(57)【要約】  本発明は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆに特異性を有する多重特異性抗体分子、抗体分子の治療的使用及び抗体分子の産生方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメイン及びヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインを含む多重特異性抗体分子であって、該抗体分子がヒトＴＮＦ−α、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆの生物活性を中和することができる、上記多重特異性抗体分子。
【請求項２】
前記抗体がヒトＴＮＦ−αに対して２００ｐＭ以上の結合親和性を有する、請求項１に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３】
前記抗体がヒトＩＬ−１７Ａに対して１００ｐＭ以上の結合親和性を有する、請求項１又は２に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４】
前記抗体がヒトＩＬ−１７Ａに対して２０ｐＭ以上の結合親和性を有する、請求項３に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項５】
前記抗体がＩＬ−１７Ｆに対して１００ｐＭ以上の結合親和性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項６】
前記抗体がＩＬ−１７Ｆに対して２０ｐＭ以上の結合親和性を有する、請求項５に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項７】
ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な前記結合ドメインがＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆヘテロ二量体にも結合する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項８】
各結合ドメインが２つの抗体可変ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項９】
前記２つの抗体可変ドメインがＶＨ／ＶＬ対である、請求項８に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１０】
分子フォーマットが、ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、タンデムｓｃＦｖ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ’Ｆｖ、ＦａｂｄｓＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆａｂ−（ｄｓｓｃＦｖ）２ｄｉＦａｂ、ｄｉＦａｂ’、ｔｒｉｂｏｄｙ、タンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ、ｓｃｄｉａｂｏｄｙ−Ｆｃ、ｓｃｄｉａｂｏｄｙ−ＣＨ３、Ｉｇ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｉｇ、Ｖ−Ｉｇ、Ｉｇ−Ｖ、Ｄｕｏｂｏｄｙ及びＤＶＤ−Ｉｇから選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１１】
ヒトＴＮＦ−αに特異的な前記結合ドメイン及びＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な前記結合ドメインがＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ及びｄｓｓｃＦｖから独立して選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１２】
ｃ）式（Ｉ）：ＶＨ１−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖と、
ｄ）式（ＩＩ）：ＶＬ１−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖と
を含むか又はそれらから構成され、
式中、
ＶＨ１は重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ１は重鎖定常領域のドメイン、例えばそのドメイン１を表し、
Ｘは結合又はリンカーを表し、
Ｙは結合又はリンカーを表し、
Ｖ１はｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表し、
ＶＬ１は軽鎖可変ドメインを表し、
ＣＬは軽鎖定常領域由来のドメイン、例えばＣκを表し、
Ｖ２はｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表す、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１３】
Ｖ１及びＶ２の少なくとも１つがｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである、請求項１２に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１４】
Ｖ１がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖであり、Ｖ２がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである、請求項１３に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１５】
Ｖ１がｄｓｓｃＦｖであり、Ｖ２がｄｓｓｃＦｖである、請求項１４に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１６】
Ｖ１がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖであって、Ｖ１が、
ａ．式（ＩＩＩ）：ＶＨ２−Ｚ１−ＶＬ２、及びＶＨ２が例えばペプチド結合を介してＸに結合する、又は
ｂ．式（ＩＶ）：ＶＬ２−Ｚ１−ＶＨ２、及びＶＬ２が例えばペプチド結合を介してＸに結合する
のポリペプチド鎖を含み、
式中、ＶＨ２は重鎖可変ドメインを表し、Ｚ１はペプチドリンカーを表し、及びＶＬ２は軽鎖可変ドメインを表す、請求項１２〜１５に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１７】
Ｖ２がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖであって、Ｖ２が、
ａ．式（Ｖ）：ＶＨ３−Ｚ２−ＶＬ３、及びＶＨ３が例えばペプチド結合を介してＹに結合する、又は
ｂ．式（ＶＩ）：ＶＬ３−Ｚ２−ＶＨ３、及びＶＬ３が例えばペプチド結合を介してＹに結合する
のポリペプチド鎖を含み、
式中、ＶＨ３は重鎖可変ドメインを表し、Ｚ２はペプチドリンカーを表し、及びＶＬ３は軽鎖可変ドメインを表す、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項１８】
Ｚ１及び／又はＺ２が、長さが１２〜２５アミノ酸のペプチドリンカー、例えば配列番号６８で示される配列である、請求項１６又は１７に記載の多重特異性抗体。
【請求項１９】
Ｘがペプチドリンカー、例えば配列番号１又は配列番号２で示される配列である、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２０】
Ｙがペプチドリンカー、例えば配列番号１又は配列番号２で示される配列である、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２１】
Ｘが配列番号２で示される配列であり、Ｙが配列番号２で示される配列である、請求項１９又は２０に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２２】
