(57)【要約】  本発明は、マイクロＲＮＡプール、並びに薬学的に許容される担体および／または希釈剤および／または賦形剤を含む、医薬組成物に関する。本発明はまた、特に、ニューロン分化を促進、刺激、または増大させるのに好適な医薬として使用するための、本発明の医薬組成物の医薬としての使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のマイクロＲＮＡ、並びに医薬的に許容される担体および／または希釈剤および／または賦形剤を含む、医薬組成物であって、複数のマイクロｍＲＮＡが、配列番号１のヌクレオチド１〜８を含むマイクロＲＮＡ、配列番号２のヌクレオチド２〜１１を含むマイクロＲＮＡ、配列番号３のヌクレオチド２〜１１を含むマイクロＲＮＡ、配列番号４のヌクレオチド２〜８を含むマイクロＲＮＡ、配列番号５のヌクレオチド２〜１１を含むマイクロＲＮＡ、配列番号６のヌクレオチド２〜８を含むマイクロＲＮＡ、配列番号７のヌクレオチド２〜１１を含むマイクロＲＮＡ、配列番号８のヌクレオチド２〜１１を含むマイクロＲＮＡ、配列番号９のヌクレオチド２〜１１を含むマイクロＲＮＡ、配列番号１０のヌクレオチド２〜１１を含むマイクロＲＮＡ、および配列番号１１のヌクレオチド２〜１１を含むマイクロＲＮＡを含み、ここで、ヌクレオチド位置は、配列の５’末端を基準に示されている、医薬組成物。
【請求項２】
以下のマイクロＲＮＡを含む、請求項１に記載の医薬組成物：
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ  ＭＩＭＡＴ００００４２２（配列番号１）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐ  ＭＩＭＡＴ００００４４６（配列番号２）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４−５ｐ  ＭＩＭＡＴ００００４４７（配列番号３）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ  ＭＩＭＡＴ００００４２８（配列番号４）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−５ｐ  ＭＩＭＡＴ００００２５０（配列番号５）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−５ｐ  ＭＩＭＡＴ００００２７５（配列番号６）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−３７０−３ｐ  ＭＩＭＡＴ００００７２２（配列番号７）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｂ−３ｐ  ＭＩＭＡＴ０００２１７２（配列番号８）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２−５ｐ  ＭＩＭＡＴ００００７３７（配列番号９）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−４１１−５ｐ  ＭＩＭＡＴ０００３３２９（配列番号１０）；および
ｈｓａ−ｍｉＲ−７０８−５ｐ  ＭＩＭＡＴ０００４９２６（配列番号１１）。
【請求項３】
医薬として使用するための、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ニューロン分化を、促進、刺激、または増大させることができる医薬として使用するための、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
神経変性疾患の治療的処置もしくは予防、または加齢性神経変性症状の治療的処置もしくは予防、または神経変性関連の認知機能低下の治療的処置もしくは予防、または神経組織の腫瘍性疾患の治療的処置もしくは予防、またはてんかんおよび/または脳卒中により引き起こされた神経組織への損傷の治療的処置もしくは予防において使用するための、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
神経組織の腫瘍性疾患が、神経膠芽腫である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
抗うつ薬として使用するための、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ヒトに投与するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ニューロン分化を、促進、刺激、または増大させる上で、同時に、別々に、または連続的に使用するための組み合わせ剤としての、
複数のマイクロＲＮＡ、並びに医薬的に許容される担体および／または希釈剤および／または賦形剤を含む部品キットであって、複数のマイクロｍＲＮＡが、配列番号１２のシード配列を含むマイクロＲＮＡ、配列番号１３のシード配列を含むマイクロＲＮＡ、配列番号１４のシード配列を含むマイクロＲＮＡ、配列番号１５のシード配列を含むマイクロＲＮＡ、配列番号１６のシード配列を含むマイクロＲＮＡ、配列番号１７のシード配列を含むマイクロＲＮＡ、配列番号１８のシード配列を含むマイクロＲＮＡ、配列番号１９のシード配列を含むマイクロＲＮＡ、配列番号２０のシード配列を含むマイクロＲＮＡ、配列番号２１のシード配列を含むマイクロＲＮＡ、および配列番号２２のシード配列を含むマイクロＲＮＡを含む、部品キット。
【請求項１０】
前記使用が、神経変性疾患の治療的処置もしくは予防、または加齢性神経変性症状の治療的処置もしくは予防、または神経変性関連の認知機能低下の治療的処置もしくは予防、または神経組織の腫瘍性疾患の治療的処置もしくは予防、またはてんかんおよび/または脳卒中により引き起こされた神経組織への損傷の治療的処置もしくは予防を含む、請求項９に記載の部品キット。
【請求項１１】
神経組織の腫瘍性疾患が神経膠芽腫である、請求項１０に記載の部品キット。
【請求項１２】
抗うつ薬として使用するための、請求項９に記載の部品キット。
【請求項１３】
以下のマイクロＲＮＡを含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の部品キット：
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ  ＭＩＭＡＴ００００４２２（配列番号１）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐ  ＭＩＭＡＴ００００４４６（配列番号２）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４−５ｐ  ＭＩＭＡＴ００００４４７（配列番号３）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ  ＭＩＭＡＴ００００４２８（配列番号４）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−５ｐ  ＭＩＭＡＴ００００２５０（配列番号５）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−５ｐ  ＭＩＭＡＴ００００２７５（配列番号６）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−３７０−３ｐ  ＭＩＭＡＴ００００７２２（配列番号７）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｂ−３ｐ  ＭＩＭＡＴ０００２１７２（配列番号８）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２−５ｐ  ＭＩＭＡＴ００００７３７（配列番号９）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−４１１−５ｐ  ＭＩＭＡＴ０００３３２９（配列番号１０）；および
ｈｓａ−ｍｉＲ−７０８−５ｐ  ＭＩＭＡＴ０００４９２６（配列番号１１）。
【請求項１４】
ヒトで使用するための、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の部品キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニューロン分化の促進に好適であり、それゆえに加齢性神経変性、並びに神経変性疾患、がん、脳卒中、てんかんなどの、神経組織への損傷が生じる疾病の処置および予防において有用である、医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢は、神経変性およびそれに関連する認知機能低下の主な危険因子である。平均寿命が伸びるにつれて、これらの現象は社会的および経済的に非常に重要になるであろう。２０５０年までに６０歳以上の人の数は２倍になって、２０億人に達し、これは世界の人口のおよそ２２％に相当することになる（世界保健機関の報告（２０１４年））。２０５０年には、８５歳を超える成人のおよそ５０％が、神経変性により引き起こされる認知機能低下を患うであろう。これらのうち、約２０００万人がヨーロッパに居住していることになり、それがヨーロッパの医療制度の支出の大幅な増加につながるであろう。したがって、老いた脳と若い脳の違いおよび環境要因が、脳機能の加齢に伴う低下にどのように影響するかについての理解を深めることが必要である。
【０００３】
成体哺乳類の脳の２つの主要な神経性ニッチ（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｎｉｃｈｅｓ）（側脳室の脳室下帯（ＳＶＺ）および海馬歯状回（ＤＧ）の顆粒細胞下帯）に存在する神経幹細胞は、放射状グリア様前駆細胞の非常に不均一な（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ）集団であり、星状細胞の特性を有し、本物の（ｂｏｎａ  ｆｉｄｅ）幹細胞マーカーを発現し、ほとんど分裂しない。これらの細胞は自己再生し、ニューロンとグリア細胞の両方に分化する能力を有する。成体海馬神経幹細胞（ａＮＳＣ）の運命の根底にあるメカニズムは盛んに議論されているトピックスである（Bonaguidi et al., 2012; Kempermann, 2011）。
【０００４】
成体のニューロン新生の加齢に伴う喪失は、多くの神経変性疾患および加齢に伴う認知機能低下の原因の１つであると考えられている。一方、健康的なライフスタイルは脳の健康に良い影響を与え、さまざまなレベルで成体のニューロンを「若返らせる」ことができる。したがって、脳の可塑性の増加を制御することは、将来的な再生医療の開発への有望な道であるかもしれない。
