(57)【要約】  本発明により、アレルギー応答の治療または予防のためのＤＮＡワクチンを提供する。ワクチンは、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）の内腔側ドメインとインフレームで融合させたアレルゲンＸまたはその断片のコード配列と、ＬＡＭＰの標的化配列を含む。ワクチンは、被験体に投与した場合、免疫応答を生じさせるための適正に構成された３次元のエピトープの提示を可能にする。ワクチンは多価分子であり得る、および／または２種類以上のＤＮＡ構築物を含む多価ワクチンの一部として提供され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）内腔側ドメイン、
ｂ．表１に記載の少なくとも１種類のアレルゲンＸ、および
ｃ．ＬＡＭＰ膜貫通ドメイン／細胞質尾部
を含むポリペプチドをコードしている単離された核酸。
【請求項２】
ＬＡＭＰが、ＬＡＭＰポリペプチド（ＬＡＭＰ−１）、ＤＣ−ＬＡＭＰ、ＬＡＭＰ−２、ＬＡＭＰ−３、ＬＩＭＰ  ＩＩまたはＥＮＤＯＬＹＮから選択される、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記ＬＡＭＰ内腔側ドメインがＬＡＭＰ−１に由来する、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
前記ＬＡＭＰ内腔側ドメインが、
（ａ）配列番号：２、
（ｂ）配列番号：３、
（ｃ）配列番号：４の２９〜３８１もしくは配列番号：５の２５〜３７０のアミノ酸、または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のバリアント、ここで、前記バリアントは（ａ）〜（ｃ）と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である、
として示すアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記ＬＡＭＰ膜貫通ドメイン／細胞質尾部が、
（ａ）配列番号：１、
（ｂ）アミノ酸配列番号：４の３８２〜４１７もしくは配列番号：５の３７１〜４０６、または
（ｃ）（ａ）〜（ｂ）のバリアント、ここで、前記バリアントは（ａ）〜（ｂ）と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である、
を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６】
アレルゲンＸが、
（ａ）配列番号：Ｙもしくは配列番号：Ｖのうちの少なくとも一方のアミノ酸配列、または
（ｂ）（ａ）のバリアント
を含み、前記バリアントは（ａ）と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性であり、
前記バリアントは、（ａ）アレルゲンＸと交差反応する抗体を生じさせる能力、ここで、前記抗体は前記アレルゲンＸにより誘導されたものである、および／または（ｂ）アレルゲンＸの生物学的活性のいずれかを保持している、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項７】
前記核酸が、
（ａ）表１に示す配列番号：Ｚまたは配列番号：Ｗのポリヌクレオチドのいずれか１つ、
（ｂ）表１に示す配列番号：Ｚまたは配列番号：Ｗのポリヌクレオチドのいずれか１つにコードされたポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、
（ｃ）表１に示す配列番号：Ｙまたは配列番号：Ｖのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド、
（ｄ）内腔側ドメイン（例えば、配列番号：２もしくは３など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）、表１に示す配列番号：Ｙのうちの１つ以上、およびトラフィッキングドメイン（配列番号：１など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）をコードしているポリヌクレオチド、
（ｅ）内腔側ドメイン（例えば、配列番号：２もしくは３など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）および表１に示す配列番号：Ｙのうちの１つ以上をコードしているポリヌクレオチド、
（ｆ）表１に示す配列番号：Ｙのうちの１つ以上およびトラフィッキングドメイン（配列番号：１など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）をコードしているポリヌクレオチド
あるいは
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドのいずれか１つと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチド
を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸または請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸、請求項８に記載のベクター、または請求項９に記載の宿主細胞にコードされたポリペプチド。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸、請求項８に記載のベクター、請求項９に記載の宿主細胞または請求項１０に記載のポリペプチドを含むワクチン。
【請求項１２】
被験体に請求項１１に記載のワクチンを、アレルギー応答が低減、抑止または予防されるのに充分な有効量で投与することを含む、アレルギー応答を治療または予防する方法。
【請求項１３】
前記ワクチンが治療的に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ワクチンが予防的に投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
プライム工程および少なくとも１回のブースト工程を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）前記ＬＡＭＰ構築物が前記被験体をプライミングするために使用される、および／または
（ｂ）前記ブースト工程が、アレルゲン、前記ＬＡＭＰ構築物、前記ＬＡＭＰ構築物にコードされたポリペプチド、または前記ＬＡＭＰ構築物を含む細胞の投与を含む、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
プライミングするために使用される前記アレルゲンがブーストするために使用されるものと同じである、請求項１５または１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
プライミングするために使用される前記アレルゲンが、ブーストするために使用されるアレルゲンのものと同じタンパク質に由来する、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
１種類より多くのアレルゲンがプライミングおよび／またはブーストするために使用される、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学および薬の分野に関する。より詳しくは、本発明は、ＤＮＡワクチンとしての使用のための核酸、およびアレルギー反応に苦しんでいるか、またはアレルギー反応を起こし易い被験体を治療するためのその使用方法に関する。また、本明細書に記載のＬＡＭＰ構築物を使用するプライムブーストプロトコルも記載する。
【背景技術】
【０００２】
アレルギー反応は、免疫系がアレルゲンと称される異物と反応して無害にする際に起こる。例えば、食物アレルギーは、死亡する可能性がある全身性ショックであるアナフィラキシーのリスクが高いため、重要な公衆衛生課題である（Ｓａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：３８０−３８４；Ｂｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：１９１−１９３）。年少者は一般公衆より食物アレルギーを発症するリスクが高い（Ｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  ３４８：９７７−９８５；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８３：７６４−７７０；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １２０：１３０４−１３１０）。３歳までの間に小児の６〜８％が、食物が原因のアレルギー反応を経験する（Ｂｏｃｋ（１９８７）Ａｌｌｅｒｇｙ  ４５：５８７−５９６；Ｂｕｒｋｓ  ａｎｄ  Ｓａｍｐｓｏｎ（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂ．Ｐｅｄｉａｔｒ．２３：２３０−２５２；Ｊａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９３；２：４４６−４５６；Ｓａｍｐｓｏｎ（１９９９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３；５：７１７−７２８）。人口の１〜２％もがナッツアレルギー、例えば、ピーナツやナッツ類に対するアレルギー持ちであり、食物アレルギーのこの発生率は一般集団において増えつつあり、罹患はアジア系民族に偏っていると考えられている。
【０００３】
アレルゲン、例えばナッツ類またはピーナツへの曝露によって引き起こされるアナフィラキシーは、ヒスタミンの過剰生成を特徴とする深刻な免疫反応をもたらし、米国の年間のアナフィラキシーによる救急外来受診の半数を占める。例えば、ナッツ類に対する極端な反応では、米国において毎年、３０，０００例を超えるアナフィラキシーおよび１００〜２００例の死亡の発生がみられる。表示されていないにも関わらず、微量のナッツ類が数千の個別ブランドの包装された食料品において一般的に検出される。１５０万人を超える米国人がナッツアレルギーによる症状に苦しんでおり、症状は多くの場合、一生続く。多くの人は微量の曝露で危険な反応が起こる。
【０００４】
ナッツアレルギーの症状を軽減させるための治療法はない。この１０年間で、ナッツアレルギーの有病率は２倍になり、成人の米国人の２％が罹患している（Ｓａｍｐｓｏｎ（１９９９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３；５：７１７−７２８；Ｓｉｃｈｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１２：１２０３−１２０７）。花粉症およびブタクサ花粉などの他の多くのアレルギーの症状は生命を脅かすものではないが、ナッツアレルギーの個体は、ナッツ１粒の１０００分の１という少量の摂取でもアナフィラキシーショックや死亡が誘導されることがあり得る（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９（１）：２４−３０；Ｗｅｎｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１０（６）：９１５−９２０）。偶発的な摂取によってアナフィラキシーが誘発された場合では、気道を広げるためにエピネフリン注射が使用される（Ｓｔａｒｋ  ａｎｄ  Ｓｕｌｌｉｖａｎ（１９８６）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７８：７６−８３；Ｓａｍｐｓｏｎ（２００３）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １１１（６）：１６０１−１６０８）。
【０００５】
食物アレルギーは、個体が経口免疫寛容の成立に失敗し、代わりにその後のアレルゲン曝露に感作された状態になったときに起こる（Ｔｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３（６）：１０２５−１０３４）。アレルギー患者では、アレルゲンが、２型ヘルパーＣＤ４＋  Ｔリンパ球（Ｔｈ２）を優先的に活性化させるが、Ｔｈ２は、ほとんどのアレルギー症状の根底にある炎症の組織化を助けるアレルギー促進性サイトカインであるインターロイキンＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３を産生する（Ｗｏｏｄｆｏｌｋ（２００７）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１８（２）：２６０−２９４）。ＩＬ−４は、抗体産生Ｂ細胞にアレルゲン特異的免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｅを分泌するように指令する（Ｄｅｌ  Ｐｒｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：４１９３−４１９８；Ｓｗａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３７９６−３８０６）。中和性のＩｇＧとは異なり、ＩｇＥは、マスト細胞および好酸球が発現する高親和性受容体Ｆｃ−εＲ１に結合し（Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：１８７−１９０；Ｂｅｎｈａｍｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３０７１−３０７７）、これらの細胞を感作する。問題となっているアレルゲンに後に曝露されると、ＩｇＥは、それに結合し、架橋し、マスト細胞に、脱顆粒し、アレルギー反応を誘発する短命な化学物質を放出するように指令するシグナルを伝達する。
【０００６】
食物アレルギーの他に、他の環境要因によってもまた、上記のようなアレルギー応答が個体において生じる場合があり得る。かかる環境要因の例としては、限定されないが、花粉、犬のふけ、猫の唾液またはイエダニが挙げられる。
【０００７】
漸増用量のアレルゲンの投与によって免疫寛容をもたらす免疫療法は、アレルギー疾患の標準的な治療法であるが、高頻度のアナフィラキシー反応のため、ナッツアレルギーの治療としては承認されていない（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９９；６：７４４−７５１；Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９０：２５６−２６２）。また、免疫療法の有用性は治療期間の長さによって制限されており、治療には３６ヵ月間もの毎週または隔週の注射が必要とされ、治療が成功する程度および服薬順守の度合もさまざまである（Ｂｏｕｓｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０２：５５８−５６２；Ｒａｎｋ  ａｎｄ  Ｌｉ（２００７）Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．８２（９）：１１１９−１１２３；Ｃｉｐｒａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｐｒｏｃ．２８：４０−４３）。
【０００８】
ＤＮＡワクチンがアレルギー疾患の治療薬として提案されている（Ｒａｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｈａｒｔｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｃｒａｍｅｒｉ  ２００７；Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。基礎となる理論的根拠は、ＤＮＡワクチンにコードされたアレルゲンタンパク質が、特徴的なＴｈ２型の応答、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３の分泌ならびにＢリンパ球によるＩｇＥの形成ならびに反応後期における好酸球の成熟および動員ではなく、ＡＰＣ、ナチュラルキラー（ＮＫ）およびＴ細胞によるインターフェロン産生を伴うアレルゲン特異的Ｔｈ１細胞応答を優先的に活性化させるということである。しかしながら、Ｔｈ１  Ｔ細胞表現型が誘導されるかＴｈ２  Ｔ細胞表現型が誘導されるかの違いの基礎となる機構には、数多くの要素、例えば、ワクチン調製物の細菌ＤＮＡの特有の特性、例えば、非メチル化ＣｐＧ  ＤＮＡ残基、自然免疫によって誘起されるサイトカイン環境、および細胞のアレルゲントラフィッキング特性が関与しているようである（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｋａｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０００９】
一般的に言うと、ＤＮＡワクチンは、１つ以上のエピトープをコードしている配列を含む改変操作された核酸である。核酸は細胞に、典型的には抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達され、核酸が発現され、発現されたタンパク質上に存在するエピトープがエンドソーム／リソソーム区画内でプロセッシングされ、最終的に細胞の表面上に提示される。例えば、Ａｕｇｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第５，６３３，２３４号には、リソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ）のエンドソーム／リソソーム標的化配列が開示され、特性評価がされており、ＬＡＭＰタンパク質をエンドソーム／リソソーム区画に標的化するのに必要なＬＡＭＰタンパク質のＣ末端領域内の極めて重要な残基が同定されている。また、Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００４／０１５７３０７号には、ＤＮＡワクチンから発現されたキメラタンパク質を、１つ以上の細胞区画／細胞小器官、例えば、リソソーム系小胞経路を通過させるための「トラフィッキングドメイン」として、ＬＡＭＰ内腔側ドメインを使用することが開示されている。キメラタンパク質は、ＬＡＭＰポリペプチドの内腔側ドメイン、抗原タンパク質から選択され既に同定されているペプチドエピトープ配列を含む抗原ドメイン、膜貫通ドメインおよびエンドソーム／リソソーム標的化配列を含む。
【００１０】
数々のＬＡＭＰキメラワクチンが提案されているが、有効なワクチンとしての機能する能力は、インビボで試験を行うと一貫性がない。例えば、Ｇｏｄｉｎｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９（６）：９（６）：ｅ９９８８７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９９８８７において、著者らにより、抗原をリソソームおよびエクソソーム系の分泌経路に標的化するためにはインタクトな内腔側ドメインが必要であること、ならびに内腔側ドメインの断片は必ずしも奏功するわけではないことが報告された。同書第６頁を参照のこと。さらに、この著者らにより、免疫応答を起こす能力は、使用される具体的な抗原とエピトープに依存性であることが認められた。例えば、第９頁、第２欄に、この著者らは、「したがって、これまでの研究により、ＶＬＰとして分泌されるＧａｇまたは可溶性形態であるＧａｇを生成するＤＮＡワクチンは、Ｔ細胞活性化およびＢ細胞活性化をさまざまなレベルで誘導し、この活性化は細胞質内Ｇａｇによって誘導される応答とも異なることが実証された」と記載している。
【００１１】
したがって、両方のＬＡＭＰドメインが存在している場合であっても、免疫応答を起こすための具体的な抗原の有効性は、使用される具体的な配列に高度に依存性であることが次第にわかってきた。実際、同じタンパク質のいろいろな抗原断片を同一のＬＡＭＰワクチンベクター内に挿入すると、惹起される免疫応答は同じでないことがわかっている。ある場合では、抗原断片によって免疫応答が生じ、別の場合では生じない。このような観察結果では、対象のタンパク質に由来するどの具体的な抗原配列が免疫応答を起こすのかを事前に予測するのを可能にすることは困難である。代わりに、ＬＡＭＰワクチンの場合では、免疫応答活性をインビボ試験によって調べる必要がある。
【００１２】
したがって、アレルギー反応の起こり易さを有効に治療するために使用され得る改善された新しいＬＡＭＰキメラワクチンが同定される必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第５，６３３，２３４号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００４／０１５７３０７号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｓａｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：３８０−３８４
【非特許文献２】Ｂｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：１９１−１９３
【非特許文献３】Ｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  ３４８：９７７−９８５
【非特許文献４】Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８３：７６４−７７０
【非特許文献５】Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １２０：１３０４−１３１０
【非特許文献６】Ｓａｍｐｓｏｎ（１９９９）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０３；５：７１７−７２８
【非特許文献７】Ｓｉｃｈｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１２：１２０３−１２０７
【非特許文献８】Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０９（１）：２４−３０
【非特許文献９】Ｗｅｎｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１０（６）：９１５−９２０
【非特許文献１０】Ｓｔａｒｋ  ａｎｄ  Ｓｕｌｌｉｖａｎ（１９８６）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７８：７６−８３
【非特許文献１１】Ｓａｍｐｓｏｎ（２００３）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １１１（６）：１６０１−１６０８
【非特許文献１２】Ｔｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３（６）：１０２５−１０３４
【非特許文献１３】Ｗｏｏｄｆｏｌｋ（２００７）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１８（２）：２６０−２９４
【非特許文献１４】Ｄｅｌ  Ｐｒｅｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：４１９３−４１９８
【非特許文献１５】Ｓｗａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５：３７９６−３８０６
【非特許文献１６】Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：１８７−１９０
【非特許文献１７】Ｂｅｎｈａｍｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３０７１−３０７７
【非特許文献１８】Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９９；６：７４４−７５１
【非特許文献１９】Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９０：２５６−２６２
【非特許文献２０】Ｂｏｕｓｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０２：５５８−５６２
【非特許文献２１】Ｒａｎｋ  ａｎｄ  Ｌｉ（２００７）Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．８２（９）：１１１９−１１２３
【非特許文献２２】Ｃｉｐｒａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｐｒｏｃ．２８：４０−４３
【非特許文献２３】Ｒａｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６
【非特許文献２４】Ｈａｒｔｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４
【非特許文献２５】Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６
【非特許文献２６】Ｃｒａｍｅｒｉ  ２００７
【非特許文献２７】Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６
【非特許文献２８】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１
【非特許文献２９】Ｋａｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２
【非特許文献３０】Ｇｏｄｉｎｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９（６）：９（６）：ｅ９９８８７．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００９９８８７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、増強された免疫原性を有する特異的抗原（１種類または複数種）を含むワクチン、特に、遺伝子ワクチン、例えばＤＮＡワクチンまたはＲＮＡワクチンを提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、本開示の抗原の使用によるワクチン接種のより有効な方法を提供することであり、本開示の抗原は、リソソーム／エンドソーム区画および関連細胞小器官（例えば、ＭＩＩＣ、ＣＩＩＶ、メラノソーム、分泌顆粒、バーベック顆粒など）に指向され、区画および関連細胞小器官でプロセッシングされ、ヘルパーＴ細胞が優先的に刺激されるように主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子に提示される。
【００１７】
本発明の核酸、したがって、コードされたタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドは、被験体、特に、アレルギーに苦しんでいるか、またはアレルギーを発症する可能性がある被験体を治療する方法において使用され得る。一般に、本発明による治療方法は、本発明の核酸を被験体に、核酸が１つ以上の免疫細胞に、好ましくは免疫系の１つ以上の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達されるのに充分な量で投与することを含む。送達されたら、核酸が発現され、コードされたタンパク質が細胞内部でプロセッシングされ、エピトープ（１つまたは複数）が細胞の表面上にディスプレイされる。本治療方法は、アレルギーに苦しんでいるか、またはアレルギーを発症する可能性がある被験体において治療的または予防的免疫応答をもたらすために核酸およびタンパク質を使用する方法とみなされ得る。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
一態様において、本発明により：少なくとも１種類のアレルゲンＸを含むＮ末端ドメイン；およびトラフィッキングドメインを含み；該トラフィッキングドメインが、アレルゲンＸを細胞内のエンドソーム区画（例えば、リソソーム）に指向する、キメラタンパク質を提供する。好ましくは、トラフィッキングドメインが、ＬＡＭＰポリペプチドの内腔側ドメイン、例えば、ＬＡＭＰ−１またはＬＡＭＰ−２ポリペプチドを含む。
【００１９】
