(57)【要約】インターロイキン−１２（ＩＬ１２）タンパク質又はその機能的部分を組み合わせてコードする１つ又は複数の核酸配列をゲノムに含む、腫瘍溶解性組換えマラバウイルスを本明細書において開示する。該腫瘍溶解性組換えマラバウイルスを使用する、患者のがんを治療するための方法もまた開示する。本開示はまた、がんの治療のための感染細胞ワクチン（ＩＣＶ）として使用する、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）タンパク質又はその機能的部分を組み合わせてコードする１つ又は複数の核酸配列をゲノムに含む腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた、腫瘍細胞も提供する。該感染細胞ワクチンを使用する患者のがんを治療するための方法もまた開示する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者のがんを治療するための方法であって、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）タンパク質又はその機能的部分を組み合わせてコードする１つ又は複数の核酸配列をゲノムに含む腫瘍溶解性マラバウイルスを、患者に投与するステップを含む方法。
【請求項２】
前記腫瘍溶解性マラバウイルスが、野生型Ｇタンパク質の２４２位に対応する位置でＧタンパク質中に変異を含み、この位置のアミノ酸、例えばグルタミンが、アルギニンへ変化していることが好ましい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍溶解性マラバウイルスが、野生型Ｍタンパク質の１２３位に対応する位置でＭタンパク質中に変異を含み、この位置のアミノ酸、例えばロイシンが、トリプトファンへ変化していることが好ましい、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＬ１２タンパク質が、野生型ヒトＩＬ１２配列に対して少なくとも６０％同一であり、例えば７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する、又は、
前記ＩＬ１２タンパク質が、野生型マウスＩＬ１２配列に対して少なくとも６０％同一であり、例えば７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＬ１２タンパク質が、それぞれ配列番号１及び配列番号２に対応するｐ４０及びｐ３５サブユニットを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＩＬ１２タンパク質が、それぞれ配列番号３及び配列番号４に対応するｐ４０及びｐ３５サブユニットを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＩＬ１２タンパク質が、アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号３に対して少なくとも６０％同一であるｐ４０サブユニットを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩＬ１２タンパク質が、アミノ酸配列が配列番号２又は配列番号４に対して少なくとも６０％同一であるｐ３５サブユニットを含む、請求項１〜４及び７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＩＬ１２タンパク質の機能的部分が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、若しくは両方の増殖を刺激すること、ヒトＮＫ／リンホカイン活性化キラー細胞の溶解活性を増強すること、ヒトＰＢＭＣを休止させることによってＩＦＮ−ガンマの産生を刺激すること、又はそれらの任意の組合せを行うこと、ができる部分である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍溶解性マラバウイルスが静脈内に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍溶解性マラバウイルスが腹腔内に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍溶解性マラバウイルスが腫瘍内に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍溶解性マラバイルスが髄腔内に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍溶解性マラバウイルスが頭蓋内に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍溶解性マラバウイルスが皮下に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍溶解性マラバウイルスが胸腔内に投与される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
インターロイキン−１２（ＩＬ１２）タンパク質又はその機能的部分を組み合わせてコードする１つ又は複数の核酸配列をゲノムに含む、腫瘍溶解性マラバウイルス。
【請求項１８】
野生型Ｇタンパク質の２４２位に対応する位置でＧタンパク質中に変異を含み、この位置のアミノ酸、例えばグルタミンが、アルギニンへ変化していることが好ましい、請求項１７に記載の腫瘍溶解性マラバウイルス。
【請求項１９】
野生型Ｍタンパク質の１２３位に対応する位置でＭタンパク質中に変異を含み、この位置のアミノ酸、例えばロイシンが、トリプトファンへ変化していることが好ましい、請求項１７又は１８に記載の腫瘍溶解性マラバウイルス。
【請求項２０】
前記ＩＬ１２タンパク質が、野生型ヒトＩＬ１２配列に対して少なくとも６０％同一であり、例えば７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する、又は
前記ＩＬ１２タンパク質が、野生型マウスＩＬ１２配列に対して少なくとも６０％同一であり、例えば７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する、
請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性マラバウイルス。
【請求項２１】
前記ＩＬ１２タンパク質が、それぞれ配列番号１及び配列番号２に対応するｐ４０及びｐ３５サブユニットを含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性マラバウイルス。
【請求項２２】
前記ＩＬ１２タンパク質が、それぞれ配列番号３及び配列番号４に対応するｐ４０及びｐ３５サブユニットを含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性マラバウイルス。
【請求項２３】
前記ＩＬ１２タンパク質が、アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号３に対して少なくとも６０％同一であるｐ４０サブユニットを含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性マラバウイルス。
【請求項２４】
前記ＩＬ１２タンパク質が、アミノ酸配列が配列番号２又は配列番号４に対して少なくとも６０％同一であるｐ３５サブユニットを含む、請求項１７〜２０及び２３のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性マラバウイルス。
【請求項２５】
前記ＩＬ１２タンパク質の機能的部分が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、若しくは両方の増殖を刺激すること、ヒトＮＫ／リンホカイン活性化キラー細胞の溶解活性を増強すること、ヒトＰＢＭＣを休止させることによってＩＦＮ−ガンマの産生を刺激すること、又はそれらの任意の組合せを行うこと、ができる部分である、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性マラバウイルス。
【請求項２６】
がんの治療のための感染細胞ワクチン（ＩＣＶ）としての使用のための、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）タンパク質又はその機能的部分を組み合わせてコードする１つ又は複数の核酸配列をゲノムに含む腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞。
【請求項２７】
前記腫瘍溶解性ラブドウイルスが、水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＶＳＶ）、アラハスウイルス（Ａｒａｊａｓ  ｖｉｒｕｓ）、コーカルウイルス（Ｃｏｃａｌ  ｖｉｒｕｓ）、イスファハンウイルス（Ｉｓｆａｈａｎ  ｖｉｒｕｓ）、マラバウイルス、ピリウイルス（Ｐｉｒｙ  ｖｉｒｕｓ）、水疱性口内炎アラゴアスウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  Ａｌａｇｏａｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＢｅＡｎ  １５７５７５ウイルス、ボテクウイルス（Ｂｏｔｅｋｅ  ｖｉｒｕｓ）、カルチャキウイルス（Ｃａｌｃｈａｑｕｉ  ｖｉｒｕｓ）、アメリカウナギウイルス（Ｅｅｌ  ｖｉｒｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａｎ）、グレーロッジウイルス（Ｇｒａｙ  Ｌｏｄｇｅ  ｖｉｒｕｓ）、ユロナウイルス（Ｊｕｒｏｎａ  ｖｉｒｕｓ）、クラマスウイルス（Ｋｌａｍａｔｈ  ｖｉｒｕｓ）、クワッタウイルス（Ｋｗａｔｔａ  ｖｉｒｕｓ）、ラホヤウイルス（Ｌａ  Ｊｏｙａ  ｖｉｒｕｓ）、マルペススプリングウイルス（Ｍａｌｐａｉｓ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ）、マウントエルゴンコウモリウイルス（Ｍｏｕｎｔ  Ｅｌｇｏｎ  ｂａｔ  ｖｉｒｕｓ）、ペリネウイルス（Ｐｅｒｉｎｅｔ  ｖｉｒｕｓ）、ツパイウイルス（Ｔｕｐａｉａ  ｖｉｒｕｓ）、ファーミントン（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ）、バイアグランデウイルス（Ｂａｈｉａ  Ｇｒａｎｄｅ  ｖｉｒｕｓ）、ミュアスプリングスウイルス（Ｍｕｉｒ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  