(57)【要約】【課題】            歯周病の非常に有効な治療及び／又は予防に用いることができる微生物を提供する。【解決手段】        本発明は、口腔バイオフィルムの組成を変化させるための特定の微生物に関し、特に虫歯及び／又は歯周病の治療及び／又は予防に用いられるための特定の微生物に関する。特に、本発明は、唾液由来の口腔バイオフィルムの細菌組成を変化させるためのプロバイオティクス剤として用いるための微生物に関し、好ましくはグラム陰性の嫌気性属の割合を減少させるためのプロバイオティクス剤及び／又は好気性属又は通性嫌気性属の割合を増加させるためのプロバイオティクス剤として用いるための微生物に関する。更に、本発明はプロバイオティクス剤としての微生物を含む口腔医薬組成物、口腔ケア製品又は栄養若しくは楽しみのための製品及びそれらの製造方法を提供する。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
虫歯及び／又は歯周病の治療及び／又は予防に用いるための微生物であって、
前記微生物は、ラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０（ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１３６９１）である、微生物。
【請求項２】
前記微生物は、弱毒化微生物又は死んだ微生物であり、好ましくは熱弱毒化微生物である、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
唾液由来の口腔バイオフィルムの細菌組成を変化させるためのプロバイオティクス剤として、好ましくは、グラム陰性の嫌気性属の割合を減少させるためのプロバイオティクス剤及び／又は好気性属又は通性嫌気性属の割合を増加させるためのプロバイオティクス剤として用いるための、請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びピラミドバクター属（Ｐｙｒａｍｉｄｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される１種以上の細菌の割合を減少させるための、
及び／又はコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及び／又はナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）の割合を増加させるための、請求項３に記載の微生物。
【請求項５】
口腔医薬組成物、口腔ケア製品又は栄養若しくは楽しみのための製品であって、
ラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０を含み、
ラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０の合計量が、虫歯及び／又は歯周病の治療及び／又は予防に十分であり、
更に、
ラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０の合計量が、前記組成物の合計質量に対し、好ましくは０．０１〜１００％の範囲内、より好ましくは０．１〜５０％の範囲内、最も好ましくは１〜１０％の範囲内であり、
及び／又は、
ラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０の合計量が、好ましくは１×１０3〜１×１０11コロニー形成単位（ＣＦＵ）の範囲内、より好ましくは１×１０5〜１×１０10ＣＦＵの範囲内である、
前記組成物又は製品。
【請求項６】
虫歯及び／又は歯周病の治療及び／又は予防に用いるための、好ましくは唾液由来の口腔バイオフィルムの細菌組成を変化させるための、請求項５に記載の組成物又は製品。
【請求項７】
グラム陰性の嫌気性属の割合を減少させるための、及び／又は好気性属又は通性嫌気性属の割合を増加させるための、請求項６に記載の組成物又は製品。
【請求項８】
バクテロイデス属、フソバクテリウム属、プレボテラ属及びピラミドバクター属からなる群から選択される１種以上の細菌の割合を減少させるための、及び／又はコリネバクテリウム属及び／又はナイセリア属の割合を増加させるための、請求項６又は７に記載の組成物又は製品。
【請求項９】
担体、賦形剤又は更に活性成分からなる群から選択される１種以上の成分を更に含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載の組成物又は製品。
【請求項１０】
前記組成物又は製品が、コーティング又はカプセル化されている、請求項５〜９のいずれか１項に記載の組成物又は製品。
【請求項１１】
前記組成物又は製品が、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、顆粒、粉末又はカプセルの形態である、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の組成物又は製品。
【請求項１２】
前記組成物又は製品が、練り歯磨き、歯磨きジェル、歯磨き粉、歯クリーニング液体、歯クリーニング泡、マウスウォッシュ、マウススプレー、デンタルフロス、チューイングガム及びトローチ剤からなる群から選択される、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の組成物又は製品。
【請求項１３】
請求項５〜１２のいずれか１項に記載の口腔医薬組成物、口腔ケア製品又は栄養若しくは楽しみのための製品の製造方法であって、
ラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０を、１種以上の他の成分、好ましくは担体、賦形剤又は更に活性成分からなる群から選択される１種以上の成分と混合する工程を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口腔バイオフィルムの組成を変化させるための特定の微生物に関し、特に虫歯及び／又は歯周病の治療及び／又は予防に用いるための特定の微生物に関する。
【０００２】
特に、本発明は、歯に由来する口腔バイオフィルムの細菌組成を変化させるためのプロバイオティクス剤として用いるための微生物に関し、好ましくは、グラム陰性の嫌気性属の割合を減少させるためのプロバイオティクス剤及び／又は好気性属又は通性嫌気性属の割合を増加させるためのプロバイオティクス剤として用いるための微生物に関する。
【０００３】
更に、本発明は、プロバイオティクス剤としての微生物を含む口腔医薬組成物、口腔ケア製品又は栄養若しくは楽しみのための製品及びそれらの製造方法を提供する。
【０００４】
歯肉の炎症状態は、主として歯垢の形成により誘発される。コロニーを形成する細菌は、食物残渣のみならず唾液成分の存在により助長されて、歯の表面にバイオフィルムを形成する。初期段階で十分に除去されていないと、歯の表面にあるプラークフィルムは、除去することが非常に困難な歯石の堆積物となる。歯肉縁での増大した数の細菌の存在により、歯肉炎として知られる歯肉の炎症を導く。感染しやすい個人においては、歯肉炎は歯周炎へと進行する可能性があり、歯の喪失につながり得る。特に、グラム陰性の細菌中に存在するリポ多糖類（ＬＰＳ）は、プロスタグランジンＥ２（ＰＥＧ２）及び感染組織中のインターロイキン並びにＴＮＦアルファのような炎症メディエーターを放出するＬＰＳ刺激されたマクロファージによって非特異的な免疫反応を引き起こす可能性がある。炎症メディエーターは、常在繊維芽細胞から更なるＰＧＥ２及びマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）の放出を誘発し、周囲組織の細胞外基質を破壊する。これにより、細菌は組織のより深くに貫通すること及び上皮及び歯根の外層から独立した炎症プロセスを促進することができ、歯周ポケットの形成を引き起こす。歯を支える歯槽骨は、細菌の進行より早く吸収し、歯の不安定化を引き起こし、未治療のままにすると、失われる。
