(57)【要約】  本開示の態様は、フローサイトメータにおいて事象を検出するための方法を含む。同じく提供されるのは、フローサイトメータにおいて細胞を検出する方法である。本開示の他の態様は、フローセルにおける汚染のレベルを判定するための方法を含む。例えば、上記で要約した方法を実施するための、コンピュータ可読媒体及びシステムも提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメータにおいて事象を検出するための方法であって、
粒子を分析器のフローセルに流すこと、
前記フローセルを通って流れる粒子を光学的にインテロゲートすること、
推定上の事象の特徴を抽出すること、
前記推定上の事象にタイムスタンプを付与すること、
推定上の以前の事象と推定上の現在の事象との時間差を求めること、および、
前記時間差を持続時間閾値と比較すること、を含み、
前記時間差が前記持続時間閾値を上回る場合、前記推定上の現在の事象を現在の事象として記憶し、
前記時間差が前記持続時間閾値を下回る場合、前記推定上の現在の事象のピーク高さ特徴及び前記推定上の以前の事象のピーク高さ特徴をピーク高さ閾値と比較し、
前記推定上の現在の事象のピーク高さ特徴が前記ピーク高さ閾値を下回る場合、前記推定上の現在の事象を廃棄し、
前記推定上の以前の事象のピーク高さ特徴が前記ピーク高さ閾値を上回る場合、前記推定上の以前の事象を以前の事象として記憶する、方法。
【請求項２】
事象が、光学系サイドローブ、流体ドリフト、ベースラインドリフト、フローセル汚染、及びその組合せからなる群から選択される信号と区別される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記粒子が細胞であり、事象が細胞事象である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が血液サンプルに由来する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞事象が小細胞事象である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記小細胞事象が血小板事象である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記小細胞事象が、微生物細胞事象又は細胞残屑事象である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記粒子をフローセルに流すことが、前記粒子を９ｐｓｉ以上のシース圧で流すことを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記粒子を光学的にインテロゲートすることが、レーザを用いて細胞を励起することを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記レーザのビーム高さが５μｍ以上である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記レーザのビーム高さが８μｍである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記持続時間閾値が２．５μｓ以下である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記持続時間閾値が２μｓである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記推定上の現在の事象のピーク高さ特徴及び前記推定上の以前の事象のピーク高さ特徴をピーク高さ閾値と比較することが、前記推定上の現在の事象及び前記推定上の以前の事象のピーク高さがピーク高さ閾値の２倍を下回るかどうかを判定することを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
コンピュータデバイスによって実行されるときに、前記コンピュータデバイスに、
前記フローセルを通って流れる粒子から推定上の事象の特徴を抽出させ、
前記推定上の事象にタイムスタンプを付与させ、
推定上の以前の事象と推定上の現在の事象との時間差を求めさせ、
前記時間差を持続時間閾値と比較させ、
前記時間差が前記持続時間閾値を上回る場合、前記推定上の現在の事象を現在の事象として記憶させ、
前記時間差が前記持続時間閾値を下回る場合、前記推定上の現在の事象のピーク高さ特徴及び前記推定上の以前の事象のピーク高さ特徴をピーク高さ閾値と比較させ、
前記推定上の現在の事象のピーク高さ特徴が前記ピーク高さ閾値を下回る場合、前記推定上の現在の事象を廃棄させ、
前記推定上の以前の事象のピーク高さ特徴が前記ピーク高さ閾値を上回る場合、前記推定上の以前の事象を以前の事象として記憶させる、命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項１６】
事象が、光学系サイドローブ、流体ドリフト、ベースラインドリフト、フローセル汚染、及びその組合せからなる群から選択された信号と区別される、請求項１５に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項１７】
前記粒子が細胞であり、事象が細胞事象である、請求項１５又は１６に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項１８】
前記細胞事象が小細胞事象である、請求項１７に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項１９】
前記細胞が血液サンプルに由来する、請求項１８に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項２０】
前記小細胞事象が血小板事象である、請求項１９に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項２１】
前記小細胞事象が、微生物細胞事象又は細胞残屑事象である、請求項１９に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項２２】
フローセルと、
前記フローセルに光学的に結合された光学粒子インテロゲーションシステムと、
請求項１５から２１のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体と、を備えるフローサイトメータ。
【請求項２３】
前記分析器が血液学分析器であり、前記粒子が細胞である、請求項２２に記載のフローサイトメータ。
【請求項２４】
フローサイトメータにおいて細胞を検出するための方法であって、
細胞を含む細胞サンプルをフローサイトメータのフローセルに流すこと、
前記フローセルを通って流れる細胞からの光信号を第１の利得設定で検出すること、および、
前記フローセルを通って流れる細胞からの光信号を第２の利得設定で検出すること、を含み、前記第２の利得設定が、前記第１の利得設定とは異なる、方法。
【請求項２５】
前記第２の利得設定が前記第１の利得設定よりも高い、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第２の利得設定が、高い細胞濃度を有する細胞サンプルを考慮に入れるためになされる、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第２の利得設定が前記第１の利得設定よりも低い、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２の利得設定が、低い細胞濃度を有する細胞サンプルを考慮に入れるためになされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１及び第２の利得設定が、フォトダイオードの利得設定、光電子増倍管（ＰＭＴ）の利得設定、又はその両方を含む、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞サンプルが血液サンプルである、請求項２４から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
第１の細胞タイプを検出するべく前記第１の利得設定で検出された光信号を解析すること、および、
第２の細胞タイプを検出するべく前記第２の利得設定で検出された光信号を解析すること、を含む、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の利得設定が前記第２の利得設定よりも高く、前記第１の利得設定で血小板が検出され、前記第２の利得設定で赤血球（ＲＢＣ）が検出される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の利得設定が前記第２の利得設定よりも低く、前記第１の利得設定で赤血球（ＲＢＣ）が検出され、前記第２の利得設定で血小板が検出される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の利得設定での光信号の検出が、前記第２の利得設定での光信号の検出と同じ持続時間にわたる、請求項２４から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１の利得設定での光信号の検出が、前記第２の利得設定での光信号の検出とは異なる持続時間にわたる、請求項２４から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１及び第２の利得設定での光信号の検出が、０．１〜１０秒から独立に選択された持続時間にわたる、請求項２４から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１及び第２の利得設定での光信号の検出が、０．５〜５秒から独立に選択された持続時間にわたる、請求項２４から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
