(57)【要約】  本発明は、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するための方法、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａを検出するための手段を含むキット、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを検出するために適した第一及び第二抗体を含む物質の組成物、並びにヒトＶＥＧＦ−Ａと非ヒトもしくはキメラタンパク質とを含む複合体を検出する方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するための方法において、
試料を第一及び第二抗体と共にインキュベートするステップであって、前記第一及び前記第二抗体がＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａに結合することができ、前記第一及び前記第二抗体の結合が互いに干渉せず、
前記抗体の一方が検出可能に標識され、よって第一抗体、ＶＥＧＦ−Ａ、及び第二抗体を含む検出可能に標識された複合体を形成するステップと、
形成された複合体を検出し、よってＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストがＶＥＧＦ−Ａ結合ポリペプチド、特にＶＥＧＦ−Ａ結合抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが抗体ベバシズマブである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
第一及び／又は第二抗体の何れかが、ＶＥＧＦ受容体が覆う又は結合するエピトープに結合する、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
第一又は第二抗体の何れかが、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなるＣＤＲを含み、又は
配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなるＣＤＲを含む、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
第一又は第二抗体の何れかが、配列番号：２のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：３のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
第一又は第二抗体の何れかが、配列番号：４のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：５のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、請求項１から６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
第一又は第二抗体が固相に結合するか又は結合することができる、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
第一抗体又は第二抗体の何れかがビオチン化され、他方の抗体がルテニル化される、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
試料が、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストで治療された患者に由来する、請求項１から９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
試料が体液、特に全血、血清又は血漿である、請求項１から１０の何れかに記載の方法。
【請求項１２】
ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａ又はそのバリアントのレベルを測定するためのキットであって、第一及び第二抗体を含み、
前記第一及び前記第二抗体が共に、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａに結合することができ、前記第一及び前記第二抗体の結合が互いに干渉せず、かつ
前記抗体の一方が検出可能に標識される、キット。
【請求項１３】
前記キットが請求項４から９の何れか一項に特定された抗体を含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
第一及び第二抗体を含有する物質の組成物であって、
前記第一及び前記第二抗体が共に、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａに結合することができ、
前記第一及び前記第二抗体の結合が互いに干渉せず、かつ
前記抗体の一方が検出可能に標識される、組成物。
【請求項１５】
ヒトＶＥＧＦ−Ａと非ヒトもしくはキメラタンパク質とを含む複合体を検出する方法であって、
（ａ）前記複合体を含む試料を、ヒトＶＥＧＦ−Ａ及び／又は非ヒトもしくはキメラタンパク質に結合することができるか又は結合する検出可能に標識された抗体又はその抗原結合断片と共にインキュベートするステップと
（ｂ）前記抗原結合タンパク質を検出するステップ
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するための方法、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａを検出するための手段を含むキット、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを検出するために適した第一及び第二抗体を含む物質の組成物、並びにヒトＶＥＧＦ−Ａと非ヒトもしくはキメラタンパク質とを含む複合体を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、ヒトの健康に対する最も致命的な脅威の一つである。米国だけで、がんは毎年ほぼ１３０万人の新規患者を侵し、心血管疾患に続く第二の主要な死亡原因であり、死者４人に約１人を占める。固形腫瘍はそれらの死亡のほとんどに関与している。所定のがんの治療では大きな進歩があったものの、全てのがんに対する全体的な５年生存率は過去２０年間でほんの約１０％向上したにすぎない。がん又は悪性腫瘍は、転移し、制御不能な形で急速に増殖し、時宜を得た検出と治療を極めて困難にしている。がんの種類に応じて、患者には、典型的には、化学療法、放射線療法及び抗体ベース薬物を含み、患者が利用可能な幾つかの治療選択肢がある。異なる治療法からの臨床転帰を予測するために有用な診断方法は、これらの患者の臨床的対応に大きな利益をもたらすであろう。
【０００３】
血管新生が様々な障害の病因に関与していることは今や十分に確立されている。これらには、固形腫瘍、増殖性網膜症もしくは加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）などの眼内血管新生症候群、関節リウマチ、２０及び乾癬が含まれる（Folkman等 J. Biol. Chem. 267:10931-10934 (1992)；Klagsbrun等 Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991)；及びGamer A, Vascular diseases. In: Pathobiology of ocular disease. A dynamic approach. Gamer A, Klintworth GK編 2版(Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710）。固形腫瘍の場合、血管新生により、腫瘍細胞は、正常細胞と比較して増殖優位性及び増殖性自律性を獲得することが可能になる。従って、腫瘍切片における微小血管密度と乳がん並びに幾つかの他の腫瘍における患者の生存との間に相関が観察されている（Weidner等 N Engl J Med 324:1-6 (1991)；Horak等 Lancet 340:1120-1124 (1992)；及びMacchiarini等 Lancet 340: 145-146 (1992)）。
【０００４】
正常及び異常な血管新生の調節における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）についての重要な役割は確立されている（Ferrara等 Endocr. Rev. 18:4-25 (1997)）。単一のＶＥＧＦ対立遺伝子でさえも喪失すると胚致死性がもたらされるという知見は、血管系の発生及び分化においてこの因子が果たす欠くことのできない役割を指し示している（Ferrara等、前出）。ＶＥＧＦが腫瘍及び眼内障害に関連する血管新生の重要なメディエーターであることもまた示されている（Ferrara等、前出）。ＶＥＧＦ ｍＲＮＡは、調べられた大多数のヒト腫瘍によって過剰発現されている（Berkman等 J Clin Invest 91:153-159 (1993)；Brown等 Human Pathol.. 26:86-91 (1995)；Brown等 Cancer Res. 53:4727-4735 (1993)；Mattern等 Brit. J. Cancer. 73:931-934 (1996)；及びDvorak等 Am J. Pathol. 146:1029-1039 (1995)）。また、眼液中のＶＥＧＦの濃度は、糖尿病性及び他の虚血関連網膜症の患者における血管の活発な増殖の存在と高度に相関している（Aiello等 N. Engl. J. Med. 331: 1480-1487 (1994)）。更に、研究では、急性黄斑変性症（ＡＭＤ）に罹患した患者の脈絡膜新生血管膜におけるＶＥＧＦの局在化が実証されている（Lopez等 Invest. Ophtalmo. Vis. Sci. 37:855-868 (1996)）。
【０００５】
内因性ＶＥＧＦレベルを測定する能力は、感度がよく特異的なアッセイの利用可能性に依存する。ＶＥＧＦに対する比色分析、化学発光分析、及び蛍光分析に基づく酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が報告されている。Houck等, 前出, (1992)；Yeo等 Clin. 国際公開第２００８／０６０７７７号 ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３１０ Chem. 38:71 (1992)；Kondo等 Biochim. Biophys. Acta 1221 :211 (1994)；Baker等 Obstet. Gvnecol. 86:815 (1995)；Hanatani等 Biosci. Biotechnol. Biochem. 59:1958 (1995)；Leith及びMichelson Cell Prolif. 28:415 (1995)；Shifren等 J. Clin. Endocrinol. Metab. 81:3112 (1996)；Takano等 Cancer Res. 56:2185 (1996)；Toi等 Cancer 77:1101 (1996)；Brekken等 Cancer Res. 58:1952 (1998)；Obermair等Br. J. Cancer 77:1870-1874 (1998)；Webb等 Clin. Sci. 94:395-404 (1998)。例えば、Ｈｏｕｃｋ等（前出(1992)）は、ｎｇ／ｍｌの感度を有すると思われる比色ＥＬＩＳＡを記載しているが、それは内因性ＶＥＧＦレベルを検出するのに十分な感度ではない可能性がある。Ｙｅｏ等（前出(1992)）は、二部位時間分解免疫蛍光アッセイを記載しているが、正常な血清中ではＶＥＧＦが検出されなかった（Yeo等 Cancer Res. 53:2912 (1993)）。Ｂａｋｅｒ等（前出(1995)）は、この免疫蛍光アッセイの修正版を使用して、妊婦の血漿中の検出可能なレベルのＶＥＧＦを報告しており、子癇前症の女性ではより高いレベルが観察された。妊婦における同様のデータが、ラジオイムノアッセイを使用してAnthony等 Ann. Clin. Biochem. 34:276 (1997)によって報告された。Ｈａｎａｔａｎｉ等（前出(1995)）は、循環ＶＥＧＦを測定することができる化学発光ＥＬＩＳＡを開発し、８〜３６ｐｇ／ｍｌの３０名の正常な個体（男性及び女性）からの血清中のＶＥＧＦレベルを報告している。Ｂｒｅｋｋｅｎ等（前出(1998)）は、ＶＥＧＦ単独又はＶＥＧＦ：Ｆｌｋ−１複合体の何れかに対して結合優先性を有する抗体を使用するＥＬＩＳＡアッセイを記載している。ＶＥＧＦ検出用のＥＬＩＳＡキットは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Minneapolis, MN）から市販されている。Ｒ＆Ｄ ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡキットはサンドイッチアッセイにおいて使用されており、そこでは、モノクローナル抗体が標的ＶＥＧＦ抗原を捕獲するために使用され、ポリクローナル抗体がＶＥＧＦを検出するために使用される。Webb等 前出(1998)。例えば、Ｏｂｅｒｍａｉｒ等（前出(1998)）もまた参照のこと。Keyt等 J. Biol. Chem. 271:7788-7795 (1996)；Keyt等 J. Biol. Chem. 271:5638 (1996)；及びShifren等（前出(1996)）もまた二重モノクローナル抗体対に基づく比色ＥＬＩＳＡを開発している。このＥＬＩＳＡはがん患者における上昇したＶＥＧＦレベルを検出することができたが、正常な個体における内因性ＶＥＧＦレベルを測定するために必要な感度は欠いていた。Rodriguez等 J. Immunol. Methods 219:45 (1998)は、ニート血漿又は血清中で１０ｐｇ／ｍｌのＶＥＧＦの感度をもたらす二部位蛍光ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡを記載している。しかしながら、この蛍光アッセイは、ＶＥＧＦの完全にインタクトな１６５／１６５及び１６５／１１０種のみを検出する（ＶＥＧＦ１６５／１６５は、３通りの他の形態、すなわち、１６５／１１０ヘテロ二量体、１１０／１１０ホモ二量体、及び５５−アミノ酸Ｃ末端断片にタンパク質分解的に切断されうることが報告されている（Keyt等 J. Biol. Chem. 271:7788-7795 (1996)；Keck等 Arch. Biochem. Biophys. 344: 103-113 (1997)）。）。
【０００６】
ＶＥＧＦ−Ａは、ＶＥＧＦ−Ａに結合してその活性を遮断する例えばアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（登録商標）のような治療用アンタゴニストの標的である。しかしながら、これまでのところ、文献に記載されているアッセイ又は市販されているアッセイでは、そのようなＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でのＶＥＧＦ−Ａレベルの測定は可能ではない。従って、そのようなアンタゴニストの存在下、特にそのような治療用アンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａレベルの検出を可能にするアッセイ及びこれらアッセイで使用される手段を開発することが緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
第一の態様では、本発明は、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するための方法に関し、該方法は、試料を第一及び第二抗体と共にインキュベートするステップであって、前記第一及び前記第二抗体が共にＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａに結合することができるステップと、形成された複合体を検出し、よってＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するステップとを含む。実施態様では、前記第一及び前記第二抗体の結合は互いに干渉しない。実施態様では、前記抗体の一方が固相に結合し又は結合することができ、前記抗体の他方が検出可能に標識される。形成された検出可能に標識された複合体は第一抗体、ＶＥＧＦ−Ａ、及び第二抗体を含む。
【０００８】
第二の態様では、本発明は、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するためのキットに関し、該キットは、第一及び第二抗体を含み、前記第一及び前記第二抗体が共にＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａに結合することができる。実施態様では、前記第一及び前記第二抗体の結合は互いに干渉しない。実施態様では、前記抗体の一方が固相に結合し又は結合することができ、前記抗体の他方が検出可能に標識される。
【０００９】
第三の態様では、本発明は、第一及び第二抗体を含有する物質の組成物であって、前記第一及び前記第二抗体が共にＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａ又はそのバリアントに結合することができる組成物に関する。実施態様では、前記第一及び前記第二抗体の結合は互いに干渉しない。実施態様では、前記抗体の一方が固相に結合し又は結合することができ、前記抗体の他方が検出可能に標識される。
【００１０】
第四の態様では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ−Ａと非ヒトもしくはキメラタンパク質とを含む複合体を検出する方法であって、（ａ）前記複合体を含む試料を、ヒトＶＥＧＦ−Ａ及び／又は非ヒトもしくはキメラタンパク質に結合することができるか又は結合している検出可能に標識された抗体と共にインキュベートするステップと、（ｂ）前記検出可能に標識された抗体又はその抗原結合断片を検出するステップとを含む、方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】Ａ：アッセイデザイン；Ｂ：ＶＥＧＦ−Ａ受容体を含むアッセイデザイン
【図２】抗体Ｍ−１３．２．５及びＭ−１３．７．４０の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列；ＣＤＲが太字で強調表示され、ＦＲに下線が付されている。
【図３】ＶＥＧＦ−Ａ受容体Ｒ１又はＲ２を伴うか伴わないＢｉａｃｏｒｅセンサーグラム。
【００１２】
［配列表］
配列番号：１：  ヒトＶＥＧＦ−Ａ
配列番号：２：  Ｍ−１３．２．５の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号：３：  Ｍ−１３．２．５の重鎖のアミノ酸配列
配列番号：４：  Ｍ−１３．７．４０の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号：５：  Ｍ−１３．７．４０の重鎖のアミノ酸配列
【発明を実施するための形態】
【００１３】
［定義］
本発明を以下に詳細に説明する前に、本発明は、ここに記載の特定の方法論、プロトコル及び試薬（これらは変わる可能性がある）には限定されないことを理解されたい。また、ここで使用される用語は特定の実施態様を説明することのみを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないこともまた理解されたい。他の定義がなされない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１４】
幾つかの文献がこの明細書の本文を通して引用される。ここで引用される文献の各々（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造者の仕様書、説明書等々を含む）は、前出又は後出にかかわらず、その全体が出典明示によりここに援用される。ここに記載の如何なるものも、本発明が先の発明によるそのような開示に先行する権利がないことの承認として解釈されるべきではない。ここに引用された文献の幾つかは、「出典明示により援用される」ものとして特徴付けられる。そのような援用された参考文献の定義又は教示と本明細書に記載された定義又は教示との間に矛盾がある場合、本明細書の本文が優先される。
【００１５】
次に、本発明の構成要素を記載する。これらの構成要素は特定の実施態様と共に列挙されるが、それらを任意の方法かつ任意の数で組み合わせて追加の実施態様を作り出すことができることを理解されたい。様々に記載された実施例及び好ましい実施態様は、本発明を明示的に記載された実施態様のみに限定するものと解釈されるべきではない。この記載は、明示的に記載された実施態様を任意の数の開示された及び／又は好ましい構成要素と組み合わせる実施態様を裏付けかつ包含するものと理解されるべきである。更に、この出願における全ての記載された構成要素の任意の配列及び組み合わせは、文脈が他を示さない限り、本出願の説明によって開示されたと考えられるべきである。
【００１６】
「含む（comprise）」という語と、「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などの変形語は、記載された整数もしくはステップ又は整数もしくはステップの群を包含することを意味するが、任意の他の整数もしくはステップ又は整数もしくはステップの群を包含しないことを意味するものではない。
【００１７】
この明細書と添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容が明確に他の意味を示さない限り、複数の指示対象を含む。
【００１８】
濃度、量、及び他の数値データは、ある「範囲」の形でここに表され又は提示されうる。そのような範囲の形は単に便宜と簡潔さのために使用され、よって範囲の限界として明示的に記載された数値ばかりでなく、各数値及び部分範囲が明示的に記載されているかのようにその範囲内に包含される全ての個々の数値又は部分範囲をまた含むように柔軟に解釈されるべきであることが理解されなければならない。例示として、「１５０ｍｇ〜６００ｍｇ」の数値範囲は、１５０ｍｇ〜６００ｍｇの明示的に記載された値だけでなく、示された範囲内の個々の値及び部分範囲もまた含むものと解釈されるべきである。従って、この数値範囲に含まれるのは、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、．．．、５８０、５９０、６００ｍｇなどの個々の値と、１５０〜２００、１５０〜２５０、２５０〜３００、３５０〜６００などの部分範囲である。この同じ原則が、一つの数値のみを記載する範囲にも適用される。更に、そのような解釈は、範囲の広さ又は記載されている特徴にかかわらず、適用されるべきである。
【００１９】
数値に関して使用される場合の「約」という用語は、示された数値よりも５％小さい下限を有し、かつ示された数値よりも５％大きい上限を有する範囲内の数値を包含することを意味する。
【００２０】
「発現レベル」という用語は、ある時点で身体又は試料中に存在する遺伝子産物の量を指す。発現レベルは、例えば、遺伝子から発現されたタンパク質又はｍＲＮＡによって測定／定量／検出されうる。発現レベルは、例えば、試料中に存在する目的の遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質）の量を、同じ試料又は参照試料（例えば、同じ個体から同時に採取された試料あるいは同じ個体又は同じ試料の同一のサイズ（重量、体積）の一部）中の同じカテゴリーの遺伝子産物の合計量（総タンパク質又はｍＲＮＡ）で正規化することによって、又は定まった試料サイズ（重量、体積など）当たりの目的の遺伝子産物の量を同定することによって、定量化されうる。発現レベルは、当該技術分野において知られている任意の方法、例えば目的の遺伝子産物の直接的検出及び定量化の方法（例えば質量分析）あるいは目的の遺伝子産物に特異的な一又は複数の異なる分子又は検出手段（例えば、プライマー、プローブ、抗体、タンパク質スキャホールド）と目的の遺伝子産物の結合によって通常は機能する目的の遺伝子産物の間接的検出及び測定の方法によって測定され又は検出されうる。（例えば、核酸プローブ又はプライマー、例えば定量的ＰＣＲ、マルチプレックスライゲーション依存プローブ増幅（ＭＬＰＡ）ＰＣＲによる）一又は複数の断片の有無の決定をまた含む、目的の遺伝子産物の遺伝子コピーのレベルの決定がまた当業者の知識の範囲内である。
【００２１】
本発明の文脈において、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸の短いポリマーを指す。それはタンパク質と同じ化学的（ペプチド）結合を有するが、一般に長さが短い。最も短いペプチドは、単一のペプチド結合によって結合された二つのアミノ酸からなるジペプチドである。トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド等々もありうる。典型的には、ペプチドは８、１０、１２、１５、１８又は２０のアミノ酸までの長さを有する。環状ペプチドでない限り、ペプチドはアミノ末端とカルボキシル末端とを有する。
【００２２】
本発明の文脈において、「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに結合されたアミノ酸の単一直鎖を指し、典型的には少なくとも約２１のアミノ酸を含む。ポリペプチドは、２本以上の鎖からなるタンパク質の１本の鎖でありうるか、又はタンパク質が１本の鎖からなる場合、タンパク質自体でありうる。
【００２３】
本発明の異なる態様の文脈では、「タンパク質」という用語は、二次及び三次構造をとる一又は複数のポリペプチドを含む分子を指し、加えて、四次構造を形成する幾つかのポリペプチド、すなわち幾つかのサブユニットから構成されるタンパク質を指す。タンパク質には、ときどき非ペプチド基が結合しているが、これは補欠分子族又は補因子と呼ばれうる。
【００２４】
ここで使用される「複合体」という用語は、互いに非常に近接していて共通の又は相互に関連する機能を果たす多くの個々の構成要素、部分（parts）又は部分（moieties）を包含する全体を指す。複合体の個々の部分は、同じ又は異なる性質のものでありうる、すなわち、それらは、限定されないが、ヌクレオチド、アミノ酸、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、又は脂質などの同じ、類似の又は異なる化学物質で構成されうる。例示として、複合体は、所定数の関連タンパク質、あるいは一又は複数のタンパク質と一又は複数の核酸の混合物、あるいは一又は複数のタンパク質と一又は複数の脂質及び／又は炭水化物の混合物を含みうる。同一、類似、又は異なる化学物質の任意の他の組み合わせもまた包含されることが理解される。複合体の個々の部分は相互に連結されていてもされていなくてもよい。典型的には、複合体の個々の部分は、共有結合又は非共有結合によって結合される。例示として、複合体はタンパク質とそれが結合する受容体とを含み得、又は複合体はタンパク質と該タンパク質のエピトープに結合した抗体とを含みうる。
【００２５】
「抗原」という用語は、免疫系にそれに対する抗体を産生させる任意の物質を指す。抗原は、体内（「自己抗原」）又は外部環境（「非自己」）に由来しうる。抗原提示細胞は、組織適合性分子上にペプチドの形で抗原を提示する。適応免疫系のＴ細胞は抗原を認識する。抗原と組織適合性分子の種類に応じて、異なる種類のＴ細胞が活性化される。
【００２６】
「抗原決定基」としても知られる「エピトープ」は、免疫系によって、具体的には抗体、Ｂ細胞、又はＴ細胞によって認識される、高分子のセグメント、特に抗原のセグメントである。エピトープは、典型的には抗原の一部であり、抗体又はその抗原結合断片に結合することができる。この文脈において、「結合」という用語は、好ましくは特異的結合に関する。本発明の文脈において、「エピトープ」という用語は、抗体によって認識されるタンパク質のセグメントを指す。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面群からなり、また特異的な三次元構造の特徴、並びに特異的な電荷特性を通常は有する。立体構造及び非立体構造エピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下で失われるという点で区別される。
【００２７】
ここで使用される場合、「バリアント」という用語は、その長さ又は配列における一又は複数の変化だけそれが由来するポリペプチド又はポリヌクレオチドと比較して異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドとして理解されるべきである。ポリペプチド又はポリヌクレオチドバリアントが由来するポリペプチド又はポリヌクレオチドは、親ポリペプチド又はポリヌクレオチドとしても知られている。「バリアント」という用語は、親分子の「断片」又は「誘導体」を含む。典型的には、「断片」は親分子よりも長さ又はサイズが小さいが、「誘導体」は親分子と比較してその配列に一又は複数の差異を示す。また包含されるものは、修飾分子、例えば限定しないが、翻訳後修飾タンパク質（例えば、グリコシル化、ビオチン化、リン酸化、ユビキチン化、パルミトイル化、又はタンパク分解的に切断されたタンパク質）及び修飾核酸、例えばメチル化ＤＮＡである。限定されるものではないがＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドなどの異なる分子の混合物もまた「バリアント」という用語に包含される。典型的には、バリアントは人工的に、好ましくは遺伝子工学的手段により構築される一方、親タンパク質もしくはポリヌクレオチドは野生型タンパク質もしくはポリヌクレオチド、又はそれらのコンセンサス配列である。しかしながら、天然に生じるバリアントもまたここで使用される「バリアント」という用語によって包含されると理解されるべきである。更に、本発明において使用可能なバリアントは、そのバリアントが親分子の少なくとも一つの生物学的活性を示す、すなわち機能的に活性であるという条件で、親分子のホモログ、オルソログ、又はパラログに由来するものあるいは人工的に構築されたバリアントに由来するものであってもよい。
【００２８】
特に、「ペプチドバリアント」、「ポリペプチドバリアント」、「タンパク質バリアント」という用語は、アミノ酸配列の一又は複数の変化だけそれが由来するペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質と比較して異なるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質として理解されるべきである。ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質バリアントが由来するペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、親ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質としても知られている。更に、本発明において使用可能なバリアントはまた、バリアントが親ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質の少なくとも一つの生物学的活性を示すという条件で、親ペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質のホモログ、オルソログもしくはパラログ、又は人工的に構築されたバリアントに由来しうる。アミノ酸配列の変化は、アミノ酸交換、挿入、欠失、Ｎ末端切断、もしくはＣ末端切断、又はこれらの変化の任意の組み合わせであり得、これらは、一又は幾つかの部位で起こりうる。ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質バリアントは、全数が５０まで（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０まで）のアミノ酸配列変化（すなわち、交換、挿入、欠失、Ｎ末端切断、及び／又はＣ末端切断）を示しうる。アミノ酸交換は、保存的、半保存的及び／又は非保存的でありうる。アミノ酸が化学的に関連したアミノ酸で置換される、半保存的及び特に保存的アミノ酸置換が好ましい。典型的な置換は、脂肪族アミノ酸間、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸間、酸性残基を有するアミノ酸間、アミド誘導体間、塩基性残基を有するアミノ酸間、又は芳香族残基を有するアミノ酸間である。典型的な半保存的及び保存的置換は次の通りである：
2019523404.tif 000003
【００２９】
新しいシステインが遊離チオールとして残る場合、Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ又はＹからＣへの変化は半保存的である。更に、当業者は、立体的に要求される位置のグリシンが置換されるべきではなく、またＰがアルファ−へリックス又はベータ−シート構造を有するタンパク質の部分に導入されるべきではないことを認識するであろう。
【００３０】
あるいは又は加えて、ここで使用される「バリアント」は、それが由来する親ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に対するある程度の配列同一性によって特徴付けることができる。より正確には、本発明の文脈におけるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質バリアントは、その親ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に対して少なくとも８０％の配列同一性を示す。特に、バリアントは少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％の配列同一性を示しうる。ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質バリアントの配列同一性は、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれ以上のアミノ酸の連続的な伸長にわたる。
【００３１】
「バイオマーカー」又は「指標」という用語は、ここでは互換的に使用される。本発明の文脈において、バイオマーカーは、生物システムの生物学的状態の指標として使用される生物システム内の物質として定義されうる。当該技術分野では、「バイオマーカー」という用語は、前記内因性物質の検出のための手段（例えば、抗体、核酸プローブなど、イメージングシステム）にもまた時折適用される。本発明の文脈において、「バイオマーカー」という用語は、検出手段にではなく、物質にのみ適用されるものとする。従って、バイオマーカーは、核酸（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡなど）、タンパク質（細胞表面受容体、細胞質ゾルタンパク質など）、代謝産物又はホルモン（血糖、インスリン、エストロゲンなど）、他の分子のある種の修飾に特徴的な分子（例えば、タンパク質上の糖部分又はホスホリル残基、ゲノムＤＮＡ上のメチル残基）又は生物によってインターナライズされている物質又はそのような物質の代謝産物のような、生体内に存在する任意の種類の分子でありうる。
【００３２】
「ＶＥＧＦ」という用語は、マウス、ラット又は霊長類などのヒト及び非ヒト種由来のＶＥＧＦを指す。時には、特定の種由来のＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦについてのｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦについてのｍＶＥＧＦなどのような用語によって示される。
【００３３】
