(57)【要約】  本発明は、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．（ココア）豆のペプチドおよび糖の加水分解物、それを調製する方法、それを含有する化粧品組成物、ならびにそれらの美容的使用、特に、皮膚を青色光から保護するためおよび／または皮膚の老化および光老化の徴候の出現に対抗するためのそれらの美容的使用に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆のペプチドおよび糖の加水分解物であって、
前記ペプチドおよび糖類が２００Ｄａと１０ｋＤａとの間の分子量を有すること、ならびに前記加水分解物が、
ａ）非発酵の、乾燥されて粉砕されたＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆を水性相に分散させる工程；
ｂ）工程ａ）で得られた水性分散物の酵素処理を２つの工程で実施する工程であり、第１の処理で少なくとも１種のカルボヒドラーゼを使用し、次に第２の処理で少なくとも１種のプロテアーゼを使用し、前記カルボヒドラーゼが、ペクチナーゼ、セルラーゼ、アラバナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼおよびβ−グルカナーゼから選択され、前記プロテアーゼは、アルカリ性、中性または酸性タイプであり、好ましくは、エンドペプチダーゼ活性を有するアルカリ性タイプのものである、工程；
ｃ）前記酵素を熱処理により変性させる工程；
ｄ）前記酵素による加水分解物の回収を固／液分離により実施する工程；
ｅ）前記加水分解物を限外濾過およびナノ濾過により精製する工程、次に任意選択で；
ｆ）工程ｅ）で得られた前記加水分解物の凍結乾燥を実施する工程
を含む方法により得られることを特徴とする、加水分解物。
【請求項２】
前記工程ａ）の豆がさらに脱脂されることを特徴とする、請求項１に記載のＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆のペプチドおよび糖の加水分解物。
【請求項３】
前記工程ｂ）のカルボヒドラーゼが、少なくとも１種のポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ベータグルカナーゼ、ベータマンナナーゼ、ベータグルコシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、アラバナーゼおよびキシラナーゼを含むカルボヒドラーゼの混合物であることを特徴とする、請求項１または２に記載のＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆のペプチドおよび糖の加水分解物。
【請求項４】
前記工程ｂ）で使用される全酵素濃度が、処理されるべき前記豆の重量に対して０．１重量％と３．０重量％の間であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項に記載のＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆のペプチドおよび糖の加水分解物。
【請求項５】
前記工程ｂ）のカルボヒドラーゼが、全乾燥物質の重量の０．５重量％のセルラーゼおよび全乾燥物質の重量の１重量％のペクチナーゼを含むことを特徴とする、請求項３または４に記載のＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆のペプチドおよび糖の加水分解物。
【請求項６】
前記工程ａ）からｄ）が、２０℃と９０℃の間の温度および３．０と１１．０の間のｐＨで実施されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項に記載のＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆のペプチドおよび糖の加水分解物。
【請求項７】
前記工程ｄ）の固／液分離が、遠心分離、スピニング、濾過などの種々の方法で実施されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか１項に記載のＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆のペプチドおよび糖の加水分解物。
【請求項８】
前記工程ｅ）で前記限外濾過が、５ｋＤａと１５ｋＤａの間のカットオフ閾値で実施され、前記ナノ濾過が、１００Ｄａと３００Ｄａの間のカットオフ閾値で実施されることを特徴とする、請求項１から７のいずれか１項に記載のＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆のペプチドおよび糖の加水分解物。
【請求項９】
活性な作用剤として、請求項１から８のいずれか１項に記載の効果的な量のＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆の加水分解物、および生理学的に許容される媒体を含むことを特徴とする化粧品組成物。
【請求項１０】
前記Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆の加水分解物が、前記組成物の全重量に対して０．００１から２０％、好ましくは０．１から１０％、好ましくは０．２から５％、さらにより好ましくは０．５から１．５％の濃度で、前記組成物中に存在することを特徴とする、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
皮膚に局所的に適用されるように製剤化されていることを特徴とする、請求項９または１０に記載の組成物。
【請求項１２】
皮膚を青色光の悪影響から保護するための、請求項９から１１のいずれか１項に記載の組成物の美容的使用。
【請求項１３】
皮膚を青色光への曝露により生じる酸化ストレスから保護するための、請求項１２に記載の美容的使用。
【請求項１４】
皮膚の老化および光老化の徴候の出現に対抗するための、請求項９から１１のいずれか１項に記載の組成物の美容的使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．（ココア）豆のペプチドおよび糖の加水分解物、それを調製する方法、それを含有する化粧用組成物、およびそれらの美容的使用、特に皮膚を青色光から保護するための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
青色光は、４００ｎｍと４９５ｎｍの間の可視光の部分を表す。それは、可視スペクトルのエネルギーが最も高い部分である。受け取られる青色光の大部分は太陽から生じる。我々の屋内環境において、我々は、照明に存在するＬＥＤ（発光ダイオード）、およびスマートフォン、タブレット、コンピュータおよびテレビジョンのスクリーンからの人工青色光に曝露されることが増加しつつある。
【０００３】
可視光の光子は、網膜細胞にある光受容体により捕捉されて、光情報伝達機構を開始する。オプシンと称されるこれらの光受容体は、Ｇタンパク質と結合し、および、光異性化反応を経て全−トランスレチナールになり、シグナル伝達カスケードを生ずる発色団である１１−シスレチナールを含有する。
【０００４】
光の知覚は、生体で２つの経路により作用する。すなわち、視覚的効果を含む主要な光学的経路、およびメラトニンの分泌、体温の調節、約２４時間周期の遺伝子の発現などの生物学的効果が続く網膜視床下部経路である。
【０００５】
青色光により網膜細胞に生ずる損傷について研究が行われてきた。可視光への曝露によって、網膜の上皮細胞内に反応性酸素種を生成が引き起こされ、そのことはミトコンドリアＤＮＡの損傷を誘発し、おそらくこれらの細胞のアポトーシスを生じさせる２、３。これらの変化は、網膜細胞におけるリポフスチンの蓄積が起こる加齢性黄斑変性の発生と関連することが示されている４。
【０００６】
それに加えて、青色光は、マウスの網膜細胞でオプシンの蓄積を誘発して、細胞の損傷を引き起こすことが最近示された５。
【０００７】
タッチタブレットなどのデバイスの使用による青色光の別の影響が報告されている。睡眠に入る前にこのタイプのデバイスを使用することは、メラトニンレベルを改変して日周リズムの偏移を引き起こす６。青色光の悪影響を阻止するために、ＬＥＤを含有するデバイスを生産する幾つかの光学ブランドが、青色に対応する波長を遮断するガラスまたはスクリーンを開発した。
【０００８】
青色光は、皮膚に対する効果も有する。ヒト皮膚のケラチノサイトおよび内皮細胞に対して、青色光が抗増殖効果を及ぼし、ケラチノサイトの分化を促進することが示された７。それに加えて、青色光は、樹状細胞の成熟を抑制する８。これらの性質は、過増殖性および／または炎症性皮膚疾患、例えば、乾癬、アトピー性皮膚炎または湿疹などの治療における青色光の使用に結びつく。
【０００９】
それに加えて、以前、特に角質層と顆粒層との界面に分泌された脂質に関して、バリア機能が変化した皮膚断片の青色光へ曝露することによって、皮膚バリアの回復が遅れることを示した。この結果は、可視スペクトルの他の波長では観察されなかったので、このことは、皮膚バリアのホメオスタシスと関係する青色光の特異的活性を示唆する１。
【００１０】
アクネの治療に関して、青色光への曝露は、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）の細菌ポルフィリンの光励起を引き起こして、該細菌の排除をもたらす９。
【００１１】
ごく最近、オプシン受容体ＯＰＮ１−ＳＷ、ＯＰＮ２、ＯＰＮ３およびＯＰＮ５の発現がケラチノサイトおよびメラノサイトで同定されて、そのことは皮膚細胞における光情報伝達の役割を果たすことを示唆した１０。皮膚細胞においてオプシンの活性化から生ずるシグナルは、約２４時間周期の遺伝子の調節を含む視覚に関係しない効果を生ずる１１。
【００１２】
青色光が皮膚において生じさせ得る悪影響を考慮すると、ヒト皮膚を青色光から保護するために使用することができる化粧品組成物を開発できることは重要であると思われる。
【００１３】
驚くべきことに、本出願人らは、皮膚のバリア機能を改善することにより青色光に対する保護活性、ならびに皮膚の老化の出現に対する予防的活性を示すことを証明した、ペプチドおよび糖に富む抽出物の開発を可能にする、ココア豆からの新規な抽出方法を開発した。
【００１４】
ココアの木は、「ココア」とも称され、古典的分類によるアオギリ科（Ｓｔｅｒｃｕｌｉａｃｅａｅ  ｆａｍｉｌｙ）のカカオ属（ｇｅｎｕｓ  Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）、または系統発生的分類によるアオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ  ｆａｍｉｌｙ）の小さい常緑樹である。ココアの木は、約３０００年前に栽培植物化された、メキシコ原産の熱帯性の種である。それは、１０から１５メートルの高さを有し、一般的に６または８メートルに刈り込まれる幹に花をつける常緑樹である。それは、３年で花をつけ始めて、一年中、花、果実および葉をつける。毎年、木は白色または僅かにピンク色の１００，０００個に及ぶ花を咲かせることができる。花は、一年中木の木質が膨潤しているように見えて、花のようなクッションと言われる。その結果として、花および果実が同時に木にあることが見出される。「豆果」と言われる木の果実は、大きい細長い漿果である。各豆果は、１５から２０ｃｍの長さで重量は４００ｇに及ぶことがある。それらは、主な枝だけでなく、直接木の幹にでも両方で育つという特別な特徴を有する。それらの特徴は、ある集団から別の集団によって大きく変わり得るだけでなく、同じ集団内でも変わり得る。果実の成熟は、遺伝子型に依存して５から７ヵ月を要する。平均で、１本の木は、１年当たり約１５０個の豆果を生ずる。豆果は多数の種子（２５と７５個の間）を含有し、それらは穂で一団になり、ココア豆と呼ばれて、それらは、デンプン、脂肪およびアルカロイドに富む。
