(57)【要約】本発明は、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ、Ｌｉｎｅｐｉｔｈｅｍａ、Ｔａｐｉｎｏｍａ、Ｔｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ、及びＭｏｎｏｍｏｒｉｕｍ種を含むアリ種の増殖を制御するのに好適なＲＮＡを生成するための組み換え配列及び方法を記載する。本明細書に記載される本発明は、ＶＬＰの特有の特性（あるいはＡＰＳＥ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒまたは「ＡＲＣ」としても知られる）を使用して、好ましくは昆虫宿主における、より好ましくはアリにおける標的遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉ前駆体を生成し、送達するための改善された系を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的昆虫を制御するための方法であって、バクテリオファージカプシドタンパク質をコードする遺伝子を含む第１のＤＮＡ配列、及びＲＮＡｉ前駆体配列に結合した少なくとも１つのバクテリオファージｐａｃ配列を含むＲＮＡ転写物をコードする第２のＤＮＡ配列で、微生物宿主を形質転換することと、前記微生物宿主の前記第１及び第２のＤＮＡ配列の発現を誘導することと、前記微生物宿主からＲＮＡｉ前駆体、または前記カプシドタンパク質及びＲＮＡｉ前駆体を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）を単離することと、前記単離されたＲＮＡｉ前駆体またはＶＬＰを前記標的昆虫と接触させることと、を含む、方法。
【請求項２】
前記バクテリオファージカプシドタンパク質が、レビウイルスに由来する、請求項１に記載の第１のＤＮＡ配列。
【請求項３】
前記レビウイルスが、Ｑβである、請求項２に記載の第１のＤＮＡ配列。
【請求項４】
前記レビウイルスが、ＭＳ２である、請求項２に記載の第１のＤＮＡ配列。
【請求項５】
前記ＲＮＡｉ前駆体配列が、配列番号２〜４及び１１〜５３を含む群から選択される配列と相同である配列を含む、請求項１に記載の第２のＤＮＡ配列。
【請求項６】
前記ＤＮＡ配列が、ヘアピンｓｉＲＮＡを含むＲＮＡｉ前駆体をコードする、請求項１に記載の第２のＤＮＡ配列。
【請求項７】
前記ＤＮＡが、アンチセンスＲＮＡを含むＲＮＡｉ前駆体をコードする、請求項１に記載の第２のＤＮＡ配列。
【請求項８】
前記第１のＤＮＡ配列及び第２のＤＮＡ配列が、別個のエピソーム上にある、請求項１に記載の微生物宿主。
【請求項９】
前記第１のＤＮＡ配列及び前記第２のＤＮＡ配列が、同一のエピソーム上にある、請求項１に記載の微生物宿主。
【請求項１０】
前記第１のＤＮＡ配列及び前記第２のＤＮＡ配列のうちの１つが、前記細菌宿主染色体内に組み込まれる、請求項１に記載の微生物宿主。
【請求項１１】
前記第１のＤＮＡ配列及び前記第２のＤＮＡ配列の両方が、前記細菌宿主染色体内に組み込まれる、請求項１に記載の微生物宿主。
【請求項１２】
前記微生物宿主が、細菌である、請求項１に記載の微生物宿主。
【請求項１３】
前記細菌が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉである、請求項１１に記載の細菌。
【請求項１４】
前記微生物宿主が、酵母である、請求項１に記載の微生物宿主。
【請求項１５】
前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１３に記載の酵母。
【請求項１６】
前記標的昆虫が、アリである、請求項１に記載の標的昆虫を制御する方法。
【請求項１７】
前記標的昆虫が、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ種を含む、請求項１に記載の標的昆虫を制御する方法。
【請求項１８】
前記標的昆虫が、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓを含む、請求項１に記載の標的昆虫を制御する方法。
【請求項１９】
前記標的昆虫が、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓを含む、請求項１に記載の標的昆虫を制御する方法。
【請求項２０】
前記標的昆虫が、Ｌｉｎｅｐｉｔｈｅｍａ  ｈｕｍｉｌｅを含む、請求項１に記載の標的昆虫を制御する方法。
【請求項２１】
前記標的昆虫が、Ｔａｐｉｎｏｍａ  ｓｅｓｓｉｌｅを含む、請求項１に記載の標的昆虫を制御する方法。
【請求項２２】
前記標的昆虫が、Ｔｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ  ｃａｅｓｐｉｔｕｍを含む、請求項１に記載の標的昆虫を制御する方法。
【請求項２３】
前記標的昆虫が、Ｍｏｎｏｍｏｒｉｕｍ  ｐｈａｒａｏｎｉｓを含む、請求項１に記載の標的昆虫を制御する方法。
【請求項２４】
前記標的昆虫が、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ種を含む、請求項１に記載の標的昆虫を制御する方法。
【請求項２５】
前記標的昆虫が、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａを含む、請求項１に記載の標的昆虫を制御する方法。
【請求項２６】
異種カーゴ分子を含むＶＬＰであって、前記異種カーゴ分子が、ＲＮＡｉ前駆体を含む、ＶＬＰ。
【請求項２７】
異種カーゴ分子を含むＶＬＰであって、前記異種カーゴ分子が、アンチセンスＲＮＡを含む、ＶＬＰ。
【請求項２８】
前記ＲＮＡｉ前駆体が、センス鎖配列、その後の非相同ループ配列、その後の前記センス鎖配列と相同であるアンチセンス配列、ならびにバクテリオファージパッケージング配列を更に含む、請求項２６に記載のＶＬＰ。
【請求項２９】
前記ＲＮＡｉ前駆体の前記センス鎖配列が、配列番号２〜４及び１１〜５３からなる群から選択される、請求項２８に記載のＶＬＰ。
【請求項３０】
前記アンチセンスＲＮＡが、バクテリオファージパッケージング配列を更に含む、請求項２７に記載のＶＬＰ。
【請求項３１】
前記アンチセンスＲＮＡの前記配列が、配列番号２〜４及び１１〜５３からなる群から選択される配列と相同である、請求項３０に記載のＶＬＰ。
【請求項３２】
ＲＮＡを含む組成物であって、前記ＲＮＡが、バクテリオファージパッケージング配列に共有結合した配列番号２〜４及び１１〜５３からなる群から選択される配列で更に構成される、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年２月２日出願の米国特許仮出願第６２／２９０，３１８号及び２０１６年９月２１日出願の米国特許仮出願第６２／３９７，７９０号の利益を主張する。
【０００２】
配列表の組み込み
２０１７年１月３１日作製かつ５２ＫＢのサイズの「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ａｎｔｓ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題するテキストファイルとして、配列表がこれに添えて提供される。このテキストファイルの内容の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、一般にはアリ、ならびに具体的にはＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ（アカヒアリ）、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓ及びＣａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ（オオアリ）、Ｌｉｎｅｐｉｔｈｅｍａ  ｈｕｍｉｌｅ（アルゼンチンアリ）、Ｔａｐｉｎｏｍａ  ｓｅｓｓｉｌｅ（コヌカアリ）、Ｔｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ  ｃａｅｓｐｉｔｕｍ（トビイロシワアリ）、及びＭｏｎｏｍｏｒｉｕｍ  ｐｈａｒａｏｎｉｓ（イエヒメアリ）を制御する方法としての、ＲＮＡ媒介遺伝子抑制のための方法及び組成物を含む。本方法及び組成物は、関連する昆虫、植物、または動物種に対する随伴的な影響なく、そのようなアリの増殖を制御する上で用途を有する。
【背景技術】
【０００４】
線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて最初に記載されたＲＮＡ媒介遺伝子抑制（ＲＮＡｉ）は、多くの他の生物において遺伝子発現を調節するための有効な方法であることが示されている（Ｆｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ３９１：８０６（１９９８））。いくつかの研究グループによって、作物に影響を与える昆虫の増殖を制御する上でのＲＮＡｉの実現可能性が、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を使用して実証されている（Ｉｖａｓｈｕｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  ｈｅｒｂｉｖｏｒｏｕｓ  ｉｎｓｅｃｔｓ．ＲＮＡ２１：８４０（２０１５）に概説）。先行技術において記載されている、ＲＮＡｉ目的で使用される組み換えＲＮＡ構築物は一般に、約１８〜約２５塩基対のｄｓＲＮＡからなるが、通常約１００〜約１，０００塩基対（ｂｐ）のより長いｄｓＲＮＡもまた含む。昆虫へのｄｓＲＮＡの導入を成功させるためには、昆虫の食事に供給される場合、効率的な取り込みのために約６０ｂｐ以上のｄｓＲＮＡが必要とされる（Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｈａｎｇｅｓ  Ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｓｎｆ７  ＲＮＡｉ  ｉｎ  Ｌａｒｖａｌ  Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅｓ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｃｏｒｎ  Ｒｏｏｔｗｏｒｍ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  Ｌｅ  Ｃｏｎｔｅ）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ７：ｅ４７５３４（２０１２））。長いｄｓＲＮＡ分子は、宿主ダイサー酵素複合体によって、インビボで多様なｓｉＲＮＡの集合へと切断される。あるいは、ＲＮＡｉ遺伝子抑制はまた、関連するプロセスを介した、特定の配列に指向されたアンチセンスＲＮＡの作用を通しても生じることができる。現場で昆虫を制御するためのＲＮＡｉ方法の実用的な適用は、インビトロＲＮＡ合成の費用ならびに環境分解及び酵素分解に対するＲＮＡの化学的脆弱性によって限定されている。
【０００５】
毒素及び造影剤のバクテリオファージＭＳ２カプシド媒介送達は、そのような薬剤をインビトロで真核細胞に送達するための有効な方法であることが示されている（Ａｓｈｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｃａｒｇｏｓ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＭＳ２ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．ＡＣＳ  ｎａｎｏ５：５７２９（２０１１））。そのようなバクテリオファージカプシドが、現場でＲＮＡｉ前駆体を昆虫に送達するために類似した機能を果たし得るかどうかは、未知である。標的昆虫へのＲＮＡｉ前駆体の有効な送達は、非特異的ＲＮＡ分解の予防、容易な投与経路、及びＲＮＡｉ前駆体が昆虫細胞によって取り込まれ、適切に処理され得るように、標的昆虫内の適切な点でＲＮＡｉ前駆体を放出する能力を必要とする。理想的には、ＲＮＡｉ前駆体及び送達系は、生成及び分布が経済的かつ比較的単純でなくてはならない。本明細書に記載される本発明は、これら全ての基準を満たし、新たなＲＮＡｉ分子の急速な発見、プロトタイピング、及び商業的規模の生成を可能にする追加の利益を有する。
Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ種は、直接注入（Ｌｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｏｃｙｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｉｎｃｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｑｕｅｅｎ  ｆｌｙｉｎｇ  ａｇｅ，ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡｉ  ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ｅｇｇ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｉｒｅ  ａｎｔ  ｖｉｒｇｉｎ  ｑｕｅｅｎｓ．ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ２７６  ３１１０（２００９））によって、またはＲＮＡｉ前駆体で処理した餌材料での給餌（Ｍ．−Ｙ．Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｉｍｐａｃｔｓ  ｏｆ  ＰＢＡＮ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｔ，Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ，ａｎｄ  ａ  ｍｏｔｈ，Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ５８：１１５９（２０１２）のいずれかによって導入されたＲＮＡｉに対して感受性であることが知られている。しかしながら、ネイキッドＲＮＡの現場適用は一般に、環境特異的分解及び非特異的分解に対するＲＮＡの感受性ために、非実用的である。更に、ＲＮＡは、給餌経過及び昆虫の腸通過中の分解に対して高度に感受性である。両方の問題は、アンチセンスＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡｉ前駆体について特に当てはまる。高度に安定した形態のＶＬＰは、インビトロでＶＬＰ由来のＲＮＡを保護する役割を果たすが、ＶＬＰがアンチセンスＲＮＡ及びＲＮＡｉ前駆体の送達系としての役割を果たす能力は、未知である。追加の疑問点としては、ＲＮＡｉはＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ種以外のアリ種の成長またはコロニー形成の阻害に有効であるか？標的化ＲＮＡｉ組成物はアリ種を識別することができるか？１つのＲＮＡｉ組成物が他のアリ種を温存しながらＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ種を標的とし得、別のＲＮＡｉ組成物が他のアリ種を温存しながらＣａｍｐｏｎｏｔｕｓ種を標的とし得るように、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ組成物を組み合わせることは可能であるか？ＶＬＰは、一般的にはアリ、ならびに具体的にはＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ及びＣａｍｐｏｎｏｔｕｓ種のＲＮＡｉ処理経路（ダイサーなど）にＲＮＡｉ前駆体を効果的に送達することができるか？ＶＬＰは、昆虫の消化管内のアンチセンスＲＮＡを保護し、依然としてインタクトなアンチセンスＲＮＡを標的昆虫の細胞へと送達することができるか？ネイキッドＲＮＡｉ前駆体は、標的アリ種による直接摂取を可能にするために効果的に製剤化することができるか？が挙げられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｂｙ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ３９１：８０６（１９９８）
【非特許文献２】Ｉｖａｓｈｕｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  ｈｅｒｂｉｖｏｒｏｕｓ  ｉｎｓｅｃｔｓ．ＲＮＡ２１：８４０（２０１５）
【非特許文献３】Ｂｏｌｏｇｎｅｓｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｃｈａｎｇｅｓ  Ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｓｎｆ７  ＲＮＡｉ  ｉｎ  Ｌａｒｖａｌ  Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅｓ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｃｏｒｎ  Ｒｏｏｔｗｏｒｍ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ  Ｌｅ  Ｃｏｎｔｅ）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ７：ｅ４７５３４（２０１２）
【非特許文献４】Ａｓｈｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｃａｒｇｏｓ  ｂｙ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＭＳ２ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ．ＡＣＳ  ｎａｎｏ５：５７２９（２０１１）
【非特許文献５】Ｌｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｏｃｙｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｏｉｎｃｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｑｕｅｅｎ  ｆｌｙｉｎｇ  ａｇｅ，ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡｉ  ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ｅｇｇ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｆｉｒｅ  ａｎｔ  ｖｉｒｇｉｎ  ｑｕｅｅｎｓ．ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ２７６  ３１１０（２００９）
【非特許文献６】Ｍ．−Ｙ．Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｉｍｐａｃｔｓ  ｏｆ  ＰＢＡＮ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ａｎ  ａｎｔ，Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ，ａｎｄ  ａ  ｍｏｔｈ，Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ５８：１１５９（２０１２）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
バクテリオファージカプシド（ＶＬＰ）内のＲＮＡを生成、パッケージング、及び／または精製する方法は、公開米国特許出願第２０１３／０１６７２６７号、同第２０１４／０３０２５９３号、及び米国特許第９，１８１，５３１号（各々の内容が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本明細書に記載される本発明は、ＶＬＰの特有の特性（あるいはＡＰＳＥ  ＲＮＡ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒまたは「ＡＲＣ」としても知られる）を使用して、好ましくは昆虫宿主における、より好ましくはアリにおける標的遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉ前駆体を生成し、送達するための改善された系を提供する。ＲＮＡｉにとって好ましい形態のｄｓＲＮＡは、相同反復配列をアニーリングして、宿主ダイサー及びダイサー様酵素によるｄｓＲＮＡ領域の適切な処理を可能にすることにより、ｄｓＲＮＡ形態が生成されるように、非相同ループ配列によって分離された、標的とされる宿主配列の逆方向反復を含む単一転写ＲＮＡとして生成されるヘアピンｓｉＲＮＡである。特に対象となる標的生物は、一般にアカヒアリとして知られるＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ、ならびに一般にオオアリとして知られるＣａｍｐｏｎｏｔｕｓ種ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓ及びｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ、一般にアルゼンチンアリとして知られるＬｉｎｅｐｉｔｈｅｍａ  ｈｕｍｉｌｅ、一般にイエヒメアリとして知られるＭｏｎｏｍｏｒｉｕｍ  ｐｈａｒａｏｎｉｓ、ならびにイエアリ（一般にコヌカアリとして知られるＴａｐｉｎｏｍａ  ｓｅｓｓｉｌｅ及び一般にトビイロシワアリとして知られるＴｅｔｒａｍｏｒｉｕｍ  ｃａｅｓｐｉｔｕｍなど）である。対象となる標的遺伝子は、個々のアリまたは総体でアリのコロニーの生存に必要とされる重要な生理的機能をコードする。アカヒアリ、オオアリ、アルゼンチンアリ、イエヒメアリ、及び様々なイエアリは、経済的及び生態学的損害の主要な原因となるため、これらのアリを制御するＲＮＡｉ方法が、特に所望される。
【０００８】
本明細書に記載される方法によってＲＮＡｉ前駆体を生成する重要な利点は、ＲＮＡ前駆体の高価かつ複雑なインビトロ合成が避けられ、単純かつ経済的な発酵方法によって所望されるＲＮＡ構築物が生成され得ることである。大量のＲＮＡｉ前駆体の生成及び精製は、所望されるポリヌクレオチドの合成を、自己組み立て型バクテリオファージカプシドタンパク質（バクテリオファージＱβまたはＭＳ２のものなど）の発現と任意で組み合わせて、所望されるポリヌクレオチドを含有する、容易に精製され、かつ比較的安定したＡＲＣ（ＶＬＰ）を生成することによって促進され、これは、標的とする害虫が摂食する植物の表面に、例えば噴霧することによって直接適用することができる。あるいは、カプシド化一本鎖ＲＮＡを安定的かつ大量に生成し、他のカプシド化一本鎖ＲＮＡとブレンドして、所望されるモル比の各鎖を生成し、ウイルスカプシドコートタンパク質を除去し、ＲＮＡの一本鎖を所望される二本鎖ＲＮＡ生成物へとアニーリングすることによって個々のＲＮＡ鎖を単離してもよい。更に、カプシド化一本鎖ＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡの供給源としての役割を果たし得る。
【０００９】