別の態様では、キメラタンパク質が、タンパク質のプロセッシングおよびペプチドエピトープのＭＨＣ  ＩＩとの結合のために少なくとも１種類のアレルゲンＸをエンドソーム／リソソーム区画または関連細胞小器官に指向する標的化配列、例えば、テトラペプチド配列Ｔｙｒ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘｂｂ（ここで、Ｘａａは任意のアミノ酸であり、Ｘｂｂは疎水性アミノ酸である）を含む。さらに別の態様では、標的化配列がジロイシン配列を含むものである。さらなる一態様では、標的化配列が、エンドサイトーシス受容体由来のサイトゾルタンパク質標的化ドメインを含むものである。好適なドメインとしては、限定されないが、Ｃ型レクチン受容体の標的化ドメイン、ＤＥＣ−２０５ポリペプチド、ｇｐ２００−ＭＲ６タンパク質、またはそのホモログ、オーソログ、バリアントもしくは修飾形態が挙げられる。
【００２０】
特に好ましい一態様では、タンパク質は、ＬＡＭＰポリペプチドの内腔側ドメインと、テトラペプチド配列Ｔｙｒ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘｂｂ（ここで、Ｘａａは任意のアミノ酸であり、Ｘｂｂは疎水性アミノ酸である）を含む細胞質ドメインとを含むものである。キメラタンパク質は、好ましくは、膜貫通型タンパク質をさらに含む。さらにより好ましくは、キメラタンパク質はまた、シグナル伝達ドメインも含む。
【００２１】
アレルゲンＸは、キメラタンパク質を生成させるために使用され得る。一態様において、好ましいアレルゲンは、表１に示す配列番号：Ｙのいずれか１つのアレルゲンＸのアミノ酸配列を含む。アレルゲンＸ（配列番号：Ｙ）をコードするものであり得るポリヌクレオチドの代表例を配列番号：Ｚとして表１に示す。このようなポリヌクレオチドは、トラフィッキングドメインと標的化ドメインの間に挿入される。挿入は、配列番号：Ｙのアミノ酸配列にフランキングするクローニング配列、例えば、“Ｌｅｕ−Ｇｌｕ”をコードするポリヌクレオチドと“Ｇｌｕ−Ｐｈｅ”をコードするポリヌクレオチド（例えば、“ＣＴＣＧＡＧ”と“ＧＡＡＴＴＣ”）などの使用によって助長され得る。
【００２２】
本発明によりさらに、表１のアレルゲンＸのいずれかをコードしている核酸分子を提供する。また、本発明により、アレルゲンＸをコードしている核酸、例えば配列番号：Ｚおよび配列番号：Ｗなどを含み、核酸分子が発現制御配列に作動可能に連結されているベクターも提供する。好ましい一態様では、ベクターが、患者をアレルゲンＸに対してワクチン接種するのに適したワクチンベクターである。別の態様では、本発明により、核酸分子を含む送達媒体であって、細胞内への核酸分子の導入を助長するための送達媒体を提供する。送達媒体は、脂質ベースのもの（例えば、リポソーム製剤）、ウイルスベースのもの（例えば、核酸分子が封入されたウイルスタンパク質を含むもの）、または細胞ベースのものであり得る。好ましい一態様では、ベクターがワクチンベクターである。
【００２３】
また、本発明により、上記の任意のベクターを含む細胞も提供する。一態様において、細胞は抗原提示細胞である。抗原提示細胞は、専門的抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞など）であっても、改変操作された抗原提示細胞（例えば、抗原提示のために必要とされる分子、例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するように改変操作された非専門的抗原提示細胞）であってもよい。抗原提示のために必要とされる分子は、他の細胞に由来するもの、例えば天然に存在するものであってもよく、それ自体が改変操作（例えば、所望の特性、例えば、抗原エピトープに対してより高い、またはより低い親和性を示すように変異または修飾）されているものであってもよい。一態様において、抗原提示細胞は、なんら共刺激シグナルを示さないものであり、抗原は自己抗原である。
【００２４】
さらに本発明により、上記の任意のベクターを含む複数の細胞を備えたキットを提供する。少なくとも２つの細胞が異なるＭＨＣクラスＩＩ分子を発現し、各細胞は同じベクターを含む。一態様において、ベクターと、ベクターを受容するための細胞とを備えたキットを提供する。
【００２５】
また、本発明により、少なくとも１つの上記の細胞を含むトランスジェニック動物も提供する。
【００２６】
本発明によりさらに、動物においてアレルゲンＸに対する免疫応答を生じさせるための方法であって：動物に上記のアレルゲンＸをコードしている核酸配列（例えば、配列番号：Ｚまたは配列番号：Ｗなど）を含む細胞またはポリヌクレオチドを投与することを含み、細胞は、動物においてキメラタンパク質を発現するか、または発現するように誘導され得る方法を提供する。一態様において、細胞は、動物がＭＨＣクラスＩＩ分子に対する免疫応答を生じないように動物のＭＨＣタンパク質と適合性のＭＨＣクラスＩＩ分子を含む。好ましい一態様では、動物がヒトである。
【００２７】
一態様において、本発明により、アレルゲンＸに対するアレルギーに苦しんでいるか、またはアレルギーを発症する可能性がある被験体を治療する方法であって、動物に上記のベクター、宿主細胞、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのいずれかを投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、ベクターが動物の細胞に感染性である。例えば、ベクターは、ウイルスベクター、例えばワクシニアベクターであり得る。動物に投与される好ましいキメラワクチンは、表１に示す配列番号：Ｙのアミノ酸配列のいずれか１つをコードしているポリヌクレオチドを含む。
【００２８】
また、プライムブーストプロトコルも想定される。例えば、本発明によりさらに、被験体においてアレルゲンＸに対する免疫応答を生じさせるための方法であって、被験体を本明細書に記載のＬＡＭＰ構築物でプライミングした後、アレルゲンＸまたは関連抗原（例えば、同じもしくは非常に類似しているタンパク質配列に由来する第２のアレルゲン）での被験体の少なくとも１回のブーストを行うことを含む方法を提供する。アレルゲン混合物を、プライミング工程とブースト工程のいずれか、または両方で使用してもよい。プライム工程に続いてブースト工程にもＬＡＭＰ構築物を使用すると有意により高い力価がもたらされることが示され、抗体応答の増強におけるＬＡＭＰの力を示す。
【００２９】
さらなる一態様では、細胞を患者から採取し、ベクターを細胞内に導入し、細胞または細胞の子孫を患者に再導入する。一態様において、細胞は、抗原提示細胞への分化能を有する幹細胞である。
【００３０】
本発明の目的および特徴は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すると、よりよく理解され得よう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】本明細書に記載の構築物を作製するために使用したヒトＬＡＭＰ−１配列のいろいろな部分を示す。
【図２】ヒトＬａｍｐ−１タンパク質（配列番号：４）の既知の構造ドメインおよびアミノ酸配列を示す。
【図３】マウスＬａｍｐ−１タンパク質（配列番号：５）の既知の構造ドメインおよびアミノ酸配列を示す
【図４】表１に示した本明細書に記載のいろいろな構築物の図式的表示である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本発明により、アレルゲンＸに対するワクチンを作製するため使用され得るキメラタンパク質およびこのようなタンパク質をコードしている核酸を提供する。一態様において、キメラタンパク質は、アレルゲンＸと、タンパク質のエンドソーム／リソソーム区画または関連細胞小器官へのトラフィッキングのためのドメインとを含む。好ましい一態様では、トラフィッキングドメインが、ＬＡＭＰポリペプチドの内腔側ドメインを含む。択一的または付加的に、キメラタンパク質は、エンドサイトーシス受容体（例えば、Ｃ型レクチン、ＤＥＣ−２０５またはｇｐ２００−ＭＲ６など）のトラフィッキングドメインを含む。ワクチンは免疫応答を調節するために使用され得る。好ましい一態様では、本発明により、アレルゲンＸを含むキメラタンパク質またはアレルゲンＸをコードしている核酸を患者に供給することにより、患者のアレルギー応答を治療または予防する方法を提供する。
【００３３】
定義
本明細書で以下において使用している具体的な用語について、以下に定義を示す。
【００３４】
本明細書および特許請求の範囲で用いる場合、単数“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”は、本文中にそうでないことを明示していない限り、複数の言及を包含している。例えば、用語“ａ  ｃｅｌｌ（細胞）”は、複数の細胞（その混合物を含む）を包含している。用語“ａ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（核酸分子）”は複数の核酸分子を包含している。
【００３５】
本明細書で用いる場合、用語“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（〜を含む）”は、組成物および方法が記載の要素を含むものであるが、他の要素を排除しないことを意味していることを意図する。“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（本質的に〜からなる）”は、組成物および方法を規定するために用いている場合、この組合せに対して本質的になんらかの意義がある他の要素を排除することを意味しているものとする。したがって、本質的に本明細書において規定された要素からなる組成物では、単離および精製の方法による微量の混入物ならびに薬学的に許容され得る担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水、保存料などは排除され得ない。“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（〜からなる）”は、本発明の組成物を投与するための微量要素の他の成分および実質的な方法工程の他は排除することを意味しているものとする。これらの移行句の各々によって規定される実施形態が本発明の範囲に含まれる。
【００３６】
本明細書で用いる場合、「リソソーム／エンドソーム区画」は、膜内ＬＡＭＰ分子、抗原プロセッシングにおいて機能を果たす加水分解酵素、ならびに抗原の認識および提示のためのＭＨＣクラスＩＩ分子を含む、膜結合型酸性液胞をいう。この区画は、細胞表面からさまざまな機構のいずれか、例えばエンドサイトーシス、食作用および飲作用によって内在化された異物の分解のため、ならびに特殊な自己融解現象によってこの区画に送達された細胞内物質の分解のための部位としての機能を果たす（ｄｅ  Ｄｕｖｅ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７：３９１，１９８３）。用語「エンドソーム」は、本明細書および特許請求の範囲で用いる場合、リソソームを包含している。
【００３７】
本明細書で用いる場合、「リソソーム関連細胞小器官」は、リソソームを含む任意の細胞小器官をいい、限定されないが、ＭＩＩＣ、ＣＩＩＶ、メラノソーム、分泌顆粒、溶解性顆粒（ｌｙｔｉｃ  ｇｒａｎｕｌｅ）、血小板密顆粒、好塩基性顆粒、バーベック顆粒、ファゴリソソーム、分泌型リソソームなどが包含される。好ましくは、かかる細胞小器官は、マンノース６−リン酸受容体がなく、ＬＡＭＰを含むが、ＭＨＣクラスＩＩ分子は含んでいても含んでいなくてもよい。概説については、例えば、Ｂｌｏｔｔ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００２；Ｄｅｌｌ’Ａｎｇｅｌｉｃａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １４：１２６５−１２７８，２０００を参照のこと。
【００３８】
本明細書で用いる場合、用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを示すために互換的に用いている。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそのアナログを含むものであり得る。ヌクレオチドは、任意の三次元構造を有するものであり得、既知または未知の任意の機能を果たすものであり得る。用語「ポリヌクレオチド」には、例えば、一本鎖、二本鎖および三重らせんの分子、遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス分子、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝型ポリヌクレオチド、アプタマー、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、ならびにプライマーが包含される。また、核酸分子には、修飾核酸分子（例えば、修飾された塩基、糖鎖および／またはヌクレオチド間リンカーを含むもの）も包含され得る。
【００３９】
本明細書で用いる場合、用語「ペプチド」は、サブユニットである２つ以上のアミノ酸、アミノ酸アナログまたはペプチド模倣物の化合物をいう。サブユニットはペプチド結合によって、または他の結合によって（例えば、エステル、エーテルなどとして）連結され得る。
【００４０】
本明細書で用いる場合、用語「アミノ酸」は、天然および／または非天然もしくは合成のいずれかのアミノ酸、例えば、グリシンおよびＤまたはＬの両方の光学異性体、ならびにアミノ酸アナログならびにペプチド模倣物をいう。３個以上のアミノ酸のペプチドは一般的に、ペプチド鎖が短ければオリゴペプチドと称される。ペプチド鎖が長い場合（例えば、約１０個より多いアミノ酸）、ペプチドは一般的にポリペプチドまたはタンパク質と称される。用語「タンパク質」は用語「ポリペプチド」を包含しているが、「ポリペプチド」は完全長より短いタンパク質であり得る。
【００４１】
本明細書で用いる場合、用語「アレルゲンＸ」は、以下の表１に列記した具体的な遺伝子／タンパク質、その断片、または個体に対して反復的に曝露するとアレルギー、すなわちＩｇＥ媒介性反応を誘導することがわかっている列記したタンパク質の混合物をいう。一般的に、アレルゲンは、アレルギー反応を誘起する能力を有する任意の化合物、物質または材料である。アレルゲンは通常、免疫応答を誘起する能力を有する化合物、物質または材料である抗原の下位区分として理解される。本発明を実施するために、アレルゲンＸは、とりわけ、天然または天然状態のアレルゲン、修飾された天然アレルゲン、合成アレルゲン、組換えアレルゲン、アレルゴイド、およびその混合物または組合せから選択され得る。特に重要なものは、ＩｇＥ媒介性即時型過敏症を引き起こす能力を有するアレルゲンＸである。
【００４２】
【表１−１】
2019537447.tif 000002
【００４３】
【表１−２】
2019537447.tif 000003
【００４４】
本明細書で用いる場合、アレルゲンＸのアミノ酸配列は、配列番号：Ｙのいずれか１つを含むものである。アレルゲンＸをコードするものであり得るポリヌクレオチドの好ましい代表例を配列番号：Ｚとして表１に示す。アレルゲンＸポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが具体的に想定される。
【００４５】
本明細書で用いる場合、「アレルゲンＸ」はまた、アレルゲンＸのバリアントも包含している。例えば、好ましい実施形態は、配列番号：Ｙと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアレルゲンＸポリペプチドバリアントを含む。このようなバリアントは、（ａ）アレルゲンＸと交差反応する抗体を生じさせる能力、ここで、抗体はアレルゲンＸにより誘導されたものである、および／または（ｂ）アレルゲンＸの生物学的活性のいずれかを保持している。このようなバリアントアレルゲンＸポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが具体的に想定される。
【００４６】
さらに、１種類より多くのアレルゲンＸを組合せ、本明細書に記載のワクチンとして投与してもよい。クローニングの際、アレルゲンＸの組合せの順序は構築物内でさまざまであり得る。さらに、アレルゲンＸの組合せは、単一のワクチン構築物内でクローニングされ得るか、または複数のワクチン構築物もしくはアレルゲンＸを含む組成物にて送達され得ることが具体的に想定される。具体的には、表１に記載のアレルゲンＸは本明細書に記載のＬＡＭＰ構築物内に、個々に、または互いとの組合せのいずれかでクローニングされ得る。本明細書においてこのパラグラフで用いる場合、名称Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１およびＣｔｅｆ１は、表１に記載のアレルゲンＸを示す。具体的には、アレルゲンＸの組合せは、本明細書に記載のＬＡＭＰ構築物内に以下の通りにクローニングされ得る：（ａ）Ｃｏｒａ１と、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｂ）Ｃｏｒａ９と、Ｃｏｒａ１、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｃ）Ｐｒｕｄｕ６と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｄ）Ａｎａｏ１と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｅ）Ａｎａｏ２と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｆ）Ａｎａｏ３と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｇ）Ｊｕｇｎ１と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｈ）Ｊｕｇｒ２と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｉ）Ｂｅｔｖ１−Ａと、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｊ）Ｃａｎｆ１と、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｋ）Ｃｙｎｄ１と、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｌ）ＤｅｒＦ１（１９−３２１）と、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｍ）ＤｅｒＦ１（９９−３２１）と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｎ）ＤｅｒＰ２と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｏ）ＤｅｒＦ２と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｐ）ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｑ）ＦｅｌＤ１と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｒ）ＦｅｌＤ２と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｓ）ＦｅｌＤ４と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｔ）Ｌｉｔｖ１と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｕ）Ｌｏｌｐ５ａと、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｖ）Ｐｈｌｐ１と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１
−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｗ）Ａｍｂａ１と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｘ）Ｐｈｌｐ５と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｙ）Ｄｅｒｆ１５と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１８、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ｚ）Ｄｅｒｆ１８と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｚｅｎ−１および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；（ａａ）Ｚｅｎ−１と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、および／またはＣｔｅｆ１のうちの少なくとも１つ；および／または（ｂｂ）Ｃｔｅｆ１と、Ｃｏｒａ１、Ｃｏｒａ９、Ｐｒｕｄｕ６、Ａｎａｏ１、Ａｎａｏ２、Ａｎａｏ３、Ｊｕｇｎ１、Ｊｕｇｒ２、Ａｍｂａ１、Ｂｅｔｖ１−Ａ、Ｃａｎｆ１、Ｃｙｎｄ１、ＤｅｒＦ１（１９−３２１）、ＤｅｒＦ１（９９−３２１）、ＤｅｒＰ２、ＤｅｒＦ２、ＤｅｒＰ１（ｄｅｌ）、ＦｅｌＤ１、ＦｅｌＤ２、ＦｅｌＤ４、Ｌｉｔｖ１、Ｌｏｌｐ５ａ、Ｐｈｌｐ１、Ｐｈｌｐ５、Ｄｅｒｆ１５、Ｄｅｒｆ１８、および／またはＺｅｎ−１のうちの少なくとも１つ。
【００４７】
この列記は、ＬＡＭＰ構築物が何を含んでいるかを示すものであって、必ずしも具体的な構築物内における抗原の配置を示しているとは限らないため、具体的なＬＡＭＰ構築物内における上記の抗原の組合せの順序はさまざまであり得る。さらに、これらの抗原は、単一のＬＡＭＰ構築物内に合わされ得るか、または複数のＬＡＭＰ構築物を含む組成物にて送達され得ることが具体的に想定される。
【００４８】
本明細書で用いる場合、「ＬＡＭＰポリペプチド」は、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＣＤ６３／ＬＡＭＰ−３、ＤＣ−ＬＡＭＰ、もしくは任意のリソソーム結合膜タンパク質、またはホモログ、オーソログ、バリアント（例えば、アレルバリアント）および修飾形態（例えば、天然に存在するか、もしくは改変操作型のいずれかの１つ以上の変異を含むもの）をいう。一態様において、ＬＡＭＰポリペプチドは、哺乳動物のリソソーム結合膜タンパク質、例えばヒトまたはマウスなどのリソソーム結合膜タンパク質である。より一般的には、「リソソーム結合膜タンパク質」は、エンドソーム／リソソーム区画またはリソソーム関連細胞小器官の膜にみられるドメインを含み、内腔側ドメインをさらに含む任意のタンパク質をいう。ＬＡＭＰ−１ポリペプチドの代表例としては、配列番号：４（ヒトＬＡＭＰ−１）、配列番号：５（マウスＬＡＭＰ−１）、またはイヌ科のＬＡＭＰ（ＸＰ＿５３４１９３）が挙げられ、これらの任意の配列が、本明細書に記載のＤＮＡワクチンの作製に使用され得る。
【００４９】
本明細書で用いる場合、「エンドサイトーシス受容体」は、そのＣ末端またはＮ末端のいずれかが細胞質に面しており、（例えば、化学結合によって）自身にコンジュゲートされているポリペプチドまたはペプチドをＭＨＣクラスＩＩ分子に、または後にＭＨＣクラスＩＩ分子と会合する細胞内区画に輸送するためのトラフィッキングドメイン（例えば、内腔側ドメイン）を含む、膜貫通型タンパク質をいう。エンドサイトーシス受容体の例としては、限定されないが、Ｆｃ−受容体、補体受容体、スカベンジャー受容体、インテグリン、レクチン（例えば、Ｃ型レクチン）、ＤＥＣ−２０５ポリペプチド、ｇｐ２００−ＭＲ６ポリペプチド、Ｔｏｌｌ様受容体、熱ショックタンパク質受容体（例えば、ＣＤ  ９１）、アポトーシス小体もしくはネクローシス小体受容体（例えば、ＣＤ  １４など）、またはそのホモログ、オーソログ、バリアント（例えば、アレルバリアント）および修飾形態（例えば、天然に存在するか、もしくは改変操作型のいずれかの１つ以上の変異を含むもの）が挙げられる。
【００５０】
本明細書で用いる場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写される、および／またはペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳されるプロセスをいう。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現には、ゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡのスプライシングが包含され得る。
【００５１】
本明細書で用いる場合、「転写制御下」または「作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結された」は、ポリヌクレオチド配列の発現（例えば、転写または翻訳）が、発現制御エレメントとコード配列の適切な並置によって制御されることをいう。一態様において、ＤＮＡ配列は、発現制御配列によってＤＮＡ配列の転写が制御および調節される場合、発現制御配列に「作動可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結され」ている。
【００５２】
本明細書で用いる場合、「コード配列」は、適切な発現制御配列の制御下に配置した場合、転写され、ポリペプチドに翻訳される配列である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシル）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列としては、限定されないが、原核生物の配列、真核生物のｍＲＮＡのｃＤＮＡ、真核生物の（例えば、哺乳動物の）ＤＮＡのゲノムＤＮＡ配列、およびさらには合成ＤＮＡ配列が挙げられ得る。ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は通常、コード配列の３’側に配置される。
【００５３】
本明細書で用いる場合、２つのコード配列は、配列またはそれぞれの相補配列が同じアミノ酸配列をコードしている場合、互いに「対応する」。
【００５４】
本明細書で用いる場合、「シグナル配列」は、小胞体トランスロケーション（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）配列を表す。この配列は、自身に連結されている（例えば、化学結合によって）ポリペプチドを小胞体小胞区画に指向してエキソサイトーシス／エンドサイトーシス細胞小器官内に進入させ、細胞小胞区画、細胞表面のいずれかに送達されるか、またはポリペプチドが分泌されるように細胞と連絡するシグナルペプチドをコードしている。このシグナル配列は場合によっては、タンパク質の成熟中に細胞によって切り落とされる。シグナル配列は、原核生物および真核生物に内在するさまざまなタンパク質と会合した状態でみられる場合があり得る。
【００５５】
本明細書で用いる場合、「トラフィッキング」とは、粗面小胞体から、抗原のプロセッシングおよびＭＨＣ  ＩＩとの結合が行われるエンドソーム／リソソーム区画または関連細胞小器官への、経路内のすべての細胞小器官または細胞区画を介するアレルゲンＸポリペプチドの移動または進行を表す。「輸送する」とは、ある特定の１つの型の細胞区画へのキメラタンパク質の送達をいう。
【００５６】
本明細書で用いる場合、別のトラフィッキング配列に実質的に相同である「トラフィッキング配列」とは、他方のトラフィッキング配列と実質的な相同性を共通して有するものである；しかしながら、実質的な相同性の最終的な試験は、トラフィッキング配列と実質的に相同な配列を含むポリペプチドがトラフィッキング配列と同じエンドソーム区画に共局在することができる機能アッセイである。
【００５７】
本明細書で用いる場合、「トラフィッキングドメイン」は、タンパク質内の、１つ以上の細胞区画／細胞小器官を介するタンパク質の小胞フローに必要とされる一連の連続または不連続のアミノ酸をいう。トラフィッキングドメインは好ましくは、このフローを媒介するための適正なタンパク質のフォールディングに必要な配列を含む。一態様において、トラフィッキングドメインは内腔側配列を含み；好ましくは、かかる配列は、細胞内フォールディングタンパク質、例えばシャペロンとの相互作用のための１つ以上の結合部位を含む。
【００５８】
本明細書で用いる場合、「標的化」とは、ポリペプチド配列がアレルゲンＸのトラフィッキングを、抗原のプロセッシングおよびＭＨＣ  ＩＩとの結合が行われる好ましい部位または細胞小器官もしくは細胞区画に指向することを表す。
【００５９】
