(57)【要約】  水素結合ネットワークを特定して、選別するための方法および装置を提供する。コンピューティングデバイスは、１または複数の分子に関連する水素結合ネットワークの探索空間を決定し、探索空間は、水素結合ネットワークに関連する複数の残基に関連している複数のエネルギー項を含むことができる。これらの複数のエネルギー項に基づいて、コンピューティングデバイスは探索空間を探索して１または複数の水素結合ネットワークを特定することができる。特定された水素結合ネットワークのスコアに基づいて、コンピューティングデバイスは、特定された１または複数の水素結合ネットワークを選別し、１または複数の選別された水素結合ネットワークを特定する。１または複数の選別された水素結合ネットワークに関連する出力を生成することができる。また、モジュラー水素結合ネットワーク介在特異性を有するホモオリゴマーを形成することができるポリペプチドを提供する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンピューティングデバイスを使用して、１または複数の分子に関連する水素結合ネットワークについて探索空間を決定することであって、前記探索空間が前記水素結合ネットワークに関連する複数の残基に関連する複数のエネルギー項を含む、探索空間を決定すること、
前記コンピューティングデバイスを使用して、前記複数のエネルギー項に基づいて１または複数の水素結合ネットワークを特定するために前記探索空間を探索すること、
前記コンピューティングデバイスを使用して、前記１または複数の特定された水素結合ネットワークのスコアに基づいて、前記１または複数の特定された水素結合ネットワークを選別して、１または複数の選別された水素結合ネットワークを特定すること；および
前記１または複数の選別された水素結合ネットワークに関連する出力を生成することを含む方法。
【請求項２】
前記探索空間が１または複数のエッジによって接続された複数のノードを有するグラフとして構成され、前記複数のノードのうちの１ノードが前記複数の残基の特定の残基に基づいており、前記特定の残基が残基位置を有し、および前記１または複数のエッジのうちの１エッジが第１のノードと、前記第１のノードと第２のノードと間の可能な相互作用に基づいて、複数のノードのうちの第２のノードとを接続する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のノードが前記複数の残基の第１の残基に関連し、前記第２のノードが前記複数の残基の第２の残基に関連し、および第１のノードと、第２のノードとの間の可能な相互作用が前記第１の残基の回転異性体および／または前記第２の残基の回転異性体の間の可能な相互作用に関連する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第１のノードと第２のノードとの間の可能な相互作用が前記第１の残基と前記第２の残基との間の相互作用エネルギーに関連する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記探索空間を決定することが、
前記第1の残基と前記第2の残基との間の前記相互作用エネルギーが閾値相互作用エネルギー未満であるかを決定すること;および
前記第1の残基と前記第2の残基との間の前記相互作用エネルギーが前記閾値相互作用エネルギー未満であることを決定した後、前記第１のノードと、前記第２のノードと、前記第１のノードおよび前記第２のノードの間の少なくとも１つのエッジとを含む水素結合ネットワークを前記探索空間に加えることを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のノードと前記第２のノードとの間の前記少なくとも１つのエッジが前記第１の残基と前記第２の残基との間の前記相互作用エネルギーに関する情報を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の残基と前記第２の残基との間の前記相互作用エネルギーに関する前記情報が複数の相互作用エネルギー値を含み、前記複数の相互作用エネルギー値の各相互作用エネルギー値が前記第１の残基の特定の回転異性体、および前記第２の残基の特定の回転異性体と関連する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記探索空間を決定することが、
第1の分子と第2の分子との間の分子間界面での少なくとも第1の残基位置および第2の残基位置を決定することであって、前記第１の残基位置が前記第１の分子の第１の残基と関連し、前記第２の残基位置が前記第２の分子の第２の残基と関連している、残基位置を決定することと、
前記少なくとも前記第１の残基位置および前記第２の残基位置に基づいて前記探索空間を決定することとを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の分子および前記第２の分子の少なくとも１つがポリペプチド鎖を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記探索空間を探索することが前記探索空間のすべてを探索することを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記探索空間のすべてを探索することが深さ優先探索を用いて前記探索空間のすべてを探索することを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記探索空間のすべてを探索することが幅優先探索を用いて前記探索空間のすべてを探索することを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記探索空間を探索することが
１または複数の初期水素結合ネットワークを特定するために、前記探索空間の第１の探索を行うこと、および
前記１または複数の初期水素結合ネットワークの第１の水素結合ネットワークと第２の水素結合ネットワークとを少なくともマージすることによって前記１または複数の特定された水素結合ネットワークを特定することを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の水素結合ネットワークと前記第２の水素結合ネットワークとをマージすることが
前記第1の水素結合ネットワークおよび前記第２の水素結合ネットワークが同一の回転異性体を共有しているかどうかを決定することと、
前記第1の水素結合ネットワークおよび前記第２の水素結合ネットワークが同一の回転異性体を共有していることを決定した後に、前記第１の水素結合ネットワークと前記第２の水素結合ネットワークをマージすることとを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記１または複数の特定された水素結合ネットワークの特に特定された水素結合ネットワークについての特定のスコアが前記特定の水素結合ネットワークに関与するいくつかの極性原子に基づいている、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記１または複数の特定された水素結合ネットワークの特に特定された水素結合ネットワークについての特定のスコアがバックグラウンド参照構造に基づいている、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記特に特定された水素結合ネットワークについての前記特定のスコアが１または複数の側鎖−主鎖水素結合に関連するスコアに基づいており、前記１または複数の側鎖−主鎖水素結合が前記バックグラウンド参照構造に関連している、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記１または複数の特定された水素結合ネットワークの特に特定された水素結合ネットワークについての特定のスコアがエネルギー関数に基づいている、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記１または複数の選別された水素結合ネットワークに関連する前記出力を生成することが前記選別された水素結合ネットワークに基づいて１または複数の分子を設計することを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記選別された水素結合ネットワークに基づいて前記１または複数の分子を設計することが選別された水素結合ネットワークにおいて１または複数の回転異性体の１または複数の比較的小さい動きを可能にすることを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１または複数の選別された水素結合ネットワークに関連する前記出力を生成することが前記１または複数の選別された水素結合ネットワークに関連する複数の出力を生成することを含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記１または複数の選別された水素結合ネットワークに関連する前記出力を生成することが前記１または複数の選別された水素結合ネットワークに基づいている合成遺伝子を生成することと、前記合成遺伝子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで特定タンパク質を発現させることと、前記特定タンパク質を精製することとを含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記合成遺伝子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで前記特定タンパク質配列を発現させることが前記合成遺伝子を含む１または複数の大腸菌において前記特定タンパク質配列を発現させることを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
１または複数のデータプロセッサおよび
コンピュータ読み取り可能な媒体を含み、実行されると、前記コンピューティングデバイスに請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法を実行させる少なくともコンピュータ読み取り可能な命令を格納するように構成されている、コンピューティングデバイス。
【請求項２５】
前記コンピュータ読み取り可能な媒体が非一時的なコンピュータ読み取り可能な媒体を含む、請求項２４に記載のコンピューティングデバイス。
【請求項２６】
コンピューティングデバイスの１また複数のプロセッサによって実行されると、前記コンピューティングデバイスに請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法を実行させる少なくともコンピュータ読み取り可能な命令を格納するように構成されている、コンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項２７】
前記コンピュータ読み取り可能な媒体が非一時的なコンピュータ読み取り可能な媒体を含む、請求項２６に記載のンピュータ読み取り可能な媒体。
【請求項２８】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法を実行するための手段を含む装置。
【請求項２９】
式Ｉ：Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５
のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、
式中、Ｚ１は、
式２：Ｊ１−Ｊ２−Ｊ３
のアミノ酸配列を含む配列を開始するヘリックスであり、
式中、Ｊ１は、Ｓ、Ｔ、ＮおよびＤからなる群から選択され、
Ｊ２は、Ｐ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｌ、Ａからなる群から選択され、および
Ｊ３は、Ｅ、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｙからなる群から選択される、または存在せず、
Ｚ３は、
式３：［ＲＫＥＤ］−Ｌ−［ＮＱＥＤＲＫＳＴ］−［ＮＱＥＤＲＫＳＴ］−［ＮＱＥＤＲＫＳＴ］−Ｇ−［ＳＴＮＱＥＤ］−［ＳＴＮＱＥＤ］−［ＳＴＮＤ］−Ｅ−［ＥＤＲＫ］−Ｖ−［ＲＫＥＤ］（配列番号１）
のアミノ酸配列を有する配列を接続するヘリックスであり、
Ｚ５は、
式４：ｘｘ−ｘｘ−［ＲＫＥＤＳＴＮＱＹＡ］（配列番号：８０）
のアミノ酸を含む配列を終止するヘリックスであり、
Ｚ２は、一般式ＢＸ１ＢＸ２、Ｘ１ＢＢＸ２、Ｘ１ＢＸ２Ｂ、Ｘ１Ｘ２ＢＢ、ＢＸ１Ｘ２Ｂ、およびＢＢＸ１Ｘ２からなる群から選択され、
式中、Ｂはｘｘ−Ｓ−Ｌ−ｘｘ−ｘｘ−Ｑ−ｘｘであり、
Ｘ１およびＸ２は
式５：Ｏ１Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７
のアミノ酸配列を独立して有し、
式中、Ｏ１、Ｏ４、Ｏ５、およびＯ７はｘｘであり、
Ｏ２およびＯ３はＩ、Ｌ、およびＡからなる群から独立して選択され、
Ｏ６はＬであり、
Ｚ４は一般式Ｂ２Ｘ３Ｂ２Ｘ４、Ｘ３Ｂ２Ｂ２Ｘ４、Ｘ３Ｂ２Ｘ４Ｂ２、Ｘ２Ｘ２Ｂ２Ｂ２、Ｂ２Ｘ１Ｘ２Ｂ２、およびＢ２Ｂ２Ｘ１Ｘ２からなる群から選択され、
式中、Ｂ２は、ｘｘ−Ｌ−Ａ−ｘｘ−ｘｘ−Ｑ−ｘｘであり、
Ｘ３およびＸ４は、
式６：Ｏ１０Ｏ１１Ｏ１２Ｏ１３Ｏ１４Ｏ１５Ｏ１６のアミノ酸配列を独立して有し、
式中、Ｏ１０、Ｏ１３、Ｏ１４、およびＯ１６はｘｘであり、
Ｏ１１は、Ｌであり、
Ｏ１２およびＯ１５は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、およびＡからなる群から独立して選択され、
式中、ｘｘは任意のアミノ酸であり、および
（ｉ）Ｚ１がＢＸ１ＢＸ２であるとき、Ｚ２はＸ３Ｂ２Ｘ４Ｂ２であり、
（ｉｉ）Ｚ１がＸ１ＢＢＸ２であるとき、Ｚ２がＸ３Ｂ２Ｂ２Ｘ４であり、
（ｉｉｉ）Ｚ１がＸ１ＢＸ２Ｂであるとき、Ｚ２がＢ２Ｘ３Ｂ２Ｘ４であり、
（ｉｖ）Ｚ１がＸ１Ｘ２ＢＢであるとき、Ｚ２はＢ２Ｂ２Ｘ３Ｘ４であり；
（ｖ）Ｚ１がＢＸ１Ｘ２Ｂであるとき、Ｚ２はＢ２Ｘ３Ｘ４Ｂ２であり、および
（ｖｉ）Ｚ１がＢＢＸ１Ｘ２であるとき、Ｚ２はＸ３Ｘ４Ｂ２Ｂ２である、
ポリペプチド。
【請求項３０】
Ｊ３が存在する、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
Ｚ１がＴＲＴである、請求項２９または３０に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
Ｚ３がＲＬＱＲＥＧＳＳＤＥＤＶＲ（配列番号８１）である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
Ｚ５がＲＱＤである、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
ＢがＲＳＬＲＥＱＥ（配列番号８２）である、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
Ｏ１、Ｏ４、Ｏ５、およびＯ７がＥ、Ｒ、およびＫからなる群から独立して選択される、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
Ｘ１およびＸ２がＥＩＩＲＥＬＥ（配列番号８３）、ＥＬＬＲＥＬＥ（配列番号８４）、およびＥＬＡＫＲＬＫ（配列番号８５）からなる群から独立して選択される、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
Ｂ２がＫＬＡＲＥＱＫ（配列番号８６）である、請求項２９〜３６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
Ｏ１２およびＯ１５がＩ、Ｌ、Ｖ、およびＡからなる群から独立して選択される、請求項２９〜３７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
Ｘ３およびＸ４が［ＹＥ］−ＬＶＥＥＬＫ（配列番号８７）、［ＹＥ］−ＬＬＲＥＩＫ（配列番号８８）、および［ＹＥ］−ＬＶＥＥＩＥ（配列番号８９）からなる群から独立して選択される、請求項２９〜３８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
Ｘ３およびＸ４がＥＬＶＥＥＬＫ（配列番号９０）、ＥＬＬＲＥＩＫ（配列番号９１）、およびＥＬＶＥＥＩＥ（配列番号９２）からなる群から独立して選択される、請求項２９〜３９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
Ｚ２は一般式ＢＸ１ＢＸ２、Ｘ１ＢＢＸ２、Ｘ１ＢＸ２Ｂ、およびＸ１Ｘ２ＢＢからなる群から選択され、Ｚ４は一般式Ｂ２Ｘ３Ｂ２Ｘ４、Ｘ３Ｂ２Ｂ２Ｘ４、Ｘ３Ｂ２Ｘ４Ｂ２およびＸ２Ｘ２Ｂ２Ｂ２からなる群から選択される、請求項２９〜４０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
配列番号２〜５からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その完全長にわたり少なくとも７５％同一であるポリペプチドを含む、請求項２９〜４１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
配列番号２〜７９からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その完全長にわたり少なくとも７５％同一であるポリペプチド。
【請求項４４】
前記群から選択されるアミノ酸配列と、その完全長にわたり少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるポリペプチドを含む、請求項４２または４３に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
カーゴに結合された、請求項２９〜４４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記ポリペプチドのホモオリゴマーを含む、請求項２９〜４５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
請求項２９〜４６のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項４８】
プロモータ配列に機能的に結合された請求項４７に記載の前記核酸を含む発現ベクター。
【請求項４９】
請求項４８に記載の前記発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年４月１日に出願の米国仮特許出願第６２／３１７，１９０号の優先権を主張し、その全体を参照によって本明細書に組み込む。
【背景技術】
【０００２】
水素結合は、生体分子の構造、機能、および相互作用特異性において重要な役割を果たしている。水素結合相互作用の新規設計には、直面する2つの主要な課題がある。第１の課題は、配向および距離の範囲を狭めるために水素結合原子が幾何学的に制限されることであり、第２の課題は、ほぼすべての極性原子が他の高分子の極性原子、または溶媒のいずれかに関与する必要があり、そうでなければ、フォールディングまたは結合すると水を取り除くことに伴ってかなりのエネルギー的なペナルティーが存在することである。ＤＮＡ二重ヘリックスは、両方の課題を上手に解決し、塩基対は一体となり、その結果、すべての埋没した極性原子が、２つの塩基間で自己完結され、ほぼ理想的な幾何学的形状を有する水素結合になる。タンパク質において、主鎖の幾何学的形状が非常に変わりやすく、極性アミノ酸対は一般に、相互の水素結合能を完全に満たすように相互作用することはでいないので、これらの課題に対処することはより複雑である。したがって、側鎖水素結合は、通常、可変的な幾何学形状および構成を有する複数のアミノ酸のネットワークを含み、一般に単一タンパク質、または結合および触媒のための極性残基を事前構築する界面内の異なる部位に極めて異なるネットワークがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本来、ＤＮＡおよびタンパク質の構造特異性は、まったく異なってコードされ、ＤＮＡにおいて、特異性は二重ヘリックスコアのモジュラー水素結合から起こるのに対して、タンパク質では、特異性は主に不規則な周縁の極性相互作用によって補完される埋没した疎水性パッキングから起こる。中央の水素結合ネットワークのモジュラーアレイによって決定される特異性を有する広範囲のタンパク質ホモオリゴマーを設計する一般的方法を本明細書に記載する。本方法を用いて、ヘリックスの２つの同心円、例えば、これまでにみられなかった三角形、四角形、およびスーパーコイルのトポロジーを含む、二量体、三量体、および四量体を設計することができる。Ｘ線結晶構造解析によって、全体的な構造、特に水素結合ネットワークが設計モデルとほとんど同一であり、水素結合ネットワークがｉｎ  ｖｉｖｏで相互作用特異性を付与することが確認される。広範な水素結合ネットワークを原子精度で設計する能力は、タンパク質設計にとって画期的な出来事であり、広範囲の合成生物学の応用へのタンパク質相互作用特異性のプログラミングを可能にする。相互作用特異性のプログラミングを可能にする水素結合ネットワークの通常アレイを有するタンパク質オリゴマーの種類も本明細書に記載する。