摂取されると、ＡＲＣは昆虫宿主の腸通過の経過中に消化され、ＲＮＡ分子は腸を覆う細胞によって吸収され得る。場合によっては、非カプシド化二本鎖ＲＮＡはまた、分解されずに昆虫宿主の腸を通過し、腸を覆う細胞によっても吸収され得る。しかしながら、ＡＲＣ内にパッケージングされていない限り、全ての種のＲＮＡ、特に一本鎖ＲＮＡが著しい分解を避けられる可能性は低い。標的昆虫細胞内では、ＲＮＡｉ前駆体は、他のものの中でも特に宿主ダイサー酵素複合体によって処理されて、重要な宿主遺伝子の発現を抑制するための宿主遺伝子転写物を標的とする有効なＲＮＡｉ形態が生成される。そのような必須遺伝子の例としては、非限定的に、脱皮または他の幼生発生事象の制御に関与する遺伝子、アクチンまたは他の細胞構造構成成分、及び複製、転写、または翻訳、または生存に必要とされる他の基本的プロセスに関連する実質的にあらゆる遺伝子が挙げられる。更に、コロニー統合性を維持するのに必要であるが、コロニーの個々の構成員にとって必ずしも致命的ではない遺伝子もまた、重要なものと見なすことができ、アリ個体数の長期的な制御のための魅力的な標的となる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、転写されたときに、ＲＮＡｉ前駆体及びバクテリオファージコートタンパク質へと翻訳されるｍＲＮＡを生成するＤＮＡ配列を含み、これらはともに、特有に安定したＶＬＰへと組み立てられるか、または単離されたＲＮＡを生成するために処理されてもよい。ＶＬＰ及び／またはＲＮＡは、摂食昆虫による摂取に好適な形態に精製されてもよい。標的昆虫によって摂取されると、ＶＬＰ及びＲＮＡは腸を通過し、その後に昆虫細胞へと同化され、そこで、ＲＮＡｉ前駆体が昆虫の生存にとって重要な標的遺伝子発現を抑制するＲＮＡｉの形態へと処理される。いくつかの実施形態において、そのような標的遺伝子の抑制は、標的昆虫の死をもたらすように設計される。別の実施形態において、標的遺伝子の抑制は、繁殖不能な子孫をもたらすように設計される。他の実施形態において、標的遺伝子の抑制は、コロニーの崩壊をもたらす。これらの実施形態の各々は、所望される結果をもたらすように、単独で使用しても、組み合わせて使用してもよい。ＶＬＰの重要な特徴は、それらが、非特異的な環境作因による分解または昆虫標的細胞リボヌクレアーゼ酵素からカプシド化ＲＮＡｉ前駆体を保護するのに十分に安定していながら、それらが摂取された後も標的昆虫細胞内のＲＮＡｉ経路へのＲＮＡｉ前駆体の導入が依然として可能なままであることである。
【００１１】
本明細書に提示される例示的なＤＮＡ配列は、ＡｓｉＳＩ−ＮｏｔＩ制限フラグメントとして好適な細菌プラスミドベクターに連結されるように設計される。そのようなＤＮＡ配列は、直接合成によって、または当業者にとって周知の技術を使用した構成物フラグメントのサブクローニングによって生成することができる。所望されるされる場合、配列は、特定の制限酵素部位を操作し、代替的なバクテリオファージｐａｃ配列を組み込むように修飾されてもよい。コードされたアンチセンスＲＮＡ及びＲＮＡｉ配列の特異性は、異なる遺伝子及び昆虫宿主を標的とするように修飾されてもよい。これらのＤＮＡ配列を誘導的に転写することができる転写プロモーターを含有する細菌プラスミドベクターとしては、非限定的に、バクテリオファージＴ７遺伝子１プロモーター、バクテリオファージＴ５プロモーター、ならびにバクテリオファージラムダＰＬ及びＰＲプロモーターが挙げられる。ｐＢＲ３２２などの細菌プラスミドベクター、ｐＵＣ誘導体、及びｐＡＣＹＣ誘導体もまた、誘導プロモーターから発現される配列をコードするバクテリオファージＱβまたはバクテリオファージＭＳ２カプシドタンパク質を含有し得る。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌以外の生物学系における発現のために、等価のベクターが当業者にとって既知である。あるいは、そのような誘導的に発現されたカプシド遺伝子は、誘導ＲＮＡｉ前駆体またはアンチセンスＲＮＡコード配列を担持する細菌プラスミドと適合する別個の細菌プラスミド上に存在してもよい。そのようなＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ分子は、「ＲＮＡカーゴ分子」と称されることがある。一実施形態において、誘導的に発現されたカプシド遺伝子は、細菌染色体に組み込まれてもよい。
【００１２】
ＲＮＡカーゴ分子を含有するＶＬＰの生成及び精製は、米国特許出願第２０１３／０１６７２６７号、同第２０１４／０３０２５９３号、及び米国特許第９，１８１，５３１号に詳細に記載されている。そのような方法はまた、米国特許出願第２０１０／０１６７９８１号、同第２０１２／００４６３４０号、ＰＣＴ／ＵＳ１２／７１４１９及びＰＣＴ／ＵＳ１４／４１１１１、ならびに米国特許第５，４４３，９６９号及び同第６，２１４，９８２号（各々の内容が参照により本明細書に組み込まれる）にも記載されている。これらの方法によって生成されたＶＬＰは、現場で使用するためにそのような材料の適用を促進するように、当業者にとって既知であるいくつかの異なる方法で処理することができる。一実施形態において、精製されたＡＲＣは、噴霧操作のために更に処理される。別の実施形態において、精製されたＡＲＣまたはそこから単離されたＲＮＡは、餌物質へと処理される。そのような処理としては、噴霧乾燥、安定剤もしくは湿潤剤の導入、または適用前のＶＬＰと他の所望される薬剤との混合物の形成を挙げることができる。現場適用は、地表もしくは空中噴霧方法、局所適用、または餌材料への組み込み及びを伴い得る。
【００１３】
当業者であれば、以下の実施例に記載される配列を修飾して、他の標的生物内の他の遺伝子の配列を反映させることによって、本発明が異なる昆虫宿主内の異なる遺伝子を標的とし得ることを理解する。故に、本発明は、任意の所与の標的生物内の特定の遺伝子を抑制するのに最良のＲＮＡｉ標的を決定するための手段、及びそれらの遺伝子を標的とする大量のＲＮＡｉを生成するための手段を提供する。更に、本発明は、組み合わせクローニング方法により、特定の遺伝子または遺伝子の組み合わせを標的とする様々なＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰまたはＲＮＡの有効性をスクリーニングすることによって、どの遺伝子または遺伝子群が、単一の昆虫または昆虫群において最も有効なＲＮＡｉ標的を構成し得るかを経験的に決定する方法を提供する。本発明はまた、現場の特定の昆虫の制御に有効なＶＬＰを、存在し得る他の昆虫の制御に有効な異なるＶＬＰと組み合わせて、昆虫制御特性を適用点に関連するものに適応させる方法も支持する。異なる昆虫は、元のＶＬＰまたはＲＮＡによって標的とされるものとは異なる目、属、または種のものであっても、ＲＮＡｉ耐性またはＲＮＡｉ耐性集合の組み合わせを含んでもよく、標的昆虫集合内の異なる遺伝子を標的とする１つ以上のＶＬＰまたはＲＮＡの組み合わせは、ＲＮＡｉ耐性の組み合わせが生じる可能性が低くあることを確実にする。
【００１４】
本発明の一実施形態において、細菌宿主内の第１のＤＮＡ配列が転写されて、バクテリオファージコートタンパク質をコードする第１のＲＮＡ分子が生成される。細菌宿主内の第２のＤＮＡ配列が転写されて、第２のＲＮＡ分子であって、バクテリオファージｐａｃ部位を含み、その後に昆虫に由来する標的遺伝子のセンス配列が続き、その後に一本鎖ループを形成することができる非相同ＲＮＡ配列が続き、その後に標的遺伝子配列のセンス配列に相補的であるアンチセンス配列が続き、その後に任意で第２のバクテリオファージｐａｃ部位が続く、第２のＲＮＡ分子が生成される。単一バクテリオファージｐａｃ部位は、第２のＲＮＡ分子の５’側に存在しても、第２のＲＮＡ分子の３’側に存在しても、第２のＲＮＡ分子の非相同ループ配列内に位置してもよい。第１のＲＮＡ分子は、細菌宿主によって翻訳されて、複数のバクテリオファージコートタンパク質を生成するｍＲＮＡであり、このバクテリオファージコートタンパク質は、バクテリオファージｐａｃ配列（複数可）を含む第２のＲＮＡ分子と物理的に関連付けられたときに自発的にＶＬＰを形成し、第２のＲＮＡ分子はＶＬＰ内にパッケージングされる。ＶＬＰは単離され、現場での適用前に必要に応じて更に精製される。あるいは、ネイキッドＲＮＡが、ＶＬＰから、または直接細菌宿主から単離され、現場適用のために処理される。ネイキッドＲＮＡまたはＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰを摂取する標的昆虫は、ＶＬＰに由来するか否かに関わらず、それらの腸を覆う宿主昆虫細胞へとＲＮＡ分子を導入する。宿主昆虫細胞内に入ると、ＲＮＡは、宿主昆虫細胞の内在性ＲＮＡｉ経路によって処理され得るか、またはアンチセンスＲＮＡとして直接機能し、宿主昆虫標的遺伝子の遺伝子発現のアンチセンスＲＮＡ媒介抑制またはＲＮＡｉ媒介抑制をもたらし得るかのいずれかとなる。一実施形態において、昆虫は、アリである。他の実施形態において、アリは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ種である。好ましい一実施形態において、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ種は、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａである。他の実施形態において、アリは、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ種である。好ましい一実施形態において、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ種は、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓである。好ましい別の実施形態において、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ種は、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓである。他の実施形態において、標的とされるアリは、アルゼンチンアリ、イエヒメアリ、コヌカアリ、またはトビイロシワアリである。いくつかの実施形態において、ＲＮＡｉは、全てのそのようなアリ種を標的としても、そのようなアリ種の任意の特定の組み合わせを標的としてもよい。
【００１５】
一実施形態において、バクテリオファージコートタンパク質をコードする第１のＤＮＡ配列と、様々なＲＮＡｉ前駆体配列をコードする異なる第２のＤＮＡ配列とを含有する、一連の宿主細菌が単離される。単離された各宿主細菌はクローン的に拡大され、細菌細胞株は記録保存される。各細菌細胞株の試料は、その後成長を追い越され、第１及び第２のＤＮＡ配列を転写するように誘導され、ＶＬＰは宿主細菌内で組み立てさせられ、ＶＬＰはそこから単離される。結果として得られる一連のＶＬＰ内のＲＮＡ配列は各々、異なるアンチセンス配列と、任意で異なる昆虫標的遺伝子または所与の昆虫標的遺伝子の異なる領域または異なる昆虫標的に由来する標的遺伝子と相同である、相補的センス配列とをコードする。一連の宿主細菌によって生成される異なるＶＬＰの各々が、標的昆虫に給餌され、例えば、標的昆虫の死亡率をスコア化することによって、宿主昆虫の遺伝子発現を抑制するそれらの能力が測定される。最高レベルの遺伝子発現のＲＮＡｉ媒介抑制をもたらすＶＬＰが、その特定の標的昆虫、または所与の標的昆虫遺伝子内の位置の最も有効なＲＮＡ標的となる。各ＶＬＰを生成した対応する細菌細胞株に頼ることで、対応する標的配列または遺伝子の迅速な特定が可能になる。同様に、対応する宿主細菌細胞株に頼ることで、現場適用または更なる実験的調査のための、宿主昆虫の標的遺伝子の遺伝子発現のＲＮＡｉ媒介抑制のための所望されるＶＬＰの迅速な規模拡大が促進される。当業者であれば、昆虫のゲノム配列データ、または可能性のある必須遺伝子をコードするそのようなゲノム配列のサブセットに基づく相補的ＤＮＡ配列のランダムまたは擬似ランダム収集が、多重または自動化クローニング技術を使用してスクリーニング可能であることを認識する。ＲＮＡｉ組成物によって標的とされないアリ（または他の昆虫種）種に危害を加えないことを確実にするために、類似したプロセスを用いて、各ＲＮＡｉ候補の標的特異性を分析することができる。
