(57)【要約】  本発明は、核酸に共役した修飾糖部分を含む化合物に関する。当該化合物は、ＲＮＡ干渉療法のための医薬、または研究および診断目的のための医薬に有用である。特に、当該化合物は肝疾患の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）を有する化合物：
［Ｓ−Ｘ１−Ｐ−Ｘ２］３−Ａ−Ｘ３−Ｚ      （Ｉ）
ここで：
Ｓは、糖を表し；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたはエチレングリコール幹（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−を表し、この際、ｍは、１，２、または３であり；
Ｐは、修飾リン酸基であり；
Ｘ２は、アルキレンまたは式（−ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＣＨ２−（ｎ＝１〜６）のアルキレンエーテルであり；
Ａは、分岐単位であり；
Ｘ３は、架橋単位を表し；
Ｚは、核酸であり；
Ｘ３とＺとの間の結合はリン酸またはチオリン酸である。
【請求項２】
式（ＩＩ）の化合物である、請求項１に記載の化合物：
［Ｓ−Ｘ１−Ｐ−Ｘ２］３−Ａ−Ｘ３−Ｚ      （ＩＩ）
ここで：
Ｓは、糖を表し；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたはエチレングリコール幹（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（ＣＨ２）２を表し、この際、ｍは、１，２、または３であり；
Ｐは、修飾リン酸基であり；
Ｘ２は、Ｃ１−Ｃ８アルキレンであり；
Ａは、以下から選択される分岐単位であり：
【化１】
2019510793.tif 000046
Ｘ３は、架橋単位であり；
Ｚは、核酸であり；
Ｘ３とＺとの間の結合はリン酸またはチオリン酸である。
【請求項３】
Ａが以下の構造：
【化２】
2019510793.tif 000047
を有する、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ａが以下の構造：
【化３】
2019510793.tif 000048
を有し、Ｘ３は上記窒素原子に結合している、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘ３が、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン−、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン−、式−（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−のアルキレンエーテル、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン−、Ｃ１−Ｃ２０アルキレン、−Ｃ０−Ｃ４アルキレン（Ｃｙ）Ｃ０−Ｃ４アルキレン−（式中、Ｃｙは置換または非置換の５員または６員のシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロシクリレンまたはヘテロアリーレン環を表す）、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４アルキレン、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＨＣ１−Ｃ４アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−ＳＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４アルキレン、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＳＣ１−Ｃ４アルキレン、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−ＯＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−、および−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−Ｓ−Ｓ−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｘ３が式−（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−のアルキレンエーテルである、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｘ３が式−（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−Ｏ−（Ｃ４−Ｃ２０アルキレン）−のアルキレンエーテルであり、前記（Ｃ４−Ｃ２０アルキレン）がＺに結合している、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
Ｘ３が、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ３Ｈ６−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６−、特に、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６−からなる群から選択され、この際、それぞれの場合において−ＣＨ２−基がＡに結合している、請求項６に記載の化合物。
【請求項９】
Ｘ３がＣ１−Ｃ２０アルキレンである、請求項２に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｘ３が、−Ｃ３Ｈ６−、−Ｃ４Ｈ８−、−Ｃ６Ｈ１２−および−Ｃ８Ｈ１６−、特に、−Ｃ４Ｈ８−、−Ｃ６Ｈ１２−および−Ｃ８Ｈ１６−からなる群から選択される、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
式（ＩＩＩ）のものである、請求項１に記載の化合物：
【化４】
2019510793.tif 000049
ここで：
Ｓは、糖を表し；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたはエチレングリコール幹（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（ＣＨ２）２−を表し、ｍは、１，２、または３であり；
Ｐは、修飾リン酸基であり；
Ｘ２は、式−Ｃ３Ｈ６−Ｏ−ＣＨ２−のアルキレンエーテルであり；
Ａは、分岐単位であり；
Ｘ３は、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ３Ｈ６−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４−Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ５Ｈ１０−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ７Ｈ１４−および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６−からなる群から選択され、それぞれの場合において−ＣＨ２−基がＡに結合しており；
Ｚは、核酸であり；
Ｘ３とＺとの間の結合はリン酸またはチオリン酸である。
【請求項１２】
前記分岐単位が炭素を含む、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記分岐単位が炭素原子である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｘ３が、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ５Ｈ１０−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ７Ｈ１４−、および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６−からなる群から選択される、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｘ３が、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−および−ＣＨ２−ＯＣ８Ｈ１６−からなる群から選択される、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
前記修飾リン酸基がチオリン酸基である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記糖が、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、ガラクトース、グルコース、グルコサミンおよびフルクトースから選択される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１８】
前記糖がＮ−アセチルガラクトサミンである、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｘ１が、エチレングリコール幹（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−（式中、ｍは１、２または３である）である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｘ１がＣ３−Ｃ６アルキレンを表す、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２１】
式：
【化５】
2019510793.tif 000050
ここで、Ｚは核酸である、
の化合物。
【請求項２２】
式：
【化６】
2019510793.tif 000051
ここで、Ｚは核酸である、
の化合物。
【請求項２３】
式：
【化７】
2019510793.tif 000052
ここで、Ｚは核酸である、
の化合物。
【請求項２４】
式：
【化８】
2019510793.tif 000053
ここで、Ｚは核酸である、
の化合物。
【請求項２５】
式：
【化９】
2019510793.tif 000054
ここで、Ｚは核酸である、
の化合物。
【請求項２６】
式：
【化１０】
2019510793.tif 000055
ここで、Ｚは核酸である、
の化合物。
【請求項２７】
式：
【化１１】
2019510793.tif 000056
ここで、Ｚは核酸である、
の化合物。
【請求項２８】
式：
【化１２】
2019510793.tif 000057
ここで、Ｚは核酸である、
の化合物。
【請求項２９】
前記核酸が、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマーおよびスピーゲルマーから選択される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３０】
前記核酸が改変されている、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項３１】
前記修飾が、核酸または塩基の類似体による置換または挿入、ならびに塩基、糖またはリン酸部分の化学修飾から選択される、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の化合物、および適切な担体または賦形剤を含む、組成物。
【請求項３３】
医薬に使用するための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の化合物、または請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
肝疾患、遺伝子疾患、血友病および出血障害、肝線維症、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、ウイルス性肝炎、稀少疾患（例えば、末端肥大症）、代謝性疾患（例えば、高コレステロール血症、脂質異常症、高トリグリセリド血症）、心血管疾患、肥満、サラセミア、肝損傷（例えば、薬剤誘発性肝障害）、ヘモクロマトーシス、アルコール性肝疾患、アルコール依存性、貧血、並びに慢性疾患の貧血の治療に使用するための、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の化合物、または請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
幹細胞を、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の化合物と接触させることを含む、肝細胞への核酸の送達方法。
【請求項３６】
各成分を一緒に添加して式（Ｉ）の化合物を形成することを含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の式（Ｉ）の化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、新規核酸コンジュゲート化合物に関する。本発明はさらに、前記コンジュゲートを含む組成物、ならびに医学、研究および診断におけるそれらの使用に関する。新規紺綬ゲート化合物は、中枢神経系疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、遺伝性疾患および遺伝性疾患、腫瘍、感染症並びに眼疾患を含む多くの疾患の治療に使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、遺伝子発現を阻害することが示されており（Ｆｉｒｅら、１９９８およびＥｌｂａｓｈｉｒら、２００１）、これは干渉ＲＮＡ分子（ｉＲＮＡ）によって媒介されるＲＮＡ干渉、すなわち「ＲＮＡｉ」と呼ばれている。短いｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物において、遺伝子特異的な転写後サイレンシングを指示し、遺伝子機能を研究するための新しいツールを提供している。ＲＮＡｉは、サイレンシングトリガーと相同なメッセンジャーＲＮＡを破壊する配列特異的な多成分ヌクレアーゼであるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって媒介される。ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡなどのｉＲＮＡ（干渉ＲＮＡ）は、遺伝子サイレンシング、すなわちタンパク質の翻訳の阻害によるタンパク質の形成を防止するオリゴヌクレオチドである。遺伝子サイレンシング物質は、医学における治療的な応用のためにますます重要になりつつある。
【０００３】
したがって、オリゴヌクレオチド（特に二本鎖ｓｉＲＮＡ）のインビボでの細胞への効率的な送達のための手段はますます重要になっており、特異的な標的化および、細胞外環境、特に血清タンパク質からの実質的な保護を必要とする。特異的な標的化を達成する１つの方法は、標的化部分をｉＲＮＡ二本鎖に共役させることである。標的化部分は、必要とされる標的部位へのｉＲＮＡ二本鎖の標的化を助け、エンドサイトーシスなどによって細胞に取り込まれる共役分子の所望の受容体部位のための適切な標的化部分を設計する必要がある。
【０００４】
例えば、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）は、肝細胞に非常に豊富に存在する高容量受容体である。３分岐クラスター配糖体の最初の開示の１つは、米国特許第５，８８５，９６８号であった。３つのＧａｌＮＡｃリガンドを有し、リン酸基を含むコンジュゲートは公知であり、Ｄｕｂｂｅｒら（２００３）に記載されている。ＡＳＧＰ−Ｒは、Ｄ−ＧａｌよりＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトシルアミン（ＧａｌＮＡｃ）に対して５０倍高い親和性を示す。
【０００５】
レクチン（アシアロ糖タンパク質受容体；ＡＳＧＰＲ）を発現する肝細胞は、グリコシル化タンパク質の末端β−ガラクトシルサブユニットまたは他のオリゴ糖を特異的に認識するが（Ｐ．Ｈ．Ｗｅｉｇｅｌら、２００２）、これは薬物へのガラクトースまたはガラクトサミンの共有結合によって肝臓に薬物を標的化するために使用されうる（Ｓ．Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ、１９９４）。さらに、結合親和性は多葉性効果によって有意に増大されうるが、これは標的ユニットの繰り返しによって達成される（Ｅ．Ａ．Ｌ．Ｂｉｅｓｓｅｎら、１９９５）。
【０００６】
ＡＳＧＰＲは、末端β−ガラクトシル含有糖タンパク質の活性エンドソーム輸送のメディエーターであるため、ＡＳＧＰＲは細胞に送達されなければならないｓｉＲＮＡのような薬物候補の標的送達に非常に適している（Ａｋｉｎｃら）。
【０００７】
しかし、これまでに開発された標的化リガンドは、常にインビボでの設定へと翻訳するわけではなく、オリゴヌクレオチド治療薬、核酸および二本鎖ｓｉＲＮＡ）のインビボ送達のために、より効率的で受容体に特異的なリガンド共役ｉＲＮＡ二本鎖およびそれらの調製のための方法に対する明確なニーズが存在している。本発明は、これらのニーズに対処することを試みるものである。
【発明の概要】
【０００８】
発明の概要
本発明は、化合物の糖部分内に３つの糖リガンドおよび修飾リン酸基を有するコンジュゲート化合物に関する。これらのコンジュゲート化合物は、インビボでの効力および持続時間が改善されていることが示されている。さらに、コンジュゲート基は、当該分野で公知のコンジュゲートと比較して、調製がずっと容易である。
【０００９】
本発明のコンジュゲート化合物は、式Ｉを有する：
【００１０】
【化１】
2019510793.tif 000002
【００１１】
ここで：
Ｓは、糖を表し；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたはエチレングリコール幹（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−を表し、この際、ｍは、１，２、または３であり；
Ｐは、修飾リン酸基であり；
Ｘ２は、アルキレンまたは式（−ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＣＨ２−（ｎ＝１〜６）のアルキレンエーテルであり；
Ａは、分岐単位であり；
Ｘ３は、架橋単位を表し；
Ｚは、核酸であり；
Ｘ３とＺとの間の結合はリン酸またはチオリン酸である。
【００１２】
核酸は、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマーおよびスピーゲルマーから選択されうる。本発明はまた、式Ｉのコンジュゲート化合物を含む医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、チオホスフェート基で修飾された３つの糖リガンド部分に共役した修飾二本鎖ｓｉＲＮＡの図解を提供する。
【図２】図２は、マウスでのＴＴＲノックダウンのインビボでの効果による、マウスにおけるインビボでの効果を示す棒グラフである。マウス（１群あたり４匹の動物）を１ｍｇ／ｋｇの１回の皮下投与で処置し、注射２日後に屠殺した。ＴＴＲのｍＲＮＡレベルをＴＡＱｍａｎＰＣＲによって定量した。ノックダウンのレベルを棒の上に示す。ｍＲＮＡレベルをＰＴＥＮに対して正規化した。ＴＴＲＣＦ０２Ｖ２１およびＴＴＲＣＦ０２Ｖ２３に示すように、ＧａｌＮＡｃリンカーシステムにおけるホスホロチオエートの導入により、（ＴＴＲＣＦ０２Ｖ２０およびＴＴＲＣＦ０２Ｖ２２に示すように）標準的なホスホジエステル結合と比較して実質的に大きな効力を示した。
【図３】図３は、マウスにおけるＴＴＲノックダウンの持続時間を示す棒グラフである。マウス（１群あたり４匹の動物）を２ｍｇ／ｋｇの１回の皮下投与で処置し、与えられた時点（注射後７，１４，２１および２８日）で屠殺した。ＴＴＲのｍＲＮＡレベルをＴＡＱｍａｎＰＣＲによって定量した。ノックダウンのレベルを棒の上に示す。ｍＲＮＡレベルをＰＴＥＮに対して正規化した。本発明のｓｉＲＮＡコンジュゲートによるノックダウンの持続時間は、（構造ＳＴ１３に示すように）標準的なＢｉｅｓｓｅｎ／ｖａｎＢｅｒｋｅｌタイプのＧａｌＮＡｃリンカーを組み込んだ化合物ＴＴＲＣＦ０２と比較して、はるかに顕著であり、より長く持続する。
【図４】図４は、マウスにおけるＴＴＲノックダウンの用量力価を示す棒グラフである。マウス（１群あたり４匹の動物）を、各用量（３、１、０．３、０．１ｍｇ／ｋｇ）で処置した。ＴＴＲのｍＲＮＡレベルをＴＡＱｍａｎＰＣＲによって定量した。ｍＲＮＡレベルをＰＴＥＮに対して正規化した。
【図５】図５は、ＴＴＲ  ｓｉＲＮＡのＧａｌＮＡｃコンジュゲートであるＳＴＳ０１６Ｌ８およびＬ９によるＴＴＲノックダウンのインビトロでの定量を示す棒グラフである。ＴＴＲＣＦ０２Ｖ２３は陽性対照を表す。ＧＮ＿Ｌｕｃは陰性対照を表す。ｍＲＮＡレベルをＰＴＥＮに対して正規化した。
【図６】図６は、ＴＴＲ  ｓｉＲＮＡのＧａｌＮＡｃコンジュゲートであるＳＴＳ０１６Ｌ４〜Ｌ７によるＴＴＲノックダウンのインビトロでの定量を示す棒グラフである。ＴＴＲＣＦ０２Ｖ２３は陽性対照を表す。ＧＮ＿Ｌｕｃは陰性対照を表す。ｍＲＮＡレベルをＰＴＥＮに対して正規化した。
【図７】図７は、マウスにおけるＴＴＲノックダウンのインビボでの効果を示す棒グラフである。マウス（１群あたり４匹の動物）を、１ｍｇ／ｋｇの１回の皮下投与で処置した。各時点（注射後８日目、１５日目、２２日目）の後に血液を採取し、市販のマウスＴＴＲ特異的ＥＬＩＳＡキットを用いてＴＴＲレベルを分析した。
【図８】図８は、マウスにおけるＰＴＥＮノックダウンのインビボでの効果を示す棒グラフである。マウス（１群あたり４匹の動物）を、各用量（１、３、１０ｍｇ／ｋｇ）で処置した。ＰＴＥＮのｍＲＮＡレベルをＴＡＱｍａｎＰＣＲによって定量した。明らかなＰＴＥＮの用量依存的なノックダウンが確認された。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
以下の定義および説明は、明細書および特許請求の範囲の双方を含むこの文書全体を通じて使用される用語に関するものである。
【００１５】
特記のない限り、以下の用語は以下の意味を有する：
「コンジュゲート」または「コンジュゲート基」は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマー化合物に結合した原子または原子群を意味する。一般に、コンジュゲート基は、薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞取り込み、電荷および／またはクリアランス特性を含むがそれらに限定されない、それらが結合する化合物の１つまたは複数の特性を修飾する。
【００１６】
「ＧａｌＮＡｃ」は、Ｎ−アセチルガラクトサミンを意味する。
【００１７】
Ｃｘ−Ｃｙアルキルは、線状または分枝状であってよいｘ〜ｙ個の炭素原子を有する飽和脂肪族炭化水素基を指す。例えばＣ１−Ｃ６アルキルは、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５およびＣ６を含む。「分岐した」とは、少なくとも１つの炭素分岐点が基中に存在することを意味する。例えば、ｔｅｒｔ−ブチルおよびイソプロピルはともに分岐した基である。Ｃ１−Ｃ６アルキル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、ブチル、２−メチル−１−プロピル、２−メチル−２−プロピル、２−メチル−１−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−３−ブチル、２，２−ジメチル−１−プロピル、２−メチル−ペンチル、３−メチル−１−ペンチル、４−メチル−１−ペンチル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、２，２−ジメチル−１−ブチル、３，３−ジメチル−１−ブチル、２−エチル−１−ブチル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチルおよびｎ−ヘキシルが挙げられる。これはまた、Ｃ１−Ｃ６アルキレンにも適用される。
【００１８】
Ｃｘ−Ｃｙアルコキシは、上のＣｘ−Ｃｙアルキルの定義に従った−ＯＣｘ−Ｃｙアルキル基を有する基または基の一部をいう。Ｃ１−Ｃ３アルコキシは、１から３個の炭素原子を含み、Ｃ１、Ｃ２およびＣ３を含む。Ｃ１−Ｃ３アルコキシの例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシおよびイソプロポキシが挙げられる。本明細書で用いられるアルコキシはまた、酸素原子（例えば、単一酸素原子）がアルキル鎖内に位置する実施形態、例えばＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３またはＣＨ２ＯＣＨ３にも及ぶ。このように、アルコキシは炭素を介して分子の残りの部分、例えば−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３に結合していてもよく、あるいはアルコキシは酸素を介して分子の残りの部分、例えば−ＯＣ１−３アルキルに結合していてもよい。場合によっては、アルコキシは酸素を介して分子の残部に結合していてもよいが、アルコキシ基はさらなる酸素原子を含み、例えば−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３である。
【００１９】
用語「核酸」は、モノマーヌクレオチドからなる分子を指す。核酸としては、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、一本鎖核酸（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖核酸（ｄｓＤＮＡ）、低分子干渉リボ核酸（ｓｉＲＮＡ）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が挙げられる。核酸はまた、単一分子内にこれらの要素の任意の組み合わせを含むことができる。
【００２０】
「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、予防を含み、一時的または永続的に、症状を改善し、軽減し、症状の原因を排除し、または所定の障害もしくは症状の兆候の出現を予防または緩徐化することを意味する。本発明の化合物は、ヒトおよび非ヒト動物の治療に有用である。
【００２１】
「有効量」または「治療有効量」または「有効用量」とは、所望の薬理学的または治療的効果を引き出し、それによって障害の有効な予防または治療をもたらすのに十分な量を意味する。障害の予防は、障害の症状の発症を医学的に有意な程度まで遅らせることによって明らかになる。障害の治療は、障害に伴う症状の減少または障害の症状の再発の改善によって明らかにされる。
【００２２】
「医薬組成物」または「組成物」は、個体に投与するのに適した物質の混合物を意味する。例えば、医薬組成物は、１つ以上の活性薬剤および医薬担体、例えば滅菌水溶液を含むことができる。
【００２３】
第１の態様において、本発明は、式Ｉの化合物を提供する：
【００２４】
【化２】
2019510793.tif 000003
【００２５】
ここで：
Ｓは、糖を表し；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたはエチレングリコール幹（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−を表し、この際、ｍは、１，２、または３であり；
Ｐは、修飾リン酸基であり；
Ｘ２は、アルキレンまたは式（−ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＣＨ２−（ｎ＝１〜６）のアルキレンエーテルであり；
Ａは、分岐単位であり；
Ｘ３は、架橋単位を表し；
Ｚは、核酸であり；
Ｘ３とＺとの間の結合はリン酸またはチオリン酸である。
【００２６】
式Ｉにおいて、分岐ユニット「Ａ」は３つの糖リガンドを収容するために３つに分岐する。この分岐単位は繋留リガンドおよび核酸に共有結合している。この分岐単位は、アルキル、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテルおよびヒドロキシアミノ基から選択される基を含む分岐脂肪族基を含むことができる。この分岐単位は、アルキル基およびエーテル基から選択される基を含んでもよい。
【００２７】
分岐単位Ａは、以下から選択される構造を有しうる：
【００２８】
【化３】
2019510793.tif 000004
【００２９】
ここで、各Ａ１は、独立してＯ、Ｓ、Ｃ＝ＯまたはＮＨを表し；
各ｎは、独立して１〜２０の整数を表す。
【００３０】
この分岐単位は、以下から選択される構造を有しうる：
【００３１】
【化４】
2019510793.tif 000005
【００３２】
ここで、各Ａ１は、独立してＯ、Ｓ、Ｃ＝ＯまたはＮＨを表し；
各ｎは、独立して１〜２０の整数を表す。
【００３３】
この分岐単位は、以下から選択される構造を有しうる：
【００３４】
【化５】
2019510793.tif 000006
【００３５】
ここで、Ａ１は、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝ＯまたはＮＨであり；
各ｎは、独立して１〜２０の整数を表す。
【００３６】
この分岐単位は、以下の構造を有しうる：
【００３７】
【化６】
2019510793.tif 000007
【００３８】
この分岐単位は、以下の構造を有しうる：
【００３９】
【化７】
2019510793.tif 000008
【００４０】
この分岐単位は、以下の構造を有しうる：
【００４１】
【化８】
2019510793.tif 000009
【００４２】
任意に、この分岐単位は炭素原子のみからなる。
【００４３】
式Ｉの化合物の「Ｘ３」部分は、架橋単位である。Ｘ３はまた、コンジュゲートリンカーとも称されうる。この架橋単位は、直鎖状であり、上記分岐単位および上記核酸に共有結合している。
【００４４】
