(57)【要約】  本発明は、概して、がん生物学の分野に関する。本明細書中に提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、ＬＲＧ５と特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与して特定のがんを治療することに関する。
2019509322.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）と特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体の有効量を、それを必要とするヒト対象に投与することを含む転移性大腸がんを患っている前記ヒト対象の治療方法であって：
前記モノクローナル抗体は、配列番号１３を含む重鎖および配列番号１４を含む軽鎖を含み；
前記モノクローナル抗体は、少なくとも４週間、毎週静脈内に投与され；
前記モノクローナル抗体の投与量は、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇである、前記方法。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体を、フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンと併用して投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体の初回用量を、フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンの投与前に投与する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記イリノテカンの初回用量は約１８０ｍｇ／ｍ２であり、約９０分かけて投与し；前記フォリン酸の初回用量は約４００ｍｇ／ｍ２であり、約１２０分かけて、かつ、前記イリノテカンの初回用量と同時に投与し；前記フルオロウラシルの初回用量は約４００ｍｇ／ｍ２であり、前記フォリン酸の初回用量の投与後に投与し；前記フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンを１４日毎に投与する、請求項３に記載の方法
【請求項５】
ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）と特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含むがんを患っている前記対象の治療方法であって：
前記モノクローナル抗体は、配列番号１３を含む重鎖および配列番号１４を含む軽鎖を含み；
前記モノクローナル抗体は、少なくとも４週間、毎週静脈内に投与され；
前記モノクローナル抗体の投与量は、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇである、前記方法。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体を、化学療法薬と併用して投与する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記化学療法薬が、フォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン、ゲムシタビンおよびナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル（アブラキサン）からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記モノクローナル抗体の初回用量を、化学療法薬の投与前に投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記モノクローナル抗体を、フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンと併用して投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体の初回用量を、フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンの投与前に投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記イリノテカンの初回用量は約１８０ｍｇ／ｍ２であり、約９０分かけて投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記フォリン酸の初回用量は約４００ｍｇ／ｍ２であり、約１２０分かけて、かつ、前記イリノテカンの初回用量と同時に投与する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記フルオロウラシルの初回用量は約４００ｍｇ／ｍ２であり、前記フォリン酸の初回用量の投与後に投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンを１４日毎に投与する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記モノクローナル抗体を、ベバシズマブ、アフリベルセプト、セツキシマブ、およびパニツムマブからなる群から選択される追加の治療薬と併用して投与する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記がんが、固形腫瘍を含む、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記がんが、結腸がん、大腸がん、膵がん、乳がん、および肺がんからなる群から選択される、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記がんが、ＡＰＣ変異を含む結腸がん、ＫＲＡＳ変異を含む結腸がん、転移性大腸がん、転移性膵がん、トリプルネガティブ乳がん、および小細胞肺がんからなる群から選択される、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記がんが、転移性大腸がんである、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の方法
【請求項２０】
前記対象が、前記モノクローナル抗体の投与前に転移性疾患の化学療法による少なくとも１例の無効例の前治療歴；既知の脳転移がないこと；平均余命１２週間以上であること；前記モノクローナル抗体の投与前の前記１４日間中に成長因子の助けなしに約１５００細胞／ｍＬを超える好中球絶対数を有すること；前記モノクローナル抗体の投与前の前記１４日間中に輸血なしで１００，０００血小板／ｍＬを超える血小板数を有すること；９．０ｇ／ｄＬ以上のヘモグロビンを有すること；および３ｇ／ｄＬ以上の血清アルブミンを有することからなる群から選択される特徴を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が、哺乳類である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が、ヒトである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）と特異的に結合する用量のヒト化モノクローナル抗体、および適切な医薬用担体を含む医薬組成物を収容する容器であって、前記用量のモノクローナル抗体が約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇである、前記容器。
【請求項２４】
前記医薬組成物が静脈内投与に適している、請求項２３に記載の容器。
【請求項２５】
転移性大腸がんの治療用途のロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）と特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体であって、
前記モノクローナル抗体は、配列番号１３を含む重鎖および配列番号１４を含む軽鎖を含み；
前記モノクローナル抗体は、少なくとも４週間、毎週静脈内に投与され；
前記モノクローナル抗体の投与量は、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇである、
前記ヒト化モノクローナル抗体。
【請求項２６】
前記モノクローナル抗体を、フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンと併用して投与する、転移性大腸がんの治療用途の請求項２５に記載のヒト化モノクローナル抗体。
【請求項２７】
前記モノクローナル抗体の初回用量を、前記フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンの投与前に投与する、転移性大腸がんの治療用途の請求項２６に記載のヒト化モノクローナル抗体。
【請求項２８】
前記イリノテカンの初回用量は約１８０ｍｇ／ｍ２であり、約９０分かけて投与し；前記フォリン酸の初回用量は約４００ｍｇ／ｍ２であり、約１２０分かけて、かつ、前記イリノテカンの初回用量と同時に投与し；前記フルオロウラシルの初回用量は約４００ｍｇ／ｍ２であり、前記フォリン酸の初回用量の投与後に投与し；前記フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンを１４日毎に投与する、転移性大腸がんの治療用途の請求項２５に記載のヒト化モノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１６年３月２２日に出願され、「抗ＬＧＲ５モノクローナル抗体の投与」と題された米国特許仮出願第６２／３１１，６３１号（参照することにより本明細書に組み入れられるものとする）の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、概して、がん生物学の分野に関する。本明細書中に提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）と特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与して特定のがんを治療することに関する。
【０００３】
配列リストの参照
本願は、電子フォーマット式配列リストと共に出願されるものである。配列リストは、約４０Ｋｂのサイズであり、２０１７年３月８日に作成し、ＢＩＯＮＯ１４ＷＯＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧという題のファイルとして提供される。この配列リストの電子フォーマットの情報は、その全文を参照することにより本明細書に組み入れられるものとする。
【背景技術】
【０００４】
ＧＰＲ４９／ＨＧ３８／ＦＥＸとしても公知であるロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）は、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体（ＬＧＲ）／糖タンパク質ホルモン受容体と構造的に類似する受容体タンパク質のＧタンパク質共役受容体（ＧＰＲ）タンパク質ファミリーに属する。ＬＧＲは、３つのサブグループに分けられる：（１）甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）受容体、および黄体ホルモン（ＬＨ）受容体を含む糖タンパク質ホルモン受容体；（２）リラキシン受容体ＬＧＲ７およびＬＧＲ８；ならびに（３）ＬＧＲ４、ＬＧＲ５、およびＬＧＲ６。ＬＧＲ５は、腸、骨格筋、胎盤、脳、および脊髄を含むいくつかの組織において発現される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本明細書中提供される方法および組成物の実施形態としては、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）と特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む転移性大腸がんを患っているヒト対象の治療方法であって、該モノクローナル抗体は配列番号１３を含む重鎖および配列番号１４を含む軽鎖を含み；該モノクローナル抗体は、少なくとも４週間、毎週静脈内に投与され；および該モノクローナル抗体の投与量は、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇである該方法が挙げられる。
【０００６】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体を、フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンと併用して投与する。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体の初回用量を、フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンの投与前に投与する。いくつかの実施形態では、イリノテカンの初回用量は約１８０ｍｇ／ｍ２であり、約９０分かけて投与し；フォリン酸の初回用量は約４００ｍｇ／ｍ２であり、約１２０分かけて、かつ、イリノテカンの初回用量と同時に投与し；フルオロウラシルの初回用量は約４００ｍｇ／ｍ２であり、フォリン酸の初回用量の投与後に投与し；フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンを１４日毎に投与する。
【０００７】
本明細書中提供される方法および組成物の実施形態としては、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）と特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含むがんを患っている対象の治療方法であって、該モノクローナル抗体は配列番号１３を含む重鎖および配列番号１４を含む軽鎖を含み；該モノクローナル抗体は、少なくとも４週間、毎週静脈内に投与され；および該モノクローナル抗体の投与量は、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇである該方法が挙げられる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体を、化学療法薬と併用して投与する。いくつかの実施形態では、化学療法薬が、フォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン、ゲムシタビンおよびナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル（アブラキサン）からなる群から選択される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体の初回用量を、化学療法薬の投与前に投与する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体を、フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンと併用して投与する。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体の初回用量を、フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンの投与前に投与する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、イリノテカンの初回用量は約１８０ｍｇ／ｍ２であり、約９０分かけて投与する。いくつかの実施形態では、フォリン酸の初回用量は約４００ｍｇ／ｍ２であり、約１２０分かけて、かつ、イリノテカンの初回用量と同時に投与する。いくつかの実施形態では、フルオロウラシルの初回用量は約４００ｍｇ／ｍ２であり、フォリン酸の初回用量の投与後に投与する。いくつかの実施形態では、フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンを１４日毎に投与する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体を、ベバシズマブ、アフリベルセプト、セツキシマブ、およびパニツムマブからなる群から選択される追加の治療薬と併用して投与する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、がんが、固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんが、結腸がん、大腸がん、膵がん、乳がん、および肺がんからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、がんは、ＡＰＣ変異を含む結腸がん、ＫＲＡＳ変異を含む結腸がん、転移性大腸がん、転移性膵がん、トリプルネガティブ乳がん、および小細胞肺がんからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、がんが、転移性大腸がんである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、対象が、モノクローナル抗体の投与前に転移性疾患の化学療法による少なくとも１例の無効例の前治療歴；既知の脳転移がないこと；平均余命１２週間以上であること；モノクローナル抗体の投与前の１４日間中に成長因子の助けなしに約１５００細胞／ｍＬを超える好中球絶対数を有すること；モノクローナル抗体の投与前の１４日間中に輸血なしで１００，０００血小板／ｍＬを超える血小板数を有すること；９．０ｇ／ｄＬ以上のヘモグロビンを有すること；および３ｇ／ｄＬ以上の血清アルブミンを有することからなる群から選択される特徴を有する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、対象が、哺乳類、例えば、ヒトである。
【００１６】
本明細書中提供される方法および組成物の実施形態としては、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）と特異的に結合するヒト化モノクローナル抗
体の用量、および適切な医薬用担体を含む医薬組成物を収容する容器であって、モノクローナル抗体の用量が約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇである該容器が挙げられる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与に適している。
【００１７】
本明細書中提供される方法および組成物の実施形態としては、転移性大腸がんの治療用途のロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）と特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体は、配列番号１３を含む重鎖および配列番号１４を含む軽鎖を含み；該モノクローナル抗体は、少なくとも４週間、毎週静脈内に投与され；および該モノクローナル抗体の投与量は、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇである該ヒト化モノクローナル抗体が挙げられる。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体を、フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンと併用して投与する。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体の初回用量を、フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンの投与前に投与する。いくつかの実施形態では、イリノテカンの初回用量は約１８０ｍｇ／ｍ２であり、約９０分かけて投与し；フォリン酸の初回用量は約４００ｍｇ／ｍ２であり、約１２０分かけて、かつ、イリノテカンの初回用量と同時に投与し；フルオロウラシルの初回用量は約４００ｍｇ／ｍ２であり、フォリン酸の初回用量の投与後に投与し；フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンを１４日毎に投与する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ヒト化モノクローナル抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の、ヒトＬＧＲ５（ＣＨＯ）との直接ＦＡＣＳ結合を示すグラフである。
【図２】ＣＴ３  ＣＲＣ腫瘍体積に対する単独および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３との併用で用いたＦＯＬＦＩＲＩの効果を示すグラフである。
【図３】１８Ｇ７Ｈ６Ａ３治療が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＬＭ３原発腫瘍体積を有意に縮小したことを示すグラフである。
【図４】ＣＴ１またはＣＴ３腫瘍を有するマウスのＦｏｌＦｉｒｉ療法が、ＬＧＲ５の上方制御をもたらすことを示すグラフである。
【図５】化学療法が、ＪＨ１０９腫瘍におけるＬＧＲ５の上方制御（４倍超）をもたらすことを示す棒グラフである。
【図６】化学療法（ゲムシタビン）と併用して投与される場合に観察された１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の顕著な活性を示すグラフである。
【図７】抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が、ＣＴ１がん幹細胞集団における生存事象数を減少させることを示す点プロットである。
【図８】ＦＯＬＦＩＲＩと併用して抗ＬＧＲ５抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療したマウスから単離した細胞は、ＦＯＬＦＩＲＩ単独で治療したマウスから単離した細胞と比較して、腫瘍形成能を非常に低下させたことを示す線グラフである。
【図９】１８Ｇ７Ｈ６Ａ３  ＦＯＬＦＩＲＩの併用から再移植細胞が、進行までの時間を有意に遅らせたことを示す線グラフである。
【図１０】化学療法（ＦＯＬＦＩＲＩ）と併用して予防的に投与される場合に観察されたヒト化抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の顕著な活性を示す線グラフである。
【図１１】抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、ホスホ−Ｔｈｒ４１／Ｓｅｒ４５−β−カテニン免疫アッセイにより示されたインビボ腫瘍細胞におけるＷｎｔシグナル伝達を阻害することができることを示す点プロットである。
【図１２】可溶な抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の濃度増加は、Ｗｎｔ３ａ＋ＲＳＰＯ２の併用によるＴＣＦ／ＬＥＦプロモーター誘導ＧＦＰ発現の誘導に影響を及ぼさず、抗ＬＧＲ５抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３はＲＳＰＯ誘導ＴＣＦ／ＬＥＦプロモーター活性を遮断しないことを示す棒グラフである。ポジティブコントロール抗体Ｃ１２は、Ｗｎｔ３ａ／ＲＳＰＯ２誘導ＴＣＦ／ＬＥＦプロモーター活性を阻害することが分かる。
