。
【０１７８】
本明細書で使用される用語「相乗的機能」又は「相乗的生物学的機能」とは、
・二重特異性体が用いられるまでは個々の融合タンパク質成分を用いても観測されない（二重特異性フォーマット中には存在しない前記抗原に対する抗体の組合せを用いて観察される活性を含むことがあるが、特に、２つの結合ドメインが二重特異性フォーマットにおいて連結されているときにのみ観察される活性のことである）
生物活性若しくは生物活性のレベル又は生物学的機能若しくは生物活性に対する効果、又は
・本開示の二重特異性タンパク質複合体の第１と第２のタンパク質が個別に用いられるときに観察される活性と比べて高い若しくは低い活性、例えば、二重特異性形態でしか観察されない活性
のことである。
【０１７９】
したがって、「相乗的」は新規の生物学的機能又は新規の活性を含む。本明細書で用いられる相乗的機能は一般には、単純なターゲティングは含まない、すなわち、結合のみに基づくが、一般に結合後の一部の阻害、活性化、シグナル伝達又は類似のものを含む。
【０１８０】
本明細書で用いられる新規の生物学的機能又は新規の活性とは、２つ若しくはそれよりも多い相乗的実体（タンパク質Ａ及びタンパク質Ｂ）が１つにまとめられる（二重特異性体として又は他の方法で）まで明らかではない若しくは存在しない生物学的機能若しくは活性又はこれまで同定されていない機能のことである。
【０１８１】
本明細書で用いられるより高いとは、ゼロからの増加を含む活性の増加、例えば、個々の複合体化されていない二重特異性成分（単数又は複数）が関連する機能アッセイにおいて活性がない二重特異性体におけるある活性のことであり、本明細書では、新たな活性又は新規の生物学的機能とも呼ばれる。本明細書で用いられるより高いには、個々の複合体化されていない二重特異性成分（単独で試験される又は連結されていることと組み合わせて）と比べて関連する機能アッセイにおいて二重特異性体の相加的機能よりも大きい、例えば、関連する活性において１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００％又はそれよりも多いことも含む。
【０１８２】
一実施形態では、一つに複合体化されていないタンパク質は二重特異性体と同じ活性を有し、この活性又は機能はこれまで未知であった。これも本明細書の文脈においては新規の相乗的機能である。
【０１８３】
一実施形態では、相乗的機能はより高い機能である。
【０１８４】
一実施形態では、相乗的機能はより低い機能である。
【０１８５】
本明細書で用いられるより低い機能とは、関連する機能アッセイにおける二重特異性体が、関連する機能アッセイにおいて活性を有する個々の複合体化されていない二重特異性成分（単数又は複数）と比べてほとんど活性がないか全くないことを言い、本明細書では、個々のタンパク質として分析される又は同じ条件下でタンパク質の混合物として分析される新たな活性又は新規の生物学的機能とも呼ばれ（天然のタンパク質、すなわち、融合タンパク質には存在しないし、前記タンパク質の活性ドメイン若しくは断片を含むｉｎ  ｖｉｖｏで存在する複合体以外の他のいかなる複合体の一部でもない組換え単離タンパク質などの）、例えば、関連する活性の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００％又はそれよりも多い減少のことである。活性の１００％よりも多い減少とは、異なる方向でのプラスの活性の増加のことであり、例えば、実体がアゴニストである場合、１００％を超える活性の減少は実体をアンタゴニストにすることができ逆もまた同じである。
【０１８６】
一実施形態では、二重特異性複合体の活性はタンパク質Ａとタンパク質Ｂの既知の機能の合計よりも低い。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、本開示の二重特異性タンパク質複合体は単に相加的生物学的機能を有する。本明細書で用いられる相加的生物学的機能とは、同じ条件下で試験された場合、成分Ａ及びＢ個別のそれぞれの合計と同じである機能のことである。相加的機能は、活性又は機能がこれまで未知であった又は同定されていなかった場合には新規の機能になることができる。
【０１８８】
スクリーニングは、同定される所望の機能に応じて、当技術分野では公知のいかなる適切なアッセイでも使用して実施される。
【０１８９】
一実施形態では、本開示の方法において用いられる機能アッセイはｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏアッセイである。
【０１９０】
本明細書で使用される「機能アッセイ」は、アッセイ条件に曝される二重特異性タンパク質複合体、抗体複合体又は抗体の混合物の１つ又は複数の所望の特性又は活性を決定するために使用することが可能なアッセイである。適切な機能アッセイは、結合アッセイ、アポトーシスアッセイ、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ、細胞成長又は増殖の阻害（細胞静止効果）アッセイ、細胞殺傷（細胞傷害効果）アッセイ、細胞シグナル伝達アッセイ、サイトカイン産生アッセイ、抗体産生及びアイソタイプスイッチ、細胞分化アッセイ、コロニー形成アッセイ、走化性アッセイ、細胞接着アッセイ、細胞遊走アッセイ、細胞周期アッセイ、代謝アッセイ（全細胞及びオルガネラ機能）、標的細胞への病原体の結合の阻害を測定するためのアッセイ、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の分泌又は他の分泌された分子を測定するアッセイ、静菌についてのアッセイ、殺菌力、ウイルスの中和、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、標識化法及び同類のものを含む抗体が結合している部位への免疫系の成分の引力を測定するアッセイでもよい。
【０１９１】
一実施形態では、マウス腫瘍モデル、自己免疫疾患のモデル、ウイルス感染若しくは細菌感染の齧歯類又は霊長類モデル、及び同類のものを含む動物モデルなどのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いることができる。
【０１９２】
当業者であれば調査している標的／タンパク質に基づいて適切な機能アッセイを選択することが十分にできる。しかし、複合体は、新たな機能性を同定する試みに関連していると考えられるアッセイを前選択せずに「標準」アッセイのパネルを受けさせることができる。
【０１９３】
二重特異性抗体複合体の文脈では、本開示に従った二重特異性抗体複合体の効力は、当業者に一般的に知られている方法によってそのようなモデルにおいて個々の抗体又は抗体（又は断片）の混合物と比較することが可能である。
【０１９４】
例えば、二重特異性抗体複合体は、抗原に結合する以外の特性を含む生物学的機能である、増殖を阻害する、細胞の生存能若しくは代謝活性に影響を及ぼす（例えば、アラマーブルーなどの染色を用いて、又は細胞により発現されるルシフェラーゼに起因する発光をモニターすることにより）、又はがん細胞のアポトーシスを引き起こす能力について試験することができる。
【０１９５】
対象の特定の疾患に密接な関係のある機能アッセイを選択することによって、本開示の方法により既知の又は未知の標的分子に結合する潜在的な治療抗体を同定することが可能になる。したがって、本開示の方法を使用して新たな標的分子を同定する及び／又は潜在的な治療抗体を直接同定することが可能になる。有利なことに、本方法はいかなる特定のアッセイ（単数又は複数）にも限定されず、要件に応じて最も適切な機能アッセイを選択する完全な柔軟性を使用者に提供する。
【０１９６】
所望の生物学的機能を求めて二重特異性抗体複合体をスクリーニングする場合、種々の戦略を用いることができる。例えば、抗体を含有する培地を生物活性について直接スクリーニングすることが可能である。代わりに、生物活性についてのスクリーニングに先立って抗体を被覆されたビーズに又はマイクロタイタープレートに結合させることが可能である。代わりに、融合タンパク質をニッケル捕捉精製ステップにおいてＨｉｓタグを介して精製することができる。そのような戦略により抗体の局所的濃度を増加させ、機能アッセイからさらに明確な結果を得ることができる。
【０１９７】
機能アッセイは、結果の信頼性を高めるために特定の二重特異性抗体複合体の異なる試料を用いて又は用いずに必要に応じて何回か繰り返すことができる。当業者には公知の種々の統計検定を用いて統計的に有意な結果を同定し、このようにして、生物学的機能を有する二重特異性抗体複合体を同定することが可能である。
【０１９８】
スクリーニングのための機能アッセイを確立すると、当業者であれば、それを超えると同定された活性が「ヒット」だと見なされる適切な閾値を設定することが可能である。１つよりも多い機能アッセイが使用されるところでは、管理しやすいヒット率を確立するためにアッセイごとの閾値を適切なレベルで設定することができる。一例では、ヒット率は３〜５％でもよい。一例では、Ｂ細胞機能を阻害する抗原の対を探索する際に設定される基準は、Ｂ細胞活性化アッセイにおいて少なくとも２つのリン酸読み出しの少なくとも３０％阻害であってよい。
【０１９９】
本発明の二重特異性タンパク質複合体では、以下のタンパク質及びペプチド成分を使用することができる。
【０２００】
一実施形態では、結合対の第１の結合パートナーＸと第２の結合パートナーＹのうちの少なくとも１つは、独立してペプチド及びタンパク質から選択され、例えば、第１の結合パートナー又は第２の結合パートナーはペプチドである。
【０２０１】
適切なペプチドには、ＧＣＮ４、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ（ヒト及びマウスＦｏｓはそれぞれＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ０１１００及びＰ０１１０１を有し、ヒト及びマウスＪｕｎはそれぞれＵｎｉｐｒｏｔ番号０５４１２及び０５６２７を有する）、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素のアミノ酸９８から１０６に対応するＨＡタグ、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）、ｃ−ｍｙｃ及びＦＬＡＧを含む群を含む。他のペプチドも本開示において使用するのに適切と予想されており、特に適切なペプチドはタンパク質精製のためのアフィニティータグである。なぜならば、そのようなペプチドはそのそれぞれの結合パートナーに高親和性で結合する傾向があるからである。
【０２０２】
一実施形態では、ペプチドはＥ５Ｂ９ではない。
【０２０３】
本明細書で使用される用語「ペプチド」とは、ペプチド結合により連結されたアミノ酸の短いポリマーのことであり、ペプチドは２〜１００の範囲で、例えば、６から９８、７から９７、８から９６又は５から２５などの５から９９のアミノ酸を含有する。一実施形態では、本開示で用いられるペプチドは５０アミノ酸残基又はそれよりも少ない、例えば、４０、３０、２０、１０又はそれよりも少ないアミノ酸配列である。
【０２０４】
一実施形態では、タンパク質は抗体又は抗体断片である。
【０２０５】
本明細書で使用される用語「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域に位置している少なくとも１つの抗原認識部位（本明細書では結合部位とも呼ばれる）を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド、ペプチド、タンパク質、等などの標的抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子のことである。
【０２０６】
本明細書で使用されるように、用語「抗体」又は「抗体分子」は抗体及びその抗原結合断片が含まれる。
【０２０７】
本明細書で用いられる用語抗体の「抗原結合断片」又は「抗体断片」とは、天然に存在するものであれ人工のものであれ、抗体の断片のことであり、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ｓｃＦｖ、二価、三価若しくは四価抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及び上記のうちのいずれかのエピトープ結合断片を含むがこれらに限定されない（例えば、Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217参照）。
【０２０８】
これらの抗体断片を作製し製造するための方法は当技術分野では周知である（例えば、Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181参照）。本開示で使用するための他の抗体断片には、国際特許出願ＷＯ０５／００３１６９、国際特許出願ＷＯ０５／００３１７０及び国際特許出願ＷＯ０５／００３１７１に記載されるＦａｂ及びＦａｂ’断片が含まれる。多価抗体は複数の特異性体、例えば、二重特異性体を含んでいてもよく又は単一特異性であってもよい（例えば、ＷＯ９２／２２８５３、ＷＯ０５／１１３６０５、ＷＯ２００９／０４０５６２、及びＷＯ２０１０／０３５０１２参照）。
【０２０９】
本明細書で用いられる「抗原結合断片」とは、その断片をペプチド又は抗原に対して特異的であると特徴付けるのに十分な親和性で標的ペプチド又は抗原に結合することができる、例えば、抗体の又は別の分子の断片のことである。
【０２１０】