Ｘ３は、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン、式−（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−のアルキレンエーテル、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン、−Ｃ０−Ｃ４アルキレン（Ｃｙ）Ｃ０−Ｃ４アルキレン（式中、Ｃｙは置換または非置換の５員または６員のシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロシクリレンまたはヘテロアリーレン環を表す）、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４アルキレン、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ１−Ｃ４アルキレン、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−ＳＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４アルキレン、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−Ｃ（Ｏ）Ｓ−Ｃ１−Ｃ４アルキレン、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−ＯＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４アルキレン、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−、および−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−Ｓ−Ｓ−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−から選択されうる。
【００４５】
Ｘ３は、式−（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−のアルキレンエーテルであってもよい。Ｘ３は、式−（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−Ｏ−（Ｃ４−Ｃ２０アルキレン）−のアルキレンエーテルであって、この際、前記（Ｃ４−Ｃ２０アルキレン）がＺに結合しているものであってもよい。Ｘ３は、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ３Ｈ６−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６−からなる群から選択されてもよく、特に−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６−からなる群から選択されてもよく、この際、それぞれの場合において−ＣＨ２−基がＡに結合している。
【００４６】
第２の態様において、本発明は、式（ＩＩ）の化合物を提供する：
【００４７】
【化９】
2019510793.tif 000010
【００４８】
ここで：
Ｓは、糖を表し；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたはエチレングリコール幹（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（ＣＨ２）２を表し、この際、ｍは、１，２、または３であり；
Ｐは、修飾リン酸基であり；
Ｘ２は、Ｃ１−Ｃ８アルキレンであり；
Ａは、以下から選択される分岐単位であり：
【００４９】
【化１０】
2019510793.tif 000011
【００５０】
Ｘ３は、架橋単位であり；
Ｚは、核酸であり；
Ｘ３とＺとの間の結合はリン酸またはチオリン酸である。
【００５１】
分岐単位Ａは、以下の構造を有しうる：
【００５２】
【化１１】
2019510793.tif 000012
【００５３】
分岐単位Ａは、以下の構造を有しうる：
【００５４】
【化１２】
2019510793.tif 000013
【００５５】
この際、Ｘ３は上記窒素原子に結合している。
【００５６】
Ｘ３は、Ｃ１−Ｃ２０のアルキレンであってもよい。好ましくは、Ｘ３は、−Ｃ３Ｈ６−、−Ｃ４Ｈ８−、−Ｃ６Ｈ１２−および−Ｃ８Ｈ１６−からなる群から選択され、特に−Ｃ４Ｈ８−、−Ｃ６Ｈ１２−および−Ｃ８Ｈ１６−からなる群から選択される。
【００５７】
第３の態様において、本発明は、式（ＩＩＩ）の化合物を提供する：
【００５８】
【化１３】
2019510793.tif 000014
【００５９】
ここで：
Ｓは、糖を表し；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたはエチレングリコール幹（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（ＣＨ２）２−を表し、ｍは、１，２、または３であり、
Ｐは、修飾リン酸基であり；
Ｘ２は、式−Ｃ３Ｈ６−Ｏ−ＣＨ２−のアルキレンエーテルであり；
Ａは、分岐単位であり；
Ｘ３は、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ３Ｈ６−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４−Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ５Ｈ１０−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ７Ｈ１４−および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６−からなる群から選択され、それぞれの場合において−ＣＨ２−基がＡに結合しており；
Ｚは、核酸であり；
Ｘ３とＺとの間の結合はリン酸またはチオリン酸である。
【００６０】
上記分岐単位は、炭素を含んでもよい。好ましくは、分岐単位は炭素である。
【００６１】
Ｘ３は、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ５Ｈ１０−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ７Ｈ１４−および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６−からなる群から選択されうる。好ましくは、Ｘ３は、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４Ｈ８、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６からなる群から選択される。
【００６２】
上記の態様のいずれについても、Ｐは、修飾リン酸基を表す。Ｐは、以下のように表されうる：
【００６３】
【化１４】
2019510793.tif 000015
【００６４】
ここで、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立して＝Ｏ、＝Ｓ、−Ｏ−、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＢＨ３、−ＯＣＨ２ＣＯ２、−ＯＣＨ２ＣＯ２Ｒｘ、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｓ）ＯＲｘおよび−ＯＲｘ（式中、ＲｘはＣ１−Ｃ６アルキルを表す）を表し、この際、
【００６５】
【化１５】
2019510793.tif 000016
【００６６】
は、化合物の残りの部分への結合を示す。
【００６７】
例えば、Ｙ１が−ＯＨを表してもよく、Ｙ２が＝Ｏまたは＝Ｓを表してもよく；または、
Ｙ１が−Ｏ−を表してもよく、Ｙ２が＝Ｏまたは＝Ｓを表してもよく；
Ｙ１が＝Ｏを表してもよく、Ｙ２が−ＣＨ３、−ＳＨ、−ＯＲｘまたは−ＢＨ３を表してもよく；
Ｙ１が＝Ｓを表してもよく、Ｙ２が−ＣＨ３、ＯＲｘまたは−ＳＨを表してもよい。
【００６８】
ある場合には、Ｙ１とＹ２との間に非局在化が存在することは、当業者には理解されるであろう。
【００６９】
好ましくは、修飾リン酸基はチオホスフェート基である。チオホスフェート基は、ジチオホスフェート（すなわち、Ｙ１が＝Ｓを表し、Ｙ２が−Ｓ−を表す）およびモノチオホスフェート（すなわち、Ｙ１が−Ｏ−を表し、Ｙ２が＝Ｓを表すか、またはＹ１が＝Ｏを表し、Ｙ２が−Ｓ−を表す）を含む。好ましくは、Ｐはモノチオホスフェートである。本発明者らは、ホスフェート基の代わりにチオホスフェート基を有するコンジュゲートによれば、インビボでの効力および作用持続時間が改善されることを見出した。
【００７０】
Ｐはまた、エチルホスフェート（すなわち、Ｙ１が＝Ｏを表し、Ｙ２がＯＣＨ２ＣＨ３を表す）であってもよい。
【００７１】
糖は、リガンドとも呼ぶことができ、標的細胞上の少なくとも１つのタイプの受容体に対する親和性を有するように選択されうる。特に、受容体は、哺乳動物の肝細胞の表面上のものであり、例えば、肝臓アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）である。
【００７２】
上記の態様のいずれについても、糖は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、ガラクトース、グルコース、グルコサミンおよびフルクトースから選択されうる。好ましくは、糖は、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。本発明の化合物は、３つのリガンドを有し、これはそれぞれ好ましくはＮ−アセチルガラクトサミンである。
【００７３】
「ＧａｌＮＡｃ」は、２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースを意味し、文献中ではＮ−アセチルガラクトサミンと一般に呼ばれている。「ＧａｌＮＡｃ」または「Ｎ−アセチルガラクトサミン」への言及は、β型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースおよびα型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノースの双方を含む。特定の実施形態では、β型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースおよびα型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノースが互換的に使用されうる。好ましくは、本発明の化合物は、β型、すなわち２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースを含む。
【００７４】
【化１６】
2019510793.tif 000017
【００７５】
本発明の化合物の「Ｘ１−Ｐ−Ｘ２」部分は、テザーまたはリンカーとも称されうる。このリンカーは直鎖状の基を含み、上記糖リガンドおよび上記分岐単位に共有結合している。
【００７６】
上記の態様のいずれについても、Ｘ１は、エチレングリコール幹（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−（式中、ｍは１、２または３である）でありうる。Ｘ１は、（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）（−ＣＨ２）２−であってもよい。Ｘ１は、（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）２（−ＣＨ２）２−であってもよい。Ｘ１は、（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）３（−ＣＨ２）２−であってもよい。好ましくは、Ｘ１は、（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）２（−ＣＨ２）２−である。あるいは、Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンを表す。Ｘ１は、プロピレンでありうる。Ｘ１は、ブチレンであってもよい。Ｘ１は、ペンチレンであってもよい。Ｘ１は、ヘキシレンであってもよい。好ましくは、アルキルは、直鎖アルキレンである。特に、Ｘ１はブチレンであってもよい。
【００７７】
第３の態様の化合物について、Ｘ２は、式−Ｃ３Ｈ６−Ｏ−ＣＨ２−のアルキレンエーテル（すなわち、Ｃ３アルコキシメチレンまたは−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２−）を表す。
【００７８】
第４の態様において、本発明は、以下の構造を有するコンジュゲート化合物を提供する：
【００７９】
【化１７】
2019510793.tif 000018
【００８０】
ここで、Ｚは核酸である。
【００８１】
第５の態様において、本発明は、以下の構造を有するコンジュゲート化合物を提供する：
【００８２】
【化１８】
2019510793.tif 000019
【００８３】
ここで、Ｚは核酸である。
【００８４】
第６の態様において、本発明は、以下の構造を有するコンジュゲート化合物を提供する：
【００８５】
【化１９】
2019510793.tif 000020
【００８６】
ここで、Ｚは核酸である。
【００８７】
第７の態様において、本発明は、以下の構造を有するコンジュゲート化合物を提供する：
【００８８】
【化２０】
2019510793.tif 000021
【００８９】
ここで、Ｚは核酸である。
【００９０】
第８の態様において、本発明は、以下の構造を有するコンジュゲート化合物を提供する：
【００９１】
【化２１】
2019510793.tif 000022
【００９２】
ここで、Ｚは核酸である。
【００９３】
第９の態様において、本発明は、以下の構造を有するコンジュゲート化合物を提供する：
【００９４】
【化２２】
2019510793.tif 000023
【００９５】
ここで、Ｚは核酸である。
【００９６】
第１０の態様において、本発明は、以下の構造を有するコンジュゲート化合物を提供する：
【００９７】
【化２３】
2019510793.tif 000024
【００９８】
ここで、Ｚは核酸である。
【００９９】
第１１の態様において、本発明は、以下の構造を有するコンジュゲート化合物を提供する：
【０１００】
【化２４】
2019510793.tif 000025
【０１０１】
ここで、Ｚは核酸である。
【０１０２】
本明細書に記載される全ての場合において、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびＬＮＡからなる群から選択されうる。
【０１０３】
核酸は、機能的核酸であってもよく、好ましくは、当該機能的核酸は、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡを、ＲＮＡとＤＮＡとの組み合わせ、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマーおよびシュピーゲルマーからなる群から選択される。特に、核酸はｓｉＲＮＡであってもよい。
【０１０４】
核酸は、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマーおよびスピーゲルマーから選択されうる。
【０１０５】
核酸は任意の長さであってよく、それらがＲＮＡｉとして有効であるような任意の数のヌクレオチドを有しうる。好ましくは、ｓｉＲＮＡは１５〜３０ヌクレオチドの範囲である。二本鎖ＲＮＡの二本鎖領域は、ワトソン−クリック塩基対形成を用いて１５〜３０ヌクレオチド塩基対の範囲でありうる。二本鎖領域は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０の塩基対を含みうる。
【０１０６】
好ましくは、核酸は、１９〜２３の塩基対を有する。例えば、核酸は、１９、２０、２１、２２または２３塩基対の長さでありうる。
【０１０７】
二本鎖ｉＲＮＡは、一端または両端が平滑末端でありうる。二本鎖ｉＲＮＡは、一方または両方の鎖の一方または両方の末端に１または２以上のヌクレオチドのオーバーハングを有しうる。オーバーハングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチド長でありうる。
【０１０８】
上記態様のいずれについても、核酸は修飾核酸でありうる。修飾は、核酸または塩基の類似体による置換または挿入、ならびに塩基、糖またはリン酸部分の化学修飾から選択されうる。
【０１０９】
核酸は、ａ）両端で平滑末端になっていてもよいし、ｂ）一方の端にオーバーハングを有し、他方の端が平滑末端であってもよいし、ｃ）両端にオーバーハングを有してもよい。
【０１１０】
第１の鎖および／または第２の鎖上の１つまたは複数のヌクレオチドを修飾して修飾ヌクレオチドを形成してもよい。第１の鎖の奇数番目のヌクレオチドの１つ以上を修飾することができる。第１の鎖の偶数番目のヌクレオチドの１つ以上は、少なくとも１つの第２の修飾によって修飾することができ、この際、少なくとも第２の修飾は１つ以上の奇数番目のヌクレオチドの修飾とは異なる。１つ以上の修飾された偶数番目のヌクレオチドの少なくとも１つは、１つ以上の修飾された奇数番目のヌクレオチドの少なくとも１つに隣接していてもよい。
【０１１１】
本発明の核酸において、第１の鎖中の複数の奇数番目のヌクレオチドが修飾されていてもよい。第１の鎖中の複数の偶数番目のヌクレオチドは、第２の修飾によって修飾することができる。第１の鎖は、共通の修飾によって修飾された隣接するヌクレオチドを含むことができる。第１の鎖はまた、第２の異なる修飾によって修飾された隣接するヌクレオチドを含んでもよい。
【０１１２】
第２の鎖の奇数番目のヌクレオチドの１つ以上は、第１の鎖の奇数番目のヌクレオチドの修飾とは異なる修飾によって修飾されてもよく、および／またはｍ第２の鎖の偶数番目のヌクレオチドの１つ以上が第１の鎖の奇数番目のヌクレオチドと同じ修飾によって修飾されてもよい。第２の鎖の１つ以上の修飾された偶数番目のヌクレオチドの少なくとも１つは、１つ以上の修飾された奇数番目のヌクレオチドに隣接していてもよい。第２の鎖の複数の奇数番目のヌクレオチドは、共通の修飾によって修飾することができ、および／または、複数の偶数番目のヌクレオチドを、第１の鎖の奇数番目のヌクレオチドに存在するのと同じ修飾によって修飾することができる。第２の鎖上の複数の奇数番目のヌクレオチドは、第２の修飾によって修飾することができ、この際、第２の修飾は、第１の鎖の奇数番目のヌクレオチドの修飾とは異なる。
【０１１３】
第２の鎖は、第１の鎖の奇数番目のヌクレオチドの修飾とは異なる第２の修飾でありうる共通の修飾によって修飾された隣接するヌクレオチドを含む。
【０１１４】
本発明の核酸において、第１の鎖の奇数番目のヌクレオチドおよび第２の鎖の偶数番目のヌクレオチドの各々は、共通の修飾で修飾されてもよく、偶数番目のヌクレオチドの各々は、第２の修飾を伴い、奇数番目のヌクレオチドの各々は、第２の異なる修飾によって第２の鎖において修飾されうる。
【０１１５】
本発明の核酸は、第１の鎖の修飾されたヌクレオチドを、第２の鎖の未修飾または異なる修飾がなされたヌクレオチドと比較して少なくとも１つのヌクレオチドだけシフトさせて有してもよい。
【０１１６】
１つの修飾および／または複数の修飾は、それぞれ独立して、３’末端のデオキシチミン、２’Ｏメチル、２’デオキシ修飾、２’アミノ修飾、２’アルキル修飾、モルホリノ修飾、５’−ホスホロチオエート基修飾、５’リン酸または５’−リン酸模倣体修飾、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基修飾からなる群から選択することができ、および／または、修飾ヌクレオチドは、ロックドヌクレオチド、無塩基ヌクレオチドまたはヌクレオチドを含む非天然塩基であってもよい。少なくとも１つの修飾は２’−Ｏ−メチルであってよく、および／または、少なくとも１つの修飾は２’−Ｆでありうる。
【０１１７】
核酸とは、遺伝子発現を妨害することができるヌクレオチドを含む２つの鎖を含む核酸を意味する。阻害は、完全または部分的であり得、標的化された様式で遺伝子発現の下方制御をもたらす。核酸は、第１の鎖（ガイド鎖でありうる）および第２の鎖（パッセンジャー鎖でありうる）である２つの別個のポリヌクレオチド鎖を含む。第１の鎖および第２の鎖は、二本鎖分子を形成するために「折り畳まれる」自己相補的である同じポリヌクレオチド分子の一部であってもよい。核酸は、ｓｉＲＮＡ分子であってもよい。
【０１１８】
第１の鎖は、アンチセンス鎖とも称されうる。第２の鎖は、センス鎖とも称されうる。
【０１１９】
核酸は、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体を含みうる。核酸はさらに、第１の鎖（当技術分野ではガイド鎖としても知られている）の全部または一部および第２の鎖（当技術分野ではパッセンジャー鎖としても知られている）の全部または一部によって形成される二本鎖核酸部分または二本鎖領域をさらに含みうる。二本鎖領域は、第１の鎖と第２の鎖との間に形成される最初の塩基対から始まり、第１の鎖と第２の鎖との間に形成される最後の塩基対で終わる（両端を含む）と定義される。
【０１２０】
二本鎖領域とは、ワトソン−クリック塩基対形成または相補的または実質的に相補的なオリゴヌクレオチド鎖間の二本鎖を可能にする他の任意の方法によって、互いに塩基対を形成する２つの相補的または実質的に相補的なオリゴヌクレオチドにおける領域を意味する。例えば、２１ヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチド鎖は、２１ヌクレオチド単位の別のオリゴヌクレオチドと塩基対を形成することができるが、各鎖上の１９ヌクレオチドのみが相補的または実質的に相補的であると、「二本鎖領域」は１９塩基対からなる。残りの塩基対は、５’および３’オーバーハングとして、または一本鎖領域として存在しうる。さらに、二本鎖領域内では、１００％相補性は必要ではなく、二本鎖領域内では実質的な相補性が許容される。実質的な相補性とは、それらが生物学的条件下でアニーリングすることができるような鎖間の相補性を指す。２つの鎖が生物学的条件下でアニーリングすることができるかどうかを経験的に決定する技術は、当技術分野で周知である。あるいは、２つの鎖を合成し、生物学的条件下で一緒に添加して、それらが互いにアニールするかどうかを決定することができる。
【０１２１】
少なくとも１つの二本鎖領域を形成する第１の鎖および第２の鎖の部分は、完全に相補的であってもよく、互いに少なくとも部分的に相補的であってもよい。核酸の長さに依存して、第１の鎖と第２の鎖との間の塩基相補性に関して完全に一致する必要は必ずしもない。しかしながら、第１の鎖および第２の鎖は、生理学的条件下でハイブリダイズすることができなければならない。
【０１２２】
少なくとも１つの二本鎖領域における第１の鎖と第２の鎖との間の相補性は、いずれの鎖にもヌクレオチドミスマッチまたは付加／欠失ヌクレオチドが存在しない点で完全でありうる。あるいは、相補性は完全ではなくてもよい。相補性は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％でありうる。
【０１２３】
第１の鎖および第２の鎖はそれぞれ、３個までのヌクレオチドだけが異なる少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む相補性の領域をそれぞれ含むことができる。
【０１２４】
本明細書中で使用される「オーバーハング」は、当技術分野における通常のおよび慣習的な意味、すなわち、二本鎖核酸中の相補鎖の末端ヌクレオチドを超えて伸びる核酸の一本鎖部分という意味を有する。用語「平滑末端」は、末端ヌクレオチドが塩基対を形成しているかどうかにかかわらず、両方の鎖が同じ位置で終結する二本鎖核酸を含む。平滑末端における第１の鎖および第２の鎖の末端ヌクレオチドは、塩基対を形成していてもよい。平滑末端における第１の鎖および第２の鎖の末端ヌクレオチドは、塩基対を形成していなくてもよい。平滑末端における第１の鎖および第２の鎖の末端の２つのヌクレオチドは、塩基対を形成していてもよい。平滑末端における第１の鎖および第２の鎖の末端の２つのヌクレオチドは、塩基対を形成していなくてもよい。
【０１２５】
核酸は、一端にオーバーハングを有し、他端に平滑末端を有しうる。核酸は、両端にオーバーハングを有していてもよい。核酸は、両端で平滑末端になっていてもよい。核酸は、第１の鎖の５’末端および第２の鎖の３’末端を有する末端で平滑末端になっていてもよいし、または第１の鎖の３’末端および第２の鎖の５’末端を有する末端で平滑末端になっていてもよい。
【０１２６】
核酸は、３’末端または５’末端にオーバーハングを含みうる。核酸は、第１の鎖上に３’オーバーハングを有しうる。核酸は、第２の鎖上に３’オーバーハングを有しうる。核酸は、第１の鎖上に５’オーバーハングを有しうる。核酸は、第２の鎖上に５’オーバーハングを有しうる。核酸は、第１の鎖の５’末端および３’末端の両方にオーバーハングを有しうる。核酸は、第２の鎖の５’末端および３’末端の両方にオーバーハングを有しうる。核酸は、第１の鎖上に５’オーバーハングを有し、第２の鎖上に３’オーバーハングを有しうる。核酸は、第１の鎖上に３’オーバーハングを有し、第２の鎖上に５’オーバーハングを有しうる。核酸は、第１の鎖上に３’オーバーハングを有し、第２の鎖上に３’オーバーハングを有しうる。核酸は、第１の鎖上に５’オーバーハングを有し、第２の鎖上に５’オーバーハングを有しうる。
【０１２７】
第２の鎖または第１の鎖の３’末端または５’末端のオーバーハングは、１、２、３、４および５ヌクレオチドの長さからなるものから選択することができる。必要に応じて、オーバーハングは、１個または２個のヌクレオチドからなっていてもよく、修飾されていてもいなくてもよい。
【０１２８】
未修飾ポリヌクレオチド、特にリボヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼによる分解を受けやすい可能性があり、したがって、修飾／修飾ヌクレオチドは本発明の核酸に含まれうる。
【０１２９】
本発明の核酸の第２の鎖および／または第１の鎖上の１つまたは複数のヌクレオチドは修飾されていてもよい。
【０１３０】
本発明の核酸の修飾は、一般に、天然ＲＮＡ分子に固有のインビトロおよびインビボでの安定性およびバイオアベイラビリティを含むが、これに限定されない潜在的な限界を克服する強力なツールを提供する。本発明による核酸は、化学修飾によって修飾されうる。修飾された核酸はまた、ヒトにおいてインターフェロン活性を誘導する可能性を最小にすることもできる。修飾は、標的細胞への核酸の機能的送達をさらに増強することができる。本発明の修飾された核酸は、第１の鎖または第２の鎖のいずれかまたは両方の１つ以上の化学的に修飾されたリボヌクレオチドを含みうる。リボヌクレオチドは、塩基部分、糖部分またはリン酸部分の化学修飾を含みうる。リボ核酸は、核酸または塩基の類似体による置換または挿入によって修飾されうる。
【０１３１】
本発明の核酸の１つ以上のヌクレオチドは修飾されていてもよい。核酸は、少なくとも１つの修飾されたヌクレオチドを含みうる。修飾されたヌクレオチドは、第１の鎖上に存在しうる。修飾されたヌクレオチドは、第２の鎖に存在しうる。修飾されたヌクレオチドは、二本鎖領域内にあってもよい。修飾されたヌクレオチドは、二本鎖領域の外側、すなわち一本鎖領域内にあってもよい。修飾されたヌクレオチドは、第１の鎖上にあって、二本鎖領域の外側にあってもよい。修飾されたヌクレオチドは、第２の鎖上にあって、二本鎖領域の外側にあってもよい。第１の鎖の３’末端ヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであってもよい。第２の鎖の３’末端ヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであってもよい。第１の鎖の５’末端ヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであってもよい。第２の鎖の５’末端ヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであってもよい。
【０１３２】
本発明の核酸は、１個の修飾されたヌクレオチドを有していてもよく、または本発明の核酸は約２〜４個の修飾されたヌクレオチドを有していてもよく、または核酸は約４〜６個の修飾されたヌクレオチド、約８〜１０個の修飾ヌクレオチド、約１２〜１４個の修飾ヌクレオチド、約１４〜１６個の修飾ヌクレオチド、約１６〜１８個の修飾ヌクレオチド、約１８〜２０個の修飾ヌクレオチド、約２０〜２２個の修飾ヌクレオチド、約２２〜２４個の修飾ヌクレオチド、約２４〜２６個の修飾ヌクレオチドまたは約２６〜２８個の修飾ヌクレオチドを有していてもよい。それぞれの場合において、前記修飾ヌクレオチドを含む核酸は、前記修飾ヌクレオチドを含まない同じ核酸と比較して少なくとも５０％のその活性を保持する。当該核酸は、前記修飾ヌクレオチドを含まない同じ核酸と比較して５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは１００％またはそれよりも多いその活性を保持しうる。
【０１３３】
修飾されたヌクレオチドは、プリンまたはピリミジンでありうる。プリンの少なくとも半分が修飾されていてもよい。ピリミジンの少なくとも半分が修飾されていてもよい。全てのプリンが修飾されていてもよい。全てのピリミジンが修飾されていてもよい。修飾されたヌクレオチドは、３’末端デオキシチミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’Ｏメチル修飾ヌクレオチド、２’修飾ヌクレオチド、２’デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、２’アミノ修飾ヌクレオチド、２’アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、ヌクレオチドを含む非天然塩基、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、５’リン酸基または５’リン酸基模倣体を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオチドからなる群から選択されうる。
【０１３４】
この核酸は、修飾ヌクレオチドを含むヌクレオチドを含むことができ、この際、塩基は、２−アミノアデノシン、２，６−ジアミノプリン、イノシン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）、６−アザピリミジン、６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン、キューオシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、ワイブトシン、ワイブトキソシン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、１−メチルアデノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、３−メチルシチジン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、ウリジン−５−オキシ酢酸および２−チオシチジンから選択される。
【０１３５】