【００１５】
ココア豆は、胚珠の５つの房室に対応する５列を含む集まりを形成する豆果の中心で群れになる。それらは、可変の卵形の平板化された形状および約２５ｍｍの長さ、約１５ｍｍの幅および約８ｍｍの厚さを有する。新鮮であるときには、それらは、糊と言われる白色パルプにより取り囲まれているので、それらは粘着性である。ココア豆の仁は、自身の上に折りたたまれた２枚の子葉を含む大きい胚により形成される。それは、品種に応じて白色から暗紫色の範囲の様々な色を有する。それは、ピンクまたは淡赤色の種皮により包まれている。ココア豆は、約５０％のココアバターと称される脂肪、５％の水、７％のデンプン、４％のセルロース、２％のテオブロミン、２０％のタンパク質、および６％のミネラル物質を含有することが知られている。
【００１６】
ココアは、興奮させる、強壮にする、栄養学的および抗ストレス効果を有することが知られており、そのような性質のために、種々の物質がココアから抽出されてきた。特に化粧品において、カカオからのココアバターが、皮膚に対するその滋養になる効果のために使用される。このバターは、特上の栄養分のある品質を有する５３％の脂肪（オレイン酸、ステアリン酸およびパルミチン酸を主として含むトリグリセリド）を含有し、その特異的特徴は、それが、植物ステロールおよびスクワレンからなる不鹸化物に富むことである。第１の物質は、抗酸化、瘢痕形成によって癒やす、および和らげる作用（熱傷およびあかぎれに対して）を有する。生まれつき皮膚および皮脂に存在する第２の物質は、角質層の脂質セメントの再生を助長する。このことが、ココアバターが、皮膚のためのマッサージバター中に、ならびに水和させる、和らげるおよび保護する香油中に成分として見出される理由である。それは、非常に乾性のおよびくせのある毛髪のケアで、ならびに枝毛の割れ始めの部分のケアにおいても価値がある。
【００１７】
その上、特許文献ＦＲ２８１０２４２から、少なくともポリフェノール、アミノ酸および不鹸化性分画を含むココアタンパク質抽出物に基づく化粧品および／または皮膚科用組成物が知られている。前記組成物は、皮膚老化の徴候の処置および予防のために有用である。この文献では、タンパク質の全酵素的加水分解の後、０．５から３％または０．５から５％の不鹸化物、アミノ酸およびポリフェノールを含む混合物を得るために、ココア豆全体、特にココアバターが使用される。
【００１８】
その上、特許文献ＷＯ２００８０１５３３４１から、体毛および／または頭髪の着色を促進するためのココア豆抽出物を含む化粧品組成物が知られている。ココア豆抽出物を調製する方法は、豆の脂質、核酸および糖類の除去を含む。ココア豆抽出物を得る方法は、ポリペプチド、ペプチドおよび遊離アミノ酸を生成させるために、タンパク質の酵素的加水分解が中心となる。
【００１９】
それに加えて、特許文献ＵＳ２０１３／００３５２９１から、ココア加水分解物から生ずる５から２０種のアミノ酸と共にペプチドを含む生物活性生成物が知られており、前記生成物は、消費および神経変性疾患の治療を意図される。この文献で使用された方法は、特に精製された、糖を含まないペプチド分画を得ることを可能にする。
【発明の概要】
【００２０】
本出願人らにより開発された本発明によるココア豆を使用する抽出方法は、上に挙げた文献と比較して新規である。この方法は、ココア豆から得られた加水分解物中の特定のペプチドおよび糖類を含む対象の標的分子を選択し且つその高含有率を保証するために最適化されている。本発明によるペプチドおよび糖の加水分解物は、不鹸化性分子または遊離アミノ酸を含まず、加水分解物中に存在するポリフェノールが痕跡量であることが、特許ＷＯ２００１９５８７２と異なるプロファイルを立証する。
【００２１】
したがって、本発明の第１の主題は、主としてペプチドおよび糖類を含むＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆のペプチドおよび糖の加水分解物である。
【００２２】
それに加えて、本発明の第２の主題は、本発明によるＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆のペプチドおよび糖の加水分解物を調製する方法であって、
ａ）粉砕されたＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆を水性相に分散させる工程；
ｂ）工程ａ）で得られた水性分散物の酵素処理を実施する工程；
ｃ）酵素による加水分解物の回収を固／液分離により実施する工程；
ｄ）加水分解物を限外濾過およびナノ濾過により精製される工程、次に任意選択で；
ｅ）工程ｄ）で得られた加水分解物の凍結乾燥を実施する工程
を含む、方法である。
【００２３】
本発明の第３の主題は、効果的な量の本発明によるＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆の加水分解物を活性な保護剤として、および生理学的に許容される媒体を含むことを特徴とする化粧品組成物である。
【００２４】
最後に、本発明の第４の主題は、皮膚のバリア機能を改善するため、ならびに皮膚の老化および皮膚の光老化の徴候の出現に対抗するために、青色光の悪影響から、特に青色光により生じる酸化ストレスから、皮膚を保護するための、本発明による組成物の美容的使用である。
【００２５】
本発明およびそれから生ずる利点は、以下の記載および添付図に画かれた非限定的な実施形態に目を通せば、より良く理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】本発明による加水分解物およびＦＲ２８１０２４２によるポリフェノールに富む水−アルコール抽出物のポリフェノール性プロファイルの比較、ならびに６Ｎ塩酸などの強酸を用いる２４から４８時間の全ペプチドの加水分解により実施された、本発明による加水分解物のアミノグラム（ａｍｉｎｏｇｒａｍ）と文献ＦＲ２８１０２４２で与えられたアミノグラムとの比較を示すグラフである。
【図２】青色光（４２５ｎｍおよび４７０ｎｍ）に曝露された後のオプシン−１、オプシン−２およびオプシン−３のレベルを示すグラフである。
【図３Ａ】本発明によるココア加水分解物による、コラーゲン１の発現の定量化を示すグラフである。
【図３Ｂ】本発明によるココア加水分解物による、エラスチンの発現の定量化を示すグラフである。
【図３Ｃ】本発明によるココア加水分解物による、フィブリリン−１の発現の定量化を示すグラフである。
【図３Ｄ】ＤＮＡのメチル化における本発明による、ココア加水分解物の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
この記載においては、本文で特に断りのない限り、
間隔が示される場合に、それは、前記間隔の上限および下限を含む、
％は、特に断りのない限り、本文において重量／重量で表現される
と理解される。
【００２８】
その上、該記載において、「Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆のペプチドおよび糖の加水分解物」または「ペプチドおよび糖の加水分解物」または「本発明によるココア加水分解物」または「加水分解物」という表現は、互換的に使用される。
【００２９】
本発明において、
「効果的な量」は、所望の結果を得るために、すなわち、特に青色光からの皮膚の保護を得ることを可能にするために必要な、毒性でない活性分子の量を意味すると理解される。
【００３０】
「主としてペプチドおよび糖類の」は、乾燥物質の重量の５０％を超える、好ましくは６０％を超える、さらにより好ましくは７０％を超える、および多分約９０％（重量／重量）に達する、好ましくは９０％のペプチドおよび糖類の量を意味すると理解される。
【００３１】
「ペプチドおよび糖の加水分解物」は、ペプチドおよび糖類（単糖およびオリゴ糖）を主としてまたは本質的に含む加水分解物を意味すると理解される。天然に豆の中に存在するタンパク質および多糖類は、加水分解されてペプチド、オリゴ糖および単糖類になり、該加水分解は、酵素的加水分解であることが有利である。
【００３２】
「局所適用」は、本発明による作用剤またはそれを含有する組成物が、皮膚、粘膜またはケラチン化された皮膚付属体の表面上に適用されまたは広げられる事実を表す。
【００３３】
「化粧用に許容される」は、本発明による作用剤またはそれを含有する組成物が、毒性または不耐性反応を惹起することなく、皮膚または粘膜と接触するために適していることを意味すると理解される。
【００３４】
「生理学的に許容される」は、毒性、不適合性、不安定性、アレルギー応答のいかなるリスクもなく、ヒト皮膚と接触する局所使用のために、または他の投与経路、例えば、経口経路もしくは皮膚中への注射による使用のために適していることを意味すると理解される。
【００３５】
したがって、本発明の第１の主題は、主としてペプチドおよび糖類を含む、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆のペプチドおよび糖の加水分解物である。
【００３６】
本発明による加水分解物は、豆単独または豆およびその殻のいずれかを含むことができる出発原料としてのＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆から得られ、豆およびその殻を含む豆を使用することが好ましい。
【００３７】
使用される豆は前以て乾燥されるが、発酵されてもまたは発酵されなくてもよい。本発明の好ましい実施形態では、使用される豆は、発酵されずに乾燥されたＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆である。
【００３８】
収穫され、洗浄されて乾燥されたＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆は、好ましくはペルー原産である。それらは、種々の品種の混合またはＣｒｉｏｌｌｏ、ＦｏｒａｓｔｅｒｏおよびＴｒｉｎｉｔａｒｉｏの３品種の少なくとも１品種に由来することができる。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態では、豆は、クリオロ（Ｃｒｉｏｌｌｏ）品種およびさらに特にポルセラナ（Ｐｏｒｃｅｌａｎａ）亜品種に由来する。その上、該ココア豆は、チョコレート生産プロセスの必須ステップ、すなわち発酵およびローストにかけられず、その理由は、これらのステップは、本用途のためのタンパク質および糖類に悪影響を有するからである。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態では、本発明によるペプチドおよび糖の加水分解物は、少なくとも１種のカルボヒドラーゼおよび少なくとも１種のプロテアーゼを用いて実施される酵素処理により得られる。酵素処理は、２ステップで実施され、第１の処理は、カルボヒドラーゼを使用して、主として二糖類および単糖類を導き、次に第２の処理は、プロテイナーゼを使用してペプチドを得る。
【００４１】
本発明のさらにより好ましい実施形態では、カルボヒドラーゼは、ペクチナーゼ、セルラーゼ、アラバナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼおよびβ−グルカナーゼから選択され、プロテアーゼは、アルカリ性、中性または酸性タイプ、好ましくはエンドペプチダーゼ活性を有するアルカリ性タイプのものである。