「ＶＥＧＦの生物学的活性」には、限定されないが、任意のＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦの結合、及びＶＥＧＦシグナル伝達活性、例えば正常及び異常双方の血管形成及び脈管形成の調節（Ferrara及びDavis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25；Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77:527-543）；胚性脈管形成及び血管形成の促進（Carmeliet等(1996) Nature 380:435-439；Ferrara等(1996) Nature 380:439-442）；及び女性生殖管における及び骨成長と軟骨形成のための周期的血管増殖の調節（Ferrara等(1998) Nature Med. 4:336-340；Gerber等(1999) Nature Med. 5:623-628）が含まれる。血管形成及び脈管形成における血管新生因子であることに加えて、多面的増殖因子としてのＶＥＧＦは、内皮細胞生存、血管透過性及び血管拡張、単球走化性及びカルシウム流入などの他の生理学的過程において複数の生物学的効果を示す（上掲のFerrara及びDavis-Smyth (1997)，及びCebe-Suarez等 Cell. Mol. Life Sci. 63:601-615 (2006)）。更に、最近の研究では、網膜色素上皮細胞、膵管細胞、及びシュワン細胞などの幾つかの非内皮細胞型に対するＶＥＧＦの分裂促進作用が報告されている。Guerrin等 (1995) J. Cell Physiol. 164:385-394；Oberg-Welsh等(1997) Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132；Sondell等(1999) J. Neurosci. 19:5731-5740。
【００３４】
本発明の文脈において、「ＶＥＧＦ−Ａ」は、配列番号：１（Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ１５６９２、遺伝子ＩＤ（ＮＣＢＩ）：７４２２）によって例示される血管内皮増殖因子タンパク質Ａを指す。ＶＥＧＦ−Ａは、ジスルフィド結合ホモ二量体を形成し得、内皮細胞に特異的に作用し、かつ増加した血管透過性の媒介、血管形成、脈管形成及び内皮細胞増殖の誘導、細胞遊走の促進、及びアポトーシスの阻害を含む様々な効果を有するグリコシル化マイトジェンとしての役割を果たす。「ＶＥＧＦ−Ａ」という用語は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するタンパク質、並びにそのアイソフォーム、断片及びバリアントを包含する。自由に分泌されるアイソフォーム又は細胞関連アイソフォームの何れかをコードする選択的スプライスによる転写物、例えば、ＶＥＧＦ−Ａのスプライスアイソフォーム、例えばＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６のスプライスアイソフォームが、それらの天然に生じる対立遺伝子及びプロセシング型と共に、特徴付けられている。断片には、限定されないが、Ferrara Mol. Biol. Cell 21:687 (2010)及びLeung等 Science 246:1306 (1989)、及びHouck等 Mol. Endocrin. 5:1806 (1991)に記載されているように、ＶＥＧＦ１６５のプラスミン切断によって産生される１１０アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子が含まれる。従って、「ＶＥＧＦ−Ａ」という用語は、配列番号：１のアミノ酸配列を有するタンパク質、並びにそのスプライスアイソフォームＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６、その１１０アミノ酸断片、並びに配列番号：１のアミノ酸配列のバリアント、スプライスアイソフォームＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６のバリアント、及びそれらの１１０アミノ酸断片のバリアントに関する。
【００３５】
最もよく特徴付けられている２つのＶＥＧＦ受容体は、「ＶＥＧＦＲ１」（Ｆｌｔ−１としても知られる）と「ＶＥＧＦＲ２」（マウスホモログについてＫＤＲ及びＦＬＫ−１としても知られる）である。各ＶＥＧＦファミリーメンバーに対する各受容体の特異性は変化するが、ＶＥＧＦ−ＡはＦｌｔ−１とＫＤＲの両方に結合する。全長Ｆｌｔ−１受容体は、７つのＩｇドメインを有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及びチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインはＶＥＧＦの結合に関与し、細胞内ドメインはシグナル伝達に関与している。ＶＥＧＦ−Ａに特異的に結合するＶＥＧＦ−Ａ受容体分子又はその断片は、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質に結合してそれを隔離し、それによってそれがシグナル伝達するのを妨げるＶＥＧＦ−Ａ阻害剤として使用することができる。また、受容体の可溶型は、ＶＥＧＦ−Ａに結合することによってＶＥＧＦ−Ａタンパク質の生物学的活性に対して阻害効果を発揮し、それによってそれが標的細胞の表面上に存在するその天然の受容体に結合するのを防ぐ。
【００３６】
「疾患」及び「障害」という用語は、ここでは互換的に使用され、組織、器官又は個体がもはやその機能を効率的に果たすことができない異常な状態、特に病気又は傷害などの異常な医学的状態を指す。必ずではないが典型的には、疾患は、そのような疾患の存在を示す特定の症状又は徴候と関連している。従って、そのような症状又は徴候の存在は、組織、器官又は個体が疾患を患っていることを示している場合がある。これらの症状又は徴候の変化は、そのような疾患の進行を示している場合がある。疾患の進行は、典型的には、疾患の「悪化」又は「改善」を示しうるそのような症状又は徴候の増減によって特徴付けられる。疾患の「悪化」は、組織、器官又は生物がその機能を効率的に果たす能力の低下によって特徴付けられる一方、疾患の「改善」は、典型的には、組織、器官又は個体がその機能を効果的に果たす能力の増加によって特徴付けられる。疾患を「発症するリスク」がある組織、器官又は個体は、健康な状態にあるが、疾患が出現する可能性を示している。典型的には、疾患を発症するリスクは、そのような疾患の早期又は弱い徴候又は症状と関連している。そのような場合、疾患の発症は依然として治療によって予防されうる。疾患の例には、限定されないが、外傷性疾患、炎症性疾患、感染性疾患、皮膚疾患、内分泌疾患、腸疾患、神経障害、関節疾患、遺伝性障害、自己免疫疾患、及び様々な種類のがんが含まれる。
【００３７】
「細胞増殖性疾患」及び「増殖性疾患」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。
【００３８】
ここで使用される「腫瘍」という用語は、悪性又は良性にかかわらず、全ての新生物細胞増殖（growth）及び増殖（proliferation）、並びに全ての前がん性及びがん性の細胞及び組織を指す。「がん」、「がん性」、「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」は、ここで言及されるように相互に排他的ではない。
【００３９】
「がん」及び「がん性」という用語は、典型的には未制御の細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すか又は記述する。がんの例には、限定されないが、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。そのようながんのより特定の例には、扁平上皮がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、及び肺扁平上皮がんを含む）、腹膜がん、肝細胞がん、胃（gastric）又は胃（stomach）がん（例えば、胃腸がんを含む）、膵臓がん（例えば、転移性膵臓がんを含む）、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞種、乳がん（局所進行、再発又は転移ＨＥＲ−２陰性乳がんを含む）、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん又は子宮がん、唾液腺がん、腎臓（kidney）又は腎（renal）がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝細胞がん及び様々な種類の頭頸部がん、並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びワルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、並びにファコマトーシスに関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、及びメイグス症候群が含まれる。
【００４０】
疾患の「症状」は、そのような疾患を有する組織、器官又は生物によって気付くことができる疾患の暗示であり、限定されないが、組織、器官又は個体の疼痛、脱力、圧痛、緊張、こわばり感、及び痙攣を含む。疾患の「徴候」又は「シグナル」には、限定されないが、バイオマーカー又は分子マーカーなどの特定の指標の存在、非存在、増加又は上昇、減少又は低下などの変化又は変更、あるいは症状の発症、存在又は悪化が含まれる。疼痛の症状には、限定されないが、持続性又は様々なヒリヒリする痛み、ズキズキする痛み、かゆみ又は刺痛として感じられうる不快な感覚が含まれる。
【００４１】
ここで使用される場合、「患者」とは、ここに開示される予後又は治療から恩恵を受けうる任意の哺乳動物、魚、爬虫類又は鳥を意味する。特に、「患者」は、実験動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、又はゼブラフィッシュ）、家畜（例えば、モルモット、ウサギ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、ラクダ、ネコ、イヌ、カメ（turtle）、カメ（tortoise）、ヘビ、トカゲ又はキンギョを含む）、又はチンパンジー、ボノボ、ゴリラ及びヒトを含む霊長類からなる群から選択される。特に「患者」はヒトである。
【００４２】
「試料」又は「目的の試料」という用語は、ここでは互換的に使用され、典型的には組織、器官又は個体の全体を表すことを意図した、そのような組織、器官又は個体よりも小さい組織、器官又は個体の一部又は一片を指す。分析時に試料は組織の状態、又は器官もしくは個体の健康状態もしくは罹患状態に関する情報を提供する。試料の例には、限定されないが、液状試料、例えば血液、血清、血漿、滑液、尿、唾液、及びリンパ液、あるいは固体試料、例えば組織抽出物が含まれる。試料の分析は視覚的又は化学的根拠で達成されうる。視覚的分析には、限定されないが、試料の形態学的評価を可能にする組織、器官又は個体の顕微鏡イメージング又はＸ線撮影スキャニングが含まれる。化学的分析には、限定されないが、特定の指標の有無の検出又はそれらの量もしくはレベルの変化が含まれる。
【００４３】
ここで使用される「参照試料」という用語は、目的の試料と実質的に同一の形で分析され、その情報が目的の試料の情報と比較される試料を指す。よって、参照試料は、目的の試料から得られた情報の評価を可能にする標準を提供する。参照試料は、健康な又は正常な組織、器官又は個体に由来し得、よって組織、器官又は個体の健康な状態の標準を提供する。正常な参照試料の状態と目的の試料の状態との間の差異が、疾患の発症のリスク、又はそのような疾患もしくは障害の存在もしくは更なる進行の指標となりうる。参照試料はまた目的の試料と同じ組織、器官、又は個体に由来しうるが、より早い時点で採取されている。先に採取された参照試料の状態と目的の試料の状態との間の差異が、疾患の進行、すなわち経時的な疾患の改善又は悪化の指標でありうる。参照試料の採取と目的の試料の採取との間にある期間が経過した場合、参照試料はより早い又は遅い時点で採取されている。そのような期間は、月（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月）、週（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８週間）、日数（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０日）、又は時間（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２時間）を表しうる。
【００４４】
指標の「低下した」又は「減少した」レベルという用語は、参照又は参照試料と比較して減少している試料中のそのような指標のレベルを指す。指標の「上昇した」又は「増加した」レベルという用語は、参照又は参照試料と比較して高い試料中のそのような指標のレベルを指す。
【００４５】
ここで使用される「アゴニスト」という用語は、受容体シグナル伝達、遺伝子発現、タンパク質合成、及びタンパク質分解などの、組織、器官又は個体における作用を引き起こす物質を指す。典型的には、アゴニストは、受容体分子の活性部位又はアロステリック部位に結合し、それによって特異的反応を引き起こすことによって作用する。アゴニストの例には、限定されないが、核酸分子、例えばｍＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ、又はタンパク質、例えばホルモン、サイトカイン、増殖因子、神経伝達物質、及び転写因子が含まれる。
【００４６】
ここで使用される「アンタゴニスト」という用語は、アゴニストの作用を遮断する物質を指す。典型的には、アンタゴニストは、受容体分子の活性部位又はアロステリック部位に結合することによって作用するか、あるいは受容体の活性の調節に通常は関与しない独特の結合部位と相互作用する。典型的には、アンタゴニストは、構造的に明確な結合部位でアゴニストと競合するか、あるいはアゴニストがその結合のために通常は引き起こすであろう作用を引き起こすことができないようにアゴニストの結合部位を変化させる。アンタゴニスト活性は、アンタゴニスト−受容体複合体の相互作用の寿命に応じて、可逆的又は不可逆的でありうる。アンタゴニストの例には、限定されないが、核酸分子、例えばｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ、あるいはタンパク質、例えばホルモン、サイトカイン、増殖因子もしくは神経伝達物質、抗体、もしくは転写因子が含まれる。
【００４７】
「アンタゴニスト抗体」という用語は、目的の分子（例えば、目的のペプチド、ポリペプチド又はタンパク質）の少なくとも一つの機能的活性を部分的にもしくは完全に低下させるか又は完全に妨げる抗体を指す。典型的には、アンタゴニスト抗体は受容体の活性部位に結合し、それによってアゴニストの受容体への結合を妨げるか、又はアゴニストの受容体への結合を立体的に妨げる形で異なる部位で受容体に結合する。
【００４８】
ここで使用される「受容体」という用語は、一又は複数の特異的シグナル伝達分子が結合する、タンパク質又はポリヌクレオチドなどの分子を指す。シグナル伝達分子は、限定されないが、核酸分子、例えばｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ、又はタンパク質、例えばホルモン、サイトカイン、増殖因子もしくは神経伝達物質、抗体もしくは転写因子を含むアゴニスト又はアンタゴニストとして作用しうる。受容体は、細胞の細胞膜、細胞質内及び／又は細胞内区画に局在している場合がある。
【００４９】
ここで使用される「免疫グロブリン（Ｉｇ）」という用語は、免疫グロブリンスーパーファミリーの免疫付与糖タンパク質を指す。「表面免疫グロブリン」は、それらの膜貫通領域によってエフェクター細胞の膜に付着しており、限定されないが、Ｂ細胞受容体、Ｔ細胞受容体、クラスＩ及びＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質、ベータ−２ミクログロブリン（約２Ｍ）、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤＳなどの分子を包含する。
【００５０】
典型的には、ここで使用される「抗体」という用語は、膜貫通領域を欠き、よって血流及び体腔内に放出されうる分泌型免疫グロブリンを指す。ヒト抗体は、それらが有する重鎖に基づいて異なるアイソタイプに分類される。抗体のクラスを定義する、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ抗体を定義する５つのタイプのヒトＩｇ重鎖があり、それぞれが異なる役割を果たし、異なるタイプの抗原に対して適切な免疫応答を指示する。ＩｇＡは、腸、気道及び尿生殖路などの粘膜領域、並びに唾液、涙液、及び母乳中に見出され、病原体による定着を防止する（Underdown及びSchiff (1986) Annu. Rev. Immunol. 4:389-417）。ＩｇＤは、抗原にさらされていないＢ細胞上の抗原受容体として主に機能し、好塩基球及び肥満細胞を活性化して抗微生物因子を産生させることに関与している（Geisberger等 (2006) Immunology 118:429-437；Chen等 (2009) Nat. Immunol. 10:889-898）。ＩｇＥは、肥満細胞及び好塩基球からのヒスタミンの放出を引き起こすアレルゲンへのその結合を介してアレルギー反応に関与している。ＩｇＥは寄生虫に対する保護にも関与している（Pier等 (2004) Immunology, Infection, and Immunity, ASM Press）。ＩｇＧは、侵入する病原体に対する抗体に基づく免疫の大部分を提供し、胎盤を通過して胎児に受動免疫を与えることができる唯一の抗体アイソタイプである（Pier等 (2004) Immunology, Infection, and Immunity, ASM Press）。ヒトには、血清中に豊富に存在する順に命名された４つの異なるＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、２、３、及び４）があり、ＩｇＧ１が最も豊富であり（約６６％）、続いてＩｇＧ２（約２３％）、ＩｇＧ３（約７％）及びＩｇＧ（約４％）である。異なるＩｇＧクラスの生物学的プロファイルは、それぞれのヒンジ領域の構造によって決まる。ＩｇＭは、単量体型及び非常に高い結合活性を有する分泌された五量体型でＢ細胞の表面上に発現される。ＩｇＭは、十分なＩｇＧが産生される前に、Ｂ細胞媒介（体液性）免疫の初期段階で病原体を排除することに関与している（Geisberger等 (2006) Immunology 118:429-437）。抗体は単量体として見出されるだけでなく、２つのＩｇ単位の二量体（例えばＩｇＡ）、４つのＩｇ単位の四量体（例えば硬骨魚のＩｇＭ）、又は５つのＩｇ単位の五量体（例えば哺乳動物ＩｇＭ）を形成することもまた知られている。
【００５１】
抗体は、典型的には、ジスルフィド結合を介して連結され、「Ｙ」字形の巨大分子に似ている、２本の同一の重鎖と同一の２本の軽鎖を含む４本のポリペプチド鎖からなる。鎖のそれぞれは、そのうちの幾つかが定常ドメインであり、他のものが可変ドメインである所定数の免疫グロブリンドメインを含む。免疫グロブリンドメインは、２つのβシートに配置された７〜９本の逆平行鎖の２層サンドイッチからなる。典型的には、抗体の重鎖は４つのＩｇドメインを含み、そのうちの３つは定常（ＣＨドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）ドメインであり、一つは可変ドメイン（ＶＨ）である。軽鎖は典型的には一つの定常Ｉｇドメイン（ＣＬ）と一つの可変Ｉｇドメイン（ＶＬ）を含む。例示的には、ヒトＩｇＧ重鎖は、ＶＬ１−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３の順でＮ末端からＣ末端に連結された４つのＩｇドメインから構成される一方、ヒトＩｇＧ軽鎖は、κ型又はλ型（Ｖκ−Ｃκ又はＶλ−Ｃλ）の何れかであるＶＬ−ＣＬの順でＮ末端からＣ末端に連結された２つの免疫グロブリンドメインから構成される。例示的には、ヒトＩｇＧの定常鎖は４４７のアミノ酸を含む。
【００５２】
「超可変領域（ＨＶＲ又はＨＶ）」及び「相補性決定領域（ＣＤＲ）」という用語はここでは互換的に使用され、配列が超可変であり、及び／又は構造的に明確なループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は６つのＨＶＲ又はＣＤＲを含み；３つがＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、３つがＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。天然抗体では、Ｈ３とＬ３が６つのＨＶＲの中で最も多様性を示し、特にＨ３は抗体に精細な特異性を付与するのに独特の役割を果たすと考えられる。例えば、Xu等 Immunity 13:37-45 (2000)；Johnson及びWu in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo編, Human Press, Totowa, NJ, 2003)を参照。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ抗体は、軽鎖の非存在下で機能的かつ安定である。例えば、Hamers-Casterman等, Nature 363:446-448 (1993)及びSheriff等, Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)を参照。多数のＨＶＲ描写が使用されており、ここに包含される。Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＨＶＲは、配列多様性に基づいており、最も一般的に使用されている（Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに構造ループの位置を指す（Chothia及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。ＡｂＭ ＨＶＲはＫａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループの妥協点を表しており、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。「接触」ＨＶＲは、入手可能な複雑な結晶構造の分析に基づいている。これらの各ＨＶＲからの残基を以下に記載する。
2019523404.tif 000004
【００５３】
ＨＶＲは、次のような「伸長ＨＶＲ」を含みうる：ＶＬにおいて、２４〜３６又は２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６又は５０〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７又は８９〜９６（Ｌ３）、及びＶＨにおいて、２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５又は４９〜６５（Ｈ２）、及び９３〜１０２、９４〜１０２、又は９５〜１０２（Ｈ３）。可変ドメイン残基は、これらの伸長ＨＶＲの定義のそれぞれについて、上掲のＫａｂａｔ等に従って番号付けされる。
【００５４】
「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」のアミノ酸は、ここで定義されるＨＶＲ残基よりも可変性が少ない残基である。典型的には、４つのＦＲが３つのＨＶＲを分離し、抗原と接触する位置にＨＶ領域を保持するためのスキャホールドとなるβシート構造を形成する。
【００５５】
「Ｋａｂａｔにおける可変ドメイン残基番号付け」又は「Ｋａｂａｔにおけるアミノ酸位置番号付け」という表現とそれらの変形表現は、上掲のＫａｂａｔ等における抗体の編集の重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用すると、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲの短縮又は挿入に対応する、より少ない又は追加のアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸インサート（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）と重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃ等々）を含みうる。「ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。従って、ＩｇＧの文脈におけるＣＨドメインは次の通りである：「ＣＨ１」は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスによるアミノ酸位置１１８〜２２０を指し；「ＣＨ２」は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスによるアミノ酸位置２３７〜３４０を指し；「ＣＨ３」は、ＫａｂａｔにおけるＥＵインデックスによるアミノ酸位置３４１〜４４７を指す。
【００５６】
「結合親和性」という用語は、一般に、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有的相互作用の合計の強度を指す。他の定義が示されない限り、ここで使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。そのパートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般に解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、限定されないが、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（例えば、ＰＣＴ出願公開公報国際公開第２００５／０１２３５９号に記載されているようなＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）；酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）；競合アッセイ（例えばＲＩＡ）を含む、当該技術分野において知られている一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般に抗原にゆっくりと結合し容易に解離する傾向があるのに対して、高親和性抗体は一般により速く抗原に結合しより長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当該技術分野において知られており、それらの何れも本発明の目的のために使用することができる。結合親和性を測定するための特定の例証的かつ例示的な実施態様を次に記載する。
【００５７】
「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、約１０応答単位（ＲＵ）で固定抗原ＣＭ５チップと共に２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００機器（BIAcore, Inc., Piscataway, NJ）を使用する表面プラズモン共鳴アッセイを使用することによって測定できる。簡潔に言えば、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、BIAcore Inc.）が、供給者の説明書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化される。抗原を１０ｍＭの酢酸ナトリウム，ｐＨ４．８で５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈した後、５μｌ／分の流量で注入しておよそ１０応答単位（ＲＵ）の結合タンパク質を達成する。抗原の注入後、１Ｍのエタノールアミンを注入して未反応基をブロックする。動態測定のために、２倍連続希釈のＦａｂ（０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を０．０５％のＴＷＥＥＮ２０（商標）界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中に２５℃でおよそ２５μｌ／分の流量で注入する。会合及び解離センサーグラムを同時に適合させることにより、単純な１対１のラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して、会合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして計算される。例えば、Chen等, J. Mol. Biol.293:865-881 (1999)を参照。上記の表面プラズモン共鳴アッセイによってオン速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、オン速度は、ストップフロー付き分光光度計（Aviv Instruments）又は撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ThermoSpectronic）のような分光光度計で測定される漸増濃度の抗原の存在下でＰＢＳ，ｐＨ７．２中の２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）の２５℃での蛍光発光強度の増加又は減少を測定する蛍光消光技術を使用して決定することができる（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）。
【００５８】
「オン速度」、「会合の速度」、「会合速度」、又は「ｋｏｎ」はまたＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００又はＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００システム（BIAcore, Inc., Piscataway, NJ）を使用して上に記載されたようにして決定することもできる。
【００５９】
典型的には、抗体はそれらの標的に対して十分な結合親和性、例えば５００ｎＭ〜１ｐＭ、すなわち５００ｎＭ、４５０ｎＭ、４００ｎＭ、３５０ｎＭ、３００ｎＭ、２５０ｎＭ、２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、１ｐＭのＫｄ値で結合する。
【００６０】
「親和性成熟」抗体は、それらの一又は複数のＨＶＲに、一又は複数の改変であって、それらの改変を有さない親抗体と比較して抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす改変を有するものである。親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモル又は更にはピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当該技術分野において知られている手順によって産生される。例えばMarks等, Bio/Technology 10:779-783 (1992)は、ＶＨ−及びＶＬ−ドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載している。ＨＶＲ及び／又はフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、例えば、Barbas等 Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)；Schier等Gene 169:147-155 (1995)；Yelton等J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)；Jackson等, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)によって記載されている。
【００６１】
抗体という用語はまたその「抗原結合断片」を包含する。抗体の「抗原結合断片」という用語は、抗体と同様な形で抗原に結合する能力を有するが、完全な抗体分子よりサイズが小さい分子を指す。例示的には、抗体の３つの「抗原結合断片」が、それぞれが単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ断片」と呼ばれる（「Ｆａｂ部分」又は「Ｆａｂ領域」とも呼ばれる）２つの同一の断片と、その名前が容易に結晶化する能力を反映している残留「Ｆｃ断片」（「Ｆｃ部分」又は「Ｆｃ領域」とも呼ばれる）との、３つの断片を産生するパパイン消化によって得られる。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤアイソタイプでは、Ｆｃ領域は、抗体の２本の重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメインに由来する２つの同一のタンパク質断片からなり；ＩｇＭ及びＩｇＥアイソタイプでは、Ｆｃ領域は各ポリペプチド鎖に３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ２〜４）を含む。加えて、更なる抗原結合断片が天然に生じるか又は人工的に構築されている。「Ｆａｂ’断片」という用語は、Ｉｇ分子のヒンジ領域を更に含むＦａｂ断片を指す一方、「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、化学的に連結されているか又はジスルフィド結合を介して連結されている２つのＦａｂ’断片を含むと理解される。「単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）」（Desmyter等 (1996) Nat. Structure Biol. 3:803-811）及び「ナノボディ」は単一のＶＨドメインのみを含むが、「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」断片は、軽鎖可変ドメインに短いリンカーペプチドを介して結合した重鎖可変ドメインを含む（Huston等 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883）。二価の一本鎖可変断片（ｄｉ−ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖを連結することによって操作されうる（ｓｃＦｖＡ−ｓｃＦｖＢ）。これは、２つのＶＨ領域と２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖を作製し、「タンデムｓｃＦｖ」（ＶＨＡ−ＶＬＡ−ＶＨＢ−ＶＬＢ）を生じさせることによってなすことができる。他の可能性は、２つの可変領域を一緒に折り畳むには短すぎるリンカーを有するｓｃＦｖの作製であり、ｓｃＦｖを二量体化させる。通常、５残基の長さを有するリンカーがこれらの二量体を作製するために使用される。このタイプは「ダイアボディ」として知られている。ＶＨドメインとＶＬドメインとの間の更に短いリンカー（１個又は２個のアミノ酸）が、単一特異性三量体、いわゆる「トリアボディ」又は「トリバディ」の形成をもたらす。二重特異性ダイアボディは、それぞれ配列ＶＨＡ−ＶＬＢ及びＶＨＢ−ＶＬＡ又はＶＬＡ−ＶＨＢ及びＶＬＢ−ＶＨＡを有する鎖に発現させることによって形成される。一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）は、１２〜２０のアミノ酸、好ましくは１４のアミノ酸のリンカーペプチド（Ｐ）によって連結されたＶＨＡ−ＶＬＢ及びＶＨＢ−ＶＬＡ断片を含む（ＶＨＡ−ＶＬＢ−Ｐ−ＶＨＢ−ＶＬＡ）。「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）」は、異なる抗体の２つのｓｃＦｖからなり、一方のｓｃＦｖがＣＤ３受容体を介してＴ細胞に結合し、他方が腫瘍特異的分子を介して腫瘍細胞に結合する融合タンパク質である（Kufer等 (2004) Trends Biotechnol. 22:238-244）。二重親和性再標的化分子（「ＤＡＲＴ」分子）は、Ｃ末端ジスルフィド架橋によって更に安定化されたダイアボディである。
【００６２】