【０００４】
一態様において、方法が提供される。コンピューティングデバイスは、１または複数の分子に関連する水素結合ネットワークの探索空間を決定する。探索空間には、水素結合ネットワークに関連する複数の残基に関連している複数のエネルギー項が含まれている。これらの複数のエネルギー項に基づいて、コンピューティングデバイスは探索空間を探索して１または複数の水素結合ネットワークを特定する。１または複数の特定された水素結合ネットワークのスコアに基づいて、コンピューティングデバイスは、特定された１または複数の水素結合ネットワークを選別し、１または複数の選別された水素結合ネットワークを特定する。コンピューティングデバイスは、１または複数の選別された水素結合ネットワークに関連する出力を生成する。
【０００５】
別の態様において、コンピューティングデバイスが提供される。コンピューティングデバイスには、１または複数のデータプロセッサおよびコンピュータ読み取り可能な媒体が含まれる。コンピュータ読み取り可能な媒体は、実行されると、コンピューティングデバイスに機能を実行させる少なくともコンピュータ読み取り可能な命令を格納するように構成されている。機能としては、探索空間が水素結合ネットワークに関連する複数の残基に関連している複数のエネルギー項を含む場合、１または複数の分子に関連する水素結合ネットワークについての探索空間を決定すること；探索空間を探索して、複数のエネルギー項に基づいて１または複数の水素結合ネットワークを特定すること；１または複数の特定された水素結合ネットワークのスコアに基づいて、特定された１または複数の水素結合ネットワークを選別し、１または複数の選別された水素結合ネットワークを特定すること；および１または複数の選別された水素結合ネットワークに関連する出力を生成することが含まれる。
【０００６】
別の態様において、コンピュータ読み取り可能な媒体が提供される。コンピュータ読み取り可能な媒体は、コンピューティングデバイスの１または複数のプロセッサによって実行されると、コンピューティングデバイスに機能を実行させる少なくともコンピュータ読み取り可能な命令を格納するように構成されている。機能としては、探索空間が水素結合ネットワークに関連した複数の残基に関連する複数のエネルギー項を含む場合、１または複数の分子に関連する水素結合ネットワークについての探索空間を決定すること；探索空間を探索して、複数のエネルギー項に基づいて１または複数の水素結合ネットワークを特定すること；１または複数の特定された水素結合ネットワークのスコアに基づいて、特定された１または複数の水素結合ネットワークを選別し、１または複数の選別された水素結合ネットワークを特定すること；および１または複数の選別された水素結合ネットワークに関連する出力を生成することが含まれる。
【０００７】
別の態様において、装置が提供される。装置には、探索空間が水素結合ネットワークに関連した複数の残基に関連する複数のエネルギー項を含む場合、１または複数の分子に関連する水素結合ネットワークについての探索空間を決定する手段；探索空間を探索して、複数のエネルギー項に基づいて１または複数の水素結合ネットワークを特定する手段；１または複数の特定された水素結合ネットワークのスコアに基づいて、特定された１または複数の水素結合ネットワークを選別し、１または複数の選別された水素結合ネットワークを特定する手段；および１または複数の選別された水素結合ネットワークに関連する出力を生成する手段が含まれる。
【０００８】
一態様において、本発明は、配列番号２〜７９からなる群から選択されるアミノ酸配列と、その完全長にわたり少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【０００９】
別の態様において、本発明は、
式Ｉ：Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５
のアミノ酸配列を含む、またはからなるポリペプチドを提供し、
式中、Ｚ１は、
式２：Ｊ１−Ｊ２−Ｊ３
のアミノ酸配列を含む配列を開始するヘリックスであり、
式中、Ｊ１は、Ｓ、Ｔ、ＮおよびＤからなる群から選択され、
Ｊ２は、Ｐ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｌ、Ａからなる群から選択され、および
Ｊ３は、Ｅ、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｙからなる群から選択される、または存在しない、および
Ｚ３は、
式３：［ＲＫＥＤ］−Ｌ−［ＮＱＥＤＲＫＳＴ］−［ＮＱＥＤＲＫＳＴ］−［ＮＱＥＤＲＫＳＴ］−Ｇ−［ＳＴＮＱＥＤ］−［ＳＴＮＱＥＤ］−［ＳＴＮＤ］−Ｅ−［ＥＤＲＫ］−Ｖ−［ＲＫＥＤ］（配列番号：１）
のアミノ酸配列を有する配列を結合するヘリックスであり、
Ｚ５は、
式４：ｘｘ−ｘｘ−［ＲＫＥＤＳＴＮＱＹＡ］（配列番号：８０）
のアミノ酸配列を含む配列を終止するヘリックスであり、
Ｚ２は、一般式ＢＸ１ＢＸ２、Ｘ１ＢＢＸ２、Ｘ１ＢＸ２Ｂ、Ｘ１Ｘ２ＢＢ、ＢＸ１Ｘ２Ｂ、およびＢＢＸ１Ｘ２からなる群から選択され、
式中、Ｂは、ｘｘ−Ｓ−Ｌ−ｘｘ−ｘｘ−Ｑ−ｘｘであり、
Ｘ１およびＸ２は、
式５：Ｏ１Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７
のアミノ酸配列を独立して有し、
式中、Ｏ１、Ｏ４、Ｏ５およびＯ７は、ｘｘであり、
Ｏ２およびＯ３は、Ｉ、Ｌ、およびＡからなる群から独立して選択され、ならびに
Ｏ６は、Ｌであり、
Ｚ４は、一般式：Ｂ２Ｘ３Ｂ２Ｘ４、Ｘ３Ｂ２Ｂ２Ｘ４、Ｘ３Ｂ２Ｘ４Ｂ２、Ｘ２Ｘ２Ｂ２Ｂ２、Ｂ２Ｘ１Ｘ２Ｂ２およびＢ２Ｂ２Ｘ１Ｘ２からなる群から選択され、
式中、Ｂ２は、ｘｘ−Ｌ−Ａ−ｘｘ−ｘｘ−Ｑ−ｘｘであり、ならびに
Ｘ３およびＸ４は、
式６：Ｏ１０Ｏ１１Ｏ１２Ｏ１３Ｏ１４Ｏ１５Ｏ１６
のアミノ酸配列を独立して有し、
式中、Ｏ１０、Ｏ１３、Ｏ１４およびＯ１６は、ｘｘであり、
Ｏ１１は、Ｌであり、ならびに
Ｏ１２およびＯ１５は、Ｉ、Ｌ、ＶおよびＡからなる群から独立して選択され、
ｘｘは、任意のアミノ酸であり、
（ｉ）Ｚ１がＢＸ１ＢＸ２であるとき、Ｚ２はＸ３Ｂ２Ｘ４Ｂ２であり、
（ｉｉ）Ｚ１がＸ１ＢＢＸ２であるとき、Ｚ２はＸ３Ｂ２Ｂ２Ｘ４であり、
（ｉｉｉ）Ｚ１がＸ１ＢＸ２Ｂであるとき、Ｚ２はＢ２Ｘ３Ｂ２Ｘ４であり、
（ｉｖ）Ｚ１がＸ１Ｘ２ＢＢであるとき、Ｚ２はＢ２Ｂ２Ｘ３Ｘ４であり；
（ｖ）Ｚ１がＢＸ１Ｘ２Ｂであるとき、Ｚ２はＢ２Ｘ３Ｘ４Ｂ２であり、および
（ｖｉ）Ｚ１がＢＢＸ１Ｘ２であるとき、Ｚ２はＸ３Ｘ４Ｂ２Ｂ２である。
【００１０】
別の態様において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸と、プロモータ配列に機能的に結合された本発明の核酸を含む発現ベクターと、発現ベクターを含む宿主細胞とを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＨＢＮｅｔ（商標）方法の概要と設計戦略を示す。（Ａ）（左側）各残基位置での設計のために見なされる極性アミノ酸型のすべての側鎖立体構造（回転異性体）、（中央）水素結合回転異性体は多くの組合せが可能であり、課題はこの空間を横切って、結合した水素結合のネットワーク（右側）を抽出することである。（Ｂ〜Ｄ）ＨＢＮｅｔ（商標）。（Ｂ）ＨＢＮｅｔ（商標）は、すべての対の位置で側鎖回転異性体間の水素結合および立体反発相互作用エネルギーを事前計算して、それらをグラフ構造に保存する。ノードは残基位置であり、相互作用するのに十分近い残基対はエッジによって接続され、各エッジに対して、相互作用エネルギー行列が存在する。黄色は、特定の閾値未満のエネルギー（良好な幾何学的形状を有し、ほとんど立体反発がない水素結合）を有する回転異性体対を示す。グラフを横切ることによって、互いに衝突しない水素結合回転異性体（ネットワーク）のすべての可能な結合性が解明される。示した簡単な例において、ＲｅｓｉおよびＲｅｓ  ｊでの２対の側鎖回転異性体が良好な幾何学的形状の水素結合を形成するが、グラフトラバーサルはこれらのうちの１つだけ（左側）が結合されたネットワークに拡張できることを示している。（Ｃ）Ｒｅｓｉ回転異性体３（ｉ：３）もＲｅｓｋ回転異性体２（ｋ：２）およびＲｅｓｊ回転異性体４（ｊ：４）に水素結合することができ、すべての満たされた重原子ドナーおよびアクセプターにより完全に結合されたＡｓｎ残基の「良好な」ネットワークをもたらすのに対して、水素結合回転異性体ｉ：６（Ｇｌｎ）およびｊ：４（Ｓｅｒ）が近くの位置ｋおよびｌに対して追加の水素結合を形成することができず、満たすことなく埋没した極性原子を残すので、（Ｄ）は拒絶される。（Ｅ〜Ｇ）設計戦略：（Ｅ）二環コイルドコイルのパラメトリック主鎖の生成：単量体サブユニットで着色し、サンプリングしたパラメータで標識した、Ｃ３対称三量体を示す：ヘリックス内側のスーパーコイル半径（Ｒｉｎ）および外側のスーパーコイル半径（Ｒｏｕｔ）、ヘリックス内側のヘリカル相（Δφ１  ｉｎ）およびヘリックス外側のスーパーコイル相（Δφ１  ｏｕｔ）、ヘリックス外側のスーパーコイル相（１１ｃｐ０）、内側ヘリックスと外側ヘリックスとの間のｚ−オフセット（Ｚｏｆｆ）、ならびにスーパーコイルねじれ（ω０）。（Ｆ）ＨＢＮｅｔ（商標）は、最良の水素結合ネットワークを特定するためにパラメトリック主鎖に適用される。（Ｇ）ネットワークは維持され、一方残りの残基位置は構築された対称オリゴマーに関連して設計される。
【図２】ヘリックスの外側環は、熱安定性を増加させ、内側ヘリックスの不十分なヘリックス傾向を克服することができる。（Ａ）設計２Ｌ４ＨＣ２＿２３の２５℃（青色）、７５℃（赤色）、９５℃（緑色）、および冷却後２５℃（紫色）でのＣＤスペクトル（２６０〜１９５ｎｍ）。（Ｂ）２Ｌ４ＨＣ２＿２３、ＧｄｍＣｌによる変性の２２２ｎｍでのモニタリング、（Ｃ）２Ｌ４ＨＣ２＿９、鎖によって着色されたスーパーコイルＣ２ホモ二量体、スーパーコイル軸を見下ろしている。（Ｄ）（Ａ）のように、２Ｌ４ＨＣ２＿９のＣＤスペクトル。（Ｅ）２Ｌ４ＨＣ２＿９の内側環の設計。（Ｆ）２２２ｎｍで吸収をモニターしているＣＤ温度溶融；２Ｌ４ＨＣ２＿９（黒色）は、２Ｌ４ＨＣ２＿９＿内側（灰色）よりかなり安定である。（Ｇ）２Ｌ６ＨＣ３＿１３、スーパーコイルＣ３ホモ二量体。（Ｈ）（Ａ）のように、異なる温度での２Ｌ６ＨＣ３＿１３のＣＤスペクトル。（Ｉ）２Ｌ６ＨＣ３＿１３＿内側。（Ｊ）２Ｌ６ＨＣ３＿１３（黒色）対２Ｌ６ＨＣ３＿１３＿内側（灰色）のＣＤスペクトルは、内側ヘリックスそれ自体が主に折り畳まれていない。すべてのＣＤデータは、平均残基楕円率（ＭＲＥ）１０３度ｃｍ２ｄｍｏｌ−１でプロットされる。
【図３】Ｘ線結晶構造解析による構造的特徴づけ。（Ａ〜Ｆ）結晶構造（白色）を６つの異なるトポロジーのために設計モデル上に重ね合わせる。（左側）完全な主鎖を（中央）設計された水素結合ネットワークに対応している断面で示し、パネルの輪郭の色は、左側の断面の色に対応し、すべてのネットワーク残基重原子にわたるＲＭＳＤは、各パネル内で報告される。（Ａ）２Ｌ６ＨＣ３＿１３（１．６４Å分解能；すべてのＣα原子に対するＲＭＳＤ＝０．５１Å）、および（Ｂ）２Ｌ６ＨＣ３＿６（２．２６Å分解能；すべてのＣα原子に対するＲＭＳＤ＝０．７７Å）は左巻きＣ３ホモ三量体であり、界面全体にわたり異なる部位で２つの同一のネットワークを有する各々は６つのヘリックスすべてに接触する。（Ｃ）２Ｌ８ＨＣ４＿１２、２つの異なる水素結合ネットワークを有する左巻きＣ４ホモ四量体；低い（３．８Å）分解能のため、水素結合ネットワーク側鎖の評価ができない。（Ｄ）２Ｌ４ＨＣ２＿９（２．５６Å分解能；すべてのＣα原子に対するＲＭＳＤ＝０．３９Å）、および（Ｅ）２Ｌ４ＨＣ２＿２３（１．５４Å分解能；すべてのＣα原子に対するＲＭＳＤ＝１．１６Å）は左巻きＣ２ホモ二量体であり、各々が１つのネットワークを有する。（Ｆ）５Ｌ６ＨＣ３＿１（２．３６Å分解能；すべてのＣα原子に対するＲＭＳＤ＝０．５１Å）は、直線状の、ねじれのないヘリックスと、異なる断面に２つの同一のネットワークとを有するＣ３ホモ三量体である。（Ｇ、Ｈ）２Ｌ６ＨＣ３＿１３（Ａ）および５Ｌ６ＨＣ３＿１（Ｆ）からの水素結合ネットワークの模式図である。示された水素結合は、設計モデルおよび結晶構造に存在する。
【図４】小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）による構造的特徴づけ。（左側）主鎖および（中央）設計モデルのための水素結合ネットワークを図３に示すように表示する。（右）設計モデルは、ＦｏＸＳを用いる実験的散乱データ（黒色）に適合させた。適合（Ｘ）のカイ２乗値は、各パネル内に示した。（Ａ）５Ｌ８ＨＣ４＿６（Ｘ＝１．３６）、２つの同一の水素結合ネットワークを有するねじれのないＣ４ホモ四量体。（Ｂ）５Ｌ４ＨＣ２＿１２（Ｘ＝ｌ．４５）、単一水素結合ネットワークを有するねじれのないＣ２ホモ二量体。（Ｃ）３Ｌ６ＨＣ２＿４（Ｘ＝２．０４）、２つの繰り返しネットワークと、内側ヘリックスを２つ、外側ヘリックスを１つ有する平行右巻きＣ２ホモ二量体。（Ｄ）２Ｌ６Ｈａｎｔｉ＿３（Ｘ＝１．８０）、内側ヘリックスを２つ、外側ヘリックスを１つ有する左巻き、逆平行ホモ二量体。逆平行の幾何学的形状のため、同じネットワークは２つの部位に起こる。
【図５】水素結合ネットワークは、特異性を付与する。（Ａ）ｈ−パッチによって計算された、連続した疎水性界面領域を増加させることよって順序づけられた６つの構造的に検証された設計のための単量体サブユニットの相互作用表面。水素結合ネットワーク残基は着色されている。（Ｂ）酵母ツーハイブリッドアッセイ由来のヒートマップを結合する。（Ａ）の設計をＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインの両構築物に融合させ、細胞増殖速度（最大ΔＯＤ／時間）を決定することによって結合を測定した。より暗い細胞は、より迅速に増殖し、したがって結合が強い。値は、少なくとも３つの生物学的反復の平均である。ヒートマップは（Ａ）のように順序づけされ、より広範なネットワークおよび良好に分割された疎水性界面領域を有する設計は、より高い相互作用特異性を示す。（Ｃ〜Ｇ）モジュラーネットワークは、プログラム可能な方法で特異性を付与する。（Ｃ）設計２Ｌ６ＨＣ３＿１３（図３Ａ）および２Ｌ６ＨＣ３＿６（図３Ｂ）に対応する主鎖は、４つの繰り返し幾何学的断面の各々で異なるネットワークに適応させることができる。（Ｄ）各断面について３つの可能性：ネットワーク「Ａ」、ネットワーク「Ｂ」または疎水性「Ｘ」。（Ｅ）この３文字の「アルファベット」を用いた組合せ設計を、（Ｂ）のような酵母ツーハイブリッドアッセイを用いて相互作用特異性について試験した。軸ラベルは、ネットワークパターンを表し、例えば、「ＡＸＢＸ」は、断面１でネットワークＡを示し、断面３でネットワークＢを示し、他の２つでＸ（疎水性）を示す。（Ｆ）図４のような組合せ設計のＳＡＸＳプロファイル；（Ｇ）ＳＥＣクロマトグラムおよび推定される分子量（ＭＡＬＳから）；設計は約２７〜３０ｋＤａの範囲に及ぶ。ＡＡＸＸ、ＸＸＢＢ、およびＸＸＸＸはそれぞれ、設計２Ｌ６ＨＣ３＿１３、２Ｌ６ＨＣ３＿６、および２Ｌ６ＨＣ３＿ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ＿１に対応する。
【図６】例示の実施形態による、コンピューティングネットワークの一例のブロック図である。
【図７Ａ】例示の実施形態による、コンピューティングデデバイスの一例のブロック図である。
【図７Ｂ】例示の実施形態による、クラウドベースサーバシステムとして配置されるコンピューティングデバイスのネットワークを表す。
【図８】例示の実施形態による方法のフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
引用されたすべての参考文献は、その全体を参照によって本明細書に組み込まれる。本出願内で、別段明記しない限り、利用される手法は、いくつかの周知の参考文献のいずれかで見つかる可能性がある：例えば、以下のようにいくつかの周知の参考文献のいずれかにおいて見出すことができる：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  １８５，Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌによる編，１９９１．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ，編，（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，ら．１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第２版（Ｒ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．  １９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ），Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９−１２８，  Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編，Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．），およびｔｈｅ  Ａｍｂｉｏｎ  １９９８  Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）。
【００１３】
本明細書で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、明示的に文脈において別段の定めがない限り、複数の指示対象を組み入れる。本明細書で用いる場合、「および」とは、明示的に別段の定めがない場合を除き、「または」と同じ意味で用いられる。
【００１４】
本明細書で用いる場合、アミノ酸残基は以下の通りに略称される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｒｐ；Ｙ）およびバリン（Ｖａｌ；Ｖ）。
【００１５】
明示的に文脈において別段の定めがない限り、本発明のいずれの態様のすべての実施形態を組合せて用いることができる。
【００１６】
一態様において、本発明は、配列番号２〜７９からなる群から選択されるアミノ酸配列とその完全長にわたり少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
ＡＸＡＸ
ＴＲＴＲＳＬＲＥＱＥＥＩＩＲＥＬＥＲＳＬＲＥＱＥＥＬＬＲＥＬＥＲＬＱＲＥＧＳＳＤＥＤＶＲＥＬＬＲＥＩＫＫＬＡＲＥＱＫＹＬＶＥＥＬＫＫＬＡＲＥＱＫＲＱＤ（配列番号２）；
ＸＡＡＸ
ＴＲＴＥＩＩＲＥＬＥＲＳＬＲＥＱＥＲＳＬＲＥＱＥＥＬＬＲＥＬＥＲＬＱＲＥＧＳＳＤＥＤＶＲＥＬＬＲＥＩＫＫＬＡＲＥＱＫＫＬＡＲＥＱＫＹＬＶＥＥＬＫＲＱＤ（配列番号３）；
ＸＡＸＡ
ＴＲＴＥＩＩＲＥＬＥＲＳＬＲＥＱＥＥＬＡＫＲＬＫＲＳＬＲＥＱＥＲＬＱＲＥＧＳＳＤＥＤＶＲＫＬＡＲＥＱＫＥＬＶＥＥＩＥＫＬＡＲＥＱＫＹＬＶＥＥＬＫＲＱＤ（配列番号４）；および
ＸＸＡＡ  
ＴＲＴＥＩＩＲＥＬＥＥＬＡＫＲＬＫＲＳＬＲＥＱＥＲＳＬＲＥＱＥＲＬＱＲＥＧＳＳＤＥＤＶＲＫＬＡＲＥＱＫＫＬＡＲＥＱＫＥＬＶＥＥＩＥＹＬＶＥＥＬＫＲＱＤ（配列番号５）
【００１７】
ポリペプチド命名法：以下に示すポリペプチドの名前は、オリゴマー化状態およびトポロジーを示し、ならびに以下の配列はトポロジーおよびオリゴマー化状態によって構築されている。最初の２文字は、スーパーコイル幾何学的形状を示し、「２Ｌ」は、左巻きスーパーコイルをもたらす２層７アミノ酸繰り返しを指し、「３Ｌ」は、右巻きスーパーコイルを有する３層１１残基繰り返しを指し、および「５Ｌ」は、５層１８残基繰り返しと直線状のヘリックス（スーパーコイル形成でない）を有するねじれのない設計を指し、これに関連して「層」は、スーパーコイル軸に沿って、幾何学的スライス、すなわち層の独特の繰り返しの数である。中央の２文字はヘリックスの総数を示し、最後の２文字は対称性を示す。したがって、「２Ｌ６ＨＣ３」はＣ３が対称の左巻き、６ヘリックス三量体を示す。下線を引いた残基は任意選択である。
【表１−１】
2019519468.tif 000003