本明細書で論じる核酸は、非修飾ＲＮＡのほか、例えば有効性を改善するために修飾されたＲＮＡ、およびヌクレオシド代用物のポリマーを含む。非修飾ＲＮＡは、核酸の成分、すなわち糖、塩基、およびリン酸部分が、天然に存在するものと同じまたは実質的に同じである（例えば、人体において自然に生じる）分子を指す。本明細書で使用される修飾ヌクレオチドは、核酸の１つ以上の成分、すなわち糖、塩基およびリン酸部分が天然に存在するものと異なるヌクレオチドを指す。それらは修飾ヌクレオチドと呼ばれるが、修飾のために、もちろんヌクレオチドではない分子、例えばリボホスエフェート骨格が鎖間のハイブリダイゼーションを可能にする非リボホスフェート構造で置換された（すなわち、修飾ヌクレオチドがリボホスフェート骨格を模倣している）ポリヌクレオチド分子を含む。
【０１３６】
核酸内で生じる以下に記載される修飾の多くは、ポリヌクレオチド分子内で、例えば、塩基、リン酸部分、またはリン酸部分の非結合Ｏの修飾のように繰り返される。場合によっては、ポリヌクレオチド中の可能な全ての位置／ヌクレオチドにおいて修飾が起こるが、多くの場合、そうではない。修飾は、３’または５’末端位置でのみなされてもよく、末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の２、３、４、５または１０ヌクレオチドなどの末端領域でのみなされてもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、またはその両方において生じうる。修飾は、本発明の核酸の二本鎖領域でのみなされてもよく、または本発明の核酸の一本鎖領域でのみなされてもよい。非連結Ｏ位でのホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端でのみなされうるが、末端領域、例えば末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の２、３、４または５ヌクレオチドの位置でのみなされてもよく、二本鎖領域および／または一本鎖領域の特に末端でなされてもよい。５’末端または３’末端はリン酸化されていてもよい。
【０１３７】
本発明の核酸の安定性は、オーバーハングに特定の塩基を含ませるか、または修飾されたヌクレオチドを一本鎖オーバーハング、例えば５’もしくは３’オーバーハング、またはその両方に含ませることによって増加させることができる。プリンヌクレオチドがオーバーハングに含まれてもよい。３’または５’オーバーハングの塩基のすべてまたは一部を修飾してもよい。修飾は、リボース糖の２’ＯＨ基における修飾の使用、リボヌクレオチドの代わりのデオキシリボヌクレオチドの使用、およびホスホチオエート修飾などのリン酸基の修飾を含むことができる。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
【０１３８】
ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解することができる。しかしながら、核酸への化学修飾は、改善された特性を付与することができ、オリゴリボヌクレオチドをヌクレアーゼに対してより安定にすることができる。
【０１３９】
本明細書中で使用される場合、修飾された核酸は、以下の１つ以上を含みうる：
（ｉ）非結合のリン酸基酸素および／または１つ以上の結合リン酸基酸素の一方または双方の改変（例えば、置換）（本発明の核酸の５’末端および３’末端に存在していても結合と称する）；
（ｉｉ）リボース糖の構成成分（例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシル）の改変（例えば、置換）；
（ｉｉｉ）リン酸部分の「脱リン」リンカーによる置換；
（ｉｖ）天然に存在する塩基の修飾または置換；
（ｖ）リボース−リン酸骨格の置換または修飾；
（ｖｉ）ＲＮＡの３’末端または５’末端の修飾（例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置換、またはＲＮＡの３’末端または５’末端のいずれかへの蛍光標識された部分の共役）。
【０１４０】
置換、修飾、改変という用語は、天然に存在する分子との差異を示す。
【０１４１】
特定の改変については、以下でより詳細に説明する。
【０１４２】
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、非結合酸素の両方が硫黄で置換されている。リン酸基中の１つ、それぞれまたは両方の非結合酸素は、それぞれ独立して、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、ＮまたはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリールである）のいずれか１つでありうる。
【０１４３】
ホスフェートリンカーは、結合酸素を窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）および炭素（架橋メチレンホスホネート）で置換することによって修飾することもできる。置換は末端酸素でなされてもよい。非結合酸素は窒素によって置換されてもよい。
【０１４４】
修飾されたヌクレオチドは、糖基の修飾を含むことができる。２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、多くの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または置換されうる。
【０１４５】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えばＲ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２’ヒドロキシルが、例えばメチレン架橋によって、同じリボース糖の４’炭素に結合している「ロックド」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）が挙げられる。
【０１４６】
「デオキシ」修飾としては、水素ハロ；アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノまたはジヘテロアリールアミノ）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；並びに、例えばアミノ官能基で任意に置換されていてもよいアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニルが挙げられる。特定の実施形態の他の置換基としては、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３，２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリルおよび２’−フルオロが挙げられる。
【０１４７】
糖基はまた、リボース中の対応する炭素とは反対の立体化学配置を有する１つ以上の炭素を含むことができる。したがって、修飾されたヌクレオチドは、アラビノースなどの糖を含みうる。
【０１４８】
修飾されたヌクレオチドはまた、Ｃ−Ｉ’において核酸塩基を欠いている「無塩基」糖を含むことができる。これらの無塩基糖は、構成糖原子の１つ以上の修飾をさらに含むことができる。
【０１４９】
２’修飾は、１つ以上のホスフェートリンカー修飾（例えば、ホスホロチオエート）と組み合わせて使用されうる。
【０１５０】
リン酸基は、非リン含有連結基で置き換えることができる。
【０１５１】
リン酸基を置換することができる部分の例としては、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。特定の実施形態において、置換は、メチレンカルボニルアミノ基およびメチレンメチルイミノ基を含みうる。
【０１５２】
リン酸リンカーおよびリボース糖は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドで置き換えられてもよい。
【０１５３】
例としては、モフィリノ、シクロブチル、ピロリジンおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代用物が挙げられる。特定の実施形態では、ＰＮＡ代用物を使用することができる。
【０１５４】
オリゴヌクレオチドの３’末端および５’末端は修飾することができる。そのような修飾は、分子の３’末端または５’末端または両端に存在し得る。これらは、末端リン酸基全体またはリン酸基の１つ以上の原子の修飾または置換を含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドの３’および５’末端は、例えばフルオロフォア（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素もしくはＣｙ５色素）などの標識部分、または保護基（例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素またはエステルに基づく）のような他の機能的分子体に結合させることができる。この機能的分子体は、リン酸基および／またはリンカーを介して糖に結合することができる。リンカーの末端原子は、リン酸基または糖のＣ−３’またはＣ−５’Ｏ、Ｎ、ＳもしくはＣ基の連結原子に連結または置換することができる。あるいは、リンカーは、ヌクレオチド代用物（例えば、ＰＮＡ）の末端原子に接続するか、または置換することができる。これらのスペーサーまたはリンカーは、例えば、−（ＣＨ２）Ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（例えば、ｎ＝３または６）、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、もしくはモルホリノ、またはビオチンおよびフルオレセイン試薬を含みうる。３’末端は−ＯＨ基であってもよい。
【０１５５】
末端修飾の他の例としては、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン類）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン類（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環芳香族炭化水素類（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ類（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド共役体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール共役体、テトラアザマクロサイクルのＥｕ３＋錯体）が挙げられる。
【０１５６】
活性を調節する、または分解に対する耐性を調節するなどの多くの理由で末端修飾を加えることができる。活性の調節に有用な末端修飾には、リン酸またはリン酸類似体による５’末端の修飾がある。本発明の核酸は、第一鎖または第二鎖上で５’リン酸化されていてもよく、または５’プライム末端にホスホリル類似体を含んでいてもよい。５’−リン酸修飾としては、ＲＩＳＣ媒介性の遺伝子サイレンシングに適合性のものが挙げられる。適切な修飾としては、５’−モノホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−ジホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−トリホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオホスフェート（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオエート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／硫黄の任意の追加の組み合わせで置換されたモノホスフェート、ジホスフェートおよびトリホスフェート（例えば、５’−α−チオトリホスフェート、５’−γ−チオトリホスフェートなど）、５’−ホスホルアミダイト類（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルホストネート類（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−ビニルホスホネート、５’−アルキルエーテルホスホネート類（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）が挙げられる。
【０１５７】
本発明の核酸は、第１および／または第２の鎖の１つまたは複数の末端に１つまたは複数のホスホロチオエート修飾を含むことができる。必要に応じて、第１の鎖のそれぞれまたはいずれかの末端は、１または２または３個のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含み得る。必要に応じて、第２の鎖のそれぞれまたはいずれかの末端は、１または２または３個のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含み得る。必要に応じて、第１の鎖の両端および第２の鎖の５’末端は、２つのホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含み得る。ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドと隣接ヌクレオチドとの間の結合が、標準的なリン酸基ではなくホスホロチオエート基を含むことを意味する。
【０１５８】
末端修飾は、分布のモニタリングにも有用である可能性があり、そのような場合、添加される基としては、フルオロフォア、例えばフルオルセインまたはＡｌｅｘａ色素が挙げられる。末端修飾はまた、取り込みを増強するために有用である可能性があり、これに対する有用な修飾としては、コレステロールが挙げられる。末端修飾はまた、ＲＮＡ因子を別の部分に架橋するのにも有用であり得る。
【０１５９】
アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルは、ＲＮＡ中に見出される最も一般的な塩基である。これらの塩基は、改良された特性を有するＲＮＡを提供するために修飾または置換することができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴリボヌクレオチドは、これらの塩基または合成および天然の核酸塩基（例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシンまたはツベルシジン）および上記修飾のいずれかを用いて調製することができる。あるいは、上記塩基のいずれかの置換または修飾類似体および「ユニバーサル塩基」を使用することができる。例としては、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル、８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニン類およびグアニン類、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシル類およびシトシン類、７−メチルグアニン、５−置換ピリミジン類、６−アザピリミジン類およびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン類が挙げられ、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、３−デアザ−５−アザシトシン、２−アミノプリン、５−アルキルウラシル、７−アルキルグアニン、５−アルキルシトシン、７−デアザアデニン、Ｎ６、Ｎ６−ジメチルアデニン、２，６−ジアミノプリン、５−アミノアリルウラシル、Ｎ３−メチルウラシル、置換１，２，４−トリアゾール類、２−ピリジノン類、５−ニトロインドール、３−ニトロインドール、５−メトキシウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、５−メトキシカルボニルメチルウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル、５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ＜４＞−アセチルシトシン、２−チオシトシン、Ｎ６−メチルアアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、Ｎ−メチルグアニン類、またはＯ−アルキル化塩基がある。
【０１６０】
本明細書で使用する場合、用語「非対合ヌクレオチド類似体」は、非塩基対合部分を含むヌクレオチド類似体を意味し、以下のものが挙げられるがこれに限定されない：６デスアミノアデノシン（ネブラリン）、４−Ｍｅインドール、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、Ｄｓ、Ｐａ、Ｎ３−ＭｅリボＵ、Ｎ３−ＭｅリボＴ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＴ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＧ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＡ、Ｎ３−エチル−ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ  ｄＣ。いくつかの実施形態では、非塩基対形成ヌクレオチド類似体はリボヌクレオチドである。他の実施形態では、デオキシリボヌクレオチドである。
【０１６１】
本明細書で使用される場合、用語「末端官能基」には、ハロゲン、アルコール、アミン、カルボン酸、エステル、アミド、アルデヒド、ケトン、エーテル基が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６２】
特定の部分が第１の鎖または第２の鎖の５’末端に連結されてもよく、無塩基リボース部分、無塩基デオキシリボース部分、２’Ｏアルキル修飾などの修飾無塩基リボースおよび修飾無塩基デオキシリボース部分；逆位無塩基性リボースおよび逆位無塩基デオキシリボース部分並びにその修飾体、Ｃ６−イミノ−Ｐｉ；Ｌ−ＤＮＡおよびＬ−ＲＮＡなどのミラーヌクレオチド；５’ＯＭｅヌクレオチド；および４’，５’−メチレンヌクレオチドなどのヌクレオチド類似体；１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルホスフェート；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート、６−アミノヘキシルホスフェート；１２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；α−ヌクレオチド；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環状３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位無塩基部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；ブリッジングまたは非ブリッジングメチルホスホネートおよび５’−メルカプト部分が挙げられる。
【０１６３】
本発明の核酸は、１つ以上の逆位ヌクレオチド、例えば逆位チミジンまたは逆位アデニンを含み得る（例えば、Ｔａｋｅｉら、２００２．ＪＢＣ２７７（２６）：２３８００−０６を参照のこと）。
【０１６４】
本明細書で使用される場合、遺伝子発現に関して「阻害する」、「ダウンレギュレートする」、または「低減する」という用語は、遺伝子の発現、または１つ以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは等価ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）のレベルの発現が、あるいは、は１つまたは複数のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性が、本発明の核酸の非存在下で観察されるものよりも低減されていることを意味し、例えば、発現は、阻害剤の非存在下で観察されるものより９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％以下まで低減され得る。
【０１６５】
本発明の核酸は、無塩基ヌクレオチドを含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、「無塩基」という用語は、塩基を欠いているか、または１’位に塩基の代わりに他の化学基を有する部分、例えば３’，３’−結合または５’，５’−結合デオキシ無塩基リボース誘導体を意味する。
【０１６６】
核酸は、修飾された第２および／または第１の鎖上の１つ以上のヌクレオチドを含み得る。交互のヌクレオチドを修飾して修飾ヌクレオチドを形成することができる。
【０１６７】
本明細書に記載されている「交互に」とは、規則的な方法で次々に起こることを意味する。言い換えれば、交互に繰り返すということは、繰り返して起こることを意味する。例えば、１つのヌクレオチドが修飾されている場合、次の連続したヌクレオチドは修飾されず、続く連続したヌクレオチドは修飾され、以下同様である。１つのヌクレオチドを第１の修飾で修飾し、次の隣接するヌクレオチドを第２の修飾で修飾し、次の連続ヌクレオチドを第１の修飾で修飾し、以下同様であるが、この際、第１および第２の修飾は異なる。
【０１６８】
本発明の核酸の第１の鎖の奇数番目のヌクレオチドの１つ以上が修飾されていてもよく、この際、第１の鎖は５’から３’へと番号が付けられる。本明細書に記載の「奇数番号」という用語は、２で割り切れない数を意味する。奇数の例は、１、３、５、７、９、１１などである。本発明の核酸の第１の鎖の偶数番目のヌクレオチドの１つ以上が修飾されていてもよく、この際、第１の鎖は５’から３’へと番号が付けられる。本明細書に記載の「偶数番号」という用語は、２で割り切れる数を意味する。偶数の例は、２、４、６、８、１０、１２、１４などである。本発明の核酸の第２の鎖の奇数番目のヌクレオチドの１つ以上が修飾されていてもよく、この際、第２の鎖は３’から５’へと番号が付けられる。本発明の核酸の第２の鎖の偶数番号のヌクレオチドの１つ以上が修飾されていてもよく、この際、第２の鎖は３’から５’へと番号が付けられる。
【０１６９】
第１および／または第２の鎖上の１つまたは複数のヌクレオチドを修飾して修飾ヌクレオチドを形成することができる。第１の鎖の奇数番目のヌクレオチドの１つ以上を修飾することができる。第１の鎖の偶数番号のヌクレオチドの１つ以上は、少なくとも第２の修飾によって修飾することができ、この際、少なくとも第２の修飾は１つ以上の偶数番目のヌクレオチドの修飾とは異なる。１つ以上の修飾偶数ヌクレオチドの少なくとも１つは、１つ以上の修飾奇数ヌクレオチドの少なくとも１つに隣接していてもよい。
【０１７０】
本発明の核酸においては、第１の鎖中の複数の奇数番号のヌクレオチドが修飾されていてもよい。第１の鎖中の複数の偶数番号のヌクレオチドは、第２の修飾によって修飾されていてもよい。第１の鎖は、共通の修飾によって改変された隣接するヌクレオチドを含むことができる。第１の鎖はまた、第２の異なる修飾によって改変された隣接するヌクレオチドを含んでもよい。
【０１７１】
第２の鎖の奇数番目のヌクレオチドの１つ以上は、第１の鎖の奇数番目のヌクレオチドの修飾とは異なる修飾によって修飾されてもよく、および／または、第２の鎖の偶数番目のヌクレオチドの１つ以上は、第１の鎖の奇数番目のヌクレオチドと同じ修飾によって修飾されてもよい。第２の鎖の１つ以上の修飾された偶数のヌクレオチドの少なくとも１つは、１つ以上の修飾された奇数番目のヌクレオチドに隣接していてもよい。第２の鎖の複数の奇数番目のヌクレオチドは共通の修飾によって修飾されてもよく、および／または、複数の偶数番目のヌクレオチドが第１の鎖の奇数番目のヌクレオチドに存在するのと同じ修飾によって修飾されてもよい。第２の鎖上の複数の奇数番号のヌクレオチドは、第２の修飾によって修飾することができ、この際、第２の修飾は第１の鎖の奇数番号のヌクレオチドの修飾とは異なる。
【０１７２】
第２の鎖は、第１の鎖の奇数番目のヌクレオチドの修飾とは異なる第２の修飾であり得る共通の修飾によって修飾される隣接するヌクレオチドを含み得る。
【０１７３】
本発明の核酸において、第１の鎖の奇数番目のヌクレオチドのそれぞれ、および第２の鎖の偶数番目のヌクレオチドのそれぞれは、共通の修飾で修飾されてもよく、偶数番目のヌクレオチドのそれぞれは、第２の修飾を伴って第１の鎖において改変されてもよく、奇数番目のヌクレオチドのそれぞれは、第２の修飾を伴って第２の鎖において改変されてもよい。
【０１７４】
本発明の核酸は、第２の鎖の未修飾のまたは異なる修飾がなされたヌクレオチドに対して少なくとも１つのヌクレオチドだけシフトさせた、第１の鎖の修飾されたヌクレオチドを有してもよい。
【０１７５】
第１の鎖において奇数番号のヌクレオチドの１つ以上またはそれぞれを修飾し、第２の鎖において偶数番号のヌクレオチドの１つ以上またはそれぞれを修飾することができる。いずれかまたは両方の鎖上の１つ以上またはそれぞれの交互のヌクレオチドは、第２の修飾によって改変され得る。第１の鎖において偶数番号のヌクレオチドの１つ以上またはそれぞれを修飾し、第２の鎖において偶数番号のヌクレオチドの１つ以上またはそれぞれを修飾することができる。いずれかまたは両方の鎖上の１つ以上またはそれぞれの交互のヌクレオチドは、第２の改変によって改変され得る。第１の鎖において奇数番号のヌクレオチドの１つ以上またはそれぞれを修飾し、奇第２の鎖において偶数番号のヌクレオチドの１つ以上を共通の修飾によって修飾することができる。いずれかまたは両方の鎖上の１つ以上またはそれぞれの交互のヌクレオチドは、第２の修飾によって改変され得る。第１の鎖において偶数番号のヌクレオチドの１つ以上またはそれぞれを修飾し、第２の鎖において奇数番号のヌクレオチドの１つまたは複数またはそれぞれを共通の修飾によって修飾することができる。いずれかまたは両方の鎖上の１つ以上のまたはそれぞれの交互のヌクレオチドは、第２の修飾によって改変され得る。
【０１７６】
第１２の態様において、本発明は、上記態様のいずれかによる化合物および適切な担体または賦形剤を含む組成物を提供する。
【０１７７】
第１３の態様において、本発明は、医薬に使用するための第１〜第１１のいずれかの態様に係る化合物または第１２の態様に係る組成物を提供する。
【０１７８】
化合物または組成物は、肝疾患、遺伝子疾患、血友病および出血障害、肝線維症、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、ウイルス性肝炎、稀少疾患（例えば、末端肥大症）、代謝性疾患（例えば、高コレステロール血症、脂質異常症、高トリグリセリド血症）、心血管疾患、肥満、サラセミア、肝損傷（例えば、薬剤誘発性肝障害）、ヘモクロマトーシス、アルコール性肝疾患、アルコール依存性、貧血、並びに慢性疾患の貧血の治療のためのものであり得る。
【０１７９】
上記化合物または組成物は、肝疾患、貧血、慢性疾患、サラセミア；薬剤誘発性肝障害、ヘモクロマトーシスおよび慢性疾患の貧血の治療に使用することができる。
【０１８０】
第１４の態様において、本発明は、幹細胞を、第１〜第１１の態様のいずれかに係る化合物に接触させることを含む、肝細胞への核酸の送達方法を提供する。
【０１８１】
第１５の態様において、本発明は、第１〜第１１の態様のいずれかに係る式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物の製造方法を提供し、当該方法は、各成分を一緒に添加して式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物を形成することを含む。
【０１８２】
以下の構造の基本要素が、この製造方法において用いられ得る。
【０１８３】
【化２５】
2019510793.tif 000026
【０１８４】
【化２６】
2019510793.tif 000027
【０１８５】
ＲＮＡの修飾
本発明のｓｉＲＮＡ分子の修飾は、一般に、天然ＲＮＡ分子に内在するインビトロおよびインビボでの安定性およびバイオアベイラビリティを含むがこれに限定されない潜在的な限界を克服する強力なツールを提供する。本発明によるｓｉＲＮＡは、化学修飾によって修飾することができる。修飾されたｓｉＲＮＡはまた、ヒトにおけるインターフェロン活性の活性化の可能性を最小化することができる。修飾は、標的細胞へのｓｉＲＮＡの機能的送達をさらに増強することができる。本発明の修飾ｓｉＲＮＡは、アンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかまたは両方の１つ以上の化学的に修飾されたリボヌクレオチドを含み得る。リボヌクレオチドは、塩基部分、糖部分またはリン酸部分の化学修飾を含み得る。リボ核酸は、核酸または塩基の類似体による置換または挿入によって修飾され得る。
【０１８６】
本発明のｓｉＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドは、修飾された塩基を含むことができる。一態様では、ｓｉＲＮＡは、修飾塩基を含む少なくとも１つのヌクレオチドを含む。一実施形態では、アンチセンス鎖上の修飾塩基である。別の実施形態では、センス鎖上の修飾塩基である。別の実施形態では、修飾塩基は二本鎖領域にある。別の実施形態では、修飾塩基は二本鎖領域の外側、すなわち一本鎖領域内にある。別の実施形態では、修飾塩基はアンチセンス鎖上にあり、二本鎖領域の外側にある。別の実施形態では、修飾塩基はセンス鎖上にあり、二本鎖領域の外側にある。別の実施形態において、アンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドが、修飾塩基を有するヌクレオチドである。別の実施形態では、センス鎖の３’末端ヌクレオチドが、修飾塩基を有するヌクレオチドである。別の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドが、修飾塩基を有するヌクレオチドである。別の実施形態では、センス鎖の５’末端ヌクレオチドが、修飾塩基を有するヌクレオチドである。
