(57)【要約】  本発明は、以下の式（Ｉ）（式中、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４及びＰ５はアミノ酸残基である）の化合物に関する。  【化１】2019509323.tif 000065  また、本発明は、カスパーゼ−２阻害剤としての上記化合物の使用及びその治療的使用に関する。また、本発明は、カスパーゼ−２活性を選択的に検出するための活性依存型プローブとしての式（Ｉ）の化合物の使用に関する。
2019509323.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）で表される化合物またはその塩の１つであり、
前記式（Ｉ）で表される化合物は、全ての想定可能なラセミ体、鏡像異性体及びジアステレオマー異性体を含む化合物。
【化１】
2019509323.tif 000047
式中、
−Ｚ１は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基であり、
−Ｐ５は下記アミノ酸残基から選択され、
【化２】
2019509323.tif 000048
−Ｐ１及びＰ４は同一又は異なるものであり、下記アミノ酸残基から選択され、
【化３】
2019509323.tif 000049
（式中、Ｚ２及びＺ３は同一又は異なるものであり、水素原子及び（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基から選択される）
−Ｐ３は下記アミノ酸残基から選択され、
【化４】
2019509323.tif 000050
−Ｒ１は以下の式から選択され、
【化５】
2019509323.tif 000051
−Ｒ２は以下の式から選択される。
【化６】
2019509323.tif 000052
（式中、
・ｍは０、１又は２であり；
・ｐは１、２、３又は４であり；
・Ｚ４はハロゲン原子であり；
・ｑは０又は１であり；
・Ｚ５は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル及びフェニル基から選択され、該フェニル基はアミノ基で置換されていてもよく；
・Ｚ６、Ｚ７及びＺ１０は同一又は異なるものであり、水素原子、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、テトラヒドロキノリニル、及び−（ＣＨ２）ｉ−アリール基から選択され、ｉは０、１又は２であり、上記アリール基は１、２、３若しくは４個のハロゲン原子又は（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基で置換されていてもよく、
・Ｚ８及びＺ９は同一又は異なるものであり、ハロゲン原子及び（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基から選択される）
【請求項２】
以下の式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩の１つであり、
前記式（ＩＩ）で表される化合物は、全ての想定可能なラセミ体、鏡像異性体及びジアステレオマー異性体を含む請求項１に記載の化合物。
【化７】
2019509323.tif 000053
式中、
−Ｒ１、Ｒ２及びＺ１は請求項１に記載の前記式（Ｉ）で定義された通りであり；
−Ｒ３は、-ＣＨ３、-ＣＨ（ＣＨ３）２、-ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２及び-ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３基から選択され；
−Ａ及びＢは同一又は異なるものであり、窒素原子及び−ＣＨ−基から選択され、
−Ｒ５及びＲ６は同一又は異なるものであり、水素原子及び（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基から選択され；
−Ｒ４は、-ＣＨ３、-ＣＨ（ＣＨ３）２、-ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、-ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３及び-（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｈ基から選択される。
【請求項３】
前記式（ＩＩ）で表される化合物のＡ及びＢうちの少なくとも１つが−ＣＨ基であり、好ましくはＡ及びＢが−ＣＨ基である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
以下の式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩の１つであり、
前記式（ＩＩＩ）で表される化合物は、全ての想定可能なラセミ体、鏡像異性体及びジアステレオマー異性体を含む請求項１から３のいずれか１項に記載の化合物。
【化８】
2019509323.tif 000054
式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＺ１は請求項１に記載の前記式（Ｉ）で定義された通りである。
【請求項５】
以下の式（ＩＶ）で表される化合物またはその塩の１つであり、
前記式（ＩＶ）で表される化合物は、全ての想定可能なラセミ体、鏡像異性体及びジアステレオマー異性体を含む請求項１から４のいずれか１項に記載の化合物。
【化９】
2019509323.tif 000055
式中、
Ｒ１及びＲ２は請求項１に記載の前記式（Ｉ）で定義された通りである。
【請求項６】
前記Ｒ１が以下の式で表される請求項１から５のいずれか１項に記載の化合物。
【化１０】
2019509323.tif 000056
【請求項７】
前記Ｒ２が以下の式から選択される請求項１から６のいずれか１項に記載の化合物。
【化１１】
2019509323.tif 000057
（式中、Ｚ’はフッ素原子であり、ｊは０、１又は２であり、好ましくはＲ２が以下の式で表される。
【化１２】
2019509323.tif 000058
【請求項８】
少なくとも１つ、好ましくは少なくとも３つの（Ｓ）立体配置の不斉炭素原子を有し、更に好ましくは全ての不斉炭素原子が（Ｓ）立体配置である、請求項１から７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
以下の式から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【化１３】
2019509323.tif 000059
（該化合物は、好ましくは以下の式で表される。）
【化１４】
2019509323.tif 000060
【請求項１０】
選択的カスパーゼ−２阻害剤として使用される請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ２が、以下の式から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の少なくとも１種の化合物と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含有する医薬組成物。
【化１５】
2019509323.tif 000061
（式中、ｍ、ｐ、ｑ、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９及びＺ１０は請求項１に記載の前記式（Ｉ）で定義された通りである）
【請求項１２】
Ｒ２が、以下の式から選択される、医薬として使用される請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【化１６】
2019509323.tif 000062
（式中、ｍ、ｐ、ｑ、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９及びＺ１０は請求項１に記載の式（Ｉ）で定義された通りである）
【請求項１３】
Ｒ２が、以下の式から選択される、カスパーゼ−２活性が関与する疾患及び／又は傷害の予防及び／又は治療に使用するための請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【化１７】
2019509323.tif 000063
（式中、ｍ、ｐ、ｑ、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９及びＺ１０は請求項１に記載の式（Ｉ）で定義された通りである）
【請求項１４】