【表１−２】
2019519468.tif 000004
【表１−３】
2019519468.tif 000005
【表１−４】
2019519468.tif 000006
【表１−５】
2019519468.tif 000007
【表１−６】
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【表１−７】
2019519468.tif 000009
【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
2019519468.tif 000012
【００１８】
本発明のこの態様のポリペプチドは、モジュラー水素結合ネットワーク介在特異性を有するホモオリゴマーを形成できることを成し遂げる実施例で示された。種々の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号２〜７９からなる群から選択されるアミノ酸配列の完全長に対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一のアミノ酸配列を含む、またはからなる。
【００１９】
本出願の全体を通して使用されるように、「ポリペプチド」という用語をその最も広い意味で用いて、サブユニットアミノ酸の配列を指す。本発明のポリペプチドは、Ｌーアミノ酸、Ｄ−アミノ酸（ｉｎ  ｖｉｖｏでＬ−アミノ酸特異的プロテアーゼに対して耐性である）、またはＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の組合せを含むことができる。本明細書に記載のポリペプチドは、化学的に合成されることができる、または組換えで発現されることができる。ポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで他の化合物に結合して、例えばＰＥＧ化、ＨＥＳ化、ＰＡＳ化、グリコシル化によって半減期の増加を促進することができる、またはＦｃ融合として、もしくは脱免疫化変異体内で生成されることができる。当業者によって理解されているように、そのような結合は共有結合または非共有結合であり得る。
【００２０】
当業者によって理解されるように、本発明のポリペプチドはＮ末端、Ｃ末端または両末端に、本発明のポリペプチドに存在しないさらなる残基が含まれてもよく、これらのさらなる残基は、基準ポリペプチドと比較して、本発明のポリペプチドのパーセント同一性を決定する際には含まれていない。
【００２１】
一実施形態において、基準ポリペプチドからの変化は、保存的アミノ酸置換である。本明細書で用いる場合、「保存的アミノ酸置換」とは、ポリペプチド機能または他の特性を変えない、または実質的には変えないアミノ酸置換を意味する。所定のアミノ酸は、類似した生理化学的特性を有する残基によって、例えば、別の残基の代わりに１つの脂肪族残基を用いる（例えば、互いにＩｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕもしくはＡｌａ）ことによって、または別の残基の１つの極性残基との置換（例えばＬｙｓとＡｒｇとの間、ＧｌｕとＡｓｐとの間、またはＧｌｎとＡｓｎとの間）によって交換することが可能である。他のそのような保存的置換、例えば、類似の疎水性特性を有するすべての領域の置換は、周知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドを本明細書に記載のアッセイのいずれか１つで試験して、所望の活性、例えば抗原結合活性、および天然のポリペプチドまたは基準ペプチドの特異性が保持されていることを確認することができる。
【００２２】
アミノ酸は、それらの側鎖の特性の類似点によって以下のように分類することができる（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，ｐｐ．７３−７５，  Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９７５））：（１）非極性：アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、メチオニン（Ｍ）；（２）非荷電極性：グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、システイン（Ｃ）、チロシン（Ｙ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；（３）酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；（４）塩基性：リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）。あるいは、天然起源の残基は、共通の側鎖特性に基づいて群に分類することができる：（１）疎水性：ノルロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；（２）中性親水性：システイン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン；（３）酸性：アスパラギン酸、グルタミン酸；（４）塩基性：ヒスチジン、リシン、アルギニン；（５）鎖配向に影響する残基：グリシン、プロリン；（６）芳香族：トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン。非保存的置換は、これらの種類のうちの１メンバーを別の種類に換えることを必要とする。特定の保存的置換としては、例えば、以下が挙げられる：アラニンをグリシンまたはセリンに；アルギニンをリシンに；アスパラギンをグルタミンまたはヒスチジンに；アスパラギン酸をグルタミン酸に；システインをセリンに；グルタミンをアスパラギンに；グルタミン酸をアスパラギン酸に；グリシンをアラニンまたはプロリンに；ヒスチジンをアスパラギンまたはグルタミンに；イソロイシンをロイシンまたはバリンに；ロイシンをイソロイシンまたはバリンに；リシンをアルギニン、グルタミン、またはグルタミン酸に；メチオニンをロイシン、チロシン、またはイソロイシンに；フェニルアラニンをメチオニン、ロイシン、またはチロシンに；セリンをトレオニンに；トレオニンをセリンに；トリプトファンをチロシンに；チロシンをトリプトファンに；および／または
フェニルアラニンをバリン、イソロイシン、またはロイシンに。
【００２３】
上述のように、本発明のポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端または両末端でさらなる残基を含むことができる。そのような残基は、使用目的に適した任意の残基であってよく、例えば、検出タグ（すなわち、蛍光タンパク質、抗体エピトープタグなど）、リンカー、精製の目的に適したリガンド（Ｈｉｓタグなど）、およびポリペプチドに機能性を追加するペプチドドメインが挙げられるがこれらに限定されない。
【００２４】
別の態様において、本発明は、
式１：Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５
のアミノ酸配列を含む、または該アミノ酸配列からなるポリペプチドを提供し、
式中、Ｚ１は、
式２：Ｊ１−Ｊ２−Ｊ３
のアミノ酸配列を含むヘリックス開始配列であり、
式中、Ｊ１は、Ｓ、Ｔ、ＮおよびＤからなる群から選択され、
Ｊ２は、Ｐ、Ｅ、Ｒ、Ｋ、Ｌ、Ａからなる群から選択され、および
Ｊ３は、Ｅ、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｙ、または非存在からなる群から選択され、
Ｚ３は、
式３：［ＲＫＥＤ］−Ｌ−［ＮＱＥＤＲＫＳＴ］−［ＮＱＥＤＲＫＳＴ］−［ＮＱＥＤＲＫＳＴ］−Ｇ−［ＳＴＮＱＥＤ］−［ＳＴＮＱＥＤ］−［ＳＴＮＤ］−Ｅ−［ＥＤＲＫ］−Ｖ−［ＲＫＥＤ］（配列番号１）
のアミノ酸配列を有する配列を結合するヘリックスであり、
Ｚ５は、
式４：ｘｘ−ｘｘ−［ＲＫＥＤＳＴＮＱＹＡ］（配列番号８０）
のアミノ酸配列を含む配列を終止するヘリックスであり、
Ｚ２は、一般式：ＢＸ１ＢＸ２、Ｘ１ＢＢＸ２、Ｘ１ＢＸ２Ｂ、Ｘ１Ｘ２ＢＢ、ＢＸ１Ｘ２ＢおよびＢＢＸ１Ｘ２からなる群から選択され、
式中、Ｂは、ｘｘ−Ｓ−Ｌ−ｘｘ−ｘｘ−Ｑ−ｘｘであり、
Ｘ１およびＸ２は、
式５：Ｏ１Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７
のアミノ酸配列を独立して有し、
式中、Ｏ１、Ｏ４、Ｏ５およびＯ７は、ｘｘであり、
Ｏ２およびＯ３は、Ｉ、Ｌ、およびＡからなる群から独立して選択され、
およびＯ６はＬであり、ならびに
Ｚ４は、一般式：Ｂ２Ｘ３Ｂ２Ｘ４、Ｘ３Ｂ２Ｂ２Ｘ４、Ｘ３Ｂ２Ｘ４Ｂ２、Ｘ２Ｘ２Ｂ２Ｂ２、Ｂ２Ｘ１Ｘ２Ｂ２およびＢ２Ｂ２Ｘ１Ｘ２からなる群から選択され、
式中、Ｂ２は、ｘｘ−Ｌ−Ａ−ｘｘ−ｘｘ−Ｑ−ｘｘであり、ならびに
Ｘ３およびＸ４は、
式６：Ｏ１０Ｏ１１Ｏ１２Ｏ１３Ｏ１４Ｏ１５Ｏ１６
のアミノ酸配列を独立して有し、
式中、Ｏ１０、Ｏ１３、Ｏ１４およびＯ１６は、ｘｘであり、
Ｏ１１は、Ｌであり、ならびに
Ｏ１２およびＯ１５は、Ｉ、Ｌ、Ｖ、およびＡからなる群から独立して選択され、
式中、ｘｘは任意のアミノ酸であり、ならびに
式中、
（ｉ）Ｚ１がＢＸ１ＢＸ２であるとき、Ｚ２はＸ３Ｂ２Ｘ４Ｂ２であり、
（ｉｉ）Ｚ１がＸ１ＢＢＸ２であるとき、Ｚ２はＸ３Ｂ２Ｂ２Ｘ４であり、
（ｉｉｉ）Ｚ１がＸ１ＢＸ２Ｂであるとき、Ｚ２はＢ２Ｘ３Ｂ２Ｘ４であり、
（ｉｖ）Ｚ１がＸ１Ｘ２ＢＢであるとき、Ｚ２はＢ２Ｂ２Ｘ３Ｘ４であり、
（ｖ）Ｚ１がＢＸ１Ｘ２Ｂであるとき、Ｚ２はＢ２Ｘ３Ｘ４Ｂ２であり、および
（ｖｉ）Ｚ１がＢＢＸ１Ｘ２であるとき、Ｚ２はＸ３Ｘ４Ｂ２Ｂ２である。
【００２５】
本発明のこの態様のポリペプチドは、モジュラー水素結合ネットワーク介在特異性を有するホモオリゴマーを形成できることを成し遂げる実施例で示された。
【００２６】
一実施形態において、Ｊ３は存在する。別の実施形態において、Ｚ１はＴＲＴである。さらなる一実施形態において、Ｚ３はＲＬＱＲＥＧＳＳＤＥＤＶＲ（配列番号８１）である。さらなる一実施形態において、Ｚ５はＲＱＤである。別の実施形態において、ＢはＲＳＬＲＥＱＥ（配列番号８２）である。さらなる実施形態において、Ｏ１、Ｏ４、Ｏ５およびＯ７は、Ｅ、ＲおよびＫからなる群から独立して選択される。さらなる実施形態において、Ｘ１およびＸ２は、ＥＩＩＲＥＬＥ（配列番号８３）、ＥＬＬＲＥＬＥ（配列番号８４）およびＥＬＡＫＲＬＫ（配列番号８５）からなる群から独立して選択される。別の実施形態では、Ｂ２はＫＬＡＲＥＱＫ（配列番号８６）である。一実施形態において、Ｏ１２およびＯ１５は、Ｉ、Ｌ、ＶおよびＡからなる群から独立して選択される。別の実施形態において、Ｘ３およびＸ４は、［ＹＥ］−ＬＶＥＥＬＫ（配列番号８７）、［ＹＥ］−ＬＬＲＥＩＫ（配列番号８８）および［ＹＥ］−ＬＶＥＥＩＥ（配列番号８９）からなる群から独立して選択される。本明細書で用いる場合、括弧内の残基は、記載されたペプチドドメイン内の所定の位置のための代替残基である。さらなる実施形態において、Ｘ３およびＸ４は、ＥＬＶＥＥＬＫ（配列番号９０）、ＥＬＬＲＥＩＫ（配列番号９１）およびＥＬＶＥＥＩＥ（配列番号９２）からなる群から独立して選択される。さらなる実施形態において、Ｚ２は一般式ＢＸ１ＢＸ２、Ｘ１ＢＢＸ２、Ｘ１ＢＸ２Ｂ、およびＸ１Ｘ２ＢＢからなる群から選択され、ならびにＺ４は一般式Ｂ２Ｘ３Ｂ２Ｘ４、Ｘ３Ｂ２Ｂ２Ｘ４、Ｘ３Ｂ２Ｘ４Ｂ２およびＸ２Ｘ２Ｂ２Ｂ２からなる群から選択される。さらなる実施形態において、本発明のこの態様のポリペプチドは、配列番号２〜５からなる群から選択されるアミノ酸配列とその完全長にわたり少なくとも７５％同一であるポリペプチドを含む。
【００２７】
本発明のいかなる態様の別の実施形態、実施形態または実施形態の組合せにおいて、ポリペプチドはカーゴに結合される。本明細書で用いる場合、「カーゴ」とは核酸、ペプチド、小分子、アミノ酸、検出可能なラベルなどを含むがこれらに限定されない任意の適切な成分であり得る。非限定的な一実施形態において、本発明のポリペプチドは、目的の「カーゴ」への共有結合を容易にするために修飾されることができる。非限定的な一実施例において、ポリペプチドは、例えば、１または複数の目的の抗原への結合を容易にするために、種々のシステイン残基を定められた位置に導入することによって修飾されることができ、その結果、ポリペプチドのナノ構造は改善された免疫応答を生成するように、ワクチンとして送達するための多数の抗原を提供するための足場を提供する。一部の実施形態において、ポリペプチドに存在するが、結合のために使用されることを目的としていない、いくつかのまたはすべての天然のシステイン残基は、定められた位置で結合を容易にするために、他のアミノ酸に変異導入されることができる。別の非限定的な実施形態において、本発明のポリペプチドは、「エンドソームの脱出」を容易にするのを支援するために、部分との結合（共有結合または非共有結合）によって修飾されることができる。目的の分子を標的細胞に送達すること、例えば標的送達を含む適用のために、重要なステップは、細胞への送達ビヒクルの侵入ポイントである膜結合オルガネラ、すなわちエンドソームから脱出できることである。エンドソームはリソソームに成熟し、それらの内容物を分解する。したがって、エンドソームがリソソームになる前に送達ビヒクルがどういうわけかエンドソームから「脱出」しない場合、エンドソームは分解して、その機能を実行しない。エンドソームを破壊して、サイトゾルへの脱出を可能にする脂質または有機ポリマーは多様にある。したがって、この実施形態において、ポリペプチドは、例えば、そのような脂質または有機ポリマーの単量体の化学結合を可能にするシステイン残基をモノマーまたは結果として生じる構築面に導入することによって修飾されることができる。別の非限定的な一例において、ポリペプチドは、例えば、本発明のナノ構造のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの可視化を可能にするフルオロフォアまたは他のイメージング剤の化学結合を可能にするシステイン残基を導入することによって修飾されることができる。
【００２８】
別の実施形態において、本発明は、同じアミノ酸配列を有する本発明の複数のポリペプチドを含むホモオリゴマー（すなわち、ホモ二量体、ホモ三量体、ホモ四量体など）を提供する。あとに続く実施例に示すように、本発明のポリペプチドは、モジュラー水素結合ネットワーク介在特異性を有するホモオリゴマーを形成することができる。
【００２９】
さらなる態様において、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。単離された核酸配列は、ＲＮＡまたはＤＮＡを含むことがあり得る。本明細書で用いる場合、「単離された核酸」とは、ゲノム配列中またはｃＤＮＡ配列中のそれらの正常な周辺核酸から除去されたものである。そのような単離された核酸配列は、コードされたタンパク質の発現および／または精製を促進するのに有用な追加の配列を含むことができ、例えば、ポリＡ配列、修飾Ｋｏｚａｋ配列、ならびにエピトープタグ、移行シグナル、および分泌シグナル、核局在シグナル、および細胞膜局在シグナルをコードする配列が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中の教示に基づけば、どの核酸配列が本発明のポリペプチドをコードすることになるかは当業者には明白であろう。
【００３０】
別の態様において、本発明は、好適な制御配列に機能的に結合された本発明のいずれかの態様の単離された核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。「組換え発現ベクター」は、核酸コード領域または遺伝子を遺伝子産物の発現をもたらすことができるどんな制御配列にでも機能的に結合するベクターが含まれる。本発明の核酸配列に機能的に結合した「制御配列」は、核酸分子の発現をもたらすことができる核酸配列である。制御配列は、その発現を導くように機能する限り、核酸配列に隣接している必要はない。したがって、例えば、翻訳されていないが転写される介在配列はプロモータ配列と核酸配列との間に存在することが可能であり、それでも該プロモータ配列はコード配列に「機能的に結合した」とみなすことができる。他のそのような制御配列としては、ポリアデニル化シグナル、終結シグナル、およびリボソーム結合部位が挙げられるが、これら限定されない。そのような発現ベクターは当分野において既知の任意の種類のものであってよく、例えば、プラスミドおよびウイルス系の発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。開示された核酸配列の発現を哺乳動物系において引き起こすために使用される制御配列は、構成型（多様なプロモータのうち任意のもの、例えば、これらに限定されないが、ＣＭＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、アクチン、ＥＦプロモータによって引き起こされる）であっても、または誘導型（例えばいくつかの誘導プロモータのうち任意のもの、例えば、これらに限定されないが、テトラサイクリン、エクジソン、ステロイド反応性のプロモータによって引き起こされる）であってもよい。宿主細胞のトランスフェクトに使用される発現ベクターの構築も当技術分野において周知であり、したがって標準的手法により達成することができる。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ｐｐ．１０９−１２８，Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編，Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．），およびｔｈｅ  Ａｍｂｉｏｎ  １９９８  Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸを参照されたい）。発現ベクターは、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡへの組込みにより、宿主生物において複製可能でなければならない。種々の実施形態において、発現ベクターはプラスミド、ウイルス系ベクターまたは他のいかなる好適な発現ベクターを含んでよい。
【００３１】
さらなる態様において、本発明は、本明細書に開示される組換え発現ベクターを含む宿主細胞を提供し、該宿主細胞は原核生物または真核生物のいずれかであり得る。本発明の発現ベクターを組み入れるように当技術分野で標準的技術を用いて、細胞を一時的にまたは安定に操作することが可能であり、そのような手法としては、標準的な細菌形質転換、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、またはリポソーム介在型、ＤＥＡＥデキストラン介在型、ポリカチオン介在型、もしくはウイルス介在型のトランスフェクションが挙げられるがこれらに限定されない。（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら，１９８９，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第２版（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい）。本発明によってポリペプチドを生成する方法は、本発明のさらなる部分である。方法は、（ａ）本発明のこの態様に従ってポリペプチドの発現を引き起こす条件下で宿主を培養するステップと、（ｂ）任意選択で発現されるポリペプチドを回収するステップとを含む。発現されたポリペプチドは、無細胞抽出物から回収することができるが、好ましくは培養培地から回収される。無細胞抽出物または培養培地からポリペプチドを回収する方法は、当業者に周知である。
【実施例】
【００３２】
ＤＮＡ相互作用特異性のモジュラーおよび予測可能な性質は分子生物学操作とＤＮＡナノテクノロジーにとって主要であるが、本来匹敵するものがなく、類似のプログラム可能な特異性をタンパク質で達成する方法は明らかでなかった。ＤＮＡ塩基より多くの極性アミノ酸が存在し、それぞれは、異なる主鎖に関連して多数の側鎖立体構造をとることができ、無数のネットワークの可能性を可能にしている。本発明者らは、一般的な計算方法を開発した。ＨＢＮｅｔ（商標）は、入力主鎖構造（図１Ａ）において可能なすべての側鎖水素結合ネットワークを迅速に列挙するために開発された。
【００３３】
計算効率のために全システムエネルギーが残基対間の相互作用の総和として一般に表され、したがって切断された水素結合のセットから結合された水素結合ネットワークを明確に区別することができないために、従来のタンパク質設計アルゴリズムは本目的に十分に適していない。ＨＢＮｅｔ（商標）は、極性側鎖のすべての対のすべての立体構造（回転異性体の状態）間の水素結合および立体反発相互作用を事前計算することから開始する。
