(57)【要約】本発明は、巨核球（MK）組成物の製造、およびその必要のある対象における血小板減少症の処置に関する。2019526245.tif 000008
2019526245.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、巨核球（MK）生成物を作製する方法：
（i）少なくとも1種のサイトカインを含む第1の培地において造血幹細胞（HSC）を含む細胞の集団を培養し、約24時間〜約96時間、細胞の集団を一次増殖させる工程、
（ii）少なくとも1種のサイトカインを含む第2の培地において細胞の集団を培養し、約24時間〜約96時間、細胞の集団を二次増殖させる工程であって、第2の培地における細胞の集団の培養が巨核球生成物発達バイアスを誘導する、工程、および
（iii）結果として得られた巨核球生成物を収集する工程。
【請求項２】
（iii）の収集工程の前に実施される、
少なくとも1種のサイトカインを含む第3の培地において細胞の集団を培養し、約72時間〜約120時間、細胞の集団を三次増殖させる工程
をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
（ii）の工程がクロマチン修飾剤の培地への添加をさらに含む、請求項1〜2のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
クロマチン修飾剤がバルプロ酸（VPA）を含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
造血幹細胞を含む細胞の集団が、臍帯血（CB）、骨髄（BM）、末梢血（PB）、またはそれらの組み合わせに由来する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
第1の培地が、幹細胞因子（SCF）、インターロイキン3（IL-3）、Fms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、トロンボポエチン（TPO）、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも1種を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第2の培地が、幹細胞因子（SCF）、トロンボポエチン（TPO）、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも1種を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
第3の培地がトロンボポエチンを含む、請求項2〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
第1の培地、第2の培地、および第3の培地のうちの少なくとも一つが、無血清（SF）培養物である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ii）が少なくとも1種の付加的なサイトカインの添加をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも1種の付加的なサイトカインがインターロイキン6（IL-6）を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
巨核球生成物が、巨核球前駆細胞、未熟巨核球、成熟巨核球、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも1種を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
巨核球前駆細胞、未熟巨核球、および成熟巨核球を含む巨核球生成物であって、該組成物が凍結保存されている、巨核球生成物。
【請求項１４】
請求項1〜12のいずれか一項によってエクスビボで生成された巨核球生成物を対象へ投与する工程を含む、その必要のある対象において血小板減少症を処置する方法。
【請求項１５】
巨核球生成物が、巨核球前駆細胞、未熟巨核球、および成熟巨核球の不均一な集団である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
巨核球生成物が対象への投与の前に凍結保存される、請求項14〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
巨核球前駆細胞、未熟巨核球、および成熟巨核球と、薬学的に許容される担体または保存剤とを含む、巨核球生成物。
【請求項１８】
治療的に有効な量の請求項17に記載の組成物を対象へ投与する工程を含む、その必要のある対象において血小板減少症を処置する方法。
【請求項１９】
その必要のある対象における血小板減少症の処置において使用するための、請求項17に記載の組成物。
【請求項２０】
その必要のある対象における血小板減少症の処置のための医薬の製造における、請求項17に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
I. 関連出願の相互参照
本願は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、2016年12月2日に出願された米国仮特許出願第62/429,501号、および参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、2016年8月4日に出願された米国仮特許出願第62/371,024号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
II. 連邦政府による資金援助に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所（NIH）によって授与された助成金番号R41HL130754の下で政府の支援を受けて成された。米国政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
III. 発明の分野
本発明の分野は、巨核球（MK）組成物の製造およびMK組成物による血小板減少症の処置のための療法である。
【背景技術】
【０００４】
IV. 背景
血小板減少症は、血中血小板の欠乏（低血小板数）を特徴とする、まれであるが、しばしば重篤な状態である。正常な血小板数は、循環血液1マイクロリットル（μL）当たり150,000〜450,000血小板（PTL）である。血小板減少症は、血小板数が何らかの理由で正常値を下回った時に起こる。脳内出血を含む内出血を引き起こし得る、血小板数が10,000 PTL/μLを下回った時のような、まれな症例においては、血小板減少症は生命を脅かし得る。血小板減少症の最も一般的な症状には、容易なもしくは過剰の皮下出血、表在性もしくは遷延性の出血、および/または点状出血が含まれ、より重篤な症例においては、血尿および/もしくは血便、疲労、黄疸、または脾腫が含まれる。米国における血小板減少症の推定有病率は、100,000人におよそ9.5人であり、子供および成人の両方に影響している。血小板減少症は、しばしば、肝疾患（最も一般的な原因）、免疫性血小板減少性紫斑病（ITP）、骨髄障害、腎不全、妊娠、化学療法によるもののような薬物誘発性血小板減少症、身体的外傷、アルコール中毒および/または重度のアルコール摂取、白血病を含むがんおよび悪性疾患、ならびにHIVまたはC型肝炎のような感染のような別の障害の結果として起こる。現在、血小板減少症のための大部分の処置は、結果として起こる低血小板数が修正されることを期待して、基礎をなす原因の処置に焦点を当てている。重篤な症例において、処置は、血液または血小板の輸血を含む場合がある。しかしながら、基礎をなす原因を処置することに未だ焦点が置かれているにも関わらず、血液および血小板の輸血は、循環血中血小板の一時的な増加しか提供せず、ボランティアドナーに依存しているため、これらの処置は、健常で有効な血小板が患者の血中で再増幅することを可能にする解決策を提供しない。造血幹細胞（HSC）増殖を使用したいくつかの実験的処置が出現しているが、それらは、エクスビボで生成された生成物の臨床的な価値に関して、限定された成功しか収めていない。血小板輸血不応状態およびヒト白血球抗原（HLA）クラスI抗体に対する同種免疫は、別の重大な臨床的懸念である。従って、血小板細胞が患者の血中で再増殖することを可能にする、血小板減少症の処置のためのドナー非依存性の細胞治療が必要とされている。さらに、エクスビボでの大規模な血小板製造が高コストであること、血小板が長期保存、例えば、凍結保存に耐えられないことが、培養物に由来する血小板の臨床移行をさらに困難にしている。従って、さらに、治療用組成物の長期保存を可能にする、血小板減少症の処置のためのドナー非依存性の細胞治療が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
V. 発明の概要
いくつかの態様において、本発明は、巨核球生成物を生成する方法に関する。いくつかの態様において、方法は、第1の培地において造血幹細胞（HSC）を含む細胞の集団を培養する第1の工程を含む。いくつかの態様において、第1の培地は、少なくとも1種のサイトカインを含む。いくつかの態様において、第1の培地は、幹細胞因子（SCF）、インターロイキン3（IL-3）、Fms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、トロンボポエチン（TPO）、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも1種を含む。いくつかの態様において、第1の培地は、幹細胞因子（SCF）を含む。いくつかの態様において、第1の培地は、インターロイキン3（IL-3）を含む。いくつかの態様において、第1の培地は、トロンボポエチン（TPO）を含む。いくつかの態様において、第1の培地は、幹細胞因子（SCF）を含まない。いくつかの態様において、第1の培地は、インターロイキン3（IL-3）を含まない。いくつかの態様において、第1の培地は、トロンボポエチン（TPO）を含まない。いくつかの態様において、第1の培地は、無血清（SF）培地である。
【０００６】
いくつかの態様において、方法は、クロマチン修飾剤の培地への添加を含む。いくつかの態様において、クロマチン修飾剤は、バルプロ酸（VPA）を含む。いくつかの態様において、クロマチン修飾剤は、第1の工程の約12時間〜約36時間後に添加される。いくつかの態様において、工程は、付加的なサイトカインの添加をさらに含む。いくつかの態様において、付加的なサイトカインは、インターロイキン6（IL-6）を含む。いくつかの態様において、付加的なサイトカインは、クロマチン修飾剤と同時に添加される。いくつかの態様において、付加的なサイトカイン剤は、クロマチン修飾剤の後に添加される。いくつかの態様において、付加的なサイトカイン剤は、クロマチン修飾剤の前に添加される。
【０００７】
いくつかの態様において、方法は、細胞の集団を一次増殖させる工程を含む。いくつかの態様において、一次増殖工程は、約24時間〜約120時間行われる。いくつかの態様において、一次増殖工程は、約24時間〜約120時間行われる。いくつかの態様において、一次増殖工程は、約24時間〜約36時間行われる。いくつかの態様において、一次増殖工程は、約24時間〜約48時間行われる。いくつかの態様において、一次増殖工程は、約36時間〜約48時間行われる。いくつかの態様において、一次増殖工程は、約24時間〜約72時間行われる。いくつかの態様において、一次増殖工程は、約36時間〜約72時間行われる。いくつかの態様において、一次増殖工程は、約48時間〜約72時間行われる。いくつかの態様において、一次増殖工程は、約72時間〜約96時間行われる。いくつかの態様において、一次増殖工程は、約72時間〜約120時間行われる。いくつかの態様において、一次増殖工程は、約96時間〜約120時間行われる。いくつかの態様において、一次増殖工程は、約48時間〜約120時間行われる。いくつかの態様において、一次増殖工程は、約24時間〜約120時間行われる。いくつかの態様において、一次増殖工程は、約36時間〜約96時間行われる。いくつかの態様において、一次増殖工程は、約48時間〜約96時間行われる。
