(57)【要約】非ウイルス遺伝子送達システム、例えば、リポポリプレックストランスフェクションベクターのフォーメーションに使用するための３つのＣ１２―２４ヒドロカルビル基およびカチオンのヘッド基を有する式（１ａ）の三本鎖のカチオンを含む脂質。核酸および標的ペプチドが本発明の脂質（または、共脂質で配合された脂質）とともにＬＰＤ複合体に配合されるとき、非常に優れた核酸トランスフェクションが観察される。
2019510083.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉａ）：
【化１】
2019510083.tif 000020
（Ｉａ）
のイオン化合物であって、
各ＸおよびＹは、同じであり、または、異なり、−Ｏ−および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−から選択され、カルボニル炭素は、基Ｒ１またはＲ２に結合し、
Ｒ１およびＲ２は、同じであり、または、異なり、ヒドロキシ、ハロゲンおよびＯＲＡから選択される１以上の置換基により置換されない、または、置換されるＣ１２−２４ヒドロカルビル基から独立してそれぞれ選択され、ＲＡはＣ１−６ヒドロカルビル基であり、
Ｒ３およびＲ４は、同じであり、または、異なり、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ’）２、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’から選択される１以上の置換基により置換されない、または、置換されるＣ１−１０ヒドロカルビル基から独立してそれぞれ選択され、Ｒ’は、同じであり、または、異なり、Ｃ１−６ヒドロカルビル基であり、
ＳｐおよびＷはともに結合であり、
Ｓｐは、ヒドロキシ、ハロゲンおよびＯＲ’から選択される１以上の置換基により置換されない、または、置換されるＣ１−８アルキレン基であり、Ｒ’は、Ｃ１−６ヒドロカルビル基であり、Ｗは、結合、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、および−Ｏ−から選択され、
Ｂは、それぞれ、同じであり、または、異なり、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲＡ、−ＮＲＡＲＡおよび−ＯＣ（Ｏ）ＲＡから選択される１以上の置換基により、置換されない、または、置換されるＣ１−６アルキレン基であり、各ＲＡは、それぞれ、Ｃ１−４ヒドロカルビルから独立して選択され、
ｍは１〜８の整数であり、
Ｑは、−ＯＲ５および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ５から選択され、Ｒ５は、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲＡから選択される１以上の置換基により置換されない、または、置換されるＣ１２−２４ヒドロカルビル基から選択され、ＲＡは、Ｃ１−６ヒドロカルビル基である、イオン化合物。
【請求項２】
Ｒ１およびＲ２は、同じであり、または、異なり、それぞれが独立して、１以上の二重結合を有するＣ１４−２２ヒドロカルビル基である、請求項１に記載のイオン化合物。
【請求項３】
ＳｐおよびＷがともに結合であり、または、Ｓｐが非置換Ｃ１−８アルキレン基であり、かつ、Ｗが結合、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、もしくは−Ｏ−である、請求項１または２に記載のイオン化合物。
【請求項４】
Ｒ３およびＲ４は、同じであり、または、異なり、それぞれが直鎖または分枝鎖の非置換Ｃ１−４アルキル基である、請求項１から３のいずれかに記載のイオン化合物。
【請求項５】
各Ｂは、非置換Ｃ１−３アルキレン基から選択される、請求項１から４のいずれかに記載のイオン化合物。
【請求項６】
ｍが、１、２、３、４、５、または６である、請求項１から５のいずれかに記載のイオン化合物。
【請求項７】
Ｒ１およびＲ２は、同じであり、または、異なり、それぞれが独立して１つの二重結合を有するＣ１４−２２ヒドロカルビル基であり、
ＳｐおよびＷがともに結合であり、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれが、直鎖または分枝鎖の非置換Ｃ１−４アルキル基であり、
各Ｂは、非置換Ｃ１−３アルキレン基から選択され、
ｍは、２、３、４、５、または６であり、
Ｑは、−ＯＲ５および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ５から選択され、
Ｒ５は、１つの二重結合を有するＣ１４−２２ヒドロカルビル基である、請求項１に記載のイオン化合物。
【請求項８】
式（Ｉｄ）：
【化２】
2019510083.tif 000021
（Ｉｄ）
のカチオンを含み、
Ｘ−Ｒ１およびＹ−Ｒ２およびＱのそれぞれは、−Ｏ−（ＣＨ２）８ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）７ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３から選択され、
ｍは、２〜５の整数である、請求項１に記載のイオン化合物。
【請求項９】
Ｘ−Ｒ１およびＹ−Ｒ２のそれぞれは、同じであり、−Ｏ−（ＣＨ２）８ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３、および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）７ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３から選択され、
Ｑは、−Ｏ−（ＣＨ２）８ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）７ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３から選択され、
ｍは、３または４である、請求項１から８のいずれかに記載のイオン化合物。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の（ｉ）イオン化合物を含む、非ウイルストランスフェクション複合体。
【請求項１１】
（ｉｉ）ポリカチオンの核酸結合成分、（ｉｉｉ）細胞表面受容体結合成分、および、任意に、（ｉｖ）核酸をさらに含む、請求項１０に記載の非ウイルストランスフェクション複合体。
【請求項１２】
薬学的に適切な担体との混合物または組み合わせにおいて、請求項１０または１１に記載のトランスフェクション複合体を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
ヒトまたは非ヒト動物に、請求項１０または１１に記載のトランスフェクション複合体を投与することを含む、遺伝子の欠陥および／または欠損によりヒトにおいてまたは非ヒト動物において生じる状態の治療もしくは予防のための、治療的もしくは予防的免疫のための、またはアンチセンスもしくはＲＮＡｉ療法のための、または癌の治療のための方法。
【請求項１４】
医薬品、例えばワクチンとしての使用のための、請求項１０または１１に記載のトランスフェクション複合体。
【請求項１５】
ヒトまたは非ヒト動物における遺伝子の欠陥および／もしくは欠損により生じる状態の治療もしくは予防における使用のための、または治療的もしくは予防的免疫のための、またはアンチセンスもしくはＲＮＡｉ療法のための、または癌の治療ための、請求項１０または１１に記載のトランスフェクション複合体。
【請求項１６】
ヒトまたは非ヒト動物における遺伝子の欠陥および／もしくは欠損において生じる状態の治療または予防における使用のための、または治療的もしくは予防的免疫のための、またはアンチセンスもしくはＲＮＡｉ療法のための、または癌の治療ための、医薬品の製造のための請求項１０または１１に記載のトランスフェクション複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的活性物質、例えば、核酸、タンパク質、または小分子の細胞への送達に適する脂質誘導体に関する。本発明は、さらに、例えば、ペプチドと組み合わせたこのような脂質を含む生物学的活性物質の細胞への送達のための非ウイルスベクターの調製における使用のための複合体、並びに、例えば、予防、治療およびワクチン接種、またはインビトロでの実験室設定におけるこのような複合体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療または他の目的のための遺伝子送達は、特に嚢胞性線維症およびある種の癌などの疾患の治療のためによく知られている。この用語は、欠損を矯正する遺伝子または遺伝子の一部の細胞への送達を指す。本明細書において、この用語はまた、標的細胞への核酸物質の導入を指すのにも用いられ、遺伝子ワクチン接種およびいわゆる細胞工場における商業的に有用なタンパク質のインビトロでの産生を含む。
【０００３】
細胞送達システムは、裸のＤＮＡまたはＲＮＡの直接注入を含むもの、ウイルスまたは遺伝子改変されたウイルスを利用するもの、および非ウイルス送達剤を使用するものの３つの広い分類に分類される。それぞれには長所と短所がある。送達剤としてのウイルスは高効率および高い細胞選択性の利点を有するが、毒性、炎症応答の生成および大きなＤＮＡ断片の取り扱いの困難性の欠点を有する。
【０００４】
非ウイルス遺伝子送達システムは、負に荷電したＤＮＡまたはＲＮＡのリン酸骨格とカチオン性脂質、ペプチドまたは他のポリマーとの間の静電相互作用による遺伝子材料のナノメートル粒子への圧縮に基づく（Erbacher, P. et al, Gene Therapy, 1999, 6, 138-145）。ウイルスとは対照的に、脂質を含む非ウイルス性トランスフェクションベクターの使用は、より低い毒性、特に低い免疫原性；より大きな安全性；コスト削減、合理的に効率的なターゲティング、およびパッケージング能力の向上、例えば、核酸材料の大きな断片を扱う性能をもたらし得る。残念ながら、より低いトランスフェクション効率が注目されている。非ウイルス遺伝子治療ベクターは最近のレビューの主題である：(Yin H, Kanasty RL, Eltoukhy AA, Vegas AJ, Dorkin JR, Anderson DG. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature reviews Genetics. 2014;15:541-55;  Schroeder A, Levins CG, Cortez C, Langer R, Anderson DG. Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery. J Intern Med. 2010;267:9-21;  Zhao Y, Huang L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Adv Genet. 2014;88:13-36。
【０００５】
遺伝子送達のための既知の複合体には、脂質ベースの核酸複合体のためのリポプレックス、ペプチドまたはポリマーベースの複合体のためのポリプレックスおよびハイブリッドシステムのためのリポポリプレックスが含まれる(Felgner et al., Human Gene Therapy 8, 1997, 511-512)。本明細書で使用する「ＬＰＤ」という用語は、脂質、インテグリン（または他の受容体）結合ペプチドおよびＤＮＡ（または他の核酸）を含む製剤を表すリポポリプレックスの形態である。ＬＰＤ複合体は、インテグリン媒介または他の受容体介在経路を介したトランスフェクションを達成し、望ましくない血清相互作用を減少させることができるように、必ずしも全体として正の電荷を有する必要はない。ペプチド成分は、核酸パッケージング機能を提供する。細胞内または細胞外の分解、エンドソームまたは他のものからＤＮＡまたはＲＮＡを遮蔽する。脂質成分は、膜融合または透過化、エンドソームまたはリソソーム分解の低減、核酸輸送物の細胞質への輸送を可能にすることにより、エンドソーム脂質二重層との相互作用を媒介する。ペプチド成分は、細胞型特異的または細胞表面受容体特異的であるように設計することができる。例えば、インテグリンまたは他の受容体に対する特異性の程度は、ＬＰＤ複合体にある程度の細胞特異性を付与することができる。細胞表面レセプター（例えば、インテグリンレセプター）への標的化およびいくつかのアデノウイルスベクターに匹敵するトランスフェクション効率からの特異性の結果を達成することができる（Du Z, Munye MM, Tagalakis AD, Manunta MD, Hart SL. The role of the helper lipid on the DNA transfection efficiency of lipopolyplex formulations. Sci Rep. 2014;4:7107;  Welser K, Campbell F, Kudsiova L, Mohammadi A, Dawson N, Hart SL, et al. Gene delivery using ternary lipopolyplexes incorporating branched cationic peptides: the role of Peptide sequence and branching. Mol Pharm. 