(57)【要約】  突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質（又はその改変体）、それをコードする配列、それを調製する方法、及びそれを含むウイルス様粒子が提供され、ここで、該タンパク質（又はその改変体）及び該ウイルス様粒子は、少なくとも２種のＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ１１及びＨＰＶ６）に対する中和抗体の生成を可能にし、したがって、前記少なくとも２種のＨＰＶ型による感染及び前記感染によって引き起こされる疾患、例えば子宮頸癌及び尖圭コンジロームの予防に使用することができる。また、前記少なくとも２種のＨＰＶ型による感染、及び該感染によって引き起こされる疾患、例えば子宮頸癌及び尖圭コンジロームを予防するための医薬組成物又はワクチンの製造における前記タンパク質及び前記ウイルス様粒子の使用が開示される。
2019502404.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体であって、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質と比較すると、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質は、以下の突然変異を有する：
（１）３〜６アミノ酸、例えば３、４、５又は６アミノ酸のＮ末端切断；そして
（２）（ａ）第２タイプの野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１７９位のアミノ酸残基の置換；又は
（ｂ）第２タイプの野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の３４６〜３５１位のアミノ酸残基の置換；又は
（ｃ）第２タイプの野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の１１９〜１４０位のアミノ酸残基の置換；そして
改変体は、１つ又はいくつか（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９個）のアミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、付加又は欠失のみによって突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質とは異なるが、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の機能、すなわち、少なくとも２つのＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ１１及びＨＰＶ６）に対する中和抗体の生成を誘導する能力を保持する；
好ましくは、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質と比較して、Ｎ末端で切断された３、４、５又は６アミノ酸を有し；
好ましくは、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質と比較して、Ｎ末端で切断された４アミノ酸を有し；
好ましくは、第２タイプの野生型ＨＰＶはＨＰＶ６であり；
好ましくは、（２）（ａ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の１６９〜１７８位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、（２）（ｂ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の３４５〜３５０位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、（２）（ｃ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の１１９〜１３９位のアミノ酸残基であり；
好ましくは、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有し；
好ましくは、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し；
好ましくは、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質は、配列番号６、７及び９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、上記突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体。
【請求項２】
請求項１に記載の突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体をコードする単離された核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の単離された核酸及び／又は請求項３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載の突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体を含む又はそれからなるＨＰＶウイルス様粒子。
【請求項６】
請求項１に記載の突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体、又は請求項２に記載の単離された核酸、又は請求項３に記載のベクター、又は請求項４に記載の宿主細胞、又は請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子を含む組成物。
【請求項７】
請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子、及び場合により医薬として許容される担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物又はワクチンであって、
好ましくは、ＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患の予防に有効な量で存在し；
好ましくは、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ１１感染及び／又はＨＰＶ６感染）による感染であり；
好ましくは、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌及び尖圭コンジロームからなる群から選択される、上記医薬組成物又はワクチン。
【請求項８】
請求項１に記載の突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体を調製する方法であって、該方法は、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体を宿主細胞で発現させ、次に、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体を宿主細胞の培養物から回収することを含み、
好ましくは宿主細胞は大腸菌であり；
好ましくは、該方法は、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体を大腸菌で発現させ、次に、大腸菌の溶解物上清を精製することによって突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体を得て；好ましくは、クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー）によって、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体を大腸菌の溶解物上清から回収することを含む、上記方法。
【請求項９】
請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子を医薬として許容される担体及び／又は賦形剤と組み合わせることを含む、ワクチンを調製する方法。
【請求項１０】
予防的有効量の請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子又は請求項７に記載の医薬組成物若しくはワクチンを対象に投与することを含む、ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防する方法であって、
好ましくは、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ１１感染及び／又はＨＰＶ６感染）による感染であり；
好ましくは、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌及び尖圭コンジロームからなる群から選択される、上記方法。
【請求項１１】
ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するための医薬組成物又はワクチンの製造における、請求項１に記載の突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質若しくはその改変体、又は請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子の使用であって、
好ましくは、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ１１感染及び／又はＨＰＶ６感染）による感染であり；
好ましくは、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌及び尖圭コンジロームからなる群から選択される、上記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子ウイルス学及び免疫学の分野に関する。特に、本発明は、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質（又はその改変体）、それをコードする配列、それを調製する方法、及びそれを含むウイルス様粒子に関し、ここで、タンパク質（又はその改変体）、ウイルス様粒子は、少なくとも２つのＨＰＶタイプ（例えば、ＨＰＶ１１及びＨＰＶ６）に対する中和抗体の生成を誘導することができ、したがって、少なくとも２つのＨＰＶタイプによる感染、及び該感染によって引き起こされる疾患、例えば、子宮頸癌及び尖圭コンジロームを予防するために使用され得る。本発明はさらに、前記少なくとも２つのＨＰＶタイプによる感染、及び前記感染によって引き起こされる疾患、例えば子宮頸癌及び尖圭コンジローマを予防するための医薬組成物又はワクチンの製造におけるタンパク質及びウイルス様粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、主に皮膚及び粘膜にイボを引き起こす。ＨＰＶタイプは、腫瘍形成との関連性に応じて、高リスクタイプと低リスクタイプに分けられる。その中で、高リスクのＨＰＶタイプによる感染は、女性の子宮頸癌を含む生殖器癌の主要な原因であることが実証されている。低リスクのＨＰＶタイプは、主に尖圭コンジロームを引き起こす。ＨＰＶ感染を予防及び制御する最も効果的な方法は、ＨＰＶワクチン、特に子宮頸癌を引き起こす高リスクＨＰＶタイプに対するワクチンをワクチン接種することである。
【０００３】
ＨＰＶの主要キャプシドタンパク質Ｌ１は、中空のウイルス様粒子（ＶＬＰ）への自己組織化の特徴を有する。ＨＰＶ  ＶＬＰは、主要キャプシドタンパク質Ｌ１の７２個の五量体で構成される対称二十面体構造を有する（Ｄｏｏｒｂａｒ、Ｊ．ａｎｄ  Ｐ．Ｈ．Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ、１９８７．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、６１（９）：２７９３−９）。ＨＰＶ  ＶＬＰは、天然のＨＰＶと構造的に非常に類似しており、天然ウイルスの中和エピトープの大部分を保持し、高力価の中和抗体の生成を誘導することができる（Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ、Ｒ．、Ｆ．Ｂｏｏｙら、１９９２  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９（２４）：１２１８０−４）。
【０００４】
しかしながら、既存の研究は、ＨＰＶ  ＶＬＰが、主に同じＨＰＶタイプに対する中和抗体の産生を誘導し、同じＨＰＶタイプに対して保護免疫を生成し、いくつかの高度に相同なＨＰＶタイプ間で低い交差防御効果しか示さないことを示す（Ｓａｒａ  Ｌ  Ｂｉｓｓｅｔｔ、Ｇｉａｄａ  Ｍａｔｔｉｕｚｚｏ、ｅｔ  ａｌ、２０１４  Ｖａｃｃｉｎｅ．３２：６５４８−６５５５）。したがって、既存のＨＰＶワクチンは、保護範囲が非常に限られている。一般に、１つのＨＰＶタイプのＶＬＰは、同じＨＰＶタイプによる感染を防ぐためにのみ使用できる。この場合、ＨＰＶワクチンの保護範囲を広げる必要がある場合、唯一の方法は、より多くのＨＰＶタイプのＶＬＰをワクチンに加えることである。現在、市販されているＨＰＶワクチン（Ｍｅｒｃｋ社のＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）（ＨＰＶ１６、１８、６及び１１に対する４価ワクチン）、ＧＳＫ社のＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）（ＨＰＶ１６及び１８に対する２価ワクチン）、及びＭｅｒｃｋ社のＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）９（９価ワクチン）は、複数のＨＰＶタイプのＶＬＰを組み合わせて調製されている。しかし、このような解決策は、ＨＰＶワクチンの製造コストを大幅に増加させ、免疫化用量の増加による安全性の問題を引き起こす可能性がある。
【０００５】
したがって、複数のＨＰＶタイプの感染、該感染によって引き起こされる疾患、例えば、子宮頸癌及び尖圭コンジロームをより経済的にかつ効果的に予防するために、複数のＨＰＶタイプに対する防御的な中和抗体の生成を誘導することができるＨＰＶウイルス様粒子を開発することが当該技術分野における急務である。
【発明の概要】
【０００６】
発明の内容
本発明は、少なくとも部分的には、本発明者らの驚くべき発見に基づいている：ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１１のＬ１タンパク質の特定のセグメントを第２のＨＰＶタイプ（ＨＰＶ６など）のＬ１タンパク質の対応するセグメントで置換した後、このようにして得られた突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質は、生物におけるＨＰＶ１１及び第２のＨＰＶ型（例えばＨＰＶ６）に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、その保護効果は、ＨＰＶ１１  ＶＬＰ及び第２のＨＰＶタイプのＶＬＰの混合物のものに匹敵し、ＨＰＶ１１に対するその保護効果は、ＨＰＶ１１  ＶＬＰ単独のものに匹敵し、第２のＨＰＶタイプ（ＨＰＶ６など）に対するその保護効果は、第２のＨＰＶタイプ単独のＶＬＰのものに匹敵する。
【０００７】