コンピュータデバイスによって実行されるときに、前記コンピュータデバイスに、
前記フローセルを通って流れる細胞サンプルの細胞からの光信号を第１の利得設定で検出させ、
前記利得設定を前記第１の利得設定から第２の利得設定に変化させ、
前記フローセルを通って流れる細胞からの光信号を前記第２の利得設定で検出させる、
命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項３９】
前記第２の利得設定が前記第１の利得設定よりも高い、請求項３８に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項４０】
前記第２の利得設定が、高い細胞濃度を有する細胞サンプルを考慮に入れるためになされる、請求項３９に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項４１】
前記第２の利得設定が前記第１の利得設定よりも低い、請求項３８に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項４２】
前記第２の利得設定が、低い細胞濃度を有する細胞サンプルを考慮に入れるためになされる、請求項４１に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項４３】
前記第１及び第２の利得設定が、フォトダイオードの利得設定、光電子増倍管（ＰＭＴ）の利得設定、又はその両方を含む、請求項３８から４２のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項４４】
前記細胞サンプルが血液サンプルである、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項４５】
前記第１の利得設定が前記第２の利得設定よりも高く、前記第１の利得設定で血小板が検出され、前記第２の利得設定で赤血球（ＲＢＣ）が検出される、請求項４４に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項４６】
前記第１の利得設定での光信号の検出が、前記第２の利得設定での光信号の検出と同じ持続時間にわたる、請求項３８から４５に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項４７】
前記第１の利得設定での光信号の検出が、前記第２の利得設定での光信号の検出とは異なる持続時間にわたる、請求項３８から４５に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項４８】
前記第１及び第２の利得設定での光信号の検出が、０．１〜１０秒から独立に選択された持続時間にわたる、請求項３８から４５に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項４９】
前記第１及び第２の利得設定での光信号の検出が、０．５〜５秒から独立に選択された持続時間にわたる、請求項３８から４５に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項５０】
フローセルと、
前記フローセルに光学的に結合された光学検出システムと、
請求項３８から４９のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体と、を備えるフローサイトメータ。
【請求項５１】
フローセルにおける汚染のレベルを判定する方法であって、
粒子を含むサンプルをフローセルに流すこと、
流している間に生粒子事象データを収集すること、
前記生粒子事象データ内の粒子事象の数をカウントすること、
フィルタされた信号を生成するべく逆ガウシアンフィルタ係数で前記生粒子事象データをフィルタすること、前記逆ガウシアンフィルタ係数は、期待パワースペクトル分散に基づいており、
前記フィルタされた信号のエネルギーを求めること、および
前記フローセルにおける汚染のレベルを判定するべく、前記フィルタされた信号の求めたエネルギーからクリーンなフローセルのベースラインエネルギーを差し引くこと、を含む、方法。
【請求項５２】
前記粒子事象の数をカウントすることが、アナログ−デジタル変換器から固定の時間間隔で生データを抽出すること、ＤＣオフセットを判定すること、および固定の閾値を下回る生データをゼロに置き換えることを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記閾値がフルダイナミックレンジの１％〜５％である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記閾値がピーク振幅の１／ｅ２である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記サンプルが、前記フローセル内のシース流体のストリームへ流し込まれ、前記期待パワースペクトル分散が、前記シース流体の圧力に基づく、請求項５１から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記粒子が細胞である、請求項５１から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記サンプルが全血サンプルである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
コンピュータデバイスによって実行されるときに、前記コンピュータデバイスに、
粒子を含むサンプルが前記フローセルを通って流れる際に生粒子事象データを収集させ、
前記生粒子事象データ内の粒子事象の数をカウントさせ、
フィルタされた信号を生成するべく逆ガウシアンフィルタ係数で前記生粒子事象データをフィルタさせ、前記逆ガウシアンフィルタ係数は、期待パワースペクトル分散に基づいており、
前記フィルタされた信号のエネルギーを求めさせ、
前記フローセルにおける汚染のレベルを判定するべく、前記フィルタされた信号の求めたエネルギーからクリーンなフローセルのベースラインエネルギーを差し引かせる、
命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項５９】
前記粒子事象の数をカウントすることが、アナログ−デジタル変換器から固定の時間間隔で生データを抽出すること、ＤＣオフセットを判定すること、および固定の閾値を下回る生データをゼロに置き換えることを含む、請求項５８に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項６０】
前記閾値がフルダイナミックレンジの１％〜５％である、請求項５９に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項６１】
前記閾値がピーク振幅の１／ｅ２である、請求項５９に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項６２】
前記サンプルが、前記フローセル内のシース流体のストリームへ流し込まれ、前記期待パワースペクトル分散が、前記シース流体の圧力に基づく、請求項５８から６１のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項６３】
前記粒子が細胞である、請求項５８から６２のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項６４】
前記サンプルが全血サンプルである、請求項６３に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項６５】
フローセルと、
前記フローセルに光学的に結合され、生粒子事象データを検出するように適合された、光学検出システムと、
請求項５８から６４のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体と、を備えるフローサイトメータ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる２０１５年１２月１８日に出願された米国特許仮出願第６２／２６９，２９４号の利益を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
光学顕微鏡法又は蛍光顕微鏡法による目視検査及び／又は自動検査を含む様々な方法が細胞解析のために用いられる。これらのタイプの細胞検査及び解析は、一般に、サンプルの細胞系統、成熟のステージ、及び／又は細胞カウントに関する情報を得るために実施される。
【０００３】
