(57)【要約】アルキル鎖を有するカチオンおよび高分子アニオンを含む複合体を含む組成物、ならびにその作製方法および使用方法を開示する。組成物は、典型的には、電荷が中性であり、室温および標準圧力で液体である。高分子アニオンは、核酸、ペプチド、タンパク質、および／または炭水化物であり得る。組成物は、皮膚バリア（角質層）を横切った皮膚細胞内への透過、高分子の皮膚細胞への送達が強化されている。組成物は、皮膚に局所適用され、この組成物は、皮膚状態の処置に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子アニオン、および
カチオン；
を含む複合体を含む高分子の経皮送達のための組成物であって、
前記複合体が皮膚に対して非刺激性であり、
前記組成物が皮膚への局所適用に適した形態である、組成物。
【請求項２】
前記組成物が室温および標準圧力で液体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記高分子アニオンおよび前記カチオンが、０．５：１、１：１、または２：１の電荷比で存在する、請求項１または請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記高分子アニオンが、核酸、ペプチド、タンパク質、およびポリサッカリドからなる群から選択される高分子である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記高分子アニオンが核酸である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記高分子アニオンが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）からなる群から選択されるＲＮＡ干渉分子であり、好ましくは、前記高分子アニオンがｓｉＲＮＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記高分子アニオンが二本鎖ｓｉＲＮＡであり、ここで、各鎖が２０〜２５ヌクレオチドの範囲の長さを有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記高分子アニオンが二本鎖ｓｉＲＮＡであり、ここで、各鎖が２３ヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記高分子アニオンが二本鎖ｓｉＲＮＡであり、ここで、各鎖が２１ヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記高分子アニオンがポリサッカリドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ポリサッカリドが、ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、蜂蜜、ヒドロキシプロピルデンプンホスファート、ムコ多糖、コンドロイチン、ペクチン、糖テンシド、海藻ポリサッカリド、トラガカント（ｔｒａｇａｎｔ）、キサンタンガム、ならびにその誘導体およびその組み合わせからなる群から選択され、好ましくは、前記ポリサッカリドがヒアルロン酸である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記カチオンが、３個の炭素原子から２０個の炭素原子までの範囲の長さを有するアルキル鎖を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記カチオンが６個の炭素原子から１６個の炭素原子までの範囲の長さを有するアルキル鎖を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記カチオンが、式ＩＩ：
【化８】
2019526626.tif 000014
の構造を有し、
式中、ｎは３〜１９の範囲（両端の値を含む）の整数である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記カチオン性界面活性剤がベンジルジメチルドデシルアンモニウムではない、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記カチオンが、ベンジルジメチルオクチルアンモニウム、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、およびベンジルジメチルステアリルアンモニウムからなる群から選択されるカチオン性界面活性剤である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記複合体のオクタノール／水分配係数（Ｐｏ／ｗ）によって決定される前記複合体の疎水性が、前記高分子アニオンがナトリウムカチオンと複合体化した場合の前記高分子アニオンの疎水性と比較して、少なくとも１ログ単位（ＬｏｇＰｏ／ｗ）増加する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記複合体の疎水性が、前記高分子アニオンがナトリウムカチオンと複合体化した場合の前記高分子アニオンの疎水性と比較した場合、１〜５ログ単位（ＬｏｇＰｏ／ｗ）増加する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記カチオンが、多孔度を増大させるかまたは角質層を除去するためのさらなる処置がない場合に角質層を横切るのに十分に前記高分子アニオンの疎水性を増大させる、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記高分子アニオンおよび前記カチオンのいずれか単独または両方が皮膚を刺激する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
ナトリウムカチオンと複合体化した高分子アニオンのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性と比較して実質的に同一である、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞に対する細胞傷害性を有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記複合体の電荷が中性である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記カチオンが、式Ｉ、
【化９】
2019526626.tif 000015
の構造を有し、
式中、
Ｑは窒素（Ｎ）またはリン（Ｐ）であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、存在しないか、水素、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルケニル、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換アルコキシ、非置換アルコキシ、置換アミノ、非置換アミノ、置換アルキルアミノ、非置換アルキルアミノ、置換アルキルチオ、または非置換アルキルチオ、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換Ｃ３〜Ｃ３０シクロアルキル、非置換Ｃ３〜Ｃ３０シクロアルキル、置換ヘテロシクリル、非置換ヘテロシクリルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の任意の対を独立して組み合わせて５員環および／または６員環を形成し、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の任意の対の組み合わせから形成された前記５員環および／または６員環は、任意選択的に、さらなるヘテロ原子を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記カチオンが、セチルトリメチルアンモニウム、デシルトリメチルアンモニウム、ベンジルジメチルドデシルアンモニウム、ミリスチルトリメチルアンモニウム、またはドデシルピリジニウムではない、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの少なくとも１つが、独立して、置換アルキルであり、ここで、前記置換アルキルが、置換アラルキルまたは非置換アラルキルである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの少なくとも１つが、独立して、置換アルキルであり、ここで、前記置換アルキルが、置換アラルキルまたは非置換アラルキルであり、
但し、前記カチオンがベンジルジメチルドデシルアンモニウムではないことを条件とする、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
Ｒ１が、独立して、置換アルキルであり、ここで、前記置換アルキルが、置換アラルキルまたは非置換アラルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が、独立して、置換アルキルまたは非置換アルキルであり、
但し、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が置換アルキルである場合、前記置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルではないことを条件とする、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２８】
Ｒ１が、独立して、置換アルキルであり、ここで、前記置換アルキルが、置換アラルキルまたは非置換アラルキルであり、
ここで、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が、独立して、置換アルキルまたは非置換アルキルであり、
但し、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が置換アルキルである場合、前記置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルではないことを条件とし、
但し、前記カチオン性界面活性剤はベンジルジメチルドデシルアンモニウムではないことを条件とする、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２９】
１つまたは複数の皮膚状態の処置を必要とする被験体において１つまたは複数の皮膚状態を処置する方法であって、前記被験体の皮膚に有効量の請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物を局所投与する工程を含む、方法。
【請求項３０】
前記組成物の局所投与工程の前、後、または同時に、
前記皮膚が、皮膚の多孔度を増加させるか、角質層の全部または一部を除去するか、角質層を介して前記複合体を押すか、そうでなければ、皮膚の１つまたは複数の層を介した前記組成物または複合体の輸送を補助するためのさらなる処置に供されない、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年８月２９日に出願された米国出願番号第６２／３８０，７６１号に基づく利益および優先権を主張しており、ここで、この米国出願の全体が参考として本明細書によって援用されることが容認される。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記述
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号５Ｒ２１ＣＡ１９１３３−０２の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列表の参照
２０１６年８月１５日に作成され、サイズが３，１３２バイトでファイル名が「ＵＣＳＢ＿２０１７＿０４２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のテキストファイルとして提出した配列表は、連邦規則集第３７巻§１．５２（ｅ）（５）に従って、本明細書中で参照により援用される。
【０００４】
発明の分野
本発明の分野は、経皮薬物送達処方物、皮膚疾患の処置などのための局所投与処方物、ならびにこれらの処方物の作製方法および使用方法である。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
皮膚疾患は、全世界の人口の７０％以上が罹患している最も一般的なヒトの疾病の１つである（Ｈａｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１３４：１５２７−１５３４（２０１４））。皮膚疾患の症状は、単なる審美上の症状（例えば、セルライト、皺、および褐色斑点）から、衰弱、さらには致命的症状（例えば、激痛、皮膚バリアの破壊、脱水症、および全身性感染）にまで及ぶ（Ｚａｋｒｅｗｓｋｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２１８：４４５−４５６（２０１５））。皮膚疾患は罹患率が高く且つ症状が人目につくことに加えて、皮膚疾患が重度であれば罹患率および死亡率が高くなるということが重なると、著しい身体的、感情的および経済的な負担となる（Ｈａｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１３４：１５２７−１５３４（２０１４）；Ｂｉｃｋｅｒｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，５５：４９０−５００（２００６））。皮膚疾患は、世界的な非致死性疾病負荷の４番目の主因であると推定され、その負荷は慢性閉塞性肺疾患、真性糖尿病、変形性関節症、および薬物乱用より大きい（Ｈａｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１３４：１５２７−１５３４（２０１４）。しかし、皮膚疾患の有効な処置方法に対する取り組みは依然として不十分なままである（Ｈａｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１３４：１５２７−１５３４（２０１４）；Ｂｉｃｋｅｒｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，５５：４９０−５００（２００６）；Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｅ．Ｅ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１３４：２６６３−２６６５（２０１４））。
【０００６】
局所および経皮への薬物送達は、他の一般的な送達経路（経口、皮下、および静脈内など）よりも多くの利点がある。これらの利点には、胃腸（ＧＩ）管に関連する主要な分解経路が回避されること、全身毒性に関連する副作用が減少すること、および無針で薬物投与されることが含まれる。Ｂｒｏｗｎ，ら，“Ｄｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ”，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，１３：１７５−８７（２００６）。
【０００７】
不運にも、皮膚の最外層である角質層（ＳＣ）は、ほとんどの異物に対するバリアとして機能し、多くの分子の受動拡散を厳格に制限する。このバリアを克服するために、いくつかの戦略（化学物質透過促進剤（ＣＰＥ）の使用が含まれる）が使用されてきた。ＣＰＥは、ＳＣ内の脂質の組成および機構を破壊することによって、種々の分子の皮膚を介した輸送を増強することが示されている（Ｋａｒａｎｄｅ，ら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，１０２：４６８８−９３（２００５））。しかし、脂質破壊の程度は、しばしば、皮膚刺激と密接に相関する（Ｋａｒａｎｄｅ  ２００５）。
【０００８】
細菌性皮膚感染の処置のために、薬物送達に対する第二の輸送バリア（細菌性バイオフィルム）が存在する。バイオフィルムで保護された細菌は、ヒトの細菌感染の６５％を占め、保護されていない細菌より抗生物質に対して５０〜５００倍の耐性を示す。Ｐａｌｍｅｒ，ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｌｏｎｇ  ｂｏｎｅ  ｎｏｎｕｎｉｏｎ：ａ  ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ”，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６９：３０３７−４２（２０１１）。抗生物質耐性は、細胞外高分子物質（ＥＰＳ）（例えば、ポリサッカリド、フミン酸、および核酸）によって生じる輸送バリアに起因する。ＳＣおよび細菌性バイオフィルムの化学組成は異なるが、ＳＣおよびバイオフィルムによって生じる輸送バリアを、類似の様式で（適切な溶媒によるバリア成分の流動化または抽出などによって）で克服することができる。
【０００９】
例えば、局所ｓｉＲＮＡのより有効な送達を達成するために多大な努力が費やされてきた。ＳＣバリアを克服するための戦略には、マイクロニードルパッチ（Ｃｈｏｎｇら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１６６：２１１−２１９（２０１３））およびレーザーアブレーション（Ｌｅｅら、Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ、２０：５８０−５８８（２００９））などの物理的方法、ソノフォレーシス（Ｔｒａｎら，８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ，４２３−４２７（２００９））およびイオン導入法（Ｋｉｇａｓａｗａら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３８３：１５７−１６０（２０１０））などの能動的方法、ならびにペプチド（Ｈｓｕら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，１０８：１５８１６−１５８２１（２０１１）；Ｌｉｎら，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０４：１３９−１４４（２０１２）；Ｕｃｈｉｄａ，ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，３８８：４４３−４５０（２０１１）；Ｙｉら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９：３６２−３７１（２０１１））および球状核酸（Ｒａｎｄｅｒｉａら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，１１２：５５７３−５５７８（２０１５）；Ｚｈｅｎｇら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，１０９：１１９７５−１１９８０（２０１２））などの受動的方法が含まれる。
【００１０】
しかし、皮膚疾患の症状は、典型的には、広い表面積にわたって出現し、しばしば、デバイスに基づく方法の使用が制限される。受動的送達方法は、しばしば、広い表面積上への適用に有用である；しかし、現在の受動的方法は制限がある（合成が複雑であることおよびｓｉＲＮＡ抱合化学を使用する必要性があることが含まれる）（Ｈｓｕら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，１０８：１５８１６−１５８２１（２０１１）；Ｃｈｅｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１７９：３３−４１（２０１４）；Ｍｅａｄｅら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，３２：１２５６−１２６１（２０１４）；Ｃｕｔｌｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１３２：１３７６−１３９１（２０１２））。
【００１１】