【０００８】
いくつかの態様において、方法は、第2の培地において細胞の集団を培養する工程を含む。いくつかの態様において、第2の培地は、少なくとも1種のサイトカインを含む。いくつかの態様において、第2の培地は、幹細胞因子（SCF）、インターロイキン3（IL-3）、Fms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、トロンボポエチン（TPO）、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも1種を含む。いくつかの態様において、第2の培地は、幹細胞因子（SCF）およびトロンボポエチン（TPO）のうちの少なくとも1種を含む。いくつかの態様において、第2の培地は、幹細胞因子（SCF）を含む。いくつかの態様において、第2の培地は、インターロイキン3（IL-3）を含む。いくつかの態様において、第2の培地は、トロンボポエチン（TPO）を含む。いくつかの態様において、第2の培地は、幹細胞因子（SCF）を含まない。いくつかの態様において、第2の培地は、インターロイキン3（IL-3）を含まない。いくつかの態様において、第2の培地は、トロンボポエチン（TPO）を含まない。いくつかの態様において、第2の培地は、無血清（SF）培地である。
【０００９】
いくつかの態様において、方法は、細胞の集団を二次増殖させる工程を含む。いくつかの態様において、二次増殖工程は、約24時間〜約120時間行われる。いくつかの態様において、二次増殖工程は、約24時間〜約120時間行われる。いくつかの態様において、二次増殖工程は、約24時間〜約36時間行われる。いくつかの態様において、二次増殖工程は、約24時間〜約48時間行われる。いくつかの態様において、二次増殖工程は、約36時間〜約48時間行われる。いくつかの態様において、二次増殖工程は、約24時間〜約72時間行われる。いくつかの態様において、二次増殖工程は、約36時間〜約72時間行われる。いくつかの態様において、二次増殖工程は、約48時間〜約72時間行われる。いくつかの態様において、二次増殖工程は、約72時間〜約96時間行われる。いくつかの態様において、二次増殖工程は、約72時間〜約120時間行われる。いくつかの態様において、二次増殖工程は、約96時間〜約120時間行われる。いくつかの態様において、二次増殖工程は、約48時間〜約120時間行われる。いくつかの態様において、二次増殖工程は、約24時間〜約120時間行われる。いくつかの態様において、二次増殖工程は、約36時間〜約96時間行われる。いくつかの態様において、二次増殖工程は、約48時間〜約96時間行われる。
【００１０】
いくつかの態様において、方法は、第3の培地において細胞の集団を培養する工程を含む。いくつかの態様において、第3の培地は、少なくとも1種のサイトカインを含む。いくつかの態様において、第3の培地は、幹細胞因子（SCF）、インターロイキン3（IL-3）、Fms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、トロンボポエチン（TPO）、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも1種を含む。いくつかの態様において、第3の培地は、幹細胞因子（SCF）およびトロンボポエチン（TPO）のうちの少なくとも1種を含む。いくつかの態様において、第3の培地は、幹細胞因子（SCF）を含む。いくつかの態様において、第3の培地は、インターロイキン3（IL-3）を含む。いくつかの態様において、第3の培地は、トロンボポエチン（TPO）を含む。いくつかの態様において、第3の培地は、幹細胞因子（SCF）を含まない。いくつかの態様において、第3の培地は、インターロイキン3（IL-3）を含まない。いくつかの態様において、第3の培地は、トロンボポエチン（TPO）を含まない。いくつかの態様において、第3の培地は、無血清（SF）培地である。いくつかの態様において、培養工程は、巨核球生成物発達バイアスの誘導を含む。いくつかの態様において、巨核球生成物発達バイアスは、巨核球前駆細胞に対するものである。いくつかの態様において、巨核球生成物発達バイアスは、未熟巨核球に対するものである。いくつかの態様において、巨核球生成物発達バイアスは、成熟巨核球に対するものである。
【００１１】
いくつかの態様において、方法は、細胞の集団を三次増殖させる工程を含む。いくつかの態様において、三次増殖工程は、約24時間〜約120時間行われる。いくつかの態様において、三次増殖工程は、約24時間〜約120時間行われる。いくつかの態様において、三次増殖工程は、約24時間〜約36時間行われる。いくつかの態様において、三次増殖工程は、約24時間〜約48時間行われる。いくつかの態様において、三次増殖工程は、約36時間〜約48時間行われる。いくつかの態様において、三次増殖工程は、約24時間〜約72時間行われる。いくつかの態様において、三次増殖工程は、約36時間〜約72時間行われる。いくつかの態様において、三次増殖工程は、約48時間〜約72時間行われる。いくつかの態様において、三次増殖工程は、約72時間〜約96時間行われる。いくつかの態様において、三次増殖工程は、約72時間〜約120時間行われる。いくつかの態様において、三次増殖工程は、約96時間〜約120時間行われる。いくつかの態様において、三次増殖工程は、約48時間〜約120時間行われる。いくつかの態様において、三次増殖工程は、約24時間〜約120時間行われる。いくつかの態様において、三次増殖工程は、約36時間〜約96時間行われる。いくつかの態様において、三次増殖工程は、約48時間〜約96時間行われる。
【００１２】
いくつかの態様において、方法は、巨核球生成物発達バイアスを誘導する工程を含む。いくつかの態様において、巨核球生成物発達バイアスは、巨核球前駆細胞に対するものである。いくつかの態様において、巨核球生成物発達バイアスは、未熟巨核球に対するものである。いくつかの態様において、巨核球生成物発達バイアスは、成熟巨核球に対するものである。
【００１３】
いくつかの態様において、方法は、結果として得られた巨核球生成物を収集する工程を含む。いくつかの態様において、巨核球生成物は、巨核球前駆細胞、未熟巨核球、成熟巨核球、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも1種を含む。いくつかの態様において、方法は、結果として得られた巨核球生成物を凍結保存する工程を含む。
【００１４】
いくつかの態様において、本発明は、巨核球生成物に関する。いくつかの態様において、巨核球生成物は、血小板減少症の処置において使用するためのものである。いくつかの態様において、巨核球生成物は、巨核球前駆細胞を含む。いくつかの態様において、巨核球生成物は、未熟巨核球を含む。いくつかの態様において、巨核球生成物は、成熟巨核球を含む。いくつかの態様において、巨核球生成物は、巨核球前駆細胞、未熟巨核球、成熟巨核球、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも1種を含む。いくつかの態様において、生成物は、凍結保存を受けることができる。いくつかの態様において、生成物は、凍結保存される。
【００１５】
いくつかの態様において、巨核球生成物は、CD41+巨核球生成物である。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも5％のCD41+巨核球生成物を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも10％のCD41+巨核球生成物を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも15％のCD41+巨核球生成物を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも20％のCD41+巨核球生成物を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも25％のCD41+巨核球生成物を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも30％のCD41+巨核球生成物を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも35％のCD41+巨核球生成物を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも40％のCD41+巨核球生成物を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも45％のCD41+巨核球生成物を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも50％のCD41+巨核球生成物を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも55％のCD41+巨核球生成物を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも60％のCD41+巨核球生成物を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも65％のCD41+巨核球生成物を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも70％のCD41+巨核球生成物を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも75％のCD41+巨核球生成物を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも80％のCD41+巨核球生成物を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも85％のCD41+巨核球生成物を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも90％のCD41+巨核球生成物を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも95％のCD41+巨核球生成物を含む。
【００１６】
いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、1％未満の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、2％未満の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、3％未満の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、4％未満の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、5％未満の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、6％未満の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、7％未満の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、8％未満の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、9％未満の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、10％未満の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、12％未満の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、15％未満の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、20％未満の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、約1％〜約5％の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、約1％〜約10％の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、約5％〜約10％の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、約1％〜約15％の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、約5％〜約15％の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、約1％〜約20％の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、約5％〜約20％の量で存在する。いくつかの態様において、巨核球前駆細胞は、約10％〜約20％の量で存在する。