フローサイトメトリは、不均一サンプルにおける異なる細胞タイプを識別及び区別するための方法である。フローサイトメータでは、細胞が１つずつ又はほぼ１つずつ感知領域を通過し、その際に各細胞はエネルギー源により照射される。典型的には、単一波長光源（例えばレーザなど）がエネルギー源として用いられ、様々なセンサのうちの１つ又は複数が、細胞と印加されたエネルギーとの相互作用に基づいてデータを記録する。フローサイトメトリは、血液学で一般に用いられ、血液の癌を含む血液の病気の診断に成功している。フローサイトメトリに加えて、他の解析方法が、血液学で及び細胞の群をキャラクタライズする際に用いられる。
【０００４】
フローサイトメトリにおける課題は、ノイズのない粒子事象（例えば、細胞事象）の取り込みを含む。例えば、光学サイドローブ、ベースラインドリフト、流体ドリフト、及び／又は電子装置のベースライン時定数は、小細胞事象に似ている望ましくない信号を生じる。フローサイトメトリデータの品質に悪影響を及ぼす他の因子は、例えば、サンプル間の有核細胞カウントの変動を含み、これは結果的に、細胞事象がアナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）の非常に小さいダイナミックレンジを占有するように蛍光信号の変動を生じる。加えて、フローセルの汚染は、フローサイトメータが有効な臨床的結果を生成することを妨げる場合がある。
【発明の概要】
【０００５】
本開示の態様は、フローサイトメータにおいて事象を検出するための方法を含む。このような方法は、粒子をフローサイトメータのフローセルに流すこと、フローセルを通って流れる粒子を光学的にインテロゲートすること、推定上の事象特徴を抽出すること、および推定上の事象にタイムスタンプを付与することを含む。このような方法は、推定上の以前の事象と推定上の現在の事象との時間差を求めること、および時間差を持続時間閾値と比較することをさらに含む。時間差が持続時間閾値を上回る場合、推定上の現在の事象が現在の事象として記憶される。時間差が持続時間閾値を下回る場合、推定上の現在の事象のピーク高さ特徴及び推定上の以前の事象のピーク高さ特徴がピーク高さ閾値と比較される。推定上の現在の事象のピーク高さ特徴がピーク高さ閾値を下回る場合、推定上の現在の事象が廃棄される。推定上の以前の事象のピーク高さ特徴がピーク高さ閾値を下回る場合、推定上の以前の事象が廃棄される。推定上の以前の事象のピーク高さ特徴がピーク高さ閾値を上回る場合、推定上の以前の事象が以前の事象として記憶される。
【０００６】
同じく提供されるのは、フローサイトメータにおいて細胞を検出する方法である。このような方法は、細胞サンプルをフローサイトメータのフローセルに流すこと、フローセルを通って流れる細胞からの光信号を第１の利得設定で検出すること、およびフローセルを通って流れる細胞からの光信号を第２の利得設定で検出することを含む。第２の利得設定は、第１の利得設定とは異なる。
【０００７】
本開示の他の態様は、フローセルにおける汚染のレベルを判定するための方法を含む。このような方法は、粒子を含むサンプルをフローセルに流すこと、流している間に生粒子事象データを収集すること、生粒子事象データ内の粒子事象の数をカウントすること、およびフィルタされた信号を生成するべく逆ガウシアンフィルタ係数で生粒子事象データをフィルタすることを含む。逆ガウシアンフィルタ係数は、期待パワースペクトル分散に基づく。このような方法は、フィルタされた信号のエネルギーを求めること、およびフローセルにおける汚染のレベルを判定するべく、フィルタされた信号の求めたエネルギーからクリーンなフローセルのベースラインエネルギーを差し引くことをさらに含む。
【０００８】
例えば、本開示の方法を実施するための、コンピュータ可読媒体及びシステムも提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】パネルＡ及びＢは、それぞれ、細胞粒子が照明されたフローセル内をどのように移動するか及びプロットされた重畳応答を描画する図である。
【図２】理想「クリーン」ガウス応答を示すプロットを描画する図である。
【図３】ベースラインドリフト及び望ましくない細胞事象応答を示すプロットを描画する図である。
【図４】本開示の一実施形態に係る無効な細胞事象信号を除去するためのフローチャートである。
【図５】アーチファクトによる血小板カウント及び濃度の汚染を示すプロットを描画する図である。
【図６】本開示の一実施形態に係る方法を用いて達成される場合の、望ましくない事象の排除を示すプロットを描画する図である。
【図７】ＲＢＣ事象及びＰＬＴ事象を示すプロットを描画する図である。
【図８】図７のプロットの拡大区域を描画する図である。
【図９】単一のアッセイの過程におけるＰＬＴ収集利得設定からＲＢＣ収集利得設定への切り替えを描画する図である。
【図１０】全アッセイ中に固定利得設定の下で行われたカウントを示すプロットを描画する図である。
【図１１】アッセイ中に動的利得調節と共に行われたカウントを示すプロットを描画する図である。
【図１２】本開示の一実施形態に係るフローセルにおける汚染のレベルを判定するためのフローチャートである。
【図１３】理想ガウシアンパルスのパワースペクトルを描画する図である。
【図１４】フローサイトメータから得られるパワースペクトルを描画する図である。
【図１５】逆ガウシアンフィルタの周波数応答を描画する図である。
【図１６】ＡＤＣからの生データからベースラインノイズが除去された、汚染度の高いフローセルに関する時間領域信号を描画する図である。
【図１７】汚染度の高いフローセルの周波数領域特徴（生データのパワースペクトル）を描画する図である。
【図１８】汚染度の高いフローセルの生データからのクリーンなフローセルに等しいエネルギーの除去後の生データのパワースペクトルを描画する図である。
【図１９】ＡＤＣからの生データからベースラインノイズが除去された、汚染の初期段階にあるフローセルに関する時間領域信号を描画する図である。
【図２０】汚染の初期段階にあるフローセルの周波数領域特徴（生データのパワースペクトル）を描画する図である。
【図２１】汚染の初期段階にあるフローセルの生データからのクリーンなフローセルに等しいエネルギーの除去後の生データのパワースペクトルを描画する図である。
【図２２】ＡＤＣからの生データからベースラインノイズが除去された、汚染されていないフローセルに関する時間領域信号を描画する図である。
【図２３】汚染されていないフローセルの周波数領域特徴（生データのパワースペクトル）を描画する図である。
【図２４】汚染されていないフローセルの生データからクリーンなフローセルに等しいエネルギーを除去した後の生データのパワースペクトルを描画する図である。
【図２５】本開示の方法を実施する際の使用が見出される、一実施形態に係る例示的なフローサイトメータの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示の態様は、フローサイトメータにおいて事象を検出するための方法を含む。同じく提供されるのは、フローサイトメータにおいて細胞を検出する方法である。本開示の他の態様は、フローセルにおける汚染のレベルを判定するための方法を含む。例えば、上記で要約した方法を実施するための、コンピュータ可読媒体及びシステムも提供される。
【００１１】
本発明の方法、コンピュータ可読媒体、及びシステムがさらに詳細に説明される前に、本開示は、もちろん変化する可能性があるものとして、説明された特定の実施形態に限定されないことが理解される。本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を説明する目的のためだけのものであって、限定するものとなることを意図されないことも理解される。
【００１２】
値の範囲が提供される場合、文脈上他の意味に明白に規定される場合を除き、下限の単位の１０分の１までの中間にある各値、該範囲の上限と下限との間、及び表記された該範囲内のあらゆる他の表記された値又は中間にある値は、本発明の方法、コンピュータ可読媒体、及びシステム内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲に独立して含まれてもよく、且つまた方法、コンピュータ可読媒体、及びシステム内に包含され、表記された範囲内のあらゆる具体的に除外される限界（ｌｉｍｉｔ）の対象になる。表記された範囲が限界の一方又は両方を含む場合、これらの含まれた限界のいずれか又は両方を除外する範囲もまた、方法、コンピュータ可読媒体、及びシステムに含まれる。
【００１３】
本明細書においてある範囲が、「約」という用語に先行されている数値とともに提示されている。「約」という用語は、それが先行する正確な数、ならびに、この用語が先行する数に近いか、または近似的である数の文言上のサポート(literal support)を提供するために本明細書で使用される。数が具体的に記載された数に近いか、または近似的であるかどうかを決定する際に、近い、または近似的な記載されていない数は、それが提示されている文脈において、具体的に記載された数の実質的均等物を提供する数であってよい。
【００１４】
他に定めのない限り、本明細書で用いられるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味をもつ。本明細書に記載のものと類似した又は等価なあらゆる方法及び材料もまた本発明の実践又は試験に用いることができるが、代表的な例証となる方法、コンピュータ可読媒体、及びシステムがここで説明される。
