(57)【要約】  ＡｕｘＰｔ１−ｘ合金ナノ粒子（ＡＮＰ）をコロイド状溶液で製造する為のパルスレーザーアブレーションの方法に関する。ＡＮＰの得られたコロイド状溶液はラテラルフローイムノアッセイ及び金属のナノ粒子（ＮＰ）の光学的散乱に基づく多様な生物学的用途に適する。該方法は材料を加熱せずに目標をアブレーションするのに十分短いパルス幅を保つ。ＮＰは蒸発無しに材料の破砕により形成する為ＮＰの酸化は最小限となる。ＮＰは生体分子と受動吸着により結合する。生体分子の結合方法は金ＮＰによる方法と同じであり、バイオアッセイと生物学的検出装置の製造手順に変更を要しない。ＡＮＰは可視域で広い消光スペクトルを有しコロイド形及び乾燥形で黒色に見える。ＮＰは生体分子の標識に使用でき、視覚ベースのバイオアッセイにて白色試験紙に対し視覚的対照をなす。ＡＮＰの黒色と金ＮＰの赤色との組み合わせにより生物学的検出アッセイの多重化が可能となる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水を含む液体中の１０ｎｍ〜１００ｎｍの粒子サイズ範囲を有するＡｕｘＰｔ１−ｘ（式中、ｘは０．９５〜０．０５の値を有する）ナノ粒子のコロイド状溶液を含むバイオコンジュゲートであって、前記ＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子は、該粒子上に吸着された複数の生体分子を有し、かつ略黒色を呈する、バイオコンジュゲート。
【請求項２】
前記生体分子は、タンパク質、抗体、ペプチド、オリゴマー、又はポリマーである、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項３】
前記生体分子は、ＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子上にＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子１マイクログラム当たりに２×１０１２個までの生体分子の量で吸着されている、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項４】
前記ＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子のコロイド状溶液は、２５℃で少なくとも３ヶ月間にわたり前記ナノ粒子の凝集又は沈殿を伴わずに安定である、請求項１に記載のバイオコンジュゲート。
【請求項５】
生体分子のためのアッセイであって、
ａ）１０ｎｍ〜１００ｎｍの粒子サイズ範囲を有するＡｕｘＰｔ１−ｘ（式中、ｘは０．９５〜０．０５の値を有する）ナノ粒子を含み、前記ＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子が、該粒子上に吸着された複数の検出用生体分子を有するバイオコンジュゲートを準備する工程と、
ｂ）前記生体分子を含む試料を前記バイオコンジュゲートに曝すことで、前記検出用生体分子を、前記ＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子に吸着させたままで前記生体分子に結合させる工程と、
ｃ）光学的散乱を測定することにより前記ＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子の存在を検出し、それにより前記試料中の前記生体分子の存在を検出する工程と、
を含む、アッセイ。
【請求項６】
前記生体分子は抗原であり、かつ前記検出用生体分子は前記抗原に対する抗体である、請求項５に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記生体分子はＲＮＡオリゴマーであり、かつ前記検出用生体分子は前記生体分子と相補的なＲＮＡオリゴマーである、請求項５に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記生体分子はＤＮＡオリゴマーであり、かつ前記検出用生体分子は前記生体分子と相補的なＤＮＡオリゴマーである、請求項５に記載のアッセイ。
【請求項９】
水を含む液体中の１０ｎｍ〜１００ｎｍの粒子サイズ範囲を有するＡｕｘＰｔ１−ｘ（式中、ｘは０．９５〜０．０５の値を有する）ナノ粒子のコロイド状溶液であって、前記ＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子は、純粋なＡｕ及び純粋なＰｔに関する（１１１）ピークの間に位置する１つの（１１１）ピークを有するＸ線回折パターンを示す、コロイド状溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２０１６年７月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／３６７，２３４号の利益を主張する。
【０００２】
［連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載］
該当なし。
【０００３】
本発明は概して、多様な生物学的アッセイ（Ａｓｓａｙ，分析評価）において使用するためのナノ粒子、より具体的には多重化アッセイを含む多様な生物学的アッセイにおいて使用するための金−白金合金ナノ粒子に関する。
【背景技術】
【０００４】
生物学的材料の検出用のシグナルを発生させるための小粒子による生物学的分子、つまり生体分子の標識は、生化学的アッセイにおいて広く使用される方法である。多くのアッセイにおいて生体分子は、最初に検出可能なシグナル粒子で標識されて、バイオコンジュゲートが形成され、次いでこのバイオコンジュゲートがその他の生体分子の検出のために使用される。その一方で、上記小粒子は、バイオコンジュゲーション反応において生体分子の存在を直接的に検出するために使用され得る。これらのバイオコンジュゲートが使用される生化学的アッセイには、ＥＬＩＳＡアッセイ、ラテラルフローアッセイ、ウェスタンブロット、ノーザンブロット、サザンブロット、及びその他の電気泳動アッセイが含まれる。これらの小粒子の良く知られた例としては、金ナノ粒子のコロイド溶液が挙げられ、その溶液は、金ナノ粒子の５３０ナノメートル（ｎｍ）付近の強力な共鳴プラズモン吸収により引き起こされるはっきりとした赤色を呈する。これらの金ナノ粒子は、多様なアッセイにおける生体分子の光学ベースの検出及び視覚ベースの検出のために使用することができる。その他の例としては、磁性ナノ粒子が挙げられ、それは直接的に又は上記のバイオコンジュゲートを使用するかのいずれかで多様な生体分子の磁気的検出において使用され得る。
