(57)【要約】本発明は、患者がＡＬＫ阻害薬に応答するかどうかを検出するための新規な方法および組成物、ならびにその患者を処置する方法を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）遺伝子における変異をもつ細胞を宿している可能性がある腫瘍を伴なう患者を処置する、下記を含む方法：
（ａ）患者由来の試料をＡＬＫ変異Ｒ１２０９Ｑ（Ｇ３６３６Ａ）および／またはＩ１２６８Ｖ（Ａ３８０２Ｇ）の存在について検査する；
（ｂ）変異Ｒ１２０９Ｑが存在すれば、ＡＬＫ阻害化合物をその患者に投与しないか、あるいはその患者が既にＡＬＫ阻害化合物の受容中であれば代替のＡＬＫ阻害化合物を投与する；
（ｃ）変異Ｉ１２６８Ｖが存在するかまたはいかなる変異も存在しなければ、ＡＬＫ阻害化合物を患者に投与する。
【請求項２】
ＡＬＫ阻害化合物または代替のＡＬＫ阻害化合物が、アレクチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、ブリガチニブ、ロルラチニブ、およびエントレクチニブからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
変異配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドを用いて検査を実施する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
さらに、患者由来の試料をＬ１１５２Ｒ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｇ１２６９Ａ、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される１以上のＡＬＫ変異の存在について検査し、いずれかの変異が存在すれば、ＡＬＫ阻害化合物をその患者に投与しないこと、あるいはその患者が既にＡＬＫ阻害化合物の受容中であれば代替のＡＬＫ阻害化合物を投与することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
さらに下記を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法：
患者由来の試料を１以上のＡＬＫ融合生成物の存在について検査する；
１以上のＡＬＫ融合生成物が存在すれば、ＡＬＫ阻害化合物をその患者に投与する；
１以上のＡＬＫ融合生成物ならびにＲ１２０９Ｑ、Ｌ１１５２Ｒ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｇ１２６９Ａ、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される１以上の変異が存在すれば、ＡＬＫ阻害化合物をその患者に投与しないか、あるいはその患者が既にＡＬＫ阻害化合物の受容中であれば代替のＡＬＫ阻害化合物を投与する。
【請求項６】
ＡＬＫ阻害化合物に対する癌患者の応答の可能性を判定するための方法であって、患者由来の試料をＡＬＫ変異Ｒ１２０９Ｑおよび／またはＩ１２６８Ｖについて検査し、変異Ｒ１２０９Ｑが存在すればその患者はＡＬＫ阻害化合物に応答しない可能性があるとレポートし、変異Ｉ１２６８Ｖが存在するかまたはいかなる変異も存在しなければその患者はＡＬＫ阻害化合物に応答する可能性があるとレポートすることを含む方法。
【請求項７】
変異配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドを用いて検査を実施する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
さらに、患者由来の試料をＬ１１５２Ｒ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｇ１２６９Ａ、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される１以上のＡＬＫ変異の存在について検査し、いずれかの変異が存在すれば、その患者はＡＬＫ阻害化合物に応答しない可能性があるとレポートし、あるいはその患者が既にＡＬＫ阻害化合物の受容中であれば代替のＡＬＫ阻害化合物を投与することを含む、請求項６〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
さらに下記を含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法：
患者由来の試料を１以上のＡＬＫ融合生成物の存在について検査する；
１以上のＡＬＫ融合生成物が存在すれば、ＡＬＫ阻害化合物をその患者に投与する；
１以上のＡＬＫ融合生成物ならびにＲ１２０９Ｑ、Ｌ１１５２Ｒ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｇ１２６９Ａ、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される１以上の変異が存在すれば、ＡＬＫ阻害化合物をその患者に投与しないか、あるいはその患者が既にＡＬＫ阻害化合物の受容中であれば代替のＡＬＫ阻害化合物を投与する。
【請求項１０】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害薬療法を、その遺伝子に変異をもつ細胞を宿している腫瘍を伴なっており、以前にアレクチニブで処置されていた患者について選択するための、下記を含む方法：
（ａ）患者由来の試料をＡＬＫ変異Ｒ１２０９Ｑ（Ｇ３６３６Ａ）および／またはＩ１２６８Ｖ（Ａ３８０２Ｇ）の存在について検査する；
（ｂ）変異Ｒ１２０９Ｑが存在すれば、ＡＬＫ阻害化合物をその患者に投与しないか、あるいは代替のＡＬＫ阻害化合物を投与する；
（ｃ）変異Ｉ１２６８Ｖが存在するかまたはいかなる変異も存在しなければ、アレクチニブをその患者に投与する。
【請求項１１】
さらに、試料を１以上のＡＬＫ変異Ｌ１１５２Ｒ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｇ１２６９Ａ、およびＧ１５４８Ｅの存在について検査し、いずれかの変異が存在すれば、ＡＬＫ阻害化合物をその患者に投与しないこと、あるいは代替のＡＬＫ阻害化合物を投与することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＡＬＫ遺伝子における変異Ｒ１２０９ＱおよびＩ１２６８Ｖに特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含む、ＡＬＫ遺伝子における変異を検出するためのキット。
【請求項１３】
さらに、１以上のＡＬＫ変異Ｌ１１５２Ｒ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｇ１２６９Ａ、およびＧ１５４８Ｅに特異的にハイブリダイズする１以上のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
さらに、ＡＬＫ融合生成物を特異的に検出する１以上のオリゴヌクレオチドを含む、請求項１１〜１２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）遺伝子における変異をもつ細胞を宿している可能性がある腫瘍を伴なう患者を処置する、下記を含む方法：
（ａ）患者由来の試料を１以上のＡＬＫ融合生成物の存在について検査する；
（ｂ）（ａ）において検査した１以上のＡＬＫ融合生成物が存在すれば、ＡＬＫ阻害化合物を投与する；
（ｃ）患者由来の試料を、Ｒ１２０９Ｑ、Ｌ１１５２Ｒ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｇ１２６９Ａ、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される１以上のＡＬＫ耐性変異の存在について検査する；
（ｄ）（ｃ）において検査した１以上のＡＬＫ耐性変異が存在すれば、ＡＬＫ阻害化合物をその患者に投与しないか、あるいはその患者が既にＡＬＫ阻害化合物の受容中であれば代替のＡＬＫ阻害化合物を投与する；
その際、１以上のＡＬＫ融合生成物および１以上のＡＬＫ耐性変異が共に存在すれば、ＡＬＫ阻害化合物をその患者に投与しないか、あるいはその患者が既にＡＬＫ阻害化合物の受容中であれば代替のＡＬＫ阻害化合物を投与する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、癌療法のための癌診断薬およびコンパニオン診断薬(companion diagnostic)に関する。特に、本発明は、癌の診断および予後ならびに処置の有効性の予測に有用な変異の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
未分化リンパ腫キナーゼ(Anaplastic Lymphoma Kinase)（ＡＬＫ）のイントロンにおける融合による遺伝子活性化は、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)（ＮＳＣＬＣ）の一般的なゲノムドライバーである。ＡＬＫ融合体が検出された肺癌患者には、標的−抗ＡＬＫ療法を処方することができる。たとえば、薬物クリゾチニブ（ＸＡＬＫＯＲＩ（登録商標））は殊にＡＬＫタンパク質の阻害薬である。クリゾチニブはＡＬＫ融合体を伴なう患者の無増悪生存(progression-free survival)を有意に改善することが示された。しかし、患者はクリゾチニブを投与された後に少なくとも一部は耐性変異の出現のため実際には増悪を避けられない。これまでに知られているミスセンス変異は、Ｌ１１５２Ｒ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｇ１２６９Ａ、およびＧ１５４８Ｅである(Van der Wekken et al. (2016) Crit. Rev. Onc. Hematol. 100:107に概説)。
