(57)【要約】  本発明は、安定な融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質、前記タンパク質を含む免疫原性組成物、ならびにＲＳＶ感染を防止および／または治療するためのその使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２１５位のアミノ酸残基の変異を、３５７位のアミノ酸の変異および３７１位のアミノ酸の変異と共に含む組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質。
【請求項２】
２１５位のアミノ酸ＳのＰへの変異（Ｓ２１５Ｐ）、３５７位のアミノ酸ＴのＫへの変異（Ｔ３５７Ｋ）、および３７１位のアミノ酸ＮのＹへの変異（Ｎ３７１Ｙ）を含む、請求項１に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項３】
（ａ）６７位のアミノ酸残基の変異；および
（ｂ）４８６位のアミノ酸残基の変異
からなる群から選択される少なくとも１つの変異をさらに含む、請求項１または２に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項４】
前記少なくとも１つのさらなる変異は、
（ａ）６７位のアミノ酸残基Ｎ／ＴのＩへの変異；
（ｂ）４８６位のアミノ酸残基ＤのＮへの変異
からなる群から選択される、請求項３に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項５】
前記タンパク質は前記融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含み、前記少なくとも１つのエピトープは、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３領域および配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体、ならびに／または配列番号７の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号９の重鎖ＣＤＲ３領域および配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号６７の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体によって認識される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項６】
前記タンパク質は三量体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項７】
短縮されたＦ１ドメイン、および前記短縮されたＦ１ドメインに結合した異種三量化ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項８】
前記異種三量化ドメインは、アミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号１４）を含む、請求項７に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項９】
前記三量化ドメインは、前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質のアミノ酸残基５１３に結合している、請求項７または８に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１０】
前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１２】
前記核酸分子は哺乳動物細胞における発現用にコドン最適化されている、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項１３】
請求項１１または請求項１２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、請求項１１もしくは１２に記載の核酸分子、および／または請求項１３に記載のベクターを含む組成物。
【請求項１５】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答の誘導に使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、請求項１１もしくは１２に記載の核酸分子、および／または請求項１３に記載のベクター。
【請求項１６】
ワクチンとして使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、請求項１１もしくは１２に記載の核酸分子、および／または請求項１３に記載のベクター。
【請求項１７】
ＲＳＶ感染の予防および／または治療に使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、請求項１１もしくは１２に記載の核酸分子、および／または請求項１３に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬の分野に関する。本発明は、特に、組換え融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸分子、および例えばワクチンにおけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９５０年代に呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）が発見されると、このウイルスは、直ちにヒトにおける上下気道感染症に関連した認定病原体になった。世界中で毎年６４００万件のＲＳウイルス感染が発生し、その結果、１６０，０００人が死亡していると推定されている（ＷＨＯ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ｕｐｄａｔｅ  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００９）。最も重篤な疾患が生じるのは、特に、未熟児、高齢者、および免疫無防備状態の個体である。２歳未満の小児では、ＲＳＶが最も一般的な呼吸器系病原体であり、呼吸器感染症による入院の約５０％を占め、入院のピークは月齢２〜４ヶ月で生じる。小児のほぼ全てが２歳までにＲＳＶに感染したことがあるとの報告がある。生涯にわたり繰り返し感染することは、自然免疫が効果を有さないことに起因する。高齢者では、ＲＳＶ疾患の負担は、一般的なインフルエンザＡ感染によって引き起こされるものと類似している。
【０００３】
ＲＳＶは、ニューモウイルス亜科（ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）に属するパラミクソウイルスである。そのゲノムは、中和抗体の主要な抗原標的であるＲＳＶ糖タンパク質（Ｇ）およびＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質として知られる膜タンパク質を含む種々のタンパク質をコードする。Ｆ１タンパク質の融合媒介部に対する抗体は、細胞へのウイルス取り込みを防止することができ、したがって、中和作用を有する。
【０００４】
ＲＳＶ  Ｆは、不可逆性タンパク質が不安定な融合前コンフォメーションから安定した融合後コンフォメーションにリフォールディングすることにより、ウイルスと宿主細胞膜とを融合する。両コンフォメーションの構造がＲＳＶ  Ｆ（ＭｃＬｅｌｌａｎ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４２，５９２−５９８（２０１３）；ＭｃＬｅｌｌａｎ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７，２４８−２５０（２０１０）；ＭｃＬｅｌｌａｎ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４０，１１１３−１１１７（２０１３）；Ｓｗａｎｓｏｎ  ＫＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０８，９６１９−９６２４（２０１１））、および関連するパラミクソウイルスの融合タンパク質について決定されており、それらはこの複雑な融合装置のメカニズムに洞察を加えている。他のＩ型融合タンパク質のように、不活性な前駆体、ＲＳＶ  Ｆ０は、フーリン様プロテアーゼによって細胞内成熟中に切断される必要がある。ＲＳＶ  Ｆは２つのフーリン部位を有し、それにより３つのタンパク質：Ｆ２、ｐ２７およびＦ１に分けられ、Ｆ１はそのＮ末端に疎水性融合ペプチド（ＦＰ）を有する。融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションにリフォールディングするために、ＦＰおよびヘプタッドリピートＡ（ＨＲＡ）を含むアミノ酸残基１３７〜２１６のリフォールディング領域１（ＲＲ１）は、へリックス、ループおよびストランドのアセンブリから長い連続へリックスに変形する必要がある。ＲＲ１のＮ末端セグメントに位置するＦＰは、その後、ウイルス膜から伸びて標的細胞の近位膜に入ることができる。次に、融合前ＦスパイクにおいてＣ末端ステムを形成し、かつヘプタッドリピートＢ（ＨＲＢ）を含むリフォールディング領域２（ＲＲ２）が、ＲＳＶ  Ｆヘッドの他方の側に位置を変え、ＨＲＡコイルドコイルトリマーをＨＲＢドメインと結合させて、６へリックスバンドルを形成する。６へリックスバンドルを完成するためのＲＲ１コイルドコイルの形成およびＲＲ２の移動は、リフォールディングの過程で起こる最も劇的な構造変化である。