これらのエネルギーは、ノードが残基位置であり、三次元空間において近い位置がエッジによって接続され、および各エッジについて２つの位置で異なる回転異性体の状態間の相互作用エネルギーを表すマトリクスがあるグラフデータ構造に保存される。次いで、ＨＢＮｅｔ（商標）はこのグラフをトラバースして、ほとんど立体反発を含まない低エネルギー水素結合によって接続された３つ以上の残基のすべてのネットワークを特定する（図１Ｂ）。最も広範囲で最低エネルギーネットワーク（図１Ｃ）は、残りの残基位置で以降の設計計算で一定に保たれる。水素結合を形成しない埋没したドナーおよびアクセプターを含むネットワーク（満たされてない）は、拒絶される（図１Ｄ）。本方法ならびに設計計算を実施するためのスクリプトの詳細を本明細書に記載する。
【００３４】
ＤＮＡ二重ヘリックスの影響を受けて、ネットワークが同じ足場内で再利用されることを可能にするために、固有の繰り返し構造を有するタンパク質オリゴマーにおいて水素結合ネットワークのホストをつとめることを試みた。自然において豊富であり、多くのタンパク質設計研究の対象であり、パラメータ的に生成されることができるコイルドコイルに注目し、幾何学的な断面の繰り返しをもたらした。自然なコイルドコイおよび設計されたコイルドコイルにおいて、埋没した極性相互作用も特異性を変えることができるが、しかしこれらのケースのほとんどは、残りの極性原子が水またはイオンによって満たされた多くても１または２つの側鎖−側鎖水素結合を含み、標準的なコイルドコイルの比較的小さい断面の界面領域は可能なネットワークの多様性および位置を限定する。これらの限定を克服するために、ヘリックスの２つの同心環を有するオリゴマー構造に焦点を置いた（図１Ｅ）。
【００３５】
「二環」トポロジーは、Ｃｒｉｃｋのコイルドコイルパラメタリゼーションの一般化を用いて、短いループで接続された内側ヘリックスおよび外側ヘリックスを含むらヘリカルヘアピン単量体サブユニットから構築した。広範囲の主鎖は、内側ヘリックスおよび外側ヘリックスの半径とヘリカル相、内側ヘリックスおよび外側ヘリックスの間のｚ−オフセット、および全体的なスーパーコイルねじれを系統的にサンプリングすることによって生成した（図１Ｅ）。次いで、ＨＢＮｅｔ（商標）を使用して、分子間界面に広がり、重原子ドナーおよびアクセプターがすべて満たされ、および少なくとも３つの側鎖を有する、ネットワークのこれらの主鎖を探索した（図１Ｆ、これらの厳しい要件のために、ごくわずかな主鎖だけがそのようなネットワークを支持することができるが、二環構造の自由度を系統的に変えることによって、何万もの主鎖を作成することが可能であり、ＨＢＮｅｔ（商標）の効率により、多数の主鎖からネットワークの探索が計算的に容易になる）。次いで、ＲｏｓｅｔｔａＤｅｓｉｇｎ（商標）を使用して、オリゴマーの周期対称と関連して残りの残基位置での回転異性体を最適化した（図１Ｇ）。Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）を使用して、設計を、総オリゴマーエネルギーに基づいて、全原子力場、ネットワーク周辺に大きな空洞または不完全なパッキングを有する設計を除去するためのフィルタリングの順に並べた。上位にランクする設計をＲｏｓｅｔｔａ（商標）「フォールド・アンド・ドック」計算を使用して評価した。設計された標的構造に通じる漏斗様の形をしたエネルギー地形を有する設計を特定し、広範なスーパーヘリックスパラメータと水素結合ネットワークにわたる計１１４の二量体、三量体、および四量体の設計物を実験的特性評価のために選択した。
【００３６】
選択した設計をコードする合成遺伝子を得て、タンパク質を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）において発現させた。発現し、可溶性だった設計物の約９０％（１０１／１１４）を親和性クロマトグラフィーで精製し、次いでそれらのオリゴマー化状態をサイズ排除クロマトグラフィー多角度光散乱法（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）で評価した。１０１のうちの６６が、設計されたオリゴマー化状態を有することがわかった。１０１の可溶性設計物は８種の異なるトポロジーにわたり、これらのうちスーパーコイル四量体は最大の埋没した界面領域を有し、埋没したドナーおよびアクセプターがすべて満たされた最少の設計物をもたらし、成功率が最低（１３の可溶性設計物のうちわずか３が適切に集合した）であった。スーパーコイル四量体を除いて、７２〜〜（６３／８８）は設計されたオリゴマー状態に集合し、これらのうち８９％（５６／６３）がＳＥＣカラムから単一ピークとして溶出された。設計されたタンパク質はさらに、円偏光二色性（ＣＤ）分光法によって特徴が明らかにされ、試験したすべての設計物は、特徴的なα−ヘリックススペクトルを示し、アンフォールディング実験をモニターしたＣＤは、これらの９０％超が９５℃で安定していたことを示した（図２）。試験したペプチドとしては、以下が挙げられる：
ＡＸＡＸ
ＴＲＴＲＳＬＲＥＱＥＥＩＩＲＥＬＥＲＳＬＲＥＱＥＥＬＬＲＥＬＥＲＬＱＲＥＧＳＳＤＥＤＶＲＥＬＬＲＥＩＫＫＬＡＲＥＱＫＹＬＶＥＥＬＫＫＬＡＲＥＱＫＲＱＤ（配列番号２）；
ＸＡＡＸ
ＴＲＴＥＩＩＲＥＬＥＲＳＬＲＥＱＥＲＳＬＲＥＱＥＥＬＬＲＥＬＥＲＬＱＲＥＧＳＳＤＥＤＶＲＥＬＬＲＥＩＫＫＬＡＲＥＱＫＫＬＡＲＥＱＫＹＬＶＥＥＬＫＲＱＤ（配列番号３）；
ＸＡＸＡ
ＴＲＴＥＩＩＲＥＬＥＲＳＬＲＥＱＥＥＬＡＫＲＬＫＲＳＬＲＥＱＥＲＬＱＲＥＧＳＳＤＥＤＶＲＫＬＡＲＥＱＫＥＬＶＥＥＩＥＫＬＡＲＥＱＫＹＬＶＥＥＬＫＲＱＤ（配列番号４）；および
ＸＸＡＡ
ＴＲＴＥＩＩＲＥＬＥＥＬＡＫＲＬＫＲＳＬＲＥＱＥＲＳＬＲＥＱＥＲＬＱＲＥＧＳＳＤＥＤＶＲＫＬＡＲＥＱＫＫＬＡＲＥＱＫＥＬＶＥＥＩＥＹＬＶＥＥＬＫＲＱＤ（配列番号５）
【００３７】
ポリペプチド命名法：以下に示すポリペプチドの名称はオリゴマー化状態およびトポロジーを示し、以下の配列はトポロジーおよびオリゴマー化状態によって構成されている。最初の２つの文字は、スーパーコイル幾何学的形状を示し、「２Ｌ」は、左巻きのスーパーコイルをもたらす２層アミノ酸反復を指し、「３Ｌ」は、右巻きのスーパーコイルによる３層１１残基繰り返しを指し、および「５Ｌ」は、５層１８残基繰り返しおよび直線状のヘリックス（スーパーコイリングがない）によるねじれのない設計を指し、これに関連して「層」とは、スーパーコイル軸に沿って、独特の繰り返し幾何学的スライス（複数可）、もしくは複数の層の数である。中央の２文字はヘリックスの総数を示し、最後の２文字は対称性を示す。したがって、「２Ｌ６ＨＣ３」は、Ｃ３が対称の左巻き、６ヘリックス三量体を示す。下線部の残基は任意選択である。
【表２−１】
2019519468.tif 000013
【表２−２】
2019519468.tif 000014
【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【表２−６】
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【表２−７】
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【表２−８】
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【表２−９】
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【表２−１０】
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【００３８】
ヘリックスの外側の環のエネルギー的寄与を探索するために、ニ環設計の安定性を、内側環だけを有する対応する設計と比較し、水素結合ネットワーク残基を含む内側ヘリックスのコア界面位置を保持し、溶媒露出面の位置を二環設計の表面と同じ方法で再設計した。２Ｌ４ＨＣ２＿９（図２Ｃ）、スーパーコイルホモ二量体は折り畳まれており、熱安定性であり（図２Ｄ）；その内側ヘリックスペプチド、２Ｌ４ＨＣ２＿９内側（図２Ｅ）もホモダイマーコイルドコイルを形成するが、熱安定性は著しく低下している（図２Ｆ）。２Ｌ６ＨＣ３＿１３（図２Ｇ）、スーパーコイルホモ三量体も、折り畳まれて、熱安定性である（図２Ｈ）が、しかし、単離して対応する内側の環ペプチド（図２Ｉ）は、折り畳まれてなく（図２Ｊ）かつ単量体である。この内側ヘリックスの配列は、正規のαまたはｄヘプタッドのパッキング位置に４つのＡｓｎ残基を有し、ここでＡｓｎが不安定であり、ならびに他のα位置およびｄ位置がそれぞれＬｅｕとＩｌｅであるので、注目すべきである。これはホモ四量体を支持することが判明している。外側のヘリックスおよび設計された水素結合ネットワークの存在下で、二環設計物をｘ線結晶構造解析によって解明されるような意図される三量体構造に集合する（図３Ａ）。合わせて、これらの結果は、ヘリックス傾向が低く、非標準のヘリックスパッキングを有する内側ヘリックスに関連しても、ヘリックスの外側の環が熱安定性を増加させるだけでなく、コイルドコイルアセンブリを引き起こすことができ、より広い界面にわたりより大きな配列多様性を可能にすることを示唆する。
【００３９】
構造特性解析
設計の正確性を評価するために、１０の結晶構造をオリゴマー化状態の範囲、スーパーヘリックスパラメータ、および水素結合ネットワークにわたって判定した（図３Ａ〜Ｆ）。結晶が得られなかった設計は、小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）によって特性を明らかにした（図４）。３つの左巻き三量体、４つの左巻き二量体、１つの左巻き四量体、およびねじれのない三角形三量体の構造を解析した。ＳＡＸＳによって特性を明らかにされたさらなるトッポロジーとしては、ねじれのない正方形四量体（図４Ａ）および二量体（図４Ｂ）ならびに平行右巻き（図４Ｃ）または逆平行左巻き（図４Ｄ）のいずれかのスーパーコイル幾何学形状を有する６ヘリックス二量体（２内側ヘリックス、１外側ヘリックス）が挙げられる。Ｘ線結晶構造解析で検証した５つの設計（図３Ａ、Ｃ〜Ｆ）もＳＡＸＳによって特性を明らかにし、次いで実験で決定したスペクトルが設計モデルから計算したスペクトルとほぼ一致することが明らかになり、極めて類似する構造が解に読み込まれることを示唆する。
【００４０】
３つの左巻き三量体構造（２Ｌ６ＨＣ３＿６、２Ｌ６ＨＣ３＿１２および２Ｌ６ＨＣ３＿１３）は、水素結合ネットワークのすべての主鎖Ｃα原子およびすべての重原子にわたり、サブオングストロームＲＭＳＤを有する設計モデルに非常に類似している（図３Ａ〜Ｂ）。これらの構造は、内側ヘリックスに対して０°、１２０°および２４０°、および外側ヘリックスに対して６０°、１８０°、および３００°のスーパーコイル相で構築され、ループは、外側Ｎ末端ヘリックスを内側Ｃ末端ヘリックス（外側ヘリックスから−６０°で）に接続する。広範囲の９残基または１２残基ネットワークは予定の水素結合を結晶構造で形成する（図３、ＡおよびＢの中央）。３つの埋没したアスパラギンが実質的に熱安定性の低下をもたらしたこれまでに設計された単環の三量体とは異なり、これらの二環三量体は９５℃、および多数の埋没した極性残基を有する塩化グアニジニウム約４．５Ｍまで安定しており、２Ｌ６ＨＣ３＿１３は１２の完全に埋没したアスパラギンを有し、２Ｌ６ＨＣ３＿６は界面の小領域に限定され、６のアスパラギンと６のグルタミンとを含む２４の埋もれた極性残基を有する。
【００４１】
４つの左巻き二量体結晶構造（２Ｌ４ＨＣ２＿９、２Ｌ４ＨＣ２＿２３、２Ｌ４ＨＣ２＿１１、および２Ｌ４ＨＣ２＿２４）はすべて、設計された平行二環トポロジーを有する。２つの二量体構造は、設計にほぼ一致する水素結合ネットワークを有し、２Ｌ４ＨＣ２＿９（図３Ｄ）および２Ｌ４ＨＣ２＿２３（図３Ｅ）は、すべてのネットワーク残基重原子にわたり、それぞれ、０．３９Åと０．９２ÅのＲＭＳＤを有し、すべてのＣα原子にわたり０．３９Åと１．１６ÅのＲＭＳＤを有する。他の２つ、２Ｌ４ＨＣ２＿１１と２Ｌ４ＨＣ２＿２４は、設計されたネットワーク側鎖を置換する水によって起こる、設計モデルからの多少の構造的偏差を有し、前者において、２つのネットワーク残基を架橋する埋没した水分子によって界面が約２Å移行し、後者において、主鎖は設計モデルとほぼ同一であるが、設計されたネットワークの側鎖は規則的な水分子に置換されている。これらの２つの例は、ネットワークの高い結合性および満足度（すべての極性原子が水素結合に関与する）の必要性を強調する。左巻き四量体構造は、設計された全体的なトポロジー（図３Ｃ）を有し、ＳＡＸＳデータは設計モデルにほぼ一致しているが、側鎖密度は低（３．８Å）解像度のために不確かであった。アミノ酸配列は、いかなる既知の配列にも無関係であり、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）の構造ベースの検索でのトップヒットは、全く異なったヘリックスバンドル構造を有する。
【００４２】
５つの逆平行６ヘリックス二量体（２Ｌ６Ｈａｎｔｉ＿１−５）は可溶性であり、設計モデルと一致するＳＡＸＳデータを用いて、設計されたオリゴマー状態に集合した。設計２Ｌ６Ｈａｎｔｉ＿３は、二量体界面に埋没したＴｙｒを有する水素結合ネットワークを含有する（図４Ｄ）。ＳＡＸＳによって特性を明らかにされた３つの右巻き６ヘリックス二量体のうち、３Ｌ６ＨＣ２＿４（図４Ｃ）および３Ｌ６ＨＣ２＿７は、設計モデルと一致した散乱を示したが、３Ｌ６ＨＣ２＿２は示さなかった。３Ｌ６ＨＣ２＿２は平行二量体を形成するように設計されたが、その結晶構造は、逆平行二量体界面を明らかにし、２つの設計の知識に光を当てた。第１の知識は、結合界面での分子間水素結合の重要性（２Ｌ６ＨＣ３＿６の９と比較して３Ｌ６ＨＣ２＿２の設計モデルは界面にわたりわずかに２つを有する（図３Ｂ））、および第２の知識は、ネットワークを補完する有益な疎水性接触の重要性（３Ｌ６ＨＣ２＿２設計モデルは界面に主としてアラニンを有する）。
【００４３】
ＳＡＸＳデータは、ねじれのない二量体、三量体および四量体の設計が目標の三角形立体構造および正方形立体構造に集合することを示唆する（図４Ａ〜Ｂ）。ギニエ解析および散乱ベクトルの低ｑ領域の適合は、試験した７のねじれのない二量体が適切なオリゴマー状態にあり、そのうちの４は実験スペクトルと、設計モデルとの間に極めて近い一致があることを示している（図４Ｂ）。３つのねじれのない四量体（５Ｌ８ＨＣ４＿１、５Ｌ８ＨＣ４＿２、および５Ｌ８ＨＣ４＿６）に関するＳＡＸＳデータは、すべて対応する設計モデルとほぼ一致した。５Ｌ８ＨＣ４＿６は、ネットワークの一端で埋没した水素結合を形成し、次いで溶媒に向かって外側に増殖し、表面のＧｌｕに結合する、Ｔｒｐを含む特徴的なネットワークを有する（図４Ａ）。そのような均一な直線状のヘリックスを有するオリゴマーは本来存在せず、またはこれらのトポロジーはこれまでに設計されなかったと考えられる。
【００４４】
２．３６Åのねじれのない三量体（５Ｌ６ＨＣ３＿１）の結晶構造は、すべてのＣα原子にわたる設計モデルに対して、０．５１ÅのＲＭＳＤを含む直線状のヘリックスを明らかにした（図３Ｆ）。２つの水素結合ネットワーク（図３Ｆ中央）、ならびにネットワーク周囲の疎水性パッキング残基（図３Ｆ右）は、すべてのネットワーク重原子にわたり、結晶構造と、設計モデルとの間が、０．４１Åと、０．４８ÅのＲＭＳＤとでほぼ同一である。スーパーコイル三量体のように、これらのネットワークの各々は、各ヘリックスからの側鎖を含有し、ヘリックスが均一で対称的な等距離になるように構築された。ヘリックスは、結晶構造においてほぼ完全に直線状であり、スーパーコイルねじれ値は、ゼロの理想的な設計値：３本の内側ヘリックスに対してはω０＝−０．０３６°／残基および３本の外側ヘリックスに対してはω０＝−０．１３７°／残基に極めて近い。アミノ酸配列によるＢｌａｓｔ検索は、１０より良いＥ値で検索されたマッチはなく、ＰＤＢ中の類似する構造の検索でヒットした上位には、長くのびた領域と隣接している３本のスーパーコイルヘリックスがある。
【００４５】
成功対不成功のネットワーク設計の比較
いくつかの傾向は、成功した設計に目立って現れた。最初に、成功した設計では、ほとんどすべての埋没した極性基は、水素結合を形成した。すべての重原子ドナーおよびアクセプターが満たされた設計を選択したが、ネットワークは、満たされてない極性水素の数が変化した。全体的に満たされた極性基の最大の割合を有するネットワークは、水素結合の総数およびネットワークに寄与する側鎖の数の両方に関して結合性が比較的高い。最も高い結合性と構造の正確性とを有するネットワークは、断面界面全体にわたり、各ヘリックスは少なくとも１本の側鎖に寄与する（図３Ａ、３Ｂ、３Ｅ、３Ｆ）。設計２Ｌ６ＨＣ３＿１３にはさらに、２つの水素結合を形成するが、満たされてない極性水素を１つ有する単一対称Ａｓｎを含む２つの小さなネットワークもあり、結晶構造において、これらの残基は設計モデルから移動し、水分子に置換される。
【００４６】
設計された水素結合ネットワークは、特異性を付与する
目標オリゴマー状態への特異性を付与する際の設計された水素結合ネットワークの役割を調べるために、ＨＢＮｅｔ（商標）なしで同じタンパク質骨格を用いて、対照設計計算を行い、疎水性界面を均一に得た。設計されたオリゴマー状態において総エネルギーが低いにもかかわらず、インシリコで、これらの設計はｆｏｌｄ−ａｎｄ−ｄｏｃｋ計算および非対称ドッキング計算においてより明白な代替エネルギー最小値を示し、非極性パッキング相互作用の制限がはるかに少ない幾何学的形状と整合する。実験的に、これらの疎水性設計は、水素結合ネットワークを有するそれらの対応物よりも可溶性が少ない発現を示し、精製中、沈殿する傾向があった。ＳＥＣ−ＭＡＬＳデータを収集するのに十分長く溶液中に残存したもののうち１つを除いてすべて、高分子量の凝集体を形成し、ＳＥＣカラムから複数のピークとして溶出した。これらの結果は、設計された水素結合ネットワークが目標オリゴマー状態へ特性を付与し、および純粋に疎水性パッキングで観察された別の状態の縮重を解決する（この縮重は、従来の単環コイルドコイルよりも本明細書に記載の二環構造に対してかなり明白である。従来の単環コイルドコイルは、多くの残基の総疎水性が少なく、ヘリックス間界面領域が少ない）。
【００４７】
ｉｎ  ｖｉｖｏで酵母ツーハイブリッドアッセイを用いて、さらに設計オリゴマーの相互作用特異性を探索した。ある範囲の二量体、三量体および四量体をコードする配列をオールバイオール結合アッセイで互いに交差させ（図５）、設計されたタンパク質相互作用の結合が細胞増殖にとって必要なので、設計のための合成遺伝子を別々のベクター中でＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインの両方とともにインフレームでクローン化した。
水素結合ネットワークが疎水性界面領域を比較的小さい領域に分割する設計は、ヘリックス界面に大きな隣接する複数の疎水性パッチを含む設計よりもかなり特異的である（図５ＡおよびＢ）。疎水性領域を最善に分割された設計は、ネットワークがオリゴマー界面全体にわたっており、各ヘリックスは少なくとも１つの側鎖に関与していた。この統一的な設計原理は、ＨＢＮｅｔ（商標）を使用して、容易に実施することができる。
【００４８】
ネットワークの規則的配列構造がモジュラー、プログラム可能な方法で特異性を付与することができるかどうか試験するために、さらなる一連の三量体を設計した。各三量体は主鎖と疎水性パッキングモチーフを有し、唯一の違いは水素結合ネットワークの配置と構成であった。この設計は、２Ｌ６ＨＣ３＿１３（図３Ａ）および２Ｌ６ＨＣ３＿６（図３Ｂ）に基づいており、これらは同じスーパーヘリックスパラメータに由来したが、それぞれ「Ａ」および「Ｂ」と呼ばれる固有のネットワークを有し、非極性残基のみを有する断面は「Ｘ」と表示される。この３文字表記を用いて、組合せ方法で新しい設計を生成し、スーパーコイルの４つの断面の繰り返し（図５Ｃ）の各々で、Ａ、ＢまたはＸ（図４Ｄ）のいずれかを配置し、その後に以前と同じ設計戦略および選択プロセスが続いた。これらの組合せの設計のうち６つを合成し、５／６が折り畳まれ、熱安定性であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで設計された三量体オリゴマー化状態に組み立てられることが判明した。２つの親設計（２Ｌ６ＨＣ３＿１３＝ＡＡＸＸと２Ｌ６ＨＣ３＿６＝ＸＸＢＢ）およびすべての疎水性対照（ＸＸＸＸ）とともに、これらの５つの設計は、オールバイオール酵母ツーハイブリッド結合実験で交差した（図５Ｅ）。組合せ設計は、すべてが同じ主鎖および高い配列全体の類似性を有するとすると、著しい特異性のレベルを示すのに対して、疎水性対照は比較的乱雑であり、中心的な水素結合ネットワークは、特異性を媒介することに明らかに関与している。
