(57)【要約】  シアリルオリゴ糖、炭水化物およびミネラルも含有するシアリルオリゴ糖含有供給源を生成する方法。このプロセスは、供給源を約６７℃からの温度に付し、（ｉ）約３５〜約９５℃の温度で耐熱フィルターを用いたろ過に付して、第１のリテンテートおよび第１の透過液を生成するか、または（ｉｉ）遠心分離に付して、軽質相と重質相とを生成し、約５０〜約７０℃の温度で軽質相をろ過して、第１のリテンテートおよび第１の透過液を生成することと、（ｂ）第１の透過液をナノろ過に、または第１の透過液をナノろ過およびダイアフィルトレーションに付して、第２のリテンテートおよび第２の透過液を生成することと、（ｃ）第２のリテンテートを濃縮して、シアリルオリゴ糖含有抽出物を生成することと、を含む。さらに、本発明は、少なくとも３’−シアリルラクトースおよび６’−シアリルラクトースを含むシアリルオリゴ糖に富む組成物、ならびに例えば栄養製剤および乳児用調整乳における、また認知機能を維持または改善するためのその使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアリルオリゴ糖、炭水化物およびミネラルを含む液体供給源からシアリルオリゴ糖を生成する方法であって、前記液体供給源を、
ａ）前記液体供給源を約６７℃の温度に加熱することと、
ｂ）熱処理された前記液体供給源を、
ｉ）約３５〜約９５℃の温度で耐熱フィルターを用いたろ過工程に付して、第１のリテンテートおよび第１の透過液を生成するか、または
ｉｉ）遠心分離に付して、軽質相と重質相とを生成し、約５０〜約７０℃の温度で前記軽質相をろ過して、第１のリテンテートおよび第１の透過液を生成することと、
ｃ）前記第１の透過液をナノろ過に、またはナノろ過およびダイアフィルトレーションに付して、第２のリテンテートおよび第２の透過液を生成することと、
ｄ）前記第２のリテンテートを濃縮して、
シアリルオリゴ糖含有抽出物を生成することと、を含むプロセスに付すことにより、生成する方法。
【請求項２】
前記（ｂ）（ｉ）のろ過工程が、約５０〜約９０℃で行われて、第１のリテンテートおよび第１の透過液を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（ｂ）（ｉ）のろ過工程が、約５０〜約７０℃で行われて、第１のリテンテートおよび第１の透過液を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記耐熱フィルターがセラミックフィルターである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記（ｂ）（ｉｉ）のろ過工程が、約５５〜約７０℃で行われて、第１のリテンテートおよび第１の透過液を生成する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記（ｂ）（ｉｉ）のろ過工程が、約６０〜約７０℃で行われて、第１のリテンテートおよび第１の透過液を生成する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記（ｂ）（ｉｉ）のろ過工程が、耐熱フィルターを使用して行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記耐熱フィルターがセラミックフィルターである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記液体供給源が、２つ以上のシアリルオリゴ糖含有流れの組み合わせを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記液体供給源は、ラクトース結晶化の副産物としての母液、乳製品透過液、乳清、乳清透過液、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記熱処理が、約６７〜約１００℃の温度で行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記液体供給源の前記熱処理が、約２〜約２０分間行われる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記液体供給源の前記熱処理が、前記液体供給源中に存在する前記ミネラルの約２％〜約１０％を沈殿させる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法工程。
【請求項１４】
前記第１の透過液が、
前記液体供給源中の前記ミネラルの約９６％未満および／または
前記液体供給源中のタンパク質の約２０％未満を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のリテンテートが、
前記液体供給源中の前記ミネラルの少なくとも約３％、および／または
前記液体供給源中の前記タンパク質の少なくとも約８０％を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ろ過工程が、前記液体供給源と比較したときに、前記第１の透過液中の不溶性ミネラルおよびタンパク質の量の減少をもたらす、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記耐熱フィルターが、セラミックフィルターである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記熱処理された液体供給源を、セラミックフィルターを用いた限外ろ過に付する、請求項１８に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのグリコシドヒドロラーゼまたはポリメラーゼ酵素反応を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）前記耐熱フィルターからの前記ろ過工程の前記第１の透過液、
ｂ）前記軽質相、
ｃ）濃縮された前記第２のリテンテート、または
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか２つ以上の組み合わせ、
を酵素反応に付する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２１】
前記酵素反応は、
●前記供給源中の少なくとも１種の二糖の分子サイズを増大させて、少なくとも１種のオリゴ糖を生成するか、または
●前記供給源中の少なくとも１種の二糖の分子サイズを減少させて、１種以上の単糖を生成する、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２２】
前記酵素は、β−ガラクトシダーゼを含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記二糖は、ラクトースを含む、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記単糖は、ガラクトースまたはグルコースを含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記オリゴ糖は、１種以上のガラクトオリゴ糖を含む、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記軽質相のろ過が限外ろ過である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記限外ろ過は、約５０℃〜約７０℃、好ましくは約５５℃〜約６５℃の温度で行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２８】
前記ナノろ過は、約２５℃〜約５５℃、好ましくは約５０℃の温度で行われる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の透過液が可溶性ミネラルと少なくとも１つの単糖または二糖とを含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２のリテンテートは、
前記第１の透過液中の前記ミネラルの約７０％未満、または
前記第１の透過液中の前記非シアリルオリゴ糖の糖の約５０％未満、を含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２のリテンテートが、
ａ）少なくとも約７重量％のシアリルオリゴ糖と、
ｂ）少なくとも約０．２重量％の中性オリゴ糖と、
ｃ）約５重量％未満のタンパク質および非タンパク質窒素と、
ｄ）約８０重量％未満の非シアリルオリゴ糖の糖と、
ｅ）約５重量％未満の灰分と、を含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２の透過液が、
第１の透過液中の前記ミネラルの少なくとも約３０％、または
第１の透過液中の前記非シアリルオリゴ糖の糖の少なくとも約５０％を含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２のリテンテートを、ナノろ過または逆浸透のいずれかに付して第３のリテンテートを生成する、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
濃縮された第２のリテンテート、または第３のリテンテートを脱色に付する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３５】
さらに、
●前記シアリルオリゴ糖含有抽出物を結晶化に付して結晶化シアリルオリゴ糖含有抽出物を生成するステップと、
●前記シアリルオリゴ糖含有抽出物または結晶化シアリルオリゴ糖含有抽出物を乾燥させて、乾燥シアリルオリゴ糖含有抽出物を生成するステップと、を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記シアリルオリゴ糖含有抽出物が、乾燥固形分ベースで
●少なくとも約７重量％のシアリルオリゴ糖と、
●少なくとも約０．２重量％の中性オリゴ糖と、
●約５重量％未満のタンパク質および非タンパク質窒素と、
●約８０重量％未満の非シアリルオリゴ糖の糖と、
●約５重量％未満の灰分と、を含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記シアリルオリゴ糖含有抽出物が、乾燥固形分ベースで、
●少なくとも約５重量％の３’−シアリルラクトースと、
●少なくとも約２重量％の６’−シアリルラクトースと、を含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法により生成されたシアリルオリゴ糖含有抽出物。
【請求項３９】
シアリルオリゴ糖に富む組成物であって、乾燥固形分ベースで、
●少なくとも約５重量％の全シアリルオリゴ糖であって
ｉ）全シアリルオリゴ糖の少なくとも約５重量％の３’−シアリルラクトース、
ｉｉ）全シアリルオリゴ糖の少なくとも約２重量％の６’−シアリルラクトース、
ｉｉｉ）全シアリルオリゴ糖の少なくとも約０．０１重量％のジシアリルラクトース、
ｉｖ）全シアリルオリゴ糖の少なくとも約０．０１重量％のシアリルラクトサミンを含む、全シアリルオリゴ糖と、
●少なくとも約０．５重量％の遊離シアル酸と、
●少なくとも約０．２重量％の中性オリゴ糖と、
●約２５重量％未満のタンパク質および非タンパク質窒素と、
●約８０重量％未満のシアリルラクトースを含まない糖と、
●約５重量％未満の灰分と、を含む、組成物。
【請求項４０】
乾燥固形分ベースで、６’−シアリルラクトースの量に対してより多い量の３’−シアリルラクトースを含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４１】
約６５：１〜約１．５：１、約１５：１〜約１．５：１、または約８：１〜約１．５：１の比で３’−シアリルラクトースおよび６’−シアリルラクトースを含む、請求項４０または４１に記載の組成物。
【請求項４２】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法によって生成されたシアリルオリゴ糖含有抽出物、または請求項４０〜４２のいずれか一項に記載のシアリルオリゴ糖に富む組成物を含む栄養製剤。
【請求項４３】
前記栄養製剤は、乳児用調整乳、後続調整乳、成長期調整乳、小児用調整乳、人乳強化剤、子供用飲食物、母体サプリメント、母体栄養製剤、発酵食品、ＵＨＴミルク、ＵＨＴドリンクヨーグルト、酸性乳飲料、ＵＨＴ粉末、医療用食品、スポーツ栄養製剤、または高齢者または老齢者向け製剤である、請求項４３に記載の栄養製剤。
【請求項４４】
１種以上の乳製品脂質、１種以上のガラクトオリゴ糖、１種以上のプロバイオティック株、１種以上のタンパク質加水分解物、ラクトフェリン、乳脂肪球皮膜（ＭＦＧＭ）製剤、またはこれらの任意の２つ以上の組み合わせをさらに含む、請求項４３または４４に記載の栄養製剤。
【請求項４５】
前記乳製品脂質が、バターミルク、高脂肪乳清タンパク質濃縮物、β−血清、バター血清、またはこれらのうちの任意の２つ以上の組み合わせを含む、請求項４５に記載の栄養製剤。
【請求項４６】
前記プロバイオティック株が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ株、またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓとＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓの両方の組み合わせを含む、請求項４５または４６に記載の栄養製剤。
【請求項４７】
前記Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ株が、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓＨＮ０１９（ＤＲ１０（商標））を含む、請求項４７に記載の栄養製剤。
【請求項４８】
前記Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ株が、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓＨＮ００１（ＤＲ２０（商標））を含む、請求項４７に記載の栄養製剤。
【請求項４９】
１０：１〜約１．５：１の３’−シアリルラクトース対６’−シアリルラクトースの比で、３’−シアリルラクトースと６’−シアリルラクトースとを含む、６ヶ月齢未満の乳児に栄養を提供するための組成物。
【請求項５０】
約１０：１〜約１．５：１のシアリルラクトース対６’−シアリルラクトースの比で、３’−シアリルラクトースと６’−シアリルラクトースとを含む、約６ヶ月〜約１２ヶ月齢の乳児に栄養を提供するための組成物。
【請求項５１】
約１０：１〜約１．５：１のシアリルラクトース対６’−シアリルラクトースの比で、３’−シアリルラクトースと６’−シアリルラクトースとを含む、１２ヶ月齢以上の乳児に栄養を提供するための組成物。
【請求項５２】
脳機能もしくは脳発達を維持または増強することに使用するための、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法、または請求項４０〜４２もしくは５０〜５２のいずれか一項に記載された方法により生成されたシアリルオリゴ糖含有抽出物もしくは組成物、または請求項４３〜４９のいずれか一項に記載の栄養製剤。
【請求項５３】
脳機能もしくは脳発達を維持または増強する非治療的方法であって、他の点では健康な対象において、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法によって生成された有効量のシアリルオリゴ糖含有抽出物、請求項４０〜４２もしくは５０〜５２のいずれか一項に記載された組成物、または請求項４３〜４９のいずれか一項に記載の栄養製剤を投与することを含む、方法。
【請求項５４】
前記シアリルオリゴ糖含有抽出物が、
ａ）シアル酸の１つ以上の構造的複合糖質、
ｂ）遊離シアル酸、または
ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方、を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５５】
前記抽出物、組成物または栄養製剤は、
ａ）脳発達の遅延を治療または予防する、
ｂ）神経細胞の生存能力または機能を維持する、
ｃ）認知発達を維持または増強する、
ｄ）認知発達の遅延を予防する、
ｅ）認知能力を維持または増強する、
ｆ）認知機能低下を予防する、
ｇ）学習、記憶力、または注意持続時間を維持または増強する、
ｈ）学習能力、記憶力または注意持続時間の低下を予防する、
ｉ）ストレスに対処する能力を維持または増強する、
ｊ）脳機能の低下を予防する、
ｋ）脳内のガングリオシドレベルを維持または増強する、
ｌ）神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）のレベルを維持または増強する、
ｍ）脳への血液、栄養素または酸素の流れを維持または増強する、
ｎ）シナプス形成を維持または増強する、
ｏ）腸／脳軸の活動を維持または増強する、
