(57)【要約】腫瘍または癌を処置する方法は、アルギニン枯渇酵素および癌免疫療法薬の投与を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
療法量のコバルト補因子を含むヒト  アルギナーゼＩ酵素および療法量の癌免疫療法薬を含む医薬組成物を投与することを含む、対象において腫瘍増殖を阻害する方法。
【請求項２】
腫瘍がアルギニン栄養要求性腫瘍細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒト  アルギナーゼＩ酵素を安定剤との会合によって安定化する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
安定剤がポリエチレングリコール、合成タンパク質ポリマー、Ｆｃ融合体、またはアルブミンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ヒト  アルギナーゼＩ酵素がＰＥＧ化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
腫瘍がアルギニノコハク酸シンセターゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギニノコハク酸リアーゼ、またはその組合わせの発現の低減または阻害を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
対象が動物対象である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
対象がヒト癌患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
癌免疫療法薬が対象の免疫応答を増強する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
癌免疫療法薬が免疫サプレッサーを阻害する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
癌免疫療法薬がチェックポイント阻止経路を遮断する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
癌免疫療法薬がＰＤ−１、ＯＸ４０または他のＢ７経路阻害薬を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
薬剤が抗−ＰＤ−１抗体または抗−ＰＤ−Ｌ１抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
癌免疫療法薬が抗−ＯＸ４０または抗−ＯＸ４０Ｌ抗体である、請求項に記載の方法。
【請求項１５】
薬剤がペンブロリズマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブまたはニボルマブを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
薬剤がイピリムマブを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍が肝細胞癌、腎細胞癌、乳癌、メラノーマ、前立腺癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌、結腸直腸癌、トリプルネガティブ乳癌、ホジキンリンパ腫、胃癌、神経膠芽細胞腫、メルケル細胞癌、肺癌、小細胞肺癌または非小細胞肺癌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ヒト  アルギナーゼＩ酵素と抗−ＰＤ−１抗体、抗−ＰＤＬ−１抗体、抗−ＯＸ４０抗体または抗−ＯＸ４０Ｌ抗体の組合わせの投与が、療法量の抗−ＰＤ−１抗体単独もしくは抗−ＰＤＬ−１抗体単独、またはヒト  アルギナーゼＩ酵素単独の投与により示される腫瘍増殖阻害と比較して腫瘍増殖阻害に対する相加効果を示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
ヒト  アルギナーゼＩ酵素と抗−ＰＤ−１抗体、抗−ＰＤＬ−１抗体、抗−ＯＸ４０抗体または抗−ＯＸ４０Ｌ抗体の組合わせの投与が、療法量の抗−ＰＤ−１抗体単独、抗−ＰＤ−Ｌｉ抗体、抗−ＯＸ４０抗体もしくは抗−ＯＸ４０Ｌ抗体単独、またはヒト  アルギナーゼＩ酵素単独の投与により示される腫瘍増殖阻害と比較して腫瘍増殖阻害に対する相乗効果を示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
ヒト  アルギナーゼＩ酵素と抗−ＰＤ−１抗体、抗−ＰＤＬ−１抗体、抗−ＯＸ４０抗体または抗−ＯＸ４０Ｌ抗体を同時に投与する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
ヒト  アルギナーゼＩ酵素と抗−ＰＤ−１抗体、抗−ＰＤＬ−１抗体、抗−ＯＸ４０抗体または抗−ＯＸ４０Ｌ抗体を逐次投与する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
ヒト  アルギナーゼＩ酵素がアルギニンの加水分解についてｐＨ７．４および３７℃で４００ｍＭ−１ｓ−１〜４，０００ｍＭ−１ｓ−１のｋｃａｔ／ＫＭを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
ヒト  アルギナーゼＩ酵素が２〜３μｇ  Ｃｏ／ｍｇアルギナーゼのコバルト対アルギナーゼ比を構成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
ヒト  アルギナーゼＩ酵素が、アルギナーゼアポ酵素を３０℃から５５℃までの温度で１５分から６０分までの期間、コバルトまたはコバルトイオンと接触させることにより調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
患者にコバルト補因子を含むＰＥＧ化ヒト  アルギナーゼＩ酵素を含む療法量の医薬組成物を投与し、かつ癌免疫療法薬を含む医薬組成物の投与を含む免疫系調節療法を施すことを含む、癌患者において癌を処置する方法。
【請求項２６】
コバルト補因子を含むＰＥＧ化ヒト  アルギナーゼＩ酵素を含む医薬組成物、および癌免疫療法薬を含む医薬組成物を、同時に投与する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
コバルト補因子を含むヒト  アルギナーゼＩ酵素を含む医薬組成物、および癌免疫療法薬を含む医薬組成物を、逐次投与する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
コバルト補因子を含むＰＥＧ化ヒト  アルギナーゼＩ酵素の療法量が、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約７．５ｍｇ／ｋｇまでである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
コバルト補因子を含むＰＥＧ化ヒト  アルギナーゼＩ酵素の療法量が、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇまでである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
コバルト補因子を含むＰＥＧ化ヒト  アルギナーゼＩ酵素の療法量が、約０．１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇまでである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
癌免疫療法薬が抗−ＰＤ−１抗体、抗−ＰＤ−Ｌ１抗体、抗−ＯＸ４０抗体または抗−ＯＸ４０Ｌ抗体である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
癌免疫療法薬が、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、アテゾリズマブおよびニボルマブから選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
癌患者が、肝細胞癌、腎細胞癌、乳癌、メラノーマ、前立腺癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌、結腸直腸癌、トリプルネガティブ乳癌、ホジキンリンパ腫、胃癌、神経膠芽細胞腫、メルケル細胞癌、肺癌、小細胞肺癌または非小細胞肺癌について処置される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
コバルト補因子を含むＰＥＧ化ヒト  アルギナーゼＩ酵素を含む医薬組成物を非経口投与する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
コバルト補因子を含むＰＥＧ化ヒト  アルギナーゼＩ酵素を含む医薬組成物を、局所、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜腔内、気管内、眼内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、筋肉内、皮下、結膜下、膀胱内、粘膜、心膜内、臍帯内、経口、吸入により、注射により、注入により、連続注入により、標的細胞の直接的な局所潅流浴により、カテーテルにより、または潅注により投与する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
医薬組成物を静脈内投与する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
患者にアルギニン枯渇薬およびチェックポイント経路阻害薬を投与することを含む、癌患者において癌を処置する方法。
【請求項３９】
アルギニン枯渇薬およびチェックポイント経路阻害薬による処置の療法効果が、アルギニン枯渇薬単独またはチェックポイント経路阻害薬単独による処置と比較して相加的である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
アルギニン枯渇薬およびチェックポイント経路阻害薬による処置の療法効果が、アルギニン枯渇薬単独またはチェックポイント経路阻害薬単独による処置と比較して相乗的である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
処置により患者において５０％から９９％までの血清アルギニン低減が生じる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
処置により患者において９０％から９９％までの血清アルギニン低減が生じる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
処置により患者において血清アルギニンが検出できないレベルにまで低減する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
アルギニン枯渇薬が、アルギナーゼ酵素、アルギニンデイミナーゼ酵素、またはその組合わせを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
酵素がヒト酵素である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
酵素が工学操作したヒト  アルギナーゼである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
酵素をＦｃフラグメント、ＰＥＧ化、アルブミンまたは合成タンパク質ポリマーとのコンジュゲーションまたは会合によって安定化する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
療法量のヒト  アルギナーゼＩ酵素またはマイコプラズマ  アルギニンデイミナーゼ酵素および療法量の癌免疫療法薬を含む医薬組成物を投与することを含む、対象において腫瘍増殖を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
腫瘍または癌を処置する方法は、アルギニン枯渇薬および癌免疫療法薬の投与を含む。
【背景技術】
【０００２】
[0001]  ある腫瘍細胞がＬ−アルギニンなどのアミノ酸に対する高い要求性をもち、Ｌ−アルギニン枯渇(depletion)条件下で死滅することは５０年以上にわたって認識されている(Wheatley and Campbell, 2002)。ヒト細胞において、Ｌ−アルギニンは３工程で合成される；まず、Ｌ−シトルリンがＬ−オルニチンおよびリン酸カルバモイルから酵素オルニチントランスカルバミラーゼ(ornithin transcarbamylase)（ＯＴＣ）により合成され、アルギニノコハク酸シンセターゼ(argininosuccinate synthetase)（ＡＳＳ）がＬ−シトルリンおよびアスパラギン酸をアルギニノコハク酸に変換し、続いてアルギニノコハク酸がアルギニノコハク酸リアーゼ(argininosuccinate lyase)（ＡＳＬ）によりＬ−アルギニンおよびフマル酸に変換される。多数の肝細胞癌(hepatocellular carcinoma)（ＨＣＣ）、メラノーマおよび腎細胞癌(Ensor et al., 2002; Feun et al., 2007; Yoon et al., 2007)はＡＳＳを発現しないので、Ｌ−アルギニン枯渇に対して感受性である。ＡＳＳ発現欠如の分子的な基礎は多様であると思われ、それには異常な遺伝子調節が含まれる。非悪性細胞はＬ−アルギニンが枯渇すると休止期（Ｇ０）に入り、よって数週間は生存し続けるが、腫瘍細胞は細胞周期が欠損し、そのためタンパク質合成が阻害されてもＤＮＡ合成が再開され、その結果、重大な不均衡および急速な細胞死が生じる(Shen et al., 2006; Scott et al., 2000)。ＨＣＣ、メラノーマおよび他のＡＳＳ欠損癌細胞についてのＬ−アルギニン枯渇の選択毒性が、インビトロ、異種移植動物モデルおよび臨床試験で広く立証された(Ensor et al., 2002; Feun et al., 2007; Shen et al., 2006; Izzo et al., 2004)。最近、Cheng et al. (2007)は、多くのＨＣＣ細胞がオルニチントランスカルバミラーゼ発現をも欠如し、よってそれらは酵素性のＬ−アルギニン枯渇に対して感受性であることも立証した。
