(57)【要約】  本明細書において記載される課題は、ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩とを含む組成物と、膵がんの治療における本組成物の使用と、に関する。別の態様において、ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩、およびマルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩を投与することによって膵がんを治療する方法を、本明細書に開示する。別の態様において、膵がんを治療するために、コビメチニブまたはその薬学的に許容される塩と、ポナチニブまたはその薬学的に許容される塩との組み合わせが組成物の状態で投与されるか、またはその組み合わせが別個に投与される。【選択図】図２０Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵がんの治療を必要とする対象において膵がんを治療する方法であって、治療有効量の活性剤の組み合わせを前記対象に投与するステップを含み、前記組み合わせが、ＭＥＫ阻害剤と、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ剤とを含む、方法。
【請求項２】
前記ＭＥＫ阻害剤が、コビメチニブ、ＧＤＣ−０６２３、トラメチニブ、ビニメチニブ、セルメチニブ、ピマセルチニブ、レファメチニブ、ＰＤ−０３２５９０１およびＢＩ−８４７３２５、またはそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＭＥＫ阻害剤が、コビメチニブ、およびトラメチニブ、またはそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＥＫ阻害剤が、コビメチニブまたはその薬学的に許容される塩である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記マルチキナーゼ剤が、ポナチニブまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記膵がんが内分泌がんである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記膵がんが外分泌がんである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記膵がんが、腺がん、腺房細胞がん、腺扁平上皮がん、粘液がん、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化がん、肝様腺がん、膵管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腫瘍、膵芽腫、漿液性嚢胞腺腫、印環細胞がん、充実性偽乳頭状腫瘍、膵管がん、および未分化がんである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記膵がんが膵管腺がんである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組み合わせが相乗的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記活性剤が逐次に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記活性剤が同時に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＭＥＫ阻害剤および前記マルチキナーゼ阻害剤が組み合わせ製剤として投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＭＥＫ阻害剤が約４５ｍｇ〜約７５ｍｇの量で投与され、前記マルチキナーゼ阻害剤が約３０ｍｇ〜約６０ｍｇの量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記量が１日１回投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＭＥＫ阻害剤がコビメチニブまたはその薬学的に許容される塩であり、前記マルチキナーゼ阻害剤がポナチニブまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
膵がんの治療のための、ａ）ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ｂ）ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩との組み合わせ。
【請求項１８】
有効量の、ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ剤またはその薬学的に許容される塩との組み合わせと、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物であって、前記組成物が膵がんの治療用である組成物。
【請求項１９】
前記ＭＥＫ阻害剤が、コビメチニブ、ＧＤＣ−０６２３、トラメチニブ、ビニメチニブ、セルメチニブ、ピマセルチニブ、レファメチニブ、ＰＤ−０３２５９０１およびＢＩ−８４７３２５、またはそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＭＥＫ阻害剤が、コビメチニブ、およびトラメチニブ、またはそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＭＥＫ阻害剤が、コビメチニブまたはその薬学的に許容される塩である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記マルチキナーゼ剤が、ポナチニブまたはその薬学的に許容される塩である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
コビメチニブまたはその薬学的に許容される塩と、ポナチニブまたはその薬学的に許容される塩とを含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩が約４５ｍｇ〜約７５ｍｇの量で存在し、前記マルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩が約３０ｍｇ〜約６０ｍｇの量で存在する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２５】
ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ剤またはその薬学的に許容される塩と、容器と、添付文書またはラベルとを含む、キット。
【請求項２６】
前記ＭＥＫ阻害剤が約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、前記マルチキナーゼ阻害剤が約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＭＥＫ阻害剤が約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与され、前記マルチキナーゼ阻害剤が約１０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書において記載される課題は、ＭＥＫ阻害剤とＲＴＫ、Ｓ６、およびＪＡＫ／ＳＴＡＴを標的とする多標的剤との組み合わせによる膵がんの治療に関する。
【０００２】
［ＥＦＳ−Ｗｅｂを介したテキストファイルとして提出され配列表への参照］
配列表の公式コピーは、２０１７年８月１０日に作成され、４７１バイトのサイズを有する５０１１５９ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴという名称のファイルによってＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に送信され、本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩ形式の文書に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
膵管腺がん（ＰＤＡＣ）は最も悪性のがんの１つであり、培養モデルで試験された膵がん細胞からの薬物応答の結果に基づいて数多くの治療法が研究されてきた。ＰＤＡＣ腫瘍の大部分は、ＭＡＰＫシグナル伝達のＫＲＡＳ変異に駆動される活性化によって引き起こされ（Ｊｏｎｅｓ  Ｓ，Ｚｈａｎｇ  Ｘ，Ｐａｒｓｏｎｓ  ＤＷ，Ｌｉｎ  ＪＣ，Ｌｅａｒｙ  ＲＪ，Ａｎｇｅｎｅｎｄｔ  Ｐ，Ｃｏｒｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｇｌｏｂａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８；３２１（５８９７）：１８０１−６，Ｅｐｕｂ  ２００８／０９／０６、Ｂｉａｎｋｉｎ  ＡＶ，Ｗａｄｄｅｌｌ  Ｎ，Ｋａｓｓａｈｎ  ＫＳ，Ｇｉｎｇｒａｓ  ＭＣ，Ｍｕｔｈｕｓｗａｍｙ  ＬＢ，Ｊｏｈｎｓ  ＡＬ，Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｒｅｖｅａｌ  ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｘｏｎ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｇｅｎｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１２；４９１（７４２４）：３９９−４０５，Ｅｐｕｂ  ２０１２／１０／３０、Ｃｉｄ−Ａｒｒｅｇｕｉ  Ａ，Ｊｕａｒｅｚ  Ｖ，Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０１５；２１（３１）：９２９７−３１６，Ｅｐｕｂ  ２０１５／０８／２７）、それによって、ＭＥＫがＰＤＡＣ患者における治療的介入のための重要な候補標的として強調されている。しかしながら、前臨床および臨床研究は、様々な補償メカニズムを介したＭＡＰＫ阻害剤に対する抵抗性が急速に発達し、それにより阻害剤の有効性を限定し、薬物抵抗性の腫瘍の発生をもたらす可能性があるために、ＭＡＰＫ経路阻害のみでは効力が欠如することを明らかにした。（Ｂａｉｎｅｓ  ＡＴ，Ｘｕ  Ｄ，Ｄｅｒ  ＣＪ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒａｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｃｏｎｔｉｎｕｅｓ，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１１；３（１４）：１７８７−８０８，Ｅｐｕｂ  ２０１１／１０／１９、ＭｃＣｕｂｒｅｙ  ＪＡ，Ｓｔｅｅｌｍａｎ  ＬＳ，Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ＷＨ，Ａｂｒａｍｓ  ＳＬ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ＲＡ，Ｍｏｎｔａｌｔｏ  Ｇ，Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ  ａｎｄ  ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ  ｃａｓｃａｄｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｈｏｗ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｃａｎ  ｒｅｓｕｌｔ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｈｏｗ  ｔｏ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１２；３（１０）：１０６８−１１１，Ｅｐｕｂ  ２０１２／１０／２３、Ｊｕｎｔｔｉｌａ  ＭＲ，Ｄｅｖａｓｔｈａｌｉ  Ｖ，Ｃｈｅｎｇ  ＪＨ，Ｃａｓｔｉｌｌｏ  Ｊ，Ｍｅｔｃａｌｆｅ  Ｃ，Ｃｌｅｒｍｏｎｔ  ＡＣ，Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＥＫ  ａｎｄ  ＰＩ３  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔ���ｃｓ，２０１５；１４（１）：４０−７，Ｅｐｕｂ  ２０１４／１１／０８）．
【０００４】
ＭＥＫ阻害剤に対する感受性および抵抗性の根底にあるメカニズムの理解を深めることで、膵がん細胞を標的とするのに有効なＭＥＫ阻害剤と組み合わせて使用する阻害剤を特定することができる。
【発明の概要】
【０００５】
一態様において、本明細書において記載される課題は、膵がんの治療を必要とする対象において膵がんを治療する方法であって、治療有効量の活性剤の組み合わせを上記対象に投与するステップを含み、上記組み合わせが、ＭＥＫ阻害剤と、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ剤とを含む、方法に関する。
【０００６】
別の態様において、本明細書において記載される課題は、膵がんの治療のための、ａ）ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ｂ）ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩との組み合わせに関する。
【０００７】
別の態様において、本明細書において記載される課題は、有効量の、ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ剤またはその薬学的に許容される塩との組み合わせと、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物であって、上記組成物が膵がんの治療用である組成物に関する。
【０００８】
別の態様において、本明細書において記載される課題は、膵がんの治療のための、ａ）ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩、ならびにＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ｂ）膵がんの治療を示す添付文書またはラベルとを含む、膵がんの治療のためのキットに関する。
【０００９】
これらおよび他の態様は以下に十分に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】２Ｄ単層培養および３Ｄスフェロイド培養におけるＫＰ４  ＰＤＡＣ細胞によるＭＥＫ阻害に対する異なる応答を示す。２Ｄおよび３Ｄ培養におけるＫＰ４がん細胞の小分子阻害剤スクリーニング。
【図２】２Ｄ単層培養および３Ｄスフェロイド培養におけるＫＰ４  ＰＤＡＣ細胞によるＭＥＫ阻害に対する異なる応答を示す。パネルＣにおいて異なる活性化をしたタンパク質の位置を暗くしたホスホキナーゼアレイの配置。
【図３】２Ｄ単層培養および３Ｄスフェロイド培養におけるＫＰ４  ＰＤＡＣ細胞によるＭＥＫ阻害に対する異なる応答を示す。２Ｄおよび３ＤにおけるＫＰ４細胞のホスホキナーゼアレイ。
【図４】２Ｄ単層培養および３Ｄスフェロイド培養におけるＫＰ４  ＰＤＡＣ細胞によるＭＥＫ阻害に対する異なる応答を示す。２Ｄまたは３Ｄで培養し、２４時間コビメチニブで処理したＫＰ４細胞のＲＴ−ＰＣＲによるタンパク質キナーゼアレイ。試料をＤＭＳＯ処理ＫＰ４  ２Ｄ対照に対して標準化した。
【図５】２Ｄ単層培養および３Ｄスフェロイド培養におけるＫＰ４  ＰＤＡＣ細胞によるＭＥＫ阻害に対する異なる応答を示す。２Ｄまたは３Ｄで培養し、２４時間コビメチニブで処理したＫＰ４細胞のルシフェラーゼレポーターアッセイ。ルシフェラーゼ活性の倍率変化に顕著な差がある転写因子は赤色で示されている。
【図６Ａ−Ｂ】ＭＥＫ阻害がＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３の活性化を誘導することを示す。（図６Ａ）ＫＰ４細胞におけるコビメチニブ処理時のＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３の活性化を検証する免疫ブロット。（図６Ｂ）ウエスタンブロットによるＰＤＡＣ細胞株およびＫＰＰ−ＧＥＭＭ由来細胞株におけるコビメチニブ処理時のｐ−ＳＴＡＴ３の増加の検証。
【図７】ＭＥＫ阻害がＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３の活性化を誘導することを示す。ＩＬ−６分泌レベルを、２４時間コビメチニブで処理したＰＤＡＣ細胞株の２Ｄ培養上清中で測定した。
【図８】ＭＥＫ阻害がＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３の活性化を誘導することを示す。ＫＰ４およびＭＩＡ−ＰＡＣＡ２細胞の生存率に対する、コビメチニブと組み合わせたＤｏｘ誘導性ＳＴＡＴ３ノックダウンの効果を測定するＣＴＧアッセイ。
【図９】ＭＥＫ阻害がＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３の活性化を誘導することを示す。Ｄｏｘ（１μｇ／ｍｌ）で７２時間処理した後のＳＴＡＴ３の効率的なノックダウンを裏付けるウエスタンブロット。