ｐ）高齢の脳で神経新生を維持または増強する、
ｑ）白質量を維持または増強する、または
ｒ）ａ）〜ｑ）のうちの任意の２つ以上の組み合わせ、のために投与される請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５６】
前記対象が、胎児、乳児または子供の対象である、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記抽出物、組成物または栄養製剤を、胎児対象の脳機能または発達を維持または増強するために、妊娠中に母親に投与する、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記抽出物、組成物または製剤を、乳児対象における脳機能または発達を維持または増強するために、母乳育児中の母親に投与する、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
加齢関連認知機能低下、認知症、アルツハイマー病、血管疾患、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、レビー小体型認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、統合失調症に伴う認知障害、化学療法誘発性神経障害、ダウン症候群、コルサコフ病、脳性麻痺、てんかん、神経性虚血、神経性再灌流障害、神経性外傷、神経性出血、神経性感染症、脳卒中、有毒物質への神経細胞の曝露、加齢性精神障害、不安障害、加齢性うつ病、微小血管障害に関連する認知症（糖尿病、低血圧、脳卒中誘発性血管性認知症、肥満など）、免疫系障害に関連する認知症、中枢神経系（ＣＮＳ）障害に関連する認知症、低血圧に関連する認知症、肥満に関連する認知症、または血管性認知症、のいずれか１つ以上に関連する軽度認知障害を治療する方法であって、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法によって生成されたシアリルオリゴ糖含有抽出物、請求項３３〜３６または４４〜４６のいずれか一項に記載の抽出物もしくは組成物、または請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の栄養製剤の有効量をそれを必要とする対象に対して投与することを含む、方法。
【請求項６０】
加齢関連認知機能低下、認知症、アルツハイマー病、血管疾患、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、レビー小体型認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、統合失調症に伴う認知障害、化学療法誘発性神経障害、ダウン症候群、コルサコフ病、脳性麻痺、てんかん、神経性虚血、神経性再灌流障害、神経性外傷、神経性出血、神経性感染症、脳卒中、有毒物質への神経細胞の暴露、加齢性精神障害、不安障害、加齢性うつ病、微小血管障害に伴う認知症（糖尿病、低血圧、脳卒中誘発性血管性認知症、肥満など）、免疫系の障害に関連する認知症、中枢神経系（ＣＮＳ）障害に関連する認知症、低血圧に関連する認知症、肥満に関連する認知症もしくは血管性認知症、乳児期発症重度発育遅延（Ｎ−アセチルノイラミン酸をコードする遺伝子の突然変異関連性の）および縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）、のいずれか１つ以上に関連する軽度認知障害を治療するための、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法によって生成されたシアリルオリゴ糖含有抽出物、請求項４０〜４２または５０〜５２のいずれか一項に記載の組成物、または請求項４３〜４９のいずれか一項に記載の栄養製剤。
【請求項６１】
加齢関連認知機能低下、認知症、アルツハイマー病、血管疾患、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、レビー小体型認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、統合失調症に伴う認知障害、化学療法誘発性神経障害、ダウン症候群、コルサコフ病、脳性麻痺、てんかん、神経性虚血、神経性再灌流障害、神経性外傷、神経性出血、神経性感染症、脳卒中、有毒物質への神経細胞の暴露、加齢性精神障害、不安障害、加齢性うつ病、微小血管障害に伴う認知症（糖尿病、低血圧、脳卒中誘発性血管性認知症、肥満など）、免疫系の障害に関連する認知症、中枢神経系（ＣＮＳ）障害に関連する認知症、低血圧に関連する認知症、肥満に関連する認知症もしくは血管性認知症、または乳児期発症重度発育遅延（Ｎ−アセチルノイラミン酸をコードする遺伝子の突然変異関連性の）および縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）、のいずれか１つ以上に関連する軽度認知障害を治療するための製剤の製造における、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法によって生成されたシアリルオリゴ糖含有抽出物、または請求項３３〜３６もしくは４４〜４６のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シアリルオリゴ糖、シアリルオリゴ糖に富む組成物を得る方法、および脳の機能または発達を維持または増強するためのシアリルオリゴ糖の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物の乳の組成は、乳児または小児の正常な成長および発達を支えることを特に目標としている（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｄｅ  ｏｆ  Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ  Ｂｒｅａｓｔｍｉｌｋ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ，Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅｖａ，１９８１）。
【０００３】
母体用調整乳、乳児用調整乳、後続調整乳、成長期調整乳、食事療法用製品および他の乳製品含有組成物は、典型的には非人乳を用いて生成される。しかしながら、人乳の栄養組成は、ある点で非人乳の栄養組成と異なる。ウシ、ヤギまたはヒツジの乳のような非ヒト全乳は、人乳とは全く異なるミルクオリゴ糖の補体を含む。
【０００４】
最適な認知発達と成長は、乳幼児発達の重要な部分である。認知発達障害は生活の質に重大な影響を及ぼすことは疑うべくもない。さらに、成長が制限されていると、長期的な健康に悪影響があることが示される。したがって、認知発達を増強しまたは健康な成長を維持することが示されている任意の薬剤は乳幼児のために幅広い利益をもたらすであろう（Ｂｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）．Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ｓｃｈｏｏｌ−ａｇｅｄ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｎｕｔｒ  Ｒｅｖ  ６２：２９５−３０６）．
【０００５】
認知機能低下は学習能力、記憶および注意持続時間の低下を特徴とし、高齢者に広範に見られる。認知機能低下を予防または遅延させるあらゆる薬剤は、高齢者の生活の質に広範な利益をもたらすであろう。
【０００６】
本発明の目的は、シアリルオリゴ糖、シアリルオリゴ糖に富む組成物を得る方法、および脳の機能または発達を維持または増強するためのシアリルオリゴ糖の使用を提供すること、あるいは少なくとも公衆に有用な選択を提供することである。
【発明の概要】
【０００７】
第一の態様において、本発明は、シアリルオリゴ糖、炭水化物およびミネラルを含む液体供給源からシアリルオリゴ糖を生成する方法を提供するものであり、液体供給源を、
ａ）液体供給源を約６７℃の温度に加熱することと、
ｂ）熱処理された液体供給源を、
（ｉ）約３５〜約９５℃の温度で耐熱フィルターを用いたろ過工程に付して、第１のリテンテートおよび第１の透過液を生成するか、または
（ｉｉ）遠心分離に付して、軽質相と重質相とを生成し、約３５〜約９５℃の温度で耐熱フィルターを用いた軽質相をろ過して、第１のリテンテートおよび第１の透過液を生成することと、
ｃ）第１の透過液をナノろ過に、またはナノろ過およびダイアフィルトレーションに付して、第２のリテンテートおよび第２の透過液を生成することと、
ｄ）第２のリテンテートを濃縮して、
シアリルオリゴ糖含有抽出物を生成することと、を含むプロセスに付すことにより、生成する方法を提供する。
【０００８】
さらなる態様において、本発明は、乾燥固形物ベースで、
●少なくとも約５重量％の全シアリルオリゴ糖であって
○全シアリルオリゴ糖の少なくとも約５重量％の３’−シアリルラクトース、
○全シアリルオリゴ糖の少なくとも約２重量％の６’−シアリルラクトース、
○全シアリルオリゴ糖の少なくとも約０．０１重量％のジシアリルラクトース、
○全シアリルオリゴ糖の少なくとも約０．０１重量％のシアリルラクトサミンを含む、全シアリルオリゴ糖と、
●少なくとも約０．５重量％の遊離シアル酸と、
●少なくとも約０．２重量％の中性オリゴ糖と、
●約２５重量％未満のタンパク質および非タンパク質窒素と、
●約８０重量％未満のシアリルラクトースを含まない糖と、
●約５重量％未満の灰分と、を含む、シアリルオリゴ糖に富む組成物に関する。
【０００９】
さらなる態様において、本発明は、３’−シアリルラクトース対６’−シアリルラクトースとして、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトースおよびシアリルラクトサミンを約１０：１：０．５〜約１．５：１：０．０３の比で含む、６ヶ月齢未満の乳児に栄養を提供するための組成物に関する。
【００１０】
さらなる態様において、本発明は、３’−シアリルラクトース対６’−シアリルラクトースとして、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトースおよびシアリルラクトサミンを約１０：１：０．５〜約１．５：１：０．０３の比で含む、約６ヶ月〜約１２ヶ月齢の乳児に栄養を提供するための組成物に関する。
【００１１】
さらなる態様において、本発明は、３’−シアリルラクトース対６’−シアリルラクトースとして、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトースおよびシアリルラクトサミンを約１０：１：０．５〜約１．５：１：０．０３の比で含む、１２ヶ月齢以上の乳児に栄養を提供するための組成物に関する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、加齢関連認知機能低下のいずれか１つ以上に関連する軽度認知障害を、またはアルツハイマー病、血管疾患、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、統合失調症に伴う認知障害、化学療法誘発性神経障害、ダウン症候群、コルサコフ病、脳性麻痺、てんかん、神経性虚血、神経性再灌流障害、神経性外傷、神経性出血、神経性感染症、脳卒中、有毒物質への神経細胞の曝露、加齢性精神障害、不安障害、加齢性うつ病、微小血管障害に関連する認知症（糖尿病、低血圧、脳卒中誘発性血管性認知症、肥満など）、免疫系障害に関連する認知症、中枢神経系（ＣＮＳ）障害に関連する認知症、低血圧に関連する認知症、肥満に関連する認知症、もしくは血管性認知症のいずれか１つ以上に関連する認知障害を治療する方法であって、シアリルオリゴ糖含有抽出物の有効量を投与することを含む、方法に関する。
【００１３】
本明細書で使用されるとき、「治療すること」は、予防すること、遅延させること、または改善することを含む。
【００１４】
以下の実施形態のうちの任意の１つ以上のものは、本明細書に記載の任意の態様またはそれらの任意の組み合わせに関連し得る。
【００１５】
好ましくは、液体供給源は、２つ以上のシアリルオリゴ糖含有流れの組み合わせを含む。
【００１６】
好ましくは、液体供給源は、ラクトース結晶化の副生成物としての母液、乳製品透過液、乳清、乳清透過液、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせを含む。
【００１７】
好ましくは、熱処理は約６７〜約１００℃の温度で行われる。
【００１８】
好ましくは、液体供給源の熱処理は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０分間行われ、そしてこれらの値のいずれかの間から適切な範囲を選択することができる。
【００１９】
好ましくは、液体供給源の熱処理は、液体供給源中に存在するミネラルの約２、３、４、５、６、７、８、９または１０％を沈殿させ、そしてこれらの値のいずれかの間から適切な範囲を選択することができる。
【００２０】
好ましくは、第１の透過液は
液体供給源中のミネラルの約９６％未満、および／または
液体供給源中のタンパク質の約２０％未満を含む。
【００２１】
好ましくは、第１のリテンテートは
液体供給源中のミネラルの少なくとも約３％、および／または
液体供給源中のタンパク質の少なくとも約８０％、を含む。
【００２２】
好ましくは、ろ過工程は、液体供給源と比較した場合、第１の透過液中の不溶性ミネラルおよびタンパク質の量の減少をもたらす。
【００２３】
好ましくは、（ｂ）（ｉ）のろ過工程は、約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０℃で行われて、第１のリテンテートおよび第１の透過液を生成し、そしてこれらの値のいずれかの間から適切な範囲を選択することができる。
【００２４】
好ましくは、（ｂ）（ｉ）の耐熱フィルターはセラミックフィルターである。
【００２５】
好ましくは、（ｂ）（ｉｉ）のろ過工程は、約５５、６０、６５、または約７０℃で行われて、第１のリテンテートおよび第１の透過液を生成し、そしてこれらの値のいずれかの間から適切な範囲を選択することができる。
【００２６】
好ましくは、（ｂ）（ｉｉ）のろ過工程は、耐熱フィルターを用いて行われる。
【００２７】
好ましくは、（ｂ）（ｉｉ）の耐熱フィルターはセラミックフィルターである。
【００２８】
好ましくは、熱処理された液体供給源は、セラミックフィルターを用いた限外ろ過に付される。
【００２９】
好ましくは、セラミック限外ろ過は約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０℃の温度で行われ、そしてこれらの値のいずれかの間から適切な範囲を選択することができる。好ましくは、セラミック限外ろ過は約６０℃〜約８０℃の温度で行われる。
【００３０】
好ましくは少なくとも１つのグリコシドヒドロラーゼまたはポリメラーゼ酵素反応。
【００３１】
好ましくは
ａ）第１の透過液
ｂ）軽質相、
ｃ）濃縮された第２のリテンテート、または
ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか２つ以上の組み合わせ。
を酵素反応に付する。
【００３２】
好ましくは酵素反応は、
ａ）供給源中の少なくとも１種の二糖の分子サイズを増大させて少なくとも１種のオリゴ糖を生成する、または
ｂ）供給源中の少なくとも１種の二糖の分子サイズを減少させて１種以上の単糖を生成する。
【００３３】
好ましくは、酵素はβ−ガラクトシダーゼを含む。
【００３４】
好ましくは、二糖はラクトースを含む。
【００３５】
好ましくは、単糖はガラクトースまたはグルコースを含む。
【００３６】
好ましくは、オリゴ糖は１種以上のガラクトオリゴ糖を含む。
【００３７】
好ましくは、軽質相のろ過は限外ろ過である。
【００３８】
好ましくは、限外ろ過は約５０、５５、６０、６５または７０℃の温度で行われ、そしてこれらの値のいずれかの間から適切な範囲を選択することができる。好ましくは、限外ろ過は約５５℃〜約６５℃の温度で行われる。
【００３９】
好ましくは、ナノろ過は約２５、３０、３５、４０、４５、５０または５５℃の温度で行われ、そしてこれらの値のいずれかの間から適切な範囲を選択することができる。好ましくは、限外ろ過は約５０℃の温度で行われる。
【００４０】
好ましくは、第２の透過液は可溶性ミネラルと少なくとも１つの単糖または二糖とを含む。
【００４１】
好ましくは、第２のリテンテートは、
第１の透過液中のミネラルの約７０％未満、または
第１の透過液中の非シアルオリゴ糖の糖の約５０％未満を含む。
【００４２】
好ましくは、第２のリテンテートは、
●少なくとも約７重量％のシアリルオリゴ糖と、
●少なくとも約０．２重量％の中性オリゴ糖と、
●約５重量％未満のタンパク質および非タンパク質窒素と
●約８０重量％未満の非シアリルオリゴ糖の糖と、
●約５重量％未満の灰分と、を含む。
【００４３】
好ましくは、第２の透過液は