【０００３】
[0002]  癌療法、特にたとえば高い死亡率を伴なう一般的形態の癌である肝癌、メラノーマおよび腎細胞癌の処置におけるＬ−アルギニン加水分解酵素の使用に関心がもたれている。癌療法には２種類のＬ−アルギニン分解酵素が用いられている：細菌性アルギニンデイミナーゼおよびヒト  アルギナーゼ。残念ながら、これらの酵素は両方とも、臨床使用に対する重大な障害となる著しい欠点を示す（それぞれ、免疫原性、および血清中でのきわめて乏しい安定性を伴なう低い触媒活性）。よって、Ｌ−アルギニン枯渇療法の療法成功はこれらの欠点に対処することにかかっているであろう。
【０００４】
[0003]  多くの癌の処置におけるもう一つの問題は、ある癌が免疫系を回避できることである。ある腫瘍は、たとえばこれを免疫チェックポイント経路により行なう；これは免疫系において免疫応答を調節することにより自己寛容性を維持する阻止経路である。これらの経路が腫瘍によって調節不全となり、その結果、免疫抵抗性になる可能性がある。これらの経路のうちの幾つか、すなわち刺激増強受容体(prostimulatory receptor)のアゴニストまたは阻害シグナルのアンタゴニストの両方（これらは両方とも抗原特異的Ｔ細胞応答の増幅をもたらす）が癌免疫療法の標的となった。幾つかの代表的な受容体およびリガンドには、特に細胞傷害性Ｔ−リンパ球関連抗原４(cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4)（ＣＴＬＡ４）、プログラム細胞死１(programmed cell death 1)（ＰＤ１）、プログラム細胞死リガンド１(programmed cell death ligand 1)（ＰＤＬ１）、リンパ球活性化遺伝子３(lymphocyte activation gene 3)（ＬＡＧ３）、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ−７−Ｈ４、およびＴ細胞膜タンパク質３(T cell membrane protein 3)（ＴＩＭ３）が含まれる(Pardoll, 2012)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Wheatley and Campbell, Pathol. Oncol. Res., 8:18-25, 2002
【非特許文献２】Ensor et al., Cancer Res., 62:5443-5450, 2002
【非特許文献３】Feun et al., J. Neurooncol., 82:177-181, 2007
【非特許文献４】Yoon et al., Int. J. Cancer, 120:897-905, 2007
【非特許文献５】Shen et al., Cancer Lett., 231:30-35, 2006
【非特許文献６】Scott et al., Br. J. Cancer, 83:800-810, 2000
【非特許文献７】Izzo et al., J. Clin. Oncol., 22:1815-1822, 2004
【非特許文献８】Cheng et al., Cancer Res., 67:309, 2007
【非特許文献９】Pardoll, Drew, Nature Reviews Cancer 12, 252-264 (April 2012)
【発明の概要】
【０００６】
[0004]  本開示のある側面は、一般に血清中のＬ−アルギニンを枯渇させる酵素で癌を処置するための組成物および方法に関する。ある態様において、癌はアルギニノコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、またはアルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）を発現しないか、あるいは他の形で欠如するものである。
【０００７】
[0005]  ある側面において、本発明は天然の金属補因子（Ｍｎ２＋）が他の金属で置き換えられたアルギナーゼタンパク質の使用をも考慮する。特定の態様において、アルギナーゼタンパク質はヒト  アルギナーゼＩのアミノ酸配列またはヒト  アルギナーゼＩＩのアミノ酸配列および非天然−金属補因子を含む。ある態様において、金属はコバルト（Ｃｏ２＋）である。本発明のヒトアルギナーゼＩおよびＩＩタンパク質は２つのＭｎ（ＩＩ）部位をもつ；非天然−金属補因子をもつ修飾されたアルギナーゼＩまたはＩＩタンパク質が生成するように、一方または両方の部位を置換することができる。ある態様において、タンパク質はｐＨ７．４で４００ｍＭ−１ｓ−１より大きなｋｃａｔ／ＫＭを示す。特定の態様において、タンパク質はｐＨ７．４で４００ｍＭ−１ｓ−１〜４，０００ｍＭ−１ｓ−１のｋｃａｔ／ＫＭを示す。他の態様において、タンパク質はｐＨ７．４、３７℃で４００ｍＭ−１ｓ−１〜２，５００ｍＭ−１ｓ−１のｋｃａｔ／ＫＭを示す。特定の態様において、本発明はヒト  アルギナーゼＩまたはＩＩのアミノ酸配列および非天然−金属補因子を含むタンパク質を考慮し、そのタンパク質は３７℃、ｐＨ７．４で４００ｍＭ−１ｓ−１より大きなｋｃａｔ／ＫＭを示す。
【０００８】
[0006]  本開示のさらに他の側面は、免疫チェックポイント経路を標的とする免疫療法処置と併せたアルギニン枯渇により癌または腫瘍を処置する方法であり、たとえばアルギニン枯渇はヒト  アルギナーゼＩまたはアルギナーゼＩＩ酵素の投与により達成でき、それには工学操作または誘導体化したアルギナーゼ酵素、および他の種に由来するアルギナーゼまたは他のアルギニン枯渇酵素であって、免疫チェックポイント標的療法と共に投与した際に少なくとも相加効果または相乗効果を示すものが含まれる。
【０００９】
[0007]  したがって本開示は、特定の態様において、療法量のコバルト補因子を含むヒト  アルギナーゼＩ酵素および癌免疫療法薬(immuno-oncology agent)を含有する医薬組成物を投与することを含む、対象において腫瘍増殖を阻害する方法として記載できる。腫瘍はアルギニン枯渇療法に応答する種々のタイプであってよく、特定の態様においてアルギニン栄養要求性腫瘍(arginine auxotrophic tumor)であり、あるいはアルギニン依存性または栄養要求性の細胞を含む。特定の態様において、栄養要求性細胞はＡＳＳ、ＯＴＣ、ＡＳＬ、またはその組合わせのうち１以上の発現の低減または阻害を示し、よってその腫瘍細胞は血清からのアルギニンを利用する必要がある。
【００１０】
[0008]  特定の態様において、患者の血清中におけるヒト  アルギナーゼＩまたは他の酵素の半減期を延長するためにその酵素を安定剤との会合によって安定化させる。本明細書中で用いる“会合(association)”には多数のタイプの会合のいずれかを含めることができ、それには共有結合または非共有結合が含まれるが、これらに限定されず、工学作製した核酸構築体から発現したタンパク質融合体、水素結合または疎水性相互作用からのもの、および当業者に知られている他のものも含めることができる。開示した方法に使用するための安定剤には下記のものが含まれるが、それらに限定されない；たとえば、ポリエチレングリコール（しばしばＰＥＧ化(pegylation)と呼ばれる）、１以上の均質な合成タンパク質ポリマーへのコンジュゲーション（エクステニレーションと呼ばれ、商品名Ｘｔｅｎ（登録商標）で市販されている）、１以上のＦｃフラグメントまたは血清タンパク質、たとえばアルブミンへのコンジュゲーション。そのような安定化された酵素および当業者に自明である他のものはすべて本開示により考慮される。
【００１１】
[0009]  開示した方法はヒトおよび非ヒト動物の両方の対象に適用でき、それには獣医学的動物、農業用動物、家畜または研究用動物が含まれるが、これらに限定されない。癌免疫療法薬によって対象の免疫応答を増強することは本開示の側面である。特定の態様において、免疫系の増強には腫瘍の存在に対する患者のＴ細胞応答の活性を増強することが含まれる。したがって、特定の態様において、癌免疫療法薬は時には細胞表面受容体である免疫サプレッサーを阻害し、チェックポイント阻害薬と呼ばれ、あるいはそのような受容体に対するリガンドである。例には、ＰＤ−１経路阻害薬、たとえば抗−ＰＤ−１抗体もしくは抗−ＰＤ−Ｌ１抗体、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）経路阻害薬、たとえば抗−ＯＸ４０もしくは抗−ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、抗−４−１ＢＢ、または他の抗Ｂ７ファミリーリガンド、たとえば抗−Ｂ７−Ｈ１および抗−Ｂ７．１が含まれるが、これらに限定されない。代表的な抗体にはペンブロリズマブ(pembrolizumab)、イピリムマブ(ipilimumab)、アテゾリズマブ(atezolizumab)またはニボルマブ(nivolumab)が含まれるが、これらに限定されない。
【００１２】
[00010]  本開示の方法は、下記のもの（それらに限定されない）を含むいずれかの応答性癌または腫瘍の処置を考慮する：肝細胞癌、腎細胞癌、乳癌、メラノーマ、前立腺癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌、結腸直腸癌、トリプルネガティブ(triple negative)乳癌、ホジキンリンパ腫、胃癌、神経膠芽細胞腫、メルケル細胞癌(Merkel cell carcinoma)、肺癌、小細胞肺癌または非小細胞肺癌。ヒト  アルギナーゼＩ酵素と抗−ＰＤ−１抗体もしくは抗−ＰＤＬ−１抗体または他の免疫チェックポイントもしくはＴＮＦ受容体の阻害薬との組合わせの投与は、療法量の抗−ＰＤ−１抗体単独または抗−ＰＤ−Ｌｉ抗体単独、またはヒト  アルギナーゼＩ酵素単独の投与により示される腫瘍増殖阻害と比較して、腫瘍増殖に対する相加効果を示すことができ、あるいは特定の態様においては腫瘍増殖または癌に対して相加効果より大きな、すなわち相乗効果を示す。これら２つの治療計画を同時に投与することができ、あるいはそれらを必要に応じて逐次投与することができる。
【００１３】
[00011]  本開示は、特定の態様において、コバルト補因子を含むＰＥＧ化ヒト  アルギナーゼＩ酵素を含む療法量の医薬組成物、および癌免疫療法薬を含む医薬組成物を投与することを含む免疫系調節療法を、患者に投与することを含む、癌患者において癌を処置する方法として記載することもできる。
【００１４】
[00012]  特定の態様において、コバルト補因子を含むＰＥＧ化ヒト  アルギナーゼＩ酵素の療法量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇから約７．５ｍｇ／ｋｇまで、約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇまで、もしくは約０．１ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇまで、または以上の範囲から導くことができるかもしくはそれに含まれるいずれかの量である。
【００１５】
[00013]  コバルト補因子を含むＰＥＧ化ヒト  アルギナーゼＩ酵素を含有する医薬組成物を非経口投与することができ、あるいは当技術分野で知られている種々の経路によりそれを送達することができ、それには下記のものが含まれるが、それらに限定されない：局所、皮下、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜腔内、気管内、眼内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、筋肉内、皮下、結膜下、膀胱内(intravesicularlly)、粘膜、心膜内、臍帯内、経口、吸入により、注射により、注入により、連続注入により、標的細胞の直接的な局所潅流浴(localized perfusion bathing)により、カテーテルにより、または潅注(lavage)により。特定の態様において、医薬組成物を静脈内または皮下に投与する。
【００１６】
[00014]  本開示は、アルギニン枯渇薬、および癌の成長または増殖を阻害または低減するチェックポイント経路阻害薬または他の免疫系調節薬を患者に投与することを含む、癌患者において癌を処置する方法として記載することもできる。これらの方法はさらに、アルギニン枯渇薬およびチェックポイント経路阻害薬による処置の療法効果がアルギニン枯渇薬単独またはそのチェックポイント経路阻害薬単独の処置と比較して相加的である、あるいはアルギニン枯渇薬およびチェックポイント経路阻害薬による処置の療法効果がアルギニン枯渇薬単独またはそのチェックポイント経路阻害薬単独の処置と比較して相乗的である、癌の処置を含む。特定の態様において、処置は患者の血清アルギニンにおける５０％から９９％まで、または９０％から９９％までの低減、あるいは患者の血清アルギニンにおける検出できないレベルにまでの低減をもたらすことができる。
【００１７】
[00015]  本方法の実施に有用な酵素には、アルギナーゼ酵素、アルギニンデイミナーゼ酵素、またはその組合わせを含めることができる。これらの酵素は、ヒト酵素、組換えヒト酵素、工学操作したヒト酵素、または他の種、たとえば哺乳動物もしくは細菌（たとえばマイコプラズマを含むが、これに限定されない）に由来する酵素であってもよい。
【００１８】