皮膚を刺激することなく治療組成物の経皮輸送を改善する組成物および方法が必要とされている。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、治療剤、予防剤、または診断剤の経皮輸送を改善するための組成物を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、皮膚内の疾患および障害を処置するための改良された組成物を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、治療剤、予防剤、または診断剤の経皮輸送を改善する方法を提供することである。
【００１５】
本発明のなおさらなる目的は、皮膚の疾患および障害を処置するための改善された方法を提供することである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｈａｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１３４：１５２７−１５３４（２０１４）
【非特許文献２】Ｚａｋｒｅｗｓｋｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２１８：４４５−４５６（２０１５）
【非特許文献３】Ｈａｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１３４：１５２７−１５３４（２０１４）
【非特許文献４】Ｂｉｃｋｅｒｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，５５：４９０−５００（２００６）
【非特許文献５】Ｈａｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１３４：１５２７−１５３４（２０１４）
【非特許文献６】Ｈａｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１３４：１５２７−１５３４（２０１４）
【非特許文献７】Ｂｉｃｋｅｒｓら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，５５：４９０−５００（２００６）
【非特許文献８】Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｅ．Ｅ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，１３４：２６６３−２６６５（２０１４）
【非特許文献９】Ｂｒｏｗｎ，ら，“Ｄｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ”，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，１３：１７５−８７（２００６）
【非特許文献１０】Ｋａｒａｎｄｅ，ら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，１０２：４６８８−９３（２００５）
【非特許文献１１】Ｐａｌｍｅｒ，ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｌｏｎｇ  ｂｏｎｅ  ｎｏｎｕｎｉｏｎ：ａ  ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ”，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，４６９：３０３７−４２（２０１１）
【非特許文献１２】Ｃｈｏｎｇら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１６６：２１１−２１９（２０１３）
【非特許文献１３】Ｌｅｅら、Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ、２０：５８０−５８８（２００９）
【非特許文献１４】Ｔｒａｎら，８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ，４２３−４２７（２００９）
【非特許文献１５】Ｋｉｇａｓａｗａら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，３８３：１５７−１６０（２０１０）
【非特許文献１６】Ｈｓｕら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，１０８：１５８１６−１５８２１（２０１１）
【非特許文献１７】Ｌｉｎら，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０４：１３９−１４４（２０１２）
【非特許文献１８】Ｕｃｈｉｄａ，ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，３８８：４４３−４５０（２０１１）
【非特許文献１９】Ｙｉら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９：３６２−３７１（２０１１）
【非特許文献２０】Ｒａｎｄｅｒｉａら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，１１２：５５７３−５５７８（２０１５）
【非特許文献２１】Ｚｈｅｎｇら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，１０９：１１９７５−１１９８０（２０１２）
【非特許文献２２】Ｈｓｕら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，１０８：１５８１６−１５８２１（２０１１）
【非特許文献２３】Ｃｈｅｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１７９：３３−４１（２０１４）
【非特許文献２４】Ｍｅａｄｅら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，３２：１２５６−１２６１（２０１４）
【非特許文献２５】Ｃｕｔｌｅｒら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１３２：１３７６−１３９１（２０１２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の概要
治療剤、予防剤、または診断剤の経皮輸送の改善のための組成物を本明細書中に開示する。組成物は、高分子性アニオンとアルキル鎖を有するカチオンとの複合体を含む。組成物は、典型的には、電荷が中性であり、室温および標準圧力で液体の形態である。いくつかの態様では、高分子性アニオンとアルキル鎖カチオンとの比は、１：１から逸脱し得る。この態様では、ナトリウムまたはクロリドなどのさらなる小さな対イオンは、電荷が中性の組成物を提供するのに十分な量で存在し得る。
【００１８】
適切な高分子性アニオンには、ＲＮＡ干渉分子（低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）など）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ペプチド、タンパク質、および／またはポリサッカリド（ヒアルロン酸など）が含まれる。
【００１９】
アルキル鎖を有する適切なカチオンには、ベンジルジメチルアルキル（ベンジルジメチルオクチルアンモニウム（ＢＤＯＡ）、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム（ＢＤＴＡ）、ベンジルジメチルステアリルアンモニウム（ＢＤＳＡ）など）が含まれる。いくつかの実施形態では、カチオンはアルキル鎖内に８個の炭素を含むか（ベンジルジメチルオクチルアンモニウム（ＢＤＯＡ）など）、カチオンはアルキル鎖内に１８個の炭素を含む（ベンジルジメチルステアリルアンモニウム（ＢＤＳＡ）など）。
【００２０】
典型的には、カチオンのアルキル鎖の長さにより、複合体が皮膚バリア（ＳＣ）を介して輸送されて皮膚細胞に侵入することができるような所望の性質が複合体に付与される。所望の性質には、十分な疎水性、流体力学的サイズ、および皮膚に対する非刺激性が含まれる。
【００２１】
本明細書中に記載の組成物は、角質層および／または表皮を介して組成物を押し出し、皮膚の多孔度を改変し、皮膚から層を除去し、または皮膚を突き刺すためのデバイス（マイクロニードルデバイス、電気穿孔器（ｅｌｅｃｒｏｐｒａｔｏｒ）、もしくはイオノポレーターなど）を使用せずに皮膚に局所投与するのに適している。典型的には、角質層を介して組成物中の薬剤を任意選択的に１つまたは複数の表皮層に送達するための皮膚へのさらなる介入（注射、ソノフォレーシス、アブレーション、エレクトロポレーション、またはイオノポレーションなど）は、必要とされない。
【００２２】
本明細書中に記載の組成物は、皮膚バリアを通過して皮膚細胞に侵入するのに適した疎水性を示す組成物である。好ましくは、薬剤は、表皮を介して真皮中に送達される。任意選択的に、薬剤は真皮を越えて送達される。
【００２３】
組成物は、皮膚の１つまたは複数の状態（審美上の状態または疾患状態が含まれる）を処置するのに有用である。審美上の状態は、皺、老人斑（肝斑）、瘢痕、およびざ瘡などを含む。病状には、炎症性、感染性、自己免疫性、アレルギー性、新生物性、および他の慢性、後天性、または急性の皮膚疾患が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、種々のアルキル鎖長についてのベンジルジメチルアルキルアンモニウムクロリドおよびローブドｓｉＲＮＡについてのアルキル鎖長の関数としての対数スケール（ＬｏｇＰｏ／ｗ）でのオクタノール−水の分配の係数Ｐｏ／ｗの変化を示す折れ線グラフである。エラーバーは、ｎ＝３の場合の平均＋ＳＤを表す。クロリド塩のＬｏｇＰｏ／ｗは、実験値および予測値が公表されている（表２を参照のこと）。
【００２５】
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、ブタ皮膚の異なる皮膚層に送達された遊離ｓｉＲＮＡまたはローブドｓｉＲＮＡの適用量のパーセンテージを示す棒グラフである。図２Ａは、ｓｉＲＮＡ１についての送達された適用用量パーセントを示す。ｓｉＲＮＡ１の経皮送達は、ＩＬ部分をローブすると有意に増強される。送達深度は左から右に向かうにつれて増加する。裸のＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ１（白抜きのバー）、ＢＤＯＡ−ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ１（斜線のバー）、ＢＤＴＡ−ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ１（網掛けのバー）、およびＢＤＳＡ−ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ１（黒塗りのバー）。エラーバーは、ｎ＝３の平均値＋ＳＤを表す。裸のＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（白抜きのバー）と比較して＊ｐ＜０．０５。図２Ｂは、ｓｉＲＮＡ２についての送達された適用用量パーセントを示す。送達深度は左から右に向かうにつれて増加する。裸のＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ２（白抜きのバー）、ＢＤＯＡ−ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ２（斜線のバー）、ＢＤＴＡ−ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ２（網掛けのバー）、およびＢＤＳＡ−ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ２（黒塗りのバー）。エラーバーは、ｎ＝３の平均値＋ＳＤを表す。＊裸のｓｉＲＮＡ２（白抜きのバー）と比較してｐ＜０．０５。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、ブタ皮膚の異なる皮膚層に送達された遊離ｓｉＲＮＡまたはローブドｓｉＲＮＡの適用量のパーセンテージを示す棒グラフである。図２Ａは、ｓｉＲＮＡ１についての送達された適用用量パーセントを示す。ｓｉＲＮＡ１の経皮送達は、ＩＬ部分をローブすると有意に増強される。送達深度は左から右に向かうにつれて増加する。裸のＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ１（白抜きのバー）、ＢＤＯＡ−ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ１（斜線のバー）、ＢＤＴＡ−ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ１（網掛けのバー）、およびＢＤＳＡ−ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ１（黒塗りのバー）。エラーバーは、ｎ＝３の平均値＋ＳＤを表す。裸のＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ（白抜きのバー）と比較して＊ｐ＜０．０５。図２Ｂは、ｓｉＲＮＡ２についての送達された適用用量パーセントを示す。送達深度は左から右に向かうにつれて増加する。裸のＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ２（白抜きのバー）、ＢＤＯＡ−ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ２（斜線のバー）、ＢＤＴＡ−ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ２（網掛けのバー）、およびＢＤＳＡ−ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ２（黒塗りのバー）。エラーバーは、ｎ＝３の平均値＋ＳＤを表す。＊裸のｓｉＲＮＡ２（白抜きのバー）と比較してｐ＜０．０５。
【００２６】
【図３Ａ】図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、細胞を種々の濃度の裸のＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ１およびローブドＦＡＭｓｉＲＮＡ１（図３Ａ）、裸のＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ１およびＩＬ部分のみ（図３Ｂ）、または裸のＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ２およびローブドＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ２（図３Ｃ）とインキュベートした場合の、インキュベーション４時間後のコントロールと比較した細胞生存パーセントを示す折れ線グラフである。エラーバーは、ｎ＝６の平均値＋ＳＤを表す。＊（培地のみとインキュベートした）コントロールと比較してｐ＜０．０５。
【図３Ｂ】図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、細胞を種々の濃度の裸のＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ１およびローブドＦＡＭｓｉＲＮＡ１（図３Ａ）、裸のＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ１およびＩＬ部分のみ（図３Ｂ）、または裸のＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ２およびローブドＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ２（図３Ｃ）とインキュベートした場合の、インキュベーション４時間後のコントロールと比較した細胞生存パーセントを示す折れ線グラフである。エラーバーは、ｎ＝６の平均値＋ＳＤを表す。＊（培地のみとインキュベートした）コントロールと比較してｐ＜０．０５。
【図３Ｃ】図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、細胞を種々の濃度の裸のＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ１およびローブドＦＡＭｓｉＲＮＡ１（図３Ａ）、裸のＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ１およびＩＬ部分のみ（図３Ｂ）、または裸のＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ２およびローブドＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ２（図３Ｃ）とインキュベートした場合の、インキュベーション４時間後のコントロールと比較した細胞生存パーセントを示す折れ線グラフである。エラーバーは、ｎ＝６の平均値＋ＳＤを表す。＊（培地のみとインキュベートした）コントロールと比較してｐ＜０．０５。
【００２７】
【図４】図４は、ＨＥＫａ細胞を種々の濃度（ｎＭ）のＢＤＯＡ−ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ１と７２時間インキュベートした場合の、コントロールと比較した細胞生存パーセントを示す折れ線グラフである。エラーバーは、ｎ＝６の平均値＋ＳＤを表す。＊（培地のみとインキュベートした）コントロールと比較してｐ＜０．０５。
【００２８】
【図５】図５は、ＨＥＫａ細胞をｓｉＲＮＡ１の種々の処方物とインキュベートした場合、または無処置のままにした場合のＧＡＰＤＨタンパク質レベル（総タンパク質あたりのＧＡＰＤＨ（無処置コントロールに対して正規化））の変化を示す棒グラフである。ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＥＫα細胞において有意な遺伝子サイレンシングをもたらす。ＧＡＰＤＨ発現はコントロール（培地のみとインキュベートした細胞）との比較である。エラーバーは、ｎ＝６の平均値＋ＳＤを表す。＊コントロールと比較してｐ＜０．０５。
【００２９】
【図６】図６は、種々のｓｉＲＮＡ処方物で処置した皮膚細胞の生存パーセントの変化（ＵＶなしコントロールと比較して）を示す棒グラフである。ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡは、ＭａｔＴｅｋ  Ｅｐｉｄｅｒｍ（商標）組織への適用後に皮膚を刺激しない。生存率を、コントロール（ＵＶ光に曝露されていない組織）によって正規化する。エラーバーは、ｎ＝３の場合の平均＋ＳＤを表す。統計的有意差は認められなかった。
【００３０】
【図７Ａ】図７Ａは、ｓｉＲＮＡおよびＵＶの種々の処方物で処置したか、ＵＶおよび生理食塩水で処置したか、または無処置（ＵＶなし）のＭａｔＴｅｋ  Ｅｐｉｄｅｒｍ（商標）組織における正規化エラスターゼレベルの変化を示す棒グラフである。ローブドｓｉＲＮＡは、ＵＶＢ光でのＭａｔＴｅｋ  Ｅｐｉｄｅｒｍ（登録商標）組織の照射後のエラスターゼの上方制御およびその後のエラスチン分解を有意に制限した。エラスターゼ発現を、ＵＶコントロール（ＵＶ光に曝露し、且つ生理食塩水で処置した組織）によって正規化する。エラスチン発現を、ＵＶなしのコントロール（ＵＶ光に曝露されていない組織）によって正規化する。エラーバーは、ｎ＝３の平均値＋ＳＤを表す。＊＊ＵＶ；生理食塩水コントロールと比較してｐ＜０．０１。＊ＵＶなしのコントロールと比較してｐ＜０．０５。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ｓｉＲＮＡの種々の処方物およびＵＶで処置したか、ＵＶおよび生理食塩水で処置したか、または無処置（ＵＶなし）のＭａｔＴｅｋ  Ｅｐｉｄｅｒｍ（商標）組織における正規化エラスチンレベルの変化を示す棒グラフである。ローブドｓｉＲＮＡは、ＵＶＢ光でのＭａｔＴｅｋ  Ｅｐｉｄｅｒｍ（登録商標）組織の照射後のエラスターゼの上方制御およびその後のエラスチン分解を有意に制限した。エラスターゼ発現を、ＵＶコントロール（ＵＶ光に曝露し、且つ生理食塩水で処置した組織）によって正規化する。エラスチン発現を、ＵＶなしのコントロール（ＵＶ光に曝露されていない組織）によって正規化する。エラーバーは、ｎ＝３の平均値＋ＳＤを表す。＊＊ＵＶ；生理食塩水コントロールと比較してｐ＜０．０１。＊ＵＶなしのコントロールと比較してｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