【０１８７】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡは１個の修飾塩基を有することができる。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、約２〜４個の修飾塩基を有し得る。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約４〜６の修飾塩基を有する。他の実施形態では、ｓｉＲＮＡは約６〜８の修飾塩基を有する。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、約８〜１０の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは約１０〜１２の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約１２〜１４の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約１４〜１６の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは約１６〜１８の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは約１８〜２０の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約２０〜２２個の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは約２２〜２４個の修飾塩基を有する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、約２４〜２６個の修飾塩基を有する。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡは約２６〜２８個の修飾塩基を有する。各場合において、前記修飾塩基を含むｓｉＲＮＡは、前記修飾塩基を含まない同じｓｉＲＮＡと比較して、少なくとも５０％の活性を保持する。
【０１８８】
修飾された塩基は、プリンまたはピリミジンであり得る。別の実施形態では、プリンの少なくとも半分が改変される。別の実施形態では、ピリミジンの少なくとも半分が改変される。別の実施形態において、プリンの全てが改変される。別の実施形態において、ピリミジンの全てが改変される。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、修飾塩基を含むヌクレオチドを含んでいてもよく、この際、当該塩基は、２−アミノアデノシン、２，６−ジアミノプリン、イノシン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２、４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）、６−アザピリミジン、６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン、クエオシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、ウィブトシン、ウィブトキソシン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、１−メチルアデノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、３−メチルシチジン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、ウリジン−５−オキシ酢酸および２−チオシチジンから選択される。
【０１８９】
別の態様では、本発明のｓｉＲＮＡは無塩基ヌクレオチドを含む。本明細書で使用される「無塩基」という用語は、塩基を欠いているか、または１’位に塩基の代わりに他の化学基（例えば、３’、３’−結合または５’、５’−結合デオキシ無塩基リボース誘導体）を有する部分を意味する。本明細書中で使用される場合、修飾された塩基を有するヌクレオチドは、無塩基ヌクレオチドを含まない。一態様では、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの無塩基ヌクレオチドを含む。一実施形態では、無塩基ヌクレオチドはアンチセンス鎖上にある。別の実施形態では、無塩基ヌクレオチドはセンス鎖上にある。別の実施形態において、無塩基性ヌクレオチドは二本鎖領域にある。別の実施形態では、無塩基ヌクレオチドは二本鎖領域の外側にある。別の実施形態では、無塩基ヌクレオチドはアンチセンス鎖上にあり、二本鎖領域の外側にある。別の実施形態では、無塩基ヌクレオチドはセンス鎖上にあり、二本鎖領域の外側にある。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドが無塩基ヌクレオチドである。別の実施形態では、センス鎖の３’末端ヌクレオチドが無塩基ヌクレオチドである。別の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドが無塩基ヌクレオチドである。別の実施形態では、センス鎖の５’末端ヌクレオチドが無塩基ヌクレオチドである。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１，２，３，４，５および６から選択される数の無塩基ヌクレオチドを有する。
【０１９０】
糖部分への修飾
別の態様は、糖部分の修飾に関する。本発明のｓｉＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチドは、修飾リボース部分を含み得る。２’−ＯＨが置換されている２’位の修飾としては、アルキル、置換アルキル、アルカリール、アリールアルキル、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＯＣＦ３、−ＯＣＮ、−Ｏ−アルキル、−Ｓ−アルキル、ＨＳ−アルキル−Ｏ、−Ｏ−アルケニル、−Ｓ−アルケニル、−Ｎ−アルケニル、−ＳＯ−アルキル、−アルキル−ＯＳＨ、−アルキル−ＯＨ、−Ｏ−アルキル−ＯＨ、−Ｏ−アルキル−ＳＨ、−Ｓ−アルキル−ＯＨ、−Ｓ−アルキル−ＳＨ、−アルキル−Ｓ−アルキル、−アルキル−Ｏ−アルキル、−ＯＮＯ２、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ−、アミノアルキル−、アミノアルコキシ、アミノ酸、アミノアシル、−ＯＮＨ２、−Ｏ−アミノアルキル、−Ｏ−アミノ酸、−Ｏアミノアシル、ヘテロシクロアルキル−、ヘテロシクロアルカリール−、アミノアルキルアミノ−、ポリアルキルアミノ−、置換シリル、メトキシエチル−（ＭＯＥ）、アルケニルおよびアルキニルから選択される非制限的な例が挙げられる。２’ヒドロキシルが、例えばメチレン架橋によって同じリボース糖の４’炭素に結合している「ロックド」核酸（ＬＮＡ）は、本発明の２’修飾体としてさらに挙げられる。好ましい置換基は、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリルおよび２’−フルオロである。
【０１９１】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１〜５の２’修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは５〜１０の２’修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、１５〜２０の２’修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、２０〜２５の２’修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、２５〜３０の２’修飾ヌクレオチドを含む。
【０１９２】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１〜５の２’−Ｏ−ＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは５〜１０の２’−Ｏ−ＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１５〜２０個の２’−Ｏ−ＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、２０〜２５の２’−Ｏ−ＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、２５〜３０の２’−Ｏ−ＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。
【０１９３】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ二本鎖領域は、１〜５の２’−Ｏ−ＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ二本鎖領域は、５〜１０の２’−Ｏ−ＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ二本鎖領域は、１５〜２０個の２’−Ｏ−ＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ二本鎖領域は、２０〜２５の２’−Ｏ−ＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ二本鎖領域は、２５〜３０の２’−Ｏ−ＣＨ３修飾ヌクレオチドを含む。
【０１９４】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが１９ヌクレオチドであるアンチセンス鎖と、長さが１９ヌクレオチドであるセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７および１９に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖がヌクレオチド２，４，６，８，１０，１２，１４，１６および１８に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、この際、前記アンチセンス鎖は５’から３’に向けて番号付けられており、前記センス鎖は３’から５’に向けて番号付けされている。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが２０ヌクレオチドのアンチセンス鎖と、長さが２０ヌクレオチドのセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７および１９に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖がヌクレオチド２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８および２０に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、この際、前記アンチセンス鎖は５’から３’に向けて番号付けられており、前記センス鎖は３’から５’に向けて番号付けされている。
【０１９５】
別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが２１ヌクレオチドのアンチセンス鎖と、長さが２１ヌクレオチドのセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド１，３，５，７，９，１１，１３，１５，１７，１９および２１に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖がヌクレオチド２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８および２０に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、この際、前記アンチセンス鎖は５’から３’に向けて番号付けられており、前記センス鎖は３’から５’に向けて番号付けされている。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２２ヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖と、２２ヌクレオチドの長さのセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド１，３，５，７，９，１１，１３、１５、１７、１９および２１に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖がヌクレオチド２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０および２２に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、この際、前記アンチセンス鎖は５’から３’に向けて番号付けられており、前記センス鎖は３’から５’に向けて番号付けされている。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２３ヌクレオチドの長さのアンチセンス鎖と、２３ヌクレオチドの長さのセンス鎖とを含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド１，３，５，７，９，１１，１３，１５、１７、１９，２１および２３に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖がヌクレオチド２，４，６，８，１０，１２，１４，１６，１８，２０および２２に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、この際、前記アンチセンス鎖は５’から３’に向けて番号付けられており、前記センス鎖は３’から５’に向けて番号付けされている。
【０１９６】
別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが１８〜２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖および長さが１８〜２３ヌクレオチドのセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド３，５，７，９，１１，１３，１５および１７に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖がヌクレオチド４，６，８，１０，１２，１４および１６に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、この際、前記アンチセンス鎖は５’から３’に向けて番号付けられており、前記センス鎖は３’から５’に向けて番号付けされている。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが１８〜２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖および長さが１８〜２３ヌクレオチドのセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド５，７，９，１１，１３および１５に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖がヌクレオチド６，８，１０，１２および１４に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、この際、前記アンチセンス鎖は５’から３’に向けて番号付けられており、前記センス鎖は３’から５’に向けて番号付けされている。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが１８〜２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖および長さが１８〜２３ヌクレオチドのセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド７，９，１１および１３に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖がヌクレオチド１０および１２に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、この際、前記アンチセンス鎖は５’から３’に向けて番号付けられており、前記センス鎖は３’から５’に向けて番号付けされている。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが１８〜２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖および長さが１８〜２３ヌクレオチドのセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド７，９および１１に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖がヌクレオチド８，１０および１２に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、この際、前記アンチセンス鎖は５’から３’に向けて番号付けられており、前記センス鎖は３’から５’に向けて番号付けされている。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが１８〜２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖および長さが１８〜２３ヌクレオチドのセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド７および９に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖がヌクレオチド８および１０に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、この際、前記アンチセンス鎖は５’から３’に向けて番号付けられており、前記センス鎖は３’から５’に向けて番号付けされている。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、長さが１８〜２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖および長さが１８〜２３ヌクレオチドのセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖がヌクレオチド９および１１に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、前記センス鎖がヌクレオチド８および１０に２’−Ｏ−ＣＨ３修飾を含み、この際、前記アンチセンス鎖は５’から３’に向けて番号付けられており、前記センス鎖は３’から５’に向けて番号付けされている。
【０１９７】
パターン
一態様では、アンチセンス二本鎖領域は、本明細書において「修飾された基」と呼ばれる複数の修飾ヌクレオチド群を含み、各修飾された基は、１つ以上の同一に修飾されたヌクレオチドからなり、各修飾された基は、その一方の側または両側が、本明細書で「隣接する基」と呼ばれる第２のヌクレオチド群に隣接しており、各隣接する基は、修飾されていないか、または前記修飾された基のヌクレオチドとは異なる様式で修飾された１つ以上のヌクレオチドからなる。一実施形態では、アンチセンス二本鎖領域における各修飾基は同一であり、すなわち、各修飾基は、同数の同一に修飾されたヌクレオチドからなる。別の実施形態では、各隣接基は等しい数のヌクレオチドを有する。別の実施形態において、各隣接基は同一である。別の実施形態において、アンチセンス二本鎖領域における前記修飾された基のヌクレオチドは、修飾塩基を含む。別の実施形態において、前記修飾された基のヌクレオチドは、修飾されたリン酸骨格を含む。別の実施形態では、前記修飾された基のヌクレオチドは修飾された２’位を含む。
【０１９８】
別の態様では、センス二本鎖領域は複数の修飾された基の群を含み、各修飾基は１つ以上の同一に修飾されたヌクレオチドからなり、各修飾基の片側または両側に隣接する基が隣接し、各隣接基は、修飾されていないか、または前記修飾された基のヌクレオチドとは異なる様式で修飾されている１つ以上のヌクレオチドからなる。一実施形態では、センス二本鎖領域の各修飾基は同一である。別の実施形態では、各隣接基は等しい数のヌクレオチドを有する。別の実施形態において、各隣接基は同一である。別の実施形態では、センス二本鎖領域における前記修飾された基のヌクレオチドは修飾塩基を含む。別の実施形態では、前記修飾された基のヌクレオチドは修飾リン酸骨格を含む。別の実施形態では、前記修飾された基のヌクレオチドは修飾された２’位を含む。
【０１９９】
別の態様では、アンチセンス二本鎖領域およびセンス二本鎖領域はそれぞれ、複数の修飾された基を含み、各修飾された基は、１つまたは複数の同一に修飾されたヌクレオチドからなり、各隣接基は、修飾されていないか、または前記修飾された基のヌクレオチドとは異なる様式で修飾されている１つ以上のヌクレオチドからなる。一実施形態では、アンチセンス二本鎖領域およびセンス二本鎖領域の各修飾基は同一である。別の実施形態では、アンチセンス二本鎖領域およびセンス二本鎖領域における各隣接基は、それぞれ等しい数のヌクレオチドを有する。別の実施形態では、アンチセンス二本鎖領域およびセンス二本鎖領域の各隣接基は同一である。別の実施形態では、アンチセンス二本鎖領域およびセンス二本鎖領域における前記修飾された基のヌクレオチドは、それぞれ同じ修飾された基および同じ隣接する基を含む。別の実施形態では、アンチセンス二本鎖領域およびセンス二本鎖領域における前記修飾された基のヌクレオチドはそれぞれ修飾塩基を含む。別の実施形態では、アンチセンス二本鎖領域およびセンス二本鎖領域における前記修飾された基のヌクレオチドは、それぞれ修飾リン酸骨格を含む。別の実施形態では、アンチセンス二本鎖領域およびセンス二本鎖領域における前記修飾された基のヌクレオチドはそれぞれ、修飾された２’位を含む。
【０２００】
一態様において、アンチセンス鎖は、本明細書において「修飾された基」と呼ばれる複数の修飾ヌクレオチドの群を含み、各修飾された基は１つ以上の同一に修飾されたヌクレオチドからなり、各修飾された基の片側または両側には、本明細書において「隣接する基」と呼ばれるヌクレオチドの第２の群が隣接し、各隣接する基は、修飾されていないか、または前記修飾された基のヌクレオチドとは異なる様式で修飾された１つ以上のヌクレオチドからなる。一実施形態では、アンチセンス鎖の各修飾された基は同一であり、すなわち、各修飾された基は同数の同一に修飾されたヌクレオチドからなる。別の実施形態では、各隣接基は等しい数のヌクレオチドを有する。別の実施形態において、各隣接基は同一である。別の実施形態では、アンチセンス鎖における前記修飾された基のヌクレオチドは、修飾された塩基を含む。別の実施形態において、前記修飾された基のヌクレオチドは、修飾されたリン酸骨格を含む。別の実施形態では、前記修飾された基のヌクレオチドは修飾された２’位を含む。
【０２０１】
別の態様では、センス鎖は、修飾された基の複数の群を含み、各修飾された基は１つ以上の同一に修飾されたヌクレオチドからなり、各修飾された基の片側または両側には隣接する基が隣接し、各隣接する基は、修飾されていないかまたは前記修飾された群のヌクレオチドとは異なる様式で修飾されている１つまたは複数のヌクレオチドからなる。一実施形態では、センス鎖中の各修飾基は同一である。別の実施形態では、各隣接基は等しい数のヌクレオチドを有する。別の実施形態において、各隣接基は同一である。別の実施形態では、センス鎖における前記修飾された基のヌクレオチドは、修飾された塩基を含む。別の実施形態において、前記修飾された基のヌクレオチドは、修飾されたリン酸骨格を含む。別の実施形態では、前記修飾された基のヌクレオチドは修飾された２’位を含む。
【０２０２】
別の態様では、アンチセンス鎖およびセンス鎖はそれぞれ複数の修飾された基を含み、各修飾された基は１つまたは複数の同一に修飾されたヌクレオチドからなり、各修飾された基の片側または両側には隣接する基が隣接し、該隣接する基は、修飾されていないか、または前記修飾された基のヌクレオチドとは異なる様式で修飾された１つ以上のヌクレオチドからなる。一実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖の各修飾基は同一である。別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖中の各隣接基は、それぞれ等しい数のヌクレオチドを有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖の各隣接基は同一である。別の実施形態において、アンチセンス鎖およびセンス鎖における前記修飾された基のヌクレオチドは、それぞれ、同じ修飾された基および同じ隣接する基を含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖中の前記修飾された基のヌクレオチドはそれぞれ修飾塩基を含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖中の前記修飾された基のヌクレオチドは、それぞれ修飾リン酸骨格を含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖中の前記修飾された基のヌクレオチドはそれぞれ修飾２’位を含む。
【０２０３】
別の態様では、修飾された基および隣接する基は、アンチセンス鎖上に規則的なパターンを形成する。別の態様において、修飾された基および隣接する基は、センス鎖上に規則的なパターンを形成する。一実施形態では、修飾された基および隣接する基は、アンチセンス鎖およびセンス鎖の両方に規則的なパターンを形成する。別の実施形態では、修飾された基および隣接する基は、アンチセンス二本鎖領域上に規則的なパターンを形成する。別の態様において、修飾された基および隣接する基は、センス二本鎖領域上に規則的なパターンを形成する。一実施形態では、修飾された基および隣接する基は、アンチセンス二本鎖領域およびセンス二本鎖領域の両方に規則的なパターンを形成する。
【０２０４】
別の態様では、パターンは空間的パターンまたは位置的パターンである。空間的または位置的パターンとは、（ａ）ヌクレオチドが二本鎖部分のヌクレオチド配列内におけるそれらの位置に依存して修飾されることを意味する。したがって、修飾されるヌクレオチドがピリミジンであるかプリンであるかは問題ではない。むしろ、修飾されたヌクレオチドの位置は、（ａ）５’末端から３’末端に向かって番号付けされた核酸鎖上における、当該鎖の５’末端のヌクレオチドを１位としたときの当該ヌクレオチドの位置（アンチセンス鎖およびセンス鎖の両方がそのそれぞれの５’末端ヌクレオチドから番号付けされている）、または、（ｂ）隣接する基に対する当該修飾された基の位置に依存する。したがって、この実施形態によれば、変更されるべき配列にかかわらず修飾パターンは常に同じである。
【０２０５】
一実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖の両方の各修飾基は同一である。一実施形態では、アンチセンス二本鎖領域およびセンス二本鎖領域の両方の各修飾基は同一である。別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖上の各修飾基および各隣接基は同一である。一実施形態では、アンチセンス二本鎖領域およびセンス二本鎖領域の両方における各修飾基および各隣接基は同一である。
【０２０６】
一実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖の両方の各修飾基、各修飾基の位置、各隣接基および各隣接基の位置は同一である。一実施形態では、アンチセンス二本鎖領域およびセンス二本鎖領域の両方における各修飾基、各修飾基の位置、各隣接基および各隣接基の位置は同一である。別の実施形態では、アンチセンス鎖上の修飾された基は、センス鎖上の修飾された基と相補的である（アンチセンス鎖上の修飾された基およびセンス鎖は互いに完全に整列している）。別の実施形態では、修飾基にミスマッチはなく、これによりアンチセンス鎖上の各修飾基はセンス鎖上の各修飾基と塩基対形成するようになっている。
【０２０７】
別の実施形態では、センス鎖上の各修飾基は、アンチセンス鎖上の修飾された基に対して１，２，３，４または５ヌクレオチドだけシフトしている。例えば、センス鎖上の各修飾された基が１個のヌクレオチドまたは１個のヌクレオチド群だけシフトし、修飾された基がアンチセンス鎖上の１位から開始した場合、センス鎖上の修飾された基は２位から始まる。別の実施形態では、アンチセンス鎖の修飾された基は、センス鎖の修飾された基と重複しない。すなわち、アンチセンス鎖上の修飾された基のヌクレオチドは、センス鎖上の修飾された基のヌクレオチドと塩基対形成しない。
【０２０８】
一実施形態では、核酸鎖の末端のデオキシリボヌクレオチドは、修飾された基の位置を決定する際に考慮されない。すなわち、位置番号付けは最初のリボヌクレオチドまたは修飾されたリボヌクレオチドから始まる。別の実施形態では、修飾された基の位置を決定する際に、核酸鎖の末端の無塩基ヌクレオチドは考慮されない。
【０２０９】
一態様では、修飾された基は、アンチセンス鎖およびセンス鎖のいずれかまたは両方の５’末端ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、隣接する基は、アンチセンス鎖およびセンス鎖のいずれかまたは両方の５’末端ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖のいずれかまたは両方の５’末端ヌクレオチドは修飾されていない。別の実施形態では、修飾された基は、アンチセンス二本鎖領域およびセンス二本鎖領域のいずれかまたは両方の５’末端ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、隣接する基は、アンチセンス二本鎖領域またはセンス二本鎖領域のいずれかまたは両方の５’末端ヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アンチセンス二本鎖領域またはセンス二本鎖領域のいずれかまたは両方の５’末端ヌクレオチドは修飾されていない。一実施形態では、２’位の修飾は、アミノ、フルオロ、メトキシ、アルコキシおよびＣ１−Ｃ３−アルキルを含む群から選択される。別の実施形態において、修飾は、２’−Ｏ−メチル、２’−アミノ−２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アルキル、および２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ３−アルキル）である。他の実施形態では、２’位の修飾は２’−Ｏ−メチルである。
【０２１０】
別の態様では、各修飾基は１つのヌクレオチドからなり、各隣接基は１つのヌクレオチドからなる。一実施形態では、アンチセンス鎖上の各修飾基は、センス鎖上の隣接する基と整列している。別の実施形態では、アンチセンス鎖上の各修飾基とセンス鎖上の修飾基とのアライメントは、１以上のヌクレオチドだけシフトしている。
【０２１１】
リン酸骨格の修飾
