(57)【要約】  本記載は、ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達する方法に関する。方法は、細胞とポリペプチドカーゴとを、ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度のペプチドシャトル剤の存在下で、接触させることを含む。また、このような合成ペプチドシャトル剤の合理的な設計に使用され得るパラメーター、これらの設計パラメーターの１つまたは複数を満たすペプチドシャトル剤、ならびに種々のポリペプチドカーゴ（例えば、転写因子、抗体、ＣＲＩＳＰＲ結合ヌクレアーゼおよび機能的ゲノム編集複合体）の標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核への送達のための合成ペプチドシャトル剤の使用に関する方法および組成物も本明細書で記載される。免疫療法の改善のためのゲノム編集ＮＫ細胞の用途および標的も記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達する方法であって、前記方法は、前記標的真核細胞と前記ポリペプチドカーゴとを、シャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度の前記シャトル剤の存在下で接触させることを含み、前記シャトル剤が、
（１）少なくとも２０アミノ酸長であり、
（２）正に帯電した親水性の外面を有する両親媒性のアルファヘリックスモチーフ、および
（３）疎水性の外面を含み、
次のパラメーター（４）〜（１５）の内の少なくとも５つが満たされるペプチドであり、
（４）疎水性の外面が、ターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスのオープンシリンダー表現に基づいて、ペプチドのアミノ酸の１２〜５０％に相当する空間的に隣接するＬ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、および／またはＭアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含む；
（５）３．５〜１１の疎水性モーメント（μ）を有する；
（６）生理学的ｐＨで少なくとも＋４の予測正味電荷を有する；
（７）８〜１３の等電点（ｐＩ）を有する；
（８）３５％〜６５％のアミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、およびＶの任意の組み合わせから構成される；
（９）０％〜３０％のアミノ酸：Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴの任意の組み合わせから構成される；
（１０）３５％〜８５％のアミノ酸：Ａ、Ｌ、Ｋ、またはＲの任意の組み合わせから構成される；
（１１）少なくとも５％のＬがペプチド中に存在するという条件で、１５％〜４５％のアミノ酸：ＡおよびＬの任意の組み合わせから構成される；
（１２）２０％〜４５％のアミノ酸：ＫおよびＲの任意の組み合わせから構成される；
（１３）０％〜１０％のアミノ酸：ＤおよびＥの任意の組み合わせから構成される；
（１４）前記ペプチド中のＡおよびＬのパーセンテージ（％Ａ＋Ｌ）と、前記ペプチド中のＫとＲのパーセンテージ（Ｋ＋Ｒ）との差異が、１０％以下である；
（１５）１０％〜４５％のアミノ酸：Ｑ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、およびＨの任意の組み合わせから構成される、方法。
【請求項２】
前記シャトル剤が、少なくとも６個の、少なくとも７個の、少なくとも８個の、少なくとも９個の、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、または全ての本明細書に記載のパラメーター（４）〜（１５）を満たす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）前記シャトル剤が、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸の最小長、および４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、６０、６５、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０アミノ酸の最大長を有するペプチドであり、
（ｉｉ）前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０の下限値と、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、または１１．０の上限値との間の疎水性モーメント（μ）を有し、
（ｉｉｉ）前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、正に帯電した親水性外面を含み、この外面が、（ａ）ヘリカルホイール投影図上に、少なくとも２個、３個または４個の隣接する正に帯電したＫおよび／またはＲ残基；および／または（ｂ）ヘリカルホイール投影図上に、１００度の連続アミノ酸間の回転角度および／またはターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスに基づいて、３個から５個のＫおよび／またはＲ残基を含む６個の隣接する残基のセグメントを含み、
（ｉｖ）前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、疎水性の外面を含み、この疎水性の外面は、（ａ）ヘリカルホイール投影図上で、少なくとも２個の隣接するＬ残基；および／または（ｂ）ヘリカルホイール投影図上で、１００度の連続アミノ酸間の回転角度および／またはターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスに基づいて、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、およびＭから選択される少なくとも５個の疎水性の残基を含む１０個の隣接する残基のセグメント、を含み、
（ｖ）前記疎水性の外面が、前記ペプチドのアミノ酸の１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、または２０％から２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％に相当する空間的に隣接するＬ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、および／またはＭアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含み、
（ｖｉ）前記ペプチドが、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０の下限値と、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、または１０．５の上限値との間の疎水性モーメント（μ）を有し、
（ｖｉｉ）前記ペプチドが、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９〜＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、または＋１５の予測実効電荷を有し、
（ｖｉｉｉ）前記ペプチドが、１０〜１３の予測ｐＩを有し、または
（ｉｘ）（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の内の任意の組み合わせである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記シャトル剤が、次のパラメーターの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または全てを満たす、請求項１〜３いずれか１項に記載の方法：
（８）前記ペプチドが、３６％〜６４％、３７％〜６３％、３８％〜６２％、３９％〜６１％、４０％〜６０％のアミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、およびＶの任意の組み合わせから構成される；
（９）前記ペプチドが、１％〜２９％、２％〜２８％、３％〜２７％、４％〜２６％、５％〜２５％、６％〜２４％、７％〜２３％、８％〜２２％、９％〜２１％、または１０％〜２０％のアミノ酸：Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴの任意の組み合わせから構成される；
（１０）前記ペプチドが、３６％〜８０％、３７％〜７５％、３８％〜７０％、３９％〜６５％、または４０％〜６０％のアミノ酸：Ａ、Ｌ、Ｋ、またはＲの任意の組み合わせから構成される；
（１１）前記ペプチドが、１５％〜４０％、２０％〜４０％、２０％〜３５％、または２０％〜３０％のアミノ酸：ＡおよびＬの任意の組み合わせから構成される；
（１２）前記ペプチドが、２０％〜４０％、２０％〜３５％、または２０％〜３０％のアミノ酸：ＫおよびＲの任意の組み合わせから構成される；
（１３）前記ペプチドが、５％〜１０％のアミノ酸：ＤおよびＥの任意の組み合わせから構成される；
（１４）前記ペプチド中のＡおよびＬ残基パーセンテージ（％Ａ＋Ｌ）と、前記ペプチド中のＫおよび／またはＲ残基のパーセンテージと（Ｋ＋Ｒ）の差異が、９％、８％、７％、６％、または５％以下である；および
（１５）前記ペプチドが、１５〜４０％、２０％〜３５％、または２０％〜３０％のアミノ酸：Ｑ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、およびＨの任意の組み合わせから構成される。
【請求項５】
前記ペプチドが、ヒスチジンリッチドメインを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒスチジンリッチドメインが、
（ｉ）前記ペプチドのＮ末端に向けておよび／またはＣ末端に向けて配置され；
（ｉｉ）少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも９０％のヒスチジン残基を含む、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個のアミノ酸のストレッチである、および／または少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、または少なくとも９個の連続するヒスチジン残基を含み；または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドが、セリンおよび／またはグリシン残基が濃縮されたフレキシブルリンカードメインを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドが、次記のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）［Ｘ１］−［Ｘ２］−［リンカー］−［Ｘ３］−［Ｘ４］（式１）；
（ｂ）［Ｘ１］−［Ｘ２］−［リンカー］−［Ｘ４］−［Ｘ３］（式２）；
（ｃ）［Ｘ２］−［Ｘ１］−［リンカー］−［Ｘ３］−［Ｘ４］（式３）；
（ｄ）［Ｘ２］−［Ｘ１］−［リンカー］−［Ｘ４］−［Ｘ３］（式４）；
（ｅ）［Ｘ３］−［Ｘ４］−［リンカー］−［Ｘ１］−［Ｘ２］（式５）；
（ｆ）［Ｘ３］−［Ｘ４］−［リンカー］−［Ｘ２］−［Ｘ１］（式６）；
（ｇ）［Ｘ４］−［Ｘ３］−［リンカー］−［Ｘ１］−［Ｘ２］（式７）；または
（ｈ）［Ｘ４］−［Ｘ３］−［リンカー］−［Ｘ２］−［Ｘ１］（式８）；
式中、
［Ｘ１］が、次記から選択され：２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［＋］−；１［＋］−１［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；および１［＋］−１［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［＋］−；
［Ｘ２］が次記から選択され：−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［ζ］−；−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［＋］−；−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［＋］−１［ζ］−；−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−２［＋］−；−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−２［ζ］−；−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−１［＋］−１［ζ］−；および−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；
［Ｘ３］が次記から選択され：−４［＋］−Ａ−；−３［＋］−Ｇ−Ａ−；−３［＋］−Ａ−Ａ−；−２［＋］−１［Φ］−１［＋］−Ａ−；−２［＋］−１［Φ］−Ｇ−Ａ−；−２［＋］−１［Φ］−Ａ−Ａ−；または−２［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−２［＋］−Ａ−Ｇ−Ａ；−２［＋］−Ａ−Ａ−Ａ−；−１［Φ］−３［＋］−Ａ−；−１［Φ］−２［＋］−Ｇ−Ａ−；−１［Φ］−２［＋］−Ａ−Ａ−；−１［Φ］−１［＋］−１［Φ］−１［＋］−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−１［Φ］−Ｇ−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−１［Φ］−Ａ−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−Ａ−Ｇ−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−Ａ−Ａ−Ａ；−Ａ−１［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−Ａ−１［＋］−Ａ−Ｇ−Ａ；および−Ａ−１［＋］−Ａ−Ａ−Ａ；
［Ｘ４］が次記から選択され：−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−Ａ；−１［ζ］−２Ａ−２［＋］；−１［＋］−２Ａ−１［＋］−Ａ；−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［ζ］−Ａ−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−２［＋］−Ａ−２［＋］；−２［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−２［＋］−Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−２［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］−Ａ；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−２［＋］；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−２［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−２［ζ］−２［＋］；−１［＋］−２［ζ］−１［＋］−Ａ；−１［＋］−２［ζ］−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−２［ζ］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−３［ζ］−２［＋］；−３［ζ］−１［＋］−Ａ；−３［ζ］−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−Ａ；−１［ζ］−２Ａ−２［＋］；−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−２［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−２［＋］−１［ζ］−１［＋］−Ａ；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］−Ａ；−１［＋］−２Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；および−１［ζ］−Ａ−１［ζ］−Ａ−１［＋］；および
［リンカー］が、次記から選択され：−Ｇｎ−；−Ｓｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎＧｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎＳｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎＧｎ（ＧｎＳｎ）ｎ−；および−（ＧｎＳｎ）ｎＳｎ（ＧｎＳｎ）ｎ−；
式中、
［Φ］はアミノ酸：Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり；
［＋］は、アミノ酸：ＬｙｓまたはＡｒｇであり；
［ζ］が、アミノ酸：Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒであり；
Ａが、アミノ酸：Ａｌａであり；
Ｇが、アミノ酸：Ｇｌｙであり；
Ｓが、アミノ酸：Ｓｅｒであり；および
ｎが、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜１〜４、または１〜３の整数である。
【請求項９】
（ｉ）前記ペプチドが、配列番号１０４、１０５、１０７、１０８、１１０〜１３１、１３３〜１３５、１３８、１４０、１４２、１４５、１４８、１５１、１５２、１６９〜２４２、および２４３〜１０２４２のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である；または前記ペプチドが、配列番号１０４、１０５、１０７、１０８、１１０〜１３１、１３３〜１３５、１３８、１４０、１４２、１４５、１４８、１５１、１５２、１６９〜２４２、および２４３〜１０２４２のいずれか１つの機能性バリアントを含むまたはそれからなり；
（ｉｉ）前記ペプチドが：
（ａ）配列番号１０４、１０５、１０７、１０８、１１０〜１３１、１３３〜１３５、１３８、１４０、１４２、１４５、１４８、１５１、１５２、１６９〜２４２、および２４３〜１０２４２のいずれか１個のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、
（ｂ）配列番号１５８および／または１５９のアミノ酸配列モチーフを含み；または
（ｃ）配列番号１５９のアミノ酸配列モチーフに作動可能に連結された配列番号１５８のアミノ酸配列モチーフを含み；または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドが、エンドソーム漏出ドメイン（ＥＬＤ）、および／または細胞膜透過性ドメイン（ＣＰＤ）を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）前記ＥＬＤが、エンドソーム溶解性ペプチド、抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）、直鎖状カチオン性アルファヘリックス抗菌性ペプチド、セクロピン−Ａ／メリチンハイブリッド（ＣＭシリーズ）ペプチド、ｐＨ依存性膜活性ペプチド（ＰＡＭＰ）、ペプチド両親媒性物質、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）のＨＡ２サブユニットのＮ末端に由来するペプチド、ＣＭ１８、ジフテリア毒素Ｔドメイン（ＤＴ）、ＧＡＬＡ、ＰＥＡ、ＩＮＦ−７、ＬＡＨ４、ＨＧＰ、Ｈ５ＷＹＧ、ＨＡ２、ＥＢ１、ＶＳＶＧ、シュードモナス毒素、メリチン、ＫＡＬＡ、ＪＳＴ−１、Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ、Ｇ（ＬＬＫＫ）３Ｇまたはそれらの任意の組合せであるか、またはそれに由来する、
（ｉｉ）前記ＣＰＤが、細胞膜透過性ペプチドまたは細胞膜透過性ペプチド由来のタンパク質形質導入ドメイン、ＴＡＴ、ＰＴＤ４、ペネトラチン（アンテナペディア）、ｐＶＥＣ、Ｍ９１８、Ｐｅｐ−１、Ｐｅｐ−２、キセントリー（Ｘｅｎｔｒｙ）、アルギニンストレッチ、トランスポータン、ＳｙｎＢ１、ＳｙｎＢ３またはそれらの任意の組合せであるか、またはそれに由来する、または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが、
（ａ）配列番号１〜１５、６３または６４のいずれか１つのアミノ酸配列、またはエンドソーム溶解活性を有するそのバリアントまたは断片を含むＥＬＤ；
（ｂ）配列番号１６〜２７または６５のいずれか１つのアミノ酸配列または細胞膜透過性活性を有するそのバリアントまたは断片を含むＣＰＤ；または
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）前記ペプチドが、配列番号１、１４、または６３のアミノ酸配列を有するＣＭ１８、ＫＡＬＡ、またはＣ（ＬＬＫＫ）３ＣであるＥＬＤ、または配列番号１、１４、または６３と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、エンドソーム溶解活性を有するそのバリアントであるＥＬＤを含み、
（ｉｉ）前記ペプチドが、配列番号１７または６５のアミノ酸配列を有するＴＡＴまたはＰＴＤ４であるＣＰＤ、または配列番号１７または６５と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一性を有し、細胞膜透過活性を有するそのバリアントであるＣＰＤを含み、または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドが、配列番号５７〜５９、６６〜７２もしくは８２〜１０２のいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号５７〜５９、６６〜７２もしくは８２〜１０２のいずれか１つに対して、少なくとも８５％、９０％、または９５％の同一性を有するその機能性バリアントを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）前記シャトル剤が、前記標的真核細胞により完全に代謝可能であり；および／または
（ｉｉ）前記標的真核細胞と前記ポリペプチドカーゴとを前記シャトル剤の存在下で接触させることにより、前記シャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率が、少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍まで、高められる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
インビトロ法である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか１項で定義のペプチドである合成ペプチドシャトル剤。
【請求項１８】
配列番号１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３８、１４０、１４２、１４５、１４８、１５１、１５２、１６９〜２４２、および２４３〜１０２４２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、または配列番号１５８および／または１５９のアミノ酸配列モチーフを含む、２０〜１００アミノ酸長さのペプチドである、請求項１７に記載の合成ペプチド。
【請求項１９】
ポリペプチドカーゴを、標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核へのインビトロでの送達に使用するための、請求項１７または１８に記載の合成ペプチドシャトル剤であって、前記合成ペプチドシャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度で使用される、合成ペプチドシャトル剤。
【請求項２０】
ポリペプチドカーゴを、標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核へのインビボでの送達に使用するための、請求項１７または１８に記載の合成ペプチドシャトル剤であって、前記合成ペプチドシャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度で使用される、合成ペプチドシャトル剤。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれか１項で定義のシャトル剤、または少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種の異なるタイプの請求項１〜１５のいずれか１項で定義のシャトル剤のカクテル、および標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核へ送達されるべきポリペプチドカーゴを含む、組成物。
【請求項２２】
ポリペプチドカーゴを、標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するための、請求項１〜１５のいずれか１項で定義のシャトル剤、または請求項１８で定義の合成ペプチドの使用であって、前記シャトル剤または合成ペプチドが、前記シャトル剤または合成ペプチドの非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度で使用される、使用。
【請求項２３】
ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するためのキットであって、請求項１〜１５のいずれか１項で定義のシャトル剤、または請求項１８で定義の合成ペプチド、および好適な容器を含む、キット。
【請求項２４】
前記ポリペプチドカーゴが、細胞膜透過性ドメインを欠いている、請求項１〜１６のいずれか１項に記載方法、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の合成ペプチドシャトル剤、請求項２１に記載の組成物、請求項２２に記載の使用、または請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記ポリペプチドカーゴが、細胞膜透過性ドメインを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載方法、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の合成ペプチドシャトル剤、請求項２１に記載の組成物、請求項２２に記載の使用、または請求項２３に記載のキット。
【請求項２６】
前記ポリペプチドカーゴが、細胞内ターゲティングドメインを含む、請求項１〜１６、２４または２５のいずれか１項に記載の方法、請求項１７〜２０、２４または２５のいずれか１項に記載の合成ペプチドシャトル剤、請求項２１、２４または２５に記載の組成物、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
前記細胞内ターゲティングドメインが、
（ａ）核移行シグナル（ＮＬＳ）；
（ｂ）核小体シグナル配列；
（ｃ）ミトコンドリアシグナル配列；または
（ｄ）ペルオキシソームシグナル配列、である、請求項２６に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【請求項２８】
（ａ）前記ＮＬＳが、Ｅ１ａ、Ｔ−Ａｇ、ｃ−ｍｙｃ、Ｔ−Ａｇ、ｏｐ−Ｔ−ＮＬＳ、Ｖｐ３、ヌクレオプラスミン、ヒストン２Ｂ、ゼノパスＮ１、ＰＡＲＰ、ＰＤＸ−１、ＱＫＩ−５、ＨＣＤＡ、Ｈ２Ｂ、ｖ−Ｒｅｌ、Ａｍｉｄａ、ＲａｎＢＰ３、Ｐｈｏ４ｐ、ＬＥＦ−１、ＴＣＦ−１、ＢＤＶ−Ｐ、ＴＲ２、ＳＯＸ９もしくはＭａｘに由来する、
（ｂ）前記核小体シグナル配列が、ＢＩＲＣ５もしくはＲＥＣＱＬ４に由来する、
（ｃ）前記ミトコンドリアシグナル配列が、Ｔｉｍ９もしくは酵母チトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＶに由来する、または
（ｄ）前記ペルオキシソームシグナル配列が、ＰＴＳ１に由来する、請求項２７に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【請求項２９】
前記ポリペプチドカーゴが、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子と複合体化されている、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【請求項３０】
前記ポリペプチドカーゴが、転写因子、ヌクレアーゼ、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、抗体、ペプチドカーゴ、酵素、酵素阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【請求項３１】
（ａ）前記転写因子が、ＨＯＸＢ４、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ９、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＭｙｏＤ、Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３、ＭａｆＡ、Ｂｌｉｍｐ−１、Ｅｏｍｅｓ、Ｔ−ｂｅｔ、ＦＯＸＯ３Ａ、ＮＦ−ＹＡ、ＳＡＬＬ４、ＩＳＬ１、ＦｏｘＡ１、Ｎａｎｏｇ、Ｅｓｒｒｂ、Ｌｉｎ２８、ＨＩＦ１−ａｌｐｈａ、Ｈｌｆ、Ｒｕｎｘ１ｔ１、Ｐｂｘ１、Ｌｍｏ２、Ｚｆｐ３７、Ｐｒｄｍ５、Ｂｃｌ−６またはそれらの任意の組合せであり；
（ｂ）前記ヌクレアーゼが、触媒的に活性なまたは触媒的に死んだ：ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、Ｃｐｆ１、ＣａｓＹ、ＣａｓＸ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼもしくはメガヌクレアーゼ、ＤＮＡ誘導性ヌクレアーゼ、ナトロノバクテリウム・グレゴリーアルゴノート（ＮｇＡｇｏ）、またはそれらの任意の組合せであり；
（ｃ）前記抗体が細胞内抗原を認識し；および／または
（ｄ）前記ペプチドカーゴが、細胞内分子を認識する、請求項３０に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【請求項３２】
細胞治療、ゲノム編集、養子細胞移入、および／または再生医療において使用するための、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【請求項３３】
前記標的真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、幹細胞、初代細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞である、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【請求項３４】
請求項１〜１５のいずれか１項で定義のシャトル剤、請求項１８で定義の合成ペプチドシャトル剤、または請求項２１で定義の組成物を含む、真核細胞。
【請求項３５】
動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、幹細胞、初代細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞である、請求項３４に記載の真核細胞。
【請求項３６】
１種または複数のＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼを単独でまたは１種または複数の対応するガイドＲＮＡおよび／または直鎖ＤＮＡテンプレートと一緒に、標的真核細胞に送達する方法であって、前記標的真核細胞と前記エンドヌクレアーゼとを、シャトル剤の非存在下の場合に比べて前記エンドヌクレアーゼの形質導入効率を高めるのに十分な濃度の前記シャトル剤の存在下で、接触させることを含み、前記シャトル剤が、請求項１〜１５のいずれか１項で定義される通りである、方法。
【請求項３７】
インビトロ法、またはインビボ法である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記１種または複数のヌクレアーゼが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記１種または複数のエンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、またはこれらの任意の組み合わせ；または触媒的に死んだＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｄＣａｓ９）、ｄＣｐｆ１、ｄＣａｓＸ、ｄＣａｓＹ、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、幹細胞、初代細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞である、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記１種または複数の対応するガイドＲＮＡおよび／または直鎖ＤＮＡテンプレートが、１種または複数の遺伝子を標的にして、対応する前記方法に供されていない親真核細胞に比較して、免疫原性を低減する、細胞傷害性を改善する、および／または別の方法で前記標的真核細胞の細胞療法のための有効性を改善する、請求項５８に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞療法が、細胞ベース癌免疫療法である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記１種または複数の対応するガイドＲＮＡおよび／または直鎖ＤＮＡテンプレートが、ＣＢＬＢ遺伝子、ｃ−ＣＢＬ遺伝子、ＧＳＫ３遺伝子、ＩＬＴ２遺伝子、ＣＩＳＨ遺伝子、ＮＫＧ２ａ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子、またはこれらの任意の組み合わせを標的とする、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達する合成ペプチドシャトル剤の製造方法であって、次記のペプチドを合成することを含む方法：
（１）少なくとも２０アミノ酸長であり、
（２）正に帯電した親水性の外面を有する両親媒性のアルファヘリックスモチーフ、および
（３）疎水性の外面を含み、
次のパラメーター（４）〜（１５）の内の少なくとも５つが満たされるペプチド。
（４）疎水性の外面が、ターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスのオープンシリンダー表現に基づいて、ペプチドのアミノ酸の１２〜５０％に相当する空間的に隣接するＬ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、および／またはＭアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含む；
（５）３．５〜１１の疎水性モーメント（μ）を有する；
（６）生理学的ｐＨで少なくとも＋４の予測正味電荷を有する；
（７）８〜１３の等電点（ｐＩ）を有する；
（８）３５％〜６５％のアミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、およびＶの任意の組み合わせから構成される；
（９）０％〜３０％のアミノ酸：Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴの任意の組み合わせから構成される；
（１０）３５％〜８５％のアミノ酸：Ａ、Ｌ、Ｋ、またはＲの任意の組み合わせから構成される；
（１１）少なくとも５％のＬがペプチド中に存在するという条件で、１５％〜４５％のアミノ酸：ＡおよびＬの任意の組み合わせから構成される；
（１２）２０％〜４５％のアミノ酸：ＫおよびＲの任意の組み合わせから構成される；
（１３）０％〜１０％のアミノ酸：ＤおよびＥの任意の組み合わせから構成される；
（１４）前記ペプチド中のＡおよびＬのパーセンテージ（％Ａ＋Ｌ）と、前記ペプチド中のＫとＲのパーセンテージ（Ｋ＋Ｒ）との差異が、１０％以下である；
（１５）１０％〜４５％のアミノ酸：Ｑ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、およびＨの任意の組み合わせから構成される。
【請求項４５】
前記ペプチドが請求項２〜１５のいずれか１項で定義の通りである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するシャトル剤を特定する方法であって、次記を含む方法：
（ａ）請求項１〜１５または１８のいずれか１項で定義のペプチドであるペプチドを合成すること；
（ｂ）前記標的真核細胞と前記ポリペプチドカーゴとを、前記ペプチドの存在下で、接触させること；
（ｃ）前記標的真核細胞中の前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を測定すること；および
（ｄ）前記標的真核細胞中の前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率の増加が観察される場合、前記ポリペプチドカーゴを形質導入するシャトル剤として、前記ペプチドを特定すること。
【請求項４７】
前記ポリペプチドカーゴが請求項２４〜３１のいずれか１項で定義の通りである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
次記を含むゲノム編集系：
（ａ）請求項１〜１５または１８のいずれか１項で定義のシャトル剤；
（ｂ）１種または複数のＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼ；および
（ｃ）１種または複数のガイドＲＮＡ。
【請求項４９】
ゲノム編集を制御する直鎖ＤＮＡテンプレートをさらに含む、請求項４８に記載のゲノム編集系。
【請求項５０】
前記１種または複数のＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ結合タンパク質９（Ｃａｓ９）、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項４８または４９に記載のゲノム編集系。
【請求項５１】
目的のポリペプチドカーゴを形質導入した真核細胞を濃縮する方法であって、次記を含む方法：
（ａ）目的のポリペプチドカーゴおよびマーカータンパク質を用いた標的真核細胞集団を同時形質導入すること；および
（ｂ）前記マーカータンパク質を形質導入された真核細胞を単離または濃縮し、それにより、前記目的のポリペプチドカーゴを形質導入された真核細胞を濃縮すること。
【請求項５２】
（ｉ）前記マーカータンパク質が前記目的のポリペプチドカーゴに共有結合していない、前記マーカータンパク質が前記目的のポリペプチドカーゴに共有結合している、前記マーカータンパク質が前記目的のポリペプチドカーゴに非共有結合している、または前記マーカータンパク質が切断可能リンカーを介して前記目的のポリペプチドカーゴに共有結合している；および／または
（ｉｉ）前記マーカータンパク質が検出可能な標識を含むか、または前記マーカータンパク質が蛍光タンパク質、蛍光標識タンパク質、生物発光タンパク質、同位体標識タンパク質、もしくは磁気標識タンパク質である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記形質導入マーカータンパク質の細胞内濃度が、前記目的の形質導入ポリペプチドカーゴの細胞内濃度と、正の相関をする、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記マーカータンパク質を形質導入された真核細胞が、フローサイトメトリー、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を用いて単離または濃縮される、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記マーカータンパク質を形質導入された真核細胞が、前記マーカータンパク質を欠く細胞から単離または選別され、それにより、マーカータンパク質陽性細胞集団および／またはマーカータンパク質陰性細胞集団を製造する、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
ステップ（ａ）および（ｂ）を、前記マーカータンパク質陰性細胞集団、前記マーカータンパク質陽性細胞集団、または前記マーカータンパク質陰性および前記マーカータンパク質陽性細胞集団の両方に対して１回または複数回反復することをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記マーカータンパク質を形質導入された真核細胞が、前記マーカータンパク質のそれらの細胞内の濃度を基準にして単離または選別される、請求項５１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記マーカータンパク質が、細胞増殖を刺激するタンパク質、細胞分化を刺激するタンパク質、細胞生存を促進するタンパク質、抗アポトーシス性タンパク質、または別の生物活性を有するタンパク質である、請求項５１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記目的のポリペプチドカーゴおよび前記マーカータンパク質が、ペプチド形質導入剤の存在下で、前記標的真核細胞を前記ポリペプチドカーゴおよび前記マーカータンパク質と接触させることにより同時形質導入され、ペプチド形質導入剤が、前記ペプチド形質導入剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴおよび前記マーカータンパク質の形質導入効率を高めるのに十分な濃度で存在する、請求項５１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
（ａ）前記ペプチド形質導入剤が、エンドソーム溶解性ペプチドであり；
（ｂ）前記ペプチド形質導入剤が、請求項１７または１８で定義の前記合成ペプチドシャトル剤であるか、またはそれを含み；
（ｃ）標的真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、幹細胞、初代細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞を含み；
（ｄ）前記目的のポリペプチドカーゴが、（ｉ）請求項２４〜３１のいずれか１項で定義のポリペプチドカーゴ；および／または（ｉｉ）１種または複数のＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼ単独でまたは１種または複数の対応する請求項３８〜４３のいずれか１項で定義のガイドＲＮＡおよび／または直鎖ＤＮＡテンプレートと一緒の前記１種または複数のＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼであり；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせである、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本記載は、種々のポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するために有用な合成ペプチドシャトル剤に関する。より具体的には、本記載は、このような合成ペプチドシャトル剤の合理的な設計に有用なパラメーターに関する。
【背景技術】
【０００２】
大きな分子を真核細胞の内部に輸送するための細胞送達技術は、特に、バイオ医薬品産業において、幅広い適用を有する。いくつかの可溶性化学物質（例えば、小分子薬）は、真核細胞膜を通って受動的に拡散し得るが、大きなカーゴ（例えば、生物製剤、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド）は、その細胞内標的に到達するためにシャトル剤の助けを必要とする。
【０００３】
細胞送達技術における進歩から大きな利益を得ると思われる領域には、ゲノム編集および細胞治療の分野が含まれ、この分野はこの２０年の間に大きな躍進を遂げた。細胞増殖、分化および再プログラムを支配する種々の増殖因子および分子手がかりを解読することにより、満たされていない医学的必要性に対応するための多数の治療的可能性の道を開くことになる。例えば、成熟細胞からの多能性幹細胞の直接的な誘導、直接細胞変換（分化転換）およびゲノム編集（ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（商標）およびＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼ技術）が、臨床適用のために細胞の治療価値を最大化するために開発された方法の例である。現在、高い治療活性を有する細胞の製造には、通常、主にウイルス性形質導入により達成されるエクスビボ操作が必要であり、ヒト適用のために重要な安全性および経済上の懸念が生じている。転写因子または人工ヌクレアーゼなどの活性タンパク質を、これらの細胞の内部に直接送達する能力は、有利なことに、安全性の懸念およびより危険な遺伝子導入法と関連する規制当局による障壁を回避し得る。特に、免疫療法を改善するために、活性ゲノム編集複合体を直接免疫細胞中に送達する方法は、極めて望ましいであろう。
【０００４】
組換えタンパク質カーゴを、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶトランス活性化タンパク質ＴＡＴ）と直接融合することを含むタンパク質形質導入手法は、多量の組換えタンパク質を必要とし、カーゴを適切な細胞内位置に送達できないことも多く、大量のエンドソームトラップおよび最終的な分解につながる。エンドソームにより捕捉されたカーゴのサイトゾルへの脱出を容易にしようとして、いくつかのエンドソーム膜破壊ペプチドが開発された。しかし、これらのエンドソーム溶解性ペプチドの多くは、すでに細胞内に送達されたカーゴのエンドソーム捕捉を軽減するように使用され、それ自体は、カーゴを細胞膜を横切って細胞内に運ぶ最初のシャトリングステップを支援しない（Ｓａｌｏｍｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｓａｌｏｍｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｅｒａｚｏ−Ｏｌｉｖｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｆａｓｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０００５】
特に、Ｓａｌｏｍｏｎｅらは、２０１２年に、Ｔａｔ１１細胞透過モチーフのＣＭ１８ハイブリッド（セクロピン−Ａの１−７およびメリチンの２−１２の残基）への融合から生じたキメラペプチドＣＭ１８−ＴＡＴ１１について記載している。このペプチドは、細胞に急速に内部移行し（そのＴＡＴモチーフによる）、その後、細胞内小胞の膜の不安定化に関与する（ＣＭ１８ペプチドの膜破壊能力による）。蛍光標識Ａｔｔｏ−６３３（分子量：７７４Ｄａ；ペプチドの分子量の２１％）に融合したペプチドＣＭ１８−ＴＡＴ１１は、エンドソーム捕捉されたＴＡＴ１１−ＥＧＦＰのサイトゾルへの脱出を容易にすると報告された（Ｓａｌｏｍｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２の図３を参照されたい）が、ＣＭ１８−ＴＡＴ１１ペプチド（単独でまたはＡｔｔｏ−６３３と複合化して）は、ポリペプチドカーゴの細胞外間隙から細胞内部への−すなわち、細胞膜を横切る送達を増大させることができるシャトル剤として機能しないことが示された。実際に、Ｓａｌｏｍｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２は、同時処理（ＴＡＴ１１−ＥＧＦＰおよびＣＭ１８−ＴＡＴ１１−Ａｔｔｏ−６３３の同時処理）と時間シフト処理（すなわち、ＴＡＴ１１−ＥＧＦＰ単独で細胞のインキュベーション後、蛍光イメージングを行い、その後、ＣＭ１８−ＴＡＴ１１−Ａｔｔｏ−６３３ペプチド単独で同じ細胞のインキュベーションの後に、再度蛍光イメージング）とを比較し、著者は、「両方とも同じ送達結果であった」ことを報告した（Ｓａｌｏｍｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２の２９５ページ、見出し「２．９  カーゴ送達アッセイ」の第１段落の最後の文を参照されたい）。換言すれば、Ｓａｌｏｍｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２は、ＣＭ１８−ＴＡＴ１１ペプチド（単独でまたはＡｔｔｏ−６３３と複合化して）ポリペプチドカーゴの細胞外間隙から細胞内への送達（すなわち、タンパク質形質導入）に影響を与えなかったことを記載した。したがって、ポリペプチドカーゴの形質導入効率を増大可能で、標的真核細胞のサイトゾルおよび／または核にカーゴを送達可能な改善されたシャトル剤の必要性が残されている。
【０００６】
本記載は、多数の文献に言及し、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓａｌｏｍｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２
【非特許文献２】Ｓａｌｏｍｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３
【非特許文献３】Ｅｒａｚｏ−Ｏｌｉｖｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【非特許文献４】Ｆａｓｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４
【発明の概要】
【０００８】
複数の異なるペプチドを、独立したポリペプチドカーゴを細胞内で真核細胞のサイトゾル／核に送達できるポリペプチドベースのシャトル剤を特定する目的でスクリーニングした。 一方では、これらの大規模スクリーニングの取り組みは、特定のドメインベースペプチドシャトル剤が、最終的にポリペプチドカーゴを内部移行する細胞の数および／または比率を増大させ、また、内部移行カーゴのサイトゾル／核区画への到達を可能とする（したがって、カーゴのエンドソーム捕捉を回避または減らす）ことにより、ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるという意外な発見をもたらした。これらのドメインベースシャトル剤は、細胞膜透過性ドメイン（ＣＰＤ）と作動可能に連結されたエンドソーム漏出ドメイン（ＥＬＤ）、および任意選択で１つまたは複数のヒスチジンリッチドメインを含む。他方では、上記スクリーニングの取り組みはまた、ポリペプチドカーゴ形質導入活性、過度の毒性、および／またはその他の望ましくない特性（例えば、不十分な溶解度および／または安定性）を持たないまたはそれらが低いいくつかのペプチドを明らかにした。本明細書では、これらの経験的データ（好ましいまたは好ましくないの両方の）を使用して、タンパク質形質導入活性を有するペプチドの合理的な設計および／または特定を可能とする一組の設計パラメーターにたどり着くために、うまくいく、あまりうまくいかない、および失敗するペプチドの生理化学的特性を特定した。
【０００９】
したがって、本記載は、シャトル剤の非存在下の場合に比べて、ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度の本明細書に記載のペプチドシャトル剤の存在下で、ポリペプチドカーゴを細胞と接触させることにより、ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するための方法に関する。より具体的には、本記載は、このような合成ペプチドシャトル剤の合理的な設計に使用され得るパラメーター、これらの設計パラメーターの１つまたは複数を満たすペプチドシャトル剤、ならびに種々のポリペプチドカーゴの標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核への送達のための合成ペプチドシャトル剤の使用に関する方法および組成物に関する。本記載はまた、本明細書に記載の１種または複数の設計パラメーターを満たすペプチドバリアントを生成するのに使用し得る機械学習またはコンピューター支援手法にも関する。
【００１０】
本記載はまた、目的のポリペプチドカーゴおよび形質導入細胞を特定および／または濃縮する手段としてのマーカータンパク質の同時形質導入に関する。意外にも、著しく高い比率の目的のポリペプチドカーゴをうまく形質導入した標的真核細胞が、同様に、マーカータンパク質もうまく形質導入したことが発見された。逆に、目的のポリペプチドカーゴを形質導入しなかった細胞の内の著しく高比率の細胞は、同様に、マーカータンパク質も形質導入しなかった。マーカータンパク質陽性の細胞の単離（例えば、ＦＡＣＳにより）により、うまく目的のポリペプチドカーゴを形質導入した細胞の比率が大きく増加し、相関は、最も高いマーカータンパク質の蛍光を示す細胞集団はまた、目的のポリペプチドカーゴの最も高い形質導入比率を示す傾向があるという点で、濃度依存性であることが明らかになった。また、第１ラウンドの目的のポリペプチドカーゴの形質導入後に、形質導入に失敗した細胞を単離して、その後の形質導入ラウンドで目的のポリペプチドカーゴを再形質導入し得るということも発見された。したがって、いくつかの態様では、本記載は、目的のポリペプチドカーゴのマーカータンパク質との同時形質導入を含む方法に関し、マーカータンパク質を使用して、目的のポリペプチドカーゴを形質導入した細胞を単離または濃縮し得る。いくつかの実施形態では、本記載はまた、例えば、第１のまたは前の形質導入反応後に、マーカータンパク質の形質導入に失敗した細胞に対し実施する、反復連続的形質導入実験を含む方法に関する。このような方法は、有用な細胞集団（例えば、細胞治療用の患者由来細胞）、および／または本質的に形質導入がより困難な細胞集団での形質導入効率を向上させるための魅力的な手法を提供する。
【００１１】
一般定義
表題およびその他の識別子、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）、（ｉｉ）、などは、単に、本明細書および特許請求の範囲の読み取りを容易にするために提示される。本明細書および特許請求の範囲における表題およびその他の識別子の使用は、ステップまたは要素が、アルファベット順または番号順で、またはそれらが提示される順序で実施されることを必ずしも必要としない。
【００１２】
単語「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とともに使用される場合には、「１つ」を意味し得るが、「１つまたは複数の」、「少なくとも１つの」および「１つまたは２つ以上の」の意味とも一致する。
【００１３】
用語「約」は、値が、値を決定するために使用されているデバイスまたは方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。一般に、技術用語「約」は、最大１０％の起こり得る変動を指定するものとする。したがって、値の１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０％の変動が、用語「約」中に含まれる。別に示されない限り、範囲の前の用語「約」の使用は、範囲の両端に適用される。
【００１４】
本明細書および特許請求の範囲において、使用されるように、単語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）（および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの、含んでいるの任意の形態）、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」（および「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」などの有しているの任意の形態）、含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）（および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの、含んでいるの任意の形態）または含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）などの、含有しているの任意の形態）は、包括的またはオープンエンドであり、さらなる列挙されていない要素または方法ステップを排除しない。
【００１５】
本明細書において、「タンパク質」または「ポリペプチド」または「ペプチド」は、任意の種類の修飾（例えば、アセチル化、リン酸化、グリコシル化、硫酸化（ｓｕｌｆａｔａｔｉｏｎ）、ＳＵＭＯ化、プレニル化、ユビキチン化などといった化学または翻訳後修飾）を含む場合も、含まない場合もある、アミノ酸の任意のペプチド連結している鎖を意味する。さらに明瞭にするために、修飾が本明細書に記載のシャトル剤のタンパク質形質導入活性を破壊しない限り、タンパク質／ポリペプチド／ペプチド修飾が想定される。
【００１６】
本明細書において、「ドメイン」または「タンパク質ドメイン」は、一般に、特定の官能基または機能を有するタンパク質の一部を指す。いくつかのドメインは、タンパク質の残部から分離された場合にその機能を保存し、したがって、モジュール方式で使用され得る。多数のタンパク質ドメインのモジュール特性は、本記載のシャトル剤内のその配置により可撓性を提供し得る。しかし、いくつかのドメインは、シャトル剤の特定の位置に（例えば、Ｎ末端またはＣ末端領域にまたはその間に）遺伝子操作された場合により良好に機能し得る。その内因性タンパク質内のドメインの位置は、ドメインが、シャトル剤内で遺伝子操作されるべき場所の指標およびリンカーのどの種類／長さが使用されるべきであるかの指標となることもある。標準組換えＤＮＡ技術は、本開示を考慮して本記載のシャトル剤内のドメインの配置および／または数を操作するために当業者により使用され得る。さらに、シャトル剤中において、ドメインの各々の機能性（例えば、細胞膜を横切る細胞浸透、エンドソーム脱出および／またはサイトゾルへのアクセスを促進する能力）を評価するために、本明細書に開示される、並びにその他の当技術分野で公知のアッセイが使用され得る。標準的な方法を用いて、シャトル剤のドメインが、細胞内に送達されるべきカーゴの活性に影響を及ぼすか否かを評価することもできる。この関連で、表現「作動可能に連結された」とは、本明細書において、本記載のシャトル剤中において、ドメインのその意図される機能（例えば、細胞浸透、エンドソーム脱出および／または細胞内ターゲッティング）を実施する能力を指す。より明確にするために、表現「作動可能に連結された」は、それらの間の特定の順序または距離に制限されない、２種以上のドメイン間の機能的結合を定義するものとする。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「合成ペプチド」または「合成ポリペプチド」などの表現において、使用される、用語「合成」は、インビトロで製造され得る（例えば、化学的に合成される、および／または組換えＤＮＡ技術を使用して製造される）天然に存在しない分子を指すものとする。種々の合成調製物の純度は、例えば、高性能液体クロマトグラフィー解析および質量分析法により評価され得る。化学合成アプローチは、それらが、大規模な組換えタンパク質精製ステップ（例えば、臨床使用のために必要とされる）の必要性を排除し得るので、細胞発現系（例えば、酵母または細菌タンパク質発現系）よりも有利であり得る。対照的に、より長い合成ポリペプチドは、より複雑であり得、および／または化学合成アプローチによって、製造するのに費用がかさみ得、このようなポリペプチドは、細胞発現系を使用してより有利に製造され得る。いくつかの実施形態では、本記載のペプチドまたはシャトル剤は、組換え宿主細胞から発現されるのとは対照的に、化学的に合成（例えば、固相または液相ペプチド合成）され得る。いくつかの実施形態では、本記載のペプチドまたはシャトル剤は、Ｎ末端メチオニン残基を欠き得る。当業者は、本記載の合成ペプチドまたはシャトル剤を、１種もしくは複数の修飾されたアミノ酸（例えば、天然に生じないアミノ酸）を使用することによって、または本記載の合成ペプチドもしくはシャトル剤を化学的に修飾することによって、安定性の特定の必要性またはその他の必要性に合うように適応させることができる。
【００１８】
本記載のシャトル剤に関連して、本明細書において使用される場合に、表現「ポリペプチドベースの」は、目下記載されるシャトル剤を、細胞毒性の増大と関連していることが多く、ヒト療法において、使用するのに適していない場合がある脂質性またはカチオン性ポリマーベースの形質導入剤などの非ポリペプチドまたは非タンパク質ベースのシャトル剤と区別するよう意図される。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「独立した」とは、一般に、互いに共有結合によって、結合していない分子または薬剤を指すものとする。例えば、表現「独立ポリペプチドカーゴ」は、本記載のシャトル剤と共有結合によって、結合していない（例えば、融合していない）、細胞内に送達されるべきポリペプチドカーゴを指すものとする。いくつかの態様では、ポリペプチドカーゴと独立している（と融合していない）シャトル剤を有することは、例えば、異なるポリペプチドカーゴのために新規融合タンパク質を再設計する必要がなく、および／またはシャトル剤対カーゴの比を容易に変更できる（融合タンパク質の場合には１：１比に制限されているのとは対照的に）、増大したシャトル剤の汎用性を提供することによって、有利であり得る。
【００２０】
本明細書で使用される場合、表現「であるか、またはに由来する」または「に由来する」は、タンパク質ドメインの活性を抑制しない、保存的アミノ酸置換、欠失、修飾、並びにバリアントまたは機能性誘導体などの所与のタンパク質ドメイン（例えば、ＣＰＤまたはＥＬＤ）の機能性バリアントを含む。
【００２１】
本記載のその他の目的、利点および特徴は、添付の図面を参照して、例示の目的のみで与えられたその特定の実施形態の以下の非制限的説明を読むと、より明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＨＥＫ２９３Ａ細胞に蛍光色素カルセイン（「１００μＭカルセイン」）が負荷され、次いで、カルセイン（「１００μＭカルセイン＋ＣＭ１８−ＴＡＴ  ５μＭ」）のエンドソーム脱出を促進するシャトル剤を用いて処理された（または処理されなかった）、カルセインエンドソーム脱出アッセイの典型的な結果を示す図である。図１Ａは、蛍光顕微鏡実験の結果を示し、図１Ｂは、フローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図２】ＨｅＬａ細胞に、カルセイン（「カルセイン１００μＭ」）が負荷され、次いで、漸増濃度のシャトル剤ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（標識された「ＣＭ１８−ＴＡＴ」）を用いて処理された、カルセインエンドソーム脱出フローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。
【図３】カルセイン（「カルセイン１００μＭ」）が負荷され、次いで、５μＭまたは８μＭのシャトル剤ＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓまたはＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（それぞれ、「ＣＭ１８−ＴＡＴ」および「ＣＭ１８−ペネトラチン」と標識）を用いて処理された、ＨｅＬａ細胞におけるカルセインエンドソーム脱出フローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。
【図４】カルセイン（「カルセイン１００μＭ」）が負荷され、次いで、５μＭまたは８μＭのシャトル剤ＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓまたはＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（それぞれ、「ＣＭ１８−ＴＡＴ」および「ＣＭ１８−ペネトラチン」と標識）を用いて処理された、ＨｅＬａ細胞におけるカルセインエンドソーム脱出フローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。
【図５】ＧＦＰカーゴタンパク質が、０、３または５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８−ＴＡＴ」と標識）と同時インキュベートされ、次いで、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、蛍光顕微鏡によって、可視化されたＧＦＰ形質導入実験の結果を示す図である。細胞は、明視野（上のパネル）および蛍光顕微鏡（下のパネル）により観察された。
【図６】ＧＦＰカーゴタンパク質（１０μＭ）が、種々の濃度のＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８−ＴＡＴ」と標識）と同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、ＧＦＰ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが図６Ａに示され、対応する細胞毒性データが図６Ｂに示されている。
【図７】種々の濃度のＧＦＰカーゴタンパク質（１０、５または１μＭ）が、５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（図７Ａ、「ＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）または２．５μＭのｄＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（図７Ｂ、「ｄＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）のいずれかと同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、ＧＦＰ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが示されている。
【図８】ＧＦＰカーゴタンパク質（１０μＭ）が、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）、ＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８ペネトラチン」と標識）および各々の二量体（ｄＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ｄＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）、ｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（「ｄＣＭ１８ペネトラチン」と標識）の種々の濃度および組合せとともに同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、ＧＦＰ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが示されている。
【図９】ＧＦＰカーゴタンパク質（１０μＭ）が、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）、ＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８ペネトラチン」と標識）および各々の二量体（ｄＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ｄＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）、ｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（「ｄＣＭ１８ペネトラチン」と標識）の種々の濃度および組合せとともに同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、ＧＦＰ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが示されている。
【図１０】ＴＡＴ−ＧＦＰカーゴタンパク質（５μＭ）が、３μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８−ＴＡＴ」と標識）と同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、ＴＡＴ−ＧＦＰ形質導入実験の典型的な結果を示す図である。細胞およびＧＦＰ蛍光は、１０ｘおよび４０ｘ倍率で明視野および蛍光顕微鏡によって、可視化された。矢印は、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓの非存在下でのＴＡＴ−ＧＦＰのエンドソーム送達並びにＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓの存在下でのその核送達を示す。
【図１１】ＴＡＴ−ＧＦＰカーゴタンパク質（５μＭ）が、種々の濃度のＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）と同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して曝露されたＴＡＴ−ＧＦＰ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが図１１Ａに示され、対応する細胞毒性データが図１１Ｂに示されている。
【図１２】ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質（５μＭ）が、５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８−ＴＡＴ」と標識）と同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して５分間曝露された、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入実験の典型的な結果を示す図である。細胞およびＧＦＰ蛍光は、１０ｘ、２０ｘおよび４０ｘ倍率で明視野および蛍光顕微鏡によって、可視化された。矢印は、ＧＦＰ−ＮＬＳの核送達の領域を示す。
【図１３】ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質（５μＭ）が、種々の濃度のＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）と同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが図１３Ａに示され、対応する細胞毒性データが図１３Ｂに示されている。
【図１４】ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質（５μＭ）が、種々の濃度と組合せのＣＭ１８−ＴＡＴ（標識された「ＣＭ１８ＴＡＴ」）、ＣＭ１８−ペネトラチン（標識された「ＣＭ１８ペネトラチン」）および各々の二量体（それぞれｄＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ、ｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ、標識された「ｄＣＭ１８ＴＡＴ」および「ｄＣＭ１８ペネトラチン」）と同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが示されている。
【図１５】ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質（５μＭ）が、種々の濃度と組合せのＣＭ１８−ＴＡＴ（標識された「ＣＭ１８ＴＡＴ」）、ＣＭ１８−ペネトラチン（標識された「ＣＭ１８ペネトラチン」）および各々の二量体（それぞれｄＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ、ｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ、標識された「ｄＣＭ１８ＴＡＴ」および「ｄＣＭ１８ペネトラチン」）と同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが示されている。
【図１６】ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質（５μＭ）が、簡素なＤＭＥＭ培地（「ＤＭＥＭ」）または１０％  ＦＢＳ（「ＦＢＳ」）を含有するＤＭＥＭ中で、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（３．５μＭ、「ＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）単独と、またはｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（１μＭ、「ｄＣＭ１８ｐｅｎ」と標識）とともに、５分間または１時間同時インキュベートされ、その後、フローサイトメトリー解析に供された、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率実験の結果を示す図である。蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが示されている。シャトル剤またはＧＦＰ−ＮＬＳを用いて処理されなかった細胞（「ｃｔｒｌ」）およびＧＦＰ−ＮＬＳを用いて処理したが、シャトル剤を用いない細胞（「ＧＦＰ−ＮＬＳ  ５μＭ」）を対照として使用した。
【図１７】ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質（５μＭ）が、１μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）とともに、または伴わずに同時インキュベートされ、その後、ＴＨＰ−１細胞に対して曝露された、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが図１７Ａに示され、対応する細胞毒性データが図１７Ｂに示されている。
【図１８】カーゴタンパク質、ＦＩＴＣ標識抗チューブリン抗体（０．５μＭ）が、５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８−ＴＡＴ」と標識）と同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に曝露された形質導入効率実験の結果を示す図である。機能的抗体送達は、明視野（２０ｘ）および蛍光顕微鏡（２０ｘおよび４０ｘ）によって、可視化され、これでは、細胞質中の蛍光チューブリン繊維が可視化された。
【図１９】抗体カーゴタンパク質（０．５μＭ）が、３．５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（標識された「ＣＭ１８ＴＡＴ」）、ＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（標識された「ＣＭ１８ｐｅｎ」）またはｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（標識された「ｄＣＭ１８ｐｅｎ」）または３．５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓおよび０．５μＭのｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓの組合せと同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に曝露された、ＦＩＴＣ標識抗チューブリン抗体形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＦＩＴＣ陽性）細胞のパーセンテージが図１９Ａに示され、対応する細胞毒性データが図１９Ｂに示されている。
【図２０】プラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ）が、Ｃｙ５（商標）色素で標識され、０、０．０５、０．５または５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（標識された「ＣＭ１８−ＴＡＴ」）と同時インキュベートされ、その後、ＨＥＫ２９３Ａ  細胞に対して曝露された、ＤＮＡトランスフェクション効率実験の結果を示す図である。フローサイトメトリー解析によって、Ｃｙ５（商標）発光（ＤＮＡ細胞内送達に対応する、ｙ軸）およびＧＦＰ発光（ＤＮＡの核送達の成功に対応する、各バーの上に示されるパーセンテージ）の定量化が可能となった。
【図２１】ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質（５μＭ）が、１、３または５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（標識された「ＣＭ１８ＴＡＴ」）、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＴＡＴ（標識された「Ｈｉｓ−ＣＭ１８ＴＡＴ」）と同時インキュベートされ、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが図２１Ａに示され、対応する細胞毒性データが図２１Ｂに示されている。
【図２２】ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質が、ＨｅＬａ細胞において、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用して細胞内に送達された形質導入効率実験の結果を示す図である。ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率は、フローサイトメトリーにより評価され、ＧＦＰ蛍光細胞のパーセンテージ（「Ｐｏｓ細胞（％）」）並びに対応する細胞生存率データ（「生存率（％）」）が示されている。図２２Ａは、種々の形質導入プロトコル（プロトコルＡ対Ｂ）を使用するＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率の比較を示す。図２２Ｂは、プロトコルＢを使用する種々の濃度のシャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４の効果を示す。
【図２３】ＧＦＰ−ＮＬＳ標識（図２４Ａ、２４Ｂ、２５および２６）またはＦＩＴＣ標識（図２４Ｃおよび２４Ｄ）抗チューブリン抗体カーゴタンパク質が、ＨｅＬａ細胞において、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を用いて細胞内に送達された形質導入実験の結果を示す顕微鏡像である。生細胞の明視野および蛍光像を図２３、２４および２６に示す。図２５では、細胞は固定され、透過処理され、抗ＧＦＰ抗体および蛍光二次抗体を用いる免疫標識に供された。白色三角窓は、核（ＤＡＰＩ）およびＧＦＰ−ＮＬＳシグナル間の同時標識領域の例を示す。図２６は、共焦点顕微鏡によって、捉えられた像を示す。
【図２４−１】ＧＦＰ−ＮＬＳ標識（図２４Ａ、２４Ｂ、２５および２６）またはＦＩＴＣ標識（図２４Ｃおよび２４Ｄ）抗チューブリン抗体カーゴタンパク質が、ＨｅＬａ細胞において、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を用いて細胞内に送達された形質導入実験の結果を示す顕微鏡像である。生細胞の明視野および蛍光像を図２３、２４および２６に示す。図２５では、細胞は固定され、透過処理され、抗ＧＦＰ抗体および蛍光二次抗体を用いる免疫標識に供された。白色三角窓は、核（ＤＡＰＩ）およびＧＦＰ−ＮＬＳシグナル間の同時標識領域の例を示す。図２６は、共焦点顕微鏡によって、捉えられた像を示す。
【図２４−２】同上。
【図２５】ＧＦＰ−ＮＬＳ標識（図２４Ａ、２４Ｂ、２５および２６）またはＦＩＴＣ標識（図２４Ｃおよび２４Ｄ）抗チューブリン抗体カーゴタンパク質が、ＨｅＬａ細胞において、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を用いて細胞内に送達された形質導入実験の結果を示す顕微鏡像である。生細胞の明視野および蛍光像を図２３、２４および２６に示す。図２５では、細胞は固定され、透過処理され、抗ＧＦＰ抗体および蛍光二次抗体を用いる免疫標識に供された。白色三角窓は、核（ＤＡＰＩ）およびＧＦＰ−ＮＬＳシグナル間の同時標識領域の例を示す。図２６は、共焦点顕微鏡によって、捉えられた像を示す。
【図２６】ＧＦＰ−ＮＬＳ標識（図２４Ａ、２４Ｂ、２５および２６）またはＦＩＴＣ標識（図２４Ｃおよび２４Ｄ）抗チューブリン抗体カーゴタンパク質が、ＨｅＬａ細胞において、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を用いて細胞内に送達された形質導入実験の結果を示す顕微鏡像である。生細胞の明視野および蛍光像を図２３、２４および２６に示す。図２５では、細胞は固定され、透過処理され、抗ＧＦＰ抗体および蛍光二次抗体を用いる免疫標識に供された。白色三角窓は、核（ＤＡＰＩ）およびＧＦＰ−ＮＬＳシグナル間の同時標識領域の例を示す。図２６は、共焦点顕微鏡によって、捉えられた像を示す。
【図２７】ＨｅＬａ細胞における動態学的（時間経過）形質導入実験の顕微鏡像を示す図であり、ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質の蛍光は、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を用いる細胞内送達の４５（図２７Ａ）、７５（図２７Ｂ）、１００（図２７Ｃ）および１２０（図２７Ｄ）秒後に追跡された。４５秒後に観察された散在性細胞質蛍光パターン（図２７Ａ）は、１２０秒で、徐々により濃縮された核パターンになる（図２７Ｄ）。
【図２８】２個のカーゴタンパク質（ＧＦＰ−ＮＬＳおよびｍＣｈｅｒｒｙ（商標）−ＮＬＳ）がシャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４によって、ＨｅＬａ細胞における、同時に細胞内に送達される同時送達形質導入実験の顕微鏡像を示す図である。細胞および蛍光シグナルは、（図２８Ａ）明視野および（図２８Ｂ〜２８Ｄ）蛍光顕微鏡によって、可視化された。白色三角窓は、核（ＤＡＰＩ）およびＧＦＰ−ＮＬＳまたはｍＣｈｅｒｒｙ（商標）間の同時標識の領域の例を示す。
【図２９−１】種々のシャトル剤または単一ドメイン／対照ペプチドを使用する、ＨｅＬａ細胞におけるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率実験の結果を示す図である。ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率は、フローサイトメトリーにより評価され、ＧＦＰ蛍光細胞のパーセンテージ（「Ｐｏｓ細胞（％）」）並びに対応する細胞生存率データ（「生存率（％）」）が図２９Ａ、２９Ｂ、２９Ｄ〜２９Ｇおよび２９Ｉ示されている。図２９Ａおよび２９Ｄ〜２９Ｆにおいて、細胞は、カーゴ／シャトル剤に１０秒間曝露された。パネルＩでは、細胞は、カーゴ／シャトル剤に１分間曝露された。図２９Ｂ、２９Ｃ、２９Ｇおよび２９Ｈでは、細胞は、カーゴ／シャトル剤に１、２または５分間曝露された。「相対蛍光強度（ＦＬ１−Ａ）」または「シグナル強度」は、シャトル剤を用いるＧＦＰ−ＮＬＳ蛍光タンパク質送達後の、ＧＦＰ蛍光シグナルを有する各細胞に由来するすべての蛍光強度の平均に相当する。図２９Ｄは、複数ドメインシャトル剤の代わりに、単一ドメインペプチド（ＥＬＤまたはＣＤＰ）のみまたはペプチドＨｉｓ−ＰＴＤ４（Ｈｉｓ−ＣＰＤ）が、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入に使用される対照実験の結果を示す。
【図２９−２】同上。
【図２９−３】同上。
【図２９−４】同上。
【図２９−５】同上。
【図３０】シャトル剤図３０Ａ：ＴＡＴ−ＫＡＬＡ、図３０Ｂ：Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４、図３０Ｃ：Ｈｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４、図３０Ｄ：ＰＴＤ４−ＫＡＬＡ、図３０Ｅ：ＥＢ１−ＰＴＤ４および図３０Ｆ：Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４−Ｈｉｓを使用して、ＧＦＰ−ＮＬＳを用いて形質導入されたＨｅＬａ細胞の顕微鏡像を示す図である。最下行パネル中の挿入図は、対応するフローサイトメトリー解析の結果を示し、ＧＦＰ蛍光を示す細胞のパーセンテージを示す。
【図３１】ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質が、異なるプロトコル（プロトコルＡ対Ｃ）を使用して、ＴＨＰ−１細胞において、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用して細胞内に送達された形質導入効率実験の結果を示す図である。ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率は、フローサイトメトリーにより評価され、ＧＦＰ蛍光細胞のパーセンテージ（「Ｐｏｓ細胞（％）」）並びに対応する細胞生存率データ（「生存率（％）」）が示されている。「Ｃｔｒｌ」は、シャトル剤の非存在下でＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質に曝露されたＴＨＰ−１細胞に対応する。
【図３２】シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用し、ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質を用いて形質導入されたＴＨＰ−１細胞の顕微鏡像を示す図である。４ｘ、１０ｘおよび４０ｘの倍率で捉えられた像が、それぞれ図３２Ａ〜３２Ｃに示されている。図３２Ｃ中の白色三角窓は、細胞（明視野）およびＧＦＰ−ＮＬＳ蛍光間の同時標識の領域の例を示す。図３２Ｄは、対応するフローサイトメトリー解析の結果を示し、ＧＦＰ蛍光を示す細胞のパーセンテージを示す。
【図３３】シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用し、ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質を用いて形質導入されたＴＨＰ−１細胞の顕微鏡像を示す図である。白色三角窓は、細胞（明視野；図３３Ａおよび３３Ｂ）とＧＦＰ−ＮＬＳ蛍光（図３３Ｃおよび３３Ｄ）との間の同時標識の領域の例を示す。
【図３４】シャトルＴＡＴ−ＫＡＬＡ、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４またはＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４を使用する、ＴＨＰ−１細胞におけるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率実験の結果を示す図である。カーゴタンパク質／シャトル剤がＴＨＰ−１細胞に対して１５、３０、６０または１２０秒間曝露された。ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率は、フローサイトメトリーにより評価され、ＧＦＰ蛍光細胞のパーセンテージ（「Ｐｏｓ細胞（％）」）並びに対応する細胞生存率データ（「生存率（％）」）が図３４Ａに示されている。図３４Ｂでは、「相対蛍光強度（ＦＬ１−Ａ）」は、シャトル剤を用いるＧＦＰ−ＮＬＳ蛍光タンパク質送達後のＧＦＰ蛍光シグナルを有する各細胞に由来するすべての蛍光強度の平均に相当する。