したがって、一態様では、本発明は、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体を提供し、ここで、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質と比較して、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質は、以下の突然変異を有する：
（１）３〜６アミノ酸、例えば３、４、５又は６アミノ酸のＮ末端切断；及び
（２）（ａ）第２のタイプの野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１７９位のアミノ酸残基の置換；又は
（ｂ）第２のタイプの野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型のＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の３４６〜３５１位のアミノ酸残基の置換；又は
（ｃ）第２のタイプの野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の１１９〜１４０位のアミノ酸残基の置換；
ならびに、改変体は、１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９個）のアミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、付加又は欠失のみによる突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質とは異なるが、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の機能、すなわち少なくとも２つのＨＰＶタイプ（例えば、ＨＰＶ１１及びＨＰＶ６）に対する中和抗体の生成を誘導する能力を保持する。
【０００８】
いくつかの好ましい実施形態では、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質と比較して、Ｎ末端で切断された４、５、６個のアミノ酸を有する。
【０００９】
いくつかの好ましい実施形態では、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質と比較して、Ｎ末端で切断された４個のアミノ酸を有する。
【００１０】
いくつかの好ましい実施形態では、第２のタイプの野生型ＨＰＶはＨＰＶ６である。いくつかの好ましい実施形態では、（２）（ａ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の１６９〜１７８位のアミノ酸残基である。
【００１１】
いくつかの好ましい実施形態では、第２のタイプの野生型ＨＰＶはＨＰＶ６である。いくつかの好ましい実施形態では、（２）（ｂ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の３４５〜３５０位のアミノ酸残基である。
【００１２】
いくつかの好ましい実施形態では、第２のタイプの野生型ＨＰＶはＨＰＶ６である。いくつかの好ましい実施形態では、（２）（ｖ）に記載の対応する位置のアミノ酸残基は、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の１１９〜１３９位のアミノ酸残基である。
【００１３】
いくつかの好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１４】
いくつかの好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質は、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１５】
いくつかの好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の１６９〜１７８位のアミノ酸残基は、配列番号３５に記載の配列を有する。
【００１６】
いくつかの好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の３４５〜３５０位のアミノ酸残基は、配列番号３６に記載の配列を有する。
【００１７】
いくつかの好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の１１９〜１３９位のアミノ酸残基は、配列番号３７に記載の配列を有する。
【００１８】
いくつかの好ましい実施形態では、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質は、配列番号６、７及び９からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、上記のような突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体をコードする単離された核酸を提供する。別の態様では、本発明は、単離された核酸を含むベクターを提供する。いくつかの好ましい実施形態では、本発明による単離された核酸は、配列番号１３、１４及び１６からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。
【００２０】
目的のポリヌクレオチドの挿入に有用なベクターは、当該技術分野において周知であり、例えば、限定されないが、クローニングベクター及び発現ベクターが挙げられる。一実施形態では、ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージなどである。
【００２１】
別の態様では、本発明はさらに、単離された核酸又はベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞としては、限定されないが、原核細胞、例えば、大腸菌、ならびに真核細胞、例えば、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばマウス細胞、ヒト細胞など）が含まれる。本発明に係る宿主細胞は、２９３Ｔ細胞などの細胞株であってもよい。
【００２２】
別の態様では、本発明は、本発明に係る突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体を含むか又はそれからなるＨＰＶウイルス様粒子に関する。
【００２３】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質を含み、該タンパク質は、野生型ＨＰＶ１１  Ｌタンパク質と比較して、３〜６アミノ酸、例えば、３、４、５又は６アミノ酸のＮ末端切断を有し、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の１６９〜１７８位のアミノ酸残基のよる、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１７９位のアミノ酸残基の置換を有する。
【００２４】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質を含み、該タンパク質は、野生型ＨＰＶ１１  Ｌタンパク質と比較して、３〜６アミノ酸、例えば、３、４、５又は６アミノ酸のＮ末端切断を有し、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の３４５〜３５０位のアミノ酸残基のよる、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の３４６〜３５１位のアミノ酸残基の置換を有する。
【００２５】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質を含み、該タンパク質は、野生型ＨＰＶ１１  Ｌタンパク質と比較して、５〜６アミノ酸、例えば、３、４、５又は６アミノ酸のＮ末端切断を有し、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の１１９〜１３９位のアミノ酸残基のよる、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の１１９〜１４０位のアミノ酸残基の置換を有する。
【００２６】
特に好ましい実施形態では、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子は、配列番号６、７又は１９に記載の配列を有する突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質を含む。
【００２７】
別の態様において、本発明はさらに、突然変異ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体、単離された核酸、ベクター、宿主細胞、又はＨＰＶウイルス様粒子を含む組成物に関する。いくつかの好ましい実施形態では、組成物は、本発明に係る突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体を含む。いくつかの好ましい実施形態では、組成物は、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子を含む。
【００２８】
別の態様では、本発明はさらに、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子、及び場合により医薬として許容される担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物又はワクチンに関する。本発明に係る医薬組成物又はワクチンは、ＨＰＶ感染、又はＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患、例えば、子宮頸癌及び尖圭コンジロームを予防するために使用することができる。
【００２９】
いくつかの好ましい実施形態では、ＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するのに有効な量で存在する。いくつかの好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶタイプによる感染（例えば、ＨＰＶ１１感染及び／又はＨＰＶ６感染）である。いくつかの好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌及び尖圭コンジロームからなる群より選択される。
【００３０】
本発明に係る医薬組成物又はワクチンは、当該技術分野で周知の方法、例えば、限定されないが、経口的に又は注射によって投与することができる。本発明において、特に好ましい投与経路は注射である。
【００３１】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明に係る医薬組成物又はワクチンは、単位用量の形態で投与される。例えば、本発明を限定するものではないが、各単位用量は、５μｇ〜８０μｇ、好ましくは２０μｇ〜４０μｇのＨＰＶウイルス様粒子を含有する。
【００３２】
別の態様では、本発明は、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体を宿主細胞で発現させ、次に、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体を宿主細胞の培養物から回収することを含む、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体を調製する方法に関する。
【００３３】
いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。
【００３４】
いくつかの好ましい実施形態では、この方法は、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体を大腸菌で発現させ、次に、大腸菌の溶解物上清を精製することによって突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体を得る工程を含む。いくつかの好ましい実施形態において、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質又はその改変体は、クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー）によって大腸菌の溶解物上清から回収される。
【００３５】
別の態様では、本発明は、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子を医薬として許容される担体及び／又は賦形剤と組み合わせることを含む、ワクチンを調製する方法に関する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、本発明に係るＨＰＶウイルス様粒子又は医薬組成物若しくはワクチンの予防有効量を対象に投与することを含む、ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防する方法に関する。好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶタイプによる感染（例えば、ＨＰＶ１１感染及び／又はＨＰＶ６感染）である。別の好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患には、限定されないが、子宮頸癌及び尖圭コンジロームが含まれる。別の好ましい実施形態では、対象はヒトなどの哺乳動物である。
【００３７】
別の態様では、本発明はさらに、ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するための医薬組成物又はワクチンの製造における、本発明の突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質若しくはその改変体又はＨＰＶウイルス様粒子の使用に関する。好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染は、１つ以上のＨＰＶタイプによる感染（例えば、ＨＰＶ１１感染及び／又はＨＰＶ６感染）である。別の好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患には、限定されないが、子宮頸癌及び尖圭コンジロームが含まれる。
【００３８】
本発明における用語の定義
本発明において、他に特定しない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学及び免疫学の実験室操作は、対応する分野で広く使用されているルーチン操作である。一方、本発明をよりよく理解するために、関連用語の定義及び説明は以下のように提供される。
【００３９】
本発明によれば、「第２のタイプの野生型ＨＰＶ」という用語は、ＨＰＶ１１以外の野生型ＨＰＶタイプを指す。本発明において、第２のタイプの野生型ＨＰＶは、好ましくは野生型ＨＰＶ６である。
【００４０】
本発明によれば、表現「対応する位置」は、配列が最適に整列された場合に比較される配列の等価な位置を指す。すなわち、配列は最も高いパーセンテージの同一性を得るために整列される。
【００４１】
本発明によれば、用語「野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質」は、ヒトパピローマウイルスタイプ１１（ＨＰＶ１１）における天然に存在する主要なキャプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の配列は当該技術分野で周知であり、公的データベース（ＮＣＢＩデータベースのアクセション番号Ｍ１４１１９．１、ＡＦ３３５６０３．１、ＡＦ３３５６０２．など）に見出すことができる。