本明細書で使用される用語「Ｆａｂ断片」とは、軽鎖（ＣＬ）のＶＬ（可変軽）ドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片並びに重鎖のＶＨ（可変重）ドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片のことである。一例では、Ｆａｂ断片の重鎖配列はＣＨ１の鎖間システインで「終わる」。一実施形態では、Ａ−Ｘ及び／又はＢ−Ｙなどの本開示の融合タンパク質で用いられるＦａｂ断片は一価である。
【０２１１】
本明細書で用いられるＦａｂ’断片とは、ヒンジ領域のすべて又は一部をさらに含むＦａｂ断片のことである。一実施形態では、Ａ−Ｘ及び／又はＢ−Ｙなどの本開示の融合タンパク質で用いられるＦａｂ’断片は一価である。
【０２１２】
本明細書で使用される用語「単鎖Ｆｖ」又は略記して「ｓｃＦｖ」とは、（例えば、ペプチドリンカーにより）連結されたＶＨとＶＬ抗体ドメインを含んだかたちで単一ポリペプチド鎖を形成する抗体断片のことである。重及び軽鎖の定常領域はこのフォーマットでは取り除かれている。本明細書で用いられる単鎖Ｆｖには、そのジスルフィド安定化バージョンが含まれ、これはペプチドリンカーに加えてジスルフィド結合が可変領域間に存在する。
【０２１３】
ジスルフィド安定化ｓｃＦｖは、可変領域が分離し再び一体となることに関係する動力学的に呼吸する一部の可変領域の傾向を取り除くことができる。
【０２１４】
本明細書で使用される用語「ｓｄＡｂ」又は「単一ドメイン抗体（単数又は複数）」とは、単一の抗原結合ドメインを含む分子のことである。この分子は人工的に作製してもよいし天然に存在しているものでもよく、ＶＨのみ、ＶＬのみ、ラクダ科ＶＨＨ、ヒトドメイン抗体、ＩｇＮＡＲなどのサメ由来抗体及びアドネクチン、リポカリン、クニッツドメインベースのバインダー、アビマー、ノッチン、フィノマー、アトリマー、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）ベースのバインダー、ダーピン、アフィボディ、アフィリン、アルマジロリピートタンパク質を含むがこれらに限定されない他の非抗体単一ドメイン結合フォーマットを含むがこれらに限定されない。
【０２１５】
抗体結合断片及び／又は二重特異性抗体複合体はＦｃ領域を含まない。本明細書で用いられる「Ｆｃ領域を含まない」とは、非存在であるＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４などのもっと低い定常ドメインのことである。しかし、ＣＨ１、ＣＫａｐｐａ／ＣＬａｍｂｄａなどの定常ドメインは存在する場合がある。
【０２１６】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は、単一特異性抗体又は抗体断片、特に、一価Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｓｄＡｂ又は類似のものである。
【０２１７】
一実施形態では、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は、単一特異性抗体又は抗体断片、特に、一価Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ又は類似のものである。
【０２１８】
本明細書で用いられる「単一特異性」とは、１つの標的抗原のみに結合する能力のことである。
【０２１９】
本明細書で用いられる「一価」とは、単一の結合部位を有し、したがって、標的抗原に１回のみ結合するだけである抗体又は抗体断片のことである。
【０２２０】
本明細書で使用される「多価」とは、同じ等しい特異性を有する２つ又はそれよりも多いエピトープ、例えば、ウイルス粒子の表面の反復同一単位に結合することができる少なくとも２つの結合部位を有する抗体又はその断片のことである。
【０２２１】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価である、すなわち、２つ又はそれよりも多い結合ドメインを有する。
【０２２２】
一実施形態では、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価である、すなわち、２つ又はそれよりも多い結合ドメインを有する。
【０２２３】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は一価であり、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は一価である。
【０２２４】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は一価であり、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価である。
【０２２５】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価であり、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は一価である。
【０２２６】
一実施形態では、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価であり、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）で用いられる抗体又は抗体断片は多価である。
【０２２７】
一実施形態では、Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙは、１つは抗原ＣＤ３３に特異的であり１つは抗原ＣＤ３に特異的である２つのｓｃＦｖ又は代わりにこれら２つの抗原に特異的な二重特異性複合体フォーマットを含む融合タンパク質ではない。
【０２２８】
一実施形態では、Ａ−Ｘ又はＢ−Ｙは、ペプチドＥ５Ｂ９に連結されたＣＤ３に特異的なｓｃＦｖ（又は代わりに別の抗体フォーマット）を含む融合タンパク質ではない。
【０２２９】
本明細書で用いられる「結合ドメイン又は部位」は、抗体のうち抗原／エピトープに接触しそれとの結合相互作用に関与する部分である。一実施形態では、結合ドメインは少なくとも１つの可変ドメイン又はその誘導体、例えば、可変ドメイン又はその誘導体の同族対などの可変ドメイン又はその誘導体の対を含有する。
【０２３０】
一実施形態では、可変ドメインは３つのＣＤＲ、特に、ＶＨ、ＶＬ又はｓｄＡｂなどの抗体ドメインを含む。一実施形態では、結合ドメインは２つの可変ドメイン及び６つのＣＤＲ及びフレームワークを含み、合わせてこれらのエレメントは、抗原／エピトープとの抗体又は結合断片の結合相互作用の特異性に寄与する。
【０２３１】
本明細書で用いられる「同族対」とは、前もって形成されたカップルとして宿主から単離される重軽鎖対のことである。この定義は、宿主由来の初めの対合が保持されていないライブラリーから単離される可変ドメインを含まない。同族対は有利である可能性がある。なぜならば、同族対は宿主において成熟された親和性である場合が多く、したがって、その対が特異的である抗原に対して高い親和性を有する可能性があるからである。
【０２３２】
本明細書で用いられる「天然に存在するドメインの誘導体」は、例えば、望ましくない特性を取り除くことなどにより、ドメインの特性を最適化するために天然に存在する配列中の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は５つよりも多いアミノ酸が置き換えられている又は欠失しているが、そのドメインの特徴的な特色（単数又は複数）は保持されていることを指すことを意図している。改変の例は、グリコシル化部位又は溶媒曝露リシンを取り除く改変である。これらの改変は、関連するアミノ酸残基を保存的アミノ酸置換で置き換えることにより達成することが可能である。
【０２３３】
一実施形態では、本開示の二重特異性抗体複合体又はその抗体／断片成分は処理されて、標的抗原（単数又は複数）に対する改善された親和性を提供する。そのような変異体は、ＣＤＲを突然変異する（Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995）、鎖シャフリング（Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の変異誘発菌種の使用（Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996）、ＤＮＡシャフリング（Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997）、ファージディスプレイ（Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996）及び性的ＰＣＲ（Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998）を含むいくつかの親和性成熟プロトコールにより得ることが可能である。Vaughanら（上記）は親和性成熟のこれらの方法を考察している。
【０２３４】
一実施形態では、第１の抗体又は抗体断片（Ａ）は第１の抗原に特異的であり、第２の抗体又は抗体断片（Ｂ）は第２の抗原に特異的であり、第１と第２の抗原は異なっている。有利なことに、二重特異性抗体複合体は２つの異なる抗原に対して特異的であることができる。これは、それぞれ異なる実体上に位置している２つの異なる抗原へ抗体複合体が結合し、それによって２つの実体を物理的に互いにすぐ近傍に近づける可能性を表す。
【０２３５】
代わりに、第１の抗体又は抗体断片（Ａ）は第１のエピトープに対して特異的であることができ、第２の抗体又は抗体断片（Ｂ）は第２のエピトープに対して特異的であることができ、第１と第２のエピトープは両方とも同じ抗原上にある。これは、抗原と二重特異性抗体複合体の間の複数の相互作用のせいで抗原に対する二重特異性抗体複合体の結合活性を大いに増強することが可能である。
【０２３６】
一実施形態では、第１（Ａ）又は第２（Ｂ）抗体断片は、断片抗原結合（Ｆａｂ）、Ｆａｂ’、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）及びＶＨＨなどの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）からなる群から選択される。
【０２３７】
便宜上、本開示の二重特異性タンパク質複合体は本明細書ではＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂと呼ばれる。しかし、この命名法は、融合タンパク質Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙがどのように設計されるのかを限定することを意図してはいない。なぜならば、本発明者らの実験は結合パートナーＸとＹをその方法に不利な影響を与えることなく逆にすることが可能であること、すなわち、Ａ−Ｙ及びＢ−Ｘを示しているからである。したがって、Ａ及びＢ並びにＸ及びＹは本技術の説明を支援するために言及される名目ラベルである。
【０２３８】
本明細書で用いられる「付加されている（attached）」とは、例えば、その例が下で考察されるペプチドリンカーなどのリンカーを介して直接的に又は間接的に連結している又は結合していることである。直接的に連結しているには、一つに融合している（例えば、ペプチド結合）又は化学的にコンジュゲートしているが含まれる。
【０２３９】
本明細書で用いられる「結合パートナー」とは、結合対の１つの成分部分のことである。
【０２４０】
一実施形態では、結合パートナーの親和性は高く、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００ｐＭ又はそれよりも強いなどの５ｎＭ又はそれよりも強い。
【０２４１】
本明細書で用いられる「結合対」とは、互いに特異的に結合する二つの結合パートナーのことである。結合対の例には、ペプチドとそれに特異的な抗体若しくは結合断片、又は酵素とリガンド、又は酵素とその酵素の阻害剤が含まれる。
【０２４２】
一実施形態では、Ｘはリンカー（ＡＳＧＧＧＧ配列番号７１又はＡＳＧＧＧＧＳＧ配列番号７２又はＡＳＧＧＧ配列番号７３又はＡＡＡＳＧＧＧ配列番号７４などの）又は当技術分野で公知の若しくは本明細書の下で考察されている任意の他の適切なリンカーを介して、抗体又は断片（タンパク質Ａ）の重鎖のＣ末端に付加されており、Ｙはリンカー（ＡＳＧＧＧＧ配列番号７１又はＡＳＧＧＧＧＳＧ配列番号７２又はＡＳＧＧＧ配列番号７３又はＡＡＡＳＧＧＧ配列番号７４などの）を介して、抗体又は断片（タンパク質Ｂ）の重鎖のＣ末端に付加されている。
【０２４３】
適切な結合対（Ｘ又はＹ）の例はＧＣＮ４（配列番号１又はＨＩＳタグを欠く、配列番号１のアミノ酸１〜３８）、その変異体、誘導体若しくは断片（例えば、配列番号７５〜９７により示される配列のうちのいずれか）、及びＧＣＮ４に対して特異的なｓｃＦｖである５２ＳＲ４（配列番号３又はＨＩＳタグを欠く、配列番号３のアミノ酸１〜２４３）又はその変異体を含むことができる。
【０２４４】
一実施形態では、第１の結合パートナー（通常はＸ）はＧＣＮ４（例えば、配列番号１に示されている）、又はその断片若しくは誘導体若しくは変異体（例えば、Ｈｉｓタグなし又は配列番号７５〜９７により示される配列のうちのいずれか１つで示される）であり、第２の結合パートナー（通常はＹ）はＧＣＮ４に対して特異的であるｓｃＦｖ若しくはｓｄＡｂ（例えば、配列番号３、９８又は９９に示される）又はその変異体若しくは誘導体若しくは断片である。
【０２４５】
一実施形態では、第１の結合パートナー（通常はＸ）はＧＣＮ４に対して特異的であるｓｃＦｖ若しくはｓｄＡｂ（例えば、配列番号３、に示される）又はその変異体若しくは誘導体若しくは断片であり、第２の結合パートナー（通常はＹ）はＧＣＮ４（例えば、配列番号１に示されている）、又はその断片若しくは変異体若しくは誘導体（例えば、配列番号７５〜９７により示される配列のうちのいずれか）である。