【０００３】
第１選択療法で増悪した患者の無増悪生存を延長するのに有効な第２選択療法がある。しかし、患者がこれらの第２選択療法に応答する程度は異なる。第２選択療法にどの患者が良好に応答し、どの患者が応答しないかについての遺伝学的根拠を知ることは、第１選択療法で増悪する患者のための処置を選択するのに大いに役立つであろう。
【０００４】
ＡＬＫにおけるある変異は一般的であり、一方で他はより低い頻度で起きる。理想的には、ＡＬＫ変異についての臨床試験は可能な限り多数の変異を標的とする。これによって、稀な変異を伴なう患者が“偽陰性”検査結果を受けないことが確実になるであろう。稀な変異が検出されないことになれば、そのような変異を伴なう患者は最適治療計画を受けられず、彼らの腫瘍に無効な投薬を受ける可能性がある。したがって、ＡＬＫ遺伝子における新規な変異が見出されると、この変異の検出はある患者の臨床転帰に影響を及ぼす可能性をもつ。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Van der Wekken et al. (2016) Crit. Rev. Onc. Hematol. 100:107
【発明の概要】
【０００６】
未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）遺伝子における変異をもつ細胞を宿している可能性がある腫瘍を伴なう患者を処置する方法であって、患者由来の試料をＡＬＫ変異Ｒ１２０９Ｑ（Ｇ３６３６Ａ）および／またはＩ１２６８Ｖ（Ａ３８０２Ｇ）のうち少なくとも１つの存在について検査することを含む方法を本明細書に提示する。変異Ｒ１２０９Ｑが存在すれば、本方法は、その患者にＡＬＫ阻害化合物を投与しないこと、あるいはその患者がＡＬＫ阻害化合物の受容中であれば代替のＡＬＫ阻害化合物を投与するかまたはＡＬＫ阻害化合物を投与しないことを含む。変異Ｉ１２６８Ｖが存在するかまたはいかなる変異も存在しなければ、本方法は、その患者にＡＬＫ阻害化合物を投与することを含む。ある態様において、ＡＬＫ阻害化合物はアレクチニブ(alectinib)、クリゾチニブ(crizotinib)、セリチニブ(ceritinib)、ブリガチニブ(brigatinib)、ロルラチニブ(lorlatinib)、エントレクチニブ(entrectinib)であってもよい。ある態様において、検査は変異配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドを用いて実施され、たとえば検査は対立遺伝子特異的ＰＣＲまたはＰＣＲ（たとえば、対立遺伝子特異的プローブを用いるｑＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ）により実施することができる。ある態様において、本方法はさらに、試料を１以上のＡＬＫ変異Ｇ１２０２Ｒ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｉ１１７１Ｓ、Ｒ１２０９Ｑ、Ｔ１１５１、およびＧ１５４８Ｅの存在について検査し、いずれかの変異が存在すれば、ＡＬＫ阻害化合物をその患者に投与しないこと、あるいはその患者がＡＬＫ阻害化合物の受容中であれば代替のＡＬＫ阻害化合物を投与するかまたはＡＬＫ阻害化合物を投与しないことを含む。ある態様において、本方法はさらに、試料を１以上のＡＬＫ変異Ｉ１２６８Ｖ、Ｓ１２０６Ｆ、Ｓ１２０６Ｙ、Ｇ１２６９Ａ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｌ１１９６Ｑ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｌ１１５２Ｒ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｆ１１７４Ｃ、およびＦ１１７４Ｖの存在について検査し、いずれかの変異が存在すれば、ＡＬＫ阻害化合物を、または処置が進行中であれば代替のＡＬＫ阻害化合物を投与することを含む。
【０００７】
ある態様において、本方法はさらに、試料を１以上のＡＬＫ融合生成物の存在について検査することを含む。ある態様において、ＡＬＫ融合生成物はＥＭＬ４−ＡＬＫ融合体である。ある態様において、ＡＬＫ融合生成物はＥＭＬ４−ＡＬＫ融合体バリアント３である。ＡＬＫ融合生成物が存在すれば、本方法はさらに、ＡＬＫ阻害化合物を投与することを含む。ＡＬＫ融合生成物、ならびにＧ１２０２Ｒ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｉ１１７１Ｓ、Ｒ１２０９Ｑ、Ｔ１１５１、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ変異が検出されれば、本方法はさらに、患者がＡＬＫ阻害化合物を受容中であるかまたは過去に受容していれば代替療法（たとえば、代替のＡＬＫ阻害薬療法）を施すこと、あるいはＡＬＫ阻害化合物を投与しないことを含む。ＡＬＫ融合生成物、ならびにＩ１２６８Ｖ、Ｓ１２０６Ｆ、Ｓ１２０６Ｙ、Ｇ１２６９Ａ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｌ１１９６Ｑ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｌ１１５２Ｒ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｆ１１７４Ｃ、およびＦ１１７４Ｖからなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ変異が検出されれば、本方法はさらに、ＡＬＫ阻害薬療法を施すことを含む。ある態様において、ＡＬＫ阻害化合物または代替のＡＬＫ阻害化合物は、アレクチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、ロルラチニブ、またはエントレクチニブから選択される。
【０００８】
ある態様において、患者由来の試料はＲＮＡを含有し、逆転写ＰＣＲ(reverse transcription PCR)（ＲＴ−ＰＣＲ）または蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(Fluorescence In Situ Hybridization)（ＦＩＳＨ）を用いて１以上のＡＬＫ変異および／または１以上のＡＬＫ融合生成物を検出する。ある態様において、試料はＤＮＡを含有し、ＰＣＲまたは他の核酸増幅法を用いて１以上のＡＬＫ変異および／または１以上のＡＬＫ融合生成物を検出する。
【０００９】
さらに、患者由来の試料をＡＬＫ変異Ｒ１２０９ＱおよびＩ１２６８Ｖのうち一方または両方について検査することを含む、ＡＬＫ阻害薬療法（たとえば、ＡＬＫ阻害化合物）に対する癌患者の応答の可能性を判定するための方法を提供する。変異Ｒ１２０９Ｑが存在すれば、本方法は、その患者がＡＬＫ阻害化合物に応答しないかまたはその患者に投与されていたＡＬＫ阻害化合物に応答し続けない可能性があるとレポートすることを含む。変異Ｉ１２６８Ｖが存在するかまたはいかなる変異も存在しなければ、その患者はＡＬＫ阻害化合物に応答する可能性があるとレポートする。ある態様において、ＡＬＫ阻害化合物はクリゾチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、ブリガチニブ、ロルラチニブ、およびエントレクチニブからなる群から選択される。ある態様において、検査は変異配列に対して相補的なオリゴヌクレオチドを用いて実施され、たとえば検査は対立遺伝子特異的プローブを用いる対立遺伝子特異的ＰＣＲまたはＰＣＲ（たとえば、ｑＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲ）を用いて実施できる。ある態様において、本方法はさらに、試料をＧ１２０２Ｒ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｉ１１７１Ｓ、Ｒ１２０９Ｑ、Ｔ１１５１、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される１以上のＡＬＫ変異の存在について検査することを含む。いずれかの変異が存在すれば、本方法は、その患者がＡＬＫ阻害化合物に応答する可能性がないか、あるいはその患者がＡＬＫ阻害化合物による処置を過去に受容していればその同じＡＬＫ阻害化合物に応答し続ける可能性がないとレポートすることを含む。ある態様において、本方法はさらに、試料を１以上のＡＬＫ融合生成物の存在について検査することを含む。ある態様において、ＡＬＫ融合生成物はＥＭＬ４−ＡＬＫ融合体である。ある態様において、ＡＬＫ融合生成物はＥＭＬ４−ＡＬＫ融合体バリアント３である。ＡＬＫ融合生成物が存在すれば、本方法は、その患者がＡＬＫ阻害化合物に応答する可能性があるとレポートすることを含む。ＡＬＫ融合生成物ならびにＧ１２０２Ｒ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｉ１１７１Ｓ、Ｒ１２０９Ｑ、Ｔ１１５１、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ変異が検出されれば、本方法は、その患者がＡＬＫ阻害化合物の受容中であるかまたは過去に受容していればその患者が代替療法（たとえば、代替のＡＬＫ阻害薬療法）に応答する可能性があるか、あるいはＡＬＫ阻害化合物に応答しないであろうとレポートすることを含む。
【００１０】