【図１０】ＭＥＫ阻害がＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３の活性化を誘導することを示す。マトリゲル浸潤アッセイにおいて、１０％ＦＢＳに応答した２Ｄおよび３Ｄで培養した膵がん細胞の浸潤能の定量化。
【図１１】コビメチニブと組み合わせたＳ６およびＳＴＡＴ３の阻害が膵がん細胞の死滅を増大させることを示す。シグナル伝達受容体および下流の標的の活性化に対するコビメチニブと組み合わせたマルチＲＴＫ阻害剤ポナチニブの効果をウエスタンブロットによって検証した。
【図１２】コビメチニブと組み合わせたＳ６およびＳＴＡＴ３の阻害が膵がん細胞の死滅を増大させることを示す。コビメチニブ＋／−ポナチニブまたはＪＡＫ阻害剤によるＳＴＡＴ３活性化および切断されたＰＡＲＰの誘導に対する効果をウエスタンブロットによって検証した。
【図１３】コビメチニブと組み合わせたＳ６およびＳＴＡＴ３の阻害が膵がん細胞の死滅を増大させることを示す。２Ｄおよび３Ｄ培養においてコビメチニブ＋／−ポナチニブで前処理したＫＰ４細胞のＰａｔｈＳｃａｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘウエスタンブロット分析。
【図１４】コビメチニブと組み合わせたＳ６およびＳＴＡＴ３の阻害が膵がん細胞の死滅を増大させることを示す。コビメチニブ＋／−ポナチニブ／Ｓ６／ＰＤＧＦＲα阻害剤によるＳ６活性化および切断されたＰＡＲＰの誘導に対する効果をウエスタンブロットによって検証した。
【図１５】コビメチニブと組み合わせたＳ６およびＳＴＡＴ３の阻害が膵がん細胞の死滅を増大させることを示す。ＫＰ４細胞の生存率に対するコビメチニブおよびルキソリチニブと組み合わせたＰＤＧＦＲ阻害剤クレノラニブの効果をＣＴＧアッセイを用いて測定した。
【図１６】コビメチニブと組み合わせたＳ６およびＳＴＡＴ３の阻害が膵がん細胞の死滅を増大させることを示す。コビメチニブとポナチニブとの間の相乗作用を、ブリス分析を用いて膵がん細胞株において分析した。
【図１７】コビメチニブと組み合わせたＳ６およびＳＴＡＴ３の阻害が膵がん細胞の死滅を増大させることを示す。コビメチニブとポナチニブとの間の相乗作用を、ブリス分析を用いて膵がん細胞株において分析した。
【図１８】コビメチニブと組み合わせたＳ６およびＳＴＡＴ３の阻害が膵がん細胞の死滅を増大させることを示す。ＫＰ４細胞におけるコビメチニブとＳ６阻害剤ラパマイシンとの間の相乗効果のブリス分析。
【図１９】コビメチニブと組み合わせたＳ６およびＳＴＡＴ３の阻害が膵がん細胞の死滅を増大させることを示す。ＫＰ４細胞におけるコビメチニブとＧＤＣ−０９８０との間の相乗効果のブリス分析。
【図２０Ａ−Ｂ】ＰＤＧＦＲα／Ｓ６／ＳＴＡＴ３およびＭＥＫの阻害が腫瘍増殖を阻害し、血清ＰＤＧＦαを減少させることを示す（図２０Ａ）。ＫＰ４異種移植モデルの腫瘍成長曲線（平均±ＳＥＭ）コビメチニブ（５ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ、ＱＤ）および／またはポナチニブ（３０ｍｇ／ｋｇ、ＰＯ、ＱＤ）で２４時間ごとに処理した（各コホートについてｎ＝１０）、（図２０Ｂ）（図２０Ａ）におけるように処理されたＫＰＰ異種移植モデルの腫瘍増殖曲線（平均±ＳＥＭ）。
【図２１】ＰＤＧＦＲα／Ｓ６／ＳＴＡＴ３およびＭＥＫの阻害が腫瘍増殖を阻害し、血清ＰＤＧＦαを減少させることを示す。ＫＰ４異種移植からの代表的な腫瘍切片を、ｐ−ＳＴＡＴ３、ｐ−Ｅｒｋ、および切断カスパーゼ３をＩＨＣによって検出するために染色、または、ＩＦによって検出するためにｐ−ＳＴＡＴ３およびＦ４／８０またはｐ−ＰＤＧＦＲαに対する抗体で共染色した。スケールバー：ＩＨＣスライドについては２０μｍ、ＩＦスライドについては５０μｍ。
【図２２】ＰＤＧＦＲα／Ｓ６／ＳＴＡＴ３およびＭＥＫの阻害が腫瘍増殖を阻害し、血清ＰＤＧＦαを減少させることを示す。ＫＰ４異種移植腫瘍のコビメチニブ／ポナチニブ治療時のＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３の活性化を検証する免疫ブロット。
【図２３】ＰＤＧＦＲα／Ｓ６／ＳＴＡＴ３およびＭＥＫの阻害が腫瘍増殖を阻害し、血清ＰＤＧＦαを減少させることを示す。ＫＰ４異種移植マウスの血漿試料の増殖因子およびサイトカインに対するＬｕｍｉｎｅｘアッセイ。
【図２４】ＰＤＡＣ患者試料由来の膵腫瘍および転移におけるｐ−Ｅｒｋおよびｐ−ＳＴＡＴ３の分析を示す。８２のＰＤＡＣ患者由来の原発性腫瘍および転移における悪性腫瘍の種々のステージのｐ−Ｅｒｋおよびｐ−ＳＴＡＴ３陽性試料の分布。
【図２５】ＰＤＡＣ患者試料由来の膵腫瘍および転移におけるｐ−Ｅｒｋおよびｐ−ＳＴＡＴ３の分析を示す。ＰＤＡＣ患者試料におけるｐ−Ｅｒｋおよびｐ−ＳＴＡＴ３を染色した代表的な原発性腫瘍および肝臓の切片。スケールバー：２０μｍ。
【図２６】ＰＤＡＣ患者試料由来の膵腫瘍および転移におけるｐ−Ｅｒｋおよびｐ−ＳＴＡＴ３の分析を示す。ＰＤＡＣ患者腫瘍試料におけるＰＤＧＦＲおよびＩＬ−６Ｒの発現のマイクロアレイ分析。
【図２７Ａ−Ｂ】微小転移巣の組織病理学的特徴を有するＫＰ４由来の３Ｄスフェロイドは、小分子阻害剤に対して異なる感受性を示すことを示す。ＫＰ４細胞を、１０％正常ＦＢＳ（２Ｄ培養用）または１０％予め熱湯加熱されているＦＢＳ（３Ｄ培養用）を含むＲＰＭＩ培地で３日間培養し、Ｋｉ６７、ｐ−ＳＴＡＴ３、および切断カスパーゼ−３について、２Ｄ細胞ペレットまたは３Ｄスフェロイドに対してＩＨＣを実施した。
【図２８】微小転移巣の病理組織学的特徴を有するＫＰ４由来の３Ｄスフェロイドが小分子阻害剤に対して異なる感受性を示すことを示す。１０％予め熱湯加熱されているＦＢＳを用いて形成されたスフェロイドは他の従来の３Ｄ培養法で見られるのと同様の薬物感受性プロファイルを示す。
【図２９】微小転移巣の病理組織学的特徴を有するＫＰ４由来の３Ｄスフェロイドが小分子阻害剤に対して異なる感受性を示すことを示す。異なる３Ｄ培養法から形成されたスフェロイドの細胞生存率アッセイおよびコロニー数アッセイ。
【図３０】コビメチニブ／ポナチニブの共処理が腫瘍増殖を阻害し、腫瘍関連マクロファージの浸潤を減少させることを示す。ＩＨＣによってｐ−Ｅｒｋとｐ−ＳＴＡＴ３抗体で調べられるか、または免疫蛍光によって抗ｐ−ＳＴＡＴ３と抗Ｆ４／８０の共染色されたＫＰＰ異種移植由来の代表的な腫瘍切片。スケールバー：ＩＨＣスライドについては２０μｍ、ＩＦスライドについては５０μｍ。
【図３１Ａ−Ｂ】コビメチニブ／ポナチニブの共処理が腫瘍増殖を阻害し、腫瘍関連マクロファージ浸潤を減少させることを示す。ＫＰ４およびＫＰＰ異種移植モデルにおけるコビメチニブ＋／−ポナチニブ投与マウスの体重変化。
【図３２】コビメチニブ／ポナチニブの共処理が腫瘍増殖を阻害し、腫瘍関連マクロファージ浸潤を減少させることを示す。ＫＰ４異種移植マウスの血漿試料の増殖因子のＬｕｍｉｎｅｘアッセイ。
【図３３】コビメチニブ／ポナチニブ共処理が腫瘍増殖を阻害し、腫瘍関連マクロファージ浸潤を減少させることを示す。ＫＰＰ異種移植腫瘍のコビメチニブ／ポナチニブ治療時のＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３の活性化を検証する免疫ブロット。
【００１１】
図６〜２３のデータは平均値±ＳＥＭとして表される。＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
膵管腺がん（ＰＤＡＣ）は最も致命的な人間の病気の一つであり、利用可能な薬物治療にはほとんど難治性のままである。ほとんどの膵がんにおいて、ＫＲＡＳに駆動されるＭＥＫ経路が変異により活性化されており、治療法の重要な標的である。しかしながら、既知の発がん性推進因子の不十分な標的化および補償性フィードバックループの活性化、ならびに転移の拡大を防げないことが、この疾患の予後不良の一因となる。
【００１３】
膜貫通受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の活性化は、結果的に細胞運命の調節をもたらす多数の生化学的カスケードを誘発する。この活性化は、細胞外環境中の分子、主に増殖因子、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質、および隣接細胞の表面に存在する接着分子によって調節される。これらのシグナルに対する細胞の応答は、分子が細胞の表面に存在する特定の受容体に結合するときに起きる。多くの成長因子（ＧＦ）は、受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーの膜貫通糖タンパク質に結合し、それらを活性化する。
【００１４】
ＲＴＫは、細胞外リガンド結合ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、およびチロシンキナーゼドメイン、ならびにいくつかの調節性チロシンを含む細胞内の構成要素を含む。ＲＴＫは細胞質ＳＴＡＴファミリー転写因子をリン酸化し活性化することができる。これらの活性化されたＳＴＡＴは核に移行する。核内に入ると、ＳＴＡＴは細胞増殖に関与する遺伝子の転写を高める。
【００１５】
血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）ファミリーのメンバーのための細胞表面チロシンキナーゼ受容体である。ＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβのアイソフォームは、細胞増殖、細胞分化、細胞増殖および発生を調節する因子である。結合すると、２つのアイソフォームが二量体化してキナーゼ活性およびＰＤＧＦＲのリン酸化を活性化する。増殖因子受容体のチロシンリン酸化部位はキナーゼの活性レベルを制御し、そして多くの場合、同様にキナーゼの基質でもある下流のシグナル伝達のための結合部位である。Ｓ６リボソームタンパク質などの下流のシグナル伝達分子を含むこのシグナル伝達カスケードは、がんを含む多くの疾患に関与している。
【００１６】
本明細書において記載されるように、二次元単層培養システムおよび三次元スフェロイド培養システムを使用することで、ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩とＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とする多標的剤またはその薬学的に許容される塩とによる併用治療が、単層およびスフェロイドの両方において膵がん細胞を標的化するのに有効であったことが見出された。理論に拘束されるものではないが、この組み合わせは、がん細胞におけるＳＴＡＴ３およびＳ６の媒介する補償性フィードバックループの活性化も防止しながら、ＰＤＧＦＲαおよびＭＥＫキナーゼを介したシグナル伝達を効果的に遮断することができる。さらに、本明細書中に記述されるように、異種移植モデルを用いて、ＭＥＫ阻害剤とポナチニブとの共処理は、腫瘍退縮を引き起こし、同時に膵腫瘍微小環境において腫瘍関連マクロファージを標的とすることによって、ＰＤＡＣ腫瘍進行を促進する骨髄集団を阻害し、それによって、二重のメカニズムを介して腫瘍退縮を促進する。ＰＤＡＣ患者試料は、腫瘍におけるＳＴＡＴ３活性化および肝臓転移におけるＥｒｋ活性化の増大を明らかにし、ＳＴＡＴ３およびＥｒｋがそれぞれＰＤＡＣ腫瘍および肝臓転移における重要な推進因子であることを示唆している。本明細書において記載されているように、これらの結果は膵がんの効果的な治療のための併用薬物治療戦略を示している。さらに、単独で投与したときの活性剤は、膵がんに対して有効性を示さない可能性がある。
【００１７】
ＰＤＧＦＲβ、ＭＥＫ、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３として同定された生存経路は、様々ながんモデルにおいて腫瘍形成および転移に関与すると報告されており（Ｌｅｓｉｎａ  Ｍ，Ｋｕｒｋｏｗｓｋｉ  ＭＵ，Ｌｕｄｅｓ  Ｋ，Ｒｏｓｅ−Ｊｏｈｎ  Ｓ，Ｔｒｅｉｂｅｒ  Ｍ，Ｋｌｏｐｐｅｌ  Ｇ，Ｓｔａｔ３／Ｓｏｃｓ３  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＩＬ−６  ｔｒａｎｓｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２０１１；１９（４）：４５６−６９，Ｅｐｕｂ  ２０１１／０４／１３、Ｙｅｎ  ＴＷ，Ａａｒｄａｌ  ＮＰ，Ｂｒｏｎｎｅｒ  ＭＰ，Ｔｈｏｒｎｉｎｇ  ＤＲ，Ｓａｖａｒｄ  ＣＥ，Ｌｅｅ  ＳＰ，Ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ａｒｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｓｍｏｐｌａｓｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ，Ｓｕｒｇｅｒｙ，２００２；１３１（２）：１２９−３４，Ｅｐｕｂ  ２００２／０２／２１、Ｗｅｉｓｓｍｕｅｌｌｅｒ  Ｓ，Ｍａｎｃｈａｄｏ  Ｅ，Ｓａｂｏｒｏｗｓｋｉ  Ｍ，Ｍｏｒｒｉｓ  ＪＰｔ，Ｗａｇｅｎｂｌａｓｔ  Ｅ，Ｄａｖｉｓ  ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｔａｎｔ  ｐ５３  ｄｒｉｖｅｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｃｅｌｌ−ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ＰＤＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｅｔａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｃｅｌｌ，２０１４；１５７（２）：３８２−９４，Ｅｐｕｂ  ２０１４／０４／１５、Ｃｏｒｃｏｒａｎ  ＲＢ，Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ  ＳＭ，Ｈａｔａ  ＡＮ，Ｆａｂｅｒ  ＡＣ，Ｐｉｒｉｓ  Ａ，Ｎａｚａｒｉａｎ  ＲＭ，ＴＯＲＣ１  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｔｏ  ＲＡＦ  ａｎｄ  ＭＥＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ＢＲＡＦ−ｍｕｔａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１３；５（１９６）：１９６ｒａ９８，Ｅｐｕｂ  ２０１３／０８／０２、Ｃｏｒｃｏｒａｎ  ＲＢ，Ｃｈｅｎｇ  ＫＡ，Ｈａｔａ  ＡＮ，Ｆａｂｅｒ  ＡＣ，Ｅｂｉ  Ｈ，Ｃｏｆｆｅｅ  ＥＭ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｅｔｈａｌ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ＢＣＬ−ＸＬ  ａｎｄ  ＭＥＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ＫＲＡＳ  ｍｕｔａｎｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２０１３；２３（１）：１２１−８，Ｅｐｕｂ  ２０１２／１２／１９、Ｄｅｎｇ  Ｊ，Ｌｉｕ  Ｙ，Ｌｅｅ  Ｈ，Ｈｅｒｒｍａｎｎ  Ａ，Ｚｈａｎｇ  Ｗ，Ｚｈａｎｇ  Ｃ，Ｓ１ＰＲ１−ＳＴＡＴ３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｆｏｒ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｔ  ｆｕｔｕｒｅ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｓｉｔｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２０１２；２１（５）：６４２−５４，Ｅｐｕｂ  ２０１２／０５／２６、Ｃｏｒｃｏｒａｎ  ＲＢ，Ｃｏｎｔｉｎｏ  Ｇ，Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ  Ｖ，Ｔｚａｔｓｏｓ  Ａ，Ｃｏｎｒａｄ  Ｃ，Ｂｅｎｅｓ  ＣＨ，ＳＴＡＴ３  ｐｌａｙｓ  ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ＫＲＡＳ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１；７１（１４）：５０２０−９，Ｅｐｕｂ  ２０１１／０５／１９）、原発性膵腫瘍におけるＭＥＫ阻害は、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を介した代替のシグナル伝達経路の活性化を誘発し、これが単剤ＭＥＫ阻害に対する抵抗性に寄与することが今や見出されている。特に、個別には細胞生存率に影響を示さなかった個々の剤が、組み合わせたときに２Ｄおよび３Ｄ培養の両方において細胞増殖を阻害することが示されている。したがって、ＭＥＫ阻害と組み合わせたＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３活性化の阻害は、膵腫瘍におけるＭＥＫ阻害剤コビメチニブまたはその薬学的に許容される塩に対する抵抗性の誘導を妨げた。一実施形態において、マルチＲＴＫおよびＪＡＫ２阻害剤ポナチニブまたはその薬学的に許容される塩をコビメチニブまたはその薬学的に許容される塩と組み合わせて治療することは、上述のように、現在診療所で探索されている薬物治療計画に対して一般的に難治性である膵腫瘍の標的化に非常に有効である。