2013;10:127-41;  Meng QH, Irvine S, Tagalakis AD, McAnulty RJ, McEwan JR, Hart SL. Inhibition of neointimal hyperplasia in a rabbit vein graft model following non-viral transfection with human iNOS cDNA. Gene Ther. 2013;20:979-86;  Manunta MD, McAnulty RJ, McDowell A, Jin J, Ridout D, Fleming J, et al. Airway deposition of nebulized gene delivery nanocomplexes monitored by radioimaging agents. Am J Respir Cell Mol Biol. 2013;49:471-80;  Kenny GD, Bienemann AS, Tagalakis AD, Pugh JA, Welser K, Campbell F, et al. Multifunctional receptor-targeted nanocomplexes for the delivery of therapeutic nucleic acids to the Brain. Biomaterials. 2013;34:9190-200;  Tagalakis AD, He L, Saraiva L, Gustafsson KT, Hart SL. Receptor-targeted liposome-peptide nanocomplexes for siRNA delivery. Biomaterials. 2011;32:6302-15;  Tagalakis AD, Grosse SM, Meng QH, Mustapa MF, Kwok A, Salehi SE, et al. Integrin-targeted nanocomplexes for tumour specific delivery and therapy by systemic administration. Biomaterials. 2011;32:1370-6;  Manunta MD, McAnulty RJ, Tagalakis AD, Bottoms SE, Campbell F, Hailes HC, et al. Nebulisation of receptor-targeted nanocomplexes for gene delivery to the airway epithelium. PLoS One. 2011;6:e26768;  Grosse SM, Tagalakis AD, Mustapa MF, Elbs M, Meng QH, Mohammadi A, et al. Tumor-specific gene transfer with receptor-mediated nanocomplexes modified by polyethylene glycol shielding and endosomally cleavable lipid and peptide linkers. FASEB J. 2010;24:2301-13）。
【０００６】
ヒト気道上皮細胞を標的とするペプチドが報告されている（WO02/072616）。樹状細胞を標的とするペプチドが報告されている（WO2004/108938）。
【０００７】
脂質／ペプチドベクターは、ある範囲の細胞株および一次細胞培養物を高効率かつ低毒性でトランスフェクトする：上皮細胞（４０％効率）、血管平滑筋細胞（５０％効率）、内皮細胞（３０％効率）および造血細胞（１０％効率）。さらに、マウスの気管支上皮のインビボトランスフェクションが、ラットの肺(Jenkins et al. , An integrin-targeted non-viral vector for pulmonary gene therapy, Gene Therapy 2000, 7, 393-400)およびブタの肺(Manunta MD, McAnulty RJ, McDowell A, Jin J, Ridout D, Fleming J, et al. Airway deposition of nebulized gene delivery nanocomplexes monitored by radioimaging agents. Am J Respir Cell Mol Biol. 2013;49:471-80;  Cunningham et al., Evaluation of a porcine model for pulmonary gene transfer using a novel synthetic vector, J Gene Med 2002, 4, 438-46)で、そしてアデノウイルスベクターの効率(上記Jenkins et al., 2000)と同等の効率で実証されている(Manunta MD, McAnulty RJ, Tagalakis AD, Bottoms SE, Campbell F, Hailes HC, et al. Nebulisation of receptor-targeted nanocomplexes for gene delivery to the airway epithelium. PLoS One. 2011;6:e26768;  Tagalakis AD, McAnulty RJ, Devaney J, Bottoms SE, Wong JB, Elbs M, et al. A receptor-targeted nanocomplex vector system optimized for respiratory gene transfer. Mol Ther. 2008;16:907-15.Jenkins et al., Formation of LID vector complexes in water alters physicochemical properties and enhances pulmonary gene expression in vivo, Gene Therapy 2003, 10, 1026-34)。
【０００８】
このようなＬＰＤ複合体または脂質／ペプチド複合体に使用するためのペプチドは、細胞表面受容体（例えば、インテグリン）認識配列を含む「ヘッド基」および非共有結合的にＤＮＡに結合することができる「テイル」の２つの機能を有さなければならない。これらの２つの成分が、それらの個々の機能を妨害しないようにスペーサーを介して共有結合している既知のペプチドには、「テイル」がWO96/15811に記載されているようなペプチド６などのポリカチオン性核酸結合成分であるペプチドを含む。
【０００９】
そのようなペプチドを含むＬＰＤ複合体を含む最初の実験は、全身送達経路または静脈内送達経路による不十分に高いトランスフェクション特性を示した。他のポリカチオン性ベクターについて記載されているように、可能性のある問題は、細網内皮系によるベクターの迅速なクリアランスおよび溶解度の低下を導く赤血球膜および血清タンパク質とベクターとの会合である(Dash, P. R., Read, M. L., Barrett, L. B., Wolfert, M. A., Seymour, L. W. (1999) Gene Therapy 6, 643-50)。全身投与によっていくらかのトランスフェクション活性を示したベクターは、主に、肝臓および肺などの臓器の初回通過毛細血管床において有効であった(Fenske, D. B., MacLachlan, I., Cullis, P. R. (2001). Curr Opin Mol Ther 3, 153-8)。このような非特異的トランスフェクション活性はいくつかの治療用途を有する可能性があるが、特定の用途のための安全な臨床用途は、はるかに大きな標的特異性を有するベクターを必要とする。
【００１０】
ＬＰＤ複合体の脂質成分に関して、そのような使用のためのカチオン性脂質は、１９８０年代後半にFelgnerによって開発され、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417, 1987およびUS 5,264,618で報告されている。Felgnerは、１：１の比で、サイトフェクチンのＤＯＴＭＡ１および中性脂質ＤＯＰＥ２からなる「リポフェクチン（Lipofectin）」という商標で知られている市販のカチオン性リポソームを開発した。
【００１１】
【化１】
2019510083.tif 000003
【００１２】
様々な他のカチオン性リポソーム製剤が考案されており、そのほとんどは合成カチオン性サイトフェクチンと中性脂質を組み合わせている。いくつかは、例えば、グリセロール骨格（ＤＯＴＭＡなど）またはＤＣ−Ｃｈｏｌ３などのコレステロールに基づくものもある。
【００１３】
【化２】
2019510083.tif 000004
【００１４】
新しいサイトフェクチンを開発する目的は、しばしば、広範囲の細胞型およびインビボ適用のために得られたベクターの送達特性を最適化することである。
【００１５】
サイトカインおよび他のカチオン性脂質は、いくつかのスペーサーを介して疎水性尾部に結合したカチオン性ヘッド基を有する正に荷電した分子である。ＤＯＴＭＡ１類似体に加えて、ジエステルＤＯＴＡＰ４のような、グリセロール骨格、代替アルキル鎖基および官能化ヘッド基に対するエーテルまたはエステル結合のいずれかを有する類似体の範囲が報告されている。これらの材料およびそれらが作動するメカニズムについてのレビューは、Angew. Chem. Int. Ed. 37, 1768-1785, 1998に見いだすことができる。多くの既知のＤＯＴＭＡ１類似体シクロフェクチンの共通の特徴は、カチオン性ヘッド基に結合した２つの疎水性テールの存在である。
【００１６】
多くの細胞型について、ＤＯＴＭＡ１およびＤＯＴＡＰ４を用いたインビトロ実験は同等レベルのトランスフェクションを与えたが、インビボで使用した場合、ＤＯＴＭＡ１はより高いトランスフェクション活性を示したことが研究により確立された。報告された他の類似体には、Ｎ、Ｎ−ジメチルＮ−エタノールアミンヘッド基を有するジエステルＤＯＲＩ５、対応するジエーテルＤＯＲＩＥ６、およびＣ１４：０類似体ＤＩＭＲＩＥ７が含まれる。
【００１７】
【化３】
2019510083.tif 000005
【００１８】
このような第４級アミンヒドロキシアルキル部分を含むサイトフェクチンは特に興味深いことが判明し、より短いヒドロキシアルキル基を有する脂質は改善された特性を生じさせる。例えば、ＤＯＲＩＥ６とヘルパー脂質ＤＯＰＥ２とのヘッド基でのヒドロキシエチル部分との共処方は、ヒドロキシプロピル−ヒドロキシペンチル基を有する脂質と比較して、ＣＯＳ．７細胞においてより高いトランスフェクション効率を与えた。これらのヒドロキシアルキルサイトフェクチンはすべてＤＯＴＭＡ１およびＤＭＲＩＥ７よりも活性があり、効率的な脂質の１つとして注目された。
【００１９】
末端ヒドロキシル基を有するサイトフェクチンは、ヒドロキシル基がＤＮＡまたは細胞膜とのリポソーム相互作用を増加させることができたか、または、電荷中和および/または水素結合を介してカチオン性脂質：ＤＯＰＥ２二重層構造を安定化することができたため、末端ヒドロキシル基を有するサイトフェクチンは、特に有効であると考えられていた。
【００２０】
WO2005/117985は、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基（すなわちＰＥＧ化脂質）を含む脂質を記載し、このようなＰＥＧ化脂質がＰＥＧ基を有さない脂質（すなわち非ＰＥＧ化脂質）に対して利点を示すことを示す。特に、血漿タンパク質への結合およびベクター凝集によって引き起こされる細網内皮系による脂質の迅速な除去の問題は、ポリマーＰＥＧ部分でベクターを遮蔽することによって改善され得る。しかしながら、ＰＥＧ化はしばしばトランスフェクション効率を大幅に低下させ、細網内皮系によって迅速に除去されないが、満足のいくトランスフェクション効率を示す脂質が必要とされている。
【００２１】
短いｎ−エチレングリコールヘッド基を有するグリセロールベースのジエーテル脂質である脂質、ＤＯＤＥＧ４  １３、および脂質複合体（脂質−ペプチド−ＤＮＡ）標的化送達へのその適用は以前に、Hurley, C. A.; Wong, J. B.; Ho, J.; Writer, M.; Irvine, S. A.; Lawrence, M. J.; Hart, S. L.; Tabor, A. B.; Hailes, H. C. Org. Biomol. Chem. 2008, 6, 2554-2559 and in Welser, K.; Campbell, F.; Kudsiova, L.; Mohammadi, A.; Dawson, N.; Hart, S.L.; Barlow, D.J.; Hailes, H.C.; Lawrence, M.J.; Tabor, A.B.; Mol. Pharm. 2013, 10, 127-141において報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明者らは、ＬＰＤ複合体の脂質部分として、またはその構成要素として有用な新しい種類のイオン化合物を発見した。イオン化合物は、カチオン性ヘッド基に結合した３つの疎水性尾部を有する三本鎖カチオン性脂質であり、その１つはアルキレングリコール結合を介して結合している。例えば、カチオン性ヘッド基に結合した２つの疎水性尾部を含む既知の二本鎖ＤＯＴＭＡ１アナログサイトフェクチンと比較して、新規の三本鎖脂質が、それらが組み込まれる合成トランスフェクションベクターのトランスフェクション効率を改善することが見出された。
【００２３】
第１の態様では、本発明は、式（Ｉａ）：
【化４】
2019510083.tif 000006
のイオン化合物を提供し、
ここで、
・各ＸおよびＹは、同じであり、または、異なり、−Ｏ−および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−から選択され、カルボニル炭素は、基Ｒ１またはＲ２に結合し、
・Ｒ１およびＲ２は、同じであり、または、異なり、ヒドロキシ、ハロゲンおよびＯＲＡから選択される１以上の置換基により置換されない、または、置換されるＣ１２−２４ヒドロカルビル基から独立してそれぞれ選択され、ＲＡはＣ１−６ヒドロカルビル基であり、