【００１５】
本明細書で挙げられたすべての刊行物及び特許は、個々の各刊行物又は特許が参照により組み入れられるように特異的に及び個々に示されたかのように参照により本明細書に組み入れられ、且つ挙げられた刊行物との関連において方法及び／又は材料を開示し及び説明するために参照により本明細書に組み入れられる。あらゆる刊行物の引用は、出願日よりも前のその開示のためであって、本発明が先願発明の理由に基づきこうした公開の日付を実際より早める権利をもたないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供された公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、独立して確認される必要がある場合がある。
【００１６】
本明細書及び付属の請求項で用いられる、単数形の「ひとつの（ａ、ａｎ）」、及び「その、前記（ｔｈｅ）」は、文脈上他の意味に明白に規定される場合を除き、複数形の指示対象を含むことに留意されたい。請求項は、あらゆる随意的な要素を除外するように起草されてもよいことにさらに留意されたい。従って、この記述は、請求項の要素の列挙又は「消極的な」限定の使用との関連において「単独で」、「のみ」などのような排他的用語の使用のための先行詞基準として作用することを意図される。
【００１７】
本開示を読めば当業者には明らかとなるように、本明細書で説明され例証される個々の実施形態の各々は、本発明の方法、コンピュータ可読媒体、及びシステムの範囲又は精神から逸脱することなく他の幾つかの実施形態のいずれかの機能部から容易に分離されてもよい又はいずれかの機能部と組み合わされてもよい個別の構成要素及び機能部を有する。あらゆる列挙される方法は、列挙される事象の順番で又は論理的に可能なあらゆる他の順番で実行することができる。
【００１８】
＜方法＞
上記で要約したように、本開示の態様は、フローサイトメータにおいて事象を検出するための方法を含む。ノイズのない細胞事象の取り込みは、光学サイドローブ、流体ドリフト、ベースラインドリフト、フローセル汚染などの現象によって難しいものとなる。これらの現象は、小細胞事象に似ている望ましくない信号を生じる。これらの望ましくない信号は、より大きい有効な信号が生成される前及び／又は後にしばしば生成される。これらの誤って取り込まれた望ましくない信号は、有効な細胞事象、例えば、小細胞事象の特徴抽出を汚染（ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅ）する。
【００１９】
図１のパネルＡに描画されるように、細胞粒子が、照明されたフローセル内を移動する。細胞粒子が照明された体積内を移動している時間中に、光検出器がレーザビームプロフィール及び細胞粒子の重畳の応答を取り込む。重畳応答が図１のパネルＢに示される。
【数１】
2019502915.tif 000003
【００２０】
デジタルデータ取り込みシステムが、この細胞事象応答を、例えば、２０メガサンプル／秒のレートでデジタル化することができる。細胞事象応答の幅は、ストリームの速度及びレーザビームプロフィールの高さに依存する。この細胞事象応答は、以下のように特徴付けることができるほぼガウス波形を生成する：
【数２】
2019502915.tif 000004
【００２１】
パラメータμは、標準分布の平均値であり、σは、標準偏差である（一方、平均値と標準偏差によって特徴付けられる正規統計分布は、性質上はガウスであり、ガウス信号パルスは統計的ではない）。この分布の分散（σ２）は、フローセルにおけるストリーム速度に依存する。シース圧（したがって、ストリーム速度）がフローセルにおいてほぼ一定である限り、分布のパルス幅（１／ｅ２ポイントでの持続時間）はほぼ一定である。
【００２２】
血液学分析中に、血小板（ＰＬＴ）は、より大きい網赤血球及び白血球の存在下で検出するのに最も小さいタイプの細胞である。血小板を正確にカウントするために、血小板は、望ましくないノイズ様の細胞事象と区別されなければならない。光学サイドローブ、流体ベースラインドリフトなどは、有効な細胞事象応答に似ている望ましくない信号を生じる。より大きい細胞事象の時間近接性は、有効な小細胞（例えば、血小板）事象ヒストグラムに悪影響を及ぼす。本発明者らは、各細胞事象の特徴を抽出する間に付与される、高分解能タイムスタンプの付与が、光学サイドローブ、流体ベースラインドリフトなどにより発生したアーチファクトを検出及び除去するのに利用され得ることを見出した。発明者らは、各抽出した細胞事象に関する高分解能タイムスタンプを採用することによって、より大きい細胞事象の近傍の小振幅事象を分離することが可能であることを見出した。本開示の方法に係る特徴抽出は、近接性事象が有効な細胞（例えば、血小板）事象であるか、又は光学系サイドローブ、流体ドリフト、ベースラインドリフト、フローセル汚染などから導出された信号であるかの、パルス幅からの判定を可能にする。
【００２３】
或る実施形態によれば、フローサイトメータにおいて事象を検出するための方法は、粒子をフローサイトメータのフローセルに流すこと、フローセルを通って流れる粒子を光学的にインテロゲートすること、推定上の事象特徴を抽出すること、および推定上の事象にタイムスタンプを付与することを含む。このような方法は、推定上の以前の事象と推定上の現在の事象との時間差を求めることと、時間差を持続時間閾値と比較することをさらに含む。時間差が持続時間閾値を上回る場合、推定上の現在の事象が現在の事象として記憶される。時間差が持続時間閾値を下回る場合、推定上の現在の事象のピーク高さ特徴及び推定上の以前の事象のピーク高さ特徴がピーク高さ閾値と比較される。推定上の現在の事象のピーク高さ特徴がピーク高さ閾値を下回る場合、推定上の現在の事象が廃棄される。推定上の以前の事象のピーク高さ特徴がピーク高さ閾値を下回る場合、推定上の以前の事象が廃棄される。推定上の以前の事象のピーク高さ特徴がピーク高さ閾値を上回る場合、推定上の以前の事象が以前の事象として記憶される。
【００２４】
「事象」とは、光学インテロゲーションシステムにより検出される場合の、粒子（例えば、細胞）がフローセルのインテロゲーションゾーンを通過することを意味する。「推定上の事象」とは、事象により生じ得る又は生じ得ない、事象に似ている光信号特徴を意味する。本開示の方法は、推定上の事象が実際に事象であるか、又は推定上の事象が有効な細胞事象応答に似ているが事実上有効な細胞事象応答ではない信号、例えば、光学サイドローブ、流体ベースラインドリフトなどから生じる信号から導出されるかの判定を可能にする。したがって、係る方法の或る態様では、事象は、光学系サイドローブ、流体ドリフト、ベースラインドリフト、フローセル汚染、及びその組合せから選択された信号と区別される。
【００２５】
フローストリーム速度は、シース圧、流体粘度、及びフローセル寸法の関数である。或る態様では、細胞をフローセルに流すことは、細胞を、９ｐｓｉ以上、例えば、９ｐｓｉ、１０ｐｓｉ以上、１１ｐｓｉ以上、１２ｐｓｉ以上、１３ｐｓｉ以上、１４ｐｓｉ以上、１５ｐｓｉ以上などのシース圧で流すことを含む。或る実施形態によれば、レーザのビーム高さは、５μｍ以上、例えば、５μｍ、６μｍ以上、７μｍ以上、８μｍ以上、９μｍ以上、１０μｍ以上、１５μｍ以上、又は２０μｍ以上である。
【００２６】
粒子（例えば、細胞）は、レーザビーム高さと相まって、事象プロフィールを生じる。シース圧が約１２ｐｓｉであり、レーザビーム高さが約８μｍであるとき、この事象プロフィールをフローストリーム速度で割ることにより、およそ２μｓの幅のガウシアンパルスが得られる。理想（「クリーン」）ガウス応答が図２に描画される。理想条件下では、メインガウス粒子プロフィールの近くに望ましくない信号は存在しない。しかしながら、実際には、光学サイドローブ、流体ドリフト、ベースラインドリフトなどの現象が、メインガウス粒子プロフィールの近くに望ましくない信号を生じる。例として、図３は、ベースラインドリフトから生じるメインガウス粒子プロフィールの近くの信号を示す。本発明者らは、本開示の方法に係る粒子特徴抽出を処理することにより、推定上の事象が、事象（例えば、細胞（例えば、血小板）がフローセルを通過すること）であるか又は非事象であるかを判定可能であることを見出した。
【００２７】
或る実施形態によれば、持続時間閾値は、２．５μｓ以下、例えば、２μｓである。或る態様では、推定上の現在の粒子事象のピーク高さ特徴及び推定上の以前の粒子事象のピーク高さ特徴をピーク高さ閾値と比較することは、推定上の現在の細胞事象及び推定上の以前の細胞事象のピーク高さがピーク高さ閾値の２倍（２ｘ）を下回るかどうかを判定することを含む。
【００２８】
或る態様では、粒子は、内部に蛍光分子が組み込まれている又はその表面に蛍光分子が直接又は間接的に付着している微粒子などの微粒子である。「微粒子」とは、０．５μｍ〜１００μｍ、例えば０．１μｍ〜２０μｍなどの、０．００１μｍ〜１０００μｍの範囲の最大寸法を有する粒子（細胞ではない）を意味する。或る態様では、微粒子は、１５μｍ以下、１０μｍ以下、５μｍ以下、１μｍ以下、０．７５μｍ以下、０．５μｍ以下、０．４μｍ以下、０．３μｍ以下、０．２μｍ以下、０．１μｍ以下、０．０１μｍ以下、又は０．００１μｍ以下などの、２０μｍ以下の最大寸法を有する。
【００２９】