「抗体」及び「その抗原結合断片」という用語はまた抗体のバリアント又はその抗原結合断片のバリアントを包含する。上で定義された任意のタンパク質バリアントに関して、抗体のバリアント又はその抗原結合断片のバリアントもまた、タンパク質バリアントに関して上で詳細に定義したように、その長さ又は配列における一又は複数の変化だけそれが誘導される抗体又は抗原結合断片と比較して異なる抗体又は抗原結合断片として理解されるべきである。加えて、抗体バリアント又はその抗原結合断片のバリアントは、抗体又は抗原結合断片の異なる部分において異なる程度の配列同一性を示しうる。フレームワーク領域に関して、ここではある程度の多様性が想定され、すなわち、個々のＦＲは、具体的に記載されたアミノ酸配列あるいは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は少なくとも９９．５％のアミノ酸配列を含むか又はそれからなりうる。異なるＦＲについては、実際の配列と例えばそれぞれのＦＲ配列の長さ、並びにそれぞれの可変鎖ドメイン内のその位置に応じて、異なる程度の配列同一性が許容されうることが理解されよう。しかしながら、抗体バリアント又はその抗原結合断片のバリアントにおいて、ＣＤＲは前記ＣＤＲの具体的に記載された配列を有していてもよく、あるいは最大で一つのアミノ酸置換においてそれと異なってもよい。而して、各ＣＤＲ中の一つのアミノ酸は異なるアミノ酸によって置換されうる。アミノ酸置換が、一つの抗体の一つの鎖の全てではないが幾つかのＣＤＲ中に存在しうることが理解されるであろう。
【００６３】
抗体もしくはその抗原結合断片、又はそれらのバリアントは、「検出可能に標識され」うる。「検出可能に標識される」という用語は、直接的又は間接的に検出されうる標識を包含する。適切な標識には、限定されないが、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、又は他の物理的手段によって検出可能な分子が含まれる。適切な標識には、限定されないが、蛍光色素（例えばＧＦＴとそのバリアント、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、フルオレセイン及びローダミン等々）、高電子密度試薬（例えば金）、酵素（例えばＥＬＩＳＡで一般に使用されているもの）、放射性核種含有分子（例えば放射性同位体）、化学発光分子、電気化学発光分子、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテン及び検出可能であるか又は検出可能にすることができる他の物質が含まれる。例示的には、抗体はビオチン化又はルテニル化されうる。抗体を標識するための方法は当業者によく知られており、例えば、Haugland (2003) Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.；Brinkley (1992) Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press, London；Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2；Glazer等Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work及びE. Work編) American Elsevier Publishing Co., New York；Lundblad, R. L.及びNoyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York；Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche編, Walter DeGruyter, Berlin and New York；及びWong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.)；DeLeon-Rodriguez等, Chem. Eur. J. 10 (2004) 1149-1155；Lewis等, Bioconjugate Chem. 12 (2001) 320-324；Li等, Bioconjugate Chem. 13 (2002) 110-115；Mier等 Bioconjugate Chem. 16 (2005) 240-237に豊富に記載されている。
【００６４】
抗体は、その存在、非存在、又はレベルが様々な測定方法、特にイムノアッセイ技術によって検出されうる潜在的なバイオマーカーを標的とする。これらには、限定されないが、ウエスタンブロッティング（免疫沈降あり又はなし）、二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫沈降、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、フローサイトメトリー、及びイムノアッセイ手順が含まれる。前記方法は、血漿又は血清を含む多種多様な組織及び試料をアッセイすることを可能にする。そのようなアッセイ形式を使用する広範囲のイムノアッセイ技術が利用可能である。例えば米国特許第４０１６０４３号、第４４２４２７９号、及び第４０１８６５３号を参照。これらには、非競合型の単一部位及び二部位又は「サンドイッチ」アッセイの両方、並びに伝統的な競合的結合アッセイが含まれる。これらのアッセイはまた標識された抗体の標的バイオマーカーへの直接結合を含む。
【００６５】
「サンドイッチアッセイ」は、サンドイッチアッセイ技術の多くの変形技術を包含する最も有用で一般的に使用されているアッセイである。簡単に言うと、典型的なアッセイでは、非標識抗体を固体基質に固定し、試験される試料を結合分子と接触させる。適切なインキュベーション時間の後、抗体−抗原複合体の形成を可能にするのに十分な期間、検出可能なシグナルを生じさせることができるレポーター分子で標識された第二抗体をついで添加し、抗体−抗原標識抗体の別の複合体の形成に十分な時間、インキュベートする。未反応物質は洗い流してもよく、アナライトの存在はレポーター分子により生成されたシグナルの観察により決定される。結果は、可視シグナルの単純な観察による定性的なものでも、既知量のバイオマーカーを含む対照試料との比較による定量的なものでもよい。
【００６６】
サンドイッチアッセイの変形例は、分析される試料と標識抗体の両方が同時に固定化抗体に添加される同時アッセイを含む。これらの技術は当業者にはよく知られており、容易に明らかなようにあらゆる小さな変更を含む。典型的なサンドイッチアッセイでは、バイオマーカー上の第一エピトープに対する第一抗体が、固相に共有結合されるか又は受動的に結合される。固相は典型的にはガラス又はポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンである。固相は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートのディスク、又はイムノアッセイを実施するのに適した任意の他の表面の形態でありうる。結合方法は当該技術分野において周知であり、一般に架橋共有結合又は物理的吸着からなり、ポリマー−抗体複合体が試験試料の調製において洗浄される。次に、分析される試料のアリコートを固相複合体に添加し、十分な期間（例えば、２〜４０分又はより都合が良い場合は一晩）、適切な条件下（例えば、室温〜４０℃、例えば２５℃〜３２℃）でインキュベートし、抗体中に存在する任意のサブユニットの結合を可能にする。インキュベーション時間の後、抗体サブユニット固相を洗浄し、バイオマーカー上の異なるエピトープに特異的な第二抗体と共にインキュベートする。第二抗体は、第二抗体のアナライトへの結合を示すために使用されるレポーター分子に結合される。
【００６７】
別の競合的方法は、アナライトを固相に固定し、ついでレポーター分子で標識されていてもされていなくてもよいアナライトに特異的な抗体に、分析される試料と一緒に固定化標的を曝露することを含む。試料中の標的分子の量とレポーター分子シグナルの強度に応じて、標的分子による競合はそのような標識抗体を介して直接検出可能でありうる。あるいは、第一抗体に特異的な第二標識抗体を標的−第一抗体複合体に曝露して、標的−第一抗体−第二抗体三次複合体を形成する。複合体は、レポーター分子によって放出されたシグナルによって検出される。
【００６８】
本明細書において使用される「レポーター分子」又は「直接検出可能な標識」という用語は、その化学的性質により、抗原結合抗体の検出を可能にする分析的に同定可能なシグナルを提供する分子を指す。このタイプのアッセイにおいて最も一般的に使用されるレポーター分子は、酵素、フルオロフォア又は放射性核種含有分子（すなわち放射性同位体）及び化学発光又は電気化学発光分子の何れかである。
【００６９】
「エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）」の場合、酵素が、典型的にはグルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸塩によって、二次抗体にコンジュゲートされる。しかしながら、容易に認識されるように、当業者には容易に利用可能である多種多様な異なる結合技術が存在する。一般的に使用される酵素には、限定されないが、とりわけ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、及びアルカリホスファターゼが含まれる。特定の酵素と共に使用される基質が、一般に、対応する酵素による加水分解の際に、検出可能な色の変化が生じるように選択される。適切な酵素の例には、限定されないが、アルカリホスファターゼ及びペルオキシダーゼが含まれる。上記の発色基質よりもむしろ蛍光生成物を生じる蛍光発生基質を用いることがまた可能である。全ての場合、酵素標識抗体を第一抗体−分子マーカー複合体に添加し、結合させ、ついで過剰の試薬を洗い流す。ついで、適切な基質を含む溶液を抗体−抗原−抗体の複合体に加える。基質は第二抗体に結合した酵素と反応して定性的な視覚的シグナルを生じ、これが、必ずではないが通常は分光光度的に更に定量されて、試料中に存在するアナライトの量の指標が得られる。あるいは、フルオレセイン及びローダミンなどの蛍光化合物を、それらの結合能を変えることなく抗体に化学的に結合させてもよい。特定の波長の光の照射によって活性化されると、蛍光色素標識抗体が光エネルギーを吸収し、分子内で励起状態を誘発し、続いて光学顕微鏡で視覚的に検出可能な特徴的な色で光を放出する。ＥＩＡにおけるように、蛍光標識抗体が第一抗体−分子マーカー複合体に結合するようにされる。未結合試薬を洗い流した後、残りの三次複合体がついで適切な波長の光に曝露され、観察された蛍光がアナライトの存在、非存在、又はレベルを示す。免疫蛍光法及びＥＩＡ法は両方とも当該技術分野で非常によく確立されている。しかしながら、放射性同位体、化学発光分子、電気化学発光分子、又は生物発光分子などの他のレポーター分子もまた用いられうる。ＶＥＧＦを検出するためのイムノアッセイは、例えば、米国特許第６８５５５０８号及び第７５４１１６０号並びに米国特許出願公開第２０１０／０２５５５１５号に記載されている。ＶＥＧＦを検出するための適切なプラットフォームは、例えば欧州特許出願公開第０９３９３１９号及び欧州特許出願公開第１６１０１２９号に記載されている。
【００７０】
更に、目的のアナライトのｍＲＮＡ又はＤＮＡが、ノーザン、ドットブロット、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析、アレイハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護アッセイの使用、又はＤＮＡマイクロアレイスナップショットを含む、市販されているＤＮＡマイクロアレイの使用からなる群から選択される方法によって検出されうる。例えば、定量的ＰＣＲアッセイなどのリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイは、当該技術分野において周知である。生物学的試料中の目的のアナライトのｍＲＮＡを検出する方法は、限定されないが、少なくとも一つのプライマーを使用する逆転写によって試料からｃＤＮＡを生成するステップ；そのように生成されたｃＤＮＡを増幅するステップ；及び増幅されたｃＤＮＡの存在を検出するステップを含む。加えて、そのような方法は、（例えば、アクチンファミリーメンバーのような「ハウスキーピング」遺伝子の比較対照ｍＲＮＡ配列のレベルを同時に調べることによって）生物学的試料中のｍＲＮＡのレベルの決定を可能にする一又は複数のステップを含みうる。加えて又は代替的に、増幅されたｃＤＮＡの配列が決定されうる。ノーザンブロット分析は、当該技術分野において周知の一般的な技術であり、例えば、Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2版, 1989, Sambrook, Fritch, Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 10 Skyline Drive, Plainview, NY 11803-2500に記載されている。遺伝子及び遺伝子産物の状態を評価するための典型的なプロトコルは、例えばAusubel等編, 1995, Current Protocols In Molecular Biology, ユニット２（ノーザンブロッティング）、４（サザンブロッティング）、１５（イムノブロッティング）及び１８（ＰＣＲ分析）に見出される。
【００７１】
ここで使用される「粒子」とは、体積、質量又は平均サイズなどの物理的性質が帰属されうる小さな局所化された物体を意味する。従って、微粒子は、対称形、球状（globular）、本質的に球状又は球形（spherical）形状、又は不規則な非対称形状又は形態のものでありうる。本発明によって想定される粒子のサイズは変わりうる。典型的には、微粒子は、ナノメートル及びマイクロメートルの範囲の直径を有する。微粒子は、５０ナノメートル〜５０マイクロメートル、すなわち５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、４００ｎｍ、５００ｎｍ、６００ｎｍ、７００ｎｍ、８００ｎｍ、９００ｎｍ、１０００ｎｍ（すなわち１μｍ）、２μｍ、３μｍ、４μｍ、５μｍ、６μｍ、７μｍ、８μｍ、９μｍ、１０μｍ、１５μｍ、２０μｍ、２５μｍ、３０μｍ、３５μｍ、４０μｍ、４５μｍ、及び５０μｍの直径を有しうる。特に、微粒子は、１００ｎｍ〜１０μｍ、特に２００ｎｍ〜５μｍ又は７５０ｎｍ〜５μｍの直径を有する。微粒子は、当業者に知られている任意の適切な材料を含むか又はそれからなり、例えば、それらは、無機又は有機材料を含むか又はそれらからなるか又はそれらから本質的になる。典型的には、それらは、金属もしくは金属の合金、又は有機材料を含むか又はそれらからなるか又はそれらから本質的になるか、あるいは炭水化物要素を含むか又はそれらからなるか又はそれらから本質的になる。微粒子の材料の例には、限定されないが、アガロース、ポリスチレン、ラテックス、ポリビニルアルコール、シリカ及び強磁性金属、合金又は組成物材料が含まれる。微粒子はまた磁性又は強磁性の金属、合金又は組成物を含むか又はそれらからなってもよい。この材料は、例えば、疎水性又は親水性のような特定の性質を有していてもよい。典型的には、微粒子は水溶液中に分散され、小さな負の表面電荷を保持し、微粒子を分離したままにし、非特異的なクラスター形成を回避する。磁性又は常磁性微粒子は磁力によって分離されうる。常磁性粒子又は磁性粒子を溶液／懸濁液から引き抜き、それらを所望の通りに保持するために磁力が加えられる一方、溶液／懸濁液の液体が除去され得、粒子が例えば洗浄されうる。
【００７２】
「緩衝液」又は「緩衝溶液」という用語は、弱酸とその共役塩基又はその逆の混合物を含む水溶液を指す。少量又は中程度の量の強酸又は塩基をそれに添加したときにそのｐＨはほとんど変化せず、従ってそれは溶液のｐＨの変化を防ぐために使用される。緩衝溶液は、多種多様な化学的用途においてｐＨをほぼ一定値に保つための手段として使用される。使用される一般的な緩衝化合物には、限定されないが、ＴＡＰＳ、ビシン、トリス、トリシン、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸、及びＭＥＳが含まれる。
【００７３】
「キット」は、少なくとも一種の試薬、例えば、障害の治療のための医薬、又は本発明のバイオマーカー遺伝子もしくはタンパク質を特異的に検出するためのプローブを含む任意の製造物（例えば、パッケージ又は容器）である。製造物は、好ましくは、本発明の方法を実施するためのユニットとして宣伝され、流通され、又は販売される。典型的には、キットは、バイアル、チューブ等々の一又は複数の容器手段を密接に収容するように区画化されたキャリア手段を更に含みうる。特に、容器手段の各々は、第一の態様の方法において使用される別個の要素の一つを含む。キットは、限定されないが、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書付き添付文書を含む更なる材料を含む一又は複数の他の容器を更に含みうる。ラベルが、組成物が特定の用途に使用されることを示すために容器上に存在してもよく、またインビボ又はインビトロの何れかでの使用のための説明を示してもよい。
【００７４】
「添付文書」は、適応症、使用法、投薬量、投与、禁忌、包装された製品と組み合わされる他の治療用製品に関する情報、及び／又はそのような治療用製品又は医薬の使用に関する警告等々を含む、治療用製品又は医薬の市販パッケージに通例含まれる説明書を指すために使用される。
【００７５】
［実施態様］
第一の態様では、本発明は、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するための方法に関する。前記方法は、第一ステップにおいて、試料の第一及び第二抗体、又は第一及び第二抗体の断片とのインキュベーションを含む。第一及び第二抗体は両方とも、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下で、ＶＥＧＦ−Ａ又はそのバリアントに結合することができる。特に、第一及び第二抗体は、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａに結合する。
【００７６】
実施態様では、第一抗体の結合と第二抗体の結合は互いに干渉しない。特定の実施態様では、第一又は第二抗体のうちの一方が固相に結合することができる。特定の実施態様では、前記第一又は第二抗体の他方は検出可能に標識される。前記試料を前記第一及び前記第二抗体と共にインキュベートすると、第一抗体、ＶＥＧＦ−Ａ又はそのバリアント、及び第二抗体を含む検出可能に標識された複合体が形成される。
【００７７】
ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するための方法の第二ステップでは、第一ステップにおいて形成された複合体が検出される。この検出は、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でのＶＥＧＦ−Ａのレベルの測定を可能にする。
【００７８】
従って、第一の態様は、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するための方法において、試料を第一及び第二抗体と共にインキュベートするステップであって、前記第一及び前記第二抗体がＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａに共に結合することができ、前記第一及び前記第二抗体の結合が互いに干渉せず、前記抗体の一方が固相に結合するか又は結合することができ、前記抗体の他方が検出可能に標識され、よって第一抗体、ＶＥＧＦ−Ａ、及び第二抗体を含む検出可能に標識された複合体を形成するステップと、形成された複合体を検出し、よってＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するステップとを含む、方法に関する。
【００７９】
特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡはヒトＶＥＧＦ−Ａ又はそのバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列又はそのバリアントを含む。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列又はそのバリアントからなる。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡのバリアントはＶＥＧＦ−Ａと同じ機能性を有する、すなわちバリアントは機能的バリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａのバリアントは、特に配列番号：１に記載の、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａのバリアントは、特に配列番号：１に記載の、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａのバリアントは、特に配列番号：１に記載の、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列と少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａのバリアントは、特に配列番号：１に記載の、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示す。本発明の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａは、単量体として又は二量体として、特にホモ二量体として存在している。
【００８０】
特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡはヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム又はそのバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡアイソフォームはヒトＶＥＧＦ−ＡアイソフォームＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９及び／又はＶＥＧＦ２０６、又はそれらのバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡアイソフォームのバリアントはそれぞれのＶＥＧＦ−Ａアイソフォームと同じ機能性を有する、すなわちアイソフォームバリアントは機能的アイソフォームバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのバリアントは、ヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列と少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示す。従って、特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦ１２１アイソフォームのバリアントは、ヒトＶＥＧＦ１２１アイソフォームのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示し；ＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦ１４５アイソフォームのバリアントは、ヒトＶＥＧＦ１４５アイソフォームのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示し；ＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦ１６５アイソフォームのバリアントは、ヒトＶＥＧＦ１６５アイソフォームのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示し、ＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦ１８９アイソフォームのバリアントは、ヒトＶＥＧＦ１８９アイソフォームのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示し、ＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦ２０６アイソフォームのバリアントは、ヒトＶＥＧＦ２０６アイソフォームのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示す。
【００８１】
特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡはヒトＶＥＧＦ−Ａ断片又はそのバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片はヒトＶＥＧＦ−Ａ１１０アミノ酸断片又はそのバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片のバリアントはそれぞれのＶＥＧＦ−Ａ断片と同じ機能性を有する、すなわち断片バリアントは機能的断片バリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片のバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片のバリアントは、ヒトＶＥＧＦ−Ａ断片のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片のバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａ断片のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片のバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａ断片のアミノ酸配列と少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片のバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａ断片のアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示す。従って、特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａの１１０アミノ酸断片のバリアントは、ヒト１１０アミノ酸ＶＥＧＦ−Ａ断片のアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示す。
【００８２】
実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ａと一又は複数のＶＥＧＦ受容体との間の相互作用を妨げる。特に、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、受容体の結合部位でＶＥＧＦ−Ａと競合するか、あるいはそれがその受容体に結合できなくなるか又はその結合によって通常は引き起こされる機能的作用を誘発できなくなるようにその受容体に対するＶＥＧＦ−Ａの結合部位を変化させる。従って、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストはＶＥＧＦ−Ａのエピトープに結合し、それによってＶＥＧＦ−Ａのその受容体への結合を妨げるか、又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは受容体のエピトープに結合し、それによって受容体に対するＶＥＧＦ−Ａの結合を妨げうる。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストはＶＥＧＦ−Ａ上のエピトープに結合し、それによってＶＥＧＦ受容体へのその結合を妨げる。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ受容体はＶＥＧＦＡ−Ｒ１及び／又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２である。
【００８３】
本発明の第一の態様の更なる実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ポリペプチド、タンパク質、ペプチボディ、イムノアドヘシン、小分子及びアプタマーからなる群から選択される。
【００８４】
アンタゴニストがタンパク質である特定の実施態様では、前記タンパク質は抗体である。特定の実施態様では、抗体は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である。特に、抗ＶＥＧＦ抗体は、十分な親和性と特異性でＶＥＧＦ−Ａに結合する抗体である。実施態様では、抗体はＶＥＧＦ−Ａに対して十分な結合親和性を有する。特に、抗体又はその抗原結合断片は、１００ｎＭ〜１ｐＭの間のＫｄ値、すなわち１００ｎＭ、５０ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐｍ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、又は１ｐＭのＫｄ値でｈＶＥＧＦ−Ａに結合する。特定の実施態様では、抗体又はその抗原結合断片は、５０ｎＭ〜５０ｐＭ、１ｎＭ〜１００ｐＭ、又は７００ｐＭ〜３００ｐＭの間のＫｄ値でヒトＶＥＧＦ−Ａ（ｈＶＥＧＦ−Ａ）に結合する。
【００８５】
特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体はモノクローナル又はポリクローナルである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａに対するアンタゴニスト抗体は組換え生産される。更なる実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体はキメラ抗体、特にヒト化抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である。特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は変異ヒトＩｇＧ１フレームワーク領域を含む。アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ヒトＶＥＧＦのその受容体への結合を遮断するマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１由来の抗原結合相補性決定領域（ＣＤＲ）を更に含む。特定の実施態様では、フレームワーク領域の大部分を含む、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体のアミノ酸配列の９３％がヒトＩｇＧ１に由来し、かつ配列の約７％がマウス抗体Ａ４．６．１に由来する（アバスチン（登録商標））。特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体はグリコシル化されている。更なる実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は約１４９０００ダルトンの分子量を有する。特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は、Presta等 (1997) Cancer Res. 57:4593-4599に従って作製された組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である、「ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ」又は「アバスチン（登録商標）」としても知られるベバシズマブ（ＢＶ）である。
【００８６】
特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は抗体断片である。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ナノボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二価一本鎖可変断片（ｄｉ−ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、及びＤＡＲＴ分子からなる群から選択される。特定の実施態様では、アンタゴニスト抗体断片は、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片、特にヒト化Ｆａｂ断片又はヒト化もしくはＦ（ａｂ’）２断片である。
【００８７】
更なる実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、Ｍｕｃａｇｅｎ、ＰＴＫ７８７、ＳＵ１１２４８、ＡＧ−０１３７３６、Ｂａｙ４３９００６（ソラフェニブ）、ＺＤ−６４７４、ＣＰ６３２、ＣＰ−５４７６３２、ＡＺＤ−２１７１、ＣＤＰ−１７１、ＳＵ−１４８１３、ＣＨＩＲ−２５８、ＡＥＥ−７８８、ＳＢ７８６０３４、ＢＡＹ５７９３５２、ＣＤＰ−７９１、ＥＧ−３３０６、ＧＷ−７８６０３４、ＲＷＪ−４１７９７５／ＣＴ６７５８及びＫＲＮ−６３３からなる群から選択される。
【００８８】
第一の態様の特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａに対する第一抗体とＶＥＧＦ−Ａに対する第二抗体が使用され、ここで前記第一抗体と前記第二抗体は両方とも、同一又は異なるエピトープでＶＥＧＦ−Ａに結合する。特定の実施態様では、前記第一抗体と前記第二抗体は両方とも、異なるエピトープでＶＥＧＦ−Ａに結合する。
【００８９】
特定の実施態様では、第一及び第二抗体は互いに干渉しない。従って、これらの抗体の一方の結合が、それぞれの他の抗体の結合を妨げたり又は減少させたりしない。本発明の実施態様では、第一及び第二抗体は、同じ単量体上の二つの異なるエピトープ及び／又は二量体の各単量体上の二つの異なるエピトープに結合する。あるいは、第一及び第二抗体は、ホモ二量体の異なる単量体上の同じ、又は実質的に同じエピトープに結合する。特定の実施態様では、前記第一抗体と前記第二抗体は両方とも、異なるエピトープでＶＥＧＦ−Ａに結合する。
【００９０】
特定の実施態様では、第一抗体及び第二抗体は互いに個々に、ＶＥＧＦ受容体、特にＶＥＧＦ−Ａ受容体ＶＥＧＦＡ−Ｒ１及び／又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２によって覆われるか又はそれによって結合されるエピトープに結合する。従って、前記第一抗体と前記第二抗体は、互いに独立して、ＶＥＧＦ−Ａ受容体、特にＶＥＧＦＡ−Ｒ１又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２と同一のエピトープに結合する。あるいは、前記第一抗体と前記第二抗体は、互いに独立して、ＶＥＧＦ−Ａ受容体、例えばＶＥＧＦＡ−Ｒ１又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２が直接結合していないが、第一及び／又は第二抗体の結合がＶＥＧＦ−Ａ受容体の結合を妨げるように受容体によって覆われているエピトープに結合する。従って、特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、ＶＥＧＦＡ−Ｒ１及び／又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２の結合について競合する。
【００９１】
特定の実施態様では、第一及び第二抗体は互いに個々に、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストと同じ又は異なるエピトープ、特にアンタゴニスト抗体とは異なるエピトープに結合する。第一又は第二抗体がアンタゴニスト、特にアンタゴニスト抗体と同じエピトープに結合する場合、第一又は第二抗体はアンタゴニストよりも低いＫｄ値でエピトープに結合すると考えられる。特定の実施態様では、第一又は第二抗体は、１．５ｎＭ未満、特に１ｎＭ未満、０．７５ｎＭ未満、特に０．５ｎＭ未満のＫｄ値でエピトープと結合する。
【００９２】
第一の態様の実施態様では、第一抗体又は第二抗体の何れかが、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５、配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなる群から選択されるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【００９３】
第一の態様の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、及び配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなる群から選択されるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、及び配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【００９４】