【０００５】
多くの生体分子は、受動吸着により純粋な金ナノ粒子の表面に高い親和性で結合する。受動吸着によるナノ粒子の表面への生体分子の結合は、該生体分子と該ナノ粒子コロイド溶液との物理的混合を必要とする。該生体分子は、そのナノ粒子表面に電気的引力及び疎水的相互作用により物理的に結合する。生体分子がナノ粒子表面に結合された、生体分子とナノ粒子とのそのような複合物は、コンジュゲート又はバイオコンジュゲートとしても知られており、そのようなコンジュゲートの製造方法は、バイオコンジュゲーションとして知られている。受動吸着により結合され得るこれらの生体分子の例としては、タンパク質、タンパク質断片、抗体、ペプチド、ＲＮＡオリゴマー、ＤＮＡオリゴマー、その他のオリゴマー、及びポリマーが挙げられる。さらに、これらの生体分子は、チオール基等の官能基を含むこともあり、その官能基も金ナノ粒子の表面に対して親和性を有し、金ナノ粒子への結合に寄与し得る。しばしば非効率的であると共に複雑かつ時間を費やす工程を要する共有結合による化学的コンジュゲーション法と比較して、受動吸着はコンジュゲーション法を単純にし、ナノ粒子のコンジュゲーション効率及び表面負荷を改善する。強力な光学的シグナルを発生させ、生体分子と効率的に結合する能力により、金ナノ粒子は、ラテラルフローイムノアッセイ等の多くの光学ベースの生物学的検出法及び視覚ベースの生物学的検出法において生体分子を標識するための第１の選択となっている。
【０００６】
金ナノ粒子の赤色に代わる色の選択肢を与え得るが、同じ表面特性及びバイオコンジュゲーション特性を有するナノ材料は、同じ試験ストリップ上で２種以上の生体分子を検出することが望まれる多重化用途のために非常に望ましい。２種以上の生体分子を検出するためには、検出される２種の生体分子の間で色の違い又は幾つかの代替的な検出方法を有する必要がある。ポリマー又はセルロースマトリックスを含む粒子中への色素分子の導入は、多彩な粒子を製造する方法の１つの例である（例えば、Horiiらの特許文献１を参照）。しかしながら、これらの粒子は、金ナノ粒子とは大きく異なる表面化学を必要とするため、生体分子検出法において使用するにはプロトコルの変更及び最適化が必要とされるであろう。該プロトコルは、金ナノ粒子を利用する既存のアッセイにおいて直接的に置き換えることができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１４−１６３７５８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
アッセイプロトコルにおいて変更を必要とせず、かつ金ナノ粒子を使用する生体分子の検出と同時に使用することができる生体分子の検出を可能にする方法及びシステムを提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
大まかに言うと、本発明は、生物医学的診断アッセイ及びその他の検出方法のための生物学的分子の標識のために使用することができるＡｕｘＰｔ１−ｘ合金ナノ粒子の製造方法、並びに該ナノ粒子を使用する生体分子のコンジュゲーションを提供する。
【００１０】
１つの実施の形態においては、本発明は、１０ナノメートル（ｎｍ）〜１００ｎｍのサイズ範囲を有するＡｕｘＰｔ１−ｘ（式中、ｘは０．９５〜０．０５の値を有する）ナノ粒子を含むバイオコンジュゲートであって、ＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子は、該粒子上に吸着された複数の生体分子を有し、かつ略黒色を呈する、バイオコンジュゲートである。幾つかの実施の形態において、上記ナノ粒子は合金であることから、ｘの値は、０．５０より大きいが１．０未満であり、かつＡｕは、合金ナノ粒子の主成分である。
【００１１】
別の実施の形態においては、本発明は、生体分子のためのアッセイであって、ａ）１０ｎｍ〜１００ｎｍの粒子サイズ範囲を有するＡｕｘＰｔ１−ｘ（式中、ｘは０．９５〜０．０５の値を有する）ナノ粒子を含み、上記ＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子が、該粒子上に吸着された複数の検出用生体分子を有するバイオコンジュゲートを準備する工程と、ｂ）生体分子を含む試料をバイオコンジュゲートに曝すことで、検出用生体分子を、ＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子に吸着させたままで生体分子に結合させる工程と、ｃ）ＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子の存在を検出し、それにより試料中の生体分子の存在を検出する工程とを含む、アッセイである。
【００１２】
本発明のこれらの特徴及び利点並びにその他の特徴及び利点は、当業者には好ましい実施形態の詳細な説明からより明らかになるであろう。その詳細な説明に付随する図面を以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明による利用のためのレーザーアブレーションシステムの概略図である。
【図２（ａ）】本発明により製造されたＡｕ０．７５Ｐｔ０．２５ナノ粒子のサイズ分布を示すグラフである。
【図２（ｂ）】本発明により製造されたＡｕ０．７５Ｐｔ０．２５ナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像である。
