(57)【要約】  本発明は、配列表の配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列からなる抗炎症活性を有するペプチドを提供する。前記ペプチドは炎症性サイトカインの発現を抑制し、炎症細胞の増殖を抑制することによって、結果的に、抗炎症活性を示すので、炎症性疾患の予防または治療に有用に使用できる。【選択図】図２ｂ
2019510077.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列からなる抗炎症活性を有するペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドは、炎症性サイトカインの発現を抑制するものである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記炎症性サイトカインは、ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α）、ＩＬ−２及びＩＮＦ−γで構成された群から選択される１つ以上の炎症性サイトカインである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは、ＣＯＸ−２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２）の発現を抑制するものである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドは、ＲＯＳ生成を減少させるものである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項６】
前記ペプチドは、炎症細胞の増殖を抑制するものである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
前記ペプチドは、Ｔ細胞の活性化を抑制するものである、請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択された１種以上のペプチドを有効成分として含む炎症性疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項９】
前記炎症性疾患は、アトピー皮膚炎、エンセフィリティス（ｅｎｃｅｐｈｉｌｉｔｉｓ）、炎症性腸炎、慢性閉鎖性肺疾患、肺血病性ショック症、肺線維症、未分化脊椎関節症、未分化関節病症、関節炎、炎症性骨溶解、慢性ウイルスまたはバクテリア感染による慢性炎症疾患、大腸炎、炎症性腸疾患、タイプ１糖尿病、リウマチ関節炎、反応性関節炎（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、骨関節炎、乾癬、強皮症、骨多孔症、アテローム性動脈硬化症、心筋炎、心内膜炎、心嚢炎、嚢胞性線維症、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ハンセン病、梅毒、ライム疾患（Ｌｙｍｅ）、ボレリア症（Ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ）、神経性−ボレリア症、結核、サルコイドーシス（Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ）、狼瘡、円板性狼瘡、凍傷性ループス、ループスシーン炎、全身性紅斑性ループス、黄斑変性、葡萄膜炎、過敏大腸症候群、クローン病、シェーグレン症候群、線維筋痛、慢性疲労症候群、慢性疲労免疫不全症候群、筋肉痛性脳脊髓炎、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病及び多発硬化症のうち、いずれか１つの疾患であることを特徴とする、請求項８に記載の薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症活性を有するペプチド、その用途及びその用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
炎症反応は、組織または細胞が損傷されるか、または外部感染原（例えば、バクテリア、黴、ウイルス、多様な種類のアレルギー誘発物質）に感染された時、局所血管と体液のうち、各種の炎症媒介因子及び免疫細胞が関連して表れる酵素活性化、炎症媒介物質分泌、体液浸潤、細胞移動、組織破壊など、一連の複合的な生理的反応と紅斑、浮腫、発熱、痛みなど、外的症状である。
【０００３】
具体的に、外部細菌が特定組織に侵入して増殖するようになれば、生体の白血球がこれを認知して増殖した外部細菌を活発に攻撃するようになるが、この過程中に発生する白血球の死骸が菌により侵入を受けた組織に蓄積されると共に、白血球により死滅された侵入菌の細胞破壊物が侵入を受けた組織内に融解されて膿瘍が形成される。
【０００４】
正常な場合、炎症反応は外部感染原を除去し、損傷された組織を再生して生命体の機能回復作用をするが、抗原が除去されないか、または内部物質が原因となって炎症反応が過度に、または持続的に起これば、人体の生命を威嚇する疾患として急性炎症、リウマチ関節炎のような関節内での疾患、乾癬などの形態に表れる皮膚疾患及び気管支喘息などのアレルギー性炎症疾患などが表れるようになり、輸血、薬物投与、臓器移植など、治療過程でも障害要因となる。
【０００５】
ＴＮＦ−α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α）は、細菌感染及び腫瘍疾患に対する宿主免疫反応中に活性化された大食細胞及びいろいろな多様な細胞により生成されるサイトカインである。このサイトカインは炎症反応の重要な媒介体とも知られているが、リウマチ性関節炎（ＲＡ）、乾癬性関節炎、クローン病、乾癬、強直性脊髄炎（ＡＳ）のような炎症性疾患に重要な役割を担当している炎症性サイトカインである。
【０００６】
例えば、リウマチ性関節炎でＴＮＦ−αは滑液炎症を持続させ、骨と軟骨を持続的に破壊させる。したがって、ＴＮＦ−αの特異的生物活性を抑制することが要求されるので、ＴＮＦ−αが媒介される細胞反応を防いで、炎症前サイトカインの活性とＴＮＦ−αにより調節される過程を調整しようとする目的にＴＮＦ−αを抑制する多様な生物学的製剤が開発されている。
【０００７】
現在、炎症治療剤には、副腎皮質ホルモン成分を用いたデキサメタゾン、コルチゾンなどがある。しかしながら、これらは炎症治療剤として作用することはするが、毒性が強く、副作用として浮腫のような症状を起こすこともある。