・Ｒ３およびＲ４は、同じであり、または、異なり、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ’）２、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’から選択される１以上の置換基により置換されない、または、置換されるＣ１−１０ヒドロカルビル基から独立してそれぞれ選択され、Ｒ’は、同じであり、または、異なり、Ｃ１−６ヒドロカルビル基であり、
・ＳｐおよびＷはともに結合であり、
・Ｓｐは、ヒドロキシ、ハロゲンおよびＯＲ’から選択される１以上の置換基により置換されない、または、置換されるＣ１−８アルキレン基であり、Ｒ’は、Ｃ１−６ヒドロカルビル基であり、Ｗは、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−および−Ｏ−結合から選択され、
・Ｂは、それぞれ、同じであり、または、異なり、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲＡ、−ＮＲＡＲＡおよび−ＯＣ（Ｏ）ＲＡから選択される１以上の置換基により、置換されない、または、置換されるＣ１−６アルキレン基であり、
各ＲＡは、それぞれ、Ｃ１−４ヒドロカルビルから独立して選択され、
・ｍは１〜８の整数であり、
・Ｑは、−ＯＲ５および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ５から選択され、Ｒ５は、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲＡから選択される１以上の置換基により置換されない、または、置換されるＣ７−２４ヒドロカルビル基から選択され、ＲＡは、Ｃ１−６ヒドロカルビル基である。
【００２４】
第２の態様では、本発明は、（ｉ）本発明の第１の態様のイオン化合物を含むトランスフェクション複合体を提供する。有利には、本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体は、さらに、（ｉｖ）細胞への送達のための核酸または他の活性物質を含む。有利には、本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体は、医薬品またはワクチンとしての使用に適する。
【００２５】
第３の態様では、本発明は、薬学的に適切な担体との混合物または組み合わせにおいて、本発明の第１の態様のイオン化合物または本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体を含む医薬組成物を提供する。
【００２６】
第４の態様では、本発明は、療法に使用するための、本発明の第１の態様のイオン化合物または本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体を提供する。
【００２７】
第５の態様では、本発明は、ヒトにまたは非ヒト動物に、本発明の第１の態様のイオン化合物または本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体を投与することを含む、遺伝子の欠陥および／もしくは欠損により、ヒトにおいてまたは非ヒト動物において生じる、状態の治療もしくは予防方法、または治療的もしくは予防的免疫方法、またはアンチセンスまたはＲＮＡｉ療法を提供する。
【００２８】
第６の態様では、本発明は、ヒトにまたは非ヒト動物に、本発明の第１の態様のイオン化合物または本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体を投与することを含む、癌を患うヒトまたは非ヒトの治療のための方法を提供する、
【００２９】
第７の態様では、本発明は、遺伝子の欠陥および／または欠損により、ヒトにおいてまたは非ヒト動物において生じる、状態の治療もしくは予防のため、または治療的または予防的免疫のため、またはアンチセンスまたはＲＮＡｉ療法のための、医薬品の製造のための、本発明の第１の態様のイオン化合物または本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体の使用を提供する。
【００３０】
第８の態様では、本発明は、ヒトにまたは非ヒト動物における、癌の治療または予防のための医薬品の製造のための、本発明の第１の態様のイオン化合物または本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体の使用を提供する。
【００３１】
第９の態様では、本発明は、遺伝子の欠陥および／または欠損により、ヒトにおいてまたは非ヒト動物において生じる、状態の治療もしくは予防における使用のための、または治療的もしくは予防的免疫のための、またはアンチセンスもしくはＲＮＡｉ療法のための、本発明の第１の態様のイオン化合物または本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体を提供する。
【００３２】
第１０の態様では、本発明は、ヒトにまたは非ヒト動物における癌の治療または予防における使用のための、本発明の第１の態様のイオン化合物または本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体を提供する。
【００３３】
第１１の態様では、本発明  核酸は、（ｉ）本発明の第１の態様のイオン化合物と；
（ｉｉ）ポリカチオンの核酸結合成分および（ｉｉｉ）細胞表面受容体結合成分を含む、ペプチドと；任意に（ｉｖ）核酸と、を含む、キットを提供する。
【００３４】
本発明の三本鎖脂質を含むＬＰＤ（脂質−ペプチド−核酸）リポポリプレックスのトランスフェクション効率は、二本鎖類似体よりも有意に高いことが分かった。我々は、ＬＰＤ複合体の脂質成分がエンドソーム膜を横切る細胞内輸送に特に重要であることを以前に示したので、これらの脂質がそのプロセスに寄与することによってトランスフェクション効率を高めると仮定されている(Du Z, Munye MM, Tagalakis AD, Manunta MD, Hart SL. The role of the helper lipid on the DNA transfection efficiency of lipopolyplex formulations. Sci Rep. 2014;4:7107) 。それらはまた、ナノ複合体の内部構造に影響を及ぼし、細胞内での核酸のより効率的な放出を可能にし得る (Munye MM, Ravi J, Tagalakis AD, McCarthy D, Ryadnov MG, Hart SL. Role of liposome and peptide in the synergistic enhancement of transfection with a lipopolyplex vector. Sci Rep. 2015;5:9292)。従って、本発明の新規な三本鎖脂質は、３つの疎水性鎖の使用に基づく、新世代の有効なサイトフェクチン遺伝子送達ベクターを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、ペプチドＭＥ２７およびプラスミドｐＣＩ−Ｌｕｃを、ＰＥＧ−エステル開裂可能脂質（ＭＥ４２）、ＰＥＧ−エステル非切断性脂質（ＣＨ３００）、本発明の三本鎖ＰＥＧ−エステル脂質（ＦＭＭ３０）、またはエステル結合によって連結されたオレオイルを有するＭＥ４２関連脂質（ＦＭＭ３２）と組み合わせて含むＬＰＤ製剤を用いたＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションを示し、それらのいくつかは中性の融合誘導性脂質ＤＯＰＥとの組み合わせであった。
【図２】図２は、図１に記載したものと同じ実験であるが、第２の細胞株、１ＨＡＥｏ−を用いて行った結果を示す。
【図３】図３は、ＰＥＧ−エステル切断可能脂質（ＭＥ４２）、ＰＥＧエステル非切断脂質（ＣＨ３００）または本発明の三本鎖ＰＥＧ−エステル脂質（ＦＭＭ３０）、エステル結合で結合したオレオイルを有するＭＥ４２関連脂質（ＦＭＭ３２）、ジエステル、Ｃ１６アルキルテール（１０６ａ）を有する不飽和脂質を含むＬＰＤ製剤によるトランスフェクションを示し、これらのいくつかは中性の融合誘導性脂質ＤＯＰＥと組み合わせられた。脂質をペプチドＭＥ２７、Ｋ１６ＣＹ、Ｋ１６ＹおよびＫ１６Ｐと組み合わせ、ＮＩＨ３Ｔ３細胞をｐＣＩ−Ｌｕｃでトランスフェクトするために使用した。
【図４】図４は、ペプチドＫ１６ＹまたはＭＥ２７と組み合わせたＰＥＧ−エステル切断可能脂質（ＭＥ４２）、ＰＥＧ−エステル非切断脂質（ＣＨ３００）または本発明の三本鎖ＰＥＧ−エステル脂質（ＦＭＭ３０）を含むＬＰＤ複合体によるトランスフェクションを示す。トランスフェクションはマウス神経芽腫細胞Ｎｅｕｒｏ２Ａで行った。
【図５】図５は、重量比０．７５：４：１（Ｌ：Ｐ：Ｄ）のペプチドＭＥ２７を有するＦＭＭ３０を含むＬＰＤ粒子の透過型電子顕微鏡（ＥＭ）画像を示す。
【図６】図６は、重量比０．７５：４：１（Ｌ：Ｐ：Ｄ）のペプチドＭＥ２７を有するＦＭＭ３０／ＤＯＰＥを含むＬＰＤ粒子の透過型電子顕微鏡（ＥＭ）画像を示す。
【図７】図７は、脂質ＦＭＭ３０またはＦＭＭ３０／ＤＯＰＥをリポソームとＤＮＡとの異なる重量比（ｗ／ｗ）で導入したペプチドＭＥ２７を含むＬＰＤナノ粒子のサイズを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
脂質
第１の態様では、本発明は、式（Ｉａ）：
【化５】
2019510083.tif 000007
のイオン化合物を提供し、
ここで、
・各ＸおよびＹは、同じであり、または、異なり、−Ｏ−および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−から選択され、カルボニル炭素は、基Ｒ１またはＲ２に結合し、
・Ｒ１およびＲ２は、同じであり、または、異なり、ヒドロキシ、ハロゲンおよびＯＲＡから選択される１以上の置換基により置換されない、または、置換されるＣ１２−２４ヒドロカルビル基から独立してそれぞれ選択され、ＲＡはＣ１−６ヒドロカルビル基であり、
・Ｒ３およびＲ４は、同じであり、または、異なり、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ’）２、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’から選択される１以上の置換基により置換されない、または、置換されるＣ１−１０ヒドロカルビル基から独立してそれぞれ選択され、Ｒ’は、同じであり、または、異なり、Ｃ１−６ヒドロカルビル基であり、
・ＳｐおよびＷはともに結合であり、
・Ｓｐは、ヒドロキシ、ハロゲンおよびＯＲ’から選択される１以上の置換基により置換されない、または、置換されるＣ１−８アルキレン基であり、Ｒ’は、Ｃ１−６ヒドロカルビル基であり、Ｗは、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−および−Ｏ−結合から選択され、
・Ｂは、それぞれ、同じであり、または、異なり、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲＡ、−ＮＲＡＲＡおよび−ＯＣ（Ｏ）ＲＡから選択される１以上の置換基により、置換されない、または、置換されるＣ１−６アルキレン基であり、
各ＲＡは、それぞれ、Ｃ１−４ヒドロカルビルから独立して選択され、
・ｍは１〜８の整数であり、
・Ｑは、−ＯＲ５および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ５から選択され、Ｒ５は、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲＡから選択される１以上の置換基により置換されない、または、置換されるＣ１２−２４ヒドロカルビル基から選択され、ＲＡは、Ｃ１−６ヒドロカルビル基である。
【００３７】
任意に、本発明の第１の態様のイオン化合物は式（Ｉａ）のものであり、ＳｐおよびＷの両方が結合しているか、またはＳｐが非置換Ｃ１−８アルキレン基であり、かつ、Ｗが結合、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−、または−Ｏ−、特に結合、−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−または−Ｏ−である。有利には、ＳｐおよびＷは共に結合であるか、またはＳｐは非置換Ｃ１−８アルキレン基であり、Ｗは−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−である。
【００３８】
本明細書で使用される用語「アルキレン」は、アルカンジイル基としても知られているアルカンから２つの水素原子、例えばＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−（プロパン−１，２−ジイル）を除去することから誘導される二価ラジカルを指す。
【００３９】
本明細書で使用される「ヒドロカルビル」という用語は、炭化水素、例えばエチルまたはフェニルから水素原子を除去することによって形成される一価の基を指す。
【００４０】
本発明の第１の態様のイオン化合物は、任意に、式（Ｉｂ）：
【化６】
2019510083.tif 000008
のものであり、
ここで、
・各ＸおよびＹは、同じであり、または、異なり、−Ｏ−および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−から選択され、カルボニル炭素は、基Ｒ１またはＲ２に結合し、
・Ｒ１およびＲ２は、同じであり、または、異なり、ヒドロキシ、ハロゲンおよびＯＲＡから選択される１以上の置換基により置換されない、または、置換されるＣ１２−２４ヒドロカルビル基から独立してそれぞれ選択され、ＲＡはＣ１−６ヒドロカルビル基であり、
・Ｒ３およびＲ４は、同じであり、または、異なり、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ’）２、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’から選択される１以上の置換基により置換されない、または、置換されるＣ１−１０ヒドロカルビル基から独立してそれぞれ選択され、Ｒ’は、同じであり、または、異なり、Ｃ１−６ヒドロカルビル基であり、