【００１７】
いくつかの態様において、未熟巨核球は、20％未満の量で存在する。いくつかの態様において、未熟巨核球は、25％未満の量で存在する。いくつかの態様において、未熟巨核球は、30％未満の量で存在する。いくつかの態様において、未熟巨核球は、35％未満の量で存在する。いくつかの態様において、未熟巨核球は、40％未満の量で存在する。いくつかの態様において、未熟巨核球は、45％未満の量で存在する。いくつかの態様において、未熟巨核球は、50％未満の量で存在する。いくつかの態様において、未熟巨核球は、約20％〜約25％の量で存在する。いくつかの態様において、未熟巨核球は、約20％〜約30％の量で存在する。いくつかの態様において、未熟巨核球は、約25％〜約30％の量で存在する。いくつかの態様において、未熟巨核球は、約25％〜約35％の量で存在する。いくつかの態様において、未熟巨核球は、約25％〜約40％の量で存在する。いくつかの態様において、未熟巨核球は、約25％〜約50％の量で存在する。いくつかの態様において、未熟巨核球は、約30％〜約50％の量で存在する。いくつかの態様において、未熟巨核球は、約35％〜約50％の量で存在する。いくつかの態様において、未熟巨核球は、約40％〜約50％の量で存在する。いくつかの態様において、未熟巨核球は、約45％〜約50％の量で存在する。
【００１８】
いくつかの態様において、成熟巨核球は、少なくとも25％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、少なくとも30％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、少なくとも35％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、少なくとも40％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、少なくとも45％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、少なくとも50％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、少なくとも55％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、少なくとも60％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、少なくとも65％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、少なくとも70％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、少なくとも75％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、75％超の量で存在する。
【００１９】
いくつかの態様において、成熟巨核球は、約25％〜約75％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、約30％〜約75％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、約25％〜約75％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、約30％〜約75％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、約35％〜約75％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、約40％〜約75％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、約45％〜約75％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、約50％〜約75％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、約55％〜約75％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、約60％〜約75％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、約65％〜約75％の量で存在する。いくつかの態様において、成熟巨核球は、約70％〜約75％の量で存在する。
【００２０】
いくつかの態様において、本発明は、その必要のある患者における血小板減少症を処置する方法に関する。いくつかの態様において、血小板減少症を処置する方法は、本発明の巨核球生成物を利用する。いくつかの態様において、本発明は、その必要のある対象における血小板数を増加させる方法に関する。いくつかの態様において、血小板数は、循環血液1マイクロリットル当たり少なくとも10,000血小板へ増加する。いくつかの態様において、血小板数は、循環血液1マイクロリットル当たり少なくとも12,000血小板へ増加する。いくつかの態様において、血小板数は、循環血液1マイクロリットル当たり少なくとも15,000血小板へ増加する。いくつかの態様において、血小板数は、循環血液1マイクロリットル当たり少なくとも25,000血小板へ増加する。いくつかの態様において、血小板数は、循環血液1マイクロリットル当たり少なくとも50,000血小板へ増加する。いくつかの態様において、血小板数は、循環血液1マイクロリットル当たり少なくとも75,000血小板へ増加する。いくつかの態様において、血小板数は、循環血液1マイクロリットル当たり少なくとも100,000血小板へ増加する。いくつかの態様において、血小板数は、循環血液1マイクロリットル当たり少なくとも125,000血小板へ増加する。いくつかの態様において、血小板数は、循環血液1マイクロリットル当たり少なくとも150,000血小板へ増加する。いくつかの態様において、血小板数は、循環血液1マイクロリットル当たり少なくとも200,000血小板へ増加する。いくつかの態様において、血小板数は、循環血液1マイクロリットル当たり少なくとも250,000血小板へ増加する。いくつかの態様において、血小板数は、循環血液1マイクロリットル当たり少なくとも300,000血小板へ増加する。いくつかの態様において、血小板数は、循環血液1マイクロリットル当たり少なくとも350,000血小板へ増加する。いくつかの態様において、血小板数は、循環血液1マイクロリットル当たり少なくとも400,000血小板へ増加する。いくつかの態様において、血小板数は、循環血液1マイクロリットル当たり少なくとも450,000血小板へ増加する。いくつかの態様において、本発明は、血小板減少症の処置のための医薬の製造における本発明の巨核球生成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
VI. 図面の簡単な説明
【図１Ａ】CB CD34+細胞のエクスビボ増殖に対するクロマチン修飾剤バルプロ酸（VPA）の効果を表す。CB CD34+細胞を、VPAの非存在下（C）または存在下で、SCF、FLT-3、IL-3、およびTPOが補足された血清含有（SC）培地または無血清（SF）培地において培養した。SF培養物において、SC培養物より多くのCD34+細胞およびCD34+/CD90+細胞が生成された。
【図１Ｂ】CB CD34+細胞のエクスビボ増殖に対するクロマチン修飾剤バルプロ酸（VPA）の効果を表す。図1B：未操作の初代CB CD34+細胞（PC）、ならびにVPAの非存在下（対照）または存在下で、SCF、FLT-3、IL-3、およびTPOが補足されたSF培地において7日間増殖させたCD34+細胞の表現型分析。
【図２Ａ】CB CD34+細胞によるエクスビボの巨核球（MK）および血小板（PTL）の生成を表す。MK培養物の時間経過分析は、MK特異的表面マーカーCD41（四角）/CD42（三角形）発現の増加を伴う、CD34（菱形）発現の漸減を示す。
【図２Ｂ】CB CD34+細胞によるエクスビボの巨核球（MK）および血小板（PTL）の生成を表す。7日目および10日目のMK培養物のフローサイトメトリードットプロット分析。
【図２Ｃ】CB CD34+細胞によるエクスビボの巨核球（MK）および血小板（PTL）の生成を表す。前方散乱特性（FSC）および側方散乱特性（SSC）（上パネル）、ならびに二重CD41/チアゾールオレンジ染色によって同定された培養物由来PTLのフローサイトメトリー分析。新たに単離したPB PTLを、対照として使用した。
【図３Ａ】CB CD34+細胞の巨核球（MK）生成能力に対する、バルプロ酸（VPA）による増殖の効果を表す。7日間、1mM VPAによって増殖させ、その後、さらに7日間、TPOによって媒介されるMK分化を受けたCB CD34+細胞から生成されたCD41発現MK培養物の表現型分析。
【図３Ｂ】CB CD34+細胞の巨核球（MK）生成能力に対する、バルプロ酸（VPA）による増殖の効果を表す。未処理のCD34+細胞または0.5mMもしくは1mM VPAによって増殖させたCD34+細胞から生成されたMK培養物によるNF-E2、PF4、およびGATA-1の発現のq-PCR分析。
【図４−１】図4は、バルプロ酸（VPA）によって増殖させた臍帯血（CB）CD34+細胞からの巨核球（MK）のエクスビボ生成を表す。
【図４−２】図4は、バルプロ酸（VPA）によって増殖させた臍帯血（CB）CD34+細胞からの巨核球（MK）のエクスビボ生成を表す。
【図５Ａ】実施例4において示されるプロトコルによって、ロバスト（robust）な数のCFU-MKが形成されたことを示す。1番目のカラムは、処理1に相当し、2番目のカラムは処理2に相当し、3番目のカラムは処理3に相当し、4番目のカラムは処理4に相当する。
【図５Ｂ】実施例4において示されるプロトコルによって、ロバストな数のCFU-MKが形成されたことを示す。1番目のカラムは、処理1に相当し、2番目のカラムは処理2に相当し、3番目のカラムは処理3に相当し、4番目のカラムは処理4に相当する。
【図６Ａ】バルプロ酸（VPA）によって増殖させた培養物から単離された巨核球（MK）が凍結保存可能であることを表す。凍結保存前のCD61+MK表現型を表す。
【図６Ｂ】バルプロ酸（VPA）によって増殖させた培養物から単離された巨核球（MK）が凍結保存可能であることを表す。凍結保存後のCD61+MK表現型を表す。
【図７Ａ−１】サイトカイン単独またはサイトカイン＋VPAの存在下で増殖させたHSCから生成された凍結保存されたMKを、解凍し、エクスビボで血小板を放出しCFU-MKを形成する能力について評価したことを表す。フローサイトメトリーを表す。
【図７Ａ−２】サイトカイン単独またはサイトカイン＋VPAの存在下で増殖させたHSCから生成された凍結保存されたMKを、解凍し、エクスビボで血小板を放出しCFU-MKを形成する能力について評価したことを表す。フローサイトメトリーを表す。