対照的に、本明細書で用いる場合、「標的化ドメイン」は、細胞区画／細胞小器官への送達に必要とされる一連のアミノ酸をいう。好ましくは、標的化ドメインは、アダプターあるいはＡＰタンパク質（例えば、ＡＰ１、ＡＰ２またはＡＰ３タンパク質など）に結合する配列である。例示的な標的化ドメイン配列はＤｅｌｌ’Ａｎｇｅｌｉｃａ，２０００（上掲）に記載されている。
【００６０】
「キメラＤＮＡ」は、大型のＤＮＡ分子内の同定可能なＤＮＡセグメントであって、自然状態では大型の分子との会合状態でみられないＤＮＡセグメントである。したがって、キメラＤＮＡがタンパク質セグメントをコードしている場合、このセグメントをコードしている配列は、天然に存在するいずれのゲノムでもコード配列にフランキングしていないＤＮＡにフランキングされる。本明細書に定義するキメラＤＮＡは、対立遺伝子変異事象または天然に存在する変異事象によって生じるものではない。
【００６１】
本明細書に記載の任意のベクター内へのクローニングを助長するためのアミノ酸をコードしている短鎖のポリヌクレオチドを、アレルゲンＸをコードしているポリヌクレオチドの末端に含めてもよい。例えば、配列番号：Ｙのアミノ酸配列にフランキングするクローニング配列、例えば、“Ｌｅｕ−Ｇｌｕ”をコードするポリヌクレオチドと“Ｇｌｕ−Ｐｈｅ”をコードするポリヌクレオチド（例えば、“ＣＴＣＧＡＧ”と“ＧＡＡＴＴＣ”）などの使用が設計構築物に含められ得る。
【００６２】
本明細書で用いる場合、「核酸送達ベクター」は、対象のポリヌクレオチドを細胞内に輸送し得る核酸分子である。好ましくは、かかるベクターは、発現制御配列に作動可能に連結されたコード配列を含む。しかしながら、対象のポリヌクレオチド配列は必ずしもコード配列を含むものでなくてもよい。例えば、一態様において、対象のポリヌクレオチド配列は、標的分子に結合するアプタマーである。別の態様では、対象の配列が、調節配列に結合して調節配列の調節を阻害する調節配列の相補配列である。さらに別の態様では、対象の配列自体が調節配列（例えば、細胞内の調節因子を調整するためのもの）である。
【００６３】
本明細書で用いる場合、「核酸送達媒体」は、ポリヌクレオチドを宿主細胞内に運ぶことができ（例えば、遺伝子または遺伝子断片、アンチセンス分子、リボザイム、アプタマーなど）、上記の核酸ベクターとの会合状態で存在する任意の分子または分子群または巨大分子と定義する。
【００６４】
本明細書で用いる場合、「核酸送達」または「核酸移入」は、導入に使用される方法に関係なく外来性ポリヌクレオチド（例えば、「導入遺伝子」など）の宿主細胞内への導入をいう。導入されたポリヌクレオチドは宿主細胞内に安定的に、または一過的に維持され得る。安定な維持には典型的には、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合性の複製起点を含むか、または宿主細胞のレプリコン内、例えば染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）または核もしくはミトコンドリアの染色体内に組み込まれることのいずれかが必要とされる。
【００６５】
本明細書で用いる場合、「ウイルスベクター」は、宿主細胞内にインビボ、エキソビボまたはインビトロのいずれかで送達されるポリヌクレオチドを含むウイルスまたはウイルス粒子をいう。ウイルスベクターの例としては、限定されないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。遺伝子移入がアデノウイルスベクターによって媒介される態様において、ベクター構築物は、アデノウイルスゲノムまたはその一部、および選択された非アデノウイルス遺伝子を含み、アデノウイルスカプシドタンパク質と会合状態のポリヌクレオチドをいう。
【００６６】
本明細書で用いる場合、「アデノウイルス媒介性遺伝子移入」または「アデノウイルス形質導入」は、遺伝子または核酸配列が宿主細胞内に、アデノウイルスの細胞への進入によって移入されるプロセスをいう。好ましくは、ウイルスは、細胞内で複製され、および／または組み込まれて転写され得るものである。
【００６７】
本明細書で用いる場合、「アデノウイルス粒子」は、外部のカプシドと内部の核酸物質で構成された個々のアデノウイルスビリオンであり、ここで、カプシドはさらにアデノウイルスエンベロープタンパク質で構成されている。アデノウイルスエンベロープタンパク質を、例えばアデノウイルス粒子を特定の細胞および／または組織型に標的化するために、ウイルスタンパク質に共有結合しているポリペプチドリガンドを含む融合ポリペプチドを含むように修飾してもよい。
【００６８】
本明細書で用いる場合、用語「分子を細胞に投与する」（例えば、発現ベクター、核酸、補助因子、送達媒体、薬剤など）は、細胞を分子で形質導入する、トランスフェクトする、マイクロインジェクションする、エレクトロポレーションするまたはシューティング（ｓｈｏｏｔｉｎｇ）することをいう。一部の態様では、分子は標的細胞内に、標的細胞を送達細胞と接触させることにより（例えば、細胞融合によって、または標的細胞と近接している場合は送達細胞を溶解させることにより）導入される。
【００６９】
本明細書で用いる場合、語句「プライムブースト」は、Ｔ細胞応答をプライミングするために使用される本明細書に記載のＬＡＭＰ構築物を使用した後、応答をブーストするためにアレルゲンを含む第２のＬＡＭＰ構築物、アレルゲンを含むＤＮＡワクチンまたは組換えアレルゲンを使用することを示す。このような異種プライム−ブースト免疫処置により、同じベクターでのプライムおよびブーストによって得られ得るものより大きい高度および幅の免疫応答が惹起される。アレルゲンＸ記憶細胞を含むＬＡＭＰ構築物でのプライミング；ブースト工程により、この記憶応答が拡張される。好ましくは、この２種類の異なる薬剤の使用により互いに対する応答は生じず、したがって互いの活性を妨げない。プライムおよび／またはブースト工程においてアレルゲンの混合物も具体的に想定される。ブーストは１回または複数回行われ得る。
【００７０】
本明細書で用いる場合、「ハイブリダイゼーション」は、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化された複合体を形成する反応をいう。水素結合は、ワトソン・クリック型塩基対合、フーグスティーン型結合によって、または任意の他の配列特異的様式で行われ得る。複合体は、二本鎖構造を形成している２つの鎖、多重鎖複合体を形成している３本以上の鎖、１本の自己ハイブリダイズ性の鎖、またはこれらの任意の組合せを含むものであり得る。ハイブリダイゼーション反応は、より大規模なプロセスの一工程、例えば、ＰＣＲ反応の開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断を構成するものであってもよい。
【００７１】
本明細書で用いる場合、別の配列とある特定のパーセンテージ（例えば、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％）の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、当該技術分野で常套的なソフトウェアプログラムを用いて最大限にアラインメントした場合、この２つの配列の比較においてパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が同じであることを意味する。
【００７２】
２つの配列は、ヌクレオチドの少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％が、規定の長さＤＮＡ配列においてマッチしている場合、「実質的に相同である」か、または「実質的に類似している」。同様に、２つのポリペプチド配列は、ポリペプチドのアミノ酸残基の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％が、規定の長さのポリペプチド配列においてマッチしている場合、「実質的に相同である」か、または「実質的に類似している」。実質的に相同な配列は、配列データバンクにて入手可能な標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することにより確認され得る。また、実質的に相同な核酸配列は、例えば、その具体的な系に対して規定されたストリンジェント条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験でも確認され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の規定は当該技術分野の技能の範囲内である。例えば、ストリンジェント条件は：５×ＳＳＣと５０％ホルムアミドで４２℃におけるハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣと０．１％ドデシル硫酸ナトリウムで６０℃における洗浄であり得る。
【００７３】
用語「配列類似性パーセント（％）」、「配列同一性パーセント（％）」などは、一般的に、共通の進化的起源を共通して有するものであり得るか、またはそうでないものであり得る核酸分子の異なるヌクレオチド配列間またはポリペプチドの異なるアミノ酸配列間の同一性または対応の度合をいう（Ｒｅｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（上掲）参照）。配列同一性は、公衆に利用可能ないくつかの配列比較アルゴリズムのいずれか、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ７，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）などを用いて調べることができる。
【００７４】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸分子間の同一性パーセントを調べるため、配列は、最適な比較の目的でアラインメントされる。２つの配列間の同一性パーセントは、配列が共通して有する同一の位置の数の関数（すなわち、同一性パーセント＝同一の位置の数／位置の総数（例えば、重なっている位置）×１００）である。一実施形態では、２つの配列は同じ長さ、またはほぼ同じ長さである。２つの配列間の同一性パーセントは、後述するものと同様の手法を用いて、ギャップの許容ありまたはなしで調べることができる。配列同一性パーセントの計算では、典型的には厳密なマッチ数がカウントされる。
【００７５】
２つの配列間の同一性パーセントの測定は、数学的アルゴリズムを用いて行われ得る。２つの配列の比較に使用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９３，９０：５８７３−５８７７の場合のように改良されたＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９０，８７：２２６４のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０；２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行うと、本発明の配列と相同なヌクレオチド配列が得られ得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行うと、本発明のタンパク質配列と相同なアミノ酸配列が得られ得る。ギャップありの比較目的のアラインメントを得るためには、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９７，２５：３３８９に記載のようにして使用され得る。あるいはまた、分子間の遠縁を検出する反復検索を行うためにはＰＳＩ−Ｂｌａｓｔが使用され得る。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）（上掲）を参照のこと。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが使用され得る。ワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／を参照のこと。
【００７６】
配列比較のために使用される数学的アルゴリズムの別の非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ  １９８８；４：１  １−１７のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列の比較のためにＡＬＩＧＮプログラムを使用する場合、ＰＡＭ１２０の残基重み付けの表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２、およびギャップペナルティ４が使用され得る。
【００７７】
好ましい一実施形態では、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントが、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ；ワールドワイドウェブ上のａｃｃｅｌｒｙｓ．ｃｏｍにおいて入手可能）内のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０，４８：４４４−４５３）のアルゴリズムを使用し、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２行列またはＰＡＭ２５０行列のいずれか、ギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６または４、および長さウェイト（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）１、２、３、４、５または６を用いて調べられる。また別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントが、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、ギャップウェイト４０、５０、６０、７０または８０、および長さウェイト１、２、３、４、５または６を用いて調べられる。特に好ましいパラメータの組（および分子が本発明の配列の同一性または相同性の制限値であるかどうかを調べるのに実行者がどのパラメータを適用すべきかについて不確定である場合に使用され得るもの）は、ギャップ開始ペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４およびフレームシフトギャップペナルティ５でのＢｌｏｓｓｕｍ  ６２スコア行列の使用である。
【００７８】
本明細書に記載の特性の統計解析は、標準的な検定、例えばｔ−検定、ＡＮＯＶＡまたはカイ二乗検定によって行われ得る。典型的には、統計学的有意性は、ｐ＝０．０５（５％）、より好ましくはｐ＝０．０１、ｐ＝０．００１、ｐ＝０．０００１、ｐ＝０．０００００１のレベルまで測定される。
【００７９】
また、ドメイン配列の「保存的修飾バリアント」も提供され得る。具体的な核酸配列に関して、保存的修飾バリアントは、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードしている核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合は本質的に同一の配列をいう。具体的には、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合型塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによる縮重コドンの置換が行われ得る（Ｂａｔｚｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ，ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８）。
【００８０】
野生型タンパク質の「生物学的活性断片」、「生物学的活性形態」、「生物学的活性等価物」および「機能性誘導体」という用語は、（活性の検出に適したアッセイを用いて測定したとき）野生型タンパク質の生物学的活性と少なくとも実質的に等しい（例えば、有意に異ならない）生物学的活性を有するものである。例えば、トラフィッキングドメインを含む生物学的活性断片は、トラフィッキングドメインを含む完全長ポリペプチドと同じ区画に共局在し得るものである。
【００８１】
本明細書で用いる場合、「インビボでの核酸送達、核酸移入、核酸療法」などは、生物体、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物の体内への外来性ポリヌクレオチドを含むベクターの直接的な導入をいい、これにより、外来性ポリヌクレオチドがかかる生物体の細胞内にインビボで導入される。
【００８２】
本明細書で用いる場合、用語「インサイチュ」は、核酸を標的細胞と近接させるインビボ核酸送達の型の１つをいう（例えば、核酸は全身投与されない）。例えば、インサイチュ送達法としては、限定されないが、核酸を直接、部位（例えば、組織内、例えば、腫瘍または心筋内）に注射すること、核酸を細胞（１つもしくは複数）または組織と開放手術野により接触させること、または核酸を部位に、医療用アクセスデバイス、例えばカテーテルを用いて送達することが挙げられる。
【００８３】
本明細書で用いる場合、用語「単離された」とは、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片が自然状態で通常、会合している細胞性およびその他の構成成分から分離された状態を意味する。例えば、ポリヌクレオチドに関して、単離されたポリヌクレオチドは、染色体内で通常、会合している５’および３’の配列から分離されているものである。当業者には明白であるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片は、その天然に存在する対応物と区別するための「単離」を必要としない。
【００８４】
本明細書で用いる場合、「標的細胞」または「レシピエント細胞」は、個々の細胞あるいは外来性核酸分子、ポリヌクレオチドおよび／またはタンパク質のレシピエントになること、またはレシピエントであることが所望される細胞をいう。また、この用語は、単一細胞の子孫も包含していることを意図しており、子孫は、天然の偶発的な、または意図的な変異のため必ずしも本来の親細胞と（形態構造またはゲノムもしくは全ＤＮＡの相補鎖が）完全に同一でない場合があり得る。標的細胞は、他の細胞と接触していてもよく（例えば、組織の場合のように）、生物体の体内に循環状態で見出されるものであってもよい。
【００８５】
本明細書で用いる場合、「被験体」は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物としては、限定されないが、ネズミ科、猿、ヒト、飼養動物、競技用動物および愛玩動物が挙げられる。他の好ましい実施形態では、「被験体」が齧歯類（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科（例えば、マウス）、イヌ科（例えば、イヌ）、ネコ科（例えば、ネコ）、ウマ科（例えば、ウマ）、霊長類、猿（例えば、サルもしくは類人猿）、サル（例えば、マーモセット、ヒヒ）、または類人猿（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）である。他の実施形態では、ヒトにおける治療有効性を実証するためのモデルとして慣用的に使用される非ヒト哺乳動物、特に哺乳動物（例えば、ネズミ科、霊長類、ぶた、イヌ科またはウサギの動物）が使用され得る。
【００８６】
本明細書で用いる場合、用語「薬学的に許容され得る担体」は、任意の標準的な医薬用担体、例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水およびエマルジョン、例えば、油／水型または水／油型エマルジョン、ならびに種々の型の湿潤剤を包含している。また、組成物に安定剤および保存料を含めてもよい。担体、安定剤およびアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１５ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））を参照のこと。
【００８７】
細胞は、外来性核酸または異種核酸が細胞内部に導入されている場合、かかる核酸によって「形質転換」、「形質導入」または「トランスフェクト」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれる（共有結合される）場合もあり、そうでない場合もあり得る。例えば原核生物、酵母および哺乳動物細胞では、形質転換ＤＮＡは、エピソームエレメント、例えばプラスミドに維持され得る。真核生物細胞において、安定的に形質転換された細胞とは、形質転換ＤＮＡが染色体内に組み込まれて、染色体の複製によって娘細胞に受け継がれるようになったものである。この安定性は、真核生物細胞が、形質転換ＤＮＡを含む娘細胞集団で構成された細胞株またはクローンを確立する能力によって実証される。「クローン」は、単一細胞または共通の祖先からの有糸分裂により派生した細胞集団である。「細胞株」は、インビトロで多世代（例えば、少なくとも約１０世代）にわたって安定な増殖能を有する一次細胞のクローンである。
【００８８】
本明細書で用いる場合、「有効量」は、有益な結果または所望の結果がもたらされるのに充分な量、例えば、核酸の移入および／または発現、および／または所望の治療エンドポイントの獲得などの有効量である。有効量は１回以上の投与、適用または投薬量で投与され得る。一態様において、核酸送達ベクターの有効量は、少なくとも２つの細胞を含む細胞集団内の少なくとも１つの細胞が形質転換／形質導入／トランスフェクトされるのに充分な量である。
【００８９】
本明細書で用いる場合、「治療有効量」は、本明細書で用いる場合、異常な生理学的応答が抑制、修正および／または正常化されるのに充分な量を意味する。一態様において、「治療有効量」は、病態の臨床的に有意な特徴、例えば病態の臨床的に有意な特徴など、例えば、抗体産生、サイトカイン生成、発熱もしくは白血球数、またはヒスタミンレベルなどが少なくとも約３０パーセント、より好ましくは少なくとも５０パーセント、最も好ましくは少なくとも９０パーセント低減されるのに充分な量である。
【００９０】
本明細書で用いる場合、用語「予防する（“ｐｒｅｖｅｎｔ”または“ｐｒｅｖｅｎｔｓ”）は、アレルギー免疫療法、アレルギーの治療、またはアレルギー患者のために設計された介入を示す他の用語との関連において、全患者の少なくとも２０％におけるＩｇＥ応答の予防を意味する。用語「予防する」は、全患者におけるＩｇＥ媒介性疾患の発症の完全な予防を意味するものではない。完全な予防を意味するという定義は、アレルギー症状を低減させる機構によってアレルギーを治療する本発明の範囲外であり、当該技術分野における「予防する」の用法とは一致しない。アレルギー免疫療法の当業者には、アレルギーの治療が患者の１００％において１００％有効ではないことはよく知られており、そのため、「予防する」の絶対的定義は本発明の状況には当てはまらない。当該技術分野で認識されている予防の概念は本発明に想定される。
【００９１】
用語「口粘膜投与」は、活性成分の局所効果または全身性効果を得るために、投薬形態を舌下または口腔内の他の箇所に置いて活性成分が患者の口腔または咽頭の粘膜と接触することを可能にする投与経路をいう。口粘膜投与経路の一例は舌下投与である。用語「舌下投与」は、活性成分の局所効果または全身性効果を得るために、投薬形態を舌の下部に置く投与経路をいう。本明細書で用いる場合、用語「皮内送達」は、皮膚の真皮へのワクチンの送達を意味する。しかしながら、ワクチンは必ずしも真皮内の排他的に位置されるのではない。真皮は、ヒトの皮膚の表面から約１．０〜約２．０ｍｍの間に位置する皮膚内の層であるが、個体間および異なる身体部において、ある一定量のばらつきがみられる。一般に、皮膚表面の１．５ｍｍ下まで達することにより真皮に到達すると予測され得る。真皮は、表面の角質層および表皮と下方の皮下層との間に位置している。送達様式に応じて、ワクチンは最終的に主として真皮内のみに位置し得るか、または最終的に表皮および真皮内に分布し得る。
【００９２】
「抗体」は、特異的エピトープに結合する任意の免疫グロブリン、例えば抗体およびその断片である。この用語は、ポリクローナル、モノクローナルおよびキメラ抗体（例えば、二重特異性抗体）を包含している。「抗体の結合部位」は、抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖の可変領域と超可変領域で構成された抗体分子の構造部分である。例示的な抗体分子はインタクトな免疫グロブリン分子、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子、およびパラトープを含んでいる免疫グロブリン分子の一部分、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）部分であり、この部分は、本明細書における治療方法での使用に好ましい。
【００９３】
「エピトープ」は、通常、短いペプチド配列またはオリゴ糖鎖で構成されており、免疫系の成分によって特異的に認識されるか、または特異的に結合される構造部である。Ｔ細胞エピトープは一般的に線状オリゴペプチドであることが示されている。２つのエピトープは、同じ抗体に特異的に結合され得る場合、互いに対応する。２つのエピトープは、どちらも同じＢ細胞受容体または同じＴ細胞受容体に対する結合能を有し、一方の抗体のそのエピトープに対する結合が他方のエピトープによる結合を実質的に抑制する（例えば、他方のエピトープの約３０％未満、好ましくは約２０％未満、より好ましくは約１０％、５％、１％または約０．１％未満が結合する）場合、互いに対応する。本発明において、複数種のアレルゲンＸを合わせてアレルゲンＸ抗原を構成してもよい（例えば、配列番号：１１、２１、２７、１０９および１１０参照）。
【００９４】
用語「抗原物質」は、本明細書で用いる場合、自然免疫応答または適応免疫応答を惹起する任意の物質を包含している。
【００９５】
用語「抗原提示細胞」は、本明細書で用いる場合、主要組織適合複合体分子またはその一部分あるいはまた１種類以上の非古典的ＭＨＣ分子またはその一部分との会合状態で抗原を表面上に提示する任意の細胞を包含している。好適なＡＰＣの例は以下に詳細に論考しており、限定されないが、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、ハイブリッドＡＰＣおよびフォスター（ｆｏｓｔｅｒ）抗原提示細胞などの全細胞が挙げられる。
【００９６】
本明細書で用いる場合、「改変操作された抗原提示細胞」は、表面上に非天然分子の部分を有する抗原提示細胞をいう。例えば、かかる細胞は、表面上に天然状態で共刺激分子を有していないものであり得るか、または表面上に天然の共刺激分子に加えて人工のさらなる共刺激分子を有するものであり得るか、または表面上に非天然のクラスＩＩ分子を発現するものであり得る。好ましい実施形態では、改変操作された抗原提示細胞は、表面上に１種類以上のアレルゲンＸを有するものである。
【００９７】
本明細書で用いる場合、「免疫エフェクター細胞」は、抗原結合能を有しており、免疫応答を媒介する細胞をいう。このような細胞としては、限定されないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞ならびに細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、例えば、ＣＴＬ株、ＣＴＬクローンおよび腫瘍、炎症または他の浸潤物由来のＣＴＬが挙げられる。
【００９８】
「単離された」または「精製された」細胞集団は、自然状態では会合している細胞および物質を実質的に含有していないものである。実質的に含有していない、または実質的に精製されたＡＰＣにより、集団の少なくとも５０％がＡＰＣであること、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％が、自然状態では会合している非ＡＰＣ細胞を本質的に含有していないことを意図する。
【００９９】
本明細書で用いる場合、「遺伝子修飾」は、細胞の正常なヌクレオチドに対する任意の付加、欠失または破壊をいう。ＡＰＣの遺伝子修飾が行われ得る任意の方法が本発明の趣旨および範囲に含まれる。当該技術分野で認識されている方法としては、ウイルス媒介性遺伝子移入、リポソーム媒介性移入、形質転換、トランスフェクションおよび形質導入、例えば、ウイルス媒介性遺伝子移入、例えばＤＮＡウイルス、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルスベースのベクターならびにレトロウイルスベースのベクターの使用が挙げられる。