【０００５】
現代社会は、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、外傷など、さまざまな神経変性関連のヒトの疾病にも冒されている。様々な中枢神経障害の処置のための神経幹細胞移植戦略は、良い展望を伴う新しい方向性を提供する。別の戦略は、加齢中または外傷後に、常在する幹細胞からの神経再生を促進することであろう。
【０００６】
すべての場合において、成体のニューロン新生の根底にある分子メカニズムの理解および制御は、ニューロン新生の加齢に伴う喪失または神経変性関連の喪失、外傷/てんかんにより活性化されたグリア細胞などの、望まない細胞の病的形成の予防および治療に、新しい可能性を切り開くと同時に、成体の神経幹細胞移植療法の開発にも、新しい可能性を切り開くであろう。
【０００７】
再生療法および神経幹細胞移植療法は非常に大きな可能性を秘めているが、実際に臨床現場で適用することができるようになるまでには、まだ解決すべき多くの問題がある。例えば、移植された神経幹細胞の運命決定は、そのほんの一部だけがニューロンに分化して、その代わりに、そのほとんどが星状細胞に分化するのを回避するように、制御されなければならない。星状細胞が、外傷後に損傷を受けた神経回路の修復に寄与しないだけでなく、治癒の障害となり得るグリア性瘢痕の形成に関与することを知ることは重要である。別の例は、外傷またはてんかんが成体のニューロン新生を損傷する可能性があることを示す研究によって提供される。事実、てんかんの間に、成体の神経幹細胞は反応性星状細胞を直接生成することができる（Sierra et al.,2015）。ニューロン新生機能障害は、順番に、内側側頭葉てんかん（MTLE）に関連する認知障害（Gargaro et al.,2013）および精神病性合併症（Heuser et al.,2009）の一因となることが示唆されており、患者の３分の１が医療処置に反応しない慢性症状である。並行して、てんかん発作において、病理学的修復および内在性修復の両方を引き起こすメカニズムとして反応性星状細胞およびニューロン異常が提案されているが(Gibbons et al., 2013)、成体の神経幹細胞がこれらのプロセスに関与し得るメカニズムは、まだ完全に知られていない。
【０００８】
今日の時点で、ほとんどの移植／再生パラダイムは、ニューロン新生の増加を許容しておらず、反対に、星状細胞分化を支持している（Dibajnia and Morshead、2013; Shimada et al., 2012）。さらに、神経幹細胞からの新しいニューロンの分化およびそれらの生存を増加させるために使用される増殖因子による処置（Leker et al., 2009）は、神経膠腫形成と相関していた（Doetsch et al., 2002)）。
【０００９】
それゆえ、神経幹細胞の星状細胞への分化を防ぎ、早期の消耗（premature exhaustion）を予防しながら、神経幹細胞のニューロン新生能力を高めるために、新しい戦略が緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
これらおよび他の必要性を満たすために、本発明は添付の独立請求項に規定されている医薬組成物および部品キットを提供する。
【００１１】
本発明のさらなる特徴および利点が、従属請求項に規定されており、それらは本明細書の不可欠な部分を形成する。
【００１２】
本明細書において、「マイクロＲＮＡ」または「ｍｉＲＮＡ」という用語は、一般的に２０〜２５の範囲のヌクレオチドの長さを有する、短い内在性の非コード領域の１本鎖ＲＮＡ分子を指す。
【００１３】
本発明は、以下の実験のセクションに記載される実験および研究活動において、本発明者らによって得られた結果に基づく。要するに、成体のニューロン新生は神経幹細胞運命決定の正確な制御を必要とすることが知られており、ここでニューロン新生は星状細胞生成を犠牲にして支持される。実験による証拠は、発生中にマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）がこのプロセスに関与していることを示しているが、海馬の幹細胞（ａＮＳＣ）におけるそれらの役割はこれまで明らかにされていない。これらのメカニズムを研究するために、本発明者らは、ｍｉＲＮＡ生合成およびＲＮＡ干渉を含む他のプロセスに必須のエンドヌクレアーゼ酵素であるＤｉｃｅｒ（Ｄｉｃｅｒ）に注目をすることを選択した。ａＮＳＣにおけるＤｉｃｅｒの特異的なインビボおよびインビトロ切断により、本発明者らは、成体マウスの海馬において、ｍｉＲＮＡが新しいニューロンの生成には不可欠であるが、星状細胞の生成には不可欠ではないことを実証した。さらに、１１種のｍＲＮＡ（配列番号１〜１１）のプールを再投与することによって、以前にＤｉｃｅｒ切断によって損傷を受けたニューロン新生を救済することができたが、本発明の目的を形成する１１種のｍＲＮＡのセットの、個々のｍｉＲＮＡまたはサブグループの投与は、効果がなかった。
【００１４】
このように、本発明者らは、成体の神経幹細胞運命決定において相乗的に作用して、星状グリア形成（ａｓｔｒｏｇｌｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を犠牲にしてニューロン新生を支持する、ｍｉＲＮＡの新しいプールを特定した。これは、インビボおよびインビトロでのニューロン新生誘導の効率を高めるための新しい薬理学的戦略への道を開く。
【００１５】
本発明は、ニューロン新生の加齢に伴う喪失（Encinas et al., 2011; Marlatt and Lucassen, 2010; Pons-Espinal et al., 2013）、並びに、例えば外傷、脳卒中、てんかん、または移植後の、腫瘍などの（例えば、神経膠芽腫）、および／または活性化されたグリア細胞の形成などの、神経組織への損傷が生じる疾患（Dibajnia and Morshead, 2013; Doetsch et al., 2002; Shimada et al., 2012; Sierra et al., 2015）の、予防または処置に、適用することができる。
【００１６】
実験的研究はマウスｍｉＲＮＡを有するマウス細胞で行ったが、ｍｉＲＮＡ配列はヒトとマウスとの間で保存されているので、得られた結果はヒトに直接適用可能である。下記の表１は、ｍｉＲ−１３９−５ｐ ＭＩＭＡＴ００００６５６（配列番号１６および５）およびｍｉＲ−３７６ｂ−３ｐ ＭＩＭＡＴ０００１０９２（配列番号１９および８）を除いて（３’末端に１塩基の違いがある）、マウスｍｉＲＮＡ配列と、ヒトｍｉＲＮＡ配列とが同一であることを示す。表１はまた、各ｍｉＲＮＡのシード配列（下線部）を示し、すなわち標的認識を決定し、通常６〜８個のヌクレオチドからなるｍｉＲＮＡ活性領域の配列を示し、典型的にはｍｉＲＮＡ５’末端から、２ヌクレオチドおよび１０ヌクレオチドの間の領域を含む。シード配列はｍｉＲＮＡの活性部分であるので、同じシード配列を有するｍｉＲＮＡは同様の活性を有すると予測される。
【表１】
2019529425.tif 000002
【００１７】
上記を踏まえると、本発明の第１の局面は、複数のマイクロＲＮＡ、並びに医薬的に許容される担体および／または希釈剤および／または賦形剤を含む、医薬組成物であって、複数のマイクロｍＲＮＡが、配列番号１のヌクレオチド１〜８を含むマイクロＲＮＡ、配列番号２のヌクレオチド２〜１１を含むマイクロＲＮＡ、配列番号３のヌクレオチド２〜１１を含むマイクロＲＮＡ、配列番号４のヌクレオチド２〜８を含むマイクロＲＮＡ、配列番号５のヌクレオチド２〜１１を含むマイクロＲＮＡ、配列番号６のヌクレオチド２〜８を含むマイクロＲＮＡ、配列番号７のヌクレオチド２〜１１を含むマイクロＲＮＡ、配列番号８のヌクレオチド２〜１１を含むマイクロＲＮＡ、配列番号９のヌクレオチド２〜１１を含むマイクロＲＮＡ、配列番号１０のヌクレオチド２〜１１を含むマイクロＲＮＡ、および配列番号１１のヌクレオチド２〜１１を含むマイクロＲＮＡを含み、ここで、ヌクレオチド位置は、配列の５’末端を基準に示されている、医薬組成物である。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態は、医薬的に許容される担体および／または希釈剤および／または賦形剤、並びに、以下のマイクロＲＮＡプールを含む、医薬組成物である：
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２４−３ｐ  ＭＩＭＡＴ００００４２２（配列番号１）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−１２７−３ｐ  ＭＩＭＡＴ００００４４６（配列番号２）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−１３４−５ｐ  ＭＩＭＡＴ００００４４７（配列番号３）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−１３５ａ−５ｐ  ＭＩＭＡＴ００００４２８（配列番号４）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−１３９−５ｐ  ＭＩＭＡＴ００００２５０（配列番号５）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−２１８−５ｐ  ＭＩＭＡＴ００００２７５（配列番号６）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−３７０−３ｐ  ＭＩＭＡＴ００００７２２（配列番号７）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−３７６ｂ−３ｐ  ＭＩＭＡＴ０００２１７２（配列番号８）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−３８２−５ｐ  ＭＩＭＡＴ００００７３７（配列番号９）；
ｈｓａ−ｍｉＲ−４１１−５ｐ  ＭＩＭＡＴ０００３３２９（配列番号１０）；および
ｈｓａ−ｍｉＲ−７０８−５ｐ  ＭＩＭＡＴ０００４９２６（配列番号１１）。
【００１９】
本発明の医薬組成物は、医薬としての使用に好適であり、特に、好ましくはヒトにおいて、ニューロン分化を、促進、刺激、または増大させることができる医薬としての使用に好適である。
【００２０】
「ニューロン分化」という用語は、特に、成体の神経幹細胞の、ニューロンへの分化を指す。
【００２１】
