(57)【要約】  明細書にはゲノムデザインを設計、試験、及び検証するための方法及びシステムが記載される。コンピュータによって実行される方法には、既知のゲノムに関するデータ及び対立遺伝子のリストを受け取ること、前記既知のゲノムにおける各対立遺伝子の存在を特定し除去すること、前記既知のゲノムにおける存在を置換するための複数の対立遺伝子選択肢を決定すること、前記既知のゲノムに基づいてゲノムデザインのための複数の代替遺伝子配列を生成すること、各規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアをそれぞれの代替遺伝子配列に割り当てることによって、それぞれの代替遺伝子配列に対して複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を当てはめて、それによりスコアを得ること、前記スコアの加重された組み合わせに基づいてそれぞれの代替遺伝子配列をスコア付けすること、及び前記スコア付けに基づくゲノムデザインとして少なくとも１つの代替遺伝子配列を選択することを含む。
2019519233.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
計算プラットフォームによって実行されるゲノムのデザイン方法であって、
計算プラットフォームにおける入力として、既知のゲノムに関するデータ及び前記既知のゲノムにおいて置換される対立遺伝子のリストを受け取ること、
前記対立遺伝子のリストに基づいて、前記計算プラットフォームによって、前記既知のゲノムにおける各対立遺伝子の存在を検出すること、
前記計算プラットフォームによって、前記既知のゲノムから各対立遺伝子の存在を除去すること、
前記計算プラットフォームによって、前記既知のゲノムにおける各対立遺伝子の存在を置換するための複数の対立遺伝子選択肢を決定すること、
前記計算プラットフォームによって、前記既知のゲノムに基づいてゲノムデザインのための複数の代替遺伝子配列を生成すること、ここでそれぞれの代替遺伝子配列は前記複数の対立遺伝子選択肢とは異なる対立遺伝子選択肢を含む、
前記計算プラットフォームによって、各規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアをそれぞれの代替遺伝子配列に割り当てることによって、それぞれの代替遺伝子配列に対して複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を当てはめて、それによりそれぞれの代替遺伝子配列に当てはめられた前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアを得ること、
前記計算プラットフォームによって、前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアの加重された組み合わせに基づいてそれぞれの代替遺伝子配列をスコア付けすること、及び
前記計算プラットフォームによって、前記加重スコア付けに基づいて、前記ゲノムデザインとして少なくとも１つの代替遺伝子配列を選択すること
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記既知のゲノム配列が野生型の大腸菌ゲノムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記既知のゲノム配列が、以前に進化させたか又は遺伝子操作された菌株又は生物から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
非必須遺伝子及び非コード配列のうち少なくとも一方について、含まれる全ての前記非必須遺伝子及び／又は非コード配列を前記既知のゲノムから除去することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の対立遺伝子選択肢が、相互に排他的な対立遺伝子選択肢を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴が、
前記ゲノムデザインにおいて１又は複数のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）様モチーフを保存すること、
前記ゲノムデザインのための禁止制限酵素サイトを除去すること、
前記既知のゲノムにおける遺伝子の５´ｍＲＮＡ二次構造を保存すること、
前記既知のゲノムにおけるＲＮＡ二次構造を保存すること、
前記ゲノムデザインにおける調節モチーフを保存すること
前記ゲノムデザインにおける既知の配列モチーフを保存すること
前記ゲノムデザインのための系統発生的保存を適用すること、及び
前記ゲノムデザインのためのＧＣ要件を満たすこと
のうち少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記各規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアを割り当てることが、各規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を前記代替遺伝子配列及び元の対立遺伝子を有する参照遺伝子配列に適用することに基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
実験によるデータに基づいて、又は各スコアに対する加重の手動指定に基づいて、前記ゲノムデザインをスコア付けするための加重された組み合わせにおける各スコアに対する加重を調整することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記スコア付けが、スコアが高いほど前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴からの偏差が少ないことを示すスコアの割り当てにさらに基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記スコア付けが、スコアが低いほど前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴からの偏差が少ないことを示すスコアの割り当てにさらに基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ゲノムデザインとして少なくとも１つの代替遺伝子配列を選択することが、どの代替遺伝子配列が所定の閾値を超える加重スコアを含むかを同定することに基づいて複数の代替遺伝子配列を選択することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
どの代替遺伝子配列が所定の閾値を上回る加重スコアを含むかを同定したら、前記同定された代替遺伝子配列を個々に又は混合されたものとして実験により試験することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記計算プラットフォームによって、前記ゲノムデザインを連続する複数のセグメントに分割することにより合成可能なＤＮＡを同定することをさらに含み、各セグメントは所定の数の塩基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ゲノムデザインが、基準遺伝コードからの若干の改変を伴う遺伝コード、根本的に再定義された遺伝コード、新規の遺伝コード、又はコドンが非標準アミノ酸に対応する遺伝コードのうちの１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ゲノムデザインにおける規則を更新する方法であって、
ゲノムデザインの１又は複数の特徴を少なくとも１つの細胞に導入すること、
ゲノム生存率を同定し、前記少なくとも１つの細胞に導入された前記１又は複数の特徴の表現型を評価するために、アッセイによって前記少なくとも１つの細胞の前記１又は複数の特徴を試験すること、
前記試験に基づいて、前記少なくとも１つの細胞に導入された前記１又は複数の特徴が、前記ゲノムデザインのための１又は複数の所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴によれば実行可能又は不合格であると予測されると判定すること、及び
前記判定に基づいてゲノムデザインのための前記所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を更新することを含む、前記方法。
【請求項１６】
前記所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を更新することが、統計的技術及び機械学習アルゴリズムにさらに基づく、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ゲノムデザインの１又は複数の特徴を、ＤＮＡ切断を用いて前記少なくとも１つの細胞に導入し、野生型遺伝子型に対して選択すること及び相同組換えを促進することの少なくとも１つを行う、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ゲノムデザインの前記１又は複数の特徴が、リコンビナーゼ又はインテグラーゼを用いて前記少なくとも１つの細胞に導入される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ゲノムデザインの前記１又は複数の特徴を前記少なくとも１つの細胞に導入することが、前記ゲノムデザインに基づいて部分ゲノム又は全ゲノムを合成することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
キネティックプレートリーダーを用いた増殖アッセイによって前記１又は複数の特徴を試験すること、をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質産生を試験するためのアッセイによって前記１又は複数の特徴を試験することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
ゲノムデザインのための前記１又は複数の所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴が、表現型のパラメータ及び遺伝子型のパラメータの１又は複数を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
所定の時点で前記細胞の集団の代表的な部分を配列決定することによって前記１又は複数の特徴を試験することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
ゲノムデザインを試験するためのコンピュータにより実行される方法であって、
既知のゲノム配列及び計算プラットフォームによって生成されたゲノムデザインの全部又は一部を取得すること、
前記ゲノムデザインにおける１又は複数の特徴は、所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴のセットについて不合格であると決定すること、
所定のデザイン目的を達成して生存可能性を高める前記ゲノムデザインに対する改変を予測すること、及び
改良されたゲノムデザインを生成するために前記予測された改変を試験することを含む、前記方法。
【請求項２５】
前記決定工程が、前記ゲノムデザインにおける個々の変異を並行して試験することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記決定工程が、前記計算プラットフォームで前記既知のゲノム配列のサンプルを分析することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ゲノムデザインについての前記予測された改変が混合されたものとして試験される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ゲノムデザインのための前記予測された改変が遺伝的多様性及び選択を用いて試験される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴のセットが、１又は複数の表現型及び遺伝子型のパラメータを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、１つの特定のセンスコドンが、鋳型ゲノム中のある１つの遺伝子又は非コードモチーフ内における全ての出現箇所で代替コドンに変更されている、前記遺伝子操作生物。
【請求項３１】
前記遺伝子が、タンパク質配列をコードする必須遺伝子又は非必須遺伝子である、請求項３０に記載の遺伝子操作生物。
【請求項３２】
特定のセンスコドンは非コードモチーフと重複する出現箇所を有する、請求項３０に記載の遺伝子操作生物。
【請求項３３】
前記非コードモチーフが、リボソーム結合部位モチーフ、ｍＲＮＡ二次構造、内部リボソーム休止部位モチーフ、又はプロモーターである、請求項３０に記載の遺伝子操作生物。
【請求項３４】
前記タンパク質配列が保存されている、請求項３１に記載の遺伝子操作生物。
【請求項３５】
前記非コードモチーフが保存されている、請求項３０に記載の遺伝子操作生物。
【請求項３６】
前記特定のセンスコドンが、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＵＧ、及びＵＵＡからなる群より選択される、請求項３０に記載の遺伝子操作生物。
【請求項３７】
前記遺伝子操作生物が大腸菌である、請求項３０に記載の遺伝子操作生物。
【請求項３８】
前記遺伝子操作生物がウイルス抵抗性であるか又は生物学的に封じ込められている、請求項３０に記載の遺伝子操作生物。
【請求項３９】
前記特定のセンスコドンに対する同族ｔＲＮＡが前記鋳型ゲノムから除去されている、請求項３０に記載の遺伝子操作生物。
【請求項４０】
前記特定のセンスコドンに対する同族ｔＲＮＡが前記再コード化されたゲノムには存在しない、請求項３０に記載の遺伝子操作生物。
【請求項４１】
前記特定のセンスコドンが、前記遺伝子操作生物内に配置され、非標準アミノ酸に再割り当てされている、請求項３０に記載の遺伝子操作生物。
【請求項４２】
前記代替コドンが同義コドンである、請求項３０に記載の遺伝子操作生物。
【請求項４３】
前記代替コドンが非同義コドンである、請求項３０に記載の遺伝子操作生物。
【請求項４４】
再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、１つの特定のセンスコドンが、鋳型ゲノム中の複数の遺伝子又は非コードモチーフ内における全ての出現箇所で代替コドンに変更されている、前記遺伝子操作生物。
【請求項４５】
鋳型ゲノム中の１つの特定のセンスコドンが、ゲノム全体で代替コドンに変更されている再コード化されたゲノムを含む、遺伝子操作生物。
【請求項４６】
再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、複数の特定のセンスコドンが、鋳型ゲノム中のある１つの必須遺伝子内における全ての出現箇所で代替コドンに変更されている、前記遺伝子操作生物。
【請求項４７】
再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、複数の特定のセンスコドンが、鋳型ゲノム中の複数の必須遺伝子内における全ての出現箇所で代替コドンに変更されている、前記遺伝子操作生物。
【請求項４８】
再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、鋳型ゲノム中の複数の特定のセンスコドンがゲノム全体で代替コドンに変更されている、前記遺伝子操作生物。
【請求項４９】
請求項１に記載の方法によってデザインされた再コード化されたゲノムを含む、遺伝子操作生物。
【請求項５０】
再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、ある１つの特定のセンスコドンの複数の出現箇所が複数の代替コドンに変更されて、前記特定のセンスコドンに対する同族ｔＲＮＡを前記遺伝子操作生物から除去可能となっている、前記遺伝子操作生物。
【請求項５１】
再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、ある１つの特定のセンスコドンの複数の出現箇所が複数の代替コドンに変更されて、前記特定のセンスコドンの翻訳機能を変更可能となっている、前記遺伝子操作生物。
【請求項５２】
再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、ある１つの特定のセンスコドンの複数の出現箇所が複数の代替コドンに変更されて、前記特定のセンスコドンの翻訳機能を除去可能となっている、前記遺伝子操作生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
本願は、２０１６年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／３５０，４６８号に対する優先権を主張するものであり、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の利益に関する声明
本発明は、米国エネルギー省助成番号ＤＥ−ＦＧ０２−０２ＥＲ６３４４５及び米国国防総省除税番号ＨＲ００１１−１３−１−０００２の国庫助成により行われた。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【０００３】
分野
本明細書に記載の態様は、概して、遺伝子操作、及び遺伝子改変された細胞及び／又は生物に関する。特に、本開示の１又は複数の態様は、規則、条件、パラメータ、又は特徴の所定のセットに基づくゲノムデザインに有用な方法及びコンピュータソフトウェアに関する。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子改変生物（ＧＭＯ：Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｓｍ）は、燃料、汎用化学製品、及び治療薬などのヒト用消耗品を生産するためにますます使用されている。ＧＭＯはまた、農業（例えば、ゴールデンライス、Ｒｏｕｎｄｕｐ  Ｒｅａｄｙ（登録商標）作物、霜害防止株（Ｆｒｏｓｔｂａｎ））、バイオレメディエーション（例えば、油の流出）、及びヘルスケア（例えば、クローン病及び口腔炎症）にも使用されている。商業的に実施されているＧＭＯにおける改変は、最適化選択下での異種遺伝子発現及び進化に制限され得ることが多い。それでも、いかなる既知の生物とも根本的に異なる合成ゲノムにより、潜在的な用途が拡大され得る。
【０００５】
最小ゲノム（Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）及び再コード化（recoded）ゲノム（Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３ａ；Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３ｂ）を作製することにかなりの関心が寄せられてきたが、ゲノムをゼロからデザインするのに十分な程に、ゲノムは理解されていない。インビボゲノム工学戦略により、非機能性ゲノムが作製される危険性が減少され得るが（Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３ａ；Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３ｂ）、所望の機能を有する生存可能なゲノムを作製する検索スペースを制限するために、合理的デザインが依然として不可欠であり得る。よって、ゲノム工学の分野は、一般的なデザインの規則、条件、パラメータ、又は特徴、これらの規則、条件、パラメータ、又は特徴を導き出す方法、及び生存可能で構築可能なゲノムを生成するために使用され得るソフトウェアを緊急に必要とし得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
以下に、本明細書に記載の様々な態様の簡単な概要を提示する。この概要は広範な概要ではなく、中心的若しくは重要な要素を特定すること又は特許請求の範囲を詳述することを意図するものではない。以下の概要は、後述するより詳細な説明への導入序文として、いくつかの概念を単純化した形で提示したに過ぎない。
【０００７】
本開示の態様は、生物学的に関連するモチーフへの障害を最小限に抑えながら、規則、条件、パラメータ、又は特徴のセットを満たすことに基づいてゲノムをデザインし、前記ゲノムデザインを合成し、且つ前記合成されたゲノムデザインを試験及び検証するための方法、アルゴリズム、計算プラットフォーム、及びコンピュータソフトウェアを提供する。計算プラットフォームは、ゲノムデザインを生成して、前記ゲノムデザインを合成及び／又は編集可能な単位に分割し、ここで前記ゲノムデザインはユーザ指定の制約を満たし、生物生存率及び構築可能性の確率を最大にする。再デザインされたゲノムのユニット又は個々の構成要素を試験してもよく、デザイン不合格は試験不合格の構成要素を特定することに基づいて検出してもよい。ゲノムデザインのための規則、条件、パラメータ、又は特徴は適切に更新されてもよく、その後のイテレーションのための推奨が提供されてもよい。
【０００８】
本開示の態様は、計算プラットフォームによって実行されるゲノムをデザインする方法に関する。前記方法は、計算プラットフォームにおける入力として、既知のゲノムに関するデータ及び前記既知のゲノムにおいて置換される対立遺伝子のリストを受け取ること、前記対立遺伝子のリストに基づいて、前記計算プラットフォームによって、前記既知のゲノムにおける各対立遺伝子の存在を検出すること、前記計算プラットフォームによって、前記既知のゲノムから各対立遺伝子の存在を除去すること、前記計算プラットフォームによって、前記既知のゲノムにおける各対立遺伝子の存在を置換するための複数の対立遺伝子選択肢を決定すること、前記計算プラットフォームによって、前記既知のゲノムに基づいてゲノムデザインのための複数の代替遺伝子配列を生成すること、ここでそれぞれの代替遺伝子配列は前記複数の対立遺伝子選択肢とは異なる対立遺伝子選択肢を含む、前記計算プラットフォームによって、各規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアをそれぞれの代替遺伝子配列に割り当てることによって、それぞれの代替遺伝子配列に対して複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を当てはめて、それによりそれぞれの代替遺伝子配列に当てはめられた前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアを得ること、前記計算プラットフォームによって、前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアの加重された組み合わせに基づいてそれぞれの代替遺伝子配列をスコア付けすること、及び前記計算プラットフォームによって、前記加重スコア付けに基づいて、前記ゲノムデザインとして少なくとも１つの代替遺伝子配列を選択することを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本開示のゲノムデザイン方法を、細菌ゲノム、マイコプラズマゲノム、酵母ゲノム、ヒトゲノム、任意の天然生物のゲノム、又は任意の以前に進化させたか若しくは操作された生物のゲノムを含む、任意の種類のゲノムに対して実行可能である。さらなる実施形態において、本開示のゲノムデザイン方法は、任意の対立遺伝子の除去、制限酵素部位の除去、反復遺伝子外回文（ＲＥＰ：Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  Ｅｘｔｒａｇｅｎｉｃ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ）配列のターミネーターによる置換、非必須遺伝子の欠失、及び機能拡張のための異種遺伝子の挿入を含む、任意のゲノム変化のデザインについて実行され得る。
【００１０】
いくつかの態様によれば、ゲノムデザインにおける規則を更新するための方法が提供される。前記方法は、ゲノムデザインの１又は複数の特徴を少なくとも１つの細胞に導入すること、ゲノム生存率を同定して前記少なくとも１つの細胞に導入された前記１又は複数の特徴の表現型を評価するために、アッセイによって前記少なくとも１つの細胞の前記１又は複数の特徴を試験すること、前記試験に基づいて、前記少なくとも１つの細胞に導入された前記１又は複数の特徴が、前記ゲノムデザインのための１又は複数の所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴によれば実行可能又は不合格であると予測されると判定すること、及び前記定に基づいてゲノムデザインのための前記所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を更新することを含む。いくつかの実施形態では、所定の規則は、統計的技術又は機械学習アルゴリズムを活用することによって更新され得る。
【００１１】
本開示の態様は、ゲノムデザインを試験及び改変するためのコンピュータにより実行される方法を提供する。前記方法は、既知のゲノム配列及び計算プラットフォームによって生成されたゲノムデザインの全部又は一部を取得すること、前記ゲノムデザインにおける１又は複数の特徴は、所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴のセットについて不合格であると決定すること、所定のデザイン目的を達成して生存可能性を高める前記ゲノムデザインに対する改変を予測すること、及び改良されたゲノムデザインを生成するために前記予測された改変を試験することを含む。
【００１２】
本開示のさらなる態様は、生存可能であるか又は所望の表現型を付与する計算的にデザインされた解が見出されない場合に、配列デザインを同定する方法を提供する。縮重ＤＮＡ配列を組み合わせて試験してもよい。生存可能又は表現型的に正しい個々の配列は、スクリーニング又は選択によって同定可能されてもよい。生存可能なＤＮＡ配列は、計算による新しいデザインの規則、条件、パラメータ、又は特徴を更新又は学習するために使用され得る。
【００１３】
本開示は、再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、１つの特定のセンスコドンが、鋳型ゲノム中のある１つの遺伝子又は非コードモチーフ内の全ての出現箇所で代替コドンに変更されている、前記遺伝子操作生物を提供する。ある態様では、前記遺伝子は、タンパク質配列をコードする必須遺伝子又は非必須遺伝子である。ある態様では、特定のセンスコドンは非コードモチーフと重複する出現箇所を有する。ある態様では、前記非コードモチーフは、リボソーム結合部位モチーフ、ｍＲＮＡ二次構造、内部リボソーム休止部位モチーフ、又はプロモーターである。ある態様では、前記タンパク質配列は保存されている。ある態様では、前記非コードモチーフは保存されている。ある態様では、前記特定のセンスコドンは、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＵＧ、及びＵＵＡからなる群より選択される。ある態様では、前記遺伝子操作生物は、大腸菌である。ある態様では、前記遺伝子操作生物は、ウイルス抵抗性であるか又は生物学的に封じ込められている。ある態様では、前記特定のセンスコドンに対する同族ｔＲＮＡが前記鋳型ゲノムから除去されている。ある態様では、前記特定のセンスコドンに対する同族ｔＲＮＡが、前記再コード化されたゲノムには存在しない。ある態様では、前記特定のセンスコドンは、前記遺伝子操作生物内に配置され、非標準アミノ酸に再割り当てさていれる。ある態様では、前記代替コドンは同義コドンである。ある態様では、前記代替コドンは非同義コドンである。本開示は、再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、１つの特定のセンスコドンが、鋳型ゲノム中の複数の遺伝子又は非コードモチーフ内における全ての出現箇所で代替コドンに変更されている、前記遺伝子操作生物を提供する。本開示は、再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、鋳型ゲノム中の１つの特定のセンスコドンがゲノム全体で代替コドンに変更されている、前記遺伝子操作生物を提供する。本開示は、再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、複数の特定のセンスコドンが、鋳型ゲノム中のある１つの必須遺伝子内における全ての出現箇所で代替コドンに変更されている、前記遺伝子操作生物を提供する。本開示は、再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、複数の特定のセンスコドンが、鋳型ゲノム中の複数の必須遺伝子内における全ての出現箇所で代替コドンに変更されている、前記遺伝子操作生物を提供する。本開示は、再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、鋳型ゲノム中の複数の特定のセンスコドンがゲノム全体で代替コドンに変更されている、前記遺伝子操作生物を提供する。本開示は、本明細書に記載の方法によってデザインされた再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物を提供する。本開示は、再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、ある１つの特定のセンスコドンの複数の出現箇所が複数の代替コドンに変更されて、前記特定のセンスコドンに対する同族ｔＲＮＡを前記遺伝子操作生物から除去可能となっている、前記遺伝子操作生物を提供する。本開示は、再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、ある１つの特定のセンスコドンの複数の出現箇所が代替コドンに変更されて、前記特定のセンスコドンの翻訳機能を変更可能となっている、前記遺伝子操作生物を提供する。本開示は、再コード化されたゲノムを含む遺伝子操作生物であって、ある１つの特定のセンスコドンの複数の出現箇所が代替コドンに変更されて、前記特定のセンスコドンの翻訳機能を除去可能となっている、前記遺伝子操作生物を提供する。
【００１４】
本開示の特定の実施形態のその他の特徴及び利点は、以下の実施形態の説明及びその図面において、並びに特許請求の範囲から、さらに十分に明らかになるであろう。
【００１５】
本実施形態の前述した特徴及びその他の特徴、並びに利点は、添付の図面と共に、具体的な実施形態についての以下の詳細な説明から、さらに十分に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】１又は複数の例示的実施形態よりソフトウェアを実行するために利用可能な例示的な計算装置のブロック図である。
【図２】１又は複数の例示的実施形態より本開示の様々な例示的実施形態を実行可能なゲノムデザインモジュールの例示的なブロック図である。
【図３】１又は複数の例示的実施形態よりゲノムをデザインするための例示的な方法ステップの例示的なフロー図である。
【図４】再コード化されたゲノムの予測されるウイルス耐性の例示的なグラフである。
【図５Ａ】５７コドンの大腸菌ゲノムの一例を示す。約５０ｋｂの８７個のセグメントに分割された再コード化されたゲノム全体を示す図である。コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＵＡ、ＵＵＧ、及びＵＡＧは、同義の代替物に計算的に置換された（中央）。他のコドン（例えば、ＵＧＣ）は未改変のままとした。色分けされたヒストグラムは、各セグメント内の７個の禁止コドンの存在量を表す。
【図５Ｂ】５７コドンの大腸菌ゲノムの一例を示す。再コード化されていない（ｗｔ；大腸菌ＭＤＳ４２）ゲノムに対する再コード化（ｒｃ）ゲノムのコドン頻度を示す図である。禁止コドンは色付けされている。
【図５Ｃ】５７コドンの大腸菌ゲノムの一例を示す。デノボ合成によって構築されたゲノムにおけるＤＮＡ編集の規模を示す図である。プロット領域は、親ゲノムと比較した改変ｂｐ数としてのＤＮＡ編集を表す。濃い灰色はインビボで検証されたゲノムの割合（６３％）を表す。Ｗｔ：野生型。
