(57)【要約】本明細書では、ＰＰＡＲγ受容体をモジュレートする脂肪酸化合物を投与することを含む、ラクトース不耐性を処置するための方法が部分的に開示される。例えば、ラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置し、かつ／または好転させることを必要としている患者のラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置し、かつ／または好転させるための方法であって、該患者に、単離された脂肪酸を含む組成物を投与することを含む、方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置し、かつ／または好転させることを必要としている患者のラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置し、かつ／または好転させるための方法であって、該患者に、単離された脂肪酸を含む組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２】
ラクターゼ遺伝子発現を刺激すことを必要としている患者におけるラクターゼ遺伝子発現を刺激するための方法であって、該患者に、単離された脂肪酸を含む組成物を投与することを含む、方法。
【請求項３】
ラクトース摂取後の下痢、腹痛および／または鼓脹を処置することを必要としているラクトース不耐性の患者の、ラクトース摂取後の下痢、腹痛および／または鼓脹を処置するための方法であって、単離された脂肪酸を含む組成物を投与することを含む、方法。
【請求項４】
前記投与することが、乳製品を含む食物の消費の前、その後またはそれと実質的に同時に行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記患者が、胃腸炎、セリアック病、クローン病、および／または細菌過剰繁殖の１つまたは複数にも罹患している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記患者が、放射線療法および／または化学療法を受けている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記投与することが、毎日、毎週、または必要に応じて３カ月、６カ月、１年もしくはそれよりも長期間にわたって行われる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記脂肪酸が、リノール酸、共役リノール酸、またはそれらの混合物である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記共役リノール酸が、トランス−１０，シス−１２共役リノール酸異性体、シス−９，トランス−１１共役リノール酸異性体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置し、かつ／または好転させることを必要としている患者のラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置し、かつ／または好転させるための方法であって、該患者に、リノール酸、共役リノール酸、またはそれらの混合物から本質的になる組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１１】
患者のラクトース不耐性を好転させるための治療有効量の脂肪酸、および任意選択で乳成分を含む、食品。
【請求項１２】
前記脂肪酸が、リノール酸、共役リノール酸、またはそれらの混合物である、請求項１１に記載の食品。
【請求項１３】
前記共役リノール酸が、トランス−１０，シス−１２共役リノール酸異性体、シス−９，トランス−１１共役リノール酸異性体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１２に記載の食品。
【請求項１４】
前記乳成分が、乳清、乳、チーズまたはクリームである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の食品。
【請求項１５】
食品に天然に存在する共役リノール酸の量よりも有意に多い量の共役リノール酸を含む、食品。
【請求項１６】
前記共役リノール酸の前記量が、前記食品に天然に存在する共役リノール酸の量よりも約５重量％、約１０重量％、約５０重量％、約１００重量％多い、または１００重量％よりも多い、請求項１５に記載の食品。
【請求項１７】
前記共役リノール酸が、トランス−１０，シス−１２共役リノール酸異性体、シス−９，トランス−１１共役リノール酸異性体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１６に記載の食品。
【請求項１８】
経口投与または消費されると、ヒト患者のラクトース不耐性を実質的に防止し、好転させ、または処置する治療有効量の共役リノール酸を含む、栄養補助組成物。
【請求項１９】
前記共役リノール酸が、トランス−１０，シス−１２共役リノール酸異性体、シス−９，トランス−１１共役リノール酸異性体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１８に記載の栄養補助組成物。
【請求項２０】
脂肪酸、薬学的に許容される充填剤、および腸溶コーティングを含む、脂肪酸の経口投与のための医薬製剤。
【請求項２１】
前記脂肪酸が、リノール酸、共役リノール酸、またはそれらの混合物である、請求項２０に記載の医薬製剤。
【請求項２２】
前記脂肪酸が、トランス−１０，シス−１２共役リノール酸異性体、シス−９，トランス−１１共役リノール酸異性体、またはそれらの混合物である、請求項２０または２１に記載の医薬製剤。
【請求項２３】
崩壊剤をさらに含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項２４】
滑沢剤をさらに含む、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項２５】
前記腸溶コーティングが、前記医薬製剤の約１重量％〜約１０重量％、約５重量％〜約１０重量％、約８重量％〜約１０重量％、約８重量％〜約１２重量％、約８重量％〜約１５重量％、約８重量％〜約２０重量％、約１０重量％〜約１２重量％、約１０重量％〜約１８重量％、または約１５重量％〜約２０重量％である、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項２６】
前記腸溶コーティングが、エチルアクリレートメタクリル酸である、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項２７】
患者に経口投与されると、前記脂肪酸を十二指腸に送達するという結果になる、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項２８】
患者に経口投与されると、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、または約７のｐＨ値で前記脂肪酸の放出をもたらす、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項２９】
それを必要としている患者に経口投与されると、該患者のラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症の好転または処置をもたらす、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項３０】
前記患者のラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症の好転または処置が、前記製剤を、１時間、１日、１週間、または１カ月の経過にわたって、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、または１０回より多く投与した後に生じる、請求項２９に記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
この出願は、２０１６年２月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／３００，３７６号（この出願の内容全体は、参考として本明細書に援用される）に対する優先権およびその利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ラクターゼタンパク質は、ラクトースをガラクトースおよびグルコースに加水分解する能力を有する、小腸の絨毛先端上に発現する二糖分解酵素（β−ガラクトシダーゼ）である。不適切なラクターゼ−フロリジン加水分解酵素（ＬＰＨ）活性は、ラクトース摂取後に下痢、腹痛または鼓脹をもたらすラクトース不耐性／吸収不全の原因となる。原発性ラクターゼ欠乏症（またはラクターゼ非持続性または低ラクターゼ症（hypolactasia））は、小腸におけるラクターゼの発現の相対的または絶対的非存在に起因する、ラクトース不耐性の主な原因であり、様々な年齢の小児期に、異なる人種群で生じる。世界人口のおよそ７０％は、原発性ラクターゼ欠乏症を有する。ラクトース欠乏症の百分率は、民族性によって変わり、食事における乳製品の使用と関係し、北欧人口の２０％、欧州地中海人口の４０％、アフリカ人口の８０％、およびアジア人口の９０％にも達する。現在利用可能な原発性ラクトース不耐性の根治的処置は存在せず、ラクトース不耐性の典型的な処置には、ラクトース排除（栄養機能障害をもたらす）または高額な（expansive）レジメン、例えばラクトース欠乏乳もしくはラクターゼ補給の使用が含まれる。米国だけでも、ラクトース不耐性の年間の経済的負担は、ほぼ２０億ドルと推定される。
【０００３】
２つの特定の一塩基多型（ＳＮＰ）が、成人型低ラクターゼ症と密接に関連することが報告されている。ラクターゼ遺伝子の上流位置１３９１０のＣ（Ｃ１３９１０）は、１００％関連性があり、位置２２０１８のＧ（Ｇ２２０１８）は、フィンランド人口ではラクターゼ非持続性と９５％を超える関連性がある。Ｔ１３９１０およびＡ２２０１８を有する個体の腸管粘膜におけるＬＰＨのｍＲＮＡの発現は、Ｃ１３９１０およびＧ２２０１８を有する個体に見出される発現よりも高く、これは、ＬＰＨ遺伝子の転写調節を示唆している。しかし、ＬＰＨ遺伝子の調節の多くは、まだ知られていない。特に、低ラクターゼ症の遺伝的特徴のいくつかの要素は解明されているが、ＬＣＴ発現を増加させることができるモジュレーターは、まだ同定されていない。したがって、ラクトース不耐性および関連障害の処置において有用な、有効な薬剤が必要である。
【０００４】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）は、核内ホルモン受容体スーパーファミリーのメンバーであり、遺伝子発現を調節する、リガンドによって活性化された転写因子である。ＰＰＡＲは、高等生物の細胞の分化、成長および代謝を調節する上で役割を果たす。
【０００５】
肝臓、腎臓、心臓、ならびに他の組織および器官に発現するアルファと、例えば脳内に発現するベータ／デルタと、ガンマ１、ガンマ２およびガンマ３の３つの形態で発現するガンマの、３種のＰＰＡＲが同定されている。ＰＰＡＲγは、ケラチノサイト分化の刺激と関連付けられており、グルコースのホメオスタシスおよび脂質代謝を制御するためのマスター遺伝子である。したがって、ＰＰＡＲγは、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）クラスの薬物の開発により、皮膚障害、例えば乾癬およびアトピー性皮膚炎、２型糖尿病を含むいくつかの病状のための薬物標的として役立ってきた。現在まで、ほとんどの研究は、主な代謝器官、例えば肝臓、脂肪細胞、膵臓または骨格筋におけるＰＰＡＲγの役割を評価するものであった。腸上皮細胞（ＩＥＣ）は、ＰＰＡＲγの別の主な供給源を構成するが、炭水化物代謝中のＩＥＣにおけるＰＰＡＲγの役割は、十分に調査されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
本明細書において、ラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置し、かつ／または好転させることを必要としている患者のラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置し、かつ／または好転させるための方法であって、該患者に、単離された脂肪酸を含む組成物を投与することを含む、方法が記載される。また、本明細書において、ラクターゼ遺伝子発現を刺激すことを必要としている患者におけるラクターゼ遺伝子発現を刺激するための方法であって、該患者に、単離された脂肪酸を含む組成物を投与することを含む、方法、ならびにラクトース摂取後の下痢、腹痛および／または鼓脹を処置することを必要としているラクトース不耐性の患者の、ラクトース摂取後の下痢、腹痛および／または鼓脹を処置するための方法であって、単離された脂肪酸を含む組成物を投与することを含む、方法が記載される。いくつかの態様では、本開示は、それを必要としている患者のラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置し、かつ／または好転させるための方法であって、脂肪酸、例えば共役リノール酸から本質的になる組成物を患者に投与することを含む、方法を対象とする。一部の実施形態では、脂肪酸は、天然に存在する脂肪酸、例えば天然に存在する共役リノール酸である。
【０００７】
ある特定の実施形態では、投与は、乳製品を含む食物の消費の前、その後またはそれと実質的に同時に行われ得る。一部の実施形態では、この方法は、脂肪酸を含む組成物を、毎日、毎週、または必要に応じて３カ月、６カ月、１年もしくはそれよりも長期間にわたって投与することを含む。患者（例えば、ヒト患者）は、胃腸炎、セリアック病、クローン病、および／もしくは細菌過剰繁殖の１つもしくは複数に罹患している場合もあり、かつ／または放射線療法および／もしくは化学療法を受けている場合もある。ある特定の実施形態では、脂肪酸は、共役リノール酸、例えばトランス−１０，シス−１２共役リノール酸異性体、シス−９，トランス−１１共役リノール酸異性体、またはそれらの混合物である。
【０００８】
他の態様では、患者のラクトース不耐性を好転させるための治療有効量の脂肪酸を含む食品が提供される。一部の実施形態では、食品は、患者のラクトース不耐性を好転させるための治療有効量の脂肪酸、および任意選択で乳成分、例えば、乳清、乳、チーズまたはクリームを含む。ある特定の実施形態では、脂肪酸は、共役リノール酸、例えばトランス−１０，シス−１２共役リノール酸異性体、シス−９，トランス−１１共役リノール酸異性体、またはそれらの混合物である。
【０００９】
また本明細書では、食品に天然に存在する脂肪酸の量、例えば天然に存在する共役リノール酸の量よりも有意に多い量の脂肪酸、例えば共役リノール酸を含む食品が提供され、ここで例えば、脂肪酸（例えば共役リノール酸）の量は、食品に天然に存在する脂肪酸の量（例えば、天然に存在する共役リノール酸の量）よりも約５重量％、約１０重量％、約５０重量％、約１００重量％多い、または約１００重量％よりも多い。一部の実施形態では、食品は、共役リノール酸を含み、該共役リノール酸は、トランス−１０，シス−１２共役リノール酸異性体、シス−９，トランス−１１共役リノール酸異性体、またはそれらの混合物である。
【００１０】
別の態様では、本開示は、治療有効量の脂肪酸、例えば共役リノール酸を含む栄養補助組成物を対象とし、治療有効量の脂肪酸、例えば治療有効量の共役リノール酸は、患者に経口投与され、または患者によって消費されると、ヒト患者のラクトース不耐性を実質的に防止し、好転させ、または処置する。一部の実施形態では、栄養補助組成物は、共役リノール酸を含み、該共役リノール酸は、トランス−１０，シス−１２共役リノール酸異性体、シス−９，トランス−１１共役リノール酸異性体、またはそれらの混合物である。
【００１１】
さらに別の態様では、本開示は、脂肪酸の経口投与のための医薬製剤を対象とする。一部の実施形態では、本開示の医薬製剤は、脂肪酸、薬学的に許容される充填剤、および腸溶コーティングを含む。一部の実施形態では、医薬製剤は、共役リノール酸である脂肪酸を含む。一部の実施形態では、医薬製剤は、脂肪酸を含み、該脂肪酸は、トランス−１０，シス−１２共役リノール酸異性体、シス−９，トランス−１１共役リノール酸異性体、またはそれらの混合物である。一部の実施形態では、本開示の医薬製剤は、崩壊剤を含む。一部の実施形態では、本開示の医薬製剤は、滑沢剤を含む。一部の実施形態では、本開示の医薬製剤は、腸溶コーティングを含み、該腸溶コーティングは、医薬製剤の約１重量％〜約１０重量％、約５重量％〜約１０重量％、約８重量％〜約１０重量％、約８重量％〜約１２重量％、約８重量％〜約１５重量％、約８重量％〜約２０重量％、約１０重量％〜約１２重量％、約１０重量％〜約１８重量％、または約１５重量％〜約２０重量％である。本開示の医薬製剤の一部の実施形態では、腸溶コーティングは、エチルアクリレートメタクリル酸（ethylacrylate  methacrylic  acid）である。
【００１２】
一部の実施形態では、本開示の医薬製剤は、患者に経口投与されると、脂肪酸を患者の十二指腸および／または患者の空腸に送達する結果となる。一部の実施形態では、本開示の医薬製剤は、患者に経口投与されると、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、または約７のｐＨ値で脂肪酸の放出をもたらす。一部の実施形態では、本開示の医薬製剤は、患者に投与されると、胃腸管において約ｐＨ４．５、約ｐＨ５、約ｐＨ５．５、約ｐＨ６、約ｐＨ６．５、または約ｐＨ７の環境下で脂肪酸の放出をもたらす。
【００１３】
一部の実施形態では、本開示の医薬製剤は、患者に経口投与されると、患者のラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症の好転または処置をもたらす。一部の実施形態では、本開示の医薬製剤は、その製剤が、規定される期間にわたって規定される回数、例えば１時間、１日、１週間、または１カ月の経過にわたって、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、または１０回より多く投与された後に、患者のラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症の好転または処置をもたらす。
【００１４】