【００１８】
膵管腺がん（ＰＤＡＣ）は、攻撃的な腫瘍増殖、転移、免疫抑制、および薬剤耐性に寄与する様々な間質要素の顕著な関与と関連している。（Ｃｉｄ−Ａｒｒｅｇｕｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）、Ｈｉｄａｌｇｏ  Ｍ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１０；３６２（１７）：１６０５−１７，Ｅｐｕｂ  ２０１０／０４／３０、Ｋｏｒｃ  Ｍ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｔｒｏｍａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，２００７；１９４（４  Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ８４−６，Ｅｐｕｂ  ２００７／１２／０６、Ｉｎｍａｎ  ＫＳ，Ｆｒａｎｃｉｓ  ＡＡ，Ｍｕｒｒａｙ  ＮＲ．Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ，Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０１４；２０（３２）：１１１６０−８１，Ｅｐｕｂ  ２０１４／０８／３０、Ｗｏｒｍａｎｎ  ＳＭ，Ｄｉａｋｏｐｏｕｌｏｓ  ＫＮ，Ｌｅｓｉｎａ  Ｍ，Ａｌｇｕｌ  Ｈ，Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０１４；３３（２３）：２９５６−６７，Ｅｐｕｂ  ２０１３／０７／１６、Ｍｏｓｅｓ  ＡＧ，Ｍａｉｎｇａｙ  Ｊ，Ｓａｎｇｓｔｅｒ  Ｋ，Ｆｅａｒｏｎ  ＫＣ，Ｒｏｓｓ  ＪＡ，Ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｙ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ａｃｕｔｅ  ｐｈａｓｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２００９；２１（４）：１０９１−５，Ｅｐｕｂ  ２００９／０３／１７、Ｔｊｏｍｓｌａｎｄ  Ｖ，Ｎｉｋｌａｓｓｏｎ  Ｌ，Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ  Ｐ，Ｂｏｒｃｈ  Ｋ，Ｄｒｕｉｄ  Ｈ，Ｂｒａｔｔｈａｌｌ  Ｃ，Ｔｈｅ  ｄｅｓｍｏｐｌａｓｔｉｃ  ｓｔｒｏｍａ  ｐｌａｙｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１１；２０１１：２１２８１０，Ｅｐｕｂ  ２０１１／１２／２３、Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ  Ｎ，Ｇｎｏｎｉ  Ａ，Ｂｒｕｎｅｔｔｉ  ＡＥ，Ｖｉｎｃｅｎｔｉ  Ｌ，Ｓａｎｔｉｎｉ  Ｄ，Ｔｏｎｉｎｉ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｔａｒｇｅｔ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１４；２１（８）：９４８−６５，Ｅｐｕｂ  ２０１３／０９／０３、Ｖａｃｃａｒｏ  Ｖ，Ｓｐｅｒｄｕｔｉ  Ｉ，Ｖａｒｉ  Ｓ，Ｂｒｉａ  Ｅ，Ｍｅｌｉｓｉ  Ｄ，Ｇａｒｕｆｉ  Ｃ，Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ：Ｉｓ  ｔｈｅｒｅ  ａ  ｌｉｇｈｔ  ａｔ  ｔｈｅ  ｅｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｕｎｎｅｌ？  Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，２０１５；２１（１６）：４７８８−８０１．Ｅｐｕｂ  ２０１５／０５／０７、Ｔｕｖｅｓｏｎ  ＤＡ，Ｎｅｏｐｔｏｌｅｍｏｓ  ＪＰ，Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｃａｌｌ  ｆｏｒ  ｎｅｗ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，Ｃｅｌｌ，２０１２；１４８（１−２）：２１−３，Ｅｐｕｂ  ２０１２／０１／２４）。腫瘍関連マクロファージは、膵腫瘍に浸潤し、患者の予後不良と相関する最も一般的な間質細胞型の一つである。（Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ  ＲＨ，Ｂａｙｎｅ  ＬＪ，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１３；２５（２）：２００−５，Ｅｐｕｂ  ２０１３／０２／２１、Ｄｉ  Ｃａｒｏ  Ｇ，Ｃｏｒｔｅｓｅ  Ｎ，Ｃａｓｔｉｎｏ  ＧＦ，Ｇｒｉｚｚｉ  Ｆ，Ｇａｖａｚｚｉ  Ｆ，Ｒｉｄｏｌｆｉ  Ｃ，Ｄｕａｌ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｏｒ  ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｇｕｔ，２０１５．Ｅｐｕｂ  ２０１５／０７／１５、Ｃｈｅｎ  ＳＪ，Ｚｈａｎｇ  ＱＢ，Ｚｅｎｇ  ＬＪ，Ｌｉａｎ  ＧＤ，Ｌｉ  ＪＪ，Ｑｉａｎ  ＣＣ，Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａ  ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｎｃｏｌ．２０１５；２２（１）：ｅ１１−９，Ｅｐｕｂ  ２０１５／０２／１７）。最近の研究はさらに、腫瘍の進行および転移におけるＴＡＭの重要な役割を示唆している。（Ｎｏｙ  Ｒ，Ｐｏｌｌａｒｄ  ＪＷ．Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：ｆｒｏｍ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｔｏ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，２０１４；４１（１）：４９−６１，Ｅｐｕｂ  ２０１４／０７／１９、Ｍｅｌｅｒｏ  Ｉ，Ｇａｕｄｅｒｎａｃｋ  Ｇ，Ｇｅｒｒｉｔｓｅｎ  Ｗ，Ｈｕｂｅｒ  Ｃ，Ｐａｒｍｉａｎｉ  Ｇ，Ｓｃｈｏｌｌ  Ｓ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１４；１１（９）：５０９−２４，Ｅｐｕｂ  ２０１４／０７／０９、Ｄｒａｋｅ  ＣＧ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ／  ＥＳＭＯ，２０１２；２３  Ｓｕｐｐｌ  ８：ｖｉｉｉ４１−６，Ｅｐｕｂ  ２０１２／０８／２９、Ｗｅｄｅｎ  Ｓ，Ｋｌｅｍｐ  Ｍ，Ｇｌａｄｈａｕｇ  ＩＰ，Ｍｏｌｌｅｒ  Ｍ，Ｅｒｉｋｓｅｎ  ＪＡ，Ｇａｕｄｅｒｎａｃｋ  Ｇ，Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｅｃｔｅｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｕｔａｎｔ  Ｋ−ｒａｓ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｕ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１１；１２８（５）：１１２０−８，Ｅｐｕｂ  ２０１０／０５／１８、Ｂｒｏｎｔｅ  Ｖ，Ｍｕｒｒａｙ  ＰＪ．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｌｏｃａｌ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ｃａｎｃｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１５；２１（２）：１１７−９，Ｅｐｕｂ  ２０１５／０２／０６）。本願発明者らの発見は、ＭＥＫ阻害に応答したＰＤＡＣにおける腫瘍細胞とＴＡＭの両方におけるＳＴＡＴ３シグナル伝達軸の役割を暗示する。本願発明者らの結果はさらに、ＭＥＫ阻害剤、例えばコビメチニブ／ＰＤＧＦＲα、Ｓ６と、ＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ阻害剤、例えばポナチニブとの共処理は、原発性腫瘍内の骨髄細胞とがん細胞の両方を標的とすることができ、細胞死滅と腫瘍退縮の増大を引き起こすことを示唆する。
【００１９】
本明細書において開示される課題は、これ以降、より十分に説明される。しかしながら、本明細書において記述される本開示の課題の多くの修正形態および他の実施形態は、本開示の課題が関係する当業者には先行する説明に提示された教示の利益を享受して思い浮かぶであろう。したがって、本開示の課題は開示された特定の実施形態に限定されるべきではなく、修正および他の実施形態は添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることを理解されたい。換言すると、本明細書において記載される課題は、すべての代替形態、修正形態、および均等物を包含する。組み込まれた文献、特許、および類似の資料の１つ以上が、定義された用語、用語の使用法、記載された技術などを含むがこれらに限定されない本出願と異なるかまたは矛盾する場合、この出願が優先する。別途定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が本明細書の一部をなすものとする。
【００２０】
Ｉ．定義
用語「膵がん」は、膵臓に由来する新生物を指す。膵がんには、外分泌がんおよび内分泌がんが含まれる。ほとんどの膵がんは外分泌腫瘍である。膵内分泌腫瘍は島細胞腫瘍とも呼ばれる。残念なことに、現在では、膵がんの予後は、早期に発見されたときでさえ不良である。本明細書において記載される方法で治療することができる膵がんには、外分泌膵がんおよび内分泌膵がんが含まれるがこれらに限定されない。外分泌性膵がんとしては、腺がん、腺房細胞がん、腺扁平上皮がん、粘液がん、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化がん、肝様腺がん、膵管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腫瘍、膵芽腫、漿液性嚢胞腺腫、印環細胞がん、充実性偽乳頭状腫瘍、膵管がん、ならびに未分化がんが含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、膵外分泌がんは膵管がんである。膵内分泌がんには、インスリノーマおよびグルカゴノーマが含まれるがこれらに限定されない。
【００２１】
いくつかの実施形態において、膵がんは、早期膵がん、非転移性膵がん、原発性膵がん、切除膵がん、進行性膵がん、局所進行性膵がん、転移性膵がん、切除不能膵がん、寛解中の膵がん、再発性膵がん、補助療法中の膵がん、または術前補助療法中の膵がんのいずれかである。いくつかの実施形態において、膵がんは局所進行膵がん、切除不能膵がん、または転移性膵管がんである。いくつかの実施形態において、膵がんはゲムシタビンに基づく治療に抵抗性である。いくつかの実施形態において、膵がんはゲムシタビンに基づく治療に難治性である。
【００２２】
本明細書において記載される方法は、以下の目的のうちの任意の１つ以上に使用することができる：膵がんの１つ以上の病状の緩和、膵がんの進行の遅延、膵がんの腫瘍サイズの縮小、膵がんの間質の破壊（破壊など）、膵臓の腫瘍増殖の阻害、全生存期間の延長、無病生存期間の延長、膵がん疾患進行までの期間の延長、膵がん腫瘍転移の予防または遅延、既存の膵がん腫瘍転移の減少（根絶など）、既存の膵がん腫瘍転移の発生または負担の軽減、膵がんの再発防止、および／または膵がん患者の臨床的利益の改善。
【００２３】
本明細書において記載される膵がん治療方法は、原発性腫瘍および転移性腫瘍を含む、膵がんの増殖、発生または拡大を阻害、緩徐化、または回復させるために、治療有効量のＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ阻害剤またはそれらの薬学的に許容される塩との組み合わせを、治療を必要とする対象（ヒトまたは動物）に投与するステップを含む。そのような投与は、投与された活性剤のうちの１つによって阻害される１つ以上のキナーゼおよび／または生存経路によって媒介される疾患の治療または予防のための方法を構成する。本明細書において開示される化合物の「投与」または「投与するステップ」は、本明細書において記載される任意の適切な製剤または投与経路を用いた、活性剤、またはそのプロドラッグもしくは他の薬学的に許容される誘導体の受容者への送達を包含する。ＭＥＫ阻害剤およびマルチキナーゼ阻害剤は、どちらの順序でも、連続的に、逐次的に、または両方の組み合わせで投与することができる。
【００２４】
用語「対象」は、霊長類（例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスなどを含むがこれらに限定されない哺乳動物などの動物を指す。ある特定の実施形態において、対象はヒトである。
【００２５】
用語「予防」または「予防的」は、組み合わせが投与されなかった場合に予想されるであろう疾患または状態の病状が継続的に非存在であることを指す。
【００２６】
本明細書において使用されるとき、用語「相乗的」は、２つ以上の単剤の相加効果よりも効果的な治療上の組み合わせを指す。ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ阻害剤とＭＥＫ阻害剤との間の相乗的相互作用の決定は、本明細書において記載されるアッセイから得られる結果に基づくことができる。例えば、本明細書に開示されているインビボまたはインビトロ方法。これらのアッセイの結果は、組み合わせ指数を得るために、ＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙの組み合わせ方法およびＣａｌｃｕＳｙｎソフトウェアによる用量効果分析を用いて分析することができる（Ｃｈｏｕ  ａｎｄ  Ｔａｌａｌａｙ，１９８４，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇｕｌ．２２：２７−５５）。提供された組み合わせは、１つ以上のアッセイシステムにおいて評価することができ、データは、抗がん剤間の相乗作用、相加作用、および拮抗作用を定量化するための標準プログラムを利用して分析することができる。例示的なプログラムは、ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙによって、Ｎｅｗ  Ａｖｅｎｕｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２に記載されている。０．８未満の組み合わせ指数値は相乗作用を示し、１．２を超える値は拮抗作用を示し、０．８〜１．２の値は相加効果を示す。組み合わせ治療薬は、「相乗効果」を提供し、「相乗的」、すなわち、共に使用される活性剤が化合物を別個に使用することから生じる効果の合計よりも大きいときに達成される効果を立証することができる。相乗効果は、活性剤が以下のときに達成され得る：（１）組み合わせた単位投与製剤で同時に共製剤化され、投与または送達される、（２）別個の製剤として、交互にまたは並行して送達される、または（３）他の投与計画による。交互療法で送達されるとき、化合物が逐次的に投与または送達されるとき、例えば別個の注射器中の異なる注射によって相乗効果が達成され得る。一般に、交互療法の間、有効用量の各々の活性剤は逐次的に、すなわち連続的に投与されるが、組み合わせ治療薬においては、有効量の２つ以上の活性剤が共に投与される。併用効果は、ブリス独立性モデルと最高単剤（ＨＳＡ）モデルの両方を用いて評価することができる（Ｌｅｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３：８０（２００７））。ブリススコアは単剤からの増強の程度を定量化し、そして正のブリススコア（０より大きい）は単純な相加性より大きいことを示唆する。２５０を超える累積陽性ブリススコアは、試験した濃度範囲内で観察された強い相乗効果とみなされる。ＨＳＡスコア（０より大きい）は、対応する濃度での単剤の応答の最大値より大きい併用効果を示唆する。
【００２７】
「スフェロイド」は、生物学的細胞が３つの次元の全てにおいて増殖するかまたはそれらの周囲と相互作用する人工的環境における三次元（３Ｄ）細胞培養として当該分野で知られている細胞培養をいう。ペトリ皿などの２Ｄ環境とは異なり、３Ｄ細胞培養では、インビボでの増殖方法と同様に、インビトロで全ての方向での細胞の増殖を可能にする。人工環境は、特定の栄養素や細胞の増殖を可能にするその他の因子を提供する培地を含む。本明細書において記載される培地は、迅速な細胞培養のための環境を提供する。「急速な」という用語は、比較培地における同一の細胞増殖に必要な期間より短い期間を指す。