第一の態様の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなる群から選択されるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【００９５】
第一の態様の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸２０−４５、配列番号：２のアミノ酸５２−６８、配列番号：２のアミノ酸７２−１０７、配列番号：２のアミノ酸１１７−１２６、配列番号：３のアミノ酸１９−４３、配列番号：３のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：３のアミノ酸７７−１１４、配列番号：３のアミノ酸１２６−１３６からなる群から選択されるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸２０−４５、配列番号：２のアミノ酸５１−６８、配列番号：２のアミノ酸７２−１０７、配列番号：２のアミノ酸１１７−１２６、配列番号：３のアミノ酸１９−４３、配列番号：３のアミノ酸５１−６９、及び配列番号：３のアミノ酸７７−１１４、配列番号：３のアミノ酸１２６−１３６からなるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【００９６】
第一の態様の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸２１−４６、配列番号：４のアミノ酸５３−６９、配列番号：４のアミノ酸７３−１０８、配列番号：４のアミノ酸１１８−１２７、配列番号：５のアミノ酸２０−４４、配列番号：５のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：５のアミノ酸７８−１１５、配列番号：５のアミノ酸１２７−１３７からなる群から選択されるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸２１−４６、配列番号：４のアミノ酸５３−６９、配列番号：４のアミノ酸７３−１０８、配列番号：４のアミノ酸１１８−１２７、配列番号：５のアミノ酸２０−４４、配列番号：５のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：５のアミノ酸７８−１１５、配列番号：５のアミノ酸１２７−１３７からなるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【００９７】
特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、及び配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなるＣＤＲを含み、かつ配列番号：２のアミノ酸２０−４５、配列番号：２のアミノ酸５２−６８、配列番号：２のアミノ酸７２−１０７、配列番号：２のアミノ酸１１７−１２６、配列番号：３のアミノ酸１９−４３、配列番号：３のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：３のアミノ酸７７−１１４、配列番号：３のアミノ酸１２６−１３６からなるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【００９８】
特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなるＣＤＲを含み、かつ配列番号：４のアミノ酸２１−４６、配列番号：４のアミノ酸５３−６９、配列番号：４のアミノ酸７３−１０８、配列番号：４のアミノ酸１１８−１２７、配列番号：５のアミノ酸２０−４４、配列番号：５のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：５のアミノ酸７８−１１５、配列番号：５のアミノ酸１２７−１３７からなるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【００９９】
第一の態様の実施態様では、第一及び／又は第二抗体は、配列番号：２、３、４及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１００】
第一の態様の実施態様では、第一及び／又は第二抗体は、配列番号：２及び４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【０１０１】
第一の態様の実施態様では、第一及び／又は第二抗体は、配列番号：３及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【０１０２】
第一の態様の実施態様では、第一又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：３のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【０１０３】
第一の態様の実施態様では、第一又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：５のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【０１０４】
第一の態様の実施態様では、第一抗体又は第二抗体の一方が検出可能に標識される。前記標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、又は他の物理的手段によって検出可能な分子でありうる。特定の実施態様では、第一又は第二抗体は、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテン及び検出可能であるか又は検出可能にされうる他の物質で標識されうる。特定の実施態様では、第一又は第二抗体はビオチン化又はルテニル化される。抗体を標識するための方法は当業者によく知られており、例えば、Haugland (2003) Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.；Brinkley (1992) Bioconjugate Chem. 3:2；Garman, (1997) Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press, London；Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2；Glazer等 Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work及びE. Work編) American Elsevier Publishing Co., New York；Lundblad, R. L.及びNoyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York；Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche編, Walter DeGruyter, Berlin and New York；及びWong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.)；DeLeon-Rodriguez等, Chem. Eur. J. 10 (2004) 1149-1155；Lewis等, Bioconjugate Chem. 12 (2001) 320-324；Li等, Bioconjugate Chem. 13 (2002) 110-115；Mier等 Bioconjugate Chem. 16 (2005) 240-237に豊富に記載されている。
【０１０５】
特定の実施態様では、第一抗体又は第二抗体のうちの一方は、固相に結合することができるか又は固相に結合している。
【０１０６】
特定の実施態様では、第一抗体は固相に結合することができるか又は固相に結合しており、かつ第二抗体又はその抗原結合断片は検出可能に標識されている。
【０１０７】
第一の態様の更なる実施態様では、第一抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：２による配列を含むか又はそれからなる軽鎖を有し、かつ第二抗体は検出可能に標識され、配列番号：４による配列を含むか又はそれからなる軽鎖を有する。
【０１０８】
第一の態様の更なる実施態様では、第一抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：４による配列を含むか又はそれからなる軽鎖を有し、かつ第二抗体は検出可能に標識され、配列番号：２による配列を含むか又はそれからなる軽鎖を有する。
【０１０９】
第一の態様の更なる実施態様では、第一抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：３による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有し、かつ第二抗体は検出可能に標識され、配列番号：５による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有する。
【０１１０】
第一の態様の更なる実施態様では、第一抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：５による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有し、かつ第二抗体は検出可能に標識され、配列番号：３による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有する。
【０１１１】
第一の態様の更なる実施態様では、第一抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：２による配列を含むか又はそれからなる軽鎖と配列番号：３による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有し、かつ第二抗体は検出可能に標識され、配列番号：４による配列を含むか又はそれからなる軽鎖と配列番号：５による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有する。
【０１１２】
第一の態様の更なる実施態様では、第一抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：４による配列を含むか又はそれからなる軽鎖と配列番号：５による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有し、かつ第二抗体は検出可能に標識され、配列番号：２による配列を含むか又はそれからなる軽鎖と配列番号：３による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有する。
【０１１３】
更なる実施態様では、固相は、ビーズ、チューブ、マイクロプレートのディスク、及び特にイムノアッセイを実施するのに適した、任意の他の適切な表面からなる群から選択される形態である。特定の実施態様では、ビーズはマイクロビーズである。マイクロビーズは、ナノメートルからマイクロメートル範囲の直径を有する微粒子である。実施態様では、微粒子は、５０ナノメートルから５０マイクロメートルの直径を有しうる。特に、微粒子は、１００ｎｍ〜１０μｍ、特に２００ｎｍ〜５μｍ、又は７５０ｎｍ〜５μｍの直径を有する。微粒子は、当業者に知られている任意の適切な材料を含むか又はそれからなり、例えばそれらは、無機又は有機材料を含むか又はそれらからなるか又はそれらから本質的になる。特に、それらは、金属もしくは金属の合金、又は有機材料を含むか又はそれらからなるか又はそれらから本質的になるか、あるいは炭水化物要素を含むか又はそれらからなるか又はそれらから本質的になる。特定の実施態様では、微粒子の材料は、アガロース、ポリスチレン、ラテックス、ポリビニルアルコール、シリカ及び強磁性金属、合金又は複合材料からなる群から選択される。微粒子はまた磁性又は強磁性金属、合金又は組成物を含むか又はそれらからなりうる。材料は、例えば疎水性又は親水性のような特定の特性を有しうる。特定の実施態様では、微粒子は水溶液中に分散され、小さな負の表面電荷を保持し、微粒子を分離したままにし、非特異的なクラスター形成を回避する。
【０１１４】
特定の実施態様では、磁性又は常磁性微粒子は磁力によって分離される。常磁性粒子又は磁性粒子を溶液／懸濁液から引き抜き、それらを所望の通りに保持するために磁力が加えられる一方、溶液／懸濁液の液体を除去することができ、粒子を例えば洗浄できる。
【０１１５】
特定の実施態様では、第一又は第二抗体はＩｇＧ抗体である。特定の実施態様では、第一又は第二抗体はＩｇＧ２抗体である。特定の実施態様では、第一又は第二抗体はＩｇＧ２ｂ抗体、又はその抗原結合断片、特にＩｇＧ２ｂ−Ｆ（ａｂ’）２断片である。
【０１１６】
第一の態様の実施態様では、試料は、特に全血、血清、血漿、尿、唾液及び痰からなる群から選択される、体液に由来するか又は体液である。特定の実施態様では、試料は、全血試料、血清、又は血漿に由来するか又はそれらである。
【０１１７】
実施態様では、試料は健康な個体又は患者に由来する。特定の実施態様では、患者は増殖性疾患、特にがん、特に転移性がんに罹患している。特定の実施態様では、患者はがん、特に転移性がんに罹患しており、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストで治療される。特定の実施態様では、患者はがん、特に転移性がんに罹患しており、ベバシズマブで治療される。
【０１１８】
特定の実施態様では、がんはがん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病からなる群から選択される。そのようながんのより特定の例には、扁平上皮がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、及び肺扁平上皮がんを含む）、腹膜がん、肝細胞がん、胃（gastric）又は胃（stomach）がん（例えば、胃腸がんを含む）、膵臓がん（例えば、転移性膵臓がんを含む）、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞種、乳がん（局所進行、再発又は転移ＨＥＲ−２陰性乳がんを含む）、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん又は子宮がん、唾液腺がん、腎臓（kidney）又は腎（renal）がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝細胞がん及び様々な種類の頭頸部がん、並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びワルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、並びにファコマトーシスに関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、及びメイグス症候群が含まれる。特に、患者は、結腸がん、肺がん、腎がん、卵巣がん、及び脳の多形性膠芽腫からなる群から選択されるがんに罹患している。
【０１１９】
特定の実施態様では、患者は哺乳動物、爬虫類、鳥又は魚である。特定の実施態様では、患者は、マウス、ラット、ウサギ、又はゼブラフィッシュモルモット、ウサギ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、ラクダ、ネコ、イヌ、カメ（turtle）、カメ（tortoise）、ヘビ、トカゲ、キンギョ及び霊長類からなる群から選択される哺乳動物である。特に、患者はヒトである。
【０１２０】
第一の態様の更なる実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するための方法は、イムノアッセイ、特にサンドイッチとも呼ばれる抗体−抗原−抗体複合体が形成されるサンドイッチイムノアッセイである。当業者は、ＶＥＧＦ−Ａの検出のためのサンドイッチアッセイでは、第一抗体が捕捉抗体として作用し得、第二抗体がトレーサー抗体として作用しうることを理解するであろう。あるいは、第二抗体が捕捉抗体として作用し得、第一抗体がトレーサー抗体として作用しうる。
【０１２１】
試料中のＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定する特定の実施態様では、第一及び第二抗体が、分析される試料と混合される。
【０１２２】
サンドイッチアッセイが洗浄ステップなしで実施される一実施態様では、そのような混合／インキュベーションは単一の反応容器中で実施される。三成分（例えば、それぞれ第一抗体又はその抗原結合断片で被覆された微粒子、試料、第二の検出可能に標識された抗体又はその抗原結合断片）を添加し混合する順序は重要ではない。この混合物が、第一抗体（特に微粒子上に被覆された第一抗体）及び検出可能に標識された第二抗体がＶＥＧＦ−Ａに結合するのに十分な時間、インキュベートされる。
【０１２３】
サンドイッチアッセイが洗浄ステップを伴って実施される別の実施態様では、第一抗体（特に微粒子上に被覆された第一抗体）、試料及び検出可能に標識された第二抗体、又はその抗原結合断片の、単一の反応容器中への添加と混合が逐次実施される。第一ステップ（アナライト捕捉ステップ）において、第一抗体で被覆された微粒子が、アナライト、すなわちＶＥＧＦ−Ａが結合するのに十分な時間、分析されるべき試料と共にインキュベートされる。洗浄ステップに続いて、検出可能に標識された第二抗体が添加され、第二抗体がアナライト、すなわちＶＥＧＦ−Ａに結合するのに十分な時間インキュベートされる。実施態様では、第一の態様の方法が競合アッセイ形式で実施される。
【０１２４】
実施態様では、混合物は６０分未満、すなわち６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、又は５分未満インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は４分から１時間（すなわち、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０分）インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は５分から４５分、すなわち５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、又は４５分、インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は５分から３０分、すなわち５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、又は３０分インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は９又は１８分間インキュベートされる。実施態様では、混合物は１〜１２時間（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２時間）インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は１〜４時間又は８〜１２時間インキュベートされる。
【０１２５】
更なる実施態様では、混合物は３〜４０℃（すなわち、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０℃）の温度でインキュベートされる。特に、混合物は３℃〜８℃（すなわち３、４、５、６、７又は８）、特に４〜５℃、又は２０℃〜２５℃（すなわち２０、２１、２２、２３、２４、又は２５℃）で、特に２０〜２２℃、又は３５〜３７℃でインキュベートされる。
【０１２６】
インキュベーション温度とインキュベーション時間が互いに依存することは当業者にはよく知られている。従って、特定の実施態様では、混合物は２０〜２５℃で１０分〜１時間インキュベートされる、すなわち混合物は、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５℃で１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０分、インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は２２℃で１０分未満又は２０分未満インキュベートされる。実施態様では、混合物は３〜８℃で１〜１２時間インキュベートされる。特に、混合物は３〜８℃、特に４〜５℃で１〜４時間又は８〜１２時間インキュベートされる。
【０１２７】
第一及び／又は第二抗体は、微粒子上に被覆された第一抗体と検出可能に標識された第二抗体が試料中のＶＥＧＦ−Ａに結合するのに十分な時間インキュベートされる。
【０１２８】
特定の実施態様では、第一及び／又は第二抗体は、生理学的溶液、特に生理学的緩衝液中に含められ、及び／又はその中でインキュベートされる。特定の実施態様では、緩衝液は、ＴＡＰＳ、ビシン、トリス、トリシン、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸、及びＭＥＳの群から選択される。特定の実施態様では、緩衝液はＭＥＳ緩衝液である。特定の実施態様では、ＭＥＳ緩衝液は次の成分を含む：５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ２（二水和物）、０．１％のＮ−メチルイソチアゾロン−ＨＣｌ、０．１％のオキシピリオン、０．１％のポリドカノール（Ｔｈｅｓｉｔ）、１．０％のアルブミンＲＰＬＡ４アッセイ品質、０．２％のＰＡＫ＜−＞Ｒ−ＩｇＧ（ＤＥＴ）、ミリポア−水、２ＮのＮａＯＨでｐＨを６．３０に調整。
【０１２９】
特定の実施態様では、形成された抗体−抗原−抗体複合体、特に第一抗体、ＶＥＧＦ−Ａ−第二抗体を含む形成された複合体が、当該技術分野においてよく知られている任意の方法によって検出される。特定の実施態様では、形成された複合体は、電気化学発光、化学発光、又は蛍光によって検出される。
【０１３０】
第二の態様では、本発明は、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するためのキットに関する。前記キットは、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａを検出するための手段を含む。
【０１３１】
特定の実施態様では、前記キットは第一及び第二抗体を含む。第一及び第二抗体は、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａに結合することができる。特に、前記第一抗体と前記第二抗体の結合は互いに干渉しない。更に、前記抗体の一方は固相に結合するか又は固相に結合することができ、前記抗体の他方は検出可能に標識される。従って、第二の態様では、本発明は、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するためのキットに関し、該キットは、第一及び第二抗体を含み、前記第一及び第二抗体はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａに結合することができ、前記第一及び前記第二抗体の結合は互いに干渉せず、前記抗体の一方は固相に結合するか又は結合することができ、前記抗体の他方は検出可能に標識される。
【０１３２】
実施態様では、キットは、バイアル及びチューブからなる群から選択される一又は複数の容器手段を密閉状態で収容するように区画化されているキャリア手段を更に含む。特定の実施態様では、容器手段は、使用される幾つかの別個の要素、特に緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を伴う添付文書からなる群から選択されるものを更に含む。ラベルが、組成物が特定の用途に使用されることを示すために容器上に存在してもよく、またインビボ又はインビトロの何れかでの使用のための指示を示してもよい。
【０１３３】
特定の実施態様では、キットは少なくとも一つの容器、前記少なくとも一つの容器上のラベル、及び前記少なくとも一つの容器内に含まれる組成物を含み、該組成物はＶＥＧＦ−Ａに結合する少なくとも一つの抗体を含む。
【０１３４】
特に、キットは、第一及び第二抗体を含む少なくとも一つの容器を含むか、あるいはキットは、一つの容器が第一抗体を含み、第二の容器が第二抗体を含む少なくとも二つの容器を含む。
【０１３５】
特に、前記容器上のラベルは、組成物が試料中のＶＥＧＦ−Ａの存在を評価するために使用できることを示している。特に、キットは、特定の試料タイプにおけるＶＥＧＦ−Ａの存在を評価するために抗体を使用するための説明書を含む。キットは、試料を調製し、試料に抗体を適用するための説明書及び材料のセットを更に含みうる。
【０１３６】
実施態様では、キットはＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを更に含む。
【０１３７】
特定の実施態様では、キットは、第一の態様の文脈内で上に特定されたような、又は更なる態様の文脈で以下に特定されるような、第一抗体、第二抗体、及びＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む一つの容器を含む。
【０１３８】
特定の実施態様では、キットは二つの容器を含み、第一の態様の文脈内で上に特定されたように、又は更なる態様の文脈で以下に特定されるように、第一の容器は第一抗体と第二抗体を含み、第二の容器はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む。
【０１３９】
特定の実施態様では、キットは三つの容器を含み、第一の態様の文脈内で上に特定されたように、又は第三の態様の文脈で以下に特定されるように、第一の容器は第一抗体を含み、第二の容器は第二抗体を含み、第三の容器はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを含む。
【０１４０】
更なる実施態様では、キットは、一又は複数の緩衝液（例えば、ブロック緩衝液、洗浄緩衝液、基質緩衝液など）、酵素標識によって化学的に改変された基質（例えば、色素原）などの他の試薬、エピトープ回収溶液、対照試料（陽性及び／又は陰性対照）、対照スライド等々からなる群から選択される成分をまた含む。キットは、キットを使用して得られた結果を解釈するための説明書をまた含みうる。
【０１４１】
特定の実施態様では、一又は複数の容器に含められる第一抗体、第二抗体、及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、凍結乾燥形態又は可溶化形態で存在する。特定の実施態様では、一又は複数の容器に含められる第一抗体、第二抗体、及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、溶液、特に生理学的溶液に含められる。特定の実施態様では、一又は複数の容器に含められる第一抗体、第二抗体、及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、生理学的緩衝液、特にＴＡＰＳ、ビシン、トリス、トリシン、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸、及びＭＥＳの群から選択される緩衝液に含められる。特定の実施態様では、一又は複数の容器に含められる第一抗体、第二抗体、及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＭＥＳ緩衝液に含められる。特定の実施態様では、ＭＥＳ緩衝液は次の成分を含む：５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ２（二水和物）、０．１％のＮ−メチルイソチアゾロン−ＨＣｌ、０．１％のオキシピリオン、０．１％のポリドカノール（Ｔｈｅｓｉｔ）、１．０％のアルブミンＲＰＬＡ４アッセイ品質、０．２％のＰＡＫ＜−＞Ｒ−ＩｇＧ（ＤＥＴ）、ミリポア−水、２ＮのＮａＯＨで６．３０にｐＨを調整。
【０１４２】
第二の態様の実施態様では、キットは、第一の態様に関して上に特定されたような、及び／又は更なる態様に関して以下に特定されるような、抗体を含む。
【０１４３】
実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ａと一又は複数のＶＥＧＦ受容体との間の相互作用を妨げる。特に、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、受容体の結合部位でＶＥＧＦ−Ａと競合するか、あるいはそれがその受容体に結合できなくなるか又はその結合によって通常は引き起こされる機能的作用を誘発できなくなるようにその受容体に対するＶＥＧＦ−Ａの結合部位を変化させる。従って、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストはＶＥＧＦ−Ａのエピトープに結合し、それによってＶＥＧＦ−Ａのその受容体への結合を妨げるか、又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは受容体のエピトープに結合し、それによって受容体に対するＶＥＧＦ−Ａの結合を妨げうる。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストはＶＥＧＦ−Ａ上のエピトープに結合し、それによってＶＥＧＦ受容体へのその結合を妨げる。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ受容体はＶＥＧＦＡ−Ｒ１及び／又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２である。
【０１４４】
本発明の第二の態様の更なる実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ポリペプチド、ペプチボディ、イムノアドヘシン、小分子及びアプタマーからなる群から選択される。
【０１４５】
アンタゴニストがポリペプチドである特定の実施態様では、前記ポリペプチドは抗体である。特定の実施態様では、抗体は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である。特に、抗ＶＥＧＦ抗体は、十分な親和性と特異性でＶＥＧＦ−Ａに結合する抗体である。実施態様では、抗体はＶＥＧＦ−Ａに対して十分な結合親和性を有する。特に、抗体は、１００ｎＭ〜１ｐＭの間のＫｄ値、すなわち１００ｎＭ、５０ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐｍ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、又は１ｐＭのＫｄ値でｈＶＥＧＦ−Ａに結合する。特定の実施態様では、抗体は、５０ｎＭ〜５０ｐＭ、１ｎＭ〜１００ｐＭ、又は７００ｐＭ〜３００ｐＭの間のＫｄ値でヒトＶＥＧＦ−Ａ（ｈＶＥＧＦ−Ａ）に結合する。
【０１４６】
特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体はモノクローナル又はポリクローナルである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａに対するアンタゴニスト抗体は組換え生産される。更なる実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体はキメラ抗体、特にヒト化抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である。特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は変異ヒトＩｇＧ１フレームワーク領域を含む。アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ヒトＶＥＧＦのその受容体への結合を遮断するマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１由来の抗原結合相補性決定領域（ＣＤＲ）を更に含む。特定の実施態様では、フレームワーク領域の大部分を含む、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体のアミノ酸配列の９３％がヒトＩｇＧ１に由来し、かつ配列の約７％がマウス抗体Ａ４．６．１に由来する（アバスチン（登録商標））。特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体はグリコシル化されている。更なる実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は約１４９０００ダルトンの分子量を有する。特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は、Presta等 (1997) Cancer Res. 57:4593-4599に従って作製された組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である、「ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ」又は「アバスチン（登録商標）」としても知られるベバシズマブ（ＢＶ）である。
【０１４７】
特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は抗原結合抗体断片である。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ナノボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二価一本鎖可変断片（ｄｉ−ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、及びＤＡＲＴ分子からなる群から選択される。特定の実施態様では、アンタゴニスト抗体断片は、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片、特にヒト化Ｆａｂ断片又はヒト化もしくはＦ（ａｂ’）２断片である。
【０１４８】
更なる実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、Ｍｕｃａｇｅｎ、ＰＴＫ７８７、ＳＵ１１２４８、ＡＧ−０１３７３６、Ｂａｙ４３９００６（ソラフェニブ）、ＺＤ−６４７４、ＣＰ６３２、ＣＰ−５４７６３２、ＡＺＤ−２１７１、ＣＤＰ−１７１、ＳＵ−１４８１３、ＣＨＩＲ−２５８、ＡＥＥ−７８８、ＳＢ７８６０３４、ＢＡＹ５７９３５２、ＣＤＰ−７９１、ＥＧ−３３０６、ＧＷ−７８６０３４、ＲＷＪ−４１７９７５／ＣＴ６７５８及びＫＲＮ−６３３からなる群から選択される。
【０１４９】
第二の態様の特定の実施態様では、キットは、ＶＥＧＦ−Ａに対する第一抗体とＶＥＧＦ−Ａに対する第二抗体を含み、前記第一抗体と前記第二抗体は両方とも、同一又は異なるエピトープでＶＥＧＦ−Ａに結合する。特定の実施態様では、前記第一抗体と前記第二抗体は両方とも、異なるエピトープでＶＥＧＦ−Ａに結合する。
【０１５０】
ＶＥＧＦ−Ａは単量体として又は二量体として、特にホモ二量体として存在する。特定の実施態様では、第一及び第二抗体は互いに干渉しない。従って、これらの抗体の一方の結合が、それぞれの他の抗体の結合を妨げたり又は減少させたりしない。第二の態様の実施態様では、第一及び第二抗体は、同じ単量体上の二つの異なるエピトープ及び／又は二量体の各単量体上の二つの異なるエピトープに結合する。あるいは、第一及び第二抗体は、ホモ二量体の異なる単量体上の同じ、又は実質的に同じエピトープに結合する。特定の実施態様では、前記第一抗体と前記第二抗体は両方とも、異なるエピトープでＶＥＧＦ−Ａに結合する。
【０１５１】
特定の実施態様では、第一及び第二抗体は互いに個々に、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストと同じ又は異なるエピトープ、特にアンタゴニスト抗体とは異なるエピトープに結合する。第一又は第二抗体がアンタゴニスト、特にアンタゴニスト抗体と同じエピトープに結合する場合、第一又は第二抗体はアンタゴニストよりも低いＫｄ値でエピトープに結合すると考えられる。特定の実施態様では、第一又は第二抗体は、１．５ｎＭ未満、特に１ｎＭ未満、０．７５ｎＭ未満、特に０．５ｎＭ未満のＫｄ値でエピトープと結合する。
【０１５２】
