(57)【要約】  ｐｈｉ２９、Ｍ２、ＳＦ５及びＧＡ１  ｐＲＮＡに由来し、高い安定性を有する三方向ジャンクション（３ＷＪ）ＲＮＡ骨格が記載される。ｐＲＮＡ  ３ＷＪ骨格は、治療及び／又は診断機能のための活性剤の送達のための、化合物、コンジュゲート、組成物及びナノ粒子を形成するために使用されうる。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪａ配列、第２のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｂ配列、及び第３のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｃ配列を含む三方向ジャンクション（３ＷＪ）ドメインを含むＲＮＡ接合骨格であって、３ＷＪドメインの第１のブランチが３ＷＪａ配列の５’位及び３ＷＪｃ配列の３’位から形成され、且つ第１のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第２のブランチが３ＷＪａ配列の３’位及び３ＷＪｂ配列の５’位から形成され、且つ第２のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第３のブランチが３ＷＪｂ配列の３’位及び３ＷＪｃ配列の５’位から形成され、且つ第３のらせん領域を含み、前記らせん領域のそれぞれが標準的なワトソン−クリック結合を形成する複数のＲＮＡヌクレオチド対を含み、（ｉ）３ＷＪａ配列が第１のらせん領域と第２のらせん領域との間に位置する不対ヌクレオチドを欠き、且つ二の不対ヌクレオチドが第２のブランチの３ＷＪａ配列に位置し、（ｉｉ）二の隣接する不対ヌクレオチドが第１のらせん領域と第３のらせん領域との間の３ＷＪｃ配列に位置し、一の不対ヌクレオチドが第２のらせん領域と第３のらせん領域との間の３ＷＪｂ配列に位置する、ＲＮＡ接合骨格。
【請求項２】
３ＷＪａ配列が配列番号７３を含み、３ＷＪｂ配列が配列番号７４を含み、３ＷＪｃ配列が配列番号７５を含む、請求項１に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【請求項３】
第２のブランチが、野生型Ｍ２  ｐＲＮＡのそれぞれ３６位、３７位の不対のアデニンヌクレオチド及びウラシルヌクレオチドに対応する位置の、隣接する不対ヌクレオチドを欠き、且つ、第３のブランチが、前記野生型Ｍ２  ｐＲＮＡの７９位の不対アデニンヌクレオチドに対応する位置の不対ヌクレオチドを欠く、請求項１に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【請求項４】
３ＷＪａ配列に存在する二の不対ヌクレオチドの下流の３ＷＪａ配列で一又は複数の不対ヌクレオチドを欠く、請求項１に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【請求項５】
３ＷＪｂ配列に存在する不対ヌクレオチドの下流の３ＷＪｂ配列で不対ヌクレオチドを欠く、請求項１に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【請求項６】
３ＷＪａ配列に存在する二の不対ヌクレオチドの下流の３ＷＪａ配列で一又は複数の不対ヌクレオチドを欠き、３ＷＪｂ配列に存在する不対ヌクレオチドの下流の３ＷＪｂ配列で不対ヌクレオチドを欠く、請求項１に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【請求項７】
治療薬、抗体、マーカー、色素、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ及びアプタマーからなる群より選択される少なくとも一の部分に結合する、請求項１に記載のＲＮＡ  ３ＷＪ骨格を含むコンジュゲート。
【請求項８】
請求項７のコンジュゲート及び薬学的に許容されるビヒクル、担体又は希釈剤を含む、組成物。
【請求項９】
第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪａ配列、第２のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｂ配列及び第３のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｃ配列を含む三方向ジャンクション（３ＷＪ）ドメインを含むＲＮＡジャンクション骨格であって、３ＷＪドメインの第１のブランチが３ＷＪａ配列の５’位及び３ＷＪｃ配列の３’位から形成され、且つ第１のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第２のブランチが３ＷＪａ配列の３’位及び３ＷＪｂ配列の５’位から形成され、且つ第２のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第３のブランチが３ＷＪｂ配列の３’位及び３ＷＪｃ配列の５’位から形成され、且つ第３のらせん領域を含み、前記らせん領域のそれぞれが、標準的なワトソン−クリック結合を形成する複数のＲＮＡヌクレオチド対を含み、（ｉ）３ＷＪａ配列が第１のらせん領域と第２のらせん領域との間に位置する不対ヌクレオチドを欠き、一の不対ヌクレオチドが第２のブランチの３ＷＪａ配列に位置し、（ｉｉ）二の隣接する不対ヌクレオチドが第２のらせん領域と第３のらせん領域との間の３ＷＪｂ配列に位置する、ＲＮＡジャンクション骨格。
【請求項１０】
治療薬、抗体、マーカー、色素、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ及びアプタマーからなる群より選択される少なくとも一の部分に結合する請求項９に記載のＲＮＡ  ３ＷＪ骨格を含むコンジュゲート。
【請求項１１】
第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪａ配列、第２のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｂ配列及び第３のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｃ配列を含む三方向ジャンクション（３ＷＪ）ドメインを含むＲＮＡジャンクション骨格であって、３ＷＪドメインの第１のブランチが３ＷＪａ配列の５’位及び３ＷＪｃ配列の３’位から形成され、且つ第１のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第２のブランチが３ＷＪａ配列の３’位及び３ＷＪｂ配列の５’位から形成され、且つ第２のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第３のブランチが３ＷＪｂ配列の３’位及び３ＷＪｃ配列の５’位から形成され、且つ第３のらせん領域を含み、前記らせん領域のそれぞれが、標準的なワトソン−クリック結合を形成する複数のＲＮＡヌクレオチド対を含み、３ＷＪａ配列が第１のらせん領域と第２のらせん領域との間に位置する不対ヌクレオチドを欠き、（１）野生型ＳＦ５  ｐＲＮＡの３１位の不対グアニンヌクレオチドに対応する位置の不対ヌクレオチド及び（２）野生型ＳＦ５  ｐＲＮＡの６９位の不対グアニンヌクレオチドに対応する位置の不対ヌクレオチドの少なくとも一を欠く、ＲＮＡジャンクション骨格。
【請求項１２】
野生型ＳＦ５  ｐＲＮＡの３１位の不対グアニンヌクレオチドに対応する位置の不対ヌクレオチドを欠く、請求項１１に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【請求項１３】
３ＷＪａ配列が配列番号８６を含み、３ＷＪｂ配列が配列番号８７を含み、３ＷＪｃ配列が配列番号８８を含む、請求項１２に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【請求項１４】
前記野生型ＳＦ５  ｐＲＮＡの６９位の不対グアニンヌクレオチドに対応する位置の不対ヌクレオチドを欠く、請求項１１に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【請求項１５】
３ＷＪａ配列が配列番号９７を含み、３ＷＪｂ配列が配列番号９８を含み、３ＷＪｃ配列が配列番号８８を含む、請求項１４に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【請求項１６】
（１）野生型ＳＦ５  ｐＲＮＡの３１位の不対ヌクレオチドに対応する位置の不対ヌクレオチド及び（２）前記野生型ＳＦ５  ｐＲＮＡの６９位の不対グアニンヌクレオチドに対応する位置の不対グアニンヌクレオチドを欠く、請求項１１に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【請求項１７】
３ＷＪａ配列が配列番号８６を含み、３ＷＪｂ配列が配列番号９８を含み、３ＷＪｃ配列が配列番号８８を含む、請求項１６に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【請求項１８】
治療薬、抗体、マーカー、色素、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ及びアプタマーからなる群より選択される少なくとも一の部分に結合する、請求項１１に記載のＲＮＡ  ３ＷＪ骨格を含むコンジュゲート。
【請求項１９】
第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪａ配列、第２のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｂ配列及び第３のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｃ配列を含む三方向ジャンクション（３ＷＪ）ドメインを含むＲＮＡジャンクション骨格であって、３ＷＪドメインの第１のブランチが３ＷＪａ配列の５’位及び３ＷＪｃ配列の３’位から形成され、且つ第１のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第２のブランチが３ＷＪａ配列の３’位及び３ＷＪｂ配列の５’位から形成され、且つ第２のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第３のブランチが３ＷＪｂ配列の３’位及び３ＷＪｃ配列の５’位から形成され、且つ第３のらせん領域を含み、前記らせん領域のそれぞれが、標準的なワトソン−クリック結合を形成する複数のＲＮＡヌクレオチド対を含み、３Ｗｊａ配列が、野生型ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡの２９位の不対ウリジンヌクレオチドに対応する第１のらせん領域と第２のらせん領域との間に位置する不対ヌクレオチドを欠き、前記野生型ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡの７２位及び７３位の二の不対ウリジンヌクレオチドに対応する位置の二の不対ヌクレオチドを欠く、ＲＮＡジャンクション骨格。
【請求項２０】
３ＷＪａ配列が配列番号３７を含み、３ＷＪｂ配列が配列番号３９を含み、３ＷＪｃ配列が配列番号４０を含む、請求項１９に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【請求項２１】
治療薬、抗体、マーカー、色素、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ及びアプタマーからなる群より選択される少なくとも一の部分に結合する、請求項１９に記載のＲＮＡ  ３ＷＪ骨格を含むコンジュゲート。
【請求項２２】
第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪａ配列、第２のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｂ配列及び第３のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｃ配列を含む三方向ジャンクション（３ＷＪ）ドメインを含むＲＮＡジャンクション骨格であって、３ＷＪドメインの第１のブランチが３ＷＪａ配列の５’位及び３ＷＪｃ配列の３’位から形成され、且つ第１のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第２のブランチが３ＷＪａ配列の３’位及び３ＷＪｂ配列の５’位から形成され、且つ第２のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第３のブランチが３ＷＪｂ配列の３’位及び３ＷＪｃ配列の５’位から形成され、且つ第３のらせん領域を含み、前記らせん領域のそれぞれが、標準的なワトソン−クリック結合を形成する複数のＲＮＡヌクレオチド対を含み、（ｉ）３ＷＪａ配列が、第１のらせん領域と第２のらせん領域との間に位置する単一の不対ヌクレオチド及び第１のらせん領域と第２のらせん領域との間に位置する不対ヌクレオチドの下流の第２のブランチの３ＷＪａ配列に位置する不対ヌクレオチド、並びに（ｉｉ）第１のらせん領域と第３のらせん領域との間の３ＷＪｃ配列に位置する単一の不対ヌクレオチドを含む、ＲＮＡジャンクション骨格。
【請求項２３】
３ＷＪａ配列が配列番号９９を含み、３ＷＪｂ配列が配列番号１００を含み、３ＷＪｃ配列が配列番号１０１を含む、請求項２２に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【請求項２４】
治療薬、抗体、マーカー、色素、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ及びアプタマーからなる群より選択される少なくとも一の部分に結合する、請求項２２に記載のＲＮＡ  ３ＷＪ骨格を含むコンジュゲート。
【請求項２５】
第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪａ配列、第２のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｂ配列、及び第３のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｃ配列を含む三方向ジャンクション（３ＷＪ）ドメインを含むＲＮＡジャンクション骨格であって、３ＷＪドメインの第１のブランチが３ＷＪａ配列の５’位及び３ＷＪｃ配列の３’位から形成され、且つ第１のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第２のブランチが３ＷＪａ配列の３’位及び３ＷＪｂ配列の５’位から形成され、且つ第２のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第３のブランチが３ＷＪｂ配列の３’位及び３ＷＪｃ配列の５’位から形成され、且つ第３のらせん領域を含み、前記らせん領域のそれぞれが、標準的なワトソン−クリック結合を形成する複数のＲＮＡヌクレオチド対を含み、（ｉ）第１のらせん領域と第２のらせん領域との間の３ＷＪａ配列に一の不対ヌクレオチドが位置しているか又は存在せず、且つ／又は一若しくは二の不対ヌクレオチドが第２のブランチの３ＷＪａ配列に位置し、（ｉｉ）一の不対又は二の隣接する不対ヌクレオチドが第１のらせん領域と第３のらせん領域との間の３ＷＪｃ配列に位置し、且つ／又は一の不対若しくは二の隣接する不対ヌクレオチドが第２のらせん領域と第３のらせん領域との間の３ＷＪｂ配列に位置する、ＲＮＡジャンクション骨格。
【請求項２６】
治療薬、抗体、マーカー、色素、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ及びアプタマーからなる群より選択される少なくとも一の部分に結合する、請求項２５に記載のＲＮＡ  ３ＷＪ骨格を含むコンジュゲート。
【請求項２７】
請求項２５のコンジュゲート及び薬学的に許容されるビヒクル、担体又は希釈剤を含む、組成物。
【請求項２８】