ニューロン分化に対する作用のおかげで、本発明の医薬組成物は、神経変性疾患、加齢性神経変性症状、神経変性関連の認知機能低下、特に神経膠芽腫などの神経組織の腫瘍性疾患、並びにてんかんおよび／または脳卒中により引き起こされた神経組織への損傷の、治療的処置もしくは予防における使用に好適である。本発明の医薬組成物はまた、抗うつ薬としての使用に好適である。実際、フルオキセチン、パロキセチン（Ｐｒｏｚａｃ）などの、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）などの抗うつ薬は、成体のニューロン新生を刺激することが知られている（Encinas et al., 2006）。成体のニューロン新生がない場合、抗うつ薬は効果がないことも知られている（Malberg et al., 2000; Santarelli et al., 2003）。本発明の組成物は、成体海馬ニューロン新生を刺激するので、ニューロン新生刺激に対するその作用によって、うつ病に起因する行動に有益な効果をもたらすことが期待される。
【００２２】
本発明の第２の局面は、該組成物に関して上述した治療的および予防的医療用途に、同時に、別々に、または連続的に使用するための組み合わせ剤としての、該組成物に関して上記で規定された複数のマイクロＲＮＡ、並びに医薬的に許容される担体および／または希釈剤および／または賦形剤を含む、部品キット（ｋｉｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｓ）である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
本発明を、添付の図面を参照して、以下の実施例でさらに説明する。添付の図面の内容は以下の通りである。
【００２４】
【図１】図１は、インビボでのＳｐｌｉｔ  Ｃｒｅウイルス媒介Ｄｉｃｅｒ切断は、ニューロンの分化および生存を妨げるが、星状グリア形成は妨げないことと示す。Ａ：ａＮＳＣの生存および分化を評価するための、Ｓｐｌｉｔ−Ｃｒｅレンチウイルス アプローチを用いたインビボでのＤｉｃｅｒ切断に用いられる手順の概略図。Ｂ：Ｓｐｌｉｔ−Ｃｒｅウイルス注射の２か月後に得た、ＦＡＣＳ選別Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋ａＮＳＣ由来のＤｉｃｅｒｍＲＮＡのｑＰＣＲ相対定量。ＣおよびＥ：ＢｒｄＵ注射１ヶ月後のＤｉｃｅｒｗｔ／ｗｔＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＷＴ）およびＤｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＫＯ）マウス由来のＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋組換え細胞を示す、代表的な顕微鏡写真。ＢｒｄＵ発現（Ｃ）、ＢｒｄＵおよびＮｅｕＮ同時発現（Ｅ、左図）、ＢｒｄＵおよびＧＦＡＰ同時発現（Ｅ、中央図）、およびＢｒｄＵおよびＳ１００ｂ同時発現（Ｅ、右図）。Ｄ：ＢｒｄＵ注射の１０日後、または１ヶ月後の、ＢｒｄＵを発現するＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋細胞の割合。Ｆ、ＧおよびＨ：ＢｒｄＵ注射の１０日後、または１ヶ月後の、ＮｅｕＮ（Ｆ）、ＤＣＸ（Ｇ）またはＳ１００ｂ（Ｈ）を同時発現するＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋ＢｒｄＵ＋細胞の割合。ＭＬ：分子層。ＧＣＬ：顆粒細胞層。ＳＧＺ：顆粒細胞下帯。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。１グループ当たり、Ｎ＝４〜６匹のマウス。スケールバー＝２０μｍ。ＤｉｃｅｒｍＲＮＡ発現解析には、独立ｔ検定を用いた。一元配置分散分析ボンフェローニ事後検定を用いて、細胞マーカーの定量を解析した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００２５】
【図２】図２は、インビボおよびインビトロで調べた成体の神経幹細胞の特徴を示す。Ａ：ＣＡＧ  ＣＡＴレポーターマウスにおいて、注射の２８日後にＳｐｌｉｔ−Ｃｒｅウイルスで標識した放射状グリア細胞（タイプ１ａＮＳＣ）。スケールバー＝２０μｍ。Ｂ：増殖条件で培養したａＮＳＣは、Ｓｏｘ２（ｉ）、ＧＦＡＰ（ｉｉ）およびＮｅｓｔｉｎ（ｉｉｉ）などの幹細胞マーカーを発現する。Ｃ：ａＮＳＣは、Ｓ１００ｂ（ｉｖ）およびＯ４（ｖｉｉ）などのグリア分化マーカー；または、ＤＣＸ（ｖ）およびＴｕｊ１（ｖｉ）などのニューロン分化マーカーを発現しない。ポジティブコントロールとして用いられる、成体マウスのニューロンの、ＤＣＸ（ｖｉｉｉ）およびＴｕｊ１（ｉｘ）についての染色。スケールバー＝５０μｍ。
【００２６】
【図３】図３は、海馬のａＮＳＣにおいて、Ｄｉｃｅｒｆｌｏｘ対立遺伝子の組換え後にＤｉｃｅｒＲＮＡおよびｍｉＲＮＡが枯渇することをインビトロで示している。Ａ：Ｃｒｅ−リコンビナーゼでヌクレオフェクションした後の、Ｄｉｃｅｒｗｔ／ｗｔＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＷＴ）、Ｄｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｗｔＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＨＴ）およびＤｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＫＯ）マウス由来の、Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋ａＮＳＣを示す、代表的な顕微鏡写真。Ｂ：Ｃｒｅによる処置は、２つのＲＮａｓｉＩＩＩドメインの大部分の切除をもたらす。Ｃｒｅ−組換え時の、３つの異なるＤｉｃｅｒ遺伝子型（Ｄｉｃｅｒｗｔ／ｗｔ（ＷＴ）、Ｄｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｗｔ（ＨＴ）およびＤｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＫＯ））は、ＰＣＲによって区別することができる。Ｃ：組換えａＮＳＣ由来のＤｉｃｅｒｍＲＮＡのｑＲＣＲ相対定量。Ｄ：組換えａＮＳＣから定量した全ｍｉＲＮＡの平均。スケールバー＝５０μｍ。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。３回の反復試験を含む、Ｎ＝３の独立した実験。一元配置分散分析ボンフェローニ事後検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００２７】
【図４】図４は、Ｄｉｃｅｒ／ｍｉＲＮＡ枯渇が、インビトロで、ａＮＳＣ増殖に影響を与えないことを示す。Ａ：Ｄｉｃｅｒ切断後の増殖を評価するために用いられる手順の概略図。ＢおよびＤ：ＢｒｄＵ（ＢａｎｄＨ）またはｐＨ３（Ｄ）を発現するＤｉｃｅｒｗｔ／ｗｔＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＷＴ）、Ｄｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｗｔＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＨＴ）およびＤｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＫＯ）マウス由来のＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋ａＮＳＣを示す代表的な顕微鏡写真。ＣおよびＥ：２時間のパルス後にＢｒｄＵを発現する（Ｃ）、または、ｐＨ３を発現する（Ｅ）Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋細胞の割合。Ｆ：視野当たりのａＮＳＣ細胞数および増殖条件下の日数を表す増殖曲線。Ｇ：分化条件下の増殖を評価するのに用いられる手順の概略図。Ｉ：ＢｒｄＵを発現するＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋細胞の割合。スケールバー＝５０μｍ。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。３回の反復試験を含む、Ｎ＝３の独立した実験。一元配置分散分析ボンフェローニ事後検定。
【００２８】
【図５】図５は、Ｄｉｃｅｒ／ｍｉＲＮＡ枯渇が、インビトロで、ａＮＳＣのＳｏｘ２およびＧＦＡＰマーカーの発現に影響を及ぼさないが、Ｎｅｓｔｉｎの発現を妨げることを示す。Ａ：Ｓｏｘ２（上図）、ＧＦＡＰ（中央図）およびＮｅｓｔｉｎ（下図）を発現するＤｉｃｅｒｗｔ／ｗｔＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＷＴ）、Ｄｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｗｔＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＨＴ）およびＤｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＫＯ）マウス由来の組換え（Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋）ａＮＳＣを示す、代表的な顕微鏡写真。Ｂ：ａＮＳＣマーカー（Ｓｏｘ２、ＧＦＡＰおよびＮｅｓｔｉｎ）を発現するＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋細胞の割合。Ｃ：組換えａＮＳＣ由来のＳｏｘ２、ＧＦＡＰおよびＮｅｓｔｉｎのｑＰＣＲ相対定量。Ｄ：組換えａＮＳＣ培養物由来のＳＯＸ２、ＧＦＡＰおよびＮＥＳＴＩＮタンパク質の定量。スケールバー＝５０μｍ。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。３回の反復試験を含む、Ｎ＝３の独立した実験。一元配置分散分析ボンフェローニ事後検定。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００２９】