特定の実施態様では、第一抗体及び第二抗体は互いに個々に、ＶＥＧＦ受容体、特にＶＥＧＦ−Ａ受容体ＶＥＧＦＡ−Ｒ１及び／又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２によって覆われるか又はそれによって結合されるエピトープに結合する。従って、前記第一抗体と前記第二抗体は、互いに独立して、ＶＥＧＦ−Ａ受容体、特にＶＥＧＦＡ−Ｒ１又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２と同一のエピトープに結合する。あるいは、前記第一抗体と前記第二抗体は、互いに独立して、ＶＥＧＦ−Ａ受容体、例えばＶＥＧＦＡ−Ｒ１又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２が直接結合していないが、第一及び／又は第二抗体の結合がＶＥＧＦ−Ａ受容体の結合を妨げるように受容体によって覆われているエピトープに結合する。従って、特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、ＶＥＧＦＡ−Ｒ１及び／又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２の結合について競合する。
【０１５３】
第二の態様の実施態様では、第一抗体又は第二抗体の何れかが、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５、配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなる群から選択されるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０１５４】
第二の態様の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、及び配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなる群から選択されるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、及び配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０１５５】
第二の態様の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなる群から選択されるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０１５６】
第二の態様の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸２０−４５、配列番号：２のアミノ酸５２−６８、配列番号：２のアミノ酸７２−１０７、配列番号：２のアミノ酸１１７−１２６、配列番号：３のアミノ酸１９−４３、配列番号：３のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：３のアミノ酸７７−１１４、配列番号：３のアミノ酸１２６−１３６からなる群から選択されるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸２０−４５、配列番号：２のアミノ酸５１−６８、配列番号：２のアミノ酸７２−１０７、配列番号：２のアミノ酸１１７−１２６、配列番号：３のアミノ酸１９−４３、配列番号：３のアミノ酸５１−６９、及び配列番号：３のアミノ酸７７−１１４、配列番号：３のアミノ酸１２６−１３６からなるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０１５７】
第二の態様の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸２１−４６、配列番号：４のアミノ酸５３−６９、配列番号：４のアミノ酸７３−１０８、配列番号：４のアミノ酸１１８−１２７、配列番号：５のアミノ酸２０−４４、配列番号：５のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：５のアミノ酸７８−１１５、配列番号：５のアミノ酸１２７−１３７からなる群から選択されるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸２１−４６、配列番号：４のアミノ酸５３−６９、配列番号：４のアミノ酸７３−１０８、配列番号：４のアミノ酸１１８−１２７、配列番号：５のアミノ酸２０−４４、配列番号：５のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：５のアミノ酸７８−１１５、配列番号：５のアミノ酸１２７−１３７からなるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０１５８】
特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、及び配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなるＣＤＲを含み、かつ配列番号：２のアミノ酸２０−４５、配列番号：２のアミノ酸５２−６８、配列番号：２のアミノ酸７２−１０７、配列番号：２のアミノ酸１１７−１２６、配列番号：３のアミノ酸１９−４３、配列番号：３のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：３のアミノ酸７７−１１４、配列番号：３のアミノ酸１２６−１３６からなるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０１５９】
特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなるＣＤＲを含み、かつ配列番号：４のアミノ酸２１−４６、配列番号：４のアミノ酸５３−６９、配列番号：４のアミノ酸７３−１０８、配列番号：４のアミノ酸１１８−１２７、配列番号：５のアミノ酸２０−４４、配列番号：５のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：５のアミノ酸７８−１１５、配列番号：５のアミノ酸１２７−１３７からなるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０１６０】
第二の態様の実施態様では、第一及び／又は第二抗体は、配列番号：２、３、４及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１６１】
第二の態様の実施態様では、第一及び／又は第二抗体は、配列番号：２及び４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【０１６２】
第二の態様の実施態様では、第一及び／又は第二抗体は、配列番号：３及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【０１６３】
第二の態様の実施態様では、第一又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：３のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【０１６４】
第二の態様の実施態様では、第一又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：５のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【０１６５】
第二の態様の実施態様では、第一抗体又は第二抗体の一方が検出可能に標識される。前記標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、又は他の物理的手段によって検出可能な分子でありうる。特定の実施態様では、第一又は第二抗体は、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテン及び検出可能であるか又は検出可能にされうる他の物質で標識されうる。特定の実施態様では、第一又は第二抗体はビオチン化又はルテニル化される。抗体を標識するための方法は当業者によく知られており、例えば、Haugland (2003) Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.；Brinkley (1992) Bioconjugate Chem. 3:2；Garman, (1997) Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2；Glazer等 Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work及びE. Work編) American Elsevier Publishing Co., New York；Lundblad, R. L.及びNoyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York；Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche編, Walter DeGruyter, Berlin and New York；及びWong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.)；DeLeon-Rodriguez等, Chem. Eur. J. 10 (2004) 1149-1155；Lewis等, Bioconjugate Chem. 12 (2001) 320-324；Li等, Bioconjugate Chem. 13 (2002) 110-115；Mier等 Bioconjugate Chem. 16 (2005) 240-237に豊富に記載されている。
【０１６６】
特定の実施態様では、第一抗体又は第二抗体の一方は、固相に結合することができるか又は固相に結合している。
【０１６７】
特定の実施態様では、第一抗体は固相に結合することができるか又は固相に結合しており、かつ第二抗体又はその抗原結合断片は検出可能に標識されている。
【０１６８】
第二の態様の更なる実施態様では、第一抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：２による配列を含むか又はそれからなる軽鎖を有し、かつ第二抗体は検出可能に標識され、配列番号：４による配列を含むか又はそれからなる軽鎖を有する。
【０１６９】
第二の態様の更なる実施態様では、第一抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：４による配列を含むか又はそれからなる軽鎖を有し、かつ第二抗体は検出可能に標識され、配列番号：２による配列を含むか又はそれからなる軽鎖を有する。
【０１７０】
第二の態様の更なる実施態様では、第一抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：３による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有し、かつ第二抗体は検出可能に標識され、配列番号：５による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有する。
【０１７１】
第二の態様の更なる実施態様では、第一抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：５による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有し、かつ第二抗体は検出可能に標識され、配列番号：３による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有する。
【０１７２】
第二の態様の更なる実施態様では、第一抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：２による配列を含むか又はそれからなる軽鎖と配列番号：３による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有し、かつ第二抗体は検出可能に標識され、配列番号：４による配列を含むか又はそれからなる軽鎖と配列番号：５による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有する。
【０１７３】
第二の態様の更なる実施態様では、第一抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：４による配列を含むか又はそれからなる軽鎖と配列番号：５による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有し、かつ第二抗体は検出可能に標識され、配列番号：２による配列を含むか又はそれからなる軽鎖と配列番号：３による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有する。
【０１７４】
更なる実施態様では、固相は、ビーズ、チューブ、マイクロプレートのディスク、及び特にイムノアッセイを実施するのに適した、任意の他の適切な表面からなる群から選択される形態である。特定の実施態様では、ビーズはマイクロビーズである。マイクロビーズは、ナノメートルからマイクロメートル範囲の直径を有する微粒子である。実施態様では、微粒子は、５０ナノメートルから５０マイクロメートルの直径を有しうる。特に、微粒子は、１００ｎｍ〜１０μｍ、特に２００ｎｍ〜５μｍ、又は７５０ｎｍ〜５μｍの直径を有する。微粒子は、当業者に知られている任意の適切な材料を含むか又はそれからなり、例えばそれらは、無機又は有機材料を含むか又はそれらからなるか又はそれらから本質的になる。特に、それらは、金属もしくは金属の合金、又は有機材料を含むか又はそれらからなるか又はそれらから本質的になるか、あるいは炭水化物要素を含むか又はそれらからなるか又はそれらから本質的になる。特定の実施態様では、微粒子の材料は、アガロース、ポリスチレン、ラテックス、ポリビニルアルコール、シリカ及び強磁性金属、合金又は複合材料からなる群から選択される。微粒子はまた磁性又は強磁性金属、合金又は組成物を含むか又はそれらからなりうる。材料は、例えば疎水性又は親水性のような特定の特性を有しうる。特定の実施態様では、微粒子は水溶液中に分散され、小さな負の表面電荷を保持し、微粒子を分離したままにし、非特異的なクラスター形成を回避する。
【０１７５】
特定の実施態様では、磁性又は常磁性微粒子は磁力によって分離される。常磁性粒子又は磁性粒子を溶液／懸濁液から引き抜き、それらを所望の通りに保持するために磁力が加えられる一方、溶液／懸濁液の液体を除去することができ、粒子を例えば洗浄できる。
【０１７６】
特定の実施態様では、第一又は第二抗体はＩｇＧ抗体である。特定の実施態様では、第一又は第二抗体又はその抗原結合断片はＩｇＧ２抗体である。特定の実施態様では、第一又は第二抗体はＩｇＧ２ｂ抗体、又はその抗原結合断片、特にＩｇＧ２ｂ−Ｆ（ａｂ’）２断片である。
【０１７７】
特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、生理学的溶液、特に生理学的緩衝液に含められる。特定の実施態様では、緩衝液は、ＴＡＰＳ、ビシン、トリス、トリシン、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸、及びＭＥＳの群から選択される。特定の実施態様では、緩衝液はＭＥＳ緩衝液である。特定の実施態様では、ＭＥＳ緩衝液は次の成分を含む：５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ２（二水和物）、０．１％のＮ−メチルイソチアゾロン−ＨＣｌ、０．１％のオキシピリオン、０．１％のポリドカノール（Ｔｈｅｓｉｔ）、１．０％のアルブミンＲＰＬＡ４アッセイ品質、０．２％のＰＡＫ＜−＞Ｒ−ＩｇＧ（ＤＥＴ）、ミリポア−水、２ＮのＮａＯＨで６．３０にｐＨを調整。
【０１７８】
特定の実施態様では、上に開示された第二の態様のキットは、第一の態様に関して上に開示されたように、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定する方法における使用のためのものである。従って、特定の実施態様では、上に開示される第二の態様のキットは、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するための方法において使用するためのものであり、該方法は、試料を前記第一及び第二抗体と共にインキュベートするステップであって、前記第一及び前記第二抗体は両方とも、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａに結合することができ、かつ前記第一及び前記第二抗体の結合が互いに干渉せず、前記抗体の一方が固相に結合しているか又は結合することができ、かつ前記抗体の他方が検出可能に標識され、それによって第一抗体、ＶＥＧＦ−Ａ、及び第二抗体を含む検出可能に標識された複合体を形成するステップと、形成された複合体を検出し、それによって、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するステップを含む。
【０１７９】
特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡはヒトＶＥＧＦ−Ａ又はそのバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列又はそのバリアントを含む。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列又はそのバリアントからなる。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡのバリアントはＶＥＧＦ−Ａと同じ機能性を有する、すなわちバリアントは機能的バリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａのバリアントは、特に配列番号：１に記載の、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａのバリアントは、特に配列番号：１に記載の、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａのバリアントは、特に配列番号：１に記載の、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列と少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａのバリアントは、特に配列番号：１に記載の、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示す。本発明の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａは、単量体として又は二量体として、特にホモ二量体として存在している。
【０１８０】
特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡはヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム又はそのバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡアイソフォームはヒトＶＥＧＦ−ＡアイソフォームＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９及び／又はＶＥＧＦ２０６、又はそれらのバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡアイソフォームのバリアントはそれぞれのＶＥＧＦ−Ａアイソフォームと同じ機能性を有する、すなわちアイソフォームバリアントは機能的アイソフォームバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのバリアントは、ヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列と少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示す。従って、特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦ１２１アイソフォームのバリアントは、ヒトＶＥＧＦ１２１アイソフォームのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示し；ＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦ１４５アイソフォームのバリアントは、ヒトＶＥＧＦ１４５アイソフォームのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示し；ＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦ１６５アイソフォームのバリアントは、ヒトＶＥＧＦ１６５アイソフォームのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示し、ＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦ１８９アイソフォームのバリアントは、ヒトＶＥＧＦ１８９アイソフォームのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示し、ＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦ２０６アイソフォームのバリアントは、ヒトＶＥＧＦ２０６アイソフォームのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示す。
【０１８１】
特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡはヒトＶＥＧＦ−Ａ断片又はそのバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片はヒトＶＥＧＦ−Ａ１１０アミノ酸断片又はそのバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片のバリアントはそれぞれのＶＥＧＦ−Ａ断片と同じ機能性を有する、すなわち断片バリアントは機能的断片バリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片のバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片のバリアントは、ヒトＶＥＧＦ−Ａ断片のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片のバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａ断片のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片のバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａ断片のアミノ酸配列と少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片のバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａ断片のアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示す。従って、特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａの１１０アミノ酸断片のバリアントは、ヒト１１０アミノ酸ＶＥＧＦ−Ａ断片のアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示す。
【０１８２】
実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ａと一又は複数のＶＥＧＦ受容体との間の相互作用を妨げる。特に、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、受容体の結合部位でＶＥＧＦ−Ａと競合するか、あるいはそれがその受容体に結合できなくなるか又はその結合によって通常は引き起こされる機能的作用を誘発できなくなるようにその受容体に対するＶＥＧＦ−Ａの結合部位を変化させる。従って、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストはＶＥＧＦ−Ａのエピトープに結合し、それによってＶＥＧＦ−Ａのその受容体への結合を妨げるか、又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは受容体のエピトープに結合し、それによって受容体に対するＶＥＧＦ−Ａの結合を妨げうる。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストはＶＥＧＦ−Ａ上のエピトープに結合し、それによってＶＥＧＦ受容体へのその結合を妨げる。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ受容体はＶＥＧＦＡ−Ｒ１及び／又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２である。
【０１８３】
本発明の第二の態様の更なる実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ポリペプチド、ペプチボディ、イムノアドヘシン、小分子及びアプタマーからなる群から選択される。
【０１８４】
アンタゴニストがポリペプチドである特定の実施態様では、前記ポリペプチドは抗体である。特定の実施態様では、抗体は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である。特に、抗ＶＥＧＦ抗体は、十分な親和性と特異性でＶＥＧＦ−Ａに結合する抗体である。実施態様では、抗体はＶＥＧＦ−Ａに対して十分な結合親和性を有する。特に、抗体又はその抗原結合断片は、１００ｎＭ〜１ｐＭの間のＫｄ値、すなわち１００ｎＭ、５０ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐｍ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、又は１ｐＭのＫｄ値でｈＶＥＧＦ−Ａに結合する。特定の実施態様では、抗体又はその抗原結合断片は、５０ｎＭ〜５０ｐＭ、１ｎＭ〜１００ｐＭ、又は７００ｐＭ〜３００ｐＭの間のＫｄ値でヒトＶＥＧＦ−Ａ（ｈＶＥＧＦ−Ａ）に結合する。
【０１８５】
特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体はモノクローナル又はポリクローナルである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａに対するアンタゴニスト抗体は組換え生産される。更なる実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体はキメラ抗体、特にヒト化抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である。特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は変異ヒトＩｇＧ１フレームワーク領域を含む。アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ヒトＶＥＧＦのその受容体への結合を遮断するマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１由来の抗原結合相補性決定領域（ＣＤＲ）を更に含む。特定の実施態様では、フレームワーク領域の大部分を含む、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体のアミノ酸配列の９３％がヒトＩｇＧ１に由来し、かつ配列の約７％がマウス抗体Ａ４．６．１に由来する（アバスチン（登録商標））。特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体はグリコシル化されている。更なる実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は約１４９０００ダルトンの分子量を有する。特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は、Presta等 (1997) Cancer Res. 57:4593-4599に従って作製された組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である、「ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ」又は「アバスチン（登録商標）」としても知られるベバシズマブ（ＢＶ）である。
【０１８６】
特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は抗体断片である。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ナノボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二価一本鎖可変断片（ｄｉ−ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、及びＤＡＲＴ分子からなる群から選択される。特定の実施態様では、アンタゴニスト抗体断片は、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片、特にヒト化Ｆａｂ断片又はヒト化もしくはＦ（ａｂ’）２断片である。
【０１８７】
更なる実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、Ｍｕｃａｇｅｎ、ＰＴＫ７８７、ＳＵ１１２４８、ＡＧ−０１３７３６、Ｂａｙ４３９００６（ソラフェニブ）、ＺＤ−６４７４、ＣＰ６３２、ＣＰ−５４７６３２、ＡＺＤ−２１７１、ＣＤＰ−１７１、ＳＵ−１４８１３、ＣＨＩＲ−２５８、ＡＥＥ−７８８、ＳＢ７８６０３４、ＢＡＹ５７９３５２、ＣＤＰ−７９１、ＥＧ−３３０６、ＧＷ−７８６０３４、ＲＷＪ−４１７９７５／ＣＴ６７５８及びＫＲＮ−６３３からなる群から選択される。
【０１８８】
第二の態様の実施態様では、試料は、特に全血、血清、血漿、尿、唾液及び痰からなる群から選択される、体液に由来するか又は体液である。特定の実施態様では、試料は、全血試料、血清、又は血漿に由来するか又はそれらである。
【０１８９】
実施態様では、試料は健康な個体又は患者に由来する。特定の実施態様では、患者は増殖性疾患、特にがん、特に転移性がんに罹患している。特定の実施態様では、患者はがん、特に転移性がんに罹患しており、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストで治療される。特定の実施態様では、患者はがん、特に転移性がんに罹患しており、ベバシズマブで治療される。
【０１９０】
特定の実施態様では、がんはがん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病からなる群から選択される。そのようながんのより特定の例には、扁平上皮がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、及び肺扁平上皮がんを含む）、腹膜がん、肝細胞がん、胃（gastric）又は胃（stomach）がん（例えば、胃腸がんを含む）、膵臓がん（例えば、転移性膵臓がんを含む）、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞種、乳がん（局所進行、再発又は転移ＨＥＲ−２陰性乳がんを含む）、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん又は子宮がん、唾液腺がん、腎臓（kidney）又は腎（renal）がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝細胞がん及び様々な種類の頭頸部がん、並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びワルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、並びにファコマトーシスに関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、及びメイグス症候群が含まれる。特に、患者は、結腸がん、肺がん、腎がん、卵巣がん、及び脳の多形性膠芽腫からなる群から選択されるがんに罹患している。
【０１９１】
特定の実施態様では、患者は哺乳動物、爬虫類、鳥又は魚である。特定の実施態様では、患者は、マウス、ラット、ウサギ、又はゼブラフィッシュモルモット、ウサギ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、ラクダ、ネコ、イヌ、カメ（turtle）、カメ（tortoise）、ヘビ、トカゲ、キンギョ及び霊長類からなる群から選択される哺乳動物である。特に、患者はヒトである。
【０１９２】
更なる実施態様では、第二の態様のキットが使用される、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でのＶＥＧＦ−Ａのレベルの測定方法は、イムノアッセイ、特にサンドイッチとも呼ばれる抗体−抗原−抗体複合体が形成されるサンドイッチイムノアッセイである。当業者は、ＶＥＧＦ−Ａの検出のためのサンドイッチアッセイでは、第一抗体が捕捉抗体として作用し得、第二抗体がトレーサー抗体として作用しうることを理解するであろう。あるいは、第二抗体が捕捉抗体として作用し得、第一抗体がトレーサー抗体として作用しうる。
【０１９３】
試料中のＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定する特定の実施態様では、第一及び第二抗体が、分析される試料と混合される。
【０１９４】
サンドイッチアッセイが洗浄ステップなしで実施される一実施態様では、そのような混合／インキュベーションは単一の反応容器中で実施される。三成分（例えば、それぞれ第一抗体又はその抗原結合断片で被覆された微粒子、試料、第二の検出可能に標識された抗体又はその抗原結合断片）を添加し混合する順序は重要ではない。この混合物が、第一抗体（特に微粒子上に被覆された第一抗体）及び検出可能に標識された第二抗体がＶＥＧＦ−Ａに結合するのに十分な時間、インキュベートされる。
【０１９５】
サンドイッチアッセイが洗浄ステップを伴って実施される別の実施態様では、第一抗体（特に微粒子上に被覆された第一抗体）、試料及び検出可能に標識された第二抗体、又はその抗原結合断片の、単一の反応容器中への添加と混合が逐次実施される。第一ステップ（アナライト捕捉ステップ）において、第一抗体で被覆された微粒子が、アナライト、すなわちＶＥＧＦ−Ａが結合するのに十分な時間、分析されるべき試料と共にインキュベートされる。洗浄ステップに続いて、検出可能に標識された第二抗体が添加され、第二抗体がアナライト、すなわちＶＥＧＦ−Ａに結合するのに十分な時間インキュベートされる。実施態様では、第一の態様の方法が競合アッセイ形式で実施される。
【０１９６】
実施態様では、混合物は６０分未満、すなわち６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、又は５分未満インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は４分から１時間（すなわち、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０分）インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は５分から４５分、すなわち５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、又は４５分、インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は５分から３０分、すなわち５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、又は３０分インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は９又は１８分間インキュベートされる。実施態様では、混合物は１〜１２時間（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２時間）インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は１〜４時間又は８〜１２時間インキュベートされる。