【００１６】
一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、アリビテロゲニン受容体タンパク質（ＶｇＲ）をコードする遺伝子の発現を抑制する。好ましい一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａのＶｇＲをコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＶｇＲをコードする遺伝子の発現は抑制しない。好ましい別の実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓまたはＣ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓのＶｇＲをコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＶｇＲをコードする遺伝子の発現は抑制しない。他の実施形態において、アルゼンチンアリ、イエヒメアリ、コヌカアリ、またはトビイロシワアリのＶｇＲ遺伝子の発現が、標的とされる。
【００１７】
一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、アリテロメラーゼ変異形Ｘ１タンパク質（ＴＶＸ１）をコードする遺伝子の発現を抑制する。好ましい一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａのＴＶＸ１をコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＴＶＸ１をコードする遺伝子の発現は抑制しない。好ましい別の実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓまたはＣ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓのＴＶＸ１をコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＴＶＸ１をコードする遺伝子の発現は抑制しない。他の実施形態において、アルゼンチンアリ、イエヒメアリ、コヌカアリ、またはトビイロシワアリのＴＶＸ１遺伝子の発現が、標的とされる。
【００１８】
一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、アリフェロモン生合成活性化神経ペプチド（ＰＢＡＮ）をコードする遺伝子の発現を抑制する。好ましい一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａのＰＢＡＮをコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＰＢＡＮをコードする遺伝子の発現は抑制しない。好ましい別の実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓまたはＣ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓのＰＢＡＮをコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＰＢＡＮをコードする遺伝子の発現は抑制しない。他の実施形態において、アルゼンチンアリ、イエヒメアリ、コヌカアリ、またはトビイロシワアリのＰＢＡＮ遺伝子の発現が、標的とされる。
【００１９】
一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、アリフェロモン生合成活性化神経ペプチド受容体（ＰＢＡＮＲ）をコードする遺伝子の発現を抑制する。好ましい一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａのＰＢＡＮＲをコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＰＢＡＮＲをコードする遺伝子の発現は抑制しない。好ましい別の実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓまたはＣ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓのＰＢＡＮＲをコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＰＢＡＮＲをコードする遺伝子の発現は抑制しない。他の実施形態において、アルゼンチンアリ、イエヒメアリ、コヌカアリ、またはトビイロシワアリのＰＢＡＮＲ遺伝子の発現が、標的とされる。
【００２０】
一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、アリｗｎｔｌｅｓｓタンパク質（ＷＬＳ）をコードする遺伝子の発現を抑制する。好ましい一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａのＷＬＳをコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＷＬＳをコードする遺伝子の発現は抑制しない。好ましい別の実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓまたはＣ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓのＷＬＳをコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＷＬＳをコードする遺伝子の発現は抑制しない。他の実施形態において、アルゼンチンアリ、イエヒメアリ、コヌカアリ、またはトビイロシワアリのＷＬＳ遺伝子の発現が、標的とされる。
【００２１】
一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、アリ複層上皮成長因子様ドメインタンパク質１０（ＭＥＧＦ１０）をコードする遺伝子の発現を抑制する。好ましい一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａのＭＥＧＦ１０をコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＭＥＧＦ１０をコードする遺伝子の発現は抑制しない。好ましい別の実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓまたはＣ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓのＭＥＧＦ１０をコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＭＥＧＦ１０をコードする遺伝子の発現は抑制しない。他の実施形態において、アルゼンチンアリ、イエヒメアリ、コヌカアリ、またはトビイロシワアリのＭＥＧＦ１０遺伝子の発現が、標的とされる。
【００２２】
一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、アリクラスリン重鎖タンパク質（ＣＨＣＰ）をコードする遺伝子の発現を抑制する。好ましい一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａのＣＨＣＰをコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＣＨＣＰをコードする遺伝子の発現は抑制しない。好ましい別の実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓまたはＣ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓのＣＨＣＰをコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＣＨＣＰをコードする遺伝子の発現は抑制しない。他の実施形態において、アルゼンチンアリ、イエヒメアリ、コヌカアリ、またはトビイロシワアリのＣＨＣＰ遺伝子の発現が、標的とされる。
【００２３】
一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、アリ細胞分裂周期７関連タンパク質（ＣＤＣ７）をコードする遺伝子の発現を抑制する。好ましい一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａのＣＤＣ７をコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＣＤＣ７をコードする遺伝子の発現は抑制しない。好ましい別の実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓまたはＣ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓのＣＤＣ７をコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＣＤＣ７をコードする遺伝子の発現は抑制しない。他の実施形態において、アルゼンチンアリ、イエヒメアリ、コヌカアリ、またはトビイロシワアリのＣＤＣ７遺伝子の発現が、標的とされる。
【００２４】
一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、アリ中心体タンパク質８９ｋｄａｌ（Ｃｅｐ８９）をコードする遺伝子の発現を抑制する。好ましい一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａのＣｅｐ８９をコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＣｅｐ８９をコードする遺伝子の発現は抑制しない。好ましい別の実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓまたはＣ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓのＣｅｐ８９をコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＣｅｐ８９をコードする遺伝子の発現は抑制しない。他の実施形態において、アルゼンチンアリ、イエヒメアリ、コヌカアリ、またはトビイロシワアリのＣｅｐ８９遺伝子の発現が、標的とされる。
【００２５】
一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、１型プロテオソーム（ｐｒｏｔｅｏｓｏｍｅ）のアリベータサブユニット（ＰＳＭＢ１）をコードする遺伝子の発現を抑制する。好ましい一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａのＰＳＭＢ１をコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＰＳＭＢ１をコードする遺伝子の発現は抑制しない。好ましい別の実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓまたはＣ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓのＰＳＭＢ１をコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＰＳＭＢ１をコードする遺伝子の発現は抑制しない。他の実施形態において、アルゼンチンアリ、イエヒメアリ、コヌカアリ、またはトビイロシワアリＰＳＭＢ１遺伝子の発現が、標的とされる。