【０２４６】
ＧＣＮ４変異体には、配列番号１に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％又は９８％、又は９９％同一性のアミノ酸配列が含まれる。ＧＣＮ４変異体には、ヌクレオチド配列配列番号２によりコードされる配列に、又は厳密な条件下で配列番号２にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一性を有するアミノ酸配列も含まれる。
【０２４７】
ＧＣＮ４断片は配列番号１のアミノ酸配列よりも短いＧＣＮ４のアミノ酸配列を含む。
【０２４８】
ＧＣＮ４誘導体とはＮ末端で又はＣ末端で、配列番号１のアミノ酸配列よりも長いＧＣＮ４のアミノ酸配列のことである。
【０２４９】
ＧＣＮ４に特異的な適切なｓｃＦｖは５２ＳＲ４（配列番号３）又はその変異体（配列番号９８又は９９）である。５２ＳＲ４の変異体には配列番号３に少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列が含まれる。５２ＳＲ４の変異体には、ヌクレオチド配列配列番号４によりコードされる配列に、又は厳密な条件下で配列番号４にハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされる配列に少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列も含まれる。
【０２５０】
本発明者らは、単鎖抗体５２ＳＲ４及びペプチドＧＣＮ４は本開示の二重特異性タンパク質複合体において使用するのに適した結合対であることを見出していた。
【０２５１】
代わりに、いかなる適切な抗体／断片及び抗原（ペプチドなどの）でもＸ及びＹとして用いることができる。好ましくは、そのようなＸとＹの対からは、Ａ−ＸとＹ−Ｂが１対１のモル比で組み合わされると７５％よりも多くのヘテロ二量体が得られる。
【０２５２】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）及び第２の結合パートナー（Ｙ）はタンパク質である。
【０２５３】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）は酵素若しくはその活性断片であり第２の結合パートナー（Ｙ）はリガンドである又はその逆もまた同じである。
【０２５４】
一実施形態では、第１の結合パートナー（Ｘ）は酵素若しくはその活性断片であり第２の結合パートナー（Ｙ）はその酵素の阻害剤である又はその逆もまた同じである。
【０２５５】
本明細書で用いられる「活性断片」とは、アミノ酸断片のことであり、これは実体では全アミノ酸配列よりも少なく、基本的に同じ生物活性又は関連する生物活性、例えば、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％などの５０％を超える活性を保持している。
【０２５６】
別の実施形態では、第１の結合パートナーＸはグルタチオン（ＧＳＨ）であり第２の結合パートナーＹはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である又はその逆もまた同じである。
【０２５７】
別の実施形態では、ＸはＦｏｓでありＹはＪｕｎである又はその逆もまた同じである。
【０２５８】
別の実施形態では、ＸはＨｉｓでありＹは抗Ｈｉｓである又はその逆もまた同じである。
【０２５９】
別の実施形態では、結合対はカルモジュリン結合ペプチドでありＹはカルモジュリンである又はその逆もまた同じである。
【０２６０】
別の実施形態では、Ｘはマルトース結合タンパク質でありＹは抗マルトース結合タンパク質若しくはその断片である又はその逆もまた同じである。
【０２６１】
他の酵素−リガンド組合せも結合パートナーにおいて使用するために想定している。タンパク質精製のための当技術分野で公知の親和性タグも適切である。なぜならば、これらのタグはそのそれぞれの結合パートナーに高親和性で結合する傾向があるからである。
【０２６２】
「同一性」は、本明細書で使用されるように、整列させた配列中のいかなる特定の位置においてもアミノ酸残基が配列間で同一であることを示している。「類似性」は、本明細書で使用されるように、整列させた配列中のいかなる特定の位置においてもアミノ酸残基が配列間で類似する種類であることを示している。例えば、ロイシンはイソロイシン又はバリンの代わりに用いることができる。多くの場合互いに代わりに用いることが可能な他のアミノ酸には、
−  フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）
−  リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）
−  アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）
−  アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；並びに
−  システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）
が含まれるがこれらに限定されない。
【０２６３】
同一性及び類似性の程度は容易に計算することが可能である（Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, the BLASTTM software available from NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656）。
【０２６４】
一実施形態では、第１又は第２の結合パートナー（Ｘ又はＹ）はタンパク質又はペプチドである。
【０２６５】
一実施形態では、第１及び第２の融合タンパク質は１つ又は複数のペプチドリンカーを含む。リンカーは融合タンパク質中の種々の位置に取り込むことができる。例えば、リンカーは結合パートナーとそれに付加されているタンパク質の間に導入することができる。
【０２６６】
一実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。
【０２６７】
本明細書で使用される用語「ペプチドリンカー」とは、アミノ酸配列を有するペプチドのことである。一定範囲の適切なペプチドリンカーは当業者には公知であろう。
【０２６８】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体の結合パートナーはペプチドリンカーを介してそのそれぞれのタンパク質に結合されている。ペプチドリンカーの例は配列番号５〜７４（表２、３及び４）に示されている。
【０２６９】
一実施形態では、融合タンパク質は翻訳融合であり、すなわち、融合タンパク質が発現されるもとの遺伝子構築物を含む宿主細胞において発現される融合タンパク質である。
【０２７０】
一実施形態では、融合タンパク質は、場合によってはペプチドリンカーを介してＡの重鎖をＸに及び／又はＢの重鎖をＹに融合させることにより調製される。
【０２７１】
一実施形態では、ペプチドリンカーは５０アミノ酸長又はそれよりも少なく、例えば、２０アミノ酸又はそれよりも少ない。
【０２７２】
一般に、融合タンパク質を組換え的に発現させるほうが効率的であり、したがって、宿主細胞において発現させることが可能な直接ペプチド結合又はペプチドリンカーが有利である可能性がある。
【０２７３】
一実施形態では、リンカーは配列５から７２に示される配列又はＰＰＰから選択される。
【表５】
2019510732.tif 000007
【表６】
2019510732.tif 000008
【０２７４】
（Ｓ）は配列１７から２０では自由選択である。別のリンカーはペプチド配列ＧＳでもよい。
【０２７５】
強固なリンカーの例には、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号６９）、ＰＰＰＰ（配列番号７０）及びＰＰＰが含まれる。
【０２７６】
他のリンカーは表４に示されている。
【表７】
2019510732.tif 000009
【０２７７】
一態様では、本開示の二重特異性タンパク質複合体を産生する方法であって、
（ａ）結合対の第１の結合パートナー（Ｘ）に付加されている第１のタンパク質（Ａ）を含む、第１の融合タンパク質（Ａ−Ｘ）を作製するステップと、
（ｂ）結合対の第２の結合パートナー（Ｙ）に付加されている第２のタンパク質（Ｂ）を含む、第２の融合タンパク質（Ｂ−Ｙ）を作製するステップと、
（ｃ）ステップａ）及びｂ）において調製された第１（Ａ−Ｘ）と第２（Ｂ−Ｙ）の融合タンパク質を一緒に混合するステップと
を含む上記方法が提供される。
【０２７８】
典型的にはステップ（ｃ）におけるＡ−ＸとＢ−Ｙの混合は１対１のモル比である。
【０２７９】
一実施形態では、本開示の複合体中で用いられるそれぞれの融合タンパク質は、発現実験において宿主細胞（単数又は複数）での発現により産生される。
【０２８０】
一態様では、本開示の二重特異性タンパク質複合体を調製する方法であって、
（ａ）結合対の第１の結合パートナー（Ｘ）に付加されている第１のタンパク質（Ａ）を含む、第１の融合タンパク質（本明細書で定義されるＡ−Ｘ）を発現させるステップと、
（ｂ）結合対の第２の結合パートナー（Ｙ）に付加されている第２のタンパク質（Ｂ）を含む、第２の融合タンパク質（本明細書で定義されるＢ−Ｙ）を発現させるステップと
を含み、
融合タンパク質Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙが同じ宿主細胞から又は異なる宿主細胞から発現される
上記方法が提供される。
【０２８１】
本明細書で用いられる異なる宿主細胞とは、同じ種類（同じクローン種でさえ）の細胞を含む、個々の細胞のことである。
【０２８２】
一実施形態では、発現は一過性発現である。一過性発現の使用は、精製に頼らずに二重特異性複合体を生成する能力と組み合わされると極めて有利である。これにより、一過性トランスフェクションは安定なトランスフェクションよりもはるかに簡単であり資源多消費ではないので、二重特異性タンパク質複合体を産生する迅速な方法が得られる。
【０２８３】
一実施形態では、発現は安定な発現である、すなわち、そこでは問題になっている融合タンパク質をコードするＤＮＡは宿主細胞ゲノム内に安定的に組み込まれている。
【０２８４】
一実施形態では、同じ又は異なるポリヌクレオチド配列上の（本明細書で定義される）Ａ−Ｘをコードするポリヌクレオチド及び（本明細書で定義される）Ｂ−Ｙをコードするポリヌクレオチドは機能アッセイの一部として細胞内にトランスフェクトされ、タンパク質が細胞内で発現される及び／又はそこから放出される。特に、ポリヌクレオチドは同じ又は異なるプラスミド上に一過性にトランスフェクトされる。
【０２８５】
Ａ−ＸとＢ−Ｙの混合は、一般的に、ＸとＹが相互作用できる条件で成し遂げられる。一実施形態では、融合タンパク質は、細胞培養条件下で細胞培養培地においてインキュベートされ、例えば、融合タンパク質は３７℃／５％ＣＯ２環境において９０分間インキュベートされる。
【０２８６】
一実施形態では、本開示の融合タンパク質は水性環境で混合され、例えば、１つの融合タンパク質はビーズ又はプレートなどの固体表面に結合させることができ、もう一方の融合タンパク質は水溶液／懸濁液中でそれに対して導入することが可能である。固相であれば過剰な成分及び試薬は容易に洗い流すことができる。一実施形態では、どちらの融合物も固相に付加されておらず、液体／溶液／培養液中で混合しているだけである。したがって、一実施形態では、Ａ−Ｘ及びＢ−Ｙは水性媒体中で遊離のタンパク質として混合している。
【０２８７】
有利なことに、本開示の方法を用いれば、異種対間（すなわち、第１の融合タンパク質［Ａ−Ｘ］と第２の融合タンパク質［Ｂ−Ｙ］の間）で形成され、同種対間（すなわち、２つの第１の融合タンパク質［Ａ−Ｘ］間又は２つの第２の融合タンパク質［Ｂ−Ｙ］間）の相互作用が最小化されている複合体を調製することが可能である。したがって、本方法により、ホモ二量体複合体の混入を最小限にして又はなしで、多数の二重特異性タンパク質複合体を調製することが可能になる。本開示の構築物及び方法の利点は、Ａ−ＸとＢ−Ｙの比がＡ−ＸとＢ−Ｙの特性により制御され、特に、モル比１対１を達成することが可能である点である。この制御の要素は、ある種に先行技術の方法よりも著しい改良点である。
【０２８８】
一実施形態では、本開示の方法は、相乗的活性を有すると同定された一対の可変領域（特に、２対の可変領域）を代替の二重特異性、三重特異性又は多特異性フォーマットに移すさらなるステップを含み、場合によって必要ならば予め前記可変領域をヒト化し、このフォーマットは代替の治療フォーマット及び／又はさらに長い期間（例えば、１週間又はそれよりも長く行われる）のアッセイにおいて試験するのに適している延長された半減期を有するフォーマットである。
【０２８９】
本明細書で使用される「多特異性の」とは、それぞれが異なる特異性でエピトープに結合することができる、例えば、２つの異なる抗原に架橋することができる、少なくとも２つの異なる結合部位を有する抗体又はその断片のことである。多特異性フォーマットは、当技術分野で公知の多特異性フォーマット及びＤＶＤ−Ｉｇ、例えば、国際公開第２００９／０４０５６２号及び国際公開第２０１０／０３５０１２号に開示されているＦａｂＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、等などの本明細書に記載される多特異性フォーマットを含む。
【０２９０】
