(57)【要約】  式(I):2019527704.tif 000036式中:  Zは直接結合または-(CH2)n-であり、ここでnは1または2であり;  XおよびYの一方はN、CHまたはCFであり、そしてXおよびYの他方はCHであり;  R1およびR2の一方は-NHR、-NR2、-OR、-SR、-S(O)R、-S(O)2Rおよび下式(A):2019527704.tif 000037の基から選ばれ、そしてR1およびR2の他方は-NHR'、-OH、-OR'および上式(A)の基から選ばれ;  Rは無置換C1-C6アルキルであり;  R'はC1-C6アルキル、5-〜12-員アリールおよびC3-C6シクロアルキルから選ばれる基であり、該基は無置換であるかまたは置換されており;  Wは-(CH2)m-、-CH2-O-CH2-、-CH2-S-CH2-または-CH2-S(O)2-CH2-であり;  pは1であり、qは1〜6の整数であり、そしてVはNであり;あるいはpは1であり、qは0であり、そしてVはCHであり;あるいはpは0であり、qは0であり、そしてVはNであり;  rは0または1であり;および  R3は-(CH2)s-NH2または-(CH2)s-OHであり、ここで sは0または1〜4の整数である;のピリミジン誘導体およびその薬学的に許容可能な塩は、RSVの阻害剤であり、従って、RSV感染治療または予防するために使用され得る。【選択図】なし
2019527704.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I):
【化１】
2019527704.tif 000033
式中:
Zは直接結合または-(CH2)n-であり、ここでnは1または2であり;
XおよびYの一方はN、CHまたはCFであり、そしてXおよびYの他方はCHであり;
R1およびR2の一方は-NHR、-NR2、-OR、-SR、-S(O)R、-S(O)2Rおよび下式(A):
【化２】
2019527704.tif 000034
の基から選ばれ、そしてR1およびR2の他方は-NHR'、-OH、-OR'および上式(A)の基から選ばれ;
Rは無置換C1-C6アルキルであり;
R'はC1-C6アルキル、5-〜12-員アリールおよびC3-C6シクロアルキルから選ばれる基であり、該基は無置換であるかまたは置換されており;
Wは-(CH2)m-、-CH2-O-CH2-、-CH2-S-CH2-または-CH2-S(O)2-CH2-であり;
mは1〜4の整数であり;
pは1であり、qは1〜6の整数であり、そしてVはNであり;あるいはpは1であり、qは0であり、そしてVはCHであり;あるいはpは0であり、qは0であり、そしてVはNであり;
rは0または1であり;および
R3は-(CH2)s-NH2または-(CH2)s-OHであり、ここで sは0または1〜4の整数である;
のピリミジン誘導体である化合物またはその薬学的に許容可能な塩。
【請求項２】
R'がC1-C6アルキル、5-〜12-員アリールおよびC3-C6シクロアルキルから選ばれる基であり、該基が無置換であるかまたはR、-OH、-OR、-CF3、-S(O)2R、-CN、-NH2、-NHRまたはNR2により置換されており、ここでRが請求項１で定義した通りである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Zが直接結合である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
R1およびR2の少なくとも１つが式(A)の基である、前記請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
式(A)の基が以下の構造:
【化３】
2019527704.tif 000035
から選ばれる、前記請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
1'-((2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-(イソペンチルアミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン;
1'-((2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-(((1r,4r)-4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン;
1'-((2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-((2-モルホリノエチル)アミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン;
1'-((2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-((4-ヒドロキシブチル)アミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン;
1'-((2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-(イソブチルアミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン;
1'-((2-(4-アミノメチル)ピぺリジン-1-イル)-4-(イソブチルアミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン;
6'-フルオロ-1'-((4-(イソペンチルアミノ)-2-(ピロリジン-1-イル)ピリミジン-5-イル)メチル)スピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン;
6'-フルオロ-1'-((4-(イソブチルアミノ)-2-モルホリノピリミジン-5-イル)メチル)スピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン;
1'-((2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-モルホリノピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン;
1'-((2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-((3-メトキシプロピル)アミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン;
1'-((2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-((3-メトキシプロピル)アミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン;
1'-((4-(3-アミノピロリジン-1-イル)-2-((4-ヒドロキシブチル)アミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン;
1'-((2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-(1,1-ジオキシドチオモルホリノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン;
1'-{[2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-(4-メタンスルホニルピペラジン-1-イル)ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2' ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン;
1-[2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-5-({6'-フルオロ-2'-オキソ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-1'-イル}メチル)ピリミジン-4-イル]ピロリジン-2-カルボキサミド;
1'-{[2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-[(4-ヒドロキシブチル)スルファニル]ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン;
1'-{[4-(4-アセチルピペラジン-1-イル)-2-(3-アミノピロリジン-1-イル)ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン;
1'-{[2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-[(2-メタンスルホニルエチル)アミノ]ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン;
1'-{[2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-[(5-ヒドロキシペンチル)アミノ]ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン;
1'-{[2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-[(4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロブタン-1,3'-インドール]-2'-オン;
1'-{[2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-(5-ヒドロキシペント-1-イン-1-イル)ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン;
1'-{[2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-(3-フルオロプロポキシ)ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン;
1'-{[2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-{[(オキサン-4-イル)メチル]アミノ}ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン;
1'-{[2-(4-アミノピぺリジン-1-イル)-4-[(4-ヒドロキシブチル)アミノ]ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン;
1'-({2-[(2-アミノエチル)アミノ]-4-[(4-ヒドロキシブチル)アミノ]ピリミジン-5-イル}メチル)-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン;
1'-{[2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-[(2-ヒドロキシエチル)アミノ]ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン;
1'-{[2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-[(3-ヒドロキシプロピル)アミノ]ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン;
1'-{[2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-(プロピルアミノ)ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン;および
1'-{[2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-(エチルアミノ)ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン;
ならびにそれらの薬学的に許容可能な塩から選ばれる、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物および薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含有する医薬組成物。
【請求項８】
療法による人体または動物体の治療において使用するための前記請求項のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
RSV感染の治療または予防において使用するための請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
RSV感染の治療または予防において使用するための医薬の製造における請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物の有効量を被検体に投与することを含む、RSV感染を患うまたはRSV感染を起こしやすい被検体の治療方法。
【請求項１２】
(a)請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物;および
(b)１つ以上のさらなる治療剤;
を含む、RSV感染を患うまたはRSV感染を起こしやすい被検体の治療における同時、別途または連続使用のための製品。
【請求項１３】
さらなる治療剤が:
(i)RSVヌクレオカプシド(N)-タンパク質阻害剤;
(ii)リンタンパク質(P)タンパク質および/または巨大(L)タンパク質を阻害するような別のタンパク質阻害剤;
(iii)F-タンパク質抗体のような抗-RSVモノクローナル抗体;
(iv)免疫調節toll様受容体化合物;
(v)抗インフルエンザおよび/または抗ライノウイルス化合物のような別の呼吸器系ウイルス抗ウイルス剤;および/または
(vi)抗炎症性化合物
である、請求項１２に記載の製品。
【請求項１４】
(a)請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物、および(b)請求項１３に記載の１つ以上のさらなる治療剤を、薬学的に許容可能な担体または希釈剤と共に含有する医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載の式(I)のピリミジンを適切な溶媒中、適切な酸と反応させることを含む、請求項１に記載の薬学的に許容可能な塩の製造方法。
【請求項１６】
酸が塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、エタンスルホン酸、アスパラギン酸およびグルタミン酸から選ばれる、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ピリミジン化合物および呼吸器合胞体ウイルス(RSV)感染の治療または予防におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