【００２８】
用語「接触する」または「接触すること」は、活性剤が標的に結合し、その活性を阻害し、減少させる、または低減することができるように、標的である酵素または生存経路に対して活性剤を十分接近させていることを意味する。
【００２９】
本明細書において使用されるとき、用語「哺乳動物」は、ヒトおよび全ての他の哺乳動物をいう。本明細書において使用されるとき、用語「哺乳動物」は「対象」または「患者」を含み、そして温血動物を指す。モルモット、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、動物園の動物、家畜、霊長類、およびヒトはすべて、この用語の意味の範囲内の動物の例であると理解される。
【００３０】
本明細書において使用されるとき、「それを必要とする哺乳動物」は、治療されることが意図される特定の状態、例えば膵がんまたは特定の型の膵がんに罹患していると診断された対象である。
【００３１】
用語「治療する」および「治療」は、治療的治療と予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃまたはｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方を指し、その目的は、がんの発症または拡大などの望ましくない生理学的変化または障害を予防または減速（軽減）することである。本開示の目的のために、有益なまたは望ましい臨床結果には、病状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち悪化しない）、疾患の進行の遅延または緩徐化、病態の寛解または好転、および検出可能か検出不能かにかかわらず緩解（部分的または全体的）が含まれるがこれらに限定されない。「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較して延長された生存期間を意味することもできる。治療の必要のあるものは、状態もしくは障害をすでに有するもの、および状態もしくは障害を有する傾向にあるもの、または状態もしくは障害を予防すべきものを含む。
【００３２】
本明細書における用語「阻害剤」の使用は、標的酵素の活性を阻害する分子を意味することを意味する。本明細書において「阻害する」とは、阻害剤の非存在下でのその酵素の活性と比較して、標的酵素の活性を減少させることを意味する。いくつかの実施形態において、用語「阻害する」は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％の、ＭＥＫ活性の低下またはがん細胞の特定の生存経路の低下を意味する。他の実施形態において、阻害は、約５％〜約２５％、約２５％〜約５０％、約５０％〜約７５％、または約７５％〜１００％の活性の減少を意味する。いくつかの実施形態において、阻害は、約９５％〜１００％の活性の低下、例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の活性の低下を意味する。そのような減少は、当業者によって認識され得るであろう、インビトロキナーゼアッセイを含む様々な技術を使用して測定できる。
【００３３】
本明細書中で使用されるとき、「ＭＥＫ阻害剤」は、ＭＥＫ（ＭＥＫ１および／またはＭＥＫ２）の１つ以上の生物活性を低減する、阻害する、またはそうでなければ減退させる分子である。活性は、適切な対照と比較して、例えば少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％または１００％の減少を含む統計的に有意な量のＭＥＫの活性を減少し得る。
【００３４】
本明細書中で使用されるとき、「マルチキナーゼ阻害剤」は、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３の生物活性を低減する、阻害する、またはそうでなければ減退させる分子である。好適なマルチキナーゼ阻害剤は、これら３つの標的の各々に対して活性を示し、そしてさらなる標的に対して活性を有し得る。例えば、実施形態において、マルチキナーゼ阻害剤は、膵腫瘍に関連する腫瘍関連マクロファージにさらに作用する。ＭＥＫ阻害剤と組み合わせたときにこれらの標的の各々に作用するマルチキナーゼ阻害剤の能力は、膵がんに対して優れた有効性を提供する。活性は、適切な対照と比較して、例えば少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％または１００％の減少を含む統計的に有意な量の標的の活性を減少し得る。
【００３５】
本開示の化合物は特異的な阻害剤であってもなくてもよい。「特異的な阻害剤」とは、関連のない標的の活性よりも規定された標的の活性を減少させる、阻害する、またはそうでなければ減退させる剤を意図する。例えば、ＭＥＫ特異的アンタゴニストは、ＭＥＫの少なくとも１つの生物活性を、任意の他のタンパク質（例えば、他のセリン／スレオニンキナーゼ）に対するアンタゴニストの阻害効果より顕著に大きい量で減少させる。いくつかの実施形態において、標的に対するアンタゴニストのＩＣ５０は、非標的に対するアンタゴニストのＩＣ５０の約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、１％、０．１％、０．０１％、０．００１％、またはそれ以下である。特異的ＭＥＫ阻害剤は、ＭＥＫの１つ以上のファミリーメンバーの生物活性を、任意の他のタンパク質（例えば、他のセリン／スレオニンキナーゼ）に対するアンタゴニストの阻害効果より顕著に大きい量で減少させる。これらの実施形態のいくつかにおいて、ＲＡＦに対するＭＥＫ阻害剤のＩＣ５０は、他のセリン／スレオニンキナーゼ、他のＭＥＫファミリーメンバーまたは他の型のキナーゼ（例えば、チロシンキナーゼ）に対するＭＥＫ阻害剤のＩＣ５０の約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、０．１％、０．０１％、０．００１％、またはそれ以下である。
【００３６】
用語「標的」または「標的とする」は、特定のＭＥＫ酵素または生存経路に関連する特定の酵素に対して特異的に作用する活性剤の能力を指す。酵素を標的とする活性剤の能力は、本明細書において記載されるように日常的な実験を通して、または他の公知の方法を使用して決定され得る。
【００３７】
本明細書において使用されるとき、「生存経路」とは、がん細胞の生存および増殖を促進し、そして活性剤に対して抵抗性になる適応性の機構または能力を指す。本明細書において使用されるとき、生存経路は、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３に関連している。
【００３８】
語句「治療有効量」は、（ｉ）膵がんを治療または予防する、（ｉｉ）膵がんの１つ以上の病状を軽減、寛解、または解消する、または（ｉｉｉ）膵がんの１つ以上の病状の発症を予防または遅延する活性剤の量を意味する。治療上有効量の薬物はがん細胞の数を減らすことができ、腫瘍サイズを低減し、末梢臓器へのがん細胞浸潤を阻害し（すなわち、ある程度緩徐化し、そして好ましくは停止させる）、腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度緩徐化し、そして好ましくは停止させる）、腫瘍増殖をある程度阻害し、および／またはがんに関連する病状のうちの１つ以上をある程度軽減する。薬物が増殖を妨げおよび／または既存のがん細胞を殺し得る限りにおいて、それは細胞増殖抑制性および／または細胞傷害性であり得る。がん治療の場合、有効性は、例えば、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）を評価することおよび／または奏効率（ＲＲ）を決定することによって測定することができる。
【００３９】
用語「薬学的に許容される塩」は、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではない塩を意味する。薬学的に許容される塩は、酸付加塩と塩基付加塩の両方を含む。語句「薬学的に許容される」は、物質または組成物が、製剤を構成する他の成分および／またはそれを用いて治療される哺乳動物と化学的および／または毒物学的に適合性でなければならないことを示す。本明細書で使用されるとき、語句「薬学的に許容される塩」は、分子の薬学的に許容される有機塩または無機塩を指す。例示的な塩としては、硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびパモエート（すなわち１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート））塩が含まれるがこれらに限定されない。薬学的に許容される塩は、酢酸イオン、コハク酸イオンまたは他の対イオンなどの別の分子を包含し得る。対イオンは、親化合物上の電荷を安定化させる任意の有機または無機部分であり得る。さらに、薬学的に許容される塩はその構造中に１を超える荷電原子を有していてもよい。複数の荷電原子が薬学的に許容される塩の一部である場合は、複数の対イオンを有する可能性がある。それ故、薬学的に許容される塩は、１つ以上の荷電原子および／または１つ以上の対イオンを有することができる。例としては、コビメチニブおよびポナチニブＨＣｌのフマル酸塩またはヘミフマル酸塩が含まれるがこれらに限定されない。
【００４０】
必要に応じて追加の定義を以下に提供する。
【００４１】
ＩＩ．インビボ方法
ＭＥＫ阻害剤とＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ阻害剤との本開示の組み合わせは、膵がんの治療に有用である。
【００４２】
実施形態において、膵がんの治療を必要とする対象において膵がんを治療する方法であって、治療有効量の活性剤の組み合わせを上記対象に投与するステップを含み、上記組み合わせが、ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ剤またはその薬学的に許容される塩とを含む、方法が本明細書において開示される。この実施形態は、腫瘍関連マクロファージの増殖を阻害することをさらに含み得る。
【００４３】
使用され得るＭＥＫ阻害剤の例としては、コビメチニブ、ＧＤＣ−０６２３、トラメチニブ、ビニメチニブ、セルメチニブ、ピマセルチニブ、レファメチニブ、ＰＤ−０３２５９０１およびＢＩ−８４７３２５、またはそれらの薬学的に許容される塩が含まれる。一実施形態において、ＭＥＫ阻害剤はコビメチニブまたはその薬学的に許容される塩である。コビメチニブは以下の構造を有する。
【化１】
2019526559.tif 000003
【００４４】
コビメチニブはＣｏｔｅｌｌｉｃ（登録商標）として販売されており、そしてヘミフマル酸塩として市販の製剤中に見出される。
【００４５】
ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とする有用なマルチキナーゼ剤はポナチニブである。ポナチニブは以下の構造を有する。
【化２】
2019526559.tif 000004
【００４６】
ポナチニブは、Ｉｃｌｕｓｉｇ（登録商標）として販売されており、塩酸塩として市販の製剤中に見出される。
【００４７】
膵がんには、内分泌がんおよび外分泌がんが含まれる。実施形態において、膵がんは、腺がん、腺房細胞がん、腺扁平上皮がん、粘液がん、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化がん、肝様腺がん、膵管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腫瘍、膵芽腫、漿液性嚢胞腺腫、印環細胞がん、充実性偽乳頭状腫瘍、膵管がん、ならびに未分化がんからなる群から選択される。一実施形態において、膵がんは膵管腺がんである。
【００４８】
実施形態において、ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩とは相乗的である。すなわち、組み合わせは、両方の剤の相加効果よりも高いレベルの有効性を提供する。実施形態において、一方または両方の活性剤単独では、膵がんに対して所望の有効性を示さない。コビメチニブまたはその薬学的に許容される塩とポナチニブまたはその薬学的に許容される塩の例では、どちらの剤単独でも膵がんに対して有効であるとは知られていない。
【００４９】
実施形態において、ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と上記マルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩は、組み合わせ製剤として投与される。実施形態において、組み合わせ治療薬は、同時または逐次投与計画として投与することができる。逐次的に投与するとき、組み合わせは２回以上の投与で投与することができる。混合投与は、別々の製剤または単一の薬学的製剤を使用する共投与、および両方の（または全ての）活性剤がその生物活性を同時に発揮する期間が好ましくは存在するいずれかの順序での連続投与を含む。
【００５０】
膵がんを治療する方法は、１つ以上の標的酵素または生存経路の活性を減少させる、阻害する、またはそうでなければ減退させる。膵腫瘍に関連する腫瘍関連マクロファージもまた標的とされ得る。インビトロキナーゼアッセイ、リン酸化標的に特異的な抗体による免疫ブロット、または活性の下流の生物学的効果の測定を含む、ＭＥＫ活性またはＰＤＧＦＲα、Ｓ６、ＳＴＡＴ３および腫瘍関連マクロファージ活性化のレベルを測定するための当技術分野において公知の任意の方法を使用して、組み合わせの活性を決定できる。
【００５１】
膵がんは初期段階でも後期段階でもよく、また転移していることもある。本明細書において記載される組み合わせは、転移したがんを含む任意のステージのがんを治療するために使用することができる。
【００５２】
有効量のＭＥＫ阻害剤とＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ阻害剤との組み合わせによる対象の治療は、単一治療を含むことができ、または一連の治療を含むことができる。
【００５３】
活性剤の有用な量は本明細書のいずこかの場所に記載されている通りである。特定の実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は約５ｍｇ〜約１００ｍｇ、または約４５ｍｇ〜約７５ｍｇの量で投与され、そしてマルチキナーゼ阻害剤は約５ｍｇ〜約１００ｍｇ、または約３０ｍｇ〜約６０ｍｇの量で投与される。実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は約６０ｍｇの量で投与され、そしてマルチキナーゼ阻害剤は約４５ｍｇの量で投与される。実施形態において、組み合わせ治療薬の投与は１日１回の経口投与である。実施形態において、ＭＥＫ阻害剤がコビメチニブまたはその薬学的に許容される塩であり、マルチキナーゼ阻害剤がポナチニブまたはその薬学的に許容される塩であることが好ましい。いくつかの実施形態において、各々の活性剤は、約０．００１μｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの用量で対象に投与され、これには、約０．００１μｇ／ｋｇ、０．０１μｇ／ｋｇ、０．０５μｇ／ｋｇ、０．１μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、および２００ｍｇ／ｋｇが含まれるが、これらに限定されない。投与されるべき組み合わせ組成物中に存在する各々の活性剤の量は、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、または約５ｍｇ〜約１００ｍｇ、または約１０ｍｇ〜約８０ｍｇ、または約４５ｍｇ〜約７５ｍｇ、または約３０ｍｇ〜約６０ｍｇであり得る。活性化合物の適切な用量は、当業者または獣医師の知識の範囲内のいくつかの要素に依存することが理解される。活性剤の用量は、例えば、対象の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、および対象の食事、投与時間、投与経路、排泄率、および任意の薬物の組み合わせに依存して変動するであろう。治療に使用される有効な用量は、特定の治療の過程にわたって増加または減少し得ることも理解されよう。投与量の変化は、診断アッセイの結果から生じ、そして明らかになり得る。
【００５４】
いくつかの実施形態において、膵がんの治療を必要とする対象において膵がんを治療するための方法であって、ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩との組み合わせを対象に投与するステップを含み、追加の両方を適用することをさらに含む方法が本明細書において記載される。追加の療法は、放射線療法、外科手術（例えば、腫瘍切除術および乳房切除術）、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ療法、モノクローナル抗体療法、またはこれらの組み合わせであり得る。追加の療法は、補助療法または術前補助療法の形態であり得る。いくつかの実施形態において、追加の療法は抗転移薬の投与である。いくつかの実施形態において、追加の療法は副作用制限剤（例えば、抗悪心剤などの治療の副作用の発生および／または重篤度を軽減することを意図した剤）の投与である。いくつかの実施形態において、追加の療法は放射線療法である。いくつかの実施形態において、追加の治療は外科手術である。いくつかの実施形態において、追加の療法は放射線療法と外科手術の組み合わせである。いくつかの実施形態において、追加の療法はガンマ線照射である。