微粒子は、球形、回転楕円体形、ロッド形、ディスク形、ピラミッド形、立方体形、シリンダ形、ナノらせん形、ナノスプリング形、ナノリング形、矢印形、涙形、四脚ブロック形、プリズム形、又は任意の他の適切な幾何学的又は非幾何学的形状を含むがこれらに限定されない任意の適切な形状を有してよい。
【００３０】
微粒子は、ラテックス、ポリスチレン、シリカ、磁性材料、常磁性材料、又はその任意の組合せを含むがこれらに限定されない任意の適切な材料で作製されてよい。
【００３１】
或る実施形態によれば、粒子は細胞であり、事象は細胞事象である。細胞は、血液サンプル（例えば、全血サンプル又はその分画物）、脳脊髄液サンプル、腹水サンプル、心膜液サンプル、胸膜液サンプル、滑液サンプル、尿サンプル、唾液サンプル、涙液サンプル、精液サンプル、羊水サンプル、痰サンプルなど、並びに嚢胞、腫瘍などから得られるサンプルを含むがこれらに限定されない関心ある細胞サンプルに存在し得る。或る実施形態によれば、細胞事象は小細胞事象である。例えば、細胞事象は、例えば白血球（ＷＢＣ）事象のガウスプロフィールなどの、より大きい細胞事象のガウスプロフィールの近傍の、血小板事象であり得る。本開示の方法により判定され得る他の小細胞事象は、微生物細胞事象を含む。関心ある微生物は、細菌、古細菌、原生動物類、真菌、藻類などを含む。或る実施形態によれば、小細胞事象は細胞残屑事象である。
【００３２】
フローサイトメータにおいて事象を検出するための例示的な方法と、血小板事象などの事象に関するクリーンな事象ヒストグラムを得る際のその有用性が、以下の実験項の実施例１で提供される。
【００３３】
上記で要約したように、本開示はまた、フローサイトメータにおいて細胞を検出するための方法を提供する。このような方法は、細胞を含む細胞サンプルをフローサイトメータのフローセルに流すこと、フローセルを通って流れる細胞からの光信号を第１の利得設定（gain setting）で検出すること、およびフローセルを通って流れる細胞からの光信号を第２の利得設定で検出することを含む。第２の利得設定は、第１の利得設定とは異なる。
【００３４】
第１及び第２の利得設定を採用する方法は、様々な使用が見出される。例えば、本発明者らは、フローサイトメトリアッセイ中に光電子信号の利得を変化させることにより、アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）の全ダイナミックレンジを用いることが可能となることを見出した。これは、アナログ−デジタル変換からの信号対ノイズ比（ＳＮＲ）及び分解能を向上させる。クラスタにおける距離メトリクスを増加させ、より良好な区別を提供するために、光電気信号の最適な利得設定を採用することができる。
【００３５】
少なくとも第１及び第２の利得設定を採用する本発明の方法の第１の特定の有用な例示的な用途は、サンプル間の細胞カウントの実質的な変動（例えば、５〜５百万）を呈する細胞サンプル（例えば、体液サンプル）における細胞を検出することに関する。固定量の蛍光染料が、通常、アッセイにおいて細胞サンプルをフローストリームに注入する前に添加される。この固定量は、サンプルにおける中央値の期待される細胞事象に基づいて選択される。サンプルが普通以上に有核細胞を有する場合、染料の濃度がより多数の細胞を染色するのに十分ではない場合がある。結果としての弱い染色は、最適には及ばない蛍光信号を生じ、細胞事象信号は、ＡＤＣのダイナミックレンジのうちのほんの小さい部分を占有する。最初のデータの取り込み後に利得設定（例えば、フォトダイオード及び／又は光電子増倍管の利得設定）を変化させることにより、すべての光センサ信号がＡＤＣのフルダイナミックレンジを占有するように利得を設定することが可能である。このフルＡＤＣ分解能により、本発明者らは、種々の細胞タイプを区別するのがより容易となることを見出した。
【００３６】
最初のデータ取り込み期間中に、光センサ信号がデフォルトの利得設定で収集されてよい。ＡＤＣの全部のダイナミックレンジを効果的に用いるのに最適な利得設定が、数ミリ秒以内に計算され得る。修正された利得設定がアッセイの残りの持続時間にわたって適用され、より良好な信号対ノイズ比及びＡＤＣのダイナミックレンジの完全利用が提供され得る。第１及び第２の利得設定を採用する例示的な方法が、以下の実験項の実施例２で提供される。
【００３７】
少なくとも第１及び第２の利得設定を採用する本発明の方法の第２の特定の有用な例示的な用途は、不均一細胞サンプル（例えば、血液サンプル）における異なるタイプの細胞をカウントすることに関するものであり、この場合、異なるタイプの細胞は異なる強度のフローサイトメトリ信号を生じる。例として、方法は、図９に概略的に例示されるように、血小板事象を第１の（より低い）利得設定で取り込み、赤血球（ＲＢＣ）事象を第２の（より高い）利得設定で取り込む際の使用が見出される。図９に示された例示的な実施形態では、ＰＬＴ収集が、第１の利得設定で或る持続時間（この例では１．８秒）にわたって行われ、次いで、ＲＢＣ収集が、その後、第２の利得設定で或る持続時間（この例では１．７秒）にわたって行われる。このようにして、アッセイを第１の「モード」（例えば、ＰＬＴモード）で行い、次いで、第２の「モード」（例えば、ＲＢＣモード）に切り換えることができ、この場合、第１のモードと第２のモードは利得設定に応じて異なる。ＰＬＴモードは、ＰＬＴ濃度、血小板分布幅（ＰＤＷ）、及び／又は平均血小板容積（ＭＰＶ）の低いエンドなどのＰＬＴ細胞事象の詳細を取り込むために実行されてよい。ＰＬＴデータが取り込まれると、利得設定は、ＲＢＣ細胞がＡＤＣのフルダイナミックレンジを占有するようにＲＢＣ細胞事象の収集のために最適に下げられる。ＲＢＣデータが取り込まれている間、ＰＬＴ濃度及び細胞カウント結果を入手可能である。血液サンプルがＰＬＴカウントの非常に低いエンドを呈するときには、利得設定を、統計的関連性のために必要とされ得る場合の、より多くのＰＬＴ細胞事象を取り込むべく設定し直して（上げて）よい。
【００３８】
したがって、少なくとも第１及び第２の利得設定を採用する方法の態様は、第１の細胞タイプを検出するべく第１の利得設定で検出された光信号を解析すること、および第２の細胞タイプを検出するべく第２の利得設定で検出された光信号を解析することを含む。
【００３９】
第１及び第２の利得設定を採用する本発明の方法を実施するときに、第２の利得設定は、例えば、細胞事象信号強度が最適を下回ると判定されるときに、第１の利得設定よりも高くてよい（例えば、普通以上の細胞濃度を有する細胞サンプルを考慮に入れるため）。或る態様では、第２の利得設定は、例えば、細胞事象信号強度が最適を上回ると判定されるときに、第１の利得設定よりも低くてよい（例えば、普通以下の細胞濃度を有する細胞サンプルを考慮に入れるため）。
【００４０】
或る実施形態によれば、第１及び第２の利得設定は、フォトダイオードの利得設定、光電子増倍管（ＰＭＴ）の利得設定、又はその両方を独立して含む。
【００４１】
方法は第１及び第２の利得設定を含むが、方法は、種々の細胞事象（例えば、種々の細胞タイプなどに対応する）の最適な収集のために望まれ得る場合の、複数の利得設定を採用してよいことが理解されるであろう。例えば、種々の細胞事象の最適な収集のためにアッセイ中に２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、又は１０以上の異なる利得設定が採用されてよい。
【００４２】
第１の利得設定での光信号の検出は、第２の利得設定での光信号の検出と同じ持続時間にわたってよい。他の態様では、第１の利得設定での光信号の検出は、第２の利得設定での光信号の検出とは異なる持続時間にわたってよい。或る実施形態によれば、第１及び第２の利得設定での光信号の検出は、０．１〜１０秒（例えば、０．５〜５秒）から独立に選択された持続時間にわたる。
【００４３】
或る態様では、フローサイトメトリアッセイは、第１の利得設定で最初の持続時間にわたって実行され、次いで、改善された（例えば、最適な）第２の利得設定でアッセイの残りの持続時間（これは最初の持続時間よりも長い場合がある）にわたって実行される。改善された利得設定は、第１の利得設定で最初の持続時間中に収集された信号（例えば、信号強度）に基づいて決定されてよい。
【００４４】
上記で要約したように、本開示はまた、フローセルにおける汚染のレベルを判定するための方法を提供する。「フローセルにおける汚染」又は「フローセルの汚染」とは、フローセルの内壁上の（例えば、細胞残屑、タンパク質などの）堆積を意味する。これらの堆積が生じるとき、フローセルを通る光路が曇り、レーザビームが歪み、種々の散乱光／蛍光信号強度が変化する。
【００４５】
このような方法は、粒子を含むサンプルをフローセルに流すこと、流している間に生粒子事象データを収集すること、および生粒子事象データ内の粒子事象の数をカウントすることを含む。方法は、フィルタされた信号を生成するべく逆ガウシアンフィルタ係数で生粒子事象データをフィルタすることをさらに含み、逆ガウシアンフィルタ係数は、期待パワースペクトル分散に基づく。方法は、フィルタされた信号のエネルギー（これはフローセルにおける汚染及び生粒子事象データにおける細胞事象の数に比例する）を判定すること、およびフローセルにおける汚染のレベルを判定するべく、フィルタされた信号の求めたエネルギーからクリーンなフローセルのベースラインエネルギーを差し引くことをさらに含む。或る実施形態によれば、流している間に生粒子事象データを収集することの後で、閾値を下回る生データ値がゼロに置き換えられる。或る態様では、フィルタされた信号の求めたエネルギーからクリーンなフローセルのベースラインエネルギーを差し引くことから得られる値は、事象の数に基づいてスケール変更される。