【図６】図６は、Ｄｉｃｅｒ／ｍｉＲＮＡ枯渇が、インビトロで、分化後の海馬のａＮＳＣのアポトーシスを増加させることを示す。Ａ：Ｄｉｃｅｒ切断後の生存を評価するために用いられる手順の概略図。Ｂ：増殖因子の滴下による、６ＤＩＶ後の、生存（上図）、濃縮核で死滅（中央図）、および活性化カスパーゼ３を発現（下図）した、Ｄｉｃｅｒｗｔ／ｗｔＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＷＴ）、Ｄｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｗｔＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＨＴ）およびＤｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＫＯ）マウス由来の、Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋ａＮＳＣを示す、代表的な顕微鏡写真。Ｃ：６ＤＩＶ後の、ＷＴａＮＳＣに正規化した、視野当たりのＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋細胞、濃縮核、活性化カスパーゼ３を発現するＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋細胞の割合。Ｄ：６ＤＩＶ後の組換えａＮＳＣ由来のＢｃｌ−２ｍＲＮＡのｑＰＣＲ相対定量。スケールバー＝５０μｍ。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。３回の反復試験を含む、Ｎ＝３の独立した実験。一元配置分散分析ボンフェローニ事後検定＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００３０】
【図７】図７は、ａＮＳＣにおけるＤｉｃｅｒ／ｍｉＲＮＡ枯渇が、インビトロで、ニューロン新生およびニューロンの成熟を損なうことを示す。Ａ：Ｄｉｃｅｒ切断後のニューロン分化を評価するために用いられる手順の概略図。Ｂ：増殖因子の滴下による、６ＤＩＶ後の、ダブルコルチン（ＤＣＸ）を発現する、Ｄｉｃｅｒｗｔ／ｗｔＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＷＴ）、Ｄｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｗｔＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＨＴ）およびＤｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＫＯ）マウス由来の組換えＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋ａＮＳＣを示す、代表的な顕微鏡写真。Ｃ：ダブルコルチン（ＤＣＸ）を発現するＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋細胞の割合。Ｄ：ＤＣＸを発現する、新たに形成された未成熟なニューロンの樹状形態を示す、代表的な顕微鏡写真。スケールバー＝５０μｍ。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。３回の反復試験を含む、Ｎ＝３の独立した実験。一元配置分散分析、ボンフェローニ事後検定、＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００３１】
【図８】図８は、Ｄｉｃｅｒ／ｍｉＲＮＡ枯渇が、インビトロで、ａＮＳＣの星状細胞分化に影響を及ぼさないことを示す。Ａ：１０％ＦＢＳによる組換えａＮＳＣの星状細胞分化を評価するために用いられる手順の概略図。Ｂ：１０％ＦＢＳによる、６ＤＩＶ後の、Ｓ１００ｂ（上図）およびＧＦＡＰ（下図）を発現する、Ｄｉｃｅｒｗｔ／ｗｔＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＷＴ）、Ｄｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｗｔＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＨＴ）およびＤｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＫＯ）マウス由来の組換えＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋ａＮＳＣを示す代表的な顕微鏡写真。Ｃ：星状細胞マーカー（ＧＦＡＰおよびＳ１００ｂ）を発現するＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋細胞の割合。Ｄ−Ｆ：６ＤＩＶ後の、組換えａＮＳＣ由来のＮｅｓｔｉｎ、ＧＦＡＰおよびＳ１００ｂ  ｍＲＮＡのｑＰＣＲ相対定量。Ｇ−Ｉ：１０％ＦＢＳによる、６ＤＩＶ後の、組換えａＮＳＣにおけるＮＥＳＴＩＮおよびＧＦＡＰタンパク質の定量。スケールバー＝５０μｍ。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。３回の反復試験を含む、Ｎ＝３の独立した実験。一元配置分散分析、ボンフェローニ事後検定、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００３２】
【図９】図９は、インビトロでの、ａＮＳＣのニューロン分化中の、ｍｉＲＮＡ発現プロファイルを示す。Ａ：Ａｓｃｌ１を発現する誘導性レトロウイルス（Ａｓｃｌ１−ＥＲＴ２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）を用いることによる、海馬のａＮＳＣのニューロン分化を誘導するための概略図。細胞は、増殖中、または７（Ｄ７）、１４（Ｄ１４）、および２１（Ｄ２１）ＤＩＶ後の分化中に、回収した。Ｂ：７、１４および２１ＤＩＶの間のニューロン分化の際に動的に制御されたｍｉＲＮＡのセットを表すヒートマップ。赤：高発現。緑：低発現。Ｃ：増殖細胞に対する分化中のいくつかの選択されたｍｉＲＮＡの倍数変化（Ｆｏｌｄ  Ｃｈａｎｇｅ、Ｆ．Ｃ．）。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。３回の反復試験を含むＮ＝２の独立した実験。対応のあるｔ検定、＊ｐ＜０．０５。
【００３３】
【図１０】図１０は、Ａｓｃｌ１を発現する誘導性レトロウイルス（Ａｓｃｌ１−ＥＲＴ２−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ）を用いることによる海馬のａＮＳＣの分化を示す。６ＤＩＶ後、４−ＯＨタモキシフェンを投与すると、９５％の感染細胞（ＧＦＰ＋）がニューロンに分化した。Ａ：６ＤＩＶでの、海馬のａＮＳＣにおけるＡｓｃｌ１発現の際のニューロン分化効率を示す、代表的な顕微鏡写真。Ｂ：６ＤＩＶ後の、異なる条件下での、感染ＧＦＰ＋（ｉ、ｉｉｉおよびｉｖ）またはＤＡＰＩ＋（ｉｉ）細胞と比較した、ＭＡＰ２またはＳ１００ｂを発現する細胞の割合。スケールバー＝５０μｍ。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。３回の反復試験を含む、Ｎ＝３の独立した実験。
【００３４】
【図１１】図１１は、ｍｉＲＮＡのニューロン新生誘導発現を示す。Ａ：Schouten et al., 2012により報告されている、ニューロン新生に関与することが知られているｍｉＲＮＡの発現レベル。Ｂ：ニューロン分化中の既知のｍｉＲＮＡの制御倍数（Ｆｏｌｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）。Ｃ：増殖中（Ｐ）、または７（Ｄ７）、１４（Ｄ１４）および２１（Ｄ２１）ＤＩＶ後の分化中の、本研究において選択したいくつかのｍｉＲＮＡの発現レベル。
【００３５】
【図１２】図１２は、１１種のｍＲＮＡのプールが、インビトロで、グリア形成（ｇｌｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を犠牲にして、成体のニューロン新生のＤｉｃｅｒ−ｃＫＯ機能障害を相乗的に救済することを示す。Ａ：増殖因子を除去した６ＤＩＶ後の、ダブルコルチン（ＤＣＸ）（上図）、ＭＡＰ２（中央図）およびＳ１００ｂ（下図）を発現する、２５０ｎＭのスクランブルＲＮＡまたは１１種類の選択したｍｉＲＮＡのプール（プール全体）でトランスフェクトした、ＷＴまたはＤｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＴｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ／ｗｔ（ＫＯ）マウス由来のａＮＳＣを示す代表的な顕微鏡写真。Ｂ：２５０ｎＭのスクランブルＲＮＡまたは２５０ｎＭのプール全体（各ｍｉＲＮＡは２５ｎＭ）でトランスフェクトした、ＷＴおよびＫＯａＮＳＣにおける、ＤＡＰＩ陽性細胞と比較した、ＤＣＸ−、ＭＡＰ２−およびＳ１００ｂ−陽性ａＮＳＣの割合。Ｃ−Ｄ：ＫＯコントロールと比較した、個々のｍｉＲＮＡのトランスフェクション（２２５ｎＭのスクランブルＲＮＡ＋２５ｎＭの特定のｍｉＲＮＡ）におけるＤＣＸ（Ｃ）およびＭＡＰ２（Ｄ）を発現するＫＯａＮＳＣの比率。Ｅ：６ＤＩＶ後の組換えＫＯａＮＳＣ由来の、ｑＰＣＲｍＲＮＡ定量。スケールバー＝５０μｍ。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。３回の反復試験を含む、Ｎ＝３の独立した実験。一元配置分散分析、ボンフェローニ事後検定、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００３６】
【図１３】図１３は、特定のｍｉＲＮＡサブプールが、インビトロで、ＤｉｃｅｒｃＫＯａＮＳＣにおいてニューロン分化を救済しないことを示す。Ａ−Ｂ：６ＤＩＶ後の、ＫＯコントロールと比較した、特定のｍｉＲＮＡサブプールによるトランスフェクションにおける、ＤＣＸ（Ａ）およびＭＡＰ２（Ｂ）を発現するＤｉｃｅｒＫＯａＮＳＣの比率。Ｃ：６ＤＩＶ後のトランスフェクトしたＫＯａＮＳＣ由来の、ｑＰＣＲｍＲＮＡ定量。ＤｉｃｅｒＫＯａＮＳＣを、２５０ｎＭのスクランブルＲＮＡ、２５０ｎＭのプール全体（２５ｎＭの各ｍｉＲＮＡ）、２５０ｎＭのサブプール１（２２０ｎＭのスクランブルＲＮＡ＋２５ｎＭのｍｉｒ−１２４−３ｐ＋２５ｎＭのｍｉｒ−１３５ａ−５ｐ）、２５０ｎＭのサブプール２（７５ｎＭのスクランブルＲＮＡ＋２５ｎＭのｍｉｒ−１３９−５ｐ＋２５ｎＭのｍｉｒ−２１８−５ｐ＋２５ｎＭのｍｉｒ−４１１−５ｐ＋２５ｎＭのｍｉｒ−１３４−５ｐ＋２５ｎＭのｍｉｒ−３７０−３ｐ＋２５ｎＭのｍｉｒ−３８２−５ｐ＋２５ｎＭのｍｉｒ−７０８−５ｐ）、２５０ｎＭのサブプール３（２２０ｎＭのスクランブルＲＮＡ＋２５ｎＭのｍｉｒ−１２７−３ｐ＋２５ｎＭのｍｉＲ−３７６ｂ−３ｐ）、または、各ｍｉＲＮＡ単独（２２５ｎＭのスクランブルＲＮＡ＋２５ｎＭの特定のｍｉＲＮＡ）でトランスフェクトした。データは、平均値±ＳＥＭとして表す。３回の反復試験を含む、Ｎ＝３の独立した実験。一元配置分散分析、ボンフェローニ事後検定、＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００３７】