同様に、遺伝子にＡＬＫ変異をもつ腫瘍を伴ない、以前にアレクチニブで処置されていた患者について、患者由来の試料をＡＬＫ変異Ｒ１２０９Ｑ（Ｇ３６３６Ａ）およびＩ１２６８Ｖ（Ａ３８０２Ｇ）のうちの一方または両方の存在について検査することを含む、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）阻害薬療法を選択する方法を提供する。Ｒ１２０９Ｑ変異が存在すれば、本方法はＡＬＫ阻害化合物を選択しないかまたは投与しないこと、あるいは代替のＡＬＫ阻害化合物を選択するかまたは投与することを含む。Ｉ１２６８Ｖ変異が存在するかまたはいかなる変異も存在しなければ、その患者にアレクチニブを選択するかまたは投与する。ある態様において、本方法は、試料をＧ１２０２Ｒ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｉ１１７１Ｓ、Ｒ１２０９Ｑ、Ｔ１１５１、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される１以上のＡＬＫ変異の存在について検査し、いずれかの変異が存在すれば、その患者にＡＬＫ阻害化合物を選択しないかまたは投与しないこと、あるいはその患者に代替のＡＬＫ阻害化合物を選択するかまたは投与することを含む。ある態様において、代替のＡＬＫ阻害化合物はクリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、およびエントレクチニブからなる群から選択される。ある態様において、本方法はさらに、試料を１以上のＡＬＫ融合生成物の存在について検査することを含む。ある態様において、ＡＬＫ融合生成物はＥＭＬ４−ＡＬＫ融合体である。ある態様において、ＡＬＫ融合生成物はＥＭＬ４−ＡＬＫ融合体バリアント３である。ＡＬＫ融合生成物が存在すれば、本方法は、その患者にＡＬＫ阻害化合物を選択するかまたは投与することを含む。ＡＬＫ融合生成物ならびにＧ１２０２Ｒ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｉ１１７１Ｓ、Ｒ１２０９Ｑ、Ｔ１１５１、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ変異が検出されれば、本方法は、ＡＬＫ阻害化合物を選択しないかまたは投与しないこと、あるいは代替のＡＬＫ阻害化合物を選択するかまたは投与することを含む。
【００１１】
同様に、Ｒ１２０９Ｑ  ＡＬＫ変異の特異的検出のためのオリゴヌクレオチド、たとえばプライマー類および少なくとも１つのプローブ（たとえば、標識プローブ）を含む、ＡＬＫ遺伝子における変異を検出するためのキットを本明細書に提示する。ある態様において、キットはさらに、Ｇ１２０２Ｒ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｉ１１７１Ｓ、Ｒ１２０９Ｑ、Ｔ１１５１、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ耐性変異の特異的検出のためのオリゴヌクレオチドを含む。ある態様において、キットはさらに、Ｉ１２６８Ｖ  ＡＬＫ変異の特異的検出のためのオリゴヌクレオチドを含む。ある態様において、キットはさらに、少なくとも１つのＡＬＫ融合生成物の特異的検出のためのオリゴヌクレオチドを含む。ある態様において、少なくとも１つのＡＬＫ融合生成物には、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合体、たとえばＥＭＬ４−ＡＬＫ融合体バリアント３が含まれる。ある態様において、キットはさらに、収容されたオリゴヌクレオチドを用いて増幅および検出を実施するための試薬、たとえば核酸ポリメラーゼ（単数または複数）、逆転写酵素、補因子、ｄＮＴＰ、緩衝液などを含む。
【００１２】
同様に、Ｉ１２６８Ｖ  ＡＬＫ変異の特異的検出のためのオリゴヌクレオチド、たとえばプライマー類および少なくとも１つのプローブ（たとえば、標識プローブ）を含む、ＡＬＫ遺伝子における変異を検出するためのキットを本明細書に提示する。ある態様において、キットはさらに、Ｇ１２０２Ｒ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｉ１１７１Ｓ、Ｒ１２０９Ｑ、Ｔ１１５１、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ耐性変異の特異的検出のためのオリゴヌクレオチドを含む。ある態様において、キットはさらに、Ｒ１２０９Ｑ  ＡＬＫ変異の特異的検出のためのオリゴヌクレオチドを含む。ある態様において、キットはさらに、少なくとも１つのＡＬＫ融合生成物の検出のためのオリゴヌクレオチドを含む。ある態様において、少なくとも１つのＡＬＫ融合生成物には、ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合体、たとえばＥＭＬ４−ＡＬＫ融合体バリアント３が含まれる。ある態様において、キットはさらに、収容されたオリゴヌクレオチドを用いて増幅および検出を実施するための試薬、たとえば核酸ポリメラーゼ（単数または複数）、逆転写酵素、補因子、ｄＮＴＰ、緩衝液などを含む。
【００１３】
さらに、癌患者がＡＬＫ阻害化合物に応答するかどうかを判定するための方法を提供する。ある態様において、本方法は下記を含む：（ａ）患者由来の試料を１以上のＡＬＫ融合生成物の存在について検査する；（ｂ）１以上のＡＬＫ融合生成物が存在すれば、その患者がＡＬＫ阻害化合物に応答するであろうと判定する；（ｃ）患者由来のその試料（または異なる試料）を、Ｇ１２０２Ｒ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｉ１１７１Ｓ、Ｒ１２０９Ｑ、Ｔ１１５１、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される１以上のＡＬＫ耐性変異の存在について検査する；（ｄ）１以上のＡＬＫ耐性変異が存在すれば、その患者はＡＬＫ阻害化合物に応答しないか、あるいはその患者がＡＬＫ阻害化合物療法を過去に受けていたならばその同じＡＬＫ阻害化合物に応答しないであろうと判定する。１以上のＡＬＫ融合生成物および１以上のＡＬＫ耐性変異が共に存在すれば、その患者はＡＬＫ阻害化合物に応答しないか、あるいはその患者がＡＬＫ阻害化合物療法を過去に受けていたならばその同じＡＬＫ阻害化合物に応答しないであろうと判定する。ある態様において、本方法はさらに、その判定に従って患者を処置することを含む。すなわち、ＡＬＫ融合生成物が存在すれば、ＡＬＫ阻害化合物をその患者に投与する；ＡＬＫ耐性変異が存在すれば、ＡＬＫ阻害化合物を投与しないか、またはその患者がＡＬＫ阻害化合物療法を過去に受けていれば代替のＡＬＫ阻害化合物を投与する；あるいは、ＡＬＫ融合生成物およびＡＬＫ耐性変異が共に存在すれば、ＡＬＫ阻害化合物を投与しないか、またはその患者がＡＬＫ阻害化合物療法を過去に受けていれば代替のＡＬＫ阻害化合物を投与する。ある態様において、ＡＬＫ阻害化合物または代替のＡＬＫ阻害化合物はアレクチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、ロラチニブ、およびエントレクチニブからなる群から選択される。ある態様において、少なくとも１つのＡＬＫ融合生成物にはＥＭＬ４−ＡＬＫ融合体が含まれる。
【００１４】
さらに、癌、たとえばＮＳＣＬＣを伴なう患者における予後を予測するための方法が含まれる。ある態様において、本方法は、患者由来の試料においてバリアント３  ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合生成物の存在または非存在を判定し；バリアント３  ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合生成物の存在が検出されれば、異なる（非バリアント３）ＡＬＫ融合生成物をもつ患者と比較してその患者についてより悪い予後（たとえば、無増悪生存時間の短縮、全生存時間の短縮、より重篤な疾患症状など）を予測することを含む。ある態様において、判定はＮＧＳ、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、およびＩＨＣ(immunohistochemistry(免疫組織化学))からなる群から選択される方法により実施される。ある態様において、試料は血液または血液製品、および腫瘍組織（たとえば、新鮮な組織またはＦＦＰＥＴ試料）を含めた患者由来の組織試料からなる群から選択される。
【００１５】
さらに、癌、たとえばＮＳＣＬＣを伴なう患者における予後を予測するための方法が含まれる。ある態様において、本方法は、患者由来の試料において変異の数を判定することを含む。ある態様において、本方法は、患者試料において変異の数を判定し;４以下の変異を伴なう患者の予後と比較して、患者試料が４より多い変異を含むならばその患者についてより悪い予後（たとえば、無増悪生存時間の短縮、全生存時間の短縮、より重篤な疾患症状など）を予測することを含む。ある態様において、判定はＮＧＳ、ＰＣＲ、ＦＩＳＨ、およびＩＨＣ（免疫組織化学）からなる群から選択される方法により実施される。ある態様において、試料は血液または血液製品、および腫瘍組織（たとえば、新鮮な組織またはＦＦＰＥＴ試料）を含めた患者由来の組織試料からなる群から選択される。ある態様において、検出された変異は、実施例５（表２、４、および５）に示す癌関連遺伝子、たとえばＡＬＫ、および他の遺伝子から選択される。ある態様において、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２５０、５００、１０００、またはそれ以上の遺伝子についての変異を変異状態について検査する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、アレクチニブ処置の前と後の患者試料におけるＲ１２０９Ｑ変異の検出および変異頻度を示す。この変異はアレクチニブ処置後の６人のうち５人の患者に検出された。