【図６】ゲノム再コード化大腸菌株の系統並びにそれらの計算上の親及び生物学的な親を含む、再コード化大腸菌株の系統図を示す図である。一般的に使用されている実験室用菌株を緑色で示す。直交ｔＲＮＡが移入された非大腸菌株を茶色で示す。既報による再コード化菌株を青色で示す。本研究で構築された菌株を黒で示す。最終菌株ｒＥ．ｃｏｌｉ−５７及びその生物学的封じ込めによる対応物であるｒＥ．ｃｏｌｉ−５７Ｃを灰色で示す。（ａａＲＳ＝アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ）。
【図７】大腸菌ＭＤＳ４２（暗色）及び計算的にデザインされたｒＥ．ｃｏｌｉ−５７ゲノム（明色、頻度表示付き）についての、セリン、アルギニン、ロイシン、及び終止コドンの頻度を示す図である。
【図８】再コード化ゲノムデザインのための計算パイプラインの概要を示す図である。ソフトウェアは、ゲノム鋳型（ＧｅｎＢａｎｋファイル）及び置換されるコドンのリストを入力として受け取る。次に、生物学的規則及び技術的規則（Ａ〜Ｇ）のユーザ定義の規則を適用して、新たに再コード化されたゲノムを生成する（Ｇｅｎｂａｎｋファイル）。合成適合性のある２〜４ｋｂの配列が生成される。規則Ａ〜Ｇを、図９Ａ〜図９Ｇに図式化し、さらに表１〜２で説明する。
【図９Ａ】計算的デザインのための規則、条件、パラメータ、特徴、又は指針を示す図である。
【図９Ｂ】計算的デザインのための規則、条件、パラメータ、特徴、又は指針を示す図である。
【図９Ｃ】計算的デザインのための規則、条件、パラメータ、特徴、又は指針を示す図である。
【図９Ｄ】計算的デザインのための規則、条件、パラメータ、特徴、又は指針を示す図である。
【図９Ｅ】計算的デザインのための規則、条件、パラメータ、特徴、又は指針を示す図である。
【図９Ｆ】計算的デザインのための規則、条件、パラメータ、特徴、又は指針を示す図である。
【図９Ｇ】計算的デザインのための規則、条件、パラメータ、特徴、又は指針を示す図である。
【図１０Ａ】再コード化ゲノムの検証のための実験的戦略を示す。１）５７個のコドンゲノムの計算的デザイン；２）重複する２〜４ｋｂの再コード化断片のデノボ合成；３）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（オレンジ）における５０ｋｂセグメントの低コピープラスミド上での構築；４）大腸菌におけるプラスミドのエレクトロポレーション（ｗｔ．ｓｅｇ：再コード化されていない染色体セグメント）；５）細胞生存率が再コード化遺伝子の発現のみに依存するように、カナマイシンカセット（Ｋａｎ）によって置換された再コード化セグメント（例えば、ｗｔ．ｓｅｇ）に対応する染色体配列；６）ａｔｔＰ配列及びａｔｔＢ配列のλインテグラーゼ媒介性の組換え（Ｐ：エピソーム、Ｂ：染色体）；６ａ，ｂ）残留ベクトルの除去（図１０Ｃ参照）；７）単一コピーの組み込まれた再コード化セグメントを含むパイプラインの概略図を示す図である。ａｔｔＬ部位−ａｔｔＲ部位を灰色で示す。
【図１０Ｂ】再コード化ゲノムの検証のための実験的戦略を示す。工程４〜工程７のＰＣＲ分析を示す図である（各レーン：「Ｌ」ＧｅｎｅＲｕｌｅｒ  １−ｋｂ  Ｐｌｕｓ  Ｌａｄｄｅｒ、「Ｃ」コントロール  Ｔｏｐ１０。４〜７の番号は、図１０Ａの概略図に対応。）。赤い矢印はＰＣＲプライマーを表す。
【図１０Ｃ】再コード化ゲノムの検証のための実験的戦略を示す。再コード化セグメントを有する残存ベクターがａｔｔＰ特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いたＣａｓ９による消化の標的となる、Ｃａｓ９媒介性ベクター除去を示す図である。６ａ）において、再コード化セグメントの余分なコピーがインタクトなａｔｔＰ配列を有する。６ｂ）は、余分なベクターコピーを除去するためのａｔｔＰ配列のＣａｓ９ターゲティングを示す。組み込まれたセグメントはａｔｔＰ配列を含まないので切断されない。全ての工程はＰＣＲ分析によって確認された。「ｇＲＮＡ」：ガイドＲＮＡ。
【図１１】ｒＥ．ｃｏｌｉ−５７ゲノム構築例を示す図である。ゲノムを、各約５０ｋｂサイズの８７個のセグメントに分割した。全ての再コード化セグメントをデノボ合成した（緑色）。これまでに合計５５個のセグメントをインビボで試験し（青色）、そのうち４４個が低コピープラスミド上で全ての遺伝子機能性について検証可能であり（赤色）、１０個のセグメントが全ての再コード化遺伝子を単一コピーにまでさらに減少可能であった（黄色）。
【図１２Ａ】再コード化菌株の表現型分析を示す。再コード化セグメントは対応する野生型遺伝子の非存在下でエピソームから発現された。再コード化されていない親株に対する倍加時間を示す図である。
【図１２Ｂ】再コード化菌株の表現型分析を示す。セグメント２１における適応度低下（fitness impairment）の局在化を示す図である。再コード化遺伝子（オレンジ色）による相補性について試験するために染色体遺伝子（灰色）を欠失させた。ｒｐｍＦ−ａｃｃＣオペロンを欠失させると倍加時間の減少が観察された。必須遺伝子を枠内に示す。
【図１２Ｃ】再コード化菌株の表現型分析を示す。ｒｐｍＦ−ａｃｃＣオペロンプロモーターの微調整により、遺伝子発現の増加及び倍加時間の減少がもたらされた（オレンジ色：初期のプロモーター、緑色：改良されたプロモーター）。
【図１２Ｄ】再コード化菌株の表現型分析を示す。２０８個の再コード化遺伝子のＲＮＡ−Ｓｅｑ分析を示す図である（青色：セグメント２１、３８、４４、４６及び７０）。野生型（Ｗｔ）遺伝子の発現を灰色で示す。差次的に発現された再コード化遺伝子を赤色で示す（絶対ｌｏｇ２変化倍率＞２、調整されたｐ値＜０．０１）。挿入図：再コード化遺伝子のＰ値分布。
【図１３Ａ】部分的に再コード化された菌株の適応度を表すグラフである。低コピープラスミド上に再コード化セグメントを有する菌株における野生型染色体配列の除去前後の倍加時間の測定値を示す（図１０Ａの工程４及び工程５参照）。
【図１３Ｂ】部分的に再コード化された菌株の適応度を表すグラフである。野生型配列の除去前後、及び染色体組込み後の倍加時間の測定値を示す（図１０Ａの工程４、工程５、工程６、及び工程７参照）。相対的倍加時間：改変株と親株（すなわち、インタクトなゲノム及び再コード化されていないセグメント）との間の変化倍率。
【図１４Ａ】セグメント４３内の全遺伝子の発現レベルが示されている、再コード化されたセグメント４３の転写状況を示す。再コード化されていない菌株（ＴＯＰ１０）において染色体欠失後に遺伝子を分析した。異なる菌株のそれぞれについてＲＮＡを調製し、ＰＥ１５０  Ｖ２キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ上で配列決定した。差次的発現の分析のために、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）を用いて遺伝子に対応するカウントを集計した。ＤＥＳｅｑ２パッケージ（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ社）を用いて、遺伝子ごとに得られたカウント数をゲノム全体のレベルで正規化した（Ａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）。再コード化遺伝子（緑色）及び再コード化されていない遺伝子（紫色）の発現レベルを示す図である。
【図１４Ｂ】セグメント４３内の全遺伝子の発現レベルが示されている、再コード化されたセグメント４３の転写状況を示す。全ての再コード化遺伝子についてのｐ値及び変化倍率を示す図である。セグメント４３内の遺伝子はいずれも、有意に差次的に発現されないことが分かった（すなわち、絶対ｌｏｇ２変化倍率＞２及び調整されたｐ値＜０．０１）。
【図１５Ａ】致死的デザインの例外のトラブルシューティングの一例を示す図である。再コード化されたセグメント４４（オレンジ色）は染色体配列を完全に欠失させると（Ｃｈｒ−Δｓｅｇ４４．０）細胞生存率を支持しなかった。原因となる再コード化遺伝子（ａｃｃＤ）は、連続的な染色体欠失によって同定された（Ｃｈｒ−Δｓｅｇ４４．１−４。「Ｘ」：生存不能）。必須遺伝子を枠内に示す。
【図１５Ｂ】致死的デザインの例外のトラブルシューティングの一例を示す図である。λ組換えを利用して、致死的なａｃｃＤ配列（ａｃｃＤ．初期、オレンジ色の再コード化コドン）を代替の再コード化ａｃｃＤ配列（ａｃｃＤ．改良、青色の代替コドン）と交換した。ｍＲＮＡ構造及びＲＢＳモチーフ強度を両方の配列について計算した。野生型（Ｗｔ）を灰色で示す。「ａｃｃＤ  ｎｕｃ。」：再コード化されたそれぞれのコドンの最初の位置。得られた生存配列（ａｃｃＤ．生存）は両方のデザイン由来のコドンを有していた。ｍＲＮＡスコア及びＲＢＳスコアは、再コード化されたコドンと再コード化されていないコドンとの予測ｍＲＮＡ折り畳みエネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）（Ｍａｒｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）又は予測ＲＢＳ強度（Ｓａｌｉｓ、２０１１）の比率である。
【図１６】ａｃｃＤの再コード化のための生存可能な代替案を探索する一例を示す図である。再コード化ａｃｃＤ遺伝子中の抵抗性コドンの位置を決定するために、無処理の再コード化されていない菌株においてＭＡＧＥ（当技術分野で公知の多重自動ゲノム工学）（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００９）を用いた。遺伝子発現破壊についての最も可能性の高い遺伝子座である遺伝子のＮ末端が特異的に標的化された（Ｐｌｏｔｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ、２０１１、Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３、Ｂｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６）。ａｃｃＤ遺伝子の最初の５個の禁止コドン（ヌクレオチド位置４、２５、５２、８５、及び１００）は、再コード化される位置に縮重塩基を有する２個のオリゴヌクレオチドによって標的化された（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧの塩基対を表す）。ＷＴは再コード化されていないａｃｃＤ配列（黒色）を表し、配列１〜配列５はＭＡＧＥ実験により得られた生存可能な遺伝子型（禁止コドンは黒色で示される）を示し、ａｃｃＤ．初期は致死的な再コード化ａｃｃＤ（黄色）を表し、ａｃｃＤ．改良は計算により生成された代替ａｃｃＤ配列を表す。各配列について予測ｍＲＮＡ折り畳みエネルギーのスコアを右側に示す。各コドンについての予測ＲＢＳ強度のスコアを下に示す（各位置についてのバーは以下の順序である：ＷＴ（黒色）；配列１〜配列５（灰色）；ａｃｃＤ．初期（黄色）；ａｃｃＤ．改良（青色））。ｍＲＮＡスコアは、再コード化配列と野生型配列との予測ｍＲＮＡ折り畳みエネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）の比率を表す。ＲＢＳスコアは、各コドンについて、再コード化配列と野生型配列との予測ＲＢＳ強度の比率を表す。ＲＢＳ強度は、リボソーム休止の代用として使用される計算スコアである。
【図１７】セグメント４４におけるａｃｃＤ遺伝子の異なる種類の配列アラインメントの一例を示す図である。ＷＴは、再コード化されていない配列に対応する。ａｃｃＤ．初期は、致死的な再コード化デザインに対応する。ａｃｃＤ．改良は、改良されたアルゴリズムによって生成された再コード化ａｃｃＤ配列に対応する。ａｃｃＤ．生存は、ａｃｃＤ．初期をａｃｃＤ．改良で置き換える組換え後に得られた生存クローンの遺伝子型に対応する。
【図１８Ａ】５７コドンのａｄｋ遺伝子の生物学的封じ込めとの適合性を示す例を示す。ｒＥ．ｃｏｌｉ−５７の生物学的封じ込めとの適合性を検証するために、必須遺伝子ａｄｋの７種のコドンの置換を２種の異なる生物学的封じ込め株（Ｃ３２１．ΔＡ．ａｄｋ＿ｄ６及びＣ３２１．ΔＡ．ａｄｋ＿ｄ６．ｔｙｒＳ＿ｄ８）に適用した。５７コドンのａｄｋで改変された生物学的封じ込め株が改変していないそれらの親株と同様の適合性を維持したことを示す図である。薄灰色：改変されていない生物学的封じ込め株（Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）、濃灰色：５７コドンのａｄｋを有する生物学的封じ込め株。
【図１８Ｂ】５７コドンのａｄｋ遺伝子の生物学的封じ込めとの適合性を示す例を示す。５７コドンのａｄｋを含む生物学的封じ込め株又は５７コドンのａｄｋを含まない生物学的封じ込め株の回避率を示す図である。ＳＣ培地：ＳＤＳ＋クロラムフェニコール、ＳＣＡ培地：ＳＤＳ＋クロラムフェニコール＋アラビノース。
【図１９Ａ】Ｃ１２３株の構築例を示す。Ｃ１２３株の作製及び分析に使用される例示的なワークフローを示す図である。デザイン段階には、大腸菌の必須遺伝子中の１２３個のＡＧＲコドンの同定を含めた。ＭＡＧＥオリゴヌクレオチドは、これらのＡＧＲコドンの全ての出現箇所を同義のＣＧＵコドンで置換するようにデザインされた。構築段階では、１１０個のＡＧＲコドンをＣＧＵに変換するためにＣｏＳ−ＭＡＧＥを使用した。多重対立遺伝子特異的コロニーＰＣＲ（ＭＡＳＣ−ＰＣＲ）を用いて所望の組換え体をスクリーニングした。ＭＡＳＣ−ＰＳＣによってスクリーニングされた９６クローンにおいて観察されなかったＡＧＲ変換は、トラブルシューティングのためにトリアージされた。インビボでのトラブルシューティング段階では、容易にＣＧＵに変換することができなかった１３個のコドンが解決された。検討段階では、Ｃ１２３株について配列決定、進化、及び表現型決定を行った。
【図１９Ｂ】Ｃ１２３株の構築例を示す。ＭＧ１６５５（Ｃｈｒ．０が上方向）に対するＣ１２３ゲノムの模式図の例である。外側のラベルはＡＧＲコドンのセット分類を示す。ＡＧＲからＣＧＵへの変換が成功した場合を放射状の緑色の線で示し、１３個の抵抗性コドンを放射状の赤色の線で示す。
【図２０Ａ】試行したＡＧＲ→ＣＧＵ置換の分析例を示す。正規化されたＯＲＦ位置に対するＡＧＲ組換えの頻度を示す図である。ＡＧＲ組換えの頻度は、ＭＡＳＣ−ＰＣＲを用いて細胞集団あたり９６クローン決定された。正規化されたＯＲＦ位置は、ＡＧＲコドンの残基数をＯＲＦの全長で割ったものであった。ＡＧＲからＣＧＵへの変換の失敗は、ｘ軸の下に赤い縦線で示す。
【図２０Ｂ】試行したＡＧＲ→ＣＧＵ置換の分析例を示す。３４℃のＬＢＬ培地中のＣ１２３系統における菌株の倍加時間が９６ウェルプレートリーダー上で３連で決定された。色付きバーは、倍加時間が決定された時にどのコドンセットが構築中であったかを示す。失敗した（すなわち、ＭＡＳＣ−ＰＣＲ頻度＜１／９６）抵抗性のＡＧＲ→ＣＧＵ変換は、トラブルシューティングパイプラインにトリアージされた。これらの１３個の抵抗性ＡＧＲコドンの最適化された置換配列を最終菌株に組み入れ（右側の灰色の部分、「＊」で表示）、得られた倍加時間を測定した。
【図２１Ａ】４個の抵抗性ＡＧＲの置換についての失敗メカニズムの例を示す。野生型ＡＧＲコドンは太字の黒色文字で示され、デザイン欠陥は赤色の文字で示され、最適化された置換遺伝子型は緑色の文字で示される。ｆｔｓＩ遺伝子及びｍｕｒＥ遺伝子が互いに重複していることを示す図である。ｆｔｓＩにおけるＡＧＡ→ＣＧＵ突然変異は、ｍｕｒＥにおいて非保存的Ａｓｐ３Ｖａｌ突然変異を導入すると考えられる。ｍｕｒＥのアミノ酸配列は、ＡＧＡ→ＣＧＡ突然変異を用いることによって保存された。
【図２１Ｂ】４個の抵抗性ＡＧＲの置換についての失敗メカニズムの例を示す。下流の必須遺伝子ｎｕｓＧについてｓｅｃＥ遺伝子がＲＢＳと重複することを示す図である。ＡＧＧ→ＣＧＵ突然変異はＲＢＳ強度を９７％減少させると予測される（４７）。ＲＢＳ強度は、ＡＧＧ→ＧＡＧ突然変異を用いることによって保存される。
【図２１Ｃ】４個の抵抗性ＡＧＲの置換についての失敗メカニズムの例を示す。ｓｓｂ遺伝子がその開始コドンの直後に内部ＲＢＳ様モチーフを有することを示す図である。ＡＧＧ→ＣＧＵ突然変異はＲＢＳ強度を９４％減少させ得る。ＲＢＳ強度は、ＡＧＡ→ＣＧＡ突然変異を緑色の文字で示される付加的なゆらぎ（wobble）変異と組み合わせて用いることによって保存される。
【図２１Ｄ】４個の抵抗性ＡＧＲの置換についての失敗メカニズムの例を示す。遺伝子ｒｎｐＡが、ＡＧＧ→ＣＧＵ突然変異によって変化し得る明確なｍＲＮＡ構造を有することを示す図である。元のＲＮＡ構造は、ＡＧＧ→ＣＧＧ突然変異を用いることによって保存される。ＲＢＳ（緑色）、開始コドン（青色）、及びＡＧＲコドン（赤色）について、予測されるＲＮＡ二次構造上に同色の枠で注釈を付した。
【図２２】同義変異の成功を予測するＲＢＳ強度及びｍＲＮＡ構造の一例を示す図である。具体的には、ｍＲＮＡ折り畳みにおける偏差（ｘ軸、ＵＮＡＦｏｌｄ計算機（４１）により３７℃で計算）に対する、予測ＲＢＳ強度（ｙ軸、Ｓａｌｉｓリボソーム結合部位計算機（４７）で計算）を示す散布図である。小さい灰色の点は、最初の１０コドン又は最後の１０コドン内にＡＧＲコドンを有する大腸菌ＭＧ１６５５における非必須遺伝子を表す。大きな灰色の点は、必須遺伝子の最初の１０コドン又は最後の１０コドンにおける成功したＡＧＲ→ＣＧＵ変換を表す。オレンジ色の星印は、必須遺伝子における失敗したＡＧＲ→ＣＧＵ突然変異（抵抗性コドン）を表す。緑色の点はこれらの抵抗性コドンについての最適解を表す。「安全な置換ゾーン」（青い影付きの領域）は、本研究で観察された成功したＡＧＲ→ＣＧＵ置換突然変異に基づいて、実験により定義されたｍＲＮＡ折り畳みの偏差及びＲＢＳ強度の偏差の範囲である。ほとんどの失敗したＡＧＲ→ＣＧＵ突然変異（オレンジ色の星印）により、「安全な置換ゾーン」の外側にあるＲＢＳ強度又はｍＲＮＡ構造における偏差が大きくなる。遺伝子ｈｏｌＢ遺伝子及びｆｔｓＩ遺伝子は、それらの最初のＣＧＵ変異が重複する必須遺伝子においてアミノ酸変化を引き起こしたことから、２つの注目すべき例外である。矢印は、抵抗性コドンの最適化された置換の４つの例（ｆｔｓＡ、ｆｏｌＣ、ｒｎｐＡ、ｒｐｓＪ）について、ＲＢＳ強度及び／又はｍＲＮＡ構造における偏差が減少することを示す。
【図２３】１４個のＮ末端ＡＧＲコドンのコドン選択の一例を示す図である。ＣＲＡＭ（Ｃｒｉｓｐｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  ＭＡＧＥ）を使用して、それらのＣＤＳの最初の１０個のコドン内に位置するいくつかのＡＧＲコドンに対するコドン選択を探索した。簡潔には、ＭＡＧＥを用いて目的のＡＧＲをランダム化することによって集団を多様化し、次にガイドＲＮＡを用いる当技術分野において一般的に知られているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム及びＣａｓ９酵素を用いて親（未改変）集団を枯渇させ、目的の位置にある全６４コドンの網羅的な検索を行った。次に、細胞集団を連続的に継代し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑを用いて配列決定することにより、コドン存在量を経時的にモニターした。左のｙ軸（コドン頻度）は、特定のコドンの相対存在量を示す（積み重ね面積プロット）。右のｙ軸は、初期の時点で０．５に正規化したｍＲＮＡ折り畳み構造（赤線）及び内部ＲＢＳ強度（青線）の複合的な偏差を任意単位（ＡＵ）で示す。０は野生型からの偏差がないことを意味する。横軸は、集団多様性の特定の読み込みが得られた実験時間を時間単位で示す。ｂｃｓＢ遺伝子及びｃｈｐＳ遺伝子は、本明細書中に記載される菌株の例において必須ではなく、したがって、本質的な遺伝子圧力下にないＡＧＲコドンに対する対照として用いる。
【図２４】ＲＢＳ強度及びｍＲＮＡ構造が１４個のＮ末端コドン置換のコドン選択を予測する一例を示す。具体的には、ＣＲＡＭ実験の結果を示す散布図である（図２３）。各パネルは異なる遺伝子を表す。Ｙ軸はＲＢＳ強度の偏差（Ｓａｌｉｓリボソーム結合部位計算機（Ｓａｌｉｓ、２０１１）で計算）を表し、Ｘ軸はｍＲＮＡ折り畳みエネルギーの偏差を示す（Ｘ軸、ＵＮＡＦｏｌｄ計算機により３７℃で計算）（Ｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）。中間時点（ｔ＝７２時間、選択後に最大の多様性を示すように選択された）におけるコドン存在量は、点の大きさによって表される。緑色の点はＷＴコドンを表す。青い点は同義ＡＧＲコドンを表す。オレンジ色の点は、生存不可能なアミノ酸置換を導入し得る残りの５８個の非同義コドンを表す。黒い四角は、ゲノム全体での再コード化作業において観察された失敗したＡＧＲ→ＣＧＵ変換を表す（表３、図１９Ａ〜図１９Ｂ）。「安全な置換ゾーン」（青い影付きの領域）は、本研究で観察された成功したＡＧＲ→ＣＧＵ置換突然変異に基づいて、実験により定義されたｍＲＮＡ折り畳みの偏差及びＲＢＳ強度の偏差の範囲である（図２１Ａ〜図２１Ｄ）。ｂｃｓＢ遺伝子及びｃｈｐＳ遺伝子は、本明細書中に記載される菌株の例において必須ではなく、したがって、本質的な遺伝子圧力下にないＡＧＲコドンに対する対照として用いる。
【図２５Ａ】ＡＧＲコドンの最適置換を予測することにより、トラブルシューティングを必要とする予測コドンの数が減少する例を示す。Ｃ１２３の構築からの実験によるデータを示す図である。１１０個のＡＧＲコドンがＣＧＵに再コード化に成功し（緑色）、１３個の抵抗性ＡＧＲコドンがトラブルシューティングを必要とした（赤色、縞模様）。
【図２５Ｂ】ＡＧＲコドンの最適置換を予測することにより、トラブルシューティングを必要とする予測コドンの数が減少する例を示す。ＡＧＲコドンの全ての出現箇所をゲノム全体で置換するための予測された抵抗性コドンを示す図である。この分析に使用された参照ゲノムは、合成される全ヌクレオチドを制限するために、置換される３１８１個のＡＧＲコドンを残して、挿入エレメント及びプロファージが除去された（Ｕｍｅｎｈｏｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）。分析によると、ＡＧＲの全ての出現箇所をＣＧＵで置換すると、２４６回の変換失敗が発生することになる（「無処理の置換」、赤い縦縞）と予測された。しかし、最良のＣＧＮ代替案を特定するためにこのワーク（情報に基づく置換）の規則を実行すると、予測される失敗率は１０．５％（１３／１２３）から２．３２％（７４／３１８１）に減少し、そのうち一部のサブセットのみ、非必須遺伝子におけるそれらの位置に起因して適応度に直接影響することになる。特定の同義ＣＧＮのそれぞれは、固有の緑色の色合いで識別され、それぞれのセクションの内側に表示される。
【図２６】大腸菌（ＥｃＭ２．１）の全ての必須遺伝子におけるＡＧＲコドンの「セット」のそれぞれを置換するための戦略例を示す図である。ここでＡＧＲコドンは白抜き三角形（様々な色）が付されている。まず、二重選択可能なｔｏｌＣカセット（二重緑色線）を、近傍の（＜５００ｋｂ）下流のＡＧＲ遺伝子座（様々な色付き線）を標的とするいくつかのオリゴヌクレオチドと共に、多重組み換えにおいてｌａｍｂｄａ  ｒｅｄを用いてゲノムと組み換える。ｔｏｌＣ挿入クローンを選択すると、ｔｏｌＣとその他の近傍の（＜５００ｋｂ）下流のＡＧＲ遺伝子座との組換え事象の強い連鎖のために、正しく選択されたＡＧＲコドンもより高い頻度で観察される（塗りつぶされた三角）。次に、同様のＡＧＲ変換オリゴヌクレオチドプールを使用して２回目の組換えを行うが、ここで別のオリゴヌクレオチドとペアにして未成熟停止を有するｔｏｌＣのＯＲＦを破壊した後、ｔｏｌＣ対向選択を適用し、再びＡＧＲ変換の集団を濃縮する。次に、３回目の多重組換えにより、再びＡＧＲ遺伝子座を標的にしてｔｏｌＣのＯＲＦが固定される。ｔｏｌＣ選択を適用した後、クローンをＭＡＳＣ−ＰＣＲによってアッセイする。所与のセットにおいてほとんどの変換がなされていると仮定すると、選択マーカーは、次に（必要に応じて）一重組み換え又は多重組み換えにおいて修復オリゴヌクレオチドを用いて除去されるであろう。次いで、ｔｏｌＣ対向選択を利用して、傷のない染色体を残すこと、及びゲノム中の他の場所で使用するためにｔｏｌＣカセットを解放することの両方を行う。
【図２７Ａ】抵抗性ＡＧＲ→ＣＧＵ突然変異についての３つの異なる失敗事例の例示的な概略図を示す。いずれの場合も、一番上の列が最初の配列、中央の列がＡＧＲ→ＣＧＵ突然変異、３番目の列の一次ＤＮＡ配列がトラブルシューティングで収束された最適解である。ＤＮＡ配列の下の緑色の枠は、同じ順序でアミノ酸配列を示す（上段が最初、中段がＡＧＲ→ＣＧＵによるもの、下段がトラブルシューティング解決策による）。図２７Ａは、必須遺伝子の末端にあるＡＧＲが下流のＯＲＦとＣ末端で重複する例を示す図である。（ｉ）ｆｔｓＩ遺伝子及びｍｕｒＥ遺伝子は互いに重複している。ｆｔｓＩにおけるＡＧＡ→ＣＧＵ突然変異により、ｍｕｒＥに非保存的Ａｓｐ３Ｖａｌ突然変異が導入され得る。ｍｕｒＥのアミノ酸配列は、ＡＧＡ→ＣＧＡ突然変異を用いることによって保存された。（ｉｉ）ｈｏｌＢ遺伝子及びｔｍｋ遺伝子は互いに重複している。ｈｏｌＢにおけるＡＧＡ→ＣＧＵ突然変異により、ｔｍｋに非保存的Ｓｔｏｐ２１４Ｃｙｓ突然変異が導入され得る。ｔｍｋのアミノ酸配列は、ＡＧＡ→ＣＧＣ突然変異を用い、３個のヌクレオチドを付加することによって保存された。
【図２７Ｂ】抵抗性ＡＧＲ→ＣＧＵ突然変異についての３つの異なる失敗事例の例示的な概略図を示す。図２７Ｂは、必須遺伝子の末端にあるＡＧＲが下流遺伝子のＲＢＳとＣ末端で重複する例を示す図である。（ｉ）ｓｅｃＥ遺伝子は下流の必須遺伝子ｎｕｓＧに対するＲＢＳと重複する。ＡＧＧ→ＣＧＵ突然変異はＲＢＳ強度を９７％減少させ得る（Ｓａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）。ＲＢＳ強度は、ＡＧＧ→ＧＡＧ突然変異を用いることによって保存される。（ｉｉ）ｄｎａＴ遺伝子は下流の必須遺伝子ｄｎａＣに対するＲＢＳと重複する。ＡＧＧ→ＣＧＵ突然変異はＲＢＳ強度を７７％減少させ得る（Ｓａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）。ＲＢＳ強度は、ＡＧＧ→ＣＧＡ突然変異を用いることによって保存される。（ｉｉ）ｆｏｌＣ遺伝子は、この菌株において必須であることが示されている下流のｄｅｄＤ遺伝子に対するＲＢＳと重複する。ＡＧＧＡＧＡ→ＣＧＵＣＧＵ突然変異はＲＢＳ強度を９９％低下させ得る（Ｓａｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）。ＲＢＳ強度は、ＡＧＧ→ＣＧＧＣＧＡ突然変異を用いることによって保存される。
【図２７Ｃ】抵抗性ＡＧＲ→ＣＧＵ突然変異についての３つの異なる失敗事例の例示的な概略図を示す。図２７Ｃは、必須遺伝子の開始部分で抵抗性ＡＧＲ変換を引き起こすＮ末端ＲＢＳモチーフを示す図である。（ｉ）ｄｎａＴ遺伝子は内部ＲＢＳ様モチーフを有する。ＡＧＧ→ＣＧＵ突然変異はＲＢＳ強度を２６倍増加させ得る（Ｓａｌｉｓ、２０１１）。付加的なゆらぎ変異と組み合わせたＡＧＡ→ＣＧＵ突然変異を用いることによってＲＢＳ強度はより良く保存される。（ｉｉ）ｐｒｆＢ遺伝子は内部ＲＢＳ様モチーフを有する。このＲＢＳモチーフは、ｐｒｆＢにおける下流の計画的フレームシフトに関与する（Ｃｕｒａｎ、１９９３）。フレームシフトを除去することによってのみ、（不十分なＲＢＳ様部位を残す）ＡＧＧ→ＣＧＵ突然変異が可能であった。フレームシフトを維持するためには、ＡＧＧ→ＣＧＧ突然変異と付加的なゆらぎ変異が必要であった。その場合、局所的ＲＢＳ強度は維持された（４行目）。（ｉｉｉ）ｓｓｂ遺伝子は内部ＲＢＳ様モチーフを有する。ＡＧＧ→ＣＧＵ突然変異はＲＢＳ強度を９４％減少させ得る。付加的なゆらぎ変異と組み合わせたＡＧＡ→ＣＧＡ突然変異を用いることによってＲＢＳ強度は保存される。
【図２８】ｓｓｂ遺伝子、ｄｎａＴ遺伝子、及びｐｒｆＢ遺伝子に関する以前の研究（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）から得たリボソーム休止データの例を示す図である。緑色の線は各遺伝子のリボソームプロファイリングデータを表す。オレンジ色の線は、アノテーション付き開始コドンの最初の３０ヌクレオチド以内にＡＧＲコドンを有するすべての遺伝子の平均を示す。２本の赤い縦線の間の領域は、（ＡＧＲコドンの１２ｂｐ後を中心とする）目的の区間を示す。興味深いことに、ｐｒｆＢ及びｓｓｂはＡＧＲコドンの後にピークを示し、ｄｎａＴについてはピークは観察されない。Ｓａｌｉｓ計算機による予測に基づいて、これらの３つの場合においてＡＧＲをＣＧＵに置換することにより、リボソームの一時停止が妨げられる（ｐｒｆＢ及びｓｓｂ）か、又はリボソームの一時停止が導入される（ｄｎａＴ）と考えられている。
【図２９】ｍＲＮＡ折り畳み変異によって説明される４種の抵抗性ＡＧＲ→ＣＧＵ突然変異のｍＲＮＡ折り畳み予測の例を示す図である。ＵＮＡｆｏｌｄを用いた開始コドンの上流１００ヌクレオチド及び下流３０ヌクレオチドのｍＲＮＡ折り畳み予測（Ｍａｒｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、２００８）。ＡＧＲ→ＣＧＵ変換の失敗を理解するためには、ｍＲＮＡの折り畳みの形状及び折り畳みエネルギーの値の両方を考慮する必要がある。「ＡＧＲ」は予測された野生型ｍＲＮＡを表し、「ＣＧＵ」は（一般には観察されない）ＡＧＲ→ＣＧＵ突然変異を有するｍＲＮＡの折り畳み予測であり、「最適化」はインビボトラブルシューティング後に見出されるＡＧＲ置換の解決策のｍＲＮＡ折り畳み予測に対応する。各構造の下に、可視化された構造の折り畳みの予測自由エネルギー（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）を示す。
【図３０】ｒｎｐＡ遺伝子に対するｍＲＮＡ折り畳み予測の例を示す。折り畳み予測のために、ＵＮＡｆｏｌｄを用いてｒｎｐＡ開始部位の上流３０ヌクレオチド及び下流１００ヌクレオチドを用いた（Ｍａｒｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、２００８）。Ａは、ＡＧＧ（青枠中）を有する野生型ｒｎｐＡ配列を示す（青い四角）。Ｂは、青枠内にＡＧＧ→ＣＧＵを有する野生型ｒｎｐＡ配列を示す（観察せず）。Ｃは、青枠内にＡＧＧ→ＣＧＧを有する野生型ｒｎｐＡ配列を示す（増殖速度異常を伴わずに観察された）。図３０Ｄは、青枠内にＡＧＧ→ＣＴＧ及びｍＲＮＡループを維持するための１つの相補的変異ＣＣＣ→ＣＣＡを有する野生型ｒｎｐＡ配列を示す（青枠内）（増殖速度異常伴わずに観察された）。
【図３１】Ｇ１５Ａ  ＡｒｇＵがＷＴ大腸菌株及び再コード化大腸菌株における発現及びアミノアシル化レベルに影響を及ぼさない例を示す図である。野生型大腸菌におけるＷＴのＡｒｇＵ  ｔＲＮＡ及びＧ１５Ａ  ＡｒｇＵ  ｔＲＮＡ（ＷＴ−ＷＴ及びＷＴ−Ｇ１５Ａ）、並びに最終菌株であるＣ１２３ａ及びＣ１２３ｂ（５０１及び５０３）について、いくつかの増殖条件で、ノーザンブロットＡｃｉｄ−Ｕｒｅａ  ＰＡＧＥを実施した。アミノアシル化レベルはすべての条件及び組み合わせについて野生型と同程度であり、変異が集団によって一掃されたにもかかわらずチャージのレベルに影響がないことを示唆している。
【図３２】２４時間の時点でのＣＲＡＭ実験における各コドン及び各遺伝子についての読み取り数の一例を示す図である。ＣＲＡＭ（Ｃｒｉｓｐｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  ＭＡＧＥ）を用いて、いくつかのＮ末端ＡＧＲコドンに対するコドン選択を調べた。左のｙ軸（読み取り数）は特定のコドンの存在量を示す。ｘ軸は、ＡＡＡからＴＴＴまでアルファベット順にランク付けされた６４種の可能なコドンを示す。実験２４時間の時点を示す。多様性は、イルミナシークエンシングによってアッセイした。ｂｃｓＢ遺伝子及びｃｈｐＳ遺伝子は必須ではなく、したがって、本質的な遺伝子圧力下にないＡＧＲコドンに対する対照として用いる。
【図３３】１４４時間の時点でのＣＲＡＭ実験における各コドン及び各遺伝子についての読み取り数の一例を示す図である。ＣＲＡＭ（Ｃｒｉｓｐｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  ＭＡＧＥ）を用いて、いくつかのＮ末端ＡＧＲコドンに対するコドン選択を調べた。左のｙ軸（読み取り数）は特定のコドンの存在量を示す。ｘ軸は、ＡＡＡからＴＴＴまでアルファベット順にランク付けされた６４種の可能なコドンを示す。実験１４４時間の時点を示す。多様性は、イルミナシークエンシングによってアッセイした。ｂｃｓＢ遺伝子及びｃｈｐＳ遺伝子は必須ではなく、したがって、本質的な遺伝子圧力下にないＡＧＲコドンに対する対照と遺伝子して用いる。