【０００８】
また、炎症原因に対して選択的に作用できなくて甚だしい免疫抑制を誘発する問題が生じる場合もある［Ｃｈｅｃｋ  Ｗ．Ａ．  ａｎｄ  Ｋａｌｉｎｅｒ  Ｍ．Ａ．，  Ａｍ．  Ｒｅｖ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｄｉｓ．，  １４１，  ｐ４４〜５１．  １９９０］。
【０００９】
また、現存する抗炎症剤である副腎皮質ホルモン成分を用いたステロイド薬剤で浮腫のような激しい副作用を表すので、副作用のない非ステロイド成分の薬剤の開発が至急な実状である。
【００１０】
本明細書の全体に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体として本明細書に参照として挿入されて、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】大韓民国登録特許第１０−１２４７３５０号
【特許文献２】大韓民国登録特許第１０−１２５７２２８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明者らは生物学的に有効な活性を有する優れるペプチドを開発しようと努力した結果、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３のアミノ酸配列で構成された群から選択される１種のアミノ酸配列からなるペプチドが抗炎症活性を表すことを究明することによって、本発明を完成するようになった。
【００１３】
したがって、本発明の目的は抗炎症活性を有するペプチドを提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、抗炎症用組成物を提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的及び利点は以下の発明の詳細な説明、請求の範囲、及び図面により一層明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の一態様によれば、本発明は配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列からなる抗炎症活性を有するペプチドを提供する。
【００１７】
本発明者らは生物学的に有効な活性を有する優れるペプチドを開発しようと努力した結果、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドが抗炎症活性を表すということを究明した。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列からなる抗炎症活性を有するペプチドに関するものである。前記ペプチドは炎症性サイトカインの発現を抑制し、炎症細胞の増殖を抑制することによって、結果的に、抗炎症活性を表すので、炎症疾患の予防または治療に有用に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１ａ】本発明の一実施例に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるＴＮＦ−α及びＩＬ−２の発現変化をＲＴ−ＰＣＲで確認した結果である。
【図１ｂ】本発明の一実施例に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるＴＮＦ−αの発現変化をＲＴ−ＰＣＲで確認したグラフである。
【図１ｃ】本発明の一実施例に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるＩＬ−２の発現変化をＲＴ−ＰＣＲで確認したグラフである。
【図１ｄ】本発明の一実施例に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによるＴＮＦ−α及びＩＬ−２の発現変化をＲＴ−ＰＣＲで確認した結果である。
【図１ｅ】本発明の一実施例に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによるＴＮＦ−αの発現変化をＲＴ−ＰＣＲで確認したグラフである。
【図１ｆ】本発明の一実施例に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによるＩＬ−２の発現変化をＲＴ−ＰＣＲで確認したグラフである。
【図１ｇ】本発明の一実施例に係る配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドによるＴＮＦ−α及びＩＬ−２の発現変化をＲＴ−ＰＣＲで確認した結果である。
【図１ｈ】本発明の一実施例に係る配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドによるＴＮＦ−αの発現変化をＲＴ−ＰＣＲで確認したグラフである。
【図１ｉ】本発明の一実施例に係る配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドによるＩＬ−２の発現変化をＲＴ−ＰＣＲで確認したグラフである。
【図２ａ】本発明の一実施例に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるＣＯＸ２の発現変化をウェスタンブロットで確認した結果である。
【図２ｂ】本発明の一実施例に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるＣＯＸ２の発現変化をウェスタンブロットで確認したグラフである。
【図２ｃ】本発明の一実施例に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによるＣＯＸ２の発現変化をウェスタンブロットで確認した結果である。
【図２ｄ】本発明の一実施例に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによるＣＯＸ２の発現変化をウェスタンブロットで確認したグラフである。
【図２ｅ】本発明の一実施例に係る配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドによるＣＯＸ２の発現変化をウェスタンブロットで確認した結果である。