３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃ配列のそれぞれが、独立して、ＲＮＡリンカー又はＲＮＡ骨格にコンジュゲートしている生物学的に活性な部分のＲＮＡ部分を含まない８から３６のヌクレオチドを含む、請求項２５に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１６年２月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／３００，５１７号の利益を主張し、その全内容が本明細書に参照により明示的に援用される。
【０００２】
政府による支援
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって授与された助成番号２０１２１７４１６０及び０８４４９１３の下での政府の支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
以前の研究では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びがんの標的化など、バイオテクノロジーに応用するパッケージング（又はプロヘッド）リボ核酸（ｐＲＮＡ）三方向ジャンクション（３ＷＪ）モチーフが実証されている。例えば、ｐｈｉ２９バクテリオファージｐＲＮＡ  ３ＷＪナノモチーフは、広範に研究され、例えばがん標的化機能性を有するナノ構造の合理的設計におけるビルディングブロックとして首尾よく使用されている（例えば、米国特許第９，２９７，０１３号を参照）。
【発明の概要】
【０００４】
診断及び治療の合理的設計におけるビルディングブロックとしてのｐＲＮＡ  ３ＷＪなどのＲＮＡナノモチーフの使用に対する一つの障害は、特徴的な低安定性であった。
新規の三叉ｐＲＮＡ  ３ＷＪモチーフと、治療剤の送達、疾患の診断、ＲＮＡ結晶化の促進、又は安定したＲＮＡアプタマーの生成を含むが、これらに限定されない治療及びバイオテクノロジーの用途において使用することができる化合物を構築するためのそれらの使用方法とが開示される。新規３ＷＪの安定性は、ｐＲＮＡの自己組織化特性に寄与する。よって、本明細書に開示されるｐＲＮＡ  ３ＷＪモチーフは、ｐＲＮＡベースのナノテクノロジーのための新しい骨格を示す。
【０００５】
ＵＶ光学融解用に設計された３成分ＲＮＡ系を用いて、７種の変異ｐｈｉ２９ｐＲＮＡ  ３ＷＪを含む１１種のｐＲＮＡ  ３ＷＪの熱力学的パラメータを測定した。以下でさらに記載される結果は、本明細書に記載のＧＡ１、ＳＦ５、及びＭ２ｐＲＮＡ  ３ＷＪのような特定の３ＷＪは、ＲＮＡベースのナノテクノロジーにおける骨格として一般的に使用されるステムｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪよりも熱力学的安定性が高いことを示す。さらに、ｐｈｉ２９ｐＲＮＡ  ３ＷＪ中の特定の欠失は、ステムｐｈｉ２９ｐＲＮＡ  ３ＷＪに比べてその安定性を増加させることが示されている。さらに、金属イオンは、ｐＲＮＡ  ３ＷＪに対する示差的安定化効果を有することが示されている。
【０００６】
本開示のいくつかの実施態様を添付図面に示す。しかしながら、添付の図面は、いくつかの実施態様を示しているだけであり、したがって、本開示の範囲を限定するものではないと考えられることに留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図１Ａは、ボールがループを表し、スティックがらせんを表すプロヘッド又はパッケージングＲＮＡ（ｐＲＮＡ）のボールアンドスティックモデルを示す。Ａ、ＣＥ及びＤバルジを含まない中央の三方向ジャンクション（３ＷＪ）部は、ボックス内に表される。３ＷＪは、ほぼ等モル濃度で混合された３つの単一ＲＮＡオリゴヌクレオチド鎖（３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃと示される）から組むことができる。挿入されたｐＲＮＡ  ３ＷＪナノモチーフは、一部の不対ヌクレオチドを除いて、ワトソン−クリック塩基ペアリングに従って塩基対をなす鎖３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃを含む。
【図１Ｂ】３ＷＪコンストラクトとして塩基対合された場合の各３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃオリゴヌクレオチド鎖の５’−３’方向を示す。
【図２】ｐｈｉ２９及びＧＡ１ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトの一次及び二次構造を示す。ワトソン−クリック塩基対を形成しないヌクレオチドは、単一塩基として示される。ｐｈｉ２９コンストラクトは、配列番号１〜３を含む。ＧＡ１コンストラクトは、配列番号４〜６を含む。
【図３】ＳＦ５及びＭ２ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトの一次及び二次構造を示す。ワトソン−クリック塩基対を形成しないヌクレオチドは、単一塩基として示される。ＳＦ５コンストラクトは、配列番号７〜９を含む。Ｍ２コンストラクトは、配列番号１０〜１２を含む。
【図４Ａ】３１．２μＭで回収され、鋭い共同転移を示す図２のｐｈｉ２９  ３ＷＪコンストラクトについての非線形融解曲線適合（Ｒ２＞０．９９）を示す。データポイントは、１°Ｃ／分の加熱速度で、６／ｓの速度で回収された。
【図４Ｂ】傾きが−ΔＨ／Ｒであり、ｙ切片がΔＳ／Ｒである、ｐｈｉ２９  ３ＷＪ融解データ（Ｒ２＞０．９９）のｖａｎ’ｔ  Ｈｏｆｆプロットのグラフである。データは、ＭｅｌｔｗｉｎのＭａｒｑｕａｒｄｔ−Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ法を用いて適合された。
【図５Ａ】ＲＮＡ構造、ＲＮＡｆｏｌｄ、ｍｆｏｌｄ及びＲＮＡｓｏｆｔを使用し、実験的に測定された様々なｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ステムｐｈｉ２９、ＧＡ１、ＳＦ５、Ｍ２）について予測された熱力学的安定性を示す。−ΔＧが大きいほど、安定性は大きい。＊ＲＮＡｓｏｆｔは、ＧＡ１ｐＲＮＡ  ３ＷＪの二次構造の自由エネルギーをコンピュータの実行時間の制限のために出力しなかった。
【図５Ｂ】ＲＮＡ構造、ＲＮＡｆｏｌｄ、ｍｆｏｌｄ及びＲＮＡｓｏｆｔを使用し、実験的に測定された様々なｐｈｉ２９ｐＲＮＡ  ３ＷＪ変異コンストラクトについて予測された熱力学的安定性を示す。−ΔＧが大きいほど、安定性は大きい。
【図６Ａ】図５Ａ及び５Ｂのプログラムを使用して、様々なｐＲＮＡ  ３ＷＪ（ｐｈｉ２９、ＧＡ１、ＳＦ５、Ｍ２）の予測された熱力学的安定性と実験的に測定された熱力学的安定性とを比較する。−ΔＧが大きいほど、安定性は大きい。＊ＲＮＡｓｏｆｔは、ＧＡ１ｐＲＮＡ  ３ＷＪの二次構造の自由エネルギーをコンピュータの実行時間の制限のために出力しなかった。
【図６Ｂ】図５Ａ及び５Ｂのプログラムを使用して、様々なｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  変異３ＷＪの予測された熱力学的安定性と実験的に測定された熱力学的安定性とを比較する。−ΔＧが大きいほど、安定性は大きい。
【図７】４つのｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトに対する金属イオン効果を示す。１００ｍＭ  Ｎａ＋及び１０ｍＭ  Ｍｇ２＋中のＧＡ１  ３ＷＪの光学的融解物は、ｖａｎ’ｔ  Ｈｏｆｆプロット適合度の線形適合カットオフ基準≧０．９０を満たさなかった。
【図８】５０ｂｐラダー（レーンｉ及びｖｉｉｉ）、ｐｈｉ２９鎖３ＷＪａ（レーンｉｉ）、ｐｈｉ２９鎖３ＷＪａ＋３ＷＪｂ（レーンｉｉｉ）、ｐｈｉ２９  ３ＷＪコンストラクト（レーンｉｖ）、ＧＡ１  ３ＷＪコンストラクト（レーンｖ）、ＳＦ５  ３ＷＪコンストラクト（レーンｖｉ）、Ｍ２  ３ＷＪコンストラクト（レーンｖｉｉ）、ｐｈｉ２９ΔＵ２９コンストラクト（レーンｉｘ）、ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２コンストラクト（レーンｘ）、ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３コンストラクト（レーンｘｉ）、ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３−７４コンストラクト（レーンｘｉｉ）、ｐｈｉ２９ΔＵ７２コンストラクト（レーンｘｉｉｉ）、ｐｈｉ２９ΔＵ７２−７３コンストラクト（レーンｘｉｖ）及びｐｈｉ２９ΔＵ７２−７３−７４コンストラクト（レーンｘｖ）のゲル移動度を示す。標準的な溶融バッファー（１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭカコジル酸ナトリウム、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７）中でアセンブリを行い、光学的融解条件下で３ＷＪコンストラクトの形成を確認した。Ｐｈｉ２９鎖  ３ＷＪａ（レーンｉｉ）及び鎖３ＷＪａ＋３ＷＪｂ（レーンｉｉｉ）は参照として含まれた。全ての３ＷＪコンストラクトはほぼ同じ速度で泳動した。
【図９】（Ａ）Ｇｕ及びＳｃｈｒｏｅｄｅｒ  (Gu X, Schroeder S. 2011. Different sequences show similar quaternary interaction stabilities in prohead viral RNA self-assembly. Journal of Biological Chemistry 286:14419-14426）並びに（Ｂ）Ｈａｏ及びＫｉｅｆｔ（Hao Y, Kieft JS. 2014. Diverse self-association properties within a family of phage packaging RNAs. RNA20:1-16）によって報告されたＮｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｄａｔａｂａｓｅの配列を用いて計算した連動ループ安定性を示す実験３ＷＪデータを示す。連動ループ配列は、各ｐＲＮＡについて提供される。実験的安定性データ及び計算された安定性データの両方は、１Ｍ塩化ナトリウム中のＲＮＡについて決定された。
【図１０Ａ】１００倍に希釈したヒト血清に１０分間曝露した後、ＴＡＥバッファー中エチジウムブロマイドで染色した２％（ｗ／ｖ）アガロース中の１０μＭ組立３ＷＪコンストラクトのゲル移動度を示す。全ての反応は３７℃で行われた。レーン（ｉ）５０ｂｐ  ＤＮＡラダー、（ｉｉ）標準的溶融バッファー＋１ユニットＲＮａｓｅ  Ｔ１（ポジティブ分解コントロール）中ｐｈｉ２９  ３ＷＪコンストラクト、（ｉｉｉ）ｐｈｉ２９  ３ＷＪコンストラクト、（ｉｖ）ＧＡ１  ３ＷＪコンストラクト、（ｖ）ＳＦ５  ３ＷＪコンストラクト、（ｖｉ）Ｍ２  ３ＷＪコンストラクト、（ｖｉｉ）ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３  ３ＷＪコンストラクト、（ｖｉｉｉ）ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３−７４  ３ＷＪコンストラクト。
【図１０Ｂ】第２のドナーからの１００倍に希釈したヒト血清に１０分間曝露した後、ＴＡＥバッファー中エチジウムブロマイドで染色した２％（ｗ／ｖ）アガロース中の１０μＭ組立３ＷＪコンストラクトのさらなるゲル移動度の結果を示す。全ての反応は３７℃で行われた。レーン（ｉ）５０ｂｐ  ＤＮＡラダー、（ｉｉ）標準的溶融バッファー（ネガティブ分解コントロール）中ｐｈｉ２９  ３ＷＪコンストラクト、（ｉｉｉ）ｐｈｉ２９  ３ＷＪコンストラクト、（ｉｖ）Ｍ２  ３ＷＪコンストラクト、（ｖ）ＳＦ５  ３ＷＪコンストラクト、（ｖｉ）ＳＦ５ΔＧ３１  ３ＷＪコンストラクト、（ｖｉｉ）ＳＦ５ΔＧ６９  ３ＷＪコンストラクト、（ｖｉｉｉ）ＳＦ５ΔＧ３１／ΔＧ６９  ３ＷＪコンストラクト。
【図１１】１０００倍に希釈したヒト血清に１０分間、３０分間及び１時間曝露した後、ＴＡＥバッファー中エチジウムブロマイドで染色した２％（ｗ／ｖ）アガロース中の１０μＭｐｈｉ２９、ＳＦ５及びＭ２組立３ＷＪコンストラクトのゲル移動度の比較を示す。全ての反応は３７℃で行われた。レーン（ｉ）５０ｂｐ  ＤＮＡラダー、（ｉｉ）１時間の標準的溶融バッファー（１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭカコジル酸ナトリウム、０．５  ＥＤＴＡ、ｐＨ７）中（ネガティブ分解コントロール）３ＷＪコンストラクト、（ｉｉｉ）１０分間１０００倍に希釈した血清中３ＷＪコンストラクト、（ｉｖ）３０分間１０００倍に希釈した血清中３ＷＪコンストラクト、（ｖ）１時間１０００倍に希釈した血清中３ＷＪコンストラクト。
【図１２】本開示による変異ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３）を図示する。
【図１３】本開示による別の変異ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３−７４）を図示する。
【図１４】３６、３７及び７９位で不対ヌクレオチドを有する野生型Ｍ２に由来するｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトを図示する。
【図１５】本開示によるトランケーションされた変異ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３）を図示する。
【図１６】本開示による別のトランケーションされた変異ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３）を図示する。
【図１７】本開示による別のトランケーションされた変異ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３）を図示する。
【図１８】本開示による別のトランケーションされた変異ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３）を図示する。
【図１９】本開示による別のトランケーションされた変異ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３）を図示する。
【図２０】本開示による別のトランケーションされた変異ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３）を図示する。
【図２１】本開示による別のトランケーションされた変異ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３）を図示する。
【図２２】本開示による別のトランケーションされた変異ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３）を図示する。
【図２３】本開示による別のトランケーションされた変異ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３）を図示する。
【図２４】本開示による別のトランケーションされた変異ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３）を図示する。
【図２５】本開示による別のトランケーションされた変異ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３）を図示する。
【図２６】本開示による別のトランケーションされた変異ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３）を図示する。
【図２７】本開示による変異Ｍ２  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（Ｍ２ΔＡ３６Ｕ３７／Ａ７９）を図示する。
【図２８】本開示によるトランケーションされた変異Ｍ２  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（Ｍ２ΔＡ３６Ｕ３７／Ａ７９）を図示する。
【図２９】本開示による別のトランケーションされた変異Ｍ２  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（Ｍ２ΔＡ３６Ｕ３７／Ａ７９）を図示する。