【００４６】
方法は、フローセルにおける汚染のレベルを判定する際の使用が見出される。或る実施形態によれば、方法の用途は、初期段階のフローセル汚染を検出することである。方法の特徴は、フローセル汚染を検出するためにフローサイトメータにおいて標準（例えば、標準参照粒子（ＳＲＰ））を実行する必要がなくなるように、それらがフローセル汚染の検出を可能にすることである。
【００４７】
汚染されたフローセルは、１つよりも多い反射を生成し、したがって、粒子（例えば、細胞）事象応答を汚す、これに重なる、及びこれに歪みを加える。フローセル汚染から生じる、追加の信号は、本来の信号を歪ませ、細胞事象スペクトル内のより高い周波数成分を生成する。本発明者らは、周波数領域における粒子事象応答を解析し、高周波数成分のエネルギーを評価することにより、初期段階のフローセル汚染が検出され得ることを見出した。
【００４８】
細胞事象応答により生成されるガウス波形を特徴づける上記の式を参照すると、パラメータμは、ベースライン揺らぎに依存する。ベースライン揺らぎは、システムの電子装置の外部干渉、レーザノイズ、暗電流、及び／又は不完全性から生じる場合がある。ベースライン回復（ＢＬＲ）回路が、ＤＣでベースラインを維持する。パラメータμは、アナログＢＬＲ回路によりＤＣオフセットをなくすこと又はデジタル領域においてＤＣオフセットを差し引くことのいずれかによりゼロにされ得る。パラメータμをゼロにすることができ、分散はすべての粒子事象に関する時間領域分布にわたって一定であることから、この時間領域信号を定周波数領域スペクトルに変換することが可能である。信号の周波数領域特徴は、すべての細胞サイズに関連した細胞事象に関して同じスペクトルを示す。したがって、この特徴を、標準参照粒子（ＳＲＰ）の実行を回避するのに利用することができる。
【００４９】
フローセル汚染に起因する高周波数スペクトルのエネルギーの変化の正確な判定は、クリーンなフローセルからの蓄積したスペクトルのエネルギーの除去により容易にされる。本発明の方法によれば、逆ガウシアンフィルタ又はハイパス周波数フィルタを計算し、これにより、クリーンなフロー細胞事象に関するパワースペクトルの逆数をとる。全部の波形が高分解能（例えば、１６ビット及び１０ＭＳＰＳ）で取り込まれ得るので、性質上はガウスであるエネルギーをデジタルにフィルタ処理することが実行可能である。このエネルギーをフィルタ処理するために、アナログ又はデジタルの形態の有限インパルス応答（ＦＩＲ）又は無限インパルス応答（ＩＩＲ）フィルタのいずれを実装することもできる。
【００５０】
或る実施形態によれば、クリーンなフローセルから与えられるエネルギーを除去するためにデジタルＦＩＲフィルタが採用される。ＦＩＲフィルタ実装は、以下の式に従って実行され得る：
【数３】
2019502915.tif 000005
【００５１】
デジタル領域でのＦＩＲフィルタ実装に関する式は、スペクトルの逆数から計算されるｂ０、ｂ１、ｂ２、ｂ３．．．．．ｂｎ係数を有し、ｘ（ｎ）は、デジタル化された生データ信号である。ｙ（ｎ）は、フィルタのデジタル出力信号である。係数（ｂ０、ｂ１、ｂ２、ｂ３．．．．．ｂｎ）は、クリーンな細胞事象により与えられる厳密なエネルギーを除去するべくさらに修正することができる。
【００５２】
信号から正規の（クリーンな）エネルギーを除去することにより、信号の複数の反射及び歪みの余分なエネルギーが計算され得る。高周波数成分のエネルギー測定は、フローセルにおける汚染のオーダーを示す。
【００５３】
或る実施形態によれば、粒子事象の数をカウントすることは、アナログ−デジタル変換器から固定の時間間隔で生データを抽出すること、ＤＣオフセットを判定すること、および固定の閾値を下回る生データをゼロに置き換えることを含む。或る態様では、閾値はフルダイナミックレンジの１％〜５％である、又は閾値はピーク振幅の１／ｅ２である。
【００５４】
或る態様では、サンプルは、フローセル内のシース流体のストリームへ流し込まれ、期待パワースペクトル分散は、シース流体の圧力に基づく。或る実施形態によれば、粒子は細胞である。例えば、サンプルは、血液サンプルであり得る、及び粒子は血球である。
【００５５】
本開示の一実施形態に係るフローセルにおける汚染のレベルを判定するための方法のフローチャートが図１２で提供される。この例では、アナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）から固定の時間間隔で生データが抽出される。ＤＣオフセットが計算される。固定の閾値（例えば、フルダイナミックレンジの３％又はピーク振幅の１／ｅ２）を下回る生データがゼロに置き換えられる。生データ内の細胞事象の数が計算される。次いで、生データが所定の係数でフィルタされ、次いで、フィルタされた信号のエネルギーが計算される。細胞事象の数に基づいてクリーンなフローセルに関するベースラインエネルギーが除去される。残りのエネルギーは、汚染のレベルを判定するべくスケール変更されてよい。
【００５６】
フローセルにおける汚染のレベルを判定するための例示的な方法が、以下の実験項の実施例３で説明される。
【００５７】
フローセルが汚染され始めるときに、細胞事象の特徴計算（例えば、ピーク高さ、幅、及びより高いモーメント）が無効になり始め、したがって、誤ったレポート、例えば、血液レポートが生成されることになる。既存の方法によれば、フローセルがスケジュールされた間隔でクリーニングされる又は標準参照粒子（ＳＲＰ）に関係する診断モードが実行されるまで、誤った血液結果を検出することはできない。本開示の方法は、初期段階のフローセル汚染を検出することを可能にし、これにより、誤った血液結果を回避することを可能にし、高価なＳＲＰビーズに関係する特別なモードでフローサイトメータを動作させる必要性をなくす。加えて、この方法は、かなり初期段階のフローセル汚染の検出を可能にするため、廃棄されるサンプルが最小にされる。さらに、システムは、必要以上に頻繁にクリーニングされる（例えば、漂白される）必要はなく、これにより、システムのチューブの寿命が延びる。
【００５８】
＜コンピュータ可読媒体及びシステム＞
上記で要約したように、同じく本開示によって提供されるのは、例えば、本開示の方法を実施する際の使用が見出される、コンピュータ可読媒体及びシステムである。
【００５９】
本開示の非一時的(non-transitory)コンピュータ可読媒体は、ディスク（例えば、磁気ディスク又は光ディスク）、ソリッドステートストレージドライブ、カード、テープ、ドラム、パンチカード、バーコード、及び磁気インク文字、並びに、表現、命令などを記憶するのに用いられ得る他の媒体を含むがこれらに限定されない。
【００６０】
或る態様では、前述のフローサイトメータにおいて事象を検出するための方法を実施する際の使用が見出される非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。或る実施形態によれば、このような非一時的コンピュータ可読媒体は、コンピュータデバイス(computing device)（例えば、フローサイトメータのコンピュータデバイス）によって実行されるときに、コンピュータデバイスに、フローセルを通って流れる粒子から推定上の事象特徴を抽出させ、推定上の事象にタイムスタンプを付与させ、推定上の以前の事象と推定上の現在の事象との時間差を求めさせ、時間差を持続時間閾値と比較させる命令を含む。時間差が持続時間閾値を上回る場合、命令は、コンピュータデバイスに、推定上の現在の事象を現在の事象として記憶させる。時間差が持続時間閾値を下回る場合、命令は、コンピュータデバイスに、推定上の現在の事象のピーク高さ特徴及び推定上の以前の事象のピーク高さ特徴をピーク高さ閾値と比較させる。推定上の現在の事象のピーク高さ特徴がピーク高さ閾値を下回る場合、命令は、コンピュータデバイスに、推定上の現在の事象を廃棄させる。推定上の以前の事象のピーク高さ特徴がピーク高さ閾値を下回る場合、命令は、コンピュータデバイスに、推定上の以前の事象を廃棄させる。推定上の以前の事象のピーク高さ特徴がピーク高さ閾値を上回る場合、命令は、コンピュータデバイスに、推定上の以前の事象を以前の事象として記憶させる。或る態様では、事象は、光学系サイドローブ、流体ドリフト、ベースラインドリフト、フローセル汚染、及びその組合せから選択された信号と区別される。或る実施形態によれば、粒子は細胞であり、ゆえに、事象は細胞事象である。関心ある細胞事象は、例えば、小細胞事象を含む。小細胞事象は、血小板事象、微生物細胞事象、細胞残屑事象などであり得る。
【００６１】