【図２】図２は、６人目の患者にアレクチニブ処置の前と後に見出された種々の変異を示す。
【図３】図３は、ＡＬＫ耐性（ALK resistance）（ＡＬＫＲ）変異を伴なう患者および伴なわない患者の無増悪生存(Progression Free Survival)（ＰＦＳ）を示す。ＰＦＳの月数がｘ軸に示される。ＡＬＫ耐性変異を伴なわない者は有意に長いＰＦＳをもつ。
【図４】図４は、ＡＬＫ耐性変異を伴なう患者および伴なわない患者の全生存(Overall Survival)（ＯＳ）を示す。ＯＳの月数がｘ軸に示される。ＡＬＫ耐性変異を伴なわない者は有意に長いＯＳをもつ。
【図５】図５は、ＡＬＫ耐性（ＡＬＫＲ）変異を伴なうかまたは伴なわず、かつＡＬＫ融合体（ＡＬＫ）を伴なうかまたは伴なわない患者のＰＦＳを示す。ＡＬＫＲもＡＬＫ融合体も伴なわない患者は最長ＰＦＳをもち、ＡＬＫ融合体を伴ないＡＬＫＲを伴なわない者がこれに続き、ＡＬＫ融合体およびＡＬＫＲ変異を伴なう者がこれに続いた。
【図６】図６は、ＡＬＫ耐性（ＡＬＫＲ）変異を伴なうかまたは伴なわず、かつＡＬＫ融合体（ＡＬＫ）を伴なうかまたは伴なわない患者のＯＳを示す。ＡＬＫＲもＡＬＫ融合体も伴なわない患者は最長ＯＳをもち、ＡＬＫ融合体を伴ないＡＬＫＲを伴なわない者がこれに続き、ＡＬＫ融合体およびＡＬＫＲ変異を伴なう者がこれに続いた。
【図７】図７は、より多くのＡＬＫ変異および非ＡＬＫ変異がＰＦＳに及ぼす影響を示す。４以下の変異を伴なう患者は、４より多い変異を伴なう患者より長いＰＦＳをもっていた。
【図８】図８は、バリアント３  ＡＬＫ融合体が無増悪生存時間に及ぼす影響を他のＡＬＫ融合体と比較して示す。ＰＦＳは、バリアント３  ＡＬＫ融合体を伴なう患者については、非バリアント３  ＡＬＫ融合体を伴なう患者のものと比較して有意に短い。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
以下の定義は本開示を理解するのに役立つ。
用語“ＡＬＫ耐性変異(ALK resistant mutation)”、“ＡＬＫ耐性変異(ALK resistance mutation)”、“ＡＬＫ阻害薬耐性変異(ALK inhibitor resistant mutation)”、“ＡＬＫ療法耐性変異(ALK therapy resistant mutation)”、および類似の用語は、ＡＬＫ遺伝子におけるＡＬＫ阻害、たとえばアレクチニブに対する耐性を付与する変異を表わすために用いられる。ＡＬＫ耐性変異の例には、Ｒ１２０９Ｑ、Ｌ１１５２Ｒ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｇ１２６９Ａ、およびＧ１５４８Ｅが含まれる。
【００１８】
用語“ＡＬＫ融合体”、“ＡＬＫ融合生成物”、および類似の用語は、ＡＬＫに関連する遺伝子融合生成物を表わす。これらの融合生成物の多くは、ＡＬＫの異常に高い発現および／またはキナーゼ活性をもたらす。例には、ＥＭＬ４、ＫＩＦ５Ｂ、ＨＩＰ１、ＫＬＣ１またはＴＦＧとＡＬＫとの融合体が含まれる。具体的な融合体を本明細書の表２および５に示す。
【００１９】
本明細書中で用いる用語“療法に応答する”、“阻害化合物に応答する”、および類似の用語は、療法または阻害化合物に対する癌患者による陽性応答を表わす。応答性は、無増悪生存（ＰＦＳ）または全生存の延長、腫瘍サイズの低減、腫瘍の増殖または転移の低減、健康状態の改善などである可能性がある。
【００２０】
用語“対立遺伝子特異的ＰＣＲ”または“対立遺伝子特異的プライマーを用いるＰＣＲ”は、標的配列の１より多いバリアント（たとえば、野生型および変異バリアント）にハイブリダイズするけれども、そのプライマーはバリアントのうち１つだけ（たとえば、変異バリアント）について適切な条件下で効率的に核酸ポリメラーゼにより延長されるという点で標的配列のバリアントを識別できるプライマーを用いるＰＣＲを表わす。標的配列の他のバリアント（たとえば、野生型）については、延長はより効率が低いか、非効率的であるか、または検出不可能である。
【００２１】
用語“試料”、“患者由来の試料”、“患者試料”、および類似の用語は、標的核酸を含有するかまたは含有すると推定されるいずれかの組成物を表わす。これは、個体から分離した組織または体液の試料、たとえば皮膚、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙液、血球、臓器および腫瘍を含み、個体から採取した細胞から樹立したインビトロ培養の試料をも表わし、これにはホルマリン固定パラフィン包埋組織(formalin-fixed paraffin embedded tissue)（ＦＦＰＥＴ）およびそれから単離した核酸が含まれる。試料には、無細胞材料、たとえば無細胞ＤＮＡ(cell-free DNA)（ｃｆＤＮＡ）または循環腫瘍ＤＮＡ(circulating tumor DNA)（ｃｔＤＮＡ）を含有する無細胞血液画分も含まれる。試料は、処理した組織または体液、たとえば精製または部分精製した核酸をも表わすことができる。
【００２２】
用語“核酸”、“ポリヌクレオチド”、および“オリゴヌクレオチド”は、単一ヌクレオチドのマルチマーまたはポリマーを表わすために互換性をもって使用できる。“オリゴヌクレオチド”は、比較的短いポリヌクレオチドを記述するために時折り用いられる用語である。オリゴヌクレオチドは、たとえば表示したヌクレオチド配列のある領域に対応する少なくとも６個のヌクレオチド、たとえば少なくとも約１０〜１２個のヌクレオチド、または少なくとも約１５〜３０個のヌクレオチドから構成できる。用語“ヌクレオチド”は、一般にモノマー、すなわち単一塩基を表わす。
【００２３】
用語“プライマー”は、標的核酸中の配列とハイブリダイズし、核酸の相補鎖に沿った合成の開始点としてそのような合成に適した条件下で作用できるオリゴヌクレオチドを表わす。フォワードプライマーとリバースプライマーがアンプリコンの境界を設定し、適切な条件下で核酸ポリメラーゼに曝露されると増幅生成物を生成する。本明細書中で用いる用語“プローブ”は、標的核酸中の配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを表わし、通常は検出可能な状態に標識される。プローブは、そのプローブを核酸ポリメラーゼにより延長されないようにする修飾、たとえば３’末端修飾、および１以上の非天然標識、たとえば発蛍光団、発色団を、場合によりクエンチャーとの組合わせでもつことができる。同一配列をもつオリゴヌクレオチドが、あるアッセイではプライマーとして、また別のアッセイではプローブとして作用できる。
【００２４】
本明細書中で用いる用語“標的配列”、“標的核酸”、または“標的”は、試料中の検出または分析すべき核酸配列部分を表わす。標的という用語には、標的配列のすべてのバリアント、たとえば１以上の変異バリアントおよび野生型バリアントが含まれる。
【００２５】
用語“シーケンシング”は、標的核酸中のヌクレオチドの配列を決定するいずれかの方法を表わす。
用語“患者”および“対象”は、疾患について診断または処置することができるかまたはできないけれども医療の対象である個体を表わす。
【００２６】
用語“投与する(administer)”、“投与(administering)”、および類似の用語は、物理的投与に限定されず、療法計画（たとえば、薬物または化学療法による処置）を推奨または処方することをも含む。
【００２７】
ＡＬＫの変異および融合バリアントの検出、予後、および処置のための方法
癌の診断および予後、ならびに療法計画の設計およびその療法計画の成功の予測に有用な、ＡＬＫのキナーゼドメインにおける新規な変異を本明細書に提示する。さらに、ＡＬＫ遺伝子における多数の異常（たとえば、ＡＬＫ融合生成物およびＡＬＫ耐性変異）が予後および療法効力に及ぼす影響を本明細書に記載する。
【００２８】
ＡＬＫの異常な活性化が幾つかのタイプの癌を駆動することは知られている。おおよそ６０％の未分化リンパ腫および３〜５％の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が、遺伝子の融合および変異によって活性化されたＡＬＫをもつ。ＡＬＫが神経芽細胞腫、神経膠芽細胞腫、食道癌および乳癌において異常に活性であることも見出されている。ＡＬＫの異常な活性化は、しばしば遺伝子融合、最も一般的にはＥＭＬ４−ＡＬＫ(echinoderm microtubule-associated protein like 4-anaplastic lymphoma kinase(棘皮動物微小管会合タンパク質様  ４−未分化リンパ腫キナーゼ))を伴なう。ＥＭＬ４−ＡＬＫ融合体は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）と関連する。大部分の融合体の場合、ＡＬＫのＮ末端、細胞外部分が、ＥＭＬ４（またはＫＩＦ５Ｂ、ＨＩＰ１、ＫＬＣ１、もしくはＴＦＧ）により置き換えられている。その結果生じる融合遺伝子の発現は、強力なプロモーター、たとえばＥＭＬプロモーターにより駆動され、その結果、ＡＬＫの細胞内チロシンキナーゼドメインの発現がより高くなる。さらに、ＥＭＬ４はコイルド−コイルを形成し、それはリガンド非依存性の二量体化、およびＡＬＫチロシンキナーゼドメインの構成性活性化をもたらす。
【００２９】