細胞死を伴う病態、特にアルツハイマー病、ハンチントン病及びパーキンソン病等の慢性退行性疾患；新生児脳障害、特に新生児脳虚血；外傷性脳障害；腎虚血；低酸素性（Ｈ−Ｉ）虚血；脳卒中様状況の脳障害；心虚血；心筋梗塞；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；網膜障害；虚血性視神経症及び緑内障等の眼疾患；皮膚損傷；糖尿病、アテローム性動脈硬化症、心虚血、痛風、偽痛風、関節のゆるみ、アテローム性動脈硬化症、アルミニウム塩に誘発される症候群、非動脈性前部虚血性視神経症（ＮＡＩＯＮ）、緑内障、代謝疾患等の無菌性炎症性疾患；細菌感染、特に孔形成毒素を産生する細菌による感染、インフルエンザウイルス感染及び一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡ、例えばマラバウイルス又は水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）等のラブドウイルス感染のような非無菌性炎症性疾患；ブルセラ、黄色ブドウ球菌及びサルモネラ等の病原菌に起因する疾患；肥満症；メタボリックシンドローム；及び非アルコール性脂肪性肝疾患の予防及び／又は治療に使用するための、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ２が、以下の式から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物の活性依存型プローブとしての使用。
【化１８】
2019509323.tif 000064
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カスパーゼ−２の選択的阻害剤として有用な新規化合物に関する。また、本発明は上記化合物の治療的使用、及びカスパーゼ−２に対する活性依存型プローブ（ＡＢＰ）としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
カスパーゼは、ペプチド基質の開裂の開始時にシステイン残基を使用する細胞内エンドプロテアーゼのファミリーである。カスパーゼは、炎症の調節における重要な意味とともに、アポトーシスによってプログラムされた細胞死の制御における重要な役割を有することが広く知られている。
【０００３】
カスパーゼは、２つの主な群：炎症過程の調整に関与するもの（−１、−４、−５、−１１、−１２）と、アポトーシスの開始及び実行において中心となるものに分類されている。アポトーシスカスパーゼには２つの群、すなわち長いＮ−末端プロドメインを有する「イニシエータ」（カスパーゼ−２、−８、−９、−１０）と、アポトーシスの「エグゼクター」である、短いプロドメイン（２０〜３０残基）を有するもの（カスパーゼ−３、−６、−７）がある。炎症及びアポトーシスの開始に関与するカスパーゼは、「細胞死エフェクタードメイン」（ＤＥＤ）及び「カスパーゼ誘引ドメイン」（ＣＡＲＤ）のようなアポトーシスシグナルの伝達に関与する構造単位を有している。これらのドメインの各々により、他のタンパク質パートナーとの同型相互作用が可能となる。
【０００４】
カスパーゼの酵素特性は、システインがペプチド結合の切断開始のための求核剤として作用する触媒性二分子（システイン、ヒスチジン）の存在に影響される。カスパーゼの活性部位、ペプチド配列ＱＡＣＸＧ（Ｘは、アルギニン（Ｒ）、グルタミン（Ｑ）又はグリシン（Ｇ）である）中に含まれる触媒性システインと、アスパラギン酸残基後の基質切断の特異性を付与し、セリンプロテアーゼグランザイムＢを除いて哺乳類プロテアーゼの中では独特である塩基性サブサイト（Ｓ１）とは高度に保存されている。一般に、カスパーゼは、酵素のサブサイトＳ１−Ｓ４によってそれぞれ認識される、切断可能な結合のＮ−末端のテトラペプチドモチーフＰ１−Ｐ４を認識する。下流に位置するアスパラギン酸（Ｐ’１及びＰ’２）も、カスパーゼの認識及び特異性に関与している。
【０００５】
カスパーゼは、優先的に認識する基質ペプチド配列に基づいて３つのグループに分類される。グループＩカスパーゼ（−１、−４及び−５）はＰ４中の疎水性残基を優先的に認識する。グループＩＩの酵素（−２、−３、−７）は、この位置でアスパラギン酸を非常に優先的に認識するが、グループＩＩＩ（−６、−８、−９、−１０）は低分子量の脂肪族鎖Ｐ４を優先的に認識する。グループＩＩでは、カスパーゼ−２は独特の認識様式を有している。実際、その触媒活性を発揮するためには、Ｐ５部位（好ましくはロイシン、イソロイシン、バリンまたはアラニン）の残基の認識が必要である。また、カスパーゼ−３及び−７は必須でない方法でＰ５残基を認識する。
【０００６】
最初にＮｅｄｄ−２と命名されたマウスの「神経前駆細胞発現発生的ダウンレ牛レート２」、ヒトのＩｃｈ−１、ＩＣＥ及びＣＥＤ３相同体、遺伝子ＣＡＳＰ２（染色体７ｑ３４−ｑ３５）によりコードされるカスパーゼ−２は、この酵素ファミリーの中でも最も保存されたメンバーである。その活性は、ヒトの神経発達中に細かく調節されている。アポトーシス促進性のカスパーゼ−２アイソフォーム２Ｌ、及び抗アポトーシス性の２Ｓアイソフォーム（切断型）の２つのアイソフォームが存在する。アイソフォーム２Ｌはほとんどの組織において優勢な形態であるが、アイソフォーム２Ｓは、脳、骨格筋及び心臓において同様のレベルで発現される。
【０００７】
カスパーゼ−２は、他のカスパーゼを十分に分解しないが、ミトコンドリア外膜透過を開始することができ、熱ショック、ＤＮＡ損傷、ミトコンドリア酸化ストレス、及び細胞骨格破壊を含む多様なストレス誘導シグナル伝達経路を調節するイニシエータカスパーゼとして作用する。
【０００８】
アポトーシス以外に、カスパーゼ−２は酸化的ストレスの調節に関与している。例えば、高齢のＣａｓｐ−２−／−マウスは、スーパーオキシドジスムターゼ及びグルタチオンペルオキシダーゼ活性の低下を示す。ある特定の環境においては、カスパーゼ−２は腫瘍抑制因子として作用し得る。実際、（Ｅμ−Ｍｙｃ遺伝子導入マウスモデルにおけるような）発癌性ストレスの下で、カスパーゼ−２欠損は腫瘍形成を増強する。最近のデータも、カスパーゼ−２がオートファジーを阻害する可能性を示唆している
【０００９】
カスパーゼ−２の遺伝的阻害は、低酸素虚血性又は興奮毒性曝露にさらされた新生仔マウスにおいて神経保護的であることがわかった。これは、周産期脳傷害の病態生理にカスパーゼ２仲介細胞死が関与する可能性があることを示唆している（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２０１１，７０（５）：７８１−９）。更に、カスパーゼ−２の遺伝的阻害により眼の神経保護が付与されている（Ａｍｈｅｄ  Ｚら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ．２０１１  Ｊｕｎ  １６；２：ｅ１７３）。
【００１０】
アルツハイマー病の細胞モデルにおいて（Ｃａｒｏｌ  Ｍ．Ｔｒｏｙら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １５，２０００，２０（４）：１３８６−１３９２）、カスパーゼ−２は、アミロイドペプチドＡβにより誘導される神経細胞死の重要なエフェクターである（Ｒｉｂｅ  ＥＭら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２０１２  ４４４（３）：５９１−９）。
【００１１】
更に、Ｐｏｚｕｅｔａら（Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１３；４：１９３９）はアミロイド前駆体タンパク質遺伝子導入マウスを使用し、
（ｉ）カスパーゼ−２が、このアルツハイマー動物モデルにおける認知機能低下に必要であり、
（ｉｉ）カスパーゼ−２を欠損している培養海馬ニューロンが、Ａβのシナプス毒性効果に対して免疫性があり、
（ｉｉｉ）カスパーゼ−２が、ＲｈｏＡ／ＲＯＣＫ−ＩＩシグナル伝達経路の活性化における重要なメディエーターであり、樹状突起棘の崩壊をもたらすことを示し、したがって、カスパーゼ−２は、アルツハイマー病におけるシナプス機能不全の重要な要因であることが示唆された。
【００１２】
また、カスパーゼ−２は、肥満、メタボリックシンドローム及び非アルコール性脂肪肝疾患を促進すると考えられる。実際、カスパーゼ−２欠損マウスは、このような状態から保護されていることが示されている（Ｍａｃｈａｄｏ  ＭＶら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ．２０１６  Ｆｅｂ  １８；７：ｅ２０９６）。
【００１３】
第一世代のカスパーゼ阻害剤は、可逆的にカスパーゼを阻害するアルデヒドペプチドであった。Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ（カスパーゼ−３及びカスパーゼ−７の優先的阻害剤）及びＡｃ−ＶＤＶＡＤ−ＣＨＯ（カスパーゼ−２、−３及び−７の優先的阻害剤）を含むカスパーゼファミリーのある種のメンバーが優先的に効果を発揮すると考えられるいくつかの配列が開発された。
【００１４】
第二世代のカスパーゼ阻害剤では、アルデヒド基は、フルオロメチルケトン基（ｆｍｋ）を有するα置換ケトンに置換されている。この種の阻害剤は、活性部位システインとの付加物を形成することによって酵素を不活性化する。Ｚ（ベンジルオキシルカルボニル）−ＶＡＤ−ｆｍｋは、この世代の広域スペクトル阻害剤である。これらの分子は、特に肝臓におけるフルオロアセテート基の放出がアコニターゼの阻害をもたらすので、インビボで毒性である。したがって、ｆｍｋ基を有する阻害剤の開発は、その肝毒性のために前臨床段階で断念された。次いで、当該技術分野において、いくつかのカスパーゼ阻害剤が合成されている（Ｐｏｒｅｂａら、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．２０１５  Ｎｏｖ  ２５；１１５（２２）：１２５４６−６２９）。特に、カスパーゼ−２活性を阻害し得る化合物は、例えばＷＯ  ２００５／１０５８２９及びＥＰ２６７０７７４に報告されている。しかし、これらの公知のカスパーゼ−２阻害剤はカスパーゼ−３に対しても非常に高い活性を有する。したがって、上記化合物は選択的カスパーゼ−２阻害剤としての能力を有し得ない。