【図３０】本開示による別のトランケーションされた変異Ｍ２  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（Ｍ２ΔＡ３６Ｕ３７／Ａ７９）を図示する。
【図３１】本開示による別のトランケーションされた変異Ｍ２  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（Ｍ２ΔＡ３６Ｕ３７／Ａ７９）を図示する。
【図３２】本開示による変異ＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ＳＦ５ΔＧ３１）を図示する。
【図３３】本開示によるトランケーションされた変異ＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ＳＦ５ΔＧ３１）を図示する。
【図３４】本開示による別のトランケーションされた変異ＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ＳＦ５ΔＧ３１）を図示する。
【図３５】本開示による別のトランケーションされた変異ＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ＳＦ５ΔＧ３１）を図示する。
【図３６】本開示による別のトランケーションされた変異ＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ＳＦ５ΔＧ３１）を図示する。
【図３７】本開示による変異ＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ＳＦ５ΔＧ６９）を図示する。
【図３８】本開示によるトランケーションされた変異ＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ＳＦ５ΔＧ６９）を図示する。
【図３９】本開示による別のトランケーションされた変異ＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ＳＦ５ΔＧ６９）を図示する。
【図４０】本開示による別のトランケーションされた変異ＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ＳＦ５ΔＧ６９）を図示する。
【図４１】本開示による別のトランケーションされた変異ＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ＳＦ５ΔＧ６９）を図示する。
【図４２】本開示による変異ＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ＳＦ５ΔＧ３１／ΔＧ６９）を図示する。
【図４３】本開示によるトランケーションされた変異ＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ＳＦ５ΔＧ３１／ΔＧ６９）を図示する。
【図４４】本開示による別のトランケーションされた変異ＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ＳＦ５ΔＧ３１／ΔＧ６９）を図示する。
【図４５】本開示による別のトランケーションされた変異ＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ＳＦ５ΔＧ３１／ΔＧ６９）を図示する。
【図４６】本開示による別のトランケーションされた変異ＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（ＳＦ５ΔＧ３１／ΔＧ６９）を図示する。
【図４７】本開示によるＧＡ１  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトを図示する。
【図４８】本開示によるジェネリック変異ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトを図示する。Ｗ及びＣは対合ヌクレオチドを表し、３ＷＪｂ鎖中のＮは不対ヌクレオチドを表す。
【図４９】本開示によるジェネリック変異ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトを図示する。Ｗ及びＣは対合ヌクレオチドを表し、３ＷＪｃ鎖中のＮは不対ヌクレオチドを表す。
【図５０】本開示によるジェネリック変異Ｍ２  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトを図示する。Ｗ及びＣは対合ヌクレオチドを表し、３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃ鎖中のＮは不対ヌクレオチドを表す。
【図５１】本開示によるジェネリック変異ＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトを図示する。Ｗ及びＣは対合ヌクレオチドを表し、３ＷＪａ及び３ＷＪｂ鎖中のＮは不対ヌクレオチドを表す。
【図５２】本開示によるジェネリック変異ＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトを図示する。Ｗ及びＣは対合ヌクレオチドを表し、３ＷＪｂ鎖中のＮは不対ヌクレオチドを表す。
【図５３】本開示によるジェネリック変異ＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトを図示する。Ｗ及びＣは対合ヌクレオチドを表し、３ＷＪａ及び３ＷＪｂ鎖中のＮは不対ヌクレオチドを表す。
【図５４】本開示によるジェネリック変異ＧＡ１  ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトを図示する。Ｗ及びＣは対合ヌクレオチドを表し、３ＷＪａ及び３ＷＪｃ鎖中のＮは不対ヌクレオチドを表す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
例示的な説明、実施例及び結果を用いて本開示の三叉ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト、ナノ粒子、化合物、組成物及び方法の様々な実施態様をさらに詳細に説明する前に、本開示のコンストラクト、ナノ粒子、化合物、組成物及び方法は、以下の説明に記載された特定の実施態様及び実施例の詳細に適用することに限定されない。本明細書で提供される記載は、例証のみを目的としており、限定的な意味で解釈されることを意図するものではない。このように、本明細書で使用される言語は、可能な限り最も広い範囲及び意味を与えられるように意図されており、実施態様及び実施例は例示的であり、網羅的ではないことを意味する。また、本明細書で使用される表現及び用語は、説明の目的のためのものであり、別途指示がない限り、限定的であると見なされるべきではないことを理解されたい。さらに、以下の詳細な説明では、本開示のより完全な理解を提供するために、多数の特定の詳細が示される。しかしながら、当業者であれば、本開示がこれらの具体的な詳細なしに実施されてもよいことは明らかであろう。他の例では、当業者に周知の特徴は、説明の不必要な複雑化を避けるために詳細には説明されていない。当業者に明らかな全ての代替、置換、改変及び均等物は、本開示の範囲内に含まれることを意図する。本明細書に開示されるコンストラクト、ナノ粒子、化合物、組成物及びそれらの製造及び適用方法及び使用方法の全ては、本開示に照らして過度の実験をすることなく作製及び実行することができる。したがって、本開示のコンストラクト、ナノ粒子、化合物、組成物及び方法は、特定の実施態様に関して記載されているが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、コンストラクト、ナノ粒子、化合物、組成物及び／又は方法に、又は本明細書に記載された方法の工程又は一連の工程に変化形が適用されうることは、当業者には明らかである。
【０００９】
米国特許第９，２９７，０１３号、米国特許第８，０８８，９１２号及び米国仮特許出願第６２／３００，５１７号を含む、本明細書で言及されるか、又は本出願のいずれかの部分で参照されるすべての特許、公開特許出願及び非特許刊行物は、それぞれの個々の特許又は刊行物が具体的かつ個々に参照により組み込まれるように示されているかのように、同じ程度にその全体が参照される。
【００１０】
本明細書中で他に規定されない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈によって別途要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書で使用される場合、特定の用語「単一」は「一つ」に限定される。
【００１１】
本開示の方法、化合物及び組成物に従って使用される場合、以下の用語は、別途指示がない限り、以下の意味を有すると理解されるべきである。
【００１２】
特許請求の範囲及び／又は明細書において、「含む（comprising）」という用語と併せて使用される場合、単語「ａ」又は「ａｎ」の使用は、「一つ」を意味しうるが、それはまた、「一又は複数」、「少なくとも一」、「一以上」の意味と一致する。特許請求の範囲において、用語「又は」は、代替物のみを指すと明示的に示されない限り、又は代替物が相互に排他的である場合、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物及び「及び／又は」のみを指す規定を支持する。用語「少なくとも一」の使用は、一だけでなく、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、１００、又はそれらに含まれる任意の整数を含むがこれらに限定されない、一より大きい任意の数量を含むと理解されるであろう。用語「少なくとも一」という用語は、それが付けられている用語に応じて、１００又は１０００又はそれ以上まで拡張することができ、加えて、１００／１０００の量は、より高度な限定はまた満足のいく結果を生み出す可能性があるため、限定的であると見なされるべきではない。加えて、用語「Ｘ、Ｙ及びＺの少なくとも一」の使用は、Ｘのみ、Ｙのみ及びＺのみ、ならびにＸ、Ｙ及びＺの任意の組合せを含むと理解される。
【００１３】
本明細書中で使用される場合、全ての数値又は範囲は、文脈上別途明示しない限り、その範囲内の値及び整数の分数並びにその範囲内の整数の分数を含む。よって、説明のため、１〜１０のような数値範囲への参照は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、並びに１．１、１．２、１．３、１．４、１．５等を含む。したがって、１〜５０の範囲への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０等最大５０まで（５０を含む）、並びに１．１，１．２，１．３，１．４，１．５等、２．１，２．２，２，３，２．４，２．５等を含む。一連の範囲への参照は、系列内の様々な範囲の境界の値を組み合わせる範囲を含む。よって、説明のために、例えば１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜７５０、７５０〜１，０００の一連の範囲の参照は、例えば１〜２０、１０〜５０、５０〜１００、１００〜５００及び５００〜１，０００の範囲を含む。
【００１４】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、単語「含む（comprising）」（及び含む（comprising）の任意の形、例えば「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」）、「有する（having）」（及び「有する（having）」の任意の形、例えば「有する（have)」及び「有する(has）」）、「含む（including）」（及び「含む（including）」の任意の形、例えば「含む（includes）」及び「含む（include）」又は「含有する（containing）」（及び「含有する（containing）の任意の形、例えば「含有する（contains）」及び「含有する（contain）」は、包括的であるか又は制約がなく、追加の引用されていない要素又は方法工程を除外しない。
【００１５】
本明細書で使用される用語「又はそれらの組み合わせ」とは、その用語に先行する列挙された項目の全ての順列及び組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ又はＡＢＣのうちの少なくとも一を含み、特定の文脈で順序が重要である場合は、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ又はＣＡＢも含むことを意図する。この例を続けると、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの一又は複数の項目又は用語の繰り返しを含有する組み合わせが明示的に含まれる。当業者であれば、文脈から明らかでない限り、典型的には、任意の組み合わせにおける項目又は用語の数に制限はないことを理解するであろう。
【００１６】
本出願を通して、用語「約（about）」は、値が組成物の誤差の固有の変動、組成物を投与するために使用される方法、又は試験対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。本明細書で使用される場合、修飾語「約」又は「ほぼ（approximately）」という修飾語は、正確な値、量、程度、方向又は他の修飾された特性若しくは値を含むことを意図しているが、測定誤差、製造公差  様々な部品若しくは構成要素に加わる応力、オブザーバの誤差、磨耗及び引き裂き、並びにそれらの組み合わせも含むことを意図する。用語「約」又は「ほぼ」は、量、一時的な持続時間などのような測定可能な値を指すときに本明細書で使用される場合、例えば±２０％又は±１０％の変動、又は±５％、又は±１％、又は±０．１％の変動を、本開示方法を実施するために適切であるように、且つ当業者に理解されるように、包含することを意味する。本明細書で使用される場合、用語「実質的に（substantially）」とは、続いて記載される事象若しくは状況が完全に起こること、又は続いて記載される事象若しくは状況が大いに生じることを意味する。例えば、用語「実質的に」とは、続いて記載される事象若しくは状況が、少なくとも９０％の確立で、又は少なくとも９５％の確立で、又は少なくとも９８％の確立で生じることを意味する。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「一実施態様」又は「実施態様」へのいずれかの言及は、実施態様に関連して記載される特定の要素、特徴、構造又は特性が少なくとも一の実施態様に含まれ、他の実施態様に含まれうることを意味する。本明細書の様々な箇所における「一実施態様では」という句の出現は、必ずしも全てが同じ実施態様を参照するものではなく、必ずしも単一の又は特定の実施態様に限定されるものでもない。
【００１８】
用語「薬学的に許容される」とは、合理的な利益／リスク比に見合った毒性、刺激及び／又はアレルギー応答のような過度の有害な副作用なしに、ヒト及び／又は動物への投与に適した化合物及び組成物を指す。本開示の化合物又はコンジュゲートは、化合物又はコンジュゲートの溶解性、送達可能性、分散性、安定性及び／又は配座完全性を改善しうる担体、ビヒクル及び希釈剤を含む一又は複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせることができる。
【００１９】