【０１００】
本発明の実施には、特に記載のない限り、当該技術分野の技能の範囲内の慣用的な分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡの手法が使用される。かかる手法は文献に充分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｉ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編，１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
【０１０１】
アレルゲンＸ抗原の配列
本発明により、アレルゲンＸに指向されるポリ核酸、ポリアミノ酸、宿主細胞、ベクターおよびかかるポリ核酸、ポリアミノ酸、宿主細胞またはベクターを必要とする、被験体の治療方法を提供する。大まかに言うと、ポリ核酸は、ポリ核酸の投与対象である被験体の体内で防御免疫応答を惹起するアレルゲン配列（ポリアミノ酸）の細胞内生成のための核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）ワクチンであると考えられたい。ポリ核酸は、投与されると、ＩｇＥ抗体の産生、顆粒球（例えば、好酸球）および他の物質を伴うＴｈ２−型応答ではなく、ＭＨＣ−ＩＩ経路ならびにＡＰＣ、ＮＫ細胞およびＴ細胞によるインターフェロンの生成を伴うアレルゲン特異的Ｔ−ヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞応答の活性化によるＩｇＧ抗体の産生による細胞媒介性免疫応答を優先的に誘起する。ある程度までは、ＭＨＣ−ＩＩおよびＭＨＣ−Ｉの両方の応答が生じ得る；しかしながら、本発明では、主として、または実質的にＭＨＣ−ＩＩ応答である応答がもたらされる。好ましくは、核酸は抗生物質耐性遺伝子をコードしていない。
【０１０２】
本発明は、少なくとも一部において、ある特定の構造的要素、したがって機能的要素の組合せにより、核酸ワクチンおよびコードされたアレルゲンにとって好都合な特性がもたらされ、当該技術分野でまだ対処されていない必要性を満たすアレルギーの治療方法が可能になるという認識に基づいている。本発明の種々の実施形態（これらは、独立した実施形態として、および独立した実施形態の２つ以上の特徴を兼ね備えた実施形態として単独で成立すると理解されることを意図している）において、組合せとしては、アレルゲンＸをリソソームにＭＨＣ  ＩＩタンパク質とともに指向するためのリソソームトラフィッキングドメインの使用が挙げられる。そのようにすることにより、アレルゲンＸに対してＩｇＥ応答ではなくＩｇＧ応答が優勢になることが可能になる。またさらには、独立した実施形態または実施形態の組合せにより、エピトープの天然に存在する三次元構造をもたらすアミノ酸配列をコードするのに充分な長さの核酸配列（例えば、完全長核酸配列またはその断片、完全長核酸配列のバリアントまたはその断片など）を含む構築物がもたらされる。好ましい実施形態では、核酸配列はアレルゲンＸ（配列番号：Ｙ）をコードしている。他の実施形態では、核酸配列は、少なくとも１種類のアレルゲンＸをコードしている。当該技術分野では免疫応答はエピトープの一次配列に対して生じ得ると認識されているが、本発明の認識では、コードされたエピトープに対するＭＨＣ−ＩＩ免疫応答の発生のための核酸ワクチンには、好ましくは、少なくともアレルゲンＸがプロセッシングのためにリソソームに送達されたときに、アレルゲンＸを含む領域において正しい三次元ペプチド構造がもたらされるのに充分な配列データをコードしている核酸構築物を使用する。なんら特定の分子論に限定されないが、適正に三次元にフォールディングされたタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドがエンドソームに送達されることにより、免疫応答のためのアレルゲンエピトープのプロセッシングおよび提示が改善されると考えられる。
【０１０３】
したがって、本発明により、アレルゲンＸとポリペプチドの内腔側配列とを含むキメラであって、内腔側配列が、抗原プロセッシングおよびＭＨＣ  ＩＩとの抗原エピトープの会合のためにエンドソーム／リソソーム区画へのキメラのトラフィッキングをもたらすものであるキメラを提供する。一態様において、キメラタンパク質は、キメラをエンドソーム／リソソーム区画に指向する細胞質標的化配列をさらに含む。さらに、キメラタンパク質は、シグナル配列および／または膜貫通配列もまた含むものであってもよい。好適なトラフィッキングドメインは、以下に論考するように、ＬＡＭＰ−１、ＬＡＭＰ−２、ＤＣ−ＬＡＭＰ、Ｔｒｐ−１、ＤＥＣ−２０５、ｇｐ２００−ＭＲ６および他のポリペプチドから供給されるものである。シグナル配列および膜貫通配列は、これらのポリペプチドに由来するものであり得るが、そうでなくてもよい。しかしながら、一態様では、抗原／ＬＡＭＰキメラは完全長ＬＡＭＰポリペプチドを含むものである。
【０１０４】
アレルゲンＸは、キメラタンパク質を生成させるために使用され得る。一態様において、好ましい組成物は、表１に示す配列番号：Ｙのいずれか１つのアレルゲンＸのアミノ酸配列または配列番号：Ｙのいずれか１つをコードしているポリヌクレオチドを含む。アレルゲンＸをコードするものであり得るポリヌクレオチドの好ましい代表例を配列番号：Ｚとして表１に示す。さらなる好ましい代表的な実施形態は、アレルゲンＸを、ヒト、ネズミ科またはイヌ科のいずれかのＬＡＭＰ配列とともに含む構築物である（例えば、配列番号：Ｗおよび配列番号：Ｖ参照）。本実施例の表３に示すように、驚くべきことに、配列番号：Ｙに対応する特定のアレルゲンＸのアミノ酸配列を含むキメラＬＡＭＰワクチンでは、試験した他の構築物と比べて予期しないロバストな免疫応答が生じることがわかった。
【０１０５】
アレルゲンＸにはアレルゲンＸのバリアントもまた包含され得る。例えば、好ましい実施形態は、配列番号：Ｙと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するアレルゲンＸポリペプチドバリアントを含む。このようなバリアントは、（ａ）アレルゲンＸと交差反応する抗体を生じさせる能力（ここで、抗体はアレルゲンＸにより誘導されたものである）、および／または（ｂ）アレルゲンＸの生物学的活性のいずれかを保持している。このようなポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが具体的に想定される。
【０１０６】
合成のアレルゲンＸ抗原および改変されたアレルゲンＸ抗原もまた、本明細書に記載の方法において使用され得る。合成の抗原アレルゲンＸペプチドエピトープは、天然のアレルゲンＸの配列と比べて修飾されたアミノ酸配列を有する。さらに、用語「合成のアレルゲンＸ抗原ペプチド」には、任意選択で介在アミノ酸配列を含む合成の抗原アレルゲンＸペプチド多量体（コンカテマー）が包含される。例えば、本発明の合成のアレルゲンＸ抗原ペプチドエピトープは、抗原アレルゲンＸペプチドエピトープの既知のアミノ酸配列に基づいて設計され得る。
【０１０７】
また、翻訳中または翻訳後、例えばリン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質分解性切断、抗体分子、膜分子または他のリガンドとの連結によって差次的に修飾された抗原アレルゲンＸペプチドも本発明の範囲に含まれる（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：２８５−３２０，１９９８）。
【０１０８】
単離されたアレルゲンＸペプチドは、適切な固相合成手順を用いて合成され得る（Ｓｔｅｗａｒｄ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｆｒｅｅｍａｎｔｌｅ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．１９６８）。好ましい方法の１つはメリフィールド法である（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒｅｓ．２３：４５１，１９６７）。このようなペプチドのアレルゲンＸ抗原活性は、例えば本明細書に記載のアッセイを用いて簡便に試験され得る。
【０１０９】
単離されたアレルゲンＸペプチドが得られたら、これは、標準的な方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティおよびサイズ排除（ｓｉｚｉｎｇ）カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差によって、またはタンパク質精製のための任意の他の標準的な手法によって精製され得る。イムノアフィニティクロマトグラフィーでは、アレルゲンＸエピトープは、これを、ペプチドまたは関連ペプチドに対して生じさせて固定支持体に固定した抗体を含むアフィニティカラムに結合させることにより単離され得る。あるいはまた、親和性タグ、例えばヘキサ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、マルトース結合ドメイン（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、インフルエンザ外被配列（Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：５０８−５０９，１９９１）およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをペプチドに結合し、適切なアフィニティカラムに通すことによる容易な精製が可能となるようにしてもよい。また、単離されたアレルゲンＸペプチドを、タンパク質分解、核磁気共鳴およびｘ線結晶学などの手法を用いて物理的特性評価してもよい。
【０１１０】
所望のエピトープのアレルゲンＸペプチド配列を単離して同定したら、このエピトープをコードする配列を含む核酸が容易に配列決定され得る。
【０１１１】
エンドサイトーシストラフィッキング配列
入手可能なデータにより、ＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞内輸送において以下のシーケンスの事象が示唆される：ＭＨＣクラスＩＩ分子とインバリアント鎖が小胞体内で会合し、ゴルジ体を経て、他の膜タンパク質、例えばＭＨＣクラスＩとともに輸送される。分子は次いで、未知の機構によって特定のエンドソーム／リソソーム細胞小器官に標的化され、構成的経路に従うＭＨＣクラスＩ分子から分離されて細胞表面に向かう。エンドサイトーシス／リソソーム経路では、インバリアント鎖はＭＨＣクラスＩＩから、酸性環境で作用するプロテアーゼによって除去される。同時に、このようなプロテアーゼによって、エンドサイトーシス／リソソーム経路に進入したタンパク質の抗原断片が生成し、生じたペプチドがクラスＩＩ分子に結合し、細胞表面へと運ばれる。
【０１１２】
リソソーム／エンドソーム区画内に存在する加水分解酵素の生合成および液胞標的化機構は広く研究されている（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｅｌｌｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：４８３，１９８９）。ゴルジ装置内で新たに合成されるヒドロラーゼは、マンノース６−リン酸受容体に対するこの酵素の結合の特異的認識マーカーとしての機能を果たすマンノース６−リン酸基を獲得し、次いでこれは、なんらかの未知の様式でプレリソソーム液胞に標的化される。そこで、受容体−酵素複合体が低ｐＨによって解離し、受容体がゴルジ装置に再利用されるとともに、酵素含有液胞はリソソームに成熟する。
【０１１３】
リソソーム膜糖タンパク質の局在は、加水分解性リソソーム酵素について明確に定義されたマンノース６−リン酸受容体（ＭＰＲ）経路とは独立した標的化機構によって制御される（Ｋｏｒｎｆｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｅｌｌｍａｎ，１９８９（上掲））。最近の研究により、リソソーム特性を有し、高濃度のリソソーム結合膜タンパク質（ＬＡＭＰ−１）およびＭＨＣクラスＩＩ分子を特徴とする別個の小胞区画が報告されている（Ｐｅｔｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．９：３４９７，１９９０）。新たに合成されるＬＡＭＰ−１および他の同様のタンパク質の細胞内輸送および標的化のリソソーム／エンドソーム区画の速度論解析により、分子が小胞体内で合成され、ゴルジ偏平嚢内でプロセッシングされ、形質膜への検出可能な蓄積なしに、その生合成の１時間以内にリソソームに輸送されることが示されている（Ｂａｒｒｉｏｃａｎａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１５：２６１（３５）：１６７５５−６３，１９８６；Ｄ’Ｓｏｕｓａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５２２，１９８６；Ｇｒｅｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０５：１２２７，１９８７）。
【０１１４】
リソソーム膜の構造および機能の研究は１９８１年に、Ａｕｇｕｓｔおよび共同研究者らによって開始され、主要な細胞糖タンパク質が発見され、これは、リソソーム膜に主に局在していることから、後にリソソーム結合膜タンパク質１および２（ＬＡＭＰ−１およびＬＡＭＰ−２）と称された（Ｈｕｇｈｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：６６４，１９８１；Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０１：８５，１９８５）。その後、同様のタンパク質がラット、ニワトリおよびヒト細胞においても同定された（Ｂａｒｒｉｏｃａｎａｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９８６（上掲）；Ｌｅｗｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１００：１８３９，１９８５；Ｆａｍｂｏｕｒｇｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０６：６１，１９８８；Ｍａｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２６８：３６０，１９８９）。
【０１１５】
典型的には、ＬＡＭＰ−１は、ｃＤＮＡクローンから推測すると（Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：８７５４，１９８８）、大型の（３４６残基）内腔側アミノ末端ドメインに続いて２４残基の疎水性膜貫通領域および短い（１２残基）カルボキシル末端細胞質尾部を有する約３８２個のアミノ酸のポリペプチドコアからなる。図２および３を参照のこと。内腔側ドメインは高度にグリコシル化されており（約２０個のアスパラギン結合複合体型オリゴ糖で置換）、プロリン／セリンリッチ領域によって隔てられた２〜約１６０残基の相同性単位からなる。このような相同ドメインの各々は、ジスルフィド結合されて内腔側ドメインの２つの半部内に対称的に配置された４つの３６〜３８残基のループを形成している一定間隔をあけた４つのシステイン残基を含む（Ａｒｔｅｒｂｕｒｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：７４１９，１９９０；また、Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５：２６３（１８）：８７５４−８，１９８８も参照のこと）。ＬＡＭＰ−２分子は、アミノ酸配列全体ではＬＡＭＰ−１と非常に類似している（Ｃｈａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：５００８，１９９０）。
【０１１６】
ＬＡＭＰ−１およびＬＡＭＰ−２は抗原提示細胞（樹状細胞）には具体的に見出されない。これらの厳密な機能は不明であるが、おそらく、なんらかの様式でリソソーム機能に関与している。これらがＭＨＣ  ＩＩとＡＰＣの多層ＭＩＩＣ小胞区画内に共局在することは、抗原のプロセッシングまたは提示との既知の機能的関連性は有していない；しかしながら、ＬＡＭＰ細胞質ドメインを含むキメラ抗原は、上記に論考したように、増強された免疫原性を示す（米国特許第５，６３３，２３４号参照）。
【０１１７】
本発明により、リソソーム結合膜タンパク質、例えばＬＡＭＰポリペプチドの内腔側ドメイン、またはその生物活性断片もしくは修飾形態（集合的に「ＬＡＭＰ−内腔側ドメイン」と称する）を含むキメラアレルゲンＸタンパク質を提供する。一態様において、ＬＡＭＰ内腔側ドメインは少なくとも２つの相同性単位を含む。好ましくは、各相同性単位は、プロリン／セリンリッチ領域によって隔てられている。より好ましくは、各相同性ドメインは、ジスルフィド結合されて一体になると、内腔側ドメインの２つの半部内に対称的に配置された４つの３６〜３８残基のループを形成し得る４つのシステイン残基を含む。最も好ましくは、内腔側ドメインは、（例えば、化学結合によって）ドメインに連結されているポリペプチドを、ＭＨＣクラスＩＩ分子との結合のためにエンドソーム／リソソーム区画もしくはリソソーム関連細胞小器官に、または別の区画／細胞小器官に送達して、そこでＭＨＣクラスＩＩ分子と結合させるために標的化してトラフィッキングするのに必要な配列を含む。
【０１１８】
好ましい一実施形態では、本発明において使用され得るＬＡＭＰ−１の内腔側ドメインの部分としては、限定されないが、配列番号：２もしくは３、または配列番号：４のアミノ酸２９〜３８１（あるいは配列番号：５の対応配列）が挙げられる。さらなる好ましい実施形態では、ＬＡＭＰ−１の膜貫通ドメイン／細胞質尾部が本発明において使用され得る。例えば、配列番号：１、または番号：４のアミノ酸配列３８２〜４１７（あるいは配列番号：５の対応配列）が、本明細書に記載のキメラワクチンに使用され得る。さらに、内腔側ドメインの断片と膜貫通ドメイン／細胞質尾部の断片の任意の組合せが使用され得る。
【０１１９】
別の態様では、キメラタンパク質は付加的または択一的に、少なくとも１つのロイシン−ロイシンペアまたは少なくとも１つのロイシン／イソロイシンペアを含むジロイシンベースシグナルを含む。好ましくは、タンパク質は、ペアの４〜５残基上流に酸性残基をさらに含む。より好ましくは、このシグナルドメインはＡＰ複合体ポリペプチドに結合する（例えば、Ｂｏｎａｆａｃｉｎｏ  ａｎｄ  Ｄｅｌｌ’Ａｎｇｅｌｉｃａ，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４５：９２３−９２６，１９９９参照）。好適なジロイシンベースドメインは、例えば、チロシナーゼ（ＴＭ−Ｘ１０−ＥＫＱＰＬＬ−Ｘ５−ＹＨＳＬ−Ｘ５）（配列番号：９７）；ＴＲＰ−２（ＴＭ−Ｘ７−ＥＡＮＱＰＬＬ−Ｘ１２）（配列番号：９８）；ならびにＰｍｅｌ７（ＴＭ−Ｘ３４−ＥＮＳＰＬＬ−Ｘ５）（配列番号：９９）およびＰ−タンパク質（例えば、Ｄｅｌｌ’Ａｎｇｅｌｉｃａ，２０００（上掲）参照）にみられ得るものである。
【０１２０】
好ましい一態様において、キメラタンパク質はまた、キメラアレルゲンＸタンパク質をエンドソーム／リソソーム区画またはリソソーム関連細胞小器官に標的化および／またはトラフィッキングするための細胞質ドメインも含む。一態様において、細胞質ドメインはＬＡＭＰポリペプチドの尾部を含む。ＬＡＭＰ−１および他の同様のリソソーム膜糖タンパク質の細胞質尾部の１１個のアミノ酸の配列は以下の配列：Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−ＣＯＯＨを有する（Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８（上掲））（配列番号：１の残基２５〜３５）。ＬＡＭＰ−１では、この配列は完全長ポリペプチドのアミノ酸３７２〜３８２である。
【０１２１】
リソソーム膜タンパク質ＬＡＭＰ−１（Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８（上掲））、ＬＡＭＰ−２（Ｃｈａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０（上掲））およびＣＤ６３（Ｈｏｔｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４８：２９５５，１９８８）の既知の細胞質尾部の配列を、ＬＡＰ（Ｐｏｈｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：２３４３，１９８８）の細胞質尾部のＴｙｒ含有インターナリゼーションシグナルと表２においてアラインメントしている。Ｔｙｒ残基はエンドソーム／リソソーム標的化に必要とされることがわかっており、米国特許第５，６３３，２３４号において、他の分子をリソソームに標的化するのに必要とされる完全な配列は、Ｔｙｒに続いて２つのアミノ酸、その後に疎水性残基が続くＴｙｒ−Ｘ−Ｘ−ｈｙｄ配列（すなわち、「Ｔｙｒモチーフ」）を必要とすることが実証された。
【０１２２】
【表２】
2019537447.tif 000004
【０１２３】
カルボキシル末端の位置またはその付近における疎水性残基の重要性は、ＬＡＭＰ−１のＴｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ配列（配列番号：１の残基３２〜３５）の修飾によって得られた結果によって示される。Ｉｌｅが他の２つの疎水性残基ＬｅｕまたはＰｈｅおよび極性残基Ｔｈｒで置換された変異型ｃＤＮＡ分子が作製された。Ｌｅｕでの置換（Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ）（配列番号：１０３）およびＰｈｅでの置換（Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ）（配列番号：１０４）はリソソーム標的化に影響しないが、Ｔｈｒ含有変異型タンパク質（Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ）（配列番号：１０５）は細胞表面に蓄積される。Ｇｌｎの代わりにＡｌａを含む変異型（Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ）（配列番号：１０６）、Ｔｈｒの代わりにＡｌａを含む変異型（Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｉｌｅ）（配列番号：１０７）および両残基の代わりにＡｌａを含む変異型（Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｉｌｅ）（配列番号：１０８）は、リソソーム膜への標的化に対して効果を有さず、これらの位置は荷電残基に占有されていても、極性残基に占有されていても、無極性残基に占有されていてもよいことを示す。
【０１２４】
したがって、リソソーム／エンドソーム区画への好ましい標的化シグナルは、細胞質ドメイン内、膜貫通ドメイン付近、またＣ末端付近にも位置するテトラペプチド配列を含む。細胞質ドメインは好ましくは、遊離カルボキシル基で終結する短いアミノ酸配列（７０個未満のアミノ酸、好ましくは３０個未満のアミノ酸、最も好ましくは２０個未満のアミノ酸）である。より好ましい一実施形態では、テトラペプチドは、標的化シグナルを含む短い細胞質尾部のＣ末端に存在するか、またはＬＡＭＰ−１と同様の状況で存在する。
【０１２５】
テトラペプチドの好適な４個のアミノ酸の配列はアミノ酸置換によって得られ得るが、モチーフがＴｙｒ−Ｘ−Ｘ−Ｈｙｄ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸であり得、Ｈｙｄは疎水性アミノ酸を表す）からなり、リソソーム／エンドソーム標的化を付与する能力が保存されている場合に限る。特に好ましいテトラペプチドの一例は、配列Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ（配列番号：１の残基３２〜３５）を有するものである。最も好ましい実施形態では、膜貫通ドメイン、最も好ましくは内腔側ドメインと併せたＬＡＭＰの細胞質尾部全体が、高度に効率的なＭＨＣクラスＩＩのプロセッシングおよび提示のために抗原ドメインの一次配列にカップリングされる。しかしながら、細胞質ドメインは、ＬＡＭＰポリペプチドの内腔側ドメインを備えている限り、トラフィッキングを助長するために必要でない。
【０１２６】
別の態様では、エンドソーム標的化ドメインは膜貫通配列を含む。特定の免疫賦活構築物の抗原ドメインの供給源としての機能を果たす多くのタンパク質は、その一次配列に膜貫通ドメインを含む表面抗原である。かかる膜貫通ドメインは保持され、細胞質ドメインは、本明細書に教示しているようなリソソーム／エンドソーム標的化ドメイン（例えば、ＬＡＭＰ内腔側ドメインを含むドメイン）で置き換えられ得る。
【０１２７】
好ましい一態様では、ＬＡＭＰの膜貫通ドメイン（Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：８７５４，１９８８参照）が、アレルゲンＸ由来ポリペプチドの一次配列および内腔側ドメインの配列にカップリングされる。ポリペプチドの膜貫通ドメインの構造は当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｂａｎｇｈａｍ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７４：１４２，１９８８；Ｋｌｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ８１５：４６８，１９８５；Ｋｙｌｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５，１９８２参照）。通常、膜貫通領域は、一次配列において、親水性領域にフランキングされた２０〜２５個の疎水性アミノ酸残基の配列としてみられる。かかる配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋのリストにあるほとんどの細胞表面抗原の配列ならびに他の多くの膜タンパク質においてみられ得る。具体的な膜貫通配列は、これが抗原ドメインを内腔側ドメインと細胞質尾部に連結する機能を果たし、膜性区画内の構築物をアンカーリングする限り、重要でない。
【０１２８】
付加的または択一的なソーティングモチーフとしては、限定されないが：標的化ドメイン、上記のチロシンモチーフドメイン；ジロイシンおよびチロシンベースのドメイン；プロリンリッチドメイン；ならびにＳ−Ｖ−Ｖドメイン（例えば、Ｂｌｏｔｔ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｉｔｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ３：１２２−１３１，２００２参照）のうちの１つ以上が挙げられ得る。
【０１２９】
エンドサイトーシス受容体の配列
抗原提示細胞、例えば樹状細胞のＭＨＣ  ＩＩ小胞区画への抗原の到達は通常、外来抗原のエンドサイトーシスによるものである。クラスＩＩ  ＭＨＣ分子との会合およびその後のプロセッシングのためにアレルゲンＸをエンドソーム／リソソーム区画またはリソソーム関連細胞小器官に運ぶためのキメラポリペプチドの作製には、エンドサイトーシス受容体のトラフィッキングドメインが使用され得る。
【０１３０】
したがって、一態様において、本発明により、（例えば、トラフィッキングドメインと抗原をコードしている核酸配列のインフレーム融合によって）エンドサイトーシス受容体のトラフィッキングドメインに連結された少なくとも１種類のアレルゲンＸを提供する。トラフィッキングドメインはアレルゲンＸをエンドソーム／リソソーム区画またはリソソーム関連細胞小器官に、区画／細胞小器官内またはアレルゲンＸが送達される次の区画内でのＭＨＣクラスＩＩ分子との会合ために局在させる。
【０１３１】
本発明によるエンドサイトーシス受容体としては、限定されないが、微生物に対する受容体、Ｆｃ受容体（例えば、ＣＤ６４、ＣＤ３２、ＣＤ１６、ＣＤ２３およびＣＤ８９）；補体受容体（例えば、ＣＲ１もしくはＣＤ３５、ＣＲ３、ＣＲ４）；スカベンジャー受容体またはアセチル化型もしくは修飾型のリポタンパク質、ポリリボヌクレオチド、リポ多糖およびシリカ粒子に結合する受容体（例えば、ＳＲＡ、ＭＡＲＣＯなど）、インテグリン（ＣＤ４９ｅ／ＣＤ２９；ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９；ＣＤ５１／ＣＤ６１）；レクチン（例えば、デクチン−１、Ｃ型レクチンなどなど）、ならびにＴｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ）が挙げられる。かかる受容体の概説については、例えば、Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ  ａｎｄ  Ｏｚｉｎｓｋｙ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：８２５−５２，２００２を参照のこと。