【０００５】
プラーク及び歯石の機械的除去の改善された方法から、強力な抗細菌特性を備える口腔ケア製品の使用までにわたって、多くの種々のアプローチがこの問題に対処してきた。
【０００６】
しかしながら、口腔内に存在する全ての細菌が疾患と関係があるわけではなく、多くは口腔内の健康を促進さえする。従って、不特定の常在細菌を根絶するのではなく、口腔菌叢の健康的な組成の方向へバランスを確立することが望ましい。
【０００７】
口腔内の細菌のプロバイオティクス活性についていくつかの研究がなされてきたが、種により大きく変化することが分かり、活性は大半無関係の効果に依存する可能性があるため、有効な適用に対する適切なパラメータの確立が困難である。
【０００８】
プロバイオティクス活性のうち、疾患関連種に対する一般的な抗細菌効果、すなわち歯の表面への細菌の接着の低減又は予防及び抗炎症性効果が文献で論じられてきた。
【０００９】
国際公開第２０１０／０７７７９５号は、連鎖球菌及び乳酸菌の特定の菌株から選択される治療的に有効な量の有益な細菌を含む、口腔の健康を改善するための組成物に関するものである。
【００１０】
歯及び口腔のケア製品を含むプロバイオティクスは、独国実用新案第２０２００９０１１３７０号によれば、歯周炎及び歯肉炎を予防できるものとして開示されており、乳酸菌、ビフィズス菌、腸球菌、胞子乳酸菌及び連鎖球菌を含む多種多様のプロバイオティクス細菌を列挙している。しかしながら、特定の菌株については言及されておらず、主張されているプロバイオティクス活性は更なる評価がされていない。
【００１１】
国際公開第２０１０／００８８７９号は、水に接触して直ちに活性化可能な不活性プロバイオティクスを含む菓子組成物を提供するものである。プロバイオティクスとして、乳酸菌及びビフィズス菌の種々の菌株が開示されている。国際公開第２０１０／００８８７９号で言及されているプロバイオティクス効果は、例えば病原菌を抑制することによる歯肉炎の低減を含む。
【００１２】
欧州特許出願公開第１８５２１２２号は、脱水した、再活性可能な微生物を含む歯及び歯肉の健康組成物に関するものである。競争に起因して感染した組織の均衡を回復することにより、微生物が悪性の病原菌叢に有効である可能性があることが説明されている。国際公開第２００５／０１８３４２号は、プロバイオティクス細菌が栄養又は付着部位を得るために競争することにより、病原体のコロニー形成又は成長を妨げることができるという競争効果にも言及している。
【００１３】
更に、単なる競争的置換に加え、疾患関連種と共に容易に洗い流される共凝集体をプロバイオティクス細菌が形成でき、口腔内の疾患関連種の量を低減する可能性があることが立証されてきている。
【００１４】
虫歯、歯垢及び歯周炎の予防又は治療のための外因性の乳酸菌の使用が、国際公開第２０００／０９０８０号に開示されている。常在微生物叢への特異的結合を通したコロニー形成（共凝集）について述べられているが、国際公開第２０００／０９０８０号によれば、プロバイオティクスの使用は、常在微生物叢の一部ではない特定の乳酸菌が歯のペリクルに直接接着することができ、それにより病原体を排除し、又はそれらの付着を防止するという効果に依存する。
【００１５】
病原体を置換するか、病原体バイオフィルム形成を妨害する凝集体を形成するプロバイオティクス細菌の能力が、国際公開第２０１２／０２２７７３号で述べられている。国際公開第２０１２／０２２７７３号は、有効な量のラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（ＣＥＣＴ  ７４８１）及びラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）（ＣＥＣＴ  ７４８０）を含む口腔の健康のためのプロバイオティクス組成物に主に関するものであり、特定の病原体に対して抗細菌特性を有することが証明されている。
【００１６】
国際公開第２０１２／０２８７５９号（欧州特許出願公開第２６１２９０４号）は、Ｓ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）とプロバイオティクス菌株の共凝集体の形成に基づいた、口腔内の感染性疾患の治療に用いるためのストレプトコッカス属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の抗菌性細菌株を提供するものである。
【００１７】
国際公開第２０１２／１００９９１号は、口腔内の連鎖球菌に結合するバインダー生物（乳酸菌）を使用し、それから洗い流すことによって、病原体によるコロニー形成及び虫歯の形成を妨げることを開示している。国際公開第２０１２／１００９９１号によれば、有効なバインダー生物は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）及びラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の特定の菌株である。
【００１８】
要約すると、ラクトバチルス属及び他の属に属する特定の菌株は、ｉｎ−ｖｉｔｒｏアッセイにおいていくつかの口腔疾患に関連する細菌種と拮抗する（参考文献１）。これらの菌株は、虫歯及び歯周病の予防及び治療のためのプロバイオティクスとして用いられる可能性がある。しかしながら、微生物の拮抗作用を証明するために用いられるアッセイは、寒天培地上で一つずつ行わるため、やや人工的である。というのも、自然には（生体では）口腔の細菌が多くの様々な種で構成されるバイオフィルムを形成するのに対し、アッセイではそれら全てが培養されているわけではないためである（参考文献２、３）。例えば、詳しい配列研究により、個々の被験者からの歯垢サンプル中に数百の種が発見された（参考文献４〜６）。いくつかのｉｎ−ｖｉｔｒｏ口腔バイオフィルムアッセイが開発され、口腔ケア製品の試験に用いられてきたが、これらは、複雑さが少ないバイオフィルムを与える比較的単純な所定の細菌接種源を典型的に用いてきた（参考文献７〜９）。口腔バイオフィルムのより高い豊富さ及び多様性を考えると、ｉｎ−ｖｉｖｏ生態系をより正確に表すために、唾液又は歯垢等の、天然かつ多様性のある口腔接種源を用いることが好ましい。
【００１９】
細菌をバイオフィルムとして育てるためにこれまで開発され、かつ用いられてきた一つのｉｎ−ｖｉｔｒｏ系は、カルガリーバイオフィルム装置（Ｃａｌｇａｒｙ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｄｅｖｉｃｅ（ＣＢＤ））である（参考文献１０）。この系において、バイオフィルムは９６ウェルプレートの蓋から突き出るペグ（ｐｅｇｓ）上で成長する。蓋を新しいベースプレートに移動することにより容易に交換することができる成長培地中にペグが浸され、それによりバイオフィルムの長期間の成長が可能になる。ＣＢＤは本来、医療機器関連感染等の用途のために、抗生物質に対する細菌バイオフィルムの感受性を決定するために開発されたため、‘最小バイオフィルム撲滅濃度（Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｂｉｏｆｉｌｍ  Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）’（ＭＢＥＣ）アッセイ（イノボテック社製、カナダ）として市販されている。以前の研究で、再現性のある生菌数を有する同一のバイオフィルムが、単純な所定の細菌接種源を用いるときに得ることができることを証明した（参考文献１１）。加えて、口腔微生物バイオフィルムモデルが、天然の接種源としての健康な個人の唾液を用いて幡種されたＣＢＤを用いて開発された（参考文献１２）。歯のエナメルと化学的に同じである表面を得るために、ＣＢＤのペグをヒドロキシアパタイトでコーティングした。次世代シーケンスの使用により、バイオフィルムの細菌組成の包括的な特徴づけができた。バイオフィルムは複雑だが再現可能であることが分かり、したがって口腔のｉｎ−ｖｉｖｏ状態を正確に表していた。