「生物学的に活性な」とは、活性剤がその生理学的効果をどのように有するかに関係なく、生物体の生理学的系を修飾する活性剤の能力を意味する。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「純粋な」又は「実質的に純粋な」とは、対象種が存在する優勢な種であることを意味し（すなわち、モル基準で、その組成物中の他の対象種よりも豊富である）、特に、実質的に精製された画分は、対象種が存在する全ての高分子種の少なくとも約５０パーセント（モル基準で）を含む組成物である。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の約８０％超、より具体的には約８５％超、約９０％超、約９５％超、又は約９９％超を含む。用語「純粋な」又は「実質的に純粋な」はまた、対象種が少なくとも６０％（ｗ／ｗ）純粋、又は少なくとも７０％（ｗ／ｗ）純粋、又は少なくとも７５％（ｗ／ｗ／ｗ）純粋、又は少なくとも８５％（ｗ／ｗ）純粋、又は少なくとも９０％（ｗ／ｗ）純粋、又は少なくとも９２％（ｗ／ｗ）又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）純粋、又は少なくとも９６％（ｗ／ｗ）純粋、又は少なくとも９７％（ｗ／ｗ）純粋、又は少なくとも９８％（ｗ／ｗ）又は少なくとも９９％（ｗ／ｗ）純粋、又は１００％（ｗ／ｗ）純粋である場合を指す。
【００２１】
この用語の範囲及び意味の動物の非制限的な例には、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット、チンチラ、ウマ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、動物園動物、オールド及びニューワールドサル、非ヒト霊長類及びヒトが含まれる。
【００２２】
「治療」とは、治療的処置を指す。「予防」とは、予防的又は防止的処置対策、又は状態又は疾患の発症を減少させることを指す。用語「治療する」とは、治療目的及び／又は予防のために組成物を対象に投与することを指す。
【００２３】
用語「治療用組成物」及び「医薬組成物」とは、当該分野で公知であるか又は本明細書で意図される任意の方法によって対象に投与されうる活性剤含有組成物を指し、ここで組成物の投与は、本明細書の他の箇所に記載されている治療効果をもたらす。さらに、本開示の組成物は、当技術分野で周知の製剤技術を使用して、遅延放出、制御放出、延長放出及び／又は持続放出を提供するように設計されうる。
【００２４】
用語「有効量」とは、本開示の方法で使用されるとき、妥当な利益／リスク比に見合った過度の有害な副作用（実質的な毒性、刺激及びアレルギー反応など）なしに、対象において検出可能な治療又は処置効果を示すのに十分な活性薬剤の量を指す。対象の有効量は、対象のタイプ、サイズ及び健康状態、処置される状態の性質及び重症度、投与方法、処置の持続時間、併用療法の性質（存在する場合）、使用される具体的な製剤などに依拠する。したがって、正確な有効量を事前に特定することはできない。しかしながら、所与の状況に対する有効量は、本明細書で提供される情報に基づく慣習的な実験を用いて、当業者によって決定されうる。
【００２５】
用語「軽減する」は、対象の状態、疾患又はその兆候の検出可能又は測定可能な改善を意味する。検出可能又は測定可能な改善には、状態若しくは疾患の発生、頻度、重症度、進行若しくは持続期間における主観的又は客観的な減少、低減、抑制、抑圧、制限若しくは制御、又は兆候若しくは根底にある若しくは疾患の結果の改善、又は疾患の好転が含まれる。効果的な治療結果は、疾患又は状態の発生、頻度、重症度、進行若しくは持続期間、又は対象における疾患又は状態の結果を改善、減少、低減、抑制、抑圧、制限、制御又は予防する「治療効果」又は「利益」をもたらすことができる。
【００２６】
状態又は疾患の安定化などの悪化の減少又は低減も良好な治療結果である。したがって、治療上の利益は、疾患若しくは状態又は疾患若しくは状態に関連する有害な兆候、合併症、結果又は根本的原因のいずれか一つ、大部分又はすべての完全な切除又は好転である必要はない。よって、状態若しくは疾患の発生、頻度、重症度、進行、若しくは持続期間における部分的な減少、低減、抑制、抑圧、制限、制御又は予防などの漸進的な改善があるとき（例えば安定化）、短期間又は長期間（時間、日、週、月など）にわたって満足のいくエンドポイントが達成されうる。状態又は疾患の潜在的な治療上の利益又は改善を提供する治療などの方法又は使用の有効性は、様々な方法及び試験アッセイによって確認することができる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「三方向ジャンクション」（「３ＷＪ」）又は「三叉」骨格（又はドメイン）とは、三のＲＮＡ配列から組まれたｐＲＮＡコンストラクトを指す。１１１ｐＲＮＡ  ３Ｗｊは、等モル濃度で混合されるときに塩基対を形成する、ＲＮＡの三の（５’→３’）鎖（図１では３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃと表される）から構築されている。より具体的には、３ＷＪａと示される第１の（５’→３’）ＲＮＡオリゴヌクレオチド配列、３ＷＪｂと示される第２の（５’→３’）ＲＮＡオリゴヌクレオチド配列及び３ＷＪｃと示される第３の（５’→３’）３ＷＪｃ配列は組み合わされ、塩基対を形成して、三叉ＰＲＮＡ  ３ＷＪを形成し、ここで、３ＷＪドメインの第１のブランチは３ＷＪａ配列の５’位及び３ＷＪｃ配列の３’位から形成され、３ＷＪドメインの第２のブランチは３ＷＪａ配列の３’位及び３ＷＪｂ配列の５’位から形成され、３ＷＪドメインの第３のブランチは、３ＷＪｂ配列の３’位及び３ＷＪｃ配列の５’位から形成され、ここで前記第１、第２及び第３のブランチの各々は、標準的なワトソン−クリック結合を形成する複数のＲＮＡヌクレオチド対を有するらせん状領域を含む。本開示の３ＷＪの１つ、２つ及び／又は３つの分枝はまた、限定されないが、Ｇ−Ｕのような非ワトソン−クリックヌクレオチド対を含みうる。
【００２８】
特定の非限定的な実施態様では、本開示のｐＲＮＡ  ３ＷＪ骨格の３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃオリゴヌクレオチド配列の各々は、独立して、ＲＮＡリンカー又はｐＲＮＡ  ３ＷＪ骨格にコンジュゲートした生物学的に活性な部分のＲＮＡ部分を含まない、８から３６ヌクレオチド（例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６ヌクレオチド）を含みうる。
【００２９】
この開示の全体を通して、変異コンストラクトに関して、「Δ」を含む下付き文字は、変異体において欠失された対応する野生型ｐＲＮＡのヌクレオチド位置を表す。用語「ドメイン」は、「コンストラクト」の代わりに使用されてもよい。オリゴヌクレオチド配列に関して使用される場合、用語「下流」とは、配列の３’末端に向かう方向を指し、「上流」とは、配列の３’末端に向かう方向をいう。
【００３０】
現在開示されているｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪ欠失変異体コンストラクト、Ｍ２  ｐＲＮＡ  ３ＷＪ欠失変異体コンストラクト及びＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪ欠失変異体コンストラクトについての生物物理学的研究は、野生型（ＷＴ）ｐｈｉ２９ｐＲＮＡの３ＷＪ部分（本明細書では「ステム」とも称される）に対するそれらの高い安定性を明らかにした。よって、記載された欠失変異体コンストラクトは、ＷＴ  ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪステムを多価のナノスケール送達システムのビルディングブロックとして利用する現在の技術に対するより堅牢な代替物として使用することができる。現在開示されている新規ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトは、以前に指摘したＷＴ  ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪモチーフのような、現在使用されている技術に対するそれらの高い安定性のために、改善された薬物送達骨格として少なくとも一の用途を有する。本明細書中に開示される高い安定性ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪ欠失変異体又は本明細書中に開示されるＭ２、ＳＦ５若しくはＧＡ１ｐＲＮＡ  ３ＷＪを用いて設計される機能性ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ、アプタマー及びアンチセンスＲＮＡ、並びに米国特許第９，２９７，０１３号に示されているような（ただしこれらに限定されない）治療分子、標的分子又は診断分子を連結するためのリンカーを含むがこれらに限定されない様々な治療分子、標的分子又は診断分子を運ぶための治療的送達ビヒクルを含むがこれらに限定されない。野生型ｐｈｉ２９、ＳＦ５、Ｍ２及びＧＡ１ｐＲＮＡの完全な配列は、米国特許第８，０８８，９１２号に示されている。
【００３１】
例えば、非限定的な実施態様では、３ＷＪ骨格に機能的に（共有結合的に）結合したｓｉＲＮＡらせんは、１０〜３０，１５〜２７又は２０〜２５ヌクレオチドを含んでもよく、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘発サイレンシング複合体）と命名されたタンパク質／ＲＮＡ複合体によるｍＲＮＡの切断を介して遺伝子発現を妨げる。ｓｉＲＮＡは、特異的に（例えば、無関係な構造の適切なコントロールと比較して統計的に有意に）、ｍＲＮＡがｓｉＲＮＡのセンス鎖と同一の配列を含む標的タンパク質の発現を抑制する。
【００３２】
非限定的な実施態様では、リボザイムは酵素活性を有するＲＮＡ分子を含みうる。リボザイムはかなりの治療可能性を有し、リボザイムの触媒中心に相補的な配列を含有するｍＲＮＡ又はＲＮＡのウイルスゲノムのようなＲＮＡ基質を遮断及び切断することによって遺伝子機能を調節することができる。
【００３３】
非限定的な実施態様では、ＲＮＡアプタマーは、結合ポケットの形成を介してリガンド（例えば、有機化合物、ヌクレオチド又はペプチド）を特異的に認識する能力において、抗体の機能と類似の機能を有するオリゴヌクレオチドのファミリーのメンバーでありうる。指数関数的濃縮（ＳＥＬＥＸ）によるリガンドの系統的進化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで開発された無作為化ＲＮＡプールから、所望の結合特異性を有するアプタマーをスクリーニングするために使用される方法である。この技術を用いて、疾患に関連するマーカーを標的とするために、様々なアプタマーを選択することができる。
【００３４】
非限定的な実施態様では、リボスイッチは、小分子に結合し、遺伝子発現を制御するＲＮＡ成分を含みうる。生物学的制御機構として、リボスイッチは代謝産物を認識し、ｍＲＮＡ転写の早期終了を誘発し、リボソームがｍＲＮＡを翻訳するのをブロックし、ｍＲＮＡを切断し、さらにはｍＲＮＡの破壊を引き起こしうる。
【００３５】
非限定的な実施態様では、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー及びリボスイッチを含むこのようなＲＮＡ部分、並びに他の触媒又は編集ＲＮＡは、当技術分野で認められた方法に従って、３ＷＪ骨格に容易に融合又はコンジュゲートして、ＲＮＡナノ粒子のアセンブリのためのモジュラーシステムを提供することができる。例えばＲＮＡナノメディシンのための本明細書に開示される化合物、組成物及び方法の利点の中には、自己組織化、高い物理化学的及び生理学的安定性、多価、標的送達、タンパク質非含有（非免疫原性、非炎症性、非毒性、リンホカイン、ケモカイン又はサイトカイン応答、例えばインターフェロン応答の非誘発性などの応答に関連する利点を含む）、ナノスケールサイズ、規定された構造及び化学量論を有する制御合成、治療と治療効果の検出の一粒子への組み合わせの寄与が含まれる。
【００３６】
非限定的な実施態様では、３ＷＪ骨格の各ブランチは、異なる治療有効量、レポーター及び／又は標的リガンドを担持し、それによって多価化合物を形成するように別々に機能化されうる。標的化合物は、細胞型特異的送達を可能にし、投与される薬物の濃度を低下させ、したがって副作用を低減する。多価アプローチは、特定の実施態様が治療剤の混合物（例えば、本明細書に組まれた３ＷＪナノ粒子複合体に組まれうる異なるサブユニットを介して送達される異なる薬物）を含み、それによって相乗効果をもたらすことを可能にする。多価は、単回投与で導入される一のナノ粒子に組み合わせられた、治療効果の検出と共に治療を可能にする、これら及び／又は他の考えられる実施態様においてさらなる利点を提供する。
【００３７】
非限定的な実施態様では、本明細書に開示される３ＷＪ骨格を含むＲＮＡナノ粒子は、典型的且つ有利にはナノメートルスケールでサイズ決定されうる。非限定的な実施態様では、１０〜５０ｎｍの範囲の粒子は、細胞表面受容体媒介性エンドサイトーシスを介して細胞膜を通過するのに十分小さいが、身体によって保持されるのに十分に大きいため、適切である。よって、本明細書に記載のナノ粒子送達は、治療剤及び／又は診断剤の薬物動態、薬力学、生体内分布及び安全性を改善する。さらに、現在開示されている治療化合物のタンパク質を含まない性質により、これらのナノ粒子は実質的に非免疫原性であり、レシピエントにおける抗体の誘導を回避することによって、これらの実施態様は、がん、ウイルス感染及び遺伝的病気を含む慢性疾患の治療のためのナノ粒子の安全な投与を可能にする。
【００３８】
非限定的な実施態様では、二つ又は三つ又はそれ以上のＲＮＡナノ構造ドメイン（例えば、ｓｉＲＮＡ、分子標的部分、リボザイム、アンチセンスＲＮＡ及びアプタマーなどの生物学的に活性な部分を含む若しくは他の機能的ドメインなどの類似又は非類似のドメイン）は、本開示の３ＷＪ骨格に共有結合されうる。
【００３９】
実験
材料及び方法
ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト設計
ｐＲＮＡ  ３ＷＪは、ほぼ等モル濃度で混合された三つのＲＮＡオリゴマーから組むことができる。この研究で調査されたｐＲＮＡコンストラクトは、３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃと称される三本のＲＮＡ鎖から組まれた（図１Ａ−Ｂ）。コンストラクトは、ほぼ等しい自由エネルギーの三つのらせんを形成するために、Ａ、ＣＥ、及びＤバルジ（図１Ａ）を含まない、折り畳みｐＲＮＡの中央３ＷＪ領域を包含するように設計された。本明細書中で利用されるｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトは、３ＷＪ「コア」において野生型に対して実質的な配列同一性を保持し、特定のコンストラクト（例えば、図２〜図３）において３ＷＪ「コア」に対して遠位の変化を含み、各ブランチのらせん形成の自由エネルギーは０．１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内であったことを裏付けた。各３ＷＪコンストラクトの三つのオリゴヌクレオチド配列を表１に示す。各分枝二本鎖の予測自由エネルギーは、二本の鎖が独立して一緒になると仮定したらせん開始条件を含む。これは、このブランチが３ＷＪにおいて同じエントロピーのペナルティを有するべきではないため、形成された第３のブランチにおけるらせん形成のペナルティを過大評価している。したがって、以下に示す計算された３ＷＪ自由エネルギー（例えば、表２）は、実際に３ＷＪの安定性を過小評価する。オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入し、製造者の指示に従って調製した。純度は、３２Ｐ標識及びゲル電気泳動によって＞９５％であることが確認された。表１試験された各ｐＲＮＡコンストラクトに関する成分３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃ（図５Ａ、５Ｂ、６Ａ及び６Ｂ）３ＷＪコンストラクト中の不対バルジヌクレオチドには下線が引かれている。下付き文字は、変異体において欠失された対応する野生型ｐＲＮＡのヌクレオチド位置を表す。
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【００４０】
ＵＶ光学溶融