【００４２】
本発明において、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列が言及される場合、それは配列番号１に記載の配列を参照して記載される。例えば、「野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１７９位のアミノ酸残基」とは、配列番号１に記載のポリペプチドの１７０〜１７９位のアミノ酸残基をいう。しかしながら、当業者は、野生型ＨＰＶ１１は様々な分離株を含み得て、様々な分離株の間でＬ１タンパク質のアミノ酸配列に差異があり得ることを理解する。さらに、当業者は、配列の相違があり得るが、Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、様々なＨＰＶ１１分離株の中で、非常に高い同一性（一般に９５％より高い、例えば９６％より高い、９７％より高い、９８％より高い、又は９９％より高い）を有し、実質的に同じ生物学的機能を有することを理解する。したがって、本発明において、「野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質」という用語には、配列番号１に記載のタンパク質だけでなく、種々のＨＰＶ１１分離株のＬ１タンパク質（ＮＣＢＩデータベースのアクセション番号Ｍ１４１１９．１、ＡＦ３３５６０３．１、ＡＦ３３５６０２．などによってコードされるＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質など）も含まれる。さらに、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、配列番号１の配列断片だけでなく、様々なＨＰＶ１１分離株のＬ１タンパク質の対応する配列断片も含む。例えば、表現「野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１７９位のアミノ酸残基」は、配列番号１の１７０〜１７９位のアミノ酸残基及び種々のＨＰＶ１１分離株のＬ１タンパク質の対応する断片を含む。
【００４３】
本発明によれば、用語「野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質」は、ヒトパピローマウイルス６タイプ（ＨＰＶ６）における天然に存在する主要なキャプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の配列は、当該技術分野で周知であり、公的データベース（例えば、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号ＡＦ０６７０４２．１、ＡＦ０９２９３２．１、Ｌ４１２１６．１、ＸＯＯ２０３．１によってコードされるＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質など）に見出すことできる。
【００４４】
本発明において、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列が言及される場合、それは配列番号２に記載の配列を参照して記載される。例えば、表現「野生型ＨＰＶ６３  Ｌ１タンパク質の１６９〜１７８位のアミノ酸残基」とは、配列番号２に記載のポリペプチドの１６９〜１７８位のアミノ酸残基をいう。しかしながら、当業者は、野生型ＨＰＶ６が、様々な分離株を含み得て、様々な分離株の間でＬ１タンパク質のアミノ酸配列に差異があり得ることを理解する。さらに、当業者は、配列の相違があり得るが、様々なＨＰＶ６分離株の中で、Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は非常に高い同一性（一般に９５％より高い、例えば９６％より高い、９７％より高い、９８％より高い、又は９９％より高い）を有し、実質的に同じ生物学的機能を有することを理解する。したがって、本発明において、用語「野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質」には、配列番号２に記載のタンパク質だけでなく、種々のＨＰＶ６分離株のＬ１タンパク質（ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号ＡＦ０６７０４２．１、ＡＦ０９２９３２．１、Ｌ４１２１６．１、ＸＯＯ２０３．１によってコードされるＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質など）も含まれる。さらに、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、配列番号２の配列断片だけでなく、様々なＨＰＶ６分離株のＬ１タンパク質の対応する配列断片も含む。例えば、表現「野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の１６９〜１７８位のアミノ酸残基」には、配列番号２の１６９〜１７８位のアミノ酸残基及び種々のＨＰＶ６分離株のＬ１タンパク質の対応する断片が含まれる。
【００４５】
本発明によれば、表現「対応する配列断片」又は「対応する断片」は、配列が最適に整列された場合に比較される配列の等価な位置に位置する断片を指す。すなわち、配列は、最大の同一性パーセンテージを得るために整列される。
【００４６】
本発明によれば、表現「Ｘアミノ酸のＮ末端切断」又は「Ｎ末端で切断されたＸアミノ酸を有する」とは、（タンパク質翻訳を開始するための）開始コドンによってコードされるメチオニン残基のよる、タンパク質のＮ末端での１〜Ｘ位のアミノ酸残基の置換を指す。例えば、Ｎ末端で切断された４アミノ酸を有するＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質は、開始コドンによってコードされるメチオニン残基による、野生型ＨＰＶ１  Ｌ１タンパク質のＮ末端での１〜４位のアミノ酸残基の置換を指す。
【００４７】
本発明によれば、「改変体」という用語は、そのアミノ酸配列が１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９個お）アミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、付加又は欠失を有し、又は本発明に係る突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質（例えば、配列番号６、７及び９に記載のタンパク質）と比較して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有し、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の機能を保持しているタンパク質を指す。本発明において、「突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の機能」という用語は、少なくとも２つのＨＰＶタイプ（例えば、ＨＰＶ１１及びＨＰＶ６）に対する中和抗体の生成を誘導する能力を指す。「同一性」という用語は、ヌクレオチド配列間又はアミノ酸配列間の類似性の尺度を指す。一般に、配列は最大マッチングを得るために整列された。「同一性」は、当該技術分野で周知の意味を有し、公開されたアルゴリズム（ＢＬＡＳＴなど）によって計算することができる。
【００４８】
本発明によれば、用語「同一性」は、２つのポリペプチド間又は２つの核酸間の適合度を指す。比較のための２つの配列が、ある部位に塩基又はアミノ酸の同じモノマーサブユニットを有する場合（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれが特定の部位にアデニンを有するか、又は２つのポリペプチドのそれぞれが特定の部位にリジンを有する）、２つの分子はその部位で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、比較のために部位の総数×１００に対して２つの配列によって共有される同一の部位数の関数である。例えば、２つの配列の１０部位のうちの６つが一致する場合、これら２つの配列は６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴ及びＣＡＧＧＴＴは、５０％の同一性を共有する（６つの部位のうち３つが一致する）。一般に、２つの配列の比較は、同一性を最大にするように行われる。このようなアラインメントは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３，１９７０）らの方法に基づくＡｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）などのコンピュータプログラムを用いて行うことができる。２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７（１９８８））のアルゴリズムを用いて決定することもでき、これは、ＰＡＭ１２０加重残基表を使用し、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を用いる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセンテージは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）に組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３（１９７０））のアルゴリズムによって決定することができ、これは、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを使用し、ギャップ加重は１６、１４、１２、１０、８、６又は４であり、長さ加重が１、２、３、４、５又は６である。
【００４９】
本明細書で使用される「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な特性に不都合な影響を与えず、又は変化させないアミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発のような当該技術分野で公知の標準的技術によって導入され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば対応するアミノ酸残基に物理的又は機能的に類似した残基（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、化学的特性、例えば、共有結合又は水素結合等を形成する能力など）で置換さえる置換を含む。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、一般に、保存的置換とは、対応するアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換することをいう。アミノ酸保存的置換を同定するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、参照により本明細書に援用されるＢｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；Ｂｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４１２−４１７（１９９７）を参照されたい）。
【００５０】
本発明によれば、用語「大腸菌発現系」は、大腸菌（株）及びベクターからなる発現系を意味し、ここで、大腸菌は、限定されないが、ＥＲ２５６６、ＢＬ２１、Ｂ８３４（ＤＥ３）、及びＢＬＲ（ＤＥ３）を含む市販の株に由来する。
【００５１】
本発明によれば、「ベクター」という用語は、その中に挿入されたポリヌクレオチドを有することができる核酸担体ツールを指す。ベクターが、そこに挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、ベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、形質転換、形質導入、又は宿主細胞へのトランスフェクションによって、宿主細胞において発現された担持遺伝物質を有することができる。ベクターは、当業者に周知であり、例えば、限定されないが、プラスミド、ファージ、コスミドなどが挙げられる。
【００５２】
本発明によれば、「医薬として許容される担体及び／又は賦形剤」という用語は、対象及び活性成分に薬理学的及び／又は生理学的に適合する担体及び／又は賦形剤を指し、当該技術分野において周知であり（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ，１９ｔｈ  ｅｄ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５参照）、例えば、限定されないが、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、及びイオン強度増強剤が挙げられる。例えば、ｐＨ調節剤としては、限定されないが、リン酸緩衝液；界面活性剤としては、限定されないが、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、又は非イオン界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−８０が含まれ；アジュバントには、限定されないが、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）及びフロイントアジュバント（例えばフロイント完全アジュバント）が含まれ；イオン強度増強剤としては、限定されないが、ＮａＣｌが挙げられる。
【００５３】
本発明によれば、「有効量」という用語は、意図された目的を効果的に達成することができる量を指す。例えば、疾患（ＨＰＶ感染など）を予防するのに有効な量は、疾患（ＨＰＶ感染など）の発生を予防、抑制、又は遅延させるのに有効な量を意味する。そのような有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
【００５４】
本発明によれば、用語「クロマトグラフィー」には、限定されないが、イオン交換クロマトグラフィー（陽イオン交換クロマトグラフィーなど）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、吸収クロマトグラフィー（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなど）、ゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル排除クロマトグラフィー）、及びアフィニティークロマトグラフィーなどが含まれる。
【００５５】
本発明によれば、用語「溶解物上清」は、以下の工程によって生成された溶液を指す：宿主細胞（例えば、大腸菌）を溶解緩衝液中で破壊し、次に、不溶性物質が、破壊された宿主細胞を含む溶解された溶液から除去される。様々な溶解緩衝液が当該技術分野において周知であり、例えば、限定されないが、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液などが挙げられる。さらに、宿主細胞の破壊は、当業者に周知の方法によって達成することができ、例えば、限定されないが、ホモジナイザー破壊、超音波処理、粉砕、高圧押出、リゾチーム処理が挙げられる。当業者には、不溶性物質を除去する方法も周知であり、これに限定されないが、ろ過及び遠心分離が挙げられる。