RSVは、パラミクソウイルス科のマイナス一本鎖RNAウイルスである。RSVは、表面を介してまたは手から手への移動により感染した人からの分泌物によって容易に伝染する。インフルエンザとは異なり、それは小粒子エアロゾルによって伝染しない。接種の成功後、インキューべーション期間は４〜６日の間であり、その間ウイルスは、感染細胞の未感染細胞との融合によっておよび壊死上皮の腐肉形成によって、鼻咽頭から下気道へと拡散する。幼児において、増加した粘液分泌および浮腫と相まって、これは粘液栓塞に至り、細気管支炎を示す遠位肺組織の過膨張および崩壊を引き起し得る。低酸素症は一般的であり、そして呼吸困難のために供給能力はしばしば損なわれる。RSV肺炎において、気道の炎症性湿潤は単核細胞からなり、そして細気管支、気管支および肺胞を含んでより一般化される。ウイルス排出の持続時間および程度は、臨床兆候および疾患の重篤度と相関していることが見い出された。
【０００３】
RSVは、世界中で、幼児および小児における重篤な呼吸器感染症の主な原因である。最も高い罹患率および死亡率は早産で生まれた幼児および小児および肺または心臓疾患を持って生まれた幼児および小児において生じるが、RSV感染のために入院した多くの幼児はその他の点で健康である。幼年期における重篤なRSV感染は、数年間の再発性喘鳴に至り得、そして後の喘息の発症に関連する。
【０００４】
RSVはまた、老人ならびに免疫不全の子供および成人ならびに慢性閉塞性肺疾患(COPD)および鬱血性心不全(CHF)を有するこれらの人々における罹患率および死亡率の主要な原因である。
【０００５】
RSVは、特定の季節に発生する;それは高度に予測可能であり、そして両半球の冬において、欧州および北米において９月〜５月に発生し、１２月および１月にピークに達し、そして熱帯国において年中発生し得る。それは２歳までに>90%の幼児および小児に影響を及ぼし、そして自然免疫は短命である;多くは毎年再感染する。インフルエンザのように、高齢者において、RSVは、10%の死亡率を伴って約10%の冬の入院を引き起こす。
【０００６】
現在の抗-RSV治療は、パリビズマブと呼ばれるRSVに対するモノクローナル抗体の使用を含む。そのようなパリビズマブの使用は、治療的よりもむしろ予防的なRSVの治療である。この抗体はしばしば効果的であるが、その使用は早産児および危険が高い幼児に対して制限される。実際、その限定された有用性は、抗-RSV治療を必要とする多くの人々にとって利用できないことを意味する。従って、既存の抗-RSV治療に対する効果的な代替物の緊急の必要性がある。
【０００７】
さらに、ベンズイミダゾールベースの化合物を含むいくつかの化合物がRSVの阻害剤として提案されている。例えば、K D Combrink et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 17 (2007), 4784-4790は、化合物BMS-433771およびその変形体を開示している。さらなるベンズイミダゾールベースの化合物は、WO-02/062290、WO-03/053344およびWO-10/103306に開示されている。
【０００８】
WO 2013/068769およびWO2016/055780は、RSVに対する活性を有するベンズイミダゾール化合物を開示している。しかしながら、さらなる化合物、特に好ましい薬物動態プロファイルを有する化合物を同定する必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
現在、新規な一連のピリミジン化合物が、好ましい薬物動態を有するRSV阻害剤として活性であることが見い出された。従って、本発明は、式(I):
【００１０】
【化１】
2019527704.tif 000003
【００１１】
式中:
Zは直接結合または-(CH2)n-であり、ここでnは1または2であり;
XおよびYの一方はN、CHまたはCFであり、そしてXおよびYの他方はCHであり;
R1およびR2の一方は-NHR、-NR2、-OR、-SR、-S(O)R、-S(O)2Rおよび下式(A):
【００１２】
【化２】
2019527704.tif 000004
【００１３】
の基から選ばれ、そしてR1およびR2の他方は-NHR'、-OH、-OR'および上式(A)の基から選ばれ;
Rは無置換C1-C6アルキルであり;
R'はC1-C6アルキル、5-〜12-員アリールおよびC3-C6シクロアルキルから選ばれる基であり、該基は無置換であるかまたは置換されており;
Wは-(CH2)m-、-CH2-O-CH2-、-CH2-S-CH2-または-CH2-S(O)2-CH2-であり;
mは1〜4の整数であり;
pは1であり、qは1〜6の整数であり、そしてVはNであり;あるいはpは1であり、qは0であり、そしてVはCHであり;あるいはpは0であり、qは0であり、そしてVはNであり;
rは0または1であり;および
R3は-(CH2)s-NH2または-(CH2)s-OHであり、ここで sは0または1〜4の整数である;
のピリミジン誘導体である化合物またはその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本明細書中で定義した任意の基、環、置換基または部分が置換されている場合、典型的には以下で定義されるようなQによって置換されている。
【００１５】
C1-6アルキル基または部分は、直線または分岐である。C1-6アルキル基は典型的には、C1-4アルキル基またはC4-6アルキル基である。C1-6アルキル基および部分の例は、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、i-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、i-ペンチル(すなわち、3-メチルブト-1-イル)、t-ペンチル(すなわち、2-メチルブト-2-イル)、ネオペンチル(すなわち、2,2-ジメチルプロパン-1-イル)、n-ヘキシル、i-ヘキシル(すなわち、4-メチルペンタン-1-イル)、t-ヘキシル(すなわち、3-メチルペンタン-3-イル)およびネオペンチル(すなわち、3,3-ジメチルブタン-1-イル)を含む。疑念を避けるために、基中に２つのアルキル部分が存在する場合、アルキル部分は同じであっても異なっていてもよい。C1-6アルキル基は、無置換であるかまたは、典型的には以下で定義されるような１つ以上の基Qにより置換されている。例えば、C1-6アルキル基は、無置換であるかまたは以下で定義されるような1、2または3個の基Qにより置換されている。
【００１６】
Qはハロ、ニトロ、-CN、OH、C1-6アルコキシ、C1-6ヒドロキシアルキル、C1-6アルキルチオ、C1-6ハロアルキル、C1-4ハロアルコキシ、-CO2R'''、-NR'''2、-SR'''、-S(=O)R'''、-S(=O)2R'''、C3-C10シクロアルキル、5〜10-員ヘテロシクリル、5-〜12-員アリールまたは5-〜12-員ヘテロアリールであり、ここで各R'''は独立してH、C1-6アルキル、C3-10シクロアルキル、5〜10-員ヘテロシクリル、5-〜12-員アリールおよび5-〜12-員ヘテロアリールから選ばれる。
【００１７】
C1-6アルコキシ基は、直線または分岐である。それは、典型的にはC1-4アルコキシ基、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、i-プロポキシ、n-プロポキシ、n-ブトキシ、sec-ブトキシまたはtert-ブトキシ基である。C1-6アルコキシ基は、無置換であるかまたは、典型的には定義されるような１個以上の基Qにより置換されている。
【００１８】
C1-6アルキルチオ基は、直線または分岐である。それは、典型的にはC1-4アルキルチオ基、例えばメチルチオ、エチルチオ、プロピルチオ、i-プロピルチオ、n-プロピルチオ、n-ブチルチオ、sec-ブチルチオまたはtert-ブチルチオ基である。C1-6アルキルチオ基は、無置換であるかまたは、典型的には定義されるような１個以上の基Qにより置換されている。
【００１９】
ハロゲンまたはハロ基は、F、Cl、BrまたはIである。好ましくは、それはF、ClまたはBrである。ハロゲンにより置換されたC1-6アルキル基は、「C1-6ハロアルキル」と示され得、これは１個以上の水素がハロにより置き換えられている上記で定義されたC1-6アルキル基を意味する。同様に、ハロゲンにより置換されたC1-6アルコキシ基は、「C1-6ハロアルコキシ」と示され得、これは１個以上の水素がハロにより置き換えられている上記で定義されたC1-6アルコキシ基を意味する。典型的には、C1-6ハロアルキルまたはC1-6ハロアルコキシは、1、2または3個の該ハロゲン原子により置換されている。ハロアルキル基およびハロアルコキシ基は、-CX3および-OCX3（ここでXはハロゲンである）のようなパーハロアルキルおよびパーハロアルコキシ基、例えば-CF3-CCl3 -OCF3および-OCCl3を含む。
【００２０】
C1-6ヒドロキシアルキル基は、１個以上のOH基により置換された上記で定義されたC1-6アルキル基である。典型的には、それは１、２または３個のOH基により置換されている。好ましくは、それは１個のOH基により置換されている。
【００２１】
5-〜12-員アリール基は、5〜12個の炭素原子、例えば6〜10個の炭素原子、例えば6個または10個の炭素原子を含む芳香族炭素環式基である。それは、単環式または縮合２環式環系（ここで芳香環は別の芳香族炭素環式環に縮合している）である。5-〜12-員アリール基の例は、フェニルおよびナフチルを含む。置換されている場合、アリール基は典型的には、C1-4アルキルまたは上記で定義されるような基Q、例えばC1-4アルキル基および上記で定義されるような基Qから選ばれる1、2または3個の基により置換されている。
【００２２】
C3-10シクロアルキル基は、3〜10個の炭素原子を有する飽和炭化水素環である。C3-10シクロアルキル基は、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルまたはシクロへプチルのようなC3-C7シクロアルキルであり得る。典型的には、それはC3-C6シクロアルキルまたはC4-C6シクロアルキル、例えばシクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシルである。１つの実施態様において、それはシクロブチルである。C3-10シクロアルキル基は、無置換であるかまたは、典型的には上記で定義されるような１個以上の基Qにより置換されている。
【００２３】
5-〜12-員ヘテロアリール基または部分は、O、NおよびSから選ばれる1、2、3または4個のヘテロ原子を含む5-〜12-員芳香族複素環基である。それは単環式または二環式である。典型的には、それは１個のN原子およびO、SおよびNから選ばれる0、1、2または3個の追加のヘテロ原子を含む。それは、例えば、5-〜7-員ヘテロアリール基、例えば5-または6-員N-含有ヘテロアリール基であり得る。例は、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、フラニル、チエニル、ピラゾリジニル、ピロリル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、チアジアゾリル、イミダゾリルおよびピラゾリル基を含む。フラニル、チエニル、ピリジルおよびピリミジニル基が好ましい。置換されている場合、ヘテロアリール基は典型的には、C1-4アルキル基および上記で定義されるような基Qから選ばれる１個以上、例えば1、2または3個の基により置換されている。
【００２４】
5-〜10-員ヘテロシクリル部分は、環中の少なくとも１個、例えば1、2または3個の炭素原子がO、S、SO、SO2、COおよびNから選ばれる原子または基で置き換えられている、単環式または二環式非芳香族、飽和または不飽和C5-10炭素環式環である。典型的には、それは、環中の1、2または3個の炭素原子がO、S、SO2、COおよびNHから選ばれる原子または基で置き換えられている飽和C5-10環である。より典型的には、それは、単環式環、好ましくは単環式C5-C6環である。例は、ピペリジル、ピぺリジン-2,6-ジオニル、ピぺリジン-2-オニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、S,S-ジオキソチオモルホリニル、1,3-ジオキソラニル、ピロリジニル、イミダゾール-2-オニル、ピロリジン-2-オニル、テトラヒドロフラニルおよびテトラヒドロピラニル部分を含む。
【００２５】
しかしながら、疑念を避けるために、ヘテロアリール基およびヘテロシクリル基の上記定義は、環中に存在し得る「N」原子に言及し、熟練した化学者に明らかなように、N原子は、単結合を介してそれぞれの隣接する環原子に結合する場合、プロトン化される(または上記で定義されるような置換基を有する)。このようなプロトン化形態は、ヘテロアリール基およびヘテロシクリル基の本定義内に含まれる。
【００２６】
式(I)のピリミジンにおいて、Zは直接結合または-(CH2)n-であり、ここでnは1または2である。１つの実施態様において、Zは直接結合である。
【００２７】
式(I)において、XおよびYの一方はN、CHまたはCFであり、そして他方はCHである。典型的には、XおよびYの一方はNまたはCFであり、そして他方はCHである。１つの実施態様において、XはCFであり、そしてYはCHである。別の実施態様において、XはNであり、そしてYはCHである。
【００２８】
R1およびR2の一方は-NHR、-NR2、-OR、-SR、-S(O)R、-S(O)2Rおよび下式(A):
【００２９】
【化３】
2019527704.tif 000005
【００３０】
の基から選ばれ、そしてR1およびR2の他方は-NHR'、-OH、-OR'および上式(A)の基から選ばれ、ここでR、p、q、V、W、R3、rおよびWは全て上記で定義した通りである。１つの実施態様において、R1およびR2の少なくとも１つは式(A)の基である。別の実施態様において、R1およびR2のそれぞれが式(A)の基である。
【００３１】
基R'はC1-C6アルキル、例えばC1-C4アルキルであり得る。あるいは、それは5-〜12-員アリール、例えばフェニル;またはC3-C6シクロアルキル、例えばC4-C6アルキルである。基R'は無置換であるかまたは置換されている。置換されている場合、それは典型的にはR、-OH、-OR、-CF3、-S(O)2R、-CN、-NH2、-NHRまたはNR2によって置換されており、ここでRは上記で定義した通りである。
【００３２】
Wは-(CH2)m-、-CH2-O-CH2-、-CH2-S-CH2-および-CH2-S(O)2-CH2-から選ばれ、ここでmは1〜4の整数である。典型的には、Wは-(CH2)m-、-CH2-O-CH2-および-CH2-S(O)2-CH2-から選ばれる。
【００３３】
Wが-(CH2)m-でありかつVがCHである場合、V、WならびにVおよびWが結合する２個のC原子により形成される環は、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルまたはシクロへプチルであり、そして上記で定義した通りのR3により置換されていてもよい。これらの実施態様において、pは1であり、かつqは0である。
【００３４】
Wが-(CH2)m-でありかつVがNである場合、V、WならびにVおよびWが結合する２個のC原子により形成される環は、アゼチジニル、ピロリジニル、ピぺリジニルまたはアゼパニルであり、そして上記で定義した通りのR3により置換されていてもよい。これらの実施態様において、pは1であり、かつqは1〜6、典型的には1〜3の整数、より典型的には1である。あるいは、これらの実施態様において、pおよびqは両方とも0である。
【００３５】