各３ＷＪコンストラクトについて、三つのＲＮＡオリゴマー３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃを、０．４μＭから４０μＭの１００倍希釈範囲にわたるほぼ等モル濃度で混合した。ＵＶ光学溶融は、３成分ＲＮＡ系の分析を変えながら、前述（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ａｎｄ  Ｔｕｒｎｅｒ  ２００９）のように行った。簡単に説明すると、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＵ−８００分光光度計を用いて、標準的な溶融バッファー条件下（１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭカコジル酸ナトリウム、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３）で融解を行った。２６０℃及び２８０ｎｍにおける吸光度を、測定可能な最大温度範囲と、中間点及びコンストラクトの予想されるＴｍｓがほぼ等しい範囲との両方で、４℃から９０℃の温度に応じて測定した。最低エネルギー構造を再現性よく形成するために、ＲＮＡ試料を９０℃に加熱し、溶解又はマグネシウムの添加前にゆっくりと冷却した。塩化ナトリウム濃度は、１０ｍＭの金属イオンを含む溶融物については１桁低下したが、他の条件は全て同じままであった。ＥＤＴＡの存在により、有効なＭｇ２＋濃度は１０ｍＭよりわずかに低かった可能性がある。各コンストラクトについて、単一のＲＮＡ鎖３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃの光学溶融と、全ての対毎の組み合わせもまた実施した。融解温度を決定するためにＭｅｌｔｗｉｎを用いて融解曲線を適合させ、平衡定数Ｋｅｑを式１によって与えたｖａｎ’ｔ  Ｈｏｆｆプロットから熱力学的パラメータを決定した。
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ここで、ＣＴ  ＝総鎖濃度であり、非自己相補的配列を含む平衡による三分子解離反応についてはｎ＝３であり、線形適合の良好さ、誤差の良好な推定値は≧０．９０であった。溶融転移の急峻性とｖａｎ’ｔ  Ｈｏｆｆプロットの直線性は、二状態溶融を示唆しているが、ΔＣｐ＝０の仮定は厳密には追従しない。エンタルピーはいくらかの温度依存性を示すが、エンタルピー及び熱容量の値には大きな誤差がある。エンタルピーとエントロピーの誤差は相関しているため、自由エネルギーは依然として有用で予測可能な値を提供する。さらに、温度依存性の熱容量の変化に対する補正は、多ブランチループモチーフの最終自由エネルギーの値、すなわち＜０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌの誤差内では小さな効果を有する。最近傍データベース（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ）（表２、図６Ａ〜６Ｂ）から計算したＲＮＡらせんの安定性寄与を差し引くことにより、ｐＲＮＡ  ３ＷＪナノモチーフの熱力学的安定性を計算した。
【００４１】
ｐＲＮＡ  ３ＷＪ二次構造及び自由エネルギー予測
四つのＲＮＡ二次構造予測プログラム：ＲＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ＲＮＡ  ｆｏｌｄ、ｍｆｏｌｄ及びＲＮＡｓｏｆｔを使用して、各ｐＲＮＡコンストラクトの二次構造及び安定性を予測した。ＲＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ＲＮＡｆｏｌｄ及びｍｆｏｌｄにおける予測に関して、ｐＲＮＡ鎖３ＷＪａ及び３ＷＪｂと、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃとは、５’-ａａａａ-３’ヘアピンと接合され、その後、コンストラクトは一本鎖として折り畳まれる。自由エネルギー予測は、ヘアピンの位置、つまり、ヘアピンが鎖３ＷＪａ及び３ＷＪｂと鎖３ＷＪｂ及び３ＷＪｃとの間、鎖３ＷＪｂ及び３ＷＪｃと鎖３ＷＪｃ及び３ＷＪａとの間、又は鎖３ＷＪｃ及び３ＷＪａと鎖３ＷＪａ及び３ＷＪｂとの間にどのように位置するかには影響されない。ＲＮＡｓｏｆｔにおける予測に関して、ｐＲＮＡ鎖３ＷＪａ及び３ＷＪｂは、５’-ａａａａ-３’ヘアピンと接合され、鎖３ＷＪｃとともに折り畳まれる。また、自由エネルギー予測は、ヘアピンの位置、つまり、ヘアピンが鎖３ＷＪａと３ＷＪｂと鎖３ＷＪｂとの間、鎖３ＷＪｂと３ＷＪｃとの間、又は鎖３ＷＪｃと３ＷＪａとの間にどのように位置するかには影響されない。各コンストラクトに関して、各プログラムによって出力される最も安定した構造は、設計された構造である。強制塩基対又は一本鎖制限は使用されなかった。追加されたヘアピンを補正するために、二つの５’−ａａａａ−３’ヘアピンペナルティを、ＲＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ＲＮＡｆｏｌｄ及びｍｆｏｌｄによって出力された二次構造安定性から差し引いた。ＲＮＡｓｏｆｔによって予測された安定性に関して、一つの５’−ａａａａ−３’ヘアピンペナルティを差し引いた。計算には３ＷＪの開始条件が考慮されるため、その自由エネルギーは、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖、又は三成分系との関連で、誤差内で正確である。二つのオリゴマーを一緒にするためのエントロピーペナルティは、開始条件の自由エネルギーに含まれる。ＲＮＡヘアピン及びＲＮＡ分子間相互作用を開始する自由エネルギーは、５．４±０．２ｋｃａｌ／ｍｏｌから６．４±０．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ（スパニングループ長さｎ＝３からｎ＝９）及びび４．０９±０．２ｋｃａｌ／ｍｏｌである。したがって、一本鎖自己折り畳みと比較して三本のオリゴヌクレオチド鎖を一緒にする際には、実質的にエントロピーエネルギー差が存在するが、多分岐ループの自由エネルギーの計算はこの差異を説明し、異なる状況で比較可能な３ＷＪモチーフの比較を行う。
【００４２】
電気泳動ゲル移動度シフトアッセイ
電気泳動ゲル移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用して、ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトの形成をモニターした。標準的な溶融バッファー中で４０μＭの濃度のＲＮＡ（１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭカコジル酸ナトリウム、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．０）を１０分間にわたって８０℃に加熱し、その後、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−２００  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ中０．１℃／ｓの速度で４℃に冷却した。ＲＮＡをスクロース充填色素と混合し、予め冷却した、エチジウムブロマイドで染色した２％（ｗ／ｖ）アガロース中、５０Ｖ及び４℃でＴＡＥバッファー中で泳動させた。ＲＮＡ一本鎖（ｐｈｉ２９  ３ＷＪａ）、対の組合せ（ｐｈｉ２９  ３ＷＪａ＋３ＷＪｂ）、及び全ての組まれたｐＲＮＡ  ３ＷＪの移動度をモニターした。
【００４３】
結果
ｐＲＮＡ  ３ＷＪナノモチーフ安定性
各コンストラクト及びそのそれぞれの３ＷＪナノモチーフについてのＵＶ光学溶融によって決定された熱力学的パラメータを表２に報告する。ＧＡ１、ＳＦ５及びＭ２ｐＲＮＡ  ３ＷＪは、ステムｐｈｉ２９ｐＲＮＡ  ３ＷＪよりも高い安定性を示した（表２）。
表２ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト及びナノモチーフについての熱力学的パラメータエンタルピー、エントロピー及び自由エネルギーにおける誤差は、それぞれ、１０％、１０％及び５％であると推定される。
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【００４４】
溶融曲線は、ＲＮＡ三重らせんから一本鎖ＲＮＡへの協調的転移の前提を裏付ける非常に急峻な転移を示した（図４Ａ）。一本鎖又は対の組み合わせ溶融物のいずれも、３ＷＪと競合する有意な転移を示さなかった（データ非表示）。例えば、ｐｈｉ２９鎖３ＷＪａ及び３ＷＪｂの溶融物は、５１℃の溶融温度を有する転移を示したが、完全な３ＷＪ（すなわち、３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃ鎖を合わせたもの）は、溶融温度５６℃で転移を示した。しかしながら、三本鎖の全てが存在する場合、３ＷＪの形成が好ましい。非自己相補的ＲＮＡ二本鎖について先に示されたように、自己相補的二本鎖を形成する一本鎖の別のコンフォメーションのＴｍが、エンタルピーが自己相補性二本鎖に関してより好ましい場合により高いＴｍを有する場合でも、非自己相補的二本鎖を形成する。３ＷＪコンストラクトの自由エネルギーはｖａｎ’ｔ  Ｈｏｆｆプロットから計算され、ここで、直線適合の良好さは全ての溶融物について≧０．９０であった（図４Ｂ）。最近傍データベース（Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｄａｔａｂａｓｅ）（表２、図６Ａ〜６Ｂ）から計算したＲＮＡらせんの安定性寄与を差し引くことにより、ｐＲＮＡ  ３ＷＪナノモチーフの熱力学的安定性を計算した。調査した３ＷＪの自由エネルギーは、−９．９ｋｃａｌ／ｍｏｌから１０．２ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲である（表２）。対照的に、３７℃での１．４ｋｃａｌ／ｍｏｌは、結合定数においてほぼ１桁の大きさである。したがって、調査された３ＷＪの形成の自由エネルギーの範囲は、結合定数に関して１４桁に及ぶ。
【００４５】
特定のウリジン（Ｕ）残留物がジャンクションから欠失した場合、ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪは安定化されている。特に、以下の二つの欠失の組み合わせは、ＷＴ  ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪと比較して安定性を増加させた：（１）鎖３ＷＪｂにおけるトリ−Ｕバルジ（すなわち、Ｕ７２−７３−７４）中の三つのＵ残基のうちの二つを伴う、鎖３ＷＪａにおける単一のＵバルジ（Ｕ２９）の欠失；及び（２）３ＷＪにおけるすべてのバルジＵ残基すなわち、Ｕ２９／Ｕ７２−７３−７４）の欠失（表２、図２）。他の調査された欠失は、ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪの安定性に重大な影響を及ぼさなかったか、又はそれを能動的に不安定化した（表２）。
【００４６】
使用した四つのＲＮＡ二次構造予測プログラムのうち、ジャンクションの実際の自由エネルギー又は変異ｐｈｉ２９ｐＲＮＡ  ３ＷＪ安定性のいずれかを正確に予測したものはなかった（図５Ａ〜５Ｂ）。最良の予測は、測定された自由エネルギーの１ｋｃａｌ／ｍｏｌ（ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３−７４についてはＲＮＡｓｏｆｔにより測定）から９ｋｃａｌ／ｍｏｌ（ｐｈｉ２９ΔＵ７２−７３についてはＲＮＡｆｏｌｄにより測定）内の範囲であり、最悪の予測は、１ｋｃａｌ／ｍｏｌ（ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３−７４についてはＲＮＡｓｏｆｔにより測定）から１１ｋｃａｌ／ｍｏｌ（ｐｈｉ２９ΔＵ７２−７３についてはＲＮＡｆｏｌｄにより測定）内の範囲であった。最良でも、予測プログラムは、測定された自由エネルギーから平均して４（±２）ｋｃａｌ／ｍｏｌ離れていた。
【００４７】
金属イオン結合
ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトの安定性に対するＮａ＋、Ｍｇ２＋及びスペルミジン（３＋荷電種）の効果を図７に示す。１００ｍＭ  ＮａＣｌに対して、ｐｈｉ２９ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトは、Ｍｇ２＋及びスペルミジンによってほぼ等しく安定化されたが、ＧＡ１、ＳＦ５及びＭ２ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトは、これらのイオンによって特異的に影響を受けた。Ｍｇ２＋の添加は、ＳＦ５及びＭ２ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトの両方を安定化した。スペルミジンの添加は、それぞれＧＡ１、ＳＦ５及びＭ２ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトに対する安定化効果を増加させた（図７）。
【００４８】
電気泳動ゲル移動度シフトアッセイ
一本鎖（ｐｈｉ２９  ３ＷＪａ）及び対の組み合わせ（ｐｈｉ２９  ３ＷＪａ＋３ＷＪｂ）に対する標準的な溶融バッファー条件（１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭカコジル酸ナトリウム、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）下での全てのｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトの移動度を示すゲルを図８に示す。全ての３ＷＪコンストラクトはほぼ同じ速度で泳動した。さらに、各ＲＮＡ一本鎖及びＴＭＳバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中の全ての対の組み合わせに対する各ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトの移動度を示すゲルを、様々な生物学的ＲＮＡの組立及び安定性について以前に出版された文献を比較した（データ非表示）。各ゲルについて、ＲＮＡ系のより多くの成分が添加されるにつれて移動度が減少し、より高分子量の複合体の形成を示した。一本鎖は最も速い移動を示し、対の組み合わせは３本のＲＮＡ  ３ＷＪ鎖が全て存在する場合に現れる遅い移動バンドと比較して中間の移動を示し（図８）、三つのＲＮＡ成分がいずれの二つの成分よりもより有利に相互作用することを示し、鎖３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃからのｐＲＮＡ  ３ＷＪの形成を確認した。
【００４９】
ループ−ループ相互作用安定性に対する３ＷＪ安定性及び自己組織化
調査したｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトの中で、ＳＦ５及びＭ２ｐＲＮＡ  ３ＷＪは熱力学的に最も安定であり、ｐＲＮＡベースのナノテクノロジーで使用されるステムｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪ骨格に対する魅力的な代替物となった。興味深いことに、これらのｐＲＮＡはこれまでに研究された実験室条件下で自己組織化のための最も高い傾向を示している。Ｇｕ及びＳｃｈｒｏｅｄｅｒ（Ｇｕ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ２０１１、ｏｐ．ｃｉｔ．）並びにＨａｏ及びＫｉｅｆｔ（Ｈａｏ  ａｎｄ  Ｋｉｅｆｔ  ２０１４、ｏｐ．ｃｉｔ．）によって提供された配列から計算されたループ−ループ相互作用安定性を有する本発明者らの測定した３ＷＪ安定性の分析は、３ＷＪナノモチーフがｐＲＮＡの安定化において補償的役割を果たすかどうかについての洞察を提供する。分析は、ループ−ループ相互作用はすべて好ましいが、３ＷＪはより広い範囲の安定性を有することを示した（図９Ａ〜Ｂ）。特に、ｐｈｉ２９及びＧＡ１ｐＲＮＡは、３ＷＪ安定性があまり好ましくなく、Ｍ２及びＳＦ５ｐＲＮＡは、より好ましい３ＷＪ安定性を有する（図９Ａ〜Ｂ）。ｐｈｉ２９及びＧＡ１ｐＲＮＡについては、ループ−ループ相互作用安定性は３ＷＪ安定性によって相殺され、一方ＳＦ５及びＭ２ｐＲＮＡについては、ループ−ループ相互作用及び３ＷＪは両方とも安定である。安定化ナノモチーフの組み合わせは、ＳＦ５及びＭ２ｐＲＮＡのみがｉｎ  ｖｉｔｒｏでより高次の多量体の自己集合を示した理由を説明するのに役立ちうる。ＳＦ５及びＭ２配列はどちらも、熱力学的安定性及びｐｈｉ２９と比較してより高次の多量体中に組む傾向と一致して、既存の同軸積み重ね又は他の好ましい相互作用を自己組織化のために中断することを必要としない３ＷＪ前組織を採用すしうる。