第１の透過液中のミネラルの少なくとも約３０％、または
第１の透過液中の非シアリルオリゴ糖の糖の少なくとも約５０％を含む。
【００４４】
好ましくは、第２のリテンテートは、ナノろ過または逆浸透のいずれかに付されて、第３のリテンテートを生成する。
【００４５】
好ましくは、濃縮された第２のリテンテート、または第３のリテンテートは脱色に付される。
【００４６】
好ましくは、この方法は、
シアリルオリゴ糖含有抽出物を結晶化に付して結晶化シアロオリゴ糖含有抽出物を生成するステップと、
シアリルオリゴ糖含有抽出物または結晶化シアリルオリゴ糖含有抽出物を乾燥させて、乾燥シアリルオリゴ糖含有抽出物を生成するステップと、を含む。
【００４７】
好ましくは、シアリルオリゴ糖含有抽出物は、約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１重量％未満のタンパク質および非タンパク質窒素を含み、そしてこれらの値のいずれかの間から適切な範囲を選択することができる。
【００４８】
好ましくは、シアリルオリゴ糖含有抽出物は、約１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１重量％未満の灰分を含み、そしてこれらの値のいずれかの間から適切な範囲を選択することができる。
【００４９】
好ましくは、シアリルオリゴ糖含有抽出物は、乾燥固形分ベースで、
●少なくとも約７重量％のシアリルオリゴ糖と、
●少なくとも約０．２重量％の中性オリゴ糖と、
●約５重量％未満のタンパク質および非タンパク質窒素と
●約８０重量％未満の非シアリルオリゴ糖の糖と、
●約５重量％未満の灰分と、を含む。
【００５０】
好ましくは、シアリルオリゴ糖含有抽出物は、乾燥固形分ベースで、
●少なくとも約５重量％の３’−シアルラクトースと、
●少なくとも約２重量％の６’−シアリルラクトースと、を含む。
【００５１】
さらなる態様において、本発明は、上記の方法のうちのいずれか１つによって生成されたシアリルオリゴ糖含有抽出物に関する。
【００５２】
好ましくは、組成物は、乾燥固形分ベースで、６’−シアリルラクトースの量に対してより多い量の３’−シアリルラクトースを含む。
【００５３】
好ましくは、組成物は、３’−シアリルラクトースと６’−シアリルラクトースを約６５：１〜約１．５：１、約１５：１〜約１．５：１、または約８：１〜約１．５：１の比で含み、そしてこれらの値のいずれかの間から適切な範囲を選択することができる。
【００５４】
さらなる態様において、本発明は、上記のような方法によって生成されたシアリルオリゴ糖含有抽出物を含むか、または上記のようなシアリルオリゴ糖に富む組成物を含む栄養製剤に関する。
【００５５】
好ましくは、栄養製剤は、乳児用調整乳、後続調整乳、成長期調整乳、小児用調整乳、人乳強化剤、子供用飲食物、母体サプリメント、母体栄養製剤、発酵食品、ＵＨＴミルク、ＵＨＴドリンクヨーグルト、酸性乳飲料、ＵＨＴ粉末、医療用食品、スポーツ栄養製剤、または高齢者または老齢者向け製剤である。
【００５６】
好ましくは、栄養製剤は、１種以上の乳製品脂質、１種以上のガラクトオリゴ糖、１種以上のプロバイオティック株、１種以上のタンパク質加水分解物、ラクトフェリン、乳脂肪球皮膜（ＭＦＧＭ）製剤、他のプレバイオティクス、またはこれらの任意の２つ以上の組み合わせをさらに含む。
【００５７】
好ましくは、栄養製剤の乳製品脂質は、バターミルク、高脂肪乳清タンパク質濃縮物、ベータ血清、バター血清、またはこれらの任意の２つ以上の組み合わせを含む。
【００５８】
好ましくは、プロバイオティック株は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓもしくはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ株、またはＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓとＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓの両方の組み合わせを含む。
【００５９】
好ましくは、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ株はＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓＨＮ０１９（ＤＲ１０（商標））を含む。
【００６０】
好ましくは、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ株はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓＨＮ００１（ＤＲ２０（商標））を含む。
【００６１】
さらなる態様において、本発明は、（ｉ）有効量の上記の方法により生成されたシアリルオリゴ糖含有抽出物、または（ｉｉ）上記のような栄養製剤を、正常な対象に、投与することを含む脳機能または脳発達を維持または増強する方法に関する。
【００６２】
好ましくは、シアリルオリゴ糖含有抽出物は、
ａ）シアル酸の１つ以上の構造複合糖質、
ｂ）遊離シアル酸、または
ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方、を含む。
【００６３】
好ましくは、抽出物、組成物または栄養製剤は、
ａ）脳発達の遅延を予防する、
ｂ）神経細胞の生存能力または機能を維持する、
ｃ）認知発達を維持または増強する、
ｄ）認知発達の遅延を予防する、
ｅ）認知能力を維持または増強する、
ｆ）認知機能低下を予防する、
ｇ）学習、記憶、または注意持続時間を維持または増強する、
ｈ）学習能力、記憶または注意持続時間の低下を予防する、
ｉ）ストレスに対処する能力を維持または増強する、
ｊ）神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）のレベルを維持または増強する、
ｋ）脳機能の低下を予防する、
ｌ）脳内のガングリオシドレベルを維持または増強する、
ｍ）脳への血液、栄養素または酸素の流れを維持または増強する、
ｎ）シナプス形成を維持または増強する、
ｏ）腸／脳軸の活動を維持または増強する、
ｐ）高齢の脳で神経新生を維持または増強する、
ｑ）白質量を維持または増強する、または
ｒ）ａ）〜ｑ）のうちの任意の２つ以上の組み合わせ、のために投与される。
【００６４】
好ましくは、対象が胎児、乳児または子供の対象である。
【００６５】
好ましくは、抽出物、組成物または栄養製剤を、胎児対象の脳機能または発達を維持または増強するために、妊娠中に母親に投与する。
【００６６】
好ましくは、抽出物、組成物または製剤を、乳児対象における脳機能または発達を維持または増強するために、母乳育児中の母親に投与する。
【００６７】
一実施形態において、個体への本発明の組成物の投与は、その個体において、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０％の脳内グリセロホスホリルコリン（ＧＰＣ）の増加をもたらし、そしてこれらの値のいずれかの間から適切な範囲を選択することができる。
【００６８】
一実施形態では、個体への本発明の組成物の投与は、その個体において少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０％の脳内グルタミン（Ｇｌｕ）の増加をもたらし、そしてこれらの値のいずれかの間から適切な範囲を選択することができる。
【００６９】
一実施形態では、個体への本発明の組成物の投与は、その個体において少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０％の脳内ミオイノシトール（Ｉｎｓ）の増加をもたらし、そしてこれらの値のいずれかの間から適切な範囲を選択することができる。
【００７０】
一実施形態では、個体への本発明の組成物の投与は、その個体において、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０％の脳内Ｌｉｐ０９の減少をもたらし、そしてこれらの値のいずれかの間から適切な範囲を選択することができる。
【００７１】
一実施形態では、個体への本発明の組成物の投与は、その個体において、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０％の脳内巨大分子（ＭＭ）の減少をもたらし、そしてこれらの値のいずれかの間から適切な範囲を選択することができる。
【００７２】
一実施形態では、個体への本発明の組成物の投与は、その個体において、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０％の脳内Ｎ−アセチルアスパルチルグルタミン酸（ＮＡＡＧ）の増加をもたらし、そしてこれらの値のいずれかの間から適切な範囲を選択することができる。
【００７３】
一実施形態では、個体への本発明の組成物の投与は、その個体において、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０％の脳内グルタミン酸−グルタミン複合体（Ｇｌｘ）の増加をもたらし、そしてこれらの値のいずれかの間から適切な範囲を選択することができる。
【００７４】
さらなる態様において、本発明は、加齢関連認知機能低下、認知症、アルツハイマー病、血管疾患、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、レビー小体型認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、統合失調症に伴う認知障害、化学療法誘発性神経障害、ダウン症候群、コルサコフ病、脳性麻痺、てんかん、神経性虚血、神経性再灌流障害、神経性外傷、神経性出血、神経性感染症、脳卒中、有毒物質への神経細胞の曝露、加齢性精神障害、不安障害、加齢性うつ病、微小血管障害に関連する認知症（糖尿病、低血圧、脳卒中誘発性血管性認知症、肥満など）、免疫系障害に関連する認知症、中枢神経系（ＣＮＳ）障害に関連する認知症、低血圧に関連する認知症、肥満に関連する認知症、または血管性認知症、のいずれか１つ以上に関連する軽度認知障害を治療する方法であって、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法によって生成されたシアリルオリゴ糖含有抽出物、請求項３３〜３６または４４〜４６のいずれか一項に記載の抽出物もしくは組成物、または請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の栄養製剤の有効量をそれを必要とする対象に対して投与することを含む、方法に関する。
【００７５】
さらなる態様において、本発明は、加齢関連認知機能低下、認知症、アルツハイマー病、血管疾患、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、レビー小体型認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、統合失調症に伴う認知障害、化学療法誘発性神経障害、ダウン症候群、コルサコフ病、脳性麻痺、てんかん、神経性虚血、神経性再灌流障害、神経性外傷、神経性出血、神経性感染症、脳卒中、有毒物質への神経細胞の曝露、加齢性精神障害、不安障害、加齢性うつ病、微小血管障害に関連する認知症（糖尿病、低血圧、脳卒中誘発性血管性認知症、肥満など）、免疫系障害に関連する認知症、中枢神経系（ＣＮＳ）障害に関連する認知症、低血圧に関連する認知症、肥満に関連する認知症、または血管性認知症、のいずれか１つ以上に関連する軽度認知障害を治療するための、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法によって生成されたシアリルオリゴ糖含有抽出物、請求項３３〜３８または４４〜４６のいずれか一項に記載の組成物、または請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の栄養製剤に関する。
【００７６】
さらなる態様において、本発明は、加齢関連認知機能低下、認知症、アルツハイマー病、血管疾患、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、レビー小体型認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、統合失調症に伴う認知障害、化学療法誘発性神経障害、ダウン症候群、コルサコフ病、脳性麻痺、てんかん、神経性虚血、神経性再灌流障害、神経性外傷、神経性出血、神経性感染症、脳卒中、有毒物質への神経細胞の曝露、加齢性精神障害、不安障害、加齢性うつ病、微小血管障害に関連する認知症（糖尿病、低血圧、脳卒中誘発性血管性認知症、肥満など）、免疫系障害に関連する認知症、中枢神経系（ＣＮＳ）障害に関連する認知症、低血圧に関連する認知症、肥満に関連する認知症、または血管性認知症、のいずれか１つ以上に関連する軽度認知障害を治療するための製剤の製造における、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法によって生成されたシアリルオリゴ糖含有抽出物、または請求項３３〜３６または４４〜４６のいずれか一項に記載の組成物、の使用に関する。
【００７７】
本明細書に開示された数値範囲（例えば、１〜１０）の言及はまた、その範囲内の全ての有理数（例えば、１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９、および１０）への言及およびその範囲内の任意の範囲の有理数（例えば、２〜８、１．５〜５．５、および３．１〜４．７）への言及をも包含することが意図される。
【００７８】
また、本発明は、広義には、本出願の明細書中で個別にまたはまとめて言及または指摘した部分、要素および特徴、ならびにこれらの部分、要素または特徴のうちのいずれか２つ以上の任意のまたはすべての組み合わせからなると言うことができ、本発明が関連する技術分野において既知の均等物を有する特定の整数が本明細書に記載されている場合、そのような既知の均等物は、あたかも個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれるとみなされる。
【００７９】
本明細書において、特許明細書および他の文書を含む外部の情報源を参照した場合、これは一般に本発明の特徴を論じるための文脈を提供することを目的としている。特に明記しない限り、そのような情報源への言及は、いかなる法域においても、そのような情報源が先行技術であること、または当該技術分野における一般常識の一部をなすことの承認として解釈されるべきではない。
【００８０】
本明細書で使用される「含む」という用語は、「〜の少なくとも一部からなる」を意味する。その用語を含む本明細書中の言及、各言及中のその用語で始まる特徴を解釈するとき、全て存在する必要があるが、他の特徴も存在することができる。「含む」および「含まれる」などの関連用語は、同様に解釈されるべきである。
【００８１】
ここで、本発明を単なる例示として図面を参照しながら説明する。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】シアリルオリゴ糖含有抽出物の生成方法のプロセスフロー図を示す。
【００８３】
【図２】８方向放射状迷路を使用した３時間の「簡単な」課題を使用した識別テストの結果を報告するグラフを示す。
【００８４】
【図３】８方向放射状迷路を使用した３時間の「より難しい」課題を使用した識別テストの結果を報告するグラフを示す。
【００８５】
【図４】４つの連続した試行内で最大１つのミスの学習基準を使用して、難しい課題に対する学習能力の結果を報告するグラフを示す。
【００８６】
【図５】対照と比較した、２つの処置群における前頭皮質におけるＰｏｌｙＳｉａ発現を報告するグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
本発明は、乳児用調整乳を含む栄養製剤に使用するための、シアリルオリゴ糖に富む抽出物の生成方法に関する。
【００８８】
本発明はまた、シアリルオリゴ糖に富む組成物、そのような組成物を含む栄養製剤、ならびにその組成物および栄養製剤の使用を提供する。
【００８９】
本発明の組成物および方法の様々な実施形態は、不純物が少ない高濃度のシアリルオリゴ糖組成物の生成を含むがこれに限定されない多数の利点を有する。
【００９０】
１．供給源物質
本発明における使用のためのシアリルオリゴ糖含有液体供給源は哺乳動物の乳から得られる。シアリルオリゴ糖を含有するという条件で、任意の画分または乳誘導体を本発明において利用することができることを理解すべきである。
【００９１】
いくつかの実施形態において、シアリルオリゴ糖含有液体供給源は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、水牛、ラクダ、ヤク、ウマ、ロバ、ラマまたはヒトの乳脂肪を含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物の乳に由来し、牛乳が好ましい供給源である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、哺乳動物の乳供給源は、本発明の方法で使用される前に少なくともタンパク質および脂肪を除去するために処理される。