二重及び多特異性フォーマット（治療フォーマットを含む）の他の例には、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、タンデムｓｃＦｖ、タンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ’Ｆｖ、ＦａｂｄｓＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’−ｓｃＦｖ、ｄｉＦａｂ、ｄｉＦａｂ’、ｓｃダイアボディ、ｓｃダイアボディ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ、ｓｃダイアボディ−ＣＨ３、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、Ｖ−ＩｇＧ、ＩｇＧ−Ｖ、ＤＶＤ−Ｉｇ、及びＤｕｏＢｏｄｙが含まれる。
【０２９１】
本明細書で用いられるダイアボディとは、２つのＦｖ対、すなわち、第１のＦｖのＶＨが第２のＦｖのＶＬに連結され、第１のＦｖのＶＬが第２のＦｖのＶＨに連結されるように２つのＦｖ内リンカーを有するＶＨ／ＶＬと追加のＶＨ／ＶＬ対のことである。
【０２９２】
本明細書で用いられるトリアボディとは、３つのＦｖ対と３つのＦｖ内リンカーを含むダイアボディに類似するフォーマットのことである。
【０２９３】
本明細書で用いられるテトラボディとは、４つのＦｖ対と４つのＦｖ内リンカーを含むダイアボディに類似するフォーマットのことである。
【０２９４】
本明細書で用いられるタンデムｓｃＦｖとは、単一のＦｖ内リンカーが存在するように単一のリンカーを介して互いに連結されている２つのｓｃＦｖ（リンカーを含むそれぞれは通常の様式である）のことである。
【０２９５】
本明細書で用いられるタンデムｓｃＦｖ−Ｆｃとは、それぞれ１つが定常領域断片−ＣＨ２ＣＨ３のＣＨ２ドメインのＮ末端に、例えば、ヒンジを介して付加している２つのタンデムｓｃＦｖのことである。
【０２９６】
本明細書で用いられるＦａｂＦｖとは、可変領域が以下の重鎖のＣＨ１及び軽鎖のＣＬのそれぞれのＣ末端に付加されているＦａｂ断片のことである。フォーマットはそのペグ化バージョンとして提供することができる。
【０２９７】
本明細書で用いられるＦａｂ’ＦｖはＦａｂＦｖに類似しており、Ｆａｂ部分がＦａｂ’で置き換えられている。フォーマットはそのペグ化バージョンとして提供することができる。
【０２９８】
本明細書で用いられるＦａｂｄｓＦｖとは、Ｆｖ内ジスルフィド結合が付加されたＣ末端可変領域を安定化しているＦａｂＦｖのことである。フォーマットはそのペグ化バージョンとして提供することができる。
【０２９９】
本明細書で用いられるＦａｂ−ｓｃＦＶは、ｓｃＦｖが軽又は重鎖のＣ末端に付加されているＦａｂ分子のことである。
【０３００】
本明細書で用いられるＦａｂ’−ｓｃＦＶは、ｓｃＦｖが軽又は重鎖のＣ末端に付加されているＦａｂ’分子のことである。
【０３０１】
本明細書で用いられるＤｉＦａｂとは、重鎖のＣ末端を介して連結されている２つのＦａｂ分子のことである。
【０３０２】
本明細書で用いられるＤｉＦａｂ’とは、そのヒンジ領域において１つ又は複数のジスルフィド結合を介して連結されている２つのＦａｂ’分子のことである。
【０３０３】
本明細書で用いられるように、ｓｃダイアボディは、分子が３つのリンカーを含みそのＶＨとＶＬ末端のそれぞれが追加のＦｖ対の可変領域の１つに連結されている正常なｓｃＦｖを形成するように、Ｆｖ内リンカーを含むダイアボディである。
【０３０４】
本明細書で用いられるｓｃダイアボディ−Ｆｃは、それぞれ１つが定常領域断片−ＣＨ２ＣＨ３のＣＨ２ドメインのＮ末端に、例えば、ヒンジを介して付加されている２つのｓｃダイアボディである。
【０３０５】
本明細書で用いられるＳｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖとは、それぞれのうちの１つが−ＣＨ２ＣＨ３断片の重鎖と軽鎖の両方のＮ末端とＣ末端に付加されている４つのｓｃＦｖのことである。
【０３０６】
本明細書で用いられるｓｃダイアボディ−ＣＨ３とは、例えば、ヒンジを介してＣＨ３ドメインにそれぞれが連結されている２つのｓｃダイアボディ分子のことである。
【０３０７】
本明細書で用いられるＩｇＧ−ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖが重鎖のそれぞれ又は軽鎖のそれぞれのＣ末端にある完全長抗体である。
【０３０８】
本明細書で用いられるｓｃＦｖ−ＩｇＧは、ｓｃＦｖが重鎖のそれぞれ又は軽鎖のそれぞれのＮ末端にある完全長抗体である。
【０３０９】
本明細書で用いられるＶ−ＩｇＧは、可変ドメインが重鎖のそれぞれ又は軽鎖のそれぞれのＮ末端にある完全長抗体である。
【０３１０】
本明細書で用いられるＩｇＧ−Ｖは、可変ドメインが重鎖のそれぞれ又は軽鎖のそれぞれのＣ末端にある完全長抗体である。
【０３１１】
ＤＶＤ−Ｉｇ（デュアルＶドメインＩｇＧとしても知られる）は、それぞれの重鎖及びそれぞれの軽鎖のＮ末端に１つ、４つの付加的可変領域を有する完全長抗体である。
【０３１２】
本明細書で用いられるＤｕｏｂｏｄｙ又は「Ｆａｂ−ａｒｍ交換」は、２つの異なるモノクローナル抗体の定常領域（典型的にはＣＨ３）においてマッチドした相補的な工学的に操作されたアミノ酸変化が、混合するとヘテロ二量体の形成をもたらす二重特異性ＩｇＧ抗体フォーマットである。第１の抗体由来の重／軽鎖対は、残基の工学的操作の結果、第２の抗体の重：軽鎖対と会合するほうを好む。
【０３１３】
存在する場合、本開示の二重特異性抗体複合体又は抗体分子の定常領域ドメインは、存在する場合、複合体又は抗体分子の提唱されている機能、特に、必要になる可能性のあるエフェクター機能を考慮して、選択することができる。例えば、定常領域ドメインはヒトＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭドメインであってよい。特に、抗体分子が治療的使用を意図されており抗体エフェクター機能が必要とされるときは、特に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプのヒトＩｇＧ定常領域ドメインを使用することができる。代わりに、抗体分子が治療目的を意図されており抗体エフェクター機能が必要とされないときは、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを使用することができる。これらの定常領域ドメインの配列変異体も使用できることは認識されるであろう。例えば、Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 1993, 30:105-108に記載されている２４１位のセリンがプロリンに交換されているＩｇＧ４分子を使用することができる。したがって、抗体がＩｇＧ４抗体である実施形態では、抗体は変異Ｓ２４１Ｐを含むことができる。
【０３１４】
抗体は種々の翻訳後修飾を受けることができることも当業者であれば理解するであろう。これらの修飾の種類及び程度は多くの場合、抗体を発現するのに使用される宿主細胞系並びに培養条件に依拠する。そのような修飾には、グリコシル化、メチオニン酸化、ジケトピペラジン形成、アスパラギン酸異性化及びアスパラギン脱アミド化の変動が含まれる場合がある。頻繁な修飾は、カルボキシペプチダーゼの作用によるカルボキシ末端塩基残基（リシン又はアルギニンなどの）の喪失である（Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995に記載されている）。したがって、抗体重鎖のＣ末端リシンは非存在でもよい。
【０３１５】
本開示は、上記の１つ又は複数の二重特異性タンパク質複合体を含む組成物であって、例えば、ホモ二量体複合体の混入を最小限にする又はなしで本開示に従ったヘテロ二量体二重特異性複合体を主に含む上記組成物も提供する。
【０３１６】
一実施形態では、組成中の融合タンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％は二重特異性タンパク質複合体形態である。
【０３１７】
一実施形態では、組成中の融合タンパク質の少なくとも６０％は二重特異性タンパク質複合体形態である。
【０３１８】
一実施形態では、形成された複合体はさらなる精製ステップを必要とせず、したがって、組成物は未精製二重特異性複合体を含む。
【０３１９】
一実施形態では、形成された複合体は１回の精製ステップ、例えば、カラムクロマトグラフィーを必要とする。
【０３２０】
一実施形態では、方法は、例えば、本開示に従った融合タンパク質の発現後及び融合タンパク質を混合する前に、少なくとも１回の精製ステップをさらに含む。
【０３２１】
一態様では、本開示は、本明細書で定義される融合タンパク質、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされた二重特異性タンパク質複合体、融合タンパク質又は前記二重特異性タンパク質複合体を含む組成物、マルチプレックス、アレイ、ライブラリーに関する。
【０３２２】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体は溶液又は懸濁液中にある。
【０３２３】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体は固体基材表面上に固定されている。
【０３２４】
一実施形態では、マルチプレックスはアレイの形態、例えば、９６又は３８４ウェルプレートなどのマイクロプレート中にある。そのようなアレイは、所望の機能性を備えた二重特異性タンパク質複合体を同定するためのスクリーニングアッセイにおいて容易に実行することが可能である。
【０３２５】
別の実施形態では、二重特異性タンパク質複合体はビーズにコンジュゲートされている。
【０３２６】
上で定義される融合タンパク質は、本開示に従った二重特異性タンパク質複合体の成分である。一態様では、本開示は本明細書に記載される融合タンパク質に関する。
【０３２７】
追加の態様では、上で定義される２つ又はそれよりも多い融合タンパク質を含むライブラリーが提供される。
【０３２８】
本明細書で使用される用語「ライブラリー」とは、組み合わせれば本開示に従った少なくとも２つの異なる二重特異性抗体複合体を形成することが可能な、本開示の２つ若しくはそれよりも多い二重特異性抗体複合体又は本開示の複数の融合タンパク質のことである。本明細書全体を通じて記載されるように、用語「ライブラリー」はその最も広い意味で使用され、サブライブラリーも包含することができる。
【０３２９】
有利なことに、ライブラリーは、特定の結合対の第１の結合パートナー（Ｘ）又は第２の結合パートナー（Ｙ）のいずれかが付加されている一定範囲の異なる融合タンパク質を含むことができる。一実施形態では、ライブラリーの一部は、それぞれが結合パートナーＸに連結しているタンパク質／抗体／断片を含み、ライブラリーの残りはそれぞれが結合パートナーＹに連結している同じタンパク質／抗体／断片を含む。したがって、これにより、１つの融合タンパク質に結合対の第１の結合パートナーが付加されておりもう一方の融合タンパク質に結合対の第２の結合パートナーが付加されている限り、任意の２つの融合タンパク質を容易に組み合わせて本開示の二重特異性タンパク質複合体を形成することが可能になる。
【０３３０】
一実施形態では、本発明の二重特異性タンパク質複合体は治療応用に適しており、疾患の処置に新規の治療薬を提供することができる。したがって、追加の態様では、治療において使用するための上記の二重特異性タンパク質複合体が提供される。二重特異性タンパク質複合体は、自己免疫疾患及びがんなどの一定範囲の疾患を処置するのに適している。
【０３３１】
逆に、Ｔリンパ球に対して特異的な１つの抗体又は抗体断片及びがん特異的抗原に対して特異的な別の抗体又は抗体断片を備えた本開示の二重特異性タンパク質複合体を工学的に作製することが可能である。その結果、本開示の二重特異性抗体複合体は、通常のモノクローナル抗体と比べた場合、より高い細胞傷害性潜在力を有することができて有利である。
【０３３２】
本開示の二重特異性タンパク質複合体は、種々の自己免疫疾患において免疫及び自己免疫反応を制御するためにＢ細胞機能を阻害するのにも特に適している。
【０３３３】
したがって、本開示は、本開示の二重特異性タンパク質複合体の投与を含む、患者において疾患を処置する方法にまで及ぶ。
【０３３４】
一態様では、本開示の１つ又は複数の二重特異性タンパク質複合体を含む医薬組成物が提供される。
【０３３５】
一実施形態では、本開示の方法のために入手される又は入手可能な融合タンパク質が提供される。
【０３３６】
一実施形態では、本開示の方法から入手される又は入手可能な二重特異性抗体複合体が提供される。
【０３３７】
一実施形態では、本開示に従った方法により同定される可変領域組合せを含む二重特異性又は多特異性抗体分子が提供される。
【０３３８】
一実施形態では、本開示の方法から得られる融合タンパク質、二重特異性抗体複合体又は二重特異性／多特異性抗体分子を含む医薬組成物などの組成物が提供される。
【０３３９】
薬学的に許容される担体、賦形剤及び／又は希釈剤を含む、種々の異なる成分を組成物に含めることが可能である。組成物は、場合により、本発明の抗体の集団の特徴を変えることができる追加の分子を含み、それによって、例えば、抗体の機能を減少する、安定化する、遅らせる、調節する及び／又は活性化することができる。組成物は、固体又は液体形態でもよく、なかんずく、粉末、錠剤、溶液又はエアロゾルの形態でもよい。
【０３４０】
本開示は、本発明の二重特異性タンパク質複合体を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と組み合わせて含む医薬又は診断組成物も提供する。したがって、処置において使用するための及び病態又は障害の処置用の薬物の製造のための本発明の二重特異性タンパク質複合体の使用が提供される。
【０３４１】
