(57)【要約】Ｖｉｂｒｉｏ属の細菌種によって引き起こされる疾患、例えば、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅによって引き起こされるコレラを防止する、好転させる、または処置するための組成物および方法が提供され、組成物は、Ｖｉｂｒｉｏ細胞に感染し、それを死滅させる２種またはそれより多い溶菌性バクテリオファージ株を含有する。バクテリオファージは有毒であり、細胞内で複製し、細菌を溶菌して、死滅させる。単一の処置における２種またはそれより多い株の使用によって、無視できる程度まで低い全バクテリオファージへの同時耐性に対する細菌の変異率の結果として、統計的に無視できる程度までファージ耐性細菌の出現が低下する。通常のヒト微生物フローラ種は影響を受けなかった。方法および組成物の代替の実施形態では、抗生剤または他の処置剤が、複数のバクテリオファージ株のカクテルと共に投与されうる。
2019510052.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるＶｉｂｒｉｏ細菌感染を防止または低減するための組成物であって、
前記細菌感染のＶｉｂｒｉｏ種の細胞に感染しそれを溶菌する複数の有毒な溶菌性バクテリオファージ株の予防混合物を含む組成物。
【請求項２】
前記溶菌性バクテリオファージ株が、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅに感染した患者の便試料由来の単離体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記複数の株が、ＩＣＰ−１、ＩＣＰ−２、ＩＣＰ−３、またはその有毒な改変体からなる群より選択される少なくとも２種のバクテリオファージ株である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記複数の株が、バクテリオファージ株ＩＣＰ−１、ＩＣＰ−２、およびＩＣＰ−３を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記株の少なくとも１種が野生型バクテリオファージの改変体または変異体であり、前記改変体が、偶発突然変異体、誘導変異体、および遺伝子操作された組換え体の群から選択される、請求項１から４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記溶菌性バクテリオファージ株のビリオンが、前記Ｖｉｂｒｉｏ感染種の細胞中で複製し、前記細胞を溶菌する、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物中の前記複数の株のうちのいずれか２種の各株のプラーク形成単位（ＰＦＵ）の量の比が、それぞれ、第１の株と第２の株の力価が約１：１０未満から、それぞれ、前記第１の株と前記第２の株の力価が１０：１超までの範囲内であることを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記対象が、以前に、前記Ｖｉｂｒｉｏ感染種に曝露されたことがない、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記対象が、前記Ｖｉｂｒｉｏ感染種に曝露され、例えば、曝露された前記対象が前記感染に罹患している患者の家庭のメンバーであるか、または曝露された前記対象が医療従事者である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記バクテリオファージの前記ビリオンが、第１の株については第１の受容体への、第２の株については第２の受容体への結合により前記Ｖｉｂｒｉｏ細胞の表面に結合し、前記第１および前記第２の受容体は分子として異なる、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
バクテリオファージの前記第１の株のビリオンが細菌細胞の外膜タンパク質に結合し、バクテリオファージの前記第２の株のビリオンがリポ多糖に結合する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
通常のミクロビオームの細胞が、前記複数のバクテリオファージ株に対する受容体を欠く、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記溶菌性バクテリオファージ株の宿主範囲が、前記感染のＶｉｂｒｉｏ種を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記感染がコレラであり、前記溶菌性バクテリオファージ株がＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの細胞に感染する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記溶菌性バクテリオファージ株の宿主範囲が、複数のＶｉｂｒｉｏ種に感染する、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記Ｖｉｂｒｉｏ種が、Ｖｉｂｒｉｏ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｖ．ａｅｓｔｉｖｕｓ、Ｖ．ａｅｓｔｕａｒｉａｎｕｓ、Ｖ．ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ、Ｖ．ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｖ．ａｌｆａｃｓｅｎｓｉｓ、Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ、Ｖ．ａｒｅｎｉｎｉｇｒａｅ、Ｖ．ａｒｔａｂｒｏｒｕｍ、Ｖ．ａｔｌａｎｔｉｃｕｓ、Ｖ．ａｔｙｐｉｃｕｓ、Ｖ．ａｚｕｒｅｕｓ、Ｖ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｂｕｂｕｌｕｓ、Ｖ．ｃａｌｖｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｃａｍｐｂｅｌｌｉｉ、Ｖ．ｃａｓｅｉ、Ｖ．ｃｈａｇａｓｉｉ、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖ．ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｃｏｒａｌｌｉｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａｅ、Ｖ．ｃｙｃｌｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｖ．ｄｉａｂｏｌｉｃｕｓ、Ｖ．ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｖ．ｅｚｕｒａｅ、Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｖ．ｆｏｒｔｉｓ、Ｖ．ｆｕｒｎｉｓｓｉｉ、Ｖ．ｇａｌｌｉｃｕｓ、Ｖ．ｇａｚｏｇｅｎｅｓ、Ｖ．ｇｉｇａｎｔｉｓ、Ｖ．ｈａｌｉｏｔｉｃｏｌｉ、Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ、Ｖ．ｈｅｐａｔａｒｉｕｓ、Ｖ．ｈｉｐｐｏｃａｍｐｉ、Ｖ．ｈｉｓｐａｎｉｃｕｓ、Ｖ．ｉｃｈｔｈｙｏｅｎｔｅｒｉ、Ｖ．ｉｎｄｉｃｕｓ、Ｖ．ｋａｎａｌｏａｅ、Ｖ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｖ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｖ．ｌｏｇｅｉ、Ｖ．ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｖ．ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ、Ｖ．ｍｉｍｉｃｕｓ、Ｖ．ｍｙｔｉｌｉ、Ｖ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、Ｖ．ｎａｖａｒｒｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｎｅｏｎａｔｅｓ、Ｖ．ｎｅｐｔｕｎｉｕｓ、Ｖ．ｎｅｒｅｉｓ、Ｖ．ｎｉｇｒｉｐｕｌｃｈｒｉｔｕｄｏ、Ｖ．ｏｒｄａｌｉｉ、Ｖ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｖ．ｐａｃｉｎｉｉ、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｐｅｃｔｅｎｉｃｉｄａ、Ｖ．ｐｅｎａｅｉｃｉｄａ、Ｖ．ｐｏｍｅｒｏｙｉ、Ｖ．ｐｏｎｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｒｏｔｉｆｅｒｉａｎｕｓ、Ｖ．ｒｕｂｅｒ、Ｖ．ｒｕｍｏｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ｖ．ｓｃｏｐｈｔｈａｌｍｉ、Ｖ．ｓｐｌｅｎｄｉｄｕｓ、Ｖ．ｓｕｐｅｒｓｔｅｓ、Ｖ．ｔａｐｅｔｉｓ、Ｖ．ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｔｕｂｉａｓｈｉｉ、Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｖ．ｗｏｄａｎｉｓ、およびＶ．ｘｕｉｉからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
抗生剤、抗真菌剤、抗原虫剤、抗炎症剤、抗脱水剤、および水分補給剤の群から選択される少なくとも１種の治療剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
液体、錠剤、カプセル剤、食品添加物、および親液性物質から選択される群のうちの１種として製剤化される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
対象におけるＶｉｂｒｉｏ種の感染を防止するかまたは好転させる方法であって、
前記Ｖｉｂｒｉｏ感染種の細胞に感染しそれを溶菌する、予防用量の複数の溶菌性バクテリオファージ株を含む組成物を前記対象に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項２０】
前記Ｖｉｂｒｉｏ種が、Ｖｉｂｒｉｏ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｖ．ａｅｓｔｉｖｕｓ、Ｖ．ａｅｓｔｕａｒｉａｎｕｓ、Ｖ．ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ、Ｖ．ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｖ．ａｌｆａｃｓｅｎｓｉｓ、Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ、Ｖ．ａｒｅｎｉｎｉｇｒａｅ、Ｖ．ａｒｔａｂｒｏｒｕｍ、Ｖ．ａｔｌａｎｔｉｃｕｓ、Ｖ．ａｔｙｐｉｃｕｓ、Ｖ．ａｚｕｒｅｕｓ、Ｖ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｂｕｂｕｌｕｓ、Ｖ．ｃａｌｖｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｃａｍｐｂｅｌｌｉｉ、Ｖ．ｃａｓｅｉ、Ｖ．ｃｈａｇａｓｉｉ、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖ．ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｃｏｒａｌｌｉｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａｅ、Ｖ．ｃｙｃｌｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｖ．ｄｉａｂｏｌｉｃｕｓ、Ｖ．ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｖ．ｅｚｕｒａｅ、Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｖ．ｆｏｒｔｉｓ、Ｖ．ｆｕｒｎｉｓｓｉｉ、Ｖ．ｇａｌｌｉｃｕｓ、Ｖ．ｇａｚｏｇｅｎｅｓ、Ｖ．ｇｉｇａｎｔｉｓ、Ｖ．ｈａｌｉｏｔｉｃｏｌｉ、Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ、Ｖ．ｈｅｐａｔａｒｉｕｓ、Ｖ．ｈｉｐｐｏｃａｍｐｉ、Ｖ．ｈｉｓｐａｎｉｃｕｓ、Ｖ．ｉｃｈｔｈｙｏｅｎｔｅｒｉ、Ｖ．ｉｎｄｉｃｕｓ、Ｖ．ｋａｎａｌｏａｅ、Ｖ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｖ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｖ．ｌｏｇｅｉ、Ｖ．ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｖ．ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ、Ｖ．ｍｉｍｉｃｕｓ、Ｖ．ｍｙｔｉｌｉ、Ｖ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、Ｖ．ｎａｖａｒｒｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｎｅｏｎａｔｅｓ、Ｖ．ｎｅｐｔｕｎｉｕｓ、Ｖ．ｎｅｒｅｉｓ、Ｖ．ｎｉｇｒｉｐｕｌｃｈｒｉｔｕｄｏ、Ｖ．ｏｒｄａｌｉｉ、Ｖ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｖ．ｐａｃｉｎｉｉ、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｐｅｃｔｅｎｉｃｉｄａ、Ｖ．ｐｅｎａｅｉｃｉｄａ、Ｖ．ｐｏｍｅｒｏｙｉ、Ｖ．ｐｏｎｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｒｏｔｉｆｅｒｉａｎｕｓ、Ｖ．ｒｕｂｅｒ、Ｖ．ｒｕｍｏｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ｖ．ｓｃｏｐｈｔｈａｌｍｉ、Ｖ．ｓｐｌｅｎｄｉｄｕｓ、Ｖ．ｓｕｐｅｒｓｔｅｓ、Ｖ．ｔａｐｅｔｉｓ、Ｖ．ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｔｕｂｉａｓｈｉｉ、Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｖ．ｗｏｄａｎｉｓ、およびＶ．ｘｕｉｉからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が、ヒト、家畜、コアラなどの動物園の動物、イヌまたはウマなどの価値の高い哺乳動物、げっ歯類またはウサギなどの実験動物、魚、およびオウムまたはインコなどの鳥から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が、患者の家庭のメンバーまたは家族のメンバー、および医師、看護師、または用務員などの医療従事者から選択されるヒトである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記投与するステップが経口である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
再水分補給治療剤の少なくとも１種および少なくとも１種の抗生物質を投与するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記投与するステップが前記Ｖｉｂｒｉｏ感染種への曝露後であり、前記方法が前記感染を好転させるステップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与するステップが、前記曝露後であり、かつコレラの症状の発症前のものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記投与するステップが、前記曝露前のものであり、前記方法が感染を防止するかまたは好転させることである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記投与するステップの前に、少なくとも約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、または約１０１３ＰＦＵ／ｍｌのバクテリオファージの総力価まで前記組成物を製剤化するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数の株のうちの少なくとも２種のＰＦＵでの力価の前記組成物を製剤化するステップが、第１の株の力価  対  第２の株の力価について、それぞれ、約１：１０未満から少なくとも約１：５まで、少なくとも約１：１まで、少なくとも約５：１まで、少なくとも約１０：１までの比の範囲内で前記株を混合するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記投与するステップの前に、前記溶菌性バクテリオファージ株のそれぞれを無毒のＶｉｂｒｉｏ種の宿主と培養するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記投与するステップの前に、前記対象におけるエスケープファージ耐性変異体の選択を限定するために前記組成物を製剤化するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記投与するステップの前に、ＩＣＰ−１、ＩＣＰ−２、ＩＣＰ−３、株１３８、株１４５、株１６３、およびその溶菌性改変体からなる群より少なくとも２種の株を選択することによって前記組成物を製剤化するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物が、少なくとも約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、または約１０１３ＰＦＵ／用量の用量で投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
前記投与するステップを反復するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
抗生物質を投与するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
投与するステップの前に、環境試料から、またはＶｉｂｒｉｏ感染対象から前記溶菌性バクテリオファージ株を単離するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象がヒトであり、前記試料が、前記感染対象の便試料である、請求項３９に記載の方法。
【請求項３８】
投与するステップの前に、前記バクテリオファージ株のビリオン混合物をカプセル化することによって前記組成物を製剤化するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３９】
Ｖｉｂｒｉｏ種の細胞の感染に特異的な複数の溶菌性バクテリオファージ株を有する組成物を含むキット。
【請求項４０】
前記組成物が単位用量で存在する、請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】
前記組成物が、ＩＣＰ−１、ＩＣＰ−２、およびＩＣＰ−３の群から選択されるバクテリオファージ株の少なくとも１種を含む、請求項３９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、発明者Ａｎｄｒｅｗ  Ｃａｍｉｌｌｉ、Ｍｉｎｍｉｎ  ＹｅｎおよびＬｙｎｎｅ  Ｃａｉｒｎｓによる２０１６年４月１日に出願された「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｅｃｉｅｓ」との表題の仮出願第６２／３１６，７０４号（これは、その全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
政府の支援
この発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって付与された助成金ＡＩ０５５０５８の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
コレラは、小腸のＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅによる増殖および毒素生成によって引き起こされる下痢症である。家庭内でコレラが急速に伝染することが、大流行の間の新たな感染の主な供給源である。これらの二次症例のピーク時間は、初発症例が現れた４８時間後である。予防的な抗生物質の使用は、通常の微生物叢が破壊されるという理由で断念され、他の薬剤は、この疾患を処置または防止するために容易に利用できない。感染リスクは、患者を有さない家族の家庭と比較して、コレラを有する患者を含有する家族の家庭で、およそ１００倍増加する。
【０００４】
増殖型の（溶菌性または有毒な）Ｖｉｂｒｉｏバクテリオファージの３種の株、ＩＣＰ−１、ＩＣＰ−２およびＩＣＰ−３が単離され、シークエンシングされている。（Ｓｅｅｄら、ｍＢｉｏ、２巻（１号）：１〜９頁、２０１１年）。これらのファージ株のそれぞれは、バングラデシュのダッカのコレラ患者の便試料から頻繁に単離されてきた。稀に、これらのファージ株のうちの２種が、１人のコレラ患者の便試料で検出され、発生率が稀であるためＰＣＲが必要とされ、ファージ株の３種すべては同じ試料中で一緒には検出されていない。
【０００５】