【００２０】
唾液に由来するｉｎ−ｖｉｔｒｏの口腔バイオフィルムの組成に対するラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）プロバイオティクス菌株の影響が、ヒドロキシアパタイトディスク及び一定膜厚フィルム培養槽（ＣＤＦＦｓ）を用いた研究で以前に調査された（参考文献１３）。生育中の及び成熟したバイオフィルムの両方への生菌株の導入により、コントロールに比べてバイオフィルムの組成が変化した。生育中のバイオフィルムにおける違いが最も顕著であり、著しく増加した数の嫌気性生物、グラム陰性の嫌気性生物及び連鎖球菌が検出された。しかしながら、成熟したバイオフィルムへの添加により、嫌気性生物及び連鎖球菌の合計は減少したが、通性及び嫌気性のグラム陰性の嫌気性生物は増加する結果となった。筆者らはまた、添加を中止した後でもＬ．ロイテリ菌株が成熟したバイオフィルム中に留まることができることを示した。
【００２１】
ＣＢＤモデルを用いることにより、複雑な口腔バイオフィルムの組成に対する非常に多数の細菌株を用いた治療の影響を個別に評価することが初めて可能になり、それにより、歯表面の健康的なバイオフィルム組成に向けたバランスに最も有効で有益な影響をもつ菌株の特別な選択をすることが可能になった。特に、特定の菌株が、口腔の健康に有益な細菌の割合を増加させる一方で、疾患に関連する細菌の割合を減少させることができることを見出した。
【００２２】
本発明の目的は、歯周病の非常に有効な治療及び／又は予防に用いることができる微生物を提供することである。
【００２３】
本発明の更なる目的は、口腔の健康に有益な細菌に有利な、唾液由来の口腔バイオフィルムの細菌組成のバランスをとることができる微生物を提供することである。
【００２４】
更に、本発明の目的は、口腔ケアにおいて本発明の微生物を有効に用いるための組成物及び製品を提供することである。
【００２５】
本発明の目的は、虫歯及び／又は歯周病の治療及び／又は予防に用いるための微生物により達成され、前記微生物はラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）ＬＰｃ−Ｇ１１０（ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１３６９１）である。
【００２６】
本発明に至るまでの広範囲のスクリーニングにより、ラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０（ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１３６９１）がバイオフィルムの群集の組成に影響を与えることが明らかになった。属レベルでは、ラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０（ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１３６９１）処理したバイオフィルム中の割合が低い分類群の多くは、バクテロイデス門（ｐｈｙｌｕｍ  Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びピラミドバクター属（Ｐｙｒａｍｉｄｏｂａｃｔｅｒ）の中の無名の属等のグラム陰性の嫌気性属であった。歯肉炎の実験的研究において、これらの分類群が歯肉炎の兆候と関連があったため、グラム陰性の嫌気性生物の割合の減少は、歯周の健康を維持するのを有利に助ける（参考文献６、２８、２９）。対照的に、ネガティブコントロールと比較して増加した多くの属は、コリネバクテリウム属及びナイセリア属等の好気性／通性嫌気性属であり、それらは歯肉の健康に典型的な初期の未熟なプラークにおいて一般的である（参考文献６、３０）。種レベルでは、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）が、熱弱毒化ラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０（ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１３６９１）で処理されたバイオフィルム中で、相対存在量が著しく低かった。フソバクテリウム・ヌクレアタムは以前も歯肉炎と関連しており（参考文献６、２９）、初期及び後期の両方の定着菌と共に共凝集する能力を通して、プラーク中の‘橋かけ’生物として記載された（参考文献３１）。
【００２７】
ラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０の菌株は、ブダペスト条約に基づいて、中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）（Ｗｕｈａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３０００７２，中国）に、２０１３年１２月２３日に寄託番号ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１３６９１としてＢｉｏＧｒｏｗｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，（Ｎｏ．１０６６６  Ｓｏｎｇｚｅ Ｒｄ．，Ｑｉｎｇｐｕ  Ｓｈａｎｇｈａｉ  ２０１７００，中国）により寄託された。
【００２８】
本発明の好ましい実施形態において、上記微生物は、弱毒化微生物又は死んだ微生物であり、好ましくは熱弱毒化微生物である。
【００２９】
以下に記載する検討において、本発明に係る微生物は、熱弱毒化された状態で特に有効であることが証明された。
【００３０】
本研究における熱弱毒化された菌株の活性は、熱処理の間の生物活性分子の放出に起因する可能性があり、これらは特定の口腔種に対していくつかの選択性を有する可能性がある。
【００３１】
ある態様において、本発明は、唾液に由来する口腔バイオフィルムの細菌組成を変化させるためのプロバイオティクス剤として、好ましくは、グラム陰性の嫌気性属の割合を減少させるためのプロバイオティクス剤及び／又は好気性属又は通性嫌気性属の割合を増加させるためのプロバイオティクス剤として用いるための上記に列挙した微生物に関し、好ましくはいずれの場合もネガティブコントロールに対するものである（下記、実施例１を参照）。
【００３２】
好ましい実施形態において、本発明に係る微生物は、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）及びピラミドバクター属（Ｐｙｒａｍｉｄｏｂａｃｔｅｒ）からなる群から選択される１種以上の細菌の割合を減少させるための、及び／又はコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及び／又はナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）の割合を増加させるためのものであり、好ましくはいずれの場合もネガティブコントロールに対するものである（下記、実施例１を参照）。