【図１４】図１４は、１０％ＦＢＳを添加したＥＭＥＭで６日間インキュベートした後の、３Ｄコラーゲンゲルで培養したＵ８７ＭＧスフェロイドを示す。Ａ：コントロールＲＮＡでトランスフェクトしたＧＦＰ＋Ｕ８７ＭＧ。Ｂ：ｍｉＲＮＡプールでトランスフェクトしたＵ８７ＭＧ。円の内側は核を含む。円の外側は浸潤性（ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ）を規定する。
【００３８】
以下の実施例は例示目的のみに提供されるものであり、添付の特許請求の範囲において規定されるように本発明の範囲を限定するものではない。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３９】
実施例１
実験手順
動物
マウスは、イタリアのＧｅｎｏａにあるＩｓｔｉｔｕｔｏ  Ｉｔａｌｉａｎｏ  ｄｉ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉａ（ＩＩＴ）の動物施設の標準的な実験室条件下で飼育した。すべての実験および手順はＩｔａｌｉａｎ  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（許可番号０５６／２０１３および２１４／２０１５−ＰＲ）および地方の動物使用委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認されており、実験動物の使用および飼育に関する欧州の法律に従って行った。Ｄｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス（Murchison et al., 2005）を、Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ  ｆｌｏｘ／ｗｔノックインレポーターマウス（Ｊａｃｋｓｏｎラボストック番号００７９０８；(Madisen et al., 2010)）と交配させた。Ｄｉｃｅｒｗｔ／ｗｔ  Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ  ｆｌｏｘ／ｗｔ（ＤｉｃｅｒＷＴ）、Ｄｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｗｔ  Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ  ｆｌｏｘ／ｗｔ（ＤｉｃｅｒＨＴ）およびＤｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ  Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ  ｆｌｏｘ／ｗｔ（ＤｉｃｅｒｃＫＯ）マウスを、全ての実験に用いた。Ｓｐｌｉｔ−Ｃｒｅ−リコンビナーゼを発現するウイルス(Beckervordersandforth et al., 2010)で感染させた時点で、全てのマウスは８週齢であった。1ヵ月後、マウスに５日間、ＢｒｄＵ（５０ｍｇ／ｋｇ）を毎日腹腔内注射した。マウスを屠殺し、ＢｒｄＵ注射の１０日後または１ヶ月後に解析した。
【００４０】
ａＮＳＣ調製、培養条件、およびｍｉＲＮＡ投与
６〜８週齢のＤｉｃｅｒｗｔ／ｗｔ  Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ  ｆｌｏｘ／ｗｔ（ＤｉｃｅｒＷＴ）、Ｄｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｗｔ  Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ  ｆｌｏｘ／ｗｔ（ＤｉｃｅｒＨＴ）およびＤｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ  Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ  ｆｌｏｘ／ｗｔ（ＤｉｃｅｒｃＫＯ）マウスの海馬から、成体の神経幹細胞（ａＮＳＣ）を得て、記載されているように（Babu et al., 2011; Walker and Kempermann, 2014）増殖培地中で増殖させた。ＣＭＶプロモーターエンハンサーと融合した構成的チキンβ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）の制御下の５μｇのＣｒｅ−リコンビナーゼ発現ベクター（ｐＣＡＧＧＳ−ＣＲＥ）のヌクレオフェクション（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ）（Ａｍａｘａ,Ｌｏｎｚａ）によって、増殖中のａＮＳＣからＤｉｃｅｒ遺伝子を取り除いた。固定の２時間前に、ＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を増殖培地中のａＮＳＣに、最終濃度１０μＭとなるように添加した。分化：ａＮＳＣを、ＦＧＦを添加（２０ｎｇ／ｍｌ）した培養培地中に、１．２×１０４細胞／ｃｍ２でプレーティングし、２４時間培養した。次いで、培地を、レチノイン酸（ＲＡ）およびＦＧＦ（５ｎｇ／ｍｌ）と共に、Ｂ２７を含む培地と交換して２４時間培養し、次の４日間にわたってＦＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）と交換して培養した。細胞を、培養中、６日間インビトロで（６  ｄａｙｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ＤＩＶ））、分化させた。星状細胞分化培地：ａＮＳＣを、増殖因子を含まない１０％ＦＢＳを含む増殖培地中に、１．２×１０４細胞／ｃｍ２の密度で、プレーティングし、６ＤＩＶにわたって培養した。レトロウイルス媒介誘導性ニューロン分化：Ａｓｃｌ１−ＥＲＴ２を発現するウイルス構築物および感染条件は、以前に記載された通りであった（Braun et al., 2013）。ニューロン分化は、増殖因子の除去および０．５ｍＭ ＯＨ−ＴＡＭ（Ｓｉｇｍａ）の添加によって、２日間誘導した。培地は２〜３時間ごとに交換した。細胞を、ＯＨ−ＴＡＭへの曝露の、７、１４または２１日後に固定した。ｍｉＲＮＡ投与：増殖ａＮＳＣを、２５０ｎＭの「コントロール模倣物」（ネガティブコントロール、ＣＮ−００１０００−０１−０５； Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、または個々の「ｍｉＲＮＡ模倣物」（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）の混合物で、ヌクレオフェクトし（Ａｍａｘａ、Ｌｏｎｚａ）、「ｍｉＲＮＡ模倣物」はそれぞれ２５ｎＭであり、ネガティブコントロールと合わせて最終濃度２５０ｎＭであった。「ｍｉＲＮＡ模倣物」がプールとしてトランスフェクトされた場合は、等モル濃度を用い、最終濃度は２５０ｎＭであった。ヌクレオフェクションの２４時間後に、細胞を分化培地にプレーティングし、６日後に分析用に回収した。
【００４１】
免疫蛍光法およびウェスタンブロット 
脳切片の免疫蛍光染色は、背側海馬全体をカバーする６つの切片のうちの１つで行った。一次抗体：ラット抗ＢｒｄＵ（１：２００；ａｂ−６３２６；Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗ダブルコルチン（１：１０００；ａｂ１８７２３：Ａｂｃａｍ）、ウサギＧＦＡＰ（１：１０００；Ｚ−０３３４；Ｄａｋｏ）、マウス抗Ｓ１００ｂ（１：２５０；Ｓｉｇｍａ），マウス抗ＮｅｕＮ（１：２５０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。二次蛍光抗体（１／１０００；ヤギＡｌｅｘａ４８８、５６８、および６４７ｎｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。４０倍の対物レンズを有する共焦点Ａ１ニコン（Ｎｉｋｏｎ）倒立顕微鏡ＳＦＣで、画像を得た。ＤＧ（歯状回）における定量および解析は、ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ）を用いて行った。細胞培養物についての免疫蛍光法は、以前に記載された通りに実施した(Babu et al., 2011)。一次抗体：ラット抗ＢｒｄＵ（１：２００；ａｂ−６３２６；Ａｂｃａｍ）、ヤギ抗ダブルコルチン（１：２００；Ｓａｎｔａｃｒｕｚ）、ウサギ抗ダブルコルチン（１：５００；ａｂ１８７２３；Ａｂｃａｍ）、ウサギＧＦＡＰ（１：１０００；Ｚ−０３３４；Ｄａｋｏ）、Ａｂｃａｍ）、ラット抗Ｎｅｓｔｉｎ（１：２００；ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、ラット抗ｐＨ３（１：５００；Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗Ｓｏｘ２（１：５００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗Ｓ１００ｂ（１：５００；Ｓｉｇｍａ）。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８−標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、１：１０００（ヤギで得られた）または１：５００（ロバ抗ヤギ）で用いた。画像は、２０倍または４０倍の倍率でＮｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ顕微鏡を用いて得た。Ｉｍａｇｅ  ＪソフトウェアのＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ  Ｐｌｕｇｉｎ（Ｍａｃｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を用いて、計数された細胞を追跡した。
【００４２】