【図３４】ＡＧＲ置換戦のそれぞれについての予測される抵抗性ＡＧＲコドンの数の一例を示す図である。３２２２個の全ＡＧＲを置換する４種の可能性のあるゲノムは、４種の置換戦略を用いてデザインされた。第一に、ゲノム全体でＡＧＲがＣＧＵに変更された（緑色のバー）。第二に、遺伝子の開始近くの局所的ｍＲＮＡ折り畳みの偏差を最小にするようにＡＧＲ同義変異が選択された（オレンジ色のバー）。第三に、ＲＢＳ強度の偏差を減少させるようにＡＧＲ同義変異が選択された（青色のバー）。最後に、両方を最小にするようにＡＧＲ同義変異が選択された（紫色のバー）。次に、これらのゲノムをカスタムソフトウェアを用いてスコア付けして比較した。安全な置換ゾーンの外側にある偏差はすべて、抵抗性コドンであると予測される。
【図３５】ＭＧ１６５５と比較した完全に再コード化されたゲノムの代表的なグラフの例である。外側の環は、各ＡＧＲコドン（縦線）が含まれているセットグループを含む。線のそれぞれには、トラブルシューティングに関する情報（トラブルシューティングの場合は赤、そうでない場合は緑）及び相対的な組換え頻度（点）が含まれる。内部の環はそれぞれ、そのセットの生成中に蓄積された突然変異を表し、各環についてのアクティブなセットが強調表示されている。内部の環は、菌株構築中のトラブルシューティング手順を表す。
【図３６Ａ】本開示の実施形態の様々な方法工程を示す概略図である。
【図３６Ｂ】ＭＡＧＥを介して代替コドンをゲノムの異なる位置に導入する実験手順を示すグラフである。次いで、集団は、一定の間隔でサンプリングされながら、対数増殖期中期で維持される。コドン分画を時間に対してプロットし、対数減衰関数を当てはめる。減衰定数は適応度を示す。
【図３６Ｃ】実験により測定された適応度を予測ＧＥＴＫスコアと比較を示した図である。ｘ軸上の各位置は、異なるゲノム位置を試験する９５種のサブ実験のうちの１つに対応する。ｙ軸上の位置は野生型に対する適応度を示し、負の値は適応度がより低いことを示し、０は野生型の適応度を示す。挿入図は、良好、平均的、又は不良のＧＥＴＫスコアによってグループ化された測定コドンの適応度を示す。予測スコアが良い例は、適応度が有意に優れている。
【図３７】様々な遺伝子の５′末端近くの隣接コドン交換の組み合わせを試験する６２種のサブ実験の結果の要約を示す図である。オリゴヌクレオチドライブラリーは、９０塩基のオリゴウィンドウ内のコドン位置での縮重を考慮して設計された。サブ実験の結果は合わせて示されるが、良好な適応度（＜７％の適応度低下）又は不良な適応度（＞１３％の適応度低下）を有するコドンの組み合わせによって区別される。一対の良好−不良適応度の概要が、５′ｍＲＮＡの折り畳み強度の変化、上流のＲＢＳモチーフ強度の変化、内部ＲＢＳモチーフ強度の変化の３種のＧＥＴＫスコア付け測定基準のそれぞれについてプロットされている。各測定基準について、低いスコアは、それぞれのモチーフの予測される破壊が少ないことを示す。
【図３８】対照についての代替コドン軌跡を示す図である。最上列は、同義コドン及び早期終止コドンが非必須遺伝子であるＬａｃＺ及びＧａｌＫの複数の位置に導入され、同義コドンと内部終止との間で同様の効果を示す、無効対照を示す。下段は、同義コドン及び内部終止コドンが必須遺伝子に導入された強力効果の対照を示す。これらは、いくつかの位置でコドン選択のより大きなダイナミックレンジと共に、内部終止と同義コドンの間に著しい差異を示す。
【図３９】遺伝子の内部の特定の位置（５′末端に限定されない）においてガンマプロテオバクテリア中の大腸菌の系統発生的に近い隣接種において観察された非同義及び同義の突然変異の試験からの結果を要約する図である。これらの位置は、一部の代替案に対する内部ＲＢＳがＧＥＴＫによって破壊的であると予測されたかどうかに従って優先順位が決められた。内部ＲＢＳスコアは代替対立遺伝子の選択肢の適応度の強力な予測因子であることが示される。
【図４０】保存により予測される非同義変異の混合されたものを試験した結果を示す図である。これらの位置は、既報の通り（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）、リボソーム休止のピークに従って優先順位が決められた。内部ＲＢＳスコアは代替対立遺伝子選択肢の適応度の強力な予測因子であることが示される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示の実施形態は、全体を通して一般的に「（複数の）制約」、「（単一の）制約」、「（複数の）規則」、「（単一の）規則」、又は「規則に基づいた」と称されることがある規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴のセットに基づいてゲノムをデザインするための方法、アルゴリズム、及びコンピュータソフトウェアに基づく。本明細書に記載の規則に基づいたゲノムデザインは、ＤＮＡ中の既知の生物学的モチーフ及び特徴を保存し、デザインされたゲノムの合成及び構築のための様々な制約、及び／又は規則、条件、パラメータ、又は特徴を満たしつつ、ゲノム改変を実行するための方法及びコンピュータアルゴリズムを含む。本明細書に記載されるように、規則、条件、パラメータ、又は特徴は、可能性のあるゲノムデザインについての各制約をスコア付けすることによってゲノムデザインを合成する際に適用され得る生物学的制約及び合成制約を意味し得る。生物学的モチーフは、必須遺伝子、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）モチーフ、ｍＲＮＡ二次構造、及び内部リボソーム休止部位モチーフなどを含み得る。いくつかの実施形態では、開示されるゲノムデザインのための方法は、遺伝子、オペロン、及びゲノムなどを含む遺伝要素をデザインすることを目的とし得る。
【００１８】
本開示の態様は、多重自動化ゲノム工学（ＭＡＧＥ）及び標的配列決定の組み合わせに基づき、ＣＲＩＳＰＲを利用したＭＡＧＥ（ＣＲＡＭ）、及び分子反転プローブ（ＭＩＰＳ）と組み合わせたＭＡＧＥなどの他の技術と共に、新しい規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を実験により導出するための方法を含む。本明細書に記載の態様は、制約条件及び／又は規則のセットに基づいてデザインしたゲノムに関する情報を提供すること、及び将来のゲノムデザインにおいて表現型の改善をもたらし得る改変を推奨することも含み得る。最終的には、本明細書に開示された規則に基づいたゲノムデザイン方法及び統合ソフトウェアは、ＤＮＡ構築物産生の効率改善及びコスト削減のためのゲノム工学及び生物学的生産の分野において有益であり得る。
【００１９】
場合によっては、特定の対立遺伝子（本明細書では「禁止対立遺伝子」又は「禁止コドン」と称することがある）のゲノム全体での対立遺伝子置換について同義対立遺伝子を選択する時など、ゲノム改変時にいくつかの課題が生じ得る。最初に、生物生存能を確保するために、ＧＣ含量及び一次ヌクレオチド配列によってコードされる調節エレメントなどの親ゲノムの基本的特徴を維持することが重要であり得る。さらに、禁止対立遺伝子が重複する遺伝子領域に含まれる場合、非同義変異の導入又は調節機能の破壊を回避するようにこれらの重複を慎重に分割する必要がある場合がある。最後に、計算によるデザインスキームは、ゲノム構築に使用される実験ツールと適合性があることが望ましいであろう。
【００２０】
よって、本明細書には、ユーザ指定の規則が適切な同義対立遺伝子置換を見つけるための制約として機能する、ゲノム再コード化ソフトウェアのための規則に基づいたアーキテクチャについて記載する。一例として、表１及び表２は、ゲノムデザイン（例えば、根本的に再コード化された大腸菌ゲノムのデザイン及び合成）に対して実施され得る規則及び制約のさらなる例を提示する。具体的には、表１はゲノムデザイン規則のための生物学的な制約、条件、パラメータ、又は特徴の例を示し、表２はゲノムデザイン規則のための合成的な制約、条件、パラメータ、又は特徴の例を示す。本明細書に記載の規則に基づいたアーキテクチャは、計算モジュール又はソフトウェアモジュールとして実装可能であり、一般的なアプリケーションに拡張可能あり、特定のニーズに従ってカスタマイズすることも可能である。
【００２１】
様々な実施形態の以下の説明では、本明細書の一部を構成し、実施可能な本開示の様々な実施形態を例示として示す添付の図面を参照する。他の実施形態も利用可能であることを理解されたい。以下の開示により、当業者は、本明細書に記載の様々な態様が、１又は複数のコンピュータプログラム製品を利用するコンピュータ化された方法、システム、デバイス、又は装置として具現化され得ることを理解するであろう。したがって、コンピュータ化された方法、システム、デバイス、及び装置の様々な態様は、完全にハードウェアからなる実施形態、完全にソフトウェアからなる実施形態、又はソフトウェアの態様とハードウェアの態様を組み合わせた実施形態の形を取り得る。さらに、コンピュータ化された方法、システム、デバイス、及び装置の様々な態様は、記憶媒体内又は記憶媒体上に具現化された、コンピュータ可読プログラムコード又は命令を有する１又は複数の持続的コンピュータ可読記憶媒体によって記憶されたコンピュータプログラム製品の形を取り得る。ハードディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、光記憶装置、磁気記憶装置、及び／又はそれらの任意の組み合わせを含む、任意の適切なコンピュータ可読記憶媒体を利用可能である。さらに、本明細書に記載されるようなデータ又はイベントを表す様々な信号は、金属ワイヤ、光ファイバ、及び／又は無線伝送媒体（例えば、空気及び／又は空間）などの信号伝達媒体を通って伝わる電磁波の形で送信元と送信先の間で転送され得る。以下の説明では、要素間の様々な接続について論じることに留意されたい。これらの接続は一般的なものであり、特に指定がない限り、直接的又は間接的、有線又は無線であり得、本明細書はこの点に関して限定することを意図しないことに留意されたい。
【００２２】
１又は複数の構成では、本開示の教示は計算装置を用いて実施することができる。図１は、ゲノムデザインのための方法の実施のためなど、本開示の態様により使用され得る計算装置１００のブロック図を示す。計算装置１００は、本明細書に説明されるような規則に基づいたゲノムデザインに関連する態様を実行及び実施するようにプログラム及び／又は構成された特殊な計算装置である。計算装置１００は、本明細書に記載されるように方法を実行し命令を実行するように構成されたゲノムデザインモジュール１０１を有していてもよい。ゲノムデザインモジュール１０１は、１又は複数の特別に構成されたプロセッサ及び１又は複数の記憶装置（例えば、データベース、ＲＡＭ、ＲＯＭ、及び他のコンピュータ可読媒体）、１又は複数の特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、及び／又は他のハードウェアコンポーネントで実行され得る。本開示を通して、ゲノムデザインモジュール１０１は、１又は複数のゲノムファイル又は鋳型（例えば、１又は複数のアノテーション付きＧｅｎＢａｎｋファイル）を受け取るため、置換される対立遺伝子のリストを受け取るため、生物学的制約及び合成制約のセットをゲノム配列に適用することによってゲノムを改変するため、並びに改変、ゲノムデザインのスコア付け、ゲノムデザインのための規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴の修正及び／又は作成に基づいて新しいゲノムデザインを作成するためなどに使用されるソフトウェア（例えば、コンピュータプログラム、アプリケーション、及び／又はアルゴリズム）及び／又はハードウェアを指し得る。具体的には、ゲノムデザインモジュール１０１は、他のアプリケーションにさらに拡張することができる、ゲノム再コード化ソフトウェアのための規則に基づいたアーキテクチャの一部であってもよい。ゲノムデザインモジュール１０１の１又は複数の特別に構成されたプロセッサは、計算装置１００の別の汎用プロセッサ１０３に加えて、又はそれと共に動作可能である。いくつかの実施形態では、ゲノムデザインモジュール１０１は、１又は複数の汎用プロセッサ１０３によって実行されるソフトウェアモジュールとすることができる。ゲノムデザインモジュール１０１及び汎用プロセッサ１０３の両方は、計算装置１００及びその関連構成要素であるＲＡＭ１０５、ＲＯＭ１０７、入力／出力（Ｉ／Ｏ）モジュール１０９、ネットワークインターフェース１１１、メモリ１１３などの動作を制御可能であり得る。
【００２３】
Ｉ／Ｏモジュール１０９は、計算装置１００のユーザが入力データを提供可能なマイクロフォン、キーパッド、キーボード、タッチスクリーン、ジェスチャセンサ若しくは他のセンサ、及び／又はタッチペンなどの入力装置１１５に接続されるように構成され得る。Ｉ／Ｏモジュール１０９はまた、モニター、テレビ、及びタッチスクリーンなどの表示装置１１７に接続されるように構成されていてもよく、グラフィックカードを含んでいてもよい。表示装置１１７及び入力装置１１５は、計算装置１００とは別個の要素として示されているが、それらは同じ構造内にあってもよい。入力装置１１５を使用して、システム管理者又はユーザは、規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴、スコア付け、所定の閾値、範囲、並びにゲノムのデザインに関する生物学的制約及び合成制約など、ゲノムデザインモジュールの様々な態様を追加及び／又は更新してもよい。入力装置１１５はまた、ゲノムデザインモジュール１０１によりゲノムファイル及びゲノムファイル内で改変される対立遺伝子又は配列のリストを入力することによってゲノムをデザインする目的で、ユーザによって操作されてもよい。
【００２４】
メモリ１１３は、コンピュータ実行可能な命令（例えば、ソフトウェア）を格納するための任意のコンピュータ可読媒体であってもよい。メモリ１１３内に格納された命令は、計算装置１００が様々な機能を実行することを可能にし得る。例えば、メモリ１１３は、オペレーティングシステム１１９及びアプリケーションプログラム１２１など、計算装置１００によって使用されるソフトウェアを格納してもよく、関連データベース１２３を含んでいてもよい。
【００２５】
ネットワークインターフェース１１１は、計算装置１００がネットワーク１３０に接続して通信することを可能にする。ネットワーク１３０は、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）及び／又はインターネットなどのワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）を含む、任意の種類のネットワークとすることが可能である。ネットワーク１３０を介して、計算装置１００は、ラップトップ、ノートブック、スマートフォン、パーソナルコンピュータ、及びサーバなどの１又は複数の計算装置１４０と通信可能である。計算装置１４０は、計算装置１００と同じ構成要素のうちの少なくともいくつかを含み得る。いくつかの実施形態では、計算装置１００は計算装置１４０に接続され、「クラウド」計算環境を形成していてもよい。
【００２６】
ネットワークインターフェース１１１は、同軸ケーブル及び光ファイバケーブルなどの通信回線を介して、あるいはセルラーバックホール又はＩＥＥＥ８０２．１１、ＩＥＥＥ８０２．１５、及びＩＥＥＥ８０２．１６などの無線規格を使用して無線でネットワーク１３０に接続可能である。いくつかの実施形態では、ネットワークインターフェースはモデムを含み得る。さらに、ネットワークインターフェース１１１は、他の計算装置１４０と通信するために、ＴＣＰ／ＩＰ、イーサネット、ファイル転送プロトコル（ＦＴＰ）、及びハイパーテキスト転送プロトコル（ＨＴＴＰ）などを含む、様々なプロトコルを使用し得る。
【００２７】
特定の態様によれば、計算装置１００は、ゲノムデータ（例えば、遺伝子配列）にアクセスするために、１又は複数のデータベース１５５と連動し得る。例えば、データベース１５５は、ヌクレオチド配列（例えば、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）のコレクション及び対応するタンパク質翻訳（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）を保存する外部データベースであってもよい。場合によっては、ゲノムデザインモジュール１０１は、データベース１５５から特定のゲノムファイル又は鋳型にアクセス及び／又はそれを受信可能であり、ゲノムデザインモジュール１０１は、規則及びスコア付けのセットに基づいてさらなるゲノムデザインのためにファイルを利用してもよい。
【００２８】
図１は、計算装置１００の例示的な実施形態である。他の実施形態では、計算装置１００はより少ない又はより多い要素を含み得る。例えば、計算装置１００は、ゲノムデザインモジュール１０１の機能を実行するために汎用プロセッサ１０３を使用してもよく、したがって、ゲノムデザインモジュール１０１のための別個のプロセッサ又はハードウェアを含まなくてもよい。
【００２９】
必須ではないが、本明細書に記載の様々な態様は、方法、データ処理システムとして、又はコンピュータ実行可能な命令を格納するコンピュータ可読媒体として具現化され得る。例えば、開示された実施形態の態様による方法の工程をプロセッサに実行させるための命令を格納するコンピュータ可読媒体が企図される。例えば、本明細書に開示されている方法の工程及びアルゴリズムの態様は、計算装置１００のプロセッサで実行され得る。そのようなプロセッサは、コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータ実行可能命令を実行することができる。
【００３０】
図２は、本開示の様々な態様を１又は複数の例示的実施形態により実行可能なゲノムデザインモジュールの例示的ブロック図を示す。具体的には、図２は、原核生物ゲノムにおける全ゲノムでの対立遺伝子置換など、任意のゲノム改変に利用可能なソフトウェアツールを含んでいてもよいゲノムデザインモジュール２０１を示す。いくつかの実施形態において、ゲノムデザインモジュール２０１はゲノムデザインモジュール１０１と同じであってもよい。
【００３１】
ゲノムデザインモジュール２０１は、ゲノム全体にわたって特定の対立遺伝子の全ての存在を除去する（翻訳因子の削除及び機能的な対立遺伝子の再割り当てを可能にする）こと、オペロンを機能的に関連する単位に再配列すること、非必須要素（例えば、潜在性プロファージ、可動要素、非必須遺伝子など）を除去すること、及び代謝経路の修正／最適化／導入などにより、ゲノムのリファクタリングを含む様々な目的に利用してもよい。
【００３２】
図２に示すように、ゲノムデザインモジュール２０１は、ゲノム鋳型ファイル２０２及び対立遺伝子リスト２０４の２種の入力を受け取り可能である。ゲノム鋳型２０２は、既知のゲノム配列又は特定のゲノム（例えば、アノテーション付きＧｅｎＢａｎｋファイルの形態で）を含み得る。いくつかの実施形態では、ゲノム鋳型２０２は、細菌ゲノム、マイコプラズマゲノム、酵母ゲノム、ヒトゲノム、任意の天然生物のゲノム、又は任意の以前に進化させたか若しくは操作された生物のゲノムを含む任意の種類のゲノムの配列を含み得る。一例として、本明細書の実施例に記載されるように、大腸菌ＭＤＳ４２ゲノム鋳型（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＰ０１２３０６．１）をゲノム鋳型２０２として使用した。対立遺伝子リスト２０４は、ゲノム全体にわたって同義的に置換される対立遺伝子のリストを含み得る。対立遺伝子リスト２０４はまた、コード配列（例えば、コドン）及び非コード配列（例えば、ｔＲＮＡ及びｓＲＮＡを含む非コードＲＮＡ、コード配列と重複してもしなくてもよい遺伝子外配列モチーフ、及び反復遺伝子外回文（ＲＥＰ）配列など）を含み得る。いくつかの実施形態では、対立遺伝子リスト２０４は、「禁止コドン」とも称されるコドンのリストを表していてもよい。例えば、以下の７種のコドン：ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＵＧ、ＵＵＡ、及びＵＡＧが、下記の大腸菌の例において置換されるコドンのリストにあった。
【００３３】
ゲノムデザインモジュール２０１は、ゲノム鋳型２０２及び対立遺伝子リスト２０４を受け取り、ゲノム中のリストから対立遺伝子の全ての出現箇所を自動的に置き換えしてもよい。例えば、ゲノムデザインモジュール２０１は、ゲノム内で、コドンのリストから禁止コドン全ての出現箇所を自動的に置き換え得る。ゲノムデザインモジュール２０１はまた、スコア付けサブモジュール２０８を利用してもよく、ゲノムデザインモジュール２０１は、得られた配列が生物学的制約２０５及び／又は合成制約２０６に最もよく当てはまるようにする同義コドンを選択するように構成され得る。いくつかの実施形態では、スコア付けサブモジュール２０８は、スコア付けツールと称されることがある。
【００３４】
表１及び表２は、それぞれゲノムデザインに適用され得る生物学的制約２０５及び合成制約２０６の例を、規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴、動機づけ、実施、及び対応するゲノムアノテーションの説明と共に提供する。合成制約２０６は、ゲノムデザインを合成するために適用され得る１又は複数の実験による規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を含み得る。場合によっては、合成制約２０６は、ゲノムデザインの間に満たされるべき供給業者及び／又は技術に特有の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴であり得る。合成制約２０６の例は、（これらに限定されないが）禁止制限酵素モチーフを除去するため、ゲノムデザインにおける遺伝子内の高／低ＧＣ含量を標準化するために同義変換を活用するため、遺伝子間領域に高／低ＧＣ含量が存在する場合に調節モチーフを保存するため、強力な二次構造を最小化するため、合成が困難であり得る反復エレメントを削除してそれらをターミネーターで置き換えるため、ホモポリマーランが遺伝子内に存在する場合に同義変換を利用して一次配列を多様化するため、ホモポリマーランが遺伝子間領域に存在する場合に調節モチーフを保存するため、別々の転写単位を全て含むモジュラーゲノム単位を合成する可能性を高めるためにオペロンを分割するためなどの規則を含み得る。
【００３５】
生物学的制約２０５は、生物学的に関連するモチーフを保存するためにゲノムデザインに適用される１又は複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を含んでいてもよく、生物学的制約２０５はゲノムデザインモジュール２０１におけるコードとして実装されてもよい。例えば、生物学的制約２０５は、ＲＮＡの予測される二次構造（例えば、ｍＲＮＡを含むがこれに限定されない）を維持するための規則を含み得る。ゲノムデザインモジュール２０１は、元の配列及び改変された設計配列の両方について予測ＲＮＡ二次構造を計算し得、スコア付けサブモジュール２０８は、その２つの間の差異の定量的表現を提供し得る。いくつかの実施形態において、ゲノムデザインモジュール２０１は、元の配列及び設計された配列の予測自由エネルギー（ΔＧ）を比較することによって（例えば、熱力学的二次構造予測）及び／又は元の配列に関して設計された配列中の同じ姉妹ヌクレオチドともはや対を成さないヌクレオチドの数を計算することによって、予測ｍＲＮＡ二次構造の偏差を計算し得る。場合によっては、所望の変更の文脈に応じて規則を修正してもよい。例えば、遺伝子の５′末端付近の変化に対して、ゲノムデザインモジュール２０１は、その遺伝子の開始コドンに対して配列の−３０ヌクレオチドから＋１００ヌクレオチドまでのｍＲＮＡ二次構造を計算し得る。
【００３６】
さらに、生物学的制約２０５はまた、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）モチーフを保存するための規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を含み得る。リボソーム結合部位は、遺伝子の約１０塩基上流（例えば、開始コドンの上流）に見出されるＤＮＡ配列モチーフ（例えば、ヌクレオチド配列）を含み得る。ゲノムデザインモジュール２０１は、（例えば、スコア付けサブモジュール２０８を使用することによって）リボソーム結合部位の破壊に従って配列デザインをスコア付けしランク付けしてもよい。例えば、（例えば、下流の重複遺伝子の発現を支持するために）ＲＢＳモチーフが重複遺伝子中に存在する場合、ＲＢＳ強度に強く影響しない突然変異のみを許容することが有益であり得る。さらに別の例では、出力デザインパラメータが重複したアーキテクチャにおいて前記ＲＢＳモチーフを保存することと矛盾する場合、コード領域を分割し、下流遺伝子の翻訳を補助するために同様の強度のＲＢＳモチーフを挿入してもよい。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ゲノムデザインモジュール２０１は、Ｓａｌｉｓリボソーム結合部位計算機（Ｓａｌｉｓ、２０１１）などの生物物理学的モデルを利用することによって、又は他の実験によるＲＢＳ強度の参照表（look-up table）によって、ＲＢＳモチーフ強度予測を実行し得る。例えば、ゲノムデザインモジュール２０１のスコア付けサブモジュール２０８は、生物物理学的モデルを使用して、参照配列及び設計配列の予測発現スコアを計算し得る（例えば、Ｓａｌｉｓ、２００１）。これらのスコアの比（又は対数比）は、この規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴の破壊の定量化された表現となり得る。
【００３８】
さらに別の例では、生物学的制約２０５は、内部リボソーム休止部位モチーフを保存するための規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を含み得る。例えば、リボソーム結合部位様モチーフ（例えば、抗Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列）の存在は、大腸菌における翻訳停止に対応し得るものであり、これらのモチーフが生物学的に重要な役割を含むことを示唆し得る（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）。したがって、ゲノムデザインモジュール２０１は、生物物理学的モデルを活用するデザイン規則を実装してもよい（例えば、Ｓａｌｉｓ、２００１）。本明細書の実施例に記載されるように、提案されたデザイン変更をスコア付けするために、変更の下流にファントムＡＴＧ開始コドンを正しい数の塩基（例えば、約１０塩基）挿入することによってコドンがＲＢＳの一部であり得ると仮定され得る。この規則に基づいて、ゲノムデザインモジュール２０１は、既存の内部リボソーム休止部位の破壊又は以前に存在しなかった強力な内部リボソーム休止部位の導入を不利にする、提案されたデザイン変更の前後に予測ＲＢＳ強度を計算し得る。
【００３９】
生物学的制約２０５のさらなる例は、（これらに限定されないが）代替の対立遺伝子又はコドンの選択が（再コード化及び異種発現の両方に対して）対立遺伝子又はコドンの選択の世界的な分布と一致していることを確認するため、ゲノムデザイン（例えば、フレームシフト、セレノシステイン挿入配列（ＳＥＣＩＳ）部位、組換え部位など）における既知の配列モチーフを保存するため、プロモーター、エンハンサー、及び／又は転写因子モチーフの保存／調整などによる調節モチーフを保存するため、ゲノムデザイン変更のための代替案を検討する際に、系統発生的に関連した近縁種に最も近い配列を選択することによってゲノムデザインのための系統発生的保存を適用するため、非破壊的な混乱による、再設計された領域間の相同性を低下させるためなどの規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を含んでいてもよい。相同性低下の例では、重複する調節モチーフを保存しながら同義コドン交換を行うための最適解は、コピーを作成することによって重複を分割することであってもよく、これは高い相同性の隣接領域をもたらし得る。相同性は、同義コドン交換又はアノテーション付きの調節モチーフを破壊しない他の変更を行うことによって破壊され得る。これは、再設計された配列を元に戻す可能性がある望ましくない組換えを防ぐことなどによって、安定したゲノムを作製するために重要であり得る。
【００４０】
さらに、ゲノムデザインモジュール２０１は、スコア付けサブモジュール２０８を使用して参照配列（例えば、ゲノム鋳型）に関して遺伝子配列（例えば、ゲノムデザイン）をスコア付けすることによって、生物学的制約２０５の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を実行し得る。いくつかの実施形態では、スコア付けサブモジュール２０８は、遺伝子又はゲノムに対する全ての可能な変化に定量的スコアを割り当て得る。このスコア付けは、所望の遺伝子型又は表現型の結果を達成するデザインのランク付け及び優先順位付けを可能にし得る。スコア付け、ランク付け、及び優先順位付け機能は、ゲノムデザインモジュール２０１用のソフトウェアのコア機能を含み得る。
【００４１】
例えば、相互に排他的な選択肢を有するデザイン選択（対立遺伝子置換を選択するためなど）の場合、ゲノムデザインモジュール２０１は、デザイン選択のランク付けを可能にし得る。いくつかの実施形態では、最良の単一デザイン選択又は任意の数の最良の単一デザイン選択を合成及び試験のために選択してもよい。他の実施形態では、所定のスコア閾値を超える全てのデザイン選択が合成されテストされてもよい。
【００４２】
さらに、ゲノムデザインモジュール２０１のスコア付けサブモジュール２０８は、異なる種類のスコア付けを実行してもよい。例えば、スコアが高いほど生物学的制約２０５（例えば、規則のセット）からの偏差が少ないことを示し得るので、好ましい場合がある。例えば、制約からの偏差が少ないということは、生物学的検証における予測される成功率が高いことを示し得る。別の例では、スコアが低いほど生物学的制約２０５（例えば、規則のセット）からの偏差が少ないことを示し得るので、好ましい場合がある。
【００４３】
ゲノムデザインモジュール２０１はさらに、特定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアの加重された組み合わせとして遺伝子デザインのためのスコア付けを実行してもよい。例えば、スコアが生物学的モチーフ値からの偏差として代替の対立遺伝子を交換する遺伝デザインについて解釈され得る場合、対立遺伝子の各選択は因子の組み合わせに従ってスコア付けされ得る。
【００４４】
すなわち、それぞれの代替遺伝子配列が参照ゲノム中の１又は複数の禁止対立遺伝子を置換するために使用され得る異なる対立遺伝子選択肢を含む、複数の代替遺伝子配列が存在し得る。したがって、ゲノムデザインモジュール２０１は、各代替遺伝子配列において各規則にスコアを割り当てることによって、生物学的制約２０５に規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を当てはめてもよい。いくつかの実施形態では、それぞれの対立遺伝子選択肢は、予測ｍＲＮＡ二次構造折り畳みエネルギーの破壊倍率及び予測リボソーム結合部位（ＲＢＳ）親和性強度の破壊倍率などを含む、生物学的制約２０５の組み合わせに従ってスコア付けされてもよい。
【００４５】
例えば、対立遺伝子選択肢を含む代替遺伝子配列についての総スコアは、以下の式を用いて（例えば、ゲノムデザインモジュール２０１によって）計算してもよい。
【００４６】
スコア＝ｗ１＊ｆ（ｍＲＮＡスコア）ｗ２＊ｇ（ＲＢＳスコア）
【００４７】