ｖｉｒｕｓ）、リードランチウイルス（Ｒｅｅｄ  Ｒａｎｃｈ  ｖｉｒｕｓ）、ハートパークウイルス（Ｈａｒｔ  Ｐａｒｋ  ｖｉｒｕｓ）、フランダースウイルス（Ｆｌａｎｄｅｒｓ  ｖｉｒｕｓ）、カメセウイルス（Ｋａｍｅｓｅ  ｖｉｒｕｓ）、モスケイロウイルス（Ｍｏｓｑｕｅｉｒｏ  ｖｉｒｕｓ）、モスリルウイルス（Ｍｏｓｓｕｒｉｌ  ｖｉｒｕｓ）、バルーウイルス（Ｂａｒｕｒ  ｖｉｒｕｓ）、フクオカウイルス（Ｆｕｋｕｏｋａ  ｖｉｒｕｓ）、カーンキャニオンウイルス（Ｋｅｒｎ  Ｃａｎｙｏｎ  ｖｉｒｕｓ）、コルビッソンウイルス（Ｎｋｏｌｂｉｓｓｏｎ  ｖｉｒｕｓ）、ルダンテックウイルス（Ｌｅ  Ｄａｎｔｅｃ  ｖｉｒｕｓ）、キューラリバウイルス（Ｋｅｕｒａｌｉｂａ  ｖｉｒｕｓ）、コネチカットウイルス（Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ  ｖｉｒｕｓ）、ニューミントウイルス（Ｎｅｗ  Ｍｉｎｔｏ  ｖｉｒｕｓ）、ソーグラスウイルス（Ｓａｗｇｒａｓｓ  ｖｉｒｕｓ）、チャコウイルス（Ｃｈａｃｏ  ｖｉｒｕｓ）、セナマドレイラウイルス（Ｓｅｎａ  Ｍａｄｕｒｅｉｒａ  ｖｉｒｕｓ）、ティンボウイルス（Ｔｉｍｂｏ  ｖｉｒｕｓ）、アルムピウォーウイルス（Ａｌｍｐｉｗａｒ  ｖｉｒｕｓ）、アルアクウイルス（Ａｒｕａｃ  ｖｉｒｕｓ）、バンゴランウイルス（Ｂａｎｇｏｒａｎ  ｖｉｒｕｓ）、ビンボウイルス（Ｂｉｍｂｏ  ｖｉｒｕｓ）、ビベンスアームウイルス（Ｂｉｖｅｎｓ  Ａｒｍ  ｖｉｒｕｓ）、ワタリガニウイルス（Ｂｌｕｅ  ｃｒａｂ  ｖｉｒｕｓ）、チャービルウイルス（Ｃｈａｒｌｅｖｉｌｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、海岸平野ウイルス（Ｃｏａｓｔａｌ  Ｐｌａｉｎｓ  ｖｉｒｕｓ）、ＤａｋＡｒＫ  ７２９２ウイルス、エントアメーバウイルス（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｖｉｒｕｓ）、ガルバウイルス（Ｇａｒｂａ  ｖｉｒｕｓ）、ゴッサスウイルス（Ｇｏｓｓａｓ  ｖｉｒｕｓ）、ハンプティドゥーウイルス（Ｈｕｍｐｔｙ  Ｄｏｏ  ｖｉｒｕｓ）、ジョインジャカカウイルス（Ｊｏｉｎｊａｋａｋａ  ｖｉｒｕｓ）、カンナマンガラムウイルス（Ｋａｎｎａｍａｎｇａｌａｍ  ｖｉｒｕｓ）、コロンゴウイルス（Ｋｏｌｏｎｇｏ  ｖｉｒｕｓ）、クールピニャウイルス（Ｋｏｏｌｐｉｎｙａｈ  ｖｉｒｕｓ）、コトンコンウイルス（Ｋｏｔｏｎｋｏｎ  ｖｉｒｕｓ）、ランジャウイルス（Ｌａｎｄｊｉａ  ｖｉｒｕｓ）、マニトバウイルス（Ｍａｎｉｔｏｂａ  ｖｉｒｕｓ）、マルコウイルス（Ｍａｒｃｏ  ｖｉｒｕｓ）、ナソウルウイルス（Ｎａｓｏｕｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、ナバロウイルスウイルス（Ｎａｖａｒｒｏ  ｖｉｒｕｓ）、ガインガンウイルス（Ｎｇａｉｎｇａｎ  ｖｉｒｕｓ）、オークベールウイルス（Ｏａｋ−Ｖａｌｅ  ｖｉｒｕｓ）、オボジャングウイルス（Ｏｂｏｄｈｉａｎｇ  ｖｉｒｕｓ）、オーイタウイルス（Ｏｉｔａ  ｖｉｒｕｓ）、オウァンゴウイルス（Ｏｕａｎｇｏ  ｖｉｒｕｓ）、パリークリークウイルス（Ｐａｒｒｙ  Ｃｒｅｅｋ  ｖｉｒｕｓ）、リオグランデシクリッドウイルス（Ｒｉｏ  Ｇｒａｎｄｅ  ｃｉｃｈｌｉｄ  ｖｉｒｕｓ）、サンジンバウイルス（Ｓａｎｄｊｉｍｂａ  ｖｉｒｕｓ）、シグマウイルス（Ｓｉｇｍａ  ｖｉｒｕｓ）、スリピュールウイルス（Ｓｒｉｐｕｒ  ｖｉｒｕｓ）、スウィートウォーターブランチウイルス（Ｓｗｅｅｔｗａｔｅｒ  Ｂｒａｎｃｈ  ｖｉｒｕｓ）、チブロガルガンウイルス（Ｔｉｂｒｏｇａｒｇａｎ  ｖｉｒｕｓ）、キシブレマウイルス（Ｘｉｂｕｒｅｍａ  ｖｉｒｕｓ）、ヤタウイルス（Ｙａｔａ  ｖｉｒｕｓ）、ロードアイランド（Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ）、アデレードリバーウイルス（Ａｄｅｌａｉｄｅ  Ｒｉｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、ベリマーウイルス（Ｂｅｒｒｉｍａｈ  ｖｉｒｕｓ）、キンバリーウイルス（Ｋｉｍｂｅｒｌｅｙ  ｖｉｒｕｓ）、又はウシ流行熱ウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ  ｅｐｈｅｍｅｒａｌ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）である、請求項２６に記載の腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞。
【請求項２８】
前記腫瘍溶解性ラブドウイルスが、マラバウイルス、例えば請求項１７〜２５のいずれか一項に記載のマラバウイルスである、請求項２７に記載の腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞。
【請求項２９】
前記マラバウイルスが、野生型Ｇタンパク質におけるＱ２４２Ｒ変異及び野生型Ｍタンパク質におけるＬ１２３Ｗ変異の両方を含む、野生型マラバウイルスの変異体である、請求項２８に記載の腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞。
【請求項３０】
前記ＩＬ１２タンパク質が、野生型ヒトＩＬ１２配列に対して少なくとも６０％同一であり、例えば７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する、又は
前記ＩＬ１２タンパク質が、野生型マウスＩＬ１２配列に対して少なくとも６０％同一であり、例えば７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有する、
請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞。
【請求項３１】
前記ＩＬ１２タンパク質が、それぞれ配列番号１及び配列番号２に対応するｐ４０及びｐ３５サブユニットを含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞。
【請求項３２】
前記ＩＬ１２タンパク質が、それぞれ配列番号３及び配列番号４に対応するｐ４０及びｐ３５サブユニットを含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞。
【請求項３３】
前記ＩＬ１２タンパク質が、アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号３に対して少なくとも６０％同一であるｐ４０サブユニットを含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞。
【請求項３４】
前記ＩＬ１２タンパク質が、アミノ酸配列が配列番号２又は配列番号４に対して少なくとも６０％同一であるｐ３５サブユニットを含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞。
【請求項３５】
前記ＩＬ１２タンパク質の機能的部分が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又は両方の増殖を刺激すること、ヒトＮＫ／リンホカイン活性化キラー細胞の溶解活性を増強すること、ヒトＰＢＭＣを休止させることによってＩＦＮ−ガンマの産生を刺激すること、又はそれらの任意の組合せを行うこと、ができる部分である、請求項２６〜３４のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞。
【請求項３６】
前記腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞が患者由来である、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞を患者に投与するステップを含む、患者のがんを治療するための方法。
【請求項３７】
患者からの腫瘍細胞に、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）タンパク質又はその機能的部分をコードする核酸配列をゲノムに含む腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させて、前記腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞を作出するステップをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞が静脈内に投与される、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞が腹腔内に投与される、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞が腫瘍内に投与される、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞が髄腔内に投与される、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞が頭蓋内に投与される、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞が皮下に投与される、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４４】
前記腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞が胸腔内に投与される、請求項３６又は３７に記載の方法。
【請求項４５】
患者のがんを治療するための、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性マラバウイルス又は請求項２６〜３５のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞の、使用。
【請求項４６】
患者のがんを治療するための、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性マラバウイルス、又は請求項２６〜３５のいずれか一項に記載の腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた腫瘍細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、全内容が参照により本明細書に組み込まれている、２０１６年８月９日出願の米国特許仮出願第６２／３７２，４０６号の優先権を主張するものである。