【図７Ｂ】サイトカイン単独またはサイトカイン＋VPAの存在下で増殖させたHSCから生成された凍結保存されたMKを、解凍し、エクスビボで血小板を放出しCFU-MKを形成する能力について評価したことを表す。チアゾール染色を表し、矢印は、血小板形成MKを指している。
【図８Ａ−１】エクスビボで生成されたMKの注入後の、NSGマウスにおけるインビボのhPTLおよびhMKの生着の評価を表す。mPBにおけるhPTLのゲーティング戦略および評価を表し；hPTLを豊富に含む血漿を、致死量以下の照射を受けたNSGマウスへ注射し、1時間後、48時間後、および120時間後に、mPB中のhPTLの存在を評価した。hPTLを、サイズおよび光散乱特性に基づきゲーティングし、ドットプロットヒストグラム上に、ヒトCD41を発現する円で囲まれたドットのクラスタとして表す。
【図８Ａ−２】エクスビボで生成されたMKの注入後の、NSGマウスにおけるインビボのhPTLおよびhMKの生着の評価を表す。mPBにおけるhPTLのゲーティング戦略および評価を表し；hPTLを豊富に含む血漿を、致死量以下の照射を受けたNSGマウスへ注射し、1時間後、48時間後、および120時間後に、mPB中のhPTLの存在を評価した。hPTLを、サイズおよび光散乱特性に基づきゲーティングし、ドットプロットヒストグラム上に、ヒトCD41を発現する円で囲まれたドットのクラスタとして表す。
【図８Ｂ−１】エクスビボで生成されたMKの注入後の、NSGマウスにおけるインビボのhPTLおよびhMKの生着の評価を表す。エクスビボで生成されたMK培養物を収集し、定量し、免疫表現型的に特徴決定したことを表す（左側ドットプロットヒストグラム）。50万個のCD41+MKを含む100万個のTNCを、致死量以下の照射を受けたNSGマウスへ注入し、インビボで産生されたhPTLの存在を60日間にわたり評価した。ドットプロットヒストグラムは、注入後3日目、10日目、28日目、および48日目にmPB中に検出されたhCD41（四分割の左上）およびhCD42b（四分割の右上）を発現するhPTLを示す。マウス抗CD41抗体によって標識されたmPTLが、四分割の右下に表される。
【図８Ｂ−２】エクスビボで生成されたMKの注入後の、NSGマウスにおけるインビボのhPTLおよびhMKの生着の評価を表す。エクスビボで生成されたMK培養物を収集し、定量し、免疫表現型的に特徴決定したことを表す（左側ドットプロットヒストグラム）。50万個のCD41+MKを含む100万個のTNCを、致死量以下の照射を受けたNSGマウスへ注入し、インビボで産生されたhPTLの存在を60日間にわたり評価した。ドットプロットヒストグラムは、注入後3日目、10日目、28日目、および48日目にmPB中に検出されたhCD41（四分割の左上）およびhCD42b（四分割の右上）を発現するhPTLを示す。マウス抗CD41抗体によって標識されたmPTLが、四分割の右下に表される。
【図８Ｃ】エクスビボで生成されたMKの注入後の、NSGマウスにおけるインビボのhPTLおよびhMKの生着の評価を表す。図8Bに記載されたエクスビボで生成されたMK培養物の注入後のmPB中のhPTLの動態および定量を表す。各線は、1匹の動物を表す（n＝7）。
【図８Ｄ】エクスビボで生成されたMKの注入後の、NSGマウスにおけるインビボのhPTLおよびhMKの生着の評価を表す。0.25×106個の未操作のCD34+HSC、および4日間サイトカイン＋VPAによって増殖させた同数のHSC（CC＃16）の子孫を注入されたNSGマウスにおけるhPTL産生を表す；mBP中のhPTL（右のパネル）およびmBM中のhMK（左のパネル）の存在を、注入後15週目に評価した。
【図８Ｅ−１】エクスビボで生成されたMKの注入後の、NSGマウスにおけるインビボのhPTLおよびhMKの生着の評価を表す。10日後に生成された不均一MK培養物（VPAによる4日間の増殖、その後、6日間のMK分化）（CC＃16）を、マウス1匹当たりおよそ5×106個の量でNSGへ移植し；マウスの脾臓（SP）およびBMにおけるヒトMK生着を、移植後6週目に評価したことを表す。レシピエントマウス由来の全mBM細胞を、ヒトコロニー形成（CFU）を可能にする条件において半固形培地に播種した。形成されたCFU内のヒトMKを、抗ヒトCD41抗体を使用したフローサイトメトリーおよび顕微鏡分析によって検出した。
【図８Ｅ−２】エクスビボで生成されたMKの注入後の、NSGマウスにおけるインビボのhPTLおよびhMKの生着の評価を表す。10日後に生成された不均一MK培養物（VPAによる4日間の増殖、その後、6日間のMK分化）（CC＃16）を、マウス1匹当たりおよそ5×106個の量でNSGへ移植し；マウスの脾臓（SP）およびBMにおけるヒトMK生着を、移植後6週目に評価したことを表す。レシピエントマウス由来の全mBM細胞を、ヒトコロニー形成（CFU）を可能にする条件において半固形培地に播種した。形成されたCFU内のヒトMKを、抗ヒトCD41抗体を使用したフローサイトメトリーおよび顕微鏡分析によって検出した。
【図８Ｆ】エクスビボで生成されたMKの注入後の、NSGマウスにおけるインビボのhPTLおよびhMKの生着の評価を表す。VPAの存在下で増殖させた培養物において生成された20万個の凍結保存された精製MKを、致死量以下の照射を受けたNSHマウスへ注入し、mPB中のhPTLの存在を、28日間評価したことを表す。各線は、1匹の動物における経時的なhPTL数を表す（n＝4）。
【図９Ａ】サイトカイン単独の存在下で増殖させたMK培養物のフローサイトメトリー分析を表す。
【図９Ｂ】サイトカイン＋VPAの存在下で増殖させたMK培養物のフローサイトメトリー分析を表す。VPAによって媒介されるHSC増殖の後に生成されたMKは、より高いiMKおよびmMKの収量をもたらす、MKP集団の初期の濃縮を示す。
【図１０Ａ】サイトカイン単独またはサイトカイン＋VPAの存在下で7日間増殖させ（4日間の増殖、その後、3日間のMK分化）、次いで、コラーゲンベースの培地に播種され、CFU-MKを形成させられた、CD34+HSCから生成されたMK培養物を表す。形成されたCFU-MKの数およびサイズを、14日後に評価した。
【図１０Ｂ】サイトカイン単独またはサイトカイン＋VPAの存在下で7日間増殖させ（4日間の増殖、その後、3日間のMK分化）、次いで、コラーゲンベースの培地に播種され、CFU-MKを形成させられた、CD34+HSCから生成されたMK培養物を表す。形成されたCFU-MKの形態学的外観を、14日後に評価した。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
VII. 詳細な説明
血小板産生または血小板生成は、骨髄（BM）造血幹細胞（HSC）が、巨核球（MK）前駆細胞を生じ、それが、まず増殖し、系統特異的マーカーを獲得し、次いで、倍数体巨核球（即ち、二倍体2Nを超えた染色体組の複製）になる、独特の過程の最終結果である。細胞は、さらなる細胞質成熟および血小板前駆細胞伸長を受け、最終的に、血小板を循環中へ排出する。このインビボでの血小板放出は、骨髄微小環境内の内因的因子（例えば、細胞骨格変化）ならびに外因的因子（例えば、細胞間接触、可溶性因子、および剪断応力）の両方に依存する、高度に効率的な事象である。この高度に複雑な過程は、エクスビボで再現するのが非常に困難であり、それが、臨床的に生存可能な血小板をエクスビボで、例えば、組織培養フラスコにおいて作製する際の主要な障害となっている。理論によって拘束されることは望まないが、この分化過程の正確な再現が困難であることが、エクスビボ造血幹細胞増殖を使用した以前の処置が、限定された成功しか収めていない理由である。インビトロでは、巨核球の極めて小さい割合のみが血小板を排出することができ、培養された巨核球によって産生される血小板の数は、インビボでの率に決してかなわない。さらに、エクスビボでの血小板の産生は、一般に、極めて高コストの手段であり、血小板は、長期保存条件、例えば、凍結保存の下で十分に保存されない。
【００２３】
本明細書中で使用されるように、「巨核球」または「MK」という用語は、血小板の産生を担う骨髄細胞をさす。巨核球という用語は、本明細書中で使用されるように、巨核球前駆細胞、未熟巨核球、および/または成熟巨核球のいずれかをさすことができる。造血幹細胞（HSC）が成熟巨核球になる過程は、巨核球生成として公知であり、一般に、以下の進行に従う。HSCは、CD34+であり、骨髄（BM）、末梢血（PB）、および臍帯血（CB）に見出される。実施例において示されるように、臍帯血は、HSCの好ましい起源である。HSCは、巨核球前駆細胞へ分化する。本明細書中で使用されるように、「巨核球前駆細胞」または「MK前駆細胞」という用語は、CD34+/CD41+/CD42-であることを特徴とする、倍数体、典型的には、4Nの巨核球細胞をさすことができる。次いで、巨核球前駆細胞は、未熟巨核球細胞へ分化する。本明細書中で使用されるように、「未熟巨核球」または「未熟MK」という用語は、CD34-/CD41+/CD42-であることを特徴とする、倍数体、典型的には、8Nの巨核球細胞をさすことができる。次いで、未熟巨核球細胞は、成熟巨核球細胞へ分化する。本明細書中で使用されるように、「成熟巨核球」または「成熟MK」という用語は、CD34-/CD41+/CD42-であることを特徴とする、倍数体、典型的には、16Nの巨核球をさすことができる。成熟巨核球細胞は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで血小板を産生することができる。
【００２４】
本明細書中で使用されるように、「巨核球生成物」または「MK生成物」という用語は、MK前駆細胞、未熟MK、および/または成熟MKのうちの一つまたは複数を種々の量で含む組成物をさすことができる。本発明の巨核球生成物は、血小板減少症を処置するため、その必要のある患者へ投与され得る。巨核球生成物組成物中のMK前駆細胞、未熟MK、および/または成熟MKの比率は、後述のように、所望の治療的使用に依って調整され得る。さらに、本発明の巨核球生成物は、長期保管のための凍結保存および解凍が可能であり得る。
【００２５】
疾患の「処置」という用語は、疾患の兆候または症状を緩和する試みにおいて、1種または複数種の薬物を患者（ヒトまたはヒト以外）へ投与する工程を含み得る、プロトコルの実行をさす。緩和は、疾患の兆候または症状が出現する前に起こってもよいし、出現後に起こってもよい。従って、「処置」には、疾患の「予防」が含まれる。「予防する」または「予防」という用語は、標的とされた病理学的状態または障害を予防するかまたは遅延させることを目的とした予防的かつ/または防止的な手段をさす。例えば、血小板減少症のケースにおいて、「予防」は、血小板数が指定された閾値、例えば、必ずではないが、血液1マイクロリットル当たり150,000血小板または血液1マイクロリットル当たり10,000血小板を下回るのを予防するため、処置の経過が進められる状況において起こり得る。さらに、「処置」は、兆候または症状の完全な緩和を必要とせず、治癒を必要とせず、具体的には、患者に対してわずかな効果しか及ぼさないプロトコルを含む。
【００２６】
本明細書中で使用されるように、「担体」という用語には、利用された投薬量および濃度において、それに曝された細胞または哺乳動物にとって無毒である、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤が含まれ得る。しばしば、薬学的に許容される担体は、水性pH緩衝溶液である。生理学的に許容される担体の例には、リン酸、クエン酸、およびその他の有機酸のような緩衝剤；以下に限定されるわけではないが、アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約10残基未満）のポリペプチド；以下に限定されるわけではないが、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンのようなタンパク質；以下に限定されるわけではないが、ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；以下に限定されるわけではないが、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンのようなアミノ酸；以下に限定されるわけではないが、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖、二糖、およびその他の糖類；以下に限定されるわけではないが、EDTAのようなキレート剤；以下に限定されるわけではないが、マンニトールもしくはソルビトールのような糖アルコール；以下に限定されるわけではないが、ナトリウムのような塩を形成する対イオン；ならびに/または以下に限定されるわけではないが、TWEEN、ポリエチレングリコール（PEG）、およびPLURONICSのような非イオン性界面活性剤が含まれるが、これらに限定されるわけではない。静菌剤を含んでもよい、そのような成分の任意の組み合わせが、本発明の組成物を満たすために有用であり得る。