Ｘが配列番号１で示される配列であり、Ｙが配列番号２で示される配列である、請求項１９又は２０に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２３】
Ｖ１及びＶ２の少なくとも１つがｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであって、Ｖ１の軽鎖及び重鎖可変ドメイン及び／又はＶ２の軽鎖及び重鎖可変ドメインが、２つの操作されたシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結される、請求項１２〜２２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２４】
Ｖ１及び／又はＶ２の少なくとも１つがｄｓｓｃＦｖ又はｄｓＦｖであって、Ｖ１及び／又はＶ２の重鎖及び軽鎖可変ドメインは、２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合によって連結されており、前記システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１００、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ１００ｂとＶＬ４９、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０１とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３、ＶＨ１０６とＶＬ５７を含むか又はそれらから構成される群から選択され、ＶＨ及びＶＬの値は所定のＶ１又はＶ２内で独立して選択される、請求項１２〜２３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２５】
前記操作されたシステイン残基の対の位置が、ＶＨ４４及びＶＬ１００である、請求項２４に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２６】
ＶＨ１及びＶＬ１がヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインを含み、Ｖ１及び／又はＶ２がヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインを含む、請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２７】
３つの結合ドメインを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２８】
前記３つの結合ドメインの各々が異なる抗原に結合する、請求項２７に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項２９】
前記抗体分子がヒト血清担体タンパク質に特異的な結合ドメインを含む、請求項２８に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３０】
前記ヒト血清担体タンパク質が、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン及びアルブミン、又はそれらのいずれかの断片で構成される群から選択される、請求項２９に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３１】
ａ．ＶＨ１及びＶＬ１がヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインを含み、並びに
ｂ．Ｖ１がヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインを含み、Ｖ２がヒト血清担体タンパク質に特異的な結合ドメイン、例えばヒト血清アルブミンを含み、又はＶ２がヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインを含み、Ｖ１がヒト血清担体タンパク質に特異的な結合ドメイン、例えばヒト血清アルブミンを含む、
請求項１２〜３０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３２】
前記抗体分子が、ヒトＴＮＦ−αに特異的な１つ以下の結合ドメインと、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な１つ以下の結合ドメインとを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３３】
前記抗体分子が、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインを含まない、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３４】
前記ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＨ１については配列番号８５で示される配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲＨ２については配列番号８６で示される配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲＨ３については配列番号８７で示される配列を有するＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３５】
前記ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＨ１については配列番号８５、ＣＤＲＨ２については配列番号８６、ＣＤＲＨ３については配列番号８７で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲを含む、請求項３４に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３６】
前記ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＬ１については配列番号８８で示される配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲＬ２については配列番号８９で示される配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有するＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３７】
前記ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＬ１については配列番号８８、ＣＤＲＬ２については配列番号８９、ＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項３６に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３８】
前記ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインが、配列番号９２又は配列番号９６で示される配列、配列番号９２又は配列番号９６で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号９２又は配列番号９６で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ２が請求項３５で示される配列を有する配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項３９】
前記ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインが、配列番号９１又は配列番号９５で示される配列、配列番号９１又は配列番号９５で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号９１又は配列番号９５で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が請求項３７で示される配列を有する配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４０】