[00016]  ある態様において、天然アルギナーゼを金属補因子の置換のみによって修飾する。他の態様において、アルギナーゼを他の修飾、たとえば置換、欠失、トランケーション、または安定化用のタンパク質もしくはポリマーへのコンジュゲーションによる安定化、たとえばＰＥＧ化のほかに、金属補因子の置換により修飾する。特定の態様において、本発明はヒト  アルギナーゼＩまたはＩＩの天然アミノ酸配列および非天然−金属補因子を含むタンパク質を提供し、その際、アミノ酸配列は天然配列の一部を欠如する。特定の態様において、非天然−金属補因子はコバルトである。ある態様において、アルギナーゼは野生型配列の一部を欠如する。他の態様において、アミノ酸配列はトランケートしたアルギナーゼＩまたはアルギナーゼＩＩ配列を含む。特定の態様において、アルギナーゼはアルギナーゼＩＩであり、野生型配列の最初の２１個のアミノ酸を欠如する。他の態様において、天然アルギナーゼがＮ−末端メチオニンを欠如する。
【００１９】
[00017]  他の側面において、本発明は少なくとも１つのアミノ酸置換を含むアルギナーゼタンパク質を考慮し、そのタンパク質は生理的条件下で、特にヒト血清のｐＨ（ｐＨ７．４）で、天然ヒト  アルギナーゼＩまたはＩＩタンパク質と比較した際に増大した触媒活性を示す。ある態様において、アルギナーゼタンパク質はヒト  アルギナーゼＩタンパク質またはヒト  アルギナーゼＩＩタンパク質である。ある態様において、タンパク質はさらに非天然−金属補因子を含む。特定の態様において、非天然−金属補因子はＣｏ＋２である。Ｃｏ＋２によるＭｎ＋２補因子の置換は、生理的ｐＨで顕著な触媒活性増大および著しいＫＭ低下をもたらす。ある側面において、本発明は非アルギナーゼアミノ酸配列に連結したアルギナーゼを含む融合タンパク質をも考慮する。一態様において、非アルギナーゼ配列は、たとえば患者に投与した際の血清中におけるアルギナーゼの半減期を延長するために、免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部を含む。Ｆｃ領域またはその一部はいずれか適切なＦｃ領域であってよい。一態様において、Ｆｃ領域またはその一部はＩｇＧ  Ｆｃ領域である。ある態様において、アルギナーゼ活性をもつアミノ酸配列は、ヒト  アルギナーゼＩの天然または変異アミノ酸配列、およびヒト  アルギナーゼＩＩの天然または変異アミノ酸配列、または当技術分野で知られている他のアルギニン枯渇酵素からなる群から選択される。特定の態様において、ダイマー型のＦｃ−アルギナーゼ融合タンパク質、アルブミンまたは合成タンパク質のコンジュゲーションが考慮される。
【００２０】
[00018]  融合タンパク質中のアルギナーゼは、天然物、変異体、および／または他の形で修飾されたもの、たとえば金属補因子修飾されたものであってもよい。ある態様において、アルギナーゼは欠失、置換、トランケーション、またはその組合わせを含むことができる。特定の態様において、本発明は融合タンパク質を含有するＦｃ−アルギナーゼを考慮し、その際、アルギナーゼはアルギナーゼＩである。一態様において、アルギナーゼは野生型配列の一部を欠如する。他の態様において、アルギナーゼはＮ−末端メチオニンを欠如するアルギナーゼＩである。さらに他の態様において、アルギナーゼはアルギナーゼＩＩであり、その際、アルギナーゼＩＩは野生型アルギナーゼＩＩ配列の最初の２１個のアミノ酸を欠如する。ある態様において、アルギナーゼはさらに非天然−金属補因子を含む。これらの態様において、いずれか一方または両方の部位を置換して、ヒト  アルギナーゼＩまたはＩＩのアミノ酸配列および非天然−金属補因子を含む融合タンパク質を作製することができる。ある態様において、非天然−金属補因子はコバルトである。ある態様において、アルギナーゼは置換を含む。本開示に使用するための代表的アルギナーゼ酵素は、より詳細にU.S. Patent No. 8,440,184に記載されており、それの全体を本明細書に援用する。
【００２１】
[00019]  本発明は、本発明のアルギナーゼタンパク質の投与により処置する方法、特に癌を伴なう対象を処置する方法をも考慮する。ある態様において、癌はＡＳＳ、ＯＴＣ、またはＡＳＬを発現しないか、あるいは他の形で欠如するものである。特定の態様において、ヒト癌はアルギニン栄養要求性癌である。前記で考察したように、アルギナーゼタンパク質は天然物、変異体、および／または他の形で修飾されたもの、たとえば金属補因子修飾されたものであってもよい。一態様において、本発明は、融合タンパク質、すなわちアルギナーゼ活性をもつアミノ酸配列およびヒト免疫グロブリンのＦｃ領域の少なくとも一部を含む融合タンパク質を含む配合物を患者に投与することを含む、ヒト癌患者を処置する方法を考慮する。ある態様において、投与は癌の癌細胞の少なくとも一部が死滅する条件下で行なわれる。他の態様において、配合物は、基準ヒト  アルギナーゼが生理的条件下で示すものより高いヒト  アルギナーゼ活性をもちさらに１以上の結合したポリエチレングリコール鎖を含むアミノ酸配列を含む。ある態様において、配合物は、前記において考察したいずれかのアルギナーゼタンパク質および医薬的に許容できる賦形剤を含む医薬配合物である。そのような医薬的に許容できる賦形剤は当業者に周知である。前記のアルギナーゼバリアントはすべてヒトの療法に有用なものとして考察される。
【００２２】
[00020]  癌はいかなるタイプの癌または腫瘍タイプであってもよい。ある態様において、癌は肝細胞癌、腎細胞癌、メラノーマ、前立腺癌、または膵臓癌である。ある態様において、配合物を局所、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜腔内、気管内、眼内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、筋肉内、皮下、結膜下、膀胱内、粘膜、心膜内、臍帯内、経口、吸入により、注射により、注入により、連続注入により、標的細胞の直接的な局所潅流浴により、カテーテルにより、または潅注により投与する。
【００２３】
[00021]  前記に述べたすべてのアルギナーゼ、バリアントなどは、好ましい態様において精製または単離されたタンパク質、好ましくはモノマータンパク質として考慮される。
【００２４】
[00022]  実施例のセクションにおける態様は、本発明のすべての側面に適用できる本発明の態様であると解釈される。
[00023]  特許請求の範囲における用語“または”は、二者択一(alternative)を表わすと明白に指示しない限り、あるいは二者択一が相互排他的でない限り、“および／または”を意味するために用いられる；ただし、本開示は二者択一のみ、および“および／または”を表わす定義を支持する。
【００２５】
[00024]  本出願全体を通して、用語“約(about)”は、ある数値がその数値を決定するために用いる組成物、デバイスまたは方法についての誤差の標準偏差を含むことを示すために用いられる。
【００２６】
[00025]  長年の特許法に従って、“a”および“an”という語は、特許請求の範囲または明細書中で“含む(comprising)”という語と組み合わせて用いられる場合、特に明記しない限り１以上を意味する。
【００２７】
[00026]  本明細書中で用いる用語“療法有効”は、療法効果を達成するために本発明の方法に用いられ、たとえばその際、処置される状態の少なくとも１つの症状が少なくとも改善される、および／またはこれらの細胞と組み合わせて使用するプロセスもしくは材料の分析に用いられる、有効薬剤および／または療法用組成物（たとえば、療法用ポリヌクレオチドおよび／または療法用ポリペプチド）の量を表わす。
【００２８】
[00027]  本発明の他の目的、特徴および利点は以下の詳細な記載から明らかになるであろう。ただし、この詳細な記載から本発明の精神および範囲内での多様な変更および改変が当業者に明らかになるであろうから、詳細な記載および具体例は本発明の具体的態様を示しているけれども説明のために示したにすぎないことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
[00028]  以下の図は本明細書の一部をなし、本発明の特定の側面をさらに立証するために含まれる。これらの図のうち１以上を本明細書に提示する特定の態様の詳細な記載と併せて参照することにより、本発明をより良く理解できる。
【図１】[00029]  図１は、マウスモデルにおける血清Ｌ−アルギニン枯渇を示すグラフである。Ｃｏ−ｈＡｒｇＩの単回ＩＰ投与で処理したＢａｌｂ／ｃマウスの血清Ｌ−Ａｒｇ濃度は、３日間にわたって≦３〜４μＭに維持されている。
【図２】[00030]  図２は、対照と比較したＣｏ−ｈＡｒｇＩで処理した際のＨＣＣ腫瘍異種移植体の縮小を示すグラフである。Ｈｅｐ３ｂ腫瘍異種移植体を保有するヌードマウスを、９日目と１２日目の２回、ＰＢＳ（〇）またはＣｏ−ｈＡｒｇＩ（●）でＩＰ注射により処理した。Ｃｏ−ｈＡｒｇＩで処理したマウスには腫瘍縮小が見られたのに対し、ＰＢＳ処理した腫瘍はチェックされずに増殖した。
【図３】[00031]  図３は、コバルト装填がヒト  アルギナーゼＩの触媒活性に及ぼす効果を示すグラフである。
【図４】[00032]  図４は、ＣＴ２６マウスモデルにおけるＣｏ−ｈＡｒｇＩ、抗ＰＤ−Ｌ１、およびＣｏ−ｈＡｒｇＩと抗ＰＤ−Ｌ１の組合わせによる、結腸癌性腫瘍の増殖阻害を示すグラフである。このデータに示されるように、これら２種類の薬剤の組合わせは腫瘍増殖の阻害について相加的なものより大きな効果をもつ。
【図５】[00033]  図５は、ＭＣ３８マウスモデルにおけるＣｏ−ｈＡｒｇＩ、抗ＯＸ４０抗体、およびＣｏ−ｈＡｒｇＩと抗ＯＸ４０抗体の組合わせによる、結腸癌性腫瘍の増殖阻害を示すグラフである。このデータに示されるように、これら２種類の薬剤の組合わせは腫瘍増殖の阻害について相加的なものより大きな効果をもつ。
【図６】[00034]  図６は、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ、抗ＰＤ−Ｌ１、およびＣｏ−ｈＡｒｇＩと抗ＰＤ−Ｌ１の組合わせによる、ＣＴ２６マウスモデルに存在するＣＤ４５＋  Ｔ細胞を示すグラフである。
【図７】[00035]  図７は、図６に示したＣＤ４５＋  Ｔ細胞中に存在するＣＤ８＋細胞を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
[00036]  本発明は、一般に、血清中のＬ−アルギニンを枯渇させる酵素で癌を処置するための組成物および方法に関する。ある態様において、癌はアルギニノコハク酸シンセターゼ（ＡＳＳ）、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）、もしくはアルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）、またはアルギニン生合成に要求される他の酵素を発現しないか、あるいは他の形で欠如するものである。天然物および変異体の両方の酵素、ならびに金属補因子が改変された酵素、他のポリペプチドに融合した酵素、ならびに血清残存率(persistence)を高めるポリマー（たとえば、高分子量ポリエチレングリコール）にコンジュゲートした酵素が考慮される。
【００３１】
Ｉ．アルギナーゼ
[00037]  アルギナーゼはマンガン含有酵素である。それは尿素サイクルの最終酵素である。アルギナーゼは、哺乳類において身体が有害なアンモニアを廃棄する一連の生物物理学的反応である尿素サイクルの第５および最終工程である。具体的には、アルギナーゼはＬ−アルギニンをＬ−オルニチンおよび尿素に変換する。
【００３２】
[00038]  Ｌ−アルギニンは一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）に対する窒素供与基質であり、Ｌ−シトルリンおよびＮＯが産生される。アルギナーゼのＫＭ（２〜５ｍＭ）はＬ−アルギニンに対するＮＯＳのもの（２〜２０μＭ）よりはるかに高いとレポートされているが、アルギナーゼはＮＯＳ活性の調節においても役割をもつ可能性がある。特定の条件下でアルギナーゼＩはＣｙｓ−Ｓ−ニトロシル化され、その結果、Ｌ−アルギニンに対するより高いアフィニティーおよびＮＯＳに対する基質利用能の低減を生じる。
【００３３】
[00039]  アルギナーゼは、幾つかのヘリックスによって囲まれたα／βフォールドの平行な８ストランド状βシートをもつホモトリマー酵素である。この酵素は、Ｌ−アルギニンのグアニジニウム炭素を求核攻撃するためのヒドロキシドの発生に不可欠な二核金属クラスター(di-nuclear metal cluster)を含む。アルギナーゼについての天然の金属はＭｎ２＋である。これらのＭｎ２＋イオンは水を配位して分子を配向および安定化させ、水が求核体として作用してＬ−アルギニンを攻撃できるようにし、それをオルニチンおよび尿素に加水分解する。
【００３４】
[00040]  哺乳類は、Ｌ−アルギニンから尿素およびＬ−オルニチンへの加水分解を触媒する２種類のアルギナーゼアイソザイム（ＥＣ  ３．５．３．１）をもつ。アルギナーゼＩ遺伝子は染色体６（６ｑ．２３）に位置し、肝細胞の細胞質ゾルに高度に発現し、尿素サイクルの最終工程としての窒素除去において機能する。アルギナーゼＩＩ遺伝子は染色体１４（１４ｑ．２４．１）上にある。アルギナーゼＩＩは、腎臓、脳および骨格筋などの組織のミトコンドリアに位置し、そこでプロリンおよびポリアミドの生合成のためのＬ−オルニチンを供給すると考えられる(Lopez et al., 2005)。
【００３５】
[00041]  アルギナーゼは細胞外Ｌ−アルギニンの分解につい５０年近く研究されてきた(Dillon et al., 2002)。経肝動脈塞栓形成術(transhepatic arterial embolisation)によりアルギナーゼを誘導することによって、若干の有望な臨床結果が達成された；それに伴なって、数人の患者がＨＣＣの部分的寛解を体験した(Cheng et al., 2005)。しかし、アルギナーゼは高いＫＭ（約２〜５ｍＭ）をもち、生理的ｐＨ値ではきわめて低い活性を示すので、化学療法目的には高用量が必要である(Dillon et al., 2002)。天然アルギナーゼは数分以内に循環から消失する(Savoca et al., 1984)が、ラットにおいてＰＥＧ−アルギナーゼＭＷ５０００の単回注射は約３日間の完全なアルギニン枯渇を達成するのに十分であった(Cheng et al., 2007)。
【００３６】