或る態様では、前述のフローサイトメータにおいて細胞を検出するための方法を実施する際の使用が見出される非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。或る実施形態によれば、このような非一時的コンピュータ可読媒体は、コンピュータデバイス（例えば、フローサイトメータのコンピュータデバイス）によって実行されるときに、コンピュータデバイスに、フローセルを通って流れる細胞サンプルの細胞からの光信号を第１の利得設定で検出させ、利得設定を第１の利得設定から第２の利得設定に変化させ、フローセルを通って流れる細胞からの光信号を第２の利得設定で検出させる命令を含む。第２の利得設定は、第１の利得設定とは異なる。例えば、第２の利得設定は、第１の利得設定よりも高くてよい（例えば、高い細胞濃度を有する細胞サンプルを考慮に入れる又はより弱い信号強度を典型的に呈する細胞タイプを検出するため）。他の態様では、第２の利得設定は、第１の利得設定よりも低い（例えば、低い細胞濃度を有する細胞サンプルを考慮に入れる又は強い信号強度を典型的に呈する細胞タイプを検出するため）。第１及び第２の利得設定は、フォトダイオードの利得設定、光電子増倍管（ＰＭＴ）の利得設定、又はその両方を含んでよい。或る実施形態によれば、第１の利得設定は第２の利得設定よりも高く、第１の利得設定で血小板が検出され、第２の利得設定で赤血球（ＲＢＣ）が検出される。第１の利得設定での光信号の検出は、第２の利得設定での光信号の検出と同じ又は異なる持続時間にわたってよい。或る態様では、第１及び第２の利得設定での光信号の検出は、０．１〜１０秒（例えば、０．５〜５秒）から独立に選択された持続時間にわたる。
【００６２】
或る態様では、前述のフローセルにおける汚染のレベルを判定するための方法を実施する際の使用が見出される非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。或る実施形態によれば、このような非一時的コンピュータ可読媒体は、コンピュータデバイス（例えば、フローサイトメータのコンピュータデバイス）によって実行されるときに、コンピュータデバイスに、粒子を含むサンプルがフローセルを通って流れる際に生粒子事象データを収集させ、生粒子事象データ内の粒子事象の数をカウントさせ、フィルタされた信号を生成するべく逆ガウシアンフィルタ係数で生粒子事象データをフィルタさせる命令を含む。逆ガウシアンフィルタ係数は、期待パワースペクトル分散に基づく。命令はさらに、コンピュータデバイスに、フィルタされた信号のエネルギーを求めさせ、フローセルにおける汚染のレベルを判定するべく、フィルタされた信号の求めたエネルギーからクリーンなフローセルのベースラインエネルギーを差し引かせる。或る態様では、粒子事象の数をカウントすることは、アナログ−デジタル変換器から固定の時間間隔で生データを抽出すること、ＤＣオフセットを判定すること、および固定の閾値を下回る生データをゼロに置き換えることを含む。或る実施形態によれば、閾値はフルダイナミックレンジの１％〜５％である、又は閾値はピーク振幅の１／ｅ２である。或る態様では、期待パワースペクトル分散は、シース流体の圧力に基づく。或る実施形態によれば、粒子は細胞である。例えば、細胞は、血液サンプルの細胞であり得る。
【００６３】
同じく本開示によって提供されるのは、本開示の方法のいずれかを行うように適合されたシステム（例えば、自動血液学システムのサブシステムであり得る、フローサイトメトリシステム）である。このようなシステムは、前述の非一時的コンピュータ可読媒体のいずれかを含んでよい。
【００６４】
或る態様では、本開示のシステムは、フローサイトメータである。このようなシステムは、フローセルと、フローセルを通って流れる関心あるサンプル（例えば、血液サンプル）の粒子を励起するように配置された励起源と、励起した粒子から放出された光信号を検出するための１つ又は複数の検出器を含む。前述の非一時的コンピュータ可読媒体のいずれかを含んでもよい、本開示の方法を実施するのに適する、フローサイトメータの例が、図２５に概略的に例示される。フローサイトメータ１０は、光源１２、ビームを曲げるためのフロントミラー１４及びリヤミラー１６、第１の円筒レンズ２０及び第２の円筒レンズ２２を収容しているビーム拡大器モジュール１８、集束レンズ２４、ビーム微調節器２６、フローセル２８、前方散乱レンズ３０、ブルズアイ検出器３２、第１の光電子増倍管３４、第２の光電子増倍管３６、及び第３の光電子増倍管３８を含む。ブルズアイ検出器３２は、０°の光散乱のための内側検出器３２ａと、７°の光散乱のための外側検出器３２ｂを有する。
【００６５】
或る態様では、光源はレーザである。しかしながら、例えばランプ（例えば、水銀、キセノン）などの他の光源を用いることができる。光源１２は、カリフォルニア州サンタクララのＣｏｈｅｒｅｎｔ社から市販されている垂直偏光空冷Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｃｕｂｅレーザとすることができる。３５０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲の波長を有するレーザを用いることができる。レーザの動作条件は、「ＣＥＬＬ−ＤＹＮ」自動血液学分析器と共に現在用いられているレーザの動作条件と実質的に同様である。
【００６６】
フローセル、レンズ、集束レンズ、ビーム微調節機構、及びレーザ集束レンズに関係するさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６３１，１６５号の、特に、第４１欄、３２行目〜第４３欄、１１行目で見ることができる。図２に示された前方光路系は、球面平凸レンズ３０と、レンズの後焦点面内に存在する二要素フォトダイオード検出器３２を含む。この構成では、二要素フォトダイオード検出器３２内の各点は、フローセル２８を通って移動する細胞からの光の特異的な集光角度にマップする。検出器３２は、軸方向光損失（ＡＬＬ）及び中角前方散乱光（ＩＡＳ）を検出することができる、ブルズアイ検出器とすることができる。米国特許第５，６３１，１６５号は、この検出器の種々の代替を、第４３欄、１２行目〜５２行目で説明する。
【００６７】
第１の光電子増倍管３４（ＰＭＴ１）は、偏光解消した側方散乱光（ＤＳＳ）を測定する。第２の光電子増倍管３６（ＰＭＴ２）は、偏光した側方散乱光（ＰＳＳ）を測定し、第３の光電子増倍管３８（ＰＭＴ３）は、選択された蛍光染料及び採用された光源に応じて、４４０ｎｍ〜６８０ｎｍの蛍光発光を測定する。光電子増倍管は、信号強度を増加させるために広範囲の波長の蛍光信号を収集する。側方散乱光及び蛍光発光は、効率的な検出を可能にするために必要とされる波長で効率よく伝送及び反射するダイクロイックビームスプリッタ４０及び４２により、これらの光電子増倍管へ誘導される。米国特許第５，６３１，１６５号は、光電子増倍管に関係する種々のさらなる詳細を、第４３欄、５３行目〜第４４欄、４行目で説明する。
【００６８】
感度は、液浸集光系を用いることにより、蛍光を測定するときに光電子増倍管３４、３６、及び３８で増強される。液浸集光系は、屈折率整合層によって第１のレンズ３０をフローセル２８に光学的に結合するものであり、広い角度にわたる集光を可能にする。米国特許第５，６３１，１６５号は、この光学系の種々のさらなる詳細を、第４４欄、５行目〜３１行目で説明する。
【００６９】
コンデンサ４４は、高分解能顕微鏡法で用いられる回折限界イメージングのために十分な収差補正を有する光学レンズ系である。米国特許第５，６３１，１６５号は、この光学系の種々のさらなる詳細を、第４４欄、３２行目〜６０行目で説明する。
【００７０】
図２５に示された他の構成要素、すなわち、スリット４６、視野レンズ４８、及び第２のスリット５０の機能は、米国特許第５，６３１，１６５号の第４４欄、６３行目〜第４５欄、２６行目で説明される。検出される光の波長又は偏光若しくは波長と偏光との両方を変化させるべく光電子増倍管の光路内に挿入される光学フィルタ５２又は５６及び偏光子５２又は５６も、米国特許第５，６３１，１６５号の第４４欄、６３行目〜第４５欄、２６行目で説明される。本明細書で用いるのに適する光学フィルタは、バンドパスフィルタ及びロングパスフィルタを含む。
【００７１】
光電子増倍管３４、３６、及び３８は、側方散乱光（その軸が入射レーザビームにほぼ垂直なコーン内に散乱した光）か、又は蛍光（入射レーザビームの波長とは異なる波長で細胞から放出された光）のいずれかを検出する。
【００７２】
米国特許第５，６３１，１６５号の選択部分が上記で参照されるが、米国特許第５，６３１，１６５号は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。或る実施形態によれば、本開示のフローサイトメータは、光センサとしてアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）を採用する。
【実施例】
【００７３】
以下の実施例は、限定するためではなく例証として提供される。
【００７４】
＜実験＞
実施例１：事象検出のための望ましくない細胞事象信号の除去
この事象検出の例では、粒子は細胞であり、クリーンな血小板（ＰＬＴ）細胞ヒストグラムを得るべく望ましくない細胞事象信号が除去される。
【００７５】
この例で用いられる方法のフローチャートが図４に示される。トリガチャネル上で２千万サンプル／秒（２０ＭＳＰＳ）分解能でアナログ−デジタル変換器（ＡＤＣ）からサンプルが取得される。サンプルを取得し、ベースライン回復（ＢＬＲ）値を差し引いた後に、細胞事象特徴が抽出され、タイムスタンプが付与される。パルス幅が３μｓを上回る場合、現在の細胞事象が廃棄される。パルス幅が３μｓを下回る場合、以前の事象と現在の事象との時間差が計算される。以前の細胞事象と現在の細胞事象との時間差が２μｓを上回る場合、現在の事象が保存され、タイムスタンプが抽出される。現在の事象のピーク高さ特徴が閾値の２倍を下回る場合、現在の事象が廃棄される。現在の事象のピーク高さ特徴が閾値の２倍を下回らず、且つ、以前の事象のピーク高さ特徴が閾値の２倍を下回る場合、以前の事象が廃棄される。現在の事象のピーク高さ特徴が閾値の２倍を下回らず、且つ、以前の事象のピーク高さ特徴が閾値の２倍を下回らない場合、以前の事象及びタイムスタンプが、リストモードファイルに書き込まれる。上記のプロセスは、データ収集期間が経過するまで実行される。