【００１５】
最近になって、一連の可逆的なカスパーゼ−２阻害剤が報告されている。インビトロでヒト組換えカスパーゼで評価した場合、これらの化合物はカスパーゼ−２を優先的に阻害することがわかったが、インビボでの使用と適合しない細胞アッセイ及び構造特性において中程度の効果を有していた（Ｍａｉｌｌａｒｄら、Ｂｉｏｒｇａｎｉｃ  ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９（２０１１）５８３３−５８５１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際公開第２００５／１０５８２９号
【特許文献２】欧州特許出願公開第２６７０７７４号明細書
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ２０１１，７０（５）：７８１−９
【非特許文献２】Ａｍｈｅｄ  Ｚら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ．２０１１  Ｊｕｎ  １６；２：ｅ１７３
【非特許文献３】Ｃａｒｏｌ  Ｍ．Ｔｒｏｙら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １５，２０００，２０（４）：１３８６−１３９２
【非特許文献４】Ｒｉｂｅ  ＥＭら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２０１２  ４４４（３）：５９１−９
【非特許文献５】Ｐｏｚｕｅｔａら、Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１３；４：１９３９
【非特許文献６】Ｍａｃｈａｄｏ  ＭＶら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ．２０１６  Ｆｅｂ  １８；７：ｅ２０９６
【非特許文献７】Ｐｏｒｅｂａら、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．２０１５  Ｎｏｖ  ２５；１１５（２２）：１２５４６−６２９
【非特許文献８】Ｍａｉｌｌａｒｄら、Ｂｉｏｒｇａｎｉｃ  ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９（２０１１）５８３３−５８５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、カスパーゼ−３に対する活性が有意に低下した、強力かつ選択的なカスパーゼ−２阻害剤の必要性が依然として存在している。特に、新生児脳虚血、心臓虚血及びアルツハイマー病等の慢性退行性疾患のようなカスパーゼ−２活性が関与する疾患及び／または傷害の予防及び／または治療に用いるための、より選択的で効率的なカスパーゼ−２阻害剤を提供することが非常に有利であろう。
【００１９】
また、カスパーゼ−２活性を特異的に検出するための活性依存型プローブとして使用するための、より有効かつ選択的なカスパーゼ−２阻害剤を提供することも非常に有利であろう。
【００２０】
本発明の化合物は、これらの必要性を満たすことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
したがって、その態様の１つによれば、本発明は、式（Ｉ）：
【００２２】
【化１】
2019509323.tif 000003
（式中、
−Ｚ１は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基であり；
−Ｐ５は下記アミノ酸残基から選択され、
【００２３】
【化２】
2019509323.tif 000004
−Ｐ１及びＰ４は同一又は異なるものであり、下記アミノ酸残基から選択され、
【００２４】
【化３】
2019509323.tif 000005
（式中、Ｚ２及びＺ３は同一又は異なるものであり、水素原子及び（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基から選択される）
−Ｐ３は下記アミノ酸残基から選択され、
【００２５】
【化４】
2019509323.tif 000006
−Ｒ１は
【００２６】
【化５】
2019509323.tif 000007
から選択され、
−Ｒ２は
【００２７】
【化６】
2019509323.tif 000008
（式中、
・ｍは０、１又は２であり；
・ｐは１、２、３又は４であり；
・Ｚ４はハロゲン原子であり；
・ｑは０又は１であり；
・Ｚ５は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル及びフェニル基から選択され、該フェニル基はアミノ基で置換されていてもよく；
・Ｚ６、Ｚ７及びＺ１０は同一又は異なるものであり、水素原子、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、テトラヒドロキノリニル、及び−（ＣＨ２）ｉ−アリール基から選択され、ｉは０、１又は２であり、上記アリール基は１、２、３若しくは４個のハロゲン原子又は（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基で置換されていてもよく、
・Ｚ８及びＺ９は同一又は異なるものであり、ハロゲン原子及び（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基から選択される）から選択され；
式（Ｉ）の前記化合物は、全ての想定可能なラセミ体、鏡像異性体及びジアステレオマー異性体である、化合物又はその塩の一つに関する。
【００２８】
広範な研究の後、本発明者は、上記式（Ｉ）の化合物が、以下の実施例に示されるように、カスパーゼ−２活性の選択的かつ効果的な阻害剤として作用することを見出した。
【００２９】
実際、本発明の化合物は、カスパーゼ−３を阻害するよりも、より効率的にカスパーゼ−２を阻害する。
【００３０】
特に、以下の実施例に示すように、本発明のいくつかの化合物は、カスパーゼ３に対する阻害効果よりも、カスパーゼ−２に対して少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍、さらにより好ましくは少なくとも１５倍高い阻害効果を示す。
【００３１】
カスパーゼ−２及びカスパーゼ−３に対する本発明の化合物の阻害効果は、ヒト組換え型カスパーゼを用いる動力学的アプローチによって評価することができる。不可逆的阻害剤については、実施例２に示される方法を用いてＫｉｎａｃｔ／ＫＩ比を測定する。可逆的阻害剤についてはｋｉを測定する。
【００３２】
さらに、上記阻害剤のいくつかが不可逆的であるという事実は、このタイプの阻害剤が、ターンオーバーとも呼ばれるタンパク質再合成の通常の速度によってのみ制限されるカスパーゼ−２の持続的な抑制において使用し得るので、非常に有利である。
【００３３】
本発明に意味において：
−「カスパーゼ阻害剤」は、前記阻害剤なしで測定された前記活性と比較し、目標とするカスパーゼの活性を低下又は抑制する化合物を意味することを意図する。
−「選択的カスパーゼ−２阻害剤」は、他のカスパーゼ、特にカスパーゼ−３の活性よりもカスパーゼ−２の活性を低下させる化合物を意味することを意図する。
【００３４】
したがって、第２の態様によれば、本発明は選択的カスパーゼ−２阻害剤としてのその使用のための本発明の化合物に関する。
【００３５】
一実施態様によれば、本発明の化合物のＲ２基は、
【００３６】
【化７】
2019509323.tif 000009
（式中、ｍ、ｐ、ｑ、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９及びＺ１０は上記で定義した通りである。）から選択される。
【００３７】
上記化合物は、有利には医薬組成物中に導入することができる。上記化合物は医薬として使用することができる。更に具体的には、上記化合物は、カスパーゼ−２活性が関与する疾患及び／又は傷害の予防及び／又は治療において使用することができる。
【００３８】
本発明の目的では、「予防」という用語は、所与の現象、すなわち本発明において、カスパーゼ−２活性が関与する疾患及び／又は障害の発現のリスクを少なくとも部分的に低減することを意味する。部分的な減少は、リスクが残っているが、本発明を実施する前よりも程度は低いことを意味する。
【００３９】
本発明の目的では、「治療」という用語は、所与の現象、すなわち、本発明において、前記所定の現象の減少、最小化、または低減を含む、カスパーゼ−２活性が関与する疾患及び／又は障害を完全または部分的に治癒することを意味することを意図する。
【００４０】