【０１９７】
更なる実施態様では、混合物は３〜４０℃（すなわち、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０℃）の温度でインキュベートされる。特に、混合物は３℃〜８℃（すなわち３、４、５、６、７又は８）、特に４〜５℃、又は２０℃〜２５℃（すなわち２０、２１、２２、２３、２４、又は２５℃）で、特に２０〜２２℃、又は３５〜３７℃でインキュベートされる。
【０１９８】
インキュベーション温度とインキュベーション時間が互いに依存することは当業者にはよく知られている。従って、特定の実施態様では、混合物は２０〜２５℃で１０分〜１時間インキュベートされる、すなわち混合物は、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５℃で１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０分、インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は２２℃で１０分未満又は２０分未満インキュベートされる。実施態様では、混合物は３〜８℃で１〜１２時間インキュベートされる。特に、混合物は３〜８℃、特に４〜５℃で１〜４時間又は８〜１２時間インキュベートされる。
【０１９９】
第一及び／又は第二抗体は、微粒子上に被覆された第一抗体と検出可能に標識された第二抗体が試料中のＶＥＧＦ−Ａに結合するのに十分な時間インキュベートされる。
【０２００】
特定の実施態様では、第一及び／又は第二抗体は、生理学的溶液、特に生理学的緩衝液中に含められ、及び／又はその中でインキュベートされる。特定の実施態様では、緩衝液は、ＴＡＰＳ、ビシン、トリス、トリシン、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸、及びＭＥＳの群から選択される。特定の実施態様では、緩衝液はＭＥＳ緩衝液である。特定の実施態様では、ＭＥＳ緩衝液は次の成分を含む：５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ２（二水和物）、０．１％のＮ−メチルイソチアゾロン−ＨＣｌ、０．１％のオキシピリオン、０．１％のポリドカノール（Ｔｈｅｓｉｔ）、１．０％のアルブミンＲＰＬＡ４アッセイ品質、０．２％のＰＡＫ＜−＞Ｒ−ＩｇＧ（ＤＥＴ）、ミリポア−水、２ＮのＮａＯＨでｐＨを６．３０に調整。
【０２０１】
特定の実施態様では、形成された抗体−抗原−抗体複合体、特に第一抗体、ＶＥＧＦ−Ａ−第二抗体を含む形成された複合体が、当該技術分野においてよく知られている任意の方法によって検出される。特定の実施態様では、形成された複合体は、電気化学発光、化学発光、又は蛍光によって検出される。
【０２０２】
第三の態様では、本発明は、第一及び第二抗体を含有する物質の組成物に関する。特に、前記第一及び前記第二抗体は、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａに結合することができる。特に、前記第一及び前記第二抗体の結合は互いに干渉しない。特に、前記抗体の一方は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、かつ前記抗体の他方は検出可能に標識されている。従って、第三の態様では、本発明は、第一抗体と第二抗体を含有する物質の組成物であって、前記第一及び前記第二抗体がＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａに結合することができ、前記第一及び前記第二抗体の結合が互いに干渉せず、かつ前記抗体の一方が固相に結合し又は結合することができ、前記抗体の他方は検出可能に標識されている、組成物に関する。
【０２０３】
特定の実施態様では、第一及び第二抗体は互いに干渉しない。従って、これらの抗体の一方の結合が、それぞれの他の抗体の結合を妨げたり又は減少させたりしない。第三の態様の特定の実施態様では、物質の組成物はＶＥＧＦ−Ａに対する第一抗体とＶＥＧＦ−Ａに対する第二抗体とを含有し、前記第一抗体と前記第二抗体は両方とも、同一又は異なるエピトープでＶＥＧＦ−Ａに結合する。本発明の実施態様では、第一及び第二抗体は、同じ単量体上の二つの異なるエピトープ及び／又は二量体の各単量体上の二つの異なるエピトープに結合する。あるいは、第一及び第二抗体は、ホモ二量体の異なる単量体上の同じ、又は実質的に同じエピトープに結合する。特定の実施態様では、前記第一抗体と前記第二抗体は両方とも、異なるエピトープでＶＥＧＦ−Ａに結合する。
【０２０４】
特定の実施態様では、第一及び第二抗体は互いに個々に、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストと同じ又は異なるエピトープ、特にアンタゴニスト抗体とは異なるエピトープに結合する。第一又は第二抗体がアンタゴニスト、特にアンタゴニスト抗体と同じエピトープに結合する場合、第一又は第二抗体はアンタゴニストよりも低いＫｄ値でエピトープに結合すると考えられる。特定の実施態様では、第一又は第二抗体は、１．５ｎＭ未満、特に１ｎＭ未満、０．７５ｎＭ未満、特に０．５ｎＭ未満のＫｄ値でエピトープと結合する。
【０２０５】
特定の実施態様では、第一及び第二抗体は互いに個々に、ＶＥＧＦ受容体、特にＶＥＧＦ−Ａ受容体ＶＥＧＦＡ−Ｒ１及び／又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２によって覆われるか又はそれによって結合されるエピトープに結合する。従って、前記第一抗体と前記第二抗体は、互いに独立して、ＶＥＧＦ−Ａ受容体、特にＶＥＧＦＡ−Ｒ１又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２と同一のエピトープに結合する。あるいは、前記第一抗体と前記第二抗体は、互いに独立して、ＶＥＧＦ−Ａ受容体、例えばＶＥＧＦＡ−Ｒ１又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２が直接結合していないが、第一及び／又は第二抗体の結合がＶＥＧＦ−Ａ受容体の結合を妨げるように受容体によって覆われているエピトープに結合する。従って、特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、ＶＥＧＦＡ−Ｒ１及び／又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２の結合について競合する。
【０２０６】
ＶＥＧＦ−Ａは単量体として又は二量体として、特にホモ二量体として存在する。従って、第三の態様の実施態様では、第一及び第二抗体は、同じ単量体上の二つの異なるエピトープ及び／又は二量体の各単量体上の二つの異なるエピトープに結合する。あるいは、第一及び第二抗体は、ホモ二量体の異なる単量体上の同じ、又は実質的に同じエピトープに結合する。
【０２０７】
第三の態様の実施態様では、第一抗体又は第二抗体の何れかが、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、及び配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５、配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなる群から選択されるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０２０８】
第三の態様の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、及び配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなる群から選択されるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、及び配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０２０９】
第三の態様の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなる群から選択されるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０２１０】
第三の態様の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸２０−４５、配列番号：２のアミノ酸５２−６８、配列番号：２のアミノ酸７２−１０７、配列番号：２のアミノ酸１１７−１２６、配列番号：３のアミノ酸１９−４３、配列番号：３のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：３のアミノ酸７７−１１４、配列番号：３のアミノ酸１２６−１３６からなる群から選択されるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸２０−４５、配列番号：２のアミノ酸５１−６８、配列番号：２のアミノ酸７２−１０７、配列番号：２のアミノ酸１１７−１２６、配列番号：３のアミノ酸１９−４３、配列番号：３のアミノ酸５１−６９、及び配列番号：３のアミノ酸７７−１１４、配列番号：３のアミノ酸１２６−１３６からなるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０２１１】
第三の態様の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸２１−４６、配列番号：４のアミノ酸５３−６９、配列番号：４のアミノ酸７３−１０８、配列番号：４のアミノ酸１１８−１２７、配列番号：５のアミノ酸２０−４４、配列番号：５のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：５のアミノ酸７８−１１５、配列番号：５のアミノ酸１２７−１３７からなる群から選択されるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸２１−４６、配列番号：４のアミノ酸５３−６９、配列番号：４のアミノ酸７３−１０８、配列番号：４のアミノ酸１１８−１２７、配列番号：５のアミノ酸２０−４４、配列番号：５のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：５のアミノ酸７８−１１５、配列番号：５のアミノ酸１２７−１３７からなるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０２１２】
特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、及び配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなる群から選択されるＣＤＲと配列番号：２のアミノ酸２０−４５、配列番号：２のアミノ酸５２−６８、配列番号：２のアミノ酸７２−１０７、配列番号：２のアミノ酸１１７−１２６、配列番号：３のアミノ酸１９−４３、配列番号：３のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：３のアミノ酸７７−１１４、配列番号：３のアミノ酸１２６−１３６からなる群から選択されるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０２１３】
特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなるＣＤＲと配列番号：４のアミノ酸２１−４６、配列番号：４のアミノ酸５３−６９、配列番号：４のアミノ酸７３−１０８、配列番号：４のアミノ酸１１８−１２７、配列番号：５のアミノ酸２０−４４、配列番号：５のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：５のアミノ酸７８−１１５、配列番号：５のアミノ酸１２７−１３７からなる群から選択されるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０２１４】
第三の態様の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２、３、４及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２１５】
第三の態様の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２及び４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。
【０２１６】
第三の態様の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：３及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【０２１７】
第三の態様の実施態様では、第一又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：３のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【０２１８】
第三の態様の実施態様では、第一又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：５のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【０２１９】
第三の態様の実施態様では、第一抗体又は第二抗体の一方が検出可能に標識される。前記標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、又は他の物理的手段によって検出可能な分子でありうる。特定の実施態様では、第一又は第二抗体は、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテン及び検出可能であるか又は検出可能にされうる他の物質で標識されうる。特定の実施態様では、第一又は第二抗体はビオチン化又はルテニル化される。抗体を標識するための方法は当業者によく知られており、例えば、Haugland (2003) Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley (1992) Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2；Glazer等 Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work及びE. Work編) American Elsevier Publishing Co., New York；Lundblad, R. L.及びNoyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche編, Walter DeGruyter, Berlin and New York；及びWong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); DeLeon-Rodriguez et al, Chem. Eur. J. 10 (2004) 1149-1155；Lewis等, Bioconjugate Chem. 12 (2001) 320-324；Li等, Bioconjugate Chem. 13 (2002) 110-115；Mier等 Bioconjugate Chem. 16 (2005) 240-237に豊富に記載されている。
【０２２０】
特定の実施態様では、第一抗体又は第二抗体の一方は、固相に結合することができるか又は固相に結合している。
【０２２１】
特定の実施態様では、第一抗体は固相に結合することができるか又は固相に結合しており、かつ第二抗体は検出可能に標識されている。
【０２２２】
第三の態様の更なる実施態様では、第一抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：２による配列を含むか又はそれからなる軽鎖を有し、かつ第二抗体は検出可能に標識され、配列番号：４による配列を含むか又はそれからなる軽鎖を有する。
【０２２３】
第三の態様の更なる実施態様では、第一抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：４による配列を含むか又はそれからなる軽鎖を有し、かつ第二抗体は検出可能に標識され、配列番号：２による配列を含むか又はそれからなる軽鎖を有する。
【０２２４】
第三の態様の更なる実施態様では、第一抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：３による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有し、かつ第二抗体は検出可能に標識され、配列番号：５による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有する。
【０２２５】
第三の態様の更なる実施態様では、第一抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：５による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有し、かつ第二抗体は検出可能に標識され、配列番号：３による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有する。
【０２２６】
第三の態様の更なる実施態様では、第一抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：２による配列を含むか又はそれからなる軽鎖と配列番号：３による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有し、かつ第二抗体は検出可能に標識され、配列番号：４による配列を含むか又はそれからなる軽鎖と配列番号：５による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有する。
【０２２７】
第三の態様の更なる実施態様では、第一抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：４による配列を含むか又はそれからなる軽鎖と配列番号：５による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有し、かつ第二抗体は検出可能に標識され、配列番号：２による配列を含むか又はそれからなる軽鎖と配列番号：３による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有する。
【０２２８】
更なる実施態様では、固相は、ビーズ、チューブ、マイクロプレートのディスク、及び特にイムノアッセイを実施するのに適した、任意の他の適切な表面からなる群から選択される形態である。特定の実施態様では、ビーズはマイクロビーズである。マイクロビーズは、ナノメートルからマイクロメートル範囲の直径を有する微粒子である。実施態様では、微粒子は、５０ナノメートルから５０マイクロメートルの直径を有しうる。特に、微粒子は、１００ｎｍ〜１０μｍ、特に２００ｎｍ〜５μｍ、又は７５０ｎｍ〜５μｍの直径を有する。微粒子は、当業者に知られている任意の適切な材料を含むか又はそれからなり、例えばそれらは、無機又は有機材料を含むか又はそれらからなるか又はそれらから本質的になる。特に、それらは、金属もしくは金属の合金、又は有機材料を含むか又はそれらからなるか又はそれらから本質的になるか、あるいは炭水化物要素を含むか又はそれらからなるか又はそれらから本質的になる。特定の実施態様では、微粒子の材料は、アガロース、ポリスチレン、ラテックス、ポリビニルアルコール、シリカ及び強磁性金属、合金又は複合材料からなる群から選択される。微粒子はまた磁性又は強磁性金属、合金又は組成物を含むか又はそれらからなりうる。材料は、例えば疎水性又は親水性のような特定の特性を有しうる。特定の実施態様では、微粒子は水溶液中に分散され、小さな負の表面電荷を保持し、微粒子を分離したままにし、非特異的なクラスター形成を回避する。
【０２２９】
特定の実施態様では、磁性又は常磁性微粒子は磁力によって分離される。常磁性粒子又は磁性粒子を溶液／懸濁液から引き抜き、それらを所望の通りに保持するために磁力が加えられる一方、溶液／懸濁液の液体を除去することができ、粒子を例えば洗浄できる。
【０２３０】
特定の実施態様では、第一又は第二抗体はＩｇＧ抗体である。特定の実施態様では、第一又は第二抗体はＩｇＧ２抗体である。特定の実施態様では、第一又は第二抗体はＩｇＧ２ｂ抗体、又はその抗原結合断片、特にＩｇＧ２ｂ−Ｆ（ａｂ’）２断片である。
【０２３１】
特定の実施態様では、物質の組成物はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを更に含有する。
【０２３２】
実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ａと一又は複数のＶＥＧＦ受容体との間の相互作用を妨げる。特に、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、受容体の結合部位でＶＥＧＦ−Ａと競合するか、あるいはそれがその受容体に結合できなくなるか又はその結合によって通常は引き起こされる機能的作用を誘発できなくなるようにその受容体に対するＶＥＧＦ−Ａの結合部位を変化させる。従って、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストはＶＥＧＦ−Ａのエピトープに結合し、それによってＶＥＧＦ−Ａのその受容体への結合を妨げるか、又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは受容体のエピトープに結合し、それによって受容体に対するＶＥＧＦ−Ａの結合を妨げうる。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストはＶＥＧＦ−Ａ上のエピトープに結合し、それによってＶＥＧＦ受容体へのその結合を妨げる。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ受容体はＶＥＧＦＡ−Ｒ１及び／又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２である。
【０２３３】
本発明の第三の態様の更なる実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ポリペプチド、ペプチボディ、イムノアドヘシン、小分子及びアプタマーからなる群から選択される。
【０２３４】
アンタゴニストがポリペプチドである特定の実施態様では、前記ポリペプチドは抗体である。特定の実施態様では、抗体は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である。特に、抗ＶＥＧＦ抗体は、十分な親和性と特異性でＶＥＧＦ−Ａに結合する抗体又はその抗原結合断片である。実施態様では、抗体又はその抗原結合断片はＶＥＧＦ−Ａに対して十分な結合親和性を有する。特に、抗体又はその抗原結合断片は、１００ｎＭ〜１ｐＭの間のＫｄ値、すなわち１００ｎＭ、５０ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐｍ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、又は１ｐＭのＫｄ値でｈＶＥＧＦ−Ａに結合する。特定の実施態様では、抗体又はその抗原結合断片は、５０ｎＭ〜５０ｐＭ、１ｎＭ〜１００ｐＭ、又は７００ｐＭ〜３００ｐＭの間のＫｄ値でヒトＶＥＧＦ−Ａ（ｈＶＥＧＦ−Ａ）に結合する。
【０２３５】
特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体はモノクローナル又はポリクローナルである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａに対するアンタゴニスト抗体又はその抗原結合断片は組換え生産される。更なる実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体はキメラ抗体、特にヒト化抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である。特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は変異ヒトＩｇＧ１フレームワーク領域を含む。アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ヒトＶＥＧＦのその受容体への結合を遮断するマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１由来の抗原結合相補性決定領域（ＣＤＲ）を更に含む。特定の実施態様では、フレームワーク領域の大部分を含む、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体のアミノ酸配列の９３％がヒトＩｇＧ１に由来し、かつ配列の約７％がマウス抗体Ａ４．６．１に由来する（アバスチン（登録商標））。特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体はグリコシル化されている。更なる実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は約１４９０００ダルトンの分子量を有する。特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は、Presta等 (1997) Cancer Res. 57:4593-4599に従って作製された組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である、「ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ」又は「アバスチン（登録商標）」としても知られるベバシズマブ（ＢＶ）である。
【０２３６】
特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は抗体断片である。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ナノボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二価一本鎖可変断片（ｄｉ−ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、及びＤＡＲＴ分子からなる群から選択される。特定の実施態様では、アンタゴニスト抗体断片は、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片、特にヒト化Ｆａｂ断片又はヒト化もしくはＦ（ａｂ’）２断片である。
【０２３７】
更なる実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、Ｍｕｃａｇｅｎ、ＰＴＫ７８７、ＳＵ１１２４８、ＡＧ−０１３７３６、Ｂａｙ４３９００６（ソラフェニブ）、ＺＤ−６４７４、ＣＰ６３２、ＣＰ−５４７６３２、ＡＺＤ−２１７１、ＣＤＰ−１７１、ＳＵ−１４８１３、ＣＨＩＲ−２５８、ＡＥＥ−７８８、ＳＢ７８６０３４、ＢＡＹ５７９３５２、ＣＤＰ−７９１、ＥＧ−３３０６、ＧＷ−７８６０３４、ＲＷＪ−４１７９７５／ＣＴ６７５８及びＫＲＮ−６３３からなる群から選択される。
【０２３８】
特定の実施態様では、第一及び／又は第二抗体及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、生理学的溶液、特に生理学的緩衝液中に含められる。特定の実施態様では、緩衝液は、ＴＡＰＳ、ビシン、トリス、トリシン、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸、及びＭＥＳの群から選択される。特定の実施態様では、緩衝液はＭＥＳ緩衝液である。特定の実施態様では、ＭＥＳ緩衝液は次の成分を含む：５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ２（二水和物）、０．１％のＮ−メチルイソチアゾロン−ＨＣｌ、０．１％のオキシピリオン、０．１％のポリドカノール（Ｔｈｅｓｉｔ）、１．０％のアルブミンＲＰＬＡ４アッセイ品質、０．２％のＰＡＫ＜−＞Ｒ−ＩｇＧ（ＤＥＴ）、ミリポア−水、２ＮのＮａＯＨでｐＨを６．３０に調整。
【０２３９】
特定の実施態様では、上に開示された物質の組成物は、第一の態様に関して上に開示されたように、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定する方法における使用のためのものである。従って、特定の実施態様では、上に開示される物質の組成物は、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するための方法において使用するためのものであり、該方法は、試料を前記第一及び第二抗体と共にインキュベートするステップであって、前記第一及び前記第二抗体は両方とも、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａに結合することができ、かつ前記第一及び前記第二抗体の結合が互いに干渉せず、前記抗体の一方が固相に結合しているか又は結合することができ、かつ前記抗体の他方が検出可能に標識され、それによって第一抗体、ＶＥＧＦ−Ａ、及び第二抗体を含む検出可能に標識された複合体を形成するステップと、形成された複合体を検出し、それによって、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するステップを含む。
【０２４０】
特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡはヒトＶＥＧＦ−Ａ又はそのバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列又はそのバリアントを含む。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列又はそのバリアントからなる。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡのバリアントはＶＥＧＦ−Ａと同じ機能性を有する、すなわちバリアントは機能的バリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａのバリアントは、特に配列番号：１に記載の、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａのバリアントは、特に配列番号：１に記載の、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａのバリアントは、特に配列番号：１に記載の、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列と少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａのバリアントは、特に配列番号：１に記載の、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示す。本発明の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａは、単量体として又は二量体として、特にホモ二量体として存在している。
【０２４１】
特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡはヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム又はそのバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡアイソフォームはヒトＶＥＧＦ−ＡアイソフォームＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９及び／又はＶＥＧＦ２０６、又はそれらのバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡアイソフォームのバリアントはそれぞれのＶＥＧＦ−Ａアイソフォームと同じ機能性を有する、すなわちアイソフォームバリアントは機能的アイソフォームバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのバリアントは、ヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列と少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示す。従って、特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦ１２１アイソフォームのバリアントは、ヒトＶＥＧＦ１２１アイソフォームのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示し；ＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦ１４５アイソフォームのバリアントは、ヒトＶＥＧＦ１４５アイソフォームのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示し；ＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦ１６５アイソフォームのバリアントは、ヒトＶＥＧＦ１６５アイソフォームのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示し、ＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦ１８９アイソフォームのバリアントは、ヒトＶＥＧＦ１８９アイソフォームのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示し、ＶＥＧＦ−ＡのＶＥＧＦ２０６アイソフォームのバリアントは、ヒトＶＥＧＦ２０６アイソフォームのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示す。
【０２４２】
特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡはヒトＶＥＧＦ−Ａ断片又はそのバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片はヒトＶＥＧＦ−Ａ１１０アミノ酸断片又はそのバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片のバリアントはそれぞれのＶＥＧＦ−Ａ断片と同じ機能性を有する、すなわち断片バリアントは機能的断片バリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片のバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片のバリアントは、ヒトＶＥＧＦ−Ａ断片のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片のバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａ断片のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片のバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａ断片のアミノ酸配列と少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ断片のバリアントは、それぞれのヒトＶＥＧＦ−Ａ断片のアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示す。従って、特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａの１１０アミノ酸断片のバリアントは、ヒト１１０アミノ酸ＶＥＧＦ−Ａ断片のアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示す。