【０００５】
現在、ＲＳＶ感染に対するワクチンは入手することができないが、疾患による高い負担のために要望されている。上述したように、ＲＳＶ融合糖タンパク質（ＲＳＶ  Ｆ）は、ヒト血清中の中和抗体の主要な標的であることから、魅力的なワクチン抗原である。ヒトの血清中の大半の中和抗体は、融合前コンフォメーションに向けられるが、融合前コンフォメーションは、その不安定さのために、溶液中およびビリオン表面のいずれでも融合後コンフォメーションに早期にリフォールディングする傾向がある。上記のように、結晶構造から、融合前状態と融合後状態との間にコンフォメーションの大きな変化があることが明らかになっている。再配列の規模から、ＲＳＶ−Ｆの融合後コンフォメーションに対する抗体の一部しか、ウイルス表面上で融合前スパイクの生得コンフォメーションと交差反応できないことが示唆された。したがって、ＲＳＶに対するワクチンを作製する努力は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前形態を含有するワクチンの開発に集中している（例えば、国際公開第２０１０１１４９７４５号パンフレット、国際公開第２０１０／１１４９７４３号パンフレット、国際公開第２００９／１０７９７９６号パンフレット、国際公開第２０１２／１５８６１３号パンフレットを参照）。しかしながら、これらの努力によっても、ヒトで試験するための候補として使用することができる安定な融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質を得るまでに至っていない。
【０００６】
したがって、ＲＳＶに対する効果的なワクチン、特に融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むワクチンが依然として要望されている。本発明は、安全で効果的な方法でＲＳＶに対するワクチンを接種するのに使用するための、そのような安定な融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、安定な組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）タンパク質、すなわち融合前コンフォメーションで安定化されている組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質、およびその断片を提供する。ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片は、融合前コンフォメーションのＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含む。特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は可溶性のタンパク質である。特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は三量体である。特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は三量体ＲＳＶ  Ｆタンパク質の多量体である。本発明はまた、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片をコードする核酸分子、およびそのような核酸分子を含むベクターを提供する。
【０００８】
本発明はまた、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、核酸分子、および／またはベクターを含む組成物、好ましくは免疫原性組成物、ならびにＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を誘導する際のその使用、特に、ワクチンとしてのその使用に関する。本発明はまた、対象に抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）免疫応答を誘導するための方法であって、有効量の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸分子、および／または前記核酸分子を含むベクターを対象に投与することを含む方法に関する。好ましくは、誘導される免疫応答は、ＲＳＶに対する中和抗体および／またはＲＳＶに対する防御免疫を特徴とする。特定の態様では、本発明は、対象に抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆ抗体を誘導するための方法であって、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸分子、および／または前記核酸分子を含むベクターを含む有効量の免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｔ３５７Ｋ、Ｎ３７１ＹおよびＤ４８６Ｎの変異を有するタンパク質Ｆの精製。イオン交換カラムからの溶出液のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過クロマトグラム。矢印は収集ピークを示す。
【図２】Ａ）還元条件下（Ｒ）および非還元条件下（ＮＲ）でのＳＥＣクロマトグラムからのピークを含む、Ｆ  Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｔ３５７Ｋ、Ｎ３７１Ｙ、Ｄ４８６Ｎタンパク質試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。ゲルはクマシーブリリアントブルーで染色されている。
【図３】精製ＲＳＶ  Ｆタンパク質Ｆ  Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｔ３５７Ｋ、Ｎ３７１Ｙ、Ｄ４８６Ｎのタンパク質濃度を、Ｑ  Ｏｃｔｅｔアッセイにより、ＣＲ９５０１およびＣＲ９５０３モノクローナル抗体を用いて測定した。ＣＲ９５０１は融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆにのみ結合する。ＣＲ９５０３は、融合前コンフォメーションおよび融合後コンフォメーションの両方のＲＳＶ  Ｆに結合する。平均±ＳＥとして示した。
【図４】ＲＳＶ  Ｆタンパク質Ｆ  Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｔ３５７Ｋ、Ｎ３７１Ｙ、Ｄ４８６Ｎの温度安定性。溶融温度（Ｔｍ℃）を示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）試験によりＳｙｐｒｏＯｒａｎｇｅ蛍光染料を用いて測定した。Ｔ３５７ＫおよびＮ３７１Ｙ置換に導入により、ＰＲＰＭのＴｍが３．５度上昇して６８．５度となった。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の融合タンパク質（Ｆ）は、宿主細胞膜とウイルス膜の融合に関与し、それは感染に必要とされる。ＲＳＶ  Ｆ  ｍＲＮＡは、Ｆ０と称される５７４個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質に翻訳され、それはＮ末端に、小胞体内のシグナルペプチダーゼで除去されるシグナルペプチド配列（例えば、配列番号１３のアミノ酸残基１〜２６）を含む。Ｆ０は、細胞プロテアーゼ（特に、フーリンまたはフーリン様））により２つの部位（アミノ酸残基１０９／１１０間および１３６／１３７間）で切断され、アミノ酸残基１１０〜１３６を含む短いグリコシル化介在配列（ｐ２７領域とも呼ばれる  が除去され、Ｆ１およびＦ２と称される２つのドメインまたはサブユニットが生成される。Ｆ１ドメイン（アミノ酸残基１３７〜５７４）は、そのＮ末端に疎水性融合ペプチドを有し、Ｃ末端に膜貫通（ＴＭ）（アミノ酸残基５３０〜５５０）領域および細胞質領域（アミノ酸残基５５１〜５７４）を有する。Ｆ２ドメイン（アミノ酸残基２７〜１０９）は、２つのジスルフィド架橋によりＦ１に共有結合する。Ｆ１−Ｆ２ヘテロ二量体は、ビリオン中でホモ三量体として集合している。