一部の態様では、本開示は、それを必要としている患者のラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を、例えば処置し、防止し、管理し、かつ／または好転させる医薬として使用するための、脂肪酸、例えばリノール酸、例えば共役リノール酸を対象とする。一部の態様では、本開示は、それを必要としている患者のラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置し、防止し、管理し、かつ／または好転させるのに使用するための脂肪酸を対象とする。一部の実施形態では、それを必要としている患者のラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置し、防止し、管理し、かつ／または好転させるのに使用するための脂肪酸は、本明細書に開示される方法のいずれかにおいて使用するための脂肪酸である。また本明細書では、本明細書に記載される方法によってラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置し、防止し、管理し、かつ／または好転させる医薬の製造における、脂肪酸、例えばリノール酸、例えば共役リノール酸の使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは、Ｃａｃｏ−２細胞における１ｍＭの３−（４’−アミノフェニル）２−メトキシプロピオン酸（ＧＥＤ）によるＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現の誘導を、刺激しなかった（ＣＴＬ）細胞と比較して示す定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析を示す（ＣＴＬ対１ｍＭのＧＥＤ、ｐ＜０．０００１）。図１Ｂは、Ｃａｃｏ−２細胞における１μＭのピオグリタゾン（Ｐｉｏ）によるＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現の誘導を、ＣＴＬ細胞と比較して示すｑＰＣＲ分析を示す（ＣＴＬ対１μＭのＰｉｏ、ｐ＜０．０００１）。図１Ａおよび１Ｂの結果は、４回の独立した実験の平均（ＳＥＭ）の平均±標準誤差を表す。ＬＣＴ遺伝子発現の変化倍率は、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現レベルに対して正規化される。図１Ｃは、Ｃａｃｏ−２細胞における３０  ＧＥＤによるＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現の誘導を、ＣＴＬ細胞と比較して示すｑＰＣＲ分析を示す（ＣＴＬ対３０ｍＭのＧＥＤ、ｐ＝０．０００２）。図１Ｄは、Ｃａｃｏ−２細胞における３０  ５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）によるＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現の誘導を、ＣＴＬ細胞と比較して示すｑＰＣＲ分析を示す（ＣＴＬ対３０ｍＭの５−ＡＳＡ、ｐ＝０．０００２）。対照細胞で測定された発現レベル（任意に１と定義される）を、図１Ａ〜１Ｄのそれぞれの基準として使用した。
【００１６】
【図２】図２Ａは、０．１ｍＭ、１ｍＭ、または３０ｍＭのＧＥＤで刺激したＣａｃｏ−２細胞におけるＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現に対するＧＥＤの用量効果を示しており、対照（ＣＴＲＬ；ＤＭＥＭ）と比較したＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。図２Ｂは、０．１μＭ、１μＭ、または１０μＭのＰｉｏで刺激したＣａｃｏ−２細胞におけるＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現に対するＰｉｏの用量効果を示しており、対照（ＣＴＲＬ；ＤＭＳＯ）と比較したＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現を、ｑＲＴ−ＰＣＲによって決定した。図２Ａおよび２Ｂの結果は、３連で実施した２〜３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＮＳ、有意差なし）。ＣＴＲＬ細胞で測定された発現レベルを、基準として使用した。
【００１７】
【図３】図３は、免疫沈降アッセイによって評価したＬＣＴタンパク質の発現を示す棒グラフである。ＬＣＴタンパク質を、１ｍＭのＧＥＤで刺激した（ＧＥＤ）、または刺激しないまま（ＣＴＲＬ）のいずれかのＣａｃｏ−２細胞から免疫沈降させた。棒は、β−アクチンシグナル強度と比較したＬＣＴタンパク質シグナル強度を表す。ＣＴＲＬシグナルは、任意に１００％と定義した。
【００１８】
【図４Ａ】図４Ａは、１ｍＭのＧＥＤで刺激した（ＧＥＤ）後の、または刺激しなかった（ＣＴＲＬ）Ｃａｃｏ−２細胞におけるＬＣＴ活性を示す棒グラフである。結果は、ＬＣＴ活性の百分率の平均±ＳＥＭ（３連で実施した３回の独立した実験）を、任意に１００％と定義したＣＴＲＬ細胞における活性と比較して表す。
【００１９】
【図４Ｂ】図４Ｂは、１μＭのＰｉｏで刺激した（Ｐｉｏ）後の、または刺激しなかった（ＣＴＲＬ）Ｃａｃｏ−２細胞におけるＬＣＴ活性を示す棒グラフである。結果は、ＬＣＴ活性の百分率の平均±ＳＥＭ（３連で実施した３回の独立した実験）を、任意に１００％と定義したＣＴＲＬ細胞における活性と比較して表す。
【００２０】
【図４Ｃ】図４Ｃは、１ｍＭのＧＥＤ（ＧＥＤ１ｍＭ）、３０ｍＭのＧＥＤ（ＧＥＤ３０ｍＭ）、３０ｍＭの５−ＡＳＡ（５ＡＳＡ３０ｍＭ）で刺激した後の、または刺激しなかった（ＣＴＲＬ）Ｃａｃｏ−２細胞におけるＬＣＴ活性を示す棒グラフである。ラクターゼ活性は、ＣＴＲＬ試料と比較して、１ｍＭのＧＥＤ（ＣＴＲＬ対ＧＥＤ１ｍＭ、ｐ＜０．００５）および３０ｍＭのＧＥＤ（ＣＴＲＬ対ＧＥＤ３０ｍＭ、ｐ＜０．００５）による刺激後に有意に上方調節された。
【００２１】
【図５】図５は、１ｍＭのＧＥＤ（ＧＥＤ１ｍＭ）および１μＭのピオグリタゾン（Ｐｉｏ１μＭ）で刺激した後の、または刺激しなかった（ＣＴＲＬ）Ｃａｃｏ−２細胞のグルコース取込み能を示す。結果は、細胞において測定されたグルコース類似体である２−デオキシグルコース（２−ＤＧ６Ｐ）のリン酸化の量（ｐｍｏｌ）で表される。ＮＳ、有意差なし。
【００２２】
【図６Ａ】図６Ａは、ＰＰＡＲγアゴニストで刺激した後のＣａｃｏ−２細胞において、ｑＰＣＲによって決定される通り、スクラーゼ−イソマルターゼ（ＳＩＭ）およびマルターゼ−グルコアミラーゼ（ＭＧＡＭ）のｍＲＮＡの相対的発現レベルを、ＬＣＴ  ｍＲＮＡと比較して示す。
【００２３】
【図６Ｂ】図６Ｂは、１ｍＭのＧＥＤ（左）もしくは１μＭのＰｉｏ（右）で刺激した後の、または刺激しないまま（ＣＴＲＬおよびＤＭＳＯ）の、ｑＰＣＲによって決定されたＣａｃｏ−２細胞におけるＳＩＭ  ｍＲＮＡの相対的発現レベルを示す。結果は、ＧＡＰＤＨレベルに対して正規化されたＳＩＭ  ｍＲＮＡの発現の変化倍率の平均±ＳＥＭ（６連（sextuplicate）で実施した２回の独立した実験）を表す。対照細胞で測定された発現レベル（任意に１と定義される）を、基準として使用した。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＮＳ、有意差なし。
【００２４】
【図６Ｃ】図６Ｃは、１ｍＭのＧＥＤ（左）もしくは１μＭのＰｉｏ（右）で刺激した後の、または刺激しないまま（ＣＴＲＬおよびＤＭＳＯ）の、ｑＰＣＲによって決定されたＣａｃｏ−２細胞におけるＭＧＡＭ  ｍＲＮＡの相対的発現レベルを示す。結果は、ＧＡＰＤＨレベルに対して正規化されたＭＧＡＭ  ｍＲＮＡの発現の変化倍率の平均±ＳＥＭ（６連で実施した２回の独立した実験）を表す。対照細胞で測定された発現レベル（任意に１と定義される）を、基準として使用した。＊＊Ｐ＜０．０１；ＮＳ、有意差なし。
【００２５】
【図７】図７は、マイクロアレイ分析およびｑＰＣＲ分析によって決定された、遺伝子発現データの相関を示す（ｒ＝０．７５４、ｐ＝０．００４６）。
【００２６】
【図８】図８は、ヒトＬＣＴ遺伝子のプロモーター領域においてコンピューターによる分析によって同定されたＰＰＡＲ応答エレメント（ＰＰＲＥ）（推定上の転写開始部位の上流３，０００ｂｐまで）、ならびにその領域に位置する直列反復配列１（direct  repeat  1）（ＤＲ１）および直列反復配列２（ＤＲ２）応答エレメントの模式図である。８ａおよび８ｂは、ヌクレオチド−２２３〜−２１０の間に位置するＤＲ２を包含するゲノム領域を増幅するために使用したプライマー対を示す。
【００２７】
【図９】図９は、ヒトＬＣＴプロモーター遺伝子におけるＰＰＲＥ（ＤＲ１およびＤＲ２）のヌクレオチド配列を示す（転写開始点に対して上流３，０００ｂｐまで）。ＬＣＴ遺伝子プロモーターの３，０００ｂｐの配列において同定された、推定上のＤＲ１のヌクレオチド配列およびＤＲ２のヌクレオチド配列に、下線が引かれている。下線が引かれているヌクレオチド配列「ＴＡＡＡＴＡ」は、潜在的ＴＡＴＡボックスを示す。図９は、配列番号３を開示している。
【００２８】
【図１０】図１０は、ＧＥＤで処理した（ＧＥＤ）、または処理しなかった（ＣＴＲＬ）Ｃａｃｏ−２細胞からの、ＣｈＩＰアッセイによる８ａ−８ｂフラグメントのｑＰＣＲ増幅シグナルを示す棒グラフを示す。結果は、ＣＴＲＬ細胞と比較した富化倍率として表す。
【００２９】
【図１１】図１１は、ルシフェラーゼ遺伝子配列の上流にＤＲ２応答エレメントを含有するレポーター構築物（ｐＧＬ４Ｌｕｃ  ＰｒｏｍＬＣＴ構築物）、またはルシフェラーゼ遺伝子配列を含有するが上流にＤＲ２配列がない対照構築物（ｐＧＬ４Ｌｕｃ）をトランスフェクトしたＣａｃｏ−２細胞における、ルシフェラーゼ遺伝子レポーターアッセイの結果を示す。結果は、ＧＥＤで刺激した後の、または刺激しなかった（ＣＴＬ）タンパク質含量について正規化された、ルシフェラーゼ活性の平均±ＳＥＭを表す（３連の２回の独立した実験）。
【００３０】
【図１２】図１２は、安定にトランスフェクトされたＰＰＡＲγノックダウンＣａｃｏ−２細胞（ＳｈＰＰＡＲ）における、ｑＰＣＲ（左）およびＬＣＴ活性（右）によって測定されたＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現を、安定にトランスフェクトされた対照細胞（ＳｈＬｕｃ）と比較して示す。結果は、３連または６連で実施した３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す（＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。
【００３１】
【図１３】図１３は、Ｃａｃｏ−２細胞におけるＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現のＧＥＤ依存性誘導に対する、ＰＰＡＲγアンタゴニストＧＷ９６６２の効果を示す棒グラフである。ＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現は、ｑＰＣＲによって決定した。細胞を、ＧＷ９６６２で処理し（＋ＧＷ９６６２）、または未処理のままにし（−ＧＷ９６６２）、次にＧＥＤで処理し（ＧＥＤ）、または未処理のままにした（対照）。結果は、ＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現における倍率変化の平均±ＳＥＭ（３連および６連で実施した２回の独立した実験の）を、ＧＷ９６６２またはＧＥＤで処理しなかった細胞と比較して表す（＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。
【００３２】
【図１４】図１４は、対照マウス（ＣＴＲＬ）および腸上皮細胞においてＰＰＡＲγの発現が欠如しているマウス（ＰＰＡＲγΔＩＥＣ）の近位小腸における相対的なＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現レベルを示す棒グラフである。結果は、平均±平均の標準偏差を表す（ＳＤ；ｎ＝５；＊、Ｐ＜０．０５）。
【００３３】
【図１５Ａ】図１５Ａは、ｑＰＣＲによって決定される通り、「離乳していない」ラットおよび「離乳した」ラットの腸の異なる切片における相対的なＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現（左）およびＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡ発現（右）を示す一対のグラフである。結果は、ＧＡＰＤＨレベルに対して正規化された相対的ｍＲＮＡ発現レベルの平均±ＳＤを表す（群ごとにｎ＝６）。
【００３４】
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、離乳したラット（四角）および離乳していないラット（丸）の空腸における、ＬＣＴ  ｍＲＮＡレベルとＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡレベルの相関を示すグラフである。
【００３５】
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、離乳したラット（四角）および離乳していないラット（丸）の十二指腸における、ＬＣＴ  ｍＲＮＡレベルとＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡレベルの相関を示すグラフである。
【００３６】
【図１６】図１６は、ＰＰＡＲγモジュレーターであるＧＥＤで３時間（ＧＥＤ  ３Ｈ）、６時間（ＧＥＤ  ６Ｈ）、または１０時間（ＧＥＤ  １０Ｈ）刺激した後の、ヒト十二指腸生検の短期間培養物中の上皮細胞によるラクターゼ  ｍＲＮＡ発現の上方調節を、刺激しなかった対照（ＣＴＬ；ＣＴＬ対ＧＥＤ６Ｈ、ｐ＝０．００８）と比較して示す棒グラフである。
【００３７】
【図１７】図１７は、フェノフィブレートで刺激したＣａｃｏ−２細胞における、ｑＰＣＲ（左）およびＬＣＴ活性（右）によって測定されたＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現を、刺激しなかった対照細胞（ＤＭＳＯ）と比較して示す一連の棒グラフである。結果は、３連で実施した３回の独立した実験の平均±ＳＥＭを表す（ＮＳ、有意差なし）。
【００３８】
【図１８Ａ】図１８Ａは、処置なし（対照）または３０ｍｇ／ｇの経口ＧＥＤで７日間処置した（ＧＥＤ）、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（上列）およびＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（下列）の近位小腸においてｉｎ  ｖｉｖｏで測定された、ＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現（左）およびＬＣＴ活性（右）を示す一連のグラフである。結果は、３回の独立した実験の合計を表す（マウス、ｎ＝２５〜３０；ラット、ｎ＝２１〜２３）。水平線は、平均値を表す（＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。
【００３９】
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、対照食（ＣＴＲＬ食）またはラクトース富化食（１５％ラクトース食）を与え、ＧＥＤで処置した（＋ＧＥＤ）またはＧＥＤで処置しなかった（＋ＣＭＣ）ラットにおける、異なる時点（０〜４日目）の糞便軟度スコアを示すグラフである。結果は、２回の独立した実験の合計を表す（群ごとにｎ＝２０；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。
【００４０】
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、４日間、対照食（対照食）またはラクトース富化食（ラクトース食）を与え、ＧＥＤで処置した（ＧＥＤ）またはＧＥＤで処置しなかった（ＣＭＣ）ラットの盲腸内容物における、総短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）濃度（ｍｍｏｌ／Ｌ）を示すグラフである。水平線は、平均値を表す（群ごとにｎ＝１０；＊、Ｐ＜０．０５；＊＊＊、Ｐ＜０．００１。
【００４１】
【図１９Ａ】図１９Ａは、天然に存在する一連のＰＰＡＲγリガンドの化学構造を示す。
【００４２】
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、刺激しなかった細胞（ＣＴＬ）、または１ｍＭのＧＥＤ（ＧＥＤ１ｍＭ）もしくは様々な濃度（５０μＭ、１００μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、１０００μＭ）の共役リノール酸（ＣＬＡ）で刺激した後の、ｑＰＣＲによって測定されるＣａｃｏ−２細胞におけるＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現の誘導を示す棒グラフである。結果は、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対して正規化されたＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現の変化倍率の平均±ＳＥＭを、ＣＴＬにおけるＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現と比較して表す（ｎ＝４連で実施した３回の独立した実験；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。
【００４３】
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、刺激しなかった細胞（ＣＴＬ）、または１ｍＭのＧＥＤ（ＧＥＤ１ｍＭ）もしくは様々な濃度（５０μＭ、１００μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、１０００μＭ）のＣＬＡで刺激した後の、Ｃａｃｏ−２細胞におけるＬＣＴ活性の誘導を示す棒グラフである。結果は、ＬＣＴ活性の変化倍率の平均±ＳＥＭを、ＣＴＬにおけるＬＣＴ活性と比較して表す（ｎ＝４連で実施した３回の独立した実験；＊、Ｐ＜０．０５；＊＊＊、Ｐ＜０．００１）。
【００４４】
【図２０Ａ】図２０Ａは、刺激しなかった（ＣＴＲＬ）、または様々な濃度（２５０μＭ、５００μＭ、１０００μＭ）のＣＬＡで刺激した、安定にトランスフェクトされたＰＰＡＲγノックダウンＣａｃｏ−２細胞（ＳｈＰＰＡＲ）および安定にトランスフェクトされた対照細胞（ＳｈＬｕｃ）における、ｑＰＣＲによって測定されるＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフである。結果は、ＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現の変化倍率の平均±ＳＥＭを、ＣＴＲＬにおけるＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現と比較して表す（ｎ＝４連で実施した３回の独立した実験；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；ＮＳ、有意差なし）。
【００４５】
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、刺激しなかった（ＣＴＲＬ）、または１ｍＭのＧＥＤ（ＧＥＤ１ｍＭ）もしくは様々な濃度（２５０μＭ、５００μＭ、１０００μＭ）のＣＬＡで刺激した、安定にトランスフェクトされたＰＰＡＲγノックダウンＣａｃｏ−２細胞（ＳｈＰＰＡＲ）および安定にトランスフェクトされた対照細胞（ＳｈＬｕｃ）における、ＬＣＴ  ｍＲＮＡ活性を示す棒グラフである。結果は、ＬＣＴ活性の変化倍率の平均±ＳＥＭを、ＣＴＲＬにおけるＬＣＴ活性と比較して表す（ｎ＝４連で実施した２回の独立した実験；＊Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；ＮＳ、有意差なし）。
【００４６】