【００４２】
カルボヒドラーゼは、少なくともポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ベータグルカナーゼ、ベータマンナナーゼ、ベータグルコシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、アラバナーゼおよびキシラナーゼを含むカルボヒドラーゼの混合物であることが有利であろう。
【００４３】
凍結乾燥されていない本発明によるココア加水分解物は、２０から７０％のペプチドおよび５から４０％の糖類を含む。本発明により乾燥支持体なしで凍結乾燥されたココア加水分解物は、２０から７０％のペプチドおよび５から４０％の糖類を含む乾燥物質を９０パーセントを超えて含む。
【００４４】
本発明の別の非常に好ましい実施形態により、本発明による加水分解物中に存在するペプチドおよび糖類は、２００Ｄａから１０ｋＤａの分子量を有する。
【００４５】
本発明による加水分解物は不鹸化物を含有しないことが有利である。
【００４６】
本発明による加水分解物が、遊離アミノ酸を含まないことも有利である。
【００４７】
最後に、本発明による加水分解物は、最大で０．０５％のポリフェノールを含み、それは図１に示す主としてメチルキサンチンタイプの分子である。
【００４８】
本発明の第２の主題は、本発明によるＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆のペプチドおよび糖の加水分解物を調製する方法であって、
ａ）粉砕されたＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆を水性相に分散させる工程；
ｂ）工程ａ）で得られた水性分散物の酵素処理を実施する工程；
ｃ）該酵素を熱処理により変性させる工程；
ｄ）酵素による加水分解物の回収を固／液分離により実施する工程；
ｅ）該加水分解物を限外濾過およびナノ濾過により精製する工程、次に任意選択で；
ｆ）工程ｅ）で得られた加水分解物の凍結乾燥を実施する工程
を含む、方法である。
【００４９】
本発明による方法のステップａ）で使用される粉砕されたＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆は、最初に収穫され、洗浄され、乾燥されて、次に圧縮により脱脂されて、ココア豆ケークを生ずる。このケークは、本発明による方法の工程ａ）を実施するために使用される。
【００５０】
乾燥は、豆の含水率を十分に低下させて貯蔵またはその後の豆の変換のために好ましい条件を保証するために、収穫後に豆が脱水される段階を意味すると理解される。
【００５１】
例えば、豆は、戸外の空気に（日向または日陰で）最大１０から２０日の持続時間の間曝露することにより、天然で乾燥することができるが、または有利には、それらは、ドライヤーで熱風を用いて、相対湿度を調節して、４０℃と６０℃の間の温度で人工的に穏やかに乾燥することもできる。
【００５２】
好ましくは、有利に、豆は洗浄された後、乾燥されて、次に粉砕されるかまたは冷凍粉砕されて脱脂される。
【００５３】
豆の脱脂は、ココア豆の脂質の全部または一部を除去する全ての方法、例えば揮発性溶媒を用いる固／液抽出、超臨界流体を用いる抽出、または圧縮などを指す。
【００５４】
本発明による方法の工程ａ）で、豆および特に圧縮ケークは、好ましくは、１０％の乾燥物質で水に溶解される。
【００５５】
本発明による方法の工程ｂ）による酵素処理は、２ステップで有利に実施されて、第１の処理は、植物細胞の壁を加水分解するためにカルボヒドラーゼを使用して、次に第２の処理は、タンパク質を加水分解するためにプロテイナーゼを使用する。
【００５６】
本発明による方法の好ましい実施形態において、カルボヒドラーゼは、ペクチナーゼ、セルラーゼ、アラバナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼおよびβ−グルカナーゼから選択され、アルカリ性、中性または酸性タイプのプロテアーゼは、好ましくは、エンドペプチダーゼ活性を有するアルカリ性タイプのものである。
【００５７】
有利には、カルボヒドラーゼは、少なくともポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ベータグルカナーゼ、ベータマンナナーゼ、ベータグルコシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、アラバナーゼおよびキシラナーゼを含むカルボヒドラーゼの混合物であろう。
【００５８】
本発明による方法の工程ｂ）で使用される酵素は、有利には、処理されるべき豆の重量に関して０．１重量％から３．０重量％から構成される。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態では、セルラーゼより多くのペクチナーゼが使用されるであろう。したがって、セルラーゼに対して２：１比のペクチナーゼを使用することが好ましい。
【００６０】
酵素の変性の工程ｃ）は、８０と９０℃の間の温度で１５分から２時間の持続時間の間実施されて、熱処理条件は、好ましくは、８５℃で４５分間である。
【００６１】
好ましくは、本発明による方法の異なる工程ａ）からｄ）の間で、温度は、２０から９０℃の間であり、ｐＨは３．０と１１．０の間である。
【００６２】
本発明による方法の工程ｃ）により実施される酵素による加水分解物の回収は、当業者に知られた種々の方法、例えば、遠心分離、スピニング、濾過などにより、固体粒子を含まない抽出物を得る様式で、固／液分離を実行することにより実施される。有利には、該液体相は遠心分離により回収される。
【００６３】
この固液分離工程に、残存タンパク質および変性した酵素の除去および透過物の回収の目的で、膜を使用して、１０から１５ｋＤａの間、好ましくは１０ｋＤａのカットオフ閾値で、限外濾過により精製するステップｄ）が続く。透析濾過は、分離性能を改善し、したがって、対象の化合物の最大量を回収するために、濃縮水を希釈することにより有利に実施される。
【００６４】
「透析濾過」は、通過を容易にして、したがって、濾過の閾値未満の分子量を有する分子の最大量を回収するために、この濃縮水の体積と等しい体積の水を用いる濃縮水の濯ぎをすることを意味すると理解される。
【００６５】
この工程ｄ）は、任意選択で遊離アミノ酸およびミネラル塩を除去するためのナノ濾過も、含むことができる。例えば、カットオフ閾値は、１００Ｄａ（ダルトン）と３００Ｄａとの間、有利には１３０と３００Ｄａとの間、および典型的には２００Ｄａであろう。
【００６６】
別の実施形態では、１０ｋＤａで限外濾過する第１の工程の後、５ｋＤａの膜を通す限外濾過の第２の工程が実施される。この工程は、分子量が５ｋＤａと１０ｋＤａの間であるペプチドおよび糖類を含有する濃縮水の分画を回収することを可能にする。
【００６７】
最後に、５ｋＤａにおけるこの限外濾過の透過物は、次に、遊離アミノ酸およびミネラルを除去して、２００Ｄａと５ｋＤａとの間のペプチドおよび糖類を含む加水分解物を得るために、ナノ濾過により精製される。
【００６８】
したがって、得られた加水分解物は、水または水を含有する溶媒の任意の混合物中にさらに希釈することができる。したがって、本発明によるココア加水分解物は、１種または複数の生理学的に許容される溶媒、例えば、水、グリセリン、エタノール、プロパンジオール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化またはプロポキシル化されたジグリコール、環状ポリオールまたはこれらの溶媒の任意の混合物などの中に、有利に希釈することができる。
【００６９】
本発明による第３の主題は、それが、活性な保護剤として、効果的な量の本発明によるＴｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ  Ｌ．豆の加水分解物、および生理学的に許容される媒体を含むことを特徴とする化粧品組成物に関する。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態では、ココア加水分解物は、組成物の全重量に対して、０．００１％から２０％、好ましくは０．１から１０％、より好ましくは０．２から５％、さらにより好ましくは０．５から１．５％の濃度で、組成物中に存在する。組成物を調製するために、本発明によるココア加水分解物は、液体または凍結乾燥された形態にできる。
【００７１】
本発明による組成物は、局所経路による投与をさらに特に意図される。したがって、これらの組成物は、化粧用に許容される媒体、すなわち、皮膚およびケラチン化された皮膚付属体と適合性の媒体を含有しなければならず、それらは、全ての化粧形態を包含する。これらの組成物は、特に、クリーム、水中油型エマルション、または油中水型もしくは多重エマルション、溶液、懸濁液、ゲル、乳剤、ローション、スティックまたはさらに粉末の形態にもできて、皮膚、口唇および／またはケラチン化された皮膚付属体に適用するために適する。これらの組成物は、溶媒、増粘剤、希釈剤、界面活性剤、抗酸化剤、染料、防腐剤、香料などの製剤化のために必要な賦形剤を含む。それらは、スキンケアまたは皮膚メイクアップ用製品として使用することができる。
【００７２】
その上、本発明による組成物は、考えられる適用分野で一般的に使用される任意の添加物ならびにそれらの製剤化のために必要な添加剤、例えば、溶媒、増粘剤、希釈剤、抗酸化剤、染料、日焼け止め、自己なめし剤、顔料、充填剤、防腐剤、香料、臭気吸収剤、化粧または薬学的活性成分、必須油、ビタミン、必須脂肪酸、界面活性剤、フィルム製造ポリマー、その他を含む。
【００７３】
ＩＮＣＩ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ＆  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ｔｈｅ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃａｒｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｉｎｃ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．により発行された「Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ、１３ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２０１０））が、広い多様な、限定されない、本発明による組成物中の追加の成分としての使用のために適当な、スキンケア産業で従来使用される化粧および薬学的成分を記載している。
【００７４】