【図３（ａ）】本発明によるＡｕ０．７５Ｐｔ０．２５試料のＸ線回折（ＸＲＤ）パターンであり、比較のために純粋なＡｕピーク及び純粋なＰｔピークの位置を、それぞれ太い実線及び太い長破線で示している。
【図３（ｂ）】Ａｕ０．７５Ｐｔ０．２５試料（下方の曲線）及びＡｕ０．９０Ｐｔ０．１０試料（上方の曲線）の（１１１）回折ピークの拡大された部分を示しており、それらの試料は、測定の間にＣｕ基材上に置かれているので、Ｃｕ（１１１）ピークを、ピーク位置の位置合わせのために使用することができ、純粋なＡｕ、純粋なＰｔ、及び純粋なＣｕの（１１１）ＸＲＤピーク位置を、それぞれ実線、長破線、及び短破線で示し、表示している。
【図３（ｃ）】Ａｕ０．７５Ｐｔ０．２５試料（実線）、Ａｕ０．９０Ｐｔ０．１０試料（破線）、及び純粋なＡｕ試料（点線）の紫外−可視（ＵＶ−Ｖｉｓ）吸収スペクトルを示す図である。
【図３（ｄ）】本発明によるコロイド状Ａｕ０．７５Ｐｔ０．２５試料の瓶の写真であり、略黒色を呈している。
【図４】ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体の結合のための４０マイクログラムの４０ｎｍの平均直径の純粋なＡｕナノ粒子（丸形）又は５０ｎｍの平均直径のＡｕ０．７５Ｐｔ０．２５ナノ粒子（正方形）のいずれかの吸着能力を示すグラフである。
【図５（ａ）】Ａｕ−抗ｈＣＧバイオコンジュゲート（上方のストリップの系列）又は本発明によるＡｕ０．７５Ｐｔ０．２５−抗ｈＣＧバイオコンジュゲート（下方のストリップの系列）のいずれかをシグナル用バイオコンジュゲートとして両方の系列において使用して分析されたヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の検出のために設計された２つ系列のラテラルフローイムノクロマトグラフィーストリップの写真であり、下方の線は試験線であり、その強度は１１００から０（ｍＩＵ  ｈＣＧ／ｍｌ）まで変化させた抗原レベルと相関し、上方の線はバイオコンジュゲートの強度線である。
【図５（ｂ）】評価されたｈＣＧ抗原の全範囲についてのＡｕ−抗ｈＣＧ（丸形で示される）バイオコンジュゲート及びＡｕ０．７５Ｐｔ０．２５−抗ｈＣＧ（正方形で示される）バイオコンジュゲートの両方の比色定量的な抗原検出能力を示す図である。
【図６（ａ）】上部は、ｈＣＧ抗原とヒト心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）抗原との両方の存在下でのＡｕ０．７５Ｐｔ０．２５−抗ｈＣＧバイオコンジュゲート及びＡｕ−抗ｃＴｎＩバイオコンジュゲートにより検出される多重化されたラテラルフローアッセイの概略図を示し、上記バイオコンジュゲートは適切な抗原を捕捉すべきであり、その後に該バイオコンジュゲートは、ニトロセルロースストリップ上にプリントされた正しい抗体により捕捉されるべきであり、下部は、１００ｎｇ／ｍｌのｈＣＧ及び１０００ｎｇ／ｍｌのｃＴｎＩの実際のテストランの写真を示し、２つの線はＡｕ０．７５Ｐｔ０．２５−抗ｈＣＧバイオコンジュゲート及びＡｕ−抗ｃＴｎＩバイオコンジュゲートについての線を示している。
【図６（ｂ）】１００ｎｇ／ｍｌのｈＣＧ及び１０００ｎｇ／ｍｌのｃＴｎＩのレベルで両方の抗原が存在する中で、どちらか一方の抗原が存在する中で、又はどちらの抗原も存在しない中での抗ｈＣＧ及び抗ｃＴｎＩのイムノクロマトグラフィー線の強度定量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
上述のように、既知の金ナノ粒子の代わりに使用され得るバイオコンジュゲートを形成するために使用することができ、アッセイ手順又はアッセイ条件に変更を要しないナノ粒子を提供することが望ましい。さらに、これらのバイオコンジュゲートが、標準的な金ナノ粒子の色である赤色と異なる色を有する場合に、同じ試験ストリップ上で多重アッセイを可能にするために有用であると考えられる。金ナノ粒子の有利な特性を大きく損なうことなく、該ナノ粒子の色を調整する１つの方法は、金とその他の金属とを合金化することである。例えば、Liuらの米国特許第８，２４６，７１４号及び米国特許第８，８５８，６７６号が参照され、そこではそれぞれ、液体中での高繰返し周波数の短パルス幅のパルスレーザーアブレーション又は液体中でのバーストレーザーアブレーションのいずれかによる金合金ナノ粒子の製造方法がそれぞれ教示されている。これらの方法の利点としては、金と第２の金属との間の原子比又は重量比として定義される合金組成の調整の柔軟性、及びコロイドの純度が挙げられる。例えば、Ａｇと種々の量のその他の原子とを合金化することにより、高いＡｇ含量を有するＡｇＣｕ合金の場合の橙色と、ほぼ等しい含量のＡｕ及びＣｕを有するＡｇＣｕ合金の場合の緑色と、高いＣｕ含量を有するＡｇＣｕ合金の場合の暗赤色との間で、色を調整することができる。しかしながら、後続の評価において、そのような合金ナノ粒子は、貯蔵後に生体分子への効果的な受動結合を欠如することが判明した。１つの理由は、該ナノ粒子が、水中に溶解された正のＡｇ＋イオン又はＣｕ＋イオンの吸着によりそれらの負の表面電荷を徐々に失い、表面電荷の中和により該ナノ粒子のタンパク質に対する親和性が減少し、コロイドを不安定化させることであると思われる。ＡｕＣｕ合金ナノ粒子の場合には、Ｃｕ酸化のためその色が徐々に失われ、そのＣｕ酸化は、該ナノ粒子の誘電率を変化させ、プラズモン共鳴波長をレッドシフトさせる。
【００１５】
イムノクロマトグラフィー検出において試験ストリップが白色のニトロセルロース紙でできている場合には、バイオコンジュゲートに関する青色又は黒色等のより暗い色も有用である。赤色以外の色を使用することで、より良好な視覚的コントラストがもたらされ、多重化検出において第２の色となり、アッセイ試料の色、例えば血液の赤色がシグナルの解明を複雑にする場合には代替的な色が必要となる場合がある。本発明は、広い消光スペクトルを有し、可視領域において明確な吸収ピークを有しないため略黒色を示すＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子を製造する方法について言及する。