ウェスタンブロット：示した時点で増殖または分化条件下においてプロテインインヒビターを含有するＲＩＰＡバッファー（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、Ｒｏｃｈｅ）を用いてタンパク質をａＮＳＣから抽出し、１０％トリスグラジエントゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。該ニトロセルロース膜を、一次抗体：ウサギＧＦＡＰ（１：５０００；Ｚ−０３３４；Ｄａｋｏ）およびラット抗Ｎｅｓｔｉｎ（１：１０００；ＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）と、ＨＲＰ−標識二次抗体（１：２５００Ｐｒｏｍｅｇａ）とを用いて、一晩プローブした。ローディングコントロールのために、ニトロセルロース膜をストリッピングし、抗グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ抗体（ＧＡＰＤＨ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＭ４３００）でリプローブした。バンドを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＬＡＳ  ４０００  ｍｉｎｉ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、ＥＣＬ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で検出し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて定量した。
【００４３】
ＲＮＡ抽出および定量的ＰＣＲ
ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ調製：６８匹のマウス（それぞれＤｉｃｅｒ遺伝子型）を、示した時点で屠殺した。ＤＧ ａＮＳＣを、Ｎｅｕｒａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｐ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて分離し、ＦＡＣＳ選別細胞を直ちにＲＮＡ抽出のために処理した。増殖培地中のＣｒｅをヌクレオフェクトしたａＮＳＣ、または分化したａＮＳＣを、示した時点で回収した。全ＲＮＡをＱＩＡｚｏｌプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ）で抽出し、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔまたはｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造元の説明書に従い精製した。ｃＤＮＡ合成（ｍＲＮＡ由来）は、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩ（商標）逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって得た；ｃＤＮＡ（ｍｉＲＮＡ由来）は、製造元の説明書に従って、ＨｉＳｐｅｃバッファー（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴキットで調製した。ｍＲＮＡは、ＡＢＩ−７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、ＱｕａｎｔｉＦａｓｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて定量した。各サンプルをＧＡＰＤＨまたはアクチンのレベルに対して正規化した。ｍｉＲＮＡは、ＡＢＩ−７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、製造元の推奨事項に従い、Ｍｏｕｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ｍｉＲＮＡ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙ（Ｑｉａｇｅｎ）およびｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、あるいは、ＶｉｉＡ  ７  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で、製造元の推奨事項に従い、ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ａｒｒａｙ  Ｒｏｄｅｎｔ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａ  Ｃａｒｄｓ  Ｓｅｔ  ｖ３．０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて定量した。
【００４４】
統計解析
データは平均±平均の標準誤差として表し、Prism 6（GraphPad, San Jose, CA, USA）で分析した。統計的有意性は、２つの実験群については、両側の独立ｔ検定で、評価した。３つ以上の群を有する実験については、ボンフェローニ事後多重比較検定を用いた一元配置分散分析を使用した。Ｐ＜０．０５の場合に、結果は有意であると考えた。
【００４５】
結果
インビボでのＳｐｌｉｔ  Ｃｒｅウイルス媒介Ｄｉｃｅｒ切断は、成体の海馬において、ニューロン新生、ニューロンの成熟および生存を損なうが、星状グリア形成は損なわない。
インビボで成体海馬ニューロン新生におけるＤｉｃｅｒの役割を研究するために、本発明者らは、Ｄｉｃｅｒについての条件付き（conditional）対立遺伝子を有するマウス系統（Ｄｉｃｅｒｆｌｏｘ、(Murchison et al., 2005)）と、Ｃｒｅ誘導性レポーターマウス系統 （Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏｆｌｏｘ、(Madisen et al., 2010)）とを交配した。本物の（bona fide）タイプ１ａＮＳＣにおいて、Ｄｉｃｅｒの条件付き切断を得るために、Ｓｐｌｉｔ−Ｃｒｅウイルス（図１Ａ）を、８週齢のＤｉｃｅｒｗｔ／ｗｔ  Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ  ｆｌｏｘ／ｗｔ（ＷＴ）、Ｄｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｗｔ  Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ  ｆｌｏｘ／ｗｔＤｉｃｅｒ（ＨＴ）、およびＤｉｃｅｒｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ  Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ  ｆｌｏｘ／ｗｔ（ＤｉｃｅｒｃＫＯ）マウスのＤＧに、注射した。このアプローチにより、ｈＧＦＡＰプロモーターとＰｒｏｍｉｎｉｎ１プロモーターの同時活性に基づいて(Beckervordersandforth et al., 2014)、Ｓｐｌｉｔ−Ｃｒｅリコンビナーゼをタイプ１ａＮＳＣで発現させることが可能になったことが注目されるべきである（図２Ａ）。このようにして、インビボでの成体海馬の顆粒細胞下層（ＳＧＺ）および顆粒細胞層（ＧＣＬ）における細胞運命を、以前に発表されたように分析した（Beckervordersandforth et al., 2014）。
【００４６】
インビボでＤｉｃｅｒ切断を調べるために、実質的に形質導入したＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋細胞、および内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として、感染していないＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ−（陰性）細胞を、ＷＴおよびＤｉｃｅｒｃＫＯマウスのＤＧからＦＡＣＳによって単離し、ＤｉｃｅｒｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲで定量した。この定量により、ＷＴマウス由来のＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋細胞（図１Ｂ、ｐ＝０．０００１）、並びにＷＴおよびＤｉｃｅｒｃＫＯマウスの両方由来のＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ−細胞（図１Ｂ、ｐ＝０．００３）と比較して、ＤｉｃｅｒｃＫＯマウス由来のＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋（陽性）細胞におけるＤｉｃｅｒｍＲＮＡレベルの７０％の減少が確認された。
【００４７】
ウイルス注射の１ヵ月後に、ＤｉｃｅｒｃＫＯａＮＳＣを起源とする子孫の生存を調査するために、マウスにブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を５日間連続して投与した。ＢｒｄＵ投与の１０日後または１ヶ月後に、Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ／ＢｒｄＵ二重陽性細胞のＳＧＺとＧＣＬの間の比率を定量した（図１Ａ）。１０日目には、ＤｉｃｅｒｃＫＯとＤｉｃｅｒＨＴマウス（図１Ｄ）のこれらの細胞の比率がわずかに増加したにもかかわらず、１ヶ月で、ＤｉｃｅｒｃＫＯマウスのこの比率は有意に減少した（図１Ｃ−Ｄ、ｐ＝０．００６）。この結果は、Ｄｉｃｅｒ枯渇が、インビボで、成体マウスの海馬のＳＧＺ／ＧＣＬにおける新生細胞の生存を損なうことを示している。さらに、Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋細胞の形態を解析したところ、Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋ＷＴ細胞と比較して、海馬のＧＣＬおよび分子層（ＭＬ）における、Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋ＤｉｃｅｒｃＫＯ細胞の突起および分枝の数が、劇的に減少していることも観察された（図１Ｃ）。この発見は、Ｄｉｃｅｒ枯渇が生存細胞の分化および成熟を損なうことを示唆した。
【００４８】