これらのクラスの追加成分の非限定的な例として、瘢痕形成剤、抗老化剤、抗皺剤、抗萎縮剤、水和剤、軟化剤、抗細菌剤、抗寄生虫剤、抗真菌剤、殺真菌剤、静真菌剤、殺細菌剤、静細菌剤、抗菌剤、抗炎症剤、抗掻痒剤、麻酔剤、抗ウイルス剤、角質溶解剤、抗フリーラジカル剤、抗脂漏性剤、抗頭垢剤、皮膚の分化、増殖または着色を調整する作用剤、浸透促進剤、落屑剤、メラニン合成を刺激または阻害する作用剤、漂白剤、脱色剤または美白剤、着色促進剤（pro-pigmentation agent）、自己なめし剤、ＮＯシンターゼ阻害剤、抗酸化剤、フリーラジカル捕捉剤および／または抗大気汚染剤、抗グリケーション剤、引締め剤（firming agent）、真皮もしくは表皮性高分子の合成を刺激するおよび／またはそれらの分解を予防もしくは阻害できる作用剤、コラーゲン合成刺激剤、エラスチン合成刺激剤、デコリン合成刺激剤、ラミニン合成刺激剤、デフェンシン合成刺激剤、シャペロン合成刺激剤、アクアポリン合成刺激剤、ヒアルロン酸合成刺激剤、角質層の脂質および構成要素（セラミド、脂肪酸、…）合成刺激剤、コラーゲン分解阻害剤、エラスチン分解阻害剤、線維芽細胞増殖刺激剤、ケラチノサイト増殖刺激剤、脂肪細胞増殖刺激剤、メラニン形成細胞増殖刺激剤、ケラチノサイト分化刺激剤、脂肪細胞分化刺激剤、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、グルコサミノグリカン合成刺激剤、ＤＮＡ修復剤、ＤＮＡ保護剤、抗掻痒剤、過敏皮膚の治療および／またはケアのための作用剤、引締め剤、抗皮膚線条剤、収斂剤、皮脂産生調整剤、皮膚弛緩剤、治癒補助剤、上皮再形成刺激剤、上皮再形成補助剤、サイトカイン成長因子、鎮静剤、抗炎症剤、毛細管循環および／または微小循環作用剤、血管新生刺激剤、血管透過性阻害剤、細胞代謝作用剤、真皮表皮接合改善を意図される作用剤、頭髪および／または体毛成長誘発剤、頭髪および／または体毛成長阻害または遅延剤、骨格筋弛緩薬、抗汚染および／または抗ラジカル剤、脂肪分解刺激剤、スリミング剤、抗セルライト剤、微小循環作用剤、細胞代謝作用剤、清浄剤、整髪剤、毛髪成長刺激剤、日焼け止め、日光遮断剤、メイキャップ剤、洗剤、薬学的製品、乳化剤、皮膚軟化剤、有機溶媒、防腐剤、脱臭活性剤、生理学的に許容される媒体、界面活性剤、研磨剤、吸収剤、審美的な構成要素、例えば、香料、顔料、着色剤、染料および天然染料など、必須油、テクスチャリング剤（texture agent）、化粧品収斂剤（cosmetic astringent）、抗アクネ剤、抗凝固剤、消泡剤、抗酸化剤、リガンド、生物学的添加剤、酵素、酵素阻害剤、酵素誘発剤、補酵素、キレート剤、植物抽出物および植物誘導体、必須油、海産物抽出物、バイオ発酵および／またはバイオテクノロジープロセス由来の作用剤、ミネラル塩、細胞抽出物、日焼け止め（紫外線Ａおよび／またはＢ照射に対して活性な有機または無機光保護剤）、セラミド、ペプチド、緩衝剤、体積剤（volume agent）、キレート剤、化学的添加剤、染料、化粧殺生物剤、変性剤、医薬収斂剤、外用鎮痛剤、成膜剤、例えば、成膜性および組成物永続性を強化するポリマー、第四級誘導体、永続性増強剤、乳白剤、ｐＨ調整および調節剤（例、トリエタノールアミン）、噴射剤、還元剤、金属イオン遮閉剤、皮膚漂白および／または��白剤、皮膚調湿剤（すなわち、湿潤剤、種々雑多および閉鎖性を含む）、保湿物質、アルファ−ヒドロキシル酸、ベータ−ヒドロキシル酸、水和剤、表皮水解剤、鎮静剤／または瘢痕形成剤、皮膚治療剤、抗皺剤、眼の下のタルミを低下または治療することができる作用剤、落屑剤、増粘剤、軟化剤、ゲル化ポリマー、ビタミンおよびそれらの誘導体、加湿剤、剥離剤、鎮静剤、皮膚硬化剤、リグナン、防腐剤（例えば、フェノキシエタノールおよびパラベン）、抗ＵＶ剤、細胞障害性、抗新生物剤、粘度改良剤、不揮発性溶媒、ビーディング剤（beading agent）、抗汗剤、脱毛剤、ワクチン、香水、皮膚再建剤、賦形剤、充填剤、ミネラル、抗マイコバクテリア剤、抗アレルギー剤、Ｈ１またはＨ２抗ヒスタミン剤、抗刺激剤、免疫システム刺激剤、免疫システム阻害剤、防虫剤、潤滑剤、顔料または染料、脱色素剤、光安定剤、およびそれらの混合物が含まれるが、ただし、それらは、組成物の他の成分、特に本発明の作用剤と物理的におよび化学的に適合性であることが条件である。
【００７５】
その上、これらの追加成分の性質は、本発明の作用剤の利点を許容し難く変化させてはならない。これらの追加の成分は、合成または天然の、例えば、植物抽出物であることができ、またはそれらはバイオ発酵プロセス由来であってもよい。追加の例は、ＩＮＣＩ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ＆  Ｈａｎｄｂｏｏｋに見出すことができる。
【００７６】
そのような追加の成分は、アミノ糖類、グルコサミン、Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、マンノサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ビタミンＢ３およびそれらの誘導体、ナイアシンアミド、デヒドロ酢酸ナトリウム、デヒドロ酢酸およびそれらの塩、植物ステロール、サリチル酸化合物、ヘキサミジン、ジアルカノイル化合物のジヒドロキシプロリン、ダイズ抽出物および誘導体、エクオール、イソフラボン、フラボノイド、フィタントリオール、ファルネゾール、ゲラニオール、ビスアボロール、ペプチドおよびそれらの誘導体、ジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−およびヘキサペプチドおよびそれらの誘導体、ｌｙｓ−ｔｈｒ−ｔｈｒ−ｌｙｓ−ｓｅｒ、パルミトイル−ｌｙｓ−ｔｈｒ−ｔｈｒ−ｌｙｓ−ｓｅｒ、カルノシン、Ｎ−アシルアミノ酸化合物、レチノイド、レチニルプロピオネート、レチノール、レチニルパルミテート、レチニル酢酸塩、レチナール、レチノイン酸、水溶性ビタミン、アスコルベート、ビタミンＣ、アスコルビルグルコシド、アスコルビルパルミテート、アスコルビルリン酸マグネシウム、アスコルビルリン酸ナトリウム、ビタミンおよびそれらの塩および誘導体、プロビタミンおよびそれらの塩および誘導体、エチルパンテノール、ビタミンＢおよびそれらの誘導体、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、ビタミンＫおよびそれらの誘導体、パントテン酸およびそれらの誘導体、パントテニルエチルエーテル、パンテノールおよびそれらの誘導体、エチルパンテノール、デクスパンテノール、ビオチン、アミノ酸およびそれらの塩および誘導体、水溶性アミノ酸、アスパラギン、アラニン、インドール、グルタミン酸、水不溶性ビタミン、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＦ、ビタミンＤおよびそれらの化合物、モノ−、ジ−およびトリテルペノイド、ベータ−イオノール、セドロールおよびそれらの誘導体、水不溶性アミノ酸、チロシン、トリプタミン、粒子状材料、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール、アラントイン、トコフェロールニコチネート、トコフェロール、トコフェロールエステル、パルミトイル−ｇｌｙ−ｈｉｓ−ｌｙｓ、植物ステロール、ヒドロキシル酸、グリコール酸、乳酸、ラクトビオン酸、ケト酸、ピルビン酸、フィチン酸、リゾホスファチジン酸、スチルベン、シンナメート、レスベラトロール、キネチン、ゼアチン、ジメチルアミノエタノール、天然ペプチド、ダイズペプチド、酸糖類の塩、グルコン酸マンガン、グルコン酸亜鉛、ピロクトンオラミン、３，４，４’−トリクロロカルバニリド、トリクロカルバン、亜鉛ピリチオン、ヒドロキノン、コージ酸、アスコルビン酸、アスコルビルリン酸マグネシウム、アスコルビルグルコシド、ピリドキシン、アロエベラ、テルペンのアルコール、アラントイン、ビスアボロール、グリチルリチン酸二カリウム、グリセリンの酸、ソルビトール、ペンタエリトリトール、ピロリドンおよびそれらの塩、ジヒドロキシアセトン、エリトルロース、グリセルアルデヒド、タルタルアルデヒド、クローブエッセンス、メントール、カンファー、ユーカリエッセンス、オイゲノール、メンチル乳酸塩、ハマメリス留出物、エイコセンおよびビニルピロリドンコポリマー、ヨードプロピルブチルカルバメート、多糖、必須脂肪酸、サリチレート、グリチルレチン酸、カロテノイド、セラミドおよび擬似セラミド、脂質複合体、一般的例として、シアバター、アンズ油、オナガー油、プルーン油、パーム油、モノイ油、カハイ油などの天然由来の油、ヒドロキノン、ＨＥＰＥＳ、プロシステイン、Ｏ−オクタノイル−６−Ｄ−マルトース、メチルグリシン二酢酸二ナトリウム塩、例えば、ジオスゲニンおよびＤＨＥＡの誘導体、ＤＨＥＡデヒドロエピアンドロステロンおよび／または化学もしくは生物学的前駆体または誘導体などのステロイド、Ｎ−エチルカルボニル−４−パラ−アミノフェノール、ブルーベリー抽出物、植物ホルモン、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）抽出物、藻の抽出物、ダイズ、ルピナス、トウモロコシおよび／またはエンドウ豆、アルベリンおよびそれらの塩、特にアルベリンクエン酸塩、ナギイカダ（ｒｕｓｃｕｓ）およびウマ栗抽出物およびそれらの組合せ、メタロプロテイナーゼ阻害剤、コショウボク（Ｓｃｈｉｎｕｓ  ｍｏｌｌｅ）抽出物を含む群から選択することができる。
【００７７】
全ての場合において、当業者は、これらの補助剤ならびにそれらの比率が、本発明による組成物の所望の有利な性質を害しないように選択されることを確実にしなければならない。
【００７８】
本発明による第４の主題は、皮膚を青色光の悪影響から保護するため、および皮膚のバリア機能を改善するため、および皮膚の老化および光老化の徴候の出現に対抗するための、本発明による組成物の美容的使用に関する。
【００７９】
「皮膚の老化の徴候」は、年代による老化に基づく皮膚の外観の任意の改変、例えば、しわおよび小さいしわ、亀裂、眼の下のタルミ、眼の周りの環、皮膚の萎縮、皮膚の弾性および／または張りの消失、光沢の鈍りまたは欠如、色素性の疵だけでなく改変された外観に全身的に反映されない皮膚の任意の内部改変、例えば、真皮の薄化および密度の減少、角質層の厚みの増大などを意味すると理解される。
【００８０】
「皮膚の光老化の徴候」は、ＵＶ放射線への曝露に続く皮膚の任意の分解、例えば、眼および口の周りの細かいしわおよび額のしわの早期出現など；鼻、頬および首の上の毛細血管拡張症（小さい膨張した血管）、種々の色素斑、例えば、赤い斑点および日光黒子、肌色のむら、皮膚の張りの一般的な消失、増大した絞扼感、口唇の皮膚の色の消失または薄化を意味すると理解され、皮膚は、厚く粗くなり得る。改変された外観に全身的に反映されない皮膚の任意の内部改変、例えば、血管壁の肥厚、線維芽細胞の形状の改変、コラーゲン合成の遅延およびコラーゲンフィブリルの分裂、異常なおよび非晶質のエラスチンを含有する材料の蓄積（日光弾性線維症）なども包含される。例示のために、本発明の実施形態を下に記載する。
【実施例】
【００８１】
［実施例１］
ココア豆からのココア加水分解物の調製
使用される豆は、それらの殻を含み、ペルー原産の、クリオロ（Ｃｒｉｏｌｌｏ）品種およびさらに特にポルセラナ（Ｐｏｒｃｅｌａｎａ）亜品種のものである。
【００８２】
手順は下記の通りである。
ａ）圧縮により、水中１０％の乾燥物質（ＤＭ）に脱脂されたココア豆のケークを溶解させる工程；
ｂ）ポリガラクツロナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ベータグルカナーゼ、ベータマンナナーゼ、ベータグルコシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、アラバナーゼおよびキシラナーゼを含む、セルラーゼ（０．５％／ＤＭ）およびペクチナーゼ（１．０％／ＤＭ）の混合物の４．５のｐＨおよび５５℃の温度における２時間の作用により、炭水化物を酵素的に加水分解する工程；
ｃ）続いて、エンドペプチダーゼタイプのアルカリ性プロテアーゼ（０．５％ＤＭ）により、９．０のｐＨおよび５５℃の温度で４時間、酵素的に加水分解する工程；
ｄ）酵素を変性させるために８５℃で４５分間熱処理する工程；
ｅ）液体相を遠心分離して回収する工程；
ｆ）液体相を１０ｋＤａの膜に通して、限外濾過および透析濾過して透過物を回収する工程；