【図２１Ａ】図２１Ａは、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに、０．５％カルボキシメチルセルロースを補充した対照食（対照食＋ＣＭＣ；ｎ＝３回の独立した実験で２４匹の動物）、または２００ｍｇ／ｋｇ／日のＣＬＡを補充した食（対照食＋ＣＬＡ２００ｍｇ／Ｋｇ／日（経口強制飼養）；ｎ＝１０匹の動物）、または３０ｍｇ／ｋｇ／日のＧＥＤを補充した食（対照食＋ＧＥＤ／Ｋｇ／日（経口強制飼養）；ｎ＝２回の独立した実験で１５匹の動物）を５日間（Ｄ５）与える効果を分析するための実験設計の模式図である。
【００４７】
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、０．５％カルボキシメチルセルロースを補充した対照食（ＣＭＣ）、３０ｍｇ／ｋｇ／日のＧＥＤ（ＧＥＤ）、または２００ｍｇ／ｋｇ／日のＣＬＡ（ＣＬＡ）を与えたラットの十二指腸組織における、ＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現レベル（ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現に対して正規化された）に関する個々のデータ点および平均値（水平線）を、ＣＭＣ対照と比較して示すグラフである。
【００４８】
【図２１Ｃ】図２１Ｃは、０．５％カルボキシメチルセルロースを補充した対照食（ＣＭＣ）、３０ｍｇ／ｋｇ／日のＧＥＤ（ＧＥＤ）、または２００ｍｇ／ｋｇ／日のＣＬＡ（ＣＬＡ）を与えたラットの空腸組織における、ＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現レベル（ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現に対して正規化された）に関する個々のデータ点および平均値（水平線）を、ＣＭＣ対照と比較して示すグラフである。
【００４９】
【図２１Ｄ】図２１Ｄは、０．５％カルボキシメチルセルロースを補充した対照食（ＣＭＣ）または２００ｍｇ／ｋｇ／日のＣＬＡ（ＣＬＡ）を与えたラットの十二指腸組織における、ＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡ発現レベル（ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現に対して正規化された）に関する個々のデータ点および平均値（水平線）を、ＣＭＣ対照と比較して示すグラフである。
【００５０】
【図２１Ｅ】図２１Ｅは、０．５％カルボキシメチルセルロースを補充した対照食（ＣＭＣ）または２００ｍｇ／ｋｇ／日のＣＬＡ（ＣＬＡ）を与えたラットの空腸組織における、ＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡ発現レベル（ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現に対して正規化された）に関する個々のデータ点および平均値（水平線）を、ＣＭＣ対照と比較して示すグラフである。
【００５１】
【図２２Ａ】図２２Ａは、０．５％カルボキシメチルセルロースを補充した対照食を与えたラットの十二指腸組織における、ＰＰＡＲγ（ＰＰＡＲｇ）  ｍＲＮＡ発現レベルとＬＣＴ（ＬＣＴ）  ｍＲＮＡ発現レベルとの間の相関を示すグラフである。
【００５２】
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、２００ｍｇ／ｋｇ／日のＣＬＡを補充した対照食を与えたラットの十二指腸組織における、ＰＰＡＲγ（ＰＰＡＲｇ）  ｍＲＮＡ発現レベルとＬＣＴ（ＬＣＴ）  ｍＲＮＡ発現レベルとの間の相関を示すグラフである。
【００５３】
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、０．５％カルボキシメチルセルロースを補充した対照食を与えたラットの空腸組織における、ＰＰＡＲγ（ＰＰＡＲｇ）  ｍＲＮＡ発現レベルとＬＣＴ（ＬＣＴ）  ｍＲＮＡ発現レベルとの間の相関分析を示すグラフである。
【００５４】
【図２２Ｄ】図２２Ｄは、０．５％カルボキシメチルセルロースを補充した対照食を与えたラットの空腸組織における、ＰＰＡＲγ（ＰＰＡＲｇ）  ｍＲＮＡ発現レベルとＬＣＴ（ＬＣＴ）  ｍＲＮＡ発現レベルとの間の相関分析を示すグラフである。
【００５５】
【図２２Ｅ】図２２Ｅは、０．５％カルボキシメチルセルロースを補充した対照食（ＣＭＣ）、３０ｍｇ／ｋｇ／日のＧＥＤ（ＧＥＤ）、または２００ｍｇ／ｋｇ／日のＣＬＡ（ＣＬＡ）を５日間与えたラットの十二指腸組織における、ＬＣＴ活性の変化倍率の個々のデータ点および平均値（水平線）を示すグラフである。
【００５６】
【図２２Ｆ】図２２Ｆは、０．５％カルボキシメチルセルロースを補充した対照食（ＣＭＣ）、３０ｍｇ／ｋｇ／日のＧＥＤ（ＧＥＤ）、または２００ｍｇ／ｋｇ／日のＣＬＡ（ＣＬＡ）を５日間与えたラットの空腸組織における、ＬＣＴ活性の変化倍率の個々のデータ点および平均値（水平線）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
詳細な説明
ここで、本開示の特徴および他の詳細を、さらに具体的に記載する。本発明をさらに説明する前に、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲に用いられるある特定の用語を、ここにまとめる。これらの定義は、本開示の残りの部分に照らして読まれ、当業者によって理解されるべきである。別段定義されない限り、本明細書で使用されるあらゆる技術用語および科学用語は、当業者によって共通に理解される意味と同じ意味を有する。
【００５８】
定義
「処置すること」は、状態、疾患、障害等を改善する任意の効果、例えば減弱、低減、モジュレートまたは排除することを含む。
【００５９】
用語「薬学的に許容されるキャリア」または「薬学的に許容される賦形剤」は、本明細書で使用される場合、薬学的投与と適合性がある、任意のすべての溶媒、分散媒、コーティング、等張剤および吸収遅延剤等を指す。薬学的に活性な物質のために、このような媒体および作用物質（agent）を使用することは、当技術分野で周知である。組成物はまた、補助的機能、付加的機能または増強された治療機能を提供する他の活性な化合物を含有することができる。
【００６０】
用語「医薬組成物」は、本明細書で使用される場合、１つまたは複数の薬学的に許容されるキャリアと一緒に製剤化された、本明細書に開示される少なくとも１つの化合物を含む組成物を指す。
【００６１】
「個体」、「患者」または「被験体」は、交換可能に使用され、哺乳動物、好ましくはマウス、ラット、他のげっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、または霊長類、最も好ましくはヒトを含む任意の動物を含む。本発明の化合物は、ヒトなどの哺乳動物に投与され得るが、他の哺乳動物、例えば獣医学的処置を必要としている動物、例えば飼育動物（例えば、イヌ、ネコ等）、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）および実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモット等）にも投与され得る。本発明の方法で処置される哺乳動物は、ＰＰＡＲ受容体のモジュレーションが望まれる、望ましくは哺乳動物である。「モジュレーション」には、アンタゴニズム（例えば、阻害）、アゴニズム、部分的アンタゴニズムおよび／または部分的アゴニズムが含まれる。
【００６２】
本明細書では、用語「治療有効量」は、研究者、獣医、医師または他の臨床医によって求められる、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する、対象の化合物の量を意味する。本発明の化合物は、疾患を処置するための治療有効量で投与される。あるいは、化合物の治療有効量は、所望の治療効果および／または予防効果を達成するのに必要な数量（quantity）、例えばＰＰＡＲ受容体と関連する疾患と関連する症状を防止または低減する量である。
【００６３】
用語「薬学的に許容される塩（複数可）」は、本明細書で使用される場合、本組成物において使用される化合物に存在し得る酸性基または塩基性基の塩を指す。塩基性の性質である本組成物に含まれる化合物は、様々な無機酸および有機酸と共に多種多様な塩を形成することができる。このような塩基性化合物の薬学的に許容される酸付加塩を調製するために使用され得る酸は、それらに限定されるものではないが、リンゴ酸塩、シュウ酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩（acid  phosphate）、イソニコチン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチジン酸塩（gentisinate）、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカリン酸塩、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびパモ酸塩（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸塩））を含む、非毒性の酸付加塩、すなわち薬理学的に許容されるアニオンを含有する塩を形成する酸である。アミノ部分を含む本組成物に含まれる化合物は、先に列挙される酸に加えて、様々なアミノ酸と共に薬学的に許容される塩を形成し得る。酸性の性質である本組成物に含まれる化合物は、様々な薬理学的に許容されるカチオンと共に塩基塩を形成することができる。このような塩の例として、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩、特に、カルシウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩、亜鉛塩、カリウム塩、および鉄塩が挙げられる。本開示の薬学的に許容される塩には、例えば脂肪酸の薬学的に許容される塩、例えば共役リノール酸の薬学的に許容される塩が含まれる。
【００６４】
本開示の化合物は、１つまたは複数のキラル中心および／または二重結合を含有することができ、したがって、立体異性体、例えば幾何異性体、鏡像異性体またはジアステレオマーとして存在し得る。用語「立体異性体」は、本明細書で使用される場合、あらゆる幾何異性体、鏡像異性体またはジアステレオマーからなる。これらの化合物は、不斉炭素原子の周りの置換基の立体配置に応じて、記号「Ｒ」または「Ｓ」によって指定され得る。本発明は、これらの化合物の様々な立体異性体およびそれらの混合物を包含する。立体異性体には、鏡像異性体およびジアステレオマーが含まれる。鏡像異性体またはジアステレオマーの混合物は、命名法で「（±）」で指定され得るが、当業者は、その構造が、キラル中心を暗黙的に示し得ることを認識されよう。
【００６５】
本発明の化合物の個々の鏡像異性体は、非対称もしくは不斉中心を含有する市販の出発材料から、またはラセミ混合物を調製した後、当業者に周知の分割方法を行うことによって、合成的に調製することができる。これらの分割方法は、（１）キラル補助基（ｃｈｉｒａｌ  ａｕｘｉｌｉａｒｙ）への鏡像異性体混合物の付着、再結晶化もしくはクロマトグラフィーによるジアステレオマーの生成混合物の分離、および補助基からの光学的に純粋な生成物の遊離、（２）光学的に活性な分割剤を用いる塩の形成、または（３）キラル液体クロマトグラフィーカラム上の光学的鏡像異性体の混合物の直接的な分離によって例示される。立体異性混合物は、周知の方法、例えばキラル相ガスクロマトグラフィー、キラル相高速液体クロマトグラフィー、キラル塩錯体としての化合物の結晶化、またはキラル溶媒中での化合物の結晶化によって、それらの構成成分である立体異性体に分割することもできる。立体異性体は、立体異性体的に純粋な中間体、試薬、および触媒から、周知の不斉合成法によって得ることもできる。
【００６６】
幾何異性体も、本発明の化合物に存在し得る。記号
【化１】
2019510745.tif 000002
は、本明細書に記載の通り、単結合、二重結合または三重結合であり得る結合を示す。本発明は、炭素−炭素二重結合の周りの置換基の配置または炭素環式環の周りの置換基の配置から生じる、様々な幾何異性体およびそれらの混合物を包含する。炭素−炭素二重結合の周りの置換基は、「Ｚ」または「Ｅ」立体配置中に存在するものと指定され、ここで用語「Ｚ」および「Ｅ」は、ＩＵＰＡＣ標準に従って使用される。別段の指定がない限り、二重結合を図示する構造は、「Ｅ」および「Ｚ」異性体の両方を包含する。
【００６７】
あるいは、炭素−炭素二重結合の周りの置換基は、「シス」または「トランス」と呼ぶことができ、ここで「シス」は、二重結合の同じ側にある置換基を表し、「トランス」は、二重結合の反対側にある置換基を表す。炭素環式環の周りの置換基の配置は、「シス」または「トランス」と指定される。用語「シス」は、環の平面の同じ側にある置換基を表し、用語「トランス」は、環の平面の反対側にある置換基を表す。置換基が環の平面の同じ側および反対側の両方に配置される化合物の混合物は、「シス／トランス」と指定される。
【００６８】
本明細書に開示の化合物は、水、エタノールなどの薬学的に許容される溶媒との溶媒和形態および非溶媒和形態で存在することができ、本発明が溶媒和形態および非溶媒和形態の両方を包含することが企図される。一実施形態では、化合物は、非晶質である。一実施形態では、化合物は、多形である。別の実施形態では、化合物は、結晶形である。
【００６９】
本発明はまた、１つまたは複数の原子が、通常天然で見出される原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子によって置き換えられていることを除き、本明細書に列挙されているものと同一の、同位体的に標識された本発明の化合物を包含する。本発明の化合物に組み込むことができる同位体の例として、水素、炭素、窒素、酸素、リン、フッ素および塩素の同位体、例えばそれぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、および３６Ｃｌが挙げられる。
【００７０】
ある特定の同位体的に標識された本開示の化合物（例えば、３Ｈおよび１４Ｃで標識されたもの）は、化合物および／または基質組織分布アッセイにおいて有用である。化合物の調製および検出性を容易にするには、トリチウム標識（すなわち、３Ｈ）および炭素−１４（すなわち、１４Ｃ）同位体が、特に好ましい。さらに、より重い同位体、例えば重水素（すなわち、２Ｈ）による置換では、より高い代謝安定性（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期の延長または必要投与量の低減）から生じるある特定の治療上の利点を得ることができ、したがって、一部の環境において好ましい場合がある。同位体的に標識された本発明の化合物は、一般に、本明細書の例えば実施例に開示のものに類似の手順に従って、非同位体的に標識された試薬を同位体的に標識された試薬で置換することによって調製することができる。
【００７１】
脂肪酸
本開示は、少なくとも部分的に、患者、例えばラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症の処置、防止、管理、および／または好転を必要としている患者に、１つまたは複数の単離された脂肪酸を投与することによって、ラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置し、管理し、防止し、かつ／または好転させるための方法を提供する。例えば、一部の実施形態では、ラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置し、管理し、防止し、かつ／または好転させるための方法は、１つまたは複数の単離された脂肪酸を含む薬学的に許容される組成物、例えば薬学的に許容される製剤を患者に投与する方法を含む。脂肪酸および単離された脂肪酸（本明細書では交換可能に使用される）は、任意の脂肪酸分子またはＰＰＡＲをモジュレートする分子を指すことができる。このような脂肪酸は、例えばＰＰＡＲ活性を増加させることによって、例えばＰＰＡＲアゴニストまたはＰＰＡＲγアゴニストとして作用することによって、例えばＰＰＡＲ活性をモジュレートすることができる。いかなる理論にも拘泥するものではないが、脂肪酸は、例えばＰＰＡＲに結合することによって、例えばＰＰＡＲリガンドとして作用することによって、ＰＰＡＲモジュレーターとして作用することができる。
【００７２】
脂肪酸には、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、短鎖脂肪酸（例えば、６個未満の炭素の脂肪族の尾部を有する脂肪酸）、中鎖脂肪酸（例えば、６〜１２個の炭素の脂肪族の尾部を有する脂肪酸）、長鎖脂肪酸（例えば、１３〜２１個の炭素の脂肪族の尾部を有する脂肪酸）、リノール酸、超長鎖脂肪酸（例えば、２２個を超える炭素の脂肪族の尾部を有する脂肪酸）、オメガ−３脂肪酸、および必須脂肪酸が含まれるが、それらに限定されない。脂肪酸には、脂肪酸の異性体、例えば共役リノール酸の異性体も含まれる。脂肪酸には、脂肪酸の異性体、例えば脂肪酸のトランスおよびシス異性体も含まれる。
【００７３】
不飽和脂肪酸には、例えば、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、リノール酸、リノールエライジン酸、α−リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、エルカ酸、ステアリドン酸、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、ドコサテトラエン酸、パウリン酸、ゴンド酸、ガドレイン酸、エイコセン酸、ネルボン酸、ミード酸、クロトン酸、エイコサジエン酸、ドコサジエン酸、ピノレン酸、エレオステアリン（elostearic）酸、β−エレオステアリン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラン酸、アドレン酸、ボセオペンタエン酸、オズボンド（ozubondo）酸、イワシ酸（sardine  acid）、ニシン酸（herring  acid）、テトラコサノールペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸が含まれるが、それらに限定されない。
【００７４】
飽和脂肪酸には、例えば、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、エナント酸、ペラルゴン酸、ウンデシル酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、マルガリン酸、ノナデシル酸、ヘンイコシル酸、トリコシル酸、ペンタコシル酸、ヘプタコシル酸、モンタン酸、ノナコシル酸、メリシン酸、ヘナトリアコンチル酸（henatriacontylic  acid）、ラッセル（lacceroic）酸、プシリン（psyllic）酸、ゲジン（geddic）酸、セロプラスチック（ceroplastic）酸、ヘキサトリアコンチル（hexatriacontylic）酸、ヘプタトリアコンタン酸、およびオクタトリアコンタン酸が含まれるが、それらに限定されない。
【００７５】