【０００２】
[0002]本開示は、インターロイキン−１２を発現する組換え腫瘍溶解性ラブドウイルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0003]以下に続く段落は、そこで論述したすべてのことが従来技術又は当業者の知識の一部分であると認めるものではない。
【０００４】
[0004]腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、正常組織中での複製能が減弱化されていながら、腫瘍細胞中で感染し、増殖するように、操作又は選択されている、有望な抗がん療法である。一部のＯＶの有効性にとって重要な１つの特徴は、抗腫瘍免疫応答を刺激する能力である。
【０００５】
[0005]成功の度合いは様々であるが、患者自身のがん細胞を患者へワクチン接種（自家細胞ワクチン）することが過去に試みられている（１、２）。その多くは、ホールセルワクチンをカルメット・ゲラン桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃｏｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）などの非特異的アジュバントと混合して用いるものであったが、腫瘍微小環境内における免疫抑制の克服が困難であることから、限定的な結果しか得られていない（３）。それにもかかわらず、臨床試験では、ホールセルワクチンに対して免疫応答をもちうる患者の生存が有意に良くなることが一貫して示されており、このことは、免疫応答が起きた場合、予後が改善されることを示唆している（４）。
【０００６】
[0006]ＩＬ−１２などのサイトカインもまた抗腫瘍免疫応答を誘導するために用いられているが、これらのサイトカインの半減期は短く、タンパク質として投与される場合、全身投与後に直面する用量制限毒性によって、これらのサイトカインの潜在的な有効性は低減される（５）。しかしながら、サイトカインベースのワクチンに対する強い免疫学的な理論的根拠により、世界中の数多くの研究所で新規の実験的アプローチの開発は推進され続けている。
【発明の概要】
【０００７】
［序論］
[0007]以下の序論は、読者を本明細書へと手引きすることを意図するものであるが、任意の発明を定義することを意図するものではない。１つ又は複数の発明は、下記の又は本文書の他の部分に記述されている、構成要素又は方法ステップの、組合せ又は下位の組合せにおいて存在してもよい。このような他の発明又は発明（複数）を特許請求の範囲に記述していないということだけで、発明者らは本明細書において開示した発明又は発明（複数）いずれに対する彼らの権利を放棄又は棄権することはない。
【０００８】
[0008]がんの治療のための腫瘍溶解性ウイルスの使用における一般的な問題点は、単剤としてウイルスを使用する抗腫瘍免疫活性化が不十分であることである。
【０００９】
[0009]抗腫瘍免疫活性化ができるＯＶでがんを治療する手段が、当分野において必要とされている。このようなＯＶは、腫瘍微小環境における免疫応答が向上した自家細胞ワクチンの中で使用することができる。
【００１０】
[0010]一態様において、本開示は、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）又はその機能的部分をコードする核酸配列又は核酸配列（複数）をゲノムに含むマラバウイルス（Ｍａｒａｂａ  ｖｉｒｕｓ）を提供することによって、がんの腫瘍溶解性ウイルス治療に関連した１つ又は複数の欠点を、課題として対処する又は改善することを試みる。ＩＬ１２タンパク質又はその機能的部分の発現は、マラバウイルスを感染させた腫瘍細胞の免疫原性を増強させる可能性がある。
【００１１】
[0011]インターロイキン１２は、ナチュラルキラー細胞刺激因子（ＮＫＳＦ）、又は細胞傷害性リンパ球成熟因子（ＣＬＭＦ）としても知られる。ＩＬ−１２は、ジスルフィド結合している２つのサブユニット、ｐ３５及びｐ４０を含有する、ヘテロ二量体サイトカインである。ヒトｐ３５及びｐ４０タンパク質の配列は、それぞれ配列番号１及び２に示す。マウスｐ３５及びｐ４０タンパク質の配列は、それぞれ配列番号３及び４に示す。ヒト及びマウスＩＬ−１２は、それらのｐ３５及びｐ４０サブユニットで、それぞれ６０％及び７０％のアミノ酸配列相同性を共有している。ジスルフィド結合したマウスｐ４０ホモ二量体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＩＬ−１２受容体に結合することができ、ＩＬ−１２活性の拮抗剤として作用することができる。マウスｐ４０単量体は、ホモ二量体の活性と比較して低い活性ではあるものの、ＩＬ−１２拮抗剤としても作用する可能性がある。本開示の関連において、このようなｐ４０の単量体及びホモ二量体は、ＩＬ１２の機能的部分であると判断されると考えられる。
【００１２】
[0012]マラバウイルスによってコードされるＩＬ１２又はその機能的部分は、ヒトｐ３５及びｐ４０配列に実質的に対応する配列を有していてもよい。マラバウイルスによってコードされるＩＬ１２又はその機能的部分は、マウスｐ３５及びｐ４０配列に実質的に対応する配列を有していてもよい。ＩＬ１２又はその機能的部分が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、又は両方の増殖を刺激すること、ヒトＮＫ／リンホカイン活性化キラー細胞の溶解活性を増強すること、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を休止させることによってＩＦＮ−ガンマの産生を刺激すること、又はそれらの任意の組合せを行うこと、ができる限りは、マラバウイルスによってコードされるＩＬ１２又はその機能的部分は野生型ヒトＩＬ１２に対して少なくとも６０％同一である配列を有していてもよい。
【００１３】
[0013]ＩＬ１２は、由来の異なるＩＬ１２の配列のキメラである配列を有していてもよい。例えば、マラバウイルスによってコードされるＩＬ１２は、ヒトｐ３５単量体の配列に実質的に対応する配列とマウスｐ４０単量体の配列に実質的に対応する配列とを有していてもよい。得られたヘテロ二量体は、ヒトＩＬ１２サブユニットとマウスＩＬ１２サブユニットとのキメラである。実施例において説明するように、マウスＩＬ１２とヒトＩＬ１２とが、ｐ４０及びｐ３５サブユニットでそれぞれ７０％及び６０％のアミノ酸配列相同性しか共有していないにもかかわらず、マラバウイルスによって発現されるマウスＩＬ１２は、そのヒトＮＫ細胞刺激特性を保持している。
【００１４】
[0014]本開示の関連において、例えば「ＩＬ１２配列」などの表現は、サブユニットが列記されている順序にかかわらず、二量体タンパク質を構成しているサブユニットの配列全体を指していると理解されたい。したがって、野生型ヒトＩＬ１２に対して少なくとも６０％同一である配列を有するマラバウイルスによってコードされるＩＬ１２に関する上記の論述は、マラバウイルスによってコードされるｐ３５及びｐ４０の配列の組合せを、野生型ヒトＩＬ１２のｐ３５及びｐ４０の配列の組合せと比較していることを理解されたい。
【００１５】
[0015]ラブドウイルスは、野生型マラバウイルスの変異体であってもよい。野生型マラバウイルスゲノムは、３’末端から５’末端へＮ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。マラバウイルス（参照により本明細書に組み込まれている米国特許第８，４８１，０２３号の配列番号１〜６；ＨＱ６６００７６．１）。本開示による野生型マラバウイルスの変異体は、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬタンパク質を、３’−Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｌ−５’以外の異なる順序でコードするヌクレオチド配列を有するゲノムを有していてもよい。マラバウイルスの変異体は、例えばＱ２４２Ｒなどの、野生型配列の２４２位に対応する位置でのＧタンパク質の変異、及び／又は、例えばＬ１２３Ｗなどの、野生型配列の１２３位に対応する位置でのマトリックス（Ｍ）タンパク質の変異を含んでいてもよい。野生型Ｇタンパク質のＱ２４２Ｒ変異及び野生型Ｍタンパク質のＬ１２３Ｗ変異の両方を含む野生型マラバウイルスの変異体は、本明細書において「ＭＧ１」と呼ぶことがある。Ｇタンパク質のアミノ酸２４２位及び／又はＭタンパク質のアミノ酸１２３位での置換を含有するマラバウイルスは、全内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第９，０４５，７２９号の第２欄、２４〜４２行に記載されている通りである。腫瘍溶解性マラバＭＧ１ウイルスは、このウイルスを正常細胞では減弱化しながら、がん細胞では極めて毒性にする、Ｇ及びＭタンパク質の両方における変異によって、遺伝子改変されている（６）。野生型マラバウイルスの変異体は、並び替えたＮ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬタンパク質を有するヌクレオチド配列を有するゲノム、並びに上記で論じたＧ及びＭタンパク質の変異のうちの１つ又は両方を、いずれも含んでいてもよい。
【００１６】
[0016]ＩＬ１２は、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列の前、Ｎ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列の後、又はＮ、Ｐ、Ｍ、Ｇ及びＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列のいずれかの間、に位置する１つ又は複数のヌクレオチド配列によってコードされていてもよい。例えば、ｐ３５及びｐ４０タンパク質の両方をコードするヌクレオチド配列は、変異型Ｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列とＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列との間に位置していてもよい。別の例において、ｐ３５をコードするヌクレオチド配列は、Ｍタンパク質をコードするヌクレオチド配列と変異型Ｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列との間に位置していてもよく、一方、ｐ４０タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、変異型Ｇタンパク質をコードするヌクレオチド配列とＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列との間に位置していてもよい。