ｇ）限外濾過液から透過物を２００Ｄａの膜に通してナノ濾過して濃縮水を回収する工程。
【００８３】
工程ｇ）で濃縮水中に得られたココア加水分解物は、３．０から４．０％の間の乾燥物質を含有する。
【００８４】
この乾燥物質は、特に２０から７０重量％のペプチドおよび分子量が２００Ｄａから１０ｋＤａの５から４０％の糖類を含む。
【００８５】
次に、加水分解物を、任意の水を含有する混合溶媒中で水に希釈することができる。したがって、本発明によるココア加水分解物は、１種または複数の生理学的に許容される溶媒、例えば、水、グリセリン、エタノール、プロパンジオール、ブチレングリコール、ジプロピレングリコール、エトキシル化またはプロポキシル化されたジグリコール、環状ポリオールなどまたはこれらの溶媒の任意の混合物に有利に希釈することができる。
【００８６】
［実施例２］
ココア豆からのココア加水分解物の調製
工程ａ）からｇ）は、実施例１で実施された手順と同一である。次に、以下の手順を実施する。
ｈ）この濃縮水の乾燥抽出物に関して、５０重量％のマルトデキストリン（乾燥支持体）と共に、ナノ濾過濃縮水を凍結乾燥するステップ。
【００８７】
工程ｈ）の濃縮水で得られたココアペプチド加水分解物は、９４．０から９８．０％の乾燥物質を含有する。
【００８８】
この乾燥物質は、特に、５０％のマルトデキストリン、１０から３５重量％のペプチドおよび分子量が２００Ｄａと１０ｋＤａの間の２から２０％の糖類を含む。
【００８９】
［実施例３］
ココア豆からのココア加水分解物の調製
工程ａ）からｇ）は、実施例２で実施された手順と同一である。次に、以下の手順を実施する。
ｈ）ナノ濾過した濃縮水を乾燥支持体なしで凍結乾燥する工程。
【００９０】
工程ｈ）で得られたココアペプチド加水分解物は、９４．０から９８．０％の間の乾燥物質を含有する。
【００９１】
この乾燥物質は、特に２０から７０重量％のペプチドおよび分子量が２００Ｄａと１０ｋＤａの間の５から４０％の糖類を含む。
【００９２】
［実施例４］
ココア豆からのココア加水分解物の調製
工程ａ）からｆ）は、実施例１で、限外濾過物１の回収のために実施した手順と同一である。次に、以下の手順を実施する。
ｇ）限外濾過透過物１を５ｋＤａの膜を通して限外濾過し、濃縮水を回収するステップ。
【００９３】
ｈ）限外濾過した濃縮水２を乾燥支持体なしで凍結乾燥するステップ。
【００９４】
工程ｈ）で得られたココアのペプチド加水分解物は、分子量が５ｋＤａと１０ｋＤａの間の９４．０から９８．０％の乾燥物質を含有する。
【００９５】
この乾燥物質は、特に２０から７０重量％のペプチドおよび５から４０％の糖類を含む。
【００９６】
［実施例５］
ココア豆からのココア加水分解物の調製
工程ａ）からｆ）は、１０ｋＤａの限外濾過の透過物（限外濾過物１）の回収のために実施例１で実施した手順と同一である。次に以下の手順を実施する。
ｇ）限外濾過物１を５ｋＤａの膜に通して限外濾過２して、透過物（限外濾過物２）を回収する工程；
ｈ）限外濾過物２を２００Ｄａの膜に通してナノ濾過し、濃縮水を回収する工程。
【００９７】
工程ｈ）で得られたココアのペプチドおよび糖の加水分解物は、分子量が２００Ｄａと５ｋＤａの間の３．０から４．０％の乾燥物質を含有する。
【００９８】
この乾燥物質は、特に２０から７０重量％のペプチドおよび５から４０％の糖類を含む。
【００９９】
［実施例６］
本発明による加水分解物とＦＲ２８１０２４２により得られた抽出物との比較
先行技術として引用した特許ＦＲ２８１０２４２は、ココアから抽出された０．０５から５重量％のアミノ酸、ココアから抽出された０．０５から５重量％のポリフェノール、および０．０５から３重量％の不鹸化物の濃縮物の組合せを含有する化粧品組成物を提案している。
【０１００】
比較抽出物として、文献ＦＲ２８１０２４２によりポリフェノールに富む水−アルコール抽出物（以下の例ではポリフェノールに富む抽出物と称する）を、以下のように調製した。
１０％の乾燥抽出物で脱脂されたケークを液体に浸してほぐすことにより、ポリフェノールを、エタノール中７０％、５０℃で１時間抽出して、次にエタノールを真空下で蒸発させる。
【０１０１】
次に、抽出物を、全てのポリフェノールのアッセイを可能にする、Ｆｏｌｉｎ  Ｃｉｏｃａｌｔｅｕの方法によりアッセイする。該方法は、没食子酸を標準として使用して、結果を没食子酸当量の重量％で表現する。
【０１０２】
２つの抽出物の定量的比較は、以下の通りである。
【０１０３】
本発明によるペプチドおよび糖の加水分解物は、
０．５％没食子酸当量のポリフェノールの含有率［１０％の本発明による加水分解物を含有する組成物は、最大０．０５％のポリフェノールを含むであろう。これは、０．５と５％の間のＦＲ２８１０２４２の最小含有率、最も近い等量に対応する（没食子酸の分子量を加水分解物中に存在するポリフェノールの分子量と比較して）。］；
遊離アミノ酸をほとんどまたは全く含有しないこと（それらはペプチド（タンパク質の部分加水分解）の形態にある）；
非鹸化性化合物を含まないこと
を特徴とする。
【０１０４】
２つの抽出物の定性的比較
本発明によるペプチドおよび糖の加水分解物が遊離アミノ酸をほとんどまたは全く含有しないことに注目することは重要である。それらは、ペプチド（タンパク質の部分加水分解）の形態にある。したがって、比較に関して、アミノ酸含有率およびペプチド含有率を比較することは適当でない。しかしながら、相対アミノグラム（２つの抽出物で表されたアミノ酸の相対プロファイル）を比較することには興味がある。
【０１０５】
ポリフェノールのプロファイルおよび本発明による加水分解物のアミノ酸のプロファイルを、図１に示す。この図は、
本発明による加水分解物およびＦＲ２８１０２４２によるポリフェノールに富む水−アルコール抽出物のポリフェノールのプロファイル、および
完全に加水分解された本発明による加水分解物およびＦＲ２８１０２４２で与えられたアミノグラムの結果のアミノ酸プロファイル
を含む。
【０１０６】
ＦＲ２８１０２４２によるポリフェノールに富む抽出物は、３種のファミリーの分子、すなわち、フラボノイド（例えば、カテキンおよび誘導体）、フェニルプロパノイド（例えば、フェルラ酸および誘導体）、およびメチルキサンチン（例えば、カフェインおよびテオブロミン）の存在の可能性がある複合体ポリフェノールのプロファイルを有する。比較により、本発明による加水分解物のポリフェノールのプロファイルは、フラボノイドをもはや含まないが、メチルキサンチンおよびフェニルプロパノイドの可能性を依然として含む。
【０１０７】
結論：
本発明による加水分解物とＦＲ２８１０２４２によるポリフェノールに富む水−アルコール抽出物との定性的比較は、ポリフェノールおよびアミノ酸（遊離または非遊離）組成に関して有意の相違を示す。
【０１０８】
［実施例７］
培養中のケラチノサイトにおいて青色光により発生した細胞反応性酸素種のレベルに対する、実施例１によるココアのペプチドおよび糖の加水分解物の効果の評価
この研究の目的は、培養中の正常ヒトケラチノサイトにおいて、青色光への曝露により生じた酸化ストレスのレベルに対する、実施例１によるココア加水分解物による処理の効果を評価することである。並行して、処理を、実施例６によるポリフェノールに富むココア加水分解物を使用して実施する。
【０１０９】
ストレスを生じさせるために、ＬＥＤからなる青色光の光源を、４１５ｎｍおよび４７０ｎｍで使用する。この曝露から生じた反応性酸素種（ＲＯＳ）は、蛍光性プローブにより細胞レベルで決定される。
【０１１０】
プロトコール：
培養中の正常ヒトケラチノサイトを、特異的培地中で０．１％体積／体積に（または１／１０００に）希釈された実施例１による加水分解物により、１日に２回予備処理して、一方で、対照培養物を未処理の条件で維持する。２４時間後に、対照培養物および処理された培養物の一部を、青色光に曝露して（４１５および４７０ｎｍ、３ｍＷ／ｃｍ２、１８分間）、一方で、他の部分を光から保護して維持する。この曝露の後、加水分解物を再び１日に２回２４時間適用する。次に、青色光への曝露を、再び繰り返して、次にＲＯＳの検出を試験する。
【０１１１】
この目的のために、細胞を、蛍光性プローブ（ＣｅｌｌＲＯＸ（登録商標）グリーン試薬、Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の存在下で３０分間３７℃に置く。固定して濯いだ後、細胞を、落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡）下で観察する。存在するＲＯＳの量に比例する蛍光強度の定量化を、得られた写真に基づいて、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ（登録商標）画像解析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）を利用して実施する。
【０１１２】
実施例４および５により得られたココア加水分解物の存在下で処理を実施した。この目的のために、実施例１の加水分解物に匹敵する濃度を得るために、加水分解物を、あらかじめ希釈した。
【０１１３】
結果：
実施例１による加水分解物を０．１％でケラチノサイトを処理すると、青色光への曝露により発生したＲＯＳのレベルを有意に低下させることが可能になる（処理されない対照と比較して、青色光に曝露された細胞における強度の＋９０％に対して、処理されて曝露された細胞では＋３４％）。それに加えて、観察された効果は、これらの同じ細胞で実施例６によりポリフェノールに富む抽出物で得られた効果より大きい。
【０１１４】
実施例４および５により得られた加水分解物による処理でも、青色光への曝露により発生したＲＯＳのレベルの低下を観察することが可能になった。
【０１１５】
結論：
加水分解物で処理されたケラチノサイトにおける細胞内ＲＯＳのレベルの低下により示されるように、実施例１、４または５の１つにより得られたココア加水分解物の加水分解物の適用により、青色光への曝露により生じた酸化ストレスを限定することが可能になる。
【０１１６】
［実施例８］
培養中のケラチノサイトにおいて、青色光により発生したミトコンドリアの反応性酸素種のレベルに対する、実施例１によるココア加水分解物の効果の評価：
この研究の目的は、培養中の正常ヒトケラチノサイトにおけるミトコンドリアのレベルで、青色光への曝露により生じた酸化ストレスのレベルに対する、実施例１によるココア加水分解物による処理の効果を評価することである。実際、ミトコンドリアは、ＲＯＳの優先的標的であり、ミトコンドリアのＤＮＡに対する損傷が、網膜の上皮細胞の可視光への曝露後に観察されている１３。並行して、実施例６によるポリフェノールに富むココア加水分解物を用いる処理を、これらの同じ細胞で実施する。
【０１１７】
プロトコール：
細胞の処理および青色光への曝露のプロトコールは、実施例７に記載されたものと同一である。これらのステップの後、ミトコンドリアのＲＯＳは、１５分間３７℃で細胞と接触して置かれた蛍光性プローブ（ＭｉｔｏＳＯＸ（商標）レッド  ミトコンドリアのスーパーオキシドインジケーター、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により現れる。濯いで固定した後、細胞を、落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡）下で観察する。存在するＲＯＳの量に比例する蛍光の強度の定量化を、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ（登録商標）画像解析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）を利用して、得られた写真に基づいて実施する。