続いて、ａＮＳＣのニューロン運命におけるＤｉｃｅｒの役割を調べた。ＤｉｃｅｒＷＴ、ＨＴ、およびｃＫＯマウスの成体の海馬のＳＧＺ／ＧＣＬにおいて、未成熟なニューロンについてはダブルコルチンマーカー（ＤＣＸ、（Gleeson et al., 1999））、あるいは、有糸分裂後のニューロンについてはＮｅｕＮマーカー（Mullen et al.,1992）を同時発現する新生細胞の比率を、ＢｒｄＵ投与の１０日後および１ヶ月後に定量した（図１Ａの通り）。ＤＣＸとＮｅｕＮの発現において、１０日後の３つのＤｉｃｅｒ遺伝子型の間に違いは見られなかった（図１Ｆおよび図１Ｇ）。しかし、本発明者らは、1ヶ月後に、４０％のＤｉｃｅｒＷＴ細胞がまた、ＤＣＸを同時発現したのに対し、１０％のＤｉｃｅｒｃＫＯ細胞または２６％のＤｉｃｅｒＨＴ細胞しかＤＣＸを同時発現しなかったことを見出した（図１Ｇ、ＷＴ対ＫＯ  ｐ＝０．００１２；ＷＴ対ＨＴ  ｐ＝０．０３９）。これと一貫して、同じ週齢では（同じ１ヶ月後に）、ＮｅｕＮ＋ＤｉｃｅｒＷＴニューロンが６０％であったのと比較して、わずか２０％のＤｉｃｅｒｃＫＯ細胞がＮｅｕＮを同時発現した（図１Ｅ左図および図１Ｆ、ｐ＝０．００５８）。さらに、新生ＮｅｕＮ＋ニューロンの比率が、１０日後から１ヶ月後で、ＤｉｃｅｒＷＴマウスのＳＧＺ／ＧＣＬにおいて有意に増加したが（図１Ｆ、ｐ＝０．００６２）、ＤｉｃｅｒｃＫＯマウスのＳＧＺ／ＧＣＬにおいては時間と共に変化はなかった（ｐ＝０．７２）。これらの結果は、Ｄｉｃｅｒ枯渇により、インビボで、成体マウスの海馬のニューロン分化および成熟が損なわれたことを示している。
【００４９】
続いて、星状細胞分化に関してａＮＳＣの運命におけるＤｉｃｅｒの役割を調べたところ、補完的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）結果が得られた（図１Ｅ中央図および右図）。ＢｒｄＵ投与の１０日後と１ヶ月後の両方において、ＤｉｃｅｒＷＴとＨＴ新生細胞の約４０％が星状細胞マーカーＳ１００ｂをＳＧＺ／ＧＣＬにおいて同時発現していた一方で、本発明者らは、ＤｉｃｅｒｃＫＯ新生細胞の７５％が、Ｓ１００ｂを同時発現していたことを見出した（図１Ｅ右図および図１Ｈ、ｐ＝０．０００２）。まとめると、これらの結果は、インビボで、成体の海馬において、タイプ１ａＮＳＣのＤｉｃｅｒ枯渇により、ニューロン新生は損なわれるが、星状グリア形成は損なわれないことを示している。
【００５０】
ＤｉｃｅｒｍＲＮＡとｍｉＲＮＡは、インビトロで、海馬のａＮＳＣにおいて、Ｄｉｃｅｒｆｌｏｘ対立遺伝子の組換え後に枯渇する
インビトロでＤｉｃｅｒ切断の効果を評価するために、ＷＴ、ＨＴおよびＤｉｃｅｒｆｌｏｘ対立遺伝子についてホモ接合性（Ｃｒｅ誘導性Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ対立遺伝子についてはヘテロ接合性）のマウスのＤＧから、以前に記載された通り (Babu et al., 2011; Walker and Kempermann, 2014)に、初代ａＮＳＣを生成し、これらの細胞を単層として培養した（図２Ｂ）。Ｄｉｃｅｒの枯渇は、構成的プロモーターの制御下でＣｒｅリコンビナーゼを発現するプラスミド（ｐＣＡＧＧＳ−Ｃｒｅ）の、ヌクレオフェクションによって得た。これらの細胞におけるＣｒｅヌクレオフェクションは、Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏタンパク質発現を活性化し（図３Ａ）、効果的にＤｉｃｅｒ遺伝子座の組換えをもたらした（図３Ｂ）。一貫して、Ｄｉｃｅｒをコードする転写物は、ＷＴａＮＳＣと比較して、ＤｉｃｅｒＨＴａＮＳＣにおいて５０％まで減少し（図３Ｃ、ｐ＝０．００８２）、ＤｉｃｅｒｃＫＯａＮＳＣにおいてほとんど完全に存在しなかった（図３Ｃ、ｐ＝０．０００３）。その結果、成熟ｍＲＮＡレベルは、ＷＴａＮＳＣと比較して、ＤｉｃｅｒＨＴａＮＳＣにおいて５０％まで減少し（図３Ｄ、ｐ＝０．０１）、ＤｉｃｅｒｃＫＯａＮＳＣにおいてほとんど完全に存在しなかった（図３Ｄ、残存ｍｉＲＮＡレベルはおよそ７％、ｐ＜０．０００１）。これらの結果は、インビトロで、Ｄｉｃｅｒｆｌｏｘ対立遺伝子の組み換えが、海馬のａＮＳＣからのＤｉｃｅｒ転写物および成熟ｍＲＮＡの両方の効率的な枯渇をもたらすことを実証した。
【００５１】
Ｄｉｃｅｒ切断は、インビトロで、幹細胞マーカーの増殖および発現に影響を及ぼさないが、分化する際のアポトーシスを増加させる。
ａＮＳＣにおけるＤｉｃｅｒＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの効率的な枯渇にもかかわらず、細胞は増殖条件下で培養すると、少なくとも１８日間インビトロで（１８ＤＩＶ）維持することができた。ＤｉｃｅｒＨＴおよびＷＴａＮＳＣと比較して、これらの細胞の細胞形態、細胞の培地交換についての必要性、および比率に、大きな違いは見られなかった。さらに、増殖条件下での、２時間のパルス後にＢｒｄＵを組み込んだＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋細胞の割合（図４Ａ−Ｃ）、またはホスホヒストンＨ３に対する免疫陽性のＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋細胞の割合（ＰＨ３  図４Ｄ−Ｅ）、または増殖因子の滴下の際の２時間のパルス後にＢｒｄＵを組み込んだＴｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋細胞の割合（図４Ｇ−Ｉ）に関して、遺伝子型間の差異は観察されなかった。一貫して、培養中に数日間成長曲線を描いた場合に、遺伝子型の間に違いは見られなかった（図４Ｆ）。従って、本発明者らは、Ｄｉｃｅｒ／ｍｉＲＮＡ枯渇はａＮＳＣ増殖に影響を及ぼさないと結論付けた。
【００５２】
続いて、本発明者らは、Ｄｉｃｅｒ／ｍｉＲＮＡ枯渇が、ａＮＳＣにおけるＳｏｘ２、ＧＦＡＰおよびＮｅｓｔｉｎなどの幹細胞マーカーの発現に影響を与えるかどうかという疑問を提起した。本発明者らは、タンパク質レベルおよび転写物のレベルの両方において、ＳＯＸ２またはＧＦＡＰ発現に変化が見られないことを見いだした（図５）。しかしながら、以前の報告（Andersson et al., 2010）と一致して、本発明者らは、ＷＴａＮＳＣと比較して、ＤｉｃｅｒｃＫＯａＮＳＣにおけるＮｅｓｔｉｎタンパク質の発現、および、ＤｉｃｅｒＨＴａＮＳＣおよびｃＫＯａＮＳＣの両方におけるＮｅｓｔｉｎ  ｍＲＮＡの発現が減少したことを、発見した（図５Ａ〜Ｃ  ｐ＝０．００２１；図５Ｄ、ＷＴ対ｃＫＯ  ｐ＝０．００５３；ＨＴ対ｃＫＯ  ｐ＝０．０３）。まとめると、これらの結果は、Ｄｉｃｅｒ／ｍｉＲＮＡ枯渇は主に、増殖、培地交換に関する必要性、およびＮｅｓｔｉｎを除くａＮＳＣ幹細胞マーカーの発現に影響を及ぼさないことを示している。
【００５３】
次に本発明者らは、分化誘導後のＤｉｃｅｒＷＴ、ＨＴおよびｃＫＯａＮＳＣの生存を調べた。この目的のために、組換え（Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋）ＤｉｃｅｒＷＴ、ＨＴおよびｃＫＯａＮＳＣをＦＡＣＳ選別し、分化条件下で培養した（図６Ａ）。６ＤＩＶ後、本発明者らは、ＤｉｃｅｒＷＴａＮＳＣと比較して、それぞれＤｉｃｅｒＨＴおよびＤｉｃｅｒｃＫＯａＮＳＣの数において、３０％および５０％の減少を見出した（図６Ｂ−Ｃ上図、ＷＴ対ｃＫＯ、ｐ＝０．０３）。さらに、ＤｉｃｅｒｃＫＯａＮＳＣの生存の減少は、濃縮核の数が有意に増加したこと（図６Ｂ−Ｃ中央図、ｐ＝０．００５１）、アポトーシスマーカー活性化カスパーゼ３の発現が有意に増加したこと（図６Ｂ−Ｃ下図、ｐ＝０．０１３）、および、アポトーシスタンパク質Ｂｌｃ−２をコードする転写物の発現が有意に減少したこと（図６Ｄ、ｐ＝０．０４）と平行していた。したがって、これらの結果は、Ｄｉｃｅｒ機能がインビトロでのａＮＳＣの増殖に必須ではないが、分化誘導時のそれらの子孫の生存に必要であることを示しており、インビボデータと一貫している（図１）。
【００５４】
ａＮＳＣにおけるＤｉｃｅｒ／ｍｉＲＮＡ枯渇は、インビトロで、ニューロン新生を損なうが、星状グリア形成は損なわない
本発明者らによって得られたインビボデータは、ａＮＳＣにおけるＤｉｃｅｒの枯渇は、成体マウスの海馬において、ニューロン新生を損なうが、星状グリア形成は損なわないことを示唆している（図１）。そこで、本発明者らは、組換え（Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋）ＤｉｃｅｒＷＴ、ＨＴおよびｃＫＯのａＮＣＳを単離し、インビトロで分化した際のニューロン新生およびニューロンの成熟について調べた（図７Ａ）。本発明者らは、ＤｉｃｅｒＨＴおよびｃＫＯのａＮＳＣは、ＷＴａＮＳＣと比較して、有意に少ないＤＣＸ＋細胞を生成することを見出した（図７Ｂ−Ｃ、ＤｉｃｅｒＨＴでは約１２％のＤＣＸ＋、ｐ＝０．０４：ＤｉｃｅｒｃＫＯでは約９％のＤＣＸ＋、ｐ＝０．００１３）。さらに、本発明者らは、ＤｉｃｅｒＷＴおよびＨＴ細胞と比較して、ＤＣＸ＋ＤｉｃｅｒｃＫＯ細胞において、神経突起の数、分枝、およびスパインの減少を観察した（図７Ｄ）。
【００５５】
次に、本発明者らは、分化後の組換え（Ｔｄ−Ｔｏｍａｔｏ＋）ＤｉｃｅｒＷＴ、ＨＴおよびｃＫＯａＮＣＳにおける星状グリア形成を調べ（図１２Ａ）、３つのＤｉｃｅｒ遺伝子型の間に差異は見られなかった（図１２Ｂ、下記）。続いて、本発明者らは１０％の胎児血清を用いて、６ＤＩＶの間、星状細胞への分化を誘導した（図８Ａ）（Wang et al.,2011）。やはり、３つのＤｉｃｅｒ遺伝子型の間で、星状細胞マーカーＧＦＡＰおよびＳ１００ｂを発現する細胞の比率に差は観察されなかった（図８Ｂ−Ｃ）。これらのデータは、３つのＤｉｃｅｒ遺伝子型において、タンパク質レベルとｍＲＮＡレベルの両方でａＮＳＣマーカーＮｅｓｔｉｎの発現が平行して減少したこと（図８Ｄ−Ｈ）、およびＧＦＡＰやＳ１００ｂなどの星状細胞マーカーの発現が劇的に増加したこと（図８Ｅ−Ｆ−Ｉ）によって、支持された。これらのインビトロでの発見は、インビボの証拠と一致しており（図１）、Ｄｉｃｅｒ機能はニューロン新生に向けたａＮＳＣ分化およびニューロンの成熟に不可欠であるが、星状グリア形成には不可欠ではないことを示している。
【００５６】
１１種のｍＲＮＡのプールは、星状グリア形成を犠牲にして、ａＮＳＣニューロン新生運命を決定する
本発明者らは、Ｄｉｃｅｒ依存性ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）関連のＤｉｃｅｒの機能が、成体海馬ニューロン新生の制御に関与するかどうかを明らかにしようと試みた。最初に、本発明者らは、増殖条件下での、およびニューロン分化の７、１４、および２１ＤＩＶ後での、ＷＴａＮＳＣにおけるｍｉＲＮＡ発現の動態を、ウイルス誘導性Ａｓｃｌ１発現によって解析した（Braun et al., 2013）（図９Ａ）。このアプローチにより、ａＮＳＣのウイルス感染後に９５％のＭＡＰ２＋ニューロンを得ることができた（図１０）。これらの細胞から３３５個の成熟ｍＲＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲによって検出し、それらの増殖下の発現レベルおよび動態に従って、それらを、初期ニューロン分化（７ＤＩＶ）、および後期ニューロン分化（１４および２１ＤＩＶ）の３つのグループに分類した（図９Ｂ）。増殖またはニューロン分化に関与することが知られているｍｉＲＮＡは、動的に制御され（図１１Ａ−Ｂ、（Schouten et al., 2012））、したがって本発明者らのアプローチの妥当性を支持している。