【００５０】
ここで、出願人は、ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪにおけるΔＵ２９／ΔＵ７２−７３及びΔＵ２９／ΔＵ７２−７３−７４欠失は安定していることを示しており（表２）、これは、機能性ＲＮＡの合理的な設計におけるステムｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪ骨格の代わりを示す。
【００５１】
ｐＲＮＡ  ３ＷＪ中の構造−エネルギー関係
ここに示した新しい熱力学データは、ＲＮＡ構造−エネルギー関係、特に３ＷＪにおける四つのバルジＵ残基についての推論の基礎を提供する。非ワトソン−クリック塩基対形成は、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用を促進し、リガンドに結合するモチーフを形成する、ＲＮＡ３Ｄ構造において優勢である。ｐｈｉ２９  ３ＷＪ結晶構造は、Ｕ２９及びＵ７２のワトソン−クリック端の間のシス塩基対の形成と、Ｕ２９及びＵ７４の間の塩基積み重ねを明らかにした。比較すると、Ｕ２９及びトリ−Ｕバルジ中の三つのＵ残基（すなわち、Ｕ７２−７３−７４）の少なくとも一つが保持されたｐｈｉ２９ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトは、これらのコンストラクトの３ＷＪを通じた塩基対形成の可能性にかかわらず、同等の熱力学的安定性を有するようには見えなかった。しかしながら、Ｕ２９及びトリ−Ｕバルジ中三つのＵ残基のうちの二つが保持された３ＷＪの安定性は、ステムｐｈｉ２９ｐＲＮＡ  ３ＷＪのものとほぼ同等であった（それぞれ４．７対４．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。興味深いことに、ｐｈｉ２９ｐＲＮＡ  ３ＷＪの安定性の顕著な増加は、トリ−Ｕバルジ中のＵ残基の一つが保持された場合（−３．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、又は３ＷＪの全てのバルジＵ残基が欠失した場合（０．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）にのみ生じた。これらの３ＷＪのどちらも、観察された塩基対形成又はジャンクションを横切るＵ残基間の塩基積み重ねを可能にしない。これは、対形成及び積み重ねがジャンクションを安定化させる唯一の好ましい第三相互作用ではないことを示唆する。これらの変異は、観察された安定性の差異に寄与する可能性がある、異なる好都合ならせん同軸積み重ね相互作用を可能にしうる。
【００５２】
ＲＮＡ二次構造予測プログラムによる自由エネルギー出力は、正確に予測できなかった。この研究で実施されたプログラムはすべて同じ自由エネルギーデータベースを利用していたが、多ブランチループが予測される方法は、ＲＮＡ構造予測プログラムによって異なる。予測は、同軸積み重ねの全ての可能なコンフォメーションを考慮し、単一の最も好ましい同軸積み重ね構成のみを含むか、又は既知の二次構造の解析からの知識ベースのパラメータを含むことができる。いずれのアルゴリズムも、本明細書で調査した３ＷＪの測定された安定性の間で観察された差異の大きさを説明することができなかった。全てのプログラムは、ｐｈｉ２９及びＧＡ１ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトの安定性を過大評価し、ＳＦ５及びＭ２ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトの安定性を過小評価した（図５Ａ〜６Ｂ）。さらに、プログラムの予測のいずれも、ステムｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪにおいて欠失を有するコンストラクトの安定性の間で差別化されなかった。例えば、最も高い安定性を有することが示された変異体も、最も低い安定性を有することが示された変異体も、そのように予測されなかった（図５Ａ〜６Ｂ）。その代わりに、欠失変異体はすべて、おおよそ同じ自由エネルギー（〜１ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内）を有すると予測された。
【００５３】
プロヘッドＲＮＡ（ｐＲＮＡ）は、ｐｈｉ２９様バクテリオファージＤＮＡパッケージングモーターの重要な成分である。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定性及び自己組織化特性のために、ｐＲＮＡは、機能的ＲＮＡ超分子構造の合理的設計における骨格としてうまく使用されてきた。現在開示されている研究の前に、ｐｈｉ２９ｐＲＮＡ以外のｐＲＮＡ配列の安定性は比較的低発現していた。本発明者らの結果は、特定のステム及び変異ｐＲＮＡ  ３ＷＪが、ステムｐｈｉ２９ｐＲＮＡ  ３ＷＪよりも安定であることを実証している。
【００５４】
血清の安定性
標準的な溶融バッファー条件下でのＵＶ光学溶融の研究から得られた結果において、少なくとも五つの３ＷＪは、ステムｐｈｉ２９  ３ＷＪ（図２）と比較して熱力学的により安定している（すなわち、よりネガティブなΔＧ３７を有する）ことが実証され、それはＧＡ１  ３ＷＪ（図２）、ＳＦ５  ３ＷＪ（図３）、Ｍ２  ３ＷＪ（図３）、ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３  ３ＷＪ（図１２）、ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３−７４  ３ＷＪ（図１３）を含んでいた（表２）。したがって、３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃ配列を含むこれらのコンストラクトは、標準的な溶融バッファー条件下でステムｐｈｉ２９  ３ＷＪコンストラクト（図２）と比較して、非常に安定していると実証された。標準的な溶融バッファー中でのＵＶ光学溶融によって決定されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性と生体液中の安定性との間の相関関係を調べるために、生理学的温度でヒト血清に曝露した後に上記熱安定性ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトの分解をモニターした。ＲＮＡ鎖３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃをほぼ等モル濃度で混合し、３７℃でヒト血清とインキュベートした。フェノール抽出／エタノール沈殿を用いて３ＷＪを回収し、標準的な溶融バッファーに再懸濁した。ＥＭＳＡについて上で概説したのと同じ条件下で、ゲル電気泳動を用いて分解を分析した。
【００５５】
図１０Ａは、１００倍に希釈したヒト血清に１０分間曝露した後、ＴＡＥバッファー中エチジウムブロマイドで染色した２％（ｗ／ｖ）アガロース中の１０μＭの熱安定性３ＷＪコンストラクトの分解結果を示す。全ての反応は３７℃で行われた。レーン（ｉ）５０ｂｐ  ＤＮＡラダー、（ｉｉ）標準的溶融バッファー＋１ユニットＲＮａｓｅ  Ｔ１（ポジティブ分解コントロール）中ｐｈｉ２９  ３ＷＪコンストラクト、（ｉｉｉ）ｐｈｉ２９  ３ＷＪコンストラクト（図２）、（ｉｖ）ＧＡ１  ３ＷＪコンストラクト（図２）、（ｖ）ＳＦ５  ３ＷＪコンストラクト（図３）、（ｖｉ）Ｍ２  ３ＷＪコンストラクト（図３）、（ｖｉｉ）ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３  ３ＷＪコンストラクト（図１２Ａ）、（ｖｉｉｉ）ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３−７４  ３ＷＪコンストラクト（図１２Ｂ）。標準的な溶融バッファーは、１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭカコジル酸ナトリウム及び０．５  ＥＤＴＡ、ｐＨ７であった。少なくとも二つの３ＷＪコンストラクトはあまり分解を示さず、よって、それらはステムｐｈｉ２９  ３ＷＪコンストラクト（図２）と比較して、ヒト血清中でより安定していることが実証された。それらは限定されないが、ＳＦ５  ３ＷＪコンストラクト（図３）及びＭ２  ３ＷＪコンストラクト（図３）を含んでいた。したがって、３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃ配列を含むこれらのコンストラクトは、ステムｐｈｉ２９  ３ＷＪコンストラクト（図２）と比較して、非常に安定していると実証された。      図１０Ｂは、先に実証された血清安定３ＷＪコンストラクトのさらなる分解結果と、第２のドナーからの１００倍に希釈したヒト血清に１０分間曝露した後、ＴＡＥバッファー中エチジウムブロマイドで染色した２％（ｗ／ｖ）アガロース中の１０μＭの変異ＳＦ３  ３ＷＪコンストラクトのさらなる分解結果とを示す。全ての反応は３７℃で行われた。レーン（ｉ）５０ｂｐ  ＤＮＡラダー、（ｉｉ）標準的溶融バッファー（ネガティブ分解コントロール）中ｐｈｉ２９  ３ＷＪコンストラクト、（ｉｉｉ）ｐｈｉ２９  ３ＷＪコンストラクト、（ｉｖ）Ｍ２  ３ＷＪコンストラクト、（ｖ）ＳＦ５  ３ＷＪコンストラクト、（ｖｉ）ＳＦ５ΔＧ３１  ３ＷＪコンストラクト、（ｖｉｉ）ＳＦ５ΔＧ６９  ３ＷＪコンストラクト、（ｖｉｉｉ）ＳＦ５ΔＧ３１／ΔＧ６９  ３ＷＪコンストラクト。変異ＳＦ５  ３ＷＪコンストラクトＳＦ５ΔＧ３１及びＳＦ５ΔＧ３１／ΔＧ６９は、ＳＦ５  ３ＷＪコンストラクトと比較して、ヒト血清中での改善した安定性を示す。
【００５６】
図１０Ａ〜１０Ｂは、二人の異なるドナーからのヒト血清中のｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトの安定性を比較する。これらの血清安定性アッセイ結果は、ＳＦ５及びＭ２  ３ＷＪコンストラクト並びにＳＦ５ΔＧ３１及びＳＦ５ΔＧ３１／ΔＧ６９欠失変異体３ＷＪコンストラクトが、ヒト血清中で、ステムｐｈｉ２９  ３ＷＪコンストラクトよりも安定であることを示す。ＳＦ５及びＭ２  ３ＷＪコンストラクトはまた、ＧＡ１  ３ＷＪコンストラクト並びにｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３及びｐｈｉ２９ΔＵ２９／Ｕ７２−７３−７４欠失変異体３ＷＪコンストラクトよりも高い安定性を示した。
【００５７】
さらに時間経過分析を、ステムｐｈｉ２９  ３ＷＪ（図２）、ＳＦ５  ３ＷＪ（図３）及びＭ２  ３ＷＪ（図３）コンストラクトについて行った。ゲル移動度の結果を図３に示す。１０００倍に希釈したヒト血清に１０分間、３０分間及び１時間曝露した後、ＴＡＥバッファー中エチジウムブロマイドで染色した２％（ｗ／ｖ）アガロース中で、３ＷＪコンストラクト（１０μＭ）を分析した。全ての反応は３７℃で行われた。レーン（ｉ）５０ｂｐ  ＤＮＡラダー、（ｉｉ）１時間の標準的溶融バッファー（１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭカコジル酸ナトリウム、０．５  ＥＤＴＡ、ｐＨ７）中３ＷＪコンストラクト、（ｉｉｉ）１０分間１０００倍に希釈した血清中３ＷＪコンストラクト、（ｉｖ）３０分間１０００倍に希釈した血清中３ＷＪコンストラクト、（ｖ）１時間１０００倍に希釈した血清中３ＷＪコンストラクト。Ｍ２及びＳＦ５の３ＷＪコンストラクトはいずれも、ヒト血清中で、時間の経過とともに、ステムｐｈｉ２９  ３ＷＪコンストラクトよりも安定であることが確認された。
【００５８】
溶融温度
ほぼ４０μＭの様々な３ＷＪコンストラクトの溶融温度（Ｔｍ）を、上で概説されているようにＵＶ光学溶融によって決定した（表３）。Ｔｍ中の誤差は、±１℃と推定される。ＳＦ５、Ｍ２、ｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３、ＳＦ５ΔＧ６９及びＳＦ５ΔＧ３１／ΔＧ６９３ＷＪコンストラクトは、４０μＭでのステムｐｈｉ２９  ３ＷＪコンストラクトよりも著しく高い溶融温度を有し、これはより高い安定性を示す。
表３様々な３ＷＪコンストラクトのＴｍ
2019510511.tif 000007
＊Ｍ２及びＳＦ５ΔＧ３１の溶融温度は、それぞれ２５μＭ及び３３μＭの濃度で報告される。
【実施例】
【００５９】
ここで一般的に説明されている本開示の発明の概念は、単に特定の態様及びその実施態様を説明する目的のために含まれる以下の追加の実施例及び実施態様を参照することによって、より容易に理解され、制限することを意図するものではない。以下の詳細な実施例は、上記のように、単に例示的なものであり、決して本開示の限定ではないと解釈されるべきである。当業者は、様々なコンストラクト、ナノ粒子、組成物、成分、手順及び方法から適切なバリエーションを直ちに認識するであろう。
【００６０】
以下の非限定的な実施例には、３配列セットのｐＲＮＡオリゴヌクレオチド（３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃ配列鎖、５’→３’）が含まれ、これらは、本開示の教示に従って形成及び使用されうる様々な３ＷＪコンストラクトを組むために使用されうる。以下又は本明細書中の他に記載する３配列セットのいずれかを、生物学的に活性な部分が（３ＷＪのより多くのブランチの一つに接続することによって）共有結合されて本開示に従って使用されるコンジュゲートが形成される３ＷＪ骨格に組み込むことができる。
【００６１】
少なくとも一の実施態様では、本開示は、第１のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む３ＷＪａ配列、第２のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む３ＷＪｂ配列及び第３のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む３ＷＪｃ配列を含む三方向ジャンクション（３ＷＪ）コンストラクトを含むＲＮＡジャンクション骨格を対象とし、ここで、３ＷＪコンストラクトの第１のブランチは、３ＷＪａ配列の５’位及び３ＷＪｃ配列の３’位から形成され、３ＷＪコンストラクトの第２のブランチは、３ＷＪａ配列の３’位及び３ＷＪｂ配列の５’位から形成され、３ＷＪコンストラクトの第３のブランチは、３ＷＪｂ配列の３’位及び３ＷＪｃ配列の５’位から形成され、ここで、前記ブランチのそれぞれは、標準的なワトソン−クリック結合を形成する複数のＲＮＡヌクレオチド対を有するらせん状領域を含む。
【００６２】
ＲＮＡジャンクション骨格の少なくとも一の実施態様では、３ＷＪｂ配列は、第２のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の位置に、又は、第１のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の位置における３ＷＪｃ配列に、単一の不対ヌクレオチド（例えば、Ｕ）を含む。
【００６３】
ＲＮＡジャンクション骨格の少なくとも一の実施態様では、３ＷＪａ配列は、第２のブランチに二の隣接する不対ヌクレオチド（例えばＣＡ）のみを含み、３ＷＪｂ配列は、第２のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の位置に単一の不対ヌクレオチド（例えばＣ）を含み、３ＷＪｃ配列は、第１のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の位置に二の隣接する不対ヌクレオチド（例えば、ＣＵ）のみを含む。
【００６４】
ＲＮＡジャンクション骨格の少なくとも一の実施態様では、３ＷＪａ配列は、第２の分枝に単一の不対ヌクレオチド（例えばＧ）を含み、３ＷＪｂ配列は、第２のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の位置に二の不対ヌクレオチド（例えば、ＧＧ）のみを含む。