【００４９】
以前の新規タンパク質設計の試みは、新しい構造および相互作用を設計するためのジグソーパズル様疎水性コアパッキングに焦点を合わせた。高度に結合され、満たされた水素結合ネットワークを設計する多体問題とは異なり、疎水性パッキングは確立されたペアワイズの分解電位によって容易に捕捉され、したがって、大部分のタンパク質界面設計は主に疎水性であり、界面にわたり埋没した水素結合を設計する試みは常に失敗してきた。極性界面は特殊な例で設計されたが、一般化することが困難であり、多く界面設計の試みは、極性接点を最適化し、所望の特異性を達成するための指向進化を必要とした。ＨＢＮｅｔ（商標）は、水素結合ネットワークを正確に設計するための一般的な計算方法を提供する。埋没した満たされてない極性原子なしで、極性接点を正確に事前に構築するこの能力は、酵素設計、小分子結合、および極性タンパク質界面ターゲティングなどのタンパク質設計の課題において広範に有用であろう。
【００５０】
二環構造は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの塩基対形成のそれに類似したプログラム可能な相互作用特異性の可能性を有する新しい種類のタンパク質オリゴマーである。一方、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの塩基対形成は主に逆平行二重ヘリックスに限定されており、設計したタンパク質水素結合ネットワークは、ある範囲のオリゴマー化状態（二量体、三量体、四量体）およびスーパーコイル幾何学的形状を有する二環構造の特定が可能である。水素結合ネットワークを可能にするためにヘリックスの外側環を加えることで、広範囲にわたるヘテロオリゴマーおよびホモオリゴマーの特異性を有するコイルドコイルの設計性を示す、Ｋｅａｔｉｎｇ、Ｗｏｏｌｆｓｏｎその他から洗練された研究に広がっている。設計モデルおよび結晶構造は、広範な水素結合ネットワーク構成および幾何学的形状が二環トポロジーの繰り返しで可能であり、熱安定性を犠牲にすることなく複数のネットワークを様々な位置で同じ主鎖に設計することでき、均一な形状だが直交結合界面を有する安定した構成要素を可能にすることを示す（図５）。ＤＮＡナノテクノロジー分野では、比較的限られた一連の水素結合相互作用から、壮大な配列の形状および相互作用を構築できることが実証された。これで、両ポリマーの利点、すなわちＤＮＡ様プログラム可能性と調整可能な特異性、幾何学的形状可変との関連、相互作用の多様性、およびタンパク質に固有の触媒機能、を有する新しいタンパク質系材料を開発することが可能になろう。
【００５１】
計算手法
水素結合ネットワーク方法（ＨＢＮｅｔ（商標））に基づくタンパク質設計に関連した計算手法を以下に詳述する。ＨＢＮｅｔ（商標）方法は、３ステップを含むことができる。第１のステップとして、徹底的であるが、効果的な探索は、所定の探索空間（特定の主鎖立体構造と見なされるすべてのアミノ酸の種類のすべての可能な側鎖回転異性体からなる）内で可能な水素結合ネットワークを特定する。第２のステップとして、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）エネルギー関数、満足度（すべての埋もれた極性原子が水素結合に関与する）、およびユーザ定義の選択肢に基づいてネットワークをスコア化し、ランクを付ける。次いで、第３のステップとして、最良のネットワーク、または最良のネットワークの組合せを設計足場上に繰り返し配置し、足場内の残りの位置についてネットワーク周辺を設計し、回転異性体を最適化するためのいずれの以降のＲｏｓｅｔｔａ（商標）方法のための「シード」として役立つ制約とともに相対的な位置に保持する。
【００５２】
ステップ１．所定の探索空間（図１Ａ〜Ｂ）においてすべての可能性がある水素結合ネットワークを特定するための徹底的な探索。
ＨＢＮｅｔ（商標）はＲｏｓｅｔｔａ（商標）の相互作用グラフ（ＩＧ）データ構造を利用し、最初に側鎖水素結合およびレナード−ジョーンズ（立体反発）エネルギー項だけでそれにデータを読み込む。グラフのノードは、すべての指示できる残基またはパック可能な残基の残基位置であり、エッジは、それらの残基間の推定上の相互作用を表し、相互作用する回転異性体のすべての対（すべてのアミノ酸の種類が考えられる）の間の二体エネルギーを保存するスパース行列を示している。水素結合と反発エネルギーを使用するだけで、好ましい（低エネルギー）水素結合幾何学的形状を有し、および立体的衝突がない、すべての回転異性体対の即時検索が可能になる。一部の実施形態において、モンテカルロまたは類似のランダム化方法を用いて、この回転異性体相互作用空間を探索することができる。
【００５３】
別の実施形態において、回転異性体相互作用空間全体を探索することができる。回転異性体相互作用空間全体を通しての探索は、相互作用グラフの再帰的深さ優先探索または再帰的幅優先探索を用い、すべての適合する非衝突結合性の水素結合側鎖回転異性体を列挙して、行うことができる。探索はグラフのノードをばかりでなく、各エッジが指す行列も横断する（各ノード当たり複数の回転異性体、および各エッジに対して複数対の回転異性体）ので、このグラフのグラフ横断アルゴリズムの実行は、ネットワークの連結ノード（残基位置）を考慮することができ、ならびに各ノードでの特定の回転異性体の原子間の水素結合を考慮する。この後者の水素結合基準はこのグラフ横断アルゴリズムについての追加のステップと動作を必要とする。
【００５４】
新しい水素結合回転異性体が考慮されるたびに、グラフ横断アルゴリズムは、そのネットワーク内のいずれの既存の回転異性体とも確実に衝突しないように回転異性体を確認することができる。それが受け入れられる場合、再帰的呼び出しはこの回転異性体で行われる。これらの再帰呼び出しは、停止状態に達する、すなわちさらなる水素結合相互作用が見つからない、またはネットワークが最初の開始残基の１つに戻って連結する、のいずれか、まで継続する。
【００５５】
ＡｓｎおよびＧｌｎなどの一部の極性アミノ酸は３つ以上の水素結合を形成することができ、水素結合ネットワークの分岐点となり、深さ優先探索はこれらの分岐アミノ酸を見逃す。これを説明すると、ルックバック機能は、１または複数の同一の回転異性体を共有するネットワークを特定し、衝突または対立する残基を調べた後、それらを完全なネットワークにマージする。冗長なネットワークを除去する。
【００５６】
ＨＢＮｅｔ（商標）、（「ＨＢＮｅｔＳｔａｐｌｅＩｎｔｅｒｆａｃｅ（商標）」）の一例を書き込んだ。グラフ横断は分子間界面の残基位置で開始される。ＨＢＮｅｔ（商標）のこの実行により、２つの利点が提供される：第１に、界面位置のみで横断を開始することにより、検索空間が縮小され、実行時間の速度が上がる。第２に、界面でネットワークだけを確実に見つける。これは本研究における手法の目標であり、各ネットワークにおいて少なくとも２つの残基が異なるポリペプチド鎖に由来することを必要とすることで、ネットワークが分子間界面にわたることを確実にする。各開始残基について、ＨＢＮｅｔＳｔａｐｌｅＩｎｔｅｒｆａｃｅ（商標）は各エッジを繰り返し、各エッジで、ネットワークは、閾値（デフォルト＝−０．７５）よりも低い相互作用エネルギーで、回転異性体対のために開始される。相互作用エネルギーが水素結合および反発寄与だけからなっているので、正エネルギーは衝突を示し、負エネルギーは水素結合を示し、閾値を設定することで、好ましい（低エネルギー）幾何学的形状を有する水素結合と、より速い計算実行時間との両方の選択が可能になる。複数の再帰的ステップのために、実行時間は水素結合回転異性体対の数に依存して指数関数的（閾値がそれほど厳格に設定されないと、上昇する）である。
水素結合回転異性体対の総数は、入力構造の間で大きく異なり、事前に算出されることができないが、広範囲の実験的テストを介して、閾値は−０．６５〜０．８５の範囲で見いだされ、好ましい水素結合がもたらされ、および所定の入力構造について多数の可能なネットワークの下流設計を含む完全な設計の実行のために約０．２〜１０分のオーダーで実行する。
【００５７】
ステップ２．すべての水素結合のスコアとランク付け。
一旦すべての可能性があるネットワークが特定されると、特定されたネットワークはスコア化され、「最良の」ネットワークを決定するためにランクを付けられる。ネットワークごとに、埋没した極性原子は溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＡ）が特定され、埋没した重原子ドナーまたはアクセプターを有するが、水素結合を形成しない（満たされてない）ネットワークは除去される。次いで、残りのネットワークは、満たされてない極性水素の最小数に基づいて、ランクを付けられる。次いでネットワークは、バックグラウンド参照構造と関連して、互いにスコア化され、足場におけるすべての指示できる位置またはパック可能な位置は、ポリアラニン、足場上に配置されたネットワーク回転異性体に変異され、次いでネットワークは完全なＲｏｓｅｔｔａ（商標）エネルギー関数（ｔａｌａｒｉｓ２０１３）でスコア化される。
【００５８】
ステップ１の間、側鎖−主鎖水素結合は、主鎖が固定されているので（どんな所定の回転異性体に対しても側鎖−主鎖水素結合の数は一定である）、明示的に考慮されない。ステップ２の間、ネットワークが参照構造上に配置されるとき、側鎖−主鎖水素結合はスコア化され、したがって、満足度のために評価（埋没した極性原子のどれくらいが、水素結合に関与するか）に含まれる。したがって、それらが明示的に検索されなくても、ＨＢＮｅｔ（商標）は側鎖−主鎖水素結合を含むネットワークを捕える。主鎖極性原子へのさらなる水素結合を有するネットワークは一般に、結合性および満足度が改善されているという点で主鎖への水素結合がない類似したネットワークよりもよくスコア化する。
【００５９】
ステップ３．最良スコアの水素結合ネットークそれぞれについて設計を行う。
ステップ２でランク付けした最良ネットワークを、入力足場上に繰り返し配置し、ＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔｓ（商標）へ、およびユーサーが定義した残りの残基位置の設計のために戻す。原子対制約は、ネットワークで水素結合を形成する各原子対に対して自動的にオンになる。これらの制約は、下流設計の間、ネットワーク残基が確実に相対位置に固定されることを確実にするように実行される設計の残部にわたって追跡される。ＨＢＮｅｔ（商標）も、以降のＲｏｓｅｔｔａ設計実行において同じ制約を指定するのに使用することができるＲｏｓｅｔｔａ（商標）制約（．ｃｓｔ）ファイルを出力する。
【００６０】
Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）命名においてこれらの原子対「制約」は、制約が破られる場合（すなわち、水素結合が壊れている場合）回転異性体が移動可能であり、およびエネルギーペナルティが適用されるという点で実際に「拘束」である。  ネットワーク原子の座標を単に固定することとは対照的に、この手法はネットワーク回転異性体の小さい動きを可能にし、ネットワーク周辺にさらなる回転異性体をパッキングするためのより多くの解決策を可能にする。ネットワーク周辺のそのタイトパッキング、ならびにすべての埋没した重原子ドナーおよびアクセプターの満足度が明らかになった傾向は、設計の成功にとって最高であり、ネットワーク周辺の水素結合幾何学的形状は理想的だが、パッキングが不十分であり、および／またはドナー／アクセプターが満たされてないよりも、並みの水素結合幾何学形状を有するネットワークにおいてすべての極性原子を満たす水素結合を有することがより重要である。
【００６１】
同じ界面で複数のネットワークを組み合わせることも考えられ、ユーザは指定することができる。１つの入力構造が１つの出力構造をもたらす（配列設計および組合せ側鎖の最適化によって判明した最低エネルギー解）典型的なＲｏｓｅｔｔａ（商標）設計とは異なり、この手法は、各入力構造について出力される数百もの設計の可能性を可能にする。
【００６２】
探索空間を定義する（アミノ酸型および側鎖回転異性体がネットワーク検索中に許可される）
ＨＢＮｅｔ（商標）は所定の探索空間内でネットワークを探索するだけである（すべての可能なアミノ酸型のすべての可能な回転異性体が所定の入力主鎖のために考慮される）。これはユーザが定義することができる。ＨＢＮｅｔ（商標）は、ＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔｓ（商標）フレームワーク内ので「ムーバー」として機能し、「タスクオペレーション」を渡され、どの残基位置が固定される、パックできる（アミノ酸型は固定されるが、側鎖立体構造は固定されない）、および指示できる、すなわち指示できる位置について、タスクオペレーションもどのアミノ酸型が各位置で許可されるかを指定できる。どのようなタスクオペレーションがない場合でもデフォルト設定は、すべての残基が設計のために考慮され、すべての極性アミノ酸がネットワーク検索において考慮されることである。  
【００６３】
足場においてすべての位置は、指示できるように設定することがありえ、ＨＢＮｅｔ（商標）の場合、埋没位置（溶媒接触可能表面積（ＳＡＳＳ）に基づいて定義される）はどのような非荷電極性アミノ酸であっても可能であり、溶媒露出位置はどのような極性アミノ酸であっても可能である。
【００６４】
計算設計
同じ軸の周りの２つ以上のヘリックススーパーコイルのパラメータを独立して変えるために、Ｃｒｉｃｋコイルドコイル・パラメータの一般化を使用し、前述のようにパラメータを定めた。各単量体サブユニットは、少なくとも１つの内側ヘリックスおよび外側ヘリックスを有する（図１Ｄ）。第１の内側ヘリックスのスーパーコイル相（Δω０  ｉｎ）および第１の内側ヘリックスのｚ−オフセットを０に固定して、相対基準点として用い、
すべての他のパラメータは、スーパーコイルねじれ（ω０）およびヘリックスねじれ（ω１）を除いて内側ヘリックスと外側ヘリックスとの間で独立して変化した。これらの２つのパラメータを結合して、巻き方を決定するので、理想的な値をω０とともにω１のために用い、ω１は大多数の設計で内側ヘリックスと外側ヘリックスとの間で一定に保持されている。左巻きスーパーコイルは、ω０＜０およびω１＝１０２．８５から生じ、右巻きスーパーコイルはω０＞０およびω１＝９８．１８から生じ、直線状の束（スーパーコイル形状でない）はω０＝０およびω１＝１００から生じる。２つの内側ヘリックスと１つの外側ヘリックスを有する、平行した６ヘリックス二量体設計（３Ｌ６ＨＣ２）の場合、外側ヘリックスのω０を内側ヘリックスのそれから偏向することができたが、右巻きスーパーコイルを維持するために正であることが必要とされた。
【００６５】
スーパーコイル二量体主鎖の追加の組は、内側ヘリックスのピッチに適合させるために、以下の式によって外側ヘリックスのピッチを抑制することによって生成した。
【００６６】
【数１】
2019519468.tif 000023
式中：
ω’０：外側ヘリックスのスーパーヘリックスねじれ
ω０：内側ヘリックスのスーパーヘリックスねじれ
Ｒ’：外側ヘリックスＲのスーパーヘリックス半径
Ｒ：外側ヘリックスのスーパーヘリックス半径
ｄ：残基当たりの上昇（１．５１に設定）
【００６７】
ピッチを抑制することで、結果として外側ヘリックスがヘリックス束の全長にわたって内側へリックスへの多くの接触を維持することになり、異なる水素結合ネットワークおよびパッキング解決策が可能になる。
【００６８】
ＨＢＮｅｔ（商標）は、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）ソフトウェアスイートの一部としてＣ＋＋で書かれている：ＨＢＮｅｔ（商標）は、モジュラーとして開発され、すべて対称的なＲｏｓｅｔｔａ（商標）アプリケーション、ならびにＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔｓ（商標）ＸＭＬフレームワークと互換性があり、そのため、ほとんどの既存の設計プロトコルにプラグインすることが可能であり、ユーザは設計タスクに特異的な選択肢をカスタマイズすることができる。ＨＢＮｅｔ（商標）は抽象基底クラスとして書かれ、該クラスから特殊化した「ムーバー」クラスは、特定の設計例のために派生することができる。特に、本明細書に記載の「ＨＢＮｅｔＳｔａｐｌｅＩｎｔｅｒｆａｃｅ（商標）」のインスタンスは、分子間界面ＡＢにわたる水素結合ネットワークを検索するために書かれた。
【００６９】
表１は、設計計算、設計計算のために用いられるコマンドラインおよびフラグの例、ならびにカスタマイズしたスコア重み付け情報のために用いられるＲｏｓｅｔｔａＳｃｒｉｐｔｓ（商標）ＸＭＬの例を示す。
【００７０】
【表３−１】
2019519468.tif 000024
【表３−２】
2019519468.tif 000025
【表３−３】
2019519468.tif 000026
【表３−４】
2019519468.tif 000027
【表３−５】
2019519468.tif 000028
【表３−６】
2019519468.tif 000029
【００７１】
設計計算
パラメータ的に生成した主鎖は、まず、理想的な主鎖生成によって加えられたどのようなねじりひずみでも軽減するために、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）で直交座標空間の最小化を使用して、規則化する。トポロジーそれぞれについて、内側ヘリックスだけについて最初の探索を行って、最も好ましいコア側鎖パッキングをもたらしたパラメータ範囲を特定し、次いで、これらの内部ヘリックスパラメータ範囲と関連して外側ヘリックスパラメータを広範囲にわたってサンプリングして、何万もの主鎖を生成した。ＨＢＮｅｔ（商標）を使用して、分子間界面に広がり、重原子ドナーおよびアクセプターがすべて満たされ、および水素結合に寄与する少なくとも３つの側鎖を含有する水素結合ネットワークのためのこれらの主鎖を探索した。埋没した界面位置について、非荷電極性アミノ酸だけを考慮し、少なくとも部分的に溶媒に露出されていた残基位置については、すべての極性アミノ酸を考慮した。より微細なサンプリングは、好ましい水素結合ネットワークおよび疎水性パッキングの両方に適合し得る主鎖パラメータ周辺で行った。単量体サブユニットのヘリックスを単鎖に結合し、構築されたタンパク質を、ＨＢＮｅｔ（商標）と併用する対称的なＲｏｓｅｔｔａ（商標）配列設計計算を使用して設計した。
【００７２】
設計を評価するための選択基準および測定基準
本明細書に記載の設計について、ステップ１の後に、大体約１００，０００のオーダーで、ネットワークを検出したが、あるとしても、ステップ２で概要を述べた基準のすべてをパスし、次いで先に進んだネットワークはわずかに少数であった。下流設計（ステップ３）の後、ネットワーク周辺のパッキングを評価した。下流設計の間、水素結合ネットワークは抑制されるので、制約がない場合ネットワークが損なわれずにどれほどよく存続しているかを測定するために、制約なしでモデルを最小化し、側鎖をリパックした。
【００７３】
最後に、設計された構造が「フォールド・アンド・ドック」対称的なＲｏｓｅｔｔａ（商標）構造予測計算によってどれくらい綿密に再現されたかについて、モデルを評価した。伸長鎖から開始し、構築されたオリゴマーのエネルギーを、標的巡回対称群の単量体サブユニットに関連するリジッドボディトランスフォームに沿って単量体の内部自由度についてモンテカルロサンプリングによって最適化した。漏斗様の形をしたエネルギー地形を有する設計に優先順位は与えられ、ａｂ  ｉｎｉｔｉｏ予測された構造は設計された構造に収束され、インシリコで整合性チェックとして用いられ、アミノ酸配列が別の状態の形をとることができる可能性を調べる。複数のネットワークを有し、分子間界面での極性成分が高い多くの設計は、強い「漏斗状」を示さなかったが、しかし大きな「エネルギーギャップ」を示し、設計された構造が、最初の「フォールド・アンド・ドック」計算の間にサンプリングしたいずれの構造よりもエネルギーが有意に低かった。実験的試験の選択肢として、大きなエネルギーギャップを有する設計も考慮された。
【００７４】
実験的検証のために選択された設計は、計算設計方法から生じる正確なアミノ酸配列で合成された。これに対する唯一の例外は、ＴｙｒまたはＴｒｐ残基が欠如している設計についであった。精製および濃度測定のためのＡ２８０をモニターするために非界面位置で表面にＴｙｒを加えた。さらに、数例において、荷電された表面残基を修飾して、緩衝液ｐＨからタンパク質の推定等電点（ｐｌ）を離した。
【００７５】
ループ閉鎖