用語「アルキル鎖」は、直鎖、分枝鎖、および環式の炭化水素基をいう。別段の指定がない限り、アルキル基には、１つまたは複数の二重結合または三重結合を含む炭化水素基が含まれる。少なくとも１つの環系を含むアルキル基は、シクロアルキル基である。少なくとも１つの二重結合を含むアルキル基はアルケニル基であり、少なくとも１つの三重結合を含むアルキル基はアルキニル基である。
【００３２】
「核酸」は、少なくとも２つのヌクレオチドから構成されるポリマーをいう。核酸は、ＲＮＡの場合のように一本鎖であり得るか、ＤＮＡの場合のように二本鎖であり得る。核酸は、天然に存在するヌクレオチドから構成され得るか、１つまたは複数の非天然ヌクレオチドを含み得る。核酸には、核酸の誘導体およびアナログ（ペプチド核酸（プリン塩基およびピリミジン塩基に置換されたポリアミノ酸配列）およびグリコール核酸（環状リボース成分がホスホジエステル結合によって連結された非環式のジオールまたはトリオールに置換されている）が含まれる）も含み得る。
【００３３】
用語「ポリサッカリド」は、グリコシル（ｇｌｙｃｏｓｙｌｉｃ）（またはグリコシド）結合を介して連結した少なくとも２つのモノサッカリド単位から構成される化合物をいう。別段の指定がない限り、ポリサッカリドは、糖成分のみを含み得るか、非糖成分も（アミノ酸および小分子アグリコンなど）含み得る。約１０，０００Ｄａを超える分子量を有するポリサッカリドを「高分子量ポリサッカリド」と称することができるのに対して、約１０，０００Ｄａ未満の分子量を有するポリサッカリドを「低分子量ポリサッカリド」と称することができる。ポリサッカリドの分子量を、当業者に公知の標準的な方法（質量分析（例えば、ＥＳＩまたはＭＡＬＤＩによる消化断片の）または既知の炭水化物配列からの計算が含まれるが、これらに限定されない）を使用して決定することができる。ポリサッカリドは、天然に存在するものまたは天然に存在しないもの、合成のもの、または半合成のものであり得る。
【００３４】
用語「タンパク質」は、鎖長が少なくとも検出可能な三次構造を生成するのに十分であるポリペプチドを形成するためにペプチド結合によって相互に連結したアミノ酸のポリマーをいう。約１００ｋＤａを超える分子量を有するタンパク質を「高分子量タンパク質」と称することができるのに対して、約１００ｋＤａ未満の分子量を有するタンパク質を「低分子量タンパク質」と称することができる。用語「低分子量タンパク質」は、タンパク質と見なすのに必要な少なくとも三次構造の必要条件を欠いている小ペプチドを除外する。タンパク質の分子量を、当業者に公知の標準的な方法（質量分析（例えば、ＥＳＩ、ＭＡＬＤＩ）または既知のアミノ酸配列およびグリコシル化からの計算が含まれるが、これらに限定されない）を使用して決定することができる。タンパク質は、天然に存在するものまたは天然に存在しないもの、合成のもの、または半合成のものであり得る。
【００３５】
「親水性」は、水と容易に相互作用する強い極性基を有する物質をいう。親水性を、水（または緩衝水溶液）と水不混和性有機溶媒（オクタノール、塩化メチレン、またはメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）との間のその物質の分配係数を測定することによって定量することができる。平衡化後の化合物の濃度が有機溶媒中よりも水中で高い場合、その化合物は親水性であると見なされる。例えば、有機溶媒がオクタノールである場合、負のｌｏｇＰ値は化合物が親水性であることを示す。
【００３６】
「疎水性」とは、水に対する親和性を欠く（水をはじいて水を吸収しないように、また水に溶解しないか水と混合しない傾向がある）物質をいう。疎水性を、水（または緩衝水溶液）と水不混和性有機溶媒（オクタノール、塩化メチレン、またはメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）との間のその物質の分配係数を測定することによって定量することができる。平衡化後の化合物の濃度が水中よりも有機溶媒中で高い場合、その化合物は疎水性であると見なされる。例えば、有機溶媒がオクタノールである場合、正のｌｏｇＰ値は化合物が疎水性であることを示す。
【００３７】
用語「有効量」または「治療有効量」は、処置されている病態または病状の１つまたは複数の症状を処置、阻害、または軽減するために、あるいはそうでなければ所望の薬理学的および／または生理学的効果を得るために十分な投薬量を意味する。正確な投薬量は、被験体に依存する変動因子（例えば、年齢、免疫系の健康状態など）、疾患または障害、および施される処置などの種々の要因に依存する。有効量の効果は、コントロールとの比較であり得る。そのようなコントロールは当該分野で公知であり、本明細書中で考察されており、例えば、薬物または薬物の組み合わせの投与前または非存在下での被験体の病状であり得るか、薬物の組み合わせの場合、組み合わせの効果を、１つの薬物のみの投与の効果と比較することができる。
【００３８】
本明細書に提供される数値範囲は、所与の範囲内のすべての値を含む。別段の指定のない限り、これには、所与の最小値、所与の最大値、および最小値と最大値の間の値が含まれる。整数に関する数値範囲については、別段の指定のない限り、範囲は最小値と最大値の間のすべての整数を含む。
【００３９】
用語「約」の使用は、一般に、記載した値のおよそ±１０％の範囲の上または下のいずれかの値を示す；他の態様では、値は、記載した値のおよそ±５％の範囲の上または下のいずれかの値の範囲であり得る；他の態様では、値は、記載した値のおよそ±２％の範囲の上または下のいずれかの値の範囲であり得る；他の態様では、値は、記載した値のおよそ±１％の範囲の上または下のいずれかの値の範囲であり得る。前述の範囲は文脈によって明確にされることを意図し、さらなる制限は暗示されない。
【００４０】
ＩＩ．組成物
本明細書中に記載の組成物は、高分子性アニオンおよびアルキル鎖を有するカチオンの複合体を含む。組成物は、ヒトまたは他の哺乳動物などの被験体への局所投与に適している。組成物は、典型的には、電荷が中性である。
【００４１】
典型的には、複合体内の高分子性アニオンおよびカチオンは、水素結合、ファンデルワールス相互作用、静電相互作用、および立体配置（ｓｔｅａｒｉｃ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）などの非共有結合性相互作用によって会合している。複合体はイオン液体組成物（ＩＬ）を形成し、その一定の性質は、公開番号ＷＯ２０１５／０６６６４７（その関連部分が本明細書中で参照により援用される）に開示されている。
【００４２】
アルキル鎖長を有するカチオンと複合体形成した高分子性アニオンは、イオン液体組成物などの組成物を形成する。アルキル鎖を有するカチオンと複合体形成した特定の高分子性アニオンを、本明細書中で、「ローブドアニオン」（ローブドｓｉＲＮＡなど）という。
【００４３】
Ａ．イオン液体
イオン液体（ＩＬ）は、ほとんどの従来の塩が固体である温度またはそれに近傍の温度で液体である結晶性もしくは無定形の塩、双性イオン、またはそれらの混合物である。例えば、イオン液体は、２００℃未満、または１００℃未満、または８０℃未満の温度で液体状態にある。いくつかのイオン液体は、室温付近の融解温度（例えば、１０℃と４０℃との間または１５℃と３５℃との間）を有する。
【００４４】
イオン液体は、室温および標準圧力で液体状態である有機塩または有機塩の混合物である。
【００４５】
双性イオンは全体として中性に帯電した分子であり、分子内の異なる化学基に形式的な正電荷および負電荷を帯びている。イオン液体の例は、Ｒｉｄｕａｎら，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，４２：９０５５−９０７０，２０１３；Ｒａｎｔｗｉｊｋら，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１０７：２７５７−２７８５，２００７；Ｅａｒｌｅら，Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．，７２（７）：１３９１−１３９８，２０００；およびＳｈｅｌｄｏｎら，Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍ．，４：１４７−１５１，２００２に記載されている。
【００４６】
イオン液体は、少なくとも１つのアニオン成分および少なくとも１つのカチオン成分を含む。任意選択的に、ＩＬはさらなる水素結合供与体（すなわち、−ＯＨまたは−ＮＨ基を提供することができる任意の分子）を含み、例には、アルコール、脂肪酸、およびアミンが含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
少なくとも１つのアニオン性成分および少なくとも１つのカチオン性成分は任意のモル比で存在し得る。例示的なモル比（カチオン：アニオン）には、１：１、１：２、２：１、１：３、３：１、２：３、３：２、およびこれらの比の間の範囲が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
いくつかの態様では、ＩＬ組成物は深共晶溶媒（ＤＥＳ）である。ＤＥＳは、ＩＬ中の各成分のいずれかよりもはるかに低い融点を有する共晶を形成する混合物から構成される。例示的なＤＥＳには、コリンオレアート、コリンヘキサノアート、コリンゲラナート、コリンマロナート（マロン酸コリン二ナトリウム）、および尿素−コリンが含まれるが、これらに限定されない。これらにおいて処方物はＤＥＳであり、真のイオン液体ではないが、それは過剰のカルボキシラートが１：１のイオン対形成を妨げるからである。
【００４９】
１．高分子アニオン
複合体中の高分子アニオンは、典型的には、５００Ｄａを超える、任意選択的に７５０Ｄａを超える、８００Ｄａを超える、９００Ｄａを超える、１ｋＤａを超える、または５ｋＤａを超える分子量を有する。任意選択的に、高分子アニオンは、１０ｋＤａを超える、１５ｋＤａを超える、２０ｋＤａを超える、３０ｋＤａを超える、４０ｋＤａを超える分子量を有する。高分子アニオンのサイズは、一般に、５００ｋＤａ未満、４００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満、任意選択的に５０ｋＤａ未満である。例えば、高分子アニオンは、典型的には、５００Ｄａ〜５０ｋＤａ、５００Ｄａ〜１００ｋＤａ、５００Ｄａ〜３００ｋＤａ、５００Ｄａ〜４００ｋＤａ、５００Ｄａ〜５００ｋＤａ、７５０Ｄａ〜５０ｋＤａ、７５０Ｄａ〜１００ｋＤａ、７５０Ｄａ〜３００ｋＤａ、７５０Ｄａ〜４００ｋＤａ、７５０Ｄａ〜５００ｋＤａ、８００Ｄａ〜５０ｋＤａ、８００Ｄａ〜１００ｋＤａ、８００Ｄａ〜３００ｋＤａ、８００Ｄａ〜４００ｋＤａ、８００Ｄａ〜５００ｋＤａ、９００Ｄａ〜５０ｋＤａ、９００Ｄａ〜１００ｋＤａ、９００Ｄａ〜３００ｋＤａ、９００Ｄａ〜４００ｋＤａ、９００Ｄａ〜５００ｋＤａ、１ｋＤａ〜５０ｋＤａ、１ｋＤａ〜１００ｋＤａ、１ｋＤａ〜３００ｋＤａ、１ｋＤａ〜４００ｋＤａ、１ｋＤａ〜５００ｋＤａ、５ｋＤａ〜５０ｋＤａ、５ｋＤａ〜１００ｋＤａ、５ｋＤａ〜３００ｋＤａ、５ｋＤａ〜４００ｋＤａ、５ｋＤａ〜５００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜５０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜１００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜３００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜４００ｋＤａ、１０ｋＤａ〜５００ｋＤａ、１５ｋＤａ〜５０ｋＤａ、１５ｋＤａ〜１００ｋＤａ、１５ｋＤａ〜３００ｋＤａ、１５ｋＤａ〜４００ｋＤａ、または１５ｋＤａ〜５００ｋＤａの範囲内の分子量を有する。
【００５０】
ａ．核酸
治療的用途、診断的用途、予防的用途、栄養補助的用途、または薬物送達用途のための任意の核酸を、ＩＬ組成物中で使用することができる。適切な核酸には、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ＤＮＡアプタマー、ＤＮＡザイム、ＲＮＡアプタマー、外部ガイド配列、ＲＮＡ干渉分子（低分子干渉ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）など）、モルホリノ、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、長鎖遺伝子間非コードＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）、ならびにリボザイム、および三重鎖形成分子が含まれる。核酸は、核酸が細胞内に到達した時点で遺伝子の機能を調整することができる。
【００５１】
アンチセンス分子は、カノニカルまたは非カノニカルな塩基対合のいずれかを介して標的核酸分子と相互作用するようにデザインされている。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えば、ＲＮアーゼＨ媒介ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解を介して標的分子の破壊を促進するように、または標的分子上で通常起こるであろうプロセシング機能（転写または複製など）を妨害するようにデザインされている。好ましくは、アンチセンス分子は、１０−６、１０−８、１０−１０、または１０−１２またはそれ未満の解離定数（Ｋｄ）で標的分子に結合する。
【００５２】
アプタマーは、規定の二次構造および三次構造（ステムループまたはＧカルテットなど）に折り畳まれ、特定の標的を認識するように進化した、１５〜５０塩基長の範囲の小核酸である。アプタマーを所望の標的に進化させる方法は、当該分野で公知である。任意選択的に、アプタマーは、１０−６未満、１０−８未満、１０−１０未満、または１０−１２未満のＫｄで標的分子に結合する。好ましくは、アプタマーは、非常に高度の特異性で標的分子に結合することができる。
【００５３】
好ましいリボザイムは、ＲＮＡ基質またはＤＮＡ基質を切断し、より好ましくは、ＲＮＡ基質を切断する。
【００５４】
三重鎖形成核酸分子は、二本鎖核酸または一本鎖核酸のいずれかと相互作用する。好ましくは、三重鎖形成分子は、１０−６未満、１０−８未満、１０−１０未満、または１０−１２未満のＫｄで標的分子に結合する。
【００５５】
外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、標的核酸分子と結合して複合体を形成し、この複合体がＲＮアーゼＰによって認識され、次いで、ＲＮアーゼＰが標的分子を切断する。ＥＧＳは、最適なＲＮＡ分子を特異的に標的にするようにデザインすることができる。種々の異なる標的分子の切断を容易にするためのＥＧＳ分子を作製および使用する方法は、当該分野で公知である。
【００５６】
遺伝子発現を、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介した非常に特異性の高い様式で効率的に抑制することもできる。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導することができ、それによって遺伝子発現を減少させるか、阻害をもすることができる二本鎖ＲＮＡである。配列特異的遺伝子を、哺乳動物細胞において酵素ダイサーによって産生されるｓｉＲＮＡを模倣する合成短二本鎖ＲＮＡを用いてサイレンシングすることができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ら  Ｎａｔｕｒｅ，４１１：４９４  ４９８（２００１））（Ｕｉ−Ｔｅｉ，ら  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４７９：７９−８２（２０００））。ｓｉＲＮＡを、化学合成するかｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することができ、あるいは、ｓｉＲＮＡは、細胞内でｓｉＲＮＡにプロセシングされる短い二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の結果であり得る。合成ｓｉＲＮＡを、一般に、アルゴリズムおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いてデザインする。供給業者には、ＡＭＢＩＯＮ（登録商標）（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘａｓ）、ＣＨＥＭＧＥＮＥＳ（登録商標）（Ａｓｈｌａｎｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、ＤＨＡＲＭＡＣＯＮ（登録商標）（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、ＭＷＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｓｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＰＲＯＬＩＧＯ（登録商標）（Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、およびＱＩＡＧＥＮ（登録商標）（Ｄｕｓｓｅｌｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれる。ｓｉＲＮＡを、ＡｍｂｉｏｎのＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡ構築キットなどのキットを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成することもできる。
【００５７】
他の有用な核酸分子には、ＣＲＩＳＰＲ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）（すなわち、修飾ＲＮＡヌクレオチド（例えば、Ｂｒａａｓｃｈ，ら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，８（１）：１−７（２００１）を参照のこと））、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。
【００５８】
ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）は、塩基配列の多数の短く直接的な反復を含むＤＮＡ遺伝子座の頭字語である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用したゲノム編集で用いる組成物を調製する方法は、ＷＯ２０１３／１７６７７２およびＷＯ２０１４／０１８４２３に詳述されている。
【００５９】
例示的なＺＦＮは、例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号、および同第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉら、Ｐｒｏｃ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９（１９９２）：４２７５−４２７９；Ｌｉら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２７６４−２７６８（１９９３）；Ｋｉｍら  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１：８８３−８８７（１９９４ａ）；Ｋｉｍら  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８−３１，９８２（１９９４ｂ）に開示されている。
【００６０】
ＴＡＬＥＮは、その全体的な構造がＺＦＮと類似しており、主な相違点は、ＤＮＡ結合ドメインがＴＡＬエフェクタータンパク質（植物病原性細菌由来の転写因子）に由来することである。特定の核酸に結合するようにＴＡＬを操作する方法は、Ｃｅｒｍａｋら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１−１１（２０１１）；米国特許出願公開第２０１１／０１４５９４０号、およびＭｉｌｌｅｒら  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２９：１４３（２０１１）に記載されている。ＴＡＬＥＮ結合ドメインの一般的なデザイン原理を、例えば、ＷＯ２０１１／０７２２４６に見出すことができる。
【００６１】
