(57)【要約】  本発明は、心組織の治療を目的とする医薬として使用されるバイオマテリアル、前記バイオマテリアルの製造法、および医薬または医療機器として使用される本発明のバイオマテリアルに関する。本発明のバイオマテリアルは、幹細胞由来の細胞外小胞を包含する生体適合性生分解性高分子を含む。本発明の前記方法は、幹細胞由来またはその分化誘導体由来の細胞外小胞を含む生体適合性液体培地中に前記生体適合性生分解性高分子を浸漬する工程、または、前記生体適合性生分解性高分子または対応する１種もしくは複数種の単量体と、幹細胞由来の細胞外小胞との混合する工程、を含む。本発明のバイオマテリアルは医薬用、特に、ヒトまたは動物の欠損した心組織の治療のためのものである。
2019526388.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞がヒト胚の破壊を含む方法由来ではない、心組織の治療を目的とする医薬として使用される、前記幹細胞に由来する細胞外小胞を包含する生体適合性生分解性高分子を含むバイオマテリアル。
【請求項２】
前記幹細胞由来細胞外小胞が万能性幹細胞、多能性幹細胞またはその分化誘導体から選択される幹細胞に由来する、請求項１に記載のバイオマテリアル。
【請求項３】
前記小胞が、心臓の血管細胞から選択される細胞由来の、万能性幹細胞、多能性幹細胞またはその分化誘導体に由来する、請求項２に記載のバイオマテリアル。
【請求項４】
前記生体適合性生分解性高分子が、以下を含む群から選択される天然起源の高分子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のバイオマテリアル：フィブリン、キトサン、コラーゲン、アルギン酸、ヒアルロン酸およびその２種または数種の混合物；脱細胞化細胞マトリックス、または、脂肪族ポリエステル類、特に、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリリンゴ酸、ポリカプロラクトン、ポリグリセロールセバケート、ポリウレタンもしくはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、これらの脂肪族ポリエステル類のうち２種または数種の混合物、脂肪族ポリエステル類の共重合体、またはこれらの共重合体の混合物から選択される合成高分子；または脱細胞化細胞外マトリックス。
【請求項５】
前記生体適合性生分解性高分子がフィブリン、コラーゲンおよびヒアルロン酸を含む群から選択される天然起源の高分子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のバイオマテリアル。
【請求項６】
前記生体適合性生分解性高分子が、幹細胞由来もしくはその分化誘導体由来の細胞外小胞を含む生体適合性液体培地中に浸漬する工程を含む方法によって得られる、または前記生体適合性生分解性高分子および／または対応する１種もしくは複数種の単量体と、幹細胞由来もしくはその分化誘導体由来の細胞外小胞、との混合によって得られる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のバイオマテリアル。
【請求項７】
前記生体適合性生分解性高分子を、幹細胞由来もしくはその分化誘導体由来の細胞外小胞を含む生体適合性液体培地中に浸漬する工程、または前記生体適合性生分解性高分子または対応する１種もしくは複数種の単量体と、幹細胞由来もしくはその分化誘導体由来の細胞外小胞との混合する工程を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のバイオマテリアルのバイオマテリアル製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマテリアル、前記バイオマテリアルの製造法、および、例えば心組織の治療を目的とした医薬または医療機器として使用される本発明のバイオマテリアルに関する。
【０００２】
本発明は、例えばヒトおよび動物の治療分野において、特に欠損組織の治療のために、適用される。
【０００３】
下記の角括弧「［  ］」内の参考文献は、実施例の最後の参考文献のリストを参照している。
【背景技術】
【０００４】
細胞治療が、疾患、事故、遺伝子変異、細胞機能の欠陥または不作動等によって生じた欠損組織を修復するための、効果的な手段であり、高い可能性を秘めていることが、急速に明らかになってきている。細胞治療は、患者の組織または臓器の機能を回復するための所謂「治療用」細胞の移植にある。実際に使用される治療用細胞は、患者自身またはドナーに由来し得る万能性幹細胞または多能性幹細胞から得られる細胞である。細胞治療の目的は、長期に亘り安定的な組織修復の結果を得るために、好ましくはこれらの「治療用細胞」の注入により、患者を治療することである。
【０００５】
Ｐｒ．  Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｍｅｎａｓｃｈｅらの刊行物、「Ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ：  ａ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ」、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  （２０１５）  ３６、７４３−７５０［１］には、例えば、ラットおよび非ヒト霊長類の心筋梗塞モデルの心臓を対象とした細胞治療技術によって得られる、一連の研究とその結果が記載されている。使用された細胞はヒト胚性幹細胞由来の心筋前駆細胞である。
【０００６】
幹細胞の研究は、ヒトに非常に有用な新たな治療法を提供するが、特に倫理問題に関しては、未だ議論の余地がある。現行の細胞治療技術を改善するため、特に、使用される細胞を作製、培養および／または形質転換するためのとりわけ現行の手段を見つけるまたは完成させるため、さらには、細胞環境や天然の拒絶機構または分解機構にかかわらずに患者における一回注入または移植を可能にする手段を見つけるために、さらなる研究が尚も求められている。また、この種の研究に各州により課せられる、概して制限的な法的枠組みにも従う必要がある。さらに、この種の治療にかかるコストは尚も相当なものである。
【０００７】
現在のところ、移植後の幹細胞の推定される作用機序の１つとして、パラクリンによる内在性シグナル経路の活性化があると考えられる。いくつかの研究から、移植後細胞と宿主組織との間のこのパラクリン相互作用は、細胞外培地中の可溶性因子の分泌のみに限定されず、細胞由来の小胞も伴うことが、示唆されている。この主題に関しては、特にＡｎａｉｓ  Ｋｅｒｖａｄｅｃ、Ｐｒ．  Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｍｅｎａｓｃｈｅら「Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅ  ｔｈｅ  ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ
ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｐａｒｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｏｒｉｇｉｎａｌ  Ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａ
ｌ  ｏｆ  Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、Ｊａｎｕａｒｙ  １３，  ２０１６；  ３５：７９５−８０７［２］において、最新の研究が発表されている。この文献では、移植細胞によって分泌された、エキソソームおよび微小粒子を包含する細胞外小胞が、パラクリン治療効果を有し得ると述べられている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、特に、細胞治療によって得られる利点は前記欠点無しで尚も享受しながら、ヒトおよび動物の欠損組織、特に心組織、の治療および／または修復のための幹細胞の使用に代わるものを提供することによって従来技術の前記欠点を解決することである。
【０００９】
実際には、本発明者らによって初めて、生体適合性高分子および幹細胞由来細胞外小胞の組み合わせが、幹細胞の非存在下での、欠損した組織、特に心組織、の修復を可能にすることが、明示され実施された。
【００１０】
すなわち、本発明は、特に、幹細胞由来の細胞外小胞を包含する生体適合性生分解性高分子を含むバイオマテリアルに関する。
【００１１】
実際に、本発明者らは、特に、本発明の枠組みの中で、特に前記組み合わせの中で、前記バイオマテリアルが生体に移植された後に徐々に消失可能であることを確かめることにより、経済的であり、倫理問題がなく、効果的であり、且つ、埋め込み装置を除去または交換するための特別な治療介入を新たに必要としない、前記バイオマテリアルに含まれる前記小胞の活性を害さない、且つ、欠損組織の長期の処置を可能にする、前記バイオマテリアルに含まれる前記小胞の安定的な且つ長期の放出を確実なものとした。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、細胞外小胞に種々のサブタイプが存在することを明らかにする、低温電子顕微鏡法の画像を示している。
【図２】図２は、単離粒子のサイズ分布において良好な再現性を示す、３つの独立した細胞外小胞調製物の、３つのナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を示している。
【図３】図３は、エキソソームマーカーの存在を確認している、且つ、細胞外小胞調製物中にこの小胞型が存在することを示すことを可能とする、ウェスタンブロットを示している。
【図４】図４は、ヘマトキシリン／エオジンで着色されたフィブリンパッチの組織切片を表す写真を示している。
【図５】図５は、取り扱いが容易であり、且つ、心外膜に固定できる、厚さ１ｍｍのフィブリンパッチを示している。
【図６】図６は、前記パッチの弾性に対するフィブリノーゲン／トロンビンにおける濃度の影響を示している（単位ｋＰａ）。
【図７】図７は、対照パッチおよび細胞外小胞を含有するパッチの写真を示している。
【図８】図８は、カルセインで標識された細胞外小胞の、前記パッチからの、細胞外小胞の放出を確認している、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍから得られた画像を示している。
【図９】図９は、ｉＰＳ−Ｐｇの細胞外小胞が血管新生誘導性であることを示す、瘢痕形成試験を示している。
【図１０】図１０は、ｉＰＳ−Ｐｇの細胞外小胞が培養液中の心細胞の生存を向上させることを示している。
【図１１】図１１は、カルセインで予め標識された細胞外小胞と一緒にインキュベートされた細胞のみに蛍光が存在することを確認している、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍで得られた結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明において、用語「高分子」とは、特に患者、ヒトまたは動物、の欠損組織の治療のための、幹細胞の小胞を含み徐々に放出することが有利にも可能であることから、有機もしくは無機高分子または有機マトリックス、特に脱細胞化細胞マリトックス、もしくは無機マトリックス、または、有機もしくは無機高分子および有機もしくは無機マトリックスの混合物、本発明の枠組みの中でそれ自体がマトリックスとみなされ得る高分子を意味する。本発明を実施するために使用できる高分子の例としては、下記のものがある。
【００１４】
本発明において、用語「生体適合性」高分子とは、有利にも以下の両方に適合性の高分子を意味する：患者への埋め込みに適合性、すなわち、この埋め込みは、治療の観点から、例えば薬事指令２００１／８３／ＥＣの点から、好ましいリスク・ベネフィット比を有する、すなわち、当該治療効果に対し、該患者においてリスクが低減され存在すらしない；且つ、幹細胞の小胞をその中に包含するのに適合性、すなわち、小胞の包含を可能とし、高分子中および／または生体適合性マトリックス中に包含される前記小胞の活性を低下させないまたはほとんど低下させない、且つ、前記バイオマテリアルが患者、ヒトまたは動物、に埋め込まれると前記小胞を放出する。
【００１５】
本発明において、用語「生分解性」高分子とは、徐々の消失を共通の目的として、生体再吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅ）および／または生分解性および／または生体吸収性（ｂｉｏａｂｓｏｒｂａｂｌｅ）であること、並びに、この、生体適合性高分子中に包含される小胞の徐々の放出を、前記バイオマテリアルが埋め込まれたヒトまたは動物である患者における前記高分子の溶解または吸収のための１種または数種の異なるまたは相補的な機構により行うこと、を意味する。すなわち、本発明の実施に好適であると本発明者らに決定されたものの中からの高分子の選択に応じて、前記溶解は、徐々に溶解する前記バイオマテリアルそれ自体と関連があり、および／または、特に体液中に存在する酵素を通じた、ヒトまたは動物の身体の排出機構と関連があり得る。
【００１６】
本発明において、本発明の実施のために本発明者らに決定された生体適合性生分解性高分子は、以下であると有利である：
フィブリン、キトサン、コラーゲン、アルギン酸、ヒアルロン酸、およびその２種または数種の混合物を含む群から選択される天然起源の高分子；
マトリックス、例えば脱細胞化細胞外マトリックス；
脂肪族ポリエステル類、特に、乳酸由来の高分子、特にポリ乳酸、またはポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリリンゴ酸、特にポリ（β−リンゴ酸）、ポリカプロラクトン、ポリグリセロールセバケート、ポリエチレングリコール、ポリウレタンまたはポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、これらの脂肪族ポリエステル類の２種または数種の混合物、脂肪族ポリエステル類の共重合体、またはこれらの共重合体の混合物から選択される合成高分子、または
上記から選択される１種または数種の天然起源の高分子の混合物、および上記から選択される１種または数種の合成高分子の混合物。
【００１７】
本発明において、前記生体適合性生分解性高分子は、フィブリン、コラーゲンおよびヒアルロン酸を含む群から選択される天然起源の高分子であることが好ましい。
【００１８】
これらの高分子は、本発明の実施を実際に可能にし、さらに、特に心組織に関して、細胞適合性であり、処置された組織の生理的拘束（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）を復元することが可能であり、前記回復後の再手術を回避し、且つ、欠損組織の正確な復元を可能にする、という利点がある。
【００１９】
本明細書で指定されたものから選択される高分子に関係なく、高分子は、治療されることとなる欠損組織または欠損している可能性がある組織、特に心組織、内または上で、ヒトまたは動物体に埋め込み可能および／または注入可能な程に質が十分であり、前記生物体にとっての化学的または生物学的な観点からのいかなるリスク（特に微生物混入）も有さないことが好ましい。