[00042]  Cheng et al. は、多くのヒトＨＣＣ細胞株がＯＴＣ（ＡＳＳのほかに）を発現せず、よってそれらはＰＥＧ−アルギナーゼに対して感受性であるという驚くべき所見を得た(Cheng et al., 2007)。Ｈｅｐ３ｂ肝癌細胞を移植したマウスにおいて、ＰＥＧ−アルギナーゼの週１回投与により腫瘍増殖遅滞が生じ、それは５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）の共投与によって増強された。しかし、ＰＥＧ−アルギナーゼはヒトの療法には非実用的なきわめて高い用量で用いられ、それはそれの生理活性が比較的低いことを反映している。
【００３７】
[00043]  これらの問題に対処するために、良好な動態および安定性を示す細菌性アルギニン加水分解酵素であるアルギニンデイミナーゼ、すなわちＡＤＩが、インビトロおよび臨床において試験された。残念ながらＡＤＩは細菌性酵素であり、したがってそれは大部分の患者において強い免疫応答および有害作用を誘導する。しかし、著しい有害応答を発現しない患者については銘記すべきパーセントが安定疾患または寛解を示す。
【００３８】
[00044]  臨床用としては、アルギナーゼを循環中で長期間（たとえば、数日間）存続させるように工学操作することが必須である。何ら修飾しない状態では、ヒト  アルギナーゼは循環中で数分間の半減期をもつにすぎない；それは主に、それのサイズが腎臓による濾過を回避するのに十分なほど大きくないからである。修飾されていないヒト  アルギナーゼは血清中での不活性化に対してきわめて感受性であり、わずか４時間の半減期で分解される。したがって、本発明は、臨床研究および療法使用の可能性のために、循環残存率が改善された新規な改良型のアルギナーゼを開発した。
【００３９】
ＩＩ．アルギナーゼバリアント
[00045]  哺乳類は、Ｌ−アルギニンから尿素およびＬ−オルニチンへの加水分解を触媒する２種類のアルギナーゼアイソザイム（ＥＣ  ３．５．３．１）をもつ。アルギナーゼＩ遺伝子は染色体６（６ｑ．２３）に位置し、肝細胞の細胞質ゾルに高度に発現し、尿素サイクルの最終工程としての窒素除去に際して機能する。アルギナーゼＩＩ遺伝子は染色体１４（１４ｑ．２４．１）上にある。アルギナーゼＩＩは、腎臓、脳および骨格筋などの組織のミトコンドリアに位置し、そこでプロリンおよびポリアミドの生合成のためのＬ−オルニチンを供給すると考えられる(Lopez et al., 2005)。Ｌ−アルギニンは一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）に対する唯一の基質であり、Ｌ−シトルリンおよびＮＯが産生される。アルギナーゼのＫＭ（２〜５ｍＭ）はＬ−アルギニンに対するＮＯＳのもの（２〜２０μＭ）よりはるかに高いとレポートされているが、アルギナーゼはＮＯＳ活性の調節においても役割をもつ可能性がある(Durante et al., 2007)。特定の条件下でアルギナーゼＩはＣｙｓ−Ｓ−ニトロシル化され、その結果、Ｌ−アルギニンに対するより高いアフィニティーおよびＮＯＳに対する基質利用能の低減を生じる(Santhanam et al., 2007)。アルギナーゼは、幾つかのヘリックスによって囲まれたα／βフォールドの平行な８ストランド状βシートをもつホモトリマー酵素である。この酵素は、Ｌ−アルギニンのグアニジニウム炭素を求核攻撃するためのヒドロキシドの発生に不可欠な二核金属クラスターを含む(Cama et al., 2003; Dowling et al., 2008)。アルギナーゼについての天然の金属はＭｎ２＋である。天然の金属（すなわち、Ｍｎ２＋）をもつアルギナーゼはｐＨ最適値９を示す。生理的ｐＨで、この酵素はＬ−アルギニンの加水分解において１０倍よりさらに低いｋｃａｔ／ＫＭを示す。天然Ｍｎ２＋をもつ基準ヒト  アルギナーゼが示すこの低い触媒活性は、ヒトの療法について問題を提起する；それは、Ｌ−アルギニン血漿レベルにおいて療法上妥当な低下を達成するためには非実用的な用量の酵素を使用しなければならない可能性があることを意味するからである。
【００４０】
[00046]  ある側面において、本発明は天然の金属補因子（Ｍｎ２＋）が他の金属で置き換えられた変異アルギナーゼを考慮する。ヒト  アルギナーゼにおける金属補因子の置換は、天然の金属補因子をもつ天然ヒト  アルギナーゼ  と比較した場合に生理的条件下でのＬ−アルギニンの加水分解速度および安定性に有益な効果を及ぼすことが見出された。他の二価カチオンによる天然の金属（Ｍｎ２＋）の置換を利用してその酵素の最適ｐＨをより低い値へシフトさせ、こうして生理的条件下での高いＬ−アルギニン加水分解速度を達成することができる。本発明のヒトアルギナーゼＩおよびＩＩタンパク質は２つのＭｎ（ＩＩ）部位をもつ；したがって、非天然−金属補因子をもつ変異したアルギナーゼＩまたはＩＩタンパク質が作製されるように、いずれか一方または両方の部位を置換することができる。
【００４１】
[00047]  ある態様において、金属はコバルト（Ｃｏ２＋）である。ヒト  アルギナーゼＩまたはヒト  アルギナーゼＩＩにおいてＭｎ２＋の位置にＣｏ２＋を取り込ませると、生理的ｐＨにおいて劇的に、より高い活性が得られる。Ｃｏ２＋を含有するヒト  アルギナーゼＩ酵素（“Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ”）はインビトロでｐＨ７．４において１０倍のｋｃａｔ／ＫＭ増大を示すことが見出された；それは、Ｍｎ２＋を含有するヒト  アルギナーゼＩ（“Ｍｎ−ｈＡｒｇＩ”）と比較して１５倍のＨＣＣ細胞傷害性増大および１３倍のメラノーマ細胞傷害性増大と解釈される。Ｃｏ−ｈＡｒｇＩの薬理学的製剤は単回注射したマウスにおいて３日間にわたって血清Ｌ−Ａｒｇを排除できることも見出された。さらに、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩの薬理学的製剤はヌードマウスにおいてＨＣＣ腫瘍異種移植体を縮小できることが見出され、それに対しＭｎ−ｈＡｒｇＩは腫瘍増殖を遅滞させたにすぎない(Ensor et al., 2002)。
【００４２】
[00048]  本発明の特定の側面において、ＰＥＧ化アルギナーゼに関する方法および組成物を開示する。具体的には、工学操作したシステイン残基（たとえば、Ｎ−末端の第３残基を置換）におけるアルギナーゼのＰＥＧ化を用いて均一なＰＥＧ化アルギナーゼ組成物を調製することができる。重合の一時的攪乱に基づくＰＥＧ化アルギナーゼの単離方法も開示する。
【００４３】
[00049]  ＰＥＧ化はポリ（エチレングリコール）ポリマー鎖を他の分子、普通は薬物または療法用タンパク質に共有結合させるプロセスである。ＰＥＧ化は、ＰＥＧの反応性誘導体を目標高分子と共にインキュベートすることによってルーティンに達成される。薬物または療法用タンパク質へのＰＥＧの共有結合は、その薬剤をホストの免疫系から“マスク”することができ（免疫原性および抗原性の低減）、その薬剤の流体力学的サイズ（溶液中におけるサイズ）を増大させて腎クリアランスを低減することによりそれの循環時間を延長することができる。ＰＥＧ化は疎水性の薬物およびタンパク質に水溶性を付与することもできる。
【００４４】
[00050]  ＰＥＧ化における第１工程は、ＰＥＧポリマーの一方または両方の末端における適切な官能化である。それぞれの末端を同一の反応性部分で活性化されているＰＥＧは“ホモ二官能性”として知られ、これに対し存在する官能基が異なる場合、そのＰＥＧ誘導体は“ヘテロ二官能性”または“ヘテロ官能性”と呼ばれる。ＰＥＧポリマーの化学的に活性な、または活性化された誘導体を調製して、ＰＥＧを目的分子に結合させる。
【００４５】
[00051]  ＰＥＧ誘導体に適した官能基の選択は、ＰＥＧにカップリングさせる予定の分子上にある反応基のタイプに基づく。たとえば、一般的な反応性アミノ酸にはリジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシンが含まれる。Ｎ−末端アミノ基およびＣ−末端カルボン酸も使用できる。
【００４６】
[00052]  第１世代のＰＥＧ誘導体を形成するために用いられた手法は、一般にＰＥＧポリマーを、ヒドロキシル基と反応性であるグループ、一般に酸無水物、酸塩化物、クロロホルメートおよびカーボネートと反応させる。第２世代のＰＥＧ化化学においては、より効率的な官能基、たとえばアルデヒド、エステル、アミドなどがコンジュゲーションに利用されるようになった。
【００４７】
[00053]  ＰＥＧ化の適用はますます進化し、複雑化しているので、コンジュゲーションのためのヘテロ二官能性ＰＥＧの必要性が増している。親水性、フレキシブルかつ生体適合性であるスペーサーが必要とされる２つの部分を連結する際には、これらのヘテロ二官能性ＰＥＧはきわめて有用である。ヘテロ二官能性ＰＥＧに好ましい末端基は、マレイミド、ビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、アミン、カルボン酸およびＮＨＳエステルである。
【００４８】
[00054]  最も一般的な修飾剤、またはリンカーは、メトキシＰＥＧ（ｍＰＥＧ）分子に基づく。それらの活性は、タンパク質修飾基をアルコール末端に付加することによる。ある場合には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧジオール）を前駆分子として用いる。そのジオールをその後、ヘテロまたはホモ−ダイマーＰＥＧ連結分子を作製するために両末端において修飾する（ＰＥＧビス−ビニルスルホンを用いる例に示すように）。
【００４９】
[00055]  タンパク質は一般に求核部位、たとえば非プロトン化チオール（システイニル残基）またはアミノ基においてＰＥＧ化される。システイニル特異的修飾試薬の例には、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヨードアセテート、ＰＥＧチオール、およびＰＥＧビニルスルホンが含まれる。４つともすべて、緩和な条件下および中性ないしわずかにアルカリ性のｐＨで強くシステイニル特異的であるが、それぞれ若干の欠点をもつ。マレイミドを用いて形成されたアミドはアルカリ性条件下で若干不安定である可能性があり、したがってこのリンカーとの配合選択肢は若干制限される場合がある。ヨードＰＥＧを用いて形成されたアミド結合はより安定であるが、ある条件下で遊離ヨウ素がチロシン残基を修飾する可能性がある。ＰＥＧチオールはタンパク質チオールとジスルフィド結合を形成するが、この結合もアルカリ性条件下で不安定な可能性がある。ＰＥＧ−ビニルスルホンの反応性はマレイミドおよびヨードＰＥＧと比較して比較的遅い；しかし、形成されたチオエーテル結合はかなり安定である。それの反応速度がより遅いことは、ＰＥＧ−ビニルスルホン反応をより制御しやすくする可能性もある。
【００５０】
[00056]  天然システイニル残基における部位特異的ＰＥＧ化が行なわれるのは稀である；これらの残基は通常はジスルフィド結合の形であるか、あるいは生物活性に必要だからである。これに対し、部位特異的変異形成を用いてチオール−特異的リンカーに対するシステイニルＰＥＧ化部位を取り込ませることができる。システイン変異は、それにＰＥＧ化試薬がアクセスできかつＰＥＧ化後になお生物活性であるようにデザインすべきである。
【００５１】
[00057]  アミン特異的修飾剤には、ＰＥＧ  ＮＨＳエステル、ＰＥＧトレシレート(tresylate)、ＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧイソチオシアネート、および他の幾つかが含まれる。すべて緩和な条件下で反応し、アミノ基に対してきわめて特異的である。ＰＥＧ  ＮＨＳエステルはおそらくより反応性の大きな作用剤の１つである；しかし、それの高い反応性は大規模でのＰＥＧ化反応をより制御しにくくする可能性がある。ＰＥＧアルデヒドはアミノ基とイミンを形成し、それが次いでシアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元されて第二級アミンになる。水素化ホウ素ナトリウムと異なり、シアノ水素化ホウ素ナトリウムはジスルフィド結合を還元しないであろう。しかし、この化学物質は高毒性であり、それが揮発性になる、より低いｐＨでは、特に注意深く取り扱わなければならない。
【００５２】
[00058]  大部分のタンパク質には多数のリジン残基があるため、部位特異的ＰＥＧ化が困難な可能性がある。幸いにこれらの試薬はプロトン化していないアミノ基と反応するので、反応をより低いｐＨで実施することによってＰＥＧ化をより低いｐＫのアミノ基へ向けることが可能である。一般に、α−アミノ基のｐＫはリジン残基のイプシロンアミノ基より１〜２ｐＨ単位低い。その分子をｐＨ７以下でＰＥＧ化することによって、しばしばＮ−末端に対する高い選択性を達成できる。しかし、これはそのタンパク質のＮ−末端部分が生物活性に必要ではない場合にのみ実行できる。それでもなお、ＰＥＧ化からの薬物動態上の有益性はしばしば有意のインビトロ生物活性損失より重要であり、ＰＥＧ化化学に関係なくはるかに大きなインビボ生物活性をもつ生成物が得られる。
【００５３】
[00059]  ＰＥＧ化方法を開発する際に考慮する幾つかのパラメーターがある。幸い、重要なパラメーターは通常は４または５を超えない。ＰＥＧ化条件の最適化への“実験の設計”アプローチはきわめて有用な可能性がある。チオール特異的ＰＥＧ化反応について、考慮すべきパラメーターには下記のものが含まれる：タンパク質濃度、ＰＥＧ−対−タンパク質比（モル基準で）、温度、ｐＨ、反応時間、およびある場合には酸素の排除。酸素はタンパク質による分子間ジスルフィド形成に関与する可能性があり、それはＰＥＧ化生成物の収率を低下させるであろう。アミン特異的修飾についても同じ要因（酸素を除外）を考慮すべきであり、ただし特にＮ−末端アミノ基を標的とする場合、ｐＨはよりいっそう重要な可能性がある。
【００５４】
[00060]  アミン−およびチオール−特異的修飾の両方について、反応条件はタンパク質の安定性に影響を及ぼす可能性がある。これにより温度、タンパク質濃度、およびｐＨが制限される可能性がある。さらに、ＰＥＧ化反応を開始する前にＰＥＧリンカーの反応性を知るべきである。たとえば、ＰＥＧ化剤がわずか７０％活性であれば、タンパク質−対−ＰＥＧ反応の化学量論においてＰＥＧの使用量は活性ＰＥＧ分子のみを計算することを確実にすべきである。ＰＥＧの反応性および質を判定する方法を後記に述べる。