【００１１】
ＲＳＶ感染に対するワクチンは現在未だ入手することはできない。ワクチン製造に有望な１つのアプローチは、精製されたＲＳＶ  Ｆタンパク質に基づくサブユニットワクチンである。しかしながら、このアプローチの場合、精製されたＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前状態のコンフォメーションに類似したコンフォメーションにあり、経時的に安定であり、かつ十分な量で製造できることが望ましい。加えて、可溶性のサブユニットベースのワクチンの場合、ＲＳＶ  Ｆタンパク質を膜貫通（ＴＭ）領域および細胞質領域の欠失により短縮して、可溶性分泌型Ｆタンパク質（ｓＦ）を生成する必要がある。ＴＭ領域は膜アンカリングおよび三量体形成を担うため、アンカーなしの可溶性Ｆタンパク質は、完全長タンパク質よりもかなり不安定であり、融合後最終状態に容易にリフォールディングするであろう。したがって、高い発現レベルおよび高い安定性を示す安定な融合前コンフォメーションの可溶性Ｆタンパク質を得るためには、融合前コンフォメーションを安定化する必要がある。また、完全長（膜結合した）ＲＳＶ  Ｆタンパク質は準安定であるため、融合前コンフォメーションの安定化は完全長ＲＳＶ  Ｆタンパク質にも、例えば、弱毒化生ワクチンまたはベクターワクチンへのアプローチにも望ましい。
【００１２】
Ｆ１およびＦ２サブユニットへ開裂する、融合前コンフォメーションにある可溶性ＲＳＶ  Ｆの安定化のために、可溶性ＲＳＶ  Ｆ  Ｃ末端側終端のＣ末端にフィブリチンに基づく三量化ドメインを融合させた（ＭｃＬｅｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１７：２−２４８−２５０（２０１０）；ＭｃＬｅｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３４０（６１３６）：１１１３−７（２０１３））。このフィブリチンドメイン、すなわち「フォルドン」はＴ４フィブリチンに由来し、以前は人工の天然三量化ドメインとして記載されている（Ｌｅｔａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｍｏｓｃｏｗ  ６４：８１７−８２３（１９９３）；Ｓ−Ｇｕｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３７：９０５−９１５．（２００４））。しかし、三量化ドメインにより安定な融合前ＲＳＶ−Ｆタンパク質は得られない（Ｋｒａｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍ．６：８１４３，（２０１５））。さらに、これらの努力によって、ヒトで試験するのに適した候補を未だ得るに至っていない。
【００１３】
最近、本発明者らは、融合前コンフォメーションにあるＲＳＶ  Ｆタンパク質を安定化することができるいくつかの変異の組み合わせを報告した（国際公開第２０１４／１７４０１８号パンフレットおよび国際公開第２０１４／２０２５７０号パンフレット）。したがって、６７位のアミノ酸残基の変異および／または２１５位のアミノ酸残基の変異、好ましくは６７位のアミノ酸残基Ｎ／ＴのＩへの変異、および／または２１５位のアミノ酸残基ＳのＰへの変異を含む、安定な融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質が報告されている。さらに、短縮されたＦ１ドメインを含み、かつ６７位のアミノ酸残基の変異および／または２１５位のアミノ酸残基の変異、好ましくは６７位のアミノ酸残基Ｎ／ＴのＩへの変異、および／または２１５位のアミノ酸残基ＳのＰへの変異を含む、可溶性融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質であって、前記短縮されたＦ１ドメインに結合した異種三量化ドメインを含むタンパク質が報告されている。またさらに、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質であって、少なくとも１つのさらなる変異、例えば、４８６位のアミノ酸残基ＤのＮへの変異を含むタンパク質が報告されている。
【００１４】
本発明によれば、２つの他の変異、すなわち３５７位および３７１位（配列番号１３による番号付け）の変異の導入もまた融合前コンフォメーションにあるタンパク質を安定化させることがわかった。
【００１５】
したがって、本発明は、２１５位のアミノ酸残基の変異、特に２１５位のアミノ酸ＳのＰへの変異（Ｓ２１５Ｐ）を、３５７位のアミノ酸の変異、特に３５７位のアミノ酸ＴのＫへの変異（Ｔ３５７Ｋ）、および３７１位のアミノ酸の変異、特に３７１位のアミノ酸ＮのＹへの変異（Ｎ３７１Ｙ）と共に含む組換え融合前Ｆタンパク質を提供する。
【００１６】
したがって、本発明は、安定な組換え融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、すなわち融合前コンフォメーションで安定化されているＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片を提供する独自の変異の組み合わせを提供する。本発明の安定な融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、またはその断片は、融合前コンフォメーションで存在する、すなわち、それらは、融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含む（提示する）。融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的なエピトープは、融合後コンフォメーションでは現れないエピトープである。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションは、天然ＲＳＶビリオンで発現するＲＳＶ  Ｆタンパク質のものと同じエピトープを含有することができ、したがって、予防的中和抗体を誘発する利点を備え得ると考えられる。
【００１７】
特定の実施形態では、本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片は、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３領域および配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体（以下、ＣＲ９５０１という）、ならびに／または配列番号７の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号９の重鎖ＣＤＲ３領域および配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体（ＣＲ９５０２という）により認識される、少なくとも１つのエピトープを含む。ＣＲ９５０１およびＣＲ９５０２は、それぞれ抗体５８Ｃ５および３０Ｄ８の重鎖および軽鎖可変領域を含み、したがって、それらの抗体の結合特異性を有するが、それらの抗体は、融合後コンフォメーションではなく、融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的に結合することが以前より示されている（国際公開第２０１２／００６５９６号パンフレットを参照）。
【００１８】
特定の実施形態では、組換え融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は三量体である。
【００１９】
本出願の全体にわたって使用される場合、当該技術分野での慣例として、ヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で提示され、アミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端の方向で提示される。
【００２０】
上記のように、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質の断片もまた、本発明に含まれる。断片は、アミノ末端（例えば、シグナル配列を切断することによって）およびカルボキシ末端（例えば、膜貫通領域および／または細胞質側末端を欠失させることによって）のいずれか、またはその両方から得ることができる。断片は、Ｆタンパク質の免疫学的に活性な断片、すなわち、対象に免疫応答を生じさせる部分を含むように選択され得る。これは、当業者にはすべてルーチン的である、インシリコ、インビトロ、および／またはインビボの方法を使用して容易に決定することができる。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明によるコード化タンパク質またはその断片は、配列番号１３のアミノ酸１〜２６に対応する、リーダー配列またはシグナルペプチドとも称されるシグナル配列を含む。シグナル配列は、通常、分泌経路に向かう、新たに合成された大部分のタンパク質のＮ末端に存在する短い（例えば、５〜３０アミノ酸長）アミノ酸配列であり、一般に、シグナルペプチダーゼによって切断されて、遊離のシグナルペプチドと成熟タンパク質とを生成する。