脂肪酸には、脂肪酸の立体異性体および脂肪酸立体異性体のラセミ混合物、例えばリノール酸の立体異性体、例えば９（Ｓ）−ヒドロキシ−１０（Ｅ），１２（Ｚ）−オクタデカジエン酸（９（Ｓ）−ＨＯＤＥ）および９（Ｒ）−ヒドロキシ−１０（Ｅ），１２（Ｚ）−オクタデカジエン酸（９（Ｒ）−ＨＯＤＥ）、ならびにリノール酸立体異性体のラセミ混合物、例えば９−ヒドロキシオクタデカジエン酸（９−ＨＯＤＥ）も含まれる。脂肪酸の立体異性体の他の例として、１３−ヒドロキシオクタデカジエン酸（１３−ＨＯＤＥ、１３（Ｓ）−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ−オクタデカジエン酸、または１３（Ｓ）−ＨＯＤＥとしても公知である）および１３（Ｒ）−ヒドロキシ−９Ｚ，１１Ｅ−オクタデカジエン酸（１３（Ｒ）−ＨＯＤＥ）が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７６】
脂肪酸は、例えば共役リノール酸であり得る。共役リノール酸（ＣＬＡ）は、共役ジエンの存在によって特徴付けられるリノール酸の位置異性体および幾何異性体の群を指す。脂肪酸には、例えば、シス−９，トランス−１１（ｃ９，ｔ１１）異性体、トランス−１０，シス−１２（ｔ１０、ｃ１２）異性体、およびトランス−１０，シス−１１（ｔ１０、ｃ１１）異性体を含む、共役リノール酸の任意の異性体が含まれ得る。例示的な共役リノール酸は、以下の構造のリノール酸で表される。
【化２】
2019510745.tif 000003
【００７７】
本開示はまた、１つまたは複数の薬学的または化粧的に許容されるキャリアと一緒に製剤化された、本明細書で開示される化合物（例えば、上に記載した単離されたＣＬＡ）を含む医薬組成物の使用を含む方法を提供する。本明細書で提供される例示的な組成物には、上に記載したＣＬＡおよび１つまたは複数の薬学的に許容されるキャリアを本質的に含む組成物が含まれる。製剤には、経口、直腸、局所、口腔（buccal）および非経口（例えば、皮下、筋肉内、皮内、または静脈内）投与に適した製剤、または局所使用に適した製剤、例えば化粧品としての製剤が含まれる。任意の所与の場合において最も適した投与形態は、処置を受ける状態の度合いおよび重症度、ならびに使用される特定の化合物の性質に応じて決まる。
【００７８】
一部の実施形態では、本開示はまた、脂肪酸または脂肪酸代謝の生成物の１つまたは複数の誘導体を含む、ラクトース不耐性および／またはラクターゼ欠乏症を処置し、防止し、モニターし、かつ／または好転させるための組成物を対象とする。一部の実施形態では、本開示はまた、脂肪酸または脂肪酸代謝の生成物の１つまたは複数の誘導体を含む組成物を患者に投与することを含む、ラクトース不耐性および／またはラクターゼ欠乏症を処置し、防止し、モニターし、かつ／または好転させるための方法を対象とする。脂肪酸および脂肪酸代謝の生成物の誘導体には、例えばホルモン、例えばプロスタグランジン（例えば、１５−デオキシ−デルタ−１２，１４−プロスタグランジンＪ２（１５ｄ−ＰＧＪ２））、トリグリセリド、リン脂質、ジアシルグリセロール、セカンドメッセンジャー（例えば、イノシトール三リン酸）、およびケトン体が含まれる。
【００７９】
脂肪酸の誘導体には、リノール酸の誘導体、例えばＤＣＰ−ＬＡ（８−［２−（２−ペンチル−シクロプロピルメチル）−シクロプロピル］−オクタン酸）、ＦＲ２３６９２４、およびそれに限定されるものではないが、１２，１３−エポキシ−９−ケト−（１０−トランス）−オクタデセン酸（ＥＫＯＤＥ）を含むリノール酸の酸化誘導体が含まれる。脂肪酸の誘導体には、５−ヒドロキシエイコサテトラエン（hydroxyicosatetraenoic）酸（５−ＨＥＴＥ）、１２−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１２−ＨＥＴＥ）、１５−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１５−ＨＥＴＥ）、１６（Ｒ）−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１６（Ｒ）−ＨＥＴＥ）、１６（Ｓ）−ヒドロキシエイコサテトラエン酸（１６（Ｓ）−ＨＥＴＥ）、および５（Ｓ），６（Ｒ）−リポキシンＡ４、５（Ｓ），６（Ｒ）、および１５（Ｒ）−リポキシンＡ４を含むが、それらに限定されないアラキドン酸の誘導体も含まれる。脂肪酸の誘導体には、脂肪酸のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）化誘導体、例えばリノール酸のペグ化誘導体、例えばペグ化共役リノール酸も含まれる。
【００８０】
一部の実施形態では、本開示は、脂肪酸代謝の１つまたは複数の中間生成物、例えばリノール酸代謝の中間生成物を含む、ラクトース不耐性および／またはラクターゼ欠乏症を処置し、防止し、モニターし、かつ／または好転させるための組成物を対象とする。一部の実施形態では、本開示はまた、脂肪酸代謝の１つまたは複数の中間生成物、例えばリノール酸代謝の中間生成物を含む組成物を患者に投与することを含む、ラクトース不耐性および／またはラクターゼ欠乏症を処置し、防止し、モニターし、かつ／または好転させるための方法を対象とする。リノール酸代謝の中間生成物には、例えば、γ−リノレン酸、ジホモ−γ−リノレン酸、アラキドン酸、およびドコサテトラン酸（docosatetranoic  acid）が含まれる。
【００８１】
一部の実施形態では、本開示は、１つまたは複数の脂肪酸プロドラッグ、例えば共役リノール酸のプロドラッグを含む、ラクトース不耐性および／またはラクターゼ欠乏症を処置し、防止し、モニターし、かつ／または好転させるための組成物を対象とする。一部の実施形態では、本開示はまた、１つまたは複数の脂肪酸プロドラッグ、例えば共役リノール酸のプロドラッグを含む組成物を患者に投与することを含む、ラクトース不耐性および／またはラクターゼ欠乏症を処置し、防止し、モニターし、かつ／または好転させるための方法を対象とする。本明細書で使用される場合、用語「プロドラッグ」は、薬理学的に活性な化合物、例えば薬理学的に活性な脂肪酸に代謝される（例えば、患者に投与された後に代謝される）化合物を指す。例として、共役リノール酸のプロドラッグには、共役リノール酸に代謝される化合物が含まれる。
【００８２】
治療上の適用
本開示は、少なくとも部分的に、脂肪酸、例えばリノール酸、例えば共役リノール酸を、それを必要としている患者（例えば、ヒト患者）に投与することによって、ラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置または好転させる（または例えばラクトース不耐性の症状を制御する）ことを対象とする。例えば、ラクトース摂取後の下痢、腹痛および／または鼓脹を処置する方法が提供され、ここで共役リノール酸（または例えば、共役リノール酸を含む組成物）は、それを必要としている被験体に、例えば経口投与によって投与される。
【００８３】
例えば一部の実施形態では、本開示は、患者が、ラクトース、例えばラクトースを含む組成物、例えばラクトースを含む食品を摂取する前、実質的に同時、または後に、脂肪酸、例えば共役リノール酸異性体を投与することによって、患者のラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置または好転させる方法を対象とする。
【００８４】
また本明細書では、ラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を低減するための組成物が提供される。例えば、一部の実施形態では、開示される組成物は、脂肪酸、例えば共役リノール酸を含む、ラクトース低含量乳または乳製品（milk  product）の一部を形成することができ、またはそれらを作製するために使用される。このような組成物は、例えば乳清製品、乳製品（milk  product）またはチーズ製品であってよく、またはそれらの一部であってよい。
【００８５】
本発明の化合物は、このような処置または好転を必要としている被験体（例えば、動物および／またはヒト）に、最適な薬学的有効性を提供する投与量で投与され得る。任意の特定の適用において使用するのに必要な用量は、選択される特定の化合物または組成物に関してだけでなく、投与経路、処置を受ける状態の性質、患者の年齢および状態、併用医薬品またはその後患者が摂取する特別食、ならびに当業者が認識する他の因子に関しても、患者ごとに様々であり、適切な投与量は、最終的に主治医、介護者、または患者の裁量によって決まることが理解されよう。上記の臨床状態および疾患を処置するために、本発明の化合物は、例えば経口、局所、非経口で、吸入スプレーによって、または直腸に、従来の非毒性の薬学的に許容されるキャリア、アジュバント、およびビヒクルを含有する投薬単位製剤で投与され得る。非経口という用語は、本明細書で使用される場合、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内注射、または注入技術を含む。
【００８６】
一般に、活性構成成分の治療有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ〜約７０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ、または約９０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与される量は、処置される疾患または適応症のタイプおよび程度、特定の患者の全体的な健康状態、化合物の相対的な生物学的有効性、化合物の製剤、製剤における賦形剤の存在およびタイプ、ならびに投与経路などの変数に応じて変わる。投与される初期投与量は、所望の血液レベルもしくは組織レベルを急速に達成するために、上位レベルを超えて増加させることができ、または初期投与量は、最適量より少なくて済む場合があり、毎日の投与量は、処置過程中、特定の状況に応じて次第に増加させることができる。ヒトの投与量は、例えば、０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇになるように設計された従来の第Ｉ相用量漸増試験において最適化され得る。投与頻度は、投与経路、投薬量および処置されている疾患状態などの因子に応じて変わり得る。例示的な投与頻度は、１日１回、週１回、および２週間毎に１回である。
【００８７】
本開示の製剤または組成物は、開示される化合物を含むことができ、典型的に、薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含むこともできる。
【００８８】
本開示の組成物は、当技術分野で周知の通り、それらの企図される使用に応じて様々な手段によって投与され得る。例えば、本発明の組成物は、経口投与する予定である場合、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤・粉剤（powder）またはシロップ剤として製剤化され得る。あるいは、本発明の製剤は、注射剤（静脈内、筋肉内、または皮下）、点滴注入調製物、浣腸剤、または坐剤として非経口投与され得る。眼部粘膜経路によって適用するために、本発明の組成物は、点眼剤または眼用軟膏として製剤化され得る。これらの製剤は、従来の手段によって調製することができ、所望の場合、組成物は、任意の従来の添加剤、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭薬、可溶化剤、懸濁化助剤、乳化剤またはコーティング剤と混合され得る。
【００８９】
本明細書で提供される製剤の一部の実施形態では、湿潤剤、乳化剤、および滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、賦香剤、防腐剤、および抗酸化剤は、製剤化された薬剤中に存在してよい。
【００９０】
本組成物は、経口、経鼻、局所（口腔および舌下を含む）、直腸、膣、エアロゾルおよび／または非経口投与に適し得る。製剤は、好都合には単位剤形で提示することができ、薬剤学の分野で周知の任意の方法によって調製され得る。単回用量を生成するためにキャリア材料と組み合わされ得る組成物の量は、処置を受ける被験体および特定の投与方法に応じて変わり得る。
【００９１】
経口投与に適した製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤（フレーバー基剤、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガントを使用する）、散剤・粉剤、顆粒剤の形態で、または水性もしくは非水性液体での液剤もしくは懸濁剤として、または水中油もしくは油中水液体エマルジョンとして、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤として、またはトローチ剤（不活性な基剤、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアを使用する）として存在することができ、それらのそれぞれは、その所定量の本組成物を活性成分として含有する。本発明の組成物はまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとして投与され得る。
【００９２】
経口投与のための固体剤形（カプセル剤、錠剤、丸剤、フィルムコーティングされた錠剤、糖でコーティングされた錠剤、散剤・粉剤、顆粒剤等）では、本開示の組成物は、１つもしくは複数の薬学的に許容されるキャリア、例えばクエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、ならびに／または以下：（１）充填剤もしくは増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／もしくはケイ酸、（２）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／もしくはアカシアなど、（３）保湿剤、例えばグリセロール、（４）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、バレイショもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム、（５）溶解遅延剤、例えばパラフィン、（６）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物、（７）湿潤剤、例えばアセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートなど、（８）吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイト粘土、（９）滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物、ならびに（１０）着色剤のいずれかと混合され得る。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、組成物は、緩衝剤を含むこともできる。ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用して、類似のタイプの固体組成物を、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル剤における充填剤として用いることもできる。
【００９３】
経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤が含まれ得る。液体剤形は、本組成物に加えて、当技術分野で共通に使用される不活性希釈剤、例えば水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、シクロデキストリン、ならびにそれらの混合物などを含有し得る。
【００９４】
懸濁剤は、本組成物に加えて、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガント、ならびにそれらの混合物としての懸濁化剤を含有し得る。
【００９５】
本明細書本文全体を通して、組成物が、特定の構成成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載される場合、組成物は、列挙された構成成分から本質的になる、またはそれからなることも企図される。同様に、プロセスが、特定のプロセスステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、または含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載される場合、そのプロセスは、やはり列挙されたプロセシングステップから本質的になる、またはそれからなる。
【００９６】
別段示される場合を除いて、ステップの順序またはある特定の動作を実施する順序は、本発明が依然として操作可能な限り重要ではない。さらに、別段の注記がない限り、２つまたはそれよりも多くのステップまたは動作は、同時に実施され得る。
【００９７】
本明細書に開示される化合物は、有機合成分野の当業者に周知のいくつかのやり方で調製され得る。
【００９８】
医薬組成物および投与経路
本開示はまた、１つまたは複数の単離された脂肪酸、例えば共役リノール酸（ＣＬＡ）、例えばトランス−１０，シス−１２共役リノール酸異性体、シス−９，トランス−１１共役リノール酸異性体、またはそれらの混合物を含む医薬組成物を投与することによって、ラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置し、防止し、または好転させるための方法を提供する。別の態様では、本開示は、ラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症の処置に使用するための医薬組成物を提供する。医薬組成物は、開示される単離された脂肪酸、例えばＣＬＡおよび薬学的に許容されるキャリアから構成され得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、ラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置し、管理し、好転させ、および／または防止するために、患者、例えばヒトに投与するための薬学的に許容されるキャリアに、特定量の治療化合物、例えば治療有効量の治療化合物、例えば治療有効量の脂肪酸（例えば、ＣＬＡ）を含有する混合物であり得る。一部の実施形態では、開示される単離された脂肪酸および薬学的に許容されるキャリアを含む医薬組成物が本明細書に提供される。一部の実施形態では、本開示は、ラクトース不耐性またはラクターゼ欠乏症を処置し、管理し、好転させ、かつ／または防止するための医薬の製造における、単離された脂肪酸の使用を対象とする。「医薬」は、本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」と本質的に同じ意味を有する。
【００９９】
薬学的に許容されるキャリアには、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに適しており、妥当なベネフィット／リスク比に見合うバッファ、キャリア、および賦形剤が含まれ得る。キャリア（複数可）は、製剤のその他の成分と適合性があり、レシピエントにとって有害でないという意味で「許容され（acceptable）」なければならない。薬学的に許容されるキャリアには、薬学的投与と適合性があるバッファ、溶媒、分散媒、コーティング、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野で公知である。一実施形態では、医薬組成物は、経口投与され、消化器系または腸内の、カプセル封入物質の吸収部位を調節するのに適した腸溶コーティングまたは親油性コーティングを含む。例えば、腸溶コーティングには、エチルアクリレート−メタクリル酸コポリマー、アミノアルキルメタクリレートコポリマー、メタクリル酸コポリマー、メタクリル酸エステルコポリマー、アンモニオアルキルメタクリレートコポリマー、ポリメタクリレート、ポリ（メタクリル酸−ｃｏ−メチルメタクリレート）、ヒドロキシプロピル−メチルセルロースフタレートが含まれ得る。