ＰＮＡを化学的にアセンブリする方法は公知である。例えば、米国特許第５，５３９，０８２号；同第５，５２７，６７５号；同第５，６２３，０４９号；同第５，７１４，３３１号；同第５，７３６，３３６号；同第５，７７３，５７１号；および同第５，７８６，５７１号を参照のこと。
【００６２】
モルホリノベースのサブユニットの性質には、典型的には以下が含まれる：安定な非荷電主鎖結合によってオリゴマー形態で結合する能力；形成されたポリマーが、相補的塩基標的核酸（標的ＲＮＡが含まれる）と、高い融解温度で１０〜１４塩基の短さのオリゴマーとでさえもハイブリッド形成することができるように、ヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、ウラシル、またはイノシン）を支持する能力；オリゴマーを哺乳動物細胞に能動輸送する能力；およびオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二本鎖がＲＮアーゼ分解に抵抗する能力。
【００６３】
ｂ．ベクター
適切なウイルスベクターには、組み換えのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびバキュロウイルスが含まれる。これらの発現ベクターは、当該分野で周知である（Ｂｏｅｃｋｌｅ  ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ，Ｔｈｅ  ＡＡＰＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，８（４）：Ｅ７３１−Ｅ７４２（２００６）；Ｈｕ，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｉｎｉｃａ，２６（４）：４０５−４１６（２００５））。細菌発現ベクター（プラスミド、コスミド、ファージミド、およびこれらの等価物が含まれる）は当該分野で公知であり、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ．Ｃｈａｐｔｅｒ  ２−Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｐｌａｓｍｉｄｓ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ．Ｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ（６ｔｈ  ｅｄ．）．（２０１０）Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ．ＩＳＢＮ  ９７８−１４０５１８１７３０で詳細に考察されている。
【００６４】
ｃ．ペプチドおよびタンパク質
一定の態様では、高分子アニオンは、ペプチドまたはタンパク質である。適切なペプチドまたはタンパク質には、健康な皮膚細胞または罹患した皮膚細胞に導入することが必要であるか望ましい任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。例えば、皮膚細胞に対して抗老化応答、抗炎症性応答、抗原性応答、抗増殖性応答、または抗アポトーシス性応答を付与するペプチドは、高分子性アニオンとして適切であり得る。
【００６５】
適切なペプチドおよびタンパク質には、構造タンパク質（コラーゲンなど）、酵素（アルギナーゼ、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、グルタチオンレダクターゼ、リパーゼなど）、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、インターフェロン、サイトカイン、および腫瘍抗原（黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）など）などが含まれる。
【００６６】
ｄ．ポリサッカリド
一定の態様では、高分子アニオンはポリサッカリドであり得る。ポリサッカリドは、ポリサッカリドが正味の負電荷を有することを条件として、中性、正電荷、または負電荷のモノサッカリド単位を含むことができる。１つまたは複数のモノサッカリド単位は、直鎖状または環状であり得る。環状単位は、α−アノマーまたはβ−アノマーと、Ｌ−異性体またはＤ−異性体との任意の組み合わせであり得る。ポリサッカリドは、天然由来のものまたは合成由来のものであり得る。
【００６７】
ポリサッカリドは、約１ｋＤａと約２，０００ｋＤａとの間（両端の値を含む）、約１ｋＤａと約１００ｋＤａとの間（両端の値を含む）、約１ｋＤａと約５０ｋＤａとの間（両端の値を含む）、約１ｋＤａと約２０ｋＤａとの間（両端の値を含む）、約３ｋＤａと約６ｋＤａとの間（両端の値を含む）、または約１０ｋＤａと２０ｋＤａとの間（両端の値を含む）の分子量を有し得る。いくつかの態様では、ポリサッカリドは、５００ｋＤａを超える、７５０ｋＤａを超える、またはさらに２，０００ｋＤａを超える分子量を有し得る。
【００６８】
一定のポリサッカリドは、約５００ｋＤａと約２，０００ｋＤａとの間（両端の値を含む）、約５００ｋＤａと約７５０ｋＤａとの間（両端の値を含む）、または約７５０ｋＤａと約２，０００ｋＤａとの間（両端の値を含む）の分子量を有し得る。他の態様では、ポリサッカリドは、１，０００Ｄａ未満、好ましくは約３００Ｄａと約１，０００Ｄａとの間（両端の値を含む）の分子量を有し得る。
【００６９】
好ましい炭水化物には、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）（低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）、コンドロイチン、ケラチン、およびヒアルロン酸が含まれるが、これらに限定されない）が含まれる（Ｙｉｐら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，２００６，５：２１３９−２１４８）。
【００７０】
他の有用なポリサッカリドには、ネクパラニブ（Ｍ４０２、Ｍｏｍｅｎｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、ヘパリン硫酸または未分画ヘパリン（ＵＦＨ）、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）（エノキサパリン（ラブノックス（登録商標））、ダルテパリン（フラグミン（登録商標））、ナドロパリンカルシウム（フラキシパリン（登録商標））、チンザパリン（イノヘップ（登録商標））、アルデパリン（ノルミフロ（登録商標））、デリンゴパリン、ベミパリン、レビパリン、もしくはセルトパリンなど）、または非抗凝固性ヘパリン（Ｏ−脱硫酸化ヘパリン（ＯＤＳＨ）など）、スロデキシド、カードラン硫酸、アカルボース（グルコバイ（登録商標））、フォンダパリヌクス（アリキストラ（登録商標））、ヒアルロン酸ナトリウム（オルソビスク（登録商標））、サイレキシン（ＣＹ−１５０３）、リビパンセル（ＧＭＩ−１０７０）、ＧＳＣ−１５０、Ｍａｎα（１−２）Ｍａｎ、シアリルルイスａ、シアリルルイスｘおよびこれらの模倣物、ＧＱ１ｂαおよびその模倣物、ならびにＬｅｗｉｓａおよびその模倣物（Ｅｒｎｓｔら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２００９，８：６６１−７７）、スロデキシド（ＳＵＬＯＮＥＸ（登録商標）、Ｋｅｒｙｘ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が含まれる。
【００７１】
他の態様では、ポリサッカリドは、植物または真菌由来の化合物（ペクチン、ガラクトマンナン／マンノグリカン、キシログルカン、またはベータグルカン／レンチナンなど）であり得る。他の適切なポリサッカリドには、キトサン、フコイダン、ガラクタン、カラギーナン、ｋ−カラギーナン、ガラクトフカン、マンノグルコロノフカン、アラビノガラクタン、キシロマンナン硫酸、キシロガラクトフカン、ウルバン、デキストラン、ならびにこれらの誘導体、およびＣｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０，２０１０：１−７；またはＰａｔｅｌ，３  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０１２，２：１７１−１８５）などに記載の他の化合物が含まれる。
【００７２】
ポリサッカリド、ヘパリン、エノキサパリン、ダルテパリン、ナドロパリン、チンザパリン、およびデリンゴパリン、ＯＤＳＨ、非抗凝固性ヘパリン（ｎｏｎ−ａｎｔｉｇｏａｇｕｌａｔｉｎｇ  ｈｅｐａｒｉｎ）、およびスロデキシドは、不妊症、吸入傷害、炎症、外陰痛、潰瘍性大腸炎、糖尿病性足部潰瘍、妊娠合併症、熱傷、嚢胞性線維症、肺の状態、陣痛、ミクロアルブミン尿、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、および血管閉塞性癌、ならびに結腸の腺癌などの状態における有効性について臨床試験で試験されてきた（Ｐａｇｅ，ＩＳＲＮ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２０１３，２０１３：１−１３）。
【００７３】
フコイダンは、抗酸化効果、免疫賦活効果、脂質低下効果、抗菌効果、および抗高血圧（ａｎｔｉｈｙｐｅｒｐｅｉｓｉｃ）効果が注目されている。フコイダンおよびウルバンは、創傷治癒のため、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ制御薬物放出のためのナノ医療においても使用されている（Ｐａｔｅｌ、３  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０１２、２：１７１−１８５）。
【００７４】
ガラクタン、カラギーナン、およびｋ−カラギーナンは、抗酸化効果、免疫賦活効果、抗炎症効果および抗侵害受容効果、抗凝固効果および抗ウイルス効果を示す。ガラクトフカンおよびマンノグルコロノフカンは、抗腫瘍効果を有し得る。アラビノガラクタン（ａｒａｂｉｎｏｇａｌａｃｔａｎｔ）は、抗凝固効果および抗血栓効果を有し得る。キシロマンナン硫酸およびキシロガラクトフカンは、特に、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、およびヒト免疫不全ウイルスなどのウイルスに対して高ウイルス効果を示す（Ｐａｔｅｌ，３  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０１２，２：１７１−１８５）。
【００７５】
デキストランは、分枝ポリサッカリドである。デキストランならびに多数のその天然に存在する誘導体および合成誘導体の両方が抗トロンビン活性を示す。
【００７６】
被験体への局所投与のための特定のポリサッカリド群には、アルギナート、寒天、アルギン酸（アライン）、カラゲーン、キチン、キトサン、グルカン、カルボキシメチル−グルカン（ＣＭ−グルカン）、キチン−グルカン、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、デキストリン、グリコーゲン、グアールガム、アラビアゴム、蜂蜜、ヒドロキシプロピルデンプンホスファート、ヒアルロン酸、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、ムコ多糖（グルコサミノグリカン）、ペクチン、糖テンシド、海藻ポリサッカリド、フカン、フコイダン、トラガカント（ｔｒａｇａｎｔ）（Ｅ４１３）、キサンタンガム、それらの誘導体、およびそれらの組み合わせ、好ましくはヒアルロン酸などのポリサッカリドが含まれる。
【００７７】
他の態様では、ポリサッカリドを、活性薬剤（ワクチン、タンパク質、または小分子など）に抱合することができる。ポリサッカリドに抱合することができる例示的なワクチンには、ヘモフィルスｂワクチン、肺炎球菌ワクチン、および髄膜炎菌ワクチンが含まれる。ポリサッカリドに抱合することができる例示的なタンパク質には、トリコサンチン、上皮成長因子、ならびに抗癌酵素であるアスパラギナーゼおよびカルボキシペプチダーゼＧ２が含まれる。ポリサッカリドに抱合することができる例示的な小分子治療薬には、ドキソルビシン、シスプラチン、カンプトテシン、マイトマイシン、メトトレキサート、およびパクリタキセルが含まれる。
【００７８】
２．カチオン
複合体中のアルキル鎖を有する適切なカチオンは、カチオン性界面活性剤を含む。カチオン性界面活性剤は、以下の一般式：
【化１】
2019526626.tif 000002
を有し、
式中、
Ｑは窒素（Ｎ）またはリン（Ｐ）であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、存在しないか、水素、置換アルキル、非置換アルキル、置換アルケニル、非置換アルケニル、置換アルキニル、非置換アルキニル、置換アルコキシ、非置換アルコキシ、置換アミノ、非置換アミノ、置換アルキルアミノ、非置換アルキルアミノ、置換アルキルチオ、または非置換アルキルチオ、置換アリール、非置換アリール、置換ヘテロアリール、非置換ヘテロアリール、置換Ｃ３〜Ｃ３０シクロアルキル、非置換Ｃ３〜Ｃ３０シクロアルキル、置換ヘテロシクリル、非置換ヘテロシクリルであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の任意の対を独立して組み合わせて５員環および／または６員環を形成し、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の任意の対の組み合わせから形成された前述の５員環および／または６員環は、任意選択的に、さらなるヘテロ原子を含む。
【００７９】
いくつかの態様では、任意選択的にさらなるヘテロ原子を含むＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の任意の対の組み合わせから形成された前記５員環および／または６員環は、複素環または芳香族複素環であり得る。
【００８０】
いくつかの態様では、カチオン性界面活性剤は、前述の式Ｉの一般式を有し、但し、カチオン性界面活性剤が、セチルトリメチルアンモニウム、デシルトリメチルアンモニウム、ベンジルジメチルドデシルアンモニウム、ミリスチルトリメチルアンモニウム、ドデシルピリジニウムのいずれでもないことを例外とする。
【００８１】
いくつかの態様では、カチオン性界面活性剤は、前述の式Ｉの一般式を有し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの少なくとも１つが、独立して、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルである。
【００８２】
いくつかの態様では、カチオン性界面活性剤は、前述の式Ｉの一般式を有し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの少なくとも１つが、独立して、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルであり、但し、カチオン性界面活性剤がベンジルジメチルドデシルアンモニウムではないことを例外とする。
【００８３】
いくつかの態様では、カチオン性界面活性剤は、前述の式Ｉの一般式を有し、Ｒ１が、独立して、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が、独立して、置換アルキルまたは非置換アルキルであり、但し、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が置換アルキルである場合、置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルではないことを条件とする。
【００８４】
いくつかの態様では、カチオン性界面活性剤は、前述の式Ｉの一般式を有し、Ｒ１が、独立して、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が、独立して、置換アルキルまたは非置換アルキルであり、但し、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が置換アルキルである場合、置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルではないことを条件とし、但し、前記カチオン性界面活性剤はベンジルジメチルドデシルアンモニウムではないことを条件とする。
【００８５】
上記の任意のカチオン性界面活性剤は、鎖内の最長の数の連続的に結合した炭素原子によって定義する場合、種々の長さ（すなわち、鎖長）の炭素鎖を含むことができる。鎖長は、３個と２０個との間（両端の値を含む）の炭素原子であり得る。
【００８６】
いくつかの態様では、電荷が中性で、疎水性を示し、皮膚に対して刺激のない複合体を形成するために、鎖長は変動し、この鎖長は高分子性アニオンの全電荷に依存し得る。
【００８７】
いくつかの態様では、複合体を形成するカチオン性界面活性剤は、以下に示す式：
【化２】
2019526626.tif 000003
（式中、ｎは、３と１９との間の任意の整数（３または１９が含まれる）である）を有する。式ＩＩの範囲内のカチオン性界面活性剤の例を、表４および５に示す。
【００８８】
いくつかの態様では、複合体中のカチオン性界面活性剤は式ＩＩの式を有し、但し、カチオン性界面活性剤がベンジルジメチルドデシルアンモニウムではないことを例外とする。
【００８９】
いくつかの態様では、複合体中のカチオン性界面活性剤は、式ＩＩ（式中、ｎは、６、１２、または１６である）の式を有する。これらのカチオン性界面活性剤はまた、一般に、それぞれ、ベンジルジメチルオクチルアンモニウム、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、またはベンジルジメチルステアリルアンモニウムと呼ばれる。
【００９０】
カチオン性界面活性剤中の炭素鎖の長さは、カチオン：アニオン複合体の疎水性、カチオン：アニオン複合体の流体力学的サイズ、および複合体の凝集力に影響を及ぼし得る。例えば、実施例１、表２および３、ならびに図１は、アニオンは不変のままであるが（ｓｉＲＮＡ１）、アルキル鎖長の長さは複合体の疎水性、流体力学的サイズ、および凝集特性に影響を及ぼすことを示す。
【００９１】
本明細書中に記載されているか本明細書中の表または実施例で言及されているカチオン性界面活性剤類または特定のカチオン性界面活性剤を、具体的に含めるか、排除するか、あるいは本明細書中に記載されているまたは本明細書中の表もしくは実施例で言及されているアニオン性高分子類または特定のアニオン性高分子と任意の組み合わせで組み合わせることができると理解すべきである。
【００９２】
Ｃ．任意選択的なさらなる治療剤、診断剤、予防剤、および／または栄養補給剤
上記の複合体に加えて、組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで治療効果、診断効果、予防効果、または栄養学的効果を提供する１つまたは複数のさらなる化学分子または生体分子を任意選択的にさらに含む。分子（本明細書中で、「薬物」ともいう）は、処置または予防される疾患または障害に基づいて選択される。薬物は、タンパク質またはペプチドなどの小分子または高分子であり得る。
【００９３】
広範囲の薬物を、さらなる薬剤として（すなわち、複合体中の薬剤に加えて）組成物に含み得る。
【００９４】
組成物は一般に電荷が中性であるが、さらなる薬物は正または負に帯電することが可能であり、薬物自体の対イオンを含むことができ、この対イオンは高分子イオンの中和に使用されたものと同じであるか異なり得る。薬物の中和に適切な対イオンには、生物学的用途に適切なイオン（ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、塩化物イオン、リン酸イオン、および硫酸イオンなど）が含まれる。
【００９５】
あるいは、さらなる薬物は、電荷が中性であり得る。
【００９６】
組成物中での使用が意図される薬物には、以下の薬物のカテゴリーおよび例ならびにこれらの薬物の代替形態（代替塩形態、遊離酸形態、遊離塩基形態、および水和物など）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