【００５５】
ＩＶ．タンパク質およびペプチド
[00061]  特定の態様において、本発明は、少なくとも１種類のタンパク質またはペプチド、たとえば安定化したアルギナーゼマルチマーを含む新規な組成物に関する。これらのペプチドは融合タンパク質中に含まれていてもよく、あるいは前記のようにある作用剤にコンジュゲートしていてもよい。
【００５６】
Ａ．タンパク質およびペプチド
[00062]  本明細書中で用いるタンパク質またはペプチドは、一般に下記のものを表わすが、それらに限定されない：約２００アミノ酸より大きなタンパク質、最大で遺伝子から翻訳された完全長配列；約１００アミノ酸より大きなポリペプチド；および／または約３から約１００までのアミノ酸のペプチド。便宜上、用語“タンパク質”、“ポリペプチド”および“ペプチド”を、本明細書中で互換性をもって用いる。
【００５７】
[00063]  特定の態様において、少なくとも１つのタンパク質またはペプチドのサイズは下記のものを含むことができるが、それらに限定されない：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５、約７５０、約７７５、約８００、約８２５、約８５０、約８７５、約９００、約９２５、約９５０、約９７５、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、約２５００、またはより多いアミノ酸残基。
【００５８】
[00064]  本明細書中で用いる“アミノ酸残基”は、当技術分野で知られているいずれかの天然アミノ酸、いずれかのアミノ酸誘導体、またはいずれかのアミノ酸模倣体を表わす。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基は連続的であり、いずれかの非アミノ酸がアミノ酸残基の配列を中断することはない。他の態様において、配列は１以上の非アミノ酸部分を含むことができる。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基の配列は１以上の非アミノ酸部分によって中断されていてもよい。したがって、用語“タンパク質またはペプチド”には、自然界に存在するタンパク質中にみられる２０の一般的なアミノ酸のうち少なくとも１つ、または下記の表１に示すものを含めた少なくとも１つの修飾されたもしくは稀なアミノ酸（それらに限定されない）を含むアミノ酸配列が含まれる。
【００５９】
【表１−１】
2019529526.tif 000002
【００６０】
【表１−２】
2019529526.tif 000003
【００６１】
[00065]  タンパク質またはペプチドは当業者に知られているいずれかの手法により製造でき、それには標準的な分子生物学的手法によるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの発現、天然源からのタンパク質またはペプチドの単離、あるいはタンパク質またはペプチドの化学合成が含まれる。種々の遺伝子に対応するヌクレオチド、ならびにタンパク質、ポリペプチドおよびペプチド配列がこれまでに開示されており、当業者に知られているコンピューター化されたデータベースに見出すことができる。そのようなデータベースの１つはNational Center for Biotechnology InformationのＧｅｎｂａｎｋおよびＧｅｎＰｅｐｔデータベースである(world wide web at ncbi.nlm.nih.gov/で入手できる)。既知の遺伝子についてのコーディング領域を、本明細書に開示した手法または当業者に知られている手法を用いて増幅および／または発現させることができる。あるいは、タンパク質、ポリペプチドおよびペプチドの種々の市販品が当業者に知られている。
【００６２】
Ｂ．核酸およびベクター
[00066]  本発明の特定の側面において、安定化したマルチマーアルギナーゼとしての融合タンパク質をコードする核酸配列を開示することができる。使用する発現系に応じて、常法に基づいて核酸配列を選択することができる。たとえば、ヒト  アルギナーゼＩおよびＩＩは大腸菌(E. coli)では利用されることが稀な多数のコドンを含み、それらが発現を妨げる可能性があるので、それぞれの遺伝子またはそのバリアントを大腸菌発現のためにコドン最適化することができる。目的タンパク質、たとえば融合したマルチマーアルギナーゼまたはシステイン置換アルギナーゼを発現させるために種々のベクターも使用できる。代表的ベクターにはプラスミドベクター、ウイルスベクター、トランスポゾンまたはリポソームベースのベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
Ｃ．宿主細胞
[00067]  本発明に有用な宿主細胞、好ましくは真核細胞は、アルギナーゼおよびその融合マルチマーの発現および分泌を可能にするように形質転換できるいずれかである。宿主細胞は、細菌、哺乳動物細胞、酵母、または糸状菌であってもよい。種々の細菌には、エシェリキア属(Escherichia)およびバチルス属(Bacillus)が含まれる。酵母菌属(Saccharomyces)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、またはピチア属(Pichia)に属する酵母を適切な宿主細胞として使用できる。下記の属を含めた糸状菌の種々の種を発現宿主として使用できる：アスペルギルス属(Aspergillus)、トリコデルマ属(Trichoderma)、アカパンカビ属(Neurospora)、ペニシリウム属(Penicillium)、セファロスポリウム属(Cephalosporium)、アクリア属(Achlya)、ポドスポラ属(Podospora)、エンドチア属(Endothia)、ケカビ属(Mucor)、コクリオボラス属(Cochliobolus)、およびピリキュラリア属(Pyricularia)。
【００６４】
[00068]  使用できる宿主生物の例には、下記のものが含まれる：細菌、たとえば大腸菌ＭＣ１０６１、枯草菌(Bacillus subtilis)派生株ＢＲＢ１(Sibakov et al., 1984)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)ＳＡＩ１２３(Lordanescu, 1975)またはストレプトコッカス・リビダンス(Streptococcus lividans)(Hopwood et al., 1985)；酵母、たとえばサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)ＡＨ  ２２(Mellor et al., 1983)およびシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)；糸状菌、たとえばアスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、アスペルギルス・アワモリ(Aspergillus awamori)(Ward, 1989)、トリコデルマ・レーゼイ(Trichoderma reesei)(Penttila et al., 1987; Harkki et al, 1989)。
【００６５】
[00069]  哺乳動物宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ラット下垂体細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ  Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２．２）、ラット肝癌細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣＣＲＬ  １５４８）、ＳＶ４０形質転換したサル腎細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、およびネズミ胚細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５８）が含まれる。以上は当技術分野で知られている多数の可能な宿主生物の例示であるが、限定ではない。原則として、原核細胞または真核細胞のいずれであっても、分泌を可能にするすべての宿主を使用できる。
【００６６】
[00070]  アルギナーゼおよび／またはそれらの融合マルチマーを発現する哺乳動物宿主細胞を、一般に親細胞株の培養に用いられる条件下で培養する。一般に、生理的塩類および栄養素を含有する標準培地、たとえば一般に５〜１０％の血清、たとえばウシ胎仔血清を補足した標準的なＲＰＭＩ、ＭＥＭ、ＩＭＥＭまたはＤＭＥＭ中で細胞を培養する。培養条件も標準的なものであり、たとえば培養物を３７℃において、静止またはローラー培養で、希望するタンパク質レベルに達するまでインキュベートする。
【００６７】
Ｄ．タンパク質精製
[00071]  タンパク質精製法は当業者に周知である。これらの手法は、あるレベルで、細胞、組織または臓器のホモジナイゼーション、およびポリペプチド画分と非ポリペプチド画分へのおおまかな分画を伴なう。別に明記しない限り、クロマトグラフィーおよび電気泳動の手法を用いて目的とするタンパク質またはポリペプチドをさらに精製して、部分的または完全な精製（または均質になるまでの精製）を達成できる。純粋なペプチドの調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィーおよび等電点電気泳動である。特に効率的なペプチド精製法は、快速液体クロマトグラフィー(fast performance liquid chromatography)（ＦＰＬＣ）またはさらに高速液体クロマトグラフィー(high performance liquid chromatography)（ＨＰＬＣ）である。
【００６８】
[00072]  精製したタンパク質またはペプチドを、他の成分から分離した組成物と呼ぶものとし、その際、タンパク質またはペプチドは、自然界で得られるそれの状態と対比していずれかの程度にまで精製されている。したがって、単離または精製されたタンパク質またはペプチドを、それが自然界で存在していた環境から離れたタンパク質またはペプチドとも呼ぶ。一般に、“精製した”は他の種々の成分を除去するために分画されたタンパク質またはペプチドの組成物を表わし、その組成物は実質的にそれの発現した生物活性を保持している。用語“実質的に精製した”を用いる場合、この表記はそのタンパク質またはペプチドが組成物の主成分を形成する、たとえば組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれ以上を構成する組成物を表わすであろう。
【００６９】
[00073]  タンパク質精製に使用するのに適した種々の手法は当業者に周知である。これらには、たとえば硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体などによる沈殿、または熱変性によるものが含まれ、続いて下記を行なう：遠心分離；クロマトグラフィー工程、たとえばイオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイトおよびアフィニティークロマトグラフィー；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにこれらと他の手法の組合わせ。当技術分野で一般に知られているように、種々の精製工程を実施する順序は変更でき、あるいはある工程を省略でき、それでもなお実質的に精製されたタンパク質またはペプチドの調製に適した方法が得られると考えられる。
【００７０】
[00074]  本開示を考慮すれば、タンパク質またはペプチドの精製度を定量するための種々の方法が当業者に分かる。これらには、たとえば有効画分の比活性を測定すること、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析により画分内のポリペプチドの量を査定することが含まれる。画分の純度を査定するための好ましい方法は、画分の比活性を計算し、それを最初の抽出物の比活性と比較し、こうして、“純度倍数”により査定したそれの純度を計算するものである。活性の量を表わすために用いる実際の単位は、もちろん、純度を追跡するために選択した特定のアッセイ法、および発現したタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存するであろう。
【００７１】
[00075]  タンパク質またはペプチドを常にそれらの最も精製された状態で提供するという一般的な要求はない。実際に、より低く実質的に精製された生成物が特定の態様において有用性をもつ可能性があるということを考慮する。部分精製は、より少ない精製工程を組み合わせて用いて、あるいは同じ一般的精製スキームの異なる形態を用いて達成できる。たとえば、ＨＰＬＣ装置を用いて実施したカチオン交換カラムクロマトグラフィーは低圧クロマトグラフィーシステムを用いる同じ手法より大きな“倍”の精製をもたらすと認識されている。より低い相対精製度を示す方法が、タンパク質生成物の総回収率において、あるいは発現したタンパク質の活性の維持において、利点をもつ可能性がある。
【００７２】
[00076]  特定の態様において、タンパク質またはペプチド、たとえば安定化したアルギナーゼマルチマー融合タンパク質、または前もしくは後ＰＥＧ化したアルギナーゼを単離または精製することができる。たとえば精製を容易にするために、Ｈｉｓタグまたはアフィニティーエピトープをそのようなアルギナーゼバリアントに含ませることができる。アフィニティークロマトグラフィーは、単離すべき物質とそれが特異的に結合できる分子との特異的アフィニティーに依存するクロマトグラフィー法である。これは受容体−リガンドタイプの相互作用である。カラム材料は結合パートナーのうちの一方を不溶性マトリックスに共有結合させることにより合成される。こうしてカラム材料はその物質を溶液から吸着できる。溶離は、条件を結合が起きないものに変化させることにより行なわれる（たとえば、ｐＨ、イオン強度、温度などの変更）。マトリックスは、それ自体が分子を有意な程度に吸着することがなくかつ広範な化学的、物理的および温度安定性をもつ物質でなければならない。リガンドは、それの結合特性に影響を及ぼさない様式でカップリングすべきである。リガンドは比較的緊密な結合を生じるべきでもある。そして、試料またはリガンドを破壊することなく物質を溶離することが可能でなければならない。