【０１１８】
実施例４および５により得られたココア加水分解物の存在下でも、処理を実施した。この目的のために、実施例１の加水分解物に匹敵する濃度を得るために、あらかじめ、加水分解物を希釈した。
【０１１９】
結果：
青色光への曝露は、ミトコンドリアのＲＯＳの増大を生じた（処理されない対照と比較して＋１５６％）。実施例１によるココア加水分解物０．１％の存在下で、ミトコンドリアのＲＯＳレベルの強い低下が観察される（処理されない対照と比較して＋８％）。観察される効果は、実施例６によるポリフェノールに富むココア加水分解物を用いてこれらの同じ細胞で得られる効果より大きい。
【０１２０】
実施例４および５により得られた加水分解物を用いる処理でも、青色光への曝露により発生したＲＯＳのレベルの低下を観察することが可能になった。
【０１２１】
結論：
実施例７で報告された結果に加えて、この試験により、ミトコンドリアのＲＯＳレベルの低下により示されるように、実施例１、４または５によるココア加水分解物の適用により、青色光への曝露により生じた酸化ストレスを限定することが可能になると結論することが可能になる。
【０１２２】
［実施例９］
青色光への曝露後のオプシン−１、−２および−３のレベルの維持に対する、実施例１によるココア加水分解物の効果。
この研究の目的は、実施例７および８で規定されたように、実施例１によるココア加水分解物により処理された正常ヒトケラチノサイトにおける光受容体オプシン−１、−２および−３のレベルに対する、青色光への曝露の効果を観察することである。これらの光受容体は、ケラチノサイトによるＯＰＮ１−ＳＷ、ＯＰＮ２およびＯＰＮ３遺伝子の発現から生じて、各オプシンに特異的な青色光波長の存在下で、シグナル伝達経路を誘発することができる１２。
【０１２３】
プロトコール：
培養中の正常ヒトケラチノサイトを、０．１％体積／体積に（または１／１０００に）希釈された実施例１による加水分解物により処理して、次に実施例１に記載されたプロトコールにより青色光に曝露する。第２の曝露後３時間に、オプシン−１、オプシン−２およびオプシン−３の検出を、間接免疫蛍光技法を使用して実施する。
【０１２４】
この目的のために、細胞を濯いで、パラホルムアルデヒド３．７％で固定してトリトンを用いて０．１％で、１０分間透過性にする。ウシ血清アルブミンを用いて１％で１０分間非特異的部位を飽和させた後、細胞を、オプシン−１（ＯＰＳＮ  Ｓｈｏｒｔ）、オプシン−２（ロドプシン）またはオプシン−３（ｐａｎｏｐｓｉｎ）に対して向けられた抗体の溶液と１時間インキュベートして、次に、フルオロクロム（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と結合した２次抗ウサギ抗体の溶液とインキュベートする。細胞を、次に落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡）下で検査する。Ｖｏｌｏｃｉｔｙ（登録商標）画像解析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）を利用して、蛍光の定量化を、得られた写真に基づいて実施する。
【０１２５】
実施例４および５により得られたココア加水分解物の存在下でも、処理を実施した。この目的のために、実施例１の加水分解物に匹敵する濃度を得るために、加水分解物を、あらかじめ希釈した。
【０１２６】
結果：
培養中のケラチノサイトの過曝露を模倣すると決定された条件下における青色光の存在下で、オプシン−１の標識強度は、このオプシンが高感度である波長に対応する４１５ｎｍにおける曝露で有意に減少する（対照と比較して−３３％）。細胞が、実施例１によるココア加水分解物を用いて０．１％で処理された条件下では、オプシン−１の標識は維持される（対照と比較して−１０％）。同じ条件下で、実施例６によるポリフェノールに富むココア加水分解物では、オプシン−１のレベルに対する保護効果を観察することが可能にならなかった（処理されない対照と比較して−３３％）。
【０１２７】
同一の処理条件下で、ケラチノサイトが青色光（４７０ｎｍ）に曝露されたとき、オプシン−２およびオプシン−３の標識の強度は、減少する（処理されない対照と比較して、それぞれ、−４３％および−２７％）。実施例１によるココア加水分解物の０．１％における存在下で、オプシンの標識は、維持されるように思われる（処理されない対照と比較して、それぞれ、−２８％および−１０％）。同じ条件下で、実施例６によるポリフェノールに富むココア加水分解物は、オプシン−２およびオプシン−３のレベルに対する保護効果を観察することが可能にならなかった（処理されない対照と比較して、それぞれ、−４２％および−３０％）。
【０１２８】
結果を図２に示す。
【０１２９】
実施例４および５により得られた加水分解物を用いる処理でも、青色光への曝露後に、オプシン−１、−２および−３のレベルの維持を観察することが可能になった。
【０１３０】
結論：
実施例１、４または５のうちの１つにより得られたココア加水分解物は、青色光への過曝露を模倣するストレスの存在下で、オプシン−１、−２および−３のレベルを維持することを可能にした。これらの結果は、本発明による加水分解物は、青色光に対して保護効果を有することを示す。
【０１３１】
［実施例１０］
青色光に曝露されたケラチノサイトにおける約２４時間周期のタンパク質ＣＲＹ−１およびＰＥＲ−１の発現のレベルに対する、実施例１によるココア加水分解物の効果：
本研究は、これらの細胞にストレスを生じさせるための、前に規定された条件下で、青色光への曝露にさらされたケラチノサイトを使用して、約２４時間周期のタンパク質ＣＲＹ−１およびＰＥＲ−１のレベルの維持に対する、実施例１によるココア加水分解物による処理の効果を評価することを含む。
【０１３２】
約２４時間周期の遺伝子の調整は、網膜細胞のレベルにおける光受容体活性化の結果の１つである。網膜細胞におけるオプシンの発現は、それ自体、光への曝露などの環境要因により調節されるＣｌｏｃｋ遺伝子の発現に依存する１３。
【０１３３】
プロトコール：
培養中の正常ヒトケラチノサイトを、０．１％体積／体積に（または１／１０００に）希釈された実施例１によるココア加水分解物を用いて処理して、次に実施例７に記載されたプロトコールにより青色光に曝露する。同じ条件下で処理された培養物を、暗所に保つ。第２の曝露後６時間に、約２４時間周期のタンパク質ＣＲＹ−１およびＰＥＲ−１の発現のレベルは、実施例９に記載された標準的プロトコールに従って、免疫細胞化学技法により明らかにされる。
【０１３４】
濯いで固定して、非特異的部位を飽和させた後、細胞を、タンパク質ＣＲＹ−１およびＰＥＲ−１に対して向けられた１次抗体とインキュベートして、次にフルオロクロム（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と結合した２次抗体とインキュベートする。細胞を、次に、落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡）下で検査する。蛍光の定量化を、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ（登録商標）画像解析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）を利用して、得られた写真に基づいて実施する。
【０１３５】
実施例４および５により得られたココア加水分解物の存在下でも、処理を実施した。この目的のために、実施例１の加水分解物に匹敵する濃度を得るために、あらかじめ、加水分解物を希釈した。
【０１３６】
結果：
細胞が暗所に保たれる条件下で、実施例１によるココア加水分解物は、０．１％で、タンパク質ＣＲＹ−１およびＰＥＲ−１の発現のレベルを、処理されない対照と比較して、それぞれ、＋１９％および＋１７％まで増大させることを可能にした。青色光への曝露（４１５ｎｍ）は、ＣＲＹ−１の有意の減少を生じて（曝露されない細胞と比較して−２５％）、それは実施例１によるココア加水分解物を用いる処理（曝露されず、および処理されない対照と比較して＋２０％）と逆になる。ＰＥＲ−１の発現のレベルに関して、それは、青色光（４１５ｎｍ）に曝露された細胞においても減少して（曝露されない細胞と比較して−１１％）、曝露および加水分解物を用いる処理を用いる条件下で、これらの同じ条件下で、対照より高く維持されるように思われる（曝露されず、および処理されない対照と比較して＋２７％）。
【０１３７】
実施例４および５により得られた加水分解物を用いる処理でも、同じ結果を観察することが可能になった。
【０１３８】
結論：
実施例１、４または５の１つにより得られたココア加水分解物を用いる処理は、青色光に曝露されたケラチノサイト中における約２４時間周期のタンパク質ＣＲＹ−１およびＰＥＲ−１のレベルを維持することを可能にした。これらの結果は、本発明による加水分解物が、青色光に対する保護効果を有することを示す。
【０１３９】
［実施例１１］
ＵＶＢストレスまたは青色光に曝露されたエクスビボの皮膚の生検試料における、フィブリリン−１ネットワークの維持に対する、実施例１によるココア加水分解物の効果：
この研究の目的は、ＵＶＢまたは青色光への曝露により生じたストレスの存在下における、フィブリリン−１ネットワークに対する実施例１によるココア加水分解物の潜在的保護効果を評価することである。
【０１４０】
弾性線維ネットワークは、特に、フィブリリン−１に富むミクロフィブリルの構造における変化に関して、光老化の特定の標的であるように思われる。このタンパク質は、表皮中に存在するオキシタラン線維の構成成分である。光老化と共に、エラスチンのミクロフィブリルは、真皮表皮接合部の下のそれらの特徴的な燭台形状を失う１４。
【０１４１】
プロトコール：
培養で維持されたヒト皮膚の生検試料を、ＰＢＳ中で１％体積／体積に（または１／１００に）希釈された実施例１によるココア加水分解物で、１日に２回２４時間処理して、次にＵＶＢ（１００ｍＪ／ｃｍ２）で照射するかまたは青色光に曝露する（４７０ｎｍ、３ｍＷ／ｃｍ２、２６分間）。並行して、生検試料を暗所に保つ。処理を再び１日に２回２４時間適用して、次に生検試料を、ＵＶＢまたは青色光への第２の曝露にさらす。さらに２４時間の処理の後、生検試料を、免疫組織化学によるフィブリリン−１検出のために回収する。
【０１４２】
この技法は、抗フィブリリン−１抗体（マウスのモノクローナル）の存在下でインキュベートされた凍結した切片を使用して実施する。１時間のインキュベーションの後に続いて濯ぎ、切片を、蛍光団と結合した２次抗マウス抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下でインキュベートする。切片を、次に落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡）下で検査する。真皮表皮接合部の下に存在するエラスチンミクロフィブリルのネットワークを、次に観察する。
【０１４３】
実施例４および５により得られたココア加水分解物の存在下でも処理を実施した。この目的で、実施例１の加水分解物に匹敵する濃度を得るために、加水分解物をあらかじめ希釈した。
【０１４４】
結果：
暗所に置いてあった生検試料について、フィブリリン−１で標識されたミクロフィブリルは、実施例１によるココア加水分解物の１％の存在下で、処理されない生検試料と比較して、より長いように思われる。
【０１４５】
生検試料がＵＶＢに曝露された条件下で、ミクロフィブリルネットワークは、明らかに減少しているように思われて、線維の垂直配向を見分けることは、もはや可能でない。生検試料が実施例１によるココア加水分解物の１％で処理されてＵＶＢに曝露された条件下で、処理されずに曝露された生検試料と比較して長い、真皮表皮接合部に垂直な線維が観察される。これらの効果は、青色光への曝露の場合にも観察された。