【００３３】
上記で説明したように、本発明に係る微生物は、バイオフィルム中の微生物バランスを、有害な細菌の割合を減らす一方で、有益な微生物が蓄積する方向に傾ける。特に、グラム陰性の嫌気性属、特にバクテロイデス属、フソバクテリウム属、プレボテラ属及びピラミドバクター属は、歯肉炎の発症に関連しており、口腔バイオフィルム組成中のその割合が、本発明に係る微生物により有利に減少する。一方で、好気性属又は通性嫌気性属、特にコリネバクテリウム属及びナイセリア属は、歯周の健康に典型的な初期の未熟なプラークにおいて一般的であり、本発明に係る微生物によりその割合が増加し、従って有益な効果を最大限に活用する。
【００３４】
本発明の更なる態様は、口腔医薬組成物、口腔ケア製品又は栄養若しくは楽しみのための製品に関し、前記組成物又は製品は、ラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０（ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１３６９１）を含み、ラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０（ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１３６９１）の合計量は、虫歯及び／又は歯周病の治療及び／又は予防に十分である。更に、ラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０（ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１３６９１）の合計量は、前記組成物の合計質量に対し、好ましくは０．０１〜１００％の範囲内、より好ましくは０．１〜５０％の範囲内、最も好ましくは１〜１０％の範囲内であり、及び／又は、ラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０（ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１３６９１）の合計量は、好ましくは１×１０3〜１×１０11コロニー形成単位（ＣＦＵ）の範囲内、より好ましくは１×１０5〜１×１０10ＣＦＵの範囲内である。
【００３５】
口腔ケアにおいて本発明の微生物を実際的に用いる組成物及び製品を提供するために、組成物は本発明に係る微生物を有効量含んで提供される。特に、上記で特定される量は、発明の効果を達成するために好適であると証明された。
【００３６】
更に、本発明は、虫歯及び／又は歯周病の治療及び／又は予防に用いるための、好ましくは唾液由来の口腔バイオフィルムの細菌組成を変化させるための上記の組成物又は製品に関する。
【００３７】
好ましくは、組成物又は製品は、グラム陰性の嫌気性属の割合を減少させるため、及び／又は好気性属又は通性嫌気性属の割合を増加させるために用いられ、いずれの場合もネガティブコントロールに対するものである。
【００３８】
特に好ましくは、組成物又は製品は、バクテロイデス属、フソバクテリウム属、プレボテラ属及びピラミドバクター属からなる群から選択される１種以上の細菌の割合を減少させるため、及び／又はコリネバクテリウム属及び／又はナイセリア属の割合を増加させるために用いられ、好ましくはいずれの場合もネガティブコントロールに対するものである（下記、実施例１参照）。
【００３９】
本発明に係る組成物は、担体、賦形剤又は更に活性成分からなる群から選択される１種以上の成分を更に含んでもよく、前記成分は例えば、非ステロイド系消炎剤、抗生物質、ステロイド、抗ＴＮＦアルファ抗体又は他のバイオテクノロジー的に製造された活性剤及び／又は活性物質に加え、鎮痛剤、デクスパンテノール、プレドニゾロン、ポビドンヨード（ｐｏｌｙｖｉｄｏｎｉｏｄｉｄｅ）、クロルヘキシジン−ビス−Ｄ−グルコン酸、ヘキセチジン、塩酸ベンジダミン、リドカイン、ベンゾカイン、マクロゴールラウリルエーテル、ベンゾカインと塩化セチルピリジニウムとの組み合わせ、又はマクロゴールラウリルエーテルと子牛血液由来のタンパク質フリー血液透析液との組み合わせの群からの活性剤、並びに、例えば、フィラー（例えばセルロース、炭酸カルシウム）、可塑剤若しくは流動改善剤（例えば滑石粉、ステアリン酸マグネシウム）、コーティング剤（例えば酢酸ビニルフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート）、崩壊剤（例えばでんぷん、架橋ポリビニルピロリドン）、造粒（ラクトース、ゼラチン）用の軟化剤（例えばクエン酸トリエチル、ジブチルフタレート）、遅延剤（例えば懸濁液中のポリ（メタ）アクリル酸メチル／エチル／２−トリメチルアミノメチルエステル共重合体、酢酸ビニル／クロトン酸共重合体）、圧縮剤（例えば微結晶セルロース、ラクトース）、溶媒、懸濁剤若しくは分散剤（例えば水、エタノール）、乳化剤（例えばセチルアルコール、レシチン）、レオロジー特性改善剤（シリカ、アルギン酸ナトリウム）、微生物安定剤（例えば塩化ベンザルコニウム、ソルビン酸カリウム）、防腐剤及び酸化防止剤（例えばＤＬ−アルファ−トコフェノール、アスコルビン酸）、ｐＨ調整剤（乳酸、クエン酸）、膨張剤若しくは不活性ガス（例えばフッ化塩化炭化水素、二酸化炭素）、色素（酸化鉄、酸化チタン）、軟膏の基本成分（例えばパラフィン、蜜ロウ）並びに文献（例えばＳｃｈｍｉｄｔ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎ．Ｗｉｒｋ− ｕｎｄ Ｈｉｌｆｓｓｔｏｆｆｅ  ｆｕｒ  Ｒｅｚｅｐｔｕｒ，Ｄｅｆｅｋｔｕｒ  ｕｎｄ  Ｇｒｏβｈｅｒｓｔｅｌｌｕｎｇ．１９９９；Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ  ｏｄｅｒ  Ｂａｕｅｒ，Ｆｒｏｍｍｉｎｇ  Ｆｕｈｒｅｒ．Ｌｅｈｒｂｕｃｈ  ｄｅｒ  Ｐｈａｒｍａｚｅｕｔｉｓｃｈｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ．８．Ａｕｆｌａｇｅ，２００６．Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｌｉｃｈｅ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）に記載されている他の成分等である。
【００４０】
本発明に係る組成物又は製品はまた、コーティング又はカプセル化されてもよい。
【００４１】
本発明に係る組成物のカプセル化は、制御された放出（例えば水と接触して直ちに）又は長期間に亘る連続的な放出を許容するという利点を有し得る。更に、組成物は分解から保護されてもよく、それにより製品寿命が改善される。活性成分のカプセル化の方法は技術的によく知られており、固有の要求事項に従って、多くのカプセル化材料及び組成物にそれらを適用する方法が利用可能である。
【００４２】
更に、本発明に係る組成物又は製品は、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、顆粒、粉末又はカプセルの形態であってもよい。
【００４３】