【０１３２】
一態様において、エンドサイトーシス受容体は専門的抗原提示細胞、例えば樹状細胞から得られるものである。樹状細胞のいくつかのエンドサイトーシス受容体、例えばマクロファージマンノース受容体（ＭＭＲ）、ホスホリパーゼＡ２−受容体、Ｅｎｄｏ  １８０およびＤＥＣ−２０５ならびにそのヒトホモログｇｐ２００−ＭＲ６（ＭｃＫａｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８）が同定されている。少なくとも、ＤＥＣ−２０５が抗原物質をＬＡＭＰおよびＭＨＣ  ＩＩが共局在しているエンドソーム／リソソーム区画に標的化するのに対して、ＭＭＲはＬＡＭＰおよびＭＨＣ  ＩＩがない末梢エンドソームにみられるという点で、ＤＥＣ−２０５はＭＭＲとは異なっていると報告されている（Ｍａｈｎｋｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５１（３）：６７３−６８４，２０００）。
【０１３３】
また、ＤＥＣ−２０５は、ＭＭＲによるものと比べて、エンドサイトーシスを受けた抗原のＣＤ４＋  Ｔ細胞への提示の大きな増強を示す。この２つの分子間のトラフィッキングおよびＭＨＣ  ＩＩへの抗原送達におけるこの違いは、被覆ピット取込み配列に加えて、ＤＥＣ−２０５のサイトゾル尾部におけるＭＭＲにはないＥＤＥ三残基の存在に起因していると報告されている。ＥＤＥ配列を含むサイトゾル尾部の遠位部分は、ＬＡＭＰおよびＭＨＣ  ＩＩを含むより深部のエンドソーム／リソソーム区画への標的化に必要とされることが示され、ＥＤＥはＡＡＡ配列で置き換えることができなかった。また、Ｍａｈｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００（上掲）により、このような細胞質尾部のトラフィッキングシグナルは、ＣＤ１６キメラをＭＨＣ  ＩＩ／ＬＡＭＰ部位にトラフィッキングして再利用するのに、および抗原提示の１００倍増大を媒介するのに充分であることも示されている。
【０１３４】
ＤＥＣ−２０５とｇｐ２００−ＭＲ６間の、特に細胞質ドメインにおける配列類似性により、この配列も同様に好適なトラフィッキング配列となる。さらに、ｇｐ２００−ＭＲ６は、ＩＬ−４の調節というさらなる重要な特性を有することが示されている。ＭｃＫａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８（１２）：４０７１−８３，１９９８により、ｇｐ２００−ＭＲ６のライゲーションによってＩＬ−４が模倣され、免疫系において抗増殖性成熟促進性の影響がもたらされ、Ｂリンパ球に対する共刺激分子の上方調節が引き起こされ得ることが示されている。
【０１３５】
しかしながら、ＬＡＭＰとのＤＥＣ−２０５融合体はエンドソーム区画へのトラフィッキングを行うのではなく、細胞表面に局在する。しかしながら、ＬＡＭＰドメインと少なくとも１種類のアレルゲンＸ、およびエンドサイトーシス受容体ドメイン、例えばＤＥＣ−２０５ドメインを併せ持つキメラタンパク質は、エンドソーム区画へのトラフィッキングを行うことができ、内在性ＬＡＭＰと共局在する。
【０１３６】
したがって、好ましい一態様において、本発明のキメラアレルゲンＸタンパク質は、リソソーム膜ポリペプチドの内腔側ドメイン（例えば、ＬＡＭＰ内腔側ドメインなど）とエンドサイトーシス受容体（例えば、ＤＥＣ−２０５またはｇｐ  ２００−ＭＲ６ポリペプチドなど）の標的化ドメインを含む。かかる構築物は、正しい標的化だけでなく、改善された抗原性も示し得る。さらなる一態様では、エンドサイトーシス受容体の標的化およびトラフィッキングの両方のドメインが少なくとも１種類のアレルゲンＸとともに提供される。キメラアレルゲンＸタンパク質は付加的または択一的に、エンドサイトーシス受容体の内腔側ドメインを含むものであり得る。なおさらなる一態様では、キメラタンパク質は、完全長のエンドサイトーシス受容体ポリペプチドを少なくとも１種類のアレルゲンＸとともに含むものであり得る。
【０１３７】
一態様において、エンドサイトーシス受容体の標的化ドメインは、ＤＥＣポリペプチドの３１個のアミノ酸の細胞質ドメインを含む（例えば、Ｍａｎｈｋｅ，ｅｔ  ａｌ．，２０００（上掲）参照）。別の態様では、標的化ドメインは、ＤＥＣ−２０５細胞質尾部の残基７〜９を含む。好ましくは、ドメインはＴｙｒモチーフを含む。より好ましくは、標的化ドメインはまた、ＤＥＣ−２０５細胞質尾部の残基１８〜２７も含む。さらなる一態様では、標的化ドメインはＥＤＥドメインを含む。例えば、ＤＥＣ−２０５の配列はＫａｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４７（６）：４４２−５０，１９９８に示されており、一方、ｇｐ２００−ＭＲ６のものはＭｃＫａｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８（上掲）に示されている。
【０１３８】
キメラアレルゲンＸタンパク質はさらに、少なくとも１種類のアレルゲンＸをエンドソーム／リソソーム区画またはリソソーム関連細胞小器官に標的化するための細胞質標的化ドメイン（例えば、細胞質ＬＡＭＰドメインなど）ならびに上記の他のドメインのうちの１つ以上（例えば、シグナル配列、膜貫通配列など）を含むものであり得る。前述のように、付加的または択一的なソーティングモチーフとしては、限定されないが、Ｍ６Ｐドメイン；チロシンモチーフドメイン；ジロイシンおよびチロシンベースのドメイン；プロリンリッチドメイン；ならびにＳ−Ｖ−Ｖドメイン（例えば、Ｂｌｏｔｔ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｉｔｔｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ３：１２２−１３１，２００２参照）のうちの１つ以上が挙げられ得る。
【０１３９】
ワクチン組成物
いくつかの抗原は、新規なキメラワクチンを作製するためにＬＡＭＰと組み合わせることができるという仮説が立てられているが；実際には、試験すると、このようなワクチンは必ずしも奏功するとは限らない。
【０１４０】
したがって、本発明により、哺乳動物においてアレルゲンＸに対する免疫応答を惹起するためのワクチン組成物を提供する。組成物は、少なくとも１種類のアレルゲンＸ（配列番号：Ｙ）をコードしている配列を含むキメラＤＮＡセグメントを含むワクチンベクターを含む。好ましくは、ＤＮＡセグメントは、リソソーム結合膜ポリペプチド（例えば、ＬＡＭＰポリペプチド（例えば、配列番号：２、３、４もしくは５）あるいはそのホモログ、オーソログ、バリアントもしくは修飾形態など）の内腔側ドメインまたはエンドサイトーシス受容体のトラフィッキングドメインをコードしている配列をさらに含む。好ましくは、内腔側ドメインまたはトラフィッキングドメインは、抗原を細胞のエンドソーム／リソソーム区画またはリソソーム関連細胞小器官にトラフィッキングし、そこで、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するか、または別の区画／細胞小器官に送達されてそこで続いてＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するようにプロセッシングされる。より好ましくは、アレルゲンＸは、区画／細胞小器官（または送達される次の区画）内でプロセッシングされてアレルゲンＸエピトープが生成し、これが細胞の表面上に提示され、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合される。
【０１４１】
また、ベクターは、膜貫通ドメイン、タンパク質をエンドソーム／リソソーム区画またはリソソーム関連細胞小器官に指向するエンドソーム／リソソーム標的化シグナルを含む細胞質ドメイン、ならびにジロイシンドメイン、Ｔｙｒモチーフ、プロリンリッチドメインおよび／またはＳ−Ｖ−Ｖドメインのうちの１つ以上もコードしていてもよい。
【０１４２】
ドメインは、順々に備えていてもよく、リンカーポリペプチドをコードしている核酸または所望の機能を有する他のアミノ酸配列（例えば、タンパク質安定化配列など）をコードしている核酸によって隔てられていてもよい。一般的に、リンカー配列を含める場合、これは、約１〜約５０個のアミノ酸の範囲のリンカーポリペプチドをコードしているものである。ベクターの最小限の要件は、所望のトラフィッキング特性を有するキメラアレルゲンＸタンパク質をコードしていることである。かかる特性は、当該技術分野で常套的なアッセイを用いて容易に試験することができる。
【０１４３】
例えば、免疫蛍光顕微鏡法を使用し、アレルゲンＸキメラタンパク質の適切な区画／細胞小器官へのトラフィッキングを確認することができる。３５Ｓメチオニンパルスチェイスラベリング解析は、アレルゲンＸキメラタンパク質の合成および分解をモニタリングし、アレルゲンＸキメラタンパク質の合成速度に対する内在性アレルゲンＸタンパク質の合成速度が本質的に等しいこと、および／またはアレルゲンＸキメラタンパク質のプロセッシングが適正に行われていることを示すために使用され得る。
【０１４４】
特定の実施形態では、キメラＤＮＡセグメントにコードされたタンパク質が、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子と複合体形成するペプチドである少なくとも１種類のアレルゲンＸエピトープを含む内部内腔ドメイン、上記のエンドソーム／リソソームトラフィッキング配列、およびエンドソーム／リソソーム標的化配列を含む細胞質ドメインを含むものである。好ましくは、標的化配列はテトラペプチド配列Ｔｙｒ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘｂｂを含むものであり、ここで、Ｘｂｂは疎水性アミノ酸である。
【０１４５】
別の態様では、キメラＤＮＡセグメントにコードされたタンパク質が、膜結合型の抗原物質と非膜結合型の抗原物質の両方をエンドソーム／リソソーム区画に標的化およびトラフィッキングするための配列を含む完全長のリソソーム膜結合ポリペプチド、例えば、ＬＡＭＰポリペプチド、そのホモログ、オーソログ、バリアントまたは修飾形態を含む。
【０１４６】
好ましい実施形態では、キメラワクチンは、（ａ）表１に示す配列番号：Ｚまたは配列番号：Ｗのポリヌクレオチドのいずれか１つ；（ｂ）表１に示す配列番号：Ｚまたは配列番号：Ｗとして同定されるポリヌクレオチドのいずれか１つにコードされたポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；（ｃ）表１に示す配列番号：Ｙまたは配列番号：Ｖのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；（ｄ）内腔側ドメイン（例えば、配列番号：２もしくは３など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）、表１に示す配列番号：Ｙのうちの１つ以上、およびトラフィッキングドメイン（配列番号：１など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）をコードしているポリヌクレオチド；（ｅ）内腔側ドメイン（例えば、配列番号：２もしくは３など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）および表１に示す配列番号：Ｙのうちの１つ以上をコードしているポリヌクレオチド；（ｆ）表１に示す配列番号：Ｙのうちの１つ以上およびトラフィッキングドメイン（配列番号：１など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）をコードしているポリヌクレオチドあるいは（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドのいずれか１つと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性のポリヌクレオチドを含むものである。
【０１４７】
アレルゲンＸキメラタンパク質をコードしている配列のアセンブリング
キメラタンパク質の構築のための手順は当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１１：９５５，１９９０参照）。所望のセグメントをコードしているＤＮＡ配列は、容易に入手可能な組換えＤＮＡ材料、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１２３０１  Ｐａｒｋｌａｗｎ  Ｄｒｉｖｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．２０８５２，Ｕ．Ｓ．Ａ．から、または所望のＤＮＡを含むＤＮＡライブラリーから入手可能なものにより得ることができる。
【０１４８】
かかるＤＮＡセグメントは最低限：アレルゲンＸタンパク質の抗原ドメインと、リソソーム膜結合ポリペプチドの内腔側ドメイン（内腔側ドメインに連結されたポリペプチドのエンドソーム／リソソーム区画もしくはリソソーム関連細胞小器官へのトラフィッキングのためのもの）および／またはエンドサイトーシス受容体のトラフィッキングドメイン（エンドソーム／リソソーム区画およびまたはリソソーム関連細胞小器官へのトラフィッキングのためのもの）をコードしている配列を含む。さらなるＤＮＡセグメントは、限定されないが：キメラタンパク質をエンドソーム／リソソーム区画またはリソソーム関連細胞小器官に標的化するための細胞質標的化配列、膜貫通配列、シグナル配列、ジロイシン配列、Ｔｙｒモチーフ、プロリンリッチドメイン、Ｍ６Ｐ配列、Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ配列ならびにクローニング配列などをコードしている配列を含むものであり得る。
【０１４９】
所望のドメイン配列に対応するＤＮＡセグメントを次いで、適切な制御配列およびシグナル配列と、組換えＤＮＡ方法論の常套的な手順を用いて会合させる。例えば、米国特許第４，５９３，００２号およびＬａｎｇｆｏｒｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：３１９１，１９８６に記載のものを参照のこと。
【０１５０】
タンパク質またはポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列は化学合成してもよく、いくつかのアプローチのうちの１つによって単離してもよい。合成すべきＤＮＡ配列は、所望のアミノ酸配列に適切なコドンを用いて設計され得る。一般に、配列の発現のための使用が意図される宿主に対して好ましいコドンが選択される。完全な配列は、標準的な方法によって調製して完全なコード配列にアセンブリングした重複するオリゴヌクレオチドからアセンブリングされ得る。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７５６，１９８１；Ｎａｍｂａｉｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９，１９８４；Ｊａｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１，１９８４を参照のこと。
【０１５１】
一態様において、キメラタンパク質のドメイン配列をコードしている１種類以上の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて個々に単離される（Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０）。ドメインは好ましくは、これを含んでいることがわかっている公衆に利用可能なクローンから単離されるが、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーから単離してもよい。好ましくは、単離された断片は、免疫原性のタンパク質配列をコードしているキメラＤＮＡが構築されることを可能にする適合性の制限エンドヌクレアーゼ部位と隣接させる。この手法は当業者によく知られている。ドメイン配列は、互いに直接融合されていてもよく（例えば、介在配列なしで）、相互に挿入されていてもよく（例えば、ドメイン配列が不連続である場合）、介在配列（例えば、リンカー配列など）によって隔てられていてもよい。
【０１５２】
オリゴヌクレオチドプライマー、プローブおよびＤＮＡライブラリーの調製、ならびに核酸ハイブリダイゼーションによるそのスクリーニングのための基本的なストラテジーは当業者によく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９（上掲）；Ｐｅｒｂａｌ，１９８４（上掲）を参照のこと。適切なゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーの構築は当該技術分野の技能の範囲内である。例えば、Ｐｅｒｂａｌ，１９８４（上掲）を参照のこと。あるいはまた、適切なＤＮＡライブラリーまたは公衆に利用可能なクローンが、生物学的研究材料の供給元、例えばＣｌｏｎｅｔｅｃｈおよびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ、ならびに公の寄託機関、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能である。
【０１５３】
選択は、ＤＮＡ発現ライブラリーの配列を発現させ、発現されたペプチドを免疫学的に検出することにより行われ得る。ＭＨＣ  ＩＩ分子および所望の抗体／Ｔ細胞受容体に結合するペプチドを発現するクローンが選択される。このような選択手順は当業者によく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９（上掲）参照）。
【０１５４】
所望のポリペプチド配列のコード配列を含むクローンが調製または単離されたら、配列は、好ましくは宿主細胞内で配列を維持するための複製起点を含む任意の適切なベクター内にクローニングされ得る。
【０１５５】
好ましい実施形態では、キメラタンパク質が、（ａ）表１に示す配列番号：Ｚまたは配列番号：Ｗのポリヌクレオチドのいずれか１つ；（ｂ）表１に示す配列番号：Ｚまたは配列番号：Ｗのポリヌクレオチドのいずれか１つにコードされたポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；（ｃ）表１に示す配列番号：Ｙまたは配列番号：Ｖのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；（ｄ）内腔側ドメイン（例えば、配列番号：２もしくは３など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）をコードしているポリヌクレオチド、表１に示す配列番号：Ｙのうちの１つ以上、およびトラフィッキングドメイン（例えば、配列番号：１または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）；（ｅ）内腔側ドメイン（例えば、配列番号：２もしくは３など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）および表１に示す配列番号：Ｙのうちの１つ以上をコードしているポリヌクレオチド；（ｆ）表１に示す配列番号：Ｙのうちの１つ以上およびトラフィッキングドメイン（配列番号：１など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）をコードしているポリヌクレオチド；あるいは（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドのいずれか１つと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチドにコードされている。このようなポリヌクレオチドにコードされたポリペプチドは、好ましいさらなる実施形態である。
【０１５６】
核酸送達媒体
一態様において、キメラワクチンをコードしている核酸ベクターが細胞内に導入される。細胞は、核酸を複製させるため、またはキメラワクチンを発現させるための宿主細胞であり得る。好ましくは、キメラワクチンを発現させるための宿主細胞は抗原提示細胞である（以下においてさらに説明する）。
【０１５７】
核酸ベクターは最低限、標的細胞内に挿入するポリヌクレオチド配列と、細胞内におけるポリヌクレオチド配列の発現（例えば、転写および／または翻訳）を制御するための、配列に作動可能に連結された発現制御配列とを含む。例としては、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、ならびに複製することができるか、あるいはインビトロもしくは宿主細胞（例えば、細菌細胞、酵母もしくは昆虫細胞など）および／または標的細胞（例えば、哺乳動物細胞、好ましくは抗原提示細胞など）内で複製され得る、および／またはキメラワクチンをコードしている配列を標的細胞内の所望の箇所に運ぶことができる他の配列が挙げられる。
【０１５８】
好ましい実施形態では、本明細書に記載のベクター／媒体は、（ａ）表１に示す配列番号：Ｚまたは配列番号：Ｗのポリヌクレオチドのいずれか１つ；（ｂ）表１に示す配列番号：Ｚまたは配列番号：Ｗのポリヌクレオチドのいずれか１つにコードされたポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；（ｃ）表１に示す配列番号：Ｙまたは配列番号：Ｖのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド；（ｄ）内腔側ドメイン（例えば、配列番号：２もしくは３など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）、表１に示す配列番号：Ｙのうちの１つ以上、およびトラフィッキングドメイン（配列番号：１など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）をコードしているポリヌクレオチド；（ｅ）内腔側ドメイン（例えば、配列番号：２もしくは３など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）および表１に示す配列番号：Ｙのうちの１つ以上をコードしているポリヌクレオチド；（ｆ）表１に示す配列番号：Ｙのうちの１つ以上およびトラフィッキングドメイン（配列番号：１など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）をコードしているポリヌクレオチド；あるいは（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のポリヌクレオチドのいずれか１つと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリヌクレオチドを含むものである。
【０１５９】
組換え発現ベクターは、動物、例えば人、ウマ、ウシ、ブタ、ラマ、キリン、イヌ、ネコまたはニワトリに容易に感染する微生物に由来するものであり得る。好ましいベクターとしては、生ワクチンとして既に使用されているもの、例えばワクシニアが挙げられる。このような組換え体は直接、宿主内に接種され得、微生物系ベクターに対する免疫だけでなく、外来抗原の発現に対する免疫も賦与され得る。本明細書において組換え生ワクチンとして想定される好ましいベクターとしては、例えば、ＲＮＡウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオウイルス、ならびにワクシニアおよびＦｌｅｘｎｅｒ，Ａｄｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２１：５１，１９９０に教示されているような他のポックスウイルスが挙げられる。
【０１６０】
発現制御配列としては、限定されないが、ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター配列、それぞれ転写のアクチベータおよびリプレッサーに結合するエンハンサー配列もしくは負の調節エレメント、および／またはリボソーム結合のための翻訳開始配列が挙げられる。例えば、細菌系発現ベクターには、プロモーター、例えばｌａｃプロモーターと、転写開始のためのシャイン・ダルガノ配列および開始コドンＡＵＧが含められ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９（上掲））。同様に、真核生物系発現ベクターには好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための非相同、相同またはキメラのプロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソームの脱離のための終止コドンが含められる。
【０１６１】
発現制御配列は、天然に存在する遺伝子から得てもよく、設計してもよい。設計された発現制御配列としては、限定されないが、変異型および／またはキメラの発現制御配列あるいは合成またはクローニングされたコンセンサス配列が挙げられる。ポリヌクレオチドが作動可能に連結され得るプロモーターとクローニング部位の両方を含むベクターは当該技術分野でよく知られている。かかるベクターは、インビトロまたはインビボでＲＮＡを転写することができ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）およびＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）などの供給元から市販されている。
【０１６２】
発現および／または転写を最適化するためには、余分な、もしくは別の翻訳開始コドンまたは転写レベルもしくは翻訳レベルのいずれかで発現を妨害もしくは低減させるかもしれない他の配列を消失させるために、ベクターの５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加または改変することが必要な場合があり得る。あるいはまた、発現を増強させるために、コンセンサスリボソーム結合部位が、開始コドンのすぐ５’側に挿入され得る。多種多様な発現制御配列（作動可能に連結されているＤＮＡ配列の発現を制御する配列）が、本発明のＤＮＡ配列を発現させるために、このようなベクターにおいて使用され得る。有用なかかる発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマ、アデノウイルス、ヘルペスウイルスの初期または後期プロモーターおよび哺乳動物細胞の遺伝子の発現を制御することがわかっている他の配列、ならびにその種々の組合せが挙げられる。
【０１６３】
一態様において、核酸送達ベクターに、ベクターの複製のための複製起点を含める。好ましくは、複製起点は、標的細胞への送達における使用のため配列を充分なコピー数で生成させるために使用され得る少なくとも１種類の型の宿主細胞において機能を果たす。したがって、好適な複製起点としては、限定されないが、細菌の細胞（例えば、エシェリキア属の種、サルモネラ属の種、プロテウス属の種、クロストリジウム属の種、クレブシエラ属の種、バチルス属の種、ストレプトマイセス属の種およびシュードモナス属の種など）、酵母（例えば、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒａｍｙｃｅｓ）属の種またはピキア属の種など）、昆虫細胞ならびに哺乳動物細胞において機能を果たすものが挙げられる。好ましい一態様では、核酸送達媒体が導入される標的細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）において機能を果たす複製起点を備える。別の態様では、宿主細胞において機能を果たすものと、標的細胞において機能を果たすものの少なくとも２つの複製起点を備える。
【０１６４】
核酸送達ベクターに、択一的または付加的に、標的細胞の染色体内への核酸送達ベクターの少なくとも一部分の組込みを助長する配列を含めてもよい。例えば、核酸送達ベクターには、標的細胞の染色体ＤＮＡと相同性の領域が含められ得る。一態様において、送達ベクターにキメラワクチンをコードしている核酸配列にフランキングする２つ以上の組換え部位を含める。
【０１６５】