【００２７】
「患者」という用語は、本明細書中で使用されるように、処置が施され得る生物系をさすことができる。生物系には、例えば、個々の細胞、一組の細胞（例えば、細胞培養物）、器官、組織、または多細胞生物が含まれ得る。「患者」とは、ヒト患者または非ヒト患者をさすことができる。
【００２８】
「有効量」または「治療的に有効な量」という用語は、本明細書中で使用されるように、処置された対象において、医学的に望ましい結果を生じることができる化合物または薬剤の量をさし得る。処置方法は、インビボまたはエクスビボで、単独でまたは他の薬物もしくは治療と共に、実施され得る。治療的に有効な量は、一つまたは複数の投与、適用、または投薬において投与され得、特定の製剤または投与経路に限定されるものではない。
【００２９】
「共投与」、「共投与される」、および「と組み合わせて」という用語は、本明細書中で使用されるように、少なくとも2種の薬剤または治療の対象への投与をさすことができる。いくつかの態様において、2種以上の薬剤/治療の共投与は、同時である。他の態様において、第1の薬剤/治療が、第2の薬剤/治療の前に施される。使用される様々な薬剤/治療の製剤および/または投与経路は変動し得ることを、当業者は理解している。
【００３０】
本発明は、例えば、実施例1〜7、9〜10、およびそこに記載された培養条件1〜20（即ち、CC＃1〜CC＃20）において示されるように、本発明の巨核球生成物を生成するため、多数の実験条件を使用する。前駆細胞生成物は、一般に、CD34+細胞、例えば、臍帯血（CB）CD34+細胞または末梢血（PB）CD34+細胞である。臍帯血細胞がCD34+細胞の好ましい起源であるが、本発明はそのように限定されるわけではない。そのような方法は、好ましくは、定義されたMK集団：CD34+/CD41+/CD42b-MK前駆細胞（MKP）、未熟CD34-/CD41+/CD42b-MK（iMK）、および成熟CD34-/CD41+/CD42b+MK（mMK）の二段階培養系を利用する。これらの培養において入手される収量はロバストであるが、例えば、臍帯血中のCD34+細胞の数によって制約され得る。CD34+細胞の数は、クロマチン修飾剤、例えば、実施例において使用されるバルプロ酸（VPA）による処理の後のエピジェネティックリプログラミングによって大いに増幅され得る。臨床的に適切なMK細胞生成物の生成をもたらす、MK分化による造血幹細胞（HSC）の統合（integration）および最適化が、本明細書中に開示される。実施例は、HSC増殖を可能にするため、様々なサイトカインを含む無血清培地において、VPAの非存在下または存在下で、第1の期間（例えば、5〜8日）においてCD34+細胞が培養された、CC＃1〜CC＃20と表記される20の異なる培養条件を開示する。得られたHSCプールを、MK分化/成熟培地において、付加的な第2の期間（例えば、4〜7日）において培養した。観察された全体収量は、サイトカイン単独の存在下で増殖させたインプットCD34+細胞については細胞1個当たり8〜33 MK（例えば、以下の表4、実施例9を参照）、サイトカイン＋VPAの存在下で増殖させたインプットCD34+細胞については細胞1個当たり9〜34 MKの範囲であった。理論によって拘束されることは望まないが、単一のCBUから2×106個ものCD34+細胞が単離され得るとすれば、CD34+細胞1個当たり28 MK以上を与える培養物は、56×106個を超えるMK、または約80kgの標準的な成人への注入のための7×105 CD41+MK/kg/体重に相当する量を生成することができ、これは、驚くほど高く、臨床的に適切な収量である。
【００３１】
より詳細には、方法は概して以下の工程を含む。最初に、CD34+細胞を入手する。CD34+細胞を入手した後、それらを培地におけるサイトカインプライミングに供する。培地は、好ましくは、無血清（SF）培地である。サイトカインプライミングは、幹細胞因子（SCF）、インターロイキン3（IL-3）、トロンボポエチン（TPO）、および/またはFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）を含み得るが、必ずしも含まなくてもよい。SCFは、中間の範囲、例えば約150ng/mLを含む、約1ng/mL〜約250ng/mLの量で存在し得る。IL-3は、中間の範囲、例えば約50ng/mLを含む、約1ng/mL〜約100ng/mLの量で存在し得る。TPOは、中間の範囲、例えば約100ng/mLを含む、約1ng/mL〜約200ng/mLの量で存在し得る。FLT-3は、中間の範囲、例えば約100ng/mLを含む、約1ng/mL〜約200ng/mLの量で存在し得る。サイトカインプライミングは、典型的には、これらの列挙された薬剤の各々を含むが、必ずしも全てが存在する必要はない。
【００３２】
サイトカインプライミングを行った後、細胞を、クロマチン修飾剤へ曝してもよいしまたは曝さなくてもよい。クロマチン修飾剤の概説は、Seidel et al.,Chromatin-modifying agents in anti-cancer therapy,Biochimie 94(11):2264-79に見出され得る。例示的なクロマチン修飾剤は、バルプロ酸（VPA）である。クロマチン修飾剤は、典型的には、サイトカインプライミングの約1日後、即ち、約24時間後に添加されるが、中間の範囲を含む、サイトカインプライミング時〜サイトカインプライミングの約3日後、即ち、約72時間後に添加されてもよい。クロマチン修飾剤は、一般に、中間の範囲、例えば約1mMを含む、約0.1mM〜約5mMの量で添加される。インターロイキン6（IL-6）を含むが、これに限定されるわけではない付加的なサイトカインが、クロマチン修飾剤と共に、またはその後、例えば、クロマチン修飾剤の添加後24〜48時間以内に添加されてもよい。あるいは、IL-6は、最初のサイトカインプライミングに添加されてもよい。IL-6は、中間の範囲、例えば約50ng/mLを含む、約5ng/mL〜約100ng/mLの量で添加され得る。
【００３３】
任意でのクロマチン修飾剤および付加的なサイトカインの添加の後、細胞培養物は、中間の範囲を含む、約1日〜約5日、即ち、約24時間〜約120時間、増殖させる。この一次増殖の後、細胞は、任意で、第2の培地に再播種される。第2の培地は、好ましくは、無血清（SF）培地である。SCFおよびTPOを含むが、これらに限定されるわけではない付加的なサイトカインが、例えば、中間の範囲、例えば約100または150ng/mLを含む、約1ng/mL〜約250ng/mLの量で、第2の培地に存在してもよい。第2の培地は、理想的には、VPAのようなクロマチン修飾剤を含まない。細胞培養物を、約1日〜約5日、即ち、約24時間〜約96時間、二次増殖させる。この二次増殖の後、細胞を任意で第3の培地に再播種する。第3の培地は、好ましくは無血清（SF）培地である。第3の培地は、中間の範囲、例えば約100ng/mLを含む、約1ng/mL〜約200ng/mLの量でTPOを有していてよい。第3の培地は、理想的には、SCF、およびVPAのようなクロマチン修飾剤を含まない。細胞培養物を、中間の範囲を含む、約1日〜約5日、即ち、約24時間〜約120時間、より好ましくは、約72時間〜約120時間、三次増殖させる。この三次増殖の後、細胞を収集する。
【００３４】
本発明の巨核球生成物は、以下の実施例6において示されるように、驚いたことに、長期保管のための凍結保存を受けることができ、巨核球生成物の高い百分率が解凍後に生存している。凍結保存されたMK培養物の解凍後の生存度は、平均71％であり、MK表現型の変化を伴わなかった。血小板は凍結保存で生存しないため、本発明の巨核球生成物が凍結保存で生存することができるという事実は、血小板の輸血および保管に関する根本的な問題を解決するため、重要である。凍結保存のために適当な本発明の巨核球生成物は、MK前駆細胞、未熟MK、および/または成熟MKの混合物を含み得る。凍結保存が可能な巨核球生成物の例示的な態様は、約1％未満〜約5％MK前駆細胞、約25％〜約35％未熟MK、および約55％〜約75％成熟MKである。しかしながら、巨核球生成物中の巨核球の個々のタイプの正確な範囲は、可変的であり得る。例えば、MK前駆細胞の量は、1％未満、約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約12％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約98％、約99％、99％超、および中間の範囲であり得、未熟MKの量は、1％未満、約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約12％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約98％、約99％、99％超、および中間の範囲であり得、成熟MKの量は、1％未満、約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約6％、約7％、約8％、約9％、約10％、約12％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％、約55％、約60％、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約98％、約99％、99％超、および中間の範囲であり得る。巨核球生成物は、含有されている巨核球に悪影響を及ぼさない、薬学的に許容される担体、保存剤、またはその他の組成物を含有していてよい。
【００３５】
いくつかの態様において、本発明は、血小板減少症を処置するため、治療的に有効な量の巨核球生成物を、その必要のある患者へ投与する方法を含む。巨核球生成物は、巨核球前駆細胞、未熟巨核球、成熟巨核球、およびそれらの組み合わせを含んでいてよい。これらの特定の巨核球群の各々は、異なる時点で患者において血小板を生成し、従って、異なる治療的有用性を保有し得る。例えば、成熟巨核球は、患者へ投与されてから数日以内に血小板を産生し、未熟巨核球は、数週以内に血小板を産生し、巨核球前駆細胞は、数ヶ月以内に血小板を産生するであろう。従って、患者の必要に依って、一つまたは複数のタイプの巨核球が巨核球生成物に含まれるよう、処置を最適化することができる。
【００３６】
本発明の巨核球生成物は、単独でまたは組み合わせて、インビボで使用され得る。従って、本発明は、薬学的に許容される担体と、薬理学的に有効な量の一つまたは複数の本発明のペプチドまたはそれらの適当な塩とを含む薬学的組成物の投与を提供する。薬学的組成物は、粉末、顆粒、溶液、懸濁物、エアロゾル、固体、丸剤、錠剤、カプセル、ゲル、局所クリーム、坐薬、経皮パッチ等として製剤化され得る。
【００３７】