【図２ｆ】本発明の一実施例に係る配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドによるＣＯＸ２の発現変化をウェスタンブロットで確認したグラフである。
【図３ａ】本発明の一実施例に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによる脾臓細胞でのＴＮＦ−α及びＩＮＦ−γ分泌変化をＥＬＩＳＡで確認した結果である。
【図３ｂ】本発明の一実施例に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによる大食細胞でのＴＮＦ−α分泌変化をＥＬＩＳＡで確認した結果である。
【図３ｃ】本発明の一実施例に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによる脾臓細胞でのＴＮＦ−α及びＩＮＦ−γ分泌変化をＥＬＩＳＡで確認した結果である。
【図３ｄ】本発明の一実施例に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによる大食細胞でのＴＮＦ−α分泌変化をＥＬＩＳＡで確認した結果である。
【図３ｅ】本発明の一実施例に係る配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドによる大食細胞でのＴＮＦ−α分泌変化をＥＬＩＳＡで確認した結果である。
【図４ａ】本発明の一実施例に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによるＲＯＳ生成減少を測定した結果である。
【図４ｂ】本発明の一実施例に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドによる増殖アッセイ結果である。
【図４ｃ】本発明の一実施例に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによるＲＯＳ生成減少を測定した結果である。
【図４ｄ】本発明の一実施例に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドによる増殖アッセイ結果である。
【図４ｅ】本発明の一実施例に係る配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドによるＲＯＳ生成減少を測定した結果である。
【図４ｆ】本発明の一実施例に係る配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドによる増殖アッセイ結果である。
【図５ａ】本発明の一実施例に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを脾臓細胞に処理し、ＣＤ３＋、ＣＤ２５＋をＦＡＣＳを通じて分析した結果である。
【図５ｂ】本発明の一実施例に係る配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを脾臓細胞に処理し、ＣＤ３＋、ＣＤ２５＋をＦＡＣＳを通じて分析したグラフである。
【図５ｃ】本発明の一実施例に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを脾臓細胞に処理し、ＣＤ３＋、ＣＤ２５＋をＦＡＣＳを通じて分析した結果である。
【図５ｄ】本発明の一実施例に係る配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドを脾臓細胞に処理し、ＣＤ３＋、ＣＤ２５＋をＦＡＣＳを通じて分析したグラフである。
【図５ｅ】本発明の一実施例に係る配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドを脾臓細胞に処理し、ＣＤ３＋、ＣＤ２５＋をＦＡＣＳを通じて分析した結果である。
【図５ｆ】本発明の一実施例に係る配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドを脾臓細胞に処理し、ＣＤ３＋、ＣＤ２５＋をＦＡＣＳを通じて分析したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明のペプチドは配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列を含み、例えば、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列からなるものでありうる。
【００２１】
バクテリア性内毒素であるＬＰＳ（Ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）は、大食細胞でｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、ＴＮＦ−α、細胞内ＲＯＳ、そして多様なインターロイキンのような炎症因子の生成を促進させる（Ｈｉｎｚ，  Ｂ．，  Ｂｒｕｎｅ，  Ｋ．  Ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２−−１０  ｙｅａｒｓ  ｌａｔｅｒ．  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  ３００（２）：３６７−３７５，  ２００２．、マウス大食細胞で血竭の抗酸化及び抗炎症効果。大韓本草学会誌２３（２）  ：  １７９−１９２，  ２００８．）。したがって、ＬＰＳにより生成される炎症因子を抑制する物質は大食細胞の活性と関連した多様な炎症疾患の治療に有用に使われることができると見なされる。
【００２２】
本発明によれば、本発明の配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドは、炎症性サイトカインの発現を抑制し、炎症関連因子であるＣＯＸ−２の発現を抑制し、ＲＯＳの生成を減少させ、Ｔ細胞の活性化を抑制することによって究極的に炎症反応を抑制する。
【００２３】
本発明の一具現例によれば、本発明の配列表の配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドは、炎症性サイトカインであるＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−αの発現を抑制する。より好ましくは本発明のペプチドはＴＮＦ−α、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γの発現を抑制する。