【００１６】
その製造は、所望のＡｕｘＰｔ１−ｘ組成（式中、ｘは該合金中の金の原子割合であり、０．９５から０．０５まで変動し得る）を有する事前に製造されたバルクターゲット材料の水又はその他の液体中でのパルスレーザーアブレーションを基礎としている。つまり、Ａｕ０．９０Ｐｔ０．１０として示されるナノ粒子は、９０原子％のＡｕと１０原子％のＰｔとを含む。そのレーザー光線は、集束レンズによりターゲット表面又はその付近に集束され、そのアブレーションされた材料は、界面活性剤又は安定化剤について一切の必要条件なく上記液体中でナノ粒子を形成する。粒子サイズ分布は、レーザー出力、集束高さ、液体の導電性、アブレーション時間、並びにパルス幅及びパルス周波数等のパラメーターにより制御される。この方法により、アブレーション液体中の非常に安定なナノ粒子のコロイド状懸濁液が得られる。製造されたコロイド状懸濁液中のナノ粒子のサイズ分布を、アブレーション後に所望のサイズ範囲のナノ粒子を回収するために遠心分離等の手段又はその他の分別法により更に改善することができる。
【００１７】
レーザーアブレーション後に、タンパク質、抗体、タンパク質断片、ペプチド、オリゴマー、ポリマー、及びチオール等の官能基を有する生体分子を含む生体分子を、上記コロイド状懸濁液に添加することができ、それらは該ナノ粒子の表面に受動吸着により結合する。
【００１８】
ＡｕＰｔナノ粒子は、触媒反応の分野においてそれらの重要な触媒特性について知られている。表面積対体積比を最大化するためには、そのような用途のために５ｎｍ未満の非常に小さい粒子サイズが必要とされ、そのような用途のためには、該ナノ粒子の色は特に関係がない。光学的特性に最も関心が持たれる本発明のような生物学的用途のためには、光学的な散乱断面積を高めるために２０ｎｍより大きい程度のより一層大きなナノ粒子のサイズが必要とされる。しかしながら、そのようなサイズのＡｕＰｔナノ粒子は、所望のサイズ範囲の利用可能な材料が無いため生物学的分野では知られていない。
【００１９】
ＡｕＰｔナノ粒子は、最も多くは化学的な方法で溶剤中での金属塩成分の同時還元により合成される。サイズ及び組成の制御のためには、金属塩の濃度、還元剤及び界面活性剤の濃度、溶剤温度、並びに反応時間等の反応パラメーターの慎重な調節が必要とされる。燃料電池における触媒として使用されるべき小さいＡｕＰｔナノ粒子の化学合成の１例は、Zhongらの米国特許第７，２０８，４３９号に開示されている。数十ナノメートルまで及ぶより大きなサイズのためには、上記反応は、組成及びサイズ分布の点での制御がより難しくなる。
【００２０】
パルスレーザーアブレーションは、バルクターゲットの組成の調整により達成され得る合金組成の調整における柔軟性を含む、金属合金ナノ粒子の形成のための幾つかの利点を示す。水中での直接的な形成は、ナノ粒子の溶剤輸送の必要性を無くし、高いコロイド懸濁液純度をもたらす。アブレーションのために過去に使用されてきたレーザーの種類に関しては、１ナノ秒（ｎｓ）から１００ナノ秒（ｎｓ）の間のパルス幅を有するナノ秒パルスレーザー、及び約１フェムト秒（ｆｓ）から１０ピコ秒（ｐｓ）の間のパルス幅を有する超短パルスレーザーという２つの主な選択肢がある。ナノ秒パルスレーザーの利点は、その高い出力及び高いアブレーション率である。不利点は、長パルスの間の累積加熱によりターゲット材料中に生ずる高熱であり、それにより該ターゲット材料の蒸発が起こる。
【００２１】
液体中でのアブレーションの場合には、ナノ秒レーザーアブレーションにより蒸発された原子種は、その液体と反応し、水中では酸化物若しくは水酸化物を形成し、又は有機液体中では炭酸塩を形成し得るが、それら全ては、最終ナノ粒子生成物のためには望ましくない。その高熱により、更に上記液体が分解され、上記ターゲット材料と反応する追加のリガンドが取り込まれることがある。例えば、Nicholsら（Nichols, W. T.; Sasaki, T. & Koshizaki, N.; Laser ablation of a platinum target in water. II. Ablation rate and nanoparticle size distributions, Journal of Applied Physics, 2006, vol 100, p114912）は、１０６４ｎｍ及び５３２ｎｍのナノ秒パルスレーザーアブレーションの間に水中でＰｔにより形成される化合物は、白金水酸化物ＰｔＯＨであることを報告している。触媒用途のためのＡｕＰｔ合金粒子のレーザー形成について、Zhangら（Jianming Zhang, Daniel Nii Oko, Sebastien Garbarino, Regis Imbeault, Mohamed Chaker, Ana C. Tavares, Daniel Guay, and Dongling Ma; Preparation of PtAu Alloy Colloids by Laser Ablation in Solution and Their Characterization; Journal of Physical Chemistry C, 2012, vol 116, pp13413-13420）により、波長２４８ｎｍのナノ秒パルス幅を有するエキシマレーザー、及び水中でのアブレーションを使用することが報告された。Zhangらにより、多様な合金組成及び５ｎｍ以下の小さいサイズが実証された。その研究においては、組成の制御のために４から１１までの広範なｐＨ値、好ましくはｐＨ１１が使用された。これは、長パルス幅によるＰｔの蒸発、及び水による引き続いての迅速な酸化の観点から理解することができる。それに対して、超短パルスレーザーアブレーションの利点は、それらの材料除去の特に低温性質である。これは１ｆｓ〜１０ｐｓのパルス幅から始めるが、そのパルス幅は、励起された高温の電子が低温の格子と平衡に達する時間スケールよりも短い。パルスが終わると、該材料には高温の電子群と低温の格子とが取り残される。さらに、ほとんどの材料については、電子拡散及びフォノン−フォノン相互作用による熱伝導はゆっくりであるか又は電子−格子相互作用と同じ程度である。したがって、材料の温度及び応力は、熱放散による緩和及び歪み応答よりも素早く上昇する。結果として、上記材料除去は、ナノ秒レーザーアブレーションでのような遅い蒸発ではなく、バルクの爆発的な機械的砕壊により生ずるため、中性原子、イオン、及び幾つかの原子の小さなクラスター等のはるかに少ない原子種しか生成されず、こうして不所望な酸化物又は水酸化物の不純物を生ずる液体との反応の機会は最小限となる。このようにして製造されたナノ粒子は、合金組成及び化合物の化学量論比等のバルク特性を維持する。