【００２６】
一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、アリアナモルシンタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する。好ましい一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａのアナモルシンをコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてアナモルシンをコードする遺伝子の発現は抑制しない。好ましい別の実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓまたはＣ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓのアナモルシンをコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてアナモルシンをコードする遺伝子の発現は抑制しない。他の実施形態において、アルゼンチンアリ、イエヒメアリ、コヌカアリ、またはトビイロシワアリのアナモルシンタンパク質遺伝子の発現が、標的とされる。
【００２７】
一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、アリアクチン５Ｃタンパク質（Ａ５Ｃ）をコードする遺伝子の発現を抑制する。好ましい一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａのＡ５Ｃをコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＡ５Ｃをコードする遺伝子の発現は抑制しない。好ましい別の実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓまたはＣ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓのＡ５Ｃをコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＡ５Ｃをコードする遺伝子の発現は抑制しない。他の実施形態において、アルゼンチンアリ、イエヒメアリ、コヌカアリ、またはトビイロシワアリのＡ５Ｃ遺伝子の発現が、標的とされる。
【００２８】
一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、アリベータアクチンタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する。好ましい一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａのベータアクチンをコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてベータアクチンをコードする遺伝子の発現は抑制しない。好ましい別の実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓまたはＣ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓのベータアクチンをコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてベータアクチンをコードする遺伝子の発現は抑制しない。他の実施形態において、アルゼンチンアリ、イエヒメアリ、コヌカアリ、またはトビイロシワアリのベータアクチン遺伝子の発現が、標的とされる。
【００２９】
一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、アリＡＴＰシンターゼデルタサブユニット（ＡＴＰＳＤ）をコードする遺伝子の発現を抑制する。好ましい一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａのＡＴＰＳＤをコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＡＴＰＳＤをコードする遺伝子の発現は抑制しない。好ましい別の実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓまたはＣ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓのＡＴＰＳＤをコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＡＴＰＳＤをコードする遺伝子の発現は抑制しない。他の実施形態において、アルゼンチンアリ、イエヒメアリ、コヌカアリ、またはトビイロシワアリのＡＴＰＳＤ遺伝子の発現が、標的とされる。
【００３０】
一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、アリＣｓｐ９タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する。好ましい一実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａのＣｓｐ９をコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＣｓｐ９をコードする遺伝子の発現は抑制しない。好ましい別の実施形態において、ＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡは、Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓまたはＣ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓのＣｓｐ９をコードする遺伝子の発現を抑制するが、他のアリ種においてＣｓｐ９をコードする遺伝子の発現は抑制しない。他の実施形態において、アルゼンチンアリ、イエヒメアリ、コヌカアリ、またはトビイロシワアリのＣｓｐ９遺伝子の発現が、標的とされる。
【００３１】
本発明の更なる一実施形態において、より広範囲のアリ制御を提供するために、遺伝子発現のＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ抑制は、追加のアリ種の標的を対象とする。そのような広範囲のアリ制御組成物を設計する上での重要な考慮は、既に危急であるスズメバチ及びミツバチ種とのいかなる交差反応性の可能性も最小化することである。ミツバチとの交差反応性に対する最小の潜在性をもってＲＮＡｉまたはアンチセンスアリ抑制の標的を特定するために、可能性のある必須遺伝子をコードする、選択したアリゲノム内に存在する保存された遺伝子を特定し、整列した。Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ（アカヒアリ）及びＣａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃｕｓ（オオアリ）に加えて、追加のオオアリ種（Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ）、アルゼンチンアリ（Ｌｉｎｅｐｉｔｈｅｍａ  ｈｕｍｉｌｅ）、コヌカアリ（Ｔａｐｉｎｏｍａ  ｓｅｓｓｉｌｅ）、ならびにイエヒメアリ（Ｍｏｎｏｍｏｒｉｕｍ  ｐｈａｒａｏｎｓｉｓ）を含む、一連のアリ種間に特有の配列を、入手可能なミツバチ及びスズメバチゲノム、ならびに特定されたアリとスズメバチ及びミツバチとの間の相同性の程度が最も低い必須遺伝子に対してスクリーニングした。入手可能な必須遺伝子のアリ候補のうち、クラスリン重鎖タンパク質及びリボソームタンパク質Ｌ３２をコードする２つの遺伝子を、アリ種間で最良の選択性を提供するものとして、かつスズメバチ及びミツバチ相同体に対して実質的にいかなる著しい相同性も有さないものとして選択した。一実施形態において、異なるアリ種に由来するこれらの遺伝子に対して指向されたＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡのうちの２つ以上の組み合わせは、他のアリ種を含む非標的種に影響を与えずに、特定のアリ種を制御するための有効な方法を提供する。
【００３２】
以下の実施例は、本発明を説明するものであり、詳細に上述され、特許請求の範囲に明記される本発明の範囲を限定することは意図されない。実施例１は、本発明を実施するための一般的な手段及び方法を提示する。実施例２は、本発明の代表として、１つの標的とされる遺伝子配列（ＶｇＲ）に関与するそのような一般的な手段及び方法の使用の詳細な説明を提示する。その後の実施例３〜１６は、本発明の追加の例を提示する。特に、実施例３〜１６に提示される標的とされる遺伝子配列についての知識は、当業者が実施例１に記載される手段及び方法を使用して、実施例２に提示される組成物に類似した組成物を生成して、様々なアリ種の全体的及び／または選択的制御の全体的な目標を達成することを可能にするのに十分である。
【実施例】
【００３３】
実施例１
発現構築物及び一般的なアッセイ手順。
標的とされる遺伝子の発現を抑制するためのＲＮＡｉ及びアンチセンスＲＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ系発現系によって生成する。各々の場合において、所望されるＲＮＡｉ前駆体を、（５’−３’）ＡｓｉＳＩ制限部位配列、標的とされる遺伝子配列、１５０ｎｔｄのループ配列、標的とされる遺伝子配列と相同である配列、及びＮｏｔＩ制限部位配列を含む合成ＤＮＡ配列として得る。合成ＤＮＡ配列を、ＡｓｉＳＩ及びＮｏｔＩで消化させ、プラスミドｐＡＰＳＥ１０１３６（配列番号１）へと連結させる。
【００３４】
プラスミドｐＡＰＳＥ１０１３６は、プラスミドｐＢＲ３２２に基づき、Ｔ７ターミネーターによって分離された２つのＴ７発現ドメインを含有する。これらの発現ドメインのうち１つは、バクテリオファージＭＳ２コートタンパク質遺伝子の単一複写物の上流にＴ７プロモーター配列を含み、その後にＴ７ターミネーターが続く。第２の発現ドメインは、特有のＡｓｉＳＩ及びＮｏｔＩ制限部位（クローニング部位の１つのｐａｃ部位５’と、クローニング部位の１つのｐａｃ部位３’とによって挟まれている）の上流にＴ７プロモーター配列を含み、その後にＭＳ２パッケージング配列が続き、その後にＴ７ターミネーターが続く。ＡｓｉＳ１−ＮｏｔＩ領域への任意の配列の連結及びＴ７プロモーターの誘導は、ＭＳ２カプシドタンパク質と、ＭＳ２  ｐａｃ部位配列に融合されたＡｓｉＳＩ−ＮｏｔＩ配列を含む非翻訳ＲＮＡ転写物との両方を生成する。誘導時、非翻訳ＲＮＡ転写物のｐａｃ部位配列は、ＭＳ２カプシドタンパク質と相互作用して、ＲＮＡ転写物をカプシド化するＶＬＰの形成を誘導する。誘導された培養物からのＶＬＰの回収及び精製、ならびに精製されたＶＬＰからのＲＮＡの任意の単離は、その後の遺伝子抑制研究のために所望されるＲＮＡｉ前駆体またはアンチセンスＲＮＡの供給源を提供する。
【００３５】
精製されたＶＬＰまたはＲＮＡが必須遺伝子発現を抑制し、それによりアリを直接殺滅する能力の単純なバイオアッセイは、定義された数の働きアリに、１０％のスクロース溶液中、既知の濃度で試験物質を給餌し、働きアリの死亡率を測定することを伴う。試験条件下で、試験ＲＮＡを添加していない１０％のスクロース溶液を給餌したアリの１２日時点での死亡率は、２５％である。このアッセイ及びその変異形は、働きアリ死亡率アッセイと称され得る。
【００３６】