【００２４】
本発明の他の具現例によれば、本発明のペプチドはプロスタグランジン（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）の生合成を刺激することによって、炎症反応調節に重要な役割をする酵素であるＣＯＸ−２の発現を抑制する。ＣＯＸ−２は、定常状態ではほとんど発現されていないが、炎症因子やサイトカイン、エンドトキシン、腫瘍形成遺伝子のようなミトゲン刺激により速い速度で発現される。
【００２５】
本発明の他の具現例によれば、本発明のペプチドは炎症反応で重要な因子であるＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）の生成を減少させる。細胞内に存在するミトコンドリア、ＸＯＤ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ、ｘａｎｔｈｉｎｅ  ｏｘｉｄａｓｅ）、ＮＡＤＰＨ酸化酵素、及びＣＯＸなどの酵素は持続的にＲＯＳを生成し、ＲＮＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）は炎症反応時、大食細胞、好中球及び他の免疫細胞の免疫反応によって多量生成され、この際、ＲＯＳも共に生成される（Ｄｅｌａｎｔｙ，  Ｎ．，  Ｄｉｃｈｔｅｒ，  Ｍ．Ａ．  Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃａｎｄ  ９８：  １４５−１５３，  １９９８．，  Ｂｒｕｎｅ，  Ｂ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｊ．，  Ｖｏｎ  Ｋｎｅｔｈｅｎ，  Ａ．  Ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ，  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ，  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ  Ｓｕｐｐｌ  ８４：  ２２−２４，  ２００３．）。
【００２６】
炎症反応は生体内復旧体系の増強及び損傷を減少させるための一連の活性メカニズムであって、非常に複雑なメカニズムで調節される。重要なことは、反復される組織の損傷や再生により炎症反応が持続されれば、炎症関連細胞でＲＯＳとＲＮＳが過剰生成され、その結果、永久的な遺伝子の変形が引起こされて病態が誘発されるということである（Ｋａｐｌａｎｓｋｉ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．，  ＩＬ−６：  ａ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｔｏ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４（１）：２５−２９，  ２００３．  ）。このようにＲＯＳとＲＮＳは炎症反応と非常に深い関連がある。
【００２７】
本発明の他の具現例によれば、本発明のペプチドはＴ細胞の活性化を抑制させる。本発明のペプチドはＬＰＳで炎症反応を誘導した細胞でＴ細胞活性発現マーカーであるＣＤ３及びＣＤ２５の発現を抑制する。
【００２８】
本発明の他の具現例によれば、本発明のペプチドは炎症細胞の増殖を抑制させる。
【００２９】
本明細書で使われる用語“ペプチド”はペプチド結合によりアミノ酸残基が互いに結合されて形成された線形の分子を意味する。本発明のペプチドは、当業界に公知された化学的合成方法、特に固相合成技術（ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５：２１４９−５４（１９６３）；  Ｓｔｅｗａｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ２ｎｄ．  ｅｄ．，  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．：  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  １１１（１９８４）  ）または液相合成技術（ＵＳ登録特許第５，５１６，８９１号）により製造できる。
【００３０】
本発明の一具現例によれば、前記ペプチドのＮ−またはＣ−末端はアセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で構成された群から選択される保護基が結合できる。
【００３１】
前述したアミノ酸の変形は、本発明のペプチドの安定性を格段に改善する作用をする。本明細書で言及される用語“安定性”は“インビボ”安定性だけでなく、貯蔵安定性（例えば、常温貯蔵安定性）も意味する。前述した保護基は生体内の蛋白質切断酵素の攻撃から本発明のペプチドを保護する作用をする。
【００３２】
本発明の他の態様は、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択された１種以上のペプチドを有効成分として含む抗炎症用組成物を提供する。
【００３３】
前記抗炎症用組成物は、前述した配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドを有効成分として含むため、共通の内容は本明細書の過度な複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【００３４】
前記配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドは、炎症性サイトカインの発現を抑制し、炎症細胞の増殖を抑制して炎症反応を抑制するので、炎症性疾患の予防または治療に非常に有効である。
【００３５】