表層リポ多糖（ＬＰＳ）のＯ１抗原であるＩＣＰ−１受容体をコードする遺伝子における、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅの変異が選択され、変異体はファージ感染に耐性である（Ｓｅｅｄら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ、８巻（９号）：１〜１３頁、２０１２年）。これらの変異は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは高頻度で生じる。動物またはヒトでの感染中には、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのリポ多糖が罹患した腸管の細菌有毒性に必要とされるため、この頻度は低下する。
【０００６】
少数のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株は、ＩＣＰ−１に対する耐性メカニズムを有する（Ｓｅｅｄら、Ｎａｔｕｒｅ、４９４巻（７４３８号）：４８９〜４９１頁、２０１３年）。しかし、ＩＣＰ−１ファージ株は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによるその耐性を克服し、ファージに感染サイクルを維持させるメカニズムを進化させた。
【０００７】
ＩＣＰ−２に対する細菌の受容体は、ＯｍｐＵと称される有毒性に対して重要な表面タンパク質である（Ｓｅｅｄら、ｅＬｉｆｅ、３巻：ｅ０３４９７頁、２０１４年）。細菌のエスケープ変異体株が、一部の患者で観察され、ＯｍｐＵタンパク質をコードする遺伝子に点変異を含有する。ある特定の患者では、もはやＯｍｐＵタンパク質を発現しない無毒のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅエスケープ変異体が排出され、これらの変異体は他の人々に疾患を伝染しないことが観察された。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓｅｅｄら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ（２０１２年）８巻（９号）：１〜１３頁
【非特許文献２】Ｓｅｅｄら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１３年）４９４巻（７４３８号）：４８９〜４９１頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
コレラおよび関連するＶｉｂｒｉｏ細菌疾患の伝染を防止する非抗生剤が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の態様は、本明細書において、対象におけるＶｉｂｒｉｏ細菌感染を防止または低減するための組成物であって、細菌感染のＶｉｂｒｉｏ種の細胞に感染しそれを溶菌する複数株の溶菌性バクテリオファージの予防混合物を含有する組成物を提供する。組成物の実施形態では、溶菌性バクテリオファージ株は、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅに感染した患者の便試料からの単離体である。例えば、複数とは、ＩＣＰ−１、ＩＣＰ−２、ＩＣＰ−３、またはそれらの有毒性改変体からなる群より選択される少なくとも２種のバクテリオファージ株である。組成物の特定の実施形態は、この複数がバクテリオファージ株ＩＣＰ−１、ＩＣＰ−２、およびＩＣＰ−３を含むカクテルである。さらなる実施形態は、株の少なくとも１種が野生型バクテリオファージの改変体または変異体であることを含み、改変体は、偶発突然変異体、誘導変異体、および遺伝子操作された組換え体の群から選択される。一般的に、バクテリオファージの溶菌性株のビリオンはＶｉｂｒｉｏ感染種の細胞中で複製し、細胞を溶菌し、対象中の細菌の死を引き起こし、このようにして感染を防止または低減する。
【００１１】
用語「有毒な」および「溶菌性の」は、本明細書で使用する場合、細菌に感染し、細菌細胞の死滅および溶菌をもたらす生産性複製サイクルを有するバクテリオファージ株を指す。用語「溶原性の」または「テンペレート」は、細菌細胞を溶原可能であり、細菌の染色体に組み込まれたファージゲノムを保有する細胞の増殖の継続をもたらすバクテリオファージ株を指す。溶原性ファージ株は、増殖において厳密に溶菌性である有毒な誘導体へ変異することができ、本明細書の組成物および方法において使用することができる。
【００１２】
実施形態のいずれかでは、組成物は、組成物中の複数株のうちのいずれか２種の各株のプラーク形成単位（ＰＦＵ）の量の比が、それぞれ、第１の株と第２の株の力価が約１：１０未満から、それぞれ、第１の株と第２の株の力価が１０：１超までの範囲内である、複数株を含有する。組成物は、以前に、例えば、対象の知る限りにおいて、Ｖｉｂｒｉｏ感染種に曝露されたことのない対象に投与するのに適している。あるいは、対象はＶｉｂｒｉｏ感染種に曝露され、例えば、曝露された対象は感染に罹患している患者の家庭のメンバーであるか、または曝露された対象は医療従事者である。
【００１３】
感染細菌の中で耐性変異体の出現を大いに低減するかまたはさらには排除するために、バクテリオファージのビリオンは、第１の株の細菌表面上の第１の受容体への結合、および第２の株の第２の受容体への結合によりＶｉｂｒｉｏ細胞の表面に結合し、第１および第２の受容体は分子として異なる。このように、大半の細菌遺伝子について約１０−７から約１０−９の細菌集団中の頻度のオーダーである、耐性への偶発突然変異の割合は、２種のファージ株に対する二重耐性変異体を得るために２乗される必要があり、これは無視できるかまたはさらには非存在である程低い割合である。したがって、本明細書における組成物の実施形態では、バクテリオファージの第１の株のビリオンは細菌細胞の外膜タンパク質ＯｍｐＵに結合し、バクテリオファージの第２の株のビリオンはリポ多糖に結合する。
【００１４】
本明細書で提供される組成物の特定の利点は、通常のミクロビオームの株の細胞が複数のバクテリオファージ株に対する受容体を欠き、通常の腸内フローラ種の生存能力に影響を与えないままであることである。溶菌性バクテリオファージ株の宿主範囲は、感染のＶｉｂｒｉｏ種を含む。例えば、感染はコレラであり、溶菌性バクテリオファージ株がＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの細胞に感染する。一部の実施形態では、溶菌性バクテリオファージ株の宿主範囲は、複数のＶｉｂｒｉｏ種に感染する能力を含む。この属の細菌は、多数の動物種の疾患の原因である。例えば、組成物の実施形態は、Ｖｉｂｒｉｏ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｖ．ａｅｓｔｉｖｕｓ、Ｖ．ａｅｓｔｕａｒｉａｎｕｓ、Ｖ．ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ、Ｖ．ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｖ．ａｌｆａｃｓｅｎｓｉｓ、Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ、Ｖ．ａｒｅｎｉｎｉｇｒａｅ、Ｖ．ａｒｔａｂｒｏｒｕｍ、Ｖ．ａｔｌａｎｔｉｃｕｓ、Ｖ．ａｔｙｐｉｃｕｓ、Ｖ．ａｚｕｒｅｕｓ、Ｖ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｂｕｂｕｌｕｓ、Ｖ．ｃａｌｖｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｃａｍｐｂｅｌｌｉｉ、Ｖ．ｃａｓｅｉ、Ｖ．ｃｈａｇａｓｉｉ、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖ．ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｃｏｒａｌｌｉｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａｅ、Ｖ．ｃｙｃｌｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｖ．ｄｉａｂｏｌｉｃｕｓ、Ｖ．ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｖ．ｅｚｕｒａｅ、Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｖ．ｆｏｒｔｉｓ、Ｖ．ｆｕｒｎｉｓｓｉｉ、Ｖ．ｇａｌｌｉｃｕｓ、Ｖ．ｇａｚｏｇｅｎｅｓ、Ｖ．ｇｉｇａｎｔｉｓ、Ｖ．ｈａｌｉｏｔｉｃｏｌｉ、Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ、Ｖ．ｈｅｐａｔａｒｉｕｓ、Ｖ．ｈｉｐｐｏｃａｍｐｉ、Ｖ．ｈｉｓｐａｎｉｃｕｓ、Ｖ．ｉｃｈｔｈｙｏｅｎｔｅｒｉ、Ｖ．ｉｎｄｉｃｕｓ、Ｖ．ｋａｎａｌｏａｅ、Ｖ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｖ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｖ．ｌｏｇｅｉ、Ｖ．ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｖ．ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ、Ｖ．ｍｉｍｉｃｕｓ、Ｖ．ｍｙｔｉｌｉ、Ｖ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、Ｖ．ｎａｖａｒｒｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｎｅｏｎａｔｅｓ、Ｖ．ｎｅｐｔｕｎｉｕｓ、Ｖ．ｎｅｒｅｉｓ、Ｖ．ｎｉｇｒｉｐｕｌｃｈｒｉｔｕｄｏ、Ｖ．ｏｒｄａｌｉｉ、Ｖ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｖ．ｐａｃｉｎｉｉ、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｐｅｃｔｅｎｉｃｉｄａ、Ｖ．ｐｅｎａｅｉｃｉｄａ、Ｖ．ｐｏｍｅｒｏｙｉ、Ｖ．ｐｏｎｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｒｏｔｉｆｅｒｉａｎｕｓ、Ｖ．ｒｕｂｅｒ、Ｖ．ｒｕｍｏｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ｖ．ｓｃｏｐｈｔｈａｌｍｉ、Ｖ．ｓｐｌｅｎｄｉｄｕｓ、Ｖ．ｓｕｐｅｒｓｔｅｓ、Ｖ．ｔａｐｅｔｉｓ、Ｖ．ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｔｕｂｉａｓｈｉｉ、Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｖ．ｗｏｄａｎｉｓ、およびＶ．ｘｕｉｉからなる群より選択される少なくとも１種であるＶｉｂｒｉｏ種に対する宿主範囲を有する複数のバクテリオファージ株を含有する。
【００１５】
種々の実施形態では、組成物は、抗生剤、抗真菌剤、抗原虫剤、抗炎症剤、抗脱水剤（ａｎｔｉ−ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）、および水分補給剤（ｈｙｄｒａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の群から選択される少なくとも１種の治療剤をさらに含む。代替の実施形態では、組成物は、液体、錠剤、カプセル剤、食品添加物、および親液性物質（ｌｙｏｐｈｉｌ）から選択される群のうちの１種として製剤化される。親液性物質に関して、組成物は、溶媒和剤として滅菌緩衝液を含むようにパッケージングされる。
【００１６】
本発明の態様は、本明細書において、対象におけるＶｉｂｒｉｏ種の感染を防止するかまたは好転（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）させる方法であって、Ｖｉｂｒｉｏ感染種の細胞に感染しそれを溶菌する、予防用量の複数の溶菌性バクテリオファージ株を含む組成物を対象に投与するステップを含む方法を提供する。例えば、Ｖｉｂｒｉｏ種は、Ｖｉｂｒｉｏ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｖ．ａｅｓｔｉｖｕｓ、Ｖ．ａｅｓｔｕａｒｉａｎｕｓ、Ｖ．ａｇａｒｉｖｏｒａｎｓ、Ｖ．ａｌｂｅｎｓｉｓ、Ｖ．ａｌｆａｃｓｅｎｓｉｓ、Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ、Ｖ．ａｒｅｎｉｎｉｇｒａｅ、Ｖ．ａｒｔａｂｒｏｒｕｍ、Ｖ．ａｔｌａｎｔｉｃｕｓ、Ｖ．ａｔｙｐｉｃｕｓ、Ｖ．ａｚｕｒｅｕｓ、Ｖ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｂｕｂｕｌｕｓ、Ｖ．ｃａｌｖｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｃａｍｐｂｅｌｌｉｉ、Ｖ．ｃａｓｅｉ、Ｖ．ｃｈａｇａｓｉｉ、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｖ．ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｃｏｒａｌｌｉｉｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａｅ、Ｖ．ｃｙｃｌｉｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｖ．ｄｉａｂｏｌｉｃｕｓ、Ｖ．ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｖ．ｅｚｕｒａｅ、Ｖ．ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｖ．ｆｏｒｔｉｓ、Ｖ．ｆｕｒｎｉｓｓｉｉ、Ｖ．ｇａｌｌｉｃｕｓ、Ｖ．ｇａｚｏｇｅｎｅｓ、Ｖ．ｇｉｇａｎｔｉｓ、Ｖ．ｈａｌｉｏｔｉｃｏｌｉ、Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ、Ｖ．ｈｅｐａｔａｒｉｕｓ、Ｖ．ｈｉｐｐｏｃａｍｐｉ、Ｖ．ｈｉｓｐａｎｉｃｕｓ、Ｖ．ｉｃｈｔｈｙｏｅｎｔｅｒｉ、Ｖ．ｉｎｄｉｃｕｓ、Ｖ．ｋａｎａｌｏａｅ、Ｖ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｖ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｖ．ｌｏｇｅｉ、Ｖ．ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ、Ｖ．ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｖｉｉ、Ｖ．ｍｉｍｉｃｕｓ、Ｖ．ｍｙｔｉｌｉ、Ｖ．ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、Ｖ．ｎａｖａｒｒｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｎｅｏｎａｔｅｓ、Ｖ．ｎｅｐｔｕｎｉｕｓ、Ｖ．ｎｅｒｅｉｓ、Ｖ．ｎｉｇｒｉｐｕｌｃｈｒｉｔｕｄｏ、Ｖ．ｏｒｄａｌｉｉ、Ｖ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｖ．ｐａｃｉｎｉｉ、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｐｅｃｔｅｎｉｃｉｄａ、Ｖ．ｐｅｎａｅｉｃｉｄａ、Ｖ．ｐｏｍｅｒｏｙｉ、Ｖ．ｐｏｎｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｒｏｔｉｆｅｒｉａｎｕｓ、Ｖ．ｒｕｂｅｒ、Ｖ．ｒｕｍｏｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ、Ｖ．ｓｃｏｐｈｔｈａｌｍｉ、Ｖ．ｓｐｌｅｎｄｉｄｕｓ、Ｖ．ｓｕｐｅｒｓｔｅｓ、Ｖ．ｔａｐｅｔｉｓ、Ｖ．ｔａｓｍａｎｉｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｔｕｂｉａｓｈｉｉ、Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ、Ｖ．ｗｏｄａｎｉｓ、およびＶ．ｘｕｉｉからなる群より選択される少なくとも１種である。
【００１７】
種々の実施形態では、対象は、ヒト、家畜、コアラなどの動物園の動物、イヌまたはウマなどの価値の高い哺乳動物、げっ歯類またはウサギなどの実験動物、魚、およびオウムまたはインコなどの鳥から選択される。例えば、対象は、患者の家庭のメンバーまたは家族のメンバー、および医師、看護師、または用務員などの医療従事者から選択されるヒトである。方法の実施形態では、投与するステップは経口である。
【００１８】
方法の実施形態は、投与するステップの後に、胃腸管のＶｉｂｒｉｏ細胞負荷の低減量を解析するステップをさらに含し、それによって、投与することにより対象におけるＶｉｂｒｉｏ種の細胞の負荷を低減し、そしてＶｉｂｒｉｏ細菌による対象のコロニー形成を防止することをもたらす。解析するステップは、ＤＮＡ含量によって、または細菌コロニーをカウントするための選択固形培地の使用によって、便試料をアッセイする非侵襲的方法を含む。処置対象に存在するバクテリオファージは、便試料中に排泄されたＰＦＵとして、または他の方法によって解析することができる。方法は、種々の実施形態では、再水分補給治療剤の少なくとも１種および少なくとも１種の抗生物質を投与するステップをさらに含む。方法は、投与するステップの後に、宿主の微生物叢の細菌フローラ含量を解析するステップをさらに含む。方法の実施形態では、投与するステップはＶｉｂｒｉｏ感染種への曝露後であり、方法は感染を好転させるステップを含む。代替の実施形態では、投与するステップは、曝露後であり、かつコレラの症状の発症前のものであるか、または投与するステップは、曝露前のものであり、方法は感染を防止するかもしくは好転させることであり、またはいくつかの組み合わせが使用される。
【００１９】
方法は、種々の実施形態では、投与するステップの前に、少なくとも約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、または少なくとも約１０１３ＰＦＵ／ｍｌのバクテリオファージの総力価まで組成物を製剤化するステップをさらに含む。複数株のうちの少なくとも２種のＰＦＵでの力価の組成物を製剤化するステップは、第１の株の力価  対  第２の株の力価について、それぞれ、約１：１０未満から少なくとも約１：５まで、少なくとも約１：１まで、少なくとも約５：１まで、少なくとも約１０：１までの比の範囲内で株を混合することによって組成物を作製するステップをさらに含む。ファージ株を混合することによって組成物を製剤化するステップの前に、方法は、投与するステップの前に、溶菌性バクテリオファージ株のそれぞれを無毒のＶｉｂｒｉｏ種の宿主と培養するステップを含む。
【００２０】
方法の実施形態は、投与するステップの前に、対象におけるエスケープファージ耐性変異体の選択を限定するために組成物を製剤化するステップをさらに含む。例えば、方法は、投与するステップの前に、ＩＣＰ−１、ＩＣＰ−２、ＩＣＰ−３、株１３８、株１４５、株１６３、およびその溶菌性改変体からなる群より少なくとも２種の株を選択することによって組成物を製剤化するステップをさらに含む。例えば、組成物は、少なくとも約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、または少なくとも約１０１３ＰＦＵ／用量の用量で投与され、選択されるこの量は、処置される対象のサイズ、年齢、および疾病の段階によって変わる。
【００２１】
方法は、一実施形態では、投与するステップを反復するステップを含む。方法は、一実施形態では、抗生物質を投与するステップを含む。方法は、一実施形態では、投与するステップの前に、環境試料から、またはＶｉｂｒｉｏ感染対象から溶菌性バクテリオファージ株を単離するステップを含む。例えば、対象はヒトであり、試料は感染対象の便試料である。方法は、一実施形態では、投与するステップの前に、バクテリオファージ株のビリオン混合物をカプセル化することによって組成物を製剤化するステップを含む。
【００２２】
本発明の態様は、本明細書において、ヒトの処置のために製剤化された単位用量の組成物を含むキットであって、複数の溶菌性バクテリオファージ株を含むある量のファージカクテルを含有し、各株はＶｉｂｒｉｏ細菌種の細胞に感染しそれを溶菌することができるキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１Ａは、ファージの存在下で２４時間のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅのｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養、およびファージを欠く対照培養の増殖曲線のセットである。横軸の時間の関数として、１ｍｌあたりの細胞数が縦軸（対数スケール）に示される。各培養におけるファージの感染多重度（ＭＯＩ）は、細胞１個あたりファージ１個である。黒丸は、ファージが存在しない対照のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの増殖を示し、細菌は対数期初期に増殖して、４時間以内に静止期に達する。ＩＣＰ−１（三角）、ＩＣＰ−２（四角）、ＩＣＰ−３（逆三角）またはこれら３種の株のファージカクテル混合物（−ｘ−）の存在下での細胞の増殖は有意に遅くなり、カクテルは、ファージを有さない対照の１ｍｌあたり１０８個の細胞と比較して、１ｍｌあたり１０３個の初期力価へと細胞力価を低減する。３種のファージ株のカクテルの存在下での細菌の増殖は、初期の１２時間に少なくとも３桁低減し、２４時間の期間全体の間、低減したままであった。図１Ｂは、２４時間の時間の関数として、図１Ａの感染した各培養物の１ｍｌあたりのファージ力価を示す。ファージ力価は２４時間の期間の間持続し、最終力価は、１ｍｌあたり約１０６から約１０８の範囲に観察された。