前記抗体がヒトＴＮＦ−αに特異的なｄｓｓｃＦｖを含み、前記ｄｓｓｃＦｖが、配列番号１０１で示される配列、配列番号１０１で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号１０１で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が請求項３５で示される配列を有し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が請求項３７で示される配列を有する配列を含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項４１】
前記抗体がヒトＴＮＦ−αに特異的なｓｃＦｖを含み、前記ｓｃＦｖが、配列番号９９で示される配列、配列番号９９で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号９９で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が請求項３５で示される配列を有し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が請求項３７で示される配列を有する配列を含む、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項４２】
ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＨ１については配列番号７１、ＣＤＲＨ２については配列番号７２、ＣＤＲＨ３については配列番号７３で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲを含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４３】
ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＬ１については配列番号７４、ＣＤＲＬ２については配列番号７５、ＣＤＲＬ３については配列番号７６で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４４】
ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインが、配列番号７８で示される配列、配列番号７８で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号７８で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が請求項４２で示される配列を有する配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４５】
ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインが、配列番号７７で示される配列、配列番号７７で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号７７で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が請求項４３で示される配列を有する配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４６】
前記抗体が、配列番号８２で示される配列、配列番号８２で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号８２で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が請求項４２で示される配列を有する配列を含む重鎖を含む、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４７】
前記抗体が、配列番号８１で示される配列、配列番号８１で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号８１で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が請求項４３で示される配列を有する配列を含む軽鎖を含む、請求項１〜４６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４８】
前記抗体分子が、ＣＤＲＨ１については配列番号１０３、ＣＤＲＨ２については配列番号１０４、ＣＤＲＨ３については配列番号１０５で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲを含むヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインを含む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項４９】
前記抗体分子が、ＣＤＲＬ１については配列番号１０６、ＣＤＲＬ２については配列番号１０７、ＣＤＲＬ３については配列番号１０８で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含むヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインを含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項５０】
前記ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインが、配列番号１１０又は配列番号１１４で示される配列、配列番号１１０又は配列番号１１４で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号１１０又は配列番号１１４で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が請求項４８で示される配列を有する配列を含む重鎖可変ドメインを含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項５１】
前記ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインが、配列番号１０９又は配列番号１１３で示される配列、配列番号１０９又は配列番号１１３で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号１０９又は配列番号１１３で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が請求項４９で示される配列を有する配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項１〜５０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子。
【請求項５２】
前記抗体がヒト血清アルブミンに特異的なｄｓｓｃＦｖを含み、前記ｄｓｓｃＦｖが、配列番号１１９で示される配列、配列番号１１９で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号１１９の配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が請求項４８で示される配列を有し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が請求項４９で示される配列を有する配列を含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項５３】