したがって、第３の態様によれば、本発明は、Ｒ２が上記で定義されている少なくとも１種の本発明の化合物と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【００４１】
第４の態様によれば、本発明は、医薬として使用するための、Ｒ２が上記で定義されている本発明の化合物に関する。
【００４２】
第５の態様によれば、本発明は、カスパーゼ−２活性が関与する疾患及び／又は障害の予防及び／又は治療に使用するための、Ｒ２が前記で定義されている本発明の化合物に関する。
【００４３】
他の実施態様によれば、本発明の化合物のＲ２基は
【００４４】
【化８】
2019509323.tif 000010
から選択される。
【００４５】
上記化合物は、有利にはカスパーゼ−２活性を選択的に検出するための活性依存型プローブとして使用することができる。
【００４６】
したがって、第６の態様によれば、本発明は、Ｒ２が前記で定義されている本発明の化合物のカスパーゼ−２活性を選択的に検出するための活性依存型プローブとしての使用に関する。
【００４７】
本発明の関連で、以下の略語及び実験式が使用される。
−Ｂｏｃ  Ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
−℃  セ氏温度
−Ｍｅ  メチル
−Ｂｎ  ベンジル
−ＡＭＣ  ７−アミノ−４−メチルクマリン
−ＰＢＳ  リン酸緩衝食塩水
−Ａｃ  アセチル
−ＲＦＵ  相対蛍光単位
−ＨＥＰＥＳ  ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
−ＤＯＴ  ジチオスレイトール
−ＥＤＴＡ  エチレンジアミン四酢酸
−ＣＨＡＰＳ  （３−（（３−コラミドプロピル）ジメチルアミノ）−１−プロパンスルホン酸
−ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
【００４８】
本発明で使用されるアミノ酸残基の略号は、標準的なポリペプチド命名法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４３：３５５２−５９（１９６９））に従い、以下の通りである：
−Ａ  アラニン
−Ｖ  バリン
−Ｄ  アスパラギン酸
−Ｅ  グルタミン酸
【００４９】
さらに、上記略語を使用することによって本発明において表されるすべてのアミノ酸残基配列において、左及び右の配向は、アミノ末端からカルボキシ末端への従来の方向であることに留意すべきである。
【００５０】
したがって、本発明のペプチドを定義する式において、Ｒ１−Ｐ５Ｐ４Ｐ３−又は−Ｐ１−Ｒ２のようなアミノ酸の配列が示されている場合、以下のことが明らかである：
（ｉ）Ｐ５アミノ酸残基の
【００５１】
【化９】
2019509323.tif 000011
部がＲ１と結合しており；
Ｐ４アミノ酸残基の一方がＰ５アミノ酸残基と結合しており；
Ｐ３アミノ酸残基の一方がＰ４アミノ酸残基と結合しており；
Ｐ１アミノ酸残基の一方が、式（Ｉ）に表わされるようにＲ２の反対側で
【００５２】
【化１０】
2019509323.tif 000012
と結合しており；
（ｉｉ）
Ｐ５アミノ酸残基の
【００５３】
【化１１】
2019509323.tif 000013
部がＰ４アミノ酸残基と結合しており
Ｐ４アミノ酸残基の一方がＰ３アミノ酸残基と結合しており；
Ｐ３アミノ酸残基の一方が、式（Ｉ）に表わされるようにＰ４アミノ酸残基の反対側で
【００５４】
【化１２】
2019509323.tif 000014
と結合しており；
Ｐ１アミノ酸残基の一方がＲ２と結合している。
【発明の効果】
【００５５】
本発明よれば、特に、新生児脳虚血、心臓虚血及びアルツハイマー病等の慢性退行性疾患のようなカスパーゼ−２活性が関与する疾患及び／または傷害の予防及び／または治療に用いるための、より選択的で効率的なカスパーゼ−２阻害剤を提供することができる。
また、カスパーゼ−２活性を特異的に検出するための活性依存型プローブとして使用するための、より有効かつ選択的なカスパーゼ−２阻害剤を提供することができる。
【００５６】
本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明、非限定的な例として与えられる以下の実施例、及び図１からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は試験を行った細胞に適用された処理による死細胞の割合を示すグラフである（状況Ａ〜Ｅは、ビンクリスチンを細胞に単独で（２０ｎＭ）適用し（状況Ａ）、又は種々の量の本発明の化合物２を組み合わせて適用した（状況Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥについて、それぞれ３、１０、３０及び６０μＭ）及びコントロール（未処理））。（％±Ｓ．Ｄ．；ｎ＝３）
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本発明の化合物
上述したように、本発明の化合物は
式（Ｉ）：
【００５９】
【化１３】
2019509323.tif 000015
（式中、
−Ｚ１は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基であり；
−Ｐ５は下記アミノ酸残基から選択され、
【００６０】
【化１４】
2019509323.tif 000016
−Ｐ１及びＰ４は同一又は異なるものであり、下記アミノ酸残基から選択され、
【００６１】
【化１５】
2019509323.tif 000017
（式中、Ｚ２及びＺ３は同一又は異なるものであり、水素原子及び（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基から選択される）
−Ｐ３は下記アミノ酸残基から選択され、
【００６２】
【化１６】
2019509323.tif 000018
−Ｒ１は
【００６３】
【化１７】
2019509323.tif 000019
から選択され、
−Ｒ２は
【００６４】
【化１８】
2019509323.tif 000020
（式中、
・ｍは０、１又は２であり；
・ｐは１、２、３又は４であり；
・Ｚ４はハロゲン原子であり；
・ｑは０又は１であり；
・Ｚ５は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル及びフェニル基から選択され、該フェニル基はアミノ基で置換されていてもよく；
・Ｚ６、Ｚ７及びＺ１０は同一又は異なるものであり、水素原子、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、テトラヒドロキノリニル、及び−（ＣＨ２）ｉ−アリール基から選択され、ｉは０、１又は２であり、上記アリール基は１、２、３若しくは４個のハロゲン原子又は（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基で置換されていてもよく、
・Ｚ８及びＺ９は同一又は異なるものであり、ハロゲン原子及び（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基から選択される）から選択され；
式（Ｉ）の上記化合物は、全ての想定可能なラセミ体、鏡像異性体及びジアステレオマー異性体である、化合物又はその塩の一つに関する。
【００６５】
したがって、本発明の化合物は、いくつかの不斉炭素原子を含む。したがって、本発明の化合物は、鏡像異性体又はジアステレオ異性体の形態で存在し得る。これらの鏡像異性体及びジアステレオ異性体、ならびにラセミ混合物を含むそれらの混合物は、本発明の一部を形成する。
【００６６】
また、本発明の化合物は、塩基又は酸付加塩の形態で存在することもできる。これらの塩は、薬学的に許容される酸で調製することができるが、例えば式（Ｉ）の化合物を精製又は単離するのに有用な他の酸の塩も本発明の一部を形成する。
【００６７】
「薬学的に許容される」という用語は、一般的に安全、非毒性、かつ生物学的にもその他の点でも望ましくないものではない医薬組成物を調製するのに有用なものを意味し、獣医学及びヒトの医薬用途に許容できるものを含む。
【００６８】
また、本発明の化合物は、水和物又は溶媒和物の形態、すなわち１又は複数の水分子又は溶媒との会合または組み合わせの形態で存在してもよい。このような水和物及び溶媒和物も本発明の一部を形成する。
【００６９】
本発明の関連で、以下の定義が適用される：
−ハロゲン原子：フッ素、塩素、臭素又はヨウ素原子。ハロゲン原子は特にフッ素原子であってもよい。
−Ｃｔ−ＣＺ：おそらくｔ〜ｚの炭素原子を含み、ｔ及びｚが１〜１０の値をとり得る炭素系鎖；例えば、Ｃ１〜Ｃ３は、おそらく１〜３個の炭素原子を含有する炭素系鎖。
−アルキル：特に１〜６個の炭素原子を含む直鎖状又は分岐状飽和脂肪族基。言及され得る例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル等が挙げられる。
−アルコキシ：アルキル基が前記に定義した通りであるＯ−アルキル基。
−アリール：５〜１０個の炭素原子、特に６〜１０個の炭素原子を含む単環式又は二環式の芳香族基。アリール基の例としては、フェニル基又はナフチル基が挙げられる。好ましくは、アリール基はフェニルである。