【０１００】
一部の実施形態では、本明細書で提供される製剤は、治療物質（therapeutic）、例えば単離された脂肪酸を、胃腸管の１つまたは複数の特定領域への送達を可能にする、腸溶コーティング、例えば親油性コーティングを含む。例えば製剤は、治療物質を、胃、十二指腸、空腸、小腸、大腸、横行結腸、上行結腸もしくは下行結腸、回腸、盲腸、および／または直腸への送達を可能にする腸溶コーティングおよび試薬を含み得る。製剤は、治療物質を、例えば錠剤、ロゼンジ、またはカプセル剤の形態の経口投与のための製剤から、ある近似のｐＨ値でまたはあるｐＨ値範囲内での放出を可能にする、腸溶コーティングおよび試薬を含み得る。例えば、本明細書で提供される製剤は、治療物質、例えば単離された脂肪酸を、経口投与のための製剤から、約３、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、または約８のｐＨ値で放出する、腸溶コーティングおよび試薬を含み得る。例えば、本明細書で提供される製剤は、治療物質を、経口投与のための製剤から、約３を超える、約４を超える、約４．５を超える、約５を超える、約５．５を超える、約６を超える、約６．５を超える、約７を超える、約７．５を超える、または約８を超えるｐＨ値で放出する、腸溶コーティングおよび試薬を含み得る。一部の実施形態では、本開示の製剤は、治療物質を、経口投与のための製剤から、約ｐＨ３〜約ｐＨ、約ｐＨ４〜約ｐＨ５、約ｐＨ５〜約ｐＨ６、約ｐＨ６〜約ｐＨ７、約ｐＨ７〜約ｐＨ８、約ｐＨ８〜約ｐＨ９、約ｐＨ４．５〜約ｐＨ７．５、約ｐＨ４〜約ｐＨ７、約ｐＨ５〜約ｐＨ７、約ｐＨ５．５〜約ｐＨ６．５、または約ｐＨ４．５〜約ｐＨ５．５のｐＨ値範囲で放出する。
【０１０１】
一部の実施形態では、開示される脂肪酸およびその任意の医薬組成物は、局所、非経口、経口、肺、気管内、鼻腔内、経皮、または十二指腸内を含む１つまたはいくつかの経路によって投与され得る。非経口投与には、皮下注射、膵臓内投与、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内注射または注入技術が含まれる。例えば、脂肪酸は、被験体に皮下投与され得る。別の例では、脂肪酸は、被験体に経口投与され得る。別の例では、脂肪酸は、胃腸管系、または胃腸管系の特定の領域（例えば、回腸、結腸または直腸）に、非経口投与によって直接的に投与され得る。
【０１０２】
本明細書に開示されるものなどの脂肪酸を含有する医薬組成物は、単位剤形で提示することができ、任意の適切な方法によって調製することができる。医薬組成物は、その所期の投与経路と適合するように製剤化されるべきである。有用な製剤は、薬学分野で周知の方法によって調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年）参照。
【０１０３】
医薬製剤は、例えば、無菌である。滅菌は、例えば、無菌濾過膜を介する濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、濾過滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後に実施することができる。
【０１０４】
非経口投与
本開示の医薬組成物は、非経口投与のために製剤化することができ、例えば静脈内、筋肉内、皮下、病巣内、または腹腔内経路を介する注射のために製剤化することができる。脂肪酸を含有する水性組成物、例えば水性医薬組成物の調製は、本開示に照らして当業者に公知となろう。典型的に、このような組成物は、注射剤として、液体溶液または懸濁液として調製することができる。また、注射前に液体を添加して溶液または懸濁液を調製するために使用するのに適した固体形態を調製することができ、その調製物は、乳化されていてもよい。
【０１０５】
注射用の使用に適した医薬形態には、無菌水性溶液または分散物；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および注入可能な無菌溶液または分散物の即時調製のための無菌散剤が含まれる。あらゆる場合、その形態は、無菌でなければならず、注射針を容易に通過できる程度に流体でなければならない。その形態は、製造および保存条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。
【０１０６】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。また分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中で、ならびに油中で調製することができる。さらに、無菌固定油を、溶媒または懸濁化媒体として用いることができる。この目的では、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含めた任意の無刺激性の固定油を用いることができる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製に（治療剤としてのそれらの使用の域を超えて）使用され得る。無菌注射可能調製物はまた、非中毒性の非経口で許容される希釈剤もしくは溶媒中の無菌で注射可能な溶液、懸濁物またはエマルジョン（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液）であり得る。用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、米国薬局方のリンゲル溶液、および等張塩化ナトリウム溶液が含まれる。特定の実施形態では、脂肪酸は、１％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび０．１％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（商標）８０を含むキャリア流体に懸濁させることができる。これらの調製物は、保存および使用の通常条件下では、微生物の成長を防止するための保存剤を含有する。
【０１０７】
注射可能な調製物、例えば、注入可能な無菌水性または油性懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、公知の技術に従って製剤化することができる。一般に、分散物は、滅菌された様々な活性成分を、基本的な分散媒および先に列挙したものの中から必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。本開示の注入可能な無菌溶液は、脂肪酸を、必要に応じて先に列挙したその他の様々な成分と共に、必要量の適切な溶媒に組み込んだ後、濾過滅菌することによって調製することができる。注入可能な無菌溶液を調製するための無菌散剤の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、それらによって、活性成分と任意の追加の所望の成分の予め滅菌濾過した溶液から、その粉末を得る。注射可能な製剤は、例えば、細菌保持フィルターを介する濾過によって、滅菌され得る。
【０１０８】
また、筋肉内注射のためにさらにまたは高度に濃縮された溶液の調製が企図される。これに関して、溶媒としてＤＭＳＯを使用すると、高濃度の脂肪酸を小さな領域に極めて急速に浸透させ、送達できるので、ＤＭＳＯの使用が好ましい。
【０１０９】
このような溶液に使用するのに適した防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、チメロサール等が含まれる。適切な緩衝液には、約ｐＨ６〜ｐＨ８、例えば約ｐＨ７〜ｐＨ７．５のｐＨを維持するのに十分な量の、ホウ酸、重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム１０、酢酸ナトリウム、重リン酸ナトリウム等が含まれる。適切な張度剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）は、デキストラン４０、デキストラン７０、ブドウ糖、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリウム等であり、したがって、溶液の塩化ナトリウム当量は、０．９％プラスまたはマイナス０．２％の範囲である。適切な抗酸化剤および安定剤には、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ亜硫酸ナトリウム、チオ尿素等が含まれる。適切な湿潤剤および清澄剤には、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー２８２およびチロキサポールが含まれる。適切な増粘剤には、デキストラン４０、デキストラン７０、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ワセリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース等が含まれる。
【０１１０】
経口投与
一部の実施形態では、脂肪酸の経口送達に適した組成物、例えば腸溶コーティング、例えば胃内抵抗性コーティングを含み、したがって組成物によって、脂肪酸を、例えば患者の胃腸管に送達することができる錠剤が本明細書に提供される。例えば、このような投与は、患者の胃腸管の罹患部分に、脂肪酸を実質的に局所的に直接適用して局所効果をもたらし得る。このような投与は、一部の実施形態では、脂肪酸の望ましくない全身吸収を実質的に回避することができる。
【０１１１】
例えば、脂肪酸、例えば単離された天然に存在する脂肪酸、例えばトランス−１０，シス−１２共役リノール酸異性体、シス−９，トランス−１１共役リノール酸異性体、または１つもしくは複数の共役リノール酸の混合物、および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む顆粒（例えば、顆粒から少なくとも部分的に形成される）を含む、経口投与のための錠剤が提供される。このような錠剤は、腸溶コーティングでコーティングされ得る。本明細書に提供される錠剤には、薬学的に許容される賦形剤、例えば充填剤、結合剤、崩壊剤、および／または滑沢剤、ならびに着色剤、放出剤（ｒｅｌｅａｓｅ  ａｇｅｎｔ）、コーティング剤、甘味剤、香味剤（ｆｌａｖｏｒｉｎｇ）、例えばウィンターグリーン、オレンジ、キシリトール、ソルビトール、フルクトース、およびマルトデキストリン、ならびに賦香剤（ｐｅｒｆｕｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、防腐剤および／または抗酸化剤が含まれ得る。
【０１１２】
一部の実施形態では、提供される医薬製剤は、脂肪酸、例えば単離された天然に存在する脂肪酸、例えばトランス−１０，シス−１２共役リノール酸異性体、シス−９，トランス−１１共役リノール酸異性体、または１つもしくは複数の共役リノール酸の混合物、および薬学的に許容される塩、例えば開示される脂肪酸、例えば単離された天然に存在する脂肪酸、例えばトランス−１０，シス−１２共役リノール酸異性体、シス−９，トランス−１１共役リノール酸異性体、または１つもしくは複数の共役リノール酸の混合物、および薬学的に許容される充填剤を含む粒内相を含む。例えば、開示される脂肪酸および充填剤は、任意選択で他の賦形剤と共に全体としてブレンドし、顆粒に形成することができる。一部の実施形態では、顆粒内相は、湿潤造粒を使用して形成することができ、例えば液体（例えば、水）を、ブレンドされた脂肪酸化合物および充填剤に添加し、次にその組合せを乾燥させ、製粉し、かつ／または篩にかけて顆粒を生成する。当業者であれば、顆粒内相を得るために他のプロセスを使用できることを理解されよう。
【０１１３】
一部の実施形態では、提供される製剤は、顆粒外相を含み、この顆粒外相は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含むことができ、顆粒内相とブレンドして開示の製剤を形成することができる。
【０１１４】
開示の製剤は、充填剤を含む顆粒内相を含むことができる。例示的な充填剤として、それらに限定されるものではないが、セルロース、ゼラチン、リン酸カルシウム、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ソルビトール、微結晶性セルロース、ペクチン、ポリアクリレート、ブドウ糖、酢酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、部分的にアルファ化されたデンプン、炭酸カルシウム、およびそれらの組合せを含む他のものが挙げられる。
【０１１５】
一部の実施形態では、開示の製剤は、結合剤を含む、顆粒内相および／または顆粒外相を含むことができ、この結合剤は一般に、医薬製剤の成分を一緒に保持するように機能することができる。本開示の例示的な結合剤として、それらに限定されるものではないが、デンプン、糖、セルロースまたは改変セルロース、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ラクトース、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、糖アルコール、およびそれらの組合せを含む他のものを挙げることができる。
【０１１６】
開示の製剤（例えば、顆粒内相および／または顆粒外相を含むもの）は、崩壊剤、例えばそれらに限定されるものではないが、デンプン、セルロース、架橋ポリビニルピロリドン、デンプングリコール酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギネート、トウモロコシデンプン、クロスカルメロース（ｃｒｏｓｍｅｌｌｏｓｅ）ナトリウム、架橋カルボキシメチルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、アカシア、およびそれらの組合せを含む他のものを含み得る。例えば、顆粒内相および／または顆粒外相は、崩壊剤を含み得る。
【０１１７】
一部の実施形態では、提供される製剤は、本明細書に記載の脂肪酸、ならびにマンニトール、微結晶性セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびデンプングリコール酸ナトリウムまたはそれらの組合せから選択される賦形剤を含む顆粒内相と、微結晶性セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、およびステアリン酸マグネシウムまたはそれらの混合物の１つまたは複数を含む顆粒外相とを含む。
【０１１８】
一部の実施形態では、提供される製剤は、滑沢剤を含むことができ、例えば顆粒外相は、滑沢剤を含有することができる。滑沢剤には、それらに限定されるものではないが、タルク、シリカ、脂肪、ステアリン、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、二酸化ケイ素、ケイ酸カルシウム、リン酸カルシウム、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸金属塩（ｍｅｔａｌｌｉｃ  ｓｔｅａｒａｔｅ）、水素化植物油、トウモロコシデンプン、安息香酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、酢酸ナトリウム、ステアリン酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、タルク、およびステアリン酸が含まれる。
【０１１９】
一部の実施形態では、医薬製剤は、腸溶コーティング（例えば、親油性コーティング）を含む。一般に、腸溶コーティングは、薬物が消化管に沿って吸収される位置を制御する、経口薬物適用のためのバリアを作成する。腸溶コーティングは、ｐＨに従って異なる速度で崩壊するポリマーを含むことができる。腸溶コーティングは、例えば、酢酸フタル酸セルロース、メチルアクリレート−メタクリル酸コポリマー、酢酸コハク酸セルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート−メタクリル酸コポリマー、エチルアクリレート−メタクリル酸コポリマー、メタクリル酸コポリマータイプＣ、ポリ酢酸ビニル−フタレート、および酢酸フタル酸セルロースを含むことができる。
【０１２０】
例示的な腸溶コーティングとして、Ｏｐａｄｒｙ（登録商標）ＡＭＢ、Ａｃｒｙｌ−ＥＺＥ（登録商標）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）グレードが挙げられる。一部の実施形態では、腸溶コーティングは、錠剤の約５重量％〜約１０重量％、約５重量％〜約２０重量％、８〜約１５重量％、約８重量％〜約２０重量％、約１０重量％〜約２０重量％、または約１２〜約２０重量％、または約１８重量％を構成し得る。例えば、腸溶コーティングは、エチルアクリレート−メタクリル酸コポリマーを含むことができる。
【０１２１】
例えば、本明細書に提供される一部の実施形態では、約０．５重量％〜約７０重量％、例えば約０．５重量％〜約１０重量％、または約１重量％〜約２０重量％の脂肪酸または薬学的に許容されるその塩を含むまたはそれから本質的になる錠剤が提供される。このような錠剤は、例えば約０．５重量％〜約６０重量％のマンニトール、例えば約３０重量％〜約５０重量％のマンニトール、例えば約４０重量％のマンニトール、および／または約２０重量％〜約４０重量％の微結晶性セルロース、もしくは約１０重量％〜約３０重量％の微結晶性セルロースを含むことができる。例えば、開示の錠剤は、約３０重量％〜約６０重量％、例えば約４５重量％〜約６５重量％、あるいは約５〜約１０重量％の脂肪酸、約３０重量％〜約５０重量％、あるいは約５重量％〜約１５重量％のマンニトール、約５重量％〜約１５重量％の微結晶性セルロース、約０重量％〜約４重量％、または約１重量％〜約７重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース、および約０重量％〜約４重量％、例えば約２重量％〜約４重量％デンプングリコール酸ナトリウムを含む顆粒内相を含み得る。
【０１２２】
別の実施形態では、脂肪酸を経口投与するための医薬錠剤製剤は、脂肪酸または薬学的に許容されるその塩（例えばナトリウム塩）、および薬学的に許容される充填剤を含む顆粒内相を含み、崩壊剤などの薬学的に許容される賦形剤を含み得る顆粒外相を含むこともできる。顆粒外相は、微結晶性セルロース、ステアリン酸マグネシウム、およびそれらの混合物から選択される構成成分を含むことができる。また、医薬組成物は、また、錠剤に対して約１２重量％〜２０重量％の腸溶コーティングを含むことができる。例えば、経口で使用するための薬学的に許容される錠剤は、約０．５重量％〜１０重量％の開示される脂肪酸（例えば、ＣＬＡ）または薬学的に許容されるその塩、約３０重量％〜５０重量％のマンニトール、約１０重量％〜３０重量％の微結晶性セルロース、およびエチルアクリレート−メタクリル酸コポリマーを含む腸溶コーティングを含むことができる。
【０１２３】