ベクターに、ベクターが標的細胞内に成功裡に導入されたこと、および／または標的細胞によって発現され得ることを検証するための検出可能および／または選択可能マーカーをさらに含めてもよい。このようなマーカーは、活性、例えば限定されないが、ＲＮＡ、ペプチドもしくはタンパク質の産生をコードしているものであり得るか、またはＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機および有機の化合物もしくは組成物などに対する結合部位を提供するものであり得る。
【０１６６】
検出可能／選択可能マーカー遺伝子の例としては、限定されないが：普通は毒性の化合物（例えば、抗生物質）に対する耐性をもたらす産物をコードしているＤＮＡセグメント；普通はレシピエント細胞内にない産物をコードしているＤＮＡセグメント（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）；遺伝子産物の活性を抑制する産物をコードしているＤＮＡセグメント；容易に同定することができる産物をコードしているＤＮＡセグメント（例えば、表現型マーカー、例えばβ−ガラクトシダーゼ、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＧ、ＢＦＰ、ＲＦＰ、ＥＧＦＰ、ＥＹＦＰ、ＥＢＦＰ、ｄｓＲｅｄ、その変異型、修飾型または増強型の形態など）、および細胞表面タンパク質）；普通は細胞の生存および／または機能に有害な産物に結合するＤＮＡセグメント；普通は他の核酸セグメントの活性を阻害するＤＮＡセグメント（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）；基質を修飾する産物（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）に結合するＤＮＡセグメント；所望の分子を単離または同定するために使用され得るＤＮＡセグメント（例えば、特定のタンパク質結合部位をコードしているセグメント）；プライマー配列；存在しない場合、特定の化合物に対して直接または間接的に耐性または感受性が付与されるＤＮＡセグメント；および／またはレシピエント細胞において毒性である産物をコードしているＤＮＡセグメントが挙げられる。
【０１６７】
マーカー遺伝子を、成功裡に遺伝子移入されたことを確認するための、および／または移入された遺伝子を発現している細胞を単離するため、および／または移入された遺伝子を細胞から回収するためのマーカーとして使用してもよい。例えば、一態様では、マーカー遺伝子が、キメラワクチンを発現している抗原提示細胞を単離および精製するために使用される。
【０１６８】
上記に論考したように、任意のドメイン配列のホモログ、バリアントおよび修飾形態が、そのそれぞれのドメイン機能の機能を果たす能力を保持している限り使用され得る。例えば、修飾された内腔側配列は、膜抗原物質および非膜抗原物質の両方をエンドソーム区画に、本来のドメイン配列と比べて少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約１００％の有効性を伴って、すなわち、免疫応答を起こすキメラ配列を含む細胞による充分な抗原提示をもたらす有効性を伴ってトラフィッキングする能力を保持していなければならない。一態様において、好適なトラフィッキングシグナルを含む配列は、オボアルブミンの充分に特性評価された抗原ドメイン、膜貫通ドメイン、および推定リソソーム／エンドソーム標的化シグナルを含むタンパク質の細胞質ドメインを含むキメラＤＮＡを構築することにより同定され得る。標的化の効率は、キメラタンパク質を発現している抗原提示細胞が、ＨＡエピトープ特異的ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞を刺激する能力を調べることにより測定され得る（例えば、米国特許第５，６３３，２３４号の実施例５参照）。
【０１６９】
実質的に類似している遺伝子、例えば、既知の遺伝子に対して約５０％より大きい、約６０％より大きい、約７０％より大きい、８０％より大きい、約９０％より大きい、好ましくは約９５％より大きい同一性を有する遺伝子が提供され得る。同一性パーセントは、当該技術分野で知られたソフトウェアプログラム、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．編，１９８７）Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３０，セクション７．７．１８，表７．７．１．に記載されたものを用いて調べることができる。好ましくは、アラインメントにデフォルトパラメータが使用される。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用するＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムはＢＬＡＳＴＮとＢＬＡＳＴＰであり、以下のデフォルトパラメータ：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；表示するヒットの最大数＝５０配列；ｓｏｒｔ  ｂｙ＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲが使用される。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴにおいて知得され得る。
【０１７０】
また、遺伝子の「保存的修飾バリアント」も提供され得る。具体的な核酸配列に関して、保存的修飾バリアントは、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードしている核酸、または核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合は本質的に同一の配列をいう。具体的には、１つ以上の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合型塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによる縮重コドンの置換が行われ得る（Ｂａｔｚｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ，ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８）。
【０１７１】
実質的に類似しているドメイン配列は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で対象のドメイン配列に特異的にハイブリダイズする配列を選択することにより最初に同定され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては：摂氏約２５度〜摂氏約３７度のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣのハイブリダイゼーションバッファー濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約６×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例としては：摂氏約４０度〜摂氏約５０度のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣのバッファー濃度；約３０％〜約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの洗浄溶液が挙げられる。高ストリンジェンシーの条件の例としては：摂氏約５５度〜摂氏約６８度のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣのバッファー濃度；約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣの洗浄溶液または脱イオン水が挙げられる。一般に、ハイブリダイゼーションのインキュベーション時間は５分間〜２４時間であり、１回、２回またはそれ以上の洗浄工程を伴い、洗浄インキュベーション時間は約１、２または１５分間である。ＳＳＣは０．１５ＭのＮａＣｌと１５ｍＭのクエン酸バッファーである。他のバッファー系を用いたＳＳＣの等価物を使用してもよいことは理解されよう。類似性はシーケンシングによって検証され得るが、好ましくはまた、あるいは択一的に、機能（例えば、エンドソーム区画にトラフィッキングする能力など）により、対象の具体的なドメインに適したアッセイを用いて検証される。
【０１７２】
相同、バリアントまたは修飾型のドメイン配列の好適性を調べるためのアッセイを行うことは、適切な活性を発現する配列をスクリーニングすることにすぎない。かかるスクリーニングは当該技術分野で常套的である。
【０１７３】
核酸送達ベクターは裸の核酸として、または細胞内への核酸の進入を助長するための１つ以上の分子と会合させた送達媒体で提供され得る。好適な送達媒体としては、限定されないが：リポソーム製剤、ポリペプチド、多糖、リポ多糖、ウイルス製剤（例えば、ウイルス、ウイルス粒子、人工のウイルスエンベロープなど）、細胞送達媒体などが挙げられる。
【０１７４】
脂質ベース製剤
生物学的活性分子の細胞内送達を助長するために設計される送達媒体は、非極性環境および極性環境の両方と（例えば、形質膜、組織液、細胞内区画などの中または上で）相互作用するものでなければならない。したがって、好ましくは送達媒体は、極性ドメインと非極性ドメインの両方または、核酸を細胞内に移行させるための移行配列を含むように設計される。
【０１７５】
極性ドメインと非極性ドメインを有する化合物は両親媒性物質と称される。カチオン性両親媒性物質は、負電荷を有するポリヌクレオチド、例えばＤＮＡと相互作用するための、生理学的ｐＨまたはその付近で正荷電となり得る極性基を有する。
【０１７６】
上記の核酸ベクターは、ベクターが細胞膜を通過して移入されるのを助長するための脂質の単層または二重層を含む製剤で提供され得る。リポソームまたは任意の形態の脂質膜、例えば、脂質平面膜またはインタクトな細胞、例えば赤血球の細胞膜が使用され得る。リポソーム製剤は、任意の手段、例えば静脈内または経口投与によって投与され得る。
【０１７７】
リポソームおよびリポソーム製剤は、標準的な方法に従って調製され得、当該技術分野でよく知られており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ；Ａｋｉｍａｒｕ，１９９５，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：１９７−２１０；Ａｌｖｉｎｇ，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１４５：５−３１；Ｓｚｏｋａ，１９８０，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７；米国特許第４，２３５，８７１号；米国特許第４，５０１，７２８号；および米国特許第４，８３７，０２８号を参照のこと。一態様において、リポソームには、リポソーム：核酸ベクター複合体を具体的な細胞型に標的化するための標的化分子を含める。特に好ましい一態様では、標的化分子は、標的組織にみられる血管または細胞の表面上の生体分子（例えば、受容体またはリガンド）に対する結合パートナー（例えば、リガンドまたは受容体）を含むものである。
【０１７８】
リポソームの電荷は、血液からのリポソームの排出における重要な決定因子であり、負電荷を有するリポソームの方が速やかに網内系に取り込まれ（Ｊｕｌｉａｎｏ，１９７５，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６３：６５１）、したがって血流中の半減期がより短い。ホスファチジルエタノールアミン誘導体を組み込むと、リポソームの凝集が抑制されることにより循環時間が増す。例えば、Ｎ−（ω−カルボキシ）アシルアミドホスファチジルエタノールアミンを、Ｌ−α−ジステアロイルホスファチジルコリンの大型の単層小胞内に組み込むことにより、インビボでのリポソームの循環寿命が劇的に長くなる（例えば、Ａｈｌ，１９９７，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３２９：３７０−３８２参照）。治療および診断での使用には、典型的には長い循環半減期を有するリポソームが望ましい。薬物動態の一般的な論考については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ  ３７−３９，Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＡＧ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ  １９９６）を参照のこと。
【０１７９】
典型的には、リポソームは、約５〜１５モルパーセントの負電荷を有するリン脂質、例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリンまたはホスファチジル−イノシトールを用いて調製される。また、添加された負電荷を有するリン脂質、例えばホスファチジルグリセロールは、自然発生的なリポソームの凝集を抑制する機能を果たし、したがって、リポソームが凝集塊の形成によって小型になるリスクを最小限にする。少なくとも約５０モルパーセントの濃度の膜剛直化剤、例えばスフィンゴミエリンまたは飽和中性リン脂質、および５〜１５モルパーセントの濃度のモノシアリルガングリオシドによってもまた、リポソーム特性、例えば剛直性が望ましく賦与され得る（例えば、米国特許第４，８３７，０２８号参照）。
【０１８０】
さらに、リポソーム懸濁液に、フリーラジカルおよび保存時の脂質過酸化的損傷に対して脂質を保護する脂質保護剤を含めてもよい。親油性フリーラジカル消去剤、例えばα−トコフェロールおよび水溶性の鉄特異的キレート剤、例えば、フェリオキシアニン（ｆｅｒｒｉｏｘｉａｎｉｎｅ）が好ましい。
【０１８１】
本発明の核酸送達媒体は、不均一なサイズの多層小胞を含むものであってもよい。例えば、小胞形成脂質を適切な有機溶媒または溶媒系に溶解させ、真空または不活性ガス下で乾燥させると脂質薄膜が形成され得る。所望により、この薄膜を適切な溶媒、例えば第三級ブタノールに再溶解させ、次いで凍結乾燥させて、より容易に水和される粉末様形態であるより均一な脂質混合物を形成してもよい。この薄膜をペプチドまたはポリペプチド複合体の水溶液で覆い、アジテーション下で典型的には１５〜６０分間にわたって水和させる。得られる多層小胞のサイズ分布は、脂質をより激しいアジテーション条件下で水和させることによって、または可溶化デタージェント、例えばデオキシコレートを添加することによって、より小さいサイズにシフトさせることができる。水和媒体には、好ましくは核酸を、最終リポソーム懸濁液中のリポソームの内容積に所望される濃度で含める。
【０１８２】
リポソーム調製後、リポソームは、所望のサイズ範囲および比較的狭い分布のリポソームサイズが得られるようにサイズ調整（ｓｉｚｅ）され得る。好ましいサイズ範囲の一例は約０．２〜０．４ミクロンであり、このサイズ範囲は、リポソーム懸濁液を慣用的なフィルター、典型的には０．２２ミクロンフィルターに通す濾過によって滅菌することが可能である。フィルターでの滅菌は、リポソームが約０．２〜０．４ミクロンまでサイズダウンされているならばハイスループットベースで行われ得る。リポソームを所望のサイズにサイズ調整するのに、いくつかの手法が利用可能である（例えば、米国特許第４，７３７，３２３号参照）。
【０１８３】
好適な脂質としては、限定されないが、ＤＯＴＭＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７）、ＤＯＧＳまたはＴｒａｎｓｆｅｃｔａｉｎ（商標）（Ｂｅｈｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：６９８２−６９８６）、ＤＮＥＲＩＥまたはＤＯＲＩＥ（Ｆｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５：６７−７５）、ＤＣ−ＣＨＯＬ（Ｇａｏ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，１９９１、ＢＢＲＣ  １７９：２８０−２８５）、ＤＯＴＡＰＴＭ（ＭｃＬａｃｈｌａｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：６７４−６２２）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ならびにグリセロ脂質化合物（例えば、ＥＰ９０１４６３およびＷＯ９８／３７９１６参照）が挙げられる。
【０１８４】
核酸送達ベクターとの複合体形成に適した他の分子としては、カチオン性分子、例えば、ポリアミドアミン（Ｈａｅｎｓｌｅｒ  ａｎｄ  Ｓｚｏｋａ，１９９３，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．４：３７２−３７９）、デンドリックポリリジン（ＷＯ９５／２４２２１）、ポリエチレンイミンもしくはポリプロピレンイミン（ＷＯ９６／０２６５５）、ポリリジン（米国特許第５，５９５，８９７号；ＦＲ  ２  ７１９  ３１６）、キトサン（米国特許第５，７４４，１６６号）、ＤＮＡ−ゼラチンコアセルベート（例えば、米国特許第６，２０７，１９５号；米国特許第６，０２５，３３７号；米国特許第５，９７２，７０７号参照）またはＤＥＡＥデキストラン（Ｌｏｐａｔａ，ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：５７０７−５７１７）が挙げられる。
【０１８５】
ウイルスベースの遺伝子送達媒体
一態様において、核酸送達媒体はウイルスまたはウイルス粒子を含む。この態様において、好ましくは、核酸ベクターはウイルスベクターを含む。ウイルスベクター、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびヘルペスウイルスは多くの場合、修飾されたウイルスゲノムと、これを囲む外被構造の２つの成分で構成されている（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４９：８０７−８３８参照）が、場合によっては、ウイルスベクターは裸の形態で、またはウイルスタンパク質以外のタンパク質で被覆された状態で導入される。現在使用されているほとんどのベクターは野生型ウイルスと同様の外被構造を有する。この構造によってウイルス核酸がパッケージングおよび保護され、標的細胞に結合して進入する手段がもたらされる。
【０１８６】
好ましくは、ウイルスベクターは、野生型ウイルスゲノムを、標的細胞内でのウイルスの増殖は不能であるが、感染性粒子を調製するために使用される宿主細胞内（例えば、パッケージング細胞またはヘルパー細胞など）でのウイルスの増殖は可能であるように修飾したものである。ベクター核酸は、一般的に、ヘルパー細胞株における複製およびパッケージングのための必須のシス作用ウイルス配列ならびに標的細胞に送達されるポリヌクレオチドの発現を調節するための発現制御配列を含む。特定のパッケージング細胞株またはヘルパー細胞株においてトランスで発現される他のウイルス機能も当該技術分野で知られている。
【０１８７】
好ましいベクターは、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、泡沫状ウイルス、レンチウイルス、セムリキ森林ウイルス、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ポックスウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスからなる群より選択されるウイルスに由来するウイルスベクターである。かかるウイルスベクターは当該技術分野でよく知られている。
【０１８８】
好ましい一態様では、使用されるウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスゲノムは、ウイルスの複製サイクルを完遂するのに必要な約３０を超える遺伝子を担持しているおよそ３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡ分子からなる。初期遺伝子は４つの領域（Ｅ１〜Ｅ４）に分けられ、これらは、宿主の抗ウイルス免疫応答を調節すると考えられているＥ３領域以外は、ウイルスの複製に必須である。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムの転写の調節を担うタンパク質をコードしている。Ｅ２領域の遺伝子（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現により、ウイルスの複製に必要なポリペプチドの合成がもたらされる。Ｅ３領域にコードされたタンパク質は、細胞傷害性Ｔ細胞および腫瘍壊死因子による細胞溶解を抑制する（Ｗｏｌｄ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄｉｎｇ，１９９１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １８４：１−８）。Ｅ４領域にコードされたタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子の発現およびスプライシングならびに宿主細胞でのシャットオフに関与している（Ｈａｌｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５６：２５０−２５７）。後期遺伝子は一般的に、ウイルスカプシドに寄与する構造タンパク質をコードしている。また、アデノウイルスゲノムは、ＤＮＡ複製に必須のシス作用性の５’および３’のＩＴＲ（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｒｅｐｅａｔ（末端逆位反復配列））およびパッケージング配列を担持している。ＩＴＲはＤＮＡ複製起点を有しており、一方、カプシド形成領域は、感染性粒子内へのアデノウイルスＤＮＡのパッケージングに必要とされる。
【０１８９】
アデノウイルスベクターを、特定の細胞（例えば、増殖性細胞など）において選択的に複製させるために、Ｈｅｉｓｅ  ａｎｄ  Ｋｉｍ（２０００，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：８４７−８５  １）に記載のようにして条件付き複製型となるように改変操作してもよい（ＣＲＡｄベクター）。別の態様では、アデノウイルスベクターはＥ１機能について複製欠陥性である（例えば、Ｅ１の完全もしくは部分的な欠失または変異誘発による）。ベクターのアデノウイルス骨格に、さらなる修飾（１つ以上のウイルス遺伝子における欠失、挿入または変異）を含めてもよい。Ｅ２修飾の一例は、ＤＢＰ（ＤＮＡ結合タンパク質）コード遺伝子上に存在する感熱性変異により例示される（Ｅｎｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７２，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１０：３２８−３３９）。また、アデノウイルス配列のＥ４領域の全部または一部が欠失され得る（例えば、ＥＰ９７４  ６６８；Ｃｈｒｉｓｔ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１１：４１５−４２７；Ｌｕｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：８３０８−８３１９参照）。必須でないＥ３領域におけるさらなる欠失により、送達されるポリヌクレオチドのサイズを大きくすることが可能となり得る（Ｙｅｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １１：６１５  ６２３）。しかしながら、ウイルスが免疫系（Ｇｏｏｄｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０：５３−７１）または炎症反応（ＥＰ００４４０２６７．３）を逃れることを可能にするポリペプチド（例えば、ｇｐ１９ｋなど）をコードしているＥ３配列の全部または一部を保持しておくことは好都合であり得る。
【０１９０】
ＩＴＲおよびパッケージング配列を保持しており、ウイルス抗原の残留合成を無効にするための実質的な遺伝子修飾を含む第２世代ベクターもまた、形質導入細胞内での発現対象遺伝子の長期発現を改善するために使用され得る。（例えば、ＷＯ９４／２８１５２；Ｌｕｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７２：２０２２−２０３２参照）。
【０１９１】
細胞内に導入されるポリヌクレオチドは、シス作用配列を除くウイルスゲノムの任意の箇所に挿入され得る。好ましくは、これは、欠失させた領域（Ｅ１、Ｅ３および／またはＥ４）との交換で、好ましくは欠失させたＥ１領域内に挿入される。
【０１９２】
アデノウイルスは、任意のヒトまたは動物供給源、特に、イヌ（例えば、ＣＡＶ−１もしくはＣＡＶ−２  Ｇｅｎｂａｎｋ整理番号はそれぞれＣＡＶＩＧＥＮＯＭおよびＣＡＶ７７０８２）、トリ（Ｇｅｎｂａｎｋ整理番号ＡＡＶＥＤＳＤＮＡ）、ウシ（例えば、ＢＡＶ３；Ｒｅｄｄｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１３９４  １４０２）、マウス（Ｇｅｎｂａｎｋ整理番号ＡＤＲＭＵＳＭＡＶＩ）、ヒツジ、ネコ、ブタまたはサル供給源に由来するものであり得るか、あるいは択一的にハイブリッドウイルスであってもよい。任意の血清型が使用され得る。しかしながら、サブグループＣのヒトアデノウイルス、特にアデノウイルス２（Ａｄ２）および５（Ａｄ５）が好ましい。かかるウイルスは、例えばＡＴＣＣから入手可能である。
【０１９３】
また、アデノウイルス粒子または空のアデノウイルスカプシドを、米国特許第５，９２８，９４４号に記載のようなウイルス媒介性コインターナリゼーション法によって核酸送達ベクターを移入するために使用することもできる。この方法は、カチオン性薬剤（１種または複数種）、例えばポリカルベンまたは１つ以上の脂質層を含む脂質小胞の存在下で行われ得る。
【０１９４】
アデノウイルス粒子は、当該技術分野の任意の慣用的な手法（例えば、ＷＯ９６／１７０７０）に従い、ウイルスの複製に必要な欠損ウイルス遺伝子をトランスで供給する補完細胞株またはヘルパーウイルスを用いて調製し、増殖させ得る。細胞株２９３（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２）およびＰＥＲＣ６（Ｆａｌｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：１９０９−１９１７）が一般的に、Ｅ１欠失を補完するために使用される。他の細胞株も、欠陥性ベクターを補完するために改変操作されている（Ｙｅｈ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５５９−５６５；Ｋｒｏｕｇｈａｋ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ，１９９５，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１５７５−１５８６；Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：７７５−７８３；Ｌｕｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２０２２−２０３；ＥＰ  ９１９６２７およびＷＯ９７／０４１１９）。アデノウイルス粒子は、培養上清みから回収され得るが、溶解後の細胞からも回収され得、任意選択で、標準的な手法（例えば、ＷＯ９６／２７６７７、ＷＯ９８／００５２４  ＷＯ９８／２６０４８およびＷＯ００／５０５７３に記載のようなクロマトグラフィー、超遠心分離）により、さらに精製され得る。
【０１９５】