ＡＬＫキナーゼの幾つかの低分子阻害薬が現在市販されており、あるいは臨床試験中である。これらには、クリゾチニブ（ＸＡＬＫＯＲＩ（登録商標））、セリチニブ（ＺＹＫＡＤＩＡ（登録商標））、アレクチニブ（ＡＬＥＣＥＮＳＡ（登録商標））、ブリガチニブ、ロルラチニブ、エントレクチニブ、および現在開発初期である他の化合物が含まれる。臨床転帰の分析およびインビトロ細胞株試験により、ＡＬＫ遺伝子におけるミスセンス変異の結果としてＡＬＫ阻害薬に対する耐性がしばしば発現することが明らかになった(Van der Wekken et al. (2016) Crit. Rev. Onc. Hematol. 100:107中に概説)。
【００３０】
ＡＬＫ阻害薬療法を受けている癌患者において見出されたＡＬＫ遺伝子における新規バリアントＲ１２０９Ｑ（Ｇ３６２６Ａ）およびＩ１２６８Ｖ（Ａ３８０２Ｇ）を本明細書に記載する。参照ヒトゲノムｈｇ１９において、Ｒ１２０９Ｑはｃｈｒ２：２９４４３５９１：Ｃ＞Ｔに対応し、Ｉ１２６８Ｖはｃｈｒ２：２９４３２６８６：Ｔ＞Ｃに対応する。参照ヒトゲノムｈｇ３８において、Ｒ１２０９Ｑはｃｈｒ２：２９２２０７２５：Ｃ＞Ｔに対応し、Ｉ１２６８Ｖはｃｈｒ２：２９２０９８２０：Ｔ＞Ｃに対応する。
【００３１】
大部分の患者において、バリアントＲ１２０９ＱはＡＬＫ阻害薬療法を施した後に検出され、これはこの変異が療法に対する耐性に関与していることの証拠を提示する。しかし、１人の被験患者においてこの変異はＡＬＫ阻害薬療法を施す前と後の両方に存在していた。他方のバリアントＩ１２６８Ｖはこの療法を施す前の患者にのみ同定され、これはそれが療法に対する感受性に関与している可能性があることを示唆する。
【００３２】
変異したＡＬＫ遺伝子または遺伝子生成物（すなわち、変異ｍＲＮＡまたは変異タンパク質）は、腫瘍組織（たとえば、新鮮な組織またはＦＦＰＥＴ組織）、気管支肺胞洗浄液、または腫瘍細胞もしくは腫瘍核酸が存在する可能性がある他の身体試料、たとえば尿、喀痰、血漿もしくは血清中に検出できる。変異は、無細胞腫瘍ＤＮＡまたはＲＮＡが存在する可能性がある無細胞材料、たとえば尿、喀痰、血漿もしくは血清中にも検出できる。
【００３３】
核酸を生体試料から単離するための方法は、たとえばSambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y. 1989)に記載されるように既知であり、幾つかのキットが市販されている（たとえば、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ、およびＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  Ｔｏｔａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，Ｒｏｃｈｅから）。ある態様において、ＤＮＡを調製し、本明細書に開示する増幅方法および検出方法のための鋳型として用いる。ある態様において、ＲＮＡを調製する。ＲＮＡをＰＣＲにより増幅するための鋳型として用いる場合、ｃＤＮＡを調製するための逆転写工程が必要である。次いで、ＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＴａｑ、Ｔａｑ誘導体、または他の耐熱性ポリメラーゼを用いて増幅を実施することができる。
【００３４】
変異特異的オリゴヌクレオチドプライマー（たとえば、対立遺伝子特異的プライマー）を用いる対立遺伝子特異的ＰＣＲにより、ＡＬＫ遺伝子における変異Ｒ１２０９Ｑ（Ｇ３６２６Ａ）およびＩ１２６８Ｖ（Ａ３８０２Ｇ）を検出する方法を本明細書に提示する。対立遺伝子特異的プライマーは一般に、標的配列（たとえば、変異配列）にマッチし、別の配列（たとえば、野生型配列）に対してはミスマッチである３’末端をもつ。場合により、対立遺伝子特異的プライマーは野生型および変異型の両方の標的配列との内部ミスマッチを含むことができる。対立遺伝子特異的ＰＣＲプライマーにおけるさらに他のミスマッチがプライマーの選択性を高めることが示された。参照：U.S. Patent 8,586,299。
【００３５】
ある態様において、本方法はさらに、対立遺伝子特異的ＰＣＲを用いていずれかの組合わせの１以上のＡＬＫ変異Ｇ１２０２Ｒ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｉ１１７１Ｓ、Ｒ１２０９Ｑ、Ｔ１１５１、Ｇ１５４８Ｅ、Ｉ１２６８Ｖ、Ｓ１２０６Ｆ、Ｓ１２０６Ｙ、Ｇ１２６９Ａ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｌ１１９６Ｑ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｌ１１５２Ｒ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｆ１１７４Ｃ、およびＦ１１７４Ｖを患者試料中に検出することを含む。ある態様において、本方法はさらに、患者由来の試料がたとえば試料からのＲＮＡ中に少なくとも１つのＡＬＫ融合生成物（参照：たとえば表２）を含有するかどうかを判定することを含む。融合生成物は、融合点のいずれかの側における増幅プライマー類（たとえば、一方のプライマーはＡＬＫ配列に対して相補的であり、他方のプライマーは融合パートナー由来の配列、たとえばＥＭＬ４に対して相補的である）を用いて、またはその融合生成物の融合点を含む配列に対して相補的な１つのプライマーを用いて検出できる。ある態様において、融合は、その融合生成物の融合点を含む配列に対して相補的な（ハイブリダイズする）標識プローブを用いて検出される。ある態様において、標識プローブはＡＬＫまたはその融合パートナー中の配列に対して相補的であり、融合体はそのプローブにハイブリダイズする増幅生成物のサイズまたは存在に基づいて検出される。
【００３６】
さらに、ＡＬＫ遺伝子における変異Ｒ１２０９Ｑ（Ｇ３６２６Ａ）およびＩ１２６８Ｖ（Ａ３８０２Ｇ）を特異的プローブで検出するための方法を提供する。プローブは多数の核酸検出法、たとえばサザンもしくはノーザンハイブリダイゼーション、リアルタイムＰＣＲ、またはＮＧＳに使用できる。代表的な変異特異的検出プローブは、検出が行なわれる反応条件下で、標的配列（たとえば、変異配列）と安定なハイブリッドを形成し、別の配列（たとえば、同一部位における野生型配列）とは安定なハイブリッドを形成しない。プローブハイブリダイゼーションが首尾よく行なわれるためには、プローブは標的配列に対して少なくとも部分的な相補性をもつ必要がある。一般に、プローブの中心部分に近接した相補性がプローブの末端における相補性より重要である。参照：たとえばInnis et al., Academic Press, NY, 1990 Chapter 32, pp. 262-267。ある態様において、プローブは、プロテイン核酸(protein-nucleic acid)（ＰＮＡ）、ロックト核酸(locked nucleic acid)（ＬＮＡ）、モレキュラービーコン(molecular beacon)プローブを含めた特定の構造をもち(Tyagi et al. (1996) Nat. Biotechnol. 3:303-308)、あるいはＳＣＯＲＰＩＯＮＳ（登録商標）セルフプロービングプライマー(self-probing primer)に含めることができる(Whitcombe et al. (1999) Nat. Biotechnol. 8:804-807)。プローブを放射性、蛍光性または発色性標識で、場合によりクエンチャー部分、たとえばＢＨＱとの組合わせで標識することができる。たとえば、変異をリアルタイム対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応により検出することができ、その際、増幅生成物へのプローブのハイブリダイゼーションの結果、プローブの酵素消化および消化生成物の検出が行なわれる（ＴａｑＭａｎプローブ、Holland et al., (1991) P.N.A.S. USA 88:7276-7280)。プローブと標的のハイブリダイゼーションは、核酸デュプレックス形成による蛍光変化を検出すること(U.S. application Ser. No. 12/330,694, 2008年12月9日出願)、またはプローブと標的のハイブリッドの特徴的な融解温度を検出することによっても検出できる(U.S. Pat. No. 5,871,908)。ある態様において、本方法はさらに、ハイブリダイゼーションプローブを用いて患者試料中のいずれかの組合わせの１以上のＡＬＫ変異Ｇ１２０２Ｒ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｉ１１７１Ｓ、Ｒ１２０９Ｑ、Ｔ１１５１、Ｇ１５４８Ｅ、Ｉ１２６８Ｖ、Ｓ１２０６Ｆ、Ｓ１２０６Ｙ、Ｇ１２６９Ａ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｌ１１９６Ｑ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｌ１１５２Ｒ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｆ１１７４Ｃ、およびＦ１１７４Ｖを検出することを含む。ある態様において、本方法はさらに、患者由来の試料がたとえば試料からのＲＮＡ中に少なくとも１つのＡＬＫ融合生成物（参照：たとえば表２）を含有するかどうかを判定することを含む。
【００３７】