巨核球生成物は、静脈内投与され得る。巨核球生成物の静脈内送達は、ボーラスを含む静脈内方法を介して患者へ投与するために適当な任意の製剤を含み得る。巨核球生成物は、注射方法を介して患者へ投与され得る。適当な注射方法には、静脈内注射に加えて、動脈内注入、筋肉内注射、経皮注射、非経口、および皮下注射が含まれ得る。巨核球製剤は、水性媒体を含んでいてよい。水性媒体には、例えば、非限定的に、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リンゲル液、等張デキストロース溶液、滅菌水、デキストロース、および乳酸リンゲル液が含まれる。非水性非経口媒体には、例えば、非限定的に、植物起源の不揮発性油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、およびピーナッツ油が含まれる。複数回投与用容器に包装される非経口調製物には、フェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルpヒドロキシ安息香酸エステル、プロピルpヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、および塩化ベンゼトニウムを含む抗微生物剤が、静菌的または静真菌的な濃度で添加されなければならない。等張剤には、例えば、非限定的に、塩化ナトリウムおよびデキストロースが含まれる。緩衝剤には、リン酸およびクエン酸が含まれ得る。抗酸化剤には、重硫酸ナトリウムが含まれ得る。
【００３８】
用量および投薬計画は、障害の性質、例えば、その治療指数、患者、患者の病歴のような、医師によって容易に決定される多様な因子に依る。一般に、治療的に有効な量の組成物が、患者へ投与される。いくつかの態様において、投与される組成物の量は、患者の体重1kg当たり約0.01mg〜約1000mgの範囲および中間の範囲である。状態の重症度に依って、体重1kg当たり約0.1mg〜約50mg（例えば、約0.1〜15mg/kg/回、より一般的には、約1〜25mg/kg体重）の組成物が、例えば、1回もしくは複数回の別々の投与によるかまたは連続注入によるかに関わらず、患者への投与のための初期候補投薬量である。製剤が放出される部位付近の組織に対する妨害または外傷を最小限に抑えるため、組成物は、比較的低い体積速度、例えば、必ずではないが、約0.001ml/日〜10ml/日で送達され得る。製剤は、具体的な生物学的薬剤に依って、低い用量で、例えば、約0.01μg/hrまたは0.1μg/hr、0.25μg/hr、1μg/hr、一般に、約200μg/hrまでの速度で放出され得、または製剤は、低い体積速度、例えば、約0.001ml/日〜約1ml/日、例えば、1日当たり0.01マイクログラム〜1日当たり約20ミリグラムの体積速度で放出され得る。投薬量は、活性要素の効力、生物学的利用率、および毒性、ならびに対象の必要条件のような多数の因子に依る。この治療の進行は、従来の方法およびアッセイによって、医師またはその他の当業者に公知の基準に基づき、容易にモニタリングされる。成功した処置および疾患の改善を査定するための前記のパラメータは、医師に周知のルーチンの手法によって容易に測定可能である。
【００３９】
送達系には、当業者に周知の徐放性のまたは長期的な送達方法も含まれる。「徐放」または「長期放出」とは、本明細書中で使用されるように、送達系が、1日より長く、好ましくは、1週より長く、最も好ましくは、少なくとも約30日〜60日またはそれ以上、薬学的に治療的な量の本発明の化合物を投与することを意味する。長期放出系には、前記の生分解性ポリマーのような、本発明のペプチドを含有している植込み型の固体またはゲル；蠕動ポンプおよびフルオロカーボンプロペラント（fluorocarbon propellant）ポンプを含むポンプ；浸透圧およびミニ浸透圧ポンプ等が含まれ得る。蠕動ポンプは、ポンプの各稼働によって設定された量の薬物を送達し、レザバーは、好ましくは、ポートを通して経皮的に補充され得る。コントローラーが、投薬量を設定し、送達された投薬量、残存している投薬量、および送達の回数に関するリードアウトを提供することもできる。フルオロカーボンプロペラントポンプは、ポンプを作動させるためにフルオロカーボン液体を利用する。フルオロカーボン液体は、薬物を放出するため、大気圧より高い蒸気圧をかけ、薬物を含有しているチャンバーを圧縮する。浸透圧ポンプ（およびミニ浸透圧ポンプ）は、一定の速度で薬物を放出するため、浸透圧を利用する。薬物は、浸透剤に囲まれた不透過性の隔膜に含有されている。半透膜が、浸透剤を含有しており、ポンプ全体がケースに収容されている。半透膜を通した水の拡散が、薬物を保持する隔膜を圧搾し、血流、器官、または組織へ薬物を押し出す。これらおよびその他のそのようなインプラントは、全身（例えば、静脈内もしくは皮下）投与または持続的長期的な局所投与を介して本発明のオリゴペプチドを送達することによって、炎症性疾患状態、特に、再発エピソードを呈するものまたは進行性であるものを処置するために特に有用である。
【００４０】
範囲の値が提供される場合、前後関係が明白に他のことを指示しない限り、その範囲の上限〜下限の、下限値の単位の10分の1までの中間の各値、およびその明記された範囲の中の他の明記された値または中間の値が、本発明に包含されることが理解される。より小さい範囲に独立に含まれ得る、これらのより小さい範囲の上限および下限も、本発明に包含され、明記された範囲の中の特別に排除された限度に従う。明記された範囲が限度の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限度の両方を排除する範囲も、本発明に含まれる。
【００４１】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語が、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書中に記載されたものに類似しているかまたは等価である任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料が本明細書中に記載される。本明細書中で言及された全ての刊行物が、参照によってその全体が本明細書中に組み入れられる。
【００４２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形（a, an, the）は、前後関係が明白に他のことを指示しない限り、複数の対象物を含む。
【００４３】
「約」という用語は、当業者によって基線値と実質的に異なると見なされないであろう値の範囲をさす。例えば、「約」という用語は、明記された値の20％以内、15％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内、0.5％以内、0.1％以内、0.05％以内、または0.01％以内にある値、およびそのような明記された値の中間の値をさすことができる。
【００４４】
本明細書中に開示された刊行物は、本発明の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供される。先行発明のため、そのような公開に先行する資格を本発明が有しないことの承認として解釈されるべきものは、本明細書中に存在しない。さらに、提供された刊行日は、実際の刊行日と異なる可能性があり、それは、独立に確認される必要があり得る。
【００４５】
本書において引用された出願および特許の各々のみならず、出願および特許の各々において引用された各々の文書または参照、特許もしくは非特許の文献（発行された各特許の手続き中を含む；「出願引用文書（application cited documents）」）、ならびにこれらの出願および特許のいずれかに対応するかつ/またはそれに基づく優先権を主張するPCTおよび外国の出願および特許の各々、ならびに出願引用文書の各々において引用されたまたは参照された文書の各々は、参照によってその全体が明示的に本明細書中に組み入れられる。より一般に、文書または参照は、本書において、特許請求の範囲の前の参考文献一覧において；または本文自体において引用され；これらの文書または参照（「本明細書中で引用された参照」）の各々のみならず、本明細書中で引用された参照の各々において引用された各々の文書または参照（製造業者の仕様書、説明書等を含む）が、参照によって明示的に本明細書中に組み入れられる。
【００４６】
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに例示するために役立つ。
【実施例】
【００４７】
VIII. 実施例
以下の実施例は、インビトロの臍帯血（CB）CD34+細胞の増殖および巨核球（MK）への分化、結果として得られたMK生成物の凍結保存、ならびに増殖/分化を介して生成されたMK生成物のインビボの輸血に関する。細胞培養条件が列挙される場合、下記表5に対応する、付随する識別番号、例えば、CC＃1が提供される。実施例において列挙された異なる細胞培養条件から入手されたCD41+MKの全体収量は、サイトカイン単独の存在下で増殖させたインプットCD34+細胞については細胞1個当たり8〜33 MK、サイトカイン＋VPAの存在下で増殖させたインプットCD34+細胞については細胞1個当たり9〜34 MKの範囲であった。1 CBUから2×106個ものCD34+細胞が単離され得るとすれば、理論によって拘束されることは望まないが、インプットCD34+細胞1個当たり28 MK以上を与える培養物は、56×106 MKまたは80kgのレシピエントへ注入するための7×105 MK/kgに相当する量を超える量を生成すると予想される。
【００４８】
1. バルプロ酸（VPA）処理による無血清（SF）培地におけるCD34+細胞の増殖
臍帯血（CB）CD34+細胞を入手し、試験群と対照群とに分離した。群を、以下の細胞培養プロトコルに供した。
0日目：CB CD34+細胞を、サイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。
1日目：1mMバルプロ酸（VPA）をSF培養物に添加した（試験群のみ）。対照群にはVPAを添加しなかった。
2〜8日目：細胞を、SF培養物中で増殖させ、7日目に収集した。全CD34+細胞増殖は、およそ200倍であった。
【００４９】
結果は、VPAによって処理された培養物（試験群）におけるCD34+細胞の数が、VPAの非存在下で増殖させた細胞の数より200倍超多いことを示した。図1参照。増殖HSCは、原始CD34+/CD90+細胞（74.2±9.8％）から主になり、続いて、グリコホリン（GPA）+赤血球細胞（17±5.4％）およびCD41+MK細胞（8.9±2％）からなっていた。VPAによって増殖させたCD34+細胞の機能のインビトロおよびインビボでの評価は、MK系統生着の改善を含む、NSGマウスへの移植後に多系列造血を再構成する能力の増加を証明した。
【００５０】
2. 異なる発達段階の巨核球（MK）が初代CD34+細胞からエクスビボで効率的に生成される
臍帯血（CB）CD34+細胞を入手した。群を、以下の細胞培養プロトコルに供した。
0日目：CD34+細胞をトロンボポエチン（TPO）を含む幹細胞因子（SCF）培地に播種した。
1〜7日目：細胞を培養物中で増殖させた。
7日目：細胞をトロンボポエチン（TPO）を含む無血清（SF）培地に再播種した。
8〜4日目：細胞を巨核球生成物へ分化させた。
14日目：細胞を収集し、定量し、特徴決定した。全CD41+巨核球増殖はおよそ3〜15倍であった。
【００５１】
結果は、PBまたはBMのCD34+細胞によって開始された培養物が、異なる発達段階のMK（CD34+/CD41+/CD42b-MK前駆細胞/始原細胞（MKPP）、未熟CD34-/CD41+/CD42b-MK（iMK）、および成熟CD34-/CD41+/CD42b+MK（mMK））を生成することを示した。とりわけ、CB由来CD34+細胞は、これらの表現型的に定義されたMK集団を含むロバストなMK培養物を漸進的に生成することができる（図2Aおよび図2B）。MKPPおよびiMKは早くも4日目に発生し、mMKは7日目に既に観察される。12日目までに、細胞の77％がCD41+細胞となり、そのうちの23％がMKPP、74％がmMKであった。これは、最初に播種されたCD34+細胞1個から3 MKという絶対収量に相当する。さらに、培養中、これらのMKは、新たに単離されたPB PTLと表現型的に比較可能なPTLを排出する（図2C）。これらの結果は、CB CD34+細胞が血小板産生巨核球の信頼性の高い起源であることを示した。
【００５２】
3. バルプロ酸（VPA）は巨核球（MK）にコミットされ分化するCD34+細胞の能力を増強する