【図１３】Ｒ−スポンジンは、ＬＧＲ５と結合する抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を遮断しないことを示す折れ線グラフである。
【図１４】ＬＧＲ５と結合する抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、三元複合体の生成を阻害することを示す棒グラフである。
【図１５】治療サンプルにおけるＬＧＲ５の発現レベルを示す。
【図１６】治療サンプルにおけるＣＴＮＮＢ１発現、およびｐ−β−カテニン発現のレベルを示す。
【図１７−１】様々な治療サンプルにおける差次的に発現された転写産物を示す。
【図１７−２】図１７−１のつづき。
【図１７−３】図１７−２のつづき。
【図１８】１８Ｇ７Ｈ６Ａ３−（ＢＮＣ１０１）治療腫瘍における差次的に発現された遺伝子を示す。
【図１９】ＦＯＬＦＩＲＩ治療腫瘍における差次的に発現された遺伝子を示す。
【図２０】併用治療腫瘍における差次的に発現された遺伝子を示す。
【図２１−１】循環ＨＬＡ＋細胞におけるＬＧＲ５のレベルを示す。
【図２１−２】図２１−１のつづき。
【図２２Ａ】図２２Ａは、循環ＨＬＡ＋細胞におけるＬＧＲ５のレベルを示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、循環ＨＬＡ＋細胞におけるＬＧＲ５のレベルを示す。
【図２３】ゲムシタビン／アブラキサンまたはゲムシタビン／アブラキサンおよび１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療したマウスの動物生存率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書中提供される方法および組成物のいくつかの実施形態は、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５（ＬＧＲ５）と特異的に結合するヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントを投与して特定のがんを治療することに関する。このようなヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントの実施形態は、２０１７年１０月８日に公開されたＰＣＴ国際公開第２０１５／１５３９１６号（その全文を参照することにより組み入れられるものとする）に開示されている。
【００２０】
ＬＧＲ５は、腸中の正常幹細胞および腫瘍開始細胞の極めて特異的マーカーとして系統追跡研究により同定された。以前に、その発現がＷｎｔ発現の抑止後にクエンチされた約１５０遺伝子が同定された。これらの「Ｗｎｔ標的遺伝子」の網羅的な特性解析により、ＬＧＲ５が、陰窩基底部において１０〜１４の増殖する楔状の細胞集団で選択的に発現されることが分かった。これらの陰窩基底部円柱細胞は、幹細胞集団の候補であると以前に提案された。遺伝性ｌａｃＺ−ＬＧＲ５レポーター遺伝子を用いたインビボ系統追跡を使用して、ＬＧＲ５腸管幹細胞は、陰窩基底部から開始し絨毛先端へ伸長するｌａｃＺ＋子孫細胞の途切れないリボンを生じる成人腸管幹細胞集団の自己再生する多分化能であることが確認された。
【００２１】
がん幹細胞（ＣＳＣ）に対するＬＧＲ５の特異的発現は、選択的および効果的にＣＳＣを標的化する機会を提供する。ＬＧＲ５は、正常な組織と比較して、大腸がん細胞（ＣＲＣ）、膵臓および大部分の他の固形腫瘍において高度に過剰発現され、これにより、ＣＲＣ、膵がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、胃がんおよび肝がんにおいてＣＳＣを標的化する広い治療濃度域を提供する。
【００２２】
ＣＲＣにおけるゲートキーパー変異は、大腸腺腫症（ＡＰＣ）の欠損であり、通常、結腸陰窩における幹細胞自己再生と分化のバランスを調節するように作用するＷｎｔシグナル伝達の異常活性化をもたらす。腸管幹細胞におけるＷｎｔシグナル伝達の調節不全は、悪性ＣＲＣへの前駆体である結腸における腺腫性ポリープの形成を引き起こす。ＬＧＲ５幹細胞は、誘導性ＡＰＣ遺伝子ノックアウトマウスを、そのＬＧＲ５幹細胞が４種（ＧＦＰ／ＹＦＰ／ＥＣＦＰ／ＲＦＰ）の蛍光遺伝子マーカーの１つを用いて特異的におよびラ
ンダムに標識化されたマウスと交配したストラテジーを使用して、これらのマウス腸管腫瘍の起源または根源であると確認された。ＡＰＣ欠失誘導４週間後の単色腫瘍（すなわち、全ＧＦＰまたは全ＲＦＰ）の外観は、これらの腫瘍が１つのＬＧＲ５幹細胞に起因することを確証させた。さらに、このモデルは、ＬＧＲ５幹細胞中の蛍光遺伝子タグが、異なる色に反転することを可能とし、その結果、赤い腫瘍を生成するＲＦＰ＋ＬＧＲ５がん幹細胞は、まだ腫瘍を播種しているが以前の全ての赤いＧＦＰ＋腫瘍塊に浸潤する青い腫瘍細胞を今生じているＥＣＦＰ＋ＬＧＲ５がん幹細胞への途中の流れの中で形質転換することができた。この反転実験は、ＬＧＲ５  ＣＳＣが腸管腫瘍の成長を開始および播種することができる腸管腫瘍の起源であることだけでなく、これらが腫瘍形成を継続的に維持する（すなわち、長期再構築能を有する）ことのさらなる確証を提供した。
【００２３】
がんにおけるＬＧＲ５の機能的役割は、リボ核酸干渉（ＲＮＡｉ）ノックダウン試験により確証された。ＣＲＣ腫瘍セルラインのパネル中のＬＧＲ５のノックダウンは、インビトロ軟寒天コロニーの成長、およびインビボＨＣＴ１１６結腸腫瘍異種移植の成長も著しく阻害した。その後、ＬＧＲ５  ＲＮＡｉノックダウンは、インビトロ患者由来のＣＲＣ腫瘍細胞からのＣＳＣコロニーの成長も低下させることが示された。最終的に、分類されたＬＧＲ５＋患者由来異種移植ＣＲＣ腫瘍細胞は、コントロールＬＧＲ５細胞と比較して、インビボで高い腫瘍形成能を有することが分かった。
【００２４】
ＣＳＣは、外科手術および標準治療の化学療法で治療された多くのがん患者の高頻度の腫瘍再発の原因となると考えられる。例えば、乳がん患者からのＣＤ４４＋ＣＳＣは、化学療法後に高濃度になり、高レベルのＣＳＣは化学療法に対する臨床反応不良と関連付けられることが分かった。同様に、転移性ＣＲＣにおいて、ＬＧＲ５の発現は、化学療法後に傷害肝において発現が上方制御され、化学療法に応答してＬＧＲ５  ＣＳＣ増加は転移性疾患を開始および／または苛立たせることを示唆している。実際に、ＬＧＲ５の発現は、原発ＣＲＣ腫瘍と比較して、転移性部位において有意に大きいことが分かった。
【００２５】
抗ＬＧＲ５抗体
本明細書中で使用されるとき、「抗体」という語は、これらに限定されないが、合成抗体、モノクローナル抗体、組換え製造された抗体、細胞内抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、合成抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）（二重特異性ｓｄＦｖを含む）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを含む。本明細書中提供されるいくつかの実施形態の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはより多重特異性であってよい。多重特異性抗体は、ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であってもよく、非相同性ポリペプチドまたは固形支持材料などの非相同エピトープだけでなく、ポリペプチドの両方に特異的であってもよい。例えば、ＰＣＴ国際公開第９３／１７７１５号；国際公開第９２／０８８０２号；国際公開第９１／００３６０号；国際公開第９２／０５７９３号；Ｔｕｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：６０−６９  （１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号；同第４，７１４，６８１号；同第４，９２５，６４８号；同第５，５７３，９２０号；同第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：１５４７−１５５３  （１９９２）（これら各々は、その全文を参照することにより本明細書中に組み入れられるものとする）参照。
【００２６】
本明細書中で使用されるとき、ＬＧＲ５としては、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００３６５８．１またはそのフラグメント（ＮＭ＿００３６６７．２内のコードヌクレオチド配列またはそのフラグメントによりコードされる）のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００３６５８．１のアミノ酸配列および全エントリ
ーならびにＮＭ＿００３６６７．２のヌクレオチド配列および全エントリーは、これら全体を参照することにより完全に組み入れられるものとする。本明細書中考えられるＬＧＲ５フラグメントの例としては、ＬＧＲ５外部ドメイン、膜貫通ドメイン、または細胞内ドメインおよびその部分が挙げられる。
【００２７】
いくつかの実施形態は、下記実施例において製造、記載されている１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１として設計される抗ＬＧＲ５抗体を含む抗ＬＧＲ５抗体の軽鎖および／または重鎖を産生するハイブリドーマに関する。１つの態様では、ハイブリドーマは、下記実施例において製造、記載されている１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１のものなどのヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖および／または重鎖を産生する。
【００２８】
いくつかの実施形態は、下記実施例において製造、記載されている１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１として設計される抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つを含む抗ＬＧＲ５抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする核酸分子に関する。いくつかの態様では、核酸分子は、下記実施例において製造、記載されている抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１のものなどのヒト化または完全ヒトモノクローナル抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする。
【００２９】
様々な実施形態では、下記実施例において製造、記載されている１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１として設計される抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つを含む抗ＬＧＲ５抗体の軽鎖および／または重鎖をコードする核酸分子もしくは分子を含むベクターを対象とする。
【００３０】
様々な実施形態では、抗体のグリコシル化を修飾することができる。例えば、脱グリコシル化抗体を製造することができる（すなわち、抗体はグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、標的抗原に対する抗体親和性を増大するように変更することができる。このような炭水化物の修飾を、例えば、抗体配列内で１つ以上の部位のグリコシル化を変更することにより行うことができる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の脱離によってこの部位においてグリコシル化の消失をもたらす１つ以上のアミノ酸置換を行うことができる。このような脱グリコシル化が抗原に対する抗体親和性を増大してもよい。このようなアプローチは、 米国特許第５，７１４，３５０号および同第６，３５０，８６１号（これらの各々はその全文を参照することにより本明細書中に組み入れられるものとする）にさらに詳細に記載されている。
【００３１】
いくつかの実施形態では、抗体は、 ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００３６５８．１（配列番号４７）またはそのフラグメントのヒトＬＧＲ５ポリペプチドと、少なくとも６０％の同一性、または少なくとも７０％の同一性、または少なくとも８０％の同一性、または少なくとも８５％の同一性、または少なくとも９０％の同一性、または少なくとも９５％の同一性、または少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するＬＧＲ５ポリペプチドを含むかまたはからなるポリペプチドと特異的に結合する。このようなフラグメントは、例えば、ＬＧＲ５ポリペプチドの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、もしくは９００の連続または非連続アミノ酸または前述の長さのいずれかの間のいずれかの数の連続または非連続アミノ酸であり得る。
【００３２】
いくつかの実施形態では、抗体は抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３であり、配列番号１３の重鎖アミノ酸配列および配列番号１１のＤＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３であり、配列番号１９を含む重鎖可変ドメインを有する。いくつかの
実施形態では、抗体は抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３であり、 配列番号１４の軽鎖配列を含む。他の実施形態では、抗体は抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３であり、 配列番号２１の軽鎖可変ドメインを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、抗体は、上記配列の配列と８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性である配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、上記配列の重鎖、軽鎖、または可変ドメインの２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、または１１８残基にわたって上記抗体配列と１００％同一性である配列を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、抗体は、抗体配列と８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性である配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体配列と８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一性である配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、または１１１残基にわたって抗体配列と１００％同一性である配列を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される抗ＬＧＲ５抗体は、ＧＹＳＦＴＡＹＷ（配列番号２３）を含む重鎖ＣＤＲ１、ＩＬＰＧＳＤＳＴ（配列番号２）を含む重鎖ＣＤＲ２、およびＡＲＳＧＹＹＧＳＳＱＹ（配列番号３）を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される抗ＬＧＲ５抗体は、ＥＳＶＤＳＹＧＮＳＦ（配列番号４）を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＬＴＳを含む軽鎖ＣＤＲ２、およびＱＱＮＡＥＤＰＲＴ（配列番号３３）を含む重軽鎖ＣＤＲ３を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される抗ＬＧＲ５抗体は：（ａ）１、２、３、または４アミノ酸置換を有する上記配列の変異体を含む重鎖ＣＤＲ１を含む。抗体は、１、２、３、または４アミノ酸置換を含む多様体を有する重鎖ＣＤＲ２を有してもよい。抗体は、１、２、３、または４アミノ酸置換を含む変異体を有する重鎖ＣＤＲ３を有してもよい。重鎖のこれらの修飾に加えて、抗体は、１、２、３、または４アミノ酸置換を含む変異体を有する軽鎖ＣＤＲ１を有してもよい。抗体は、１、２、３、または４アミノ酸置換を含む変異体を有する軽鎖ＣＤＲ２を有してもよい。抗体は、１、２、３、または４アミノ酸置換を有する軽鎖ＣＤＲ３を有してもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は保存アミノ酸置換である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される抗ＬＧＲ５抗体は、添付の配列リスト中、本明細書で記載された配列と少なくとも８０％または９０％配列同一性を有する重鎖可変領域を含む抗体を含む。抗体は、本明細書で記載された抗体配列と少なくとも８０％または９０％配列同一性を有する軽鎖可変領域を有してもよい。
【００３８】
２つのアミノ酸配列（または２つの核酸配列）のパーセント同一性を、例えば、最適比較目的のための配列アラインメント（例えば、第一配列の配列においてギャップを導入することができる）により決定することができる。それから、対応する位置におけるアミノ酸またはヌクレオチドを比較し、２つの配列間のパーセント同一性は配列により共有される同じ位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同位置数／位置の総数×１００）。この２つの配列の実際の比較を、周知の方法により、例えば、数学アルゴリズムにより行うことができる。このような数学アルゴリズムの特定の非限定的例は、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：５８７３−５８７７  （１９９３）（これはその全文を参照することにより本明細書中に組み入れられるものとする）に記載されている。このようなアルゴリズムを、Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２９：２９９４−３００５  （２００１）（その全文を参照することにより本明細書中に組み入れられるものとする）に記載されているように、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラム（バージョン２．２）に組込む。ＢＬＡＳＴおよびギャップドＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＮ）の初期パラメーターを使用することができる。２００２年４月１０日に利用可能な範囲でｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照。１つの実施形態では、検索されたデータベースは、非冗長の（ＮＲ）データベースであり、配列比較のためのパラメーターを：フィルターなし；期待値１０；語長３で設定することができ；マトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２であり、ならびにギャップコストは１１のＥｘｉｓｔｅｎｃｅおよび１のＥｘｔｅｎｓｉｏｎを有する。
【００３９】
いくつかの実施形態は、可変軽（ＶＬ）ドメインおよび／または可変重（ＶＨ）ドメイン中に１つ以上のアミノ酸残基を含み、下記実施例で製造、記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１として設計される抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つを含む上記抗体の変異体も包含する。いくつかは、１つ以上のＶＬ  ＣＤＲおよび／または１つ以上のＶＨ  ＣＤＲ中に１つ以上の追加のアミノ酸残基置換を有する上記抗体の変異体も包含する。上記抗体のＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメインおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ中への置換の誘導により生成された抗体を、インビトロおよびインビボ、例えば、ＬＧＲ５とのその結合能について試験することができる（例えば、これらに限定されないが、ＥＬＩＳＡおよびＢＩＡｃｏｒｅを含む免疫アッセイによる）。
【００４０】
様々な実施形態として、ＬＧＲ５と特異的に結合する下記実施例で製造、記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１として設計される抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つなどの、抗ＬＧＲ５抗体のＶＨドメイン、ＶＨ  ＣＤＲ、ＶＬドメイン、またはＶＬ  ＣＤＲの誘導体を含むＬＧＲ５と特異的に結合する抗体が挙げられる。当業者に公知の標準技術を使用して、例えば、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在性変異誘発を含む、抗体をコードするヌクレオチド配列中の変異（例えば、付加、欠失、および／または置換）を誘導することができる。１つの実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ誘導体としては、元のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲに対して、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、または２未満のアミノ酸置換が挙げられる。別の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ誘導体は、１つ以上の予測される非必須アミノ酸残基（すなわち、抗体がＬＧＲ５と特異的に結合するために重要でないアミノ酸残基）において成される保存アミノ酸置換（例えば、上記）を有する。あるいは、飽和変異誘発によるなど、ＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲコード配列の全
部または部分に沿ってランダムに変異を導入することができ、得られた変異体を生物活性に対してスクリーニングして活性を保持する変異体を同定することができる。変異誘発後、コードされた抗体を発現させることができ、抗体活性を決定することができる。
【００４１】
いくつかの実施形態は、ＬＧＲ５と特異的に結合する抗体またはそのフラグメントも包含し、該抗体は、下記実施例で製造、記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１として設計されるものを含む抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つを含む本明細書に記載された抗体のいずれかの可変重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列と、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一性である可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列を含む。