【００５５】
いくつかの実施形態において、治療は、治療の中止後に対象において持続的応答をもたらす。「持続的応答」とは、治療中止後の腫瘍増殖の低減に対する持続的効果を指す。例えば、腫瘍サイズは、投与段階の開始時のサイズと比較して同じで維持されるかまたはより小さくあり得る。いくつかの実施形態において、持続的応答は、治療期間と少なくとも同一の期間、治療期間の少なくとも１．５倍、２．０倍、２．５倍、または３．０倍の長さを有する。
【００５６】
本明細書において開示される治療方法は、部分的または完全な応答をもたらし得る。本明細書中で使用されるとき、「完全寛解」または「ＣＲ」とは、全ての標的病変の消失をさし、「部分寛解」または「ＰＲ」は、標的病変の最長直径の合計（ＳＬＤ）の、ベースラインＳＬＤを基準として、少なくとも３０％の減少を指し、「安定した疾患」または「ＳＤ」は、治療開始以来の最小のＳＬＤを基準にして、ＰＲに適格とするのに十分な標的病変の縮小もＰＤに適格とするのに十分な増加も示さないことを指す。本明細書で使用されるとき、「全奏効率」（ＯＲＲ）は、完全寛解（ＣＲ）率と部分寛解（ＰＲ）率の合計を指す。
【００５７】
本明細書において開示される治療方法は、組み合わせ治療薬を投与された対象の無増悪生存期間および全生存期間の増加をもたらし得る。本明細書において使用されるとき、「無増悪生存期間」（ＰＦＳ）は、治療中の疾患（例えば、がん）が悪化しない、治療中および治療後の期間の長さを指す。無増悪生存期間には、患者が完全寛解または部分寛解を経験した時間の長さ、および患者が安定した疾患を経験した時間の長さが含まれうる。
【００５８】
本明細書において使用されるとき、「全生存期間」とは、特定の期間の経過後に生存している可能性が高い群にある対象の割合をいう。
【００５９】
いくつかの実施形態において、組み合わせを投与される対象は、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、およびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）などの哺乳動物である。いくつかの実施形態において、治療される対象はヒトである。
【００６０】
膵がんの治療を必要とする対象は、がんの病状を示す人、がんと診断されたもの、膵がんから寛解している対象、またはがんを発症するリスクが高い対象（例えば、遺伝的素因、ある特定の食事または環境への曝露）であり得る。
【００６１】
本明細書において記載される多くの組み合わせは相乗的であると決定されるであろう。
【００６２】
本明細書において記載されるインビトロ方法は、培養のための培地に添加する前に熱湯加熱された血清を含む培地中で細胞を培養することを含む、スフェロイド細胞培養を調製する方法を使用する。培地は３−Ｄスフェロイドを迅速に培養するように改変され得ることが見出された。改変培地は、培養される細胞と接触させる前にウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を熱湯加熱することによって調製される。実施形態において、ＦＢＳは９５〜１００℃で１０分間熱湯加熱されており、その時点で血清の色は黄色に変わる。次いで、熱湯加熱したＦＢＳを８０００×ｇで２０分間遠心分離し、０．２２μｍのフィルター孔径を有する滅菌Ｃｏｒｎｉｎｇ真空フィルターユニットを通してろ過する。有用な培地は、約５％〜約２０％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清を含む。スフェロイド培養用の培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位ｍｌ−１のペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地に１０％（ｖ／ｖ）の熱湯加熱ＦＢＳを添加することによって調製する。スフェロイド培地は使用前に新たに調製する必要がある。熱湯加熱ＦＢＳは４℃で２〜３ヶ月保存できる。単層培養用の培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位ｍｌ−１のペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地に１０％（ｖ／ｖ）の正常ＦＢＳを添加することによって調製する。遊走アッセイ用の培地は、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位ｍｌ−１のペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地に２０％（ｖ／ｖ）の正常ＦＢＳを添加することによって調製する。
【００６３】
ＩＩＩ．組み合わせ薬学的組成物
実施形態において、本明細書において記載される課題は、膵がんの予防的治療または治療的治療のためのａ）ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ｂ）ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩との組み合わせに関する。
【００６４】
実施形態において、本明細書において記載される課題は、ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ剤またはその薬学的に許容される塩との組み合わせの有効量、薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物に関する。特定の実施形態において、薬学的組成物は膵がんの治療用である。
【００６５】
実施形態において、組成物は、コビメチニブ、ＧＤＣ−０６２３、トラメチニブ、ビニメチニブ、セルメチニブ、ピマセルチニブ、レファメチニブ、ＰＤ−０３２５９０１およびＢＩ−８４７３２５、またはそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択されるＭＥＫ阻害剤を含む。一実施形態において、ＭＥＫ阻害剤はコビメチニブまたはその薬学的に許容される塩である。特定の実施形態において、ＭＥＫ阻害剤はヘミフマル酸コビメチニブである。
【００６６】
実施形態において、マルチキナーゼ剤は、ポナチニブまたはその薬学的に許容される塩である。一実施形態において、マルチキナーゼ阻害剤は塩酸ポナチニブである。
【００６７】
実施形態において、組成物は、コビメチニブまたはその薬学的に許容される塩と、ポナチニブまたはその薬学的に許容される塩とを含む。実施形態において、組成物はヘミフマル酸コビメチニブと塩酸ポナチニブとを含む。
【００６８】
組み合わせ中に存在する各々の活性剤の量は、約１ｍｇ〜約１０００ｍｇ、または約５ｍｇ〜約１００ｍｇ、または約１０ｍｇ〜約８０ｍｇ、または約４５ｍｇ〜約７５ｍｇ、または約３０ｍｇ〜約６０ｍｇであり得る。実施形態において、ＭＥＫ阻害剤は約４５ｍｇ〜約７５ｍｇの量で存在し、上記マルチキナーゼ阻害剤は約３０ｍｇ〜約６０ｍｇの量で存在する。
【００６９】
組み合わせ治療薬は、「相乗効果」を提供し、「相乗的である」こと、すなわち、活性剤が一緒に使用されたときに達成される効果が、これらの活性剤を別個に使用することから生じる効果の合計よりも大きいことを示し得る。相乗効果は、活性剤が以下のときに達成され得る：（１）組み合わせた単位投与製剤で同時に共製剤化され、投与または送達される、（２）別個の製剤として、交互にまたは並行して送達される、または（３）他の投与計画による。交互療法で送達されるとき、活性剤が逐次的に投与または送達されるとき、例えば別個の注射器中の異なる注射、別個の丸剤もしくはカプセル剤、または別個の注入によって相乗効果が達成され得る。一般に、交互療法の間、有効用量の各々の活性剤は逐次的に、すなわち連続的に投与されるが、組み合わせ治療薬においては、有効量の２つ以上の活性剤が共に投与される。
【００７０】
ＭＥＫ阻害剤および／またはマルチキナーゼ阻害剤は、本明細書において各々が活性剤とも呼ばれ、標準的な薬務に従って薬学的組成物として製剤化することができる。例示的なマルチキナーゼ阻害剤、ポナチニブは、１５ｍｇ、３０ｍｇ、および４５ｍｇの強度で経口投与用の錠剤として入手可能である。例示的なＭＥＫ阻害剤、コビメチニブは、経口投与用の錠剤として２０ｍｇの強度で入手可能である。しかしながら、この態様によれば、ＭＥＫ阻害剤もしくはマルチキナーゼ阻害剤またはその両方を、担体または希釈剤などの薬学的に許容される賦形剤と共に含む他の薬学的組成物が提供される。
【００７１】
典型的な製剤は、活性剤と１種以上の賦形剤を混合することによって調製される。適切な賦形剤は当業者に周知であり、炭水化物、ワックス、水溶性および／または膨潤性ポリマー、親水性または疎水性物質、ゼラチン、油、溶媒、水などの物質が含まれる。使用される特定の賦形剤は、活性剤が適用されている手段および目的に依存するであろう。溶媒は一般に、哺乳動物に投与するのに安全であると当業者によって認識されている溶媒（ＧＲＡＳ）に基づいて選択される。一般に、安全な溶媒は、水のような無毒の水性溶媒および水に可溶性または混和性の他の無毒の溶媒である。好適な水性溶媒には、水、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ３００）など、およびそれらの混合物が含まれる。製剤はまた、１種以上の緩衝剤、安定化剤、界面活性剤、湿潤剤、潤滑剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、抗酸化剤、不透明剤、滑剤、加工助剤、着色剤、甘味剤、芳香剤、香味剤、および活性剤の洗練された体裁を提供するか、または医薬製品（すなわち、医薬）の製造を補助するための他の既知の添加剤をも含み得る。
【００７２】
製剤は、従来の溶解および混合手順を用いて調製することができる。例えば、バルク原薬（すなわち、活性剤または活性剤の安定化形態（例えば、シクロデキストリン誘導体または他の既知の錯化剤との複合体））を、上述の１種以上の賦形剤の存在下で好適な溶媒に溶解する。活性剤は、典型的には、薬物の容易に制御可能な投与量を提供し、そして処方された投与計画に対する患者の服薬順守を可能にするために医薬剤形に製剤化される。
【００７３】
適用のための薬学的組成物（または製剤）は、薬物を投与するために使用される方法に応じて様々な方法で包装することができる。一般に、流通用物品は、適切な形態で医薬製剤を中に入れた容器を含む。好適な容器は当業者には周知であり、ボトル（プラスチックおよびガラス）、サシェ、アンプル、プラスチック袋、金属製シリンダーなどの物質が含まれる。容器はまた、包装内容物への不注意な接近を防止するための不正開封防止の組み合わせ資材を含んでもよい。さらに、容器の上に容器の内容物を記載するラベルが貼られている。ラベルには適切な警告も含まれる場合がある。一実施形態において、容器はブリスターパックである。
【００７４】
医薬製剤は、様々な投与経路および投与型のために調製することができる。例えば、所望の程度の純度を有する活性剤を任意選択的に薬学的に許容される賦形剤と、凍結乾燥製剤、粉砕粉末、または水溶液で混合することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）。製剤化は、周囲温度で適切なｐＨで所望の純度で、生理学的に許容可能な担体、すなわち使用される投与量および濃度で受容者に対して無毒である担体と混合することによって実施され得る。製剤のｐＨは、主に特定の用途および化合物の濃度に依存するが、約３〜約８の範囲であり得る。ｐＨ５の酢酸緩衝液中での製剤化は好適な実施形態である。
【００７５】
活性剤は滅菌であり得る。特に、インビボ投与に使用される製剤は滅菌される必要がある。そのような滅菌は、滅菌ろ過膜を通してろ過することによって容易に達成される。
【００７６】
活性剤は通常、固体組成物、凍結乾燥製剤または水溶液として保存することができる。
【００７７】
活性剤を含む薬学的組成物は、様式、すなわち量、濃度、スケジュール、治療単位、ビヒクルおよび投与経路で、優れた医療行為と一致する形で製剤化、投与および投与することができる。これに関連して考慮すべき要素は、治療される特定の傷害、治療される特定の哺乳動物、個別の患者の臨床状態、傷害の原因、剤の送達部位、投与方法、投与計画、および医療従事者に知られている他の要素を含む。投与される化合物の「治療有効量」はそのような考慮事項によって左右されるであろう。許容可能な賦形剤は、使用される用量および濃度において、レシピエントに対して非毒性でありリン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン等のアミノ酸；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはポリソルベート（例えば、ＴＷＥＥＮ（商標））、ポロキサマー（たとえば、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標））もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含み得る。活性剤はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルによって調製されたマイクロカプセル中に、コロイド状ドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルション中に、捕捉され得る。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに開示されている。
【００７８】
活性剤の徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適切な例には、活性剤を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、マトリックスは、成形品の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（ＵＳ３７７３９１９）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロスフェアなどの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標））ならびにポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【００７９】
製剤は、本明細書において詳述される投与経路に適したものを含む。製剤は、単位剤形で都合よく提供されてもよく、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製されてもよい。技術および製剤は一般にＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見られる。そのような方法は、活性剤を１種以上の副成分を構成する担体と会合させる工程を含む。一般に、製剤は、活性剤を液体担体もしくは微粉化した固体担体または両方と均一かつ密接に会合させ、次いで必要ならば生成物を成形することにより製造される。
【００８０】
経口投与に適した活性剤の製剤は、各々が所定量の活性剤を含む丸剤、カプセル剤、カシェ剤または錠剤などの個別の単位として調製することができる。
【００８１】
圧縮錠剤は、任意選択的に結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性剤または分散剤と混合された粉末または顆粒のような自由流動形態の活性剤を適切な機械で圧縮することによって調製され得る。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末活性剤の混合物を適切な機械で成形することによって製造することができる。錠剤は、任意選択的に被覆または刻み目を入れることができ、任意選択的にそれからの活性剤の徐放または制御放出を提供するように製剤化される。
【００８２】
錠剤、トローチ剤、ロゼンジ、水性または油性懸濁液、分散性粉末または顆粒、エマルション、硬または軟カプセル、例えばゼラチンカプセル、シロップまたはエリキシルは経口使用のために調製され得る。経口使用を目的とした活性剤の製剤は、薬学的組成物の製造のための当該技術分野において既知の任意の方法に従って調製することができ、そのような組成物は、口当たりの良い製剤を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤を含む１つ以上の剤を含み得る。錠剤の製造に適した薬学的に許容される無毒の賦形剤と混合した活性剤を含む錠剤は許容される。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウムまたは炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤、トウモロコシデンプン、またはアルギン酸などの造粒剤および崩壊剤、デンプン、ゼラチン、またはアカシアなどの結合剤、およびステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルクなどの滑剤であり得る。錠剤は被覆されていなくてもよく、または胃腸管内での崩壊および吸収を遅らせ、それによって長期間にわたって持続作用をもたらすためのマイクロカプセル化を含む既知の技術によって被覆されていてもよい。例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートのような時間遅延物質を単独でまたはワックスと共に用いてもよい。