バルプロ酸（VPA）への曝露が、巨核球（MK）にコミットされ分化する臍帯血（CB）CD34+細胞の能力に影響しないことを確かめるため、トロンボポエチン（TPO）によって媒介されるMKの分化および成熟に対するVPAの効果を試験した。このため、50,000個の凍結保存されたCB CD34+細胞を、幹細胞因子（SCF）、インターロイキン3（IL-3）、Fms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、およびTPOが補足された無血清（SF）培地に播種し、前記実施例1に記載されたように、VPAの存在下または非存在下（試験対対照）で増殖させた。7日後に、収集する代わりに、VPAおよびサイトカインを除去するため、細胞を洗浄し、TPOのみが補足されたSF培地に再播種した。VPAによって増殖させた培養物においては、サイトカインのみによって増殖させた培養物より、およそ50％多いCD41+MKが検出された（図3A）。これは、VPAの存在下で播種されたCD34+細胞1個から生成されたおよそ40 MKという最終収量に相当し、それに対して、VPAの非存在下で播種されたCD34+細胞1個によって生成されたCD41+MKは、およそ5であった。q-PCR分析は、MK分化前にVPAに曝された培養物におけるMK特異的遺伝子（GATA1、PF4、およびNFE2）のアップレギュレーションを確認した（図3B）。これらの結果は、MK分化前のVPA曝露が、MKの最終収量を改善することを証明している。
【００５３】
4. バルプロ酸（VPA）によって増殖させた臍帯血（CB）CD34+細胞からの巨核球（MK）のエクスビボ生成
臍帯血（CB）CD34+細胞を入手し、以下の処理（CC＃15）に供した。
0日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。
1日目：1mMバルプロ酸（VPA）をSF培養物に添加した。
1〜5日目：細胞をSF培養中で増殖させた。
5〜12日目：細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種し、12日目に収集した。
【００５４】
図4に示される結果は、0日目に、CD34+細胞への強力なバイアスが存在することを示した。5日目までに、いくらかの分化が起こり始めていたが、顕著な量のCD34+細胞が未だ存在した。分化培地中でさらに5日経った後、10日目に、巨核球（MK）の86.4％が、CD41+/CD61+MKへ分化していた。
【００５５】
5. バルプロ酸（VPA）によって増殖させた臍帯血（CB）CD34+細胞から生成された巨核球（MK）培養物はコロニー形成単位（CFU）を形成することができる
臍帯血（CB）CD34+細胞を入手し、以下の処理に供した。
処理1：（CC＃11）
0〜5日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。細胞を培養物中で増殖させた。
5〜8日目：細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。細胞を培養物中で増殖させた。
8〜12日目：細胞を100ng/mL TPOのみを含むStemline培地に再播種した。
【００５６】
処理2：（CC＃14）
0〜5日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。細胞を培養物中で増殖させた。
5〜8日目：細胞を10ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。細胞を培養物中で増殖させた。
8〜12日目：細胞を100ng/mL TPOのみを含むStemline培地に再播種した。
【００５７】
処理3：（CC＃17）
0日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。
1日目：1mMバルプロ酸（VPA）をSF培養物に添加した。
1〜5日目：細胞をSF培養物中で増殖させた。
5〜8日目：細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。
8〜12日目：細胞を100ng/mL TPOのみを含むStemline培地に再播種した。
【００５８】
処理4：（CC＃19）
0日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。
1日目：1mMバルプロ酸（VPA）をSF培養物に添加した。
1〜5日目：細胞をSF培養物中で増殖させた。
5〜8日目：細胞を10ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。
8〜12日目：細胞を10ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含む1/2体積のStemline培地に再播種した。
【００５９】
図5に示される結果は、数が相当少なく、主として混合クラスタであった他のCFU（図5B）と比較して、サイズが大、中、小に及ぶ、ロバストな数のCFU-MK（図5A）を示した。図5Aおよび図5Bの各々の1番目のカラムは、処理1（CC＃11）に対応し、2番目のカラムは、処理2（CC＃14）に対応し、3番目のカラムは、処理3（CC＃17）に対応し、4番目のカラムは、処理4（CC＃19）に対応する。
【００６０】
6. バルプロ酸（VPA）によって増殖させた培養物から単離されたCD61+巨核球（MK）は凍結保存が可能である
A. 臍帯血（CB）CD34+細胞を入手し、様々な培養プロトコル（本明細書中に記載されるCC＃5、CC＃15、CC＃16、およびCC＃17）に供した。結果として得られた分化巨核球生成物から、CD61+巨核球（MK）を免疫磁気的に精製した。CD61+MKを、未精製の不均一巨核球（MK）生成物と共に3ヶ月間凍結保存した。次いで、精製CD61+MKおよび不均一MK生成物を解凍し、表現型について評価した。精製CD61+MKについての結果は、下記表1に示され、不均一MK生成物の結果は、下記表2に示される。
【００６１】
（表１）精製CD61+MK細胞生成物の凍結保存前後の生存度およびMK表現型の回収
2019526245.tif 000003
【００６２】
（表２）不均一MK細胞生成物の凍結保存前後の生存度およびMK表現型の回収
2019526245.tif 000004
【００６３】
B. 臍帯血（CB）CD34+細胞を入手し、前記実施例4の処理3に記載された培養プロトコルCC＃17に供した。結果として得られた分化巨核球生成物から、CD61+巨核球（MK）を免疫磁気的に精製した。CD61+MKを3ヶ月間凍結保存した。結果は、凍結保存前、MKの70.9％が生存し、解凍後、68.4％が生存していたことを示し、MKは解凍後に驚くほど高レベルに保存されていた。解凍後のMKの集団は、以下のように分布した：CD34+/CD41+が全MK集団の0.9％を占め、CD41+/CD42-が全MK集団の27.4％を占め、CD41+/CD42+が全MK集団の65.5％を占めた。図6Aに示されるように、凍結保存前、VPAによって増殖させた培養物から単離された巨核球（MK）の86.4％がCD61+細胞であり、図6Bに示されるように、解凍後、VPAによって増殖させた培養物から単離された巨核球（MK）の89.4％がCD61+細胞であった。
【００６４】
C. （培養プロトコルCC＃17に供された）サイトカイン単独またはサイトカイン＋VPAの存在下で増殖させたHSCから生成された凍結保存されたMKを、解凍し、エクスビボで血小板を放出しCFU-MKを形成する能力について評価した。結果は、図7Aおよび図7B（チアゾールオレンジ染色）に示される。
【００６５】
7. 統合された培養プロトコル
臍帯血（CB）CD34+細胞を入手し、以下の処理に供する。
0日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のIL-3、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含む無血清（SF）培養物に播種する。1日目：1mMバルプロ酸（VPA）および50ng/mL IL-6をSF培養物に添加する。
1〜7日目：細胞をSF培養物中で増殖させる。
7日目：細胞を10ng/mL〜150ng/mLの範囲の量のSCFおよび100ng/mLの量のTPOを含むSF培地に再播種する。
7〜10日：細胞を増殖させ、分化させる。
10日目：細胞を100ng/mLの量のTPOを含むSF培地に再播種する。
10〜14日目：細胞を分化させる。
14日目：細胞を収集し、定量し、特徴決定する。
【００６６】
8. 免疫低下NSGマウスにおけるヒトのMKおよび血小板の生着
エクスビボで生成されたMKの、免疫低下NSGマウスへの注入後にインビボで血小板を生成する能力を調査した。最初に、新鮮なヒト多血小板血漿をレシピエント動物へ注入し、注入の約1時間後〜5日後、マウス末梢血（mPB）中のヒトPTLの存在を査定した（図8A）。ヒトCD41標識とカップリングされた、ヒトPTLのサイズおよび光散乱特性を、MK培養物注入後のmPB中のヒトPTLの検出のための陽性対照として使用した。MK培養物をエクスビボで生成し、採集し、定量し、表現型的に評価し、4つの異なる実験群に注入した：基本MK培養系（0〜7日目、100ng/ml SCFおよび50ng/ml TPOを含むSF QBSF培地、その後、8〜10日目、50ng/ml TPOのみを含むSF QBSF培地）（Iancu-Rubin et al. Blood 2011,Exp Hematol 2012 and 2014,Leukemia 2017）において生成されたMK集団を受容した第1の群；サイトカイン単独の存在下で生成されたMK（CC＃10）を受容した第2の群；サイトカイン＋VPAの存在下で生成されたMK（CC＃16）を受容した第3の群；および新たに精製されたCD61+MKを受容した第4の群。これらの3つの群において注入されたMK培養物（CC＃16）は、不均一MK集団を含み、注入された細胞の総数は約60万〜約500万と変動した（下記表3参照）。図8に例示されるように、エクスビボで生成されたMK生成物の注入によって、NSGレシピエントマウスのmPBにhPTLが検出可能となり、マウス骨髄（mBM）にCD41+細胞が検出可能となった。
【００６７】
結果は、驚いたことに、MKが基本培養条件（SCFおよびTPOのみを含む無血清培地における二段階培養）において生成された時、比較可能な数のMKの注入後のインビボhPTL産生の程度が、VPAの存在下での培養において生成されたMKと比較して、より大きいことを示した。理論によって拘束されることは望まないが、精製MKの注入後のインビボPTL産生の欠如は、注射されたMKの数が限定されていたことに起因した。結論として、CB HSCに由来するエクスビボで産生されたMK細胞生成物は、PTLを即時放出することができるmMKおよびiMKを含むのみならず、MKおよびPTLを持続的に産生することができるMKPおよびHPCも含む。
【００６８】
実施例6において例示されたように、増殖させたMKは、凍結保存が可能である。しかしながら、重要なことに、それらはインビボで血小板を産生することもできた。より具体的には、不均一であっても、精製されたものであっても、凍結保存されたMKを免疫低下NSGマウスへ注入した時、それらはインビボで血小板を産生することができた。不均一MK培養物または精製MK培養物のいずれかを注入された各群の動物5匹中2匹が、インビボでhPTLを放出した。驚いたことに、10万個という少ない精製MKの注入の後、早くも3日目、7日目、10日目に、hPTLがmPB中に観察された。しかしながら、後の時点においては、検出不可能なレベルにまで数が低下した（図8F）。対照的に、不均一MK集団を注入されたNSGマウスにおいては、hPTL産生が3ヶ月もの間持続し、この期間は、精製MK培養物を与えられたものより有意に長かった。理論によって拘束されることは望まないが、これらの所見は、精製成熟MKの集団は、迅速な初期のPTL産生をもたらすことができ、MK前駆細胞および成熟MKから構成された不均一MK集団は、インビボで、迅速なPTL産生および持続的なPTL産生の両方を可能にし得ることを示す。
【００６９】
（表３）エクスビボで生成されたMKの注入後にNSGマウスにおいてインビボで生成されたhPTLの査定