【００９３】
例として、シアリルオリゴ糖含有供給源は、透過液を生成するチーズ製造またはカゼイン製造などの上流の乳加工から生成されてもよい。上流乳加工の例としては、チーズホエー、レンネット（スイート）ホエー、またはスキムミルクもしくは生乳の限外ろ過の生成が挙げられる。乳清タンパク質の限外ろ過の後、そのタンパク質は乳清リテンテート中に保持され、シアリルオリゴ糖、ラクトースおよびミネラルが限外ろ過膜を通過するので、そして乳清透過液は、シアリルオリゴ糖、ラクトースおよびミネラルを含有する。
【００９４】
シアリルオリゴ糖含有液体供給源（例えば、上流の乳製品加工からの透過液）は、次いで、１つ以上のろ過工程によって加工されてもよく、１つ以上の濃縮工程を含んでもよい。
【００９５】
いくつかの実施形態では、シアリルオリゴ糖含有液体供給源は、全乳、再混合、粉末または新鮮な脱脂乳のろ過から生じる透過液、再結合または再構成された全脂乳または脱脂乳粉末、脱脂乳濃縮物、脱脂乳リテンテート、濃縮乳、限外ろ過ミルクリテンテート、初乳、乳清（スイートホエー、乳酸ホエー、鉱酸ホエー、再構成ホエーパウダー、除タンパクホエーを含む）、任意の乳加工流れ由来の組成物、任意の乳加工流れの限外ろ過もしくは精密ろ過により得られる透過液由来の組成物、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせを含む。
【００９６】
一実施形態では、シアリルオリゴ糖含有液体供給源は、１つまたは複数のろ過工程および／または濃縮工程によって処理された上流の乳加工からの透過液を含む。一実施形態では、シアリルオリゴ糖含有液体供給源は、ラクトース結晶化の副生成物として生成された母液を含む。ラクトース結晶化に続いて、結晶化ラクトースは残りの溶液から分離される。残りの溶液、母液（ラクトース除去（ｄｅｌａｃｔｏｓｅｄ）透過液またはＤｅｌａｃとしても知られている）は、ラクトース、シアリルオリゴ糖およびミネラルを含む。
【００９７】
一実施形態において、シアリルオリゴ糖含有液体供給源は、１つ以上のシアリルオリゴ糖含有流れを含む。
【００９８】
様々な実施形態において、シアリルオリゴ糖含有液体供給源は、ラクトース結晶化の母液（ラクトース除去透過液）、乳製品透過液、乳清、乳清透過液、またはそれらの２つ以上の組み合わせを含む。
【００９９】
様々な実施形態において、シアリルオリゴ糖含有液体供給源は、少なくとも約０．２、０．５、１、２、４、６、８、１０または１２重量％のシアリルオリゴ糖を含み、適切な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約０．２〜約１２、約０．２〜約８、約０．２〜約６、約０．２〜約４、約０．５〜約１２、約０．５〜約１０、約０．５〜約６、約０．５〜約２、約１〜約１２、約１〜約１０、約１〜約４、約２〜約１２、約２〜約８、約２〜約６、約４〜約１２、約４〜約１０、約４〜約６、約６〜約１２、約６〜約１０または約８〜約１２重量％のシアリルオリゴ糖）。
【０１００】
様々な実施形態において、シアリルオリゴ糖含有液体供給源は、約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２または２．２５重量％未満のタンパク質および非タンパク質窒素を含み、適切な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約０．０１〜約２．２５、約０．０１〜約１．５、約０．０１〜約１．２５、約０．０１〜約０．５、約０．０１〜約０．３、約０．０１〜約０．２、約０．０５〜約２．２５、約０．０５〜約２、約０．０５〜約１．５、約０．０５〜約０．７５、約０．０５〜約０．４、約０．０５〜約０．２５、約０．１〜約２．２５、約０．１〜約１．７５、約０．１〜約１．２５、約０．１〜約０．７５、約０．１〜約０．５、約０．２〜約２．２５、約０．２〜約２、約０．２〜約０．７５、約０．２〜約０．５、約０．２５〜約２．２５、約０．２５〜約２、約０．２５〜約１．５、約０．２５〜約１．２５、約０．２５〜約１、約０．２５〜約０．７５、約０．３〜約２．２５、約０．３〜約２、約０．３〜約１．５、約０．３〜約１、約０．３〜約０．７５、約０．４〜約２．２５、約０．４〜約２、約０．４〜約１、約０．４〜約０．７５、約０．５〜約２．２５、約０．５〜約２、約０．５〜約１．７５、約０．５〜約１、約０．７５〜約２．２５、約０．７５〜約２、約０．７５〜約１．５、約１〜約２．２５、約１〜約１．７５、約１〜約１．５、約１．２５〜約２．２５、約１．２５〜約１．７５、約１．２５〜約１．５、約１．５〜約２．２５、約１．５〜約２、または約１．７５〜約２．２５重量％のタンパク質）。
【０１０１】
様々な実施形態において、シアリルオリゴ糖含有液体供給源は、約１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０または少なくとも約７５重量％未満の非シアリルオリゴ糖の糖を含み、および適切な範囲は、これらの値のいずれかの間から選択することができる（例えば、約１０〜約７５、約１０〜約７０、約１０〜約６５、約１０〜約６０、約２０〜約７５、約２０〜約７０、約２０〜約６５、約２０〜約６０、約３０〜約７５、約３０〜約７０、約３０〜約６５、約３０〜約６０、約４０〜約７５、約４０〜約７０、約４０〜約６５、または約４０〜約６０重量％の非シアリルオリゴ糖である）。
【０１０２】
様々な実施形態において、シアリルオリゴ糖含有液体供給源は、約６５：１、５０：１、４０：１、３０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１．５：１または１．５：１の比で、３’−シアリルラクトースと６’−シアリルラクトースとを含み、適切な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約６５：１〜約１．５：１、約６５：１〜約１．５：１、６５：１〜約３：１、約６５：１〜約７：１、約６５：１〜約９：１、約６５：１〜約１３：１、約６５：１〜約１５：１、６５：１〜約２０：１、約５０：１〜約１．５：１、約５０：１〜約１．５：１、約５０：１〜約３：１、約５０：１〜約７：１、約５０：１〜約９：１、約５０：１〜約１３：１、約５０：１〜約１５：１、約５０：１〜約２０：１、約４０：１〜約１．５：１、４０：１〜約１．５：１、約４０：１〜約３：１、４０：１〜約７：１、約４０：１〜約９：１、約４０：１〜約１３：１、約４０：１〜約１５：１、約４０：１〜約２０：１、約３０：１〜約１．５：１、約３０：１〜約１．５：１、約３０：１〜約３：１、約３０：１〜約７：１、約３０：１〜約９：１、約３０：１〜約１３：１、約３０：１〜約１５：１、約３０：１〜約２０：１、約２５：１〜約１．５：１、約２５：１〜約１．５：１、約２５：１〜約４：１、約２５：１〜約８：１、約２５：１〜約１０：１、約２５：１〜約１２：１、約２５：１〜約１４：１、約２５：１〜約２０：１、約２０：１〜約１．５：１、約２０：１〜約１．５：１、約２０：１〜約３：１、約２０：１〜約８：１、約２０：１〜約１１：１、２０：１〜約１５：１、１５：１〜約１．５：１、約１５：１〜約１．５：１、約１５：１〜約２：１、約１２：１〜約１．５：１、約１２：１〜約１．５：１、約１２：１〜約２：１、約１０：１〜約１．５：１、約１０：１〜約１．５：１、約１０：１〜約２：１、約８：１〜約１．５：１、約８：１〜約１．５：１、約１８：１〜約２：１、約７：１〜約１．５：１、約７：１〜約１．５：１、約７：１〜約２：１、約６：１〜約１．５：１、約６：１〜約１．５：１、約６：１〜約２：１、約５：１〜約１．５：１、約１５：１〜約１：１、約１２：１〜約１：１、約１０：１〜約１：１、約８：１〜約１：１、約７：１〜約１：１、約６：１〜約１：１、約５：１〜約１：１、約１５：１〜約２：１、約１２：１〜約２：１、約１０：１〜約２：１、約８：１〜約２：１、約７：１〜約２：１、約６：１〜約２：１、約５：１〜約２：１、約１５：１〜約３：１、約１２：１〜約３：１、約１０：１〜約３：１、約８：１〜約３：１、約７：１〜約３：１、約６：１〜約３：１、または約５：１〜約３：１。
【０１０３】
シアリルオリゴ糖含有液体供給源が母液である実施形態では、３’−シアリルラクトースと６’−シアリルラクトースの比は約１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１．５：１または１．５：１であり、適切な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約１５：１〜約１．５：１、約１２：１〜約１．５：１、約１０：１〜約１．５：１、約８：１〜約１．５：１、約７：１〜約１．５：１、約６：１〜約１．５：１、約５：１〜約１．５：１、約１５：１〜約１：１、約１２：１〜約１：１、約１０：１〜約１：１、約８：１〜約１：１、約７：１〜約１：１、約６：１〜約１：１、約５：１〜約１：１、約１５：１〜約２：１、約１２：１〜約２：１、約１０：１〜約２：１、約８：１〜約２：１、約７：１〜約２：１、約６：１〜約２：１、約５：１〜約２：１、約１５：１〜約３：１、約１２：１〜約３：１、約１０：１〜約３：１、約８：１〜約３：１、約７：１〜約３：１、約６：１〜約３：１、または約５：１〜約３：１）。
【０１０４】
２．不溶性ミネラルとタンパク質の除去
本方法の第１の工程は、シアリルオリゴ糖含有供給源から少なくとも不溶性のミネラルおよびタンパク質を除去する。いくつかの実施形態において、第１の工程はまた、シアリルオリゴ糖含有供給源から脂肪を除去する。
【０１０５】
一実施形態では、シアリルオリゴ糖含有液体供給源は、供給源中のミネラルを沈殿させるために少なくとも約６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４℃、または少なくとも約７５℃の温度に加熱される。この工程の間、温度は蒸気もしくは水、または蒸気と水の両方の注入により制御することができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、シアリルオリゴ糖含有液体供給源は、少なくとも約３０、６０または９０秒間、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９または１０分間加熱される。好ましくは、加熱工程は約５分間行われる。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、液体供給源の熱処理は、液体供給源中に存在するミネラルの約２、３、４、５、６、７、８、９または１０％を沈殿させ、そして適切な範囲は、これらのいずれかの値の間から選択され得る（例えば、約２〜約１０、約２〜約８、約２〜約６、約３〜約１０、約３〜約９、約３〜約８、約３〜約６、約４〜約１０、約４〜約８、約４〜約６％）。
【０１０８】
様々な実施形態において、シアリルオリゴ糖含有液体供給源は、供給源から不溶性ミネラルを除去するための脱塩工程に付される。
【０１０９】
一実施形態では、加熱によって生成した任意の沈殿ミネラルを含む不溶性ミネラルを遠心分離によって除去する。当業者には容易に明らかなように、不溶性ミネラルを除去するための他の適切な方法を使用することができる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、脱塩工程はまた、シアリルオリゴ糖含有液体供給源からタンパク質を除去する。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、脱塩液体供給源は、以下に記載される方法のうちのいずれかを使用して濃縮される。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、ろ過は、少なくともタンパク質を除去するために使用される。他の実施形態では、ろ過を用いて少なくとも不溶性ミネラルおよびタンパク質を除去する。
【０１１３】
セラミックろ過
様々な実施形態において、セラミックろ過を使用して、シアリルオリゴ糖含有液体供給源から不溶性ミネラルおよびタンパク質を除去する。セラミックろ過は、ろ過透過液中に含まれるラクトース、オリゴ糖および可溶性ミネラルから、ろ過リテンテート中に保持されるタンパク質および不溶性ミネラルを分離する。
【０１１４】
一実施形態では、シアリルオリゴ糖含有液体供給源は、セラミックろ過が約３５〜約９５℃の温度で行われる前に、上述のように加熱されて供給源中のミネラルを沈殿させる。
【０１１５】
一実施形態では、上記のようにシアリルオリゴ糖含有液体供給源を加熱して供給源中のミネラルを沈殿させ、続いて遠心分離し、次いで約５０〜約７０℃の温度で軽質相セラミックろ過を行う。
【０１１６】
例示的な一実施形態では、この方法はセラミック限外ろ過を含む。
【０１１７】
様々な実施形態において、この方法は、酸化アルミニウムまたは酸化ジルコニウムを含むセラミック膜を用いるセラミックろ過を含む。
【０１１８】
様々な実施形態において、セラミックろ過は、少なくとも約５００、６００、７００、７５０、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，２５０、１，３００、１，４００、１、５００、１，７５０、２，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、５０，０００、１００，０００、１５０，０００または２００，０００Ｄａの分子量カットオフを有する膜を用いて行われ、有用な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約５００〜約２００，０００、約５００〜１００，０００、約５００〜約３０，０００、約５００〜約１０，０００、約５００〜約５，０００、約５００〜約２，５００、約５００〜約２，０００、約５００〜約１，５００、約７５０〜約２００，０００、約７５０〜約１００，０００、７５０〜約３０，０００、７５０〜約１０，０００、約７５０〜約５，０００、約７５０〜約２，５００、約７５０〜約２，０００、約７５０〜約１，５００、約１，０００〜約２００，０００、約１，０００〜約１００，０００、約１，０００〜約３０，０００、約１，０００〜約１０，０００、約１，０００〜約５，０００、約１，０００〜約２，５００、約１，０００〜約２，０００、または約１，０００〜約１，５００Ｄａ）。
【０１１９】
様々な実施形態において、セラミックろ過は、少なくとも約０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２５、０．４、０．５、０．６、０．７５、０．８、１、１．２５、１．４、１．５、１．６、１．７５、１．８、２、２．５または３μｍの孔径を有する膜を用いて行われ、有用な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約０．００１〜約３、約０．００１〜約２．５、約０．００１〜約２、０．００１〜約１．７５、０．００１〜約１．５、約０．００５〜約３、約０．００５〜約２．５、約０．００５〜約２、０．００５〜約１．７５、０．００５〜約１．５、約０．０１〜約３、約０．０１〜約２．５、約０．０１〜約２、０．０１〜約１．７５、または約０．０１〜約１．５μｍ）。
【０１２０】
様々な実施形態において、セラミックろ過は少なくとも約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５℃の温度で行われ、有用な範囲はこれらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約３０〜約９５、約４０〜約９５、約５０〜約９５、約４０〜約９０、約５０〜約９０、約６０〜約９０、約６５〜約９０、約４０〜約８５、約５０〜約８５、約５５〜約８５、約６０〜約９０、約６５〜約９０、約４０〜約８０、約５０〜約８０、約５５〜約８０、約６０〜約８０、約６５〜約８０、約４０〜約７５、約５０〜約７５、約５５〜約７５、約６０〜約７５、または約６５〜約７５℃）。
【０１２１】
様々な実施形態において、セラミックろ過は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５バールの圧力で行われ、有用な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約１〜約１５、約２〜約１５、約３〜約１５、約１〜約１２、約３〜約１２、約１〜約１０、約３〜約１０、約１〜約８、約２〜約８、約３〜約８、約１〜約７、約２〜約７、約３〜約７、約１〜約６、約２〜約６、約３〜約６、約１〜約５、約２〜約５、または約３〜約５バール）。
【０１２２】
一実施形態では、方法は、ダイアフィルトレーションと組み合わせたセラミックろ過を含む。
【０１２３】
その他のろ過方法