前記抗体がヒト血清アルブミンに特異的なｓｃＦｖを含み、前記ｓｃＦｖが、配列番号１１７で示される配列、配列番号１１７で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号１１７で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が請求項４８で示される配列を有し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が請求項４９で示される配列を有する配列を含む、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。
【請求項５４】
ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインと、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインと、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインとを含む三重特異性抗体分子であって、前記抗体分子が、
ａ．配列番号１２５で示される配列、配列番号１２５で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号１２５で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲが請求項３５、３７及び４２で示される配列を有する配列を含むか又はそれから構成される第１のポリペプチド、及び
ｂ．配列番号１３１で示される配列、配列番号１３１で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号１３１で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲが請求項４３、４８及び４９で示される配列を有する配列を含むか又はそれから構成される第２のポリペプチド
を含むか又はそれから構成される、三重特異性抗体分子。
【請求項５５】
ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインと、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインと、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインとを含む三重特異性抗体分子であって、
ａ．配列番号１２７で示される配列、配列番号１２７で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号１２７で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲが請求項３５、３７及び４２で示される配列を有する配列を含むか又はそれから構成される第１のポリペプチド、及び
ｂ．配列番号１３１で示される配列、配列番号１３１で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号１３１で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲが請求項４３、４８及び４９で示される配列を有する配列を含むか又はそれから構成される第２のポリペプチド
を含むか又はそれから構成される、三重特異性抗体分子。
【請求項５６】
前記抗体分子が、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆの生物活性を中和することができる、請求項５４又は５５に記載の三重特異性抗体分子。
【請求項５７】
請求項１〜５６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子又はそのポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチド。
【請求項５８】
請求項５７に定義された１又は複数のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５９】
請求項５７又は５８の１つ以上のポリヌクレオチド又はベクターをそれぞれ含む宿主細胞。
【請求項６０】
２つのベクターを含む宿主細胞であって、各ベクターが請求項１〜５６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子の異なるポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項６１】
請求項５９又は６０に定義された宿主細胞から多重特異性抗体分子を発現させることを含むプロセス。
【請求項６２】
請求項１〜５６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子及び少なくとも１種の賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項６３】
請求項１〜５６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子、又は治療に使用するための請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
請求項１〜５６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体分子の治療有効量又は請求項６２に記載の医薬組成物を投与することを含む、それを必要とする患者を治療する方法。
【請求項６５】
ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインと、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインと、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインとを含み、並びに配列番号１２６で示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる第１のポリペプチド、及び配列番号１３２で示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる第２のポリペプチドを含むか又はそれらから構成される、三重特異性抗体分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異性を有する多重特異性抗体分子に関する。また、本発明は、該抗体分子の治療的使用及びその産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ＲＡ）患者における疾患の主要な推進因子としてのＴＮＦ−αの役割は十分に確立されている。実際に、抗ＴＮＦ−α抗体は患者ケアを変えてきた。しかしながら、この成功にもかかわらず、多くの患者が臨床的寛解を達成しないため、まだ満たされていない医学的必要性が依然として存在する。したがって、ＲＡの治療に対する次の臨床的野望は、この満たされていない臨床的必要性に対処し、臨床的寛解を達成する患者の割合を有意に改善する治療を提供することである。最近の研究では、ＲＡ患者においてＴｈ１７／ＩＬ−１７生物学的経路の増強があるとみられることが強調されている。ＲＡ患者の末梢血におけるＴｈ１７細胞の割合が健常志願者と比較して増加し、抗ＴＮＦ−αでの処置後にこれがさらに増加することが示されている（Ａｌｚａｂｉｎ．ｅｔ  ａｌ．、２０１２、Ｃｈｅｎ．ｅｔ  ａｌ．、２０１１、Ａｅｒｔｓ．ｅｔ  ａｌ．、２０１０）。抗ＴＮＦ−α治療後の相補的な生物学的経路に対するこの増強は、多くの患者が治療に対する部分的な応答しか持たない理由、又は治療に対する初期応答にもかかわらず一部の患者が再発する理由を部分的に説明し得る。
【０００３】