上記式で、ｗ１及びｗ２は加重を表し、ｆ及びｇはそれぞれの規則の定量化の関数を表す。さらに、加重ｗ１及びｗ２は、実験により決定されてもよく、ゲノムデザインを合成及び試験した結果に従って更新又は修正されてもよい。他の実施形態では、ユーザが（例えば、ゲノムデザインモジュール２０１及び／又は計算装置１００への入力として）各加重を手動で指定（例えば、入力）することが可能な手動指定によって加重が調整され得る。加重及びスコア付けはまた、全体的に適用されてもよく、又は文脈特有であってもよい。例えば、加重の第１のセットが当てはまり遺伝子の５′末端付近に適用され得るが、異なる加重のセット又は規則、制約、条件、パラメータ、若しくは特徴の異なる組み合わせが当てはまり遺伝子の異なる領域（例えば、遺伝子の中央）において適用され得る。本明細書の実施例に記載されるように、大腸菌におけるコドン選択のための以下の加重が、交換の成功を予測し得ることが実験により見出された。
【００４８】
スコア＝（０．６５／１．５４１１）＊ｍＲＮＡ比×（０．３５／８．４２５７）＊（１＋ＬＯＧ（ＲＢＳ比））
【００４９】
さらなる実施形態では、ゲノムデザインモジュール２０１は、図８に示すように自動計算によるデザインパイプラインに従い得る。例えば、ゲノムデザインモジュール２０１は、生物学的制約２０５を考慮しながら、遺伝子重複の全ての出現箇所において、対立遺伝子リスト２０４及びゲノム鋳型２０２に基づいて、禁止対立遺伝子置換を最初に実行してもよい。次いで、ゲノムデザインモジュール２０１は、生物学的制約２０５を考慮しながら、各遺伝子における残りの禁止対立遺伝子置換を独立して適用し得る。例えば、置換されるべき各対立遺伝子について、同義の対立遺伝子置換について複数の選択肢があり得る。デザインは、野生型配列からの偏差を定量化するデザインの規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴（例えば、二次構造、ＧＣ含量、ＲＢＳモチーフ強度）に関して最小限の破壊を招く可能性がある。
【００５０】
しかしながら、いくつかの実施形態では、全ての可能性のある対立遺伝子又はコドンの改変の網羅的比較は計算上高価であり得、反復が遅くなる。例えば、大腸菌を再コード化する場合、遺伝子あたり約１７個の禁止コドン及び１コドンあたり４種の可能な同義的交換があり、その結果、遺伝子あたり４１７の可能な配列が得られる。したがって、ゲノムデザインモジュール２０１は、全体的な最小値を識別するのではなく、閾値内の各規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を満たす解を識別し得る。満足のいく解を識別するために、ゲノムデザインモジュール２０１は、深さ優先探索に基づくアルゴリズムを用いて横断されるグラフとしてゲノム再コード化問題を識別し、示してもよい。いくつかの実施形態では、このアルゴリズムは、グラフ検索に基づくコドン置換アルゴリズムと称されることがある。
【００５１】
例えば、グラフ中のノードはユニークな代替遺伝子配列を表していてもよい。グラフ内の兄弟ノードは、特定のコドンの値が異なる場合があり得る。各ノードの子ノードは、次の下流コドンのすべての可能な変更を表し得る。各ノードには、ＧＣ含量、二次構造、及びコドン希少度の偏差を含む、各規則に対応するスコアが割り当てられ得る。各スコアは、特定のコドンを中心とする塩基対ウィンドウ（例えば、４０塩基対ウィンドウ又は任意の他の数の塩基対のウィンドウ）についてのそれぞれのスコアプロファイルにおける野生型配列からの偏差の定量的尺度であり得る。すべてのスコアがそれぞれのプロファイルの閾値を下回っている限り、ノードを拡張して追跡してもよい。あるレベルにある全てのノードが閾値に違反している場合、アルゴリズム（例えば、ゲノムデザインモジュール２０１によって実行される）は、以前のノードに後戻りして異なる分岐を選択してもよい。アルゴリズムが特定の遺伝子に対する解を見つけることができない場合、閾値制約を修正して検索を再開してもよい。いくつかの実施形態において、グラフ検索に基づくアルゴリズムはまた、ゲノムデザインのための対立遺伝子置換において適用され得る。
【００５２】
グラフ検索に基づくコドン（又は対立遺伝子）選択の後、ゲノムデザインモジュール２０１は、ゲノムデザインのための合成及び構築の制約を考慮して、技術的な規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を当てはめてもよい。例えば、ゲノムデザインモジュール２０１は、特定の制限酵素部位及びホモポリマー配列を除去すること、並びにＧＣ含量をバランスさせることなどによって、ＤＮＡ供給業者の制約を満たすために、合成制約２０６を用いてゲノム鋳型２０２をさらに修正してもよい。最後に、ゲノムデザインモジュール２０１は、改変ゲノムを所定のサイズのセグメント（例えば、任意の数の塩基のセグメント）に分割してもよい。例えば、ゲノムデザインモジュール２０１は、最初に改変ゲノムを約５０ｋｂのセグメントに分割し、次いで各セグメントを２〜４ｋｂの合成単位又は断片に分割してもよい。
【００５３】
さらなる実施形態では、ゲノムデザインモジュール２０１はまた、ユーザがゲノムについて手動で指定された改変のリストを提供することを可能にし得る。いくつかの実施形態では、これらの手動で指定された改変（補助デザインノートと称される場合もある）は、実験による検証に由来する解決策、又は一般化された規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴がまだ実行されていない特例を含み得る。例えば、大腸菌を再コード化する場合、ｔＲＮＡＬｅｕを使用してロイシンをコードするＵＵＧコドンが、タンパク質コード遺伝子全体にわたる置換のための７種のコドンのうちの１つとして選択された。しかしながら、同じコドン（ＵＵＧ）が翻訳開始コドンとして現れるとき、それはｔＲＮＡｆＭｅｔによってデコードされるため置換される必要はない。したがって、遺伝子発現レベルの摂動を最小限にするために、これらの開始コドンを置き換えないように補助デザインノートが追加された。自動化された対立遺伝子置換を容易にするために、補助デザインノートをソフトウェアに実装してもよい。他の補助デザインノートでは、以前の実験による試験に基づいて、手動置換が必須遺伝子のＡＧＲコドンに指定された。さらに別の補助デザインノートでは、ｆｄｈＦ遺伝子、ｆｄｎＧ遺伝子、及びｆｄｏＧ遺伝子において、セレノシステイン挿入配列（ＳＥＣＩＳ）部位に重なるコドンが、手動で再コード化された。
【００５４】
ゲノムデザインモジュール２０１は、最終的に複数の代替遺伝子配列（それぞれ異なるコドン又は対立遺伝子選択肢を含む）を生成し、加重スコア付けに基づいて少なくとも１つの代替遺伝子配列をゲノムデザインとして選択してもよい。ゲノムデザインモジュール２０１は、最終ゲノムデザインのファイル（例えば、ＧｅｎＢａｎｋファイル）を含んでいてもよい最終ゲノムデザイン２１０を出力してもよい。いくつかの場合、ゲノムデザインモジュール２０１は、ゲノムデザイン２１０を隣接するセグメントに分割することによって合成可能なＤＮＡを同定してもよく、各セグメントは所定の数の塩基からなる。例えば、ゲノムデザインモジュール２０１はまた、合成及び試験され得る２〜４キロベース（ｋｂ）の合成適合性の断片のリストを生成してもよい。さらに、生物学的制約２０５及び合成２０６のための１又は複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴は、最終ゲノムデザイン２１０に由来する実験による試験に基づいて更新されてもよい。
【００５５】
追加の実施形態では、最終的なゲノムデザインは、基準遺伝コードからの若干の改変を伴う遺伝コード、根本的に再定義された遺伝コード、新規の遺伝コード、又はコドンが非標準アミノ酸（ｎｓＡＡｓ）に対応する遺伝子コードのうちの１つに基づいていてもよい。
【００５６】
図３は、本開示の態様による例示的な方法のフロー図である。具体的には、図３は、生物学的制約、合成制約、及びスコア付けデザインのための規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴の適用に基づいてゲノムをデザインするための例示的な方法の工程を示す。図３の工程は、ゲノムデザインモジュール１０１、ゲノムデザインモジュール２０１、又はスコア付けサブモジュール２０８などのうちの少なくとも１つによるなどして、計算プラットフォームによって実行され得る。図３の方法の結果として、ゲノムデザインが選択され、最終デザインとして出力されてもよい。
【００５７】
図３の方法は、既知のゲノムに関するデータ及び既知のゲノムにおいて置換される対立遺伝子のリストに関するデータを受け取る計算プラットフォームの工程３０２から開始してもよい。例えば、ゲノムデザインモジュール２０１は、ゲノム鋳型２０２（例えば、既知のゲノム参照配列を含む）及び対立遺伝子のリスト２０４を入力として受け取り得る。工程３０４で、計算プラットフォームは、対立遺伝子のリストに基づいて既知のゲノム内の各対立遺伝子の存在を識別し得る。例えば、ゲノムデザインモジュール２０１は、ゲノム配列２０２において置換される全ての対立遺伝子（例えば、禁止コドン）を見出し得る。工程３０６において、計算プラットフォームは、既知のゲノムから各対立遺伝子の存在を除去し得る。例えば、ゲノムデザインモジュール２０１は、既知のゲノム２０２における全ての存在において対立遺伝子の置換又は除去を適用してもよい。いくつかの実施形態では、ゲノムデザインモジュール２０１は、既知のゲノム２０２において禁止コドンの置換又は除去を適用し得る。
【００５８】
工程３０８において、前記算プラットフォームは、既知のゲノムにおける各対立遺伝子の存在を置き換えるための複数の対立遺伝子選択肢を決定し得る。例えば、ゲノムデザインモジュール２０１は、既知のゲノム２０２における各対立遺伝子の存在のそれぞれを置き換えるために利用され得るいくつかの同義対立遺伝子があることを識別し得る。代替の構成では、前記方法の工程３０６及び工程３０８は、ゲノムデザインモジュール２０１によって実行される１つの工程として組み合わせることができ、ゲノムデザインモジュール２０１は、既知のゲノムから除去する対立遺伝子を識別し、各対立遺伝子の存在を置き換えるための複数の対立遺伝子選択肢を決定し得る。
【００５９】
工程３１０で、前記計算プラットフォームは、既知のゲノムに基づいてゲノムデザインのための複数の代替遺伝子配列を生成し得る。例えば、ゲノムデザインモジュール２０１は複数の代替遺伝子配列を生成してもよく、それぞれの代替遺伝子配列は前記複数の同義対立遺伝子選択肢とは異なる対立遺伝子選択肢を含む。
【００６０】
工程３１２において、前記計算プラットフォームは、各規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアをそれぞれの代替遺伝子配列に割り当てることによって、それぞれの代替遺伝子配列に対して複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を当てはめて、それによりそれぞれの代替遺伝子配列に当てはめられた前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコア得ることができる。例えば、ゲノムデザインモジュール２０１又はスコア付けサブモジュール２０８は、生物学的制約２０５及び合成制約２０６についての１又は複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を利用して、それぞれの対立遺伝子選択肢に関して各規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアを計算してもよい。すなわち、スコア付けサブモジュール２０８は、コーディングｍＲＮＡ二次構造の保存、リボソーム結合部位モチーフの保存、及び内部リボソーム休止部位モチーフの保存などを含む、各規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてスコアを計算する。（異なる対立遺伝子選択肢を含む）それぞれの代替遺伝子配列は、規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴のそれぞれについて計算されたスコアを有し得る。
【００６１】
工程３１４では、計算プラットフォームによって、前記複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴についてのスコアの加重された組み合わせに基づいて、それぞれの代替遺伝子配列をスコア付けしてもよい。例えば、ゲノムデザインモジュール２０１は、特定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴に由来するスコアの加重された組み合わせとして、それぞれの代替遺伝子配列についてスコア付けを実行してもよい。工程３１６において、計算プラットフォームは、加重スコア付けに基づいて、ゲノムデザインとして少なくとも１つの代替遺伝子配列を選択してもよい。例えば、ゲノムデザインモジュール２０１は、どの代替遺伝子配列が所定の閾値を超える加重スコアを含むかを同定することに基づいて、１又は複数の代替遺伝子配列を最終ゲノムデザイン２１０として選択し得る。場合によっては、選択の後に、ゲノムデザインモジュール２０１は、最終ゲノムデザイン２１０を、合成及び試験に利用することができるＧｅｎｂａｎｋファイルとして出力してもよい。いくつかの実施形態では、どの代替遺伝子配列が所定の閾値を超える加重スコアを含むかを同定した後、同定された代替遺伝子配列を個々に又はライブラリーとして（例えば、配列が混合されたもの）、実験により試験してもよい。さらなる実施形態では、ゲノムデザインモジュール２０１は、ルール予測と実験により観察された生存率の比較に基づいて、複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴における１又は複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を更新してもよい。例えば、最終ゲノムデザイン２１０を合成して生存率について試験し、合成された最終ゲノムデザイン２１０を試験した結果を（他のデザインの結果と共に）使用して将来のゲノムデザインのための新しい規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を更新及び導出してもよい。
【００６２】
さらなる実施形態では、計算プラットフォーム（例えば、ゲノムデザインモジュール１０１又はゲノムデザインモジュール２０１を備える計算装置１００）を利用することなどによって、ゲノムデザインにおける１又は複数の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を更新し得る。第一に、ゲノムデザインの１又は複数の特徴を少なくとも１つの細胞に導入してもよい。いくつかの実施形態において、ゲノムデザインの１又は複数の特徴が、野生型遺伝子型に対して選択するため及び／又は相同組換えを促進するために、ＤＮＡ切断を用いて少なくとも１つの細胞に導入され得る。特徴を細胞に導入する他の例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、又は制限エンドヌクレアーゼなどを使用することを含み得る。
【００６３】
他の実施形態において、ゲノムデザインの１又は複数の特徴は、リコンビナーゼ／インテグラーゼを使用することによって少なくとも１つの細胞に導入され得る。特徴を細胞に導入する別の例は、多重自動ゲノム工学（ＭＡＧＥ）、λレッド組換え、部位特異的リコンビナーゼ／インテグラーゼ（例えば、Ｃｒｅ、ＰｈｉＣ３１、λインテグラーゼ、Ｆｌｐなど）、又はリコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）などの使用を含み得る。他の実施形態では、ゲノムデザインの１又は複数の特徴を少なくとも１つの細胞に導入することは、ゲノムデザインに基づいて部分ゲノム又は全ゲノムを合成することをさらに含み得る。さらに、いくつかの実施形態では、１又は複数の特徴を、動態プレートリーダーを使用した増殖アッセイによって試験され得る。他の実施形態において、１又は複数の特徴は、タンパク質産生を試験するためのアッセイによって試験され得る。別の実施形態において、１又は複数の特徴は、所定の時点で細胞集団の代表的な部分を配列決定することによって試験され得る。例えば、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）を使用して、どの遺伝子型が集団において濃縮又は枯渇するようになるかをモニターしてもよく、これは相対的な適応度情報として解釈され得る。
【００６４】
少なくとも１つの細胞に導入された１又は複数の特徴のゲノム生存率を同定して表現型を評価するために、アッセイによって少なくとも１つの細胞に導入された１又は複数の特徴を試験してもよい。いくつかの実施形態において、１又は複数の特徴は、ベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、バクテリオファージ、又は人工染色体）上で試験され得るか、染色体に組み込まれ得る。前記試験に基づいて、少なくとも１つの細胞に導入された１又は複数の特徴が、ゲノムデザインのための１又は複数の所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴によって実行可能又は不合格であると予測されると判定され得る。前記判定に基づいてゲノムデザインのための所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴が最終的に更新され得る。ゲノムデザインのための１又は複数の所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴は、表現型のパラメータ及び遺伝子型のパラメータの１又は複数を含み得る。
【００６５】
さらなる実施形態では、計算プラットフォームは、統計的技術及び機械学習アルゴリズムにさらに基づいてゲノムデザインのための所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴が更新され得る。例えば、計算プラットフォームは、これに限定されないが、深層学習を含む表現学習アルゴリズムを使用して、新しい規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を更新及び／又は自動的に推論し得る。教師付き学習又は非教師付き学習、半教師付き学習、強化学習、及び深層学習を含む、新しい規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を更新及び学習するために、他の機械学習技術を使用してもよい。これらの技術は、畳み込みニューラルネットワーク、ランダムフォレスト、隠れマルコフモデル、オートエンコーダ、及びボルツマンマシンなどの特定の技術を含み得る。別の例では、ユーザは、分析に基づいて新しい規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴を手動で定義するために計算プラットフォームを利用してもよい。
【００６６】
さらなる実施形態では、ゲノムデザインは、計算プラットフォーム（例えば、ゲノムデザインモジュール１０１又はゲノムデザインモジュール２０１を含む計算装置１００）によって生成され、所定の規則、制約、条件、パラメータ、及び特徴のセットを満たさない前記ゲノムデザイン内の１又は複数の特徴を決定することにより、計算プラットフォームによってテストされ得る。いくつかの実施形態では、所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴のセットは、表現型のパラメータ及び遺伝子型のパラメータの１又は複数を含み得る。計算プラットフォームは、既知のゲノム配列のサンプル（例えば、ゲノムデザインの元になる既知のゲノム配列）を取得又はそれにアクセスしてもよく、計算プラットフォームは、既知のゲノム配列のサンプルをさらに分析してもよい。いくつかの実施形態では、ゲノムデザインにおける個々の突然変異を並行して試験することにより、計算によって所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴のセットを満たさないゲノムデザイン中の１又は複数の特徴を決定し得る。他の実施形態では、ゲノムデザインおける個々の突然変異を多重方式で試験することにより、計算によって所定の規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴のセットを満たさないゲノムデザイン中の１又は複数の特徴を決定し得る。
【００６７】
計算プラットフォームは、所定のデザイン目的を満たし、生存の可能性を高めるために実行され得るゲノムデザインに対する改変を予測し得る。例えば、所定のデザイン目的は、変更する必要があり得る天然ゲノムの１又は複数の特徴を含み得る。天然ゲノム配列は生存可能であり得るが、デザインが依然として生存可能であるかどうかを決定するためには、再コード化されたゲノム配列又はゲノムデザインを試験する必要があり得る。改変を予測した後、計算プラットフォームは、予測された改変を試験して、改善されたゲノムデザインを生成し得る。いくつかの実施形態では、ゲノムデザインについて予測された改変が混合されたものとして試験され得る。他の実施形態では、ゲノムデザインについて予測された改変は、遺伝的な多様性及び選択を用いて試験され得る。
【００６８】
上記の開示は本発明を全般的に説明するものである。本明細書に開示された全ての参考文献は、参照により明示的に組み込まれる。以下の特定の実施例を参照することによって、より完全な理解を得ることができるが、これらの実施例は例示のみを目的として本明細書に記載され、本発明の範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を説明する目的で示されており、いかなる形でも本開示を限定することを意図しない。本実施例は、本明細書に記載の方法と共に、現在の好ましい実施形態の代表例であり、例示であり、本開示の範囲に対する限定として意図されていない。当業者は、特許請求の範囲によって定義されるような本開示の趣旨に包含される変更及び他の使用を思い付くであろう。他の均等な実施形態は、本開示、図面及び添付の特許請求の範囲を考慮すると明らかになるであろう。
【００７０】
実施例１
５７コドンゲノムのデザイン、合成、及び試験
ある態様によれば、本明細書には、根本的に再コード化された大腸菌をデザイン及び構築するための方法が記載される。遺伝子コドン別の目的で使う再コード化は、自然界では通常は見られない機能でゲノムを強化するための強力なアプローチである。基準遺伝コードの縮重により、同じアミノ酸が複数の同義コドンによってコードされることが可能になる。天然生物の間で６４コドンのコードがほぼ普遍的であること（Ｃｒｉｃｋ、１９６３）は、コドン置換を合成生物の遺伝的単離のための強力な手段としている。例えば、大部分の生物は細胞タンパク質の翻訳のための共通の６４コドンの鋳型に従うが、いくつかの原核生物ゲノム及び真核生物のゲノムに見られるこの普遍的なコードからの逸脱（Ａｍｂｒｏｇｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００７、Ｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｏｂａ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１、Ｍａｃｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９７９、Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）により、拡大した遺伝コードを有する合成生物の探究が促進された。
【００７１】
ゲノム全体の同義コドン置換により、遺伝的隔離及び拡張された生物学的機能を示す固有の生物を構築するためのメカニズムが提供される。コドンがゲノム全体で同義的に置き換えられてその同族ｔＲＮＡが除去されると、ゲノム再コード化生物（ＧＲＯ：ｇｅｎｏｍｉｃａｌｌｙ  ｒｅｃｏｄｅｄ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）は失われたコドンをもはや翻訳しないことがある（Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３ｂ）。したがって、天然のウイルス、プラスミド、及び他の生物から得られたＤＮＡが不適切に翻訳されて、再コード化菌株をウイルス感染及び遺伝子水平伝播に対して非感受性にすることになりため、遺伝的隔離が達成される（図４）。
【００７２】
例えば、図４は、大腸菌ファージの集団について、未割り当ての欠落コドン（例えば、同族翻訳なし）の数の増加を伴う再コード化大腸菌株において適切に翻訳されると予測されるバクテリオファージ遺伝子の割合を示す。本実施例において、１種のコドン＝ＵＡＧ、３種のコドン＝ＵＡＧ、ＡＧＧ、及びＡＧＡ、並びに７種のコドン＝ＵＡＧ、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＵＧ、及びＵＵＡである。
【００７３】
遺伝子翻訳百分率は、以下の式によって計算することが可能である。
【００７４】
【数１】
2019519233.tif 000003
【００７５】
さらに、新規の化学的性質を有するタンパク質は、生物直交型反応性、光応答性要素、又は生物物理学的プローブに対する化学的結合手（chemical handle）として機能する非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）を組み込むための置換されたコドンを再割り当てすることによって探索され得る（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）。コドンの再割り当てにより、環境中に天然には存在しないｎｓＡＡｓへの代謝依存性を確立することも可能になり、環境、産業、及び医療用途において主要な考慮事項となり得るＧＲＯの生物学的封じ込めを強化する（Ｍａｒｌｉｅｒｅ、２００９、Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５，  Ｒｏｖｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）。いくつかの実施形態では、非標準アミノ酸（ｎｓＡＡ）は、２０個の標準タンパク質をコードするアミノ酸以外の任意のアミノ酸を含み得る。言い換えれば、ｎｓＡＡは、所与の天然生物のコドンとは割り当てが異なる１又は複数のコドンを使用して組み込まれた任意のアミノ酸を含み得る。
【００７６】
本明細書には、産業用途に関連するウイルス耐性の生物学的に封じ込められた生物を生産することを目的とした、ゲノム全体にわたる複数のコドン置換のための方法が記載される。７種の異なるコドンの全６２，２１４の出現箇所（全大腸菌コドンの５．４％に相当）が同義的に置換されている大腸菌ゲノムの２．５Ｍｂ（６３％）の実験による試験と共に、計算によるデザインを提示する（図５Ａ〜図５Ｃ）。新たに再コード化されたゲノムは、本明細書中に記載されるようにｒＥ．ｃｏｌｉ−５７と称され得るものであり、構築されると、５７個の基準６４コドンからなる（図６）。いくつかの合成ゲノムが既に報告されているが（Ｂｌｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．、２０００、Ｃｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００２、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００３、Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００５、Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０、Ａｎｎａｌｕｒｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）、本願の規模の機能的に改変された合成ゲノムは、未だ探求されていない（図５Ｃ）。
【００７７】
いくつかの場合において、コドン使用の変更は、翻訳開始からタンパク質折り畳みまでの複数のレベルで遺伝子発現及び細胞適応度に影響を及ぼし得る（Ｋｕｄｌａ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、Ｔｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０、Ｐｌｏｔｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１、Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３、Ｑｕａｘｅｔ  ａｌ．、２０１５、Ｂｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６）。それでも、コドン選択肢の個々の影響を解析することは困難なままであることがあり、新しいゲノムデザインに対する障壁を課している。本開示は、合成ゲノムのプロトタイプを迅速に作成するための予測ツール及び効率的な技術を提供する。
【００７８】
これまでにない規模及び複雑さのゲノム工学の目標に取り組むため、計算ツール、費用対効果の高いデノボ合成戦略、及び包括的な実験による検証の計画が本明細書に記載される。例えば、７種のコドンの全ての出現箇所を置き換えるために必要とされる改変の数は、ＵＡＧコドンのゲノム全体における置き換えのために以前に用いられた単一コドン編集戦略の現在の能力をはるかに超え得る（Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３ｂ，  Ｉｓａａｃｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）。ＭＡＧＥ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００９）又はＣａｓ９（Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３）を使用して複数の対立遺伝子を同時に編集し得るが、これらの戦略は多数のオリゴヌクレオチド及びＲＮＡガイドを使用した広範囲のスクリーニングを含み、オフターゲット変異を引き起こす可能性があり得る（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００９）。デノボ合成は、生物学的鋳型とは無関係にほとんど無制限の数の改変を可能にする。さらに、ＤＮＡ合成のコスト急落により、ゲノム全体を合成するための経済的障壁が減っている。
【００７９】
この実施例では、終止コドンＵＡＧ、アルギニンコドンＡＧＡ、及びアルギニンコドンＡＧＧの３種のコドンを置換のために選択した（図６）。これらのコドンはまたゲノム中の最も稀なコドンに含まれ、必要とされる変化の数を最小にした。他のコドンは、それらのアンチコドンが内因性アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによりｔＲＮＡ同一性要素として認識されないように選択され、それにより異種ｔＲＮＡはｎｓＡＡの組込みの際に標準アミノ酸で誤ってチャージされることはない。最後に、明確な再割り当てを可能にするために、自身のｔＲＮＡが同一アミノ酸に対する他の同義コドンと重複しないコドンが選択された。したがって、ＡＧＡ（Ａｒｇ）、ＡＧＧ（Ａｒｇ）、ＡＧＣ（Ｓｅｒ）、ＡＧＵ（Ｓｅｒ）、ＵＵＧ（Ｌｅｕ）、ＵＵＡ（Ｌｅｕ）、及びＵＡＧ（Ｓｔｏｐ）の７種のコドン（「禁止コドン」と称する）が置換対象となった（図５Ａ〜図５Ｃ、図６、図３）。
【００８０】