別の態様は、リン酸骨格への修飾に関する。本発明のｓｉＲＮＡのヌクレオチドの全部または一部は、非修飾核酸に見られるようなホスホジエステル結合を介して連結されていてもよい。しかし、本発明のｓｉＲＮＡは、修飾ホスホジエステル結合を含んでいてもよい。アンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかのホスホジエステル結合は、独立して、窒素および硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含むように修飾され得る。一実施形態において、リボヌクレオチドを隣接するリボヌクレオチドに連結するホスホエステル基は、修飾された基で置換される。一実施形態において、ホスホエステル基を置換する修飾基は、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエートまたはホスホルアミデート基から選択される。
【０２１２】
一実施形態では、アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てがホスホジエステル結合を介して連結される。別の実施形態では、アンチセンス二本鎖領域のヌクレオチドの全てがホスホジエステル結合を介して連結される。別の実施形態では、センス鎖のヌクレオチドの全てがホスホジエステル結合を介して連結される。別の実施形態では、センス二本鎖領域のヌクレオチドのすべてがホスホジエステル結合を介して連結される。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、１，２，３，４，５，６，７，８，９または１０から選択される数の修飾ホスホエステル基を含む。別の実施形態において、アンチセンス二本鎖領域は、１，２，３，４，５，６，７，８，９または１０から選択される数の修飾ホスホエステル基を含む。別の実施形態において、センス鎖は、１，２，３，４，５，６，７，８，９または１０から選択される数の修飾ホスホエステル基を含む。別の実施形態において、センス二本鎖領域は、１，２，３，４，５，６，７，８，９または１０から選択される数の修飾ホスホエステル基を含む。
【０２１３】
５’および３’末端修飾
本発明のｓｉＲＮＡは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかまたは両方の末端５’または３’末端に、一つまたは複数の修飾ヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、非環式ヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む核酸分子を含んでいてもよい。一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の５’および３’末端ヌクレオチドは修飾されていない。別の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドが修飾される。別の実施形態では、センス鎖の５’末端ヌクレオチドが修飾される。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドが修飾される。別の実施形態では、センス鎖の３’末端ヌクレオチドが修飾される。別の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドおよびセンス鎖の５’末端ヌクレオチドが修飾される。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドおよびセンス鎖の３’末端ヌクレオチドが修飾される。別の実施形態では、５’アンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドおよびセンス鎖の３’末端ヌクレオチドが修飾される。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドおよびセンス鎖の５’末端ヌクレオチドが修飾される。別の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端ヌクレオチドおよびセンス鎖の５’および３’末端ヌクレオチドの両方が修飾される。アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドおよび３’末端ヌクレオチドの両方が修飾されてもよい。別の実施形態では、センス鎖の５’および３’末端ヌクレオチドの両方が修飾される。
【０２１４】
アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドはリン酸化されていてもよい。別の実施形態では、センス鎖の５’末端ヌクレオチドがリン酸化される。別の実施形態では、アンチセンス鎖およびセンス鎖の両方の５’末端ヌクレオチドがリン酸化される。別の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドはリン酸化され、センス鎖の５’末端ヌクレオチドは遊離ヒドロキシル基（５’−ＯＨ）を有する。別の実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドがリン酸化され、センス鎖の５’末端ヌクレオチドが修飾される。別の実施形態において、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドは５’Ｅビニルホスホネートを有する。
【０２１５】
５’および３’末端ヌクレオチドへの修飾は、これらの末端ヌクレオチド上の５’および３’位に限定されない。末端ヌクレオチドへの修飾の例としては、これらに限定されないが、ビオチン、逆位（デオキシ）無塩基、アミノ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ＣＮ、ＣＦ、メトキシ、イミダゾール、カルボキシレート、チオエート、Ｃ１〜Ｃ１０の低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリールまたはアリールアルキル、ＯＣＦ３、ＯＣＮ、Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルケニル；ＳＯ−ＣＨ３；ＳＯ２ＣＨ３；ＯＮＯ２；ＮＯ２、Ｎ３；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；例えば、特にＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／５４４５９、欧州特許ＥＰ０５８６５２０Ｂ１またはＥＰ０６１８９２５Ｂ１（これらの全体が参照により引用される）に記載されているような、ポリアルキルアミノまたは置換シリルが挙げられる。本明細書で使用する場合、「アルキル」とはＣ１−Ｃ１２アルキルを意味し、「低級アルキル」は、Ｃ１−、Ｃ２−、Ｃ３−、Ｃ４−、Ｃ５−およびＣ６−アルキルなどのＣ１−Ｃ６アルキルを意味する。
【０２１６】
別の態様では、アンチセンス鎖の５’末端、センス鎖の５’末端、アンチセンス鎖の３’末端またはセンス鎖の３’末端がプロドラッグ部分に共有結合させてもよい。一実施形態において、この部分は、エンドソームにおいて切断され得る。別の実施形態では、この部分は細胞質内で切断され得る。
【０２１７】
異なる種類の末端修飾の例を表１に示す。
【０２１８】
【表１】
2019510793.tif 000028
【０２１９】
別の実施形態では、アンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかまたは両方の末端３’ヌクレオチドまたは２つの末端３’−ヌクレオチドは、２’−デオキシヌクレオチドである。別の実施形態では、２’−デオキシヌクレオチドは２’−デオキシ−ピリミジンである。別の実施形態では、２’−デオキシヌクレオチドは２’デオキシ−チミジンである。
【０２２０】
ｓｈＲＮＡ（ショートヘアピンループＲＮＡ）および連結ｓｉＲＮＡ
別の態様は、ｓｈＲＮＡおよび連結ｓｉＲＮＡに関する。アンチセンス鎖とセンス鎖とは、互いに共有結合していてもよい。そのような結合は、アンチセンス鎖およびセンス鎖をそれぞれ形成するいずれのヌクレオチドの間でも起こり得、そして共有結合または非共有結合によって形成され得る。共有結合は、好ましくはメチレンブルーおよび二官能基を含む群から選択される化合物により、両方の鎖を１回または数回、１つまたは複数の位置でそれぞれ連結することによって形成され得る。そのような二官能基は、好ましくはビス（２−クロロエチル）アミン、Ｎ−アセチル−Ｎ’−（ｐ−グリオキシルベンゾイル）シスタミン、４−チオウラシルおよびソラレンを含む群から選択される。
【０２２１】
さらに、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、ループ構造によって連結されていてもよい。ループ構造は、ポリエチレングリコールなどの非核酸ポリマーから構成されてもよい。アンチセンス鎖の５’末端がセンス鎖の３’末端に連結されていてもよく、またはアンチセンス鎖の３’末端がセンス鎖の５’末端に連結されていてもよい。ループは、核酸、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）からなることができ、またはポリマーによって形成されてもよい。ループの長さは、ループ構造または類似の構造を介して折り畳みが起こり得るように２つの鎖を共有結合的に連結できれば十分である。
【０２２２】
リボ核酸構築物は、適切なベクター系に組み込むことができる。好ましくは、ベクターは、ＲＮＡｉの発現のためのプロモーターを含む。プロモーターは、ｐｏｌＩＩＩ、Ｕ６、Ｈ１または７ＳＫのような当該分野で公知の任意のものから選択することができる。
【０２２３】
本発明による核酸は、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み得る。好ましくは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、ヌクレオチド配列全体に分布していてもよく、任意の数で任意の位置に存在してもよい。好ましくは、核酸は、１〜１０個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。好ましくは、アンチセンス鎖は、各末端に少なくとも１個のホスホロチオエート修飾を有する。好ましくは、アンチセンス鎖は、各末端に１〜３個のホスホロチオエート修飾を有する。最も好ましくは、アンチセンス鎖は、各末端に２個のホスホロチオエート修飾を有する。好ましくは、センス鎖は、３’末端に少なくとも１個のホスホロチオエート修飾を有する。好ましくは、センス鎖は、３’末端に１〜３個のホスホロチオエート修飾を有する。最も好ましくは、センス鎖は、３’末端に２個のホスホロチオエート修飾を有する。
【０２２４】
オーバーハングしたｓｉＲＮＡ
センス鎖またはアンチセンス鎖の３’末端または５’末端のオーバーハングは、１，２，３，４および５ヌクレオチドの長さからなるものから選択され得る。あるいは、ｓｉＲＮＡ分子は、両端が平滑末端のものであってもよく、１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８または２９の連続したヌクレオチドの長さを有し得る。
【０２２５】
一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、一端が平滑末端であり、ｓｉＲＮＡ分子の二本鎖部分は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９の連続したヌクレオチドから選択される長さを有し得る。
【０２２６】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡ分子は、いずれかの鎖上の両端にオーバーハングを有し、ｓｉＲＮＡ分子の二本鎖部分は、１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８または２９の連続したヌクレオチドから選択される長さを有し得る。
【０２２７】
オーバーハングは、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドおよび／またはＴＴジヌクレオチドを含み得る。
【０２２８】
本発明の核酸分子の製造
本発明の核酸は、インビトロ（例えば、転写から脱落）またはインビボのいずれかで核酸を化学的に合成または発現させるなどの当技術分野における通常の方法を用いて作製することができる。例えば、固相化学合成を使用するか、または発現ベクターを使用する。一実施形態では、発現ベクターは、標的細胞において本発明の核酸を産生することができる。本明細書に記載の核酸分子の合成方法は、当業者に公知である。
【０２２９】
本発明の核酸の送達のための製剤
ｓｉＲＮＡおよび共役された化合物は、細胞との直接接触（「ネイキッド」ｓｉＲＮＡ）などの当業者に公知の様々な方法によって、または細胞への標的化もしくは送達を容易にする１つまたは複数の薬剤との組み合わせによって、インビトロおよびインビボの両方で細胞に送達することができる。このような薬剤および方法には、リポプレックス、リポソーム、イオントフォレシス、ヒドロゲル、シクロデキストリン、ナノカプセル、マイクロおよびナノスフェア並びにタンパク質性ベクターが含まれる。核酸／ビヒクルの組み合わせは、直接注入または注入ポンプの使用によってインビボで局所的に送達することができる。本発明のｓｉＲＮＡおよびコンジュゲートは、静脈内、皮下、筋肉内もしくは皮内注射または吸入などの様々な手段によってインビボで送達することができる。分子は、医薬品として使用することができる。好ましくは、医薬品は、被験体における疾患状態の症状を予防し、発症を調節し、治療し、または緩和する。
【０２３０】
ポリ（エチレングリコール）脂質（ＰＥＧ修飾、または長期循環リポソームまたはステルスリポソーム）を含む表面修飾リポソームを含む組成物の使用もまた、提供される。これらの製剤は、リポソームまたはリポプレックスの凝集および融合を防止することによって、リポソームまたはリポプレックス溶液の安定性を増加させる方法を提供する。これらの製剤によれば、単核食細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン作用および排除に抵抗し、それにより、カプセル化薬物のより長い血液循環時間および増強された組織曝露を可能にするというインビボでのさらなる利点も得られる。このようなリポソームは、恐らくは血管新生が生じた標的組織における血管外漏出および捕捉によって腫瘍に選択的に蓄積する可能性がある。長期循環リポソームは、特にＭＰＳの組織に蓄積することが知られている従来のカチオン性リポソームと比較して、ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態および薬力学を向上させる（Ｌｉｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  １９９５，４２，２４８６４−２４７８０；Ｃｈｏｉら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１０３９１；Ａｎｓｅｌｌら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１０３９０；Ｈｏｌｌａｎｄら、国際ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１０３９２）。長期循環リポソームはまた、ヌクレアーゼ分解からｓｉＲＮＡを保護する。
【０２３１】
本発明のｓｉＲＮＡ結合体は、医薬組成物として製剤化することができる。医薬組成物は、単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、医薬品または診断薬として使用することができる。例えば、本発明の１つ以上のｓｉＲＮＡコンジュゲートは、送達ビヒクル（例えば、リポソーム）および、担体や希釈剤などの賦形剤と組み合わせることができる。他の薬剤、例えば防腐剤および安定剤を添加することもできる。核酸分子の送達のための方法は、当該分野で公知であり、当業者の知識の範囲内である。
【０２３２】
本発明のｓｉＲＮＡコンジュゲートは、別々にまたは同時に投与される他の治療化合物と組み合わせて、例えば組み合わせ単位用量として投与することもできる。一実施形態では、本発明は、安定剤、防腐剤、希釈剤、緩衝剤などの生理学的／薬学的に許容される賦形剤中に本発明による１つ以上のｓｉＲＮＡコンジュゲートを含む医薬組成物を含む。
【０２３３】
投与量
本発明の薬剤および医薬組成物の投与量レベルは、当業者であれば通常の実験によって決定することができる。一実施形態では、単位用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重のｓｉＲＮＡを含み得る。あるいは、用量は、１０ｍｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、または１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、または０．０５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ体重、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇ体重、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ体重、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重、または０．５ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。
【０２３４】
医薬組成物は、滅菌注射用の水性の懸濁液または溶液、または凍結乾燥形態であってもよい。一実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥されたリポプレックスまたはリポプレックスの水性懸濁液を含み得る。リポプレックスは、好ましくは、本発明のｓｉＲＮＡを含む。そのようなリポプレックスは、インビトロまたはインビボのいずれかで、本発明のｓｉＲＮＡを標的細胞に送達するために使用され得る。
【０２３５】
本発明の医薬組成物および医薬は、薬学的に有効な用量で哺乳動物被験体に投与することができる。哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットから選択することができる。
【０２３６】
送達の経路
二本鎖ｓｉＲＮＡを含むコンジュゲート組成物は、種々の経路によって被験体に送達され得る。例示的な経路としては、皮下、静脈内、局所、直腸、肛門、膣、鼻、肺、眼が挙げられる。
【０２３７】
コンジュゲート組成物は、薬学的に許容される担体とともに、投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与に適合する任意のおよび全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含むものとする。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、組成物中でのその使用は本発明の範囲内のものである。補助的な活性化合物も組成物に組み込まれ得る。
【０２３８】
本発明の組成物は、局所的または全身的治療が望まれるかどうか、および治療される領域に応じて、多くの方法で投与され得る。投与は、局所（眼、膣、直腸、鼻腔内、経皮など）、経口または非経口であり得る。非経口投与には、静脈内点滴、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射、または髄腔内または脳室内投与が含まれる。
【０２３９】
投与経路および投与部位は、標的化を強化するために選択され得る。例えば、筋細胞を標的化するためには、関心のある筋肉への筋肉内注射が理にかなった選択であろう。肺細胞は、エアロゾル形態のｉＲＮＡを投与することによって標的化され得る。血管内皮細胞は、バルーンカテーテルをｉＲＮＡでコーティングし、ＤＮＡを機械的に導入することによって標的化することができる。
【０２４０】
上記のような修飾、糖部分の修飾、パターン、５’および３’末端修飾、オーバーハング、製剤、送達、投与量および送達経路がいずれのタイプのｉＲＮＡ分子にも等しく適用され得、ｓｉＲＮＡに限定されないことは、当業者には理解されるであろう。
【０２４１】
本発明の第１３の態様によれば、医薬における本発明の化合物または組成物の使用が提供される。本発明によるＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、肝疾患、慢性疾患、サラセミア、薬物誘導性肝障害、血色素症および貧血または慢性疾患の貧血の治療に使用することができる。
【０２４２】
本発明のさらなる態様において、本発明のコンジュゲートを用いて肝細胞へ核酸を送達する方法が提供される。この方法は、肝細胞を本発明の化合物と接触させる工程を含む。この方法は、診断目的、治療目的または研究目的のために、インビトロまたはインビボで使用され得る。
【実施例】
【０２４３】
実施例：
一般情報
特に断りのない限り、すべての反応は窒素雰囲気下で行った。ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ  ４００ＭＨｚ  ＵｌｔｒａｓｈｉｅｌｄＴＭで記録し、すべての化学シフト（δ）をＴＭＳと比較して測定した。
【０２４４】
実施例１−ＧａｌＮＡｃの合成ホスホルアミダイト：
【０２４５】
【化２７】
2019510793.tif 000029
【０２４６】
各ホスホルアミダイトの合成は、主にＰｒａｋａｓｈら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２５（２０１５）４１２７−４１３０に記載されている手順に従う。
【０２４７】
ガラクトサミンペンタアセテートをトリメチルシリルトリフルオロメチルスルホネートを用いて活性化し、４−ベンジルオキシ−１−ブタノールと反応させた。ベンジル保護基を加水分解により除去した後、得られたアルコールを、Ｄｕｂｂｅｒ，２００３に記載の方法に従ってホスホルアミダイトに変換した。
【０２４８】
【化２８】
2019510793.tif 000030
【０２４９】
ベンジル保護トリエチレングリコールを出発物質として使用して、上記と同じ手順に従ってＳＴ２１を合成した。
【０２５０】
【化２９】
2019510793.tif 000031
【０２５１】
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−５−アセトアミド−２−（アセトキシメチル）−６−（２−（２−（２−（ベンゾイルオキシ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３４−ジイルジアセテート（１９）
１，２−ジクロロエタン（７００ｍＬ）中の１５（６４．２ｇ、１６６ミリモル）の溶液に、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（２２．１０ｇ、９９ミリモル、１８．０４ｍＬ、０．６当量）を添加し、褐色の懸濁液を１５分間撹拌した。粉砕した４Ａモレキュラーシーブ（８５ｇ）を添加し、１５分間攪拌を続けた。トリエチレングリコールモノベンジルエーテル（５１．８ｇ、２１５ミリモル、４７．５ｍＬ、１．３当量）を滴下添加により１５分間かけて添加し、室温で攪拌を続けた。反応混合物を珪藻土のプラグで濾過し、続いて温ジクロロメタンですすいだ。濾液を氷冷ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（８００ｍＬ）に注ぐことによりクエンチし、激しく撹拌した。層を分離し、水層をジクロロメタン（２×３００ｍＬ）でさらに２回抽出した。合わせた有機層を水（６００ｍＬ）およびブライン（６００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空濃縮して黄色油状物を得た。精製は、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中５〜１００％ＥｔＯＡｃ）により行い、１９と採りエチレングリコールモノベンジルエーテルとの混合物（６４ｇ）を得た。この物質をジクロロメタン（４３０ｍＬ）に溶解し、続いてトリエチルアミン（３８．４ｇ、３８０ミリモル、５２．８ｍＬ、４当量）およびＤＭＡＰ（２．３２１ｇ、１９．００ミリモル、０．２当量）を添加した。次いで、バッチ式添加により、ＴＢＤＭＳＣｌ（２１．４７ｇ、１４２ミリモル、１．５当量）を加え、室温で２時間撹拌を続けた。反応混合物を濾過し、続いて氷冷飽和ＮａＨＣＯ３飽和溶液（１Ｌ）に注いだ。層を分離し、水層をジクロロメタン（２×３００ｍＬ）でさらに２回抽出した。合わせた有機層をブライン（１Ｌ）で１回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。減圧濃縮後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中７０〜１００％ＥｔＯＡｃ）により１９を無色油状物として得た（３６ｇ、収率３０％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．３８  −  ７．２８  （ｍ，  ５Ｈ），  ６．５８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １１．２，  ３．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．７９  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．５３  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ４．２８  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  １１．２，  ９．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．１６  −  ４．０６  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．８８  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ６．０，  ２．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．７５  （ｔｄ，  Ｊ  ＝  ５．７，  ２．７  Ｈｚ，  ４Ｈ），  ３．７１  −  ３．５８  （ｍ，  ７Ｈ），  ２．１５  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．０４  （ｓ，  ３Ｈ），  １．９７  （ｓ，  ３Ｈ），  １．９５  （ｓ，  ３Ｈ）。
【０２５２】
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−５−アセトアミド−２−（アセトキシメチル）−６−（２−（２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ）エトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジイルジアセテート（ＳＴ２０）
テトラヒドロフラン（３３０ｍＬ）および２−プロパノール（３３０ｍＬ）中の１９（４７．６８ｇ、８４ミリモル）の溶液に、活性炭上の１０％パラジウム（１２．９２ｇ、１２．１４ミリモル、１．４５当量）を添加した。反応混合物に水素（バルーン）を入れ、室温で一晩撹拌を続けた。反応混合物を珪藻土で濾過し、温ジクロロメタンですすいだ。真空濃縮後、ＳＴ２０を得た（３７ｇ、収率９４％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．８１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９７  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １１．２，  ３．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．６１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．５６  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０３  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．８８  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  １１．１，  ８．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８２  −  ３．７３  （ｍ，  １Ｈ），  ３．６３  -  ３．４５  （ｍ，  ９Ｈ），  ３．４１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．１１  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．００  （ｓ，  ３Ｈ），  １．８９  （ｓ，  ３Ｈ），  １．７８  （ｓ，  ３Ｈ）。
【０２５３】
（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−５−アセトアミド−２−（アセトキシメチル）−６−（２−（２−（（（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ）オキシ）エトキシ）エトキシ）エトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジイルジアセテート（ＳＴ２１）
無水アセトニトリル（８ｍＬ）および乾燥ジクロロメタン（４０ｍＬ）中の４，５−ジシアノイミダゾール（９６１ｍｇ、８．１３ミリモル、０．６５当量）の溶液に、粉砕した４Ａモレキュラーシーブ（４．４ｇ）を添加した。次いで、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（４９０３ｍｇ、１６．２７ミリモル、５．１６ｍＬ、１．３当量）をシリンジを介して添加し、１０分間室温で撹拌した。次いで、乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）中のＳＴ２０の溶液（６０００ｍｇ、１２．５１ミリモル）を１０分間かけて反応混合物に添加した。反応混合物を綿栓で濾過し、続いて減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィーによる精製を２回（ヘプタン中１０〜１００％ＥｔＯＡｃ）行い、ＳＴ２１を淡黄色油状物として得た（６．９ｇ、収率７４％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．８１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９７  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １１．２，  ３．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．５５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．０  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ３．８８  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  １１．２，  ８．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．８２  -  ３．４５  （ｍ，  １６Ｈ），  ２．７７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．１１  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．００  （ｓ，  ３Ｈ），  １．８９  （ｓ，  ３Ｈ），  １．７７  （ｓ，  ３Ｈ），  １．１３  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ６．８，  ３．１  Ｈｚ，  １２Ｈ）。