【００２２】
特定の実施形態では、本発明によるタンパク質またはその断片はシグナル配列を含まない。
【００２３】
特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質（の断片）は可溶性である。特定の実施形態では、本発明による安定な融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片は、短縮されたＦ１ドメインを含み、かつ前記短縮されたＦ１ドメインに結合した異種三量化ドメインを含む。本発明によれば、短縮されたＦ１ドメインのＣ末端アミノ酸残基への異種三量化ドメインの結合、および安定化変異により、高発現を示し、かつ融合前特異的抗体に結合する可溶性のＲＳＶ  Ｆタンパク質が提供されることが示され、これは、このタンパク質が融合前コンフォメーションにあることを示している。加えて、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、融合前コンフォメーションで安定化される、すなわち、タンパク質のプロセシング後でもなお、それらは融合前特異的抗体ＣＲ９５０１および／またはＣＲ９５０２に結合し、融合前特異的エピトープが保持されることを示す。
【００２４】
特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は三量体ＲＳＶ  Ｆタンパク質の多量体である。したがって、いくつかの実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、三量体のより高次のアセンブリのためのアセンブリドメインを含み得る。
【００２５】
ＲＳＶは、２つの抗原性サブグループ：ＡおよびＢを有する単一血清型として存在することが知られている。２つのグループのプロセシングされた成熟Ｆタンパク質のアミノ酸配列は約９３％同一である。本出願の全体にわたって使用される場合、アミノ酸位置は、サブグループＡのＲＳＶ  Ｆタンパク質の配列（配列番号１３）を参照して付与される。したがって、本発明で使用される場合、「ＲＳＶ  Ｆタンパク質の位置「ｘ」のアミノ酸という表現は、配列番号１３のＲＳＶ  Ｆタンパク質の位置「ｘ」にあるアミノ酸に対応するアミノ酸を意味する。本出願の全体にわたって使用される番号付け方式では、１は未成熟Ｆ０タンパク質（配列番号１３）のＮ末端アミノ酸を指すことに留意されたい。他のＲＳＶ株が使用される場合、Ｆタンパク質のアミノ酸位置は、他のＲＳＶ株の配列を配列番号１３のＦタンパク質と必要に応じてギャップを挿入しながらアライメントすることにより、配列番号１３のＦタンパク質の番号付けを参照して付与される。配列アラインメントは、当該技術分野でよく知られた方法を使用して、例えばＣＬＵＳＴＡＬＷ、ＢｉｏｅｄｉｔまたはＣＬＣ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈによって行うことができる。
【００２６】
特定の実施形態では、ＲＳＶ株は、配列番号２０からなるＲＳＶ株である。
【００２７】
特定の実施形態では、ＲＳＶ株は、ＲＳＶ  Ｂ株である。特定の実施形態では、ＲＳＶ株は、配列番号１５からなるＲＳＶ  Ｂ株である。
【００２８】
本発明によるアミノ酸は、２０種の天然（もしくは「標準」アミノ酸）、または、例えばＤ−アミノ酸（キラル中心を有するアミノ酸のＤ−エナンチオマー）などのそれらの変異体のいずれであってもよく、あるいは、例えばノルロイシンなどの、タンパク質中に天然には見出されない変異体のいずれであってもよい。標準アミノ酸は、その特性に基づいて、いくつかのグループに分類することができる。重要な因子としては、電荷、親水性または疎水性、サイズ、および官能基がある。これらの特性は、タンパク質構造およびタンパク質−タンパク質間相互作用にとって重要である。アミノ酸の中には、他のシステイン残基とジスルフィド共有結合（またはジスルフィド架橋）を形成することができるシステイン、タンパク質骨格のターンを誘導するプロリン、および他のアミノ酸よりもフレキシブルなグリシンなど、特別な特性を有するものがある。表１は、標準アミノ酸の略語および特性を示す。
【００２９】
タンパク質に対する変異は、ルーチン的な分子生物学手順により行い得ることは当業者にはわかるであろう。本発明による変異は、好ましくは、これらの変異を含まないＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現レベルの増大および／または安定性の増大をもたらす。
【００３０】
特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片は、
（ａ）６７位のアミノ酸残基の変異；および
（ｂ）４８６位のアミノ酸残基の変異
からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる変異を含む。
【００３１】
特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる変異は、
（ａ）６７位のアミノ酸残基Ｎ／ＴのＩへの変異；および
（ｂ）４８６位のアミノ酸残基ＤのＮへの変異
からなる群から選択される。
【００３２】
特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質またはその断片は、少なくとも４つの変異（野生型ＲＶ  Ｆタンパク質、例えば配列番号１３のアミノ酸配列を含むタンパク質と比較して）を含む。特定の実施形態では、タンパク質またはその断片は、少なくとも５つの変異を含む。
【００３３】
特定の実施形態では、タンパク質またはその断片は、少なくとも６つの変異を含む。
【００３４】
したがって、特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは、
（ａ）４６位のアミノ酸残基の変異；
（ｂ）８３位のアミノ酸残基の変異；
（ｃ）９２位のアミノ酸残基の変異；
（ｄ）１８４位のアミノ酸残基の変異；
（ｅ）２０３位のアミノ酸残基の変異；
（ｆ）２０７位のアミノ酸残基の変異；および
（ｇ）４８７位のアミノ酸残基の変異
からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる変異を含む。
【００３５】
特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる変異は、
（ａ）４６位のアミノ酸残基ＳのＧへの変異；
（ｂ）８３位のアミノ酸残基ＬのＭへの変異；
（ｃ）９２位のアミノ酸残基ＥのＤへの変異；
（ｄ）１８４位のアミノ酸残基ＧのＮへの変異；
（ｅ）２０３位のアミノ酸残基ＶのＩへの変異；
（ｆ）２０７位のアミノ酸残基ＶのＩへの変異；および
（ｇ）４８７位のアミノ酸残基ＥのＱ、ＮまたはＩへの変異
からなる群から選択される。
【００３６】
特定の他の実施形態では、異種三量化ドメインは、アミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号１４）を含む。
【００３７】
上記のように、特定の実施形態では、本発明のタンパク質またはその断片は短縮されたＦ１ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「短縮された」Ｆ１ドメインは、完全長Ｆ１ドメインではないＦ１ドメイン、すなわち、Ｎ末端またはＣ末端で１つまたは複数のアミノ酸残基が欠失しているＦ１ドメインを指す。本発明によれば、少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞質側末端は、可溶性細胞外ドメインとしての発現を可能にするために欠失されている。
【００３８】
特定の他の実施形態では、三量化ドメインは、ＲＳＶ  Ｆ１ドメインのアミノ酸残基５１３に結合している。したがって、特定の実施形態では、三量化ドメインは、配列番号１４を含み、かつＲＳＶ  Ｆ１ドメインのアミノ酸残基５１３に結合している。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明のＲＳＶ  Ｆタンパク質は、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現レベルは、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して増大している。特定の実施形態では、発現レベルは少なくとも５倍、好ましくは１０倍まで増大している。特定の実施形態では、発現レベルは１０倍超増大している。
【００４１】