Wが-CH2-O-CH2-でありかつVがNである場合、V、WならびにVおよびWが結合する２個のC原子により形成される環は、モルホリニルである。Wが-CH2-O-CH2-でありかつVがCHである場合、V、WならびにVおよびWが結合する２個のC原子により形成される環は、ピラニルである。
【００３６】
式(A)の基において、pは1であり、qは1-6、例えば1-3の整数であり、そしてVはNである;またはpは1であり、qは0であり、そしてVはCHである;またはpは0であり、qは0であり、そしてVはNである。１つの実施態様において、pは1であり、qは1または2であり、そしてVはNである。
【００３７】
式(A)の基の例は、以下の構造を含む:
【００３８】
【化４】
2019527704.tif 000006
【００３９】
本発明の特定の化合物は、以下の表に示す化合物およびその薬学的に許容可能な塩を含む:
【００４０】
【表１−１】
2019527704.tif 000007
【００４１】
【表１−２】
2019527704.tif 000008
【００４２】
【表１−３】
2019527704.tif 000009
【００４３】
【表１−４】
2019527704.tif 000010
【００４４】
【表１−５】
2019527704.tif 000011
【００４５】
【表１−６】
2019527704.tif 000012
【００４６】
本発明の化合物は、不斉中心またはキラル中心を含み得、従って異なる立体異性形態で存在する。ジアステレオマー、エナンチオマーおよびアトロプ異性体、ならびにラセミ混合物などのそれらの混合物を含むがこれらに限定されない本発明の化合物の全ての立体異性形態が本発明の一部を形成することが意図される。１つ以上のキラル中心を含む式(I)の化合物は、エナンチオマー的またはジアステレオ異性体的に純粋な形態で、または異性体の混合物の形態で使用され得る。
【００４７】
本発明は、上記定義した通りの本発明の化合物の全ての幾何および位置異性体を含む。例えば、本発明の化合物が二重結合または縮合環を含む場合、cis-およびtrans-体、ならびにそれらの混合物は本発明の範囲内に含まれる。また、単一の位置異性体および位置異性体の混合物の両方とも、本発明の範囲内である。
【００４８】
本発明の化合物は、無溶媒和物形態ならびに水、エタノールなどの薬学的に許容可能な溶媒との溶媒和形態で存在し得、そして本発明は溶媒和物形態および無溶媒和物形態の両方を含むことが意図される。
【００４９】
本発明の化合物は、異なる互変異性形態で存在し得、そして全てのこのような形態は本発明の範囲内である。用語「互変異性体」または「互変異性形態」は、低エネルギー障壁を介して相互変換可能な異なるエネルギーの構造異性体をいう。例えば、プロトン互変異生態(プロトトロピー互変異性体としても知られる)は、ケト-エノール互変異性のようなプロトンの移動を介する相互変換を含む。原子価互変異性体は、いくつかの結合電子の再編成による相互変換を含む。
【００５０】
本発明の化合物は、以下の実施例に記載の合成方法によって、またはこのような方法と類似の方法によって調製され得る。
【００５１】
従来の方法によって、式(I)のピリミジンはその薬学的に許容可能な塩に変換され得、そして塩は遊離化合物に変換され得る。例えば、式(I)のピリミジンは、薬学的に許容可能な酸と接触して薬学的に許容可能な塩を形成し得る。薬学的に許容可能な塩は、薬学的に許容可能な酸または塩基との塩である。
【００５２】
薬学的に許容可能な酸は、塩酸、硫酸、リン酸、二リン酸、臭化水素酸または硝酸などの無機酸、およびクエン酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、酒石酸、安息香酸、酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸またはp-トルエンスルホン酸などの有機酸の両方を含む。薬学的に許容可能な塩基は、アルカリ金属(例、ナトリウムまたはカリウム)およびアルカリ土類金属(例、カルシウムまたはマグネシウム)水酸化物およびアルキルアミン、アラルキルアミンおよび複素環アミンなどの有機塩基を含む。
【００５３】
本発明の化合物は、生物学的試験において呼吸器合胞体ウイルス(RSV)の阻害剤であると見い出された。化合物は、従って治療的に有用である。従って、本発明は、人体または動物体の療法による治療方法における使用のための、上記で定義した通りの式(I)のピリミジンである化合物、またはその薬学的に許容可能な塩をさらに提供する。本発明はまた、RSV感染の治療または予防方法における使用のための、上記で定義した通りの本発明の化合物を提供する。なおさらに、本発明は、RSV感染の治療または予防における使用のための医薬の製造における、上記で定義した通りの本発明の化合物の使用を提供する。RSV感染を患うまたはRSV感染を起こしやすい被検体は、従って上記で定義した通りの本発明の化合物の該被検体への投与を含む方法によって治療され得る。被検体の状態は、それによって改善または和らげられ得る。
【００５４】
RSV感染は、典型的には気道感染である。RSV感染は、子供、例えば１０歳以下の子供または２歳以下の幼児における感染であり得る。１つの実施態様において、本発明は、小児患者におけるRSV感染の治療または予防における使用のための、上記で定義した通りの化合物を提供する。或いは、感染は、熟年または高齢者、例えば60歳を超える成人、70歳を超える成人、または80歳を超える成人における感染であり得る。本発明はさらに、高齢患者におけるRSV感染の治療または予防における使用のための化合物を提供する。
【００５５】
RSV感染は、免疫不全個体あるいはCOPDまたはCHFを患う個体における感染であり得る。別の実施態様において、RSV感染は、易感染性でない個体、例えばその他の点で健康である個体における感染である。
【００５６】
本発明の化合物は、種々の剤形で、例えば錠剤、カプセル、糖-またはフィルム-被覆錠剤、液体溶液または懸濁液の形態で経口で、または非経口、例えば筋肉内、静脈内または皮下で投与され得る。従って、化合物は、注入、点滴によって、または吸入または噴霧によって与えられ得る。化合物は、好ましくは経口投与によって与えられる。
【００５７】
用量は、患者の年齢、体重および状態、および投与経路を含む種々の因子に依存する。１日投与量は、広範な制限内で変化し得、そして個々における個体の要求に調節される。しかしながら、典型的には、化合物が単独で成人のヒトに投与される場合の各投与経路について採用される用量は、0.0001〜650 mg/kg体重、最も一般的には0.001〜10 mg/kg体重の範囲、例えば0.01〜1 mg/kgである。このような用量は、例えば１日1〜5回与えられ得る。静脈内注入について、適切な１日用量は、0.0001〜1 mg/kg体重、好ましくは0.0001〜0.1 mg/kg体重である。１日投与量は、単回投与量として、または分割投与スケジュールに従って投与され得る。
【００５８】
錠剤またはカプセルなどの単位用量形態は、通常1-250 mgの活性成分を含む。例えば、式(I)の化合物は、100-250 mgの間の用量で１日１回、１日２回または３回のいずれかでヒト患者に投与され得る。例えば、式(I)の化合物は、100-250 mgの間の用量で１日１回、１日２回または３回のいずれかでヒト患者に投与され得る。
【００５９】
式(I)の化合物およびその薬学的に許容可能な塩は、そのままで使用され得る。あるいは、それらは、医薬組成物の形態で投与され得る。従って、本発明はまた、本明細書中前記で定義した通りの式(I)の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を、薬学的に許容可能な補助剤、希釈剤または担体と共に含有する医薬組成物を提供する。適切な医薬製剤の選択および調製についての従来の手順は、例えば"Pharmaceuticals - The Science of Dosage Form Designs", M. E. Aulton, Churchill Livingstone, 1988に記載されている。
【００６０】
投与の様式に依存して、医薬組成物は、好ましくは0.05〜99 %w(重量パーセント)、より好ましくは0.05〜80 %w、なおより好ましくは0.10〜70 %w、およびさらにより好ましくは0.10〜50 %wの活性成分を含有し、全ての重量パーセントは全組成物に基づく。
【００６１】
本発明はさらに、本明細書中前記で定義した通りの式(I)の化合物またはその薬学的に許容可能な塩を薬学的に許容可能な補助剤、希釈剤または担体と混合することを含む、本発明の医薬組成物の調製方法を提供する。
【００６２】
本発明の化合物は、種々の剤形で投与され得る。従って、それらは、例えば錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性または油性懸濁液、溶液、分散性粉末または顆粒として経口投与され得る。本発明の化合物はまた、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、経皮、点滴技術によるかまたは吸入または噴霧によるかであろうとなかろうと、非経口で投与され得る。化合物はまた、坐剤として投与され得る。
【００６３】
本発明の医薬組成物の固体経口形態は、活性化合物と一緒に、希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、コーンスターチまたはジャガイモでんぷん;潤滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、および/またはプリエチレングリコール;結合剤;例えばでんぷん、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルピロリドン;脱凝集剤、例えばでんぷん、アルギン酸、アルギネートまたはでんぷんグリコール酸ナトリウム;泡立ち混合物;染料;甘味料;湿潤剤、例えばレシチン、ポリソルベート、ラウリルサルフェート;および一般に医薬製剤において使用される非毒性および薬理学的不活性物質を含み得る。そのような医薬製剤は、公知の方法、例えば混合、顆粒化、打錠、糖被覆またはフィルム被覆プロセスによって製造され得る。
【００６４】
経口投与のための液体分散液は、シロップ、乳化液および懸濁液であり得る。シロップは、担体として、例えばサッカロースまたはグリセリンおよび/またはマンニトールおよび/またはソルビトールと一緒にサッカロースを含み得る。
【００６５】
懸濁液および乳化液は、担体として、例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロール、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルアルコールを含み得る。筋肉内注入のための懸濁液または乳化液は、活性化合物と一緒に、薬学的に許容可能な担体、例えば滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール、例えばプロピレングリコール、および所望であれば適切な量のリドカイン塩酸塩を含み得る。懸濁液のためのさらなる適切な担体は、滅菌水、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ポリソルベート80、ポリビニルピロリドン(PVP)、エアロゾルAOT(すなわち、l,2-ビス(2-エチルヘキソキシカルボニル)エタンスルホン酸ナトリウム)、pluronic F127および/またはcaptisol(すなわち、スルホブチルエーテル-ベータ-シクロデキストリン)を含む。
【００６６】
本発明の化合物は、例えば:
(i) 0.5% w/vヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)/0.1% w/vポリソルベート80;
(ii) 0.67% w/vポリビニルピロリドン(PVP)/0.33% w/vエアロゾルAOT(l,2-ビス(2-エチルヘキソキシカルボニル)エタンスルホン酸ナトリウム);
(iii) 1 % w/v pluronic F 127;および
(iv) 0.5% w/vポリソルベート80
から選ばれる担体中の水性懸濁液として処方され得る。
【００６７】
担体は、当業者に公知の標準的な手順によって調製され得る。例えば、担体(i)〜(iv)のそれぞれは、必要な量の賦形剤を適切な容器に量り取り、最終体積の約80%の水を加え、そして溶液が形成されるまで磁気攪拌することによって調製され得る。次いで担体は、水で所定の体積にされる。式Iの化合物の水性懸濁液は、必要な量の式Iの化合物を適切な容器に量り取り、必要な体積の100%の担体を加え、そして磁気攪拌することによって調製され得る。
【００６８】
注入または点滴のための溶液は、担体として、例えば滅菌水を含み得るか、または、好ましくはそれらは滅菌の水性の等張生理食塩溶液の形態であり得る。
【００６９】
本発明の化合物はまた、ウイルス感染の治療のために用いられる他の化合物と共に投与され得る。従って、本発明はさらに、ウイルス感染、特にRSVによる感染の治療または予防のための、本発明の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、あるいは本発明の化合物を含有する医薬組成物または製剤を、他の治療剤（単数または複数）と同時にまたは連続で、あるいはこれら治療剤との組み合わせ製剤として投与する組み合わせ療法に関する。
【００７０】
本明細書中、用語「組み合わせ」が使用され、これは同時、個別または連続投与をいうと理解されるべきである。本発明の１つの局面において、「組み合わせ」は同時投与をいう。本発明の別の局面において、「組み合わせ」は個別投与をいう。本発明のさらなる局面において、「組み合わせ」は連続投与をいう。投与が連続または個別である場合、第２成分の投与の遅延は、組み合わせの有益な効果を喪失するようなものではないべきである。
【００７１】
組み合わせ療法における使用に適切な治療剤は、
(i)RSVヌクレオカプシド(N)-タンパク質阻害剤;
(ii)リンタンパク質(P)タンパク質および巨大(L)タンパク質を阻害するような他のRSVタンパク質阻害剤;
(iii)F-タンパク質抗体のような抗-RSVモノクローナル抗体;
(iv)免疫調節toll様受容体化合物;
(v)抗インフルエンザおよび抗ライノウイルス化合物のような他の呼吸器系ウイルス抗ウイルス剤;および/または
(vi)抗炎症性化合物を含む。
【００７２】
RSVヌクレオカプシド(N)-タンパク質は、ウイルス転写および複製において極めて重要な役割を果たし、ゲノムRNAとウイルスでコードされたRNA-依存RNAポリメラーゼとの間の相互作用を媒介する。RSV P-およびL-タンパク質は、RSVのウイルスでコードされたRNA-依存RNAポリメラーゼの成分である。
【００７３】
本発明のさらなる局面によれば、RSVの治療において使用するための、上記(i)〜(vi)として列挙した治療剤の１つ以上と組み合わせた本明細書中前記で定義した通りの式(I)の化合物またはその薬学的に許容可能な塩が提供される。
【００７４】
以下の実施例は本発明を例示する。しかしながら、それらは本発明をいかようにも限定しない。
【実施例】
【００７５】