【図３５】ＴＨＰ−１細胞が、シャトル剤の存在下で２．５時間、ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴに毎日曝露された形質導入効率実験の結果を示す図である。図３５Ａ〜３５Ｅでは、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４が使用され、図３５Ｆでは、Ｈｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４が使用された。ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率は、１日目または３日目にフローサイトメトリーにより決定され、結果は、図３５Ａ〜３５Ｃおよび３５Ｆにおいて、ＧＦＰ蛍光細胞のパーセンテージ（「Ｐｏｓ細胞（％）」）並びに対応する細胞生存率データ（「生存率（％）」）として表される。図３５Ｄは、１、２、４および２４時間後のＴＨＰ−１細胞の代謝活性指数を示し、図３５Ｅは、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４シャトルに対して曝露された細胞の、１〜４日後のＴＨＰ−１細胞の代謝活性指数を示す。
【図３６】フローサイトメトリーにより測定されるような、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用する、複数の異なる細胞型（例えば、接着および懸濁液、並びに細胞株および初代細胞）におけるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率の比較を示す図である。結果は、ＧＦＰ蛍光細胞のパーセンテージ（「Ｐｏｓ細胞（％）」）並びに対応する細胞生存率データ（「生存率（％）」）として表される。
【図３７】図３７Ａ〜３７Ｈは、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用し、ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴを用いて形質導入された種々の細胞型の蛍光顕微鏡像を示す図である。ＧＦＰ蛍光は、１０ｘの倍率で蛍光顕微鏡によって、可視化された。挿入図中に、並行フローサイトメトリー実験の結果も提供されている（生存率およびＧＦＰ蛍光細胞のパーセンテージ）。
【図３８】シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用し、ＧＦＰ−ＮＬＳを用いて形質導入された一次ヒト筋芽細胞の蛍光顕微鏡像を示す図である。細胞は、固定され、透過処理され、その後、抗ＧＦＰ抗体および蛍光二次抗体を用いてＧＦＰ−ＮＬＳが免疫標識された。免疫標識されたＧＦＰは、図３８Ａに示されており、図３８Ｂでは、この像に、核（ＤＡＰＩ）標識が重ねられている。
【図３９】細胞内に送達されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体の活性を評価するために使用されたトランスフェクションプラスミド代替アッセイの配置図（図３９Ａ、３９Ｂおよび３９Ｃ）および蛍光像例（図３９Ｄおよび３９Ｅ）を示す図である。（図３９Ａ）１日目に、細胞には、蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）およびＧＦＰを、その２つのオープンリーディングフレームを隔てる停止コドンとともにコードする発現プラスミドがトランスフェクトされる。発現プラスミドを用いる細胞のトランスフェクションは、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）発現のみをもたらす（図３９Ｄ）。次いで、プラスミドＤＮＡを停止コドンで切断するように設計／プログラムされているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体が、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）を発現するトランスフェクトされた細胞に、細胞内に送達され、その結果、プラスミドＤＮＡが停止コドンで二本鎖切断される（図３９Ｂ）。一部の細胞では、切断されたプラスミドのランダムな非相同ＤＮＡ修復が生じ、停止コドンの除去（図３９Ｃ）、したがって、ＧＦＰ発現および蛍光をもたらす（図３９Ｅ）。白色三角窓は、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）およびＧＦＰ蛍光の同時標識の領域の例を示す。
【図４０】ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）およびＧＦＰを発現するＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡像を示す図であり、プラスミド代替ＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳにより媒介される切断を示す。パネルＡ〜Ｄでは、ＨｅＬａ細胞は、３種のプラスミド：図３９Ａ〜３９Ｆの簡単な説明に記載されるようなプラスミド代替およびそれぞれ、Ｃａｓ９−ＮＬＳタンパク質およびｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする２種のその他の発現プラスミドで同時トランスフェクトされた。停止コドンでのプラスミド代替のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により媒介される切断およびその後の細胞によるＤＮＡ修復によって、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）（図４０Ａおよび４０Ｃ）に加えて、ＧＦＰの発現（図４０Ｂおよび４０Ｄ）が可能となる。図４０Ｅ〜４０Ｈでは、ＨｅＬａ細胞に、プラスミド代替がトランスフェクトされ、次いで、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用し、活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体を用いて形質導入された。停止コドンでのプラスミド代替のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ媒介切断およびその後の細胞によるＤＮＡ修復によって、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）（図４０Ｅおよび４０Ｇ）に加えて、ＧＦＰの発現（図４０Ｆおよび４０Ｈ）が可能となる。
【図４１Ａ】（レーンＡ〜Ｄ）アガロースゲル電気泳動により分離されたＤＮＡ切断アッセイ（Ｔ７Ｅ１アッセイ）の産物を示す図であり、これは、細胞性ゲノムＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介切断を測定するために使用される。ＨｅＬａ細胞に、ＰＰＩＢ遺伝子を切断するようにプログラムされたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体を用いて形質導入した。白色の四角１および２で囲まれた切断産物の存在は、シャトルＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４（図４１Ａ、レーンＢ）を使用して、または陽性対照（図４１Ａ、レーンＤ）として使用される脂質トランスフェクション剤を用いて細胞内に送達されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体によるＰＰＩＢ遺伝子の切断を示す。この切断産物は、陰性対照（図４１Ａ、レーンＡおよびＣ）には存在しない。
【図４１Ｂ】アガロースゲル電気泳動により分離されたＤＮＡ切断アッセイ（Ｔ７Ｅ１アッセイ）の産物を示す図であり、これは、細胞性ゲノムＤＮＡ（ＰＰＩＢ  ＤＮＡ配列）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により媒介される切断を測定するために使用される。左側のパネルは、ＨｅＬａ細胞におけるシャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を用いる複合体の送達後のＣＲＩＰＲ／Ｃａｓ９複合体による増幅されたＰＰＩＢ  ＤＮＡ配列の切断産物を示す。右側のパネルは、陰性対照としてのＴ７Ｅ１消化手順前の増幅されたＤＮＡ配列を示す。
【図４１Ｃ】アガロースゲル電気泳動により分離されたＤＮＡ切断アッセイ（Ｔ７Ｅ１アッセイ）の産物を示す図であり、これは、細胞性ゲノムＤＮＡ（ＰＰＩＢ  ＤＮＡ配列）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により媒介される切断を測定するために使用される。左側のパネルは、脂質トランスフェクション剤（ＤｈａｒｍａＦｅｃｔ（商標）トランスフェクション試薬Ｔ−２０ＸＸ−０１番）の存在下でＣａｓ９／ＲＮＡ複合体とともにＨｅＬａ細胞をインキュベーションした後に増幅されたＰＰＩＢ  ＤＮＡ配列を示す（陽性対照）。右側のパネルは、陰性対照としてのＴ７Ｅ１消化手順前の増幅されたＤＮＡ配列を示す。
【図４２】種々の濃度のシャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４および異なるカーゴ／シャトル曝露時間を使用して、転写因子ＨＯＸＢ４を用いて形質導入されているＴＨＰ−１細胞の転写活性を示す図である。ＨＯＸＢ４の核内送達の成功は、リアルタイムＰＣＲによって、標的遺伝子のｍＲＮＡレベルをモニタリングすることにより決定され、結果は、陰性対照（シャトル剤を用いないＨＯＸＢ４）におけるものに対して正規化され、「対照を上回る倍数」（左側のバー）として表現される。総細胞性ＲＮＡ（ｎｇ／μＬ）が、定量化され、細胞生存力（右側のバー）のマーカーが使用された。「Φ」または「Ｃｔｒｌ」は、「処理なし」を意味し、「ＴＦ」は、「転写因子単独」を意味し、「ＦＳ」は、「シャトル単独」を意味する。
【図４３】種々の濃度のシャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４および異なるカーゴ／シャトル曝露時間を使用して、転写因子ＨＯＸＢ４を用いて形質導入されているＴＨＰ−１細胞の転写活性を示す図である。ＨＯＸＢ４の核内送達の成功は、リアルタイムＰＣＲによって、標的遺伝子のｍＲＮＡレベルをモニタリングすることにより決定され、結果は、陰性対照（シャトル剤を用いないＨＯＸＢ４）におけるものに対して正規化され、「対照を上回る倍数」（左側のバー）として表現される。総細胞性ＲＮＡ（ｎｇ／μＬ）が、定量化され、細胞生存力（右側のバー）のマーカーが使用された。「Φ」または「Ｃｔｒｌ」は、「処理なし」を意味し、「ＴＦ」は、「転写因子単独」を意味し、「ＦＳ」は、「シャトル単独」を意味する。
【図４４】種々の濃度のシャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４および異なるカーゴ／シャトル曝露時間を使用して、転写因子ＨＯＸＢ４を用いて形質導入されているＴＨＰ−１細胞の転写活性を示す図である。ＨＯＸＢ４の核内送達の成功は、リアルタイムＰＣＲによって、標的遺伝子のｍＲＮＡレベルをモニタリングすることにより決定され、結果は、陰性対照（シャトル剤を用いないＨＯＸＢ４）におけるものに対して正規化され、「対照を上回る倍数」（左側のバー）として表現される。総細胞性ＲＮＡ（ｎｇ／μＬ）が、定量化され、細胞生存力（右側のバー）のマーカーが使用された。「Φ」または「Ｃｔｒｌ」は、「処理なし」を意味し、「ＴＦ」は、「転写因子単独」を意味し、「ＦＳ」は、「シャトル単独」を意味する。
【図４５】シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用し、野生型ＨＯＸＢ４カーゴを用いて形質導入されたＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡像を示す図である。形質導入されたＨＯＸＢ４−ＷＴが核中に蓄積することを可能にするために３０分インキュベーションした後、細胞を固定し、透過処理し、ＨＯＸＢ４−ＷＴを一次抗ＨＯＸＢ４モノクローナル抗体および蛍光二次抗体（図４５Ｂおよび４５Ｄ）を使用して標識した。核をＤＡＰＩを用いて標識した（図４５Ａおよび４５Ｃ）。白色三角窓は、核およびＨＯＸＢ４間を同時標識する領域の例を示し、図４５Ａ対４５Ｂ（ｘ２０の倍率）および図４５Ｃ対４５Ｄ（ｘ４０の倍率）を比較する。
【図４６】アガロースゲル電気泳動により分離されたＤＮＡ切断アッセイの産物を示す図であり、これは、異なるシャトル剤を用いる複合体の細胞内送達後の細胞性ゲノムＤＮＡ（ＨＰＴＲ配列）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により媒介される切断を測定するために使用される。図４６Ａは、ＨｅＬａ細胞において、シャトル剤：Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４−ＨｉｓおよびＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４を用いた結果を示す。図４６Ｂは、ジャーカット細胞において、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４−ＨｉｓおよびＨｉｓ−ＣＭ１８−Ｌ２−ＰＴＤ４を用いた結果を示す。陰性対照（パネルＡおよびＢにおけるレーン４）は、シャトル剤の存在をともなわずにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体とともに細胞をインキュベーションした後に増幅されたＨＰＴＲ  ＤＮＡ配列を示す。陽性対照（パネルＡおよびＢにおけるレーン５）は、市販の脂質トランスフェクション剤の存在下でＣａｓ９／ＲＮＡ複合体とともに細胞のインキュベーションした後に増幅されたＨＰＴＲ  ＤＮＡ配列を示す。
【図４７】シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４、ＴＡＴ−ＫＡＬＡ、ＥＢ１−ＰＴＤ４、Ｈｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４およびＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４−Ｈｉｓを使用し、転写因子ＨＯＸＢ４を用いて形質導入されているＴＨＰ−１細胞の転写活性を示す図である。ＨＯＸＢ４の核内送達の成功は、リアルタイムＰＣＲによって、標的遺伝子のｍＲＮＡレベルをモニタリングすることにより決定され、結果は、陰性対照（シャトル剤を用いないＨＯＸＢ４）におけるものに対して正規化され、「対照に対する倍数」（左側のバー）として表現される。総細胞性ＲＮＡ（ｎｇ／μＬ）が、定量化され、細胞生存力（右側のバー）のマーカーが使用された。「Φ」または「Ｃｔｒｌ」は、「処理なし」を意味し、「ＴＦ」は、「転写因子単独」を意味し、「ＦＳ」は、「シャトル単独」を意味する。
【図４８】Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４によるラット頭頂皮質におけるインビボＧＦＰ−ＮＬＳ送達を示す図である。手短に説明すると、ＧＦＰ−ＮＬＳ（２０μＭ）を、シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４（２０μＭ）の存在下で１０分間、ラットの頭頂皮質中に注射した。背腹側ラット脳切片を集め、４ｘ（図４８Ａ）、１０ｘ（図４８Ｃ）および２０ｘ（図４８Ｄ）の倍率で蛍光顕微鏡により解析した。注射部位は、頭頂皮質（ＰＣｘ）の最深層中に位置する。Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４シャトル剤の存在下で、ＧＦＰ−ＮＬＳは、ＰＣｘの、脳梁（Ｃｏｒｐｕｓ  Ｃａｌｌｕｓ）（Ｃｃ）の、および線条体（Ｓｔｒ）の（白色曲線は脳構造間の限界を記す）細胞核中に拡散した。図４８Ｂは、ＦｒａｎｋｌｉｎおよびＰａｘｉｎｏｓのラット脳アトラスからの注射部位の定位座標（黒色矢印）を示す。Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４の存在下でのＧＦＰ−ＮＬＳの注射を、脳の左側で実施し、陰性対照（ＧＦＰ−ＮＬＳ単独の注射）を反対側で実施した。図４８Ｂ中の黒丸および黒色連絡線は、蛍光写真（図４８Ａ、４８Ｃおよび４８Ｄ）において、観察された領域を示す。
【図４９−１】図４９Ａ及び図４９Ｂは、ペプチドＦＳＤ５およびＶＳＶＧ−ＰＴＤ４の、それぞれ、ヘリカルホイール（左パネル）および「オープンシリンダー」（右パネル）表現を示す図である。各アミノ酸残基の幾何学的形状は、残基の側鎖に基づくその生化学的性質（すなわち、疎水性、電荷、または親水性）に対応する。ＦＳＤ５とＶＳＶＧ−ＰＴＤ４の２つのオープンシリンダー表現の間の主要な差異の１つは、ＦＳＤ５中の高度疎水性コアの存在であり（図４９Ａ、左と右のパネルに概要を示す）、これはＶＳＶＧ−ＰＴＤ４には存在しない。図４９Ａと４９Ｂの下部中央のパネルのシリンダーは、簡略化バージョンの右パネルのオープンシリンダー表現であり、「Ｈ」は高疎水性表面領域を表し；「ｈ」は疎水性表面領域を表し；「＋」は正電荷残基を表し；「ｈ」は親水性残基を表す。
【図４９−２】図４９Ｃ〜４９Ｆは、ペプチドＦＳＤ５、ＦＳＤ１８、ＶＳＶＧ−ＰＴＤ４、およびＦＳＤ４４の構造のそれぞれ、予測した３次元モデルを示す図である。
【図４９−３】図４９Ｇは、ペプチドＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４；ＥＢ１−ＰＴＤ４；Ｈｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４；ＦＳＤ５；ＦＳＤ１０；ＦＳＤ１９；ＦＳＤ２０；ＦＳＤ２１；ＦＳＤ４４；ＦＳＤ４６；およびＦＳＤ６３、の複数の配列アラインメントを、それぞれの残基位置に関する「一貫性」スコアと共に示す図である。アライメントに際し、ヒスチジンリッチドメインは、自発的に除外した。
【図５０−１】蛍光の標識抗体をカーゴとして用いて、シャトル剤ＦＳＤ５によりうまく形質導入した生存ＨｅＬａ細胞の顕微鏡像を示す。図５０Ａは、明視野（上段パネル）および蛍光顕微鏡法（下段パネル）により２０ｘ倍率で可視化した、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４）抗体の細胞質形質導入を示す図である。図５０Ｂおよび５０Ｃは、明視野（上段パネル）および蛍光顕微鏡法（下段パネル）により、それぞれ１０ｘおよび２０ｘ倍率で可視化した、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）抗体の細胞質形質導入を示す図である。
【図５０−２】図５０Ｄは、核周辺膜中で抗原を認識する抗ＮＵＰ９８抗体をシャトル剤ＦＳＤ１９を用いてＨｅＬａ細胞に形質導入した形質導入実験の結果を示す図である。形質導入後、ＨｅＬａ細胞を固定し、透過処理し、抗ＮＵＰ９８抗体（左パネル）およびヘキスト核染色（右パネル）を認識する蛍光（Ａｌｅｘａ（商標）４８８）二次抗体で標識した。上段および下段パネルパネルは、それぞれ２０ｘおよび４０ｘ倍率で取得された画像を示す。
【図５１−１】図５１Ａ〜５１Ｆは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳゲノム編集複合体が、種々のシャトル剤ペプチド（ＦＳＤ５、ＦＳＤ８、ＦＳＤ１０、ＦＳＤ１８）を用いて、種々の細胞型（ＨｅＬａ、ＮＫ細胞、ＮＩＣ−Ｈ１９６細胞、ＨＣＣ−７８細胞、およびＲＥＣ−１細胞）中に形質導入し、成功したゲノム編集がゲノムＤＮＡ切断アッセイにより確認されたゲノム編集実験の結果を示す図である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体は、ＨＰＲＴゲノムＤＮＡ配列を切断するように設計されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡと複合化された組換えＣａｓ９−ＮＬＳからなる。成功したゲノム編集は、非切断ゲノム標的遺伝子（薄い点線の矢印）と比較して、ゲノムＤＮＡ切断産物（濃い中実矢印）の検出により観察された。陰性対照（「−ｃｔｒｌ」）は、シャトル剤ペプチドの非存在下で実施した形質導入実験由来のものであった。切断産物バンドの相対シグナル強度をゲル上で直接定量化するために、イメージングソフトウェアを使用した。所与のレーンの全バンドの合計は、１００％のシグナルに相当し、各レーンの下端のイタリック体の数値は、２つの切断産物バンド（濃い中実矢印）のみの相対シグナル％の合計である。
【図５１−２】図５１Ｇは、短いＤＮＡテンプレート（７２ｂｐ）の非存在下（「テンプレートなし」）または存在下（「＋５００ｎｇ」）で、ＦＳＤ５により形質導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体による標的ＨＰＲＴゲノム配列の切断を示す。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、濃い中実矢印は、この標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ媒介切断産物に対応するバンドを示し、このことは、ＤＮＡテンプレートの存在下および非存在下で完全に機能するゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。各レーンの下端のイタリック体の数値は、２つの切断産物バンド（濃い中実矢印）のみの相対シグナル％の合計である。図５１Ｈは、短いＤＮＡテンプレートに特異的なプライマーを用いた、図５１Ｇの試料のＰＣＲ増幅の結果であり、ＤＮＡテンプレート配列のゲノムインサートを示す（図５１Ｈの矢印を参照されたい）。図５１Ｉは、長い直鎖ＤＮＡテンプレート（１６３１  ｂｐ）の非存在下（「テンプレートなし」）または存在下（「＋５００ｎｇ」）で、ＦＳＤ５により形質導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体による標的ＨＰＲＴゲノム配列の切断を示す。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、濃い中実矢印は、この標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ媒介切断産物に対応するバンドを示し、このことは、ＤＮＡテンプレートの存在下および非存在下で完全に機能するゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。各レーンの下端のイタリック体の数値は、２つの切断産物バンド（濃い中実矢印）のみの相対シグナル％の合計である。図５１Ｊは、ゲノム切断部位をまたいで増幅するように設計されたプライマーを用いた、図５１Ｉの試料のＰＣＲ増幅の結果を示す図である。長いＤＮＡテンプレート配列のゲノムインサートは、「＋５００ｎｇ」（微弱）および「＋１０００ｎｇ」（より黒い）レーンのより大きなバンドの存在により可視化される。図５１Ｊの矢印を参照されたい。図５１Ｋおよび５１Ｌは、ＨｅＬａ（図５１Ｋ）およびＮＫ細胞（図５１Ｌ）におけるシャトル剤ＦＳＤ１８の非存在下（「−ｃｔｒｌ」）または存在下でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳゲノム編集複合体を用いた、標的ゲノムＤＮＭＴ１  ＤＮＡ配列の切断の、ＰＣＲ増幅およびアガロースゲル電気泳動による分離後の結果を示す図である。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、濃い中実矢印は、この標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ媒介切断産物に対応するバンドを示し、このことは、完全に機能するゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。種々のバンドのそれぞれの相対シグナル強度をゲル上で直接定量化するために、イメージングソフトウェアを使用した。所与のレーンの全バンドの合計は、１００％のシグナルに相当し、各レーンの下端のイタリック体の数値は、２つの切断産物バンド（濃い中実矢印）のみの相対シグナル％の合計である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳゲノム編集複合体を形質導入するために、リポフェクタミン系遺伝子導入試薬ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を用いた場合、ゲノムＤＮＡ切断は観察されなかった。
【図５２−１】種々の細胞型：ＴＨＰ−１（図５２Ａ）；ＮＫ（図５２Ｂ〜Ｄ）およびＨｅＬａ（図５２Ｅ）において、種々の濃度、暴露時間で用いたシャトル剤ＦＳＤ１０、ＦＳＤ１８、ＦＳＤ１９、ＦＳＤ２１、ＦＳＤ２３またはＦＳＤ４３の非存在下（「−ｃｔｒｌ」）または存在下で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳおよびｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳおよびシングルガイドＲＮＡを用いた、標的ゲノムＢ２Ｍ  ＤＮＡ配列の切断の、アガロースゲル電気泳動による分離後の結果を示す図である。細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１複合体およびＦＳＤシャトル剤と共に、示した時間と濃度でインキュベートした。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、より濃い中実矢印は、この標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ系媒介切断産物に対応するバンドを示し、このことは、完全に機能するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。種々のバンドのそれぞれの相対シグナル強度をゲル上で直接定量化するために、イメージングソフトウェアを使用した。所与のレーンの全バンドの合計は、１００％のシグナルに相当し、各レーンの下端のイタリック体の数値は、２つの切断産物バンド（濃い中実矢印）のみの相対シグナル％の合計である。
【図５２−２】種々の細胞型：ＮＫ（図５２Ｆ〜Ｇ）；ＴＨＰ−１（図５２Ｈ）および初代筋芽細胞（図５２Ｉ）において、種々の濃度、暴露時間で用いたシャトル剤ＦＳＤ１０、ＦＳＤ１８、ＦＳＤ１９またはＦＳＤ２３の非存在下（「−ｃｔｒｌ」）または存在下で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳおよびシングルガイドｃｒＲＮＡを用いた、標的ゲノムＧＳＫ３（図５２Ｆ）、ＣＢＬＢ（図５２Ｇ）およびＤＮＭＴ１（図５２Ｈ〜Ｉ）ＤＮＡ配列の切断の、アガロースゲル電気泳動による分離後の結果を示す図である。細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１複合体およびＦＳＤと共に、示した時間と濃度でインキュベートした。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、より濃い中実矢印は、これらの標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ系媒介切断産物に対応するバンドを示し、このことは、完全に機能するＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。
【図５２−３】図５２Ｊ〜５２Ｎは、ＮＫ細胞（図５２Ｆ〜５２Ｇ）およびＮＫ−９２細胞（図５２Ｈ）において、種々の濃度、暴露時間で用いたシャトル剤ＦＳＤ１０、ＦＳＤ２１、ＦＳＤ２２またはＦＳＤ２３の非存在下（「−ｃｔｒｌ」）または存在下で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳおよびシングルガイドｃｒＲＮＡを用いた、標的ゲノムＮＫＧ２Ａ  ＤＮＡ配列の切断の、アガロースゲル電気泳動による分離後の結果を示す図である。細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１複合体と共に、示した時間と濃度でインキュベートした。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、より濃い中実矢印は、この標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ系媒介切断産物に対応するバンドを示し、このことは、完全に機能するＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。
【図５３】標的ゲノムＨＰＲＴ、ＤＮＭＴ１およびＢ２Ｍ  ＤＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲ系による切断の結果を示す。２つのゲノムＨＰＲＴとＤＮＭＴ１（図５３Ａ）ＤＮＡ配列またはゲノムＢ２Ｍエキソン２（図５３Ｂ）上の２つのＤＮＡ座位がＨｅＬａ細胞中で、これらの目的のために設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳゲノム編集複合体を用いて標的化され、これらは、シャトル剤ペプチドＦＳＤ１８を用いて形質導入された。ゲノムＢ２Ｍエキソン２（図５３Ｃ）上の２つのＤＮＡ座位が、アガロースゲル電気泳動による分離後、種々の濃度、暴露時間で用いたシャトル剤ＦＳＤ１０、ＦＳＤ２１またはＦＳＤ２３の非存在下（「−ｃｔｒｌ」）または存在下で、ＮＫ細胞中でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳおよびシングルガイドｃｒＲＮＡ−１，ｃｒＲＮＡ−２または両方を用いて標的化された。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、より濃い中実矢印は、ｃｒＲＮＡ−１またはｃｒＲＮＡ２またはＢ２Ｍエキソン２用の両方（ｃｒＲＮＡ１＋２）の存在下でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介切断産物に対応するバンドを示し、このことは、完全に機能するＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。
【図５４】図５４Ａ〜５４Ｄは、Ｔ細胞が漸増濃度のシャトル剤ＦＳＤ２１（８μＭ：図５４Ｂ、１０μＭ：図５４Ｃ、および１２μＭ：図５４Ｄ）、１．３３μＭのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ系および２μＭのＢ２ＭゲノムＤＮＡ配列を標的とするシングルガイドｃｒＲＮＡで処理されたフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。ＨＬＡ陽性およびＨＬＡ陰性（Ｂ２Ｍノックアウト）細胞を、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＨＬＡ−ＡＢＣ抗体を用いることにより、処理の７２時間後に特定した。左シフト細胞集団は、Ｂ２Ｍ遺伝子の不活性化に起因して、細胞表面ＨＬＡ受容体の不活性化に成功したことを示す。
【図５５】図５５Ａ〜５５Ｄは、Ｔ細胞が漸増濃度のシャトル剤ＦＳＤ１８（８μＭ：図５５Ｂ、１０μＭ：図５５Ｃ、および１２μＭ：図５５Ｄ）、１．３３μＭのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ系および２μＭのＢ２Ｍ  ＤＮＡ配列を標的とするシングルガイドｃｒＲＮＡで処理されたフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。ＨＬＡ陽性およびＨＬＡ陰性（Ｂ２Ｍノックアウト）細胞を、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＨＬＡ−ＡＢＣ抗体を用いることにより、処理の７２時間後に特定した。左シフト細胞集団は、Ｂ２Ｍ遺伝子の不活性化に起因して、細胞表面ＨＬＡ受容体の不活性化に成功したことを示す。
【図５６】ＴＨＰ−１細胞が、１．３３μＭのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ系、それぞれＢ２ＭゲノムＤＮＡ配列内の異なる部位を標的とする２μＭの１個または３個のガイドｃｒＲＮＡおよび３μＭのＦＳＤ１８の混合物で処理された（図５６Ｂ〜５６Ｅ）または処理されなかった（「未処理」、図５６Ａ）フローサイトメトリーアッセイの結果を示す。未処理細胞（図５６Ａ）、ｃｒＲＮＡ  Ｅ処理細胞（図５６Ｂ）、ｃｒＲＮＡ  Ｇ処理細胞（図５６Ｃ）、ｃｒＲＮＡ  Ｊ処理細胞（図５６Ｄ）およびｃｒＲＮＡ  Ｅ＋Ｇ＋Ｊ処理細胞（図５６Ｅ）における、ＨＬＡ陽性およびＨＬＡ陰性（Ｂ２Ｍノックアウト）細胞を、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＨＬＡ−ＡＢＣ抗体を用いることにより、処理の４８時間後に特定した。左シフト細胞集団は、Ｂ２Ｍ遺伝子の不活性化に起因して、細胞表面ＨＬＡ受容体の不活性化に成功したことを示す。
【図５７】ＮＫ−９２細胞をゲノム編集して、内在性ＮＫＧ２Ａ遺伝子の不活化が標的ＨｅＬａ細胞を死滅させるそれらの能力を高め得るか否かを判定する実験結果を示す図である。手短に説明すると、シャトル剤ペプチドＦＳＤ２３を用いて、ＮＫＧ２Ａ遺伝子を切断するように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳゲノム編集複合体をＮＫ−９２細胞に形質導入した。形質導入後、ＮＫ−９２細胞をフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ＮＫＧ２Ａ抗体で免疫標識し、その後、図５７Ａに示すようにフローサイトメトリーにより分析して、ＮＫＧ２Ａの不活性化の成功を確認した。対照として、非標識野生型ＮＫ−９２細胞（「非標識ＷＴ細胞」）は、抗体シグナルがなく、標識野生型ＮＫ−９２細胞（「標識ＷＴ細胞」）は、完全な免疫標識シグナルを有した。ＮＫＧ２Ａ−ＫＯ  ＮＫ−９２細胞の場合、２つの細胞集団（ピーク）：１つは、細胞表面上のＮＫＧ２Ａ受容体発現の完全なノックアウトを有するもの（「完全ＮＫＧ２Ａ  ＫＯ細胞」）、およびもう１つは、発現の部分的欠如を有するもの（「部分的なＮＫＧ２Ａ  ＫＯ細胞」）が観察された。図５７Ｂは、前もって細胞内蛍光染料（カルセイン）をロードした標的ＨｅＬａ細胞を野生型（実線）またはゲノム編集ＮＫＧ２Ａ−ＫＯ（点線）エフェクターＮＫ−９２細胞に、種々のエフェクター：標的比率（Ｅ：Ｔ比率）で曝露した細胞傷害性アッセイの結果を示す図である。細胞傷害性を、標的ＨｅＬａ細胞の細胞膜の破壊（「％細胞溶解」）により生じた、細胞外間隙への細胞内のカルセインの相対的放出により評価した。
【図５８−１】Ｔ細胞が、ＧＦＰ−ＮＬＳ、Ｂ２ＭゲノムＤＮＡ配列を切断するように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ複合体、およびシャトル剤ＦＳＤ１８の混合物で処理された（図５８Ａ〜５８Ｆ）、または処理されなかった（図５８Ａ）フローサイトメトリーアッセイの結果を示す。図５８Ｂおよび５８Ｃは、処理の５時間後の、ＧＦＰ蛍光（ｘ軸）と細胞表面ＨＬＡ発現（ｙ軸）を基準にした２次元フローサイトメトリー分析の結果を示す。それらのＧＦＰ蛍光に基づいてＧＦＰ陰性画分（図５８Ｅ）およびＧＦＰ陽性画分（図５８Ｆ）への細胞の蛍光標識細胞分取（図５８Ｄ）により、ＧＦＰ陽性画分中のゲノム編集（ＨＬＡ陰性）細胞の比率が２９．７％に増大した（図５８Ｆ）。その後、各細胞画分を標準的Ｔ７Ｅ１切断アッセイと、これに続く、アガロースゲル電気泳動に供し、ゲノム編集の有効性を評価した。結果を図５８Ｇに示し、薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、より濃い中実矢印は、この標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ系媒介切断産物に対応するバンドを示す。レーン２、３および４の下端の値は、そのレーン中の切断産物バンド（中実矢印）の相対的シグナル強度（％）に相当する。
【図５８−２】同上。
【図５８−３】同上。
【図５９−１】Ｔ細胞が、ＧＦＰ−ＮＬＳ、内在性Ｂ２Ｍ遺伝子を切断するように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ複合体、およびシャトル剤ＦＳＤ１８の混合物で処理された（図５９Ｃ〜５９Ｅ）、または処理されなかった（図５９Ａおよび５９Ｂ）フローサイトメトリーアッセイの結果を示す。図５９Ａおよび５９Ｂは、ペプチドシャトル剤にも、ＧＦＰやＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１にも曝露されなかった「未処理」陰性対照細胞の結果を示し、これは、ＧＦＰ蛍光（図５９Ａ）および細胞表面ＨＬＡ発現（図５９Ｂ）に対しフローサイトメトリーにより分析された。Ｔ細胞は、ペプチドＦＳＤ１８を介して、ＧＦＰ−ＮＬＳおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１の両方で同時形質導入され、得られたＧＦＰ蛍光分布を図５９Ｃに示す。図５９Ｃに示す２つのゲートは、ＧＦＰ陽性であると見なされた細胞画分（「ＧＦＰ＋」；９３．２％；実線ゲート）、および高いＧＦＰ蛍光を示すと見なされた細胞の細画分（「ＧＦＰ高」；３３．１％；点線ゲート）を示す。蛍光標識細胞分取を実施して、高いＧＦＰ蛍光を示すと見なされた細胞（図５９Ｅ）に比べて、ＧＦＰ陽性であると見なされる細胞（図５９Ｄ）の細胞表面ＨＬＡ発現のレベルを定量化した。１２μＭまたは１５μＭのＦＳＤ１８を用いて、上記同時形質導入実験を繰り返し、続けて、ＧＦＰ陽性およびＧＦＰ陰性細胞画分への蛍光標識細胞分取を実施した。それぞれの画分を標準的Ｔ７Ｅ１切断アッセイに供し、種々の試料をアガロースゲル電気泳動に供した。
【図５９−２】同上。
【図６０】Ｔ細胞が、ペプチドＦＳＤ１８を用いて、カーゴＧＦＰ−ＮＬＳで第１の形質導入（図６０Ｂ）に供されたまたは供されなかった（「未処理」；図６０Ａ）フローサイトメトリー分析の結果を示す。第１の形質導入は、５５．４％のＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率をもたらした（図６０Ｂ）。蛍光標識細胞分取を実施して、第１の形質導入後にＧＦＰ陰性細胞（図６０Ｃ）を単離し、このＧＦＰ陰性細胞集団を、ペプチドＦＳＤ１８を用いて、ＧＦＰ−ＮＬＳの第２の形質導入に供した。この第２の形質導入の結果を図６０Ｄに示し、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率は、６０．６％であることが明らかになった。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
配列表
本出願は、２０１７年１０月１０日に作成された、約５ＭＢの大きさを有するコンピューター可読形式の配列表を含む。このコンピューター可読形式配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。
【表１−１】
2019531316.tif 000002
【表１−２】
2019531316.tif 000003
【００２４】
大規模スクリーニングの取り組みにより、細胞膜透過性ドメイン（ＣＰＤ）と作動可能に連結されたエンドソーム漏出ドメイン（ＥＬＤ）、および任意選択で１つまたは複数のヒスチジンリッチドメインを含むドメインベースペプチドシャトル剤が、真核細胞中の独立したポリペプチドカーゴの形質導入効率を増大させ、それにより、カーゴがサイトゾル／核区画に到達するという発見に至った（例えば、実施例１〜１５を参照されたい）。逆に、上記スクリーニングの取り組みはまた、ポリペプチドカーゴ形質導入能力、過度の毒性、および／またはその他の望ましくない特性（例えば、不十分な溶解度および／または安定性）を持たないまたはそれらが低いいくつかのペプチドを明らかにした。
【００２５】
これらの経験的データ（好ましいまたは好ましくないの両方）に基づいて、より多く成功するシャトル剤に共通する物理化学的性質をより良く理解するために、成功する、あまり成功しない、および失敗するペプチドのアミノ酸配列および性質を比較した。この比較には、次の２つの主要な手法：第１に、種々のスクリーニングしたペプチドを、我々の準拠する生物学的特性評価データに基づいて、それらの形質導入性能に従ってマニュアルで層別化すること；および第２に、より単純に、所与のポリペプチドカーゴおよび細胞株に対し、種々のペプチドの形質導入効率および細胞毒性のみを考慮する、「形質導入スコア」手法；が含まれた。
【００２６】
マニュアル層別化の場合は、例えば、それらの溶解度／安定性／合成の容易さ；エンドソームに捕捉されたカルセインの脱出を容易にするそれらの能力（例えば、実施例２を参照されたい）；種々の細胞型および細胞株（例えば、初代、不死化、付着、懸濁、など）で、ならびに種々の形質導入プロトコル下で、フローサイトメトリーで評価して、１種または複数のタイプの独立したポリペプチドカーゴを細胞内に送達する能力（例えば、実施例３〜６および８〜１５を参照されたい）；蛍光顕微鏡法（例えば、蛍光標識カーゴに対し）、増大した転写活性（例えば、転写因子カーゴに対して）、またはゲノム編集能力（例えば、ヌクレアーゼカーゴまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１などのゲノム編集複合体に対して）（例えば、実施例３〜６および８〜１５を参照されたい）、ならびに種々の形質導入プロトコル下で、種々の細胞型および細胞株（例えば、初代、不死化、付着、懸濁、など）に対する毒性、により評価して、ポリペプチドカーゴをサイトゾルおよび／または核に送達するそれらの能力を十分に考慮して、スクリーニングしたペプチドをそれらの形質導入性能に従って個別に評価した。
【００２７】
「形質導入スコア」手法の場合には、各ペプチドを所与の細胞株および蛍光標識ポリペプチドカーゴに対応するスコアを割り付け、これは、形質導入効率および細胞の毒性データの両方を組み合わせて、単一の数値とする。形質導入スコアは、所与のペプチド、カーゴおよび細胞型に対するフローサイトメトリーにより観察された最高のパーセンテージの形質導入効率に、試験した細胞株中のペプチドの細胞生存率パーセントを単純に掛け合わせることにより計算した。その後、成功する、あまり成功しない、または失敗するシャトル剤としてペプチドを層別化するためのスクリーニングツールとして、ペプチドをそれらの形質導入スコアで選別した
【００２８】
上記マニュアルキュレーションおよび「形質導入スコア」ベース分析により、成功したドメインベースシャトル剤により一般的に共有されるいくつかのパラメーターが明らかになった（例えば、実施例Ａを参照されたい）。これらのパラメーターはその後、ポリペプチドカーゴ形質導入活性を有し、既知の推定ＣＰＤおよび／またはＥＬＤを欠くおよび／またはこれらに基づかない新規ペプチドシャトル剤をマニュアルで設計するために使用された（例えば、実施例Ｂを参照されたい）。さらに、最多数の設計パラメーターを満たすペプチドは通常、最高の形質導入スコアを有したが、最小数の設計パラメーターを満たすペプチドは通常、最低の形質導入スコアを有したことが観察された。
【００２９】
本明細書に記載の設計パラメーターは、アミノ酸配列が機械学習アルゴリズム（例えば、実施例Ｃ．１を参照されたい）を用いて生成された複数の合成ペプチドを試験することによりさらに確認された。この機械学習アルゴリズムは、ドメインベースペプチドの形質導入効率および細胞の毒性データを用いて（しかし、本明細書に記載の設計パラメーターを用いないで）「訓練」された。興味深いことに、機械学習アルゴリズムにより生成された、最高の形質導入スコアを示すペプチドは通常、本明細書に記載の全ての設計パラメーターを満たすペプチドであり、それにより、新規ペプチドシャトル剤の形質導入活性の積極的設計および／または予測でのそれらの使用を具体化する（例えば、特定のポリペプチドカーゴおよび／または細胞型に適応させる）。さらに、コンピューター支援ランダムペプチド配列生成と、それに続けて、記述子フィルタリングを用いて、本明細書に記載の設計パラメーターのほぼ全てを満たす、１０，０００個のペプチドバリアントのリストを生成した（実施例Ｃ．２を参照されたい）。
【００３０】
合理的に設計されたペプチドシャトル剤は、エンドソーム捕捉された蛍光染料の脱出を容易にすることが本明細書で示され、エンドソーム溶解活性が示唆された（例えば、実施例Ｄを参照されたい）。さらに、種々の異なる細胞型（付着および懸濁の両方）において、合理的に設計されたペプチドシャトル剤の種々のポリペプチドカーゴ（例えば、蛍光タンパク質、転写因子、抗体、ならびにＤＮＡテンプレートを有するまたは有さないＣＲＩＳＰＲ結合ゲノム編集複合体の全体）を形質導入する能力も、本明細書で示される（例えば、実施例Ｅ〜Ｇを参照されたい）。
【００３１】
合理的設計パラメーターおよびペプチドシャトル剤
いくつかの態様では、本記載は、ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達する方法に関する。方法は、標的真核細胞とポリペプチドカーゴとを、シャトル剤の非存在下の場合に比べて前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度のシャトル剤の存在下で、接触させることを含む。いくつかの態様では、シャトル剤は、１つまたは複数の次のパラメーターを満たすペプチドに関する。
【００３２】
（１）いくつかの実施形態では、シャトル剤は、少なくとも２０アミノ酸長のペプチドである。例えば、ペプチドは、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のアミノ酸残基の最小長および３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５または１５０個のアミノ酸残基の最大長さを含み得る。いくつかの実施形態では、より短いペプチド（例えば、２０〜５０個のアミノ酸の範囲の）は、化学的合成手法により、より容易に合成され、精製され得、臨床使用により適し得る（細胞発現系から精製しなければならない組換えタンパク質とは対照的に）ので特に有利であり得る。本記載における数および範囲は、５の倍数として列挙されることが多いが、本記載は、そのように制限されてはならない。例えば、本明細書に記載される最大長さは、本記載において、５６、５７、５８…６１、６２などの長さも包含し、本記載において、列挙されないことは、単に簡潔さのためであると理解されなければならない。同じ論拠は、本明細書で記載される同一性の％にも当てはまる。
【００３３】
（２）いくつかの実施形態では、ペプチドシャトル剤は、両親媒性のアルファヘリックスモチーフを含む。本明細書で使用される場合、表現の「アルファヘリックスモチーフ」または「アルファヘリックス」は、別段の指定がない限り、１００度の連続アミノ酸間の回転角度および／またはターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスを有する右巻きコイル状またはスパイラル構造（らせん体）を意味する。本明細書で使用される場合、表現の「アルファヘリックスモチーフを含む」または「両親媒性のアルファヘリックスモチーフ」などは、ペプチドがシャトル剤として細胞中で使用される場合に実際に取るかどうかに関係なく、ペプチド一次アミノ酸配列に基づく生物学的設定で本記載のペプチド（またはペプチドのセグメント）が取ると予測される３次元構造を意味する。さらに、本記載のペプチドは、種々のペプチドの位置で１つまたは複数のアルファヘリックスモチーフを含み得る。例えば、シャトル剤ＦＳＤ５は、その長さ全体にわたりアルファヘリックスを取ることが予測される（図４９Ｃを参照されたい）が、シャトル剤ＦＳＤ１８は、ペプチドのＮおよびＣ末端領域に向いた２つの別々のアルファヘリックスを含むことが予測される（図４９Ｄを参照されたい）。いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、例えば、図４９Ｅおよび４９Ｆに示すようなベータシートモチーフを含むと予測されない。タンパク質およびペプチド中のアルファヘリックスおよびベータシートの存在を予測する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、１つのこのような方法は、新規ペプチド構造予測のためのオンライン情報源（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｓｅｒｖ．ｒｐｂｓ．ｕｎｉｖ−ｐａｒｉｓ−ｄｉｄｅｒｏｔ．ｆｒ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＰＥＰ−ＦＯＬＤ／）である、ＰＥＰ−ＦＯＬＤ（商標）を用いた３Ｄモデリングに基づくものである（Ｌａｍｉａｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｔｈｅｖｅｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ペプチドおよびタンパク質中のアルファヘリックスの存在の他の予測方法が既知であり、当業者なら容易に利用できる。
【００３４】
本明細書で使用される場合、表現の「両親媒性の」は、疎水性および親水性要素（例えば、ペプチドを構成するアミノ酸の側鎖に基づいて）の両方を有するペプチドを意味する。例えば、表現の「両親媒性のアルファヘリックス」または「両親媒性アルファヘリックスモチーフ」は、らせん体を形成するアミノ酸の側鎖の性質に基づいて、非極性疎水性面および極性親水性面を有するアルファヘリックスモチーフを取ると予測されるペプチドを意味する。
【００３５】
（３）いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、Ｒおよび／またはＫ残基に富むものなどの正に帯電した親水性の外面を有する両親媒性のアルファヘリックスモチーフを含む。本明細書で使用される場合、表現の「正に帯電した親水性外面」は、アルファヘリックスホイール投影図に基づいて、両親媒性アルファヘリックスモチーフの片側にクラスター化された少なくとも３個のリシン（Ｋ）および／またはアルギニン（Ｒ）残基の存在を意味する（例えば、図４９Ａの左パネルを参照されたい）。このようなヘリカルホイール投影図は、ｈｔｔｐ：／／ｒｚｌａｂ．ｕｃｒ．ｅｄｕ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｗｈｅｅｌ／ｗｈｅｅｌ．ｃｇｉ．で入手可能なオンラインヘリカルホイール投影図ツールなどの種々のプログラムを用いて作製し得る。いくつかの実施形態では、両親媒性のアルファヘリックスモチーフは、正に帯電した親水性外面を含み、この外面は、（ａ）少なくとも２個、３個または４個の隣接する正に帯電したＫおよび／またはＲ残基；および／または（ｂ）ヘリカルホイール投影図上に、１００度の連続アミノ酸間の回転角度および／またはターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスに基づいて、３個から５個のＫおよび／またはＲ残基を含む６個の隣接する残基のセグメントを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、疎水性の外面を含む両親媒性のアルファヘリックスモチーフを含み、疎水性の外面は、（ａ）ヘリカルホイール投影図上で、少なくとも２個の隣接するＬ残基；および／または（ｂ）ヘリカルホイール投影図上で、１００度の連続アミノ酸間の回転角度および／またはターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスに基づいて、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、およびＭから選択される少なくとも５個の疎水性の残基を含む１０個の隣接する残基のセグメント、を含む。
【００３７】
（４）いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、空間的に隣接する高度疎水性残基（例えば、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、および／またはＭ）から構成される高度疎水性コアを有する両親媒性アルファヘリックスモチーフを含む。いくつかの実施形態では、例えば、図４９Ａ、右パネルに示すように、ターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスのオープンシリンダー表現に基づいて、高度疎水性コアは、空間的に隣接し、ヒスチジンリッチドメインを除外して計算して（下記参照）、ペプチドのアミノ酸の１２〜５０％に相当するＬ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、および／またはＭアミノ酸から構成され得る。いくつかの実施形態では、高度疎水性コアは、ペプチドのアミノ酸の１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、または２０％から２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％に相当する空間的に隣接するＬ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、および／またはＭアミノ酸から構成され得る。より具体的には、高度疎水性コアパラメーターは、最初に、ペプチドのアミノ酸をオープンシリンダー表現に配置し、その後、図４９Ａ、右パネルに示すように、連続した高度疎水性残基（Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、Ｍ）の領域を描写することにより計算し得る。この描写された高度疎水性コアに含まれる高度疎水性残基の数は、その後、ヒスチジンリッチドメイン（例えば、Ｎおよび／またはＣ末端ヒスチジンリッチドメイン）を除くペプチドの合計アミノ酸長さで除算される。例えば、図４９Ａに示したペプチドの場合、描写した高度疎水性コア中に８個の残基が、およびペプチド中に２５個の合計残基（末端の１２個のヒスチジンを除く）が存在する。したがって、高度疎水性コアは３２％（８／２５）である。
【００３８】
（５）疎水性モーメントは、アミノ酸の側鎖の疎水性のベクトル和から計算される、らせん体、ペプチド、またはその一部の両親媒性の尺度に関する（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２）。ポリペプチドの疎水性モーメントを計算するためのオンラインツールは、ｈｔｔｐ：／／ｒｚｌａｂ．ｕｃｒ．ｅｄｕ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｗｈｅｅｌ／ｗｈｅｅｌ．ｃｇｉ．から利用可能である。高疎水性モーメントは強力な両親媒性を示すが、低疎水性モーメントは不十分な両親媒性を示す。いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、３．５〜１１（μ）の疎水性モーメントを有するペプチドまたはアルファヘリックスドメインからなり得るまたはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、シャトル剤は、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０の下限値と、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、または１１．０の上限値との間の疎水性モーメントを有する両親媒性アルファヘリックスモチーフを含むペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、シャトル剤は、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０の下限値と、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、または１０．５の上限値との間の疎水性モーメントを有するペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、疎水性モーメントは、ペプチドに存在し得る全てのヒスチジンリッチドメインを除外して、計算される。
【００３９】
（６）いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、側鎖Ｋ、Ｒ、Ｄ、およびＥから計算して、生理学的ｐＨで、少なくとも＋４の予測される実効電荷を有し得る。例えば、ペプチドの実効電荷は、生理学的ｐＨで少なくとも＋５、＋６、＋７、少なくとも＋８、少なくとも＋９、少なくとも＋１０、少なくとも＋１１、少なくとも＋１２、少なくとも＋１３、少なくとも＋１４または少なくとも＋１５であり得る。これらの正電荷は、一般に、負に帯電したアスパラギン酸および／またはグルタミン酸残基とは対照的に、正に帯電したリシンおよび／またはアルギニン残基のより多い存在により付与される。
【００４０】
（７）いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、８〜１３、好ましくは１０〜１３の予測等電点（ｐＩ）を有し得る。ペプチドまたはタンパク質の等電点を計算および／または測定するプログラムおよび方法は、当技術分野において既知である。例えば、ｐＩは、ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／で入手可能なＰｒｏｔ  Ｐａｒａｍソフトウェアを用いて計算し得る。
【００４１】
（８）いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、３５〜６５％の疎水性残基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）から構成され得る。特定の実施形態では、ペプチドシャトル剤は３６％〜６４％、３７％〜６３％、３８％〜６２％、３９％〜６１％、４０％〜６０％のアミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、およびＶの任意の組み合わせから構成され得る。
【００４２】
（９）いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、０〜３０％の中性親水性残基（Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ）から構成され得る。特定の実施形態では、ペプチドシャトル剤は、１％〜２９％、２％〜２８％、３％〜２７％、４％〜２６％、５％〜２５％、６％〜２４％、７％〜２３％、８％〜２２％、９％〜２１％、または１０％〜２０％のアミノ酸：Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴの任意の組み合わせから構成され得る。
【００４３】
（１０）いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、３５〜８５％のアミノ酸：Ａ、Ｌ、Ｋおよび／またはＲから構成され得る。特定の実施形態では、ペプチドシャトル剤は３６％〜８０％、３７％〜７５％、３８％〜７０％、３９％〜６５％、または４０％〜６０％のアミノ酸：Ａ、Ｌ、Ｋ、またはＲの任意の組み合わせから構成され得る。 
【００４４】
（１１）いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、１５〜４５％のアミノ酸：Ａおよび／またはＬから構成され得る。但し、ペプチド中に少なくとも５％のＬが存在するという条件下の場合である。特定の実施形態では、ペプチドシャトル剤は、１５％〜４０％、２０％〜４０％、２０〜３５％、または２０〜３０％のアミノ酸：ＡおよびＬの任意の組み合わせから構成され得る。但し、ペプチド中に少なくとも５％のＬが存在するという条件下の場合である。
【００４５】
（１２）いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、２０〜４５％のアミノ酸：Ｋおよび／またはＲから構成され得る。特定の実施形態では、ペプチドシャトル剤は、２０％〜４０％、２０〜３５％、または２０〜３０％のアミノ酸：ＫおよびＲの任意の組み合わせから構成され得る。
【００４６】
（１３）いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、０〜１０％のアミノ酸：Ｄおよび／またはＥから構成され得る。特定の実施形態では、ペプチドシャトル剤は、５〜１０％のアミノ酸：ＤおよびＥの任意の組み合わせから構成され得る。
【００４７】
（１４）いくつかの実施形態では、ペプチドシャトル剤中のＡおよび／またはＬのパーセンテージと、Ｋおよび／またはＲのパーセンテージとの絶対的差異は、１０％以下であり得る。特定の実施形態では、ペプチドシャトル剤中のＡおよび／またはＬのパーセンテージと、Ｋおよび／またはＲのパーセンテージとの絶対的差異は、９％、８％、７％、６％、または５％以下であり得る。
【００４８】
（１５）いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、１０％〜４５％のアミノ酸：Ｑ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、またはＨ（すなわち、Ａ、Ｌ、Ｋ、またはＲ以外）から構成され得る。特定の実施形態では、ペプチドシャトル剤は、１５〜４０％、２０％〜３５％、または２０％〜３０％のアミノ酸：Ｑ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、およびＨの任意の組み合わせから構成され得る。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、少なくとも１個の、少なくとも２個の、少なくとも３個の、少なくとも４個の、少なくとも５個の、少なくとも６個の、少なくとも７個の、少なくとも８個の、少なくとも９個の、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、少なくとも１２個の、少なくとも１３個の、少なくとも１４個の、または全ての本明細書に記載のパラメーター（１）〜（１５）を満たす。特定の実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、パラメーター（１）〜（３）の全てを満たし、また、少なくとも６個の、少なくとも７個の、少なくとも８個の、少なくとも９個の、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、または全ての本明細書に記載のパラメーター（４）〜（１５）を満たす。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、１個のみのヒスチジンリッチドメインを含み、１個のヒスチジンリッチドメインの残基は、本明細書に記載のパラメーター（１）〜（１５）の計算／評価に含めてよい。いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、２個以上のヒスチジンリッチドメインを含む場合、１個のヒスチジンリッチドメインの残基のみを、本明細書に記載のパラメーター（１）〜（１５）の計算／評価に含めてよい。例えば、本記載のペプチドシャトル剤が、最初のＮ末端を向いたヒスチジンリッチドメインのおよびＣ末端を向いて第２のヒスチジンリッチドメインの２個のヒスチジンリッチドメインを含む場合、最初のヒスチジンリッチドメインのみを、本明細書に記載のパラメーター（１）〜（１５）の計算／評価に含めてよい。
【００５１】
いくつかの実施形態では、機械学習またはコンピューター支援設計手法を実行して、本明細書に記載のパラメーター（１）〜（１５）の１個または複数を満たすペプチドを生成し得る。パラメーター（１）および（５）〜（１５）などのいくつかのパラメーターは、コンピューター支援設計手法でより実施し易いが、パラメーター（２）、（３）および（４）などの構造的パラメーターは、マニュアル設計手法により適用し易い。したがって、いくつかの実施形態では、１個または複数のパラメーター（１）〜（１５）を満たすペプチドは、コンピューター支援およびマニュアル設計手法を組み合わせて生成し得る。例えば、本明細書（またはその他のもの）で効果的シャトル剤として機能することが示される複数のペプチドの複数の配列アラインメント分析は、いくつかのコンセンサス配列−すなわち、共通に認められる疎水性、カチオン性、親水性のアラニンおよびグリシンアミノ酸の交互変化のパターンの存在を明らかにした。これらのコンセンサス配列の存在は、構造的パラメーター（２）、（３）および（４）を満たすように（すなわち、両親媒性のアルファヘリックス形成、正に帯電した面、および１２％〜５０％の高度疎水性コアを）誘発する可能性がある。したがって、これらのおよびその他のコンセンサス配列を機械学習および／またはコンピューター支援設計手法に採用して、１個または複数のパラメーター（１）〜（１５）を満たすペプチドを生成し得る。
【００５２】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載のペプチドシャトル剤は、以下のアミノ酸配列を含むかまたはこれらからなり得る：
（ａ）［Ｘ１］−［Ｘ２］−［リンカー］−［Ｘ３］−［Ｘ４］（式１）；
（ｂ）［Ｘ１］−［Ｘ２］−［リンカー］−［Ｘ４］−［Ｘ３］（式２）；
（ｃ）［Ｘ２］−［Ｘ１］−［リンカー］−［Ｘ３］−［Ｘ４］（式３）；
（ｄ）［Ｘ２］−［Ｘ１］−［リンカー］−［Ｘ４］−［Ｘ３］（式４）；
（ｅ）［Ｘ３］−［Ｘ４］−［リンカー］−［Ｘ１］−［Ｘ２］（式５）；
（ｆ）［Ｘ３］−［Ｘ４］−［リンカー］−［Ｘ２］−［Ｘ１］（式６）；
（ｇ）［Ｘ４］−［Ｘ３］−［リンカー］−［Ｘ１］−［Ｘ２］（式７）；または
（ｈ）［Ｘ４］−［Ｘ３］−［リンカー］−［Ｘ２］−［Ｘ１］（式８）；
式中、
［Ｘ１］は、次記から選択される：２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［＋］−；１［＋］−１［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；および１［＋］−１［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［＋］−；
［Ｘ２］は、次記から選択される：−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［ζ］−；−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［＋］−；−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［＋］−１［ζ］−；−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−２［＋］−；−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−２［ζ］−；−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−１［＋］−１［ζ］−；および−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；
［Ｘ３］は、次記から選択される：−４［＋］−Ａ−；−３［＋］−Ｇ−Ａ−；−３［＋］−Ａ−Ａ−；−２［＋］−１［Φ］−１［＋］−Ａ−；−２［＋］−１［Φ］−Ｇ−Ａ−；−２［＋］−１［Φ］−Ａ−Ａ−；または−２［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−２［＋］−Ａ−Ｇ−Ａ；−２［＋］−Ａ−Ａ−Ａ−；−１［Φ］−３［＋］−Ａ−；−１［Φ］−２［＋］−Ｇ−Ａ−；−１［Φ］−２［＋］−Ａ−Ａ−；−１［Φ］−１［＋］−１［Φ］−１［＋］−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−１［Φ］−Ｇ−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−１［Φ］−Ａ−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−Ａ−Ｇ−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−Ａ−Ａ−Ａ；−Ａ−１［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−Ａ−１［＋］−Ａ−Ｇ−Ａ；および−Ａ−１［＋］−Ａ−Ａ−Ａ；
［Ｘ４］は、次記から選択される：−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−Ａ；−１［ζ］−２Ａ−２［＋］；−１［＋］−２Ａ−１［＋］−Ａ；−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［ζ］−Ａ−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−２［＋］−Ａ−２［＋］；−２［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−２［＋］−Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−２［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］−Ａ；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−２［＋］；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−２［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−２［ζ］−２［＋］；−１［＋］−２［ζ］−１［＋］−Ａ；−１［＋］−２［ζ］−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−２［ζ］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−３［ζ］−２［＋］；−３［ζ］−１［＋］−Ａ；−３［ζ］−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−Ａ；−１［ζ］−２Ａ−２［＋］；−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−２［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−２［＋］−１［ζ］−１［＋］−Ａ；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］−Ａ；−１［＋］−２Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；および−１［ζ］−Ａ−１［ζ］−Ａ−１［＋］；および
［リンカー］は次記から選択される：−Ｇｎ−；−Ｓｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎＧｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎＳｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎＧｎ（ＧｎＳｎ）ｎ−；および−（ＧｎＳｎ）ｎＳｎ（ＧｎＳｎ）ｎ−；
式中、［Φ］はアミノ酸：Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり；［＋］は、アミノ酸：ＬｙｓまたはＡｒｇであり；［ζ］は、アミノ酸：Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒであり；Ａはアミノ酸：Ａｌａであり；Ｇはアミノ酸：Ｇｌｙであり；Ｓはアミノ酸：Ｓｅｒであり；ｎは、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜１〜４、または１〜３の整数である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、配列番号１０４、１０５、１０７、１０８、１１０〜１３１、１３３〜１３５、１３８、１４０、１４２、１４５、１４８、１５１、１５２、１６９〜２４２、および２４３〜１０２４２のアミノ酸配列のいずれか１つを含むかまたはこれからなり得る。いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、配列番号１５８および／または１５９のアミノ酸配列モチーフを含み得、これは、ペプチドＦＳＤ５、ＦＳＤ１６、ＦＳＤ１８、ＦＳＤ１９、ＦＳＤ２０、ＦＳＤ２２、およびＦＳＤ２３のいずれかで見出された。いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、配列番号１５９のアミノ酸配列モチーフに作動可能に連結された配列番号１５８のアミノ酸配列モチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、配列番号１０４、１０５、１０７、１０８、１１０〜１３１、１３３〜１３５、１３８、１４０、１４２、１４５、１４８、１５１、１５２、１６９〜２４２、および２４３〜１０２４２のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるペプチド、または配列番号１０４、１０５、１０７、１０８、１１０〜１３１、１３３〜１３５、１３８、１４０、１４２、１４５、１４８、１５１、１５２、１６９〜２４２、および２４３〜１０２４２のいずれか１つの機能性バリアントであるペプチドを含み得るまたはそれからなり得る。本明細書で使用される場合、「機能性バリアント」は、ポリペプチドカーゴ形質導入活性を有するペプチドを意味し、これは、参照ペプチドとは１個または複数の保存的アミノ酸置換分だけ異なる。本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基と置き換えられる置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において詳細に明らかにされており、これらの側鎖には、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、配列番号５７〜５９、６６〜７２または８２〜１０２の内のいずれか１つのアミノ酸配列または配列番号５７〜５９、６６〜７２もしくは８２〜１０２の内のいずれか１つに対して少なくとも６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％もしくは９５％の同一性を有するその機能性バリアントを含み得るまたはそれからなり得る。いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、配列番号５７〜５９、６６〜７２または８２〜１０２の内のいずれか１つの配列番号の内の１つまたは複数のアミノ酸配列を含まない。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、本明細書に記載のペプチドのオリゴマー（例えば、二量体、三量体など）を含み得る。このようなオリゴマーは、同一または異なる種類のシャトル剤単量体を共有結合することによって、（例えば、単量体配列中に導入されたシステイン残基を連結するジスルフィド架橋を使用して）構築され得る。いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、Ｎ末端および／またはＣ末端システイン残基を含み得る。
【００５６】
ヒスチジンリッチドメイン
いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、１つまたは複数のヒスチジンリッチドメインをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ヒスチジンリッチドメインは、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％または少なくとも９０％のヒスチジン残基を含む、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個または少なくとも６個のアミノ酸のストレッチであり得る。いくつかの実施形態では、ヒスチジンリッチドメインは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個  少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個または少なくとも９個の連続するヒスチジン残基を含み得る。理論に束縛されるものではないが、シャトル剤中のヒスチジンリッチドメインは、エンドソームの酸性条件下での、そのイミダゾール基のプロトン化によって、エンドソームにおいて、プロトンスポンジとして作用し得、エンドソーム膜不安定化の別の機序を提供し、したがって、エンドソームにより捕捉されたカーゴが、サイトゾルに到達する能力をさらに促進する。いくつかの実施形態では、ヒスチジンリッチドメインは、ペプチドシャトル剤のＮおよび／またはＣ末端に位置し得るまたはＮおよび／またはＣ末端を向いて位置し得る。
【００５７】
リンカー
いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、１つまたは複数の好適なリンカー（例えば、フレキシブルポリペプチドリンカー）を含み得る。いくつかの実施形態では、このようなリンカーは、２つ以上の両親媒性のアルファヘリックスモチーフ（例えば、図４９Ｄのシャトル剤ＦＳＤ１８を参照されたい）を離れさせ得る。いくつかの実施形態では、リンカーを用いて、さらに２つのドメイン（ＣＰＤ、ＥＬＤ、またはヒスチジンリッチドメイン）を相互から分離できる。いくつかの実施形態では、リンカーは、回転能力を有さない小さい疎水性アミノ酸（グリシンなど）および安定性および可動性を付与する極性セリン残基の配列を付加することにより形成され得る。リンカーは、柔らかく、シャトル剤のドメインが動くのを可能にし得る。いくつかの実施形態では、プロリンは、おおきな立体構造剛性を付加する場合があるので回避され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、セリン／グリシンリッチリンカー（例えば、ＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳなど）であり得る。いくつかの実施形態では、適したリンカーを含むシャトル剤の使用は、独立ポリペプチドカーゴを、付着細胞ではなく懸濁細胞に送達するために有利であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、−Ｇｎ−；−Ｓｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎＧｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎＳｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎＧｎ（ＧｎＳｎ）ｎ−；または−（ＧｎＳｎ）ｎＳｎ（ＧｎＳｎ）ｎ−を含むまたはこれらからなり、Ｇはアミノ酸Ｇｌｙであり；Ｓはアミノ酸Ｓｅｒであり、ｎは１〜５の整数である。
【００５８】
エンドソーム漏出ドメイン（ＥＬＤ）
いくつかの態様では、本記載のペプチドシャトル剤は、エンドソーム脱出および細胞質区画へのアクセスを促進するためにエンドソーム漏出ドメイン（ＥＬＤ）を含み得る。本明細書で使用される場合、表現「エンドソーム漏出ドメイン」は、エンドソームにより捕捉された高分子に、細胞質区画に到達する能力を付与するアミノ酸の配列を指す。理論に束縛されるものではないが、エンドソーム漏出ドメインは、短い配列（ウイルスまたは細菌ペプチドに由来することが多い）であり、これは、エンドソーム膜の不安定化およびエンドソーム内容物の細胞質への放出を誘導すると考えられている。本明細書で使用される場合、表現「エンドソーム溶解性ペプチド」は、エンドソーム膜不安定化特性を有するペプチドのこの全般的なクラスを指すものとする。したがって、いくつかの実施形態では、本記載の合成ペプチドまたはポリペプチドベースのシャトル剤は、エンドソーム溶解性ペプチドであるＥＬＤを含み得る。このようなペプチドの活性は、例えば、実施例２に記載されるカルセインエンドソーム脱出アッセイを使用して評価され得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ＥＬＤは、ｐＨ依存性膜活性ペプチド（ＰＭＡＰ）またはｐＨ依存性溶解性ペプチドなどの酸性ｐＨで膜を破壊するペプチドであり得る。例えば、ペプチドＧＡＬＡおよびＩＮＦ−７は、ｐＨの低下が、それらが含有するアミノ酸の電荷を修飾する場合にアルファヘリックスを形成する両親媒性ペプチドである。理論に束縛されるものではないが、より詳しくは、ＧＡＬＡなどのＥＬＤは、ｐＨの低減によるコンホメーション変化後に、膜脂質の細孔およびフリップフロップの形成によって、エンドソーム漏出を誘導することが示唆される（Ｋａｋｕｄｏ，Ｃｈａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｌｉ，Ｎｉｃｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。対照的に、ＩＮＦ−７などのＥＬＤは、エンドソーム膜中に蓄積することおよびそれを不安定化することによって、エンドソーム漏出を誘導することが示唆されている（Ｅｌ−Ｓａｙｅｄ，Ｆｕｔａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。したがって、エンドソーム成熟の過程で、同時におこるｐＨの低下が、ペプチドの構造の変化を引き起こし、これが、エンドソーム膜を不安定化し、エンドソーム内容物の放出につながる。同一原理が、シュードモナスの毒素Ａに当てはまると考えられる（Ｖａｒｋｏｕｈｉ，Ｓｃｈｏｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ｐＨの低下後、毒素のトランスロケーションドメインの構造が変化し、細孔が形成されたエンドソーム膜へのその挿入が可能となる（Ｌｏｎｄｏｎ  １９９２，Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  １９９２）。これは最終的に、エンドソーム不安定化をもたらし、エンドソームの外側へ複合体を移動させる。上記のＥＬＤは、本記載のＥＬＤ並びにその作用機序が十分に明らかにされ得ないエンドソーム漏出のその他の機序内に包含される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ＥＬＤは、直鎖状カチオン性アルファヘリックス抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）などの抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）であり得る。これらのペプチドは、細菌膜と強力に相互作用するその能力のために自然免疫応答において、重要な役割を果たす。理論に束縛されるものではないが、これらのペプチドは、水溶液中で無秩序な状態をとるが、疎水性環境においては、アルファヘリックス二次構造をとると考えられる。後者の構造は、通常の濃度依存性膜破壊特性に寄与すると考えられる。エンドソーム中に特定の濃度で蓄積すると、一部の抗菌ペプチドは、エンドソーム漏出を誘導し得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＥＬＤは、セクロピン−Ａ／メリチンハイブリッド（ＣＭシリーズ）ペプチドなどの抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）であり得る。このようなペプチドは、膜破壊能力を有する、最小の最も有効なＡＭＰ由来ペプチドの中１つであると考えられる。セクロピンは、グラム陽性およびグラム陰性菌の両方に対して膜撹乱能を有する抗菌ペプチドのファミリーである。セクロピンＡ（ＣＡ）、第１の特定された抗菌ペプチドは、直鎖状構造を有する３７個のアミノ酸から構成される。メリチン（Ｍ）、２６個のアミノ酸のペプチドは、ハチ毒において、見られる細胞膜溶解性因子である。セクロピン−メリチンハイブリッドペプチドは、どの抗菌剤においても望ましい特性である、真核細胞に対する細胞毒性を有さない（すなわち、非溶血性の）短い効率的な抗生物質ペプチドを生成するとわかっている。これらのキメラペプチドは、セクロピンＡの親水性Ｎ末端ドメインの、メリチンの疎水性Ｎ末端ドメインとの種々の組合せから構築され、細菌モデル系で試験されてきた。２つの２６マー、ＣＡ（１−１３）Ｍ（１−１３）およびＣＡ（１−８）Ｍ（１−１８）（Ｂｏｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）が、メリチンの細胞傷害性効果を伴わずに、天然セクロピンＡのより広範な、改善された効力を実証するとわかっている。
【００６２】
より短いＣＭシリーズペプチドを製造しようとする試みでは、Ａｎｄｒｅｕら、１９９２の著者は、２６マー（ＣＡ、１−８）Ｍ、１−１８などのハイブリッドペプチドを構築し、それらを、２０マー（ＣＡ、１−８）Ｍ、１−１２、１８マー（ＣＡ、１−８）Ｍ、１−１０並びに６種の１５マー（ＣＡ（１−７）Ｍ（１−８）、ＣＡ（１−７）Ｍ（２−９）、ＣＡ（１−７）Ｍ（３−１０）、ＣＡ（１−７）Ｍ（４−１１）、ＣＡ（１−７）Ｍ（５−１２）およびＣＡ、１−７）Ｍ、６−１３と比較した。２０および１８マーは、ＣＡ（１−８）Ｍ（１−１８）と比較して同様の活性を維持した。６種の１５マーの中でも、ＣＡ（１−７）Ｍ（１−８）は、低い抗菌活性を示したが、その他の５種は、溶血性効果を有さない２６マーと比較して、同様の抗生物質効力を示した。したがって、いくつかの実施形態では、本記載の合成ペプチドまたはポリペプチドベースのシャトル剤は、上記のものなどのＣＭシリーズペプチドバリアントであるか、またはそれに由来するＥＬＤを含み得る。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ＥＬＤは、メリチン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）の残基２〜１２と融合している、セクロピン−Ａ（ＫＷＫＬＦＫＫＩＧＡＶＬＫＶＬＴＴＧ）の残基１〜７から構成されるＣＭシリーズペプチドＣＭ１８であり得る［Ｃ（１−７）Ｍ（２−１２）］ＣＭ１８は、細胞膜透過性ペプチドＴＡＴと融合される場合には、独立に細胞膜を越え、エンドソーム膜を不安定化し、一部のエンドソームにより捕捉されたカーゴが、サイトゾルに放出されることを可能にする（Ｓａｌｏｍｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。しかし、著者の実験の一部における、フルオロフォア（ａｔｔｏ−６３３）と融合されたＣＭ１８−ＴＡＴ１１ペプチドの使用は、フルオロフォア自体の使用が、例えば、エンドソーム膜の光化学的破壊によるエンドソーム溶解（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｓｉｓ）に寄与するとわかったので（Ｅｒａｚｏ−Ｏｌｉｖｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、フルオロフォアに対するペプチドの寄与についての不確実性を強める。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ＥＬＤは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＣＭ１８、または配列番号１に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％もしくは９５％の同一性を有し、エンドソーム溶解活性を有するそのバリアントであり得る。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ＥＬＤは、エンドソーム中に蓄積するとエンドソーム膜不安定化を引き起こし得る、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）のＨＡ２サブユニットのＮ末端に由来するペプチドであり得る。
【００６６】
いくつかの実施形態では、本記載の合成ペプチドまたはポリペプチドベースのシャトル剤は、表Ｉに示されるＥＬＤであるか、またはそれに由来するＥＬＤ、またはエンドソーム脱出活性および／もしくはｐＨ依存性膜破壊活性を有するそのバリアントを含み得る。
【表２】
2019531316.tif 000004
【００６７】