精製されたＶＬＰまたはＲＮＡがコロニー統合性を破壊して、長期的な根絶を提供する能力を測定するために設計されたより複雑なアッセイは、Ｌｕらによって記載されるものに類似したバイオアッセイを含む。実験室コロニーから新たに出現した未交尾の女王アリを、未交尾の女王アリを単離するのに十分に小さいが、有王群内の働きアリから世話を受け、近くの交尾した女王アリからのプライマーフェロモンへの曝露を可能にするのに十分に大きい孔を蓋に有する、３ｃｍの直径のプレート巣内に保管する。新たに交尾した女王アリを、午後３〜４時の交尾飛翔後に現場から収集し、未交尾の女王アリに隣接する容器内に収容して、女王アリ間（保育働きアリ間、及び交尾した女王アリと未交尾の女王アリとの間）の直接の物理的な相互作用を避けながら、フェロモンプライミングを可能にする。
【００３７】
精製またはカプシド化されたＲＮＡを、既知の濃度になるまで１０％のスクロース溶液（重量／体積）中に溶解させ、毛細管チューブを介して女王アリの幼虫の世話をする保育働きアリに１２日間提供する。ＶｇＲを標的とするカプシド化またはネイキッドｄｓＲＮＡのいずれかの給餌による、ＲＮＡ干渉を通した未交尾の女王アリにおける必須遺伝子のサイレンシングは、卵形成を消失させ、未交尾の女王アリの交尾能力を含む奇形をもたらすか、またはコロニー増殖に別様に干渉することができる。この「未交尾の女王アリバイオアッセイ」の変形形態を利用して、他の遺伝子のＲＮＡｉ抑制を決定することができる。
【００３８】
実施例２
ＶｇＲ遺伝子抑制のためのＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰによるアリ種の制御。
ビテロゲニン受容体タンパク質（ＶｇＲ遺伝子）をコードする遺伝子を、ＲＮＡｉによって標的として、他の昆虫との比較でのアリ種内の遺伝子配列の相違に基づいて、アリ個体数を制御することができる。更に、２０５５〜２７４５位に６９１ヌクレオチド（配列番号２）を含む、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａのＶｇＲ遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列ＸＭ＿０１１１６８４６０）の少なくとも１つの領域は、アリ間でＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａに特有である。この領域をまた、２つの大体等しいサイズのＲＮＡｉ前駆体（−２０５５〜２４００位の３４５ヌクレオチド（配列番号３）及び２４０１−２７４５位の３４４ヌクレオチド（配列番号４））として単離した。これらの配列に基づくＲＮＡｉ組成物の使用は、これらの配列に対する有意な相同性を欠くアリ種に危害を加えることなく、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａの選択的制御を可能にする
【００３９】
アリＶｇＲ遺伝子の６９１塩基対の特有領域のセンス複写物及びアンチセンス複写物を含み、ＡｓｉＳＩ及びＮｏｔＩ制限部位が隣接する１５０塩基対の非相同ループ配列によって反復複写物が分離された、逆方向反復をコードする、１５４８ヌクレオチド合成ＤＮＡ構築物（配列番号５）を設計し、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＧｅｎｅＡｒｔ遺伝子合成サービス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）によって合成した。構築物を、ＡｓｉＳ１−ＮｏｔＩ制限フラグメントとしてプラスミドｐＡＰＳＥ１０１３６の対応する制限部位に挿入して、対応する発現プラスミドｐＡＰＳＥ１０３９７（配列番号６）を形成した。
【００４０】
発現プラスミド（配列番号６）をＥ．ｃｏｌｉ宿主株ＨＴＥ１１５（ＤＥ３）へと形質転換した（Ｔｉｍｍｏｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｄｓＲＮＡｓ  ｃａｎ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ．Ｇｅｎｅ２６３：１０３−１２（２００１））。形質転換された細菌株のアンピシリン耐性クローンを、ＬＢ寒天プレート上で選択する。その後、選択された培養物がＯＤ６０００．８に達するまで、選択されたクローンを、アンピシリンを含有する１００ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で成長させ、この時点で、１ｍＭの最終濃度になるまでイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加して、ＭＳ２カプシドタンパク質及びＶｇＲ  ＲＮＡ前駆体のＴ７ポリメラーゼ指向転写を誘導する。誘導された培養物を、誘導後少なくとも４時間成長させて、ＶＬＰ形成に十分な時間を与える。４℃、３，０００ｇでの遠心分離によって、細胞を収集する。各ペレットを、処理するまで４℃で保管する。
【００４１】
１０ｍＭのＮａＣｌを含有する約１０体積の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中に各ペレットを再懸濁することによって、アリＶｇＲ遺伝子を標的とする６９１塩基対の幹ＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰを精製し、超音波処理して、細胞を溶解させる。１６，０００ｇでの遠心分離によって、細胞細片を除去する。１ｍＬ当たり約１００単位の最終濃度になるまで添加されるＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の添加によって、各試料を更に処理し、３７℃で２時間インキュベートする。その後、１ｍＬ当たり１５０マイクログラムの最終濃度になるまでプロテアーゼＫを添加し、３７℃で更に３時間インキュベートする。４．１Ｍの最終濃度になるまで硫酸アンモニウムを水に添加することによって、飽和硫酸アンモニウム溶液を調製する。１８６ｍＭ（約１：２２の希釈）の最終濃度になるまで飽和硫酸アンモニウムを酵素的に処理したＶＬＰに添加し、２時間氷上に置く。１６，０００ｇでの遠心分離によって、望まれない沈殿物をライセートから除去する。１５５ｍｇの乾燥硫酸アンモニウムを除去したライセートの各ｍＬに直接添加することによって、第２の沈殿を行う。各試料をボルテックスし、氷上で２時間インキュベートする。各沈殿物を１６，０００ｇで遠心沈殿し、１０ｍＭのＮａＣｌを含有する、元の体積の１０分の１の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中に固体沈殿物を再懸濁する。
【００４２】
ＶｇＲ遺伝子を標的とするもう２つのＲＮＡｉ前駆体配列を、上述のように調製した。配列番号３と相同である３４５のヌクレオチドセンス配列及びアンチセンス配列を含み、１５０ｎｔｄの非相同ループによって分離された、８５８ｎｔｄの合成ＤＮＡ配列を合成し（配列番号７）、ＡｓｉＳ１−ＮｏｔＩ制限フラグメントとしてプラスミドｐＡＰＳＥ１０１３６の対応する制限部位に挿入して、発現プラスミドｐＡＰＳＥ１０４２６配列番号８（配列番号８）を形成した。Ｔ７プロモーター（複数可）の誘導時、このプラスミドは、３４５塩基対の幹ＲＮＡｉ前駆体を含むＲＮＡ転写物を生成する。配列番号４と相同である３４４のヌクレオチドセンス配列及びアンチセンス配列を含み、１５０ｎｔｄの非相同ループによって分離された、８５６ｎｔｄの長さの別の合成ＤＮＡ配列もまた合成し（配列番号９）、ＡｓｉＳ１−ＮｏｔＩ制限フラグメントとしてプラスミドｐＡＰＳＥ１０１３６の対応する制限部位に挿入して、発現プラスミドｐＡＰＳＥ１０４２７（配列番号１０）を形成した。Ｔ７プロモーター（複数可）の誘導時、このプラスミドは、３４４塩基対の幹ＲＮＡｉ前駆体を含むＲＮＡ転写物を生成する。発現プラスミド配列番号８及び配列番号１０を、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主幹ＨＴＥ１１５（ＤＥ３）へと別個に形質転換し、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａのＶｇＲを標的とする、それぞれ３４５及び３４４塩基対の幹ＲＮＡｉ前駆体を含有する２つの形質転換された株の各々から、ＶＬＰを単離する。合計で、６９１、３４４、及び３４４塩基対のＲＮＡｉ前駆体を含む、ＶｇＲ発現を抑制するための３つの異なるＶＬＰ変異形を生成する。
【００４３】
Ｌｕらによって記載され、実施例１に記載されるものに類似した、低下したビテロゲニン生成のためのバイオアッセイを実行する。ＶｇＲを標的とするカプシド化またはネイキッドｄｓＲＮＡのいずれかの給餌による、ＲＮＡｉを通した未交尾の女王アリにおけるＶｇＲ遺伝子のサイレンシングは、卵形成を消失させ、故にアリの有効な制御を直接実証することができる。
【００４４】
実施例３
テロメラーゼ遺伝子抑制のためのＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰによるアリ種の制御。
テロメラーゼタンパク質をコードする遺伝子もまた、ＲＮＡｉによって効果的に標的とすることで、他の昆虫との比較でのアリ種内の遺伝子配列の相違に基づいて、一般にアリ個体数を制御することができる。更に、１２４〜３４９位の２２６ヌクレオチド（配列番号１１）、３７５〜４７９位の１０５ヌクレオチド（配列番号１２）、５３２〜６７８位の１４７ヌクレオチド（配列番号１３）、８８５〜６７９位の２０７ヌクレオチド（配列番号１４）、及び１０３５〜１１４８位の１１４ヌクレオチド（配列番号１５）を含む、テロメラーゼをコードするＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＸＭ＿０１１１７４５７５）の少なくとも５つのセグメントは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａに特有である。上に特定されたテロメラーゼ遺伝子の特有領域と相同であるセンス配列及びアンチセンス配列の逆方向反復を含み、１５０塩基の非相同ループ配列によって分離された、合成ＤＮＡ配列を構築し、ｐＡＰＳＥ１０１３６へとクローニングする。実施例１及び２に記載されるように生成したＶＬＰを得た。未交尾の女王アリバイオアッセイを使用して、結果として得られるカプシド化ＲＮＡｉ前駆体がアリの繁殖を阻害する能力を決定する。生存可能な幼虫の生成ができないことは、テロメラーゼが、アリ及びアリのコロニー根絶のための実行可能なＲＮＡｉ標的となることを示す。
【００４５】
実施例４
フェロモン生合成活性化神経ペプチド遺伝子抑制のためのＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰによるアリ種の制御。
フェロモン生合成活性化神経ペプチド（ＰＢＡＮ）をコードする遺伝子もまた、ＲＮＡｉによって効果的に標的とすることで、他の昆虫との比較でのアリ種内の遺伝子配列の相違に基づいて、一般にアリを制御することができる。更に、１１６〜２２３位の１０８ヌクレオチド（配列番号１６）を含む、ＰＢＡＮをコードするＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＮＭ＿００１３０４５９８．１）の少なくとも１つのセグメントは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａに特有である。上に特定されたＰＢＡＮ遺伝子の特有領域と相同であるセンス配列及びアンチセンス配列の逆方向反復を含み、１５０塩基の非相同ループ配列によって分離された、合成ＤＮＡ配列を構築し、ｐＡＰＳＥ１０１３６へとクローニングする。実施例１及び２に記載されるように生成したＶＬＰを得た。働きアリ死亡率バイオアッセイを使用して、結果として得られるカプシド化ＲＮＡｉ前駆体がアリの死亡率を増加させる能力を決定する。死亡率に加えて、ＰＢＡＮ阻害は、行軍アリの道しるベフェロモンの構築能力の喪失により、行軍アリが進行する（及び故にコロニーの位置を特定する）能力を破壊することによって、コロニーの崩壊を補助することが予測される。
【００４６】
実施例５