【００２０】
本発明において、本発明の実施のために、例えばフィブリン、コラーゲンおよびヒアルロン酸から選択される高分子に関係なく、高分子は、５０ｎｍ〜１．２μｍ、好ましくは６０ｎｍ〜１μｍの範囲の孔径を有すると有利である。この孔径は、有利に、小胞の十分な包含と、組織および／またはその機能の復元速度と適合性である小胞の放出と組み合わされた高分子の分解速度とを可能にする。
【００２１】
フィブリンは、心組織の治療を目的とした本発明の実施に特に有利であるが、天然においては血液凝固の機序の中で生産され、一般的に実験室ではフィブリノーゲンおよびトロンビンの混合により得られる。トロンビンは、可溶性フィブリノーゲンを不溶性フィブリン糸に変換するセリンプロテアーゼとして作用する。本発明において、用語「フィブリン」は、あらゆる形態のフィブリンを意味する。フィブリンの例としては、限定はされないが、フィブリンＩ、フィブリンＩＩおよびフィブリンＢＢまたはこれらのフィブリンの混合物が挙げられる。フィブリンは、形成される際、細孔によって分けられる原線維ネットワークを形成し、下記の実施例で示されるように、その孔径はフィブリノーゲンおよびトロンビンの各濃度を調整することにより正確に制御可能である。フィブリンは単量体形態であっても高分子形態であってもよく、該高分子形態は架橋結合または部分的架橋結合していることが好ましい。本発明の実施のために、フィブリンは、インサイツにおける重合もしくは二次的ゲル化（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｇｅｌａｔｉｏｎ）により、注入可能であり、および／または、治療される欠損組織上もしくは内もしくは異常区域上に断片もしくは「パッチ」の形態で埋め込み可能もしくは配置可能であり、且つ、埋め込み後に自然に分解可能であるという利点を有する。本発明を実施するために使用できるフィブリン高分子を調製するためにフィブリン単量体を使用する方法および組成物の例としては、例えば、以下の文献に記載がある：米国特許第５，７５０，６５７号［３］、同第５，７７０，１９４号［４］、同第５，７７３，４１８号［５］および同第５，８０４，４２８号［６］、または、Ｗｏｎｇら、「Ｆｉｂｒｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｔｏ  ｄｅｌｉｖｅｒ  ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２００３；８９：５７３−８２［７］；Ｓｐｉｃｅｒら、Ｆｉｂｒｉｎ  ｇｌｕｅ  ａｓ  ａ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１０；１４８：４９−５５［８］；  Ｗｈｅｌａｎら、「Ｆｉｂｒｉｎ  ａｓ  ａ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１４；１９６：１−８［９］；Ａｈｍａｄら、Ｆｉｂｒｉｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ：「Ｔｈｅ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０１５；８１：１２１−３６［１０］。フィブリノーゲンの重合速度は、ｐＨに働きかけることにより、例えば、ｐＨ緩衝溶液を用いることにより、および／または、フィブリノーゲンおよびトロンビンの各濃度の比を正確に調整することにより、調節することができる。本発明を実施するために使用できるフィブリンを得ることを可能とする市販製品の例としては、ヒトまたは動物体の組織内または上に埋め込みおよび／または注入するのに十分な品質のものが好ましい。これは、例えば、ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）、ＴＩＳＳＵＣＯＬ  ���ＩＴ（登録商標）、ＡＲＴＩＳＳ（登録商標）、ＴＩＳＳＥＥＬ（登録商標）、ＶＩＶＯＳＴＡＴ（登録商標）であり得る。本発明者らは、例えば、２０ｍｇ／ｍＬ−４Ｕのフィブリノーゲン／トロンビン濃度比（この量
のトロンビンが２５−μＬの液滴の形態で均一に分散している）が、以下の文献で報告されているように、３７℃、５〜１０分間での、該混合物の重合、および、フィブリノーゲン溶液と最初に混合された胚性幹細胞に由来する心筋前駆細胞のベクトル化、の達成に最適であったことを示した：Ｂｅｌｌａｍｙら、「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｅｎｅｆｉｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｉｎｔｏ  ａ  ｆｉｂｒｉｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ」、Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．  ２０１５  Ｓｅｐ；３４：１１９８−２０７［１１］、およびＰｒ．  Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｍｅｎａｓｃｈｅら、「Ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ：  ａ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ」、Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．  ２０１５；３６：７４３−５０［１２］。
【００２２】
キトサンは、β−およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンが結合したＤ−グルコサミンの不規則分布から構成される多糖類であり、例えばキチンの脱アセチル化によって得られる。キトサンは、多様な分子量で市販されており、通常は７０％〜９０％の脱アセチル化度を有する。キトサンの分子量は３，８００〜２０，０００Ｄａと様々である。キトサンは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に類似した構造特性を有しており、下記のＴ．  ＣｈａｎｄｙおよびＣＰ  Ｓｈａｒｍａの文献、「ｃｈｉｔｏｓａｎｅ  ｃｏｍｍｅ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｕ」、Ｂｉｏｍａｔ、Ａｒｔ．  Ｃｅｌｌｓ、Ａｒｔ．  Ｏｒｇ、１８；  １−２４  １９９０［１３］に記載されるようなグリコサミノグリカンの機能を模倣していると思われる。市販されおり且つ本発明を実施するために使用できるキトサンの例としては、例えば、シグマ・アルドリッチ社製、ロット番号ＳＬＢＧ１６７３Ｖ、１９０ｋＤ、粘度２０〜３００ｃｐｓ、７５〜８５％のアセチル化度のキトサン、または、現在臨床で使用されているキトサンを基剤とする止血薬（ＣｈｉｔｏＦｌｅｘ（登録商標）、ＣｈｉｔｏＧａｕｚｅ（登録商標）ＰＲＯを挙げることができる。
【００２３】
本発明を実施するために使用できる、特に心組織の治療を目的とする本発明の実施のために使用できるコラーゲンは、例えば、若いウシもしくはブタの集団またはＥＳＢ（狂牛病）を有さないことを保証された動物に由来する医療用コラーゲンであることが好ましい。配給される動物は、閉鎖集団由来、または、オーストラリア、ブラジルおよびニュージーランドなどのＢＳＥ症例が報告されたことがない国に由来することが好ましい。製造法に応じて、コラーゲンまたはその変性型であるゼラチンが、下記のものとして使用できることを示す、かなりの数の研究がある：Ｌａｄａｇｅらの文献、「Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ
Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｍａｍｍａｌｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｏｓｔ−ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ」、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１３；８：ｅ５９６５６［１４］に記載されているような、注射剤形態の、有効な物質媒介物、または、Ｐｏｌｉｚｚｏｔｉらの文献、「Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｇｅｌｆｏａｍ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｒｉｏｓｔｉｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｎ  ｃｌｏｔ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ」、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、  ２０１２；７：ｅ３６７８８［１５］もしくはＭｏｒｃｕｅｎｄｅら、「Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ
ＮＧＦ，  ＢＤＮＦ，  ＮＴ−３  ａｎｄ  ＧＤＮＦ  ｏｎ  ａｘｏｔｏｍｉｚｅｄ  ｅｘｔｒａｏｃｕｌａｒ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｒａｔｓ」、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ．  ２０１３；２５０：３１−４８［１６］に記載されているような、Ｇｅｌｆｏａｍ（商標）などの、止血スポンジの形態をとり得るパッチ、または、Ｗｅｉらの文献、「Ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ＦＳＴＬ１  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔ
ｉｏｎ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｓ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｈｅａｒｔ」、Ｎａｔｕｒｅ．  ２０１５  Ｓｅｐ  ２４；５２５（７５７０）：４７９−８５  ［１７］；Ｊｏら、「Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＢＭＰ−２  ａｎｄ  ＢＭＰ−７  ｆｏｒ  ｂｏｎｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｈｅｐａｒｉｎｉｚｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｍｅｍｂｒａｎｅ」、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ
Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｓｕｒｇ．  ２０１５；４４：９２１−８．）［１８］；およびＯｌｉｖｅｒ  Ｒ．ら、１９７６、Ｃｌｉｎ．  Ｏｒｔｈｏｐ  １１５：  ２９１−３０；  １９８０、Ｒｒ  Ｊ．  Ｅｘｐ  Ｃｈｅｍｉｎ  ６１、５４４−５４９；  １９８１、Ｃｏｎｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ  ９：  ５９−６２［１９］に記載されているような、膜。
【００２４】
アルギン酸は、Ｓｋｊａｋ−Ｂｒａｅｒｋ，  Ｇ．；Ｇｒａｓｄａｌｅｎ，  Ｈ．；Ｓｍｉｄｓｒｏｄ，  Ｏ．の文献、Ｉｎｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｉｏｎｉｃ  ｇｅｌｓ．  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．  Ｐｏｌｙｍ．  １９８９，  １０，  ３１−５４  ［２０］に記載のように、天然において生産される、天然に豊富な、陰イオン性親水性多糖類である。本発明を実施するために使用できるアルギン酸の例は、例えば、以下の文献に記載されている：Ｓｋｊａｋ−Ｂｒａｅｒｋら［２０］、またはＫｏｌａｍｂｋａｒら、「Ａｎ  ａｌｇｉｎａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ  ｂｏｎｅ  ｄｅｆｅｃｔｓ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１１；３２：６５−７４［２１］；Ｒｕｖｉｎｏｖら、「Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ＨＧＦ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｌｇｉｎａｔｅ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ  ｏｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ
ｉｎ  ａ  ｈｉｎｄｌｉｍｂ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｍｏｄｅｌ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１０；  ３１：４５７３−４５８２［２２］、並びに、Ｍａｎｎらの文献、「Ｏｎｅ−ｙｅａｒ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ＡＵＧＭＥＮＴ−ＨＦ：  ａ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ａｌｇｉｓｙｌ  ｉｎ
ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ」、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ．  ２０１６；１８：３１４−２５［２３］に報告されたアルギン酸の注射剤（Ａｌｇｉｓｙｌ−ＬＶＲ（登録商標）を評価した臨床試験報告。
【００２５】
ヒアルロン酸も、心組織の治療を目的とした本発明の実施において有利であり、結合組織、上皮組織および神経組織に広範に分布しているグリコサミノグリカンであって、例えば、硝子体液中および滑液中に存在している。ヒアルロン酸は、細胞外マトリックスの主成分の１つである。本発明の実施において、例えば、以下の文献に記載される製品を用いることが可能である：Ｓｉｌｖａら、「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＬＬＫＫＫ１８  ｌｏａｄｅｄ  ｉｎｔｏ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｎａｎｏｇｅｌ  ｆｏｒ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」、Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．  ２０１６  Ａｕｇ  １０；２３５：１１２−２４［２４］、または、Ｓｏｒａｎｎｏら、「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０  ｖｉａ  ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｒｅｎａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ａｃｕｔｅ  ｋｉｄｎｅｙ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ」、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２０１６；３１１：Ｆ３６２−７２［２５］、または、Ｅｃｋｈｏｕｓｅら、「Ｌｏｃａｌ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＴＩＭＰ−３  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ
ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．  ２０１４；６：２２３ｒａ２１［２６］。これは、例えば、Ｌａｎｄｉらの文献、「Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  ｓｋｉｎ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｓｙｎｄａｃｔｙｌｙ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ：  ａ  ｎｏｖｅｌ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｏｄｅｌ」、Ｊ  Ｈａｎｄ  Ｓｕｒｇ  Ｅｕｒ  Ｖｏｌ．  ２０１４  Ｎｏｖ；３９（９）：９９４−１０００［２７］に記載されるような、皮膚の修復を目的とした製品、例えばＨｙａｌｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）、または、Ｇｕｔｏｗｓｋｉ  ＫＡ．の文献、「Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｉｌｌｅｒｓ：  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅｓ」、Ｃｌｉｎ  Ｐｌａｓｔ  Ｓｕｒｇ．  ２０１６；４３：４８９−９６［２８］で提示されたものなどの、美容外科で使用されるフィラー製品であってもよい。ヒアルロン酸には、ゲル形態のインプラントを形成させるために、例えばカテーテルの使用により心組織に注入可能である、または、外科手術である開胸術により送達可能である、という利点があり、これにより、例えば８〜１０日間かけた前記小胞の徐放送達が可能となる。
【００２６】
本発明は、脱細胞化細胞外マトリックスを用いても実施可能である。前記細胞外マトリックスは、哺乳類の組織内の細胞を取り囲み支持している複雑な構造体である。前記細胞外マトリックスは、以下の３種の主要な生体分子から構成される：構造タンパク質、例えば、コラーゲンおよびエラスチン、特殊なタンパク質、例えば、フィブリリン、フィブロネクチンおよびラミニン、並びにプロテオグリカン、例えば、グリコサミノグリカン。脱細胞化細胞外マトリックスは、細胞外マトリックスの構造が脱細胞化された後も維持されるように調製されることがより好ましい。そのようなマトリックスを、例えば、組織から、好ましくは、本発明のバイオマテリアルで治療されるべき欠損組織に対応する、またはそれと適合性である組織から調製するために、例えば、以下に記載のプロトコルを用いることができる：文献ＷＯ２００７０２５２３３［２９］、またはＫｈｏｒｒａｍｉｒｏｕｚ  Ｒらの刊行物、「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｈｅｅｐ  ａｏｒｔｉｃ  ｖａｌｖｅ  ｃｏｎｄｕｉｔｓ」、Ａｄｖ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．  ２０１４；５９：２９９−３０７［３０］またはＨｅ．らの刊行物、「Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ
ＳＤＳ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｎ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＣＭ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｉｎ  ｗｈｏｌｅ  ｏｒｇａｎ  ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ｋｉｄｎｅｙｓ」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ
Ｂ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．  ２０１６  Ａｐｒ  ８．  ｄｏｉ：  １０．１００２／ｊｂｍ．ｂ．３３６６８［３１］。前記マトリックスは同種組織から調製されてもよいし、異種組織から調製されてもよい。これは例えば心組織であってよく、例えばＶｅｎｔｒｉｇｅｌ（商標）ブタ心臓由来の脱細胞化細胞外マトリックスなどであり、例えば、Ｓｅｉｆ−Ｎａｒａｇｈｉらの文献「Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ
ａｎ  ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｉｎｇ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１３；５：１７３ｒａ２５［３２］に記載されている。
【００２７】
本発明において、高分子は、例えば、脂肪族ポリエステル類、特に、乳酸由来高分子、特にポリ乳酸すなわち「ＰＬＡ」、またはポリグリコール酸、ポリグリコール酸、乳酸−グリコール酸共重合体、ポリリンゴ酸、ポリカプロラクトン、これらの脂肪族ポリエステル類のうちの２種または数種の混合物、脂肪族ポリエステル類の共重合体、またはこれらの共重合体の混合物から選択される、合成高分子であり得る。
【００２８】
ＰＬＡは、エステル結合を形成するための、ヒドロキシル基上での、ある乳酸分子の酸基と、別のものとの反応により、長いフィラメント状の分子が構築された、完全生分解性高分子である。身体においては、埋め込み後、逆方向の反応が起こり、それにより放出された乳酸が通常の代謝過程に組み込まれる。例えば、該高分子に酸官能基または親水性物質を導入することによる、積極的な方法（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ）により該高分子を滅菌（ｓｔｅｒｉｌｉｓｅ）することによって、生体内でのＰＬＡの生分解速度を上げることができる。ＰＬＡは、水との反応によって、または酵素の作用で分解される、生分解性高分子を用いて縫合が行われる外科手術においても、使用される。ＰＬＡは、ある種の３Ｄプリンターによっても使用され得る物質である。主に２つの合成法、重縮合または開環重合、を用いてＰＬＡは入手される。２つの単量体、（Ｌ）−乳酸（ＬＬＡ）および（Ｄ）−乳酸（ＤＬＬＡ）、が使用される。本発明を実施するために使用できるＰＬＡは、例えば、Ｍｏｈｉｔｉ−Ａｓｌｉらの文献、「Ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ  ｌｏａｄｅｄ  ＰＬＡ  ｎａｎｏｆｉｂｒｏｕｓ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｋｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ
ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｏｆ  ｆｕｌｌ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｉｎｃｉｓｉｏｎ  ｗｏｕｎｄｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ｂ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．  ２０１５  Ｏｃｔ  ２８．  ｄｏｉ：  １０．１００２／ｊｂｍ．ｂ．３３５２０［３３］；Ｔｙｌｅｒらの文献、「Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  （ＰＬＡ）  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ２０１６  Ｊｕｌ  １５．  ｐｉｉ：  Ｓ０１６９−４０９Ｘ（１６）３０２１１−３．  ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１６．０６．０１８［３４］；およびＪａｍｅｓらの文献、「Ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ）  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ２０１６  Ｊｕｎ  ２５．  ｐｉｉ：  Ｓ０１６９−４０９Ｘ（１６）３０１９３−４．  ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１６．０６．００９［３５］に記載されるもの、または、例えば製品名Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標-エボニック社製）で市販されているものである。
【００２９】
本発明を実施するために使用できる乳酸−グリコール酸共重合体は、例えば、Ｌｉｕらの文献「ＨＢ−ＥＧＦ  ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｉｎ  ＰＧＡ／ＰＬＬＡ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｖｉａ  ｓｕｂｃｒｉｔｉｃａｌ  ＣＯ２  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ」、２０１６；１０３：１５０−９  ［３６］；Ｔｈａｔｃｈｅｒらの文献「Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β４  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ）  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ：
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ」、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ２０１２；１２７０：１１２−９  ［３７］に記載のもの；または、例えば製品名Ｒｅｓｏｍｅｒ（登録商標）の市販品である。
【００３０】
本発明を実施するために使用できるポリリンゴ酸は、例えば、Ｐｏｒｔｉｌｌａ−Ａｒｉａｓ  ＪＡらの文献、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｄｅｇｒａｄａｂｉｌｉｔｙ，  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒｓ  ｏｆ  ｆｕｎｇａｌ  ｐｏｌｙ（ｂｅｔａ，Ｌ−ｍａｌｉｃ  ａｃｉｄ）」、Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｂｉｏｓｃｉ．  ２００８；８：５４０−５０［３８］；Ｌｏｙｅｒらの文献、「Ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙ（ｍａｌｉｃ  ａｃｉｄ）−ｂａｓｅｄ  ｄｅｒｉｖａｔｅｓ：  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｎ
ａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ」、Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ．  ２０１４；２２：５５６−７５  ［３９］に記載のものである。
【００３１】
本発明を実施するために使用できるポリカプロラクトンは、例えば、Ｐａｔｅｌ  ＪＪらの文献、「Ｄｕａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＥＰＯ  ａｎｄ  ＢＭＰ２  ｆｒｏｍ
ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｄｕｌａｒ  ｐｏｌｙ−ε−ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ
ｐｒｅｆａｂｒｉｃａｔｅｄ  ｂｏｎｅ  ｆｌａｐｓ」、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  Ｐａｒｔ  Ｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２０１５；２１：８８９−９７［４０］；Ｓｉｎｇｈ  Ｓらの文献、「Ｔｈｅ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＶＥＧＦ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ｈｅｐａｒｉｎ．」Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１１；３２：２０５９−２０６９［４１］；Ｊｅｏｎｇらの文献、「Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ  ｓｃａｆｆｏｌｄ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ
ｖｉｖｏ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ  ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ．  ２０１２；１００：２０８８−９６［４２］に記載のもの；または、例えば、リファレンスＮＣＴ０２６８０１０６、ニキャスト社（Ｎｉｃａｓｔ  Ｌｔｄ．  ｃｏｍｐａｎｙ）の下で、皮膚創傷の治療用の即席電界紡糸マトリックスの形態で臨床評価中のものである。
【００３２】
本発明においては、上記のものから選択される１種または数種の天然起源の高分子の混合物、および上記のものから選択される１種または数種の合成高分子の混合物を用いることもできる。
【００３３】
本発明において、用語「幹細胞由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）」は、本明細書では「幹細胞由来の細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ
ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）」または「小胞」または「微小小胞」とも称され、特にインビトロの培養下で、幹細胞によって産生される１種または数種の要素を意味し、例えば、幹細胞が生存する環境で見られる小胞または微小小胞、エキソソーム、アポトーシス小体および微小粒子が挙げられる。従って、本発明に係る小胞は不均一な集団を含むが、その要素は特にその大きさと内容物によって識別できる。
【００３４】
本物のシャトルとして働くことで、これらの小胞は、特に、とある重要なシグナル経路（活性生体脂質も）に対して作用するマイクロＲＮＡの移動、および標的組織の細胞の遺伝子発現が可能なＤＮＡの断片の移動、を確実にすることにより細胞間情報伝達において重要な役割を果たす。本発明者らによって、心筋層内の移植後心筋前駆細胞およびそれに由来する小胞の機能等価性が特に確認された。本発明のバイオマテリアルによるこれらの小胞の有効な利用により、小胞がその効果を及ぼし得るのに十分な長さの期間、小胞が標的組織内に存在することを確認すること、および、急速な除去が、望ましくない全身性拡散を尚も引き起こしながら、このアプローチの有効性を損なうことを防ぐこと、が可能となる。
【００３５】
本発明において、幹細胞由来の細胞外小胞は、例えば、万能性幹細胞、多能性幹細胞またはその分化誘導体に由来させることができる。これは、例えば、以下から選択される細胞に由来する小胞であり得る：万能性細胞、すなわち、胚性幹細胞または誘導万能性体細胞または誘導万能性幹細胞（ｉＰＳ）、すなわち、成体から採取され、種々の方法、例え
ば、限定はされないが、アデノウイルス、プラスミド、トランスポゾン、センダイウイルス、合成ｍＲＮＡおよび組換えタンパク質によって万能性細胞として再プログラムされた細胞（ｃｅｌｌｕｌｅｓ）、例えば、ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａの文献、「Ａ  ｄｅｃａｄｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｔｏ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ．」、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１６；１７：１８３−９３［４３］に記載のものなど。これは、例えば、以下から選択される細胞に由来する小胞であり得る：多能性細胞、例えば間葉系幹細胞、またはその分化誘導体、特に、心筋細胞、血管細胞、筋肉細胞、網膜細胞、神経細胞、髄質細胞、骨軟骨細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、腸細胞、造血細胞、および免疫系細胞、特に、限定はされないが、樹状細胞。本発明の実施のために使用される、細胞の選択、ひいては小胞の選択は、当然ながら、特に修復されるべき欠損組織の、本発明のバイオマテリアルが使用される際の所望の治療標的によって決まる。
【００３６】
本発明において、上記細胞からの、本発明を実施するために使用できる小胞の調製は、細胞の破壊を必要とせず、且つ、最終産物がより良好に標準化されるという利点がある。実際に、前記小胞は、交絡因子に当然なるであろう小胞を含有しない（またはほとんど含有しない）ことが前もって確認された培地中に、当該細胞によって分泌される。細胞外小胞はこれらの条件培地から得られる。以下の文献は、幹細胞を培養するための方法、および、種々の細胞型から、本発明を実施するために使用できるこれらの培養物に由来する小胞を調製するための方法を記載している：
Anais Kervadec et al. [2].
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after first line chemotherapy in NSCLC − Oncoimmunology. 2015 Aug 12;5(4):e1071008. eCollection 2016 [50].
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【００３７】
すなわち、幹細胞がインビトロにおいて培地中で維持され、該幹細胞から産生された小胞が回収され、例えば前記文献に記載の通りに、有利には精製され、および／またはタンジェンシャルフィルトレーションおよび／もしくはクロマトグラフィーにかけられ、その後、本発明が実施される。
【００３８】
本発明において、生体適合性高分子は幹細胞由来の細胞外小胞を包含する。用語「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」とは、スポンジのように、高分子に小胞が含侵していること、または、小胞が液相において高分子と混合されており、高分子の重合時に高分子の構造内に捕捉されていること、を意味する。従って、本発明が企図する溶液は、小胞の制御放出を可能にし、且つ、水性媒体中において単回注射された小胞が曝されるであろう急速な洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）を回避するための、選択された小胞を有する選択された生体適合性高分子の機能付与または包含とみなすことができる。この包含または機能付与は、特に、前記高分子の賢明な選択、選択された小胞の性質、および高分子に小胞を含ませるために使用される手法により、実行できる。
【００３９】
本発明を実施するために使用できる本発明による包含法は、本明細書の以下に記載される。この包含は、本発明のバイオマテリアルにその分解を通じて全ての小胞を放出させ、長期的にバイオマテリアルによる欠損組織の治療を維持するのに十分な量で実行されることが好ましい。包含の上限は、特に、選択された高分子の包含能に関連付けられる上限である。また、欠損組織の拡張的な治療を確実にするのに十分な包含であることが、有用である。
【００４０】
本発明の方法は簡便且つ経済的である。本発明の方法は、選択された高分子を用いて、または、部分重合型もしくは非部分重合型の選択された高分子の、および、選択された小胞の、前駆単量体を用いて、実施できる。
【００４１】
本発明の方法は、幹細胞由来もしくはその分化誘導体由来の、または、生体適合性生分解性高分子と、および／もしくは、対応する１種もしくは複数種の単量体と、幹細胞由来もしくはその分化誘導体由来の細胞外小胞との混合物由来の、細胞外小胞を含む生体適合性液体培地中に、生体適合性生分解性高分子を浸漬する工程を含む。
【００４２】
本発明において、用語「生体適合性液体培地」は、小胞をそれらの形態および機能性で保存する液体培地を意味する。生体適合性液体培地は、インビトロまたはインビボにおいて幹細胞が前記小胞を産生する培地を十分に再現する水溶液であることが好ましい。生体適合性液体培地は、例えば、小胞を産生させるために選択された幹細胞のインビトロの培地に近い、もしくはそれと同一の溶液、または小胞を保存する生理溶液であり得る。前述の文献に記載されている培地が生体適合性液体培地として好適である。本発明のバイオマテリアルを形成するために、高分子内の小胞を多く包含するように、液体培地中の小胞の濃度が高いことがより好ましい。本発明において、小胞における濃度は３×１０１０〜３×１０１２（３百億〜３千億）小胞／ｍＬであることが好ましい。
【００４３】
例えば幹細胞の液体培地から、好ましい濃度を達成するために、幹細胞の液体培地の精密濾過または遠心分離によって、小胞の濃縮を進めることができる。生体適合性液体培地中で微小小胞を得るために使用できる方法論の例が、前述の文献［２］および［４４］〜［８２］に記載されている。
【００４４】
本発明において、高分子は、第一工程で製造され、次に、場合により、スポンジのようにより多くの小胞を吸収するように乾燥または部分乾燥され、次に、小胞に含侵され得る。また、選択された高分子または部分架橋高分子の前駆単量体は、選択された小胞と、例えば小胞を含む生体適合性培地と、重合前に混合され得る。本発明の方法では、小胞を包含する高分子がその後得られる。
【００４５】
すなわち、本発明において、小胞を含む生体適合性培地を含侵させた、またはそれと混合した、高分子、またはその部分的単量体または高分子前駆物質は、修復されるべき組織または異常区域におけるインサイツでの重合のために注射可能な形態で患者に投与することができ、あるいは、修復されるべき組織または異常区域上に既に重合した断片または「パッチ」の形態で埋め込むことができる。
【００４６】
本発明において、用語「断片」または「パッチ」とは、本明細書で定義されるような、治療されるべき生体内区域（例えば欠損組織）上に貼付することができる、小胞を包含する、本発明のバイオマテリアルの断片を意味する。この断片または「パッチ」は、治療されるべきヒト組織または動物組織の表面を、部分的または全体的に、十分に覆うことを可能にする寸法と、治療用小胞を長期的に放出するために十分な数の治療用小胞を含有することを可能にする厚さとを有することが好ましい。本発明において、治療されるべき組織
と接触できる断片または「パッチ」の表面は、有利には、５〜３０ｃｍ２、好ましくは１５〜２５ｃｍ２の寸法を有することができる。本発明において、治療されるべき組織と接触できる断片または「パッチ」の厚さは、有利には、０．５〜２ｍｍ、好ましくは０．８〜１．２ｍｍとすることができる。
【００４７】
例えば、本発明において、有利には、上記の寸法などの寸法を有する断片またはパッチは、有利には、１０１０〜１０１２個の小胞を含むことができる。
【００４８】
本発明において、上記で定義されたものなどの単量体または部分重合体は、治療されるべき組織上または異常区域上に断片またはパッチを埋め込むための「接着剤」として使用することができ、この重合により組織上のパッチの固定化が可能となる。本発明において、組織上のパッチの固定化は、パッチを組織上に接着させることにより、または、組織とパッチの境界面において選択された高分子の単量体を重合することにより、または、例えば外科用接着剤を使用することにより、達成することもでき、例えば、前記高分子のうちの１つがこの役割を果たすことができる。
【００４９】
例えば、本発明の方法は、上記のように、例えばＰＬＡを用いて、エレクトロスピニングまたは３Ｄプリンティングなど、高分子の三次元構造を正確に定義することを可能にする手法によって、実施することもできる。例えば、以下の文献に記載の手法を用いることができる：Ｋｒｉｓｈｎａｎらの文献、「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｍｂｅｄｄｅｄ  ｎａｎｏｆｉｂｅｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｎｉｃｈｅ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０１６；９７：１７６−９５［８３］；またはＬｕ  Ｙらの文献、「Ｃｏａｘｉａｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ  ｆｉｂｅｒｓ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ  Ｒｅｖ  Ｎａｎｏｍｅｄ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１６  Ｆｅｂ  ５．  ｄｏｉ：  １０．１００２／ｗｎａｎ．１３９１．  ［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］［８４］；または、Ｇａｅｔａｎｉ  Ｒらの文献、「Ｅｐｉｃａｒｄｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａ  ３Ｄ−ｐｒｉｎｔｅｄ  ｇｅｌａｔｉｎ／ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｐａｔｃｈ  ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０１５；６１：３３９−４８［８５］。
【００５０】
本発明のバイオマテリアルは、移植幹細胞無しで、または移植幹細胞を補完するものとして、欠損組織を治療することを可能にする。
【００５１】
すなわち、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載されるものなどのバイオマテリアルにも関する。本明細書にて開示されるように、これは、例えば、ヒトまたは動物の欠損組織の治療を目的とする医薬とすることができる。本発明において、前記医薬は、例えば、心組織、血管組織、筋肉組織、眼球組織、大脳組織、髄質組織、骨軟骨組織、肝臓組織、腎臓組織、腸組織、造血組織または免疫組織から選択される組織の治療を目的とすることができる。
【００５２】
本発明の既に記載された多くの利点、および当業者には明らかな利点の中でも、本発明のバイオマテリアルは、最小限に浸潤的に、例えばカテーテル法により、または外科的に、送達された小胞の効果的なベクトル化を可能にし、さらに、細胞それ自体の移植に固有の、従来技術の多くの問題、特に物流、コストおよび倫理、を克服することを可能にする細胞療法を介して、幹細胞の生産性効果を二重にすると言うこともできる。本発明におい
て、前記バイオマテリアルは、特に、移植の促進、損失の低減、元の組織の治療を同時に行うこと、並びに移植された幹細胞の統合および機能付与のために、細胞移植片を同時に行うこともできる。
【００５３】
本発明の他の特徴および利点は、特に、情報提供を目的として非限定的に以下に示される実験および図面に照らし合わせることで、当業者には明らかとなり得る。
【実施例】
【００５４】
実施例１：幹細胞から小胞を得る方法
本発明の実施を目的とした小胞の生産のために、非限定例として以下のプロトコルが使用される：
心細胞の小胞の産生のためには、Ｂａｒｉｌｅらの文献［４４］に記載のプロトコル。
間葉系幹細胞の小胞の産生のためには、Ｌａｉらの文献［４６］に記載のプロトコル。
神経幹細胞の小胞の産生のためには、Ｂａｕｌｃｈらの文献［４７］に記載のプロトコル。
【００５５】
例えば、ｉＰＳ由来心血管前駆細胞の細胞外小胞の場合、供給業者セルラー・ダイナミクス・インターナショナル社（ＣＤＩ社、米国ウィスコンシン州マディソン）から得た、ヒトｉＰＳ由来心筋前駆細胞（ｉＰＳ−Ｐｇ：ｉＣｅｌｌ心筋前駆細胞（ｉＣｅｌｌ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌ）、参照：ＣＰＣ−３０１−０２０−００１−ＰＴ）を使用した。凍結保存ｉＰＳから生じるこれらの前駆細胞を、解凍し、フィブロネクチン（参照：１１０５１４０７００１、ロシュ・アプライド・サイエンス社（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、米国インディアナ州インディアナポリス）で事前コーティングしたフラスコ内に７８，０００細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種し、供給業者が推奨する増殖プロトコルに従って、無血清培地中、７％ＣＯ２、３７℃で４日間培養する：ウィリアムＥ培地（参照：Ａ１２１７６−０１、ライフテクノロジーズ社、サン・トーバン、フランス）に、パック：「肝細胞維持用サプリメントパック」（参照：ＣＭ４０００、ライフテクノロジーズ社）のカクテルＢ（Ｃｏｃｋｔａｉｌ  Ｂ）、２５μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（参照：１５７５０、ライフテクノロジーズ社）、および１μｇ／ｍｌのゼブラフィッシュ由来ＦＧＦ−２（参照：ＧＦＺ１、セル・ガイダンス・システム社（Ｃｅｌｌ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ）、ケンブリッジ、英国）を添加。無血清培地中で培養した細胞に、細胞外小胞（ＥＶ）を産生および分泌させる。培養２日目（Ｄ２）に培地を交換し、培養４日目（Ｄ４）にその条件培地を収集する。この条件培地には４８時間（３日目および４日目）分泌された細胞外小胞が含有される。この条件培地を、細胞外小胞の単離用に回収する。培地および培養条件は、細胞の種類（例えば間葉系細胞か神経細胞か）に応じて変更を加えてもよい。