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、１種または複数のＥＬＤまたはＥＬＤのタイプを含み得る。より詳しくは、それらは、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種またはそれ多くのＥＬＤを含み得る。いくつかの実施形態では、シャトル剤は、１〜１０種のＥＬＤ、１〜９種のＥＬＤ、１〜８種のＥＬＤ、１〜７種のＥＬＤ、１〜６種のＥＬＤ、１〜５種のＥＬＤ、１〜４種のＥＬＤ、１〜３種のＥＬＤなどを含み得る。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤内のその他のドメイン（ＣＰＤ、ヒスチジンリッチドメイン）に対するＥＬＤの順序または配置は、シャトル剤の折返し輸送能力が保持される限り変わってもよい。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＥＬＤは、表Ｉ中に列挙されるいずれか１種のバリアントまたは断片であり、エンドソーム溶解活性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＥＬＤは、配列番号１〜１５、６３もしくは６４のいずれか１種のアミノ酸配列または配列番号１〜１５、６３もしくは６４のいずれか１種に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％もしくは９５％同一であり、エンドソーム溶解活性を有する配列を含み得る、またはそれからなり得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、配列番号１〜１５、６３、または６４の内のいずれか１つの配列番号の内の１つまたは複数のアミノ酸配列を含まない。
【００７１】
細胞浸透ドメイン（ＣＰＤ）
いくつかの態様では、本記載のシャトル剤は、細胞浸透ドメイン（ＣＰＤ）を含み得る。本明細書で使用される場合、表現「細胞浸透ドメイン」とは、ＣＰＤを含有する高分子（例えば、ペプチドまたはタンパク質）に、細胞に形質導入される能力を付与するアミノ酸の配列を意味する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＣＰＤは、細胞膜透過性ペプチドまたは細胞膜透過性ペプチドのタンパク質形質導入ドメインであり得る（または由来し得る）。細胞膜透過性ペプチドは、さまざまなカーゴ（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、小分子化合物またはそうでなければ膜不透過性であるその他の高分子／化合物）を細胞内にうまく送達するためのキャリアとして機能し得る。細胞膜透過性ペプチドは、塩基性アミノ酸に富み、高分子と融合される（または、そうではなく作動可能に連結される）と、細胞内への内部移行を媒介する短いペプチドを含むことが多い（Ｓｈａｗ，Ｃａｔｃｈｐｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。最初の細胞膜透過性ペプチドは、転写のＨＩＶ−１トランスアクチベーター（Ｔａｔ）タンパク質の細胞浸透能力を解析することにより特定された（Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ  １９８８，Ｖｉｖｅｓ，Ｂｒｏｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。このタンパク質は、その細胞膜内への挿入および細孔の形成を促進する「ＴＡＴ」と名付けられた短い親水性アミノ酸配列を含有する。この発見以来、多数のその他の細胞膜透過性ペプチドが報告されてきた。この関連で、いくつかの実施形態では、ＣＰＤは、表ＩＩに記載されるような細胞膜透過性ペプチドまたは細胞膜透過性活性を有するそのバリアントであり得る。
【表３】
2019531316.tif 000005
【００７３】
理論に束縛されるものではないが、細胞膜透過性ペプチドは、細胞膜と相互作用し、その後、ピノサイトーシスまたはエンドサイトーシスによって、細胞膜を通過すると考えられる。ＴＡＴペプチドの場合には、その親水性および電荷は、その細胞膜内の挿入および細孔の形成を促進すると考えられる（Ｈｅｒｃｅ  ａｎｄ  Ｇａｒｃｉａ  ２００７）。疎水性ペプチド内のアルファヘリックスモチーフ（例えば、ＳＰ）も、細胞膜内に細孔を形成すると考えられる（Ｖｅａｃｈ、Ｌｉｕら、２００４）。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、１種もしくは複数のＣＰＤまたはＣＰＤのタイプを含み得る。より詳しくは、それらは、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種または少なくとも５種またはそれより多いＣＰＤを含み得る。いくつかの実施形態では、シャトル剤は、１から１０種の間のＣＰＤ、１から６種の間のＣＰＤ、１から５種の間のＣＰＤ、１から４種の間のＣＰＤ、１から３種の間のＣＰＤなどを含み得る。
【００７５】
いくつかの実施形態では、ＣＰＤは、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＴＡＴ、または配列番号１７に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％もしくは９５％の同一性を有し、細胞膜透過性活性を有するそのバリアント、或いは配列番号１８のアミノ酸配列を有するペネトラチン、または配列番号１８に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％もしくは９５％の同一性を有し、細胞膜透過性活性を有するそのバリアントであり得る。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ＣＰＤは、配列番号６５のアミノ酸配列を有するＰＴＤ４、または配列番号６５に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％もしくは９５％の同一性を有するそのバリアントであり得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤内のその他のドメイン（ＥＬＤ、ヒスチジンリッチドメイン）に対するＣＰＤの順序または配置は、シャトル剤の折返し輸送能力が保持される限り変わってよい。
【００７８】
いくつかの実施形態では、ＣＰＤは、表ＩＩに記載されるいずれか１種のバリアントまたは断片であり、細胞膜透過性活性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＣＰＤは、配列番号１６〜２７もしくは６５のいずれか１種のアミノ酸配列または配列番号１６〜２７もしくは６５のいずれか１種に対して少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％もしくは９５％同一であり、細胞膜透過性活性を有する配列を含み得る、またはからなり得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、配列番号１６〜２７または６５の内の１つまたは複数のアミノ酸配列を含まない。
【００８０】
カーゴ
いくつかの態様では、本記載のペプチドシャトル剤は、ポリペプチドカーゴ（例えば、独立したポリペプチドカーゴ）を、標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するのに有用であり、合成ペプチドシャトル剤は、前記合成ペプチドシャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドカーゴは、細胞内送達をさらに容易にするために１種または複数のＣＰＤと融合され得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドカーゴと融合されるＣＰＤは、本記載のシャトル剤中に存在し得るＣＰＤと同一であっても、異なっていてもよい。このような融合タンパク質は、標準組換え技術を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、独立ポリペプチドカーゴは、第２の生物学的に活性なカーゴ（例えば、生物学的に活性なポリペプチドまたは化合物）と、融合され、複合体形成され、または共有結合により結合され得る。或いはまたは同時に、ポリペプチドカーゴは、細胞内ターゲッティングドメインを含み得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドカーゴは、それがその意図される生物学的効果を実施するために核に送達されなければならない。１つのこのような例として、カーゴが、核送達のために意図されるポリペプチド（例えば、転写因子）である場合がある。この関連で、ウイルスＤＮＡの移行の機序に関する研究は、核移行シグナル（ＮＬＳ）の特定につながった。ＮＬＳ配列は、核エンベロープを横切る移行のトランスポーターおよびメディエーターとして作用するタンパク質（インポーチンαおよびβ）により認識される。ＮＬＳは、一般に、アルギニン、ヒスチジンおよびリシンなどの荷電アミノ酸が豊富であり、インポーチンによるその認識に部分的に関与する正電荷を付与する。したがって、いくつかの実施形態では、ポリペプチドカーゴは、表ＩＩＩに記載されるようなＮＬＳのうち１種または複数などの、核送達を容易にするためのＮＬＳまたは核ターゲッティング活性を有するそのバリアントを含み得る。もちろん、特定の実施形態では、ポリペプチドカーゴは、その天然ＮＬＳを含み得ることが理解される。
【表４】
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【００８２】
組換えタンパク質は、細胞質に送達されると、真核細胞のタンパク質輸送系に曝露される。実際、すべてのタンパク質は、細胞の細胞質において合成され、次いで、シャトルタンパク質により認識される小さいアミノ酸配列に基づく輸送の系によって、その最終細胞内局在位置に再分配される（Ｋａｒｎｉｅｌｙ  ａｎｄ  Ｐｉｎｅｓ  ２００５，Ｓｔｏｊａｎｏｖｓｋｉ，Ｂｏｈｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。ＮＬＳに加えて、その他の局在性配列は、本記載のポリペプチドカーゴの細胞内送達後、種々のオルガネラへの細胞内ターゲッティングを媒介し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本記載のポリペプチドカーゴは、表ＩＶに列挙されるような配列のうち１種または複数などの、シャトル剤およびカーゴの、特定のオルガネラへの送達を促進するための細胞内局在化シグナルまたは対応する細胞内ターゲッティング活性を有するそのバリアントを含み得る。
【表５】
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【００８３】
いくつかの実施形態では、カーゴは、細胞内送達向けの生物学的に活性な（組換え）ポリペプチド（例えば、転写因子、サイトカインまたはヌクレアーゼ）などの生物学的に活性な化合物であり得る。本明細書で使用される場合、表現「生物学的に活性な」とは、標的細胞中に導入された場合に、化合物の、構造的、調節的および／または生化学的機能を媒介する能力を指す。
【００８４】
いくつかの実施形態では、カーゴは、転写因子などの核送達のために意図される組換えポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、転写因子は、ＨＯＸＢ４（Ｌｕ、Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９（Ｔａｋｅｄａ、Ｇｏｏｌｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ９、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ  ２００６）、ＭｙｏＤ（Ｓｕｎｇ、Ｍｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３  ａｎｄ  ＭａｆＡ（Ａｋｉｎｃｉ、Ｂａｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、Ｂｌｉｍｐ−１（Ｌｉｎ、Ｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、Ｅｏｍｅｓ、Ｔ−ｂｅｔ（Ｇｏｒｄｏｎ、Ｃｈａｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、ＦＯＸＯ３Ａ（Ｗａｒｒ、Ｂｉｎｎｅｗｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、ＮＦ−ＹＡ（Ｄｏｌｆｉｎｉ、Ｍｉｎｕｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、ＳＡＬＬ４（Ａｇｕｉｌａ、Ｌｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、ＩＳＬ１（Ｆｏｎｏｕｄｉ、Ｙｅｇａｎｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、ＦｏｘＡ１（Ｔａｎ、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、Ｎａｎｏｇ、Ｅｓｒｒｂ、Ｌｉｎ２８（Ｂｕｇａｎｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、ＨＩＦ１−α（Ｌｏｒｄ−Ｄｕｆｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、Ｈｌｆ、Ｒｕｎｘ１ｔ１、Ｐｂｘ１、Ｌｍｏ２、Ｚｆｐ３７、Ｐｒｄｍ５（Ｒｉｄｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）またはＢｃｌ−６（Ｉｃｈｉｉ、Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）であり得る。
【００８５】
いくつかの実施形態では、カーゴは、ゲノム編集技術にとって有用なヌクレアーゼなどの、核送達向けの組換えポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、Ｃｐｆ１（Ｚｅｔｓｃｈｅら、２０１５）、ＣａｓＸおよび／またはＣａｓＹ（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）（Ｃｏｘら、２０１５）、ホーミングエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ナトロノバクテリウム・グレゴリーアルゴノート（ＮｇＡｇｏ；Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）などのＤＮＡ誘導性ヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組合せであり得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、触媒的に死んだＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｄＣａｓ９）、ｄＣｐｆ１、ｄＣａｓＸ、ｄＣａｓＹ、またはこれらの任意の組み合わせなどの触媒的に死んだエンドヌクレアーゼであってもよい。それでも、本明細書で明示的に言及されないその他のヌクレアーゼも本記載に包含され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、核移行シグナル（例えば、Ｃａｓ９−ＮＬＳ、Ｃｐｆ１−ＮＬＳ、ＺＦＮ−ＮＬＳ、ＴＡＬＥＮ−ＮＬＳ）と融合され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、核酸（例えば、１種または複数のガイドＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方）と複合体形成され得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡ結合活性を有し得るが、ＤＮＡを切断する能力を欠き得る。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、１種または複数のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、例えば、以下に記載される１種または複数のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの細胞内送達（例えば、核送達）のために使用され得る。
【００８７】
そのそれぞれのＣａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７およびＣａｓ８タンパク質、並びに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉ−Ｅ型）におけるＣｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃａｓ７、Ｃａｓ５およびＣａｓ６ｅサブユニットおよび緑膿菌（Ｉ−Ｆ型）におけるＣｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３およびＣａｓ６ｆを含む、これらのＣａｓタンパク質のシグネチャー相同体およびサブユニットを含む、Ｉ型およびその亜型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＩ（Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。そのそれぞれのＣａｓ１、Ｃａｓ２およびＣａｓ９タンパク質、並びにＣｓｎ複合体を含む、これらのＣａｓタンパク質のシグネチャー相同体およびサブユニットを含む、ＩＩ型およびその亜型Ａ、Ｂ、Ｃ（Ｍａｋａｒｏｖａら、２０１１）。
【００８８】
そのそれぞれのＣａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ６およびＣａｓ１０タンパク質、並びにＣｓｍおよびＣＭＲ複合体を含むこれらのＣａｓタンパク質のシグネチャー相同体およびサブユニットを含む、ＩＩＩ型およびその亜型Ａ、ＢおよびＭＴＨ３２６様モジュール（Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。ＩＶ型は、Ｃａｓタンパク質のＣｓｆ３ファミリーを表す。このファミリーのメンバーは、アシドチオバチルス・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）ＡＴＣＣ２３２７０、アゾアルカス属（Ａｚｏａｒｃｕｓ）の種（ＥｂＮ１株）およびロドフェラックス・フェリレデューセンス（Ｒｈｏｄｏｆｅｒａｘ  ｆｅｒｒｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）（ＤＳＭ１５２３６／ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２１／Ｔ１１８株）において、ＣＲＩＳＰＲリピート付近に現れる。後者２種では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座は、プラスミド上に見られる。Ｖ型およびその亜型は、最近になって発見され、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１およびＣ２ｃ３を含む。ＶＩ型は、公知の配列に対してわずかな相同性しか共有しないと報告された酵素Ｃ２ｃ２を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、本明細書に記載のものなどのさまざまな適用のために、上記のヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの内の１種または複数とともに使用され得る。ＣＲＩＳＰＲ系は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合、ヘリカーゼおよびヌクレアーゼモチーフなどのそのそれぞれの核酸と相互作用する（Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｂａｒｒａｎｇｏｕ  ＆  Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，２０１４）。ＣＲＩＳＰＲ系は、種々のゲノム編集適用のために使用され得、これは以下に挙げられる：
非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および／または相同組換え（ＨＤＲ）（Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）を実施するＣａｓ媒介性ゲノム編集法、
その他のタンパク質パートナーとの複合体形成を伴って、または伴わずに、プロモーター配列と、１種または数種のｇＲＮＡと、およびＲＮＡポリメラーゼと結合された場合に転写開始を抑制および／または活性化し得る、触媒的に死んだＣａｓ（ｄＣａｓ）（Ｂｉｋａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）、
転写抑制、転写活性化、クロマチンリモデリング、蛍光リポーター、ヒストン修飾、リコンビナーゼ系アセチル化、メチル化、ユビキチン化、リン酸化、ＳＵＭＯ化、リボシル化およびシトルリン化を含むゲノムの特定の部位に酵素活性をもたらす方法として種々の機能性タンパク質ドメインとも融合され得る、触媒的に死んだＣａｓ（ｄＣａｓ）（Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）。
【００９０】
当業者ならば、本シャトル剤は、本実施例ではＣａｓ９およびＣｐｆ１を用いて例示されるが、本明細書に記載されるようなその他のヌクレアーゼを用いて使用され得ることは理解するであろう。したがって、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼおよびこのようなヌクレアーゼまたはその他のもののバリアントが本記載に包含される。一態様では、本記載は、ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ、またはそのバリアント（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合できるが、ヌクレアーゼ活性を失っているもの；または転写因子に融合されているもの）などのヌクレアーゼ活性を有する任意のカーゴを広く包含することを理解されたい。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドカーゴは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカインまたは腫瘍壊死因子などのサイトカインであり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドカーゴは、ホルモンまたは増殖因子であり得る。いくつかの実施形態では、カーゴは、抗体（例えば、標識抗体、治療抗体、抗アポトーシス性抗体、細胞内抗原を認識する抗体）であり得る。いくつかの実施形態では、カーゴは、例えば、研究および／または診断目的のための細胞内送達が意図される検出可能な標識（蛍光ポリペプチドまたはリポーター酵素）であり得る。
【００９２】
いくつかの実施形態では、カーゴは、球状タンパク質または繊維状タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、カーゴは、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５〜５０から約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｋＤａまたはそれ以上の内のいずれか１つの分子量を有し得る。いくつかの実施形態では、カーゴは、約２０〜２００ｋＤａの分子量を有し得る。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドカーゴは、細胞内分子認識するペプチドなどのペプチドカーゴであり得る。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ポリペプチドカーゴは、酵素および／または酵素阻害剤であり得る。
【００９５】
いくつかの実施形態では、本記載のペプチドシャトル剤は、ポリペプチドカーゴを、種々の型の標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するのに有用であり、合成ペプチドシャトル剤は、前記合成ペプチドシャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度で使用される。標的真核細胞は、動物細胞、哺乳動物細胞またはヒト細胞であり得る。いくつかの実施形態では、標的真核細胞は、幹細胞（例えば、胚幹細胞、多能性幹細胞、誘導性多能性幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、末梢血幹細胞）、初代細胞（例えば、筋芽細胞、線維芽細胞）または免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、抗原提示細胞）であり得る。タンパク質形質導入に対して抵抗性がある、または受け入れられないことが多い細胞は、本記載の合成ペプチドまたはポリペプチドベースのシャトル剤の興味深い候補であり得るということは理解されよう。
【００９６】
非毒性で、代謝可能なシャトル剤
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、５０μＭ、４５μＭ、４０μＭ、３５μＭ、３０μＭ、２５μＭ、２０μＭ、１５μＭ、１０μＭ、９μＭ、８μＭ、７μＭ、６μＭ、５μＭ、４μＭ、３μＭ、２μＭ、１μＭ、０．５μＭ、０．１μＭ、または０．０５μＭまでの濃度まで、目的の標的真核細胞に対して非毒性であり得る。本記載のシャトル剤の細胞毒性は、任意の適した方法を使用して測定され得る。さらに、形質導入プロトコルは、シャトル剤の毒性を低減または最小にするように、および／またはトランスフェクション効率を改善／最大化するように適応され得る（例えば、使用されるシャトルおよび／またはカーゴの濃度、シャトル／カーゴ曝露時間、血清の存在下または非存在下での曝露）。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、目的の標的真核細胞によって、容易に代謝可能である。例えば、シャトル剤は、全体的にまたは本質的に、シャトル剤に対して、標的真核細胞が代謝／分解する細胞機構を有するペプチドまたはポリペプチドからなり得る。実際、本記載の合成ペプチドおよびポリペプチドベースのシャトル剤の細胞内半減期は、フルオロフォアなどの外来有機化合物の半減期よりもかなり小さいと予測される。しかし、フルオロフォアは、毒性であり得、それらが臨床的に安全に使用され得る前に調べられなければならない（Ａｌｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、臨床使用に適したものであり得る。いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、毒性が不確かであるか、または排除されていないドメインまたは化合物の使用を避け得る。
【００９８】
カクテル
いくつかの実施形態では、本記載は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５種類の異なるタイプの本明細書において定義されるような合成ペプチドまたはポリペプチドベースのシャトル剤のカクテルを含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、種々の種類の合成ペプチドまたはペプチドシャトル剤（例えば、異なる種類のドメインを含む種々のシャトル剤）を組み合わせることにより、種々のポリペプチドカーゴを細胞内に送達するための高められた汎用性を提供し得る。さらに、理論に束縛されるものではないが、低濃度の種々の種類のシャトル剤を組み合わせることにより、単一種類のシャトル剤（例えば、より高濃度の）を使用に伴う細胞毒性を低減するのに役立ち得る。
【００９９】
方法、キット、使用および細胞
いくつかの実施形態では、本記載は、ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達する方法に関する。方法は、標的真核細胞とポリペプチドカーゴとを、シャトル剤の非存在下の場合に比べて前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度の前記シャトル剤の存在下で、接触させることを含む。いくつかの実施形態では、標的真核細胞とポリペプチドカーゴとをシャトル剤の存在下で接触させることにより、前記シャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率が、少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍まで、高められる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本記載は、ポリペプチドカーゴの標的真核細胞のサイトゾルへの形質導入効率を増大させるための方法に関する。本明細書で使用される場合、表現「形質導入効率の増大」は、本記載のシャトル剤の、目的のカーゴ（例えば、ポリペプチドカーゴ）が、細胞膜を横切って細胞内に送達される標的細胞の集団のパーセンテージまたは割合を改善する能力を指す。免疫蛍光顕微鏡、フローサイトメトリーおよびその他の適した方法が、カーゴ形質導入効率を評価するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、例えば、免疫蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳおよびその他の適した方法による尺度として、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％の形質導入効率を可能にし得る。いくつかの実施形態では、本記載のシャトル剤は、例えば、実施例３．３ａに記載されるアッセイによる、または当技術分野で公知の別の適したアッセイによる尺度として、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の細胞生存率と一緒に、上記の形質導入効率のうちの１種を可能にし得る。
【０１０１】
標的細胞形質導入効率の増大に加えて、本記載のシャトル剤は、目的のカーゴ（例えば、ポリペプチドカーゴ）の、標的細胞のサイトゾルへの送達を促進し得る。この関連で、カーゴは、細胞膜を通った後に細胞内エンドソーム中にトラップされることが多く、これがカーゴの細胞内利用能を制限し、さらに、カーゴの最終的な代謝分解をもたらし得るので、細胞外カーゴを、ペプチドを使用して標的細胞のサイトゾルへ効率的に送達することは、難題であり得る。例えば、ＨＩＶ−１  Ｔａｔタンパク質由来のタンパク質形質導入ドメインの使用は、カーゴの、細胞内小胞への大量隔離をもたらすと報告されている。いくつかの態様では、本記載のシャトル剤は、エンドソームにより捕捉されたカーゴの、エンドソームから脱出し、細胞質コンパートメントに到達する能力を促進し得る。この関連で、語句「独立ポリペプチドカーゴのサイトゾルへの形質導入効率を増大させること」中の表現「サイトゾルへ」は、本記載のシャトル剤の、細胞内に送達された目的のカーゴが、エンドソーム捕捉を脱出し、細胞質コンパートメントに到着することを可能にする能力を指すものとする。目的のカーゴがサイトゾルに到達した後、続いて、種々の細胞内区画（例えば、核、核小体、ミトコンドリア、ペルオキシソーム）にターゲッティングされ得る。いくつかの実施形態では、したがって、表現「サイトゾルへ」は、サイトゾル送達だけでなく、カーゴが、細胞質コンパートメントに入ることを最初に必要とするその他の細胞内コンパートメントへの送達も包含するものとする。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本記載の方法は、インビトロ法である。いくつかの実施形態では、本記載の方法は、インビボ法である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本記載の方法は、標的真核細胞と、シャトル剤、または本明細書において定義されるような組成物、およびポリペプチドカーゴとを接触させることを含み得る。いくつかの実施形態では、シャトル剤または組成物は、混合物を形成するためにポリペプチドカーゴとともにプレインキュベートされ得、その後、標的真核細胞を混合物に対して曝露する。いくつかの実施形態では、シャトル剤のタイプは、細胞内に送達されるべきポリペプチドカーゴのアミノ酸配列に基づいて選択され得る。他の実施形態では、シャトル剤のタイプは、細胞内に送達されるべきポリペプチドカーゴのアミノ酸配列、細胞型、組織の種類などを考慮するように選択され得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、方法は、シャトル剤または組成物を用いる標的細胞の複数回の処理を含み得る（例えば、１日あたり１、２、３、４回もしくはそれ以上の回数および／または所定のスケジュールで）。このような場合には、低濃度のシャトル剤または組成物が望ましい（例えば、毒性を低減するために）。いくつかの実施形態では、細胞は、懸濁細胞または付着細胞であり得る。いくつかの実施形態では、当業者は、シャトル剤、ドメイン、使用および方法の異なる組み合わせを用いて、ポリペプチドカーゴを特定の細胞に送達する特定の必要性に本記載の教示を適応させることができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本記載の方法を、ポリペプチドカーゴを、インビボで細胞に細胞内送達する方法に適用してもよい。このような方法は、組織、臓器または系への非経口投与または直接注射により達成され得る。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、シャトル剤または組成物およびポリペプチドカーゴは、血清の存在下または非存在下で標的細胞に曝露され得る。いくつかの実施形態では、方法は、臨床使用または治療的使用に適したものであり得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本記載は、ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、本記載は、ポリペプチドカーゴの、標的真核細胞のサイトゾルへの形質導入効率を増大させるためのキットに関する。キットは、本明細書において定義されるようなシャトル剤または組成物および適した容器を含み得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、標的真核細胞は、動物細胞、哺乳動物細胞またはヒト細胞であり得る。いくつかの実施形態では、標的真核細胞は、幹細胞（例えば、胚幹細胞、多能性幹細胞、誘導性多能性幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、末梢血幹細胞）、初代細胞（例えば、筋芽細胞、線維芽細胞）または免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞、抗原提示細胞）であり得る。いくつかの実施形態では、本記載は、本明細書において定義されるような合成ペプチドまたはポリペプチドベースのシャトル剤を含む単離細胞に関する。いくつかの実施形態では、細胞は、タンパク質誘導性多能性幹細胞であり得る。タンパク質形質導入に対して抵抗性がある、または受け入れられないことが多い細胞は、本記載の合成ペプチドまたはポリペプチドベースのシャトル剤の興味深い候補であり得るということは理解されよう。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本記載は、ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達する合成ペプチドシャトル剤の製造方法に関し、該方法は、次記のペプチドを合成することを含む：
（１）少なくとも２０アミノ酸長であり、
（２）正に帯電した親水性の外面を有する両親媒性のアルファヘリックスモチーフ、および
（３）疎水性の外面を含み、
次のパラメーター（４）〜（１５）の内の少なくとも５つが満たされるペプチド。
（４）疎水性の外面が、ターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスのオープンシリンダー表現に基づいて、ペプチドのアミノ酸の１２〜５０％に相当する空間的に隣接するＬ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、および／またはＭアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含む；
（５）３．５〜１１の疎水性モーメント（μ）を有する；
（６）生理学的ｐＨで少なくとも＋４の予測正味電荷を有する；
（７）８〜１３の等電点（ｐＩ）を有する；
（８）３５％〜６５％のアミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、およびＶの任意の組み合わせから構成される；
（９）０％〜３０％のアミノ酸：Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴの任意の組み合わせから構成される；
（１０）３５％〜８５％のアミノ酸：Ａ、Ｌ、Ｋ、またはＲの任意の組み合わせから構成される；
（１１）少なくとも５％のＬがペプチド中に存在するという条件で、１５％〜４５％のアミノ酸：ＡおよびＬの任意の組み合わせから構成される；
（１２）２０％〜４５％のアミノ酸：ＫおよびＲの任意の組み合わせから構成される；
（１３）０％〜１０％のアミノ酸：ＤおよびＥの任意の組み合わせから構成される；
（１４）ペプチド中のＡおよびＬのパーセンテージ（％Ａ＋Ｌ）と、ペプチド中のＫとＲのパーセンテージ（％Ｋ＋Ｒ）との差異は、１０％以下である；
（１５）１０％〜４５％のアミノ酸：Ｑ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、およびＨの任意の組み合わせから構成される。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本記載は、ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するシャトル剤を特定する方法に関し、該方法は、（ａ）本明細書で定められるペプチドであるペプチドを合成すること；（ｂ）標的真核細胞と、ポリペプチドカーゴを前記ペプチドの存在下で接触させること；（ｃ）標的真核細胞におけるポリペプチドカーゴの形質導入効率を測定すること；および（ｄ）標的真核細胞中の前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率の増大が観察される場合、ポリペプチドカーゴを形質導入するシャトル剤としてそのペプチドを特定すること；を含む。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本記載は、ゲノム編集系に関し、該系は、（ａ）本明細書で定義のシャトル剤；（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼ；および（ｃ）１つまたは複数のガイドＲＮＡ、を含む。いくつかの実施形態では、ゲノム編集系は、ゲノム編集を制御する直鎖ＤＮＡテンプレートをさらに含み得る。
【０１１２】
改善された細胞治療のためのゲノム編集
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシャトル剤、合成ペプチド、組成物、および方法を用いて、天然の細胞または非遺伝子操作細胞に比べて、細胞治療の改善のために、ゲノム編集複合体（例えば、ＣＲＩＳＰＲベースゲノム編集複合体）を遺伝子操作した細胞に形質導入し得る。このような改善は、例えば、遺伝子操作された細胞の免疫原性を低減させることおよび／または遺伝子操作された細胞の活性／効力を改善することを含み得る。
【０１１３】
ゲノムエンジニアリングにとって特に魅力的な免疫細胞は、腫瘍細胞を認識し死滅させるその天然の能力を考慮すれば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であろう。したがって、いくつかの実施形態では、本記載は、本明細書に記載のシャトル剤、合成ペプチド、組成物、および方法の、ＮＫ細胞（または同じ改変から恩恵を受けると思われるその他の免疫細胞）を細胞ベースの免疫療法の改善を目的として、遺伝子操作するために、ゲノム編集複合体（例えば、ＣＲＩＳＰＲベースゲノム編集複合体）を形質導入するための使用に関する。例えば、本記載は、ＣＢＬＢ遺伝子、ｃ−ＣＢＬ遺伝子、ＧＳＫ３遺伝子、ＩＬＴ２遺伝子、ＣＩＳＨ遺伝子、ＮＫＧ２ａ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子、またはこれらの任意の組み合わせを標的とするガイドＲＮＡおよび／または直鎖ＤＮＡテンプレートを含む１種または複数のＣＲＩＳＰＲベースゲノム編集複合体の細胞内送達に関し得る。このような遺伝子標的は、以下で考察するように、ノックアウト後のＮＫ媒介細胞傷害活性を増強し得る。
【０１１４】
１．ＮＫＧ２Ａ（ＫＬＲＣ１、ＣＤ１５９Ａ、キラー細胞レクチン様受容体Ｃ１）
ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａは、ＭＨＣクラスＩ特異的ＮＫ抑制性受容体として機能する（Ｂｒａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔＣＤ１６ｄｉｍとして知られるＮＫ細胞サブセット（約１０％の末梢ＮＫ）により発現され、これらは通常細胞傷害性が低い（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＮＫＧ２Ａリガンドは、非古典的ＭＨＣクラスＩ  ＨＬＡ−Ｅ分子であり、あらゆるヒト細胞で発現される。ＮＫＧ２Ａ受容体によるＨＬＡ−Ｅの認識は、「自己免疫寛容」機序の一部であり（ＫＩＲ受容体も含む）、ＮＫ細胞傷害性の負の調節をもたらす（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【０１１５】
非古典的ＨＬＡクラスＩ、主にＨＬＡ−ＥおよびＨＬＡ−Ｇ（ＩＬＴ−２標的を参照されたい）の、免疫監視を逃れ、より激しい癌再発および手術後の全生存期間の低減をもたらす役割を示す臨床的証拠が存在する（ｄｅ  Ｋｒｕｉｊｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７ａ；Ｙｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７ｂ；Ｙｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７ｃ；Ｙｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７ｄ；Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｉｓｈｉｇａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５；Ｚｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。養子免疫細胞療法中のＮＫＧ２Ａ−ＫＯ  ＮＫ細胞の使用は、腫瘍微小環境中のＨＬＡ−Ｅ分子（膜結合または可溶性）の存在の影響を弱め得る。さらに、ＩＬ１５またはＩＬ１２発現Ｋ５６２フィーダー細胞から増殖させたＮＫ細胞は、ＮＫＧ２ＡＰＯＳ細胞をもたらし（Ｄｅｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、増殖工程中は、この抑制性受容体をノックアウト知ることが望ましいであろう。さらに、実施例Ｇ．９の結果は、ＮＫＧ２Ａ−ＫＯ  ＮＫ９２細胞は、ＩＦＮγ処理ＨｅＬａ細胞に対し、極めて高い細胞傷害性であることを示している。
【０１１６】
２．ＩＬＴ２（Ｉｇ様転写物２遺伝子）
ＩＬＴ２は、ＮＫ細胞を含むいくつかの免疫細胞上で発現される抑制性受容体である（Ｋｉｒｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。この受容体のリガンドは、ＨＬＡ−Ｇ分子であり、これは、胸腺および栄養芽層のみで天然に発現される。しかし、多くの腫瘍は、ＩＬＴ２受容体活性化を介した抑制により免疫細胞攻撃を回避するためにＨＬＡ−Ｇを発現する能力を取得する実際に、ＮＫＬＩＬＴ２−細胞は、ＨＬＡ−Ｇ−過剰発現Ｋ５６２細胞に対して、親ＮＫＬより強力である（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。さらに、ＯＶＣＡＲ−３癌細胞におけるＨＬＡ−Ｇの過剰発現は、ＮＫ細胞媒介細胞傷害性を弱めた（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＨＬＡ−Ｅと同様に、癌細胞上でのＨＬＡ−Ｇの発現は、一般に、予後不良と関連している。
【０１１７】
３．ｃ−ＣｂｌおよびＣｂｌ−Ｂ（カシタスＢ系統リンパ腫癌原遺伝子ファミリー）。
これらの遺伝子（カシタスＢ系統リンパ腫癌原遺伝子、Ｃｂｌファミリー由来）はＥ３リガーゼをコードし、タンパク質ユビキチン化経路（細胞質タンパク質含量の調節）で機能を有する。Ｅ３リガーゼは、Ｕｂ（ユビキチン）と標的タンパク質上の特定のリシン残基との間の共有結合の形成を触媒する（哺乳動物中ではＥ３リガーゼは１０００を超える）。Ｃｂｌファミリーメンバーは、リン酸化された受容体およびアダプターに結合し、ユビキチン化することにより、免疫細胞上の受容体チロシンキナーゼによるシグナル伝達の負の調節に関与する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；ｕｔｚ−Ｎｉｃｏｌａｄｏｎｉ，２０１５）。ｃ−ｃｂｌおよびＣｂｌ−ｂの両方は、リン酸化されたＬＡＴアダプターをユビキチン化することが示された。ＮＫ細胞活性化後のＬＡＴの燐酸化は、その他のメディエーター、特にＰＬＣ−γを動員するのに必要であり、ｓｉＲＮＡ媒介ｃ−ｃｂｌおよびＣｂｌ−ｂノックダウンは、Ｂ細胞リンパ腫７２１．２２１−Ｃｗ４に対するＮＫ細胞活性を高めた（Ｍａｔａｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【０１１８】
Ｃｂｌ−ｂユビキチン化の標的として、その他のＴＡＭ（Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ、Ｍｅｒ）受容体が特定された（Ｐａｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。しかし、ＴＡＭ受容体がＮＫ細胞を負に調節するとするならば、Ｃｂｌ−ｂノックアウトは、むしろ、ＮＫ細胞活性の低下に関連するはずである。したがって、ＴＡＭ受容体は、ＮＫ細胞の強化するための良好な標的であると見なされ得るが、Ｃｂｌ−ｂノックアウト経由では可能性が低そうである。
【０１１９】
インビボ調査では、Ｃｂｌ−ｂ−／−マウスが原発腫瘍増殖を防ぐことが示された（Ｌｏｅｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。さらに、これらのマウスから単離されたＮＫ細胞は、活性化されると、増殖およびＩＦＮ−γ産生を高めた（Ｐａｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。
【０１２０】
４．ＧＳＫ３Ｂ（グリコーゲンシンターゼキナーゼベータ）
ＧＳＫ３ｂは、いくつかの細胞機能、例えば、増殖、アポトーシス、炎症反応、ストレス、などに関与するＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼである（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。ＮＫ細胞中のＧＳＫ３ｂの（小さい阻害剤を用いた）阻害は、ＡＭＬ（ＯＣＩ−ＡＭＬ３）に対する細胞傷害性（おそらく、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α産生、２Ｂ４刺激およびＬＦＡ−１の発現上昇により）の増加に繋がる（Ｐａｒａｍｅｓｗａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６；Ａｏｕｋａｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。我々は、最近、ＧＳＫ３β阻害剤のＳＢ２１６７６３がＨｅＬａ細胞に対するＮＫ９２の細胞傷害活性を高めることを示した（データは示さず）。この効果は、ＩＬ−１５とのコインキュベーションにより高められる。
【０１２１】
５．ＣＩＳＨ（サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質）
ＣＩＳタンパク質は、サイトカインシグナル伝達（ＳＯＣＳ）の抑制因子のメンバーであり、これは、リン酸化されたＪＡＫに結合し、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を阻害する。近年、Ｃｉｓｈ−／−マウスにより、ＣＩＳがＩＬ１５シグナル伝達の重要な抑制因子であることが示された（Ｄｅｌｃｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ＩＬ１５暴露後、これらの細胞は、長期のＩＬ１５応答、ＩＦＮ−γの産生上昇、および細胞傷害性能力の増加があった。さらに、ＩＬ１５応答性と、ＮＫＧ２Ｄ依存性細胞傷害性との間で明確な相関がある（Ｈｏｒｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０１２２】
臨床試験では、養子ＮＫ細胞療法中に、ＮＫ細胞活性を持続させるために、ＩＬ２およびＩＬ１５などのサイトカインの同時注入が強く推奨される。しかし、このような同時注入は、患者に対し深刻な副作用を誘導する。ＩＬ１５高感受性ＮＫ細胞（ＣＩＳＨノックアウト）は、治療の利益になるであろう。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩ文意の成分である、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードするＢ２Ｍ遺伝子の破壊は、ＭＨＣクラスＩを発現している全ての細胞の免疫原性を実質的に低減させ得る。他の態様では、ＮＫ細胞のゲノムは、本明細書に記載のようにゲノム編集系の送達後には改変できる。より具体的には、ＮＫ細胞の細胞傷害性は、ＮＫ媒介細胞傷害活性を増強し得る特定の推定標的、例えば、ＮＫＧ２Ａ、ＩＬＴ２、ｃ−Ｃｂｌ、Ｃｂｌ−ｂ、ＧＳＫ３ＢおよびＣＩＳＨ遺伝子をターゲットにするゲノム編集系の送達後に改善できる。
【０１２４】
目的のポリペプチドカーゴおよびマーカータンパク質を用いた同時形質導入
ドメインベースの合理的に設計されたペプチドシャトル剤の、２つのポリペプチドカーゴを標的真核細胞集団に同時形質導入する能力が本明細書および国際公開第２０１６／１６１５１６号で実証された。本記載の実施例Ｉは、標的真核細胞集団中における、目的のポリペプチドカーゴ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−エンドヌクレアーゼ）および独立したマーカータンパク質（例えば、ＧＦＰ）の同時形質導入は、目的のポリペプチドカーゴの全体的な形質導入効率を高めるとは限らない。しかし、意外にも、著しく高い比率の目的のポリペプチドカーゴをうまく形質導入した標的真核細胞が、同様に、マーカータンパク質もうまく形質導入したことが発見された。逆に、目的のポリペプチドカーゴを形質導入しなかった細胞の内の著しく高比率の細胞は、同様に、マーカータンパク質も形質導入しなかった。マーカータンパク質陽性の細胞の単離（例えば、ＦＡＣＳにより）により、うまく目的のポリペプチドカーゴを形質導入した細胞の比率が大きく増加し、相関は、最も高いマーカータンパク質の蛍光を示す細胞集団はまた、目的のポリペプチドカーゴの最も高い形質導入比率を示すという点で、濃度依存性であることが明らかになった。
【０１２５】
いくつかの態様では、本記載は、目的のポリペプチドカーゴを形質導入した真核細胞を濃縮する方法に関する。方法は、（ａ）標的真核細胞集団に目的のポリペプチドカーゴおよびマーカータンパク質を同時形質導入すること；および（ｂ）マーカータンパク質を形質導入された真核細胞を単離または濃縮し、それにより、目的のポリペプチドカーゴを形質導入された真核細胞を濃縮すること、を含み得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、マーカータンパク質は、目的のポリペプチドカーゴに共有結合していなくてもよく（例えば、マーカータンパク質は、目的のポリペプチドカーゴとは独立している）、マーカータンパク質は目的のポリペプチドカーゴに共有結合していてもよく、マーカータンパク質は目的のポリペプチドカーゴに非共有結合（例えば、タンパク質ドメイン−タンパク質ドメイン相互作用を介して、静電気的におよび／または立体構造的に結合している）していてもよく、またはマーカータンパク質は、切断可能リンカー（例えば、エンドソーム、リソソーム中、またはサイトゾル中で発現する酵素などの酵素による切断部位を含むリンカーペプチド）を介して、目的のポリペプチドカーゴに共有結合していてもよい。いくつかの実施形態では、形質導入マーカータンパク質の細胞内濃度は、目的の形質導入ポリペプチドカーゴの細胞内濃度と、正の相関をなし得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、マーカータンパク質は、検出可能な標識を含み得る。本明細書で使用される場合、「検出可能な標識」は、当業者がその標識を含む細胞を特定し、その標識を欠く細胞から分離するのを可能とする分子または粒子を意味する。いくつかの実施形態では、マーカータンパク質は、蛍光タンパク質、蛍光標識タンパク質、生物発光タンパク質、同位体標識したタンパク質、磁気標識タンパク質、またはマーカータンパク質を含む細胞のマーカータンパク質を欠く細胞からの分離を可能とする、または細胞内のマーカータンパク質のレベルに基づいて細胞の分離を可能とする別の検出可能な標識であってよい。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、マーカータンパク質を形質導入された真核細胞は、フローサイトメトリー、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）、またはその他の既知の細胞／選別技術を用いて単離または濃縮し得る。形質導入細胞をうまく単離または濃縮することは、例えば、比較的低い形質導入効率になり得る、機能的ＣＲＩＳＰＲベースゲノム編集複合体などのポリペプチドカーゴの場合に、特に有利なことがある。
【０１２９】
また、本明細書の実施例Ｉでは、意外にも、第１ラウンドの目的のポリペプチドカーゴの形質導入後に、形質導入に失敗した細胞を単離して、その後の形質導入ラウンドで目的のポリペプチドカーゴを再形質導入し得るということも開示された。これらの結果は、第１ラウンドの目的のポリペプチドカーゴの形質導入後に、形質導入に失敗した細胞がその後の形質導入に不応性とは限らないことを示唆している。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本記載は目的のポリペプチドカーゴを形質導入された真核細胞を濃縮する方法に関し、該方法は、（ａ）標的真核細胞集団に目的のポリペプチドカーゴおよびマーカータンパク質を同時形質導入すること；（ｂ）マーカータンパク質を形質導入された真核細胞をマーカータンパク質を欠く細胞から単離し、それにより、マーカータンパク質陽性細胞集団およびマーカータンパク質陰性細胞集団を産生することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）および（ｂ）を、マーカータンパク質陰性細胞集団、マーカータンパク質陽性細胞集団、またはマーカータンパク質陰性およびマーカータンパク質陽性細胞集団の両方に対して１回または複数回反復してよい。いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドカーゴを形質導入された真核細胞を濃縮する方法は、例えば、マーカータンパク質の形質導入に陰性の細胞を単離し、マーカータンパク質陰性細胞集団を再形質導入することにより、自動化し得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本記載は目的のポリペプチドカーゴを形質導入された真核細胞を濃縮する方法に関し、該方法は、（ａ）標的真核細胞集団に目的のポリペプチドカーゴおよびマーカータンパク質を同時形質導入すること；および（ｂ）マーカータンパク質を形質導入された真核細胞を、マーカータンパク質のそれらの細胞内濃度を基準にして、単離すること、を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のマーカータンパク質は、細胞増殖を刺激するタンパク質（例えば、増殖因子または転写因子）、細胞分化を刺激するタンパク質、細胞生存を促進するタンパク質、抗アポトーシス性タンパク質、または別の生物活性を有するタンパク質であり得る。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドカーゴおよびマーカータンパク質は、ペプチド形質導入剤の存在下で、標的真核細胞をポリペプチドカーゴおよびマーカータンパク質と接触させることにより、同時形質導入され得、ペプチド形質導入剤は、前記ペプチド形質導入剤の非存在下の場合に比べて、ポリペプチドカーゴおよびマーカータンパク質の形質導入効率を高めるのに十分な濃度で存在する。いくつかの実施形態では、ペプチド形質導入剤は、エンドソーム溶解性ペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチド形質導入剤は、ドメインベースペプチドシャトル剤、または本明細書で定義された、国際公開第２０１６／１６１５１６号および／または米国特許第９，７３８，６８７号の合理的に設計されたペプチドシャトル剤であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、上述のドメインベースペプチドシャトル剤は、細胞膜透過性ドメイン（ＣＰＤ）と作動可能に連結されたエンドソーム漏出ドメイン（ＥＬＤ）、またはヒスチジンリッチドメインおよびＣＰＤと作動可能に連結されたＥＬＤを含む合成ペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、上述のドメインベースペプチドシャトル剤は：（ａ）２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０アミノ酸残基の最小の長さ、および３５、４０、４５、５０、５５、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５または１５０アミノ酸残基の最大の長さを含む、（ｂ）生理学的ｐＨで、少なくとも＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９、＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４または＋１５の予測される正味電荷を有する、（ｃ）水溶液に可溶性である、または（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の何れかの組合せである。いくつかの実施形態では、ＥＬＤ、ＣＰＤ、ヒスチジンリッチドメイン、リンカードメインは、本明細書で定義の通りである。いくつかの実施形態では、標的真核細胞は、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、幹細胞、初代細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、またはその他の細胞型もしくは細胞亜型を含む、またはそれらからなる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドカーゴは、（ｉ）本明細書で定義のポリペプチドカーゴ；および／または（ｉｉ）１種または複数のＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼ単独でまたは１種または複数の対応する本明細書で定義のガイドＲＮＡおよび／または直鎖ＤＮＡテンプレートを伴った該１種または複数のＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼであってよい。
【０１３５】
項目
いくつかの実施形態では、本記載は、次の項目に関し得る：
１．ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達する方法であって、前記方法は、標的真核細胞とポリペプチドカーゴとを、シャトル剤の非存在下の場合に比べて前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度の前記シャトル剤の存在下で、接触させることを含み、前記シャトル剤が、
（１）少なくとも２０アミノ酸長であり、
（２）正に帯電した親水性の外面を有する両親媒性のアルファヘリックスモチーフ、および
（３）疎水性の外面を含み、
次のパラメーター（４）〜（１５）の内の少なくとも５つが満たされるペプチドである。
（４）疎水性の外面が、ターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスのオープンシリンダー表現に基づいて、ペプチドのアミノ酸の１２〜５０％に相当する空間的に隣接するＬ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、および／またはＭアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含む；
（５）３．５〜１１の疎水性モーメント（μ）を有する；
（６）生理学的ｐＨで少なくとも＋４の予測正味電荷を有する；
（７）８〜１３の等電点（ｐＩ）を有する；
（８）３５％〜６５％のアミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、およびＶの任意の組み合わせから構成される；
（９）０％〜３０％のアミノ酸：Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴの任意の組み合わせから構成される；
（１０）３５％〜８５％のアミノ酸：Ａ、Ｌ、Ｋ、またはＲの任意の組み合わせから構成される；
（１１）少なくとも５％のＬがペプチド中に存在するという条件で、１５％〜４５％のアミノ酸：ＡおよびＬの任意の組み合わせから構成される；
（１２）２０％〜４５％のアミノ酸：ＫおよびＲの任意の組み合わせから構成される；
（１３）０％〜１０％のアミノ酸：ＤおよびＥの任意の組み合わせから構成される；
（１４）ペプチド中のＡおよびＬのパーセンテージ（％Ａ＋Ｌ）と、ペプチド中のＫとＲのパーセンテージ（Ｋ＋Ｒ）との差異は、１０％以下であり、
（１５）１０％〜４５％のアミノ酸：Ｑ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、およびＨの任意の組み合わせから構成される。
【０１３６】
２．前記シャトル剤が、少なくとも６個の、少なくとも７個の、少なくとも８個の、少なくとも９個の、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、または全ての本明細書に記載のパラメーター（４）〜（１５）を満たす、項目１に記載の方法。
【０１３７】
３．（ｉ）前記シャトル剤が、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸の最小長、および４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、６０、６５、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０アミノ酸の最大長を有するペプチドであり、
（ｉｉ）前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０の下限値と、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、または１１．０の上限値との間の疎水性モーメント（μ）を有し、
（ｉｉｉ）前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、正に帯電した親水性外面を含み、この外面は、（ａ）ヘリカルホイール投影図上に、少なくとも２個、３個または４個の隣接する正に帯電したＫおよび／またはＲ残基；および／または（ｂ）ヘリカルホイール投影図上に、１００度の連続アミノ酸間の回転角度および／またはターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスに基づいて、３個から５個のＫおよび／またはＲ残基を含む６個の隣接する残基のセグメントを含み、
（ｉｖ）前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、疎水性の外面を含み、疎水性の外面は、（ａ）ヘリカルホイール投影図上で、少なくとも２個の隣接するＬ残基；および／または（ｂ）ヘリカルホイール投影図上で、１００度の連続アミノ酸間の回転角度および／またはターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスに基づいて、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、およびＭから選択される少なくとも５個の疎水性の残基を含む１０個の隣接する残基のセグメント、を含み、
（ｖ）前記疎水性の外面が、前記ペプチドのアミノ酸の１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、または２０％から２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％に相当する空間的に隣接するＬ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、および／またはＭアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含み、
（ｖｉ）前記ペプチドが、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０の下限値と、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、または１０．５の上限値との間の疎水性モーメント（μ）を有し、
（ｖｉｉ）前記ペプチドが、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９〜＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、または＋１５の予測実効電荷を有し、
（ｖｉｉｉ）前記ペプチドが、１０〜１３の予測ｐＩを有し、または
（ｉｘ）（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の内の任意の組み合わせである、項目１または２に記載の方法。
【０１３８】
４．前記シャトル剤が、次のパラメーターの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または全てを満たす、項目１〜３いずれか１項に記載の方法：
（８）ペプチドが、３６％〜６４％、３７％〜６３％、３８％〜６２％、３９％〜６１％、４０％〜６０％のアミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、およびＶの任意の組み合わせから構成される；
（９）ペプチドが、１％〜２９％、２％〜２８％、３％〜２７％、４％〜２６％、５％〜２５％、６％〜２４％、７％〜２３％、８％〜２２％、９％〜２１％、または１０％〜２０％のアミノ酸：Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴの任意の組み合わせから構成される；
（１０）ペプチドが、３６％〜８０％、３７％〜７５％、３８％〜７０％、３９％〜６５％、または４０％〜６０％のアミノ酸：Ａ、Ｌ、Ｋ、またはＲの任意の組み合わせから構成される；
（１１）ペプチドが、１５％〜４０％、２０％〜４０％、２０％〜３５％、または２０％〜３０％のアミノ酸：ＡおよびＬの任意の組み合わせから構成される；
（１２）ペプチドが、２０％〜４０％、２０％〜３５％、または２０％〜３０％のアミノ酸：ＫおよびＲの任意の組み合わせから構成される；
（１３）５％〜１０％のアミノ酸：ＤおよびＥの任意の組み合わせから構成される；
（１４）ペプチド中のＡおよびＬ残基パーセンテージ（％Ａ＋Ｌ）と、ペプチド中のＫおよび／またはＲ残基のパーセンテージ（Ｋ＋Ｒ）との差異が、９％、８％、７％、６％、または５％以下である；および
（１５）ペプチドが、１５〜４０％、２０％〜３５％、または２０％〜３０％のアミノ酸：Ｑ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、およびＨの任意の組み合わせから構成される。
【０１３９】
５．前記ペプチドが、ヒスチジンリッチドメインを含む、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【０１４０】
６．前記ヒスチジンリッチドメインが、
（ｉ）ペプチドのＮ末端に向けておよび／またはＣ末端に向けて配置され；
（ｉｉ）少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも９０％のヒスチジン残基を含む、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個のアミノ酸のストレッチである、および／または少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、または少なくとも９個の連続するヒスチジン残基を含み；または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、項目５に記載の方法。
【０１４１】
７．前記ペプチドが、セリンおよび／またはグリシン残基が濃縮されたフレキシブルリンカードメインを含む、項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【０１４２】
８．前記ペプチドが、次記のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）［Ｘ１］−［Ｘ２］−［リンカー］−［Ｘ３］−［Ｘ４］（式１）；
（ｂ）［Ｘ１］−［Ｘ２］−［リンカー］−［Ｘ４］−［Ｘ３］（式２）；
（ｃ）［Ｘ２］−［Ｘ１］−［リンカー］−［Ｘ３］−［Ｘ４］（式３）；
（ｄ）［Ｘ２］−［Ｘ１］−［リンカー］−［Ｘ４］−［Ｘ３］（式４）；
（ｅ）［Ｘ３］−［Ｘ４］−［リンカー］−［Ｘ１］−［Ｘ２］（式５）；
（ｆ）［Ｘ３］−［Ｘ４］−［リンカー］−［Ｘ２］−［Ｘ１］（式６）；
（ｇ）［Ｘ４］−［Ｘ３］−［リンカー］−［Ｘ１］−［Ｘ２］（式７）；または
（ｈ）［Ｘ４］−［Ｘ３］−［リンカー］−［Ｘ２］−［Ｘ１］（式８）；
式中、
［Ｘ１］が、次記から選択され：２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［＋］−；１［＋］−１［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；および１［＋］−１［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［＋］−；
［Ｘ２］が次記から選択され：−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［ζ］−；−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［＋］−；−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［＋］−１［ζ］−；−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−２［＋］−；−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−２［ζ］−；−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−１［＋］−１［ζ］−；および−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；
［Ｘ３］が次記から選択され：−４［＋］−Ａ−；−３［＋］−Ｇ−Ａ−；−３［＋］−Ａ−Ａ−；−２［＋］−１［Φ］−１［＋］−Ａ−；−２［＋］−１［Φ］−Ｇ−Ａ−；−２［＋］−１［Φ］−Ａ−Ａ−；または−２［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−２［＋］−Ａ−Ｇ−Ａ；−２［＋］−Ａ−Ａ−Ａ−；−１［Φ］−３［＋］−Ａ−；−１［Φ］−２［＋］−Ｇ−Ａ−；−１［Φ］−２［＋］−Ａ−Ａ−；−１［Φ］−１［＋］−１［Φ］−１［＋］−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−１［Φ］−Ｇ−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−１［Φ］−Ａ−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−Ａ−Ｇ−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−Ａ−Ａ−Ａ；−Ａ−１［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−Ａ−１［＋］−Ａ−Ｇ−Ａ；および−Ａ−１［＋］−Ａ−Ａ−Ａ；
［Ｘ４］が次記から選択され：−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−Ａ；−１［ζ］−２Ａ−２［＋］；−１［＋］−２Ａ−１［＋］−Ａ；−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［ζ］−Ａ−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−２［＋］−Ａ−２［＋］；−２［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−２［＋］−Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−２［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］−Ａ；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−２［＋］；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−２［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−２［ζ］−２［＋］；−１［＋］−２［ζ］−１［＋］−Ａ；−１［＋］−２［ζ］−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−２［ζ］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−３［ζ］−２［＋］；−３［ζ］−１［＋］−Ａ；−３［ζ］−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−Ａ；−１［ζ］−２Ａ−２［＋］；−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−２［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−２［＋］−１［ζ］−１［＋］−Ａ；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］−Ａ；−１［＋］−２Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；および−１［ζ］−Ａ−１［ζ］−Ａ−１［＋］；および
［リンカー］が、次記から選択され：−Ｇｎ−；−Ｓｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎＧｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎＳｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎＧｎ（ＧｎＳｎ）ｎ−；および−（ＧｎＳｎ）ｎＳｎ（ＧｎＳｎ）ｎ−；
式中、
［Φ］が、アミノ酸：Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり；
［＋］が、アミノ酸：ＬｙｓまたはＡｒｇであり；
［ζ］が、アミノ酸：Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒであり；
Ａが、アミノ酸：Ａｌａであり；
Ｇが、アミノ酸：Ｇｌｙであり；
Ｓが、アミノ酸：Ｓｅｒであり；および
ｎが、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜１〜４、または１〜３の整数である。
【０１４３】
９．（ｉ）前記ペプチドが、配列番号１０４、１０５、１０７、１０８、１１０〜１３１、１３３〜１３５、１３８、１４０、１４２、１４５、１４８、１５１、１５２、１６９〜２４２、および２４３〜１０２４２のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である；または前記ペプチドが、配列番号１０４、１０５、１０７、１０８、１１０〜１３１、１３３〜１３５、１３８、１４０、１４２、１４５、１４８、１５１、１５２、１６９〜２４２、および２４３〜１０２４２のいずれか１つの機能性バリアントを含むまたはそれからなり；
（ｉｉ）前記ペプチドが：
（ａ）配列番号１０４、１０５、１０７、１０８、１１０〜１３１、１３３〜１３５、１３８、１４０、１４２、１４５、１４８、１５１、１５２、１６９〜２４２、および２４３〜１０２４２のいずれか１個のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり；
（ｂ）配列番号１５８および／または１５９のアミノ酸配列モチーフを含み；または
（ｃ）配列番号１５９のアミノ酸配列モチーフに作動可能に連結された配列番号１５８のアミノ酸配列モチーフを含み；または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【０１４４】
１０．ペプチドが、エンドソーム漏出ドメイン（ＥＬＤ）、および／または細胞膜透過性ドメイン（ＣＰＤ）を含む、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【０１４５】
１１．（ｉ）前記ＥＬＤが、エンドソーム溶解性ペプチド、抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）、直鎖状カチオン性アルファヘリックス抗菌性ペプチド、セクロピン−Ａ／メリチンハイブリッド（ＣＭシリーズ）ペプチド、ｐＨ依存性膜活性ペプチド（ＰＡＭＰ）、ペプチド両親媒性物質、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）のＨＡ２サブユニットのＮ末端に由来するペプチド、ＣＭ１８、ジフテリア毒素Ｔドメイン（ＤＴ）、ＧＡＬＡ、ＰＥＡ、ＩＮＦ−７、ＬＡＨ４、ＨＧＰ、Ｈ５ＷＹＧ、ＨＡ２、ＥＢ１、ＶＳＶＧ、シュードモナス毒素、メリチン、ＫＡＬＡ、ＪＳＴ−１、Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ、Ｇ（ＬＬＫＫ）３Ｇまたはそれらの任意の組合せであるか、またはそれに由来する、
（ｉｉ）前記ＣＰＤが、細胞膜透過性ペプチドまたは細胞膜透過性ペプチド由来のタンパク質形質導入ドメイン、ＴＡＴ、ＰＴＤ４、ペネトラチン（アンテナペディア）、ｐＶＥＣ、Ｍ９１８、Ｐｅｐ−１、Ｐｅｐ−２、キセントリー（Ｘｅｎｔｒｙ）、アルギニンストレッチ、トランスポータン、ＳｙｎＢ１、ＳｙｎＢ３またはそれらの任意の組合せであるか、またはそれに由来する、または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、項目１０に記載の方法。
【０１４６】
１２．前記ペプチドが、
（ａ）配列番号１〜１５、６３または６４のいずれか１つのアミノ酸配列、またはエンドソーム溶解活性を有するそのバリアントまたは断片を含むＥＬＤ；
（ｂ）配列番号１６〜２７または６５のいずれか１つのアミノ酸配列または細胞膜透過性活性を有するそのバリアントまたは断片を含むＣＰＤ；または
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方を含む、項目１０または１１に記載の方法。
【０１４７】
１３．（ｉ）前記ペプチドが、配列番号１、１４、または６３のアミノ酸配列を有するＣＭ１８、ＫＡＬＡ、またはＣ（ＬＬＫＫ）３ＣであるＥＬＤ、または配列番号１、１４、または６３と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、エンドソーム溶解活性を有するそのバリアントであるＥＬＤを含み、
（ｉｉ）前記ペプチドが、配列番号１７または６５のアミノ酸配列を有するＴＡＴまたはＰＴＤ４であるＣＰＤ、または配列番号１７または６５と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一性を有し、細胞膜透過活性を有するそのバリアントであるＣＰＤを含み、または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、項目１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【０１４８】
１４．前記ペプチドが、配列番号５７〜５９、６６〜７２もしくは８２〜１０２のいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号５７〜５９、６６〜７２もしくは８２〜１０２のいずれか１つに対して、少なくとも８５％、９０％、または９５％の同一性を有するその機能性バリアントを含む、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【０１４９】
１５．（ｉ）前記シャトル剤が、標的真核細胞により完全に代謝可能であり；および／または
（ｉｉ）標的真核細胞とポリペプチドカーゴとをシャトル剤の存在下で接触させることにより、前記シャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率が、少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍まで、高められる、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【０１５０】
インビトロ法である、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【０１５１】
１７．項目１〜１５のいずれか１項で定義のペプチドである合成ペプチドシャトル剤。
【０１５２】
１８．配列番号１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３８、１４０、１４２、１４５、１４８、１５１、１５２、１６９〜２４２、および２４３〜１０２４２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、または配列番号１５８および／または１５９のアミノ酸配列モチーフを含む、２０〜１００アミノ酸長さのペプチドである、項目１７に記載の合成ペプチド。
【０１５３】
１９．ポリペプチドカーゴを、標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核へのインビトロでの送達に使用するための、項目１７または１８に記載の合成ペプチドシャトル剤であって、前記合成ペプチドシャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度で使用される、合成ペプチドシャトル剤。
【０１５４】
２０．ポリペプチドカーゴを、標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核へのインビボでの送達に使用するための、項目１７または１８に記載の合成ペプチドシャトル剤であって、前記合成ペプチドシャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度で使用される、合成ペプチドシャトル剤。
【０１５５】
２１．項目１〜１５のいずれか１項で定義のシャトル剤、または少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種の異なるタイプの項目１〜１５のいずれか１項で定義のシャトル剤のカクテル、および標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核へ送達されるべきポリペプチドカーゴを含む、組成物。
【０１５６】
２２．ポリペプチドカーゴを、標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するための、項目１〜１５のいずれか１項で定義のシャトル剤、または項目１８で定義の合成ペプチドの使用であって、シャトル剤または合成ペプチドが、前記シャトル剤または合成ペプチドの非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度で使用される、使用。
【０１５７】
２３．ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するためのキットであって、項目１〜１５のいずれか１項で定義のシャトル剤、または項目１８で定義の合成ペプチド、および好適な容器を含む、キット。
【０１５８】
２４．前記ポリペプチドカーゴが、細胞膜透過性ドメインを欠いている、項目１〜１６のいずれか１項に記載方法、項目１７〜２０のいずれか１項に記載の合成ペプチドシャトル剤、項目２１に記載の組成物、項目２２に記載の使用、または項目２３に記載のキット。
【０１５９】
２５．前記ポリペプチドカーゴが、細胞膜透過性ドメインを含む、項目１〜１６のいずれか１項に記載方法、項目１７〜２０のいずれか１項に記載の合成ペプチドシャトル剤、項目２１に記載の組成物、項目２２に記載の使用、または項目２３に記載のキット。
【０１６０】
２６．前記ポリペプチドカーゴが、細胞内ターゲティングドメインを含む、項目１〜１６、２４または２５のいずれか１項に記載の方法、項目１７〜２０、２４または２５のいずれか１項に記載の合成ペプチドシャトル剤、項目２１、２４または２５に記載の組成物、項目２２〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【０１６１】
２７．前記細胞内ターゲティングドメインが、
（ａ）核移行シグナル（ＮＬＳ）；
（ｂ）核小体シグナル配列；
（ｃ）ミトコンドリアシグナル配列；または
（ｄ）ペルオキシソームシグナル配列、である、項目２６に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【０１６２】
２８．（ａ）前記ＮＬＳが、Ｅ１ａ、Ｔ−Ａｇ、ｃ−ｍｙｃ、Ｔ−Ａｇ、ｏｐ−Ｔ−ＮＬＳ、Ｖｐ３、ヌクレオプラスミン、ヒストン２Ｂ、ゼノパスＮ１、ＰＡＲＰ、ＰＤＸ−１、ＱＫＩ−５、ＨＣＤＡ、Ｈ２Ｂ、ｖ−Ｒｅｌ、Ａｍｉｄａ、ＲａｎＢＰ３、Ｐｈｏ４ｐ、ＬＥＦ−１、ＴＣＦ−１、ＢＤＶ−Ｐ、ＴＲ２、ＳＯＸ９もしくはＭａｘに由来する、
（ｂ）前記核小体シグナル配列が、ＢＩＲＣ５もしくはＲＥＣＱＬ４に由来する、
（ｃ）前記ミトコンドリアシグナル配列が、Ｔｉｍ９もしくは酵母チトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＶに由来する、または
（ｄ）前記ペルオキシソームシグナル配列が、ＰＴＳ１に由来する、項目２７に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【０１６３】
２９．前記ポリペプチドカーゴが、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子と複合体化されている、項目２４〜２９のいずれか１項に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【０１６４】
前記ポリペプチドカーゴが、転写因子、ヌクレアーゼ、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、抗体、ペプチドカーゴ、酵素、酵素阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせである、項目２４〜２９のいずれか１項に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【０１６５】