【００２２】
図１は、本発明による液体中でのナノ粒子の製造のためのレーザーアブレーションシステムの１例を図解している。レーザー光線１は、レンズ２により集束され、振動ミラー３によりターゲット４へと導かれる。上記ターゲット４は、ｘｙｚ方向移動ステージ７上に配置された容器６中に収容された液体５中に沈められている。ナノ粒子８は、レーザーアブレーション後に又はアブレーションの間に、上記容器６を通じて液体５を通過させる流動システムにおいて回収され得る。
【００２３】
生物学的用途のためには、選択される主たる液体は水である。１０ＭΩ・ｃｍ以上の程度の高い電気抵抗の脱イオン水が好ましい。アブレーションにより生成される粒子サイズの制御においては、導電性が重要であることが判明している。導電性を調整するために、塩化ナトリウム等の単純な塩を、アブレーションの前に液体５に添加することで、導電性の安定化のために１０マイクロモラー（μＭ）〜１００マイクロモラー（μＭ）という低い塩の濃度がもたらされる。好ましくは、上記導電性は、約１マイクロＳ／ｃｍ〜約１０マイクロＳ／ｃｍの範囲にある。好ましくは、上記液体のｐＨは中性である。ｐＨの調整のためにｐＨ緩衝液は必要とされず、コロイド懸濁液の安定化のために安定化剤は必要とされない。本明細書に開示される生物学的用途の例に示されるように、コロイド状のナノ粒子懸濁液が中性ｐＨで製造されることは重要な利点である。該コロイド状懸濁液の製造のために酸性ｐＨ又は塩基性ｐＨが必要とされるのであれば、それは、生体分子自体が正しい電荷及び機能のために好ましいｐＨを有する生物学的用途と対立することとなる。
【００２４】
本発明による好ましいレーザーは、約１ｆｓから約１００ｐｓの間のパルス幅を有する超高速パルスレーザーである。幾つかの実施形態においては、上記パルス幅は、約１ｆｓから約１０ｐｓ未満までである。上記波長は、約１μｍ、又はそれぞれ可視領域若しくは紫外領域におけるその２倍波若しくは３倍波であり得る。好ましいパルスの繰返し周波数は、約０．１ＭＨｚから１ＭＨｚの間である。生産速度が許容可能である限りは、より低い繰返し周波数も使用することができる。好ましい個々のパルスエネルギーは、約１マイクロジュール（μＪ）から１ミリジュール（ｍＪ）の間であり、約１μＪ〜約１００μＪの範囲であり得る。典型的な１ＭＨｚで１０ワットの平均出力では、１０μＪのパルスエネルギーが適切である。高い繰返し周波数の１つの利点は、電離したプラズマ状態のアブレーションされた材料のプルームが、レーザーの集束外に移動する前に多重レーザーパルスを受けることができ、それにより大きな粒子の破壊、及びナノ粒子のサイズ分布の改善が促されることである。不利点は、ターゲット表面上での熱の蓄積であるが、熱の付与はレーザビーム走査速度の増加により軽減することができる。
【００２５】
上記ターゲット４は、ＡｕｘＰｔ１−ｘで示され、その組成の変数ｘが０．９５から０．０５までの範囲である合金を含む。上記ターゲットは合金であることから、つまりＡｕ及びＰｔの両方を該組成物中に有することから、本発明により製造されたナノ粒子は、常にＡｕ及びＰｔの両方を含む。幾つかの実施形態においては、好ましくは、上記合金はＡｕを過半量で含み、つまりは、ｘは０．５０より大きく１．００より小さい。もう１つの実施形態においては、ｘは０．７５以上である。そのようなターゲットは、金及び白金を同時溶融させて、均一な融液を形成させ、次いでその溶融物を冷却することにより製造することができる。次いでＸ線回折（ＸＲＤ）を使用することで、アブレーション前のターゲットの結晶性及び合金組成を確認することができる。エネルギー分散型Ｘ線（ＥＤＸ）分析等のその他の方法も、使用前の合金組成を確認するために都合がよい。
【００２６】
金及び白金は、二元金属合金組成物において広い混和性ギャップを有することが知られており、つまりは、固体合金において、金及び白金は互いに偏折して、局所析出物を形成することが知られている。偏折の程度は、溶融された合金の冷却速度に依存し、冷却速度が遅いほど、より多くの偏折が起きる。通常、バルク金属溶融物を非常に素早く冷却することは困難であることから、或る程度の偏折は、形成される合金ターゲットにおいては避けることができず、それは合金ナノ粒子の製造についての問題点である。混和性ギャップは、混和性ギャップがゼロであると知られているＡｕ−Ａｇ系及びＡｕ−Ｃｕ系のような金属成分の間で良好な親和性を有するそれらの合金にとっては問題ではない。非混和性金属の場合に、本発明者らは、超短パルスレーザーアブレーションが、製造されたナノ粒子の組成的均一性を改善するための対応策として非常に有用であることを見出した。この理由は、アブレーション直後に常に液体状態で存在する高温のナノ粒子が、アブレーションの間に周囲液体中に放出される時に、それらのナノ粒子は、液体との密着、及び小さなナノ粒子の大きな表面積対体積比のため、非常に素早く冷却されるからである。上記冷却速度は、１０３Ｋ／ｓ〜１０４Ｋ／ｓであると見積もることができ、それは典型的なバルクの冷却速度よりも数桁高い。そのような素早い冷却速度は、効果的に偏折を防ぐことができ、より均一な合金ナノ粒子をもたらす。
【００２７】