【００５６】
使用する幹細胞にかかわらず、細胞外小胞の単離のために、条件培地を回収し、１２００ｇで６分間の通常の遠心分離にかけて、細胞および混入する細胞片をペレット化する。そのようにして清澄化した上清を、きれいなチューブに移す。その上清は、保存のために−８０℃で凍結してもよいし、あるいは、細胞外小胞の単離用に新鮮なまま使用してもよい。単離のために、清澄化した前記培地を、無菌超遠心用チューブ内で、１００，０００ｇで１６時間、真空下、４℃の温度で、最大加速度および最大減速度を用いて、超遠心する。超遠心後の上清を取り除き、ペレットを少量の無菌ＰＢＳ中で再懸濁し、０．１μｍで濾過する。この細胞外小胞の調製物は、本発明の実施のために直ちに使用してもよいし、あるいは、−８０℃で保存してもよい。
【００５７】
得られた小胞は、低温電子顕微鏡法により、「ナノ粒子トラッキング解析」（ＮＴＡ）法およびウェスタンブロットで、キャラクタリゼーションおよび解析を行う。
【００５８】
低温電子顕微鏡法は、細胞外小胞を観察し、エキソソーム（５０〜１５０ｎｍ）、微小粒子（１００〜５００ｎｍ）およびアポトーシス小体（５００ｎｍ超の多胞性粒子）など、細胞外小胞の種々の亜集団の存在を同定することを可能にする。添付の図１は、細胞外小胞がｉＰＳ由来心血管前駆細胞から得られた場合の、細胞外小胞の種々のサブタイプの存在を明らかにしている、低温電子顕微鏡法の画像（ａ）〜（ｆ）を示している。エキソソーム（ａ、ｄ）および微小粒子（ｂ、ｅ、ｃ）の構造および大きさが分かる。アポトーシス小体であり得る多胞性構造（ｆ）も観察される。
【００５９】
４８８ｎｍレーザーを備えた、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＬＭ−１０（商標）（ＮＴＡ−３．２、マルバーン・インスツルメンツ社（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）、モルバーン、英国）プラットフォーム上での、「ナノ粒子トラッキング解析」（ＮＴＡ）法によって、細胞外小胞がｉＰＳ由来心血管前駆細胞から得られた場合の、各調製物中の粒径の分布および細胞外小胞の濃度を測定することが可能となる。添付の図２は、分離された粒径の分布における、良好な再現性を示す、３つの独立した細胞外小胞調製物（レプリケート１、２および３）の、３つのナノ粒子トラッキング解析を示している。
【００６０】
ウェスタンブロット法は、特に細胞外小胞がｉＰＳ由来心血管前駆細胞から得られた場合の、細胞外小胞のサブタイプであるエキソソームの存在を、抗体、特に特有のＣＤ８１およびＣＤ６３、を用いて解析することを可能にする。添付の図３は、エキソソームマーカーの存在を確認している、且つ、細胞外小胞調製物中にこの小胞型が存在することを示すことを可能とする、この解析の結果を示している。ＣＤ８１は、これらの分泌細胞に対して、前記小胞中で濃縮されている。
【００６１】
実施例２：小胞の標識
本実施例では、本発明のバイオマテリアルの作製時に選択された高分子内の小胞の統合または包含を検証するために、以下で詳述される２つの小胞標識法、着色剤による標識およびカルセイン−ＡＭ（ＡＭ＝アセトキシメチル）による標識、のうちの一方または他方を使用する。
【００６２】
（ａ）着色剤による標識
得られた細胞外小胞の全サブタイプの膜を一律に標識するため、疎水性着色剤、ＤｉＤ
Ｖｙｂｒａｎｔ細胞トレーサー（商標）（参照：Ｖ−２２８８７、Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）Ｃｅｌｌ−Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、モレキュラープローブス社）（以後「ＤｉＤ」）を使用する。清澄化した条件培地（上記参照）を超遠心用チューブに移す。体積をＰＢＳで１５〜２０ｍＬにメスアップする。均質化された条件培地１ｍＬ当たり、１μＬのＤｉＤ  Ｖｙｂｒａｎｔ細胞トレーサーを添加する。この条件培地を４℃で３時間、１００，０００ｇで超遠心する。ペレットをＰＢＳ中で再懸濁する。その体積を再度２０ｍＬにメスアップし、懸濁液を４℃で９０分間、１００，０００ｇで再度超遠心して、遊離混入ＤｉＤを除去する。得られたペレットをＰＢＳ中で再懸濁する。このようにして標識された小胞は遠赤外の蛍光を発する。
【００６３】
（ｂ）カルセイン−ＡＭによる細胞外小胞の標識
Ｇｒａｙ  ＷＤらの文献、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｃｏｖａｒｉａｎｔ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｉｎ  ｈｙｐｏｘｉａ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ２０１５  Ｊａｎ１６；  １１６（２）：２５５−６３［８６］に記載されているプロトコルを用いる。カルセイン−ＡＭの前駆物質は、細胞および細胞外小胞の脂質二重層を透過する非蛍光性の疎水性分子である。機能的なエステラーゼの存在下で、この前駆物質は切断され、蛍光性且つ親水性となり、細胞内部のシグナルを捕捉する。カルセイン−ＡＭ（カ
タログ番号Ｃ３１００ＭＰ、ライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ））はＤＭＳＯ中に溶解し、最終濃度は１ｍＭとする。ｉＰＳ−Ｐｇの培養から得られた条件培地を、３７℃で１時間、２μＭのカルセインＡＭと共にインキュベートする。この培地を１００，０００ｇで１６時間超遠心する。標識された細胞外小胞のペレットをＰＢＳ中で再懸濁する。ペレットの洗浄のために、新たなＰＢＳを１７ｍＬ添加した後、懸濁液を再度１００，０００ｇで１６時間超遠心する。内部移行実験用に、この洗浄された細胞外小胞のペレットをきれいなＰＢＳ中に再懸濁する。前記洗浄から得られた上清は、遊離カルセインでは起こり得る混入を確認するための対照として使用する。蛍光性カルセインで緑色に標識された細胞外小胞は、顕微鏡イメージングをフローサイトメトリーと組み合わせることを可能にする装置の一部である、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標）Ｍａｒｋ  ＩＩ  Ｉｍａｇｅ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、メルクミリポア社）によって、可視化される。
【００６４】
実施例３：本発明のバイオマテリアルの作製
３．ａ）フィブリンパッチの作製：
フィブリンパッチは、本実施例に開示された通りに作製された。原理的には、遠心分離後に得られた細胞外小胞（上記の実施例１を参照）をフィブリノーゲン水溶液中に再懸濁し、その後、この溶液をトロンビン溶液と混合する。フィブリン重合体の形成が行われ、その後、同時に、細胞外小胞が被覆および捕捉される。
【００６５】
フィブリンを得るために、ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）製品（オムリックス・バイオファーマシューティカルズ−エチコン・バイオサージェリー社（Ｏｍｒｉｘ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ−Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｂｉｏｓｕｒｇｅｒｙ）、ベルギー）を用い、以下の２つの成分を用いて、フィブリンの断片すなわち「パッチ」を作製する：
ヒトフィブリノーゲン（５０〜９０ｍｇ／ｍｌの溶液を２ｍｌ）
ヒトトロンビン（８００〜１２００Ｕ／ｍｌの溶液を２ｍｌ）
【００６６】
ＰＢＳまたはα−ＭＥＭ液中に各々溶解された、フィブリノーゲン溶液の、およびトロンビン溶液の混合物を用いて、パッチを形成する。成分の割合は下記の表Ｉに示され、２つの溶液の体積比は１：１とする。特に、前記成分の一方を様々な濃度にして試験して、パッチの取扱い性、パッチの弾性、メッシュのサイズ、並びに小胞の包含性および放出性などのフィブリンパッチの物理的特性を洗練するために、２つの前記成分を用いて、下記の表Ｉ（パラグラフｄ）中の同一の濃度を調製する。
【００６７】
図面および本明細書において、数字が続く「Ｆ」はフィブリノーゲンにおける濃度を表し、この数字はこの濃度を単位ｍｇ／ｍＬで表し；「Ｔ」は、トロンビンにおける濃度であり、その後ろにこの濃度が単位Ｕ／ｍＬで表されている。
【００６８】
３．ｂ）成分の濃度に応じたフィブリンパッチの特徴
フィブリノーゲン／トロンビン（Ｆ／Ｔ）の濃度を変えて、いくつかのパッチを作製した。本発明者らは、フィブリノーゲン／トロンビンにおける濃度が高いほど、パッチがより速く重合されることを観察した。この現象の主な効果は、パッチ内部のメッシュのサイズの変動にあり、重合が速いほど、細孔はより大きくなる。これは、添付の図４に示されているように、クライオスタットとヘマトキシリン／エオジン染色とにより、パッチの切断部で容易に確認できる。フィブリン線維は暗紫色に見える。
【００６９】
添付の図４において、写真（Ａ）は１０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンおよび２Ｕ／ｍＬのトロンビン（Ｆ１０Ｔ２）によるパッチを示しており；写真（Ｂ）はＦ２０ｍｇ／ｍＬ＋Ｔ４Ｕ／ｍｌ（Ｆ２０Ｔ４）によるパッチを示しており；写真（Ｃ）はＦ４０ｍｇ／ｍＬ＋Ｔ８Ｕ／ｍｌ（Ｆ４０Ｔ８）によるパッチを示している。写真は全て同一倍率で撮
影されたものである。スケールバーは２００μｍである。
【００７０】
この図に示される写真は、パッチ内部の細孔のサイズがフィブリノーゲンの濃度（Ｆ）およびトロンビンの濃度（Ｔ）のそれぞれにより変化することを示しており、ここで、最小濃縮（ｌｅａｓｔ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）の（Ａ）および（Ｂ）は最大濃縮（ｍｏｓｔ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）の（ＣおよびＤ）よりも小さな細孔を有している。生産された断片またはパッチにおいて、５０μｍ〜２００μｍの範囲の孔径が観察された。
【００７１】
パッチの構造の変動の帰結として、パッチの取扱い性がある。本発明者らは、種々のＦ／Ｔ濃度のパッチの取扱い性および縫合性を評価した。
【００７２】
本発明者らは、Ｆ５Ｔ１〜Ｆ４０Ｔ８の間で、細胞外小胞の含侵および埋め込みに有利なパッチの取扱い性を観察した。パッチの取扱い性もパッチの厚さに基づくものである。実験中に認められた有利な厚さは０．８〜１．２ｍｍである。添付の図５は、例として、得られたパッチの１つを示しており、パッチは１ｍｍの厚さを有している。
【００７３】
３．ｄ）弾性：
パッチの弾性も、本発明者らは、Ｆ／Ｔにおける濃度によるものであると考えた。ＡｉｒＥｘｐｌｏｒｅｒＲ超音波システム（スーパーソニック・イマジン社（Ｓｕｐｅｒｓｏｎｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｅ））を用いて、ゲル内部の領域を選択した後、弾性を直接測定した。Ｓｈｅａｒ  Ｗａｖｅ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒデバイスを用いて得られた結果は、添付の図６に示されるように、Ｆ／Ｔ濃度の増加に伴う、パッチの剛性の増加を示している。この図には、パッチの弾性（単位ｋＰａ）に対するＦ／Ｔにおける濃度の影響が示されている。心臓用パッチの場合、弾性の最適範囲は６〜１５ｋＰａであり、好ましい値は１０ｋＰａ付近である。しかし、弾性は標的組織の性質に応じて調節されるべきである。
【００７４】
３．ｅ）２４ウェルプレートの１ウェルのサイズのフィブリンパッチにおける細胞外小胞の包含プロトコルの例：
備品：
５％無菌アガロース
無菌ＰＢＳ中の、実施例１により作製されたｉＰＳ−Ｐｇの細胞外小胞、
無菌ＰＢＳ中のフィブリノーゲン溶液（Ｅｖｉｃｅｌ、オムリックス・バイオファーマシューティカルズ社、ベルギー）
無菌ＰＢＳ中のトロンビン溶液（Ｅｖｉｃｅｌ、オムリックス・バイオファーマシューティカルズ社、ベルギー）
α−ＭＥＭ培地（参照：２２５７１０２０  ＧＩＢＣＯ、ライフテクノロジーズ社）
２４ウェルプレート（「Ｐ２４」）（参照：００９２２４、ＴＰＰ、ダッチャー社（Ｄｕｔｓｃｈｅｒ））
【００７５】
方法：
１：５％アガロースを調製し、オートクレーブ滅菌する（１３４℃での液体用プロトコル）。
２：まだ液体のこのアガロース溶液をＰ２４ウェル内に入れ、ウェルの底を被覆し、２０分間硬化させる。このアガロースは、フィブリンパッチがウェルの底に付着することを防ぐ。
３：所望のパッチの物理的特性を持たせるために、下記の表に従って、フィブリノーゲンにおける濃度およびトロンビンにおける濃度を選択する。
４：所望のフィブリノーゲン濃度を有し、２０×１０６個の細胞外小胞と混合される、Ｐ２４サイズのパッチ当たりの、１５０μＬの最終体積の、溶液Ａを、ＰＢＳまたはα−Ｍ
ＥＭ中で調製する。
５：所望のトロンビンにおける濃度を有する、１５０μＬ中の最終体積の、Ｐ２４サイズのパッチ当たりの、溶液Ｂを、ＰＢＳまたはα−ＭＥＭ中で調製する。
６：適当なホモジナイズと泡の発生回避のために、ピペットで前後運動させて、１５０μＬの溶液Ａと１５０μＬの溶液Ｂとを十分に混合する。
７：３７℃で２０〜２５分間インキュベートする。
８：α−ＭＥＭ培地またはＰＢＳ培地を添加してパッチを覆い、乾燥を防ぐ。２４ウェルプレートの１ウェルのサイズのパッチを覆うのに約１ｍｌの液体が必要である。
９：休ませるためにパッチを静置する、有利には４時間である。
【００７６】
【表１】
2019526388.tif 000003
【００７７】
３．ｆ）フィブリンパッチ内の標識細胞外小胞の可視化：
細胞外小胞をカルセインＡＭで標識し、フィブリンパッチに包含させる。このパッチを次に、ＯＣＴ（商標）（参照：ＴＦＭ−５、ＭＭフランス社（ＭＭ  Ｆｒａｎｃｅ））でコートし、液体窒素中で凍結し、クライオスタットで切断する。切断の厚さは７〜１０μｍの間で変動する。切片を蛍光顕微鏡法で観察する。切片を、４０倍または６３倍の倍率で撮影された写真の形態で、図７に示す。
【００７８】
用語「対照パッチ」は、標識小胞を受け取っていないパッチを指して用いられる。用語「細胞外小胞パッチ」は、カルセインで標識された細胞外小胞を含有するパッチを指して用いられる。図７は、２つの異なる時点（Ｄ０：重合直後；Ｄ２：α−ＭＥＭ培地中３７℃で２日間のインキュベーション後）かつ２つの異なる蛍光顕微鏡の倍率（４０倍および６３倍）での実験における、カルセインで標識された細胞外小胞を含有する、または含有しないパッチを示している。対照パッチのパッチが見えるように、レーザーは意図的に押し出されている。