【００４２】
別の実施形態は、下記実施例で製造、記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１として設計される抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つなどの、抗ＬＧＲ５抗体のいずれか部分における保存アミノ酸置換の導入を含む。「保存的アミノ酸置換」が機能的に均等なアミノ酸を置換するアミノ酸置換を表すことは、当技術分野では周知である。保存アミノ酸変化は、得られたペプチドのアミノ酸配列においてサイレント変化をもたらす。例えば、同様の極性の１つ以上のアミノ酸は機能的均等物として作用し、ペプチドのアミノ酸配列内のサイレント変化をもたらす。中性荷電である置換、およびより小さい残基によって残基を置換する置換を、たとえこの残基が異なる基であっても「保存的置換」と見なしてもよい（例えば、より小さいイソロイシンによるフェニルアラニンの置換）。類似の側鎖を有するアミノ酸ファミリーが当技術分野において定義されている。保存的アミノ酸置換のいくつかのファミリーを、表１に示す。
【表１】
2019509322.tif 000003
【００４３】
抗ＬＧＲ５抗体を用いたがん幹細胞成長の遮断
いくつかの実施形態は、抗ＬＧＲ５抗体を用いたインビトロおよびインビボでのがん肝細胞成長の遮断に関する。いくつかの実施形態では、肝細胞増殖の遮断方法は、がん幹細胞への抗ＬＧＲ５抗体の有効量を投与することを含み、該抗ＬＧＲ５抗体の有効量は該がん幹細胞の成長を低下させるのに充分である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、肝細胞増殖の遮断方法は、がん幹細胞への抗ＬＧＲ５抗体の有効量を投与することを含み、該抗ＬＧＲ５抗体の有効量は該がん幹細胞の増殖を低下さ
せるもしくは遮断する、または成長を低下させるまたは遮断するのに充分である。
【００４５】
いくつかの態様では、抗ＬＧＲ５抗体の有効量をインビトロでがん幹細胞に投与する。他の態様では、抗ＬＧＲ５抗体の有効量をインビボでその治療を必要とする患者のがん幹細胞に投与する。
【００４６】
本明細書中で使用されるとき、「がん幹細胞」という語は、大規模にまたは無制限に増殖することができ、がん中に大部分のがん細胞を生じる細胞を表す。いくつかの態様では、該大部分のがん細胞は、所与のがん中のがん細胞の大部分を表す。例証のためであり限定されないが、がん幹細胞は、がんの塊の大部分を含む、腫瘍の創始細胞またはがん細胞の前駆体であり得る。いくつかの態様では、がん幹細胞は、細胞へのいずれかの追加の変異または外来性細胞増殖誘発または発がん物質の導入なしで、免疫無防備状態の個体に移植する場合、分裂して１つ以上の腫瘍を形成する細胞を言う。いくつかの態様では、がん幹細胞は、分裂して追加のがん幹細胞ならびに最終分化したがん細胞またはがん組織を産生する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、がん幹細胞成長、増殖、または生存能を、ＬＧＲ５−ＲＳｐｏ結合またはシグナル伝達による干渉なしに遮断する。いくつかの実施形態では、がん幹細胞成長、増殖、または生存能を、ＬＧＲ５−ＲＳｐｏ結合またはシグナル伝達による干渉なしに、ＷｎｔによるＬＧＲ５シグナル伝達の遮断または阻害により遮断する。
【００４８】
がん幹細胞成長の遮断に関して使用されるとき、「有効量」という語は、いかなる程度によっても、がん幹細胞の成長を低下するのに充分な抗ＬＧＲ５抗体の量を表す。当技術分野で公知のいずれものアッセイを使用してがん幹細胞成長を測定することができる。例えば、がん幹細胞成長を、コロニー数、細胞総数、または細胞集団もしくはコロニーの体積／大きさにより測定することができる。いくつかの実施形態では、がん幹細胞成長を、下記実施例１に記載された腫瘍様塊成長アッセイ（tumor sphere growth assay）により測定することができる。
【００４９】
特定の実施形態では、抗ＬＧＲ５抗体の有効量は、がん幹細胞集団もしくは腫瘍様塊（tumorsphere）成長において、測定したとき、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の低下まで、または前述の数のいずれかの間のいずれかのパーセントまでがん幹細胞成長を遮断することができる。いくつかの態様では、抗ＬＧＲ５抗体は、下記実施例で製造、記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１として設計される抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つまたは組合せである。
【００５０】
例えば、いくつかの実施形態では、抗ＬＧＲ５抗体の有効量は、がん幹細胞集団または腫瘍様塊成長において、測定したとき、少なくとも約５％〜９９％、５％〜８０％、５〜４０％、１０％〜９９％、１０〜８０％、１０〜６０％、１０％〜４０％、２０〜９９％、２０％〜８０％、２０％〜６０％、２０％〜４０％、５０％〜９８％、５０％〜８０％、または６０％〜９９％の低下までがん幹細胞成長を遮断することができる。いくつかの態様では、抗ＬＧＲ５抗体は、下記実施例で製造、記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１として設計される抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つまたは組合せである。
【００５１】
他の実施形態では、抗ＬＧＲ５抗体の有効量は、がん幹細胞集団または腫瘍様塊成長において、測定したとき、少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、２０
０倍、もしくは１０００倍低下、または前述の数のいずれかの間のいずれか倍低下するまでがん幹細胞成長を遮断することができる。いくつかの態様では、抗ＬＧＲ５抗体は、下記実施例で製造、記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１として設計される抗ＬＧＲ５抗体のいずれか１つまたは組合せである。
【００５２】
いくつかの実施形態では、上記のいずれかの程度までがん幹細胞成長を遮断するのに充分な抗ＬＧＲ５抗体の有効量は、約１ｎＭ、５０ｎＭ、７５ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、５０μＭ、７５μＭ、１００μＭ、１５０μＭ、２００μＭ、２５０μＭ、３００μＭ、３５０μＭ、４００μＭ、５００μＭ、５５０μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、７５ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭ、８００ｍＭ、９００ｍＭ、１０００ｍＭ、１Ｍ、５Ｍ、１０Ｍ、１５Ｍ、２０Ｍ、２５Ｍ、３０Ｍ、３５Ｍ、４０Ｍ、４５Ｍ、５０Ｍ、７５Ｍ、１００Ｍの濃度、または前述の濃度のいずれか２つの間のいずれか数である。いくつかの態様では、抗ＬＧＲ５抗体組成物は、下記実施例で製造、記載される１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１として設計される抗体の両方を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される抗ＬＧＲ５抗体は、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、および前述の値のいずれかの間の範囲のＫＤを有するヒトＬＧＲ５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される抗ＬＧＲ５抗体は、約１０ｎＭ未満、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、および前述の値のいずれかの間の範囲内の親和性を有するＬＧＲ５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される抗ＬＧＲ５抗体は、約０．０００１ｎＭ超、０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭ、および前述の値のいずれかの間の範囲内の親和性を有するＬＧＲ５と結合する。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本明細書中提供される抗ＬＧＲ５抗体は、 配列番号４７のアミノ酸Ｔ１７５、Ｅ１７６、Ｑ１８０、Ｒ１８３、Ｓ１８６、Ａ１８７、Ｑ１８９、Ｄ２４７、Ｅ２４８、Ｔ２５１、Ｒ２５４、Ｓ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２６０を含むかもしくはからなる、または該アミノ酸内のエピトープと結合する。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される抗ＬＧＲ５抗体は、ロイシン高濃度反復６〜９を含むかもしくはからなる、または該反復内のエピトープと結合する（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２７（１２）：１３４５−５０（この全文を参照することにより組み入れられるものとする）参照）。いくつかの実施形態では、本明細書中提供される抗ＬＧＲ５抗体は、ＬＧＲ５外部ドメインの凸面を含むかもしくはからなる、または該凸面内の、エピトープと結合する（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２７（１２）：１３４５−５０（この全文を参照することにより組み入れられるものとする）参照）。
【００５５】
いくつかの実施形態は、本明細書中提供される抗ＬＧＲ５抗体の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含むがん治療方法を含む。いくつかの実施形態では、がんは、膵がん、大腸がん、肺がん、膵がん、およびトリプルネガティブ乳がんなどの乳がんから選択される。いくつかの実施形態では、大腸がんは、大腸腺腫症（ＡＰＣ）遺伝子中の不活性化変異を含み、ＡＰＣ遺伝子中の不活性化変異を含まないか、または野生型ＡＰＣ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、がんである。いくつかの実施形態では、がんは、上昇したレベルのＬＧＲ５タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、がんは、上昇したレベルのＬＧＲ５タンパク質を発現する結腸がんである。いくつかの実施形態では、がんは、上昇したレベルのＬＧＲ５タンパク質を発現する膵がんである。いくつかの
実施形態では、がんは、上昇したレベルのＬＧＲ５タンパク質を発現する乳がんである。
【００５６】
いくつかの実施形態は、疾病がβカテニンの活性化、および／または異常なβカテニンシグナル伝達に関連する対象の疾病の治療方法を含む。いくつかの実施形態は、本明細書中提供される抗ＬＧＲ５抗体の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態は、少なくとも１つの追加の治療薬と併用して、本明細書中提供される抗ＬＧＲ５抗体の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む疾病の治療方法を含む。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、化学療法薬を含む。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、生物学的薬剤を含む。いくつかの実施形態は、化学療法薬および生物学的薬剤と併用して、本明細書中提供される抗ＬＧＲ５抗体を投与することを含む。いくつかの実施形態では、化学療法薬と併用した本明細書中提供される抗ＬＧＲ５抗体の投与は、腫瘍などのがんにおけるＬＧＲ５の発現レベルを増加させることができる。本明細書中提供される方法のいくつかの実施形態は、腫瘍またはがんにおけるＬＧＲ５タンパク質発現のレベルを決定することを含む。
【００５８】
本明細書中提供される方法のいくつかの実施形態は、本明細書中提供される抗ＬＧＲ５抗体を用いた治療のため、対象を特定することを含む。いくつかの実施形態は、正常組織における同じＬＧＲ５タンパク質の発現と比較して、対象が、ＬＧＲ５の発現レベル上昇を含む腫瘍を有するか否かを決定することを含む。いくつかの実施形態は、治療のための対象を、腫瘍が上昇したＬＧＲ５の発現レベルを有するか否か選択することを含む。いくつかの実施形態は、対象が、ＡＰＣ遺伝子中の不活性化変異を含む腫瘍を含むか否かを決定することも含む。いくつかの実施形態は、治療のための対象を、腫瘍がＡＰＣ遺伝子中の不活性化変異を含むか否かを選択することも含む。
【００５９】
上記に関連する方法、組成物および関連開示は、例えば、２０１３年５月１０日に公開されたＰＣＴ国際公開第２０１３／０６７０５５号（この内容はその全文を参照することにより本明細書に組み入れられるものとする）、ならびに例えば、２０１３年５月１０日に公開されたＰＣＴ国際公開第２０１３／０６７０５４号（この内容はその全文を参照することにより本明細書に組み入れられるものとする）、ならびに例えば、２０１３年５月１０日に公開されたＰＣＴ国際公開第２０１３／０６７０５７号（この内容はその全文を参照することにより本明細書に組み入れられるものとする）、ならびに例えば、２０１３年５月１０日に公開されたＰＣＴ国際公開第２０１３／０６７０６０号（この内容はその全文を参照することにより本明細書に組み入れられるものとする）に提供されている。
【００６０】
医薬組成物
本明細書中提供されるＬＧＲ５と特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを、投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。このような組成物は、通常、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントおよび薬剤的に許容可能な担体を含む。本明細書中で使用されるとき、「薬剤的に許容可能な担体」という語は、医薬の投与に適合した、いずれかおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含むことを意図している。適切な担体は、本分野の標準参考書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（参照することにより本明細書に組み入れられるものとする）の最新版に記載されている。このような担体または希釈剤の好ましい例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。不揮発性油などのリポソームおよび非水性ビヒクルを使用してもよい。医薬活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。従来の媒体または薬剤が活性化合物と相溶性でない限りを除いて、組成
物中にその使用は考えられる。補足的活性化合物も組成物中に組み込むことができる。
【００６１】
本発明の医薬組成物を製剤し、投与のその目的の経路に適合させる。投与経路の例としては、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、および直腸内投与が挙げられる。非経口、経皮、または皮下適用のために使用される液剤または懸濁剤は次の成分を含むことができる：注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧調整剤。ｐＨを塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節することができる。非経口製剤をガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジまたは複数回投与バイアル中に封入することができる。
【００６２】
注射用途に適した医薬組成物は、滅菌水溶液（水に可溶な場合）または滅菌注射可能な液剤もしくは分散液の即時調合製剤用分散剤および滅菌散剤を含む。静脈内投与のため、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、クレモフォールＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州パーシッパニー）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。担体は、溶媒または、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物を含む分散媒体であり得る。多くの場合、組成物中に、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール類、塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収を、組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらすことができる。
【００６３】
滅菌注射用液剤を、必要に応じて、上記列挙された成分の１つまたは組合せと、活性化合物を適切な溶媒中必要な量で混合し、次いで、濾過滅菌することにより製造することができる。概して、分散剤を、基本的分散媒体および上記列挙されたものから必要な他の成分を含む滅菌ビヒクル中に活性化合物を混合することにより分散剤を製造する。滅菌注射可能液剤の製造用滅菌散剤の場合、製造方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、活性成分および前もって滅菌ろ過したその液剤からいずれかの追加の所望の成分の散剤を得る。
【００６４】
投与の容易さおよび投与量の一様性のため、単位剤形で組成物を製剤することは特に有利である。本明細書中で使用されるとき、単位剤形は、治療される対象に対して単位投与量として適した物理的に分離した単位を表し；各単位は、必要な医薬担体と併せて所望の治療効果を得るように算出された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形のための規格は、活性化合物の固有の特性および達成される特定の治療効果、ならびに個体の治療のためのこのような活性化合物を配合する技術に固有の制限により決定づけられ、かつ、直接的に依存する。
【００６５】
医薬組成物を、投与のための指示書と一緒に、容器、パック、またはディスペンサー中に収容することができる。
【００６６】
キット
本明細書中提供されるいくつかの実施形態としては、キットが挙げられる。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書中提供されヒト化抗体を備える。いくつかの実施形態では、抗体は、凍結乾燥されている。いくつかの実施形態では、抗体は、水溶液である。いくつかの実施形態では、キットは、抗体の投与のために医薬担体を備える。いくつかの実施形態では、キットは、化学療法薬も備える。いくつかの実施形態では、化学療法薬は
、フォリン酸、フルオロウラシル、イリノテカン、ゲムシタビンおよびナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル（アブラキサン）から選択される。
【００６７】
いくつかの実施形態としては、ＬＧＲ５と特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント、および適切な医薬用担体の用量を含む医薬組成物を収容する容器が挙げられ、該用量はがんを患っている対象を治療するのに適切である。ヒト化モノクローナル抗体または抗原結合性フラグメントの用量は、約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、もしくは前述の投与量のいずれか２つの間の範囲より多い、より少ない、または、と同等であり得る。いくつかの実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの用量は、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与に適している。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、腹腔内注射に適している。
【００６８】
治療方法
方法、組成物およびキットのいくつかの実施形態は、がんを患っている対象の治療方法を含む。いくつかのこのような方法は、ＬＧＲ５と特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。該対象は、哺乳類、例えば、ヒトであり得る。
【００６９】
いくつかの実施形態では、がんは固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態では、がんは、結腸がん、大腸がん、膵がん、乳がん、または肺がんであり得る。いくつかの実施形態では、がんは、ＡＰＣ変異を含む結腸がん、ＫＲＡＳ変異を含む結腸がん、転移性大腸がん、転移性膵がん、トリプルネガティブ乳がん、および小細胞肺がんであり得る。
【００７０】
ＬＧＲ５と特異的に結合するヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号２３を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号２５を含む重鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号２７を含む重鎖ＣＤＲ３などの重鎖ＣＤＲを含むことができる。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１９を含む重鎖可変ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１３を含む重鎖を含むことができる。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号２９を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号３１を含む軽鎖ＣＤＲ２、および／または配列番号３３を含む軽鎖ＣＤＲ３などの軽鎖ＣＤＲを含むことができる。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号２１を含む軽鎖可変ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１４を含む軽鎖を含むことができる。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号１３を含む重鎖および配列番号１４を含む軽鎖を含むことができる。いくつかの実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントは、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３である。
【００７１】