本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は安定である、すなわち、例えば精製、凍結融解サイクル、および／または保存など、タンパク質の処理時に融合後コンフォメーションに容易には変化しない。
【００４２】
特定の実施形態では、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、変異のないＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して、４℃での保存時の安定性が増大している。特定の実施形態では、タンパク質は、４℃での保存時に、少なくとも３０日間、好ましくは少なくとも６０日間、好ましくは少なくとも６カ月間、より一層好ましくは少なくとも１年間安定である。「保存時に安定な」とは、タンパク質を溶液（例えば、培地）中に４℃で少なくとも３０日間保存した際に、そのタンパク質が依然として融合前特異的抗体（例えば、ＣＲ９５０１）に特異的な少なくとも１つのエピトープを示すことを意味する。特定の実施形態では、タンパク質は、融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質の４℃での保存時に少なくとも６ヶ月間、好ましくは少なくとも１年間、少なくとも１つの融合前特異的エピトープを提示する。
【００４３】
特定の実施形態では、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、前記変異のないＲＳＶ  Ｆタンパク質と比較して、熱に曝されたときの安定性が増大している。特定の実施形態では、融合前ＲＥＶ  Ｆタンパク質は、５５℃の温度で、好ましくは５８℃の温度で、より好ましくは６０℃の温度で少なくとも３０分間にわたり熱に安定である。「熱に安定」とは、例えば、実施例に記載の方法による測定で、タンパク質が、少なくとも３０分間、高温（すなわち、５５℃以上の温度）に曝された後も依然として少なくとも１つの融合前特異的エピトープを提示することを意味する（図４を参照）。
【００４４】
特定の実施形態では、タンパク質は、適切な製剤緩衝液中で１〜６回の凍結融解サイクルに供された後も、少なくとも１つの融合前特異的エピトープを提示する。
【００４５】
本出願の全体にわたって使用される場合、当該技術分野での慣例として、ヌクレオチド配列は、５’から３’の方向で提示され、アミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端の方向で提示される。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明によるコード化タンパク質は、配列番号１３のアミノ酸１〜２６に対応する、シグナル配列またはシグナルペプチドとも称されるリーダー配列をさらに含む。これは、分泌経路に向かう新規に合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短い（通常、５〜３０アミノ酸長）ペプチドである。特定の実施形態では、本発明によるタンパク質はリーダー配列を含まない。
【００４７】
特定の実施形態では、タンパク質はＨＩＳタグを含む。Ｈｉｓタグまたはポリヒスチジンタグは、多くの場合、タンパク質のＮ末端またはＣ末端にある、少なくとも５個のヒスチジン（Ｈ）残基からなる、タンパク質中のアミノ酸モチーフであり、一般には精製目的のために使用される。
【００４８】
本発明は、本発明によるＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸分子をさらに提供する。
【００４９】
好ましい実施形態では、本発明によるタンパク質をコードする核酸分子は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞における発現用にコドン最適化される。コドン最適化の方法は知られており、既に報告されている（例えば、国際公開第９６／０９３７８号パンフレット）。野生型配列と比べて少なくとも１つの好ましくないコドンがより好ましいコドンで置換される場合に、配列はコドン最適化されると考えられる。本明細書では、好ましくないコドンとは、生物において、同じアミノ酸をコードする別のコドンと比べて使用される頻度が低いコドンであり、より好ましいコドンとは、生物において、好ましくないコドンと比べて使用される頻度が高いコドンである。特定の生物におけるコドン使用の頻度は、コドン頻度表、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎに見出すことができる。２つ以上の好ましくないコドン、好ましくは、ほとんどまたはすべての好ましくないコドンが、より好ましいコドンに置き換えられることが好ましい。生物で最も高頻度に使用されるコドンがコドン最適化配列に使用されることが好ましい。好ましいコドンに置き換えられると、概して発現が高くなる。
【００５０】
多くの異なるポリヌクレオチドおよび核酸分子が、遺伝子コードの縮重の結果として同じタンパク質をコードし得ることは当業者に理解されるであろう。また、当業者が慣例の技術を使用して、タンパク質を発現させることになる任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するように、核酸分子がコードするタンパク質配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行い得ることも、理解される。したがって、特に指定しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含んでも含まなくてもよい。
【００５１】
核酸配列は、慣例の分子生物学技術を使用してクローン化することができ、またはＤＮＡ合成により新規に作製することができ、それは、ＤＮＡ合成および／または分子クローニングの分野の事業を有するサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）により、慣例の手順を使用して行われ得る。
【００５２】
本発明はまた、上記の核酸分子を含むベクターを提供する。したがって、特定の実施形態では、本発明による核酸分子はベクターの一部である。このようなベクターは、当業者によく知られた方法により容易に操作することができ、例えば、原核細胞および／または真核細胞において複製できるように設計することができる。加えて、多くのベクターは、真核細胞の形質転換に使用することができ、そのような細胞のゲノムに全体としてまたは部分的に組み込まれ、その結果、そのゲノムに所望の核酸を含む安定な宿主細胞が得られる。使用されるベクターは、ＤＮＡのクローニングに適し、かつ目的の核酸の転写に使用することができるものであればいかなるベクターでもよい。本発明による好適なベクターは、例えば、アデノベクター、アルファウイルス、パラミクソウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスベクターなどである。当業者は好適な発現ベクターを選択し、機能的方法で本発明の核酸配列を挿入することができる。
【００５３】
融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞もまた本発明の一部を形成する。融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、腫瘍細胞株、ＢＨＫ細胞、ヒト細胞株、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、もしくは酵母、真菌、昆虫細胞など、またはトランスジェニック動物もしくはトランスジェニック植物における分子の発現を含む組換えＤＮＡ技術によって生成することができる。特定の実施形態では、細胞は多細胞生物由来であり、特定の実施形態では、細胞は脊椎動物または無脊椎動物起源である。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、細胞はヒト細胞である。一般に、宿主細胞における、本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質などの組換えタンパク質の生成は、発現可能形式でそのタンパク質をコードする異種核酸分子の宿主細胞への導入、核酸分子の発現に資する条件下での細胞の培養、および前記細胞におけるタンパク質発現を可能にすることを含む。発現可能形式でタンパク質をコードする核酸分子は、発現カセットの形態であってもよく、通常、エンハンサー、プロモーター、ポリアデニル化シグナルなど、核酸の発現をもたらすことができる配列を必要とする。当業者は、宿主細胞内での遺伝子の発現を得るのに様々なプロモーターが使用可能であることを認識している。プロモーターは構成的であっても調節的であってもよく、ウイルス、原核生物、もしくは真核生物の供給源を含む種々の供給源から入手すること、または人為的に設計することが可能である。