2019526245.tif 000005
TNC＝全有核細胞
【００７０】
9. 培養最適化からの平均巨核球収量およびいくつかの細胞培養条件の付加的なエクスビボ特徴決定
臍帯血（CB）に由来するCD34+HSCを、バルプロ酸（VPA）の非存在下または存在下で4日間または7日間増殖させ、次いで、様々なサイトカインカクテルを利用した条件において巨核球（MK）の分化および成熟に向けて誘導した。VPAなしの細胞培養条件（「サイトカイン単独」）は、本明細書中に記載されるCC＃1〜4、9〜14を含み、VPAを含むもの（「サイトカイン＋VPA」）は、本明細書中に記載されるCC＃5〜8、15〜20を含む。両方の細胞培養物群におけるMK収量の平均値±標準偏差（SD）は、下記表4に表される。代表的なフローサイトメトリー分析が、図9A（サイトカインのみのCC＃11）および9B（サイトカイン＋VPAのCC＃17）に表される。「サイトカイン単独」および「サイトカイン＋VPA」について共通の時点（8日目）で採取されたCFUの代表的な数が、図10に表される。
【００７１】
（表４）培養最適化からのMK収量
2019526245.tif 000006
【００７２】
これらの培養条件は、培養物の15〜57％と変動し得る生成されたMK収量の割合をさらに最大化するための最適化を表す。これらの条件において得られたMKの優勢な亜集団は、VPA処理に関わらず、mMKからなる。しかしながら、VPAの存在下で生成された培養物は、サイトカイン単独と比較して、より多数のCD34+/CD41+MK前駆細胞およびアッセイ可能CFU-MKを含有していた（図9参照）。
【００７３】
10. 付加的な細胞培養プロトコル
以下の付加的な細胞培養プロトコルを、臍帯血（CB）CD34+細胞に対して実施した。
処理1：（CC＃1）
0日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。
1〜8日目：細胞をSF培養物中で増殖させた。
8〜12日目：細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。
12日目：細胞を収集した。
【００７４】
処理2：（CC＃2）
0日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。
1〜8日目：細胞をSF培養物中で増殖させた。
8〜12日目：細胞を100ng mL TPOのみを含むStemline培地に再播種した。
12日目：細胞を収集した。
【００７５】
処理3：（CC＃3）
0日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。
1〜8日目：細胞をSF培養物中で増殖させた。
8〜12日目：細胞を150ng/mL SCFおよび100ng mL TPOを含むQBSF培地に再播種した。
12日目：細胞を収集した。
【００７６】
処理4：（CC＃4）
0日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。
1〜8日目：細胞をSF培養物中で増殖させた。
8〜12日目：細胞を100ng mL TPOのみを含むQBSF培地に再播種した。
12日目：細胞を収集した。
【００７７】
処理5：（CC＃5）
0日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。
1日目：1mMバルプロ酸（VPA）をSF培養物に添加した。
1〜8日目：細胞をSF培養物中で増殖させた。
8〜12日目：細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。
12日目：細胞を収集した。
【００７８】
処理6：（CC＃6）
0日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。
1日目：1mMバルプロ酸（VPA）をSF培養物に添加した。
1〜8日目：細胞をSF培養物中で増殖させた。
8〜12日目：細胞を100ng/mL TPOのみを含むStemline培地に再播種した。
12日目：細胞を収集した。
【００７９】
処理7：（CC＃7）
0日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。
1日目：1mMバルプロ酸（VPA）をSF培養物に添加した。
1〜8日目：細胞をSF培養物中で増殖させた。
8〜12日目：細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むQBSF培地に再播種した。
12日目：細胞を収集した。
【００８０】
処理8：（CC＃8）
0日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。
1日目：1mMバルプロ酸（VPA）をSF培養物に添加した。
1〜8日目：細胞をSF培養物中で増殖させた。
8〜12日目：細胞は、100ng/mL TPOのみを含むQBSF培地に再播種した。
12日目：細胞を収集した。
【００８１】
処理9：（CC＃9）
0〜5日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。細胞を、SF培養物中で増殖させた。
5〜12日目：細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。
12日目：細胞を収集した。
【００８２】
処理10：（CC＃10）
0〜5日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。細胞を、SF培養物中で増殖させた。
5〜8日目：細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。細胞を増殖させた。
8〜12日目：細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含む1/2体積のStemline培地に再播種した。
12日目：細胞を収集した。
【００８３】
処理11：（CC＃12）
0〜5日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。細胞をSF培養物中で増殖させた。
5〜12日目：細胞を10ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。
12日目：細胞を収集した。
【００８４】
処理12：（CC＃13）
0〜5日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。細胞をSF培養物中で増殖させた。
5〜8日目：細胞を10ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。細胞を増殖させた。
8〜12日目：細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含む1/2体積のStemline培地に再播種した。
12日目：細胞を収集した。
【００８５】
処理13：（CC＃16）
0日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。
1日目：1mMバルプロ酸（VPA）をSF培養物に添加した。
1〜5日目：細胞をSF培養物中で増殖させた。
5日目：細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。
5〜8日目：細胞をSF培養物中で増殖させた。
8日目：細胞を150ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含む1/2体積のStemline培地に再播種した。
8〜12日目：細胞をSF培養物中で増殖させた。
12日目：細胞を収集した。
【００８６】
処理14：（CC＃18）
0日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。
1日目：1mMバルプロ酸（VPA）をSF培養物に添加した。
1〜5日目：細胞をSF培養物中で増殖させた。
5日目：細胞を10ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。
5〜12日目：細胞をSF培養物中で増殖させた。
12日目：細胞を収集した。
【００８７】
処理15：（CC＃20）
0日目：CB CD34+細胞をサイトカインカクテルによってプライミングし、無血清（SF）培養物（Stemline培地）に播種した。サイトカインカクテルは、150ng/mLの量の幹細胞因子（SCF）、50ng/mLの量のインターロイキン3（IL-3）、100ng/mLの量のFms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）、および100ng/mLの量のトロンボポエチン（TPO）を含んでいた。
1日目：1mMバルプロ酸（VPA）をSF培養物に添加した。
1〜5日目：細胞をSF培養物中で増殖させた。
5日目：細胞を10ng/mL SCFおよび100ng/mL TPOを含むStemline培地に再播種した。
5〜8日目：細胞をSF培養物中で増殖させた。
8日目：細胞を100ng/mL TPOのみを含むStemline培地に再播種した。
8〜12日目：細胞をSF培養物中で増殖させた。
12日目：細胞を収集した。
【００８８】
（表５）実施例において表記された培養条件によって組織化されたCD41+巨核球の収量の実測値、対、理論値
2019526245.tif 000007
【００８９】
以上の好ましい態様の例および説明は、特許請求の範囲によって定義される本発明を限定するものではなく、例示するものと理解されるべきである。容易に認識されるように、前記の特色の多数の変更および組み合わせが、特許請求の範囲に示される本発明から逸脱することなく利用され得る。そのような変更は、本発明の範囲からの逸脱とは見なされず、そのような変更は、全て、以下の特許請求の範囲の範囲内に含まれるものとする。本明細書中に引用された全ての参照が、参照によってその全体が組み入れられる。
【図１Ａ】
2019526245.tif 000009
【図１Ｂ】
2019526245.tif 000010
【図２Ａ】
2019526245.tif 000011
【図２Ｂ】
2019526245.tif 000012
【図２Ｃ】
2019526245.tif 000013
【図３Ａ】
2019526245.tif 000014
【図３Ｂ】
2019526245.tif 000015
【図４−１】
2019526245.tif 000016
【図４−２】
2019526245.tif 000017
【図５Ａ】
2019526245.tif 000018
【図５Ｂ】
2019526245.tif 000019
【図６Ａ】
2019526245.tif 000020
【図６Ｂ】
2019526245.tif 000021
【図７Ａ−１】
2019526245.tif 000022
【図７Ａ−２】
2019526245.tif 000023
【図７Ｂ】
2019526245.tif 000024
【図８Ａ−１】
2019526245.tif 000025
【図８Ａ−２】
2019526245.tif 000026
【図８Ｂ−１】
2019526245.tif 000027
【図８Ｂ−２】
2019526245.tif 000028
【図８Ｃ】
2019526245.tif 000029
【図８Ｄ】
2019526245.tif 000030
【図８Ｅ−１】
2019526245.tif 000031
【図８Ｅ−２】
2019526245.tif 000032
【図８Ｆ】
2019526245.tif 000033
【図９Ａ】
2019526245.tif 000034
【図９Ｂ】
2019526245.tif 000035
【図１０Ａ】
2019526245.tif 000036
【図１０Ｂ】
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【国際調査報告】
2019526245.tif 000038
2019526245.tif 000039