がんを患っている対象を治療するためのヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの投与量は、約１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、５５ｍｇ／ｋｇ、６０ｍｇ／ｋｇ、６５ｍｇ／ｋｇ、７０ｍｇ／ｋｇ、もしくは前述の投与量のいずれか２つの間の範囲より多い、より少ない、または、と同等であり得る。いくつかの実施形態では、ヒト化
モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの投与量は、約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約２．５ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇである。
【００７２】
ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの投与頻度は、毎日、毎週、または毎月であり得る。いくつかの実施形態では、投与は、１日１回、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、または６日毎であり得る。いくつかの実施形態では、投与は、週１回、２週毎、３週毎、または４週毎であり得る。いくつかの実施形態では、投与は毎月であり得る。
【００７３】
ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの投与経路は、生物製剤の投与に適切であり得る。例えば、投与は、腹腔内注射、または静脈内ルート経由であり得る。
【００７４】
ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの投与は、化学療法薬と併用であり得る。化学療法薬の例としては、フォリン酸（ロイコボリン）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、イリノテカン、ゲムシタビンおよびナノ粒子アルブミン結合パクリタキセル（アブラキサン）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＦＯＬＦＩＲＩ併用：フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンを、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントと併用して投与することができる。いくつかの実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントとの併用でがんを治療する方法における化学療法薬の初回用量を、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの初回用量の投与前に投与することができる。いくつかの実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントとの併用でがんを治療する方法における化学療法薬の初回用量を、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの初回用量の投与後に投与することができる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、イリノテカンの初回用量は約１８０ｍｇ／ｍ２であり、約９０分かけて投与し；フォリン酸の初回用量は約４００ｍｇ／ｍ２であり、約１２０分かけて、かつ、イリノテカンの初回用量と同時に投与し；フルオロウラシルの初回用量は約４００ｍｇ／ｍ２であり、フォリン酸の初回用量の投与後に投与することができる。いくつかの実施形態では、フォリン酸、フルオロウラシル、およびイリノテカンを１４日毎に投与する。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを、追加の治療薬と併用して投与することができる。追加の治療薬の例としては、ベバシズマブ、アフリベルセプト、セツキシマブ、およびパニツムマブが挙げられる。
【実施例】
【００７７】
実施例１−ＬＧＲ５抗体のヒト化
ヒト生殖系列配列を、マウス抗体１８Ｇ７．１のヒト化のため、アクセプターフレームワークとして使用した。密接な生殖系列配列を見出すために、最も類似の発現軽鎖および最も類似の重鎖を、ＮＣＩ  ＩｇＢＬＡＳＴ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／）により生殖系列配列データベースにおいて特定した。この検索において、１８Ｇ７．１のＣＤＲ配列をマスクした。最適な発現配列の選択は、カノニカル（canonical）残基および界面（interface）残基の配列同定についてのチェック、ならびにＣＤＲループ長の類似性についてのチェックを含んだ。
【００７８】
候補ヒト化配列および親マウスモノクローナル抗体１８Ｇ７．１間の主要構造フレームワーク残基において可能性のある構造的矛盾を特定するために、三次元モデルを生成した。抗体構造物の複合体を使用して、グラフト化した候補ヒト化配列を含む相同性モデルを
作製し、次いで、分子エネルギー最小化を行った。コンピュータソフトウェアＰｙｍｏｌを用いた構造解析を使用して、適切なフォールディングに強力にネガティブに影響を及ぼし得る残基を特定した。
【００７９】
この解析から、以下を含んだ６つの候補ＶＨ鎖が構築された：１）フォールディングに対するありそうな影響の解析に基づいた候補ヒト化フレームワーク領域内の選択された置換を含む機能的ヒトフレームワーク およびｉｉ）親１８Ｇ７．１マウス抗体ＣＤＲ（配列番号１、２、および３）。ヒトＩｇＧ１定常部に対する融合インフレームを化学的に合成する。
【００８０】
同様に、以下を含んだ２つの候補ＶＬ鎖を構築した：１）フォールディングに対するありそうな影響の解析に基づいた候補ヒト化フレームワーク領域内の選択された置換を含む機能的ヒトフレームワーク およびｉｉ）親１８Ｇ７．１マウス抗体ＣＤＲ（配列番号４、５、および６）。ヒトＩｇＧ１定常部に対してインフレームに融合した候補ＶＬ鎖および候補ＶＨ鎖を化学的に合成する。
【００８１】
選択された候補変異体ヒト化重鎖および軽鎖の組合せを、哺乳類細胞へのコトランスフェクションにより機能性について試験した。上記のこの６つの候補ヒト化１８Ｇ７．１重鎖のそれぞれを、候補１８Ｇ７．１軽鎖の１つにより、ＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトし、フローサイトメトリーにより、ＬＧＲ５抗原結合活性について条件培地をアッセイした。上記加えて、３つの候補ヒト化１８Ｇ７．１重鎖を、第二候補１８Ｇ７．１軽鎖により、ＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトし、フローサイトメトリーにより、ＬＧＲ５抗原結合活性について条件培地をアッセイした。１８Ｇ７Ｈ６として公知であり、最も頑強な結合を示した１８Ｇ７．１候補重鎖／軽鎖の組合せ（ヒト化変異体）を親和性成熟について選択した。
【００８２】
実施例２−ヒト化ＬＧＲ５抗体親和性成熟
選択されたヒト化変異体１８Ｇ７Ｈ６の親和性を向上するために、アラニン系統的変異導入法および飽和変異誘発の組合せを使用した。重鎖ＣＤＲ１ならびに軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ３中の残基をアラニンに変異させ、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、得られた条件培地をフローサイトメトリーによりＬＧＲ５抗原結合活性についてアッセイした。重鎖ＣＤＲ３に対して飽和変異誘発を行い、ＣＤＲ３中の全ての残基をその位置におけるオリジナルアミノ酸同一性を除いて、１９の天然アミノ酸の各々に変異させた。変異のそれぞれをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、得られた条件培地をフローサイトメトリーによりＬＧＲ５抗原結合活性についてアッセイした。
【００８３】
これらの変異を、数を増やしながら３つのコンストラクト中に組み込んだ。それから、これらの３つのコンストラクトをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、得られた条件培地をフローサイトメトリーによりＬＧＲ５抗原結合活性についてアッセイした。２つのコンストラクト１８Ｇ７Ｈ６Ａ１および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を、さらなる特性解析のために選択した。表１Ａは、抗体の特定の配列を一覧にしている。
【表２−１】
2019509322.tif 000004
【表２−２】
2019509322.tif 000005
【００８４】
実施例３−ヒト化ＬＧＲ５抗体の製造
１８Ｇ７Ｈ６Ａ１、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および１８Ｇ７Ｃｈと名付けられたキメラ１８Ｇ７．１（ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合された１８Ｇ７．１由来のマウスＦａｂ）を構築し、増幅し、２００ｍｌの体積における発現評価のため、一過性トランスフェクションを用いてチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ）に一過性にコトランスフェクトした。それから、１８Ｇ７ＣＨに対して５リットルならびに１８Ｇ７Ｈ６Ａ１および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の両方に対して２．５リットルの最終体積においてＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ細胞の大規模一過性トランスフェクションを開始した。ワンステップのタンパク質Ａクロマトグラフィーを用いて、清澄化された培養上澄み液を精製した。コントロールサンプルとして社内ヒト抗体を含む１ｍｇ／ｍｌの濃度の精製物質を用いて、ＳＥ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびエンドトキシン測定の形態での産生物の品質分析を行った。結果は、回収した産生物が高純度であることを示した（＞９５．７％）。
【００８５】
実施例４−ヒト化ＬＧＲ５抗体のためのセルライン構築
１８Ｇ７Ｈ６Ａ３抗体を発現する安定ＧＳ−ＣＨＯトランスフェクタントプールを、発
現ベクターｐ１８Ｇ７Ｈ６Ａ３／ＤＧＶを用いてＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ宿主細胞のトランスフェクションにより作製した。この抗体をコードする遺伝子を含むＤＧＶを構築し、トランスフェクトして、その後、得られたクローナルセルラインを、ＦＡＣＳ法を用いてトランスフェクタントプールのシングルセルソーティングにより生成した。クローニング中に作製した９６ウェルプレートを、シングルコロニーの存在について毎週スクリーニングした。約２週間後、１０００コロニーからの上澄みをＯｃｔｅｔ（登録商標）システム法を用いて抗体産生についてスクリーニングした。スクリーニングした１０００コロニーのうち、９９１コロニーは検出可能レベルの抗体を産生した。Ｏｃｔｅｔデータを順位づけし、最も高く産生したコロニーを進行のため選択した。
【００８６】
最も高く順位づけされたコロニーをＣＤ  ＣＨＯ培地中の９６ディープウェルプレート中の懸濁培養液に移動し、その後、継代培養培地に適合させた。選択されたセルラインの産生能を、バイオリアクター方法を可能な限り密接に模倣したフィードレジメ（feed regime）を用いて行われる。培養液を１２日目で回収し、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）システム法を用いて抗体濃度についてアッセイした。回収における抗体濃度は、＜２０ｍｇ／Ｌ〜３０００ｍｇ／Ｌの範囲であった。産生能スクリーニングにおける順位、セルラインの由来となる親プールおよびそれぞれのセルラインがシングルコロニーから生じたという証拠に基づいて、さらなる評価のため２０セルラインを選択した。この２０セルラインの培養液を、９６ディープウェルプレートから振盪フラスコへの連続継代培養液により拡大した。「簡易」流加懸濁培養液生産能評価における順位および振盪フラスコ培養液における日常的継代培養中の許容可能な成長特性を有する（日常的継代培養において一貫して≧１×１０６生存細胞／ｍＬ）ことに基づいて、２つの１０Ｌの実験室スケールの撹拌槽バイオリアクターにおける評価のため、先導（lead）セルラインを選択した。この先導セルラインは、一貫して、日常の継代培養中、高成長および高生存率を示し、回収時において＞２０００ｍｇ／Ｌのタイターを有していた。このセルラインをマスターセルバンク（ＭＣＢ）の作製および１０Ｌ実験室スケールのバイオリアクターにおける評価のために使用した。
【００８７】
実施例５−ヒトＬＧＲ５とのヒト化ＬＧＲ５抗体結合
ＦＡＣＳベースアッセイを使用して、ＣＨＯ細胞表面で過剰発現された組換えヒトＬＧＲ５と、精製１８Ｇ７Ｈ６Ａ１および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の結合を測定した。ＣＨＯおよびＣＨＯ−ＬＧＲ５細胞を、４℃において１８Ｇ７Ｈ６Ａ１または１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の連続希釈で染色し、表面染色をＰＥ結合抗ヒトＩｇＧ二次抗体で検出して、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒで分析した。ヒトＬＧＲ５結合に対する１８Ｇ７Ｈ６Ａ１および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３のＥＣ５０は、＜１０ｎＭであった。抗体コントロール（ＭＯＰＣ）をこの実験におけるネガティブコントロールならびにＬＧＲ５を含まない野生型ＣＨＯとして使用した。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、野生型ＣＨＯとの結合を示さず、アイソタイプコントロールはヒトＬＧＲ５とのいかなる測定可能な結合を示さなかった。
【００８８】
１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の治療有効性および安全性を調査するために、あり得る動物モデル種を特定するため、種ホモログにより発現されたＬＧＲ５に対する１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の交差反応性を一連のインビトロ結合試験において決定した。図１参照。図に示すように、抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（ＢＮＣ１０１）は、ヒトおよびサルＬＧＲ５と強力に結合するが、ラットまたはマウスＬＧＲ５と結合しないことが分かった。
【００８９】
実施例６−プレート結合組換えヒトＬＧＲ５外部ドメインと、ヒト化ＬＧＲ５抗体の結合
ヒトＬＧＲ５と、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の結合を、ＥＬＩＳＡベースプレート結合アッセイを用いてインビトロでアッセイした。アッセイは、ＥＬＩＳＡプレート結合精製組換えＬＧＲ５外部ドメイン−ＩｇＧ−Ｆｃ融合物と結合している抗体を
、西洋わさびペルオキシダーゼ共役抗ヒトＩｇＧ−ＣＨ１二次抗体を含むＬＧＲ５結合抗体の検出で測定した。ヒトＬＧＲ５−Ｆｃに対する１８Ｇ７Ｈ６Ａ３のＥＣ５０は、３００ｐＭであることが分かった。
【００９０】
実施例７−腫瘍細胞に対するヒト化ＬＧＲ５抗体の結合特性
異なるレベルのＬＧＲ５を発現するヒトがんセルラインに対する１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の結合特性をフローサイトメトリーにより分析して、異種性腫瘍集団に対する１８Ｇ７Ｈ６Ａ３のあり得る標的化特性を確定した。複数の腫瘍セルラインにおけるＬＧＲ５の発現レベルを、フローサイトメトリーにより定量化した。
【００９１】
この試験において、結腸がん腫のがんセルライン（ＣＴ１（Ｂｉｏｎｏｍｉｃｓ）、ＣＴ３（Ｂｉｏｎｏｍｉｃｓ）、ＤＬＤ１（ＡＴＣＣ）、Ｌｓ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ）、ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ）、ＳＷ４８（ＡＴＣＣ）、ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ）、ＳＷ６２０（ＡＴＣＣ）およびＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ））、トリプルネガティブ乳がんセルライン（Ｈｓ５７８Ｔ（ＡＴＣＣ）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ））、膵がんセルライン（ＡｓＰＣ−１（ＡＴＣＣ）、ＢｘＰＣ３（ＡＴＣＣ）、Ｃａｐａｎ２（ＡＴＣＣ）、ＨＰＡＦＩＩ（ＡＴＣＣ）、ＳＷ１９９０（ＡＴＣＣ）、ＣＦＰＡＣ（ＡＴＣＣ）、Ｐａｎｃ１０．０５（ＡＴＣＣ）およびＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ））、シスプラチン感受性卵巣がんセルライン（ＯＶＣＡＲ３（ＡＴＣＣ）およびＳＫ−ＯＶ−３（ＡＴＣＣ））、シスプラチン耐性卵巣がんセルライン（ＳＫ−ＯＶ−３／ＣＰ、ＯＶＣＡＲ８／ＣＰ、Ｉｇｒｏｖ１／ＣＰおよびＡ２７８０／ＣＰ（ＴＧＥＮ））ならびに肺腺がんセルラインＨＯＰ６２（ＡＴＣＣ）を含むヒト腫瘍セルラインを分析した。
【００９２】
コンフルエンス近くの細胞成長を、ＴｒｙｐＬＥ細胞解離緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてリフトし、カウントして、ウェル当たり１×１０５細胞で９６ウェルＶ底プレート中に播種した。染色緩衝液（ＰＢＳ／０．８％ ウシ血清アルブミン）中、連続希釈で１００ｎＭの初回濃度で１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を試験した。サンプルを、３０分間氷上でインキュベートし、それから、４℃で２分間、１８００ｒｐｍで遠心分離して、染色緩衝液で３回洗浄した。５０μｌの二次抗体ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＰＥ結合体、１：２５０希釈（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、染色緩衝液中、各対応するウェルに添加した。サンプルを氷上さらに１５分間インキュベートし、それから、上記のように洗浄して、死細胞を除去するためにヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する１００μｌ染色緩衝液中に再懸濁した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ｉｎｃ）ソフトウェアを用いて、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーでサンプルを分析した。
【００９３】
複数の腫瘍セルライン中のＬＧＲ５の細胞表面発現レベルを、フローサイトメトリーにより定量化した。ＣＴ１大腸腫瘍細胞および膵がんセルラインＰａｎｃ−１、Ｃａｐａｎ２およびＣＦＰＡＣは、最も高いＬＧＲ５の発現体に含まれる。膵がんセルライン（ＡｓＰＣ−１、ＳＷ１９９０、ＨＰＡＦＩＩ）、シスプラチン耐性卵巣がんセルライン（ＯＶＣＡＲ８／ＣＰ、Ａ２７８０／ＣＰおよびＩｇｒｏｖ１／ＣＰ）ならびに結腸がん、乳がんおよび卵巣がんセルライン（ＳＷ４８、Ｈｓ５７８ＴおよびＯＶＣＡＲ３）において、中程度の発現レベルが観察された。結腸がん（ＳＷ４８０、ＬｏＶｏ）および乳がんセルライン（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）において、低レベルだが検出可能レベルのＬＧＲ５細胞表面発現が観察された。表２に、腫瘍セルラインと結合する１８Ｇ７Ｈ６Ａ３  ＦＡＣＳのデータを纏めている。
【表３−１】
2019509322.tif 000006
【表３−２】
2019509322.tif 000007
【００９４】
実施例８−ヒト化抗ＬＧＲ５抗体によるインビボでの悪液質大腸腫瘍成長の阻害
ＣＴ１原発性ＣＲＣ異種移植モデルは、ステージＩＶ転移性結腸がん患者由来であった。この腫瘍のＤＮＡシークエンシングは、Ｋ−Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ｐ５３およびＡＰＣを含む複数の遺伝子における通常の結腸がん変異と同定した。無血清条件下の培養液中に維持される低継代のＣＴ１腫瘍様塊を、０日目にマトリゲル中のＳＣＩＤ／Ｂｇマウスに皮下注射し、腫瘍サイズおよび体重について週２回モニターした。２５日目、腫瘍が１２０ｍｍ３に達した場合、ＣＴ１皮下腫瘍を、１０匹のマウスの群にランダムに分けた。マウスを、ＰＢＳ、抗体コントロールＭＯＰＣ、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３またはヒト／マウスキメラ１８Ｇ７Ｃｈのいずれかで治療した。マウスに、２．５週間、１５ｍｇ／ｋｇで週２回投与した（合計５回投与）。
【００９５】
４回の投与（１５ｍｇ／ｋｇ、週２回）の過程においてＰＢＳおよびＭＯＰＣ抗体コントロールと比較して、抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３はインビボで有意な抗腫瘍活性を示した。抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ１は抗腫瘍活性を示したが、モノクローナル１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１および親マウスキメラ１８Ｇ７Ｃｈ抗体の両方に対して優れた活性を示した。表３は、Ｌｇｒ５＋Ａｂｓの１〜４回投与後のＣＴ１腫瘍体積減少パーセント（群対ＭＯＰＣ）を示す。
【表４】
2019509322.tif 000008
【００９６】
実施例９−ヒト化抗ＬＧＲ５抗体によるインビボでの大腸腫瘍成長の阻害
ＣＴ３原発性ＣＲＣ異種移植モデルは、Ｋ−Ｒａｓ、Ｈ−Ｒａｓ、ＡＰＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＴＥＮ、ＳＴＫ１１、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＦＧＦＲ２、ＶＡＮＧＬ２、およびＩＳＣＯにおける変異を有するステージＩＩＩ  ｍＣＲＣ患者由来であった。低継代凍結保存ＣＴ３原発性異種移植腫瘍フラグメントを、５匹のＳＣＩＤ／Ｂｇマウスに移植した。５匹のＣＴ３原発性異種移植片担持ＳＣＩＤマウスからプールした平均約１１５０ｍｍ３の腫瘍を、移植後４１日目に取り出し、分離してマトリゲル中のＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウスの皮下に再移植し、腫瘍サイズおよび体重について週２回モニターした。腫瘍が平均１３０ｍｍ３に達した場合、マウスをランダムに分けた（移植後３４日目）。マウスを、ＰＢＳ