フェロモン生合成活性化神経ペプチド受容体遺伝子抑制のためのＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰによるアリ種の制御。
フェロモン生合成活性化神経ペプチド受容体（ＰＢＡＮＲ）をコードする遺伝子もまた、ＲＮＡｉによって効果的に標的とすることで、他の昆虫との比較でのアリ種内の遺伝子配列の相違に基づいて、一般にアリを制御することができる。更に、２４〜２４７位の２２４ヌクレオチド（配列番号１７）、５５１〜６９１位の１４１ヌクレオチド（配列番号１８）、１４６２〜１５７０位の１０９ヌクレオチド（配列番号１９）、１６１３〜１７１８位の１０６ヌクレオチド（図Ｔ、配列番号２０）を含む、ＰＢＡＮＲをコードするＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＪＸ６５７０４０）の少なくとも４つのセグメントは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａに特有である。上に特定されたＰＢＡＮ遺伝子の特有領域と相同であるセンス配列及びアンチセンス配列の逆方向反復を各々含み、１５０塩基の非相同ループ配列によって分離された、合成ＤＮＡ配列を構築し、ｐＡＰＳＥ１０１３６へとクローニングする。実施例１及び２に記載されるように生成したＶＬＰを得た。働きアリ死亡率バイオアッセイを使用して、結果として得られるカプシド化ＲＮＡｉ前駆体がアリの死亡率を増加させる能力を決定する。個々の死亡率に加えて、ＰＢＡＮ阻害は、行軍アリの道しるベフェロモンの構築能力の喪失により、行軍アリが進行する（及び故にコロニーを再配置する）能力を破壊することによって、コロニーの崩壊を補助することが予測される。
【００４７】
実施例６
Ｗｎｔｌｅｓｓ遺伝子抑制のためのＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰによるアリ種の制御。
ｗｎｔｌｅｓｓタンパク質をコードする遺伝子もまた、ＲＮＡｉによって効果的に標的とすることで、他の昆虫との比較でのアリ種内の遺伝子配列の相違に基づいて、一般にアリを制御することができる。更に、２９２〜４３１位の１４１ヌクレオチド（配列番号２１）及び１４８９〜１６６５位の１７７ヌクレオチド（配列番号２２）を含む、ｗｎｔｌｅｓｓタンパク質をコードするＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＸＭ＿０１１１６２７７１．１）の少なくとも２つのセグメントは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａに特有である。上に特定されたｗｎｔｌｅｓｓをコードする遺伝子の特有領域と相同であるセンス配列及びアンチセンス配列の逆方向反復を各々含み、１５０塩基の非相同ループ配列によって分離された、合成ＤＮＡ配列を構築し、ｐＡＰＳＥ１０１３６へとクローニングする。実施例１及び２に記載されるように生成したＶＬＰを得た。実施例２に記載される未交尾の女王アリバイオアッセイの変形形態を使用して、結果として得られるカプシド化ＲＮＡｉ前駆体がアリの繁殖を阻害する能力を決定することができる。羽アリの生成ができないことは、ｗｎｔｌｅｓｓが、アリのコロニー根絶のための実行可能なＲＮＡｉ標的となることを示す。羽の発達ができないことは、交尾飛翔を行う能力を妨げ、これはコロニーの崩壊をもたらし得、そのコロニー内のアリが分散し、新たなコロニーを確立する能力を制限するだろう。
【００４８】
実施例２に記載される未交尾の女王アリバイオアッセイを使用して、結果として得られるカプシド化ＲＮＡｉ前駆体がアリの繁殖を阻害する能力を決定する。生存可能な幼虫の生成ができないことは、ｗｎｔｌｅｓｓ遺伝子が、アリのコロニー根絶のための実行可能なＲＮＡｉ標的となることを示す。
【００４９】
実施例７
複層上皮成長因子様ドメインタンパク質１０遺伝子抑制のためのＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰによるアリ種の制御。
複層上皮成長因子様ドメインタンパク質１０（ＭＥＧＦ１０）をコードする遺伝子もまた、ＲＮＡｉによって効果的に標的とすることで、他の昆虫との比較でのアリ種内の遺伝子配列の相違に基づいて、一般にアリ個体数を制御することができる。更に、１７１２〜１８４８位の１３７ヌクレオチド（配列番号２３）を含む、ＭＥＧＦ１０をコードするＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＸＭ＿０１１１６９５２０．１）の少なくとも１つのセグメントは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａに特有である。上に特定されたＭＥＧＦ１０遺伝子の特有領域と相同であるセンス配列及びアンチセンス配列の逆方向反復を含み、１５０塩基の非相同ループ配列によって分離された、合成ＤＮＡ配列を構築し、ｐＡＰＳＥ１０１３６へとクローニングする。実施例１及び２に記載されるように生成したＶＬＰを得た。働きアリ死亡率バイオアッセイを使用して、結果として得られるカプシド化ＲＮＡｉ前駆体がアリのコロニーを破壊する能力を決定する。ＭＥＧＦ１０の抑制は、個々のアリの死及びコロニー破壊をもたらす重度の神経学的効果を生成することが予測される。更に、ＭＥＧＦ１０の抑制は、正常な幼虫発生を破壊する。
【００５０】
実施例８
クラスリン重鎖タンパク質遺伝子抑制のためのＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰによるアリ種の制御。
クラスリン重鎖タンパク質をコードする遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＸＭ＿０１１１６１３００１）は、ＲＮＡｉによって効果的に標的とすることで、他のハチ類の昆虫に見出される遺伝子配列との比較でのアリ種内の遺伝子配列の相違に基づいて、一般にアリ個体数を制御することができる。ヌクレオチド３２１２〜３３１４の配列（配列番号２４）は、アリ間でＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａに特有のＲＮＡｉ標的となり、ヌクレオチド２０２２〜２０９２（配列番号２５）及びヌクレオチド４７９４〜４８９４（配列番号２６）の配列も同様である。上に特定されたクラスリン重鎖タンパク質遺伝子の特有領域のうちのいずれか１つと相同であるセンス配列及びアンチセンス配列の逆方向反復を含み、１５０塩基の非相同ループ配列によって分離された、合成ＤＮＡ配列を構築し、ｐＡＰＳＥ１０１３６へとクローニングする。実施例１及び２に記載されるように生成したＶＬＰを得た。働きアリ死亡率バイオアッセイを使用して、結果として得られるカプシド化ＲＮＡｉ前駆体がアリを制御する能力を決定する。配列番号２４（１０％のスクロース溶液中、５００ｍｇ／Ｌの濃度で提供）を含むＶＬＰは、８４％の１２日間の死亡率をもたらした。
【００５１】
Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ  ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ（オオアリ）、Ｌｉｎｅｐｉｔｈｅｍａ  ｈｕｍｉｌｅ（アルゼンチンアリ）、Ｔａｐｉｎｏｍａ  ｓｅｓｓｉｌｅ（コヌカアリ）、及びＭｏｎｏｍｏｒｉｕｍ  ｐｈａｒａｏｎｓｉｓ（イエヒメアリ）などの他のアリ種の、クラスリン重鎖タンパク質をコードする遺伝子もまた、アリ間に特有であり、スズメバチ及びミツバチ遺伝子相同体においては完全に欠損している配列をコードする。これらは、個々の各アリ種に特異的なＲＮＡｉ標的となる。例えば、ヌクレオチド２０３６〜２１０６（配列番号２７）及び４８０８〜４９０８（配列番号２８）のＣ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓのクラスリン重鎖タンパク質遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＸＭ＿０１１２６８０４７１）配列を上述のように合成して、Ｃ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓを特異的に制御するための記載されるＶＬＰを生成することができる。ヌクレオチド１９５１〜２０２１位（配列番号２９）及び４７２３〜４８２３（配列番号３０）のＬ．ｈｕｍｉｌｅのクラスリン重鎖タンパク質遺伝子配列（ＮＣＢＩ配列識別子ＸＭ＿０１２３６９４７２１）は、アルゼンチンアリに特異的であり、これらの配列を含有する本明細書に記載される合成構築物は、アルゼンチンアリの制御に特異的である。同様に、ヌクレオチド２１５２〜２２２２位（配列番号３１）及び４９２４〜４８９４（配列番号３２）のＭ．ｐｈａｒａｏｎｓｉｓのクラスリン重鎖タンパク質遺伝子配列（ＮＣＢＩ配列識別子ＸＭ＿０１２６７１７６５１）は、イエヒメアリに特異的であり、これらの配列を含有する本明細書に記載される合成構築物は、イエヒメアリの制御に特異的である。
【００５２】
実施例９
細胞分裂周期７関連タンパク質キナーゼ遺伝子抑制のためのＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰによるアリ種の制御。
細胞分裂周期７関連タンパク質キナーゼ（ＣＤＣ７）をコードする遺伝子もまた、ＲＮＡｉによって効果的に標的とすることで、他の昆虫との比較でのアリ種内の遺伝子配列の相違に基づいて、一般にアリ個体数を制御することができる。更に、１７５〜３０１位間の１２７ヌクレオチド（配列番号３３）、７０３〜８０３位間の１０１ヌクレオチド（配列番号３４）、及び７９６〜９０２位間の１０７ヌクレオチド（配列番号３５）を含む、ＣＤＣ７をコードするＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＸＭ＿０１１１６５０８９．１）の少なくとも３つのセグメントは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａに特有である。上に特定されたＣＤＣ７遺伝子の特有領域と相同であるセンス配列及びアンチセンス配列の逆方向反復を含み、１５０塩基の非相同ループ配列によって分離された、合成ＤＮＡ配列を構築し、ｐＡＰＳＥ１０１３６へとクローニングする。実施例１及び２に記載されるように生成したＶＬＰを得た。働きアリ死亡率バイオアッセイを使用して、結果として得られるカプシド化ＲＮＡｉ前駆体がアリを制御する能力を決定する。
【００５３】
実施例１０
中心体タンパク質８９ｋｄａｌ遺伝子抑制のためのＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰによるアリ種の制御。
中心体タンパク質８９ｋｄａｌ（Ｃｅｐ８９）をコードする遺伝子もまた、ＲＮＡｉによって効果的に標的とすることで、他の昆虫との比較でのアリ種内の遺伝子配列の相違に基づいて、一般にアリ個体数を制御することができる。４６１〜５７９位間の１１９ヌクレオチド（配列番号３６）及び１５０６−１６１０位間の１０５ヌクレオチド（配列番号３７）を含む、Ｃｅｐ８９をコードするＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＸＭ＿０１１１７５２５６．１）の少なくとも２つのセグメントは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａに特有である。上に特定されたＣｅｐ８９遺伝子の特有領域と相同であるセンス配列及びアンチセンス配列の逆方向反復を含み、１５０塩基の非相同ループ配列によって分離された、合成ＤＮＡ配列を構築し、ｐＡＰＳＥ１０１３６へとクローニングする。実施例１及び２に記載されるように生成したＶＬＰを得る。働きアリ死亡率バイオアッセイを使用して、結果として得られるカプシド化ＲＮＡｉ前駆体がアリを制御する能力を決定した。配列番号２８及び配列番号２９（１０％のスクロース溶液中、１００ｍｇ／Ｌの濃度で提供）を含むＶＬＰは、８３％の１２日間の死亡率をもたらした。