【００８３】
活性剤の水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤と混合した剤を含む。このような賦形剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クロスカルメロース、ポビドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアガムなどの懸濁剤、および天然ホスファチド（例えばレシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸および無水ヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物（例、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）などの分散剤または湿潤剤が含まれる。水性懸濁液は、エチルｐ−ヒドロキシ安息香酸またはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸などの１種以上の保存剤、１種以上の着色剤、１種以上の香味剤、およびスクロースまたはサッカリンなどの１種以上の甘味剤も含み得る。
【００８４】
活性剤の薬学的組成物は、滅菌注射用水性または油性懸濁液などの滅菌注射用製剤の形態であり得る。この懸濁液は、上述の適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して既知の技術に従って製剤化することができる。滅菌注射用製剤は、１，３−ブタンジオールなどの非毒性の非経口として許容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。滅菌注射用製剤はまた、凍結乾燥粉末として調製され得る。使用され得る許容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、リンガー液および生理食塩液である。加えて、滅菌の不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として慣習的に使用され得る。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性不揮発性油が使用され得る。さらに、オレイン酸などの脂肪酸も同様に注射剤の調製に使用することができる。
【００８５】
単一剤形を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性剤の量は、治療を受ける宿主および特定の投与方法に応じて変動し得る。例えば、ヒトへの経口投与を意図した徐放性製剤は、全組成物の約５から約９５％（重量：重量）まで変動し得る適切かつ都合のよい量の担体物質と配合した約１から１０００ｍｇの活性剤を含み得る。薬学的組成物は、投与用に容易に測定可能な量を提供するように調製することができる。例えば、静脈内注入を目的とする水溶液は、約３０ｍＬ／時の速度で好適な容量の注入が起こり得るように、溶液１ミリリットルあたり約３〜５００μｇの活性剤を含み得る。
【００８６】
非経口投与に適した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および製剤を意図する受容者の血液と等張にする溶質を含み得る水性および非水性の滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤および増粘剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。
【００８７】
直腸投与用の製剤は、例えばココアバターまたはサリチル酸塩を含む適切な基剤を有する坐剤として提供され得る。
【００８８】
肺内投与または経鼻投与に適した製剤は、例えば、０．１〜５００ミクロンの範囲の粒径（０．５、１、３０ミクロン、３５ミクロンなどのミクロン単位で増大する０．１ミクロン〜５００ミクロンの範囲の粒径を含む）を有し、これは、肺胞嚢に到達するように、鼻腔からの急速吸入または口からの吸入によって投与される。好適な製剤は、活性剤の水溶液または油性溶液を含む。エアロゾルまたは乾燥粉末投与に適した製剤は、従来の方法に従って調製することができ、そして以下に記載されるような治療または予防障害においてこれまでに使用されている化合物などの他の治療薬と共に送達することができる。
【００８９】
膣内投与に適した製剤は、活性剤に加えて当該技術分野において適切であることが知られているような担体を含むペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー製剤として提供されてもよい。
【００９０】
製剤は、単位用量または複数用量の容器、例えば密封アンプルおよびバイアルに包装することができ、そして使用直前に、注射のために、滅菌液体担体、例えば、水の添加のみを必要とする凍結乾燥（凍結乾燥）状態で保存することができる。即席の注射溶液および懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製される。好ましい単位投与製剤は、本明細書において上述されるような１日用量もしくは単位１日サブ用量、またはその適切な部分の活性剤を含むものである。
【００９１】
本課題は、獣医用担体と共に上述で定義された少なくとも１つの活性剤を含む獣医学的組成物をさらに提供する。獣医用担体は、組成物を投与する目的に有用な物質であり、そして獣医学の技術分野において他の点では不活性であるか許容され、そして活性剤と適合性である固体、液体、または気体物質であり得る。これらの獣医学的組成物は、非経口的に、経口的に、または他の任意の所望の経路によって投与され得る。
【００９２】
ＩＶ．製造品
別の態様において、本明細書に記載されているのは、製造品、例えば、膵がんの治療に有用な物質を含む「キット」である。キットは、膵がんの治療のための、ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩との組み合わせを含む容器を含む。キットは、容器上または容器に付随するラベルまたは添付文書をさらに含み得る。用語「添付文書」は、そのような治療用製品の使用に関する適応症、使用法、投与量、投与、禁忌および／または警告についての情報を含む、治療用製品の市販パッケージに通常含まれる指示を指すために使用される。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、注射器、ブリスターパックなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチック等の様々な材料から形成することができる。容器は、状態を治療するのに有効な、ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩とマルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩との組み合わせを保持し、そして滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。ラベルまたは添付文書は、組成物が膵がんの治療に使用されることを示している。あるいは、またはさらに、製品は、注射用静菌液（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液等の薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器をさらに含み得る。それはさらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、および注射器を含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の物質を含み得る。
【００９３】
キットは、ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩、および別々に製剤化されている場合はマルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩製剤の投与のための指示書をさらに含み得る。例えば、キットが、ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩を含む第１の組成物、およびマルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩を含む第２の医薬製剤を含む場合、キットは、治療を必要とする患者への第１および第２の薬学的組成物の同時、逐次、または別個の投与のための指示書をさらに含み得る。
【００９４】
別の実施形態において、キットは、ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩とマルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩との組み合わせの固体経口形態の送達に適している。そのようなキットは、好ましくは複数の単位投与量を含む。そのようなキットは、それらの意図された使用の順序で並べられた投与量を有するカードを含み得る。そのようなキットの例は「ブリスターパック」である。ブリスターパックは包装業界では周知され、医薬単位剤形の包装に広く使用されている。必要に応じて、例えば数字、文字、もしくは他のマーキングの形で、または投与量を投与することができる治療スケジュールの日を指定するカレンダー挿入物による、記憶補助を提供することができる。
【００９５】
一実施形態によれば、キットは、（ａ）ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩を含む第１の容器と、任意選択的に（ｂ）マルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩製剤を含む第２の容器とを含み得る。あるいは、またはさらに、キットは、注射用静菌液（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液等の薬学的に許容される緩衝液を含む第３の容器をさらに含み得る。それはさらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、および注射器を含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の物質を含み得る。
【００９６】
キットがＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩とマルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩との組成物を含む他の特定の実施形態において、キットは、個別のボトルまたは、個別に分けられたホイルパケットなどの別個の組成物を含む容器を含み得るが、別個の組成物が単一の分割されていない容器内に収容されていてもよい。典型的には、キットは別個の成分の投与のための指示書を含む。キット形態は、別個の成分が好ましくは異なる剤形（例えば、経口と非経口）で投与されるとき、異なる投与間隔で投与されるとき、または組み合わせの個別の成分の用量設定が処方医によって望まれるときに特に有利である。
【００９７】
さらに別の実施形態において、本明細書において記載される課題は、予め熱湯加熱されている血清、すなわち培地での使用前に一定時間熱湯加熱されている血清を使用する培地に関する。この培地は、熱湯加熱されていない正常血清を使用する培地と比較して、スフェロイドの迅速な形成をもたらす。実施形態において、細胞を培養するための培地は約１０％の熱湯加熱されたウシ胎仔血清を含み、上記血清は培地に添加する前に９５〜１００℃で１０分間熱湯加熱されている。
【００９８】
本明細書において記載される課題は、以下の特定の実施形態を含む。
【００９９】
１．膵がんの治療を必要とする対象において膵がんを治療する方法であって、有効量の活性剤の組み合わせを上記対象に投与するステップを含み、上記組み合わせが、ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ剤またはその薬学的に許容される塩とを含む、方法。
【０１００】
２．上記ＭＥＫ阻害剤が、コビメチニブ、ＧＤＣ−０６２３、トラメチニブ、ビニメチニブ、セルメチニブ、ピマセルチニブ、レファメチニブ、ＰＤ−０３２５９０１およびＢＩ−８４７３２５、またはそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、実施形態１に記載の方法。
【０１０１】
３．上記ＭＥＫ阻害剤が、コビメチニブ、およびトラメチニブ、またはそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、上述のいずれかの実施形態に記載の方法。
【０１０２】
４．上記ＭＥＫ阻害剤が、コビメチニブまたはその薬学的に許容される塩である、上述のいずれかの実施形態に記載の方法。
【０１０３】
５．上記マルチキナーゼ剤が、ポナチニブまたはその薬学的に許容される塩である、上述のいずれかの実施形態に記載の方法。
【０１０４】
６．上記膵がんが内分泌がんである、上述のいずれかの実施形態に記載の方法。
【０１０５】
７．上記膵がんが外分泌がんである、上述のいずれかの実施形態に記載の方法。
【０１０６】
８．上記膵がんが、腺がん、腺房細胞がん、腺扁平上皮がん、粘液がん、破骨細胞様巨細胞を伴う未分化がん、肝様腺がん、膵管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腫瘍、膵芽腫、漿液性嚢胞腺腫、印環細胞がん、充実性偽乳頭状腫瘍、膵管がん、および未分化がんである、上述のいずれかの実施形態に記載の方法。
【０１０７】
９．上記膵がんが膵管腺がんである、上述のいずれかの実施形態に記載の方法。
【０１０８】
１０．上記組み合わせが相乗的である、上述のいずれかの実施形態に記載の方法。
【０１０９】
１１．上記活性剤が逐次に投与される、上述のいずれかの実施形態に記載の方法。
【０１１０】
１２．上記活性剤が同時に投与される、上述のいずれかの実施形態に記載の方法。
【０１１１】
１３．上記ＭＥＫ阻害剤および上記マルチキナーゼ阻害剤が組み合わせ製剤として投与される、上述のいずれかの実施形態に記載の方法。
【０１１２】
１４．上記ＭＥＫ阻害剤が約４５ｍｇ〜約７５ｍｇの量で投与され、上記マルチキナーゼ阻害剤が約３０ｍｇ〜約６０ｍｇの量で投与される、上述のいずれかの実施形態に記載の方法。
【０１１３】
１５．上記量が１日１回投与される、上述のいずれかの実施形態に記載の方法。
【０１１４】
１６．上記ＭＥＫ阻害剤がコビメチニブ、またはヘミフマル酸コビメチニブなどのその薬学的に許容される塩であり、上記マルチキナーゼ阻害剤がポナチニブ、またはポナチニブＨＣｌなどのその薬学的に許容される塩である、上述のいずれかの実施形態に記載の方法。
【０１１５】
１７．膵がんの予防的治療または治療的治療のためのａ）ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ｂ）ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩との組み合わせ。
【０１１６】
１８．有効量の、ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩と、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とするマルチキナーゼ剤またはその薬学的に許容される塩との組み合わせと、薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物であって、上記組成物が膵がんの治療用である、組成物。
【０１１７】
１９．上記ＭＥＫ阻害剤が、コビメチニブ、ＧＤＣ−０６２３、トラメチニブ、ビニメチニブ、セルメチニブ、ピマセルチニブ、レファメチニブ、ＰＤ−０３２５９０１およびＢＩ−８４７３２５、またはそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、上述のいずれかの実施形態に記載の組成物。
【０１１８】
２０．上記ＭＥＫ阻害剤が、コビメチニブ、およびトラメチニブ、またはそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、上述のいずれかの実施形態に記載の組成物。
【０１１９】
２１．上記ＭＥＫ阻害剤が、コビメチニブまたはその薬学的に許容される塩である、上述のいずれかの実施形態に記載の組成物。
【０１２０】
２２．上記マルチキナーゼ剤が、ポナチニブまたはその薬学的に許容される塩である、上述のいずれかの実施形態に記載の組成物。
【０１２１】
２３．コビメチニブまたはその薬学的に許容される塩と、ポナチニブまたはその薬学的に許容される塩とを含む、上述のいずれかの実施形態に記載の組成物。
【０１２２】
２４．上記ＭＥＫ阻害剤またはその薬学的に許容される塩が約４５ｍｇ〜約７５ｍｇの量で存在し、上記マルチキナーゼ阻害剤またはその薬学的に許容される塩が約３０ｍｇ〜約６０ｍｇの量で存在する、上述のいずれかの実施形態に記載の組成物。
【０１２３】
２５．ＭＥＫ阻害剤またはその製薬上許容される塩と、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３を標的とする、マルチキナーゼ剤またはその製薬上許容される塩と、容器と、添付文書またはラベルとを含むキット。