【００２４】
【図２】図２Ａは、ファージを投与されていない対照のマウスと比較して、指示されたファージ株のうちの各１種を投与されたかまたは３種の株のカクテルを投与された幼仔マウスの小腸に存在するＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの生菌数（ＣＦＵ）の低減を示すグラフ表示である。ファージは、約１０６から約１０７ＰＦＵの間の用量で投与された。３種の株のカクテルによって細菌力価は５桁を超えて検出限界（約１０コロニー）まで低減し、個々の株のそれぞれは２桁から５桁の間まで細菌負荷を低減したことが観察された。図２Ｂは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅに感染した図２Ａの動物の小腸におけるファージ力価のグラフ表示である。
【００２５】
【図３】図３Ａ〜３Ｅは、細菌感染の２４時間前までにファージを投与される場合に、細菌細胞数のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ負荷量（ｂｕｒｄｅｎ）が低減したことを示す、幼仔マウスの小腸モデルからのＰＦＵおよびＣＦＵアッセイのグラフ表示である。シンボル図形：ＩＣＰ−１は円として、ＩＣＰ−２は四角として、ＩＣＰ−３は三角として示される。図３Ａは、３種のファージ株のそれぞれに対して、細菌感染なしの３時間、６時間、１２時間、または２４時間後にファージ力価が保持されたことを示し、２４時間生存したファージは、１００から約１０６と約１０７の間までの最終力価を示す。円はＩＣＰ−１であり、四角はＩＣＰ−２であり、三角はＩＣＰ−３である。図３Ｂは、チャレンジ用量の細菌を受容する前の指定期間の、３種の株のファージカクテルを用いるファージ予防法後の小腸あたりの細菌数を示す。マウスを約２×１０５から約５×１０５ＰＦＵの量のファージカクテルで処置し、次いで、約５×１０５から約９×１０５の間の量のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ細胞による感染でチャレンジした。感染の２４時間後にマウスを屠殺し、腸ホモジネート中の細菌ＣＦＵを測定した。細菌の細胞数は、ファージを投与されていない対照対象と比較して数桁低減し、予防法は、感染の６時間前に最も多く投与されることをデータが示している。ファージ予防法が、細菌チャレンジの２４時間前までに与えられた場合に、５日齢のマウスの小腸におけるＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの負荷を低減した。ファージカクテルは、チャレンジの６時間または１２時間前に最も有効に投与され、さらにチャレンジの２４時間前に投与した後でも、腸内の細菌負荷は、ファージを投与されていない対照対象よりも約１００分の１まで低減したことが観察された。破線は検出限界である。感染の２４時間前に投与したファージによる予防法の後でさえ、観察された細菌の細胞数は、ファージを投与されていない対照動物と比較して少なくとも２桁低減した。図３Ｃは、図３Ｂの動物の感染の６時間、１２時間または２４時間前のいずれかのファージ予防法後の小腸あたりのファージのＰＦＵを示し、ファージ生成の最大値は、細菌チャレンジの２４時間前にファージを投与された動物において観察される。図３Ｄは、３種のファージ株のカクテルでの予防法および高用量（１から１．３×１０８個のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ細胞）でのチャレンジの後に生存している細菌のＣＦＵを示す。ＣＦＵは少なくとも約１桁から２桁低減し、有効性の最大値は細菌チャレンジの６時間前にファージを投与する予防法の後に観察されることをデータは示す。図３Ｅは、図３Ｄに示される腸試料のファージ力価であるＰＦＵの持続性を示す。
【００２６】
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ感染の３時間または２４時間前の時点でファージカクテルを投与した幼仔ウサギ対象から得られたデータを表すグラフである。図４Ａは、ＩＣＰファージカクテルの３×１０８ＰＦＵを投与し、３時間または２４時間後に屠殺した後の時点での、細菌感染のない小腸におけるファージ保持について示す。ＰＦＵとしての相当な数のファージが、各時点で保持され、３時間後には初期投入ファージの約１０％まで、２４時間後には約１％まで低減したことが分かった。図４Ｂは、４×１０９から８×１０９ＰＦＵのファージカクテルを投与し、次いで、３時間または２４時間後に５×１０８ＣＦＵのＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅでチャレンジしたウサギの小腸で観察されたＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの細胞数を示す。チャレンジの３時間前に投与した対象では、半分を超える対象が検出限界内に細菌のＣＦＵを示さず、残りの対象の細菌数は２桁から３桁低減したことをデータが示す。チャレンジの２４時間前に投与したファージ予防法の結果として、腸あたりのＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの細菌数は、２桁から３桁低減した。図４Ｃは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅチャレンジ後の、図４Ｂの対象のファージのＰＦＵ数の解析を示す。図４Ｂで見られる細菌の低減が、細菌に感染した対象におけるファージの溶菌成長を原因とするかどうかを予期した通り、多数のファージが対象の小腸に存在したことをデータは示す。同様のＰＦＵが、細菌チャレンジの３時間または２４時間前のいずれかに予防として投与された対象から観察され、単離された。
【００２７】
【図５】図５は、図４Ａ〜Ｃに示す時間経過の終わりまでの、対象の初期体重のパーセントを示す。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅによるチャレンジの３時間または２４時間前のいずれかにファージカクテルの予防法を受ける対象は、未処置の対照（ファージなし、Ｖｃなし）の体重に匹敵する体重を維持し、チャレンジの３時間前の予防法は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅによるチャレンジ後の体重の維持に関して２４時間での投与より有効であった。対照的に、ファージにより処置されずにＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅに感染した対象は、この実施例の過程の間に体重の約１０〜１５％を失い、これは、短期間での大きな体重減少である。対照動物のわずかな体重減少は、対象の幼仔ウサギをその雌親から分離した結果として生じた。
【００２８】
【図６】図６は、成体動物モデルにおいてファージが持続する能力の決定である。ファージカクテルがマウスに投与され、指示された時点で採取された便試料をファージ含量についてアッセイした。ファージは、投与後１２時間および３６時間、ならびに最大６０時間において、対象あたりの再現可能な力価で検出可能であった。
【００２９】
【図７】図７は、抗生物質（陽性対照）、またはファージカクテル、または熱で死滅させたファージカクテル（陰性対照）で処置した動物の便における、０日目（処置の直前）および２日目（処置のおよそ３６時間後）に採取された便試料から抽出されたゲノムＤＮＡの、図６からの試料のベータ多様性（ｂｅｔａ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）についての主座標分析である。ゲノムＤＮＡは、１６ｓ  Ｖ４領域特異的プライマーを用いるＰＣＲ用の鋳型として使用した。ＰＣＲ産物を精製し、ＮｅｘｔｅｒａシークエンシングアダプターをＰＣＲによって付加し、２５０ｂｐのペアーエンドＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑのランを使用してシークエンシングした。データは、ＱＩＩＭＥ  ｖ１．８を使用して解析した。操作的分類単位（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  ｕｎｉｔ）（ＯＴＵ）は、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓデータベースを使用して割り当てた９９％類似性および系統発生によって選択した。各点は、１匹の動物からの腸内微生物集団を表す。抗生物質処置後の動物群のミクロビオーム（ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ）が、０日目と１日目の間、および１日目と２日目の間で類似していなかったことをデータが示す。対照的に、ファージカクテルで処置した対照動物群および熱で死滅させたファージカクテルで処置した対照動物群では、これらの日数のいずれの間でも、対象のミクロビオームに非類似性が存在しなかった。これらの結果は、ファージ処置が微生物叢の組成に影響を及ぼさなかったことを示す。
【００３０】
【図８】図８は、抗生物質試料を省略して、図７と同じデータの解析を示す。試料間のベータ多様性の量の差は、図７におけるよりかなり低く、群のいずれの間にも非類似性の識別可能なパターンは存在せず、ファージ処置が微生物叢の組成に影響を及ぼさなかったことをさらに示す。
【００３１】
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、図３Ａにおけるような幼仔マウスの小腸モデルからのＣＦＵアッセイのグラフ表示である。図９Ａは、それぞれ、指示されたＩＣＰ−１：ＩＣＰ−２：ＩＣＰ−３の比を有するカクテルの６×１０６と４×１０７の間の総ＰＦＵで経口投与されたマウス、およびファージで処置されなかった対照群から得られた、図３ＡにおけるようなＣＦＵデータを示す。２４時間後、マウスは、３×１０５と５×１０５の間のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅのＣＦＵで経口的にチャレンジされた。感染の２４時間後、マウスは屠殺され、小腸で生存しているＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅのＣＦＵ数が計数された。破線は検出限界を表し、実線の横棒は中央値を表す。各円は１匹の動物を表す。ダンの事後多重比較検定を用いるクラスカル−ワリス検定を使用して有意性を計算した。＊Ｐ＝０．０１〜０．０５、＊＊Ｐ＝０．００１〜０．０１。１：１：１と１：１：１０の比が対象への最も有意な保護を提供したことをデータが示す。図９Ｂは、ファージカクテルが、高用量のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅチャレンジの１２時間前に投与された図３ＤにおけるようなＣＦＵデータを示す。ファージ予防法は、ファージなしの対照群と比較した場合に、小腸において、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのコロニー形成を１桁から２桁低減し、この結果は、様々な比の株で調製したカクテルで処置された群で観察された。マウスは、指示されたカクテル比の６×１０５から２×１０６の間の総ＰＦＵで経口投与され、対照群はファージで処置されなかった。１２時間後、マウスは、２×１０８から３×１０８の間のＣＦＵのＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅで経口的にチャレンジされた。感染の２４時間後、マウスは屠殺され、小腸で生存しているＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅが、小腸あたりのＣＦＵを計算することによって計数された。破線は検出限界を表し、実線の横棒は中央値を表す。各円は１匹の動物を表す。ダンの事後多重比較検定を用いるクラスカル−ワリス検定を使用して有意差を計算した。＊Ｐ＝０．０１〜０．０５、＊＊＊Ｐ＝０．０００１〜０．００１。１：１：１の比が対象への最も有意な保護を提供したことをデータが示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本明細書における組成物の実施形態は、高い危険性がある人々においてコレラを防止する際に使用するための３種の天然に存在する有毒なバクテリオファージ株のカクテル懸濁物である。この組成物は、経口摂取によって投与され、チャレンジの２４時間前までに１０８のＰＦＵで投与された場合に、動物モデルにおけるＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅのコロニー形成および疾患から保護する。バクテリオファージ株は、無毒のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの宿主で増殖し、ポリエチレングリコール沈殿によってほぼ均一になるまで精製され、最終力価が１０９ＰＦＵ／ｍｌになるまで食塩水中に再懸濁される。
【００３３】
予防的な抗生物質の使用という介入は、通常の微生物叢に対する破壊を原因として断念される。「ファージ予防法」、すなわち、Ｖｉｂｒｉｏ関連疾患の発生を防止するためのファージカクテルの投与を、本明細書で実証される、有毒なＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ特異的バクテリオファージ株のうちの２種またはそれより多い株のカクテルである組成物を経口投与することによって、代わりに使用することができる。そのそれぞれが異なる細胞受容体を標的とする様々なバクテリオファージ株の使用、およびＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの有毒性因子としてのこれらの受容体の重要性によって、患者内の細菌のエスケープ変異体の出現が大いに制限される。
【００３４】
感染の動物モデルにおけるコレラを防止するために予防的に使用された３種の天然に存在するバクテリオファージ株は、ヒトにおいてコレラを防止するために同様に作用することが想定される。ファージ予防法を受ける標的集団は、コレラ患者の家庭の接触、医療関係者などの曝露の高い危険性がある他者、および最近曝露されたが未だ無症状の一般集団の人々を含む。本明細書の実施例は、ファージカクテルをマウスまたはウサギのそれぞれに経口投与することによって、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅの致死用量によるその後のチャレンジから２４時間まで（これまでに試験された最も長い時間）の間、マウスまたはウサギが保護されることを示す。動物およびヒトの感染部位である小腸におけるＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの負荷は、大いに低減され、動物が下痢または体重減少の徴候を示さないことがさらに観察された。
【００３５】
本明細書で提供される組成物の実施形態のカクテルにおける各ファージ株は、有毒なファージ型であり、通常、宿主細菌細胞を溶菌し（死滅させ）、かつ溶原化するテンペレートまたは溶原性ファージ株とは反対に、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ細胞の感染および溶菌ラウンドに絶えず関与することを意味する。３種のファージ株のそれぞれは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅに特異的に感染し、それを死滅させ、他の細菌種に感染せず、それを死滅させない、すなわち各株は、Ｖｉｂｒｉｏのすべての種が試験された訳ではないが、非常に狭い１種の宿主範囲または１つの属の宿主範囲を有する。したがって、抗生物質または広い宿主範囲のファージと比較して本明細書のファージカクテルの利点は、対象の宿主微生物叢の通常のフローラ種を破壊せず、胃腸障害などの副作用をほとんど起こさないことである。抗生物質と比較した別の利点は、ファージビリオンがＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの存在下で複製し、したがって、迅速に数を増やしてＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅを阻止することができることである。組成物中の３種のファージ株は、一部のコレラ患者の分泌性下痢中に自然に見出されるが、３種のファージ株のすべてが、自然に一緒に出現することは観察されたことがなく、したがって、本発明者らのカクテルの本組成物は新規である。
【００３６】
バクテリオファージ組成物を投与することによる細菌のコロニー形成の低減は、院内の（院内感染した）菌血症の最も一般的な原因因子であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓおよびバンコマイシン耐性のＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓグラム陽性細菌種についての、２０１１年８月２３日に発行されたＭｏｒｒｉｓらの米国特許第８，００３，３２３号に示されている。グラム陽性細菌株は、グラム陰性細菌と実質的に異なり、例えば、後者はリポ多糖から構成される外膜を含有する。この主要な差によって、古典的技術を使用する染色する能力についてだけでなく、抗生物質感受性、ヒト免疫系との相互作用を含む種々の医学的特性について、ならびに微生物学的特性および環境特性のスペクトラムについて説明される。
【００３７】
Ｖｉｂｒｉｏ属のグラム陰性細菌病原体によるヒトおよび種々の動物種の感染の防止および処置のための組成物および方法が本明細書で提供される。Ｖｉｂｒｉｏ細菌の培養およびファージによる感染に対する増殖条件、ならびにファージの調製および精製および用量設定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）についての詳細な方法は、参照によりその全体として本明細書に組み込まれるＳｅｅｄら、ｍＢｉｏ、２巻（１号）：１〜９頁（２０１１年）に示されている。細菌株の構築のためのならびに組換え細菌株を操作および入手するための方法は、参照によりその全体として本明細書に組み込まれるＳｅｅｄら、ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ、８巻（９号）：１〜１３頁（２０１２年）に示されている。天然環境試料および便試料からのファージの単離のための方法、ならびにこれらの株の特徴付けは、参照によりその全体として本明細書に組み込まれるＳｅｅｄら、ｅＬｉｆｅ、３巻：ｅ０３４９７頁（２０１４年）に示されている。抗細菌剤としてのファージの使用のための方法は、Ｌｙ−Ｃｈａｔａｉｎ、Ｍ．，  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．  ５巻：論文５１：１〜７頁（２０１４年）に示され、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ感染の処置のためのファージ株Ｆｅｌｉｘのマイクロカプセル化のための方法は、Ｍａ，  Ｙ．ら、Ａｐｐ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏ．  ７４巻（１５号）：４７９９〜４８０５頁（２００８年）に示されている。ファージ株ＣＰ−Ｔ１の単離および特徴付けのための方法、Ｖｉｂｒｉｏファージの一般化された形質導入株および温度感受性プラークを得るための変異誘発は、Ｈａｖａ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｍｉｃｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、４６巻：２１７〜２２５頁（２００１年）に示されている。これらの方法は、本特許請求の範囲の組成物において使用するためのこのファージ株の有毒な透明プラーク形成改変体の単離のために容易に適応できると想定される。ＵＶにより変異誘発されたファージラムダのマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの連続培養、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに対するこのファージ株のＯｒｆＸ遺伝子の挿入変異誘発など、宿主防御系によって不活性化を遅延させるバクテリオファージの改変については、１９９８年６月１６日に発行されたＭｅｒｒｉｌらの米国特許第５，７６６，８９２号に記載されている。
【００３８】
単語「ファージ」は、本明細書で使用する場合、細菌に特異的なウイルスである用語「バクテリオファージ」の短縮形であり、これらの単語は、本明細書で使用する場合、互換可能である。句「重湯様便」は、本明細書で使用する場合、コレラ患者によって排出される分泌性下痢を意味するものとする。句「盲腸液（ｃｅｃａｌ  ｆｌｕｉｄ）」は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅに関して本明細書で使用する場合、感染した症候性の（コレラ症状）対象または患者の盲腸における流体を意味する。例えば、幼仔ウサギは動物モデルを提供し、ヒトの重湯様便と非常に類似している盲腸液を生成し、したがって、これらの動物をコレラの動物モデル系として使用する。
【００３９】
略語「ＩＤ５０」は、本明細書で使用する場合、動物の半数に感染を生じる細菌の量を意味する。略語「ＣＦＵ」はコロニー形成単位を意味し、これは細菌生細胞の数の尺度である。感染した動物の盲腸液は、約１０８ＣＦＵ／ｍｌのＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅを含有する。句「感染多重度」（ＭＯＩ）は、細菌の数に対して添加されたファージの数の比を意味する。例えば、ＭＯＩ０．１は、１０個の細菌細胞毎に１個のファージビリオンを意味し、ＭＯＩ５は、細菌細胞毎に５個のファージを意味する。