【００５７】
本発明者らは、発現がニューロン新生の初期段階に関連するｍｉＲＮＡが、Ｄｉｃｅｒ依存性ニューロン新生機能障害を緩和できると仮定した。したがって、本発明者らは、初期ニューロン分化（７ＤＩＶ）中に優先的濃縮（倍数変化：Ｌｏｇ＞２）および高い発現レベル（Ｃｔ値＜２５）を示す、１１種のｍｉＲＮＡのグループ：ｍｉＲ−３７６ｂ−３ｐ、１３９−５ｐ、２１８−５ｐ、４１１−５ｐ、１２７−３ｐ、１３４−５ｐ、３７０−３ｐ、１３５ａ−５ｐ、３８２−５ｐ、７０８−５ｐ、１２４−３ｐに注目した（図９Ｂ、倍率、および図９Ｃ）。ＤｉｃｅｒｃＫＯａＮＳＣにおいて、ａＮＳＣを、１１種のｍｉＲＮＡを含有するプール（以下、「プール全体」と呼ぶ、配列番号１〜１１）、またはコントロールｍｉＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの６日後、本発明者らは、コントロールのｍｉＲＮＡではなくプール全体が、ニューロンマーカーＤＣＭ（図１２Ａ−Ｂ、ｐ＝０．０１２；ｍＲＮＡ定量については図１２Ｅ、ｐ＝０．０３）およびＭＡＰ２（図１２Ａ−Ｂ、ｐ＝０．０００１）の発現によって示されるように、ＤｉｃｅｒｃＫＯ細胞におけるニューロン分化を２倍誘導し、それにより、ニューロン新生のＤｉｃｅｒｃＫＯ機能障害を、ＷＴレベルまで救済することを見出した。代わりに、個別に投与した場合、１１種のｍｉＲＮＡのいずれもが、プール全体と比較して、ＤｉｃｅｒｃＫＯａＮＳＣにおいてニューロン新生を救済することができなかった（図１２Ｃ−Ｄ）。
【００５８】
本発明者らは、これらのｍｉＲＮＡが、ニューロン新生の刺激に加えて星状グリア形成を抑制できるかどうかを調べるために、プール全体またはコントロールｍｉＲＮＡを用いたトランスフェクション後の、ＤｉｃｅｒｃＫＯａＮＳＣにおけるＳ１００ｂマーカーの発現を解析した。本発明者らは、Ｓ１００ｂの発現（図１２Ａ−Ｂ、ｐ＝０．００３）とＧＦＡＰをコードするｍＲＮＡの発現（図１２Ｅ、ｐ＝０．００１９）によって示されるように、星状細胞への分化の減少を見出し、このことは、これらのｍｉＲＮＡが、ａＮＳＣの運命のニューロンと星状細胞との間での切り替えの制御に関与していることを示唆している。
【００５９】
さらに、本発明者らはまた、特定のｍｉＲＮＡサブプールの効果を解析し、それらの効果をプール全体の効果と比較した。しかしながら、サブプールのいずれも、Ｄｉｃｅｒ−ｃＫＯａＮＳＣの損なわれたニューロン分化を救済しなかった（図１３、サブプール１；サブプール２およびサブプール３）。これらの結果は、１１種のｍｉＲＮＡが、グリア形成を犠牲にして、相乗効果により海馬のａＮＳＣにおけるニューロン運命決定を支持するのに十分かつ必要であることを実証している。
【００６０】
この証拠に基づいて、本発明者らはまた、ａＮＳＣにおける星状細胞またはニューロンへの分化の制御に関与する可能性がある１１種のｍｉＲＮＡの潜在的な標的を特定するためのインシリコの解析を行った。ｍｉＲＷａｌｋ２．０ソフトウェアを非常に制限的なパラメータと共に使用し、予測された標的の非常に大きな割合（３７％、すなわち４９２９個中１８１７個）を、１１種のｍｉＲＮＡのうち少なくとも２種が有することが見出された。興味深いことに、これらの遺伝子の多くは、発生中の星状細胞またはニューロンにおいて発現されることが以前に示されている（Cahoy et al.,2008）。そこで、本発明者らは、１１種のｍｉＲＮＡが、グリア形成促進伝子および抗ニューロン新生遺伝子を同時に抑制することによって、それらのニューロン新生促進効果を達成することができると仮定した。この可能性を試験するために、本発明者らは１１種のｍｉＲＮＡのうちの少なくとも５種について標的と予測される遺伝子を手作業で選択し、コントロールｍｉＲＮＡ、プール全体またはサブプールを用いたトランスフェクション後の、ＤｉｃｅｒｃＫＯａＮＳＣにおけるそれらの発現レベルを測定した。確かに、プール全体でのトランスフェクション後（図１２Ｅ）では、ＤｉｃｅｒｃＫＯａＮＳＣにおけるニューロン新生の救済後に、ＳＰ１（ｐ＝０．０００１）などのニューロン分化の負の制御因子、または、Ａｑｐ４（ｐ＝０．０００２）、Ｓｍａｄ３（ｐ＝０．０００１）およびＴｇｆｂｒ１（ｐ＝０．０００１）などの星状細胞分化の負の制御因子の発現に顕著な減少が見られたが、サブプールでのトランスフェクション後（図１３Ｃ）では見られなかった（図１２Ｅ）。これらの結果は、１１種のｍｉＲＮＡがグリア形成促進遺伝子および抗ニューロン新生遺伝子の同時抑制によりニューロン新生運命を決定するという仮説を裏付けるものである。
【００６１】
考察
本発明者らが行った研究は、成体の海馬において１１種のｍｉＲＮＡのセットが、星状グリア形成を犠牲にした、ａＮＳＣのニューロンへの分化に重要であることを初めて示した。驚くべきことに、これらのｍｉＲＮＡは、プールとして投与された場合にのみ、既に損なわれたニューロン新生を正常レベルまで救済したが、個々のｍｉＲＮＡの投与は効果を示さなかった。それゆえ、本発明者らが行った研究は、相乗的に遺伝子調節メカニズムを活性化することによって、ａＮＳＣの分化プログラムに影響を及ぼすという、ｍｉＲＮＡの協同性の新たな概念に対する実験的証拠を提供した。
【００６２】
成体のニューロン新生は脊椎動物の間で高度に保存されたプロセスである（Gage and Temple, 2013）が、ニューロン新生と星状グリア形成運命の適切な獲得の制御の根底にあるメカニズムはまだ解明されていなかった（Bonaguidi et al., 2012; Kempermann, 2011）。本発明者らは、タイプＩａＮＳＣにおいてインビボおよびインビトロで行った研究により、ａＮＳＣにおけるＤｉｃｅｒ切断がニューロン新生を損なうが、星状グリア形成を損なわないことを実証した。それゆえ、得られた結果は、ｍｉＲＮＡが、成体の海馬おいてニューロ新生系列を維持し、星状グリア形成を妨げるのに必要な、新たな調節のレベルを表すことを明らかにしている。
【００６３】
その上、本発明者らが実施した研究は、１１種のｍＲＮＡがａＮＳＣにおいてＤｉｃｅｒ切断後にニューロン新生を救済することができるという証拠を提供し、ｍｉＲＮＡがａＮＳＣにおいて重要なニューロン新生制御因子であることを実証している。さらに、本発明者らが使用したインビトロモデルは、ａＮＳＣのニューロン運命の早期決定に関与する特定のｍｉＲＮＡを機能的に分析することを可能にした。実際に、本発明者らは、１１種のｍＲＮＡのプールが、ＤｉｃｅｒｃＫＯａＮＳＣにおける正常（野生型）レベルまでのニューロン新生の救済に、十分かつ必要であることを見出した。
【００６４】
実施例２：神経膠芽腫における治療的応用
Ｕ８７ＭＧ（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１４）は、一般に研究されているグレードＩＶの神経膠腫細胞株であり、４０年以上にわたり少なくとも１，７００の文献で解析されており、ヌードマウスの脳内注射で悪性神経膠腫を誘発することが示されている。この細胞株を、J.Pontenおよび准教授が１９６６年から１９６９年までの間に、ステージＩＶの４４歳の男性がん患者（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１５およびＡＴＣＣ  ＨＴＢ−１６も参照）から入手した。Ｕ８７ＭＧのゲノム配列の解析により、他のどの細胞株と比較しても比類のないレベルの突然変異の結果が得られ、ホモ接合性変異を持つ５１２個の遺伝子が明らかになり、１５４個のＳＮＶ（単一ヌクレオチド変異）、１７８個の小さなインデル、１４５個の大きな微小欠失および３５個の染色体間転座が含まれていた。
【００６５】
方法
ヒト初代神経膠芽腫細胞株Ｕ８７ＭＧを、１．２×１０４細胞／ｃｍでプレーティングして、培養培地で２４時間培養した。３つの培地条件を試験した：ｉ）１０％ＦＢＳを添加したＥＭＥＭ培地；ｉｉ）ＦＢＳなしのＥＭＥＭ培地；および（ｉｉｉ）レチノイン酸を添加したＮＢ。翌日、細胞を、２５０ｎＭの模倣物（ネガティブコントロール、ＣＮ−００１０００−０１−０５；Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、または、本発明の１１種のｍＲＮＡのプールで、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、製造元の説明書に従いトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、細胞をトリプシンで剥がし、計測して、スフェロイドに好適な適切な密度でプレーティングした。およそ５００個の細胞を含むスフェロイドを、３Ｄコラーゲンゲルに移し、加湿チャンバー内で３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。ゲル中にスフェロイドを含有させた１、４および６日後に、画像を得た。
【００６６】
結果
神経膠芽腫Ｕ８７ＭＧスフェロイドをコラーゲンゲル中で６日間培養し、本発明のｍｉＮプールがその浸潤性および増殖特性に影響を及ぼし得るかどうかを試験した。図１４に示したように、６日間インキュベーションした後に、本発明のｍｉＲＮＡプールをトランスフェクトしたＵ８７ＭＧスフェロイドは、全ての試験条件で、コントロールスフェロイドと比較した場合に、中心核の半径の顕著な減少を示し（二元配置分散分析、ｐ＜０．０５  ＥＭＥＭ−ＦＢＳ；ｐ＜０．０１  ＮＢ）、１０％ＦＢＳを添加したＥＭＥＭにおいて浸潤性を測定した場合にも、中心核の半径の顕著な減少を示した（二元配置分散分析、ｐ＜０．００１））。これらの結果は、本発明の選択されたｍｉＲＮＡプールがヒト神経膠芽腫Ｕ８７ＭＧ細胞株の増殖および転移特性をインビトロで阻害することを示し、グレードＩＶのヒト神経膠芽腫の浸潤性を阻害するための新しい治療アプローチの始まりを示すものである。
【００６７】
参考文献
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【００６８】
2019529425.tif 000004
【００６９】
2019529425.tif 000005
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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