【０１２４】
次の例は、例示のために提供されるものであり、限定のためのものではない。
【実施例】
【０１２５】
＜物質および方法＞
細胞株と試薬：
ＤＳＭＺ由来のＰＡ−ＴＵ−８９８８Ｔ細胞、およびＪＣＲＢ由来のＳＵＩＴ−２細胞を除いて、全ての細胞株はＡＴＣＣ由来であった。全ての細胞株は、細胞株の同一性を確認するためにＳＮＰおよびＳＴＲ分析を日常的に実施するＧｅｎｅｎｔｅｃｈ細胞株コア施設に保管された。全ての細胞株を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位ｍｌ−１のペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で日常的に培養した。ラパマイシンおよびポナチニブはＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから、クレノラニブはＡｒｏｇ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから入手し、そしてコビメチニブ、ＧＤＣ−０９４１、およびＧＤＣ−０９８０はＧｅｎｅｎｔｅｃｈで合成された。ヒトホスホキナーゼアレイキットはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＲＹ００３Ｂ）から、Ｃｉｇｎａｌ−４５−ＰａｔｈｗａｙレポーターアッセイはＱｉａｇｅｎ（ＣＣＡ−９０１Ｌ）から、ヒトチロシンキナーゼＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲアレイはＱｉａｇｅｎ（ＰＡＨＳ−１６１Ｚ）から、ＭＤＳＣ単離キットはＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃから入手した。これらのキットを用いた全てのアッセイは製造業者の指示に従って実施した。
【０１２６】
ウエスタンブロッティングおよび細胞生存率アッセイ：
細胞を１０ｃｍディッシュに播種し、１μＭの小分子阻害剤で２４時間処理した。細胞溶解物を、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＲＩＰＡ溶解バッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、タンパク質をニトロセルロース膜に転写した。イムノブロッティングは標準的な方法を用いて実施した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いてタンパク質バンドを定量した。一次抗体：ｐ−Ｅｒｋ、ｐ−ＳＴＡＴ３、ｐ−Ｓ６、全Ｓ６、ｐ−ＰＤＧＦＲα、ｐ−ＰＤＧＦＲβ、ｐ−ＲＳＫ３、切断ＰＡＲＰ、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｍｃｌ、サバイビン、Ｒａｂ１１、ｐ−Ａｋｔ、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、全ＳＴＡＴ３、全ＰＤＧＦＲα（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐ−ＥｐｈＡ７（Ｇｅｎｅ  Ｔｅｘ）、およびｐ−ＥｐｈＡ２／３、ＥｐｈＡ２／５（ＭｙＢｉｏｓｃｏｕｒｃｅ）。
【０１２７】
細胞生存率アッセイは、細胞を様々な薬理学的阻害剤の用量滴定（０．００１〜１０μＭ）または固定用量（１μＭ）で７２時間処理し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて生存率を測定することによって実施した。ブリススコアは、以前に記載されたように計算された。（Ｂｏｒｉｓｙ  ＡＡ，Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＰＪ，Ｈｕｒｓｔ  ＮＷ，Ｌｅｅ  ＭＳ，Ｌｅｈａｒ  Ｊ，Ｐｒｉｃｅ  ＥＲ，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，２００３；１００（１３）：７９７７−８２，Ｅｐｕｂ  ２００３／０６／１２）。
【０１２８】
レンチウイルス感染：
ｓｈＳＴＡＴ３に対するレンチウイルス粒子は、以前に記載されたように生成された。（Ｍｏｆｆａｔ  Ｊ，Ｇｒｕｅｎｅｂｅｒｇ  ＤＡ，Ｙａｎｇ  Ｘ，Ｋｉｍ  ＳＹ，Ｋｌｏｅｐｆｅｒ  ＡＭ，Ｈｉｎｋｌｅ  Ｇ，Ａ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ＲＮＡｉ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ａｎ  ａｒｒａｙｅｄ  ｖｉｒａｌ  ｈｉｇｈ−ｃｏｎｔｅｎｔ  ｓｃｒｅｅｎ，Ｃｅｌｌ，２００６；１２４（６）：１２８３−９８．Ｅｐｕｂ  ２００６／０３／２８）。Ｄｏｘ誘導システムにおけるｓｈＳＴＡＴ３はＬａｋｅＰｈａｒｍａ  Ｉｎｃ．から入手した。ｓｈＳＴＡＴ３に使用した標的配列はＡＡＴＣＴＴＡＧＣＡＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＴであった。ＫＰ４およびＭＩＡ−ＰＡＣＡ２細胞を最適化された力価のレンチウイルスで形質導入し、そして１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを用いて選択した。
【０１２９】
ルミネックスアッセイおよびＥＬＩＳＡ：
７２時間培養したがん細胞からの培養上清または動物実験からの終点で採取した血漿試料についてのＬｕｍｉｎｅｘアッセイを、製造者の取扱説明書に従ってマルチプレックスキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して実施した。ＰＤＧＦαのＥＬＩＳＡは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからのキットを使用して実施した。
【０１３０】
浸潤アッセイ：
２％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ中の細胞をＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ浸潤チャンバー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の倒立インサートに播種した。下部チャンバーを化学誘引物質としての１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩで満たし、１８時間のインキュベーション後に下部チャンバーに侵入した細胞数をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて測定した。
【０１３１】
動物実験：
全ての動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針に従って実施された。全ての投与計画は、異種移植において十分に許容された。２つの異種移植モデルを使用した：ヒトＰＤＡＣ由来細胞株ＫＰ４、および、ＫＰＰ−ＧＥＭＭマウスから単離された腫瘍由来の細胞。５×１０６個の細胞を、いかなるマトリゲルも使用せずに免疫不全マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の右側腹部に皮下移植した。腫瘍が約２００ｍｍ３に到達した後に、マウスを無作為化し、ビヒクル（ＭＣＴ＋２５ｍＭのクエン酸緩衝液、ｐＨ２．７５）、コビメチニブ（５ｍｇ／ｋｇ）＋／−ポナチニブ（３０ｍｇ／ｋｇ）を、ＰＯ、ＱＤで処理した。示された間隔でＵｌｔｒａ−Ｃａｌ  ＩＶキャリパーを用いて腫瘍容積を測定した。同一の動物からの腫瘍容積の繰り返し測定を経時的に適切に分析するために、混合モデリングアプローチを使用した。（Ｊｏｓｅ  Ｐｉｎｈｅｉｒｏ  ＤＢ，Ｓａｉｋａｔ  ＤｅｂＲｏｙ，Ｄｅｅｐａｙａｎ  Ｓａｒｋａｒ，Ｒ  Ｃｏｒｅ  ｔｅａｍ．Ｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｍｉｘｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｐａｃｋａｇｅ  ’ｎｌｍｅ’２００８）。このアプローチは、反復測定と、試験終了前の動物の処理に関連しない全ての死亡による中程度の脱落との両方に対処する。各々の用量レベルにおけるｌｏｇ２腫瘍容積の時間経過に非線形プロファイルを適合させるために、三次回帰スプラインを使用した。よって、これらの非線形プロファイルは、混合モデル内の用量に関連していた。ビヒクルのパーセンテージとしての腫瘍増殖阻害（％ＴＧＩ）は、以下の式を用いて、ビヒクルに対する１日当たりのそれぞれの用量群についてのフィット曲線下面積（ＡＵＣ）のパーセンテージとして計算した。
％ＴＧＩ＝１００×（１−ＡＵＣ用量／ＡＵＣビヒクル）
【０１３２】
％ＴＧＩの不確定区間（ＵＩ）を決定するために、適合曲線および適合共分散行列を使用して、％ＴＧＩの分布に対する近似として無作為標本を生成した。無作為標本は、近似混合モデルの１，０００回の模擬実現で構成され、各実現について％ＴＧＩが再計算された。報告されたＵＩは、当てはめられたモデルを考えると、９５％の時間の％ＴＧＩの再計算値がこの領域に入るであろう値であった。模擬分布の２．５パーセンタイルと９７．５パーセンタイルが、上部ＵＩと下部ＵＩとして使用された。＞６０％の腫瘍増殖阻害が有意とみなされた。（Ｗｏｎｇ  Ｈ，Ｃｈｏｏ  ＥＦ，Ａｌｉｃｋｅ  Ｂ，Ｄｉｎｇ  Ｘ，Ｌａ  Ｈ，ＭｃＮａｍａｒａ  Ｅ，Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２；１８（１４）：３８４６−５５．Ｅｐｕｂ  ２０１２／０６／０１）。
【０１３３】
プロットは、Ｒバージョン２．８．１（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ  ２００８；Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ；Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）およびＥｘｃｅｌバージョン１２．０．１（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して実行および生成した。データはＲ、バージョン２．８．１を用いて分析され、混合モデルはｎｌｍｅパッケージ、バージョン３．１−８９（４１）を用いてＲ内で適合した。
【０１３４】
免疫組織化学および免疫蛍光：
免疫組織化学および免疫蛍光は、ホルマリン固定パラフィン包埋の、細胞ペレット、全組織切片、およびＴＭＡブロック（ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ、Ｉｎｃ．）から切り出した４μｍ厚の切片上で実施した。スライドを脱パラフィン化し、抗原賦活化を、Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄａｋｏ）を用いてＰＴ  Ｍｏｄｕｌｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。内因性ペルオキシダーゼ活性を３％Ｈ２Ｏ２で遮断し、３％ＢＳＡを内在性免疫グロブリンの遮断に使用した。ｐ−Ｅｒｋおよびｐ−ＳＴＡＴ３に対する一次抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を１μｇ／ｍｌで、ｐ  −  ＰＤＧＦＲα（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を０．４μｇ／ｍｌで、Ｆ４／８０（Ｓｅｒｏｔｅｃ）を１０μｇ／ｍｌで、Ｇｒ−１（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を１μｇ／ｍｌで、切断カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を０．６μｇ／ｍｌで、およびＣＤ８α（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を５μｇ／ｍｌで使用した。抗体結合は、ＩＨＣ染色について、Ｖｅｃｓｔａｔｉｎ  ＡＢＣ  Ｅｌｉｔｅホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）またはＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎポリ−ＨＲＰ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および金属強化３，３’−ジアミノベンジジン（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用し、免疫蛍光染色について、ＴＳＡキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にＰｏｗｅｒＶｉｓｉｏｎポリ−ＨＲＰ（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して検出した。ＩＨＣスライドの対比染色は、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン（Ｒｏｗｌｅｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて実施した。
【０１３５】
組織学：
全スライド画像を、Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ  ＸＲ自動スライドスキャニングプラットフォーム（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｈａｍａｍａｔｓｕ  Ｃｉｔｙ，Ｓｈｉｚｕｏｋａ  Ｐｒｅｆ．，Ｊａｐａｎ）を用いて、最終倍率２００倍で取得した。
【０１３６】
マイクロアレイおよびＲＮＡ配列決定分析：
正常およびＰＤＡＣのヒト組織における遺伝子発現は、Ｇｅｎｅ  ＬｏｇｉｃのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧＵ１３３Ｐアレイを用いて測定した。遺伝子発現データをロバストマルチチップ平均（ＲＭＡ）法によって標準化した。発現プローブセット２０３１３１＿ａｔをヒトＰＤＧＦＲαに、２０２２７３＿ａｔをヒトＰＤＧＦＲβに、２０５９４５＿ａｔをヒトＩＬ６−Ｒに、および２０４１７１＿ａｔをＰＲＳ６ＫＢ１に使用した。
【０１３７】
統計学的分析
全てのデータは、平均±平均の標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）として表される。スチューデントｔ検定（両側）を使用して、２つの群を比較し、ＰｒｉｓｍまたはＥｘｃｅｌを使用してＰ値を計算した。Ｐ＜０．０５を有意とみなした。生存曲線は、カプラン−マイヤー法を用いてプロットした。
【０１３８】
＜実施例１：膵がん細胞スフェロイド培養におけるＭＥＫ阻害に対する感受性＞
二次元（２Ｄ）および三次元（３Ｄ）培養で培養した膵がん細胞が様々ながん治療薬にどのように応答するかを比較するために、本願発明者らはＫＲＡＳ変異型ＰＤＡＣがん細胞株ＫＰ４を２０３のがんの適切な標的の小分子阻害剤および既知の化学療法薬のパネルで処理した（表１）。
【表１−１】
2019526559.tif 000005
【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
2019526559.tif 000009
【０１３９】
３Ｄ培養に関して、本明細書に記載されるのは、比較的迅速な「ハイスループット」分析を促進するための方法である。培地に添加する前に９５〜１００℃で１０分間予め熱湯加熱した１０％のウシ胎仔血清を含む培地中でがん細胞を培養すると、一貫して３Ｄ「スフェロイド」が急速に形成されることが観察された。この方法を用いて形成されたスフェロイドは、外周層におけるＫｉ６７染色の優勢な局在化、および７２時間までの切断カスパーゼ−３によって示されるアポトーシスを伴う壊死／アポトーシス中心を有する、低レベルの増殖を含む、以前に記載されたスフェロイドの全ての典型的な特徴を示した（図２７）。それらの薬物感受性パターンもまた以前に記載されたスフェロイドと同様であった（図２８および２９）。
【０１４０】
２０３の化合物のパネルを用いた２Ｄおよび３Ｄ培養条件におけるＫＰ４細胞の処理は、いくつかの剤に対する異なる感受性を明らかにした（図１）。３Ｄ培養は一般に薬物治療に対してより耐性があり、ＫＰ４スフェロイドは、ほとんどが化学療法剤からなるパネルからの１８の阻害剤のサブセットに対して２Ｄ培養物よりも実際に有意に抵抗性が高かった（図１）。意外なことに、本願発明者らはまた、２Ｄ培養より３Ｄ培養に有効であった１１の阻害剤を同定した（図１）。これらの１１の阻害剤は、複数のシグナル伝達経路を標的とする活性が報告されている様々な分子から構成されていた。これらの阻害剤のうち４つ（コビメチニブ、ＧＤＣ−０６２３、ＡＺＤ６２４４、ＰＤ９０１）はＭＥＫ経路を標的とし、３つはＰＩ３Ｋ経路を標的とし（ＧＤＣ−０９４１、ＧＤＣ−０９８０、Ｇ３８３９０）、そして１つはＭＥＴ経路を標的とする（Ｇ４５２０３）。
【０１４１】
＜実施例２：膵がん細胞における２Ｄ培養対３Ｄ培養における異なる調節がなされる複数のシグナル伝達経路＞