０．０５ミリメートル〜１ミリメートルの範囲であり得る小さなレーザー焦点サイズのため、バルクターゲット中の偏折の範囲がレーザー焦点より大きくなることがないように注意せねばならない。これは、上記バルクターゲット４のサブミクロンの空間分解能を有するＥＤＸマッピングによって確認され得る。
【００２８】
図２（ａ）は、本発明により製造された典型的なＡｕ０．７５Ｐｔ０．２５合金ナノ粒子のコロイド状懸濁液のサイズ分布の１例を示す。ピークサイズは４５ｎｍにあり、それは、光学的散乱が測定されるべきシグナルである本明細書で検討される生物学的用途に理想的である。幾つかの実施形態においては、本発明によるナノ粒子は、４０ｎｍ〜６０ｎｍの範囲である。本発明においては、本発明によるＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子の好ましい粒子サイズ範囲は、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲である。純粋なＡｕナノ粒子は、４０ｎｍ〜６０ｎｍの平均粒径で強力なプラズモン散乱を示すことがよく知られている。ｘの範囲が０．９５〜０．０５であるＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子に関しては、本明細書で示されるように（図３（ｃ）を参照）、吸収（光学的消光）スペクトルにおける明らかなプラズモンピークが存在せず、したがってその散乱は、散乱強度が粒子体積の二乗に比例する、すなわち粒子が大きいほど散乱が強くなるという散乱のレイリーの法則にほとんど従うこととなる。大きく重い粒子の低いコロイド安定性及び取り扱いの困難性を考慮して、生物学的用途における光学的検出のためには、１０ｎｍ〜１００ｎｍのナノ粒子のサイズ範囲が最も適している。サイズ分布は、遠心分離又はその他の分別の手段等の下流のサイズ選択法により更に改善することができる。図２（ｂ）は、上記ナノ粒子の暗視野透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像である。原子吸収（ＡＡ）分析を該試料に対して行うことで、該ナノ粒子の全組成を測定した。結果として、Ｐｔ原子パーセントは２８％と測定され、これは初期のバルクターゲット組成の２５原子％のＰｔと非常に近い。
【００２９】
図３（ａ）は、Ａｕ０．７５Ｐｔ０．２５試料の３０度〜１２０度の広い範囲でのθ−２θ方式のＸＲＤパターンを示す。純粋なＡｕ及び純粋なＰｔの理論ピーク位置も比較のためにそれぞれ太い実線及び長破線で示されている。該合金粒子が、その成分と同じ面心立方（ｆｃｃ）構造を有することが分かる。図３（ｂ）は、銅基材上で乾燥されたＡｕ０．７５Ｐｔ０．２５試料及びＡｕ０．９０Ｐｔ０．１０試料の（１１１）ピークの拡大された部分を示す。純粋なＡｕ及び純粋なＰｔのピークは、比較のために太い実線及び太い長破線で示されている。Ｃｕ（１１１）ピークは、位置合わせのために太い短破線で示されている。両方の試料は、小さいナノ粒子の広がり効果のため幅広いＸＲＤピークを示す。理論上は、Ａｕ０．９０Ｐｔ０．１０試料については、Ａｕ０．７５Ｐｔ０．２５試料と比較してより高いそのＡｕ含量のため、純粋なＡｕピークに向かうシフトがあるべきであるが、そのシフトは、ＸＲＤにおいては該ピークの広がりのため不明確である。それにもかかわらず、両方の（１１１）ピークは純粋なＡｕ線と純粋なＰｔ線との間に位置していることは明白であり、それは、該ナノ粒子が合金でできており、ＸＲＤにより検出可能な偏折を有しないことを示唆している。そのような偏折が存在したならば、それぞれの成分は、純粋なＡｕの位置及び純粋なＰｔの位置に明確な一組のピークを示すこととなり、それらは、純粋なＡｕのＸＲＤ線と純粋なＰｔのＸＲＤ線との間での大きな分離を前提として見分けることができる。
【００３０】
図３（ｃ）は、Ａｕ０．７５Ｐｔ０．２５試料（実線）のＵＶ−Ｖｉｓ吸収（より厳密には光学的消光としても知られる）スペクトルを、Ａｕ０．９０Ｐｔ０．１０コロイド試料（破線）及び純粋なＡｕナノ粒子試料（点線）と比較している。純粋なＡｕナノ粒子試料は、５３０ｎｍによく知られた顕著なプラズモン共鳴吸収ピークを有する。１０原子パーセントの少量のＰｔと合金化させることにより、そのプラズモンピークは劇的に低下し、５２０ｎｍ付近での弱くかつ幅広い隆起部がバックグラウンドと重なり合うことになる。Ｐｔ含量がＡｕ０．７５Ｐｔ０．２５試料中で２５原子パーセントに増大すると、上記スペクトルは、明らかなプラズモンピークを一切伴わずに、紫外領域から赤外領域までに幅広くかつ強力な吸収を示し、このスペクトルは、該ナノ粒子へのタンパク質のバイオコンジュゲーション後にも同じままである。そのような幅広いスペクトルは、暗褐色を呈するＡｕ０．７５Ｐｔ０．２５試料の瓶の写真を示す図３（ｄ）に図示されるように、コロイド状懸濁液による暗色の視覚効果を生ずる。
【００３１】
本発明により製造されるナノ粒子のコロイド状懸濁液は、室温、つまりは２５℃で塩又は界面活性剤等の安定化剤の完全な不存在下で安定である。室温で３ヶ月間にわたり貯蔵した後にも、該ナノ粒子の偏折又は沈殿は観察されない。半年間にわたる長い貯蔵寿命が確認される。本発明によるナノ粒子を使用して製造されたバイオコンジュゲートについても同様の安定性が期待される。
【００３２】
このナノ粒子の高いＡｕ含量は、受動吸着による抗体及びタンパク質のコンジュゲーションのために有利である。純粋なＡｕナノ粒子の場合に、タンパク質及び抗体の受動吸着は、イムノアッセイ及び生物学的検出システムにおいて広く使用される低コストかつ適切なバイオコンジュゲーション法である。新たな材料でできたナノ粒子の場合に、バイオコンジュゲーションプロトコルを従来の純粋なＡｕナノ粒子のプロトコルから変更しないことは、バイオアッセイ及び生物学的検出装置の製造業者にとって非常に有益である。
【００３３】