全ての温度は℃である。融点はStuart SMP30デジタル融点機器を用いてオープンキャピラリー中で測定し、そして補正しない。NMRスペクトルは、Bruker Avance-III-400(1H=400.06 MHz; 19F=376.4 MHz; 13C=100.6 MHz)で周囲プローブ温度(名目295K)で重クロロホルム(CDCl3)または六重水素化ジメチルスルホキシド(DMSO-d6)のいずれかを溶媒として用いて記録した。化学シフト(δ)は、ppm対内部標準としてのTMS(1H NMR, 13C NMR)で与える。結合定数は、ヘルツ(Hz)で与える。CI MS(陽イオン)は、TLCプレートエクスプレスリーダーを用いてAdvionエクスプレッションコンパクト質量分析計で行った。シリカゲルプレート、Supelco. S-A(254nMでの蛍光指示薬)(Sigma-Aldrich Chemie GmbH Riedstr. 2D-8955T, Steinheim 497329-970, Germany)をTLCモニタリングのために用いた。
【００７６】
追加の液体クロマトグラフィー質量スペクトルは、Acquity UPLC(Waters Corp.)を備えたQToF Premier質量分析計で得た。LC分離は、100%水性(0.1%の水中ギ酸)〜100%有機(0.1%のアセトニトリル中ギ酸)の逆相勾配を用いて0.6 mL/minでC18 BEHクロマトグラフィーカラム(2.1 mm x 100 mmおよび1.7 um粒子径)上で達成した。カラムクロマトグラフィーは、Sigma-Aldrich(The Old Brickyard, Gillingham, SP8 4JL. UK)からのシリカゲル(70-230メッシュ)を用いて、またはKP-Sil, UltraまたはNHカラムを用いるBiotage Isolera Oneシステムを用いて行った。マイクロ波合成は、T640ターミナルコントローラーを有するMilestone microSYNTH MA020高度マイクロ波合成ラボステーションを用いて行った。エネルギー出力は、500ワットであり、そして加熱プログラムは、6-分温度ランプおよび10-分冷却を含んだ。試薬は、Sigma-Aldrich、FluorochemおよびAlfa Aesarから得、そしてさらなる精製なしで用いた。
【００７７】
略語
DCM:ジクロロメタン
DIAD  アゾジカルボン酸ジイソプロピル
DIPEA:N,N-ジ-イソプロピルエチルアミン
DME:1,2-ジメトキシエタン
DMF:N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO:ジメチルスルホキシド
EtOAc  酢酸エチル
EtOH  エタノール
HATU:O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HBTU:O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
HMDS  ヘキサメチルジシラザン
mCPBA  メタ-クロロパーオキシ安息香酸
MeCN  アセトニトリル
MeOH  メタノール
NMM:N-メチルモルホリン
Pd2(dba)3  トリス(ジベンジリデンアセトン)二パラジウム(0)
rt:室温
TBTU  O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N’,N’-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
TFA  トリフルオロ酢酸
THF  テトラヒドロフラン
TMEDA  N,N,N’,N’-テトラメチルエチレンジアミン
【００７８】
調製例1:
5-(ヒドロキシメチル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン
ウラシル(10.0 g, 89.2 mmol, 1.0 eq.)およびパラホルムアルデヒド(3.24 g, 107 mmol, 1.2 eq.)をKOH(0.5 M, 133 ml)で処理し、そして混合物を50℃で8時間30分間加熱し、rtで64時間攪拌し、次いで50℃で24時間加熱した。混合物を氷浴中で0℃に冷却し、そしてHCl(濃)でpH 6まで酸性化した。沈殿物を濾過し、水で洗浄し、そしてオーブン乾燥して標題化合物(4.93 g, 39%)を白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 11.05 (s, 1H), 10.71 (s, 1H), 7.24 (s, 1H), 4.85 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 4.11 (dd, J = 5.5, 1.1 Hz, 2H). Rf  = 0.10 (50:8:1 DCM:EtOH:NH3)
【００７９】
調製例2
2,4-ジクロロ-5-(クロロメチル)ピリミジン
調製例1からの5-(ヒドロキシメチル)ピリミジン-2,4(1H,3H)-ジオン(5.53 g, 38.9 mmol, 1 eq.)をオキシ塩化リン(V)(27.2 ml, 292 mmol, 7.5 eq.)で処理し、続いてDIPEA(25.8 ml, 156 mmol, 4 eq.)を滴下した。得られた懸濁物にトルエン(5.7 ml)を加え、そして混合物を110℃で19時間加熱した。オキシ塩化リン(V)を減圧下で除去し、そして残渣をHCl(1.5 M, 125 ml)に注ぎ、rtまで冷却し、そしてEtOAc(2 × 50 ml)で抽出し、水(50 ml)、NaHCO3(50 mlの飽和溶液)およびブライン(50 ml)で連続して洗浄した。有機物をMgSO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し、そしてカラムクロマトグラフィー(1:1 石油:EtOAc)により精製して標題化合物(6.07 g, 79%)を橙色オイルとして得た。
【００８０】
調製例3
2,4-ジクロロ-5-(ヨードメチル)ピリミジン
調製例2からの(2,4-ジクロロ-5-ヨードメチル)ピリミジン(6.07 g, 30.4 mmol, 1 eq.)のアセトン(30 ml)溶液にヨウ化ナトリウム(7.27 g, 30.4 mmol, 1 eq.)を加え、そして得られた混合物をrtで1時間攪拌し、次いで加熱還流し、そしてさらに30分間攪拌した。得られた混合物をrtまで冷却し、そして沈殿物を濾去した。濾液を減圧下でエバポレートし、そして残渣をジエチルエーテル(200 ml)中に取った。有機物をメタ重亜硫酸ナトリウム(50 mlの飽和溶液)、水(50 ml)およびブライン(50 ml)で連続して洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮して標題化合物(7.35 g, 84%)を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.62 (s, 1H), 4.41 (s, 2H); Rf = 0.68 (1:1 石油エーテル:EtOAc)
【００８１】
調製例4
1'-((2,4-ジクロロピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン
MeCN(50 ml)中の調製例3からの2,4-ジクロロ-5-(ヨードメチル)ピリミジン(1.73 g, 5.98 mmol, 1 eq.)、6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン(1.06 g, 5.98 mmol, 1 eq.)およびK2CO3(2.03 g, 14.7 mmol, 2.45 eq.)を5時間加熱還流した。混合物をrtまで冷却し、そしてMeCNを減圧下で除去した。残渣をDCM(50 ml)と水(50 ml)との間で分配した。有機層を水(25 ml)およびブライン(25 ml)で連続して洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣の固体をカラムクロマトグラフィー(400:8:1 DCM:EtOH:NH3)により精製して標題化合物(1.44 g, 71%)を明茶色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.56 (s, 1H), 7.11 - 7.07 (m, 2H), 6.88 - 6.82 (m, 2H), 5.06 (s, 2H), 1.71 - 1.67 (m, 2H), 1.60 - 1.56 (m, 2H); MS CI 339.8 [M + H]+
【００８２】
調製例5
1'-((2-クロロ-4-(イソペンチルアミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン
EtOH(6 ml)中の調製例4からの1'-((2,4-ジクロロピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン(145 mg, 0.43 mmol, 1 eq.)、イソペンチルアミン(51 μl, 0.59 mmol, 1 eq.)およびNaHCO3(86 mg, 1.02 mmol, 2.38 eq.)を1 h加熱還流し、そして混合物をrtで一晩攪拌した。EtOHを減圧下で除去し、そして残渣に水(20 ml)を加えた。沈殿物をろ取して標題化合物(166 mg, 99%)を灰白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 8.11 (s, 1H), 7.06 (s, 1H, NH), 6.82 - 6.74 (m, 3H), 4.72 (s, 2H), 3.47 - 3.42 (m, 2H), 1.81 - 1.78 (m, 2H), 1.67 - 1.59 (m, 3H), 1.48 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 0.95 (d, J = 6.4 Hz, 6H). MS CI 390.1 [M + H]+
【００８３】
調製例5と類似の方法で調製した化合物を以下の表に示す:
【００８４】
【表２−１】
2019527704.tif 000013
【００８５】
【表２−２】
2019527704.tif 000014
【００８６】
【表２−３】
2019527704.tif 000015
【００８７】
【表２−４】
2019527704.tif 000016
【００８８】
【表２−５】
2019527704.tif 000017
【００８９】
調製例7
1'-((2-クロロ-4-((2-モルホリノエチル)アミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン
調製例4からの1'-((2,4-ジクロロピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン(0.20 g, 0.59 mmol, 1 eq.)のMeCN(6 ml)溶液をDIPEA(206 μl, 1.18 mmol, 2 eq.)および4-(2-アミノエチル)モルホリン(78 μl, 0.59 mmol, 1 eq.)で処理した。得られた溶液をrtで60時間攪拌した。MeCNを減圧下でエバポレートし、残渣をDCM(50 ml)に溶解し、そして有機層をHCl(0.5 M, 3 × 50 ml)で抽出した。水層をpH 7.8(NaHCO3)まで塩基性化した。この溶液をDCM(3 × 50 ml)で抽出し、有機層をブライン(80 ml)で洗浄し、そしてNa2SO4で乾燥した。溶媒を減圧下でエバポレートして標題化合物(196 mg, 76%) を白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.12 (s, 1H), 7.19 (s, 1H, NH), 6.82 - 6.72 (m, 3H), 4.74 (s, 2H), 3.72 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 3.59 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 2.57 (t, J = 6.4 Hz, 2H) 2.53 (t, J = 4.4 Hz, 4H), 1.80 - 1.77 (m, 2H), 1.62- 1.59 (m, 2H); MS CI 432.9 [M + H]+.
【００９０】
調製例11
1'-((2-クロロ-4-((テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン
MeCN(4 ml)中の調製例4からの1'-((2,4-ジクロロピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン(135 mg, 0.40 mmol, 1 eq.)を4-アミノテトラヒドロピラン(41 μl, 0.40 mmol, 1 eq.)およびDIPEA(142 μl, 0.80 mmol, 2 eq.)のMeCN(2 ml)溶液で処理した。混合物をrtで60時間攪拌し、そして白色沈殿物の形成を観察した。混合物をマイクロ波バイアルに移し、そしてマイクロ波中、70℃で30分間加熱した。沈殿物を濾過し、そしてDCMに溶解した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を19:1ヘプタン:EtOAc溶液(× 3)で洗浄し、そして乾燥して標題化合物(78.1 mg, 49%)を灰白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.08 (s, 1H), 7.16 (s, 1H, NH), 6.81 - 6.71 (m, 3H), 4.70 (s, 2H), 3.52 (td, J = 7.0, 5.2 Hz, 2H), 3.44 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.32 (s, 3H), 1.90 - 1.83 (m, 2H), 1.82 - 1.77 (m, 2H), 1.60 - 1.57 (m, 2H); MS CI 404.1 [M + H]+.
【００９１】
調製例12
1'-((2-クロロ-4-((3-メトキシプロピル)アミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン
MeCN(4 ml)中の調製例4からの1'-((2,4-ジクロロピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン(135 mg, 0.40 mmol, 1 eq.)をDIPEA(142 μl, 0.80 mmol, 2 eq.)および3-メトキシプロピルアミン(43 μl, 0.40 mmol, 1 eq.)で処理した。得られた溶液をマイクロ波中、70℃で20分間攪拌した。MeCNを減圧下でエバポレートし、残渣をDCM(50 ml)に溶解し、有機層を水(2 × 20 ml)で洗浄し、そしてMgSO4で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー(15-75%ヘプタン:EtOAc)により精製して標題化合物(88 mg, 57%)を白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.08 (s, 1H), 7.16 (s, 1H, NH), 6.81 - 6.72 (m, 3H), 4.70 (s, 2H), 3.53 (td, J = 7.0, 5.2 Hz, 2H), 3.44 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.32 (s, 3H), 1.91 - 1.83 (m, 2H), 1.81 - 1.77 (m, 2H), 1.61 - 1.58 (m, 2H); MS CI 390.8 [M + H]+.