本発明の抗炎症用組成物が適用できる炎症性疾患は、アトピー皮膚炎（ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）、エンセフィリティス（ｅｎｃｅｐｈｉｌｉｔｉｓ）、炎症性腸炎（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）、慢性閉鎖性肺疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ）、肺血病性ショック症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｈｏｃｋ）、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、未分化脊椎関節症（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｓｐｏｎｄｙｌｏａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）、未分化関節病症（ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ａｒｔｈｒｏｐａｔｈｙ）、関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、炎症性骨溶解（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｏｓｔｅｏｌｙｓｉｓ）、慢性ウイルスまたはバクテリア感染による慢性炎症疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｂｙ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｖｉｒａｌ  ｏｒ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）、大腸炎（ｃｏｌｉｔｉｓ）、炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ）、タイプ１糖尿病（ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ）、リウマチ関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、反応性関節炎（Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、骨関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、乾癬（ｐｓｏｒｉａｓｉｓ）、強皮症（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、骨多孔症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、アテローム性動脈硬化症（ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、心筋炎（ｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ）、心内膜炎（ｅｎｄｏｃａｒｄｉｔｉｓ）、心嚢炎（ｐｅｒｉｃａｒｄｉｔｉｓ）、嚢胞性線維症（ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、橋本甲状腺炎（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ’ｓ  ｔｈｙｒｏｉｄｉｔｉｓ）、グレーブス病（Ｇｒａｖｅｓ’  ｄｉｓｅａｓｅ）、ハンセン病（ｌｅｐｒｏｓｙ）、梅毒（ｓｙｐｈｉｌｉｓ）、ライム疾患（Ｌｙｍｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）、ボレリア症（Ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ）、神経性−ボレリア症（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｂｏｒｒｅｌｉｏｓｉｓ）、結核（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、サルコイドーシス（Ｓａｒｃｏｉｄｏｓｉｓ）、狼瘡（ｌｕｐｕｓ）、円板性狼瘡（ｄｉｓｃｏｉｄ  ｌｕｐｕｓ）、凍傷性ループス（ｃｈｉｌｂｌａｉｎ  ｌｕｐｕｓ）、ループス腎炎（ｌｕｐｕｓ  ｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、全身性紅斑性ループス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、黄斑変性（ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、葡萄膜炎（ｕｖｅｉｔｉｓ）、過敏大腸症候群（ｉｒｒｉｔａｂｌｅ  ｂｏｗｅｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、線維筋痛（ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ）、慢性疲労症候群（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｆａｔｉｇｕｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、慢性疲労免疫不全症候群（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｆａｔｉｇｕｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、筋肉痛性脳脊髓炎（ｍｙａｌｇｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ）、筋萎縮性側索硬化症（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌ���ｒｏｓｉｓ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、及び多発硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）を含むが、これに限定されるものではない。
【００３６】
前記炎症疾患の予防または治療用組成物は、薬剤学的組成物で製造できる。
【００３７】
本発明の組成物が薬剤学的組成物で製造される場合、本発明の組成物は（ａ）前述した本発明のペプチドの薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含むものでありうるが、これに限定されるものではない。
【００３８】
本明細書で、用語“薬剤学的有効量”は前述したペプチドの効能または活性を達成することに十分な量を意味する。