病態又は障害は、例えば、感染症（ウイルス性、細菌性、真菌性及び寄生性）、感染に関連するエンドトキシンショック、関節リウマチなどの関節炎、重症喘息などの喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病（Pilonidal disease）、腹膜炎、乾癬、血管炎、外科的癒着（surgical adhesions）、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫ブドウ膜炎；多発性硬化症、ループス（全身性エリトマトーデスなどの）及びギランバレー症候群などの中枢及び末梢神経系の免疫媒介炎症性疾患；アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維性肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎炎、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫疾患、膵炎、外傷（手術）、移植片対宿主病、移植片拒絶、心筋梗塞並びに粥状動脈硬化などの虚血性疾患を含む心疾患、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、変形性関節炎、歯周炎、低酸症（hypochlorhydia）並びに乳がん、肺がん、胃がん、卵巣がん、肝細胞がん、結腸がん、膵がん、食道がん、頭頸部がん、腎がんなどのがん、特に、腎細胞癌、前立腺がん、肝がん、メラノーマ、肉腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、胎盤性絨毛癌、子宮頸がん、及び甲状腺がん、並びにその転移型からなる群から選択することができる。
【０３４２】
本開示は、本発明の二重特異性タンパク質複合体を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と組み合わせて含む医薬又は診断組成物も提供する。したがって、処置において及び薬物の製造において使用するための本発明の二重特異性タンパク質複合体の使用が提供される。
【０３４３】
組成物は、通常薬学的に許容される担体を含むことになる無菌の医薬組成物の一部として普通、供給されることになる。本発明の医薬組成物は薬学的に許容されるアジュバントをさらに含むことができる。
【０３４４】
本発明は、本発明の抗体分子又は二重特異性抗体複合体を薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体のうちの１つ又は複数と一緒に添加して混合することを含む、医薬又は診断組成物の調製のための工程も提供する。
【０３４５】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される賦形剤」とは、本発明の組成物の所望の特徴を増強する薬学的に許容される製剤担体、溶液又は添加物のことである。賦形剤は当技術分野では周知であり、緩衝剤（例えば、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤及び炭酸水素緩衝剤）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールが含まれる。溶液又は懸濁液はリポソーム又は生分解性マイクロスフェアに被包することが可能である。製剤は、一般に、無菌の製造工程を用いて実質的に無菌の形態で提供されることになる。
【０３４６】
これには、製剤のために使用される緩衝溶媒溶液の濾過による生産及び無菌化、無菌緩衝溶媒溶液中での抗体の無菌懸濁、並びに当業者によく知られている方法による製剤の無菌容器中への分注が含まれることがある。
【０３４７】
薬学的に許容される担体はそれ自体が、組成物を受ける個体にとって有害な抗体の産生を誘導するべきではないし、毒性を持つべきではない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、アミノ酸共重合体及び不活性ウイルス粒子などの大きなゆっくり代謝される巨大分子であってよい。
【０３４８】
薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸、プロピオン酸、マロン酸及び安息香酸などの有機酸の塩を使用することが可能である。
【０３４９】
治療組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体をさらに含有することができる。そのような担体であれば、患者による摂取のために、医薬組成物を、錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ジェル、シロップ、スラリー及び懸濁液として処方することができる。
【０３５０】
本発明の二重特異性タンパク質複合体は溶媒中に分散させて、例えば、溶液又は懸濁液の形態で送達することが可能である。本発明の二重特異性タンパク質複合体は、適切な生理溶液、例えば、生理食塩水、薬学的に許容される溶媒又は緩衝液に懸濁することが可能である。当技術分野で公知の緩衝液は、約４．０から５．０のｐＨを達成するために１ｍｌの水当たり０．０５ｍｇから０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇから９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇから０．２５ｍｇのポリソルベート、０．２５ｍｇから０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇから０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含有することができる。上記のように、懸濁液は、例えば、凍結乾燥した抗体から作ることが可能である。
【０３５１】
薬学的に許容される担体の徹底的な検討はRemington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991)で入手可能である。
【０３５２】
二重特異性抗体複合体（又は本開示の二重特異性／多特異性抗体分子）は医薬又は診断組成物中で唯一の活性成分であってもよく、或いは他の抗体成分、例えば、抗ＴＮＦ、抗ＩＬ−１β、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγ若しくは抗ＬＰＳ抗体、又はキサンチンなどの非抗体成分を含む他の活性成分を伴うことができる。他の適切な活性成分には、トレランスを誘導することができる抗体、例えば、抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４抗体が含まれる。
【０３５３】
追加の実施形態では、本開示に従った抗体、断片又は組成物は、追加の医薬活性剤、例えば、コルチコステロイド（フルチカゾンプロピオン酸エステルなどの）及び／若しくはベータ２アゴニスト（サルブタモール、サルメテロール又はホルモテロールなどの）又は細胞成長及び増殖阻害剤（ラパマイシン、シクロホスファミド（cyclophosphmide）、メトトレキサートなどの）又は代わりにＣＤ２８及び／若しくはＣＤ４０阻害剤と組み合わせて用いられる。一実施形態では、阻害剤は小分子である。別の実施形態では、阻害剤は標的に特異的な抗体である。
【０３５４】
医薬組成物は治療的有効量の本発明の二重特異性抗体複合体（又は本開示の二重特異性／多特異性抗体分子）を適切に含む。
【０３５５】
本明細書で使用される用語「治療的有効量」とは、標的とされた疾患若しくは状態を処置する、寛解する若しくは予防する、又は検出可能な治療若しくは予防効果を示すのに必要な治療剤の量のことである。任意の抗体では、治療的有効量は、最初は細胞培養アッセイにおいて、又は動物モデルにおいて、通常、齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタ若しくは霊長類においてのどちらかで推定することが可能である。動物モデルを使用して適切な濃度範囲及び投与経路を決定することもできる。次に、そのような情報を使用すればヒトにおける有用な用量及び投与のための経路を決定することが可能である。
【０３５６】
ヒト対象についての正確な治療的有効量は、疾病状態の重症度、対象の全般的健康、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与時間及び回数、薬物組合せ（単数又は複数）、反応感受性及び治療に対するトレランス／応答に依拠することになる。この量はルーチンな実験方法により決定することが可能であり、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療的有効量は０．０１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇになる。代わりに、用量は１日当たり１０から１００、２００、３００又は４００ｍｇなどの１日当たり１から５００ｍｇであってよい。医薬組成物は、所定量の本発明の活性剤を含有する単位用量形態で都合よく提示することができる。
【０３５７】
組成物は患者に独立して投与してもよいし、又は他の薬剤、薬物若しくはホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、逐次又は別々に）投与してもよい。
【０３５８】
本発明の抗体分子が投与される用量は、処置される状態の性質、存在する炎症の程度及び抗体分子が予防的に使用されているのか又は既存の状態を処置するために使用されているのかどうかに依拠する。投与回数は抗体分子の半減期及びその効果の持続時間に依拠することになる。抗体分子の半減期が短い（例えば、２から１０時間）場合、１日当たり１又は複数用量を与える必要がある場合もある。代わりに、抗体分子の半減期が長い（例えば、２から１５日）場合、１日当たり１回、１週間当たり１回又は１若しくは２か月ごとに１回でも用量を与えるだけでよい場合もある。
【０３５９】
本開示では、最終製剤のｐＨは抗体又は断片の等電点の値に類似してはいない。なぜならば、製剤のｐＨが７である場合、８〜９又はそれよりも上のｐｌが適切である場合があるからである。理論に縛られたくはないが、これは最終的に最終製剤に改善された安定性をもたらすことができる、例えば、抗体又は断片は溶液のままであると考えられる。
【０３６０】
本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮（transdermal）、経皮（transcutaneous）（例えば、ＷＯ９８／２０７３４参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所的、舌下、膣内又は直腸経路を含むがこれらに限定されないいかなる数の経路によっても投与することができる。皮下噴射器を使用して本発明の医薬組成物を投与することもできる。
【０３６１】
組成物の直接送達は、一般的には、皮下に、腹腔内に、静脈内に若しくは筋肉内に注射により実現される、又は組織の間質腔に送達されることになる。組成物は対象の特定の組織にも投与することが可能である。投薬処置は単回服用予定でも複数回服用予定でもよい。
【０３６２】
生成物が注射又は注入目的である場合、油性又は水性溶媒中の懸濁液、水溶液又は乳化液の形態を帯びることができ、生成物は懸濁剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの調合剤を含有することができる。代わりに、二重特異性タンパク質複合体（又は本開示の二重特異性／多特異性抗体分子）は、適切な無菌液体と一緒に使用する前の復元のために乾燥形態でもよい。消化管を使用する経路により組成物を投与するつもりであれば、組成物は抗体を分解から保護ししかし消化管から吸収された後は二重特異性タンパク質複合体を放出する薬剤を含有する必要があることになる。
【０３６３】
本開示に従った噴霧可能な製剤は、例えば、ホイル包みに充填された単回用量単位（例えば、密封されたプラスチック容器又はバイアル）として提供することができる。それぞれのバイアルは、容積が、例えば、２ｍｌの溶媒／溶液緩衝液中に単位用量を含有する。
【０３６４】
本明細書で使用される用語「変異体」とは、対応する野生型ペプチド又はタンパク質のアミノ酸又はヌクレオチド配列と比べた場合、少なくとも１つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列変化を含有するペプチド又はタンパク質のことである。変異体は対応する野生型ペプチド又はタンパク質に少なくとも８０％、又は８５％、又は９０％、又は９５％、又は９８％、又は９９％配列同一性を含むことができる。しかし、変異体は、対応する野生型ペプチド又はタンパク質に実質的に類似する機能を示すのであれば、８０％未満の配列同一性を含むことが可能である。
【０３６５】
抗原には、Ｔ細胞若しくはＢ細胞シグナル伝達受容体などの細胞表面受容体、共刺激分子、チェックポイント阻害剤、ナチュラルキラー細胞受容体、免疫グロブリン受容体、ＴＮＦＲファミリー受容体、Ｂ７ファミリー受容体、接着分子、インテグリン、サイトカイン／ケモカイン受容体、ＧＰＣＲ、成長因子受容体、キナーゼ受容体、組織特異的抗原、がん抗原、病原体認識受容体、補体受容体、ホルモン受容体又はサイトカイン、ケモカイン、ロイコトリエン、成長因子、ホルモン若しくは酵素などの可溶性分子又はそのイオンチャネル、エピトープ、断片及び翻訳後修飾形態が含まれる。
【０３６６】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体は１つ又は２つの細胞表面受容体特異性を含む。
【０３６７】
一実施形態では、二重特異性タンパク質複合体は１つ又は２つのサイトカイン又はケモカイン特異性を含む。
【０３６８】