【００４０】
句「相変異（ｐｈａｓｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」は、本明細書で使用する場合、表現型の変化をもたらす頻度の高い、可逆的遺伝子変化を指し、本明細書において、通常、ファージ耐性に対する細菌細胞の変異を指すために使用される。句「ヌル変異」は、変異を保有する遺伝子によってコードされるタンパク質の機能をノックアウトする変異を指す。
【００４１】
略語「ＰＦＵ」は、感染性ファージ粒子（ビリオン）の数またはファージ力価の尺度であるプラーク形成単位を意味する。句「有毒なファージ」は、溶菌方式で純粋に増殖し、透明プラークを生成するファージ型を指す。有毒なファージ株は、ＤＮＡを細菌細胞に組み込むことができ、そうすることで細菌ゲノムの一部となり、次いで、一部は溶菌性に増殖し、それによって濁ったプラークを生成するが休止状態のままである、代替の生活環を有するファージの「溶原性」株と対照をなす。用語「溶菌性の」は、バクテリオファージ株の生活環の特徴に関して、「有毒な」と同じ意味を有するものとする。
【００４２】
略語「ＬＰＳ」は、外膜脂質二重層の表面単層を形成するリポ多糖を表し、これらの用語は互換的に使用される。外膜は、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅなどのグラム陰性細菌の最も外側の表面である。単語「Ｏ−抗原」は、細菌細胞の表面から外に広がる、ＬＰＳのオリゴ糖の繰り返し部分を指す。これは、ヒト免疫系によって標的とされることが多く、したがって、その名称が説明される。Ｏ−抗原は、ファージ株のすべてではないが、多くに対する受容体である。世界中の大多数のコレラの症例の原因であるＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの血清群Ｏ１に関して、Ｏ−抗原は、テトロン酸（ｔｅｔｒｏｎａｔｅ）連結ペロサミンの１２〜１８回の繰り返しから構成される。約２００種のＯ−抗原型または血清群がＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ種内で特徴付けられており、これらはＯ１からＯ２００と示される。
【００４３】
病原性Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの生活環は、Ｎｅｌｓｏｎら  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １０月；７巻（１０号）：６９３〜７０２頁、２００９年において総説されている。コレラ患者の重湯様便試料の約半分は、力価の高い有毒な（溶菌性の）ファージを含有し（Ｎｅｌｓｏｎら  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０４巻、１９０９１〜１９０９６頁、２００７年、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ２１４１９１３）、最初の観察は８６年前に報告された（ｄ’Ｈｅｒｅｌｌｅら、Ｉｎｄ．  Ｍｅｄ．  Ｇａｚ．  ６２巻：６１４〜６１６頁、１９２７年）。科学者らは、溶菌性ファージがＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの伝染および播種に影響を及ぼす場合があることを推測した（ｄ’Ｈｅｒｅｌｌｅら  Ｉｎｄ．  Ｍｅｄ．  Ｇａｚ．  ６２巻：６１４〜６１６頁；１９２７年；Ｐａｓｒｉｃｈａら  Ｉｎｄ．  Ｍｅｄ．  Ｇａｚ．  ６６巻、５４３〜５５０頁、１９３１年；Ｆａｒｕｑｕｅら  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０２巻、１７０２〜１７０７頁、２００５年；Ｊｅｎｓｅｎら  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０３巻、４６５２〜４６５７頁、２００６年；Ｆａｒｕｑｕｅら  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０２巻、６１１９〜６１２４頁、２００５年）。しかし、潜在的な影響に関する状況証拠のみが報告されてきた（ｄ’Ｈｅｒｅｌｌｅら  Ｉｎｄ．  Ｍｅｄ．  Ｇａｚ．  ６２巻：６１４〜６１６頁、１９２７年；Ｆａｒｕｑｕｅら  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０２巻、１７０２〜１７０７頁、２００５年；Ｆａｒｕｑｕｅら  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０２巻、６１１９〜６１２４頁、２００５年）。
【００４４】
したがって、本明細書の実施例は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの感染性に対する２種またはそれより多い溶菌性ファージ株のカクテルの影響の程度を解析する。本明細書の実施例は、溶菌性ファージが、用量依存方式で、小腸におけるＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの負荷を低減することを示す（Ｎｅｌｓｏｎら  ＰＬｏＳ  ＩＣＰ−２．  ４巻、ｅ１０００１８７頁、２００８年、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ２５６３０２９）。本明細書の実施例は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅに対するファージ療法の最初に制御された実験室での実証を表す。
【００４５】
バングラデシュで入手された保管重湯様便を使用して実施された遡及研究において、溶菌性ファージの治療潜在力を本明細書の実施例で調査した。一部の溶菌性ファージは十年の調査期間にわたって一過性であったが、ＩＣＰ−１と称される１種のファージは、この期間中遍在したままであることが分かり（Ｓｅｅｄら  ｍＢｉｏ．  ２巻（１号）、ｐｉｉ：ｅ００３３４〜１０頁（２０１１年）、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３０３７００４）、今日も存在したままであることが発見された。ここで、ＩＣＰ−１は、流行性のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株と密接に関連するよう適合した可能性があることが想定される。ＩＣＰ−１のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅとの相互作用を研究する際に、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでかつ小規模（ｐｏｎｄ  ｍｉｃｒｏｃｏｓｍ）に、ＩＣＰ−１耐性変異体の急速な発生に関する相変異を使用することが発見された（Ｓｅｅｄら  ＰＬｏＳ  ＩＣＰ−２．  ８巻（９号）：ｅ１００２９１７頁（２０１２年）、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３４４１７５２）。相変異体は切断されたＬＰＳ  Ｏ抗原を有し、野生型ＬＰＳはＩＣＰ−１に対する受容体であることが決定された。さらに、細菌相変異体は感染を引き起こす能力が減弱されていることが分かり、このような変異体が患者の便試料において見出されなかったことを説明する。したがって、ＩＣＰ−１は、ファージが繁殖し続けるＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ細胞に伴ってヒトに侵入することができる。
【００４６】
一部のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株は、ＩＣＰ−１の複製を特異的に妨げるファージ誘導性染色体島様エレメント（ＰＬＥ）である別の防御メカニズムを使用する（Ｓｅｅｄら  Ｎａｔｕｒｅ．  ４９４巻（７４３８号）：４８９〜９１頁（２０１３年）、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３５８７７９０）。驚くべきことに、ＩＣＰ−１単離体のうちの半数が、それを破壊の標的とすることによってＰＬＥを回避することに特化した機能的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを有することが発見された（Ｓｅｅｄら  Ｎａｔｕｒｅ．  ４９４巻（７４３８号）：４８９〜９１頁、２０１３年）。これは、グラム陰性細菌のＰＬＥについての最初の報告であり、ファージによってコードされた機能性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓについての最初の報告でもある。１９３１年にイラクで単離されたものを含み、ＩＣＰ−１に対する防御に特化されたＰＬＥを含有するいくつかの古典的な生物型株が見出された。したがって、細菌とファージの間の分子レベルでの戦いが少なくとも８０年間続いている。
【００４７】
別の溶菌性ファージ株であるＩＣＰ−２は、もとはバングラデシュで単離され、排出された細菌の集団構造を劇的に変化させるように、バングラデシュおよびハイチでのヒト感染中のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅに選択圧を発揮する。ＩＣＰ−２は、ハイチの流行から入手した試料において、これまでに特定された唯一の溶菌性ファージである。一部の患者は、ＩＣＰ−２の受容体である、主要な外膜タンパク質ＯｍｐＵの２つの細胞外ループのうちの１つにおいて単一のアミノ酸変化を有するとして特徴付けられたＩＣＰ−２耐性変異体を排出した。ＯｍｐＵは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの重要な有毒性因子であることが公知であり、その発現は、腸管の感染中に高度に上方調節される。試験されたいくつかの変異体が有毒なままであったため、単一のアミノ酸変異体はＯｍｐＵの発現および少なくとも部分的な機能を保持する。しかし、これらは、宿主の外側での増殖の間、中程度の適応度欠損を受ける。この適応度欠損は、変異体ＯｍｐＵ対立遺伝子が集団内で固定されなかった理由を説明しうる。興味深いことに、他の患者は、ＴｏｘＲにヌル変異を有する、異なる型のＩＣＰ−２耐性変異体細菌株を生じることが観察された。ＴｏｘＲは、ｏｍｐＵと有毒性遺伝子の正の転写調節因子である。したがって、これらの患者から排出された集団はＩＣＰ−２耐性である。これらの細菌の細胞は、外膜に通常量のＯｍｐＵを発現することができない。これらの細菌は有毒性遺伝子発現を欠く。これらの様々な集団は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅに選択圧を発揮するファージ発生（ｐｈａｇｅ  ｂｌｏｏｍ）のヒト感染中の段階に従って選択されたことが想定された。例えば、ＴｏｘＲのヌル変異は、感染の早期にはおそらく耐容性を示さないが、細菌の負荷量が高く、コレラ毒素が既に分泌性下痢を誘発している感染後期には重要でない。
【００４８】
感染性疾患と戦うために、特に、細菌における多剤耐性が世界規模となっているため、抗生物質が有効性を失っている時代には、多面的アプローチが必要とされる。有効な防止戦略が細菌感染を原因とする疾患負荷量を低減するのに必要不可欠である。したがって、本明細書で提供される組成物および方法の実施形態は、Ｖｉｂｒｉｏ属の細菌によって引き起こされる疾患、特に、病因因子であるＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅによって引き起こされる重度の脱水性疾患であるコレラに対する予防療法として、バクテリオファージの特異性および迅速に作用する特性を利用する。３種の有毒なファージの混合物またはカクテルである組成物を使用して、コレラ病原の２種の動物モデルを用いる本明細書の方法は、この手法が疾患を低減するのに上手く使用されたことを示す。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのチャレンジの２４時間前までのファージの経口投与により、腸管のコロニー形成が低減され、コレラ様下痢が防止された。生存するＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅのコロニーは、ファージ感受性について試験され、どれも３種のファージすべてに対して耐性でなかった。ゲノムシークエンシングおよび改変体解析により、耐性は、ファージ受容体の生成に必要とされる遺伝子の変異によって主として付与されることが示された。さらに、観察された耐性株は有毒性を損なっている可能性がある。Ｖｉｂｒｉｏ種によって引き起こされるコレラおよび関連疾患などの急性感染では、ファージ予防法によりヒトの健康に細菌疾患が与える影響を制限する潜在的な戦略が与えられる。
【００４９】
コレラは、水媒介細菌であるＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅによって引き起こされる急性の、重度の脱水性下痢疾患である。コレラは、実質的に世界的な健康負担のままであり、アフリカおよびアジアの多くの部分で風土病性である（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ７巻、５２１〜５３０頁、２００７年）。ハイチ（Ｌｕｑｕｅｒｏら  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２２巻、４１０〜４１６頁、２０１６年）およびイラク（Ｂａｇｃｃｈｉ，  Ｓ．  Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １６巻、２４〜２５頁、２０１６年）などの被災国または戦争により荒廃した国で最近広がっている流行病によって、突然の大流行に対する集団の脆弱性が強調される。現在推奨される防止的手段として、ＷＨＯに事前認定された経口コレラワクチンによる集団ワクチン接種（Ｑａｄｒｉら  Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７４巻、１７２３〜１７３２頁、２０１６年）ならびに衛生および衛生実施の意識の高まり（Ｔａｙｌｏｒら  ＰｌｏＳ  Ｏｎｅ  １０巻、ｅ０１３５６７６頁、２０１５年）が挙げられる。しかし、清浄な水の入手は困難であり、ワクチン接種運動には有効性に対する先見と時間が必要とされ、両方の方法は、大流行の場合には、即時的保護として計画上実行可能ではない。
【００５０】
家庭での伝染が、コミュニティ内でのＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの急速な広がりに主に寄与している。初発症例の家庭での接触は、最初の患者が病気になった２から３日後にコレラ症状を示すことが多い（Ｈａｒｒｉｓら  ＰＬｏＳ  ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ  ｔｒｏｐｉｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２巻、ｅ２２１頁、２００８年）。したがって、迅速な予防処置の使用によって、コレラの家庭内での広がりをくい止めるための臨床介入に対して満たされていない必要性が現在存在する。抗生物質による化学的予防法はコレラの負荷量を有効に低減する場合があるが（Ｒｅｖｅｉｚら  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ６巻、ｅ２７０６０頁（２０１１年））、薬剤耐性菌の発生と広がりを原因として、ＷＨＯは、この実施を推奨していない（ＷＨＯ、２０１４年）。さらに、抗生物質の広範な作用は、常在腸内微生物叢の腸内菌共生バランス失調（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）を引き起こし、患者を他の腸内感染の危険性にさらすこととなる。
【００５１】
環境および臨床適用にバクテリオファージ（ファージ）を使用することへの関心が、ほぼ一世紀前のバクテリオファージの発見以来出現している（Ｗｉｔｔｅｂｏｌｅら  Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ５巻、２２６〜２３５頁、２０１４年）。抗生物質と対照的に、ファージ株は、複製ウイルスであるため細菌標的に特異的であり、自動投与、すなわち、ファージの複製によってプラークを形成可能な生存ファージの総力価または数（プラーク形成単位、ＰＦＵ）が増加し、用量に寄与する現象が可能である。
【００５２】
コレラを防止または処置するためにファージを使用する以前の試みは複雑な結果をもたらした。Ｄｕｔｔａら  Ｂｕｌｌ．  Ｗｌｄ  Ｈｌｔｈ  Ｏｒｇ．  ２８巻、３５７〜３６０頁（１９６３年）は、幼仔ウサギモデルにおいて、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのチャレンジの１時間前に与えられた単一のファージ型によってコレラ症状の発症が防止されたことを示した。Ｊａｉｓｗａｌら  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  １５巻、１５２〜１５６頁（２０１３年）は、成体ウサギモデルにおいて、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのチャレンジの６から１２時間前に与えられた５種の溶菌性バクテリオファージ型のカクテルによって下痢の重症度が若干低減されたが、細菌負荷を有意に低下させることはできなかったことを示した。成体マウスにおける第２の研究は、病原性細菌によるチャレンジの前にファージが投与されなかったため、予防法を扱わなかった（Ｊａｉｓｗａｌら  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３０４巻、４２２〜４３０頁、２０１４年）。
【００５３】
３種の単離されたＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ特異的、溶菌性（有毒な）ファージである、ＩＣＰ−１、ＩＣＰ−２、およびＩＣＰ−３が、バングラデシュのコレラ患者の重湯様便試料から単離された（Ｓｅｅｄら  ｍＢｉｏ  ２巻、ｅ００３３４〜００３１０頁、２０１１年）。ＩＣＰ−１およびＩＣＰ−２それぞれに対する受容体は、それぞれ、リポ多糖（ＬＰＳ）Ｏ１抗原（Ｓｅｅｄら  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ８巻、ｅ１００２９１７頁、２０１２年）および主要な外膜ポリンＯｍｐＵ（Ｓｅｅｄら  ｅＬｉｆｅ  ３巻、ｅ０３４９７頁、２０１４年）として特定され、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの有毒性因子と考えられる。ＩＣＰ−３に対する受容体は未だ知られていないが、少なくとも部分的な役割はＬＰＳ−Ｏ抗原に対して想定される。これらの有毒なファージは、ヒトにおける感染のその自然な過程においてＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅに有意な殺菌圧力を加えることが示された（Ｓｅｅｄら  ｅＬｉｆｅ  ３巻、ｅ０３４９７頁、２０１４年）。
【００５４】
様々な受容体を標的とする様々なファージ株を含有するカクテルは、生存集団における多数のファージ耐性Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ単離体の可能性を低減する。受容体は、異なる化学組成を有するか、または異なる遺伝子によってコードされるか、または異なる分子経路から生じるため、互いに異なっている。したがって、３種のＩＣＰファージのカクテルは、疾患の動物モデルにおいて、コレラの徴候を防止するために小腸に遷移するＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅを特異的に標的とする潜在的な予防処置であることが本明細書で想定される。
【００５５】
本明細書の実施例は、経口的に適用されるＩＣＰカクテルの予防的使用により、幼仔マウスモデルにおけるＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅによるコロニー形成が防止されたことを示す。ＩＣＰカクテルは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのチャレンジの２４時間前までに投与される場合に、幼仔ウサギモデルにおけるコレラ症状の発症もまた防止した。この原理証明研究により、粘膜病原体によって引き起こされる疾患を防止するためにファージ予防法が成功裏に使用されることが証明される。
【００５６】
この研究の一部は、参照によりその全体として本明細書に組み込まれている、本発明者らによる共著である表題「Ａ  ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｖｉｒｕｌｅｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ」のＹｅｎ，  Ｍ、Ｃａｉｒｎｓ，  Ｌ．Ｓ．およびＡ．  Ｃａｍｉｌｌｉ、Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ８巻：１４１８７頁、２０１７年２月１日の科学論文で公開されている。
【００５７】
医薬組成物