ウイルス表面タンパク質の修飾によって広範な宿主範囲を有するアデノウイルスに由来するベクターを用いた細胞型特異的標的化を行ってもよい。例えば、アデノウイルスの感染の特異性は、許容性細胞の表面に存在する細胞受容体との結合によって調べられる。これに関連して、アデノウイルスカプシドの表面に存在するファイバーとペントンは、細胞付着に極めて重要な役割を果たしている（Ｄｅｆｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：３６６１−３６７３）。したがって、アデノウイルスの細胞標的化は、ファイバーおよび／またはペントンをコードしているウイルス遺伝子の遺伝子修飾により、特有の細胞表面受容体と特異的相互作用を行い得る修飾されたファイバーおよび／またはペントンを生成させることによって行われ得る。かかる修飾の例はＷｉｃｋａｒｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：８２２１−８２２９；Ａｒｒｉｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｖｉｒｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６８：６８６６−６８６９；Ｒｏｕｘ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：９０７９−９０８３；Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｖｉｌｅ，１９９５，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１９０−１９９；ＷＯ９３／０９２２１およびＷＯ９５／２８４９４に記載されている。
【０１９６】
特に好ましい一態様では、アデノ随伴ウイルスの配列がベクターとして使用される。ヒトパルボウイルスＡＡＶ−２（アデノ随伴ウイルス２型）に由来するベクターが、現在開発中の遺伝子送達媒体の中で最も将来有望である。一本鎖ＤＮＡをパッケージングするためのこの系の特徴のいくつかにより、これが、遺伝子ワクチンの送達のための裸のＤＮＡの考えられる代替物であることが示唆される。魅力的な主な特徴は、他のウイルスベクター、例えばワクシニアまたはアデノウイルスとは対照的に、ＡＡＶベクターは、いずれのウイルス遺伝子も発現しないことである。ワクチン構築物内に含める唯一のウイルスＤＮＡ配列は１４５ｂｐの末端逆位反復配列（ＩＴＲ）である。したがって、裸のＤＮＡでの免疫処置の場合のように、発現される唯一の遺伝子は、抗原または抗原キメラのものである。さらに、ＡＡＶベクターでは、分裂細胞および非分裂細胞（ヒト末梢血単球由来樹状細胞など）のどちらも形質導入され、導入遺伝子発現は持続的であり、粘膜免疫を生じさせるのに経口および鼻腔内送達が可能であることが知られている。さらに、必要とされるＤＮＡの量は数桁、ずっと少ないようであり、最大応答は、１０１０〜１０１１個の粒子またはコピー数のＤＮＡ用量であるのに対して、裸のＤＮＡでは５０ｕｇまたは約１０１５コピーの用量である。
【０１９７】
一態様において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ  ＩＴＲキメラタンパク質コード構築物に含まれたＤＮＡと、ＡＡＶコード領域（ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐの遺伝子）を含み、ＩＴＲがないＡＡＶヘルパープラスミドＡＣＧ２とによる適切な細胞株（例えば、ヒト２９３細胞）のコトランスフェクションによってパッケージングされる。続いて、細胞をアデノウイルスＡｄ５に感染させる。ベクターは、細胞ライセートから当該技術分野で知られた方法（例えば、塩化セシウム密度勾配超遠心分離など）を用いて精製され得、検出可能な複製可能ＡＡＶまたはアデノウイルスがないことが確実であることが（例えば、細胞変性効果のバイオアッセイによって）検証される。ＡＡＶ力価は、プロテイナーゼＫでの消化後に調製されたウイルスＤＮＡ試料を用いた定量的ＰＣＲによって測定され得る。好ましくは、かかる方法によってもたらされるベクター力価はおよそ５×１０１２〜１×１０１３個のＤＮａｓｅ耐性粒子／ｍｌである。
【０１９８】
他の態様では、レトロウイルスベクターが使用される。レトロウイルスは、ウイルスにコードされた逆転写酵素を用いて複製する組込み型ウイルスの一類型であり、ウイルスＲＮＡゲノムが二本鎖ＤＮＡに複製され、これが、感染した細胞（例えば、標的細胞）の染色体ＤＮＡ内に組み込まれる。かかるベクターとしては、マウス白血病ウイルス、特にモロニー（Ｇｉｌｂｏａ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２４１：２９）またはフレンドＦＢ２９株（ＷＯ９５／０１４４７）に由来するものが挙げられる。一般的に、レトロウイルスベクターは、ウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの全部または一部が欠失しており、５’および３’のＬＴＲならびにカプシド形成配列が保持されている。これらのエレメントは、レトロウイルスベクターの発現レベルまたは安定性が高まるように修飾され得る。かかる修飾としては、レトロウイルスのカプシド形成配列をレトロトランスポゾンのもの、例えばＶＬ３０で置き換えることが挙げられる（例えば、米国特許第５，７４７，３２３号参照）。好ましくは、対象のポリヌクレオチドはカプシド形成配列の下流に、好ましくはレトロウイルスゲノムと逆方向に挿入される。細胞特異的標的化は、当該技術分野で知られているように、抗体または抗体断片とレトロウイルスエンベロープタンパク質とのコンジュゲーションによって行われ得る。
【０１９９】
レトロウイルス粒子は、ヘルパーウイルスの存在下で、またはレトロウイルスベクターでは欠損させるレトロウイルス遺伝子（例えば、ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖ）をゲノム内に組み込まれた状態で含む適切な補完（パッケージング）細胞株において調製される。かかる細胞株は先行技術において報告されている（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｍａｎ，１９８９，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ７：９８０；Ｄａｎｏｓ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｖｉｒｏｌ．１６７：４００）。ｅｎｖ遺伝子の産物は、標的細胞の表面上に存在するウイルス受容体に対するウイルス粒子の結合を担い、したがって、レトロウイルス粒子の宿主範囲を決定する。本発明との関連において、両種指向性エンベロープタンパク質を含むパッケージング細胞株、例えばＰＡ３１７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ９０７８）または２９３ＥＩ６（ＷＯ９７／３５９９６）を使用し、ヒトおよび他の種の標的細胞の感染を可能にすることが好都合である。レトロウイルス粒子は好ましくは培養上清から回収され、任意選択で、標準的な手法（例えば、クロマトグラフィー、超遠心分離）により、さらに精製してもよい。
【０２００】
他の適切なウイルスとしてはポックスウイルスが挙げられる。ポックスウイルス科のいくつかの構成員のゲノムがマッピングされ、配列決定されている。ポックスウイルスベクターは、ポックスウイルス科の任意の構成員、特にカナリア痘、鶏痘およびワクシニアウイルスから得られ得る。好適なワクシニアウイルスとしては、限定されないが、コペンハーゲン株（Ｇｏｅｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌ．１７９：２４７−２６６；Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｖｉｒｏｌ．１９６：３８１−４０１）、ワイス株および修飾型アンカラ（ＭＶＡ）株（Ａｎｔｏｉｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｖｉｒｏｌ．２４４：３６５−３９６）が挙げられる。ワクシニアウイルスベクターを構築するための一般的な条件は当該技術分野で知られている（例えば、ＥＰ８３  ２８６およびＥＰ２０６  ９２０；Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３：６−１４；Ｓｕｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｓｓ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８４７−１０８５１参照）。好ましくは、対象のポリヌクレオチドは、必須でない座内、例えばｎＯＤ７コード遺伝子間領域内または不活性化もしくは欠失によってウイルスの増殖および複製が有意に損なわれない任意の遺伝子内に挿入される。
【０２０１】
ポックスウイルス粒子は、当該技術分野で報告されているようにして調製される（Ｐｉｃｃｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５４５−５６３；米国特許第４，７６９，３３０号；米国特許第４，７７２，８４８号；米国特許第４，６０３，１１２号；米国特許第５，１００，５８７号および米国特許第５，１７９，９９３号）。一般的には、ドナープラスミドを構築し、大腸菌内での増殖によって増幅させ、慣用的な手順によって単離される。次いで、これを適切な細胞培養物（例えば、ニワトリ胚線維芽細胞）中にポックスウイルスゲノムと一緒に導入し、相同組換えによってポックスウイルス粒子を生成させる。これは培養上清から、または溶解工程（例えば、化学的溶解、凍結／解凍、浸透圧ショック、超音波処理など）後の培養細胞から回収され得る。連続的な複数回のプラーク精製を使用し、混在する野生型ウイルスを除去することができる。ウイルス粒子は次いで、当該技術分野で知られた手法（例えば、クロマトグラフィー法または塩化セシウムもしくはスクロース勾配での超遠心分離）を用いて精製され得る。
【０２０２】
天然痘を根絶するためのグローバルキャンペーンにおいてワクシニアがウイルス生ワクチンとして使用されたことにより、ワクシニアは、組換え生ワクチンベクターとしての開発の当然の選択肢となった。１００種類に近い異なる外来タンパク質を発現している組換え生ワクシニアウイルスが報告されており、そのいくつかは有効な実験用ワクチンである（Ｍｏｓｓ  ａｎｄ  Ｆｌｅｘｎｅｒ，１９８７に概説）。ワクシニアは、その大きなゲノムサイズ、少なくとも２５，０００塩基対の外来ＤＮＡの受容能およびほとんどの真核生物細胞型（昆虫細胞など）に対する感染能のため、発現ベクターとして特に多用途である（同書）。他のＤＮＡウイルスとは異なり、ポックスウイルスは、感染細胞の細胞質内で排他的に複製し、宿主染色体との組換えウイルスＤＮＡの遺伝子交換の可能性が低い。組換えワクシニアベクターは、さまざまな供給源、例えば人間、他の哺乳動物、寄生生物、ＲＮＡおよびＤＮＡウイルス、細菌ならびにバクテリオファージに由来するタンパク質を適正にプロセッシングし、発現することが示されている。
【０２０３】
ウイルスは、ほとんどの哺乳動物に対して感染能を有し、広範なヒトおよび動物疾患の研究のための有用なベクターとなっている。外来タンパク質をコードしているＤＮＡの発現は、宿主のウイルス系調節エレメント、例えば上流プロモーター配列および、必要な場合はＲＮＡプロセッシングシグナルによって制御される。ワクシニアウイルスゲノムの必須でない領域内への外来ＤＮＡの挿入が相同組換えによって行われている（Ｐａｎｉｃａｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，７９：４９２７，１９８２；Ｍａｃｋｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：７４１５，１９８２）。
【０２０４】
ＤＮＡによる外来遺伝子の発現は、挿入部位もしくはその付近の転写調節エレメントのため、またはより厳密な遺伝子改変操作によって行われ得る。外来遺伝子の挿入および発現を大きく助長するプラスミドベクターが構築されている（Ｍａｃｋｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，４９：８５７，１９８２）。このようなベクターは、ワクシニア転写プロモーターと、ワクシニアゲノムの必須でない領域に由来するＤＮＡにフランキングされた外来コード配列の挿入のための１つ以上の特有の制限エンドヌクレアーゼ部位とで構成された発現部位を含む。プロモーターの選択によって発現の時期（例えば、初期または後期）とレベルが決定され、一方、フランキングしているＤＮＡ配列によって相同組換えの部位が決定される。
【０２０５】
この手順によって作製される千個のウイルス粒子のうち約１個だけが組換え体である。組換えウイルスプラークはＤＮＡハイブリダイゼーションによって同定することができるが、効率的な選択手順が開発されている。必須でないワクシニアウイルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子セグメントをフランキング配列として使用することによりＴＫ座内で外来遺伝子が組み換えられ、挿入によってＴＫ遺伝子が不活性化される。ＴＫウイルスの選択は、ＴＫ細胞内において５−ブロモデオキシウリジンの存在下でウイルスプラークアッセイを行うことにより行われる。ヌクレオシドアナログのリン酸化および結果としてのウイルスＤＮＡ内への致死性組込みは、ＴＫ＋  親ウイルスに感染した細胞内でのみ起こる。トランスフェクションおよび組換えの効率にもよるが、プラークのうち最大８０個が所望の組換え体であり、残りは自然発生的なＴＫ変異型である。
【０２０６】
大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子ならびに第２の遺伝子の発現部位を含むプラスミドベクターでは、組換え体を親ウイルスと区別する択一的な方法が可能である（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３４０３，１９８５）。かかる組換え体によって形成されるプラークは、適切な指示薬を添加すると形成される青色によって能動的に同定され得る。ＴＫ選択とβ−ガラクトシダーゼ発現の両方を組み合わせることにより、組換えウイルスが容易にかつ迅速に単離される。次いで、この組換え体を適切な細胞株での増殖によって増幅させ、挿入された遺伝子の発現を適切な酵素学的、免疫学的または物理的手順によって確認する。
【０２０７】
ワクシニアウイルスゲノムに追加できる遺伝情報の量の上限はまだ不明である。しかしながら、ほぼ２５，０００塩基対の外来ＤＮＡの追加は、ウイルス収量に対して明白に有害な効果はなかった（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２５：２１，１９８３）。必要であれば、ワクシニアウイルスゲノムの大型セグメントを欠失させると、さらなる許容量を得ることができよう（Ｍｏｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４０：３８７，１９８１）。
【０２０８】
ウイルスカプシド分子には、標的化および／または細胞内への進入を助長するための標的化部分が含められ得る。好適な標的化分子としては、限定されないが：化学コンジュゲート、脂質、糖脂質、ホルモン、糖類、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、ポリリジン、ＰＥＩなど）、ペプチド、ポリペプチド（例えば、ＷＯ９４／４０９５８参照）、ビタミン類、抗原、レクチン、抗体およびその断片が挙げられる。好ましくは、かかる標的化分子は、細胞特異的マーカー、組織特異的マーカー、細胞受容体、ウイルス抗原、抗原エピトープまたは腫瘍関連マーカーを認識して結合するものである。
【０２０９】
ウイルス粒子を主体とする組成物は、１０〜１０１４ｉ．ｕ．（感染単位）、好ましくは１０〜１０１１ｉ．ｕ．の用量形態で製剤化され得る。この力価は慣用的な手法によって測定され得る。核酸送達ベクターの用量は好ましくは０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、さらに特に０．１〜２ｍｇ／ｋｇに構成される。
【０２１０】
細胞ベースの送達媒体
本発明による核酸ベクターを標的細胞に、ベクターを含む他の細胞（「送達細胞」）によって送達することができる。ベクターを細胞内に導入するための方法は当該技術分野で知られており、細胞の核内へのＤＮＡのマイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−４８８）；ＣａＰＯ４を用いたトランスフェクション（Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：２７４５  ２７５２）、エレクトロポレーション（Ｃｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１５：１３１１−１３２６）；リポフェクション／リポソーム融合（Ｆｅｉｇｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７）および粒子ボンバードメント（Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９５６８−９５７２）が挙げられる。好適な細胞としては自己および非自己細胞が挙げられ、異種細胞も挙げられ得る。送達細胞を、その死を誘導することによって（例えば、細胞に誘導性自殺遺伝子を供給することにより）、その内容物が標的細胞に送達されるように誘導してもよい。
【０２１１】
補助分子
本発明による組成物に、細胞内への核酸送達ベクターの導入を助長するため、および／または特定の治療効果を増強させるための１種類以上の補助分子を含めてもよい。
【０２１２】
また、本発明による組成物には、動物／ヒトの体内での分解を抑止するため、および／または標的細胞のベクターでのトランスフェクション／感染を改善するために、１種類以上の安定化物質、例えば、脂質、ヌクレアーゼ阻害薬、ヒドロゲル、ヒアルロニダーゼ（ＷＯ９８／５３８５３）、コラゲナーゼ、ポリマー、キレート剤（ＥＰ８９０３６２）が含められ得る。かかる物質は、単独または組合せ（例えば、カチオン性および中性の脂質）で使用され得る。
【０２１３】
また、アデノウイルスタンパク質はエンドソームの不安定化能および細胞内へのＤＮＡの取込みの増強能を有することも示されている。脂質複合体化ＤＮＡベクターを含む溶液とのアデノウイルスの混合またはタンパク質架橋剤を用いてアデノウイルスに共有結合されたポリリジンにＤＮＡを結合することにより、核酸送達ベクターの取込みおよび発現が実質的に改善され得る（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ａｍ．Ｉ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：２４７−２５２参照）。
【０２１４】
宿主細胞
本発明による核酸ベクターは、さまざまな宿主細胞、例えば限定されないが：原核生物細胞（例えば、大腸菌、スタフィロコッカス属の種、バチルス属の種）；酵母細胞（例えば、サッカロミセス属の種）；昆虫細胞；線虫類の細胞；植物細胞；両生類細胞（例えば、ツメガエル）；鳥類細胞；および哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、マウス細胞、哺乳動物細胞株、一次培養哺乳動物細胞、例えば切開組織由来のもの）において発現させることができる。
【０２１５】
分子は、生物体から単離された宿主細胞、生物体の一部である宿主細胞、または生物体に導入された宿主細胞において発現させ得る。一態様では、融合分子をインビトロの、例えば培養状態の宿主細胞において発現させる。別の態様では、融合分子を、融合分子をコードしている核酸を含む体細胞および／または生殖細胞を含むトランスジェニック生物体（例えば、トランスジェニックマウス、ラット、ウサギ、ブタ、霊長類など）において発現させる。トランスジェニック動物を構築するための方法は当該技術分野でよく知られており、常套的である。
【０２１６】
また、核酸ベクターを細胞内にインビトロで導入し、この細胞（例えば、幹細胞、造血細胞、リンパ球など）を宿主生物体に導入してもよい。細胞は宿主生物体に対して異種であっても自己であってもよい。例えば、細胞を宿主生物体から採取し、核酸ベクターを細胞内にインビトロで導入し、次いで宿主生物体に再導入してもよい。
【０２１７】
抗原提示細胞
本発明の好ましい一態様では、上記のものなどの核酸送達媒体が、天然の、または改変操作された抗原提示細胞内に導入される。
【０２１８】
用語「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、本明細書で用いる場合、表面上に抗原を、主要組織適合複合体分子、好ましくはクラスＩＩ分子またはその一部分との会合状態で提示する任意の細胞を包含している。好適なＡＰＣの例は以下に詳細に論考されており、限定されないが、全細胞、例えばマクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、ハイブリッドＡＰＣ、およびフォスター抗原提示細胞が挙げられる。ハイブリッドＡＰＣの作製方法は報告されており、当該技術分野で知られている。
【０２１９】
樹状細胞（ＤＣ）は強力な抗原提示細胞である。ＤＣは、Ｔ細胞の活性化および増殖に必要とされるシグナルのすべてをもたらすことが示されている。このようなシグナルは２つの型にカテゴリー分類され得る。第１の型は、免疫応答に対して特異性を付与するものであり、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３（“ＴＣＲ／ＣＤ３”）複合体と、ＡＰＣの表面上の主要組織適合複合体（上記に定義した“ＭＨＣ”）クラスＩまたはＩＩタンパク質によって提示された抗原ペプチドとの間の相互作用によって媒介される。この相互作用は、Ｔ細胞の活性化が起こるのに必要であるが充分でない。実際、第２の型のシグナルがないと、第１の型のシグナルはＴ細胞アネルギーをもたらし得る。第２の型シグナルは、共刺激シグナルと称され、抗原特異的でもＭＨＣ拘束性でもなく、第１の型のシグナルの存在下でＴ細胞の充分な増殖応答およびＴ細胞エフェクター機能の誘導をもたらし得る。
【０２２０】
いくつかの分子は、共刺激活性を増強させることが示されている。このようなものとしては、限定されないが、熱安定性抗原（ＨＳＡ）、コンドロイチン硫酸修飾ＭＨＣインバリアント鎖（Ｉｉ−ＣＳ）、細胞内接着分子Ｉ（ＩＣＡＭ−１）、ならびにＡＰＣの表面上のＢ７共刺激分子およびその対抗受容体ＣＤ２８またはＴ細胞上のＣＴＬＡ−４が挙げられる。
【０２２１】
他の重要な共刺激分子はＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、ＣＤ８６である。本明細書で用いる場合、用語「共刺激分子」は、Ｔ細胞の表面上のＴＣＲによって結合されたペプチド／ＭＨＣ複合体と一緒に作用した場合、ペプチドに結合するＴ細胞の活性化を行う共刺激効果をもたらす任意の単一の分子または分子の組合せを包含している。したがって、この用語は、Ｂ７、またはＡＰＣ上の他の共刺激分子（１種もしくは複数種）、ペプチド／ＭＨＣ複合体と一緒にコグネイトリガンドに結合し、Ｔ細胞の表面上のＴＣＲがペプチドに特異的に結合するとＴ細胞の活性化をもたらすその断片（単独、別の分子（１種もしくは複数種）との複合体状態、または融合タンパク質の一部として）を包含している。共刺激分子は、さまざまな供給元、例えばＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒなどから市販されている。
【０２２２】
本発明の一態様では、Ｒｏｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９６：１３５−１５１，１９９６およびＢｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９６：１２１−１３５，１９９６に記載の方法が、哺乳動物、例えばマウス、サルまたはヒトの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から未熟樹状細胞および成熟樹状細胞の両方を生成させるために使用される。簡単には、単離されたＰＢＭＣを、免疫磁気手法によって前処理してＴ細胞とＢ細胞を枯渇させる。リンパ球枯渇ＰＢＭＣを次いで、ヒト血漿（好ましくは、自己血漿）およびＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４を補給したＲＰＭＩ培地中で９日間、例えば約７日間）培養し、樹状細胞を生成させる。樹状細胞は、その前駆細胞の単球と比較した場合、非接着性である。したがって、およそ７日目、非接着性細胞を、さらなる加工処理のために収集する。
【０２２３】
ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下におけるＰＢＭＣに由来する樹状細胞は、非接着特性を失っている場合があり得、培養物からサイトカイン刺激が除かれるとマクロファージ細胞に逆戻りする運命にあるという点で未熟である。未熟状態の樹状細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ拘束経路のための天然状態のタンパク質抗原のプロセッシングにおいて非常に有効である（Ｒｏｍａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１１６９，１９８９）。培養樹状細胞のさらなる成熟は、必要な成熟因子を含めたマクロファージ条件培地（ＣＭ）中で３日間培養することにより行われる。成熟樹状細胞は、提示のために新たなタンパク質を捕捉することはあまりできないが、静止期のＴ細胞（ＣＤ４およびＣＤ８の両方）を増殖して分化するように刺激することの方がずっと得意である。
【０２２４】
成熟樹状細胞は、形態構造の変化によって、例えば、より運動性の細胞質プロセスの形成；その非接着；以下のマーカー：ＣＤ８３、ＣＤ６８、ＨＬＡ−ＤＲもしくはＣＤ８６のうちの少なくとも１種類の存在；またはＦｃ受容体、例えばＣＤ１１５の減少によって同定することができる（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１，１９９１に概説）。成熟樹状細胞は、典型的な細胞蛍光撮影法（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈｙ）ならびに細胞分取の手法およびデバイス、例えば、ＦＡＣＳｃａｎおよびＦＡＣＳｔａｒを用いて収集および解析され得る。フローサイトメトリーに使用される一次抗体は、成熟樹状細胞の細胞表面抗原に特異的なものであり、市販されている。二次抗体は、後でＦＩＴＣ−またはＰＥ−コンジュゲートストレプトアビジンを伴うビオチン化Ｉｇであり得る。
【０２２５】
あるいはまた、他に、樹状細胞を上方調節（活性化）し、単球を活性型樹状細胞の表現型に変換させるための方法が報告されている。この方法は、培養培地へのカルシウムイオノフォアの添加によって単球を活性型樹状細胞に変換させることを伴う。例えば、２４〜４８時間の培養期間の最初にカルシウム２１イオノフォアＡ２３１８７を添加すると、プールされた「単球＋ＤＣ」画分の一様な活性化および樹状細胞表現型の変換がもたらされた：特徴的には、活性型集団は一様にＣＤ１４（Ｌｅｕ  Ｍ３）陰性となり、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＩＣＡＭ−１、１３７．１および１３７．２を上方調節する。さらに、この活性型の大量集団は、少数ベースでもさらなる精製型として同様に機能を果たす。特定の組合せ（１つまたは複数）のサイトカインは、カルシウムイオノフォアを用いて行われる活性化／変換のために増幅させる（または部分的に置換する）ために成功裡に使用された：このようなサイトカインとしては、限定されないが、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２およびＩＬ−４が挙げられる。各サイトカインは、単独で与えた場合、最適な上方調節には不充分である。
【０２２６】
ＡＰＣを単離するための第２のアプローチは、血液中を既に循環している比較的大量数のコミットされる前のＡＰＣを収集することである。コミットされたＡＰＣをヒト末梢血から単離するためのこれまでの手法は、物理的手順、例えばメトリザミド勾配と接着／非接着工程の組合せ（Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ８７：７６９８−７７０２，１９９０）；パーコール勾配分離（Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：９９６−１００３，１９９４）；および蛍光活性化細胞分取手法（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：６８４０−５２，１９９３）を伴うものであった。
【０２２７】
専門的抗原提示細胞（またはその前駆細胞）を単離するための当該技術分野で常套的な多くの方法があること、ならびにかかる方法および開発されるかもしれない他のものは限定的なものでなく、本発明の範囲に包含されることは当業者には明らかなはずである。
【０２２８】