【０２５４】
【化３０】
2019510793.tif 000032
【０２５５】
（３ａＲ、５Ｒ、６Ｒ、７Ｒ、７ａＲ）−５−（アセトキシメチル）−２−メチル−５，６，７，７ａ−テトラヒドロ−３ａＨ−ピラノ［３，２−ｄ］オキサゾール−６，７−ジイルジアセテート（１５）
ジクロロメタン（８７０ｍＬ）中のガラクトサミンペンタアセテート（１２５ｇ、３２１ミリモル）の懸濁液に、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（１０７ｇ、４８２ミリモル、８７ｍＬ、１．５当量）を室温で３０分間かけて滴下により添加した。反応混合物を４０℃に２時間加熱した後、室温に冷却し、氷冷した飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０００ｍＬ）を注ぐことによりクエンチした。層を分離し、水層をジクロロメタン（２×３００ｍＬ）でさらに２回抽出した。合わせた有機層を水（５００ｍＬ）およびブライン（８００ｍＬ）で洗浄し、続いてＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。真空中で濃縮した後、１５を淡黄色油状物として得た（１０９ｇ、粗収率１０３％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ６．００  （ｄ，  Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．４７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ３．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９１  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ７．４，  ３．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．２９  -  ４．０６  （ｍ，  ３Ｈ），  ４．０３  −  ３．９７  （ｍ，  １Ｈ），  ２．１３  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．０７  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．０  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ２．０６  （ｄ，  Ｊ  ＝  １．３  Ｈｚ，  ３Ｈ）。
【０２５６】
（２Ｒ、３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、６Ｒ）−５−アセトアミド−２−（アセトキシメチル）−６−（４−（ベンジルオキシ）ブトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジイルジアセテート（１６）
ジクロロメタン（１２００ｍＬ）中の１５（１０９ｇ、３３１ミリモル）の溶液に、粉末状のモレキュラーシーブ４Ａ（７５ｇ）を添加し、続いて室温で１５分間撹拌した。混合物に４−ベンジルオキシ−１−ブタノール（８９ｇ、４９７ミリモル、８７ｍＬ、１．５当量）を添加し、撹拌をさらに１５分間続けた。次いで、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（４４．１ｇ、１９９ミリモル、３６．０ｍＬ、０．６当量）を滴下により１５分間かけて添加した。反応混合物の撹拌を２時間続けた。混合物の濾過を珪藻土のプラグで行い、続いてジクロロメタン（２００ｍＬ）で１回すすいだ。ろ液を氷冷飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０００ｍＬ）に注ぐことによりクエンチした。層を分離し、続いて水層をジクロロメタン（２×５００ｍＬ）で２回抽出した。合わせた有機層を水（６００ｍＬ）およびブライン（６００ｍＬ）で洗浄し、続いてＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。減圧下で濃縮した後、１％Ｅｔ３Ｎ（ヘプタン中２０〜８０％ＥｔＯＡｃ）で中和したシリカ上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、１６を無色油状物として得て、ゆっくりと結晶化させた（１０９ｇ、収率６５％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．８３  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ７．３９  -  ７．２３  （ｍ，  ５Ｈ），  ５．２１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １１．２，  ３．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４４  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．０７  -  ３．９７  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．８７  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  １１．２，  ８．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．７２  （ｐ，  Ｊ  ＝  ５．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．４９  −  ３．３７  （ｍ，  ３Ｈ），  ２．１０  （ｓ，  ３Ｈ），  １．９９  （ｓ，  ３Ｈ），  １．８９  （ｓ，  ３Ｈ），  １．７６  （ｓ，  ３Ｈ），  １．５４  （ｑｄ，  Ｊ  ＝  ８．０，  ５．２，  ４．６  Ｈｚ，  ４Ｈ）。
【０２５７】
（２Ｒ、３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、６Ｒ）−５−アセトアミド−２−（アセトキシメチル）−６−（４−ヒドロキシブトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジイルジアセテート（１７）
テトラヒドロフラン（１０００ｍＬ）および２−プロパノール（１０００ｍＬ）中の１６（１０９．６グラム、２１５ミリモル）の溶液に、炭素上の１０％パラジウム（１７．１７ｇ、１６．１３ミリモル、１０％、０．０７５当量）を添加し、フラスコに水素（大気圧）を入れた。反応混合物の撹拌を室温で一晩続けた。混合物を珪藻土のプラグで濾過し、減圧濃縮した。トルエン（２×３００ｍＬ）およびジクロロメタン（２×３００ｍＬ）で物質を２回ストリッピングした後、１７を白色粘着性固体として得た（８７ｇ、収率９７％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）  δ  ５．３３  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ３．５，  １．０  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．０５  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １１．３，  ３．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．５５  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．２０  −  ３．９７  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．８７  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  １０．１，  ５．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ３．６０  −  ３．４８  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．３０  （ｐ，  Ｊ  ＝  １．８  Ｈｚ，  １Ｈ），  ２．１４  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．０２  （ｓ，  ３Ｈ），  １．９４  （ｓ，  ３Ｈ），  １．９２  （ｓ，  ３Ｈ），  １．６１  （ｄｔｄ，  Ｊ  ＝  １６．８，  １１．０，  １０．１，  ３．６  Ｈｚ，  ４Ｈ）。
【０２５８】
（２Ｒ、３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、６Ｒ）−５−アセトアミド−２−（アセトキシメチル）−６−（４−（（（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ）オキシ）ブトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３、４−ジイルジアセテート（ＳＴ２３）
乾燥アセトニトリル（２０ｍＬ）および乾燥ジクロロメタン（２０ｍＬ）中の４，５−ジシアノイミダゾール（１．９４０グラム、１６．４３ミリモル、０．６５当量）の溶液に、アルゴン雰囲気下、粉砕したモレキュラーシーブ４Ａ（９ｇ）を添加した。次いで、２−シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト（１０．００ｇ、３３．２ミリモル、１０．５３ｍＬ、１．３１当量）をシリンジを介して添加し、１０分間室温で撹拌した。次に、乾燥ジクロロメタン（５０ｍＬ）中の１７（１０．６ｇ、２５．３ミリモル）の溶液を滴下により１０分間かけて添加した。さらに３０分間撹拌した後、反応混合物を綿栓で濾過し、減圧濃縮した。この物質の精製は、複数のフラッシュカラムクロマトグラフィー工程（ヘプタン中０％〜１００％ＥｔＯＡｃ、５％Ｅｔ３Ｎ）により行い、ＳＴ２３（１１．７５ｇ、収率７２％）を淡黄色油状物として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．８２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １１．２，  ３．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０２  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．９３  −  ３．８２  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７８  −  ３．６５  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．６４  -  ３．４９  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．４８  −  ３．４０  （ｍ，  １Ｈ），  ２．７６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．１１  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．００  （ｓ，  ３Ｈ），  １．８９  （ｓ，  ３Ｈ），  １．７７  （ｓ，  ３Ｈ），  １．６２  −  １．４６  （ｍ，  ４Ｈ），  １．１３  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ６．８，  ３．６  Ｈｚ，  １２Ｈ）．  ３１Ｐ  ＮＭＲ  （１６２  ＭＨｚ，  Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ−ｄ）  １４７  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．６  Ｈｚ）。
【０２５９】
【化３１】
2019510793.tif 000033
【０２６０】
６−（ベンジルオキシ）ヘキサン−１−オール（１８）
冷却し、激しく撹拌したテトラヒドロフラン（５００ｍＬ）中の水素化ナトリウム（９０ｇ、２２４２ミリモル、３．５当量）の懸濁液に、テトラヒドロフラン（１０００ｍＬ）中の１，６−ヘキサンジオール（２６５ｇ、２２４２ミリモル、３．５当量）の溶液を滴下により１時間かけて添加した。さらに３０分間撹拌した後、テトラヒドロフラン（５００ｍＬ）中の臭化ベンジル（７６ｍＬ、６４１ミリモル、１当量）の溶液を３０分間かけて添加した。添加が完了したら、反応混合物を室温にし、一晩撹拌を続けた。反応混合物を５℃の温度に冷却し、続いて水（２００ｍＬ）をゆっくりと添加した。次いで、混合物を減圧濃縮し、ジクロロメタン（６００ｍＬ）に再溶解し、水（３０００ｍＬ）で洗浄した。水層をジクロロメタン（３×５００ｍＬ）でさらに３回抽出した。合わせた有機層を水（３×４００ｍＬ）およびブライン（１×５００ｍＬ）で洗浄し、続いてＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮した。重力カラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の０〜５０％ＥｔＯＡｃ）により精製を行い、１８（２５ｇ、収率２０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．４０  −  ７．２７  （ｍ，  ５Ｈ），  ４．５０  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．６４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．４７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．６８  −  １．５１  （ｍ，  ４Ｈ），  １．４７  −  １．３１  （ｍ，  ４Ｈ），  １．２７  （ｓ，  １Ｈ）。
【０２６１】
（２Ｒ、３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、６Ｒ）−５−アセトアミド−２−（アセトキシメチル）−６−（（６−（ベンジルオキシ）ヘキシル）オキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジイルジアセテート（ＳＴ３０Ｂｎ）
ジクロロメタン（３２０ｍＬ）中の１５（２８ｇ、８５ミリモル）の溶液に、粉末状のモレキュラーシーブ４Ａ（１０ｇ）を添加し、５分間攪拌した。次いで、１８（２６．６ｇ、１２８ミリモル、１．５当量）を添加し、さらに１５分間撹拌を続けた。トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（９．２６ｍＬ、５１．０ミリモル、０．６当量）を１５分間かけて滴下により添加した。撹拌を室温で２時間続けた。反応混合物を綿栓で濾過し、続いて氷冷飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３００ｍＬ）でクエンチした。層を分離し、抽出をジクロロメタン（２×１５０ｍＬ）でさらに２回行った。合わせた有機層を水（１５０ｍＬ）およびブライン（１５０ｍＬ）で洗浄し、続いてＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、真空中で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の２０〜１００％ＥｔＯＡｃ）により精製して、ＳＴ３０Ｂｎを無色油状物として得た（２５ｇ、収率５５％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．３８  −  ７．２７  （ｍ，  ５Ｈ），  ５．４３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．３８  −  ５．２７  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．７１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．５０  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．２１  −  ４．０７  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．９６  -  ３．８１  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．４７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．３  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ２．１４  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．０５  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．００  （ｓ，  ３Ｈ），  １．９４  （ｓ，  ３Ｈ），  １．６８  -  １．５１  （ｍ，  ４Ｈ），  １．４４  −  １．３０  （ｍ，  ４Ｈ）。
【０２６２】
（２Ｒ、３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、６Ｒ）−５−アセトアミド−２−（アセトキシメチル）−６−（（６−ヒドロキシヘキシル）オキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジイルジアセテート（ＳＴ３０）
テトラヒドロフラン（２５０ｍＬ）および２−プロパノール（２５０ｍＬ）中のＳＴ３０Ｂｎ（２９ｇ、５４ミリモル）の溶液に、炭素上の１０％パラジウム（０．５８２ｇ、０．５４７ミリモル、０．０７５当量）を添加した。フラスコに水素（大気圧）を入れ、混合物の撹拌を室温で一晩続けた。反応混合物を珪藻土のプラグで濾過し、濾液を真空中で濃縮した。トルエン（２×２００ｍＬ）およびジクロロメタン（２×２００ｍＬ）で２回ストリッピングした後、ＳＴ３０を無色油状物として得た（２４ｇ、収率９９％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，メタノール−ｄ４）  δ  ５．３７  −  ５．２６  （ｍ，  １Ｈ），  ５．１０  −  ４．９７  （ｍ，  １Ｈ），  ４．６７  −  ４．４８  （ｍ，  ２Ｈ），  ４．２０  −  ３．９３  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．９２  −  ３．７７  （ｍ，  １Ｈ），  ３．５２  （ｈｅｐｔ，  Ｊ  ＝  ９．４，  ８．１  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ３．３６  −  ３．２３  （ｍ，  １Ｈ），  ２．１７  −  ２．０９  （ｍ，  ３Ｈ），  ２．０５  −  １．９８  （ｍ，  ３Ｈ），  １．９７  −  １．８７  （ｍ，  ６Ｈ），  １．６３  −  １．４５  （ｍ，  ４Ｈ），  １．４３  −  １．２９  （ｍ，  ４Ｈ）。
【０２６３】
（２Ｒ、３Ｒ、４Ｒ、５Ｒ、６Ｒ）−５−アセトアミド−２−（アセトキシメチル）−６−（（６−（（（２−シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ）オキシ）ヘキシル）オキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４−ジイルジアセテート（ＳＴ３１）
乾燥ジクロロメタン（５５０ｍＬ）中のＳＴ３０（２１．２ｇ、４７．４ミリモル）の溶液に、アルゴン雰囲気下、ＤＩＰＥＡ（８３ｍＬ、４７４ミリモル、１０当量）およびモレキュラーシーブ４Ａ（３０グラム）を添加した。反応混合物を０℃の温度に冷却し、２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（１３．４６ｇ、５６．９ミリモル、１．２当量）を滴下により１０分間かけて添加した。混合物を温めながら、３０分間撹拌を継続した。反応混合物を綿栓で濾過し、Ｅｔ３Ｎ処理したシリカ（６０ｇ）上に直接被覆した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の１０〜６０％ＥｔＯＡｃ、５％Ｅｔ３Ｎ）により精製して、ＳＴ３１を黄色タールとして得た（２４．８ｇ、収率７８％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．８２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ９．２  Ｈｚ，  １Ｈ），  ５．２１  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．９６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  １１．３，  ３．４  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．４８  （ｄ，  Ｊ  ＝  ８．５  Ｈｚ，  １Ｈ），  ４．０２  （ｓ，  ３Ｈ），  ３．９１  −  ３．８１  （ｍ，  １Ｈ），  ３．７９  −  ３．６３  （ｍ，  ３Ｈ），  ３．６３  −  ３．４９  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．４５  −  ３．３７  （ｍ，  １Ｈ），  ２．７６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．８  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．１０  （ｓ，  ３Ｈ），  ２．００  （ｓ，  ３Ｈ），  １．８９  （ｓ，  ３Ｈ），  １．７７  （ｓ，  ３Ｈ），  １．５８  −  １．４０  （ｍ，  ４Ｈ），  １．３７  −  １．２２  （ｍ，  ４Ｈ），  １．１３  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ６．８，  ３．９  Ｈｚ，  １２Ｈ）。
【０２６４】
実施例２−トレブラーシントンＳＴ４１の合成
【０２６５】
【化３２】
2019510793.tif 000034
【０２６６】
２−（（４−（ベンジルオキシ）ブトキシ）メチル）−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（１）
ジメチルスルホキシド（３２０ｍＬ）中のペンタエリトリトール（１６０ｇ、１１７５ミリモル、１０当量）の懸濁液に、水酸化カリウム（６５．９ｇ、１１７５ミリモル、１０当量）を添加し、室温で１５分間攪拌した。次いで、１．５時間にわたって、ジメチルスルホキシド（１０７ｍＬ）中の４−ベンジルオキシ−１−ブロモブタン（２２．３２ｍＬ、１１８ミリモル、１当量）の溶液を添加した。添加が完了したら、反応混合物の撹拌を室温で一晩続けた。反応混合物を３Ｍ  ＨＣｌ水溶液の添加によりｐＨ＝２に酸性化し、得られた白色懸濁液をガラスフィルターで濾過した。濾液をさらに水（９００ｍＬ）で希釈し、分液漏斗に移し、生成物をジクロロメタン（３×２００ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水（４×２００ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。淡黄色油状物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の５０〜１００％ＥｔＯＡｃ）により精製して、１を無色油状物として得た（２０．４６ｇ、収率５８％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．４１  −  ７．２７  （ｍ，  ５Ｈ），  ４．５０  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７０  （ｓ，  ６Ｈ），  ３．５２  −  ３．４３  （ｍ，  ６Ｈ），  ２．５４  （ｓ，  ３Ｈ），  １．７１  −  １．６４  （ｍ，  ４Ｈ）。
【０２６７】
ジエチル３，３’−（（２−（（４−（ベンジルオキシ）ブトキシ）メチル）−２−（（（３−エトキシ−３−オキソプロパ−１−エン−１−イル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイル）ビス（オキシ））ジアクリレート（２）
ジクロロメタン（３００ｍＬ）中の１（２０．４６ｇ、６８．６ミリモル）の溶液に、Ｎ−メチルモルホリン（３３．９ｍＬ、３０９ミリモル、４．５当量）を加えた。反応混合物を氷浴で冷却し、プロピオン酸エチル（２７．８ｍＬ、２７４ミリモル、４当量）を単一ストリームを介して添加した。反応混合物の撹拌を１５分間続け、続いて反応混合物を室温まで温めた。２時間の反応時間の後、反応混合物を減圧濃縮して暗褐色油状物を得た。粗物質の精製をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の０〜３７％ＥｔＯＡｃ）により行い、２を黄色油状物として得た（３１．５６ｇ、収率７８％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．５４  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．６  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ７．３９  −  ７．２８  （ｍ，  ５Ｈ），  ５．２３  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．６  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ４．５０  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１６  （ｑ，  Ｊ  ＝  ７．１  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．８７  （ｓ，  ６Ｈ），  ３．５３  −  ３．３３  （ｍ，  ６Ｈ），  １．６９  −  １．５５  （ｍ，  ４Ｈ），  １．２６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．１  Ｈｚ，  １２Ｈ）。
【０２６８】
ジエチル３，３’−（（２−（（４−（ベンジルオキシ）ブトキシ）メチル）−２−（（３−エトキシ−３−オキソプロポキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイル）ビス（オキシ））ジプロパノエート（３）
エタノール（１４６３ｍＬ）中の２（３１．５６ｇ、５３．２ミリモル）の溶液に、炭素上の１０％パラジウム（２．８３ｇ、２．６６ミリモル、０．０５当量）およびピリジン（２．１５３ｍＬ、２６．６ミリモル、０．５当量）を加えた。反応混合物に水素（大気圧）を加え、混合物の撹拌を室温で一晩続けた。反応混合物を珪藻土のプラグでろ過し、続いてろ液を減圧下で濃縮した。これにより、３を黄色油状物として得た（２９．７５ｇ、収率９３％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．３８  −  ７．２７  （ｍ，  ５Ｈ），  ４．５１  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１３  （ｑ，  Ｊ  ＝  ７．１  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．６４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．４８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．２  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．３９  −  ３．３３  （ｍ，  ８Ｈ），  ３．３０  （ｓ，  ２Ｈ），  ２．５２  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．７０  −  １．５６  （ｍ，  ４Ｈ），  １．２６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．１  Ｈｚ，  ９Ｈ）。
【０２６９】
３，３’−（（２−（（４−（ベンジルオキシ）ブトキシ）メチル）−２−（（３−ヒドロキシプロポキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイル）ビス（オキシ））ビス（プロパン−１−オール）（ＳＴ４０）