【００９２】
調製例13
1'-((4-(3-アミノピロリジン-1-イル)-2-クロロピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン
調製例4からの1'-((2,4-ジクロロピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン(135 mg, 0.40 mmol, 1 eq.)、3-アミノピロリジン二塩酸塩(64.0 mg, 0.40 mmol, 1 eq.)、NaHCO3(135 mg, 1.6 mmol, 4 eq.)およびイソプロパノール(10 ml)の混合物を2時間30分間加熱還流した。混合物をrtまで冷却し、そしてイソプロパノールを減圧下で除去した。残渣を水(20 ml)とDCM(20 ml)との間で分配した。有機層を水(20 ml)およびブライン(20 ml)で連続して洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮し、そしてカラムクロマトグラフィー(1:1ヘプタン:EtOAc〜EtOAc)により精製して標題化合物(52 mg, 34%)を灰白色固体として得た。
Rf = 0.79 (9:1 DCM:MeOH); MS CI 388.9 [M + H]+.
【００９３】
調製例14
1'-((2-クロロ-4-(1,1-ジオキシドチオモルホリノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン
調製例4からの1'-((2,4-ジクロロピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン(190 mg, 0.56 mmol, 1 eq.)、チオモルホリン-S,S-ジオキシド(58 mg, 0.56 mmol, 1 eq.)、NaHCO3(131 mg, 1.29 mmol, 2.32 eq.)およびイソプロパノール(10 ml)をマイクロ波中、100℃で30分間加熱した。イソプロパノールを減圧下で除去した。残渣をDCM(15 ml)と水(15 ml)との間で分配した。有機層を水(15 ml)およびブライン(15 ml)で連続して洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮して1’-((2-クロロ-4-チオモルホリノピリミジン-5-イル)メチル)-6’-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3’-インドリン]-2’オン(265 mg)を橙色オイルとして得、これをさらなる精製なしで次の工程に用いた。
【００９４】
1’-((2-クロロ-4-チオモルホリノピリミジン-5-イル)メチル)-6’-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3’-インドリン]-2’オン(265 mg, 0.56 mmol)のDCM(15 ml)溶液を0℃まで冷却した。mCPBA(251 mg, 1.12 mmol, 2 eq.)を5分割して5分かけて加え、そして混合物をrtまで温め、そしてさらに4時間攪拌した。混合物をNaHCO3(3 × 25 mlの飽和溶液)で洗浄し、水性洗浄液をDCM(3 × 25 ml)で抽出し、そして合わせた有機物をMgSO4で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(9:1ヘプタン:EtOAc〜1:1ヘプタン:EtOAc)により精製して標題化合物(66 mg, 20%)を白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.08 (s, 1H), 6.84 - 6.69 (m, 2H), 6.25 (dd, J = 8.6, 2.2 Hz, 1H), 4.86 (s, 2H), 4.09 - 4.01 (m, 4H), 3.29 - 3.21 (m, 4H), 1.86 - 1.79 (m, 2H), 1.64 - 1.58 (m, 2H); MS CI 437.8 [M + H]+.
【００９５】
調製例17
1'-({2-クロロ-4-[(4-ヒドロキシブチル)スルファニル]ピリミジン-5-イル}メチル)-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン
DMF(8 ml)中の調製例4からの1'-((2,4-ジクロロピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン(135 mg, 0.40 mmol, 1 eq.)、メルカプトブタノール(45 μl, 0.44 mmol, 1.1. eq.)およびK2CO3(110 mg, 0.80 mmol, 2 eq.)の混合物を80℃で2時間加熱した。混合物をrtまで冷却し、そしてEtOAc(10 ml)と水(10 ml)との間で分配した。水層をEtOAc(2 × 10 ml)でさらに抽出し、そして合わせた有機物を水(10 ml)およびブライン(10 ml)で連続して洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(1:4〜4:1 EtOAc:ヘプタン)により精製して標題化合物(61 mg, 37%)を灰白色固体として得た。
Rf = 0.78 (100:8:1 DCM:MeOH:NH3); MS CI 409.1 [M + H]+.
【００９６】
調製例21
1'-[(2,4-ジクロロピリミジン-5-イル)メチル]-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロブタン-1,3'-インドール]-2'-オン
MeCN(12 ml)中の調製例3からの2,4-ジクロロ-5-(ヨードメチル)ピリミジン(510 mg, 1.77 mmol, 1 eq.)、6'-フルオロスピロ[シクロブタン-1,3'-インドリン]-2'-オン(338 mg, 1.77 mmol, 1 eq.)およびK2CO3(598 mg, 4.34 mmol, 2.45 eq.)を3時間加熱還流した。混合物をrtまで冷却し、そしてMeCNを減圧下で除去した。残渣をDCM(20 ml)と水(20 ml)との間で分配した。有機層を水(10 ml)およびブライン(10 ml)で連続して洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣の固体をカラムクロマトグラフィー(14% EtOAc:ヘプタン)により精製して標題化合物(338 mg, 82%)を薄黄色固体として得た。
Rf = 0.67 (2:1ヘプタン:EtOAc); MS CI 381.1 [M - Cl + H]+.
【００９７】
調製例22
1'-{[2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-[(4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロブタン-1,3'-インドール]-2'-オン
EtOH(4 ml)中の調製例21からの1'-[(2,4-ジクロロピリミジン-5-イル)メチル]-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロブタン-1,3'-インドール]-2'-オン(145 mg, 0.43 mmol, 1 eq.)、4-アミノシクロヘキサノール塩酸塩(45.4 mg, 0.30 mmol, 1 eq.)およびNaHCO3(59.9 mg, 1.02 mmol, 2.38 eq.)を5 h加熱還流し、そして混合物をrtまで冷却した。EtOHを減圧下で除去し、そして残渣に水(20 ml)を加えた。沈殿物をろ取して標題化合物(68.5 mg, 43%)を白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 8.05 (s, 1H), 7.45 (dd, J = 8.2, 5.2 Hz, 1H), 7.01 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 6.82 (ddd, J = 9.4, 8.3, 2.3 Hz, 1H), 6.61 (dd, J = 8.7, 2.2 Hz, 1H), 4.58 (s, 2H), 4.07 - 3.93 (m, 1H), 3.78 - 3.65 (m, 1H), 2.68 - 2.55 (m, 2H), 2.47 - 2.19 (m, 4H), 2.08 - 1.98 (m, 4H), 1.57 - 1.29 (m, 6H). Rf = 0.87 (100:8:1 DCM:MeOH:NH3).
【００９８】
調製例23
1'-{[2-クロロ-4-(5-ヒドロキシペント-1-イン-1-イル)ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン
調製例4からの1'-((2,4-ジクロロピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン(1.01 g, 3.0 mmol, 1 eq.)およびペンチン-1-オール(0.42 ml, 4.5 mmol, 1.5 eq.)をトリエチルアミン(1.75 ml, 12.6 mmol, 4 eq.)の脱気した1,4-ジオキサン(10 ml)溶液に加えた。ヨウ化銅(28 mg, 4 mol%)およびビス(トリフェニルホスフィン)パラジウムクロリド(42 mg, 2 mol%)を加え、そして混合物を60℃で2時間加熱した。混合物を減圧下で濃縮し、そしてカラムクロマトグラフィー(1:1-6:4 EtOAc:ヘプタン)により精製して標題化合物(1.03 g, 75%)を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 8.48 (s, 1H), 6.79 (dd, J = 8.2, 5.2 Hz, 1H), 6.73 (ddd, J= 9.4, 8.2, 2.2 Hz, 1H), 6.63 (dd, J= 8.9, 2.2 Hz, 1H), 5.05 (s, 2H), 3.82 (td, J = 6.0, 5.1 Hz, 2H), 2.72 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 1.94 (tt, J = 7.0, 5.9 Hz, 2H), 1.82 - 1.78 (m, 2H), 1.59 - 1.55 (m, 2H). Rf = 0.13 (1:1ヘプタン:EtOAc).
【００９９】
調製例24
1'-{[2-クロロ-4-(3-フルオロプロポキシ)ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン
水素化ナトリウム(鉱油中60%)(10.6 mg, 0.44 mmol, 1.1 eq.)を3-フルオロプロパン-1-オール(30 μl, 0.4 mmol, 1 eq.)のDMF(3 ml)溶液に加え、そして混合物をrtで10分間攪拌した。DMF(1 ml)中の調製例4からの1'-((2,4-ジクロロピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン(135 mg, 0.4 mmol, 1 eq.)を滴下し、そして混合物をrtで1時間攪拌した。水(10 ml)を加え、そして混合物をEtOAc(2 × 10ml)で抽出した。有機層を水(2 × 10 ml)およびブライン(10 ml)で連続して洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、そして減圧下でエバポレートした。残渣をカラムクロマトグラフィー(3:1ヘプタン:EtOAc)により精製して標題化合物(97 mg, 64%)を薄黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 8.26 (s, 1H), 6.95 - 6.52 (m, 3H), 4.86 (s, 2H), 4.73 - 4.41 (m, 4H), 2.32 - 2.11 (m, 2H), 1.84 - 1.70 (m, 2H), 1.58 - 1.48 (m, 2H). MS CI 381.1 [M + H]+.
【０１００】
実施例1
1'-((2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-(イソペンチルアミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン
トルエン(8 ml)中の調製例5からの1'-((2-クロロ-4-(イソペンチルアミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン(77.8 mg, 0.20 mmol, 1 eq.)、3-アミノピロリジン二塩酸塩(32.0 mg, 0.20 mmol, 1 eq.)、2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2’,4’,6’-トリイソプロピルビフェニル(19.1 mg, 0.04 mmol, 20 mol%)、炭酸セシウム(260 mg, 0.80 mmol, 4 eq.)およびPd2(dba)3(18.3 mg, 0.02 mmol, 10 mol%)の混合物を100℃で26時間加熱した。追加の2-ジシクロヘキシルホスフィノ-2’,4’,6’-トリイソプロピルビフェニル(10 mol%)およびPd2(dba)3(5 mol%)を加え、そして反応物をさらに19時間100℃で攪拌した。反応混合物をrtまで冷却し、減圧下で濃縮し、そしてカラムクロマトグラフィー(150:8:1 DCM:EtOH:NH3)により精製して標題化合物(41.0 mg, 47%)を明茶色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.98 (s, 1H), 6.82 (dd, J = 8.9, 2.0 Hz, 1H), 6.77 - 6.68 (m, 2H), 6.42 (t, J = 4.9 Hz, 1H, NH), 4.64 (s, 2H), 3.82 - 3.54 (m, 4H), 3.52 (td, J = 7.2, 5.4 Hz, 2H), 3.28 (dd, J = 11.1, 4.8 Hz, 2H), 2.21 - 2.10 (m, 5H), 1.78 - 1.70 (m, 3H), 1.68 - 1.55 (m, 2H), 1.55 - 1.51 (m, 2H), 1.47 - 1.42 (m, 2H), 1.26 (t, J = 7.0 Hz, 1H), 0.92 (d, J = 8.2 Hz, 6H); MS CI 439.9 [M + H]+.