本発明の一態様では、溶菌性の（増殖型のまたは有毒な）複製サイクルを有する少なくとも２種のＶｉｂｒｉｏバクテリオファージ株の複数のビリオン（プラーク形成単位、ＰＦＵを生じることができるウイルス）を含む医薬組成物が提供される。組成物は、任意選択で、薬学的に許容される担体をさらに含む。ある特定の実施形態では、組成物は、カプセル化されるかまたはマイクロカプセル化される。ある特定の実施形態では、これらの組成物は、任意選択で、１種または複数のさらなる治療剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、さらなる治療剤（複数可）は、増殖因子、抗炎症剤、昇圧剤、コラゲナーゼ阻害剤、局所ステロイド、マトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤、アスコルベート、アンジオテンシンＩＩ、アンジオテンシンＩＩＩ、カルレティキュリン、テトラサイクリン、フィブロネクチン、コラーゲン、トロンボスポンジン、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、およびヒアルロン酸からなる群より選択される。
【００５８】
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される担体」は、所望の特定の剤形に適するように、ありとあらゆる溶媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤などを含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９５年は、医薬組成物の製剤化およびその調製のための公知の技術において使用される種々の担体を開示する。薬学的に許容される担体として役割を果たすことができる材料の一部の例として、これらに限定されないが、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；セルロースならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、およびセルロースアセテートなどのその誘導体；トラガカント末；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐剤ワックス（ｓｕｐｐｏｓｉｔｏｒｙ  ｗａｘ）などの賦形剤；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；エチルオレエートおよびエチルラウレートなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱性物質不含水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝溶液が挙げられ、ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性かつ適合性の滑沢剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、矯味矯臭剤および芳香剤、保存料および酸化防止剤も、配合者の判断に従って、組成物中に存在しうる。
【００５９】
治療有効用量
また別の態様では、本発明の処置方法に従って、病原性Ｖｉｂｒｉｏの伝染の防止は、家族のメンバーまたは疾患に対する危険性がある他の対象と接触し、本明細書に記載されている医薬組成物を投与することによって促進される。したがって、本発明は、特定種のＶｉｂｒｉｏと関連する細菌疾患の処置のための方法であって、所望の結果を達成するのに必要な量および時間で、少なくとも２種の増殖型のＶｉｂｒｉｏバクテリオファージ株を含む活性剤を含む治療有効量の医薬組成物を投与するステップを含む方法を提供する。これは、細菌感染の発症を防止するかもしくは感染のさらなる発生を防止するための治療手段として、または細菌感染の発生を伴う合併症を最小限にする予防手段として、発明の医薬を投与することを包含することが認識される。
【００６０】
本発明のある特定の実施形態では、医薬組成物の「治療有効量」は、細菌感染のさらなる発生を防止するのに有効な量である。本発明の方法による組成物は、感染の発生の防止に有効な任意の量および任意の投与経路を使用して投与されてよい。したがって、表現「感染の防止に有効な量」は、本明細書で使用する場合、標的のＶｉｂｒｉｏ種の発生を防止するかまたは遅延させるのに、さらに、以前に獲得した感染の発症を退行させるかまたはその感染の発症から回復させるのに十分な量の組成物を指す。正確な投薬量は、処置される患者を考慮して個々の医師によって選択される。投薬量および投与は、十分なレベルの活性剤をもたらすかまたは所望の効果を維持するように調整される。考慮されうるさらなる因子として、疾患状態の重症度、例えば、感染の症状；患者の年齢、体重および性別；食事、投与の時間および頻度；薬物の組み合わせ；反応感度；ならびに治療への耐容性／応答が挙げられる。長時間作用する医薬組成物を１日１回、または３から４日毎、週毎、または２週間に１回、特定の組成物の半減期およびクリアランス速度に応じて投与してもよい。組成物のバクテリオファージ株は疾患を引き起こす望ましくないＶｉｂｒｉｏ細胞内で自己複製する細菌ウイルスであるため、処置の成功には単一用量のみが必要とされる場合があることは特定の発明の範囲内である。
【００６１】
一般に、約１０ｇから約２００ｇの体重を有する小動物対象に適当な投薬量、すなわち、適切な投薬量は、対象のサイズに応じて、複数のバクテリオファージ株のカクテルまたは混合組成物の約１０４から約１０８の合計ＰＦＵの範囲内である。例えば、幼仔マウスまたは幼仔ウサギなどの小動物に対する、複数のバクテリオファージ株のカクテルまたは混合組成物の合計ＰＦＵの適切な範囲は、約１０４から約１０５、または約１０５から約１０６、または約１０６から約１０７、または約１０７から約１０８、または約１０８から約１０９である。ヒト患者または大型動物対象に対しては、適切な範囲は約１０７から約１０１１である。例えば、体重が約２０ｋｇから約２００ｋｇの対象に対する、複数のバクテリオファージ株のカクテルまたは混合組成物の合計ＰＦＵの適切な用量は、患者または対象のサイズ、年齢および健康に応じて、約１０７から約１０８を含有してよく、または約１０８から約１０９を含有してよく、または約１０９から約１０１０を含有してよく、または約１０１０から約１０１１を含有してよい。非常に大型の、価値の高い家畜または動物園の動物、例えば、競走馬の種馬または絶滅寸前の白サイを処置する熟練の獣医は、２００ｋｇの患者に対する投薬量から体重が８５０ｋｇ、１０００ｋｇ、１６００ｋｇまたはそれより重い動物に、適切な投薬量および範囲をスケールアップすることができる。
【００６２】
本発明の活性剤は、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、単位剤形（ｄｏｓａｇｅ  ｕｎｉｔ  ｆｏｒｍ）で製剤化されるのが好ましい。表現「単位剤形」は、本明細書で使用する場合、処置される患者に適当な活性剤の物理的に別個の単位を指す。しかし、本発明の組成物を毎日使用するなど、全体で１回またはそれより多い頻度の使用は、健全な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されることになることが理解される。任意の活性剤に対して、治療有効用量は、細胞培養アッセイにおいてか、または動物モデル、通常は、マウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタにおいてのいずれかで最初に推定することができる。動物モデルは、望ましい濃度範囲および投与経路を達成するためにも使用される。次いで、このような情報を使用して、ヒトに投与するための有用な用量および経路を決定することができる。治療有効用量は、症状または状態を好転させる活性剤の量を指す。活性剤の治療有効性および毒性は、細胞培養または実験動物における標準の薬学的手順、例えば、ＥＤ５０（この用量は、集団の５０％において治療的に有効である）およびＬＤ５０（この用量は、集団の５０％に対して致死的である）によって決定することができる。治療効果に対する毒性の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表現することができる。大きな治療指数を呈する医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物の研究から得られたデータは、ヒトに使用するための投薬量の範囲を製剤化するのに使用される。
【００６３】
有効用量は、本明細書および添付の付録Ａ、および本明細書で引用された参照文献に記載されており、ここで、参照により本明細書に組み込まれる方法に従って調製された保存溶液の公知の力価に基づいて、実験室のＶｉｂｒｉｏ細胞で測定されるプラーク形成単位（ＰＦＵ）として表現される。保存溶液は、例えば、少なくとも約１０１０、１０１１、または約１０１２ＰＦＵ／ｍｌを含有する。幼仔などの小型対象に適切な用量は、約１０９または１０１０のＰＦＵを含有し、１００ｋｇの対象に対する用量は、１桁大きくてもよい。Ｖｉｂｒｉｏ疾患に感染したヒトへの対象の事前曝露に基づいて、耐容性および要件を決定するのは、担当医の知識の範囲内である。
【００６４】
医薬組成物の投与
所望の投薬量において適当な薬学的に許容される担体を用いる製剤化の後に、この発明の医薬組成物を、ヒトおよび他の哺乳動物に、重症度ならびに活性な感染を有する患者への曝露および処置されるＶｉｂｒｉｏ株への曝露の位置に応じて、局所的に（散剤、軟膏、または滴によって）、経口的に、直腸に、非経口的に、槽内に、膣内に、腹腔内に、口腔に、眼に、または鼻に投与することができる。
【００６５】
経口投与用の液体剤形として、これらに限定されないが、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が挙げられる。活性剤に加えて、液体剤形は、本技術分野で通常使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、アメリカホドイモ油（ｇｒｏｕｎｄｎｕｔ  ｏｉｌ）、トウモロコシ油、胚種油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの混合物を含有してよい。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、湿潤剤、乳化および懸濁化剤、甘味料、矯味矯臭剤および芳香剤も含むことができる。
【００６６】
発明の医薬組成物の局所または経皮投与用剤形として、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、散剤、液剤、スプレー剤、吸入剤、またはパッチ剤が挙げられる。活性剤は、滅菌条件下で、要求されうる薬学的に許容される担体および任意の必要とされる保存料または緩衝液と混合される。例えば、眼または皮膚の感染は、水性の液滴、ミスト、エマルション、またはクリーム剤で処置されてもよい。投与は治療的であってもよく、予防的であってもよい。予防製剤は、潜在的な感染部位、または感染源、例えば、汚染した水、食品、糞便への曝露、または切り傷（ｃｕｔ）および創傷に存在するかまたは適用されてもよい。軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、およびゲル剤は、この発明の活性剤に加えて、動物性および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、酸化亜鉛、またはそれらの混合物などの賦形剤を含有してもよい。
【００６７】
注射用調製物、例えば、滅菌注射用の水性または油性懸濁物は、適切な分散または湿潤剤および懸濁化剤を使用する公知の技術に従って製剤化されてもよい。滅菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液、懸濁物またはエマルション、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液としてであってもよい。用いられうる許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンガー溶液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．および等張な塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来より用いられている。この目的のために、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無刺激の不揮発性油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製において使用される。例えば、細菌保持フィルターを通す濾過によって、または使用前に滅菌水もしくは他の滅菌注射用媒体中に溶解もしくは分散することができる滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、注射用製剤を滅菌することができる。活性剤の作用を延長するために、皮下または筋肉内注射から薬剤の吸収を遅らせることがしばしば望ましい。非経口投与された活性剤の吸収の遅延は、薬剤を油状ビヒクルに溶解または懸濁することによって達成される場合がある。注射用デポー形態または経口投与用形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中に薬剤のマイクロカプセルマトリクスを形成することによって作製される。ポリマーに対する活性剤の比および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、活性剤の放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例として、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポー注射用および経口製剤は、体組織と適合性であるリポソームまたはマイクロエマルション中に薬剤を捕捉することによっても調製される。
【００６８】
経口投与用固体剤形として、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤が挙げられる。このような固体剤形では、活性剤は、少なくとも１種の不活性な、薬学的に許容される賦形剤または担体、例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムならびに／またはａ）充填剤もしくは増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸、ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシアなど、ｃ）保水剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、例えば、グリセロール、ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のシリケート、および炭酸ナトリウム、ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、ｆ）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物、ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなど、ｈ）吸収剤、例えば、カオリンおよびベントナイト粘土、ならびにｉ）滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ならびにそれらの混合物と混合される。
【００６９】
同様の型の固体組成物は、ラクトースまたは乳糖および高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、軟質および硬質充填ゼラチンカプセルに充填剤として用いてもよい。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶性コーティング、放出制御コーティングおよび医薬製剤化技術分野で周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製することができる。このような固体剤形では、活性剤は、少なくとも１種の不活性希釈剤、例えば、スクロース、ラクトースまたはデンプンと混合されてよい。このような剤形は、通常の実施であるが、不活性希釈剤以外のさらなる物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶セルロースのような打錠用滑沢剤および他の打錠助剤も含んでよい。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合には、剤形は緩衝剤も含んでよい。これらは、任意選択で、不透明剤を含有してもよく、腸管のある特定の部分で、任意選択で、遅延方式で、活性剤のみを、または優先的に放出する組成のものでもありうる。使用することができる埋め込み用組成物の例として、ポリマー物質およびワックスが挙げられる。
【００７０】
医薬組成物の使用
上記で論じ、実施例においてより詳細に記載するように、Ｖｉｂｒｉｏ細菌細胞に感染し、Ｖｉｂｒｉｏ細菌細胞内で複製する少なくとも２種の異なる溶菌性バクテリオファージ株を含有する医薬組成物は、細菌感染の発生または進行を防止するのに有用である。一般に、これらの組成物は、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅによって引き起こされるコレラなどのヒトにおける感染、または同一または異なるＶｉｂｒｉｏ種によって引き起こされる対応する疾患を有する動物におけるさらなる感染ならびに感染の流行性および汎流行性の発生を防止するのに臨床的に有用であると考えられる。
【００７１】
本発明によって包含される診断、予後および治療方法は、ヒトにおいて状態を処置することに限定されず、これらに限定されないが、ウシ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、マウス、およびウマの種を含む任意の哺乳動物における同様の状態を処置するのに使用されてもよいことが認められる。所与の動物種において感染を処置する場合、その種に感染性のＶｉｂｒｉｏの細胞に感染しそれを死滅させる適切な溶菌性バクテリオファージは、動物が見出される環境において容易に利用可能である。したがって、本明細書の方法は、これらの状態にも適用可能であると想定される。
【実施例】
【００７２】
（実施例１  増殖条件および株）
この研究で使用されるバクテリオファージ株および細菌株を表１および２に列挙する。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株は、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｍ）を補充したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス中で増殖させた。ＩＣＰカクテルは、等しい数のＶｉｂｒｉｏファージＩＣＰ−１、ＩＣＰ−２、およびＩＣＰ−３を含む。これらのファージは、バングラデシュのコレラ患者の重湯様便試料から以前に単離した。ＩＣＰ−１はＡＣ４７４１株で単離したが、ＩＣＰ−２およびＩＣＰ−３は、Ｅ７９４６のＳｍ耐性単離体であるＡＣ５３で単離した。すべての実施例は、ＡＣ５３  Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのＯ１  Ｅｌ  Ｔｏｒ株Ｅ７９４６を使用して実行した。ＡＣ４６５３およびＡＣ２８４６株を陰性対照としてプラークアッセイで使用した。ＩＣＰ−１およびＩＣＰ−３はＡＣ４６５３細菌株でプラークを形成することができず、ＩＣＰ−２はＡＣ２８４６細菌株でプラークを形成することができない。
【表１】
2019510052.tif 000003
【表２】
2019510052.tif 000004
【００７３】
（実施例２  バクテリオファージの調製）
【００７４】
高力価のＩＣＰファージのストックを、寒天プレートで増殖させた後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿によって調製した。簡潔には、各ファージは、軟寒天（０．３％のアガロースを補充したＬＢブロス）オーバーレイ中で適当なＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株と共に増殖させた。コンフルエントになると、オーバーレイをＳＴＥ緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で、穏やかに揺らしながら、４℃で終夜インキュベートし、ファージを溶出した。ＳＴＥファージ溶液を遠心分離により清澄化し、滅菌濾過し、１×ＰＥＧ（４％のＰＥＧ８０００、０．５ＭのＮａＣｌ）で、４℃で１〜３日間インキュベートして、ファージを沈殿させた。４℃で、１０，０００×ｇで１５分間の遠心分離によりファージを回収して、ファージのペレットをＳＴＥ緩衝液に再懸濁させた。前述のように、プラークアッセイによってファージ力価を測定した（Ｄｕｔｔａら、同書）。
【００７５】
（実施例３  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのファージ死滅アッセイ）
Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの単一コロニーから始めた終夜培養物を、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｍ）を補充したＬＢ５０ｍｌ中でＯＤ６００が０．０５となるまで希釈し、通気しながら３７℃で増殖させた。１５分後、ファージを各培養物に添加した。図１Ｂで指定した時点で、ＣＦＵ／ｍＬおよびＰＦＵ／ｍＬのそれぞれを測定するために試料を採取した。
【００７６】
（実施例４  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅによる幼仔マウスの感染）