本発明に係る組成物又は製品は、練り歯磨き、歯磨きジェル、歯磨き粉、歯クリーニング液体、歯クリーニング泡、マウスウォッシュ、マウススプレー、デンタルフロス、チューイングガム及びトローチ剤からなる群から選択されてもよい。
【００４４】
そのような組成物又は製品は、ケイ酸塩、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、酸化アルミニウム及び／又はヒドロキシアパタイト等の研磨系（研磨剤及び／又は光沢剤）、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルサルコシン酸ナトリウム及び／又はコカミドプロピルベタイン等の界面活性剤、グリセロール及び／又はソルビトール等の保湿剤、例えばカルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、カラギナン及び／又はラポナイト（登録商標）等の増粘剤、サッカリン、芳香剤及び不快味の印象に対する味覚是正剤等の甘味料、味覚修正物質（例えばリン酸イノシトール、ヌクレオチド（例えばグアノシン一リン酸塩、アデノシン一リン酸塩又は他の物質（例えばグルタミン酸ナトリウム又は２−フェノキシプロピオン酸）））、メントール誘導体（例えばＬ−メンチル乳酸、Ｌ−メンチルアルキルカーボネート、メントンケタール）、イシリン及びイシリン誘導体等の冷却剤、安定剤、及びフッ化ナトリウム、モノフルオロリン酸ナトリウム、二フッ化スズ、４級フッ化アンモニウム、クエン酸亜鉛、硫酸亜鉛、ピロリン酸スズ、二塩化スズ、種々のピロリン酸塩の混合物、トリクロサン、塩化セチルピリジニウム、乳酸アルミニウム、クエン酸カリウム、窒化カリウム、塩化カリウム、塩化ストロンチウム、過酸化水素、芳香物質、重炭酸ナトリウム及び／又は香り修正剤等の活性剤を含んでもよい。
【００４５】
チューイングガム又はデンタルケアチューイングガムは、チューイングガム基剤を含んでもよく、前記チューイングガム基剤は、例えば、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡ）、ポリエチレン、（低分子又は中分子の）ポリイソブタン（ＰＩＢ）、ポリブタジエン、イソブテン／イソプレン共重合体、ポリビニルエチルエーテル（ＰＶＥ）、ポリビニルブチルエーテル、ビニルエステルとビニルエーテルとの共重合体、スチレン／ブタジエン共重合体（ＳＢＲ）、又は例えば酢酸ビニル／ラウリン酸ビニル、酢酸ビニル／ステアリン酸ビニル若しくはエチレン／酢酸ビニル及び例えば欧州特許第０２４２３２５号、米国特許第４５１８６１５号、米国特許第５０９３１３６号、米国特許第５２６６３３６号、米国特許第５６０１８５８号若しくは米国特許第６９８６７０９号に記載されたエラストマーの混合物に基づくビニルエラストマー等のエラストマーを含む。加えて、チューイングガム基剤は、更に、例えば炭酸カルシウム、二酸化チタン、酸化ケイ素、滑石粉、酸化アルミニウム、リン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、水酸化マグネシウム及びそれらの混合物等の（鉱物）フィラー、可塑剤（例えばラノリン、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、酢酸エチル、ジアセチン（グリセロールジアセテート）、トリアセチン（グリセロールトリアセテート）及びクエン酸トリエチル）、乳化剤（例えば、レシチン並びに例えばグリセロールモノステアレート等の脂肪酸のモノ及びジグリセリド等のリン脂質）、酸化防止剤、ワックス（例えばパラフィンワックス、カンデリラワックス、カルナバワックス、マイクロクリスタリンワックス及びポリエチレンワックス）、脂肪又は脂肪油（例えば硬化（水素化）植物性又は動物性脂肪）及びモノ、ジ又はトリグリセリド等の更なる成分を含んでもよい。
【００４６】
最後に本発明はまた、上述したような口腔医薬組成物、口腔ケア製品又は栄養若しくは楽しみのための製品の製造方法に関し、次の工程を含むものである。
【００４７】
ラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０を、１種以上の他の成分、好ましくは担体、賦形剤又は更に活性成分からなる群から選択される１種以上の成分と混合する工程。
【００４８】
以下の実施例は範囲の限定を意図することなく本発明を説明するために加えられる。
【００４９】
実施例１：複雑なｉｎ−ｖｉｔｒｏ口腔バイオフィルムの組成に影響を与える細菌株のスクリーニング
多くのプロバイオティクス菌株の候補である、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）及びラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）についてスクリーニングを行った。
【００５０】
サンプル採集
一般的な無菌の管の中に喀出することにより、５ミリリットルの唾液を実験参加者から得た。唾液を氷上に置き、採集から１時間以内に植菌のために用いた。ＣＢＤプレートの植菌のためにサンプルを等量で混合した。
【００５１】
カルガリーバイオフィルム装置の植菌及びバイオフィルムのインキュベート
混合された唾液を１５秒間ボルテックスし、必要とするウェルの数に到達するまで、９６ウェルマイクロプレート中に１ウェルに対し２００μｌをピペットで入れた。マイクロプレートの外側付近のウェルは使用しなかった。ペグを有するＣＢＤの蓋を、ヒドロキシアパタイトでコーティングされたペグが唾液中に浸るようにマイクロプレートの上に取り付けた。それからＣＢＤプレートを３７℃、＋５％二酸化炭素の空気中で１８時間インキュベートし、その後、蓋をブタ胃由来のムチン（１ｇ／Ｌ）、ヘミン（１０ｍｇ／Ｌ）及びビタミンＫ（０．５ｍｇ／Ｌ）で補われた２００μｌの予備還元されたブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）ブロス（Ｆｌｕｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ）成長培地を含む新しいベースプレートに移した。ペグを＋５％二酸化炭素の空気中で１４日間インキュベートし、成長培地を３．５日ごとに交換した。
【００５２】
バイオフィルムの処理
７日間の成長後、ＢＨＩ中に懸濁された１×１０8ＣＦＵｓ／ｍｌの濃度の生きた若しくは熱弱毒化されたプロバイオティクス菌株、ネガティブコントロール（無菌ＢＨＩ）、又はポジティブコントロール（０．１％ｖ／ｖチモール）を用いて、バイオフィルムを７日間、毎日２回処理した。プロバイオティクス菌株の熱弱毒化は、細菌懸濁液をＴｅｃｈｎｅ社製のブロックヒーター中に８０℃で３０分間置くことで行った。インキュベート後、懸濁液を氷上に５分間置き、それから要求があるまで−７０℃で保管した。生きたプロバイオティクス調製物は要求があるまで−７０℃で保管し、使用前にブロックヒーター上で、３７℃で３０分間インキュベートすることにより解凍した。
【００５３】
処理は毎日午前９時及び午後５時に行った。処理手順のために、各プロバイオティクス調製物又はコントロールの２００ミリリットル分取を９６ウェルマイクロプレートの適切なウェルにピペットで入れた。３つのペグの３つのサンプル複製（合計９つのペグ）を１回のプロバイオティクス調製で処理した。バイオフィルムを備えるペグを、ＣＢＤの蓋を処理物が含まれるマイクロプレートへ移すことにより、プロバイオティクス調製物又はコントロール中に浸漬させた。暴露は１分間、振とう器を用いた緩やかな撹拌により行った。それからペグを成長培地に戻す前に、ＰＢＳ中で３０秒間振とう器を用いて簡単に浸漬することにより洗浄した。