別の例では、経口で使用するための薬学的に許容される錠剤は、約５〜約１０重量％の脂肪酸（例えば、ＣＬＡ）または薬学的に許容されるその塩、約４０重量％のマンニトール、約８重量％の微結晶性セルロース、約５重量％のヒドロキシプロピルメチルセルロース（hydroxypropylmethyl  cellulose）、および約２重量％のデンプングリコール酸ナトリウムを含む顆粒内相、約１７重量％の微結晶性セルロース、約２重量％のデンプングリコール酸ナトリウム、約０．４重量％のステアリン酸マグネシウムを含む顆粒外相、ならびにエチルアクリレート−メタクリル酸コポリマーを含む、錠剤に被せる腸溶コーティングを含むことができる。
【０１２４】
一部の実施形態では、医薬組成物は、約１３重量％または約１５重量％、１６重量％、１７重量％または１８重量％を構成する腸溶コーティング、例えばＡｃｙｒｌＥＺＥ（登録商標）を含有することができる（例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／０５４８２６参照）。
【０１２５】
コーティングが溶解し、活性成分が放出される点での速度は、その溶解速度である。一実施形態では、錠剤は、例えばＵＳＰ／ＥＰタイプ２装置（パドル）により１００ｒｐｍで、ｐＨ７．２を有するリン酸緩衝液中３７℃で試験した場合、約１２０分〜約２４０分後、例えば１８０分後に約５０％〜約１００％の脂肪酸を放出する溶解プロファイルを有することができる。別の実施形態では、錠剤は、例えばＵＳＰ／ＥＰタイプ２装置（パドル）により１００ｒｐｍで、ｐＨ１．０を有する希釈ＨＣｌ中３７℃で試験した場合、１２０分後に脂肪酸が実質的に全く放出されない溶解プロファイルを有することができる。別の実施形態では、本明細書に提供される錠剤は、例えばＵＳＰ／ＥＰタイプ２装置（パドル）により１００ｒｐｍで、ｐＨ６．６を有するリン酸緩衝液中３７℃で試験した場合、３０分後に約１０％〜約３０％、または約５０％以下の脂肪酸を放出する溶解プロファイルを有することができる。
【０１２６】
製剤、例えば錠剤は、一部の実施形態では、患者に経口投与されると、患者における脂肪酸の最小血漿濃度をもたらし得る。別の実施形態では、開示される製剤は、患者に経口投与されると、患者の結腸または直腸に、例えば患者の罹患部位または疾患部位に局所送達される。
【０１２７】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、本明細書に開示の疾患、および障害の処置を対象とする少なくとも１つの他の薬剤を投与することをさらに含むことができる。一実施形態では、企図される他の薬剤は、共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）され得る（例えば、逐次または同時に）。
【０１２８】
企図される薬剤には、グルココルチコイド、細胞分裂阻害薬（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃｓ）、抗体、イムノフィリンに作用する薬剤、インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノール酸塩、および小型の生物学的薬剤を含む免疫抑制剤が含まれる。例えば、企図される免疫抑制剤には、それらに限定されるものではないが、タクロリムス、シクロスポリン、ピメクロリムス、シロリムス、エベロリムス、ミコフェノール酸、フィンゴリモド、デキサメタゾン、フルダラビン、シクロホスファミド、メトトレキセート、アザチオプリン、レフルノミド、テリフルノミド、アナキンラ、抗胸腺細胞グロブリン、抗リンパ球グロブリン、ムロモナブ−ＣＤ３、アフツズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、エファリズマブ、ダクリズマブ、バシリキシマブ、アダリムマブ、インフリキシマブ、セルトリズマブペゴル、ナタリズマブ、およびエタネルセプトが含まれる。企図される他の薬剤には、抗生物質、止痢薬、緩下剤、鎮痛薬（pain  reliever）、他の脂肪酸、鉄補給剤、およびカルシウムまたはビタミンＤまたはＢ−１２補給剤が含まれる。
【０１２９】
投与量および投与頻度
例示的な製剤は、約３５ｍｇ〜約５００ｍｇの脂肪酸を含むまたはそれから本質的になる剤形を含む。例えば、約３５ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１１０ｍｇ、１２０ｍｇ、１３０ｍｇ、１４０ｍｇ、１５０ｍｇ、１６０ｍｇ、１７０ｍｇ、１８０ｍｇ、１９０ｍｇ、２００ｍｇ、または２５０ｍｇの脂肪酸を含む製剤が本明細書に提供される。一実施形態では、製剤は、約４０ｍｇ、８０ｍｇ、または１６０ｍｇの本明細書に記載の脂肪酸を含むことができる。一部の実施形態では、製剤は、少なくとも１００μｇの脂肪酸を含むことができる。例えば、製剤は、約０．１ｍｇ、０．２ｍｇ、０．３ｍｇ、０．４ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、または２５ｍｇの脂肪酸を含むことができる。投与される量は、処置される疾患または適応症のタイプおよび程度、患者の全体的な健康状態および大きさ、脂肪酸のｉｎ  ｖｉｖｏ効力、医薬製剤、ならびに投与経路などの変数に応じて変わることになる。初期投与量は、所望の血液レベルまたは組織レベルを急速に達成するために、上位レベル（ｕｐｐｅｒ  ｌｅｖｅｌ）を超えて増加させることができる。あるいは、初期投与量は、最適量より少なくて済む場合があり、投与量は、処置過程中、次第に増加させることができる。ヒトの投与量は、例えば、４０ｍｇ〜１６０ｍｇになるように設計された従来の第Ｉ相用量漸増試験において最適化され得る。投薬頻度は、投与経路、投与量および処置されている疾患などの因子に応じて変わり得る。投薬頻度は、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回、１日７回、１日８回、１日９回、１日１０回、１日１０回超、週１回、２週間に１回、１カ月に１回および必要に応じてを含み得る。一部の実施形態では、投薬は、７日にわたって１日１回である。  
【実施例】
【０１３０】
本明細書に記載される実施形態を、以下の実施例によってさらに例示する。実施例は、単に例示目的で提供され、いかなる方式でも本実施形態の範囲または内容を制限すると解釈されるべきではない。
【０１３１】
（実施例１：材料および方法）
細胞培養および処理
Ｃａｃｏ−２（結腸腺癌）細胞を、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Ｄｕｔｓｃｈｅｒ、Ｂｒｕｍａｔｈ、Ｆｒａｎｃｅ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（５ｍｌ／ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１％非必須アミノ酸（５ｍｌ／ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、Ｆｒａｎｃｅ）中で成長させた。すべての細胞株を、制御された５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃において、コンフルエントな単層として培養した。
【０１３２】
細胞への刺激のために、１ウェル当たり１×１０６個の細胞を、６ウェルプレートに播種した。細胞を同調させるために、１６時間にわたって血清を取り除いた後に刺激を与えた。細胞を、ＧＥＤ（Ｎｏｇｒａ  Ｐｈａｒｍａ  Ｌｔｄ、Ｉｒｅｌａｎｄ）、ピオグリタゾン（１μＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）またはＣＬＡ（様々な濃度、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理した。必要な場合には、ＤＭＳＯビヒクル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を対照として使用した。２４時間刺激を与えた後に、細胞を無菌ＰＢＳで３回洗浄した後、ＲＮＡを抽出した。細胞刺激は、マイクロアレイ分析について４回反復して実施し、他の刺激について３回、４回、または６回反復して実施した。
【０１３３】
ＲＮＡ抽出
細胞を、１％β−メルカプトエタノールを含有する溶解緩衝液（ＲＡ１、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）で溶解させた。全ＲＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｈｏｅｒｄｔ、Ｆｒａｎｃｅ）で抽出した。リボヌクレアーゼ不活化後、全ＲＮＡから、デオキシリボヌクレアーゼ処理によって微量ゲノムＤＮＡを除き、リボヌクレアーゼを含まないＤＥＰＣ−水中に全ＲＮＡを溶離させた。ＲＮＡの純度を、ＵＶ分光法によって、Ｎａｎｏｄｒｏｐ系（Ｎｙｘｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）により２２０〜３５０ｎｍで評価した。また、マイクロアレイ実験の前に、ＲＮＡをＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００バイオアナライザでプロファイリングした。最小濃度５０ｎｇ／μｌの全ＲＮＡ  １μｇを、マイクロアレイ分析およびｑＲＴ−ＰＣＲ分析で使用した。
【０１３４】
マイクロアレイ
二色遺伝子発現マイクロアレイを使用して、試料からのｃＲＮＡを比較した。４４，０００の遺伝子をスクリーニングした。試料からのＲＮＡを、まずｃＤＮＡ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ、Ａｇｉｌｅｎｔ）に逆転写し、次にそれを、ＣＴＬ試料（緑色蛍光）についてはシアニン３−ＣＴＰの存在下で、ＰＰＡＲ−γモジュレーター試料（赤色蛍光）についてはシアニン５−ＣＴＰの存在下で、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるｃＲＮＡの合成および増幅のための基質として使用した。二標識ｃＲＮＡを混合し、同じアレイ（Ｇ４８５１Ａ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ８×４４Ｋ）上でハイブリダイズし、次に走査した（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇ２５０５Ｂスキャナーを用いた）。蛍光を、レーザー励起後に可視化し、各遺伝子の過剰発現または過小発現状態を得るために２つのフルオロフォアの相対強度を比として表した（ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用した）。この分析を、ＰＰＡＲ−γモジュレーターごとに実施した。
【０１３５】
定量ＰＣＲ
目的の遺伝子発現を、対応する逆転写ｍＲＮＡの定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって定量した。全ＲＮＡ  １μｇを、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。増幅は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７０００配列検出系（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用し、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用して実施した。ヒト転写物ごとのプライマー対を、ｑＰｒｉｍｅｒデポーソフトウェア（ｐｒｉｍｅｒｄｅｐｏｔ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）を用いて選択した。ｑＰＣＲシグナルの定量を、ΔＣｔ相対的定量方法を使用し、ヒトおよびラット試料についてはＧＡＰＤＨを参照遺伝子として使用し、マウス試料についてはβ−アクチンを使用して実施した。値は、対照条件と比較して、ｍＲＮＡレベルの変動または増加倍率の相対量に関して表した。
【０１３６】
免疫沈降
ＬＣＴタンパク質の発現レベルを、免疫沈降の後、ウェスタンブロッティング分析によって決定した。簡潔には、全タンパク質を、古典的なプロテアーゼ阻害剤カクテルを補充した、２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含有するＲＩＰＡ緩衝液を使用して、Ｃａｃｏ−２細胞から抽出した。全タンパク質２５０μｇを、ラクターゼに対する特異的抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）２μｇを用いて、終夜４℃で免疫沈降させた。免疫沈降したタンパク質を、タンパク質Ａ／Ｇアガロースビーズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）でコーティングし、４℃で４時間、穏やかに混合した。ビーズをＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄し、次に１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって電気泳動し、ポリフッ化ビニリデン膜（ＰＶＤＦ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に移した。膜を、ＬＣＴに対する特異的モノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；１：１０００、終夜４℃）または「１０％インプット」ローディングコントロールについてはβ−アクチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；１：２００００、室温で２時間）を用いてイムノブロッティングした。次に膜を、二次セイヨウワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗体（抗ウサギ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）および抗マウス（Ｓｉｇｍａ）、１：１００００、室温で１時間）を用いてインキュベートし、最後に、製造者のプロトコール（ＥＣＬ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に従って、化学発光基質を用いて明らかにした。膜を、オートラジオグラフィーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に曝露した。
【０１３７】
ラクターゼ活性
ラクターゼ活性を、グルコースオキシダーゼ方法（Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｓｉｇｍａ）を使用することによって評価した。このラクターゼアッセイは、試料を、ラクトース緩衝溶液（０．１ｍｏｌ／ｌのマレイン酸Ｎａ緩衝液中０．０５６ｍｏｌ／ｌのラクトース）とともにインキュベートすることによって、ラクターゼの作用に従って生成されたグルコースの量を測定することに基づく。Ｃａｃｏ−２細胞については、ラクターゼ活性は、細胞単層から直接決定した。細胞単層を十分に洗浄した後、ラクトース緩衝液を用いて３７℃で１時間インキュベートした。上清を回収し、５０μｌをグルコースオキシダーゼ試薬１００μｌで希釈し、３７℃で１時間インキュベートした。反応を、Ｈ２ＳＯ４１００μｌで停止させ、分光光度法によって４５０ｎｍで読み取った。ラクターゼ活性が腸管試料から決定されたら、組織試料を、最初にクラッシュアイス上０．９％ＮａＣｌ中、ダウンスホモジナイズした。次に、これらのホモジネートを０．９％ＮａＣｌ（１／５００）で希釈し、希釈物５０μｌを、ラクトース緩衝液とともにインキュベートし、それを使用してラクターゼ活性を決定した。実験ごとに、試料に残存したグルコースに起因するバックグラウンドを、ラクトースを含まない緩衝液中、細胞または細胞抽出物をインキュベートすることによって測定した。
【０１３８】
グルコースの取込みアッセイ
グルコースの取込みを、グルコースの取込み比色アッセイキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用することによって、製造者の指示に従って評価した。簡潔には、Ｃａｃｏ−２細胞を、９６ウェルプレートに、１ウェル当たり細胞３０，０００個の密度で播種した。細胞を同調させるために、１６時間にわたって血清を取り除いた後に刺激を与えた。細胞を、ＧＥＤ（１ｍＭ）またはピオグリタゾン（１μＭ）で２４時間処理した。次に、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、２％ＢＳＡを含有するＫＲＰＨ緩衝液１００μｌ（クレブスリンガーリン酸−ＨＥＰＥＳ（ＫＲＰＨ）緩衝液−２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭのＭｇＳＯ４、１ｍＭのＣａＣｌ２、１３６ｍＭのＮａＣｌ、および４．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．４）とともに４０分間インキュベートすることによって、グルコース飢餓状態にした。次に、２−デオキシグルコース１０μｌ（２−ＤＧ；１０ｍＭ）を添加し、２０分間インキュベーションを続けた。２−ＤＧは、細胞によって取り込まれ、ヘキソキナーゼによって２−ＤＧ６Ｐにリン酸化され、その２−ＤＧ６Ｐはさらに代謝することができず、細胞内に蓄積する。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、提供された抽出緩衝液８０μｌを用いて溶解した。２−ＤＧ６Ｐの量（細胞によるグルコースの取込みに正比例する）は、比色検出アッセイによって、製造者のプロトコールに従って決定した。
【０１３９】
ＰＰＡＲ−γノックダウン細胞の作製
ＰＰＡＲγノックダウンＩＥＣを、ｐＳＵＰＥＲ．ｒｅｔｒｏ系（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ）を使用して得た。ヒトＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡのヌクレオチド１０５〜１２３に相当するフォワードおよびリバース標的配列（５’−ＧＣＣＣＴＴＣＡＣＴＡＣＴＧＴＴＧＡＣ−３’（配列番号１））を、ｐＳＵＰＥＲｒｅｔｒｏベクター（ｐＲＳ）のＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ制限部位にクローニングして、ＳｈＰＰＡＲ構築物を得た。ルシフェラーゼ遺伝子を標的とした、配列５’−ＡＣＧＣＴＧＡＧＴＡＣＴＴＣＧＡＡＡＴ−３’（配列番号２）を含有する負の対照であるｐＲＳプラスミドも作製した（ＳｈＬｕｃ構築物）。両方の構築物を、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ技術を使用して、製造者のプロトコールに従ってＣａｃｏ−２細胞にトランスフェクトした。安定にトランスフェクトされたクローンを、ピューロマイシン（５μｇ／ｍｌ）を補充した完全培養培地を用いるトランスフェクション後２４時間で選択した。ＰＰＡＲγ発現のサイレンシングを、定量ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析によってチェックした。ＳｈＰＰＡＲ細胞株およびＳｈＬｕｃ細胞株が確立されたら、２．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを補充した完全培地中で維持した。
【０１４０】
レポーター遺伝子アッセイ