、抗体コントロールＭＯＰＣ、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３、１８Ｇ７Ｈ６Ａ１またはヒト／マウスキメラ１８Ｇ７Ｃｈのいずれかで治療した。３４日目でスタートし、マウスに、２．５週間（５回投与）、１５ｍｇ／ｋｇで週２回投与した。全マウスを、体重および腫瘍サイズ、ならびに健康全般および外観について、終了するまで、週２回モニターした。
【００９７】
抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ１は抗腫瘍活性を示したが、４回の投与（１５ｍｇ／ｋｇ、週２回）後、モノクローナル１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、ＰＢＳおよびＭＯＰＣ抗体コントロールと比較して、有意な抗腫瘍活性を示した。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、親マウスキメラ１８Ｇ７Ｃｈ抗体に対して優れた活性および１８Ｇ７Ｈ６Ａ１に対して均等な活性を示した。表４は、試験Ａｂｓのｎ回投与後のＣＴ３腫瘍体積減少パーセント（群対ＭＯＰＣ）を示す。
【表５】
2019509322.tif 000009
【００９８】
実施例１０−ＦＯＬＦＩＲＩと併用したヒト化抗ＬＧＲ５抗体によるインビボでの大腸腫瘍成長の阻害
ＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウスに、ＣＳＣ条件下成長したＣＴ３細胞を移植した。移植後４０日目、腫瘍が約１６０ｍｍ３に達した場合、ｉ）ＰＢＳ、ｉｉ）１５日間５日毎（合計３回投与）のＦｏｌＦｉｒｉ（５ＦＵ  ３０ｍｇ／ｋｇ、ロイコボリン  ９０ｍｇ／ｋｇおよびイリノテカン  ２４ｍｇ／ｋｇ）、ならびにｉｉｉ）ＦｏｌＦｉｒｉ（ｉｉと同様に）および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（１５ｍｇ／ｋｇ、週２回）を含む治療群にランダムに分けた。腫瘍体積の分析から、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３およびＦｏｌＦｉｒｉの併用は、ＦｏｌＦｉｒｉレジメンと比較してＣＴ３腫瘍の成長を低下させることが分かった。併用治療は、６１日目、６５日目、６８日目、７１日目および７５日目の腫瘍体積を、それぞれ、約５８％、５３％、４５％、３３％および３７％減少させた（図２）。
【００９９】
実施例１１−ヒト化抗ＬＧＲ５抗体によるインビボでの膵がん腫瘍成長の阻害
単剤または標準治療との併用における１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の有効性を評価するため、膵がん異種移植モデルを試験した。ＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウスに、ＡｓＰＣ−１細胞を移植した（マトリゲル＋ＲＰＭＩ（比１：１）中）。移植後２０日目、腫瘍を５つの群：ｉ）ＰＢＳ、ｉｉ）ＭＯＰＣ（１５ｍｇ／ｋｇ、週２回、腹腔内）、ｉｖ）ゲムシタビン（９０ｍｇ／ｋｇ、週２回、腹腔内）ならびにｖ）上記投与でのゲムシタビンおよび１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の同時併用にランダムに分けた。
【０１００】
１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、単剤として、移植後４１日目、生理食塩水および／またはコントロールＩｇＧと比較して、ほとんど４０％まで腫瘍成長を阻害したことを見出した。加えて、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３およびゲムシタビンの併用は、ゲムシタビン単独と比較して、ＡｓＰＣ−１モデルの腫瘍成長を有意に阻害した（移植後６１日目で３６％まで）。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、単剤として、６５日目まで、ＰＢＳおよびコントロールＩｇＧと比較して、腫瘍成長をいくらか阻害した。
【０１０１】
実施例１２−ヒト化抗ＬＧＲ５抗体によるインビボでのトリプルネガティブ乳がん腫瘍成長の阻害
このインビボ試験を、低継代トリプルネガティブ乳がん細胞（ＥＲ−、ＰＲ−、非ＨＥＲ２過剰発現）を用いて行った。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＬＭ３細胞を、ＤＭＥＭ／１０
％ＦＢＳ／Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ培地を含む接着培養液中で維持した。０日目、ＣＢ．１７
ＳＣＩＤマウスに、ＲＰＭＩ：マトリゲル（１：１）中のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＬＭ３細胞を、４番目の乳腺脂肪体に注射し、腫瘍サイズおよび体重について週２回モニターした。２７日目、腫瘍が約１５５ｍｍ３に達した場合、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＬＭ３腫瘍を、１０匹のマウスの４つの群にランダムに分けた。マウスを、ＰＢＳ、抗体コントロールＭＯＰＣ、または１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療した。マウスに、３．５週間、１５ｍｇ／ｋｇで週２回投与した（７回投与）。抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、ＰＢＳ（６０．７％腫瘍成長阻害）またはＭＯＰＣ抗体（４９．３％腫瘍成長阻害）コントロールと比較して有意な抗腫瘍活性を示すことを見出した（図３）。
【０１０２】
実施例１３−ＳＮ３８またはＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤で治療した大腸がん細胞におけるＬＧＲ５の発現誘導
ＤＬＤ１、ＨＣＴ１１６、ＬＳ１７４ｔ、ＬｏＶｏ、ＳＷ４８、ＳＷ４８０およびＳＷ６２０を含むＣＲＣセルラインのパネルを、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ二重阻害剤（ＮＶＰ）またはＳＮ３８（イリノテカンの活性代謝物）もしくは５ＦＵ（５−フルオロウラシル）を含む２つの異なる細胞傷害性薬物で治療した。細胞を１ｕＭで上記薬剤を用いて治療し、７２時間後に回収した。それから、細胞をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７と結合した抗ＬＧＲ５  Ｍａｂで染色し、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒを用いてフローサイトメトリーによりデータ解析した。
【０１０３】
ＣＲＣセルラインのフローサイトメトリー分析は、ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤で治療した場合、ＬｏＶｏ、ＨＣＴ１１６、ＬＳ１７４ｔ、ＳＷ４８、ＳＷ４８０およびＳＷ６２０細胞中、ＬＧＲ５がより多く発現することを示した。加えて、ＳＮ３８での治療は、ＨＣＴ１１６、ＬＳ１７４ｔ、ＳＷ４８、ＳＷ４８０、および特にＳＷ６２０細胞におけるＬＧＲ５の発現を促進した。しかしながら、５ＦＵ治療は、これらの系列のいずれにおいてもＬＧＲ５の発現を誘導せず、ＬＧＲ５の発現を支配する発症機序はこれらの系統において異なるものであることを示唆している。これらのデータは、治療はＬＧＲ５ネガティブ非がん幹細胞集団を主に標的化していたので、ＬＧＲ５＋細胞は上記薬剤での治療に対してより耐性を有することを示している。これらの薬剤での治療がこれらの細胞に対してＬＧＲ５発現を上方制御する場合を理解するため、本発明者らは、全てのセルラインにおけるフローサイトメトリーによるＬＧＲ５細胞表面発現を分析した。ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害剤での治療と同時に、ＬＧＲ５の発現は、ＬｏＶｏにおいて有意に上方制御された。これらのデータは、小分子阻害剤または細胞傷害性薬物を用いた治療がＬＧＲ５ｎｅｇ細胞を標的化し、これらの細胞内のＬＧＲ５の発現を増加させることを示している。
【０１０４】
実施例１４−小分子阻害剤または細胞傷害性薬物を用いて治療した膵がんセルラインにおいてＬＧＲ５の発現を促進する
上記発見をさらに発展させるため、ＣＲＣセルラインに加えて、ｎａｂ−パクリタキセル、ゲムシタビンおよびタキソールを含む関連標準治療、ならびにＰＩ３Ｋ、ＭＥＫおよびＧＳＫ３βの阻害剤などの膵がんにおける大部分の関連経路を標的化する小分子阻害剤も用いて治療された一連の膵臓セルラインにおいて、ＬＧＲ５の発現を調査した。試験された膵臓セルラインとしては：ＡｓＰｃ１、ＨＰＡＦＩＩ、ＰＡＮＣ１、ＢｘＰＣ３、ＣＦＰＡＣ、ＰＡＮＣ１０．０５、Ｃａｐａｎ２およびＳＷ１９９０が挙げられる。ｎａｂ−パクリタキセルを用いた治療は、フローサイトメトリーにより評価されるとき、ＰＡＮＣ１、ＢｘＰｃ３およびＰＡＮＣ１０．０５におけるＬＧＲ５の上方制御をもたらす。ゲムシタビン治療は、ＰＡＮＣ１におけるＬＧＲ５を上方制御し、タキソール治療はＨＰＡＦＩＩにおけるＬＧＲ５の発現の増加をもたらす。ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ治療は、ＣＦＰＡＣにおけるＬＧＲ５の上方制御をもたらし、ＭＥＫ阻害剤はＨＰＡＦＩＩおよびＳＷ１９９０においてＬＧＲ５を上方制御する。
【０１０５】
実施例１５−ＦＯＬＦＩＲＩレジメン（５ＦＵ、ロイコボリンおよびイリノテカン）を用いて治療された大腸がん腫瘍においてＬＧＲ５を上方制御する
化学療法が大腸腫瘍においてＬＧＲ５の発現を変化させるか否かを調査するため、マウスを、５ＦＵ（３０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）、ロイコボリン（９０ｍｇ／ｋｇ）およびイリノテカンの２つの異なる用量（２４ｍｇ／ｋｇまたは８ｍｇ／ｋｇ）を用いて、５日毎に治療した。これらの試験結果は、ＣＴ３腫瘍は化学レジメンに感受性があるが、ＣＴ１腫瘍は完全に消失せず、レジメンに対する抵抗をいくらか示すことを示した（図４）。ＬＧＲ５の発現のＦＯＬＦＩＲＩ治療の効果を検査するため、ＣＴ１およびＣＴ３患者由来腫瘍およびＬＧＲ５の発現から、全ｍＲＮＡを抽出し、ｑＲＴ−ＰＣＲにより決定し、その対応するＧＡＰＤＨ転写産物から各サンプルのＬＧＲ５のＣｔ値（サイクル閾値）を差し引いてＤＣＴ（ΔＣｔ）値を得ることにより解析した。データは、２のＤＣＴ乗として表される。ＬＧＲ５の存在量の分析は、対応する生理食塩水治療された腫瘍と比較して、ＣＴ１腫瘍（約２倍）およびＣＴ３腫瘍（約３．５倍）の両方において、ＬＧＲ５転写産物が増加することを示した。
【０１０６】
実施例１６−単独およびｎａｂ−パクリタキセルとの併用でゲムシタビンを用いて治療された膵がん腫瘍においてＬＧＲ５を上方制御する
膵がんに対する標準治療の化学療法治療が膵腫瘍においてＬＧＲ５の発現を変化させるか否かを調査するため、ゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルの併用で、週２回マウスを治療した（ＪＨ１０９原発異種移植）。末端基分析において、腫瘍ｃＤＮＡを用いたｑＲＴ−ＰＣＲデータは、対応する生理食塩水治療された腫瘍と比較して、化学療法治療腫瘍におけるＬＧＲ５の発現の著しい増加を示し、標準治療での治療が腫瘍細胞においてＬＧＲ５の上方制御をもたらすことを示している。
【０１０７】
膵腫瘍の患者由来異種移植片モデルであるＪＨ１０９モデルにおけるＬＧＲ５の発現。レシピエントにおいて継続的に継代された腫瘍塊をマウスに移植したが、インビトロ培養条件に暴露しなかった。腫瘍担持マウスの化学療法レジメン（ゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルの併用）での治療は、腫瘍成長の有意な阻害をもたらした。結腸がんモデルと一致して、化学療法は、ＪＨ１０９腫瘍におけるＬＧＲ５の上方制御（４倍超）をもたらし、化学療法での治療時にがん幹細胞集団の増殖をさらに示唆している。例えば、図５参照。
【０１０８】
実施例１７−ヒト化抗ＬＧＲ５抗体によるインビボでの膵がん腫瘍成長の阻害
１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の有効性も、膵がん異種移植モデルにおいて調査した。ＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウスに、ＰＡＮＣ１細胞（１Ｅ６／マウス、皮下、マトリゲル＋ＲＰＭＩ（比１：１））を移植し、移植後４１日目に治療群：ｉ）ＰＢＳ、ｉｉ）ＩｇＧコントロール（１５ｍｇ／ｋｇ、週２回、腹腔内）、ｉｉｉ）１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（１５ｍｇ／ｋｇ、週２回、腹腔内）、ｉｖ）ゲムシタビン（９０ｍｇ／ｋｇ、週２回、腹腔内）ならびにｖ）ゲムシタビンおよび１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の同時併用（１５ｍｇ／ｋｇ、週２回、腹腔内）にランダムに分けた。３週間に割り当てられた群において、ゲムシタビンを投与して腫瘍成長を阻害した。全マウスを、体重および腫瘍サイズ、ならびに健康全般および外観について、週２回モニターした。
【０１０９】
腫瘍体積の分析は、腫瘍成長を阻害するため、単剤として１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を選択する傾向にある（移植後７０日目で３０％まで）が、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３およびゲムシタビンの併用は、ゲムシタビン単独群と比較して、ＰＡＮＣ１腫瘍成長を有意に阻害した（移植後８０日目で５２％まで）。図６参照。
【０１１０】
この実施例では、化学療法（ゲムシタビン）と併用して投与される場合に観察された１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の有意な活性は、ゲムシタビン治療に応答した標的抗原ＬＧＲ５の発現増
加に起因し得る。
【０１１１】
実施例１８−ヒト化抗ＬＧＲ５抗体によるインビボでの以前治療した膵がん腫瘍成長の阻害
セルラインに加えて、本発明者らは、単剤または膵がんのＪＨ１０９原発性患者由来異種移植片モデルにおける標準治療との併用での１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の有効性も調査した。ＪＨ１０９異種移植モデルは、５−ＦＵ、ゲムシタビン、エルビタックスおよび放射線療法を含む４つの治療レジメンを受けた患者由来である。元の患者腫瘍は、インビトロ培養に暴露しないで継続的に免疫不全マウス内で継代された。ＪＨ１０９モデルにおいて１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の有効性を試験するため、腫瘍担持マウス（ｎ＝７）を、コントロールＩｇＧ（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、週２回）、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（１５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、週２回）単剤、標準治療の化学療法（ゲムシタビン（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、週１回；およびｎａｂ−パクリタキセル  ３０ｍｇ／ｋｇ、静脈内、週１回）の併用、化学療法およびコントロールＩｇＧの併用、ならびに化学療法および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の併用で治療した。単剤の１８Ｇ７Ｈ６Ａ３  ｍＡｂは、腫瘍成長に影響を及ぼさず、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とＮａｂ−パクリタキセルとの併用、およびゲムシタビン化学療法は、化学療法単独と比較して有意に大きな程度の腫瘍阻害をもたらした。化学療法と併用した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、化学療法単独と比較して７７％より強力に腫瘍成長阻害をもたらした。１８Ｇ７Ｈ７Ａ３化学療法併用で治療した３匹のマウスは、その腫瘍を完全に根絶した（測定可能な腫瘍は検出されなかった）。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３化学療法併用群は、治療中断後でさえ腫瘍成長を抑制し続け、１匹のマウスは化学療法休止後３か月でも測定可能な腫瘍はなかった。この実施例では、化学療法（ゲムシタビン＋ｎａｂ−パクリタキセル）と併用で投与された場合に観察された１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の有意な活性は、ゲムシタビンｎａｂ−パクリタキセル治療に応答して標的抗原ＬＧＲ５の発現増加に起因し得るが、化学療法治療後インビボで原発腫瘍の再成長または再発を阻止して原発腫瘍の大部分（tumor bulk）を根絶することの実証である。
【０１１２】
実施例１９−ヒト化ＬＧＲ５抗体治療はがん幹細胞集団を低減する
フローサイトメトリー分析のため、５つの個別の腫瘍由来細胞を、幹細胞特定マーカーＣＤ４４、およびＣＤ１６６に対する様々な抗体で染色した。腫瘍を分離し、マウス細胞のため枯渇し、それから、生存可能な細胞についてカウントした。分離した細胞を、フローサイトメトリーによる細胞表面幹細胞マーカー発現の分析に使用した。
【０１１３】
ＣＤ１６６＋／ＣＤ４４＋、ＬＧＲ５＋／ＣＤ１６６＋、またはＬＧＲ５＋／ＣＤ１６６＋／ＣＤ４４＋  サブ集団により定義されたがん幹細胞集団は減少した（図７）。
【０１１４】
実施例２０−ヒト化ＬＧＲ５抗体治療はインビボでの結腸がん腫瘍再発およびがん幹細胞発生頻度を低減する
ＦｏｌＦｉｒｉと併用した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の効果を、結腸がんＣＴ３モデル（実施例１０）で試験した。この原発腫瘍有効性試験の結果は、３サイクルのＦＯＬＦＩＲＩ大群と併用した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、腫瘍成長の低下において、ＦｏｌＦｉｒｉ単独より効果的であることを示した。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３  ＦＯＬＦＩＲＩ併用レジメンががん幹細胞（ＣＳＣ）発生頻度の低減においても効果的であるか否かを決定するため、７８日目の腫瘍を回収し、分離し、プールして、腫瘍ナイーブＣＢ１７．Ｓｃｉｄマウスの新しいコホートに、１０、３０、１００細胞／横腹の限界希釈アッセイで再移植した。それから、マウスを、腫瘍成長について週２回モニターし、腫瘍はさらなる治療なしで成長を可能とした。
【０１１５】
ＦＯＬＦＩＲＩと併用して抗ＬＧＲ５抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療したマウスから単離した細胞は、ＦＯＬＦＩＲＩ単独で治療したマウスから単離した細胞と比較して、腫瘍形
成能を非常に低下させた（図８）。加えて、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３  ＦＯＬＦＩＲＩ併用からの再移植細胞は、ＦＯＬＦＩＲＩ単独と比較して、有意により遅い腫瘍成長プロファイルおよび進行までの時間の遅延（図９）を有した。最終的に、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３治療は、４０日目において、線形回帰分析によりがん幹細胞発生頻度を６倍低減した（１／８５６．３  １８Ｇ７Ｈ６Ａ３／ＦＯＬＦＩＲＩ対１／１３８．６（ＦＯＬＦＩＲＩ））。これらのデータは、ＦＯＬＦＩＲＩと併用した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は腫瘍開始またはがん幹細胞集団を効果的に標的化することを示している。６８日目は、３０細胞／動物データの最終日であった。データは、ｐ＝０．００３９で有意である。
【０１１６】
実施例２１−ヒト化ＬＧＲ５抗体治療はインビボでの膵がん腫瘍再発およびがん幹細胞発生頻度を低減する
ゲムシタビンと併用した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の効果を、膵がんＰＡＮＣ１モデルで試験した。この試験は、ゲムシタビンと併用した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が、ゲムシタビン単独と比較してＰＡＮＣ１モデルにおける腫瘍成長を有意に阻害することを示した。これらの治療群からの腫瘍細胞を回収し、分離し、プールして、限界希釈アッセイ（５００、１５００、４５００または１３５００細胞／動物）においてＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウスの新しいコホートに再移植し、治療なしで成長させた。
【０１１７】
ゲムシタビンと併用して抗ＬＧＲ５抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療したマウスから単離した細胞は、ゲムシタビン単独で治療したマウスから単離した細胞と比較して、限界希釈アッセイ再移植において腫瘍形成能を非常に低下させた。ゲムシタビンおよび１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の併用治療した再移植ＰＡＮＣ１腫瘍は、４５００細胞（ゲムシタビンにおいて４０％対併用において２０％）を移植したマウスにおいて、および１３５００細胞（ゲムシタビンにおいて１００％対併用において７０％）を移植したマウスにおいても生着頻度の低減を示した。線形回帰を用いて、ゲムシタビン移植腫瘍におけるがん幹細胞の発生頻度は、併用群と比較してゲムシタビンにおいて約１．５倍高かった（１４８８３中の１対２１３３６中の１）。これらのデータは、ゲムシタビンと併用した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は腫瘍開始またはがん幹細胞集団を効果的に標的化することを示している。
【０１１８】
ＰＡＮＣ１腫瘍に加えて、本発明者らは、単剤または１８Ｇ７Ｈ６Ａ３と併用したゲムシタビンで治療したＡｓＰＣ−１腫瘍担持マウスにおいて、限界希釈実験（５００、１５００、４５００および１３５００細胞を用いた）における生着パーセントおよびがん幹細胞発生頻度も分析した。治療後４０日目の腫瘍体積測定は、４５００または１３５００細胞を移植したマウスにおいてゲムシタビン対併用における腫瘍担持マウスのパーセント減少を示した（それぞれ、４０％および８０％対３０％および５０％）。がん幹細胞の発生頻度は、ゲムシタビン対併用群において１．５倍超大きく、ゲムシタビンと併用した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は膵がんにおけるがん幹細胞集団を標的化していることをさらに示した。
【０１１９】
実施例２２−ヒト化ＬＧＲ５抗体治療はインビボでのトリプルネガティブ乳がん腫瘍再発およびがん幹細胞発生頻度を低減する