【００５６】
発明の有益な効果
研究は、ＨＰＶ１１と他のＨＰＶタイプ（ＨＰＶ６など）との間に一定の交差防御があるが、そのような交差防御は非常に低く、一般的に、同ＨＰＶタイプのＶＬＰの保護レベルの１％より低く、さらには１０００分の１、さらには１０００分の１であることを示す。したがって、ＨＰＶ１１ワクチンでワクチン接種された対象は、他のＨＰＶタイプ（ＨＰＶ６など）に感染するリスクがなおも高い。
【００５７】
本発明は、突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質及びそれによって形成されるＨＰＶウイルス様粒子を提供する。本発明によるＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ１１及び他のＨＰＶタイプ（例えば、ＨＰＶ６）に対して有意な交差防御を提供することができる。特に、同じ免疫化用量で、本発明によるＨＰＶウイルス様粒子は、生物中の少なくとも２つのＨＰＶタイプ（例えば、ＨＰＶ１１及びＨＰＶ６）に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、その効果は、複数のＨＰＶタイプのＶＬＰの混合物（例えば、ＨＰＶ１１  ＶＬＰとＨＰＶ６  ＶＬＰの混合物）の効果に匹敵する。したがって、本発明によるＨＰＶウイルス様粒子は、同時に少なくとも２種のＨＰＶタイプ（例えば、ＨＰＶ１１及びＨＰＶ６）による感染、ならびに該感染に関連する疾患を予防するために使用することができ、大幅に有益な技術的効果を有する。これは、ＨＰＶワクチンの保護範囲を拡大し、ＨＰＶワクチンの製造コストを削減するという点で特に重要な利点を有する。
【００５８】
本発明の実施形態は、図面及び実施例を参照してさらに詳細に説明される。しかしながら、当業者であれば、以下の図面及び実施例は、本発明の範囲を規定するのではなく、単に本発明を例示することを意図していることを理解する。以下の図面及び好ましい実施形態の詳細な説明によれば、本発明の様々な目的及び利点は、当業者にとって明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、実施例１における精製された変異変異型タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：ＨＰＶ１１Ｎ４（Ｎ末端で切断された４アミノ酸を有するＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質）；レーン２：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１；レーン３：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２；レーン４：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３；レーン５：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４；レーン６：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ５。結果は、クロマトグラフィー精製後、タンパク質Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５は９５％以上の純度に達したことを示した。
【図２】図２Ａ〜２Ｆは、タンパク質ＨＰＶ１１Ｎ４、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５をそれぞれ含む試料の分子篩クロマトグラフィー分析の結果を示す。図２Ａ：ＨＰＶ１１Ｎ４；図２Ｂ：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１；図２Ｃ：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２；図２Ｄ：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３；図２Ｅ：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４；図２Ｆ：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ５。結果は、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５をそれぞれ含む試料の最初のタンパク質ピークが約１２分で現れ、これはＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰのそれに匹敵していることを示した。これは、これらの全ての突然変異型タンパク質がＶＬＰにアセンブルすることができたことを示した。
【図３】図３Ａ〜３Ｆは、ＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰの沈降速度分析の結果を示す。図３Ａ：ＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ；図３Ｂ：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１  ＶＬＰ；図３Ｃ：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２  ＶＬＰ；図３Ｄ：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ；図３Ｅ：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４  ＶＬＰ；図３Ｆ：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰ。結果は、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰの沈降係数は、それぞれ１４０Ｓ、１３８Ｓ、１１１Ｓ、１３９Ｓ及び１３９Ｓであったことを示した。これは、上記で調製した５つの突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１が、サイズ及び形態に関して野生型ＶＬＰ（ＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ、１３６．３Ｓ）に類似したウイルス様粒子にアセンブルできることを示した。
【図４】図４Ａ〜４Ｆは、様々なＶＬＰサンプルの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）写真（１００，０００倍、バー＝０．１μｍで撮影）を示す。図４Ａ、ＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ；図４Ｂ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１  ＶＬＰ；図４Ｃ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２  ＶＬＰ；図４Ｄ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ；図４Ｅ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４  ＶＬＰ；図４Ｆ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰ。結果は、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５が、ＨＰＶ１１Ｎ４と類似しており、約２５ｎｍの半径を有するＶＬＰにアセンブルし得たことを示した。
【図５】図５Ａ〜５Ｆは、それぞれＨＰＶ１１Ｎ４、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５によって形成される熱安定性評価の結果を示す。図５Ａ、ＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ；図５Ｂ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１  ＶＬＰ；図５Ｃ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２  ＶＬＰ；図５Ｄ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ；図５Ｅ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４  ＶＬＰ；図５Ｆ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰ。結果は、これらのタンパク質によって形成された全てのＶＬＰが非常に高い熱安定性を有することを示した。
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰの低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏＥＭ）写真及び分析された構造を示す；図６Ａ及び図６Ｃは、それぞれＨ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰの低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏＥＭ）写真を示す；図６Ｂ及び図６Ｄは、低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏＥＭ）を用いて分析したＨ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰの３次元構造を示し、それぞれ１７．３８Å及び２０．４８Åの解像度であった。
【図７】図７は、マウスにおける実験グループＨ１１Ｎ４−６Ｔ１、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４とＨ１１Ｎ４−６Ｔ５、及び対照グループＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ、ＨＰＶ６Ｎ５  ＶＬＰと混合ＨＰＶ１１／ＨＰＶ６  ＶＬＰの免疫防御の評価結果を示す。結果は以下を示した：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰのいずれかが、マウスにおけるＨＰＶ１１及びＨＰＶ６に対する高力価中和抗体の生成を誘導し得た；それらのＨＰＶ１１に対する防御効果は、ＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ単独又は混合ＨＰＶ１１／ＨＰＶ６  ＶＬＰのものに匹敵し、ＨＰＶ６Ｎ５  ＶＬＰ単独のものよりも有意に高かった。ＨＰＶ６に対するそれらの防御効果は、ＨＰＶ６Ｎ５  ＶＬＰ単独又は混合ＨＰＶ１１／ＨＰＶ６  ＶＬＰのものに匹敵し、ＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ単独よりも有意に高かった。Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２  ＶＬＰはまた、マウスにおいてＨＰＶ１１及びＨＰＶ６に対する高力価中和抗体の生成を誘導し得るが、ＨＰＶ６に対する中和抗体の生成を誘導するその能力は、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰよりも弱かった。これらの結果は、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰが、ＨＰＶ１１感染及びＨＰＶ６感染を予防するための有効なワクチンとして使用でき、ＨＰＶ１１  ＶＬＰ及びＨＰＶ６  ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できることを示した。
【図８】図８Ａ〜図８Ｃは、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰをそれぞれマウスにワクチン接種した後のマウス血清中の中和抗体力価の評価結果を示す。図８Ａ：アルミニウムアジュバントグループ１（１０μｇの免疫化用量でアルミニウムアジュバントを使用）；図８Ｂ：アルミニウムアジュバントグループ２（１μｇの免疫化用量でアルミニウムアジュバントを使用）；図８Ｃ：アルミニウムアジュバントグループ３（０．１μｇの免疫化用量でアルミニウムアジュバントを使用）。結果は以下を示した：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰのいずれかが、マウスにおけるＨＰＶ１１に対する高力価中和抗体の生成を誘導することができ、それらの保護効果が、同用量でＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ単独のもの又は混合したＨＰＶ１１／ＨＰＶ６  ＶＬＰのものに匹敵し、同用量でＨＰＶ６Ｎ５  ＶＬＰ単独のものよりも有意に優れていた。それらは、マウスにおけるＨＰＶ６に対して高力価の中和抗体の産生を誘導することができ、それらの保護効果が、同用量でＨＰＶ６Ｎ５  ＶＬＰ単独のもの又は混合したＨＰＶ１１／ＨＰＶ６  ＶＬＰのものに匹敵し、同用量でＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ単独のものよりも有意に優れていた。これは、ＨＰＶ１１及びＨＰＶ６に対して、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰとＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰは、良好な交差免疫原性及び交差防御を有することを示した。
【図９】図９は、カニクイザルをＨ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ又はＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰでワクチン接種した後のカニクイザル血清中の中和抗体の評価結果を示す。結果は、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰのいずれかが、カニクイザルにおけるＨＰＶ１１及びＨＰＶ６に対する高力価の中和抗体の生成を誘導し得、それらの保護効果が、混合ＨＰＶ１１／ＨＰＶ６  ＶＬＰのものに匹敵することを示した。これは、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰが、ＨＰＶ１１とＨＰＶ６に対して良好な交差免疫原性及び交差保護を有することを示した。
【００６０】
配列情報
本発明に関与する配列のいくつかを以下の表１に提供する。
【００６１】
【表１】
2019502404.tif 000003
【００６２】
配列１（配列番号１）：
MWRPSDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVKRTNIFYHASSSRLLAVGHPYYSIKKVNKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPLLNKYDDVENSGGYGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGTQCSNTSVQNGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPLDICGTVCKYPDYLQMAADPYGDRLFFYLRKEQMFARHFFNRAGTVGEPVPDDLLVKGGNNRSSVASSIYVHTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNHLFVTVVDTTRSTNMTLCASVSKSATYTNSDYKEYMRHVEEFDLQFIFQLCSITLSAEVMAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKEKQDPYKDMSFWEVNLKEKFSSELDQFPLGRKFLLQSGYRGRTSARTGIKRPAVSKPSTAPKRKRTKTKK
【００６３】
配列２（配列番号２）：
MWRPSDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVTRTNIFYHASSSRLLAVGHPYFSIKRANKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPFLNKYDDVENSGSGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGKQCTNTPVQAGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPIDICGTTCKYPDYLQMAADPYGDRLFFFLRKEQMFARHFFNRAGEVGEPVPDTLIIKGSGNRTSVGSSIYVNTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCASVTTSSTYTNSDYKEYMRHVEEYDLQFIFQLCSITLSAEVMAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKEKPDPYKNLSFWEVNLKEKFSSELDQYPLGRKFLLQSGYRGRSSIRTGVKRPAVSKASAAPKRKRAKTKR
【００６４】
配列３（配列番号３）：
MSDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVKRTNIFYHASSSRLLAVGHPYYSIKKVNKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPLLNKYDDVENSGGYGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGTQCSNTSVQNGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPLDICGTVCKYPDYLQMAADPYGDRLFFYLRKEQMFARHFFNRAGTVGEPVPDDLLVKGGNNRSSVASSIYVHTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNHLFVTVVDTTRSTNMTLCASVSKSATYTNSDYKEYMRHVEEFDLQFIFQLCSITLSAEVMAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKEKQDPYKDMSFWEVNLKEKFSSELDQFPLGRKFLLQSGYRGRTSARTGIKRPAVSKPSTAPKRKRTKTKK
【００６５】
配列４（配列番号４）：
MDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVTRTNIFYHASSSRLLAVGHPYFSIKRANKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPFLNKYDDVENSGSGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGKQCTNTPVQAGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPIDICGTTCKYPDYLQMAADPYGDRLFFFLRKEQMFARHFFNRAGEVGEPVPDTLIIKGSGNRTSVGSSIYVNTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNQLFVTVVDTTRSTNMTLCASVTTSSTYTNSDYKEYMRHVEEYDLQFIFQLCSITLSAEVVAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKQKPDPYKNLSFWEVNLKEKFSSELDQYPLGRKFLLQSGYRGRSSIRTGVKRPAVSKASAAPKRKRAKTKR
【００６６】
配列５（配列番号５）：
MSDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVKRTNIFYHASSSRLLAVGHPYFSIKRANKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPLLNKYDDVENSGGYGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGTQCSNTSVQNGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPLDICGTVCKYPDYLQMAADPYGDRLFFYLRKEQMFARHFFNRAGTVGEPVPDDLLVKGGNNRSSVASSIYVHTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNHLFVTVVDTTRSTNMTLCASVSKSATYTNSDYKEYMRHVEEFDLQFIFQLCSITLSAEVMAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKEKQDPYKDMSFWEVNLKEKFSSELDQFPLGRKFLLQSGYRGRTSARTGIKRPAVSKPSTAPKRKRTKTKK
【００６７】
配列６（配列番号６）：
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【００６８】
配列７（配列番号７）：
Sequence 7 (SEQ ID NO: 7): 
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【００６９】
配列８（配列番号８）：
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【００７０】
配列９（配列番号９）：
MSDSTVYVPPPNPVSKVVATDAYVKRTNIFYHASSSRLLAVGHPYYSIKKVNKTVVPKVSGYQYRVFKVVLPDPNKFALPDSSLFDPTTQRLVWACTGLEVGRGQPLGVGVSGHPLLNKYDDVENSGGYGGNPGQDNRVNVGMDYKQTQLCMVGCAPPLGEHWGKGTQCSNTSVQNGDCPPLELITSVIQDGDMVDTGFGAMNFADLQTNKSDVPLDICGTVCKYPDYLQMAADPYGDRLFFYLRKEQMFARHFFNRAGTVGEPVPDDLLVKGGNNRSSVASSIYVHTPSGSLVSSEAQLFNKPYWLQKAQGHNNGICWGNHLFVTVVDTTRSTNMTLCASVTTSSTYTNSDYKEYMRHVEEFDLQFIFQLCSITLSAEVMAYIHTMNPSVLEDWNFGLSPPPNGTLEDTYRYVQSQAITCQKPTPEKEKQDPYKDMSFWEVNLKEKFSSELDQFPLGRKFLLQSGYRGRTSARTGIKRPAVSKPSTAPKRKRTKTKK
【００７１】
配列１０（配列番号１０）：
ATGAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCACGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCTCTGTTTGACCCCACTACACAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCGTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCAGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAATAGGTCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGATCCTTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATATATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCCGAAAAAGAAAAACAGGACCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCTTCTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAAGCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA
【００７２】
配列１１（配列番号１１）：
ATGGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCTAACCCTGTATCCAAAGTTGTTGCCACGGATGCTTATGTTACTCGCACCAACATATTTTATCATGCCAGCAGTTCTAGACTTCTTGCAGTGGGTCATCCTTATTTTTCCATAAAACGGGCTAACAAAACTGTTGTGCCAAAGGTGTCAGGATATCAATACAGGGTATTTAAGGTGGTGTTACCAGATCCTAACAAATTTGCATTGCCTGACTCGTCTCTTTTTGATCCCACAACACAACGTTTGGTATGGGCATGCACAGGCCTAGAGGTGGGCAGGGGACAGCCATTAGGTGTGGGTGTAAGTGGACATCCTTTCCTAAATAAATATGATGATGTTGAAAATTCAGGGAGTGGTGGTAACCCTGGACAGGATAACAGGGTTAATGTTGGTATGGATTATAAACAAACACAATTATGCATGGTTGGATGTGCCCCCCCTTTGGGCGAGCATTGGGGTAAAGGTAAACAGTGTACTAATACACCTGTACAGGCTGGTGACTGCCCGCCCTTAGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGCGATATGGTTGACACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCTGATTTGCAGACCAATAAATCAGATGTTCCTATTGATATATGTGGCACTACATGTAAATATCCAGATTATTTACAAATGGCTGCAGACCCTTATGGTGATAGATTATTTTTTTTTCTACGGAAGGAACAAATGTTTGCCAGACATTTTTTTAACAGGGCTGGCGAGGTGGGGGAACCTGTGCCTGATACTCTTATAATTAAGGGTAGTGGAAATCGAACGTCTGTAGGGAGTAGTATATATGTTAACACCCCAAGCGGCTCTTTGGTGTCCTCTGAGGCACAATTGTTTAATAAGCCATATTGGCTACAAAAAGCCCAGGGACATAACAATGGTATTTGTTGGGGTAATCAACTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACCAACATGACATTATGTGCATCCGTAACTACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAAGAGTACATGCGTCATGTGGAAGAGTATGATTTACAATTTATTTTTCAATTATGTAGCATTACATTGTCTGCTGAAGTAGTGGCCTATATTCACACAATGAATCCCTCTGTTTTGGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACATTAGAAGATACCTATAGGTATGTGCAGTCACAGGCCATTACCTGTCAAAAGCCCACTCCTGAAAAGCAAAAGCCAGATCCCTATAAGAACCTTAGTTTTTGGGAGGTTAATTTAAAAGAAAAGTTTTCTAGTGAATTGGATCAGTATCCTTTGGGACGCAAGTTTTTGTTACAAAGTGGATATAGGGGACGGTCCTCTATTCGTACCGGTGTTAAGCGCCCTGCTGTTTCCAAAGCCTCTGCTGCCCCTAAACGTAAGCGCGCCAAAACTAAAAGGTAA
【００７３】
配列１２（配列番号１２）：
ATGAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCACGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTTTTCCATAAAACGGGCTAACAAAACTGTTGTGCCAAAGGTGTCAGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCTCTGTTTGACCCCACTACACAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCGTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCAGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAATAGGTCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGATCCTTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATATATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCCGAAAAAGAAAAACAGGACCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCTTCTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAAGCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA
【００７４】
配列１３（配列番号１３）：
ATGAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCACGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCTCTGTTTGACCCCACTACACAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGACAGCCATTAGGTGTGGGTGTAAGTGGACATCCTTTCCTAAATAAATATGATGATGTTGAAAATTCAGGGAGTGGTGGTAACCCTGGACAGGATAACAGGGTTAATGTTGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCGTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCAGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAATAGGTCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGATCCTTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATATATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCCGAAAAAGAAAAACAGGACCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCTTCTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAAGCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA
【００７５】
配列１４（配列番号１４）：
ATGAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCACGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCTCTGTTTGACCCCACTACACAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAAGGTAAACAGTGTACTAATACACCTGTACAGGCTGGTGACTGCCCGCCCTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCAGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAATAGGTCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGATCCTTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATATATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCCGAAAAAGAAAAACAGGACCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCTTCTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAAGCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA
【００７６】
配列１５（配列番号１５）：
ATGAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCACGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCTCTGTTTGACCCCACTACACAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCGTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCAGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAACAGGGCTGGCGAGGTGGGGGAACCTGTGCCTGATACTCTTATAATTAAGGGTAGTGGAAATCGAACGTCTGTAGGGAGTAGTATATATGTACATACACCTAGTGGATCCTTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTGTCTAAATCTGCTACATACACTAATTCAGATTATAAGGAATATATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCCGAAAAAGAAAAACAGGACCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCTTCTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAAGCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA
【００７７】
配列１６（配列番号１６）：
ATGAGCGACAGCACAGTATATGTGCCTCCTCCCAACCCTGTATCCAAGGTTGTTGCCACGGATGCGTATGTTAAACGCACCAACATATTTTATCACGCCAGCAGTTCTAGACTCCTTGCTGTGGGACATCCATATTACTCTATCAAAAAAGTTAACAAAACAGTTGTACCAAAGGTGTCTGGATATCAATATAGAGTGTTTAAGGTAGTGTTGCCAGATCCTAACAAGTTTGCATTACCTGATTCATCTCTGTTTGACCCCACTACACAGCGTTTAGTATGGGCGTGCACAGGGTTGGAGGTAGGCAGGGGTCAACCTTTAGGCGTTGGTGTTAGTGGGCATCCATTGCTAAACAAATATGATGATGTAGAAAATAGTGGTGGGTATGGTGGTAATCCTGGTCAGGATAATAGGGTTAATGTAGGTATGGATTATAAACAAACCCAGCTATGTATGGTGGGCTGTGCTCCACCGTTAGGTGAACATTGGGGTAAGGGTACACAATGTTCAAATACCTCTGTACAAAATGGTGACTGCCCCCCGTTGGAACTTATTACCAGTGTTATACAGGATGGGGACATGGTTGATACAGGCTTTGGTGCTATGAATTTTGCAGACTTACAAACCAATAAATCGGATGTTCCCCTTGATATTTGTGGAACTGTCTGCAAATATCCTGATTATTTGCAAATGGCAGCAGACCCTTATGGTGATAGGTTGTTTTTTTATTTGCGAAAGGAACAAATGTTTGCTAGACACTTTTTTAATAGGGCCGGTACTGTGGGGGAACCTGTGCCTGATGACCTGTTGGTAAAAGGGGGTAATAATAGGTCATCTGTAGCTAGTAGTATTTATGTACATACACCTAGTGGATCCTTGGTGTCTTCAGAGGCTCAATTATTTAATAAACCATATTGGCTTCAAAAGGCTCAGGGACATAACAATGGTATTTGCTGGGGAAACCACTTGTTTGTTACTGTGGTAGATACCACACGCAGTACAAATATGACACTATGTGCATCTGTAACTACATCTTCCACATACACCAATTCTGATTATAAGGAATATATGCGCCATGTGGAGGAGTTTGATTTACAGTTTATTTTTCAATTGTGTAGCATTACATTATCTGCAGAAGTCATGGCCTATATACACACAATGAATCCTTCTGTTTTGGAGGACTGGAACTTTGGTTTATCGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATACTTATAGATATGTACAGTCACAGGCCATTACCTGTCAGAAACCCACACCCGAAAAAGAAAAACAGGACCCCTATAAGGATATGAGTTTTTGGGAGGTTAACTTAAAAGAAAAGTTTTCTTCTGAATTAGATCAGTTTCCCCTTGGACGTAAGTTTTTATTGCAAAGTGGATATCGAGGACGGACGTCTGCTCGTACAGGTATAAAGCGCCCAGCTGTGTCTAAGCCCTCTACAGCCCCCAAACGAAAACGTACCAAAACCAAAAAGTAA
【００７８】
配列３５（配列番号３５）：
KQCTNTPVQA
【００７９】
配列３６（配列番号３６）：
TTSSTY
【００８０】
配列３７（配列番号３７）：
FLNKYDDVENSGSGGNPGQDN
【００８１】
本発明を実施するための具体的な形態
本発明は、以下の実施例を参照してさらに説明されるが、これらの実施例は、本発明を限定するのではなく、本発明を説明する目的でのみ使用される。
【００８２】
他に示されない限り、本発明において使用される分子生物学的実験方法及び免疫学的アッセイは、実質的にSambrook J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 及びF. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995に記載される方法に従って実施される。制限酵素は、製造業者によって推奨される条件下で使用される。当業者であれば、これらの実施例は本発明を説明するために用いられているが、本発明の保護範囲を限定するものではないことを理解する。
【００８３】
実施例１．突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の発現及び精製
発現ベクターの構築
ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質由来の特定のセグメントを含む突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質（Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１）をコードする発現ベクターは、マルチサイト突然変異誘発のためのＰＣＲによって構築した。使用した初期鋳型は、プラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ１１Ｎ４Ｃ（Ｎ末端で切断された４アミノ酸を有するＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質をコードする；表２に１１Ｌ１Ｎ４と略記する）であった。各ＰＣＲの鋳型及びプライマーを表２に示し、ＰＣＲの増幅条件を以下のようにした：９４℃で１０分間の変性；２５サイクル（９４℃で５０秒間の変性、一定温度で一定時間のアニーリング、７２℃で７．５分間の伸長）；最後に７２℃で１０分間伸長する。使用したＰＣＲプライマーの配列を表３に列挙した。
【００８４】
増幅産物（５０μＬ）に２μＬの制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩを添加し、得られた混合物を３７℃で６０分間インキュベートした。消化産物１０μＬを用いて、塩化カルシウム法により調製したコンピテント大腸菌ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入）４０μＬを形質転換した。形質転換された大腸菌は、カナマイシンを含む固体ＬＢ培地（ＬＢ培地の成分：ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉末５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １０ｇ／Ｌ、以下同様）（最終濃度２５ｍｇ／ｍＬ、以下同様）に播種され、３７℃で１０〜１２時間静置培養し、単一のコロニーがはっきりと観察できるようにした。単一コロニーを採取し、４ｍＬ液体ＬＢ培地（カナマイシン含有）を含むチューブに接種し、３７℃で２２０ｒｐｍで１０時間、振とう培養した後、１ｍｌの細菌溶液を採取し、−７０℃で保存した。大腸菌からプラスミドを抽出し、Ｔ７プライマーを用いて、プラスミドに挿入された目的の断片のヌクレオチド配列を配列決定した。配列決定の結果は、構築されたプラスミド（発現ベクター）に挿入された目的の断片のヌクレオチド配列が配列番号１２であり、そのコードされたアミノ酸配列が配列番号５である（対応するタンパク質をＨ１１Ｎ４−６Ｔ１と記す）ことを示した。突然変異型タンパク質Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１は、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の４９〜６３位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の４９〜６３位のアミノ酸残基による置換によって、ＨＰＶ１１Ｎ４と異なる。
【００８５】
Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ（Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 2009;6:343-5. doi: 10.1038/nmeth.1318）を使用して、他の突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質をコードする発現ベクターを構築した。この突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質は、ＨＰＶ６  Ｌ１由来の特定のセグメントを含んでいた。要するに、突然変異を含む短い断片及び突然変異を含まない長い断片がＰＣＲによって得られ、次に、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ系を用いて２つの断片を連結して環を形成させた。使用した初期鋳型は、プラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ１１Ｎ４Ｃ、及びプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ６Ｎ５Ｃ（Ｎ末端で切断された５アミノ酸を有するＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質をコードする；表２では６Ｌ１Ｎ５と略記される）を含んでいた。各ＰＣＲの鋳型及びプライマーを表２に示し、短い断片を増幅するためのＰＣＲの増幅条件は以下の通りである：９４℃で１０分間の変性；２５サイクル（９４℃で５０秒間の変性、一定温度で一定時間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長）；最後に７２℃で１０分間伸長する。長い断片を増幅するためのＰＣＲの増幅条件は以下の通りである：９４℃で１０分間の変性；  ２５サイクル（９４℃で５０秒間の変性、一定温度で一定時間のアニーリング、７２℃で７．５分間の伸長）；最後に７２℃で１０分間伸長する。使用したＰＣＲプライマーの配列を表３に示す。増幅産物を電気泳動に供し、次に、ＤＮＡ抽出キットを用いて目的の断片を回収し、その濃度を決定した。増幅により得られた短い断片と長い断片を２：１のモル比（総体積３μＬ）で混合し、次に、３μＬの２×Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢから購入、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、  Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼを含有する）を添加し、５０℃で１時間反応させた。
【００８６】