３２１ｂｐのゲノムフラグメント（ヒトラクターゼ遺伝子の転写開始部位の上流にある最初の３２１ｂｐに相当する）を、「Ｈｓ−Ｐｒｏｍ−０．３Ｋｂセンス」および「Ｈｓ−Ｐｒｏｍ−０．３Ｋｂアンチセンス」オリゴヌクレオチドにそれぞれ導入されたＸｈｏＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位を使用して、ｐＧＬ４−Ｌｕｃレポーターベクターにクローニングした。この構築物および空ベクター対照を、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）技術を使用し、Ｃａｃｏ−２細胞中で一過性にトランスフェクトした。トランスフェクション後６時間で、細胞を、ＰＰＡＲγモジュレーターで１２時間処理した。ルシフェラーゼ活性を、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２（商標）１４２０マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）中で測定した。
【０１４１】
クロマチン免疫沈降実験
ＬＣＴ遺伝子プロモーター上へのＰＰＡＲγの物理的結合を、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）実験によって、１００ｍｍの細胞培養ペトリ皿中、１ｍＭのＧＥＤで２４時間刺激したＣａｃｏ−２細胞（５×１０６個の細胞）において研究した。Ｃａｃｏ−２細胞を、無血清培地を添加することによって１６時間同調させ、次に、既に記載されているプロトコールを使用して、２４時間刺激した。次に、細胞をＰＢＳですすぎ、タンパク質−ＤＮＡ複合体を、１％ＰＦＡを添加することによって室温で３０分間固定させた。この結合を、グリシン（０．１２５Ｍ）を添加することによって停止させた。細胞を、冷ＰＢＳおよびプロテアーゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ）の存在下で擦り取ることによって収集した。遠心分離によって得られた細胞ペレットを、ＳＤＳ緩衝液３００μｌ（１％ＳＤＳ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、プロテアーゼ阻害剤）に取り込み、３０秒間超音波処理し（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ、ＢｉｏｒｕｐｔｏｒＵＣＤ２００ＴＭ−ＥＸ）、その後３０秒間の静止時間を設けた。免疫沈降ごとに、超音波処理した架橋試料１２５μＬを、ＩＰ緩衝液２２５μｌ（１％トリトンＸ−１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．１およびプロテアーゼ阻害剤）で希釈し、タンパク質Ａ／Ｇビーズ４０μＬ（５０％スラリータンパク質Ａ／Ｇセファロース、Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびサケ精子ＤＮＡ  ５μｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加することによって、４時間にわたって事前に清澄にした。複合体を、インキュベーションによって、特異的抗ＰＰＡＲγ抗体（Ｃ２６Ｈ１２ウサギモノクローナル抗体、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いて、回転させながら終夜４℃で免疫沈降させた。免疫複合体を、タンパク質Ａ／Ｇセファロース（５０％）４０μＬとサケ精子ＤＮＡ２μｇを添加することによって回収し、４℃で４時間インキュベートした。ビーズを、洗浄緩衝液１（０．１％ＳＤＳ、１％トリトンＸ−１００、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％デオキシコール酸塩、１ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で２回洗浄し、洗浄緩衝液２（０．１％ＳＤＳ、１％トリトンＸ−１００、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％デオキシコール酸塩、１ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で２回洗浄し、洗浄緩衝液３（０．２５ｍＭのＬｉＣｌ、０．５％デオキシコール酸塩、０．５％ＮＰ４０、０．５ｍＭのＥＧＴＡ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で１回洗浄し、洗浄緩衝液４（１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で３回洗浄した。次に、共免疫沈降させたＤＮＡを、抽出緩衝液１５０μｌ（０．１ＭのＮａＨＣＯ３、１％ＳＤＳ）で抽出した。架橋を終夜６５℃で逆転させた。次に、ＤＮＡを、ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して精製し、ＰＣＲによって分析した。
【０１４２】
動物実験法
動物実験を、公認のパスツール研究所動物ケア施設（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ  ｄｅ  Ｌｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ；番号Ｂ５９−３５００９）で、政府指針（番号２０１０／６３／ＵＥ；政令２０１３−１１８）および動物倫理委員会の承認に従って実施した。特定病原体除去雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ（Ｆｒａｎｃｅ）から得た。マウスおよびラットを、特定病原体除去施設内の空調管理された室内で、温度（２２±１℃）、湿度（６５〜７０％）を制御し、１２時間の明／１２時間の暗サイクルにより、それぞれ動物５匹／ケージおよび動物３匹／ケージで収容した。動物に、実験用の標準固形飼料（指定される場合を除く）を与え、オートクレーブした水道水を自由に飲めるように提供した。動物を、研究に入る前に少なくとも１週間順応させた。
【０１４３】
ラクターゼの発現および活性に対するＧＥＤの効果を評価するために、離乳したＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）および離乳したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２カ月齢を超える）を、３０ｍｇ／ｋｇのＧＥＤまたはビヒクル（０．５％ＣＭＣ、１％Ｔｗｅｅｎ  ８０）の胃内強制飼養を毎日受ける２つの群に無作為化した。７日間処置した後、動物を安楽死させ、胃腸管を正中線開腹術により取り出した。およそ０．５ｃｍの近位腸組織標本を、さらなる抽出のために急速凍結させた。ＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現およびＬＣＴ活性を、上記の通り評価した。
【０１４４】
さらに、ラクトース不耐性と関連する症状に対するＧＥＤの効果を、Ｓｓｎｉｆｆ  Ｓｐｅｚｉａｌｄｉａｅｔｅｎ  ＧｍｂＨ（Ｓｏｅｓｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって提供されたラクトース富化食を与えた離乳したラットで評価した。動物を、毎日モニターし、秤量し、糞便軟度を評価した。
【０１４５】
ＩＥＣに特異的ＰＰＡＲ−γ欠失を有するノックアウトマウス（ＰＰＡＲ−γΔＩＥＣ）からの近位腸試料は、Ｄａｎｉｅｌ  Ｍｅｔｚｇｅｒ教授（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＩＧＢＭＣ（Ｉｎｓｅｒｍ／ＣＮＲＳ／Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ））によって提供された。
【０１４６】
ＳＣＦＡ定量
ＳＣＦＡを、参照によって本明細書に組み込まれるMomose,  Y.、ら「Studies  on  antidiabetic  agents  X.  Synthesis  and  biological  activities  of  pioglitazone  and  related  compounds.」Chem  Pharm  Bull（東京）３９巻、１４４０〜１４４５頁（１９９１年）に記載される通り抽出し、測定した。
【０１４７】
遺伝子型解析
Ｃａｃｏ−２細胞に関するＣ／Ｔ１３９１０およびＧ／Ａ２２０１８多型のＬＣＴ遺伝子型解析を、参照によって本明細書に組み込まれるMastrofrancesco,  A.ら「Preclinical  studies  of  a  specific  PPARgamma  modulator  in  the  control  of  skin  inflammation.」J  Invest  Dermatol  １３４巻、１００１〜１０１１頁（２０１４年）に記載される通り決定した。
【０１４８】
統計的分析
すべてのグラフを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびＳｔａｔＸａｃｔ  ｖ．７．０（Ｃｙｔｅｌ  Ｓｔｕｄｉｏ）ソフトウェアを用い、ノンパラメトリックＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を使用してプロットし、分析した。０．０５未満のＰ値（Ｐ＜０．０５）を、統計的に有意とみなした。
【０１４９】
（実施例２：ＰＰＡＲγモジュレーターはラクターゼ活性を誘導する）
いかなる遺伝子発現変化がＰＰＡＲγ活性化によって誘導されたかを決定するために、遺伝子発現データを、刺激しなかったＣａｃｏ−２細胞およびＰＰＡＲγ刺激後のＣａｃｏ−２細胞から収集した。ＰＰＡＲγモジュレーターに曝露した後のＣａｃｏ−２細胞の遺伝子発現プロファイル変化を、マイクロアレイ分析によって評価した。この研究では、ピオグリタゾン（Ｐｉｏ）およびＧＥＤ−０５０７−３４−Ｌｅｖｏ（ＧＥＤ）の２つの異なるＰＰＡＲγ活性化因子を使用した。ピオグリタゾン（Ｐｉｏ）は、ＴＺＤ薬物クラスの周知のメンバーである。ＧＥＤは、アミノフェニル−アルファ−メトキシプロピオン酸ファミリーの化合物のメンバーである。ＧＥＤは、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願第１４／３９４，９１６号に記載されている。分析した４４，０００の遺伝子の中で、ＬＣＴ遺伝子は、１ｍＭのＧＥＤ、３０ｍＭのＧＥＤ、および１μＭのＰｉｏによる刺激後に上方調節された主な遺伝子であったことが観測された（表１）。ＬＣＴ遺伝子発現は、刺激しなかった細胞と比較して、１ｍＭのＧＥＤ（５．２８倍±０．５５；Ｐ＜０．０５）、３０ｍＭのＧＥＤ（８．２８倍±１．７；Ｐ＜０．０５）に対する応答において、およびＰｉｏ（１７．９３倍±５．１；Ｐ＜０．０５）によって、有意に増加した。
【表１】
2019510745.tif 000004
【０１５０】
ＬＣＴ遺伝子発現を刺激するＧＥＤおよびピオグリタゾンの能力を、１ｍＭおよび３０ｍＭのＧＥＤ、１μｍのＰｉｏ、ならびに５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）に曝露した後に、定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を使用してＣａｃｏ−２細胞におけるＬＣＴ遺伝子発現を評価することによって確認した。対照レベルと比較したＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現の有意な増加は、１ｍＭのＧＥＤ（５．７６±０．８９倍の変化；ｐ＜０．０００１；図１Ａ）、１μＭのＰｉｏ（１４．７７±１．３７倍の変化；ｐ＜０．０００１；図１Ｂ）、３０ｍＭのＧＥＤ（ｐ＝０．０００２；図１Ｃ）、および３０ｍＭの５−ＡＳＡ（ｐ＜０．０００１；図１Ｄ）への曝露後に観測された。
【０１５１】
ＰＰＡＲγ活性化因子であるＧＥＤのレベルの増加に応答する、Ｃａｃｏ−２細胞におけるＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現レベルの変化も分析した。用量応答分析によって、ＬＣＴ  ｍＲＮＡ遺伝子発現が、刺激しなかった細胞（ＣＴＲＬ）と比較して、０．１ｍＭ、１ｍＭおよび３０ｍＭのＧＥＤへの曝露（図２Ａ）、または０．１μＭ、１μＭもしくは１０μＭのＰｉｏへの曝露（図２Ｂ）後に増加したことが実証された。ＬＣＴ遺伝子発現の最大平均増加は、１ｍＭのＧＥＤおよび１μＭのＰｉｏへの曝露後に観測された（図２Ａおよび２Ｂ）。また、免疫沈降アッセイおよび免疫染色アッセイによって、ＰＰＡＲγ活性化因子が、Ｃａｃｏ−２細胞におけるＬＣＴタンパク質発現の増加を誘導したことが実証された（図３、ただしデータ示さず）。これらの結果は、アゴニスト化合物によるＰＰＡＲγの刺激によって、ＬＣＴ  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルが、有意に強力に増加したことを実証している。
【０１５２】
ＰＰＡＲγの刺激によってＬＣＴ活性が増加するかどうかを決定するために、Ｃａｃｏ−２細胞におけるＬＣＴ活性を、ＰＰＡＲγモジュレーターによる刺激後に測定した。ＬＣＴ活性を、ラクトースとともにＣａｃｏ−２細胞のインキュベーション後に、Ｃａｃｏ−２培養上清におけるグルコース生成率として測定した。１ｍＭのＧＥＤ（図４Ａ）または１μＭのＰｉｏ（図４Ｂ）によってＣａｃｏ−２細胞を刺激すると、処理しなかった細胞（ＣＴＲＬまたはＤＭＳＯ、それぞれ図４Ａおよび４Ｂ）と比較して、ＬＣＴ活性がそれぞれ３倍および２倍を超えて有意に増加した（図４Ａおよび４Ｂ）。ＬＣＴ活性を、１ｍＭのＧＥＤ、３０ｍＭのＧＥＤ、または３０ｍＭの５−ＡＳＡを用いてＣａｃｏ−２細胞を刺激した後にも評価した。ＬＣＴ活性の有意な増加が、対照細胞（ＣＴＲＬ）と比較して、１ｍＭまたは３０ｍＭのＧＥＤを用いる刺激後に観測されたが、３０ｍＭの５−ＡＳＡでは観測されなかった（図４Ｃ；ＣＴＲＬ対１ｍＭのＧＥＤ、ｐ＜０．００５；ＣＴＲＬ対３０ｍＭのＧＥＤ、ｐ＜０．００５）。これらの結果は、複数のＰＰＡＲγアゴニストを用いて腸上皮細胞株を刺激すると、ＬＣＴ活性が有意に増加したことを実証している。
【０１５３】
１ｍＭのＧＥＤまたは１μＭのＰｉｏによってＣａｃｏ−２細胞を刺激すると、ＬＣＴの発現および活性の増加が観測されたにもかかわらず、Ｃａｃｏ−２細胞のグルコースの取込みは有意に変化しなかった（図５）。二糖分解酵素であるスクラーゼ−イソマルターゼ（ＳＩＭ）およびマルターゼ−グルコアミラーゼ（ＭＧＡＭ）の発現レベルは、Ｃａｃｏ−２細胞におけるＬＣＴの発現レベルよりも低かったことが見出された。さらに、ＰＰＡＲγの刺激により、ＬＣＴ遺伝子発現は増加したが、ＰＰＡＲγの刺激後に、ＳＩＭまたはＭＧＡＭの発現の有意な増加は観測されなかった（図６Ｂおよび６Ｃ）。実際、ピオグリタゾンによる刺激は、ＳＩＭおよびＭＧＡＭ発現の両方の有意な低下を誘導した（図６Ｂおよび６Ｃ）。これらの実験は、観察されたＰＰＡＲγアゴニスト誘導グルコース生成の増加が、ＬＣＴ以外の二糖分解酵素の発現が増加した結果としては、またはＣａｃｏ−２細胞によるグルコース取込みが増加した結果としては、起こらなかったことを実証している。むしろこれらの結果は、グルコース生成の任意の増加が、ＰＰＡＲγアゴニストによる刺激後のＬＣＴ遺伝子発現の増加から生じたことを強く示唆している。
【０１５４】
ＰＰＡＲγアゴニストで刺激したＣａｃｏ−２細胞から得られたマイクロアレイデータの再現性を評価するために、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）研究およびマイクロアレイ研究から得られたデータの相関分析を実施した（図７）。この分析によって、マイクロアレイ（マイクロアレイ倍率）とｑＰＣＲ（刺激２倍率（Fold  Stimulation  2））データの間に有意な相関が存在することが確認された（ｒ＝０．７５４、ｐ＝０．００４６）。
【０１５５】
まとめると、これらのデータは、ＰＰＡＲγモジュレーターが、Ｃａｃｏ−２細胞においてＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現およびＬＣＴ活性を誘導することができたことを実証している。
【０１５６】
（実施例３：ラクターゼ遺伝子プロモーターの分析）
ヒトＬＣＴ遺伝子において特徴付けられた一塩基多型の中でも、Ｃ／Ｔ１３９１０およびＧ／Ａ２２０１８の２つの多型が、低ラクターゼ症と関連している。ホモ接合型ＣＣ１３９１０およびＧＧ２２０１８遺伝子型は、ラクターゼの非持続性表現型と関連している。興味深いことに、Ｃａｃｏ−２細胞の遺伝子型は、ＣＣ１３９１０およびＧＧ２２０１８であり、このことは、ＰＰＡＲγモジュレーターが、ラクターゼ非持続性個体においてＬＣＴ遺伝子発現を制御でき得ることを示唆している。
【０１５７】
この可能性を調査するために、ＬＣＴ遺伝子プロモーターを、ＰＰＡＲ応答エレメント（ＰＰＲＥ）配列の存在について分析した。ＰＰＡＲγは、別の核内受容体ＲＸＲとのヘテロ二量体として、ＤＮＡに結合することができる。ヘテロ二量体ＰＰＡＲγ−ＲＸＲは、ＰＰＲＥを定義付ける、１個のヌクレオチド（直列反復配列１（ＤＲ１）として公知である）または２個のヌクレオチド（直列反復配列２（ＤＲ２）として公知である）で間隔を空けた短い二量体回文配列（コンセンサス配列ＡＧＧＴＣＡまたはＴＧＡＣＣＴ）を認識する。ヒトＬＣＴ遺伝子の転写開始部位から上流にある３，０００塩基対のコンピューターによる分析を実施し、ＰＰＡＲγがＬＣＴ遺伝子発現を調節できるようにし得る、いくつかの潜在的なＤＲ１およびＤＲ２のＰＰＲＥ配列の存在が明らかになった（図８および図９）。
【０１５８】
クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を実施して、これらの推定上のＰＰＲＥ配列が、ＰＰＡＲγによって結合されるかどうかについて決定した。ＣｈＩＰ分析によって、ＬＣＴ遺伝子転写開始部位の上流−２２３ｂｐ〜−２１０ｂｐの間およびＬＣＴ遺伝子プロモーター内に位置しているＤＲ２が、１ｍＭのＧＥＤによる２４時間の刺激後に、Ｃａｃｏ−２細胞におけるＰＰＡＲγによって結合されたことが明らかになった（図１０）。ＰＰＡＲγが結合したゲノム配列の定量ＰＣＲ分析によって、１ｍＭのＧＥＤによる刺激後にこのＰＰＲＥに結合したＰＰＡＲγの量が、刺激しなかった細胞と比較して２倍多かったことが実証された（図１０）。
【０１５９】
このＰＰＡＲγが結合したＤＲ２配列を含有するゲノムフラグメントを、ルシフェラーゼ遺伝子配列の上流でｐＧＬ４ベクターにクローニングし（ｐＧＬ４Ｌｕｃ  Ｐｒｏｍ  ＬＣＴ構築物）、Ｃａｃｏ−２細胞においてレポーター遺伝子アッセイで試験した。ｐＧＬ４Ｌｕｃ  Ｐｒｏｍ  ＬＣＴ構築物をトランスフェクトされた細胞では、ルシフェラーゼ活性は、ＧＥＤによる刺激（ＧＥＤ）の存在下で、処理しなかった細胞（ＣＴＬ；図１１）と比較して有意に増加したが、このことは、ＧＥＤが、ＤＲ２配列へのＰＰＡＲγの結合を刺激し、ルシフェラーゼ発現増加を誘発したことを示している。このＤＲ２配列が欠如しているルシフェラーゼ構築物（ｐＧＬ４Ｌｕｃ）を安定にトランスフェクトされた細胞では、ＧＥＤによる刺激後に、ルシフェラーゼ活性に有意な変化が観測されなかった。これらの結果は、遺伝子プロモーターにこのＤＲ２が存在することにより、下流遺伝子カセット発現のＰＰＡＲγ媒介性の活性化が容易になったことを実証しており、このＤＲ２応答エレメントが、そのＬＣＴ遺伝子プロモーターにおいて機能的であることを示唆している。
【０１６０】
（実施例４：ＰＰＡＲγ標的遺伝子としてのラクターゼ遺伝子）