・Ｂは、それぞれ、同じであり、または、異なり、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲＡ、−ＮＲＡＲＡおよび−ＯＣ（Ｏ）ＲＡから選択される１以上の置換基により、置換されない、または、置換されるＣ１−６アルキレン基であり、Ｂは好ましくは非置換であり、
各ＲＡは、それぞれ、Ｃ１−４ヒドロカルビルから独立して選択され、
・ｍは１〜８の整数であり、
・Ｑは、−ＯＲ５および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ５から選択され、Ｒ５は、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲＡから選択される１以上の置換基により置換されない、または、置換されるＣ１２−２４ヒドロカルビル基から選択され、ＲＡは、Ｃ１−６ヒドロカルビル基である。
【００４１】
任意に、本発明の第１の態様のイオン化合物は、式（Ｉａ）または（Ｉｂ）のものであり、各Ｂが非置換Ｃ１−３アルキレン基、特にエチレンから選択される。
【００４２】
本発明の第１の態様のイオン化合物は、任意に、式（Ｉｃ）：
【化７】
2019510083.tif 000009
のものであり、
ここで、
・各ＸおよびＹは、同じであり、または、異なり、−Ｏ−および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−から選択され、カルボニル炭素は、基Ｒ１またはＲ２に結合し、
・Ｒ１およびＲ２は、同じであり、または、異なり、ヒドロキシ、ハロゲンおよびＯＲＡから選択される１以上の置換基により置換されない、または、置換されるＣ１２−２４ヒドロカルビル基から独立してそれぞれ選択され、ＲＡはＣ１−６ヒドロカルビル基であり、
・Ｒ３およびＲ４は、同じであり、または、異なり、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−ＣＮ、−Ｎ（Ｒ’）２、および−Ｃ（Ｏ）Ｒ’から選択される１以上の置換基により置換されない、または、置換されるＣ１−１０ヒドロカルビル基から独立してそれぞれ選択され、Ｒ’は、同じであり、または、異なり、Ｃ１−６ヒドロカルビル基であり、
・ｍは１〜８の整数であり、
・Ｑは、−ＯＲ５および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ５から選択され、Ｒ５は、ヒドロキシ、ハロゲン、−ＯＲＡから選択される１以上の置換基により置換されない、または、置換されるＣ１２−２４ヒドロカルビル基から選択され、ＲＡは、Ｃ１−６ヒドロカルビル基である。
【００４３】
本明細書で使用される「ヒドロカルビル」という用語は、特に明記しない限り、直鎖または分岐、飽和または不飽和基を指す。
【００４４】
任意に、本発明の第１の態様のイオン化合物は、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）のものであり、ここで、Ｒ１およびＲ２は、同じであり、または、異なり、それぞれが独立して、Ｃ１２−２４ヒドロカルビル基、例えば、一、二、または三重結合、特に二重結合を有する不飽和Ｃ１４−２２アルケニル基である。有利には、Ｒ１およびＲ２は、同じであり、または、異なり、それぞれが独立して、１つの二重結合を有する、直鎖不飽和Ｃ１６またはＣ１８アルケニル基である。任意に、Ｒ１およびＲ２は、−（ＣＨ２）５−１０ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）５−９ＣＨ３、特に、−（ＣＨ２）６−９ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）６−８ＣＨ３、例えば、−（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３または−（ＣＨ２）８ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３から選択される。好ましくは、二重結合はシスであり、Ｒ１およびＲ２は、−（ＣＨ２）５−１０ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）５−９ＣＨ３、特に、−（ＣＨ２）６−９ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）６−８ＣＨ３、例えば、−（ＣＨ２）７ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３または−（ＣＨ２）８ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３から選択される。好ましくは、Ｘ−Ｒ１およびＹ−Ｒ２は、−Ｏ−（ＣＨ２）８ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）７ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３から選択される。好ましくは、ＸおよびＹのそれぞれは、同じである。好ましくは、Ｒ１およびＲ２のそれぞれは、同じである。好ましくは、Ｘ−Ｒ１およびＹ−Ｒ２のそれぞれは、同じである。好ましくは、Ｘ−Ｒ１およびＹ−Ｒ２のそれぞれは、同じであり、−Ｏ−（ＣＨ２）８ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）７ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３から選択される。
【００４５】
任意に、本発明の第１の態様のイオン化合物は、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）のものであり、ここで、Ｒ３およびＲ４は、同じであり、または、異なり、直鎖または分岐鎖、非置換Ｃ１−１０アルキル基、例えば、直鎖または分岐鎖、非置換Ｃ１−６アルキル基、特に、直鎖または分岐鎖、非置換Ｃ１−４アルキル基、例えば、メチルまたはエチルから独立してそれぞれ選択される。有利には、Ｒ３およびＲ４は、同じであり、例えば、両方メチルまたは両方エチル、特に両方メチルである。
【００４６】
任意に、本発明の第１の態様のイオン化合物は、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）のものであり、ここで、ｍは、１、２、３、４、５、６または７、例えば２、３、４、５または６、特に２、３、４または５から選択される。本発明の第１の態様のさらなる実施形態では、ｍは３または４である。
【００４７】
任意に、本発明の第１の態様のイオン化合物は、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（Ｉｃ）のものであり、ここで、Ｑは−ＯＲ５および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ５から選択され、Ｒ５は、Ｃ１２−２４ヒドロカルビル基、例えば、Ｃ１４−２２ヒドロカルビル基、例えば、一、二、または三重結合を有する不飽和Ｃ１４−２２アルケニル基、特に、１つの二重結合、特にシス二重結合を有する直鎖不飽和Ｃ１６またはＣ１８アルケニル基から選択される。任意に、Ｒ５は、−（ＣＨ２）５−１０ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）５−９ＣＨ３、特に、−（ＣＨ２）６−９ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）６−８ＣＨ３、例えば、−（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３または−（ＣＨ２）８ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３である。好ましくは、二重結合はシスであり、Ｒ５は、−（ＣＨ２）５−１０ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）５−９ＣＨ３、特に、−（ＣＨ２）６−９ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）６−８ＣＨ３、例えば、−（ＣＨ２）７ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３または−（ＣＨ２）８ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３である。好ましくは、Ｑは、−Ｏ−（ＣＨ２）８ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）７ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３から選択される。
【００４８】
疑義を避けるために、本発明の第１の態様の脂質の任意の要素のいずれかを、本発明の第１の態様のさらなる実施形態において組み合わせることができる。例えば、本発明の第１の態様の１つの実施形態において、イオン化合物は、式（Ｉａ）のものであり、式中、Ｒ１およびＲ２は、同じであり、または、異なり、それぞれ独立してＣ１４−２２ヒドロカルビル基であり；ＳｐおよびＷは両方とも結合であり；Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、直鎖または分枝鎖の非置換Ｃ１−６アルキル基であり；Ｂは、それぞれ、非置換Ｃ１−３アルキレン基から選択され；ｍは３、４、５、６、または７である。同様に、本発明の第１の態様の１つの実施形態において、イオン化合物は、式（Ｉｂ）のものであり、式中、Ｒ１およびＲ２は、同じであり、または、異なり、それぞれ独立してＣ１４−２２ヒドロカルビル基であり；Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、直鎖または分枝鎖の非置換Ｃ１−６アルキル基であり；Ｂは、それぞれ、非置換Ｃ１−３アルキレン基から選択され；ｍは３、４、５、６、または７である。再び同様に、本発明の第１の態様の１つの実施形態において、イオン化合物は、式（Ｉｃ）のものであり、式中、Ｒ１およびＲ２は、同じであり、または、異なり、それぞれ独立してＣ１４−２２ヒドロカルビル基であり；Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、直鎖または分枝鎖の非置換Ｃ１−６アルキル基であり；ｍは３、４、５、６、または７である。本発明の第１の態様のさらなる実施形態において、イオン化合物は、式（Ｉａ）のものであり、式中、Ｒ１およびＲ２は、同じであり、または、異なり、それぞれ独立してＣ１４−２０ヒドロカルビル基、例えば、１つ、２つ、または３つの二重結合を有する不飽和Ｃ１４−２０アルケニル基であり；ＳｐおよびＷは両方とも結合であり；Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、直鎖または分枝鎖の非置換Ｃ１−６アルキル基であり；Ｂは、それぞれ、非置換Ｃ１−３アルキレン基から選択され；ｍは３、４、５、または６であり；Ｒ５は、Ｃ１４−２０ヒドロカルビル基、例えば、１つ、２つ、または３つの二重結合を有する不飽和Ｃ１４−２０アルケニル基から選択される。同様に、本発明の第１の態様のさらなる実施形態において、イオン化合物は、式（Ｉｂ）のものであり、式中、Ｒ１およびＲ２は、同じであり、または、異なり、それぞれ独立してＣ１４−２０ヒドロカルビル基、例えば、１つ、２つ、または３つの二重結合を有する不飽和Ｃ１４−２０アルケニル基であり；Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、直鎖または分枝鎖の非置換Ｃ１−４アルキル基であり；Ｂは、それぞれ、非置換Ｃ１−３アルキレン基から選択され；ｍは３、４、５、または６であり；Ｒ５は、Ｃ１４−２０ヒドロカルビル基、例えば、１つ、２つ、または３つの二重結合を有する不飽和Ｃ１４−２０アルケニル基から選択される。再び同様に、本発明の第１の態様の１つの実施形態において、イオン化合物は、式（Ｉｃ）のものであり、式中、Ｒ１およびＲ２は、同じであり、または、異なり、それぞれ独立してＣ１４−２０ヒドロカルビル基、例えば、１つ、２つ、または３つの二重結合を有する不飽和Ｃ１４−２０アルケニル基であり；Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、直鎖または分枝鎖の非置換Ｃ１−４アルキル基であり；ｍは３、４、５、または６であり；Ｒ５は、Ｃ１４−２０ヒドロカルビル基、例えば、１つ、２つ、または３つの二重結合を有する不飽和Ｃ１４−２０アルケニル基から選択される。本発明の第１の態様のなおさらなる実施形態において、イオン化合物は、式（Ｉａ）のものであり、式中、Ｒ１およびＲ２は、同じであり、または、異なり、それぞれ独立して１つの二重結合を有する直鎖不飽和Ｃ１６またはＣ１８アルケニル基であり；ＳｐおよびＷは両方とも結合であり；Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、メチルまたはエチルであり；Ｂは、それぞれ、エチレン基であり；ｍは３、４、または５であり；Ｒ５は、１つの二重結合を有する、直鎖の不飽和Ｃ１６またはＣ１８アルケニル基である。同様に、本発明の第１の態様のなおさらなる実施形態において、イオン化合物は、式（Ｉｂ）のものであり、式中、Ｒ１およびＲ２は、同じであり、または、異なり、それぞれ独立して１つの二重結合を有する直鎖不飽和Ｃ１６またはＣ１８アルケニル基であり；Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、メチルまたはエチルであり；Ｂは、それぞれ、エチレン基であり；ｍは３、４、または５であり；Ｒ５は、１つの二重結合を有する、直鎖の不飽和Ｃ１６またはＣ１８アルケニル基である。同様に、本発明の第１の態様のなおさらなる実施形態において、イオン化合物は、式（Ｉｃ）のものであり、式中、Ｒ１およびＲ２は、同じであり、または、異なり、それぞれ独立して１つの二重結合を有する直鎖不飽和Ｃ１６またはＣ１８アルケニル基であり；Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、メチルまたはエチルであり；ｍは３、４、または５であり；Ｒ５は、１つの二重結合を有する、直鎖の不飽和Ｃ１６またはＣ１８アルケニル基である。