変異ＡＬＫ遺伝子をもつ細胞を宿している可能性がある腫瘍を伴なう患者をＡＬＫ阻害薬で処置する方法であって、患者試料をＡＬＫ変異Ｒ１２０９Ｑ（Ｇ３６３６Ａ）および／またはＩ１２６８Ｖ（Ａ３８０２Ｇ）のうちの一方または両方の存在について検査することを含む方法を本明細書に提示する。変異Ｉ１２６８Ｖが見出されれば、本方法はさらに、ＡＬＫ阻害薬療法（たとえば、ＡＬＫ阻害化合物、たとえばクリゾチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、ブリガチニブ、ロルラチニブ、またはエントレクチニブ）を施すことを含むが、変異Ｒ１２０９Ｑが見出されれば、本方法はさらに、ＡＬＫ阻害薬療法が既に進行中であれば代替療法（たとえば、代替のＡＬＫ阻害薬療法）を施すこと、あるいはＡＬＫ阻害薬療法を施さないことを含む。ある態様において、本方法はさらに、患者試料をＧ１２０２Ｒ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｉ１１７１Ｓ、Ｔ１１５１、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される１以上のＡＬＫ変異（たとえば、いずれかの組合わせのいずれか１、２、３、４、５、６、７種類のＡＬＫ耐性変異、または８種類すべてのＡＬＫ耐性変異）の存在について検査することを含み、これらの変異のうち少なくとも１つが見出されれば、本方法はさらに、ＡＬＫ阻害薬療法が進行中であれば代替療法（たとえば、代替のＡＬＫ阻害薬療法）を施すこと、あるいはＡＬＫ阻害薬療法を施さないことを含む。ある態様において、本方法はさらに、患者試料をＳ１２０６Ｆ、Ｓ１２０６Ｙ、Ｇ１２６９Ａ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｌ１１９６Ｑ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｌ１１５２Ｒ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｆ１１７４Ｃ、およびＦ１１７４Ｖからなる群から選択される１以上のＡＬＫ変異（たとえば、いずれかの組合わせのいずれか１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種類のＡＬＫ感受性変異、または１１種類すべての感受性変異）の存在について検査し、少なくとも１つの感受性変異が検出されれば、ＡＬＫ阻害薬療法（たとえば、処置が進行中であれば代替のＡＬＫ阻害薬処置）を施すことを含む。ある態様において、本方法はさらに、患者由来の試料が少なくとも１つのＡＬＫ融合生成物を含むかどうかを判定することを含む。ＡＬＫ融合生成物が検出された場合、本方法はさらに、ＡＬＫ阻害薬療法を施すことを含む。ＡＬＫ融合生成物、ならびにＧ１２０２Ｒ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｉ１１７１Ｓ、Ｒ１２０９Ｑ、Ｔ１１５１、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ変異（たとえば、いずれかの組合わせのいずれか１、２、３、４、５、６、７種類のＡＬＫ耐性変異、または８種類すべてのＡＬＫ耐性変異）が検出された場合、本方法はさらに、ＡＬＫ阻害薬療法が進行中である場合には代替療法（たとえば、代替のＡＬＫ阻害薬療法）を施すこと、あるいはＡＬＫ阻害薬療法を施さないことを含む。ある態様において、本方法はさらに、患者試料をＳ１２０６Ｆ、Ｓ１２０６Ｙ、Ｇ１２６９Ａ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｌ１１９６Ｑ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｌ１１５２Ｒ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｆ１１７４Ｃ、およびＦ１１７４Ｖからなる群から選択される１以上のＡＬＫ変異（たとえば、いずれかの組合わせのいずれか１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種類のＡＬＫ感受性変異、または１１種類すべての感受性変異）の存在について検査し、少なくとも１つの感受性変異が検出されれば、ＡＬＫ阻害薬療法（たとえば、処置が進行中であれば代替のＡＬＫ阻害薬）を施すことを含む。ある態様において、ＡＬＫ阻害薬療法（たとえば、ＡＬＫ阻害化合物）または代替のＡＬＫ阻害薬療法は、アレクチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、ロルラチニブ、またはエントレクチニブから選択される。
【００３８】
たとえばドット−ブロットまたは核酸アレイフォーマットにおける多重プローブへのハイブリダイゼーション、マルチプレックスＰＣＲ、たとえばマルチプレックス対立遺伝子特異的ＰＣＲおよびマルチプレックスＰＣＲ、続いて変異特異的な融解温度を特徴とする各プローブによるプローブ融解アッセイを用いて、多重変異を同時または個別に検出することができる。多重変異は、核酸シーケンシングにより検出することもできる。シーケンシングは、当技術分野で既知のいずれかの方法により実施できる。特に有利なものは、ハイスループット単分子シーケンシング（次世代シーケンシング(next generation sequencing)、すなわちＮＧＳ）である。そのような技術の例には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，カリフォルニア州サンディエゴ）、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ニューヨーク州グランドアイランド）、ＳＭＲＴ（登録商標）試薬を用いるＰａｃｉｆｉｃ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，カリフォルニア州メンローパーク）、またはＧｅｎｉａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｈｅ  Ｇｅｎｉａ，カリフォルニア州サンタクララ）もしくはＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（英国ケンブリッジ）が開発したナノポアベースのシーケンシング技術、またはシーケンシング・バイ・シンセシス(sequencing by synthesis)を伴なうかまたは伴なわない他のいずれかの既存もしくは将来の単分子シーケンシング技術が含まれる。融合体は、特定のＡＬＫ融合体に対して特異的であるかまたは１より多いＡＬＫ融合体の存在を検出できるプライマーまたはプローブを、たとえばUS7700339およびUS20160304937の記載に従って設計することにより検出できる。
【００３９】
シーケンシング技術には、たとえば患者の血清中にごく少量存在する循環腫瘍ＤＮＡ(circulating tumor DNA)（ｃｔＤＮＡ）からのごく少量の標的核酸の検出の感度および特異度を高めることができるデータ解析工程を含めることができる。試料バーコーディングおよび誤差修正を含むそのような方法の例が、U.S. patent application US20140296081およびUS20160032396に記載されている。
【００４０】
さらに、ＡＬＫ阻害薬に対する患者の悪性腫瘍の応答の可能性を判定するための方法を提供する。ある態様において、本方法は、患者由来の試料を変異Ｒ１２０９Ｑ（Ｇ３６２６Ａ）およびＩ１２６８Ｖ（Ａ３８０２Ｇ）のうちの一方または両方の存在について検査することを含む。変異Ｉ１２６８Ｖが見出されれば、本方法はその患者がＡＬＫ阻害薬療法（たとえば、ＡＬＫ阻害化合物）に応答する可能性があるとレポートすることを含む。変異Ｒ１２０９Ｑが見出されれば、特にその患者がＡＬＫ阻害薬で処置されていれば、本方法はその患者がＡＬＫ阻害薬療法に応答する可能性がないとレポートすることを含む。そのような場合、本方法はその患者が同一のＡＬＫ阻害薬療法に応答する可能性はないけれどもその患者が代替のＡＬＫ阻害薬療法を含めた代替療法に応答する可能性があるとレポートすることを含む。ある態様において、本方法はさらに、患者由来の試料をＬ１１５２Ｒ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｇ１２６９Ａ、およびＧ１５４８Ｅから選択される１以上のＡＬＫ耐性変異の存在について検査し、少なくとも１つのＡＬＫ耐性変異が見出されれば、特にその患者がＡＬＫ阻害薬で処置されていれば、本方法はその患者がＡＬＫ阻害薬療法に応答する可能性がないとレポートすることを含む。そのような場合、本方法はその患者が同一のＡＬＫ阻害薬療法に応答する可能性はないけれどもその患者が代替のＡＬＫ阻害薬療法を含めた代替療法に応答する可能性があるとレポートすることを含む。ある態様において、ＡＬＫ阻害薬療法はアレクチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、ロルラチニブ、またはエントレクチニブから選択される。ある態様において、本方法はさらに、患者由来の試料が少なくとも１つのＡＬＫ融合生成物を含有するかどうかを判定することを含む。ＡＬＫ融合生成物が検出された場合、本方法はさらに、ＡＬＫ阻害薬療法を施すことを含む。ＡＬＫ融合生成物、ならびにＲ１２０９、Ｌ１１５２Ｒ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｇ１２６９Ａ、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ耐性変異が検出された場合、本方法はさらに、ＡＬＫ阻害薬療法が進行中である場合には代替療法（たとえば、代替のＡＬＫ阻害薬療法）を施すこと、あるいはＡＬＫ阻害薬療法を施さないことを含む。
【００４１】