【０１４６】
実施例４および５により得られた加水分解物を用いる処理でも、同じ結果を観察することが可能になった。
【０１４７】
結論：
これらの結果は、ＵＶＢストレスおよび青色光への曝露の場合に、フィブリリン−１に関して、実施例１、４または５の１つにより得られたココア加水分解物の保護効果を示し、光老化の予防における利点を示唆する。
【０１４８】
［実施例１２］
エクスビボの皮膚の生検試料における、シンデカン−４の発現のレベルに対する、実施例１によるココア加水分解物の効果：
本研究の目的は、ヒト皮膚の生検試料におけるシンデカン−４のレベルに対する、実施例１によるココア加水分解物の潜在的効果を評価することである。
【０１４９】
シンデカン−４は、細胞表面に存在するヘパラン硫酸塩を有するプロテオグリカンであり、それは、細胞の相互作用メディエーターの役割を演じて、細胞接着、移動、増殖、エンドサイトーシスおよびメカノトランスダクションの機構を調節する１５。
【０１５０】
プロトコール：
ヒト皮膚の生検試料を、ＰＢＳ中で１％体積／体積に（または１／１００に）希釈された実施例１によるココア加水分解物で、１日に２回、合計７２時間処理した。
【０１５１】
次に、シンデカン−４を、これらの生検試料の切片で、免疫組織化学により現した。この目的のために、切片を、シンデカン−４に対して向けられた１次抗体（ウサギポリクローナル）と接触させる。インキュベーションおよび濯ぎの後、蛍光団と結合した２次抗ウサギ抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を切片に適用する。次に、切片を落射蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ顕微鏡）下で検査する。蛍光の定量化は、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ（登録商標）画像解析ソフトウェア（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｉｎｃ．）を利用して、得られた写真に基づいて実施する。
【０１５２】
結果：
実施例１によるココア加水分解物は、シンデカン−４のレベルを、処理されない対照生検試料と比較して＋１８％だけ増大させることを可能にした。この効果は、実施例６により調製されたポリフェノールに富むココア加水分解物で、より低い程度で観察される（＋１２％）。
【０１５３】
結論：
実施例１によるココア加水分解物は、皮膚の生検試料において、シンデカン−４に対する活性を有し、ケラチノサイトとそれらの細胞外環境との間の相互作用に対する潜在的効果を示唆する。
【０１５４】
［実施例１３］
実施例２によるココア加水分解物の抗老化および若返り活性を示すインビトロ試験
真皮は、表皮に養分を与える要素であることに加えて、表皮に堅牢な支持を提供する。それは、主として、線維芽細胞ならびに主としてコラーゲン、エラスチンおよび基礎物質と称される物質からなる細胞外基質からなる。これらの構成要素は、線維芽細胞によって合成される。表皮と真皮との間の接着は、真皮表皮接合により確実にされる。
【０１５５】
コラーゲンは、皮膚の細胞外基質の主要素をなすタンパク質である。現在までに、２０種のタイプのコラーゲンが同定されており、ＩからＸＸまで標識されている。主として真皮全体に存在するコラーゲンは、タイプＩおよびＩＩＩコラーゲンであり、それらは真皮全体の細胞外基質を形成する（これらのコラーゲンは、真皮の乾燥重量の７０から８０％を占める）。老化と共に、真皮は薄くなって、しわが皮膚表面に現れる。その結果として、皮膚の完全性および外部からの機械的攻撃に対するその抵抗性を確実にすることについての、コラーゲンの重要な役割を考慮に入れれば、これらのコラーゲン、特にタイプＩコラーゲンの合成の刺激は、皮膚の老化の徴候を軽減するための効果的な手段であるように思われる（Ｔｚａｐｈｌｉｄｏｕ  Ｍ．による総説、Ｍｉｃｒｏｎ  ３５（２００４）１７３−１７７）。
【０１５６】
１．若い細胞対老化した細胞の研究
以下の研究は、真皮の細胞外基質の構成成分であるコラーゲンＩ、エラスチンおよびフィブリリン１の発現に対する、実施例２によるココア加水分解物（図中で加水分解物と称する）の効果を研究することによって、その抗老化および抗光老化活性ならびにその若返り活性を評価することを可能にした。後者の活性も、ＤＮＡのメチル化に対する、実施例２によるココア加水分解物の効果、エピジェネティックな標的を研究することにより評価した。
【０１５７】
老化で、コラーゲン線維および弾性線維は、減少した合成および増大した分解に基づいて変化して、張りの減少および弾性の喪失と共に皮膚品質の低下を生ずる。
【０１５８】
細胞若返りの要求を可能にするために、本発明者らは、コラーゲンＩおよびエラスチンの場合、内因性で（複製的老化）老化した、またはフィブリリン１の場合には、繰り返されるＵＶ照射により外因性で老化した、これらの細胞内の線維の構造に関与するタンパク質の発現を定量化した。
【０１５９】
タンパク質の発現の観察された再活性化の機構を理解するために、本発明者らは、内因性で老化した細胞におけるＤＮＡメチル化の分析を実施した。実際、細胞老化の特徴の１つは、ジヌクレオチドＣｐＧに含有されるシトシンのレベルにおける、ＤＮＡ内のメチル化されたゾーンの蓄積である。このことは、プロモーターの不活性化およびある遺伝子の発現の減少を生じさせる。
【０１６０】
細胞障害性の予備的評価
分子の細胞障害性をＮＨＤＦで評価した。
【０１６１】
細胞障害性は、０．１％ＤＭＳＯで１／２ｌｏｇずつ７段階の希釈で水溶液に可溶な、試験した最大濃度で評価した。
【０１６２】
化合物を細胞と２４時間接触させた。最後の３時間の間に、即時使用のＲｏｃｈｅのＷＳＴ１（登録商標）比色試験薬を培地に導入した。
【０１６３】
この試薬は、テトラゾリウム塩、紫色インジケーターを含有する。この試薬は、代謝的に活性な細胞により、開裂してホルマザンという黄色インジケーターを形成する。したがって、黄色着色のレベルは、生きている細胞の数に比例する。吸光度測定は４５０ｎｍで実施する。
【０１６４】
試験では、対照の９０％未満の値を、生成物の細胞障害性の可能性を示すと考える（グラフ中の緑色の線により表す）。これは、細胞の代謝活性が低下していることも示すことができる。７５％未満の値は、有意の細胞障害性を示す（グラフ中の赤い線により表す）。
【０１６５】
それに加えて、細胞を顕微鏡下で観察して、それらの外的特徴を観察して比較した。
【０１６６】
実施例２によるココア加水分解物は、１０００ｐｐｍで高い細胞障害性および２００と２０ｐｐｍとの間で、それより弱いものの有意の細胞障害性を示す。実施例２によるココア加水分解物は、２ｐｐｍと２０ｐｐｍとの間では、有意の細胞障害性を示さない。
【０１６７】
試験のために保持される濃度：
実施例２によるココア加水分解物は、以下の濃度２０、１０、５ｐｐｍで試験する。
【０１６８】
標的コラーゲンＩ
コラーゲンＩは、皮膚にその機械的抵抗性を与える、主要素となるコラーゲンである。
【０１６９】
このタンパク質は、脊椎動物のコラーゲンの９０％を占める。それは、骨のフレームワークの構成要素となり（強化コンクリートの強化になぞらえることができる）、より一般的に共通の結合組織となる。それは、骨、皮膚、腱、角膜および内臓に見出される。
【０１７０】
コラーゲンＩの発現に対する実施例２によるココア加水分解物の効果の評価方法
若いＮＨＤＦ（正常ヒト皮膚の線維芽細胞）または複製的老化により老化したＮＨＤＦを、９６−ウェルプレートに接種して、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【０１７１】
細胞を、試験製品の存在下で２４時間処理した。
【０１７２】
次に、細胞をホルマリンで固定して、タンパク質の発現を、免疫蛍光により検出した。
【０１７３】
蛍光標識を撮像して自動化された顕微鏡（Ａｒｒａｙｓｃａｎ  Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＴＭ）により定量化した。蛍光をｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐａｒｔｉｍｅｎｔａｌ分析により定量化した。
【０１７４】
コラーゲンＩの発現に対する実施例２によるココア加水分解物の効果の評価
結果を図３Ａに示す。
【０１７５】
実施例２によるココア加水分解物は、複製により老化した細胞と比較して、コラーゲンＩの発現を再活性化することを可能にする。実際、実施例２によるココア加水分解物の３通りの試験濃度で得られた標的とされたタンパク質の発現のパーセンテージは、老化した細胞モデルで得られたパーセントより高い。
【０１７６】
結論：
実施例２によるココア加水分解物は、処理されない老化した細胞と比較して、タンパク質発現を再開することにより、および若い対照と比較して、タンパク質発現を部分的に再建することにより、皮膚の老化の標的であるコラーゲンＩに作用する成分である。
【０１７７】
標的エラスチン
エラスチンは、構造糖タンパク質であり（ラミニンおよびフィブロネクチンと類似）、ＥＣＭの組成物中に入る。エラスチンは、構造タイプの線維状タンパク質のファミリーのタンパク質である。それは、本質的に成長期の間に、線維芽細胞により分泌されて、弾性を有する。その合成は年齢と共に減少し、エラスチンは、伸びないコラーゲンにより置き換えられることが見出される。皮膚線条は、機械的歪みと関連するこの過程の目に見える例である。皮膚の老化はこの第２の例である。
【０１７８】
エラスチンは、細胞外基質で線維芽細胞により合成されて、最初はプロエラスチンの形態で、次にトロポエラスチンの形態で、細胞外空間に分泌される。エラスチンは、フィブリリンに加えて、弾性線維の主要素となる構成要素（９０％まで）である。したがって、横向きの共有結合により弾性線維を形成するエラスチンおよびフィブリリンと関連するコラーゲンは、細胞外基質の主要な構成成分である。エラスチンの合計産生は思春期の辺りで停止する。この後、エラスチンの利用できる量は、経時的に減少するであろう。
【０１７９】
エラスチンの分解は、エラスターゼという、線維芽細胞により分泌される酵素の作用と結びついている。エラスターゼの酵素作用はα１−アンチトリプシンにより阻害される。分解の阻害は、エラスチンの安定性を増大させる平衡を創り出す。
【０１８０】
他との区別を示す特徴がエラスチンを特徴づける。すなわち、エラスチンは、細胞が接続されることを可能にして、生物学的組織の形成を可能にする。したがって、皮膚、肺、血管、結合組織およびある種の腱および軟骨の適当な機能性は、エラスチンの特徴と密接に結びついている。その名が示すように、エラスチンは弾性である。等しい直径で、それは、ゴムバンドより５倍弾性である。それは、破断する前に休止時のその長さの１５０％まで伸びることができる。したがって、それは、組織が伸びた後それらの初期状態に回復することを可能にして、そのことがそれらに柔軟性を与える。
【０１８１】
エラスチンは、支持体としてはたらく皮膚の真皮に見出される。老化すると、例えば、下にある筋肉の収縮の作用にもはや逆らえない、真皮の弾性および張りの喪失は、しわの外観を生じさせる。それに加えて、紫外線への曝露は、エラスチンの分解を増大させる。
【０１８２】
エラスチンの発現に対する実施例２によるココア加水分解物の効果の評価方法
若いＮＨＤＦ（正常ヒト皮膚の線維芽細胞）または複製的老化により老化したＮＨＤＦを９６−ウェルプレートに接種して、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【０１８３】