【００４９】
本発明の第１の態様の、イオン化合物は、任意に、式（Ｉｄ）：
【化８】
2019510083.tif 000010
のものであり、
ここで、
・Ｘ−Ｒ１およびＹ−Ｒ２およびＱは、それぞれ、−Ｏ−（ＣＨ２）８ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）７ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３から選択され；
・ｍは２〜５の整数である。
【００５０】
任意に、本発明の第１の態様のイオン化合物は、式（Ｉｄ）のものであり、式中、ｍは３または４である。
【００５１】
任意に、本発明の第１の態様のイオン化合物は、式（Ｉｄ）のものであり、Ｘ−Ｒ１およびＹ−Ｒ２は、それぞれ、同じであり、−Ｏ−（ＣＨ２）８ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）７ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３から選択される。任意に、本発明の第１の態様のイオン化合物は、式（Ｉｄ）のものであり、式中、Ｘ−Ｒ１およびＹ−Ｒ２は、それぞれ、同じであり、−Ｏ−（ＣＨ２）８ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）７ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３から選択され；Ｑは、−Ｏ−（ＣＨ２）８ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）７ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３から選択され；ｍは３または４である。
【００５２】
任意に、本発明の第１の態様のイオン化合物は、式（Ｉｄ）のものであり、式中、Ｘ−Ｒ１およびＹ−Ｒ２は、それぞれ、同じであり、−Ｏ−（ＣＨ２）８ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）７ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３から選択され、Ｑは、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）７ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３である。任意に、本発明の第１の態様の脂質は、式（Ｉｄ）のカチオンを含み、式中、Ｘ−Ｒ１およびＹ−Ｒ２は、それぞれ、同じであり、−Ｏ−（ＣＨ２）８ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）７ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３から選択され、Ｑは、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）７ＣＨ［Ｚ］＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３であり；ｍは３または４である。
【００５３】
本発明の第１の態様のイオン化合物は、典型的には、無機対イオン、例えば、塩化物または臭化物などの薬学的に許容されるアニオンを含む。
【００５４】
トランスフェクション複合体
第２の態様では、本発明は、（ｉ）本発明の第１の態様のイオン化合物を含むトランスフェクション複合体を提供する。本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体は、任意に、（ｉｉ）ポリカチオン性核酸結合成分および（ｉｉｉ）細胞表面受容体結合成分をさらに含む。典型的には、ポリカチオン性核酸結合成分（ｉｉ）および細胞表面受容体結合成分（ｉｉｉ）はともにペプチド誘導体を形成する。有利には、本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体は、（ｉｖ）核酸をさらに含む。
【００５５】
本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体は、典型的には、非ウイルストランスフェクション複合体、例えば、ＬＰＤ（またはＬＩＤ）複合体である。
【００５６】
第１１の態様では、本発明は、
（ｉ）核酸、
（ｉｉ）上記定義の本発明のイオン化合物、
（ｉｉｉ）ポリカチオンの核酸結合成分、および
（ｉｖ）細胞表面受容体結合成分
を含む、キットを提供する。
【００５７】
例えば、本発明は、
（ｉ）本発明  核酸の第１の態様のイオン化合物；
（ｉｉ）ポリカチオンの核酸結合成分および（ｉｉｉ）細胞表面受容体結合成分を含むペプチド；および任意に（ｉｖ）核酸を含む、キットを提供する。
【００５８】
本発明の第１１の態様のキットは、例えば、本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体を組み立てるために使用することができる。
【００５９】
第３の態様において、本発明は、本発明の第１の態様のイオン化合物または本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体を、薬学的に適切な担体と混合または組み合わせて含む医薬組成物を提供する。
【００６０】
ペプチド
１つの実施形態において、本発明の第２の態様のペプチド誘導体は、式Ａ−Ｂ−Ｃのものであり、式中：
Ａはポリカチオンの核酸結合成分であり、
Ｂはスペーサエレメントであり、
Ｃは細胞表面受容体結合成分である。
【００６１】
細胞内で切断されやすいスペーサーエレメントペプチドを含む本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体は、標的細胞のトランスフェクションをもたらすには、細胞内で切断されやすいスペーサーのないペプチドを含む従来技術の複合体よりも効果的であることが判明している。
【００６２】
ポリカチオン性核酸結合成分Ａは、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合することができる任意のポリカチオンである。ポリカチオンは、ポリカチオンそれ自体であってもよく、あるいは、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合する性能が保持されていれば、任意の数のカチオン性モノマーを有していてもよい。例えば、３〜１００のカチオン性モノマー、例えば１０〜２０、例えば１４〜１８、例えば約１６が存在してもよい。
【００６３】
用語「ポリカチオンの核酸結合成分」は、当該分野で周知であり、少なくとも３つの反復カチオン性アミノ酸残基または正に荷電した基を有する他のカチオン性単位を有するポリマーを指し、このようなポリマーは生理学的条件下で核酸との複合体形成が可能である。核酸結合ポリカチオンの分子の例は、１つ以上のカチオン性アミノ酸を含むオリゴペプチドである。そのようなオリゴペプチドは、例えば、オリゴリジン分子、オリゴ−ヒスチジン分子、オリゴ−アルギニン分子、オリゴ−オルニチン分子、オリゴジアミノプロピオン酸分子、もしくはオリゴ−ジアミノ酪酸分子、またはヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチンジアミノプロピオン酸およびジアミノ酪酸残基の任意の組合せを含む組み合わされたオリゴマーであることとしてもよい。上記オリゴペプチドのいずれかは、例えば合計で３〜３５個、例えば５〜２５個の残基、好ましくは１０〜２０個の残基、例えば１４〜１８個の残基、例えば１６個の残基を有することができる。
【００６４】
オリゴリジンは、特に好ましくは、例えば３〜３５、例えば２〜２５、例えば１０〜２０のリシン残基、例えば１３〜１９、例えば１４〜１８、例えば１５〜１７残基、例えば１６残基、すなわち［Ｋ］１６を有し、「Ｋ」はリシンを示す。
【００６５】
ポリカチオンの成分のさらなる例としては、デンドリマーおよびポリエチレンイミンが挙げられる。 ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、遺伝子送達能を有する非毒性の架橋カチオンポリマーである(Proc. Natl. Acad. Sci., 1995, 92, 7297-7301)。ポリエチレンイミンは、Fluka（８００ｋＤａ）またはSigma（５０ｋＤａ）から得ることができ、あるいはPolyPlus-トランスフェクション（Illkirch、France）から、トランスフェクション目的のために予め希釈することができる。典型的には、ＰＥＩはＤＮＡに対して９倍過剰で使用すると最も効率的であり、過剰率はＰＥＩ窒素：ＤＮＡリン酸として、そしてｐＨ５〜８で計算される。そのようなパラメータは、当業者によく知られている方法で最適化することができる。
【００６６】
スペーサーエレメントペプチドＢは、有利に細胞内で切断されやすい。細胞内で切断されやすいスペーサーエレメントペプチドＢは、細胞のエンドソーム、リソソームおよび／または細胞質内で切断されやすい可能性がある。切断の影響を受けやすいとは、本明細書では、要素ＡおよびＣが触れたままの時間スケールにわたってエレメントが切断されやすいことを意味すると理解される。エレメントＢは、細胞性ペプチド分解経路が有効になるよりも迅速に切断される。
【００６７】
好ましくは、スペーサーエレメントペプチドは、酵素的切断、還元的切断、またはｐＨ依存性切断、例えば、加水分解の影響を受けやすい。酵素的切断の場合、本発明の１つの態様において、好ましいペプチドは、ＮＯＸ（ＮＡＤＨ−オキシダーゼ）、ＧＩＬＴ（γ−インターフェロン誘導性リソソームチオールレダクターゼ）およびＰＤＩ（タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ）から選択される酵素による切断を受けやすいものである。本発明の別の態様では、好ましいペプチドは、エンドソーム中に存在する酵素、例えばフリンまたはカテプシンのようなエンドソームプロテアーゼによる切断の影響を受けやすいものである。
【００６８】
好ましくは、スペーサーエレメントペプチドＢは、
ａ）ジスルフィド結合を含むペプチド鎖；
ｂ）エステル結合を含むペプチド鎖；
ｃ）フリンによって切断されやすいアミノ酸配列；および
ｄ）カテプシン酵素による切断を受けやすいアミノ酸配列；
から選択される基を含む。
【００６９】
ジスルフィド結合は、好ましくは、通常の大気および生理学的条件下で安定であるが、エンドソームにおいて還元的に切断され得るものである。同様に、本発明のペプチド鎖におけるエステル結合は、中性ｐＨで安定であるが、エンドソームの酸性環境で切断されるエステル結合であることが好ましい（例えば、６．０未満のｐＨ、好ましくは５．５未満のｐＨ、または５．０未満のｐＨで）。
【００７０】
例えば、
ｉ）ＲＸ１ＫＲ；および
ｉｉ）ＲＸ２ＲＲ；
から選択される、フリンによる切断を受けやすいアミノ酸配列であって、
式中、Ｘ１およびＸ２は、同じであり、または、異なり、それぞれ、任意のアミノ酸残基である（Zimmer et al., J. Biol. Chem., 2001, 276, 31642-31650; Nakayama, Biochem. J., 1997, 327, 625-635）
【００７１】
好ましいアミノ酸残基Ｘ１はＬｙｓ（Ｋ）およびＶａｌ（Ｖ）を含み、例えばＬｙｓ（Ｋ）である。好ましいアミノ酸残基Ｘ２は、Ｌｙｓ（Ｋ）およびＶａｌ（Ｖ）、例えばＶａｌ（Ｖ）である。
【００７２】
例えば、カテプシン酵素は、任意の適切なカテプシン酵素であり得る(Pillay et al., Biochem. J., 2002, 363, 417-429参照)。例えば、カテプシンＢであってもよい。例えば、カテプシンＢ(Pechar et al., Macromol. Chem. Phys., 1997, 198, 1009-1020参照)による切断を受けやすいアミノ酸配列は、以下から選択される配列を含む：
ｉｉｉ）Ｘ３Ｘ４であって、Ｘ３がチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）およびイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）から選択され、Ｘ４がグリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）から選択される。
【００７３】
好ましくは、Ｘ３はチロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）およびロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）から選択される。
【００７４】
例えば、配列Ｘ３Ｘ４は、ＧＦＧ３Ｘ４として、例えばＧＦＬＧとして存在し得る（Pechar et al., Bioconjugate Chem., 2000, 11, 131-139において使用されるように）。
【００７５】
スペーサーエレメントペプチドＢは、リンカーをさらに含んでいてもよく、好ましくはペプチド、すなわちアミノ酸残基、またはポリエチレングリコール基、またはこれらの２つの混合物を含む。アミノ酸は、天然由来でもよく、非天然由来でもよい。それらはＬ−またはＤ−配置を有することができる。リンカーは、２個以上のアミノ酸を有していてもよい。例えば、３つ以上のアミノ酸、例えば４つ以上、例えば５つ以上、例えば１０までのアミノ酸またはそれ以上を含み得る。アミノ酸は同じであっても異なっていてもよいが、オリゴリジン配列がポリカチオン性核酸結合成分としての活性を有するため、スペーサーにおいては一般に複数のリシン残基（またはベクター複合体のポリカチオンの核酸結合成分における使用に適した他のカチオン性アミノ酸）の使用を避けるべきである。