【００１７】
[0017]明確にするために記すると、本開示は（ｉ）マラバウイルスによってコードされたタンパク質の順序を変えること、（ｉｉ）上述の通り、Ｇ及び／又はＭタンパク質における変異を含むこと、並びに（ｉｉｉ）ＩＬ１２又はその機能的部分をコードするヌクレオチド配列又は配列（複数）の位置を変えること、のうちの任意の組合せを企図していることを理解されたい。
【００１８】
[0018]別の態様において、本開示は、患者からの腫瘍細胞に、ＩＬ１２又はその機能的部分を発現する腫瘍溶解性ラブドウイルスを感染させた、感染細胞ワクチン（ＩＣＶ）を提供する。感染細胞ワクチンでは、腫瘍細胞を患者から取り出し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍溶解性ラブドウイルスに感染させる。次いで、ウイルス感染させた細胞を感染細胞ワクチン（ＩＣＶ）として患者に投与することができる。腫瘍溶解性ラブドウイルスは、本明細書において論述されている通り、インターロイキン−１２（ＩＬ１２）又はその機能的部分をコードする核酸配列をゲノムに含むマラバウイルスであってもよい。ＩＣＶは、腹腔内に、静脈内に、鼻腔内に、頭蓋内に、皮下に、髄腔内に、皮内に、胸腔内に、又は筋肉内に投与されてもよい。
【００１９】
[0019]明確にするために記すると、本開示が、腫瘍溶解性ラブドウイルスによって発現されたＩＬ１２又はその機能的部分が、上記で論述したマラバウイルスによって発現されるＩＬ１２又はその機能的部分と同じであってもよいことを企図していることを理解されたい。
【００２０】
[0020]明確にするために記すると、本開示は（ｉ）野生型ラブドウイルスによってコードされたタンパク質の順序を変えること、及び（ｉｉ）ＩＬ１２又はその機能的部分をコードするヌクレオチド配列又は配列（複数）を、ラブドウイルスタンパク質をコードする遺伝子のいずれかの間に置くこと、の任意の組合せを企図していることも、また理解されたい。
【００２１】
[0021]他の態様において、本開示は、開示したマラバウイルス又は開示した感染細胞ワクチンの投与による、がんを治療するための方法を提供する。本開示はまた、これに関連する、がんを治療するための、開示したマラバウイルス又は開示した感染細胞ワクチンの使用も提供する。
【００２２】
[0022]ここで、本開示の実施形態を、単に例として、添付の図を参照にしながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】組換えＭＧ１−ＩＬ１２腫瘍溶解性ラブドウイルスを形成する、ＭＧ１のＧ遺伝子とＬ遺伝子との間へのＩＬ１２遺伝子の挿入を示す図である。
【図２】ＩＬ１２を発現する組換えＭＧ１では、示したＭＯＩでのＢ１６Ｆ１０腫瘍細胞に対する細胞傷害性が、ＭＧ１単独の場合とほぼ同じであることを示す例を示すグラフである。
【図３】ＩＬ１２を発現する組換えＭＧ１では、示したＭＯＩにおけるＣＴ２６ｌａｃＺ腫瘍細胞に対する細胞傷害性が、ＭＧ１単独の場合とほぼ同じであることを示す例を示すグラフである。
【図４】ＥＬＩＳＡによって測定した場合、組換えＭＧ１−ＩＬ１２を感染させた照射Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を含む例示的ＩＣＶが、ＩＬ１２サイトカインを産生することを示すグラフである。
【図５】ＥＬＩＳＡによって測定した場合、組換えＭＧ１−ＩＬ１２を感染させた照射ＣＴ２６ｌａｃＺ腫瘍細胞を含む例示的ＩＣＶが、ＩＬ１２サイトカインを産生していることを示すグラフである。
【図６】ＥＬＩＳＡによって測定した場合、組換えＭＧ１−ＩＬ１２を感染させた照射Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を含む例示的ＩＣＶを投与された腫瘍ナイーブマウスの肺ホモジネートでは、ＩＬ１２サイトカインのレベルが増加していたことを実証するグラフである。
【図７】ＥＬＩＳＡによって測定した場合、組換えＭＧ１−ＩＬ１２を感染させた照射Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を含む例示的ＩＣＶを投与された腫瘍ナイーブマウスの肺ホモジネートでは、ＩＦＮγサイトカインのレベルが増加していたことを実証するグラフである。
【図８】フローサイトメトリーによって測定した場合、組換えＭＧ１−ＩＬ１２を感染させた照射Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を含む例示的ＩＣＶで処置した腫瘍ナイーブマウスの肺では、ＣＤ３＋Ｔ細胞の総数が変化しないことを示すグラフである。
【図９】フローサイトメトリーによって測定した場合、組換えＭＧ１−ＩＬ１２を感染させた照射Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を含む例示的ＩＣＶで処置した腫瘍ナイーブマウスの肺では、ＮＫ１．１＋細胞の総数が増加していることを示すグラフである。
【図１０】フローサイトメトリーによって測定した場合、組換えＭＧ１−ＩＬ１２を感染させた照射Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を含む例示的ＩＣＶで処置した腫瘍ナイーブマウスの肺では、ＮＫ１．１＋ＩＦＮγ＋細胞の総数が増加していることを示すグラフである。
【図１１】フローサイトメトリーによって測定した場合、組換えＭＧ１−ＩＬ１２を感染させた照射Ｂ１６Ｆ１０腫瘍細胞を含む例示的ＩＣＶで処置した腫瘍ナイーブマウスの肺において、ＮＫ１．１＋グランザイムＢ＋細胞の総数が増加していることを示すグラフである。
【図１２】ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶでの処置後、腫瘍ナイーブマウスから分離した脾細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでのクロム放出細胞傷害性試験の結果を示すグラフであり、標的ＹＡＣ１細胞の死滅の増加を実証している。
【図１３】ＩＬ１２なしのＭＧ１  ＩＣＶの投与、及び非感染Ｂ１６Ｆ１０細胞と比較した、マウスへのＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶの静注投与後のＢ１６Ｆ１０肺転移の低下を示すグラフである。
【図１４】ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶをワクチン接種されたマウスの腹膜腔におけるＮＫ（ＮＫ１．１−ＣＤ３−）細胞の動員の増加を示すグラフである。
【図１５】ＣＤ６９染色によって測定した場合、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶをワクチン接種されたマウスの腹膜腔において、ＮＫ（ＮＫ１．１−ＣＤ３−）細胞の蓄積が活性化されることを示すグラフである。
【図１６】ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶをワクチン接種されたマウスでは、ＲＭＡ−Ｓ腫瘍細胞に曝露した場合の拒絶率が増加することを示すグラフである。
【図１７】ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶをワクチン接種された、腹膜Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を有するマウスの生存の増加を示すグラフである。
【図１８】ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶのワクチンの効果が抗ＮＫ１．１抗体を使用するＮＫ細胞の枯渇によって抑制されることから、ワクチン接種後の担癌マウスの生存の増加がＮＫ細胞依存性であることを実証するグラフである。
【図１９】ナイーブマウスから分離され、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶで刺激してある分離樹状細胞（ＤＣ）と共培養した脾細胞によるＩＦＮγ分泌の増加を示すグラフである。
【図２０】ナイーブマウスから分離され、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶで刺激してある分離ＤＣと共培養した脾細胞によるＩＦＮγ分泌の増加が、主にＮＫ細胞集団に起因することを示すグラフである。
【図２１】ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶで刺激してある分離ＤＣで条件づけた無細胞培地に向かう分離ナイーブＮＫ細胞の移動度の増加を実証する、走化性アッセイの結果を示すグラフである。
【図２２】ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶで刺激されているＤＣとの共培養後、ＩＰ−１０ケモカインが培養培地中へ放出されることを実証するグラフである。
【図２３】ＩＰ−１０中和抗体でのＩＰ−１０の中和が、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶによって刺激されたＤＣで条件づけした培地中で誘導されたＮＫ細胞走化性を抑制することを実証するグラフである。
【図２４】ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶのワクチン接種後では、ＭＧ１  ＩＣＶのワクチン接種、又はウイルスＭＧ１若しくは組換えウイルスＭＧ１−ＩＬ１２のいずれか単独での処置後と比較して、最初の腫瘍植付け以後のマウスの生存に及ぼす効果が有益であることを説明する図である。
【図２５】ＭＧ１−ＩＬ１２でのワクチン接種後の生存の増加に伴って、腹膜臓器の総重量（関連した腫瘍量を含む）の減少が相応することを実証するグラフである。
【図２６】週２回、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶをワクチン接種された、大きな進行性腫瘍を有するマウスにおける、３週間の期間内の生存に及ぼす有益な効果を説明する図である。
【図２７】ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶをワクチン接種された代表的な１匹のマウスについて、経時的な腫瘍量の縮小を実証しているＭＲＩスキャンを示す画像である。