【００７０】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物のうち、化合物のサブグループは、式（ＩＩ）の化合物によって構成される：
【００７１】
【化１９】
2019509323.tif 000021
（式中、
−Ｒ１、Ｒ２及びＺ１は式（Ｉ）で定義された通りであり；
−Ｒ３は、-ＣＨ３、-ＣＨ（ＣＨ３）２、-ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２及び-ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３基から選択され；
−Ａ及びＢは同一又は異なるものであり、窒素原子及び−ＣＨ−基から選択され、
−Ｒ５及びＲ６は同一又は異なるものであり、水素原子及び（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基から選択され；
−Ｒ４は、-ＣＨ３、-ＣＨ（ＣＨ３）２、-ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、-ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３及び-（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｈ基から選択され；
式（ＩＩ）の前記化合物は、全ての想定可能なラセミ体、鏡像異性体及びジアステレオマー異性体である。）
【００７２】
好ましくは、式（ＩＩ）において、Ａ及びＢの少なくとも１つは−ＣＨ基であり、より好ましくはＡ及びＢは−ＣＨ基である。
【００７３】
本発明の好ましい様式によれば、本発明の化合物は式（ＩＩＩ）又はその塩の一つであってもよい。
【００７４】
【化２０】
2019509323.tif 000022
（式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＺ１は式（Ｉ）で定義された通りである。）
式（ＩＩＩ）の前記化合物は、全ての想定可能なラセミ体、鏡像異性体及びジアステレオマー異性体である。
【００７５】
好ましい実施態様によれば、本発明の化合物は式（ＩＶ）又はその塩の一つであってもよい。
式（ＩＶ）：
【００７６】
【化２１】
2019509323.tif 000023
（式中、
Ｒ１及びＲ２は式（Ｉ）で定義された通りである。）
式（ＩＶ）の上記化合物は、全ての想定可能なラセミ体、鏡像異性体及びジアステレオマー異性体である。
【００７７】
他の好ましい実施態様によれば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び／又は（ＩＶ）において、Ｒ１は
【００７８】
【化２２】
2019509323.tif 000024
である。
【００７９】
他の好ましい実施態様によれば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び／又は（ＩＶ）において、Ｒ２は
【００８０】
【化２３】
2019509323.tif 000025
（式中、Ｚ’はフッ素原子であり、ｊは０、１又は２である）である。
【００８１】
好ましくは、Ｒ２は
【００８２】
【化２４】
2019509323.tif 000026
である。
【００８３】
好ましい実施態様によれば、本発明の化合物は、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも３つの（Ｓ）立体配置の不斉炭素原子を有する。更に好ましくは、本発明の化合物の全ての不斉炭素原子が（Ｓ）立体配置である。
【００８４】
本発明の一般式（Ｉ）の化合物のうち、特に以下の化合物を挙げることができる：
【００８５】
【表１】
2019509323.tif 000027
【００８６】
好ましくは、一般式（Ｉ）の化合物は
【００８７】
【化２５】
2019509323.tif 000028
である。
【００８８】
本発明の化合物の調製
本発明の化合物は、有機合成及びペプチド合成によって調製することができる。ペプチド合成による構造の構築は、当業者の一般的知識に属し、更なる詳細は、Ｌｉｎｔｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５，４８，６７７９−６７８２及びＣｈａｕｖｉｅｒら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ  ２０１１，２：ｅ２０３に開示されている。本発明の化合物をもたらすＲ１、Ｒ２、Ｐ１、Ｐ３、Ｐ４及びＰ５の前駆体は、方法の種々の工程で導入される。
【００８９】
前駆体は、市販製品、又は当業者にとって周知のプロトコルによって官能基が付された市販製品のいずれかであってもよい。更なる詳細及び参考文献は「Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｃａｓｐａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｇｅｎｔｓ；ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ；ＣＲＣ  Ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｅｄｉｒｅｄ  ｂｙ  Ｔｏｍ  Ｏ´Ｂｒｉｅｎ  ＆  Ｓｔｅｖｅｎ  Ｄ．Ｌｉｎｔｏｎ  ｃｈａｐｔｅｒ  ７  ｂｙ  ＢＲ  Ｕｌｌｍａｎ．であり得る。
【００９０】
特に、本発明の実施例１は、本発明の化合物２の調製のプロトコルを例示する。
【００９１】
応用
前記に明記し、以下の実施例によって明らかに示されるように、本発明の化合物は選択的カスパーゼ−２阻害剤として有用である。
【００９２】
実際、実施例で指摘されるように、本発明の化合物は、カスパーゼ−３よりもカスパーゼ−２についての阻害効果が優れていることが示される。結果として、それらはカスパーゼ−３に関して選択的にカスパーゼ−２を阻害するのに効率的である。
【００９３】
ａ）治療分野
上記の観点から、本発明の化合物、特に、Ｒ２基が
【００９４】
【化２６】
2019509323.tif 000029
（式中、ｍ、ｐ、ｑ、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９及びＺ１０は前記で定義された通りである）から選択される化合物は治療分野で使用することができる。
【００９５】
したがって、その態様の１つによれば、本発明は、医薬、特にカスパーゼ−２を選択的に阻害することが意図される医薬に使用するための、Ｒ２が前記で定義された通りである化合物に関する。
【００９６】
言い換えると、本発明は、医薬、特にカスパーゼ−２を選択的に阻害ための医薬の調製のための、Ｒ２が前記で定義された通りである本発明の化合物の使用に関する。
【００９７】
言い換えると、本発明は、Ｒ２が前記で定義された通りである、少なくとも１種の本発明の化合物を含む医薬、特にカスパーゼ−２を選択的に阻害するための医薬に関する。
【００９８】
したがって、他の態様によれば、本発明は、カスパーゼ−２活性が関与する疾患及び／又は障害の予防及び／又は治療に使用するための、Ｒ２が前記で定義された通りである本発明の化合物に関する。
【００９９】
言い換えると、本発明は、カスパーゼ−２活性が関与する疾患及び／又は障害の予防及び／又は治療を意図する医薬の調製のための、Ｒ２が前記で定義された通りである本発明の化合物に関する。
【０１００】
特に、前記疾患及び／又は障害は、細胞死を伴う病状、特に以下から選択することができる：
−アルツハイマー病、ハンチントン病及びパーキンソン病等の慢性退行性疾患；
−新生児脳障害、特に新生児脳虚血；
−外傷性脳障害；
−腎虚血；
−低酸素性（Ｈ−Ｉ）虚血；
−脳卒中様状況の脳障害；
−心虚血；
−心筋梗塞；
−筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；
−網膜障害；
−虚血性視神経症及び緑内障等の眼疾患；
−皮膚損傷；
−糖尿病、アテローム性動脈硬化症、心虚血、痛風、偽痛風、関節のゆるみ、アテローム性動脈硬化症、アルミニウム塩に誘発される症候群、非動脈性前部虚血性視神経症（ＮＡＩＯＮ）、緑内障、代謝疾患等の無菌性炎症性疾患；
−細菌感染、特に孔形成毒素を産生する細菌による感染、インフルエンザウイルス感染及び一本鎖（ｓｓ）ＲＮＡ、例えばマラバウイルス又は水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）等のラブドウイルス感染のような非無菌性炎症性疾患；
−ブルセラ、黄色ブドウ球菌及びサルモネラ等の病原菌に起因する疾患；
−肥満症；
−メタボリックシンドローム；及び
−非アルコール性脂肪性肝疾患
【０１０１】
より詳細には、前記疾患及び／又は障害は慢性退行性疾患から選択される。好ましくは、それらはアルツハイマー病、ハンチントン病及びパーキンソン病の中から、特にはアルツハイマー病から選択される。
【０１０２】
他の態様によれば、本発明は、Ｒ２が前記で定義された通りである本発明の化合物の少なくとも１種の少なくとも有効量を予防及び／又は治療を必要とする個体に投与する工程を少なくとも含む、カスパーゼ−２活性が関与する疾患及び／又は障害を予防及び／又は治療する方法に関する