【００７６】
リンカーは、例えば、ジペプチドグリシン−グリシン（ＧＧ）またはグリシン−アラニン（ＧＡ）であり得る。
【００７７】
リンカーは、ポリエチレングリコール部分であってもよく、またはポリエチレングリコール部分を含んでいてもよい。ポリエチレングリコール部分は、１〜３０個のエチレングリコール単位、好ましくは１〜１５単位、より好ましくは１〜８単位、例えば２〜６単位、例えば４単位を含むことができる。
【００７８】
好ましくは、リンカーは、ポリカチオン性核酸結合成分Ａに結合しているスペーサーエレメントペプチドＢの末端にある。
【００７９】
好ましくは、細胞表面受容体結合成分Ｃはペプチドを含む。細胞表面受容体結合成分Ｃがペプチドを含む場合、ペプチドは、長さが最大２０アミノ酸であってもよく、またはより長くてもよい。ペプチドは、一般に、少なくとも５つのアミノ酸を有するが、より少ないアミノ酸を有してもよい。一般に、ペプチドは、６〜２０を含む任意の数のアミノ酸を有する。一般に、ペプチドは１５アミノ酸以下、より好ましくは１２アミノ酸以下、最も好ましくは１０アミノ酸以下を有することが好ましい。一般に、ペプチドは５以上のアミノ酸、例えば６以上のアミノ酸を有することが好ましい。最も好ましくは、ペプチドは７つのアミノ酸を有する。
【００８０】
好ましくは、細胞表面受容体結合成分Ｃは、環状領域を含むペプチドを含む。環状ペプチドは、ペプチド中に少なくとも２つのシステイン残基を提供することによって形成され、それによりジスルフィド結合のフォーメーションを可能にする。したがって、好ましい細胞表面受容体結合成分Ｃは、１つ以上のジスルフィド結合を形成することができる２つ以上のシステイン残基を有するペプチドからなるか、またはそれを含む。好ましくは、システイン残基は、一次受容体結合部分に隣接する。
【００８１】
本発明の一実施形態では、細胞表面受容体結合成分Ｃは、インテグリン結合ペプチドを含む。インテグリン結合ペプチドは、細胞の表面上に見出されるインテグリンに特異的に結合することができる任意のペプチドである。インテグリン結合ペプチドは、天然に存在するインテグリン結合リガンド、例えば、細胞外マトリックスタンパク質、ウイルスキャプシドタンパク質、細菌タンパク質インベーシン、ヘビ毒ディスインテグリンタンパク質、またはそのようなタンパク質のインテグリン結合断片であり得る。このようなインテグリン結合タンパク質およびその断片は、天然源から、または、組換え技術によって得ることができる。インテグリン結合ペプチドは、特に、合成、精製および保存の容易さ、化学修飾の可能性、およびインビボでの潜在的に低い免疫原性のために使用することが好ましい。好ましいインテグリン結合ペプチドは、WO96/15811、特にWO98/54347に記載されているものである。例えば、インテグリン結合ペプチドは、α４β１インテグリンに特異的であり得る。
【００８２】
この実施形態において、細胞表面レセプター結合成分Ｃは、好ましくは、以下から選択されるペプチドを含む：
ａ）ＲＧＤ；
ｂ）ＲＲＥＴＡＷＡ；
ｃ）ＬＤＶ
【００８３】
本発明のさらなる実施形態では、細胞表面受容体結合成分Ｃは、ヒト気道上皮（ＨＡＥ）細胞に結合することができるペプチドを含む。好ましいＨＡＥ細胞結合ペプチドは、WO02/072616（Ｈａｒｔ５）に記載されているものである。この実施形態では、細胞表面受容体結合成分Ｃは、好ましくは、
ａ）  Ｘ５ＳＭ；
ｂ）  ＬＸ６ＨＫ；
ｃ）  ＰＳＧＸ７ＡＲＡ；
ｄ）  ＳＸ８ＲＳＭＮＦ；および 
ｅ）  ＬＸ９ＨＫＳＭＰ；
から選択されるペプチドを含み、
ここで、Ｘ５は塩基性アミノ酸残基であり、Ｘ６はＱまたはＰであり、Ｘ７はＡまたはＴであり、Ｘ８は酸性アミノ酸残基であり、Ｘ９はＰまたはＱである。
【００８４】
好ましくは、細胞表面受容体結合成分Ｃは、
ａ）  Ｘ５ＳＭ；
ｂ）  ＬＸ６ＨＫ；および
ｃ）  ＰＳＧＡＡＲＡ，
から選択されるペプチドを含み、
ここで、Ｘ５は塩基性アミノ酸残基であり、Ｘ６はＱまたはＰである。
【００８５】
好ましくはＸ５はＫまたはＲである。好ましくはＸ６はＰである。好ましくはＸ７はＡである。好ましくはＸ８はＥまたはＱである。好ましくはＸ８はＥである。好ましくはＸ９はＰである。したがって、好ましいペプチドは、ＬＱＨＫＳＭＰ、ＬＰＨＫＳＭＰ、ＶＫＳＭＶＴＨ、ＳＥＲＳＭＮＦ、ＶＧＬＰＨＫＦ、ＹＧＬＰＨＫＦ、ＰＳＧＡＡＲＡ、ＳＱＲＳＭＮＦおよびＰＳＧＴＡＲＡから選択される配列を含むものである。
【００８６】
本発明の別の実施形態では、細胞表面受容体結合成分Ｃは、ヒト樹状細胞に結合することができるペプチドを含む。好ましいヒト樹状細胞結合ペプチドは、ＷＯ２００４／１０８９３８に記載されているものである。例えば、そのようなペプチドは、以下：
ａ）  ＰＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｔ；
ｂ）  ＰＳＸ１３Ｓ；
ｃ）  ＱＸ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｑ；
ｄ）  ＳＸ１７Ｓ、
から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドから選択され得、
ここで、Ｘ１０、Ｘ１１およびＸ１２は同一でも異なっていてもよく、それぞれアミノ酸残基を表し、
Ｘ１３はアミノ酸残基を表し、
Ｘ１４及びＸ１６は同じであっても、異なっていてもよく、それぞれはアミノ酸残基を表し、
Ｘ１５は、アミド側鎖を有するアミノ酸残基、例えばＮまたはＱを表し、
Ｘ１７は脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基、例えばＬまたはＩを表す。
【００８７】
好ましい実施形態では、細胞表面受容体結合成分Ｃは、
ａ）  ＣＲＧＤＣＬＧ；
ｂ）  ＣＲＧＤＣＬＧ；
ｃ）  ＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧ；
ｄ）  ＣＲＧＤＭＦＧＣＡ；
ｅ）  ＣＲＲＥＴＡＷＡＣＧ；
ｆ）  ＣＲＧＥＭＦＧＣＡ；
ｇ）  ＣＳＥＲＳＭＮＦＣＧ；
ｈ）  ＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ；および
ｉ）  ＣＬＰＨＫＳＭＰＣＧ
から選択されるペプチドを含む。
【００８８】
本発明は、リポポリプレックス（ＬＰＤ）トランスフェクションベクターのフォーメーションにおける本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体の使用を提供する。トランスフェクションベクターは、細胞に対するエンティティを標的化するために使用することができ、エンティティは、核酸または他の分子、例えば、治療的または薬学的に活性のある分子、または検出可能な標識を含む分子である。
【００８９】
医療用途
本発明のイオン化合物は、特に、切断可能なペプチドと組み合わせて使用する場合、腫瘍細胞に対するベクター複合体のターゲッティングを改善することがさらに見出されている。したがって、第１の発明のイオン化合物は、癌、治療または予防免疫またはアンチセンスまたはＲＮＡｉ療法の治療における使用を見出す。したがって、本発明は、有効量の本発明の第１の態様のイオン化合物を適切な複合体中で患者に投与することを含む、癌、治療または予防接種、またはアンチセンスまたはＲＮＡｉ療法を治療する方法を提供する。したがって、本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体は、癌の治療、治療または予防免疫、またはアンチセンスまたはＲＮＡｉ療法に使用される。従って、本発明は、有効量の本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体を患者に投与することを含む、癌の治療、治療的または予防的免疫、またはアンチセンスまたはＲＮＡｉ療法の方法を提供する。本発明の第１の態様のイオン化合物または本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体は、本発明の第３の態様の医薬組成物で投与することができ、イオン化合物またはトランスフェクション複合体を、薬学的に適切な担体との混合物または組み合わせで含む。
【００９０】
第４の態様において、本発明は、本発明の第１の態様のイオン化合物または治療に用いるための本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体を提供する。本発明はさらに、医薬またはワクチンとしての使用のための、本発明の第１の態様のイオン化合物または本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体を提供する。例えば、本発明の第４の態様は、遺伝子の欠陥および／もしくは欠損により引き起こされる状態の治療または予防に用いるための、癌の治療に使用するための、治療的もしくは予防的免疫のための、または、アンチセンスもしくはＲＮＡｉ療法ための、本発明の第１の態様のイオン化合物または本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体を提供する。
【００９１】
核酸成分（Ｄ）は、任意の適切な核酸であり得る。それは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、または化学的に修飾された核酸模倣物、例えばＰＮＡ分子であり得る。それは、例えば、標的細胞において有用性を有するタンパク質をコードすることができる。それは、アンチセンス核酸またはＲＮＡｉ核酸であり得る。ＲＮＡｉは、標的遺伝子によって産生された細胞メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子を、ｍＲＮＡ分子の短い部分に相補的な配列を含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子に曝露することによって達成される。細胞内では、二本鎖ＲＮＡ分子が切断されて、標的ｍＲＮＡ分子に結合することができる短い（２１〜２３ヌクレオチド長）一本鎖および二本鎖断片を産生する。そのような結合は、ヌクレアーゼによる標的ｍＲＮＡの切断をもたらし、その結果、標的遺伝子の発現レベルの低下をもたらす。したがって、核酸成分自体がＲＮＡｉ分子（「ｓｉＲＮＡ」）であってもよく、あるいは、投与される核酸は、転写されたとき、ＲＮＡｉ分子、すなわちＲＮＡ干渉を介して標的遺伝子の発現を抑制することができるＲＮＡを産生する配列を含むＤＮＡ分子であってもよい。
【００９２】
本発明はまた、本発明のトランスフェクション複合体の製造方法を提供する。
【００９３】
第５の態様では、本発明は、ヒトまたは非ヒト動物へ、本発明の第１の態様のイオン化合物を投与することを含む、遺伝子の欠陥および／または欠損によってヒトまたは非ヒト動物において引き起こされる状態の治療または予防のための方法、または、第２の態様のトランスフェクション複合体を提供する。
【００９４】
本明細書において用語「遺伝子の欠陥および／または欠損」とは、遺伝子のコード領域の欠陥または欠損のみならず、遺伝子の制御エレメントの欠陥または欠損、例えば、トランスもしくはシスでの制御エレメント、または、直接的または間接的にかかわらず、遺伝子の転写または翻訳に関与する任意の他の要素における欠陥または欠損を指す。
【００９５】
第６の態様では、本発明は、本発明の第１の態様のイオン化合物を、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ）またはヒトまたは非ヒト動物へのＲＮＡｉ療法に適した核酸を含む第２の態様のトランスフェクション複合体と共に投与することを含む、ヒトまたは非ヒト動物の治療的または予防的免疫の方法を提供する。本発明はまた、本発明の第１の態様のイオン化合物を核酸とともに、または、核酸を含む本発明の第２の態様のトランスフェクション複合体を、ヒトまたは動物に投与することを含む、アンチセンス療法の方法であって、核酸がアンチセンス療法での使用に適した核酸（例えばＲＮＡ）、またはＲＮＡｉ療法に適した核酸である、方法を提供する。
【００９６】
実施例
特に明記しない限り、合成のための溶媒および試薬は、市販の供給業者からの試薬等級であり、さらに精製することなく使用した。Pangborn, A. B.; Giardello, M. A.; Grubbs, R. H.; Rosen, R. K.; Timmers, F. J. Organometallics 1996, 15, 1518-1520に記載される手順を用いて、乾燥したＣＨ２Ｃｌ２を、無水アルミナカラムを用いて得た。すべての湿気に敏感な反応は、オーブン乾燥ガラス器具を使用して窒素またはアルゴン雰囲気下で行った。ＵＶ、過マンガン酸カリウムおよびリンモリブデン酸染色による検出を伴うKieselgel 60 F254プレート上でのＴＬＣによって、反応をモニターした。フラッシュカラムクロマトグラフィーはシリカゲル（粒径４０〜６３μｍ）を用いて行った。１Ｈ  ＮＭＲおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、Bruker AMX300MHz、Avance-500MHzおよびAvance-600MHz機械で記録した。結合定数は、ヘルツ（Ｈｚ）単位で測定され、特に明記しない限り、スペクトルは２９８Ｋで得られた。質量スペクトルは、Thermo Finnegan MAT 900XP、Micromass Quattro LCエレクトロスプレーおよびVG70-SE質量分析計で記録した。赤外線スペクトルをShimadzu FTIR-8700分光計で記録した。
【００９７】
ＤＯＤＥＧ４（１３）