【０２４３】
実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ａと一又は複数のＶＥＧＦ受容体との間の相互作用を妨げる。特に、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、受容体の結合部位でＶＥＧＦ−Ａと競合するか、あるいはそれがその受容体に結合できなくなるか又はその結合によって通常は引き起こされる機能的作用を誘発できなくなるようにその受容体に対するＶＥＧＦ−Ａの結合部位を変化させる。従って、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストはＶＥＧＦ−Ａのエピトープに結合し、それによってＶＥＧＦ−Ａのその受容体への結合を妨げるか、又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは受容体のエピトープに結合し、それによって受容体に対するＶＥＧＦ−Ａの結合を妨げうる。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストはＶＥＧＦ−Ａ上のエピトープに結合し、それによってＶＥＧＦ受容体へのその結合を妨げる。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ受容体はＶＥＧＦＡ−Ｒ１及び／又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２である。
【０２４４】
本発明の第三の態様の更なる実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ポリペプチド、ペプチボディ、イムノアドヘシン、小分子及びアプタマーからなる群から選択される。
【０２４５】
アンタゴニストがポリペプチドである特定の実施態様では、前記ポリペプチドは抗体である。特定の実施態様では、抗体は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である。特に、抗ＶＥＧＦ抗体は、十分な親和性と特異性でＶＥＧＦ−Ａに結合する抗体である。実施態様では、抗体はＶＥＧＦ−Ａに対して十分な結合親和性を有する。特に、抗体又はその抗原結合断片は、１００ｎＭ〜１ｐＭの間のＫｄ値、すなわち１００ｎＭ、５０ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐｍ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、又は１ｐＭのＫｄ値でｈＶＥＧＦ−Ａに結合する。特定の実施態様では、抗体又はその抗原結合断片は、５０ｎＭ〜５０ｐＭ、１ｎＭ〜１００ｐＭ、又は７００ｐＭ〜３００ｐＭの間のＫｄ値でヒトＶＥＧＦ−Ａ（ｈＶＥＧＦ−Ａ）に結合する。
【０２４６】
特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体はモノクローナル又はポリクローナルである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａに対するアンタゴニスト抗体は組換え生産される。更なる実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体はキメラ抗体、特にヒト化抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である。特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は変異ヒトＩｇＧ１フレームワーク領域を含む。アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ヒトＶＥＧＦのその受容体への結合を遮断するマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１由来の抗原結合相補性決定領域（ＣＤＲ）を更に含む。特定の実施態様では、フレームワーク領域の大部分を含む、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体のアミノ酸配列の９３％がヒトＩｇＧ１に由来し、かつ配列の約７％がマウス抗体Ａ４．６．１に由来する（アバスチン（登録商標））。特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体はグリコシル化されている。更なる実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は約１４９０００ダルトンの分子量を有する。特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は、Presta等 (1997) Cancer Res. 57:4593-4599に従って作製された組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である、「ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ」又は「アバスチン（登録商標）」としても知られるベバシズマブ（ＢＶ）である。
【０２４７】
特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は抗体断片である。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ナノボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二価一本鎖可変断片（ｄｉ−ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、及びＤＡＲＴ分子からなる群から選択される。特定の実施態様では、アンタゴニスト抗体断片は、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片、特にヒト化Ｆａｂ断片又はヒト化もしくはＦ（ａｂ’）２断片である。
【０２４８】
更なる実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、Ｍｕｃａｇｅｎ、ＰＴＫ７８７、ＳＵ１１２４８、ＡＧ−０１３７３６、Ｂａｙ４３９００６（ソラフェニブ）、ＺＤ−６４７４、ＣＰ６３２、ＣＰ−５４７６３２、ＡＺＤ−２１７１、ＣＤＰ−１７１、ＳＵ−１４８１３、ＣＨＩＲ−２５８、ＡＥＥ−７８８、ＳＢ７８６０３４、ＢＡＹ５７９３５２、ＣＤＰ−７９１、ＥＧ−３３０６、ＧＷ−７８６０３４、ＲＷＪ−４１７９７５／ＣＴ６７５８及びＫＲＮ−６３３からなる群から選択される。
【０２４９】
第三の態様の実施態様では、試料は、特に全血、血清、血漿、尿、唾液及び痰からなる群から選択される、体液に由来するか又は体液である。特定の実施態様では、試料は、全血試料、血清、又は血漿に由来するか又はそれらである。
【０２５０】
実施態様では、試料は健康な個体又は患者に由来する。特定の実施態様では、患者は増殖性疾患、特にがん、特に転移性がんに罹患している。特定の実施態様では、患者はがん、特に転移性がんに罹患しており、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストで治療される。特定の実施態様では、患者はがん、特に転移性がんに罹患しており、ベバシズマブで治療される。
【０２５１】
特定の実施態様では、がんはがん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病からなる群から選択される。そのようながんのより特定の例には、扁平上皮がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺がん、及び肺扁平上皮がんを含む）、腹膜がん、肝細胞がん、胃（gastric）又は胃（stomach）がん（例えば、胃腸がんを含む）、膵臓がん（例えば、転移性膵臓がんを含む）、膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞種、乳がん（局所進行、再発又は転移ＨＥＲ−２陰性乳がんを含む）、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん又は子宮がん、唾液腺がん、腎臓（kidney）又は腎（renal）がん、肝臓がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝細胞がん及び様々な種類の頭頸部がん、並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びワルデンストレームマクログロブリン血症を含む）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、並びにファコマトーシスに関連する異常な血管増殖、浮腫（脳腫瘍に関連するものなど）、及びメイグス症候群が含まれる。特に、患者は、結腸がん、肺がん、腎がん、卵巣がん、及び脳の多形性膠芽腫からなる群から選択されるがんに罹患している。
【０２５２】
特定の実施態様では、患者は哺乳動物、爬虫類、鳥又は魚である。特定の実施態様では、患者は、マウス、ラット、ウサギ、又はゼブラフィッシュモルモット、ウサギ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリ、ラクダ、ネコ、イヌ、カメ（turtle）、カメ（tortoise）、ヘビ、トカゲ、キンギョ及び霊長類からなる群から選択される哺乳動物である。特に、患者はヒトである。
【０２５３】
更なる実施態様では、上に開示された物質の組成物が使用されるＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でのＶＥＧＦ−Ａのレベルの測定方法は、イムノアッセイ、特にサンドイッチとも呼ばれる抗体−抗原−抗体複合体が形成されるサンドイッチイムノアッセイである。当業者は、ＶＥＧＦ−Ａの検出のためのサンドイッチアッセイでは、第一抗体が捕捉抗体として作用し得、第二抗体がトレーサー抗体として作用しうることを理解するであろう。あるいは、第二抗体が捕捉抗体として作用し得、第一抗体がトレーサー抗体として作用しうる。
【０２５４】
試料中のＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定する特定の実施態様では、第一及び第二抗体が、分析される試料と混合される。
【０２５５】
サンドイッチアッセイが洗浄ステップなしで実施される一実施態様では、そのような混合／インキュベーションは単一の反応容器中で実施される。三成分（例えば、それぞれ第一抗体又はその抗原結合断片で被覆された微粒子、試料、第二の検出可能に標識された抗体又はその抗原結合断片）を添加し混合する順序は重要ではない。この混合物が、第一抗体（特に微粒子上に被覆された第一抗体）及び検出可能に標識された第二抗体がＶＥＧＦ−Ａに結合するのに十分な時間、インキュベートされる。
【０２５６】
サンドイッチアッセイが洗浄ステップを伴って実施される別の実施態様では、第一抗体（特に微粒子上に被覆された第一抗体）、試料及び検出可能に標識された第二抗体、又はその抗原結合断片の、単一の反応容器中への添加と混合が逐次実施される。第一ステップ（アナライト捕捉ステップ）において、第一抗体で被覆された微粒子が、アナライト、すなわちＶＥＧＦ−Ａが結合するのに十分な時間、分析されるべき試料と共にインキュベートされる。洗浄ステップに続いて、検出可能に標識された第二抗体が添加され、第二抗体がアナライト、すなわちＶＥＧＦ−Ａに結合するのに十分な時間インキュベートされる。実施態様では、第一の態様の方法が競合アッセイ形式で実施される。
【０２５７】
実施態様では、混合物は６０分未満、すなわち６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、又は５分未満インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は４分から１時間（すなわち、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０分）インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は５分から４５分、すなわち５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、又は４５分、インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は５分から３０分、すなわち５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、又は３０分インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は９又は１８分間インキュベートされる。実施態様では、混合物は１〜１２時間（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２時間）インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は１〜４時間又は８〜１２時間インキュベートされる。
【０２５８】
更なる実施態様では、混合物は３〜４０℃（すなわち、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０℃）の温度でインキュベートされる。特に、混合物は３℃〜８℃（すなわち３、４、５、６、７又は８）、特に４〜５℃、又は２０℃〜２５℃（すなわち２０、２１、２２、２３、２４、又は２５℃）で、特に２０〜２２℃、又は３５〜３７℃でインキュベートされる。
【０２５９】
インキュベーション温度とインキュベーション時間が互いに依存することは当業者にはよく知られている。従って、特定の実施態様では、混合物は２０〜２５℃で１０分〜１時間インキュベートされる、すなわち混合物は、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５℃で１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０分、インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は２２℃で１０分未満又は２０分未満インキュベートされる。実施態様では、混合物は３〜８℃で１〜１２時間インキュベートされる。特に、混合物は３〜８℃、特に４〜５℃で１〜４時間又は８〜１２時間インキュベートされる。
【０２６０】
第一及び／又は第二抗体は、微粒子上に被覆された第一抗体と検出可能に標識された第二抗体が試料中のＶＥＧＦ−Ａに結合するのに十分な時間インキュベートされる。
【０２６１】
特定の実施態様では、第一及び／又は第二抗体は、生理学的溶液、特に生理学的緩衝液中に含められ、及び／又はその中でインキュベートされる。特定の実施態様では、緩衝液は、ＴＡＰＳ、ビシン、トリス、トリシン、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸、及びＭＥＳの群から選択される。特定の実施態様では、緩衝液はＭＥＳ緩衝液である。特定の実施態様では、ＭＥＳ緩衝液は次の成分を含む：５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ２（二水和物）、０．１％のＮ−メチルイソチアゾロン−ＨＣｌ、０．１％のオキシピリオン、０．１％のポリドカノール（Ｔｈｅｓｉｔ）、１．０％のアルブミンＲＰＬＡ４アッセイ品質、０．２％のＰＡＫ＜−＞Ｒ−ＩｇＧ（ＤＥＴ）、ミリポア−水、２ＮのＮａＯＨでｐＨを６．３０に調整。
【０２６２】
特定の実施態様では、形成された抗体−抗原−抗体複合体、特に第一抗体、ＶＥＧＦ−Ａ−第二抗体を含む形成された複合体が、当該技術分野においてよく知られている任意の方法によって検出される。特定の実施態様では、形成された複合体は、電気化学発光、化学発光、又は蛍光によって検出される。
【０２６３】
第四の態様では、本発明は、第一タンパク質としてのヒトＶＥＧＦ−Ａと第二タンパク質としての非ヒトもしくはキメラタンパク質を含むタンパク質複合体を検出する方法であって、
（ａ）前記複合体を含む試料を、前記複合体のＶＥＧＦ−Ａ及び／又は第二非ヒトもしくはキメラタンパク質に結合することができるか又は結合している検出可能に標識された抗体と共にインキュベートするステップと、
（ｂ）複合体に結合した検出可能に標識された抗体を検出するステップ
を含む、方法に関する。
【０２６４】
特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡはヒトＶＥＧＦ−Ａ又はそのバリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列又はそのバリアントを含む。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列又はそのバリアントからなる。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡのバリアントはＶＥＧＦ−Ａと同じ機能性を有する、すなわちバリアントは機能的バリアントである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａのバリアントは、特に配列番号：１に記載の、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａのバリアントは、特に配列番号：１に記載の、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａのバリアントは、特に配列番号：１に記載の、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列と少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を示す。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａのバリアントは、特に配列番号：１に記載の、ヒトＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列と８５％、９５％、又は９８％の配列同一性を示す。
【０２６５】
第四の態様の特定の実施態様では、非ヒトもしくはキメラタンパク質はＶＥＧＦ−Ａに結合する抗体である。
【０２６６】
従って、特定の実施態様では、検出される複合体は、ヒトＶＥＧＦ−Ａ又はそのバリアントと、ＶＥＧＦ−Ａに結合する非ヒトもしくはキメラ抗体を含む。
【０２６７】
特定の実施態様では、検出可能に標識される抗体又はその抗原結合断片はＶＥＧＦ−Ａに結合する。
【０２６８】
検出可能に標識された抗体がＶＥＧＦ−Ａに結合する実施態様では、非ヒト抗体又はキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は、同一又は異なるエピトープでＶＥＧＦ−Ａに結合する。特定の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は異なるエピトープでＶＥＧＦ−Ａに結合する。
【０２６９】
特定の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は互いに干渉しない。従って、これらの抗体の一方の結合が、それぞれの他の抗体の結合を妨げたり又は減少させたりしない。本発明の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は、同じ単量体上の二つの異なるエピトープ及び／又は二量体の各単量体上の二つの異なるエピトープに結合する。あるいは、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は、ホモ二量体の異なる単量体上の同じ、又は実質的に同じエピトープに結合する。特定の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は異なるエピトープでＶＥＧＦ−Ａに結合する。
【０２７０】
特定の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は互いに個々に、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストと同じ又は異なるエピトープ、特にアンタゴニスト抗体とは異なるエピトープに結合する。非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体がアンタゴニスト、特にアンタゴニスト抗体と同じエピトープに結合する場合、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体はアンタゴニストよりも低いＫｄ値でエピトープに結合すると考えられる。特定の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は、１．５ｎＭ未満、特に１ｎＭ未満、０．７５ｎＭ未満、特に０．５ｎＭ未満のＫｄ値でエピトープと結合する。
【０２７１】
特定の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は互いに個々に、ＶＥＧＦ受容体、特にＶＥＧＦ−Ａ受容体ＶＥＧＦＡ−Ｒ１及び／又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２によって覆われるか又はそれによって結合されるエピトープに結合する。従って、前記非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は、ＶＥＧＦ−Ａ受容体、特にＶＥＧＦＡ−Ｒ１又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２と同一のエピトープに結合する。あるいは、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は、ＶＥＧＦ−Ａ受容体、例えばＶＥＧＦＡ−Ｒ１又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２が直接結合していないが、第一及び／又は第二抗体の結合がＶＥＧＦ−Ａ受容体の結合を妨げるように受容体によって覆われているエピトープに結合する。従って、特定の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は、ＶＥＧＦＡ−Ｒ１及び／又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２の結合について競合する。
【０２７２】
ＶＥＧＦ−Ａは単量体として又は二量体として、特にホモ二量体として存在する。従って、第四の態様の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は、同じ単量体上の二つの異なるエピトープ及び／又は二量体の各単量体上の二つの異なるエピトープに結合する。あるいは、第一及び第二抗体は、ホモ二量体の異なる単量体上の同じ、又は実質的に同じエピトープに結合する。
【０２７３】
第四の態様の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体の何れかが、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、及び配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５、配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなる群から選択されるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０２７４】
第四の態様の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、及び配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなる群から選択されるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、及び配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０２７５】
第四の態様の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は、配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなる群から選択されるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなるＣＤＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０２７６】
第四の態様の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は、配列番号：２のアミノ酸２０−４５、配列番号：２のアミノ酸５２−６８、配列番号：２のアミノ酸７２−１０７、配列番号：２のアミノ酸１１７−１２６、配列番号：３のアミノ酸１９−４３、配列番号：３のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：３のアミノ酸７７−１１４、配列番号：３のアミノ酸１２６−１３６からなる群から選択されるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：２のアミノ酸２０−４５、配列番号：２のアミノ酸５１−６８、配列番号：２のアミノ酸７２−１０７、配列番号：２のアミノ酸１１７−１２６、配列番号：３のアミノ酸１９−４３、配列番号：３のアミノ酸５１−６９、及び配列番号：３のアミノ酸７７−１１４、配列番号：３のアミノ酸１２６−１３６からなるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０２７７】
第四の態様の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は、配列番号：４のアミノ酸２１−４６、配列番号：４のアミノ酸５３−６９、配列番号：４のアミノ酸７３−１０８、配列番号：４のアミノ酸１１８−１２７、配列番号：５のアミノ酸２０−４４、配列番号：５のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：５のアミノ酸７８−１１５、配列番号：５のアミノ酸１２７−１３７からなる群から選択されるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。特定の実施態様では、第一抗体及び／又は第二抗体は、配列番号：４のアミノ酸２１−４６、配列番号：４のアミノ酸５３−６９、配列番号：４のアミノ酸７３−１０８、配列番号：４のアミノ酸１１８−１２７、配列番号：５のアミノ酸２０−４４、配列番号：５のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：５のアミノ酸７８−１１５、配列番号：５のアミノ酸１２７−１３７からなるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０２７８】
特定の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、及び配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなる群から選択されるＣＤＲと配列番号：２のアミノ酸２０−４５、配列番号：２のアミノ酸５２−６８、配列番号：２のアミノ酸７２−１０７、配列番号：２のアミノ酸１１７−１２６、配列番号：３のアミノ酸１９−４３、配列番号：３のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：３のアミノ酸７７−１１４、配列番号：３のアミノ酸１２６−１３６からなる群から選択されるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０２７９】
特定の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は、配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなるＣＤＲと配列番号：４のアミノ酸２１−４６、配列番号：４のアミノ酸５３−６９、配列番号：４のアミノ酸７３−１０８、配列番号：４のアミノ酸１１８−１２７、配列番号：５のアミノ酸２０−４４、配列番号：５のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：５のアミノ酸７８−１１５、配列番号：５のアミノ酸１２７−１３７からなる群から選択されるＦＲを含む抗体によって結合されるエピトープに結合する。
【０２８０】
第四の態様の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は、配列番号：２、３、４及び５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２８１】
第四の態様の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は、配列番号：２のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：３のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【０２８２】
第四の態様の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は、配列番号：４のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：５のアミノ酸配列を有する重鎖を含む。
【０２８３】
第四の態様の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体及び／又は検出可能に標識された抗体が分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、又は他の物理的手段によって検出可能な分子で標識される。特定の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体及び／又は検出可能に標識された抗体は、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて一般的に使用されるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテン及び検出可能であるか又は検出可能にされうる他の物質で標識されうる。特定の実施態様では、第一又は第二抗体はビオチン化又はルテニル化される。抗体を標識するための方法は当業者によく知られており、例えば、Haugland (2003) Molecular Probes Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Inc.; Brinkley (1992) Bioconjugate Chem. 3:2; Garman, (1997) Non-Radioactive Labeling: A Practical Approach, Academic Press, London; Means (1990) Bioconjugate Chem. 1:2；Glazer等 Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (T. S. Work及びE. Work編) American Elsevier Publishing Co., New York；Lundblad, R. L.及びNoyes, C. M. (1984) Chemical Reagents for Protein Modification, Vols. I and II, CRC Press, New York; Pfleiderer, G. (1985) "Chemical Modification of Proteins", Modern Methods in Protein Chemistry, H. Tschesche編, Walter DeGruyter, Berlin and New York；及びWong (1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla.); DeLeon-Rodriguez et al, Chem. Eur. J. 10 (2004) 1149-1155；Lewis等, Bioconjugate Chem. 12 (2001) 320-324；Li等, Bioconjugate Chem. 13 (2002) 110-115；Mier等 Bioconjugate Chem. 16 (2005) 240-237に豊富に記載されている。
【０２８４】
特定の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体と検出可能に標識された抗体は、固相に結合することができるか又は固相に結合している。
【０２８５】
特定の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体は固相に結合することができるか又は固相に結合している。
【０２８６】
第四の態様の更なる実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：２による配列を含むか又はそれからなる軽鎖を有し、かつ検出可能抗体は、配列番号：４による配列を含むか又はそれからなる軽鎖を有する。
【０２８７】
第四の態様の更なる実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：４による配列を含むか又はそれからなる軽鎖を有し、かつ検出可能に標識された抗体は配列番号：２による配列を含むか又はそれからなる軽鎖を有する。
【０２８８】
第四の態様の更なる実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：３による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有し、かつ検出可能に標識された抗体は配列番号：５による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有する。
【０２８９】
第四の態様の更なる実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：５による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有し、かつ検出可能に標識された抗体は配列番号：３による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有する。
【０２９０】
第四の態様の更なる実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：２による配列を含むか又はそれからなる軽鎖と配列番号：３による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有し、かつ検出可能に標識された抗体は配列番号：４による配列を含むか又はそれからなる軽鎖と配列番号：５による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有する。
【０２９１】
第四の態様の更なる実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体は固相に結合しているか又は固相に結合することができ、配列番号：４による配列を含むか又はそれからなる軽鎖と配列番号：５による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有し、かつ検出可能に標識された抗体は配列番号：２による配列を含むか又はそれからなる軽鎖と配列番号：３による配列を含むか又はそれからなる重鎖を有する。
【０２９２】