【００７３】
[00077]  サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）は、溶液中の分子をそれらのサイズ、またはより技術的な用語ではそれらの流体力学的体積に基づいて分離するクロマトグラフィー法である。それは通常は大型分子または高分子複合体、たとえばタンパク質および工業的ポリマーに適用される。一般に、移動相として有機溶媒を用いるゲル浸透クロマトグラフィーという名称に対比して、カラムを通して試料を輸送するために水溶液を用いる場合、その手法はゲル濾過クロマトグラフィーとして知られている。
【００７４】
[00078]  ＳＥＣの基礎となる原理は、異なるサイズの粒子は異なる速度で固定相から溶出する（濾過される）というものである。その結果、粒子の溶液がサイズに基づいて分離される。すべての粒子が同時またはほぼ同時に装填される限り、同じサイズの粒子は一緒に溶出するはずである。それぞれのサイズ排除カラムは分離できるある範囲の分子量をもつ。排除限界はこの範囲の上端の分子量を規定し、それは固定相にトラップされるには分子が大きすぎる分子量である。浸透限界は分離範囲の下端の分子量を規定し、それは十分に小さなサイズの分子が固定相のポア内へ完全に浸透でき、かつこの分子の嵩より小さいすべての分子は小さすぎるためそれらが単一バンドとして溶出する分子量である。
【００７５】
[00079]  高速液体クロマトグラフィー（また高圧クロマトグラフィー，ＨＰＬＣ）は、生化学および分析化学において化合物を分離、同定および定量するために頻繁に用いられる形態のカラムクロマトグラフィーである。ＨＰＬＣは、クロマトグラフィー充填材（固定相）を保持するカラム、カラムを通して移動相（単数または複数）を移動させるポンプ、および分子の保持時間を示す検出器を用いる。保持時間は固定相、分析される分子、および使用する溶媒（単数または複数）間の相互作用に応じて変動する。
【００７６】
Ｖ．医薬組成物
[00080]  本発明の新規アルギナーゼは、腫瘍細胞増殖を阻害するために、最も好ましくは局所進行癌または転移癌を伴なう癌患者において癌細胞を死滅させるために、全身または局所に投与できることを考慮する。それらは静脈内、クモ膜下、および／または腹腔内に投与することができる。それらは単独で、または抗増殖薬との組合わせで投与することができる。一態様において、それらは外科処置または他の措置の前に、患者の癌負荷を軽減するために投与される。あるいは、それらは外科処置の後に、残存する癌（たとえば、外科処置で排除できなかった癌）がある場合、生存しないことを確実にするために投与することができる。
【００７７】
[00081]  本発明は療法用製剤の特定の性質によって限定されないものとする。たとえば、そのような組成物は、生理的に許容できる液体、ゲルまたは固体キャリヤー、および賦形剤と一緒に配合物中において提供できる。これらの療法用製剤は、哺乳類に、動物医療用としてたとえば家畜に、およびヒトの臨床用として、他の療法薬と同様な方法で投与することができる。一般に、療法効果を得るために必要な投与量は、用途のタイプ、および投与の様式、ならびに個々の対象の個別の要求条件に従って異なるであろう。
【００７８】
[00082]  そのような組成物は、一般に液剤または懸濁液剤として、注射剤として、調製される。適切な希釈剤および賦形剤は、たとえば水、塩類溶液、デキストロース、グリセロールなど、およびその組合わせである。さらに、所望により組成物は少量の補助物質、たとえば湿潤剤または乳化剤、安定剤またはｐＨ緩衝剤を含有することができる。
【００７９】
[00083]  臨床適用を考慮する場合、意図する適用に適した形の医薬組成物−発現ベクター、ウイルスストック、タンパク質、抗体および薬物−を調製する必要がある。一般に、本発明の医薬組成物は、医薬的に許容できるキャリヤーに溶解または分散した有効量の１種類以上のアルギナーゼバリアントまたは追加の薬剤を含む。“医薬的または薬理学的に許容できる”という句は、必要に応じて動物、たとえばヒトに投与した際に、有害な、アレルギー性の、または他の不都合な反応を生じない分子類および組成物を表わす。本明細書に開示した方法により単離した少なくとも１種類のアルギナーゼバリアント、たとえば安定化したマルチマーアルギナーゼもしくはＰＥＧ化アルギナーゼ、または追加の有効成分を含有する医薬組成物の調製は、本開示を考慮すれば当業者に分かるであろう；たとえば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990に例示されており、これを本明細書に援用する。さらに、動物（たとえば、ヒト）への投与について、製剤はＦＤＡ生物学的基準事務局(FDA Office of Biological Standards)が要求する無菌性、発熱性、全般的安全性および純度の基準を満たすべきであることが理解されるであろう。
【００８０】
[00084]  本明細書中で用いる“医薬的に許容できるキャリヤー”には、当業者に知られているあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（たとえば、抗細菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩類、保存剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、矯味矯臭剤、色素などの物質、およびその組合わせが含まれる（参照：たとえば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, 本明細書に援用する）。一般的なキャリヤーが有効成分と不適合である場合を除いて、医薬組成物におけるそれの使用を考慮する。
【００８１】
[00085]  本発明は、それを固体、液体またはエアゾールのいずれの形態で投与する予定か、あるいは注射などの投与経路のために無菌であるべきかどうかに応じて、種々のタイプのキャリヤーを含むことができる。本発明は、当業者に知られているように、静脈内、皮内、経皮、クモ膜下、動脈内、腹腔内、鼻腔内、膣内、直腸内、局所、筋肉内、皮下、粘膜、経口、局所、局部、吸入（たとえば、エアゾール吸入）、注射、注入、連続注入により、標的細胞の直接的な局所潅流浴により、カテーテルにより、潅注により、脂質組成物（たとえば、リポソーム）中において、もしくは他の方法、または以上のいずれの組合わせにより投与することができる（参照：たとえば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, 本明細書に援用する）。
【００８２】
[00086]  アルギナーゼバリアントは遊離塩基、中性または塩の形態で配合して組成物にすることができる。医薬的に許容できる塩類には、たとえば、タンパク質組成物の遊離アミノ基と形成されるもの、すなわち無機酸、たとえば塩酸もしくはリン酸、または有機酸、たとえば酢酸、シュウ酸、酒石酸もしくはマンデル酸と形成されるものが含まれる。遊離カルボキシル基と形成される塩類を、無機塩基、たとえばナトリウム、カリウム、アンモニウムもしくは第二鉄の水酸化物；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。配合されると、液剤はその投与配合物と適合する様式において療法有効な量で投与されるであろう。配合物は多様な剤形で容易に投与される：たとえば、非経口投与用にたとえば注射液としてまたは肺への送達用にエアゾールとして配合したもの、あるいは消化管投与用に薬物放出カプセル剤として配合したものなど。
【００８３】
[00087]  さらに、本発明によれば投与に適した本発明組成物は、不活性希釈剤を含むかまたは含まない医薬的に許容できるキャリヤー中において提供される。キャリヤーは吸収性でなければならず、液体、半固体、すなわちペースト、または固体キャリヤーを含む。いずれか一般的な媒体、作用剤、希釈剤またはキャリヤーがレシピエントに対して、またはそれに含有される組成物の療法有効性に対して有害である場合を除いて、本発明方法を実施する際に使用するための投与可能な組成物中におけるそれの使用は適切である。キャリヤーまたは希釈剤の例には、脂肪、油、水、塩類溶液、脂質、リポソーム、樹脂、結合剤、増量剤など、またはその組合わせが含まれる。組成物は１以上の成分の酸化を遅らせるための種々の抗酸化剤を含むこともできる。さらに、微生物の作用の阻止は保存剤、たとえば種々の抗細菌剤および抗真菌剤によりもたらすことができ、それにはパラベン類（たとえば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、またはその組合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
[00088]  本発明によれば、いずれか好都合かつ実用的な様式で、すなわち溶解、懸濁、乳化、混合、カプセル封入、吸収などにより、組成物をキャリヤーと混和する。そのような操作は当業者にとってルーティンである。
【００８５】
[00089]  本発明の特定の態様において、組成物を半固体または固体キャリヤーと十分に混和または混合する。混合はいずれか好都合な様式で、たとえば摩砕により実施できる。療法活性の喪失、すなわち胃における変性から組成物を保護するために、混合過程で安定剤を添加することもできる。組成物に使用するための安定剤の例には、緩衝剤、アミノ酸、たとえばグリシンおよびリジン、炭水化物、たとえばデキストロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース、ソルビトール、マンニトールなどが含まれる。
【００８６】
[00090]  さらなる態様において、本発明はアルギナーゼバリアント、１種類以上の脂質、および水性溶媒を含有する医薬用脂質ビヒクル組成物の使用に関する。本明細書中で用いる用語“脂質”は、特徴的に水に不溶性であり、有機溶媒で抽出できる、広範な物質のいずれかを含むと定義されるであろう。この広範なクラスの化合物は当業者に周知であり、本明細書中で用語“脂質”が用いられる際、それはいずれか特定の構造に限定されない。例には、長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体を含む化合物が含まれる。脂質は天然物または合成品（すなわち、ヒトがデザインまたは製造したもの）であってよい。しかし、脂質は通常は生体物質である。生体脂質は当技術分野で周知であり、それにはたとえば中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質(lysolipid)、スフィンゴ糖脂質(glycosphingolipid)、糖脂質、スルファチド、エーテル結合およびエステル結合した脂肪酸を含む脂質、ならびに重合性脂質、ならびにその組合わせが含まれる。もちろん、本明細書に具体的に記載したもの以外の化合物であって当業者が脂質として理解しているものも、本発明の組成物および方法に含まれる。
【００８７】
[00091]  当業者は組成物を脂質ビヒクルに分散させるために使用できる広範な手法を熟知しているであろう。たとえば、安定化したマルチマー型またはＰＥＧ化アルギナーゼは、当業者に知られているいずれかの手段で、脂質を含有する溶液に分散させ、 脂質に溶解し、脂質で乳化し、脂質と混合し、脂質と組み合わせ、脂質に共有結合させ、脂質に懸濁液として含有させ、ミセルまたはリポソームに収容し、またはそれらと複合体形成させ、あるいは他の形で脂質または脂質構造体と会合させることができる。分散によってリポソームの形成が生じる場合または生じない場合がある。
【００８８】
[00092]  動物患者に投与する本発明組成物の実際の用量は、身体的および生理的要因、たとえば体重、状態の重症度、処置する疾患のタイプ、以前のまたは並行している療法介入、患者の特発症、および投与経路によって決定できる。投与量および投与経路に応じて、好ましい投与量および／または有効量の投与回数は対象の応答に従って異なる可能性がある。いずれにしろ、投与に関与する専門家が個々の対象について組成物中の有効成分（単数または複数）の濃度および適切な用量（単数または複数）を決定するであろう。
【００８９】
[00093]  特定の態様において、医薬組成物は、たとえば少なくとも約０．１％の有効化合物を含むことができる。他の態様において、有効化合物はたとえばその単位の重量の約２％〜約７５％、または約２５％〜約６０％、およびその中で推論できるいずれかの範囲を構成することができる。当然、それぞれの療法有用組成物中の有効化合物（単数または複数）の量は、その化合物のいずれか特定の単位量中に適切な投与量が得られるように調製できる。溶解度、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品保存寿命、および他の薬理学的考慮事項などの要因を、そのような医薬配合物の技術分野における専門家が考慮するであろう；したがって多様な投与量および治療計画が望ましい可能性がある。
【００９０】
[00094]  限定ではない他の例において、用量は投与当たり約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重まで、またはそれ以上、およびその中で導き出せるいずれかの範囲を含むこともできる。本明細書中に挙げる数値から導き出せる、限定ではない例において、上記の数値に基づいて約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲を投与することができる。
【００９１】
ＶＩＩ．定義
[00095]  用語“ａａ”はアミノ酸（単数または複数）を表わす。アミノ酸置換は、分子中のアミノ酸位置、たとえば３０３により、１文字コードを用いて示される（数字の前の文字は置き換えられるアミノ酸を示し、一方、数字の後の文字は導入されるアミノ酸を示す）。