【００３９】
本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、燐酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、珪酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアル酸マグネシウム及び／又はミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。
【００４０】
本発明の薬剤学的組成物は前記成分の以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、貯蔵剤などを追加で含むことができるが、これに限定されるものではない。
【００４１】
適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１９ｔｈ  ｅｄ．，  １９９５）に詳細に記載されている。
【００４２】
本発明の薬剤学的組成物は経口または非経口、好ましくは非経口で投与することができ、非経口投与の場合には、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、局所投与、経皮投与などにより投与することができるが、これに限定されるものではない。
【００４３】
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因により多様に処方できる。一方、本発明の薬剤学的組成物のどんな投与量は１日当たり０．０００１−２００μｇである。
【００４４】
本発明の薬剤学的組成物は当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量形態に製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造できる。
【００４５】
この際、剤形はオイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液形態であるか、またはエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、またはジェル（例えば、ハイドロジェル）形態であることもあり、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨に従って本発明の範囲がこれら実施例により制限されないということは当業界で通常の知識を有する者において自明である。
【００４７】
実施例
合成例１：ペプチドの合成
クロロトリチルクロライドレジン（Ｃｈｌｏｒｏ  ｔｒｉｔｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｒｅｓｉｎ；  ＣＴＬ  ｒｅｓｉｎ，  Ｎｏｖａ  ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ  Ｎｏ．  ０１−６４−００２１）７００ｍｇを反応容器に入れて、メチレンクロライド（ＭＣ）１０ｍｌを加えて３分間撹拌した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）１０ｍｌを入れて３分間撹拌した後、また溶媒を除去した。反応器に１０ｍｌのジクロロメタン溶液を入れて、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）４００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かして、１時間の間撹拌しながら反応させた。反応後、洗浄し、メタノールとＤＩＥＡ（２：１）をＤＣＭ（ｄｅｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）に溶かして１０分間反応させ、過量のＤＣＭ／ＤＭＦ（１：１）で洗浄した。溶液を除去し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を１０ｍｌ入れて３分間撹拌した後、また溶媒を除去した。脱保護溶液（２０％のピペリジン（Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｅ）／ＤＭＦ）１０ｍｌを反応容器に入れて１０分間常温で撹拌した後、溶液を除去した。同量の脱保護溶液を入れて、また１０分間反応を維持した後、溶液を除去し、各々３分ずつＤＭＦで２回、ＭＣで１回、ＤＭＦで１回洗浄してＡｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＣＴＬ  Ｒｅｓｉｎを製造した。新しい反応器に１０ｍｌのＤＭＦ溶液を入れて、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｓｗｉｓｓ）２００ｍｍｏｌｅ、ＨｏＢｔ  ２００ｍｍｏｌｅ及びＢｏｐ  ２００ｍｍｏｌｅを入れた後、撹拌してよく溶かした。反応器に４００ｍｍｏｌｅ  ＤＩＥＡを分画で２回に亘って入れた後、全ての固体が溶けるまで最小限５分間撹拌した。溶かしたアミノ酸混合溶液を脱保護されたレジンがある反応容器に入れて、１時間の間常温で撹拌しながら反応させた。反応液を除去し、ＤＭＦ溶液で３回５分ずつ撹拌した後、除去した。反応レジンを少量取って、カイザーテスト（Ｎｉｈｙｄｒｉｎ  Ｔｅｓｔ）を用いて反応程度を点検した。脱保護溶液で上記のように同一に２回脱保護反応させてＡｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＣＴＬ  Ｒｅｓｉｎを製造した。ＤＭＦとＭＣで十分に洗浄し、もう一度カイザーテストを遂行した後、前記と同一に以下のアミノ酸付着実験を遂行した。選ばれたアミノ酸配列に基づいてＦｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨの順に連鎖反応させた。Ｆｍｏｃ−保護基を脱保護溶液で１０分ずつ２回反応させた後、よく洗浄して除去した。無水酢酸とＤＩＥＡ、ＨｏＢｔを入れて一時間の間アセチル化を遂行した後、製造されたペプチジルレジンをＤＭＦ、ＭＣ及びメタノールで各々３回洗浄し、窒素空気をゆっくり流して乾燥した後、Ｐ２Ｏ５下で真空に減圧して完全に乾燥した後、脱漏溶液［トリフルロ化酢酸（Ｔｒｉｆｌｕｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）９５％、蒸溜水２．５％、チオアニソール（Ｔｈｉｏａｎｉｓｏｌｅ）２．５％］３０ｍｌを入れた後、常温で時々振り回しながら２時間反応を維持した。フィルタリングを行ってレジンを濾過し、レジンを少量のＴＦＡ溶液で洗浄した後、母液と合せた。減圧を用いて全体ボリュームが半分位残るよ��に蒸留し、５０ｍｌの冷たいエーテルを加えて沈殿を誘導した後、遠心分離して沈殿を集めて、もう２回冷たいエーテルで洗浄した。母液を除去し、窒素下で十分に乾燥して精製前の配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチドを０．８ｇ合成した（収率：９０．１％）。分子量測定機を用いて測定時、分子量５２１．６（理論値：５２１．５）を得ることができた。