本開示に従った方法により同定される対になった標的に対する抗体又は断片は、実験用試薬、アッセイ用試薬又は治療薬として使用するのに適したいかなるフォーマットにも組み込むことができる。
【０３６９】
したがって、一態様では、本開示は、任意のフォーマットの対としての抗体断片又はその組合せの使用に及び、その例は上に与えられている。
【０３７０】
本開示は、特定の抗原特異性を備えた前記新規のフォーマットを含む医薬組成物などの組成物までも及ぶ。
【０３７１】
追加の態様では、本開示は処置におけるフォーマット及び組成物の使用を含む。
【０３７２】
一実施形態では、本開示の二重特異性タンパク質複合体を使用すれば、対象の抗原（単数又は複数）の活性を機能的に変えることができる。例えば、二重特異性タンパク質複合体は前記抗原（単数又は複数）の活性を直接的に又は間接的に中和する、拮抗する又は刺激することができる。
【０３７３】
本開示は、例えば、
ａ）結合対の第１の結合パートナー（Ｘ）に付加されている第１の抗体又は抗体断片（Ａ）を含む１つ又は複数の融合タンパク質（本明細書で定義されるＡ−Ｘ）、及び
ｂ）結合対の第２の結合パートナー（Ｙ）に付加されている第２の抗体又は抗体断片（Ｂ）を含む１つ又は複数の融合タンパク質（本明細書で定義されるＢ−Ｙ）を含むキットであって、後者が第１の結合パートナーに対して特異的であり、
例えば、第１の結合パートナー（Ｘ）がペプチド又はポリペプチドであり第２の結合パートナー（Ｙ）がそれに特異的な抗体又は抗体断片であり、
Ｙである第２の結合パートナーが第１の結合パートナーＸに特異的であり、第２の結合パートナーが、例えば、それに特異的な抗体又は抗体断片であり、２つの結合パートナーの特異的相互作用（結合相互作用などの）が、ａ）とｂ）由来の２つの融合タンパク質を物理的に一つにまとめて二重特異性タンパク質複合体を形成するヘテロ二量体繋を形成し、
融合タンパク質（単数又は複数）が複合体化された又は非複合体形態である
上記キットにまでも及ぶ。
【０３７４】
有利なことに、キットは本開示の二重特異性タンパク質複合体を含んでいてもよいし、又は複合体化された若しくは非複合体形態である融合タンパク質を含んでいてもよい。前者の場合では、二重特異性タンパク質複合体は便利さと使用のしやすさを提供する「枠を超える」使用の準備が整っており、後者の場合では、二重特異性タンパク質複合体は異なる融合タンパク質を組み合わせることにより使用者の要件に従って会合させることが可能である。
【０３７５】
別の実施形態では、キットは使用のための説明書をさらに含む。
【０３７６】
さらに別の実施形態では、キットは１つ又は複数の機能アッセイを実施するための１つ又は複数の試薬をさらに含む。
【０３７７】
一実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質、二重特異性タンパク質複合体、マルチプレックス、格子、ライブラリー、組成物、等は実験用試薬としての使用を目的とする。
【０３７８】
追加の態様では、ヌクレオチド配列、例えば、上で定義される融合タンパク質及び／又は二重特異性タンパク質複合体をコードするＤＮＡ配列が提供される。
【０３７９】
一実施形態では、ヌクレオチド配列、例えば、本開示に従った二重特異性タンパク質複合体をコードするＤＮＡ配列が提供される。
【０３８０】
一実施形態では、ヌクレオチド配列、例えば、本開示に従った二重特異性又は多特異性抗体分子をコードするＤＮＡ配列が提供される。
【０３８１】
本明細書の開示は上で定義されるヌクレオチド配列を含むベクターにも及ぶ。
【０３８２】
本明細書で使用される用語「ベクター」とは、それがすでに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子のことである。ベクターの例は「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡセグメントをそこにライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループである。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができる。ある種のベクターは、それが導入されている宿主細胞内で自律複製することができる（例えば、細菌性の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞のゲノムに組み込むことが可能であり、そこではベクターはそれに続いて宿主ゲノムと一緒に複製される。プラスミドは最も一般的に使用されている形態のベクターであるので、本明細書では、用語「プラスミド」と「ベクター」は互換的に使用することができる。
【０３８３】
ベクターを構築することができる一般的な方法、すなわち、トランスフェクション法及び培養法は当業者には周知である。これに関しては、"Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishingを参照する。
【０３８４】
本明細書で使用される用語「選択可能なマーカー」とは、その発現によってマーカー遺伝子を含有するベクターを形質転換されている又はトランスフェクトされている細胞を同定することができるようになるタンパク質のことである。広範囲の選択マーカーが当技術分野では公知である。例えば、典型的には選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与える。選択可能マーカーは、例えば、蛍光マーカーなどの視覚的に同定可能なマーカーでも可能である。蛍光マーカーの例には、ローダミン、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ及びその種々のコンジュゲートが含まれる。
【０３８５】
本開示の抗体をコードする１つ又は複数のＤＮＡ配列を含む１つ又は複数のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。本開示の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のためにはいかなる適切な宿主細胞／ベクター系でも使用することができる。細菌、例えば、大腸菌及び他の微生物系を使用してもよいし、又は真核生物、例えば、哺乳動物宿主細胞発現系を使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞にはＣＨＯ、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞が含まれる。
【０３８６】
本開示は、本開示に従った融合タンパク質の産生のための工程であって、本開示のベクターを含有する宿主細胞を、本開示の分子をコードするＤＮＡからタンパク質を発現するのに適した条件下で培養し、分子を単離することを含む上記工程も提供する。
【０３８７】
本開示の二重特異性タンパク質複合体は診断／検出キット中で使用することができ、抗原特異性の特定の組合せを備えた二重特異性タンパク質複合体が使用される。例えば、キットは、両方が同じ細胞型上に存在している２つの抗原に対して特異的である二重特異性抗体複合体を含み、両方の抗原が首尾よく検出される場合にのみ確定診断を下すことができる。非複合体形態の２つの別々の抗体又は抗体断片よりもむしろ本開示の二重特異性抗体複合体を使用することにより、検出の特異性を大いに増強することが可能になる。
【０３８８】
一実施形態では、二重特異性抗体複合体は固体表面に固定される。固体表面は例えば、チップ又はＥＬＩＳＡプレートであってもよい。
【０３８９】
試料中で第１と第２のペプチドの存在を検出するための本開示の二重特異性タンパク質複合体の使用がさらに提供され、二重特異性複合体は検出剤として使用される。
【０３９０】
本開示の二重特異性抗体複合体は、例えば、結合した抗体−抗原複合体の検出を促進する蛍光マーカーにコンジュゲートすることができる。そのような二重特異性抗体複合体は免疫蛍光顕微鏡のために使用することが可能である。代わりに、二重特異性抗体複合体はウェスタンブロッティング又はＥＬＩＳＡのためにも使用することができる。
【０３９１】
一実施形態では、抗体（特に、本発明に従った抗体又は断片）を精製するための工程が提供される。
【０３９２】
一実施形態では、本開示に従った融合タンパク質又は二重特異性タンパク質複合体を精製するための工程であって、不純物がカラム上に保持され抗体は非結合画分に維持されるように、アニオン交換クロマトグラフィーを非結合モードで実施するステップを含む、上記工程が提供される。ステップは、例えば、ｐＨ約６〜８で実施することができる。
【０３９３】
工程は、例えば、ｐＨ約４〜５で実施される、カチオン交換クロマトグラフィーを用いる最初の捕捉ステップをさらに含むことができる。
【０３９４】
工程は、生成物及び工程関連不純物が生成物ストリームから適切に分離されることを確実にする追加のクロマトグラフィーステップ（単数又は複数）をさらに含むことができる。
【０３９５】
精製工程は、濃縮及びダイアフィルトレーションステップなどの１つ又は複数の限外濾過ステップも含むことができる。
【０３９６】
上で使用される「精製された形態」は、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗ又はそれよりも多い純度などの少なくとも９０％純度を指すことを意図されている。
【０３９７】
本明細書の文脈では、「含む（comprising）」は「含む（including）」と解釈するべきである。
【０３９８】
ある種の要素を含む開示の態様は、関連する要素「からなる」又は「基本的にからなる」別の実施形態に及ぶことも意図されている。
【０３９９】
本明細書で用いられるプラスの実施形態は本開示の排除的なある種の態様の土台の役を果たすことができる。
【０４００】
二重特異性複合体に関係する方法の文脈における開示は、複合体それ自体に等しく当てはまり、逆もまた同じである。
【０４０１】
本明細書で参照されるすべての参考文献は、参照により具体的に組み込まれる。
【０４０２】
参考文献
1.Ribosome display efficiently selects and evolves high-affinity antibodies in vitro from immune libraries. Hanes J, Jermutus L, Weber-Bornhauser S, Bosshard HR, Pluckthun A. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 14130-14135
2.Directed in Vitro Evolution and Crystallographic Analysis of a Peptide-binding Single Chain Antibody Fragment (scFv) with Low Picomolar Affinity. Zhand C, Spinelli S, Luginbuhl B, Amstutz P, Cambillau C, Pluckthun A. (2004) J. Biol. Chem. 279, 18870-18877
3.Antigen recognition by conformational selection. Berger C, Weber-Bornhauser S, Eggenberger Y, Hanes J, Pluckthun A, Bosshard H. R. (1999) F.E.B.S. Letters 450, 149-153
【実施例】
【０４０３】
（例１）
異なるフォーマットに組み合わされた異なる方法由来のＶ領域を有する二重特異性抗体標的に対するヘテロ二量体的に繋ぎ合わされたタンパク質複合体の評価
序論：
多数の二重特異性組合せをスクリーニングするため、Ｖ領域は異なる方法に由来し、したがって、ヘテロ二量体繋により異なるＡ−Ｘ：Ｙ−Ｂフォーマットに連結してもよい。例えば、Ｂ細胞培養及び単細胞単離により導かれるＶ領域はＦａｂ−Ｘ：Ｆａｂ−Ｙ二重特異性体を生み出すＦａｂ−Ｘ又はＦａｂ−Ｙフォーマットでもよい。ファージディスプレイにより導かれるＶ領域はｓｃＦｖ−Ｘ：ｓｃＦｖ−Ｙ二重特異性体を生み出すｓｃＦｖ−Ｘ又はｓｃＦｖ−Ｙフォーマットでもよい。二重特異性体は、異なる供給源のＶ領域及びフォーマット、すなわち、Ｆａｂ−Ｘ：ｓｃＦｖ：Ｙ又はｓｃＦｖ：Ｘ：Ｆａｂ−Ｙを組み合わせることにより作製してもよい。Ｆａｂ−Ｘ、Ｆａｂ−Ｙ、ｓｃＦｖ−Ｘ又はｓｃＦｖ−Ｙは定量化された一過性上澄みとして精製される又は利用されてもよい。この例では、Ｂ細胞培養及び単細胞単離により導かれるＶ領域は互いに（Ｆａｂ−Ｘ：Ｆａｂ−Ｙ）及びファージディスプレイに由来するＶ領域に（Ｆａｂ−Ｘ：ｓｃＦｖ−Ｙ）組み合わされた。本明細書の下の例中のＸはｓｃＦｖ  ５２ＳＲ４（配列番号３）を表し、ＹはＧＣＮ４ペプチド（配列番号１）である。
【０４０４】
方法：
免疫化：選択された抗原をコードするＤＮＡは、遺伝子合成又は商業的供給源により入手し、強力な構成的プロモーターを備えた発現ベクター中にクローニングした。次に、社内電気穿孔システムを使用して、プラスミドＤＮＡをＲａｂ−９ウサギ線維芽細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１４１４（商標））にトランスフェクトした。２４時間後、細胞はフローサイトメトリーにより抗原発現について調べ、使用するまで液体窒素中にアリコートで凍結した。同じ細胞上での同時発現、又は単一若しくは複数をトランスフェクトされた細胞の混合物を作ることによりウサギ当たり最大６抗原を免疫化した。ウサギは３用量の細胞で免疫化した。
【０４０５】