鎮痛薬／解熱薬（例えば、アスピリン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、ナプロキセンナトリウム、ブプレノルフィン、塩酸プロポキシフェン、ナプシル酸プロポキシフェン、塩酸メペリジン、塩酸ヒドロモルフォン、モルヒネ、オキシコドン、コデイン、重酒石酸ジヒドロコデイン、ペンタゾシン、重酒石酸ヒドロコドン、レボルファノール、ジフルニサル、サリチル酸トロラミン、塩酸ナルブフィン、メフェナム酸、ブトルファノール、サリチル酸コリン、ブタルビタール、クエン酸フェニルトロキサミン、クエン酸ジフェンヒドラミン、メトトリメプラジン、塩酸シンナメドリン、およびメプロバマート）；
抗生物質（例えば、ネオマイシン、ストレプトマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポリン、アンピシリン、ペニシリン、テトラサイクリン、およびシプロフロキサシン）；
抗糖尿病薬（例えば、ビグアニドおよびスルホニル尿素誘導体）；
抗真菌剤（例えば、グリセオフルビン、ケトコナゾール、イトラコナゾール（ｉｔｒａｃｏｎｉｚｏｌｅ）、アンホテリシンＢ、ナイスタチン、およびカンジシジン）；
血圧降下剤（例えば、プロプラノロール、プロパフェノン、オクスプレノロール（ｏｘｙｐｒｅｎｏｌｏｌ）、ニフェジピン、レセルピン、トリメタファン、フェノキシベンズアミン、パルギリン塩酸塩、デセルピジン、ジアゾキシド、モノ硫酸グアネチジン、ミノキシジル、レシンナミン、ニトロプルシッドナトリウム、インドジャボク、アルセロキシロン、およびフェントラミン）；
抗炎症剤（例えば、（非ステロイド性）インドメタシン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、ナプロキセン、イブプロフェン、ラミフェナゾン、ピロキシカム、（ステロイド性）コルチゾン、デキサメタゾン、フルアザコート、セレコキシブ、ロフェコキシブ、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、およびプレドニゾン）；
抗新生物薬（例えば、シクロホスファミド、アクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、マイトマイシン、メトトレキサート、フルオロウラシル、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、メチル−ＣＣＮＵ、シスプラチン、エトポシド、カンプトセシンおよびその誘導体、フェネステリン、パクリタキセルおよびその誘導体、ドセタキセルおよびその誘導体、ビンブラスチン、ビンクリスチン、タモキシフェン、およびピポスルファン）；
免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、ミゾリビン、およびＦＫ５０６（タクロリムス））；
抗片頭痛剤（例えば、エルゴタミン、プロプラノロール、ムチン酸イソメテプテン、およびジクロラルフェナゾン）；
抗狭心症剤（例えば、β−アドレナリン遮断薬；カルシウムチャネル遮断薬（ニフェジピンおよびジルチアゼムなど）；および硝酸塩（ニトログリセリン、二硝酸イソソルビド、四硝酸ペンタエリスリトール、および四硝酸エリスリチルなど））；
抗関節炎剤（例えば、フェニルブタゾン、スリンダク、ペニシラミン、サルサラート、ピロキシカム、アザチオプリン、インドメタシン、メクロフェナマート、金チオリンゴ酸ナトリウム、ケトプロフェン、オーラノフィン、オーロチオグルコース、およびトルメチンナトリウム）；
抗痛風剤（例えば、コルヒチンおよびアロプリノール）；
抗凝固薬（例えば、ヘパリン、ヘパリンナトリウム、およびワルファリンナトリウム）；
血栓溶解剤（例えば、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、およびアルテプラーゼ）；
抗線維素溶解剤（例えば、アミノカプロン酸）；
血液動態剤（例えば、ペントキシフィリン）；
抗血小板薬（例えば、アスピリン）；
抗ヒスタミン薬／止痒薬（例えば、ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、クロルフェニラミン、マレイン酸ブロムフェニラミン、シプロヘプタジン塩酸塩、テルフェナジン、フマル酸クレマスチン、トリプロリジン、カルビノキサミン、ジフェニルピラリン、フェニンダミン、アザタジン、トリペレンナミン、マレイン酸デクスクロルフェニラミン、メトジラジン、および）；
カルシウム調節に有用な薬剤（例えば、カルシトニンおよび副甲状腺ホルモン）；
抗菌剤（例えば、硫酸アミカシン、アズトレオナム、クロラムフェニコール、パルミチン酸クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クリンダマイシン、パルミチン酸クリンダマイシン、リン酸クリンダマイシン、メトロニダゾール、メトロニダゾール塩酸塩、硫酸ゲンタマイシン、塩酸リンコマイシン、硫酸トブラマイシン、バンコマイシン塩酸塩、硫酸ポリミキシンＢ、コリスチメタートナトリウム、および硫酸コリスチン）；
抗ウイルス剤（例えば、インターフェロンα、β、またはγ、ジドブジン、塩酸アマンタジン、リバビリン、およびアシクロビル）；
抗菌薬（例えば、セファロスポリン（セファゾリンナトリウム、セフラジン、セファクロール、セファピリンナトリウム、セフチゾキシムナトリウム、セフォペラゾンナトリウム、セフォテタン二ナトリウム、セフロキシムｅアゾチル、セフォタキシムナトリウム、セファドロキシル一水和物、セファレキシン、セファロチンナトリウム、塩酸セファレキシン一水和物、セファマンドールナファート、セフォキシチンナトリウム、セフォニシドナトリウム、セフォラニド、セフトリアキソンナトリウム、セフタジジム、セファドロキシル、セフラジン、およびセフロキシムナトリウムなど）；ペニシリン（アンピシリン、アモキシシリン、ペニシリンＧベンザチン、シクラシリン、アンピシリンナトリウム、ペニシリンＧカリウム、ペニシリンＶカリウム、ピペラシリンナトリウム、オキサシリンナトリウム、塩酸バカンピシリン、クロキサシリンナトリウム、チカルシリン二ナトリウム、アズロシリンナトリウム、カルベニシリンインダニルナトリウム、ペニシリンＧプロカイン、メチシリンナトリウム、およびナフシリンナトリウムなど）；エリスロマイシン（エチルコハク酸エリスロマイシン、エリスロマイシン、エリスロマイシンエストラート、ラクトビオン酸エリスロマイシン、ステアリン酸エリスロマイシン、およびエチルコハク酸エリスロマイシンなど）；ならびにテトラサイクリン（塩酸テトラサイクリン、ドキシサイクリンヒクラート、ミノサイクリン塩酸塩、アジスロマイシン、クラリスロマイシンなど））；
抗感染薬（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）；
ステロイド性の化合物、ホルモン、およびホルモンアナログ（例えば、インクレチンおよびインクレチン模倣物（ＧＬＰ−１およびエクセナチドなど）、アンドロゲン（ダナゾール、シピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン、エチルテストステロン、エナント酸テストステロン、メチルテストステロン、およびフルオキシメステロンなど）；エストロゲン（エストラジオール、エストロピパート、および結合型エストロゲンなど）；プロゲスチン（メトキシプロゲステロン酢酸エステルおよび酢酸ノルエチンドロンなど）；コルチコステロイド（トリアムシノロン、ベタメタゾン、ベタメタゾンリン酸エステルナトリウム、デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム、酢酸デキサメタゾン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン酢酸エステル懸濁剤、トリアムシノロンアセトニド、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロンリン酸エステルナトリウム、メチルプレドニゾロンコハク酸エステルナトリウム、ヒドロコルチゾンコハク酸エステルナトリウム、トリアムシノロンヘキサアセトニド、ヒドロコルチゾン、シピオン酸ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、酢酸フルドロコルチゾン、酢酸パラメタゾン、テブト酸プレドニゾロン、および酢酸プレドニゾロンなど）；ならびに甲状腺ホルモン（レボチロキシンナトリウムなど））；
血糖降下剤（例えば、ヒトインスリン、精製ウシインスリン、精製ブタインスリン、組み換えインスリン、インスリンアナログ、グリブリド、クロルプロパミド、グリピジド、トルブタミド、およびトラザミド）；
脂質低下剤（例えば、クロフィブラート、デキストロサイロキシンナトリウム、プロブコール、プラバスタチン（ｐｒａｖａｓｔｉｔｉｎ）、アトルバスタチン、ロバスタチン、およびナイアシン）；
赤血球生成刺激に有用な薬剤（例えば、エリスロポエチン）；
油溶性ビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫなど）；
ならびに他の薬剤（ミトタン、ハロニトロソ尿素、アントラサイクリン（ａｎｔｈｒｏｃｙｃｌｉｎｅ）、およびエリプチシンなど）。
【００９８】
これらの有用な薬物クラスおよび他のクラスの説明ならびに各クラス内の種のリストを、Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅ，Ｔｈｅ  Ｅｘｔｒａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，３０ｔｈ  Ｅｄ．（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ  １９９３）（その開示全体が本明細書中で参照により援用される）に見出すことができる。
【００９９】
Ｄ．例示的な複合体
上記のアニオンおよびカチオンを組み合わせてＩＬを形成することができる。例えば、核酸、ベクター、アニオン性のペプチドまたはタンパク質、アニオン性ポリサッカリド、およびその組み合わせを、式Ｉのカチオンと組み合わせることができる。例示的な複合体には、以下が含まれる。
【０１００】
（ｉ）ｓｉＲＮＡとカチオン界面活性剤との複合体の例
いくつかの形態では、ＩＬは、上記のように式Ｉのカチオン界面活性剤と複合体化したｓｉＲＮＡを含み、式Ｉにおいて、（ｉ）カチオン性界面活性剤がセチルトリメチルアンモニウム、デシルトリメチルアンモニウム、ベンジルジメチルドデシルアンモニウム、ミリスチルトリメチルアンモニウム、またはドデシルピリジニウムではないことを例外とし；（ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの少なくとも１つが、独立して、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルであり；（ｉｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの少なくとも１つが、独立して、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルであり、ここで、カチオン性界面活性剤がベンジルジメチルドデシルアンモニウムではなく；（ｉｖ）Ｒ１が、独立して、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が、独立して、置換アルキルまたは非置換アルキルであり、但し、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が置換アルキルである場合、置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルではないことを条件とし；または（ｉｖ）Ｒ１が、独立して、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が、独立して、置換アルキルまたは非置換アルキルであり、但し、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が置換アルキルである場合、置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルではないことを条件とし、ここで、カチオン性界面活性剤がベンジルジメチルドデシルアンモニウムではない。
【０１０１】
いくつかの形態では、ＩＬは、式ＩＩ
【化３】
2019526626.tif 000004
（式中、ｎは、３と１９との間の任意の整数（３または１９が含まれる）である）のカチオン性界面活性剤と複合体化したｓｉＲＮＡを含み、但し、カチオン性界面活性剤がベンジルジメチルドデシルアンモニウムではないことを例外とし、ここで、ｓｉＲＮＡは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびその組み合わせから選択される。
【０１０２】
いくつかの形態では、ＩＬは、ヒドロキシエチルトリメチルアンモニウム、テトラデシルトリメチルアンモニウム、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、ベンジルジメチルステアリルアンモニウム、およびその組み合わせから選択されるカチオン性界面活性剤と複合体化したｓｉＲＮＡを含み、ここで、ｓｉＲＮＡは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびその組み合わせから選択される。
【０１０３】
いくつかの形態では、ＩＬは、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、ベンジルジメチルステアリルアンモニウム、およびその組み合わせから選択されるカチオン性界面活性剤と複合体化したｓｉＲＮＡを含み、ここで、ｓｉＲＮＡは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、およびその組み合わせから選択される。
【０１０４】
（ｉｉ）アニオン性ポリサッカリドおよびカチオン性界面活性剤との複合体の例
いくつかの形態では、ＩＬは、式Ｉのカチオン界面活性剤と複合体化したアニオン性ポリサッカリドを含む。
【０１０５】
いくつかの形態では、ＩＬは、上記のように式Ｉのカチオン界面活性剤と複合体化したアニオン性ポリサッカリド（例えば、ヒアルロン酸、アルギナート、アルギン酸、グリコサミノグリカンなど）を含み、式Ｉにおいて、（ｉ）カチオン性界面活性剤が、セチルトリメチルアンモニウム、デシルトリメチルアンモニウム、ベンジルジメチルドデシルアンモニウム、ミリスチルトリメチルアンモニウム、ドデシルピリジニウムのいずれでもなく；（ｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの少なくとも１つが、独立して、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルであり；（ｉｉｉ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの少なくとも１つが、独立して、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルであり、ここで、カチオン性界面活性剤がベンジルジメチルドデシルアンモニウムではなく；（ｉｖ）Ｒ１が、独立して、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が、独立して、置換アルキルまたは非置換アルキルであり、但し、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が置換アルキルである場合、置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルではないことを条件とし；または（ｉｖ）Ｒ１が、独立して、置換アルキルであり、ここで、置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が、独立して、置換アルキルまたは非置換アルキルであり、但し、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４が置換アルキルである場合、置換アルキルは、置換アラルキルまたは非置換アラルキルではないことを条件とし、ここで、カチオン性界面活性剤がベンジルジメチルドデシルアンモニウムではないことを例外とする。
【０１０６】
いくつかの形態では、ＩＬは、式ＩＩ
【化４】
2019526626.tif 000005
（式中、ｎは、３と１９との間の任意の整数（３または１９が含まれる）である）のカチオン性界面活性剤と複合体化したヒアルロン酸、アルギナート、アルギン酸、グリコサミノグリカン、およびその組み合わせ、好ましくはヒアルロン酸を含み、但し、カチオン性界面活性剤がベンジルジメチルドデシルアンモニウムではないことを例外とする。
【０１０７】
いくつかの形態では、ＩＬは、ヒドロキシエチルトリメチルアンモニウム、テトラデシルトリメチルアンモニウム、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、ベンジルジメチルステアリルアンモニウム、およびその組み合わせから選択されるカチオン性界面活性剤と複合体化したヒアルロン酸、アルギナート、アルギン酸、グリコサミノグリカン、およびその組み合わせ、好ましくはヒアルロン酸を含む。
【０１０８】
いくつかの形態では、ＩＬは、ヒドロキシエチルトリメチルアンモニウム、テトラデシルトリメチルアンモニウム、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウム、ベンジルジメチルステアリルアンモニウム、およびその組み合わせから選択されるカチオン性界面活性剤と複合体化したヒアルロン酸を含む。
【０１０９】
Ｅ．組成物の性質
カチオンおよび高分子性アニオンは、典型的には電荷的中性であり、皮膚バリアを横切って皮膚細胞に侵入するのに十分に疎水性である複合体を形成する。さらに、組成物は、一般に、皮膚に対して刺激性がない。
【０１１０】
１．電荷的中性
典型的には、組成物は電荷が中性である。
【０１１１】
組成物に含まれる複合体において、種々のアルキル鎖長を含み得るカチオンと高分子性アニオンとは、典型的には１：１の電荷比で混合される。しかし、他の電荷比を使用して、種々のアルキル鎖長のカチオンと高分子性アニオンとを混合することができる（例えば、適切な電荷比（アルキル鎖カチオン上の電荷に対する高分子性アニオン上の電荷）には、０．５：１、１：１、または２：１、およびその間の比が含まれる）。いくつかの態様では、種々のアルキル鎖長のカチオンおよび高分子性アニオンは、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、もしくは１０：１のモル比、または複合体全体に電荷的中性を付与するための任意の適切なモル比で混合される。高分子性アニオン上の電荷とアルキル鎖カチオン上の電荷との比が１（１：１）から逸脱する場合、複合体上の電荷を中和するのに十分な量のさらなる対イオンが存在し得る。薬物の中和に適切な対イオンには、生物学的用途に適切なイオン（ナトリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、塩化物イオン、リン酸イオン、および硫酸イオンなど）が含まれる。
【０１１２】
組成物の電荷的中性を、複合体中のイオンに加えて他のイオンを含めることによって付与することができる。例えば、高分子性イオン複合体を、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液中に懸濁または溶解することができる。
【０１１３】
２．組成物中の複合体の疎水性
形成された複合体の疎水性を、Ｌｏｇ１０値で示されるオクタノール／水分配係数（Ｐｏ／ｗ）によって特徴づけることができる（表２）。典型的には、種々のアルキル鎖長を有するカチオンと高分子性アニオンとの複合体の疎水性は、高分子性アニオンのオクタノール／水分配係数（Ｐｏ／ｗ）によって決定したところ、高分子アニオンがナトリウムイオンと複合体化した場合の高分子アニオンの疎水性と比較した場合に少なくとも１Ｌｏｇ（１０）単位（ＬｏｇＰｏ／ｗ）高い。
【０１１４】
いくつかの態様では、高分子アニオンの疎水性は、高分子アニオンのオクタノール／水分配係数によって決定したところ、１〜５Ｌｏｇ（１０）単位（ＬｏｇＰｏ／ｗ）の範囲で増加する。
【０１１５】
複合体中の所与の高分子性アニオンの疎水性を決定するために、目的の複合体中に存在する場合の高分子性アニオンのＬｏｇＰｏ／ｗを決定し、ナトリウムイオンと複合体化した場合の同一の高分子性アニオンのＬｏｇＰｏ／ｗと比較することができる。Ｐｏ／ｗ分配係数を、任意の標準試験を使用して測定することができる。例示的な試験を以下に提供する。
【０１１６】
５ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏを、５ｍＬオクタノールと室温で一晩混合することができる。次いで、ナトリウムイオンまたはアルキル鎖を有するカチオンと複合体化した高分子性アニオンを含む複合体を混合物に添加し、暗所において室温で一晩再度混合させる。一晩のインキュベーション後、溶液を遠心分離してオクタノール層と水層を分離する。各層に存在する高分子性アニオンの濃度を、紫外可視分光法、または、例えば、ＳＡＦＩＲＥ，ＸＦＬＵＯＲ４，Ｖ４．５０マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用した蛍光分光法によって定量する。ｓｉＲＮＡを検出するために、蛍光検出を４８５ｎｍの励起および５２０ｎｍの発光で実施することができ、この方法を、直線性、正確度、および精度について検証することができる。ＬｏｇＰｏ／ｗを、水層と比較したオクタノール層中の蛍光の比の対数として計算することができる。
【０１１７】
３．皮膚に対する非刺激性
本明細書中に記載の組成物は、典型的には、皮膚を刺激しない。ＩＬ中の各成分（すなわち、アニオン性成分およびカチオン性成分）は、それ自体で皮膚を刺激し得る。しかし、組成物中に含まれる複合体中で使用したイオン成分の組み合わせは、皮膚表面に適用された場合に非刺激性であるか、実質的に非刺激性である（すなわち、皮膚反応はせいぜい最小限である）。
【０１１８】
組成物は、最小限の皮膚反応（発赤、発疹、痒み、灼熱感、またはヒリヒリする感覚など）を引き起こすか、全く皮膚反応を引き起こさない可能性がある。最小限の皮膚反応とは、刺激の徴候を伴うが、被験体にとって不快感や痛みがないわずかな皮膚反応であると理解され得る。
【０１１９】
例えば、組成物は、高分子アニオンおよびカチオンのみのいずれかまたは両方が皮膚に対して刺激がある場合でさえも、皮膚に対して非刺激性である。
【０１２０】
典型的には、組成物は皮膚細胞に対して非毒性である。組成物は、皮膚に適用した場合に、健康な皮膚細胞にいかなる副作用（健康な皮膚細胞の生存率の低下など）も誘発しない。例えば、組成物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの健康な皮膚細胞に対する細胞傷害性が、ナトリウムカチオンと複合体化した高分子アニオンのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞傷害性と実質的に同一である。
【０１２１】
４．皮膚層を介した輸送
典型的には、組成物は、その多孔度を増大させるため、またはＳＣおよび／もしくは皮膚の１つまたは複数のさらなる層を介して組成物を押すための皮膚へのさらなる処置を必要としない、１つまたは複数の皮膚バリア層（ＳＣなど）および／または１つまたは複数の皮膚細胞層（表皮および真皮など）を介して輸送するのに十分な疎水性がある。
【０１２２】
ヒトの皮膚を、表皮と真皮に分類することができる。各成分は層に細分される。
【０１２３】
ａ．表皮を介した輸送
表皮は、以下の５つの副層に分類される：角質層、淡明層、顆粒層、有棘層、および胚芽層（「基底層」とも呼ばれる）。表皮は血管を欠き、真皮からの拡散によって栄養を得ている。
【０１２４】
表皮は、最内層の有糸分裂によって形成されるいくつかの細胞層に分けられる。細胞層が分化してケラチンで満たされるようになるにつれて形状と構成が変化した層が押し上げられる。これらの細胞層は、最終的に角質層と呼ばれる最上層に到達し、皮膚バリア層として機能し、剥がれ落ちるかまたは落屑する。表皮の最外層は、２５〜３０層の死細胞からなる。
【０１２５】
本明細書中に記載の複合体は、表皮の５つの異なる副層を介して輸送され、真皮に到達することができる。典型的には、皮膚への局所適用後、アルキル鎖を有するカチオンと複合体化した高分子性アニオンは、ナトリウムイオンと複合体化した場合の同一の高分子性アニオンの局所適用後に達成される量よりも多い量で角質層を介して輸送され、表皮の種々の副層に到達する。アルキル鎖を有するカチオンと複合体化した高分子性アニオンは、局所投与後に、１つまたは複数の皮膚層（１つまたは複数の表皮層、さらには１つまたは複数の真皮層など）を通過することができる。これらの態様では、組成物は、ナトリウムイオンと複合体化した場合の同一の高分子性アニオンを局所適用した後に達成される量よりも多い量で、１つまたは複数の皮膚層を通過する。
【０１２６】
任意選択的に、アルキル鎖を有するカチオンと複合体化した高分子性アニオンは、局所投与後に全ての皮膚層を通過する。この態様では、組成物は、ナトリウムイオンと複合体化した場合の同一の高分子性アニオンを局所適用した後に達成される量よりも多い量で、全ての皮膚層を通過する。
【０１２７】
ｂ．真皮内への輸送
真皮は、上皮組織からなる表皮の下の皮膚層である。真皮は、構造的に以下の２つの領域に分類される：表皮に隣接する、乳頭領域と呼ばれる表面領域、および網状領域として公知の深部のより厚い領域。
【０１２８】
真皮は基底膜によって表皮に緊密に連結している。真皮はまた触覚および温感を提供する多数の神経終末を保有している。真皮は、毛包、汗腺、皮脂腺、アポクリン腺、リンパ管、血管を含む。真皮内の血管は、真皮自体の細胞からおよび表皮の基底層から栄養物を提供し、且つ老廃物を除去する。
【０１２９】
好ましくは、組成物を皮膚に局所適用した後、アルキル鎖を有するカチオンと複合体化した高分子性アニオンは、ナトリウムアニオンと複合体した同一の高分子性アニオンの局所適用後に達成される量よりも多い量で、表皮を介して１つまたは複数の真皮層に輸送される。
【０１３０】
ＩＩＩ．組成物を作製する方法
組成物を作製する方法は当該分野で公知であり、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２６：５５５８−５５６３（２００５）に記載されている。
【０１３１】
典型的には、方法は、スキーム１に示すように、カチオンのクロリド塩およびアニオン交換樹脂（例えば、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸのアンバーライトＩＲＡ−４０２水酸化物形態のアニオン交換樹脂）などの使用によるカチオンのクロリド塩の対応する水酸化物塩への変換を含む。カチオンのクロリド塩を、超高純度のｄｄＨ２Ｏ（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹの超高純度ｄｄＨ２Ｏ）に、１．０重量％の濃度などの適切な濃度で溶解し、一定の撹拌下で１時間過剰量の樹脂と混合する。次いで、スラリーを遠心分離して樹脂をペレット化し、上清を回収する。完全なアニオン交換を、硝酸銀（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯのｄｄＨ２Ｏ中の２ｇ／ｍＬ硝酸銀溶液）を滴下した後の沈殿物の欠如によって検証することができる。カチオン水酸化物の最終溶液を凍結乾燥させてｄｄＨ２Ｏを除去することができる。
【化５】
2019526626.tif 000006
【０１３２】
同様に、高分子性アニオンナトリウム塩は、スキーム２に示すように、カチオン交換樹脂（例えば、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸのアンバーライトＩＲ−１２０水素カチオン交換樹脂）を使用して酸性形態に変換することができる。完全なカチオン交換を、滴定によって検証することができる。水素形態の高分子性アニオンの最終溶液を凍結乾燥させてｄｄＨ２Ｏを除去することができる。
【化６】
2019526626.tif 000007
【０１３３】
スキーム３に示されるように、高分子性アニオン上の酸性基を、適切な溶媒中でカチオンを添加すること（例えば、メタノール中で、カチオン、任意選択的に、カチオン性界面活性剤の水酸化物形態を添加すること）によって対応するカチオンと複合体化し、任意選択的に、中和することができる。一晩などの適切な期間、室温で常に撹拌しながら中和を進行させることが可能である。次いで、溶媒（例えば、メタノール）を回転蒸発などにより除去し、続いて凍結乾燥させ、そしてローブドアニオンを、さらに使用するまで、例えば、−２０℃で保存する。
【化７】
2019526626.tif 000008
【０１３４】
ＩＶ．組成物を使用する方法
組成物は、角質層を介して、好ましくは１つまたは複数の表皮層まで、または表皮層を介して、複合体を輸送するのに有効な量で被験体（ヒトまたは他の哺乳動物）の皮膚に局所的に適用される。有効量の複合体を真皮に輸送することができる。任意選択的に、複合体は、１つまたは複数の真皮層を越えて細胞に送達される。複合体は、単独で、または１つまたは複数のさらなる治療剤、診断剤、予防剤、または栄養補給剤と組み合わせて、皮膚の種々の層を介して輸送することができる。
【０１３５】
組成物の局所適用の前に、同時に、またはその後に、皮膚の多孔度を増大させ、１つまたは複数の角質層を除去し、そして／または皮膚を介して組成物の複合体または成分を押し進めるために皮膚をさらに処置することなく、複合体は、角質層を介して、任意選択的に、表皮および／または真皮の異なる層までまたはこれらを介して輸送される。
【０１３６】
個体の皮膚に適用した場合、組成物は、発赤、灼熱感および／または痒みの感覚などによって証明される過度の刺激を引き起こさない。
【０１３７】
ＩＬ複合体中の各成分（すなわち、アニオン性成分およびカチオン性成分）またはＩＬ中のイオン性成分および薬物は、それ自体で皮膚を刺激し得る。しかし、組成物中で使用されるイオン性成分（またはイオン性成分および薬物）の組み合わせは、皮膚表面に適用された場合に刺激がない。
【０１３８】
本明細書中に記載の組成物は、皮膚疾患を処置するのに有効な量で局所的に適用することができる。いくつかの態様では、組成物は、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ分子を含む。任意選択的に、組成物は、ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡなどの複合体を含む。
【０１３９】
Ａ．標的化送達
組成物は、角質層、表皮、および／または真皮内などの特定の部位に、または皮膚の全ての層を介し且つ越えて薬物を送達するように選択することができる。
【０１４０】
実施例に示されるように、使用されるＩＬに応じて、異なるＩＬは、以下の３つの異なる輸送形態を示した：１）ドナー溶液中の薬物保持。２）ＳＣ、表皮、および真皮内での局在化と保持の強化。３）皮膚のすべての層からアクセプター溶液への経皮透過の促進。全ての態様では、１つまたは複数の成分自体は刺激性を示し得るが、組成物は皮膚に対して刺激性がない。
【０１４１】
いくつかの態様では、送達すべき薬剤（または複合体）が皮膚の層内に送達されるような組成物の成分（例えばカチオン性成分、アニオン性成分）を選択する。これは、皮膚の疾患または障害の処置（感染症、切り傷、熱傷、または発疹の処置など）に特に有用であり得る。
【０１４２】
他の態様では、送達すべき薬物が皮膚を介して（真皮内の層を越えてなど）輸送されるような組成物の成分（例えば、カチオン性成分、アニオン性成分、および／または薬物）を選択する。
【０１４３】
さらに他の態様では、角質層を介した薬物（または他の物質）の移動を妨げるような組成物の成分を選択する。これは、皮膚を保護するか、大きな開放性創傷を処置するためのコーティングとして有用であり得る。これらの組成物での使用に適切な複合体は、組成物の透過を制限する特徴を有する。これらの特徴には、角質層を通過する組成物と比較して、凝集体または粒子の形成、粘度の増加、および／または密度の増加が含まれる。
【０１４４】
Ｂ．処置すべき病状
本明細書中に記載のＩＬ組成物を、任意選択的に治療薬、診断薬、予防薬、および／または栄養補助薬と共に、高分子性アニオンの経皮送達のために使用することができる。
【０１４５】
ＩＬ組成物を、皮膚の疾患または障害（アトピー性皮膚炎、座瘡、創傷、発疹、毛包炎、せつ腫症、カルブンケル症、真菌感染、および感染を原因とする他の疾患を含むがこれらに限定されない）を処置するために皮膚表面に適用することができる。
【０１４６】
Ｃ．有効量
有効量は、処置すべき病状および高分子性アニオン、ならびに任意選択的に皮膚に送達すべきさらなる薬物によって変動する。有効量は、組成物の１回または１回を超える局所適用で到達することができる。例えば、１０ｎｇ、２０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、２０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、または１０ｍｇの１つまたは複数の薬剤（高分子性アニオン、任意選択的に、さらなる薬物と共に）を含む各適用物を皮膚部位に適用し、有効用量の１０ｎｇ、２０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、１μｇ、１０μｇ、２０μｇ、５０μｇ、１００μｇ、１ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、５０ｍｇ、または１００ｍｇの薬剤をそれぞれ送達させることができる。
【０１４７】
有効量の活性薬剤を、適用回数を変更すること、各適用における薬剤の量を変更すること、またはその両方によって送達させることができる。有効量の活性薬剤を、１日、２〜３日の期間にわたって、１週間の期間にわたって、または数週間から３〜６ヶ月間にわたって送達させることができる。
【０１４８】
適切な投薬量は、０．００１μｇ〜１０００ｍｇの高分子アニオンおよび／または薬物を含む適切な体積の組成物の、処置されるべき被験体の皮膚部位への局所適用を含む。
【０１４９】
Ｄ．投薬形態
ＩＬ組成物は、有効量の高分子性アニオンおよび／または薬物を皮膚に送達する投薬単位および投薬形態であり得る。
【０１５０】
皮膚への送達に適切な任意の投薬形態を使用することができる。組成物は、フィルム、デポー剤、パッチ剤、または無溶媒液剤、クリーム剤、ローション剤の形態であり得る。投薬形態を、単回または複数回の適用による有効量の高分子性アニオンの送達のために予め包装することができる。
【０１５１】
１つの態様では、組成物を保持するためのリザーバを含む薬物送達デバイスによって組成物を皮膚表面に送達する。任意選択的に、リザーバはまた、１つまたは複数のさらなる薬物を含む。
【０１５２】
別の態様では、組成物を、薬物送達デバイス内に含めることができる。異なるジオメトリおよび構造を有する種々の異なるデバイスを使用することができる。例えば、デバイスはＩＬ組成物を含む多区画デバイスであり得、任意選択的に、さらなる区画は１つまたは複数のさらなる薬剤を含む。
【０１５３】
典型的には、ＩＬ組成物が皮膚バリアを通過して皮膚細胞に到達することができるので、投薬形態は、注射デバイス（マイクロニードルを有するデバイスなど）または皮膚透過性を増大させるかまたは皮膚を介して複合体を押すための他のデバイスもしくは薬剤を必要とせずに送達される。
【実施例】
【０１５４】
実施例１．ローブドｓｉＲＮＡの合成および特徴づけ
材料と方法
イオン液体（ＩＬ）部分をローブしたｓｉＲＮＡを、以前に記載のように酸−塩基中和によって合成した（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２６：５５５８−５５６３（２００５））。ベンジルジメチルアルキルアンモニウムクロリド塩を、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ＦＡＭ−ＧＡＰＤＨｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ１、５’−ＦＡＭ−ＧＡＣＧＵＡＡＡＣＧＧＣＣＡＣＡＡＧ  ＵＵＣ−３’（配列番号１））、ＦＡＭ−ＧＡＰＤＨｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ２、５’−ＦＡＭ−ＧＵＧＵＧＡＡＣＣＡＣＧＡＧＡＡＡＵＡＵＵ−３’（配列番号２））、ＦＡＭ−エラスターゼｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ３、５’−ＦＡＭ−ＵＣＡＣＵＵＡＣＡＧＧＡＵＣＵＡＵＡＡＵＵ−３’（配列番号３））、およびＦＡＭ−コントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ４、５’−ＦＡＭ−ＵＡＡＧＧＣＵＡＵＧＡＡＧＡＧＡＵＡＣＵＵ−３’（配列番号４））を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。
【０１５５】
クロリド塩を、アンバーライトＩＲＡ−４０２水酸化物形態アニオン交換樹脂（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）を使用してクロリド塩の対応する水酸化物塩に変換した。ベンジルジメチルアルキルアンモニウムクロリド塩を、超高純度のｄｄＨ２Ｏ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）に１．０重量％の濃度で溶解し、過剰量の樹脂と常に撹拌しながら１時間混合した。次いで、スラリーを濃縮して樹脂をペレット化し、上清を回収した。完全なアニオン交換を、硝酸銀（２ｇ／ｍＬのｄｄＨ２Ｏ溶液、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の滴下後の沈殿物の欠如によって検証した。ベンジルジメチルアルキルアンモニウムヒドロキシドの最終溶液を凍結乾燥させてｄｄＨ２Ｏを除去した。同様に、ｓｉＲＮＡナトリウム塩を、アンバーライトＩＲ−１２０水素カチオン交換樹脂（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）を使用して酸性形態に変換した。完全なカチオン交換を、滴定によって検証した。水素形態のｓｉＲＮＡの最終溶液を凍結乾燥させてｄｄＨ２Ｏを除去した。ｓｉＲＮＡ上の酸性基を、等量のベンジルジメチルアルキルアンモニウムヒドロキシドのメタノール溶液の添加によって中和した。常に撹拌しながら室温で一晩中和を進行させた。次いで、メタノールを回転蒸発により除去し、続いて凍結乾燥させ、ローブドｓｉＲＮＡを、さらに使用するまで−２０℃で保存した。
【０１５６】
ローブドｓｉＲＮＡの組成を、元素分析によって確認した。ＣＨＮ元素分析を、ＣＥ−４４０迅速元素分析装置（Ｅｘｅｔｅｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて行った。試料サイズは、小型のアルミニウムカプセル中で約１ｍｇであった。カプセルを保護用のニッケル製スリーブに入れ、オートサンプラーホイールに投入し、機械的に操作される石英取鍋を用いて燃焼炉に導入した。炭素、窒素、および水素の重量パーセントを、酸素富化ヘリウム雰囲気中、１０００℃での高温燃焼によって決定した。
【０１５７】
ローブドｓｉＲＮＡを、オクタノールおよび水への分配を測定すること（ＬｏｇＰｏ／ｗ）によって特徴づけた。５ｍＬ  ｄｄＨ２Ｏを、５ｍＬオクタノールと室温で一晩混合した。次いで、ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡまたはローブドＦＡＭ−ｓｉＲＮＡを混合物に添加し、暗所において室温で一晩再度混合させた。一晩のインキュベーション後、溶液を遠心分離してオクタノール層と水層を分離した。各層に存在するＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの濃度を、ＳＡＦＩＲＥ，ＸＦＬＵＯＲ４，Ｖ４．５０マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用した蛍光分光法によって定量した。蛍光検出を４８５ｎｍの励起および５２０ｎｍの発光で実施し、この方法を、直線性、正確度、および精度について検証した。測定中の線形範囲は、０．２５ｐｍｏｌ／ｍＬ〜２５ｐｍｏｌ／ｍＬ（ｒ２＝０．９９９９）であった。ＬｏｇＰｏ／ｗを、水層と比較したオクタノール層中の蛍光の比の対数として計算した。
【０１５８】
凝集特性を、光子相関分光法（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）によって決定した。ローブドＦＡＭ−ｓｉＲＮＡをｄｄＨ２Ｏまたはオクタノールに溶解し、３０分間超音波処理した。２５℃、固定角１７３°で測定した。ＦＡＭ−標識ｓｉＲＮＡからの干渉を避けるために、赤色レーザーを使用して測定した。ここに引用したサイズは、ローブドｓｉＲＮＡの流体力学直径の平均値である。
【０１５９】
統計解析
別段の記述がある場合を除き、報告したデータは平均±ＳＤである。適切な場合には、統計的有意性を、マイクロソフトエクセルにおける一元配置ＡＮＯＶＡおよび事後検定または両側で対応のないスチューデントｔ検定によって確認した。有意水準をｐ＜０．０５に設定した。
