(57)【要約】【課題】ＴＬＲ４シグナル伝達経路を通して宿主免疫応答の態様を標的とすることにより、ＥＢＯＶ感染の作用を限定する新規な治療薬に対する必要が依然としてある。【解決手段】  本発明は、エボラウイルス（ebola virus）感染又はマールブルクウイルス（Marburg virus）感染を治療するための方法であって、対象に有効量の式（Ｉ）の化合物又はその薬剤学的に許容される塩を投与することを含む方法に関する。【化１】2019529355.tif 000004【選択図】図１Ａ
2019529355.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エボラウイルス（ebola virus）に感染した患者を治療するための方法であって、前記治療を必要とする前記感染患者に治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与することを含む方法。
【請求項２】
エリトラン四ナトリウム塩が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記感染患者に治療有効量の抗ウイルス化合物を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記感染患者が、エボラウイルス（ebola virus）感染の存在についての試験が陽性になった後に治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記感染患者が、エボラウイルス（ebola virus）感染の前記存在について、ＰＣＲ、ｒｔ−ＰＣＲ、直接抗原検出試験、細胞培養中でのウイルス単離又はそれらの組合わせを使用して試験される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記感染患者においてエボラ（ebola）誘導性サイトカインレベルの減少を引き起こすことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記感染患者におけるエボラ（ebola）誘導性サイトカインレベルの減少を引き起こすことをさらに含み、サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３又はそれらの組合わせを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記感染患者におけるエボラ（ebola）誘導性ケモカインレベルの減少を引き起こすことをさらに含み、ケモカインが、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＩＦ又はそれらの組合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記感染患者におけるエボラ（ebola）誘導性刺激因子レベルの増加を引き起こすことをさらに含み、刺激因子が、Ｇ−ＣＳＦ、ＫＣ又はそれらの組合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記感染患者における顆粒球及びＴリンパ球の減少を引き起こすことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記感染患者におけるＣＤ３+Ｔリンパ球の減少を引き起こすことをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記感染患者が、臨床症状の発現後に治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与され、前記臨床症状が、発熱、頭痛、咽頭炎、下痢、嘔吐、筋肉痛、関節痛、皮膚発疹、内出血もしくは外出血又はそれらの組合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩が、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、冠動脈内投与、動脈内投与、皮内投与、経皮送達、気管内投与、皮下投与、関節内投与、心室内投与、吸入、脳内、鼻腔内、神経内、口腔内、眼内、肺内投与、カテーテルの含浸、坐剤及び組織内への直接注射によるもの、又は全身性で吸収される局所性もしくは粘膜投与を含む経路の１つによって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩が静脈内投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与することの作用が、前記感染患者におけるウイルス力価の減少を引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記感染患者が、投与１回当たり約１μｇから約２４０ｍｇの範囲内にある治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
フィロウイルス（filovirus）に感染した患者を治療するための方法であって、前記治療を必要とする前記感染患者に、有効成分及び医薬上許容される担体を含む組成物を投与することを含み、前記有効成分が、エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を含む、方法。
【請求項１８】
エリトラン四ナトリウム塩が投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者が、クエバウイルス（cuevavirus）、エボラウイルス（ebola virus）及びマールブルクウイルス（Marburg virus）からなる群から選択されるフィロウイルス（filovirus）科のメンバーに感染している、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記患者が、ブンディブギョエボラウイルス（Bundibugyo Ebolavirus）、レストンエボラウイルス（Reston Ebolavirus）、スーダンエボラウイルス（Sudan Ebolavirus）、タイフォレストエボラウイルス（Tai Forest Ebolavirus）及びザイールエボラウイルス（Zaire Ebolavirus）又はそれらの組合わせを含む群から選択されるエボラウイルス（ebola virus）に感染している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記感染患者に治療有効量の抗ウイルス化合物を投与することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記感染患者が、フィロウイルス（filovirus）感染の存在についての試験が陽性になった後に治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記感染患者が、フィロウイルス（filovirus）感染の前記存在について、ＰＣＲ、ｒｔ−ＰＣＲ、直接抗原検出試験、細胞培養中でのウイルス単離又はそれらの組合わせを使用して試験される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記感染患者におけるフィロウイルス（filovirus）誘導性サイトカインレベルの減少を引き起こすことをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記感染患者におけるフィロウイルス（filovirus））誘導性サイトカインレベルの減少を引き起こすことをさらに含み、サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３又はそれらの組合わせを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記感染患者におけるフィロウイルス（filovirus）誘導性ケモカインレベルの減少を引き起こすことをさらに含み、ケモカインが、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＩＦ又はそれらの組合わせを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
前記感染患者におけるフィロウイルス（filovirus）誘導性刺激因子レベルの増加を引き起こすことをさらに含み、刺激因子が、Ｇ−ＣＳＦ、ＫＣ又はそれらの組合わせである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
前記感染患者における顆粒球及びＴリンパ球の減少を引き起こすことをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
前記感染患者におけるＣＤ３+Ｔリンパ球の減少を引き起こすことをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記感染患者が、臨床症状の発現後に治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与され、前記臨床症状が、発熱、頭痛、咽頭炎、下痢、嘔吐、筋肉痛、関節痛、皮膚発疹、内出血もしくは外出血又はそれらの組合わせを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３１】
エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩が、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、冠動脈内投与、動脈内投与、皮内投与、経皮送達、気管内投与、皮下投与、関節内投与、心室内投与、吸入、脳内、鼻腔内、神経内、口腔内、眼内、肺内投与、カテーテルの含浸、坐剤及び組織内への直接注射によるもの、又は全身性で吸収される局所性もしくは粘膜投与を含む経路の１つによって投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項３２】
エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩が、静脈内投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与することの作用が、前記感染患者におけるウイルス力価の減少を引き起こす、請求項１７に記載の方法。
【請求項３４】
前記感染患者が、投与１回当たり約１μｇから約２４０ｍｇの範囲内にある治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項３５】
マールブルクウイルス（Marburg virus）に感染した患者を治療するための方法であって、前記治療を必要とする前記感染した患者に治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与することを含む方法。
【請求項３６】