Ｂ細胞培養及び単離による抗体発見：Ｂ細胞培養物はZublerら(1985)により記載された方法に類似する方法を使用して調製した。手短に言えば、免疫化ウサギからの脾臓又はＰＢＭＣ由来Ｂ細胞を、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｌｔｄ）、２％ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、０．１％βメルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、３％活性化脾細胞培養上澄み及びガンマ線照射突然変異ＥＬ４マウス胸腺腫細胞（５×１０４／ウェル）を補充した２００μｌ／ウェル  ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を備えたバーコード化９６ウェル組織培養プレートにおいてウェル当たりおおよそ２０００〜５０００細胞の密度で、５％ＣＯ２環境において３７℃で７日間培養した。
【０４０６】
Ｂ細胞培養上澄み中の抗原特異的抗体の存在は、ウサギを免疫化するのに用いた抗原を同時トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を使用する均一蛍光ベースの結合アッセイを使用して判定した。スクリーニングは、バーコード化９６ウェル組織培養プレート由来の１０μｌの上澄みを、標的抗原をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を含有する（おおよそ３０００細胞／ウェル）バーコード化３８４ウェル黒壁アッセイプレートにＭａｔｒｉｘ  Ｐｌａｔｅｍａｔｅリキッドハンドラを使用して移すことを含んでいた。結合はヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｆｃγ特異的Ｃｙ−５コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いて明らかにした。プレートはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００細胞検出システム上で読み取った。
【０４０７】
一次スクリーニングに続いて、陽性上澄みはＡｖｉｓｏ  Ｏｎｙｘ  ｈｉｔ−ｐｉｃｋｉｎｇ  ｒｏｂｏｔを使用して９６ウェルバーコード化マスタープレート上にまとめ、細胞培養プレート中のＢ細胞は−８０℃で凍結した。次に、マスタープレートは、抗原で別々にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞及び抗原供給源として組換えタンパク質で被覆したＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上での均一蛍光ベースの結合アッセイにおいてスクリーニングした。これはウェルごとの抗原特異性を判定することが目的であった。
【０４０８】
対象のウェルの選択からの抗体可変領域遺伝子の回収を可能にするために、デコンボリューションを実施してＢ細胞の不均一集団を含有する所与のウェルにおいて抗原特異的Ｂ細胞の同定を可能にした。これは蛍光フォーカス法（Clargo et al., 2014.Mabs 2014 Jan 1: 6(1) 143-159; EP1570267B1）を使用して達成した。手短に言えば、陽性ウェル由来の免疫グロブリン分泌Ｂ細胞を、標的抗原をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞又はビオチン化標的抗原及びヤギ抗ウサギＦｃγ断片特異的ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）の１対１２００最終希釈で被覆したストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）のいずれかと混合した。３７℃での１時間の静置インキュベーション後、抗原特異的Ｂ細胞はそのＢ細胞を取り囲んでいる蛍光ハローの存在のために同定することができた。いくつかのこれらの個々のＢ細胞クローンは、Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡を使用して同定されたが、次に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆマイクロマニュピレーターを用いて選び取り、ＰＣＲチューブ内に蓄積した。蛍光フォーカス法を使用して、直接免疫化ウサギの骨髄由来のＢ細胞の不均一集団からも抗原特異的Ｂ細胞を同定した。
【０４０９】
抗体可変領域遺伝子は、重及び軽鎖可変領域特異的プライマーを使用して逆転写（ＲＴ）ＰＣＲにより単細胞から回収した。２ラウンドのＰＣＲを実施し、３’及び５’末端に制限部位を組み込んでいるネステッド二次ＰＣＲにより可変領域をマウスＦａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ（ＶＨ）又はマウスカッパ（ＶＬ）哺乳動物発現ベクターにクローニングすることができた。Ｆａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ発現ベクターのための重及び軽鎖構築物は、Ｆｅｃｔｉｎ２９３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞に又はＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＥｘｐｉ２９３細胞に同時トランスフェクトし、組換え抗体が容積５ｍｌの６ウェル組織培養プレートで発現された。発現の５〜７日後、上澄みを収穫した。上澄みは、抗原をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞及び組換えタンパク質で被覆したＳｕｐｅｒａｖｉｄｉｎ（商標）ビーズ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）又は抗原トランスフェクトＨＥＫ細胞上での均一蛍光ベースの結合アッセイにおいて試験した。これはクローン化された抗体の特異性を確認するために実行した。
【０４１０】
小規模ＦａｂＡ−Ｘ及びＦａｂＢ−Ｙの作製
Ｅｘｐｉ２９３細胞はＥｘｐｉ２９３（商標）発現培養液において、最終濃度０．５×１０６生細胞／ｍＬまでルーチン的に継代し、軌道振盪インキュベーター（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ、Ｉｎｆｏｒｓ  ＨＴ）において１２０ｒｐｍで８％ＣＯ２及び３７℃でインキュベートした。
【０４１１】
トランスフェクションの日、自動細胞計測器（Ｖｉ−ＣＥＬＬ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して細胞生存率及び濃度を測定した。最終細胞濃度２．５×１０６生細胞／ｍＬを達成するため、適切な容積の細胞懸濁系を無菌２５０ｍＬエルレンマイヤー振盪フラスコに添加し、５０ｍＬトランスフェクションごとに新鮮な予熱したＥｘｐｉ２９３（商標）発現培養液を添加することにより４２．５ｍＬの容積まで養育した。
【０４１２】
トランスフェクションごとに脂質ＤＮＡ複合体を調製するため、全体で５０μｇの重鎖及び軽鎖プラスミドＤＮＡを全容積２．５ｍＬまでＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培養液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に希釈し、１３５μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を全容積２．５ｍＬまでＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培養液に希釈した。すべての希釈物を穏やかに混合し室温で長くても５分間インキュベートし、その後それぞれのＤＮＡ溶液をそれぞれの希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬に添加して、全容積５ｍＬを得た。ＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬混合物は穏やかに混合し、室温で２０〜３０分間インキュベートしてＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬複合体を形成させた。
【０４１３】
ＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬複合体インキュベーションを終わらせた後、５ｍＬのＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬複合体をそれぞれの振盪フラスコに添加した。振盪フラスコは軌道振盪インキュベーター（Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎ、Ｉｎｆｏｒｓ  ＨＴ）において１２０ｒｐｍで８％ＣＯ２及び３７℃でインキュベートした。
【０４１４】
トランスフェクションのおおよそ１６〜１８時間後、２５０μＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサー１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２．５ｍＬのＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサー２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をそれぞれの振盪フラスコに添加した。
【０４１５】
細胞培養物はトランスフェクション７日後に収穫した。細胞は５０ｍＬ回転チューブ（Ｆａｌｃｏｎ）に移し、４０００ｒｐｍで３０分間回転させ、その後０．２２μｍ  Ｓｔｅｒｉｃｕｐ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して無菌濾過した。浄化し無菌濾過した上澄みは４℃で保存した。最終発現レベルはプロテインＧ−ＨＰＬＣにより判定した。
【０４１６】
小規模（５０ｍｌ）精製：Ｆａｂ−ＸとＦａｂ−Ｙの両方を、小規模真空ベースの精製システムを使用する親和性捕捉により別々に精製した。手短に言えば、５０ｍｌの培養上澄みを０．２２μｍ無菌濾過し、その後５００μＬのＮｉセファロースビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を添加した。次に、上澄みビーズ混合物は約１時間転がし、その後上澄みは吸引を適用して取り除いた。次に、ビーズはＷａｓｈ１（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．２）及びＷａｓｈ２（０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で洗浄した。溶出は５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０＋１Ｍ  ＮａＣｌを用いて実施した。溶出画分はＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、ｐＨ７．４に緩衝液交換し０．２２μｍ濾過した。最終プールはＡ２８０スキャン、ＳＥ−ＵＰＬＣ（ＢＥＨ２００法）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元及び非還元）により、内毒素ではＰＴＳ  Ｅｎｄｏｓａｆｅシステムを使用してアッセイした。
【０４１７】
ファージディスプレイによる抗体発見：
ファージ選択は、社内の大きなナイーブヒトｓｃＦｖファージミドディスプレイライブラリーを使用して完了させた。抗原は社内エレクトロポレーションシステムを使用してＲａｂ−９ウサギ線維芽細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１４１４（商標））上で発現させる、又はＦｅｃｔｉｎ２９３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞上で一過性に発現させる、又はＮｕｎｃ  ｍａｘｉｓｏｒｂ  ＥＬＩＳＡプレート上に直接被覆されたＲ＆Ｄシステム（１９６８−ＳＬ、１４３０−ＣＤ）から組換えＦｃ融合として表示させた。
【０４１８】
細胞パニング約１０１２ファージでは、約１〜１０×１０７抗原トランスフェクト細胞及び約１〜１０×１０７非抗原トランスフェクト細胞を、３％のＢＳＡ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ中でブロックした。次に、ブロックされたファージ粒子は、氷上で振盪しながら少なくとも３０分間、ブロックされた非抗原トランスフェクト細胞と一緒にインキュベートした。次に、非結合ファージを非抗原トランスフェクト細胞から取り除き、氷上で振盪しながら少なくとも３０分間、ブロックされた抗原トランスフェクト細胞と一緒にインキュベートした。次に、トランスフェクト細胞は０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する冷ＰＢＳ中４回洗浄し非結合ファージをすべて取り除いた。次に、抗原トランスフェクト細胞に結合していたファージは１００ｍＭのＨＣｌを使用して溶出させ、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で中和した。細胞片はＰＢＳ中に再懸濁し、細胞片と酸中和溶出液の両方を使用して、３７℃で１時間、指数関数的に成長する（約０．５ＯＤ６００）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ−１細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ）に感染させた。次に、ＴＧ−１細胞は抗生物質選択培地を含有する寒天上に蒔き、３０℃で一晩成長させた。