【０１０１】
実施例2
1'-((2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-(((1r,4r)-4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン
DMF(7 ml)中の調製例6からの1'-((2-クロロ-4-(((1r,4r)-4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン(140 mg, 0.335 mmol, 1 eq.)、3-アミノピロリジン二塩酸塩(85.3 mg, 0.259 mmol, 1.6 eq.)およびK2CO3(184 mg, 1.33 mmol, 4 eq.)の混合物を100℃で16時間加熱した。混合物をrtまで冷却し、そしてEtOAc(10 ml)と水(10 ml)との間で分配した。水層をEtOAc(2 × 10 ml)でさらに抽出し、そして合わせた有機物を水(10 ml)およびブライン(10 ml)で連続して洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(DCM〜9:1 DCM:MeOH)により精製して標題化合物(51 mg, 33%)を灰白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.96 (s, 1H), 6.79 (dd, J = 8.9, 1.9 Hz, 1H), 6.75 - 6.65 (m, 2H), 6.35 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 4.61 (s, 2H), 3.95 - 3.83 (m, 1H), 3.78 - 3.50 (m, 5H), 3.25 (dd, J = 11.0, 4.6 Hz, 1H), 2.23 - 2.10 (m, 1H), 2.07 - 1.97 (m, 4H), 1.78 - 1.63 (m, 5H), 1.60 - 1.55 (m, 2H), 1.47 - 1.17 (m, 5H); MS CI 468.0 [M + H]+.
【０１０２】
実施例2と類似の方法で調製した化合物を以下の表に示す:
【０１０３】
【表３−１】
2019527704.tif 000018
【０１０４】
【表３−２】
2019527704.tif 000019
【０１０５】
【表３−３】
2019527704.tif 000020
【０１０６】
【表３−４】
2019527704.tif 000021
【０１０７】
【表３−５】
2019527704.tif 000022
【０１０８】
【表３−６】
2019527704.tif 000023
【０１０９】
【表３−７】
2019527704.tif 000024
【０１１０】
実施例6
1'-((2-(4-アミノメチル)ピぺリジン-1-イル)-4-(イソブチルアミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン
調製例9からの1'-((2-クロロ-4-(イソブチルアミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン(75 mg, 0.2 mmol)および4-(アミノメチル)ピぺリジン(17 μl, 0.2 mmol)のトルエン(8 ml)溶液を炭酸セシウム(130 mg, 2 eq.)で処理した。ジシクロヘキシルホスフィノ-2’,4’,6’-トリイソプロピルビフェニル(GD2)(23.7 mg, 15 mol%)を加え、そして混合物を100℃で26時間加熱した。混合物を冷却し、トルエンを減圧下で除去し、そしてカラムクロマトグラフィー(200:8:1 DCM:EtOH:NH3)により精製して標題化合物を灰白色固体(21 mg, 23%)として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.96 (s, 1H), 6.81 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H), 6.76 - 6.67 (m, 2H), 6.48 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.76 - 4.70 (m, 2H), 4.63 (s, 2H), 3.20 (dd, J = 6.7, 5.4 Hz, 2H), 2.78 (td, J = 13.1, 2.6 Hz, 2H), 2.58 (d, J = 6.5 Hz, 2H), 1.93 - 1.83 (m, 1H), 1.80 - 1.75 (m, 1H), 1.77 - 1.73 (m, 2H), 1.61 - 1.45 (m, 8H), 1.19 - 1.07 (m, 2H), 0.91 (d, J = 6.7 Hz, 6H); MS CI 453.0 [M + H]+.
【０１１１】
実施例10
1'-((2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-((テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン
DMF(4 ml)中の調製例11からの1'-((2-クロロ-4-((テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル)アミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン(68 mg, 0.17 mmol, 1 eq.)、3-アミノピロリジン二塩酸塩(29.7 mg, 0.19 mmol, 1.1 eq.)およびK2CO3(70.5 mg, 0.51 mmol, 3eq.)の混合物をマイクロ波中、140℃で15分間、続いて150℃で30分間加熱した。水(15 ml)を加え、そして混合物をEtOAc(3 × 10 ml)で抽出し、有機物を水(3 × 15 ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。カラムクロマトグラフィー(0〜20% MeOH:DCM + 1% NH3)により精製して標題化合物(14.2 mg, 18%)を黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.00 (s, 1H), 6.85 - 6.68 (m, 3H), 6.59 - 6.48 (m, 1H), 4.65 (s, 2H), 4.20 - 4.07 (m, 1H), 3.99 (dt, J = 11.6, 3.6 Hz, 2H), 3.82 - 3.59 (m, 3H), 3.52 (td, J = 11.6, 2.4 Hz, 2H), 3.26 (dd, J = 10.9, 4.4 Hz, 1H), 2.21 - 2.10 (m, 1H), 2.03 - 1.91 (m, 2H), 1.81 - 1.73 (m, 2H), 1.80 - 1.50 (m, 6H), 1.59 - 1.52 (m, 2H); MS CI 454.1 [M + H]+.
【０１１２】
実施例11
1'-((2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-((3-メトキシプロピル)アミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン
調製例12からの1'-((2-クロロ-4-((3-メトキシプロピル)アミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン(77.7 mg, 0.2 mmol, 1 eq.)、3-アミノピロリジン二塩酸塩(35.0 mg, 0.22 mmol, 1.1 eq.)、K2CO3(82.9 mg, 0.6 mmol, 3 eq.)およびDMF(4 ml)をマイクロ波中、140℃で30分間、続いて150℃でさらに15分間加熱した。水(15 ml)を加え、そして混合物をEtOAc(3 × 10 ml)で抽出し、合わせた有機物を水(3 × 15 ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(DCM: MeOH中1% NH3) 100:0〜90:10により精製して標題化合物(28.4 mg, 32%)を橙色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.96 (s, 1H), 6.80 (dd, J = 8.9, 2.0 Hz, 1H), 6.76 - 6.66 (m, 2H), 6.49 (t, J = 5.3 Hz, 1H), 4.62 (s, 2H), 3.84 - 3.51 (m, 4H), 3.47 (td, J = 6.8, 5.4 Hz, 2H), 3.41 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.31 (s, 3H), 3.25 (dd, J = 11.1, 4.8 Hz, 1H), 2.17 - 2.08 (m, 1H), 1.89 - 1.81 (m, 2H), 1.77 - 1.72 (m, 2H), 1.75 - 1.68 (m, 1H), 1.58 (s, 2H), 1.55 - 1.50 (m, 2H); MS CI 440.9 [M + H]+.
【０１１３】
実施例12
1'-((4-(3-アミノピロリジン-1-イル)-2-((4-ヒドロキシブチル)アミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン
調製例13からの1'-((4-(3-アミノピロリジン-1-イル)-2-クロロピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン(48 mg, 0.126 mmol, 1 eq.)、4-アミノ-1-ブタノール(19 μl, 0.201 mmol, 1.6 eq.)、K2CO3(17.4 mg, 0.126 mmol, 1 eq.)およびDMF(4 ml)を100℃で3時間加熱し、さらなる(13 μl, 0.126 mmol, 1 eq.)4-アミノ-1-ブタノールを加え、そして混合物をさらに5時間攪拌した。K2CO3(34.8 mg, 0.252 mmol, 2 eq)を加え、そして混合物をさらに8時間加熱した。水(10 ml)およびEtOAc(10 ml)を加えた。水層をEtOAc(2 × 10 ml)で抽出し、そして合わせた有機物を水(2 × 10 ml)およびブライン(10 ml)で連続して洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(0-10% MeOH/DCM)により精製して標題化合物(19.1 mg, 34%)を白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.51 (s, 1H), 6.80 - 6.60 (m, 2H), 6.49 (dd, J = 9.0, 2.2 Hz, 1H), 4.95 (s, 2H), 4.93 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.92 - 3.81 (m, 2H), 3.77 - 3.69 (m, 1H), 3.69 - 3.62 (m, 3H), 3.45 - 3.33 (m, 3H), 2.24 - 2.08 (m, 1H), 1.90 - 1.56 (m, 8H), 1.79 - 1.74 (m, 2H), 1.54 - 1.49 (m, 2H); MS CI 442.0 [M + H]+.
【０１１４】
実施例20
1'-{[2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-[(4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロブタン-1,3'-インドール]-2'-オン
調製例22からの1'-{[2-(3-アミノピロリジン-1-イル)-4-[(4-ヒドロキシシクロヘキシル)アミノ]ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロブタン-1,3'-インドール]-2'-オン(57.5 mg, 0.133 mmol, 1 eq.)、3-アミノピロリジン二塩酸塩(34.0 mg, 0.214 mmol, 1.6 eq.)、K2CO3(73.8 mg, 0.534 mmol, 4 eq.)およびMeCN(6 ml)を21時間加熱還流した。MeCNを減圧下でエバポレートした。水(10 ml)およびDCM(10 ml)を加えた。有機層を水(2 × 10 ml)で洗浄した。水層をDCM(10 ml)で抽出し、そして合わせた有機物をブライン(10 ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(1-10% MeOH/DCM)により精製して標題化合物(40.3 mg, 63%)を白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.92 (s, 1H), 7.40 (dd, J = 8.2, 5.3 Hz, 1H), 6.75 (td, J = 9.5, 2.2 Hz, 1H), 6.66 (dd, J = 8.9, 2.2 Hz, 1H), 6.33 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 4.51 (s, 2H), 3.99 - 3.84 (m, 1H), 3.80 - 3.60 (m, 4H), 3.59 - 3.50 (m, 1H), 3.24 (dd, J = 11.1, 4.6 Hz, 1H), 2.70 - 2.55 (m, 2H), 2.43 - 2.20 (m, 4H), 2.18 - 1.97 (m, 5H), 1.80 - 1.68 (m, 2H), 1.64 (d, J = 31.0 Hz, 6H), 1.48 - 1.26 (m, 5H).
MS CI 481.2 [M + H]+.
【０１１５】
実施例20と類似の方法で調製した化合物を以下の表に示す:
【０１１６】
【表４−１】
2019527704.tif 000025
【０１１７】
【表４−２】
2019527704.tif 000026
【０１１８】
【表４−３】
2019527704.tif 000027
【０１１９】
【表４−４】
2019527704.tif 000028
【０１２０】
実施例24
1'-{[2-(4-アミノピぺリジン-1-イル)-4-[(4-ヒドロキシブチル)アミノ]ピリミジン-5-イル]メチル}-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン
調製例8からの1'-((2-クロロ-4-((4-ヒドロキシブチル)アミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン(58.6 mg, 0.15 mmol, 1 eq.)、4-アミノピぺリジン(25 μl, 0.24 mmol, 1.6 eq.)、K2CO3(82.9 mg, 0.60 mmol, 4 eq.)およびMeCN(5 ml)を76時間加熱還流した。MeCNを減圧下でエバポレートした。水(10 ml)およびDCM(10 ml)を加えた。有機層を水(2 × 10 ml)で洗浄した。水層をDCM(10 ml)で抽出し、そして合わせた有機物をブライン(10 ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(1-5% MeOH/DCM)により精製して標題化合物(38.2 mg, 56%)を白色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 7.94 (s, 1H), 6.80 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H), 6.76 - 6.66 (m, 2H), 6.47 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 4.64 (s, 1H), 4.61 (s, 1H), 4.61 (s, 1H),  3.64 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.40 (td, J = 6.3, 4.8 Hz, 2H), 2.91 - 2.81 (m, 3H), 1.87 - 1.78 (m, 4H), 1.76 - 1.72 (m, 3H), 1.70 - 1.57 (m, 5H), 1.55 - 1.50 (m, 2H), 1.24 (qd, J= 12.5, 4.2 Hz, 2H). MS CI 455.1 [M + H]+.