【０１０３】
他の態様によれば、本発明は、Ｒ２が前記で定義された通りである本発明の化合物の少なくとも１種と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【０１０４】
本発明の医薬組成物は、より詳細には、Ｒ２が前記で定義された通りである本発明の化合物の少なくとも１種の有効量を含有し得る。
【０１０５】
「有効量」とは、制御または治療をする状態のプラスの改善を誘発するのに十分であるが、重篤な副作用を避けるのに十分に低い量を意味する。有効量は、得られる医薬作用、または治療する特定の状態、最終使用者の年齢及び健康状態、治療／予防される状態の重症度、治療の期間、他の治療の性質、用いられる特定の化合物もしくは生成物／組成物、投与経路、及び同様の要因によって変化し得る。
【０１０６】
Ｒ２が前記で定義された通りである本発明の式（Ｉ）の化合物は、当該技術分野で認められているいずれかの様式により有効量を投与することができる。
【０１０７】
一実施態様では、本化合物は、経口、経鼻、舌下、眼科用、局所、直腸、経膣、経尿道、非経口投与により投与することが意図される組成物で使用することができる。
【０１０８】
投与経路及びガレヌス製剤は、所望の薬学的効果に従って、当業者によって適合されるであろう。
【０１０９】
当業者は、過度の実験及び個人的な知識に依拠することなく、所与の適応症に対する本発明の化合物の治療上有効な用量を確認することができるであろう。
【０１１０】
本発明の医薬組成物は、投与量、ガレヌス形態、投与経路等に応じて、任意の既知の適切な薬学的に許容される賦形剤と共に製剤化することができる。
【０１１１】
本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される賦形剤」には、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等が含まれる。任意の従来の賦形剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、本発明の医薬又は医薬組成物におけるその使用が意図される。
【０１１２】
本発明の医薬又は医薬組成物は、錠剤、丸剤、散剤、ロゼンジ剤、サシェ剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、溶液剤、シロップ剤、エアゾール、スプレー剤、軟膏剤、ゲル剤、クリーム剤、スティック、ローション剤、ペースト剤、軟質及び硬質ゼラチンカプセル剤、坐剤、無菌注射剤、無菌パッケージ化散剤等の形態であってもよい。
【０１１３】
一実施態様によれば、本発明の医薬組成物は、病状、特にアルツハイマー病の予防及び／又は治療に有用な、本発明の式（Ｉ）の化合物とは異なる薬剤と別個に、または連続的に、または同時に投与することが意図される。
【０１１４】
ｂ）活性依存型プローブ
本発明の化合物、より具体的にはＲ２基が
【０１１５】
【化２７】
2019509323.tif 000030
から選択される化合物はカスパーゼ２を選択的に検出するための活性依存型プローブとして使用することができる。
【０１１６】
したがって、一態様によれば、本発明は、Ｒ２が前記で定義された通りである本発明の化合物の、カスパーゼ−２活性を選択的に検出するための活性依存型プローブ（ＡＢＰ）としての使用に関する。
【０１１７】
本発明は、例示の目的のみのために提供され、かついかなる方法によっても本発明を限定すると解釈すべきではない下記の実施例及び図１に言及することによってよりよく理解されるであろう。
【実施例１】
【０１１８】
実施例１：本発明の化合物２の調製
本発明の化合物２の合成は、以下に示す化合物ＴＲＰ６０１の調製法により得られる。
【０１１９】
【化２８】
2019509323.tif 000031
【０１２０】
ＴＲＰ６０１の合成は、Ｄ．Ｃｈａｕｖｉｅｒら、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ（２０１１）２，ｅ２０３に開示されている。
【０１２１】
本発明の化合物２は、ＴＲＰ６０１とは、Ｐ１及びＰ４アミノ酸残基がＴＲＰ６０１における
【０１２２】
【化２９】
2019509323.tif 000032
に代え、
【０１２３】
【化３０】
2019509323.tif 000033
により表わされこと；及び
ＴＲＰ６０１における
【０１２４】
【化３１】
2019509323.tif 000034
に代え、
【０１２５】
【化３２】
2019509323.tif 000035
が存在することにおいて異なっている。
【０１２６】
したがって、Ｐ１及びＰ４アミノ酸残基を導入するために、
【０１２７】
【化３３】
2019509323.tif 000036
に代え、前駆体
【０１２８】
【化３４】
2019509323.tif 000037
を用い、
【０１２９】
【化３５】
2019509323.tif 000038
に代え、前駆体
【０１３０】
【化３６】
2019509323.tif 000039
を用いることを除き、ＴＲＰ６０１をもたらすために前記文献に開示されている工程を再現することによって、化合物２は得られる。
【０１３１】
Ｐ１及びＰ４アミノ酸残基の前駆体は、アミノ基が当業者に周知のプロトコルによりＢｏｃ基で保護されている市販の（Ｓ）−アスパラギン酸から開始して調製される。
【０１３２】
【化３７】
2019509323.tif 000040
の前駆体は、Ｈｅｒｄｅｉｓ  Ｃ  Ｈｕｂｍａｎｎ  Ｈ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｅｔｒｙ  １９９２，３：１２１３に従って得られ、Ｘは、Ｍａｉｌｌａｒｄらｉｎ  Ｂｉｏｏｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９（２０１１）：５８３３−５８５１に開示されたようにして得られた。
【０１３３】
化合物２の他の構成要素は、前記刊行物中のＴＲＰ６０１と同じ様式で、すなわち同じ試薬で、同じ条件で同じ量で導入されている。
【０１３４】
したがって、化合物２は９０％を超える収率で得られ、ＨＰＬＣによって特徴付けられる。
【０１３５】
実施例２：カスパーゼ−２及びカスパーゼ−３阻害アッセイ（インビトロ）
本発明の化合物２がカスパーゼ−２及びカスパーゼ−３を阻害する効率は、以下に説明するプロトコルを用いて評価した。
【０１３６】
既知のグループＩＩカスパーゼ阻害剤（カスパーゼ−２、カスパーゼ−３及びカスパーゼ７の阻害剤）である比較化合物Δ２Ｍｅ−ＴＲＰ６０１の効果を、Ｃｈａｕｖｉｅｒら、２０１１  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ  ２０１１，２：ｅ２０３に開示されたのと同様のプロトコルでアッセイした。
【０１３７】
上記２種の試験化合物を以下に示す：
【０１３８】
【化３８】
2019509323.tif 000041
【０１３９】
本実施例では、カスパーゼ−２及びカスパーゼ−３は、それぞれＥｎｚｏ  Ｌｉｆｅ（登録商標）（ＡＬＸ−２０１−０５７−Ｕ１００）及びＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）（７０７−Ｃ３−０１０／ＣＦ）により供給されるヒト組換え型活性酵素である。
【０１４０】
カスパーゼ−２は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＤＴＴ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＣＨＡＰＳ及び８００ｍＭコハク酸を含む「カスパーゼ−２緩衝液」中、最終濃度０．１ｎＭで使用される。カスパーゼ−３は、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１％  ＣＨＡＰＳ、５ｍＭ  ＤＴＴ及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む「カスパーゼ−３緩衝液」中、最終濃度０．５ｎＭで使用される。
【０１４１】
酵素活性測定のために使用されるペプチド基質は、ＥｎｚｏＬｉｆｅ（登録商標）により市販されているＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ及びＡｃ−ＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ（それぞれＡＬＸ−２６０−０３１−Ｍ００５及びＡＬＸ−２６０−０６０−Ｍ００５として言及される）である。上記化合物は、ＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）末端基の存在により蛍光性である。ＡＭＣの遊離により、９６ウェルマイクロプレート（ＣＯＳＴＡＲ  ３９１５）中の経時的な蛍光単位ＲＦＵにおける酵素活性を追跡することが可能となる。
【０１４２】