合成コストを最小にし、ゲノム安定性を改善するために、本明細書中に記載される５７コドンのゲノムは、減少ゲノム大腸菌株ＭＤＳ４２に基づく（Ｐｏｓｆａｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）。開示された計算ツールにより、生物学的制約及び技術的制約を満たしながら、すべてのタンパク質をコードする遺伝子中の標的コドンの全ての存在に対する同義置換が自動化される。これらの制約の例を、図８及び図９、並びに表１及び表２に示す。具体的には、すべてのコード遺伝子のアミノ酸配列は保存され、タンパク質合成レベルは、禁止コドンを運搬する重複する遺伝子を分離して、潜在的な組換え事象を最小にするための同義コドンを導入することによって維持された（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００５、Ｔｅｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）。残りのコドンの相対的コドン使用頻度は、翻訳要求を満たすために（Ｙｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）、且つ、予想されるリボソーム結合部位（ＲＢＳ）強度、ｍＲＮＡ二次構造折り畳みエネルギー、及びＧＣ含量を含む一次ヌクレオチド配列の特徴を保持するために（Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３ｂ、Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３ａ）保存された。最後に、最終ゲノムデザインから合成が困難な配列を回避（例えば、ホモポリマーの除去、極端なＧＣ含量領域の正規化、及び反復配列の減少）するように調整した（図９Ａ〜図９Ｇ）。
【００８１】
全体として、禁止コドンはゲノム全体に一様に分布しており、平均して１遺伝子あたり約１７コドンの変化であった。コドン置換の成功のための厳密な試験を提供する必須遺伝子（Ｙａｍａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００８）は、全禁止コドンの約６．３％（６２，２１４コドンのうち３，９０３コドン）を含む。全体として、再コード化されたゲノムは、禁止コドンの全ての出現箇所を除去し、一次ＤＮＡ配列を調整してデザイン上の制約に適応するために、合計１４８，９５５箇所の変更を必要とした。
【００８２】
デザインされた後に、再コード化されたゲノムは２〜４キロベース（ｋｂ）の１，２５６個の合成適合性のある重複した断片で解析された。約５０ｋｂの８７個のセグメントをそれぞれ構築して試験した（図８）。約５０ｋｂのセグメントは、平均して１セグメント当たりの全遺伝子数が約４０であり必須遺伝子数が約３である、管理可能な数の遺伝子を含む。さらに、５０ｋｂは酵母中での構築及び大腸菌へのシャトリングのために都合のよいサイズであり得ることが見出された。重要なことに、以前の研究（Ｍａｎｄｅｌｌ、Ｄ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｎａｔｕｒｅ．５１８、５５−６０（２０１５）；Ｋ．Ｍ．Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｃａｓ９  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１０、１１１６−１１２１（２０１３））に基づいて、各セグメントは平均してほぼ１個のみの潜在的に致死的な再コーディングの例外含むと推定された。
【００８３】
図１０Ａ〜図１０Ｃは、本実施例において利用された実験戦略を概説する。簡潔には、各セグメントを出芽酵母中で構築し、低コピープラスミド上で大腸菌に直接的にエレクトロポレーションした。必須遺伝子におけるエラーは致死的となり得るため、対応する染色体セグメントを順次欠失させることにより、再コード化遺伝子の機能についてのストリンジェントな試験が提供される。これまでに、全ゲノムの６３％及び必須遺伝子の５３％を占める、５５個のセグメントにわたる２，２２９個の再コード化遺伝子の染色体欠失が行われた（図１１）。さらに、これら５５個のセグメントのうち４４個のセグメント中の再コード化遺伝子はすべて、最適化を必要とせずに野生型染色体遺伝子を補完することがわかった。これらの菌株の増殖を評価し、遺伝子発現をＲＮＡ−Ｓｅｑにより分析した（図１２Ａ〜図１２Ｂ）。さらに、これらの菌株の大部分は、染色体欠失に対する適応度の低下はごくわずかであった（図１２Ａ、図１３Ａ、及び図１３Ｂ）。
【００８４】
さらに、２０８個の再コード化遺伝子のＲＮＡ−Ｓｅｑ分析により、コドン置換により大多数はわずかな転写の変化しか示さないことが示唆される（図１４Ａ〜図１４Ｂ）。２８個の遺伝子のみが有意に差次的に発現されることが見出された（すなわち、２倍以上の変化、ｐ＜０．０１）（２７個が高発現、１個が低発現）。
【００８５】
野生型セグメント全体を補完することができなかった再コード化セグメント（例えば、５５個のセグメントのうち１１個のセグメント）を、原因遺伝子の位置が特定されるまで染色体の狭い領域を欠失させることによって試験した。全体として、同義コドン置換のために細胞生存能を維持することができなかった１３個の再コード化必須遺伝子が見出された。いくつかの実施形態では、これらは「例外的デザイン」と呼ばれることがある。
【００８６】
例外的デザインを解決するためのトラブルシューティングパイプラインを開発するためのテストケースとして、セグメント４４を選択した（図１５Ａ〜図１５Ｂ）。遺伝子ａｃｃＤについて示されているように、ＲＢＳ強度及びｍＲＮＡの折り畳みが最初に分析され、遺伝子発現における破壊の最も可能性の高い原因を特定した（Ｐｌｏｔｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１、Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３、Ｂｏｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６）。次に、縮重ＭＡＧＥオリゴを使用して、生存可能な代替コドンのプロトタイプを迅速に作成した（図１６）。ｍＲＮＡ二次構造スコアを計算するために、目的のコドンの周りに４０ｂｐの移動ウィンドウ（sliding window）を使用した。ｍＲＮＡ二次構造をスコア付けするため、目的のコドンに対して−３０〜＋１００ヌクレオチドである歪んだ間隔（skewed interval）としてアルゴリズムをさらに更新した。特に、最初の１００ヌクレオチドのコドンについては、前記ウィンドウは遺伝子の開始部を中心としていた。
【００８７】
最後に、よりストリンジェントなｍＲＮＡ及びＲＢＳのスコア付けパラメータを用いて新たな再コード化配列を計算により生成し（図１５Ａ、図１５Ｂ、図１７）、複数サイクルのλレッド組換えを介して再コード化セグメントに導入した。染色体を順次欠失させることにより生存クローンを選択した。
【００８８】
いくつかの場合において、全ての生存クローンは、改良されたデザインのＮ末端及び初期の（致死的）デザインのＣ末端を有するａｃｃＤの特定の配列を有しており、成功した同義コドン置換のためのＮ末端最適化の重要性が強調される（Ｋｕｄｌａ  ｅｔ  ａｌ．、２００９、Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３）。さらに、２種類の遺伝子間の高度な相同性によると予想されるそのような組換え事象は、配列を効果的に入れ替えて生存可能な再コード化コドンの検索空間を増加させる。
【００８９】
適切な染色体発現をさらに確認するために、λインテグラーゼを用いて再コード化セグメントを染色体に組み込んだ。次いで、ａｔｔＰ特異的Ｃａｓ９媒介ＤＮＡ切断を使用して、組み込まれていないプラスミドをすべて除去し、ゲノムごとに単一の組込みイベントを残した。セグメント組込み時に適応度の変化は見られなかった（図１３Ａ〜図１３Ｂ）。最後に、すべての検証された菌株のＤＮＡ配列分析は、菌株の遺伝子操作において予想され得る、突然変異のある程度のインビボ蓄積を示唆する可能性がある。それでも、完全なゲノム再コード化を達成するために、最終菌株において、非致死的復帰変異及びサイレント変異がＭＡＧＥを用いて修正され得る。
【００９０】
特定の態様によれば、コドン使用頻度及びｔＲＮＡアンチコドンの両方に対する実質的な改変により、コドン逆転を防ぐための適切な選択を行わずに、減少した遺伝コードの不安定性がもたらされ得る（Ｏｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９）。しかしながら、再コード化状態への機能的依存を確立することにより、改変されたゲノムを安定化され、ストリンジェントな生物学的封じ込めメカニズムが提供され得る（Ｍａｒｌｉｅｒｅ、２００９）。一例として、菌株が生存可能なままであるためにはｎｓＡＡを必要とするよう、全てのＵＡＧコドンが除去されて２種の必須遺伝子（ａｄｋ及びｔｙｒＳ）が改変された生物学的に封じ込められた株を開発した（Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）。最終的なｒＥｃｏｌｉ−５７株が、類似の生物学的封じ込めメカニズムを支持するかどうかを決定するために、５７コドン型のａｄｋ及びｔｙｒＳの両方がインビボで機能的に活性であることを確認した。さらに、再コード化ｎｓＡＡ依存性ａｄｋ遺伝子は、元の菌株について報告されたものと同様の適応度及び極めて低い回避率を有することが見出された（図１８Ａ〜図１８Ｂ）。
【００９１】
禁止コドンの全ての出現箇所がゲノムから除去された後でさえ、５種のｔＲＮＡ（ａｒｇＵ、ａｒｇＷ、ｓｅｒＶ、ｌｅｕＸ、ｌｅｕＺ）及び１種の放出因子（ｐｒｆＡ）の遺伝子が除去されるまで遺伝コードは変化しないままであり得る。ｒＥｃｏｌｉ−５７が完全に再コード化されてｔＲＮＡが除去された時点で、前記菌株をウイルス耐性及び遺伝子水平伝播などの新規な性質について試験してもよい。さらに、直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡのペアを導入して、最大４種のｎｓＡＡまで遺伝コードを拡張可能である。
【００９２】
最終的には、本明細書に記載されているように、堅牢なデザインソフトウェアによって支持される階層的なインビボ検証アプローチは、大規模合成ゲノム構築及び遺伝コードの根本的な変更に利用可能であり得る。遺伝的に隔離され再コード化ゲノムは、生体細胞の合成機能を拡張し、バイオテクノロジーにおける幅広い応用のための固有の枠組みを提供する可能性がある。
【００９３】
ＤＮＡ合成
ＤＮＡは、産業連携先であるＧｅｎ９、ＳＧＩ−ＤＮＡ、Ｔｗｉｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｅｗｉｚ、及びＩＤＴ  ＤＮＡテクノロジーによって合成された。合成パイプラインは、合成誤り率及びＱＣの制約を考慮して、合成コスト及び所要時間を低減させることを主目的として開発された。Ｇｅｎ９がＤＮＡの大部分を合成し、サイズが１．２〜４．２ｋｂの断片として３，９６０ｋｂが提供された。追加の合成は、Ｔｗｉｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（１．４〜２．０ｋｂの範囲の断片として３０ｋｂ）、ＩＤＴ（１．０〜１．７ｋｂの範囲の断片として２７ｋｂ）、及びＧｅｎｅｗｉｚ（１２．４〜３．０ｋｂの範囲中の断片として２６ｋｂ）によって提供された。追加の３２８ｋｂ（ＳＧＩ−ＤＮＡ）、３６ｋｂ（Ｔｗｉｓｔ）、及び６ｋｂ（Ｇｅｎ９）が合成されたが、最終ゲノムセグメント合成においては使用されなかった。
【００９４】
合成ＤＮＡのＰＣＲ増幅
全ての合成ＤＮＡを構築前にＰＣＲ増幅及び精製した。３０μＬのＰＣＲ反応物を以下のように調製した：１μＬの希釈鋳型ＤＮＡ（１〜５ｎｇ／μＬの範囲の１μＬ  合成鋳型ＤＮＡ（ｓｙｎＤＮＡ）、９μＬのＴＥ緩衝液中に希釈）、２μＬのプライマーミックス（１０μＭの各プライマー、５０μＬのＴＥ緩衝液中に混合）、１５μＬの２ｘＳｅｑＡｍｐ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．）、及び１５μＬのＰＣＲグレードの水。ＰＣＲサイクルは、９５℃：１分、９８℃：１０秒、６０℃：１５秒、６８℃：２分、３５サイクルであった。１％アガロースゲルを用いて１μＬのＰＣＲ産物を分析した。２ｘＫＡＰＡ−ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて失敗したＰＣＲの最適化を行った。３０μＬのＰＣＲ反応物を以下のように調製した：１μＬの希釈鋳型ＤＮＡ（同上）、２μＬのプライマーミックス（同上）、１５μＬの２ｘＫＡＰＡ−ＨｉＦｉ、及び１２μＬのＰＣＲグレードの水。ＰＣＲサイクルは、９５℃：１分、９８℃：２０秒、６０℃：１５秒、７２℃：２分、３０〜３５サイクルであった。ＰＣＲ産物を２％Ｅ−ｇｅｌ  Ｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を用いてゲル精製した。
【００９５】
出芽酵母のセグメント構築
セグメント構築には、ＧｅｎｅＡｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｏｒｄｅｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を改変して用いた。線状化のために使用する制限部位ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩを含むようにベクターｐＹＥＳ１Ｌを改変し、出芽酵母ウラシル選択マーカーをベクター骨格に付加した（「ｐＹＥＳ１Ｌ−ＵＲＡ」と称する）。３７℃で５時間、その後６５℃で２０分の酵素失活、２０℃で３０分のＥｎｄ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｍｏｄｕｌｅ（ＮＥＢ）処理により、両方の酵素を用いてベクター消化を行った。線状ベクターを精製し（Ｚｙｍｏ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）、使用前にＤＮＡゲル上でサイズを確認した。各構築反応（１０〜１５断片が各構築に使用される）について、増幅した合成断片（各４００ｎｇ）を混合して精製し、次いで１００ｎｇの精製された線状ベクターｐＹＥＳ１Ｌ−ＵＲＡを加えた。ＳＡＶＡＮＴ  ＤＮＡ  １２０  ＳｐｅｅｄＶａｃ濃縮器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を使用してベクター／断片ＤＮＡ混合物を約１０μＬの体積に濃縮した。
【００９６】
ＭａＶ２０３コンピテント細胞の形質転換は製造業者の指示に従って行った。トリプトファンを含まないＣＭグルコース培地に細胞をプレーティングし、３０℃で３日間インキュベートした。コロニーＰＣＲを使用してセグメント構築についてスクリーニングした。酵母コロニーを１５μＬの０．０２Ｍ  ＮａＯＨ中に溶解し、９５℃で５分間煮沸し、５分間氷上に保った後、４０μＬのｄｄＨ２Ｏで希釈した。１．５μＬの混合物を、ＫＡＰＡ２Ｇマルチプレックスポリメラーゼ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたマルチプレックスＰＣＲの鋳型として使用した。ＰＣＲ条件は、９８℃：５分、９８℃：３０秒、６２℃：３０秒、７２℃：３０秒、７２℃：５分（３２サイクル）であった。陽性ＰＣＲを示すコロニーのみを使用した。大腸菌形質転換のために、細胞を１５μＬの０．０２Ｍ  ＮａＯＨ中に溶解し、ガラスビーズと共に５分間ボルテックスし、氷上に置いた。１．５μＬの溶解混合物をエレクトロコンピテントＴＯＰ１０細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に加え、直ちにエレクトロポレーションし（１．８ｋＶ、２５μＦａｒａｄｓ、２００Ω）、３７℃で１時間回復させた後、スペクチノマイシン選択プレート上にプレーティングした。
【００９７】
大腸菌法−菌株及び培養
エレクトロコンピテント大腸菌ＴＯＰ１０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＢＷ３８０２８（Ｃｏｎｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）において実施されたセグメント１９、２２、２３、４３、４４、４７を除くすべてのセグメントについての全プロセスに使用した。トラブルシューティングにＥｃＭ２．１無処理菌株を使用した（ＥｃＭ２．１は、ＭＡＧＥに対して最適化された菌株である。大腸菌ＭＧ１６５５  ｍｕｔＳ＿ｍｕｔ  ｄｎａＧ＿Ｑ５７６Ａ  ｅｘｏＸ＿ｍｕｔ  ｘｏｎＡ＿ｍｕｔ  ｘｓｅＡ＿ｍｕｔ１２５５７００：：ｔｏｌＱＲＡ  Δ（ｙｂｈＢ−ｂｉｏＡＢ）：：［λｃＩ８５７  Ｎ（ｃｒｏ−ｅａ５９）：：ｔｅｔＲ−ｂｌａ］）（Ｇｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）。
【００９８】
液体培地は、溶原培地のＬｅｎｎｏｘ製剤（ＬＢＬ：１％ｗ／ｖバクトトリプトン、０．５％ｗ／ｖ酵母抽出物、０．５％ｗ／ｖ塩化ナトリウム）、及びスペクチノマイシン（９５μｇ／ｍＬ）、クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）、カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）、ゼオシン（１０μｇ／ｍＬ）などの適切な選択剤からなるものであった。固体培養培地は、必要に応じて同濃度の抗生物質を含有する、１．５％ｗ／ｖのＢａｃｔｏ  Ａｇａｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むオートクレーブ処理したＬＢＬからなるものであった。
【００９９】
プラスミド形質転換、Ｌａｍｂｄａ  Ｒｅｄ組換え、ＭＡＧＥ
ｐＹＥＳ１Ｌ−ＵＲＡプラスミドで形質転換されたＴＯＰ１０細胞及びＢＷ３８０２８細胞（Ｃｏｎｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）は、全てのパイプライン菌株遺伝子操作の対象であった。ベクターｐＹＥＳ１Ｌ−ＵＲＡ上の再コード化セグメントの平均コピー数は１．８プラスミド／ゲノムであることがわかった。
【０１００】
相同染色体上の再コード化されていないセグメント配列のノックアウトは、ゲノム遺伝子座を特異的に標的とするｌａｍｂｄａ  ｒｅｄ組換えによって達成される。カナマイシンカセット欠失の５０ｂｐ相同性アームはゲノムセグメントの両側を標的とし、これは再コード化セグメントを有するプラスミドの両側とは配列が異なる。よって、前記カセットはゲノムセグメントを特異的に置換する。
【０１０１】
全ての細胞をｐＫＤ７８プラスミド（Ｄａｔｓｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）で形質転換してｌａｍｂｄａ  ｒｅｄ組換え機構を導入した。アラビノース（２μｇ／ｍｌ）中でリコンビナーゼ発現を２時間誘導した後、二本鎖ＰＣＲ産物又はＭＡＧＥオリゴヌクレオチドのいずれかを用いてＤＮＡを形質転換した。具体的には、１００ｎｇの二本鎖ＰＣＲ産物を用いて全てのカナマイシンカセットを欠失させた。カナマイシン選択能をモニタリングするために、各組換えを陰性対照（脱イオン水）と対にした。他の組換え実験を既報（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００９）に記載のとおり行い、全オリゴヌクレオチドプールを最大５μＭに調整した。３４℃で３時間回復させた後、細胞を許容培地（ＭＡＧＥ用）又は選択培地（例えば、カナマイシン）中にプレーティングし、３４℃で一晩インキュベートした。プレーティングした細胞の量は、ＭＡＧＥ実験では約１０３細胞、プラスミド形質転換では約１０７細胞、及びカナマイシンカセット欠失では約１０８細胞であった。次に、得られた菌株をＰＣＲにより検証した。
【０１０２】
オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＣＲオリゴヌクレオチド及びプライマーの完全な表を表３及び表４に見出すことができる。組換え又はＳａｎｇｅｒ配列決定に使用するＰＣＲ産物を、製造業者の標準的プロトコルに従ってＫａｐａ  ２Ｇ  Ｆａｓｔポリメラーゼを用いて増幅した。既報の方法（Ｉｓａａｃｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）に従って、ＫＡＰＡ２Ｇ  Ｆａｓｔ  ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲキットを用いた多重遺伝子型判定に多重対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ｍａｓｃＰＣＲ）を使用した。ｍａｓｃＰＣＲ用のプライマーは、この目的のために特別に構築された自動化ソフトウェアを使用して設計された。サンガー配列決定反応は、第三者（Ｇｅｎｅｗｉｚ）を通じて実施した。ｐＫＤ７８形質転換工程、カナマイシン欠失工程、ａｔｔＰ−ゼオシン挿入工程、及びλ組込み工程の後にｍａｓｃＰＣＲスクリーニングを実施した。
【０１０３】
再コード化セグメントのゲノム組込み
λインテグラーゼを、再コード化セグメントプラスミドの大腸菌ゲノムへの組込みに使用した（Ｈａｌｄｉｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。ａｔｔＰ部位を、ゼオシン耐性マーカーと共に、ｌａｍｂｄａ  ｒｅｄ組換えによってセグメントベクターに付加した。次いで、λインテグラーゼを４２℃で６時間熱誘導し、細胞をスクリーニングのためのスペクチノマイシンプレート及びカナマイシンプレート上にプレーティングした。ａｔｔＰ特異的プライマー及びａｔｔＢ特異的プライマー（ａｔｔＢ−ｓｅｑ−ｆ：ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＴＧＣ  ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＧＴＧ  ＴＴＧ  ＡＧ；ａｔｔＢ−ｓｅｑｒ：ＧＡ  ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＣＧＣ  ＧＴＧ  ＡＧＧ；ａｔｔＰ−ｆ：ＧＣＧＣＴＡＡＴＧＣＴＣＴＧＴＴＡＣＡＧ；ａｔｔＰ−ｒ：ＧＡＡＡＴＣＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴ  ＧＡＣＴＧＡ）、並びに対立遺伝子特異的プライマー（表４）を用いてＰＣＲスクリーニングを行い、正しいプラスミド組込みを有するクローンを同定した。
【０１０４】
Ｃａｓ９誘導性ベクター除去
組み込み後にさらに検証ステップを実行して、細胞中に再コード化セグメントの他のコピーが残っていないことを確認した。染色体への組込みの前には、全ての再コード化セグメントプラスミドがλ組込みのためのａｔｔＰ部位を含んでいる。λ組込みによりａｔｔＢ部位へのゲノム組込み時にａｔｔＰ配列が改変されるので、組込まれていないプラスミドのみがインタクトなａｔｔＰ配列を保有する。ＳｐＣａｓ９タンパク質が全てのエピソーム性（非組込み）セグメントプラスミドにおいて二本鎖切断を誘導するようなａｔｔＰ特異的Ｃａｓ９標的化（図１０Ｃ）（Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３）を用いて、プラスミドの残存コピーを除去した。次に、線状化された残りのプラスミドを消化し、得られた菌株はプラスミドを含まない。
【０１０５】
具体的には、ＳｐＣａｓ９タンパク質遺伝子を含むプラスミド、並びにｔｒａｃｒＲＮＡ及び未改変ａｔｔＰ配列に対するガイドＲＮＡを構築した（プラスミド詳細（ＤＳ−ＳＰｃａｓ、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド４８６４５）：ｃｌｏＤＦ１３由来、ｃａｒｂ、ｐｒｏＣプロモーター、ＳＰｃａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡ（天然プロモーター及び天然ターミネーターを有する）、Ｊ２３１００プロモーター、（同じプラスミド上へのスペーサー中でのクローニングを容易にするために付加される）１個のリピート）。前記スペーサーにクローニングされたガイドＲＮＡ配列は、ＴＣＡＧＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＡＧＴである。プラスミドを形質転換し、形質転換の３時間後に細胞をプレーティングしてＳｐＣａｓ９プラスミドに対する選択下（カルベニシリン）（約１０７細胞）、３７℃で増殖させた。得られた細胞を全てのａｔｔＰ配列の喪失についてＰＣＲ検証した。再コード化セグメントを有する組込みベクターの存在を、ｍＡｓＰＣＲによって確認した。
【０１０６】
適応度の測定
菌株倍加時間は既報の通りに計算した（Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３ｂ）。簡潔には、培養物を平底９６ウェルプレート中で増殖させた（１５０μＬ  ＬＢＬ、３４℃、３００ｒ．ｐ．ｍ．）。増殖キネティクス（ＯＤ６００）を、３６５ｃｐｍで軌道振盪しながら、３４℃で一晩、５分間隔で、Ｂｉｏｔｅｋ  Ｅｏｎマイクロプレートリーダーでモニタリングした。倍加時間は、ｔ＝Δｔ×Ｉｎ（２）／ｍによって計算した。ここで、各時点でΔｔ＝５分であり、ｍは、５つの連続する時点（２０分間隔）の移動ウィンドウの線形回帰によって計算したｌｎ（ＯＤ６００）の最大勾配である。分析はＭａｔｌａｂ（登録商標）スクリプトを用いて実施した。
【０１０７】
４４個のセグメントすべてについて観察された適応度の平均変化の減少は、再コード化されていない親株の適応度に対して１５％である。７５％のセグメント（３３個のセグメント）は、野生型と比較して２０％未満の適応度の減少を有することが観察され、４％のセグメント（２個のセグメント）のみ、５０％を超える適応度の減少を有することが観察され（セグメント２１及び８４）、これを「実質的な減少」と称する場合もある。
【０１０８】
重度の適応度低下の調査
遺伝子欠失により親株と比較して倍加時間が減少した場合、適応度を低下させる再コード化遺伝子を決定した。これは、再コード化遺伝子がうまく発現されなかったことを示唆する。ｌａｍｂｄａ  ｒｅｄ組換えを用いて各染色体遺伝子を徐々に欠失させ、各欠失後の倍加時間を測定することにより、低下遺伝子の位置を特定した（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。位置が特定されると、適応度を低下させる再コード化遺伝子はトラブルシューティングパイプラインを用いて対処される。
【０１０９】
まず、前記遺伝子を、野生型配列ではなく、再コード化された配列のみをプライムする対立遺伝子特異的プライマーを用いてサンガー配列決定した。以下の２つのトラブルシューティング経路のうちの１つを決定するために配列決定結果を分析した。
【０１１０】
１）配列決定により適応度低下を引き起こす突然変異が明らかにされた。具体的には、これらは計算によるゲノムデザインに含まれていない突然変異を指す。それらの変異はＭＡＧＥを用いて修正された。
【０１１１】
２）計算によるデザインと比較して、配列中に変異が同定されなかった。再コード化遺伝子の適応度の低下は、再コード化コドンに由来すると推定された。
【０１１２】
図１２Ａ及び図１２Ｂ（セグメント２１）はトラブルシューティング戦略を示す。潜在的に有害なコドンは、適応度が低下した遺伝子（ｆａｂＨ）及びオペロン全体のプロモーター（上流遺伝子ｙｃｅＤに位置する３種の再コード化コドン）の両方において同定された。適応度を低下させるコドンを見出すために、当初の再コード化スキームに対応するオリゴヌクレオチドを用いて、無処理菌株（ＥｃＭ２．１（Ｇｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４））においてＭＡＧＥを行った（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００９）。３サイクルのＭＡＧＥの後、細胞を許容培地上にプレーティングした（約１０３細胞）。野生型配列を標的とするｍａｓｃＰＣＲプライマーを用いて９６個のクローンをスクリーニングした。再コード化コドンが組み込まれたクローンの倍加時間を測定した（約２０）。ｆａｂＨ遺伝子において変化させたコドンについては有意な適応度の低下は観察されなかった。したがって、前記プロモーターにおける当初の設計変更は困難な変更として確認された。縮重ＭＡＧＥオリゴヌクレオチドを用いて無処理菌株においてＭＡＧＥを行った。３サイクルのＭＡＧＥの後、細胞を許容培地上にプレーティングした（１０３細胞）。禁止コドンのない代替の再コード化デザインが同定された。
【０１１３】
生物学的封じ込めアッセイ
再コード化生物が関与する最も効果的な生物学的封じ込め戦略（Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）は、非標準アミノ酸に対応するように再設計された３種の遺伝子であるチロシルｔＲＮＡシンテターゼ（ｔｙｒＳ）、アデニル酸キナーゼ（ａｄｋ）、及びビフェニルアラニルｔＲＮＡシンテターゼ（ｂｉｐＡＲＳ）を用いる。再コード化株の生物学的封じ込め能力をアッセイするために、それらの再設計された遺伝子が再コード化戦略と適合性があることを確認することが重要である。
【０１１４】
ｂｉｐＡＲＳ遺伝子は、７種の禁止コドンのいずれも含まないので、適合性があると考えられ、再コード化株に組み込むことが可能である。１種の禁止コドンと２種の付加的調節変異のみを含むａｄｋ遺伝子は、生物学的に封じ込められた株において再コード化され、さらに検証された。複数の禁止コドンを含むｔｙｒＳ遺伝子は、本研究では問題なく再コード化されたが、再コード化ｔｙｒＳの生物学的封じ込め戦略についてはまだ試験されていない。
【０１１５】
本研究で使用された菌株は以下の背景を有する。全ての菌株は、ＥｃＮＲ２（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５  ΔｍｕｔＳ：：ｃａｔ  Δ（ｙｂｈＢｂｉｏＡＢ）：：［λｃＩ８５７  Ｎ（ｃｒｏ−ｅａ５９）：：ｔｅｔＲ−ｂｌａ］）に基づいていた。Ｃ３２１株［４８９９９株（ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／４８９９９）］及びＣ３２１．ΔＡ株［４８９９８株（ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／４８９９８）］は、Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能である。Ｃ３２１．ΔＡ．ａｄｋ＿ｄ６及びＣ３２１．ΔＡ．ａｄｋ．ｄ６＿ｔｙｒＳ．ｄ８＿ｂｉｐＡＲＳ．ｄ７は、既報に基づく（Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）。
【０１１６】
ＭＡＧＥを使用して、生物学的に封じ込められた菌株であるＣ３２１．ΔＡ．ａｄｋ．ｄ６（逸出頻度は約１０〜６）及びａｄｋ．ｄ６＿ｔｙｒＳ．ｄ８＿ｂｉｐＡＲＳ．ｄ７（逸出頻度＜１０〜１２の最も生物学的に封じ込められた菌株）において、ａｄｋの３種のコドン変化を含ませた。得られた菌株（Ｃ３２１．ΔＡ．ａｄｋ．ｄ６．ｒｃ及びＣ３２１．ΔＡ．ａｄｋ．ｄ６．ｒｃ＿ｔｙｒＳ．ｄ８＿ｂｉｐＡＲＳ．ｄ７）の適応度を上記のように評価した。逸出頻度は前述のように測定した。（Ｍａｎｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）．簡潔には、全ての菌株を許容条件下で増殖させ、対数後期に回収した。細胞をＬＢＬ中で２回洗浄し、ＬＢＬ中に再懸濁した。生細胞ｃｆｕは、許容培地上の１０倍連続希釈の３回の技術的反復の平均及び平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）から計算した。３回の技術的反復物を非許容培地上にプレーティングし、７日間モニターした（約１０７細胞）。ＳＤＳ及びクロラムフェニコールを含むＬＢＬ（ＳＣ）、並びにＳＤＳ、クロラムフェニコール、及び０．２％アラビノースを含むＬＢＬ（ＳＣＡ）の２つの異なる非許容培地条件を用いた。
【０１１７】
ＤＮＡ及びＲＮＡの配列決定法−ゲノム配列決定
Ｉｌｌｕｓｔｒａ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ＧｅｎｏｍｉｃＰｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃｓ）を用いて、１ｍＬの一晩培養した培養物から細菌ゲノムＤＮＡを精製し、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）又はＮｅｂＮｅｘｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてライブラリーを構築した。ライブラリーは、ＰＥ２５０  Ｖ２キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）と共にＭｉＳｅｑ装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて配列決定した。