【００５４】
細胞培養培地は種々のベンダーから入手可能であり、好適な培地は、宿主細胞が目的のタンパク質、ここでは融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現するようにルーチン的に選択することができる。好適な培地は血清を含有しても含有しなくてもよい。
【００５５】
「異種核酸分子」（本明細書では「導入遺伝子」とも呼ぶ）は、宿主細胞に天然には存在しない核酸分子である。それは、例えば、標準の分子生物学技術によりベクターに導入される。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列に作動可能に連結される。これは、例えば、導入遺伝子をコードする核酸をプロモーターの制御下に置くことで行われ得る。さらなる調節配列を加えることもできる。導入遺伝子の発現のために多くのプロモーターが使用可能であり、それらは当業者に知られており、例えば、それらは、ウイルス、哺乳動物、合成のプロモーターなどを含んでもよい。真核細胞内での発現を得るのに好適なプロモーターの非限定的な例としては、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号明細書）、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、例えばＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー／プロモーターからのｎｔ．−７３５〜＋９５を含むものが挙げられる。ポリアデニル化シグナル、例えばウシ成長ホルモンのポリＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号明細書）を導入遺伝子の後に存在させることができる。あるいは、いくつかの広く使用されている発現ベクターが当該技術分野および商用供給源から入手可能であり、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡおよびｐＥＦベクターシリーズ、ＢＤ  ＳｃｉｅｎｃｅｓのｐＭＳＣＶおよびｐＴＫ−Ｈｙｇ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのｐＣＭＶ−Ｓｃｒｉｐｔなどがあり、これらは、目的のタンパク質を組換え技術により発現させるために、または好適なプロモーターおよび／もしくは転写ターミネーター配列、ポリＡ配列などを得るために使用することができる。
【００５６】
細胞培養は、付着細胞培養、例えば培養容器の表面またはマイクロキャリアに付着させた細胞、および懸濁培養など、任意のタイプの細胞培養であってよい。大抵の大規模懸濁培養は、操作およびスケールアップが最も簡単であるため、バッチ法または流加法として操作される。最近では、灌流原理に基づく連続法がより一般的になりつつあり、また好適でもある。好適な培養培地も当業者によく知られており、一般に、商用供給源から大量に得ること、または標準プロトコルにしたがって注文生産することが可能である。培養は、例えば、バッチ、流加、連続システムなどを使用して、シャーレ、ローラーボトルまたはバイオリアクター内で行うことができる。細胞を培養する好適な条件は知られている（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）、およびＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ  ０−４７１−３４８８９−９）を参照）。
【００５７】
本発明は、上記の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、および／または核酸分子、および／またはベクターを含む組成物をさらに提供する。したがって、本発明は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションには存在するが、融合後コンフォメーションには存在しないエピトープを提示する融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む組成物を提供する。本発明はまた、このような融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸分子および／またはベクターを含む組成物を提供する。本発明はさらに、上記のような融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質および／または核酸分子および／またはベクターを含む免疫原性組成物を提供する。本発明はまた、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導するための、本発明による安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、核酸分子、および／またはベクターの使用を提供する。さらに、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導するための方法であって、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質および／または核酸分子および／またはベクターを対象に投与することを含む方法を提供する。また、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導する際に使用するための、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、核酸分子および／またはベクターを提供する。さらに、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導する際に使用する薬剤を製造するための、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質および／または核酸分子および／またはベクターの使用を提供する。
【００５８】
本発明の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、核酸分子、またはベクターは、ＲＳＶ感染の防止（予防）および／または治療に使用することができる。特定の実施形態では、防止および／または治療は、ＲＳＶ感染に罹りやすい患者群を標的にすることができる。そのような患者群としては、以下に限定されるものではないが、例えば、高齢者（例えば、５０歳以上、６０歳以上、および好ましくは６５歳以上）、若齢者（例えば、５歳以下、１歳以下）、入院患者、および抗ウイルス性化合物で治療されたが、十分な抗ウイルス応答を示さなかった患者が挙げられる。
【００５９】
本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、核酸分子、および／またはベクターは、例えば、ＲＳＶを原因とする疾患もしくは病態の単独の治療および／または予防に、あるいは（既存または将来の）ワクチン、抗ウイルス剤および／またはモノクローナル抗体など、他の予防的治療および／または療法的治療と組み合わせて使用することができる。
【００６０】
本発明は、本発明による融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、核酸分子、および／またはベクターを利用して、対象のＲＳＶ感染を防止および／または治療するための方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、対象のＲＳＶ感染を防止および／または治療するための方法は、上記のような融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、核酸分子、および／またはベクターの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。治療有効量は、ＲＳＶによる感染から生じる疾患または病態を防止、寛解および／または治療するのに効果のあるタンパク質、核酸分子、またはベクターの量を指す。防止は、ＲＳＶの伝播の阻害もしくは低減、またはＲＳＶによる感染に関連した症状の１つもしくは複数の発症、進展、もしくは進行を阻害もしくは低減することを包含する。本明細書で使用される寛解は、目に見える、もしくは認知できる疾患の症状、ウイルス血症、またはインフルエンザ感染の他の任意の計測可能な徴候の低減を指し得る。
【００６１】