【００６５】
ＲＮＡジャンクション骨格の少なくとも一の実施態様では、３ＷＪａ配列は、第２の分枝に不対ヌクレオチドを欠いており、３ＷＪｂ配列は、第２のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の位置に二の不対ヌクレオチド（例えば、ＧＧ）のみを含む。
【００６６】
ＲＮＡジャンクション骨格の少なくとも一の実施態様では、３ＷＪａ配列は、第２の分枝に不対ヌクレオチドを欠いており、３ＷＪｂ配列は、第２のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の位置に単一の不対ヌクレオチド（例えば、Ｇ）のみを含む。
【００６７】
ＲＮＡジャンクション骨格の少なくとも一の実施態様では、３ＷＪａ配列は、単一の不対ヌクレオチド（例えばＧ）を含み、３ＷＪｂ配列は、第２のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の位置に単一の不対ヌクレオチド（例えば、Ｇ）を含む。
【００６８】
ＲＮＡジャンクション骨格の少なくとも一の実施態様では、３ＷＪａ配列は、第１のブランチのらせん領域と第２のブランチのらせん領域との間の位置に単一の不対ヌクレオチド（例えば、Ｇ）と、第２のブランチの一部の第１のらせん領域の下流に単一の不対ヌクレオチド（例えば、Ｇ）を含み、３ＷＪｃ配列は、第１のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の位置に単一の不対ヌクレオチド（例えば、Ａ）を含む。
【００６９】
野生型ｐｈｉ２９ｐＲＮＡ由来のステムｐｈｉ２９ｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクト（図２）は、第２のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の位置の野生型ｐｈｉ２９ｐＲＮＡ全体の７２，７３及び７４位に対応する位置の３ＷＪｂ配列に三つの不対ヌクレオチド（ＵＵＵ）を、第１のブランチのらせん領域と第２のブランチのらせん領域との間の位置の野生型ｐｈｉ２９ｐＲＮＡの２９位に対応する位置の３ＷＪａ配列に不対ヌクレオチドＵを含む（ここで、位置番号は、野生型ｐｈｉ２９ｐＲＮＡ全体の配列に対応する）。本開示の少なくとも一の実施態様は、第２のらせん領域と第３のらせん領域との間の位置の３ＷＪｂ配列で不対ヌクレオチドＵ（Ｕ７２及びＵ７３）のうちの２つが欠失しており、第１のらせん領域と第２のらせん領域との間の３ＷＪａ配列で単一の不対ヌクレオチドＵ（Ｕ２９）が欠失しているｐｈｉ２９ｐＲＮＡ  ３ＷＪ欠失変異体コンストラクト（図１２のｐｈｉ２９ΔＵ２９／ΔＵ７２−７３）に関する。
【００７０】
野生型Ｍ２ｐＲＮＡに由来するステムＭ２  ３ＷＪコンストラクト（図１４）は、第２のブランチのＭ２  ３ＷＪａ配列中の３６及び３７位に位置する二の隣接する不対ヌクレオチド（ＡＵ）と、コンストラクトの第３のブランチのＭ２  ３ＷＪｂ配列中の７９位に位置する不対ヌクレオチド（Ａ）とを含む（位置番号は野生型Ｍ２ｐＲＮＡ全体の配列に対応する）。本開示の少なくとも一の実施態様は、第２のブランチのＷＴ  ３ＷＪａ配列中の３６及び３７位に対応する二の不対ヌクレオチドＡＵが欠失し、コンストラクトの第３のブランチのＷＴ  ３ＷＪｂ配列中の７９位に対応する不対ヌクレオチドＡが欠失しているＭ２ｐＲＮＡ  ３ＷＪ欠失変異体コンストラクト（Ｍ２ΔＡＵＡ）に関する。
【００７１】
ステムＳＦ５  ３ＷＪコンストラクト（図３）は、第２のブランチの３ＷＪａ配列の３１位に不対ヌクレオチド（Ｇ）を含み、第２のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の位置の３ＷＪｂ配列の６９及び７０位に二の隣接する不対ヌクレオチド（ＧＧ）を含む（位置番号は野生型ＳＦ５ｐＲＮＡ全体の配列に対応する）。本開示の特定の実施態様は、ＳＦ５  ３ＷＪの３ＷＪａ及び３ＷＪｂ配列の不対ヌクレオチドの１、２又は３個、例えば、３ＷＪａ配列のＧ３１（ＳＦ５ΔＧ３１）（例えば図３２）、３ＷＪＢ配列のＧ６９（ＳＦ５ΔＧ６９）（例えば図３７）、３ＷＪａ及び３ＷＪｂ配列のＧ３１及びＧ６９の両方（ＳＦ５ΔＧ３１／ΔＧ６９）（例えば図４２）、又は３ＷＪａ及び３ＷＪｂ配列のＧ３１、Ｇ６９及びＧ７０（ＳＦ５ΔＧ３１／ΔＧ６９−７０）が欠失しているＳＦ５ｐＲＮＡ  ３ＷＪ欠失変異体コンストラクトに関する。
【００７２】
野生型ＧＡ１  ｐＲＮＡに由来するステムＧＡ１  ３ＷＪコンストラクト（図２）は、第１のブランチのらせん領域と第２のブランチのらせん領域との間の位置の３ＷＪａ配列の２７位に位置する単一の不対ヌクレオチド（Ｇ）を、コンストラクトの第２のブランチの位置の３ＷＪａ配列の３２位に位置する単一の不対ヌクレオチド（Ｇ）を、並びに第１のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の位置の３ＷＪｃ配列の８９位に位置する単一の不対ヌクレオチド（Ａ）を含む（位置番号は、野生型ＧＡ１ｐＲＮＡ全体の配列に対応する）。本開示の少なくとも一の実施態様は、２７位、３２位若しくは８９位の一つに不対ヌクレオチドを欠くか、又は２７位及び３２位、若しくは２７位及び８９位、若しくは３２位及び８９位に二の不対ヌクレオチドを欠くＧＡ１ｐＲＮＡ  ３ＷＪ欠失変異体に関する。
【００７３】
以下の実施例は、本開示の様々な３ＷＪコンストラクトを塩基対形成するために使用されうるｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３配列セット（３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃ配列鎖、５’→３’）の非限定的な例である（実施例１〜１３はそれぞれ図１２、１３及び１５〜２５に示され、一般的には図４８〜４９に示される）。
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【００７４】
以下の実施例１４〜３２は、本開示の様々な３ＷＪコンストラクトを塩基対形成するために使用されうるＭ２ｐＲＮＡ  ３配列セット（３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃ配列鎖、５’→３’）の非限定的な例である（実施例１４、２９〜３１及び図２７はそれぞれ図３及び図２７〜３１に示され、一般に図５０に示される）。
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【００７５】
以下の実施例３３〜４７は、本開示の様々な３ＷＪコンストラクトを塩基対形成するために使用されうるＳＦ５ｐＲＮＡ  ３配列セット（３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃ配列鎖、５’(R)３’）の非限定的な例である（実施例３３〜４７はそれぞれ図３２〜４６に示され、一般的には図５１〜５３に示される）。
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【００７６】
以下の実施例４８は、本開示の様々な３ＷＪコンストラクトを塩基対形成するために使用されうるＧＡ１ｐＲＮＡ  ３配列セット（３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃ配列鎖、５’→３’）の非限定的な例である（実施例４８は図４７及び一般的に図５４に示されている）。
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【００７７】
以下の実施例４９〜５６は、本開示の様々な３ＷＪコンストラクトを塩基対形成するために使用されうるｐＲＮＡ  ３配列セット（３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃ配列鎖、５’→３’）の非限定的な一般表現であり、実施例４９〜５０（図４８−４９）はｐｈｉ２９  ３ＷＪに、実施例５１（図５０）はＭ２  ３ＷＪに、実施例５２〜５５（図５１−５３）はＳＦ５  ３ＷＪに、実施例５６（図５４）はＧＡ１  ３ＷＪに関する。Ｗ及びＣは、３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃ鎖から３ＷＪで組まれたときに対を形成するヌクレオチドを表し、Ｎは組まれた３ＷＪの不対ヌクレオチドを表す。
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【００７８】
図４８〜４９（実施例４９〜５０）は、本開示の一般的なｐｈｉ２９  ｐＲＮＡ  ３ＷＪ変異体コンストラクトの実施態様を示す。上述したように、各３ＷＪコンストラクトは、各々がらせん領域を含み、各らせん領域が標準的なワトソン−クリック結合（例えばＧ−Ｃ、Ｃ−Ｇ、Ｕ−Ａ、Ａ−Ｕ）を形成する複数のヌクレオチド塩基対（Ｗ−Ｃ）を含み、図４８に示すように、第２のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の３ＷＪｂ配列中の位置に、又は図４９に示すように第１のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の３ＷＪｃ配列中の位置に単一の不対ヌクレオチドＮ（すなわち、Ｃ、Ｇ、Ａ又はＵ）も含有しうる三のブランチを含む。図４８及び図４９の３ＷＪのブランチの一又は複数に生じうる非ワトソン−クリックヌクレオチド塩基対は、例えば、Ｇ−Ｕ、Ｕ−Ｇ、Ｕ−Ｃ、Ｃ−Ｕ、Ｇ−Ａ、Ａ−Ｇ、Ａ−Ｃ、Ｃ−Ａを含む。
【００７９】
図５０（実施例５１）は、本開示の一般的なＭ２ｐＲＮＡ  ３ＷＪ変異コンストラクトの一実施態様を示す。Ｍ２  ３ＷＪコンストラクトは、各々がらせん領域を含み、各らせん領域が標準的なワトソン−クリック結合（例えばＧ−Ｃ、Ｃ−Ｇ、Ｕ−Ａ、Ａ−Ｕ）を形成する複数のヌクレオチド塩基対（Ｗ−Ｃ）を含み、第２のブランチの３ＷＪａに二の隣接する不対ヌクレオチドＮ（すなわちＣ、Ｇ、Ａ又はＵ）を、第２のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の３ＷＪｂ配列中の位置に単一の不対ヌクレオチドＮ（すなわち、Ｃ、Ｇ、Ａ又はＵ）を、並びに図５０に示されるように、第３のブランチのらせん領域と第１のブランチのらせん領域との間の３ＷＪｃ配列中の位置に隣接する不対ヌクレオチドＮの対（すなわち、Ｃ、Ｇ、Ａ及びＵより選択される）も含有しうる三のブランチを含む。図５０の３ＷＪのブランチの一又は複数に生じうる非ワトソン−クリックヌクレオチド塩基対は、例えば、Ｇ−Ｕ、Ｕ−Ｇ、Ｕ−Ｃ、Ｃ−Ｕ、Ｇ−Ａ、Ａ−Ｇ、Ａ−Ｃ、Ｃ−Ａを含む。
【００８０】
図５１〜５３（実施例５２〜５５）は、本開示の一般的なＳＦ５  ｐＲＮＡ  ３ＷＪ変異体コンストラクトの実施態様を示す。ＳＦ５  ３ＷＪコンストラクトは、それぞれらせん領域を含む三のブランチを含み、各らせん領域は、標準的なワトソン−クリック結合（例えばＧ−Ｃ、Ｃ−Ｇ、Ｕ−Ａ、Ａ−Ｕ）を形成する複数のヌクレオチド塩基対（Ｗ−Ｃ）を含む。図５１の実施態様は、第２のブランチの３ＷＪａに単一の不対ヌクレオチドＮ（すなわち、Ｃ、Ｇ、Ａ又はＵ）を、第２のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の位置の３ＷＪｂに二の隣接する不対ヌクレオチドＮ（すなわち、Ｃ、Ｇ、Ａ又はＵ）を含有する。図５２の実施態様は、第２のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の位置の３ＷＪｂに二の隣接する不対ヌクレオチドＮ（すなわち、Ｃ、Ｇ、Ａ又はＵ）を含有する。図５３の実施態様は、第２のブランチの３ＷＪａに単一の不対ヌクレオチドＮ（すなわち、Ｃ、Ｇ、Ａ又はＵ）を、第２のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の位置の３ＷＪｂに単一の不対ヌクレオチドＮ（すなわち、Ｃ、Ｇ、Ａ又はＵ）を含有する。３ＷＪコンストラクトが、第２のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の位置の３ＷＪｂに単一の不対ヌクレオチドＮ（すなわち、Ｃ、Ｇ、Ａ又はＵ）のみを含有し、第２のブランチのＧ３１と、第２のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の位置のＧ６９に対応する不対ヌクレオチドが欠失していることを除いて、実施態様５４は図５１〜５３に類似する。図５１〜５３及び図５４の３ＷＪのブランチの一又は複数に生じうる非ワトソン−クリックヌクレオチド塩基対は、例えば、Ｇ−Ｕ、Ｕ−Ｇ、Ｕ−Ｃ、Ｃ−Ｕ、Ｇ−Ａ、Ａ−Ｇ、Ａ−Ｃ、Ｃ−Ａを含む。
【００８１】
図５４（実施例５６）は、本開示の一般的なＧＡ１  ｐＲＮＡ  ３ＷＪ変異コンストラクトの一実施態様を示す。ＧＡ１  ３ＷＪコンストラクトは、それぞれらせん領域を含む三のブランチを含み、各らせん領域は、標準的なワトソン−クリック結合（例えばＧ−Ｃ、Ｃ−Ｇ、Ｕ−Ａ、Ａ−Ｕ）を形成する複数のヌクレオチド塩基対（Ｗ−Ｃ）を含む。図５４の実施態様は、第１のブランチのらせん領域と第２のブランチのらせん領域との間の位置の３ＷＪａに単一の不対ヌクレオチドＮ（すなわち、Ｃ、Ｇ、Ａ又はＵ）を、第２のブランチの３ＷＪａに単一の不対ヌクレオチドＮ（すなわち、Ｃ、Ｇ、Ａ又はＵ）を、並びに、第１のブランチのらせん領域と第３のブランチのらせん領域との間の位置の３ＷＪｃに単一の不対ヌクレオチドＮ（すなわち、Ｃ、Ｇ、Ａ又はＵ）を含有する。
【００８２】
さらに、本明細書中に開示される個々の３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃ鎖は、実施例において明示的に示される組み合わせとは異なる３配列セットで組み合わせられうる。例えば、代替的なＭ２  ３ＷＪコンストラクトについては、配列番号６１、６３及び６４を組み合わせることができ、又は配列番号６５、６３及び６０を組み合わせることができる。ｐｈｉ２９及びＳＦ５  ３ＷＪコンストラクトについても同様の代替組み合わせを作製することができた。
【００８３】
上記のように、上記のｐＲＮＡ  ３ＷＪコンストラクトは、一又は複数の分枝を介して、少なくとも一の生物学的に活性な部分と結合してコンジュゲート、複合体又はナノ粒子を形成する骨格として使用することができる。本開示の少なくとも一の実施態様は、各々が一の生物学的に活性な部分が連結されたＲＮＡ  ３ＷＪ骨格を含む複数のモノマーを含む多価オリゴマー複合体に関する。本明細書の他の箇所に記載されるように、生物学的に活性な部分は、治療薬、抗体、マーカー、色素、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ及び／又はアプタマーでありうる。治療薬、抗体、マーカー、色素、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ及び／又はアプタマーは、三つのオリゴヌクレオチド配列３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃが混合物中で組み合わされ、３ＷＪに自己組織化される前に、三つのオリゴヌクレオチド配列３ＷＪａ、３ＷＪｂ又は３ＷＪｃの一つに、直接又はオリゴヌクレオチドのようなリンカー分子を介して、結合されうる。オリゴヌクレオチド配列３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃの一つ、二つ又は三つは、治療薬、抗体、マーカー、色素、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ及び／又はアプタマーに結合してコンジュゲート、複合体又はナノ粒子を形成することができる。非ＲＮＡ部分は、任意の適切な方法でｐＲＮＡ  ３ＷＪドメインに結合することができる。例えば、葉酸は、１，６−ヘキサンジアミン結合によってアデノシン５’−一リン酸（ＡＭＰ）にコンジュゲートすることができる。９３％の純度に達するための逆ＨＰＬＣ後、葉酸−ＡＭＰをｐｈｉ２９ｐＲＮＡの５’末端に組み込むことができる。例えば、転写における葉酸−ＡＭＰとＡＴＰとの１６：１の比は、葉酸を含有するｐＲＮＡの６０％超をもたらした（Gene Ther. 2006 May; 13(10):814-20）。Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｒｅｖ．  ２０１０  Ｊｕｎ；  ３９（６）：２０５４−７０に示されているように、化学物質をＲＮＡにこのジュゲートするための多くの他の方法が当業者に知られている。他の連結方法及び生物学的に活性な部分は、米国特許第９，２９７，０１３号に示されている。