【０１１８】
ＳＮＰのコール
２つの異なるパイプラインを使ってゲノムを分析した。一倍体ゲノム分析を支持するＢｒｅｓｅｑ（Ｄｅａｔｈｅｒａｇｅ、２０１４）を、１つの種類のセグメントのみを有する菌株（すなわち、再コード化又は再コード化されていない野生型）についてのＳＮＰ及び短い挿入欠失のコールに用いた。Ｂｒｅｓｅｑはデフォルトのパラメータで使用した。
【０１１９】
ＲＮＡｓｅｑ法
ＲＮＡを、再コード化セグメントのエピソーム性コピー及び染色体セグメントの欠失を有する菌株から調製した。ＲＮＡは、ＲＮＡｐｒｏｔｅｃｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて安定化され、ｍｉＲＮｅａｓｙキット（ＱＩＡＧＥＮ）で抽出された。ｒＲＮＡ含有量は、ｒｉｂｏＺｅｒｏ  ｒＲＮＡ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて減少させた。Ｔｒｕｓｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてＲＮＡｓｅｑライブラリーを構築した。ＰＥ１５０  Ｖ２キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）と共にＭｉＳｅｑ装置（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてライブラリーを配列決定した。
【０１２０】
ＲＮＡｓｅｑ分析
ＲＮＡｓｅｑ実験から得られたＦＡＳＴＱファイルを、デフォルトパラメータを用いてＢＷＡ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００９ａ）を用いてマッピングし、ＳＡＭＴＯＯＬ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００９ｂ）を用いて処理（インデックス付け、並べ替え）して、各サンプルについてのｂａｍファイルを生成した。データの分析にはカスタムＲスクリプトを使用した。ＧｅｎｏｍｉｃＦｅａｔｕｒｅｓライブラリー（Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ）を用いて読み取りを遺伝子に関連づけ、ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのＤＥＳｅｑライブラリー（Ａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）を用いて差次的発現分析を行った。絶対ｌｏｇ２変化倍率が２より大きく、且つ調整されたｐ値が０．０１より小さい遺伝子を、差次的に発現される遺伝子として分類した。具体的には、部分的に再コード化された菌株及びＴＯＰ１０対照をＲＮＡＳｅｑにより個々に分析した。各遺伝子の発現を、（再コード化された又は再コード化されていない）各サンプルにおいてＤＥＳｅｑ２（Ａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）を用いて他のすべてのサンプルにおける同一遺伝子の発現（５つの独立したセグメント）と比較して、全サンプルにわたる遺伝子発現の代表的範囲を得た。例えば、セグメント４４におけるｆｏｌＣ遺伝子の発現レベルは、再コード化セグメント４４（再コード化コピーのみ）、ＴＯＰ１０（野生型コピーのみ）、及び他のすべての部分的に再コード化された菌株（セグメント４４は再コード化されていない、例えば、ｆｏｌＣ遺伝子の野生型コピーのみ）において測定された。
【０１２１】
実施例２
コドン選択の規則−大腸菌におけるレアアルギニンコドンの編集
いくつかの態様によれば、本明細書には、ゲノムデザインについての規則、制約、条件、パラメータ、又は特徴のための実験による検証及び更新の方法が記載される。具体的には、レアアルギニンコドンであるＡＧＡ及びＡＧＧ（ＡＧＲ）はコドン選択のケーススタディを示し、ＡＧＲは他の同義の代替コドン（ＣＧＮ）とは異なる重要な転写及び翻訳特性をコードする。ＡＧＲコドンの１２３個の出現箇の全てが全ての必須遺伝子から除去されている大腸菌株が作られた。１１０個のＡＧＲコドンは同義のＣＧＵに置き換えられたが、残りの１３個のＡＧＲは生存可能な代替案を特定するために多様化を必要とした。成功した置換コドンは、場合によってはアミノ酸同一性を犠牲にして、局所的リボソーム結合部位様モチーフ及び局所的ｍＲＮＡ二次構造を保存する傾向があった。これらの観察に基づいて、代替コドンが生存可能である可能性が高いと考えられる多次元の「安全な置換ゾーン」（ＳＲＺ）に対して測定基準を実験により定義した。必須ＡＧＲに対する同義及び非同義の代替物をさらに評価するために、野生型対立遺伝子の多様な集団を枯渇させるためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づく方法を実施した。この方法により、全６４種のコドン代替物の適応度の影響の包括的評価が可能になった。この方法を使用して、ＳＲＺの関連性は、１４種の異なる遺伝子におけるコドン適応度を経時的に追跡することによって確認された。ＳＲＺの外側にあるコドンは、増殖集団から急速に枯渇する可能性があることが見出された。
【０１２２】
最終的には、遺伝コードは固有の冗長性を持ち（Ｃｒｉｃｋ、１９６３）、最大６種の異なるコドンが単一のアミノ酸を特定する。このことは、同義コドンが同等であることを意味する（Ｋｉｍｕｒａ、１９７７）が、ほとんどの原核生物及び多くの真核生物（ｄｏｓ  Ｒｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００４；Ｎｅｗｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｒｎｉｓｃｈ、２０１４）は同義代替物に対する強いコドン選択を示す（Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｏｖ、２００８；Ｐｌｏｔｋｉｎ  ａｎｄ  Ｋｕｄｌａ、２０１１）。異なる種が異なるコドンを優先するように進化してきたが、コドンの偏りはそれぞれの種内でほぼ一致している（Ｈｅｒｓｈｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｏｖ、２００８）。しかしながら、所与のゲノム内では、コドンの偏りはコドンの位置によって個々の遺伝子間で異なっており、コドンの選択は機能的な結果をもたらすことが示唆される。例えば、レアコドンは必須遺伝子の開始部分に濃縮されており（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ、１９９０；Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ、１９９４）、コドン使用頻度は、特にＮ末端において（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３）、タンパク質レベルに強く影響する（Ｋａｎｅ、１９９５；Ｓｈａｒｐ  ａｎｄ  Ｌｉ、１９８７；Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３）。このことは、コドン使用頻度がタンパク質発現の調節においてまだよく理解されていない役割を果たすことを示唆する。
【０１２３】
これらに限定されないが、タンパク質の折り畳みを最適化するために翻訳の早い段階でリボソームの休止を促進すること（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３）、翻訳開始の最適化やｍＲＮＡ分解の調節するためｍＲＮＡの二次構造を調整すること、ｔＲＮＡレベルとの共進化によりリボソームの失速を防止すること（Ｐｌｏｔｋｉｎ  ａｎｄ  Ｋｕｄｌａ、２０１１）、適切なリボソーム間隔及び効果的な翻訳のための「翻訳勾配」を提供すること（Ｔｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）、又はオペロン中の各遺伝子の独立した制御のための翻訳調節の層を提供すること（Ｌｉ、２０１５）など、いくつかの仮説によりコドン使用頻度がこの効果をどのように媒介するかについての説明が試みられている。さらに、コドンの使用頻度は翻訳の忠実度に影響を与える可能性があり（Ｈｏｏｐｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ、２０００）、プロテオームはデコードするｔＲＮＡプールの微調整によって調整される可能性がある（Ｇｉｎｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）。Ｑｕａｘ  ｅｔ  ａｌ．は、生物学がどのようにコドンを選択するかについての優れた総説を提供しているが、全ゲノムにおけるコドン選択の系統的で網羅的な研究は成されていない（Ｑｕａｘｅ  ａｌ．、２０１５）。比較的少数の遺伝子におけるコドン選択の効果を調査する研究が始まったばかりである（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３；Ｉｓａａｃｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１；Ｋｕｄｌａ  ｅｔ  ａｌ．、２００９；Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３ａ；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）。さらに、ＵＡＧ終止コドンが大腸菌から完全に除去されており（Ｌａｊｏｉｅ  ２０１３ａ）、ＡＧＧコドンが多義的に再割り当てされているが（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５；Ｍｕｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５；Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）、センスコドンを完全に置き換えるというゲノム全体での試みは報告されていない。既出の研究は、そのような置換に対する未知の制約があることを証明した（Ｉｓａａｃｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１；Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３ａ；Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３ｂ）。単一菌株においてコドンの全ての必須出現箇所を置換する試みにより、これらの制約に対する価値ある洞察が提供されるだろう。さらに、いくつかの制約が特定の遺伝子に存在することが知られているが、全ゲノム規模で同義コドンの分解を探求する試みは成されていない。
【０１２４】
レアアルギニンコドンであるＡＧＡ及びＡＧＧ（ＩＵＰＡＣの慣例に従ってＡＧＲを含む）は最も置換困難なコドンの１つであり、それらとリボソーム結合配列との類似性が重要な非コード機能の根底をなすことが文献に示唆されているため（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ、１９９０、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３、Ｓｐａｎｊａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８、Ｓｐａｎｊａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０、Ｂｏｎｅｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．、１９８５）、本明細書の実施例に記載の通り、これらのコドンが本研究のために選択された。さらに、これらのコドンの使用頻度が稀であるため（大腸菌ＭＧ１６５５の必須遺伝子において１２３の出現箇所及び全ゲノムにおいて４２２８の出現箇所（表３））、必須遺伝子中の全てのＡＧＲ出現箇所を置換することは扱いやすい目標となり、必須遺伝子はコドン置換による適応度の影響を識別するためのストリンジェントな試験セットとして機能する（Ｂａｂａ、ｅｔ  ａｌ．、２００６）。さらに、最近の研究はいくつかのＡＧＲコドンを他の同義コドンに直接変異させることの難しさを示している（Ｚｅｎｇ、ｅｔ  ａｌ、２０１４）が、著者は失敗の機序の説明又は代替デザインの実施の成功については報告していない。ＡＧＲコドンの１２３の出現箇所の全てを同義のＣＧＵコドンと置き換えることによって必須遺伝子から除去することを試みた。一次核酸配列を最大限に破壊するようにＣＧＵが選択された（ＡＧＲ→ＣＧＵ）。この戦略はデザイン上の欠陥を最大化し、それにより再割り当てされた遺伝コードを用いてゲノムをデザインするための規則が明らかになるであろうと仮定した。重要なことに、デザイン欠陥に対する偏りのない実験による検索を確実にするために、個々のコドンの標的は事前に検査しなかった。
【０１２５】
この改変ゲノムを構築するために、共選択多重自動化ゲノム工学（ＣｏＳ−ＭＡＧＥ）を用いて（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２、Ｇｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）、必須遺伝子から１２３個のＡＧＲコドンのすべてが除去された大腸菌株（Ｃ１２３）を作製した（図１９Ａ）。ＣｏＳ−ＭＡＧＥはｌａｍｂｄａ  ｒｅｄ媒介組換えを利用し（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０００、Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）、選択可能な対立遺伝子（例えば、ｔｏｌＣ）における突然変異と近傍の目的の編集（例えば、ＡＧＲ変換）との関連性を利用して、これらの編集を有する細胞を濃縮する（図Ｓ１）。Ｃ１２３構築を効率化するために、効率的なｌａｍｂｄａ  ｒｅｄ媒介ゲノム工学のために以前に最適化された菌株である（Ｇｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４、Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）大腸菌株ＥｃＭ２．１を最初に選択した。ＥｃＭ２．１についてＣｏＳ−ＭＡＧＥを使用すると、最適化されていない菌株におけるＭＡＧＥに対して、対立遺伝子置換頻度が１０倍改善されるが、すべての編集が同一のレプリコア（replichore）上にあり、選択可能な対立遺伝子の５００キロベース以内にある場合は、最適に機能する（Ｇｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）。この要求を満たすために、必須遺伝子中の１２３個のＡＧＲコドンの全てを含む１２個のセグメントにゲノムを分割した。各セグメントのＣｏＳ−ＭＡＧＥを可能にするためにｔｏｌＣカセットをゲノム中に移動させることにより、インビボで大きな細胞集団全体でＡＧＲ→ＣＧＵ突然変異の各セットのプロトタイプを迅速に作成することが可能となった。必須遺伝子中の１２３個のＡＧＲコドンのうち、このプロセスによって１１０個がＣＧＵに変更される可能性があり（図１）、ほとんどの必須遺伝子のコドン使用頻度にかなりの柔軟性があることが明らかになった。対立遺伝子置換（この場合、ＡＧＲ→ＣＧＵコドン置換）頻度は、これら１１０個の許容コドン全体で大きく異なっており、対立遺伝子置換頻度と遺伝子中のＡＧＲコドンの正規化位置との間に明確な相関関係はなかった（図２Ａ）。
【０１２６】
残りの１３個のＡＧＲ→ＣＧＵ突然変異は観察されず、コドン置換頻度が検出限界である細菌集団の１％未満であることが示唆された。これらの「抵抗性コドン（recalcitrant codon）」は、有害又は非組換え性であると想定され、さらなる分析のためにトラブルシューティングパイプラインにトリアージした（図１９Ａ及び図１９Ｂ）。興味深いことに、１３個の抵抗性コドンのうちの１個を除くすべてがそれらの遺伝子のそれぞれの末端近くに共局在し、これらの位置でのコドン選択の重要性が示唆され、７個は開始コドンの最大３０ｎｔ下流であり、５個は終止コドンの最大３０ヌクレオチド（ｎｔ）上流であった（図２０Ａ、下パネル）。これらの失敗したＡＧＲ→ＣＧＵ突然変異を、明白なデザインエラーとして調べた。例えば、ｆｔｓＩ＿ＡＧＡ１７５９は、必須遺伝子であるｍｕｒＥの２番目のコドン及び３番目のコドンと重複し、適応度を低下させる可能性があるミスセンス変異（ｍｕｒＥ  Ｄ３Ｖ）を導入する。ｆｔｓＩ＿ＡＧＡをＣＧＡで置き換えることにより、ＭｕｒＥの一次アミノ酸配列を保存しながら適応度への影響を最小限に抑えて、禁止ＡＧＡコドンの置き換えに成功した（図２１Ａ）。同様に、ｈｏｌＢ＿ＡＧＡ４は上流の必須遺伝子ｔｍｋと重複し、ＡＧＡをＣＧＵで置き換えると、ｔｍｋの終止コドンがＣｙｓに変換され、ｔｍｋのＣ末端に１４個のアミノ酸が付加される。いくつかのＣ末端伸長は大腸菌において十分に許容されるが（Ｏｈｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）、ｔｍｋを伸長することは有害であるようだ。終止コドンを含む３つのヌクレオチドをｈｏｌＢ開始コドンの前に挿入することによって、ｈｏｌＢ＿ＡＧＡのＣＧＣへの置き換えに成功した。これにより、ｔｍｋ／ｈｏｌＢ重複が低減され、両遺伝子のコード配列が保存された（図２７Ａ）。
【０１２７】
残りの４個のＣ末端不全についてはより微細な重複エラーが確認され、ＡＧＲ→ＣＧＵ突然変異により下流遺伝子に属するＲＢＳモチーフ（ｎｕｓＧの場合はｓｅｃＥ＿ＡＧＧ３７６、ｄｎａＣの場合はｄｎａＴ＿ＡＧＡ５３２、及びｄｅｄＤの場合はｆｏｌＣ＿ＡＧＡＡＧＧ１２４９，１２５２、後者は２つのコドンを構成する）が破壊されることが決定された。ｎｕｓＧとｄｎａＣの両方が必須であることにより、ｓｅｃＥ及びｄｎａＴにおいてＡＧＲをＣＧＵに置き換えると翻訳開始及び重複するｎｕｓＧ及びｄｎａＣの発現が致死的に妨げられることが示唆される（図２１Ｂ及び図２７Ｂ）。ｄｅｄＤは必須ではないとアノテーションされているが（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）、ｆｏｌｃにおいてＡＧＲをＣＧＵに置き換えると、ＥｃＭ２．１（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２）の生存に不可欠なｄｅｄＤの一部が破壊されたと仮定された。この仮説を支持して、Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）によって削除されなかったｄｅｄＤの２９ヌクレオチドを欠失されず、ｆｏｌＣと重複していなかったことから、この配列は記載された菌株において必須であることが示唆された。この変換の予想外の失敗は、よくアノテーションされた生物体においても設計上の欠陥を予測することの難題を強調している。これらＲＢＳモチーフの破壊がＡＧＲ→ＣＧＵ変換の失敗の根底にあるという観察と一致して、ｓｅｃＥに対する非同義（Ａｒｇ→Ｇｌｙ）変換を含む、ＲＢＳ強度を保存するコドンを選択することによって３つの設計欠陥の全てが克服された。
【０１２８】
これらの教訓により、リボソームがコーディングＤＮＡ配列中のリボソーム結合部位モチーフに遭遇すると翻訳中に一時停止するという以前の観察と合わせて（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）、Ｎ末端ＡＧＲ→ＣＧＵの失敗に対する重要な洞察が提供された。本明細書に記載されるように、ＲＢＳ様モチーフは、ＲＢＳモチーフ（典型的には開始コドンの前に生じ得る）及び類似のモチーフ（オープンリーディングフレーム中に生じ得るが必ずしも翻訳開始を引き起こさない）の両方を指し得る。Ｎ末端の障害のうち３つ（ｓｓｂ＿ＡＧＡ１０、ｄｎａＴ＿ＡＧＡ１０、及びｐｒｆＢ＿ＡＧＧ６４）は、ＣＧＵの交換によって分断又は作成されたＲＢＳ様モチーフを有していた。一方、ｐｒｆＢ＿ＡＧＧ６４は、リボソーム結合部位モチーフの一部であり、ｐｒｆＢにおける必須のフレームシフト変異を引き起こすが（Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３ａ、Ｃｒａｉｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９８５、Ｃｕｒｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３）、一時停止モチーフに媒介されるｓｓｂ発現及びｄｎａＴ発現の調節は報告されていない。それにもかかわらず、リボソーム休止データ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）は、リボソーム占有ピークがｓｓｂに対するＡＧＲコドンのすぐ下流に存在し、ｄｎａＴについては存在しないことを示した（図２８）。その一方で、失敗したＣＧＵ突然変異は、ｐｒｆＢ及びｓｓｂに対するＲＢＳ様モチーフを弱め、ｄｎａＴに対するＲＢＳ様モチーフを強化することが予測され（図２１Ｃ及び図２７Ｃ）、ＲＢＳ占有率と細胞適応度との間の機能的関係が示唆された。
【０１２９】
この仮説と一致して、トラブルシューティングパイプラインからのコドン置換の成功により、失敗したＡＧＲ→ＣＧＵ変異によって引き起こされた大きな予測偏差と比較して、予測ＲＢＳ強度が保存される（図２２、ｙ軸及びオレンジ色の星印と緑色の点との比較）。興味深いことに、ｄｎａＴ＿ＡＧＡ１０をＣＧＮ又はＮＮＮのいずれかに置き換える試みは失敗し、周囲のコドンのゆらぎ位置を操作してアルギニンアミノ酸を保存することによってのみｄｎａＴ＿ＡＧＡ１０を置き換えることができた（図２７Ｃ）。これらのゆらぎ変異体は、ＡＧＡ→ＣＧＵ突然変異によって引き起こされるＲＢＳ強度の増加を補うようであり、ゆらぎ変異体を有するＲＢＳモチーフ強度は未改変配列から８倍の偏差であったが、ＡＧＡ→ＣＧＵ単独のＲＢＳモチーフ強度は２７倍の偏差であった。
【０１３０】
顕著なＲＢＳ強度の偏差を示さなかった残りのいくつかのＮ末端障害事例（ｒｎｐＡ＿ＡＧＧ２２、ｆｔｓＡ＿ＡＧＡ１９、ｆｒｒ＿ＡＧＡ１６、及びｒｐｓＪ＿ＡＧＡ２９８）をよりよく理解するために、タンパク質発現の他の潜在的な核酸決定基を調べた。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５′末端近くのｍＲＮＡ二次構造がタンパク質発現に強く影響を与えるという観察（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３）に基づいて、ＡＧＲ→ＣＧＵ突然変異はしばしば標的遺伝子の開始コドン付近のｍＲＮＡの予測される折り畳みエネルギー及び構造を変化させることが分かった（図２１Ｄ及び図２９）。縮重ＭＡＧＥオリゴから得られたコドン置換の成功は、ＣＧＵと比較してｍＲＮＡ二次構造の破壊を低減させた（図２２、緑色の点）。例えば、ｒｎｐＡは、そのＲＢＳ及び開始コドンの近くに、ＡＧＧコドンの両方のグアニン及び近くのシトシンとの間の塩基対合に依存する、予測されたｍＲＮＡループを有する（図２１Ｄ、図３０Ａ）。重要なことに、試みられたすべてのｒｎｐＡ  ＡＧＧ２２ＣＧＮ突然変異のうちＡＧＧ２２ＣＧＧだけが観察され、ＣＧＧだけがこのｍＲＮＡ構造を保存するという事実は、それが生理学的に重要であることを示唆する（図２１Ｄ、図３０Ｂ〜図３０Ｃ）。これを支持して、ｒｎｐＡ  ＡＧＧ２２ＣＵＧ突然変異（Ａｒｇ→Ｌｅｕ）は、ステム中の相補的ヌクレオチドがＣＣ（ＡＧＧと塩基対）からＣＡ（ＣＵＧと塩基対）に変更された場合にのみ導入が成功し、ＲＢＳモチーフ強度及びアミノ酸同一性の両方が変化したが天然のＲＮＡ構造が保存された（図３０Ｄ）。
【０１３１】
４つ全ての最適化遺伝子配列の分析により、失敗したＣＧＵ変異と比較して、計算によるｍＲＮＡ折り畳みエネルギー（ＵＮＡＦｏｌｄ（Ｍａｒｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、２００８）を用いて計算）における偏差の減少が示された（図２２、ｘ軸オレンジ色の星印及び緑色の点）。同様に、これらの遺伝子について予測されるｍＲＮＡ構造（異なるｍＲＮＡ折り畳みソフトウェアを用いて計算：ＮＵＰＡＣＫ（Ｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１））は、ＣＧＵ変異によって強く変化し、実験により最適化された解決法で修正された（図２９）。
【０１３２】
これら１３個の抵抗性コドンのトラブルシューティングにより、天然のｍＲＮＡ折り畳みエネルギー又はＲＢＳ強度からの大きな偏差をもたらす突然変異がコドン置換の失敗と関連することが明らかになった。全ての試みられたＡＧ→ＣＧＵ突然変異についてこれら２つの測定基準を計算することによって、安全置換ゾーン（ＳＲＺ）が実験により定義され、その範囲内では大部分のＣＧＵ突然変異が許容された（図２２、斜線領域）。ＳＲＺは、ｍＲＮＡの折り畳みエネルギー又はＲＢＳ強度に関連した抵抗性ＡＧＲ→ＣＧＵ突然変異を全く含まない最大の多次元空間として定義される（図２２、赤色の星印）。ＳＲＺは、天然コドンに関して１０％未満のｍＲＮＡ折り畳みエネルギーの偏差及び天然コドンに関して半対数未満のＲＢＳ様モチーフスコアの偏差を含み、コドン置換の定量的指針を提供する。特に、１３個の抵抗性コドンを置き換えるために使用された最適解は、ＣＧＵへの突然変異で見られる偏差と比較して、これらの２つのパラメータのうちの少なくとも１つについての偏差の減少を常に示した。さらに、１３個の抵抗性コドンに対する解は、実験により定義されたＳＲＺとほぼ完全に重複していた。これらの結果は、ｍＲＮＡ折り畳みエネルギー及びＲＢＳ強度の計算による予測が、設計された突然変異が致死的である可能性があるかどうかを予測するための第一近似として使用され得ることを示唆する。問題のある対立遺伝子を予測するためのインシリコでの発見的問題解決法を開発することにより、インビボでのゲノム工学に必要な検索空間が減少し、生存可能なままである根本的に改変されたゲノムを作成することが可能となる。
【０１３３】
１３個の全ての抵抗性コドンについて生存可能な置換配列を同定した後、成功した１１０個のＣＧＵ変換を１３個の最適化コドン置換と組み合わせて、そのアノテーション付き必須遺伝子の全てから１２３個のＡＧＲコドン全て除去されたＣ１２３株を産生した。次に、Ｃ１２３の配列を決定してＡＧＲ除去を確認し、公的に利用可能なゲノム再配列決定パイプラインであるＭｉｌｌｓｔｏｎｅを使用して解析した（Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）。必須遺伝子であるｐｓｓＡ及びｃｃａにおいてＡＡＧ（Ｌｙｓ）からＡＧＧ（Ａｒｇ）への２つの自然突然変異が観察された。これらの変異をＡＡＧに戻す試みはうまくいかなかったが、おそらくこれは機能的な補償を示唆しており、これらの変異は縮重ＭＡＧＥオリゴヌクレオチドを用いて、ｐｓｓＡではＣＣＧ（Ｐｒｏ）、ｃｃａではＣＡＧ（Ｇｌｎ）に置き換えられた。得られたＣ１２３ａ株は、アノテーション付き必須遺伝子においてＡＧＲコドンが完全に欠失された最初の菌株である。この菌株は、ＡＧＲコドンを大腸菌ゲノムから完全に除去することが可能であり、ＡＧＲ翻訳機能の明確な再割り当てが可能になるという強力な証拠を提供する。
【０１３４】
増殖動態分析により、９６ウェルプレートリーダーにおいて溶原性ブロス（ＬＢ）中、３４℃で、倍加時間がＥｃＭ２．１の５２．４（＋／−２．６）分（０個のＡＧＲコドンが変化した）からＣ１２３ａの６７（＋／−１．５）分（必須遺伝子中の１２３個のＡＧＲコドンが変化した）に増加したことが示された。特に、適応度は、Ｃ１２３株構築中に有意に変動した（図２０Ｂ）。これは、ミスマッチ修復欠損（ｍｕｔＳ−）バックグラウンドにおける適応度欠損を軽減するためのコドン脱最適化（ＡＧＲ→ＣＧＵ）及び代償性自然突然変異に起因し得る。全体として、Ｃ１２３ａの適応度の低下は、菌株の構築中に発生したオンターゲット（ＡＧＲ→ＣＧＵ）又はオフターゲット（自然突然変異）によって引き起こされる可能性がある。このように、ｍｕｔＳの不活性化は、有用な進化的ツールでありうると共に障害でもある。最終的なゲノム配列分析により、１２３個の所望のＡＧＲ変換と共に、Ｃ１２３ａがＥｃＭ２．１親株には見られない４１９個の非同義自然変異を有することが明らかなった（図３５）。特に興味深いのは、ｔＲＮＡＡｒｇ（ａｒｇＵ）のＤアームに位置する変異ａｒｇＵ＿Ｇ１５Ａであり、これはＡＧＳセット４を用いたＣｏＳ−ＭＡＧＥ中に発生した。ａｒｇＵ＿Ｇ１５ＡはＣＧＵ要求の増加及びＡＧＲ要求の減少を補償するが、Ｃ１２３においてこの突然変異を元に戻すことに関連する直接的な適応度の代償は観察されず、ａｒｇＵ＿Ｇ１５Ａはインビトロでのアミノアシル化効率又はインビボでのアミノアシルｔＲＮＡプールに影響を及ぼさない（図３１）。Ｍｕｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．及びＢａｂａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｕｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５、Ｂａｂａ、ｅｔ  ａｌ．、２００６）に一致して、ａｒｇＷ（ｔＲＮＡＡｒｇＣＣＵ；ＡＧＧのみをデコード）は、ａｒｇＵ（ｔＲＮＡＡｒｇＵＣＵ；ＡＧＧ及びＡＧＡ両方をデコード）で補完できるため、Ｃ１２３ａでは不要であった。しかしながら、ａｒｇＵはＡＧＡをデコードすることができる唯一の大腸菌ｔＲＮＡであり、プロテオームの残りの部分についてＡＧＲコドンを翻訳することが必要とされるであろうことから、Ｃ１２３ａにおいて必須のままである（Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３ｂ）。
【０１３５】
全ての既知の必須遺伝子から全てのＡＧＲコドンを除去した後のＣ１２３ａの遺伝的安定性を評価するために、ＡＧＲコドンが回復するかどうか及び／又は自然突然変異が適応度を改善するかどうかを試験するために、Ｃ１２３ａを７８日間（６４０世代）継代した。７８日後、配列決定された集団において追加のＡＧＲコドンは検出されず、単離されたクローンの倍加時間はＣ１２３ａよりも２２％早くから２２％遅い範囲であった（ｎ＝６０）。局所ＲＢＳ強度及びｍＲＮＡ折り畳みがコドン選択にどのように影響するかについてさらに洞察を得るために、進化実験を実施して、ＡＧＲコドンのそれぞれにおける６４種の可能性のあるコドン置換の全ての競合適応度を調べた。ＭＡＧＥはインビボで生存可能なゲノム改変を探索するための強力な方法であるが、最適ではないコドン選択に関連した適応度代償をマッピングすることに目的があり、全体的な適応度最大値又はそれに近いと仮定された親遺伝子型を枯渇させたコドンランダム化が必要である。これを行うために、ＣＲＡＭ（Ｃｒｉｓｐｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ−ＭＡＧＥ）と呼ばれる方法が開発された。第一に、標的ＡＧＲコドンをＮＮＮに変更するだけでなく、２０ｂｐのＣＲＩＳＰＲ標的遺伝子座を破壊するであろう、少なくとも５０ｎｔ下流のいくつかの同義変化も生じさせるオリゴヌクレオチドを設計した。ＭＡＧＥを用いて並行してＡＧＲのそれぞれをＮＮＮと置換し、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９を用いて親遺伝子型を有する細胞集団を枯渇させた。このアプローチは、元のコドンを含む、コドン空間の網羅的探索を可能にしたが、圧倒的多数の親遺伝子型を欠いていた。ＣＲＡＭに続いて、集団を２４時間毎に１：１００で６日間継代し、Ｉｌｌｕｍｉｎａの配列決定を用いて各継代前にサンプリングした（図２３）。
【０１３６】