パクリタキセルと併用した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の効果を、トリプルネガティブ乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ＬＭ３モデル（実施例１２）で試験した。この試験は、パクリタキセルと併用した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、パクリタキセル単独と比較して、腫瘍成長において最小の相加的阻害を有した。これらの腫瘍を回収し、分離し、プールして、１０、３０、１００細胞／横腹で限界希釈アッセイにおいてＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウスの新しいコホートに再移植し、治療なしで成長させた。
【０１２０】
パクリタキセルと併用して抗ＬＧＲ５抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療したマウスから単離した細胞は、パクリタキセル単独で治療したマウスから単離した細胞と比較して、腫瘍形成能を非常に低下させた。加えて、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３＋パクリタキセル腫瘍からの再移植
細胞は、パクリタキセル単独と比較して、有意により遅い腫瘍成長プロファイルおよび進行の遅延時間を有した。最終的に、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３＋パクリタキセル治療は、線形回帰解析により、がん幹細胞発生頻度を低減した。これらのデータは、パクリタキセルと併用した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は腫瘍開始またはがん幹細胞集団を効果的に標的化することを示している。
【０１２１】
実施例２３−ヒト化抗ＬＧＲ５抗体および化学療法を用いた予防的治療によりインビボでの転移性大腸がん成長の阻害
大腸がん患者の肝転移由来の低継代大腸がん細胞（ＢＭＣＲＣ０８６）を用いて、インビボ試験を行った。０日目、ＢＭＣＲＣ０８６細胞を解凍し、ＲＰＭＩ：マトリゲル（１：１）に懸濁し、ＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウスの腹に皮下注射した。腫瘍サイズおよび体重について、動物を週２回モニターした。７日目、マウスを、ＰＢＳ、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３、ＦＯＬＦＩＲＩまたは１８Ｇ７Ｈ６Ａ３と併用したＦＯＬＦＩＲＩで治療した。マウスに、７．５週間１５ｍｇ／ｋｇで週２回、ＰＢＳおよび１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を投与した（１６回投与）。マウスに、４週間、ＦＯＬＦＩＲＩ（７日目、１２日目、１７日目、２２日目、２７日目および３２日目に３０ｍｇ／ｋｇフルオロウラシルおよび９０ｍｇ／ｋｇロイコボリン；８日目、１３日目、１８日目、２３日目、２８日目および３３日目に２４ｍｇ／ｋｇイリノテカン）を投与した（６回投与）。ＦＯＬＦＩＲＩと併用した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、ＦＯＬＦＩＲＩ単独と比較して、有意な抗腫瘍活性を示した（図１０）。
【０１２２】
実施例２４−ヒト化ＬＧＲ５抗体治療はＷｎｔシグナル伝達経路を阻害する
インビボ腫瘍有効性試験において結腸がんＣＴ１（実施例８）およびＣＴ３（実施例９）からの１８Ｇ７Ｈ６Ａ３治療した腫瘍を、ウェスタンブロット解析により特徴づけした。各治療マウスからの腫瘍サンプル（群当たりｎ＝５〜１０マウス）を殺処分後切除し、液体窒素冷却した乳鉢内で直ちに凍結し、乳棒で粉砕（凍結粉砕）し、液体窒素中で急速冷凍して使用するまで−８０℃で貯蔵した。凍結粉砕した腫瘍を、時々ボルテックスしながら、氷上で３０分間、氷冷溶解緩衝液（ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ緩衝液を減らして）で溶解した。腫瘍ライセートタンパク質を含む上澄みを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析し、次いで、Ｗｎｔシグナルタンパク質（およびそのリン酸化体）の数についてウェスタンブロッティングした。多くの治療群間の有意差を、ＣＴ１およびＣＴ３腫瘍のウェスタンブロットで観察した。図１１ではホスホ−Ｔｈｒ４１／Ｓｅｒ４５−β−カテニン（Ｗｎｔシグナルタンパク質）は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３がインビボで腫瘍細胞におけるＬＧＲ５シグナル伝達を阻害することができることを示すタンパク質の不活性型、およびその後の分解型のマーカーである。
【０１２３】
実施例２５−ヒト化ＬＧＲ５抗体治療はインビボＷｎｔシグナル伝達経路を阻害しない
親ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞およびＬＧＲ５を安定に発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に、ＴＣＦ−ＬＥＦレポーターベクター含有レンチウイルス（ＧＦＰ  Ｃｉｇｎａｌ、ＱＩＡＧＥＮ）を形質導入し、レポーターの安定発現について選択した。親およびＬＧＲ５の発現安定レポーター系統を、９６ウェルプレート中２５，０００／ウェルで播種し、オーバーナイトで取り付け、血清飢餓させて、抗体またはビヒクルで６時間治療してから、組換えヒトＷｎｔ３ａ（３ｎＭ）および組換えヒトＲ−スポンジンで１８時間治療した。各Ｒ−スポンジン１〜３の２つの濃度およびＲ−ｓｐｏ４の１つの濃度を、ＴＣＦ／ＬＥＦレポーターセルラインの活性化において異なるＲ−スポンジンの活性の本発明者らの分析に基づいて試験した（１００ｐＭ、３００ｐＭ、１ｎＭ、３ｎＭまたは１０ｎＭ）。レポーター誘導ＧＦＰシグナルをプレートリーダーで測定した。示した全実験は試験した各Ｒ−スポンジンについての３つの独立した実験（２回繰り返して各実験を行った）からプールしたデータである（データは平均値＋ＳＤ）。
【０１２４】
図１２に示すように、可溶１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の濃度増大は、Ｗｎｔ３ａ＋ＲＳＰＯ１、
ＲＳＰＯ２またはＲＳＰＯ３の併用によるＴＣＦ／ＬＥＦプロモーター誘導ＧＦＰ発現の誘導に影響を及ぼさなかった。ＲＳＰＯおよびＷｎｔの存在下でＬＧＲ４およびＬＧＲ５両方によりシグナル伝達活性の誘導を阻害することが分かっているポジティブコントロール抗体７６Ｃ１２も示す。このデータは、抗ＬＧＲ５抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３がＲＳＰＯ誘導ＴＣＦ／ＬＥＦプロモーター活性を遮断しないことを示している。
【０１２５】
実施例２６−ヒト化ＬＧＲ５抗体は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）機序により腫瘍細胞を標的化する
ＣＨＯ−ＬＧＲ５細胞をコンフルエントまで成長させ、遠心沈殿させて、ＰＢＳ中に再懸濁し、カウントした。細胞のアリコート（約１００ｋ）を１００μＭ前以て温めた（３７℃）ＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル）を含む別のチューブに添加し、混合物をセルインキュベーター内で１５分間インキュベートした。最終ＣＦＳＥ濃度は約１μＭであった。次に、細胞を洗浄し、前以て温めた培地に再懸濁し、インキュベーター内でさらに３０分間入れた後、ＰＢＳで洗浄した。それから、染色した細胞を１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（１００μＭ）で染色した。抗体のＣＨＯ−ＬＧＲ５細胞との結合を保証するため、いくつかの試験では、細胞のアリコートを、二次ヤギ抗ヒトＰＥ共役抗体でも染色し、実験室においてｃａｌｉｂｕｒ機で分析した。Ｕ９３７細胞を、ＤＤＡＯ−ＳＥ（ＤＤＡＯスクシンイミジルエステル；１００Ｋ細胞に対して２μＭの染料）で１５分間、実験室内の遮光場所で、かつ、室温において染色した。それから、細胞は１ｍｌのＦＢＳ（ウシ胎仔血清）であり、次いで、遮光場所で５分間インキュベートした。次に、細胞を、ＦＢＳ（１０％）を添加したＰＢＳで洗浄し、ＦＢＳ（２．５％）を添加したＲＰＭＩ中に再懸濁した。ＣＨＯ−ＬＧＲ５−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３およびＵ９３７−ＤＤＡＯ−ＳＥ標識化細胞両方をセルインキュベーター内で５時間、同時インキュベートし、実験室においてｃａｌｉｂｕｒ機で分析した。ネガティブコントロールとして、ＣＨＯ−ＬＧＲ５−ＣＦＳＥ細胞（１８Ｇ７Ｈ６Ａ３染色なし）のアリコートもＵ９３７と同時インキュベートし、ｃａｌｉｂｕｒ機で分析した。
【０１２６】
フローサイトメトリーデータの解析は、ＣＦＳＥおよび１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で染色した大部分のＣＨＯ−ＬＧＲ５細胞は生存可能であり、ｃａｌｉｂｕｒ機で検出可能であることを示した。加えて、Ｕ９３７（Ｕ９３７（ヒト単球細胞系統；エフェクター細胞）およびＣＨＯ−ＬＧＲ５細胞の両方は染色された場合検出可能であり、個別に獲得された。最終的に、Ｕ９３７−ＤＤＡＯ−ＳＥおよびＣＨＯ−ＬＧＲ５−ＣＦＳＥ−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の同時インキュベーションは、細胞の二重ポジティブ集団を同定したが、しかしながら、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を欠くＵ９３７およびＣＨＯ−ＬＧＲ５−ＣＦＳＥの同時インキュベーションは二重ポジティブ集団を生成しなかった。二重ポジティブ集団の存在は、Ｕ９３７（ＦｃＲを発現する）とＣＨＯ−ＬＧＲ５−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（Ｆｃ部分を発現する）との交差結合を示し、ＡＤＣＣは１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の抗腫瘍活性の機序の１つであることをさらに示唆している。
【０１２７】
実施例２７−ヒト化ＬＧＲ５抗体はＬＧＲ５を内部移行する
１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の内部移行を、ＬＧＲ５を過剰発現するＣＨＯ細胞に対して検査した。細胞を１００ｎＭ抗体で４℃において３０分〜２時間染色し、過剰Ａｂを洗い落とし、染色した細胞を４℃または３７℃のいずれかでインキュベートした。細胞をＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識二次抗体で様々な時点において染色し、細胞表面結合抗体の内部移行をモニターした。３７℃におけるインキュベーション時、内部移行した割合は、６．７０３±１．２８２分の表面局在に対して実測値ｔ１／２であった。表面結合抗体のいくらか減少が観察されたが、内部移行は４℃におけるインキュベーションにより多くが遮断された。
【０１２８】
実施例２８−ヒト化ＬＧＲ５抗体は可溶ＲＳＰＯとＬＧＲ５との結合を競合的に遮断し
ない
ヒトＲ−スポンジン１／２／３／４タンパク質の存在下、ビオチン−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とｈＬＧＲ５−Ｆｃとの相互作用を、競合ＥＬＩＳＡフォーマットを用いて検査した。ＬＧＲ５−Ｆｃを９６ウェル高結合ＥＬＩＳＡプレート上に２μｇ／ｍＬで塗布し、４℃オーバーナイトでインキュベートした。プレートをＰＢＳ＋１％ＢＳＡで遮断した。ビオチン−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を結合緩衝液中１μｇ／ｍＬまで希釈した。ＬＧＲ５−Ｆｃおよびビオチン−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３間の前の直接結合ＥＬＩＳＡから濃度を選択して、ＥＣ５０濃度超の頑強なシグナルを得た。競合タンパク質を、様々な濃度においてビオチン−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３と同時にＥＬＩＳＡプレートに添加した。１：１，０００希釈のストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ＃８９０８０３）を検出に使用した。プレートをＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ）で発色し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４プレートリーダーで４５０ｎｍにおいてデータを収集した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６プログラムを用いてデータ解析を行った。ビオチン−ｍＡｂおよび競合濃度のいくつかを変更してＥＬＩＳＡを３回繰り返した。
【０１２９】
ポジティブコントロール、ＬＧＲ５−Ｆｃを、ビオチン−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とプレート上のｈＬＧＲ５−Ｆｃとの結合と競合させた。Ｒ−スポンジン１／２／３／４を、ビオチン−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３と、プレート上に塗布されたＬＧＲ５−Ｆｃとの結合を阻害する能力について試験した。タンパク質はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、哺乳類細胞内で発現される完全長コンストラクトである。Ｒ−スポンジンタンパク質の最高濃度において、ＬＧＲ５との抗体結合の完全な遮断は観察されなかった（図１３）。
【０１３０】
実施例２９−ヒト化ＬＧＲ５抗体は可溶ＲＳＰＯとＬＧＲ５との結合を競合的に遮断しない
リガンド単独（ＲＳＰＯまたはＮｏｒｒｉｎ）とＬＧＲ５との結合は、ＬＧＲ５シグナル伝達を誘導するのに充分ではない。代わりに、ＬＧＲ５は、複数の共受容体と三元複合体を形成してシグナル伝達を誘導する。ＬＧＲ５三元複合体の形成に対する１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の効果を検査するため、Ｒ−スポンジン１／２／３／４およびＮｏｒｒｉｎの存在下、ＬＧＲ５と、ＲＮＦ４３、ＺＮＲＦ３、およびＬＲＰ６との結合を、ＥＬＩＳＡフォーマットを用いて検査した。ＲＮＦ４３−Ｆｃ、ＺＮＲＦ３−Ｆｃ、およびＬＲＰ６−Ｆｃを、１×ＰＢＳ中の４μｇ／ｍＬで９６ウェル高結合プレート上に塗布した。プレートを４℃オーバーナイトでインキュベートし、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで遮断した。ＬＧＲ５−Ｆｃを、Ｒ−スポンジン１／２／３／４の１μｇ／ｍＬまたはＮｏｒｒｉｎ  ０．５μｇ／ｍＬの存在下または非存在下全てで、一次緩衝液中１μｇ／ｍＬまで希釈した。Ｒ−スポンジン１／２／３／４またはＮｏｒｒｉｎを、ＥＬＩＳＡプレートに添加する前に、ｈＬＧＲ５−Ｆｃと一緒にプレインキュベートした。各条件について三組のウェルを使用し、三組を同じ条件で試験した。１：２，０００抗ＦＬＡＧ  ｍＡｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用して結合したｈＬＧＲ５−Ｆｃを検出した。抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ（ＪＩＲ）の１：１０，０００希釈を検出のために使用した。プレートをＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ）で発色し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４プレートリーダーで４５０ｎｍにおいてデータを収集した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６プログラムを用いてデータ解析を行った。ＬＧＲ５、リガンドＲＳＰＯまたはＮｏｒｒｉｎ、および共受容体（ＲＮＦ４３−Ｆｃ、ＺＮＲＦ３−Ｆｃ、およびＬＲＰ６−Ｆｃ）との三元複合体の形成が観察された。
【０１３１】
次に、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を、ＬＧＲ５−ＦｃおよびＲＳＰＯまたはＮｏｒｒｉｎの存在下でＥＬＩＳＡプレートにさらに添加した。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、ＲＳＰＯおよびＮｏｒｒｉｎ両方ならびに３つの共受容体（ＲＮＦ４３、ＺＮＲＦ３、およびＬＲＰ６）とのＬＧＲ５三元複合体の形成を有意に低減させた。図１４参照。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、リガンド結合と直接的または競合的に競合しないので、このデータは、阻害のアロステリックな
モデルの証拠である。
【０１３２】
実施例３０−抗ＬＧＲ５抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３のエピトープマッピング
抗体１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が結合するＬＧＲ５の特定領域をさらに特徴づけするため、水素重水素交換質量分析法を用いてエピトープマッピング実験を行った。水素−重水素交換実験を行う前に、塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）の様々な濃度中の非重水素化緩衝液で調製した試験消化物を作製して、ＬＧＲ５単独の最適なペプチドカバレッジ（peptide coverage）のためのタンパク質分解条件を最適化した。ＤＸＭＳのペプシン消化のため、サンプルを５℃で解凍してから直ちに０．０５％トリフルオロ酢酸で１００μｌ／分の流速で、ブタペプシン（Ｓｉｇｍａ）を充填したプロテアーゼカラムで消化した。消化性フラグメントをＣ１８トラップカラムに回収し、６〜３８％の直線的アセトニトリルグラジエントを用いてＣ１８逆相カラム（Ｖｙｄａｃ）で分離した。カラム溶出物をＬＣＱ  Ｃｌａｓｓｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ，Ｉｎｃ．）またはＱ−ＴＯＦ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）に直接エレクトロスプレーした。ＭＳ／ＭＳデータセットからのペプシン生成ペプチドの決定を、ＳＥＱＵＥＳＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ，Ｉｎｃ．）の使用により容易にした。それから、この組のペプチドを、ＤＸＭＳ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｓｉｅｒｒａ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州モデスト）によりさらに検証した。異なる濃度のＧｄｎＨＣｌのペプチドカバレッジマップを比較して、各個別のタンパク質またはタンパク質複合体の最適カバレッジマップを、その後の重水素交換実験に使用した。前に記載したように０℃で全ての工程を行った。
【０１３３】
タンパク質緩衝液中のＬＧＲ５−Ｆｃ、または１８Ｇ７Ｈ６Ａ３とプレインキュベートしたＬＧＲ５−Ｆｃを、５０％Ｄ２Ｏの最終濃度までＤ２Ｏ緩衝液と混合することにより交換実験を開始した。混合物を、１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、または１０，０００秒間、０℃でインキュベートしてから、交換反応を氷冷クエンチ溶液（０．９６％ギ酸、０〜０．８Ｍ塩酸グアニジン）の添加により反応停止し、０．５８％ギ酸および０〜０．５Ｍ塩酸グアニジンの最終濃度、ｐＨ２．５のサンプルを得た。それから、サンプルをドライアイスで直ちに凍結し、−８０℃で貯蔵した。ＤＸＭＳ実験のデータ処理は、前に記載したように専用ソフトウェアを利用した（ＤＸＭＳ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ、Ｓｉｅｒｒａ  Ａｎａｌｙｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）。
【０１３４】
水素／重水素（Ｈ／Ｄ）交換データは、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の結合および抗原に対する抗体の結合と同時に表面露出残基が埋め込まれるせいで溶媒暴露が変化することに関する詳細を提供する。ＨＤ交換データ解析は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３が、Ｘ線結晶試験により同定されたＲ−スポンジン結合部位の面の反対のロイシン高濃度反復６〜９の凸型表面内の配列番号４７のアミノ酸Ｔ１７５、Ｅ１７６、Ｑ１８０、Ｒ１８３、Ｓ１８６、Ａ１８７、Ｑ１８９、Ｄ２４７、Ｅ２４８、Ｔ２５１、Ｒ２５４、Ｓ２５７、Ｎ２５８、Ｋ２６０と結合することを示している。（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２７（１２）：１３４５−５０（その全文を参照することにより組み入れられるものとする）参照）。これらのデータは、ＬＧＲ５とＲ−スポンジンとの結合に関する残基が１８Ｇ７Ｈ６Ａ３との結合に関連しないことを示している。これらの先行する結果は、ＬＧＲ５における他の構造的要素が１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の結合部位に関連し得るという事実を除外しない。
【０１３５】
実施例３１−結腸がんを患っているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の投与
結腸がんを患っているヒト患者の集団を、化学療法で治療し、腫瘍体積をモニターする。平均腫瘍体積が拡大を止め、実際に、化学療法の開始と同時に減少することが観察される。長期間の後、腫瘍体積は安定化し、最終的に増大し始める。
【０１３６】
結腸がんを患っている第二ヒト患者集団を、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３と同時投与される化学療
法を治療する。再び、平均腫瘍体積をモニターする。腫瘍体積が拡大を止め、実際に、化学療法の開始と同時に減少することが観察される。腫瘍体積は、第一集団より実質的に低い最小体積まで減少することが観察される。腫瘍サイズは第一集団に対して実質的に延長した時間、低いままであることも分かる。
【０１３７】
実施例３２−結腸がんを患っているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の投与
結腸がんを患っているヒト患者の第一集団に化学療法を単独で施行する。結腸がんを患っているヒト患者の第二集団に１８Ｇ７Ｈ６Ａ３と併用した化学療法を施行する。
【０１３８】
第一集団は、腫瘍サイズおよび成長の一時的減少を示し、その後、腫瘍成長は再開し、症状は元に戻る。化学療法治療後の腫瘍成長は、その後の化学療法に対して治療不応性である。