３１．（ａ）前記転写因子が、ＨＯＸＢ４、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ９、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＭｙｏＤ、Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３、ＭａｆＡ、Ｂｌｉｍｐ−１、Ｅｏｍｅｓ、Ｔ−ｂｅｔ、ＦＯＸＯ３Ａ、ＮＦ−ＹＡ、ＳＡＬＬ４、ＩＳＬ１、ＦｏｘＡ１、Ｎａｎｏｇ、Ｅｓｒｒｂ、Ｌｉｎ２８、ＨＩＦ１−ａｌｐｈａ、Ｈｌｆ、Ｒｕｎｘ１ｔ１、Ｐｂｘ１、Ｌｍｏ２、Ｚｆｐ３７、Ｐｒｄｍ５、Ｂｃｌ−６またはそれらの任意の組合せであり；
（ｂ）前記ヌクレアーゼが、触媒的に活性なまたは触媒的に死んだ：ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、Ｃｐｆ１、ＣａｓＹ、ＣａｓＸ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼもしくはメガヌクレアーゼ、ＤＮＡ誘導性ヌクレアーゼ、ナトロノバクテリウム・グレゴリーアルゴノート（ＮｇＡｇｏ）、またはそれらの任意の組合せであり；
（ｃ）前記抗体が細胞内抗原を認識し；および／または
（ｄ）前記ペプチドカーゴが、細胞内分子を認識する、項目３０に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【０１６６】
３２．細胞治療、ゲノム編集、養子細胞移入、および／または再生医療において使用するための、項目２４〜３１のいずれか１項に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【０１６７】
３３．前記標的真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、幹細胞、初代細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞である、項目２４〜３２のいずれか１項に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【０１６８】
３４．項目１〜１５のいずれか１項で定義のシャトル剤、項目１８で定義の合成ペプチドシャトル剤、または項目２１で定義の組成物を含む、真核細胞。
【０１６９】
３５．動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、幹細胞、初代細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞である、項目３４に記載の真核細胞。
【０１７０】
３６．１種または複数のＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼを単独でまたは１種または複数の対応するガイドＲＮＡおよび／または直鎖ＤＮＡテンプレートと一緒に、標的真核細胞に送達する方法であって、標的真核細胞とエンドヌクレアーゼとを、シャトル剤の非存在下の場合に比べて前記エンドヌクレアーゼの形質導入効率を高めるのに十分な濃度の前記シャトル剤の存在下で、接触させることを含み、前記シャトル剤が、項目１〜１５のいずれか１項で定義される通りである、方法。
【０１７１】
３７．インビトロ法、またはインビボ法である、項目３６に記載の方法。
【０１７２】
３８．前記１種または複数のヌクレアーゼが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、またはこれらの任意の組み合わせである、項目３６または３７に記載の方法。
【０１７３】
３９．前記１種または複数のエンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、またはこれらの任意の組み合わせ；または触媒的に死んだＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｄＣａｓ９）、ｄＣｐｆ１、ｄＣａｓＸ、ｄＣａｓＹ、またはこれらの任意の組み合わせである、項目３６または３７に記載の方法。
【０１７４】
４０．前記標的真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、幹細胞、初代細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞である、項目３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【０１７５】
４１．前記１種または複数の対応するガイドＲＮＡおよび／または直鎖ＤＮＡテンプレートが、１種または複数の遺伝子を標的にして、対応する前記方法に供されていない親真核細胞に比較して、免疫原性を低減する、細胞傷害性を改善する、および／または別の方法で標的真核細胞の細胞療法のための有効性を改善する、項目５８に記載の方法。
【０１７６】
４２．前記細胞療法が、細胞ベース癌免疫療法である、項目４１に記載の方法。
【０１７７】
４３．前記１種または複数の対応するガイドＲＮＡおよび／または直鎖ＤＮＡテンプレートが、ＣＢＬＢ遺伝子、ｃ−ＣＢＬ遺伝子、ＧＳＫ３遺伝子、ＩＬＴ２遺伝子、ＣＩＳＨ遺伝子、ＮＫＧ２ａ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子、またはこれらの任意の組み合わせを標的とする、項目４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【０１７８】
４４．ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達する合成ペプチドシャトル剤の製造方法であって、次記のペプチドを合成することを含む方法：
（１）少なくとも２０アミノ酸長であり、
（２）正に帯電した親水性の外面を有する両親媒性のアルファヘリックスモチーフ、および
（３）疎水性の外面を含み、
次のパラメーター（４）〜（１５）の内の少なくとも５つが満たされるペプチド。
（４）疎水性の外面が、ターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスのオープンシリンダー表現に基づいて、ペプチドのアミノ酸の１２〜５０％に相当する空間的に隣接するＬ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、および／またはＭアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含む；
（５）３．５〜１１の疎水性モーメント（μ）を有する；
（６）生理学的ｐＨで少なくとも＋４の予測正味電荷を有する；
（７）８〜１３の等電点（ｐＩ）を有する；
（８）３５％〜６５％のアミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、およびＶの任意の組み合わせから構成される；
（９）０％〜３０％のアミノ酸：Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴの任意の組み合わせから構成される；
（１０）３５％〜８５％のアミノ酸：Ａ、Ｌ、Ｋ、またはＲの任意の組み合わせから構成される；
（１１）少なくとも５％のＬがペプチド中に存在するという条件で、１５％〜４５％のアミノ酸：ＡおよびＬの任意の組み合わせから構成される；
（１２）２０％〜４５％のアミノ酸：ＫおよびＲの任意の組み合わせから構成される；
（１３）０％〜１０％のアミノ酸：ＤおよびＥの任意の組み合わせから構成される；
（１４）ペプチド中のＡおよびＬのパーセンテージ（％Ａ＋Ｌ）と、ペプチド中のＫとＲのパーセンテージ（Ｋ＋Ｒ）との差異は、１０％以下である；
（１５）１０％〜４５％のアミノ酸：Ｑ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、およびＨの任意の組み合わせから構成される。
【０１７９】
４５．ペプチドが項目２〜１５のいずれか１項で定義の通りである、項目４４に記載の方法。
【０１８０】
４６．ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するシャトル剤を特定する方法であって、次記を含む方法：
（ａ）項目１〜１５または１８のいずれか１項で定義のペプチドであるペプチドを合成すること；
（ｂ）標的真核細胞とポリペプチドカーゴとを、前記ペプチドの存在下で、接触させること；
（ｃ）標的真核細胞中のポリペプチドカーゴの形質導入効率を測定すること；および
（ｄ）標的真核細胞中のポリペプチドカーゴの形質導入効率の増加が観察される場合、前記ポリペプチドカーゴを形質導入するシャトル剤として、ペプチドを特定すること。
【０１８１】
４７．前記ポリペプチドカーゴが項目２４〜３１のいずれか１項で定義の通りである、項目４６に記載の方法。
【０１８２】
４８．次記を含むゲノム編集系：
（ａ）項目１〜１５または１８のいずれか１項で定義のシャトル剤；
（ｂ）１種または複数のＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼ；および
（ｃ）１種または複数のガイドＲＮＡ。
【０１８３】
４９．ゲノム編集を制御する直鎖ＤＮＡテンプレートをさらに含む、項目４８に記載のゲノム編集系。
【０１８４】
５０．前記１種または複数のＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ結合タンパク質９（Ｃａｓ９）、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、またはこれらの任意の組み合わせである、項目４８または４９に記載のゲノム編集系。
【０１８５】
５１．目的のポリペプチドカーゴを形質導入した真核細胞を濃縮する方法であって、次記を含む方法：
（ａ）目的のポリペプチドカーゴおよびマーカータンパク質を用いた標的真核細胞集団を同時形質導入すること；および
（ｂ）マーカータンパク質を形質導入された真核細胞を単離または濃縮し、それにより、目的のポリペプチドカーゴを形質導入された真核細胞を濃縮すること。
【０１８６】
５２．（ｉ）マーカータンパク質が目的のポリペプチドカーゴに共有結合していない、マーカータンパク質が目的のポリペプチドカーゴに共有結合している、マーカータンパク質が目的のポリペプチドカーゴに非共有結合している、またはマーカータンパク質が切断可能リンカーを介して目的のポリペプチドカーゴに共有結合している；および／または
（ｉｉ）マーカータンパク質が検出可能な標識を含むか、またはマーカータンパク質が蛍光タンパク質、蛍光標識タンパク質、生物発光タンパク質、同位体標識タンパク質、もしくは磁気標識タンパク質である、項目５１に記載の方法。
【０１８７】
５３．形質導入マーカータンパク質の細胞内濃度が、目的の形質導入ポリペプチドカーゴの細胞内濃度と、正の相関をする、項目５１または５２に記載の方法。
【０１８８】
５４．マーカータンパク質を形質導入された真核細胞が、フローサイトメトリー、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を用いて単離または濃縮される、項目５１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【０１８９】
５５．マーカータンパク質を形質導入された真核細胞が、マーカータンパク質を欠く細胞から単離または選別され、それにより、マーカータンパク質陽性細胞集団および／またはマーカータンパク質陰性細胞集団を製造する、項目５１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【０１９０】
５６．ステップ（ａ）および（ｂ）を、マーカータンパク質陰性細胞集団、マーカータンパク質陽性細胞集団、またはマーカータンパク質陰性およびマーカータンパク質陽性細胞集団の両方に対して１回または複数回反復することをさらに含む、項目５５に記載の方法。
【０１９１】
５７．マーカータンパク質を形質導入された真核細胞が、マーカータンパク質のそれらの細胞内の濃度を基準にして単離または選別される、項目５１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【０１９２】
５８．マーカータンパク質が、細胞増殖を刺激するタンパク質、細胞分化を刺激するタンパク質、細胞生存を促進するタンパク質、抗アポトーシス性タンパク質、または別の生物活性を有するタンパク質である、項目５１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【０１９３】
５９．目的のポリペプチドカーゴおよびマーカータンパク質が、ペプチド形質導入剤の存在下で、標的真核細胞をポリペプチドカーゴおよびマーカータンパク質と接触させることにより、同時形質導入され、ペプチド形質導入剤が、前記ペプチド形質導入剤の非存在下の場合に比べて、ポリペプチドカーゴおよびマーカータンパク質の形質導入効率を高めるのに十分な濃度で存在する、項目５１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【０１９４】
６０．（ａ）ペプチド形質導入剤が、エンドソーム溶解性ペプチドであり；
（ｂ）ペプチド形質導入剤が、項目１７または１８で定義の合成ペプチドシャトル剤であるか、またはそれを含み；
（ｃ）標的真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、幹細胞、初代細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞を含み；
（ｄ）目的のポリペプチドカーゴが、（ｉ）項目２４〜３１のいずれか１項で定義のポリペプチドカーゴ；および／または（ｉｉ）１種または複数のＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼ単独でまたは１種または複数の対応する項目３８〜４３のいずれか１項で定義のガイドＲＮＡおよび／または直鎖ＤＮＡテンプレートと一緒の該１種または複数のＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼであり；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせである、項目５９に記載の方法。
【０１９５】
本記載のその他の目的、利点および特徴は、添付の図面を参照して、例示の目的のみで与えられたその特定の実施形態の以下の非限定的説明を読むと、より明らかとなる。
【０１９６】
実施例
実施例１：
材料および方法
１．１  材料
すべての化学物質は、別に断りのない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ  ｏｒ  Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）から、または同等の等級のものをＢｉｏＳｈｏｐ  Ｃａｎａｄａ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）またはＶＷＲ（Ｖｉｌｌｅ  Ｍｏｎｔ−Ｒｏｙａｌ，ＱＣ，Ｃａｎａｄａ）から購入した。
１．２  試薬
【表６−１】
2019531316.tif 000008
【表６−２】
2019531316.tif 000009
【０１９７】
１．３  細胞株
ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３Ａ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＴＨＰ−１、ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＡ４６、Ｂａｌｂ３Ｔ３およびＨＴ２、ＫＭＳ−１２、ＤＯＨＨ２、ＲＥＣ−１、ＨＣＣ−７８、ＮＣＩ−Ｈ１９６およびＨＴ２細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から入手し、製造業者の使用説明書に従って培養した。筋芽細胞は、Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ  Ｊ．Ｐ．  Ｔｒｅｍｂｌａｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ  Ｌａｖａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）により寄贈された初代ヒト細胞である。
【表７−１】
2019531316.tif 000010
【表７−２】
2019531316.tif 000011
【０１９８】
１．４  タンパク質精製
融合タンパク質を、Ｔ５プロモーターを含有する、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性ベクターを使用して標準条件下で、細菌（大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３）中で発現させた。培地は、１リットルあたり、２４ｇの酵母抽出物、１２ｇのトリプトン、４ｍＬのグリセロール、２．３ｇ  ＫＨ２ＰＯ４および１２．５ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４を含有していた。細菌培養液を、撹拌下、適当な抗生物質（例えば、アンピシリン）とともに３７℃でインキュベートした。発現は、１ｍＭ  ＩＰＴＧの最終濃度を用い、０．５から０．６の間の光学密度（６００ｎｍ）で、３０℃で３時間誘導した。５０００ＲＰＭで遠心分離した後、細菌を回収し、細菌ペレットを−２０℃で保存した。
【０１９９】
細菌ペレットを、フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）１ｍＭを含むＴｒｉｓバッファー（Ｔｒｉｓ  ２５ｍＭ  ｐＨ７．５、ＮａＣｌ  １００ｍＭ、イミダゾール  ５ｍＭ）中に再懸濁し、１０００バールでホモジナイザ−Ｐａｎｄａ  ２Ｋ（商標）を３回通すことによって、溶解した。溶液を、１５０００ＲＰＭ、４℃で３０分間遠心分離した。上清を集め、０．２２μＭの濾過装置を用いて濾過した。
【０２００】
ＦＰＬＣ（ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００Ｒ）を使用して、５カラム容積（ＣＶ）のＴｒｉｓバッファーを用いて予め平衡化したＨｉｓＴｒａｐ（商標）ＦＦカラム上に可溶化したタンパク質をロードした。カラムを、３０カラム容積（ＣＶ）の、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１１４を補給したＴｒｉｓバッファーを用いて、続いて、３０ＣＶの、イミダゾール４０ｍＭを含むＴｒｉｓバッファーを用いて洗浄した。５ＣＶの、３５０ｍＭイミダゾールを含むＴｒｉｓバッファーを用いてタンパク質を溶出し、収集した。特定のタンパク質に対応する収集した画分を、標準変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、調べた。
【０２０１】
精製タンパク質を、タンパク質のｐＩに従う所望のｐＨのＴｒｉｓ  ２０ｍＭに希釈し、５ＣＶの、Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３０ｍＭを用いて予め平衡化した適当なイオン交換カラム（Ｑセファロース（商標）またはＳＰセファロース（商標））上にロードした。１０ＣＶの、Ｔｒｉｓ  ２０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３０ｍＭを用いてカラムを洗浄し、１５ＣＶで１ＭまでのＮａＣｌ勾配を用いてタンパク質を溶出した。特定のタンパク質に対応する収集した画分を、標準変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、調べた。次いで、精製タンパク質を洗浄し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（商標）遠心分離フィルター１０，０００ＭＷＣＯでＰＢＳ  １Ｘ中で濃縮した。タンパク質濃度を、標準Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを使用して評価した。
【０２０２】
１．５  合成ペプチドおよびシャトル剤
この研究に使用したすべてのペプチドは、ＧＬＢｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）から購入し、その純度は、高性能液体クロマトグラフィー解析および質量分析法によって確認した。いくつかの場合には、ペプチド二量体の調製を可能にするＣ末端システイン残基を含有するようにペプチドを合成した。これらの二量体のペプチドを、２つの単量体のＣ末端システイン間のジスルフィド橋を用いて直接合成した。本実施例において、試験した合成ペプチドおよびシャトル剤の各々のアミノ酸配列および特徴は、表１．３、表Ｂ１、および表Ｃ１にまとめている。
【表８−１】
2019531316.tif 000012
【表８−２】
2019531316.tif 000013
【表８−３】
2019531316.tif 000014
【０２０３】
結果は、ＥｘＰＡＳｙ（商標）バイオインフォマティクスリソースポータル（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）から利用可能なＰｒｏｔＰａｒａｍ（商標）オンラインツールを用いて計算した。
ＭＷ：分子量
ｐＩ：等電点
電荷：正（＋）および負（−）に帯電した残基の合計数
【０２０４】
実施例２：
ペプチドシャトル剤は、エンドソームにより捕捉されたカルセインの脱出を促進する
２．１  エンドソーム脱出アッセイ
エンドソーム漏出を研究するために、およびシャトル剤の添加が、ポリペプチドカーゴのエンドソーム漏出を促進するか否かを調べるために、顕微鏡ベースの、およびフローサイトメトリーベースの蛍光アッセイを開発した。これら方法は、国際出願第ＰＣＴ／ＣＡ２０１６／０５０４０３号の実施例２に記載されている。
【０２０５】
２．１．１  顕微鏡によるエンドソーム漏出可視化
カルセインは、細胞外培地に投与された場合に、細胞によって、容易に内部移行される膜不透過性蛍光分子である。その蛍光は、ｐＨ依存性であり、カルセインは、高濃度で自己消光する。内部移行すると、カルセインは、細胞エンドソームにおいて、高濃度で捕捉されるようになり、点状パターンとして蛍光顕微鏡によって、可視化され得る。エンドソーム漏出後、カルセインは、細胞質に放出され、この放出は、拡散パターンとして蛍光顕微鏡によって、可視化され得る。
【０２０６】
カルセインアッセイが実施される１日前に、対数増殖期にある細胞を採取し、２４ウェルプレート（ウェルあたり８０，０００個細胞）中に播種した。実施例１に記載されるように、好適な成長培地中で、一晩インキュベートすることによって、細胞を付着させた。翌日、培地を除去し、３００μＬの、ＦＢＳを含まない、６２．５μｇ／ｍＬ（１００μＭ）のカルセインを含有する（２５０μｇ／ｍＬ、４００μＭのカルセインを含めるＨＥＫ２９３Ａの場合を除く）新鮮培地と置き換えた。同時に、試験されるべきシャトル剤を、所定の濃度で添加した。プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を１ｘＰＢＳ（３７℃）で洗浄し、ＦＢＳを含有する新鮮培地を添加した。プレートを３７℃で２．５時間インキュベートした。細胞を３回洗浄し、位相差および蛍光顕微鏡（ＩＸ８１（商標）、Ｏｌｙｍｐｕｓ）により可視化した。
【０２０７】
典型的な結果が、図１Ａに示されており、これでは、カルセイン（「１００μＭカルセイン」）をロードされた未処理ＨＥＫ２９３Ａ細胞は、蛍光顕微鏡によって、可視化された場合に、低い強度、点状蛍光パターンを示す（上段左側パネル）。対照的に、カルセインのエンドソーム脱出を促進するシャトル剤（「１００μＭカルセイン＋ＣＭ１８−ＴＡＴ  ５μＭ」）を用いて処理されたＨｅＬａ細胞は、より多くの割合の細胞において、高い強度、より多くの核酸蛍光パターンを示す（上段右側パネル）。
【０２０８】
２．１．２  フローサイトメトリーによるエンドソーム漏出定量化
カルセインが細胞質中に放出されると、蛍光強度シグナルが増大するので、顕微鏡に加えて、フローサイトメトリーによって、エンドソーム漏出のより定量的な解析が可能となる。カルセイン蛍光は、エンドソームの酸性環境と比較して、生理学的ｐＨで（例えば、サイトゾル中で）最適である。
【０２０９】
カルセインアッセイが実施される１日前に、対数増殖期にある細胞を採取し、９６ウェルプレート（ウェルあたり２０，０００個細胞）中に播種した。実施例１に記載されるように、好適な成長培地中で、一晩インキュベートすることによって、細胞を付着させた。翌日、培地を除去し、５０μＬの、血清を含まない、６２．５μｇ／ｍＬ（１００μＭ）のカルセインを含有する（２５０μｇ／ｍＬ、４００μＭのカルセインを含めるＨＥＫ２９３Ａの場合を除く）新鮮培地と置き換えた。同時に、試験されるべきシャトル剤を、所定の濃度で添加した。プレートを３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を１×ＰＢＳ（３７℃）で洗浄し、５〜１０％血清を含有する新鮮培地を添加した。プレートを３７℃で２．５時間インキュベートした。細胞を１×ＰＢＳを用いて洗浄し、トリプシン処理を使用して剥離した。適当な成長培地の添加によって、トリプシン処理を停止し、フローサイトメトリー（Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６、Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （ＢＤ）を使用してカルセイン蛍光をクエンチした。
【０２１０】
エンドソームにより捕捉されたカルセインに起因する蛍光のベースラインを有する細胞を、エンドソームからのカルセインの放出のために増大した蛍光を有する細胞と区別するために、未処理カルセインが負荷された細胞を対照として使用した。エンドソーム脱出定量化のために蛍光シグナル平均値（「平均カウント」）を解析した。いくつかの場合には、対照（未処理カルセインが負荷された細胞）に対して平均値カウントの増大倍数に対応する「平均倍数」を算出した。また、細胞に対応するフローサイトメトリーによって、スキャンされるイベント（大きさおよび粒度）も解析した。細胞死亡率を、総スキャンイベント中の細胞のパーセンテージによりモニターした。それが対照よりも低くなった場合には、毒性のために壊死細胞片の数が増大していると考え、アッセイを破棄した。
【０２１１】
典型的な結果が、図１Ｂに示されており、これでは、未処理カルセインが負荷されたＨｅＬａ細胞（「カルセイン１００μＭ」、左側パネル）と比較して、エンドソーム脱出を促進するシャトル剤（「カルセイン１００μＭ＋ＣＭ１８−ＴＡＴ  ５μＭ」、右側パネル）を用いて処理された、カルセインが負荷されたＨｅＬａ細胞の蛍光強度の増大（右にシフト）が観察された。カルセイン蛍光の増大は、エンドソーム（酸性）から細胞質（生理学的）へのカルセインの放出と関連するｐＨの増大によって、引き起こされる。
【０２１２】
２．２  エンドソーム脱出アッセイからの結果
２．２．１  ＨｅＬａ細胞
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例２．１に記載されるようなエンドソーム脱出アッセイにおいて、試験した。フローサイトメトリー解析の結果は、以下にまとめられている。各場合において、フローサイトメトリー結果はまた、蛍光顕微鏡により確認された（データは示さず）。
【表９】
2019531316.tif 000015
【表１０】
2019531316.tif 000016
【０２１３】
表２．１および表２．２における結果は、カルセインが負荷されたＨｅＬａ細胞を、シャトル剤ＣＭ１８−ペネトラチン−ＣｙｓおよびＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（ドメイン構造ＥＬＤ−ＣＰＤを有する）を用いて処理することにより、未処理の対照細胞または単独で（ＣＭ１８、ＴＡＴ−Ｃｙｓ、ペネトラチン−Ｃｙｓ）または一緒に（ＣＭ１８＋ＴＡＴ−Ｃｙｓ、ＣＭ１８＋ペネトラチン−Ｃｙｓ）使用される単一ドメインペプチドを用いて処理された細胞と比較して、平均細胞カルセイン蛍光強度の増大がもたらされることを示す。これらの結果は、ＣＭ１８−ペネトラチン−ＣｙｓおよびＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓが、エンドソームにより捕捉されたカルセインの脱出を促進するが、単一ドメインペプチド（単独でまたは一緒に使用される）は促進しないことを示唆する。
【表１１】
2019531316.tif 000017
【表１２】
2019531316.tif 000018
【表１３】
2019531316.tif 000019
【０２１４】
表２．３（図２）、表２．４および表２．５（図３）における結果は、ＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓおよびＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓが、ＨｅＬａ細胞において、エンドソームにより捕捉されたカルセインの脱出を用量依存的に促進することを示唆する。いくつかの場合には、１０μＭを超えるＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓまたはＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓの濃度は、ＨｅＬａ細胞における細胞毒性の増大と関連していた。
【表１４】
2019531316.tif 000020
【表１５】
2019531316.tif 000021
【０２１５】
表２．６および表２．７における結果は、シャトルペプチド二量体（２つ以上のＥＬＤおよびＣＰＤを含む分子である）が、対応する単量体と同等であるカルセインエンドソーム脱出レベルを促進できることを示唆する。
【０２１６】
２．２．３  ＨＥＫ２９３Ａ細胞
種々の細胞株に対するシャトル剤の効果を調べるために、ＨＥＫ２９３Ａ細胞を培養し、実施例２．１に記載されるようなエンドソーム脱出アッセイで試験した。フローサイトメトリー解析の結果を、以下の表２．８、および図１Ｂにまとめている。
【表１６】
2019531316.tif 000022
【０２１７】
表２．８、および図１Ｂにおける結果は、カルセインが負荷されたＨＥＫ２９３Ａ細胞を、シャトル剤ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓを用いて処理することにより、未処理の対照細胞と比較して、平均細胞カルセイン蛍光強度の増大がもたらされることを示す。
【０２１８】
２．２．２  筋芽細胞
シャトル剤の初代細胞に対する効果を調べるために、初代筋芽細胞を培養し、実施例２．１に記載されるようなエンドソーム脱出アッセイで試験した。フローサイトメトリー解析の結果を、以下の表２．９および表２．１０、および図４にまとめている。各場合において、フローサイトメトリー結果は、蛍光顕微鏡によっても確認された。
【表１７】
2019531316.tif 000023
【表１８】
2019531316.tif 000024
【０２１９】
表２．９（図４にグラフにより示される）および表２．１０における結果は、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓが、初代筋芽細胞において、エンドソームにより捕捉されたカルセインの脱出を用量依存的に促進することを示唆する。１０μＭを超えるＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓの濃度は、ＨｅＬａ細胞についてと同様に、筋芽細胞における細胞毒性の増大と関連していた。
【表１９】
2019531316.tif 000025
【０２２０】
表２．１１における結果は、シャトルペプチド二量体が、初代筋芽細胞において、対応する単量体と同等であるカルセインエンドソーム脱出レベルを促進できることを示唆する。
【０２２１】
実施例３：ペプチドシャトル剤はＧＦＰ形質導入効率を高める
３．１  タンパク質形質導入アッセイ
形質導入アッセイが実施される１日前に、対数増殖期にある細胞を回収し、９６ウェルプレート（ウェルあたり２０，０００個細胞）中に播種した。細胞を、ＦＢＳを含有する適当な成長培地中で一晩インキュベートした（実施例１を参照のこと）。翌日、別の滅菌１．５ｍＬチューブ中で、示した濃度のカーゴタンパク質を、５０μＬの、血清を含まない（特に断りのない限り）新鮮培地中で、シャトル剤として試験されるペプチド（０．５〜５μＭ）とともに３７℃で（プロトコルに応じて）１または１０分間予混合した（プレインキュベートした）。ウェル中の培地を除去し、細胞を、３７℃に予め加温した新たに調製したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて３回洗浄した。細胞を、カーゴタンパク質／シャトル剤混合物とともに３７℃で示した時間（例えば、１、５または６０分間）インキュベートした。インキュベートした後、細胞を、３７℃に予め加温した新たに調製したＰＢＳおよび／またはヘパリン（０．５ｍｇ／ｍＬ）を用いて３回迅速に洗浄した。ヒトＴＨＰ−１血液細胞には、その後の解析（顕微鏡およびフローサイトメトリー）における望ましくない細胞膜結合タンパク質バックグラウンドを避けるために、ヘパリンを用いる洗浄が必要であった。細胞を、５０μＬの、血清を含む新鮮培地中、３７℃で最後にインキュベートし、その後解析した。
【０２２２】
３．１ａ  プロトコルＡ：付着細胞のタンパク質形質導入アッセイ
形質導入アッセイが実施される１日前に、対数増殖期にある細胞を回収し、９６ウェルプレート（ウェルあたり２０，０００個細胞）中に播種した。細胞を、血清を含有する適切な成長培地中で一晩インキュベートした（実施例１を参照のこと）。翌日、別個の滅菌１．５ｍＬチューブ中で、シャトル剤を室温で滅菌蒸留水中で希釈した（カーゴが、核酸であるか、または核酸を含んでいる場合には、ヌクレアーゼ不含水を使用した）。シャトル剤にペプチドを添加し、必要に応じて、滅菌ＰＢＳまたは細胞培地（無血清）を添加して、細胞を覆うのに十分な最終容量（例えば、９６ウェルプレートのウェルあたり１０〜１００μＬ）の、所望の濃度のシャトル剤およびカーゴを得た。次いで、ペプチド／カーゴ混合物を実験のために直ちに使用した。各実験に少なくとも３種：（１）ペプチド単独（例えば、試験される最高濃度で）の対照、（２）カーゴ単独の対照、および（３）カーゴまたはシャトル剤を何ら含まない対照を含めた。ウェル中の培地を除去し、細胞を、３７℃に予め加温したＰＢＳを用いて１回洗浄し、カーゴタンパク質／ペプチド混合物とともに３７℃で所望時間にわたりインキュベートした。ウェル中のペプチド／カーゴ混合物を除去し、細胞をＰＢＳを用いて１回洗浄し、新鮮完全培地を添加した。解析の前に、細胞をＰＢＳを用いて最後にもう一度洗浄し、新鮮完全培地を添加した。
【０２２３】
３．１ｂ  プロトコルＢ：懸濁細胞のタンパク質形質導入アッセイ
形質導入アッセイが実施される１日前に、対数増殖期にある懸濁細胞を回収し、９６ウェルプレート（ウェルあたり２０，０００個細胞）中に播種した。細胞を、血清を含有する適切な成長培地中で一晩インキュベートした（実施例１を参照のこと）。翌日、別個の滅菌１．５ｍＬチューブ中で、シャトル剤を室温で滅菌蒸留水中で希釈した（カーゴが、核酸であるか、または核酸を含んでいる場合には、ヌクレアーゼ不含水を使用した）。シャトル剤にペプチドを添加し、必要に応じて、滅菌ＰＢＳまたは細胞培養培地（血清不含）を添加して、細胞を再懸濁に十分な最終容量（例えば、９６ウェルプレートのウェルあたり１０〜１００μＬ）の、所望の濃度のシャトル剤およびカーゴを得た。次いで、シャトル剤／ペプチドを実験のために直ちに使用した。各実験に少なくとも３種：（１）ペプチド単独（例えば、試験される最高濃度で）の対照、（２）カーゴ単独の対照、および（３）カーゴまたはシャトル剤を何ら含まない対照を含めた。細胞を４００ｇで２分間遠心分離し、次いで、培地を除去し、細胞を、３７℃に予め加温したＰＢＳに再懸濁した。細胞を４００ｇで再度２分間遠心分離し、ＰＢＳを除去し、細胞をシャトル剤／カーゴ混合物と共に、所望の時間にわたり３７℃で再懸濁した。その後、２００μＬの完全培地を細胞に直接添加した。細胞を、４００ｇで２分間遠心分離し、培地を除去した。ペレットを３７℃に予め加温した２００μＬのＰＢＳ中に再懸濁し、洗浄した。別の遠心分離を実施後、ＰＢＳを除去し、細胞を５０μＬのトリプシン−ＥＤＴＡ溶液中で２分間再懸濁した。２００μＬの完全培地を直接加え、細胞を、４００ｇで２分間遠心分離した。培地を除去し、細胞を２００μＬの完全培地に再懸濁した。
【０２２４】
３．２  蛍光顕微鏡解析
細胞質および核細胞区画における蛍光タンパク質カーゴの送達を、蛍光ランプ（モデルＵ−ＬＨ１００ＨＧＡＰＯ）および種々のフィルターを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７０（商標）顕微鏡（Ｊａｐａｎ）を用いて観察した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ｆｉｌｔｅｒ  Ｕ−ＭＦ２（商標）（Ｃ５４９４２−Ｅｘｃ４９５／Ｅｍ５１０）を使用して、ＧＦＰおよびＦＩＴＣ標識抗体の蛍光シグナルを観察した。ＯｌｙｍｐｕｓフィルターＨＱ−ＴＲ（商標）（Ｖ−Ｎ４１００４−Ｅｘｃ５５５−６０／Ｅｍ６４５−７５）を使用して、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）およびＧＦＰ抗体蛍光シグナルを観察した。ＯｌｙｍｐｕｓフィルターＵ−ＭＷＵ２（商標）（Ｅｘｃ３３０／Ｅｍ３８５）を使用して、ＤＡＰＩまたはＢｌｕｅ  Ｈｏｅｃｈｓｔ蛍光シグナルを観察した。５０μＬの新鮮培地中でインキュベートされた細胞を、種々の倍率視野（４ｘ〜４０ｘ）で顕微鏡（明視野および蛍光）によって、直接観察した。ＣｏｏｌＳＮＡＰ−ＰＲＯ（商標）カメラ（シリーズＡ０２Ｄ８７４０２１）を使用して細胞を観察し、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏｐｌｕｓ（商標）ソフトウェアを使用して画像を取得した。
【０２２５】
３．２ａ  細胞免疫標識
付着細胞を、２４プレートウェルのウェルあたり１．５ｘ１０５個細胞を滅菌ガラスストリップ上に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。固定のために、細胞をウェルあたり５００μＬのホルムアルデヒド（３．７％  ｖ／ｖ）中、室温で１５分間インキュベートし、ＰＢＳを用いて３回５分間洗浄した。透過処理のために、細胞をウェルあたり５００μＬのＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００（０．２％）中、室温で１０分間インキュベートし、ＰＢＳを用いて３回５分間洗浄した。ブロッキングのために、細胞を、ウェルあたり５００μＬの、１％  ＢＳＡ（ＰＢＳ／ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中で、室温で６０分間インキュベートした。一次マウスモノクローナル抗体をＰＢＳ／ＢＳＡ（１％）で希釈した。細胞を、３０μＬの一次抗体中で、４℃で一晩インキュベートした。細胞をＰＢＳを用いて３回５分間洗浄した。二次抗体をＰＢＳ／ＢＳＡ（１％）で希釈し、細胞を２５０μＬの二次抗体中で、室温、暗所で３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳを用いて３回５分間洗浄した。細胞を含有するガラスストリップを、１０μＬの封入剤、ＤＡＰＩを含むＦｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄ（商標）を用いて顕微鏡ガラススライドに取り付けた。
【０２２６】
３．３  フローサイトメトリー解析：
ＧＦＰの蛍光を、フローサイトメトリー（Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６、Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ社  （ＢＤ）を使用して定量化した。処理細胞における蛍光タンパク質の内部移行による蛍光の増大を定量化するために、未処理細胞を使用してベースラインを確立した。未処理細胞の最大蛍光を上回る蛍光シグナルを有する細胞のパーセンテージ、「平均％」または「Ｐｏｓ細胞（％）」を使用して、陽性蛍光細胞を特定する。「相対蛍光強度（ＦＬ１−Ａ）」は、シャトル剤を用いる蛍光タンパク質送達後の蛍光シグナルを有する各細胞からのすべての蛍光強度の平均に相当する。また、細胞に対応するフローサイトメトリーによりスキャンされるイベント（大きさおよび粒度）も解析した。未処理細胞と比較して、処理細胞のスキャンされた総イベントにおける細胞のパーセンテージを比較して、細胞毒性（細胞生存率％）をモニタリングした。
【０２２７】
３．３ａ  生存率解析
該当する場合には、レザズリン試験を用いて細胞の生存率を評価した。レザズリンは、代謝的に活性な細胞中で、ミトコンドリア酵素によって、青色から桃色に変換されるナトリウム塩着色剤である。生存細胞のパーセンテージを定量化するために、生存細胞のみに起こるこの比色変換を、分光法解析によって、測定できる。レザズリンのストック溶液を、水中、１ｍｇ／１００ｍＬで調製し、４℃で保存した。９６ウェルプレートの各ウェルに２５μＬのストック溶液を添加し、細胞を３７℃で１時間インキュベートし、その後、分光法解析した。レザズリン酵素反応に使用したインキュベーション時間は、ウェル中で使用した細胞の量および培地の容量に応じて変えた。
【０２２８】
３．４  ＧＦＰの構築およびアミノ酸配列
Ｎ末端に６ｘヒスチジンタグおよびセリン／グリシンリッチリンカーならびにＣ末端にセリン／グリシンリッチリンカーおよび停止コドン（−）を含有するＧＦＰタンパク質を発現するように、ＧＦＰをコードする遺伝子を、Ｔ５細菌発現ベクターに挿入した。組換えＧＦＰタンパク質を、実施例１．４に記載されるように精製した。ＧＦＰ構築物の配列は、以下であった：
【化１】
2019531316.tif 000026
（ＭＷ＝３１．４６ｋＤａ；ｐＩ＝６．１９）
セリン／グリシンリッチリンカーは太字である。
ＧＦＰ配列には下線を付与した。
【０２２９】
３．５  ＨｅＬａ細胞におけるＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓによるＧＦＰ形質導入：蛍光顕微鏡
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例３．１に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、ＧＦＰ組換えタンパク質を、０、３または５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴとともに同時インキュベートし、次いで、ＨｅＬａ細胞に対して１時間曝露した。細胞を、実施例３．２に記載されるように明視野および蛍光顕微鏡により観察した。図５に示される結果は、ＧＦＰが、シャトル剤ＣＭ１８−ＴＡＴの存在下でＨｅＬａ細胞に細胞内に送達されたことを示す。
【０２３０】
３．６  ＨｅＬａ細胞におけるシャトル剤によるＧＦＰ形質導入：用量反応（ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ、ｄＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ、ＧＦＰ）および細胞生存率
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例３．１〜３．３に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、ＧＦＰ組換えタンパク質を、種々の濃度のＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓまたは二量体化されたＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（ｄＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ）と同時インキュベートし、次いで、ＨｅＬａ細胞に１時間曝露した。結果は、表３．１および図６Ａ〜６Ｂに示されている。
【表２０】
2019531316.tif 000027
【０２３１】
表３．１および図６Ａは、５、３、１および０．５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓを含まずに、またはそれとともに、ＧＦＰ（５μＭ）を用いて形質導入されたＨｅＬａ細胞のフローサイトメトリー解析の蛍光強度の結果を示す。対応する細胞毒性データは、表３．１、および図６Ｂに示されている。これらの結果は、シャトル剤ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓが、ＧＦＰの形質導入効率を用量依存的に高めることを示唆する。
【表２１】
2019531316.tif 000028
【０２３２】
表３．２および図７は、５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（図７Ａ）または２．５μＭのｄＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（図７Ｂ）を含まずに、またはそれとともに種々の濃度のＧＦＰ（１〜１０μＭ）を用いて形質導入されたＨｅＬａ細胞のフローサイトメトリー解析の蛍光強度の結果を示す。
【０２３３】
３．７  ＨｅＬａ細胞におけるＧＦＰ形質導入：ＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓおよびＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓならびにその二量体の用量反応
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例３．１に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、ＧＦＰ組換えタンパク質（５μＭ）を、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ、ＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓおよび各々（ｄＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ、ｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ）の二量体の種々の濃度および組合せと同時インキュベートし、次いで、ＨｅＬａ細胞に対して１時間曝露した。細胞を、実施例３．３に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表３．３および図８に、ならびに表３．４および図９に示されている。
【表２２】
2019531316.tif 000029
【０２３４】
表３．３および図８における結果は、シャトル剤ＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓおよびｄＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓを使用するとＨｅＬａ細胞のＧＦＰ形質導入効率が高められることを示す（図８中のバー「１」および「２」を参照のこと）。ＣＭ１８−ペネトラチン−ＣｙｓまたはｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ単独を使用した場合はＧＦＰ細胞内送達が観察されなかったが（図８中のバー「３」または「４」を参照のこと）、ＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓとＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（単量体または二量体）との組合せは、ＧＦＰタンパク質送達を改善した（図８中の４つの最も右のバーを参照のこと）。
【表２３】
2019531316.tif 000030
【０２３５】
表３．４および図９における結果は、シャトル剤ＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓおよびｄＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（図９におけるバー「１」および「２」を参照のこと）を使用した場合、ＨｅＬａ細胞において、ＧＦＰの形質導入効率が高まることを示す。ＣＭ１８−ペネトラチン−ＣｙｓまたはｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ単独を使用した場合はＧＦＰ細胞内送達が観察されなかったが（図９中のバー「３」または「４」を参照のこと）、ＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓとＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（単量体または二量体）との組合せは、ＧＦＰタンパク質送達を改善した（図９中の４つの最も右のバーを参照のこと）。
【０２３６】
３．８  ＨｅＬａ細胞におけるシャトル剤によるＧＦＰ形質導入：対照
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例３．１に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、ＧＦＰ組換えタンパク質（５μＭ）を、各５μＭの以下のペプチド：ＴＡＴ−Ｃｙｓ、ＣＭ１８、ペネトラチン−Ｃｙｓ、ＴＡＴ−Ｃｙｓ＋ＣＭ１８、ペネトラチン−Ｃｙｓ＋ＣＭ１８およびＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓのそれぞれと同時インキュベートし、次いで、ＨｅＬａ細胞に対して１時間曝露した。ＧＦＰ蛍光を明視野および蛍光顕微鏡によって、可視化した。顕微鏡結果（データは示さず）は、ＧＦＰが、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓを使用してうまく細胞内に送達されたことを示した。しかし、ＧＦＰは、単一ドメインペプチドを単独（ＣＭ１８、ＴＡＴ−Ｃｙｓ、ペネトラチン−Ｃｙｓ）または一緒に（ＣＭ１８＋ＴＡＴ−Ｃｙｓ、ＣＭ１８＋ペネトラチン−Ｃｙｓ）使用すると、うまく細胞内に送達されなかった。これらの結果は、カルセインエンドソーム脱出アッセイに関して表２．１および表２．２に示されるものと一致する。
【０２３７】
実施例４：ペプチドシャトル剤はＴＡＴ−ＧＦＰ形質導入効率を高める
実施例３における実験は、シャトル剤の、ＧＦＰを細胞内に送達する能力を示した。この実施例において、示された実験は、シャトル剤がまた、ＣＰＤと融合されているＧＦＰカーゴタンパク質（ＴＡＴ−ＧＦＰ）の細胞内送達も増大させ得ることを示す。
【０２３８】
４．１  ＴＡＴ−ＧＦＰの構築およびアミノ酸配列
構築は、ＴＡＴ配列が、６ｘヒスチジンタグとＧＦＰ配列の間にクローニングされた点を除いて、実施例３．４に示されるように実施した。６ｘヒスチジンタグ、ＴＡＴ、ＧＦＰおよび停止コドン（−）は、セリン／グリシンリッチリンカーにより分離されている。組換えＴＡＴ−ＧＦＰタンパク質を、実施例１．４に記載されるように精製した。ＴＡＴ−ＧＦＰ構築物の配列は以下であった：
【化２】
2019531316.tif 000031
［配列番号６１］
（ＭＷ＝３４．０６ｋＤａ；ｐＩ＝８．３６）
ＴＡＴ配列には下線を付与した。
セリン／グリシンリッチリンカーは太字である。
【０２３９】
４．２  ＨｅＬａ細胞におけるＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓによるＴＡＴ−ＧＦＰ形質導入：蛍光顕微鏡による可視化
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例３．１に記載されるタンパク質形質導入アッセイにおいて、試験した。手短に説明すると、ＴＡＴ−ＧＦＰ組換えタンパク質（５μＭ）を、３μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓと同時インキュベートし、次いで、ＨｅＬａ細胞に対して１時間曝露した。細胞およびＧＦＰ蛍光を、１０ｘおよび４０ｘ倍率で明視野および蛍光顕微鏡により可視化し（実施例３．２に記載されるように）、結果例が、図１０に示されている。顕微鏡結果により、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓの非存在下で、ＴＡＴ−ＧＦＰは、低い強度の、文献に報告されたようなエンドソーム分布を示すことが明らかになった。対照的に、ＴＡＴ−ＧＦＰは、シャトル剤ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓの存在下で細胞質および核に送達される。理論に束縛されるものではないが、ＴＡＴペプチド自体は、核移行シグナル（ＮＬＳ）として作用し得、ＴＡＴ−ＧＦＰの核局在化を説明する。これらの結果は、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓが、ＴＡＴ−ＧＦＰ形質導入効率を増大させ、エンドソームにより捕捉されたＴＡＴ−ＧＦＰが、細胞質および核区画に到達することを可能にすることを示す。
【０２４０】
４．３  ＨｅＬａ細胞におけるＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓによるＴＡＴ−ＧＦＰ形質導入：形質導入された細胞の用量反応および生存率
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例３．１に記載されるタンパク質形質導入アッセイにおいて、試験した。手短に説明すると、ＴＡＴ−ＧＦＰ組換えタンパク質（５μＭ）を、種々の濃度のＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（０、０．５、１、３または５μＭ）と同時インキュベートし、次いで、ＨｅＬａ細胞に対して１時間曝露した。細胞を、実施例３．３に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表４．３および図１１Ａに示されている。対応する細胞毒性データは、図１１Ｂに示されている。
【表２４】
2019531316.tif 000032
【０２４１】
実施例５：ペプチドシャトル剤はＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率および核局在化を高める
実施例３および４における実験は、シャトル剤の、ＧＦＰおよびＴＡＴ−ＧＦＰを細胞内に送達する能力を示した。この実施例で示される実験は、シャトル剤が、核移行シグナル（ＮＬＳ）と融合されたＧＦＰタンパク質カーゴの核送達を促進し得ることを示す。
【０２４２】
５．１  ＧＦＰ−ＮＬＳの構築およびアミノ酸配列
構築は、最適化されたＮＬＳ配列を、ＧＦＰ配列と停止コドン（−）の間に挿入したという点を除いて実施例３．４に記載されるように実施した。ＮＬＳ配列は、ＧＦＰ配列および停止コドンから２つのセリン／グリシンリッチリンカーにより分離されている。組換えＧＦＰ−ＮＬＳタンパク質を、実施例１．４に記載されるように精製した。ＧＦＰ−ＮＬＳ構築物の配列は、以下であった：
【化３】
2019531316.tif 000033
（ＭＷ＝３４．８５ｋＤａ；ｐＩ＝６．４６）
ＮＬＳ配列には下線を付与した。
セリン／グリシンリッチリンカーは太字である。
【０２４３】
５．２  ５分でのＨｅＬａ細胞におけるＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓによるＧＦＰ−ＮＬＳの核送達：蛍光顕微鏡による可視化
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例３．１に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ）を、５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓと同時インキュベートし、次いで、ＨｅＬａ細胞に対して曝露した。５分後、ＧＦＰ蛍光を、１０ｘ、２０ｘおよび４０ｘの倍率で明視野および蛍光顕微鏡によより可視化し（実施例３．２に記載されるように）、結果例が図１２に示されている。顕微鏡結果は、ＧＦＰ−ＮＬＳが、わずか５分のインキュベーション後に、シャトル剤ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓの存在下で核に効率的に送達されることを示した。
【０２４４】
５．３  ＨｅＬａ細胞におけるＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓによるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入：形質導入された細胞の用量反応および生存率
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例３．１に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ）を、０、０．５、１、３または５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓと同時インキュベートし、次いで、ＨｅＬａ細胞に対して１時間曝露した。細胞を、実施例３．３に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表５．１および図１３Ａに示されている。対応する細胞毒性データは、図１３Ｂに示されている。
【表２５】
2019531316.tif 000034
【０２４５】
これらの結果は、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓが、ＨｅＬａ細胞において、用量依存的にＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率を高めることができることを示す。
【０２４６】
５．４  ＨｅＬａ細胞におけるＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ、ＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓおよびそれらの二量体によるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例３．１に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ）を、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ、ＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓおよび各々（ｄＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ、ｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ）の二量体の種々の濃度および組合せと同時インキュベートし、次いで、ＨｅＬａ細胞に対して１時間曝露した。細胞を、実施例３．３に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表５．２および表５．３、並びに図１４および図１５に示されている。
【表２６】
2019531316.tif 000035
【表２７】
2019531316.tif 000036
【０２４７】
表５．２および表５．３ならびに図１４および図１５における結果は、シャトル剤ＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓおよびｄＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓを使用により、ＨｅＬａ細胞へのＧＦＰ−ＮＬＳの形質導入効率が増大することを示す（図１４および図１５中のバー「１」および「２」を参照のこと）。ＣＭ１８−ペネトラチン−ＣｙｓまたはｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ単独を使用するとＧＦＰ−ＮＬＳ細胞内送達は観察されなかったが（図１４および図１５中のバー「３」および「４」を参照のこと）、ＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓのＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（単量体または二量体）の組合せは、ＧＦＰ−ＮＬＳ細胞内送達を改善した（図１４および図１５中の４つの最も右のバーを参照のこと）。
【０２４８】
５．５  ＨｅＬａ細胞におけるシャトル剤によるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入：ＦＢＳを用いるまたは用いないで、５分対１時間インキュベーション
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例３．１に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ）を、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（３．５μＭ）の単独で、またはこれと、ｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（１μＭ）を一緒に、同時インキュベートした。細胞を、単純ＤＭＥＭ培地（「ＤＭＥＭ」）または１０％  ＦＢＳ（「ＦＢＳ」）を含有するＤＭＥＭ培地中で５分または１時間インキュベートし、その後、実施例３．３に記載されたようなフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表５．４、および図１６に示されている。シャトル剤またはＧＦＰ−ＮＬＳで処理されなかった細胞（「ｃｔｒｌ」）およびＧＦＰ−ＮＬＳを用いたが、シャトル剤を用いないで処理した細胞（「ＧＦＰ−ＮＬＳ  ５μＭ」）を対照として使用した。
【表２８】
2019531316.tif 000037
【０２４９】
表５．４および図１６における結果は、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ単量体への比較的少量の二量体ｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓの添加でさえ（１μＭ、「ｄＣＭ１８ｐｅｎ」）、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率を改善したことを示す。興味深いことに、細胞内ＧＦＰ−ＮＬＳ送達は、わずか５分のインキュベーションで達成され、送達はＦＢＳの存在下でも依然として達成可能であった（低減したが）。
【０２５０】
５．６  ＴＨＰ−１懸濁細胞におけるシャトル剤によるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入
シャトル剤のＧＦＰ−ＮＬＳを細胞内に送達する能力を、懸濁液中で成長する急性単球性白血病細胞株であるＴＨＰ−１細胞において、試験した。ＴＨＰ−１細胞を培養し（実施例１を参照のこと）、実施例３．１に記載されるタンパク質形質導入アッセイで試験した。ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ）を、１μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓと同時インキュベートし、または１μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓを加えずにインキュベートし、ＴＨＰ−１細胞に対して５分間曝露し、その後、実施例３．３に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表５．５、および図１７Ａに示されている。対応する細胞毒性データは、図１７Ｂに示されている。
【表２９】
2019531316.tif 000038
【０２５１】
表５．５および図１７における結果は、シャトル剤の、タンパク質カーゴを、懸濁液で成長したヒト単球性細胞株に細胞内送達する能力を実証する。
【０２５２】
実施例６：ペプチドシャトル剤は、ＦＩＴＣ標識抗チューブリン抗体の形質導入効率を増大させる
実施例３〜５における実験は、シャトル剤の、ＧＦＰ、ＴＡＴ−ＧＦＰおよびＧＦＰ−ＮＬＳの形質導入効率を増大させる能力を示した。この実施例で提供される実験は、シャトル剤がまた、より大きなタンパク質カーゴ：ＦＩＴＣ標識抗チューブリン抗体も送達できることを示す。ＦＩＴＣ標識抗チューブリン抗体は、（Ａｂｃａｍ、ａｂ６４５０３）から購入し、１５０ＫＤａの推定分子質量を有する。送達および顕微鏡プロトコルは、実施例３に記載されている。
【０２５３】
６．１  ＨｅＬａ細胞におけるＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓによる機能的抗体の形質導入：顕微鏡による可視化
ＦＩＴＣ標識抗チューブリン抗体（０．５μＭ）を、５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓと同時インキュベートし、ＨｅＬａ細胞に対して１時間曝露した。抗体送達を明視野（２０ｘ）および蛍光顕微鏡（２０ｘおよび４０ｘ）により可視化した。図１８に示されるように、細胞質での蛍光チューブリン繊維が可視化され、細胞の内側の抗体の機能性を実証した。
【０２５４】
６．２  ＨｅＬａ細胞におけるＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ、ＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓおよび二量体による機能的抗体の形質導入：フローサイトメトリー
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例３．１に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。ＦＩＴＣ標識抗チューブリン抗体（０．５μＭ）を、３．５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ、ＣＭ１８−ペネトラチン−ＣｙｓもしくはｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓまたは、３．５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓと０．５μＭのｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓの組合せと同時インキュベートし、ＨｅＬａ細胞に対して１時間曝露した。細胞を、実施例３．３に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表６．１および図１９Ａに示されている。対応する細胞毒性データは、図１９Ｂに示されている。
【表３０】
2019531316.tif 000039
【０２５５】
表６．１および図１８と図１９における結果は、ＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓおよびＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓの両方が、ＦＩＴＣ標識抗チューブリン抗体の細胞内送達を促進することを示す。実施例３〜５におけるＧＦＰ、ＴＡＴ−ＧＦＰおよびＧＦＰ−ＮＬＳを用いた結果と対照的に、ＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓは、単独で使用された場合に（ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓなしで）抗体カーゴを細胞内送達できた。しかし、ＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓおよびｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓの組合せは、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ単独を用いる場合と比較して、より高い細胞内送達を可能にし、ＣＭ１８−ペネトラチン−ＣｙｓおよびｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓと比較してより少ない細胞毒性を有していた（図１９Ａおよび図１９Ｂを参照のこと）。
【０２５６】
実施例７：
ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓは、細胞内プラスミドＤＮＡ送達を可能にするが、プラスミド発現は不十分である
この実施例では、ＧＦＰをコードするプラスミドを使用するＨＥＫ２９３Ａ細胞における、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓシャトル剤の、プラスミドＤＮＡを細胞内送達する能力を試験した。
【０２５７】
７．１  ＨＥＫ２９３Ａ細胞における遺伝子導入アッセイ
遺伝子導入アッセイが実施される１日前に、対数増殖期にある哺乳動物細胞（ＨＥＫ２９３Ａ）を回収し、２４ウェルプレート中に播種した（ウェルあたり５０，０００個細胞）。細胞を、ＦＢＳを含有する適切な成長培地で一晩インキュベートした。翌日、別個の滅菌１．５ｍＬチューブで、Ｃｙ５（商標）蛍光で標識したｐＥＧＦＰを、３７℃で１０分間、１００μＬの最終容量で、新鮮ＰＢＳ中、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（０．０５、０．５または５μＭ）と混合した。ウェル中の培地を除去し、細胞を、ＰＢＳを用いて３回迅速に洗浄し、５００μＬの、ＦＢＳを含まない加温培地を添加した。細胞にｐＥＧＦＰおよびＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ溶液を添加し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳを用いて洗浄し、ＦＢＳを含有する新鮮培地を添加した。細胞を３７℃でインキュベートし、その後、実施例３に記載されるようなフローサイトメトリー解析に供した。
【０２５８】
７．２  ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓを用いるプラスミドＤＮＡ送達
プラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ）を、Ｃｙ５（商標）色素を用い、製造業者の使用説明書（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  ＬＬＣ）に従って標識した。Ｃｙ５（商標）部分は、標準遺伝子導入プロトコルを使用する非標識プラスミドと比較した場合に、遺伝子導入効率に影響を及ぼさなかった（データは示さず）。フローサイトメトリー解析は、ＤＮＡ細胞内送達に対応するＣｙ５（商標）発光、核送達の成功、ＤＮＡ転写およびタンパク質発現に対応するＧＦＰ発光の定量化を可能にした。結果は、表７．１、および図２０に示されている。
【表３１】
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【０２５９】
表７．１、および図２０に示される結果は、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓが、ＤＮＡ単独とともにインキュベートされた細胞（「ｐＥＧＦＰ−Ｃｙ５」）と比較して、０．０５、０．５および５μＭ濃度で使用された場合にプラスミドＤＮＡの細胞内送達を増大させることができたことを示す。しかし、ＧＦＰの発現は細胞中で検出されず、これは、極めてわずかなプラスミドＤＮＡしか、細胞質区画に到達して核局在化を可能にしなかったことを示唆する。理論に束縛されるものではないが、プラスミドＤＮＡが、エンドソーム中に大規模に隔離され、細胞質区画への脱出を妨げたことがあり得る。Ｓａｌｏｍｏｎｅら、２０１３は、プラスミドＤＮＡを細胞内送達するためのＣＭ１８−ＴＡＴ１１ハイブリッドペプチドの使用を報告した。彼らは、遺伝子導入効率を評価するためにルシフェラーゼ酵素リポーターアッセイを使用したが、これは、エンドソームからうまく放出され、核に送達されるプラスミドＤＮＡの割合が、ルシフェラーゼ酵素の強力な活性のために過大評価され得るので、細胞質／核送達の効率を定量化するのに理想的ではない場合がある。この関連で、Ｓａｌｏｍｏｎｅら、２０１３の著者は、さらに、ルシフェラーゼの発現は、（裸の）ＤＮＡ分子の小胞中への大規模な捕捉と一緒に起こることを記し、これは、表７．１、および図２０に示される結果と一致する。
【０２６０】
７．３  ＨｅＬａ細胞におけるペプチドによるプラスミドＤＮＡ送達
ＨＥＫ２９３Ａ細胞で観察されたペプチドＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（０．１％、表７．１を参照されたい）の不十分な遺伝子導入効率の後で、別の細胞株（ＨｅＬａ）中で、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓを用いて、表１．３、表Ｂ１、および表Ｃ１に記載のほかのペプチドと共に、実験を繰り返した。
【０２６１】
遺伝子導入アッセイが実施される１日前に、対数増殖期にあるＨｅＬａ細胞を採取し、９６ウェルプレート中に播種した（ウェルあたり１０，０００個細胞）。細胞を、ＦＢＳを含有する適切な成長培地で一晩インキュベートした。翌日、別の滅菌１．５ｍＬチューブで、試験するペプチドおよびポリヌクレオチドカーゴ（ｐＥＧＦＰ−Ｃ１）を無血清培地中、５０μＬの最終量で、３７℃で１０分間混合した。ウェル中の培地を除去し、細胞を３７℃下、ＰＢＳで素早く１回洗浄した。試験するペプチドおよびポリヌクレオチドカーゴを含む混合物を、細胞に加え、３７℃で示した時間（例えば、１分、１時間または４時間）にわたりインキュベートした。インキュベーション後、細胞を３７℃でＰＢＳを用いて１回洗浄し、ＦＢＳを含有する新鮮培地を添加した。細胞を３７℃でインキュベートし、その後、実施例３．２に記載されるようなフローサイトメトリー解析に供して、遺伝子導入効率（すなわち、細胞のＥＧＦＰ発現）および生存率を判定した。結果を表７．２に示す。
【表３２−１】
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【表３２−２】
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【０２６２】
表７．２の全ての試験したペプチドは、１％未満の遺伝子導入効率を示した。さらに、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓの低遺伝子導入効率が、ＨｅＬａ細胞中で確認された（０．０８％）。これらの結果は、ポリペプチドカーゴを送達するのに好適なペプチドが、プラスミドＤＮＡの送達に好適するとは限らないことがあることを示す。例えば、シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４−Ｈｉｓは、本明細書において、ポリペプチドカーゴを効果的に形質導入する（例えば、実施例１０を参照されたい）が、このペプチドは、０．３４％のみのＤＮＡプラスミド遺伝子導入効率を示した（表７．２）。
【０２６３】
実施例８：
シャトル剤へのヒスチジンリッチドメインの付加は、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率をさらに改善する
８．１  ＨｅＬａ細胞におけるＨｉｓ−ＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓによるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入：顕微鏡による可視化
ＧＦＰ−ＮＬＳ（５μＭ、実施例５を参照のこと）を、５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓまたはＨｉｓ−ＣＭ１８−ＴＡＴと同時インキュベートし、ＨｅＬａ細胞に対して１時間曝露した。細胞内送達されたＧＦＰ−ＮＬＳの核蛍光が、蛍光顕微鏡により確認され（データは示さず）、ＧＦＰ−ＮＬＳの核への送達の成功を示す。
【０２６４】
８．２  ＨｅＬａ細胞におけるＨｉｓ−ＣＭ１８−ＴＡＴによるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入：フローサイトメトリー
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例３．１に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。ＧＦＰ−ＮＬＳ（５μＭ）を、０、１、３または５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓまたはＨｉｓ−ＣＭ１８−ＴＡＴと同時インキュベートし、ＨｅＬａ細胞に対して１時間曝露した。細胞を、実施例３．３に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表８．１および図２１Ａに示されている。対応する細胞毒性データは、図２１Ｂに示されている。
【表３３】
2019531316.tif 000043
【０２６５】
際立ったているのは、表８．１、および図２１における結果が、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＴＡＴが、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓと比較して、３μＭおよび５μＭ濃度でＧＦＰ−ＮＬＳタンパク質形質導入効率を約２倍増大できたことを示すことである。これらの結果は、ＥＬＤおよびＣＰＤを含むシャトル剤に、ヒスチジンリッチドメインを添加することが、そのポリペプチドカーゴ形質導入効率を大幅に増大させ得ることを示唆する。あるいは、または同時に、シャトル剤を、ＣＰＤと融合された（ただし、ＥＬＤを欠く）ヒスチジンリッチドメインを含有するさらなる独立合成ペプチドと組み合わせることが、タンパク質形質導入について同様の利点を提供し得、ヒスチジンリッチドメインの濃度が、シャトル剤の濃度から独立して変えられるまたは制御されることを可能にするという付加された利点を有する。理論に束縛されるものではないが、ヒスチジンリッチドメインは、エンドソームにおいて、プロトンスポンジとして作用し得、エンドソーム膜不安定化の別の機序を提供する。
【０２６６】
実施例９：
Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４は、ＧＦＰ−ＮＬＳ、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）−ＮＬＳおよびＦＩＴＣ標識抗チューブリン抗体の形質導入効率および核送達を増大させる
９．１  タンパク質形質導入プロトコル
プロトコルＡ：細胞培地における送達のためのタンパク質形質導入アッセイ
形質導入アッセイが実施される１日前に、対数増殖期にある細胞を回収し、９６ウェルプレート（ウェルあたり２０，０００個細胞）中に播種した。細胞を、ＦＢＳを含有する適当な成長培地中で一晩インキュベートした（実施例１を参照のこと）。翌日、別個の滅菌１．５ｍＬチューブ中で、所望の濃度のカーゴタンパク質を、５０μＬの新鮮血清不含培地（特に断りのない限り）中で所望の濃度のシャトル剤とともに３７℃で１０分間予め混合した（プレインキュベートした）。ウェル中の培地を除去し、細胞を、３７℃に予め加温したＰＢＳを用いて１〜３回（使用した細胞の種類に応じて）洗浄した。細胞を、カーゴタンパク質／シャトル剤混合物とともに３７℃で所望時間にわたりインキュベートした。インキュベートした後、細胞を、３７℃に予め加温したＰＢＳおよび／またはヘパリン（０．５ｍｇ／ｍＬ）を用いて３回洗浄した。ヒトＴＨＰ−１血液細胞には、その後の解析（顕微鏡およびフローサイトメトリー）における望ましくない細胞膜結合タンパク質バックグラウンドを避けるためにヘパリンを用いる洗浄を使用した。細胞を、５０μＬの、血清を含む新鮮培地中、３７℃で最後にインキュベートし、その後解析した。
【０２６７】
プロトコルＢ：ＰＢＳ中の付着細胞のタンパク質形質導入アッセイ
形質導入アッセイが実施される１日前に、対数増殖期にある細胞を回収し、９６ウェルプレート（ウェルあたり２０，０００個細胞）中に播種した。細胞を、血清を含有する適切な成長培地中で一晩インキュベートした（実施例１を参照のこと）。翌日、別個の滅菌１．５ｍＬチューブ中で、シャトル剤を室温で滅菌蒸留水中で希釈した（カーゴが、核酸であるか、または核酸を含んでいる場合には、ヌクレアーゼ不含水を使用した）。シャトル剤にカーゴタンパク質を添加し、必要に応じて、滅菌ＰＢＳを添加して、細胞を覆うのに十分な最終容量（例えば、９６ウェルプレートのウェルあたり１０〜１００μＬ）で、所望の濃度のシャトル剤およびカーゴを得た。次いで、シャトル剤／カーゴ混合物を実験のために直ちに使用した。各実験に少なくとも３種：（１）シャトル剤単独（例えば、試験される最高濃度で）の対照、（２）カーゴ単独の対照および（３）カーゴまたはシャトル剤のいずれも含まない対照などを含めた。ウェル中の培地を除去し、細胞を、３７℃に予め加温したＰＢＳを用いて１回洗浄し、次いで、所望の時間にわたり、すべての細胞を覆うように、シャトル剤／カーゴ混合物を添加した。ウェル中のシャトル剤／カーゴ混合物を除去し、細胞をＰＢＳを用いて１回洗浄し、新鮮完全培地を添加した。解析の前に、細胞をＰＢＳを用いて１回洗浄し、新鮮完全培地を添加した。
【０２６８】
プロトコルＣ：ＰＢＳ中の懸濁細胞へのタンパク質形質導入アッセイ
形質導入アッセイが実施される１日前に、対数増殖期にある懸濁細胞を回収し、９６ウェルプレート（ウェルあたり２０，０００個細胞）中に播種した。細胞を、血清を含有する適切な成長培地中で一晩インキュベートした（実施例１を参照のこと）。翌日、別個の滅菌１．５ｍＬチューブ中で、シャトル剤を室温で滅菌蒸留水中で希釈した（カーゴが、核酸であるか、または核酸を含んでいる場合には、ヌクレアーゼ不含水を使用した）。シャトル剤にカーゴタンパク質を添加し、必要に応じて、滅菌ＰＢＳまたは細胞培養培地（無血清）を添加して、細胞を再懸濁するのに十分な最終容量（例えば、９６ウェルプレートのウェルあたり１０〜１００μＬ）で、所望の濃度のシャトル剤およびカーゴを得た。次いで、シャトル剤／カーゴ混合物を実験のために直ちに使用した。各実験に少なくとも３種：（１）シャトル剤単独（例えば、試験される最高濃度で）の対照、（２）カーゴ単独の対照および（３）カーゴまたはシャトル剤のいずれも含まない対照などを含めた。細胞を４００ｇで２分間遠心分離し、次いで、培地を除去し、細胞を、３７℃に予め加温したＰＢＳに再懸濁した。細胞を４００ｇで再度２分間遠心分離し、ＰＢＳを除去し、細胞をシャトル剤／カーゴ混合物中に再懸濁した。所望のインキュベーション時間後、１００μＬの完全培地を細胞に直接添加した。細胞を、４００ｇで２分間遠心分離し、培地を除去した。ペレットを３７℃に予め加温した２００μＬのＰＢＳ中に再懸濁し、洗浄した。別に遠心分離した後、ＰＢＳを除去し、細胞を１００μＬの完全培地に再懸濁した。解析の前に最後の２つのステップを１回反復した。
【０２６９】
９．２  プロトコルＡまたはＢを用いた、ＨｅＬａ細胞におけるＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４によるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入：フローサイトメトリー
シャトル剤形質導入効率に対する異なるプロトコルの効果を比較するために、ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例９．１に記載されるようなプロトコルＡまたはＢを使用するタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、プロトコルＡを使用し、ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ、実施例５．１を参照のこと）を、１０μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、ＨｅＬａ細胞に対して１時間曝露するか、またはプロトコルＢを使用し、３５μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、ＨｅＬａ細胞に対して１０秒間曝露した。細胞を、実施例３．３に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表９．１および図２２Ａに示されている。（「Ｐｏｓ細胞（％）」は、ＧＦＰシグナルを発する細胞のパーセンテージである）。
【表３４】
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【０２７０】
上記の結果は、プロトコルＡと比較して、プロトコルＢを使用して、シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用するカーゴＧＦＰ−ＮＬＳのより高いタンパク質形質導入効率が得られたことを示す。
【０２７１】
９．３  プロトコルＢを使用したＨｅＬａ細胞におけるＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４によるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入：フローサイトメトリー
用量反応実験を実施して、タンパク質形質導入効率に対するＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４濃度の効果を評価した。ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例９．１のプロトコルＢに記載されるタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ、実施例５．１を参照のこと）を、０、５０、３５、２５または１０μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、次いで、ＨｅＬａ細胞に対して１０秒間曝露した。細胞を、実施例３．３に記載のフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表９．２および図２２Ｂに示されている。
【表３５】
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【０２７２】
上記の結果は、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４が、ＨｅＬａ細胞において、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率を用量依存的に増大させ得ることを示す。
【０２７３】
９．４  プロトコルＢを使用すたＨｅＬａ細胞におけるＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４によるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入：顕微鏡による可視化
ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ、実施例５．１を参照のこと）を、実施例９．１に記載されるようにプロトコルＢを使用して、３５μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、次いで、ＨｅＬａ細胞に対して１０秒間曝露した。次いで、細胞を、実施例３．２および３．２ａに記載されるように蛍光顕微鏡解析に供した。
【０２７４】
図２３および図２４に示される結果例の場合、最終洗浄ステップ後に４ｘ、２０ｘおよび４０ｘの倍率で明視野および蛍光顕微鏡によって、ＨｅＬａ細胞のＧＦＰ蛍光を直ちに可視化した。
【０２７５】
図２３では、図２３Ａ、２３Ｂおよび２３Ｃの上段のパネルは、それぞれ、４ｘ、２０ｘおよび４０ｘの倍率の核標識（ＤＡＰＩ）を示し、下段のパネルは、対応するＧＦＰ−ＮＬＳ蛍光を示す。図２３Ｃでは、白色三角窓は、核（ＤＡＰＩ）とＧＦＰ−ＮＬＳシグナルとの間の同時標識領域の例を示す。図２３Ｄでは、上段および下段のパネルは、ＨｅＬａ細胞の明視野像例を示し、中段のパネルは、対応するＦＡＣＳ解析の結果を示し（実施例３．３に記載されるように実施した）、これは、９６プレート中のＧＦＰシグナルを有する細胞のパーセンテージを示す。陰性対照試料（すなわち、いずれのシャトル剤も含まないＧＦＰ−ＮＬＳに対して曝露された細胞；データは示さず）では有意なＧＦＰ蛍光は観察されなかった。