【００７９】
この図において、黒い点は、パッチ内部に見ることができる蛍光性細胞外小胞に対応する。
【００８０】
対照パッチには、点状の緑色蛍光は存在しておらず、これは小胞が存在しないことを意味している。パッチのメッシュは対照パッチと細胞外小胞パッチとに見ることができる。
しかし、「細胞外小胞パッチ」では、使用された種々の濃度における２つのパッチで、緑色の点の存在が分かる。これらの緑色点の存在は、カルセインで標識された細胞外小胞が存在することを意味している。これらの細胞外小胞はパッチ内部に存在している。
【００８１】
３．ｇ）フィブリンパッチの細胞外小胞の放出試験
カルセイン−ＡＭで標識された２０×１０６個の細胞外小胞を含有する上記（表Ｉ）の種々のＦ／Ｔ濃度のパッチを、純粋α−ＭＥＭ培地、すなわち、細胞外小胞のサイズの粒子を含有しない培地中で４８時間インキュベートした。
【００８２】
次に、これらの培地を収集し、１２００ｇで１０分間遠心してフィブリンデブリをペレット化し、上清をきれいなチューブに移す。このようにして清澄化した培地をＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍで解析する。結果を図８に示す。
【００８３】
Ｆ５Ｔ１＋細胞外小胞という条件の条件培地およびＦ２０Ｔ４＋細胞外小胞という条件の条件培地中で、細胞外小胞は標識され、パッチ内に包含された。条件培地中の粒子の存在は、細胞外小胞の放出を示している。この放出はＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍで確認された。
【００８４】
ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍで得られた結果は、４８時間後の条件培地中に細胞外小胞の放出が実際にあることを示している。Ｆ５Ｔ１単独パッチおよびＦ２０Ｔ４単独パッチから回収された培地である対照に対して、Ｆ５Ｔ１＋細胞外小胞パッチおよびＦ２０Ｔ４＋細胞外小胞パッチの比較を行う。Ｆ５Ｔ１＋細胞外小胞条件の培地およびＦ２０Ｔ４＋細胞外小胞条件の培地中で、陰性対照と比較して、ポジティブな事象が観察される。
【００８５】
３．ｈ）ヒアルロン酸パッチの作製：
このパッチは、Ｅｃｋｈｏｕｓｅら［２４］に記載されているパッチであってよい。これは、特に、皮膚修復を目的とした製品Ｈｙａｌｏｍａｔｒｉｘ（登録商標）であってもよいし、あるいは、Ｇｕｔｏｗｓｋｉ  ＫＡの文献［２５］で提示された美容外科で使用されるフィラー製品であってもよい。上記のように、小胞含侵用にα−ＭＥＭ培地またはＰＢＳ培地を使用することが好ましい。
【００８６】
本発明者らは、細胞外小胞を制御された速度で８〜１０日間放出するゲルの形態の移植片を形成するための、カテーテル（経皮的アプローチ）を用いることで心組織に注入可能な、または、外科的に（開胸術）投与可能な、製剤を開発している。既に臨床応用に使用されている非架橋結合ＨＡが選択される。
【００８７】
３．ｉ）コラーゲンパッチの作製：
パッチは、Ｐｏｌｉｚｚｏｔｉらの文献［１５］に記載されているようなＧｅｌｆｏａｍ（商標）などの、止血性スポンジであってもよいし、あるいは、Ｗｅｉらの文献［１６］に記載されるような膜のパッチであってもよい。
【００８８】
実施例４：欠損組織の修復に対する本発明の細胞外小胞の有効性の試験
ａ）細胞外小胞の生物活性の解析−瘢痕形成試験（「創傷治癒アッセイ」）：
ヒト臍帯血由来の血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣシングルドナー、参照：Ｃ−１２２００、プロモセル社（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）、ハイデルベルク、ドイツ）を、４２，０００細胞／ｃｍ２の密度で無コート９６ウェルプレート上に播種し、内皮細胞用の完全培地（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ、参照：Ｃ−２２２１０、プロモセル社、ハイデルベルク、ドイツ＋Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｐａｃｋ、参照：Ｃ−３９２１０、プロモセル社）中、３７℃、５％ＣＯ２で、コンフルエントになるまで（一晩）培養した。
【００８９】
その後、１０μｌピペット用チップによるスクラッピングで、Ｔ０（初期時点０）に、コンフルエントの細胞層に、穴または「スクラッチゾーン」または「傷」を作製し、倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ−ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｔｉ、株式会社ニコン、東京、日本）によりリアルタイムで傷跡の位置を特定する。
【００９０】
次に、細胞を以下の通りの異なる条件下で２４時間培養する：完全な培地中（陽性対照）、または「欠乏（ｐｏｏｒ）」培地中（陰性対照；補体無しの培地）、または純粋なウシ胎仔血清から単離された細胞外小胞を含有する欠乏培地中、またはｉＰＳ−Ｐｇの細胞外小胞を含有する欠乏培地中。各ウェルの画像を６時間毎に２４時間撮影する。各時点で、画像解析によりスクラッチゾーンの表面を測定する。
【００９１】
瘢痕形成の割合は次の通りに算出される：％瘢痕形成＝１００％×（表面Ｔ０−表面Ｔ）／（表面Ｔ０）。各条件は、３回の反復実験により平均を取り、少なくとも、３つの独立した細胞外小胞調製物について試験する（バイオロジカルレプリケート）。添付の図９に示されるように、細胞外小胞が非常に再現性よく内皮細胞の遊走を刺激すること、および、小胞の数が及ぼす効果があること、が示された。図９は、ｉＰＳ−Ｐｇの細胞外小胞が血管新生誘導性であることを示す瘢痕形成試験を示している。（ａ）ＨＵＶＥＣを様々な量の細胞外小胞と１８時間インキュベートした後の瘢痕形成の割合を縦軸に示すヒストグラム。ＨＵＶＥＣの遊走に対する用量効果が観察される。傷は、（ｂ）陽性対照では完全に治癒しており、（ｃ）陰性対照では治癒しておらず、（ｄ）高用量の細胞外小胞においてはほぼ完全に治癒している。
【００９２】
ｂ）ＥＶｃの生物活性の解析−生存率試験：
心筋芽細胞の不死化ラット細胞株であるＨ９ｃ２を、０．２％ゼラチンで予めコーティングされた６ウェルプレート上に、２５，０００細胞／ｃｍ２の密度で播種し、５％ＣＯ２、３７℃で、以下の完全培地中で培養する：１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン／アンホテリシン（ＰＳＡ）を含有するＤＭＥＭ  ｇｌｕｔａｍａｘ（参照：１０５６６−０１６、ギブコ社、米国マサチューセッツ州ウォルサム）。２４時間または４８時間後、２つのウェルから得られる細胞を、Ｍｕｓｅ（商標）Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用い、供給業者の説明書に従って、カウントする（Ｔ０）。
【００９３】
他のウェルについては、培地を交換し、細胞を以下の通りの異なる条件下で２７時間インキュベートする：完全な培地中（陽性対照）、または、無血清培地（ＤＭＥＭ  ｇｌｕｔａｍａｘ＋１％ＰＳＡ）中（陰性対照、ストレス培地）、または、様々な濃度の細胞外小胞を含有する無血清培地中。
【００９４】
２７時間のインキュベーション後、各条件下での生細胞をＭｕｓｅ（商標）Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒでカウントする（Ｔ２７）。各条件はデュプリケートで評価し、得られた値を平均する。生存率は次の通りに算出される：１００％×（Ｔ２７細胞数−Ｔ０細胞数）／Ｔ０細胞数。
【００９５】
添付の図１０は、３回のバイオロジカルレプリケート（すなわち、独立した生存率試験の実験により評価された、３つの異なる、ｉＰＳ−Ｐｇの細胞外小胞調製物）の結果を示している。細胞外小胞は心細胞の生存を向上させる。
【００９６】
ｃ）標的細胞による細胞外小胞の内部移行の解析：
生存率試験を利用して、カルセインＡＭで標識された細胞外小胞が内部に取り入れられるかどうかを確認した。上記のように、細胞外小胞を添加した、または添加していない、欠乏培地中で、Ｈ９ｃ２を培養する。ここで、細胞外小胞はカルセインで予め標識されて
いるか、または標識されていない。２０時間のインキュベーション後、細胞を回収しＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍで解析する。Ｈ９ｃ２細胞内の蛍光の存在は、標識された細胞外小胞の内部移行を示している。添付の図１１から分かるように、標識細胞外小胞と共にインキュベートされた細胞は蛍光性であるが、対照は蛍光性ではないことが観察された。
【００９７】
図１１において、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍで得られた結果から、カルセインで予め標識された細胞外小胞と一緒にインキュベートされた細胞のみに蛍光が存在することが確認される。カルセインＡＭの存在下で培養された細胞の蛍光強度ヒストグラムおよび画像は、これらの細胞においての強い緑色蛍光を示している（ａ−８およびｂ−７：陽性対照、時点Ｔ１９ｈに細胞（ｃｅｌｌｕｌｅｓ）＋カルセイン、すなわち、１時間の標識；ａ−７およびｂ−８：２０時間の前記実験の間、細胞＋カルセイン）。カルセイン無しの陰性対照は実際に陰性である（ａ−４およびｂ−１：完全培地；ａ−３およびｂ−２：欠乏培地；ａ−２およびｂ−５：非標識のｉＰＳ−Ｐｇの細胞外小胞；ａ−１およびｂ−３：非標識のＦＢＳの細胞外小胞）。
【００９８】
第一洗浄（ｆｉｒｓｔ  ｗａｓｈｉｎｇ）後の上清と共にインキュベートされた細胞は陰性対照よりも若干蛍光性が高いが（ａ−５）、この蛍光は顕微鏡では見えない（ｂ−６）。最後に、カルセインで標識されたｉＰＳ−Ｐｇの細胞外小胞と共にインキュベートされた細胞は、洗浄上清（ｗａｓｈｉｎｇ  ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）と共にインキュベートされた細胞よりもずっと強く、且つ、カルセインで直接標識された細胞（ｃｅｌｌｕｌｅｓ）（ａ−６およびｂ−４）未満の強度の緑色である。
【００９９】
ｄ）本発明のバイオマテリアルによる欠損組織の修復の解析
小胞を含有する、または含有しないパッチを、上記の実施例に記載のプロトコルに従って作製する。作製後、これらのパッチを、欠損心臓上に、縫合により配置もしくは固定するか、または、接着剤で接着させる。
【０１００】
心機能の変化および対照（すなわち小胞無しのパッチ）と比較した効果をモニターするために、異なる時点での心エコーにより、小胞のパッチの有効性の評価を行う。
【０１０１】
実施例５：コラーゲンの調製および多能性細胞由来または万能性細胞由来の細胞外小胞によるコラーゲンの包含
本実施例では、高い吸収能を有する変性したコラーゲンまたはゼラチンである、Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標、ファイザー社）について考えた。
【０１０２】
Ｇｅｌｆｏａｍ（登録商標）を用いることで、良好な弾性により取扱いが容易で且つ縫合可能なパッチが得られる。このパッチの原理は、小胞溶液がパッチに小胞を含侵させるように、乾燥状態のパッチを、上記のようにして得られた小胞の溶液と共にインキュベートすることである（３５ページの３０行目のベース（ｂａｓｅ）と重複？）。
【０１０３】
実施例６：ヒト臍帯内皮細胞由来の細胞外小胞の作製
１．細胞外小胞の作製
ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ；Ｃ−１２２００；プロモセル社））を、０．２％ゼラチンでコーティングされたフラスコ内で、５０００細胞／ｃｍ２の密度で、補体（キットＣ−３９２１０；プロモセル社）を添加した内皮細胞の完全培地（内皮細胞用増殖培地；Ｃ−２２０１０；プロモセル社）中で、培養する。培地はＤ１およびＤ４に新しくする。細胞がコンフルエントになったら、完全培地を欠乏培地（サプリメント無しの培地）と交換する。２日後、この条件培地を１２００ｇで６分間遠心して壊死細胞片を除去し、その後、細胞外小胞の単離に移る。
【０１０４】
２種類のマーカー、ＤｉＤ（ジアルキルインドカルボシン色素（Ｄｉａｌｋｙｌ  Ｉｎｄｏｃａｒｂｏｃｙｉｎｅ  Ｄｙｅ））およびカルセインＡＭ、で小胞を標識する。
【０１０５】
ｉ．）ジアルキルインドカルボシン色素：ジアルキルインドカルボシン（ＤｉＤ）マーカーは、脂溶性のフルオロフォアであり、細胞外小胞により内部移行し、発光波長６６５ｎｍの蛍光を発する。１ｍｌの条件培地中に１μｌのＤｉＤマーカーを直接添加することにより、細胞外小胞をＤｉＤ（Ｖ−２２８８７、Ｖｙｂｒａｎｔ  Ｃｅｌｌ−ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、インビトロジェン社）で標識する。標識後の培地を３７℃で１時間保管した後、細胞外小胞を単離するための１回目の超遠心を行い、その後、内部移行しなかったマーカーを除去するために２回目の超遠心を行う。ＦＢＳの細胞外小胞はカルセインＡＭで標識されないため、ＤｉＤを用いてＦＢＳの細胞外小胞を標識した。
【０１０６】
ｉｉ．）アセトキシメチルカルセイン：アセトキシメチル（Ａｃｅｔｏｘｙ  Ｍｅｔｈｙｌ）（ＡＭ）カルセインは二重脂質膜を通過する疎水性のフルオロフォアである。細胞外小胞内部に入ると、カルセインＡＭは該分子を親水性且つ蛍光性にするエステラーゼの作用で切断される。この機構により、カルセインは、細胞外小胞の研究においてＤｉＤよりも特異性の高いマーカーである。１ｍＭの初期濃度が得られるように、カルセインＡＭ（カタログ番号Ｃ３１００ＭＰ、ライフテクノロジーズ社）を５０μｌのＤＭＳＯで希釈する。２μＭの最終濃度が得られるように、１体積のこのカルセインＡＭ溶液を条件培地に添加する。単離工程前に細胞外小胞を標識することを可能とするために、標識後の条件培地を３７℃で１時間保存する。
【０１０７】
前記細胞の条件培地またはウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（細胞外小胞を天然に含有する）を、３７，５００ｒｐｍ（１００，０００ｇ）、４℃、１６時間の超遠心にかける。サイクルの終わりに、上清を除去し、０．１μｍで濾過したＰＢＳでペレットを再懸濁する。細胞外小胞を予め標識していた場合、２０ｍｌの濾過ＰＢＳを前記再懸濁ペレットに添加し、細胞外小胞によって内部移行されなかったフルオロフォアを除去するために、３７，５００ｒｐｍ、４℃、１６時間の２回目の超遠心を行う。
【０１０８】
２．パッチの作製
フィブリンを生成するために使用されたフィブリノーゲンおよびトロンビンは、ＥＶＩＣＥＬキット（オムリックス・バイオファーマシューティカルズ−エチコン・バイオサージェリー社、ベルギー）から得られる。パッチ作製用に、フィブリノーゲントロンビン混合物を堆積する１時間前に、１ｍｌの無菌アガロースを各ウェルの底に堆積することにより、２４ウェルプレートを用意する。この工程により、後のパッチの回収が容易となるように、形成されたパッチは、底に粘着せずに、ウェルの壁面のみに付着する。
【０１０９】