【０１３９】
第二集団は、基礎レベルまで腫瘍サイズの減少および腫瘍成長の休止を示す。腫瘍成長は、治療レジメンの完了中または完了と同時に再開しない。レジメンの完了後、成長は再発せず、がんの症状はもはや第二集団に存在しない。
【０１４０】
実施例３３−結腸がんを患っているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の投与は生存率を増大する
結腸がんを患っているヒト患者の第一集団に化学療法を単独で施行する。結腸がんを患っているヒト患者の第二集団に１８Ｇ７Ｈ６Ａ３と併用した化学療法を施行する。
【０１４１】
治療（１年）後の設定期間における患者生存率をモニターする。第二集団の患者生存率は第一集団の患者生存率より実質的に高いことが観察される。すなわち、第一集団の生存率と比較して、第二集団の有意により高い割合が治療後１年目を過ぎて生存している。
【０１４２】
後の間隔においても同様に観察され、第一間隔において生存したものの中で、第二群のメンバーは治療後１年で生存した第一群のメンバーである第二間隔（治療後２年）まで有意により生存しそうであることが観察される。
【０１４３】
実施例３４−乳がんを患っているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の投与
乳がんを患っているヒト患者の集団を、化学療法で治療し、腫瘍体積をモニターする。平均腫瘍体積が拡大を止め、実際に、化学療法の開始と同時に減少することが観察される。長期間の後、腫瘍体積は安定化し、最終的に増大し始める。
【０１４４】
乳がんを患っている第二ヒト患者集団を、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３と同時投与される化学療法により治療する。再び、平均腫瘍体積をモニターする。腫瘍体積が拡大を止め、実際に、化学療法の開始と同時に減少することが観察される。腫瘍体積は、第一集団より実質的に低い最小体積まで減少することが観察される。腫瘍サイズは第一集団に対して実質的に延長した時間、低いままであることも分かる。
【０１４５】
実施例３５−乳がんを患っているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の投与
乳がんを患っているヒト患者の第一集団に化学療法を単独で施行する。乳がんを患っているヒト患者の第二集団に１８Ｇ７Ｈ６Ａ３と併用した化学療法を施行する。
【０１４６】
第一集団は、腫瘍サイズおよび成長の一時的減少を示し、その後、腫瘍成長は再開し、症状は戻る。化学療法治療後の腫瘍成長は、その後の化学療法に対して治療不応性である。
【０１４７】
第二集団は、基礎レベルまで腫瘍サイズの減少および腫瘍成長の休止を示す。腫瘍成長
は、治療レジメンの完了中または完了と同時に再開しない。レジメンの完了後、成長は再発せず、がんの症状はもはや第二集団に存在しない。
【０１４８】
実施例３６−乳がんを患っているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の投与は生存率を増大する
乳がんを患っているヒト患者の第一集団に化学療法を単独で施行する。乳がんを患っているヒト患者の第二集団に１８Ｇ７Ｈ６Ａ３と併用した化学療法を施行する。
【０１４９】
治療（１年）後の設定期間における患者生存率をモニターする。第二集団の患者生存率は第一集団の患者生存率より実質的に高いことが観察される。すなわち、第一集団の生存率と比較して、第二集団の有意により高い割合が治療後１年目を過ぎて生存している。
【０１５０】
後の間隔においても同様に観察され、第一間隔において生存したものの中で、第二群のメンバーは１年のポット治療で生存した第一群のメンバーである第二間隔（治療後２年）まで有意により生存しそうであることが観察される。
【０１５１】
実施例３７−結腸がんを患っているヒト患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の投与は副作用を低減する
結腸がんを患っているヒト患者の第一集団に化学療法ならびにＬＧＲ５−ＲＳＰＯ結合およびシグナル伝達を遮断する抗ＬＧＲ５抗体を投与する。結腸がんを患っているヒト患者の第二集団に化学療法および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を投与する。
【０１５２】
第一集団は、ＬＧＲ５によるＲＳＰＯ１シグナル伝達の干渉に関連する治療副作用がないことを示す。これらの副作用は患者の健康にとって有害になる。
【０１５３】
化学療法と併用して１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を投与した第二集団は、ＬＧＲ５によるＲＳＰＯ１シグナル伝達の干渉に関連する治療副作用がないことを示さない。
【０１５４】
実施例３８−進行性ＣＲＣ腫瘍におけるＬＧＲ５の発現
ＬＧＲ５転写産物発現を、ＬＧＲ５特異的プローブを含むＲＮＡｓｃｏｐｅ技術を用いて調査した。ＬＧＲ５転写産物は、結腸、腸管、小脳および膵臓を含む組織で検出可能であった。ＬＧＲ５転写産物は、ＣＴ１  ＣＲＣおよびＪＨ１０９膵腫瘍を含む患者由来異種移植片（ＰＤＸ）組織でも検出可能であった。ＬＧＲ５の発現を、初期（グレードＩ）対進行性（転移性）病変を含む腫瘍形成能の異なる段階において単離されたＣＲＣ患者サンプルで調査した。ＬＧＲ５転写産物は、ＣＲＣグレードＩ、ＩＩおよびＩＩ病変において発現され、ＣＲＣ転移性病変において高度に発現された。
【０１５５】
実施例３９−転移性膵臓患者由来異種移植片におけるＬＧＲ５の発現
転移性膵臓患者由来異種移植片におけるＬＧＲ５の発現を、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＱＰＣＲ）を用いて調査した。腫瘍組織のサンプルを急速凍結またはＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州）を含むクライオバイアル（ｃｒｙｏｖｉａｌ）に添加し、数時間４℃でインキュベートした後−７０℃に移動した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州）を用いて、全ＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州）および製造者により提供されたプロトコールを用いてｃＤＮＡを合成した。ヒトＬＧＲ５転写産物存在量を、ヒト特異的ＬＧＲ５およびＧＡＰＤＨプライマーならびにＳｔｅｐＯｎｅ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州）の次の熱的条件：５０℃（２分）；９０℃（２分）および９０℃（１５秒）の４０サイクルおよび６０℃（１分）および融解曲線アセスメント（６５℃〜９５℃）を用いて測定した。ＬＧＲ５存在量を、式２＾δＣｔを用いて定量した。
【０１５６】
転移性膵臓患者由来異種移植片において、ＬＧＲ５は高度に発現された。化学療法を用いた治療は、膵腫瘍においてＬＧＲ５の発現の増加をもたらした。ヒト特異的プライマーを使用して、ＬＧＲ５転写産物は、一連の膵臓患者由来異種移植片のＱＰＣＲを用いて測定可能であった。ＬＧＲ５は大部分の腫瘍で検出可能であったが、転移性腫瘍におけるＬＧＲ５の発現が増加する傾向であり、進行性腫瘍形成能においてＬＧＲ５に対する役割をさらに示唆した。
【０１５７】
ＪＨ１０９、ＡＳＰＣ１およびＰＡＮＣ１を含む一連の膵腫瘍においてＬＧＲ５の発現を調査した。標準治療（ＳＯＣ）（ＪＨ１０９におけるジェムザールおよびアブラキサンならびにＰＡＮＣ１およびＡＳＰＣ１におけるジェムザール単独）を用いた治療は、前述の腫瘍のそれぞれにおけるＬＧＲ５の発現の誘導をもたらした（図１５）。特に、ＬＧＲ５の発現は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３およびＳＯＣの併用で治療した腫瘍におけるコントロール（生理食塩水またはＭＯＰＣ）に匹敵するレベルまで減少した。これらのデータは、ＬＧＲ５の発現が、ＰＡＮＣ腫瘍における併用療法（１８Ｇ７Ｈ６Ａ３＋ＳＯＣ）に対する応答のバイオマーカーとして役割を果たすことができることをさらに示している。
【０１５８】
実施例４０−ＣＴＮＮＢ１はＣＲＣおよび膵腫瘍における１８Ｇ７Ｈ６Ａ３標的遺伝子の１つである
１８Ｇ７Ｈ６Ａ３のためのＷｎｔ経路における可能性ある標的を調査した。Ｗｎｔ  ＱＰＣＲプレート（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州）を、９６ウェルＰＣＲプレート中の約８０Ｗｎｔ経路遺伝子に対するプライマーを用いて調製した。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３またはＭＯＰＣ（コントロール）治療腫瘍からのｃＤＮＡをプールし、ＷｎｔプレートにおけるＱＰＣＲを行った。各プレートのデータを対応するＧＡＰＤＨに対して正規化し、各遺伝子の存在量を式２＾δＣｔを用いて測定した。倍差を測定するため、各１８Ｇ７Ｈ６Ａ３治療腫瘍におけるデータを、ＭＯＰＣ治療群からの対応する値により割った。１より大きいかまたは１より小さい値は、それぞれ、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３治療群における上方制御かまたは下方制御を示した。上方制御または下方制御された遺伝子数の初期評価は、両方の腫瘍モデル（ＣＴ１およびＣＴ３）において、上方制御された遺伝子より下方制御された遺伝子が多いことを示し、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は遺伝子発現に対する阻害効果を有することを示唆した。詳細な分析は、ＦＺＤＢ、ＦＺＤ７、ＷＮＴ７Ｂ、ＦＢＸＷ１１、ＦＺＤ１、ＤＶＬ１、ＣＳＮＫ２Ａ１およびＣＴＮＮＢ１を含むいくつかの差次的に発現された遺伝子を同定した。
【０１５９】
子宮頚がんでは、ＬＧＲ５の発現およびＣＴＮＮＢ１の間に密接な相関関係があり得る。他の試験では、ＬＧＲ５の過剰発現（ＬＧＲ５組換えベクターを使用）または下方制御（ｓｈＲＮＡ使用）は、それぞれ、ＣＴＮＮＢ１の上方制御または下方制御をもたらした（Ｃｈｅｎ  Ｑ，  Ｃａｏ  ＨＺ，  Ｚｈｅｎｇ  ＰＳ．  ２０１４．  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ５：  ９０９２−１０５）。加えて、子宮頚がん患者からの免疫組織化学スライドの分析は、ＬＧＲ５およびＣＴＮＮＢ１発現の間の有意な相関関係を示した。この試験では、ＣＴＮＮＢ１発現を、ＱＰＣＲ（転写産物レベルを測定するため）およびウェスタンブロッティング（タンパク質発現を評価するため）をさらに用いて調査した。ヒト特異的プライマーを使用して、ＣＴＮＮＢ１発現を、膵腫瘍およびＣＲＣ腫瘍において調査した。実施例４５で説明したＬＧＲ５の発現と同様に、ＳＯＣを用いた治療はＣＴＮＮＢ１発現を増大し、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３およびＳＯＣの併用はＣＴＮＮＢ１発現の減少をもたらした。加えて、ＣＴＮＮＢ１発現は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療したＣＴ１腫瘍において約３５％減少した。従って、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を用いた治療はＣＴＮＮＢ１を阻害する。β−カテニンおよびホスホ−β−カテニン（Ｗｎｔ経路における活性の欠如を示す）の発現を、ウェスタンブロット解析により調査した。ＡＳＰＣ１腫瘍におけるウェスタンブロットデータは、単剤またはＳＯＣと併用した１８Ｇ７Ｈ６Ａ３がｐβ−カテニンを上方制御
するＱＰＣＲデータを確証し、これらの腫瘍におけるＷｎｔ経路活性の阻害を示唆した（図１６）。
【０１６０】
ｐ−β−カテニン、ＧＳＫ−３β（全ておよびホスホ）、およびＬＲＰ６を含むＷｎｔ経路の他の成分を、一連のＣＲＣ腫瘍、膵腫瘍および乳腺腫瘍において調査した。ウェスタンブロットデータの定量は、ＡＳＰＣ１およびＰＡＮＣ１腫瘍におけるＷｎｔ経路シグナル伝達の有意な阻害を示したが、他のモデルではＷｎｔ経路の下方制御の傾向をいくらか明らかにしている。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を用いた治療に応答しないＢＭＣＲＣ０８６腫瘍は、ＬＧＲ５の発現およびＷｎｔシグナル伝達経路成分に対して陰性であり、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３に対する作用の機序は特異的にＬＧＲ５を標的化しＷｎｔシグナル伝達を阻害することをさらに支持した。
【０１６１】
ＡＳＰＣ１、ＰＡＮＣ１およびＪＨ１０９を含む膵腫瘍におけるＷｎｔ経路遺伝子の発現を調査した。インビボデータに基づいて、ＰＡＮＣ１およびＡＳＰＣ１の両方において、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３治療腫瘍対ＰＢＳ治療腫瘍間の腫瘍体積の差があった。対照的に、ＪＨ１０９腫瘍は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３単剤またはＳＯＣ化学療法併用のいずれかを含む標準治療レジメンに対して応答しなかった。応答細胞（ＰＡＮＣ１およびＡＳＰＣ１）および非応答細胞（ＪＨ１０９）におけるＷｎｔ遺伝子発現の差を調査した。併用治療群では、Ｗｎｔ６、ＦＺＤ８、ＦＯＳＬ１、Ｗｎｔ１１、ＮＦＡＴＣおよびＦＺＤ５は、ＡＳＰＣ１およびＰＡＮＣ１併用治療腫瘍において下方制御され、ＪＨ１０９腫瘍において上方制御された。膵臓およびＣＲＣデータの両方では、ＷＮＴ１１、ＷＮＴ６、ＦＲＺＢおよびＰＲＩＣＫＥＬを含む遺伝子は、ＰＡＮＣ１、ＡＳＰＣ１、ＣＴ１およびＣＴ３細胞において下方制御されたが、ＪＨ１０９細胞では下方制御されなかった。
【０１６２】
遺伝子ツリー解析（Gene Tree analysis）は、Ｗｎｔ１１、ＦＲＡＴ１、ＬＥＦ１、ＧＳＫ３Ｂ、ＦＺＤ８およびＬＲＰ６を含む１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を用いて治療した膵腫瘍において同時制御された可能性ある遺伝子を同定した。各治療における差次的に発現された転写産物の分析は、膵腫瘍より２倍多く上方制御または２分の１に下方制御される遺伝子も同定した（図１７）。Ｗｎｔ７Ａなどのいくつかの遺伝子は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３対コントロール治療腫瘍における全ての腫瘍間で共通であった。
【０１６３】
実施例４１−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３はＣＴ１腫瘍における転写を阻害する
１８Ｇ７Ｈ６Ａ３標的遺伝子の発現を、初期対後期腫瘍形成能において調査した。マウスは、ＣＴ１を移植したマウスであり、３日目、１０日目および１７日目においてコントロール、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３群、ＦＯＬＦＩＲＩ群または化学療法群から腫瘍を回収した。３日目の各腫瘍からの全ＲＮＡを回収し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｉｐｓを用いて遺伝子アレイハイブリダイゼーションのために調製した。差次的に発現された遺伝子（１．５または２倍より多い、ｐ＜０．０５）の全体的分析は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療した（単剤またはＦＯＬＦＩＲＩと併用して）腫瘍において、上方制御された遺伝子より下方制御された遺伝子が多かった。これは、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を用いた治療は、全体的細胞転写装置に対するより大きな抑制効果を有した可能性があることを示唆した。ＰＣＡ（主成分分析）は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３およびコントロール治療腫瘍での全体的遺伝子発現における近接効果も示した。しかしながら、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３をＦＯＬＦＩＲＩに添加した場合（すなわち、併用群）、併用対ＦＯＬＦＩＲＩ間の明白な分離があり、ＬＧＲ５の標的化は、ＦＯＬＦＩＲＩ治療腫瘍における遺伝子発現を有意に変化させた可能性があることを示唆した。
【０１６４】
１８Ｇ７Ｈ６Ａ３対ビヒクルにおける差次的に発現された遺伝子の分析は、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３治療腫瘍において下方制御されるＡＮＧＰＴ２、ＡＫＡＰ１２およびＡＤＭなどのいくつかの腫瘍プロモーター、ならびに１８Ｇ７Ｈ６Ａ３治療腫瘍において上方制御され
るＤＡＢ１、ＭＩＲ６５５、ＮＫＸ１−２などのいくつかの腫瘍サプレッサーを同定した（図１８）。逆に、ＦＯＬＦＩＲＩ治療は、腫瘍プロモーター（ＦＢＮ２、ＨＫＤＣ１、ＡＢＣＢ１、ＦＧＦ２）ならびにＴＲＩＢ３、ＡＴＦ３およびＴＩＭＰ３などのいくつかの腫瘍サプレッサーも上方制御するように思われる（図１９）。ＦＯＬＦＩＲＩおよび１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の併用は、ＡＬＤＯＣ、ＣＤＨ５、ＩＴＧＡ２などのより多くの腫瘍プロモーターの下方制御、ならびにＺＢＴＢ１１、ＩＴＰＫＡ、ＰＳＭＣ３ＩＰおよびＢＡＫ１などのより多くの腫瘍サプレッサーの上方制御をもたらした（図２０）。
【０１６５】
実施例４２−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３治療は膵臓患者由来異種移植の同所性モデルの末梢血液中のヒトＣＴＣを減少させる
原発腫瘍成長および転移の阻害における１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の役割を調査するため、一連の膵臓患者由来異種移植片サンプル、ならびにＰＡＮＣ１４２４細胞およびＰＡＮＣ１４２７細胞においてＬＧＲ５の発現を検査した。
【０１６６】
腫瘍サンプルをＮＯＤ／ＳＣＩＤ（非肥満糖尿病性重複合免疫不全）マウスの皮下に移植し、その後、インビボ試験のために指定したレシピエントの膵臓に移植した。腫瘍体積を毎週超音波で測定し、〜１００ｍｍ３の腫瘍を有するマウスを有効性試験に登録し、次のもので処理した：１−  ＭＯＰＣアイソタイプ（１５ｍｇ／ｋｇ、週２回；腹腔内）；２−  １８Ｇ７Ｈ６Ａ３（１５ｍｇ／ｋｇ、週２回；腹腔内）；３−  ＳＯＣ（ジェムザール  ５０ｍｇ／ｋｇ；腹腔内、週２回およびアブラキサン  ３０ｍｇ／ｋｇ、静脈内、週２回）；４−  上記用量での１８Ｇ７Ｈ６Ａ３およびＳＯＣの併用。この試験の最後に、各腫瘍担持マウスからの末梢血液を、ＣＴＣ（フローサイトメトリー使用）および循環ＤＮＡアセスメントのために集めた。フローサイトメトリーのため、血液サンプルを、製造者プロトコールを用いてＲＢＣ溶解緩衝液（ＡＣＫ緩衝液、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈ、カリフォルニア州）で処理し、４℃で３０分間、ヒトＨＬＡ−ＦＩＴＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州）およびヒトＬＧＲ５−ＡＦ６４７（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州）で染色した。実験室においてＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｕｒ機での捕捉の前に、染色緩衝液（ＰＢＳ−ＦＢＳ３％）および７ＡＡＤ（７−アミノアクチノマイシン）で２回、細胞を洗浄し、ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ｄｅ  Ｎｏｖｏ、カリフォルニア州）を用いてデータを解析した。
【０１６７】
様々な膵臓患者由来異種移植片サンプルにおいて、ＬＧＲ５は発現された。ヒトＣＴＣを末梢血液中で検出した。ＨＬＡ＋細胞のパーセントはＭＯＰＣ対１８Ｇ７Ｈ６Ａ３において有意に変化しなかったが、循環ＨＬＡ＋ＬＧＲ５＋細胞のパーセントは、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３治療マウスで有意に減少した（図２１）。
【０１６８】
ＨＬＡ＋細胞のパーセントは、化学療法対併用治療マウスで有意な変化はなかったが、しかしながら、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３およびＳＯＣの併用は、同時および減量設定の両方においてＨＬＡ＋ＬＧＲ５＋細胞をほとんど完全に切除した（図２２Ａおよび図２２Ｂ）。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３治療（単剤またはＳＯＣと併用）は、膵臓患者由来異種移植の同所性モデルの末梢血液中のヒトＣＴＣを有意に減少させる。
【０１６９】
実施例４３−他のモデルにおけるＬＧＲ５の発現
ＬＧＲ５の発現を、フローサイトメトリーおよびＲＮＡｓｃｏｐｅを用いて、カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅｓ）（Ｃｙｎｏｓ）由来の皮膚サンプルで調査した。Ｃｙｎｏｓからの皮膚サンプルを、０日目、７日目、１４日目および２１日目においてビヒクルまたは１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の様々な用量（Ｇ２：１０ｍｇ／ｋｇ；Ｇ３：５０ｍｇ／ｋｇ；およびＧ４：１５０ｍｇ／ｋｇ）で治療した。試験終了時、皮膚サンプルを、抗菌剤（ペニシリンおよびストレプトマイシン）および抗真菌液剤（Ａｎｔｉ−Ａｎｔｉ  １００×、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州）を添加し
たＤＭＥＭ中で準備した。皮膚サンプルを、コラゲナーゼおよびサーモリシン（リベラーゼ、Ｒｏｃｈ  Ｉｎｃ、カリフォルニア州）の混合液を用いて消化した。皮膚前駆細胞（ＳＰ）をリベラーゼと一緒に、機械的破砕をしながらオーバーナイトのインキュベーション後に単離した。ＳＰを、ラット抗ヒトＬＧＲ５（ＡＦ６４７、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州）で染色し、実験室においてｃａｌｉｂｕｒ機で分析した。ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｄｅｎｏｖｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、カリフォルニア州）を用いたデータ解析は、ＬＧＲ５はＣｙｎｏｓ  ＳＰにおいて検出可能であるが、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３（異なる用量）対ビヒクル治療群間のＬＧＲ５頻度の有意な差はないことを示した。ＲＮＡｓｃｏｐｅを用いて、ＬＧＲ５は、特に毛包幹細胞およびずっと程度は低いが皮膚上皮細胞において皮膚領域で検出可能であった。ビヒクル対１８Ｇ７Ｈ６Ａ３治療サンプルのＬＧＲ５ポジティブ領域の有意な差はなかった。
【０１７０】