一実施形態では、ＡＰＣ、したがって１種類以上の抗原を提示する細胞は自己のものである。別の実施形態では、抗原を提示するＡＰＣは同種のもの、すなわち異なる被験体に由来するものである。
【０２２９】
上記に論考したように、キメラ分子をコードしている核酸はＡＰＣ内に、上記の方法または当該技術分野で知られた他のもの、例えば限定されないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、融合、マイクロインジェクション、ウイルスベースの送達または細胞ベースの送達を用いて導入され得る。Ａｒｔｈｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４（ｌ）：１７−２５，１９９７には、ヒト樹状細胞内への遺伝子移入方法の比較が報告されている。
【０２３０】
既知の部分的な推定ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、ヒトＭＨＣの遺伝子構成、アミノ酸およびヌクレオチド配列（コンセンサス配列を含む）が公表されており（例えば、Ｚｅｍｍｏｕｒ  ａｎｄ  Ｐａｒｈａｍ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３３：３１０−３２０，１９９１参照）、ＨＬＡバリアントを発現する細胞株が知られており、一般的に、多くのものと同様にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（“ＡＴＣＣ”）から入手可能である。したがって、ＰＣＲを使用すると、ＭＨＣクラスＩＩコードヌクレオチド配列は本発明の発現ベクターに容易に作動可能に連結され、次いでこれが、発現のための適切な細胞を形質転換するのに使用される。
【０２３１】
専門的ＡＰＣ、例えばマクロファージ、Ｂ細胞、単球、樹状細胞およびランゲルハンス細胞が使用され得る。これらは、１）自己ドナー；２）治療対象の宿主とは異なるＨＬＡ特異性を有する異種ドナーの血液もしくは組織から；または３）異なる種の異種ドナーから標準的な手順を用いて収集される（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，セクション３および１４，１９９４）。細胞は、正常な宿主または感染性疾患、がん、自己免疫疾患もしくはアレルギーを有する患者から単離され得る。
【０２３２】
プロフェッショナルＡＰＣは末梢血液から、白血球アフェレーシスおよび“ＦＩＣＯＬＬ／ＨＹＰＡＱＵＥ”密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌおよび不連続パーコール密度勾配による段階的遠心分離）を用いて得られ得る。ＡＰＣによって内在化され、対象の抗原に特異的でないＴ細胞の活性化をもたらす可能性がある抗原へのＡＰＣの曝露が回避される手順が使用される。
【０２３３】
天然では抗原提示しない細胞を、適切な分子をコードしている配列を導入することによって抗原提示するように改変操作してもよい。例えば、ＭＨＣクラスＩＩ分子、補助分子、共刺激分子および抗原プロセッシング補助分子をコードしている核酸配列が、直接合成、クローニング、かかる遺伝子を含む細胞からのＤＮＡの精製などの後に導入され得る。本明細書に記載の組成物および方法において使用される分子をコードしている遺伝子を得るための得策手段の一例は、選択した核酸鋳型に対して選択したオリゴヌクレオチドプライマーペアを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅である。例えば、上皮細胞、内皮細胞、腫瘍細胞、線維芽細胞、活性型Ｔ細胞、好酸球、ケラチノサイト、星状細胞、小グリア細胞、胸腺皮質上皮細胞、シュワン細胞、網膜色素上皮細胞、筋芽細胞、血管平滑筋細胞、軟骨細胞、エンテロサイト、甲状腺細胞（ｔｈｙｒｏｃｙｔｅ）および尿細管細胞が使用され得る。これらは、宿主から外植されたばかりで、確立された細胞株を形成するために細胞培養で高継代のものでない一次細胞であってもよく、比較的均一であり、多世代にわたって、または無限に増殖能を有する確立された細胞株であってもよい。
【０２３４】
専門的ＡＰＣでない細胞は、自己ドナー；異種（“ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ”または“ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ”）ドナーの任意の組織から単離され、この場合、これらは、さまざまな既知の分離方法を用いて存在させる（Ｄａｒｌｉｎｇ，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉａ．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ．Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）。非自己細胞、例えば異種（“ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ”または“ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ”）細胞を、既知のヒトＨＬＡ特異性とマッチするＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分子を発現するようにエキソビボで改変操作してもよい。このような細胞は次いで、改変操作された細胞のＨＬＡ特異性とマッチするヒト被験体に導入され得る。細胞は、１種類以上の本発明によるキメラワクチンを発現するようにエキソビボでさらに改変操作される。
【０２３５】
改変操作された細胞は、標準的な細胞培養方法によって細胞培養状態で維持される（Ｄａｒｌｉｎｇ，Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉａ”．Ｊ．Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ”．Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）。本発明における使用のため細胞株は、さまざまな供給元（例えば、ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ＆  Ｈｙｂｉｄｏｍａｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，第８版，１９９５）から入手されるか、または標準的な方法（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６）を用いて作製される。非形質転換細胞株がヒト被験体における使用に好ましい。
【０２３６】
一態様において、ＧＭ−ＣＳＦの影響下で樹状細胞に分化しているＣＤ３４＋  前駆細胞を被験体の身体から採取し、本発明によるキメラワクチンをコードしている核酸を細胞内に導入し、次いでこれを被験体に再注入する。エンドソーム／リソソーム標的化シグナルに連結された抗原配列を含む（好ましくは、ＬＡＭＰ様内腔側ポリペプチドを含む）構築物を使用すると、特定の抗原に由来するペプチドと形質導入された抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子との会合が増強され、有意により強力な全身性のＴ細胞依存性免疫応答がもたらされる。このストラテジーにおいてトランスフェクトされる抗原提示細胞は好ましくは自己細胞であるが、宿主において有効に抗原を提示する任意のＭＨＣクラスＩＩ細胞が上記のようにして使用され得る。
【０２３７】
ペプチドワクチン
同様に本発明の範囲に含まれるのは、無細胞ペプチド免疫原を含むワクチンであって、免疫原が、リソソーム膜ポリペプチド（例えば、ＬＡＭＰポリペプチドまたはそのホモログ、オーソログ、バリアントもしくは修飾型など）の配列、あるいはアレルゲンＸを、エンドソーム／リソソーム区画またはリソソーム関連細胞小器官にＭＨＣクラスＩＩ分子との結合のために標的化およびトラフィッキングするための、またはＭＨＣクラスＩＩ分子との結合のための別の区画／細胞小器官への送達のためのエンドサイトーシス受容体の配列と融合された少なくとも１種類のアレルゲンＸを含むワクチンである。好ましくは、アレルゲンＸは区画／細胞小器官（または送達される次の区画／細胞小器官）内でプロセッシングされ、アレルゲンＸエピトープが生成して、免疫応答の調節能を有するＭＨＣクラスＩＩ分子に結合される。
【０２３８】
また、キメラワクチンには、膜貫通領域および／またはリソソーム標的化領域を有する細胞質尾部（好ましくは、ＬＡＭＰポリペプチド由来のもの）、および／またはジロイシンドメイン、Ｔｙｒモチーフ、ＭＲ６ドメイン、プロリンリッチドメイン、および／またはＳｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌドメインも含められ得る。また、キメラワクチンを、生物体の身体へのその投与が助長されるように膜性構造内に結合させてもよい。例えば、キメラワクチンは、米国特許第４，４４８，７６５号に記載のように、リポソーム内に組み込まれ得る。
【０２３９】
好ましい実施形態では、本発明のペプチドワクチンは：（ａ）表１に示す配列番号：Ｚまたは配列番号：Ｗのポリヌクレオチドのいずれか１つにコードされたポリペプチド；（ｂ）表１に示す配列番号：Ｙまたは配列番号：Ｖのアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｃ）内腔側ドメイン（例えば、配列番号：２もしくは３など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）、表１に示す配列番号：Ｙのうちの１つ以上、およびトラフィッキングドメイン（配列番号：１など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）を含むポリペプチド；（ｄ）内腔側ドメイン（例えば、配列番号：２もしくは３など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）および表１に示す配列番号：Ｙのうちの１つ以上を含むポリペプチド；（ｅ）表１に示す配列番号：Ｙのうちの１つ以上およびトラフィッキングドメイン（配列番号：１など、または配列番号：４もしくは５に示すようなもの）を含むポリペプチド；あるいは（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のポリヌクレオチドのいずれか１つと少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するポリペプチドを含むものである。
【０２４０】
タンパク質またはポリペプチドが免疫原として使用される場合、これは、組換え細胞内での上記のＤＮＡ構築物のいずれか１種類以上の発現によって産生させてもよく、化学合成によって調製してもよい。例えば、メリフィールド手法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，第８５巻，第２１４９〜２１５４頁，１９６８）が使用され得る。
【０２４１】
ポリヌクレオチドとしてのＬＡＭＰ構築物、ＬＡＭＰ構築物のコードタンパク質および／または細胞（例えば、本明細書に記載のＬＡＭＰ構築物を発現する抗原提示細胞）でプライミングした後、アレルゲンＸでブーストすることは本発明の好ましい一実施形態である。さらなる好ましい実施形態では、本明細書に記載のＬＡＭＰ構築物でプライミングした後、アレルゲンで、好ましくは、アレルゲンＸが由来するタンパク質に由来するアレルゲンでブーストすることが具体的に想定され、さらにいっそうよりロバストな免疫応答（特に、抗体レパートリーの多様性および力価の観点で）を生じさせるために使用され得る。
【０２４２】
投与
本発明によるワクチン物質は、上記の免疫賦活構築物を含むものであり得るか、または組換え微生物、もしくは免疫賦活構築物を発現する抗原提示細胞であり得る。本発明によるワクチン物質を含む組成物の調製および個体の免疫処置のためのかかる組成物の投与は、当業者によく知られた免疫処置の原理に従って行われる。
【０２４３】
大量のこのような物質は、本明細書に記載のキメラアレルゲンＸタンパク質を発現するレプリコンを含む組換え細胞または形質転換細胞を培養することにより得られ得る。培養方法は当業者によく知られており、上記に挙げた文献の１つ以上に教示されている。ワクチン物質は一般的に、組換え細胞または形質転換細胞の培養によって産生させ、当該技術分野で、例えば米国特許第４，４４６，１２８号（引用により本明細書に組み込まれる）に報告されているようにして、薬理学的に許容され得る液剤もしくは懸濁剤（これは通常、生理学的に適合性の水溶液である）またはコート錠、錠剤、カプセル剤、坐剤もしくはアンプルに製剤化する。投与は、任意の適切な経路、例えば経口、経直腸、鼻腔内であり得るか、または注射によるものであり得、ここで、注射は、例えば経皮、皮下、筋肉内または静脈内であり得る。
【０２４４】
ワクチン組成物は哺乳動物に、哺乳動物において免疫応答が誘導されるのに充分な量で投与される。投与のための好ましい最低限の量は、投与前に存在していたものの少なくとも４倍の濃度まで抗体形成を誘起するのに必要とされる量である。投与のための典型的な初期用量は、静脈内、筋肉内もしくは皮下投与する場合は１０〜５０００マイクログラムまたは１０５〜１０１１プラーク形成単位の組換えベクターであろうが、この量は、投与を実施する臨床医により、ワクチンおよび免疫応答を誘導する他の薬剤の投与において一般的に行われるようにして調整され得る。免疫を誘導するためには通常、単回投与で充分であり得るが、応答を確実にするため、またはブーストするために、（例えば、アレルゲンＸが由来するものと同じタンパク質に由来する組換え産生型を用いて）反復投与を行ってもよい。
【０２４５】
ワクチンは、最初は非ヒト哺乳動物（例えば、マウスまたは霊長類）において試験され得る。例えば、接種マウスの免疫応答のアッセイが、野生型抗原より抗体、Ｔ細胞の増殖、およびリソソーム標的化キメラタンパク質に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答が大きいことを実証するために使用され得る。マウスにおいて高度に有効なＤＮＡワクチン製剤が適切なサル免疫応答も惹起するかどうかを調べるために、キメラタンパク質はアカゲザルにおいて評価され得る。一態様において、各サルには、１回の免疫処置で合計５ｍｇのＤＮＡがＩＭ送達で２つの部位に分けて投与され、免疫処置は０日目と４、８および２０週目に行われ、さらなる用量は任意である。ワクチンに対する免疫応答をモニタリングするために、抗体応答、ＡＤＣＣ、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞サイトカイン生成、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞抗原特異的サイトカイン染色が測定され得る。
【０２４６】
本発明による製剤化および投与の好適な方法のさらなる説明は、米国特許第４，４５４，１１６号（構築物）、米国特許第４，６８１，７６２号（組換え細菌）ならびに米国特許第４，５９２，００２号および同第４，９２０，２０９号（組換えウイルス）をみるとよい。
【０２４７】
アレルギーの治療
本発明により、アレルゲンＸと相関している花粉症の治療に有用な製剤を提供する。これまでに、アレルゲンのタンパク質コード配列をコードしているＤＮＡプラスミドを動物に送達すると、ＩＦＮ−γの生成が高まり得、ＩＬ−４の生成が低下し得ることが調べられており、これは、具体的なアレルゲンに対してアレルギーの動物を治療するのに有用である。本発明により、アレルゲンＸと相関しているアレルギーを有する患者を治療するための改善されたワクチン組成物を提供する。本発明の融合タンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ小胞を横切る特定の細胞内トラフィッキングパターンを有し、免疫系に対するアレルゲンＸの提示の増強をもたらすもの、具体的には抗体応答の増強をもたらすものである。本発明によって提供される核酸および組成物はアレルギー免疫療法の実施に有用である。
【０２４８】
本発明により、細胞に投与した場合、特異的抗体応答の増大がもたらされる製剤を提供する。アレルゲンＸに対する抗体応答の増大はＩｇＥ媒介性アレルギー疾患を治療するのに有用である。ＩｇＥは、その細胞拘束性およびその結果としてのコグネイトアレルゲンへの結合時の細胞内シグナル伝達と関連する特定の特性を有する。Ｂ細胞がＴｈ２細胞によって分泌されたＩＬ−４を受容すると、アレルゲンに対してＩｇＥを産生する。これにより、Ｂ細胞がＩｇＥクラス抗体を産生するよう指示されることが補助される。Ｂ細胞によって分泌されると、ＩｇＥは、マスト細胞および好酸球によって発現されるその高親和性受容体Ｆｃ−εＲＩに結合し、これらの細胞および動物を、その後のアレルゲン曝露に対して感作状態にする。その結果として、アレルゲンを摂取、吸入または経粘膜接触するとアレルギーの症状が誘発され得る。抗体の結合特性のため、アレルギー症状を低減させる方法の１つは、ＩｇＥによる結合に利用可能な遊離アレルゲンを他の抗体クラスとの競合によってキレート化することであると提案されている。特に、ＩｇＧを高めるアレルギー用製剤がアレルギー疾患を低減させるための道であると提案されている。本明細書に記載の発明はＩｇＧ産生の増強を誘導し、したがって、臨床的に有意な様式でＩｇＧに対するＩｇＥの比の低減をもたらすものである。
【０２４９】
特に好ましい一実施形態では、本発明により、アレルゲンＸに対するアレルギーの治療または予防の方法を提供する。好ましい方法の一例では、本明細書に記載のアレルゲンＸおよびリソソーム結合膜ポリペプチド（例えば、ＬＡＭＰポリペプチド、そのホモログ、オーソログ、バリアントもしくは修飾形態）の内腔側トラフィッキングドメインまたはエンドサイトーシス受容体の内腔側トラフィッキングドメイン、ならびにアレルゲンＸ抗原をエンドソーム／リソソーム区画またはリソソーム関連細胞小器官に標的化するため、および区画／細胞小器官内または抗原が送達される別の区画／細胞小器官内のいずれかでのＭＨＣクラスＩＩ分子との会合のための、ＬＡＭＰポリペプチド、そのホモログ、オーソログ、バリアントもしくは修飾形態またはエンドサイトーシス受容体の細胞質標的化ドメインをコードしているポリヌクレオチドである。かかるキメラＤＮＡ分子に、上記のようなさらなるドメイン配列をコードさせてもよい（例えば、膜貫通ドメイン、シグナル配列、エンドソーム／リソソーム区画またはリソソーム関連細胞小器官に標的化するための細胞質ドメイン、ジロイシンドメイン、Ｔｙｒモチーフドメイン、プロリンリッチドメイン、Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌドメインなどをコードしている配列）。
【０２５０】
より一般的には、一実施形態において、本発明により、アレルゲンＸに対する哺乳動物の免疫応答を調節する（すなわち、かかる応答を賦活、増強または低減させる）ためのワクチン組成物を提供する。好ましくは、組成物はワクチンベクターを含み、ベクターは、アレルゲンＸを含むタンパク質およびリソソーム結合膜ポリペプチド（例えば、ＬＡＭＰポリペプチド、そのホモログ、オーソログ、バリアントもしくは修飾形態）の内腔側トラフィッキングドメインまたはエンドサイトーシス受容体の内腔側トラフィッキングドメイン、ならびに抗原をエンドソーム／リソソーム区画またはリソソーム関連細胞小器官に標的化するため、および区画／細胞小器官内または抗原が送達される別の区画／細胞小器官内のいずれかでのＭＨＣクラスＩＩ分子との会合のための、標的化ドメイン、例えば、ＬＡＭＰポリペプチド、そのホモログ、オーソログ、バリアントもしくは修飾形態またはエンドサイトーシス受容体の細胞質標的化ドメインをコードしているキメラＤＮＡセグメントを含むものである。かかるキメラＤＮＡ分子に、上記のようなさらなるドメイン配列をコードさせてもよい（例えば、膜貫通ドメイン、シグナル配列、エンドソーム／リソソーム区画またはリソソーム関連細胞小器官に標的化するための細胞質ドメイン、ジロイシンドメイン、Ｔｙｒモチーフドメイン、プロリンリッチドメイン、Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌドメインなどをコードしている配列）。
【０２５１】
キット
本発明は、本明細書に記載の方法の実施を容易にするためのキットをさらに含む。一態様において、キットは、上記の核酸ベクターおよびベクターを受容するための細胞を備えている。キットは、細胞を専門的ＡＰＣに改変操作するための１種類以上の核酸をさらに備えていてもよい。しかしながら、一態様では、細胞が専門的ＡＰＣである。細胞は共刺激分子を発現するものであっても、そうでなくてもよい。好ましい一態様において、細胞が共刺激分子を発現しない場合、ベクターにコードされた抗原は自己抗原である。別の態様では、異なるＭＨＣ分子（例えば、人において発現されることがわかっているもの）を発現する細胞パネルを備えている。さらなる一態様では、キットは、細胞内へのベクターの進入を助長するための試薬（例えば、脂質ベース製剤、ウイルスパッケージング材料、細胞など）を備えている。なおさらなる一態様では、ベクターにコードされた抗原に特異的な１種類以上のＴ細胞株を備えており、ベクターが免疫応答を惹起する、調節する、または増強させる能力を検証する。
【０２５２】
実施例
次に、本発明を、以下の実施例を参照しながらさらに説明する。以下のことは一例にすぎないこと、および依然として本発明の範囲に含まれる状態で詳細事項に対する修正が行われ得ることは認識されよう。
【実施例１】
【０２５３】
実施例１−アレルゲンＸ構築物の構築
表１に記載のキメラアレルゲンＸワクチンをコードしているいくつかの異なる核酸構築物を構築した。配列番号：Ｚのポリヌクレオチドを含むプラスミドを、当該技術分野でよく知られた手法を用いて設計した。具体的には、ＬＡＭＰ−１内腔側ドメイン（配列番号：２）の一部分を含み、それをアレルゲンＸ（配列番号：Ｙ）および次いでＬＡＭＰ−１膜貫通／細胞質尾部（配列番号：１）の一部分に融合した遺伝子融合体をコードしているポリヌクレオチドを含むプラスミドを、ＮＴＣ  ８３８２ベクター内に挿入した。構築されたかかるポリヌクレオチド代表例を配列番号：Ｗとして示す。得られた構築物の配列を確認し、タンパク質発現を確認した。
【実施例２】
【０２５４】
実施例２−アレルゲンＸをコードしているプラスミドに対するマウスの免疫応答の評価
実施例１に記載のアレルゲンＸ抗原構築物を免疫応答の調節能について、Ｓｕ，Ｙａｎ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｍａｒｋｅｔｏｎ，ａｎｄ  Ｔｅｒｉ  Ｈｅｉｌａｎｄ．“ＣｒｙＪ−ＬＡＭＰ  ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｒｅｄ  Ｃｅｄａｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ｒｏｂｕｓｔ  Ｔｈ１−Ｔｙｐｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｄｅｌ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１６（２０１６）：１−１５に記載のアッセイを用いて試験した。
【０２５５】
各構築物での結果を表３に報告する。特に記載のない限り、「対照」構築物は、アレルゲン配列のないベクター骨格である。
【０２５６】
【表３−１】
2019537447.tif 000005
【０２５７】
【表３−２】
2019537447.tif 000006
【０２５８】
【表３−３】
2019537447.tif 000007
【０２５９】
【表３−４】
2019537447.tif 000008
【０２６０】
【表３−５】
2019537447.tif 000009
【０２６１】
【表３−６】
2019537447.tif 000010
【０２６２】
【表３−７】
2019537447.tif 000011
【０２６３】
６〜８週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを対照ベクターまたはワクチンのいずれかで処置し、Ｂｉｏｊｅｃｔ皮内送達によって０、７および１４日目に免疫処置した。マウスをミョウバンアジュバントありの組換えアレルゲン（５μｇ／マウス）で４２日目にブーストし、２１、３５および５６日目に採血した。
【０２６４】
血清試料を１％のＢＳＡ含有ＰＢＳ中で１：１００（２１日目）、１：２０００（３５日目）または１：５０００（５６日目）倍希釈した。５６日目、試料を１：３で７回の段階希釈によってさらに希釈し、エンドポイント抗体力価を測定した。ＩｇＥを検出するため、血清をＡｇａｒｏｓｅ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で５０分間処理し、次いで、１：２０に希釈した試料をＥＬＩＳＡプレートに負荷した。試料を、ヤギ抗マウスＩｇＧ１−ＨＲＰ、ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌ）、またはラット抗マウス−ＩｇＥ−ビオチン（Ｒ３５−１１８、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の後にＰｉｅｒｃｅ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて検出した。反応を、ＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用いて発色させ、ＴＭＢ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを用いて停止させた。プレートの読み取り（ＯＤ４５０）を、Ｅｐｏｃｈ  ＥＬＩＳＡ  ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）を使用することによって行った。エンドポイント力価は、バックグラウンド平均（ＰＢＳ）より上の読み値を２回差し引くことにより求めた。各群のエンドポイント力価またはＯＤ４５０値の平均および標準誤差を、Ｅｘｃｅｌの統計機能を使用することによって解析した。ＩｇＥデータを、スチューデントのＴ検定を使用することによって解析した。検定は両側であり、ｐ値≦０．０５を有意とみなした。
【０２６５】
本明細書に記載のことの変形、修正および他の実施は、本発明および特許請求の範囲の趣旨および範囲から逸脱することなく当業者に思いつくであろう。具体的に示した特許、特許出願、国際出願および参考文献はすべて、引用によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
【図１】
2019537447.tif 000012
【図２】
2019537447.tif 000013
【図３】
2019537447.tif 000014
【図４−１】
2019537447.tif 000015
【図４−２】
2019537447.tif 000016
【図４−３】
2019537447.tif 000017
【図４−４】
2019537447.tif 000018
【図４−５】
2019537447.tif 000019
【図４−６】
2019537447.tif 000020
【図４−７】
2019537447.tif 000021
【図４−８】
2019537447.tif 000022
【図４−９】
2019537447.tif 000023
【図４−１０】
2019537447.tif 000024
【図４−１１】
2019537447.tif 000025
【図４−１２】
2019537447.tif 000026
【図４−１３】
2019537447.tif 000027
【図４−１４】
2019537447.tif 000028
【図４−１５】
2019537447.tif 000029
【図４−１６】
2019537447.tif 000030
【図４−１７】
2019537447.tif 000031
【図４−１８】
2019537447.tif 000032
【図４−１９】
2019537447.tif 000033
【図４−２０】
2019537447.tif 000034
【図４−２１】
2019537447.tif 000035
【図４−２２】
2019537447.tif 000036
【図４−２３】
2019537447.tif 000037
【配列表】
2019537447000001.app
【国際調査報告】
2019537447.tif 000038
2019537447.tif 000039
2019537447.tif 000040
2019537447.tif 000041
2019537447.tif 000042
2019537447.tif 000043
2019537447.tif 000044