【０２７６】
図２４は、明視野（図２４Ａ）および蛍光像（図２４Ｂ）を示す。図２４Ｂ中の挿入図は、対応するＦＡＣＳ解析の結果を示し（実施例３．３に記載されるように実施した）、これは、９６プレートウェル中のＧＦＰシグナルを有する細胞のパーセンテージを示す。陰性対照試料（すなわち、いずれのシャトル剤も含まないＧＦＰ−ＮＬＳに対して曝露された細胞；データは示さず）では有意なＧＦＰ蛍光は観察されなかった。
【０２７７】
図２５に示される結果例については、実施例３．２ａに記載されるようにＨｅＬａ細胞を固定し、透過処理し、免疫標識に供し、その後、実施例３．２に記載されるように蛍光顕微鏡によって、可視化した。ＧＦＰ−ＮＬＳを、一次マウスモノクローナル抗ＧＦＰ抗体（Ｆｅｌｄａｎ、＃Ａ０１７）および二次ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ（商標）−５９４抗体（Ａｂｃａｍ  ＃１５０１１６）を使用して標識した。図２５Ａおよび２５Ｂの上段パネルは、核標識（ＤＡＰＩ）を示し、下段パネルは、ＧＦＰ−ＮＬＳの対応する標識を示す。図２５Ａおよび２５Ｂは、それぞれ、２０ｘおよび４０ｘの倍率の画像例を示す。白色三角窓は、核とＧＦＰ−ＮＬＳとの間の同時標識の領域の例を示す。陰性対照試料（すなわち、いずれのシャトル剤も含まずにＧＦＰ−ＮＬＳに対して曝露された細胞；データは示さず）では有意なＧＦＰ−ＮＬＳ標識は観察されなかった。
【０２７８】
図２６は、生存細胞の６３ｘの倍率で共焦点顕微鏡を用いて取得した画像例を示す。図２６Ａは、明視野像を示し、図２６Ｂは、対応する蛍光ＧＦＰ−ＮＬＳを示す。図２６Ｃは、図２６Ａの画像と、図２６Ｂの画像間のオーバーレイである。陰性対照試料（すなわち、いずれのシャトル剤も含まずにＧＦＰ−ＮＬＳに対して曝露された細胞、データは示さず）では有意なＧＦＰ−ＮＬＳ蛍光は観察されなかった。
【０２７９】
９．４ａ  プロトコルＢを用いたＨｅＬａ細胞におけるＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４によるＦＴＩＣ標識抗チューブリン抗体形質導入：顕微鏡による可視化
ＦＩＴＣ標識抗チューブリン抗体（０．５μＭ、Ａｂｃａｍ、ａｂ６４５０３）を、実施例９．１に記載されるようにプロトコルＢを使用して、５０μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、次いで、ＨｅＬａ細胞に対して１０秒間曝露した。次いで、細胞を、実施例３．２および３．２ａに記載されるように蛍光顕微鏡解析に供し、ＨｅＬａ細胞における抗チューブリン抗体のＦＩＴＣ蛍光を、最終洗浄ステップ後に２０ｘの倍率で明視野および蛍光顕微鏡によって、直ちに可視化した。結果例は、図２４Ｃおよび図２４Ｄに示されている。陰性対照試料（すなわち、いずれのシャトル剤も含まずにＦＩＴＣ標識抗チューブリン抗体に対して曝露された細胞；データは示さず）では有意なＦＩＴＣ蛍光は観察されなかった。
【０２８０】
全体的に、実施例９．４および９．４ａにおける結果は、ＧＦＰ−ＮＬＳおよびＦＩＴＣ標識抗チューブリン抗体カーゴが、シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４の存在下で、成功裏に形質導入され、ＨｅＬａ細胞の核および／またはサイトゾルに送達されることを示す。
【０２８１】
９．５  ＨｅＬａ細胞におけるＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４によるＧＦＰ−ＮＬＳ動力学的形質導入：顕微鏡による可視化
ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ、実施例５．１を参照のこと）を、実施例９．１に記載されるようにプロトコルＢを使用して、５０μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、次いで、ＨｅＬａ細胞に対して１０秒間曝露した。洗浄ステップ後、ＨｅＬａ細胞のＧＦＰ蛍光を、種々の時間間隔後に２０ｘの倍率で蛍光顕微鏡（実施例３．２）によって、直ちに可視化した。図２７に典型的な結果が示されており、これでは、４５、７５、１００および１２０秒後に蛍光顕微鏡像が取得された（それぞれ、図２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃおよび２７Ｄを参照のこと）。
【０２８２】
図２７Ａに示されるように、拡散細胞性ＧＦＰ蛍光は通常、４５秒後に観察され、多くの細胞では、核中のより低いＧＦＰ蛍光の領域を有する。これらの結果は、４５秒後にシャトル剤を介して、細胞内に送達されたＧＰＦ−ＮＬＳの主に細胞質の分布、および低い核の分布を示唆する。図２７Ｂ〜２７Ｄは、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４シャトル剤およびＧＦＰ−ＮＬＳカーゴに対する曝露の７５秒後（図２７Ｂ）、１００秒後（図２７Ｃ）および１２０秒後（図２７Ｄ）の、ＧＦＰ蛍光の、細胞核への段階的な再分布を示す。陰性対照試料（すなわち、いずれのシャトル剤も含まずにＧＦＰ−ＮＬＳに対して曝露された細胞；データは示さず）では有意なＧＦＰ蛍光は観察されなかった。
【０２８３】
実施例９．５における結果は、ＧＦＰ−ＮＬＳが、シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４の存在下で２分までにＨｅＬａ細胞の核に成功裏に送達されるということを示す。
【０２８４】
９．６  ＨｅＬａ細胞におけるＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４によるＧＦＰ−ＮＬＳおよびｍＣｈｅｒｒｙ（商標）−ＮＬＳ同時形質導入：顕微鏡による可視化
ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）−ＮＬＳ組換えタンパク質を、実施例１．４に記載されるように構築し、細菌発現系から発現、精製した。ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）−ＮＬＳ組換えタンパク質の配列は、以下であった：
【化４】
2019531316.tif 000046
（ＭＷ＝３４．７１ｋＤａ；ｐＩ＝６．６８）
ＮＬＳ配列には下線を付与した。
セリン／グリシンリッチリンカーは太字である。
【０２８５】
ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ、実施例５．１を参照のこと）およびｍＣｈｅｒｒｙ（商標）−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ）を、実施例９．１に記載されるようにプロトコルＢを使用して、３５μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、次いで、ＨｅＬａ細胞に対して１０秒間曝露した。洗浄ステップ後、細胞を、実施例３．２に記載されるように２０ｘの倍率で明視野および蛍光顕微鏡によって、直ちに可視化した。図２８に結果例が示されており、これでは、明視野（図２８Ａ）、ＤＡＰＩ蛍光（図２８Ｂ）、ＧＦＰ−ＮＬＳ蛍光（図２８Ｃ）およびｍＣｈｅｒｒｙ（商標）−ＮＬＳ蛍光（図２８Ｄ）を示す対応する画像が示されている。白色三角窓は、細胞核におけるＧＦＰ−ＮＬＳと、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）蛍光シグナルとの間の同時標識の領域の例を示す。陰性対照試料（すなわち、いずれのシャトル剤も含まずにＧＦＰ−ＮＬＳまたはｍＣｈｅｒｒｙ（商標）に対して曝露された細胞；データは示さず）では有意なＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙ（商標）蛍光は観察されなかった。
【０２８６】
これらの結果は、ＧＦＰ−ＮＬＳおよびｍＣｈｅｒｒｙ（商標）−ＮＬＳが、シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４の存在下でＨｅＬａ細胞中の核に成功裏に一緒に送達されることを示す。
【０２８７】
９．７  ＴＨＰ−１懸濁細胞におけるＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４によるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入：フローサイトメトリー
Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４の、ＧＦＰ−ＮＬＳを懸濁細胞の核に送達する能力を、ＴＨＰ−１細胞を使用して試験した。ＴＨＰ−１細胞を培養し、実施例９．１に記載されるようなプロトコルＡおよびＣを使用してタンパク質形質導入アッセイで試験した。ＧＦＰ−ＮＬＳ（５μＭ、実施例５．１を参照のこと）を、１μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、ＴＨＰ−１細胞に対して１時間曝露するか（プロトコルＡ）、または５μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、ＴＨＰ−１細胞に対して１５秒間曝露した（プロトコルＣ）。細胞を、実施例３．３に記載のフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表９．３、および図３１に示されている。
【表３６】
2019531316.tif 000047
【０２８８】
９．８  ＴＨＰ−１細胞におけるＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４によるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入：顕微鏡による可視化
ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ、実施例５．１を参照のこと）を、実施例９．１に記載されるようなプロトコルＣを使用して、５μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、次いで、ＴＨＰ−１細胞に対して１５秒間曝露した。細胞を、実施例３．２に記載されるような顕微鏡可視化に供した。
【０２８９】
図３２に示される結果例の場合、ＨｅＬａ細胞のＧＦＰ蛍光を、最終洗浄ステップ後、４ｘ、１０ｘおよび４０ｘの倍率で（それぞれ、図３２Ａ〜３２Ｃ）、明視野（上段パネル）および蛍光（下段パネル）顕微鏡によって、直ちに可視化した。図３２Ｃの白色三角窓は、明視野および蛍光像間の同時標識の領域の例を示す。図３２Ｄは、対応するＦＡＣＳ解析の典型的な結果を示し（実施例３．３に記載されるように実施された）、これは、ＧＦＰシグナルを有する９６プレートウェル中の細胞のパーセンテージを示す。さらなる結果は、図３３に示されており、これでは、図３３Ａおよび３３Ｂは、明視野像を示し、図３３Ｃおよび３３Ｄは、対応する蛍光像を示す。白色三角窓は、図３３Ａと３３Ｃとの間、および図３３Ｂと３３Ｄとの間の同時標識の領域の例を示す。最も右側のパネルは、対応するＦＡＣＳ解析（実施例３．３に記載されるように実施された）の典型的な結果を示し、これは、９６プレートウェル中のＧＦＰシグナルを有する細胞のパーセンテージを示す。
【０２９０】
陰性対照試料（すなわち、いずれのシャトル剤も含まずにＧＦＰ−ＮＬＳに対して曝露された細胞；データは示さず）では有意なＧＦＰ蛍光は観察されなかった。
【０２９１】
この実施例における結果は、シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４の存在下でＴＨＰ−１細胞において、ＧＦＰ−ＮＬＳが成功裏に細胞内に送達されることを示す。
【０２９２】
実施例１０：種々の複数ドメインシャトル剤は、単一ドメインペプチドとは異なり、ＨｅＬａ細胞およびＴＨＰ−１細胞において、ＧＦＰ−ＮＬＳをうまく形質導入する。
１０．１  ＨｅＬａ細胞における種々のシャトル剤によるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入：フローサイトメトリー
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例９．１に記載されるようなプロトコルＢを使用してタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ、実施例５．１を参照のこと）を、５０μＭの種々のシャトル剤と同時インキュベートし、ＨｅＬａ細胞に対して１０秒間曝露した。細胞を、実施例３．３に記載のフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表１０．１および図２９Ａに示されている。「Ｐｏｓ細胞（％）」は、ＧＦＰシグナルを発するすべての細胞の平均パーセンテージである。陰性対照（「Ｃｔｒｌ」）は、いずれのシャトル剤も含まずにＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ）とともにインキュベートされた細胞に該当する。
【表３７】
2019531316.tif 000048
【０２９３】
１０．２  ＨｅＬａ細胞における種々のインキュベーション時間と種々のシャトル剤によるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入：フローサイトメトリー
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例９．１に記載されるようなプロトコルＢを使用してタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ、実施例５．１を参照のこと）を、１０μＭのＴＡＴ−ＫＡＬＡ、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４またはＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４と１、２または５分間同時インキュベートした。最終洗浄ステップ後、細胞を、実施例３．３に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表１０．２および図２９Ｂに示されている。「Ｐｏｓ細胞（％）」は、ＧＦＰシグナルを発するすべての細胞の平均パーセンテージである。陰性対照（「Ｃｔｒｌ」）は、いずれのシャトル剤も含まずにＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ）とともにインキュベートされた細胞に該当する。
【表３８】
2019531316.tif 000049
【０２９４】
１０．３  ＨｅＬａ細胞における種々インキュベーション時間およびＴＡＴ−ＫＡＬＡ、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４およびＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４によるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入：フローサイトメトリー
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例９．１に記載されるようなプロトコルＣを使用してタンパク質形質導入アッセイにおいて、試験した。手短に説明すると、ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ、実施例５．１を参照のこと）を、５μＭのＴＡＴ−ＫＡＬＡ、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４またはＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４と１、２または５分間同時インキュベートした。最終洗浄ステップ後、細胞を、実施例３．３に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表１０．３および図２９Ｃに示されている。陰性対照（「Ｃｔｒｌ」）は、いずれのシャトル剤も含まずにＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ）とともにインキュベートされた細胞に該当する。
【表３９】
2019531316.tif 000050
【０２９５】
１０．４  ＨｅＬａ細胞における種々のシャトル剤によるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入：フローサイトメトリー
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例９．１に記載されるようなプロトコルＢを使用してタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ、実施例５．１を参照のこと）を、５０μＭの種々のシャトル剤と同時インキュベートし（アミノ酸配列および特性については表１．３を参照のこと）、ＨｅＬａ細胞に対して１０秒間曝露した。細胞を、実施例３．３に記載のフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表１０．３ａおよび表１０．３ｂならびに図２９Ｅおよび図２９Ｆに示されている。「Ｐｏｓ細胞（％）」は、ＧＦＰシグナルを発するすべての細胞の平均パーセンテージである。陰性対照（「Ｃｔｒｌ」）は、いずれのシャトル剤も含まずにＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ）とともにインキュベートされた細胞に該当する。
【表４０】
2019531316.tif 000051
【表４１】
2019531316.tif 000052
【０２９６】
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例９．１に記載されるようなプロトコルＢを使用してタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ、実施例５．１を参照のこと）を、１０μＭのＴＡＴ−ＫＡＬＡ、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４またはＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４と１、２または５分間同時インキュベートした。最終洗浄ステップ後、細胞を、実施例３．３に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表１０．３ｃおよび表１０．３ｂならびに図２９Ｇおよび図２９Ｈに示されている。「Ｐｏｓ細胞（％）」は、ＧＦＰシグナルを発するすべての細胞の平均パーセンテージである。陰性対照（「Ｃｔｒｌ」）は、いずれのシャトル剤も含まずにＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ）とともにインキュベートされた細胞に該当する。
【表４２】
2019531316.tif 000053
【表４３】
2019531316.tif 000054
【０２９７】
シャトル剤ＣＭ１８−ＰＴＤ４を、モデルとして使用して、個々のタンパク質ドメインのモジュール性ならびに修飾されるその能力を実証した。より詳しくは、Ｎ末端システイン残基（「Ｃｙｓ」）、ＥＬＤおよびＣＰＤドメイン間の種々のフレキシブルリンカー（「Ｌ１」：ＧＧＳ、「Ｌ２」：ＧＧＳＧＧＧＳ、および「Ｌ３」：ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ）の有無並びにヒスチジンリッチドメインの種々の長さ、位置およびバリアントを調査した。
【０２９８】
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例９．１に記載されるようなプロトコルＢを使用してタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ、実施例５．１を参照のこと）を、２０μＭの、シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４の種々のシャトルペプチドバリアント（アミノ酸配列および特性については表１．３を参照のこと）と１分間同時インキュベートした。最終洗浄ステップ後、細胞を、実施例３．３に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表１０．３ｅおよび図２９Ｉに示されている。「Ｐｏｓ細胞（％）」は、ＧＦＰシグナルを発するすべての細胞の平均パーセンテージである。陰性対照（「Ｃｔｒｌ」）は、いずれのシャトル剤も含まずにＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ）とともにインキュベートされた細胞に該当する。
【表４４】
2019531316.tif 000055
【０２９９】
これらの結果は、所与のシャトルの形質導入効率および細胞生存率の程度を調節するために所与のシャトル（例えば、ＣＭ１８−ＰＴＤ４）における変動を使用し得ることを示す。より詳しくは、ＣＭ１８−ＰＴＤ４へのＮ末端システイン残基の付加（Ｃｙｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を参照のこと）は、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率を１１％低下させたが（４７．６％から３６．６％に）、細胞生存率を３３．９％から７８．７％に増大させた。ＣＭ１８およびＰＴＤ４ドメイン間への種々の長さのフレキシブルリンカードメイン（Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）の導入は、形質導入効率の著しい喪失をもたらさなかったが、細胞生存率を増大させた（ＣＭ１８−Ｌ１−ＰＴＤ４、ＣＭ１８−Ｌ２−ＰＴＤ４およびＣＭ１８−Ｌ３−ＰＴＤ４を参照のこと）。最後に、ヒスチジンリッチドメインのアミノ酸配列および／または位置の変動は、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４の形質導入効率および細胞生存率の完全な喪失をもたらさなかった（３Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４、１２Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４、ＨＡ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４、３ＨＡ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４、ＣＭ１８−Ｈｉｓ−ＰＴＤ４およびＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４−Ｈｉｓを参照のこと）。注目すべきは、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４のＣ末端に第２のヒスチジンリッチドメインを付加すること（すなわち、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４−Ｈｉｓ）は、６０％から６８％への形質導入効率を増大させ、細胞生存率は同様であったことである。
【０３００】
１０．５  ＨｅＬａ細胞における単一ドメインペプチドまたはＨｉｓ−ＣＰＤペプチドによるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入の欠如：フローサイトメトリー
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例９．１に記載されるようなプロトコルＢを使用してタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ、実施例５．１を参照のこと）を、５０μＭの種々の単一ドメインペプチド（ＴＡＴ、ＰＴＤ４、ペネトラチン、ＣＭ１８、Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ、ＫＡＬＡ）または２ドメインペプチドＨｉｓ−ＰＴＤ４（ＥＬＤを欠く）と同時インキュベートし、ＨｅＬａ細胞に対して１０秒間曝露した。最終洗浄ステップ後、細胞を、実施例３．３に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表１０．４および図２９Ｄに示されている。「Ｐｏｓ細胞（％）」は、ＧＦＰシグナルを発するすべての細胞の平均パーセンテージである。陰性対照（「Ｃｔｒｌ」）は、いずれの単一ドメインペプチドまたはシャトル剤も伴わずにＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ）とともにインキュベートされた細胞に該当する。
【表４５】
2019531316.tif 000056
【０３０１】
これらの結果は、単一ドメインペプチドＴＡＴ、ＰＴＤ４、ペネトラチン、ＣＭ１８、Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ、ＫＡＬＡまたは２ドメインペプチドＨｉｓ−ＰＴＤ４（ＥＬＤを欠く）が、ＨｅＬａ細胞において、ＧＦＰ−ＮＬＳをうまく形質導入できないことを示す。
【０３０２】
１０．６  ＨｅＬａ細胞におけるＴＡＴ−ＫＡＬＡ、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４、Ｈｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４、ＰＴＤ４−ＫＡＬＡ、ＥＢ１−ＰＴＤ４およびＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４−ＨｉｓによるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入：顕微鏡による可視化
ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ、実施例５．１を参照のこと）を、実施例９．１に記載されるようにプロトコルＢを使用して、５０μＭのシャトル剤と同時インキュベートし、次いで、ＨｅＬａ細胞に対して１０秒間曝露した。２分のインキュベーション後、細胞を、実施例３．２に記載されるように顕微鏡によって、可視化した。
【０３０３】
図３０における結果例については、最終洗浄ステップ後に２０ｘまたは４０ｘの倍率で明視野（下段パネル）および蛍光（上段および中段パネル）顕微鏡によって、ＨｅＬａ細胞のＧＦＰ蛍光を直ちに可視化した。シャトル剤ＴＡＴ−ＫＡＬＡ、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４およびＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４を用いた結果が、それぞれ、図３０Ａ、３０Ｂおよび３０Ｃに示されている。シャトル剤ＰＴＤ４−ＫＡＬＡ、ＥＢ１−ＰＴＤ４およびＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４−Ｈｉｓを用いた結果が、それぞれ、図３０Ｄ、３０Ｅおよび３０Ｆに示されている。最下行パネル中の挿入図は、対応するＦＡＣＳ解析（実施例３．３に記載されるように実施された）の結果を示し、これは、ＧＦＰシグナルを有する９６プレートウェル中の細胞のパーセンテージを示す。陰性対照試料（すなわち、いずれのシャトル剤も含まずにＧＦＰ−ＮＬＳに対して曝露された細胞；データは示さず）では有意なＧＦＰ蛍光は観察されなかった。
【０３０４】
１０．７  ＴＨＰ−１細胞における種々のインキュベーション時間およびＴＡＴ−ＫＡＬＡ、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４およびＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４によるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入：フローサイトメトリー
ＴＨＰ−１細胞を培養し、実施例９．１に記載されるようなプロトコルＣを使用してタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ、実施例５．１を参照のこと）を、１μＭのＴＡＴ−ＫＡＬＡ、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４またはＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４と１５、３０、６０、または１２０秒間同時インキュベートした。最終洗浄ステップ後、細胞を、実施例３．３に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。ＧＦＰシグナルを発するすべての細胞の平均パーセンテージ（「Ｐｏｓ細胞（％）」）が、表１０．４ａに、および図３４Ａに示されている。平均蛍光強度は、表１０．５および図３４Ｂに示されている。陰性対照（「Ｃｔｒｌ」）は、いずれのシャトル剤も含まずにＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ）とともにインキュベートされた細胞に該当する。
【表４６】
2019531316.tif 000057
【表４７】
2019531316.tif 000058
【０３０５】
実施例１１：
血清の存在下で低濃度のシャトル剤を用いる反復毎日処理は、ＴＨＰ−１細胞において、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入をもたらす
１１．１  ＴＨＰ−１細胞におけるＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４またはＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４を用いるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入：フローサイトメトリー
ＴＨＰ−１細胞を培養し、実施例９．１に記載のプロトコルＡに対し、以下の修正を行って、タンパク質形質導入アッセイにより試験した。ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５、２．５または１μＭ、実施例５．１を参照のこと）を、０．５もしくは０．８μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４と、または０．８μＭのＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、次いで、ＴＨＰ−１細胞に対して、血清を含有する細胞培養培地の存在下で各日１５０分間曝露した。１日または３日間のシャトル剤／カーゴに対する反復曝露後に、細胞を洗浄し、実施例３．３に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表１１．１、および図３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃおよび３５Ｆに示されている。陰性対照（「Ｃｔｒｌ」）は、いずれのシャトル剤も含まずにＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ）とともにインキュベートされた細胞に該当する。
【表４８】
2019531316.tif 000059
【０３０６】
Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４およびＧＦＰ−ＮＬＳに対して反復して曝露されたＴＨＰ−１細胞の生存率を、実施例３．３ａに記載されるように調べた。結果は、表１１．２および表１１．３に、ならびに図３５Ｄおよび図３５Ｅに示されている。表１１．２および図３５Ｄにおける結果は、１、２、４および２４時間後のＴＨＰ−１細胞の代謝活性指数を示し、表１１．３および図３５Ｅにおける結果は、１〜４日後のＴＨＰ−１細胞の代謝活性指数を示す。
【表４９】
2019531316.tif 000060
【表５０】
2019531316.tif 000061
【０３０７】
実施例１１における結果は、血清の存在下での、比較的低濃度のＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４またはＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４を用いる反復毎日（または長期）処理が、ＴＨＰ−１細胞において、ＧＦＰ−ＮＬＳの細胞内送達をもたらすことを示す。結果はまた、カーゴ形質導入効率および／または細胞生存率を改善するために、シャトル剤およびカーゴの投与量を独立に調整できることを示唆する。
【０３０８】
実施例１２：Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４は、複数の細胞株において、ＧＦＰ−ＮＬＳの形質導入効率および核送達を増大させる
１２．１  種々の付着細胞および懸濁細胞における、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４によるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入：フローサイトメトリー
実施例９．１に記載されるようなプロトコルＢ（付着細胞）またはＣ（懸濁細胞）を使用して、シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４の、ＧＦＰ−ＮＬＳを種々の接着および懸濁細胞の核に送達する能力を調べた。試験した細胞株には、ＨｅＬａ、Ｂａｌｂ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３、筋芽細胞、ジャーカット、ＴＨＰ−１、ＣＡ４６およびＨＴ２細胞を含め、これらを実施例１に記載されるように培養した。ＧＦＰ−ＮＬＳ（５μＭ、実施例５．１を参照のこと）を、３５μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、付着細胞に対して１０秒間曝露するか（プロトコルＢ）、または５μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、懸濁細胞に対して１５秒間曝露した（プロトコルＣ）。細胞を洗浄し、実施例３．３に記載されるようにフローサイトメトリー解析に供した。結果は、表１２．１および図３６に示されている。「Ｐｏｓ細胞（％）」は、ＧＦＰシグナルを発するすべての細胞の平均パーセンテージである。
【表５１】
2019531316.tif 000062
【０３０９】
１２．２  いくつかの接着および懸濁細胞におけるＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を用いるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入：顕微鏡による可視化
実施例９．１に記載されるように、ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（５μＭ、実施例５．１を参照のこと）を、プロトコルＡを使用して、３５μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、付着細胞に対して１０秒間曝露するか、またはプロトコルＢを使用して、５μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、懸濁細胞に対して１５秒間曝露した。細胞を洗浄した後、ＧＦＰ蛍光を、明視野および蛍光顕微鏡によって、可視化した。２９３Ｔ（図３７Ａ）、Ｂａｌｂ３Ｔ３（図３７Ｂ）、ＣＨＯ（図３７Ｃ）、筋芽細胞（図３７Ｄ）、ジャーカット（図３７Ｅ）、ＣＡ４６（図３７Ｆ）、ＨＴ２（図３７Ｇ）、およびＮＩＨ３Ｔ３（図３７Ｈ）細胞の、１０ｘ倍率で取得したＧＦＰ蛍光の画像例を示す。挿入図は、実施例３．３に記載されるように実施された対応するフローサイトメトリー結果で、ＧＦＰ−ＮＬＳ−陽性細胞のパーセンテージを示す。陰性対照試料（すなわち、いずれのシャトル剤も含まずにＧＦＰ−ＮＬＳに対して曝露された細胞；データは示さず）では有意なＧＦＰ蛍光は観察されなかった。
【０３１０】
実施例３．２ａに記載されるように細胞免疫標識を使用して、固定化し、透過処理した筋芽細胞の、ＧＦＰ−ＮＬＳの核局在性をさらに確認した。ＧＦＰ−ＮＬＳを、一次マウスモノクローナル抗ＧＦＰ抗体（Ｆｅｌｄａｎ、＃Ａ０１７）および二次ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ（商標）  −５９４抗体（Ａｂｃａｍ  ＃１５０１１６）を使用して標識した。核をＤＡＰＩを用いて標識した。初代ヒト筋芽細胞の結果例が、図３８に示されており、これでは、ＧＦＰ免疫標識が図３８Ａに示されており、ＧＦＰ免疫標識およびＤＡＰＩ標識のオーバーレイが、図３８Ｂに示されている。陰性対照試料（すなわち、いずれのシャトル剤も含まずにＧＦＰ−ＮＬＳに対して曝露された細胞；データは示さず）では有意なＧＦＰ標識は観察されなかった。
【０３１１】
顕微鏡結果は、ＧＦＰ−ＮＬＳが、シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用してすべての試験された細胞の核に成功裏に送達されることを示した。
【０３１２】
実施例１３：Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ系の形質導入およびＨｅＬａ細胞におけるゲノム編集を可能にする
１３．１  Ｃａｓ９−ＮＬＳ組換えタンパク質
実施例１．４に記載されるように、Ｃａｓ９−ＮＬＳ組換えタンパク質を構築し、細菌発現系から発現させ、精製した。製造されたＣａｓ９−ＮＬＳ組換えタンパク質の配列は、以下であった：
【化５】
2019531316.tif 000063
（ＭＷ＝１６２．９ｋＤａ；ｐＩ＝９．０５）
ＮＬＳ配列には下線を付与した。
セリン／グリシンリッチリンカーは太字である。
【０３１３】
１３．２  遺伝子導入プラスミド代替アッセイ
このアッセイによって、うまく送達された活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を視覚的に特定することが可能になる。図３９Ａに示されるように、アッセイは、蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）およびＧＦＰを、その２つのオープンリーディングフレームを隔てた停止コドンとともにコードする発現プラスミドＤＮＡを細胞に遺伝子導入することを含む。発現プラスミドを用いる細胞の遺伝子導入は、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）発現をもたらすが、ＧＦＰ発現をもたらさない（図３９Ｂ）。次いで、プラスミドＤＮＡを停止コドンで切断するように設計／プログラムされているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）を発現する遺伝子導入された細胞に、細胞内送達される（図３９Ｄ）。活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体の形質導入の成功は、プラスミドＤＮＡを停止コドンで切断するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体をもたらす（図３９Ｃ）。一部の細胞では、切断されたプラスミドのランダムな非相同ＤＮＡ修復が生じ、停止コドンの除去、したがって、ＧＦＰ発現および蛍光をもたらす（図３９Ｅ）。
【０３１４】
遺伝子導入プラスミド代替アッセイの１日目に、種々の実験条件用のＤＮＡプラスミド（２５０ｎｇ）を、別の滅菌１．５ｍＬチューブ中でＤＭＥＭ（５０μＬ）に希釈し、ボルテックス処理し、短時間遠心分離した。別の滅菌１．５ｍＬチューブ中で、Ｆａｓｔｆｅｃｔ（商標）遺伝子導入試薬を、３：１の割合（３μＬのＦａｓｔｆｅｃｔ（商標）遺伝子導入試薬に対して１μｇのＤＮＡ）で、無血清の抗生物質不含ＤＭＥＭ（５０μＬ）に希釈し、素早くボルテックス処理し、短時間遠心分離した。次いで、Ｆａｓｔｆｅｃｔ（商標）／ＤＭＥＭ混合物をＤＮＡ混合物に添加し、素早くボルテックス処理し、短時間遠心分離した。次いで、Ｆａｓｔｆｅｃｔ（商標）／ＤＭＥＭ／ＤＮＡ混合物を室温で１５〜２０分間インキュベートし、その後、細胞に添加した（ウェルあたり１００μＬ）。次いで、細胞を３７℃および５％ＣＯ２で５時間インキュベートした。その後、培地を完全培地（血清を含む）と交換し、３７℃および５％ＣＯ２で２４〜４８時間さらにインキュベートした。次いで、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）シグナルを見るために細胞を蛍光顕微鏡下で可視化した。
【０３１５】
１３．３  Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４媒介ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ系送達およびプラスミドＤＮＡの切断
ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）を、実施例１３．２のプラスミド中のｍＣｈｅｒｒｙ（商標）およびＧＦＰコード配列の間に停止コドンを含有するＥＭＸ１遺伝子のヌクレオチド配列をターゲッティングするように設計した。使用したｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの配列は以下であった：
【化６】
2019531316.tif 000064
【０３１６】
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例１３．２に記載されるような遺伝子導入プラスミド代替アッセイに供した。１日目に、ＨｅＬａ細胞に、図３９Ａに示されるようにｍＣｈｅｒｒｙ（商標）タンパク質をコードするプラスミド代替を遺伝子導入した。２日目に、実施例９．１に記載されるようなプロトコルＢを使用して、Ｃａｓ９−ＮＬＳ組換えタンパク質（２μＭ、実施例１３．１を参照のこと）およびＲＮＡ（ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ；２μＭ、上記を参照のこと）の混合物を５０μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、混合物（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体）をＨｅＬａ細胞に対して１０秒間曝露した。ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）およびＧＦＰコード配列の間の停止コドンでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による二本鎖プラスミドＤＮＡ切断（図３９Ｂ）並びにいくつかの場合には細胞によるその後の非相同修復は、停止コドン除去をもたらし（図３９Ｃ）、それによって、３日目に同一細胞におけるｍＣｈｅｒｒｙ（商標）およびＧＦＰ蛍光タンパク質の両方の発現を可能にする（図３９Ｄ〜図３９Ｅ）。図３９Ｄおよび３９Ｅの白色三角窓は、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）およびＧＦＰ間の同時標識の領域の例を示す。
【０３１７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ系の陽性対照として、ＨｅＬａ細胞を培養し、３種のプラスミド：プラスミド代替（実施例１３．２に記載されるような）およびＣａｓ９−ＮＬＳタンパク質をコードするその他の発現プラスミド（実施例１３．１）およびｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（実施例１３．３）、を同時遺伝子導入した。典型的な蛍光顕微鏡結果が、図４０Ａ〜Ｄに示されている。パネルＡおよびＢは、遺伝子導入の２４時間後の細胞を示し、パネルＣおよびＤは、遺伝子導入の７２時間後の細胞を示す。
【０３１８】
図４０Ｅ〜４０Ｈは、図３９に記載されるような、３５μＭのシャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用して実施された、並行遺伝子導入プラスミド代替アッセイの結果を示す。図４０Ｅおよび４０Ｆは、形質導入の２４時間後の細胞を示し、パネルＧおよびＨは、形質導入の４８時間後の細胞を示す。図４０Ｅおよび４０Ｇは、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）蛍光を示し、図４０Ｆおよび４０Ｈは、ＧＦＰ蛍光を示し、後者は、形質導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体およびその後の細胞による非相同修復による停止コドンの除去に起因する。陰性対照試料（すなわち、いずれのシャトル剤も含まずにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体に対して曝露された細胞；データは示さず）では有意な細胞性ＧＦＰ蛍光は観察されなかった。
【０３１９】
１３．４  Ｔ７Ｅ１アッセイ
Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ１）と用いて、培養細胞中のオンターゲットＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓゲノム編集イベントを検出できる。概要を示すと、標的細胞由来のゲノムＤＮＡをＰＣＲで増幅する。その後、ＰＣＲ産物を変性し、再アニーリングして野生型ＤＮＡとＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ変異ＤＮＡとの間でヘテロ二本鎖形成を可能とする。ミスマッチＤＮＡを認識し、切断するＴ７Ｅ１を用いてヘテロ二本鎖を消化する。得られた切断および完全長ＰＣＲ産物は、ゲル電気泳動法により可視化される。
【０３２０】
Ｔ７Ｅ１アッセイを、Ｅｄｉｔ−Ｒ（商標）合成ｃｒＲＮＡ陽性対照（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｕ−００７０００−０５番）およびＴ７エンドヌクレアーゼＩ（ＮＥＢ、カタログ番号Ｍ０３０２Ｓ）を用いて実施した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の送達後、細胞を１００μＬのＰｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ  Ｍ０５３０Ｓ番）中で添加物とともに溶解した。細胞を５６℃で１５〜３０分間インキュベートし、続いて、９６℃で５分間不活性化した。プレートを短時間遠心分離して、ウェルの底に液体を集めた。解析される各試料について、５０μＬのＰＣＲ試料を準備した。ＰＣＲ試料を９５℃に１０分間加熱し、次いで、ゆっくりと（＞１５分）室温に冷却した。次いで、ＰＣＲ産物（約５μＬ）をアガロースゲル（２％）上で分離して、増幅を確認した。各反応物の１５μＬをＴ７Ｅ１ヌクレアーゼとともに３７℃で２５分間インキュベートした。直ちに、全反応容量を、アガロースゲル（２％）上で適当なゲルローディングバッファーとともに泳動させた。
【０３２１】
１３．５  Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４およびＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４媒介ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ系送達およびゲノムＰＰＩＢ配列の切断
実施例９．１に記載されるようなプロトコルＡを使用して、Ｃａｓ９−ＮＬＳ組換えタンパク質（２５ｎＭ、実施例１３．１）およびＰＰＩＢ遺伝子のヌクレオチド配列をターゲッティングするｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（５０ｎＭ、下記を参照のこと）から構成される混合物を、１０μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４またはＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、無血清培地中でＨｅＬａ細胞とともに１６時間インキュベートした。
構築したｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡおよびそれらの標的の配列は以下であった：
【化７】
2019531316.tif 000065
１６時間後、ＨｅＬａ細胞をＰＢＳを用いて洗浄し、血清を含む培地中で４８時間インキュベートした。ＨｅＬａ細胞を回収して、実施例１３．４に記載されるようなＴ７Ｅ１プロトコルアッセイを進めた。
【０３２２】
図４１Ａは、ＰＣＲ増幅後のＰＰＩＢ  ＤＮＡ配列を有するアガロースゲルを示す。レーンＡは、いずれの処理も行わないＨｅＬａ細胞（すなわち、シャトルもＣａｓ９／ＲＮＡ複合体もなし）中の増幅されたＰＰＩＢ  ＤＮＡ配列を示す。レーンＢ：白色四角１番の枠に入っている２つのバンドは、シャトルＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４を用いるＣＲＩＰＲ／Ｃａｓ９複合体の送達後の複合体によるＰＰＩＢ  ＤＮＡ配列の切断産物である。レーンＣ：これらのバンドは、シャトルを含まずにＣａｓ９／ＲＮＡ複合体とともにＨｅＬａ細胞をインキュベーションした後に増幅されたＰＰＩＢ  ＤＮＡ配列を示す（陰性対照）。レーンＤ：白色四角２番の枠に入っているバンドは、脂質遺伝子導入剤（ＤｈａｒｍａＦｅｃｔ（商標）遺伝子導入試薬＃Ｔ−２０ＸＸ−０１）の存在下でＣａｓ９／ＲＮＡ複合体とともにＨｅＬａ細胞をインキュベーションした後に増幅されたＰＰＩＢ  ＤＮＡ配列を示す（陽性対照）。シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用して同様の結果が得られた（データは示さず）。
【０３２３】
図４１Ｂは、ＰＣＲ増幅後のＰＰＩＢ  ＤＮＡ配列を有するアガロースゲルを示す。左側のパネルは、ＨｅＬａ細胞におけるシャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を用いる複合体の送達後のＣＲＩＰＲ／Ｃａｓ９複合体による増幅されたＰＰＩＢ  ＤＮＡ配列の切断産物を示す。右側のパネルは、陰性対照としてのＴ７Ｅ１消化手順前の増幅されたＤＮＡ配列を示す。
【０３２４】
図４１Ｃは、ＰＣＲ増幅後のＰＰＩＢ  ＤＮＡ配列を有するアガロースゲルを示す。左側のパネルは、脂質トランスフェクション剤（ＤｈａｒｍａＦｅｃｔ（商標）トランスフェクション試薬＃Ｔ−２０ＸＸ−０１）の存在下でＣａｓ９／ＲＮＡ複合体とともにＨｅＬａ細胞をインキュベーションした後に増幅されたＰＰＩＢ  ＤＮＡ配列を示す（陽性対照）。右側のパネルは、陰性対照としてのＴ７Ｅ１消化手順前の増幅されたＤＮＡ配列を示す。
【０３２５】
これらの結果は、シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４およびＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４が、機能的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体をＨｅＬａ細胞の核にうまく送達することおよびこの送達がゲノムＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介切断をもたらすことを示す。
【０３２６】
１３．６  ＨｅＬａおよびジャーカット細胞における、種々のシャトル剤によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ系送達およびゲノムＨＰＴＲ配列の切断
実施例９．１に記載されるようなプロトコルＢを使用して、Ｃａｓ９−ＮＬＳ組換えタンパク質（２．５μＭ、実施例１３．１）およびＨＰＴＲ遺伝子のヌクレオチド配列をターゲッティングするｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（２μＭ、以下を参照のこと）から構成される混合物を、３５μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４−Ｈｉｓ、Ｈｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４またはＥＢ１−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、ＨｅＬａまたはジャーカット細胞とともにＰＢＳ中で２分間インキュベートした。
構築したｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡおよびそれらの標的の配列は以下であった：
【化８】
2019531316.tif 000066
【０３２７】
２分後、細胞をＰＢＳを用いて洗浄し、血清を含む培地中で４８時間インキュベートした。細胞を回収し、実施例１３．４に記載されるようなＴ７Ｅ１プロトコルアッセイを進めた。図４６は、ＰＣＲ増幅後のＨＰＴＲ  ＤＮＡ配列および種々のシャトル剤を用いる複合体の送達後のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による増幅されたＨＰＴＲ  ＤＮＡ配列の切断産物を有するアガロースゲルを示す。図４６Ａは、ＨｅＬａ細胞において、シャトル剤：Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４−ＨｉｓおよびＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４を用いた結果を示す。図４６Ｂは、ジャーカット細胞において、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４およびＨｉｓ−ＣＭ１８−Ｌ２−ＰＴＤ４を用いた結果を示す。陰性対照（レーン４）は、シャトル剤を含めないで、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体とともに細胞をインキュベーションした後に増幅されたＨＰＴＲ  ＤＮＡ配列を示す。陽性対照（図４６Ａおよび４６Ｂ中のレーン５）は、脂質遺伝子導入剤（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（商標）遺伝子導入試薬ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製品番号１３７７８１００）の存在下でＣａｓ９／ＲＮＡ複合体とともに細胞をインキュベーションした後に増幅されたＨＰＴＲ  ＤＮＡ配列を示す。
【０３２８】
これらの結果は、本記載の種々のポリペプチドシャトル剤が、機能的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体をＨｅＬａおよびジャーカット細胞の核にうまく送達し得ることおよびこの送達が、ゲノムＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介性切断をもたらすことを示す。
【０３２９】
実施例１４：Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４は、ＴＨＰ−１細胞における転写因子ＨＯＸＢ４の形質導入を可能にする
１４．１  ＨＯＸＢ４−ＷＴ組換えタンパク質
ヒトＨＯＸＢ４組換えタンパク質を、実施例１．４に記載されるように構築し、細菌発現系から発現させ、精製した。製造したＨＯＸＢ４−ＷＴ組換えタンパク質の配列は以下であった：
【化９】
2019531316.tif 000067
（ＭＷ＝２８．５４ｋＤａ；ｐＩ＝９．８９）
開始剤メチオニンおよび６ｘヒスチジンタグは太字である。
【０３３０】
１４．２  リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｔ−ＰＣＲ）
対照および処理細胞を、別の滅菌１．５ｍＬチューブに移し、３００ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレットを適切なバッファーに再懸濁して、細胞を溶解する。その後、ＲＮＡアーゼ不含７０％エタノールを添加し、続いて、ピペッティングによって、混合する。溶解物をＲＮｅａｓｙ（商標）Ｍｉｎｉスピンカラムに移し、１３０００ＲＰＭで３０秒間遠心分離する。適切なバッファーを用いる数回の洗浄および遠心分離ステップの後、溶出物を、氷上で滅菌１．５ｍＬチューブ中に集め、次いで、各チューブ中のＲＮＡ量を分光光度計を用いて定量化する。ＤＮアーゼ処理のために、２μｇのＲＮＡを１５μＬのＲＮアーゼ不含水で希釈する。次いで、１．７５μＬの１０Ｘ  ＤＮアーゼバッファーおよび０．７５μＬのＤＮアーゼを添加し、続いて、３７℃で１５分間インキュベートする。逆転写酵素処理のために、０．８８μＬのＥＤＴＡ（５０ｎＭ）を添加し、続いて、７５℃で５分間インキュベートする。ＰＣＲチューブ中で、０．５μｇのＤＮアーゼ処理ＲＮＡを、４μＬのｉＳｃｒｉｐｔ（商標）逆転写Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（５Ｘ）および２０μＬのヌクレアーゼ不含水と混合する。ＰＣＲ機器において、次のプログラム：２５℃で５分、４２℃で３０分および８５℃で５分、を用いて混合物をインキュベートする。新たに合成されたｃＤＮＡを滅菌１．５ｍＬチューブ中に移し、２μＬのヌクレアーゼ不含水で希釈する。ウェルあたり１８μＬのｑＰＣＲ機器（ＣＦＸ−９６（商標））の混合物を解析のためにＰＣＲプレートに加える。
【０３３１】
１４．３  ＴＨＰ−１細胞におけるＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４によるＨＯＸＢ４−ＷＴ形質導入：用量反応および生存率
ＴＨＰ−１細胞を培養し、実施例９．１に記載されるようなプロトコルＡを使用して、タンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、形質導入の１日前にＴＨＰ−１細胞を、３００００個細胞／ウェルで播種した。ＨＯＸＢ４−ＷＴ組換えタンパク質（０．３、０．９または１．５μＭ、実施例１４．１）を、種々の濃度のＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４（０、０．５、７．５、０．８または１μＭ）と同時インキュベートし、次いで、血清の存在下でＴＨＰ−１細胞に対して２．５時間曝露した。ＨＯＸＢ４活性のマーカーとして標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定するために、細胞を実施例１４．２に記載されるようなリアルタイムＰＣＲ解析に供し、次いで、陰性対照細胞（処理なし）において、検出された標的遺伝子ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、「対照に対する倍数」値を得た。全ＲＮＡレベル（ｎｇ／μＬ）も細胞生存率のマーカーとして測定した。結果は、表１４．１および図４２に示されている。
【表５２】
2019531316.tif 000068
【０３３２】
これらの結果は、ＴＨＰ−１細胞を、シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４および転写因子ＨＯＸＢ４−ＷＴの混合物に対して、血清の存在下で２．５時間曝露することが、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写の用量依存性増大をもたらすことを示す。これらの結果は、ＨＯＸＢ４−ＷＴは、活性形態でＴＨＰ−１細胞の核にうまく送達され、転写活性化を媒介し得ることを示唆する。
【０３３３】
１４．４  ＴＨＰ−１細胞におけるＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４によるＨＯＸＢ４−ＷＴ形質導入：時間経過および生存率（０〜４８時間）
ＴＨＰ−１細胞を培養し、実施例９．１に記載されるようなプロトコルＡを使用して、タンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、第一の時間経過実験の１日前にＴＨＰ−１細胞を、３００００個細胞／ウェルで播種した。ＨＯＸＢ４−ＷＴ組換えタンパク質（１．５μＭ、実施例１４．１）を、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４（０．８μＭ）と同時インキュベートし、次いで、血清の存在下でＴＨＰ−１細胞に対して０、２．５、４、２４または４８時間曝露した。ＨＯＸＢ４活性のマーカーとして標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定するために、細胞を実施例１４．２に記載されるようなリアルタイムＰＣＲ解析に供し、次いで、陰性対照細胞（処理なし）において、検出された標的遺伝子ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、「対照に対する倍数」値を得た。全ＲＮＡレベル（ｎｇ／μＬ）も細胞生存率のマーカーとして測定した。結果は、表１４．２および図４３に示されている。
【表５３】
2019531316.tif 000069
【０３３４】
１４．５  ＴＨＰ−１細胞において、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４によるＨＯＸＢ４−ＷＴ形質導入：時間経過および生存率（０〜４時間）
ＴＨＰ−１細胞を培養し、実施例９．１に記載されるようなプロトコルＡを使用して、タンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、第一の時間経過実験の１日前にＴＨＰ−１細胞を、３００００個細胞／ウェルで播種した。ＨＯＸＢ４−ＷＴ組換えタンパク質（０．３μＭ、実施例１４．１）を、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４（０．８μＭ）と同時インキュベートし、次いで、ＴＨＰ−１細胞に対して血清の存在下で０、０．５、１、２、２．５、３または４時間曝露した。ＨＯＸＢ４活性のマーカーとして標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定するために、細胞を実施例１４．２に記載されるようなリアルタイムＰＣＲ解析に供し、次いで、陰性対照細胞（処理なし）において、検出された標的遺伝子ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、「対照に対する倍数」値を得た。全ＲＮＡレベル（ｎｇ／μＬ）も細胞生存率のマーカーとして測定した。結果は、表１４．３および図４４に示されている。
【表５４】
2019531316.tif 000070
【０３３５】
１４．６  ＨｅＬａ細胞におけるＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４によるＨＯＸＢ４−ＷＴ形質導入：免疫標識および顕微鏡による可視化
実施例９．１に記載されるようなプロトコルＢを使用して、組換えＨＯＸＢ４−ＷＴ転写因子（２５μＭ、実施例１４．１）を３５μＭのＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４と同時インキュベートし、ＨｅＬａ細胞に対して１０秒間曝露した。形質導入されたＨＯＸＢ４−ＷＴが核に蓄積するのを可能にするために３０分インキュベートした後、実施例３．２ａに記載されるように、細胞を固定し、透過処理し、免疫標識した。ＨＯＸＢ４−ＷＴを１／５００希釈した一次マウス抗ＨＯＸＢ４モノクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏ  重量％ＮＢＰ２−３７２５７）および１／１０００希釈した二次抗マウス抗体Ａｌｅｘａ（商標）−５９４（Ａｂｃａｍ  ＃１５０１１６）を使用して標識した。核をＤＡＰＩを用いて標識した。実施例３．２に記載されるように、２０ｘおよび４０ｘの倍率で明視野および蛍光顕微鏡によって、細胞を可視化し、結果例は、図４５に示されている。核標識（図４５Ａおよび４５Ｃ）とＨＯＸＢ４−ＷＴ標識（図４５Ｂおよび４５Ｄ）の間に同時局在性が観察され、ＨＯＸＢ４−ＷＴが、シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４の存在下で３０分後に核にうまく送達されたことを示す。白色三角窓は、核（ＤＡＰＩ）およびＨＯＸＢ４−ＷＴ免疫標識の間の同時局在性の領域の例を示す。
【０３３６】
１４．７  ＴＨＰ−１細胞における種々のシャトル剤によるＨＯＸＢ４−ＷＴ形質導入：用量反応および生存率
ＴＨＰ−１細胞を培養し、実施例９．１に記載されるようなプロトコルＡを使用して、タンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、第一の時間経過実験の１日前にＴＨＰ−１細胞を、３００００個細胞／ウェルで播種した。ＨＯＸＢ４−ＷＴ組換えタンパク質（１．５μＭ、実施例１４．１）を、０．８μＭのシャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４、ＴＡＴ−ＫＡＬＡ、ＥＢ１−ＰＴＤ４、Ｈｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４およびＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４−Ｈｉｓと同時インキュベートし、次いで、血清の存在下でＴＨＰ−１細胞に対して２．５時間曝露した。ＨＯＸＢ４活性のマーカーとして標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定するために、細胞を実施例１４．２に記載されるようなリアルタイムＰＣＲ解析に供し、次いで、陰性対照細胞（処理なし）において、検出された標的遺伝子ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、「対照に対する倍数」値を得た。全ＲＮＡレベル（ｎｇ／μＬ）も細胞生存率のマーカーとして測定した。結果は、表１４．４および図４７に示されている。
【表５５】
2019531316.tif 000071
【０３３７】
実施例１５：Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４によるラット頭頂皮質におけるインビボＧＦＰ−ＮＬＳ送達
シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４の、ラット脳細胞の核において、インビボでＧＦＰ−ＮＬＳを送達する能力を試験した。
別個の滅菌１．５ｍＬチューブ中で、シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を、滅菌蒸留水により室温で希釈した。次いで、カーゴタンパク質として使用されるＧＦＰ−ＮＬＳを、シャトル剤に添加し、必要に応じて、滅菌ＰＢＳを添加して、ラット脳における注射のために十分な最終容量（例えば、各注射脳部位あたり５μＬ）で、所望の濃度のシャトル剤およびカーゴを得た。次いで、シャトル剤／カーゴ混合物を実験のために直ちに使用した。ＧＦＰ−ＮＬＳ単独の注射に対応する１種の陰性対照を実験に含めた。
【０３３８】
３匹のラットの頭頂皮質の両側に注射を実施した。左頭頂皮質（同側）、シャトル剤（２０μＭ）およびＧＦＰ−ＮＬＳ（２０μＭ）から構成される混合物を注射し、右頭頂皮質（反対側）では、陰性対照としてＧＦＰ−ＮＬＳ（２０μＭ）のみを注射した。外科手技のために、イソフランを用いてマウスに麻酔した。次いで、動物を定位固定フレームに入れ、頭蓋表面を露出させた。５μＬ  Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジを用いて、シャトル／カーゴ混合物またはＧＦＰ−ＮＬＳ単独（２０μＭ）を両側に注入できすようにするために、適当な部位で２つの穴をドリルで開けた。十字縫合に対して、前後側（ＡＰ）、側面（Ｌ）および背腹側（ＤＶ）座標：（ａ）ＡＰ  ＋０．４８ｍｍ、Ｌ  ±３ｍｍ、Ｖ  −５ｍｍ、（ｂ）ＡＰ  −２ｍｍ、Ｌ  ±１．３ｍｍ、Ｖ  −１．５ｍｍ、（ｃ）ＡＰ  −２．６ｍｍ、Ｌ  ±１．５ｍｍ、Ｖ  −１．５ｍｍ、をとった。シャトル／カーゴ混合物またはカーゴ単独の注射容量は、注射部位あたり５μＬとし、注射は１０分間実施した。その後、実験者は、１分間待ち、その後ニードルを脳から除去した。すべての測定は、動物の疼痛および不快感を最小にするように、手術の前、その間およびその後に行った。手術後、パラホルムアルデヒド（４％）を用いる２時間の灌流によって、動物を屠殺し、脳を集め、顕微鏡解析のために準備した。試験手順は、カナダ動物管理協会からのガイドラインに準拠し、動物実験委員会により承認された。
【０３３９】
背腹側ラット脳切片を集め、４ｘ（図４８Ａ）、１０ｘ（図４８Ｃ）および２０ｘ（図４８Ｄ）の倍率で蛍光顕微鏡により解析した。注射部位は、頭頂皮質（ＰＣｘ）の最深層中に位置する。Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４シャトル剤の存在下で、ＧＦＰ−ＮＬＳは、ＰＣｘの、脳梁（Ｃｏｒｐｕｓ  Ｃａｌｌｕｓ）（Ｃｃ）の、および線条体（Ｓｔｒ）の（白色曲線は脳構造間の限界を記す）細胞核中に拡散した。図４８Ｂは、ＦｒａｎｋｌｉｎおよびＰａｘｉｎｏｓのラット脳アトラスからの注射部位の定位座標（黒色矢印）を示す。Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４の存在下でのＧＦＰ−ＮＬＳの注射を、脳の左側で実施し、陰性対照（ＧＦＰ−ＮＬＳ単独の注射）を反対側で実施した。図４８Ｂ中の黒丸および黒色連絡線は、蛍光写真（図４８Ａ、４８Ｃおよび４８Ｄ）において、観察された領域を示す。
【０３４０】
この実験は、シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４の存在下でのラット頭頂皮質におけるその定位固定注射後のカーゴＧＦＰ−ＮＬＳの細胞送達を実証した。結果は、頭頂皮質のより深い層（注射部位）から脳梁（ｃｏｒｐｕｓ  ｃａｌｌｕｓ）および線条体（被殻）の背側レベルへの、細胞の核におけるＧＦＰ−ＮＬＳの送達を示す。対照的に、陰性対照では、ＧＦＰ−ＮＬＳが、注射部位の周囲に局所的に唯一検出可能である。この実験は、シャトル剤が、注射部位（頭頂皮質）におけるカーゴの核送達および両側に隣接する脳領域（脳梁（ｃｏｒｐｕｓ  ｃａｌｌｕｓ）および線条体ラット脳）を通してその拡散を誘導したことを示す。
【０３４１】
実施例Ａ：ドメインベースペプチドシャトル剤の生理化学的特性
複数の異なるペプチドを、独立したポリペプチドカーゴを細胞内で真核細胞のサイトゾル／核に送達できるポリペプチドベースのシャトル剤を特定する目的で最初にスクリーニングした。一方では、大規模スクリーニングの取り組みにより、細胞膜透過性ドメイン（ＣＰＤ）と作動可能に連結されたエンドソーム漏出ドメイン（ＥＬＤ）、および任意選択で１つまたは複数のヒスチジンリッチドメインを含むドメインベースペプチドシャトル剤が、真核細胞中の独立したポリペプチドカーゴの形質導入効率を増大させ、それにより、カーゴがサイトゾル／核区画に到達するという発見に至った（実施例１〜１５を参照されたい）。逆に、これらのスクリーニングの取り組みは、ポリペプチドカーゴ形質導入能力、過度の毒性、および／またはその他の望ましくない特性（例えば、不十分な溶解度および／または安定性）を持たないまたはそれらが低いいくつかのペプチドを明らかにした。
【０３４２】
これらの経験的データに基づいて、より多く成功するシャトル剤に共通する性質をより良く理解するために、成功する、あまり成功しない、および失敗するペプチドの生理化学的特性を比較した。この手法には、例えば、次記を十分に考慮した、形質導入性能に従って、種々のペプチドのマニュアルによる層別化を含めた。（１）それらの溶解度／安定性／合成の容易さ；（２）カルセインのエンドソーム脱出を容易にするそれらの能力（例えば、実施例２を参照されたい）；（３）種々の細胞型および細胞株（例えば、初代、不死化、付着、懸濁、など）で、ならびに種々の形質導入プロトコル下で、フローサイトメトリーで評価して、１種または複数のタイプの独立したポリペプチドカーゴを細胞内に送達するそれらの能力（例えば、実施例３〜６および８〜１５）；および（４）蛍光顕微鏡法（例えば、蛍光標識カーゴに対し）、増大した転写活性（例えば、転写因子カーゴに対して）、またはゲノム編集能力（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１などのヌクレアーゼカーゴに対して）（例えば、実施例３〜６および８〜１５を参照されたい）、ならびに種々の形質導入プロトコル下で、種々の細胞型および細胞株（例えば、初代、不死化、付着、懸濁、など）に対する毒性、により評価して、ポリペプチドカーゴをサイトゾルおよび／または核に送達するそれらの能力。
【０３４３】
上記マニュアルによるキュレーションと同時に、所与の蛍光標識カーゴ（ＧＦＰ、ＧＦＰ−ＮＬＳ、または蛍光標識抗体）および細胞株に対するそれぞれのペプチドの形質導入能力および細胞毒性をさらなるスクリーニングツールとして単一の「形質導入スコア」に統合した。このスコアは、［（ある細胞型の場合に所与のペプチドのフローサイトメトリーにより観察された最大形質導入効率％）ｘ（試験細胞株中のペプチドの生存率％）］／１０００のように計算され、所与の細胞型およびポリペプチドカーゴに対して、０〜１０の全形質導入スコアを与える。これらの分析は、約８（例えば、成功したドメインベースペプチドシャトル剤に対して）〜０．０６７程度の低さ（例えば、単一ドメイン陰性対照ペプチドに対して）の範囲の形質導入スコアを有するドメインベースペプチドを特定した。
【０３４４】
上記マニュアルキュレーションおよび「形質導入スコア」ベース分析により、多くの成功したドメインベースシャトル剤に共通のいくつかのパラメーターが明らかになった。これらのパラメーターにいくつかを表Ａ１に記載している。ＧＦＰをポリペプチドカーゴとして用いたＨｅＬａ細胞における「形質導入スコア」ベース分析の１例は、表Ａ２に示されている。ＨｅＬａ以外の細胞株およびＧＦＰ以外のポリペプチドカーゴを用いた、他の形質導入スコアベース分析も同様に実施したが、簡潔さのためにここでは示さない。
【０３４５】
成功しなかったシャトル剤は、２０アミノ酸未満の残基長を有することが明らかになった（表Ａ１およびＡ２のパラメーター１を参照されたい）。４個のアミノ酸：アラニン、ロイシン、リシンおよびアルギニンは、ほとんどの成功したシャトル剤において、主要な、最も頻発する残基であった（ペプチドの残基の３５〜８５％；パラメーター１０を参照されたい）。これらの残基は、これらのペプチド配列のアルファヘリックス構造および両親媒性を要求する（パラメーター２〜５）。多くの場合、シャトル剤中のＡ／Ｌ残基のパーセンテージ（１５〜４５％）とＫ／Ｒ残基のパーセンテージ（２０〜４５％）との間には、バランスが存在し（パラメーター１１、１２および１４）、負に帯電した残基のパーセンテージは、多くの場合、１０％以下であることが明らかになった（パラメーター１４）。逆に、１６個のその他のアミノ酸残基（Ａ、Ｌ、ＫおよびＲ以外の）は通常、シャトル剤の１０〜４５％であった（パラメーター１５）。成功したシャトル剤は通常、８〜１３の予測等電点（ｐＩ）（パラメーター７）、および＋４以上の予測実効電荷（パラメーター６）を有し、ＤＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓは、＋２６もの高さの予測実効電荷を有する。疎水性残基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）は通常、シャトル剤の３５〜６５％を構成し、中性親水性残基（Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ）は通常、０〜３０％であった（パラメーター８および９）。
【０３４６】
表Ａ２に示すように、最も成功したシャトル剤（例えば、５．０を超える形質導入スコアのもの）は通常、表Ａ１に示した範囲の外側のパラメーターはほとんどなかった。しかし、形質導入効率の大きな増加はまた、例えば、満たされなかったパラメーターが推奨領域の外側に入る程度に応じて、および／または他のパラメーターが推奨領域の中位の近くに入るかどうかに応じて、いくつかのパラメーターが満たされないシャトル剤でも観察された。したがって、「最適」範囲内に入るいくつかのパラメーターを有するシャトル剤は、推奨範囲の外側に入る他のパラメーターを補償する可能性がある。前述のように、２０アミノ酸より短いペプチドは、どのように多くの他のパラメーターが満たされようとも、何ら大きな形質導入能力を示さなかった（例えば、０．４未満の形質導入スコア）。２０アミノ酸長さより大きいペプチドで、０．４未満の形質導入スコアを有するペプチドの中で、ＶＳＶＧ−ＰＴＤ４（０．３５のスコア）は６個のパラメーターを満たすことができず、また、ＪＳＴ−ＰＴＤ４（０．０８３のスコア）は、１０個のパラメーターを満たすことができなかった。ＫＡＬＡ（０．１２のスコア）は、４個のパラメーターを満たすことができず、パラメーター１１および１４は推奨範囲を遙かに超えており、Ａ／Ｌ残基の過剰およびＡ／ＬとＬ／Ｒのパーセンテージとの間の大きな不均衡を反映している。表Ａ２の形質導入スコア範囲は、適宜選択され、また、他の範囲を選択でき、本記載の範囲内にあることは理解されたい。
【表５６−１】
2019531316.tif 000072
【表５６−２】
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【表５７−１】
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【表５７−２】
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【０３４７】
Ｙ＝はい；Ｎ＝いいえ；白色セル＝表Ａ１に示すパラメーター範囲に入る値；黒色セル＝表Ａ１に示すパラメーター範囲に入らない値。Ｈｉｓ−ＬＡＨ４−ＰＴＤ４は５．０を超える形質導入スコアを得たが、細胞内のＧＦＰ蛍光パターンが、点状物として蛍光顕微鏡法により観察され、ＧＦＰカーゴがエンドソーム中に捕捉されたままで残されたことを示唆するので、この分析から除外した。それにもかかわらず、Ｈｉｓ−ＬＡＨ４−ＰＴＤ４は、パラメーター２、３、１１、１２、１４および１５に関して、表Ａ１に示された範囲に入らないいくつかのパラメーターを有したことは、注目に値する。
【０３４８】
実施例Ｂ：合成ペプチドシャトル剤の合理的設計
表Ａ１に示したパラメーター、および得られた経験的知識（例えば、実施例１〜１５）を用いて、そのパラメーターが、うまくいくペプチドシャトル剤の設計に使用できるか否かを評価するために、表Ｂ１に記載のペプチドをマニュアルで設計した。
【０３４９】
実施例３．１ａに一般的に記載のタンパク質形質導入アッセイを用いて、表Ｂ１に記載のペプチドの、ＨｅＬａ細胞にＧＦＰ−ＮＬＳカーゴを形質導入するその能力（実施例３．４を参照されたい）を試験した。ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（１０μＭ）を１０μＭのペプチドと同時インキュベートした後、ＨｅＬａ細胞に１分間曝露した。細胞を、実施例３．３に記載のフローサイトメトリー解析に供した。結果を表Ｂ２およびＢ３に示す。実施例Ａで考察した「形質導入スコア」ベース分析も実施し、結果を表Ｂ４に示す。形質導入ＧＦＰ−ＮＬＳの核送達の成功（通常、ただの１分間のペプチドへの暴露後）は、実施例３．２に記載のように蛍光顕微鏡法により確認された（データは示さず）。
【０３５０】
ペプチドＦＳＤ１〜ＦＳＤ５は、最初は、成功したドメインベースシャトル剤のＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４−Ｈｉｓに基づいて設計され、ペプチドＦＳＤ１〜ＦＳＤ４は、表Ａ１に示す１つまたは複数のパラメーターを満たさないように意図的に設計され、ＦＳＤ５は１５全てのパラメーターを満たすように設計された。表Ｂ２からわかるように、ペプチドＦＳＤ１〜ＦＳＤ４は、２．４５％〜３７．６％の範囲の形質導入効率を示した。対照的に、ペプチドＦＳＤ５は、高形質導入効率（７０．５％）および低毒性（８６％の細胞生存率）を示した。
【０３５１】
（新規ペプチド構造予測のためのオンライン情報源である、ＰＥＰ−ＦＯＬＤを用いた３次元モデリングにより、ＦＳＤ５のアルファヘリックス構造が予測された（図４９Ｃ；ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｓｅｒｖ．ｒｐｂｓ．ｕｎｉｖ−ｐａｒｉｓ−ｄｉｄｅｒｏｔ．ｆｒ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＰＥＰ−ＦＯＬＤ／を参照されたい）。対照的に、３．５％のみの形質導入効率を示した（表１０．３ａを参照されたい）ペプチドＶＳＶＧ−ＰＴＤ４は、より短いアルファヘリックス、短いベータシート（白色矢印）、およびランダムコイル（白色の形のはっきりしない境界）を含む異なる構造を取ることが予測された。
【０３５２】
図４９Ａおよび４９Ｂに示すＦＳＤ５およびＶＳＶＧ〜ＰＴＤ４のヘリカルホイール投影図および側面オープンシリンダー表現（出展：ｈｔｔｐ：／／ｒｚｌａｂ．ｕｃｒ．ｅｄｕ／ｓｃｒｉｐｔｓ／ｗｈｅｅｌ／ｗｈｅｅｌ．ｃｇｉ）は、ＦＳＤ５の両親媒性の性質を、ＶＳＶＧ−ＰＴＤ４に比較して図示する。各アミノ酸残基の幾何学的形状は、残基の側鎖に基づくその生化学的性質（すなわち、疎水性、電荷、または親水性）に対応する。ＦＳＤ５とＶＳＶＧ−ＰＴＤ４の２つのオープンシリンダー表現との間の主要な差異の１つは、ＦＳＤ５中の高度疎水性コアの存在であり（図４９Ａ、左と右のパネルに概要を示す）、これはＶＳＶＧ−ＰＴＤ４には存在しない。図４９Ａと４９Ｂの下部中央のパネルのシリンダーは、簡略化バージョンの右パネルのオープンシリンダー表現であり、「Ｈ」は高疎水性表面領域を表し；「ｈ」は疎水性表面領域を表し；「＋」は正電荷残基を表し；「ｈ」は親水性残基を表す。
【０３５３】
ＦＳＤ５の高形質導入効率を考慮して、我々は、このシャトル剤をペプチドＦＳＤ６〜ＦＳＤ２６を設計するためのモデルとして使用した。表Ｂ２に示すように、形質導入能力を完全に失うことなく、比較的高度のアミノ酸置換が可能である。但し、表Ａ１にしめす設計パラメーターのほとんどが満たされることが前提である。ＦＳＤ６〜ＦＳＤ２６の内で、ほぼ完全な形質導入効率の喪失を示した唯一のペプチドは、ＦＳＤ６で、これは、両親媒性のアルファヘリックス構造をとると予測されなかった。興味深いことに、ペプチドＦＳＤ１８は、１０μＭで使用した場合、ＨｅＬａ細胞中で高い毒性を示したが、他の細胞型で使用した場合、高い形質導入効率と相対的に低い毒性を示し（実施例ＥおよびＧを参照されたい）、ペプチド毒性は、細胞型に応じて変化する可能性があることを示唆している。ＰＥＰ−ＦＯＬＤを用いた３次元モデリングにより、ＦＳＤ１８の２つの別のアルファヘリックスが予測された（図４９Ｄを参照されたい）。
【０３５４】
ペプチドＦＳＮ１〜ＦＳＮ８は、表Ａ１に示す設計パラメーターの１つまたは複数が満たされない場合に、形質導入効率に与える効果を調査するために設計された。例えば、ＦＳＮ７は、わずか３．５６％の形質導入効率を示し、ＰＥＰ−ＦＯＬＤにより、２つのベータシートが形成され、アルファヘリックスが形成されないことが予測された（図４９Ｆ）。
【表５８−１】
2019531316.tif 000076
【表５８−２】
2019531316.tif 000077
【表５８−３】
2019531316.tif 000078
結果は、ＥｘＰＡＳｙ（商標）バイオインフォマティクスリソースポータル（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）から利用可能なＰｒｏｔＰａｒａｍ（商標）オンラインツールを用いて計算した。ｐＩ：等電点；電荷：陽性（＋）および陰性（−）帯電残基の合計数
【表５９−１】
2019531316.tif 000079
【表５９−２】
2019531316.tif 000080
【表６０】
2019531316.tif 000081
【表６１−１】
2019531316.tif 000082
【表６１−２】
2019531316.tif 000083
【０３５５】
下記アライメントで示すように、ペプチドＦＳＤ５、ＦＳＤ１６、ＦＳＤ１８、ＦＳＤ１９、ＦＳＤ２０、ＦＳＤ２２、およびＦＳＤ２３の一次アミノ酸配列は関連する。
【化１０】
2019531316.tif 000084
【０３５６】
実施例Ｃ：
合成ペプチドシャトル剤のコンピューター支援設計
Ｃ．１  機械学習支援設計手法
表Ｃ１に記載のペプチドは、“Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ’’（Ｇｉｇｕｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）と題するＳｅｂａｓｔｉｅｎ  Ｇｉｇｕｅｒｅらによる論文に記載のアルゴリズムを用いて設計した。このコンピューター予測法は、カーネル学習法および機械学習法に基づくアルゴリズムの使用をベースにしている（Ｓｈａｗｅ−Ｔａｙｌｏｒ  Ｊ．ａｎｄ  Ｃｒｉｓｔｉａｎｉｎｉ  Ｎ．，２００４）。これらのアルゴリズムは、目的の生物学的作用に応じて、最大生物活性を有するペプチドを選別することを目的とする。ここで、我々は、タンパク質形質導入アッセイで現在までに試験した全てのペプチドを考慮し、それらを３つの別々のグループに分けた。グループの構成は、実施例Ａで記載のように計算した「形質導入スコア」をベースにした。グループ１は、低毒性で効果的細胞送達を示すペプチドから構成し；グループ２は、効果的細胞送達を示すが、毒性の高いペプチドから構成し；およびグループ３は、何らの大きなポリペプチドカーゴ形質導入能力も示さなかったペプチドから構成した。
【０３５７】
各グループのペプチドのスコアを用いて、さらなるペプチドバリアントの生成の出発データ点とした。アルゴリズムは、グループ１のペプチドの配列およびスコアを、効果的形質導入能力を有するペプチドバリアントの予測のための陽性基準として使用した。グループ２と３の配列およびスコアを、検索フィールドを表すアルゴリズムの陰性対照として含めた。アルゴリズムにより生成されたペプチドバリアントは、３５アミノ酸長さを有するものに限定された。実行後、予測法は、１６個の配列（ＦＳＤ２７〜ＦＳＤ４２）を生成した。表Ａ１に示す設計パラメーターに関してこれらの１６個の配列を解析後、ペプチドＦＳＤ２７、ＦＳＤ３４およびＦＳＤ４０のみが、全ての設計パラメーターを満たした（表Ｃ２を参照されたい）。他のペプチドバリアントは、表Ａ１に示すパラメーターの外側に入る１つまたは複数のパラメーターを有した。
【表６２】
2019531316.tif 000085
結果は、ＥｘＰＡＳｙ（商標）バイオインフォマティクスリソースポータル（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）から利用可能なＰｒｏｔＰａｒａｍ（商標）オンラインツールを用いて計算した。ｐＩ：等電点；電荷：陽性（＋）および陰性（−）帯電残基の合計数
【表６３】
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【０３５８】
ＨｅＬａ細胞を培養し、実施例３．１ａに記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質（１０μＭ）を１０μＭのペプチドと同時インキュベートした後、ＨｅＬａ細胞に１分間曝露した。細胞を、実施例３．３に記載のフローサイトメトリー解析に供した。結果を表Ｃ３に示す。
【表６４】
2019531316.tif 000087
【０３５９】
興味深いことに、表Ａ１に示す全ての設計パラメーターを満たすアルゴリズムを用いて生成した３個のペプチド（すなわち、ＦＳＤ２７、ＦＳＤ３４およびＦＳＤ４０）はそれぞれ、２５〜３３％の形質導入効率を示し、細胞生存率は８３．９〜９８％であった。他のペプチドは、ＦＳＤ４１を除いて、通常、１２％未満の形質導入効率を示した。ＦＳＤ４１は、形質導入効率３７％を示した（毒性は、ＦＳＤ２７、ＦＳＤ３４、およびＦＳＤ４０より高いが）。単一パラメーター（例えば、効率スコア）のみがアルゴリズムをプログラムするのに使用されたが、ＦＳＤ２７、ＦＳＤ３４およびＦＳＤ４０の結果は、表Ａ１に示される設計パラメーターの有用性を検証する。
【０３６０】
Ｃ２．ペプチドバリアントのコンピューター支援生成