【００９２】
[00096]  本明細書中で用いる用語“一部(portion)”は、タンパク質に関する場合（“特定のタンパク質の一部”におけるように）、そのタンパク質のフラグメントを表わす。そのフラグメントは、４アミノ酸残基からアミノ酸配列全体マイナス１アミノ酸までの範囲のサイズであってもよい。
【００９３】
[00097]  本明細書中で用いる用語“タンパク質”および“ポリペプチド”は、ペプチド結合により連結したアミノ酸を含む化合物を表わし、互換性をもって用いられる。
[00098]  本明細書中で用いる用語“融合タンパク質”は、外因性タンパク質フラグメント（非アルギナーゼタンパク質からなる融合パートナー）に結合した（すなわち作動可能な状態で連結した）目的タンパク質（すなわち、ヒト  アルギナーゼまたはそのバリアント）を含むキメラタンパク質を表わす。融合パートナーは血清半減期、溶解度、または両方を増大させる可能性がある。それは、宿主細胞もしくは培養上清または両方からの組換え融合タンパク質の精製を可能にするために、アフィニティータグ（たとえば、ｈｉｓ−タグ）をも備えていてもよい。
【００９４】
[00099]  用語“作動可能な(operable)組合わせで”、“作動可能な順序で”、および“作動可能な状態で(operably)連結した”は、特定の遺伝子の転写および／または目的タンパク質分子の合成を指令できる核酸分子が生成する様式での核酸配列の連結を表わす。この用語は、機能性タンパク質が生成する様式でのアミノ酸配列の連結をも表わす。
【００９５】
[000100]  本明細書中で用いる用語“Ｋｍ”は、ある酵素についてのミカエリス−メンテン定数(Michaelis-Menten constant)を表わし、特定の酵素が酵素触媒反応においてそれの最大速度の半分を生じる特異的基質の濃度と定義される。
【００９６】
[000101]  本明細書中で用いる用語ｋｃａｔは、ターンオーバー数、すなわち酵素が最大効率で作動する際にそれぞれの酵素部位が単位時間当たり生成物に変換する基質分子の数を表わす。
【００９７】
[000102]  本明細書中で用いる用語Ｋｃａｔ／Ｋｍは、酵素がいかに効率的に基質を生成物に変換するかの尺度である特異性定数である。
[000103]  用語“Ｍｎ−ｈＡｒｇＩ”は、Ｍｎ（ＩＩ）補因子をもつヒト  アルギナーゼＩを表わす。用語“Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ”は、Ｃｏ（ＩＩ）補因子をもつヒト  アルギナーゼＩ（変異体または天然物）を表わす。用語“ＩＣ５０”は半数（５０％）阻害濃度（ＩＣ）であり、したがって有効性の尺度である。
【００９８】
[000104]  用語“ＰＥＧ化された(pegylated)”は、それの高度の生体適合性および修飾の容易さのため薬物キャリヤーとして広く用いられているポリエチレングリコール （ＰＥＧ）とのコンジュゲーションを表わす(Harris et al., 2001)。種々の薬物、タンパク質およびリポソームへの結合は、滞留時間を改善しかつ毒性を低減することが示された(Greenwald et al., 2000; Zalipsky et al., 1997)。有効薬剤にＰＥＧをその鎖端のヒドロキシル基により、および他の化学的方法で、カップリング（たとえば、共有結合）させることができる；しかし、ＰＥＧ自体は最大で分子当たり２つの有効薬剤に限られる。種々のアプローチにおいて、ＰＥＧとアミノ酸のコポリマーが新規な生体材料として開発され、それらはＰＥＧの生体適合性を保持するが、分子当たり多数の結合点（より大きな薬物装填量）という利点が追加され、かつそれらは多様な適用に適合するように合成デザインできる(Nathan et al., 1992; Nathan et al., 1993)。
【００９９】
[000105]  用語“遺伝子”は、ポリペプチドまたはその前駆体の製造に必要な制御配列およびコード配列を含むＤＮＡ配列を表わす。ポリペプチドは、完全長コード配列により、または希望する酵素活性が保持される限りコード配列のいずれか一部によりコードすることができる。
【０１００】
[000106]  用語“対象”は、ヒトを含めた動物を表わす。
[000107]  用語“野生型”は、自然界に存在する供給源から単離された際の遺伝子または遺伝子生成物の特徴をもつ遺伝子または遺伝子生成物を表わす。野生型遺伝子は集団に最も頻繁に見られるものであり、よって恣意的に“ノーマル”または“野生型”形態の遺伝子と表記される。これに対し、用語“修飾された”または“バリアント”または“変異体”は、野生型の遺伝子または遺伝子生成物と比較した場合に配列および／または機能特性に修飾（すなわち、変異した特性）を示す遺伝子または遺伝子生成物を表わす。自然界に存在する変異体を単離できることを明記する；これらは、野生型遺伝子または遺伝子生成物と比較した場合にそれらが変異した特性をもつという事実によって同定される。
【０１０１】
ＶＩＩＩ．キット
[000108]  本発明は、キット、たとえば療法用キットを提供する。たとえば、キットは本明細書に記載する１以上の医薬組成物、および場合によりそれらの使用のための指示を含むことができる。キットは、そのような組成物の投与を達成するための１以上のデバイスをも含むことができる。たとえば、対象キットは、医薬組成物、および癌性腫瘍内への組成物の直接静脈内注射を達成するためのカテーテルを含むことができる。他の態様において、対象キットは、送達デバイスで使用するために場合により医薬として配合した、または凍結乾燥した、安定化されたマルチマー型アルギナーゼまたは単離されたＰＥＧ化アルギナーゼのプレフィルドアンプルを含むことができる。
【０１０２】
[000109]  キットは、ラベル付きの容器を含むことができる。適切な容器には、たとえばボトル、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、多様な材料、たとえばガラスまたはプラスチックから作成できる。容器は、たとえば前記のように療法および非療法適用に有効な抗体を含有する組成物を収容することができる。容器上のラベルは、その組成物を特定の療法または非療法適用に使用することを指示でき、インビボまたはインビトロのいずれかの使用、たとえば前記に述べたもののための用法を指示することもできる。本発明のキットは一般に、前記の容器、ならびに商業および利用者の立場から望ましい物質（緩衝液、希釈剤、増量剤、注射針、注射器、および使用のための指示を備えたパッケージインサートを含む）を含む１以上の他の容器を含むであろう。
【実施例】
【０１０３】
ＩＸ．実施例
[000110]  以下の実施例は本発明の特定の好ましい態様および側面を説明するためのものであり、その範囲を限定するものと解釈すべきではない。以下の実験の開示において、下記の略号を適用する：ｅｑ（当量）；Ｍ（モル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）；Ｎ（規定）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；ＥＣ（摂氏温度）；ＭＷ（分子量）；ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）；ｍｉｎ（分）。
【０１０４】
実施例１
アルギナーゼＩにおける金属の取込みおよび含量測定
[000111]  Ｍｎ２＋およびＣｏ２＋の取込みは、アルギナーゼの精製、続いて１０ｍＭの金属と共に５０℃で１０分間のインキュベーション工程により達成できる。アルギナーゼ調製物の最終的な金属含量およびアイデンティティーを決定するために、タンパク質試料Ｍｎ−ｈＡｒｇＩ（１４５μＭ）、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ（１８２μＭ）、および関連の透析用緩衝液（１００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．４）を２％硝酸中に希釈し、誘導結合プラズマ質量分析(inductively coupled plasma mass spectrometry)（ＩＣＰ−ＭＳ，Department of Geological Sciences, University of Texas at Austin)により分析して、透析緩衝液中にみられた金属の濃度を最終タンパク質試料の金属濃度から差し引き、タンパク質濃度で割ることにより、タンパク質のコバルト、鉄、マンガンおよび亜鉛含量を定量した。タンパク質濃度を決定するために、アミノ酸配列に基づいてｈＡｒｇＩについての吸光係数を計算した (Gill and von Hippel, 1989)。アルギナーゼＩについてのすべてのタンパク質濃度を、最終緩衝液濃度６Ｍ塩酸グアニジニウム、２０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ６．５における計算値ε２８０＝２４，１８０Ｍ−１ｃｍ−１に基づいて計算した。比較のために、ＢＳＡを基準として用いるＢＣＡアッセイにおいてもアルギナーゼ濃度を計算した。この方法を用いて、Ｃｏ２＋と共にインキュベートしたアルギナーゼ試料が２．１±０．５当量のＣｏおよび０．４±０．１当量のＦｅを含有し、検出可能な量のＺｎまたはＭｎを含まないことが認められた。Ｍｎ２＋と共にインキュベートした試料は１．５±０．２当量のＭｎおよび０．４±０．１当量のＦｅを含有し、検出可能な量のＺｎまたはＣｏを含まない。よって、加熱インキュベーションはコバルトの取込みのために有効な方法である。
【０１０５】
[000112]  コバルト装填の追加試験によって、より高い割合のコバルト装填を達成でき、より高い比活性が得られることが立証された。これらの試験の結果を次表および図３に示す。
【０１０６】
【表２】
2019529526.tif 000004
【０１０７】
[000113]  星印のデータを図３に示す。
実施例２
肝細胞癌細胞および転移性メラノーマに対するＣｏ−Ａｒｇおよびそれのバリアントの細胞傷害性
[000114]  工学操作したアルギナーゼのインビトロ細胞傷害性を試験するために、種々の濃度（０〜１００ｎＭ）のＭｎ−ＡｒｇＩ、Ｃｏ−ＡｒｇＩ、またはＣｏ−ｈＡｒｇＩバリアントを、ＨＣＣ（Ｈｅｐ  ３ｂ）細胞またはメラノーマ（Ａ３７５）細胞(American Type Culture Collection)と共に、９６ウェルプレートにおいて５００細胞／ウェルの播種密度で、ウシ胎仔血清を補足したＤＭＥＭ培地中においてインキュベートした。３７℃で２４時間のインキュベーションの後、細胞を種々の濃度のアルギナーゼ含有培地で三重に処理した。対照溶液は培地中の緩衝塩類溶液であった。処理した細胞を３７℃および５％  ＣＯ２に維持した。１、３、５および７日目に、１００μＬ／ウェルのＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、毎時１〜２回、穏やかに撹拌しながら４時間インキュベートすることによる標準ＭＴＴアッセイ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によって細胞を試験した。これに続いて、溶液を吸引し、次いで２００μＬのＤＭＳＯを各ウェルに添加した。自動プレートリーダーを用いて各ウェルについての５７０ｎｍにおける吸光度を判定して、対照と比較した生存細胞の相対数を決定した。得られたデータを指数方程式に当てはめて、アルギナーゼ細胞傷害性についての見掛けＩＣ５０値を決定した。５日目からのＩＣ５０値を計算して、Ｍｎ−ｈＡｒｇＩについて５±０．３ｎＭ（約０．１８μｇ／ｍｌ）の値、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩについて０．３３±０．０２ｎＭ（約０．０１２μｇ／ｍｌ）の値のＩＣ５０値を得た。よって、ＨＣＣに対してＣｏ−ＡｒｇＩ酵素はＭｎ置換酵素より１５倍大きな細胞傷害性であると思われる。転移性メラノーマ細胞株（Ａ３７５）に対しては、Ｍｎ−ｈＡｒｇＩは４．１±０．１ｎＭ（約０．１５μｇ／ｍｌ）の見掛けＩＣ５０を生じた。Ｃｏ−ｈＡｒｇＩとのインキュベーションは、０．３２±０．０６ｎＭ（約０．０１２μｇ／ｍｌ）の見掛けＩＣ５０を伴なう１３倍の細胞傷害性増大をもたらす。
【０１０８】
実施例３
インビボ半減期を延長するためのＦｃ−アルギナーゼ融合タンパク質の工学操作
[000115]  療法用ポリペプチド、たとえばＴＮＦ−α阻害薬エタネルセプト(etanercept)（Ｅｎｂｒｉｌ（商標））のインビボ半減期を延長するために、ＩｇＧ  Ｆｃドメインへの融合が広く用いられている。Ｆｃドメインは、血管内皮および多数の他の組織に発現しているＦｃγＲｎ受容体に結合する(Roopenian and Akilesh, 2007)。ＩｇＧ  Ｆｃドメインに対するＦｃγＲｎのアフィニティーはｐＨ依存性が強い。結合はエンドソームコンパートメントの酸性ｐＨで起きて、タンパク質を細胞表面へ再循環させ、こうしてタンパク質分解を回避することができる。生理的ｐＨでは結合アフィニティーがきわめて低いので、細胞表面でＦｃドメインがＦｃγＲｎから離脱する。ＦｃγＲｎを介したエンドソーム再循環は、免疫グロブリンの血清半減期を少なくとも４〜７倍、ヒトにおいて約７〜１４日に延長すると推定される。Ｆｃ融合体はこの特性を利用して半減期の短い分子に長い半減期を付与する。しかし、ヒト  アルギナーゼはホモトリマーであり、したがってそれ自体がダイマーであるＩｇＧ  Ｆｃに融合すれば得られるＦｃ−アルギナーゼポリペプチドは高分子量凝集体を形成する可能性があるであろう。
【０１０９】
[000116]  この問題は、トリマー化が崩壊してモノマー型で安定である変異形のアルギナーゼを採用することにより回避された。トリマー化およびアルギナーゼＩのサブユニット境界面がある程度詳細に研究された(Lavulo et al., 2001)。Ｇｌｕ２５６Ｇｌｎの単一アミノ酸置換はトリマー化を崩壊させ、モノマー型アルギナーゼＩ酵素が形成されることが示された(Sabio et al., 2001)。このバリアントの発現および精製の後、定常状態動態解析によって、１，３２０ｓ−１ｍＭ−１のｋｃａｔ／ＫＭをもつＣｏ−ｈＡｒｇＩと比較してほとんど同一の活性であることが明らかになった。