様々な実施形態において、限外ろ過またはナノろ過が少なくともタンパク質を除去するために使用される。ろ過を使用して、ろ過透過液に含まれるラクトースおよび可溶性ミネラルなどの糖類から、ろ過リテンテートに保持されるタンパク質を分離することができる。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、限外ろ過またはナノろ過は、ダイアフィルトレーションと組み合わせて使用される。
【０１２５】
驚くべきことに、高温で実施される限外ろ過は、下流の処理工程において改善された収率、例えばナノろ過リテンテートおよび最終的なシアリルオリゴ糖含有抽出物中の改善されたシアリルオリゴ糖収率をもたらすことが見出された。ＵＦ温度を約１０℃から約５０℃に上昇させると、その過程でシアリルオリゴ糖の収率が約１００％上昇する。ＵＦ温度を約１０℃から約６５℃に上昇させると、シアリルオリゴ糖の収率が約１３０％上昇する。約６５℃を超えるＵＦ温度の上昇は、シアリルオリゴ糖の収量を増加させるが、６５℃まで上昇させた場合よりも少なく増加する。
【０１２６】
様々な実施形態において、限外ろ過は少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５または９０℃の温度で行われ、有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選択され得る（例えば、約２５〜約９０、約４０〜約９０、約５０〜約９０、約３０〜約８５、約４０〜約８５、約５０〜約８５、約５５〜約８５、約３０〜約８０、約４０〜約８０、約５０〜約８０、約５５〜約８０、約３０〜約７５、約４０〜約７５、約５０〜約７５、約５５〜約７５、約３０〜約７０、約４０〜約７０、約５０〜約７０、約５５〜約７０、約３０〜約６５、約６５〜約７５、約５０〜約６５、または約５５〜約６５℃）。
【０１２７】
限外ろ過に適した膜には、ポリエーテルスルホン膜が含まれる。当業者に明らかであるように、当技術分野において公知の他の限外ろ過膜もまた適切であり得る。
【０１２８】
様々な実施形態において、限外ろ過は、少なくとも約１，０００、１，５００、２，０００、３，０００、３，５００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１２，５００、１５，０００、１７，５００、２０，０００、２５，０００または３０，０００Ｄａの分子量カットオフを有する膜を用いて行われ、有用な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約１，０００〜約３０，０００、約３，０００〜約３０，０００、約５，０００〜約３０，０００、約１，０００〜約２５，０００、約２，０００〜約２５，０００、約３，０００〜約２５，０００、約５，０００〜約２５，０００、約１，０００〜約２０，０００、約２，０００〜約２０，０００、約３，０００〜約２０，０００、約５，０００〜約２０，０００、約１０，０００〜約２０，０００、約２，０００〜約１５，０００、約３，０００〜約１５，０００、約５，０００〜約１５，０００、約２，０００〜約１０，０００、約３，０００〜約１０，０００、または約５，０００〜約１０，０００Ｄａ）。
【０１２９】
様々な実施形態において、限外ろ過は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５バールの圧力で行われ、有用な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約１〜約１５、約２〜約１５、約３〜約１５、約４〜約１５、約５〜約１５、約１〜約１２、約２〜約１０、約３〜約１０、約４〜約１０、約５〜約１０、約１〜約８、約２〜約８、約３〜約８、約４〜約８、約５〜約８、約１〜約７、約２〜約７、約３〜約７、約４〜約７、約５〜約７、約１〜約６、約２〜約６、約３〜約６、約４〜約６、約５〜約６、約１〜約５、約２〜約５、約３〜約５または約４〜約５バール）。
【０１３０】
様々な実施形態において、ナノろ過は、少なくとも約０．１、０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９または１ｋＤａの分子量カットオフを有する膜を用いて行われ、有用な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約０．１〜約１、約０．１〜約０．８、約０．１〜約０．５、約０．１〜約０．４、約０．１〜約０．３、約０．１〜約０．２５、約０．１〜約０．２、約０．２〜約１、約０．２〜約０．６、約０．２〜約０．５、約０．２〜約０．３、約０．２〜約０．２５、約０．３〜約１、約０．３〜約０．８、約０．３〜約０．６、約０．３〜約０．５、約０．４〜約１、約０．４〜０．６、約０．５〜約１、約０．５〜約０．８、約０．６〜約１、約０．６〜約０．７、約０．７〜約１ｋＤａ）。
【０１３１】
様々な実施形態において、ナノろ過は少なくとも約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０または７５℃の温度で行われ、有用な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約１５〜約７５、約２０〜約７５、約２５〜約７５、約１５〜約７０、約２０〜約７０、約２５〜約７０、約１５〜約６５、約２０〜約６５、約２５〜約６５、約１５〜約６０、約２０〜約６０、約２５〜約６０、約１５〜約５５、約２０〜約５５、または約２５〜約５５℃）。
【０１３２】
ナノろ過に適した膜としては、ポリアミドイミド膜またはポリアミド薄膜複合膜が挙げられる。適切なポリアミドイミド膜としては、Ｓｙｎｄｅｒ（登録商標）ＮＦＳ、ＮＦＸおよびＮＦＷ膜を含むＳｙｎｄｅｒ（登録商標）ＮＦ膜が挙げられる。当業者に明らかであるように、当技術分野において公知の他のナノろ過膜もまた適切であり得る。
【０１３３】
様々な実施形態において、ナノろ過は、少なくとも約１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００または少なくとも約５００Ｄａのカットオフ分子量を有する膜を用いて行われ、有用な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約１０〜約５００、約５０〜約５００、約１００〜約５００、約１０〜約４００、約５０〜約４００、約１００〜約４００、約１０〜約３００、約５０〜約３００、約１００〜約３００、約１０〜約２５０、約５０〜約２５０、または約１００〜約２５０Ｄａ）。
【０１３４】
様々な実施形態において、ナノろ過は少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０または少なくとも約７５バールの圧力で行われ、有用な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約５〜約７５、約３０〜約７５、約３５〜約７５、約５〜約７０、約３０〜約７０、約３５〜約７０、約５〜約６５、約３０〜約６５、約３５〜約６５、約５〜約６０、約２５〜約６０、約３０〜約６０、約３５〜約６０、約４０〜約６０、約５〜約５５、約２５〜約５５、約３０〜約５５、約３５〜約５５、約４０〜約５５、約５〜約５０、約２５〜約５０、約３０〜約５０、約３５〜約５０、約４０〜約５０、約５〜約４５、約２５〜約４５、約３０〜約４５、約３５〜約４５、または約４０〜約４５バール）。
【０１３５】
３．二糖除去
シアリルオリゴ糖含有供給源物質中のシアリルオリゴ糖から二糖、特にラクトースを分離するために様々な方法を使用することができる。
【０１３６】
３．１酵素反応
いくつかの実施形態では、方法は、１種以上の単糖またはオリゴ糖を生成するために１種以上の二糖の分子サイズを増加または減少させるための酵素反応を含む。
【０１３７】
反応生成物をろ過に付して酵素反応により生成した単糖またはオリゴ糖を除去してもよい。ガラクトオリゴ糖などのオリゴ糖を測定する方法は、“ＡＯＡＣ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ２００１．０２  ｔｒａｎｓ−Ｇａｌａｃｔｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（ＴＧＯＳ），”ｉｎ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ，ＵＳＡ，２００５”によって示されている。この目的のために設計された任意の適切な方法もまた使用され得る。適切なろ過条件は上記で考察されている。ろ過条件、例えば、膜孔径または分子量カットオフ、温度および圧力は、除去される単糖類または多糖類がリテンテート中に保持され、そしてシアリルオリゴ糖が透過液中に含まれるように、またはその逆になるように選択される。シアリルオリゴ糖を測定する方法は、Ｆｏｎｇ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｍｉｌｋ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ−ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｏｏｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５９（１８），ｐｐ．９７８８−９７９５．に示されている。
【０１３８】
一実施形態では、酵素反応は、二糖の分子サイズを増大させて、一種以上の多糖を生成する。別の実施形態では、酵素反応は二糖の分子サイズを減少させて一種以上の単糖を生成する。
【０１３９】
一実施形態では、酵素はβ−ガラクトシダーゼである。β−ガラクトシダーゼは、ガラクトースと他の糖との間のβ−グリコシド結合の加水分解を触媒する。酵素反応の条件を操作して、単糖および／またはオリゴ糖を生成することができる。
【０１４０】
βガラクトシダーゼは、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐｐ．、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓｉｎｇｕｌａｒｉｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ、ｃｉｔｒｏｖｏｒｕｍまたはＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．から供給することができる。
【０１４１】
例えば、利用可能な過剰の二糖がある場合には、オリゴ糖を生成するためのグリコシル基転移が好ましい。グリコシル基転移を促進するために、酵素反応の前に濃縮工程を実施することが必要としてもよい。
【０１４２】
様々な実施形態では、少なくとも１種の二糖の分子サイズを大きくするための投入材料（第１の透過液または脱塩液体供給源）は、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％または少なくとも約７０％の二糖、特にラクトースを含む。適切な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間、例えば、約３０％〜約７０％または約４０％〜約６０％から選択されてもよい。
【０１４３】
利用可能な二糖が限られている場合には、単糖を生成するための加水分解が好ましい。様々な実施形態では、少なくとも１つの二糖の分子サイズを減少させるための酵素反応への投入材料（第１の透過液または脱塩液体供給源）は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０重量％の二糖、特にラクトースを含む。適切な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間、例えば、約５〜約４０または約２０〜約３０重量％から選択することができる。
【０１４４】
加水分解反応のために、我々はこの反応を３つのｐＨ値：６．１、６．３および６．５でおよび４０℃で乳透過液について行った。単一の酵素添加レートを使用した（３６７３５ＮＬＵ／ｋｇラクトース）。酵素はＤａｎｉｓｃｏからのＧＯＤＯ−ＹＬＮ２であった。反応はまた、ラクトース母液（ラクトース濃度４２％ｗ／ｗ）、ｐＨ４．２８、および２つの温度（５４および５８．５℃）でも行われた。使用した酵素は、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ（ＵＫ）からの１７ＭＤＰであった。我々が選択した条件は推奨されているものと類似していたが、プロセス条件は酵素に合うように修正した。テストしたさまざまなパラメータ間で、結果に著しい変動は見られなかった。
【０１４５】
例示的な一実施形態では、β−ガラクトシダーゼはラクトースからのガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の産生を触媒する。反応生成物は、ＧＯＳを除去するためにナノろ過に付してもよい。一実施形態において、ナノろ過は、ＧＯＳおよびタンパク質を除去するために使用される。
【０１４６】
他の例示的な実施形態では、β−ガラクトシダーゼはラクトースからのガラクトースおよびグルコースの生成を触媒する。反応生成物は、ガラクトースおよびグルコースを除去するためにナノろ過に付することができる。一実施形態において、ナノろ過は、ガラクトース、グルコースおよび可溶性ミネラルを除去する。
【０１４７】
様々な実施形態において、２つ以上の酵素反応工程が行われる。
【０１４８】
例えば、一実施形態において、第１の酵素反応工程は、一種以上の単糖を生成するために行われる。第２の酵素工程は、一種以上のオリゴ糖を生成するために行われる。
【０１４９】
一実施形態では、第１の酵素反応工程はセラミックろ過後に行われる。別の実施形態では、第１の酵素反応工程は、脱塩後、限外ろ過の前に行われる。
【０１５０】
一実施形態では、第２の酵素反応工程は、ナノろ過後かつ濃縮前に行われる。
【０１５１】
４．濃縮
様々な実施形態では、この方法は、シアリルオリゴ糖を濃縮するための１つ以上の工程を含む。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、濃縮は水を除去することによる。これを達成するために、ナノろ過、逆浸透または蒸発などの任意の濃縮プロセスを使用することができる。逆浸透と蒸発の両方を使用することができる。
【０１５３】
濃縮を目的とした蒸発は、任意の適切な蒸発プロセスによって実施することができる。流下膜式蒸発器、上昇式膜式蒸発器、プレート式蒸発器、または多重効用式蒸発器などの蒸発器を使用することができる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、ナノろ過は逆浸透と組み合わせて使用される。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、例えば、オリゴ糖を生成するための酵素反応の前に、ナノろ過、逆浸透および蒸発が使用される。
【０１５６】
５．脱色
一実施形態では、変色および／または望ましくない臭いを引き起こす不純物を除去するために反応生成物を脱色に付する。脱色は、可視光波長範囲にわたって分光光度計で吸光度の変化を測定することによって決定することができる。
【０１５７】
一実施形態では、脱色は液体流れを活性炭に曝すことによって行われる。次のろ過工程は、流れから活性炭を除去するために行われる。脱色はバッチまたは連続プロセスとして実施することができる。
【０１５８】
様々な実施形態において、脱色は少なくとも約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または少なくとも約９５℃の温度で行われ、有用な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約２５〜約９５、約４０〜約９５、約５０〜約９５、または約５５〜約９５℃）。
【０１５９】
６．結晶化および乾燥
様々な実施形態において、少なくとも１つの濃縮工程がシアリルオリゴ糖含有抽出物を生成するために行われる。
【０１６０】
シアリルオリゴ糖含有抽出物は、当技術分野において公知の適切な方法を使用して乾燥させることができる。一実施形態では、抽出物は乾燥前に結晶化に付される。
【０１６１】
７．シアリルオリゴ糖含有組成物および抽出物
本発明の抽出物および組成物は、シアリルオリゴ糖および中性オリゴ糖に富み、ラクトース、タンパク質およびミネラルなどの不純物が少ない。
【０１６２】
シアリルオリゴ糖は、少なくとも１つのシアル酸部分を含むオリゴ糖である。シアル酸は、ノイラミン酸のＮ−またはＯ−置換誘導体である。哺乳類の乳は、遊離のシアリルオリゴ糖と、糖タンパク質および／または糖脂質に結合したシアリルオリゴ糖の両方を含む。
【０１６３】
様々な実施形態において、組成物は遊離シアル酸を含有する。
【０１６４】
様々な実施形態において、組成物または抽出物は、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、ジシアリルラクトース、シアリルラクトサミン、またはそれらのうちの任意の２つ以上の組み合わせを含む。例示的な実施形態では、組成物または抽出物は、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、ジシアリルラクトースおよびシアリルラクトサミンを含む。