（２，３−ビス−オクタデカ−９−エニルオキシプロピル）−ジメチルアミンおよび４−ＥＧ臭化物（ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ）３−ＣＨ２ＣＨ２−Ｂｒ）から、｛２，３−ジ［（Ｚ））−オクタデシル−９−エニルオキシ］−プロピル｝−Ｎ−｛２−［２−（２−｛２−ヒドロキシ−エトキシ）−エトキシ］−エトキシ］−エチル｝−Ｎ、Ｎ−ジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＥＧ４）（１３）（ＣＨ３００）を、以前に、Dori, Y.; Bianco-Peled, H.; Satija, S.; Fields, G. B.; McCarthy, J. B.; Tirrell, M. J. Biomed. Mater. Res. 2000, 50, 75-81により報告されたように、合成した。
【００９８】
【化９】
2019510083.tif 000011
【００９９】
ＤＯＤＥＧ４（１３）（ＣＨ３００）はまた、US7,598,421、実施例４に記載されるような合成であり得る。
【０１００】
ＤＯＤＥＧ４との類似体
異なる鎖長のＲ１およびＲ２ヒドロカルビル基を有する、かつ、ｍについての異なる値、すなわち、異ならせたポリエチレングリコール鎖長を有する、ＤＯＤＥＧ４（１３）（ＣＨ３００）と同様の塩を、US7,598,421に記載されているように調製することができる（特に、実施例の３、５、６、および７参照。）。例えば、ＤＯＤＥＧ３は、US7,598,421の実施例３のプロトコールセットによって合成することができる。
【０１０１】
【化１０】
2019510083.tif 000012
【０１０２】
ＤＯｅｓＤＥＧ４（１５）
ジエステル類似体ＤＯｅｓＤＥＧ４（１５）は、（２，３−ビス−ヘプタデカ−９−エニルカルボキシプロピル）−ジメチルアミンの４−ＥＧ臭化物による四級化を介してＤＯＤＥＧ４（１３）と同様に調製した。
【０１０３】
三級アミン（１６）
２，３−ジ−（（９Ｚ）−オクタデセニルオキシ）プロピル−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミン（１６）は、Hurley, C. A.; Wong, J. B.; Hailes, H. C.; Tabor, A. B. J. Org. Chem. 2004, 69, 980−983に記載されているように、オクタデカ−９−エニルメシラートおよび３−ジメチルアミノ−１，２−プロパンジオールから調製された。
【０１０４】
４−ＥＧ臭化物（１７）
１１−ブロモ−３，６，９−トリオキソウンデカン−１−オール（１７）は、Hurley, C. A.; Wong, J. B.; Ho, J.; Writer, M.; Irvine, S. A.; Lawrence, M. J.; Hart, S. L.; Tabor, A. B.; Hailes, H. C. Org. Biomol. Chem. 2008, 6, 2554−2559に記載されているように調製された。
【０１０５】
４−ＥＧオレオイルエステル（２０）
４−ＥＧオレオイルエステル（２０）は、ＣＨ２Ｃｌ２中のＤＩＣおよびＤＭＡＰの存在下において、オレイン酸と４−ＥＧ臭化物との反応により調製された。
【０１０６】
【化１１】
2019510083.tif 000013
【０１０７】
無水ジクロロメタン（５０ｍＬ）中のオレイン酸（２．００ｍＬ、６．３０ｍｍｏｌ）、４−ＥＧ臭化物１７（１．５０ｇ、５．８３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（７０ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）の溶液を室温で５分間撹拌した。０℃に冷却した後、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（１．２０ｍＬ、７．７５ｍｍｏｌ）を滴下し、混合物を室温で１８時間撹拌した。ジクロロメタンを減圧除去し、酢酸エチル（６０ｍＬ）を加え、混合物を炭酸水素ナトリウム（２×６０ｍＬ）、ブライン（６０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、真空中で濃縮した。シリカフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン、１：４）による精製により、２０を黄色の油状物（１．６５ｇ、５４％）として得た。RF 0.19 (EtOAc/ヘキサン, 1:4); ｖmax(ニート(neat))/cm-1 2923, 1736, 1457; 1H NMR (300 MHz; CDCl3) δ 0.84 (t, J = 6.7 Hz, 3H), 1.18-1.30 (m, 20H), 1.58 (m, 2H), 1.93-2.00 (m, 4H), 2.29 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.43 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.59-3.67 (m, 10H), 3.77 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 4.19 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 5.27-5.36 (m, 2H); 13C NMR (75 MHz; CDCl3) δ14.1, 22.6, 24.9, 27.2, 29.1-29.8 (重畳信号), 30.4, 31.9, 34.0, 63.3, 69.2, 70-4-70.6 (重畳信号), 71.2, 129.7, 130.0, 173.6; m/z [HRMS ES+]は、[MNa]＋543.2671がみられた。C26H49O579BrNaは、543.2661を必要とする。
【０１０８】
ＴＣ−ＤＯＤＥＧ４（１４）
三本鎖イオン化合物（９Ｚ）−Ｎ−（２，３−ビス（（９Ｚ）−オクタデセニルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１３−オキソ−３，６，９，１２−テトラオキサトリアコン−２１−エン−１−アミニウムブロマイド（ＴＣ−ＤＯＤＥＧ４）（１４）は、４−ＥＧオレオイルエステル（２０）による（２，３−ビス−オクタデカ−９−エニルオキシプロピル）−ジメチルアミン（１６）の四級化によって合成された。
【０１０９】
【化１２】
2019510083.tif 000014
【０１１０】
アセトン（２ｍＬ）中のアミン（１６）（０．２６０ｇ、０．４２０ｍｍｏｌ）および４−ＥＧオレオイルエステル（２０）（０．２４０ｇ、０．４６０ｍｍｏｌ）の溶液を、封管中、９０℃で４８時間撹拌した。アセトンを減圧除去した。フラッシュシリカクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、１９：１）による精製により、淡黄色の油としてＴＣ−ＤＯＤＥＧ４（１４）を得た（１７１ｍｇ、３６％）。RF 0.40 (CH2Cl2/MeOH, 9:1); ｖmax(ニート(neat))/cm-12950, 2859, 1740, 1464; 1H NMR(600 MHz; CDCl3) δ0.83 (t, J = 7.0 Hz, 9H), 1.13-1.22 (m, 64H), 1.51 (m, 4H), 1.57 (m, 2H), 1.92-1.97 (m, 12H), 2.29 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 3.38-3.51 (m, 14H), 3.51 (m, 6H), 3.58 (m, 4H), 3.92-4.05 (m, 4H), 4.08 (m, 1H), 4.18 (m, 2H), 5.27 (m, 6H); 13C NMR (150 MHz; CDCl3) δ14.2, 22.8, 25.0, 26.1, 26.3, 27.26, 27.30, 29.0, 29.1-29.9 (重畳信号), 30.1, 32.1, 32.7, 34.2, 53.3, 53.4, 63.3, 65.0, 65.2, 66.8, 68.6, 69.29, 69.32, 70.3, 70.4, 70.5, 70.6, 72.1, 73.5, 127.9-130.5 (重畳信号), 173.9; m/z [HRMS ES+]は、[M-Br]＋ 1060.9904がみられた。C67H130NO7は、1060.9847; m/z (+ES) 1061 ([M-Br]+, 100%), 980 (60), 931 (70), 843 (65), 306 (63) を必要とする。
【０１１１】
三級アミン（１８）
（９Ｚ）−３−（ジメチルアミノ）プロパン−１，２−ジイルジオレエート（１８）を、Narang, A.S.; Thoma, L.; Miller, D. D.; Mahato, R. I. Bioconjugate Chem. 2005, 16, 156-168に記載されるように調製した。
【０１１２】
ＴＣ−ＤＯｅｓＤＥＧ４（１９）
三本鎖イオン化合物（９Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（３−（オレオイルオキシ）−２−（（９Ｚ）−２−オキソオクタデセニルオキシ）プロピル）−１３−オキソ−３，６，９，１２−テトラオキサトリアコン−２１−エン−１−臭化アミニウム（ＴＣ−ＤＯｅｓＤＥＧ４）（１９）は、４−ＥＧオレオイルエステル（２０）による（２，３−ビス−ヘプタデカ−９−エニルカルボキシプロピル）−ジメチルアミン（１８）の四級化によって合成された。
【０１１３】
【化１３】
2019510083.tif 000015
【０１１４】
アセトン（２ｍＬ）中のアミン１８（０．６１０ｇ、０．９４１ｍｍｏｌ）および４−ＥＧオレオイルエステル２０（０．６４０ｇ、１．２２ｍｍｏｌ）の溶液を密封管中、８０℃で４８時間撹拌した。アセトンを減圧除去した。フラッシュシリカクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、１９：１）による精製により、１９を淡黄色の油状物として得た（１１８ｍｇ、１１％）。RF 0.24 (CH2Cl2/MeOH, 19:1); ｖmax (ニート(neat))/cm-12924, 2854, 1740, 1465; 1H NMR (500 MHz; CDCl3) δ0.86 (t, J = 6.8 Hz, 9H), 1.25-1.32 (m, 60H), 1.58 (m, 6H), 1.99 (m, 12H), 2.30 (t, J = 7.5 Hz, 4H), 2.34 (m, 2H), 3.44 (s, 3H), 3.51 (s, 3H), 3.64-3.68 (m, 11H), 3.82 (dd, J = 13.5 and 10.0 Hz, 1H), 3.94 (m, 2H), 4.05 (m, 2H), 4.13 (m, 1H), 4.20 (t, J = 5.0 Hz, 2H), 4.35 (d, J = 13.5 Hz, 1H), 4.48 (dd, J = 12.3 および3.3 Hz, 1H), 5.28-5.35 (m, 6H), 5.64 (m, 1H); 13C NMR (125 MHz; CDCl3) δ14.2, 22.7, 24.7, 24.8, 25.0, 25.7, 27.2, 27.3, 29.1-29.8, 31.6, 32.0, 34.0, 34.3, 52.8, 52.9, 63.2, 63.3, 64.0, 64.9, 65.6, 65.8, 69.3, 70.1, 70.45, 70.48, 70.6, 129.7-130.1 (重畳信号), 172.9, 173.2, 173.8; m/z[HRMS ES+]は、[M-Br]+ 1088.9382がみられた。C67H126NO9は1088.9433を必要とし、m/z（+ ES）1089（[M-Br]＋、100％）。
【０１１５】
ＴＣ−ＤＯｅｓＤＥＧ４に対する類似体
ｍ＝２である三本鎖脂質ＴＣ−ＤＯＤＥＧ３およびＴＣ−ＤＯｅｓＤＥＧ３は、同様に、（２，３−ビス−オクタデカ−９−エニルオキシプロピル）−ジメチルアミン（１６）および（２，３−ビス−ヘプタデカ−９−エニルカルボキシプロピル）−ジメチルアミン（１８）のそれぞれを３−ＥＧオレオイルエステルで四級化によって合成することができる。
【０１１６】
脂質ＭＥ４２（比較）
（２，３−ビス−オクタデカ−９−エニルオキシプロピル）−（８−ヒドロキシ−３，６−ジオキソオクチルオキシカルボニルブチル）−ジメチルアンモニウムブロミド（ＭＥ４２）をWO2007/138324（４１および４２ページ参照）に記載されるように調製した。
【０１１７】
【化１４】
2019510083.tif 000016
【０１１８】
脂質ＦＭＭ３２（比較）
【化１５】
2019510083.tif 000017
【０１１９】
脂質ＤＨＤＴＭＡ（１０６ａ）（比較）
ＤＨＤＴＭＡは、Writer M, Hurley CA, Sarkar S, Copeman DM, Wong JB, et al. Analysis and optimization of the cationic lipid component of a lipid/peptide vector formulation for enhanced transfection in vitro and in vivo. J Liposome Res. 2006; 16:373-389に記載されるジエーテル結合によって連結された２つの不飽和Ｃ１６アルキル鎖を有するグリセロール骨格に基づくカチオン性脂質である。
【０１２０】
ペプチド合成
記載されたペプチド（表１Ａ）は、標準的な機器および技術を用いて合成された。
【０１２１】
テーブル１Ａ：ペプチド配列
【表１】
2019510083.tif 000018
【０１２２】
テーブル１Ｂ：ペプチド質量
【表２】
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【０１２３】
ＭＥ２７はＳＹＲＯ自動化ペプチド合成装置で合成した。