エリトラン四ナトリウム塩が投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記感染患者に治療有効量の抗ウイルス化合物を投与することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記感染患者が、マールブルクウイルス（Marburg virus）感染の存在についての試験が陽性になった後に治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記感染患者が、マールブルクウイルス（Marburg virus）感染の前記存在について、ＰＣＲ、ｒｔ−ＰＣＲ、直接抗原検出試験、細胞培養中でのウイルス単離又はそれらの組合わせを使用して試験される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記感染患者におけるマールブルク（Marburg）誘導性サイトカインレベルの減少を引き起こすことをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記感染患者におけるマールブルク（Marburg）誘導性サイトカインレベルの減少を引き起こすことをさらに含み、サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３又はそれらの組合わせを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記感染患者におけるマールブルク（Marburg）誘導性ケモカインレベルの減少を引き起こすことをさらに含み、ケモカインが、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＩＦ又はそれらの組合わせを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記感染患者におけるマールブルク（Marburg）誘導性刺激因子レベルの増加を引き起こすことをさらに含み、刺激因子が、Ｇ−ＣＳＦ、ＫＣ又はそれらの組合わせである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４４】
前記感染患者における顆粒球及びＴリンパ球の減少を引き起こすことをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記感染患者におけるＣＤ３+Ｔリンパ球の減少を引き起こすことをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記感染患者が、臨床症状の開始後に治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与され、前記臨床症状が、発熱、頭痛、重度の倦怠感、下痢、腹痛及び痙攣、悪心、嘔吐、筋肉痛、「ゴーストのような」風貌、嘔吐物中、大便中もしくは鼻、歯肉及び膣からの重度の出血性症状、非刺激性皮膚発疹、睾丸炎、錯乱、皮膚刺激性、攻撃性又はそれらの組合わせを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４７】
エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩が、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、冠動脈内投与、動脈内投与、皮内投与、経皮送達、気管内投与、皮下投与、関節内投与、心室内投与、吸入、脳内、鼻腔内、神経内、口腔内、眼内、肺内投与、カテーテルの含浸、坐剤及び組織内への直接注射によるもの、又は全身性で吸収される局所性もしくは粘膜投与を含む経路の１つによって投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩が静脈内投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与することの作用が、前記感染患者におけるウイルス力価の減少を引き起こす、請求項３５に記載の方法。
【請求項５０】
前記感染患者が、投与１回当たり約１μｇから約２４０ｍｇの範囲内にある治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与される、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府資金による研究開発に関する陳述
本発明は、米国立衛生研究所により授与されたＮＩＨ補助金番号第Ｕ１９ＡＩ１０９９４５−０１号及び第Ｕ１９ＡＩ１０９６６４号の下で政府による支援を受けた。米国政府は、本発明に対して所定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、エボラ（ebola）及びマールブルク（Marburg）ウイルス感染を治療するための方法に関する。詳細には、本発明は、エボラ（ebola）又はマールブルク（Marburg）ウイルス感染を治療するためにエリトランを投与することを含む方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
エボラウイルス（ebola virus）病（ＥＶＤ）は、エボラウイルス出血性熱としても知られており、西アフリカにおける散発性大発生に歴史的に関連した疾患である。２０１６年１月の世界保健機関のファクトシート第１０３号（http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs103/en/）を参照されたい。現在まで、ザイール（Zaire）、ブンディブギョ（Bundibugyo）、スーダン（Sudan）、レストン（Reston）及びタイフォレスト（Tai Forest）の５種のエボラウイルス（ebola virus）（ＥＢＯＶ）が同定されている。
【０００４】
ＥＶＤは、ウイルスと接触した後、典型的には２日から３週間の間に始まる下記の初期の徴候及び症状：発熱、疲労、咽頭炎、筋肉痛及び頭痛を含む。これらの初期症状には、その後、嘔吐、下痢、発疹、肝臓及び腎臓の機能低下、ならびに一部の症例では内出血及び外出血の両方が続く。検査所見には、少ない白血球数及び血小板数ならびに肝酵素値上昇が含まれる。
【０００５】
現在、対症療法は、口腔液及び静脈内輸液を用いた再水和を含む。特定の症状の治療は、生存率を改善するが、ＥＶＤのために利用できる実証された治療法は、依然として存在しない。さらに、ＥＶＤ治療のために利用できる認可されたワクチンはない。
【０００６】
２０１６年６月１０日現在、ギニア、リベリア及びシエラレオネにおいて計２８，６１６例のエボラ（ebola）症例が報告されており、２０１４年のＥＶＤ大発生に起因して１１，３１０例の関連死が生じた。２０１６年６月１０日の世界保健機関のエボラ（ebola）状況報告書（http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/208883/1/ebolasitrep_10Jun2016_eng.pdf?ua=1）を参照されたい。したがって、ＥＢＯＶ感染の作用を制限する治療薬に対する必要が存在する。
【０００７】
本発明者らは、ＥＶＤが、細菌性敗血症に関連するいくつかの顕著な特徴又は「敗血症性ショック」としても知られているものを示すことを認識した。組織因子（ＴＦ）、増加したＤ二量体、トロンボモデュリン、フェリチン及び血小板減少症の発現に起因する播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を含む多数の凝固障害は、従来の細菌誘導性敗血症性ショック及びＥＢＯＶ誘導性ショックの両方に関連する（Bray et al., J. Infect. Dis. 188: 1613-1617 (2003)；Hellman et al., Plos Pathogens 11: e1005088 (2015)）。さらに、免疫機能障害、リンパ球減少症及び全身性炎症は、さらに「サイトカインストーム」としても知られている炎症性メディエーターの大量の制御されない産生の開始に起因して観察され、ＥＶＤ及び細菌性敗血症の両方の高度に病原性の性質と相関関係にある（Bray et al., J. Infect. Dis. 188: 1613-1617 (2003)；Hellman et al., Plos Pathogens 11: e1005088 (2015)；Falasca et al., Cell Death and Diff. 22: 1250-1259 (2015)；Feldmarm et al., Lancet 377: 849-862 (2011))。最後に、疾患の後期は、内皮機能不全及び臓器不全に関連する（Feldmann et al., Lancet 377: 849-862 (2011)）。
【０００８】
細菌性敗血症に関連する疾患の発生の中心をなすのは、グラム陰性菌によって産生したリポ多糖（ＬＰＳ）の検出に続くＴＬＲ４シグナル伝達経路の活性化である。さらに、ＬＰＳへの曝露後の活性酸素種（ＲＯＳ）の蓄積に続いて生成される酸化された宿主リン脂質の認識も、ＴＬＲ４シグナル伝達の二次的な、それでも強力な誘導因子として関係付けられてきた。Imai et al., Cell 1333: 235-249 (2008）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
以前の報告書は、ＴＬＲ４-/-マウスが致死的インフルエンザ（influenza）の攻撃に耐性であることを指摘している。Shirey et al., Nature 497 (7450): 498-502 (2013)。さらに、Shirey et al.は、ＴＬＲ４シグナル伝達をブロックすることが、ＴＬＲ４拮抗薬であるエリトランを用いたマウスの治療後の致死的なインフルエンザ（influenza）の攻撃からマウスを保護することを証明した。しかし、ＥＶＤの病因にＴＬＲ４シグナル伝達が関係することは、これまで非常に付随的なままであった。したがって、ＴＬＲ４シグナル伝達経路を通して宿主免疫応答の態様を標的とすることにより、ＥＢＯＶ感染の作用を限定する新規な治療薬に対する必要が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の概要
１つの態様では、本発明は、エボラウイルス（ebola virus）に感染した患者を治療するための方法であって、前記治療を必要とする感染患者に治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与することを含む方法に関する。１つの実施形態では、エリトラン四ナトリウム塩が投与される。１つの実施形態では、本発明は、感染患者に治療有効量の抗ウイルス化合物を投与することをさらに含む。本発明の別の実施形態では、感染患者は、エボラウイルス（ebola virus）感染の存在についての試験が陽性になった後に治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与される。本発明の別の実施形態では、感染患者は、エボラウイルス（ebola virus）感染の存在について、ＰＣＲ、ｒｔ−ＰＣＲ、直接抗原検出試験、細胞培養中でのウイルス単離又はそれらの組合わせを使用して試験される。
【００１１】
１つの実施形態では、本発明は、感染患者におけるエボラ（ebola）誘導性サイトカインレベルの減少を引き起こすことをさらに含む。別の実施形態では、本発明は、感染患者におけるエボラ（ebola）誘導性サイトカインレベルの減少を引き起こすことをさらに含み、サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３又はそれらの組合わせを含む。別の実施形態では、本発明は、感染患者におけるエボラ（ebola）誘導性ケモカインレベルの減少を引き起こすことをさらに含み、ケモカインは、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＩＦ又はそれらの組合わせを含む。さらに別の実施形態では、本発明は、感染患者におけるエボラ（ebola）誘導性刺激因子レベルの増加を引き起こすことをさらに含み、刺激因子は、Ｇ−ＣＳＦ、ＫＣ又はそれらの組合わせである。別の実施形態では、本発明は、感染患者における顆粒球及びＴリンパ球の減少を引き起こすことをさらに含む。さらに別の実施形態では、本発明は、感染患者におけるＣＤ３+Ｔリンパ球の減少を引き起こすことをさらに含む。
【００１２】