配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドも前記のような方法により合成を進行した。
【００４８】
【表１】
2019510077.tif 000003
【００４９】
実施例１：ＴＮＦ−α  ＆  ＩＬ−２  ＲＴ−ＰＣＲ
６−７週齢マウスを犠牲にして脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）を得て、細胞濾過器を用いて脾臓を潰して無血清ＲＰＭＩ１６４０培地と共に遠心分離した。上層は捨てて、ＲＢＣ（赤血球）を除去するためにＲＢＣ溶解バッファを使用した。２回の間ＲＢＣを除去し、無血清ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄した後、適当量の無血清ＲＰＭＩ１６４０培地を添加した。細胞数を測定して９６ウェルプレート（１×１０６細胞／ウェル）、２４ウェルプレート（１×１０７細胞／ディッシュ）にシーディングした。翌日、各々のペプチドサンプル（０．２、２、２０ｕｇ／ｍｌ）と刺激剤であるＬＰＳを処理した。この際、タイムポイントを合せて実験を進行した。
【００５０】
Ｅａｓｙ  Ｂｌｕｅ（Ｉｎｔｒｏｎ）を使用して全体ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡから単一鎖ＤＮＡを合成するためにＲＴプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ）を使用して３ｕｇ  ＲＮＡ、ランダムヘキサマー２ｕｇとＤＥＰＣを処理した水を加えて総２０ｕｌになるようにし、６５℃で５分、４２℃で１時間の間反応させた。また９５℃で５分間加熱してｃＤＮＡを作った。ＰＣＲは、ＰＣＲプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ）を使用して３ｕｌ  ｃＤＮＡ、ＣＧＩ  ５８遺伝子に特異的な１０ｐｍｏｌｅのプライマーをＰＣＲプリミックスに混合して施行した。ＰＣＲ条件は９４℃で３０秒、５５℃〜５６℃で３０秒、７２℃で３０秒で反応させた。サイクル数遺伝子はＰＣＲ結果が指数的に増幅することができる条件で分析した。ＰＣＲ産物の５ｕｌを得て１％アガロースゲルに電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して確認して、その結果を図１ａ乃至図１ｉに示した。
【００５１】
【表２】
2019510077.tif 000004
【００５２】
図１ａ乃至図１ｉから確認できるように、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド処理時、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２の発現が減少する傾向が表れた。
【００５３】
実施例２：ウェスタンブロット
実施例１で収得した脾臓細胞を用いて１×１０７細胞／ウェルの細胞密度で２４ウェルプレートにシーディングした。次に、一晩の間培養した後、配列表の配列番号１、配列番号２、及び配列番号３のペプチドを濃度別（０．２−２０ｕｇ／ｍｌ）に処理し、２４時間の間３７℃培養器で培養後、細胞溶解バッファを処理して溶解物を確保した後、タンパク質を定量した。次に、炎症誘導因子であるＣＯＸ２に対するウェスタンブロットを遂行して、その結果を図２ａ乃至図２ｆに示した。
【００５４】
図２ａ乃至図２ｆから確認ができるように、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド処理時、ＣＯＸ２の発現が減少した。
【００５５】
実施例３：ＥＬＩＳＡ
３−１：ＥＬＩＳＡ（脾臓細胞）
実施例１で、ペプチドサンプルと刺激剤であるＬＰＳを処理した脾臓細胞を４８時間後、培養培地を回収、得た培地は確認しようとするサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ）のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して実験を実施した。
【００５６】
３−２：ＥＬＩＳＡ（Ｒａｗ２６４．７細胞）
Ｒａｗ２６４．７細胞を１×１０６細胞／４８ウェルでシーディングし、一晩の間培養した。確認しようとする試料を細胞に０．２、２、２０ｕｇ／ｍｌ前処理し、３０分後に刺激剤であるＬＰＳを処理した。計画したタイムポイントに合せて培養した。２４時間後、培養培地を回収、得た培地は確認しようとするサイトカイン（ＴＮＦ−α）のＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を使用して実験を実施して、その結果を図３ａ乃至図３ｆに示した。
【００５７】
図３ａ乃至図３ｄから確認できるように、配列番号１または配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチド処理時、脾臓細胞でＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γ分泌が減少し、ＲＡＷ２６４．７でＴＮＦ−α分泌が減少する傾向が表れた。
【００５８】
また、図３ｅから確認できるように、配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド処理時、ＲＡＷ２６４．７でＴＮＦ−α分泌が減少した。
【００５９】
実施例４：増殖アッセイ及びＦＡＣＳ
４−１．増殖アッセイ（脾臓細胞）
実施例１に記載されたように、ペプチドサンプルと刺激剤であるＬＰＳを処理し、２４時間後にＥｚ−ｃｙｔｏｘキットを用いて実験を実施した。