【０４１９】
Ｎｕｎｃ  ｍａｘｉｓｏｒｂ  ＥＬＩＳＡプレートパニングでは、プレートにＲ＆Ｄシステム（１９６８−ＳＬ、１４３０−ＣＤ）由来の組換えＦｃ融合物をＰＢＳ中５℃で一晩、５μｇ／ｍＬで被覆した。次の日、約１０１２ファージを、１．５％のＢＳＡ及び２．５％の脱脂粉乳を含有するＰＢＳ中で少なくとも１時間ブロックした。ＥＬＩＳＡプレートは３％のＢＳＡ中少なくとも１時間ブロックした。洗浄されたブロックＥＬＩＳＡプレートにブロックされたファージ粒子を添加し、少なくとも３０分間放置した。次に、非結合ファージは０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中で洗浄することにより取り除かれた。次に、ＥＬＩＳＡプレートに結合していたファージは１００ｍＭのＨＣｌを使用して溶出させ、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で中和した。酸中和溶出液を使用して、３７℃で１時間、指数関数的に成長する（約０．５ＯＤ６００）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ−１細胞に感染させた。次に、ＴＧ−１細胞は抗生物質選択培地を含有する寒天上に蒔き、３０℃で一晩成長させた。
【０４２０】
適正な細胞、適正なタンパク質又は２つの技法の組合せの実験ごとに３ラウンドのパニングを完了させた。それぞれのラウンドの間、ファージ粒子は以下の方法により救出した。
【０４２１】
ファージミド含有ＴＧ１細胞（合計でおよそ５×１０９）を使用して２×ＴＹ（抗生物質及び０．１％のグルコースを含有する）に播種し、対数期中期、ＯＤ６００＝０．５〜０．６に到達するまで３７℃、２５０ｒｐｍで成長させ、その到達した時点で細胞にＭ１３ＫＯ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）耐干渉性ヘルパーファージ（２０倍ＭＯＩ）を感染させた。培養物は旋回させて、３７℃で３０分間そのままにしておき、続いて３７℃で３０分間、５０ｒｐｍでゆっくり振盪させた。次に、ヘルパーファージ感染ＴＧ１細胞は２５００×ｇで１５分間遠心分離によりペレット化し、上澄みは取り除いて、細胞は２×ＴＹ（抗生物質を含有する）に再懸濁させた。再懸濁細胞は３０℃で１６時間、２５０ｒｐｍで振盪しながら成長させ、ファージ生産させた。
【０４２２】
続く午前中、細胞は２５００×ｇで１５分間遠心分離により培養物から分離した。ファージ含有上澄みは新しいチューブに取り除き、遠心分離を繰り返した。精製した上澄みに、５分の１体積の２０％ＰＥＧ塩（２．５ＭのＮａＣｌ、２０％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ８０００）を添加し、混合して、３０分間氷上に放置し、上澄みからファージを沈殿させた。次に、沈殿したファージは２５００×ｇで１５分間遠心分離によりペレット化し、ファージペレットはＰＢＳに再懸濁し、次のラウンドのパニングに備えた。
【０４２３】
３ラウンドのパニングの完了に続いて、プラスミド精製及び連鎖状１ｍＬスケールファージ救出が、最終ラウンドのパニング由来のアウトプットファージ感染コロニーから選ばれた個々の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コロニーについて実施された。可能な場合には、それぞれの試料は結合組換えＦｃ融合物又は無関係なタンパク質についてＥＬＩＳＡにより試験した。陽性の「ヒット」は陰性シグナルの３倍よりも大きな抗原結合シグナルを有する任意の試料であると判定された。手短に言えば、すべてのＥＬＩＳＡプレートは、４℃で一晩、ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌで抗原を被覆させた。洗浄はアッセイのそれぞれのステップ間で実施し、ＰＢＳ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有する）中４回の洗浄からなっていた。ＥＬＩＳＡプレートにスクリーニング試料を添加するのに先立って少なくとも１時間、すべてのプレートは３％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中でブロックし、すべての試料は２．５％牛乳を含有するＰＢＳ中でブロックした。次に、抗Ｍ１３  ＨＲＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をＰＢＳ（３％のＢＳＡを含有している）中５０００分の１希釈で添加し１時間放置した。最終洗浄に続いて、ＴＭＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）をすべてのウェルに添加し、プレートのＯＤを６３０及び４９０ｎｍで読み取り、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙプレート読取り機を使用して△ＯＤを記録した。異なるパニング戦略のヒットから選択したものを、ファージミドベクターから哺乳動物発現ベクターへサブクローニングしてｓｃＦｖ−ＦＣ構築物を作製した。組換えタンパク質がスクリーニングに利用できない場合は、ｓｃＦｖは前スクリーニングなしでサブクローニングした。ｓｃＦｖ−ＦＣ構築物は、Ｆｅｃｔｉｎ２９３（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＨＥＫ２９３細胞又はＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトし、組換え抗体は５ｍｌの容積の６ウェル組織培養プレートで発現させた。５〜７日の発現後、上澄みが収穫された。ＨＥＫ２９３培養上澄み中の抗原特異的抗体の存在は、ｓｃＦｖをパニングする対象の抗原で共トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を使用する均一蛍光ベースの結合アッセイを使用して判定した。スクリーニングは、１０μｌの上澄みを、標的抗原をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を含有するバーコード化３８４ウェル黒壁アッセイプレートに移す（およそ３０００細胞／ウェル）ことを含んだ。結合はヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃγ特異的Ｃｙ−５コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いて明らかにした。プレートはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ８２００細胞検出システム上で読み取った。これはクローン化された抗体の特異性を確かめるために行われた。
【０４２４】
バイオアッセイにおいて機能的活性についてｓｃＦｖを試験するために、ｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ−Ｙ哺乳動物発現ベクター（ＡＡＡＳＧＧＧリンカー）並びにＦａｂ−Ｘ（ＡＳＧＧＧＧリンカー）及びＦａｂ−Ｙ（ＡＳＧＧＧリンカー）（ＶＨ）又はマウスカッパ（ＶＬ）哺乳動物発現ベクターに再びサブクローニングした。
【０４２５】
【表８】
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【０４２６】
スクリーニングアッセイ
ドナーＰＢＭＣを３７℃に設定した水浴を使用して急速解凍し、５０ｍｌＦａｌｃｏｎチューブに慎重に移した。次に、ＰＢＭＣは、浸透圧ショックを最小化するためアッセイ培養液で５ｍｌまで液滴で希釈した。次に、細胞は２０ｍｌまで慎重に希釈し、その後最終培養液希釈液を添加して、容積を５０ｍｌにした。次に、細胞は５００ｇで５分間回転させ、その後上澄みを取り除いて細胞を１ｍｌ培養液に再懸濁した。次に、細胞は計数し１．６６×１０６細胞／ｍｌまで希釈し、その後ウェル当たり３０μｌをＶ字型底ＴＣプレートに分注し、最終アッセイ濃度５．０×１０４細胞／ウェルを与える。次に、細胞プレートは必要になるまで３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中にカバーして保存し、最小限１時間休ませる。
【０４２７】
Ｆａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ試薬はアッセイ培養液において、等モル比、最終アッセイ濃度の５倍で混合し、３７℃、５％ＣＯ２で９０分間インキュベートした。試料は９６ウェルＵ字型底ポリプロピレンプレートにおいて調製し、インキュベーション中はカバーした。
【０４２８】
１０μｌの５×Ｆａｂ又はｓｃＦｖ−Ｘ＋Ｆａｂ又はｓｃＦｖ−Ｙ混合物を、細胞を含有する適切な試験ウェルに添加し、１０００ｒｐｍで３０秒間振盪することにより混合し、その後３７℃、５％ＣＯ２で９０分間インキュベートした。
【０４２９】
次に、細胞は１０μｌの抗ヒトＩｇＭで刺激した。刺激の最終アッセイ濃度は、アッセイパネル読み出し情報により変動し、３つの抗体カクテルＡ、Ｂ及びＣ（下で詳述）は、５０μｇ／ｍｌ（カクテルＡ及びＣ）又は２５μｇ／ｍｌ（カクテルＢ）のいずれかの最終アッセイ濃度で刺激した。次に、アッセイプレートは１０００ｒｐｍで３０秒間穏やかに混合し、その後３７℃、５％ＣＯ２で５分間（抗体カクテルＡ及びＣ）又は２分間（抗体カクテルＢ）インキュベートした。アッセイは、１５０μｌの氷冷ＢＤ  ＣｙｔｏＦｉｘをすべてのウェルの添加することにより停止し、室温で１５分間インキュベートした。次に、固定された細胞は５００ｇで５分間回転させて細胞をペレット状にし、ＢｉｏＴｅｋ  ＥＬｘ４０５プレート洗浄機を使用して上澄みを除去させた。ペレットはプレートを２４００ｒｐｍで３０秒間ボルテックスすることにより再懸濁した。次に、細胞は、１００μｌの氷冷ＢＤ細胞透過処理緩衝液ＩＩＩを３０分間添加することにより４℃で透過処理した。次に、細胞は１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し５００ｇで５分間回転させた。上澄みはＥＬｘ４０５により再び取り除き、その後それを使用して残っている透過処理緩衝剤はいずれも洗い流すために２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を迅速に分注した。細胞は５００ｇで再び回転させ、上澄みは反転により取り除いた。先行する回転ステップ中、抗体カクテルはＦＡＣＳ緩衝液で調製し、光を遮断したままにした。次に、細胞はボルテックスする（２４００ｒｐｍ、３０秒間）ことにより再懸濁し、その後２０μｌの抗体カクテルをすべてのウェルの添加し、プレートは１０００ｒｐｍで３０秒間振盪させた。次に、細胞は暗所において室温で６０分間インキュベートした。
【０４３０】
次に、細胞は５００ｇの回転をかけて２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、それぞれのステップ後に上澄みを取り除いた。最後に、細胞は２４００ｒｐｍで３０秒間ボルテックスすることにより再懸濁し、その後最終２０μｌのＦＡＣＳ緩衝液を添加した。次に、プレート（単数又は複数）はＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ  ＨＴＦＣ／ｉＱｕｅ装置上で読み取った。
ＦＡＣＳ緩衝液＝ＰＢＳ＋１％  ＢＳＡ＋０．０５％  ＮａＮ３＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ
抗体カクテル＝１対５  ＣＤ２０  ＰＥ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）＋１対５  ＰＬＣｇａｎｍａ２  ＡＦ８８＋１対１０  Ａｋｔ  ＡＦ６４７（ＦＡＣＳ緩衝液で希釈）。
【表９】
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【０４３１】
結果
図８及び図９は、ヘテロ二量体的に繋ぎ合わされたＦａｂ−Ｘ＋Ｆａｂ−Ｙ又はＦａｂ−Ｘ＋ｓｃＦｖ−Ｙ構築物により形成されるＣＤ７９ｂ／ＣＤ２２及びＣＤ７９ｂ／ＣＤ４５二重特異性組合せで処置すると、抗ＩｇＭで活性化された場合のヒトＢ細胞でのＰＬＣγ２及びＡｋｔのリン酸化が阻害されることを実証している。Ｆａｂ−Ｘ及びＦａｂ−Ｙ構築物は精製されており、ｓｃＦｖ−Ｙ構築物は未精製一過性ＨＥＫ上澄みであった。
【配列表フリーテキスト】
【０４３２】
配列番号１：＜２２３＞CN4(7P14P)配列
配列番号２：＜２２３＞DNA encoding
配列番号３：＜２２３＞52SR4 ds scFv配列
配列番号４：＜２２３＞DNA encoding
配列番号５〜１３：＜２２３＞フレキシブルペプチドリンカー
配列番号１４〜２１：＜２２３＞フレキシブルリンカー
配列番号２２〜２６：＜２２３＞フレキシブルリンカー：Xaaは天然に存在する任意のアミノ酸であり得る。
配列番号２７〜５４：＜２２３＞フレキシブルリンカー
配列番号５５〜６８：＜２２３＞リンカー
配列番号６９〜７０：＜２２３＞ペプチド配列
配列番号７１〜７４：＜２２３＞リンカー
配列番号７５〜９７：＜２２３＞GCN4ペプチド変異体
配列番号９８〜９９：＜２２３＞52SR4 scFV変異体
配列番号１００〜１０３：＜２２３＞シグナル配列
【図１】
2019510732.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2019510732.tif 000021
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