【０１１０】
[000117]  この構築体を次いでＦｃ発現ベクターにクローニングした。Ｆｃ発現ベクターは、ｐＴＲＣ９９ａプラスミド（Ａｍｅｒｓｈａｍ）をベースとし、ＤｓｂＡリーダー配列に続いてＩｇＧ  Ｆｃコーディング領域、ＥｃｏＲＩ制限部位および終止コドンを含む構築体である。ベクターと遺伝子の両方をＥｃｏＲＩで消化することによりモノマーアルギナーゼ遺伝子をＦｃコーディング領域の後にインフレーム配置し、その後、ライゲートし、シーケンシングおよび発現のために大腸菌（ＢＬ２１）内へ形質転換した。ＩｇＧ  Ｆｃは普通はグリコシル化されているタンパク質であるので、組換えＩｇＧまたはＦｃ融合体の発現はこれまで、細菌と異なりＮ−連結グリコシル化を行なうことができる組換え哺乳動物細胞において行なわれていた。しかし、Ａｓｎ２９７におけるグリコシル化は活性化作用をもつ阻害性Ｆｃγ受容体（ヒトにおいてはＦｃγＲＩ〜ＩＩＩ）への結合のためには必須であるが、それはアフィニティーまたはＦｃγＲｎへのｐＨ依存性結合に対しては顕著な効果をもたない(Tao and Morrison, 1989; Simmons et al., 2002)。よって、細菌において発現したアグリコシル化(aglycosylated)ＩｇＧ抗体は、霊長類において、哺乳動物細胞において発現した完全グリコシル化抗体とほとんど区別できない血清残存率を示す(Simmons et al., 2002)。これまでの有力な考えと対照的に、ＩｇＧ抗体およびＦｃタンパク質を大腸菌においてｇ／Ｌに及ぶレベルで発酵槽内で効率的に発現させることができる。大腸菌発現は技術的にはるかに簡単かつ迅速である。さらに、得られるタンパク質はアグリコシル化型であるので、それは療法用糖タンパク質の発現において重要な問題であるグリカン不均質性を示さない(Jefferis, 2007)。融合タンパク質をプロテインＡクロマトグラフィーによって精製し、ダイマー化できなかったポリペプチドに対比した適正にフォールディングしたダイマー型Ｆｃ−アルギナーゼ融合体の収率をＦＰＬＣゲルクロマトグラフィーにより定量する。この製法によって、インビボ試験に適したきわめて安定な形態のヒト  アルギナーゼが得られた。
【０１１１】
実施例４
アルギナーゼのＰＥＧ化
[000118]  アルギナーゼを精製し、次いでＣｏＣｌ２で１０ｍＭにし、５０℃に１０分間加熱した。遠心して沈殿を分離した後、１００，０００  ＭＷＣＯ濾過デバイス（Ａｍｉｃｏｎ）を用いてＰＥＧ−５０００アルギナーゼを十分に緩衝液交換し（１０％グリセロールを含むＰＢＳ）、０．２ミクロンのシリンジフィルター（ＶＷＲ）で滅菌した。カブトガニ血球抽出物(Limulus Amebocyte Lysate)（ＬＡＬ）キット（Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いてすべてのＰＥＧ化酵素をリポ多糖（ＬＰＳ）含量について分析した。
【０１１２】
[000119]  ＰＥＧ化Ｃｏ−ｈＡｒｇＩは野生型とほとんど同一の血清安定性をもつことが認められ、１６９０±２９０ｓ−１ｍＭ−１のｋｃａｔ／ＫＭ値を示した。
実施例５
マウスモデルにおける血清Ｌ−Ａｒｇ枯渇
[000120]  Ｂａｌｂ／ｃマウスを、５００μｇの薬理学的に調製したＰＥＧ化Ｃｏ−ｈＡｒｇＩまたは等体積のＰＢＳを単回ＩＰ注射することにより処理した。０、４８、７２、および９６時間目の時点で採血のために心臓静脈穿刺することによりマウスをと殺した。血液試料を直ちに４００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ４と５０：５０（ｖ／ｖ）混合して、３０分間凝血させ、血清分離のために遠心した。得られた血清を次いで大型タンパク質および沈殿の除去のために１０，０００  ＭＷＣＯデバイス（Ａｍｉｃｏｎ）で濾過し、フロースルーを分析用に採集した。Ｌ−アルギニン標準品、対照マウス血清、および実験試料をＯＰＡ（Ａｇｉｌｅｎｔ）で誘導体化し、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）（５μｍ，４．６×１５０ｍｍ）で分離した；本質的にはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの記載（Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ：５９８０−３０８８）に従い、ただし、より良好なピーク分離を得るために流速を１／２低減しかつ取得時間を２倍にすることによって、分離プロトコルをわずかに改変した。血清Ｌ−Ａｒｇレベルを定量するために、Ｌ−Ａｒｇピーク面積を濃度に対してプロットすることによりＬ−アルギニン標準曲線を作成した。単回量の薬理学的に調製したＣｏ−ｈＡｒｇＩは、Ｌ−Ａｒｇを３日間にわたって検出限界以下に維持するために十分であった（図１）。
【０１１３】
実施例６
Ｃｏ−ｈＡｒｇＩを用いるＨＣＣ腫瘍異種移植処理
[000121]  ７５％集密組織培養物から採集した約１０６個のＨＣＣ細胞をヌードマウス側腹部に皮下注射した。ＨＣＣ異種移植腫瘍が約０．５ｃｍ３の直径にまで増殖した後（９日目）、マウスを２グループに配属した。実験グループには９日目および１２日目に５００μｇの薬理学的に最適化したＣｏ−ｈＡｒｇＩのＩＰ注射を施した。対照グループには９日目および１２日目にＰＢＳのＩＰ注射を施した。図２にみられるように、ＰＢＳ処理した腫瘍は１５日目までにサイズが３倍に拡大した。明らかに対照的に、Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ処理した腫瘍は１５日目までにサイズが縮小した。Ｍｎ−ｈＡｒｇＩ処理した腫瘍は増殖速度の遅滞を示したにすぎない(Cheng et al., 2007)。Ｃｏ−ｈＡｒｇＩはＨＣＣに対してインビトロおよびインビボの両方において有効性の高い化学療法薬であると思われる。
【０１１４】
実施例７
腫瘍微小環境におけるＣｏ−ｈＡｒｇＩおよび抗−ＰＤ−Ｌ１  ＡｂによるＬ−アルギニンバランスの攪乱
[000122]  ヒトアルギナーゼＩ（ｈＡｒｇＩ）はＭｎ２＋−依存性酵素であり、血清中では低い活性および非安定性を示す。骨髄由来免疫抑制細胞(Myeloid-derived suppressor cell)（ＭＤＳＣ）はｈＡｒｇＩおよび一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）を発現し、それらはＬ−アルギニンの利用能を制御し、それによりＴ細胞の機能を調節する。ＭＤＳＣによるＬ−アルギニン枯渇はＴ細胞の抗腫瘍機能障害および腫瘍の宿主免疫回避と関連づけられている。末梢血単核細胞、骨髄単核細胞およびＣＤ３４＋細胞におけるＬ−アルギニン生合成経路の酵素の発現を分析して、これらの細胞のＯＴＣおよびＡＳＳ発現が低レベルであることが明らかになった；これは、これらの細胞が生理的機能のために外因性／細胞外Ｌ−アルギニンに依存することを示唆する。この所見に基づいて、Ｌ−アルギニンの長期枯渇はＭＤＳＣ集団に負の作用を及ぼし、したがって腫瘍増殖の免疫調節を増強すると考えられる。Ｍｎ２＋天然補因子をＣｏ２＋で置き換えることにより開発した工学操作したｈＡｒｇＩ（ＡＥＢ１１０２）を用いてこの仮説を試験し、その結果、内因性ｈＡｒｇＩと比較して改善された触媒活性および血清安定性が得られた。工学操作した酵素を前記に従って同様にＰＥＧ化する。ＰＥＧ化Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ仲介による長期間の広範なＬ−アルギニン枯渇の効果を、インビボで単独投与ならびに抗−ＰＤ−Ｌ１および抗−ＰＤ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と組合わせ投与したネズミＣＴ２６結腸癌モデルにおいて試験した。
【０１１５】
[000123]  雌Ｅｎｖｉｇｏ  Ｂａｌｂ／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＨｓｄ）をこれらの試験に用いた。それらは試験の１日目に６〜７週齢であった。被験動物に０日目に５．０Ｅ＋０５  ＣＴ２６．ＷＴ細胞を皮下移植した。すべてのマウスを被験グループに配属し、下記に従って処理を開始した：
ＡＥＢ−００１−１０３７
−  グループ１：ビヒクル（ＰＢＳ）  ＩＰ，Ｑ７Ｄ×４；プラス  アイソタイプ対照，１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ，（Ｑ３Ｄ×２；３オフ）×４
−  グループ２：ＡＥＢ１１０２，（３ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ，Ｑ７Ｄ×４）
−  グループ３：抗−ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ，１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ，（Ｑ３Ｄ×２；３オフ）×４
−  グループ４：ＡＥＢ１１０２，３ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ，Ｑ７Ｄ×４；プラス  抗−ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ，１０ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ，（Ｑ３Ｄ×２；３オフ）×４。
【０１１６】
[000124]  ＡＥＢ１１０２を週１回で４回投与した（３、１０、１７、２４日目）。
[000125]  抗−ＰＤ−Ｌ１を、各週１日オン２日オフ、１日オン３日オフで、８回投与した（３、６、１０、１３、１７、２０、２４、２７日目）。
【０１１７】
[000126]  すべての動物を臨床徴候について少なくとも１日１回観察した。個々の体重および腫瘍体積を週３回記録した。腫瘍サイズが２０００ｍｍ３の数値に達した時点で個々のマウスを終結させた。
【０１１８】
[000127]  ＡＥＢ１１０２（ＰＥＧ化Ｃｏ−ｈＡｒｇＩ）によるＣＴ２６マウスのインビボ処理により、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１を標的とする標準免疫調節抗体に匹敵する療法効果が得られた。重要なことに、ＡＥＢ１１０２と抗−ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂとの併用療法により、ＡＥＢ１１０２単独および免疫療法単独と比較して明らかに相乗的または少なくとも相加的な抗腫瘍効果が得られた。
【０１１９】
[000128]  この試験からのデータを図４にグラフで示す。それらのデータは、抗−免疫チェックポイントタンパク質受容体（抗−ＰＤ−１）およびリガンド（抗−ＰＤ−Ｌ１）と組み合わせたＰＥＧ化Ｃｏ−ｈＡｒｇＩによる処理の効果を反映している。この図において、上の曲線はアイソタイプ対照抗体であり、第２曲線は抗−ＰＤ−Ｌ１抗体であり、第３曲線はＰＥＧ化Ｃｏ−ｈＡｒｇＩであり、最下の曲線はＰＥＧ化Ｃｏ−ｈＡｒｇＩと抗−ＰＤ−Ｌ１抗体の併用処理である。それらのデータにみられるように、２種類の薬剤の組合わせは腫瘍増殖の阻害に対して相加効果より大きな効果をもつ。
【０１２０】
[000129]  リンパ球Ｔ細胞活性化の効果も、3日目に採取した試料において測定した。４グループにおいてＣＤ４５＋を発現した生細胞総数のパーセント、およびＣＤ８＋でもあるＣＤ４５＋細胞のパーセントを表３に示す。これらのデータを図６および７にグラフの形でも示す。
【０１２１】
【表３】
2019529526.tif 000005
【０１２２】
[000130]  まとめると、これらの結果は、腫瘍微小環境におけるＬ−アルギニンの生理的バランスの攪乱が腫瘍を阻害し、さらに腫瘍を免疫療法に対して感受性にすることを立証する。
【０１２３】
実施例８
ＡｒｇＩおよびＯＸ４０による結腸癌処理の処理効果
[000131]  ＭＣ３８結腸癌細胞の懸濁液を雌Ｃ５７ＢＬ／マウスの側腹部に注射した。腫瘍体積が７５〜１００ｍｍ３に達した０日目の時点で、マウスをランダムにグループ分けした。カリパスを用いて腫瘍体積を週２回測定した。処理を０日目に開始した。
【０１２４】
[000132]  第１グループに１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照を２週に１回、６週間注射し、第２グループに３ｍｇ／ｋｇのｃｏ−アルギナーゼＩを週１回、６週間注射し、第３グループに１０ｍｇ／ｋｇの抗−ＯＸ４０ａｂを週１回、６週間注射し、第４グループに３ｍｇ／ｋｇのｃｏ−ＡｒｇＩおよび１０ｍｇ／ｋｇの抗ＯＸ４０ａｂを週１回、６週間注射した。この試験からのデータを図５に示す。ｃｏ−ＡｒｇＩは最適以下で投与されたと思われるが、ＡｒｇＩとａＯＸ４０の組合わせは腫瘍体積の縮小または腫瘍阻害に対して相加効果より大きな効果をもつ傾向がみられる。
【０１２５】
[000133]  本明細書および特許請求の範囲に開示した組成物および方法はすべて、本開示を考慮して過度の実験なしに調製および実施できる。本発明の組成物および方法を好ましい態様によって記載したが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、これらの組成物および方法、ならびに本明細書に記載した方法の工程または工程の順序に変更を適用できることは当業者に明らかであろう。より具体的には化学的および生理的に関連する特定の薬剤に置き換えて同じまたは類似の結果を達成できるのは明らかであろう。そのような類似の置き換えおよび改変はすべて当業者に明らかであり、特許請求の範囲に規定する本発明の精神、範囲および概念に含まれるものとする。
【０１２６】
参考文献
以下の参考文献を、それらが本明細書に述べるものを補足する代表的な操作その他の詳細を提供する範囲内で本明細書に援用する。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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