コロイド状金属ナノ粒子の表面上でのタンパク質吸着は自発的過程であると知られており、その際、タンパク質が大きいほど、金属表面に対してより高い親和性を示す。この過程は、電荷相互作用（静電引力）及び疎水的相互作用を含む数多くの要因により引き起こされ、それは、金ナノ粒子を下流の電子顕微鏡法用染色又は比色的なイムノクロマトグラフィーアッセイのためにタンパク質及び抗体とバイオコンジュゲートさせるための第１の手段である。ｐＨ及びタンパク質濃度の両方がこの反応において決定的に重要であり、それらは最適化されねばならない。タンパク質の等電点からかけ離れたｐＨは、電荷相互作用を乱し、不十分なタンパク質の添加は、不安定なタンパク質−ナノ粒子コンジュゲートをもたらすため、塩又は緩衝液に曝された時に凝集がもたらされる。したがって、様々な実施形態において、中性のｐＨがナノ粒子製造の間に使用されることで、タンパク質吸着等の生物学的用途の間にｐＨの最適化がしやすくなることは重要な利点であり得る。
【００３４】
吸着させ、ナノ粒子をブロッキングし、遠心分離し、洗浄して、過剰の未反応のタンパク質を除去した後で、吸着されたバイオコンジュゲートを、過剰のチオールでの処理を通じて溶液に置き換えることができる（Mirkin et al., Anal. Chem. 2000, 72, pp 5535-5541）。ナノ粒子と一緒にインキュベートする前に、生体分子を蛍光性分子で標識することで、置き換えられたタンパク質の数を定量することができる手段が提供される。この実験を使用して、Ａｕナノ粒子と比較したＡｕ０．７５Ｐｔ０．２５ナノ粒子の抗体結合能力を定量した。
【００３５】
蛍光標識されたヤギ抗マウスＩｇＧを、種々の濃度に希釈し、４０μｇの４０ｎｍのＡｕナノ粒子又は５０ｎｍのＡｕ０．７５Ｐｔ０．２５ナノ粒子のいずれかと一緒にｐＨ７．４にて室温で１時間にわたりインキュベートした。図４は、２つの抗体結合曲線の比較を示す。飽和条件で、Ａｕ０．７５Ｐｔ０．２５ナノ粒子が、所与の材料重量当たりにＡｕナノ粒子と比べて３倍を上回る抗体の数を収容可能であることが分かる。この高い吸着能力は全く予想外であり、Ａｕ０．７５Ｐｔ０．２５ナノ粒子が、比色的なイムノアッセイのための標識として大きな可能性を有することを示唆している。４０ｎｍ〜６０ｎｍのサイズ範囲においてナノ粒子の結合能力にほとんど差は見られないことから、結合能力の差はその小さなサイズの差によるものではない。
【００３６】
バイオセンサーの性能は、抗体及びＤＮＡ等の標的とする生体分子の表面密度と大きく相関することが示された。これは、ナノ粒子上に固定化された抗体がその抗原を認識せねばならず、この構築物がわずかな限られた時間量で、通常は１５分間以内でニトロセルロースメンブレン上に固定化された抗体により認識されねばならないラテラルフローイムノアッセイの場合に特に当てはまる。このような場合に、所与の量のナノ粒子当たりの抗体負荷の最大化により、アッセイ感度が高まり、ダイナミックレンジが広がることが分かった。ラテラルフローアッセイにおける視覚的標識としてのＡｕ０．７５Ｐｔ０．２５ナノ粒子の性能を、妊娠ホルモンであるヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を検出するサンドウィッチアッセイにより評価した。
【００３７】
ラテラルフローイムノアッセイ及びｈＣＧ抗原のために設計されたモノクローナル抗ｈＣＧ抗体を、Scripps Laboratories社から購入し、更なる精製をせずに使用した。ラテラルフローストリップは、０．５ｃｍ幅のストリップにつき試験線としての０．５μｇの抗ｈＣＧ抗体及び０．５μｇのヤギ抗マウス抗体（Lampire Biological Laboratories社）をプリントすることにより作製した。Ａｕナノ粒子及びＡｕ０．７５Ｐｔ０．２５ナノ粒子の両方を、ｐＨ８．２でそれぞれ６μｇ／ｍｌ又は２０μｇ／ｍｌの抗ｈＣＧ抗体と反応させた。１時間曝した後に、これらのナノ粒子を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の１０ｍｇ／ｍＬ溶液で３０分間にわたりブロッキングした。抗体とコンジュゲートされたナノ粒子を、次いで遠心分離により洗浄し、約４００μｇ／ｍＬの金属濃度で再懸濁させた。
【００３８】
ｈＣＧの希釈物をランニングバッファー中で作製し、５μＬのナノ粒子コンジュゲートを、５０μＬのそれぞれの希釈物に添加した。次いでラテラルフローストリップを、コンジュゲート−抗原混合物中に浸し、１５分間にわたり展開させた。図５（ａ）は、ｈＣＧ抗原の量を漸減させたラテラルフローアッセイにおいて使用されたこれらの２種のコンジュゲートの写真を示す。全てのストリップは、明白なコントロール線を示しており、それにより結果が確認される。さらに、Ａｕナノ粒子コンジュゲートのストリップは、それらの基準となる赤色を示したが、Ａｕ０．７５Ｐｔ０．２５ナノ粒子コンジュゲートのストリップは、目立つ黒色を呈しており、それはコロイド状のナノ粒子の色が試験ストリップ上で維持されることを裏付けている。ｈＣＧ抗原濃度に対する試験線シグナルの定量が、図５（ｂ）に示されている。Ａｕ０．７５Ｐｔ０．２５粒子は、Ａｕナノ粒子と等しい感度及びダイナミックレンジ性能を示しているため、それらは、ラテラルフローアッセイにおいて別の色が所望される場合にＡｕナノ粒子の優れた代替物となる。
【００３９】
Ａｕナノ粒子及びＡｕ０．７５Ｐｔ０．２５ナノ粒子の両方を用いる多重化されたラテラルフローアッセイは、ｈＣＧに対する抗体の１本の線と、ヒト心筋トロポニンＩ（ｃＴｎＩ；HyTest社）に対する抗体のもう１本の線とを同じ試験ストリップ上にプリントすることにより行うことができる。異なるナノ粒子を異なる標的抗体で修飾することで、つまりＡｕ０．７５Ｐｔ０．２５：抗ｈＣＧ及びＡｕ：抗ｃＴｎＩにより、抗原及び粒子の両方が一緒に混合され、試験ストリップに流された場合に、２つの異なる色の線の発色がもたらされるべきである。図６（ａ）は、この考え方を、概略図及び写真として図解しており、その際、両方の粒子は、ストリップに曝す前に１０００ｎｇ／ｍｌのｃＴｎＩ及び１００ｎｇ／ｍｌのｈＣＧと混合された。はっきりした色の差が明らかにされ得て、これらの線の強度は、図６（ｂ）において定量される。シグナルは、両方の抗原の添加時には高かったが、抗原が存在しなかった場合には、その線にあるシグナルは、評価された両方の線についてシステムのノイズと一致する水準にまで下がった。少量の非特異的な結合が生じたが、これらは恐らく抗体に依存し、アッセイの最適化により最小限にすることができる。