【００５４】
パイロシークエンス解析のためのペグの除去及びサンプルのプロピジウムモノアジド処理
１４日目に、バイオフィルムを備えるペグを、殺菌されたプライヤを用いて蓋から折り取り、殺菌されたＰＢＳに３回浸すことで洗浄した。それから全ての目に見えるバイオフィルム素材を、殺菌されたキュレットを用いて除去し、５００μｌのＰＢＳ中に懸濁させた。３つのペグからの素材が解析のための１サンプルを作るために混合され、３つのサンプルを各処理群に対して処理した。細胞外ＤＮＡ及び死細胞又は損傷細胞からのＤＮＡのその後のＰＣＲ増幅を抑制するために、各サンプルをプロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）処理した（参考文献１４）。１．２５μｌのＰＭＡをＰＢＳ中に懸濁された細胞に加え（最終濃度は５０μＭ）、暗闇中で時折振とうしながら５分間室温でインキュベートした。それからサンプルがＰＭＡとＤＮＡとの間の共有結合を形成するために、５００Ｗのハロゲンランプから２０ｃｍの距離で５分間露光した。暴露時間の間、過剰な加熱を回避するためにサンプルを氷上に置き、時折振とうした。ＰＭＡ処理の直後、ＤＮＡ抽出のためにサンプルを使用した。
【００５５】
ＤＮＡ抽出
ＧｅｎＥｌｕｔｅ細菌ＤＮＡ抽出キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて、混合された唾液及びバイオフィルムサンプルからＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ抽出を、製造元の指示に従って行うとともに、さらにグラム陽性細胞からのＤＮＡの回収を増加させるため、追加の細胞溶解工程を行い、サンプルを４５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液中で、３７℃で３０分間インキュベートした。
【００５６】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のパイロシークエンス
以前述べたように、部分的な１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のいくつかの微修正を加えた４５４パイロシークエンスを用いて、バイオフィルム及び唾液の細菌組成を測定した（参考文献６）。合成融合プライマー（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｉｍｅｒｓ）を用いて、Ｖ１−Ｖ３の超可変領域をカバーする約５００塩基対の長さの１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の断片のＰＣＲ増幅を各ＤＮＡサンプルに対して行った。融合プライマーは、Ｌｉｂ−ＬのエマルジョンＰＣＲ法を用いた４５４パイロシークエンスのためのロシュ社製ＧＳ−ＦＬＸチタニウムシリーズのアダプター配列（Ａ及びＢ）とともに、広範囲の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子プライマーである２７ＦＹＭ（参考文献１５）及び５１９Ｒ（参考文献１６）で構成されていた。フォワードプライマーは、既述した１２塩基のエラー修正ゴレイバーコード（ｅｒｒｏｒ−ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ  Ｇｏｌａｙ  ｂａｒｃｏｄｅｓ）を含んでいた。ＰＣＲ反応を、適切にバーコードされたフォワードプライマー及びリバースプライマーとともに、Ｅｘｔｅｎｓｏｒ  Ｈｉ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲマスターミックス（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて行った。ＰＣＲ条件は次の通りであった。９５℃で５分間の初期変性に続いて９５℃で４５秒間、５３℃で４５秒間及び７２℃で４５秒間を２５サイクル行い、最終伸張を７２℃で５分間行った。それからＰＣＲ増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて製造元の指示に従って精製した。増幅産物のサイズ及び純度を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＮＡ  １０００キット及びＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  バイオアナライザを用いて確認した。増幅産物の定量を、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ蛍光核酸染色液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた蛍光アッセイを用いて行った。それから増幅産物を等モル濃度（１×１０9分子／μｌ）で混合した。エマルジョンＰＣＲ及びサンプルの一方向配列決定を、イギリス、ケンブリッジのケンブリッジ大学生化学部にあるＬｉｂ−Ｌキット及びロシュ社製の４５４  ＧＳ−ＦＬＸ＋  チタニウムシリーズシーケンサーを用いて行った。
【００５７】
配列解析
バージョン１．３４の‘ｍｏｔｈｕｒ’ソフトウェア一式（参考文献１７）を用いて、ｍｏｔｈｕｒ．ｏｒｇにある４５４標準操作手順（参考文献１８）に従って配列解析を行った。ｍｏｔｈｕｒにより実行されるように、ＡｍｐｌｉｃｏｎＮｏｉｓｅアルゴリズム（参考文献１９）を用いて配列のノイズを除去した。配列は４００塩基未満の長さであり、及び／又は以下の一つ：２個を超える（＞２）プライマーとのミスマッチ、１個を超える（＞１）バーコード領域とのミスマッチ、及び８個を超える（＞８）塩基の長さのホモポリマー、を有しており、これらを廃棄した。プライマーとバーコードを除去するために残った配列をトリムし、ＳＩＬＶＡ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ参照アライメント（参考文献２０）に合わせて並べた。キメラ配列を同定するためにＵＣｈｉｍｅアルゴリズム（参考文献２１）を用い、それからキメラ配列をデータセットから除去した。配列を平均近傍アルゴリズム（ａｖｅｒａｇｅ  ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いて０．０１５の遺伝的距離（おおよそ種のレベル）で操作的分類単位（ＯＴＵｓ）にクラスター化し、ヒト口腔マイクロバイオーム・データベース（Ｈｕｍａｎ  Ｏｒａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）（ＨＯＭＤ）リファレンスセット（バージョン１３）と共に単純ベイズ分類器（Ｎａｉｖｅ  Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ）（参考文献２２）を用いて同定した。
【００５８】
統計学的解析