蛍光値は、マイクロプレートリーダーＢＭＧ  ＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡを用いて、分光蛍光光度計により３７℃で測定する。この装置は、ソフトウェアＢｉｏｌｉｓｅ（登録商標）で駆動し、ペルチェ効果による熱電冷却装置を備えている。実験データの数学的解析はソフトウェアＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ（登録商標）により行なう。
【０１４３】
試験化合物の阻害特性を、カスパーゼ−２又はカスパーゼ−３のいずれかに関するｋｉｎａｃｔ／ＫＩ比の測定により評価する。上記式において、
−Ｋｉｎａｃｔは最大不活性化速度定数であり、
−ＫＩは、酵素に対する阻害剤の親和性を反映する以下の式による解離定数である。
【０１４４】
【数１】
2019509323.tif 000042
【０１４５】
したがって、比が高いほど、阻害剤はより効果的である。
【０１４６】
前記比は連続法（Ａｌｌｉｓｏｎ  ＲＤ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２００１  Ｍａｙ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ３：Ｕｎｉｔ  ３．５．；Ｃｈａｕｖｉｅｒら、２０１１  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ  ２：ｅ２０３；Ｔａｎら、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１５，５８：５９８−３１２）によって測定される。
【０１４７】
手短に言えば、カスパーゼ活性は、未処理のカスパーゼ（対照）又は試験化合物とインキュベートしたカスパーゼの存在下、時間の関数としての蛍光発生基質（λｅｘｃ＝３５５ｎｍ、λｅｍ＝４６０ｎｍ）の加水分解をモニターすることにより、ＢＭＧ  Ｆｌｕｏｓｔａｒマイクロプレートリーダー（ブラック９６穴マイクロプレート）を用い、３７℃で３０分間、測定し、進行速度曲線の直線部分から初期速度（Ｖ０）を測定した。
【０１４８】
基質及び化合物はあらかじめＤＭＳＯで１０ｍＭに溶解し、最終溶媒濃度は４％（ｖ  ／  ｖ）未満に維持した。Ｖ０、相対速度、ＫＭ及びＩＣ５０は、Ｍａｒｓ  ｄａｔａｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ２．０及びＫａｌｅｉｄａｇｒａｐｈソフトウェアを用いて実験データから求めた。
【０１４９】
不可逆的な阻害剤については、不活性化は、Ｅ及びＩが酵素及び阻害剤の遊離形態であり、Ｅ＊Ｉがミカエリス複合体の動態キメラであり、Ｅ−Ｉが共有結合複合体または不活性化酵素である最小動力学スキームによって表すことができる。
【０１５０】
【数２】
2019509323.tif 000043
【０１５１】
阻害剤結合親和性（解離定数、ＫＩ）及び一次速度定数（ｋ３）パラメータを、進行曲線法を用いて求めた。比ｋ３／ＫＩは、実験データを式（Ｆ．Ｕ．、蛍光単位）に適合させることによって得た。
【０１５２】
【数３】
2019509323.tif 000044
【０１５３】
実験データの式への線形及び非線形回帰適合は、Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈソフトウェアで実施した。
【０１５４】
カスパーゼ−２及びカスパーゼ−３活性のｋｉｎａｃｔ／ＫＩ比の測定
ｋｉｎａｃｔ／ＫＩ比測定の連続法を用いて、カスパーゼ−２及びカスパーゼ−３に対する試験化合物の阻害活性を評価した。
【０１５５】
反応混合物は、酵素及び緩衝液を37℃でインキュベートすることによって調製する。
【０１５６】
試験阻害化合物は、種々の濃度（ＩＣ５０の１／４；ＩＣ５０の１／２；ＩＣ５０；ＩＣ５０の２倍；  ＩＣ５０の４倍）で調製し、マイクロプレートに入れる。
【０１５７】
本発明の化合物２については、阻害について使用する濃度は：
−カスパーゼ−２は０；０．１６２５；０．３１２５；０．６２５；１．２５及び２．５ｎＭであり；
−カスパーゼ−３は６．２５；１２．５；２５；５０及び１００ｎＭである。
【０１５８】
化合物Δ２Ｍｅ−ＴＲＰ−６０１については阻害について使用する濃度は：
カスパーゼ−２は０．１５６２５；０．３１２５；０．６２５；１．２５及び２．５ｎＭであり；
カスパーゼ−３は０．１５６２５；０．３１２５；０．６２５；１．２５及び２．５ｎＭである。
【０１５９】
次いで、酵素、緩衝液及び基質を含む反応混合物をウェルに迅速に添加する。
【０１６０】
酵素活性は４５〜６０分の間で測定する。
【０１６１】
ＲＦＵ（相対蛍光単位）＝ｆ（時間）曲線を、以下の式に従い、試験分子の各濃度について追跡する：
（（（（−Ｖ０）＊（ｅｘｐ（−ｋｏｂｓ＊ｍ０）））＋Ｖ０）／ｋｏｂｓ＊）＋ＲＦＵ０
式中、
−Ｖ０は、試験阻害性化合物の濃度０における初期速度（ＲＦＵ．ｓ−１）に対応し；
−ｋｏｂｓは不活性化速度定数であり；
−ＲＦＵ０はｔ＝０における蛍光値であり；
−ｍ０は変数、すなわち阻害剤濃度である。
【０１６２】
Ｋａｌｅｉｇａｇｒａｐｈソフトウェアを用いて双曲線の曲線ｆ（［Ｉ］）＝  ｋｏｂｓを調整し、以下の式に基づいてｋｉｎａｃｔ／ｋＩ比を得る。
Ｋｏｂｓ＝ｋｉｎａｃｔｘ［Ｉ］／（ＫＩｘ［Ｉ］）
【０１６３】
このようにして得られたｋｉｎａｃｔ／ＫＩ比を下記表に報告する。
【０１６４】
【表２】
2019509323.tif 000045
【０１６５】
この表から、化合物２は、カスパーゼ−２の阻害についてΔ２Ｍｅ−ＴＲＰ６０１と同じくらい効率的であることが明らかである。
【０１６６】
しかし、上記２種の化合物は、カスパーゼ−３については全く異なる反応を示す。
【０１６７】
実際、化合物２は、カスパーゼ−３を不活性化するよりも、５７倍効率よくカスパーゼ−２を不活性化する。
【０１６８】
Δ２Ｍｅ−ＴＲＰ−６０１はこの選択性を示さないことが認められる。
【０１６９】
結論として、化合物２は、カスパーゼ−２を阻害するのに有効であるだけでなく、カスパーゼ−３と比較し、カスパーゼ−２について選択的である。
【０１７０】
実施例３：細胞死アッセイに対する保護
本実施例においては、ビンクリスチン（ビンカアルカロイド）によって誘導される細胞死に対する本発明の化合物２の保護効果を、ヨウ化プロピジウム染色に基づく周知のフローサイトメトリー細胞死アッセイを用いて試験を行なう。
【０１７１】
ａ）細胞モデル
化合物２の保護効果を評価するために、カスパーゼ依存性細胞モデルを使用する。
【０１７２】
本モデルではヒトＨｅＬａ細胞を用いる。ＨｅＬａ細胞（子宮頸癌細胞株）はアメリカンタイプ細胞コレクション（ＡＴＣＣ）から入手し、１０％ＦＣＳ及び抗生物質（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＭＥＭ，Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ，  ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、Ｐｙｒｕｖａｔｅ）（Ｇｉｂｃｏ，  Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養した。
【０１７３】
ヒトＨｅＬａ細胞を、水で５ｍＭに溶解したビンクリスチン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理する。ビンクリスチンは、部分的にチューブリンタンパク質に結合し、分裂中に細胞が染色体を分離するのを止めるように機能する。次いで、細胞はアポトーシスを受ける。
【０１７４】
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、細胞膜透過性、細胞死の徴候を評価する。
【０１７５】
ｂ）治療及びマーキングの条件
薬物治療の２４時間前に、ＨｅＬａ細胞を２４ウェルプレートに播種した。次いで培養培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、種々の濃度（３、１０、３０及び６０μＭ）の化合物２を含む新鮮な培地をビンクリスチンの添加の１時間前に加えた。細胞を２０ｎＭのビンクリスチンに４８時間曝露したが、又は曝露していない（対照）。
【０１７６】
各ウェルの内容物を集め（上清＋トリプシン処理の生成物）、ＰＢＳに加え、次いで遠心分離する（９００ｒｐｍ；５分）。
【０１７７】
得られたペレットを、ヨウ化プロピジウムを含む培地３００μＬに入れ、暗所で５分間インキュベートし（３７℃、５％ＣＯ２）、次いでフローサイトメトリー分析を行なう。
【０１７８】
ｃ）細胞分析
次いで、細胞を５６１ｎｍの励起を有するフローサイトメトリーで分析する。
【０１７９】
蛍光標識細胞分取は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて実施した。各試料、５０００個の細胞からのデータを登録し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  ＰｒｏＴＭソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。分析には、ＦＬ−１及びＦＬ−３チャネルとともにＦＳＣ（前方散乱／細胞のサイズに関する）及びＳＳＣ（細胞散乱／細胞の粒状性に関する）パラメータが含まれていた。