【０１６５】
様々な実施形態において、抽出物または組成物は、全固形分に対するパーセンテージとして、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０、２５、３０、３５または４０重量％のシアリルオリゴ糖を含む。適切な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約１〜約４０、約５〜約４０、約７〜約４０、約１０〜約４０、約１〜３５、約５〜約３５、約７〜約３５、約１０〜約３５、約１〜約３０、約５〜約３０、約７〜約３０、約１０〜約３０、約１〜約２５、約５〜約２５、約７〜約２５、約１０〜約２５、約１〜約２０、５〜約２０、約７〜約２０、約１０〜約２０、約１〜約１５、約５〜約１５、約７〜約１５または約１０〜約１５重量％のシアリルオリゴ糖）。
【０１６６】
様々な実施形態では、組成物または抽出物は、全固形分の百分率として少なくとも約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０、２５、３０、３５または４０重量％の３’−シアリルラクトースを含み、適切な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約１〜約４０、約５〜約４０、約７〜約４０、約１０〜約４０、約１〜３５、約５〜約３５、約７〜約３５、約１０〜約３５、約１〜約３０、約５〜約３０、約７〜約３０、約１０〜約３０、約１〜約２５、約５〜約２５、約７〜約２５、約１０〜約２５、約１〜約２０、５〜約２０、約７〜約２０、約１０〜約２０、約１〜約１５、約５〜約１５、約７〜約１５または約１０〜約１５重量％の３’−シアリルラクトース）。
【０１６７】
様々な実施形態において、組成物または抽出物は、全固形分の百分率として少なくとも約０．１、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７または２０重量％の６’−シアリルラクトースを含み、適切な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約０．１〜約２０、約０．１〜約１５、約０．１〜約１２、約０．１〜約１０、約０．１〜約８、約０．５〜約２０、約０．５〜約１５、約０．５〜約１２、約０．５〜約１０、約０．５〜約８、約１〜約２０、約１〜約１５、約１〜約１２、約１〜約１０、約１〜約８、約１．５〜約２０、約１．５〜約１５、約１．５〜約１２、約１．５〜約１０、約１．５〜約８、約２〜約２０、約２〜約１５、約２〜約１２、約２〜約１０、約２〜約８、約２．５〜約２０、約２．５〜約１５、約２．５〜約１２、約２．５〜約１０、約２．５〜約８、約３〜約２０、約３〜約１５、約３〜約１２、約３〜約１０、または約３〜約８重量％の６’−シアリルラクトース）。
【０１６８】
様々な実施形態において、抽出物または組成物は、全固形分の百分率として少なくとも約０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０４、０．０５、０．０７５、０．１、０．２、０．２５、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、２重量％のジシアリルラクトースを含み、適切な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約０．００１〜約２、約０．００１〜約１、約０．００５〜約１．５、約０．００５〜約１、約０．０１〜約２、約０．０１〜約１．５、約０．０１〜約１．２５、約０．０１〜約１、約０．０１〜約０．７５、０．０２〜約２、約０．０２〜約１．５、約０．０２〜約１．２５、約０．０２〜約１、約０．０２〜約０．７５、約０．０３〜約２、約０．０３〜約１．５、約０．０３〜約１．２５、約０．０３〜約１、約０．０３〜約０．７５、約０．０５〜約２、約０．０５〜約１．５、約０．０５〜約１．２５、約０．０５〜約１または少なくとも約０．０５〜約０．７５重量％のジシアリルラクトース）。
【０１６９】
様々な実施形態において、抽出物または組成物は、全固形分の百分率として、少なくとも約０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０２５、０．０３、０．０４、０．０５、０．０７５、０．１、０．２、０．２５、０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、１．７５、または少なくとも約２重量％のシアリルラクトサミンを含み、適切な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約０．００１〜約２、約０．００１〜約１、約０．００５〜約１．５、約０．００５〜約１、約０．０１〜約２、約０．０１〜約１．５、約０．０１〜約１．２５、約０．０１〜約１、約０．０１〜約０．７５、約０．０２〜約２、約０．０２〜約１．５、約０．０２〜約１．２５、約０．０２〜約１、約０．０２〜約０．７５、約０．０３〜約２、約０．０３〜約１．５、約０．０３〜約１．２５、約０．０３〜約１、約０．０３〜約０．７５、約０．０５〜約２、約０．０５〜約１．５、約０．０５〜約１．２５、約０．０５〜約１、または少なくとも約０．０５〜約０．７５重量％のシアリルラクトサミン）。
【０１７０】
様々な実施形態において、抽出物または組成物は、乾燥固形分ベースで、６’−シアリルラクトースの量に対してより多い量の３’−シアリルラクトースを含む。
【０１７１】
様々な実施形態において、抽出物または組成物は、約１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１または１：２の比率で３’−シアリルラクトースおよび６’−シアリルラクトースを含み、適切な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約１０：１〜約１：１、約８：１〜約１：１、約７：１〜約１：１、約６：１〜約１：１、約５：１〜約１：１、約１５：１〜約２：１、約１２：１〜約２：１、約１０：１〜約２：１、約８：１〜約２：１、約７：１〜約２：１、約６：１〜約２：１、約５：１〜約２：１、約１５：１〜約３：１、約１２：１〜約３：１、約１０：１〜約３：１、約８：１〜約３：１、約７：１〜約３：１、約６：１〜約３：１、または約５：１〜約３：１。
【０１７２】
様々な実施形態において、組成物または抽出物は、乳脂肪球皮膜（ＭＦＧＭ）、シアル酸含有タンパク質およびガングリオシドを含む他のシアル酸含有化合物をさらに含む。
【０１７３】
本明細書で使用される「シアル酸含有化合物」という用語は、結合シアル酸を含有する脂質、およびタンパク質などの化合物を含む。本明細書に記載の組成物または抽出物中に存在するシアル酸含有化合物の例には、タンパク質およびガングリオシドが含まれる。乳脂肪球皮膜は、本明細書に記載の組成物および抽出物中に存在する化合物含有シアル酸供給源の一例である。
【０１７４】
様々な実施形態において、組成物または抽出物は、全固形分の割合として、少なくとも約０．５％の他のシアル酸含有化合物を含む。
【０１７５】
組成物および抽出物はさらに中性オリゴ糖を含む。いくつかの実施形態では、組成物または抽出物は追加の中性オリゴ糖を含む。
【０１７６】
中性オリゴ糖は電荷を持たないオリゴ糖である。本発明の組成物中に存在する中性オリゴ糖はガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、Ｎ−アセチルラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミニルグルコース、Ｎ−アセチルガラクトサミニルラクトース、イソグロボトリオース、３’−ガラクトシルラクトース、４’−ガラクトシルラクトース、６’−ガラクトシルラクトース、ノボ−ラクト−Ｎ−ペンタオース−Ｉ、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、およびラクト−Ｎ−ネオヘキサオースが含まれる。フラクトオリゴ糖は、Ｃｕａｎｙ，Ｄｅｎｉｓ，Ｔｈｉｅｒｒｙ  Ｂｅｎｅｔ，ａｎｄ  Ｓｅａｎ  Ａｕｓｔｉｎ．２０１０  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ９３（１０）ｐ２０２−２１２．に記載されているような方法によって検出することができる。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、組成物は追加の中性オリゴ糖を含有する。
【０１７８】
様々な実施形態において、抽出物または組成物は少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．２５、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０、２５または３０重量％の中性オリゴ糖を含み、適切な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約０．０１〜約３０、約０．０１〜約２０、約０．０１〜約１５、約０．０１〜約１０、約０．０１〜約６、０．０１〜約２、約０．０１〜約０．５、約０．０５〜約３０、約０．０５〜約２５、約０．０５〜約２０、約０．０５〜約１５、約０．０５〜約１０、約０．１〜約３０、約０．１〜約２５、約０．１〜約２０、約０．１〜約１５、約０．１〜約１０、約０．２〜約３０、約０．２〜約２５、約０．２〜約２０、約０．２〜約１５、約０．２〜約１０、約０．２５〜約３０、約０．２５〜約２５、約０．２５〜約２０、約０．２５〜約１５、約０．２５〜約１０、約０．５〜約３０、約０．５〜約２５、約０．５〜約２０、約０．５〜約１５、約０．５〜約１０、約１〜約３０、約１〜約２５、約１〜約２０、約１〜約１５、約１〜約１０、約２〜約３０、約２〜約２５、約２〜約２０、約２〜約１５、約２〜約１０、約５〜約３０、約５〜約２５、約５〜約２０、約５〜約１５、約１０〜約３０、約１０〜約２５、または約１０〜約２０重量％の中性オリゴ糖）。
【０１７９】
様々な実施形態において、抽出物または組成物は、約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１重量％未満のタンパク質および非タンパク質窒素を含み、適切な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約１〜約２０、約１〜約１５、約１〜約１０、約１〜約８、約１〜約６、約１〜約５、約２〜約２０、約２〜約１６、約２〜約１１、約２〜約９、約２〜約８、約２〜約７、約３〜約２０、約３〜約１５、約３〜約１３、約３〜約９、約３〜約８、約３〜約６、約４〜約２０、約４〜約１５、約４〜約１０、約４〜約９、約４〜約８、約４〜約７、約５〜約２、０５〜約１６、約５〜約１０、約５〜約８、約５〜約７、約６〜約２０、約６〜約１７、約６〜約１１、約６〜約１０、約６〜約９、約７〜約２０、約７〜約１５、約７〜約１０、約８〜約２０、約８〜約１７、約８〜約１２、約９〜約２０、約９〜約１５、約１０〜約２０、約１０〜約１６、約１１〜約２０  １１〜約１６、約１２〜約２０、約１２〜約１７、約１３〜約２０、約１３〜約１６、約１４〜約２０、約１４〜約１８または約１５〜約２０重量％のタンパク質および非タンパク質窒素）。
【０１８０】
本明細書中で使用されるとき、用語「非シアリルオリゴ糖」は、シアリルオリゴ糖を除く組成物中の全ての糖をいう。非シアリルオリゴ糖には、二糖（特にラクトース）、単糖（グルコースおよびガラクトースを含む）および他のオリゴ糖（中性オリゴ糖および酸性オリゴ糖を含む）が含まれる。
【０１８１】
様々な実施形態では、抽出物または組成物は、約８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５重量％、または３０重量％未満の非シアリルオリゴ糖の糖を含み、適切な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約３０〜約８５、約３０〜約８０、約３０〜約７５、約４０〜約８５、約４０〜約８０、約４０〜約７５、約５０〜約８５、約５０〜約８０、約５０〜約７５、約５０〜約７０、約５５〜約８５、約５５〜約８０、約５５〜約７５、約５５〜約７０、約６０〜約８５、約６０〜約８０、約６０〜約７５、約６０〜約７０、約６５〜約８５、約６５〜約８０、約６５〜約７５、約６５〜約７０、約７０〜約８５、約７０〜約８０、または約７０〜約７５重量％の非シアリルオリゴ糖の糖）。
【０１８２】
様々な実施形態では、抽出物または組成物は、約１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または約１重量％未満の灰分を含み、適切な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約０〜約１５、約０〜約１２、約０〜約１０、約０〜約７、約０〜約５、１〜約１５、約１〜約１２、約１〜約１０、約１〜約７、約１〜約５、約２〜約１５、約２〜約１２、約２〜約１０、約２〜約７、約３〜約１５、約３〜約１２、約３〜約１０、約３〜約７、約４〜約１５、約４〜約１２、約４〜約１０、約４〜約７、約５〜約１５、約５〜約１２、または約５〜約１０重量％の灰分）。
【０１８３】
８．栄養製剤
本発明の抽出物および組成物は、母体用調整乳、乳児用調整乳、後続調整乳、成長期調整乳、小児用調整乳、人乳強化剤、子供用飲食物、母体サプリメント、母体栄養製剤、発酵食品、ＵＨＴミルク、ＵＨＴドリンクヨーグルト、酸性乳飲料、ＵＨＴ粉末、医療用食品、スポーツ栄養製剤、または高齢者または老齢者向け製剤を含む栄養製剤に使用するのに適している。
【０１８４】
本明細書で使用される「母体用調整乳」という用語は、妊娠中の女性が妊娠中に服用するための組成物を意味する。本明細書で使用される「乳児用調整乳」という用語は、０日〜６ヶ月の間の年齢の乳児用の組成物を意味する。本明細書で使用される「後続調整乳」という用語は、６ヶ月〜１歳までの乳児用の組成物を意味する。本明細書で使用される「成長期調整乳」という用語は、１歳以上の幼児および子供用の組成物を意味する。成長期調整乳には、成長期調整乳粉末またはＧＵＭＰが含まれる。本明細書で使用される「小児用調整乳」という用語は、生まれてから年を重ねた子供用の組成物を意味する。
【０１８５】
当業者には理解されるように、種々の組成物「乳児用調整乳」、「後続調整乳」、「成長期調整乳」および「小児用調整乳」についての年齢範囲は個体の発達に応じて子供ごとに異なり得る。これらの製品は、濃縮物またはすぐに飲める液体として液体の形態であり得るか、または粉末濃縮物として提供され得る。
【０１８６】
様々な実施形態において、栄養製剤は、少なくとも約０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４または５％のシアリルオリゴ糖含有抽出物または組成物を含み、適切な範囲は、これらの値のうちのいずれかの間から選択され得る（例えば、約０．００５〜約５、約０．００５〜約３、約０．００５〜約１、約０．００５〜約０．５、約０．００５〜約０．０５、約０．０１〜約５、約０．０１〜約３、約０．０１〜約１、約０．０１〜約０．５、０．０１〜約０．１、約０．０５〜約５、約０．０５〜約４、約０．０５〜約１、約０．０５〜約０．１、約０．１〜約５、約０．１〜約４、約０．１〜約１、約０．１〜約０．５、約０．５〜約５、約０．５〜約３、約０．５〜約１、約１〜約５、約１〜約４、約１〜約３、約２〜約５、約２〜約４、約３〜約５％のシアリルオリゴ糖についての含有抽出物または組成物を含む）。
【０１８７】
様々な実施形態において、栄養製剤は、重量／容量に基づいて少なくとも約０．００５％の総シアリルオリゴ糖を含む。
【０１８８】
８．１乳児と子供のための製剤
様々な実施形態において、乳児用調整乳は、重量／重量固形分を基準にして少なくとも約０．１７％の総シアリルオリゴ糖を含む。
【０１８９】
様々な実施形態において、後続調整乳は、重量／重量固形分基準で少なくとも約０．１９％の総シアリルオリゴ糖を含む。
【０１９０】
様々な実施形態において、成長期調整乳は、重量／重量固形分を基準にして少なくとも約０．１９％の総シアリルオリゴ糖を含む。
【０１９１】
様々な実施形態では、母体用調整乳は、重量／重量固形分を基準にして少なくとも約０．１５％の総シアリルオリゴ糖を含む。
【０１９２】
本明細書で使用するとき、乳児用調整乳は、０〜６ヶ月齢の乳児のための栄養調整乳、６ヶ月〜１歳の乳児のための後続調整乳、１２ヶ月歳以降の乳児のための成長期調整乳を指す。母体用調整乳は、妊娠しようとしている、妊娠している、または授乳中の女性用である。
【０１９３】
本明細書に記載のシアリルオリゴ糖抽出物および組成物を含む栄養製剤は、当技術分野において公知の製剤に組み込まれてもよい。適切な製剤および成分は当業者に明らかであろう。
【０１９４】
一実施形態では、抽出物または組成物は、例えば、３’−シアリルラクトースと比較して、よりヒト化された乳ベースの栄養を送達する。「よりヒト化されている」とは、例えば３’−シアリルラクトースに関して、抽出物または組成物が、未改変形態または未加工形態の供給源物質よりも、組成的または機能的にヒトの母乳に近いことを意味する。