別の態様では、本発明は、マールブルクウイルス（Marburg virus）（ＭＡＲＶ）に感染した患者を治療するための方法であって、前記治療を必要とする感染患者に治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与することを含む方法に関する。１つの実施形態では、エリトラン四ナトリウム塩が投与される。１つの実施形態では、本発明は、感染患者に治療有効量の抗ウイルス化合物を投与することをさらに含む。本発明の別の実施形態では、感染患者は、マールブルクウイルス（Marburg virus）感染の存在についての試験が陽性になった後に治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与される。本発明の別の実施形態では、感染患者は、マールブルクウイルス（Marburg virus）感染の存在について、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ＰＣＲ、ｒｔ−ＰＣＲ、直接抗原検出試験、細胞培養中でのウイルス単離、血清中和又はそれらの組合わせを使用して試験される。
【００１３】
１つの実施形態では、本発明は、感染患者におけるマールブルク（Marburg）誘導性サイトカインレベルの減少を引き起こすことをさらに含む。別の実施形態では、本発明は、感染患者におけるマールブルク（Marburg）誘導性サイトカインレベルの減少を引き起こすことをさらに含み、サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３又はそれらの組合わせを含む。別の実施形態では、本発明は、感染患者におけるマールブルク（Marburg）誘導性ケモカインレベルの減少を引き起こすことをさらに含み、ケモカインは、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＩＦ又はそれらの組合わせを含む。さらに別の実施形態では、本発明は、感染患者におけるマールブルク（Marburg）誘導性刺激因子レベルの増加を引き起こすことをさらに含み、刺激因子は、Ｇ−ＣＳＦ、ＫＣ又はそれらの組合わせである。別の実施形態では、本発明は、感染患者における顆粒球及びＴリンパ球の減少を引き起こすことをさらに含む。さらに別の実施形態では、本発明は、感染患者におけるＣＤ３+Ｔリンパ球の減少を引き起こすことをさらに含む。
【００１４】
本発明の１つの実施形態では、感染患者は、臨床症状の発現後に治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与され、臨床症状は、発熱、頭痛、咽頭炎、下痢、嘔吐、筋肉痛、関節痛、皮膚発疹、内出血もしくは外出血又はそれらの組合わせを含む。本発明の別の実施形態では、エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩は、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、冠動脈内投与、動脈内投与、皮内投与、経皮送達、気管内投与、皮下投与、関節内投与、心室内投与、吸入、脳内、鼻腔内、神経内、口腔内、眼内、肺内投与、カテーテルの含浸、坐剤及び組織内への直接注射によるもの、又は全身性で吸収される局所性もしくは粘膜投与を含む経路の１つによって投与される。別の実施形態では、エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩は、静脈内投与される。本発明の１つの実施形態では、エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与することの作用は、感染患者におけるウイルス力価の減少を引き起こす。
【００１５】
本発明の１つの実施形態では、感染患者は、投与１回当たり約１μｇ〜約２４０ｍｇの範囲内にある治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与される。
【００１６】
別の態様では、本発明は、フィロウイルス（filovirus）に感染した患者を治療するための方法であって、前記治療を必要とする感染患者に、有効成分及び医薬上許容される担体を含む組成物を投与することを含み、有効成分は、エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を含む、方法に関する。１つの実施形態では、エリトラン四ナトリウム塩は、投与される。本発明の１つの実施形態では、患者は、クエバウイルス（cueva virus）、エボラウイルス（ebola virus）及びマールブルクウイルス（Marburg virus）からなる群から選択されるフィロウイルス（filovirus）科のメンバーに感染している。本発明の別の実施形態では、患者は、ブンディブギョエボラウイルス（Bundibugyo ebolavirus）、レストンエボラウイルス（Reston ebolavirus）、スーダンエボラウイルス（Sudan ebolavirus）、タイフォレストエボラウイルス（Tai Forest ebolavirus）及びザイールエボラウイルス（Zaire ebolavirus）又はそれらの組合わせを含む群から選択されるエボラウイルス（ebola virus）に感染している。本発明の別の実施形態では、感染患者は、フィロウイルス（filovirus）感染の存在についての試験が陽性になった後に治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与される。本発明の１つの実施形態では、感染患者は、フィロウイルス（filovirus）感染の存在について、ＰＣＲ、ｒｔ−ＰＣＲ、直接抗原検出試験、細胞培養中でのウイルス単離又はそれらの組合わせを使用して試験される。
【００１７】
１つの実施形態では、本発明は、感染患者におけるフィロウイルス（filovirus）誘導性サイトカインレベルの減少を引き起こすことをさらに含む。別の実施形態では、本発明は、感染患者におけるフィロウイルス（filovirus）誘導性サイトカインレベルの減少を引き起こすことをさらに含み、サイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３又はそれらの組合わせを含む。別の実施形態では、本発明は、感染患者におけるフィロウイルス（filovirus）誘導性ケモカインレベルの減少を引き起こすことをさらに含み、ケモカインは、ＩΡ−１０、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＩＦ又はそれらの組合わせを含む。さらに別の実施形態では、本発明は、感染患者におけるフィロウイルス（filovirus）誘導性刺激因子レベルの増加を引き起こすことをさらに含み、刺激因子は、Ｇ−ＣＳＦ、ＫＣ又はそれらの組合わせである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】エリトランは、致死的なエボラウイルス（ebola virus）の攻撃からマウスを保護する。エボラウイルス（ebola virus）（ＥＢＯＶ）感染のための治療薬としてのエリトランの使用について調査した試験の概略である。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、腹腔内注射（ｉ．ｐ．）によって１０００ｐｆｕのマウス適応ＥＢＯＶにより誘発された。マウスは、計１０日間にわたり腹腔内注射によってプラセボ（ビヒクル）又は２３３μｇのエリトランを含む連日注射を受けた。
【図１Ｂ】エリトランは、致死的なエボラウイルス（ebola virus）の攻撃からマウスを保護する。（Ａ）に指示したように治療及び監視したマウスの生存曲線は、１群５匹の２群からなる２件の独立実験からの累積データを使用して生成した。
【図１Ｃ】エリトランは、致死的なエボラウイルス（ebola virus）の攻撃からマウスを保護する。臨床スコアは、実施例に記載したように割り当てた。
【図１Ｄ】エリトランは、致死的なエボラウイルス（ebola virus）の攻撃からマウスを保護する。ＥＢＯＶ誘発後の経過日数における体重変化（％）である。
【図１Ｅ】エリトランは、致死的なエボラウイルス（ebola virus）の攻撃からマウスを保護する。エリトラン治療マウス及びコントロールマウスにおける感染後第６日のウイルス血症である。プラセボ群のマウス４匹及びエリトラン治療群のマウス５匹に基づく平均値±ＳＥ。
【図２Ａ】エリトラン治療は、顆粒球及びＴリンパ球のレベルを減少させる。ＦＳＣ対ＳＳＣのプロットは、好中球活性化及び動員の指標であるＥＢＯＶ感染マウスにおける顆粒球（好中球）の粒度及び絶対計数の増加を証明している。
【図２Ｂ】エリトラン治療は、顆粒球及びＴリンパ球のレベルを減少させる。絶対好中球計数である。分析は、ＥＢＯＶ誘発後第６日に実施した。
【図２Ｃ】エリトラン治療は、顆粒球及びＴリンパ球のレベルを減少させる。モック、プラセボ及びエリトラン治療マウスから単離された白血球中のＣＤ３+Ｔ細胞サブセットの絶対計数である。分析は、ＥＢＯＶ誘発後第６日に実施した。
【図３Ａ】エリトラン治療は、フリーラジカルのレベルを低下させる。活性酸素種／活性窒素種（ＲＯＳ／ＲＮＳ）。未感染プラセボ治療マウスに対する平均倍率差である平均値±ＳＥは、１群当たり５匹に基づく（モック、全パネル及びプラセボへのエリトラン）。*ｐ＜０．０５、プラセボ群と比較して）。
【図４Ａ】短いエリトラン治療期間は、マウスをエボラウイルス（ebola virus）の攻撃から保護しない。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを第０日から開始して連続４日間にわたりエリトラン又はプラセボにより治療した。生存率スコアである。１群当たり５匹のマウスに基づく平均値±ＳＥ。
【図４Ｂ】短いエリトラン治療期間は、マウスをエボラウイルス（ebola virus）の攻撃から保護しない。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを第０日から開始して連続４日間にわたりエリトラン又はプラセボにより治療した。臨床的スコアである。１群当たり５匹のマウスに基づく平均値±ＳＥ。
【図４Ｃ】短いエリトラン治療期間は、マウスをエボラウイルス（ebola virus）の攻撃から保護しない。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを第０日から開始して連続４日間にわたりエリトラン又はプラセボにより治療した。体重である。１群当たり５匹のマウスに基づく平均値±ＳＥ。
【図５】エリトラン治療は、顆粒球及びＴリンパ球のレベルを減少させる。個々のマウス由来のＦＳＣ対ＳＳＣのプロットは、好中球活性化の指標であるＥＢＯＶ感染マウスにおける顆粒球（好中球）の粒度及び絶対計数の増加を証明している。
【図６】サイトカイン及びケモカインのレベルをＥＢＯＶ感染群及びプラセボ群において定量した。エリトラン治療は、Ｔｈ１関連性ＴＮＦα及びＴｈ２関連性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３）における減少に関連していた。エリトラン治療は、所定のケモカイン（例えば、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ１０）、ＭＩＧ（ＣＸＣＬ９）、ＭＩＰ−１α（ＣＣＬ３）、ＭＩＰ−１β（ＣＣＬ４）、ＭＩＰ−２（ＣＸＣＬ２）、ＲＡＮＴＥＳ（ＣＣＬ５）及びＬＩＦ）の産生の減少にも関連していた。
【図７Ａ】エリトラン治療は、末梢血中の好中球を活性化する。モック、プラセボ及びエリトラン治療マウスにおける好中球集団の比較である。ＣＤ６４に対して陽性であるＣＤ１１ｂ+細胞のパーセンテージ：基本データ（左側）及び定量的データ（右側）である。１群当たり５匹のマウスに基づく平均値±ＳＥ。
【図７Ｂ】エリトラン治療は、末梢血中の好中球を活性化する。モック、プラセボ及びエリトラン治療マウスにおける好中球集団の比較である。ＣＤ６９に対して陽性であるＣＤ１１ｂ+Ｌｙ６Ｇ／Ｌｙ６Ｃ+のパーセンテージ：基本データ（左側）及び定量的データ（右側）である。１群当たり５匹のマウスに基づく平均値±ＳＥ。