ヒトなどの対象に投与するために、本発明は、本明細書に記載する融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、核酸分子、および／またはベクターと、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物を使用することができる。この場合、「薬学的に許容される」という用語は、担体もしくは賦形剤が、使用する用量および濃度で、それらを投与する対象に望ましくない、または有害な効果を引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容される担体および賦形剤は、当該技術分野でよく知られている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；およびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照）。ＲＳＶ  Ｆタンパク質または核酸分子は、凍結乾燥製剤を利用することも可能であり得るが、滅菌溶液として製剤化し、投与することが好ましい。滅菌溶液は、滅菌ろ過または当該技術分野でそれ自体知られている他の方法によって調製される。その後、溶液は凍結乾燥されるか、または医薬投与容器に充填される。溶液のｐＨは一般に、ｐＨ３．０〜９．５、例えばｐＨ５．０〜７．５の範囲である。ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、通常、薬学的に許容される好適な緩衝剤を含む溶液中に存在し、組成物はまた塩を含有してもよい。任意選択により、アルブミンなどの安定剤が含まれ得る。特定の実施形態では、洗浄剤が添加される。特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は注射用製剤に製剤化することができる。
【００６２】
特定の実施形態では、本発明による組成物は、１種または複数種のアジュバントをさらに含む。適用される抗原決定基に対する免疫応答をさらに高めるアジュバントは当該技術分野で知られている。「アジュバント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書では同義的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１種以上の物質と定義される。ここでは、アジュバントは、本発明のＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する免疫応答を増強するために使用される。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；油−エマルジョン組成物（または水中油型組成物）、例えば、ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルション（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照）；サポニン製剤、例えばＱＳ２１および免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）など（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照）；細菌または微生物の派生物（これらの例には、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧ−モチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ−リボシル化細菌毒素またはその変異体、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴなどがある）；真核生物のタンパク質（例えば、抗体もしくはその断片（例えば、抗原自体またはＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８０に向けられたもの）および受容体へのリガンド（例えば、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦなど）（これらは受容細胞と相互作用すると、免疫応答を刺激する））が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウムアルミニウム、またはそれらの組み合わせの形態のアルミニウムを、１用量当たり０．０５〜５ｍｇ、例えば０．０７５〜１．０ｍｇのアルミニウム含有量の濃度で、アジュバントとして含む。
【００６３】
融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質はまた、例えばポリマー、リポソーム、ビロソーム、ウイルス様粒子などのナノ粒子と組み合わせて、またはそれにコンジュゲートさせて投与することができる。融合前Ｆタンパク質は、アジュバントの有無にかかわらず、ナノ粒子と組み合わせるか、その中に封入するか、またはそれにコンジュゲートさせることができる。リポソーム内への封入は、例えば米国特許第４，２３５，８７７号明細書に記載されている。高分子へのコンジュゲーションは、例えば米国特許第４，３７２，９４５号明細書または米国特許第４，４７４，７５７号明細書に開示されている。他の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、多量体のより高次のアセンブリに集合される。
【００６４】
他の実施形態では、組成物はアジュバントを含まない。
【００６５】
特定の実施形態では、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンを作製する方法であって、本発明による組成物を準備する工程、およびそれを薬学的に許容される組成物に製剤化する工程を含む方法を提供する。「ワクチン」という用語は、ある特定の病原体または疾患に対して対象にある程度の免疫を誘導するのに有効な活性成分を含有する薬剤または組成物を指し、これにより、その病原体または疾患による感染に関連する症状の重症度、期間、または他の徴候が少なくとも低減（最大で完全消失）する。本発明では、ワクチンは、有効量の融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質、および／または融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸分子、および／または前記核酸分子を含むベクターを含み、これにより、ＲＳＶのＦタンパク質に対する免疫応答がもたらされる。これは、入院に至る重篤な下気道疾患を防止し、対象のＲＳＶ感染および複製による肺炎および細気管支炎などの合併症の頻度を低減する方法を提供する。本発明による「ワクチン」という用語は、それが医薬組成物であり、したがって、通常、薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含むことを意味する。それは、さらなる活性成分を含んでもよく含まなくてもよい。特定の実施形態では、それは、例えばＲＳＶの他のタンパク質および／または他の感染因子に対する免疫応答を誘導する他の成分をさらに含む組み合せワクチンであってもよい。さらなる活性成分の投与は、例えば、別個の投与によって行われても、本発明のワクチンとさらなる活性成分の組み合わせ製剤を投与することによって行われてもよい。
【００６６】
組成物は、対象、例えばヒト対象に投与することができる。単回投与のための組成物中のＲＳＶ  Ｆタンパク質の総用量は、例えば約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ、例えば１μｇ〜１ｍｇ、例えば１０μｇ〜１００μｇとすることができる。推奨用量の決定は実験により行われ、当業者にはルーチン的である。
【００６７】
本発明による組成物の投与は、標準の投与経路を使用して実施することができる。非限定的実施形態としては、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、または例えば鼻腔内、口腔内などの粘膜投与などの非経口投与が挙げられる。一実施形態では、組成物は筋肉内注射により投与される。当業者は、ワクチン中の抗原に対する免疫応答を誘導するために、組成物、例えばワクチンを投与する様々な可能性を認識している。
【００６８】
本明細書で使用する対象は、好ましくは哺乳動物、例えば、げっ歯類、例えばマウス、コットンラットなど、または非ヒト霊長類、またはヒトである。対象は、好ましくは、ヒト対象である。
【００６９】
タンパク質、核酸分子、ベクター、および／または組成物はまた、初回免疫として、または追加免疫として、同種または異種初回免疫−追加免疫レジメンで投与することができる。追加免疫ワクチン接種を実施する場合、通常、そのような追加免疫ワクチン接種は、最初に対象に組成物を投与した後（このような場合には「初回免疫ワクチン接種」と呼ばれる）、１週〜１年、好ましくは２週〜４ヶ月のある時点で同じ対象に投与される。特定の実施形態では、投与は初回免疫投与および少なくとも１回の追加免疫投与を含む。
【００７０】