【００６０】
４−２．ＦＡＣＳ［細胞内ＲＯＳアッセイ（ＤＣＦ−ＤＡ）］
Ｒａｗ２６４．７細胞を１×１０６細胞／６ウェルでシーディングし、一晩の間培養した。確認しようとする試料を細胞に１、１０、５０ｕｇ／ｍｌで前処理し、３０分後に刺激剤であるＬＰＳを処理した。計画したタイムポイントに合せて培養した後、ＤＣＦ−ＤＨを処理３０分後、ＦＡＣＳを用いて蛍光の程度にて酸化活性を測定して、その結果を図４ａ乃至図４ｆに示した。
【００６１】
図４ａ乃至図４ｆから確認できるように、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド処理時、ＲＯＳ生成が減少した。また、増殖アッセイで前記ペプチド処理時、脾臓細胞生存率が減少した。
【００６２】
実施例５：活性化Ｔ細胞分析（ＦＡＣＳシステム）
実施例１に記載されたように、ペプチドサンプルと刺激剤であるＬＰＳを処理し、２４時間後、抗体（ＣＤ３、ＣＤ２５）活性化Ｔ細胞マーカーを３０分間処理後、ＰＢＳで２回洗浄してＦＡＣＳ分析を実施して、その結果を図５ａ乃至図５ｆに示した。
【００６３】
図５ａ乃至図５ｆから確認できるように、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチド処理時、ＣＤ３＋、ＣＤ２５＋細胞が減少した。
【００６４】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者に当たって、このような具体的な技術は単に一具現例であり、これに本発明の範囲が制限されるものでない点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とその等価物により定義されるということができる。
【産業上の利用可能性】
【００６５】
本発明は、抗炎症活性を有するペプチド、その用途及びその用途関するものである。
【図１ａ】
2019510077.tif 000005
【図１ｂ】
2019510077.tif 000006
【図１ｃ】
2019510077.tif 000007
【図１ｄ】
2019510077.tif 000008
【図１ｅ】
2019510077.tif 000009
【図１ｆ】
2019510077.tif 000010
【図１ｇ】
2019510077.tif 000011
【図１ｈ】
2019510077.tif 000012
【図１ｉ】
2019510077.tif 000013
【図２ａ】
2019510077.tif 000014
【図２ｂ】
2019510077.tif 000015
【図２ｃ】
2019510077.tif 000016
【図２ｄ】
2019510077.tif 000017
【図２ｅ】
2019510077.tif 000018
【図２ｆ】
2019510077.tif 000019
【図３ａ】
2019510077.tif 000020
【図３ｂ】
2019510077.tif 000021
【図３ｃ】
2019510077.tif 000022
【図３ｄ】
2019510077.tif 000023
【図３ｅ】
2019510077.tif 000024
【図４ａ】
2019510077.tif 000025
【図４ｂ】
2019510077.tif 000026
【図４ｃ】
2019510077.tif 000027
【図４ｄ】
2019510077.tif 000028
【図４ｅ】
2019510077.tif 000029
【図４ｆ】
2019510077.tif 000030
【図５ａ】
2019510077.tif 000031
【図５ｂ】
2019510077.tif 000032
【図５ｃ】
2019510077.tif 000033
【図５ｄ】
2019510077.tif 000034
【図５ｅ】
2019510077.tif 000035
【図５ｆ】
2019510077.tif 000036
【配列表】
2019510077000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年8月22日(2018.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】
本発明は、抗炎症活性を有するペプチド及びその用途に関するものである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
本発明の他の態様は、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択された１種以上のペプチドを有効成分として含む抗炎症用組成物を提供する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
Ｅａｓｙ  Ｂｌｕｅ（Ｉｎｔｒｏｎ）を使用して全体ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡから単一鎖ＤＮＡを合成するためにＲＴプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ）を使用して３ｕｇ  ＲＮＡ、ランダムヘキサマー２ｕｇとＤＥＰＣを処理した水を加えて総２０ｕｌになるようにし、６５℃で５分、４２℃で１時間の間反応させた。また９５℃で５分間加熱してｃＤＮＡを作った。ＰＣＲは、ＰＣＲプリミックス（Ｉｎｔｒｏｎ）を使用して３ｕｌ  ｃＤＮＡ、ＣＧＩ  ５８遺伝子に特異的な１０ｐｍｏｌｅのプライマーをＰＣＲプリミックスに混合して施行した。ＰＣＲ条件は９４℃で３０秒、５５℃〜５６℃で３０秒、７２℃で３０秒で反応させた。遺伝子はＰＣＲ結果が指数的に増幅することができる条件で分析した。ＰＣＲ産物の５ｕｌを得て１％アガロースゲルに電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色して確認して、その結果を図１ａ乃至図１ｉに示した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
本発明は、抗炎症活性を有するペプチド及びその用途関するものである。
【国際調査報告】
2019510077.tif 000037
2019510077.tif 000038
2019510077.tif 000039
2019510077.tif 000040
2019510077.tif 000041
2019510077.tif 000042