乾燥テトラヒドロフラン（３３１ｍＬ）中の、２．４Ｍ水素化アルミニウムリチウムのテトラヒドロフラン溶液（７６ｍＬ、１８３ミリモル、６．２当量）を０℃の温度に冷却した。次いで、温度が１０℃未満に保たれるような速度で、乾燥テトラヒドロフラン（２００ｍＬ）中の３（１７．７ｇ、２９．６ミリモル）の溶液を加えた。添加が完了したら、反応混合物をゆっくりと室温に到達させながら一晩撹拌を続けた。反応物をテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）でさらに希釈し、０℃の温度に冷却した。水（２．０ｍＬ）、４Ｍ  ＮａＯＨ水溶液（２．０ｍＬ）および水（６．０ｍＬ）をゆっくりと添加することによって、反応混合物のクエンチを行った。白色の沈殿物を乾燥Ｎａ２ＳＯ４プラグ上での濾過により除去し、続いてテトラヒドロフランで２回リンスした。濾液を真空中で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中の０〜１０％ＭｅＯＨ）によりこれを精製して、ＳＴ４０を無色油状物として得た（９．５５ｇ、収率６８％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．３９  −  ７．２７  （ｍ，  ５Ｈ），  ４．５１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７４  （ｑ，  Ｊ  ＝  ５．２  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．５８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．５  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．４９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．１  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．４０  （ｓ，  ８Ｈ），  ３．３３  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．２７  （ｓ，  ３Ｈ），  １．７９  （ｐ，  Ｊ  ＝  ５．３  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．７１  −  １．５８  （ｍ，  ４Ｈ）。
【０２７０】
８，８−ビス（（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロポキシ）メチル）−１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１，１６−ジフェニル−２，６，１０，１５−テトラオキサヘキサデカン（ＳＴ４０ＤＭＴｒＢｎ）
ピリジンで２回ストリッピングすることによりＳＴ４０（９．５５ｇ、２０．２１ミリモル）から残留水を除去し、次いで、アルゴン雰囲気下でピリジン（４６４ｍＬ）に再溶解させた。反応混合物にモレキュラーシーブ３Ａ（２０ｇ）を加え、１５分間攪拌を続けた。固体ＤＭＴｒＣｌ（３０．８ｇ、９１ミリモル、４．５当量）を添加し、暗橙色となった混合物の撹拌を一晩続けた。反応物を綿栓で濾過し、濾液をＥｔ３Ｎ中和シリカに被覆した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の０〜４０％ＥｔＯＡｃ、５％Ｅｔ３Ｎ）により精製を行い、ＳＴ４０ＤＭＴｒＢｎを黄色発泡油として得た（２５．３ｇ、収率８４％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．４３  −  ７．３７  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．３３  −  ７．２１  （ｍ，  ２３Ｈ），  ７．１９  -  ７．１３  （ｍ，  ３Ｈ），  ６．８２  −  ６．７５  （ｍ，  １２Ｈ），  ４．４６  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７４  （ｓ，  １８Ｈ），  ３．４３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．３  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．３９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．２６  −  ３．１７  （ｍ，  １０Ｈ），  ３．０６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．７８  （ｐ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．６４  −  １．４９  （ｍ，  ４Ｈ）。
【０２７１】
４−（３−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロポキシ）−２，２−ビス（（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロポキシ）メチル）プロポキシ）ブタン−１−オール（ＳＴ４０ＤＭＴｒＯＨ）
テトラヒドロフラン（２７５ｍＬ）中のＳＴ４０ＤＭＴｒＢｎ（２５．３ｇ、１８．３４ミリモル）の溶液に、ジョンソン・マッセイ・タイプ３３８の炭素上５％パラジウム（５．８５ｇ、２．７５ミリモル、０．１５当量）を添加した。フラスコに水素（大気圧）を充填し、４５分の反応時間後、それを窒素でフラッシュした。反応混合物を珪藻土のプラグでろ過し、真空中で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の０〜４０％ＥｔＯＡｃ、５％Ｅｔ３Ｎ）により精製を行い、ＳＴ４０ＤＭＴｒＯＨを白色発泡固体（１１．９５ｇ、収率５０％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．４４  −  ７．３７  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．３４  -  ７．２１  （ｍ，  １８Ｈ），  ７．２０  −  ７．１３  （ｍ，  ３Ｈ），  ６．８３  -  ６．７５  （ｍ，  １２Ｈ），  ３．７５  （ｓ，  １８Ｈ），  ３．６０  -  ３．５３  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．３９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．２７  （ｔ，  ２Ｈ），  ３．２２  （ｓ，  ８Ｈ），  ３．０７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ２．２６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．９  Ｈｚ，  １Ｈ），  １．７９  （ｐ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．６０  −  １．５１  （ｍ，  ４Ｈ）。
【０２７２】
４−（３−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロポキシ）−２，２−ビス（（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロポキシ）メチル）プロポキシ）ブチル（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホルアミダイト（ＳＴ４１）
乾燥ジクロロメタン（１６２ｍＬ）中のＳＴ４０ＤＭｔｒＯＨ（１１．９５ｇ、９．２７ミリモル）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（１６．１８ｍＬ、９３ミリモル、１０当量）およびモレキュラーシーブ４Ａ（２５ｇ）を添加し、０℃の温度に冷却した。次いで、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（２．６１ｇ、１１．０３ミリモル、１．２当量）を滴下により１５分間かけて反応物に添加した。室温に到達させながら、反応混合物の撹拌をさらに１５分間続けた。反応混合物を綿栓で濾過し、濾液をＥｔ３Ｎ処理シリカ（５０ｇ）に被覆した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の０〜３５％ＥｔＯＡｃ、５％Ｅｔ３Ｎ）により精製を行い、無色タール（１０．６５ｇ、収率７７％）としてＳＴ４１を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．４４  −  ７．３７  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．３３  −  ７．２１  （ｍ，  １８Ｈ），  ７．２０  −  ７．１３  （ｍ，  ３Ｈ），  ６．８３  −  ６．７５  （ｍ，  １２Ｈ），  ３．８６  −  ３．７０  （ｍ，  ２０Ｈ），  ３．６７  −  ３．５０  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．３９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．２９  −  ３．１６  （ｍ，  １０Ｈ），  ３．０６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ２．５７  （ｔ，  ２Ｈ），  １．７８  （ｐ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．６５  −  １．４９  （ｍ，  ４Ｈ），  １．１６  （ｄｄ，  Ｊ  ＝  ９．１，  ６．８  Ｈｚ，  １２Ｈ）。
【０２７３】
【化３３】
2019510793.tif 000035
【０２７４】
２−（（（６−（ベンジルオキシ）ヘキシル）オキシ）メチル）−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（４）
ジメチルスルホキシド（１１０ｍＬ）中のペンタエリスリトール（５５．２ｇ、４０６ミリモル、１０当量）の懸濁液に、水酸化カリウム（２２．７６ｇ、４０６ミリモル、１０当量）を加え、室温で１５分間攪拌した。次いで、１．５時間にわたって、ジメチルスルホキシド（３６．６ｍＬ）中のベンジル６−ブロモヘキシルエーテル（１１ｇ、４０．６ミリモル、１当量）の溶液を加えた。添加が完了したら、反応混合物の撹拌を室温で一晩続けた。反応混合物を３Ｍ  ＨＣｌ水溶液の添加によりｐＨ〜１に酸性化し、得られた白色エマルジョンを水（７００ｍＬ）でさらに希釈し、分液漏斗に移し、生成物をジクロロメタン（４×７０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を水（３×７０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧濃縮した。淡黄色油状物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の５０〜１００％ＥｔＯＡｃ）により精製して、４を無色油状物として得た（９．１６ｇ、収率６７％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．３８  −  ７．２７  （ｍ，  ５Ｈ），  ４．５０  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７０  （ｓ，  ６Ｈ），  ３．４９  −  ３．３９  （ｍ，  ６Ｈ），  ２．８３  （ｓ，  ３Ｈ），  １．６６  −  １．５２  （ｍ，  ４Ｈ），  １．４５  −  １．２８  （ｍ，  ４Ｈ）。
【０２７５】
ジエチル３，３’−（（２−（（（６−（ベンジルオキシ）ヘキシル）オキシ）メチル）−２−（（（３−エトキシ−３−オキソプロパ−１−エン−１−イル）オキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイル）ビス（オキシ））ジアクリレート（５）
ジクロロメタン（１５０ｍＬ）中の２（９．１ｇ、２７．９ミリモル）の溶液に、Ｎ−メチルモルホリン（１３．７９ｍＬ、１２５ミリモル、４．５当量）を加えた。反応混合物を氷浴上で冷却し、そこにプロピオン酸エチル（１１．３０ｍＬ、１１２ミリモル）を単一ストリームを介して加えた。反応混合物の撹拌を１５分間続け、続いて反応混合物を室温まで温めた。２時間の反応時間の後、反応混合物を減圧濃縮して暗褐色油状物を得た。粗物質の精製をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の０〜３０％ＥｔＯＡｃ）により行い、５を淡黄色油状物として得た（１５．８５ｇ、収率７９％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．５４  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．６  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ７．３７  −  ７．２７  （ｍ，  ５Ｈ），  ５．２３  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．６  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ４．５０  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１６  （ｑ，  Ｊ  ＝  ７．１  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．８８  （ｓ，  ６Ｈ），  ３．４６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．４１  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．６５  −  １．４９  （ｍ，  ４Ｈ），  １．４３  −  １．２１  （ｍ，  １３Ｈ）。
【０２７６】
ジエチル３，３’−（（２−（（（６−（ベンジルオキシ）ヘキシル）オキシ）メチル）−２−（（３−エトキシ−３−オキソプロポキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイル）ビス（オキシ））ジプロパノエート（６）
エタノール（７５０ｍＬ）中の５（１５．８５ｇ、２５．５ミリモル）の溶液に、炭素上の１０％パラジウム（１．３５９ｇ、１．２７７ミリモル、０．０５当量）およびピリジン（１．０３３ｍＬ、１２．７７ミリモル、０．５当量）を添加した。反応混合物に水素（大気圧）を加え、これを室温で一晩撹拌した。反応混合物を珪藻土のプラグで濾過した後、濾液を減圧下で濃縮し、６を淡黄色油状物として得た（１５．２７ｇ、収率９１％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．３７  −  ７．２７  （ｍ，  ５Ｈ），  ４．５０  （ｓ，  ２Ｈ），  ４．１４  （ｑ，  Ｊ  ＝  ７．１  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．６４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．４７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．４０  −  ３．２６  （ｍ，  １０Ｈ），  ２．５２  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．６９  −  １．４６  （ｍ，  ４Ｈ），  １．４４  −  １．３０  （ｍ，  ４Ｈ），  １．２６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．１  Ｈｚ，  ９Ｈ）。
【０２７７】
３，３’−（（２−（（（６−（ベンジルオキシ）ヘキシル）オキシ）メチル）−２−（（３−ヒドロキシプロポキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイル）ビス（オキシ））ビス（プロパン−１−オール）（ＳＴ４２）
乾燥テトラヒドロフラン（３６０ｍＬ）中の６（１９．２７ｇ、３０．７ミリモル）の溶液を０℃の温度に冷却した。次いで、テトラヒドロフラン（１２８ｍＬ、３０７ミリモル、１０当量）中の２．４Ｍ水素化アルミニウムリチウムを滴下により１時間かけて添加した。添加が完了したら、反応混合物をゆっくりと室温に到達させながら一晩撹拌を続けた。冷却した後、水（１１．７ｍＬ）、４Ｍ  ＮａＯＨ水溶液（１１．７ｍＬ）および水（３５ｍＬ）をゆっくり添加することによって反応を停止させた。白色の沈殿物を乾燥Ｎａ２ＳＯ４プラグ上での濾過により除去し、続いてテトラヒドロフランで２回リンスした。濾液を減圧下で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中の０〜６％ＭｅＯＨ）により精製を行って、ＳＴ４２（１１．６４ｇ、収率７２％）を無色油として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．３８  −  ７．２７  （ｍ，  ５Ｈ），  ４．５０  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．５８  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．５  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．４７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．４０  （ｓ，  ６Ｈ），  ３．３６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．３２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．２９  （ｓ，  ３Ｈ），  １．７９  （ｐ，  Ｊ  ＝  ５．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．７０  −  １．４９  （ｍ，  ４Ｈ），  １．４４  −  １．２８  （ｍ，  ４Ｈ）。
【０２７８】
８，８−ビス（（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロポキシ）メチル）−１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１，１８−ジフェニル−２，６，１０，１７−テトラオキサオクタデカン（ＳＴ４３ＤＭＴｒＢｎ）
ピリジンで２回ストリッピングすることによりＳＴ４２（４．００ｇ、７．９９ミリモル）から残留水を除去し、次いで、アルゴン雰囲気下でピリジン（１６５ｍＬ）に再溶解させた。反応混合物にモレキュラーシーブ４Ａ（８ｇ）を加え、１５分間撹拌を続けた。固体ＤＭＴｒＣｌ（１３．５４ｇ、３９．９ミリモル、５当量）を添加し、暗橙色となった混合物の撹拌を室温で続けた。２時間後、追加のＤＭＴｒＣｌ（４．０６ｇ、１１．９８ミリモル、１．５当量）を加え、撹拌を一晩続けた。反応物を綿栓で濾過し、濾液をＥｔ３Ｎ中和シリカ（４０ｇ）に被覆した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の０〜３５％ＥｔＯＡｃ、５％Ｅｔ３Ｎ）により精製を行い、ＳＴ４３ＤＭＴｒＢｎを黄色発泡油（１０．４４ｇ、収率８６％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．４３  −  ７．３７  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．３４  −  ７．２１  （ｍ，  ２３Ｈ），  ７．１９  −  ７．１２  （ｍ，  ３Ｈ），  ６．８２  −  ６．７６  （ｍ，  １２Ｈ），  ４．４７  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．７４  （ｓ，  １８Ｈ），  ３．４１  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  １４．６，  ６．５  Ｈｚ，  ８Ｈ），  ３．２６  −  ３．１６  （ｍ，  １０Ｈ），  ３．０６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．７８  （ｐ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．５６  （ｐ，  ２Ｈ），  １．４５  （ｐ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．３８  −  １．２１  （ｍ，  ４Ｈ）。
【０２７９】
６−（３−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロポキシ）−２，２−ビス（（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロポキシ）メチル）プロポキシ）ヘキサン−１−オール（ＳＴ４３ＤＭＴｒＯＨ）
テトラヒドロフラン）（２００ｍＬ）中のＳＴ４３ＤＭＴｒＢｎ（１０．２ｇ、７．２５ミリモル）の溶液に、炭素上の５％パラジウムであるジョンソン・マッセイ・タイプ３３８（２．３１３ｇ、１．０８ミリモル、０．１５当量）を添加した。フラスコに水素（大気圧）を充填し、５０分の反応時間の後、それを窒素でフラッシュした。反応混合物を珪藻土のプラグで濾過し、減圧濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の０〜４０％ＥｔＯＡｃ、５％Ｅｔ３Ｎ）により精製を行い、ＳＴ４３ＤＭＴｒＯＨを白色泡状物として得た（３．８３ｇ、収率３８％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．４４  −  ７．３６  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．３４  −  ７．２１  （ｍ，  １８Ｈ），  ７．２０  −  ７．１３  （ｍ，  ３Ｈ），  ６．８４  −  ６．７３  （ｍ，  １２Ｈ），  ３．７５  （ｓ，  １８Ｈ），  ３．６２  −  ３．５３  （ｍ，  ２Ｈ），  ３．４０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．２７  −  ３．１６  （ｍ，  １０Ｈ），  ３．０７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．７９  （ｐ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．５６  −  １．４１  （ｍ，  ４Ｈ），  １．３７  −  １．２３  （ｍ，  ５Ｈ）。
【０２８０】
６−（３−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロポキシ）−２，２−ビス（（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロポキシ）メチル）プロポキシ）ヘキシル（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホルアミダイト（ＳＴ４３）
乾燥ジクロロメタン（５０ｍＬ）中のＳＴ４３ＤＭｔｒＯＨ（３．８３ｇ、２．７６ミリモル）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（４．８２ｍＬ、２７．６ミリモル、１０当量）およびモレキュラーシーブ４Ａ（７ｇ）を加え、０℃の温度に冷却した。次いで、２−シアノエチルＮ、Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．９４８ｇ、４．００ミリモル、１．４５当量）を１５分かけて滴下により反応物に添加した。室温に到達させながら、反応混合物の撹拌をさらに１５分間続けた。反応混合物を綿栓で濾過し、濾液をＥｔ３Ｎ処理したシリカ（１０ｇ）に被覆した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の０〜３０％ＥｔＯＡｃ、５％Ｅｔ３Ｎ）により精製を行い、ＳＴ４３を無色タール（３．４８ｇ、収率８３％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．４４  −  ７．３７  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．３３  −  ７．２０  （ｍ，  １８Ｈ），  ７．１９  −  ７．１３  （ｍ，  ３Ｈ），  ６．８３  −  ６．７５  （ｍ，  １２Ｈ），  ３．８７  −  ３．６９  （ｍ，  ２０Ｈ），  ３．６６  −  ３．５１  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．３９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．２８  −  ３．１５  （ｍ，  １０Ｈ），  ３．０７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ２．６０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．７９  （ｐ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．５８  （ｐ，  Ｊ  ＝  ３．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．４６  （ｐ，  Ｊ  ＝  ６．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．３９  −  １．２３  （ｍ，  ４Ｈ），  １．１７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ７．３  Ｈｚ，  １２Ｈ）。
【０２８１】
【化３４】
2019510793.tif 000036
【０２８２】
（（８−ブロモオクチル）オキシ）（ｔｅｒｔ−ブチル）ジメチルシラン（７）
乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）中の８−ブロモオクタン−１−オール（８ｇ、３８．３ミリモル）の溶液に、イミダゾール（６．５１ｇ、９６ミリモル、２．５当量）を添加した。透明な溶液が得られたら、ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ（７．５０ｇ、４９．７ミリモル、１．２当量）を少量ずつ添加したところ発熱反応が観察され、最高温度は４０℃に達した。反応混合物の撹拌を室温で一晩続けた。得られた黄色の懸濁液をＥｔ２Ｏ（４０ｍＬ）で希釈し、ブライン（４０ｍＬ）で洗浄した。水層をＥｔ２Ｏ（２×４０ｍＬ）でさらに２回抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。減圧下で濃縮した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の０〜４０％ＥｔＯＡｃ）により精製を行い、７を無色油状物として得た（１１．７３ｇ、収率９５％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ３．６０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．６，  １．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．４１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．９  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．８５  （ｐ，  Ｊ  ＝  ７．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．６０  -  １．３７  （ｍ，  ４Ｈ），  １．３７  −  １．２４  （ｍ，  ６Ｈ），  ０．８９  （ｓ，  ９Ｈ），  ０．０５  （ｓ，  ６Ｈ）。
【０２８３】
２−（（（８−（（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）オキシ）オクチル）オキシ）メチル）−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（８）
ジメチルスルホキシド（４５ｍＬ）中のペンタエリスリトール（１６．８４ｇ、１２４ミリモル、１０当量）の懸濁液に、水酸化カリウム（６．９４ｇ、１２４ミリモル、１０当量）を加え、これを室温で１５分間撹拌した。次いで、２時間かけて、７（４ｇ、１２．３７ミリモル、１当量）を添加した。添加が完了したら、反応混合物の撹拌を室温で一晩続けた。反応混合物をＥｔ２Ｏ（３×１５０ｍＬ）で３回抽出し、全ての有機層をブライン（５０ｍＬ）で別々に洗浄した。次いで、合わせた水層をＥｔ２Ｏ（５０ｍＬ）でもう一度抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下で濃縮した。淡黄色油状物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃ）により精製して、８を無色油状物として得た（０．５３ｇ、収率１１％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ３．７２  （ｄ，  Ｊ  ＝  ３．７  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．６０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．４７  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．４２  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ２．７３  （ｓ，  ３Ｈ），  １．６３  −  １．４４  （ｍ，  ４Ｈ），  １．３０  （ｓ，  ８Ｈ），  ０．８９  （ｓ，  ９Ｈ），  ０．０５  （ｓ，  ６Ｈ）。
【０２８４】
エチル１５，１５−ビス（（（３−エトキシ−３−オキソプロパ−１−エン−１−イル）オキシ）メチル）−２，２，３，３−テトラメチル−４，１３，１７−トリオキサ−３−シライコス−１８−エン−２０−オエート（９）