動物実験は、Ｔｕｆｔｓ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  ＭｅｄｉｃｉｎｅおよびＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅの規則に従って実施した。４および５日齢のＣＤ−１幼仔マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を感染させた。各群のマウスは、少なくとも２匹の異なる同腹仔に由来する動物を含んだ。この研究では、雄および雌の動物の両方を使用した。動物の性と各実験の結果の間に観察可能な相関は存在しなかった。この動物は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅに以前に曝露されておらず、したがって、それらのミクロビオームにいかなるＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ特異的ファージも保有していないため、常在Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅファージの存在についてマウスを試験しなかった。
【００７７】
２．５％の重炭酸ナトリウム中に希釈したファージを用いる経口挿管により、ファージ処置群の幼仔マウスに経口胃を介して（ｏｒｏｇａｓｔｒｉｃａｌｌｙ）投与した。コレラ処置群の幼仔マウスは、約１０５ＣＦＵ（「通常の」感染用量）、または約１０９ＣＦＵ（「高い」感染用量）の２．５％の重炭酸ナトリウム中に希釈したＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅを受けた。細菌の少なくとも３時間前にファージ調製物を投与したため、理論的に計算したＭＯＩは、ファージと細菌の間の相互作用の正確な尺度とはならなかった。代わりに、動物に接種した細菌とファージの力価を投入材料から計算し、したがって、範囲は、ファージの投入数、または各実施例の結論で観察された結果として表される。例えば、マウスを感染の２４時間後に屠殺し、小腸を切開し、２０％のグリセロールを補充したＬＢブロス中にホモジナイズし、細胞の内容物のアッセイのためにホモジネートを連続希釈し、１００μｇ／ｍＬのＳｍを補充したＬＢ寒天上で平板培養して、小腸あたりのＣＦＵを計算した。小腸ホモジネートからファージを抽出するために、腸ホモジネートのアリコートをクロロホルムで処理し、１０，０００×ｇで５分間遠心分離した。上清を採取し、プラークアッセイで使用して、小腸あたりのＰＦＵの計算を可能とした。ファージ予防法を生き延びるＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ細胞の耐性プロファイルを評価するために、動物あたり最大１０個のコロニーを無作為に選択し、各ファージ株ＩＣＰ−１、ＩＣＰ−２およびＩＣＰ−３の平板培養力価の効率を各コロニーに対して決定した。
【００７８】
（実施例５  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅによる幼仔ウサギの感染）
３日齢の幼仔ニュージーランドシロウサギ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をこの研究で使用した。ウサギの各群は、少なくとも２匹の異なる同腹仔に由来する動物を含有し、雄および雌の動物の両方が含まれた。動物の性と各実験の結果の間に観察可能な相関は存在しなかった。２．５％の重炭酸ナトリウム中に希釈したファージを用い、ファージ処置群の幼仔ウサギに経口胃を介して投与した。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅによる感染の３時間前に、幼仔ウサギを腹腔内注射（体重１グラムあたり２μｇ）により塩酸ラニチジンで前処置し、胃の酸性度を低減した（Ｃａｒａｃｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。幼仔ウサギを２．５％の重炭酸ナトリウム中に希釈した５×１０８ＣＦＵのＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＡＣ５３に感染させた。マウスの例では、対象に接種される細菌およびファージ調製物の力価は、調製物の力価および適当な投薬量から計算した。実施例の開始時と、感染過程を通して周期的に動物を秤量した。体重のパーセンテージを感染期間の終わりの体重を開始時の体重で割って計算した。感染の１２〜２０時間後に動物を屠殺した。
【００７９】
コレラに罹患する幼仔ウサギは、典型的には、１２〜１４時間以内に体重の１０〜１５％を失い、この時点で屠殺する。体重の１０％未満を失う幼仔ウサギは、本発明者らのＩＡＣＵＣプロトコールに従って、感染の２０時間後に屠殺する。幼仔は選別行動によりＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ感染後、母親に戻すことができず、感染期間中食餌を与えられないため、この時間制限が必要である。
【００８０】
切開後、各ウサギの腸を２０％のグリセロールを補充したＬＢブロス中でホモジナイズした。存在する場合、１ｍｌシリンジで盲腸液を採取した。盲腸液および腸ホモジネートを連続希釈し、１００μｇ／ｍｌのＳｍを含有するＬＢ寒天上で平板培養して、腸あたりのＣＦＵを計算した。幼仔マウスの感染について記載したように、ホモジネートからファージを回収した。生存Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのコロニーをコロニー精製し、ＩＣＰファージに対する耐性について平板培養の効率アッセイによって評価した。
【００８１】
（実施例６  平板培養の効率アッセイ）
平板培養の効率（ＥＯＰ）アッセイをファージの捕食を生き延びた単離体について実施した。各ファージは、単離体、ＡＣ５３およびまた陰性対照としてのファージ耐性株（ＩＣＰ−１およびＩＣＰ−３についてはΔｗｂｅＬ  ＡＣ４６５３、ならびにＩＣＰ−２についてはΔｏｍｐＵ  ＡＣ２８４６）において力価を測定した。ＥＯＰは、動物単離体でのファージ力価をＡＣ５３でのファージ力価で割って計算した。検出限界は１×１０−６であった。ＥＯＰが約１×１０−６未満であることが観察された場合、単離体は耐性と記載され、ＥＯＰが約１×１０−１より大きいことが観察された場合、単離体は感受性と記載され、ＥＯＰがこれらの値の間であると観察された場合、単離体は部分的に感受性であると記載した。
【００８２】
（実施例７  ファージ耐性単離体の配列解析）
Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、単一末端の１５０ｂｐシークエンシングのために全ゲノムライブラリーを調製した。シークエンシングは、Ｔｕｆｔｓ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＣｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００を使用して行った。ゲノムはＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ８ソフトウェアを使用してアセンブルし、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのＯ１  Ｎ１６９６１（Ｓｅｅｄら  ｍＢｉｏ  ２巻、ｅ００３３４〜００３１０頁、２０１１年）の基準ゲノムに対して整列させた。ファージ耐性を付与する可能性がある変異を決定するために、２０％の頻度閾値でマッピングした読み取りデータに関して改変体解析を実施した。結果をＡＣ５３改変体（Ｓｅｅｄら  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ８巻、ｅ１００２９１７頁、２０１２年）と比較して、野生型接種物に見出されるものを除去した。３種のＩＣＰファージのすべてに感受性であることが決定された生存単離体をシークエンシングし、得られた改変体はまた、耐性単離体の改変体解析から除去した。
【００８３】
（実施例８  ３種のファージＩＣＰカクテルはＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅをｉｎ  ｖｉｔｒｏで死滅させる）
８６年前のコレラ便における溶菌性ファージについての最初の報告以来、コレラ感染またはコレラの大流行の動態へのこのようなファージの作用について、事例的または相関的報告のみが存在した（ｄ’Ｈｅｒｅｌｌｅら  １９２７年、同書；Ｆａｒｕｑｕｅら  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０２巻、１７０２〜１７０７頁、２００５年；Ｆａｒｕｑｕｅら  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０２巻、６１１９〜６１２４頁、２００５年）。しかし、ごく最近、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ感染への溶菌性ファージの作用を試験する制御実験、およびファージ株の分子解析の結果についての報告が現れた（Ｚａｈｉｄら  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７６巻：５２６６〜５２７３頁、２００８年；Ｎｅｌｓｏｎら  ＰＬｏＳ  ＩＣＰ−２．  ４巻、ｅ１０００１８７頁、２００８年、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ２５６３０２９；Ｓｅｅｄら  ｍＢｉｏ．  ２巻（１号）．ｐｉｉ：ｅ００３３４〜１０頁、２０１１年．  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３０３７００４；Ｓｅｅｄら  Ｎａｔｕｒｅ．  ４９４巻（７４３８号）：４８９〜９１頁、２０１３年、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３５８７７９０）。これらの研究はいずれも、感染前にファージを対象に投与することから得られる予防法について実証しなかった。
【００８４】
ここでは、様々なアッセイを使用して、重湯様便から、天然の溶菌性ファージ／Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの対のセットを得る。一般に、溶菌性ファージは重湯様便から単離し、小腸のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ感染を妨げることが見出されている。細菌のチャレンジと同時投与したＩＣＰ−１ファージは、用量依存方式で、幼仔マウスの小腸のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ負荷を低減した（Ｎｅｌｓｏｎら  ＰＬｏＳ  ＩＣＰ−２．  ４巻、ｅ１０００１８７頁、２００８年、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ２５６３０２９）。しかし、この阻害作用が、流行性Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株と関連する他の溶菌性ファージに特徴的であるかどうかは知られておらず、予防法は実証されなかった。実際に、一部の溶菌性ファージが、腸感染中の過剰な捕食を控えるよう進化し、その結果、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅが感染を確立し、コレラを引き起こすのに十分な高密度まで複製し、ファージの継続的な繁殖と、ファージおよび宿主細菌細胞の両方を播種して環境に戻すことを可能とすることができる可能性がある。
【００８５】
最初のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの死滅時間経過分析により、３種のファージのＩＣＰカクテルが、それぞれ個々のファージよりもＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅを死滅させるのに有効であることが示された（図１Ａ）。宿主株である、感染性かつ病原性のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ  Ｅ７９４６（ＡＣ５３）の培養物を、各ファージおよび細菌ミックスに対して感染多重度（ＭＯＩ）１で、以下の培養条件で増殖させた：ファージ非存在（対照）；または各溶菌性バクテリオファージ株ＩＣＰ−１、ＩＣＰ−２、およびＩＣＰ−３が別々に存在、もしくはＩＣＰカクテルが存在。細菌（図１Ａ）およびファージ（図１Ｂ）力価を、１時間毎に８時間、ならびに１２および２４時間で計数した。
【００８６】
データは、最初にファージ感染のすべての条件において細菌集団が減少し、ＩＣＰ−１またはＩＣＰ−３の存在下で増殖した培養物では、４から６時間以内に、それぞれ増殖が再開したことを示す（図１Ａ）。ＩＣＰ−２の存在下でインキュベートした細胞は、よりゆっくりと増殖が再開し、２４時間以内には対照と同じ密度に達した。
【００８７】
対照的に、ＩＣＰカクテルで増殖した細胞は、実験の終わりまでファージなしの対照と同じ密度に達しなかった。ファージ力価は下降し、実施例の過程にわたってすべての条件で安定したままであった（図１Ｂ）。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅは、出発細菌接種物が、高く（５×１０７ＣＦＵ）、かつ液体培養の時間経過中に陽性選択されたファージ耐性変異体を含有する可能性があったことを考慮すると、時間をわたってファージ捕食を回避することができた。
【００８８】
（実施例９  幼仔マウス小腸のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅコロニー形成はＩＣＰファージカクテルによって低減する）
ファージ株およびこれらの宿主細菌に対する遺伝子型および表現型の変動性が高いため、本明細書で使用する戦略は、重湯様便から単離した天然に存在する溶菌性ファージ／Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅカクテルに解析を制限することである。個体群動態学は、バングラデシュの様々な患者から以前に単離した３つのこのような対に対する感染経過にわたって決定する（Ｎｅｌｓｏｎら  ＰＬｏＳ  ＩＣＰ−２．  ４巻、ｅ１０００１８７頁、２００８年、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ２５６３０２９；Ｓｅｅｄら  ｍＢｉｏ．  ２巻（１号）．ｐｉｉ：ｅ００３３４〜１０頁、２０１１年、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３０３７００４）。存在するファージに耐性である重湯様便中のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅのパーセンテージを決定した。この解析は、溶菌性ファージおよびＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅを含有する重湯様便の保管試料を使用する。本明細書で使用する３種のファージ、ＩＣＰ−１、ＩＣＰ−２およびＩＣＰ−３は、シークエンシングおよび宿主範囲の決定によって以前に解析された（Ｓｅｅｄら  ｍＢｉｏ．  ２巻（１号）．ｐｉｉ：ｅ００３３４〜１０頁、２０１１年、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３０３７００４）。
【００８９】
ＩＣＰカクテルは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅを死滅させることにおいて各ファージ株単独よりも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで有効であることが、ここで観察された。これがｉｎ  ｖｉｖｏでも当てはまるかどうかを試験するために、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのコロニー形成についての幼仔マウスモデルで、予防実験を実施した。ＩＣＰカクテルを試験して、ＩＣＰカクテルが、幼仔マウスの小腸のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ感染を防止するのに有効であるかどうかを決定した。マウスは５つの群に分けられ、ファージなし（対照）、またはそれぞれ別個のファージ株ＩＣＰ−１、ＩＣＰ−２、およびＩＣＰ−３、または本明細書でＩＣＰカクテル（もしくはファージカクテルもしくはバクテリオファージカクテル）と称される３種のファージ株すべての混合物のいずれかを受けた。
【００９０】
マウスに、５×１０５コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅによる感染の３時間前に、経口胃接種により約１×１０６から１×１０７ＰＦＵの間の用量で、ファージ調製物を投与した。２４時間後、マウスを屠殺し、小腸のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅおよびファージを計数した。
【００９１】
小腸で生存しているＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ細胞の数は、ファージなしの非処置対照と比較して、ファージが投与されたすべての条件において、少なくとも２桁低減したことが観察された。投与された個々の単一株の中で、ＩＣＰ−３は、ＣＦＵ数のかなりの低減（３桁から６桁の低減）（ｎ．ｓ．）によって判断されるように、細菌細胞を低減するかまたは排除するのに最も成功した単一ファージとして観察された。図２Ａを参照のこと。
【００９２】
ＩＣＰカクテルは、個々の株のいずれよりも有効であることが観察され、５匹のマウスのうちの４匹の腸ホモジネートで検出可能なＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅは存在しなかった（Ｐ＜０．０１）。これらのデータは、個々に各ファージ株と比較して、３種の株のＩＣＰカクテルがＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅのコロニー形成を防止するのに優れていたことを示す。ＰＦＵとしてのファージ数が、期間の終わりに小腸に依然として存在し（図２Ｂ）、これらのファージは、腸管で生存し、持続して、細菌病原性細胞に対する保護を与え続けることができることを示した。
【００９３】
バクテリオファージカクテルが、各株を個々に投与するよりも一般的な防止手段であるかどうかを決定するために、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ感染の２４時間前までに投与した場合に、ＩＣＰカクテルを有効性について試験した。宿主細菌の非存在下で、長期間、ファージが小腸内で生存するかどうかを決定するために、マウスに経口胃管栄養法によりファージ（３×１０７から３×１０８ＰＦＵの間）を投与し、３、６、１２、または２４時間後に屠殺した。腸ホモジネートからのファージ力価をプラークアッセイを使用して決定した（図３Ａ）。３時間後、ＩＣＰ−１およびＩＣＰ−３に対するファージ力価が安定したままであることが観察され、一方、ＩＣＰ−２の力価はおよそ１０分の１に下降した。３種のファージ株すべてに関し、力価は、６から１２時間後に１０分の１から１００分の１しか下降しなかった。２４時間後、ＩＣＰ−１およびＩＣＰ−２は、依然として小腸あたりおよそ１０５ＰＦＵで保持され、ＩＣＰ−３の力価は、小腸あたり１０２から１０４ＰＦＵの間に落ちた。これらのデータは、相当な数のＩＣＰファージが、宿主細菌である病原性Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの細胞の非存在下で、少なくとも２４時間、腸管内で生存することができたことをさらに示す。
【００９４】
Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅへの曝露の数時間前に投与された場合のファージ保護の程度を試験するために、５×１０５または９×１０５ＣＦＵの間のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅによるチャレンジの６、１２または２４時間前の時点で、幼仔マウスにＩＣＰカクテルを接種した。陰性対照群の動物はファージで処置しなかった。図４Ｂのデータは、６時間の予防法が最も成功したことを示し、ファージなしの対照群と比較して、生存するＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの細胞数は、少なくとも３桁低減し、ファージを受けた７匹のマウスのうちの４匹で、検出可能なＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅは観察されなかった（Ｐ＜０．０００１）。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの細胞数は、１２時間の群に対して有意に低いことが観察され（Ｐ＜０．００１）、これらの動物のうちの４匹は、実験の終わりに検出可能なＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅを有さなかった。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの細胞数はまた、２４時間の群で２桁低減した。さらに、溶菌性ファージのＰＦＵは、感染の２４時間後に検出可能であった（図３Ｃ）。
【００９５】