【図７Ｃ】エリトラン治療は、末梢血中の好中球を活性化する。モック、プラセボ及びエリトラン治療マウスにおける好中球集団の比較である。ＣＤ１１+Ｌｙ６Ｇ／Ｌｙ６Ｃ+のパーセンテージを総リンパ球数（ＦＳＣ対ＳＳＣに基づく）で割ることによって決定した好中球対全リンパ球数の比率である。１群当たり５匹のマウスに基づく平均値±ＳＥ。
【図７Ｄ】エリトラン治療は、末梢血中の好中球を活性化する。モック、プラセボ及びエリトラン治療マウスにおける好中球集団の比較である。ＣＤ１１+Ｌｙ６Ｇ／Ｌｙ６Ｃ+のパーセンテージをＣＤ３+Ｔリンパ球数で割ることによって決定した好中球対ＣＤ３+Ｔリンパ球数の比率である。１群当たり５匹のマウスに基づく平均値±ＳＥ。
【図７Ｅ】エリトラン治療は、末梢血中の好中球を活性化する。モック、プラセボ及びエリトラン治療マウスにおける好中球集団の比較である。Ｌｙ６Ｇ／Ｌｙ６Ｃ+に対して陽性であるＣＤ１１ｂ+細胞のパーセンテージである。１群当たり５匹のマウスに基づく平均値±ＳＥ。
【図８Ａ】エリトラン治療は、Ｔリンパ球ならびにＴｈ１及びＴｈ１７関連性サイトカインに対して陽性染色する細胞のパーセンテージを減少させる。モック、プラセボ及びエリトラン治療群における活性化の指示マーカーに対して陽性である指示されたＴ細胞集団のパーセンテージ：代表的な基本データ（左側）及び定量的データ（右側）である。ＩＦＮγに対して陽性であるＣＤ３+ＣＤ８+Ｔ細胞。感染後第６日の１群当たり５匹のマウスに基づく平均値±ＳＥ。
【図８Ｂ】エリトラン治療は、Ｔリンパ球ならびにＴｈ１及びＴｈ１７関連性サイトカインに対して陽性染色する細胞のパーセンテージを減少させる。モック、プラセボ及びエリトラン治療群における活性化の指示マーカーに対して陽性である指示されたＴ細胞集団のパーセンテージ：代表的な基本データ（左側）及び定量的データ（右側）である。ＩＦＮγに対して陽性であるＣＤ３+ＣＤ４+Ｔ細胞。感染後第６日の１群当たり５匹のマウスに基づく平均値±ＳＥ。
【図８Ｃ】エリトラン治療は、Ｔリンパ球ならびにＴｈ１及びＴｈ１７関連性サイトカインに対して陽性染色する細胞のパーセンテージを減少させる。モック、プラセボ及びエリトラン治療群における活性化の指示マーカーに対して陽性である指示されたＴ細胞集団のパーセンテージ：代表的な基本データ（左側）及び定量的データ（右側）である。ＩＬ−１７に対して陽性であるＣＤ３+ＣＤ４+Ｔ細胞。感染後第６日の１群当たり５匹のマウスに基づく平均値±ＳＥ。
【図８Ｄ】エリトラン治療は、Ｔリンパ球ならびにＴｈ１及びＴｈ１７関連性サイトカインに対して陽性染色する細胞のパーセンテージを減少させる。モック、プラセボ及びエリトラン治療群における活性化の指示マーカーに対して陽性である指示されたＴ細胞集団のパーセンテージ：代表的な基本データ（左側）及び定量的データ（右側）である。ＩＬ−４に対して陽性であるＣＤ３+ＣＤ４+Ｔ細胞。感染後第６日の１群当たり５匹のマウスに基づく平均値±ＳＥ。
【図８Ｅ】エリトラン治療は、Ｔリンパ球ならびにＴｈ１及びＴｈ１７関連性サイトカインに対して陽性染色する細胞のパーセンテージを減少させる。モック、プラセボ及びエリトラン治療群における活性化の指示マーカーに対して陽性である指示されたＴ細胞集団のパーセンテージ：代表的な基本データ（左側）及び定量的データ（右側）である。ＣＤ６９に対して陽性であるＣＤ４+ＣＤ３+Ｔ細胞。感染後第６日の１群当たり５匹のマウスに基づく平均値±ＳＥ。
【図８Ｆ】エリトラン治療は、Ｔリンパ球ならびにＴｈ１及びＴｈ１７関連性サイトカインに対して陽性染色する細胞のパーセンテージを減少させる。白血球数におけるＣＤ３+Ｔ細胞サブセットの絶対計数である。
【図９Ａ】ＰＢＭＣサブセットのパーセンテージ及びＣＤ８+Ｔ細胞の活性化である。赤血球溶解に続くエボラウイルス（ebola virus）感染後第６日にフローサイトメトリーによって決定された末梢血中のＣＤ１９+Ｂ細胞のパーセンテージである。１群当たり５匹のマウスに基づく平均値±ＳＥ。
【図９Ｂ】ＰＢＭＣサブセットのパーセンテージ及びＣＤ８+Ｔ細胞の活性化である。赤血球溶解に続くエボラウイルス（ebola virus）感染後第６日にフローサイトメトリーによって決定された末梢血中のＣＤ３３５+ＮＫ細胞のパーセンテージである。１群当たり５匹のマウスに基づく平均値±ＳＥ。
【図９Ｃ】ＰＢＭＣサブセットのパーセンテージ及びＣＤ８+Ｔ細胞の活性化である。赤血球溶解に続くエボラウイルス（ebola virus）感染後第６日にフローサイトメトリーによって決定された末梢血中のＣＤ１４+単球のパーセンテージである。１群当たり５匹のマウスに基づく平均値±ＳＥ。
【図９Ｄ】ＰＢＭＣサブセットのパーセンテージ及びＣＤ８+Ｔ細胞の活性化である。エボラウイルス（ebola virus）誘発後第６日にフローサイトメトリーによって決定されたＣＤ６９+（活性化）ＣＤ８+Ｔ細胞のパーセンテージである。１群当たり５匹のマウスに基づく平均値±ＳＥ。
【図１０Ａ】エリトランは、致死的なＭＡＲＶ誘発からマウスを保護する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ｉ．ｐ．経路によって１，０００ＰＦＵのマウス適応ＭＡＲＶにより誘発された。マウスは、ｉ．ｐ．経路によりエリトラン又はプラセボ（ビヒクル）の１０日間の連日注射を受けた。プラセボ又はエリトランを用いて治療されたＭＡＲＶ注射マウスから生成された生存率曲線である。１群当たり５匹のマウスを対象とする２件の独立実験の平均値±ＳＥ。
【図１０Ｂ】エリトランは、致死的なＭＡＲＶ誘発からマウスを保護する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ｉ．ｐ．経路によって１，０００ＰＦＵのマウス適応ＭＡＲＶにより誘発された。マウスは、ｉ．ｐ．経路によりエリトラン又はプラセボ（ビヒクル）の１０日間の連日注射を受けた。割り当てられた臨床的スコアである。１群当たり５匹のマウスを対象とする２件の独立実験の平均値±ＳＥ。
【図１０Ｃ】エリトランは、致死的なＭＡＲＶ誘発からマウスを保護する。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、ｉ．ｐ．経路によって１，０００ＰＦＵのマウス適応ＭＡＲＶにより誘発された。マウスは、ｉ．ｐ．経路によりエリトラン又はプラセボ（ビヒクル）の１０日間の連日注射を受けた。ＭＡＲＶ誘発後の体重変化である。１群当たり５匹のマウスを対象とする２件の独立実験の平均値±ＳＥ。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
先天性免疫系は、侵入する微生物に対する最初の防衛線である。免疫コンピテント細胞、例えばマクロファージ、樹状細胞、好中球及び内皮細胞は、グラム陽性菌及びグラム陰性菌、ウイルス、真菌及びマイコプラズマ（Mycoplasma）などの様々な病原体の表面上で病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識する。トール様受容体（ＴＬＲ）は、保存されたＰＡＭＰによって規定された控え目な刺激に応答して細胞の先天性免疫シグナル伝達経路を始動させる、緊密に関連する受容体の１ファミリーである。現在まで、１０種のヒトＴＬＲが同定されている。ＴＬＲ４は、典型的には、グラム陰性菌による感染中に生成されたリポ多糖（ＬＰＳ）に応答して先天性免疫シグナル伝達を活性化することに関連している。しかし、以前には、ＴＬＲ４欠損性マウスがマウス適応インフルエンザ（influenza）菌株Ａ／ＰＲ／８／３４による感染に強度に耐性であることが証明されている。Nhu et al., Mucosal Immunology 3 (1): 29-39, (2010)。ＴＬＲ４変異マウスは、酸誘導性急性肺傷害に対する自然抵抗性を示すことも証明されている。Imai et al., Cell 133: 235-249 (2008)。しかし、感染した対象におけるＴＬＲ４の阻害がＥＢＯＶ感染後に強力な治療作用を提供できるかどうかを指摘した試験はない。実際に、細胞系での実験を含むのは、ＥＢＯＶとＴＬＲ４との間の相互作用を報告している試験のみである。例えば、以前に、ＥＢＯＶ糖タンパク質（ＧＰ）が、ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ４／ＭＤ２細胞にＬＰＳによって誘導されたレベルに類似するレベルへのＩＬ−６、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−β  ＲＮＡの発現を誘導することが報告された。Okumura et al., J. Virol. 84 (1): 27-33 (2010)。さらに、Okumuraは、ＥＢＯＶ  ＧＰが共トランスフェクトされた２９３Ｔ細胞由来のＴＬＲ４と共沈降することを報告したが、これは、ＥＢＯＶ  ＧＰがＴＬＲ４と物理的に相互作用することを確証している。Escudero-Perezは、感染した細胞から剥離したＧＰを調査することによってＥＢＯＶ  ＧＰ／ＴＬＲ４関係をさらに特徴付けた。Escudero-Perez et al., PLoS 10 (11): e1004509 (2014)。ＥＢＯＶに感染した患者の血液中で検出された剥離した多量のＧＰに注目して、Escudero-Perezは、マウス抗ＴＲＬ４抗体（ＨＴＡ１２５）を用いて樹状細胞及びマクロファージ細胞を前治療し、次にそれらの同一細胞を剥離したＧＰと共にインキュベートした。剥離したＧＰの樹状細胞及びマクロファージ細胞の両方への結合は、抗ＴＬＲ４抗体を用いた細胞の治療後には減少したため、これは、樹状細胞及びマクロファージ細胞への剥離したＧＰの結合がＴＬＲ４との相互作用を含む可能性が高いことを示唆している。抗ＴＬＲ４抗体による細胞の前治療もＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−１β及びＩＬ−１ＲＡの遊離を相当に大きく減少させた。
【００２０】
エリトラン（Ｅ５５６４、化合物１２８７、ＳＧＥＡ又は（α−Ｄ−グルコピラノース、３−Ｏ−デシル−２−デオキシ−６−Ｏ−［２−デオキシ−３−Ｏ−［（３Ｒ）−３−メトキシデシル）−６−Ｏ−メチル−２−［［（−１１Ｚ）−１−オキソ−１１−オクタデセニル）アミノ］−４−Ｏ−ホスホノ−β−Ｄ−グルコピラノシル］−２−［（１，３−ジオキソテトラデシル）アミノ］−１−（リン酸二水素））は、ＴＬＲ４の効果的な拮抗薬であることが以前に証明されている。この薬物は、米国特許第５，６８１，８２４号に化合物１として記載されており、この特許文献は、化合物１の説明及びそれを製造する方法について参照により本明細書に組み込まれる。エリトランは、式（Ｉ）：
【化１】
2019529355.tif 000003
の構造を有しており、多数の薬剤学的に許容される塩の１つとして提供され得る。式（Ｉ）の化合物は、米国特許第６，９０６，０４２号に記載されたミセルの形態で調製され得、この特許文献は、そのようなミセルの説明及びそれを調製するための方法に関して全体として参照により本明細書に組み込まれる。好ましい実施形態では、エリトランは、四ナトリウム塩として提供される。
【００２１】
本発明は、ＥＢＯＶに感染した患者を治療するための方法であって、前記治療を必要とする感染患者に治療有効量のエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与することを含む方法に関する。別の実施形態では、本発明は、動物におけるＥＢＯＶ感染を、その動物にＴＬＲ４の阻害剤を投与することによって治療する方法を提供する。本発明の１つの実施形態は、フィロウイルス（filovirus）に感染した患者を治療するための方法であって、前記治療を必要とする感染患者に、有効成分及び医薬上許容される担体を含む組成物を投与することを含み、有効成分は、エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を含む、方法に関する。
【００２２】