【図２８】ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶを感染させたＳＷ６２０細胞と培養したＰＢＭＣにおける、ヒトＮＫ細胞の活性化の増加を示すグラフである。
【図２９】ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶ感染ＳＷ６２０細胞と培養したＰＢＭＣから調製した無細胞条件培地の刺激効果によって、ヒトＮＫ細胞の遊走の増加が誘発されることを実証するグラフである。
【図３０】ヒトＰＢＭＣとＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶ感染ＳＷ６２０細胞との共培養後の、ＩＰ−１０ケモカイン産生の増加を示すグラフである。
【図３１】５０：１のエフェクター：標的比でＭＶ１−ＩＬ１２  ＩＣＶ感染ＳＷ６２０細胞と培養した、ヒトがん患者から分離したＮＫ細胞の、ｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞傷害性の増強を示すグラフである。
【図３２】３０：１のエフェクター：標的比でＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶ感染ＳＷ６２０細胞と培養した、ヒトがん患者から分離したＮＫ細胞の、ｅｘ  ｖｉｖｏでの細胞傷害性の増強を示すグラフである。
【図３３】ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶの全身静注処置後の、腫瘍ナイーブマウス脾臓におけるＮＫ１．１＋ＩＦＮγ＋細胞の総数の増加を示すグラフである。
【図３４】ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶの全身静注処置後の、腫瘍ナイーブマウス脾臓におけるＮＫ１．１＋グランザイムＢ＋細胞の総数の増加を示すグラフである。
【図３５】ＭＧ１−ＩＬ１２感染Ｋ５６２細胞と培養した個々の健康な患者のＰＢＭＣを使用した、ｅｘ  ｖｉｖｏでのクロム放出細胞傷害性試験の結果を示すグラフである。
【図３６】ＭＧ１−ＩＬ１２感染Ｋ５６２細胞と培養した個々の健康な患者のＰＢＭＣを使用した、ｅｘ  ｖｉｖｏでのクロム放出細胞傷害性試験の結果を示すグラフである。
【図３７】ＭＧ１−ＩＬ１２感染Ｋ５６２細胞と培養した個々のがん患者のＰＢＭＣを使用した、ｅｘ  ｖｉｖｏでのクロム放出細胞傷害性試験の結果を示すグラフである。
【図３８】ＭＧ１−ＩＬ１２感染Ｋ５６２細胞と培養した個々のがん患者のＰＢＭＣを使用した、ｅｘ  ｖｉｖｏでのクロム放出細胞傷害性試験の結果を示すグラフである。
【図３９】腫瘍植付け後のＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、様々なＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶ投与経路の使用による有効性の違いを示すグラフである。
【図４０】ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶのワクチン接種後のＮＫ細胞の動員及び活性化の機序の提案モデルを説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
[0063]概して、本開示は、サイトカインＩＬ１２をコードする導入遺伝子配列をゲノムに含むマラバウイルスと、患者由来の自家腫瘍細胞に、ＩＬ１２を発現する腫瘍溶解性組換えラブドウイルスをｅｘ  ｖｉｖｏで感染させた感染細胞ワクチン（ＩＣＶ）と、マラバウイルス又は感染細胞ワクチンの投与を通してがんを治療する方法と、がんを治療するためのマラバウイルス又は感染細胞ワクチンの使用とを提供する。いかなる理論にも拘泥するものではないが、本開示の著者らは、ＩＬ１２の発現によって、投与された腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍免疫応答が増強されうると考える。
【００２５】
[0064]腹膜癌腫症（ＰＣ）は、胃腸及び卵巣がんを含む腹部悪性腫瘍の転移のなかで、最も一般的で扱いにくい部位の１つである（７）。腹膜癌腫症は、生活の質及び生存率中央値の著しい低下、並びに新規治療の選択肢が必要となる予後不良を伴う一般的ながん転移である。ＰＣは、伝統的な化学療法の使用については、腸閉塞症などの合併症が起きている患者に対して用いることができないという難題を抱えている（８）。ＰＣ治療における別の難題は、治療薬送達の難しさである。有効な治療に対する別の障害とは、全身的に用いる又は標的部位へ直接送達する免疫調節剤の毒性及び短い半減期である。
【００２６】
[0065]本開示の一態様は、腫瘍溶解性ウイルスの抗腫瘍免疫応答を増強することによって、これらの課題のうちの１つ又は複数を克服することができる。例として、特定の一実施形態において、サイトカインＩＬ１２を発現する腫瘍溶解性ラブドウイルスを、ｅｘ  ｖｉｖｏで患者の腫瘍細胞に感染させる。これらの感染細胞を、次いで、感染細胞ワクチン（ＩＣＶ）として患者に再投与する。いかなる理論にも拘泥するものではないが、本開示の著者らは、感染腫瘍細胞が、ＩＬ１２の産生によって補われる免疫賦活性環境をもたらすと考える。ｉｎ  ｓｉｔｕでのＩＬ１２の発現によって、ＩＬ１２の高用量投与に関連した半減期及び／又は毒性の問題点が低減される。本開示の著者らは、ＩＬ１２の発現は、腫瘍部位に対して、ＮＫ細胞を動員、刺激するよう働きかけ、腫瘍の大きさを縮小させると考える。免疫応答に適応する触手であるＮＫ細胞の活性化は、長期記憶を付与し、それによって、腫瘍再発の可能性を低減すると考えられる。
【００２７】
[0066]材料及び方法：
[0067]細胞株及びマウス：
[0068]マウスＣＴ２６結腸癌、マウスＢ１６Ｆ１０  Ｆ１０黒色腫、ヒトＳＷ６２０結腸直腸腺癌、ヒトＨＣＴ１５結腸直腸腺癌、ヒトＡ５４９肺癌、マウスＹＡＣ−１リンパ腫、ヒトＫ５６２白血病細胞株（いずれもＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから）を、接着性細胞株用のダルベッコ改変イーグル培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で、又は非接着性細胞株用の１０％ウシ胎仔血清（Ｃａｎｓｅｒａ、Ｅｔｏｂｉｃｏｋｅ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）添加ローズウェルパーク記念研究所培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で増殖させた。ラウシャーマウス白血病ウイルス誘導Ｔ細胞リンパ腫（ＲＭＡ）及びＲＭＡ−Ｓ（ＲＭＡのＭＨＣ欠損変異体）は、Ａ．Ｖｅｉｌｌｅｔｔｅ博士（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  ｄｅ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅｓ  Ｃｌｉｎｉｑｕｅ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）から入手した。６〜８週齢の雌のＢａｌｂ／Ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から購入した。動物は病原体のない条件で収容し、実験はすべて、ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｔｔａｗａ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅの承認を得て実施した。
【００２８】
[0069]ＭＧ１−ＩＬ１２の構築：
[0070]マウスＩＬ１２は、マラバＭＧ１へのクローニングを実施しやすくするために、ｐＯＲＦ−ｍＩＬ−１２（ＩＬ−１２ｅｌａｓｔｉ（ｐ３５：：ｐ４０））（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）からＰＣＲ増幅して、ＭｌｕＩ（５’）及び（３’）クローニング部位を付加した（９）。組換えＭＧ１−ＩＬ１２ウイルスは、既述の通り（１０）、レスキューさせた。簡潔に記すと、Ａ５４９を、Ｔ７ポリメラーゼを発現するワクシニアウイルスに感染させ、その後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、マラバＮ、Ｐ及びＬをコードするｐＣＩ−Ｎｅｏプラスミド（それぞれ１、１．２５、０．２５ｍｇ）と共にＭＧ１−ＩＬ−１２ＤＮＡプラスミド２ｍｇでトランスフェクトした。レスキューされたウイルスをＳＮＢ１９細胞で継代し、次いで、プラークを精製し、増幅させ、ベロ細胞で力価を測定した。
【００２９】
[0071]生存率アッセイ：
[0072]Ｂ１６ｌａｃＺ、ＣＴ２６ｌａｃＺ、ＳＷ６２０及びＨＣＴ１５細胞株は、９６ウェルプレート（２×１０４細胞／ウェル）へ播種した。２４時間後に、細胞に、０．００１〜１０ｐｆｕ／細胞の感染価（ＭＯＩ）でＭＧ１又はＭＧ１−ＩＬ１２ウイルスを感染させた。２０μｇ／ｍｌの最終濃度になるまで４８時間インキュベーションした後、アラマーブルー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加した。６時間のインキュベーション後、５７０ｎｍの波長で吸光度を読み取った。
【００３０】
[0073]抗体及びＦＡＣＳ分析：
[0074]脾臓及び肺リンパ球集団の分析のために、臓器をマウスから採取し、赤血球を塩化アンモニウム−カリウム溶解（ＡＣＫ）緩衝液を用いて溶解した。モノクローナル抗体は、いずれもｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの抗ＴＣＲ−ｂ（Ｈ５７−５９７）、抗ＮＫ１．１（ＰＫ１３６）を用いた。１時間のＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）インキュベーションの後、いずれもＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの抗ＣＤ３（１７Ａ２）、抗ＮＫ１．１（ＰＫ１３６）、抗ＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）、及び抗グランザイムＢ（１６Ｇ６）を使用して、脾臓及び肺ＮＫ細胞ＩＦＮ−γ及びグランザイムＢの分泌を分析した。ヒトＮＫ細胞遊走及び活性化について用いたモノクローナル抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄからの抗ＣＤ５６（ＨＣＤ５６）、いずれもｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）及び抗ＣＤ６９（ＦＮ５０）である。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）の取得はＣｙＡｎ−ＡＤＰ  Ｓｕｍｍｉｔソフトウエア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｃａｎａｄａ）を使用して実施し、Ｋａｌｕｚａソフトウエア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてデータを解析した。