線状ペプチド配列：テフロン（登録商標）フリットおよび５００μｌのカップリング容量を有する２ｍｌシリンジを使用して、２０μｍｏｌスケールでペプチドを合成した。Ｆｍｏｃ−ＧｌｙプレロードされたＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＴ樹脂またはＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−樹脂をこれらの配列に使用した。Ｆｍｏｃ−Ｐｅｇ４−ＣＯＯＨを以前に報告された手順に従って合成した（WO2005/117985の82頁のＦｍｏｃ−Ｈａａ４−ＣＯＯＨの合成を参照のこと−Ｆｍｏｃ−Ｈａａ４−ＣＯＯＨはその明細書中でＦｍｏｃ−Ｐｅｇ４−ＣＯＯＨに与えられた名称であった）。ＴＧＴ樹脂は最初に１０分間膨潤したが、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ樹脂はＤＭＦ中で最初の膨潤時間（数時間）を延長する必要があった。ＨＢＴＵ（ＤＭＦ中）およびＤＩＰＥＡ（ＮＭＰ中）を４倍過剰の試薬を用いて通例のカップリングを行った。Ｆｍｏｃを、ＤＭＦ中のピペリジンの４０％溶液で３分間、２０％溶液で１０分間切断した。合成サイクルは、４０分のカップリング時間、４０％ピペリジンを用いたＦｍｏｃ脱保護のための３分、２０％ピペリジンを用いたＦｍｏｃ脱保護および洗浄工程のための別の１０分からなるものであった。ＤＭＦでの合成および最後の洗浄サイクルの後、ペプチドを、Ｓｙｒｏの「マニュアル」／「エンプティ」機能を用いてＤＣＭ、メタノールおよびジエチルエーテル（それぞれ３回）で洗浄した。エーテルを蒸発させるのを助けるために、より多くの時間吸引を行った。
【０１２４】
樹脂上のジスルフィド結合フォーメーション：
樹脂上にジスルフィド架橋を形成するために、樹脂をＰＥフリットを入れた注射器に入れ、ＤＭＦ中で膨潤させた。過剰のＤＭＦを除去した後、新たに調製したヨウ素の最小量のＤＭＦ溶液（例えば、２ｍｌシリンジについては５００μｌ、樹脂負荷に対しては１０当量のヨウ素）を添加し、シリンジを４時間の間、４分ごとに２０秒間ボルテックスした。試薬溶液を除去し、樹脂をＤＭＦで１０〜２０回、ＤＣＭ、メタノールおよびエーテルでそれぞれ３回洗浄した。
【０１２５】
切断および脱保護：
シリンジを切断のためにヒュームフードに移した。切断は、９５％ＴＦＡ、２．５％ＴＩＳおよび２．５％Ｈ２Ｏのカクテルで行った。新たに調製したカクテルの最小量を加えて樹脂を覆った（例えば、２ｍｌシリンジで＜５００μｌ）。４時間後、切断溶液をプランジャーを用いてポリプロピレン（ＰＰ）チューブに通し、樹脂を別の少量の切断カクテル（例えば、２ｍｌのシリンジで２００μｌ）で洗浄した。次いで、ペプチドをエーテルで沈殿させた（例えば、２ｍｌのシリンジの合わせた画分に約４ｍｌのジエチルエーテルを加えた）。ＰＰチューブを少なくとも１５分間冷凍庫に入れ、次いで３０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、溶液をペプチドペレットからデカントした。遠心分離およびデカンテーションを約２ｍｌのエーテルで２回繰り返した。最後に、ペプチドを水またはｔＢｕＯＨ／水（４：１）に溶解し、凍結乾燥させた。いくつかのペプチド配列は非常に貧弱な溶解性を示し、時には、ふわふわした（fluffy）ペプチドを得るために、異なる溶媒混合物（水、ｔＢｕＯＨまたはアセトニトリル）を用いたいくつかの凍結乾燥／溶解プロセスが必要であった。
【０１２６】
ペプチドを逆相ＨＰＬＣで分析し、＞９０％純度まで逆相ＨＰＬＣで精製した。Micromass Quattro ES-MS（ソフトウェア：Masslynx）を用いて質量スペクトルを記録し、質量を表１Ｂに記録した。
【０１２７】
Ｋ１６ＣＹ、Ｋ１６ＹおよびＫ１６Ｐは、AMS Bio Ltd.、Birmingham、UKから購入し、半自動ペプチド合成化学を用いて合成した。ペプチドを逆相ＨＰＬＣで分析し、必要に応じて純度８５％まで逆相ＨＰＬＣで精製した。相対的な分子量を表１Ｂに示す。
【０１２８】
Ｋ１６は前述のように購入した（Hart et al., Lipid-mediated enhancement of transfection by a nonviral integrin-targeting vector. Hum Gene Ther., 1998, 9, 575-585）。相対的な分子量を表１Ｂに示す。
【０１２９】
これらの凍結乾燥ペプチドはすべて水中で１０ｍｇ／ｍｌに希釈し、数ヶ月間−２０℃で保存した。解凍後、ペプチドのアリコートを数週間、4℃で保存する。
【０１３０】
プラスミドＤＮＡ
プラスミドｐＣＩ−Ｌｕｃ（５．７ｋｂ）は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時／初期プロモーターエンハンサーによって駆動されるルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＣＩ（Promega, Southampton, UK）からなる。プラスミドをエシェリヒア・コリＤＨ５α中で増殖させ、バクテリアアルカリ溶解後に樹脂カラム（Qiagen Ltd., Crawley, UK）上で精製した。イソプロパノール沈殿したＤＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、次いで１ｍｇ／ｍｌの水に溶解した。
【０１３１】
インビトロトランスフェクション
試験した細胞は、１ＨＡＥ−ヒト気道上皮細胞、ＮＩＨ３Ｔ３マウス線維芽細胞、およびＮｅｕｒｏ２Ａマウス神経芽細胞腫細胞を含んでいた。細胞を９６ウェルプレートに約２×１０４細胞／ウェルで播種し、次いで完全増殖培地中で３７℃で一晩インキュベートした。翌日、以下の順序で成分を混合することにより、本質的に以前に記載されたように（Hart et al., 1998）、リポポリプレックス（ＬＰＤ）製剤を調製した：ＯｐｔｉＭＥＭ中８０μｇ／ｍｌの脂質（Ｌ）５０μｌ、ＯｐｔｉＭＥＭ中の１１０μｇ／ｍｌのペプチド（Ｐ）７０μｌおよびＯｐｔｉＭＥＭ中の４０μｇ／ｍｌのプラスミドｐＣＩ−Ｌｕｃ（Ｄ）５０μｌ（それぞれ２：４：１の重量比に相当）。すべての複合体をピペットで短時間混合し、室温で１時間保持し、次にＯｐｔｉＭＥＭで希釈して１．５７ｍｌの最終容量にした。０．２５μｇのプラスミドＤＮＡに相当する２００マイクロリットルの複合体を、完全増殖培地を除去した後、各培養ウェルに添加した。すべてのトランスフェクションはそれぞれ６ウェルで実施した。複合体の沈降および細胞接触を促進するために、遠心分離（１５００ｒｐｍ、５分間）を行った。細胞を新鮮な培地で２４時間交換する前に、３７℃で４時間、複合体と共にインキュベートし、その後、レポーター遺伝子発現をルシフェラーゼアッセイ（Promega、Madison、WI、USA）によって分析した。
【０１３２】
特に明記しない限り、カチオン性リポソームは、２つのイオン化合物の混合物を含み、例えば、ＦＭＭ３０およびＤＯＰＥは、イオン化合物を１：１の比で含む。
【０１３３】
ＮＩＨ３Ｔ３および１ＨＡＥｏ−細胞を、ペプチドＭＥ２７およびプラスミドｐＣＩ−Ｌｕｃおよび脂質製剤の１つを含有するＬＰＤ製剤でトランスフェクトした：
・１：１のモル比のＣＨ３００／ＤＯＰＥ、
・１：１のモル比のＦＭＭ３０／ＤＯＰＥ、
・４：１：５のモル比のＣＨ３００／ＦＭＭ３０／ＤＯＰＥ、
・１：１：２のモル比のＣＨ３００／ＦＭＭ３０／ＤＯＰＥ、
・１：１のモル比のＦＭＭ３２／ＤＯＰＥ。
【０１３４】
陽性対照として、市販のトランスフェクション試薬Lipofectamine 2000（Life Technologies Inc.から購入したL2K）で、細胞をトランスフェクトした。総脂質：ペプチド：ＤＮＡ比は、１：４：１、２：４：１、または４：４：１であった。ＬＰＤ製剤はすべて、上記の順序でＬ：Ｐ：Ｄの順番で混合することによって調製した。結果を図１および図２に示す。
【０１３５】
ＭＥ２７、Ｋ１６ＣＹ、Ｋ１６ＹおよびＫ１６Ｐの４つの異なるペプチドを用いて脂質の異なる組み合わせを含有するＬＰＤ製剤を調製し、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を上記のようにｐＣＩ−Ｌｕｃでトランスフェクトするために使用した。使用した脂質は：
・１：１のモル比のＣＨ３００／ＤＯＰＥ、
・１：１のモル比のＦＭＭ３０／ＤＯＰＥ、
・４：１：５のモル比のＣＨ３００／ＦＭＭ３０／ＤＯＰＥ、
・１：１：２のモル比のＣＨ３００／ＦＭＭ３０／ＤＯＰＥ、
・１：１のモル比のＦＭＭ３２／ＤＯＰＥ、
・１：１のモル比の１０６ａ（ＤＨＤＴＭＡ）／ＤＯＰＥ、
・１：１のモル比のＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ、
であった。
【０１３６】
市販の試薬であるDOTAP、LipofectinおよびLipofectamine 2000（L2K）も、ペプチドおよびＤＮＡとのＬＰＤの組み合わせで比較した。すべてのＬ：Ｐ：Ｄ重量比は２：４：１であり、ウェルにはそれぞれ０．２５μｇのｐＣＩ−Ｌｕｃが与えられた。結果は図３に示される。
【０１３７】
異なる脂質ＭＥ４２／ＤＯＰＥ（ＭＥ４２）、ＣＨ３００／ＤＯＰＥ（ＣＨ３００）またはＦＭＭ３０／ＤＯＰＥを含むＬＰＤ製剤を、標的ペプチドＭＥ２７またはＫ１６Ｙのいずれかとともに調製し、Ｎｅｕｒｏ−２Ａマウス神経芽腫細胞をトランスフェクトするために使用した。結果を図４に示す（試験したペプチドがＧＡＣＹＧＬＰＨＫＦＣＧ「Ｙ」コアモチーフと共にポリリジン部分を含むため、図４のペプチド「Ｙ」に対するＮ．ｂ参照はより正確に「Ｋ１６Ｙ」を参照すべきである）。
【０１３８】
ルシフェラーゼおよびタンパク質アッセイ
４℃で２０分間、細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、１×Reporter Lysis Buffer（Promega, Madison, WI, USA）を細胞に２０μｌ添加してから−８０℃で少なくとも３０分間凍結させ、続いて室温で解凍する。次いでルシフェラーゼ活性をLuciferase Assay System（Promega, Madison, WI, USA）およびOptima Fluostarプレートリーダー（BMG Labtech）を用いて10秒間測定した。Bio-Rad（Hercules、CA、USA）タンパク質アッセイ試薬を使用して、各トランスフェクションライセートに存在するタンパク質の量を、製造者の指示に従って決定し、ルシフェラーゼ試験から２０μｌを１８０μｌの試薬に加えて１／５に希釈し、室温で１０分間インキュベートした後、ＯＤ５９０をある範囲のＢＳＡ標準と比較する。インビトロルシフェラーゼ活性は、タンパク質１ミリグラムあたりの相対発光単位（ＲＬＵ）（ＲＬＵ／ｍｇ）として表した。
【０１３９】
パーティクルイメージング
重量比０．７５：４：１（Ｌ：Ｐ：Ｄ）で、ペプチドＭＥ２７を有するＦＭＭ３０を含むＬＰＤ粒子の透過電子顕微鏡画像を図５（ＦＭＭ３０−ＰＤ−０．７５）に示し、同じ重量で脂質ＦＭＭ３０／ＤＯＰＥを図６（ＦＭＭ３０／ＤＯＰＥ−ＰＤ０．７５）に示す。
【０１４０】
脂質ＦＭＭ３０またはＦＭＭ３０／ＤＯＰＥを有するペプチドＭＥ２７を含有するＬＰＤナノ粒子のサイズを、NanoZS Zetasizer（Malvern）を用いた動的光散乱によるＤＮＡに対するリポソームの異なる重量比（ｗ／ｗ）で測定した。結果を図７に示す。
【０１４１】
結果と考察
ＮＩＨ３Ｔ３および１ＨＡＥｏ−細胞における脂質のインビトロトランスフェクション効率
図１および図２は、三本鎖イオン化合物ＦＭＭ３０を含むＬＰＤ製剤を用いたトランスフェクションレベルが、ＮＩＨ３Ｔ３および１ＨＡＥｏ−細胞株の二本鎖脂質ＣＨ３００よりはるかに高かったことを示している。ＦＭＭ３０の高い比率での脂質の混合物（ＣＨ３００／ＦＭＭ３０／ＤＯＰＥ）を含むＬＰＤ製剤もまた、ＦＭＭ３０の少量を含むものと比較して良好に機能した。ＦＭＭ３２／ＤＯＰＥを含有する製剤は、ＣＨ３００／ＤＯＰＥ製剤に同様に低レベルのトランスフェクションを与えた。
【０１４２】
図３は、最高レベルのトランスフェクションを生み出すＦＭＭ３０／ＤＯＰＥ含有ＬＰＤ製剤における各ペプチドについての製剤を示し、ＦＭＭ３０／ＤＯＰＥ含有ＬＰＤ製剤についてのトランスフェクションレベルが、これまでにトランスフェクションに最適であることが示された、Ｃ１６脂質１０６ａ並びに３つの市販の試薬の全てよりも高かった。
【０１４３】
Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞株における脂質のインビトロトランスフェクション効率
以前の結果は、ＭＥ２７／ＭＥ４２がＮｅｕｒｏ−２Ａマウス神経芽腫細胞に最適であることを示した。図４に示された結果は、脂質ＦＭＭ３０／ＤＯＰＥが１：４：１（Ｌ：Ｐ：Ｄ）の比でわずかに良好に同等に有効であることを示している。ＦＭＭ３０／ＤＯＰＥは、また、ＬＰＤトランスフェクションでの親脂質組合せＣＨ３００／ＤＯＰＥよりも有意により良好であった。
【０１４４】
ＬＰＤパーティクルイメージング
図５に示す０．７５：４：１（Ｌ：Ｐ：Ｄ）および図６に示す同じ重量比の脂質ＦＭＭ３０／ＤＯＰＥの重量比でペプチドＭＥ２７を有するＦＭＭ３０を含むナノ粒子はいずれも、ロッドおよび球体を含む形状の組み合わせで、非常に似たサイズである。
【０１４５】
図７に示すように、ＦＭＭ３０／ＤＯＰＥ脂質を含むナノ粒子は、両方の粒子が約８０ｎｍで最小である０．７５：４：１を除くすべての重量比にわたってＦＭＭ３０（ＤＯＰＥなし）を含有するナノ粒子よりも小さかった。
【図１】
2019510083.tif 000022
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2019510083.tif 000026
【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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2019510083.tif 000030