【００４０】
本発明によるＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子は、生体分子が本発明によるＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子にコンジュゲートされた多種多様のバイオコンジュゲートのためのリポーター標識として広く使用されることとなる。検討される生体分子としては、タンパク質、ペプチド、抗体、ＲＮＡオリゴマー、ＤＮＡオリゴマー、その他のオリゴマー、及びポリマーが挙げられる。本発明のＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子は、Ａｕナノ粒子で標識されたバイオコンジュゲートが、ＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子で標識されたバイオコンジュゲートと一緒に使用される多重化アッセイにおいても使用され、それぞれは同じ試験ストリップ上で異なる色として検出可能である。
【００４１】
少なくとも１つの実施形態において、本発明は、水を含む液体中の１０ｎｍ〜１００ｎｍの粒子サイズ範囲を有するＡｕｘＰｔ１−ｘ（式中、ｘは０．９５〜０．０５の値を有する）ナノ粒子のコロイド状溶液を含むバイオコンジュゲートであって、ＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子は、該粒子上に吸着された複数の生体分子を有し、かつ略黒色を呈する、バイオコンジュゲートを含む。
【００４２】
少なくとも１つの実施形態において、生体分子は、タンパク質、抗体、ペプチド、オリゴマー、又はポリマーを含む。
【００４３】
少なくとも１つの実施形態において、生体分子は、ＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子上にＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子１マイクログラム当たりに２×１０１２個までの生体分子の量で吸着されている。
【００４４】
少なくとも１つの実施形態において、ＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子のコロイド状溶液は、２５℃で少なくとも３ヶ月間にわたりナノ粒子の凝集又は沈殿を伴わずに安定である。
【００４５】
少なくとも１つの実施形態において、本発明は、生体分子のためのアッセイであって、ａ）１０ｎｍ〜１００ｎｍの粒子サイズ範囲を有するＡｕｘＰｔ１−ｘ（式中、ｘは０．９５〜０．０５の値を有する）ナノ粒子を含み、ＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子が、該粒子上に吸着された複数の検出用生体分子を有するバイオコンジュゲートを準備する工程と、ｂ）上記生体分子を含む試料を上記バイオコンジュゲートに曝すことで、検出用生体分子を、ＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子に吸着させたままで生体分子に結合させる工程と、ｃ）光学的散乱を測定することによりＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子の存在を検出し、それにより上記試料中の生体分子の存在を検出する工程とを含む、アッセイを含む。
【００４６】
少なくとも１つの実施形態において、アッセイにおける生体分子は抗原を含み、かつ検出用生体分子は抗原に対する抗体である。
【００４７】
少なくとも１つの実施形態において、アッセイにおける生体分子はＲＮＡオリゴマーを含み、かつ検出用生体分子は生体分子と相補的なＲＮＡオリゴマーである。
【００４８】
少なくとも１つの実施形態において、アッセイにおける生体分子はＤＮＡオリゴマーを含み、かつ検出用生体分子は生体分子と相補的なＤＮＡオリゴマーである。
【００４９】
少なくとも１つの実施形態において、本発明は、水を含む液体中の１０ｎｍ〜１００ｎｍの粒子サイズ範囲を有するＡｕｘＰｔ１−ｘ（式中、ｘは０．９５〜０．０５の値を有する）ナノ粒子のコロイド状溶液であって、ＡｕｘＰｔ１−ｘナノ粒子は、純粋なＡｕ及び純粋なＰｔに関する（１１１）ピークの間に位置する１つの（１１１）ピークを有するＸ線回折パターンを示す、コロイド状溶液を含む。
【００５０】
上述の発明は、関連する法的基準に従って記載されており、したがってその記載は、限定的な性質のものではなく例示的な性質のものである。開示された実施形態に対する変形及び変更は当業者に明らかとなり、それらは本発明の範囲内に含まれ得る。したがって、本発明に与えられた法的な保護範囲は、添付の特許請求の範囲を検討することによってのみ決定され得る。
【図１】
2019523416.tif 000003
【図２（ａ）】
2019523416.tif 000004
【図２（ｂ）】
2019523416.tif 000005
【図３（ａ）】
2019523416.tif 000006
【図３（ｂ）】
2019523416.tif 000007
【図３（ｃ）】
2019523416.tif 000008
【図３（ｄ）】
2019523416.tif 000009
【図４】
2019523416.tif 000010
【図５（ａ）】
2019523416.tif 000011
【図５（ｂ）】
2019523416.tif 000012
【図６（ａ）】
2019523416.tif 000013
【図６（ｂ）】
2019523416.tif 000014
【国際調査報告】
2019523416.tif 000015