【００３１】
[0075]Ｅｘ  ｖｉｖｏでの脾細胞傷害性試験
[0076]５１Ｃｒ放出アッセイは、既述の通り（１１）実施した。簡潔に記すと、脾細胞は、被処置及び対照マウスから、処置２日後に採取した。ＡＣＫ緩衝液処理した脾細胞は再懸濁し、指定されたエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比でクロム標識ＹＡＣ−１細胞と混合した。
【００３２】
[0077]ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍拒絶アッセイ
[0078]ｉｎ  ｖｉｖｏ拒絶アッセイは、既述の通り（１１）実施した。簡潔に記すと、ＲＭＡ及びＲＭＡ−Ｓを、５及び０．５ｍｍｏｌ／ＬのＣＦＳＥでそれぞれ標識した。ＩＣＶ処置２４時間後に、各細胞型の１：１混合物を含有する細胞１×１０６個をＣ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内へ注射した。翌日（２４時間）、２ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ含有ＰＢＳ、５ｍＬで腹膜を洗浄することによって腹膜細胞を収集した。収集した細胞を、ＣＦＳＥ標識の存在についてフローサイトメトリーを行って分析した。
【００３３】
[0079]Ｂ１６Ｆ１０細胞のウイルス感染、並びに走化性及びケモカインの分析のための骨髄由来ＤＣとの共培養
[0080]ＭＧ１又はＭＧ１−ＩＬ１２（ＭＯＩ＝０．１ｐｆｕ／細胞）を感染させたＢ１６Ｆ１０細胞を、感染１８時間後に回収し、９６ウェルプレート中で、他の箇所で説明した骨髄由来樹状細胞（ＤＣ）と、ＤＣ培地（１％ＦＢＳ）（１倍の２−メルカプトエタノール（カタログ番号２１９８５−０２３、Ｇｉｂｃｏ、ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した完全ＲＰＭＩ）中で３：１比で培養した（１２）。２４時間後、培地を収集し、さらなる分析まで−８０℃で保管した。
【００３４】
[0081]サイトカイン及びケモカインの分析
[0082]ＤＣ共培養上清からのマウスＩＦＮγは、製造業者の使用説明書に従ってＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）キットによって検出した。肺ＩＬ１２及びＩＦＮγ発現について、マウス１匹当たり５×１０５細胞／１００μｌの照射Ｂ１６、ＭＧ１  ＩＣＶ又はＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶを静注処置したＣ５７Ｂｌ／６マウスからの肺を、処置２４時間後に切除し、１ｍｌのＰＢＳ中でホモジナイズした。マウスＭＣＰ−１、ＳＤＦ−１及びＩＰ−１０ケモカインは、ＩＣＶ処置１８時間後、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの腹水から（ｉｎ  ｖｉｖｏで）、又は組織培養上清から、製造業者の使用説明書に従ってＥＬＩＳＡｒｒａｙキット（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してアッセイした。
【００３５】
[0083]マウスのトランスウェル走化性アッセイ
[0084]ケモカイン又は走化性アッセイの評価のための組織培養上清は、ＤＣ培地中で作出した。ＮＫ細胞の走化性は、既述の通り（１３）、トランスウェルシステムを使用して評価した。簡潔に記すと、ＤＣ培養物からの条件培地５００μｌを、５μｍ孔のトランスウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）の下段チャンバーに添加した。ＤＸ５＋で選択したＮＫ細胞３×１０５個を上段チャンバーに添加し、プレートを３７℃で３時間インキュベートした。下段チャンバー中の細胞を回収し、トリパンブルーで染色し、カウントした。遊走率は、（底部チャンバー中のＮＫ細胞総数／投入ＮＫ細胞総数）×１００として算出した。ＮＫ細胞指数の算出には、（ＮＫ細胞遊走率／培地のみの群からのＮＫ細胞遊走率）を用いた。
【００３６】
[0085]ヒトのトランスウェル走化性アッセイ
[0086]条件培地は、１８時間、ＩＣＶ−ＰＢＭＣを３：１比で直接共培養することによりＤＣ培地で作出した。１×１０６個のＰＢＭＣを上段チャンバーに添加し、プレートを３７℃で３時間インキュベートした。下段チャンバー中の細胞を回収し、抗ＣＤ５６（ＨＣＤ５６）及び抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）で染色し、ＦＡＣＳによって定量化した。遊走率は、（底部チャンバー中のＮＫ細胞総数／投入ＮＫ細胞総数）×１００として算出した。ＮＫ細胞指数の算出には、（ＮＫ細胞遊走率／培地のみの群からのＮＫ細胞遊走率）を用いた。
【００３７】
[0087]ＤＣ−ＭＧ１−ＩＬ−１２−ＩＣＶ／脾細胞の共培養
[0088]ＤＣ−ＭＧ１−ＩＬ−１２−ＩＣＶを、ＭＡＣＳ  ＣＤ１１ｃ＋  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって分離し、９６ウェルプレートフォーマットで、２×１０５脾細胞／ウェルのナイーブ脾細胞と、ＤＣ培地中で１：５比で共培養した。２４時間後、無細胞の上清をＩＦＮγの測定のために−８０℃に保管した。細胞内ＦＡＣＳによる脾細胞上での細胞内ＩＦＮγ染色もまた、上述の通りに実施した。
【００３８】
[0089]マウスモデル：
[0090]治療的処置モデル。
[0091]ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７Ｂｌ／６マウスそれぞれにおけるＣＴ２６及びＢ１６Ｆ１０腹膜癌腫症は、腹腔内への腫瘍細胞５×１０５個の植付け後３日目に、１×１０４個のＩＣＶで処置した。ＣＴ２６巨大腫瘍モデルについては、腫瘍細胞５×１０５個を腹膜内に植付け、磁気共鳴（ＭＲ）スキャンによって３ｍｍ超の大きさを有する腫瘍を確認した後、ＩＣＶの６回投与の処置レジメンを開始した。動物はイソフルランガスで鎮静させ、７テスラＧＥ／Ａｇｉｌｅｎｔ  ＭＲ  ９０１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＵＳＡ）でＭＲスキャニングを実施した。各マウスについて、冠状及び体軸断面における１個のローカライザー及び２個の高速スピンエコー（ＦＳＥ）シーケンスの、３種類のＭＲパルスシーケンスを用いた。ＦＳＥシーケンスのパラメーター：エコートレイン数＝８、バンド幅＝１６ｋＨｚ、エコー時間＝４２ｍｓ、繰り返し時間＝１５００ｍｓ、撮像視野＝３５ｍｍ、マトリックス＝２５６×２５６、スライス厚＝１ｍｍ。マウス当たりのＭＲスキャン合計時間は約１５分であった。経過観察のＭＲスキャンは、処置開始後１週、６週及び１３週目に、同じＭＲスキャンパラメーターを用いて実施した。
【００３９】
[0092]予防的処置モデル。
[0093]Ｃ５７Ｂｌ／６マウス腹腔内に、１×１０３個の照射Ｂ１６、ＭＧ１  ＩＣＶ又はＭＧ１−ＩＬ−１２−ＩＣＶの単回投与によるワクチン接種を行った。翌日、マウスは、Ｂ１６Ｆ１０−ＬａｃＺ細胞３×１０５個を静注にて曝露させ、腫瘍細胞注入後４日目に屠殺し、続いて、既述の通り、Ｘ−ｇａｌ（Ｂｉｏｓｈｏｐ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｃａｎａｄａ）を用いて肺転移の染色及び定量化を行った（１４）。肺表面の転移の総数は、実体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｎｃｏｒｄ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、全肺葉で測定した。
【００４０】
[0094]統計分析
[0095]統計分析はすべて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６．０ソフトウエアを使用して決定した。統計的有意性は、カットオフ値Ｐ＝０．０５を用いたＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって決定した。データは、±ＳＤとして示した。
【００４１】
[0096]マウスＩＬ１２（ＭＧ１−ＩＬ１２）をコードするＭＧ１腫瘍溶解性ウイルスの特性決定
[0097]ｐ３５及びｐ４０サブユニットから構成されているマウスＩＬ１２導入遺伝子（ｐ７０）を、腫瘍溶解性マラバウイルス変異体ＭＧ１のバックボーンに組み込み、ＭＧ１−ＩＬ１２を創出した（図１）。この複製可能な腫瘍溶解性ウイルスは、親のＭＧ１に匹敵する効率でマウス及びヒトの腫瘍細胞株いずれにも感染することがわかり、ＩＬ１２の発現は、ウイルスの複製又は伝播に負の影響を及ぼしてはいなかった（図２及び３）。さらに、ＩＬ１２は、ＭＧ１−ＩＬ１２を感染させたＢ１６Ｆ１０（２２ｐｇ／細胞）及びＣＴ２６（１８０ｐｇ／細胞）細胞の培養培地中で検出された（図４及び５）。これらの結果は、まとめると、ＭＧ１−ＩＬ−１２はウイルスの複製及びＩＬ−１２分泌をもたらすマウス腫瘍細胞にうまく感染することができ、これによってＭＧ１−ＩＬ１２感染細胞ワクチン（ＩＣＶ）が得られることを実証している。
[0098]
【実施例】
【００４２】
[0099]ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶはＮＫ細胞介在の腫瘍拒絶を増強する。