コンピューター支援設計手法を採用して、表Ａ１に示す設計パラメーターのほとんどまたは全てを満たすペプチドバリアントの設計および生成の実現性を実証した。第１に、この手法には、構造上異なるがそれでも成功するペプチドシャトル剤の一次アミノ酸配列をマニュアルで検討および比較し、構造的パラメーター（２）、（３）および（４）を満たすこと（すなわち、両親媒性のアルファヘリックス形成、正に帯電した面、および１２％〜５０％の高度疎水性コア）に繋がる一般的コンセンサス配列を特定することを含めた。第２に、この手法には、設計パラメーターのほとんど、または全てを満たすペプチドバリアントのリストを生成するために、コンピューター支援ランダムペプチド配列生成と、それに続けて、記述子フィルタリング、コンセンサス配列および（１）と（５）〜（１５）の設計パラメーターの内の１つまたは複数の組み込みを含めた。これについては、以下にさらに詳しく考察する。
【０３６１】
第１に、比較的高い形質導入効率スコアを有することが本明細書で示されたペプチドの一次アミノ酸配列を、ＣＬＵＳＴＡＬＷ  ２．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ−ｂｉｎ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）；Ｌｏｇ−Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ（ＭＵＳＣＬＥ）による複数配列比較（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）；およびＰＲＡＬＩＮＥ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｂｉ．ｖｕ．ｎｌ／ｐｒｏｇｒａｍｓ／ｐｒａｌｉｎｅｗｗｗ／を含む、オンライン複数配列アラインメントツールを用いて比較した。比較のために選択されたペプチドには、次の１１個：Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４；ＥＢ１−ＰＴＤ４；Ｈｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４；ＦＳＤ５；ＦＳＤ１０；ＦＳＤ１９；ＦＳＤ２０；ＦＳＤ２１；ＦＳＤ４４；ＦＳＤ４６；およびＦＳＤ６３のペプチドを含めたが、解析はこれらの１１個のペプチドのみに限定しなかった。図４９Ｇは、ＰＲＡＬＩＮＥを用いた１１個の代表的ペプチドのアライメントを示し、各整列させた残基位置の下部の「整合」スコアは、その残基位置での保存の程度である（ゼロは保存が最小であり、１０が最大保存である）。例えば、相対位置２９のアラニン（Ａ）は、図４９Ｇに示す１１個すべてのペプチドで保存され、これは、１０の「整合」スコアに割付けられた。本明細書で（または他で）記載のペプチドのライブラリーのこのような複数配列分析は、次の一般的構造であることが明らかになった。
（ａ）［Ｘ１］−［Ｘ２］−［リンカー］−［Ｘ３］−［Ｘ４］（式１）；
（ｂ）［Ｘ１］−［Ｘ２］−［リンカー］−［Ｘ４］−［Ｘ３］（式２）；
（ｃ）［Ｘ２］−［Ｘ１］−［リンカー］−［Ｘ３］−［Ｘ４］（式３）；
（ｄ）［Ｘ２］−［Ｘ１］−［リンカー］−［Ｘ４］−［Ｘ３］（式４）；
（ｅ）［Ｘ３］−［Ｘ４］−［リンカー］−［Ｘ１］−［Ｘ２］（式５）；
（ｆ）［Ｘ３］−［Ｘ４］−［リンカー］−［Ｘ２］−［Ｘ１］（式６）；
（ｇ）［Ｘ４］−［Ｘ３］−［リンカー］−［Ｘ１］−［Ｘ２］（式７）；または
（ｈ）［Ｘ４］−［Ｘ３］−［リンカー］−［Ｘ２］−［Ｘ１］（式８）；
式中、［Ｘ１］、［Ｘ２］、［Ｘ３］、［Ｘ４］、および［リンカー］は、下表で定義の通りである：
【表６５−１】
2019531316.tif 000088
【表６５−２】
2019531316.tif 000089
【０３６２】
第２に、スクリプトを設計し、プログラミング言語、パイソンで組み込み、全てのパラメーター（予測等電点のパラメーター（ｐＩ、パラメーター７）を計算するソースコードは、本実施例を作成する時点では利用できなかったので、このパラメーターを除いて）を満たす配列をランダムに生成し、フィルターにかけた。表Ａ１に記載の構造パラメーター２、３、４（両親媒性アルファヘリックス、正帯電表面、および高度疎水性コア）は、式１〜８および表Ｃ４（配列中の疎水性、カチオン性、親水性、ＡｌａおよびＧｌｙアミノ酸の適切な交互変化）に示したコンセンサス配列をコードに入力することにより満たし、表Ａ１に記載の生化学的パラメーター（１）、（５）、（６）、および（８）〜（１５）は全て個別にコード中に入力し、１０，０００個のバリアントペプチド配列を生成した。これらのバリアントペプチド配列は、配列番号２４３〜１０２４２に対応する。
【０３６３】
実施例Ｄ：合理的に設計されたペプチドは、エンドソームにより捕捉されたカルセインの脱出を促進する
実施例２に一般的に記載のようにカルセインエンドソーム脱出アッセイを実施し、蛍光顕微鏡法（データは示さず）およびフローサイトメトリー（ＦＳＤ５の結果を以下に示す）により特性を明らかにした。
ＦＳＤ１８は、ＦＳＤ５に類似の結果を示した（データは示さず）。
【表６６】
2019531316.tif 000090
【０３６４】
蛍光顕微鏡法およびフローサイトメトリー実験の結果は、合理的に設計されたペプチドシャトル剤は、ドメインベースペプチドシャトル剤と同様に、エンドソームにより捕捉されたカルセインの脱出を用量依存的に促進することを示した。
【０３６５】
実施例Ｅ：合理的に設計されたペプチドは、種々の細胞型における形質導入効率を高める
実施例３．１ａ（付着細胞）または実施例３．１ｂ（懸濁細胞）に一般的に記載のようにして、示された濃度で、カーゴとしての１０μＭのＧＦＰ−ＮＬＳを用い、示した時間にわたり合理的に設計されたペプチドを用いて、種々の細胞型におけるタンパク質形質導入アッセイを実施した後、フローサイトメトリー（実施例３．３）および蛍光顕微鏡法（実施例３．２）により特性を明らかにした。フローサイトメトリー分析の結果を下表に示す。蛍光顕微鏡により、細胞の核へのＧＦＰ−ＮＬＳの送達の成功が実証された（データは示さず）。
【表６７】
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【表６８】
2019531316.tif 000092
【表６９】
2019531316.tif 000093
【表７０】
2019531316.tif 000094
【表７１】
2019531316.tif 000095
【０３６６】
実施例Ｆ：合理的に設計されたペプチドシャトル剤は、抗体の形質導入を可能にする
Ｆ．１  ＨｅＬａ細胞におけるＦＳＤ５による蛍光標識抗体の形質導入
ペプチドＦＳＤ５およびカーゴとしての抗体を用いて、１分のインキュベーション時間後に、実施例３．１で一般的に記載のタンパク質形質導入アッセイを実施した後、蛍光顕微鏡法（実施例３．２）により特性を明らかにした。図５０は、ＨｅＬａ細胞中でペプチドＦＳＤ５（８μＭ）により１分間送達されたヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）および抗ウサギＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４）抗体の細胞質形質導入ならびに蛍光顕微鏡法により２０ｘ倍率でＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４  Ａｂ（図５０Ａ）で；および１０ｘと２０ｘ倍率でＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  Ａｂ（それぞれ、図５０Ｂおよび５０Ｃ）で可視化した結果を示す。生細胞の明視野および蛍光像をそれぞれ上段および下段パネルに示す。
【０３６７】
次の実験は、他のペプチドＦＳＤペプチドが同様に、機能的抗体：核膜を標識できる抗ＮＵＰ９８抗体、およびアポトーシス促進性カスパーゼ３タンパク質に結合して不活化する２つの抗活性カスパーゼ３抗体を送達できることを示す。送達、顕微鏡および細胞免疫標識プロトコルは、実施例３に記載されている。
【０３６８】
Ｆ．２  ＨｅＬａ細胞におけるＦＳＤ１９による抗ＮＵＰ９８抗体の形質導入
抗ＮＵＰ９８抗体（１０μｇ）を、７．５μＭのＦＳＤ１９と同時インキュベートし、ＨｅＬａ細胞に対して４時間曝露した。細胞を洗浄し、パラホルムアルデヒド４％で固定し、０．１％トリトン（商標）で透過処理し、蛍光標識（Ａｌｅｘａ（商標）Ｆｌｕｏｒ  ４８８）ヤギ抗ラット抗体で標識した。核周辺膜および細胞核に結合した抗体は、２０ｘ（上段パネル）および４０ｘ（下段パネル）の蛍光顕微鏡法により可視化した。図５０Ｄに示すように、緑色蛍光シグナル（左パネル）が核膜から発光され、また、ヘキスト染色と重なり合わせさっており（右パネル）、抗ＮＵＰ９８抗体が、その形質導入後に細胞の内側でその機能を保持したことを示している。
【０３６９】
Ｆ３．ＴＨＰ−１およびジャーカット細胞におけるＦＳＤ２３による２つの機能性抗活性カスパーゼ３抗体の形質導入ＥＬＩＳＡ切断型ＰＡＲＰアッセイによる定量化
モノクローナル（ｍＡｂ）およびポリクローナル（ｐＡｂ）抗活性化カスパーゼ３抗体（２μｇ）を７．５μＭのＦＳＤ２３の存在下でＴＨＰ−１およびジャーカット細胞と５分間、独立に、同時インキュベートした。それぞれの抗体の抗アポトーシス性効果を、ＥＬＩＳＡ切断型ＰＡＲＰアッセイによりカスパーゼ３活性化アポトーシスのレベルにより評価し、後述のように分光法により定量化した。
【０３７０】
実験の日に、対数増殖期にある細胞を回収し、遠心分離（４００ｇ、３分間）し、９６ウェルプレート中で無血清ＲＰＭＩ中に再懸濁した（ウェルあたり１５０μＬ中に５００，０００個の細胞）。細胞を遠心分離し、試験するペプチド（７．５μＭ）および２μｇの形質導入される抗体から構成される混合物と共に、５分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、２４ウェルプレートの血清含有ＲＰＭＩ中に３７℃で１時間再懸濁した。アクチノマイシンＤ（２μｇ／ｍＬ）、細胞傷害性アポトーシス誘導因子を細胞と共に４時間インキュベートした。細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、ＰＡＲＰ（切断型）［２１４／２１５］ヒトＥＬＩＳＡキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、製造業者説明書に従って試験し、その後、分光法分析を実施した。結果を表Ｆ１に示す。
【表７２】
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【０３７１】
ＴＨＰ−１およびジャーカット細胞の結果は、ＦＳＤ２３が機能性抗活性カスパーゼ３抗体の形質導入に成功したことを示す。抗ＴＮＦ抗体を非特異的陰性対照およびアクチノマイシンＤを細胞傷害性アポトーシス誘導因子として使用した。アクチノマイシンＤ（［−］）の非存在下では、各抗活性カスパーゼ３  ｍＡｂおよびｐＡｂの送達は、抗ＴＮＦ抗体の送達が細胞生存率に対し識別可能な影響を与えなかった「抗ＴＮＦ」対照に比べて、アポトーシスの基本レベルを低減させた。アクチノマイシンＤ（「＋」）の存在下では、ＦＳＤ２３を伴う両抗活性カスパーゼ３抗体の送達後、「抗ＴＮＦ」対照に比べて、生じるアポトーシスを低減した。
【０３７２】
実施例Ｇ：合理的に設計されたペプチドシャトル剤は、ＣＲＩＳＰＲベースゲノム編集複合体の形質導入を可能とする
我々は、合理的に設計されたペプチドシャトル剤の機能的ＣＲＩＳＰＲベースゲノム編集複合体を真核細胞の核に送達する能力を標準的ＤＮＡ切断アッセイを用いて試験した。これらのアッセイを用いて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介細胞ゲノムＤＮＡ配列ＨＰＲＴ（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）およびＤＮＭＴ１（ＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ１）の切断を測定した。種々のシャトル剤によるゲノム編集複合体の細胞内送達後、短い（７２ｂｐ）および長い（１６３１ｂｐ）ＤＮＡテンプレートの相同組換え（ＨＤＲ）をＨＰＲＴゲノム切断部位で実施し、測定した。
【０３７３】
Ｇ１．合理的に設計されたペプチドシャトル剤によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体形質導入、ゲノム標的配列の切断、および種々の細胞株中での相同組換え
Ｇ．１．１  機能的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体の形質導入
Ｃａｓ９−ＮＬＳ組換えタンパク質は、実施例１３．１に記載のようにして調製された。実施例３．１ａに一般的に記載の形質導入プロトコルを用いて、Ｃａｓ９−ＮＬＳ組換えタンパク質およびＨＰＴＲ遺伝子のヌクレオチド配列をターゲッティングするｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（下記参照）から構成される混合物を、種々の濃度のＦＳＤ５、ＦＳＤ８、ＦＳＤ１０またはＦＳＤ１８と同時インキュベートし、さらに、ＨｅＬａ、ＨＣＣ−７８、ＮＩＣ−Ｈ１９６またはＲＥＣ−１細胞と共にＰＢＳ中で２分間、または血清含有培地中で４８時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、回収して、実施例１３．４に記載されるようなＴ７Ｅ１プロトコルアッセイを進めた。
構築したｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡおよびそれらの標的の配列は以下であった：
【化１１】
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【０３７４】
図５１Ａ〜５１Ｆは、種々の細胞型：ＨｅＬａ（図５１Ａおよび５１Ｂ）；ＮＫ（図５１Ｃ）；ＮＩＣ−１９６Ｈ（図５１Ｄ）；ＨＣＣ−７８（図５１Ｅ）およびＲＥＣ−１細胞（図５１Ｆ）において、種々の濃度、暴露時間で用いたシャトル剤ＦＳＤ５、ＦＳＤ８、ＦＳＤ１０またはＦＳＤ１８の非存在下（「−ｃｔｒｌ」）または存在下で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（２．５μＭ）およびｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（２μＭ）を用いた、アガロースゲル電気泳動による分離後の、標的ゲノムＨＰＲＴ  ＤＮＡ配列の切断の結果を示す。いくつかの事例では、ゲルレーンは、二通りにロードされた。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、より濃い中実矢印は、この標的遺伝子の切断産物に対応するバンドを示し、このことは、機能的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。我々は、種々のバンドのそれぞれの相対シグナル強度をゲル上で直接定量化するために、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＩｍａｇｅＬａｂ（商標）ソフトウェア（バージョン５．２．１、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ−ｒａｄ．ｃｏｍ／ｅｎ−ｃａ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｉｍａｇｅ−ｌａｂ−ｓｏｆｔｗａｒｅ？ｔａｂ＝Ｄｏｗｎｌｏａｄ）を使用した。所与のレーンの全バンドの合計は、１００％のシグナルに相当し、各レーンの下端のイタリック体の数値は、２つの切断産物バンド（濃い中実矢印）のみの相対シグナル％の合計である。陰性対照（「−ｃｔｒｌ」、すなわち、シャトル剤の非存在下でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体に曝露された細胞）では、切断産物のバンドは見つからなかった。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集複合体の核への送達が成功し、標的遺伝子の切断を生じたことを示す。
【０３７５】
Ｇ．１．２  短い直鎖ＤＮＡテンプレートと一緒のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体の形質導入により、相同組換えが生じる
Ｃａｓ９−ＮＬＳ組換えタンパク質（２．５μＭ）（実施例１３．１を参照されたい）；ＨＰＴＲ遺伝子のヌクレオチド配列を標的とするｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（２μＭ）（上記参照）；ペプチドシャトル剤ＦＳＤ５（１５μＭ）；および０ｎｇまたは５００ｎｇの短い直鎖テンプレートＤＮＡ（７２ｂｐ；下記参照）を含む混合物を調製した。
【化１２】
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【０３７６】
この混合物を血清含有培地中でＨｅＬａ細胞に４８時間曝露した。その後、細胞を洗浄し、実施例１３．４に記載されるようなＴ７Ｅ１アッセイに供した。
図５１Ｇは、短いＤＮＡテンプレートの非存在下（「テンプレートなし」）または存在下（＋５００ｎｇ）で、ＦＳＤ５（１５μＭ）により形質導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による標的ＨＰＲＴゲノム配列の切断を示す。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、より濃い中実矢印は、この標的遺伝子の切断産物に対応するバンドを示し、このことは、完全に機能するゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。各レーンの下端のイタリック体の数値は、２つの切断産物バンド（より濃い中実矢印）のみの相対シグナル％の合計である。これらの結果は、テンプレートＤＮＡの存在下または非存在下で、ＦＳＤ５が機能的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を形質導入できることを示す。
【０３７７】
相同組換えが起こったかどうかを検証するために、我々は、ＦＳＤ５／ＣＲＩＳＰＲ／短いＤＮＡテンプレート処理細胞から抽出したゲノムＤＮＡを用い、特別に設計したこの配列を標的とするオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、短いＤＮＡテンプレート配列を増幅した。短いＤＮＡテンプレート配列の増幅により、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳゲノム編集によるＨＰＲＴ遺伝子の切断後、このテンプレートのゲノム中への挿入が確証された。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動により分離され、結果は図５１Ｈに示されている。ゲノムＤＮＡが切断されたが、ＤＮＡテンプレートが供給されなかった「テンプレートなし」では、増幅は、検出されなかった（図５１Ｈ）。対照的に、ゲノムＤＮＡが切断され、ＤＮＡテンプレートが供給された「＋５００ｎｇ」試料では、適切なサイズのアンプリコンが検出された（図５１Ｈ、濃い実線）。アンプリコンの検出は、短いＤＮＡテンプレート配列のゲノムへの挿入が成功したことを示す。これらの結果は、短いＤＮＡテンプレートの存在下で、ＦＳＤ５がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を形質導入でき、相同組換えが生じたことを示す。
【０３７８】
Ｇ．１．３  長い直鎖ＤＮＡテンプレートと一緒のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体の形質導入により、相同組換えが生じる
Ｃａｓ９−ＮＬＳ組換えタンパク質（２．５μＭ）（実施例１３．１を参照されたい）；ＨＰＴＲ遺伝子のヌクレオチド配列を標的とするｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ（２μＭ）（上記参照）；ペプチドシャトル剤ＦＳＤ５（１５μＭ）；および０ｎｇまたは５００ｎｇのＧＦＰをコードする長い直鎖テンプレートＤＮＡ（１６３１ｂｐ；下記参照）を含む混合物を調製した。
【化１３】
2019531316.tif 000099
【０３７９】
この混合物を血清含有培地中でＨｅＬａ細胞に４８時間曝露した。細胞をＰＢＳで洗浄し、回収して、実施例１３．４に記載されるようなＴ７Ｅ１プロトコルアッセイを進めた。
【０３８０】
図５１Ｉは、長いＤＮＡテンプレートの非存在下（「テンプレートなし」）または存在下（「＋５００ｎｇ」）で、ＦＳＤ５（１５μＭ）により形質導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体による標的ゲノムＨＰＲＴゲノム配列の切断を示す。切断産物は、濃い中実矢印で示される。これらの結果は、長いテンプレートＤＮＡの存在下または非存在下で、ＦＳＤ５が機能的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を形質導入できることを示す。
【０３８１】
相同組換えが起こったかどうかを検証するために、我々は、ＦＳＤ５／ＣＲＩＳＰＲ／長いＤＮＡテンプレート処理細胞から抽出したゲノムＤＮＡを用い、特別に設計したこの配列に隣接するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、長いＤＮＡテンプレート配列を増幅した。長いＤＮＡテンプレート配列の増幅により、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳゲノム編集によるＨＰＲＴ遺伝子の切断後、このテンプレートのゲノム中への挿入が確証された。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動により分離され、結果は図５１Ｊに示されている。「テンプレートなし」試料では、長いＤＮＡテンプレートの挿入を欠くアンプリコンに対応する単一バンドが検出された。対照的に、「＋５００ｎｇ」（微弱）および「＋１０００ｎｇ」（より黒い）試料に対応する追加のより大きなバンド（矢印で示す）が検出され、ゲノムＤＮＡ中への一部の長いＤＮＡテンプレートの挿入を示す。これらの結果は、長いＤＮＡテンプレートの存在下で、ＦＳＤ５がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体を形質導入でき、相同組換えが生じたことを示す。
【０３８２】
Ｇ２．合理的に設計されたシャトル剤によるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ複合体形質導入、ＨｅＬａおよびＮＫ細胞中でのゲノム標的配列の切断
実施例３．１ａに記載の形質導入プロトコルを用いて、Ｃｐｆ１−ＮＬＳ組換えタンパク質（２．５μＭ）およびＤＮＭＴ１遺伝子のヌクレオチド配列をターゲッティングするｃｒＲＮＡ（２μＭ；下記を参照のこと）から構成される混合物を、種々の濃度のＦＳＤ１８と同時インキュベートし、さらに、ＨｅＬａまたはＮＫ細胞と共にＨｅＬａ細胞中で２分間、またはＰＢＳ中のＮＫ細胞中でもしくは血清不含培地中で９０秒間インキュベートした。
製造したＣｐｆ１−ＮＬＳ組換えタンパク質の配列は以下であった：
【化１４】
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（ＭＷ＝１５５．７ｋＤａ；ｐＩ＝８．３４）
ＮＬＳ配列には下線を付与した。
セリン／グリシンリッチリンカーは太字である。
使用したｃｒＲＮＡの配列は、以下であった：
【化１５】
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【０３８３】
２分後（ＨｅＬａ）または９０秒後（ＮＫ）、細胞をＰＢＳで洗浄し、回収して、実施例１３．４に記載されるようなＴ７Ｅ１プロトコルアッセイを進めた。ＰＣＲ増幅ＤＮＭＴ１  ＤＮＡ配列およびこの配列のＰＣＲ増幅切断産物をアガロースゲルで分離し、結果を図５１Ｋ（ＨｅＬａ細胞）および５１Ｌ（ＮＫ細胞）に示す。陰性対照（「−ｃｔｒｌ」）は、シャトル剤の非存在下でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ複合体に曝露された細胞に対応する。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、濃い中実矢印は、この標的遺伝子の切断産物に対応するバンドを示し、このことは、完全に機能するＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。各レーンの下端のイタリック体の数値は、２つの切断産物バンド（濃い中実矢印）のみの相対シグナル％の合計である。これらの結果は、ＦＳＤ１８が機能的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ複合体をこれらの細胞の核中に形質導入して、標的遺伝子の切断することができることを示す。
【０３８４】
ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）技術は、市販のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質送達用に最適化されたリポフェクタミン系遺伝子導入試薬である。しかし、同等のＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１の形質導入用の試薬は、現時点で存在しない。興味深いことに、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）試薬を我々が使用すると、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ複合体を付着細胞および懸濁細胞を送達できなかった。対照的に、ＦＳＤ１８は、ＨｅＬａ細胞中のＤＮＭＴ１標的の確実な切断を、およびＮＫ細胞ではより低いが観察可能な切断を可能とした。
【０３８５】
これらの結果は、シャトル剤ＦＳＤ１８が、機能的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ複合体をＨｅＬａおよびＮＫ細胞の核にうまく送達したこと、およびこの送達がゲノムＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ媒介ゲノムＤＮＡ切断をもたらしたことを示す。
【０３８６】
実施例Ｇ．３〜Ｇ．１０：合理的に設計されたペプチドシャトル剤は、単一または複数遺伝子の標的化を可能とし、および／または種々のＣＲＩＳＰＲベースゲノム編集複合体の同時送達を可能とする
これらの実施例は、合理的に設計されたペプチドシャトル剤の複数遺伝子標的の同時の送達および編集を可能とする。機能的ＣＲＩＳＰＲベースゲノム編集複合体を真核細胞の核に送達し、標準的ＤＮＡ切断アッセイを用いて、ゲノム編集の成功を評価した。これらのアッセイを用いて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介細胞ゲノムＤＮＡ配列ＨＰＲＴ（ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１）およびＢ２Ｍ（β２ミクログロブリンＨＬＡサブユニット）の切断を測定し、さらに、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介細胞ゲノムＤＮＡ配列ＮＫＧ２Ａ（阻害性ＮＫ細胞受容体２Ａ）、ＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）、ＣＢＬＢ（Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ）、ＤＮＭＴ１（ＤＮＡ（シトシン−５−）−メチルトランスフェラーゼ１）およびＢ２Ｍ（β２ミクログロブリンＨＬＡサブユニット）の切断を測定した。我々はまた、同じ細胞中で１つまたは２つの遺伝子を標的とする複数のＣＲＩＳＰＲ系の送達を用いたより複雑なゲノム編集手法を実施した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１複合体を、一緒にＨｅＬａ細胞に送達し、ＨＰＲＴおよびＤＮＭＴ１遺伝子をそれぞれ編集したか、またはエキソン２の２つの異なる座位のＢ２Ｍ遺伝子を編集した。最終的に、我々は、それぞれ特殊なｃｒＲＮＡを有する２つのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１複合体を同時送達し、ＮＫ細胞のＢ２Ｍ遺伝子中の２つのエキソンを編集した。
【０３８７】
Ｇ．３  種々の合理的に設計されたペプチドシャトル剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１複合体をＨｅＬａ、ＴＨＰ−１およびＮＫ細胞中のＢ２Ｍ遺伝子編集のために送達する。
Ｃａｓ９−ＮＬＳ組換えタンパク質は、実施例１３．１に記載のようにして調製された。Ｃｐｆ１−ＮＬＳ組換えタンパク質は、実施例Ｇ．２に記載のようにして調製された。実施例３．１ａに一般的に記載の形質導入プロトコルを用いて、Ｃａｓ９−ＮＬＳ組換えタンパク質とそのそれぞれのｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡとから構成される混合物、またはＣｐｆ１−ＮＬＳ組換えタンパク質とＢ２Ｍ遺伝子のヌクレオチド配列を標的とするそのそれぞれのシングルガイドｃｒＲＮＡ（下記参照）とから構成される混合物を、種々の濃度のペプチドＦＳＤ１０、ＦＳＤ１８、ＦＳＤ１９、ＦＳＤ２１、ＦＳＤ２２、またはＦＳＤ２３と同時インキュベートし、さらに、ＨｅＬａ、ＴＨＰ−１またはＮＫ細胞と共にＰＢＳ中で９０秒間、または血清不含培地中で１時間、または血清含有培地中で４８時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、回収して、実施例１３．４に記載されるようなＴ７Ｅ１プロトコルアッセイを進めた。
構築したｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡおよびそれらの標的の配列は以下であった：
【化１６】
2019531316.tif 000102
【０３８８】
図５２Ａ〜５２Ｄは、種々の細胞型：ＴＨＰ−１（図５２Ａ）、およびＮＫ（図５２Ｂ、５２Ｃ、５２Ｄ）において、種々の濃度、暴露時間で用いたペプチドＦＳＤ１０、ＦＳＤ１８、ＦＳＤ１９、ＦＳＤ２１またはＦＳＤ２３の非存在下（「−ｃｔｒｌ」）または存在下で、ｃｒＲＮＡ−１またはｃｒＲＮＡ−２（２μＭ）と共にＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１（１．３３μＭ）の送達後に切断された標的ゲノムＢ２Ｍ  ＤＮＡ配列の、アガロースゲル電気泳動による分離の結果を示す。図５２Ｄは、ＦＳＤ１８またはＦＳＤ２１の存在下で、それぞれの、特異的シングルガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ−１またはｃｒＲＮＡ−２）を保持するＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１複合体の送達後のゲノムＢ２Ｍエキソン２  ＤＮＡ配列の切断産物を示す。図５２Ｅは、１０μＭで、ＨｅＬａ細胞中１時間使用したペプチドＦＳＤ２２の非存在下（「−ｃｔｒｌ」）または存在下で、ゲノムＢ２Ｍエキソン２  ＤＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（２．５μＭ）およびｃｒＲＮＡ（２μＭ）による、アガロースゲル電気泳動による分離後の切断産物を示す。ゲルレーンは、二通りにロードされた。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、濃い中実矢印は、この標的遺伝子の切断産物に対応するバンドを示し、このことは、完全に機能するＣＲＩＳＰＲゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。我々は、種々のバンドのそれぞれの相対シグナル強度をゲル上で直接定量化するために、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＩｍａｇｅＬａｂ（商標）ソフトウェア（バージョン５．２．１、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ−ｒａｄ．ｃｏｍ／ｅｎ−ｃａ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｉｍａｇｅ−ｌａｂ−ｓｏｆｔｗａｒｅ？ｔａｂ＝Ｄｏｗｎｌｏａｄ）を使用した。所与のレーンの全バンドの合計は、１００％のシグナルに相当し、各レーンの下端のイタリック体の数値は、２つの切断産物バンド（濃い中実矢印）のみの相対シグナル％の合計である。陰性対照（「−ｃｔｒｌ」、すなわち、ＦＳＤペプチドの非存在下でＣＲＩＳＰＲ系に曝露された細胞）では、切断産物のバンドは見つからなかった。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集複合体の核への送達の成功し、標的遺伝子の切断を生じたことを示す。
【０３８９】
Ｇ．４  種々の合理的に設計されたペプチドシャトル剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系を、ＮＫ、ＴＨＰ−１および初代筋芽細胞中のＧＳＫ３、ＣＢＬＢおよびおＤＮＭＴ１遺伝子編集のために送達する。
Ｃｐｆ１−ＮＬＳ組換えタンパク質は、実施例Ｇ．２に記載のようにして調製された。実施例３．１ａに一般的に記載の形質導入プロトコルを用いて、Ｃｐｆ１−ＮＬＳ組換えタンパク質と、ＧＳＫ３、ＣＢＬＢおよびおＤＮＭＴ１遺伝子のヌクレオチド配列を標的とするシングルガイドｃｒＲＮＡ（下記参照）とから構成される混合物を、種々の濃度のＦＳＤ１０、ＦＳＤ１８、ＦＳＤ１９またはＦＳＤ２３と同時インキュベートし、さらに、ＮＫ細胞と共に血清含有培地中で４８時間、およびＴＨＰ−１またはＰＢＳ中の初代筋芽細胞中で９０秒間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、回収して、実施例１３．４に記載されるようなＴ７Ｅ１プロトコルアッセイを進めた。
構築したｃｒＲＮＡおよびそれらの標的の配列は以下であった：
【化１７】
2019531316.tif 000103
【０３９０】
図５２Ｆ〜５２Ｉは、種々の細胞型：ＮＫ（図５２Ｆおよび５２Ｇ）、ＴＨＰ−１（図５２Ｈ）および初代筋芽細胞（図５２Ｉ）において、種々の濃度、暴露時間で用いたシャトル剤ＦＳＤ１０、ＦＳＤ１８、ＦＳＤ１９またはＦＳＤ２３の非存在下（「−ｃｔｒｌ」）または存在下で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１（１．３３μＭ）およびｃｒＲＮＡ（２μＭ）を用いた、標的ゲノムＧＳＫ３、ＣＢＬＢおよびＤＮＭＴ１  ＤＮＡ配列の、アガロースゲル電気泳動による分離後の切断の結果を示す。ゲルレーンは、二通りにロードされた。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、濃い中実矢印は、この標的遺伝子の切断産物に対応するバンドを示し、このことは、完全に機能するＣＲＩＳＰＲゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。
【０３９１】
Ｇ．５  種々の合理的に設計されたペプチドシャトル剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系を、ＮＫ細胞中でのＮＫＧ２Ａ遺伝子編集のために送達する。
Ｃｐｆ１−ＮＬＳ組換えタンパク質は、実施例Ｇ．２に記載のようにして調製された。実施例３．１ａに一般的に記載の形質導入プロトコルを用いて、Ｃｐｆ１−ＮＬＳ組換えタンパク質と、ＮＫＧ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列を標的とするシングルガイドｃｒＲＮＡ（下記参照）とから構成される混合物を、種々の濃度のＦＳＤ１０、ＦＳＤ２１、ＦＳＤ２２またはＦＳＤ２３と同時インキュベートし、さらに、ＮＫおよびＮＫ−９２細胞と共にＰＢＳ中で９０秒間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、回収して、実施例１３．４に記載されるようなＴ７Ｅ１プロトコルアッセイを進めた。
構築したｃｒＲＮＡおよびそれらの標的の配列は以下であった：
【化１８】
2019531316.tif 000104
【０３９２】
図５２Ｊ〜５２Ｎは、ＮＫおよびＮＫ−９２細胞において、種々の濃度、暴露時間で用いたシャトル剤ＦＳＤ１０、ＦＳＤ２１、ＦＳＤ２２またはＦＳＤ２３の非存在下（「−ｃｔｒｌ」）または存在下で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１（１．３３μＭ）およびｃｒＲＮＡ（２μＭ）を用いた、標的ゲノムＮＫＧ２Ａ  ＤＮＡ配列の、アガロースゲル電気泳動による分離後の切断の結果を示す。ゲルレーンは、二通りにロードされた。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、濃い中実矢印は、この標的遺伝子の切断産物に対応するバンドを示し、このことは、完全に機能するＣＲＩＳＰＲゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。
【０３９３】
Ｇ．６  種々の合理的に設計されたペプチドシャトル剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１複合体をＨｅＬａおよびＮＫ細胞中でのＨＰＲＴ、ＤＮＭＴ１およびＢ２Ｍ遺伝子編集のために同時送達する。
Ｃａｓ９−ＮＬＳ組換えタンパク質は、実施例１３．１に記載のようにして調製された。Ｃｐｆ１−ＮＬＳ組換えタンパク質は、実施例Ｇ．２に記載のようにして調製された。実施例３．１ａに一般的に記載の形質導入プロトコルを用いて、Ｃａｓ９−ＮＬＳ組換えタンパク質とそのそれぞれのｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡとから構成される混合物、またはＣｐｆ１−ＮＬＳ組換えタンパク質とＤＮＭＴ１、ＨＰＲＴおよびＢ２Ｍ遺伝子のヌクレオチド配列を標的とするそのそれぞれのシングルガイドｃｒＲＮＡ（下記参照）とから構成される混合物を、種々の濃度のＦＳＤ１０、ＦＳＤ１８、ＦＳＤ２１またはＦＳＤ２３と同時インキュベートし、さらに、ＨｅＬａおよびＮＫ細胞と共にＰＢＳ中で９０秒間または２分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、回収して、実施例１３．４に記載されるようなＴ７Ｅ１プロトコルアッセイを進めた。
構築したｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡおよびそれらの標的の配列は以下であった：
【化１９】
2019531316.tif 000105
【０３９４】
図５３Ａ〜５３Ｃは、ＨｅＬａおよびＮＫ細胞において、種々の濃度、暴露時間で用いたシャトル剤ＦＳＤ１０、ＦＳＤ１８、ＦＳＤ２１またはＦＳＤ２３の非存在下（「−ｃｔｒｌ」）または存在下で、種々のＣＲＩＳＰＲ系を用いた、標的ゲノムＤＮＭＴ１、ＨＰＲＴおよびＢ２Ｍ  ＤＮＡ配列の、アガロースゲル電気泳動による分離後の切断の結果を示す。図５３Ａは、ＨｅＬａ細胞中の、ＤＮＭＴ１標的化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１（１．２５μＭ）複合体およびＨＰＲＴ標的化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（１．２５μＭ）複合体の同時送達後の、同じゲノムＤＮＡ抽出物由来のＤＮＭＴ１（左パネル）およびＨＰＲＴ（右パネル）ＤＮＡ切断産物を示す。図５３Ｂは、ＨｅＬａ細胞中の、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１（１．２５μＭ）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（１．２５μＭ）の同時送達後の、同じゲノムＤＮＡ抽出物由来のＢ２Ｍエキソン２の切断産物を示す。それぞれの複合体は、Ｃｐｆ１に隣接する特異的ｃｒＲＮＡ（左パネル）またはＣａｓ９に隣接する特異的ｃｒＲＮＡ（右パネル）を介してＢ２Ｍエキソン２中の異なる座位を標的とした。図５３Ｃは、ＦＳＤ１０（上段パネル）、ＦＳＤ２１（中断パネル）またはＦＳＤ２３（下段パネル）の存在下で、それぞれが、特異的シングルガイドｃｒＲＮＡ−１またはｃｒＲＮＡ−２（２μＭ）を保持するＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１（１．３３μＭ）複合体の同時送達後のゲノム抽出物由来のＢ２Ｍエキソン２の切断結果を示す。それぞれの実験では、ＮＫ細胞を、ｃｒＲＮＡ−１と共にＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１またはｃｒＲＮＡ−２と共にＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、または両方の複合体に曝露した。
【０３９５】
Ｇ．７  種々の合理的に設計されたペプチドシャトル剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１複合体を、Ｔ細胞中でのＢ２Ｍ遺伝子編集のために送達する。
Ｃｐｆ１−ＮＬＳ組換えタンパク質は、実施例Ｇ．２に記載のようにして調製された。
【０３９６】
別段の指定がない限り、本明細書で使用するＴ細胞は、ヘパリン処置したチューブ中に収集した健康なヒト血液から取得した。Ｔ細胞をフィコール（商標）技術（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＧＥまたはＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単離した。手短に説明すると、コニカルチューブ（５０ｍＬ）中で血液をフィコール（商標）溶液と混合し、２２８０ｒｐｍで２０分間遠心分離した。単核細胞を採取し、別のコニカルチューブ（５０ｍＬ）中で移した後、ＰＢＳで洗浄し、１１００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞を５ｍＬの２０％のＦＢＳ含有ＰＢＳ中で再懸濁した。細胞を計数した後、ＲＰＭＩ  ａｄｖａｎｃｅｄ（カタログ番号１２６３３０１２；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（１５１４０１２２；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％Ｌ−グルタミン（２５０３００８１；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＩＬ−２；３０Ｕ／ｍｌ）で構成された培地中でインキュベートした。次に、Ｔ細胞をヒトＴ細胞濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  カタログ番号：１９０５１）を用いて、製造業者の説明書に従ってネガティブ選択により濃縮した。濃縮したＴ細胞を、特異的抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  カタログ番号３００４３８）を用いて確認した。このステップで、集めた細胞は通常、約９９％Ｔ細胞であった。実験の前の５日間、完全培地中で、３０Ｕ／ｍＬのＩＬ２および抗ＣＤ２８抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  カタログ番号１６−０２８９−８５）を添加することにより、Ｔ細胞を活性化した。その後、Ｔ細胞増殖の活性化を抗ＣＤ２５および抗ＣＤ１３７抗体の両方を用いて二重チェックした。
【０３９７】
実施例３．１ａに一般的に記載の形質導入プロトコルを用いて、Ｃｐｆ１−ＮＬＳ組換えタンパク質と、Ｂ２Ｍ遺伝子のヌクレオチド配列を標的とするシングルガイドｃｒＲＮＡとから構成される混合物を、種々の濃度のＦＳＤ２１またはＦＳＤ１８ペプチドシャトル剤と同時インキュベートし、さらに、Ｔ細胞と共にＰＢＳ中で９０秒間インキュベートした。それぞれのＢ２Ｍ  ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ベースＢ２Ｍ遺伝子切断を媒介するように設計され、その表現型の効果は細胞表面ＨＬＡの破壊により調べることができ、これは、蛍光のＡＰＣマウス抗ヒトＨＬＡ−ＡＢＣ抗体を用いてフローサイトメトリーにより検出できる。
【０３９８】
その後、細胞を、１％ＦＢＳおよび４μＬのＡＰＣマウス抗ヒトＨＬＡ−ＡＢＣ抗体を含む１００μＬのＰＢＳ中に懸濁させ、その後、暗所で、周囲温度で２０分間インキュベーションした。次に、１％のＦＢＳを含有する１ｍＬのＰＢＳをその懸濁液に加え、続けて、１２００ｒｐｍで５分間遠心分離した。最後に、ペレットを、１％ＦＢＳ含有１００〜２００μＬのＰＢＳ中で再懸濁した後、フローサイトメトリー分析を実施した。
【０３９９】
それぞれに前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）パラメーターを用いた細胞サイズおよび粒状度を基準にしたフローサイトメトリー結果は、形質導入Ｔ細胞の生存率が、種々の試験濃度のＦＳＤ２１またはＦＳＤ１８ペプチドシャトル剤と、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系との同時送達により実質的に影響を受けなかったことを示した（データは示さず）。
【０４００】
図５４Ａ〜５４Ｄおよび５５Ａ〜５５Ｄは、それぞれ、シャトルペプチドＦＳＤ２１およびＦＳＤ１８を介したＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ゲノム編集複合体の送達を示す。図５４Ａおよび５５Ａでわかるように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１またはシャトルペプチドに曝露されなかった「未処理」陰性対照細胞は、有意なゲノム編集を示さなかった（ＨＬＡ陰性細胞の欠如）。図５４Ｂ〜５４Ｄは、８、１０および１２μＭのＦＳＤ２１の濃度は、９．８７％、８．６８％、および１２．２％のＨＬＡ陰性細胞を生じ、機能的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ゲノム編集複合体の核送達およびその後のゲノム編集に成功したことを示す。図５５Ｂ〜５５Ｄは、８、１０および１２μＭのＦＳＤ１８の濃度は、８．０％、９．４３％、および７．９％のＨＬＡ陰性細胞を生じ、機能的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ゲノム編集複合体の核送達およびその後のゲノム編集に成功したことを示す。
【０４０１】
Ｇ．８  単一の合理的に設計されたペプチドシャトル剤を用いた、ＴＨＰ−１細胞株中のＢ２Ｍを標的とする複数ガイドｃｒＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１複合体の形質導入
Ｃｐｆ１−ＮＬＳ組換えタンパク質は、実施例Ｇ．２に記載のようにして調製された。実施例３．１ａに一般的に記載の形質導入プロトコルを用いて、Ｃｐｆ１−ＮＬＳ組換えタンパク質と、Ｂ２Ｍ遺伝子の３つの選択されたヌクレオチド配列の１つを標的とするシングルガイドｃｒＲＮＡ（下記参照）とから構成される混合物を、（３μＭ）のＦＳＤ１８と同時インキュベートし、さらに、ＴＨＰ−１細胞と共にＰＢＳ中で９０秒間インキュベートした。Ｃｐｆ１−ＮＬＳ組換えタンパク質と、それぞれ３つの異なるＢ２Ｍ遺伝子のヌクレオチド配列を標的とする３つのガイド（下記参照）のから構成される混合物を用いて、同じ実験を実施した。実施例Ｇ．７に記載のようにして、フローサイトメトリー実験を実施した。また、実施例１３．４に記載のように、Ｔ７Ｅ１プロトコルアッセイで進めるために、細胞をＰＢＳで洗浄し、回収した。
構築したｃｒＲＮＡおよびそれらの標的の配列は以下であった：
【化２０】
2019531316.tif 000106
【０４０２】
それぞれに前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）パラメーターを用いた細胞サイズおよび粒状度を基準にしたフローサイトメトリー結果は、形質導入ＴＨＰ−１細胞の生存率が、ガイドｃｒＲＮＡ（ＲＮＡ−Ｅ、ＲＮＡ−Ｇ、ＲＮＡ−Ｊ）を別々に、または組み合わせて含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の存在により実質的影響を受けなかったことを示す（データは示さず）。
【０４０３】
図５６Ａでわかるように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１またはシャトルペプチドに曝露されなかった「未処理」陰性対照細胞は、有意なゲノム編集を示さなかった（ＨＬＡ陰性細胞の欠如）。図５６Ｂ〜５６Ｄは、別々に使用されたそれぞれのガイドｃｒＲＮＡ（ＲＮＡ−Ｅ、ＲＮＡ−Ｇ、ＲＮＡ−Ｊ）は、同等のＨＬＡ  ＫＯ効率をもたらしたことを示すが、図５６Ｅは、３つのガイドｃｒＲＮＡの組み合わせが、ＨＬＡ  ＫＯ効率をほぼ２倍まで高めることを示す。これらの観察は、実施例１３．４に記載のＴ７Ｅ１切断アッセイと、これに続く、アガロースゲル電気泳動を実施することにより確認された（データは示さず）。
【０４０４】
Ｇ．９  ＮＫＧ２Ａ遺伝子を不活化するためにゲノム編集したＮＫ細胞の増大した細胞傷害性。
ＮＫ−９２細胞中でゲノム編集を実施して、内在性ＮＫＧ２Ａ遺伝子の不活化が、ＮＫ−９２細胞の細胞傷害性を高めるかどうかを評価した。手短に説明すると、百万個のＮＫ−９２細胞を、ＮＫＧ２Ａ遺伝子を標的とするＣｐｆ１−ＮＬＳ（１．５μＭ）ｇＲＮＡ複合体、およびＦＳＤ２３（６μＭ）と共に９０秒間インキュベートした。形質導入後、細胞を、完全培地中でＩＬ２（２０ｎｇ／ｍＬ）と共に３７℃で４８時間インキュベートした。その後、ＮＫ−９２細胞を、製造業者の推奨条件に従って、フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ＮＫＧ２Ａ抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＃ＣＤ１５９ａ）で免疫標識した。次いで、ＮＫ−９２細胞をＦＡＣＳで分析し、それらの抗ＮＫＧ２Ａ検出（ＰＥ蛍光）レベルの関数としてスコア化した。結果を図５７Ａに示す。対照として、非標識野生型ＮＫ−９２細胞（「非標識ＷＴ細胞」）は、抗体シグナルがなく、標識野生型ＮＫ−９２細胞（「標識ＷＴ細胞」）は、完全な免疫標識シグナルを有した。ＮＫＧ２Ａ−ＫＯ  ＮＫ−９２細胞の場合、２つの細胞集団（ピーク）：１つは、細胞表面上のＮＫＧ２Ａ受容体発現の完全なノックアウトを有するもの（「完全ＮＫＧ２Ａ  ＫＯ細胞」）、およびもう１つは、発現の部分的欠如を有するもの（「部分的なＮＫＧ２Ａ  ＫＯ細胞」）が観察された。
【０４０５】
ＮＫＧ２Ａ遺伝子の不活化のＮＫ−９２細胞の細胞傷害性に対する影響を調査するために、我々は、ＷＴ  およびＮＫＧ２Ａ  ＫＯ  ＮＫ−９２細胞の標的ＨｅＬａ細胞を死滅させる能力を評価した。ＮＫ細胞中のＮＫＧ２Ａ遺伝子によりコードされるＮＫＧ２Ａ受容体は通常、標的候補細胞の表面上に発現されるＨＬＡ−Ｅエピトープに結合する。ＨＬＡ−ＥエピトープはＮＫ細胞の細胞傷害活性を抑制する（エフェクター）。このエフェクター：標的細胞結合を改善するために、ＨｅＬａ細胞をインターフェロン（５０ｎｇ／ｍＬ）で処理し、それらのＨＬＡ−Ｅ細胞表面発現を高めた。エフェクターＮＫ−９２細胞への曝露の前に、インターフェロン処理ＨｅＬａ細胞を、無傷の生細胞の容易に浸透する非蛍光の疎水性化合物であるカルセイン−ＡＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＃Ｃ３０９９）に、３７℃で４５分間曝露した。細胞内のエステラーゼによるカルセイン−ＡＭの加水分解により、細胞質中に十分に維持される親水性の強力な蛍光化合物であるカルセインを生成する。細胞内のカルセインを有するＨｅＬａ細胞は、その後、遠心分離され、完全培地中でインキュベートした後、９６ウェルプレート中、３７℃で４時間、ＷＴまたはＮＫＧ２Ａ−ＫＯ  ＮＫ細胞に曝露された。エフェクターＮＫ細胞による標的ＨｅＬａ細胞の死滅により、細胞内のカルセインの細胞外の培地中への放出が起こる。その後、９６ウェルプレートを１２５０ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清中のカルセインシグナルを４８８ｎｍの励起と５１０ｎｍの検出により分光測光法で分析した。結果を図５７Ｂに示し、これは、エフェクターＮＫ細胞の、標的ＨｅＬａ細胞に対する種々の比率（Ｅ：Ｔ比率）の関数として、標的ＨｅＬａ細胞の溶解パーセンテージ（カルセイン放出により測定）を示す。結果は、ＮＫ−９２細胞の表面上のＮＫＧ２Ａ受容体発現のノックアウト（「ＮＫ９２  ＮＫＧ２Ａ−ＫＯ」）は、野生型ＮＫ−９２細胞（ＮＫ９２−ＷＴ）に比べて、エフェクター細胞の細胞傷害活性を高めた。より具体的には、ＮＫＧ２Ａ−ＫＯ  ＮＫ−９２エフェクター細胞は、試験した種々のエフェクター：標的比率（Ｅ：Ｔ比率）で、ＷＴ  ＮＫ−９２細胞より、１０〜１５％多くの標的ＨｅＬａ細胞を死滅させた。
【０４０６】
Ｇ．１０  種々の合理的に設計されたペプチドシャトル剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系を、ＨｅＬａおよびＮＫ−９２細胞中でのＢ２ＭおよびＮＫＧ２Ａ遺伝子編集のために送達する。
Ｃｐｆ１−ＮＬＳ組換えタンパク質は、実施例Ｇ．２に記載のようにして調製された。実施例３．１ａに一般的に記載の形質導入プロトコルを用いて、Ｃｐｆ１−ＮＬＳ組換えタンパク質と、Ｂ２ＭまたはＮＫＧ２Ａ遺伝子のヌクレオチド配列を標的とするシングルガイドｃｒＲＮＡ（下記参照）とから構成される混合物を、２０μＭまたは６μＭの示したペプチドと同時インキュベートし、さらに、ＨｅＬａまたはＮＫ−９２細胞と共にＰＢＳ中で１分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、回収して、実施例１３．４に記載されるようなＴ７Ｅ１プロトコルアッセイを進めた。
構築したｃｒＲＮＡおよびそれらの標的は：Ｂ２Ｍ  ｃｒＲＮＡ−Ｇ（配列番号１６８）およびＮＫＧ２Ａ  ｃｒＲＮＡ（配列番号１６５）であった。
【０４０７】
表Ｇ１は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１（１．３３μＭ）およびｃｒＲＮＡ（２μＭ）による標的ゲノムＢ２ＭおよびＮＫＧ２Ａ  ＤＮＡ配列の切断から生じた挿入および欠失パーセンテージ（％ＩＮＤＥＬ）を示す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１とｃｒＲＮＡは、Ｔ７Ｅ１アッセイおよびアガロースゲル電気泳動（ｎ＝２）による直接定量化後に、ＨｅＬａおよびＮＫ−９２細胞中で、示したペプチドを種々の濃度で用いて形質導入した。パラメーター（５）（低疎水性モーメント）を満たすことができなかった、ペプチドＦＳＤ６７は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１をｌ形質導入できなかった。
【表７３】
2019531316.tif 000107
【０４０８】
実施例Ｈ：合理的に設計されたペプチドシャトル剤は、転写因子ＨＯＸＢ４の形質導入を可能にする
ヒトＨＯＸＢ４組換えタンパク質（実施例１４．１）を構築し、実施例１．４に記載の細菌発現系から発現させ、精製した。ＴＨＰ−１細胞を培養し、実施例３．１ｂに一般的に記載のタンパク質形質導入アッセイで試験した。手短に説明すると、形質導入の１日前にＴＨＰ−１細胞を、３００００個細胞／ウェルで播種した。ＨＯＸＢ４−ＷＴ組換えタンパク質（３００ｎＭまたは５０ｎＭ）を、ＦＳＤ１０またはＦＳＤ１８（１μＭ）と同時インキュベートした後、血清の存在下でＴＨＰ−１細胞に３０分間曝露した。ＨＯＸＢ４活性のマーカーとして標的遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定するために、細胞を実施例１４．２に記載されるようなリアルタイムＰＣＲ解析に供し、次いで、陰性対照細胞（処理なし）において検出された標的遺伝子ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、「対照に対する倍数」値を得た。全ＲＮＡレベル（ｎｇ／μＬ）も細胞生存率のマーカーとして測定した。結果を下に示す。
【表７４】
2019531316.tif 000108
【０４０９】
これらの結果は、シャトル剤ＦＳＤ１０およびＦＳＤ１８が、血清の存在下、転写因子ＨＯＸＢ４−ＷＴを、ＴＨＰ−１細胞の核に送達でき、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写の用量依存性増大をもたらすことを示す。
【０４１０】
実施例Ｉ：独立した蛍光タンパク質マーカーの同時形質導入は、形質導入細胞の単離の成功を可能とする。
本明細書に記載のドメインベースおよび合理的に設計されたペプチドシャトル剤の、２つの異なるポリペプチドカーゴを同時形質導入する能力を実施例９．６に（すなわち、蛍光タンパク質ＧＦＰ−ＮＬＳおよびｍＣｈｅｒｒｙ−ＮＬＳ）および実施例Ｇ．６（すなわち、ゲノム編集複合体ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１の同時形質導入）に示す。
【０４１１】
実施例Ｉに提示された結果は、蛍光タンパク質マーカー（例えば、ＧＦＰ−ＮＬＳ）およびゲノム編集複合体（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１）の同時形質導入の成功を示す。意外にも、蛍光タンパク質マーカーの同時形質導入が全体ゲノム編集効率それ自体を有意に高めることは見いだせなかったが、著しく高比率のゲノム工学に対し好ましい細胞は、蛍光タンパク質マーカーに対しても好ましいものであった。蛍光タンパク質マーカーに対し好ましい細胞の単離により、ゲノム編集に成功する細胞の比率が大きく増大した。さらに、相関は、タンパク質マーカーの最高の蛍光を示す細胞集団はまた、ゲノム編集成功の最高比率を示したという点で、濃度特異的であることが明らかになった。
【０４１２】
Ｉ．１  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳおよびＧＦＰ−ＮＬＳの同時形質導入後のＦＡＣＳによるゲノム編集Ｔ細胞の濃縮
Ｃｐｆ１−ＮＬＳ組換えタンパク質は、実施例Ｇ．２に記載のようにして調製され、ＧＦＰ−ＮＬＳ組換えタンパク質は実施例５．１に記載のように調製された。
【０４１３】
別段の指定がない限り、本明細書で使用するＴ細胞は、ヘパリン処置したチューブ中に収集した健康なヒト血液から取得した。Ｔ細胞をフィコール（商標）技術（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＧＥまたはＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（商標）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて単離した。手短に説明すると、コニカルチューブ（５０ｍＬ）中で血液をフィコール（商標）溶液と混合し、２２８０ｒｐｍで２０分間遠心分離した。単核細胞を採取し、別のコニカルチューブ（５０ｍＬ）中で移した後、ＰＢＳで洗浄し、１１００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞を５ｍＬの２０％のＦＢＳ含有ＰＢＳ中で再懸濁した。細胞を計数した後、ＲＰＭＩ  ａｄｖａｎｃｅｄ（カタログ番号１２６３３０１２；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎｓｔｒｅｐ（１５１４０１２２；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、１％Ｌ−グルタミン（２５０３００８１；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＩＬ−２；３０Ｕ／ｍｌ）で構成された培地中でインキュベートした。次に、Ｔ細胞をヒトＴ細胞濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  カタログ番号：１９０５１）を用いて、製造業者の説明書に従ってネガティブ選択により濃縮した。濃縮したＴ細胞を、特異的抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  カタログ番号３００４３８）を用いて確認した。このステップで、集めた細胞は通常、約９９％Ｔ細胞であった。実験の前の５日間、完全培地中で、３０Ｕ／ｍＬのＩＬ２および抗ＣＤ２８抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  カタログ番号１６−０２８９−８５）を添加することにより、Ｔ細胞を活性化した。その後、Ｔ細胞増殖の活性化を抗ＣＤ２５および抗ＣＤ１３７抗体の両方を用いて二重チェックした。
【０４１４】
Ｔ細胞を、実施例Ｇ．２に一般的に記載のように、Ｂ２Ｍ遺伝子を切断し、不活化するように設計した、ガイドＲＮＡ（Ｂ２Ｍ  ｃｒＲＮＡ−Ｅ、配列番号１６６）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１複合体を形質導入し、ゲノム編集細胞中の細胞表面ＨＬＡの不活化を生じた。手短に説明すると、４百万個の活性化Ｔ細胞をそれぞれの条件に対し用いた。１つの実験条件では、細胞を１５μＭのペプチドＦＳＤ１８およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ複合体を含む混合物で処理した直後に、細胞を９０秒間インキュベートした。第２の実験条件では、ＧＦＰ−ＮＬＳ（２０μＭ）を、１５μＭのＦＳＤ１８およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ複合体を含む混合物に加えた直後に、細胞を９０秒間インキュベートした。未処理細胞を陰性対照として用いた。形質導入後、細胞を洗浄し、培地に再懸濁した。未処理細胞およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ複合体で処理した細胞を、完全培地中で４８時間インキュベートした後、フローサイトメトリーおよびＴ７Ｅ１分析を実施した。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳおよびＧＦＰ−ＮＬＳ複合体で処理した細胞の第１の部分を、Ｔ細胞培地中で４８時間インキュベートした後、フローサイトメトリーおよびＴ７Ｅ１分析を実施した。細胞の第２の部分を遠心分離し、１％血清を含むＰＢＳ中に再懸濁した。ＧＦＰ陽性（＋）およびＧＦＰ陰性（−）細胞を、蛍光シグナルに基づいてセルソーターを用いて分離し、画分を集め、Ｔ細胞培地中で４８時間インキュベートした後、フローサイトメトリーおよびＴ７Ｅ１分析実施した。
【０４１５】
結果は図５８Ａ〜５８Ｆに示し、図中、象限１（Ｑ１）はＨＬＡ陽性（ゲノム編集されなかった）およびＧＦＰ陰性である細胞を表し；象限２（Ｑ２）はＨＬＡ陽性（ゲノム編集されなかった）およびＧＦＰ陽性である細胞を表し；象限３（Ｑ３）はＨＬＡ陰性（ゲノム編集成功）およびＧＦＰ陽性である細胞を表し；象限４（Ｑ４）はＨＬＡ陰性（ゲノム編集成功）およびＧＦＰ陰性である細胞を表す。それぞれに前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）パラメーターを用いた細胞サイズおよび粒状度を基準にしたフローサイトメトリー結果は、ＧＦＰ−ＮＬＳおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の試験条件下での同時送達が、形質導入Ｔ細胞の生存率に大きな影響を与えなかったことを示した（データは示さず）。
【０４１６】
図５８Ａに示すように、ペプチドシャトル剤にも、ＧＦＰにも、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１にも曝露されなかった「未処理」陰性対照細胞は、９９％の細胞をＱ１（ゲノム編集されなかった、ＧＦＰ陰性）中に生じた。図５８Ｂは、ＧＦＰ−ＮＬＳの非存在下でペプチドＦＳＤ１８（１５μＭ）およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１に曝露された細胞は、１０．１％の細胞をＱ４−すなわち、ＨＬＡ陰性（ゲノム編集成功）およびＧＦＰ陰性中に生じたことを示す。図５８Ｃは、ペプチドＦＳＤ１８の存在下で、ＧＦＰ−ＮＬＳおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１の両方に曝露された細胞は、６５．７％（５４．４％＋１１．３％）のＧＦＰ陽性細胞をＱ２＋Ｑ３中に生じ、１１．７％（０．４４１％＋１１．３％）のＨＬＡ陰性細胞（ゲノム編集成功）をＱ３＋Ｑ４中に生じた。図５８Ｂおよび５８Ｃを比較すると、ＧＦＰの存在または非存在が、全体ゲノム編集ゲノム編集効率を大きく高めることは見出されなかった（１０．１％に対するＨＬＡ陰性細胞の１１．７％）。意外にも、ゲノム編集細胞（ＨＬＡ陰性）の９６％超が、ＧＦＰ陽性でもあったことが観察された［図５８Ｃ、Ｑ３／（Ｑ３＋Ｑ４）］。それらのＧＦＰ蛍光に基づいてＧＦＰ陰性画分（図５８Ｅ）およびＧＦＰ陽性画分（図５８Ｆ）への細胞の蛍光標識細胞分取（図５８Ｄ）により、ＧＦＰ陽性画分中のゲノム編集（ＨＬＡ陰性）細胞の比率が２９．７％に増大した（図５８Ｆ）。際だったことに、ＧＦＰ陰性画分中のゲノム編集（ＨＬＡ陰性）細胞の比率は（図５８Ｅ）、０．１％未満であった。
【０４１７】
その後、それぞれの細胞画分を実施例１３．４に記載のようにＴ７Ｅ１切断アッセイに供し、種々の試料をアガロースゲル電気泳動に供した。結果を図５８Ｇに示すが、薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、より濃い中実矢印は、この標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ系媒介切断産物に対応するバンドを示し、このことは、完全に機能するＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。図５８Ｇからわかるように、ＧＦＰ陽性細胞画分（「ＧＦＰ＋細胞」；レーン４）は、選別前の細胞（「細胞選別なし」；レーン３）と比較して、ゲノム編集効率を高めた。ペプチドＦＳＤ１８およびＧＦＰ−ＮＬＳを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ複合体（レーン３）およびＧＦＬ−ＮＬＳ不含（レーン２）は、同じゲノム編集レベルを示し、ＧＦＰ−ＮＬＳの添加は、形質導入プロセスに影響を与えないことを示す。ＧＦＰ陰性細胞画分（レーン５）、および陰性対照（［未処理］；レーン１）は、検出可能なゲノム編集を示さなかった。
【０４１８】
Ｉ．２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳおよびＧＦＰ−ＮＬＳの同時形質導入後のＦＡＣＳによるゲノム編集Ｔ細胞のさらなる濃縮
実施例Ｉ．１に記載の実験を、１２μＭまたは１５μＭのペプチドＦＳＤ１８を用いて、活性化Ｔ細胞に対し繰り返した。ＦＳＤ１８の両方の濃度は類似の結果をもたらしたので、１５μＭのＦＳＤ１８を用いた結果のみを本明細書で示す。それぞれに前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）パラメーターを用いた細胞サイズおよび粒状度を基準にしたフローサイトメトリー結果は、ＧＦＰ−ＮＬＳおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の試験条件下での同時送達が、形質導入Ｔ細胞の生存率に大きな影響を与えなかったことを示した（データは示さず）。
【０４１９】
図５９Ａおよび５９Ｂは、ペプチドシャトル剤にも、ＧＦＰやＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１にも曝露されなかった「未処理」陰性対照細胞の結果を示し、これは、ＧＦＰ蛍光（図５９Ａ）および細胞表面ＨＬＡ発現（図５９Ｂ）に対しフローサイトメトリーにより分析された。Ｔ細胞を、ペプチドＦＳＤ１８（１５μＭ）を介して、ＧＦＰ−ＮＬＳおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１の両方で同時形質導入し、それらの蛍光シグナルを基準にして選別して、細胞画分を集め、４８時間インキュベートした。ＧＦＰ蛍光分布で選別して得られた細胞画分を図５９Ｃに示す。図５９Ｃの２つのゲートは、ＧＦＰ陽性であると見なされた細胞画分（「ＧＦＰ＋」；９３．２％）、および高いＧＦＰ蛍光を示すと見なされた細胞の細画分（「ＧＦＰ高」；３３．１％）を示す。蛍光標識細胞分取分析を実施して、高いＧＦＰ蛍光を示すと見なされた細胞（図５９Ｅ）に比べて、ＧＦＰ陽性であると見なされる細胞（図５９Ｄ）の細胞表面ＨＬＡ発現のレベルを定量化した。図５９Ｄでわかるように、２１．８％のＧＦＰ陽性細胞は、ＨＬＡ陰性（ゲノム編集成功）であり、この値は、細胞中の高ＧＦＰ蛍光を示す際だった４１．６％にまで上昇した（図５９Ｅ）。したがって、ゲノム編集成功（ＨＬＡ陰性）細胞の比率は、蛍光タンパク質マーカー（ＧＦＰ−ＮＬＳ）の蛍光レベルと共に増大した。
【０４２０】
１２μＭまたは１５μＭのＦＳＤ１８を用いて、上記同時形質導入実験を繰り返し、続けて、ＧＦＰ陽性およびＧＦＰ陰性細胞画分への蛍光標識細胞分取を実施した。それぞれの画分を実施例１３．４に記載のようにＴ７Ｅ１切断アッセイに供し、種々の試料をアガロースゲル電気泳動に供した。上述のフローサイトメトリー実験の結果と一致して、Ｔ７Ｅ１切断アッセイの結果は、ＧＦＰ陽性細胞画分は、ＧＦＰ陰性細胞画分に比べて、増大したゲノム編集効率を有した（データは示さず）。
【０４２１】
Ｉ．３  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳおよびＧＦＰ−ＮＬＳの同時形質導入後のＦＡＣＳによるゲノム編集ＴＨＰ−１細胞の濃縮
実施例Ｉ．１およびＩ．２で実施した実験をＴＨＰ−１細胞で再現し、類似の結果を得た。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳおよびＧＦＰ−ＮＬＳの２μＭのＦＳＤ１８の存在下での同時形質導入と、これに続く、ＧＦＰ陽性細胞の蛍光標識細胞分取により、ゲノム編集細胞が大きく濃縮された（データは示さず）。
【０４２２】
Ｉ．４  予め選別されたＧＦＰ陰性細胞におけるその後の形質導入の成功
この実施例は、ペプチドシャトル剤による第１ラウンドの形質導入後に形質導入されなかった細胞が、その後の形質導入に不応性とは限らないことを示している。
【０４２３】
実施例Ｉ．１に記載のようにして得たＴ細胞をＦＳＤ１８（１０μＭ）およびＧＦＰ−ＮＬＳ（２０μＭ）の９０秒間の同時インキュベーションにより第１の形質導入に供した後、洗浄し、３７℃でインキュベートした。「未処理」陰性対照細胞は、ＧＦＰシグナルを示さなかった（図６０Ａ）。ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入後に細胞選別を１８時間実施した。蛍光シグナルを基準にしてセルソーターを用いてＧＦＰ陽性およびＧＦＰ陰性細胞を分離し（図６０Ｂを参照されたい）、ＧＦＰ陰性細胞を回収し、単離した（図６０Ｃを参照されたい）。ＧＦＰ陰性細胞集団に対し、第１の形質導入と同じプロトコルを用いて第２のＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入を実施した。以前に記載したように１８時間後にＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入をフローサイトメトリーにより解析し、ＧＦＰ陽性細胞をフローサイトメトリーによりスコア化した。この第２の形質導入の結果を図６０Ｄに示し、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率は、６０．６％であることが明らかになった。
【０４２４】
この実施例は、ペプチドシャトル剤による第１ラウンドの形質導入後に形質導入されなかった細胞が、その後の形質導入に不応性とは限らないこと、および出発細胞集団中の全体形質導入効率は、形質導入されなかった細胞画分に対する反復連続形質導入実験により増大し得ることを示している。この反復連続形質導入実験の方法は、実施例Ｉ．１、Ｉ．２およびＩ．３で提供された同時形質導入結果と共に、有用な細胞集団（例えば、細胞治療用の患者由来細胞）、および／または本質的に形質導入がより困難な細胞集団におけるゲノム編集効率を高める魅力的な方法を示唆する。
【０４２５】
参考文献
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Ｆａｎａｒａ，Ｐ．，Ｍ．Ｒ．Ｈｏｄｅｌ，Ａ．Ｈ．Ｃｏｒｂｅｔｔ  ａｎｄ  Ａ．Ｅ．Ｈｏｄｅｌ（２０００）．”Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ（ＮＬＳ）−ｉｍｐｏｒｔｉｎ  ａｌｐｈａ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａｕｔｏ−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＬＳ  ｂｉｎｄｉｎｇ．”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５（２８）：２１２１８−２１２２３．
Ｆａｓｏｌｉ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）“Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｉｎｓｉｇｈｔ  ｉｎｔｏ  ＣＭ１８−Ｔａｔ１１  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｐｅｒｔｕｒｂｉｎｇ  ａｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｐａｔｃｈ−ｃｌａｍｐ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ．”  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．１９（７）：９２２８−３９．
Ｆａｗｅｌｌ，Ｓ．，Ｊ．Ｓｅｅｒｙ，Ｙ．Ｄａｉｋｈ，Ｃ．Ｍｏｏｒｅ，Ｌ．Ｌ．Ｃｈｅｎ，Ｂ．Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｂａｒｓｏｕｍ（１９９４）．”Ｔａｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌｓ．”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９１（２）：６６４−６６８．
Ｆｏｍｉｎａｙａ，Ｊ．，Ｃ．Ｕｈｅｒｅｋ  ａｎｄ  Ｗ．Ｗｅｌｓ（１９９８）．”Ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｖｉａ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．”  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５（４）：５２１−５３０．
Ｆｏｍｉｎａｙａ，Ｊ．ａｎｄ  Ｗ．Ｗｅｌｓ（１９９６）．”Ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｕｌｔｉｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｎｏｖｅｌ  ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ．”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１（１８）：１０５６０−１０５６８．
Ｆｏｎｏｕｄｉ，Ｈ．，Ｍ．Ｙｅｇａｎｅｈ，Ｆ．Ｆａｔｔａｈｉ，Ｚ．Ｇｈａｚｉｚａｄｅｈ，Ｈ．Ｒａｓｓｏｕｌｉ，Ｍ．Ａｌｉｋｈａｎｉ，Ｂ．Ａ．Ｍｏｊａｒａｄ，Ｈ．Ｂａｈａｒｖａｎｄ，Ｇ．Ｈ．Ｓａｌｅｋｄｅｈ  ａｎｄ  Ｎ．Ａｇｈｄａｍｉ（２０１３）．”ＩＳＬ１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．”  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８（１）：ｅ５５５７７．
Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）ＤＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｎａｔｒｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｒｅｇｏｒｙｉ  Ａｒｇｏｎａｕｔｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３４，７６８−７７３．
Ｇｉｇｕｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｈｉｎｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．２０１５  Ａｐｒ  ７；１１（４）：ｅ１００４０７４．
Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＲＩＳＰＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｄｕｌａｒ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．Ｃｅｌｌ  １５４，４４２−４５１．
Ｇｉｌｍｏｒｅ，Ｔ．Ｄ．ａｎｄ  Ｈ．Ｍ．Ｔｅｍｉｎ（１９８８）．”ｖ−ｒｅｌ  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｓｐｌｅｅｎ  ｃｅｌｌｓ．”  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６２（３）：７０３−７１４．
Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｓ．Ｍ．Ｎｇ，Ａ．Ｍｅｃｈｌｅｒ，Ｌ．Ｌ．Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ｊａｎｓ（２００９）．”Ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｎｏｎｄｉｖｉｄｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．”  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ２３（９）：２９９６−３００６．
Ｇｏｒｄｏｎ，Ｓ．Ｍ．，Ｊ．Ｃｈａｉｘ，Ｌ．Ｊ．Ｒｕｐｐ，Ｊ．Ｗｕ，Ｓ．Ｍａｄｅｒａ，Ｊ．Ｃ．Ｓｕｎ，Ｔ．Ｌｉｎｄｓｔｅｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｒｅｉｎｅｒ（２０１２）．”Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  Ｔ−ｂｅｔ  ａｎｄ  Ｅｏｍｅｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｋｅｙ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ．”  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３６（１）：５５−６７．
Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｓ．，Ｊ．Ｔ．Ｓｐａｒｒｏｗ，Ｊ．Ｈａｕｅｒ，Ｍ．Ｐ．Ｍｉｍｓ，Ｆ．Ｅ．Ｌｅｌａｎｄ，Ｓ．Ｌ．Ｗｏｏ  ａｎｄ  Ｌ．Ｃ．Ｓｍｉｔｈ（１９９６）．”Ａ  ｎｏｖｅｌ  ＤＮＡ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．”  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ３（５）：４４８−４５７．
Ｇｏｕｌｄ，Ｓ．Ｊ．，Ｇ．Ａ．Ｋｅｌｌｅｒ，Ｎ．Ｈｏｓｋｅｎ，Ｊ．Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉ（１９８９）．”Ａ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｔｒｉｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｏｒｔｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｓ．”  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０８（５）：１６５７−１６６４．
Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｐ．Ｍ．Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ（１９８８）．”Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔａｔ  ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ．”  Ｃｅｌｌ  ５５（６）：１１７９−１１８８．
Ｇｒｉｍｅｓ，Ｍ．Ｌ．，Ｊ．Ｚｈｏｕ，Ｅ．Ｃ．Ｂｅａｔｔｉｅ，Ｅ．Ｃ．Ｙｕｅｎ，Ｄ．Ｅ．Ｈａｌｌ，Ｊ．Ｓ．Ｖａｌｌｅｔｔａ，Ｋ．Ｓ．Ｔｏｐｐ，Ｊ．Ｈ．ＬａＶａｉｌ，Ｎ．Ｗ．Ｂｕｎｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｗ．Ｃ．Ｍｏｂｌｅｙ（１９９６）．”Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＴｒｋＡ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ．”  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６（２４）：７９５０−７９６４．
Ｇｕｏ，Ｚ．Ｙ．，Ｌｖ，Ｙ．Ｇ．，Ｗａｎｇ，Ｌ．，Ｓｈｉ，Ｓ．Ｊ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｇ．Ｘ．，Ｗｅｎ，Ｗ．Ｈ．＆  Ｙａｎｇ，Ａ．Ｇ．（２０１５）．Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ｇ  ａｎｄ  ＨＬＡ−Ｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９３，１０−６．
Ｈａｌｌｂｒｉｎｋ，Ｍ．，Ａ．Ｆｌｏｒｅｎ，Ａ．Ｅｌｍｑｕｉｓｔ，Ｍ．Ｐｏｏｇａ，Ｔ．Ｂａｒｔｆａｉ  ａｎｄ  Ｕ．Ｌａｎｇｅｌ（２００１）．”Ｃａｒｇｏ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．”  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５１５（２）：１０１−１０９．
Ｈｅｒｃｅ，Ｈ．Ｄ．ａｎｄ  Ａ．Ｅ．Ｇａｒｃｉａ（２００７）．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｓｕｇｇｅｓｔ  ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＨＩＶ−１  ＴＡＴ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｃｒｏｓｓ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０４（５２）：２０８０５−２０８１０．
Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）．“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ：ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．”  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１：４７４−４７７．
Ｈｏｒｎｇ，Ｔ．，Ｂｅｚｂｒａｄｉｃａ，Ｊ．Ｓ．＆  Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．（２００７）．ＮＫＧ２Ｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １５  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８，１３４５−５２．
Ｈｕｒｔ，Ｅ．Ｃ．，Ｂ．Ｐｅｓｏｌｄ−Ｈｕｒｔ，Ｋ．Ｓｕｄａ，Ｗ．Ｏｐｐｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｇ．Ｓｃｈａｔｚ（１９８５）．”Ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｔｗｅｌｖｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ｈａｌｆ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｅ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）ｏｆ  ａｎ  ｉｍｐｏｒｔｅｄ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｎ  ｄｉｒｅｃｔ  ｍｏｕｓｅ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｍａｔｒｉｘ．”  ＥＭＢＯ  Ｊ  ４（８）：２０６１−２０６８．
Ｉｃｈｉｉ，Ｈ．，Ａ．Ｓａｋａｍｏｔｏ，Ｙ．Ｋｕｒｏｄａ  ａｎｄ  Ｔ．Ｔｏｋｕｈｉｓａ（２００４）．”Ｂｃｌ６  ａｃｔｓ  ａｓ  ａｎ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．”  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３（２）：８８３−８９１．
Ｉｒｉｅ，Ｙ．，Ｋ．Ｙａｍａｇａｔａ，Ｙ．Ｇａｎ，Ｋ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｅ．Ｄｏ，Ｃ．Ｈ．Ｋｕｏ，Ｅ．Ｔａｉｒａ  ａｎｄ  Ｎ．Ｍｉｋｉ（２０００）．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｉｄａ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｈｉｃｈ  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ａｒｃ，ｃｏｎｔａｉｎｓ  ｎｏｖｅｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ，ａｎｄ  ｃａｕｓｅｓ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｃｅｌｌｓ．”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５（４）：２６４７−２６５３．
Ｉｓｈｉｇａｍｉ，Ｓ．，Ａｒｉｇａｍｉ，Ｔ．，Ｏｋｕｍｕｒａ，Ｈ．，Ｕｃｈｉｋａｄｏ，Ｙ．，Ｋｉｔａ，Ｙ．，Ｋｕｒａｈａｒａ，Ｈ．，Ｍａｅｍｕｒａ，Ｋ．，Ｋｉｊｉｍａ，Ｙ．，Ｉｓｈｉｈａｒａ，Ｙ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｋ．，Ｕｅｎｏｓｏｎｏ，Ｙ．＆  Ｎａｔｓｕｇｏｅ，Ｓ．（２０１５）．Ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）−Ｅ  ａｎｄ  ＨＬＡ−Ｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３５，２２７９−８５．