単量体のヘリックスを単鎖に結合するために、高分解能結晶構造において、ＤＳＳＰで特定された、５以下の残基からなるループを介して２つのヘリックス領域にわたるフラグメントで構成される主鎖試料の網羅的なデータベースを生成した。このデータベースで、最適化された重ね合わせアルゴリズムを使用して、フラグメントの末端残基の強固なアライメト、および目標をパラメトリックに設計された主鎖を介して、候補ループを特定した。
【００７６】
そして、厳密なアライメント公差（０．３５Å以内  ＲＭＳＤ）下の候補は、目標主鎖重原子座標への厳しい座標制約および整列した候補主鎖重原子座標への穏やかな座標制約の下、ねじれ空間の最小化により目標主鎖へ完全に整列した。次いで、候補ループ配列は、ループ主鎖のアライメントを介して生成されたソース構造データベースへの配列プロファイル制約の下で設計され、および最終ループ設計として最低スコアリング候補が選択された。
【００７７】
構造分析
タンパク質ＢＬＡＳＴ（商標）探索をＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）  Ｗｅｂサーバを使用して実行し、１０．０のＥｘｐｅｃｔ閾値（Ｅ値カットオフ）およびＢＬＯＳＵＭ６２置換行列を用いて、すべての非冗長タンパク質配列（「ｎｒ」データベース）に対して探索した。
【００７８】
結晶構造および設計モデルを、すべての重原子を用いる構造ベースのアライメントによって重ねた。このアライメントから、ＲＭＳＤをすべてのα炭素原子にわたり、および水素結合ネットワーク残基の重原子にわたり計算した。
【００７９】
我々の設計の構造的独自性を調べるために、ＭＩＣＡＮアライメントアルゴリズムを用いて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）の同じ対称性群のホモオリゴマーバイオユニットに対して探求した。
【００８０】
結晶化二環構造についてのパラメ―タを計算するために、「グローバル対称」最適化オプションとともにコイルドコイルクリックパラメータ化（ＣＣＣＰ）Ｗｅｂサーバを使用し、目的の構造としては、すべて対称ホモオリゴマーである。パラメータが所定の構造の内側ヘリックスと外側ヘリックスとの間で変化したので、各結晶構造について、パラメータはヘリックスの内側環と外側環に対して別々に計算し、ヘリックスの内側環のすべてのヘリックス残基、またはヘリックスの外側環のすべてのヘリックス残基のいずれかに対応する．ｐｄｂファイルを入力した。
【００８１】
図面のためのすべての構造画像は、ＰｙＭＯＬ（商標）を使用して生成した。
【００８２】
実験的方法
合成遺伝子の構築
合成遺伝子は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ）から得たものであり、ｐＥＴ２１−ＮＥＳＧまたはｐＥＴ−２８ｂ＋大腸菌発現ベクターのいずれかに送達して、各ベクターのＮｄｅｌ部位およびＸｈｏｌ部位に挿入した。ｐＥＴ２１−ＮＥＳＧ構築物については、合成ＤＮＡはＣ末端ヘキサヒスチジンタグとともにフレーム内にクローニングした。ｐＥＴ−２８ｂ＋構築物については、合成ＤＮＡはＮ末端ヘキサヒスチジンタグおよびトロンビン切断部位とともにフレーム内にクローン化し、停止コドンはＣ末端に導入した。タンパク質発現のために、プラスミドを化学的にコンピテントな大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＳｔａｒまたはＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒ−ｐＬｙｓＳ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換した。酵母ツーハイブリッドアッセイのための構築物は、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーによって形成し、挿入物は鋳型としてｐＥＴ−２１またはｐＥＴ−２８大腸菌発現ベクターからＰＣＲによって生成したか、またはｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）（ＩＤＴ）としての注文で生成した。すべてのプライマーおよびｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）からの注文であった。
【００８３】
タンパク質発現および精製
５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン（ｐＥＴ２１−ＮＥＳＧ）または３０μｇ／ｍＬのカナマイシン（ｐＥＴ−２８ｂ＋）の存在下で、スターター培養物をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地で、３７℃で一晩、または、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈで、３７℃で８時間のいずれかで増殖させた。スターター培養物を用いて、抗生物質含有５００ｍＬのＬＢ、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  ＢｒｏｔｈまたはＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ  ＩＩ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を播種した。培養物は０．６〜０．９のＯＤ６００で０．２〜０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、１８℃で一晩発現させた（その後多くの設計物も３７℃で４時間発現させたが、収率に注目すべき相違はなかった）。細胞を、５０００ｒｃｆ、４℃で１５分間遠心分離することによって収集して、溶解緩衝液（２０  ｍＭのＴｒｉｓ、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール、室温でｐＨ８．０）に再懸濁させ、次いでリゾチーム、デオキシリボヌクレアーゼ、およびＥＤＴＡフリーカクテルプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）または１ｍＭのＰＭＳＦの存在下で超音波処理によって溶解した。可溶化液を４℃、１８，０００ｒｐｍで少なくとも３０分間、遠心分離することによって清澄化させ、溶解緩衝液で前平衡させたＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）カラムに加えた。カラムを５カラム体積（ＣＶ）の洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、３００ｍＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのイミダゾール、室温でｐＨ８．０）で３回洗浄し、続いて３〜５ＣＶの高塩分洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ＭのＮａＣｌ、３０ｍＭのイミダゾール、室温でｐＨ８．０）で洗浄し、次いで５ＣＶの洗浄緩衝液で洗浄した。タンパク質は、２０ｍＭのＴｒｉｓ、３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾールと共に、室温でｐＨ８．０で溶出させた。タンパク質は、損なわれていないＨｉｓタグとともに、最初にＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＣＤで選別した。可能ならば、タグを切断し、試料を結晶構造解析、ＳＡＸＳ、およびＧｄｍＣｌ溶融のためにさらに精製した。
【００８４】
ｐＥＴ−２８構築物のＮ末端ヘキサヒスチジンタグを室温で４時間または一晩、制限グレードトロンビン（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ６９６７１−３）を用いて切断し、酵素の試料液への希釈は１：５０００を用いた。２時間後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって完全な切断が観察され、少なくとも１８時間までの時点で、疑似切断は観察されなかった。トロンビンを添加する前に、緩衝液を溶解緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、３００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのイミダゾール）に取り替えた。切断後、試料をベンズアミジン樹脂カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｉｓｈｅｒ  ＃４５−０００−２８０）に加え、樹脂を再懸濁させ、試料を章動させながらカラム上で３０〜６０分間インキュベートした。通過画分を収集し、１．５ＣＶの溶解緩衝液でベンズアミジン樹脂を洗浄することによって追加試料を得た。１ｍＭのＰＭＳＦを添加して、残存する遊離トロンビンも阻害した。次いで、試料を追加のＮｉ−ＮＴＡカラムに移し、１．５のＣＶの溶解緩衝液で洗浄した。タンパク質は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いたＦＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって、さらに精製した。ＳＡＸＳのためのゲル濾過緩衝液は、２０ｍＭのＴｒｉｓ，室温でｐＨ８．１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２％グリセロールであった。結晶構造解析のために、２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌを用いた。設計されたタンパク質のいずれもシステインを含まなかったので、還元剤は加えなかった。
【００８５】
サイズ排除クロマトグラフィー、多角度光散乱（ＳＥＣ−ＭＡＬＳ）
ＳＥＣ−ＭＡＬＳ実験では、ｍｉｎｉＤＡＷＮ  ＴＲＥＯＳ多角度静的光散乱に接続されたＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００カラムおよびＯｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ  （領域拡張型屈折計）検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ  ＣＡ，ＵＳＡ）を使用した。タンパク質試料をＴＢＳ（ｐＨ  ８．０）またはＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）に３〜５ｍｇ／ｍＬの濃度で注入した。溶出種の重量平均モル質量（Ｍｗ）、ならびに数平均モル質量（Ｍｎ）を推定するために、ＡＳＴＲＡＴＭ（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ソフトウェアを使用してデータを分析し、多分散指数（ＰＤＩ）によって単分散性を評価した＝Ｍｗ／Ｍｎ。
【００８６】
円偏光二色性（ＣＤ）測定
ＣＤ波長走査（２６０〜１９５ｎｍ）および温度溶融（２５〜９５℃）は、ＪＡＳＣＯ  Ｊ−１５００またはＡＶＩＶモデル４２０  ＣＤ分光計を用いて測定した。温度溶融は２２２ｎｍで吸収シグナルがモニターされ、４℃／分の加熱速度で実施した。タンパク質試料は、０．１ｃｍのキュベットにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４中０．２〜０．５ｍｇ／ｍＬであった。
【００８７】
塩化グアニジニウム（ＧｄｍＣｌ）滴定は、２５℃、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中で、自動滴定装置とともに同じ分光計上で実行し、スターラーバー付１ｃｍキュベット中の０．０２５〜０．０６ｍｇ／ｍＬ濃度のタンパク質を用いて２２２ｎｍでモニターした。各滴定は、ステップごとに１分間の混合時間で少なくとも４０の均一に分配された濃度点からなった。滴定剤溶液は、ＰＢＳ＋ＧｄｍＣｌ中の同じ濃度タンパク質からなり、ＧｄｍＣｌ濃度は屈折率によって決定した。
【００８８】
内側ヘリックスペプチド
Ｎ末端アセチル化およびＣ末端アミド化によるペプチド２Ｌ４ＨＣ２＿９＿内側および２Ｌ６ＨＣ３＿１３＿内側は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ）からの注文であった。２Ｌ４ＨＣ２＿９＿内側＝ＳＳＤＹＬＲＥＴＩＥＥＬＲＥＲＩＲＥＬＥＲＥＩＲＲＳＮＥＥＩＥＲＬＲＥＥＫＳ（配列番号９３）、および２Ｌ６ＨＣ３＿１３＿内側＝ＴＥＲＥＮＮＹＲＮＥＥＮＮＲＫＩＥＥＥＩＲＥＩＫＫＥＩＫＫＮＫＥＲＤ（配列番号９４）。ＣＤ実験のためにペプチドはＰＢＳ  ｐＨ７．４に溶解し、さらにＰＢＳ  ｐＨ７．４に透析した。
【００８９】
タンパク質試料の結晶化
精製したタンパク質試料は、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ  ８．０および１００ｍＭのＮａＣｌ中で約１２ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。試料は、以下の結晶化スクリーンを利用して、Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｒｏｂｏｔ（Ａｒｔ  Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）による疎行列法（ＪａｎｃａｒｉｋおよびＫｉｍ，１９９１）を使用して選別した：Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｓｃｒｅｅｎ（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｃｒｅｅｎ、  ＰＥＧ／Ｉｏｎ、ＩｎｄｅｘおよびＰＥＧＲｘ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｌｉｓｏ  Ｖｉｅｊｏ，ＣＡ）。異なる設計物の結晶化のための最適条件が、以下の通り判明した。２Ｌ６ＨＣ３＿６、０．２Ｍのフッ化ナトリウム、０．１ＭのＭＥＳ  ｐＨ５．５および２０％のＰＥＧ  ４００；２Ｌ６ＨＣ３＿１２、２．２Ｍのマロン酸ナトリウム  ｐＨ５．０；２Ｌ６ＨＣ３＿１３、０．０６Ｍのクエン酸、０．０４ＭのＢＩＳ−ＴＲＩＳプロパンｐＨ４．１および１６％のＰＥＧ  ３，３５０；２Ｌ８ＨＣ４＿１２、０．２Ｍの酢酸ナトリウム三水和物、０．１ＭのＴｒｉｓ塩酸塩ｐＨ８．５および３０％のＰＥＧ  ４，０００；３Ｌ６ＨＣ２＿２、０．１Ｍの酢酸ナトリウム三水和物ｐＨ４．５および３．０Ｍの塩化ナトリウム；２Ｌ４ＨＣ２＿２３、０．２Ｍの塩化リチウムおよび２０％のＰＥＧ  ３，３５０；２Ｌ４ＨＣ２＿９、０．１Ｍのクエン酸三ナトリウム無水物  ｐＨ５．０、３０％のＰＥＧ  ＭＭＥ  ５５０；２Ｌ４ＨＣ２＿１１、０．１ＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８．５および２．０Ｍの硫酸アンモニウム；５Ｌ６ＨＣ３＿１、０．１Ｍのクエン酸  ｐＨ３．５および３．０Ｍの塩化ナトリウム；および２Ｌ４ＨＣ２＿２４は２０ｍｇ／ｍＬまで濃縮され、０．１Ｍのクエン酸  ｐＨ３．５、２．０Ｍの硫酸アンモニウム中で結晶化した。結晶は、０．２μＬのタンパク質溶液と０．２μＬのリザーバー溶液の１：１混合物からなる滴下による、シッティングドロップ蒸気拡散法によって、１〜１４日後に得られた。
【００９０】
Ｘ線データ収集および構造決定
設計されたタンパク質の結晶は、１５〜２０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含有するリザーバー溶液中に入れ、次いで液体窒素中でフラッシュ冷却した。Ｘ線データセットは、Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＬＢＮＬ）でのＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  ＳｏｕｒｃｅのＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙビームライン５．０．１、８．２．１および８．２．２のためにＢｅｒｋｅｌｅｙ  Ｃｅｎｔｅｒで収集した。データセットは、ＨＫＬ２０００を用いてインデックスをつけ、縮小した。すべての設計構造は、初期の探索モデルとして設計モデルを用いたＰｈｅｎｉｘスイート内のプログラムＰＨＡＳＥＲによる分子置換法によって決定した。分子置換から得られた原子位置および結果として生じた電子密度マップを用いて、設計構造を構築し、結晶学的精密化およびモデルの再構築を開始した。構造精密化は、ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅプログラムを使用して実行した。ＣＯＯＴを使用する手動再構築および水分子の付加により、最終モデルの構築が可能になった。結合長、角度および二面角のための理想的な幾何学的形状との平均二乗偏差の差は、Ｐｈｅｎｉｘで算出した。すべての最終モデルの全体の立体化学的性質は、プログラムＭＯＬＰＲＯＢＩＴＹを使用して評価した。
【００９１】
小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）
試料は、室温でｐＨ８．０の２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２％、１５０ｍＭのＮａＣｌと２％のグリセロール中でのゲル濾過によって精製し、カラムの空隙容量に先行する画分をバッファサブトラクションのためのブランクとして使用した。散乱計測は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  ＳｏｕｒｃｅでＳＩＢＹＬＳ  １２．３．１  ビームラインで実行した。Ｘ線波長（λ）は、１Åであり、試料からＭａｒ１６５検出器までの距離は１．５ｍであり、０．０１〜０．３Å−１の散乱ベクトルｑ（ｑ＝４πｓｉｎθ／λ、２θは散乱角である）の範囲に対応する。データセットは、１２ｋｅＶで０．５、１および６秒間の曝露を使用して収集した。低いｑシグナルの飽和または放射線損傷をもたらす長い曝露の場合、データセットは、同じ試料からの低い曝露とマージした。濃度依存的効果を試験するために、試料ごとに、データを少なくとも２つの異なる濃度、３〜７ｍｇ／ｍＬ範囲の「高」濃度試料と、１〜２ｍｇ／ｍＬ範囲の「低」濃度試料とで収集した。データは、前述のようにＳｃＡｔｔｅｒソフトウェアパッケージを用いて分析した。濃度依存性を示さなかった試料については、信号対雑音およびギニエフィッティングに基づく最善のデータセットを分析のために使用した。ＦｏＸＳを用いて、設計モデルを実験的な散乱プロファイルと比較し、適合（Ｘ）値の性質を算出した。設計モデルについて、発現ベクターによって導入された余分な残基をＲｏｓｅｔｔａ（商標）リモデルを用いて計算モデルに加えたので、設計配列は実験試料の配列と適合した。溶液中のこれらの余分なタグ残基の立体配座柔軟性をとらえるために、１設計当たり１００の独立モデルを生成した。次いで、これらの１００のモデルをＲｏｓｅｔｔａ（商標）によってクラスター化し、偏りを避けるために、最大のクラスターのクラスター中心を、実験データに適合するために用いる単一の代表的なモデルとして選択した。
【００９２】
酵母ツーハイブリッド法
Ｇｉｂｓｏｎアセンブリーを使用して、タンパク質バインダーをＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインを有するプラスミド（ｐＯＢＤ２）およびまたはＧＡＬ４転写活性化ドメインを有するプラスミド（ｐｏＡＤ）にクローン化し、次いで配列を確認した。試験したバインダーの対ごとに、修飾ＬｉＯＡｃ形質転換プロトコルを用いて、酵母株ＰＪ６９−４ａをプラスミドの適切な対で形質転換し、形質転換した酵母のレスキューおよび選択はトリプトファンおよびロイシンがない最小液体培地で行った。アッセイの前に、形質転換細胞を１：１０で希釈し、トリプトファンおよびロイシンがない新鮮な最小培地で、１６時間増殖させた。この最初のインキュベーションの後、再び細胞を１：１０で希釈し、振盪させながら、９６ウェルプレート中で増殖させた。今回の培地はトリプトファン、ロイシンおよびヒスチジンがない２００μＬの最小培地であった。ＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインとの間のタンパク相互作用は細胞がヒスチジンの非存在下で増殖するのに必要であるので、相互作用の成功は増殖速度によって近づくことができる。細胞の光学密度（ＯＤ）を１０分ごとに４８時間にわたり測定し、増殖速度を６０分ごとの間隔で算出した。１時間当たり（ｍａｘＶ）の最大増殖速度をバインダー対間の相互作用の代用として使用した。