エリトラン治療に続く、フィロウイルス（filovirus）感染に応答した炎症メディエーターの包括的遊離の全身性減少は、免疫系の過剰反応に関連する疾患の病原性特徴を軽減することができる。これに関連して、近年の研究は、炎症メディエーターの中等度の減少が細菌性敗血症における生存率と相関することを示した。Surbatovic et.al.,Sci Rep 5: 11355 (2015)。Falasca et al., Cell Death and Diff. 22: 1250-1259 (2015)及びBaize et al., Clin Exp Immunol 128: 163-8 (2002)では、ＥＢＯＶ感染における致死率は、高レベルの前炎症性サイトカインＩＬ−６、ケモカイン及び抗炎症性サイトカインＩＬ−１０と関連付けられている。エリトランは、ケモカイン産生を阻害することに加えて、これらの研究においてＩＬ−６及びＩＬ−１０の両方を減少させた（図１２Ｃ及び１２Ｄ）。
【００２３】
本発明の方法と共に使用するために好適な化合物には、ＴＬＲ４の阻害剤が含まれる。本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法は、ＴＬＲ４シグナル伝達を阻害するためにエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を使用して実施される。エリトランは、ＴＬＲ４を通したＬＰＳシグナル伝達を妨害する合成脂質Ａアナログである。エリトラン及びその薬剤学的に許容される塩は、ＬＰＳを競合的に阻害してＭＤ−２の疎水性ポケットに結合する。結合すると、エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩は、ＴＬＲ４二量体化及び細胞内シグナル伝達を防止する。
【００２４】
本発明の１つの実施形態では、エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を用いた治療は、エボラ（ebola）誘導性病状を減少させる。ＥＢＯＶ感染に関連する症状には、特に発熱、頭痛、咽頭炎、下痢、嘔吐、筋肉痛、関節痛、皮膚発疹、内出血もしくは外出血又はそれらの組合わせが含まれる。さらに、本明細書に開示した本発明による、感染後の数日間においてエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を用いた治療はまた、ＥＢＯＶ感染による全身性作用の低下をもたらす可能性がある。本発明の１つの実施形態では、肝酵素レベルにおけるＥＢＯＶ誘導性増加は、エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩による治療によって減少する。
【００２５】
ＥＢＯＶ感染は、結果として多数のサイトカインの発現を生じさせる。ウイルス感染によって誘発された過剰な炎症は、重大な病状を生じさせることがある。本発明の別の実施形態では、ＴＬＲ４は、ＥＢＯＶ感染対象におけるＥＢＯＶ誘導性サイトカインＲＮＡ発現を減少させるために拮抗される。本発明の１つの実施形態では、ＴＬＲ４拮抗薬であるエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩は、感染した対象におけるＥＢＯＶ誘導性サイトカインＲＮＡ発現の産生における減少を生じさせることができる。何らかの特定の理論に拘束されることを望むことなく、ＥＢＯＶは、細胞に感染し、炎症性サイトカインの産生を駆動する細胞シグナル伝達経路を活性化すると考えられる。
【００２６】
本発明によると、ＴＬＲ４経路は、ＥＢＯＶに感染した対象における炎症性サイトカインの産生を減少させるためにエリトランによる標的とすることができる。本発明の１つの実施形態では、エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３又はその組合わせのＥＢＯＶ誘導性発現を減少させるために使用される。本発明の方法は、ＩＰ−１０、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＬＩＦ又はその組合わせのＴＬＲ４媒介性発現を減少させるために使用することもできる。さらに、本発明の方法は、Ｇ−ＣＳＦ、ＫＣ又はその組合わせにおける増加を引き起こすために使用することができる。本発明の方法は、エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与することにより、ＥＢＯＶ感染患者における顆粒球及びＴリンパ球を減少させるために使用することもできる。さらに別の実施形態では、方法は、ＥＢＯＶ感染患者におけるＣＤ３+Ｔリンパ球の減少を引き起こすことができる。
【００２７】
本発明のさらに別の実施形態では、エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩の作用は、未治療対象と比較して感染患者におけるＥＢＯＶ複製の減少を生じさせる。任意の特定の理論に拘束されることを望むことなく、エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩がＴＬＲ４シグナル伝達上に及ぼす阻害作用は、ウイルス増殖にあまり好適ではない細胞環境を生成すると考えられる。したがって、本発明の１つの実施形態は、ＥＢＯＶ感染患者におけるウイルス力価の減少を引き起こすためにエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を投与する方法に関する。
【００２８】
本発明の方法は、任意の菌株のＥＢＯＶ感染を治療するために使用され得る。本発明の１つの実施形態によると、本方法は、ブンディブギョエボラウイルス（Bundibugyo ebolavirus）菌株に対する治療に関する。本発明の１つの実施形態によると、本方法は、レストンエボラウイルス（Reston ebolavirus）菌株に対する治療に関する。本発明の１つの実施形態によると、本方法は、スーダンエボラウイルス（Sudan ebolavirus）菌株に対する治療に関する。本発明の１つの実施形態によると、本方法は、タイフォレストエボラウイルス（Tai Forest ebolavirus）菌株に対する治療に関する。本発明の１つの実施形態によると、本方法は、ザイールエボラウイルス（Zaire ebolavirus）菌株に対する治療に関する。さらに、本発明の方法は、他のフィロウイルス（filoviruses）又はクエバウイルス（cuevavirus）及びマールブルクウイルス（Marburg virus）を含む他のフィロウイルス（filovirus）科のメンバーを治療するためにも使用され得る。
【００２９】
本発明の１つの実施形態によると、本発明の方法は、対象の試験片中のＥＢＯＶ感染の存在を検出することを含む。多数の様々な検査室診断試験は、直接抗原検出試験、細胞培養中のウイルス単離、リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｒＲＴ−ＰＣＲ）又はその他によるＥＢＯＶ特異的ＲＮＡ（例えば、核タンパク質（ＮＰ）ＲＮＡ）の検出を含め、試験片中のＥＢＯＶの存在を検出するために使用され得る。
【００３０】
本発明の方法によると、治療は、ＥＢＯＶによる感染後又は臨床症状の発生から約２日後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、約７日後、約１．５週間後、約２週間後、約２．５週間後又は約３週間後までに開始することができる。本発明のより好ましい実施形態によると、治療は、ＥＢＯＶによる感染の約２日後までに開始することができる。本発明は、ウイルス感染に罹患している対象又はより詳細にはＥＢＯＶ感染に罹患している対象を治療する方法に関する。
【００３１】
本発明によるエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩の投与は、典型的には、数日間の経過にわたって実施される。本発明の方法の有効性は、用量依存法で増加することが証明されており、高用量であるほど感染に対してより効果的な治療を提供する。単回投与は、１μｇからおよそ２４０ｍｇで投与され得る。１つの実施形態では、単回投与は、１μｇからおよそ５０ｍｇで投与され得る。別の実施形態では、単回投与は、１μｇからおよそ７０ｍｇで投与され得る。さらに別の実施形態では、単回投与は、１μｇからおよそ９０ｍｇで投与され得る。さらに別の実施形態では、単回投与は、１μｇからおよそ１２５ｍｇで投与され得る。さらに別の実施形態では、単回投与は、１μｇからおよそ１５０ｍｇで投与され得る。さらに別の実施形態では、単回投与は、１μｇからおよそ２００ｍｇで投与され得る。その適切な量は、感染対象の特徴及び好ましい投与経路に従って当業者が決定することができる。
【００３２】
本発明の方法では、エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩は、１２〜１００時間、例えば６０〜８０又は７２時間の期間にわたって静脈内注射によって患者に投与され得る。注射用量速度は、例えば、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）／時、例えば０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇ／時又は０．０３〜０．１ｍｇ／ｋｇ／時で変動し得る。エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩の注射には、必要に応じて、０．００１〜０．５ｍｇ／ｋｇ（体重）の用量で投与できる、エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩のボーラス注射が先行し得る。患者に投与されるエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩の総量は、例えば、６０〜８０時間の期間にわたる注射による５０〜６００ｍｇ、例えば１５０〜５００ｍｇの薬剤であり得る。
【００３３】
別の実施形態では、エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩は、１〜２０ｍｇの総１日量に対して１〜１０時間の期間にわたって静脈内注射によって患者に投与され得る。例えば、患者に投与されるエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩の総量は、５時間までの期間にわたって静脈内注射によって投与される１日量で約１から約１０ｍｇであり得る。１つの実施形態では、患者に投与されるエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩の総量は、約１時間の期間にわたって静脈内注射によって投与される１日量で５ｍｇである。１つの実施形態では、患者に投与されるエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩の総量は、約４時間の期間にわたって静脈内注射によって投与される１日量で５ｍｇである。
【００３４】
投与の量及び方法は、治療の経過中に変動する場合がある。例えば、患者は、最初に感染の初期段階中に静脈内注射によってエリトラン又はその薬剤学的に許容される塩を摂取し、その後に感染の約１４日後までを含む一連の日数にわたり投与の吸入方法が続けられる。
【００３５】
当業者であれば、適切な投与頻度をさらに決定することができる。例えば、薬物は、１日当たり１〜４回、好ましくは１日当たり２〜４回投与され得る。投与は、選択された期間にわたって連続的であり得るか、または一連の間隔をあけた投与であり得る。薬物の投与は、感染の症状が消失するまで継続され得る。一部の場合、数日間にわたり投与を継続するのが好ましい場合がある。１つの実施形態では、投与は、感染の臨床症状が消失した後に数日間継続され得る。特定の用量範囲及び医薬製剤は、投与方法及び治療される対象の特定の物理的特徴に従って変動し得ると理解すべきである。