Ｋａｋｕｄｏ，Ｔ．，Ｓ．Ｃｈａｋｉ，Ｓ．Ｆｕｔａｋｉ，Ｉ．Ｎａｋａｓｅ，Ｋ．Ａｋａｊｉ，Ｔ．Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｋ．Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｈ．Ｋａｍｉｙａ  ａｎｄ  Ｈ．Ｈａｒａｓｈｉｍａ（２００４）．”Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｅｑｕｉｐｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ：ａｎ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｖｉｒａｌ−ｌｉｋｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ．”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（１９）：５６１８−５６２８．
Ｋａｒｎｉｅｌｙ，Ｓ．ａｎｄ  Ｏ．Ｐｉｎｅｓ（２００５）．”Ｓｉｎｇｌｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−−ｄｕａｌ  ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｄｕａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．”  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ  ６（５）：４２０−４２５．
Ｋａｔｏ，Ｇ．Ｊ．，Ｗ．Ｍ．Ｌｅｅ，Ｌ．Ｌ．Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｖ．Ｄａｎｇ（１９９２）．”Ｍａｘ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃ−Ｍｙｃ．”  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ６（１）：８１−９２．
Ｋｉｃｈｌｅｒ，Ａ．，Ａ．Ｊ．Ｍａｓｏｎ  ａｎｄ  Ｂ．Ｂｅｃｈｉｎｇｅｒ（２００６）．”Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．”  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７５８（３）：３０１−３０７．
Ｋｉｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）．“Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ”．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００３  Ｆｅｂ  １８；１００（４）：１５６４−１５６８．
Ｋｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）．‘’Ｕｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｓｃｅｎａｒｉｏ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ’’．Ｂｉｏｌ  Ｄｉｒｅｃｔ．２０１１；６：３８．
Ｋｉｒｗａｎ，Ｓ．Ｅ．＆  Ｂｕｒｓｈｔｙｎ，Ｄ．Ｎ．（２００５）．Ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  Ｉｇ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｉｇ−ｌｉｋｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ２（ＩＬＴ２／ＣＤ８５ｊ／ＬＩＬＲＢ１／ＬＩＲ−１）．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５，５００６−１５．
Ｋｌｅｉｎｓｃｈｍｉｄｔ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ａ．Ｓｅｉｔｅｒ（１９８８）．”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｎ１  ｏｆ  Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ．”  ＥＭＢＯ  Ｊ  ７（６）：１６０５−１６１４．
Ｋｏｈｌｅｒ，Ｍ．，Ｄ．Ｇｏｒｌｉｃｈ，Ｅ．Ｈａｒｔｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｆｒａｎｋｅ（２００１）．”Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｅ１Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｉｍｐｏｒｔ  ｉｓ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｍｐｏｒｔｉｎ  ａｌｐｈａ３  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．”  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８９（２）：１８６−１９１．
Ｋｗｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）．“Ａ  Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ＨＧＰ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔｈａｔ  Ｒｅｔａｉｎｓ  Ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ”．Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，７：１２６０−６５．
Ｌａｍｉａｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）．“ＰＥＰ−ＦＯＬＤ３：ｆａｓｔｅｒ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｌｉｎｅａｒ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４４（Ｗ１）：Ｗ４４９−５４．
Ｌａｎｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．，Ｐ．Ｋａｎｄａ  ａｎｄ  Ｒ．Ｃ．Ｋｅｎｎｅｄｙ（１９８６）．”Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ＳＶ４０  Ｔ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｓｉｇｎａｌ．”  Ｃｅｌｌ  ４６（４）：５７５−５８２．
Ｌｅｅ，Ｎ．，Ｌｌａｎｏ，Ｍ．，Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ，Ｍ．，Ｉｓｈｉｔａｎｉ，Ａ．，Ｎａｖａｒｒｏ，Ｆ．，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｏｔｅｔ，Ｍ．＆  Ｇｅｒａｇｈｔｙ，Ｄ．Ｅ．（１９９８）．ＨＬＡ−Ｅ  ｉｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９５，５１９９−２０４．
Ｌｅｖｙ，Ｅ．Ｍ．，Ｂｉａｎｃｈｉｎｉ，Ｍ．，Ｖｏｎ  Ｅｕｗ，Ｅ．Ｍ．，Ｂａｒｒｉｏ，Ｍ．Ｍ．，Ｂｒａｖｏ，Ａ．Ｉ．，Ｆｕｒｍａｎ，Ｄ．，Ｄｏｍｅｎｉｃｈｉｎｉ，Ｅ．，Ｍａｃａｇｎｏ，Ｃ．，Ｐｉｎｓｋｙ，Ｖ．，Ｚｕｃｃｈｉｎｉ，Ｃ．，Ｖａｌｖａｓｓｏｒｉ，Ｌ．＆  Ｍｏｒｄｏｈ，Ｊ．（２００８）．Ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−Ｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ３２，６３３−４１．
Ｌｉ，Ｗ．，Ｆ．Ｎｉｃｏｌ  ａｎｄ  Ｆ．Ｃ．Ｓｚｏｋａ，Ｊｒ．（２００４）．”ＧＡＬＡ：ａ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．”  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５６（７）：９６７−９８５．
Ｌｉｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｆ．Ｃ．Ｃｈｏｕ，Ｌ．Ｔ．Ｙｅｈ，Ｓ．Ｈ．Ｆｕ，Ｈ．Ｙ．Ｃｈｉｏｕ，Ｋ．Ｉ．Ｌｉｎ，Ｄ．Ｍ．Ｃｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｈ．Ｋ．Ｓｙｔｗｕ（２０１３）．”Ｂ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １（ＢＬＩＭＰ−１）ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  ＮＯＤ  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ｔｈ１  ａｎｄ  Ｔｈ１７  ｃｅｌｌｓ．”  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５６（１）：１３６−１４６．
Ｌｉｕ，Ｘ．，Ｐ．Ｋ．Ｔｉａｎ，Ｄ．Ｗ．Ｊｕ，Ｍ．Ｈ．Ｚｈａｎｇ，Ｍ．Ｙａｏ，Ｘ．Ｔ．Ｃａｏ  ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．Ｇｕ（２００３）．”Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｐ２１ＷＡＦ−１  ａｎｄ  ＧＭ−ＣＳＦ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｐｌｅｘ．”  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０（７）：５２９−５３９．
Ｌｏｅｓｅｒ，Ｓ．，Ｌｏｓｅｒ，Ｋ．，Ｂｉｊｋｅｒ，Ｍ．Ｓ．，Ｒａｎｇａｃｈａｒｉ，Ｍ．，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ，Ｓ．Ｈ．，Ｗａｄａ，Ｔ．，Ｂｅｉｓｓｅｒｔ，Ｓ．，Ｍｅｌｉｅｆ，Ｃ．Ｊ．＆  Ｐｅｎｎｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．（２００７）．Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｂｌ−ｂ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０４，８７９−９１．
Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅ．（１９９２）．”Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ：ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ．”  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １１１３（１）：２５−５１．
Ｌｏｒｄ−Ｄｕｆｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）“Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｂｙ  ＨＩＦ−１ａｌｐｈａ：Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｇ６ＰＴ  ｗｉｔｈ  ｍｕｍｂａｉｓｔａｔｉｎ  ａｎａｌｏｇｓ  ｉｎ  ｈｙｐｏｘｉｃ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ”．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ２７：４８９−４９７．
Ｌｏｒｉｅａｕ，Ｊ．Ｌ．，Ｊ．Ｍ．Ｌｏｕｉｓ  ａｎｄ  Ａ．Ｂａｘ（２０１０）．”Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ａｄｏｐｔｓ  ａ  ｔｉｇｈｔ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｈａｉｒｐｉｎ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ  ａｔ  ｔｈｅ  ｌｉｐｉｄ：ｗａｔｅｒ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．”  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０７（２５）：１１３４１−１１３４６．
Ｌｉｎ，Ａ．，Ｙａｎ，Ｗ．Ｈ．，Ｘｕ，Ｈ．Ｈ．，Ｇａｎ，Ｍ．Ｆ．，Ｃａｉ，Ｊ．Ｆ．，Ｚｈｕ，Ｍ．＆  Ｚｈｏｕ，Ｍ．Ｙ．（２００７）．ＨＬＡ−Ｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｓ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  １８，１８０４−９．
Ｌｉｕ，Ｑ．，Ｚｈｏｕ，Ｈ．，Ｌａｎｇｄｏｎ，Ｗ．Ｙ．＆  Ｚｈａｎｇ，Ｊ．（２０１４）．Ｅ３  ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅ  Ｃｂｌ−ｂ  ｉｎ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  １３，１８７５−８４．
Ｌｕ，Ｓ．Ｊ．，Ｑ．Ｆｅｎｇ，Ｙ．Ｉｖａｎｏｖａ，Ｃ．Ｌｕｏ，Ｔ．Ｌｉ，Ｆ．Ｌｉ，Ｇ．Ｒ．Ｈｏｎｉｇ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌａｎｚａ（２００７）．”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＨｏｘＢ４  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．”  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ  １６（４）：５４７−５５９．
Ｌｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１５）．“Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｅｓｃａｐｅ  ａｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ．”  Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｂ，３：１０６８−１０７８．
Ｌｕｔｚ−Ｎｉｃｏｌａｄｏｎｉ，Ｃ．，Ｗｏｌｆ，Ｄ．＆  Ｓｏｐｐｅｒ，Ｓ．（２０１５）．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｅ３  Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｂｌ−ｂ．Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ  ５，５８．
Ｍａｃｋ，Ｍ．，Ｂ．Ｌｕｃｋｏｗ，Ｐ．Ｊ．Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｃｉｈａｋ，Ｇ．Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐ．Ｒ．Ｃｌａｐｈａｍ，Ｎ．Ｓｉｇｎｏｒｅｔ，Ｍ．Ｍａｒｓｈ，Ｍ．Ｓｔａｎｇａｓｓｉｎｇｅｒ，Ｆ．Ｂｏｒｌａｔ，Ｔ．Ｎ．Ｗｅｌｌｓ，Ｄ．Ｓｃｈｌｏｎｄｏｒｆｆ  ａｎｄ  Ａ．Ｅ．Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９８）．”Ａｍｉｎｏｏｘｙｐｅｎｔａｎｅ−ＲＡＮＴＥＳ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＣＣＲ５  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ＨＩＶ  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ．”  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８７（８）：１２１５−１２２４．
Ｍａｅｎｇ，Ｃ．Ｈ．，Ｊ．Ｈ．Ｙｉ，Ｊ．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｙ．Ｈｏｎｇ，Ｍ．Ｋ．Ｃｈｏｉ，Ｈ．Ａ．Ｊｕｎｇ，Ｊ．Ｏ．Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｈ．Ｐａｒｋ，Ｙ．Ｓ．Ｐａｒｋ，Ｗ．Ｋ．Ｋａｎｇ  ａｎｄ  Ｈ．Ｙ．Ｌｉｍ（２０１３）．”Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｏｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ．”  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ３３（１０）：４６１９−４６２６．
Ｍａｈｌｕｍ，Ｅ．，Ｄ．Ｍａｎｄａｌ，Ｃ．Ｈａｌｄｅｒ，Ａ．Ｍａｒａｎ，Ｍ．Ｊ．Ｙａｓｚｅｍｓｋｉ，Ｒ．Ｂ．Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．Ｅ．Ｂｏｌａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｇ．Ｓａｒｋａｒ（２００７）．”Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａ  ｎｏｎｃａｒｒｉｅｒ  ｔｏ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｎｏｎｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．”  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３６５（２）：２１５−２２１．
Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ”．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９（６）：４６７−７７．
Ｍａｋｋｅｒｈ，Ｊ．Ｐ．，Ｃ．Ｄｉｎｇｗａｌｌ  ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｌａｓｋｅｙ（１９９６）．”Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｎｅｕｔｒａｌ  ａｎｄ  ａｃｉｄｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．”  Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ  ６（８）：１０２５−１０２７．
Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｆｏｎｇ，Ｄ．，Ｉ．Ｎａｖａｒｒｏ−Ｑｕｉｒｏｇａ，Ｉ．Ｏｃｈｏａ，Ｉ．Ａｌｖａｒｅｚ−Ｍａｙａ，Ｍ．Ａ．Ｍｅｒａｚ，Ｊ．Ｌｕｎａ  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．Ａｒｉａｓ−Ｍｏｎｔａｎｏ（１９９９）．”Ｎｅｕｒｏｔｅｎｓｉｎ−ＳＰＤＰ−ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ａ  ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｅｌｌｓ．”  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  ６９（２）：２４９−２６２．
Ｍａｔａｌｏｎ，Ｏ．，Ｆｒｉｅｄ，Ｓ．，Ｂｅｎ−Ｓｈｍｕｅｌ，Ａ．，Ｐａｕｋｅｒ，Ｍ．Ｈ．，Ｊｏｓｅｐｈ，Ｎ．，Ｋｅｉｚｅｒ，Ｄ．，Ｐｉｔｅｒｂｕｒｇ，Ｍ．＆  Ｂａｒｄａ−Ｓａａｄ，Ｍ．（２０１６）．Ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄａｐｔｏｒ  ＬＡＴ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ｃ−ｇａｍｍａ  ｂｙ  ＳＨＰ−１  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ  ９，ｒａ５４．
Ｍａｕｒｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｅ．ｖｏｎ  Ｓｔｅｂｕｔ（２００４）．”Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１．”  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３６（１０）：１８８２−１８８６．
ＭｃＫａｙ，Ｔ．，Ｐ．Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｓ．Ｊｅｚｚａｒｄ，Ｄ．Ｃｕｒｉｅｌ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃｏｕｔｅｌｌｅ（２００２）．”Ｓｅｃｒｅｔｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｌｉａｒｙ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．”  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５（４）：４４７−４５４．
Ｍｉｄｏｕｘ，Ｐ．，Ａ．Ｋｉｃｈｌｅｒ，Ｖ．Ｂｏｕｔｉｎ，Ｊ．Ｃ．Ｍａｕｒｉｚｏｔ  ａｎｄ  Ｍ．Ｍｏｎｓｉｇｎｙ（１９９８）．”Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅｓ．”  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ９（２）：２６０−２６７．
Ｍｉｌｅｎｋｏｖｉｃ，Ｄ．，Ｔ．Ｒａｍｍｉｎｇ，Ｊ．Ｍ．Ｍｕｌｌｅｒ，Ｌ．Ｓ．Ｗｅｎｚ，Ｎ．Ｇｅｂｅｒｔ，Ａ．Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｓｐｅｃｋｉｎｇ，Ｄ．Ｓｔｏｊａｎｏｖｓｋｉ，Ｓ．Ｒｏｓｐｅｒｔ  ａｎｄ  Ａ．Ｃｈａｃｉｎｓｋａ（２００９）．”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  Ｔｉｍ９  ａｎｄ  Ｔｉｍ１０  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｐａｃｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．”  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２０（１０）：２５３０−２５３９．
Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｉ．，Ｎ．Ｋａｓａｉ  ａｎｄ  Ｙ．Ｈａｙａｓｈｉｚａｋｉ（１９９４）．”［Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｙｒｏｉｄ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ（ＴＳＨ）ｇｅｎｅ］．”  Ｎｉｈｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  ５２（４）：９４０−９４７．
Ｍｏｅｄｅ，Ｔ．，Ｂ．Ｌｅｉｂｉｇｅｒ，Ｈ．Ｇ．Ｐｏｕｒ，Ｐ．Ｂｅｒｇｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｉ．Ｂ．Ｌｅｉｂｉｇｅｒ（１９９９）．”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ，ＲＲＭＫＷＫＫ，ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＰＤＸ−１．”  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４６１（３）：２２９−２３４．
Ｍｏｎｔｒｏｓｅ，Ｋ．，Ｙ．Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｓｕｎ，Ｓ．Ｗｉｌｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｗ．Ｋｒｉｓｓａｎｓｅｎ（２０１３）．”Ｘｅｎｔｒｙ，ａ  ｎｅｗ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｕｎｉｑｕｅｌｙ  ｅｑｕｉｐｐｅｄ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｄｒｕｇｓ．”  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ３：１６６１．
Ｍｏｒｅｌａｎｄ，Ｒ．Ｂ．，Ｇ．Ｌ．Ｌａｎｇｅｖｉｎ，Ｒ．Ｈ．Ｓｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｌ．Ｇａｒｃｅａ  ａｎｄ  Ｌ．Ｍ．Ｈｅｒｅｆｏｒｄ（１９８７）．”Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｔｈａｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ２Ｂ．”  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７（１１）：４０４８−４０５７．
Ｍｏｒｒｉｓ，Ｍ．Ｃ．，Ｌ．Ｃｈａｌｏｉｎ，Ｍ．Ｃｈｏｏｂ，Ｊ．Ａｒｃｈｄｅａｃｏｎ，Ｆ．Ｈｅｉｔｚ  ａｎｄ  Ｇ．Ｄｉｖｉｔａ（２００４）．”Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＮＡｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．”  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １１（９）：７５７−７６４．
Ｍｏｒｒｉｓ，Ｍ．Ｃ．，Ｊ．Ｄｅｐｏｌｌｉｅｒ，Ｊ．Ｍｅｒｙ，Ｆ．Ｈｅｉｔｚ  ａｎｄ  Ｇ．Ｄｉｖｉｔａ（２００１）．”Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．”  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９（１２）：１１７３−１１７６．
Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ａ．，Ｄ．Ｓｈｕｍ，Ｈ．Ｍｏｒｉｏｋａ，Ｅ．Ｏｔｓｕｋａ  ａｎｄ  Ｈ．Ｋａｓａｍａｔｓｕ（２００２）．”Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｐ３  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔｉｎ  ａｌｐｈａ  ２／ｂｅｔａ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｎｔｒｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ  ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０．”  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７６（１８）：９３６８−９３７７．
Ｏ’Ｋｅｅｆｅ，Ｄ．Ｏ．（１９９２）．”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ，ａｃｔｉｖｅ−ｓｉｔｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ．”  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ２９６（２）：６７８−６８４．
Ｐａｏｌｉｎｏ，Ｍ．，Ｃｈｏｉｄａｓ，Ａ．，Ｗａｌｌｎｅｒ，Ｓ．，Ｐｒａｎｊｉｃ，Ｂ．，Ｕｒｉｂｅｓａｌｇｏ，Ｉ．，Ｌｏｅｓｅｒ，Ｓ．，Ｊａｍｉｅｓｏｎ，Ａ．Ｍ．，Ｌａｎｇｄｏｎ，Ｗ．Ｙ．，Ｉｋｅｄａ，Ｆ．，Ｆｅｄｅｄａ，Ｊ．Ｐ．，Ｃｒｏｎｉｎ，Ｓ．Ｊ．，Ｎｉｔｓｃｈ，Ｒ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ−Ｆａｄｅｍｒｅｃｈｔ，Ｃ．，Ｅｉｃｋｈｏｆｆ，Ｊ．，Ｍｅｎｎｉｎｇｅｒ，Ｓ．，Ｕｎｇｅｒ，Ａ．，Ｔｏｒｋａ，Ｒ．，Ｇｒｕｂｅｒ，Ｔ．，Ｈｉｎｔｅｒｌｅｉｔｎｅｒ，Ｒ．，Ｂａｉｅｒ，Ｇ．，Ｗｏｌｆ，Ｄ．，Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．，Ｋｌｅｂｌ，Ｂ．Ｍ．＆  Ｐｅｎｎｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．（２０１４）．Ｔｈｅ  Ｅ３  ｌｉｇａｓｅ  Ｃｂｌ−ｂ  ａｎｄ  ＴＡＭ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｖｉａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０７，５０８−１２．
Ｐａｒｅｎｔｅ，Ｒ．Ａ．，Ｓ．Ｎｉｒ  ａｎｄ  Ｆ．Ｃ．Ｓｚｏｋａ，Ｊｒ．（１９９０）．”Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｌｅａｋａｇｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｃｏｎｔｅｎｔｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＧＡＬＡ．”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９（３７）：８７２０−８７２８．
Ｐａｒａｍｅｓｗａｒａｎ，Ｒ．，Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｐ．，Ｍｏｒｅｔｏｎ，Ｓ．Ａ．，Ｘｉａ，Ｚ．，Ｈｏｕ，Ｙ．，Ｌｅｅ，Ｄ．Ａ．，Ｇｕｐｔａ，Ｋ．，ｄｅＬｉｍａ，Ｍ．，Ｂｅｃｋ，Ｒ．Ｃ．＆  Ｗａｌｄ，Ｄ．Ｎ．（２０１６）．Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＧＳＫ３  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ＡＭＬ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ７，１１１５４．
Ｐａｔｅｌ，Ｐ．＆  Ｗｏｏｄｇｅｔｔ，Ｊ．Ｒ．（２０１７）．Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ｋｉｎａｓｅ  ３：Ａ  Ｋｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  Ａｌｌ  Ｐａｔｈｗａｙｓ？  Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １２３，２７７−３０２．
Ｐａｕｌ，Ｒ．Ｗ．，Ｋ．Ｅ．Ｗｅｉｓｓｅｒ，Ａ．Ｌｏｏｍｉｓ，Ｄ．Ｌ．Ｓｌｏａｎｅ，Ｄ．ＬａＦｏｅ，Ｅ．Ｍ．Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｗ．Ｏｖｅｒｅｌｌ（１９９７）．”Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＡＬ４／ｉｎｖａｓｉｎ．”  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８（１０）：１２５３−１２６２．
Ｐｅｒｅｚ，Ｆ．，Ａ．Ｊｏｌｉｏｔ，Ｅ．Ｂｌｏｃｈ−Ｇａｌｌｅｇｏ，Ａ．Ｚａｈｒａｏｕｉ，Ａ．Ｔｒｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ａ．Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ（１９９２）．”Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ａｓ  ａ  ｓｉｇｎａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅａｒ  ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｐｅｐｔｉｄｅ．”  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １０２（Ｐｔ  ４）：７１７−７２２．
Ｐｉｍｅｎｔａ，Ｄ．Ｃ．，Ｖ．Ｃ．Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｃｈａｏ，Ｍ．Ａ．Ｊｕｌｉａｎｏ  ａｎｄ  Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ（２０００）．”Ａｌｐｈａ１−ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ  ａｎｄ  ｋａｌｌｉｓｔａｔｉｎ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ．”  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ  １９（５）：４１１−４１８．
Ｐｏｌｉ，Ａ．，Ｍｉｃｈｅｌ，Ｔ．，Ｔｈｅｒｅｓｉｎｅ，Ｍ．，Ａｎｄｒｅｓ，Ｅ．，Ｈｅｎｔｇｅｓ，Ｆ．＆  Ｚｉｍｍｅｒ，Ｊ．（２００９）．ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ（ＮＫ）ｃｅｌｌｓ：ａｎ  ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２６，４５８−６５．
Ｐｒｉｅｖｅ，Ｍ．Ｇ．ａｎｄ  Ｍ．Ｌ．Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９９９）．”Ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ−ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ａｒｅ  ｎｏｔ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．”  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９（６）：４５０３−４５１５．
Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ，Ｒ．，Ｊ．Ｘａｖｉｅｒ，Ｎ．Ｒａｎｇａｒａｊ，Ｎ．Ｍ．Ｒａｏ  ａｎｄ  Ｖ．Ｇｏｐａｌ（２００７）．”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＴＡＴ−Ｍｕ，Ｍｕ  ａｎｄ  Ｍｕ−Ｍｕ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．”  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ９（４）：２７５−２８６．
Ｒｉｄｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）“Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｍｕｒｉｎｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ”．Ｃｅｌｌ，１５７：５４９−５６４
Ｓａｌｏｍｏｎｅ，Ｆ．，Ｆ．Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉ，Ｍ．Ｄｉ  Ｌｕｃａ，Ｃ．Ｂｏｃｃａｒｄｉ，Ｒ．Ｎｉｆｏｓｉ，Ｇ．Ｂａｒｄｉ，Ｌ．Ｄｉ  Ｂａｒｉ，Ｍ．Ｓｅｒｒｅｓｉ  ａｎｄ  Ｆ．Ｂｅｌｔｒａｍ（２０１２）．”Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｅｓｃａｐｅ．”  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １６３（３）：２９３−３０３．
Ｓａｌｏｍｏｎｅ  Ｆ．，Ｃａｒｄａｒｅｌｌｉ  Ｆ，Ｓｉｇｎｏｒｅ  Ｇ，Ｂｏｃｃａｒｄｉ  Ｃ，Ｂｅｌｔｒａｍ  Ｆ．（２０１３）“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＭ１８−Ｔａｔ１１  ｈｙｂｒｉｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ：ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ−ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．”  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．８（７）：ｅ７０１０８．
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ．，Ｒ．Ｐ．Ｈａｒｂｏｔｔｌｅ，Ｙ．Ｙｏｋｏｓａｋｉ，Ｊ．Ｋｕｎｄｅ，Ｄ．Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃｏｕｔｅｌｌｅ（１９９８）．”Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ＰＬＡＥＩＤＧＩＥＬＴＹ，ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｌｐｈａ９ｂｅｔａ１−ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．”  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４２９（３）：２６９−２７３．
Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｖ．，Ｍ．Ｍｏｌｉｎｅｔｅ，Ｈ．Ｂｏｅｕｆ，Ｇ．ｄｅ  Ｍｕｒｃｉａ  ａｎｄ  Ｊ．Ｍｅｎｉｓｓｉｅｒ−ｄｅ  Ｍｕｒｃｉａ（１９９２）．”Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｉｓ  ａ  ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｓｅｐａｒａｔｅ  ｆｒｏｍ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．”  ＥＭＢＯ  Ｊ  １１（９）：３２６３−３２６９．
Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｇ．Ｙ．Ｗｕ，Ｃ．Ｍ．Ｗａｌｔｏｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｈ．Ｗｕ（１９９９）．”Ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ＤＮＡ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  Ｇ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｇｒｅａｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｌｉｖｅｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．”  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １０（６）：１０７５−１０８３．
Ｓｃｏｔｔ，Ｍ．Ｓ．，Ｆ．Ｍ．Ｂｏｉｓｖｅｒｔ，Ｍ．Ｄ．ＭｃＤｏｗａｌｌ，Ａ．Ｉ．Ｌａｍｏｎｄ  ａｎｄ  Ｇ．Ｊ．Ｂａｒｔｏｎ（２０１０）．”Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｕｃｌｅｏｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３８（２１）：７３８８−７３９９．
Ｓｈａｗ，Ｐ．Ａ．，Ｉ．Ｒ．Ｃａｔｃｈｐｏｌｅ，Ｃ．Ａ．Ｇｏｄｄａｒｄ  ａｎｄ  Ｗ．Ｈ．Ｃｏｌｌｅｄｇｅ（２００８）．”Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ＣＲＥ  ｐｒｏｔｅｉｎ．”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７（４）：１１５７−１１６６．
Ｓｈａｗｅ−Ｔａｙｌｏｒ  Ｊ，Ｃｒｉｓｔｉａｎｉｎｉ  Ｎ（２００４）Ｋｅｒｎｅｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐａｔｔｅｒｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｐｒｅｓｓ．
Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＰＥＰ−ＦＯＬＤ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｍｉｎｉｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ”．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｈｅｏｒ．Ｃｏｍｐｕｔ．１０：４７４５−４７５８．
Ｓｈｏｙａ，Ｙ．，Ｔ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔ．Ｋｏｄａ，Ｋ．Ｉｋｕｔａ，Ｍ．Ｋａｋｉｎｕｍａ  ａｎｄ  Ｍ．Ｋｉｓｈｉ（１９９８）．”Ｔｗｏ  ｐｒｏｌｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ−  ａｎｄ  ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｏｒｎａ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ．”  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２（１２）：９７５５−９７６２．
Ｓｏｍａｓｅｋａｒａｍ，Ａ．，Ａ．Ｊａｒｍｕｚ，Ａ．Ｈｏｗ，Ｊ．Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｎ．Ｎａｖａｒａｔｎａｍ（１９９９）．”Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ．”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（４０）：２８４０５−２８４１２．
Ｓｔｏｊａｎｏｖｓｋｉ，Ｄ．，Ｍ．Ｂｏｈｎｅｒｔ，Ｎ．Ｐｆａｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ（２０１２）．”Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ．”  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ  ４（１０）．
Ｓｕｄｂｅｃｋ，Ｐ．ａｎｄ  Ｇ．Ｓｃｈｅｒｅｒ（１９９７）．”Ｔｗｏ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｒｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｏｆ  ＳＲＹ  ａｎｄ  ＳＯＸ９．”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２（４４）：２７８４８−２７８５２．
Ｓｕｎｇ，Ｍ．Ｓ．，Ｊ．Ｙ．Ｍｕｎ，Ｏ．Ｋｗｏｎ，Ｋ．Ｓ．Ｋｗｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｂ．Ｏｈ（２０１３）．”Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＭｙｏＤ  ｐｒｏｔｅｉｎ．”  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４３７（１）：１５６−１６１．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ａｎｄ  Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）．”Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．”  Ｃｅｌｌ  １２６（４）：６６３−６７６．
Ｔａｋｅｄａ，Ａ．，Ｃ．Ｇｏｏｌｓｂｙ  ａｎｄ  Ｎ．Ｒ．Ｙａｓｅｅｎ（２００６）．”ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｌｏｃｋｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３４＋  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．”  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６６（１３）：６６２８−６６３７．
Ｔａｎ，Ｙ．，Ｚ．Ｘｉｅ，Ｍ．Ｄｉｎｇ，Ｚ．Ｗａｎｇ，Ｑ．Ｙｕ，Ｌ．Ｍｅｎｇ，Ｈ．Ｚｈｕ，Ｘ．Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｙｕ，Ｘ．Ｍｅｎｇ  ａｎｄ  Ｙ．Ｃｈｅｎ（２０１０）．”Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ＦｏｘＡ１  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｐ１９  ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｎｅｕｒａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．”  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｄｅｖ  １９（９）：１３６５−１３７４．
Ｔａｎ，Ｙ．Ｘ．，Ｃ．Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｌ．Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｌｉｎ，Ｙ．Ｗａｎｇ，Ｓ．Ｂ．Ｌｉ，Ｘ．Ｐ．Ｊｉｎ，Ｈ．Ｗ．Ｇａｏ，Ｆ．Ｓ．Ｄｕ，Ｆ．Ｇｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓ．Ｐ．Ｊｉ（２０１２）．”Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｅｌｉｔｔｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｎａｌｏｇ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｐＨ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．”  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  １４（４）：２４１−２５０．
Ｔｈｅｖｅｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，“ＰＥＰ−ＦＯＬＤ：ａｎ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｂｏｔｈ  ｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄｅｄ  ｃｙｃｌｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．”  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１２．４０，Ｗ２８８−２９３．
Ｕｈｅｒｅｋ，Ｃ．，Ｊ．Ｆｏｍｉｎａｙａ  ａｎｄ  Ｗ．Ｗｅｌｓ（１９９８）．”Ａ  ｍｏｄｕｌａｒ  ＤＮＡ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３（１５）：８８３５−８８４１．
Ｖａｒｋｏｕｈｉ，Ａ．Ｋ．，Ｍ．Ｓｃｈｏｌｔｅ，Ｇ．Ｓｔｏｒｍ  ａｎｄ  Ｈ．Ｊ．Ｈａｉｓｍａ（２０１１）．”Ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｅｓｃａｐｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．”  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １５１（３）：２２０−２２８．
Ｖｅａｃｈ，Ｒ．Ａ．，Ｄ．Ｌｉｕ，Ｓ．Ｙａｏ，Ｙ．Ｃｈｅｎ，Ｘ．Ｙ．Ｌｉｕ，Ｓ．Ｄｏｗｎｓ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈａｗｉｇｅｒ（２００４）．”Ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ．”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９（１２）：１１４２５−１１４３１．
Ｖｉｖｅｓ，Ｅ．，Ｐ．Ｂｒｏｄｉｎ  ａｎｄ  Ｂ．Ｌｅｂｌｅｕ（１９９７）．”Ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ＨＩＶ−１  Ｔａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅｕｓ．”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２（２５）：１６０１０−１６０１７．
Ｗａｇｓｔａｆｆ，Ｋ．Ｍ．，Ｄ．Ｊ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｊ．Ｔｒｅｍｅｔｈｉｃｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．Ｊａｎｓ（２００７）．”Ｈｉｓｔｏｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅａｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．”  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １５（４）：７２１−７３１．
Ｗａｒｒ，Ｍ．Ｒ．，Ｍ．Ｂｉｎｎｅｗｉｅｓ，Ｊ．Ｆｌａｃｈ，Ｄ．Ｒｅｙｎａｕｄ，Ｔ．Ｇａｒｇ，Ｒ．Ｍａｌｈｏｔｒａ，Ｊ．Ｄｅｂｎａｔｈ  ａｎｄ  Ｅ．Ｐａｓｓｅｇｕｅ（２０１３）．”ＦＯＸＯ３Ａ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ａ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｉｎ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．”  Ｎａｔｕｒｅ  ４９４（７４３７）：３２３−３２７．
Ｗｅｌｃｈ，Ｋ．，Ｊ．Ｆｒａｎｋｅ，Ｍ．Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｉ．Ｇ．Ｍａｃａｒａ（１９９９）．”ＲａｎＢＰ３  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａｎ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｉｍｐｏｒｔｅｄ  ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｂｙ  ｉｍｐｏｒｔｉｎ−ａｌｐｈａ３．”  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９（１２）：８４００−８４１１．
Ｗｉｅｄｅｎｈｅｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｒｏｍ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔａｒｇｅｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０８，１００９２−１００９７．
Ｗｉｔｚｅｌ，Ｉ．，Ｍ．Ｇｒａｅｓｅｒ，Ｔ．Ｋａｒｎ，Ｍ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｗｉｒｔｚ，Ｄ．Ｓｃｈｕｔｚｅ，Ａ．Ｒａｕｓｃｈ，Ｆ．Ｊａｎｉｃｋｅ，Ｋ．Ｍｉｌｄｅ−Ｌａｎｇｏｓｃｈ  ａｎｄ  Ｖ．Ｍｕｌｌｅｒ（２０１３）．”Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｓ  ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−ｔｒｅａｔｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒｓ．”  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １３９（５）：８０９−８１６．
Ｗｕ，Ｊ．，Ｌ．Ｚｈｏｕ，Ｋ．Ｔｏｎｉｓｓｅｎ，Ｒ．Ｔｅｅ  ａｎｄ  Ｋ．Ａｒｔｚｔ（１９９９）．”Ｔｈｅ  ｑｕａｋｉｎｇ  Ｉ−５  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＱＫＩ−５）ｈａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ａｎｄ  ｓｈｕｔｔｌｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．”  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（４１）：２９２０２−２９２１０．
Ｗｕ，Ｄ．，Ｋｕｉａｓｔｅ，Ｉ．，Ｍｏｒｅａｕ，Ｐ．，Ｃａｒｏｓｅｌｌａ，Ｅ．＆  Ｙｏｔｎｄａ，Ｐ．（２０１５）．Ｒｅｓｃｕｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ＨＬＡ−Ｇ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ６，３７３８５−９７．
Ｗｙｍａｎ，Ｔ．Ｂ．，Ｆ．Ｎｉｃｏｌ，Ｏ．Ｚｅｌｐｈａｔｉ，Ｐ．Ｖ．Ｓｃａｒｉａ，Ｃ．Ｐｌａｎｋ  ａｎｄ  Ｆ．Ｃ．Ｓｚｏｋａ，Ｊｒ．（１９９７）．”Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｓ  ｂｉｌａｙｅｒｓ．”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６（１０）：３００８−３０１７．
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Ｙｉｅ，Ｓ．Ｍ．，Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ｙｅ，Ｓ．Ｒ．，Ｌｉ，Ｋ．，Ｄｏｎｇ，Ｄ．Ｄ．＆  Ｌｉｎ，Ｘ．Ｍ．（２００７ｂ）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｏｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  １４，２７２１−９．
Ｙｉｅ，Ｓ．Ｍ．，Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ｙｅ，Ｓ．Ｒ．，Ｌｉ，Ｋ．，Ｄｏｎｇ，Ｄ．Ｄ．＆  Ｌｉｎ，Ｘ．Ｍ．（２００７ｃ）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  Ｇ（ＨＬＡ−Ｇ）ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ５８，２６７−７４．
Ｙｉｅ，Ｓ．Ｍ．，Ｙａｎｇ，Ｈ．，Ｙｅ，Ｓ．Ｒ．，Ｌｉ，Ｋ．，Ｄｏｎｇ，Ｄ．Ｄ．＆  Ｌｉｎ，Ｘ．Ｍ．（２００７ｄ）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ｇ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  １２８，１００２−９．
Ｙｕ，Ｚ．，Ｃ．Ｈ．Ｌｅｅ，Ｃ．Ｃｈｉｎｐａｉｓａｌ  ａｎｄ  Ｌ．Ｎ．Ｗｅｉ（１９９８）．”Ａ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｏｆ  ｏｒｐｈａｎ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴＲ２．”  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １５９（１）：５３−６０．
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Ｚｈｅｎ，Ｚ．Ｊ．，Ｌｉｎｇ，Ｊ．Ｙ．，Ｃａｉ，Ｙ．，Ｌｕｏ，Ｗ．Ｂ．＆  Ｈｅ，Ｙ．Ｊ．（２０１３）．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ＨＬＡ−Ｅ  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｎ  ＨＬＡ−Ｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔａｇｅ  ＩＩＩ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｍｅｄ  Ｏｎｃｏｌ  ３０，４８２．
Ｚｈｏｕ，Ｈ．，Ｓ．Ｗｕ，Ｊ．Ｙ．Ｊｏｏ，Ｓ．Ｚｈｕ，Ｄ．Ｗ．Ｈａｎ，Ｔ．Ｌｉｎ，Ｓ．Ｔｒａｕｇｅｒ，Ｇ．Ｂｉｅｎ，Ｓ．Ｙａｏ，Ｙ．Ｚｈｕ，Ｇ．Ｓｉｕｚｄａｋ，Ｈ．Ｒ．Ｓｃｈｏｌｅｒ，Ｌ．Ｄｕａｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｄｉｎｇ（２００９）．”Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４（５）：３８１−３８４．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図２９−３】
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【図２９−４】
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【図２９−５】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９−１】
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【図４９−２】
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【図４９−３】
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【図５０−１】
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【図５０−２】
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【図５１−１】
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【図５１−２】
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【図５２−１】
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【図５２−２】
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【図５２−３】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８−１】
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【図５８−２】
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【図５８−３】
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【図５９−１】
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【図５９−２】
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【図６０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年8月6日(2018.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達する方法であって、前記方法は、前記標的真核細胞と前記ポリペプチドカーゴとを、シャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度の前記シャトル剤の存在下で接触させることを含み、前記シャトル剤が、
（１）少なくとも２０アミノ酸長であり、
（３）正に帯電した親水性の外面および
疎水性の外面
を有する
（２）両親媒性のアルファヘリックスモチーフを含み、
次のパラメーター（４）〜（１５）の内の少なくとも５つが満たされるペプチドであり、
（４）疎水性の外面が、ターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスのオープンシリンダー表現に基づいて、ペプチドのアミノ酸の１２〜５０％に相当する空間的に隣接するＬ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、および／またはＭアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含む；
（５）３．５〜１１の疎水性モーメント（μ）を有する；
（６）生理学的ｐＨで少なくとも＋４の予測正味電荷を有する；
（７）８〜１３の等電点（ｐＩ）を有する；
（８）３５％〜６５％のアミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、およびＶの任意の組み合わせから構成される；
（９）０％〜３０％のアミノ酸：Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴの任意の組み合わせから構成される；
（１０）３５％〜８５％のアミノ酸：Ａ、Ｌ、Ｋ、またはＲの任意の組み合わせから構成される；
（１１）少なくとも５％のＬがペプチド中に存在するという条件で、１５％〜４５％のアミノ酸：ＡおよびＬの任意の組み合わせから構成される；
（１２）２０％〜４５％のアミノ酸：ＫおよびＲの任意の組み合わせから構成される；
（１３）０％〜１０％のアミノ酸：ＤおよびＥの任意の組み合わせから構成される；
（１４）前記ペプチド中のＡおよびＬのパーセンテージ（％Ａ＋Ｌ）と、前記ペプチド中のＫとＲのパーセンテージ（Ｋ＋Ｒ）との差異が、１０％以下である；
（１５）１０％〜４５％のアミノ酸：Ｑ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、およびＨの任意の組み合わせから構成される、方法。
【請求項２】
前記シャトル剤が、少なくとも６個の、少なくとも７個の、少なくとも８個の、少なくとも９個の、少なくとも１０個の、少なくとも１１個の、または全ての本明細書に記載のパラメーター（４）〜（１５）を満たす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）前記シャトル剤が、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０アミノ酸の最小長、および４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、６０、６５、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０アミノ酸の最大長を有するペプチドであり、
（ｉｉ）前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０の下限値と、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、１０．５、１０．６、１０．７、１０．８、１０．９、または１１．０の上限値との間の疎水性モーメント（μ）を有し、
（ｉｉｉ）前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、正に帯電した親水性外面を含み、この外面が、（ａ）ヘリカルホイール投影図上に、少なくとも２個、３個または４個の隣接する正に帯電したＫおよび／またはＲ残基；および／または（ｂ）ヘリカルホイール投影図上に、１００度の連続アミノ酸間の回転角度および／またはターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスに基づいて、３個から５個のＫおよび／またはＲ残基を含む６個の隣接する残基のセグメントを含み、
（ｉｖ）前記両親媒性のアルファヘリックスモチーフが、疎水性の外面を含み、この疎水性の外面は、（ａ）ヘリカルホイール投影図上で、少なくとも２個の隣接するＬ残基；および／または（ｂ）ヘリカルホイール投影図上で、１００度の連続アミノ酸間の回転角度および／またはターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスに基づいて、Ｌ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、およびＭから選択される少なくとも５個の疎水性の残基を含む１０個の隣接する残基のセグメント、を含み、
（ｖ）前記疎水性の外面が、前記ペプチドのアミノ酸の１２．５％、１３％、１３．５％、１４％、１４．５％、１５％、１５．５％、１６％、１６．５％、１７％、１７．５％、１８％、１８．５％、１９％、１９．５％、または２０％から２５％、３０％、３５％、４０％、または４５％に相当する空間的に隣接するＬ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、および／またはＭアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含み、
（ｖｉ）前記ペプチドが、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０の下限値と、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０、１０．１、１０．２、１０．３、１０．４、または１０．５の上限値との間の疎水性モーメント（μ）を有し、
（ｖｉｉ）前記ペプチドが、＋４、＋５、＋６、＋７、＋８、＋９〜＋１０、＋１１、＋１２、＋１３、＋１４、または＋１５の予測実効電荷を有し、
（ｖｉｉｉ）前記ペプチドが、１０〜１３の予測ｐＩを有し、または
（ｉｘ）（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の内の任意の組み合わせである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記シャトル剤が、次のパラメーターの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または全てを満たす、請求項１〜３いずれか１項に記載の方法：
（８）前記ペプチドが、３６％〜６４％、３７％〜６３％、３８％〜６２％、３９％〜６１％、４０％〜６０％のアミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、およびＶの任意の組み合わせから構成される；
（９）前記ペプチドが、１％〜２９％、２％〜２８％、３％〜２７％、４％〜２６％、５％〜２５％、６％〜２４％、７％〜２３％、８％〜２２％、９％〜２１％、または１０％〜２０％のアミノ酸：Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴの任意の組み合わせから構成される；
（１０）前記ペプチドが、３６％〜８０％、３７％〜７５％、３８％〜７０％、３９％〜６５％、または４０％〜６０％のアミノ酸：Ａ、Ｌ、Ｋ、またはＲの任意の組み合わせから構成される；
（１１）前記ペプチドが、１５％〜４０％、２０％〜４０％、２０％〜３５％、または２０％〜３０％のアミノ酸：ＡおよびＬの任意の組み合わせから構成される；
（１２）前記ペプチドが、２０％〜４０％、２０％〜３５％、または２０％〜３０％のアミノ酸：ＫおよびＲの任意の組み合わせから構成される；
（１３）前記ペプチドが、５％〜１０％のアミノ酸：ＤおよびＥの任意の組み合わせから構成される；
（１４）前記ペプチド中のＡおよびＬ残基パーセンテージ（％Ａ＋Ｌ）と、前記ペプチド中のＫおよび／またはＲ残基のパーセンテージ（Ｋ＋Ｒ）との差異が、９％、８％、７％、６％、または５％以下である；および
（１５）前記ペプチドが、１５〜４０％、２０％〜３５％、または２０％〜３０％のアミノ酸：Ｑ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、およびＨの任意の組み合わせから構成される。
【請求項５】
前記ペプチドが、ヒスチジンリッチドメインを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒスチジンリッチドメインが、
（ｉ）前記ペプチドのＮ末端に向けておよび／またはＣ末端に向けて配置され；
（ｉｉ）少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％もしくは少なくとも９０％のヒスチジン残基を含む、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個のアミノ酸のストレッチである、および／または少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、または少なくとも９個の連続するヒスチジン残基を含み；または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ペプチドが、セリンおよび／またはグリシン残基が濃縮されたフレキシブルリンカードメインを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドが、次記のアミノ酸配列を含むまたはそれからなる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（ａ）［Ｘ１］−［Ｘ２］−［リンカー］−［Ｘ３］−［Ｘ４］（式１）；
（ｂ）［Ｘ１］−［Ｘ２］−［リンカー］−［Ｘ４］−［Ｘ３］（式２）；
（ｃ）［Ｘ２］−［Ｘ１］−［リンカー］−［Ｘ３］−［Ｘ４］（式３）；
（ｄ）［Ｘ２］−［Ｘ１］−［リンカー］−［Ｘ４］−［Ｘ３］（式４）；
（ｅ）［Ｘ３］−［Ｘ４］−［リンカー］−［Ｘ１］−［Ｘ２］（式５）；
（ｆ）［Ｘ３］−［Ｘ４］−［リンカー］−［Ｘ２］−［Ｘ１］（式６）；
（ｇ）［Ｘ４］−［Ｘ３］−［リンカー］−［Ｘ１］−［Ｘ２］（式７）；または
（ｈ）［Ｘ４］−［Ｘ３］−［リンカー］−［Ｘ２］−［Ｘ１］（式８）；
式中、
［Ｘ１］が、次記から選択され：２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［＋］−；１［＋］−１［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；および１［＋］−１［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［＋］−；
［Ｘ２］が次記から選択され：−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［ζ］−；−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−２［＋］−；−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［＋］−１［ζ］−；−２［Φ］−１［＋］−２［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−２［＋］−；−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−２［ζ］−；−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−１［＋］−１［ζ］−；および−２［Φ］−２［＋］−１［Φ］−１［ζ］−１［＋］−；
［Ｘ３］が次記から選択され：−４［＋］−Ａ−；−３［＋］−Ｇ−Ａ−；−３［＋］−Ａ−Ａ−；−２［＋］−１［Φ］−１［＋］−Ａ−；−２［＋］−１［Φ］−Ｇ−Ａ−；−２［＋］−１［Φ］−Ａ−Ａ−；または−２［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−２［＋］−Ａ−Ｇ−Ａ；−２［＋］−Ａ−Ａ−Ａ−；−１［Φ］−３［＋］−Ａ−；−１［Φ］−２［＋］−Ｇ−Ａ−；−１［Φ］−２［＋］−Ａ−Ａ−；−１［Φ］−１［＋］−１［Φ］−１［＋］−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−１［Φ］−Ｇ−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−１［Φ］−Ａ−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−Ａ−Ｇ−Ａ；−１［Φ］−１［＋］−Ａ−Ａ−Ａ；−Ａ−１［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−Ａ−１［＋］−Ａ−Ｇ−Ａ；および−Ａ−１［＋］−Ａ−Ａ−Ａ；
［Ｘ４］が次記から選択され：−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−Ａ；−１［ζ］−２Ａ−２［＋］；−１［＋］−２Ａ−１［＋］−Ａ；−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［ζ］−Ａ−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−２［＋］−Ａ−２［＋］；−２［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−２［＋］−Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−２［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］−Ａ；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−２［＋］；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−２［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−２［ζ］−２［＋］；−１［＋］−２［ζ］−１［＋］−Ａ；−１［＋］−２［ζ］−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［＋］−２［ζ］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−３［ζ］−２［＋］；−３［ζ］−１［＋］−Ａ；−３［ζ］−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−Ａ；−１［ζ］−２Ａ−２［＋］；−１［ζ］−２Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；−２［＋］−Ａ−１［＋］−Ａ；−２［＋］−１［ζ］−１［＋］−Ａ；−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］−Ａ；−１［＋］−２Ａ−１［＋］−１［ζ］−Ａ−１［＋］；および−１［ζ］−Ａ−１［ζ］−Ａ−１［＋］；および
［リンカー］が、次記から選択され：−Ｇｎ−；−Ｓｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎＧｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎＳｎ−；−（ＧｎＳｎ）ｎＧｎ（ＧｎＳｎ）ｎ−；および−（ＧｎＳｎ）ｎＳｎ（ＧｎＳｎ）ｎ−；
式中、
［Φ］はアミノ酸：Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、またはＶａｌであり；
［＋］は、アミノ酸：ＬｙｓまたはＡｒｇであり；
［ζ］が、アミノ酸：Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｔｈｒ、またはＳｅｒであり；
Ａが、アミノ酸：Ａｌａであり；
Ｇが、アミノ酸：Ｇｌｙであり；
Ｓが、アミノ酸：Ｓｅｒであり；および
ｎが、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜１〜４、または１〜３の整数である。
【請求項９】
（ｉ）前記ペプチドが、配列番号１０４、１０５、１０７、１０８、１１０〜１３１、１３３〜１３５、１３８、１４０、１４２、１４５、１４８、１５１、１５２、１６９〜２４２、および２４３〜１０２４２のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である；または前記ペプチドが、配列番号１０４、１０５、１０７、１０８、１１０〜１３１、１３３〜１３５、１３８、１４０、１４２、１４５、１４８、１５１、１５２、１６９〜２４２、および２４３〜１０２４２のいずれか１つの機能性バリアントを含むまたはそれからなり；
（ｉｉ）前記ペプチドが：
（ａ）配列番号１０４、１０５、１０７、１０８、１１０〜１３１、１３３〜１３５、１３８、１４０、１４２、１４５、１４８、１５１、１５２、１６９〜２４２、および２４３〜１０２４２のいずれか１個のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、
（ｂ）配列番号１５８および／または１５９のアミノ酸配列モチーフを含み；または
（ｃ）配列番号１５９のアミノ酸配列モチーフに作動可能に連結された配列番号１５８のアミノ酸配列モチーフを含み；または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドが、エンドソーム漏出ドメイン（ＥＬＤ）、および／または細胞膜透過性ドメイン（ＣＰＤ）を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
（ｉ）前記ＥＬＤが、エンドソーム溶解性ペプチド、抗菌性ペプチド（ＡＭＰ）、直鎖状カチオン性アルファヘリックス抗菌性ペプチド、セクロピン−Ａ／メリチンハイブリッド（ＣＭシリーズ）ペプチド、ｐＨ依存性膜活性ペプチド（ＰＡＭＰ）、ペプチド両親媒性物質、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）のＨＡ２サブユニットのＮ末端に由来するペプチド、ＣＭ１８、ジフテリア毒素Ｔドメイン（ＤＴ）、ＧＡＬＡ、ＰＥＡ、ＩＮＦ−７、ＬＡＨ４、ＨＧＰ、Ｈ５ＷＹＧ、ＨＡ２、ＥＢ１、ＶＳＶＧ、シュードモナス毒素、メリチン、ＫＡＬＡ、ＪＳＴ−１、Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ、Ｇ（ＬＬＫＫ）３Ｇまたはそれらの任意の組合せであるか、またはそれに由来する、
（ｉｉ）前記ＣＰＤが、細胞膜透過性ペプチドまたは細胞膜透過性ペプチド由来のタンパク質形質導入ドメイン、ＴＡＴ、ＰＴＤ４、ペネトラチン（アンテナペディア）、ｐＶＥＣ、Ｍ９１８、Ｐｅｐ−１、Ｐｅｐ−２、キセントリー（Ｘｅｎｔｒｙ）、アルギニンストレッチ、トランスポータン、ＳｙｎＢ１、ＳｙｎＢ３またはそれらの任意の組合せであるか、またはそれに由来する、または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ペプチドが、
（ａ）配列番号１〜１５、６３または６４のいずれか１つのアミノ酸配列、またはエンドソーム溶解活性を有するそのバリアントまたは断片を含むＥＬＤ；
（ｂ）配列番号１６〜２７または６５のいずれか１つのアミノ酸配列または細胞膜透過性活性を有するそのバリアントまたは断片を含むＣＰＤ；または
（ｃ）（ａ）および（ｂ）の両方を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉ）前記ペプチドが、配列番号１、１４、または６３のアミノ酸配列を有するＣＭ１８、ＫＡＬＡ、またはＣ（ＬＬＫＫ）３ＣであるＥＬＤ、または配列番号１、１４、または６３と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有し、エンドソーム溶解活性を有するそのバリアントであるＥＬＤを含み、
（ｉｉ）前記ペプチドが、配列番号１７または６５のアミノ酸配列を有するＴＡＴまたはＰＴＤ４であるＣＰＤ、または配列番号１７または６５と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一性を有し、細胞膜透過活性を有するそのバリアントであるＣＰＤを含み、または
（ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）の両方である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ペプチドが、配列番号５７〜５９、６６〜７２もしくは８２〜１０２のいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号５７〜５９、６６〜７２もしくは８２〜１０２のいずれか１つに対して、少なくとも８５％、９０％、または９５％の同一性を有するその機能性バリアントを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）前記シャトル剤が、前記標的真核細胞により完全に代謝可能であり；および／または
（ｉｉ）前記標的真核細胞と前記ポリペプチドカーゴとを前記シャトル剤の存在下で接触させることにより、前記シャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率が、少なくとも１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍まで、高められる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
インビトロ法である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか１項で定義のペプチドである合成ペプチドシャトル剤。
【請求項１８】
配列番号１０４、１０５、１０７、１０８、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３８、１４０、１４２、１４５、１４８、１５１、１５２、１６９〜２４２、および２４３〜１０２４２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、または配列番号１５８および／または１５９のアミノ酸配列モチーフを含む、２０〜１００アミノ酸長さのペプチドである、請求項１７に記載の合成ペプチド。
【請求項１９】
ポリペプチドカーゴを、標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核へのインビトロでの送達に使用するための、請求項１７または１８に記載の合成ペプチドシャトル剤であって、前記合成ペプチドシャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度で使用される、合成ペプチドシャトル剤。
【請求項２０】
ポリペプチドカーゴを、標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核へのインビボでの送達に使用するための、請求項１７または１８に記載の合成ペプチドシャトル剤であって、前記合成ペプチドシャトル剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度で使用される、合成ペプチドシャトル剤。
【請求項２１】
請求項１〜１５のいずれか１項で定義のシャトル剤、または少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種の異なるタイプの請求項１〜１５のいずれか１項で定義のシャトル剤のカクテル、および標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核へ送達されるべきポリペプチドカーゴを含む、組成物。
【請求項２２】
ポリペプチドカーゴを、標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するための、請求項１〜１５のいずれか１項で定義のシャトル剤、または請求項１８で定義の合成ペプチドの使用であって、前記シャトル剤または合成ペプチドが、前記シャトル剤または合成ペプチドの非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度で使用される、使用。
【請求項２３】
ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するためのキットであって、請求項１〜１５のいずれか１項で定義のシャトル剤、または請求項１８で定義の合成ペプチド、および好適な容器を含む、キット。
【請求項２４】
前記ポリペプチドカーゴが、細胞膜透過性ドメインを欠いている、請求項１〜１６のいずれか１項に記載方法、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の合成ペプチドシャトル剤、請求項２１に記載の組成物、請求項２２に記載の使用、または請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記ポリペプチドカーゴが、細胞膜透過性ドメインを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載方法、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の合成ペプチドシャトル剤、請求項２１に記載の組成物、請求項２２に記載の使用、または請求項２３に記載のキット。
【請求項２６】
前記ポリペプチドカーゴが、細胞内ターゲティングドメインを含む、請求項１〜１６、２４または２５のいずれか１項に記載の方法、請求項１７〜２０、２４または２５のいずれか１項に記載の合成ペプチドシャトル剤、請求項２１、２４または２５に記載の組成物、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
前記細胞内ターゲティングドメインが、
（ａ）核移行シグナル（ＮＬＳ）；
（ｂ）核小体シグナル配列；
（ｃ）ミトコンドリアシグナル配列；または
（ｄ）ペルオキシソームシグナル配列、である、請求項２６に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【請求項２８】