【０１６０】
結果
カチオン性部分をローブしたｓｉＲＮＡを、カチオン／アニオン交換およびその後の酸−塩基中和からなる簡単で調整可能な二段階プロセスを使用してイオン液体を形成するために合成した（スキーム１〜３）。
【０１６１】
ベンジルジメチルアルキルアンモニウムを、以前に記載のように、ＩＬ部分として使用した（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２６：５５５８−５５６３（２００５））。以下の３つの異なるアルキル鎖長を使用した：オクチル（ＢＤＯＡ）、テトラデシル（ＢＤＴＡ）、およびステアリル（ＢＤＳＡ）（表５）。さらに、２つの異なるグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ノックダウン配列（ｓｉＲＮＡ１およびｓｉＲＮＡ２と省略）ならびにマトリックスメタロプロテイナーゼ−１２（ＭＭＰ−１２）ノックダウン配列（ｓｉＲＮＡ３と省略）および非サイレンシングコントロールｓｉＲＮＡ配列（ｓｉＲＮＡ４と省略）（表５）を含むいくつかの異なるｓｉＲＮＡ配列を使用した。次いで、複合体を凍結乾燥させて、全ての残留水を除去した。元素分析を使用して、１：１のイオン対形成および最終組成を確認した（表１）。具体的には、炭素、窒素、および水素の重量パーセントは、予測値と有意に異ならなかった。
【０１６２】
ローブドｓｉＲＮＡを、オクタノール／水分配（Ｐｏ／ｗ）によって特徴づけた（表２）。予想どおり、全てのローブドｓｉＲＮＡはオクタノールによく分配される。裸のｓｉＲＮＡ１は親水性が高い一方で（ＬｏｇＰｏ／ｗ＝−３．７６±０．１３）、ローブドｓｉＲＮＡ１は疎水性を示し、ＬｏｇＰｏ／ｗは、ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ１の１．４３±０．０４からＢＤＴＡ−ｓｉＲＮＡ１の３．７９±０．３８までの範囲であった。使用したｓｉＲＮＡ配列と無関係に、類似の結果が認められた（表２）。さらに、全てのローブドｓｉＲＮＡは、その対応するベンジルジメチルアルキルアンモニウム塩より疎水性が高かった。例えば、ＢＤＯＡクロリドはわずかに疎水性であり、ＬｏｇＰｏ／ｗ＝０．８５（予測値）である。対照的に、ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ１は約４倍疎水性が高かった。
【０１６３】
【表１】
2019526626.tif 000009
表１は、ＩＬ部分をローブしたＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ１および−ｓｉＲＮＡ１についての炭素、水素、および窒素の重量％ならびに炭素／窒素比を示す。ｎ＝３の標準偏差を括弧内に示す。期待値および測定値を示し、測定値は期待値と比較しても遜色がなく、ＩＬ部分の組み込みを強く示唆している。
【０１６４】
【表２】
2019526626.tif 000010
【０１６５】
表２は、ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ１および−ｓｉＲＮＡ２のＬｏｇＰｏ／ｗを示す。ｎ＝３の標準偏差を括弧内に示す。１予測値；２Ｈａｎｓｃｈら，Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ＱＳＡＲ  −Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ，Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ，ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｃ  Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，ｐ．１８２（１９９５）；３Ｈａｎｓｃｈら，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ．，ｐ．１８８（１９９５）。
【０１６６】
オクタノール中および水中でのローブドｓｉＲＮＡのサイズおよび凝集特性を、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して決定した。皮膚を容易に透過しないポリプレックスと対照的に、皮膚バリアを容易に通過し、皮膚細胞に到達する、分子スケールでＩＬ部分をローブしたｓｉＲＮＡを産生した。ｓｉＲＮＡ配列が分配に影響を及ぼさないようであるので、ここではｓｉＲＮＡ１のみを研究した。重要なことに、ＤＬＳ測定は、ローブドｓｉＲＮＡ１が個別の複合体を形成し、オクタノール（ＳＣの代表）中で凝集しないことを示唆している（表３）。親水性の裸のｓｉＲＮＡ１はオクタノールに溶解しないので、ＤＬＳを行わなかった。しかし、水中では、裸のｓｉＲＮＡ１の流体力学直径は１．０６±０．３２ｎｍであった。全てのローブドｓｉＲＮＡはオクタノールに溶解した。オクタノール中でのローブドｓｉＲＮＡ１の流体力学直径は水中での裸のｓｉＲＮＡ１より大きく、この流体力学直径は、ＩＬ部分のアルキル鎖長が増加するにつれて増大した。ＢＤＴＡおよびＢＤＳＡ−ｓｉＲＮＡ１について、水中での凝集が認められた。具体的には、ＢＤＴＡ−ｓｉＲＮＡ１およびＢＤＳＡ−ｓｉＲＮＡ１は、水中でそれぞれ１８２．０±９２．４ｎｍおよび８４６．４±１７６．１ｎｍの流体力学直径を有していた。対照的に、ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ１は、水中での凝集が認められなかった（流体力学直径＝１．６３±０．１６ｎｍ）。コントロールとして、ｓｉＲＮＡポリプレックス（リポフェクタミン（登録商標）ＲＮＡｉＭａｘ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）のサイズも決定した。裸のｓｉＲＮＡ１と同様に、ＲＮＡｉＭａｘ−ｓｉＲＮＡ１はオクタノールに不溶であり、したがって、ＤＬＳは行わなかった。水中では、流体力学半径は８８．３±１．２ｎｍであった。まとめると、データは、ローブドｓｉＲＮＡはオクタノール中で凝集せず、したがって、ポリプレックスとは対照的に単一の複合体として疎水性ＳＣを介して移動することができることを示す。
【０１６７】
【表３】
2019526626.tif 000011
【０１６８】
表は、ローブドＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの複合体有効直径（ｎｍ）を示す。ｎ＝３の標準偏差を括弧内に示す。
【０１６９】
実施例２．ローブドｓｉＲＮＡは皮膚を介して効率的に輸送される。
材料と方法
皮膚輸送の測定
ブタ全層皮膚（（Ｌａｍｐｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｉｐｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を本研究で使用した。全ての皮膚試料を−８０℃で保存した。使用直前に皮膚を解凍し、毛を刈り込んだ。皮膚片をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、皮膚伝導率を測定して試料が無傷であることを確認した。皮膚透過を、フランツ拡散セル（ＦＤＣ）で、以前に記載のように（Ｃｈｅｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１７９：３３−４１（２０１４）；Ｋａｒａｎｄｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２：１９２−１９７（２００４））、評価した。簡潔に述べれば、受容体区画をｐＨ７．４のＰＢＳで満たした。各試験処方物を三連で評価した。ＳＣを上に向けて皮膚をマウントし、試験処方物を適用する前にドナー区画を大気に３０分間開放して乾燥状態にした。皮膚の下側（真皮）と受容体溶液との間の全ての気泡を注意深く除去した。１５０μＬの５０μＭ  ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡまたはローブドＦＡＭ−ｓｉＲＮＡを、皮膚表面に適用した。ＦＤＣを、穏やかに撹拌しながら３７℃で２４時間インキュベートした。２４時間後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５回洗浄することによって、処方物を皮膚から除去した。粘着テープ（Ｓｃｏｔｃｈ（登録商標）透明テープ，３Ｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｅ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）で剥ぎ取ることによってＳＣを表皮から単離した。テープによる剥ぎ取りを連続して１０回行った。剥ぎ取ったテープを、以下に示すようにガラスバイアル中に回収した：ＳＣ１＝１回目の剥ぎ取りおよびＳＣ２〜１０＝２回目〜１０回目の剥ぎ取り。１０回の剥ぎ取りでＳＣ全体が除去されたと見なした。テープでの剥ぎ取り後、外科用滅菌メスを使用して真皮から表皮を単離した。表皮および真皮を小片に切断し、個別のガラスバイアルに移した。最後に、受容器溶液からの３ｍＬをガラスバイアルに移した。蛍光ｓｉＲＮＡの抽出のために、３ｍＬのメタノールおよびＰＢＳ（ｐＨ７．４）（１：１、ｖ／ｖ）混合物を各バイアルに添加し、室温で一晩振盪した。その後、溶液を１０分間遠心分離して皮膚組織をペレット化した。上清を取り出し、必要に応じて希釈し、蛍光プローブの濃度を上記のように蛍光分光法により決定した。
【０１７０】
皮膚輸送の視覚化
ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡおよびローブドＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの皮膚内への輸送を視覚化するために、処方物を上記のようにＦＤＣ中の皮膚に適用した。２４時間のインキュベーション後、Ｌｅｉｃａ  Ｃｒｙｏｓｔａｔ  ＣＭ１８５０（Ｌｅｉｃａ，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）を使用して、適用領域に対応する薄片（２０μｍ）を調製した。薄片を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  １０００共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）を用いて画像化した。実験条件間の比較のために、すべての機器設定をサンプル間で一定に保った。
【０１７１】
結果
皮膚透過を、フランツ拡散セル（ＦＤＣ）を使用して、以前に記載のように（Ｃｈｅｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１７９：３３−４１（２０１４）；Ｋａｒａｎｄｅら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２２：１９２−１９７（２００４））、評価した。重要なことに、ｓｉＲＮＡ１の皮膚輸送は、ＩＬ部分のローブによって有意に増強された（図２Ａおよび２Ｂ）。適用用量の生存表皮内への送達パーセント（％）は、裸のｓｉＲＮＡ１においてたった２．０６±０．１５であったのと比較して、ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ１、ＢＤＴＡ−ｓｉＲＮＡ１、およびＢＤＳＡ−ｓｉＲＮＡ１において９．８５±２．６４、９．６０±２．８５、および７．３３±０．２４であった。同様に、適用用量の真皮のより深い組織層内への送達％は、裸のｓｉＲＮＡ１においてたった２．２６±１．１６であったのと比較して、ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ１およびＢＤＳＡ−ｓｉＲＮＡ１において１２．９４±２．５６および８．８９±０．７７であった。興味深いことに、適用用量の真皮内への送達％は、ｓｉＲＮＡ１にＢＤＴＡをローブした場合、実質的に阻害された（０．４９±０．１８）。使用したｓｉＲＮＡ配列と無関係に、類似の結果が認められた（図２Ｂ）。
【０１７２】
皮膚内へのローブドＦＡＭ−ｓｉＲＮＡの送達の増強を、共焦点顕微鏡法を使用して確認した。ｓｉＲＮＡの皮膚輸送は、ＩＬ部分をローブした場合に非ローブドｓｉＲＮＡと比較して有意に高かった。
【０１７３】
実施例３．ローブドｓｉＲＮＡは細胞に対して有毒ではない。
材料と方法
細胞培養
【０１７４】
全ての細胞培養材料を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から入手した。ヒト成体表皮角化細胞を、ヒト角化細胞増殖サプリメント、２５Ｕ／ｍＬペニシリン、２５μｇ／ｍＬストレプトマイシン、および５０μｇ／ｍＬネオマイシンを補足したＥｐｉＬｉｆｅ培地中で培養した。培養物を５％ＣＯ２にて３７℃で成長させた。
【０１７５】
細胞培養における生体適合性の評価
細胞を９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中に播種し、付着させ、増殖させた。細胞の密集度が約８０％に到達した時点で、培地を除去し、ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ、ローブドＦＡＭ−ｓｉＲＮＡ、またはベンジルジメチルアルキルアンモニウムクロリド塩を含む培地を添加した。培地のみをコントロールとして使用した。細胞を試験溶液と３７℃および５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。インキュベーション後、試験溶液を除去し、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、新鮮な培地を各ウェルに添加した。細胞を一晩増殖させた後、ＭＴＴ細胞増殖アッセイ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を用いて生存率について評価した。生存率を、ＳＡＦＩＲＥ，ＸＦＬＵＯＲ４，Ｖ４．５０マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用して、製造者の推奨プロトコールに従って決定した。
【０１７６】
結果
ローブドｓｉＲＮＡが細胞膜を通過する能力を、共焦点レーザー走査型顕微鏡法（ＣＬＳＭ）によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。ヒト成体上皮角化細胞（ＨＥＫａ細胞）は、生存表皮の初代細胞型であり、したがって、これを全てのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究のために使用した。ＨＥＫａ細胞を１００ｎＭのローブドｓｉＲＮＡ１と４時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で核染色し、画像化してｓｉＲＮＡ１内在化を視覚化した。ローブドｓｉＲＮＡ１の内在化を裸のｓｉＲＮＡ１の内在化と比較した。重要なことに、細胞内在化は、裸のｓｉＲＮＡ１と比較して、ＩＬ部分のローブによって増強された。他方では、細胞内在化の程度は使用されるＩＬ部分に依存するようである。例えば、ＢＤＴＡは最も内在化を増強した一方で、ＢＤＯＡは最低の増強を示した。
【０１７７】
ＭＴＴアッセイ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を使用して、ＨＥＫａ細胞に対するローブドｓｉＲＮＡの生体適合性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。重要なことに、ローブドｓｉＲＮＡ１は、１００ｎＭまでＨＥＫａ細胞に対する細胞傷害性は無視できるほどしか示さない（図３Ａ）。しかし、１００ｎＭを超えると、ＢＤＴＡ−ｓｉＲＮＡ１およびＢＤＳＡ−ｓｉＲＮＡ１について細胞傷害性が認められた。具体的には、１０００ｎＭ  ＢＤＴＡ−ｓｉＲＮＡ１またはＢＤＳＡ−ｓｉＲＮＡ１とのインキュベーション後、培養培地のみとインキュベートしたＨＥＫａ細胞と比較して、細胞生存率％は１８．４８±２．６６および６７．６０±９．９２であった。対照的に、１０００ｎＭ  ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ１とのインキュベーション後には有意な細胞傷害性は認められなかった。裸のｓｉＲＮＡ１は、研究した全ての濃度で無毒であった（図３Ａ〜３Ｃ）。さらに、ＢＤＯＡ、ＢＤＴＡ、およびＢＤＳＡは、ｓｉＲＮＡをローブして送達させた場合より遊離塩として有毒なようである（図３Ｂ）。この所見は、より高い濃度で最も明白であった；しかし、その差は統計的に有意ではなかった（ｐ＞０．０５）。また、使用したｓｉＲＮＡ配列と無関係に類似の結果が認められた（図３Ｃ）。
【０１７８】
実施例４．ローブドｓｉＲＮＡは、皮膚組織内に首尾よく内在化する。
材料と方法
細胞をポリ−Ｄ−リジンコーティングしたガラス底培養皿（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ）に播種し、接着させ、増殖させた。細胞の密集度が約８０％に到達した時点で、培地を除去し、ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡまたはローブドＦＡＭ−ｓｉＲＮＡを含む培地を添加した。細胞を、試験処方物と標準的培養条件下で４時間インキュベートした。試験溶液とのインキュベーション後、細胞を５μｇ／ｍＬ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて室温で５分間染色し、次いで、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でそれぞれ５分間ずつ３回洗浄した。細胞を、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  １０００共焦点レーザー走査型顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）を用いて画像化した。実験条件間の任意の比較のために全ての機器設定を一定に保ち、３０倍のシリコン浸漬対物レンズを使用して細胞の全厚を取得した。
【０１７９】
結果
ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡは、生存皮膚深層（表皮および真皮）への優れた輸送、裸のｓｉＲＮＡと比較して細胞内在化を改善する能力、ならびにＢＤＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＢＤＳＡ−ｓｉＲＮＡと比較して優れた生体適合性を示した（図２Ａ〜３Ｃ）。細胞培養物中のｓｉＲＮＡは典型的には応答を誘発するためにインキュベーション時間を長くする必要があるので、７２時間のインキュベーション後にＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡの細胞内在化および生体適合性も確認した。予想通り、ＨＥＫａ細胞内の細胞内在化は、裸のｓｉＲＮＡ１と比較して、ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ１への７２時間の曝露後に有意に増強された。さらに、培地のみでインキュベートした細胞と比較して、３００ｎＭまでのＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡでの細胞傷害性は無視できるほどであった（図４）。
【０１８０】
さらなるコントロールとして、ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ１の細胞内在化を、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ−ｓｉＲＮＡ１と比較した。ＲＮＡｉＭａｘ−ｓｉＲＮＡ１と対照的に、ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ１の細胞内在化は有意に少ない。しかし、興味深いことに、ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ１の内在化パターンは著しく異なっていた。具体的には、ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ１は、細胞質局在化を示す拡散蛍光を示した。対照的に、ＲＮＡｉＭａｘ−ｓｉＲＮＡ１は、エンドソーム隔離を示す点状の蛍光を示した。