マウスを病原性細菌のより高度なチャレンジで処理した場合、ＩＣＰカクテルがコロニー形成を制限するかどうかを決定するために、図３ＢおよびＣにおけるよりもおよそ２００倍高い用量である、１×１０８ＣＦＵのＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅを幼仔マウスに接種した。図３Ｄのデータは、ＩＣＰカクテルが、チャレンジの６、１２、または２４時間前のいずれかでファージを投与されたマウスにおいて、少なくとも２桁、小腸のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅのコロニー形成を有意に低減するのに有効であったことを示す。ファージのＰＦＵは、３種のファージすべてで処置された群のレベルと同様のレベルで、感染の２４時間後に検出した（図３Ｅ）。同時に、これらのデータは、小腸のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅのコロニー形成を防止するファージ予防法アプローチの潜在的な使用を示す。
【００９６】
Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ細菌をＩＣＰカクテルを投与したマウスのうちの数匹の腸ホモジネートから単離した（図２および３）。腸内の感染の複雑さにより、単にＩＣＰファージと遭遇しなかったためにこれらの細菌が生存した可能性がある。あるいは、これらの細胞は、ファージ捕食を回避させる遺伝子変異を含有することができた。
【００９７】
（実施例１０  ＩＣＰカクテルは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ感染の幼仔ウサギモデルにおける保護を提供する）
【００９８】
さらなる哺乳動物モデル系でコレラを防止するＩＣＰカクテルの能力を評価するために、幼仔ウサギを用いる動物モデルを使用した。幼仔マウスと対照的に、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅによって感染した幼仔ウサギは、コレラに関連する大量の分泌性下痢を生じる（Ａｂｅｌら  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３８巻、６Ａ  ６  １〜１５頁、２０１５年）。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの非存在下で、ファージがウサギの腸管内に保持されうるかどうかを確立するために、動物にＩＣＰカクテル（３×１０８ＰＦＵ）のみを投与した。３または２４時間後、動物を屠殺し、腸ホモジネートからファージ力価を決定した。
【００９９】
２４時間後でさえも、１０６個のファージが各腸から回収されたことが観察された（図４Ａ）。ＩＣＰカクテルがＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅによる感染を遮断することができるかどうかを決定するために、５×１０８ＣＦＵのＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅによるチャレンジの３または２４時間前のいずれかに幼仔ウサギの２つの群に、ファージ（４×１０９から８×１０９の間のＰＦＵ）を経口胃を介して投与した。対照群はファージを受けなかった。動物は、コレラの徴候、具体的には体重減少（図５）および重湯様便（本明細書ではコレラ様下痢とも称される）の存在についてモニタリングした。ファージなしの対照群は、以前に公開された観察（Ａｂｅｌら  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３８巻、６Ａ  ６  １〜１５頁、２０１５年）と一致して、感染の１２から１４時間後にコレラ様症状を有することを観察し、この時点で屠殺した。各感染したウサギの盲腸が膨張しており、およそ０．５から１ｍｌの蓄積した流体を含有することが観察され、これは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ感染のさらなる徴候である。およそ１０９〜１０１０ＣＦＵの細菌が、この群由来の各動物の盲腸液および腸のこれらのホモジネート（図３Ｂ）から計数された。
【０１００】
Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅは、感染の３時間前にＩＣＰカクテルを投与した７匹のウサギのうちの４匹の組織で検出されず（図４Ｂ）、処置によってこれらの動物から感染が取り除かれたことを示す。１０６から１０８ＣＦＵの間のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅが、この群の残りの３匹のウサギ由来の腸ホモジネートから得られ、非処置群と比較して１０分の１〜１００，０００分の１の減少が計算された（図４Ｂ、ｐ＜０．００１）。およそ１０５から１０９ＣＦＵの間のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅが、感染の２４時間前にファージを投与した動物の各腸からカウントされ（図４Ｂ）、ファージを投与されていない対照動物と比較して１０分の１〜１００，０００分の１の細菌負荷の低下を示した（Ｐ＜０．０５）。
【０１０１】
（実施例１１  ３種のファージ株に耐性のＶｉｂｒｉｏ変異体は処置した幼仔マウスでは生じなかった）
生存細胞のファージ耐性表現型プロファイルを決定するために、図３Ｂおよび３Ｃの実施例から得られたＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅのコロニーをコロニー精製用に無作為に選択した。細菌培養物を単離したコロニーから得て、耐性表現型に関して単離体を特徴付けるために平板培養の効率（ＥＯＰ）アッセイで使用した。結果を表３に示しており、それに対するデータが参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｅｎら、同書、２０１７年、補足ファイル１、表Ｓ１および補足ファイル２の詳細、表Ｓ３も参照されたい。
【０１０２】
ファージ予防法を生き延びたＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅがＩＣＰファージに感受性であるかまたは耐性であるかを決定するために、マウスおよびウサギの腸ホモジネートのそれぞれに由来するＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ単離体をコロニー精製用に無作為に選択し、単離体のファージ耐性表現型を平板培養の効率（ＥＯＰ）アッセイ（Ｙｅｎら、同書）によって測定し、ここで、感受性は、０．１より大きい、親の野生型Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅに対して正規化した効率と定義され；部分的感受性は、０．１から１０−５と定義され；耐性はＥＯＰが１０−６未満である。
【０１０３】
これらのデータにより、チャレンジの６または１２時間前にＩＣＰカクテルを受けたマウス由来のコロニー単離体の１００％が３種のＩＣＰファージすべてに対して感受性であったと結論付けられる。チャレンジの２４時間前にＩＣＰカクテルを与えられたマウス由来の単離体の大多数も３種のＩＣＰファージのすべてに対して感受性であることが観察されたが、少数は異なるＩＣＰ耐性表現型を示した。３種のファージ株すべてに耐性であるものは観察されなかった。
【０１０４】
最も重要なのは、３種のＩＣＰファージすべてに耐性であると特徴付けることができる幼仔マウスの腸由来の相当な数の単離体を見出せないという事実が、カクテルミックスが感染の継続的防止に適した治療剤であることを示すことである。
【表３】
2019510052.tif 000005
【０１０５】
表３は、図３で見られるファージカクテルで処置した幼仔マウスの腸ホモジネートから得た単離体からの結果を、処置と病原性細菌によるチャレンジの間の期間の関数として示す。病原体のチャレンジの６時間前に処置したマウスの腸ホモジネートから、３０個の細菌単離体が試験され、その１００％が３種のＩＣＰ株すべてに対して感受性であった。同様に、チャレンジの１２時間前に処置したマウスから、５０個の試験された単離体が、全体として、３種のＩＣＰ株すべてに対して感受性であった。チャレンジの２４時間前に処置したマウスから、９９個の単離体が試験され、そのうちの７５個（８１％）が３種のＩＣＰ株のすべてに対して感受性であった。４つの単離体だけが、３種のＩＣＰ株のうちの２種に対して耐性であり、１つの単離体はＩＣＰ−１およびＩＣＰ−３に対して部分的感受性の表現型を有し、３つの単離体はＩＣＰ−１に対する部分的感受性およびＩＣＰ−３に対する耐性を示した。最も重要なのは、３種のファージすべてに耐性である単離体が観察されなかったことであった。
【０１０６】
（実施例１２  ＩＣＰファージ株に対する細菌の耐性の遺伝学的基礎）
耐性に対する遺伝学的基礎を決定するために、図４Ｂおよび４Ｃからの動物の試料から得た２４個の単離体を全ゲノムシークエンシングと、その後の改変体解析によって解析した（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇら  Ｎａｔｕｒｅ  ４０６巻、４７７〜４８４頁、２０００年；Ｌａｚｉｎｓｋｉら  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５４巻、２５〜３４頁、２０１３年）。Ｏ−抗原合成遺伝子のポリＡトラクト（ｐｏｌｙ−Ａ  ｔｒａｃｔ）におけるスリップ鎖誤対合が、異常なＯ−抗原を生じ、ＩＣＰ−１耐性を付与しうることが以前に示された（Ｓｅｅｄら  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ８巻、ｅ１００２９１７頁、２０１２年）。
【０１０７】
ＩＣＰ−１およびＩＣＰ−３耐性単離体の変異は、オープンリーディングフレームＶＣ０２４０（ｇｍｈＤ）とＶＣ０２６４（ｒｊｇ）の間のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの第１染色体に位置するＯ−抗原合成遺伝子に見出された（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  ａｃｔａ  １６９０巻、９３〜１０９頁、２００４年）（補足ファイル３、表Ｓ４）。ＬＰＳ変異はこれらの単離体の耐性の共通の供給源であったが、このような変異を有する株は無毒であることが以前に示されていたため、これは主要な関心事ではない（Ｋａｍｐら  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ９巻、ｅ１００３８００頁、２０１３年；Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら  ＰＬｏＳ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １０巻、ｅ１００４７８２頁、２０１４年；Ｆｕら  Ｃｅｌｌ  ｈｏｓｔ  ＆  ｍｉｃｒｏｂｅ  １４巻、６５２〜６６３頁、２０１３年）。例えば、ｏｍｐＵおよびｔｏｘＲにおける変異はＩＣＰ−２耐性を付与する（Ｓｅｅｄら  ｅＬｉｆｅ  ３巻、ｅ０３４９７頁、２０１４年）。本明細書のデータは、ＩＣＰ−２耐性単離体の変異がオープンリーディングフレームＶＣ０６３３（ｏｍｐＵ）またはＶＣ０９８４（ｔｏｘＲ）に見出されたことを示す（補足ファイル３、表Ｓ４）。
【０１０８】
耐性の遺伝学的基礎を決定するために、様々な耐性表現型に基づき選択した３６個の単離体に関して、全ゲノムシークエンシングおよび改変体解析を行った（Ｙｅｎら、同書）。ＩＣＰ−１およびＩＣＰ−３耐性単離体に見出される変異を有する株の単離により得られた結果は、図３のマウスの実施例から観察されるものと類似した。これらの株のうちの３３個について、Ｏ−抗原合成に関与する遺伝子に変異が観察された。３つの株については、公知のファージ耐性戦略に関連する変異は検出されなかった。２種の動物モデルにおけるこれらのデータから、ファージ耐性の主な供給源は、ファージ受容体の生成に必要とされる遺伝子の変異であることが結論付けられた。
【０１０９】
（実施例１３  処置した幼仔ウサギではコレラ症状がない）
最も重要なのは、ファージカクテルによる幼仔ウサギの処置の結果として、本明細書の実施例で観察された細菌負荷の低下に加えて、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのチャレンジの２０時間後までにファージを投与した群のいずれかで、ウサギに対して、重湯様便または有意な体重減少の証拠は観察されなかったことである（図５）。対照的に、ファージ非存在でＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅに感染した対照ウサギは、２４時間以内に体重の約１０％を失った。
【０１１０】
マウスと異なり、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅに感染したウサギは、盲腸の拡大と共に分泌性下痢を含む、ヒトで観察されるこの疾患の胃の症状の多くを生じうる。したがって、ファージカクテルによる処置および病原性細菌によるチャレンジの異なる群の対象は、疾患の徴候についてさらに観察され、盲腸液を採取して体積を測定した。
【０１１１】
これらの動物の解剖の際に、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ感染の２４時間前にファージを投与した１０匹の群のうち、１匹の対象のみで（動物番号１６、表４を参照のこと）、０．１ｍｌの盲腸液が存在することが分かった。同じカクテルで３時間処置した他の動物の盲腸では、流体の蓄積が示されなかった。対照的に、ファージカクテルで処置されていないが、細菌性病原体でチャレンジされた、チャレンジされた動物はすべて盲腸液を生じた。
【表４】
2019510052.tif 000006
【０１１２】
表４に示すように、細菌の存在について盲腸液を解析した。ファージカクテルを受けていない動物由来の流体試料はすべて、約１０８〜１０９ＣＦＵの高い細菌数を示した。ファージカクテルで処置した対象はコレラの症状を生じず、カクテルを受けていない対照動物は疾患の徴候および盲腸内の細菌の存在を示したことが結論付けられた。
【０１１３】
およそ約１０４〜１０６から約１０８〜１０９ＰＦＵが、ファージ処置した動物の各腸ホモジネートから採取され（図３Ｃ）、ファージが処置および感染の経過にわたって腸内で持続したことを示した。これらの観察は、ＩＣＰカクテルにより、実施例の期間にわたってコレラの徴候に対して保護されたことを示す。
【０１１４】
（実施例１４  ３種のファージ株に対して耐性の変異体はウサギで生じなかった）
ウサギの腸ホモジネートからコロニー単離体を得て、病原性細菌によるチャレンジの３時間または２４時間前に処置した群から耐性変異の存在について解析した。使用された定量的基準は、マウスモデル系についてのものと同じであった。
【０１１５】
得られた結果は、マウスモデルで得られた結果と類似した。３種のファージ株すべてに耐性を付与する変異を獲得した単離体は観察されなかった。３時間処置した動物から得た２０個の単離体のうち、２０％は３種のファージ株すべてに感受性を保持することが観察され；１つはＩＣＰ−１のみに耐性であり；ＩＣＰ−２のみまたはＩＣＰ−３のみに耐性のものはなかった。少数の単離体はファージの対に対して部分的感受性であった。表５を参照のこと。
【表５】
2019510052.tif 000007
【０１１６】
まとめると、これらのデータは、ファージカクテルが、ｉｎ  ｖｉｖｏで、２種の異なる哺乳動物系でＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ細胞を死滅させるのに効率的であり、かつ腸のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅによるコロニー形成を低減または防止することを示す。３種の異なるファージ株のファージカクテルは、コレラ感染の幼仔ウサギモデルにおけるコレラ様下痢の発症に対する保護も提供する。さらに、ＩＣＰファージ株の１種または２種に耐性である動物によって排出された単離体は、Ｏ１−抗原変異体について記載されているように、無毒の変異を有することが観察された（Ｓｅｅｄら  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ８巻、ｅ１００２９１７頁、２０１２年）。
【０１１７】
これらのデータは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅに特異的なファージカクテルの予防的投与は、２種の動物モデルにおけるコロニー形成とウサギ動物モデルにおけるコレラ様下痢の両方を低減することによって、コレラに対して保護的であることを示す。ＩＣＰカクテルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅを死滅させることに成功し、幼仔マウスのコロニー形成を防止し、幼仔ウサギにおけるコレラ様下痢の発症を排除した。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅは、一部のファージで処置した動物の腸ホモジネートから単離することができたが、生存集団は一貫して数桁小さかった。ＩＣＰファージに対して耐性を付与する特定された多くの変異は、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅに対する有毒性の損失を生じる可能性があることに留意することが重要である。決定的には、本明細書の実施例の時間経過の終わりに、細菌集団は、３種のＩＣＰファージの少なくとも１種に対して感受性のままであった。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ細胞を死滅させることにおけるＩＣＰカクテルの有効性は、少なくとも部分的には、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ感染の時点で腸内に存在するファージの濃度の関数である。
【０１１８】
（実施例１５  ファージカクテルは腸内微生物叢の組成を破壊しない）
通常のヒトの微生物叢はＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの細胞を含まない。ファージ受容体は、特定の属または種の細菌宿主の表面の構造との相互作用に対して高度に特異的である可能性がある。したがって、対象の全ミクロビオームを一掃することができる抗生物質療法と対照的に、３種の特異的バクテリオファージ株の混合物またはカクテルである治療剤が、通常のヒト（またはマウスもしくはウサギ）のミクロビオームの一部を構成する無関係の細菌の属または種に影響を及ぼさないということが本発明の利点である。
【０１１９】
成体動物モデルの腸内微生物叢に関するＩＣＰファージ株の特異性を試験するために、マウスに、ファージカクテル、または抗生物質または熱で死滅させたファージカクテルを投与した。投与前の数日間に、便試料を採取した。図６は、ファージが成体の腸内で少なくとも６０時間持続したことを示す。
【０１２０】
対象のファージカクテル処置がミクロビオームの組成に何らかの影響を及ぼすかどうかを決定するために、さらなる解析が行われた。ゲノムＤＮＡは、凍結保存した便試料から抽出し、１６Ｓ  Ｖ４領域に特異的なプライマーを用いるＰＣＲの鋳型として使用した。ＰＣＲ産物を精製し、ＮｅｘｔｅｒａシークエンシングアダプターをＰＣＲによって付加した。２５０ｂｐのペアーエンドＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑのランを使用して試料を解析し、データは、ＱＩＩＭＥ  ｖ１．８を使用して解析した。操作的分類単位は、９９％類似性によって選択し、Ｇｒｅｅｎｇｅｎｅｓデータベースを使用して系統発生を割り当てた。
【０１２１】
試料のベータ多様性は、主成分分析を使用して図７に示す。この解析によって、集団間の類似性スコアとして作用する試料の対の間の系統学的な距離が計算される。図７のデータは、ファージカクテルで処置した対象および対照（熱で死滅させたファージカクテルを受ける）のミクロビオーム集団は非常に類似することを示す。陽性対照動物：抗生物質で処置した動物から得た試料の２つの群に対して非類似性が観察された（動物が抗生物質で２日間処置された左の軸に近い６個の点；および動物が抗生物質で１日間処置された底の軸に近い５つの点の群）。
【０１２２】
これらのデータは、ファージを熱で死滅させた（対照）にもかかわらず、ファージカクテルで１または２日間処置した対象の腸内微生物叢は組成が類似し、その結果、微生物叢の破壊が起こらないことがファージカクテル投与の結果であったことを示す。抗生物質で処置した試料のデータを除くことを含んだデータの別の解析では（図８）、この解析により、様々な便試料の細菌集団由来のミクロビオームの関連性の程度は、０日間処置、１日間処置、または２日間処置した動物由来の便と同様であり、３種のファージ株の生きているかまたは熱で死滅させたファージカクテルの存在は、関連性の程度に影響を及ぼさなかったことが示される。図８は、抗生物質で処置した動物由来の試料を省略してプロットしたこれらのデータ点を示す。試料のクラスタリングは存在せず、最も大きな広がりは横座標にあり、図７の４６％と比較して、１０％である。ここでのデータは、散在しており、熱で死滅させたファージに関する対照と比較して、生きたファージでの処置に関するクラスタリングの差を示していないため、これらのデータにより、ファージでの処置がミクロビオームに影響を及ぼさず、カクテルがＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ細菌細胞に宿主特異的であることが確認される。
【０１２３】
これらのデータは、カクテル中に存在し、対象の予防法に使用したファージ株が、通常の腸内微生物集団に特徴的な細菌の非Ｖｉｂｒｉｏ種の集団分布に感染せず、これを変更しないため、病原性Ｖｉｂｒｉｏ細菌細胞への感染およびその死滅に対して特異的であることを示す。
【０１２４】
（実施例１６  ファージカクテルは広い範囲の構成成分株の比で有効である）