[00100]本開示の著者らは、以前に、自家腫瘍細胞に腫瘍溶解性ウイルスをｅｘ  ｖｉｖｏで感染させることで、定着（established）した非許容性の腫瘍に対する強い免疫応答をｉｎ  ｖｉｖｏで誘発することができることを実証している（１５）。ＭＧ１及びＭＧ１−ＩＬ１２が、ＩＣＶとして用いた場合に、免疫応答を同様に誘導できるかどうかを確かめるために、著者らは、モックを感染させた又はＭＧ１若しくはＭＧ１−ＩＬ１２を感染させたいずれかのγ照射Ｂ１６Ｆ１０細胞５×１０５個を静脈内注射（静注）した。著者らは、以前に、腫瘍のない動物において、ＩＣＶの静注投与が、注入された細胞が肺の中に急速に用量依存的に蓄積し、１日にわたって残存することに結びつくことを示している（１６）。ＩＣＶ送達後、ＭＧＩ−ＩＬ１２  ＩＣＶを投与されたマウスからの肺ホモジネート中では、単独で細胞を又はＭＧ１  ＩＣＶを投与された動物と比較して有意に高いレベルのＩＬ１２が検出された（図６、ｔ＝２４時間）。ＩＬ１２の濃度の上昇が何らかの機能的影響を及ぼすかどうかを確かめるために、ＩＬ１２応答性サイトカインＩＦＮγのレベルを測定した。ＩＬ１２の増加に一致して、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶで処置したマウスの肺では、ＭＧ１  ＩＣＶを投与されたマウス又は照射細胞と比較して、ＩＦＮγのレベルも上昇していた（図７）。ＩＬ１２は、ＮＫ及びＴ細胞の両方を標的としてＩＦＮγ分泌を促進するため（１７）、著者らは、次に、どの細胞型が我々のＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶでの処置に対して反応しているのかを決定しようと試みた。興味深いことに、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶのワクチン接種によって肺におけるＴ細胞の総数への影響は認められなかったが、肺に存在するＮＫ細胞の総数に３倍の増加が認められ、このことは、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶがＮＫ細胞の動員を増強することを示唆している（図８及び９）。加えて、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶの注射後、ＩＦＮγ及びグランザイムＢ陽性ＮＫ細胞の総数が、それぞれ約７及び４倍増加しており、このことは、ＮＫ細胞活性化の増加を示している（図１０及び１１）。さらに効果を調べるために、ＹＡＣ−１標的細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性活性をｅｘ  ｖｉｖｏで測定し、ＭＧ１−ＩＬ−１２  ＩＣＶ処置したマウスから分離した脾細胞がＹＡＣ−１の死滅のレベルを有意に高めたことが認められた（図１２）。これらのデータは、送達部位へのＮＫ細胞動員の促進、及び付随する脾臓ＮＫ細胞の全身活性化における、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶの働きを裏付けるものであった（図３３及び３４）。この効果が腫瘍排除の促進に転換されたかどうかを判断するために、Ｂ１６Ｆ１０肺転移部を、照射細胞、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶ又はＭＧ１  ＩＣＶのいずれか単独での静注送達によって処置した（図１３）。ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶの全身送達は、検出可能な肺転移の数を、ＭＧ１  ＩＣＶ又は照射細胞での処置と比較して有意に減じるには十分なものであった。これらの結果は、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶが、ＮＫ細胞動員、及び感染細胞ワクチンの抗腫瘍効果を有意に向上させるエフェクター機能を刺激することができることを示唆するものである。
【００４３】
[00101]ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶは、ＮＫ細胞活性化を増強し、腹膜癌腫症モデルにおける生存を向上させる。
【００４４】
[00102]最初に得られた知見は、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶによって誘発された、ＭＧ１  ＩＣＶとの比較において向上した抗腫瘍応答は、送達部位への細胞傷害性ＮＫ細胞の動員の増強に寄与するＩＬ１２の強力な走化性特性に、部分的に起因していることを示唆している（図９、１０及び１１）。したがって、著者らは、次に、マウス腹腔内へのＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶのワクチン接種が、腹膜腔内の腫瘍の排除を促進し、生存の増加を促進することができるかどうかを評価することを試みた。静脈内へのＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶワクチン接種における先の観察と同様に、著者らは、腹腔内へのワクチン接種の２４時間後、ＭＧ１  ＩＣＶと比較して、腹膜におけるＮＫ細胞の割合の増加（１９％対４９％、ｐ＝０．００７３）を認めた（図１４）。浸潤性ＮＫ細胞はまた、活性化マーカーＣＤ６９の有意な上方調節も示し、このことは、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶをワクチン接種されたマウスでは、腹膜に蓄積するＮＫ細胞がより高く活性化されたことを示している（図１５）（１８、１９）。これらの知見を補足するために、ワクチン接種したマウスをＮＫ−感受性ＲＭＡ−Ｓ腫瘍細胞株及びＲＭＡ親腫瘍細胞株に曝露させることによってｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＫ細胞の細胞傷害性試験を実施し、腹膜腔へ遊走した活性化ＮＫ細胞が殺腫瘍性であるかどうかを検討した。ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶでのワクチン接種後、腫瘍細胞排除は有意に促進され、このことは、ＩＣＶが介在したＮＫ細胞の動員及び活性化が、腹膜からの腫瘍細胞の排除を効果的に促進することができることを実証している（図１６）。この結論を支持するように、Ｂ１６Ｆ１０腹膜腫瘍を有するマウスへのＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶワクチン接種の防御効果は、ＮＫ細胞の枯渇に対しては完全に無効にされており、このことはさらに、このＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶワクチン接種による処置戦略の治療的効果がＮＫ細胞の動員及び活性化に依存することを示唆している（図１７及び１８）。
【００４５】
[00103]ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶに応じたＮＫ細胞の活性化及び遊走は、樹状細胞からのＩＰ１０の分泌に部分的に依存する。
【００４６】
[00104]これらのデータは、ＮＫ細胞の活性化と遊走と機能とを促進するＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶの能力を明確に確立するものであるが、ＮＫ細胞機能の重要なメディエーターである樹状細胞（ＤＣ）がｉｎ  ｖｉｖｏでＮＫ細胞の活性化と遊走と機能とを促進するプロセスに関与するかどうかは不明である。ＭＧ１−ＩＬ１２存在下でのＮＫ細胞とＤＣとの間の相互作用を理解するために、著者らは、無処理骨髄由来ＤＣ、又はモックの、ＭＧ１若しくはＭＧ１−ＩＬ１２感染Ｂ１６Ｆ１０細胞と培養した骨髄由来ＤＣのいずれかの存在下で培養した、脾細胞からのＩＦＮγ産生を定量化した。特に、著者らは、予めＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶに曝露させたＤＣと培養した脾細胞が、ＮＫ細胞特異的なＩＦＮγ分泌の有意な増加をもたらすことを見出し、このことは、ＤＣがＮＫ細胞のサイトカイン分泌を促進することを示唆している（図１９及び２０）。次のステップは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのトランスウェル走化性アッセイを使用して、ＮＫ細胞遊走を促進するＤＣの能力を調べることであった。５μｍの膜を横切るＮＫ細胞の遊走が、ＭＧ１  ＩＣＶ又はＭＧ１−ＩＬ−１２  ＩＣＶのいずれかによって有意に増加することがわかったが、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶでの遊走ＮＫ細胞の割合のほうが高かった（図２１）。ＮＫ細胞遊走は、ＤＣの存在下で条件づけられた培地によってさらに増加し、このことは、ＤＣがＮＫ細胞の活性化及び遊走の増加に対する刺激を与えていることを示唆している。次に、著者らは、ＤＣによって通常分泌されているケモカインのどれが、認められた効果を媒介していたかを同定することを試みた。ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質−１）及びＳＤＦ−１（ストロマ細胞由来因子−１）分泌に対する効果は何ら検出できなかったにもかかわらず、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶはＩＰ−１０（ＩＦＮ誘導タンパク質−１０）の有意な増加を誘導することがわかった（図２２）。ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶと培養したＤＣ由来条件培地中のＩＰ−１０を中和するとｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮＫ細胞の遊走能力が有意に阻害され、このことは、ＩＰ−１０の中心的役割を確認するものである（図２３）。
【００４７】
[00105]ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶは、マウスにおける定着腹膜疾患の処置において有効である。
【００４８】
[00106]これらの知見は、まとめると、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶは活性化ＮＫ細胞の動員を刺激することによって腹膜区画内のＢ１６Ｆ１０腫瘍の増殖速度を有意に低下させうることを示唆している。腹膜癌腫症は、後期の胃腸及び婦人科悪性腫瘍の一般的な症状であるため、本開示の著者らは、処置時に腹膜疾患を伴う結腸がん（ＣＴ２６）の臨床的に意義のあるモデルにおいて、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶが治療的効果をもたらしうるかどうかを確かめることを試みた。これを達成するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ２６腫瘍細胞を植付けた（図２４）。３日後、マウスに、照射細胞単独、ウイルス単独、又は感染細胞ワクチンの、単回投与の処置を行った。照射ＣＴ２６細胞、ＭＧ１、ＭＧ１−ＩＬ１２及びＭＧ１  ＩＣＶで処置されたマウスはいずれも、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶを投与されたマウスと比較して（９０％超、治癒したマウス２６匹／２００日を超えて生存したマウス２８匹、図２４及び２５）、生存時間中央値が有意に低く、腹膜腫瘍量が増加した。興味深いことに、治癒したマウスでは長期に継続する免疫が発達し、処置１４８日後に、生き残ったマウスの側腹部にＣＴ２６細胞５×１０５個を再曝露させると、治癒したマウスで腫瘍が拒絶された（５／５マウス）。ただし、この抗腫瘍記憶免疫応答は、ＣＴ２６腫瘍、及び、反対側腹部で同系の４Ｔ１腫瘍細胞を曝露させた場合に腫瘍を発現したすべてのマウス（５／５マウス）に対して特異的なものであった。驚くべきことに、腹腔内へ施された処置が、静脈内又は皮下注射と比較して優れた有効性を有することから、有効性が付与されたＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶでは、ワクチン接種の経路は重要な役割を果たしている（図３９）。