【００３６】
請求項の主題をより明確及び簡潔に記載するために、下記の定義は、本明細書で使用する用語の意味に関する指針を提供することが意図されている。
【００３７】
本明細書で使用する冠詞「１つの（a）」及び「１つの（an）」は、他に特に指示されない限り、「１つ以上」又は「少なくとも１つ」を意味する。すなわち、不定冠詞「１つの（a）」及び「１つの（an）」による本発明の任意の要素についての言及は、その要素の１つ以上が存在する可能性を排除しない。
【００３８】
数値及び範囲、例えば組成物中に存在する式（Ｉ）の化合物の量は、本発明の様々な実施形態とまとめて列挙される。列挙した数値及び範囲間に含まれる全ての数値及び範囲は、他の点で明示的に記載されない限り、本発明により含まれると意図されると理解すべきである。
【００３９】
用語の化合物の「有効量」は、所望の作用を提供するが、毒性を伴わないか又は許容できる毒性を伴う化合物の十分な量を意味する。この量は、対象の種、年齢及び健康状態、治療されている疾患の重症度、使用される特定の化合物、その投与方式などに依存して対象毎に変動する可能性がある。当業者であれば、適切な有効量を決定することができる。
【００４０】
本明細書で使用する「治療」、「治療する」又は「治療すること」は、対象又は対象由来の単離組織もしくは細胞系への治療薬の適用又は投与であると定義される。対象は、一般的には、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状又は疾患もしくは障害（例えば、ＥＢＯＶ）に向かう素因を有する。詳細には、本明細書で使用するように、治療は、依然として感染していない対象とは対照的に、ウイルス、例えばＥＢＯＶに既に感染している対象に向けられる。治療の目的は、一般に、そのような疾患、障害又は症状を治癒させるか、治すか、軽減するか、緩和するか、矯正するか、改善するか、又は好転させることである。本明細書で使用する「治療された」は、治癒されるか、治されるか、軽減されるか、緩和されるか、矯正されるか、改善されるか、又は好転される疾患又は障害に関する。
【００４１】
本発明の方法と共に使用するために好適な化合物は、治療上有効な量で投与される。用語「治療有効量」は、指示された生物学的又は医学的反応を引き出す活性化合物又は医薬品の量を示すために使用される。この反応は、研究者、獣医師、医師又は他の臨床医によって探求される組織、系（ヒトを含む動物）において発生する可能性がある。
【００４２】
本明細書で使用する用語「薬剤学的に許容される塩」は、信頼できる医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わずにヒト及び下等動物の組織と接触させて使用するために好適であり、かつ妥当なベネフィット／リスク比と釣り合っている塩を意味する。薬剤学的に許容される塩は、当技術分野において周知である。例えば、S. M. Berge, et al.は、J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19 (1977)で薬剤学的に許容される塩について詳細に記載している。塩は、その中で教示された化合物の最終的単離及び精製中にインサイチューで調製することができ、または下記で概して記載するように遊離塩基もしくは遊離酸官能基を好適な試薬と反応させることによって分離することができる。例えば、遊離塩基官能基は、好適な酸と反応させることができる。さらに、その中で教示された化合物が酸性成分を有する場合、その好適な薬剤学的に許容される塩は、例えば、アルカリ金属塩、例えばナトリウム又はカリウム塩；及びアルカリ土類金属塩、例えばカルシウム又はマグネシウム塩などの金属塩を含むことができる。式Ｉの範囲内に含まれる化合物のナトリウム塩は、例えば、米国特許出願公開第１２／５１６，０８２号及び米国特許出願公開第２００８／０２２７９９１号に記載されている。医薬上許容される非毒性酸付加塩の例は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸及び過塩素酸又は有機酸、例えば酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸などを用いて、または例えばイオン交換などの当技術分野において使用される他の方法を使用することによって形成される塩である。他の薬剤学的に許容される塩には、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモン酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれる。代表的なアルカリ塩又はアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが含まれる。別の薬剤学的に許容される塩には、適切な場合、例えばハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩及びアリールスルホン酸塩などの対イオンを使用して形成された非毒性のアンモニウム、第４級アンモニウム、及びアミンカチオンが含まれる。一部の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、ナトリウム塩、例���ば四ナトリウム塩である。
【００４３】
用語「対象」は、治療、観察又は実験の目的である動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。哺乳動物は、マウス、ラット、ハムスター、アレチネズミ、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、キリン、広鼻類のサル、霊長類、例えばサル、チンパンジー及び類人猿からなる群から選択され得る。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
【００４４】
本明細書で使用する用語「拮抗薬」及び「阻害剤」は、「天然の」又は「自然の」分子又は化合物の作用を阻害する分子又は化合物を意味する。
【００４５】
一部の実施形態では、本明細書に記載した化合物は、全身性で投与される。本明細書で使用する「全身性投与」は、それによって本明細書に記載した化合物を全身性で利用可能にできる任意の手段を意味する。一部の実施形態では、全身性投与は、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、冠動脈内投与、動脈内（例えば、頸動脈内への）投与、皮内投与、皮下投与、経皮送達、気管内投与、皮下投与、関節内投与、静脈内投与、吸入（例えば、エーロゾル）、脳内、鼻腔内、神経内、口腔内、眼内、肺内投与、カテーテルの含浸、坐剤及び組織内への直接注射によるもの、または全身性で吸収される局所性もしくは粘膜投与を含む。粘膜投与には、例えば、吸入、点鼻薬、点眼薬などによる呼吸組織への投与；経肛門又は経膣経路、例えば坐剤によってなどの投与が含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載した化合物は、静脈内投与される。他の実施形態では、本明細書に記載した化合物は、経口投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載した化合物は、週に１から５回静脈内投与され得る。一部の他の実施形態では、本明細書に記載した化合物は、経口により１日１回以上（例えば、１日１回、１日２回又は１日３回）投与され得る。さらに別の実施形態では、本明細書に記載した化合物は、１日に１回以上腹腔内投与され得る。さらに別の実施形態では、治療レジメンは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９又は約１０日間継続し得る。
【００４６】
本発明と共に使用するために好適な医薬製剤は、賦形剤、保存料、医薬上許容される担体及びそれらの組合わせを含むこともでき、用語「医薬上許容される担体又は賦形剤」は、一般的に安全、非毒性であり、決して生物学的にも他の点でも有害ではない医薬組成物を調製する際に有用である担体又は賦形剤を意味し、獣医学的使用及びヒトの製薬学的使用のために許容される担体又は賦形剤を含む。本明細書及び特許請求の範囲において使用する「医薬上許容される担体又は賦形剤」には、１種及び２種以上のそのような担体又は賦形剤の両方が含まれる。
【００４７】
好適な賦形剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカントガム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、食塩液、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリアクリル酸、例えばCarbopolが挙げられるが、それらに限定されない。組成物は、追加して、潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油；湿潤剤；乳化剤；懸濁化剤；保存料、例えばメチル−、エチル−及びプロピル−ヒドロキシ−安息香酸塩；ｐＨ調整剤、例えば無機及び有機の酸及び塩基；甘味剤；ならびに矯味剤を含むことができる。
【００４８】
本発明の方法は、他の治療レジメンと組み合わせて使用することもできる。例えば、本発明の１つの実施形態は、エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩が対症療法、例えば再水和と組み合わせて使用される組合わせ療法に関する。さらに、本発明の１つの実施形態は、エリトラン又はその薬剤学的に許容される塩が治療有効量の抗ウイルス化合物と組み合わせて使用される組合わせ療法に関する。
【実施例】
【００４９】
実施例１
動物の誘発及び治療
ＥＢＯＶを用いた全ての作業は、Galveston National LaboratoryのBSL-4施設で実施した。フローサイトメトリーは、University of Texas Medical Branch標準手術手順に従って４８時間にわたりＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒドを用いて不活性化し、University of Texas Medical Branch Flow Cytometry Core Facilityで利用できるLSRII Fortessaフローサイトメーター（BD Biosciences）を用いた分析のためにＢＳＬ−４から除去した後に実施した。ＥＢＯＶ感染マウスから血清試料を除去するために、試料は、University of Texas Medical Branch標準手術手順プロトコールに従って５Ｍｒａｄの線量を用いてγ線照射した。スタッフは、ＥＢＯＶを用いた作業についての米国政府の許可を有しており、適切な訓練を積んでいた。
【００５０】
マウスのＥＢＯＶ感染は、University of Texas Medical Branch Institutional Animal Care and Use Committeeに従ってGalveston National LaboratoryのABSL-4封じ込め施設において実施した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスであるＴＬＲ４-/-及びＴＮＦＲ１／２-/-マウスは、Jackson Laboratoriesから購入した。マウス（８〜１０週齢）は、腹腔内注射によって１０００ｐｆｕのマウス適応ＥＢＯＶ菌株又はマウス適応マールブルク（Marbug）菌株Mayinga Ci67（ＰＭＩＤ２１２８９１２２）により感染させた。全ウイルスストックは、ウイルス力価を検証するために誘発時点に逆滴定した。エリトランは、製造業者によって記載されたように調製し、２．３３ｍｇ／ｍＬの最終濃度へ希釈した（Eisai）。マウスは、１００μＬのプラセボ（ビヒクル）又はエリトランからなる連日投与を２３３μｇ／日の有効量で受容した。マウスは、誘発後第０日から第１４日にわたり１日２回監視し、その後、第１５日から第２８日の試験終了時まで１日１回の監視を継続した。疾患は、下記のパラメーター：呼吸困難（可能性のあるスコア０〜５）、横臥（０〜９）、無反応（０〜５）及び出血／大出血（０〜５）を使用してスコア付けした。全マウスは、ＥＢＯＶ誘発後第２８日に安楽死させた。