加えて、本発明のタンパク質は、例えば、本発明のタンパク質に結合可能な抗体が個体の血清中にあるか否かを確定することにより、個体の免疫状態を検査するための診断ツールとして使用することができる。したがって、本発明はまた、患者のＲＳＶ感染の存在を検出するためのインビトロ診断方法であって、ａ）前記患者から得られた生体試料を本発明によるタンパク質と接触させる工程と、ｂ）抗体−タンパク質複合体の存在を検出する工程とを含む方法に関する。
【００７１】
このような方法によって得ることができ、かつ／または得られる安定化された融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質もまた、上記のようなその使用と共に本発明の一部を形成する。
【実施例】
【００７２】
実施例１：配列番号２１で示される安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドの調製
融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆの安定性を高めるために、２つのさらなるアミノ酸置換を、先に報告した融合前ＲＳＶ  Ｆ変異体（国際公開第２０１４／１７４０１８号パンフレットおよび国際公開第２０１４／２０２５７０号パンフレット）に導入した。Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）でコンストラクトを合成し、コドンを最適化した。このコンストラクトを、部位特異的変異誘発およびＰＣＲに関する分野で広く知られている標準的方法により、ｐＣＤＮＡ２００４にクローニング、または生成し、配列を決定した。使用した発現プラットフォームは、２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。製造業者の説明書に従い、２９３Ｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、細胞に一過性にトランスフェクトし、３７℃および１０％ＣＯ２で５日間培養した。培養上清を回収し、３００ｇで５分間遠心して、細胞および細胞片を除去した。次いで、０．２２μｍの真空フィルタを使用して、遠心上清を滅菌ろ過し、使用するまで４℃で保存した。
【００７３】
実施例２：融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質の精製
組換えポリペプチドを、初期精製用の陽イオンイオン交換カラム、次いで残存する混入物を除去する洗練ステップ用のｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを適用する２ステップ精製プロトコルによって精製した。初期イオン交換ステップのために、培養上清を２容量の５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０で希釈し、５ｍｌのＨｉＴｒａｐ  Ｃａｐｔｏ  Ｓカラムに毎分５ｍｌで通した。次いで、カラムを、１０カラム容量（ＣＶ）の２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５で洗浄し、２ＣＶの２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５で溶出した。スピン濃縮器を用いて溶出液を濃縮し、ランニング緩衝液として４０ｍＭ  トリス、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４を用い、ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムを使用してタンパク質をさらに精製した。図１に、ゲルろ過カラムのクロマトグラムを示す。ドミナントピークは融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質を含有した。このピークを含有する画分を再びプールし、ＯＤ２８０を使用してタンパク質濃度を測定し、使用するまで４℃で保存した。図２に、最終タンパク質調製物の非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示すが、見てわかるように、純度は９５％超であった。バンドの同一性はウエスタンブロッティングおよびタンパク質Ｆ特異的抗体を用いて確認した（図示せず）。
【００７４】
Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｏｃｔｅｔ（ＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）を使用して上清中のタンパク質濃度を測定した。ＣＲ９５０１（融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質を特異的に認識する抗体）およびＣＲ９５０３（融合後ＲＳＶ  Ｆタンパク質を認識する）を、標準のプロトコルによりビオチン化し、ストレプトアビジンバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ、ＵＫ）に固定化した。その後、コーティングされたバイオセンサーをモック細胞培養上清でブロックした。定量的実験を以下のとおりに行った：温度３０Ｃ、振盪速度１０００ｒｐｍ、アッセイ時間３００秒。
【００７５】
タンパク質濃度を標準曲線により算出した。標準曲線は、コーティングした各抗体について、モック培地で希釈した融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質（Ｋｒａｒｕｐ  ｅｔ．ａｌ．，２０１５、上記）を用いて作成した（図３）。データ解析は、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ解析６．４ソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて行った。
【００７６】
実施例３：ＲＳＶ  Ｆタンパク質の温度安定性
精製したタンパク質の温度安定性を示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）により決定した。精製した融合前Ｆタンパク質を９６ウェル光学ｑＰＣＲプレート内でＳＹＰＲＯ橙色蛍光染料（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｓ６６５０）と混合した。染料とタンパク質の最適濃度を実験により決定した（データは示さず）。タンパク質の希釈はすべてＰＢＳで行い、減算参照用として染料のみを含有する陰性対照サンプルを使用した。測定はｑＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＶｉｉＡ  ７）により、次のパラメータを使用して行った：２５〜９５℃は毎秒０．０１５℃の速度で昇温。データは連続的に取得した。Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  ＰＲＩＳＭソフトウエア（バージョン５．０４）を用いて溶融曲線を作成した。非線形ＥＣ５０シフト方程式を用い、最大蛍光の５０％で溶融温度を算出した。配列番号２１のＲＳＶ  Ｆタンパク質の溶融温度は６８．５度であった（図４）。３５７位および３７１位に置換のない参照融合前ＲＳＶ  Ｆの溶融温度は６５．０であり、二重変異により溶融温度が３．５度上昇したことを意味する。
【００７７】
【表１】
2019523644.tif 000002
【００７８】
【表２】
2019523644.tif 000003
【００７９】
配列
ＲＳＶ  Ｆタンパク質完全長配列サブグループＡ（配列番号１３）
【化１】
2019523644.tif 000004
ＲＳＶ  Ｆタンパク質Ｂ１完全長配列（配列番号１５）
【化２】
2019523644.tif 000005
配列番号１４（フィブリチン）
ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ
ＲＳＶ  Ｆタンパク質ＣＬ５７−ｖ２２４完全長配列（配列番号２０）
【化３】
2019523644.tif 000006
ＲＳＶ  Ｆ、Ｎ６７Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｄ４８６Ｎ、ならびに３５７Ｋおよび３７１Ｙ（配列番号２１）
【化４】
2019523644.tif 000007
ＣＲ９５０１重鎖（配列番号１６）：
【化５】
2019523644.tif 000008
ＣＲ９５０１軽鎖（配列番号１７）：
【化６】
2019523644.tif 000009
ＣＲ９５０２重鎖（配列番号１８）：
【化７】
2019523644.tif 000010
ＣＲ９５０２軽鎖（配列番号１９）：
【化８】
2019523644.tif 000011
【図１】
2019523644.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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