さらに、悪性腫瘍を伴ない、アレクチニブで過去に処置された患者について、ＡＬＫ阻害薬を選択するための方法を提供する。本方法は、患者由来の試料を変異Ｒ１２０９Ｑ（Ｇ３６２６Ａ）およびＩ１２６８Ｖ（Ａ３８０２Ｇ）のうちの一方または両方の存在について検査することを含む。変異Ｉ１２６８Ｖが見出されれば、本方法はアレクチニブをＡＬＫ阻害薬療法として選択することを含む。変異Ｒ１２０９Ｑが見出されれば、本方法は代替療法（たとえば、代替のＡＬＫ阻害薬療法）を選択すること、あるいはＡＬＫ阻害薬療法を選択しないことを含む。ある態様において、本方法はさらに、患者由来の試料をＬ１１５２Ｒ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｇ１２６９Ａ、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される１以上のＡＬＫ変異の存在について検査し、少なくとも１つの変異が見出されれば、代替療法（たとえば、代替のＡＬＫ阻害薬療法）を選択すること、あるいはＡＬＫ阻害薬療法を選択しないことを含む。ある態様において、本方法はさらに、患者由来の試料が少なくとも１つのＡＬＫ融合生成物を含有するかどうかを判定することを含む。ＡＬＫ融合生成物が検出された場合、本方法はさらに、たとえばアレクチニブを含めたＡＬＫ阻害薬療法を施すことを含む。ＡＬＫ融合生成物、ならびにＲ１２０９、Ｌ１１５２Ｒ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｇ１２６９Ａ、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ耐性変異が検出された場合、本方法はさらに、代替療法（たとえば、代替のＡＬＫ阻害薬療法）を施すこと、あるいはＡＬＫ阻害薬療法を施さないことを含む。ある態様において、代替のＡＬＫ阻害薬療法はクリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、ロルラチニブ、またはエントレクチニブから選択される。
【００４２】
ＡＬＫ遺伝子における変異Ｒ１２０９Ｑ（Ｇ３６２６Ａ）およびＩ１２６８Ｖ（Ａ３８０２Ｇ）のうちの一方または両方を検出するのに必要な試薬を収容したキットを本明細書に提示する。ある態様において、キットは、変異配列に対して特異的な（すなわち、野生型配列を変異配列から識別できる）オリゴヌクレオチド、たとえばプローブおよび増幅プライマー、ならびに変異Ｒ１２０９ＱおよびＩ１２６８Ｖが位置するＡＬＫ遺伝子部分を捕獲するための捕獲プローブを含む。ある態様において、キットはＤＮＡまたは対応するｍＲＮＡ配列における変異Ｒ１２０９Ｑ（Ｇ３６２６Ａ）およびＩ１２６８Ｖ（Ａ３８０２Ｇ）を検出するために必要な試薬を収容している。たとえば、キットはさらに増幅および検出のアッセイを実施するために必要な試薬、たとえばＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＲ、逆転写（たとえば、ＲＴ−ＰＣＲについて）、および／または転写仲介増幅(transcription mediated amplification)（ＴＭＡ）の成分を含む。ある態様において、変異特異的オリゴヌクレオチドは検出可能な状態に標識されている。ある態様において、キットは標識のための試薬およびその標識を検出するための試薬を含む。たとえば、オリゴヌクレオチドがビオチンで標識されていれば、キットはストレプトアビジン試薬を酵素およびそれの発色性基質と共に含むことができる。ある態様において、キットはさらに、ＡＬＫ遺伝子におけるＧ１２０２Ｒ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｉ１１７１Ｓ、Ｒ１２０９Ｑ、Ｔ１１５１、およびＧ１５４８Ｅから選択される少なくともさらに１つの変異（たとえば、いずれかの組合わせのいずれか１、２、３、４、５、６、７種類のＡＬＫ耐性変異、または８種類すべてのＡＬＫ耐性変異）を検出するための試薬を収容している。ある態様において、キットはさらに、ＡＬＫ遺伝子におけるＩ１２６８Ｖ、Ｓ１２０６Ｆ、Ｓ１２０６Ｙ、Ｇ１２６９Ａ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｌ１１９６Ｑ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｌ１１５２Ｒ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｆ１１７４Ｃ、およびＦ１１７４Ｖから選択される少なくともさらに１つの変異（たとえば、いずれかの組合わせのいずれか１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種類のＡＬＫ感受性変異、または１１種類すべての感受性変異）を検出するための試薬を収容している。
【００４３】
ある態様において、キットはｍＲＮＡにおける変異Ｒ１２０９Ｑ（Ｇ３６２６Ａ）およびＩ１２６８Ｖ（Ａ３８０２Ｇ）を検出するための試薬を含む。この態様は、ＤＮＡにおける変異を検出するためのキットと構成要素を共有し、さらにＲＮＡベースの検出のための、下記のうち１以上の試薬を含む：逆転写酵素活性をもつＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素、ＲＮＡｓｅ  Ｈ活性をもつ酵素、およびオリゴｄＴ捕獲試薬。
【００４４】
ある態様において、キットはＡＬＫタンパク質における変異Ｒ１２０９ＱおよびＩ１２６８Ｖを検出するための試薬を含む。キットは、変異ＡＬＫタンパク質に対して特異的であるけれども野生型ＡＬＫタンパク質に対しては特異的でない抗体を含むことができる。ある態様において、キットは患者由来の血液（たとえば、血漿または血清）試料中の変異タンパク質を検出するための試薬を収容している。ある態様において、キットは患者由来の組織試料中の変異体を検出するための試薬を収容している。
【００４５】
ある態様において、少なくとも１つのＡＬＫ変異またはＡＬＫ融合体の存在を検出するためのキットを提供する。ある態様において、キットはＡＬＫ変異Ｒ１２０９Ｑを特異的に検出するための（すなわち、アミノ酸１２０９をコードするヌクレオチド位置において変異配列をたとえば野生型配列から識別できる）オリゴヌクレオチド（たとえば、プライマーおよびプローブ、またはそのバリアント、たとえばスコーピオンプローブ(Scorpion probe))を収容している。ある態様において、キットはＡＬＫ変異Ｉ１２６８Ｖを特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドを収容している。ある態様において、キットは、Ｇ１２０２Ｒ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｉ１１７１Ｓ、Ｒ１２０９Ｑ、Ｔ１１５１、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ耐性変異（たとえば、いずれかの組合わせのいずれか１、２、３、４、５、６、７種類のＡＬＫ耐性変異、または８種類すべてのＡＬＫ耐性変異）を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドを収容している。ある態様において、キットはさらに、ＡＬＫ遺伝子におけるＩ１２６８Ｖ、Ｓ１２０６Ｆ、Ｓ１２０６Ｙ、Ｇ１２６９Ａ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｌ１１９６Ｑ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｌ１１５２Ｒ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｆ１１７４Ｃ、およびＦ１１７４Ｖからなる群から選択される少なくともさらに１つの変異（たとえば、いずれかの組合わせのいずれか１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種類のＡＬＫ感受性変異、または１１種類すべての感受性変異）を検出するための試薬を収容している。
【００４６】
ある態様において、キットは、少なくとも１つのＡＬＫ融合生成物を検出するためのオリゴヌクレオチドを収容している。たとえば、キットは、１以上のＡＬＫ融合生成物の融合点のいずれかの側に適合するプライマー類、および個々の融合生成物を特異的に検出するかまたは１より多い融合生成物を検出するプローブを収容することができる。ある態様において、キットは、Ｇ１２０２Ｒ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｉ１１７１Ｓ、Ｒ１２０９Ｑ、Ｔ１１５１、およびＧ１５４８Ｅからなる群から選択される少なくとも１つのＡＬＫ耐性変異（たとえば、いずれかの組合わせのいずれか１、２、３、４、５、６、７種類のＡＬＫ耐性変異、または８種類すべてのＡＬＫ耐性変異）ならびに１以上のＡＬＫ融合生成物を特異的に検出するためのオリゴヌクレオチドを収容している。ある態様において、キットはさらに、ＡＬＫ遺伝子におけるＩ１２６８Ｖ、Ｓ１２０６Ｆ、Ｓ１２０６Ｙ、Ｇ１２６９Ａ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｌ１１９６Ｑ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｌ１１５２Ｒ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｆ１１７４Ｃ、およびＦ１１７４Ｖからなる群から選択される少なくともさらに１つの変異（たとえば、いずれかの組合わせのいずれか１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種類のＡＬＫ感受性変異、または１１種類すべての感受性変異）を検出するための試薬を収容している。ある態様において、１以上のＡＬＫ融合生成物は１以上のＥＭＬ４−ＡＬＫ（たとえば、表２に挙げるもの）、ＫＩＦ５Ｂ−ＡＬＫ、ＨＩＰ１−ＡＬＫ、ＫＬＣ１−ＡＬＫ、およびＴＦＧ−ＡＬＫから選択できる。