Ｃｙｎｏｓから単離された遺伝子発現末梢血液単球を調査した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキットを用いて全ＲＮＡを抽出し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州）を用いてｃＤＮＡを合成した。各処理からｃＤＮＡをプールし、ＲＴ２  Ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＳＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州）に添加した。最終混合物を、ケモカインまたは炎症性ケモカインのためのＣｙｎｏ  ＱＰＣＲプライマーを含む９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ＰＣＲの温度プロファイルは：９５℃で１０分間および９５℃、１５秒の４０サイクルおよび６０℃で１分、次いで融解曲線段階を含む。各プレートにおけるデータ（Ｃｔ値）を、対応するＧＡＰＤＨから差し引くことにより正規化し、各転写産物の存在量を式２＾ＤＣＴを用いて算出した。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３群のいずれか対ビヒクル治療群間の差次的に発現された（２倍超）転写産物数の分析は、遺伝子アレイデータと一致して、上方制御された遺伝子より下方制御された遺伝子がずっと多いことを示した。用量漸増に伴い、上方制御された遺伝子はより少なく、下方制御された遺伝子はより多かった。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の最終投与後４週間Ｃｙｎｏｓが治療を受けないＧ４回復（Ｇ４Ｒ）群は、ほとんど同様の数の上方制御遺伝子、下方制御遺伝子を示した。詳細な分析は、その発現が１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の用量に対して逆相関関係にある、すなわち、１０ｍｇ／ｋｇで最高、１５０ｍｇ／ｋｇで最低である差次的に発現された遺伝子（ＣＣＬ１１、ＩＬ３、ＳＰＰ１、ＣＣＬ１３、ＣＸＣＬ６およびＴＮＦＲＳＦ１１ｂ）を同定した。
【０１７１】
治療間で共通に下方制御された遺伝子としては、ＣＣＬ１、ＩＦＮγ、ＣＣＲ８、ＩＬ２、ＩＬ３およびＩＬ４が挙げられ、このうちいくつかはＭ１またはＭ２マクロファージが高濃度である。
【０１７２】
実施例４４−ヒト化抗ＬＧＲ５抗体によるインビボでの小細胞肺がん腫瘍成長の阻害
患者由来小細胞肺がん異種移植モデル。ＢＬＧ２９３腫瘍から分離した腫瘍細胞を、マトリゲル中のＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウスの皮下に移植し、腫瘍サイズおよび体重について週２回モニターした。腫瘍が平均１３０ｍｍ３に達した場合、マウスをランダムに分けた。マウスを、ＰＢＳ、抗体コントロールＭＯＰＣ、または１８Ｇ７Ｈ６Ａ３のいずれかで治療した。マウスに、１５ｍｇ／ｋｇで週２回投与した。全マウスを、体重および腫瘍サイズ、ならびに健康全般および外観について、終了するまで、週２回モニターした。
【０１７３】
１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は、ＰＢＳ（２４．９％腫瘍成長阻害）またはＭＯＰＣ抗体（２４．７％腫瘍成長阻害）コントロールと比較して有意な抗腫瘍活性を示した。
【０１７４】
実施例４５−１８Ｇ７Ｈ６Ａ３は減量化学療法後再発する膵腫瘍を有するマウスの生存率を増大させる
Ｐａｎｃ１４２７（ＵＣＳＤ１４２７）腫瘍は、化学療法（ゲムシタビン／アブラキサ
ン）および１８Ｇ７Ｈ６Ａ３を用いた治療により完全に減量（消失）した。腫瘍が退消失した場合、化学療法は止め、マウスを１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療したかまたは治療しなかった。１８Ｇ７Ｈ６Ａ３で治療した動物は、コントロール動物と比較して、著しく健康であったが、いく匹かのマウスは跛行または体重損失などの重症な健康観察のせいで安楽死させなければならなかった。１５０日目、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３および化学療法で治療した７／８のマウスは生存し、対して、化学療法単独で治療したマウスは４／８が生存した。図２３に結果をまとめている。
【０１７５】
実施例４６−患者への１８Ｇ７Ｈ６Ａ３の投与
転移性大腸がん患者のＢＮＣ１０１（抗ＬＧＲ５ヒト化モノクローナル抗体）のフェーズＩ、用量漸増試験を下記のように行う。最終製品名：注入用ＢＮＣ１０１液剤。活性成分名：ＢＮＣ１０１、１８Ｇ７Ｈ６Ａ３、ＥＴ１０１、ＬＧＲ５抗体。
【０１７６】
試験目的
最大耐用量（ＭＴＤ）を決定するため転移性大腸がん患者に静脈内投与されたＢＮＣ１０１の推奨フェーズＩＩ用量（ＲＰ２Ｄ）、安全性、耐容性および薬物動態（ＰＫ）プロファイル。主目的は転移性大腸がん患者におけるＢＮＣ１０１単剤および化学療法との併用の両方のＭＴＤを決定することである。第二目的は以下の通りである。転移性大腸がん患者におけるＢＮＣ１０１単剤および化学療法との併用の両方のＲＰ２Ｄを決定すること。ＢＮＣ１０１の安全性および耐容性［有害事象（ＡＥ）、投薬欠落または投薬遅延］を評価すること。ＢＮＣ１０１の免疫原性（ＢＮＣ１０１に対する抗体の産生）について評価すること。ＢＮＣ１０１単剤および化学療法との併用の両方の薬物動態（ＰＫ）（半減期、分布およびクリアランスの体積）を決定すること。ＢＮＣ１０１で治療された転移性大腸がん患者の全奏効率（ＯＲＲ）、無進行生存率（ＰＦＳ）および全生存率（ＯＳ）の初期評価を行うこと。探索目的は以下の通りである。疾患関連バイオマーカーの変化（ＣＥＡ）を評価すること。活性のバイオマーカー［薬力学、例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、ＬＧＲ５＋細胞、循環腫瘍ＤＮＡ］を評価すること。
【０１７７】
安全性エンドポイント
治療誘発事象（臨床データおよび実験室データ）を評価すること。投薬中断および投薬中止を評価すること。
【０１７８】
重要患者選択規準
１．署名された書面によるインフォームドコンセント。  ２．年齢＞１８歳。  ３．米国東海岸がん臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータススコア０〜１。  ４．転移性疾患に対して少なくとも２回の化学療法（単剤治療コホート）または少なくとも１回の化学療法（併用治療コホート）に抵抗性のあった組織学的または細胞学的に確認された大腸がん患者、かつ、医師および患者双方の意見において実験的治療を試行することが不当でない。この６か月以内のアジュバントＦＯＬＦＯＸ（フォリン酸；フルオロウラシル（５−ＦＵ）；およびオキサリプラチン）が治療法と見なされる。第一治療後の維持ストラテジーが追加の治療法として考えられていない。  ５．患者は、該患者またはその治療を危険にさらすことがない生検を行い易い利用可能な腫瘍病変を有しなければならない。単剤漸増コホート３以降の患者、単剤拡大コホート、および全併用治療患者は、２回連続の腫瘍病変生検（可能ならいつでも最低限２回の新鮮なコア／パンチが好ましい）を提供することに同意かつ提供する意思がある。原発性腫瘍の代わりに、肝転移から生検することができる。新鮮な生検の腫瘍組織の存在は、適切な準備なしの組織学的または細胞学的手順を用いて訓練された病理学者により認定されるものとする。  ６．固形がんの治療効果判定のためのガイドライン（ＲＥＣＩＳＴ）１．１版による測定可能な疾病。  ７．既知の脳転移がない。  ８．少なくとも≧１２週の平均余命。  ９．正常な臓器および髄機能：  ａ．登録前に過去１４日間成長因子の助けなしに好中球絶対数＞１，５００
／ｍＬ。  ｂ．登録前に過去１４日間輸血なしで血小板＞１００，０００／ｍＬ。  ｃ．ヘモグロビン≧９．０ｇ／ｄＬ−患者は輸血されていてもよく、この規準を満足する赤血球新生治療を受けていてもよい。  ｄ．全ビリルビン＜１．５×正常の施設基準値上限（ＵＬＮ）（ジルベール症候群を有する対象では＜２×ＵＬＮ）。  ｅ．血清アルブミン≧３ｇ／ｄＬ。  １０．アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）（血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ、ＳＧＯＴ）およびアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）（血清グルタミン酸ピルビン酸アミノ基転移酵素、ＳＧＰＴ）＜２．５×施設基準ＵＬＮ（肝臓への侵襲がある対象では＜５×施設基準ＵＬＮだが、ビリルビン上昇と関連し得ない）。  １１．生検を受ける患者のため、プロトロンビン時間（ＰＴ）および活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）／正常範囲内（±１５％）の国際標準化比（ＩＮＲ）。  １２．クレアチニン＜１．５×施設基準ＵＬＮまたはクレアチニンクリアランス＞６０ｍＬ／分／１．７３ｍ２（国際標準より上のクレアチニンレベルを有する対象）。  １３．妊娠する／妊娠させる可能性のある女性／男性の充分な避妊。
【０１７９】
投薬およびスケジュール
交互に、２つの分離した組みのコホートにおいて漸増を行う：単剤ＢＮＣ１０１用量漸増は併用化学療法コホートにおける用量漸増に先行する。後者の場合、ＢＮＣ１０１は、ＦＯＬＦＩＲＩと併用して用量漸増される。併用化学療法コホートは、ＲＰ２Ｄが単剤治療コホートにおいて決定されるまで治療を開始しない。併用化学療法コホートにおける漸増は、単剤コホートの単剤ＲＰ２Ｄより低い１つのレベルで開始する。化学療法とＢＮＣ１０１の併用からさらなる毒性は予期されないが、初回用量より低い２つの追加の段階的縮小（de-escalation）レベルを使用するが、これらは必要なことである。
【０１８０】
ＢＮＣ１０１単剤治療
標準３＋３フェーズＩ試験デザインを使用する。初回用量は、動物において最大無毒性量（ＮＯＡＥＬ）の用量（ヒトで２．５ｍｇ／ｋｇ）の３０分の１であり、受容体結合における種の違いを考慮して算出した。その後のＢＮＣ１０１用量レベルは５、１０、および１５ｍｇ／ｋｇである。
【０１８１】
投与スケジュールは、毎週である（ｑｌｗ）。
【０１８２】
サイクル期間は、サイクル間の休止の週はなくて、４週間（２８日）（４週毎に点滴）である。
【０１８３】
用量漸増を行ってＭＴＤを決定する。用量コホート内での用量漸増または減少はしない。全ての場合で、ＢＮＣ１０１を朝に投与し、同日にトランスレーショナルリサーチ用の血液サンプルの調製および輸送を時間的に可能とすべきである。
【０１８４】
用量漸増を、２．５ｍｇ／ｋｇの用量（動物の最大ＮＯＡＥＬ用量の３０分の１）の３患者のコホートから始める。２８日の最後に（ＢＮＣ１０１を４回投与）、試験薬物に起因するＣＴＣＡＥグレード≧２ＡＥが観察されない場合、３患者の第二コホートを次の用量レベル（５ｍｇ／ｋｇ）で治療する。さらなる用量漸増を３患者のコホートにおいて続ける（１０ｍｇ／ｋｇで開始し、それから、１５ｍｇ／ｋｇ）。
【０１８５】
３対象コホートの３対象のうちの１人が用量規制毒性（ＤＬＴ）を経験する場合、この用量レベルを６対象に拡げる。２人以上の対象がＤＬＴを経験する場合、これ以上の対象をこのレベルでは投与せず、６対象がこの用量レベルで治療されていない限り、前の用量において３人の追加対象を加える。
【０１８６】
２８日間にわたって第一用量の時点からＤＬＴについて対象を評価する。適切な場合、
新たに登録した対象に対する用量漸増を、コホートの全対象がその２８日目ＤＬＴアセスメントを完了した後で行う。不変の疾患または反応する疾患を有する対象または５６日目（２サイクル）より後の対象は、疾患が進行するまでＢＮＣ１０１を毎週投与することを許容することができる。
【０１８７】
試験した最大用量のＢＮＣ１０１においてＤＬＴが報告されない場合、実験動物（カニクイザル）において示される最大暴露に匹敵するＢＮＣ１０１暴露を含むＰＫプロファイルを示す患者のコホートは、ＲＰ２Ｄである。
【０１８８】
最低限９人の追加対象は、６対象のうち＜２人がグレード３（２４時間で回復するグレード３の注入反応を含まない）もしくはグレード４のＡＥ（ＤＬＴ）を経験する結果となる最大用量レベルにおいて、またはこのような毒性の非存在下において充分なＰＫ暴露を達成した後でさらに登録する。
【０１８９】
ＦＯＬＦＩＲＩと併用したＢＮＣ１０１
ＢＮＣ１０１単剤治療の用量漸増が完了し、安全を宣言してＲＰ２Ｄに達した後、転移性大腸がん患者は、単剤で特定されたＲＰ２Ｄより低い１用量レベルのＢＮＣ１０１を用いたこれらの併用化学療法コホートで開始することができる。これらのコホートはそれぞれ３対象を含む。漸増は単剤治療コホートで使用したのと同じルールにより進める。この初回ＢＮＣ１０１用量は、最大６患者のうち２人のＤＬＴを示すべきであるが、３＋３ルールに従って、２人の追加の段階的縮小コホートを準備して化学療法と併用したＲＰ２Ｄを特定する。
【０１９０】
試験した最大用量のＢＮＣ１０１併用においてＤＬＴが報告されない場合、実験動物において示される最大暴露に匹敵するＢＮＣ１０１暴露を含むＰＫプロファイルを示す患者のコホートは、化学療法と併用したＲＰ２Ｄである。
【０１９１】
最低限９人の追加対象は、６対象のうち＜２人がグレード３（２４時間で回復するグレード３の注入反応を含まない）もしくはグレード４のＡＥ（ＤＬＴ）を経験する結果となる最大用量レベルにおいて、またはこのような毒性の非存在下において充分なＰＫ暴露を達成した後で、併用コホートにおいてさらに登録する。
【０１９２】
ＦＯＬＦＩＲＩ成分：イリノテカン（ＩＲＩ）−初回用量１８０ｍｇ／ｍ２（１日目９０分かけて）、ロイコボリン（ＬＶ）−初回用量４００ｍｇ／ｍ２（ＩＲＩと同時に１日目１２０分かけて投与）、５−ＦＵボーラス−初回用量４００ｍｇ／ｍ２（それから、１日目ＬＶ後に投与）、５−ＦＵ点滴−初回用量２４００ｍｇ／ｍ２（１日目に開始して４８時間かけて投与）。ＦＯＬＦＩＲＩサイクルを１４日毎に繰り返す。
【０１９３】
ＤＬＴ定義
ＤＬＴは、いずれかの所与の漸増コホートのサイクル１（０〜２８日目）において起こる下記のもののいずれかと定義される：ＮＣＩ  ＣＴＣＡＥ  ｖ４．０を用いたグレード３または４の非血液毒性（アナフィラキシー反応を含む）；４８時間より長く持続するグレード３の吐き気または適切な治療にもかかわらず起こるグレード４の嘔吐もしくはグレード≧３の下痢のいずれか；いずれもの持続期間のグレード４の血小板減少症および単剤治療コホートにおいていずれもの持続期間または併用化学療法コホートにおける＞７日持続するグレード４の無併発性好中球減少症（すなわち、熱も感染症もない）。入院を必要とするグレード４の発熱性好中球減少症および３週間を超える治療遅延およびＱＴｃインターバルの≧５００ミリ秒への延長またはベースライン平均ＱＴｃインターバルから６０ミリ秒の増長を必要とするいずれかのグレード３の血液毒性。最大の医学的管理を受けていない対象の高脂血症またはサプリメントの服用で抑えられている電解質異常を除いた、
いずれもの他の薬物関連≧グレード３の非血液有害事象（アナフィラキシー反応を含む）。全てのＡＥは、疾患進行（ＰＤ）に対する観察された毒性間の明快な関係性がない限り、強力に治療に関連すると見なされる。これらの判断基準を満足する有害事象は、ＤＬＴの報告またはＭＴＤの決定の目的のためと見なされない。
【０１９４】
治療の長さ
患者は、どれでも最初に起こる、ＰＤ、容認されない毒性、同意の撤回、またはスポンサーによる試験停止まで治療される。
【０１９５】
サンプルサイズ
約５４人までの患者がこの試験において治療され、単剤および化学療法との併用の両方で、毒性プロファイル、ＤＬＴ、およびＭＴＤおよび／またはＢＮＣ１０１のＲＰ２Ｄを決定する。用量レベルコホート当たり１〜６人の評価可能な患者がＢＮＣ１０１の毒性およびＰＫプロファイルを評価するために十分なデータを提供すると見込まれる。一旦、ＲＰ２Ｄを特定したら、これらのコホートの拡張（少なくとも９人までの追加患者）は、単剤治療群および併用化学療法群の両方で行われる。試験した最大ＢＮＣ１０１用量においてＤＬＴが報告されない場合、実験動物において示される最大暴露に匹敵するＢＮＣ１０１暴露を含むＰＫプロファイルを示す患者のコホートは、ＲＰ２Ｄである。
【０１９６】
訪問頻度
４週サイクルの各週に全７（±３）日。生存の経過観察情報およびその後の抗がん治療は、死、追跡不能、患者の同意撤回、またはスポンサーによる試験停止まで、治療の休止後３か月毎に収集される。
【０１９７】
安全アセスメント
０〜２８日目（サイクル１）のＤＬＴについて対象を評価する。最後の投薬後、３０日にわたって有害事象を報告する。安全性を継続的に報告する。最後の投薬後２８日目と３０日目の間で起こる有害事象を報告するが、ＭＴＤの決定に不可欠なものでない。パフォーマンスステータスを毎週スコアし、ベースライン、各サイクルの開始時（例えば、４週間毎）、研究終了（ＥＯＳ）訪問時およびいずれものＡＥの回復時に身体検査を行う。
【０１９８】
心電図（ＥＣＧ）モニタリング
全１２リードＥＣＧを、３回、少なくとも５分離して得るものとする。ベースライン（第一投与に先んじて１４日中に）、サイクル１の１日目および１５日目に集中的に、ならびに８日目および２２日目の投薬前に、ＥＣＧを得る。サイクル２およびその後のサイクル（複数）の１日目の投薬前にＥＣＧを得る。ＥＯＳ  ＥＣＧは回収しなければならない。アセスメントのために、地域の研究室にＥＣＧを送付する。
【０１９９】
応答アセスメント
コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンを、ベースラインおよび８週間毎に行う。第一応答アセスメントは５６日目（２サイクル後）である。抗腫瘍応答のための放射線医学試験を、前の２８日以内に行われない場合にＥＯＳ訪問において繰り返す。記録の電話経過観察またはレビューを、６か月間毎月およびその後の１８か月間は３か月毎に行う（合計２４か月）。
【０２００】
薬物動態アセスメント
薬物動態サンプルを、サイクル１の１日目および１５日目ならびに疎らに８日目および２２日目に集中的に得る。サイクル２およびその後のサイクル（複数）の１日目に疎らにサンプルを得る。ＢＮＣ１０１の点滴中、および点滴後（点滴終了後）、投薬前（点滴開始前）に血液サンプルを採血する。
【０２０１】
細胞および分子バイオマーカーアセスメント
患者は、ベースライン、サイクル１の間毎週、それぞれその後のサイクルの１日目および治療終了時に血液を採取して、薬力学効果の指標としてＣＴＣおよびバイオマーカー（ＬＧＲ５を含むがこれらに限定されない）のレベルを測定する。患者は、ベースラインおよびサイクル１の２２日目に２回の対応皮膚生検も受ける（各生検は２回の新鮮なコア／パンチである）。患者は、追加の毛髪サンプル（毛包幹細胞の収集を含む）を採取してもよい。
【０２０２】
腫瘍病変生検
単剤治療漸増コホート１および２の生検は必要でない。対応生検（ベースラインおよび２２日目）は、単剤治療漸増コホート３以降、および単剤治療拡大コホートには必須である。対応生検は、全併用治療患者には必須である。各生検は、好ましくは可能ならいつでも、最低限２回の新鮮なコア／パンチである。原発性腫瘍の代わりに、肝転移から生検することができる。新鮮な生検の腫瘍組織の存在は、適切な準備なしの組織学的または細胞学的手順を用いて訓練された病理学者により認定されるものとする。全サンプルを匿名化する。個体の特定は、調査またはスポンサーにより確認することができない。中央標準研究所に属するパスワード保護されたデータは、患者またはこの患者を治療する医師に公表されない。患者情報は、リサーチデータの無記名の報告の中で厳密に使用される。このようなリサーチデータは、患者のチャート内に記載されないし、臨床医にも利用できず、診断のためにも治療のためにも使用せず、かつ、使用することができない。
【０２０３】
免疫原性アセスメント
抗ＢＮＣ１０１抗体の存在を、ベースライン、各投薬前、治療終了時、および１２週間治療中止後４週毎に試験する。単剤治療対併用治療コホートにおける患者の異なる性質および予測される漸進的変化のせいで、異なる数のサンプルをそれぞれにおいて得ることができる場合がある。
【０２０４】
本明細書中で使用されるとき、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、または「を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同じ意味であり、包括的またはオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素または方法ステップを排除しない。
【０２０５】
上記説明は、本発明のいくつかの方法および材料を開示している。本発明は、製造方法および装置においてこの方法および材料の修正、ならびに変更を受けやすい。このような修正は、本明細書で開示された本発明の本開示または実践の考察から当業者には明白になるだろう。結果として、本発明は本明細書で開示された特定の実施形態に限定されるものではなく、本発明の真の範囲および趣旨内に入る全ての修正および変更を包含する。
【０２０６】
これらに限定されないが、公表および未公表の応用、特許、および参考文献を含む本明細書で引用した全ての参照は、その全文を参照することにより本明細書に組み入れられるものとし、これにより、本明細書の部分とする。参照により組み入れられた出版物および特許または特許応用が本明細書に含まれる開示と矛盾する点で、本明細書は、このような矛盾する材料に取って代わるおよび／またはこのような矛盾する材料より優先されるものとする。
【図１】
2019509322.tif 000010
【図２】
2019509322.tif 000011
【図３】
2019509322.tif 000012
【図４】
2019509322.tif 000013
【図５】
2019509322.tif 000014
【図６】
2019509322.tif 000015
【図７】
2019509322.tif 000016
【図８】
2019509322.tif 000017
【図９】
2019509322.tif 000018
【図１０】
2019509322.tif 000019
【図１１】
2019509322.tif 000020
【図１２】
2019509322.tif 000021
【図１３】
2019509322.tif 000022
【図１４】
2019509322.tif 000023
【図１５】
2019509322.tif 000024
【図１６】
2019509322.tif 000025
【図１７−１】
2019509322.tif 000026
【図１７−２】
2019509322.tif 000027
【図１７−３】
2019509322.tif 000028
【図１８】
2019509322.tif 000029
【図１９】
2019509322.tif 000030
【図２０】
2019509322.tif 000031
【図２１−１】
2019509322.tif 000032
【図２１−２】
2019509322.tif 000033
【図２２Ａ】
2019509322.tif 000034
【図２２Ｂ】
2019509322.tif 000035
【図２３】
2019509322.tif 000036
【配列表】
2019509322000001.app
【国際調査報告】
2019509322.tif 000037
2019509322.tif 000038
2019509322.tif 000039
2019509322.tif 000040