統計学的なＯＴＵベースの多様度の比較のために、各サンプルの配列を同じ数（最も少ない配列数を有するサンプルの数）ランダムにサブサンプリングした。Ｇｏｏｄのノンパラメトリックな被覆率（ｃｏｖｅｒａｇｅ）推定器（参考文献２３）を用いて群集の試料採取の範囲を評価した。Ｓｉｍｐｓｏｎの逆数多様度指数（参考文献２４）を用いて群集の多様度を計算した。ｔｈｅｔａＹＣ計算器（参考文献２５）を用いて生成される距離行列を用いてサンプル／処理群の群集構造を比較した。Ｒ（ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）中に生成される非計量多次元尺度構成法（ｎｏｎ−ｍｅｔｒｉｃ  ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｃａｌｉｎｇ）（ＮＭＤＳ）プロットを用いて距離行列を可視化した。ｔｈｅｔａＹＣ距離行列に基づく処理群間に統計学的に著しい差異があるかどうかを測定するために、ｍｏｔｈｕｒで実行されるように、分子分散解析（ＡＭＯＶＡ）（参考文献２６）を使用した。‘ｖｅｇａｎ’パッケージを用いて、細菌属の割合に基づくヒートマップ及び樹状図をＲ中に生成した。樹状図は、ｖｅｇａｎパッケージにより実行されるような群集構造中の‘Ｂｒａｙ−Ｃｕｒｔｉｓ’非類似指数に基づいていた。線形判別解析効果量（Ｌｉｎｅａｒ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｅｆｆｅｃｔ  Ｓｉｚｅ）（ＬＥｆＳｅ）（参考文献２７）解析を用いて、ネガティブコントロールバイオフィルムと処理群との間での有意差が十分な種レベルのＯＴＵｓを検出した。
【００５９】
結果
うまく増幅された複製は、熱弱毒化処理実験のポジティブコントロール処理に由来していた。キメラ配列のフィルタリング及び除去後の解析に対して、合計４６８，２６１個の１６Ｓ  ｒＤＮＡ配列が得られ、４２７塩基の平均長さであった。バイオフィルムサンプル中に検出された種レベルのＯＴＵｓの平均数は、混合した唾液接種源中で２１３．３（±２４．７）個及び２８４（±１．４）個であった。
【００６０】
熱弱毒化されたプロバイオティクス菌株で処理されたバイオフィルムと、ネガティブコントロールバイオフィルムとの非計量多次元尺度構成法（ＮＭＤＳ）プロットにおける比較は、ほとんどの場合において細菌群集構造（群集に存在する全てのＯＴＵｓの相対存在量に基づくｔｈｅｔａＹＣ計算器）に際立った違いを示さなかった。しかしながら、Ｌ．パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０を用いた処理は、ネガティブコントロールに対し差異が現れ、これはコントロールから離れる方向へのＮＭＤＳの軸に沿った移動により示された。単独のチモールのポジティブコントロールの複製サンプルは、ネガティブコントロールに対して最大の非類似を示した。個々の処理とネガティブコントロール間の差異は統計学的に有意ではなかったが、分子分散解析（ＡＭＯＶＡ）は、異なる処理群間で全体的に有意差があることを示した（Ｐ値＜０．００１）。
【００６１】
種々の属の相対存在量に基づく樹状図及びヒートマップを用いたバイオフィルムの組成の比較は、ＯＴＵ解析の調査結果を支持した。熱弱毒化処理に関し、３分の２のＬ．パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０の複製は、残ったバイオフィルムとは別にクラスター化した。ヒートマップは、これらの差異が主にバクテロイデス属、フソバクテリウム属、プレボテラ属及びピラミドバクター属の相対存在量の減少及びコリネバクテリウム属及びナイセリア属の増加に起因していることを示した。加えて、チモール処理したバイオフィルムは、他のバイオフィルム及びネガティブコントロールに対して著しい相違を示し、主にコリネバクテリウム属、ナイセリア属及びストレプトコッカス属で構成されていた。
【００６２】
線形判別解析効果量（ＬＥｆＳｅ）を用いた統計学的解析は、３７の種レベルのＯＴＵｓが、ＬパラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０とネガティブコントロールとの間で有意差が十分であったことを示した。
【００６３】
実施例２：プロバイオティクストローチ剤又はコンプリメイト（ｃｏｍｐｒｉｍａｔｅ）
2019502397.tif 000002
【００６４】
製造方法：
・成分１及び６を５０℃の真空箱型乾燥機中、最大圧力１０ｍｂａｒで１６時間乾燥する。
・全ての成分を正確に秤量する。
成分１、２、３、４及び５を合わせ、十分に混合した（ブロックＡ）。プロバイオティクス材料は、１グラムあたり約１０5〜１０12コロニー形成単位（ＣＦＵ）の活性を有する凍結乾燥の形態で用いる。
・次にブロックＡを成分６に加え、５分間十分に混合する。
・タブレットプレスＥＫ０（Ｋｏｒｓｃｈ  ＡＧ社製、ベルリン）の中で、１５〜２０ｋＮの調整圧力で粉末混合物をタブレットへと圧縮する。
目標パラメータは：
・タブレット直径：２０ｍｍ
・タブレット重さ：２．０ｇ
・密封したアルミニウムの小袋に室温で保管する。５個のトローチ剤に対し１ｇの乾燥剤を除湿のために用いる（真空箱型乾燥機中で、１０５℃で３時間保管することにより活性化する）。
【００６５】
実施例３：粉末歯磨剤
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【００６６】
製造方法：
・成分７を５０℃の真空箱型乾燥機中、最大圧力１０ｍｂａｒで１６時間乾燥する。
・全ての成分を正確に秤量する。
・成分１、２、３及び４を合わせ、十分に混合する（ブロックＡ）。
・必要であれば、成分５及び６を合わせ、十分に混合する（ブロックＢ）。プロバイオティクス材料は、１グラムあたり約１０5〜１０12コロニー形成単位（ＣＦＵ）の活性を有する凍結乾燥の形態で用いる。
・続いてブロックＡ及びＢを合わせ、十分に混合する。
・混合物に成分７を追加し、十分に５分間混合する。
・粉末混合物がそれぞれ０．５ｇの割り当てとなるように調製し、密閉されたアルミニウムの小袋中の１割り当てに対し１ｇの乾燥剤（真空箱型乾燥機中で、１０５℃で３時間保管することにより活性化する）とともに室温で保管する。
【００６７】
実施例４：粉末歯磨剤
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【００６８】
製造方法
・成分６、９及び１０を、５０℃の真空箱型乾燥機中、最大圧力１０ｍｂａｒで１６時間乾燥する。
・全ての成分を正確に秤量する。
・成分１、２、３、４、５及び６を合わせ、十分に混合する（ブロックＡ）。
・成分７及び８を合わせ、十分に混合する（ブロックＢ）。プロバイオティクス材料は、１グラムあたり約１０5〜１０12コロニー形成単位（ＣＦＵ）の活性を有する凍結乾燥の形態で用いる。
・続いてブロックＡ及びＢを合わせ、十分に混合する。
・成分９及び１０を合わせ、十分に混合する（ブロックＣ）。
・２つの混合物（ブロックＡ／Ｂ及びブロックＣ）を合わせ、５分間十分に混合する。
・タブレットプレスＥＫ０（Ｋｏｒｓｃｈ  ＡＧ、ベルリン）の中で、１５〜２０ｋＮの調整圧力で粉末混合物をタブレットへと圧縮する。
目標パラメータ
・タブレット直径：９ｍｍ
・タブレット重さ：０．３ｇ
・密封したアルミニウムの小袋に室温で保管する。３個のタブレットに対し１ｇの乾燥剤を除湿のために用いる（真空箱型乾燥機中で、１０５℃で３時間保管することにより活性化する）。
【００６９】
実施例５：チューイングガム
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【００７０】
製造方法：
・成分２を５０℃の真空箱型乾燥機中、最大圧力１０ｍｂａｒで１６時間乾燥する。
・全ての成分を正確に秤量する。
・成分１を、均一な塊が得られるまで加熱ニーダーを備えるチューイングガムラボニーダー中で４５〜５９℃で混錬する。加熱は混合プロセスの間中行われる。
・続いて成分２、３及び４を加え、混合物が均一になり、粉末がもはや見えなくなるまで混錬する。
・成分６を、成分５（ブロックＣ）又は成分７（ブロックＤ）のいずれかに入れ込む。プロバイオティクス材料は、１グラムあたり約１０5〜１０12コロニー形成単位（ＣＦＵ）の活性を有する凍結乾燥の形態で用いる。一様な懸濁液が得られるまで成分を混合する。