（ａ）前記ＮＬＳが、Ｅ１ａ、Ｔ−Ａｇ、ｃ−ｍｙｃ、Ｔ−Ａｇ、ｏｐ−Ｔ−ＮＬＳ、Ｖｐ３、ヌクレオプラスミン、ヒストン２Ｂ、ゼノパスＮ１、ＰＡＲＰ、ＰＤＸ−１、ＱＫＩ−５、ＨＣＤＡ、Ｈ２Ｂ、ｖ−Ｒｅｌ、Ａｍｉｄａ、ＲａｎＢＰ３、Ｐｈｏ４ｐ、ＬＥＦ−１、ＴＣＦ−１、ＢＤＶ−Ｐ、ＴＲ２、ＳＯＸ９もしくはＭａｘに由来する、
（ｂ）前記核小体シグナル配列が、ＢＩＲＣ５もしくはＲＥＣＱＬ４に由来する、
（ｃ）前記ミトコンドリアシグナル配列が、Ｔｉｍ９もしくは酵母チトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＶに由来する、または
（ｄ）前記ペルオキシソームシグナル配列が、ＰＴＳ１に由来する、請求項２７に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【請求項２９】
前記ポリペプチドカーゴが、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子と複合体化されている、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【請求項３０】
前記ポリペプチドカーゴが、転写因子、ヌクレアーゼ、サイトカイン、ホルモン、増殖因子、抗体、ペプチドカーゴ、酵素、酵素阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【請求項３１】
（ａ）前記転写因子が、ＨＯＸＢ４、ＮＵＰ９８−ＨＯＸＡ９、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ９、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、ＭｙｏＤ、Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３、ＭａｆＡ、Ｂｌｉｍｐ−１、Ｅｏｍｅｓ、Ｔ−ｂｅｔ、ＦＯＸＯ３Ａ、ＮＦ−ＹＡ、ＳＡＬＬ４、ＩＳＬ１、ＦｏｘＡ１、Ｎａｎｏｇ、Ｅｓｒｒｂ、Ｌｉｎ２８、ＨＩＦ１−ａｌｐｈａ、Ｈｌｆ、Ｒｕｎｘ１ｔ１、Ｐｂｘ１、Ｌｍｏ２、Ｚｆｐ３７、Ｐｒｄｍ５、Ｂｃｌ−６またはそれらの任意の組合せであり；
（ｂ）前記ヌクレアーゼが、触媒的に活性なまたは触媒的に死んだ：ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、Ｃｐｆ１、ＣａｓＹ、ＣａｓＸ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ホーミングエンドヌクレアーゼもしくはメガヌクレアーゼ、ＤＮＡ誘導性ヌクレアーゼ、ナトロノバクテリウム・グレゴリーアルゴノート（ＮｇＡｇｏ）、またはそれらの任意の組合せであり；
（ｃ）前記抗体が細胞内抗原を認識し；および／または
（ｄ）前記ペプチドカーゴが、細胞内分子を認識する、請求項３０に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【請求項３２】
細胞治療、ゲノム編集、養子細胞移入、および／または再生医療において使用するための、請求項２４〜３１のいずれか１項に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【請求項３３】
前記標的真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、幹細胞、初代細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞である、請求項２４〜３２のいずれか１項に記載の方法、合成ペプチドシャトル剤、組成物、使用、またはキット。
【請求項３４】
請求項１〜１５のいずれか１項で定義のシャトル剤、請求項１８で定義の合成ペプチドシャトル剤、または請求項２１で定義の組成物を含む、真核細胞。
【請求項３５】
動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、幹細胞、初代細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞である、請求項３４に記載の真核細胞。
【請求項３６】
１種または複数のＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼを単独でまたは１種または複数の対応するガイドＲＮＡおよび／または直鎖ＤＮＡテンプレートと一緒に、標的真核細胞に送達する方法であって、前記標的真核細胞と前記エンドヌクレアーゼとを、シャトル剤の非存在下の場合に比べて前記エンドヌクレアーゼの形質導入効率を高めるのに十分な濃度の前記シャトル剤の存在下で、接触させることを含み、前記シャトル剤が、請求項１〜１５のいずれか１項で定義される通りである、方法。
【請求項３７】
インビトロ法、またはインビボ法である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記１種または複数のヌクレアーゼが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記１種または複数のエンドヌクレアーゼが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、またはこれらの任意の組み合わせ；または触媒的に死んだＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（ｄＣａｓ９）、ｄＣｐｆ１、ｄＣａｓＸ、ｄＣａｓＹ、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、幹細胞、初代細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞である、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記１種または複数の対応するガイドＲＮＡおよび／または直鎖ＤＮＡテンプレートが、１種または複数の遺伝子を標的にして、対応する前記方法に供されていない親真核細胞に比較して、免疫原性を低減する、細胞傷害性を改善する、および／または別の方法で前記標的真核細胞の細胞療法のための有効性を改善する、請求項５８に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞療法が、細胞ベース癌免疫療法である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記１種または複数の対応するガイドＲＮＡおよび／または直鎖ＤＮＡテンプレートが、ＣＢＬＢ遺伝子、ｃ−ＣＢＬ遺伝子、ＧＳＫ３遺伝子、ＩＬＴ２遺伝子、ＣＩＳＨ遺伝子、ＮＫＧ２ａ遺伝子、Ｂ２Ｍ遺伝子、またはこれらの任意の組み合わせを標的とする、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達する合成ペプチドシャトル剤の製造方法であって、次記のペプチドを合成することを含む方法：
（１）少なくとも２０アミノ酸長であり、
（３）正に帯電した親水性の外面および
疎水性の外面
を有する
（２）両親媒性のアルファヘリックスモチーフを含み、
次のパラメーター（４）〜（１５）の内の少なくとも５つが満たされるペプチド。
（４）疎水性の外面が、ターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスのオープンシリンダー表現に基づいて、ペプチドのアミノ酸の１２〜５０％に相当する空間的に隣接するＬ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、および／またはＭアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含む；
（５）３．５〜１１の疎水性モーメント（μ）を有する；
（６）生理学的ｐＨで少なくとも＋４の予測正味電荷を有する；
（７）８〜１３の等電点（ｐＩ）を有する；
（８）３５％〜６５％のアミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、およびＶの任意の組み合わせから構成される；
（９）０％〜３０％のアミノ酸：Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴの任意の組み合わせから構成される；
（１０）３５％〜８５％のアミノ酸：Ａ、Ｌ、Ｋ、またはＲの任意の組み合わせから構成される；
（１１）少なくとも５％のＬがペプチド中に存在するという条件で、１５％〜４５％のアミノ酸：ＡおよびＬの任意の組み合わせから構成される；
（１２）２０％〜４５％のアミノ酸：ＫおよびＲの任意の組み合わせから構成される；
（１３）０％〜１０％のアミノ酸：ＤおよびＥの任意の組み合わせから構成される；
（１４）前記ペプチド中のＡおよびＬのパーセンテージ（％Ａ＋Ｌ）と、前記ペプチド中のＫとＲのパーセンテージ（Ｋ＋Ｒ）との差異が、１０％以下である；
（１５）１０％〜４５％のアミノ酸：Ｑ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、およびＨの任意の組み合わせから構成される。
【請求項４５】
前記ペプチドが請求項２〜１５のいずれか１項で定義の通りである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達するシャトル剤を特定する方法であって、次記を含む方法：
（ａ）請求項１〜１５または１８のいずれか１項で定義のペプチドであるペプチドを合成すること；
（ｂ）前記標的真核細胞と前記ポリペプチドカーゴとを、前記ペプチドの存在下で、接触させること；
（ｃ）前記標的真核細胞中の前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を測定すること；および
（ｄ）前記標的真核細胞中の前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率の増加が観察される場合、前記ポリペプチドカーゴを形質導入するシャトル剤として、前記ペプチドを特定すること。
【請求項４７】
前記ポリペプチドカーゴが請求項２４〜３１のいずれか１項で定義の通りである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
次記を含むゲノム編集系：
（ａ）請求項１〜１５または１８のいずれか１項で定義のシャトル剤；
（ｂ）１種または複数のＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼ；および
（ｃ）１種または複数のガイドＲＮＡ。
【請求項４９】
ゲノム編集を制御する直鎖ＤＮＡテンプレートをさらに含む、請求項４８に記載のゲノム編集系。
【請求項５０】
前記１種または複数のＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼが、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＩＶ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ結合タンパク質９（Ｃａｓ９）、Ｃｐｆ１、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項４８または４９に記載のゲノム編集系。
【請求項５１】
目的のポリペプチドカーゴを形質導入した真核細胞を濃縮する方法であって、次記を含む方法：
（ａ）目的のポリペプチドカーゴおよびマーカータンパク質を用いた標的真核細胞集団を同時形質導入すること；および
（ｂ）前記マーカータンパク質を形質導入された真核細胞を単離または濃縮し、それにより、前記目的のポリペプチドカーゴを形質導入された真核細胞を濃縮すること。
【請求項５２】
（ｉ）前記マーカータンパク質が前記目的のポリペプチドカーゴに共有結合していない、前記マーカータンパク質が前記目的のポリペプチドカーゴに共有結合している、前記マーカータンパク質が前記目的のポリペプチドカーゴに非共有結合している、または前記マーカータンパク質が切断可能リンカーを介して前記目的のポリペプチドカーゴに共有結合している；および／または
（ｉｉ）前記マーカータンパク質が検出可能な標識を含むか、または前記マーカータンパク質が蛍光タンパク質、蛍光標識タンパク質、生物発光タンパク質、同位体標識タンパク質、もしくは磁気標識タンパク質である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記形質導入マーカータンパク質の細胞内濃度が、前記目的の形質導入ポリペプチドカーゴの細胞内濃度と、正の相関をする、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記マーカータンパク質を形質導入された真核細胞が、フローサイトメトリー、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、磁気細胞分離（ＭＡＣＳ）を用いて単離または濃縮される、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記マーカータンパク質を形質導入された真核細胞が、前記マーカータンパク質を欠く細胞から単離または選別され、それにより、マーカータンパク質陽性細胞集団および／またはマーカータンパク質陰性細胞集団を製造する、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
ステップ（ａ）および（ｂ）を、前記マーカータンパク質陰性細胞集団、前記マーカータンパク質陽性細胞集団、または前記マーカータンパク質陰性および前記マーカータンパク質陽性細胞集団の両方に対して１回または複数回反復することをさらに含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記マーカータンパク質を形質導入された真核細胞が、前記マーカータンパク質のそれらの細胞内の濃度を基準にして単離または選別される、請求項５１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記マーカータンパク質が、細胞増殖を刺激するタンパク質、細胞分化を刺激するタンパク質、細胞生存を促進するタンパク質、抗アポトーシス性タンパク質、または別の生物活性を有するタンパク質である、請求項５１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記目的のポリペプチドカーゴおよび前記マーカータンパク質が、ペプチド形質導入剤の存在下で、前記標的真核細胞を前記ポリペプチドカーゴおよび前記マーカータンパク質と接触させることにより同時形質導入され、ペプチド形質導入剤が、前記ペプチド形質導入剤の非存在下の場合に比べて、前記ポリペプチドカーゴおよび前記マーカータンパク質の形質導入効率を高めるのに十分な濃度で存在する、請求項５１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
（ａ）前記ペプチド形質導入剤が、エンドソーム溶解性ペプチドであり；
（ｂ）前記ペプチド形質導入剤が、請求項１７または１８で定義の前記合成ペプチドシャトル剤であるか、またはそれを含み；
（ｃ）標的真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、幹細胞、初代細胞、免疫細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、または樹状細胞を含み；
（ｄ）前記目的のポリペプチドカーゴが、（ｉ）請求項２４〜３１のいずれか１項で定義のポリペプチドカーゴ；および／または（ｉｉ）１種または複数のＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼ単独でまたは１種または複数の対応する請求項３８〜４３のいずれか１項で定義のガイドＲＮＡおよび／または直鎖ＤＮＡテンプレートと一緒の前記１種または複数のＣＲＩＳＰＲ結合エンドヌクレアーゼであり；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）の任意の組み合わせである、請求項５９に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
【図１】ＨＥＫ２９３Ａ細胞に蛍光色素カルセイン（「１００μＭカルセイン」）が負荷され、次いで、カルセイン（「１００μＭカルセイン＋ＣＭ１８−ＴＡＴ  ５μＭ」）のエンドソーム脱出を促進するシャトル剤を用いて処理された（または処理されなかった）、カルセインエンドソーム脱出アッセイの典型的な結果を示す図である。図１Ａは、蛍光顕微鏡実験の結果を示し、図１Ｂは、フローサイトメトリー実験の結果を示す。
【図２】ＨｅＬａ細胞に、カルセイン（「カルセイン１００μＭ」）が負荷され、次いで、漸増濃度のシャトル剤ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（標識された「ＣＭ１８−ＴＡＴ」）を用いて処理された、カルセインエンドソーム脱出フローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。
【図３】カルセイン（「カルセイン１００μＭ」）が負荷され、次いで、５μＭまたは８μＭのシャトル剤ＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓまたはＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（それぞれ、「ＣＭ１８−ＴＡＴ」および「ＣＭ１８−ペネトラチン」と標識）を用いて処理された、ＨｅＬａ細胞におけるカルセインエンドソーム脱出フローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。
【図４】カルセイン（「カルセイン１００μＭ」）が負荷され、次いで、５μＭまたは８μＭのシャトル剤ＣＭ１８−ＴＡＴ−ＣｙｓまたはＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（それぞれ、「ＣＭ１８−ＴＡＴ」および「ＣＭ１８−ペネトラチン」と標識）を用いて処理された、ＨｅＬａ細胞におけるカルセインエンドソーム脱出フローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。
【図５】ＧＦＰカーゴタンパク質が、０、３または５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８−ＴＡＴ」と標識）と同時インキュベートされ、次いで、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、蛍光顕微鏡によって、可視化されたＧＦＰ形質導入実験の結果を示す図である。細胞は、明視野（上のパネル）および蛍光顕微鏡（下のパネル）により観察された。
【図６】ＧＦＰカーゴタンパク質（１０μＭ）が、種々の濃度のＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８−ＴＡＴ」と標識）と同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、ＧＦＰ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが図６Ａに示され、対応する細胞毒性データが図６Ｂに示されている。
【図７】種々の濃度のＧＦＰカーゴタンパク質（１０、５または１μＭ）が、５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（図７Ａ、「ＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）または２．５μＭのｄＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（図７Ｂ、「ｄＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）のいずれかと同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、ＧＦＰ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが示されている。
【図８】ＧＦＰカーゴタンパク質（１０μＭ）が、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）、ＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８ペネトラチン」と標識）および各々の二量体（ｄＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ｄＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）、ｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（「ｄＣＭ１８ペネトラチン」と標識）の種々の濃度および組合せとともに同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、ＧＦＰ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが示されている。
【図９】ＧＦＰカーゴタンパク質（１０μＭ）が、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）、ＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８ペネトラチン」と標識）および各々の二量体（ｄＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ｄＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）、ｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（「ｄＣＭ１８ペネトラチン」と標識）の種々の濃度および組合せとともに同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、ＧＦＰ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが示されている。
【図１０】ＴＡＴ−ＧＦＰカーゴタンパク質（５μＭ）が、３μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８−ＴＡＴ」と標識）と同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、ＴＡＴ−ＧＦＰ形質導入実験の典型的な結果を示す図である。細胞およびＧＦＰ蛍光は、１０ｘおよび４０ｘ倍率で明視野および蛍光顕微鏡によって、可視化された。矢印は、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓの非存在下でのＴＡＴ−ＧＦＰのエンドソーム送達並びにＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓの存在下でのその核送達を示す。
【図１１】ＴＡＴ−ＧＦＰカーゴタンパク質（５μＭ）が、種々の濃度のＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）と同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して曝露されたＴＡＴ−ＧＦＰ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが図１１Ａに示され、対応する細胞毒性データが図１１Ｂに示されている。
【図１２】ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質（５μＭ）が、５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８−ＴＡＴ」と標識）と同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して５分間曝露された、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入実験の典型的な結果を示す図である。細胞およびＧＦＰ蛍光は、１０ｘ、２０ｘおよび４０ｘ倍率で明視野および蛍光顕微鏡によって、可視化された。矢印は、ＧＦＰ−ＮＬＳの核送達の領域を示す。
【図１３】ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質（５μＭ）が、種々の濃度のＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）と同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが図１３Ａに示され、対応する細胞毒性データが図１３Ｂに示されている。
【図１４】ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質（５μＭ）が、種々の濃度と組合せのＣＭ１８−ＴＡＴ（標識された「ＣＭ１８ＴＡＴ」）、ＣＭ１８−ペネトラチン（標識された「ＣＭ１８ペネトラチン」）および各々の二量体（それぞれｄＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ、ｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ、標識された「ｄＣＭ１８ＴＡＴ」および「ｄＣＭ１８ペネトラチン」）と同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが示されている。
【図１５】ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質（５μＭ）が、種々の濃度と組合せのＣＭ１８−ＴＡＴ（標識された「ＣＭ１８ＴＡＴ」）、ＣＭ１８−ペネトラチン（標識された「ＣＭ１８ペネトラチン」）および各々の二量体（それぞれｄＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ、ｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ、標識された「ｄＣＭ１８ＴＡＴ」および「ｄＣＭ１８ペネトラチン」）と同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが示されている。
【図１６】ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質（５μＭ）が、簡素なＤＭＥＭ培地（「ＤＭＥＭ」）または１０％  ＦＢＳ（「ＦＢＳ」）を含有するＤＭＥＭ中で、ＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（３．５μＭ、「ＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）単独と、またはｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（１μＭ、「ｄＣＭ１８ｐｅｎ」と標識）とともに、５分間または１時間同時インキュベートされ、その後、フローサイトメトリー解析に供された、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率実験の結果を示す図である。蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが示されている。シャトル剤またはＧＦＰ−ＮＬＳを用いて処理されなかった細胞（「ｃｔｒｌ」）およびＧＦＰ−ＮＬＳを用いて処理したが、シャトル剤を用いない細胞（「ＧＦＰ−ＮＬＳ  ５μＭ」）を対照として使用した。
【図１７】ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質（５μＭ）が、１μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８ＴＡＴ」と標識）とともに、または伴わずに同時インキュベートされ、その後、ＴＨＰ−１細胞に対して曝露された、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが図１７Ａに示され、対応する細胞毒性データが図１７Ｂに示されている。
【図１８】カーゴタンパク質、ＦＩＴＣ標識抗チューブリン抗体（０．５μＭ）が、５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（「ＣＭ１８−ＴＡＴ」と標識）と同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に曝露された形質導入効率実験の結果を示す図である。機能的抗体送達は、明視野（２０ｘ）および蛍光顕微鏡（２０ｘおよび４０ｘ）によって、可視化され、これでは、細胞質中の蛍光チューブリン繊維が可視化された。
【図１９】抗体カーゴタンパク質（０．５μＭ）が、３．５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（標識された「ＣＭ１８ＴＡＴ」）、ＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（標識された「ＣＭ１８ｐｅｎ」）またはｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓ（標識された「ｄＣＭ１８ｐｅｎ」）または３．５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓおよび０．５μＭのｄＣＭ１８−ペネトラチン−Ｃｙｓの組合せと同時インキュベートされ、その後、ＨｅＬａ細胞に曝露された、ＦＩＴＣ標識抗チューブリン抗体形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＦＩＴＣ陽性）細胞のパーセンテージが図１９Ａに示され、対応する細胞毒性データが図１９Ｂに示されている。
【図２０】プラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ）が、Ｃｙ５（商標）色素で標識され、０、０．０５、０．５または５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（標識された「ＣＭ１８−ＴＡＴ」）と同時インキュベートされ、その後、ＨＥＫ２９３Ａ  細胞に対して曝露された、ＤＮＡトランスフェクション効率実験の結果を示す図である。フローサイトメトリー解析によって、Ｃｙ５（商標）発光（ＤＮＡ細胞内送達に対応する、ｙ軸）およびＧＦＰ発光（ＤＮＡの核送達の成功に対応する、各バーの上に示されるパーセンテージ）の定量化が可能となった。
【図２１】ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質（５μＭ）が、１、３または５μＭのＣＭ１８−ＴＡＴ−Ｃｙｓ（標識された「ＣＭ１８ＴＡＴ」）、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＴＡＴ（標識された「Ｈｉｓ−ＣＭ１８ＴＡＴ」）と同時インキュベートされ、ＨｅＬａ細胞に対して曝露された、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率実験の結果を示す図である。細胞は、フローサイトメトリーにより評価され、蛍光（ＧＦＰ陽性）細胞のパーセンテージが図２１Ａに示され、対応する細胞毒性データが図２１Ｂに示されている。
【図２２】ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質が、ＨｅＬａ細胞において、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用して細胞内に送達された形質導入効率実験の結果を示す図である。ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率は、フローサイトメトリーにより評価され、ＧＦＰ蛍光細胞のパーセンテージ（「Ｐｏｓ細胞（％）」）並びに対応する細胞生存率データ（「生存率（％）」）が示されている。図２２Ａは、種々の形質導入プロトコル（プロトコルＡ対Ｂ）を使用するＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率の比較を示す。図２２Ｂは、プロトコルＢを使用する種々の濃度のシャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４の効果を示す。
【図２３】ＧＦＰ−ＮＬＳ標識（図２４Ａ、２４Ｂ、２５および２６）またはＦＩＴＣ標識（図２４Ｃおよび２４Ｄ）抗チューブリン抗体カーゴタンパク質が、ＨｅＬａ細胞において、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を用いて細胞内に送達された形質導入実験の結果を示す顕微鏡像である。生細胞の明視野および蛍光像を図２３、２４および２６に示す。図２５では、細胞は固定され、透過処理され、抗ＧＦＰ抗体および蛍光二次抗体を用いる免疫標識に供された。白色三角窓は、核（ＤＡＰＩ）およびＧＦＰ−ＮＬＳシグナル間の同時標識領域の例を示す。図２６は、共焦点顕微鏡によって、捉えられた像を示す。
【図２４−１】ＧＦＰ−ＮＬＳ標識（図２４Ａ、２４Ｂ、２５および２６）またはＦＩＴＣ標識（図２４Ｃおよび２４Ｄ）抗チューブリン抗体カーゴタンパク質が、ＨｅＬａ細胞において、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を用いて細胞内に送達された形質導入実験の結果を示す顕微鏡像である。生細胞の明視野および蛍光像を図２３、２４および２６に示す。図２５では、細胞は固定され、透過処理され、抗ＧＦＰ抗体および蛍光二次抗体を用いる免疫標識に供された。白色三角窓は、核（ＤＡＰＩ）およびＧＦＰ−ＮＬＳシグナル間の同時標識領域の例を示す。図２６は、共焦点顕微鏡によって、捉えられた像を示す。
【図２４−２】同上。
【図２５】ＧＦＰ−ＮＬＳ標識（図２４Ａ、２４Ｂ、２５および２６）またはＦＩＴＣ標識（図２４Ｃおよび２４Ｄ）抗チューブリン抗体カーゴタンパク質が、ＨｅＬａ細胞において、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を用いて細胞内に送達された形質導入実験の結果を示す顕微鏡像である。生細胞の明視野および蛍光像を図２３、２４および２６に示す。図２５では、細胞は固定され、透過処理され、抗ＧＦＰ抗体および蛍光二次抗体を用いる免疫標識に供された。白色三角窓は、核（ＤＡＰＩ）およびＧＦＰ−ＮＬＳシグナル間の同時標識領域の例を示す。図２６は、共焦点顕微鏡によって、捉えられた像を示す。
【図２６】ＧＦＰ−ＮＬＳ標識（図２４Ａ、２４Ｂ、２５および２６）またはＦＩＴＣ標識（図２４Ｃおよび２４Ｄ）抗チューブリン抗体カーゴタンパク質が、ＨｅＬａ細胞において、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を用いて細胞内に送達された形質導入実験の結果を示す顕微鏡像である。生細胞の明視野および蛍光像を図２３、２４および２６に示す。図２５では、細胞は固定され、透過処理され、抗ＧＦＰ抗体および蛍光二次抗体を用いる免疫標識に供された。白色三角窓は、核（ＤＡＰＩ）およびＧＦＰ−ＮＬＳシグナル間の同時標識領域の例を示す。図２６は、共焦点顕微鏡によって、捉えられた像を示す。
【図２７】ＨｅＬａ細胞における動態学的（時間経過）形質導入実験の顕微鏡像を示す図であり、ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質の蛍光は、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を用いる細胞内送達の４５（図２７Ａ）、７５（図２７Ｂ）、１００（図２７Ｃ）および１２０（図２７Ｄ）秒後に追跡された。４５秒後に観察された散在性細胞質蛍光パターン（図２７Ａ）は、１２０秒で、徐々により濃縮された核パターンになる（図２７Ｄ）。
【図２８】２個のカーゴタンパク質（ＧＦＰ−ＮＬＳおよびｍＣｈｅｒｒｙ（商標）−ＮＬＳ）がシャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４によって、ＨｅＬａ細胞における、同時に細胞内に送達される同時送達形質導入実験の顕微鏡像を示す図である。細胞および蛍光シグナルは、（図２８Ａ）明視野および（図２８Ｂ〜２８Ｄ）蛍光顕微鏡によって、可視化された。白色三角窓は、核（ＤＡＰＩ）およびＧＦＰ−ＮＬＳまたはｍＣｈｅｒｒｙ（商標）間の同時標識の領域の例を示す。
【図２９−１】種々のシャトル剤または単一ドメイン／対照ペプチドを使用する、ＨｅＬａ細胞におけるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率実験の結果を示す図である。ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率は、フローサイトメトリーにより評価され、ＧＦＰ蛍光細胞のパーセンテージ（「Ｐｏｓ細胞（％）」）並びに対応する細胞生存率データ（「生存率（％）」）が図２９Ａ、２９Ｂ、２９Ｄ〜２９Ｇおよび２９Ｉ示されている。図２９Ａおよび２９Ｄ〜２９Ｆにおいて、細胞は、カーゴ／シャトル剤に１０秒間曝露された。パネルＩでは、細胞は、カーゴ／シャトル剤に１分間曝露された。図２９Ｂ、２９Ｃ、２９Ｇおよび２９Ｈでは、細胞は、カーゴ／シャトル剤に１、２または５分間曝露された。「相対蛍光強度（ＦＬ１−Ａ）」または「シグナル強度」は、シャトル剤を用いるＧＦＰ−ＮＬＳ蛍光タンパク質送達後の、ＧＦＰ蛍光シグナルを有する各細胞に由来するすべての蛍光強度の平均に相当する。図２９Ｄは、複数ドメインシャトル剤の代わりに、単一ドメインペプチド（ＥＬＤまたはＣＤＰ）のみまたはペプチドＨｉｓ−ＰＴＤ４（Ｈｉｓ−ＣＰＤ）が、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入に使用される対照実験の結果を示す。
【図２９−２】同上。
【図２９−３】同上。
【図２９−４】同上。
【図２９−５】同上。
【図３０】シャトル剤図３０Ａ：ＴＡＴ−ＫＡＬＡ、図３０Ｂ：Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４、図３０Ｃ：Ｈｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４、図３０Ｄ：ＰＴＤ４−ＫＡＬＡ、図３０Ｅ：ＥＢ１−ＰＴＤ４および図３０Ｆ：Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４−Ｈｉｓを使用して、ＧＦＰ−ＮＬＳを用いて形質導入されたＨｅＬａ細胞の顕微鏡像を示す図である。最下行パネル中の挿入図は、対応するフローサイトメトリー解析の結果を示し、ＧＦＰ蛍光を示す細胞のパーセンテージを示す。
【図３１】ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質が、異なるプロトコル（プロトコルＡ対Ｃ）を使用して、ＴＨＰ−１細胞において、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用して細胞内に送達された形質導入効率実験の結果を示す図である。ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率は、フローサイトメトリーにより評価され、ＧＦＰ蛍光細胞のパーセンテージ（「Ｐｏｓ細胞（％）」）並びに対応する細胞生存率データ（「生存率（％）」）が示されている。「Ｃｔｒｌ」は、シャトル剤の非存在下でＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質に曝露されたＴＨＰ−１細胞に対応する。
【図３２】シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用し、ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質を用いて形質導入されたＴＨＰ−１細胞の顕微鏡像を示す図である。４ｘ、１０ｘおよび４０ｘの倍率で捉えられた像が、それぞれ図３２Ａ〜３２Ｃに示されている。図３２Ｃ中の白色三角窓は、細胞（明視野）およびＧＦＰ−ＮＬＳ蛍光間の同時標識の領域の例を示す。図３２Ｄは、対応するフローサイトメトリー解析の結果を示し、ＧＦＰ蛍光を示す細胞のパーセンテージを示す。
【図３３】シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用し、ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴタンパク質を用いて形質導入されたＴＨＰ−１細胞の顕微鏡像を示す図である。白色三角窓は、細胞（明視野；図３３Ａおよび３３Ｂ）とＧＦＰ−ＮＬＳ蛍光（図３３Ｃおよび３３Ｄ）との間の同時標識の領域の例を示す。
【図３４】シャトルＴＡＴ−ＫＡＬＡ、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４またはＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４を使用する、ＴＨＰ−１細胞におけるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率実験の結果を示す図である。カーゴタンパク質／シャトル剤がＴＨＰ−１細胞に対して１５、３０、６０または１２０秒間曝露された。ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率は、フローサイトメトリーにより評価され、ＧＦＰ蛍光細胞のパーセンテージ（「Ｐｏｓ細胞（％）」）並びに対応する細胞生存率データ（「生存率（％）」）が図３４Ａに示されている。図３４Ｂでは、「相対蛍光強度（ＦＬ１−Ａ）」は、シャトル剤を用いるＧＦＰ−ＮＬＳ蛍光タンパク質送達後のＧＦＰ蛍光シグナルを有する各細胞に由来するすべての蛍光強度の平均に相当する。
【図３５】ＴＨＰ−１細胞が、シャトル剤の存在下で２．５時間、ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴに毎日曝露された形質導入効率実験の結果を示す図である。図３５Ａ〜３５Ｅでは、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４が使用され、図３５Ｆでは、Ｈｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４が使用された。ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率は、１日目または３日目にフローサイトメトリーにより決定され、結果は、図３５Ａ〜３５Ｃおよび３５Ｆにおいて、ＧＦＰ蛍光細胞のパーセンテージ（「Ｐｏｓ細胞（％）」）並びに対応する細胞生存率データ（「生存率（％）」）として表される。図３５Ｄは、１、２、４および２４時間後のＴＨＰ−１細胞の代謝活性指数を示し、図３５Ｅは、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４シャトルに対して曝露された細胞の、１〜４日後のＴＨＰ−１細胞の代謝活性指数を示す。
【図３６】フローサイトメトリーにより測定されるような、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用する、複数の異なる細胞型（例えば、接着および懸濁液、並びに細胞株および初代細胞）におけるＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率の比較を示す図である。結果は、ＧＦＰ蛍光細胞のパーセンテージ（「Ｐｏｓ細胞（％）」）並びに対応する細胞生存率データ（「生存率（％）」）として表される。
【図３７】図３７Ａ〜３７Ｈは、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用し、ＧＦＰ−ＮＬＳカーゴを用いて形質導入された種々の細胞型の蛍光顕微鏡像を示す図である。ＧＦＰ蛍光は、１０ｘの倍率で蛍光顕微鏡によって、可視化された。挿入図中に、並行フローサイトメトリー実験の結果も提供されている（生存率およびＧＦＰ蛍光細胞のパーセンテージ）。
【図３８】シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用し、ＧＦＰ−ＮＬＳを用いて形質導入された一次ヒト筋芽細胞の蛍光顕微鏡像を示す図である。細胞は、固定され、透過処理され、その後、抗ＧＦＰ抗体および蛍光二次抗体を用いてＧＦＰ−ＮＬＳが免疫標識された。免疫標識されたＧＦＰは、図３８Ａに示されており、図３８Ｂでは、この像に、核（ＤＡＰＩ）標識が重ねられている。
【図３９】細胞内に送達されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体の活性を評価するために使用されたトランスフェクションプラスミド代替アッセイの配置図（図３９Ａ、３９Ｂおよび３９Ｃ）および蛍光像例（図３９Ｄおよび３９Ｅ）を示す図である。（図３９Ａ）１日目に、細胞には、蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）およびＧＦＰを、その２つのオープンリーディングフレームを隔てる停止コドンとともにコードする発現プラスミドがトランスフェクトされる。発現プラスミドを用いる細胞のトランスフェクションは、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）発現のみをもたらす（図３９Ｄ）。次いで、プラスミドＤＮＡを停止コドンで切断するように設計／プログラムされているＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体が、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）を発現するトランスフェクトされた細胞に、細胞内に送達され、その結果、プラスミドＤＮＡが停止コドンで二本鎖切断される（図３９Ｂ）。一部の細胞では、切断されたプラスミドのランダムな非相同ＤＮＡ修復が生じ、停止コドンの除去（図３９Ｃ）、したがって、ＧＦＰ発現および蛍光をもたらす（図３９Ｅ）。白色三角窓は、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）およびＧＦＰ蛍光の同時標識の領域の例を示す。
【図４０】ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）およびＧＦＰを発現するＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡像を示す図であり、プラスミド代替ＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳにより媒介される切断を示す。パネルＡ〜Ｄでは、ＨｅＬａ細胞は、３種のプラスミド：図３９Ａ〜３９Ｆの簡単な説明に記載されるようなプラスミド代替およびそれぞれ、Ｃａｓ９−ＮＬＳタンパク質およびｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡをコードする２種のその他の発現プラスミドで同時トランスフェクトされた。停止コドンでのプラスミド代替のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により媒介される切断およびその後の細胞によるＤＮＡ修復によって、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）（図４０Ａおよび４０Ｃ）に加えて、ＧＦＰの発現（図４０Ｂおよび４０Ｄ）が可能となる。図４０Ｅ〜４０Ｈでは、ＨｅＬａ細胞に、プラスミド代替がトランスフェクトされ、次いで、シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用し、活性ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体を用いて形質導入された。停止コドンでのプラスミド代替のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ媒介切断およびその後の細胞によるＤＮＡ修復によって、ｍＣｈｅｒｒｙ（商標）（図４０Ｅおよび４０Ｇ）に加えて、ＧＦＰの発現（図４０Ｆおよび４０Ｈ）が可能となる。
【図４１Ａ】（レーンＡ〜Ｄ）アガロースゲル電気泳動により分離されたＤＮＡ切断アッセイ（Ｔ７Ｅ１アッセイ）の産物を示す図であり、これは、細胞性ゲノムＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介切断を測定するために使用される。ＨｅＬａ細胞に、ＰＰＩＢ遺伝子を切断するようにプログラムされたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体を用いて形質導入した。白色の四角１および２で囲まれた切断産物の存在は、シャトルＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４（図４１Ａ、レーンＢ）を使用して、または陽性対照（図４１Ａ、レーンＤ）として使用される脂質トランスフェクション剤を用いて細胞内に送達されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体によるＰＰＩＢ遺伝子の切断を示す。この切断産物は、陰性対照（図４１Ａ、レーンＡおよびＣ）には存在しない。
【図４１Ｂ】アガロースゲル電気泳動により分離されたＤＮＡ切断アッセイ（Ｔ７Ｅ１アッセイ）の産物を示す図であり、これは、細胞性ゲノムＤＮＡ（ＰＰＩＢ  ＤＮＡ配列）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により媒介される切断を測定するために使用される。左側のパネルは、ＨｅＬａ細胞におけるシャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を用いる複合体の送達後のＣＲＩＰＲ／Ｃａｓ９複合体による増幅されたＰＰＩＢ  ＤＮＡ配列の切断産物を示す。右側のパネルは、陰性対照としてのＴ７Ｅ１消化手順前の増幅されたＤＮＡ配列を示す。
【図４１Ｃ】アガロースゲル電気泳動により分離されたＤＮＡ切断アッセイ（Ｔ７Ｅ１アッセイ）の産物を示す図であり、これは、細胞性ゲノムＤＮＡ（ＰＰＩＢ  ＤＮＡ配列）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により媒介される切断を測定するために使用される。左側のパネルは、脂質トランスフェクション剤（ＤｈａｒｍａＦｅｃｔ（商標）トランスフェクション試薬Ｔ−２０ＸＸ−０１番）の存在下でＣａｓ９／ＲＮＡ複合体とともにＨｅＬａ細胞をインキュベーションした後に増幅されたＰＰＩＢ  ＤＮＡ配列を示す（陽性対照）。右側のパネルは、陰性対照としてのＴ７Ｅ１消化手順前の増幅されたＤＮＡ配列を示す。
【図４２】種々の濃度のシャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４および異なるカーゴ／シャトル曝露時間を使用して、転写因子ＨＯＸＢ４を用いて形質導入されているＴＨＰ−１細胞の転写活性を示す図である。ＨＯＸＢ４の核内送達の成功は、リアルタイムＰＣＲによって、標的遺伝子のｍＲＮＡレベルをモニタリングすることにより決定され、結果は、陰性対照（シャトル剤を用いないＨＯＸＢ４）におけるものに対して正規化され、「対照を上回る倍数」（左側のバー）として表現される。総細胞性ＲＮＡ（ｎｇ／μＬ）が、定量化され、細胞生存力（右側のバー）のマーカーが使用された。「Φ」または「Ｃｔｒｌ」は、「処理なし」を意味し、「ＴＦ」は、「転写因子単独」を意味し、「ＦＳ」は、「シャトル単独」を意味する。
【図４３】種々の濃度のシャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４および異なるカーゴ／シャトル曝露時間を使用して、転写因子ＨＯＸＢ４を用いて形質導入されているＴＨＰ−１細胞の転写活性を示す図である。ＨＯＸＢ４の核内送達の成功は、リアルタイムＰＣＲによって、標的遺伝子のｍＲＮＡレベルをモニタリングすることにより決定され、結果は、陰性対照（シャトル剤を用いないＨＯＸＢ４）におけるものに対して正規化され、「対照を上回る倍数」（左側のバー）として表現される。総細胞性ＲＮＡ（ｎｇ／μＬ）が、定量化され、細胞生存力（右側のバー）のマーカーが使用された。「Φ」または「Ｃｔｒｌ」は、「処理なし」を意味し、「ＴＦ」は、「転写因子単独」を意味し、「ＦＳ」は、「シャトル単独」を意味する。
【図４４】種々の濃度のシャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４および異なるカーゴ／シャトル曝露時間を使用して、転写因子ＨＯＸＢ４を用いて形質導入されているＴＨＰ−１細胞の転写活性を示す図である。ＨＯＸＢ４の核内送達の成功は、リアルタイムＰＣＲによって、標的遺伝子のｍＲＮＡレベルをモニタリングすることにより決定され、結果は、陰性対照（シャトル剤を用いないＨＯＸＢ４）におけるものに対して正規化され、「対照を上回る倍数」（左側のバー）として表現される。総細胞性ＲＮＡ（ｎｇ／μＬ）が、定量化され、細胞生存力（右側のバー）のマーカーが使用された。「Φ」または「Ｃｔｒｌ」は、「処理なし」を意味し、「ＴＦ」は、「転写因子単独」を意味し、「ＦＳ」は、「シャトル単独」を意味する。
【図４５】シャトルＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４を使用し、野生型ＨＯＸＢ４カーゴを用いて形質導入されたＨｅＬａ細胞の蛍光顕微鏡像を示す図である。形質導入されたＨＯＸＢ４−ＷＴが核中に蓄積することを可能にするために３０分インキュベーションした後、細胞を固定し、透過処理し、ＨＯＸＢ４−ＷＴを一次抗ＨＯＸＢ４モノクローナル抗体および蛍光二次抗体（図４５Ｂおよび４５Ｄ）を使用して標識した。核をＤＡＰＩを用いて標識した（図４５Ａおよび４５Ｃ）。白色三角窓は、核およびＨＯＸＢ４間を同時標識する領域の例を示し、図４５Ａ対４５Ｂ（ｘ２０の倍率）および図４５Ｃ対４５Ｄ（ｘ４０の倍率）を比較する。
【図４６】アガロースゲル電気泳動により分離されたＤＮＡ切断アッセイの産物を示す図であり、これは、異なるシャトル剤を用いる複合体の細胞内送達後の細胞性ゲノムＤＮＡ（ＨＰＴＲ配列）のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により媒介される切断を測定するために使用される。図４６Ａは、ＨｅＬａ細胞において、シャトル剤：Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４−ＨｉｓおよびＨｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４を用いた結果を示す。図４６Ｂは、ジャーカット細胞において、Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４−ＨｉｓおよびＨｉｓ−ＣＭ１８−Ｌ２−ＰＴＤ４を用いた結果を示す。陰性対照（パネルＡおよびＢにおけるレーン４）は、シャトル剤の存在をともなわずにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体とともに細胞をインキュベーションした後に増幅されたＨＰＴＲ  ＤＮＡ配列を示す。陽性対照（パネルＡおよびＢにおけるレーン５）は、市販の脂質トランスフェクション剤の存在下でＣａｓ９／ＲＮＡ複合体とともに細胞のインキュベーションした後に増幅されたＨＰＴＲ  ＤＮＡ配列を示す。
【図４７】シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４、ＴＡＴ−ＫＡＬＡ、ＥＢ１−ＰＴＤ４、Ｈｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４およびＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４−Ｈｉｓを使用し、転写因子ＨＯＸＢ４を用いて形質導入されているＴＨＰ−１細胞の転写活性を示す図である。ＨＯＸＢ４の核内送達の成功は、リアルタイムＰＣＲによって、標的遺伝子のｍＲＮＡレベルをモニタリングすることにより決定され、結果は、陰性対照（シャトル剤を用いないＨＯＸＢ４）におけるものに対して正規化され、「対照に対する倍数」（左側のバー）として表現される。総細胞性ＲＮＡ（ｎｇ／μＬ）が、定量化され、細胞生存力（右側のバー）のマーカーが使用された。「Φ」または「Ｃｔｒｌ」は、「処理なし」を意味し、「ＴＦ」は、「転写因子単独」を意味し、「ＦＳ」は、「シャトル単独」を意味する。
【図４８】Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４によるラット頭頂皮質におけるインビボＧＦＰ−ＮＬＳ送達を示す図である。手短に説明すると、ＧＦＰ−ＮＬＳ（２０μＭ）を、シャトル剤Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４（２０μＭ）の存在下で１０分間、ラットの頭頂皮質中に注射した。背腹側ラット脳切片を集め、４ｘ（図４８Ａ）、１０ｘ（図４８Ｃ）および２０ｘ（図４８Ｄ）の倍率で蛍光顕微鏡により解析した。注射部位は、頭頂皮質（ＰＣｘ）の最深層中に位置する。Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４シャトル剤の存在下で、ＧＦＰ−ＮＬＳは、ＰＣｘの、脳梁（Ｃｏｒｐｕｓ  Ｃａｌｌｕｓ）（Ｃｃ）の、および線条体（Ｓｔｒ）の（白色曲線は脳構造間の限界を記す）細胞核中に拡散した。図４８Ｂは、ＦｒａｎｋｌｉｎおよびＰａｘｉｎｏｓのラット脳アトラスからの注射部位の定位座標（黒色矢印）を示す。Ｈｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４の存在下でのＧＦＰ−ＮＬＳの注射を、脳の左側で実施し、陰性対照（ＧＦＰ−ＮＬＳ単独の注射）を反対側で実施した。図４８Ｂ中の黒丸および黒色連絡線は、蛍光写真（図４８Ａ、４８Ｃおよび４８Ｄ）において、観察された領域を示す。
【図４９−１】図４９Ａ及び図４９Ｂは、ペプチドＦＳＤ５およびＶＳＶＧ−ＰＴＤ４の、それぞれ、ヘリカルホイール（左パネル）および「オープンシリンダー」（右パネル）表現を示す図である。各アミノ酸残基の幾何学的形状は、残基の側鎖に基づくその生化学的性質（すなわち、疎水性、電荷、または親水性）に対応する。ＦＳＤ５とＶＳＶＧ−ＰＴＤ４の２つのオープンシリンダー表現の間の主要な差異の１つは、ＦＳＤ５中の高度疎水性コアの存在であり（図４９Ａ、左と右のパネルに概要を示す）、これはＶＳＶＧ−ＰＴＤ４には存在しない。図４９Ａと４９Ｂの下部中央のパネルのシリンダーは、簡略化バージョンの右パネルのオープンシリンダー表現であり、「Ｈ」は高疎水性表面領域を表し；「ｈ」は疎水性表面領域を表し；「＋」は正電荷残基を表し；「ｈ」は親水性残基を表す。
【図４９−２】図４９Ｃ〜４９Ｆは、ペプチドＦＳＤ５、ＦＳＤ１８、ＶＳＶＧ−ＰＴＤ４、および、二つのベータシートを有し、アルファヘリックスを有さないペプチドの構造のそれぞれ、予測した３次元モデルを示す図である。
【図４９−３】図４９Ｇは、ペプチドＨｉｓ−ＣＭ１８−ＰＴＤ４；ＥＢ１−ＰＴＤ４；Ｈｉｓ−Ｃ（ＬＬＫＫ）３Ｃ−ＰＴＤ４；ＦＳＤ５；ＦＳＤ１０；ＦＳＤ１９；ＦＳＤ２０；ＦＳＤ２１；ＦＳＤ４４；ＦＳＤ４６；およびＦＳＤ６３、の複数の配列アラインメントを、それぞれの残基位置に関する「一貫性」スコアと共に示す図である。アライメントに際し、ヒスチジンリッチドメインは、自発的に除外した。
【図５０−１】蛍光の標識抗体をカーゴとして用いて、シャトル剤ＦＳＤ５によりうまく形質導入した生存ＨｅＬａ細胞の顕微鏡像を示す。図５０Ａは、明視野（上段パネル）および蛍光顕微鏡法（下段パネル）により２０ｘ倍率で可視化した、ヤギ抗ウサギＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４）抗体の細胞質形質導入を示す図である。図５０Ｂおよび５０Ｃは、明視野（上段パネル）および蛍光顕微鏡法（下段パネル）により、それぞれ１０ｘおよび２０ｘ倍率で可視化した、ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８）抗体の細胞質形質導入を示す図である。
【図５０−２】図５０Ｄは、核周辺膜中で抗原を認識する抗ＮＵＰ９８抗体をシャトル剤ＦＳＤ１９を用いてＨｅＬａ細胞に形質導入した形質導入実験の結果を示す図である。形質導入後、ＨｅＬａ細胞を固定し、透過処理し、抗ＮＵＰ９８抗体（左パネル）およびヘキスト核染色（右パネル）を認識する蛍光（Ａｌｅｘａ（商標）４８８）二次抗体で標識した。上段および下段パネルパネルは、それぞれ２０ｘおよび４０ｘ倍率で取得された画像を示す。
【図５１−１】図５１Ａ〜５１Ｆは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳゲノム編集複合体が、種々のシャトル剤ペプチド（ＦＳＤ５、ＦＳＤ８、ＦＳＤ１０、ＦＳＤ１８）を用いて、種々の細胞型（ＨｅＬａ、ＮＫ細胞、ＮＩＣ−Ｈ１９６細胞、ＨＣＣ−７８細胞、およびＲＥＣ−１細胞）中に形質導入し、成功したゲノム編集がゲノムＤＮＡ切断アッセイにより確認されたゲノム編集実験の結果を示す図である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体は、ＨＰＲＴゲノムＤＮＡ配列を切断するように設計されたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡと複合化された組換えＣａｓ９−ＮＬＳからなる。成功したゲノム編集は、非切断ゲノム標的遺伝子（薄い点線の矢印）と比較して、ゲノムＤＮＡ切断産物（濃い中実矢印）の検出により観察された。陰性対照（「−ｃｔｒｌ」）は、シャトル剤ペプチドの非存在下で実施した形質導入実験由来のものであった。切断産物バンドの相対シグナル強度をゲル上で直接定量化するために、イメージングソフトウェアを使用した。所与のレーンの全バンドの合計は、１００％のシグナルに相当し、各レーンの下端のイタリック体の数値は、２つの切断産物バンド（濃い中実矢印）のみの相対シグナル％の合計である。
【図５１−２】図５１Ｇは、短いＤＮＡテンプレート（７２ｂｐ）の非存在下（「テンプレートなし」）または存在下（「＋５００ｎｇ」）で、ＦＳＤ５により形質導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体による標的ＨＰＲＴゲノム配列の切断を示す。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、濃い中実矢印は、この標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ媒介切断産物に対応するバンドを示し、このことは、ＤＮＡテンプレートの存在下および非存在下で完全に機能するゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。各レーンの下端のイタリック体の数値は、２つの切断産物バンド（濃い中実矢印）のみの相対シグナル％の合計である。図５１Ｈは、短いＤＮＡテンプレートに特異的なプライマーを用いた、図５１Ｇの試料のＰＣＲ増幅の結果であり、ＤＮＡテンプレート配列のゲノムインサートを示す（図５１Ｈの矢印を参照されたい）。図５１Ｉは、長い直鎖ＤＮＡテンプレート（１６３１  ｂｐ）の非存在下（「テンプレートなし」）または存在下（「＋５００ｎｇ」）で、ＦＳＤ５により形質導入されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ複合体による標的ＨＰＲＴゲノム配列の切断を示す。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、濃い中実矢印は、この標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳ媒介切断産物に対応するバンドを示し、このことは、ＤＮＡテンプレートの存在下および非存在下で完全に機能するゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。各レーンの下端のイタリック体の数値は、２つの切断産物バンド（濃い中実矢印）のみの相対シグナル％の合計である。図５１Ｊは、ゲノム切断部位をまたいで増幅するように設計されたプライマーを用いた、図５１Ｉの試料のＰＣＲ増幅の結果を示す図である。長いＤＮＡテンプレート配列のゲノムインサートは、「＋５００ｎｇ」（微弱）および「＋１０００ｎｇ」（より黒い）レーンのより大きなバンドの存在により可視化される。図５１Ｊの矢印を参照されたい。図５１Ｋおよび５１Ｌは、ＨｅＬａ（図５１Ｋ）およびＮＫ細胞（図５１Ｌ）におけるシャトル剤ＦＳＤ１８の非存在下（「−ｃｔｒｌ」）または存在下でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳゲノム編集複合体を用いた、標的ゲノムＤＮＭＴ１  ＤＮＡ配列の切断の、ＰＣＲ増幅およびアガロースゲル電気泳動による分離後の結果を示す図である。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、濃い中実矢印は、この標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ媒介切断産物に対応するバンドを示し、このことは、完全に機能するゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。種々のバンドのそれぞれの相対シグナル強度をゲル上で直接定量化するために、イメージングソフトウェアを使用した。所与のレーンの全バンドの合計は、１００％のシグナルに相当し、各レーンの下端のイタリック体の数値は、２つの切断産物バンド（濃い中実矢印）のみの相対シグナル％の合計である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳゲノム編集複合体を形質導入するために、リポフェクタミン系遺伝子導入試薬ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（商標）を用いた場合、ゲノムＤＮＡ切断は観察されなかった。
【図５２−１】種々の細胞型：ＴＨＰ−１（図５２Ａ）；ＮＫ（図５２Ｂ〜Ｄ）およびＨｅＬａ（図５２Ｅ）において、種々の濃度、暴露時間で用いたシャトル剤ＦＳＤ１０、ＦＳＤ１８、ＦＳＤ１９、ＦＳＤ２１、ＦＳＤ２３またはＦＳＤ４３の非存在下（「−ｃｔｒｌ」）または存在下で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳおよびｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳおよびシングルガイドＲＮＡを用いた、標的ゲノムＢ２Ｍ  ＤＮＡ配列の切断の、アガロースゲル電気泳動による分離後の結果を示す図である。細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１複合体およびＦＳＤシャトル剤と共に、示した時間と濃度でインキュベートした。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、より濃い中実矢印は、この標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ系媒介切断産物に対応するバンドを示し、このことは、完全に機能するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。種々のバンドのそれぞれの相対シグナル強度をゲル上で直接定量化するために、イメージングソフトウェアを使用した。所与のレーンの全バンドの合計は、１００％のシグナルに相当し、各レーンの下端のイタリック体の数値は、２つの切断産物バンド（濃い中実矢印）のみの相対シグナル％の合計である。
【図５２−２】種々の細胞型：ＮＫ（図５２Ｆ〜Ｇ）；ＴＨＰ−１（図５２Ｈ）および初代筋芽細胞（図５２Ｉ）において、種々の濃度、暴露時間で用いたシャトル剤ＦＳＤ１０、ＦＳＤ１８、ＦＳＤ１９またはＦＳＤ２３の非存在下（「−ｃｔｒｌ」）または存在下で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳおよびシングルガイドｃｒＲＮＡを用いた、標的ゲノムＧＳＫ３（図５２Ｆ）、ＣＢＬＢ（図５２Ｇ）およびＤＮＭＴ１（図５２Ｈ〜Ｉ）ＤＮＡ配列の切断の、アガロースゲル電気泳動による分離後の結果を示す図である。細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１複合体およびＦＳＤと共に、示した時間と濃度でインキュベートした。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、より濃い中実矢印は、これらの標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ系媒介切断産物に対応するバンドを示し、このことは、完全に機能するＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。
【図５２−３】図５２Ｊ〜５２Ｎは、ＮＫ細胞（図５２Ｆ〜５２Ｇ）およびＮＫ−９２細胞（図５２Ｈ）において、種々の濃度、暴露時間で用いたシャトル剤ＦＳＤ１０、ＦＳＤ２１、ＦＳＤ２２またはＦＳＤ２３の非存在下（「−ｃｔｒｌ」）または存在下で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳおよびシングルガイドｃｒＲＮＡを用いた、標的ゲノムＮＫＧ２Ａ  ＤＮＡ配列の切断の、アガロースゲル電気泳動による分離後の結果を示す図である。細胞をＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１複合体と共に、示した時間と濃度でインキュベートした。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、より濃い中実矢印は、この標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ系媒介切断産物に対応するバンドを示し、このことは、完全に機能するＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。
【図５３】標的ゲノムＨＰＲＴ、ＤＮＭＴ１およびＢ２Ｍ  ＤＮＡ配列のＣＲＩＳＰＲ系による切断の結果を示す。２つのゲノムＨＰＲＴとＤＮＭＴ１（図５３Ａ）ＤＮＡ配列またはゲノムＢ２Ｍエキソン２（図５３Ｂ）上の２つのＤＮＡ座位がＨｅＬａ細胞中で、これらの目的のために設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ＮＬＳおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳゲノム編集複合体を用いて標的化され、これらは、シャトル剤ペプチドＦＳＤ１８を用いて形質導入された。ゲノムＢ２Ｍエキソン２（図５３Ｃ）上の２つのＤＮＡ座位が、アガロースゲル電気泳動による分離後、種々の濃度、暴露時間で用いたシャトル剤ＦＳＤ１０、ＦＳＤ２１またはＦＳＤ２３の非存在下（「−ｃｔｒｌ」）または存在下で、ＮＫ細胞中でＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳおよびシングルガイドｃｒＲＮＡ−１，ｃｒＲＮＡ−２または両方を用いて標的化された。薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、より濃い中実矢印は、ｃｒＲＮＡ−１またはｃｒＲＮＡ２またはＢ２Ｍエキソン２用の両方（ｃｒＲＮＡ１＋２）の存在下でのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１媒介切断産物に対応するバンドを示し、このことは、完全に機能するＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳゲノム編集複合体の形質導入に成功したことを示す。
【図５４】図５４Ａ〜５４Ｄは、Ｔ細胞が漸増濃度のシャトル剤ＦＳＤ２１（８μＭ：図５４Ｂ、１０μＭ：図５４Ｃ、および１２μＭ：図５４Ｄ）、１．３３μＭのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ系および２μＭのＢ２ＭゲノムＤＮＡ配列を標的とするシングルガイドｃｒＲＮＡで処理されたフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。ＨＬＡ陽性およびＨＬＡ陰性（Ｂ２Ｍノックアウト）細胞を、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＨＬＡ−ＡＢＣ抗体を用いることにより、処理の７２時間後に特定した。左シフト細胞集団は、Ｂ２Ｍ遺伝子の不活性化に起因して、細胞表面ＨＬＡ受容体の不活性化に成功したことを示す。
【図５５】図５５Ａ〜５５Ｄは、Ｔ細胞が漸増濃度のシャトル剤ＦＳＤ１８（８μＭ：図５５Ｂ、１０μＭ：図５５Ｃ、および１２μＭ：図５５Ｄ）、１．３３μＭのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ系および２μＭのＢ２Ｍ  ＤＮＡ配列を標的とするシングルガイドｃｒＲＮＡで処理されたフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。ＨＬＡ陽性およびＨＬＡ陰性（Ｂ２Ｍノックアウト）細胞を、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＨＬＡ−ＡＢＣ抗体を用いることにより、処理の７２時間後に特定した。左シフト細胞集団は、Ｂ２Ｍ遺伝子の不活性化に起因して、細胞表面ＨＬＡ受容体の不活性化に成功したことを示す。
【図５６】ＴＨＰ−１細胞が、１．３３μＭのＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ系、それぞれＢ２ＭゲノムＤＮＡ配列内の異なる部位を標的とする２μＭの１個または３個のガイドｃｒＲＮＡおよび３μＭのＦＳＤ１８の混合物で処理された（図５６Ｂ〜５６Ｅ）または処理されなかった（「未処理」、図５６Ａ）フローサイトメトリーアッセイの結果を示す。未処理細胞（図５６Ａ）、ｃｒＲＮＡ  Ｅ処理細胞（図５６Ｂ）、ｃｒＲＮＡ  Ｇ処理細胞（図５６Ｃ）、ｃｒＲＮＡ  Ｊ処理細胞（図５６Ｄ）およびｃｒＲＮＡ  Ｅ＋Ｇ＋Ｊ処理細胞（図５６Ｅ）における、ＨＬＡ陽性およびＨＬＡ陰性（Ｂ２Ｍノックアウト）細胞を、ＡＰＣ標識マウス抗ヒトＨＬＡ−ＡＢＣ抗体を用いることにより、処理の４８時間後に特定した。左シフト細胞集団は、Ｂ２Ｍ遺伝子の不活性化に起因して、細胞表面ＨＬＡ受容体の不活性化に成功したことを示す。
【図５７】ＮＫ−９２細胞をゲノム編集して、内在性ＮＫＧ２Ａ遺伝子の不活化が標的ＨｅＬａ細胞を死滅させるそれらの能力を高め得るか否かを判定する実験結果を示す図である。手短に説明すると、シャトル剤ペプチドＦＳＤ２３を用いて、ＮＫＧ２Ａ遺伝子を切断するように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳゲノム編集複合体をＮＫ−９２細胞に形質導入した。形質導入後、ＮＫ−９２細胞をフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ＮＫＧ２Ａ抗体で免疫標識し、その後、図５７Ａに示すようにフローサイトメトリーにより分析して、ＮＫＧ２Ａの不活性化の成功を確認した。対照として、非標識野生型ＮＫ−９２細胞（「非標識ＷＴ細胞」）は、抗体シグナルがなく、標識野生型ＮＫ−９２細胞（「標識ＷＴ細胞」）は、完全な免疫標識シグナルを有した。ＮＫＧ２Ａ−ＫＯ  ＮＫ−９２細胞の場合、２つの細胞集団（ピーク）：１つは、細胞表面上のＮＫＧ２Ａ受容体発現の完全なノックアウトを有するもの（「完全ＮＫＧ２Ａ  ＫＯ細胞」）、およびもう１つは、発現の部分的欠如を有するもの（「部分的なＮＫＧ２Ａ  ＫＯ細胞」）が観察された。図５７Ｂは、前もって細胞内蛍光染料（カルセイン）をロードした標的ＨｅＬａ細胞を野生型（実線）またはゲノム編集ＮＫＧ２Ａ−ＫＯ（点線）エフェクターＮＫ−９２細胞に、種々のエフェクター：標的比率（Ｅ：Ｔ比率）で曝露した細胞傷害性アッセイの結果を示す図である。細胞傷害性を、標的ＨｅＬａ細胞の細胞膜の破壊（「％細胞溶解」）により生じた、細胞外間隙への細胞内のカルセインの相対的放出により評価した。
【図５８−１】Ｔ細胞が、ＧＦＰ−ＮＬＳ、Ｂ２ＭゲノムＤＮＡ配列を切断するように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ複合体、およびシャトル剤ＦＳＤ１８の混合物で処理された（図５８Ａ〜５８Ｆ）、または処理されなかった（図５８Ａ）フローサイトメトリーアッセイの結果を示す。図５８Ｂおよび５８Ｃは、処理の５時間後の、ＧＦＰ蛍光（ｘ軸）と細胞表面ＨＬＡ発現（ｙ軸）を基準にした２次元フローサイトメトリー分析の結果を示す。それらのＧＦＰ蛍光に基づいてＧＦＰ陰性画分（図５８Ｅ）およびＧＦＰ陽性画分（図５８Ｆ）への細胞の蛍光標識細胞分取（図５８Ｄ）により、ＧＦＰ陽性画分中のゲノム編集（ＨＬＡ陰性）細胞の比率が２９．７％に増大した（図５８Ｆ）。その後、各細胞画分を標準的Ｔ７Ｅ１切断アッセイと、これに続く、アガロースゲル電気泳動に供し、ゲノム編集の有効性を評価した。結果を図５８Ｇに示し、薄い点線矢印は、標的遺伝子に対応するバンドを示し、より濃い中実矢印は、この標的遺伝子のＣＲＩＳＰＲ系媒介切断産物に対応するバンドを示す。レーン２、３および４の下端の値は、そのレーン中の切断産物バンド（中実矢印）の相対的シグナル強度（％）に相当する。
【図５８−２】同上。
【図５８−３】同上。
【図５９−１】Ｔ細胞が、ＧＦＰ−ＮＬＳ、内在性Ｂ２Ｍ遺伝子を切断するように設計されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１−ＮＬＳ複合体、およびシャトル剤ＦＳＤ１８の混合物で処理された（図５９Ｃ〜５９Ｅ）、または処理されなかった（図５９Ａおよび５９Ｂ）フローサイトメトリーアッセイの結果を示す。図５９Ａおよび５９Ｂは、ペプチドシャトル剤にも、ＧＦＰやＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１にも曝露されなかった「未処理」陰性対照細胞の結果を示し、これは、ＧＦＰ蛍光（図５９Ａ）および細胞表面ＨＬＡ発現（図５９Ｂ）に対しフローサイトメトリーにより分析された。Ｔ細胞は、ペプチドＦＳＤ１８を介して、ＧＦＰ−ＮＬＳおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１の両方で同時形質導入され、得られたＧＦＰ蛍光分布を図５９Ｃに示す。図５９Ｃに示す２つのゲートは、ＧＦＰ陽性であると見なされた細胞画分（「ＧＦＰ＋」；９３．２％；実線ゲート）、および高いＧＦＰ蛍光を示すと見なされた細胞の細画分（「ＧＦＰ高」；３３．１％；点線ゲート）を示す。蛍光標識細胞分取を実施して、高いＧＦＰ蛍光を示すと見なされた細胞（図５９Ｅ）に比べて、ＧＦＰ陽性であると見なされる細胞（図５９Ｄ）の細胞表面ＨＬＡ発現のレベルを定量化した。１２μＭまたは１５μＭのＦＳＤ１８を用いて、上記同時形質導入実験を繰り返し、続けて、ＧＦＰ陽性およびＧＦＰ陰性細胞画分への蛍光標識細胞分取を実施した。それぞれの画分を標準的Ｔ７Ｅ１切断アッセイに供し、種々の試料をアガロースゲル電気泳動に供した。
【図５９−２】同上。
【図６０】Ｔ細胞が、ペプチドＦＳＤ１８を用いて、カーゴＧＦＰ−ＮＬＳで第１の形質導入（図６０Ｂ）に供されたまたは供されなかった（「未処理」；図６０Ａ）フローサイトメトリー分析の結果を示す。第１の形質導入は、５５．４％のＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率をもたらした（図６０Ｂ）。蛍光標識細胞分取を実施して、第１の形質導入後にＧＦＰ陰性細胞（図６０Ｃ）を単離し、このＧＦＰ陰性細胞集団を、ペプチドＦＳＤ１８を用いて、ＧＦＰ−ＮＬＳの第２の形質導入に供した。この第２の形質導入の結果を図６０Ｄに示し、ＧＦＰ−ＮＬＳ形質導入効率は、６０．６％であることが明らかになった。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本記載は、ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達する合成ペプチドシャトル剤の製造方法に関し、該方法は、次記のペプチドを合成することを含む：
（１）少なくとも２０アミノ酸長であり、
（３）正に帯電した親水性の外面および
疎水性の外面
を有する
（２）両親媒性のアルファヘリックスモチーフを含み、
次のパラメーター（４）〜（１５）の内の少なくとも５つが満たされるペプチド。
（４）疎水性の外面が、ターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスのオープンシリンダー表現に基づいて、ペプチドのアミノ酸の１２〜５０％に相当する空間的に隣接するＬ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、および／またはＭアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含む；
（５）３．５〜１１の疎水性モーメント（μ）を有する；
（６）生理学的ｐＨで少なくとも＋４の予測正味電荷を有する；
（７）８〜１３の等電点（ｐＩ）を有する；
（８）３５％〜６５％のアミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、およびＶの任意の組み合わせから構成される；
（９）０％〜３０％のアミノ酸：Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴの任意の組み合わせから構成される；
（１０）３５％〜８５％のアミノ酸：Ａ、Ｌ、Ｋ、またはＲの任意の組み合わせから構成される；
（１１）少なくとも５％のＬがペプチド中に存在するという条件で、１５％〜４５％のアミノ酸：ＡおよびＬの任意の組み合わせから構成される；
（１２）２０％〜４５％のアミノ酸：ＫおよびＲの任意の組み合わせから構成される；
（１３）０％〜１０％のアミノ酸：ＤおよびＥの任意の組み合わせから構成される；
（１４）ペプチド中のＡおよびＬのパーセンテージ（％Ａ＋Ｌ）と、ペプチド中のＫとＲのパーセンテージ（％Ｋ＋Ｒ）との差異は、１０％以下である；
（１５）１０％〜４５％のアミノ酸：Ｑ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、およびＨの任意の組み合わせから構成される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３５】
項目
いくつかの実施形態では、本記載は、次の項目に関し得る：
１．ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達する方法であって、前記方法は、標的真核細胞とポリペプチドカーゴとを、シャトル剤の非存在下の場合に比べて前記ポリペプチドカーゴの形質導入効率を高めるのに十分な濃度の前記シャトル剤の存在下で、接触させることを含み、前記シャトル剤が、
（１）少なくとも２０アミノ酸長であり、
（３）正に帯電した親水性の外面および、
疎水性の外面
を有する
（２）両親媒性のアルファヘリックスモチーフを含み、
次のパラメーター（４）〜（１５）の内の少なくとも５つが満たされるペプチドである。
（４）疎水性の外面が、ターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスのオープンシリンダー表現に基づいて、ペプチドのアミノ酸の１２〜５０％に相当する空間的に隣接するＬ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、および／またはＭアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含む；
（５）３．５〜１１の疎水性モーメント（μ）を有する；
（６）生理学的ｐＨで少なくとも＋４の予測正味電荷を有する；
（７）８〜１３の等電点（ｐＩ）を有する；
（８）３５％〜６５％のアミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、およびＶの任意の組み合わせから構成される；
（９）０％〜３０％のアミノ酸：Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴの任意の組み合わせから構成される；
（１０）３５％〜８５％のアミノ酸：Ａ、Ｌ、Ｋ、またはＲの任意の組み合わせから構成される；
（１１）少なくとも５％のＬがペプチド中に存在するという条件で、１５％〜４５％のアミノ酸：ＡおよびＬの任意の組み合わせから構成される；
（１２）２０％〜４５％のアミノ酸：ＫおよびＲの任意の組み合わせから構成される；
（１３）０％〜１０％のアミノ酸：ＤおよびＥの任意の組み合わせから構成される；
（１４）ペプチド中のＡおよびＬのパーセンテージ（％Ａ＋Ｌ）と、ペプチド中のＫとＲのパーセンテージ（Ｋ＋Ｒ）との差異は、１０％以下であり、
（１５）１０％〜４５％のアミノ酸：Ｑ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、およびＨの任意の組み合わせから構成される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７８】
４４．ポリペプチドカーゴを標的真核細胞の細胞外間隙からサイトゾルおよび／または核に送達する合成ペプチドシャトル剤の製造方法であって、次記のペプチドを合成することを含む方法：
（１）少なくとも２０アミノ酸長であり、
（３）正に帯電した親水性の外面および
疎水性の外面
を有する
（２）両親媒性のアルファヘリックスモチーフを含み、
次のパラメーター（４）〜（１５）の内の少なくとも５つが満たされるペプチド。
（４）疎水性の外面が、ターン当たり３．６残基を有するアルファヘリックスのオープンシリンダー表現に基づいて、ペプチドのアミノ酸の１２〜５０％に相当する空間的に隣接するＬ、Ｉ、Ｆ、Ｖ、Ｗ、および／またはＭアミノ酸から構成される高度疎水性コアを含む；
（５）３．５〜１１の疎水性モーメント（μ）を有する；
（６）生理学的ｐＨで少なくとも＋４の予測正味電荷を有する；
（７）８〜１３の等電点（ｐＩ）を有する；
（８）３５％〜６５％のアミノ酸：Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、およびＶの任意の組み合わせから構成される；
（９）０％〜３０％のアミノ酸：Ｎ、Ｑ、Ｓ、およびＴの任意の組み合わせから構成される；
（１０）３５％〜８５％のアミノ酸：Ａ、Ｌ、Ｋ、またはＲの任意の組み合わせから構成される；
（１１）少なくとも５％のＬがペプチド中に存在するという条件で、１５％〜４５％のアミノ酸：ＡおよびＬの任意の組み合わせから構成される；
（１２）２０％〜４５％のアミノ酸：ＫおよびＲの任意の組み合わせから構成される；
（１３）０％〜１０％のアミノ酸：ＤおよびＥの任意の組み合わせから構成される；
（１４）ペプチド中のＡおよびＬのパーセンテージ（％Ａ＋Ｌ）と、ペプチド中のＫとＲのパーセンテージ（Ｋ＋Ｒ）との差異は、１０％以下である；
（１５）１０％〜４５％のアミノ酸：Ｑ、Ｙ、Ｗ、Ｐ、Ｉ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｆ、Ｅ、Ｄ、Ｃ、Ｍ、Ｎ、Ｔ、およびＨの任意の組み合わせから構成される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５４】
ペプチドＦＳＮ１〜ＦＳＮ８は、表Ａ１に示す設計パラメーターの１つまたは複数が満たされない場合に、形質導入効率に与える効果を調査するために設計された。
【表５８−１】
2019531316.tif 000185
【表５８−２】
2019531316.tif 000186
【表５８−３】
2019531316.tif 000187
結果は、ＥｘＰＡＳｙ（商標）バイオインフォマティクスリソースポータル（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）から利用可能なＰｒｏｔＰａｒａｍ（商標）オンラインツールを用いて計算した。ｐＩ：等電点；電荷：陽性（＋）および陰性（−）帯電残基の合計数
【表５９−１】
2019531316.tif 000188
【表５９−２】
2019531316.tif 000189
【表６０】
2019531316.tif 000190
【表６１−１】
2019531316.tif 000191
【表６１−２】
2019531316.tif 000192
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４９−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４９−２】
2019531316.tif 000193
【国際調査報告】
2019531316.tif 000194
2019531316.tif 000195
2019531316.tif 000196
2019531316.tif 000197
2019531316.tif 000198