【０１２１】
実施例25
1'-({2-[(2-アミノエチル)アミノ]-4-[(4-ヒドロキシブチル)アミノ]ピリミジン-5-イル}メチル)-6'-フルオロ-1',2'-ジヒドロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドール]-2'-オン
調製例8からの1'-((2-クロロ-4-((4-ヒドロキシブチル)アミノ)ピリミジン-5-イル)メチル)-6'-フルオロスピロ[シクロプロパン-1,3'-インドリン]-2'-オン(58.6 mg, 0.15 mmol, 1 eq.)、エチレンジアミン(16 μl, 2.4 mmol, 1.6 eq.)、K2CO3(20.7 mg, 0.15 mmol, 1 eq.)およびMeCN(5 ml)を4時間加熱還流した。エチレンジアミン(84 μl, 12.6 mmol, 8.4 eq.)を加え、そして混合物をさらに72時間加熱還流した。MeCNを減圧下でエバポレートした。水(10 ml)およびDCM(10 ml)を加えた。有機層を水(2 × 10 ml)で洗浄した。水層をDCM(10 ml)で抽出し、そして合わせた有機物をブライン(10 ml)で洗浄し、MgSO4で乾燥し、濾過し、そして減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー(10% MeOH/DCM)により精製して標題化合物(18.9 mg, 30%)を無色オイルとして得た。
1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 7.92 (s, 1H), 6.81 (dd, J = 8.9, 2.1 Hz, 1H), 6.79 - 6.70 (m, 2H), 6.66 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 5.25 (s, 1H), 4.63 (s, 2H), 3.68 (t, J= 6.0 Hz, 2H), 3.43 (dt, J = 12.6, 6.4 Hz, 4H), 2.88 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.29 - 2.08 (m, 3H) 1.80 - 1.75 (m, 2H), 1.73 - 1.59 (m, 4H), 1.58 - 1.54 (m, 2H). MS CI 415.1 [M + H]+.
【０１２２】
実施例30:  生物学的試験
インビトロにおける薬効
化合物を、以下のプロトコルに従ってRSV融合アッセイおよびプラーク減少アッセイに供した。
【０１２３】
RSV融合アッセイ
HEK 293T/17細胞を、10 % FBSおよび1x ペニシリン-ストレプトマイシン(Pen/Strep)を含むDulbecco’s培地(DMEM)中、T75培養フラスコ中で培養し、そして使用前に37℃に温めた。細胞をまず3 mlのリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)で簡単に洗浄することによって継代し、続いて37℃で3 TrypLEと共に4分間インキュベートした。次いで7 mlの培地をフラスコに加え、そして細胞をフラスコの底部に対してピペッティング(x3)によって分散させた。２つのさらなるT75フラスコにそれぞれ15 mlの新鮮な培地中の2 x 106細胞を播種した。
【０１２４】
細胞を6-ウェルプレートと同じ密度でT75プレート上に播種し、T75フラスコの面積と6-ウェルプレートからの１個の1.75 cm半径のウェルとを比較した。7.79 x 2 mlの3 x 105細胞ml-1を用いて単一のT75フラスコに播種した。
【０１２５】
HEK細胞を上記のT75フラスコから取り出した。細胞を計数し、そして新鮮な培地中で3 x 105細胞/mlに希釈した。２個のT75フラスコにそれぞれ15.58 mlの希釈した細胞を播種した。
【０１２６】
HEK細胞にトランスフェクトすべきプラスミドDNA(pFR-LucおよびpcDNA3.1_Gal4/ NFκBについて)を、まずトランスフェクション試薬Fugene 6(Promega)を含む無血清培地(DMEM + Pen/Strep)中で調製した。トランスフェクションを以下の通り設定した(Luc = pFR_Luc, Gal4 = pcDNA3.1+_Gal4/NFκB, A2_F = pcDNA3.1+_A2_F)
【０１２７】
トランスフェクション
１    Luc + A2_F_1
２    Gal4
【０１２８】
無血清培地を1.5 mlエッペンドルフチューブ中に置き、次いでfugene 6を培地に加えた。チューブを1秒間ボルテックスし、その後RTで5分間インキュベートした。次いでプラスミドDNAをチューブに加え、1秒間ボルテックスし、次いでRTで15分間インキュベートした。
【０１２９】
次いでトランスフェクション試薬を、フラスコを立てて傾けそして試薬をフラスコ中に既にある培地に直接加えることによって適切なT75フラスコに加えた。次いでフラスコを後ろに傾け、それによって培地を完全に混合し得、その間、フラスコを正しい上下の向に配置する前に細胞を乱さず、そして37℃および5% CO2で一晩インキュベートした。
【０１３０】
化合物を、3.3 μM、1 μM、500 nM  200 nMまたは100 nMのいずれかの頂点［最終］を与える１２点希釈曲線において1:3に希釈した(ポリプロピレン丸底96ウェルプレート中)。コントロール化合物は常に100 nMの濃度で行った。
【０１３１】
次いで細胞を計数し、そして新鮮な培地中で4 x 105細胞/mlに希釈した。50 μlのトランスフェクション集団1細胞をアッセイプレートの全てのウェルに加えた。100 μlの希釈した化合物(化合物あたり2列)、標準曲線(１列)およびコントロール(100 nM RV(100 %阻害、４つのウェル)、DMSO(0%阻害、８つのウェル))を適切なウェルに加えた。次いで50 μlの希釈した(4 x 105細胞/ml) トランスフェクション集団2細胞を全てのウェルに加えた。
【０１３２】
次いでプレートを37℃および5% CO2で24 hrインキュベートした。
【０１３３】
緩衝液をルシフェラーゼアッセイ(20 mMトリシン、10 mM MgSO4、1 mM EDTA、10 mM DTT)および溶解(25 mMトリス-ホスフェート、8 mM MgCl2、1 mM DTT、1% Triton X-100、15%グリセロール)のために調製し、そして-20℃で保存した。ルシフェリン基質を100 mM Tris-HCl、15.76 g/L、Coenzyme A、10.36 g/L、23.5 mMルシフェリン、7.48 g/L、26.6 mM ATPおよび14.66 g/Lから調製し、そして-80℃で保存した。
【０１３４】
発光を記載の通り測定した:
(a)ルシフェラーゼ
培地をVirkon中に捨て、そしてプレートをウェルあたり100ul PBSで洗浄した。20 ul/ウェルの溶解緩衝液を各ウェルに加え、そしてRTで5分間振盪してインキュベートした。ルシフェリンを1:50の希釈でLAABに加えて機能ルシフェリン緩衝液を得た。100 μlの機能ルシフェリン緩衝液を各ウェルに加え、そして発光を直ちに測定した。
【０１３５】
(b)レサズリン
培地をVirkon中に捨て、そして100 ul SFM + 2 0ul CellTitre-Blue溶液を各ウェルに加えた。プレートを37℃、5% CO2で2時間インキュベートした。レサズリン蛍光を590 nmで測定した。
【０１３６】
プラーク減少アッセイ1:
ベロ細胞を96-ウェルプレート中、3% FCSを補充した100μLの体積のOptimem中にウェル当たり4 x 104細胞の濃度で播種した。加湿5% CO2雰囲気中、37℃での一晩のインキュベーション後、細胞の単層は約90%のコンフルエントであるべきであった。抗ウイルス化合物を、U-底96ウェルプレート中、予備加温した無血清(SF)Optimem中で滴定した。DMSO溶液中の化合物について、100% DMSO中の滴定をまず行い、そして各濃度を個々に加えてSF培地中4% DMSOで2 x最終濃度にし、ウイルスと混合した(ウイルスを含む2%最終DMSO)。次いで培地を細胞から取り除き、そしてPBS(100μl/ウェル)で置き換えた。
【０１３７】
RSVストックを解凍し、そしてSF Optimem培地中で4000 PFU/mLlに希釈した。等体積のウイルスを滴定プレート上の化合物に加えた。PBSを細胞から取り除き、次いでこれにウイルス/化合物溶液(50 μL/ウェル)を接種した。細胞を37℃+ 5% CO2加湿インキュベーター中で2 hインキュベートして感染させた。接種物を取り除き、そして培地(Optimem + 1% FCS)を細胞に加えた(100 μl/ウェル)。続いて細胞を加湿インキュベーター中、37℃ + 5% CO2で48 hインキュベートした。
【０１３８】
免疫染色手順:
培地を細胞から取り除き、そして単層をPBSで洗浄した。細胞をPBS中の氷冷80%アセトンで-20℃で20分間固定した(100 μl/ウェル)。固定剤を取り除き、そして細胞をプレートを反転させて30分間乾燥する。ブロッキング溶液(PBS-T中5%脱脂粉乳)を細胞に加え(150 μL/ウェル)、そしてプレートを室温で30分間インキュベートした。ブロッキング溶液を取り除き、そしてプレートをPBS-Tで１回洗浄した。ブロッキング溶液中の一次抗体をプレートに加え(50μl/ウェル)、そして37℃で1hインキュベートした。次いでプレートをPBS-Tで3回洗浄した。ブロッキング溶液中の二次抗体をプレートに加え(50μL/ウェル)、そして暗所中、37℃で1hインキュベートした。プレートを上記の通り洗浄し、次いで10分間乾燥した。プレートをOdyssey Imager(Li-Cor Biosciences)上、800 nMチャネル中、42 μMの解像度、培地品質およびレベル5強度でスキャンした。
【０１３９】
データ分析:
得られた画像を保存し、そしてコンピューター画像化ソフトウェアを活用してプラーク数を計数した。化合物についてのEC50値を、Graphpad Prismソフトウェアを用いて得られた用量応答曲線[３つの可変log(阻害剤)対応答]から誘導した。
【０１４０】
【表５】
2019527704.tif 000029
【０１４１】
プラーク減少アッセイ2:
このRSVプラーク減少アッセイは、RSV感染の異なる焦点における感染単位の数の定量を可能とする感染性アッセイである。これは、その他の点では健康な組織培養細胞の単層内で染色する特異的抗体によって検出されるウイルス抗原のゾーンによって示される。各プラークは単一の感染性ウイルス粒子に由来するので、抗-ウイルス効果の正確な計算は、抗-ウイルス化合物の存在下および非存在下でプラークを計数することによって得られ得る。HEp-2細胞(ATCC, CCL23)をフラスコ中で継代し、そして96-ウェルプレート中、抗生物質を含み10% FBSを補充したDMEM中で播種した。接種および続くインキュベーションの間、細胞を3% FBSを含むDMEM中で培養した。１ウェル当たり１００プラーク形成単位のRSV(RSV A2 VR-1540)(PFU)を、化合物の１０の段階希釈物と混合した。続いて、100 μLのウイルス/化合物混合物をコンフルエントのHEp-2細胞単層に加えた。細胞およびウイルス/化合物混合物を、加湿5% CO2インキュベーター中、35℃で1日間インキュベートした。
【０１４２】
細胞をPBSで２回洗浄し、その後50% v/v EtOH/MeOHを加え、次いで-20℃で保存した。染色の日に、まず固定剤をプレートから取り除いた。プレートをPBSで３回洗浄した。予備滴定した量の一次抗体を60 μL PBS/2%粉ミルクに加え、そしてプレートをrtで1 hインキュベートした。プレートをPBS/0.05% Tween20で３回洗浄し、その後60 μL PBS/2%粉ミルク中のヤギ抗-マウス西洋わさびペルオキシダーゼを加え、そしてrtで1 hインキュベートした。PBS/0.05% Tween20での３回洗浄工程後、60 μLのすぐに使用できるTrueBlueを加え、そしてプレートをrtで10-15分間インキュベートし、その後MilliQ水を加えた。プレートを水で１回洗浄し、30-60分間インキュベートし、そして水の除去後、暗所で空気乾燥した。
【０１４３】