・まず、ブロックＣをチューイングガムの塊に加え、均一な塊が得られるまで再度混錬する。
・最後に、ブロックＤを適宜処理する。追加後、組成物は均一なチューイングガムの塊が得られるまで混錬しなければならない。
・ミキサーから塊を取り出し、エンボス加工セット“ｓｌａｂｓ”を用いて、エンボスローラーによりミニスティックに加工する。
・密封したアルミニウムの小袋に室温で保管する。７個のチューイングガムに対し１ｇの乾燥剤を除湿のために用いる（真空箱型乾燥機中で、１０５℃の３時間保管することにより活性化する）。
【００７１】
実施例６：プロバイオティクスビーズレット（ｂｅａｄｌｅｔｓ）
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【００７２】
製造方法：
アルギン酸塩ビーズレットの沈殿のための塩化カルシウム溶液の製造：
・２％の塩化カルシウム溶液を蒸留水及び塩化カルシウムから製造する。ＣａＣｌ2が完全に溶解するように注意しなければならない。
【００７３】
アルギン酸塩溶液の製造（アルギン酸塩の代わりにペクチン又はゲランガムを用いてもよい）：
・撹拌機を備え、バッチサイズに適した反応容器の中に水を供給する。
・撹拌機を作動させ、高レベルで撹拌しながら、アルギン酸塩、アラビアガム、小麦繊維及びプロバイオティクスに加えて任意で要求されるゲランガムのそれぞれの量を追加する。
・混合物を撹拌しながら８０℃に加熱し、５分間この温度を維持する。この工程の間、ゲル形成成分が溶解する。
・その後、加熱をやめ、塊がなくなるまで更に少なくとも３０分間熱いゲル溶液を撹拌する。
・続いて、溶液を撹拌しながら３９〜４３℃に冷蔵により冷却する。
・必要であれば、別の容器の中に芳香剤及び染料を供給し、十分に混合する。芳香剤を用いない場合、染料をグリセロールと混合する。
・染料分散液が均一に混合されたら、アルギン酸塩溶液とともにバッチ容器に加える。混合容器を約１０％の量のアルギン酸塩水溶液で数回洗浄し、懸濁液に加える。
・アルギン酸塩懸濁液を少なくとも更に５分間撹拌する。
・続いて、潜在的に存在する空気を除去するために、バッチを少なくとも更に１５分低スピードで撹拌する。
【００７４】
ビーズレットの沈殿のためのアルギン酸溶液の塩化カルシウム溶液への滴下：
・２つの排出口を備える堅く密閉可能な圧力安定反応容器にアルギン酸塩懸濁液を移す。１つの排出口には加圧空気を適用する。第２の排出口はチューブを経由して滴下ユニットのノズルへと導く。
・アルギン酸塩溶液が約４５℃の温度に到達するように、反応容器を加熱プレート上で調節する。溶液をマグネチックスターラーで僅かに撹拌する。
・反応容器に圧力を適用した後、アルギン酸塩溶液を発振器により振動を設定したノズルに向かって押し出する。圧力及び発振器の周波数の適応により、ノズル先端で得られる液滴の大きさを調節してもよい。
・ノズル先端に形成するアルギン酸塩溶液の液滴が、最初に調製される塩化カルシウム溶液が循環する漏斗状の回収容器に落ちる。
・硬化したアルギン酸塩ビーズレットが漏斗を通して塩化カルシウム溶液と共に通過し、ふるいに集められ、回収された塩化カルシウム溶液をドリッピングユニットの下の漏斗に戻して再利用する。
【００７５】
排気温度が４５℃に到達するまで、供給温度８０℃の空気流乾燥機中（Ａｅｒｏｍａｔｉｃ  ｆｌｏｗｂｅｄ−ｄｒｉｅｒ）でビーズレットを乾燥させる。
【００７６】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年9月18日(2018.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯周病の治療及び／又は予防に用いるための微生物であって、
前記微生物は、ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１３６９１として寄託されたラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０である、微生物。
【請求項２】
前記微生物は、弱毒化微生物又は死んだ微生物であり、好ましくは熱弱毒化微生物である、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
口腔医薬組成物、口腔ケア製品又は栄養若しくは楽しみのための製品であって、
ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１３６９１として寄託されたラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０を含み、
ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１３６９１として寄託されたラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０の合計量が、歯周病の治療及び／又は予防に十分であり、
更に、
ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１３６９１として寄託されたラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０の合計量が、前記組成物の合計質量に対し、好ましくは０．０１〜１００％の範囲内、より好ましくは０．１〜５０％の範囲内、最も好ましくは１〜１０％の範囲内であり、
及び／又は、
ＣＣＴＣＣ  Ｍ  ２０１３６９１として寄託されたラクトバチルス・パラカゼイＬＰｃ−Ｇ１１０の合計量が、好ましくは１×１０3〜１×１０11コロニー形成単位（ＣＦＵ）の範囲内、より好ましくは１×１０5〜１×１０10ＣＦＵの範囲内であり、
歯周病の治療及び／又は予防に用いるための、好ましくは唾液由来の口腔バイオフィルムの細菌組成を変化させることによって歯周病の治療及び／又は予防に用いるための、
前記組成物又は製品。
【請求項４】
グラム陰性の嫌気性属の割合を減少させるための、及び／又は好気性属又は通性嫌気性属の割合を増加させるための、請求項３に記載の組成物又は製品。
【請求項５】
バクテロイデス属、フソバクテリウム属、プレボテラ属及びピラミドバクター属からなる群から選択される１種以上の細菌の割合を減少させるための、及び／又はコリネバクテリウム属及び／又はナイセリア属の割合を増加させるための、請求項３又は４に記載の組成物又は製品。
【請求項６】
担体、賦形剤又は更に活性成分からなる群から選択される１種以上の成分を更に含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の組成物又は製品。
【請求項７】
前記組成物又は製品が、コーティング又はカプセル化されている、請求項３〜６のいずれか１項に記載の組成物又は製品。
【請求項８】
前記組成物又は製品が、溶液、懸濁液、乳液、錠剤、顆粒、粉末又はカプセルの形態である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の組成物又は製品。
【請求項９】
前記組成物又は製品が、練り歯磨き、歯磨きジェル、歯磨き粉、歯クリーニング液体、歯クリーニング泡、マウスウォッシュ、マウススプレー、デンタルフロス、チューイングガム及びトローチ剤からなる群から選択される、請求項３〜８のいずれか１項に記載の組成物又は製品。
【国際調査報告】
2019502397.tif 000007
2019502397.tif 000008
2019502397.tif 000009