【０１９５】
抽出物または組成物の増加させたヒト化の一例は、３’−シアリルラクトースと６’−シアリルラクトースの比率による分娩後の３〜４ヶ月よりも上の乳児に関連する。
【０１９６】
本出願人は、乳児および子供用のシアリルオリゴ糖の補体および濃度は異なる年齢および発達段階で変化することを測定した。特に、３’−シアリルラクトースと６’−シアリルラクトースの比率は、乳児または子供の発達に伴って変化する。
【０１９７】
一実施形態では、３’−シアリルラクトースと６’−シアリルラクトースの最適な比率は、特定の年齢層または発達段階の乳児または子供向けに特別に調整された組成物で投与することができる。
【０１９８】
一実施形態では、組成物は、４〜６ヶ月齢以上の乳児６’−シアリルラクトースよりも多量の３’−シアリルラクトースを提供する。
【０１９９】
他の実施形態では、組成物は、３’−シアリルラクトースおよび６’−シアリルラクトースを約１０：１〜約１．５：１の比で含む３ヶ月未満の乳児への栄養を提供する。一実施形態では、組成物は乳児用調製乳である。
【０２００】
様々な実施形態において、組成物は、３’−シアリルラクトースおよび６’−シアリルラクトースを約１０：１〜約１．５：１の比で含む、６ヶ月未満の乳児に栄養を提供するための組成物である。一実施形態では、組成物は乳児用調製乳である。
【０２０１】
様々な実施形態において、組成物は、３’−シアリルラクトースと６’−シアリルラクトースとを約１０：１〜約１．５：１の比率で含む、約６ヶ月〜約１２ヶ月の乳児に栄養を提供するための組成物である。一実施形態では、組成物は後続調整乳である。
【０２０２】
種々の実施形態では、組成物は、３’−シアリルラクトースおよび６’−シアリルラクトースを約１０：１〜約１：２の比で含む、１２ヶ月齢以上の乳児に栄養を提供するための組成物である。種々の実施形態では、組成物は、成長期調整乳または小児用調整乳である。
【０２０３】
小児用調整乳は、例えば下記に示される。
【表１】
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【０２０４】
９．脳の機能または発達の維持または増強
本明細書に記載の栄養製剤、シアリルオリゴ糖含有抽出物または組成物を投与して、正常な対象における脳機能または発達を維持または増強することができる。
【０２０５】
製剤または組成物の投与から利益を得ることができる対象には、新生児、乳児、幼児、子供、妊婦、授乳中の母親、成人、競技者、他のスポーツ選手または高齢者が含まれる。
【０２０６】
本明細書中で使用される場合、用語「正常な対象」とは、損なわれた脳機能または発達に関連する疾患または状態に罹患していない対象をいう。
【０２０７】
「有効量」は、治療的、予防的効果を与えるのに必要な量である。動物とヒトに対する投与量の相互関係（体表面積の平方メートル当たりのミリグラムに基づく）はＦｒｅｉｒｅｉｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９６６）．によって記載されている。体表面積は、対象の身長および体重からおおよそ決定することができる。例えば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅｓ，Ｇｅｉｇｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａｒｄｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７０，５３７を参照されたい。当業者に認識されているように、投与経路、担体の使用法などに応じて有効用量も変わる。
【０２０８】
本明細書中で使用される場合、用語「脳の機能または発達を維持すること（ｔｏ  ｍａｉｎｔａｉｎ）」または「脳の機能または発達を維持する（ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ）」は互換的に使用され、一般に脳機能の低下の予防または維持、正常な脳発達の維持または脳発達の遅延の予防を指す。これらの用語には、脳発達の遅延予防、神経細胞の生存能力または機能の維持、認知発達の維持、認知発達の遅延の防止、認知能力の維持、認知機能の低下の予防、学習能力、記憶力または注意持続時間の低下の維持または防止、ストレスに対処する対象の能力の維持、脳内のガングリオシドのレベルの維持、脳内のタンパク質結合シアル酸、例えば神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）のレベルの維持、脳への血液、栄養素または酸素の流れの維持、シナプス形成の維持、腸／脳軸の活動の維持、または神経新生の維持が含まれる。
【０２０９】
本明細書で使用されるとき、用語「脳の健康または発達を増強すること」または「脳の健康および発達を増強する」は、本明細書で互換的に使用され、一般に脳機能の増進または改善および脳発達の進行を指す。これらの用語には、認知発達または能力の増強、学習、記憶力または注意持続時間の増強、ストレスに対処する対象の能力の増強、脳内のガングリオシドのレベルの増強、脳内のタンパク質結合シアル酸、例えば神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）のレベルの増強、脳への血液、栄養素または酸素の流れの増強、シナプス形成の増強、腸／脳軸の活動の増強または神経新生の増強が含まれる。
【０２１０】
最適な認知発達は、乳児および幼児の発達の重要な部分である。したがって、認知発達を増強することを示すいずれかの薬剤は、乳児や子供に大きな利益をもたらす。
【０２１１】
認知発達を評価するための多種多様な方法が当業者に周知である。評価されるべき認識の性質、対象の特徴または同一性（例えば、これらに限定されないが種、年齢、健康状態、幸福など）、または適用可能であり得る他の要因に応じて、特定の方法が好ましいことがあることは明らかであろう。例えば、非ヒト対象における認知発達の評価に有用な方法論は、実施例１に記載されるように、モリス水迷路試験および新規物体認識課題試験を含む。ヒト対象における認知発達の評価に有用な方法論の例には、表１に要約されたツールが含まれる。
【表２】
2019523278.tif 000004
【０２１２】
一実施形態において、個体への本発明の組成物の投与は、その個体において、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０％の脳内のグリセロホスホリルコリン（ＧＰＣ）の増加をもたらし、適切な範囲はこれらの値のうちのいずれかの間から選択され得る。
【０２１３】
一実施形態では、個体への本発明の組成物の投与は、その個体において少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０％の脳内グルタミン（Ｇｌｕ）の増加をもたらし、適切な範囲はこれらの値のうちのいずれかの間から選択され得る。
【０２１４】
一実施形態では、個体への本発明の組成物の投与は、その個体において少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０％の脳内ミオイノシトール（Ｉｎｓ）の増加をもたらし、適切な範囲はこれらの値のうちのいずれかの間から選択され得る。
【０２１５】
一実施形態では、個体への本発明の組成物の投与は、その個体において少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０％の脳内Ｌｉｐ０９の減少をもたらし、適切な範囲はこれらの値のうちのいずれかの間から選択され得る。
【０２１６】
一実施形態では、個体への本発明の組成物の投与は、その個体において、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０％の脳内巨大分子（ＭＭ）の減少をもたらし、適切な範囲はこれらの値のうちのいずれかの間から選択され得る。
【０２１７】
一実施形態では、本発明の組成物を個体に投与すると、その個体において、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０％の脳内Ｎ−アセチルアスパルチルグルタミン酸（ＮＡＡＧ）の増加をもたらし、適切な範囲はこれらの値のうちのいずれかの間から選択され得る。
【０２１８】
一実施形態では、個体への本発明の組成物の投与は、その個体において、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０または５０％の脳内グルタミン酸−グルタミン複合体（Ｇｌｘ）の増加をもたらし、適切な範囲はこれらの値のうちのいずれかの間から選択され得る。
【０２１９】
１０．認知症
一実施形態では、本発明の抽出物または組成物は、症状として認知機能低下を含む疾患を治療または改善するために使用することができる。例えば、抽出物または組成物の使用は、認知低下の速度を低下させる、患者の認知を維持する、またはその患者の認知能力を向上させることができる。病気の兆候として現れる、認知機能低下を含む病気の例には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病または認知症が含まれる。
【０２２０】
したがって、一実施形態では、本発明は、生成されたシアリルオリゴ糖含有抽出物の有効量を投与することを含む、任意の１つ以上のまたは加齢関連認知機能低下、認知症、アルツハイマー病、血管疾患、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）、レビー小体型認知症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、統合失調症に伴う認知障害、化学療法誘発性神経障害、ダウン症候群、コルサコフ病、脳性麻痺、てんかん、神経性虚血、神経性再灌流障害、神経性外傷、神経性出血、神経性感染症、脳卒中、有毒物質への神経細胞の曝露、加齢性精神障害、不安障害、加齢性うつ病、微小血管障害に関連する認知症（糖尿病、低血圧、脳卒中誘発性血管性認知症、肥満など）、免疫系障害に関連する認知症、中枢神経系（ＣＮＳ）障害に関連する認知症、低血圧に関連する認知症、肥満に関連する認知症、または血管性認知症、乳児期発症重度発育遅延（Ｎ−アセチルノイラミン酸をコードする遺伝子の突然変異関連性の）および縁取り空胞を伴う遠位型ミオパチー（ＤＭＲＶ）、に関連する認知低下の治療または予防における記載された抽出物または組成物の使用に関する。
【実施例】
【０２２１】
実施例１
シアリルオリゴ糖含有抽出物は、４つの異なる方法を用いて生成される。シアリルオリゴ糖、タンパク質、非タンパク質窒素、ラクトースおよび灰分の含有量が決定される。
【０２２２】
１．方法Ａ
ラクトース結晶化からの母液を含むシアリルオリゴ糖含有材料を提供する。
【０２２３】
供給源物質を、６７℃より高い温度で少なくとも２分間加熱して母液中のミネラルを沈殿させる。不溶性ミネラルといくらかのタンパク質を遠心分離によって除去する。
【０２２４】
脱塩された供給源物質を、β−ガラクトシダーゼとの酵素反応工程に付してラクトースをガラクトースおよびグルコースに分解する。
【０２２５】
限外ろ過を、３〜２０ｋＤａの孔径を有する膜を用いて、５０℃〜７０℃、２〜１０バールで行い、タンパク質を除去する。
【０２２６】
糖類、可溶性ミネラルおよびシアリルオリゴ糖を含む限外ろ過透過液を、１００〜２５０Ｄａの孔径を有する膜を用いて２５〜５５℃、３０〜５０バールで行われるナノろ過／ダイアフィルトレーションに付してガラクトース、グルコースおよび可溶性ミネラルを除去する。
【０２２７】
シアリルオリゴ糖に富むナノろ過リテンテートを蒸発に付して濃縮リテンテートを生成する。任意には、蒸発の前に逆浸透および／またはナノろ過を行う。
【０２２８】
任意には、β−ガラクトシダーゼを使用して第２の酵素反応を行い、グルコースおよびガラクトースを生成するか、またはＧＯＳを生成する。
【０２２９】
濃縮リテンテートまたは酵素生成物を脱色および任意にはろ過に付して、シアリルオリゴ糖に富む液体抽出物を生成する。
【０２３０】
液体抽出物を任意に乾燥して、乾燥抽出物を生成する。任意には、液体抽出物を乾燥前に結晶化する。
【０２３１】
２．方法Ｂ
ラクトース結晶化からの母液を含むシアリルオリゴ糖含有材料を提供する。
【０２３２】
供給源物質を、６７℃より高い温度で少なくとも２分間加熱して母液中のミネラルを沈殿させる不溶性ミネラルといくらかのタンパク質を遠心分離によって除去する。
【０２３３】
脱塩された供給源物質を、３〜２０ｋＤａの孔径を有する膜を用いて５０〜７０℃、２〜１０バールで行われる限外ろ過に付してタンパク質を除去する。
【０２３４】
糖、可溶性ミネラルおよびシアリルオリゴ糖を含む限外ろ過透過液を、１００〜２５０Ｄａの孔径を有する膜を用いて２５℃〜５５℃、３０〜５０バールで行われるナノろ過／ダイアフィルトレーションに付して小さい糖および可溶性ミネラルを除去する。
【０２３５】
シアリルオリゴ糖に富むナノろ過リテンテートを蒸発に付して濃縮リテンテートを生成する。任意には、蒸発の前に逆浸透および／またはナノろ過を行う。
【０２３６】
酵素反応はβ−ガラクトシダーゼを用いて行われ、グルコースおよびガラクトースを生成するか、またはＧＯＳを生成する。
【０２３７】
酵素生成物を脱色およびろ過に付して、シアリルオリゴ糖に富む液体抽出物を生成する。
【０２３８】
液体抽出物を任意に乾燥して、乾燥抽出物を生成する。任意には、液体抽出物を乾燥前に結晶化する。
【０２３９】
３．方法Ｃ
ラクトース結晶化からの母液を含むシアリルオリゴ糖含有材料を提供する。
【０２４０】
供給源物質を、６７℃より高い温度で少なくとも２分間加熱して母液中のミネラルを沈殿させる。
【０２４１】
２μｍに対し３００Ｄａの孔径／ＭＷＣＯを有する膜を使用して、５０℃〜９０℃、１〜６バールで供給源物質をセラミックろ過に付して不溶性ミネラルおよびタンパク質を除去する。
【０２４２】
脱塩され脱タンパク質された物質を、β−ガラクトシダーゼとの酵素反応工程に付してラクトースをガラクトースおよびグルコースに分解する。
【０２４３】
１００〜２５０Ｄａの孔径を有する膜を使用して、２５〜５５℃、３０〜５０バールで、物質をナノろ過／ダイアフィルトレーションに付してガラクトース、グルコースおよび可溶性ミネラルを除去する。
【０２４４】
シアリルオリゴ糖に富むナノろ過リテンテートを蒸発に付して濃縮リテンテートを生成する。任意には、蒸発の前に逆浸透および／またはナノろ過を行う。
【０２４５】
任意には、β−ガラクトシダーゼを使用して第２の酵素反応を行い、グルコースおよびガラクトースを生成するか、またはＧＯＳを生成する。
【０２４６】
濃縮リテンテートまたは酵素生成物を脱色および任意にはろ過に付して、シアリルオリゴ糖に富む液体抽出物を生成する。
【０２４７】
液体抽出物を任意に乾燥して、乾燥抽出物を生成する。任意には、液体抽出物を乾燥前に結晶化する。
【０２４８】
４．方法Ｄ
ラクトース結晶化からの母液を含むシアリルオリゴ糖含有材料を提供する。
【０２４９】
供給源物質を、６７℃より高い温度で少なくとも２分間加熱して母液中のミネラルを沈殿させる。
【０２５０】
２μｍに対し３００Ｄａの孔径／ＭＷＣＯを有する膜を使用して、５０℃〜９０℃、１〜６バールで供給源物質をセラミックろ過に付して不溶性ミネラルおよびタンパク質を除去する。
【０２５１】
１００〜２５０Ｄａの孔径を有する膜を使用して、２５〜５５℃、３０〜５０バールで、脱塩され脱タンパク質された物質をナノろ過／ダイアフィルトレーションに付して糖および可溶性ミネラルを除去する。
【０２５２】
シアリルオリゴ糖に富むナノろ過リテンテートを蒸発に付して濃縮リテンテートを生成する。任意には、蒸発の前に逆浸透および／またはナノろ過を行う。
【０２５３】
β−ガラクトシダーゼを使用して第２の酵素反応を行い、グルコースおよびガラクトースを生成するか、またはＧＯＳを生成する。
【０２５４】
酵素生成物を脱色および任意にはろ過に付して、シアリルオリゴ糖に富む液体抽出物を生成する。
【０２５５】
液体抽出物を任意に乾燥して、乾燥抽出物を生成する。任意には、液体抽出物を乾燥前に結晶化する。
【０２５６】
５．結果
方法Ａ〜Ｄによって生成されたシアリルオリゴ糖に富む抽出物の組成を表１に示す。
【表３】
2019523278.tif 000005
【０２５７】
実施例２
動物モデル（子豚）を使用して、認知に対するシアリルオリゴ糖に富む組成物の効果を測定した。
【０２５８】
１．動物モデル
子豚の脳構造と機能はヒト早期産児のものとよく似ている（Ｐｏｎｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２０００．２２３（１）：ｐ．１０２−８、Ｍｏｕｇｈａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．Ｄｉｅｔ，１９９２．６７：ｐ．４０−１１３）。
【０２５９】