ＬＣＴ遺伝子発現の制御におけるＰＰＡＲγの役割および特異性をさらに確認するために、ＰＰＡＲ−γに対する低分子ヘアピン型アンチセンスＲＮＡを安定に発現するＣａｃｏ−２細胞株（ＳｈＰＰＡＲ）を構築して、ＰＰＡＲ−γ発現レベルの特異的ノックダウンをもたらした。ＳｈＰＰＡＲ細胞では、ＬＣＴ遺伝子転写（図１２、左）およびＬＣＴ活性（図１２、右）は共に、Ｃａｃｏ−２のＳｈＬｕｃ対照細胞と比較して、それぞれ６３％および３３％有意に低下した。これらの結果は、ＰＰＡＲγアゴニストへの曝露によって誘導されたＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現およびＬＣＴ活性が、ＰＰＡＲγ発現に依存していたことを実証している。
【０１６１】
ＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現を誘導するＧＥＤの能力を、ＰＰＡＲ−γアンタゴニストであるＧＷ９６６２の存在下で分析した。ＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現の増加を誘導するＧＥＤの能力は、ＧＷ９６６２の存在下で著しく低下した（図１３）。この結果は、ＰＰＡＲγアゴニストへの曝露によって誘導されたＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現およびＬＣＴ活性が、ＰＰＡＲγ活性に依存していたことを実証している。
【０１６２】
ＬＣＴ  ｍＲＮＡの発現を、対照マウス（ＣＴＲＬマウス）およびＩＥＣにＰＰＡＲγの特異的欠失を呈するマウス（ＰＰＡＲγΔＩＥＣＫＯマウス；図１４）の近位小腸において分析した。ＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現は、ＣＴＲＬ動物と比較して、ＰＰＡＲγΔＩＥＣＫＯマウスの小腸の近位部において有意に低下した（図１４）。この結果は、近位小腸におけるＬＣＴの発現が、ＰＰＡＲγ発現に依存していたことを実証している。
【０１６３】
ＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現およびＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡ発現は、離乳していない野生型Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの十二指腸および空腸において、それらの離乳した対応物と比較して有意に増加した（図１５Ａ）。ＰＰＡＲγとＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現の増加も、離乳していないラットの十二指腸および空腸において有意に相関していた（図１５Ｂおよび１５Ｃ）。これらの結果は、ＰＰＡＲγとＬＣＴの発現の増加が、離乳していないラットの近位腸において有意に相関していたことを実証している。
【０１６４】
ＧＥＤに６時間曝露すると、ヒト十二指腸生検の短期間培養物において、やはりラクターゼの発現および活性の有意な増加が誘導された（図１６、ただしデータ示さず）。この結果は、ＰＰＡＲγアゴニストへの曝露が、ヒト十二指腸組織におけるＬＣＴ発現の有意な増加を刺激したことを実証している。
【０１６５】
まとめると、これらの結果は、ＰＰＡＲγが、ＬＣＴ遺伝子発現を制御する非常に重要な因子であることを実証している。
【０１６６】
ＬＣＴ遺伝子発現の制御への別のＰＰＡＲ受容体の潜在的な関与も評価した。特異的ＰＰＡＲαモジュレーターであるフェノフィブレートは、Ｃａｃｏ−２細胞におけるＬＣＴ活性またはＬＣＴ遺伝子転写を誘導し、増加させることができなかった（図１７）。さらに、ＰＰＡＲα発現は、ＳｈＰＰＡＲγ細胞株において、またはＰＰＡＲγΔＩＥＣマウスのＩＥＣにおいて修飾されなかったが（データ示さず）、このことは、ＰＰＡＲαがＬＣＴ発現を調節する役割を果たさないことを示している。これらの結果は、ＰＰＡＲαの発現および活性化の増加が、複数の実験パラダイムにおいてＬＣＴ遺伝子の発現および活性の増加に寄与しなかったことを実証している。
【０１６７】
ＰＰＡＲγとＬＣＴの関係をｉｎ  ｖｉｖｏでさらに探索するために、ＰＰＡＲγモジュレーターによるＬＣＴ遺伝子発現の潜在的な誘導を、げっ歯類において評価した。簡潔には、３０ｍｇ／ｋｇのＧＥＤを、離乳したＣ５７ＢＬ／６マウスおよびＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに強制飼養によって毎日、７日間投与し、ＬＣＴ活性およびｍＲＮＡレベルの両方を、小腸の近位部で測定した。ＧＥＤは、両方の種においてＬＣＴの発現および活性を有意に増加させた（図１８Ａ）。これらの結果によって、ＧＥＤによる処置がラクトース不耐性と関連する症状を改善できるかどうかの試験に至った。この目的では、ＬＣＴ発現が欠如しているために自然にＬＣＴ非持続性になっている離乳したラットに、ラクトース富化食（総食餌重量の１５％または６０％）を与えた。等カロリーのラクトース不含食を受けた対照動物と比較して、ラクトース群のラットは、体重が低下し、軟便および下痢を起こした。ラクトース富化食を与えた動物にＧＥＤを強制飼養させた後、糞便軟度は、４０％を超えて急速に改善された（図１８Ｂ）。ラットを４日目に屠殺し、ＧＥＤで処置したラットは、処置しなかったラットと比較して盲腸体積の有意な低下を呈した（データ示さず）と共に、ラクトース発酵の盲腸の（ceacal）最終生成物に相当する短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）の濃度が有意に低下していた（図１８Ｃ）。これらの結果は、ＰＰＡＲγアゴニストへの曝露が、マウスおよびラットにおけるＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現およびＬＣＴ活性の増加を刺激したこと、ならびにＰＰＡＲγアゴニストへの曝露が、ラクトース富化食と関連する症状を改善したことを実証している。したがって、ＧＥＤで処置したラットで得られた糞便軟度が４０％〜５０％改善されたことは、ＰＰＡＲγ活性のモジュレートが、ヒトのラクトース耐性の改善と臨床的に関連し得ることを明らかに示唆している。
【０１６８】
（実施例５：ＣＬＡは腸上皮細胞株におけるラクターゼ遺伝子の発現および活性を誘導する）
ＬＣＴの発現および活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導する、自然のＰＰＡＲγモジュレーターであるトランス−１０，シス−１２共役リノール酸（ＣＬＡ）異性体の能力を調査した。リノレン酸およびいくつかの他の天然に存在するＰＰＡＲγアゴニストの構造は、図１９Ａに提示されている。ＣＬＡ（１ｍＭ）は、１ｍＭのＧＥＤと同じく効率的に、Ｃａｃｏ−２細胞におけるＬＣＴ遺伝子発現を誘導した（図１９Ｂ；例えば、１ｍＭのＧＥＤを１ｍＭのＣＬＡと比較されたい）。ＣＬＡはまた、１００ｍＭまたはそれを超える濃度で、Ｃａｃｏ−２細胞におけるＬＣＴ活性を有意に増加させ、１ｍＭのＣＬＡは、対照レベルを超えて、１ｍＭのＧＥＤと比較して２倍を超えるＬＣＴ活性の増加を誘導した（図１９Ｃ）。ＬＣＴの発現および活性のＣＬＡ依存性誘導は、ＰＰＡＲγノックダウン細胞において強力に損なわれた（図２０Ａおよび２０Ｂ）。これらの結果は、自然のＰＰＡＲγアゴニストが、腸上皮細胞株におけるＬＣＴの発現および活性を誘導することができること、ならびに観測されたＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現およびＬＣＴ活性の増加が、ＰＰＡＲγ発現に依存していたことを実証している。またこれらの結果は、食物に天然に存在するＰＰＡＲγモジュレーターが、ラクトース不耐性を管理するのに有望となり得ることを強く示唆している。
【０１６９】
（実施例６：ＣＬＡはラクターゼ遺伝子の発現および活性をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導する）
ＣＬＡがＬＣＴの発現および活性をｉｎ  ｖｉｖｏで誘導するかどうかを決定するために、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに対照食を与え、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ；０．５％）、ＣＬＡ、またはＧＥＤのいずれかを５日間投与し、その後、ＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡ、ＬＣＴ  ｍＲＮＡ、およびＬＣＴ活性のレベルを測定した。ＣＬＡは、２００ｍｇ／ｋｇ／日で経口強制飼養によって投与し、ＧＥＤは、３０ｍｇ／ｋｇ／日で経口強制飼養によって投与した（図２１Ａ）。
【０１７０】
ＧＥＤおよびＣＬＡの両方の投与によって、十二指腸組織におけるＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現が、ＣＭＣを補充した対照食を与えた動物において観測されたレベルと比較して有意に増加した（図２１Ｂ）。ＣＭＣを補充した対照食を与えた動物において観測されたレベルと比較して、ＣＬＡではなくＧＥＤの投与後に、空腸組織におけるＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現の有意な増加が観測された（図２１Ｃ）。ＣＬＡ投与は、ＣＭＣを補充した対照食を与えた動物において観測されたレベルと比較して、空腸および十二指腸の両方におけるＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡ発現レベルの有意な増加を誘導した（図２１Ｄおよび２１Ｅ）。さらに、ＣＭＣまたはＣＬＡを与えた動物の十二指腸におけるＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現レベルとＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡ発現レベルの誘導の間に、有意な相関が観測された（図２２Ａおよび２２Ｂ）。ＣＭＣまたはＣＬＡを与えた動物の空腸におけるＬＣＴ  ｍＲＮＡ発現レベルとＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡ発現レベルの誘導の間に、有意な相関は観測されなかった（図２２Ａおよび２２Ｂ）。これらの結果は、ＣＬＡをラットに５日間経口投与すると、十二指腸組織におけるＬＣＴ  ｍＲＮＡのレベルおよびＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡのレベルが有意に増加し、空腸組織ではＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡレベルが有意に増加したことを実証している。
【０１７１】
ＣＬＡの経口投与から生じるＬＣＴ活性レベルも分析した。ＧＥＤおよびＣＬＡの両方の経口投与によって、５日後に、ＣＭＣを補充した対照食を与えた動物におけるＬＣＴ活性レベルと比較して、十二指腸組織におけるＬＣＴ活性が有意に増加した（図２２Ｅ）。またＧＥＤの経口投与によって、ＣＭＣを補充した対照食を与えた動物におけるＬＣＴ活性レベルと比較して、空腸組織におけるＬＣＴ活性が有意に増加した（図２２Ｆ）。
【０１７２】
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって共通に理解される意味と同じ意味を有する。
【０１７３】
本記載を通して、組成物およびキットが特別な構成成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）ものとして記載される場合、またはプロセスおよび方法が特別なステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）ものとして記載される場合、さらに、列挙されている構成成分から本質的になるもしくはそれからなる本発明の組成物およびキットが存在すること、ならびに列挙されている処理ステップから本質的になるもしくはそれからなる本発明によるプロセスおよび方法が存在することが企図される。
【０１７４】
本願では、要素または構成成分が、列挙されている要素もしくは構成成分の一覧に含まれ、かつ／またはその一覧から選択されると言われる場合、その要素もしくは構成成分は、列挙されている要素もしくは構成成分のいずれか１つであってよく、またはその要素もしくは構成成分は、列挙されている要素もしくは構成成分の２つもしくはそれよりも多くからなる群から選択され得ることを理解されたい。
【０１７５】
さらに、本明細書に記載される組成物または方法の要素および／または特徴は、本明細書において明示的であろうと暗示的であろうと、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々なやり方で組み合わせられ得ることを理解されたい。例えば、特定の化合物が言及されている場合、その化合物は、文脈によって別段の理解がされない限り、本発明の組成物の様々な実施形態および／または本発明の方法において使用され得る。換言すれば、本願における実施形態は、明瞭かつ簡潔な適用を記載し、図示できるように記載され、図示されているが、実施形態は、本発明の教示および本発明から逸脱することなく、様々に組み合わせられ、または分離され得ることが企図され、そのように理解されよう。例えば、本明細書に記載され、図示されているあらゆる特徴は、本明細書に記載され、図示されている本発明のあらゆる態様に適用できることを理解されよう。
【０１７６】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本開示では、文脈が不適切でない限り、冠詞の文法的目的語の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「１つの要素（an  element）」は、１つの要素または１つより多くの要素を意味する。
【０１７７】
「および／または」という用語は、本開示では、別段の指定がない限り「および」あるいは「または」のいずれかを意味するために使用される。
【０１７８】
「〜のうちの少なくとも１つ（at  least  one  of）」という表現は、文脈および使用から別段理解されない限り、この表現に後続する列挙されている目的語のそれぞれ、および列挙されている目的語の２つまたはそれよりも多くの様々な組合せを個々に含むと理解されたい。３つまたはそれよりも多く列挙されている目的語に関する「および／または」という表現は、文脈から別段理解されない限り、同じ意味を有すると理解されたい。
【０１７９】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語の使用は、それらの文法的均等物を含めて、別段具体的に記載されていない限り、または文脈から理解されない限り、一般に無制限かつ非限定的であり、例えば列挙されていない追加の要素またはステップを除外しないと理解されたい。
【０１８０】
「約」という用語の使用が定量値の前にある場合、本開示はまた、別段具体的に記載されない限り、その特定の定量値自体を含む。
【０１８１】
例えば、ポリマーの分子量が提供されており、絶対値でない場合、その分子量は、別段指定されない限り、または文脈から理解されない限り、平均分子量であると理解されたい。
【０１８２】
ステップの順序またはある特定の動作を実施する順序は、本発明が依然として操作可能な限り重要でないことを理解されたい。さらに、２つまたはそれよりも多くのステップまたは動作は、同時に実施され得る。
【０１８３】
本明細書の様々な箇所で、置換基が、群または範囲により開示される。具体的には、その説明は、このような群および範囲のメンバーのそれぞれおよびすべての個々の副組み合わせを含むことが企図される。例えば、「Ｃ１〜６アルキル」という用語は、具体的には、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ１〜Ｃ６、Ｃ１〜Ｃ５、Ｃ１〜Ｃ４、Ｃ１〜Ｃ３、Ｃ１〜Ｃ２、Ｃ２〜Ｃ６、Ｃ２〜Ｃ５、Ｃ２〜Ｃ４、Ｃ２〜Ｃ３、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ３〜Ｃ５、Ｃ３〜Ｃ４、Ｃ４〜Ｃ６、Ｃ４〜Ｃ５、およびＣ５〜Ｃ６アルキルを個々に開示することが企図される。他の例では、０〜４０の範囲の整数は、具体的には、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、および４０を個々に開示することが企図され、１〜２０の範囲の整数は、具体的には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、および２０を個々に開示することが企図される。さらなる例として、「任意選択で１〜５個の置換基で置換されている」という句は、具体的には、０個、１個、２個、３個、４個、５個、０〜５個、０〜４個、０〜３個、０〜２個、０〜１個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、２〜５個、２〜４個、２〜３個、３〜５個、３〜４個、および４〜５個の置換基を含み得る化学基を個々に開示することが企図されることが挙げられる。
【０１８４】
本明細書における任意のすべての例、または例示的用語、例えば「など（such  as）」または「を含む（including）」の使用は、別段特許請求されていない限り、単に本発明をより良く例示し、本発明の範囲を制限しないことが企図される。本明細書におけるいかなる用語も、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施にとって必須であることを示すものと解釈されるべきではない。
【０１８５】
一般的事柄として、百分率が特定されている組成物は、別段の指定がない限り重量によるものである。さらに、ある変数にある定義が伴っていない場合、その変数の以前の定義が優先する。
【０１８６】
参考文献の援用
本明細書で言及されるあらゆる科学論文、刊行物、および特許文献は、あたかもそれぞれ個々の刊行物または特許が、参照によって具体的に個々に組み込まれるかのように、あらゆる目的でその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。矛盾が生じる場合、本明細書の任意の定義を含む本願が優先する。
【０１８７】
均等物
本発明の具体的な実施形態を論じてきたが、上記の明細書は、例示的なものであり、限定的ではない。本発明の多くの変更形態が、本明細書を見直すことにより当業者に明らかとなろう。本発明の完全な範囲は、特許請求の範囲を、それらの均等物の全範囲と共に参照し、本明細書を、このような変更形態と共に参照することによって決定されるべきである。
【０１８８】
別段指定されない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される成分の量、反応条件等を表すあらゆる数値は、あらゆる場合において、「約」という用語によって修飾されると理解されたい。したがって、そうでないと示されない限り、本明細書および添付の特許請求に記載される数値パラメータは、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて変わり得る近似値である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２２Ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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