アセンブルされた生成物（６μＬ）を用いて、塩化カルシウム法により調製したコンピテント大腸菌ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入）４０μＬを形質転換した。形質転換された大腸菌は、カナマイシンを含む固体ＬＢ培地上に播種され、単一のコロニーがはっきりと観察されるまで、３７℃で１０〜１２時間静置培養された。単一コロニーを採取し、液体ＬＢ培地（カナマイシン含有）４ｍＬを含むチューブに接種し、３７℃で２２０ｒｐｍで１０時間、振とう培養した後、１ｍｌの細菌溶液を採取し、−７０℃で保存した。大腸菌からプラスミドを抽出し、Ｔ７プライマーを用いて、プラスミドに挿入された目的の断片のヌクレオチド配列を配列決定した。配列決定の結果は、構築されたプラスミド（発現ベクター）に挿入された目的の断片のヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１３、１４、１５、及び１６であり、それらのコードされたアミノ酸配列はそれぞれ配列番号６、７、８、及び９であったことを示した（対応するタンパク質はそれぞれ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４、及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５と命名された）。
【００８７】
突然変異型タンパク質Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２は、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の１１９〜１４０位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の１１９〜１３９位のアミノ酸残基による置換によってＨＰＶ１１Ｎ４と異なる。突然変異型タンパク質Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３は、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の１７０〜１７９位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の１６９〜１７８位のアミノ酸残基による置換によってＨＰＶ１１Ｎ４と異なる。突然変異型タンパク質Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ６は、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の２５７〜２８８位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の２５７〜２８８位のアミノ酸残基による置換によってＨＰＶ１１Ｎ４と異なる。突然変異型タンパク質Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ５は、野生型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質の３４６〜３５１位のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ６  Ｌ１タンパク質の３４５〜３５０位のアミノ酸残基による置換によってＨＰＶ１１Ｎ４と異なる。
【００８８】
【表２】
2019502404.tif 000004
【００８９】
【表３】
2019502404.tif 000005
【００９０】
ラージスケールでの突然変異型タンパク質の発現
組換えプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３、ｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４、及びｐＴＯ−Ｔ７−Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ５をそれぞれ含む大腸菌を−７０℃の冷蔵庫から取り出し、カナマイシンを含有する１００ｍＬのＬＢ液体培地に播種し、２００ｒｐｍ及び３７℃で約８時間インキュベートした。次に、培養物をカナマイシンを含む５００ｍＬのＬＢ培地に移し（１ｍｌの細菌溶液を移した）、さらにインキュベートした。細菌の濃度が約０．６のＯＤ600に達したとき、培養温度を２５℃に下げ、各培養ボトルに５００μＬのＩＰＴＧを添加した。インキュベーションをさらに８時間行った。インキュベーションが終了した後、細菌を遠心分離によって回収した。Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５タンパク質を発現する細菌をそれぞれ得た。
【００９１】
突然変異型タンパク質を発現する細菌の破砕
得られた細菌は、１ｇの細菌１ｇ／１０ｍＬの溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．２、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）の比で再懸濁された。細菌は、超音波装置を用いて３０分間破砕された。破砕された細菌を含む溶解溶液を１３５００ｒｐｍ（３００００ｇ）で１５分間遠心分離し、上清（すなわち、破砕された細菌の上清）を得た。
【００９２】
突然変異型タンパク質のクロマトグラフィー精製
装置：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（すなわち、元のＡｍｅｒｓｈａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｃｏ．）によって製造されたＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００分取液体クロマトグラフィーシステム
クロマトグラフィー媒体：ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏ．）、ＣＨＴ−ＩＩ（Ｂｉｏ−ＲＡＤから購入）及びＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏ．）
緩衝液：２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＤＴＴ；２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＤＴＴ、２Ｍ  ＮａＣｌ
試料：上記で得られたそれぞれＨ１１Ｎ４−６Ｔ１、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５を含む破砕された細菌の上清。
【００９３】
溶出プロトコール：
（１）ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗによる破砕した細菌の上清の陽イオン交換精製：試料をカラムに装填し、次に、４００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液で不要なタンパク質を溶出し、続いて、８００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液で目的のタンパク質を溶出した。８００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液で溶出された画分を回収した；
（２）ＣＨＴ−ＩＩ（ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー）による、工程（１）で得られた溶出画分のクロマトグラフィーによる精製：工程（１）で得られた溶出画分は、ＮａＣｌ濃度が０．５Ｍになるように希釈されるように希釈され；試料をカラムに装填し、５００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で溶出した後、１０００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で目的のタンパク質を溶出し、１０００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で溶出した画分を回収した；
（３）ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）による、工程（２）で得られた溶出画分の精製：試料をカラムに装填し、次に、不要なタンパク質を１０００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液で溶出した後、２００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で目的のタンパク質を溶出し、２００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液で溶出された画分を回収した。
【００９４】
（３）で得られた１５０μＬの溶出画分を３０μＬの６×泳動緩衝液に加えた。得られた溶液を均一に混合し、８０℃の水浴中で１０分間インキュベートした。次に、得られた試料の１０μｌを１２０Ｖで１２０分間、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、電気泳動バンドをクーマシーブリリアントブルーで染色した。電気泳動結果を図１に示した。結果は、前記精製工程後、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５タンパク質が９５％以上の純度を有することを示した。
【００９５】
同様の方法により、大腸菌及びプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ１１Ｎ４Ｃを用いてＨＰＶ１１Ｎ４タンパク質を調製し、精製した。大腸菌及びプラスミドｐＴＯ−Ｔ７−ＨＰＶ６Ｎ５Ｃを用いてＨＰＶ６Ｎ５タンパク質を調製し、精製した。
【００９６】
実施例２：ＨＰＶウイルス様粒子のアセンブリと粒子の形態学的試験
ＨＰＢウイルス様粒子のアセンブリ
所定体積（約２ｍｌ）のタンパク質Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４又はＨ１１Ｎ４−６Ｔ５は、（１）２Ｌ保存緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）；（２）２Ｌ再生緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０、２ｍＭ  ＣａＣｌ2、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）；及び（３）２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌに対して連続的に透析した。透析は３つの緩衝液のそれぞれで１２時間行った。
【００９７】
同様の方法により、ＨＰＶ１１Ｎ４及びＨＰＶ６Ｎ５タンパク質を、ＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ及びＨＰＶ６Ｎ５  ＶＬＰにそれぞれアセンブルした。
【００９８】
モレキュラーシーブクロマトグラフィー分析
透析した試料を、１１２０コンパクトＬＣ高速液体クロマトグラフィーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によるモレキュラーシーブクロマトグラフィー分析に供し、分析カラムは、ＴＳＫ  Ｇｅｌ  ＰＷ５０００ｘｌ  ７．８ｘ３００ｍｍであった。分析結果を図２Ａ〜２Ｆに示した。結果は、タンパク質Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５をそれぞれ含む試料の最初のタンパク質ピークは約１２分で現れたことを、これはＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰのそれに匹敵することを示した。これは、上記で調製したタンパク質がＶＬＰにアセンブルすることができたことを示した。
【００９９】
沈降速度分析
沈降速度分析のための装置は、光学検査システム及びＡｎ−５０Ｔｉ及びＡｎ−６０Ｔｉローターを備えたＢｅｃｋｍａｎ  ＸＬ−Ａ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅであった。ＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰの沈降係数を沈降速度法により分析した。結果を図３Ａ〜３Ｆに示した。結果は、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰの沈降係数はそれぞれ１４０Ｓ、１３８Ｓ、１１１Ｓ、１３９Ｓ及び１３９Ｓであることを示した。これは、５つの突然変異型ＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質が、サイズ及び形態に関して野生型ＶＬＰ（ＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ、１３６．３Ｓ）に類似したウイルス様粒子にアセンブルすることができることを示した。
【０１００】
ウイルス様粒子の形態学的試験
ＶＬＰを含む試料１００μＬを透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で観察した。使用した装置は、ＪＥＯＬ  Ｌｔｄ．によって供給された１００ｋＶ透過電子顕微鏡（倍率１００，０００倍）であった。要するに、１３．５μＬの試料を２％リンタングステン酸（ｐＨ７．０）で陰性に染色し、炭素被覆した銅グリッドに固定し、次いでＴＥＭで観察した。結果を図４Ａ〜４Ｆに示した。結果は、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５がウイルス様粒子にアセンブルし得ることを示した。さらに、これらの結果はまた、これらの突然変異型タンパク質によってアセンブルした粒子が約２５ｎｍの半径を有し、サイズが均一であることを示した。これは、これらの突然変異型タンパク質がＨＰＶ１１  Ｌ１タンパク質（ＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ）に類似しており、均一なサイズのＶＬＰにアセンブルすることができたことを示した。
【０１０１】
実施例３：ウイルス様粒子の熱安定性の評価
ＨＰＶ１１Ｎ４、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５により形成されたＶＬＰは、ＧＥ  Ｃｏｍｐａｎｙ（すなわち、もともとはＭｉｃｒｏＣａｌ  Ｃｏ．）から購入した示差走査熱量計ＶＰキャピラリーＤＳＣを用いてそれらの熱安定性について評価した。タンパク質の保存緩衝液を対照として使用し、タンパク質を１０℃〜９０℃の温度範囲内で１．５℃／分の加熱速度で走査した。検出結果を図５Ａ〜５Ｆに示した。結果は、タンパク質によって形成されたこれらのＶＬＰのすべてが非常に高い熱安定性を有することを示した。
【０１０２】
実施例４：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰの３次元構造の再構築