【００７６】
クリーンな血小板（ＰＬＴ）細胞ヒストグラムを得るためのこの例示的な方法の有用性が図５〜図８で実証される。図５は、振幅軸上の原点のより近くでのＰＬＴ群の汚染を示す。図７は、ＰＳＳ側方散乱チャネルにおけるＰＬＴ群の汚染を非常に明瞭に示す。図７では、無効な事象が異なる色で明瞭に示される。これらの事象は、ＰＬＴ細胞事象ではないが、光学アーチファクト、ＡＰＤの熱的影響、流体ドリフト、又は電子装置のベースラインノイズにより発生した無効な事象である。図６は、ＰＬＴ細胞群のクリーンな対数正規分布を達成するためのこのアルゴリズムの出力である。この例では、サンプルは、１：２５０に希釈され、注入速度は２．９μＬ／ｓであった。
【００７７】
実施例２：光学利得の動的調節による細胞事象の改善された取り込み
この例では、デジタルデータ取り込みサブシステムは、細胞事象カウント並びにアッセイの持続時間の追跡を維持する。アッセイにおける所定の時点で、データ取り込みシステムが、或る細胞事象信号（例えば、細胞事象からの前方散乱光）が期待値を下回ると判定する場合、光電子信号の可変利得設定が増加される。データ取り込みサブシステムが、アッセイの初めに固定の時間（約３００ｍｓ）内に不飽和の事象に比べて多くの飽和した細胞事象を見つける場合、光電子信号の可変利得設定が減少される。
【００７８】
動的利得調節（dynamic gain adjustment）のない場合の細胞事象のプロットが図１０に示される。アッセイ中に動的利得調節が採用された場合の細胞事象のプロットが図１１に示される。図１０及び図１１では、上側のプロット及び下側のプロットは、それぞれ、ＰＳＳ／ＡＬＬ及びＰＳＳ／ＤＳＳである。
【００７９】
図１０及び図１１は、特に、体液モード、又はアッセイに関する染料の量が期待平均細胞カウントに基づいて固定される場合の任意のアッセイでの、動的利得調節の有益な効果を実証する。この方法は、特に、期待されるよりもアッセイにおいて顕著により多くの又は少ない量の有核細胞が存在するときの、細胞の細胞核における染料の浸透のばらつきの問題に対処する。図１０は、アッセイにおいて期待されるよりも多い細胞が存在するときの効果を示す。すべての細胞が染色されるわけではないので、セル群間のクラスタ距離が非常に小さい場合にセル群を区別することは非常に難しい。図１１は、可変利得調節に関係する本明細書で説明される方法が、散乱プロットにおけるセル群クラスタの分離を容易にすることを示す。図１１は、有核細胞が期待されるよりも多く、固定量の染料がすべての有核細胞を染色するには不十分であった場合を示す。逆に、期待されるよりもはるかに少ない有核細胞が存在するときには、固定量の染料が細胞核及び血漿を染色し、したがって、光センサ上の細胞事象応答が飽和する。飽和した信号は、クラスタ分離のためのどのようなさらなる情報ももたず、したがって、アッセイがアクティブである間、利得を動的に低減させることが非常に望ましい。
【００８０】
この方法のさらなる利点は、１つのアッセイを２つ以上の所定の利得設定に分けることである。図９は、ＰＬＴ細胞群の特徴のより良好な抽出を達成するべくＲＢＣアッセイが２つのグループに分割されることを示す。これは、小細胞事象をより大きい利得設定で抽出することができ、より大きい細胞をより小さい利得設定で抽出することができることを示す。このように、アナログ−デジタル変換器電子装置の全部のダイナミックレンジを活用することが可能である。
【００８１】
その決定は、アッセイの実行時間中に動的に行うことができ、利得は、データ完全性に影響を及ぼすことなく数十ミリ秒以内に調節し、安定化させることができる。
【００８２】
実施例３：周波数領域における細胞事象応答及び高周波数成分のエネルギーを解析することによる初期段階のフローセル汚染の検出
理論的には、１０ＭＳＰＳで２マイクロ秒の持続時間の理想ガウシアンパルスは、１．７５ＭＨｚの帯域幅を占有する。理論値を用いる代わりに、既存の電子装置でクリーンなフローセル上でとられた実験データから帯域幅を計算した。実験データは、クリーンなフローセルにおける関心ある帯域幅はおよそ１．６５ＭＨｚであり、したがって、理論上のものに非常に近いことを示す。理想ガウシアンパルスのパワースペクトル及びクリーンなフローセルからとられた実験データのパワースペクトルが、それぞれ、図１３及び図１４に示される。
【００８３】
ガウシアンパルスは、クリーンな細胞事象信号を表す。フローセルにおける汚染は、細胞事象信号により多くのエネルギーを追加する。クリーンなフローセルを表す細胞事象のエネルギーを差し引くべく周波数領域におけるガウシアンスペクトルの逆応答が計算される。細胞事象における残りのエネルギーは、フローセルにおける汚染に正比例する。スペクトルの有効な正規化は、システムのノイズフロアに依存する。ノイズフロアが十分に低いとき（例えば、フルダイナミックレンジの１％未満）、パワースペクトルは、セル振幅に容易に正規化され得る。
【００８４】
生データから、ゲートピークに基づいて細胞事象の数がカウントされる。ピークが識別されると、生データは、ベースラインノイズを排除するべく閾値に最初にフロアされる（ｆｉｒｓｔ  ｆｌｏｏｒｅｄ）。次いで、細胞事象のみの生データが逆ガウシアンフィルタでフィルタされる。逆ガウシアンフィルタの周波数応答のグラフが図１５に描画される。
【００８５】
逆ガウシアンフィルタの出力は、フローセル汚染からの何らかのエネルギーを示す。汚染の影響を正確に測るために、クリーンなフロー細胞事象に関する残留エネルギーが差し引かれる。最終的な値は、フローセルからの複数の反射に起因する残りのエネルギーの優れた表示である。
【００８６】
汚染度の高いフローセルから得られるデータが図１６〜図１８に示される。図１６は、ＡＤＣからの生データからベースラインノイズが除去された、汚染度の高いフローセルに関する時間領域信号（ステージ１）を示す。図１７は、汚染度の高いフローセルの周波数領域特徴（生データのパワースペクトル）（ステージ２）を示す。図１８は、クリーンなフローセルに等しいエネルギーの除去後の生データのパワースペクトルを示す。この例では、高エネルギー（−８ｄＢ／Ｈｚ）は、高レベルの汚染を示す。
【００８７】
汚染の初期段階にあるフローセルから得られるデータが図１９〜図２１に示される。図１９は、ＡＤＣからの生データからベースラインノイズが除去された、汚染の初期段階にあるフローセルに関する時間領域信号を示す。図２０は、汚染の初期段階にあるフローセルの周波数領域特徴（生データのパワースペクトル）を示す。図２１は、クリーンなフローセルに等しいエネルギーの除去後の生データのパワースペクトルを示す。この例では、より低いエネルギー（−２４ｄＢ／Ｈｚ）は、汚染の初期段階を示す。
【００８８】
汚染されていないフローセルから得られるデータが図２２〜図２４に示される。図２２は、ＡＤＣからの生データからベースラインノイズが除去された、汚染されていないフローセルに関する時間領域信号を示す。図２３は、汚染されていないフローセルの周波数領域特徴（生データのパワースペクトル）を示す。図２４は、クリーンなフローセルに等しいエネルギーの除去後の生データのパワースペクトルを示す。低エネルギー（−３２ｄＢ／Ｈｚ）は、フローセルが汚染されていないことを示す。
【００８９】
上記の発明は理解を明確にする目的での例示及び例によってある程度詳細に説明されているが、付属の請求項の精神又は範囲から逸脱することなく特定の変化及び修正が本発明に加えられてよいことが、この発明の教示に照らせば当業者にはすぐに分かる。
【００９０】
したがって、上記は本発明の原理を単に例示するだけである。本明細書で明示的に説明又は図示されないが、本発明の原理を具体化する、本発明の精神及び範囲内に含まれる種々の構成を当業者は考案できることが理解されるであろう。さらに、本明細書に列挙されるすべての例及び条件付きの文言は、当該技術分野を進展させるために本発明者らによって提供される本発明の原理及び概念を読者が理解するのを助けることを主として意図され、このような具体的に列挙される例及び条件に限定されないと解釈されるべきである。さらに、本発明の原理、態様、及び実施形態、並びにその具体例を列挙する本明細書でのすべての文は、その構造の均等物と機能の均等物との両方を包含することを意図される。加えて、このような均等物は、現在公知の均等物と将来開発される均等物、すなわち、構造に関係なく同じ機能を果たす開発される任意の要素との両方を含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書で図示及び説明される例示的な実施形態に限定されることを意図されない。むしろ、本発明の範囲及び精神は、付属の請求項によって具体化される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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