【００４７】
ある態様において、キットはさらに、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、両方の活性をもつ酵素、および／またはその酵素（単数または複数）の活性に必要ないずれかの補因子を収容している。ある態様において、キットはさらに、核酸増幅に使用できる追加の試薬、たとえばｄＮＴＰおよび／または緩衝試薬を備えている。ある態様において、キットはさらに、使い捨ての構成要素、たとえばチューブ、マルチウェルプレートまたはキャピラリーチップなどを収容している。
【００４８】
ある態様において、キットはさらに、患者由来の試料中の内部対照、たとえばハウスキーピング遺伝子を検出するための、プライマー類および少なくとも１つのプローブを含む。ある態様において、キットはさらに、たとえばそれぞれのＡＬＫ変異およびＡＬＫ融合体についての、キット構成要素により検出できる少なくとも１つの陽性対照を含む。ある態様において、キットはさらに、陰性対照、たとえば野生型ＡＬＫヒトＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【実施例】
【００４９】
実施例１．肺癌患者におけるＡＬＫ変異の検出
アレクチニブ処置前とアレクチニブ処置後に患者由来の無細胞ＤＮＡを分離した。このｃｆＤＮＡに、標準Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑワークフローを用いる次世代シーケンシングおよびUS20140296081に記載された分析を施した。シーケンシングデータを用いて患者の一塩基変異(single nucleotide variation)（ＳＮＶ）を同定し、その患者について２つの時点のうち一方のみに存在していたＳＮＶをさらに調べた。１つのバリアントＲ１２０９Ｑを６人の患者において同定した。５／６人の患者において、それはアレクチニブ療法後にのみ存在し（図１）、これはそれがアレクチニブに対する耐性を付与する可能性があるという証拠を提示する。６人目の患者においてはアレクチニブに対する既知の耐性バリアントが検出されたので、別のクローンがアレクチニブ耐性を付与した可能性がある（図２）。他のバリアントＩ１２６８Ｖが１人の患者において、ただしアレクチニブ処置前にのみ同定され、これはそれがアレクチニブに対する感受性を付与している可能性があることを示唆する。
【００５０】
図１は、アレクチニブ処置の前と後の患者試料における変異の検出および変異頻度を示す。１つのバリアントＲ１２０９Ｑが６人の患者において同定された。５／６人の患者において、それはアレクチニブ療法後にのみ存在し、これはそれがアレクチニブに対する耐性を付与する可能性があるという証拠を提示する。他のバリアントＩ１２６８Ｖが１人の患者において、ただしアレクチニブ処置前にのみ同定され、これはそれがアレクチニブに対する感受性を付与している可能性があることを示唆する。
【００５１】
図２は、６人目の患者においてアレクチニブ処置の前と後に見出された種々の変異を示す。この患者において、アレクチニブに対する既知の耐性バリアントが検出されたので、別のクローンがアレクチニブ耐性を付与した可能性があることを示唆する。
【００５２】
実施例２：ＡＬＫ融合体転帰に影響を及ぼす因子
表１は、ＡＬＫ融合体バリアント３（ＥＭＬ４エキソン６がＡＬＫエキソン２０に連結したもの）を伴なう患者についてのハザード比がそれを伴なわない患者のものよりはるかに高いことを示す。図８は、他のＡＬＫ融合体と対比してバリアント３融合体を伴なう患者について無増悪生存（ＰＦＳ）が有意に短いことを示す。これは人種および処置状態に関係なく当てはまることが認められた（すなわち、ＡＬＫ阻害薬処置に際してＡＬＫ融合体バリアント３を伴なう個体はＡＬＫ阻害薬処置に際してＡＬＫ融合体を伴なう個体より悪い転帰をもつであろう）。平均すると、バリアント３融合体を伴なう場合、約２．６倍多く増悪する可能性がある（ｐ値０．００１２）。この２．６のハザード比は、アレクチニブによる処置の前に採取した７２人の患者の血漿試料について実施されたＣｏｘ  ＰＨ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｂｌｅ  Ｍｏｄｅｌからのものであった。このモデルは、バリアント３融合効果から、交絡因子（人種、ベースライン腫瘍測定値など）について調整して、無増悪生存（ＰＦＳ）を予測した。ハザード比はアジア人種についての数値１を基準とする。たとえば、ＡＬＫ融合体を伴なう白人個体はＡＬＫ融合体を伴なうアジア人個体より２．０９１倍高いリスクをもつ。
【００５３】
【表１】
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【００５４】
実施例３：一塩基変異（ＳＮＶ）およびＡＬＫ融合体の分析
クリゾチニブ処置後（たとえばアレクチニブによる第２選択処置の前）に増悪した１８８人の病期ＩＩＩＢ−ＩＶのＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）患者から血漿試料を採集した。これらの患者はそれ以前に蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によりＡＬＫ融合体陽性と判定されていた。循環腫瘍ＤＮＡパネル（Ａｖｅｎｉｏ  ｃｔＤＮＡパネル）を用いて、最も一般的なＡＬＫ融合体の存在または非存在を検出した。表２は検出された融合体の頻度を示す。
【００５５】
【表２】
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【００５６】
試料におけるＡＬＫ耐性変異とＡＬＫ融合体の存在は、表３に示すような相関性をもっていた。ＡＬＫ耐性変異にはＧ１２０２Ｒ、Ｉ１１７１Ｔ、Ｖ１１８０Ｌ、Ｉ１１７１Ｎ、Ｉ１１７１Ｓ、Ｒ１２０９Ｑ、Ｌ１１５２Ｒ、Ｃ１１５６Ｙ、Ｆ１１７４Ｌ、Ｌ１１９６Ｍ、Ｇ１２６９Ａ、およびＧ１５４８Ｅが含まれ、ＡＬＫ融合体には表２に開示するものが含まれる。これらの結果は、耐性変異がＡＬＫ融合体バリアント中に生じることを示す。
【００５７】
【表３】
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【００５８】
ＡＬＫ耐性（ＡＬＫＲ）変異陽性（１１）および陰性（１７７）患者について無増悪生存率および全生存率を追跡した。図３および４に示すように、生存率は耐性変異を保有する患者において有意に低かった。
【００５９】
（ｉ）ＡＬＫ融合体陽性（ＡＬＫ）、ＡＬＫ耐性変異陽性（ＡＬＫＲ）患者（１１）；（ｉｉ）ＡＬＫ融合体陽性、ＡＬＫ耐性変異陰性患者（７０）；および（ｉｉｉ）ＡＬＫ融合体陰性、ＡＬＫ耐性変異陰性患者（１０７）について、同様に無増悪生存率および全生存率を追跡した。図５および６に示すように、ＡＬＫ融合体または耐性変異のいずれも伴わない患者が最も長く生存し、ＡＬＫ融合体を伴なうけれどもＡＬＫ耐性変異伴わない患者がこれに続いた。ＡＬＫ融合体とＡＬＫ耐性変異の両方を伴なう患者が最も低い生存率をもっていた。
【００６０】
実施例４：処置期間およびＡＬＫ耐性変異数が生存に及ぼす影響
ＡＬＫ耐性変異を伴なう患者または伴なわない患者の無増悪生存および全生存はクリゾチニブ第１選択処置、それに続くアレクチニブ第２選択処置の日数と相関していた。クリゾチニブ処置期間と無増悪生存および全生存のいずれかとの間に有意の相関性はみられなかった。
【００６１】
実施例５：ＡＬＫ変異および非ＡＬＫ変異の数が生存に及ぼす影響
４以下のＡＬＫおよび非ＡＬＫ変異を伴なう患者において無増悪生存を追跡し、４より多いＡＬＫおよび非ＡＬＫ変異を伴なう者と比較した。これらの変異には、表２、表４および表５に示すものが含まれる。非ＡＬＫ変異について、それぞれの遺伝子は患者がその遺伝子に複数の変異をもっていたとしても１回カウントされた。図７に示すように、より少ない変異を伴なう患者ほどより長い無増悪生存をもっていた。４以下の変異と比較した＞４の変異をもつ者についてのハザード比は２．１２であった。検出された一塩基変異（ＳＮＶ）ＡＬＫ変異には、処置に対する感受性、処置に対する耐性、および処置に対する未知の有意性の指標となる変異が含まれる。これらを表４に示す。表５は、さらに他のＡＬＫ融合体および非ＡＬＫ変異を示す。ＣＮＡはコピー数増幅(copy number amplification)を表わす。
【００６２】
【表４】
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【００６３】
【表５−１】
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【００６４】
【表５−２】
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【００６５】
【表５−３】
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【００６６】
【表５−４】
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【００６７】
【表５−５】
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【００６８】
【表５−６】
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【００６９】
【表５−７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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