以前に報告された方法（Wolf M, Garcea RL, Grigorieff N. et al. Proc Natl Acad Sci U S A. (2010), 107(14): 6298-303）に従って、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰの３次元構造は、低温電子顕微鏡法（ｃｒｙｏＥＭ）を用いて再構築された。簡単に述べると、低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏＥＭ）を用いて、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰを観察し、次に、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰの低温電子顕微鏡（ｃｒｙｏＥＭ）写真（図６Ａ及び６Ｃ）では、コンピュータの重なり及び構造の再構成のために、均一なサイズ及び５０ｎｍより大きい直径を有する、それぞれ３００個の粒子及び３６０個の粒子を選択し、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰの三次元構造を得た。得られた三次元構造を図６Ｂ及び６Ｄ（それぞれ１７．３８Å及び２０．４８Åの解像度にて）に示した。結果は、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰの両方が、７２個のキャプソマー（形態学的サブユニット、ペンタマー）からなるＴ＝７の二十面体構造（ｈ＝１、ｋ＝２）を有することを示した。準同値原理に一致する従来の二十面体ウイルスキャプシドとは異なり、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰの構造における構成的サブユニットはすべて、六量体を含まず、五量体であった。さらに、前記ＶＬＰは、約６０ｎｍの外径を有していた。これらは、以前報告された天然のＨＰＶウイルス粒子及び真核生物発現系によって調製されたＨＰＶ  ＶＬＰ（例えば、ポックスウイルス発現系）の三次元構造と同様であった（Baker TS, Newcomb WW, Olson NH. et al. Biophys J. (1991), 60(6): 1445-1456. Hagensee ME, Olson NH, Baker TS, et al. J Virol. (1994), 68(7):4503-4505. Buck CB, Cheng N, Thompson CD. et al. J Virol. (2008), 82(11): 5190-7）。
【０１０３】
実施例５：動物におけるウイルス様粒子の免疫防御の評価
Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５によって形成されたＶＬＰの免疫防御をマウスで評価した。ワクチン接種のための動物は、５〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（正常な等級）（Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＳＬＡＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．ＬＴＤから購入）であった。
【０１０４】
上記で調製したＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ、ＨＰＶ６Ｎ５  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰ、及び混合したＨＰＶ１１／ＨＰＶ６  ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰとＨＰＶ６Ｎ  ＶＬＰの混合物）をそれぞれアルミニウムアジュバントに吸収させた。免疫原に応じてマウスを８群に分け、各群に４匹のマウスを含めた。ワクチン接種手順は以下の通りであった：第０週の最初のワクチン接種、ならびにそれぞれ第２週及び第４週のブースターワクチン接種。マウスに皮下注射によりワクチン接種した。使用した免疫原及びその用量を表４に示した。最初のワクチン接種後の８週目に、眼球から静脈血を採取し、血清を分離した。血清中の中和抗体の力価を測定した。検出結果を図７に示した。結果は、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰのいずれかが、マウスにおけるＨＰＶ１１及びＨＰＶ６に対する高力価中和抗体の生成を誘導し得ることを示した。ＨＰＶ１１に対するそれらの防御効果は、ＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ単独又は混合したＨＰＶ１１／ＨＰＶ６  ＶＬＰのものと同等であり、ＨＰＶ６Ｎ５  ＶＬＰ単独のものよりも有意に高かった。ＨＰＶ６に対するそれらの防御効果は、ＨＰＶ６Ｎ５  ＶＬＰ単独又は混合したＨＰＶ１１／ＨＰＶ６  ＶＬＰのものに匹敵し、ＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ単独よりも有意に高かった。Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２  ＶＬＰは、マウスにおいてＨＰＶ１１及びＨＰＶ６に対する高力価の中和抗体の生成を誘導することができたが、ＨＰＶ６に対する中和抗体の生成を誘導するその能力は、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰよりも弱かった。これらの結果は、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰが、ＨＰＶ１１感染及びＨＰＶ６感染を予防するための有効なワクチンとして使用でき、ＨＰＶ１１  ＶＬＰ及びＨＰＶ６  ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できることを示した。
【０１０５】
【表４】
2019502404.tif 000006
【０１０６】
実施例６：ＶＬＰでワクチン接種したマウスの血清中の中和抗体力価の評価
この実験において、ワクチン接種スケジュールを表５に示した。全てのマウス（６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌性マウス）を３群に分けた：アルミニウムアジュバントグループ１（１０μｇの免疫化用量で、アルミニウムアジュバントを使用する）、アルミニウムアジュバントグループ２（１μｇの免疫化用量で、アルミニウムアジュバントを使用する）、アルミニウムアジュバントグループ３（０．１μｇの免疫化用量で、アルミニウムアジュバントを使用する）。各グループをさらに５つのサブグループに分けた。対照サブグループ１〜３は、それぞれＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ単独、ＨＰＶ６Ｎ５  ＶＬＰ単独、及び混合したＨＰＶ１１／ＨＰＶ６  ＶＬＰでワクチン接種され、実験サブグループ１〜２は、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰでそれぞれワクチン接種された。
【０１０７】
６匹のマウス／サブグループに、それぞれ１０μｇ、１μｇ、０．１μｇの免疫化用量及び１ｍｌの注射容量で、腹腔内注射によりワクチン接種した。すべてのマウスを０週目に最初のワクチン接種に付し、次いで２週目及び４週目に追加免疫ワクチン接種を行った。８週目に、眼窩出血により血液サンプルを採取し、血清中のＨＰＶ１１及びＨＰＶ６に対する抗体の力価を分析した。その分析結果を図８Ａ〜８Ｃに示した。結果は以下を示した：Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５が、マウスにおけるＨＰＶ１１に対する高力価中和抗体の生成を誘導し得、それらの保護効果が、同じ用量でＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ単独又は混合したＨＰＶ１１／ＨＰＶ６  ＶＬＰのものに匹敵し、同じ用量でＨＰＶ６Ｎ５  ＶＬＰ単独のものより有意に優れていた。マウスのＨＰＶ６に対する高力価の中和抗体の生成を誘導することができ、それらの保護効果は同じ用量のＨＰＶ６Ｎ５  ＶＬＰ単独又は混合したＨＰＶ１１／ＨＰＶ６  ＶＬＰのものに匹敵し、同じ用量のＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ単独よりも有意に優れていた。これは、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰが、ＨＰＶ１１及びＨＰＶ６に対する良好な交差免疫原性及び交差防御を有することを示した。
【０１０８】
【表５】
2019502404.tif 000007
【０１０９】
実施例７：セロコンバージョンを誘導するためのＶＬＰのＥＣ50の評価
６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌性マウス（８匹のマウス）に単回腹腔内注射によりアルミニウムアジュバントを接種した。実験群にＨ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ又はＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰ（０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ又は０．０１１μｇの免疫化用量で）を用いた。対照群にＨＰＶ６Ｎ５  ＶＬＰ単独又はＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ単独（０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ又は０．０１１μｇの免疫化用量で）、又は混合したＨＰＶ１１／ＨＰＶ６  ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ６Ｎ５  ＶＬＰとＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰの混合物）、各ＶＬＰについて免疫化用量は０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ又は０．０１１μｇであった）を用いた。免疫容量は１ｍＬであった。さらに、ワクチンを希釈するための希釈剤をブランク対照として使用した。８匹のマススを各グループにおいてワクチン接種し、ワクチン接種から５週後に血清を回収した。その後、血清の中和抗体力価を中和化試験によって、及びＲｅｅｄ−Ｍｕｅｎｃｈ法（Reed LJ MH. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am J Hyg. 1938; 27:493-7）によって決定し、セロコンバージョンを誘導する（すなわち、マウスにおける抗体の生成を誘導する）ためのＥＤ50を各試料について計算した。結果を表６．１〜６．５に示す。
【０１１０】
【表６】
2019502404.tif 000008
【０１１１】
【表７】
2019502404.tif 000009
【０１１２】
【表８】
2019502404.tif 000010
【０１１３】
【表９】
2019502404.tif 000011
【０１１４】
【表１０】
2019502404.tif 000012
【０１１５】
結果は以下を示した：マウスにおけるＨＰＶ６に対する抗体の産生を誘導するためのＨ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰのＥＤ50は、ＨＰＶ６Ｎ５  ＶＬＰ単独のもの及び混合したＨＰＶ１１／ＨＰＶ６  ＶＬＰのものに匹敵し、ＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ単独のものよりも有意に優れていた；マウスにおけるＨＰＶ１１に対する抗体の酸性を誘導するためのＨ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰのＥＤ50は、ＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ単独のもの及び混合したＨＰＶ１１／ＨＰＶ６  ＶＬＰのものに匹敵し、ＨＰＶ６Ｎ５  ＶＬＰ単独のものより有意に優れていた。これはさらに、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰが、ＨＰＶ６及びＨＰＶ１１に対する良好な交差免疫原性及び交差防御を有することを示した。
【０１１６】
実施例８：カニクイザルにおけるＨ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰの免疫防御の評価
同体重のカニクイザル１８匹を無作為に３グループ（各グループあたり６匹のサル）に分け、グループ１のサルに５μｇのＨ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰをワクチン接種した。グループ２のサルに、５μｇのＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰをワクチン接種した；グループ３のサルに１０μｇの混合したＨＰＶ１１／ＨＰＶ６  ＶＬＰ（５μｇのＨＰＶ６Ｎ５  ＶＬＰ＋５μｇのＨＰＶ１１Ｎ４  ＶＬＰ）をワクチン接種した。使用したアジュバントはアルミニウムアジュバントであり、注入量は１ｍｌであり、サルは筋肉内注射によってワクチン接種された。ワクチン接種スケジュールを表７に示した。
【０１１７】
ワクチン接種から２ヶ月後、静脈血を採取し、血清の中和抗体力価を中和試験により決定した。実験結果を図９に示した。結果は、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰのいずれかが、カニクイザルにおけるＨＰＶ１１及びＨＰＶ６に対する中和抗体の酸性を誘導し得ることを示した。それらによって誘導された中和抗体の力価は、混合したＨＰＶ１１／ＨＰＶ６  ＶＬＰによって誘導された中和抗体の力価に匹敵した。これらの結果は、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰの両方が良好な免疫原性を有し、カニクイザルにおけるＨＰＶ６及びＨＰＶ１１に対する交差防御を誘導することができ、それらのＨＰＶ１１及びＨＰＶ６に対する防御効果は、混合したＨＰＶ１１／ＨＰＶ６  ＶＬＰのものに匹敵したことを示した。したがって、Ｈ１１Ｎ４−６Ｔ３  ＶＬＰ及びＨ１１Ｎ４−６Ｔ５  ＶＬＰは、ＨＰＶ６及びＨＰＶ１１による感染を予防するために使用することができる。
【０１１８】
【表１１】
2019502404.tif 000013
【０１１９】
本発明の特定の実施形態について詳細に説明したが、当業者であれば、本明細書に開示された教示によれば、様々な修正及び変更が可能であり、そのような修正及び変更は、本発明の範囲内であることを理解する。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその同等物によって与えられる。
【図１】
2019502404.tif 000014
【図２】
2019502404.tif 000015
【図３】
2019502404.tif 000016
【図４Ａ】
2019502404.tif 000017
【図４Ｂ】
2019502404.tif 000018
【図４Ｃ】
2019502404.tif 000019
【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
2019502404.tif 000031
【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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