パッチは、実験に応じて、２つの異なる濃度を有するフィブリノーゲンとトロンビンとの混合物によって形成される。５ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンと１ｕ／ｍｌのトロンビンとで作製されたパッチ（Ｆ５Ｔ１）、および２０ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲンと４ｕ／ｍｌのトロンビンとで作製されたパッチ（Ｆ２０Ｔ４）。フィブリノーゲンおよびトロンビンを、条件に応じて、３種類の異なる溶液、α最小必須培地（αＭＥＭ）、ＰＢＳまたはＮａＣｌ、で希釈する。重合を誘導するために、フィブリノーゲンとトロンビンとを、２４ウェルプレート内で、等量（すなわちそれぞれ１５０μｌ）で、混合する。３７℃に１時間置いた後（パッチが重合するための時間）、パッチが乾燥するのを防ぐために、１ｍｌ（またはそれ以上）の培地（パッチに使用した培地と同じ）をパッチの上に添加する。小胞をフィブリノーゲン溶液に添加してから、それをトロンビンと混合することにより、パッチ内への小胞の包含を重合前に行う。
【０１１０】
３．パッチの微視的構造の研究
フィブリンパッチを、作製の４時間後（すなわちＤ０）および３日後（すなわちＤ３）に、ウェルから回収する。回収したパッチは、凍結保存液（ＯＣＴ（登録商標））で満たしたウェル内に配置し、液体窒素中で徐々に凍結させ、その後−８０℃で保存する。これらのパッチを、クライオスタットで１０μｍ厚の切片に切断し、以下で凍結されることとなる顕微鏡用スライド上に配置する。これらのスライドをヘマトキシリン／エオジンで着色し、その後、スライドスキャナーで解析する。そのようにして得られた画像の解析は、ＮＤＰＶｉｅｗソフトウェアを用いて行った。
【０１１１】
４．パッチ上での細胞外小胞の露出
ａ．）蛍光顕微鏡：ＤｉＤで標識されたＦＢＳの細胞外小胞を含有するパッチを回収し、Ｄ０およびＤ３に凍結する。クライオスタットで切断後、スライドをＦｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄで封入し、Ｑｕｉｃａｍ  ＣＤＤカメラ（キューイメージング社（Ｑｉｍａｇｉｎｇ  ｃｏｒｐ．）、サレー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ）に接続されたＬｅｉｃａ  ＤＭ  ２０００蛍光顕微鏡（ライカ社、ウェッツラー、ドイツ）を用いて調べた。画像はＭｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェアを用いて解析した。
【０１１２】
ｂ．）共焦点顕微鏡：共焦点顕微鏡は、オプティカルスプリットと呼ばれる非常に浅い深度で画像を作製することができる光学顕微鏡である。この単純な光子共焦点系は、フルオロフォアを直接励起する波長の励起光を使用する。この共焦点系は、非焦点領域からの蛍光を除去する光検出器の前に配置されるウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ）（または共焦点絞り（ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｉｒｉｓ））を特徴とする。この系を用いて、非常に高い解像度でパッチ上の細胞外小胞をイメージングした。このために、３種類のパッチを作製した。カルセインとＤｉＤとで二重標識されたＨＵＶＥＣの細胞外小胞を２１．１０９個含有するＦ５Ｔ１パッチ、非標識細胞外小胞を含有するＦ５Ｔ１パッチ、陰性対照と見なされる、細胞外小胞を含有しない裸のＦ５Ｔ１パッチ。これらのパッチを、Ｄａｋｏ（登録商標）封入剤を用いた共焦点に適したスライド上に直接回収し、Ｍｅｒｉｅｍ  Ｇａｒｆａ−Ｔｒａｏｒｅが指揮するネッケル病院（Ｎｅｃｋｅｒ  ｈｏｓｐｉｔａｌ）のイマジン研究所（ＩＭＡＧＩＮＥ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の細胞イメージングプラットフォームの共焦点顕微鏡を用いて調べた。
【０１１３】
ｃ．）二光子顕微鏡：二光子励起顕微鏡法は、共焦点顕微鏡の光学的手法と、赤外領域の励起光を用いる多光子励起とを組み合わせた手段である。この場合、レーザー光の焦点（ｆｏｃｕｓ  ｐｏｉｎｔ）のみが励起される。高度に局在化された励起により、実験の所要時間を増加させるフルオロフォアの光退色および試料の変性が低減される。高波長（＞９００ｎｍ）の励起光を使用することで、試料内部のより深くへの透過（１５０μｍではなく最大５００μｍ）が確実となり、より厚い試料に対しての適用することが可能となる。二光子顕微鏡は、パッチを切片化し材料を失うリスクを冒す必要なく、いくつかのオプティカルスプリットを作成することによって、パッチの三次元構造の研究を可能にする。この試験のために３種類のＦ５Ｔ１パッチを作成した。ＤｉＤとカルセインＡＭとで二重標識された、ＨＵＶＥＣの細胞外小胞を含有するまたは含有しない、２種類のパッチ、および細胞外小胞を含有しない１種類のパッチを、Ｄａｋｏ（登録商標）タイプの封入剤を用いた共焦点に適したスライド上に回収し、ネッケル病院のイマジン研究所の細胞イメージング用プラットフォームの二光子顕微鏡を用いて調べた。
【０１１４】
５．細胞外小胞の定量化
ａ．）ナノ粒子トラッキング解析：細胞外小胞の作製および単離後、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を用いて細胞外小胞を定量化する。ＮＴＡまたはＮａｎｏＳｉｇｈｔ（ＬＭ１０レーザー４８８ｎｍ、マルバーン・インスツルメンツ社、モルバーン、英国）は、ナノ粒子を個別に追跡できる、ナノ粒子の解析法である。この技術は、動的な光の拡散およびブラウン運動の解析を介して、粒径当たりの、濃度および分布曲線を得ることを
可能にする。ＮＴＡは、密閉容器に含有される溶液中に懸濁された粒子によって反射された光を検出することを可能にする光学顕微鏡を含む。
【０１１５】
ｂ．）ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ：ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標）Ｘ  Ｍａｒｋ  ＩＩ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、アムニス社（Ａｍｎｉｓ））（ＩＳ）は、フローサイトメトリーの解析特性と顕微鏡イメージングの解析特性とを組み合わせた技術である。
【０１１６】
この解析法は、１０を超える異なる蛍光性マーカーを高解像度で検出することを可能にする。この手法は解析用にほんの少しの材料（１５μｌ）しか必要とせず、このことはこの手法を非常に有益なものとしている。この手法は、標識された細胞外小胞を観察することを可能にし、細胞外小胞の作製時に対照として用いられ、また、標識された細胞外小胞の濃度を測定することも可能にする。
【０１１７】
６．ＤｉＤで標識されたＦＢＳの細胞外小胞の放出の定量化
ＤｉＤで標識されたＦＢＳの細胞外小胞を２１  １０９個含有するフィブリンパッチＦ５Ｔ１を、２４ウェルプレート内に流し込んだ。１時間の重合の後、１ｍｌのαＭＥＭ培地を添加した。このプレートを３７℃の恒温器内で保管する。様々な制御用時間（ｃｏｎｔｒｏｌ  ｔｉｍｅ）にパッチおよびその懸濁培地を回収し、−８０℃で凍結した。
【０１１８】
培地吸引時にＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ装置のキャピラリーが詰まることを防ぐために、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍによる解析の前に、回収した培地を４０μｍのフィルターを用いて濾過した。
【０１１９】
７．カルセインＡＭで標識されたＨＵＶＥＣの細胞外小胞の放出の定量化
カルセインＡＭで標識されたＨＵＶＥＣの細胞外小胞を２１  １０９個含有するフィブリンパッチＦ５Ｔ１を、２４ウェルプレート内に流し込んだ。フィブリノーゲンにトロンビンを添加した１時間後に、１．５ｍｌのαＭＥＭを各ウェルに添加する。各時点において、２つの異なるスキームに従って培地を回収した：
培地の変更：培地を完全に、すなわち１．５ｍｌを回収し、等量のαＭＥＭ培地に置き換える。
一定分量：追加の培地は添加しないで、各時点に一定分量の２５０μｌを回収する。
【０１２０】
試料は、様々な制御時間に回収し、後の解析まで−８０℃または３７℃で保存する。
【０１２１】
８．パッチの分解の定量化
供給業者のプロトコルに従いＤダイマー用ＥＬＩＳＡキット（ＤＨＤＤＩＭＥＲ、Ｈｕｍａｎ  Ｄ−ＤＩＭＥＲ  ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ、サーモサイエンティフィック社）を用いたＤダイマーの定量化により、フィブリンパッチの分解の定量化を行う。カルセイン標識アッセイのために、細胞外小胞が回収された培地の同じ試料に対して、Ｄダイマーをアッセイし、パッチからの細胞外小胞の放出特性をフィブリン分解と比較した。
【０１２２】
９．パッチの取扱い性試験
この取扱い性試験の目的は、外科医が手術中に難なく使用できるパッチの最適組成を決定することである。最適なパッチとは、従来のピンセットで回収することが容易であり、ウェルの壁面から、裂けることなく容易に剥離し、剥離後に縮まず、且つ、手術中に組織上に配置された後に、または試験中に保存液中で、その初期形状に戻すことができる、パッチである。パッチの取扱いの比較用に、３つのパラメーターが選択された：
ピンセットでつかめること。
壁面から取り外した後に円形状の維持すること。
冷凍保存液中においてパッチが初期形状に復帰すること。
【０１２３】
２つの異なるフィブリノーゲン濃度およびトロンビン濃度でフィブリンパッチを作製した（Ｆ５Ｔ１およびＦ２０Ｔ４）。これら２つの成分（フィブリノーゲンおよびトロンビン）に、適当な量の培地を加えた。この実験では、３種類の異なる培地を試験した（αＭＥＭ、ＰＢＳおよびＮａＣｌ）。臨床用でよく見られるものであるため、これらの培地を選んだ。パッチの作製によって、濃度および添加された培地に基づいて、パッチが重合し、種々の時点で凍結することが示されている。実際に、Ｆ２０Ｔ４パッチは、Ｆ５Ｔ１パッチよりも速く重合し、同一濃度では、αＭＥＭ培地またはＰＢＳ培地で作製されたパッチはＮａＣｌで作製されたパッチよりも速く硬化する。ウェル内でのフィブリノーゲンとトロンビンとの混合の４時間後、パッチを回収し、パッチを凍結可能にする組織凍結保存用ゲル（ＯＣＴ（登録商標））を含む小ウェル内に置く。
【０１２４】
αＭＥＭを用いて作製したフィブリンパッチＦ５Ｔ１およびフィブリンパッチＦ２０Ｔ４は、回収、ウェル内での配置、折り重なることのない円形状の良好な保持、が容易である。ＰＢＳを用いて作製されたＦ２０Ｔ４パッチは、αＭＥＭと混合されたパッチで得られたものと同じ特徴を有するが、一方、ＰＢＳを用いて作製されたＦ５Ｔ１パッチは、壁面から剥離している間により脆くなり、壁面から取り外された際にわずかに収縮するが、この収縮は凍結保存用ゲル中での延展後に消える。
【０１２５】
【表２】
2019526388.tif 000004
【０１２６】
ＮａＣｌ溶液を含有するＦ５Ｔ１パッチはうまく重合できなかった。Ｄ０にこれらのパッチを回収する際、テクスチャがまだ硬化しておらず、壁面から取り外す際にピンセットに張り付いた。パッチ作製の１日後、これらのパッチはプレートのウェル内で破けた。
【０１２７】
これらの試験を終えて、取扱い性に関して、特に、ウェルから取り外す際の構造の維持、および、得られたテクスチャの剛性により該重合体が収縮しないこと、について、αＭ
ＥＭを用いて作製されたパッチが最良の結果となると結論付けられた。これらの特徴はこのバッチを最良な臨床使用のための候補とするものである。ＰＢＳを用いて作製されたパッチも良好な結果を示している。
【０１２８】
１０．パッチの微視的構造の研究
フィブリンパッチは、約１ナノメートルのサイズを有する細胞外小胞を運搬することを目的とする。各作製条件で得られた種々の構造を比較するために、および、細胞外小胞の追加と協働し得る最適条件を決定するために、これらのパッチの微視的構造を研究した。様々なパッチを重合後の異なる時点で凍結した。クライオスタットで得られた切片を、ヘマトキシリン／エオジンで着色し、スライドスキャナーでデジタル化した。
【０１２９】
結果から、Ｄ０において、αＭＥＭまたはＰＢＳを用いて作製されたＦ５Ｔ１パッチは、完全には重合していないことが示されている。実際に、これらのパッチの微視的構造の研究では、３日後に同じ濃度および培地の条件において観察される構造と比較して、架橋されていないフィブリンのテクスチャが示されている。Ｄ３において、αＭＥＭまたはＰＢＳを用いて作製されたＦ５Ｔ１パッチは、高濃度のフィブリノーゲンで得られるものと比較して微細な線維と小さな細孔を有する、よく構築された構造を有する。
【０１３０】
αＭＥＭまたはＰＢＳを用いて作製されたＦ２０Ｔ４パッチは、Ｄ０とＤ３とで類似の構造を有する。これらのパッチはトロンビンがフィブリノーゲンに添加された直後に急速に重合し、低濃度で見られるものよりも明らかに大きい細孔を有する線維網へと組織化する。結果は、ＮａＣｌ溶液を用いて得られたパッチの線維構造が、他の２つの培地を用いて得られたパッチと異なることを示している。Ｄ０において、ＮａＣｌを用いて作製されたＦ５Ｔ１パッチは、均一ではない、非常に厚い線維と非常に大きな細孔を有し、一方、同じ溶液を用いて作製されたＦ２０Ｔ４パッチは、Ｄ０にαＭＥＭまたはＰＢＳと混合されたＦ５Ｔ１パッチで観察された構造、つまり重合していないテクスチャ、に相当する構造を有する。これらの結果から、低濃度のフィブリノーゲンを用いて作製されたパッチ、すなわちＦ５Ｔ１が、細胞外小胞の運搬に最も適していると思われる。
【０１３１】
重合後にＦ５Ｔ１パッチが形成する小サイズの細孔は、フィブリンとの混合時に包含したい粒子のサイズに適していると思われる。加えて、低濃度であることを考慮すると、Ｆ５Ｔ１パッチはより急速に分解し、すなわち、心筋層への移植後すぐに含有物の放出に駆り立てられる。これらの結果を、取扱い性試験で得られた結果と比較すると、αＭＥＭと混合されたＦ５Ｔ１パッチが、細胞外小胞の包含に最も有利な高分子であると思われる、という結論が得られる。
【０１３２】
１１．パッチ上での細胞外小胞の露出
本研究の目的は、液相中の高分子におけるその混合後に重合されたパッチ上の細胞外小胞の存在を明らかにすること、並びに、これらの粒子がフィブリンパッチ内部でどのように組織化されるのかを確認し、これらの結果が、必ずしも他のバイオマテリアルにそのまま外挿することはできないにしても、異なる高分子を用いた後の開発のために有用な参照ベース（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｂａｓｅ）を提供することを知ることであった。
【０１３３】
ａ．）蛍光顕微鏡：蛍光顕微鏡を用いたパッチの研究によって、フィブリンは青色の自然蛍光を発することが示されている。ＤｉＤで標識された細胞外小胞が包含された条件においてのみ、不均一な大きさのいくつかの赤点が、パッチのいくつかの位置に見られる。これらの点は、赤色フィルターを用いてのみ見ることができ、ＤｉＤのみが添加された対照パッチや標識無しの裸のパッチでは見ることができない。これらの赤点は、ＤｉＤで標識されたＦＢＳの細胞外小胞に相当し得る。クライオスタットでパッチを切断する際のこれらの細孔の破壊が材料の喪失をもたらし得るため、これらの粒子はフィブリン線維上に
局在し、パッチの細孔上にはまず観察されないことが好ましい。
【０１３４】