【００５１】
ウイルス血症の分析
全ＲＮＡは、製造業者（Qiagen）のプロトコールによってQIAampウイルスＲＮＡミニキットを使用してＥＢＯＶ誘発後第６日に採取した血清試料から単離した。核タンパク質（ＮＰ）遺伝子の絶対的定量は、プローブ用のワンステップＲＴ−ｄｄＰＣＲアドバンストキット（Biorad）を使用して、ＥＢＯＶゲノムＲＮＡ、GenBankアクセッション番号第ＡＦ０８６８３３のヌクレオチド２，０９５〜２．１５３に対応するＮＰ遺伝子断片に対して特異的であるプローブを用いてフォワードプライマーＧＣＣＡＣＴＣＡＣＧＧＡＣＡＡＴＧＡＣＡ、リバースプライマーＧＣＡＴＧＣＧＡＧＧＧＣＴＧＧＴＴ及びプローブＦＡＭ−ＡＧＡＡＡＴＧＡＡＣＣＣＴＣＣＧＧＣＴ−ＭＢＧを使用して実施した。手短には、５０ｐｇのＲＮＡを、各試料について、５μＬのスーパーミックス、２μＬの逆転写酵素、１μＬの３００ｍＭのＤＴＴ及び１μＬの２０×のNP custom Taqmanアッセイ（Life Technologies）に添加した。ｄｄＰＣＲ反応混合物を、ＱＸ２００液滴生成装置（BioRad）上で液滴を作製するためにカートリッジ上に装填した。液滴を９６ウエルＰＣＲプレート（Eppendorf、Hauppauge、NY）上に移し、９６ディープウエル反応モジュールを備えるＣ１０００サーマルサイクラー（BioRad）上で増幅させた。サイクル条件は、４２℃で６０分間、９５℃で１０分間であり、その後、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間の３９サイクルが続き、さらに９８℃で１０分間の最終酵素非活性化工程が続いた。最後に、ＰＣＲプレートは、各試料中の陽性及び陰性液滴の数を定量する液滴リーダー上に装填した。各試料中の最終濃度を得るために、QuantaSoftソフトウエアを使用して分析を実施した。
【００５２】
フローサイトメトリーによる末梢血中の好中球及びＴ細胞の分析
赤血球は、製造業者（Sigma Aldrich）によって推奨された溶解溶菌バッファーを使用して溶解させた。細胞は、４００×ｇでペレット化し、２％の胎児ウシ血清を含有するリン酸緩衝食塩液中で洗浄し、次の抗体：パネル１、ＣＤ３−ＢＵＶ．３９５（１４５−２Ｃ１１、BD Biosciences）、ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５（ＲＭ４−５、BD Biosciences）、ＣＤ８−ＢＶＬＴ．４２１（５３−６．７、BD Biosciences）、ＩＦＮγ−Ａｌｅｘａ．４８８（ＸＭＧ１．２、BD Biosciences）、ＩＬ１７Ａ−ＰＥ（ＴＣ１１−１８Ｈ１０．１、BD Biosciences）、ＩＬ４−ＡＰＣ（１１Ｂ１１、BD Biosciences）、パネル２、ＣＤ１１ｂ−Ａｌｅｘａ．４８８（Ｍｌ／７０、BioLegend）、Ｌｙ６Ｇ／Ｌｙ６Ｃ．Ａｌｅｘａ．６４７（ＲＢ６−８Ｃ５、BioLegend）、ＣＤ６４．ＢＶＬＴ．４２１（Ｘ５４−５／７．１、BioLegend）、ＣＤ６９−ＰＥ（Ｈ１．２Ｆ３、BioLegend）、ＣＤ３−ＢＵＶ．３９５、ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ．Ｃｙ５．５、パネル３、ＣＤ１−ＡＰＣ（１Ｄ３、BD Biosciences）、ＣＤ１４−ＢＵＶ．７３７（ｒｍＣ５−３、BD Biosciences）及びＣＤ３３５−ＦＩＴＣ（２９Ａ１．４、BD Biosciences）を用いて染色した。絶対計数を決定するために、製造業者の取扱説明書に従ってCountBright絶対計数ビーズ（ThermoFisher Scientific）を使用した。データは、LSRII Fortessaフローサイトメーター（BD Biosciences）を使用して収集し、FlowJoを用いて分析した。
【００５３】
末梢血中のサイトカイン、ケモカイン及びフリーラジカルの分析
感染後第６日に収集した血清試料は、照射し、ＢＳＬ−４から取り出し、Eve TechnologiesによるMultiplex-32電磁ビーズをベースとするアッセイ（Millipore）を使用して分析した。全フリーラジカルは、製造業者によって提供されたプロトコールを用いて、OxiSelectインビトロＲＯＳ／ＲＮＳアッセイキット（Cell BioLabs）を使用して測定した。
【００５４】
統計分析
分析は、Graphpad Prismソフトウエア（バージョン６．０４）を使用して実施した。生存率曲線の比較は、ロングランク（Long-rank）（Mantel-Cox）検定を使用して実施した。対応のあるｔ検定（片側）を使用して、群間の血漿中のウイルス血症、サイトカイン、ケモカイン及びフリーラジカルのレベルならびに免疫細胞のパーセンテージの差を比較した。
【００５５】
実施例２
７〜８週齢の年齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、通常、誘発の７日間以内における１００％死亡率を生じさせる、第０日に腹腔内注射によって１０００ｐｆｕのマウス適応ＥＢＯＶを用いて感染させた。マウスは、次に、第０日に開始する２３３μｇのエリトラン（Ｅ５５６４）又はビヒクルを投与する腹腔内注射からなる１０日間の連続する連日投与を受容した。各マウスを計量し、疾患進行に関連する症状について毎日臨床的にスコア付けした。疾患進行の徴候が観察されたら、マウスを１日２回監視した。任意の個別カテゴリーにおける８又は３の総スコアの受けたマウスは、施設のプロトコールに従って即時に安楽死させた。プラセボを受容していたマウスの１００％は、誘発後第７日までに死ぬか、又は安楽死のための基準を満たした（図１Ｂ）。１日１回のエリトラン治療を受容したマウスのうち、試験の終了時である誘発後第２８日まで７０％が生存した（ｐ＜０．０００１）。これらの結果に基づいて、ＴＬＲ４-/-マウスは、致死的ＥＢＯＶ誘発に対して生存するであろうと結論付けられた。しかし、ＴＬＲ４-/-マウスは、野生型マウスと同様にＥＢＯＶに対して感受性のままであった。図１Ｃに示したように、臨床スコアは、疾患の症候性段階から始まる、エリトラン治療マウスと比較して増加したスコアを示しているプラセボを受容しているマウスを用いた生存率曲線と平行している（第６日）。体重減少は、プラセボ群及びエリトラン治療群両方のマウスにおいて観察された。しかし、エリトラン治療マウスは、第８日後に観察される臨床スコアにおける全体的改善を伴う回復期間後に正常体重に戻った（図１Ｄ）。ウイルス血症の定量的ＲＴ−ＰＣＲに基づく分析は、エリトラン治療がウイルス血症を２対数（１ｍＬ当たり１０7〜１０5ゲノム等量）低下させることを証明した（図１Ｅ）。
【００５６】
ＰＢＭＣのフローサイトメトリーに基づく分析は、ＥＢＯＶ感染マウスの群と未感染マウス群との両方に由来するＰＢＭＣ間に衝撃的な差があることを明らかにした（図２Ａ）。顆粒球に関連する粒度における明確な増加は、ＦＳＣ×ＳＳＣ分析後の証拠であった（引き続いての確証染色後のプロット上の好中球として指示される）。これらの観察所見は、好中球の活性化と関連すると決定された。エリトラン治療が、観察される粒度及び活性化の類似の増加にもかかわらず、絶対計数に関して好中球集団の拡張を遮断した（図２Ｂ）。顆粒球は、プラセボ群ではモック試料中の細胞２，０７０個／μＬから細胞９，４８５個／μＬへ増加したが（ｐ＜０．０１３）、他方では、エリトラン治療マウス（ｎ．ｓ．）では細胞２，７８６個／μＬへの限定された増加が観察された。ゲート顆粒球サブセットの詳細な分析は、この集団の大多数が二重ＣＤ１１ｂ+Ｌｙ６Ｇ／Ｌｙｃ６Ｃ+好中球であり、プラセボ群及びエリトラン群において観察された好中球のパーセンテージに差がないことを明らかにした（図７Ｅ）。エリトランを用いた治療は、顆粒球数の減少にもかかわらず、活性化マーカーＣＤ６４（図７Ａ）及びＣＤ６９（図７Ｂ）を発現する好中球のパーセンテージを有意に増加させた。ＣＤ１１ｂ+Ｌｙ６Ｇ／Ｌｙ６Ｃ+好中球対全リンパ球の比率は、モック感染マウスでの０．１９からプラセボ群の１．３９及びエリトラン治療マウスでの２．１５へ増加した（図７Ｃ）。同様に、ＣＤ１１ｂ+Ｌｙ６Ｇ／Ｌｙ６Ｃ+好中球対ＣＤ３+Ｔリンパ球の比率は、モック感染マウスでの１．４１からプラセボ群の５．２６及びエリトラン治療マウスでの１１．０５へ増加した（図７Ｄ）。これらをまとめると、これらの観察所見は、エリトランによる治療が顆粒球減少症を減少させ、より高いパーセンテージの活性化ＣＤ１１ｂ+Ｌｙ６Ｇ／Ｌｙ６Ｃ+好中球を生じさせることを示す。
【００５７】
エリトラン治療マウス中でのＣＤ３+Ｔ細胞対好中球の比率減少に基づいて、Ｔリンパ球サブセットＣＤ３+、ＣＤ３+ＣＤ４+及びＣＤ３+ＣＤ８+Ｔ細胞について試験した。ＥＢＯＶによる感染は、全てのこれらの集団の減少を生じさせ、これは、ＥＶＤのヒト及び動物モデルの両方においてＥＢＯＶ感染症の顕著な特徴であるリンパ球減少症と一致している（図２Ｃ）。予想外にも、エリトランによる治療は、第６日に分析されたように、３種のリンパ球集団全部の絶対計数をさらに減少させた。ゲートＣＤ８+及びＣＤ４+Ｔ細胞の相対活性化状態は、Ｔｈ関連サイトカインを分泌するサブセット及び活性化のマーカーを発現するサブセットを分析することによって試験した。ＥＢＯＶ感染は、ＩＦＮγに対して陽性であるＣＤ８+及びＣＤ４+Ｔ細胞のパーセンテージをそれぞれ４．１倍（図８Ａ）及び３．７倍（図８Ｂ）増加させた。感染は、ＩＬ−１７Ａに対して陽性であるＣＤ４+Ｔ細胞のパーセンテージを同様に３．０倍増加させたが（図８Ｃ）、ＩＬ−４に対して陽性であるＣＤ４+Ｔ細胞（図８Ｄ）又は活性化マーカーＣＤ６９（図８Ｅ）のパーセンテージを変化させなかった。これらのデータは、ＥＢＯＶによるマウスの感染後のＴｈ１／Ｔｈ１７タイプの反応の誘導を証明している。エリトランによる治療は、ＩＦＮγ分泌性ＣＤ８+（図８Ａ）及びＣＤ４+Ｔ細胞（図８Ｂ）ならびにＩＬ−１７Ａ分泌性ＣＤ４+Ｔ細胞のレベルを劇的に減少させ、これらは、ほぼモック感染マウス（図８Ｃ）におけるレベルに達した。他方、エリトランによる治療は、ＩＬ−４に対して陽性であるＣＤ４+Ｔ細胞を３．８倍増加させ（図８Ｄ）、ＣＤ６９に対して陽性であるＣＤ４+Ｔ細胞のパーセンテージを２．８倍増加させたが（図８Ｅ）、ＣＤ８+Ｔ細胞のパーセンテージを増加させなかった（図９Ｄ）。Ｂ細胞、Ｎ細胞及び単球の分析は、これらの集団にエリトランが作用を全く及ぼさないことを証明した（図９Ａ〜Ｃ）。これらのデータは、エリトランによる治療がＴｈ１及びＴｈ１７反応を強力に鈍化させ、Ｔｈ２に向かって反応をシフトさせることを示唆している。
【００５８】
エリトランがＴｈ関連性及び包括的免疫学的反応に及ぼす作用を詳細に評価するため、感染後第６日に採取した血清試料を、multiplexビーズをベースとするアッセイを使用してサイトカイン／ケモカインレベルについてアッセイした。図３Ａ及び図６に示したように、プラセボ群とエリトラン治療マウスとの間で特徴的なパターンが観察された。詳細には、ＥＢＯＶ感染は、モック感染マウスと比較してプラセボ群及びエリトラン治療群の両方でアッセイした大多数の炎症マーカーの増加を生じさせた。しかし、エリトランによる治療は、数種のサイトカインのレベルを減少させた。他方、ＴＮＦαは、減少した唯一のＴｈ１関連サイトカインであり、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３を含む多数のＴｈ２関連性サイトカインは、プラセボを受容していたマウスと比較してエリトラン治療マウスにおいて減少された。ＴＮＦαにおける減少は、ＴＮＦαがＴＬＲ４シグナル伝達経路の活性化に関連する中心エフェクター分子であるため、一部にはエリトランの直接的阻害作用に起因する可能性がある。エリトラン治療マウスにおいて増加した顕著なサイトカインは、Ｇ−ＣＳＦ及びＭ−ＣＳＦのみであった。炎症反応におけるＴＮＦαの多面発現性の役割に起因して、ＥＢＯＶ感染に対するＴＮＦＲ１Ｒ２-/-マウスの感受性を評価した。野生型マウスとＴＮＦＲ１Ｒ２-/-マウスとの間で疾患及び生存率における差は観察されなかった。ＴＮＦαの過剰量又は遅延発現は、この結果と一致して疾患の原因に寄与する可能性があるが、ＴＮＦαは、免疫反応の調節において中心的役割も果たす。