ＣＲＡＭの２４時間後の配列決定により、全てのコドン（終止コドンを含む）の存在が示され（図３２）、集団内に大規模な多様性を生み出すための技術として前記方法が検証された。さらなる分析のための全ての配列は、変化した下流配列を含む対立遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲによって増幅された。続いてこれらの集団の継代により、多くの遺伝子特異的傾向が明らかになった（図２３、図３３、図３３）。具体的には、トラブルシューティングを必要とする全てのコドン（ｄｎａＴ＿ＡＧＡ１０、ｆｔｓＡ＿ＡＧＡ１９、ｆｒｒ＿ＡＧＡ１６、ｒｎｐＡ＿ＡＧＧ２２）は、それらの野生型ＡＧＲコドンに収束し、元のコドンが全体的に最適化されていたことを示唆している。代替コドンが元のＡＧＲを置換した全ての場合について、ｍＲＮＡ折り畳みエネルギー及び局所的ＲＢＳ強度（リボソーム休止の代用として）の予測偏差をこれらの代替コドンについて計算し、得られた測定基準をこの位置での経時的なコドン分布の進化と比較した。推定されたＳＲＺ内に入る配列の割合もまた、図２２から計算された。ＣＲＡＭは当初、多様なｍＲＮＡ折り畳みエネルギー及びＲＢＳ強度を導入したが、これらの遺伝子型は、多くの場合、親のＡＧＲ値と同様のパラメータに急速に収束した（図２３、重なり部分）。遺伝子の開始近くの予測されたｍＲＮＡ折り畳み及び内部ＲＢＳ強度を強く妨害コドンは、数日間の増殖の後に不利になり、得られた測定基準がインシリコで最適なコドン置換を予測するために使用できることが示唆された。対照的に、非必須制御遺伝子であるｂｃｓＢ及びｃｈｐＳはＲＮＡ構造又はＲＢＳ強度を保存したコドンに収束せず、ＲＮＡ二次構造及びＲＢＳ強度の観察された保存が必須遺伝子に生物学的に関連するという結論が支持された。興味深いことに、ｔｉｌＳ＿ＡＧＡ１９はこの効果にそれほど感受性を有さず、その特定の位置でのコドン選択が選択下にないことが示唆された。さらに、ｉｐｓＧ集団に対する平均内部ＲＢＳ強度は親のＡＧＲ値に向かって収束したが、ｍＲＮＡ折り畳みエネルギー平均はそのようにならず、遺伝子内のこの位置がｍＲＮＡ折り畳みよりもＲＢＳ破壊に対してより感受性を有し得ることが示唆された。ｌｐｔＦ遺伝子は逆の傾向をたどった。
【０１３７】
興味深いことに、いくつかの遺伝子（ｌｐｔＦ、ｉｐｓＧ、ｔｉｌＳ、ｇｙｒＡ、及びｒｉｍＮ）は、アミノ酸同一性をＡｒｇからＰｒｏ、Ｌｙｓ、又はＧｌｕに変更したコドンを選択し、非コード機能がこれらの位置でアミノ酸同一性に勝ることが示唆された。重要なことに、必須遺伝子における成功したコドン置換の全てはＳＲＺ内に入り（図２４）、６４コドン全ての偏りのない試験に基づく発見的問題解決法が検証された。一方、非必須制御遺伝子であるｃｈｐＳは、ＳＲＺへの依存性が少なかった。これらの観察に基づいて、全体的なコドンの偏りはｔＲＮＡ利用可能性によって影響され得るが（Ｐｌｏｔｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１、Ｎｏｖｏａ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２、Ｉｋｅｍｕｒａ、１９８５）、所与の位置でのコドン選択は少なくとも（１）アミノ酸配列、（２）開始コドン及びＲＢＳ付近のｍＲＮＡ構造、（３）ＲＢＳ媒介性の休止の３つのパラメータによって定義され得る。場合によっては、これらのパラメータのサブセットが選択されていない可能性があり、前記測定基準のサブセットに対してのみ収束する進化した配列を生じる。他の場合には、全ての測定基準が重要となり得るが、一次核酸配列はそれら全てに等しく適応する柔軟性を持たない可能性があり、細胞の適応度を損なうコドン置換がもたらされる。
【０１３８】
これらの規則を使用して、全てのＡＧＲコドンがゲノム全体で置換されたインシリコでゲノム案を作成し、無処理置換戦略と比較して予測されるデザイン欠陥（例えば、ＳＲＺ外の測定基準を有する同義コドン）数がほぼ４分の１に減少した（図２５Ａ、図２５Ｂ、図３４）。さらに、抵抗性コドンの予測により、ＭＡＧＥを用いてインビボで迅速に試験可能な仮説が提供される。次に成功した置換配列は、再設計されたゲノムにおいて同時に実行してもよい。これらの規則により、ＡＧＲ翻訳機能を明確に再割り当てするために使用することができる、ＡＧＲコドンを完全に欠失したゲノムを作成することの取り扱いやすさが増大することが期待される。
【０１３９】
大腸菌の必須遺伝子からＡＧＲコドンの全ての出現箇所を包括的に除去することにより、コードＤＮＡ配列、ＲＢＳ媒介性の翻訳開始／休止、又はｍＲＮＡ構造の破壊によって説明され得る１３種のデザイン欠陥が明らかになった。各因子の重要性が報告されているが、本明細書に記載の方法により、それらがゲノム機能にどの程度及びどれ位の頻度で影響を及ぼすかを体系的に探究される。さらに、本明細書に記載の方法により、生存不能ゲノムをデザインする機会を低減するための定量的指針が確立される。追加の因子が疑いなくゲノム機能に影響を与えるが、これらの指針により失敗した同義コドン置換の全ての出現箇所が捕捉されたという事実（図２２）は、開示されたゲノムデザイン指針により生存ゲノムの一次配列に対する許容可能な改変の強固な第一近似が提供されることを示唆する。安価なＤＮＡ合成と組み合わせたこれらの設計規則により、生物学的封じ込め、ウイルス耐性、及びアミノ酸レパートリーの拡張などの有用な特性を示す根本的に再設計されたゲノムの構築を容易になるであろう（Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５）。
【０１４０】
材料及び方法
使用した菌株及び培養方法
この研究に使用された菌株はＥｃＭ２．１に由来した（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５  ｍｕｔＳ＿ｍｕｔ  ｄｎａＧ＿Ｑ５７６ＡｅｘｏＸ＿ｍｕｔ  ｘｏｎＡ＿ｍｕｔ  ｘｓｅＡ＿ｍｕｔ  １２５５７００：：ｔｏｌＱＲＡ  Δ（ｙｂｈＢ−ｂｉｏＡＢ）：：［λｃＩ８５７  Ｎ（ｃｒｏ−ｅａ５９）：：ｔｅｔＲ−ｂｌａ］）（Ｃａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）。液体培地は、溶原培地のＬｅｎｎｏｘ製剤（ＬＢＬ：１％ｗ／ｖバクトトリプトン、０．５％ｗ／ｖ酵母抽出物、０．５％ｗ／ｖ塩化ナトリウム）（Ｌｅｎｎｏｘ、１９５５）、及び適切な選択剤であるカルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）及びＳＤＳ（０．００５％ｗ／ｖ）からなるものであった。ｔｏｌＣ対向選択のために、１４．４μｇタンパク質／μＬであると測定された自己精製物（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、１９７１）を１：１００希釈したコリシンＥ１（ｃｏｌＥ１）を使用し（Ｉｓａａｃｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１、Ｌａｊｏｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３ｂ）、バンコマイシンを６４μｇ／ｍＬで用いた。固体培養培地は、必要に応じて同濃度の抗生物質を含有する１．５％ｗ／ｖのＢａｃｔｏ  Ａｇａｒ（Ｆｉｓｈｅｒ）を含むオートクレーブ処理したＬＢＬからなるものであった。ＣｏｌＥ１寒天プレートを既報の通りに作製した（Ｇｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）。倍加時間は、３４℃で一晩、３６５ｃｐｍで軌道振盪しながらＢｉｏｔｅｋ  Ｅｏｎマイクロプレートリーダーで決定し、ｍａｔｌａｂ  ｓｃｒｉｐｔを使用して分析した。
【０１４１】
オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応及び等温集合
組換え又はＳａｎｇｅｒ配列決定に使用するＰＣＲ産物を、製造業者の標準的プロトコルに従ってＫａｐａ  ２Ｇ  Ｆａｓｔポリメラーゼを用いて増幅した。既報の方法に従って、ＫＡＰＡ２Ｇ  Ｆａｓｔ  ＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲキットを用いてＡＧＲ置換事象の多重遺伝子型判定のために、多重対立遺伝子特異的ＰＣＲ（ｍａｓｃＰＣＲ）を用いた（Ｉｓａａｃｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１、Ｍｏｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）。サンガー配列決定反応は第三者（Ｇｅｎｅｗｉｚ）を通じて実施した。ＣＲＡＭプラスミドは、ＰＣＲ（Ｙａｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）及びＩＤＴからＧｂｌｏｃｋで得られたＣＲＩＳＰＲ／ＰＡＭ配列を用いて線状化したプラスミド骨格から、５０℃で６０分間の等温構築により構築した（Ｇｉｓｂｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００９）。
【０１４２】
ｌａｍｂｄａ  ｒｅｄ組換え、ＭＡＧＥ、及びＣｏＳ‐ＭＡＧＥ
λレッド再結合、ＭＡＧＥ、及びＣｏＳ−ＭＡＧＥを前述のように実施した（Ｇｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００９）。一本鎖組換えでは、ＭＡＧＥオリゴヌクレオチドを１μＭで使用したが、多重選択組換えでは共選択オリゴヌクレオチドは０．２μＭであり、全オリゴヌクレオチドプールは５μＭであった（７〜１４オリゴヌクレオチド）。二本鎖ＰＣＲ産物を組み換える場合（例えば、ｔｏｌＣ挿入）、１００ｎｇの二本鎖ＰＣＲ産物を用いた。ＣｏＳ−ＭＡＧＥをｔｏｌＣ選択と一緒に使用して標的ＡＧＲコドンを置換したため、ｔｏｌＣ選択性能をモニタリングするために、各組換えを水のみで組換えた対照と対にした。各オリゴヌクレオチドセットの標準的なＣｏＳ−ＭＡＧＥプロトコルは、ｔｏｌＣを挿入し、ｔｏｌＣを不活性化し、ｔｏｌＣを再活性化し、ｔｏｌＣを削除することであった。ＭａｓｃＰＣＲスクリーニングは、ｔｏｌＣの挿入工程、不活性化工程、及び欠失工程で行われた。全てのλＲｅｄ組換えの後に、３ｍＬのＬＢＬ中での回復、続いて既報（Ｇｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４）のようにして行ったＳＤＳ選択（ｔｏｌＣ挿入、ｔｏｌＣ活性化）又はＣｏｌＥ１対向選択（ｔｏｌＣ不活性化、ｔｏｌＣ欠失）を行った。
【０１４３】
一般的なＡＧＲ代替戦略
必須遺伝子のＡＧＲコドンは、１２３個の固有のＡＧＲコドン（８２個のＡＧＡ、４１個のＡＧＧ）を含む共有セット（１０７個のコーディング領域）を明らかにする目的で２つの補足的な情報源（Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．、２００６、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）に従って必須遺伝子アノテーションを相互参照することによって、発見された。ｏｐｔＭＡＧＥ（Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００１、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００９）を用いて、各ＡＧＲをＣＧＵに変換する９０−ｍｅｒオリゴヌクレオチド（複製フォークのラギング鎖を標的とする）を設計した。ＡＧＲ置換オリゴヌクレオチドの総数は、可能であれば複数の編集をコード化するようにオリゴヌクレオチドを設計し、オリゴヌクレオチドの５′末端及び３′末端に少なくとも２０ｂｐの相同性を維持することにより、１１９個まで削減された。次いで、所与のセット内の全ての標的の複製方向に対して最大で５６４，６２２ｂｐ上流で単一のマーカー（ｔｏｌＣ）が挿入され得るように、染色体位置に基づいてオリゴヌクレオチドを複雑さが異なる（最小：７、最大：１４）１２個のＭＡＧＥオリゴセットにプールした。ｔｏｌＣ挿入部位は、１２個のプールのそれぞれについて、遺伝子間領域又は所与のプールについての距離基準を満たす非必須遺伝子のいずれかに同定された。１２個のオリゴヌクレオチドプールそれぞれの記述については表５を参照。
【０１４４】
トラブルシューティング戦略
抵抗性ＡＧＲは、変換プロセスの第３工程の後に選別された少なくとも９６個のクローンのうちの１個でＣＧＵに変換されなかったものとして定義された。次いで、抵抗性ＡＧＲコドンを、親株（ＥｃＭ２．１）においてトラブルシューティングのためにトリアージした（図１２Ａ）。第一に、コドンの配列構成を、アノテーションの誤り又は重複遺伝子のための破壊されたＲＢＳのようなデザインエラー又は潜在的な問題について調べた。ほとんどの場合、修正されたオリゴヌクレオチドは容易に設計及び試験可能であった。そのような明白な再設計が不可能であった場合は、ＡＧＲをＣＧＮ突然変異で置き換えることを試みた。ＡＧＲをＣＧＮに置き換える試みにより組換え体が得られなかった場合、代償的な同義変異を、抵抗性ＡＧＲの周囲の３アミノ酸のウィンドウで試験した。必要に応じて、ＡＧＲからＮＮＮへの変異をコードするオリゴヌクレオチドと再結合することにより、同義的ストリンジェンシーを緩和した。トラブルシューティングワークフローの各工程の後、２つの連続したＣｏＳ−ＭＡＧＥ組換えからの９６クローンを、野生型遺伝子型にハイブリダイズするプライマーを用いた対立遺伝子特異的ＰＣＲを用いてスクリーニングした。野生型アンプリコンの産生に失敗した配列を、変換を確認するためにサンガー配列決定した。ＬＢＬ中の全てのクローンの倍加時間を測定して、配列決定データを適応度データと対にし、最短の倍加時間を有する組換えクローンを選択した。倍加時間は、Ｂｉｏｔｅｋプレートリーダー（Ｅｏｎ又はＨ１のいずれか）で増殖曲線を得ることによって決定し、ウェブベースのオープンソースゲノム再配列決定ソフトウェアを使用して分析した。次にこの遺伝子型をＭＡＧＥを用いた菌株構築の最後に完全菌株に導入し、ＭＡＳＣ−ＰＣＲスクリーニングによって確認した。
【０１４５】
ｍＲＮＡの折り畳み及びＲＢＳ強度の計算
各配列についてのｍＲＮＡ折り畳み及びＲＢＳ強度値を計算するためにカスタムＰｙｔｈｏｎパイプラインを使用した。ｍＲＮＡの折り畳みはＵＮＡＦｏｌｄ計算機（Ｍａｒｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、２００８に基づき、ＲＢＳ強度はＳａｌｉｓ計算機（Ｓａｌｉｓ、２０１１）に基づいた。ｍＲＮＡの折り畳みのためのパラメータは、温度（３７℃）であり、使用されるウィンドウは平均して遺伝子の開始部位周辺の−３０：＋１００ｎｔから−１５：＋１００ｎｔの間であり、Ｇｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１３に基づいていた。ＲＢＳ強度の唯一のパラメータはＲＢＳとプロモーターの間の距離であり、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２に基づくと平均して目的のコドンの後の９〜１０ｎｔである。データの可視化はカスタムＭａｔｌａｂコードを介して実行された。
【０１４６】
必須遺伝子においてＡＧＲコドンを欠く菌株の全ゲノム配列決定
剪断されたゲノムＤＮＡは、Ｃｏｖａｒｉｓ  Ｅ２１０中で１３０μＬの精製されたゲノムＤＮＡを剪断することによって得られた。全ゲノムライブラリー調製は既報のように実施した（Ｒｏｈｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）。簡潔には、１３０μＬの精製ゲノムＤＮＡをＣｏｖａｒｉｓ  Ｅ２１０中で以下のプロトコルを用いて一晩剪断した。負荷サイクル：１０％、強度：５、サイクル／バースト：２００、時間：７８０秒／サンプル。アガロースゲル上でサンプルの剪断についてアッセイし、分布が許容される場合（ピーク分布約４００ｎｔ）、既報（Ｒｏｈｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）に記載されているようにＳＰＲＩ／逆ＳＰＲＩ精製によってサンプルをサイズ選択した。次に断片を平滑化し、ｐ５／ｐ７アダプターを連結し、続いてフィルイン（ｆｉｌｌ−ｉｎ）及びギャップ（ｇａｐ）修復（ＮＥＢ）を行った。各サンプルを、ＳＹＢＲグリーン及びＫａｐａ  Ｈｉｆｉを用いてｑＰＣＲ定量した。これを使用して、Ｐ５−ｓｏｌプライマー及びＰ７−ｓｏｌプライマーを使用してバーコード化のために得られたライブラリーを増幅するためのサイクル数を決定した。得られた個々のライブラリーをＮａｎｏｄｒｏｐにより定量しプールした。得られたライブラリーをｑＰＣＲ及びＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎで定量し、ＭｉＳｅｑ  ２×１５０で泳動した。データを分析して、ウェブベースのオープンソースゲノム再配列決定ツールであるＭｉｌｌｓｔｏｎｅを使用して、ＡＧＲ変換を確認し、オフターゲット突然変異を同定した。
【０１４７】
ＮＮＮ配列決定及びＣＲＩＳＰＲ
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、所望のＡＧＲコドン変化の隣の未改変標的部位で染色体を選択的に切断することによって野生型親遺伝子型を枯渇させた。標的部位は、標化されるＡＧＲコドンに近接して近いＧｅｎｅｉｏｕｓの内蔵標的部位ファインダーを使用して決定した。ＡＧＲコドンの上流５０ｂｐ未満であり、同義変化で破壊される可能性がある部位を選択した。複数の部位がこれらの基準を満たす場合、ゲノムの他の部分と最低レベルの配列類似性を有する部位が選択された。翻訳開始部位の後の最初の３０ｎｔにＡＧＲコドンを有する２４個の遺伝子の全てについて、約１３０ｂｐの長さのオリゴを設計した。これらのオリゴは、ＡＧＲ位置にＮＮＮランダムコドン、及びＡＧＲコドンの少なくとも５０ｎｔ下流にあるＣＲＩＳＰＲ標的部位における複数の（最大６つまでの）同義変化の両方を組み込んでいた。これによりＣＲＩＳＰＲ標的部位を破壊すると同時にＡＧＲ遺伝子座が改変され、親の遺伝子型が削除された後の遺伝子座のランダム化を確実にする。Ｃａｓ９発現プラスミドＤｓＣａｓ９を有する親株ＥｃＭ２．１において組換えを実施した。２４個の遺伝子のそれぞれについて、１μＭ濃度の特異的突然変異誘発オリゴを用いて５サイクルのＭＡＧＥを実施した。ガイドを有するＣＲＩＳＰＲリピートスペーサープラスミドを選択された部位を標的とするように設計し、最後の組換えサイクル後に多様化プールのそれぞれにエレクトロポレーションした。１時間の回復後、ＤｓＣａｓ９プラスミド及びリピートスペーサープラスミドの両方を選択し、２４のＡＧＲコドンのそれぞれについて３つの並行した系統で１４４時間継代した。２時間の選択の後、２４時間毎に、サンプルを採取して細胞を選択培地中で１／１００に希釈した。
【０１４８】
ＣＲＩＳＰＲ部位改変を組み込んだ菌株の特異的増幅を可能にするＰＣＲプライマーを用いて各ランダム化集団を増幅した。次いで、各ＡＧＲコドンについて得られた三連ライブラリーをプールし、Ｐ５−ｓｏｌプライマー及びＰ７−ｓｏｌプライマーでバーコード化して、ＭｉＳｅｑ  １×５０上で泳動した。カスタムＭａｔｌａｂコードを使用してデータを分析しました。
【０１４９】
各遺伝子及び各データ点について、読み取りを参照ゲノムとアライメントし、各コドンの頻度を計算した。図２３において、任意の単位でのｍＲＮＡ構造の偏差（赤線）及びＲＢＳ強度の偏差（青線）は、頻度と各コドンに対する偏差の積として計算した。
【０１５０】
実施例３
ゲノム工学ツールキット及び多遺伝子座検証実験
本明細書に記載の方法は、ゲノム全体にわたってコドンを再割り当てするためのソフトウェアライブラリであるＧｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｔｏｏｌｋｉｔ（ＧＥＴＫ）を利用する。ＧＥＴＫソフトウェアは、再コード化遺伝子及び全ゲノムの設計及び合成を支援する（図３６Ａ）。前記ソフトウェアは生物物理学的制約を考慮に入れて、最善のコドン再割り当てを選択し、再設計された生物が障害されるか又は生存不能になるリスクを最小限にする。本明細書に記載のソフトウェアコード化方法を使用して、ゲノム全体にわたる位置を再コード化し、本明細書に記載の方法によって特定されるコドン選択により設計例外の危険性が低減されることが実証された。
【０１５１】
本明細書に記載の設計規則を検証するために、ゲノム全体で同義コドン置換を試験するための実験を行った。２３５のコドン競合実験を設計し、コドン置換の予測困難性に従って優先順位を付けた。ｍＲＮＡ、ＲＢＳ、又は内部ＲＢＳのうちの少なくとも１つが設計規則によって少なくとも１つの代替コドンについて有意に破壊されていると予測される位置を選択した。実施例１と同様に、ＡＧＡ（Ａｒｇ）、ＡＧＧ（Ａｒｇ）、ＡＧＣ（Ｓｅｒ）、ＡＧＵ（Ｓｅｒ）、ＵＵＧ（Ｌｅｕ）、及びＵＵＡ（Ｌｅｕ）の６種の禁止センスコドンを考慮に入れた。設計規則により予測されるスコアとしてｍａｘ＿｛ｍＲＮＡ｜ＲＢＳ｜ｉｎｔｅｒｎａｌ＿ＲＢＳ｝が閾値を超えたか、又は少なくとも１つの不良再コード化が生じた位置を優先した。各サブ実験について、標的に同義コドンを導入するＭＡＧＥオリゴを設計した。いくつかのサブ実験のために、非同義突然変異を導入するＭＡＧＥオリゴを設計した。各サブ実験は別々のウェルで行い、ＭＡＧＥを使用してそのサブ実験用のオリゴセットをエレクトロポレーションした。母集団を定期的にサンプリングし、対数増殖期を維持するために希釈した。サンプルを配列決定してコドン存在量を定量するために使用し、次に相対適応度を計算するために使用した（図３６Ｂ）。
【０１５２】
予測スコアを実験による適応度測定値と比較した（図３６Ｃ）。本実験により、代替コドン予測により設計上の問題を最小化し得ることが明らかになった。必須遺伝子の５′末端の単一コドン変化を試験する場合、良好なスコアを有すると分類されたコドン（ｍＲＮＡの折り畳み、リボソーム結合部位強度、及び内部リボソーム休止部位の予測される破壊が最小）は適応度に有意に少ない影響をもたらす（Ｋ−Ｓテスト）。同じ９０−ｍｅｒオリゴウィンドウ内のコドン交換の試験的組み合わせは、予測されたスコアと観察された適応度との間でさらに強い対応を示した（図３７）。
【０１５３】
無効対照として、同義コドン及び早期終止コドンが非必須遺伝子であるＬａｃＺ及びＧａｌＫの複数の位置に導入され、同義コドンと内部停止との間で同様の効果が示された（図３８、上段）。強力な効果の対照として、同義コドン及び内部終止コドンが必須遺伝子に導入された。これらは、いくつかの位置でコドン選択のより大きなダイナミックレンジを有し、内部終止コドンと同義コドンの間に著しい違いを示す（図３８、下段）
【０１５４】
同義置換は試験するまでもなく、本明細書に記載された規則に従ってうまくスコア付けされる大腸菌の系統発生的な近隣種（例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａなどのガンプロテオバクテリア）において観察された非同義置換を、コドンを置換する能力について試験した。内部ＲＢＳモチーフの破壊を防止することは、潜在的に高いＲＢＳ破壊（図３９）（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ  ｐ＝３．Ｅ−１４）を有する遺伝子座及び強いリボソーム休止ピークを有することが観察された遺伝子座の両方について（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）（図４０）（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ  ｐ＝７．９Ｅ−０５）、遺伝子内部のコドンを選択するための有効な規則である。
【０１５５】
ゲノム遺伝子座標的の選択
２３５コドン競合実験のための標的は、３つの９６ウェルプレートにまとめられた。
【０１５６】
プレート１：必須遺伝子の５′における単一コドン変化
必須遺伝子の５′末端付近、すなわち開始コドンに対して（−３０、＋１００）塩基付近に存在する９５個のコドンを選択した。以下のフィルターによって記述されるように、予測される最低スコアが少なくとも１つのフィルターの閾値を超える位置（ＲＢＳ又はｍＲＮＡのフォールディング予測が不良）を考慮した。
【０１５７】
【表１】
2019519233.tif 000004
【０１５８】
閾値は以下のように選択された。
RBS_log_ratio:3.3=1+math.log_e(10)
mRNA_positive_ratio:1.1=10%偏差
max_internal_RBS_score:4.1=3.3+９６ウェルプレート未満にするためには若干多め
【０１５９】
候補セットは、設計において少なくとも１つの問題を有するターゲットを含む（すなわち、最も悪い設計は不良である）。これらのターゲットのうち少なくとも２つは、重複遺伝子に非同義変異を導入し、アミノ酸の意味と調節遺伝子発現シグナルの保存とのバランスをとるソフトウェアの態様を試験することが可能になる。
【０１６０】
プレート２：コドン変化及び隣接縮重部位試験の組み合わせ
単一の変化の中から、９０塩基対のオリゴヌクレオチドサイズ内で他のものに隣接して起こるものを組み合わせて、隣接オリゴのすべての組み合わせを試験した新しい一連のサブ実験とした。そのようなターゲットは６２個あった。
【０１６１】
禁止コドンに隣接する非禁止コドンにおける同義コドン交換を用いて１２のサブ実験を設計した。いくつかの選択禁止コドンのいずれかの側ですべての同義コドン交換されたオリゴが設計された。例えば、アルギニンＶ−Ｒ−Ｇの周囲の領域は、オリゴではＧＴＮ−ＣＧＮ−ＧＧＮのように見える可能性がある。これらのために、最善の同義解でさえも不良の場合、最良の同義コドン交換で閾値を超えるスコアを有する再コード化を目標とする。
【０１６２】
プレート３：系統発生的保存の試験
最終的な６６個のサブ実験は、許可された非同義置換の原因として系統発生的保存を試験するために設計された。ガンマプロテオバクテリアの７種の菌株をアラインメントし、大腸菌に対する非同義の変異を有するコドンが同定された。必須遺伝子の５′末端付近及び必須遺伝子の中央部を標的として試験した。５′標的を保存するため、以下に記述されるように、予測される悪いスコアが存在する系統発生的保存上のデータにおいて観察された非同義変化からサブセットを選択した。
【０１６３】
【表２】
2019519233.tif 000005
【０１６４】
これらの選択は、プレート１由来の対応する単一コドン縮重オリゴと競合した。
【０１６５】
遺伝子の中央部での保存のために、必須遺伝子における約３５００の候補標的を、１）潜在的な最大値が不良であって同義変化を有する、内部ＲＢＳスコア、及び２）リボソーム休止データからのピークの位置（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１２）の２つの基準を用いて減らした。
【０１６６】
内部ＲＢＳについては、９個の固有の位置にある１２個の標的を合計２１個のオリゴに対して選択した。使用されるフィルターを以下に示す。
【０１６７】
【表３】
2019519233.tif 000006
【０１６８】
Ｗｅｉｓｓｍａｎでは、９つの固有な位置に１４の標的、又は２３個のオリゴヌクレオチドを選択した。
【０１６９】
オリゴヌクレオチドは、既報に記載の通りに設計した（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００９）。ＤＮＡは、産業連携先であるＩＤＴ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）によって合成された。
【０１７０】
菌株及び培養
競合試験には、ＥｃＭ２．１無処理菌株を使用した（ＥｃＭ２．１は、大腸菌ＭＧ１６５５  ｍｕｔＳ＿ｍｕｔ  ｄｎａＧ＿Ｑ５７６Ａ  ｅｘｏＸ＿ｍｕｔ  ｘｏｎＡ＿ｍｕｔ  ｘｓｅＡ＿ｍｕｔ  １２５５７００：：ｔｏｌＱＲＡ  Δ（ｙｂｈＢ−ｂｉｏＡＢ）：：［λｃＩ８５７  Ｎ（ｃｒｏ−ｅａ５９）：：ｔｅｔＲ−ｂｌａ］であり、ＭＡＧＥに対して最適化された菌株である）。
【０１７１】
液体培地は、溶原培地のＬｅｎｎｏｘ製剤（ＬＢＬ：１％ｗ／ｖバクトトリプトン、０．５％ｗ／ｖ酵母抽出物、０．５％ｗ／ｖ塩化ナトリウム）及び適切な選択剤であるカルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）からなるものであった。固体培養培地は、必要に応じて同濃度の抗生物質を含有する１．５％ｗ／ｖのＢａｃｔｏ  Ａｇａｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）を含むオートクレーブ処理したＬＢＬからなるものであった。
【０１７２】
実験設定
ＥｃＭ２．１株を用いた組み換え実験を、以前に記載されたように、全ての異なる競合実験について同じ条件で行った。実験に応じて、全オリゴプールを最大５μＭに調整した。
【０１７３】
オリゴの形質転換後、細胞を１時間後、３時間後、５時間後、７時間後、及び２４時間後に取り出して配列を決定した。細胞を一定の対数期に維持するように希釈を行った。各時点で、プール中に存在する細胞の数を数えるために、細胞を許容培地上にプレーティングした。これらの数値に基づいて、各時点間の倍加数を計算することができた。
【０１７４】
【表４】
2019519233.tif 000007
【０１７５】
配列決定
各集団をＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ５プライマー及びＰ７プライマーで増幅及びバーコード化し、プールし、ＰＥ−１５０キットを用いてＭｉＳｅｑ又はＮｅｘｔＳｅｑにより配列決定した。読み取りを基準ゲノムに逆多重化し、各コドンの頻度を各サブ実験について計算した。
【０１７６】
相対的対立遺伝子の適応度の推定及びスコア付け
各サブ実験について、各コドンの相対頻度を計算した。次いで、画分を最初の時点での画分に対して正規化した。次に、各コドンについて、適応度は、対数関数を全ての時点にわたってコドン画分に適合させ、減衰定数を測定適応度として採用することによって推論された。ｍＲＮＡ構造の偏差及びＲＢＳ強度の偏差はＧＥＴＫを用いて計算され、スコアは実験により測定された適応度と比較された。
【０１７７】
【表５】
2019519233.tif 000008
【０１７８】
【表６】
2019519233.tif 000009
【０１７９】
【表７】
2019519233.tif 000010
【０１８０】
【表８】
2019519233.tif 000011
【０１８１】
【表９】
2019519233.tif 000012
【０１８２】
【表１０】
2019519233.tif 000013
【０１８３】
【表１１】
2019519233.tif 000014
【０１８４】
【表１２】
2019519233.tif 000015
【０１８５】
【表１３】
2019519233.tif 000016
【０１８６】
【表１４】
2019519233.tif 000017
【０１８７】
【表１５】
2019519233.tif 000018
【０１８８】
【表１６】
2019519233.tif 000019
【０１８９】
【表１７】
2019519233.tif 000020
【０１９０】
【表１８】
2019519233.tif 000021
【０１９１】
【表１９】
2019519233.tif 000022
【０１９２】
【表２０】
2019519233.tif 000023
【０１９３】
【表２１】
2019519233.tif 000024
【０１９４】
【表２２】
2019519233.tif 000025
【０１９５】
【表２３】
2019519233.tif 000026
【０１９６】
【表２４】
2019519233.tif 000027
【０１９７】
【表２５】
2019519233.tif 000028
【０１９８】
【表２６】
2019519233.tif 000029
【０１９９】
【表２７】
2019519233.tif 000030
【０２００】
【表２８】
2019519233.tif 000031
【０２０１】
【表２９】
2019519233.tif 000032
【０２０２】
【表３０】
2019519233.tif 000033
【０２０３】
【表３１】
2019519233.tif 000034
【０２０４】
【表３２】
2019519233.tif 000035
【０２０５】
【表３３】
2019519233.tif 000036
【０２０６】
【表３４】