ｂ．）共焦点顕微鏡：ＤｉＤおよびカルセインＡＭで二重染色されたＨＵＶＥＣの細胞外小胞を含有するＦ５Ｔ１パッチが、共焦点顕微鏡で、一切クライオスタットで切断する必要なく、解析された。細胞外小胞をパッチ内に包含させる前に、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍで細胞外小胞の標識を調節した。二重標識された細胞外小胞を含有するパッチの研究において、いくつかの蛍光点の存在が示されたが、そのサイズと色はパッチに包含される細胞外小胞を示唆している。これらの円形の粒子はパッチ中に散在している。ある粒子は緑色フィルターでのみ見ることができ、他は赤色フィルターでのみ見える。少数の粒子が２つのマーカーを内部移行させたと思われ、緑色フィルターと赤色フィルターの両方で見える。これらの蛍光点は、標識されていない細胞外小胞を含有するパッチおよび細胞外小胞を含有しないパッチには見られない。
【０１３５】
ｃ．）二光子顕微鏡：カルセインＡＭとＤｉＤとで二重標識した細胞外小胞を含有する、または細胞外小胞を含有しないＦ５Ｔ１パッチを、二光子顕微鏡で解析した。二光子顕微鏡は、クライオスタットでパッチを切断する必要も、フィブリンをフルオロフォアで標識する必要もなく、すべての厚さのパッチにおいて、パッチを検査することを可能にする。二光子顕微鏡でのパッチの解析の結果は、フィブリンが緑色フィルターおよび赤色フィルターにおいて自然蛍光性であることを示しており、これは、フィブリンがその重合後に形成するネットワークを識別することを可能にする。カルセインおよびＤｉＤで標識された細胞外小胞を含有するＦ５Ｔ１パッチの研究は、パッチ中に分散した、様々な大きさの、緑色および赤色の、いくつかの蛍光点の存在を示しており、これは、標識された細胞外小胞を示唆するものである。サイズの大きな粒子は、高分子内でクラスター状に配置されたいくつかの小胞に該当し得る。ｚ−ｓｔａｃｋでのパッチの解析は、これらの粒子が、ネットワークの線維上に主に存在し、パッチの空洞内にはまず存在しないことを示している。これらの蛍光性粒子は、フィブリンのネットワークのみが観察される、標識されていない細胞外小胞を含有し、細胞外小胞を含有しない、対照パッチには見られない。
【０１３６】
１２．パッチからの細胞外小胞の放出の定量化
細胞外小胞の放出実験ではＦ５Ｔ１  αＭＥＭパッチを試験したが、これはこの濃度で得られるパッチがＦ２０Ｔ４パッチほど厚くないためであり、この濃度選択によって、フィブリンネットワークの細胞外小胞の培地に向かってのより良好な拡散および特にインビトロ条件下でのパッチのより速い分解速度がもたらされ得る。
【０１３７】
ａ．）ＤｉＤで標識された細胞外小胞ＦＢＳの放出の定量化
プロトコルに従って種々の培地を異なる時点で回収する。その培地を−８０℃で保存した。解析の当日、培地吸引時にＩＳ装置のキャピラリーを詰まらせ得る、フィブリンの分解により生じる大型デブリを除去するために、全ての培地を４０μｍフィルターで濾過した。
この実験用の陽性対照は以下である：
ｑＥＶ  ＤｉＤ＋：フィブリンパッチに包含されるＤｉＤで標識された細胞外小胞に相当する量、すなわち、２１．１０９個の、０．１μｍで濾過された５０μｌのＰＢＳに懸濁された、ＮＴＡで定量化された粒子（ｑＥＶ  ＮＴＡ）、すなわち、４．２．１０８粒子／μｌの濃度（［ＥＶ］ＮＴＡ）、を含有する試料。
ＰＢＳ  ＤｉＤ＋：細胞外小胞の標識に必要な量と等しい量のＤｉＤで標識された、０．１μｍで濾過されたＰＢＳの試料。
αＭＥＭ  ＤｉＤ＋：細胞外小胞の標識に必要な量と等しい量のＤｉＤで標識された、αＭＥＭの試料。
陰性対照は以下である：
ｑＥＶ  ＤｉＤ−：２１  １０９の非標識の細胞外小胞を含有する試料。
濾過ＰＢＳ：０．１μｍで濾過された５０μｌのＰＢＳを含有する試料。
【０１３８】
【表３】
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【０１３９】
【表４】
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【０１４０】
パッチの放出培地の試料のＩＳにおいて得られた結果を表ＩＩＩにまとめる。各条件の収率は、２１  １０９個の細胞外小胞のＩＳの収率に対して算出される。この数字は５．０７×１０６に相当し、以下の通りに算出された：
ＩＳによる１００％においての収率：（［ＥＶ］ＩＳ／［ＥＶ］ＮＴＡ）×ｑＥＶ  ＮＴＡ
すなわち、（１．０１×１０５／４．２×１０８）×２１×１０９
【０１４１】
ＩＳで得られた結果は、Ｆ５Ｔ１パッチが、Ｄ０にある特定の量の細胞外小胞を放出する（パッチ内に包含されたものの約１０％）ことを示している。Ｄ０からＤ３までで、細胞外小胞の量の２／３の減少が観察され、パッチの収率は９％から３％に移っている。Ｄ３からＤ１５まで、放出培地中の細胞外小胞の量は一定のままであった。Ｄ０からＤ３までに観察されたこの細胞外小胞の減少は、Ｄ０の半重合（ｓｅｍｉ−ｐｏｌｙｍｅｒｉｓｅｄ）状態から数日後の完全重合・構造化状態へと移る、パッチの高次構造の変化によるものである可能性があり、この変化により、パッチの内部に向かって培地中の遊離細胞外小胞を引き付ける静電力を介して、この期間に、該重合体内により多くの粒子が閉じ込められ得る。この解析において、全ての培地は４０μｍで濾過されたが、装置を正しく使う
ために必要と考えられたこの濾過工程は、フィルターによって除去されるフィブリンデブリに捕捉されたままとなり得る一定量の粒子の喪失の後に、細胞外小胞の定量化に偏りをもたらす可能性があった。ＤｉＤを含有するＰＢＳ培地およびαＭＥＭ培地のＩＳによる解析は、このマーカーが、ＤｉＤで標識された細胞外小胞で観察されたものと比較可能な懸濁粒子の形態をとることを示しており、これが、ポジティブな現象の数を定量化する際に、ＤｉＤの粒子を培地中に放出された細胞外小胞としてカウントすることによって、第二の偏りをもたらす。この理由により、残りの細胞外小胞定量化実験用のマーカーの選択は、カルセインＡＭへと移った。
【０１４２】
ｂ．）カルセインＡＭで標識されたＨＵＶＥＣの細胞外小胞の放出の定量化
この実験では、いくつかの条件を、培地を回収する方法、培地を交換する方法、または一定分量を交換する方法に従って実験し、試料の保存温度は−８０℃または３７℃とした。パッチの培地交換には、培地へと向かうパッチの粒子の拡散現象を促進し、フィブリンの分解現象を促進する目的がある。３７℃での試料保存は、内側に捕捉されたままとなり得る粒子の最大数が放出されるように、チューブ内に回収されたフィブリンデブリの分解現象の継続を可能にするために選ばれ、これにより、ＩＳでの解析の前に、試料の濾過工程と関連付けられる細胞外小胞の定量化の偏りを克服することが可能となるだろう。
【０１４３】
試験された４つの条件における、パッチによる細胞外小胞の放出の割合の比較は、かなり類似した特性を示し、パッチの作製後、最初の３日間に放出ピークがあり、その後は少数の粒子が長期に亘って放出される。このピークは、Ｄ３に回収された培地中の一定量の粒子の存在に対応しており、条件に基づいて、パッチ内に包含される細胞外小胞は１０〜２０％と定量化される。Ｄ３に再度見られるこのピークは、重合時にパッチ内に完全に取り込まれず、培地が添加された際に懸濁状態で存在することとなった、αＭＥＭ培地中に懸濁された細胞外小胞に対応し得る。その後は、パッチによって後日に放出される細胞外小胞の量は、平均して３〜５％である。最初の３日間とその後日との間のこのパッチによって放出される細胞外小胞の量の違いは、粒子を容易に拡散させる非架橋型から、新たに形成された線維に捕捉された細胞外小胞を閉じ込める重合型へと移る、この期間における該高分子の変換と関連付けられ得る。培地が分注され３７℃で保存された条件においては、Ｄ３に見られた細胞外小胞の量は、他の３つの条件で見られた細胞外小胞の量よりもかなり少なく；これは、このパッチの重合がより速いため、または、このパッチの作製時により少ない細胞外小胞しか存在しないためであり得る。後日の細胞外小胞の放出は、培地を完全に回収し新鮮な培地と交換した条件下で、わずかに、より十分なものとなる。この放出の差は、添加された新鮮培地へと向かう粒子の受動拡散現象、または、これらの条件下での高分子のより十分な分解の結果であり得る。
【０１４４】
試料の保存温度はこれらの培地中に見られる細胞外小胞の量に影響しないため、３７℃での保存は、コントロール中に回収されたフィブリンデブリに捕捉されたであろう粒子の、より十分な放出をもたらさないように思われる。
【０１４５】
条件に基づくパッチからの細胞外小胞の累積的放出特性と、理論上の受動的放出曲線との比較は、細胞外小胞の放出が非常に少なく、この曲線の変化に追従しないことを示しており、そのため、高分子からの粒子の放出は粒子の受動拡散には関連付けられないと思われる。
【０１４６】
１３．パッチ分解のモニタリング
細胞外小胞の放出を定量化するためにＩＳで解析された同じ培地を、Ｄダイマーの投与に用いた。Ｄダイマーはフィブリンの分解により生じる産物であるが、その投与を、パッチからの細胞外小胞の放出が実際に高分子の分解によるものであるかどうかを判定するための参照として用いる。一定分量だけ回収され３７℃で保存された試料中を除く全ての条
件で、Ｄダイマーの投与はＤ３にピークを示す。なお、Ｄダイマーの割合はこの条件下では異なって変化し、Ｄ３においてピークは存在せず、長期間に渡りフィブリンの分解生成物中で徐々に増加する。この曲線と同じ条件下での細胞外小胞の投与との比較は、類似の変化プロファイルを示す。培地中の細胞外小胞の量はこのパッチの分解速度に準じており、試験された他の試料と比べて、この条件下において不十分な、Ｄ３における細胞外小胞の放出ピークの存在は、他のパッチよりも、この期間で不十分な分解レベルの、パッチのテクスチャに関連があると思われる。他の条件においては、Ｄダイマーの変化は互いに類似している。Ｄ３にこれらのパッチの分解の増加に対応する高い割合があり、その後、Ｄダイマーの量は減少する。これは、パッチがその重合および硬化の後に高次構造を変化させる時に該当し得る。
【０１４７】
培地が交換された条件においては、Ｄダイマーの割合はキャンセルされるまで減少し、これは、これらのパッチの分解が非常に少ないか存在しないことを示唆している。すなわち、これらの条件下での、わずかにより十分な、細胞外小胞におけるパッチの収率は、添加された新鮮な培地に向けたより良好な粒子の拡散に関連している。Ｄ−ダイマーの投与曲線と各条件下での細胞外小胞の投与曲線との比較により、高分子の分解とこれらの培地中に見られる粒子の量との間の相関関係が示される。高い割合のＤ−ダイマーが投与された３つの条件では、細胞外小胞の放出ピークが見られる。Ｄ７から開始して、細胞外小胞の濃度は、αＭＥＭ培地が交換された条件、すなわち、フィブリンの分解が既に存在しない条件下では、それほど十分なものではなかった。
【０１４８】
実施例７：インビボ試験
本実施例では、再灌流心筋梗塞のブタモデルが選択されるが、次のいくつかの理由による：これらの種の冠動脈の解剖学的形態、および、胸郭の形状によってヒツジよりも心エコー評価に適していること、および心臓サイズ／体重の比がヒトのそれに近いことである。プロトコルには、まず、冠動脈のネットワークの可視化のための血管形成術用カテーテルの大腿部への再導入（ｔｒａｎｓｆｅｍｏｒａｔｉｖｅ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）と、その後の、左前下行枝（ＬＡＤ）の中央部における血管形成術用バルーンの位置付けを可能にするガイドワイヤーの挿入とが含まれる。次に、蛍光透視で確認される、第二主対角枝（ｓｅｃｏｎｄ  ｍａｊｏｒ  ｄｉａｇｏｎａｌ  ｂｒａｎｃｈ）の下流の、ＬＡＤの遠位域の血流を断絶するために、バルーンを９０分間かけて徐々に膨張させる。バルーンの収縮後、血管の透過性を確認するために、２回目の血管造影を行う。毎日のアミオダロンおよびβ遮断薬の経口による前投与、並びにアミオダロンの術中灌流により、不整脈が予防され得る。手術後、動物は一日量のアスピリンおよびクロピドグレルを与えられ得る。２つの主な臨床的状況を模倣するために、２通りの実験を行うべきである。
【０１４９】
梗塞作製の３週間後、細胞外小胞を含侵させたバイオマテリアルまたは対照用の細胞外小胞を含有しないバイオマテリアルの経皮的心内膜投与（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｅｎｄｏｃａｒｄｉａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）がブタに行われ得る。麻酔後、大動脈弁を通じて左心室内にガイドワイヤーが進められた後、ガイドワイヤー上にピッグテールカテーテルが挿入され得る。心筋機能障害の領域を定めるために、前後像および側面像の両方で、左心室の機能研究が行われ得る。専用カテーテル（Ｃ−Ｃａｔｈ（登録商標）、セリアド社（Ｃｅｌｙａｄ）、モン＝サン＝ギベール、ベルギー）が、シースを通じて挿入され、蛍光透視下で左心室に進められ得る。このカテーテルは、７５度湾曲した針を有し、小サイズから大サイズへと漸増する側面孔を有する。細胞外小胞を含有するゲルが、約０．５ｍｌ／分の速度で１０部位程度に注入され、逆行性の漏出を最小限にするために針を取り除く前に数秒間待機され得る。
【０１５０】
投与の効果の解析を注入の３ヶ月後に行う。最後の要点は、処置直前（すなわち、梗塞の３週間後）および屠殺時に行われた心エコーおよび磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）で評価さ
れた機能結果である。ガドリニウム注射後の左心室機能（体積および駆出率）、心筋血流および梗塞サイズを評価するために、ＭＲＩシーケンスが定められる。屠殺後、外植した心臓は、標準的な組織学的評価（梗塞の大きさ）および免疫組織化学解析（血管新生、炎症性細胞の浸潤、マクロファージの極性化）用に処理される。加えて、心房性ナトリウム利尿ペプチドの解析のために、前記処置の前、および屠殺時に血液試料が採血される。また、心筋層の保持（細胞の生存および増殖、血管新生、並びに脈管形成）に寄与する経路に関与する遺伝子の発現差異を検出するために、心筋層の断片をトランスクリプトーム解析にかける。最後に、組織の異常増殖が無いことを確認するために、種々の臓器（肺、肝臓、腎臓）の生検を行う。全てのデータを収集し、盲検解析にかける。
【０１５１】
ゲル／パッチ形態での移植アプローチは２つの理由で正当と認められる。第一に、とある患者は心筋梗塞を起こした後に心臓手術を必要とし、インプラントの形態で配置された、細胞外小胞を含侵させた本発明のマテリアル、および／または壊死部の心外膜上のゲルによる心筋修復から恩恵を受け得る。すなわち、上記の介入手順に従って梗塞を作製されたブタに対して、これらの外科適用を目的とした別の一連の実験が行われ得る。梗塞作製の３週間後、および目視によって梗塞部の位置を決定した後、左開胸術により、心臓にアプローチがなされる。細胞外小胞を含侵させた本発明のマテリアルが、インプラントの形態および／またはゲルの形態で、この梗塞部の心外膜上に、その境界を越えて広がるように配置される。その後、開胸が閉じられる。３ヶ月後、左心室内経皮投与によって行われた処置に関する上記と同一の基準に従う評価のために、動物は安楽死させられる。
【０１５２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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