【００５９】
以前の分析において観察された炎症反応の全体的下方調節と一致して、ケモカイン産生における広範な減少が検出された。ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−２、ＭＩＧ及びＩＰ−１０は、エリトラン治療マウスにおいて全部が有意に減少した。しかし、エリトラン治療は、ＫＣに対して１０．０倍増加したマクロファージ、上皮細胞及び活性化好中球によって分泌された好中球化学誘引物質の産生における有意な増加を生じさせた。
【００６０】
幹細胞分化及び前駆細胞発生に関連するサイトカインのレベルは、エリトラン治療によって増加又は減少した。エリトラン治療は、Ｇ−ＣＳＦのレベルを７．０倍増加させた。Ｇ−ＣＳＦは、顆粒球発達に向かう前駆幹細胞の分化を刺激する。同様に、統計学的に有意ではないが、エリトラン治療は、マクロファージ分化因子であるＭ−ＣＳＦのレベルを５８％増加させたが、その増加は、統計的に有意ではなかった。これとは逆に、血清中ＩＬ−７レベルは、エリトラン治療マウスにおいて４１％減少された。ＩＬ−７は、リンパ球前駆細胞への造血性幹細胞分化を誘導し、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の分化及び生存率を促進する。ＩＬ−７における減少は、エリトラン治療マウスにおいて観察されたＴリンパ球における全体的減少に寄与する可能性がある。白血病阻害因子（ＬＩＦ）の血清中レベルは、エリトラン治療マウスでは１０．３分の１に減少した。この観察所見は、ＬＩＦ発現レベルが細胞分化と反比例するために特に興味深い。したがって、エリトラン治療マウスにおけるＬＩＦレベルの減少は、増加した免疫細胞分化の指標である。
【００６１】
最後に、フリーラジカルの全レベルについての血清試料を、過酸化水素（Ｈ2Ｏ2）、ペルオキシルラジカル（ＲＯＯ-）、一酸化窒素（ＮＯ）及びペルオキシニトリル（ＯＮＯＯ-）と反応するOxiSelectインビトロ活性酸素種／活性窒素種（ＲＯＳ／ＲＮＳ）アッセイを使用して分析した。以前の観察所見と一致して、ＥＢＯＶ感染は、フリーラジカルのレベルを２２．３倍増加させた（図３Ａ）。興味深いことに、エリトラン治療は、これを部分的に逆転させ、フリーラジカルの２３％減少を生じさせた。概して、血清分析は、「サイトカインストーム」の誘導と関連するメディエーターの広範なダウンレギュレーションと一致する、エリトラン治療マウスにおける変化した細胞外環境を解明した。
【００６２】
実施例３
関連するウイルスを集めた科の１つであるフィロウイルス（filovirus）科は、細菌性敗血症と関連する共通特徴を共有するため、エリトランがマウスを致死的ＭＡＲＶ誘発から保護する能力について評価した。マウスを、図１Ａに提供した概略に示したように治療した。しかし、マウスは、第０日にマウス適応ＭＡＲＶにより誘発された。図１０Ａに示したように、感染マウスの９０％は、致死的ＭＡＲＶ誘発に対して生存したが、コントロール群由来のマウスで生存したのは１匹（２０％）のみであった。残ったエリトラン治療マウスについての平均臨床スコアは、１を超えるスコアと判定されたのが感染に負けたマウスのみであったため、比較的未変化のまま維持された（図１０Ｂ）。これとは逆に、コントロール群の全マウスは、誘発後第８日及び第９日に３又は４の臨床スコアであると判定された。ＥＢＯＶ感染マウスにおいて観察されたように、コントロールマウスの平均体重は、ＭＡＲＶ誘発後に相当大きく減少した（図１０Ｃ）。しかし、エリトラン治療マウスではわずかな減少のみが観察された。ＥＢＯＶ感染してエリトラン治療を受けたマウスにおいて観察された体重増加に類似して、エリトラン治療を受けたＭＡＲＶ感染マウスにおいても体重の増加が観察された。これらをまとめると、データは、エリトラン治療が致死的フィロウイルス（filovirus）感染からの生存率を促進することに有効であることを示している。
【００６３】
マールブルクウイルス（Marburg virus）によって引き起こされる疾病は、一連の症状に関連している。例えば、www.who.int/mediacentre/factsheets/fs_marburg/en/で世界保健機関によって公表されたマールブルク（Marburg）出血性熱ファクトシートを参照されたい。症状は、高熱、重度の頭痛及び重度の倦怠感を伴って突発する可能性がある。患者は、一般に筋肉痛及び疼痛を経験する。第３日に、患者は、重度の水様性下痢、腹部の疼痛及び痙攣、悪心ならびに嘔吐を示すことがある。下痢は１週間にわたり持続することがあり、患者は、やつれた容貌、くぼんだ目、無感動な顔及び極度の無気力からなる「ゴーストのような」風貌を示すことがある。多数の患者は、症状の開始後５から７日間に重度の出血性症状を発生する。新鮮血は、嘔吐物中、大便中に見られ、鼻、歯肉及び膣から流出する。ドイツ及びユーゴスラビアにおける１９６７年の大発生では、患者は、症状の発生後２から７日間に痒みのない皮膚発疹を示した。後期には、症状の発生後の約１５日間に男性患者が睾丸炎を示す場合がある。中枢神経系を罹患した患者は、錯乱、非刺激性及び攻撃性を示す場合がある。
【００６４】
致死的症例には、通常、頻回に複数領域からの出血が含まれる。死亡は、症状の開始後８から９日間に最も頻回に発生し、通常、重度の失血及びショックが先行する。
【００６５】
これらの観察所見は、ＴＬＲ４拮抗作用がＥＢＯＶ感染患者を治療するための緊急に必要とされる治療的介入戦略を提供できることを示している。全ての炎症反応の広範な減少が観察されたが、Ｔｈ２サイトカインの特異的ダウンレギュレーションが、エリトランにより治療されたマウスの生存率増加に関連する重要な作用機序を表す可能性がある。さらに、ＥＢＯＶ感染に対する全体的反応における一般的減少は、過活動免疫反応に関連する疾患の病原性特徴を緩和する可能性がある。ＥＢＯＶ感染における致死率は、高レベルの前炎症性サイトカインＩＬ−６、ケモカイン及び抗炎症性サイトカインＩＬ−１０二関連している。予想外にも、エリトランは、ケモカイン産生を阻害することに加えて、これらの研究においてＩＬ−６及びＩＬ−１０の両方を減少させた。さらに、敗血症における疾患進行は、抗炎症性Ｔｈ２反応への前炎症性Ｔｈ１反応からのシフトによって媒介されることが証明されている。したがって、これらの研究において観察されたエリトランの生存率促進作用は、Ｔｈ２関連性サイトカインのダウンレギュレーションの結果として持続性Ｔｈ１反応と関連する可能性がある。
【００６６】
炎症反応の減少は、ＴＬＲ４特異的阻害剤であるエリトランの阻害活性と直接的に関連する可能性が高い。ＴＬＲ４は、免疫（例えば、適応及び先天性の両方の免疫細胞サブセット）及び非免疫細胞（例えば、腸上皮細胞系）の両方を含む多数の細胞タイプにおいて発現する。したがって、炎症性メディエーターの広範な減少は、エリトランの包括的作用に起因する可能性がある。細菌性敗血症において証明されたように、持続性ＴＬＲ４刺激は、過剰に悪化した免疫学的反応を生じさせ、最終的に有益な反応より多くの損傷を引き出す。しかし、本試験において証明されたように、ＴＬＲ４の非存在は、ＥＢＯＶ誘発後に同等に有害であり、これは、エリトランの作用がＥＢＯＶとＴＬＲ４との直接的（ＧＰ）又は間接的（ＯｘＰＬ）関連を部分的に鈍化させる可能性があることを示唆している。したがって、ＴＬＲ４シグナル伝達経路のより限定された誘導は、有益な免疫反応を生じさせる可能性がある。
【００６７】
好中球活性化の明確な指示がＰＢＭＣの本発明者らの分析において検出された（図２Ａ）。したがって、エリトラン治療マウスの末梢血中の好中球の数がより少ないことは、結果として骨髄からの好中球動員の減少を生じさせる、増加した組織移動、増加したターンオーバー又は化学走性シグナル伝達減少に起因する可能性がある。好中球膜剛性（例えば、ＴＮＦα）を誘導することが知られている炎症性メディエーターの減少は、細菌性敗血症の動物モデルにおいて観察されたように、血管組織内での移動を促進して腐骨化を減少させる可能性がある。同様に、末梢血中のＴリンパ球のより低レベルは、改善されたケモカイン勾配の発生に起因する増加した組織移動の結果である可能性がある。さらに、高レベルのケモカインは、これらの化学誘引物質の全身性遊離に起因して、エリトラン治療の非存在下で適正な組織移動を混乱させる可能性がある。これらの試験において分析したケモカインの大多数における有意な減少が観察された。しかし、これらの減少が好中球計数及び／又は移動に及ぼす特定の作用は、依然として決定されないままである。
【００６８】
これらの試験がＴＬＲ４シグナル伝達のＥＢＯＶ媒介性誘導の推定的役割を示唆しているにもかかわらず、ＴＬＲ４のＧＰ媒介性刺激をブロックすることよりもむしろ酸化リン脂質（Ｏｘ−ＰＬ）の炎症性作用を減少させることにより、エリトランがＥＢＯＶ感染マウスを保護する可能性がある。感染、アポトーシス及び組織損傷後に生成されるＯｘ−ＰＬは、樹状細胞（ＤＣ）の成熟を妨害し、その結果、限定されたリンパ球活性化を生じさせることが証明されている。結果として生じるＯｘ−ＰＬは、前炎症性及び抗炎症性の両方のメディエーターの産生を誘発する炎症反応に重度の調節作用を示す。Ｏｘ−ＰＬの形成は、ＥＢＯＶ感染後の好中球の知られている活性化及びその後のＲＯＳの遊離と一致している。Ｏｘ−ＰＬが疾患の経過中のＴＬＲ４シグナル伝達をさらに刺激し得ることは実行可能である。この考えは、ＯｘＰＬのエリトラン拮抗作用がＴＬＲ４との相互作用をブロックすることによって媒介されることを証明した、疾患のインフルエンザ（influenza）モデルを利用した以前の観察所見によって支持されている。Shirey et al., Nature 497 (7450): 498-502 (2013)。
【００６９】
炎症性メディエーターの包括的減少は、エリトランがサイトカインストームの発生を鈍化させることを指示している。さらに、敗血症を引き起こす細菌感染症は、典型的には、同様にフィロウイルス（filovirus）感染についても該当し得る、疾患が進行するにつれてのＴｈ１反応からＴｈ２反応へのシフトを特徴とする（Aziz et al., J Leukoc Biol 55: 329-42 (2013)。エリトラン治療マウスにおける細胞外環境は、Ｔｈ２反応へ進行したと思われる、プラセボ群の血清中サイトカイン分析と比較して延長されたＴｈ１反応を示唆している。これとは逆に、細胞内染色分析は、未治療ＥＢＯＶ感染マウスと比較して、対向するＴｈ２反応が、ＩＬ−４分泌性ＣＤ４+Ｔ細胞における増加によって決定されるようにエリトラン治療マウスで第６日に開始されていたことを示している。これは、Ｔｈ２関連性サイトカインにおける有意な減少によって認められるように、Ｔｈ２反応の開始を遅延させるエリトラン治療によって説明することができる。重度の細菌性敗血症を有する患者は、低いＴｈ１：Ｔｈ２比を有するが、他方非敗血症患者ではその反対のことが観察される（Ferguson et al., Intensive Care Med 25: 106-9 (1999)）。したがって、エリトラン治療による血漿ウイルス血症減少及び改善された生存率は、遅延Ｔｈ１反応に起因する可能性がある。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【国際調査報告】
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