２Ｄ対３Ｄにおける膵がん細胞の観察された異なる処理の感受性に潜在的に寄与するシグナル伝達経路を同定するために、本願発明者らは、２Ｄおよび３Ｄ条件下でのＫＰ４細胞において、ホスホキナーゼアレイ、遺伝子発現アレイ、およびルシフェラーゼ発現レポーターアッセイを実施し、そしてシグナル伝達タンパク質の発現レベルの変化を比較した。ホスホキナーゼアレイは、２Ｄで培養したＫＰ４細胞と比較したＫＰ４スフェロイドにおいて、ｐ３８、ＥＲＫ、ＥＧＦＲ、ＭＳＫ、Ａｋｔ、ＴＯＲ、ＣＲＥＢ、ＨＳＰ−２７、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ５α、Ｈｃｋ、Ｃｈｋ−２、ｃ−Ｊｕｎ、ＲＳＫ１／２／３、ｅＮＯＳ、ｐ２７およびＰＬＣ−γ１を含むいくつかのシグナル伝達タンパク質のチロシンリン酸化の増加を示し、３Ｄ条件におけるシグナル伝達経路の実質的な「再配線」を示唆している（図２および３）。ＫＰ４単層培養において、ＭＥＫ阻害は、ＥＲＫ、ＲＳＫ、およびＰＬＣ−γ１リン酸化を下方制御し、そしてＳＴＡＴファミリータンパク質およびＡｋｔの活性化を増加させた（図３）。対照的に、ＫＰ４スフェロイドは、ＭＥＫ阻害時にＥＲＫ、ＲＳＫ、およびＰＬＣ−γ１に加えてＡｋｔおよびＳＴＡＴファミリータンパク質の活性化の低下を示した。ＭＥＫ阻害は、ＫＰ４スフェロイドにおいてｃ−Ｊｕｎの活性化のみを誘導した。
【０１４２】
ＫＰ４単層培養およびスフェロイド培養におけるプロテインキナーゼに対応するｍＲＮＡの発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、いくつかのＲＴＫについて、特に、ＦＧＦＲ３、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＢ６、およびＩＮＳＲについて、ＫＰ４スフェロイドにおける発現の上昇を実証した（図４）。ＭＥＫ阻害は、ＫＰ４単層とスフェロイドの両方においてこれらのＲＴＫの大部分の下方制御を引き起こした。しかしながら、ＰＤＧＦＲαおよびＰＤＧＦＲβの発現は、コビメチニブ処理時にＫＰ４単層培養において有意に上方制御された。対照的に、ＥＰＨＡ１およびＥＰＨＢ１の発現は、ＭＥＫ阻害時にＫＰ４スフェロイドにおいて選択的に上昇した（図４）。まとめると、これらの知見は、標準的な２Ｄ条件で見られるものと比較して観察された薬物処理に対する異なる感受性に寄与し得るＰＤＡＣ由来細胞についての３Ｄ培養条件に特異的な薬物応答プロファイルを明らかにする。
【０１４３】
大きなパネルのルシフェラーゼレポーターアッセイを用いたコビメチニブ処理時の転写因子経路活性化の変化のさらなる評価は、ＫＰ４単層培養物がＳＴＡＴ３、ｃ−Ｍｙｃ、ＧＲＥ、ＫＬＦ４、ＩＳＲＥ、およびＧＡＳの転写因子の活性化の増大を示すことを明らかにした（図５）。対照的に、ＫＰ４スフェロイドは、これらの転写因子の同様のレベルの活性化を示さなかった。これらの結果は、単層対スフェロイド条件におけるＭＥＫ経路阻害に応答して代替的な生存促進シグナル伝達経路の活性化に寄与する可能性がある複数の転写因子の異なる調節を意味する。
【０１４４】
ホスホキナーゼアレイおよび遺伝子発現アレイの結果を、ＫＰ４細胞のコビメチニブ処理時のｐ−ＰＤＧＦＲα、ｐ−ＳＴＡＴ３、ｐ−Ｅｒｋ、ｐ−Ｓ６、およびｐ−ＲＳＫについてのウエスタンブロットによって検証し、ｐ−ＰＤＧＦＲα、ｐ−ＳＴＡＴ３、およびｐ−Ｓ６の活性化レベルの増加が観察された（図６Ａ）。増加したｐ−ＳＴＡＴ３はまた、複数のＰＤＡＣヒトがん細胞株においてコビメチニブ処理時に再現可能に検出された（図６Ｂ）。重要なことに、ＳＴＡＴ３活性化を促進することができるＩＬ−６リガンドの分泌の増加もまた、複数のＰＤＡＣ細胞株において観察された（図７）。ＳＴＡＴ３活性化の要件と一致して、ＫＰ４およびＭＩＡ−ＰＡＣＡ２細胞におけるＳＴＡＴ３のＲＮＡｉノックダウンは、コビメチニブ処理時に細胞死を誘導した（図８および９）。さらに、複数のＰＤＡＣ細胞株およびＫＰＰ−ＧＥＭＭ腫瘍由来細胞株を用いたインビトロ細胞浸潤アッセイは、ＭＥＫ阻害時のがん細胞の浸潤能力の低下を実証した（図１０）。これらの結果は、単剤としてのＭＥＫ阻害は原発性腫瘍退縮を引き起こすのに十分ではないが、それががん細胞の浸潤能を阻害し得ることを示唆している。まとめると、これらの結果は、ＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３によって媒介されるシグナル伝達経路が、膵がん細胞におけるＭＥＫ阻害時にがん細胞の生存を可能にし得ることを示唆している。
【０１４５】
＜実施例３：ＭＥＫ阻害を伴うＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３の阻害は、ＰＤＡＣ細胞のアポトーシスを効果的に促進する＞
以前の研究は、ＭＥＫ阻害が複数のＲＴＫの上方制御および活性化ならびに「バイパス」生存メカニズムとしてのＩＬ６／ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路をもたらし得ることを報告している（Ｄｕｎｃａｎ  ＪＳ，Ｗｈｉｔｔｌｅ  ＭＣ，Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｋ，Ａｂｅｌｌ  ＡＮ，Ｍｉｄｌａｎｄ  ＡＡ，Ｚａｗｉｓｔｏｗｓｋｉ  ＪＳ，Ｄｙｎａｍｉｃ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｋｉｎｏｍｅ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＭＥＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ，Ｃｅｌｌ，２０１２；１４９（２）：３０７−２１．Ｅｐｕｂ  ２０１２／０４／１７、Ｌｅｅ  ＨＪ，Ｚｈｕａｎｇ  Ｇ，Ｃａｏ  Ｙ，Ｄｕ  Ｐ，Ｋｉｍ  ＨＪ，Ｓｅｔｔｌｅｍａｎ  Ｊ，Ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｖｉａ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔａｔ３  ｉｎ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ−ａｄｄｉｃｔｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，２０１４；２６（２）：２０７−２１，Ｅｐｕｂ  ２０１４／０７／３０、Ｄａｉ  Ｂ，Ｍｅｎｇ  Ｊ，Ｐｅｙｔｏｎ  Ｍ，Ｇｉｒａｒｄ  Ｌ，Ｂｏｒｎｍａｎｎ  ＷＧ，Ｊｉ  Ｌ，ＳＴＡＴ３  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ＭＥＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｍｉＲ−１７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１；７１（１０）：３６５８−６８，Ｅｐｕｂ  ２０１１／０３／３０）。しかしながら、膵がんは関与していなかった。Ｓ６とＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３カスケードの両方を単独でまたはコビメチニブと組み合わせて標的とするマルチＲＴＫ阻害剤ポナチニブの有効性を腫瘍細胞増殖アッセイで試験した。コビメチニブ治療はＰＤＡＣ細胞株においてＳＴＡＴ３およびＳ６の活性化を促進し（図６Ａ）、コビメチニブ／ポナチニブによる組み合わせ処理は、２Ｄおよび３Ｄ培養物において、ＰＤＧＦＲα、ＳＴＡＴ３、Ｓ６、ＥＲＫ１／２、Ａｋｔの活性化を阻害し、生存促進タンパク質Ｂｃｌ−ＸＬ、Ｍｃｌ−１、サバイビンの発現を減少させ、切断されたＰＡＲＰレベルを増加させた（図１１、１２および１３）。ポナチニブはＰＤＡＣ細胞における下流のシグナル伝達経路を潜在的に調節することができるエフリン受容体のキナーゼ活性を阻害することが以前に報告されているが、ＰＤＡＣモデルにおいて、コビメチニブ／ポナチニブの組み合わせ処理はエフリン受容体（ＥｐｈＡ２／３、ＥｐｈＡ２／５、およびＥｐｈＡ７）の活性に影響を及ぼさなかった（図１１）。
【０１４６】
ポナチニブは、Ｓ６およびＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３シグナル伝達のみならず、ＦＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、エフリン受容体に加え、ＰＤＧＦＲαを阻害するので、本願発明者らはコビメチニブと組み合わせて他のＰＤＧＦＲα、Ｓ６、およびＪＡＫ２阻害剤の効果を調べることによりポナチニブの選択的活性をさらに調べた。ＥＧＦＲ阻害剤エルロチニブまたはＰＤＧＦＲ阻害剤の効果とは対照的に、コビメチニブおよびＳ６阻害剤、ラパマイシン、またはＧＤＣ−０９８０との組み合わせ処理によるＳ６活性化の下方制御は、ＫＰ４細胞における細胞死を促進した（図１４、１８、および１９）。ＰＤＧＦＲα阻害剤、クレノラニブ、ＪＡＫ２阻害剤、ルキソリチニブ、およびコビメチニブによる三重の組み合わせ処理後のＰＤＧＦＲαおよびＳＴＡＴ３活性化の同時下方制御もまた、ＫＰ４細胞増殖を阻害し、そして顕著な細胞死を引き起こした（図１５）。しかしながら、本願発明者らは、ＲＴＫ、Ｓ６、およびＪＡＫ／ＳＴＡＴを同時標的化し、そしてＰＤＡＣ細胞の増殖を効果的に阻害するコビメチニブ／ポナチニブ処理による最も強い相乗作用を観察した（図１１、１２、１３、１４、１６、および１７）。コビメチニブおよび／またはポナチニブによるＰＤＡＣ細胞株の処理は、単剤としての細胞生存率に影響を及ぼさなかったが、２Ｄと３Ｄ培養の両方において組み合わせて細胞増殖を阻害するのに相乗的であり、ＰＤＡＣに対する潜在的に有効な治療戦略としてのコビメチニブ／ポナチニブの組み合わせを明らかにした（図１２、１６および１７）。
【０１４７】
＜実施例４：コビメチニブ／ポナチニブ共処理はマウスモデルにおいて腫瘍退縮を誘導する＞
インビボでのコビメチニブ／ポナチニブの組み合わせの有効性を試験するために、本願発明者らはＫＰ４およびＫＰＰ−ＧＥＭＭ由来腫瘍細胞を用いて異種移植試験を実施した。コビメチニブとポナチニブはどちらもＫＰ４異種移植において単剤としては無効であったが、コビメチニブとポナチニブとの共処理は、腫瘍増殖の顕著な阻害および、切断されたカスパーゼ３の増加を伴う細胞死の増加を引き起こした（図２０（ＫＰ４細胞）、２１および２２）。ＫＰＰ−ＧＥＭＭ由来細胞株異種移植腫瘍でも同様の結果が得られたが、本発明者らは、主に腫瘍退縮とは対照的に、腫瘍増殖の著しい遅延を観察した（図２０（ＫＰＰ細胞））。コビメチニブ／ポナチニブ組み合わせ処理はまた、ＫＰ４異種移植において１０３％ＴＧＩ（％腫瘍増殖阻害）およびＫＰＰ異種移植において７１％ＴＧＩをもたらした（表２）。コビメチニブ／ポナチニブの組み合わせ処理は、ＫＰ４異種移植試験においてマウスでのいくらかの連結した体重減少を引き起こしたが、ＫＰＰ−ＧＥＭＭ由来異種移植試験においては引き起こさなかった。ＫＰ４異種移植試験では、２０％を超える体重減少のために２匹のマウスを試験の初期に離脱させなければならなかった。しかしながら、組み合わせ処理の過程の間、残りのマウスにおいて許容可能な閾値を超える顕著な体重減少は観察されなかった（図３１Ａ）。移植された腫瘍の病理組織学的分析、ＩＨＣ染色、およびイムノブロッティングは、コビメチニブ治療時のｐ−ＰＤＧＦＲα、ｐ−ＳＴＡＴ３、およびｐＳ６の予想される誘導を確認し、これはコビメチニブとポナチニブとの共処理に続いて顕著に下方制御された（図２１、２２、３０、および３３）。顕著に高いＰＤＧＦα、ＰＤＧＦβの血清レベル、およびＩＬ−６の増加したレベルもまた、コビメチニブ処理マウスにおいて観察された（図２３）。コビメチニブ／ポナチニブの共処理は血清ＰＤＧＦαおよびＰＤＧＦβレベルを減少させたがＶＥＧＦまたはＦＧＦレベルは減少させず、ＰＤＡＣがんモデルにおけるポナチニブによるＰＤＧＦＲα経路の特異的関連性を強調した（図２３および３２）。
【０１４８】
ＰＤＡＣ腫瘍内の骨髄細胞区画の分析は、Ｆ４／８０＋腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）が最も優勢な骨髄性集団であることを明らかにした（図２１）。コビメチニブ／ポナチニブ共処理は、腫瘍中のＴＡＭの数を顕著に減少させ、マクロファージ阻害因子ＧＣＳＦの血清レベルを誘導し、そしてマクロファージ活性化因子ＧＭ−ＣＳＦおよびＭＣＳＦのレベルを減少させた（図２２および２３）。これらの知見は、コビメチニブ／ポナチニブの共処理が、下流のＭＥＫ、Ｓ６、およびＳＴＡＴ３の生存経路に加えてＰＤＧＦＲα経路を標的とすることによって腫瘍細胞と骨髄細胞の両方の集団を無効化するのに有効であることを示す。さらに、この知見は、この組み合わせ処理が腫瘍の退縮を促進しうることを示唆している。
【表２】
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【０１４９】
＜実施例５：ＰＤＡＣ患者の肝転移におけるＥｒｋおよびＳＴＡＴ３の異なる活性化＞
これらの知見の潜在的な臨床的関連性を調べるために、本願発明者らはｐ−Ｅｒｋおよびｐ−ＳＴＡＴ３について７６のヒトＰＤＡＣ組織サンプルおよび４つの肝転移のＩＨＣ分析を実施した。Ｅｒｋは、主にステージＩおよびＩＩの悪性腫瘍を有する患者において、１３％のＰＤＡＣ組織試料（１０／７６）において活性化され、ＳＴＡＴ３活性化は、２６％の試料（２０／７６）において観察され、６．５％の試料（５／７６）は、主にステージＩの悪性腫瘍において、活性化された、ＥｒｋとＳＴＡＴ３の両方を示した（図２４および２５）。さらに、肝臓転移の５０％がＥｒｋ活性化を示し（２／４）、そしてＳＴＡＴ３活性化が２５％のサンプルにおいて見られた（１／４）（図２４および２５）。さらに、遺伝子発現分析は、ヒト患者由来のＰＤＡＣ腫瘍が、正常組織と比較して、増加したレベルのＲＴＫ  ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、およびＩＬ６−Ｒを発現することをさらに明らかにした（図２６、表３）。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【０１５０】
表３のデータは、ＰＤＡＣ腫瘍がＰＤＧＦＲ、ＩＬ−６、およびＳＴＡＴ３シグナル伝達によって駆動され得ること、およびこれらの経路がＭＥＫ経路阻害に対する応答を制限し得ることを示唆する。これらの知見はまた、ＭＥＫ経路が、ヒト膵がん患者における転移時にＳＴＡＴ３媒介生存カスケードに切り替わらない肝臓転移における腫瘍細胞の生存において重要な役割を果たし得ることを示す。
【０１５１】
本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は同一の意味を有する。使用される数字（例えば、量、温度等）に関して正確さを確実にするための努力がなされてきたが、いくつかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。
【０１５２】
本明細書および特許請求の範囲を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含んでいる」という用語は、文脈上他に必要とされる場合を除き、非排他的な意味で使用される。本明細書において記載される実施形態は、「からなる」および／または「から本質的になる」実施形態を含むことが理解される。
【０１５３】
本明細書において使用されるとき、値について言及するときの「約」という用語は、いくつかの実施形態において±５０％、いくつかの実施形態において±２０％、いくつかの実施形態において±１０％、いくつかの実施形態において±５％、いくつかの実施形態において特定の量から±１％、いくつかの実施形態において±０．５％、およびいくつかの実施形態において±０．１％の、特定の量からの変動を包含することを意味し、そのような変動は開示された方法を実施するため、または開示された組成物を使用するために適切であるためである。
【０１５４】
ある範囲の値が提供されるとき、文脈が他を明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限との間、および、その述べられた範囲内の他の述べられた値または中間の値における、各々の中間の値は、その下限の単位の１０分の１まで包含される。独立してより小さな範囲に含まれ得るこれらの小さい範囲の上限および下限はまた、述べられた範囲内の任意の具体的に除外された限定を有することを条件として、包含される。述べられる範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限界のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた含まれる。
【０１５５】
本明細書に記載されている多くの修正および他の実施形態は、前述の説明および関連する図面に提示されている教示の恩恵を受けて、この課題が関係する当業者には思い浮かぶであろう。したがって、課題は開示された特定の実施形態に限定されるべきではなく、修正および他の実施形態は添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることを理解されたい。本明細書では特定の用語が使用されているが、それらは一般的かつ説明的な意味でのみ使用されており、限定を目的としていない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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