更なる実施態様では、固相は、ビーズ、チューブ、マイクロプレートのディスク、及び特にイムノアッセイを実施するのに適した、任意の他の適切な表面からなる群から選択される形態である。特定の実施態様では、ビーズはマイクロビーズである。マイクロビーズは、ナノメートルからマイクロメートル範囲の直径を有する微粒子である。実施態様では、微粒子は、５０ナノメートルから５０マイクロメートルの直径を有しうる。特に、微粒子は、１００ｎｍ〜１０μｍ、特に２００ｎｍ〜５μｍ、又は７５０ｎｍ〜５μｍの直径を有する。微粒子は、当業者に知られている任意の適切な材料を含むか又はそれからなり、例えばそれらは、無機又は有機材料を含むか又はそれらからなるか又はそれらから本質的になる。特に、それらは、金属もしくは金属の合金、又は有機材料を含むか又はそれらからなるか又はそれらから本質的になるか、あるいは炭水化物要素を含むか又はそれらからなるか又はそれらから本質的になる。特定の実施態様では、微粒子の材料は、アガロース、ポリスチレン、ラテックス、ポリビニルアルコール、シリカ及び強磁性金属、合金又は複合材料からなる群から選択される。微粒子はまた磁性又は強磁性金属、合金又は組成物を含むか又はそれらからなりうる。材料は、例えば疎水性又は親水性のような特定の特性を有しうる。特定の実施態様では、微粒子は水溶液中に分散され、小さな負の表面電荷を保持し、微粒子を分離したままにし、非特異的なクラスター形成を回避する。
【０２９３】
特定の実施態様では、磁性又は常磁性微粒子は磁力によって分離される。常磁性粒子又は磁性粒子を溶液／懸濁液から引き抜き、それらを所望の通りに保持するために磁力が加えられる一方、溶液／懸濁液の液体を除去することができ、粒子を例えば洗浄できる。
【０２９４】
特定の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体及び／又は検出可能に標識された抗体はＩｇＧ抗体である。特定の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体及び／又は検出可能に標識された抗体はＩｇＧ２抗体である。特定の実施態様では、非ヒトもしくはキメラ抗体及び／又は検出可能に標識された抗体はＩｇＧ２ｂ抗体、又はその抗原結合断片、特にＩｇＧ２ｂ−Ｆ（ａｂ’）２断片である。
【０２９５】
第四の態様の特定の実施態様では、ステップ（ａ）においてインキュベートされた前記複合体を含む試料がまたＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストと共にインキュベートされる。特定の実施態様では、前記複合体を含む試料とＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストとのインキュベーションは、検出可能に標識された抗体又はその抗原結合断片とのインキュベーションの前、同時又は後に実施される。
【０２９６】
実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ａと一又は複数のＶＥＧＦ受容体との間の相互作用を妨げる。特に、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、受容体の結合部位でＶＥＧＦ−Ａと競合するか、あるいはそれがその受容体に結合できなくなるか又はその結合によって通常は引き起こされる機能的作用を誘発できなくなるようにその受容体に対するＶＥＧＦ−Ａの結合部位を変化させる。従って、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストはＶＥＧＦ−Ａのエピトープに結合し、それによってＶＥＧＦ−Ａのその受容体への結合を妨げるか、又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは受容体のエピトープに結合し、それによって受容体に対するＶＥＧＦ−Ａの結合を妨げうる。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストはＶＥＧＦ−Ａ上のエピトープに結合し、それによってＶＥＧＦ受容体へのその結合を妨げる。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ受容体はＶＥＧＦＡ−Ｒ１及び／又はＶＥＧＦＡ−Ｒ２である。
【０２９７】
第四の態様の更なる実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ポリペプチド、ペプチボディ、イムノアドヘシン、小分子及びアプタマーからなる群から選択される。
【０２９８】
アンタゴニストがポリペプチドである特定の実施態様では、前記ポリペプチドは抗体である。特定の実施態様では、抗体は抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である。特に、抗ＶＥＧＦ抗体は、十分な親和性と特異性でＶＥＧＦ−Ａに結合する抗体又はその抗原結合断片である。実施態様では、抗体又はその抗原結合断片はＶＥＧＦ−Ａに対して十分な結合親和性を有する。特に、抗体又はその抗原結合断片は、１００ｎＭ〜１ｐＭの間のＫｄ値、すなわち１００ｎＭ、５０ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐｍ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、又は１ｐＭのＫｄ値でｈＶＥＧＦ−Ａに結合する。特定の実施態様では、抗体又はその抗原結合断片は、５０ｎＭ〜５０ｐＭ、１ｎＭ〜１００ｐＭ、又は７００ｐＭ〜３００ｐＭの間のＫｄ値でヒトＶＥＧＦ−Ａ（ｈＶＥＧＦ−Ａ）に結合する。
【０２９９】
特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体はモノクローナル又はポリクローナルである。特定の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａに対するアンタゴニスト抗体は組換え生産される。更なる実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体はキメラ抗体、特にヒト化抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体である。特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は変異ヒトＩｇＧ１フレームワーク領域を含む。アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は、ヒトＶＥＧＦのその受容体への結合を遮断するマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ．４．６．１由来の抗原結合相補性決定領域（ＣＤＲ）を更に含む。特定の実施態様では、フレームワーク領域の大部分を含む、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体のアミノ酸配列の９３％がヒトＩｇＧ１に由来し、かつ配列の約７％がマウス抗体Ａ４．６．１に由来する（アバスチン（登録商標））。特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体はグリコシル化されている。更なる実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は約１４９０００ダルトンの分子量を有する。特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は、Presta等 (1997) Cancer Res. 57:4593-4599に従って作製された組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である、「ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ」又は「アバスチン（登録商標）」としても知られるベバシズマブ（ＢＶ）である。
【０３００】
特定の実施態様では、アンタゴニストＶＥＧＦ−Ａ抗体は抗体断片である。抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ナノボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二価一本鎖可変断片（ｄｉ−ｓｃＦｖ）、タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ、二重特異性ダイアボディ、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、及びＤＡＲＴ分子からなる群から選択される。特定の実施態様では、アンタゴニスト抗体断片は、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片、特にヒト化Ｆａｂ断片又はヒト化もしくはＦ（ａｂ’）２断片である。
【０３０１】
更なる実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、Ｍｕｃａｇｅｎ、ＰＴＫ７８７、ＳＵ１１２４８、ＡＧ−０１３７３６、Ｂａｙ４３９００６（ソラフェニブ）、ＺＤ−６４７４、ＣＰ６３２、ＣＰ−５４７６３２、ＡＺＤ−２１７１、ＣＤＰ−１７１、ＳＵ−１４８１３、ＣＨＩＲ−２５８、ＡＥＥ−７８８、ＳＢ７８６０３４、ＢＡＹ５７９３５２、ＣＤＰ−７９１、ＥＧ−３３０６、ＧＷ−７８６０３４、ＲＷＪ−４１７９７５／ＣＴ６７５８及びＫＲＮ−６３３からなる群から選択される。
【０３０２】
特定の実施態様では、複合体、検出可能に標識された抗体及び／又はＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストは、生理学的溶液、特に生理学的緩衝液中に含められる。特定の実施態様では、緩衝液は、ＴＡＰＳ、ビシン、トリス、トリシン、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸、及びＭＥＳの群から選択される。特定の実施態様では、緩衝液はＭＥＳ緩衝液である。特定の実施態様では、ＭＥＳ緩衝液は次の成分を含む：５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ２（二水和物）、０．１％のＮ−メチルイソチアゾロン−ＨＣｌ、０．１％のオキシピリオン、０．１％のポリドカノール（Ｔｈｅｓｉｔ）、１．０％のアルブミンＲＰＬＡ４アッセイ品質、０．２％のＰＡＫ＜−＞Ｒ−ＩｇＧ（ＤＥＴ）、ミリポア−水、２ＮのＮａＯＨでｐＨを６．３０に調整。
【０３０３】
ステップ（ａ）の特定の実施態様では、検出可能に標識された抗体は前記複合体を含む試料と混合される。この混合物は、検出可能に標識された抗体が複合体に結合するのに十分な時間の間、インキュベートされる。
【０３０４】
実施態様では、混合物は６０分未満、すなわち６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、又は５分未満インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は４分から１時間（すなわち、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０分）インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は５分から４５分、すなわち５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、又は４５分、インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は５分から３０分、すなわち５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、又は３０分インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は２０分未満又は１０分未満インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は１８又は９分間インキュベートされる。
【０３０５】
実施態様では、混合物は１〜１２時間（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２時間）インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は１〜４時間又は８〜１２時間の間インキュベートされる。
【０３０６】
更なる実施態様では、混合物は３〜４０℃（すなわち、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０℃）の温度でインキュベートされる。特に、混合物は３℃〜８℃（すなわち３、４、５、６、７又は８）、特に４〜５℃、又は２０℃〜２５℃（すなわち２０、２１、２２、２３、２４、又は２５℃）で、特に２０〜２２℃、又は３５〜３７℃でインキュベートされる。
【０３０７】
インキュベーション温度とインキュベーション時間が互いに依存することは当業者にはよく知られている。従って、特定の実施態様では、混合物は２０〜２５℃で１０分〜１時間インキュベートされる、すなわち混合物は、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５℃で１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０分、インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は２２℃で１０分未満又は２０分未満インキュベートされる。更なる実施態様では、混合物は３〜８℃で８〜１２時間インキュベートされる、すなわち混合物は、３、４、５、６、７、又は８℃で８、９、１０、１１、又は１２時間、インキュベートされる。特定の実施態様では、混合物は４℃で１２時間インキュベートされる。特に、混合物は３〜８℃、特に４〜５℃で１〜４時間又は８〜１２時間インキュベートされる。
【０３０８】
特定の実施態様では、複合体及び／又は検出可能に標識された抗体は、生理学的溶液、特に生理学的緩衝液中に含められ、及び／又はその中でインキュベートされる。特定の実施態様では、緩衝液は、ＴＡＰＳ、ビシン、トリス、トリシン、ＴＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、カコジル酸、及びＭＥＳの群から選択される。特定の実施態様では、緩衝液はＭＥＳ緩衝液である。特定の実施態様では、ＭＥＳ緩衝液は次の成分を含む：５０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ−Ｎａ２（二水和物）、０．１％のＮ−メチルイソチアゾロン−ＨＣｌ、０．１％のオキシピリオン、０．１％のポリドカノール（Ｔｈｅｓｉｔ）、１．０％のアルブミンＲＰＬＡ４アッセイ品質、０．２％のＰＡＫ＜−＞Ｒ−ＩｇＧ（ＤＥＴ）、ミリポア−水、２ＮのＮａＯＨでｐＨを６．３０に調整。
【０３０９】
特定の実施態様では、形成された抗体−抗原−抗体複合体、特にヒトＶＥＧＦ−Ａ及び非ヒトもしくはキメラ抗体、及び検出可能に標識された抗体又はその抗原結合断片を含む形成された複合体が、当該技術分野においてよく知られている任意の方法によってステップ（ｂ）において検出される。特定の実施態様では、形成された複合体は、電気化学発光、化学発光、又は蛍光によって検出される。
【０３１０】
特に、本発明は、次の項に関する：
１．  ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するための方法において、
試料を第一及び第二抗体と共にインキュベートするステップであって、前記第一及び前記第二抗体がＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａ又はそのバリアントに結合することができ、前記第一及び前記第二抗体の結合が互いに干渉せず、
前記抗体の一方が検出可能に標識され、よって第一抗体、ＶＥＧＦ−Ａ又はそのバリアント、及び第二抗体を含む検出可能に標識された複合体を形成するステップと、
形成された複合体を検出し、よってＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するステップと
を含む、方法。
２．  ＶＥＧＦ−ＡアンタゴニストがＶＥＧＦ−Ａ結合ポリペプチド、特にＶＥＧＦ−Ａ結合抗体である、第１項に記載の方法。
３．  ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが抗体ベバシズマブである、第１項又は第２項に記載の方法。
４．  第一及び／又は第二抗体の何れかが、ＶＥＧＦ受容体が覆う又は結合するエピトープに結合する、第１項から第３項の何れか一項に記載の方法。
５．  第一又は第二抗体の何れかが、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなるＣＤＲを含み、又は
配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなるＣＤＲを含む、第１項から第４項の何れか一項に記載の方法。
６．  第一抗体及び／又は第二抗体の何れかが、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなるＣＤＲを含み、配列番号：２のアミノ酸２０−４５、配列番号：２のアミノ酸５２−６８、配列番号：２のアミノ酸７２−１０７、配列番号：２のアミノ酸１１７−１２６、配列番号：３のアミノ酸１９−４３、配列番号：３のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：３のアミノ酸７７−１１４、配列番号：３のアミノ酸１２６−１３６からなるＦＲを含むか、又は
配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなるＣＤＲを含み、配列番号：４のアミノ酸２１−４６、配列番号：４のアミノ酸５３−６９、配列番号：４のアミノ酸７３−１０８、配列番号：４のアミノ酸１１８−１２７、配列番号：５のアミノ酸２０−４４、配列番号：５のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：５のアミノ酸７８−１１５、配列番号：５のアミノ酸１２７−１３７からなるＦＲを含む抗体が結合するエピトープに結合する、第１項から第５項の何れか一項に記載の方法。
７．  第一又は第二抗体の何れかが、配列番号：２のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：３のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、第１項から第６項の何れか一項に記載の方法。
８．  第一又は第二抗体の何れかが、配列番号：４のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：５のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、第１項から第６項の何れか一項に記載の方法。
９．  第一又は第二抗体が固相に結合するか又は結合することができる、第１項から第８項の何れか一項に記載の方法。
１０．  第一抗体が固相に結合するか又は結合することができ、配列番号：２のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：３のアミノ酸配列を有する重鎖を含み、第二抗体が検出可能に標識され、配列番号：４のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：５のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、第１項から第９項の何れか一項に記載の方法。
１１．  第一抗体又は第二抗体の一方がビオチン化される、第１項から第１０項の何れか一項に記載の方法。
１２．  第一抗体又は第二抗体の一方がルテニル化される、第１項から第１０項の何れか一項に記載の方法。
１３．  試料が、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストで治療された患者に由来する、第１項から第１２項の何れか一項に記載の方法。
１４．  試料が体液、特に全血、血清又は血漿である、第１項から第１３項の何れか一項に記載の方法。
１５．  ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａ又はそのバリアントのレベルを測定するための方法がサンドイッチイムノアッセイである、第１項から第１４項の何れか一項に記載の方法。
１６．  ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するための方法が、電気化学発光による形成された複合体の検出を含む、第１項から第１５項の何れか一項に記載の方法。
１７．  ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａのレベルを測定するためのキットであって、第一及び第二抗体を含み、
前記第一及び前記第二抗体が共に、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａに結合することができ、前記第一及び前記第二抗体の結合が互いに干渉せず、
前記抗体の一方が検出可能に標識される、キット。
１８．  前記キットが第４項から第１２項の何れか一項に特定された抗体を含む、第１７項に記載のキット。
１９．  第一及び第二抗体を含有する物質の組成物であって、
前記第一及び前記第二抗体が共に、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａ又はそのバリアントに結合することができ、
前記第一及び前記第二抗体の結合が互いに干渉せず、かつ
前記抗体の一方が検出可能に標識される、組成物。
２０．  第一及び／又は第二抗体の何れかが、ＶＥＧＦ受容体が覆う又は結合するエピトープに結合する、第１９項に記載の物質の組成物。
２１．  第一又は第二抗体の何れかが、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなるＣＤＲを含み、又は
配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなるＣＤＲを含む、第１９項又は第２０項に記載の物質の組成物。
２２．  第一抗体及び／又は第二抗体の何れかが、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなるＣＤＲを含み；配列番号：２のアミノ酸２０−４５、配列番号：２のアミノ酸５２−６８、配列番号：２のアミノ酸７２−１０７、配列番号：２のアミノ酸１１７−１２６、配列番号：３のアミノ酸１９−４３、配列番号：３のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：３のアミノ酸７７−１１４、配列番号：３のアミノ酸１２６−１３６からなるＦＲを含むか、又は
配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなるＣＤＲを含み、配列番号：４のアミノ酸２１−４６、配列番号：４のアミノ酸５３−６９、配列番号：４のアミノ酸７３−１０８、配列番号：４のアミノ酸１１８−１２７、配列番号：５のアミノ酸２０−４４、配列番号：５のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：５のアミノ酸７８−１１５、配列番号：５のアミノ酸１２７−１３７からなるＦＲを含む抗体が結合するエピトープに結合する、第１９項から第２１項の何れか一項に記載の物質の組成物。
２３．  第一又は第二抗体の何れかが、配列番号：２のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：３のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、第１９項から第２２項の何れか一項に記載の物質の組成物。
２４．  第一又は第二抗体の何れかが、配列番号：４のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：５のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、第１９項から第２３項の何れか一項に記載の物質の組成物。
２５．  第一又は第二抗体が固相に結合するか又は結合することができる、第１９項から第２４項の何れか一項に記載の物質の組成物。
２６．  第一抗体又はその断片が固相に結合するか又は結合することができ、配列番号：２のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：３のアミノ酸配列を有する重鎖を含み、第二抗体が検出可能に標識され、配列番号：４のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：５のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、第１９項から第２５項の何れか一項に記載の物質の組成物。
２７．  第一抗体又は第二抗体の一方がビオチン化される、第１９項から第２６項の何れか一項に記載の物質の組成物。
２８．  第一抗体又は第二抗体の一方がルテニル化される、第１９項から第２７項の何れか一項に記載の物質の組成物。
２９．  前記組成物がＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを更に含有する、第１９項から第２８項の何れか一項に記載の物質の組成物。
３０．  ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが抗体ベバシズマブである、第２９項に記載の物質の組成物。
３１．  ヒトＶＥＧＦ−Ａと非ヒトもしくはキメラタンパク質とを含む複合体を検出する方法であって、
（ａ）前記複合体を含む試料を、ヒトＶＥＧＦ−Ａもしくはそのバリアント及び／又は非ヒトもしくはキメラタンパク質に結合することができるか又は結合する検出可能に標識された抗体と共にインキュベートするステップと
（ｂ）前記抗原結合タンパク質を検出するステップ
を含む、方法。
３２．  複合体が、ヒトＶＥＧＦ−Ａと、ＶＥＧＦ−Ａに結合した非ヒトもしくはキメラ抗体又はその抗原結合断片とを含む、第３１項に記載の方法。
３３．  非ヒトもしくはキメラタンパク質と検出可能に標識された抗体が、両方とも、ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストの存在下でＶＥＧＦ−Ａに結合することができる、第３１項又は第３２項に記載の方法。
３４．  非ヒトもしくはキメラタンパク質又は検出可能に標識された抗体の何れかが、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなるＣＤＲを含み、又は
配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなるＣＤＲを含む抗体が結合するエピトープに結合する、第３１項から第３３項の何れかに記載の方法。
３５．  非ヒトもしくはキメラタンパク質又は検出可能に標識された抗体の何れかが、配列番号：２のアミノ酸４６−５１、配列番号：２のアミノ酸６９−７１、配列番号：２のアミノ酸１０８−１１６、配列番号：３のアミノ酸４４−５２、配列番号：３のアミノ酸７０−７６、配列番号：３のアミノ酸１１５−１２５からなるＣＤＲを含み、配列番号：２のアミノ酸２０−４５、配列番号：２のアミノ酸５２−６８、配列番号：２のアミノ酸７２−１０７、配列番号：２のアミノ酸１１７−１２６、配列番号：３のアミノ酸１９−４３、配列番号：３のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：３のアミノ酸７７−１１４、配列番号：３のアミノ酸１２６−１３６からなるＦＲを含むか、又は
配列番号：４のアミノ酸４７−５２、配列番号：４のアミノ酸７０−７２、配列番号：４のアミノ酸１０９−１１７、配列番号：５のアミノ酸４５−５２、配列番号：５のアミノ酸７０−７７、及び配列番号：５のアミノ酸１１６−１２６からなるＣＤＲを含み、配列番号：４のアミノ酸２１−４６、配列番号：４のアミノ酸５３−６９、配列番号：４のアミノ酸７３−１０８、配列番号：４のアミノ酸１１８−１２７、配列番号：５のアミノ酸２０−４４、配列番号：５のアミノ酸５３−６９、及び配列番号：５のアミノ酸７８−１１５、配列番号：５のアミノ酸１２７−１３７からなるＦＲを含む、第３１項から第３４項の何れかに記載の方法。
３６．  非ヒトもしくはキメラタンパク質又は検出可能に標識された抗体の何れかが、配列番号：２のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：３のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、第３１項から第３５項の何れかに記載の方法。
３７．  非ヒトもしくはキメラタンパク質又は検出可能に標識された抗体の何れかが、配列番号：４のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：５のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、第３１項から第３６項の何れか一項に記載の方法。
３８．  非ヒトもしくはキメラタンパク質又は検出可能に標識された抗体の何れかが固相に結合するか又は結合することができる、第３１項から第３７項の何れかに記載の方法。
３９．  非ヒトもしくはキメラタンパク質が固相に結合するか又は結合することができ、配列番号：２のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：３のアミノ酸配列を有する重鎖を含み、第二抗体が検出可能に標識され、配列番号：４のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号：５のアミノ酸配列を有する重鎖を含む、第３１項から第３８項の何れかに記載の方法。
４０．  非ヒトもしくはキメラタンパク質又は検出可能に標識された抗体がビオチン化又はルテニル化される、第３１項から第３９項の何れかに記載の方法。
４１．  ステップ（ａ）の前に、それと同時に、又はそれに続いて、前記複合体を含む試料をＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストと共に更にインキュベートする、第３１項から第４０項の何れかに記載の方法。
４２．  ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストが抗体ベバシズマブである、第４１項に記載の方法。
【実施例】
【０３１１】
次の実施例は、特許請求の範囲に記載の本発明を例証するために提供されるもので、限定するためではない。
【０３１２】
実施例１：Ｂｉａｃｏｒｅエピトープビニング
二量体ＶＥＧＦ−Ａ１２１上の３種のモノクローナル抗体又は抗体断片コンジュゲートのエピトープ接近可能性を評価するために、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を三元エピトープビニング実験に使用した（図１参照）。ここに記載のＶＥＧＦ−Ａに対する親和性を有する抗体は、ｒＨ−４．６．１−ＩｇＧ（アバスチン）、１３．２．５−Ｆ（ａｂ‘）２−Ｂｉ、及び１３．７．４０−Ｒｕである。ＳＣ１センサーをＢｉａｃｏｒｅシステム中に取り付け、製造者の説明書に従ってＨＢＳＮ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ）中で規準化した。システム緩衝液を５％のＤＭＳＯ及び０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４に変えた。試料緩衝液は、１ｍｇ／ｍｌのＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン、Ｓｉｇｍａ＃８６５２４）を補充したシステム緩衝液であった。システムは２５℃で操作した。取付けたＳＣ１センサーに抗体捕捉システムを固定した。１６００ＲＵのモノクローナルマウス抗ヒトＦＣガンマ−パン捕捉抗体（ＭＡＨＦｃｇ−パン、Ｒｏｃｈｅ）を、供給者によって記載されているように一般的なＥＤＣ／ＮＨＳ化学によって、全てのセンサーフローセルに固定した。捕捉システムを、１０ｍＭのＮａＯＨを用いた２０μｌ／分での１５秒間の注入と、続く１０ｍＭのグリシン緩衝液ｐＨ ２．５を用いた２０μｌ／分でそれぞれ１分間の２回の注入によって、再生させた。
【０３１３】
フローセル１及びフローセル２に、７５ｎＭの一次抗体ｒＨ−４．６．１−ＩｇＧを３０μｌ／分で１分間、５μｌ／分で注入した。両フローセル上の捕捉システムを、試料緩衝液中２μＭのヒト正常ＩｇＧ（Ｒｏｃｈｅ）と１μＭのＭ−３３（Ｒｏｃｈｅ）の混合物を使用する３０μｌ／分での３分の注入によって飽和させた。調製のこの段階では、フローセル１上のアッセイセットアップが抗原のない参照となった。１５０ｎＭのＶＥＧＦ−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ１２１、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）をフローセル２に３０μｌ／分で３分間注入し、ｒＨ−４．６．１−ＩｇＧによってセンサー上にディスプレイさせた。ディスプレイされた二量体ＶＥＧＦ１２１上の潜在的に接近可能な第二抗体結合部位を飽和させるために、７５ｎＭのｒＨ−４．６．１−ＩｇＧを２０μｌ／分で３分間の会合時間の間、フローセル１及び２中に再び注入した。７５ｎＭのビオチン化抗体断片１３．２．５−Ｆ（ａｂ’）２−Ｂｉをフローセル１及び２中に２０μｌ／分で３分間注入し、続いて７５ｎＭの１３．７．４０−Ｒｕを３０μｌ／分で３分間連続注入した。画像中の黒い線（図２）は、最初の１３．２．５−Ｆ（ａｂ’）２−Ｂｉコンジュゲートと、センサー表面が上記のように準備された後の２番目の１３．７．４０−Ｒｕコンジュゲートの、フローセル２中への連続注入を示している。黒の点線は、参照としてのフローセル１上へのＶＥＧＦ−Ａ１２１の存在を伴わない１３．２．５−Ｆ（ａｂ’）２−Ｂｉ及び１３．７．４０−Ｒｕの２回の連続注入のシグナルレベルを示す。フローセル２では、１３．７．４０−Ｒｕは増加する結合シグナルを示し、これは先行する１３．２．５−Ｆ（ａｂ’）２−Ｂｉ注入の予想されるシグナル飽和レベルより高い。これは、両方のコンジュゲートに対するＶＥＧＦ−Ａ１２１エピトープの接近可能性を示している。ＶＥＧＦ−Ａ抗原が省かれているフローセル１では、相互作用は検出できなかった。ＶＥＧＦ−Ａが存在しない（図２Ｂ）か、又はＶＥＧＦＡ−Ｒ１（図２Ｃ）もしくはＶＥＧＦＡ−Ｒ２（図２Ｄ）も存在する対照実験では、試験抗体の結合がＶＥＧＦ−Ａ特異的であることと、抗体が、ＶＥＧＦ−Ａ受容体が結合するか、又はＶＥＧＦ−Ａ受容体の結合によって覆われるＶＥＧＦ−Ａのエピトープに結合することが証明された。
【０３１４】
実施例２：Ｅｌｅｃｓｙｓ競合アッセイ
測定はサンドイッチアッセイ形式で実施した。ｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ６０１アナライザーでのシグナル検出は電気化学発光に基づいている。このサンドイッチアッセイでは、ビオチン−コンジュゲート（すなわち捕捉抗体）をストレプトアビジン被覆磁気ビーズの表面に固定する。検出抗体はシグナル伝達部分として錯化ルテニウムカチオンを有する。アナライトの存在下では、発色性ルテニウム錯体が固相に架橋され、ｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ６０１アナライザーの測定セルに含まれる白金電極での励起後に６２０ｎｍで発光する。シグナル出力は任意の光単位である。
【０３１５】
実験的ＶＥＧＦ−Ａ抗原アッセイを次のように実施した。抗原陽性試料に少なくとも５０倍モル過剰のＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストを添加し、３０分間インキュベートしてＶＥＧＦ−Ａと平衡結合させた。ＶＥＧＦ−Ａアンタゴニストと共にプレインキュベートした５０μｌの試料を、１００ｍＭのリン酸カリウムと２２５ｍＭのＫＣｌを含むｐＨ７．０の生理学的緩衝液中の５０μｌの１μｇ／ｍｌの捕捉抗体−ビオチンコンジュゲートと５０μｌの１μｇ／ｍｌの検出抗体ルテニウム標識コンジュゲートを用いてｃｏｂａｓ（登録商標）ｅ６０１アナライザーで測定した。９分のインキュベーション時間後、５０μｌのストレプトアビジン被覆常磁性微粒子を添加し、更に９分間インキュベートした。その後、ＶＥＧＦ−Ａ抗原を（これらの実験で発生した電気化学発光シグナルを介して）検出した。ＶＥＧＦ−Ａは、アバスチンの存在下でＥｌｅｃｓｙｓ競合アッセイを使用して検出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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