【００９３】
質量分析
ゲルバンドを単離し、重炭酸アンモニウムで洗浄し、６０℃で１５分間ＤＴＴで還元した。冷却後、還元チオール基をアルキル化するために、室温の暗所で１５分間、ゲル部分をヨードアセトアミドで処理した。プロテアーゼ消化を、酵素に対する基質、濃度が１０：１の配列グレードトリプシンで４時間、３７℃で遂行した。ＬＣＭＳ／ＭＳ分析の前に、ペプチド試料を真空で乾燥し、０．１％ギ酸に再懸濁した。液体クロマトグラフィーは、Ｃ１２樹脂を充填した３ｃｍのカシルフリットトラップの下流にＣ１８樹脂を充填した１５ｃｍのカラムにわたり６０分間の勾配からなっていた。スペクトルは、データ依存性取得を用いてＴｈｅｒｍｏ  Ｖｅｌｏｓ  Ｐｒｏ質量分析計に収集した。各試料に３つの技術的反復で注入し、ペプチドはタンパク質推測のためにＳＥＱＵＥＳＴとＰｅｒｃｏｌａｔｏｒを使用し、続いてＩＤＰｉｃｋｅｒで特定した。
【００９４】
さらなる態様において、方法が提供される。コンピューティングデバイスは、１または複数の分子に関連した水素結合ネットワークのための探索空間を決定する。探索空間は、水素結合ネットワークに関連した複数の残基に関連した複数のエネルギー項を含む。コンピューティングデバイスは探索空間を探索して、複数のエネルギー項に基づいて１または複数の水素結合ネットワークを特定する。１または複数の特定された水素結合ネットワークのスコアに基づいて、コンピューティングデバイスは、特定された１または複数の水素結合ネットワークを選別して、１または複数の選別された水素結合ネットワークを特定する。コンピューティングデバイスは、１または複数の選別された水素結合ネットワークに関連した出力を生成する。
【００９５】
別の態様において、コンピューティングデバイスが提供される。コンピューティングデバイスには、１または複数のデータプロセッサおよびコンピュータ読み取り可能な媒体が含まれる。コンピュータ読み取り可能な媒体は、実行されると、コンピューティングデバイスに機能を実行させる少なくともコンピュータ読み取り可能な命令を格納するように構成されている。機能としては、探索空間が水素結合ネットワークに関連した複数の残基に関連する複数のエネルギー項を含む場合、１または複数の分子に関連する水素結合ネットワークについての探索空間を決定すること；探索空間を探索して、複数のエネルギー項に基づいて１または複数の水素結合ネットワークを特定すること；１または複数の特定された水素結合ネットワークのスコアに基づいて、特定された１または複数の水素結合ネットワークを選別して、１または複数の選別した水素結合ネットワークを特定すること；および１または複数の選別した水素結合ネットワークに関連する出力を生成することが含まれる。
【００９６】
別の態様において、コンピュータ読み取り可能な媒体が提供される。コンピュータ読み取り可能な媒体は、コンピューティングデバイスの１または複数のプロセッサによって実行されると、コンピューティングデバイスに機能を実行させる少なくともコンピュータ読み取り可能な命令を格納するように構成されている。機能としては、探索空間が水素結合ネットワークに関連した複数の残基に関連する複数のエネルギー項を含む場合、１または複数の分子に関連する水素結合ネットワークについての探索空間を決定すること；探索空間を探索して、複数のエネルギー項に基づいて１または複数の水素結合ネットワークを特定すること；１または複数の特定された水素結合ネットワークのスコアに基づいて、特定された１または複数の水素結合ネットワークを選別して、１または複数の選別された水素結合ネットワークを特定すること；および１または複数の選別された水素結合ネットワークに関連する出力を生成することが含まれる。
【００９７】
別の態様において、装置が提供される。装置には、探索空間が水素結合ネットワークに関連した複数の残基に関連する複数のエネルギー項を含む場合、１または複数の分子に関連する水素結合ネットワークについての探索空間を決定する手段；探索空間を探索して、複数のエネルギー項に基づいて１または複数の水素結合ネットワークを特定する手段；１または複数の特定された水素結合ネットワークのスコアに基づいて、特定された１または複数の水素結合ネットワークを選別して、１または複数の選別した水素結合ネットワークを特定する手段；および１または複数の選別した水素結合ネットワークに関連する出力を生成する手段が含まれる。
【００９８】
コンピューティング環境の例
図６は、コンピューティングネットワークの一例のブロック図である。本明細書に開示する上述の手法の一部またはすべて、例えば、これに限定されないが、ソフトウェア、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）ソフトウェアスイート、ＲｏｓｅｔｔａＤｅｓｉｇｎ（商標）、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）アプリケーション、および／または本明細書に記載の他のコンピュータソフトウェアとコンピュータハードウェアの一部として開示される、および／またはこれらによって実行される手法は、コンピューティングデバイスの一部でありえ、および／または該装置によって実行され得る。例えば、図６は、ネットワーク６０６を介して、クライアントデバイス６０４ａ，６０４ｂおよび６０４ｃ、ならびにタンパク質データベース６０８と通信するように構成されるタンパク質設計システム６０２を示す。一部の実施形態において、タンパク質設計システム６０２および／またはタンパク質データベース６０８は、本明細書に記載の方法および手法の一部またはすべてを実行するように構成されたコンピューティングデバイス、例えば、これに限定されないが、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）の一部として、またはＲｏｓｅｔｔａに関連している方法８００および機能性であり得る。一部の実施形態において、タンパク質データベース６０８は、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）に関連する、および／またはＲｏｓｅｔｔａによって使用される情報を格納することができる。
【００９９】
ネットワーク６０６は、ＬＡＮ、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、企業内イントラネット、公衆インターネットまたはネットワーク化されたコンピューティングデバイス間に通信経路を提供するように構成されている任意の他のネットワーク種類に対応することができる。ネットワーク６０６は、１または複数のＬＡＮ、ＷＡＮ、企業内イントラネットおよび／または公衆インターネットの組み合わせに対応することもできる。
【０１００】
図６は３つのクライアントデバイス６０４ａ、６０４ｂ、６０４ｃを示しているだけであるが、分散型アプリケーション・アーキテクチャは何十、何百または何千ものクライアントデバイスに対応することができる。さらに、クライアントデバイス６０４ａ、６０４ｂ、６０４ｃ（または任意の追加のクライアントデバイス）は、どんなコンピューティングデバイス、例えば、通常のラップトップコンピュータ、デスクトップコンピュータ、ネットワーク端末、無線通信装置（例えば、携帯電話またはスマートフォン）などであってもよい。一部の実施形態において、クライアントデバイス６０４ａ、６０４ｂ、６０４ｃは、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）ソフトウェアスイートの問題解決／使用専用にすることができる。他の実施形態において、クライアントデバイス６０４ａ、６０４ｂ、６０４ｃは、多くのタスクを実行するように構成されている汎用コンピュータとして使用することができ、Ｒｏｓｅｔｔａ（商標）の問題解決／使用専用である必要がない。さらに他の実施形態において、タンパク質設計システム６０２および／またはタンパク質データベース６０８の機能性の一部またはすべては、クライアントデバイス、例えばクライアントデバイス６０４ａ、６０４ｂおよび／または６０４ｃに組み込むことができる。
【０１０１】
コンピューティング環境アーキテクチャ
図７Ａは、コンピューティングデバイス（例えば、システム）の一例のブロック図である。特に、図７Ａに示すコンピューティングデバイス７００は、タンパク質設計システム６０２、クライアントデバイス６０４ａ、６０４ｂ、６０４ｃ、ネットワーク６０６、および／またはタンパク質データベース６０８のコンポーネントを含み、および／またはこれらのうちの１または複数の機能を実行し、および／または本明細書に記載の方法と手法、例えば、これに限定されないが方法８００の一部またはすべてを実施するように構成されることができる。コンピューティングデバイス７００は、ユーザインターフェイスモジュール７０１、ネットワーク通信インターフェイスモジュール７０２、１または複数のプロセッサ７０３、およびデータストレージ７０４を含むことができ、それらすべてはシステムバス、ネットワーク、または他の接続機構７０５を介して連結させることができる。
【０１０２】
ユーザインターフェイスモジュール７０１は、外部ユーザの入出力装置にデータを送信し、および／またはデータを受信するように動作可能であり得る。例えば、ユーザインターフェイスモジュール７０１は、ユーザ入力装置、例えば、キーボード、キーパッド、タッチスクリーン、コンピュータマウス、トラックボール、ジョイスティック、カメラ、音声認識モジュール、および／または他の類似の装置にデータを送信するおよび／またはそれらの装置からデータを受信するように構成することができる。ユーザインターフェイスモジュール７０１は、ユーザ表示装置、例えば、１または複数のブラウン管（ＣＲＴ）、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、発光ダイオード（ＬＥＤ）、デジタルライトプロセッシング（ＤＬＰ）技術、プリンタ、電球、および／または現在知られているもしくは後日開発されるいずれかの他の類似の装置に出力を提供するようにも構成されることができる。ユーザインターフェイスモジュール７０１は、可聴出力、例えばスピーカー、スピーカージャック、音声出力ポート、音声出力装置、イヤホーンおよび／または他の類似の装置を生成するようにも構成されることができる。
【０１０３】
ネットワーク通信インターフェイスモジュール７０２は、ネットワーク、例えば、図６に示すネットワーク６０６を介して通信するように構成される１または複数の無線インターフェイス７０７および／または１または複数の有線インターフェイス７０８を含むことができる。無線インターフェイス７０７は、１または複数の無線送信機、受信機、および／またはトランシーバ、例えばブルートゥーストランシーバ、ジグビートランシーバ、Ｗｉ−Ｆｉトランシーバ、ＷｉＭＡＸトランシーバおよび／または無線ネットワークを介して通信するように構成可能な他の類似の種類の無線トランシーバを含むことができる。有線インターフェイス７０８は、１または複数の有線送信機、受信機、および／またはトランシーバ、例えば、イーサネトトランシーバ、ユニバーサル・シリアル・バス（ＵＳＢ）トランシーバ、またはツイストペアケーブル、１または複数のワイヤケーブル、同軸ケーブル、ファイバ光リンク、もしくは有線ネットワークへの類似の物理接続を介して通信するように構成可能な類似のトランシーバを含むことができる。
【０１０４】
一部の実施形態において、ネットワーク通信インターフェイスモジュール７０２は、信頼性が高い、セキュリティ保護されたおよび／または、認証された通信を提供するように構成されることができる。本明細書に記載の通信のそれぞれについて、信頼性が高い通信（すなわち保証されたメッセージ配信）を確実にするための情報が、おそらくメッセージヘッダおよび／またはフッタの部分（例えば、パケット／メッセージシーケンシング情報、カプセル化ヘッダおよび／またはフッタ、サイズ／時間情報、ならびにＣＲＣおよび／またはパリティーチェック値のような送信照合情報）として提供され得る。通信は、セキュリティ保護したものにし得る（例えば、エンコードもしくは暗号化され得る）、および／または１または複数の暗号化プロトコルおよび／またはアルゴリズム、例えば、これらに限定されないがＤＥＳ、ＡＥＳ、ＲＳＡ、Ｄｉｆｆｉｅ−Ｈｅｌｌｍａｎおよび／またはＤＳＡを使用して暗号解読／デコードされ得る。通信をセキュリティ保護したものにする（次いで暗号解読／デコードする）ために、他の暗号化プロトコルおよび／またはアルゴリズムも同様に、または本明細書に列挙したものに加えて使用することができる。
【０１０５】
プロセッサ７０３は、１または複数の汎用プロセッサおよび／または１もしくは複数の専用プロセッサ（例えば、デジタル信号プロセッサ、特定用途向け集積回路など）を含めることができる。プロセッサ７０３は、データストレージ７０４に含まれるコンピュータ読み取り可能なプログラム命令７０６および／または本明細書に記載の他の命令を実行するように構成されることができる。データストレージ７０４は、プロセッサ７０３の少なくとも１つで読み取られ、および／またはアクセスされることができる１または複数のコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を含めることができる。１または複数のコンピュータ読み取り可能なストレージ媒体は、揮発性および／または不揮発性のストレージコンポーネント、例えば、光学ストレージ、磁気ストレージ、有機ストレージ、または他のメモリもしくはディスクストレージを含めることができ、全体または一部としてプロセッサ７０３の少なくとも１つと一体化されることができる。一部の実施形態において、データストレージ７０４は、単一の物理的装置（例えば、１台の光学ストレージ、磁気ストレージ、有機ストレージ、または他のメモリもしくはディスクストレージのユニット）を使用して実現されることができるが、他の実施形態において、データストレージ７０４は２台以上の物理的装置を使用して実現されることができる。
【０１０６】
データストレージ７０４は、コンピュータ読み取り可能なプログラム命令７０６およびおそらく追加データを含めることができる。例えば、一部の実施形態において、データストレージ７０４は、タンパク質設計システムおよび／またはタンパク質データベース、例えば、タンパク質設計システム６０２、タンパク質データベース６０８によって利用されるデータの一部またはすべてを格納することができる。一部の実施形態において、データストレ−ジ７０４は、本明細書に記載の方法および手法の少なくとも一部、および／または本明細書に記載の装置およびネットワークの機能性の少なくとも一部を実行するために必要とされるストレージを含めることができる。
【０１０７】
図７Ｂは、例示の実施形態によるクラウドベースサーバとして配置されたコンピューティングクラスタ７０９ａ、７０９ｂ、７０９ｃのネットワーク６０６を表す。タンパク質設計システム６０２のためのデータおよび／またはソフトウェアは、プログラムロジックおよび／またはクラウドベースアプリケーションおよび／またはサービスのデータを格納する１または複数のクラウドベース装置に格納されることができる。一部の実施形態において、タンパク質設計システム６０２は、単一コンピューティングセンターに存在する単一コンピューティングデバイスであり得る。他の実施形態において、タンパク質設計システム６０２は、単一コンピューティングセンターにおいて、または多様な地理的位置に位置される複数のコンピューティングセンターに位置される複数のコンピューティングデバイスさえ含めることができる。
【０１０８】
一部の実施形態において、タンパク質設計システム６０２用のデータおよび／またはソフトウェアは、有形のコンピュータ読み取り可能な媒体（またはコンピュータ読み取り可能なストレージ媒体）に格納され、およびクライアントデバイス６０４ａ、６０４ｂおよび６０４ｃ、および／または他のコンピューティングデバイスがアクセスできるコンピュータ読み取り可能な情報としてコードされることができる。一部の実施形態において、タンパク質設計システム６０２用のデータおよび／またはソフトウェアは、単一ディスクドライブまたは他の有形のストレージ媒体に格納されることができる、あるいは１または複数の多様な地理的位置に位置した複数のディスクドライブまたは他の有形のストレージ媒体に実現されることができる。
【０１０９】
図７Ｂは、例示の実施形態によるクラウドベースサーバシステムを表す。図７Ｂにおいて、タンパク質設計システム６０２の機能は、３つのコンピューティングクラスタ７０９ａ、７０９ｂおよび７０９ｃの間で分散されることができる。コンピューティングクラスタ７０９ａは、１または複数のコンピューティングデバイス７００ａ、クラスタストレージアレイ７１０ａ、およびローカルクラスタネットワーク７１２ａによって接続されるクラスタルータ７１１ａを含めることができる。同様に、コンピューティングクラスタ７０９ｂは、１または複数のコンピューティングデバイス７００ｂ、クラスタストレージアレイ７１０ｂ、およびローカルクラスタネットワーク７１２ｂによって接続されるクラスタルータ７１１ｂを含めることができる。同様に、コンピューティングクラスタ７０９ｃは、１または複数のコンピューティングデバイス７００ｃ、クラスタストレージアレイ７１０ｃ、およびローカルクラスタネットワーク７１２ｃによって接続されるクラスタルータ７１１ｃを含めることができる。
【０１１０】
一部の実施形態において、コンピューティングクラスタ７０９ａ、７０９ｂおよび７０９ｃの各々は、同数のコンピューティングデバイス、同数のクラスタストレージアレイ、および同数のクラスタルータを有することができる。しかし、他の実施形態において、各コンピューティングクラスタは、異なる数のコンピューティングデバイス、異なる数のクラスタストレージアレイ、および異なる数のクラスタルータを有することができる。各コンピューティングクラスタにおけるコンピューティングデバイス、クラスタストレージアレイ、およびクラスタルータの数は、コンピューティングタスクまたは各コンピューティングクラスタに割り当てられるタスクに依存し得る。
【０１１１】
例えば、コンピューティングクラスタ７０９ａにおいて、コンピューティングデバイス７００ａは、タンパク質設計システム６０２の種々のコンピューティングタスクを実行するように構成されることができる。一実施形態において、タンパク質設計システム６０２の種々の機能性は、１または複数のコンピューティングデバイス７００ａ、７００ｂおよび７００ｃの間で分散されることができる。コンピューティングクラスタ７０９ｂおよび７０９ｃにおいてコンピューティングデバイス７００ｂおよび７００ｃは、コンピューティングクラスタ７０９ａにおけるコンピューティングデバイス７００ａと同様に構成されることができる。一方では、一部の実施形態において、コンピューティングデバイス７００ａ、７００ｂおよび７００ｃは、異なる機能を実行するように構成されることができる。
【０１１２】
一部の実施形態において、タンパク質設計システム６０２に関連したコンピューティングタスクおよび格納されたデータは、タンパク質設計システム６０２の処理要件、コンピューティングデバイス７００ａ、７００ｂおよび７００ｃの処理能力、各コンピューティングクラスタにおけるコンピューティングデバイス間およびコンピューティングクラスタそれ自体の間のネットワーク結合のレイテンシ、および／または全体のシステムアーキテクチャのコスト、速度、フォールトトレランス、回復力、効率、および／または他の設計目標に寄与し得る他の要因に少なくとも部分的に基づいて、コンピューティングデバイス７００ａ、７００ｂおよび７００ｃにわたって分散されることができる。
【０１１３】
コンピューティングクラスタ７０９ａ、７０９ｂおよび７０９ｃのクラスタストレージアレイ７１０ａ、７１０ｂおよび７１０ｃは、ハードディスク装置の群への読込みおよび書込みアクセスを管理するように構成されるディスクアレイコントローラを含むデータストレージアレイであり得る。単独でまたはそれぞれのコンピューティングデバイスと組み合わせて、ディスクアレイコントローラは、クラスタストレージアレイに格納されるデータのバックアップまたは冗長なコピーを管理して、１または複数のコンピューティングデバイスが１または複数のクラスタストレージアレイにアクセスするのを防止するディスクドライブまたは他のクラスタストレージアレイの障害および／もしくはネットワーク障害に対して保護するように構成されることができる。
【０１１４】