最も有効なカクテルの調製に使用したＩＣＰ−１、ＩＣＰ−２およびＩＣＰ−３の各ファージ株のビリオン数の比を、最適な相対量を決定するために変化させた。試験され、ＩＣＰ−１：ＩＣＰ−２：ＩＣＰ−３について３種のＩＣＰ株のそれぞれからの投入ファージの数の比である１：１：１を使用する上記データと比較した３種のファージ株のさらなる比は、１：１：１０、１：１０：１、１０：１：１、および１：５：１０であった。宿主細菌病原体のファージ受容体の変異、ならびにファージ株の吸着、バースト時間およびバーストサイズの相対的動力学が、細菌の死滅およびファージの最大持続性の程度に影響を与えうるかどうかについて、これらの実施例は比の可能な最適化について試験する。この実施例では、３種のファージ株のうちのいずれか２種についてのＭＯＩの範囲が、この比の２桁の差の範囲で変化した（１０：１と比較した１：１０）。
【０１２５】
上記図３Ｂおよび３Ｄの幼仔マウスモデルを使用する、２種の異なるチャレンジ量のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅについての図９Ａおよび９Ｂのデータは、すべての比が予防法において有効であったこと、およびすべてが、１：１：１の比に関してここで得た結果と同様の腸内の病原性細菌数の低減という結果を与えたことを示した。したがって、ファージで処置されていない対照対象と比較して、ファージカクテルは、細菌負荷を、一部の対象において検出限界内まで完全に低減し、他の対象において約２桁低減した。これらのデータは、ここで、ファージ株は、細菌に対する親和性、バーストサイズ、バースト時間、およびファージの生活環の他の特徴の動力学において類似することを示す。
【０１２６】
さらに、本明細書の実施例では、細菌負荷の完全な低減が、より短い予防時間で動物モデル系に関して観察されたため、各用量のタイミングの最適化は、ヒトへの使用に対する臨床試験に入る前に解析される。風土病性コレラの環境に生きる個体は繰り返しＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅに曝露される可能性があるため、その個体、さらには集団においてもそれが完全に根絶される点まで、それぞれの個体の感染を制御するために複数回用量が処方される。
【０１２７】
現在のファージ療法調査は、進行中の感染を処置することに焦点を当てている。ここでの結果は、感染を防止することにおけるファージ療法の可能性を示している。ここで示されたデータは、病原性細菌との相互作用に対する少なくとも２種の異なる型のファージ受容体を有する複数のファージ株を有する、本明細書で示されるファージカクテルを使用する組成物および方法を用いて、コレラを防止する見込みはさらなる調査を保証することを示す。急速に作用するファージ予防法アプローチは、コレラ症状を示す個体の家庭内での接触など危険性がある個体において有用である。家庭内での広がりを制限することによって、疾患の全体的負荷量が低減する。粘膜病原体に対する予防処置としてのファージの適用は、これによってヒトの健康への細菌感染の影響を制限する、迅速かつ特異的な手段を表す。
【０１２８】
（実施例１７  淡水中でファージに応答するＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅのバイオフィルムの解析）
以前に、複数ラウンドのコロニー精製によって得られ、プラークアッセイおよびゲノムシークエンシングによってファージを欠くことが確認された、３種のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの便の単離体のそれぞれは、キチンフレークを含有する池水中でバイオフィルムとして増殖させる。このプロセスは、バイオフィルム内のそれらの天然の超感染性状態（ｈｙｐｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｓｔａｔｅ）で細菌を調製する。得られたバイオフィルムは、記載されているような超音波破壊によって単一細胞懸濁物とされる（Ｔａｍａｙｏら  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．７８巻（８号）：３５６０〜９頁（２０１０年）、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ２９１６２７０）。
【０１２９】
溶菌性ファージは、０．０１、０．１および１という低い感染多重度（ＭＯＩ）で添加される。それぞれの混合物を、本明細書に記載されている経口胃管栄養法により９匹の幼仔マウスの群に接種する（Ｎｅｌｓｏｎら  ＰＬｏＳ  ＩＣＰ−２．  ４巻、ｅ１０００１８７頁（２００８年）、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ２５６３０２９）。これらのＭＯＩは、重湯様便に見出される典型的な範囲を網羅するという点で生理学的である（Ｎｅｌｓｏｎら  ＰＬｏＳ  ＩＣＰ−２．  ４巻、ｅ１０００１８７頁（２００８年）；Ｓｅｅｄら  ｍＢｉｏ．２巻（１号）．ｐｉｉ：ｅ００３３４〜１０頁（２０１１年）、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３０３７００４）。さらに、これらのＭＯＩはそれぞれ、感染していないＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ細胞の一部が、小腸に侵入してコロニー形成を確立することを可能とする。ファージを含まない対照接種は、各株について実施される。８、１６および２４時間に、１群あたり３匹のマウスを安楽死させ、小腸におけるファージおよびＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの力価を決定する。典型的には、ファージの非存在下での、１０５ＣＦＵのＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの接種物は、２４時間までに１０７ＣＦＵを超えて増加する。有毒性の高いファージは、細菌における溶菌増殖のラウンドを通してそれ自体の力価を劇的に増大させ、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの力価を急峻に下降させる。対照的に、有毒性の低いファージは、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの負荷にほとんどまたは全く影響を有さない。試験したほとんどまたはすべての溶菌性ファージがＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ感染を妨げることが分かった。感染の過程中に存在するファージの数をモニタリングすることによって、効果が捕食およびファージの複製によるものであるか、または動物のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ感染の結果を幾分か変化させる単一ラウンドのファージ感染によるものであるかが決定される。
【０１３０】
溶菌性ファージがＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ感染を強力に妨げる場合、ファージ耐性に対する選択圧が存在することが想定される。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの集団は、ＬＰＳ  Ｏ１−抗原の生成の相変動性の損失により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、急速にＩＣＰ−１に耐性となる（Ｓｅｅｄら  ＰＬｏＳ  ＩＣＰ−２．  ８巻（９号）：ｅ１００２９１７頁（２０１２年）、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３４４１７５２）。しかし、これらの相改変体は、コロニー形成の幼仔マウスモデルで無毒であることが分かった。したがって、これらの相改変体は、いくつかの重湯様便から数百個のコロニーをスクリーニングした後には、検出されなかった。それにもかかわらず、このような変異体はより低い頻度で存在することが可能である。ＩＣＰ−２は受容体としてＯ１−抗原を使用しないため、ファージ耐性は腸感染中に迅速に生じる可能性があり、これはファージ／Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの個体群動態学に大きな影響を及ぼしうるのが妥当である。保管ファージ陽性重湯様便試料は、ファージ耐性単離体に対する詳細な（ｄｅｅｐ）スクリーニングを実施するのに有利に使用される。
【０１３１】
約４名の患者由来の試料を、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅに対して選択的な培地を含有する大きなペトリプレート上で平板培養する。各試料から７，６８０個のコロニーを選択して、ウェルあたり６０μｌのＬＢブロスを含む２０個の３８４ウェルプレートへと移すようロボットをプログラムする。各ウェルは、約１０５ＣＦＵのＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅを受容する。ウェル中の培地は、第１列を除き、約１０３プラーク形成単位（ＰＦＵ）のファージを含有し、０．０１の出発ＭＯＩを与える。ウェルの第１列は、細胞増殖のための陽性対照としてファージを含まない対照を含有する。３８４ウェルプレートを時折振盪しながら、プレートリーダー中で、２４℃で８時間インキュベートし、ＯＤ６００測定を０．５時間毎に行う。
【０１３２】
ファージ耐性をアッセイするために、エンドポイント読み取りの代わりに、ＯＤ６００を時間の関数としてモニタリングし、可能な異なる分類のファージ耐性変異体に関する情報を得る。データから、ファージ耐性単離体のパーセンテージを各便試料において計算する。ファージ耐性単離体は、三連のコロニー精製によって各便試料に対して得られ、上述のようにファージ耐性について再試験する。
【０１３３】
ファージ耐性のメカニズムをゲノムシークエンシングおよび変異解析により決定する。上記から確認したファージ耐性単離体（最大７２株）のゲノムをシークエンシングし、同じ便試料から単離したファージ感受性ゲノムとそれぞれ比較して、ファージ耐性を担う変異を特定する。候補ファージ耐性変異を、変異を新鮮な細胞バックグラウンドに移し、ファージ耐性について試験することによって確認する。この戦略を使用して、ファージ受容体およびファージ耐性の新規メカニズムを発見する（Ｓｅｅｄら  ｍＢｉｏ．  ２巻（１号）．ｐｉｉ：ｅ００３３４〜１０頁、２０１１年、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３０３７００４；Ｓｅｅｄら  Ｎａｔｕｒｅ．  ４９４巻（７４３８号）：４８９〜９１頁、２０１３年、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３５８７７９０；Ｓｅｅｄら  ＰＬｏＳ  ＩＣＰ−２．  ８巻（９号）：ｅ１００２９１７頁、２０１２年、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３４４１７５２）。
【０１３４】
上記実施例は、腸感染中の溶菌性ファージおよびＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの個体群動態学、ならびにファージ耐性のメカニズムに関する定量的情報を提供する。結果は、大流行中のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅと特定のファージ株の会合頻度、および個々の感染の結果に関する溶菌性ファージの作用の理解に影響を与える。さらに、結果は、コレラ患者を処置するファージ療法を開発するために役立つ場合がある。
【０１３５】
播種中に臨床的に得られたファージ株とＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株の対の個体群動態学を決定する。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの播種に対するコレラの便中の溶菌性ファージの影響はほとんど知られていない。増殖性ファージ感染には代謝的に活性な宿主が必要であるため、ここで、ファージは貧栄養水中での播種に対して最小限の影響を有するが、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの増殖を支持するためにキチンが存在する場合には大きな影響を有することが想定される。キチンは、天然の淡水環境において主要な炭素源である。このセクションで、上記の３種の溶菌性ファージ／Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの対を使用して、幼仔ウサギ宿主を使用し盲腸から播種性の高いＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅおよびファージを採取してこの仮定を試験する。
【０１３６】
溶菌性ファージを上述のバイオフィルム増殖Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅと混合し、次いで、３匹の幼仔ウサギの群に経口胃接種する。ファージなしで接種した対照群は、各株に含まれる。症候性である場合、各動物を安楽死させ、盲腸液を採取する。未加工試料（デブリまたは凝集物の除去なし）を分割して、以下のアッセイに使用する。一部をボルテックスして凝集物を分散させ、試料中のファージＰＦＵおよびＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅ細胞の数を決定するために使用する。別の部分を、開口したビーカー中キチンフレークを添加するかまたは添加しない池水で希釈し、播種適応度アッセイを実施する。さらに別の部分を使用して、以下に記載するように伝染に対する溶菌性ファージの作用を決定する。
【０１３７】
播種アッセイのために、ファージおよびＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅを各ビーカー中８、１６、２４、４８および９６時間インキュベートした後、力価についてアッセイする。Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの減少（または増殖）速度をファージを欠く対照の速度と比較する。これらの実施例の結果は、溶菌性ファージが、貧栄養および栄養の十分な（キチン）環境の両方において播種中のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの適応度に対して有する影響を解明する。ファージが、キチン含有環境で排出された細菌に感染および増殖し続ける場合、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの生活環が明らかになる。このようなデータは、溶菌性ファージを使用して、環境リザーバーの細菌含量を制御するという概念を支持する。一方、播種のストレスを考慮すると、ファージは、貧栄養またはキチン含有環境により、いずれの環境でも増殖することができない場合がある。このシナリオでは、ファージは、依然としてＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅと会合する場合があり、このようにして、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅが新たな宿主に伝染するまで存在し、不活性なままである。
【０１３８】
溶菌性ファージの存在下で播種したＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの伝染性を決定する。コレラの広がりを理解するためのその重要性にもかかわらず、池水中間体を介するコレラの糞便−経口伝染に対する溶菌性ファージの作用は調査されてこなかった。活発に複製してもしなくても、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅと会合したファージは、汚染水からの疾患の伝染を低減することが想定される。
【０１３９】
上記の盲腸液のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅおよび会合した溶菌性ファージの播種培養物を使用して、以下の修正を伴い、幼仔マウスへの伝染を測定する。競合実験を実施する代わりに、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのＩＤ５０を決定する。ここで、溶菌性ファージは競合するＬａｃＺ−  Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株を攻撃し、したがって、競合指数（ＣＩ）値が高度に変動性であるため、競合実験は不可能である。
【０１４０】
ＩＤ５０を決定するために、上記実施例からの２４時間の時点での播種培養物の一部を池水で連続希釈し、ファージおよび細菌の様々な濃度を達成する。３匹の幼仔マウスの群に、１０１、１０２、１０３および１０４ＣＦＵのＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅのそれぞれを含有すると推定される希釈物を経口胃接種する。２４時間後、幼仔マウスを安楽死させ、小腸におけるＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの負荷を決定する。ＩＤ５０は、グラフを用いて決定する。この実施例により、池水中の溶菌性ファージがＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの感染性を低減する、すなわち、実質的に高いＩＤ５０を生じることが決定される。これらの実施例の結果により、淡水の汚染された部分に由来するＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの伝染に対する溶菌性ファージの作用を理解するための価値ある情報が得られる。
【０１４１】
コレラの急速な伝染に対する溶菌性ファージの影響を決定する。上記実施例は、汚染された池水からの伝染に対する溶菌性ファージの作用を試験する。しかし、同様に重要であるが答えられていない質問は、溶菌性ファージが、重湯様便中に排出された超感染性Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの急速な伝染に影響を与えるかどうかというものである。溶菌性ファージは、超感染性の便のＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの伝染を大いに低減することが想定される。
【０１４２】
上記の幼仔ウサギの盲腸液から幼仔マウスへの超感染性伝染のモデルを使用し、３種のファージ／Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅの対に関する伝染を測定する。幼仔マウスのＩＤ５０をそれぞれ新たに得られた盲腸液試料について測定する。このアッセイを使用して、超感染性Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅのＩＤ５０が１０２ＣＦＵであることが分かり、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖した（超感染性ではない）細菌の１０分の１である（Ｂｕｔｌｅｒら  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６０巻（２号）、４１７〜２６頁、２００６年、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ２７５４２０４；Ｎｅｌｓｏｎら  ＰＬｏＳ  ＩＣＰ−２．  ４巻、ｅ１０００１８７頁、２００８年、ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ２５６３０２９）。したがって、ファージ含有試料に対するＩＤ５０をファージを欠く試料のＩＤ５０と比較する。この実施例は、盲腸液中の溶菌性ファージが、通常、超感染性Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅであるものの感染性を大いに低減するかどうかに応じて変わる。これらの実施例の結果により、例えば、流行中に家庭内で起こる、便から排出されたＶ．ｃｈｏｌｅｒａｅの急速な伝染に対する溶菌性ファージの作用を理解するための価値ある情報が得られる（Ｈａｒｒｉｓら  ＰＬｏＳ  Ｎｅｇｌ．  Ｔｒｏｐ．  Ｄｉｓ．  ２巻、ｅ２２１頁、２００８年；Ｗｅｉｌら  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．  １５；４９巻（１０号）：１４７３〜９頁、２００９年）。
【０１４３】
本発明は、ここで、十分に記載され実施可能とされ、さらなる実施形態が以下の特許請求の範囲によって記載され、これらは例示的に過ぎず、さらなる限定と解釈されるべきではない。すべての引用された参照文献の内容は、ここでその全体として本明細書に組み込まれる。
【図１】
2019510052.tif 000008
【図２】
2019510052.tif 000009
【図３】
2019510052.tif 000010
【図４】
2019510052.tif 000011
【図５】
2019510052.tif 000012
【図６】
2019510052.tif 000013
【図７】
2019510052.tif 000014
【図８】
2019510052.tif 000015
【図９】
2019510052.tif 000016
【国際調査報告】
2019510052.tif 000017
2019510052.tif 000018
2019510052.tif 000019
2019510052.tif 000020