細胞を試験製品の存在下で２４時間処理した。
【０１８４】
次に、細胞をホルマリンで固定して、タンパク質の発現を免疫蛍光により検出した。
【０１８５】
蛍光標識を撮像して自動化された顕微鏡により定量化した（Ａｒｒａｙｓｃａｎ  Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＴＭ）。蛍光を、ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐａｒｔｉｍｅｎｔａｌ分析により定量化した。
【０１８６】
エラスチンの発現に対する実施例２によるココア加水分解物の効果の評価
結果を図３Ｂに示す。
【０１８７】
実施例２によるココア加水分解物は、エラスチンの発現を、老化した細胞と比較して僅かに再活性化することを可能にする。
【０１８８】
結論：
実施例２によるココア加水分解物は、試験された３通りの濃度で、処理されない老化した細胞と比較して僅かにタンパク質発現を再開することにより、および若い対照と比較してタンパク質発現を部分的に再建させることにより、エラスチンという皮膚の老化の標的に作用する成分である。
【０１８９】
標的フィブリリン１
フィブリリン１は、弾性線維と関連してそれらのアセンブリーにあずかるミクロフィブリルの構成要素となるタンパク質である。
【０１９０】
フィブリリン１の発現に対するココアのペプチドの加水分解物の効果の評価方法
若いＮＨＤＦ（正常ヒト皮膚の線維芽細胞）または照射により外因性で老化したＮＨＤＦを、９６−ウェルプレートに接種して、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【０１９１】
外因性の老化を意図される細胞を、ＵＶＡで各照射の間に２４時間おいて３回、およびＵＶＢで各照射の間に４８時間おいて２回照射した。
【０１９２】
細胞を、試験製品の存在下で２４時間処理した。
【０１９３】
次に、細胞をホルマリンで固定して、タンパク質の発現を免疫蛍光により検出した。
【０１９４】
蛍光標識を撮像して自動化された顕微鏡により定量化した（Ａｒｒａｙｓｃａｎ  ＣｅｌｌｏｍｉｃｓＴＭ）。蛍光を、ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｐａｒｔｉｍｅｎｔａｌ分析により定量化した。
【０１９５】
フィブリリン１の発現に対する実施例２によるココア加水分解物の効果の評価
結果を図３Ｃに示す。
【０１９６】
実施例２によるココア加水分解物は、フィブリリン１の発現を、老化した細胞と比較して再活性化することを可能にする。
【０１９７】
結論
実施例２によるココア加水分解物は、処理されない老化した細胞と比較して、試験された３通りの濃度でそのタンパク質発現を再開すること、および若い対照と比較してタンパク質発現をほとんど完全に再建することにより、フィブリリン１という皮膚の老化の標的に作用する成分である。
【０１９８】
標的ＤＮＡメチル化
メチル化はヒストンのＮ末端の改変である。それは、リジンまたはアルギニンで起こり得て、それは、１、２または３個のメチル基の付加により具体化され得る。メチル化された残基および付加された基の数に依存して、それは、転写の活性化または抑制と関連する。長い間静的であると考えられていたヒストンメチル化が、アセチル化およびリン酸化よりも安定であるが、動的過程が関与する可逆的改変であることが判明している。ヒストンデメチラーゼの増大する数が同定されている。一般的に、このタイプの改変は、アセチル化に拮抗性であり、リジンの脱アセチル化は、それらのメチル化に先行しなければならない。この拮抗作用は、ヘテロクロマチンドメイン（それは、一般的に発現され得ず、ある鍵アミノ酸でメチル化されている）とユウクロマチンドメイン（それは一般的に発現され得て、アセチル化されている）との間のある動的平衡への発展をもたらす。例えば、ヒストンＨ３のリジン９は、メチル化されたときに、周囲のクロマチンの抑制と関連することが知られている。このメチル化は、タンパク質、ＨＰ１により認識され、それは、したがって、メチル化されたＨ３に結合する。ＨＰ１は、次に、タンパク質Ｓｕｖ３９、ヒストンメチルトランスフェラーゼを引き寄せ、それは、隣接するヌクレオソームのヒストンＨ３のリジン９等をメチル化し得る。したがって、どのように、ヒストンＨ３はメチル化されて、クロマチンは凝縮されるであろうかが段階的に分かる。しかしながら、このヘテロクロマチンの侵入は、相手側のＨ３のリジン９がすでにアセチル化されていれば、停止されるであろう。したがって、競争的平衡が、発現されたクロマチンドメインと抑制されたクロマチンドメインとの間で発生する。ヒストンの尾部の改変は、エピジェネティック「マーク」の役割を果たし、異なるクラスのタンパク質の動員を生じさせ、その理由は、アセチル化またはメチル化したリジンは、異なるタンパク質ドメインによって認識されるからである。それに加えて、クロマチンのレベルにおけるある因子の動員において、ヒストンの改変およびすでに結合したタンパク質の先行する存在が必要となる。したがって、ヒストンのコードは、クロマチンと関連する他の因子の関係で解釈されて、それは、改変されたヒストンとタンパク質がクロマチンのために動員されるかどうかを決定する他の因子との間の相互作用の組合せである。生体の全ての組織は、老化により影響される。この過程は、多数の出版物に記載されている、ＤＮＡの特定のシトシン残基のレベルにおけるメチル化における変化などのエピジェネティックな改変と結びついている。老化、細胞分裂および劣化した高分子の蓄積におけるエピジェネティックな改変の作用が、老化した表現型に寄与する。それに加えて、環境およびランダム事象が、ＤＮＡメチル化およびヒストンメチル化およびアセチル化などのエピジェネティックな機構の媒介により、この表現型を改変し得る。エピジェネティックな改変の潜在的な可逆性によって、それらが老化に関連する病理の治療において魅力的な標的となる。
【０１９９】
ＤＮＡのメチル化に対する実施例２によるココア加水分解物の効果の評価方法
若いＮＨＤＦ（正常ヒト皮膚の線維芽細胞）または複製的老化により老化したＮＨＤＦを、９６−ウェルプレートに接種して、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。
【０２００】
細胞を試験製品の存在下で２４時間処理した。
【０２０１】
次に、細胞をトリプシンの存在下で剥離して溶解させた。ゲノムＤＮＡをエタノールで沈殿させた。
【０２０２】
ＤＮＡのメチル化のレベルをＥｎｚｏキット：５−メチルシトシンＤＮＡ  ＥＬＩＳＡキットを使用してＥＬＩＳＡによりアッセイした。値は、結果を見やすくするために、５０％から開始して示す。
【０２０３】
ＤＮＡのメチル化に対する実施例２によるココア加水分解物の効果の評価
結果を図３Ｄに示す。
【０２０４】
実施例２によるココア加水分解物は、複製により老化したＮＨＤＦにおけるメチル化レベルを、若い細胞で観察されるレベルに近づけるために、１０および５ｐｐｍに低下させることを可能にする。
【０２０５】
結論
実施例２によるココア加水分解物は、エピジェネティックな老化の標的であるＤＮＡのメチル化レベルの低下に作用する成分であり、したがって、それは、潜在的若返り活性を有する。
【０２０６】
−抗老化および若返り活性に対する一般的結論
老化の経過において、コラーゲン線維および弾性線維が、減少した合成および増大した分解に基づいて変化する。実施例２によるココア加水分解物が、細胞若返りに作用することを示すために、老化した細胞内のこれらの線維の構造に関与するタンパク質の発現について、内因性（複製的老化）ではコラーゲンＩおよびエラスチンの場合に、または繰り返されるＵＶ照射（光老化）による外因性では、フィブリリン１の場合に、定量化を実施した。
【０２０７】
実施例２によるココア加水分解物は、３種のマーカーの発現を再開することを可能にする。
【０２０８】
ＤＮＡメチル化の分析に関して、実施例２によるココア加水分解物は、この実験では一様な結果を有し、それは、３通りの試験濃度のうち２通りでメチル化を減少させる。この効果は、細胞外基質のタンパク質の発現を再活性化することを可能にするこの生成物の作用の様式について情報を与えて、それはその若返り効果を与える。
【０２０９】
実施例２によるココア加水分解物は、したがって、抗老化および若返らせる生物学的抗老化活性を有する活性成分または物質である。それは、老化した細胞で観察されるタンパク質発現と比較して、タンパク質発現を再開することにより、一貫して皮膚老化の３種の標的に作用する。それは、成熟細胞内におけるＤＮＡメチル化に対するその作用により示されるように、エピジェネティクスに対しても新規な活性を有する。最後に、それは、細胞外基質のタンパク質の合成に対するその効力に基づく深い抗老化作用を示す。
【０２１０】
［実施例１４］
ケアクリーム
【表１】
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【０２１１】
手順
１．相Ａを主容器中に注いで、均質化を開始する。７０から７５℃に加熱する。
２．ＵｌｔｒａＴｈｉｘ  Ｐ−１００に振りかけて、約３０分間徹底的に混合する。
３．相Ｄの成分を第２のビーカーに加えて７０から７５℃で加熱する。
４．あらかじめ混合しておいた相Ｃを相Ａに均質化が完了するまで加える。
５．７０から７５℃で、相Ｄを主容器に加えて徹底的に混合する。エマルションは、完全に均一でなければならない。
６．冷却を開始する。
７．混合物が約５０℃に達したときに、あらかじめ混合しておいた相Ｅを加えて徹底的に混合する。
８．周囲温度で、相Ｆを加えて、均一な混合物が得られるまで混合する。
９．２５℃で停止する。
【０２１２】
性質：
外観：  白色クリーム
ｐＨ：    ５．２から５．６
粘度（Ｄ０）  ２５，０００から５０，０００（ブルックフィールドＲＶＴ／スピンドルＢ／５ＲＰＭ／１分／２５℃）
【０２１３】
この剤形の保存を２８日にわたる二重有効性試験により検証した。
【０２１４】
しかしながら、防腐剤は、それらの有効性の最低レベルに最適化しなかった。
【０２１５】
［実施例１５］
屋外活動のための保護流体（インビトロの日焼け保護ＳＰＦ３０）
【表２】
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【０２１６】
手順
１．水を主容器に加えて、相Ａの成分を周囲温度で加える。
２．相Ａに振りかけて混合し均質にする。
３．相Ｃの成分を隣接する容器に加えて、混合しながら６５から７０℃に加熱し、次に周囲温度に冷却する。
４．周囲温度で、相Ｃ＋相Ｄを均質化する。
５．ＣＤを、主容器に加えて、均一なエマルションが得られるまで徹底的に混合する。
６．相Ｅをあらかじめ混合して、主容器に混合しながら加える。
７．相Ｆをあらかじめ混合して５０℃にして、主容器に混合しながら加える。
８．相Ｇの成分を順次加えて、徹底的に混合して均質にする。
９．２５℃で停止する。
【０２１７】
性質：
外観：  黄色流体
ｐＨ：    ５．５から６．０
粘度（Ｄ０）  ブルックフィールドＲＶＴ／スピンドル３／５ＲＰＭ／１分／２５℃：５０００から１１，０００ｃｐｓ
【０２１８】
この剤形の保存を、二重有効性試験により２８日にわたって検証した。
【０２１９】
しかしながら、防腐剤は、それらの有効性の最低レベルに最適化しなかった。
【０２２０】
［引用文献］
【表３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【国際調査報告】
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