【０１８１】
実施例５．ローブドｓｉＲＮＡは細胞内での遺伝子発現を首尾よくサイレンシングする。
材料と方法
細胞を９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中に播種し、付着させ、増殖させた。細胞の密集度が約８０％に到達した時点で、培地を除去し、ＦＡＭ−ｓｉＲＮＡまたはローブドＦＡＭ−ｓｉＲＮＡを含む培地を添加した。培地のみをコントロールとして使用した。細胞を試験溶液と３７℃および５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした。インキュベーション後、総タンパク質およびＧＡＰＤＨ発現を定量した。総タンパク質を、ビシンコニン酸タンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて評価し、ＧＡＰＤＨレベルを、ＫＤａｌｅｒｔ  ＧＡＰＤＨアッセイキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を製造者の推奨するプロトコールに従って使用し、且つＳＡＦＩＲＥ，ＸＦＬＵＯＲ４，Ｖ４．５０マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ，Ｍｏｒｒｉｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を使用して測定した。
【０１８２】
結果
ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡが治療応答を誘発する能力を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで最初に確認した。ＧＡＰＤＨを、モデルノックダウン標的として使用した。ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ１をＨＥＫａ細胞と種々の濃度でインキュベートし、ＧＡＰＤＨノックダウンを以前に記載のように評価した（Ｃｈｅｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１７９：３３−４１（２０１４））。コントロールとして、裸のｓｉＲＮＡ１およびＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ４（非サイレンシングコントロールｓｉＲＮＡ）も研究した。さらなるコントロールとして、ＲＮＡｉＭａｘ−ｓｉＲＮＡ１およびＲＮＡｉＭａｘ−ｓｉＲＮＡ４も、製造者の推奨する濃度（１０ｎＭ）で使用した。予想どおり、裸のｓｉＲＮＡ１および非サイレンシングｓｉＲＮＡ４処方物は、７２時間のインキュベーション後にＨＥＫａ細胞内でのＧＡＰＤＨ発現を減少させなかった（図５）。さらに、１００ｎＭおよび２００ｎＭのＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ１は、無処置コントロールと比較して、ＧＡＰＤＨ発現の有意差は認められなかった。しかし、３００ｎＭ  ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ１とのインキュベーションは、ＧＡＰＤＨを有意にノックダウンした（無処置コントロールと比較して５８．７±２．０％のＧＡＰＤＨ発現）（図５）。同様に、１０ｎＭ  ＲＮＡｉＭａｘ−ｓｉＲＮＡ１とのインキュベーションは、ＧＡＰＤＨを有意にノックダウンした（無処置コントロールと比較して３６．９±３．２％のＧＡＰＤＨ発現）。
【０１８３】
実施例６．ＭａｔＴｅｋ  Ｅｐｉｄｅｒｍ（商標）組織試料におけるローブドｓｉＲＮＡの疾患処置および生体適合性。
材料と方法
ＭａｔＴｅｋ  Ｅｐｉｄｅｒｍ（商標）ヒト皮膚等価組織を以前に記載のように使用して（Ａｆａｑら，Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１８：５５３−５６１（２００９））、ローブドｓｉＲＮＡを使用した早発性の皺形成の処置を評価した。簡潔に述べれば、６ウェル培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中で、Ｅｐｉｄｅｒｍ（商標）組織を２．５ｍＬ培地にて３７℃および５％ＣＯ２で２４時間順化させた。２４時間のインキュベーション後、培地を交換し、１００μＬのｄｄＨ２Ｏ（コントロール）または５０μＭ未変性エラスターゼｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ３）、５０μＭ  ＢＤＯＡ−コントール非サイレンシングｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ４）、２５μＭ  ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ３、または５０μＭ  ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ３を、皮膚組織の頂端側に適用した。２４時間のインキュベーション後、試験処方物を除去し、波長３０２ｎｍの６ワットＵＶランプおよび白色光管（Ｃｏｌｅ  Ｐａｒｍｅｒ，Ｖｅｒｎｏｎ，ＩＬ）を使用して、皮膚を２００ｍＪ／ｃｍ２のＵＶＢ照射に曝露した。照射を、Ｓｏｌａｒｍｅｔｅｒモデル６．２ＵＶメーター（Ｓｏｌａｒ  Ｌｉｇｈｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｉｎｃ．，Ｇｌｅｎｓｉｄｅ，ＰＡ）を用いて測定した。曝露後、新たに調製した処方物を皮膚組織に再適用し、さらに９６時間インキュベートした。実験の終わりに、２ｍＬの培地を回収し、ヒトエラスチンＥＬＩＳＡキットおよびヒトＭＭＰ−１２  ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｍａｔｉｋ  ＵＳＡ  ＬＬＣ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）を、それぞれ製造元の推奨するプロトコールに従って使用して、エラスチンおよびエラスターゼの含有量について分析した。試験処方物の生体適合性を、ＭａｔＴｅｋの推奨プロトコールに従ってＭＴＴアッセイを使用して確認した。
【０１８４】
結果
ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡの臨床的な可能性を、ヒトの皮膚等価組織における皮膚老化モデルに対して評価した（Ａｆａｑら，Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１８：５５３−５６１（２００９））。エラスターゼ上方制御は、紫外線照射誘発性の皺形成の重要因子として提唱されている（Ｔｓｕｊｉら，Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，７４：２８３−２９０（２００１））。したがって、局所適用したＲＮＡｉでのエラスターゼのノックダウンを、皮膚皺の処置および防止のための選択肢として提案する。ＵＶＢ照射およびＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡの適用後、組織生存率の低下は認められなかった（図６）。この結果により、以下が確認される：１）紅斑下線量の照射、および２）ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡの生体適合性。さらに、ＵＶＢ照射により、ＵＶＢ照射に曝露しない組織と比較して、エラスターゼが有意に上方制御され（図７Ａ）、エラスチンが有意に低下し（図７Ｂ）、疾患モデルにおける有効性が確認された。裸のｓｉＲＮＡ３またはＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ４の局所適用ではエラスターゼの上方制御およびその結果としてのエラスチン分解から防御することができなかった。対照的に、５０μＭおよび２５μＭの両方でのＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ３の適用により、ＵＶＢ照射後の皮膚の状態を不変に維持することができ、したがって、ローブドｓｉＲＮＡの臨床的な可能性が確認された（図７Ａおよび７Ｂ）。
【０１８５】
実施例７．カチオン対合ヒアルロン酸（ＨＡ）は効率的な皮膚透過剤である。
材料と方法
カチオン対合ＨＡを、実施例１に記載の方法にしたがって調製した。
【０１８６】
結果
異なるカチオン対合ＨＡ種およびそのオクタノール−水分配係数を、表４に示す。疎水性カチオンのヒアルロン酸との対合により、疎水性カチオンのオクタノール−水分配係数が劇的に増強される。このオクタノール−水分配係数の増強は、疎水性カチオンの皮膚透過を増大させると期待される。ヒアルロン酸の疎水性カチオンとの対合により、疎水性カチオンのオクタノール−水分配係数が１，０００，０００倍まで改善され、これは、ｓｉＲＮＡで認められる係数に類似する。かかる分配係数の劇的な増強は、疎水性カチオンの皮膚透過を増大させると期待される。
【０１８７】
【表４】
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【０１８８】
実施例８．コリン−ゲラン酸ＩＬの存在下でのウシ血清アルブミンおよびオボアルブミンの皮膚送達。
材料と方法
コリンおよびゲラン酸深共晶液を、ＷＯ２０１５／０６６６４７に記載のように調製し、蛍光標識したアルブミン（ウシ血清アルブミンまたはオボアルブミン）をこれに添加した。アルブミン負荷コリン−ゲラン酸処方物をブタ皮膚上に２４時間置き、皮膚を切断してアルブミンの透過を評価した。ＰＢＳを使用してコントロール実験を行った。
【０１８９】
結果
アルブミンがコリンおよびゲラン酸から送達された場合に、アルブミンの有意且つ深部への透過が認められた。コリンおよびゲラン酸の処方物の利点は、他のタンパク質（インスリン、抗体、および治療ペプチドが含まれる）に及ぶことが期待される。コリンおよびゲラン酸の利点は、他のイオン液体に及ぶことも期待される。
【０１９０】
ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡは、皮膚の深部生存組織層（表皮および真皮）への最高の増強を示した（図２Ａおよび２Ｂ）。さらに、ＢＤＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＢＤＳＡ−ｓｉＲＮＡと比較して細胞内在化効率は低いが、ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡは、有意により高い濃度で皮膚細胞に対して無視できるほどの細胞傷害性しか示さない（図３Ａ〜３Ｃ）。
【０１９１】
以前に記載されているように（Ａｆａｑら，Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，１８：５５３−５６１（２００９））、ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡが皺形成を防止する能力を、ヒト皮膚等価組織における皮膚老化モデルに対して評価した。ＢＤＯＡローブド抗エラスターゼｓｉＲＮＡを、ヒト皮膚等価組織の頂端表面上に適用した。コントロールとして、生理食塩水、裸の抗エラスターゼｓｉＲＮＡ、およびＢＤＯＡローブド非サイレンシングコントロールｓｉＲＮＡも試験した。ＵＶＢ照射は、コントロール組織において有意なエラスターゼ上方制御およびエラスチン分解を誘導した（図７Ａおよび７Ｂ）。対照的に、２５μＭまたは５０μＭのＢＤＯＡローブド抗エラスターゼｓｉＲＮＡで処置した組織は、曝露されていない（すなわち、ＵＶＢ処置なし）健康な組織と同一のエラスターゼおよびエラスチンの含有量を示した。
【０１９２】
ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡの有効性および安全性は、物理化学的性質と関連する。輸送範囲は、ローブドｓｉＲＮＡの疎水性と良く相関する。裸のｓｉＲＮＡは親水性であり、ＳＣを介した輸送は最小である（図２Ａおよび２Ｂ）。対照的に、疎水性ローブドｓｉＲＮＡは、有意な量でＳＣを透過することができた。ＢＤＴＡは疎水性が最も高く、ＳＣ内への輸送が最も高かった。しかし、ＢＤＴＡとＳＣ脂質との間の融合性が高いために、ＢＤＴＡ−ｓｉＲＮＡは皮膚表層に保持され、深部組織層に透過しなかった。したがって、ドナー溶液からＳＣ内およびＳＣから皮膚の生存組織層内への分配を増強するためのバランスを探し求めなければならない。ローブドｓｉＲＮＡの細胞内在化は、疎水性とも良く相関する。ＢＤＴＡ−ｓｉＲＮＡのＬｏｇＰｏ／ｗは、ローブドｓｉＲＮＡの間で最高であり、ＢＤＴＡ−ｓｉＲＮＡ１の細胞内在化度は最高であった。対照的に、ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡのＬｏｇＰｏ／ｗはローブドｓｉＲＮＡ間で最低であり、ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡ１の細胞内在化度は最低であったが、裸のｓｉＲＮＡ１よりは依然として有意に高かった。
【０１９３】
ローブドｓｉＲＮＡの疎水性と輸送特性とは関連するので、ＩＬ部分カウンター種の容易な操作でローブドｓｉＲＮＡの有効性が調整される見込みがある。カウンター種のアルキル鎖長を変動させることによって疎水性をある範囲に調整可能なようである。ＢＤＯＡのローブによってＬｏｇＰｏ／ｗが最低になった一方で、ＢＤＴＡ−ｓｉＲＮＡおよびＢＤＳＡ−ｓｉＲＮＡは、疎水性が有意により高かった。しかし、疎水性と鎖長との間の関係は比例しなかった。具体的には、ＢＤＴＡ（アルキル鎖＝１４炭素）は、ＢＤＳＡ（アルキル鎖＝１８炭素）より有意に疎水性が高かった。これは、予測値および実験で決定された値によると鎖長と共に比例して増加する個別のベンジルジメチルアルキルアンモニウム種のＬｏｇＰｏ／ｗと対照的である（図１、ｒ２＝０．９４９７）。凝集体の凝集特性およびサイズも、アルキル鎖長に依存するようである（表３）。理想的には、ローブドｓｉＲＮＡは、経皮輸送および経細胞輸送を最大にするために、ポリプレックスとは逆に、単一の疎水性分子として輸送されるであろう。ポリプレックスへの凝集は、皮膚輸送の動態学および送達深度を有意に妨げると予想され、したがって、ＩＬ部分のアルキル鎖長の最適化によって凝集は回避されるはずである。例示的なカチオン（ナトリウムをコントロールとして使用）およびアニオンを、表５に示す。
【０１９４】
【表５】
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【０１９５】
リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘは、ｓｉＲＮＡが細胞内に一貫して、迅速に、且つ効率的に送達させるように長年にわたって最適化されてきた市販のｓｉＲＮＡポリプレックスプラットフォームである。ＲＮＡｉＭａｘ−ｓｉＲＮＡは、１／３０の濃度で、ＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡより優れていた（図５）。したがって、このデータは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養における遺伝子サイレンシグ適用のためのＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡの使用を支持していない。この相違は、ローブドｓｉＲＮＡの水溶液中での安定性に関連し得る。ＲＮＡｉＭａｘ−ｓｉＲＮＡポリプレックスは高塩溶液および緩衝液中で安定である一方で、ローブドｓｉＲＮＡは１：１イオン対合によって単純にまとまっているだけであるので、希薄な水性条件下で溶解すると予想される。ｓｉＲＮＡのリン酸基とＩＬ部分との間のイオン会合を最大にすることは、解離を軽減し、その後に溶液中の低濃度での細胞内在化および遺伝子サイレンシングを最大化するための１つの潜在的な選択肢であり得る。イオン液体は、選択されるイオン対合に応じて、非溶媒および溶液中の両方で種々の程度のイオン会合を有することが知られている（Ｚｈａｎｇら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，３５：１４７５−１５１７（２００６））。
【０１９６】
解離を最大にするのに必要な高濃度のベンジルジメチルアルキルアンモニウムローブドｓｉＲＮＡも、有意に細胞傷害性が認められた。輸送特性と同様に、細胞傷害性は疎水性とよく相関する。疎水性がＩＬ部分の細胞傷害性の指標として一般的に使用されることを考慮すれば、これは驚くべきことではないが（Ｒａｎｋｅら，Ｅｃｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｓａｆｅｔｙ，５８：３９６−４０４（２００４）；Ｒａｎｋｅら，Ｅｃｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｓａｆｅｔｙ，６７：４３０−４３８（２００７））、皮膚および細胞内への輸送の増強と生体適合性との間でバランスをとる必要があるので、ローブドｓｉＲＮＡの使用にはいくらかの制限が課せられ得る。しかし、興味深いことに、ローブドｓｉＲＮＡは等濃度のＩＬ部分のクロリド塩よりも毒性が低いようである（図３Ａ〜３Ｃ）。これは、イオン対合が各成分の細胞傷害性をいくらか低下し得ることを示唆し、このことはイオン液体毒性についての以前の研究と一致している（Ａｏｙａｇｉら，ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，０３：２１４−２３８（２０１５）；Ｚａｋｒｅｗｓｋｙら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１１１：１３３１３−１３３１８（２０１４））。
【０１９７】
他方では、ヒト皮膚等価組織では有毒作用は認められなかった。したがって、細胞培養におけるノックダウンまたはその後のｉｎ  ｖｉｖｏでの全身投与後のためにこのストラテジーを拡張するには生体適合性のみが問題になり得る。裸のｓｉＲＮＡと比較して細胞内在化が増強されること、および優れた皮膚送達と組み合わせるとエンドソーム区画から回避または放出されることにより、皮膚において遺伝子サイレンシングを適用するにあたりＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡの使用が非常に支持される。実際、皮膚は、ローブドｓｉＲＮＡが単一の複合体として疎水性ＳＣを透過し、次いで生存表皮中の罹患細胞と直ちに相互作用することができ、したがって、解離の程度を制限し、細胞内在化および遺伝子サイレンシングを増強するという固有の環境を提供する。これは、ヒト皮膚等価組織へのＢＤＯＡ−ｓｉＲＮＡの適用後の所見と一致する（図６、７Ａ、および７Ｂ）。さらに、ローブドｓｉＲＮＡの特性および挙動は、ｓｉＲＮＡ配列と無関係である。このことにより、公知のタンパク質ノックダウン標的が存在する無数の他の皮膚疾患（乾癬、アトピー性皮膚炎、皮膚癌、黒皮症、先天性爪肥厚症、および他の多数の疾患など）の処置のためにローブドｓｉＲＮＡが使用できるという可能性が見えてくる（Ｚａｋｒｅｗｓｋｙら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２１８：４４５−４５６（２０１５））。さらに、これにより、いくつかのタンパク質標的を同時にノックダウンするローブドｓｉＲＮＡカクテルを使用した、より有効な処置の可能性が見えてくる。
【０１９８】
したがって、ＲＮＡｉの局所適用を用いたエラスターゼのノックダウンは、皮膚皺の処置および防止のための実行可能な選択肢であり得、また、現在の選択肢の安全な代替法を患者に提供することができる。局所適用されたＲＮＡｉは、皮膚を介して細胞内に輸送されて治療応答を誘発しなければならない。さらに、治療は生体適合性でなければならない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2019526626.tif 000020
【図３Ｃ】
2019526626.tif 000021
【図４】
2019526626.tif 000022
【図５】
2019526626.tif 000023
【図６】
2019526626.tif 000024
【図７Ａ】
2019526626.tif 000025
【図７Ｂ】
2019526626.tif 000026
【配列表】
2019526626000001.app
【国際調査報告】
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