新生子豚は、ヒトと同様に発達が遅く、その体重はその成熟体重に対して比較的小さい。このため、新生子豚も低出生体重児も産後の発達障害にかかりやすい。在胎期間のために小さく生まれた（ＳＧＡ）（０．７−１．０ｋｇＢＷ）自然出産の子豚は、空間学習障害と白質の異常な発達有することが報告されている（Ｒａｄｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１４．９（３）：ｐ．ｅ９１９５１）。子豚はＳＧＡ関連の認知障害と潜在的な介入を調査するために使用することができる扱いやすいトランスレーショナルモデルである。さらに、子豚の消化器系は、ヒト乳児と同様の生理機能と解剖学的構造を共有しており、同等な栄養要件を有している。
【０２６０】
２．試験設計
３日齢のオスの家畜子豚（ｎ＝４８）を３つの群のうちの１つ（ｎ＝１６／群）に無作為に分け、３〜３７日齢間、異なるシアリルオリゴ糖を含む製剤を与えた。試験群を表２に記載する。
【０２６１】
子豚を、１２時間の明期（０８：００〜２０：００）および暗期（２０：００〜０８：００）の周期で、温度調節された部屋に１囲いあたり２匹収容した。
【０２６２】
ＳＬ強化粉乳（または対照用の普通粉乳）１８０ｇを温水８５０ｍＬと混合して製剤を形成した。次いで、子豚に、８：００、１３：００、１８：００、および２２：３０時に、最初の２週間で２８５ｍＬ製剤／ｋｇ／日、残りの週で２３０ｍＬ／ｋｇ／日を与え、最後の給餌で追加の５０ｍＬ製剤／ｋｇ／日を与えた。
【表４】
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【０２６３】
子豚の体重、乳摂取量および健康状態を毎日評価した。赤血球（ＲＢＣ）膜中のコルチゾールおよびシアリルオリゴ糖レベルを測定するために、安楽死の時点で血液サンプルを採取した。
【０２６４】
３．脳試料採取
３８〜３９日齢に、ＭＲＳスキャンのために２〜３．５％のイソフルランの麻酔から回復させることなく、子豚をリーザバーブ（ｌｅｔｈａｂａｒｂ）注射によって安楽死させた。脳の異なる領域からの組織サンプルを集め、そして−８０℃で貯蔵した。前述の方法を用いてこれらの試料について分析を行った（ｓｅｅ  Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１５．５２（１）：ｐ．２５６−２６９、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．，２０１４．１１１（２）：ｐ．３３２−４１、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，２００７．８５（２）：ｐ．５６１−９、を参照されたい。
【０２６５】
４．識別試験
４．１  方法
２試験が行われた：８方向放射状迷路を使った「簡単な」課題（課題１）と、より「難しい」課題（課題２）。
【０２６６】
両方の課題について、嗅覚学習を防ぐために、すべてのアームが同じ匂いを持つように、１つのアームにアクセス可能な乳を、残りの７つのアームにアクセスできない乳を提供した。
【０２６７】
両方の課題について、３つの黒点からなる視覚的な手がかりをアーム中にアクセス可能な乳を有するドアに配置した。
【０２６８】
課題１では、アクセスできない牛乳を入れた残りの７つのドアに、１つの黒点の視覚的手がかりを配置した。課題２では、残りの７つのドアに、２つの黒点の視覚的な手がかりを配置した。
【０２６９】
２３日目から１０日間にわたり、各課題について４０回の試行が行われた。それぞれの子豚を個別に８方向放射状迷路に入れた。
【０２７０】
学習能力の評価は、視覚的手がかりをうまく学習するためにかかった試行の数に基づいて測定された。各試行中にアクセス可能な乳アームを見つけることにおけるミスと成功の数を使用して、学習を定量化した。子豚が間違ったドアに入るか、頭全体を通すたびにミスが記録された。子豚が正しいドアに入ったとき、成功が記録された。視覚的手がかりを学ぶための基準は、３回の連続した試行における最大１回のミスである。頭上のビデオカメラは学習と記憶試験の間、連続的に記録し、訓練を受けた観察者が手動で結果を記録する。すべての試験は、試行群が分からない訓練を受けたスタッフによって行われる。結果はビデオ素材の独立した分析によって裏付けされた。
【０２７１】
ストレスを軽減し、子豚を試験プロトコールに習熟させるために、学習期間の開始時に同じ囲いからの２頭の子豚を迷路に入らせた。
【０２７２】
４．２  結果
５分短期記憶試験では群間に有意差はなかった。図３に示すように、第３群の子豚は、３時間の長期記憶試行においてより良好に行った。
【０２７３】
図４に示されるように、コックス回帰分析を用いたＰ＜０．０５の４つ連続する試行にわたって、第３群の子豚は、ただ１つのミスという基準に基づく難しい課題においてより良好に行った。
【０２７４】
５．磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）を用いた脳の構造的および代謝的評価
５．１  方法
局所脳代謝を評価するためにプロトン磁気共鳴分光法（１Ｈ−ＭＲＳ）を行った。インビボＭＲＩは、出生後の子豚の脳の形態計測イメージングを可能にする強力なツールである。
【０２７５】
手短に言えば、動物を、ＲＦ送信および受信の両方のために１５チャネルＲＦコイルを使用して３Ｔ  ＭＲスキャナー（Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｓｋｙｒａ、Ｅｒｌａｎｇｅｎ）の右側方位置に置いた。麻酔は、麻酔器（ＭＰＩ、米国）を使用して全ＭＲＩスキャン手順の間中２〜３．５％のイソフルランで維持された。ボクセルサイズは、前頭葉灰白質および白質上で１５×１４×２０ｍｍ３であった（左から右へ１５ｍｍ、上から下へ１４ｍｍ、前方から後方へ２０ｍｍ）（図１）。ＭＲＳは、局在化シングルボクセルスピンエコーＰｏｉｎｔ  ＲＥＳｏｌｖｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  （ＰＲＥＳＳ）シーケンスを使用して実施した。このＰＲＥＳＳシーケンスは、
2019523278.tif 000007
、
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および
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の形の３つのスライス選択ＲＦパルスを有する。このＰＲＥＳＳシーケンスにおけるＳＥのＴＥは
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に等しい。この研究では、ＴＲは２０００ｍｓであり、３つのＴＥが使用された：３５ｍｓ（図１Ｂ）、１３５ｍｓ（図１Ｃ）および２７０ｍｓ（図１Ｄ）。
【０２７６】
大脳白質、皮質灰白質および線条体などの基底構造の絶対量を定量化するために、３Ｄ体積測定ＭＲＩを用いて脳の発達を評価した。
【０２７７】
拡散強調画像法（ＤＷＩ）と拡散テンソル撮像法（ＤＴＩ）は、微細構造の組織と脳の発達を評価するために行った。
【０２７８】
３．０Ｔｅｓｌａスキャナー（Ｓｉｅｍｅｎｓ）を用いたインビボＭＲ技術を用いて、脳発達の変化を評価した。分析方法は、Ｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ３２．１０（２０１４）：１３９６−１４０２によって報告された全脳テンプレート、組織特異的確率マップおよび解剖学的ラベリングマップを用いたＨ１−ＭＲ分光法（局所脳代謝）と組み合わせた、３Ｄ体積測定ＭＲＩ（マクロ構造評価）、拡散強調画像法および拡散テンソル撮像法（ミクロ構造評価）を含んでいた。
【０２７９】
５．２  結果
第３群は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、ミオイノシトール（Ｉｎｓ）およびグルタミン酸＋グルタミン（Ｇｌｘ）の絶対レベルの有意な増加を示した。さらに、前頭葉Ｉｎｓ、Ｎ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）、総ＮＡＡ、総コリン（ＴＣｈｏ）、総グルタチオン（Ｇｌｔｈ）、ホスホリルコリン（ＰＣｈ）と、総白質体積または全脳体積の間に有意な正の相関があった（Ｐ＜０．０１）。
【０２８０】
グルタミン酸は脳の主要な興奮性神経伝達物質であり、学習と記憶の前頭−海馬メカニズムにおいて重要な役割を果たしている。物覚えのよい学習者は物覚えの悪い学習者と比較して変調されたグルタミン酸の早いピークを特徴とすることが研究により示唆されている（Ｓｔａｎｌｅｔ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｖｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｓｓｅｓｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  １Ｈ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．２０１７  Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ  １５３：１：１８９−１９７）。
【０２８１】
ミオイノシトールは学習および記憶を含む脳の発達における役割に関与している。海馬および扁桃体における異常に低いミオイノシトールおよびグルタミン酸レベルが、鬱病患者において検出されている。内側前頭前野と扁桃体のグルタミン酸レベルは実行機能と記憶機能のある海馬のそれとの間に有意な相関がある（Ｓｈｉｒａｙａｍａ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ，Ｇｌｕｔａｍａｔｅ，ａｎｄ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｆｒｏｎｔａｌ  ｃｏｒｔｅｘ，Ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ  ａｎｄ  ａｍｙｇｄａｌａ  ｉｎ  ｍａｊｏｒ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ２０１７  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ：Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｉｎｇ  ２；２：１９６−２０４）。精神病の危険性が高い患者において海馬絶対ミオイノシトール濃度の有意な低下が検出された（Ｂａｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ａｎｄ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ  ａｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｙｍｐｔｏｍ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｉｎ  ｕｌｔｒａ−ｈｉｇｈ  ｒｉｓｋ  ｆｏｒ  ｐｓｙｃｈｏｓｉｓ．２０１３  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｎｅｕｒｏｐｓｃｈｏｐａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２３；２：ｐａｇｅ  Ｓ４４８）。
【０２８２】
ＧＰＣ（アルファグリセリルホスホリルコリン）の増加傾向もまた、示された。ＧＰＣは神経保護に関与しており（Ｐｌａｎｇａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  （２０１４）１１９：２：２５３−２６１）、そして認知機能障害を有する患者において利益を提供し（Ｓｃａｐｉｃｃｈｉｏ  Ｐ．（２０１３）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １２３；７）、そして認知能力を向上させそして認知低下を遅らせるための栄養補助剤としての見込みが示されている（ＤｅＦｉｎａ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）。
【表５−１】
2019523278.tif 000011
【表５−２】
2019523278.tif 000012
【表５−３】
2019523278.tif 000013
【０２８３】
上記の表２に示されている有意差（Ｐ＜０．０５）は、多重比較に対するＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの調整を含む一般線形モデル（一変量ＡＮＯＶＡ）に基づいている。
【０２８４】
したがって、シアリルオリゴ糖は、子豚の神経発達を最適化するために必要な多くの重要な脳代謝産物および神経伝達物質を変化させ得る。
【０２８５】
６．定量的生化学分析
６．１  方法
ポリシアル酸（ｐｏｌｙＳｉａ）の濃度を測定した。ＰｏｌｙＳｉａは、胚脳内の神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）を時空間的に修飾する特有のシアル酸ポリマーであり、細胞遊走、神経成長、軸索誘導、シナプス可塑性、ならびに正常な神経回路および神経発生の発達に関与している。ＰｏｌｙＳｉａの発現は、神経可塑性、神経結合のリモデリング、または神経発生が進行している嗅球、海馬、脳室下帯、視床、前頭前野皮質、および扁桃体で見られる。ＰｏｌｙＳｉａは、神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、成長因子（ＦＧＦ２）、および神経伝達物質（ドーパミン）などの様々な神経学的に活性な分子を調節して、それらの関与するシグナル伝達を調節し得る。
【０２８６】
免疫蛍光法を用いて生化学分析を実施した。凍結ミクロトームを用いて、子豚の海馬および前頭皮質からの厚さ８μｍの連続冠状断を調製した。脳切片を氷冷４％パラホルムアルデヒド中で１５分間固定し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中ですすぎ、そして０．３％トリトンＸ−１００で３０分間透過処理し、続いてＰＢＳ中０．３％ヤギ血清（ＲＴ）でブロッキングした。次いで、切片を、ｐｏｌｙＳｉａ−ＮＣＡＭのｐｏｌｙＳｉａ部分を検出するため特異的な一次抗体（１：２００；ＭＡＢ５３２４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）と共に一晩（４℃）インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、切片をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合二次抗体（１：２００；１１５−５４５−０７５，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）と共に室温で１時間インキュベートした。すべての切片をＤＡＰＩ（Ｈ−１２００、ＶＥＣＴＯＲ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）で対比染色した。画像を得て、共焦点顕微鏡を用いて分析した。
【０２８７】
ウェスタンブロットを用いて、従来の方法（Ｃｈｅｎ  ２０１４，Ｚｈｕ  ２０１５）に従ってｐｏｌｙＳｉａ−ＮＣＡＭ発現レベルおよび他の問題のあるマーカーを分析した。一次抗体（抗ｐｏｌｙＳｉａ−ＮＣＡＭ抗体、ＭＡＢ５３２４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の希釈度は１：１０００であり、ＧＡＰＤＨを各ゲルにロードされたタンパク質の量の対照として使用し、０．０５μｇ／ｍＬの抗ＧＡＰＤＨ  ｍＡｂ（ＭＡＢ５７１８、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＵＳＡ）を用いて検出した。二次抗体（抗マウスＩｇＧ、Ａ４４１６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を１：１００００の希釈として使用した。タンパク質バンドの定量化は、Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｅｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いてフィルムをスキャンすることによって行った。全てのフィルム上のバンドの密度は、非飽和条件下で決定された。
【０２８８】
６．２  結果
ウェスタンブロット法を用いた群間で海馬におけるｐｏｌｙＳｉａ‐ＮＣＡＭ発現に有意差はなかった。しかしながら、対照と比較して、２つの処置群の前頭皮質において有意に高いＰｏｌｙＳｉａ発現があった（Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析、図４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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