2019519233.tif 000037
【０２０７】
【表３５】
2019519233.tif 000038
【０２０８】
【表３６】
2019519233.tif 000039
【０２０９】
【表３７】
2019519233.tif 000040
【０２１０】
【表３８】
2019519233.tif 000041
【０２１１】
【表３９】
2019519233.tif 000042
【０２１２】
【表４０】
2019519233.tif 000043
【０２１３】
【表４１】
2019519233.tif 000044
【０２１４】
【表４２】
2019519233.tif 000045
【０２１５】
【表４３】
2019519233.tif 000046
【０２１６】
【表４４】
2019519233.tif 000047
【０２１７】
【表４５】
2019519233.tif 000048
【０２１８】
【表４６】
2019519233.tif 000049
【０２１９】
【表４７】
2019519233.tif 000050
【０２２０】
【表４８】
2019519233.tif 000051
【０２２１】
【表４９】
2019519233.tif 000052
【０２２２】
【表５０】
2019519233.tif 000053
【０２２３】
【表５１】
2019519233.tif 000054
【０２２４】
【表５２】
2019519233.tif 000055
【０２２５】
【表５３】
2019519233.tif 000056
【０２２６】
【表５４】
2019519233.tif 000057
【０２２７】
【表５５】
2019519233.tif 000058
【０２２８】
【表５６】
2019519233.tif 000059
【０２２９】
【表５７】
2019519233.tif 000060
【０２３０】
【表５８】
2019519233.tif 000061
【０２３１】
【表５９】
2019519233.tif 000062
【０２３２】
【表６０】
2019519233.tif 000063
【０２３３】
【表６１】
2019519233.tif 000064
【０２３４】
【表６２】
2019519233.tif 000065
【０２３５】
【表６３】
2019519233.tif 000066
【０２３６】
【表６４】
2019519233.tif 000067
【０２３７】
【表６５】
2019519233.tif 000068
【０２３８】
【表６６】
2019519233.tif 000069
【０２３９】
【表６７】
2019519233.tif 000070
【０２４０】
【表６８】
2019519233.tif 000071
【０２４１】
【表６９】
2019519233.tif 000072
【０２４２】
【表７０】
2019519233.tif 000073
【０２４３】
【表７１】
2019519233.tif 000074
【０２４４】
【表７２】
2019519233.tif 000075
【０２４５】
【表７３】
2019519233.tif 000076
【０２４６】
参考文献
本明細書においては参考文献を著者別で明示するが、完全な引用を以下に示す。引用された各参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
1. Gibson, D.G., Glass, J.I., Lartigue, C., Noskov, V.N., Chuang, R.Y., Algire, M.A., Benders, G.A., Montague, M.G., Ma, L., Moodie, M.M., et al.(2010). Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science 329, 52-56.
2. Lajoie, M.J., Kosuri, S., Mosberg, J.A., Gregg, C.J., Zhang, D., and Church, G.M.(2013a). Probing the limits of genetic recoding in essential genes. Science 342, 361-363.
3. Lajoie, M.J., Rovner, A.J., Goodman, D.B., Aerni, H.R., Haimovich, A.D., Kuznetsov, G., Mercer, J.A., Wang, H.H., Carr, P.A., Mosberg, J.A., et al.(2013b). Genomically recoded organisms expand biological functions. Science 342, 357-360.
4. Crick, F.H.(1963). On the genetic code. Science 139, 461-464.
5. Liu, C.C., Schultz, P.G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444(2010).
6. P. Marliere, The farther, the safer: a manifesto for securely navigating synthetic species away from the old living world. Syst. Synth. Biol. 3, 77-84(2009).
7. Mandell, D.J. et al., Biocontainment of genetically modified organisms by synthetic protein design. Nature. 518, 55-60(2015).
8. Rovner, A.J. et al., Recoded organisms engineered to depend on synthetic amino acids. Nature. 518, 89-93(2015).
9. A. Ambrogelly, S. Palioura, D. Soll, Natural expansion of the genetic code. Nat. Chem. Biol. 3, 29-35(2007).
10. A. Kano, Y. Andachi, T. Ohama, S. Osawa, Novel anticodon composition of transfer RNAs in Micrococcus luteus, a bacterium with a high genomic G + C content. Correlation with codon usage. J. Mol. Biol. 221, 387-401(1991).
11. T. Oba, Y. Andachi, A. Muto, S. Osawa, CGG: an unassigned or nonsense codon in Mycoplasma capricolum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, 921-925(1991).
12. G. Macino, G. Coruzzi, F. G. Nobrega, M. Li, A. Tzagoloff, Use of the UGA terminator as a tryptophan codon in yeast mitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 76, 3784-3785(1979).
13. J. Ling, P. O’Donoghue, D. Soll, Genetic code flexibility in microorganisms: novel mechanisms and impact on physiology. Nat. Rev. Microbiol. 13, 707-721(2015).
14. K. J. Blight, A. A. Kolykhalov, C. M. Rice, Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture. Science. 290, 1972-1974(2000).
15. J. Cello, A. V. Paul, E. Wimmer, Chemical synthesis of poliovirus cDNA: generation of infectious virus in the absence of natural template. Science. 297, 1016-1018(2002).
16. H. O. Smith, C. A. Hutchison, C. Pfannkoch, J. C. Venter, Generating a synthetic genome by whole genome assembly: φX174 bacteriophage from synthetic oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 15440-15445(2003).
17. L. Y. Chan, S. Kosuri, D. Endy, Refactoring bacteriophage T7. Mol. Syst. Biol. 1, 2005.0018(2005).
18. D. G. Gibson et al., Complete chemical synthesis, assembly, and cloning of a Mycoplasma genitalium genome. Science. 319, 1215-1220(2008).
19. N. Annaluru et al., Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344, 55-58(2014).
20. G. Kudla, A. W. Murray, D. Tollervey, J. B. Plotkin, Coding-sequence determinants of gene expression in Escherichia coli. Science. 324, 255-258(2009).
21. T. Tuller, Y. Y. Waldman, M. Kupiec, E. Ruppin, Translation efficiency is determined by both codon bias and folding energy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 3645-3650(2010).
22. J. B. Plotkin, G. Kudla, Synonymous but not the same: the causes and consequences of codon bias. Nat. Rev. Genet. 12, 32-42(2011).
23. D. B. Goodman, G. M. Church, S. Kosuri, Causes and effects of N-terminal codon bias in bacterial genes. Science. 342, 475-479(2013).
24. M. Zhou et al., Non-optimal codon usage affects expression, structure and function of clock protein FRQ. Nature. 495, 111-115(2013).
25. T. E. F. Quax, N. J. Claassens, D. Soll, J. van der Oost, Codon Bias as a Means to Fine-Tune Gene Expression. Mol. Cell. 59, 149-161(2015).
26. G. Boel et al., Codon influence on protein expression in E. coli correlates with mRNA levels. Nature. 529, 358-363(2016).
27. F. J. Isaacs et al., Precise manipulation of chromosomes in vivo enables genome-wide codon replacement. Science. 333, 348-353(2011).
28. H. H. Wang et al., Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution. Nature. 460, 894-898(2009).
29. K. M. Esvelt et al., Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat. Methods. 10, 1116-1121(2013).
30. G. Posfai et al., Emergent properties of reduced-genome Escherichia coli. Science. 312, 1044-1046(2006).
31. K. Temme, D. Zhao, C. A. Voigt, Refactoring the nitrogen fixation gene cluster from Klebsiella oxytoca. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7085-7090(2012).
32. A. H. Yona et al., tRNA genes rapidly change in evolution to meet novel translational demands. Elife. 2, e01339(2013).
33. Y. Yamazaki, H. Niki, J.-I. Kato, in Microbial Gene Essentiality: Protocols and Bioinformatics, A. L. Osterman, S. Y. Gerdes, Eds.(Humana Press, Totowa, NJ, 2008), vol. 416 of Methods in Molecular BiologyTM, pp. 385-389.
34. S. Anders, W. Huber, Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11, R106(2010).
35. S. Osawa, T. H. Jukes, Codon reassignment(codon capture) in evolution. J. Mol. Evol. 28, 271-278(1989).
36. H. M. Salis, The ribosome binding site calculator. Methods Enzymol. 498, 19-42(2011).
37. T. Conway et al., Unprecedented high-resolution view of bacterial operon architecture revealed by RNA sequencing. MBio. 5, e01442-14(2014).
38. C. J. Gregg et al., Rational optimization of tolC as a powerful dual selectable marker for genome engineering. Nucleic Acids Res. 42, 4779-4790(2014).
39. K. A. Datsenko, B. L. Wanner, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 6640-6645(2000).
40. A. Haldimann, B. L. Wanner, Conditional-replication, integration, excision, and retrieval plasmid-host systems for gene structure-function studies of bacteria. J. Bacteriol. 183, 6384-6393(2001).
41. D. E. Deatherage, J. E. Barrick, Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol. Biol. 1151, 165-188(2014).
42. H. Li, R. Durbin, Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760(2009a).
43. H. Li et al., The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079(2009b).
44. S. Anders, W. Huber, Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11, R106(2010).
45. Carr PA, et al.(2012) Enhanced multiplex genome engineering through co-operative oligonucleotide co-selection. Nucleic Acids Res 40(17):e132
46. Lennox ES(1955) Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology 1(2):190-206.
47. Schwartz SA & Helinski DR(1971) Purification and characterization of colicin E1. The Journal of biological chemistry 246(20):6318-6327.
48. Mosberg JA, Gregg CJ, Lajoie MJ, Wang HH, & Church GM(2012) Improving Lambda Red Genome Engineering in Escherichia coli via Rational Removal of Endogenous Nucleases. PLoS One (9):e44638.
49. Yaung SJ, Esvelt KM, & Church GM(2014) CRISPR/Cas9-mediated phage resistance is not impeded by the DNA modifications of phage T4. PLoS One 9(6):e98811.
50. Gibson DG, et al.(2009) Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods 6(5):343-345.
51. Baba T, et al.(2006) Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol 2:2006 0008.
52. Hashimoto M, et al.(2005) Cell size and nucleoid organization of engineered Escherichia coli cells with a reduced genome. Mol Microbiol 55(1):137-149.
53. Ellis HM, Yu D, DiTizio T, & Court DL(2001) High efficiency mutagenesis, repair, and engineering of chromosomal DNA using single-stranded oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci U S A 98(12):6742-6746.
54. Markham NR & Zuker M(2008) UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. Methods in molecular biology 453:3-31.
55. Rohland N & Reich D(2012) Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome research 22(5):939-946.
56. Zadeh JN, et al.(2011) NUPACK: Analysis and design of nucleic acid systems. J Comput Chem 32(1):170-173.
57. Li GW, Oh E, & Weissman JS(2012) The anti-Shine-Dalgarno sequence drives translational pausing and codon choice in bacteria. Nature 484(7395):538-541.
58. Chen GF & Inouye M(1990) Suppression of the negative effect of minor arginine codons on gene expression; preferential usage of minor codons within the first 25 codons of the Escherichia coli genes. Nucleic Acids Res 18(6):1465-1473.
59. Rosenberg AH, Goldman E, Dunn JJ, Studier FW, & Zubay G(1993) Effects of consecutive AGG codons on translation in Escherichia coli, demonstrated with a versatile codon test system. J Bacteriol 175(3):716-722.
60. Spanjaard RA & van Duin J(1988) Translation of the sequence AGG-AGG yields 50% ribosomal frameshift. Proc Natl Acad Sci U S A 85(21):7967-7971.
61. Spanjaard RA, Chen K, Walker JR, & van Duin J(1990) Frameshift suppression at tandem AGA and AGG codons by cloned tRNA genes: assigning a codon to argU tRNA and T4 tRNA(Arg). Nucleic Acids Res 18(17):5031-5036.
62. Bonekamp F, Andersen HD, Christensen T, & Jensen KF(1985) Codon-defined ribosomal pausing in Escherichia coli detected by using the pyrE attenuator to probe the coupling between transcription and translation. Nucleic Acids Res 13(11):4113-4123.
63. Zeng Y, Wang W, & Liu WR(2014) Towards reassigning the rare AGG codon in Escherichia coli. Chembiochem : a European journal of chemical biology 15(12):1750-1754.
64. Yu D, et al.(2000) An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 97(11):5978-5983.
65. Lajoie MJ, Gregg CJ, Mosberg JA, Washington GC, & Church GM(2012) Manipulating replisome dynamics to enhance lambda Red-mediated multiplex genome engineering. Nucleic Acids Res 40(22):e170.
66. Curran JF(1993) Analysis of effects of tRNA:message stability on frameshift frequency at the Escherichia coli RF2 programmed frameshift site. Nucleic Acids Res 21(8):1837-1843.
67. Ohtake K, et al.(2012) Efficient decoding of the UAG triplet as a full-fledged sense codon enhances the growth of a prfA-deficient strain of Escherichia coli. I 194(10):2606-2613.
68. Craigen WJ, Cook RG, Tate WP, & Caskey CT(1985) Bacterial peptide chain release factors: conserved primary structure and possible frameshift regulation of release factor 2. Proc Natl Acad Sci U S A 82(11):3616-3620.
69. Goodman D, Kuznetsov, G., Lajoie, M., Ahern, B.,(2015) Millstone, a web based genome engineering and analysis software.
70. Novoa EM & Ribas de Pouplana L(2012) Speeding with control: codon usage, tRNAs, and ribosomes. Trends in genetics: TIG 28(11):574-581.
71. Novoa EM, Pavon-Eternod M, Pan T, & Ribas de Pouplana L(2012) A role for tRNA modifications in genome structure and codon usage. Cell 149(1):202-213.
72. Ikemura T(1985) Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms. Mol Biol Evol 2(1):13-34.
73. Lajoie MJ, Soll D, & Church GM(2015) Overcoming challenges in engineering the genetic code. J Mol Biol.
74. N. R. Markham, M. Zuker, DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction. Nucleic Acids Res. 33, W577-81(2005).
【図１】
2019519233.tif 000077
【図２】
2019519233.tif 000078
【図３】
2019519233.tif 000079
【図４】
2019519233.tif 000080
【図５Ａ】
2019519233.tif 000081
【図５Ｂ】
2019519233.tif 000082
【図５Ｃ】
2019519233.tif 000083
【図６】
2019519233.tif 000084
【図７】
2019519233.tif 000085
【図８】
2019519233.tif 000086
【図９Ａ−１】
2019519233.tif 000087
【図９Ａ−２】
2019519233.tif 000088
【図９Ｂ】
2019519233.tif 000089
【図９Ｃ】
2019519233.tif 000090
【図９Ｄ】
2019519233.tif 000091
【図９Ｅ】
2019519233.tif 000092
【図９Ｆ】
2019519233.tif 000093
【図９Ｇ】
2019519233.tif 000094
【図１０Ａ】
2019519233.tif 000095
【図１０Ｂ】
2019519233.tif 000096
【図１０Ｃ】
2019519233.tif 000097
【図１１】
2019519233.tif 000098
【図１２Ａ】
2019519233.tif 000099
【図１２Ｂ】
2019519233.tif 000100
【図１２Ｃ】
2019519233.tif 000101
【図１２Ｄ】
2019519233.tif 000102
【図１３Ａ】
2019519233.tif 000103
【図１３Ｂ】
2019519233.tif 000104
【図１４Ａ】
2019519233.tif 000105
【図１４Ｂ】
2019519233.tif 000106
【図１５Ａ】
2019519233.tif 000107
【図１５Ｂ】
2019519233.tif 000108
【図１６】
2019519233.tif 000109
【図１７】
2019519233.tif 000110
【図１８Ａ】
2019519233.tif 000111
【図１８Ｂ】
2019519233.tif 000112
【図１９Ａ】
2019519233.tif 000113
【図１９Ｂ】
2019519233.tif 000114
【図２０Ａ】
2019519233.tif 000115
【図２０Ｂ】
2019519233.tif 000116
【図２１Ａ】
2019519233.tif 000117
【図２１Ｂ】
2019519233.tif 000118
【図２１Ｃ】
2019519233.tif 000119
【図２１Ｄ】
2019519233.tif 000120
【図２２】
2019519233.tif 000121
【図２３】
2019519233.tif 000122
【図２４】
2019519233.tif 000123
【図２５Ａ】
2019519233.tif 000124
【図２５Ｂ】
2019519233.tif 000125
【図２６】
2019519233.tif 000126
【図２７Ａ】
2019519233.tif 000127
【図２７Ｂ】
2019519233.tif 000128
【図２７Ｃ】
2019519233.tif 000129
【図２８】
2019519233.tif 000130
【図２９】
2019519233.tif 000131
【図３０】
2019519233.tif 000132
【図３１】
2019519233.tif 000133
【図３２】
2019519233.tif 000134
【図３３】
2019519233.tif 000135
【図３４】
2019519233.tif 000136
【図３５】
2019519233.tif 000137
【図３６Ａ】
2019519233.tif 000138
【図３６Ｂ】
2019519233.tif 000139
【図３６Ｃ】
2019519233.tif 000140
【図３７】
2019519233.tif 000141
【図３８】
2019519233.tif 000142
【図３９】
2019519233.tif 000143
【図４０】
2019519233.tif 000144
【配列表】
2019519233000001.app
【国際調査報告】
2019519233.tif 000145
2019519233.tif 000146
2019519233.tif 000147