【０１８０】
種々の濃度のビンクリスチン及び化合物２を細胞に適用した各処理について下記表に示す。
【０１８１】
【表３】
2019509323.tif 000046
【０１８２】
ヨウ化プロピジウム陽性細胞の割合から細胞死が推定される。結果を図１に示すが、ここで、ヒストグラムは３つの個々の実験の手段表す。各実験値は、５０００個の細胞のフローサイトメトリー分析に対応する。
【０１８３】
ビンクリスチンも阻害剤も含まない対照組成物により、自然に死んだ細胞の量を推定することが可能である。
【０１８４】
ビンクリスチンを含むが阻害剤を含まない組成物Aにより、自然死細胞とビンクリスチンによって誘導されるアポトーシス細胞の合計に対応する死細胞の総数が提供される。
【０１８５】
従って、上記結果から、化合物２がビンクリスチンによって誘導されるアポトーシス死から細胞を用量依存的に保護することが明らかである。
【図１】
2019509323.tif 000066
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月6日(2019.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）で表される化合物またはその塩の１つであり、
前記式（Ｉ）で表される化合物は、全ての想定可能なラセミ体、鏡像異性体及びジアステレオマー異性体を含む化合物。
【化１】
2019509323.tif 000067
式中、
−Ｚ１は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基であり、
−Ｐ５は下記アミノ酸残基から選択され、
【化２】
2019509323.tif 000068
−Ｐ１及びＰ４は同一又は異なるものであり、下記アミノ酸残基から選択され、
【化３】
2019509323.tif 000069
（式中、Ｚ２及びＺ３は同一又は異なるものであり、水素原子及び（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基から選択される）
−Ｐ３は下記アミノ酸残基から選択され、
【化４】
2019509323.tif 000070
−Ｒ１は以下の式から選択され、
【化５】
2019509323.tif 000071
−Ｒ２は以下の式から選択される。
【化６】
2019509323.tif 000072
（式中、
・ｍは０、１又は２であり；
・ｐは１、２、３又は４であり；
・Ｚ４はハロゲン原子であり；
・ｑは０又は１であり；
・Ｚ５は（Ｃ１−Ｃ６）アルキル及びフェニル基から選択され、該フェニル基はアミノ基で置換されていてもよく；
・Ｚ６、Ｚ７及びＺ１０は同一又は異なるものであり、水素原子、（Ｃ１−Ｃ４）アルキル、テトラヒドロキノリニル、及び−（ＣＨ２）ｉ−アリール基から選択され、ｉは０、１又は２であり、上記アリール基は１、２、３若しくは４個のハロゲン原子又は（Ｃ１−Ｃ４）アルキル基で置換されていてもよく、
・Ｚ８及びＺ９は同一又は異なるものであり、ハロゲン原子及び（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基から選択される）
【請求項２】
以下の式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩の１つであり、
前記式（ＩＩ）で表される化合物は、全ての想定可能なラセミ体、鏡像異性体及びジアステレオマー異性体を含む請求項１に記載の化合物。
【化７】
2019509323.tif 000073
式中、
−Ｒ１、Ｒ２及びＺ１は請求項１に記載の前記式（Ｉ）で定義された通りであり；
−Ｒ３は、-ＣＨ３、-ＣＨ（ＣＨ３）２、-ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２及び-ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３基から選択され；
−Ａ及びＢは同一又は異なるものであり、窒素原子及び−ＣＨ−基から選択され、
−Ｒ５及びＲ６は同一又は異なるものであり、水素原子及び（Ｃ１−Ｃ６）アルキル基から選択され；
−Ｒ４は、-ＣＨ３、-ＣＨ（ＣＨ３）２、-ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、-ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３及び-（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｈ基から選択される。
【請求項３】
前記式（ＩＩ）で表される化合物のＡ及びＢうちの少なくとも１つが−ＣＨ基である請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
以下の式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩の１つであり、
前記式（ＩＩＩ）で表される化合物は、全ての想定可能なラセミ体、鏡像異性体及びジアステレオマー異性体を含む請求項１から３のいずれか１項に記載の化合物。
【化８】
2019509323.tif 000074
式中、
Ｒ１、Ｒ２及びＺ１は請求項１に記載の前記式（Ｉ）で定義された通りである。
【請求項５】
以下の式（ＩＶ）で表される化合物またはその塩の１つであり、
前記式（ＩＶ）で表される化合物は、全ての想定可能なラセミ体、鏡像異性体及びジアステレオマー異性体を含む請求項１から４のいずれか１項に記載の化合物。
【化９】
2019509323.tif 000075
式中、
Ｒ１及びＲ２は請求項１に記載の前記式（Ｉ）で定義された通りである。
【請求項６】
前記Ｒ１が以下の式で表される請求項１から５のいずれか１項に記載の化合物。
【化１０】
2019509323.tif 000076
【請求項７】
前記Ｒ２が以下の式から選択される請求項１から６のいずれか１項に記載の化合物。
【化１１】
2019509323.tif 000077
（式中、Ｚ’はフッ素原子であり、ｊは０、１又は２である。）
【請求項８】
少なくとも１つの（Ｓ）立体配置の不斉炭素原子を有する請求項１から７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
以下の式から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【化１２】
2019509323.tif 000078
【請求項１０】
選択的カスパーゼ−２阻害剤として使用される請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ２が、以下の式から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の少なくとも１種の化合物と、少なくとも１種の薬学的に許容される賦形剤とを含有する医薬組成物。
【化１３】
2019509323.tif 000079
（式中、ｍ、ｐ、ｑ、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９及びＺ１０は請求項１に記載の前記式（Ｉ）で定義された通りである）
【請求項１２】
Ｒ２が、以下の式から選択される、医薬として使用される請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【化１４】
2019509323.tif 000080
（式中、ｍ、ｐ、ｑ、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９及びＺ１０は請求項１に記載の式（Ｉ）で定義された通りである）
【請求項１３】
Ｒ２が、以下の式から選択される、カスパーゼ−２活性が関与する疾患及び／又は傷害の予防及び／又は治療に使用するための請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【化１５】
2019509323.tif 000081
（式中、ｍ、ｐ、ｑ、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ７、Ｚ８、Ｚ９及びＺ１０は請求項１に記載の式（Ｉ）で定義された通りである）
【請求項１４】
細胞死を伴う病態；新生児脳障害；外傷性脳障害；腎虚血；低酸素性（Ｈ−Ｉ）虚血；脳卒中様状況の脳障害；心虚血；心筋梗塞；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；網膜障害；眼疾患；皮膚損傷；無菌性炎症性疾患；病原菌に起因する疾患；肥満症；メタボリックシンドローム；及び非アルコール性脂肪性肝疾患の予防及び／又は治療に使用するための、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ２が、以下の式から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物の活性依存型プローブとしての使用。
【化１６】
2019509323.tif 000082
【国際調査報告】
2019509323.tif 000083
2019509323.tif 000084
2019509323.tif 000085