プレートをスキャンし、そして免疫染色したプラークを計数するためのBioSpot分析ソフトウェア(virospots)を備えたImmunospot S6 UV分析器を用いて分析した。プラーク計数を用いてRSVについてのウイルスコントロールウェル中のスポット計数(SC)の平均に対する%感染を計算した。IC50/IC90値を、GraphPad 5.0(Prism)において種々の勾配を有する4-パラメーター非線形回帰に適合した阻害曲線の内挿によって、それぞれシグナルの50%または90%減少として計算した。
【０１４４】
【表６】
2019527704.tif 000030
【０１４５】
実施例31: インビトロ薬物動態
化合物を以下のアッセイに供し、肝ミクロソーム安定性、浸透性、血漿タンパク質結合および計算した分配/分布計数を調査した。
【０１４６】
ミクロソームインキュベーション:実験手順
プールしたヒト肝ミクロソーム(プールした男性および女性)、プールしたラット肝ミクロソーム(雄Sprague Dawleyラット)およびプールしたイヌ肝ミクロソーム(雄ビーグル犬)を信頼できる商業的供給業者から購入し、そして使用前に-80℃で保存する。
【０１４７】
ミクロソーム(最終タンパク質濃度0.5 mg/mL)、0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.4および試験化合物(最終基質濃度3 μM;最終DMSO濃度0.25 %)を、NADPH(最終濃度1 mM)を加えて反応を開始する前に37℃で予備インキュベートする。最終インキュベーション体積は50 μLである。コントロールインキュベーションは、各試験した化合物について含まれ、ここで0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.4はNADPHの代わりに加えられる(NADPHを引く)。２つのコントロール化合物は、各種を含む。全てのインキュベーションは、各試験について単数で行う。
【０１４８】
化合物を0、5、15、30および45分間インキュベートする。コントロール(NADPHを引く)は、45分間のみインキュベートする。反応は、適切な時間点で25 μLのインキュベートを50 μLのメタノールに移すことによって停止させる。停止プレートは、2,500 rpm、4℃で20分間遠心分離し、タンパク質を沈殿させる。タンパク質の沈殿後、サンプルの上清を4つの化合物までのカセット中で合わせ、内部標準を加え、そしてサンプルをLC-MS/MSによって分析する。
【０１４９】
時間に対するlnピーク面積比(化合物ピーク面積/内部標準ピーク面積)のプロットから、線の勾配を決定する。続いて、半減期および固有クリアランスを計算する。
【０１５０】
MDR1-MDCK浸透性:実験手順
NIH(Rockville, MD, USA)から得たMDR1-MDCK細胞を6 - 30の間の継代数で使用する。細胞をMillipore Multiscreen Transウェルプレート上に3.4 x 105細胞/cm2で播種する。細胞をDMEM中で培養し、そして培地を3日目に交換する。4日目に浸透性研究を行う。細胞培養およびアッセイインキュベーションを5 % CO2の雰囲気下、95 %の相対湿度で37℃で行う。アッセイの日に、側底面および先端面の両方を37℃に温めた所望のpHでハンクス平衡塩類溶液(HBSS)で２回すすぐことによって単層を調製する。次いで細胞を所望のpHで先端区画および側底区画の両方において40分間HBSSと共にインキュベートし、生理学的パラメーターを安定化させる。
【０１５１】
投薬溶液は、試験化合物をアッセイ緩衝液で希釈し、10 μM(1 % v/vの最終DMSO濃度)の最終試験化合物濃度を得ることによって調製する。蛍光完全性マーカーであるルシファーイエローもまた投薬溶液に含まれる。分析標準は、試験化合物DMSO希釈液から調製され、そして緩衝液に移され、1 % v/v DMSO濃度を維持する。
【０１５２】
A-B浸透性の評価のために、HBSSを先端区画から取り除き、そして試験化合物投薬溶液で置き換える。次いで先端区画インサートは、新鮮な緩衝液(1 % v/v DMSOを含む)を含むコンパニオンプレートに置かれる。B-A浸透性の評価のために、HBSSをコンパニオンプレートから取り除き、そして試験化合物投薬溶液で置き換える。新鮮な緩衝液(1 % v/v DMSOを含む)を先端区画インサートに加え、次いでこれをコンパニオンプレートに置く。
【０１５３】
60分で、先端区画インサートおよびコンパニオンプレートを分離し、そして先端および側底サンプルを分析のために希釈する。
【０１５４】
試験化合物の浸透性を２回評価する。公知の浸透性特性の化合物を各アッセイプレート上でコントロールとして行う。
【０１５５】
試験およびコントロール化合物を、サンプルの適切な希釈で8-点較正を用いてLC-MS/MSカセット分析により定量する。開始濃度(C0)を投薬溶液から決定し、そして実験回復をC0ならびに先端および側底区画の濃度から計算する。
【０１５６】
実験を通しての単層の完全性を、蛍光分析を用いてルシファーイエロー浸透によりチェックする。ルシファーイエロー浸透は、単層が損傷している場合、高い。
【０１５７】
タンパク質結合決定:実験手順
試験化合物の溶液(5 μM, 0.5 %最終DMSO濃度)を緩衝液(pH 7.4)および100 %種特異的血漿中で調製する。実験を、半透過性膜によって分離された２つの区画での平衡透析を用いて行う。緩衝溶液を膜の１方の側に加え、そして血漿溶液を他方の側に加える。平衡後、サンプルを膜の両側から取る。標準を血漿および緩衝液中で調製し、そして37℃でインキュベートする。試験化合物のインキュベーションを２回行う。コントロール化合物を各実験に含ませる。
【０１５８】
化合物の各バッチについての溶液を２つのグループ(タンパク質不含有およびタンパク質含有)に合わせ、次いでカセットをタンパク質不含有溶液(7点)およびタンパク質含有溶液(6点)について２セットの較正標準を用いてLC-MS/MSにより分析する。
【０１５９】
LogD決定:実験手順
0.1 Mのリン酸緩衝液pH 7.4(オクタノールで飽和)を、1mgの固体試験化合物を含むバイアルに加え、そして溶液を混合し、約15分間超音波処理する。溶液をチューブに移し、遠心分離し、そして上清を上部から取り除き、底部にいかなる固体化合物も残す。この上清を、次いで0.2 μmのフィルターを通してシリンジ濾過し、初期溶液を製造する。
【０１６０】
リン酸緩衝液中に異なる比のオクタノールおよび化合物を含む３つのバイアルを調製し、logD値の範囲をカバーした。バイアルを混合して平衡にし、次いで遠心分離して、オクタノールを除去する前に２相が完全に分離していることを確実にし、そして緩衝液サンプルを分析する。
【０１６１】
次いで、対応するバイアルからの水溶液を４つのカセット中で合わせ、そして、一般的LC-MS/MS条件を用いて分析する。各バイアル中の化合物の量を、初期溶液を段階希釈することによって生成される6点標準曲線に対して定量する。次いでlogDをこれらの濃度から計算する。
【０１６２】
LogP決定
LogP値を、Viswanadhan et al.; J. Chem. Inf. Comput. Sci. 1989; 29:163-172に記載の方法を用いて、ChemAxonから入手可能なソフトウェアで計算した。
【０１６３】
結果
実施例2について
【０１６４】
【表７】
2019527704.tif 000031
【０１６５】
実施例32: インビボ薬物動態
化合物の薬物動態を、1 mg/kg (IV)および10 mg/kg (PO)の用量でMICEにおいてインビボで研究した。
【０１６６】
方法
Sprague Dawleyラットを、静脈内および経口投与により実験化合物で処理した。各投与経路について３匹の動物を、化合物の投薬後１０の時間点で連続血液サンプリングで用いた。
【０１６７】
静脈内ボーラスを、1mg/kgの用量および40:60ジメチルアセトアミド/生理食塩水(0.9% w/v生理食塩水)中の1mgmlの濃度で投与した。動物の体重を量り、そして200-250gの間であれば用いた。連続血液サンプルを、投薬後0.02、0.08、0.25、0.50、1、2、4、6、8および24時間で採取した。動物を任意の明らかな臨床兆候または症状について観察した。血液サンプルを抗凝固剤(ヘパリンナトリウム)中に送り、そして4℃で遠心分離した。続いて血漿サンプルを分析前に-20℃未満で凍結保存した。
【０１６８】
アセトニトリルを用いたタンパク質沈殿後、サンプルを、エレクトロスプレーイオン化を用いてタンデム液体クロマトグラフィー/質量分析で分析した。内部標準を有する全行列曲線(full matrix curve)を用い、そしてPKパラメーターを計算した。
【０１６９】
同様の方法において、経口投与を5または10 mg/kgの用量で水中1%メチルセルロース(Sigma M7140)、0.1% Tween 80中5mg/mlの濃度で強制飼養によって行った。連続サンプルを上記の通り取った。
【０１７０】
結果
【０１７１】
【表８】
2019527704.tif 000032
【０１７２】
実施例33:水性処方物
実施例1の化合物を、以下の手順に従ってpH4で30% w/v captisol(すなわちスルホブチルエーテル-β-シクロデキストリン)中の溶液として処方する。
【０１７３】
30% w/v captisol(すなわちスルホブチルエーテル-β-シクロデキストリン)の担体を、必要量のcaptisolを適切な容器に量り取り、最終体積の水の約80%を加え、そして溶液が形成されるまで磁気攪拌することによって調製する。次いで担体を水で所定の体積にする。
【０１７４】
実施例1の化合物の水溶液を、175 mgの化合物を適切な容器に量り取り、そして必要な体積の担体の約80%を加えることによって調製する。塩酸の水溶液を用いて、pHをpH2に調節し、そして得られる混合物を、溶液が形成されるまで磁気攪拌する。次いで処方物を担体で所定の体積にし、そして水酸化ナトリウムの水溶液を用いてpHをpH4に調節する。
【０１７５】
実施例34  錠剤組成物
それぞれ0.15 gの重量でありかつ25 mgの本発明の化合物を含む錠剤を以下の通り製造する:
10,000錠剤についての組成物
本発明の化合物(250 g)
ラクトース(800 g)
コーンスターチ(415g)
タルク粉末(30 g)
ステアリン酸マグネシウム(5 g)
【０１７６】
本発明の化合物、ラクトースおよびコーンスターチの半分を混合する。次いで混合物を0.5 mmメッシュサイズの篩に通す。コーンスターチ(10 g)を暖かい水(90 mL)に懸濁する。得られるペーストを用いて粉末を顆粒化する。顆粒を乾燥し、そして1.4 mmメッシュサイズの篩上で小さなフラグメントに粉砕する。残りの量のスターチ、タルクおよびマグネシウムを加え、注意深く混合し、そして錠剤に加工する。
【０１７７】
実施例35  注射可能処方物
本発明の化合物  200 mg
塩酸溶液0.1Mまたは
pH 4.0〜7.0に十分な水酸化ナトリウム溶液0.1M
10 mLに十分な滅菌水
【０１７８】
本発明の化合物を大部分の水(35℃-40℃)に溶解し、そして必要に応じて塩酸または水酸化ナトリウムでpHを4.0と7.0との間に調節する。次いでバッチを水で所定の体積にし、そして滅菌細孔フィルターを通して滅菌10 mL琥珀ガラスバイアル(タイプ1)中にろ過し、そして滅菌クロージャーおよびオーバーシールを用いて密封する。
【０１７９】
実施例36  筋肉内注射
本発明の化合物  200 mg
ベンジルアルコール  0.10 g
グリコフロール75  1.45 g
3.00 mlに十分な注射用水
【０１８０】
本発明の化合物をグリコフロールに溶解する。次いでベンジルアルコールを加えそして溶解し、そして水を加えて3 mLにする。次いで混合物を滅菌細孔フィルターを通してろ過し、そして滅菌3 mLガラスバイアル(タイプ1)に密封する。
【０１８１】
実施例37  シロップ処方物
本発明の化合物  250 mg
ソルビトール溶液  1.50 g
グリセロール  2.00 g
安息香酸ナトリウム  0.005 g
香味料  0.0125 mL
5.00 mLに十分な精製水
【０１８２】
本発明の化合物を、グリセロールと大部分の精製水との混合物に溶解する。次いで安息香酸ナトリウムの水溶液を溶液に加え、続いてソルビトール(sorbital)溶液を加え、そして最後に香味料を加える。精製水で所定の体積にし、そしてよく混合する。
【国際調査報告】
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