【００４９】
[00107]次に、著者らは、定着巨大腫瘍における処置の効果を測定することを試みた。植付け後１０日目から１７日目の間、腫瘍をＭＲＩによって可視化し、有意な腫瘍塊（８ｍｍ超はクラス１、及び３ｍｍ超はクラス２）を有するマウスを、２週間にわたって投与される照射細胞、ＭＧ１  ＩＣＶ又はＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶの６回投与処置に先立ち、処置群に無作為に割り付けた（図２６）。１５日目までに照射細胞で処置した動物はすべて死亡したことから、明らかに致死腫瘍量であったにもかかわらず、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶは完全な防御を実現した（２１／２１が８０日を超えて生存し、試験は進行中である）。経過観察のＭＲＩスキャンにおいて、処置の初期に巨大腫瘍塊の存在が確認されていたが、後期時点では劇的に縮小しているのが目立つ（図２７）。まとめると、これらの結果は、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶが、腹膜癌腫症のマウスモデルにおける腹膜内の巨大定着腫瘍の排除を促進するための有効なアプローチであることを実証している。
【００５０】
[00108]ＭＧ１−ＩＬ−１２  ＩＣＶはヒトＮＫ細胞の細胞傷害性及び遊走能を増強する。
【００５１】
[00109]ＩＬ−１２のマウスｐ４０及びｐ３５サブユニットが、それらのヒトの同等物とそれぞれ７０％及び６０％相同性を共有していることを考慮すると、マウスｐ４０及びｐ３５サブユニットは、ヒトＮＫ及びＴ細胞を機能的に活性化することができる（２０）。著者らは、次に、ワクチンが、ｅｘ  ｖｉｖｏでヒトＮＫ細胞に対して同様の効果を誘発できることを確認することを試みた。これを達成するために、照射ＳＷ６２０結腸がん細胞にＭＧ１又はＭＧ１−ＩＬ１２を感染させ、（ｔｈｅ  Ｏｔｔａｗａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄ  承認番号２０１１８８４によって承認されている周術期採血手順の一環として）健康なドナーから分離した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）と培養した。先の知見に一致して、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶは、ＰＢＭＣのＮＫ細胞（ＣＤ５６＋ＣＤ３−）サブセットにおいて、ＮＫ細胞活性化の既定のマーカーである、ＣＤ６９の発現の有意な増加をもたらした（図２８）。加えて、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶとのＰＢＭＣ共培養上清では、ＩＰ−１０走化性タンパク質の分泌も有意に増加した。このＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶとのＰＢＭＣ共培養上清は、ｅｘ  ｖｉｖｏのトランスウェルシステムにおいてＮＫ細胞の遊走を増強し、このことは、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶワクチンが、ヒト由来のＮＫ細胞及びマウス由来のＮＫ細胞から同様の応答を誘発することを示唆している（図２９及び３０）。最後に、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶでＰＢＭＣを刺激すると、Ｋ５６２標的腫瘍細胞に対する細胞傷害活性の上昇がもたらされ、このことは、ＭＧ１−ＩＬ１２  ＩＣＶの存在下で培養したヒトＮＫ細胞の活性化と遊走能の増強とが、腫瘍細胞を根絶する能力の上昇と関連していることを示唆している（図３１、３２、３５、３６、３７及び３８）。これらの結果は、まとめると、自家感染腫瘍細胞ワクチンはＰＣ患者の処置において極めて必要とされる治療的効果をもたらす可能性があるという仮説を支持するものである。
【００５２】
[00110]上記の実施例がマウスにおける特定のマラバウイルスの有効性を実証している一方で、著者らは、本開示によるマラバウイルス及びＩＣＶはまた、ヒトにおけるがんの腫瘍溶解性ウイルス治療に関係した１つ又は複数の欠点を、課題として対処する又は改善するものと考えている。
【００５３】
[00111]腹膜癌腫症は、本開示によるマラバウイルスを使用して処置することができるがん症状の一例として使用する。他の腫瘍タイプ、及び他の位置における腫瘍もまた、本開示によるマラバウイルス及びＩＣＶを用いた治療が可能であると著者らは考えている。
【００５４】
[00112]上記において、説明を目的として、実施例を十分に理解させるために数多くの詳細を示している。しかしながら、これらの具体的な詳細が必要ではないことは、当業者には明らかであろう。したがって、記述してきたことは、単に記述した実施例の適用を例示しているにすぎず、数多の改変及び変形が上記の教示に照らして可能である。
【００５５】
[00113]上記の説明では実施例を示しているため、当業者は、改変及び変形が特定の実施例に対してなされうるということを理解するであろう。したがって、特許請求の範囲は、本明細書において記載された特定の実施例によって限定されるべきではないが、全体として本明細書と一貫性があるように解釈されるべきである。
【００５６】
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【００５７】
付録Ａ−配列：
配列番号１  −  ヒトＩＬ１２  ｐ３５サブユニット
mwppgsasqp ppspaaatgl hpaarpvslq crlsmcparslllvatlvll dhlslarnlp    61
vatpdpgmfp clhhsqnllr avsnmlqkar qtlefypctseeidheditk dktstveacl    121
pleltknesc lnsretsfit ngsclasrkt sfmmalclssiyedlkmyqv efktmnakll    181
mdpkrqifld qnmlavidel mqalnfnset vpqkssleepdfyktkiklc illhafrira    241
vtidrvmsyl nas
配列番号２  −  ヒトＩＬ１２  ｐ４０サブユニット
mchqqlvisw fslvflaspl vaiwelkkdv yvveldwypdapgemvvltc dtpeedgitw    61
tldqssevlg sgktltiqvk efgdagqytc hkggevlshsllllhkkedg iwstdilkdq    121
kepknktflr ceaknysgrf tcwwlttist dltfsvkssrgssdpqgvtc gaatlsaerv    181
rgdnkeyeys vecqedsacp aaeeslpiev mvdavhklkyenytssffir diikpdppkn    241
lqlkplknsr qvevsweypd twstphsyfs ltfcvqvqgkskrekkdrvf tdktsatvic    301
rknasisvra qdryysssws ewasvpcs
配列番号３  −  マウスＩＬ１２  ｐ３５サブユニット
mvsvptasps asssssqcrs smcqsryllf latlallnhlslarvipvsg parclsqsrn    61
llkttddmvk tareklkhys ctaedidhed itrdqtstlktclplelhkn esclatrets    121
sttrgsclpp qktslmmtlc lgsiyedlkm yqtefqainaalqnhnhqqi ildkgmlvai    181
delmqslnhn getlrqkppv geadpyrvkm klcillhafstrvvtinrvm gylssa
配列番号４  −  マウスＩＬ１２  ｐ４０サブユニット
mcpqkltisw faivllvspl mamwelekdv yvvevdwtpdapgetvnltc dtpeedditw    61
tsdqrhgvig sgktltitvk efldagqytc hkggetlshshlllhkkeng iwsteilknf    121
knktflkcea pnysgrftcs wlvqrnmdlk fnikssssspdsravtcgma slsaekvtld    181
qrdyekysvs cqedvtcpta eetlpielal earqqnkyenystsffirdi ikpdppknlq    241
mkplknsqve vsweypdsws tphsyfslkf fvriqrkkekmketeegcnq kgaflvekts    301
tevqckggnv cvqaqdryyn sscskwacvp crvrs
【図１】
2019527737.tif 000003
【図２】
2019527737.tif 000004
【図３】
2019527737.tif 000005
【図４】
2019527737.tif 000006
【図５】
2019527737.tif 000007
【図６】
2019527737.tif 000008
【図７】
2019527737.tif 000009
【図８】
2019527737.tif 000010
【図９】
2019527737.tif 000011
【図１０】
2019527737.tif 000012
【図１１】
2019527737.tif 000013
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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