【００８４】
先の記載に従って、本開示は少なくとも特定の実施態様では以下に関する。
【００８５】
条項１．第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪａ配列、第２のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｂ配列及び第３のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｃ配列を含む三方向ジャンクション（３ＷＪ）ドメインを含むＲＮＡジャンクション骨格であって、３ＷＪドメインの第１のブランチが３ＷＪａ配列の５’位及び３ＷＪｃ配列の３’位から形成され、且つ第１のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第２のブランチが３ＷＪａ配列の３’位及び３ＷＪｂ配列の５’位から形成され、且つ第２のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第３のブランチが３ＷＪｂ配列の３’位及び３ＷＪｃ配列の５’位から形成され、且つ第３のらせん領域を含み、前記らせん領域のそれぞれが、標準的なワトソン−クリック結合を形成する複数のＲＮＡヌクレオチド対を含み、並びに（ｉ）３ＷＪａ配列が第１のらせん領域と第２のらせん領域との間に位置する不対ヌクレオチドを欠き、二の不対ヌクレオチドが第２のブランチの３ＷＪａ配列に位置し、（ｉｉ）二の隣接する不対ヌクレオチドが第１のらせん領域と第３のらせん領域との間の３ＷＪｃ配列に位置し、一の不対ヌクレオチドが第２のらせん領域と第３のらせん領域との間の３ＷＪｂ配列に位置する、ＲＮＡジャンクション骨格。
【００８６】
条項２．３ＷＪａ配列が配列番号７３を含み、３ＷＪｂ配列が配列番号７４を含み、３ＷＪｃ配列が配列番号７５を含む、条項１に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【００８７】
条項３．第２のブランチが、野生型Ｍ２  ｐＲＮＡのそれぞれ３６位、３７位の不対アデニンヌクレオチド及びウラシルヌクレオチドに対応する位置の、隣接する不対ヌクレオチドを欠き、且つ、第３のブランチが、前記野生型Ｍ２  ｐＲＮＡの７９位の不対アデニンヌクレオチドに対応する位置の不対ヌクレオチドを欠く、条項１又は２に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【００８８】
条項４．３ＷＪａ配列に存在する二の不対ヌクレオチドの下流の３ＷＪａ配列で一又は複数の不対ヌクレオチドを欠く、条項１から３のいずれか一項に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【００８９】
条項５．３ＷＪｂ配列に存在する不対ヌクレオチドの下流の３ＷＪｂ配列で不対ヌクレオチドを欠く、条項１から４のいずれか一項に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【００９０】
条項６．３ＷＪａ配列に存在する二の不対ヌクレオチドの下流の３ＷＪａ配列で一又は複数の不対ヌクレオチドを欠き、３ＷＪｂ配列に存在する不対ヌクレオチドの下流の３ＷＪｂ配列で不対ヌクレオチドを欠く、条項１から５のいずれか一項に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【００９１】
条項７．第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪａ配列、第２のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｂ配列及び第３のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｃ配列を含む三方向ジャンクション（３ＷＪ）ドメインを含むＲＮＡジャンクション骨格であって、３ＷＪドメインの第１のブランチが３ＷＪａ配列の５’位及び３ＷＪｃ配列の３’位から形成され、且つ第１のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第２のブランチが３ＷＪａ配列の３’位及び３ＷＪｂ配列の５’位から形成され、且つ第２のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第３のブランチが３ＷＪｂ配列の３’位及び３ＷＪｃ配列の５’位から形成され、且つ第３のらせん領域を含み、前記らせん領域のそれぞれが、標準的なワトソン−クリック結合を形成する複数のＲＮＡヌクレオチド対を含み、並びに（ｉ）３ＷＪａ配列が第１のらせん領域と第２のらせん領域との間に位置する不対ヌクレオチドを欠き、一の不対ヌクレオチドが第２のブランチの３ＷＪａ配列に位置し、（ｉｉ）二の隣接する不対ヌクレオチドが第２のらせん領域と第３のらせん領域との間の３ＷＪｂ配列に位置する、ＲＮＡジャンクション骨格。
【００９２】
条項８．第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪａ配列、第２のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｂ配列及び第３のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｃ配列を含む三方向ジャンクション（３ＷＪ）ドメインを含むＲＮＡジャンクション骨格であって、３ＷＪドメインの第１のブランチが３ＷＪａ配列の５’位及び３ＷＪｃ配列の３’位から形成され、且つ第１のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第２のブランチが３ＷＪａ配列の３’位及び３ＷＪｂ配列の５’位から形成され、且つ第２のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第３のブランチが３ＷＪｂ配列の３’位及び３ＷＪｃ配列の５’位から形成され、且つ第３のらせん領域を含み、前記らせん領域のそれぞれが、標準的なワトソン−クリック結合を形成する複数のＲＮＡヌクレオチド対を含み、並びに３ＷＪａ配列が第１のらせん領域と第２のらせん領域との間に位置する不対ヌクレオチドを欠き、（１）野生型ＳＦ５  ｐＲＮＡの３１位の不対グアニンヌクレオチドに対応する位置の不対ヌクレオチド及び（２）野生型ＳＦ５  ｐＲＮＡの６９位の不対グアニンヌクレオチドに対応する位置の不対ヌクレオチドの少なくとも一を欠く、ＲＮＡジャンクション骨格。
【００９３】
条項９．野生型ＳＦ５  ｐＲＮＡの３１位の不対グアニンヌクレオチドに対応する位置の不対ヌクレオチドを欠く、条項８に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【００９４】
条項１０．３ＷＪａ配列が配列番号８６を含み、３ＷＪｂ配列が配列番号８７を含み、３ＷＪｃ配列が配列番号８８を含む、条項８又は９に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【００９５】
条項１１．野生型ＳＦ５  ｐＲＮＡの６９位の不対グアニンヌクレオチドに対応する位置の不対ヌクレオチドを欠く、条項８から１０のいずれか一項に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【００９６】
条項１２．３ＷＪａ配列が配列番号９７を含み、３ＷＪｂ配列が配列番号９８を含み、３ＷＪｃ配列が配列番号８８を含む、条項８から１１のいずれか一項に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【００９７】
条項１３．（１）野生型ＳＦ５  ｐＲＮＡの３１位の不対ヌクレオチドに対応する位置の不対ヌクレオチド及び（２）野生型ＳＦ５  ｐＲＮＡの６９位の不対グアニンヌクレオチドに対応する位置の不対グアニンヌクレオチドを欠く、条項８から１２のいずれか一項に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【００９８】
条項１４．３ＷＪａ配列が配列番号８６を含み、３ＷＪｂ配列が配列番号９８を含み、３ＷＪｃ配列が配列番号８８を含む、条項８から１３のいずれか一項に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【００９９】
条項１５．第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪａ配列、第２のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｂ配列及び第３のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｃ配列を含む三方向ジャンクション（３ＷＪ）ドメインを含むＲＮＡジャンクション骨格であって、３ＷＪドメインの第１のブランチが３ＷＪａ配列の５’位及び３ＷＪｃ配列の３’位から形成され、且つ第１のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第２のブランチが３ＷＪａ配列の３’位及び３ＷＪｂ配列の５’位から形成され、且つ第２のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第３のブランチが３ＷＪｂ配列の３’位及び３ＷＪｃ配列の５’位から形成され、且つ第３のらせん領域を含み、前記らせん領域のそれぞれが、標準的なワトソン−クリック結合を形成する複数のＲＮＡヌクレオチド対を含み、並びに３Ｗｊａ配列が、野生型ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡの２９位の不対ウリジンヌクレオチドに対応する第１のらせん領域と第２のらせん領域との間に位置する不対ヌクレオチドを欠き、野生型ｐｈｉ２９  ｐＲＮＡの７２位及び７３位の不対ウリジンヌクレオチドに対応する位置の二の不対ヌクレオチドを欠く、ＲＮＡジャンクション骨格。
【０１００】
条項１６．３ＷＪａ配列が配列番号３７を含み、３ＷＪｂ配列が配列番号３９を含み、３ＷＪｃ配列が配列番号４０を含む、条項１５に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【０１０１】
条項１７．第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪａ配列、第２のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｂ配列及び第３のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｃ配列を含む三方向ジャンクション（３ＷＪ）ドメインを含むＲＮＡジャンクション骨格であって、３ＷＪドメインの第１のブランチが３ＷＪａ配列の５’位及び３ＷＪｃ配列の３’位から形成され、且つ第１のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第２のブランチが３ＷＪａ配列の３’位及び３ＷＪｂ配列の５’位から形成され、且つ第２のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第３のブランチが３ＷＪｂ配列の３’位及び３ＷＪｃ配列の５’位から形成され、且つ第３のらせん領域を含み、前記らせん領域のそれぞれが、標準的なワトソン−クリック結合を形成する複数のＲＮＡヌクレオチド対を含み、並びに（ｉ）３ＷＪａ配列が、第１のらせん領域と第２のらせん領域との間に位置する単一の不対ヌクレオチド、及び第１のらせん領域と第２のらせん領域との間に位置する不対ヌクレオチドの下流の第２のブランチの３ＷＪａ配列に位置する不対ヌクレオチド、及び（ｉｉ）第１のらせん領域と第３のらせん領域との間の３ＷＪｃ配列に位置する単一の不対ヌクレオチドを含む、ＲＮＡジャンクション骨格。
【０１０２】
条項１８．３ＷＪａ配列が配列番号９９を含み、３ＷＪｂ配列が配列番号１００を含み、３ＷＪｃ配列が配列番号１０１を含む、条項１７に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【０１０３】
条項１９．第１のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪａ配列、第２のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｂ配列及び第３のＲＮＡポリヌクレオチドを含む３ＷＪｃ配列を含む三方向ジャンクション（３ＷＪ）ドメインを含むＲＮＡジャンクション骨格であって、３ＷＪドメインの第１のブランチが３ＷＪａ配列の５’位及び３ＷＪｃ配列の３’位から形成され、且つ第１のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第２のブランチが３ＷＪａ配列の３’位及び３ＷＪｂ配列の５’位から形成され、且つ第２のらせん領域を含み、３ＷＪドメインの第３のブランチが３ＷＪｂ配列の３’位及び３ＷＪｃ配列の５’位から形成され、且つ第３のらせん領域を含み、前記らせん領域のそれぞれが、標準的なワトソン−クリック結合を形成する複数のＲＮＡヌクレオチド対を含み、並びに（ｉ）第１のらせん領域と第２のらせん領域との間の３ＷＪａに一の不対ヌクレオチドが位置しているか又は存在せず、及び／又は、一又は二の不対ヌクレオチドが第２のブランチの３ＷＪａ配列に位置し、（ｉｉ）一の不対又は二の隣接する不対ヌクレオチドが第１のらせん領域と第３のらせん領域との間の３ＷＪｃ配列に位置し、及び／又は一の不対又は二の隣接する不対ヌクレオチドが第２のらせん領域と第３のらせん領域との間の３ＷＪｂ配列に位置する、ＲＮＡジャンクション骨格。
【０１０４】
条項２０．治療薬、抗体、マーカー、色素、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、リボスイッチ及びアプタマーからなる群より選択される少なくとも一の部分に結合する条項１から１９のいずれか一項のＲＮＡ  ３Ｗｊ骨格を含むコンジュゲート。
【０１０５】
条項２１．条項２０のコンジュゲート及び薬学的に許容されるビヒクル、担体又は希釈剤を含む、組成物。
【０１０６】
条項２２．３ＷＪａ、３ＷＪｂ及び３ＷＪｃ配列のそれぞれが、独立して、ＲＮＡリンカー又はＲＮＡ骨格にコンジュゲートしている生物学的に活性な部分のＲＮＡ部分を含まない８から３６のヌクレオチドを含む、条項１から１９のいずれか一項に記載のＲＮＡジャンクション骨格。
【０１０７】
本明細書に開示されるｐＲＮＡ  ３ＷＪ骨格、化合物、コンジュゲート、組成物、ナノ粒子並びにそれらの製造及び適用方法は、本開示に照らして過度の実験をすることなく作製及び実行することができる。本開示は、特定の実施態様に関連して説明しており、それによってその態様がより完全に理解され認識されるが、本開示がこれらの特定の実施態様に限定されることは意図されていない。それどころか、すべての代替、変更及び等価物は、本開示の範囲内に含まれることが意図される。したがって、特定の実施態様を含む上記の実施例は、本開示の実施を説明する役割を果たすであろうが、示された詳細は、例示的なものであり、特定の実施態様の説明のためのみのものであり、最も有用且つ容易に理解される手順の記載並びに本開示の方法及び組成物の原理及び概念的な態様の記載であると考えられるものを提供するために示される。本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される様々な組成物の処方、本明細書に記載の方法、又は本明細書に記載の方法の工程若しくは一連の工程において変更を行うことができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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