【００５４】
実施例１１
１型プロテオソームベータ−サブユニットタンパク質遺伝子抑制のためのＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰによるアリ種の制御。
１型プロテオソームのベータサブユニットをコードする遺伝子もまた、ＲＮＡｉによって効果的に標的とすることで、他の昆虫との比較でのアリ種内の遺伝子配列の相違に基づいて、一般にアリ個体数を制御することができる。７４〜２２６位間の１５３ヌクレオチド（配列番号３８）及び８８５〜１０２１位間の１３７ヌクレオチド（配列番号３９）を含む、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＸＭ＿０１１１５９６６３．１）の少なくとも２つのセグメントは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａに特有である。上に特定された１型プロテオソームのベータサブユニットをコードする遺伝子の特有領域と相同であるセンス配列及びアンチセンス配列の逆方向反復を各々含み、１５０塩基の非相同ループ配列によって分離された、合成ＤＮＡ配列を構築し、ｐＡＰＳＥ１０１３６へとクローニングした。実施例１及び２に記載されるように生成したＶＬＰを得る。働きアリ死亡率バイオアッセイを使用して、結果として得られるカプシド化ＲＮＡｉ前駆体がアリを制御する能力を決定した。配列番号３８及び配列番号３９（１０％のスクロース溶液中、５００ｍｇ／Ｌの濃度で提供）を含むＶＬＰは、６９％の１２日間の死亡率をもたらした。
【００５５】
実施例１２
アナモルシン遺伝子抑制のためのＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰによるアリ種の制御。
アナモルシン（アポトーシス阻害剤）をコードする遺伝子もまた、ＲＮＡｉによって効果的に標的とすることで、他の昆虫との比較でのアリ種内の遺伝子配列の相違に基づいて、一般にアリ個体数を制御することができる。３１９〜５３８位間の２２０ヌクレオチド（配列番号４０）及び９９６〜１１０５位間の１１０ヌクレオチド（配列番号４１）を含む、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ（ＮＣＢＩ配列識別子ＸＭ＿０１１１６１００６．１）遺伝子の少なくとも２つのセグメントは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａに特有である。上に特定されたアナモルシン遺伝子の特有領域と相同であるセンス配列及びアンチセンス配列の逆方向反復を各々含み、１５０塩基の非相同ループ配列によって分離された、合成ＤＮＡ配列を構築し、ｐＡＰＳＥ１０１３６へとクローニングする。実施例１及び２に記載されるように生成したＶＬＰを得た。働きアリ死亡率バイオアッセイを使用して、結果として得られるカプシド化ＲＮＡｉ前駆体がアリを制御する能力を決定する。
【００５６】
実施例１３
アクチン５Ｃ遺伝子抑制のためのＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰによるアリ種の制御。
アクチン５Ｃ遺伝子もまた、ＲＮＡｉによって効果的に標的とすることで、他の昆虫との比較でのアリ種内の遺伝子配列の相違に基づいて、一般にアリ個体数を制御することができる。−１６〜２８３位間の３００ヌクレオチド（配列番号４２）を含む、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＸＭ＿０１１１６１００６．１）の少なくとも２つのセグメントは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａに特有である。上に特定されたアクチン５Ｃ遺伝子の特有領域と相同であるセンス配列及びアンチセンス配列の逆方向反復を各々含み、１５０塩基の非相同ループ配列によって分離された、合成ＤＮＡ配列を構築し、ｐＡＰＳＥ１０１３６へとクローニングする。実施例１及び２に記載されるように生成したＶＬＰを得た。働きアリ死亡率バイオアッセイを使用して、結果として得られるカプシド化ＲＮＡｉ前駆体がアリを制御する能力を決定する。
【００５７】
実施例１４
β−アクチン遺伝子抑制のためのＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰによるアリ種の制御。
β−アクチン遺伝子もまた、ＲＮＡｉによって効果的に標的とすることで、他の昆虫との比較でのアリ種内の遺伝子配列の相違に基づいて、一般にアリ個体数を制御することができる。−４９〜２５０位間の３００ヌクレオチド（配列番号４３）を含む、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＸＭ＿０１１１７５３３７．１）の少なくとも１つのセグメントは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａに特有である。上に特定されたβ−アクチン遺伝子の特有領域と相同であるセンス配列及びアンチセンス配列の逆方向反復を含み、１５０塩基の非相同ループ配列によって分離された、合成ＤＮＡ配列を構築し、ｐＡＰＳＥ１０１３６へとクローニングした。実施例１及び２に記載されるように生成したＶＬＰを得る。実施例２に記載される働きアリ死亡率バイオアッセイを使用して、結果として得られるカプシド化ＲＮＡｉ前駆体がアリを制御する能力を決定した。働きアリ死亡率バイオアッセイを使用して、結果として得られるカプシド化ＲＮＡｉ前駆体がアリを制御する能力を決定した。配列番号３５（１０％のスクロース溶液中、１００ｍｇ／Ｌの濃度で提供）を含むＶＬＰは、９０％の１２日間の死亡率をもたらした。
【００５８】
実施例１５
ＡＴＰシンターゼのデルタサブユニットをコードする遺伝子の抑制のためのＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰによるアリ種の制御。
【００５９】
ＡＴＰシンターゼのデルタサブユニットをコードする遺伝子もまた、ＲＮＡｉによって効果的に標的とすることで、他の昆虫との比較でのアリ種内の遺伝子配列の相違に基づいて、一般にアリ個体数を制御することができる。１〜３８７位間の３８７ヌクレオチド（配列番号４４）を含む、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＸＭ＿０１１１５８２０４．１）の少なくとも１つのセグメントは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａに特有である。上に特定されたＡＴＰシンターゼのデルタサブユニットをコードする遺伝子の特有領域と相同であるセンス配列及びアンチセンス配列の逆方向反復を含み、１５０塩基の非相同ループ配列によって分離された、合成ＤＮＡ配列を構築し、ｐＡＰＳＥ１０１３６へとクローニングした。実施例１及び２に記載されるように生成したＶＬＰを得る。働きアリ死亡率バイオアッセイを使用して、結果として得られるカプシド化ＲＮＡｉ前駆体がアリを制御する能力を決定した。配列番号３６（１０％のスクロース溶液中、５００ｍｇ／Ｌの濃度で提供）を含むＶＬＰは、８１％の１２日間の死亡率をもたらした。
【００６０】
実施例１６
Ｃｓｐ９遺伝子抑制のためのＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰによるアリ種の制御。
【００６１】
外皮及び脱皮を調節するＣｓｐ９遺伝子もまた、ＲＮＡｉによって効果的に標的とすることで、他の昆虫との比較でのアリ種内の遺伝子配列の相違に基づいて、一般にアリ個体数を制御することができる。４６〜２８３位間の２３８ヌクレオチド（配列番号４５）を含む、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＥＥ１２９４７１．１）の少なくとも１つのセグメントは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａに特有である。上に特定されたＣｓｐ９遺伝子の特有領域と相同であるセンス配列及びアンチセンス配列の逆方向反復を含み、１５０塩基の非相同ループ配列によって分離された、合成ＤＮＡ配列を構築し、ｐＡＰＳＥ１０１３６へとクローニングした。実施例１及び２に記載されるように生成したＶＬＰを得た。働きアリ死亡率バイオアッセイを使用して、結果として得られるカプシド化ＲＮＡｉ前駆体がアリを制御する能力を決定する。
【００６２】
実施例１７
ｒｐＬ３２遺伝子抑制のためのＲＮＡｉ前駆体を含有するＶＬＰによるアリ種の制御。
【００６３】
機能的リボソームへのｒＲＮＡの組み立て及び成熟に非常に重要なタンパク質をコードするｒｐＬ３２遺伝子もまた、ＲＮＡｉによって効果的に標的とすることで、他のハチ類昆虫との比較でのアリ種間の遺伝子配列の相違に基づいて、一般にアリ個体数を制御することができる。４６〜２８３位間の２３８ヌクレオチド（配列番号４５）を含む、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＥＥ１２９４７１．１）の少なくとも１つのセグメントは、Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａに特有である。ヌクレオチド４６４〜５３６（配列番号４６）及び４５２〜５３２（配列番号４７）のＳｏｌｅｎｏｐｓｉｓ  ｉｎｖｉｃｔａ遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＸＭ＿０１１１７５５０７１）の２つの追加のセグメントは、アカヒアリを制御するための特有のＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ標的となる。ヌクレオチド４１７〜４８９位（配列番号４８）及び４０５〜４８５位（配列番号４９）を含む、Ｃ．ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓのｒｐＬ３２遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＸＭ＿０１１２５７０２７１）の領域は、オオアリを制御するための特有のＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ標的となる。ヌクレオチド４３３〜５０５位（配列番号５０）及び４２１〜５０１位（配列番号５１）を含む、Ｌ．ｈｕｍｉｌｅのｒｐＬ３２遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＸＭ＿０１２３８００５８１）の領域は、アルゼンチンアリを制御するための特有のＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ標的となる。ヌクレオチド４５９〜５３１位（配列番号５２）及び４６３〜５４３位（配列番号５３）を含む、Ｍ．ｐｈａｒａｏｎｓｉｓのｒｐＬ３２遺伝子（ＮＣＢＩ配列識別子ＸＭ＿０１２６７１５７９１）の領域は、イエヒメアリを制御するための特有のＲＮＡｉまたはアンチセンスＲＮＡ標的となる。
【００６４】
上に特定されたｒｐＬ３２遺伝子の特有領域と相同であるセンス配列及びアンチセンス配列の逆方向反復を含み、１５０塩基の非相同ループ配列によって分離された、合成ＤＮＡ配列を構築し、ｐＡＰＳＥ１０１３６へとクローニングする。実施例１及び２に記載されるように生成したＶＬＰを得た。働きアリ死亡率バイオアッセイを使用して、結果として得られるカプシド化ＲＮＡｉ前駆体がアリを制御する能力を決定する。
【配列表】
2019510475000001.app
【国際調査報告】
2019510475.tif 000002
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