ジクロロメタン（３０ｍＬ）中の８（２．９４ｇ、７．７６ミリモル）の溶液に、Ｎ−メチルモルホリン（３．８４ｍＬ、３４．９ミリモル、４．５当量）およびエチルプロピオネート（３．７ｍＬ、３６．５ミリモル、４．７当量）を添加した。発熱反応が観察され、氷浴を用いて２０℃の温度に冷却した。反応混合物の撹拌を室温で一晩続けた。反応混合物を減圧濃縮して暗褐色油状物を得た。これをフラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の０〜４０％ＥｔＯＡｃ）により精製して、９を淡黄色油状物として得た（３．８４ｇ、収率７３％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．５４  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．６  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ５．２３  （ｄ，  Ｊ  ＝  １２．６  Ｈｚ，  ３Ｈ），  ４．１６  （ｑ，  Ｊ  ＝  ７．１  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．８９  （ｓ，  ６Ｈ），  ３．５９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．４２  （ｓ，  ２Ｈ），  ３．３６  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．５６  −  １．４５  （ｍ，  ４Ｈ），  １．３５  −  １．２２  （ｍ，  １７Ｈ），  ０．８９  （ｓ，  ９Ｈ），  ０．０５  （ｓ，  ６Ｈ）。
【０２８５】
エチル１５，１５−ビス（（３−エトキシ−３−オキソプロポキシ）メチル）−２，２，３，３−テトラメチル−４，１３，１７−トリオキサ−３−シライコサン−２０−オエート（１０）
エタノール（１６７ｍＬ）中の９（３．８４ｇ、５．７１ミリモル）の溶液に、炭素上の１０％パラジウム（０．３０４ｇ、０．２８５ミリモル、０．０５当量）およびピリジン（０．２１３ｍＬ、２．８５ミリモル、０．５当量）を添加した。反応混合物に水素（大気圧）を加え、混合物の撹拌を室温で一晩続けた。反応混合物を珪藻土のプラグで濾過した後、濾液を減圧濃縮し、１０を黄色油状物として得た（３．８６ｇ、収率１００％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ４．１４  （ｑ，  Ｊ  ＝  ７．１  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．６４  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．５９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．７  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．４０  −  ３．２８  （ｍ，  １０Ｈ），  ２．５３  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．５５  −  １．４６  （ｍ，  ４Ｈ），  １．３５  −  １．２３  （ｍ，  １７Ｈ），  ０．８９  （ｓ，  ９Ｈ），  ０．０５  （ｓ，  ６Ｈ）。
【０２８６】
１５、１５−ビス（（３−ヒドロキシプロポキシ）メチル）−２，２，３，３−テトラメチル−４，１３，１７−トリオキサ−３−シライコサン−２０−オール（ＳＴ４４）
乾燥テトラヒドロフラン（６７ｍＬ）中の１０（３．８６ｇ、５．６９ミリモル）の溶液を−５℃の温度に冷却した。次いで、テトラヒドロフラン（２４ｍＬ、５７ミリモル、１０当量）中の２．４Ｍ水素化リチウムアルミニウムを滴下により１時間かけて添加した。添加が完了したら、反応混合物をゆっくりと室温に到達させながら一晩撹拌を続けた。翌日、反応混合物を０℃の温度に冷却し、硫酸ナトリウム・十水和物（１８．３２ｇ、５６．９ミリモル、１０当量）をバッチ式で添加することによりクエンチした。白色の沈殿物を、乾燥Ｎａ２ＳＯ４プラグによる濾過によって除去し、続いてテトラヒドロフランで２回すすいだ。濾液を減圧下で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中の０〜７％ＭｅＯＨ）による精製を行って、ＳＴ４４を淡黄色油状物（１．９６ｇ、収率６０％）として得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ３．７５  （ｔ，  Ｊ  ＝  ５．３  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．６４  −  ３．５５  （ｍ，  ８Ｈ），  ３．４８  -  ３．２７  （ｍ，  １３Ｈ），  １．８０  （ｈ，  Ｊ  ＝  ５．４，  ４．８  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．５８  −  １．４６  （ｍ，  ４Ｈ），  １．３６  −  １．２５  （ｍ，  ８Ｈ），  ０．８９  （ｓ，  ９Ｈ），  ０．０５  （ｓ，  ６Ｈ）。
【０２８７】
８，８−ビス（（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロポキシ）メチル）−１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−２０，２０，２１，２１−テトラメチル−１−フェニル−２，６，１０，１９−テトラオキサ−２０−シラドコサン（ＳＴ４５ＤＭＴｒＴＢＤＭＳ）
ピリジンで２回ストリッピングすることによりＳＴ４４（１．９４ｇ、３．５１ミリモル）から残留水を除去し、次いで、アルゴン雰囲気下でピリジン（７０ｍＬ）に再溶解させた。反応混合物にモレキュラーシーブ４Ａ（４ｇ）を加え、１５分間攪拌を続けた。固体ＤＭＴｒＣｌ（４．１６ｇ、１２．２８ミリモル、３．５当量）を２時間かけてバッチで添加した。さらに１．５時間後、追加のＤＭＴｒＣｌ（２．３８ｇ、７．０２ミリモル、２当量）を加え、暗橙色となった混合物の撹拌を室温で一晩続けた。この反応物を、ＭｅＯＨ（４．４ｍＬ、１０９ミリモル、３１当量）の添加によってクエンチし、１５分間撹拌した。次いで、反応混合物を綿栓で濾過し、濾液をＥｔ３Ｎ中和シリカ（２０ｇ）に被覆した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃ、５％Ｅｔ３Ｎ）により精製し、ＳＴ４５ＤＭＴｒＴＢＤＭＳを黄色発泡油として得た（０．４４ｇ、収率８％）。出発物質および中間体を収率６０％で回収した。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．４３  −  ７．３８  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．２７  （ｑ，  Ｊ  ＝  ８．１，  ７．３  Ｈｚ，  １８Ｈ），  ７．１９  −  ７．１３  （ｍ，  ３Ｈ），  ６．８１  −  ６．７６  （ｍ，  １２Ｈ），  ３．７６  （ｓ，  １８Ｈ），  ３．５８  （ｔｄ，  Ｊ  ＝  ６．５，  ３．０  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．４４  （ｄｔ，  Ｊ  ＝  ３３．９，  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．３５  −  ３．１６  （ｍ，  １０Ｈ），  ３．０７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．７９  （ｈ，  Ｊ  ＝  ６．３  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．５２  −  １．３９  （ｍ，  ４Ｈ），  １．３４  −  １．２０  （ｍ，  ８Ｈ），  ０．８９  （ｓ，  ９Ｈ），  ０．０４  （ｓ，  ６Ｈ）。
【０２８８】
８−（３−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロポキシ）−２，２−ビス（（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロポキシ）メチル）プロポキシ）オクタン−１−オール（ＳＴ４５ＤＭＴｒＯＨ）
乾燥テトラヒドロフラン（１２ｍＬ）中のＳＴ４５ＤＭＴｒＴＢＤＭＳ（２．２０ｇ、１．５０７ミリモル）の溶液に、テトラヒドロフラン（１．６８８ｍＬ、１．６８８ミリモル、１．１２当量）中の１Ｍ  ＴＢＡＦを添加し、これを室温で一晩撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃ、５％Ｅｔ３Ｎ）により精製して、ＳＴ４５ＤＭＴｒＯＨを無色油状物として得た（１．７４ｇ、収率８３％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．４４  −  ７．３７  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．３４  −  ７．２１  （ｍ，  １８Ｈ），  ７．２０  −  ７．１２  （ｍ，  ３Ｈ），  ６．８２  −  ６．７５  （ｍ，  １２Ｈ），  ３．７５  （ｓ，  １８Ｈ），  ３．５９  （ｑ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ２Ｈ），  ３．４０  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．５  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．２６  −  ３．１５  （ｍ，  １０Ｈ），  ３．０７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．７９  （ｐ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．５６  −  １．３９  （ｍ，  ４Ｈ），  １．３７  −  １．２０  （ｍ，  ９Ｈ）。
【０２８９】
８−（３−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロポキシ）−２，２−ビス（（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）プロポキシ）メチル）プロポキシ）オクチル（２−シアノエチル）ジイソプロピルホスホルアミダイト（ＳＴ４５）
乾燥ジクロロメタン（２５ｍＬ）中のＳＴ４５ＤＭＴｒＯＨ（１．９ｇ、１．４１２ミリモル）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（２．４６６ｍＬ、１４．１２ミリモル、１０当量）およびモレキュラーシーブ４Ａ（３．８ｇ）を添加し、０℃の温度に冷却した。次いで、２−シアノエチルＮ、Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（０．４０１ｇ、１．６９４ミリモル、１．２当量）を５分間かけて滴下により反応物に添加した。室温に到達させながら、反応混合物の撹拌をさらに１５分間続けた。反応混合物を綿栓で濾過し、濾液をＥｔ３Ｎ処理したシリカ（７．５ｇ）上に被覆した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（ヘプタン中の０〜１００％ＥｔＯＡｃ、５％Ｅｔ３Ｎ）により精製して、ＳＴ４５を透明な油として得た（１．３７ｇ、収率５９％）。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）  δ  ７．４４  −  ７．３７  （ｍ，  ６Ｈ），  ７．３３  −  ７．２０  （ｍ，  １８Ｈ），  ７．１９  −  ７．１３  （ｍ，  ３Ｈ），  ６．８２  −  ６．７４  （ｍ，  １２Ｈ），  ３．８８  −  ３．７０  （ｍ，  ２０Ｈ），  ３．６８  −  ３．５２  （ｍ，  ４Ｈ），  ３．３９  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ３．３０  −  ３．１５  （ｍ，  １０Ｈ），  ３．０７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  ６Ｈ），  ２．６１  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，  ２Ｈ），  １．７９  （ｈ，  Ｊ  ＝  ６．５，  ５．９  Ｈｚ，  ６Ｈ），  １．６３  −  １．５４  （ｍ，  ２Ｈ），  １．５０  −  １．４０  （ｍ，  ２Ｈ），  １．３７  −  １．２１  （ｍ，  ８Ｈ），  １．１７  （ｔ，  Ｊ  ＝  ６．４  Ｈｚ，  １２Ｈ）。
【０２９０】
実施例３−核酸コンジュゲートの合成
すべてのオリゴヌクレオチドは、ＡＫＴＡオリゴパイロットシンセサイザーで合成された。市販の固体支持体および２’Ｏ−メチルＲＮＡホスホルアミダイト、２’−フルオロ、２’−デオキシＲＮＡホスホルアミダイトおよび市販の長いトレブラーホスホルアミダイト（ＳＴＫＳ）（グレンリサーチ）を使用した。オリゴヌクレオチド合成、脱保護および精製は、当技術分野で公知の標準的な手順に従った。オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成は、商業的に利用可能なオリゴヌクレオチド製造業者（バイオスプリング、フランクフルト、ドイツ）によって実施した。
【０２９１】
【化３５】
2019510793.tif 000037
【０２９２】
ＧａｌＮＡｃシントン（ＳＴ２１、ＳＴ２３、ＳＴ３１）またはトレブラーシントン（ＳＴＫＳ、ＳＴ４１、ＳＴ４３、ＳＴ４５）の共役は、標準的なホスホルアミダイトのカップリング条件下で、対応するホスホルアミダイトをオリゴ鎖の５’末端にカップリングすることにより行った。ホスホロチオエートの導入は、標準的な市販のチオール化試薬（ＥＤＩＴＨ、リンクテクノロジーズ）を用いて行った。
【０２９３】
一本鎖は、メチルアミン水溶液を用いてＣＰＧを切断し、得られた粗オリゴヌクレオチドについては、塩化ナトリウム勾配を用いたＡＫＴＡピュアＨＰＬＣシステム上のイオン交換クロマトグラフィー（リソースＱ、６ｍＬ、ＧＥヘルスケア）を用いて精製した。生成物を含有する画分をプールし、サイズ排除カラム（ゼータデックス、ＥＭＰバイオテック）上で脱塩し、凍結乾燥した。
【０２９４】
二本鎖化には、それぞれの一本鎖の等モル量を水に溶解し、８０℃で５分間加熱した。冷却後、得られた二本鎖を凍結乾燥した。
【０２９５】
【表２】
2019510793.tif 000038
【０２９６】
比較核酸コンジュゲート分子の合成−ＴＴＲＣＦ０２
【０２９７】
【化３６】
2019510793.tif 000039
【０２９８】
ＧａｌＮＡｃリンカーＳＴ１３の活性エステル（ＮＨＳ）を用いて、センス鎖を合成後に修飾した：
【０２９９】
【化３７】
2019510793.tif 000040
【０３００】
ＳＴ１３の合成およびカップリングは、ＰＦＰ活性エステルの代わりにＮＨＳを使用したこと以外は、公開された手順（Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２０１５  Ａｕｇ  １９；２６（８）：１４５１−５）と同様に行った。
【０３０１】
最終コンジュゲート（ＴＴＲＣＦ０２）の構造：
【０３０２】
【化３８】
2019510793.tif 000041
【０３０３】
配列
以下の配列の修飾キー：
太字＝２’Ｏ−メチルリボヌクレオチド
下線＝２’フルオロ／２’デオキシリボヌクレオチド
ｐｓ＝ホスホロチオエート結合
【０３０４】
【化３９】
2019510793.tif 000042
【０３０５】
以下の配列の修飾キー：
ｆは２’フルオロ２’デオキシリボヌクレオチドを示し、
ｍは２’Ｏメチルリボヌクレオチドを示し、
（ｐｓ）はホスホロチオエート結合を示す。
【０３０６】
【化４０】
2019510793.tif 000043
【０３０７】
【化４１】
2019510793.tif 000044
【０３０８】
実施例４−インビボアッセイおよびマウスにおけるＴＴＲノックダウンの持続時間
８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６ＪＯｌａＨｓｄマウスに、３００μＬ／ｋｇの単回皮下注射（各群４匹）によりそれぞれの用量を注射した。
【０３０９】
各時点でマウスを屠殺し、肝臓を採取し、ＴＡＱｍａｎ分析を用いてＴＴＲ  ｍＲＮＡについて分析した。
【０３１０】
インビボでの標的遺伝子の発現：
新鮮な肝臓組織から、実質的にＦｅｈｒｉｎｇら、２０１４年に記載の手法により、全ＲＮＡを単離した：
標的ｍＲＮＡノックダウン分析のために、マウスを屠殺した直後に組織を解剖し、直ちに液体窒素中で急速冷凍した。タングステンカーバイドビーズ（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を使用して、ＭｉｘｅｒＭｉｌｌＭＭ３０１（レッチュゲーエムベーハー、ハーン、ドイツ）で約２０ｍｇの組織をホモジナイズした。ＩｎｖｉｓｏｒｂＳｐｉｎＴｉｓｓｕｅＲＮＡＭｉｎｉＫｉｔ（インビテック、ベルリン、ドイツ）を用いて、全ＲＮＡをライセートから単離した。組織に応じて、２５〜１００ｎｇの全ＲＮＡを、バイオテズゲーエムベーハー、ベルリン、ドイツから得られたアンプリコンセットを用いた定量的ＴａｑＭａｎＲＴ−ＰＣＲに使用した：ＴａｑＭａｎＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＲＴ−ＰＣＲのための標準的なプロトコールを用いたＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ（ソフトウェア：ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ  ｖ１．６．３（エービーアイライフテクノロジーズ））またはＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）により、それぞれ３００ｎｍｏｌ／Ｌおよび１００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度のプライマーおよびプローブを用いて（Ｆｅｈｒｉｎｇら、２０１４年に記載されているように）行った。ＴａｑＭａｎデータは、比較Ｃｔ法を用いて計算した。ｍＲＮＡレベルをＰＴＥＮに対して正規化した。
【０３１１】
【表３】
2019510793.tif 000045
【０３１２】
上記の方法を、１ｍｇ／ｋｇの単回皮下投与に用いた。マウスを注射の２日後に犠牲にした。試験化合物は、ＴＴＲＣＦ０２、ＴＴＲＣＦ０２Ｖ２０、ＴＴＲＣＦ０２Ｖ２１、ＴＴＲＣＦ０２Ｖ２２およびＴＴＲＣＦ０２Ｖ２３であった。ＧａｌＮＡｃリンカーシステム（ＴＴＲＣＦ０２Ｖ２１およびＴＴＲＣＦ０２Ｖ２３）にホスホロチオエートを導入したところ、標準的なホスホジエステル結合（ＴＴＲＣＦ０２Ｖ２０およびＴＴＲＣＦ０２Ｖ２２）と比較して実質的に大きい効力を示した。結果を図２に示す。
【０３１３】
上記の方法を、２ｍｇ／ｋｇの単回皮下投与に用いた。所定の時点（注入後７，１４，２１および２８日）にマウスを屠殺した。試験化合物は、ＰＴＥＮＣＦ０２（コントロール）、ＴＴＲＣＦ０２、ＴＴＲＣＦ０２Ｖ２１およびＴＴＲＣＦ０２Ｖ２３であった。結果を図３に示す。
【０３１４】
実施例５−ＴＴＲＣＦ０２Ｖ２１およびＴＴＲＣＦ０２Ｖ２３の用量力価
８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＪＯｌａＨｓｄマウスに、３００μＬ／ｋｇの単回皮下注射（１群当たり４匹）のそれぞれの用量（３、１、０．３、０．１ｍｇ／ｋｇ）を注射した。ＰＢＳをコントロールとして使用した。２日後にマウスを屠殺し、肝臓を採取し、ＴＡＱｍａｎ分析を用いてＴＴＲ  ｍＲＮＡについて分析した。実施例４と同様にしてサンプルの分析を行った。
【０３１５】
ｓｉＲＮＡ  ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＴＴＲＣＦ０２Ｖ２１およびＴＴＲＣＦ０２Ｖ２３の両方が、用量依存的にＴＴＲレベルを低下させるのに非常に有効であった。結果を図４に示す。
【０３１６】
実施例６−様々なＴＴＲ  ｓｉＲＮＡ  ＧａｌＮＡｃコンジュゲートのＴＴＲノックダウンのインビトロでの定量
種々のＴＴＲ  ｓｉＲＮＡ  ＧａｌＮＡｃコンジュゲートであるＳＴＳ０１６Ｌ４〜Ｌ９のＴＴＲノックダウンについてのインビトロでの定量を、肝細胞アッセイにより行った。
【０３１７】
一次肝細胞（ライフテクノロジー）を、製造者のプロトコールに従って６ウェルプレート（６００，０００細胞／ウェル）に播種し、それぞれの濃度のＧａｌＮａｃコンジュゲートとともにインキュベートした。インキュベーションの２４時間後に細胞を回収し、ＲＮＡを単離し、実施例４と同様にＴａｑｍａｎ分析を用いて分析した。
【０３１８】
すべての異なるｓｉＲＮＡ  ＧａｌＮＡｃコンジュゲートであるＳＴＳ０１６Ｌ４〜Ｌ９が、ＴＴＲレベルの低減に非常に有効であった。結果を図５および図６に示す。ＴＴＲＣＦ０２Ｖ２３は陽性対照を表す。ＧＮ＿Ｌｕｃは陰性対照を表す。
【０３１９】
実施例７−インビボアッセイおよびマウスにおけるＴＴＲノックダウンの持続時間
８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６ＪＯｌａＨｓｄマウスに、１ｍｇ／ｋｇの用量を３００μＬ／ｋｇの単回皮下注射（１群当たり４匹）で注射した。
【０３２０】
各時点（注射後８日目、１５日目、２２日目）後に血液を採取し、市販のマウスＴＴＲ特異的ＥＬＩＳＡキットを用いてＴＴＲレベルを分析した。
【０３２１】
すべての異なるｓｉＲＮＡ  ＧａｌＮＡｃコンジュゲートであるＳＴＳ０１６Ｌ４〜Ｌ９が、ＴＴＲレベルの低減に非常に有効であった。結果を図７に示す。
【０３２２】
実施例８−マウスにおけるＰＴＥＮノックダウンのインビボアッセイ
８週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６ＪＯｌａＨｓｄマウスに、３００μＬ／ｋｇの単回皮下注射（１群当たり４匹）のそれぞれの用量（１、３、１０ｍｇ／ｋｇ）を注射した。ＰＢＳをコントロールとして使用した。
【０３２３】
投与２日後にマウスを屠殺し、肝臓を採取し、ＴＡＱｍａｎ分析を用いてＰＴＥＮｍＲＮＡについて分析した。
【０３２４】
インビボでの標的遺伝子の発現：
新鮮な肝臓組織から、実質的にＦｅｈｒｉｎｇら、２０１４年に記載の手法を用いて全ＲＮＡを単離した：
標的ｍＲＮＡノックダウン分析のために、マウスを屠殺した直後に組織を解剖し、直ちに液体窒素中で急速冷凍した。タングステンカーバイドビーズ（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を使用してＭｉｘｅｒＭｉｌｌＭＭ３０１（レッチュゲーエムベーハー、ハーン、ドイツ）で約２０ｍｇの組織をホモジナイズした。ＩｎｖｉｓｏｒｂＳｐｉｎＴｉｓｓｕｅＲＮＡＭｉｎｉＫｉｔ（インビテック、ベルリン、ドイツ）を用いて、全ＲＮＡをライセートから単離した。組織に応じて、２５〜１００ｎｇの全ＲＮＡを、バイオテズゲーエムベーハー、ベルリン、ドイツから得られたアンプリコンセットを用いた定量的ＴａｑＭａｎＲＴ−ＰＣＲに使用した：ＴａｑＭａｎＲＴ−ＰＣＲ反応は、ＲＴ−ＰＣＲのための標準的なプロトコールを用いたＡＢＩＰＲＩＳＭ７７００ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｏｒ（ソフトウェア：ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ  ｖ１．６．３（エービーアイライフテクノロジーズ））またはＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＲｅａｌＴｉｍｅＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＢＩ）により、それぞれ３００ｎｍｏｌ／Ｌおよび１００ｎｍｏｌ／Ｌの濃度のプライマーおよびプローブを用いて（Ｆｅｈｒｉｎｇら、２０１４年に記載されているように）行った。ＰＴＥＮ用のＴａｑＭａｎプローブは、実施例４に記載のものと同じであった。
【０３２５】
結果を図８に示す。ＰＴＥＮの明確な用量依存性ノックダウンが確認された。
【０３２６】
参考文献：
１．Ｆｉｒｅ，  Ａ．；  Ｘｕ，  Ｓ．；  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，  Ｍ．  Ｋ．；  Ｋｏｓｔａｓ，  Ｓ．  Ａ．；  Ｄｒｉｖｅｒ，  Ｓ．  Ｅ．；  Ｍｅｌｌｏ，  Ｃ．  Ｃ．，  Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９９８，  ３９１  （６６６９），  ８０６−１１．
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４．Ｗｅｉｇｅｌ，  Ｐ．  Ｈ．；  Ｙｉｋ，  Ｊ．  Ｈ．，  Ｇｌｙｃａｎｓ  ａｓ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｓｉｇｎａｌｓ：  ｔｈｅ  ｃａｓｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ／ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ２００２，  １５７２  （２−３），  ３４１−６３．
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６．Ｂｉｅｓｓｅｎ，  Ｅ．  Ａ．；  Ｂｒｏｘｔｅｒｍａｎ，  Ｈ．；  ｖａｎ  Ｂｏｏｍ，  Ｊ．  Ｈ．；  ｖａｎ  Ｂｅｒｋｅｌ，  Ｔ．  Ｊ．，  Ｔｈｅ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ａ  ｔｒｉａｎｔｅｎｎａｒｙ  ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ｈｅｐａｔｉｃ  ａｓｉａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｌｏｗｅｒｉｎｇ  ａｇｅｎｔ．  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １９９５，  ３８  （１１），  １８４６−５２．
７．Ａｋｉｎｃ，  Ａ．；  Ｑｕｅｒｂｅｓ，  Ｗ．；  Ｄｅ，  Ｓ．；  Ｑｉｎ，  Ｊ．；  Ｆｒａｎｋ−Ｋａｍｅｎｅｔｓｋｙ，  Ｍ．；  Ｊａｙａｐｒａｋａｓｈ，  Ｋ．  Ｎ．；  Ｊａｙａｒａｍａｎ，  Ｍ．；  Ｒａｊｅｅｖ，  Ｋ．  Ｇ．；  Ｃａｎｔｌｅｙ，  Ｗ．  Ｌ．；  Ｄｏｒｋｉｎ，  Ｊ．  Ｒ．；  Ｂｕｔｌｅｒ，  Ｊ．  Ｓ．；  Ｑｉｎ，  Ｌ．；  Ｒａｃｉｅ，  Ｔ．；  Ｓｐｒａｇｕｅ，  Ａ．；  Ｆａｖａ，  Ｅ．；  Ｚｅｉｇｅｒｅｒ，  Ａ．；  Ｈｏｐｅ，  Ｍ．  Ｊ．；  Ｚｅｒｉａｌ，  Ｍ．；  Ｓａｈ，  Ｄ．  Ｗ．；  Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，  Ｋ．；  Ｔｒａｃｙ，  Ｍ．  Ａ．；  Ｍａｎｏｈａｒａｎ，  Ｍ．；  Ｋｏｔｅｌｉａｎｓｋｙ，  Ｖ．；  Ｆｏｕｇｅｒｏｌｌｅｓ，  Ａ．  ｄ．；  Ｍａｉｅｒ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＲＮＡｉ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｗｉｔｈ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｄ  Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ：  ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１０，  １８  （７），  １３５７−１３６４．
８．Ｆｅｈｒｉｎｇ，  Ｖ．；  Ｓｃｈａｅｐｅｒ，  Ｕ．；  Ａｈｒｅｎｓ，  Ｋ．；  Ｓａｎｔｅｌ，  Ａ．；  Ｋｅｉｌ，  Ｏ．；  Ｅｉｓｅｒｍａｎｎ，  Ｍ．；  Ｇｉｅｓｅ，  Ｋ．；  Ｋａｕｆｍａｎｎ，  Ｊ．，  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｉＲＮＡ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｖｉａ  ｎｏｖｅｌ  Ｌｉｐｏｐｌｅｘ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ＤＡＣＣ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１４，  ２２  （４），  ８１１−２０．
９．Ｐｒａｋａｓｈ，  Ｔ．  Ｐ．；  Ｂｒａｄ  Ｗａｎ，  Ｗ．；  Ｌｏｗ，  Ａ．；  Ｙｕ，  Ｊ．；  Ｃｈａｐｐｅｌｌ，  Ａ．  Ｅ．；  Ｇａｕｓ，  Ｈ．；  Ｋｉｎｂｅｒｇｅｒ，  Ｇ．  Ａ．；  Oｓｔｅｒｇａａｒｄ，  Ｍ．  Ｅ．；  Ｍｉｇａｗａ，  Ｍ．  Ｔ．；  Ｓｗａｙｚｅ，  Ｅ．  Ｅ．；  Ｓｅｔｈ，  Ｐ．  Ｐ．，  Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ５′−ｔｒｉａｎｔｅｎｎａｒｙ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１５，  ２５  （１９），  ４１２７−４１３０．
１０．Ｌｉ，  Ｌ．−Ｃ．；  Ｏｋｉｎｏ，  Ｓ．  Ｔ．；  Ｚｈａｏ，  Ｈ．；  Ｐｏｏｋｏｔ，  Ｄ．；  Ｐｌａｃｅ，  Ｒ．  Ｆ．；  Ｕｒａｋａｍｉ，  Ｓ．；  Ｅｎｏｋｉｄａ，  Ｈ．；  Ｄａｈｉｙａ，  Ｒ．，  Ｓｍａｌｌ  ｄｓＲＮＡｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２００６，  １０３  （４６），  １７３３７−１７３４２．
【図１】
2019510793.tif 000058
【図２】
2019510793.tif 000059
【図３】
2019510793.tif 000060
【図４】
2019510793.tif 000061
【図５】
2019510793.tif 000062
【図６】
2019510793.tif 000063
【図７】
2019510793.tif 000064
【図８】
2019510793.tif 000065
【配列表】
2019510793000001.app
【国際調査報告】
2019510793.tif 000066
2019510793.tif 000067
2019510793.tif 000068
2019510793.tif 000069