タンパク質設計システム６０２の機能がコンピューティングクラスタ７０９ａ、７０９ｂおよび７０９ｃのコンピューティングデバイス７００ａ、７００ｂおよび７００ｃにわたり分散されることができる様式と同様に、これらのコンポーネントの種々の活性部分および／またはバックアップ部分はクラスタストレージアレイ７１０ａ、７１０ｂおよび７１０ｃにわたり分散されることができる。例えば、一部のクラスタストレージアレイは、タンパク質設計システム６０２のデータおよび／またはソフトウェアの一部を格納するように構成されることができるのに対して、他のクラスタストレージアレイはタンパク質設計システム６０２のデータおよび／またはソフトウェアの別の部分を格納することができる。さらに、一部のクラスタストレージアレイは、他のクラスタストレージアレイに格納されているデータのバックアップバージョンを格納するように構成されることができる。
【０１１５】
コンピューティングクラスタ７０９ａ、７０９ｂおよび７０９ｃにおけるクラスタルータ７１１ａ、７１１ｂおよび７１１ｃは、コンピューティングクラスタのために内部通信および外部通信を提供するように構成されるネットワーク機器を含めることができる。例えば、コンピューティングクラスタ７０９ａにおけるクラスタルータ７１１ａは、１または複数のインターネットスイッチングおよびルーティングデバイスを含めることができ、当該インターネットスイッチングおよびルーティングデバイスは、（ｉ）ローカルクラスタネットワーク７１２ａを介するコンピューティングデバイス７００ａとクラスタストレージアレイ７０１ａとの間のローカルエリアネットワーク通信、および（ｉｉ）ネットワーク６０６へのワイドエリアネットワーク接続７１３ａを介するコンピューティングクラスタ７０９ａとコンピューティングクラスタ７０９ｂおよび７０９ｃとの間のワイドエリアネットワーク通信を提供するように構成される。クラスタルータ７１１ｂおよび７１１ｃは、クラスタルータ７１１ａと同様のネットワーク機器を含めることができ、クラスタルータ７１１ｂおよび７１１ｃは、クラスタルータ７１１ａがコンピューティングクラスタ７０９ａに対して実行するのと同様のネットワーキング機能をコンピューティングクラスタ７０９ｂおよび７０９ｃに対して実行することができる。
【０１１６】
一部の実施形態において、クラスタルータ７１１ａ、７１１ｂおよび７１１ｃの構成は、コンピューティングデバイスおよびクラスタストレージアレイのデータ通信要件、クラスタルータ７１１ａ、７１１ｂおよび７１１ｃにおけるネットワーク機器のデータ通信能力、ローカルネットワーク７１２ａ，７１２ｂ，７１２ｃのレイテンシおよびスループット、ワイドエリアネットワークリンク７１３ａ、７１３ｂおよび７１３ｃのレイテンシ、スループットおよびコスト、ならびに／またはモデレーションシステムアーキテクチャのコスト、速度、フォールトトレランス、回復力、効率および／または他の設計目標に寄与し得る他の要因に少なくとも部分的に基づき得る。
【０１１７】
操作方法の例
図８は、方法８００の一例のフローチャートである。方法８００は、少なくとも図７Ａと関連して記述されるコンピューティングデバイス７００などのコンピューティングデバイスによって実施されることができる。
【０１１８】
方法８００は、ブロック８１０で始めることができ、コンピューティングデバイスは１または複数の分子に関連する水素結合ネットワークについての探索空間を決定することができ、探索空間は、少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように水素結合ネットワークに関連する複数の残基に関連する複数のエネルギー項を含める。
【０１１９】
一部の実施形態において、探索空間は、１または複数のエッジによって接続された複数のノードを有するグラフとして構成されることができ、複数のノードのうちの１つのノードは、複数の残基のうちの特定の残基に基づき、該特定の残基は残基位置を有し、および
少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、１または複数のエッジのうちの１つのエッジは、第１のノードと第２のノードとの間の可能性がある相互作用に基づき複数のノードのうちの第１のノードと第２のノードを接続する。これらの実施形態の特徴において、第１のノードは、複数の残基のうちの第１の残基に関連することができ、第２のノードは複数の残基のうちの第２の残基に関連し、および少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、第１のノードと第２のノードとの間の可能性がある相互作用は、第１の残基の回転異性体および／または第２の残基の回転異性体の間の可能性がある相互作用に関連する。これらの実施形態のさらなる特徴において、第１のノードと第２のノードとの間の可能性がある相互作用の間は、少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、第１の残基と第２の残基との間の相互作用エネルギーに関連し得る。これらの実施形態のさらに多くの特徴において、探索空間を決定することは以下を含めることができる：第１の残基と第２の残基の間の相互作用エネルギーが閾値相互作用エネルギー未満かを決定すること；および第１の残基と第２の残基の間の相互作用エネルギーが閾値未満であることを決定した後に、第１のノード、第２のノード、および第１のノードと第２のノードとの間の少なくとも１つのエッジを、少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、探索空間に加えることを含み得る。これらの実施形態のさらなる特徴において、第１のノードと第２のノードとの間の少なくとも１つのエッジは、少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、第１の残基と第２の残基との間の相互作用エネルギーについての情報を含めることができる。これらの実施形態のさらなる特徴において、第１の残基と第２の残基との間の相互作用エネルギーについての情報は、複数の相互作用エネルギー値を含めることができ、複数の相互作用エネルギー値中の各相互作用エネルギー値は、少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、第１の残基の特定の回転異性体および第２の残基の特定の回転異性体に関連している。
【０１２０】
別の実施形態において、探索空間を決定することは、第１の分子と第２の分子との間の分子間界面で少なくとも第１の残基位置および第２の残基位置を決定することであって、第１の残基位置が第１の分子の第１の残基に関連し、および第２の残基位置が第２の分子の第２の残基に関連している、残基位置を決定すること；および少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、少なくとも第１の残基位置および第２の残基位置に基づいて探索空間を決定することを含めることができる。これらの実施形態の一部において、第１の分子および第２の分子のうちの少なくとも１つは、少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、ポリペプチド鎖を含めることができる。
【０１２１】
ブロック８２０で、コンピューティングデバイスは、少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、複数のエネルギー項に基づいて１または複数の水素結合ネットワークを特定するために探索空間を探索することができる。一部の実施形態において、探索空間を探索することは、少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、探索空間のすべてを探索することを含める。これらの実施形態の特徴において、探索空間のすべてを探索することは、深さ優先探索を使用する。これらの実施形態の別の特徴において、探索空間のすべてを探索することは、少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、幅優先探索を使用して探索空間のすべてを探索することを含める。
【０１２２】
別の実施形態において、探索空間を探索することは、１または複数の初期の水素結合ネットワークを特定するために探索空間の第１の探索を実行すること；および少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、１または複数の初期の水素結合ネットワークの第１の水素結合ネットワークと、第２の水素結合ネットワークを少なくともマージすることによって１または複数の特定した水素結合ネットワークを特定することを含めることができる。これらの実施形態の特徴において、第１の水素結合ネットワークと第２の水素結合ネットワークとをマージすることは、第１の水素結合ネットワークと第２の水素結合ネットワークとが同一の回転異性体を共有するかどうか決定すること；および第１の水素結合ネットワークと第２の水素結合ネットワークとが同一の回転異性体を共有することを決定した後、少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、第１の水素結合ネットワークと第２の水素結合ネットワークとをマージすることを含めることができる。
【０１２３】
ブロック８３０で、少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、コンピューティングデバイスは、特定した１または複数の水素結合ネットワークを選別して、１または複数の特定した水素結合ネットワークのスコアに基づいて、１または複数の選別した水素結合ネットワークを特定することができる。一部の実施形態において、少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、１または複数の特定した水素結合ネットワークの特に特定した水素結合ネットワークについての特定のスコアは、この特定の水素結合ネットワークに関与する多くの極性原子に基づくことができる。別の実施形態において、少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、１または複数の特定した水素結合ネットワークの特に特定した水素結合ネットワークについての特定のスコアは、バックグラウンド参照構造に基づくことができる。これらの実施形態の特徴において、特に特定された水素結合ネットワークについての特定のスコアが１または複数の側鎖−主鎖水素結合に関連するスコアに基づくことができ、１または複数の側鎖−主鎖水素結合は、少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、バックグラウンド参照構造に関連することができる。さらに別の実施形態において、１または複数の特定した水素結合ネットワークの特に特定した水素結合ネットワークについての特定のスコアは、少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、エネルギー関数に基づくことができる。
【０１２４】
ブロック８４０で、１または複数の選別した水素結合ネットワークに関連した出力は、生成することができる。一部の実施形態において、１または複数の選別した水素結合ネットワークに関連した出力を生成することは、少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、選別した水素結合ネットワークに基づいて１または複数の分子を設計することを含めることができる。これらの実施形態の特徴において、選別した水素結合ネットワークに基づいて１または複数の分子を設計することは、少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、選別した水素結合ネットワークにおいて１または複数の回転異性体の１または複数の比較的小さい動きが可能になることを含める。
【０１２５】
別の実施形態において、１または複数の選別した水素結合ネットワークに関連した出力を生成することは、少なくとも上の「計算手法」のセクションで述べたように、１または複数の選別した水素結合ネットワークに関連した複数の出力を生成することを含めることができる。さらに他の実施形態において、１または複数の選別した水素結合ネットワークに関連した出力を生成することは、１または複数の選別した水素結合ネットワークに基づいている合成遺伝子を生成すること；合成遺伝子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで特定のタンパク質を発現させること；および特定のタンパク質を精製することを含めることができる。これらの実施形態の特徴において、合成遺伝子を用いてｉｎ  ｖｉｖｏで特定のタンパク質配列を発現させることは、少なくとも上の「実験的方法」のセクションで述べたように、合成遺伝子を含む１または複数の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）内で特定のタンパク質配列を発現させることを含める。
【０１２６】
本明細書に示す特徴は一例であり、かつ本発明の好ましい実施形態の例示考察の目的のためだけであり、本発明の種々の実施形態の原理および概念的態様についての最も有用で容易に理解される説明と思われるものを提供するために提示される。この点に関し、本発明の構造的な詳細を本発明の基本的理解に必要とされるよりも詳細に示す試みはなされていないが、当業者であれば、図面および／または実施例とともになされる説明により本発明のいくつかの形態が実際に実施される方法は明らかであろう。
【０１２７】
以下の諸例で明確かつ明白に修正されない限り、または意味の適用がいかなる解釈でも無意味もしくは本質的に無意味にする場合、上記の定義および説明は、いかなる将来の解釈も支配することを意味し、意図される。その用語の解釈がそれを無意味または本質的に無意味にする場合、その定義はＷｅｂｓｔｅｒ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ、第３版、または当業者に既知の辞書、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｓｍｉｔｈ編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，  ２００４）から取得されるべきである。
【０１２８】
本明細書で用いる場合、特に明記しない限り、用語「ａ」および「ａｎ」は、「１つ」、「少なくとも１つ」または「１または複数」を意味すると解する。文脈によって必要とされない限り、本明細書で用いる単数形の用語は複数形を包含し、複数形の用語は単数形を包含する。
【０１２９】
説明およびクレーム全体にわたり、文脈上明白に他の意味に解すべき場合を除き、「含む」、「含んでいる」などの単語は、排他的または網羅的な意味ではなく包含的な意味に解釈されるものとする。すなわち、「含むが、それに限定されない」という意味である。さらに単数または複数を使用している言葉は、それぞれ複数または単数も含む。さらに、本出願で用いるとき、「本明細書に」、「上の」および「以下の」、ならびに類似の意味の言葉は、全体として本出願を指し、本出願のいかなる特定の部分を指すものではない。
【０１３０】
上記の説明は、本開示の実施形態の完全な理解、および説明を可能にする特定の詳細を提供する。しかし、当業者は、本開示がこれらの詳細なしで実行され得ることを理解するであろう。他の例において、周知の構造および機能は、本開示の実施形態の説明を不必要に不明瞭することを避けるために、詳細に示してなく、または説明していない。本開示の実施形態の説明は、網羅的である、または本開示を開示される正確な形態に限定することを意図しない。本開示の具体的な実施形態および実施例は、本明細書において例示を目的として記述されており、当技術分野の当業者が認識するように、種々の均等な修正は、本開示の範囲内で可能である。
【０１３１】
本明細書に引用されるすべての参考文献は、参照によって組み込まれる。本開示のさらなる実施形態を提供するために、必要に応じて、本開示の態様は、上記参考文献および出願のシステム、機能および概念を使用するよう修正され得る。これらおよび他の変更は、詳細な説明を考慮して本開示になされることができる。
【０１３２】
前述の実施形態のいずれかの特定の要素は、他の実施形態における要素と、組み合わせる、または置換されることが可能である。さらに、本開示の特定の実施形態に関連している利点は、これらの実施形態に関連して記述されているが、他の実施形態もそのような利点を示すこともありえ、すべての実施形態は本開示の範囲内に入る、そのような利点を示す必要がない。
【０１３３】
上記の詳細な説明は、添付の図面を参照して、開示されるシステム、デバイス、および方法の種々の特徴および機能を説明する。図面において、文脈が別段指示しない限り、類似の記号は一般的に、類似の成分を特定する。詳細な説明、図面および特許請求の範囲において記載の例示的な実施形態は、限定することを意味しない。他の実施形態を利用することができ、本明細書に示す主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、本明細書に示す他の変更をすることができる。本明細書に一般的に記述され、図面に例示されている本開示の態様は多種多様な異なる構成で配置され、置換され、組み合わせられ、分離され、設計されることが可能であり、そのすべては本明細書に明確に可能とみなされている。
【０１３４】
図面におけるいずれかまたはすべてのラダー図、シナリオ、およびフローチャートに関して、および本明細書に記述の各ブロックおよび／または通信は、例示の実施形態により情報の処理および／または情報の送信を表し得る。他の実施形態は、これらの例示の実施形態の範囲内に包含される。これらの他の実施形態において、例えば、ブロックとして記載された機能、送信、通信、要求、応答および／またはメッセージは、実質的に同時または逆の順序も含めて、関連する機能性に応じて、示されたまたは記述された順序から外れた順序で実行してもよい。さらに、本明細書に記述のいずれのラダー図、シナリオおよびフローチャートを用いて、より多いもしくはより少ないブロックおよび／または機能を使用してもよく、またこれらラダー図、シナリオ、およびフローチャートは、部分的または全体的に互いに組み合わせてもよい。
【０１３５】
情報の処理を表すブロックは、本明細書に記載の方法または手法の特定の論理機能を実行するように構成することができる回路に対応してもよい。あるいは、またはさらに、情報の処理を表すブロックは、モジュール、セグメント、またはプログラムコードの一部（関連データを含めて）に対応してもよい。プログラムコードは、方法または手法において特定の論理機能または動作を実行するために、プロセッサで実行可能な１または複数の命令を含んでよい。プログラムコードおよび／または関連データは、ディスクもしくはハードドライブもしくは他のストレージ媒体を含むストレージデバイスなどの任意の種類のコンピュータ読み取り可能な媒体に格納してもよい。
【０１３６】
コンピュータ読み取り可能な媒体は、レジスタメモリ、プロセッサキャッシュ、およびランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）などの、短期間データを記憶するコンピュータ読み取り可能な媒体などの、非一時的なコンピュータ読み取り可能な媒体も含めてよい。コンピュータ読み取り可能な媒体は、例えば、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、光学もしくは磁気ディスク、コンパクトディスク・リードオンリーメモリ（ＣＤ‐ＲＯＭ）のような、二次もしくは持続的長期記憶装置などの、より長期間プログラムコードおよび／またはデータを格納する非一時的なコンピュータ読み取り可能な媒体も含めてよい。コンピュータ読み取り可能な媒体は、いかなる他の揮発性または不揮発性ストレージシステムであってもよい。コンピュータ読み取り可能な媒体は、例えば、コンピュータ読み取り可能なストレージ媒体、または有形のストレージデバイスと見なしてもよい。さらに、１または複数の情報送信を表すブロックは、同じ物理デバイス内のソフトウェアモジュールおよび／またはハードウェアモジュールの間の情報送信に対応することができる。しかし、他の情報送信は、異なる物理デバイス内のソフトウェアモジュールおよび／またはハードウェアモジュールの間にあり得る。
【０１３７】
本開示の多数の修正および変更は、上記の教示を考慮して可能である。
【０１３８】
本明細書に示す特徴は一例であり、かつ本発明の好ましい実施形態の例示考察の目的のためだけであり、本発明の種々の実施形態の原理および概念的態様についての最も有用で容易に理解される説明と思われるものを提供するために提示される。この点に関し、本発明の構造的な詳細を本発明の基本的理解に必要とされるよりも詳細に示す試みはなされていないが、当業者であれば、図面および／または実施例とともになされる説明により本発明のいくつかの形態が実際に実施される方法は明らかであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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