現在、ＲＡの病因におけるＩＬ−１７の役割についての証拠を提供する文献がある。サイトカインのＩＬ−１７ファミリーは、２３〜３６ｋＤａの分子量及び二量体構造を有する構造類似性に基づく６つの構成員から構成される。初代構成員であるＩＬ−１７Ａ（文献では単にＩＬ−１７と言及されることも多い）は、他の構成員であるＩＬ−１７Ｂ、ＩＬ−１７Ｃ、ＩＬ−１７Ｄ、ＩＬ−１７Ｅ（ＩＬ−２５としても知られている）及びＩＬ−１７Ｆと１６％〜５０％のアミノ酸配列相同性を共有している。ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆは、最大の相同性（５０％）を共有し、同じ受容体複合体に結合するため、これらの２つのサイトカインの間には共通の生物活性が認められている。さらに、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆは、ホモ二量体としてだけでなく、ＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体としても存在する。ＩＬ−１７Ｅ（ＩＬ−２５）はＩＬ−１７Ａとの類似性が最も低い。ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの生物活性に対する重要性及び関連性は、これらが同じＩＬ−１７ＲＡ／ＩＬ−１７ＲＣ受容体複合体を共有するという知見であり、ＩＬ−１７ＡはＩＬ−１７ＲＡに対して最大の親和性を有するが、ＩＬ−１７ＦはＩＬ−１７ＲＣに強く結合する。ＩＬ−１７ＲＡを利用する他のファミリー構成員は、ＩＬ−１７ＲＡ／ＩＬ−１７ＲＢ受容体複合体を介してシグナル伝達するＩＬ−１７Ｅである。
【０００４】
ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆは、Ｔｈ１７サブセットのＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生される。さらに、他のＴ細胞サブセットは、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｔｃ１７）、ｇｄＴ細胞及びＮＫＴ細胞を含むＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆを産生する。ＩＬ−１７Ａを分泌することが報告されている他の細胞集団には、好中球、単球、ＮＫ細胞、リンパ様組織誘導因子様細胞（ＬＴｉ様細胞）、腸パネート細胞、さらにＢ細胞及びマスト細胞が含まれる。加えて、上皮細胞がＩＬ−１７Ｆを分泌することが報告されている。
【０００５】
ＩＬ−１７サイトカインに応答する細胞型は、異なる受容体の発現によって反映される。ＩＬ−１７ＲＡは造血組織において特に高レベルで、遍在的に発現するが、ＩＬ−１７ＲＣは、関節、肝臓、腎臓、甲状腺及び前立腺の非免疫細胞においてより高度に発現する。この差次的発現は、高レベルのＩＬ−１７ＲＣを発現する細胞がＩＬ−１７Ｆに対してより応答性である可能性があり、ＩＬ−１７ＲＣよりもＩＬ１７−ＲＡの発現が高い細胞がＩＬ−１７Ａに対してより容易に応答し得ることから、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの生物活性における違いを説明する可能性がある。ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆに応答する特定の細胞型は、線維芽細胞、上皮細胞、ケラチノサイト、滑膜細胞及び内皮細胞を含み、ＩＬ−１７ＡはＴ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージに作用することも報告されている。
【０００６】
ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆは、線維芽細胞、内皮細胞及び上皮細胞由来の炎症性サイトカイン、ケモカイン及びマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＭＭＰ−１３を含む）の誘導物質である。ＩＬ−１７ＦはＩＬ−１７Ａよりも活性が低いことがしばしば報告されているが、ＩＬ−１７ＦとＴＮＦ−αとの組み合わせでは生物学的応答の上昇が認められる（Ｚｒｉｏｕａｌ．ｅｔ  ａｌ．、２００９）。ＴＮＦ−αとのこの相加的又は相乗的な生物活性は、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの両方で認められ、ｍＲＮＡ安定性の向上による可能性がある。ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの両方の発現は、ＲＡ患者において増加することが示されており（Ｚｒｉｏｕａｌ．ｅｔ  ａｌ．、２００９）、ＲＡ病変におけるＴ細胞及びＩＬ−１７の寄与は現在文献によく発表されている（Ｈｏｔ＆Ｍｉｏｓｓｅｃ  ２０１１、Ｔｒｕｃｈｅｔｅｔ．ｅｔ  ａｌ．、２０１３）。ヒト滑膜及び骨外植片を用いた研究では、ＩＬ−１７Ａが軟骨及び骨の分解を増加させることが証明されている（Ｃｈａｂａｕｄ．ｅｔ  ａｌ．、２００１）。マウスのコラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）モデルにおけるさらなる研究でも、ＩＬ−１７Ａの過剰発現が滑膜炎症及び関節破壊を誘導し、ＣＩＡがＩＬ−１７Ａ遮断及びＩＬ−１７欠損マウスによって阻害されることが示されている（Ｌｕｂｂｅｒｔｓ、２００１＆２００４、Ｎａｋａｅ、２００３）。
【０００７】
したがって、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１７の生物学的経路の両方が同時にブロックされる治療は、ＲＡ患者、またＴＮＦ−α及びＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆによって媒介される他の病的障害の治療において応答率を優位に改善し、既存の満たされていない必要性に対処する可能性を有する。
【０００８】
国際公開第２０１４／０４４７５８号明細書（Ｃｏｖａｇｅｎ  ＡＧ）には、グリコシル化ＩＬ−１７Ａを阻害しＴＮＦ−αに結合することができる融合構築物が開示されている。国際公開第２０１３／０６３１１０号明細書（Ａｂｂｖｉｅ  Ｉｎｃ．）には、ＴＮＦ及びＩＬ−１７に結合することができる多価ＤＶＤ−Ｉｇ結合タンパク質が開示されている。国際公開第２０１４／１３７９６１号明細書（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）には、抗ＴＮＦ抗体及び抗ＩＬ−１７Ａ二重特異性抗体が開示されている。しかしながら、これらの分子は、ＩＬ−１７Ｆが中和されず、上記のようにＩＬ−１７ＦがＩＬ−１７Ａに類似の生物活性を付与するため、限定された効果しか得られず、したがって、これらの治療分子ではＩＬ−１７の生物学的経路の部分的な阻害しか達成することができない。ＴＮＦ−αの阻害と組み合わせたＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの両方の阻害は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１７Ａのみのブロッカーよりも改善された有効性を提供し得る。
【０００９】
本発明者らは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆを阻害することができ、患者に新しい治療選択肢を提供するであろう新規多重特異性抗体を開発した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０４４７５８号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１３／０６３１１０号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１４／１３７９６１号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ａｌｚａｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２
【非特許文献２】Ｃｈｅｎ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１
【非特許文献３】Ａｅｒｔｓ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０
【非特許文献４】Ｚｒｉｏｕａｌ．ｅｔ  ａｌ．，２００９
【非特許文献５】Ｈｏｔ＆Ｍｉｏｓｓｅｃ  ２０１１
【非特許文献６】Ｔｒｕｃｈｅｔｅｔ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３
【非特許文献７】Ｃｈａｂａｕｄ．ｅｔ  ａｌ．，２００１
【非特許文献８】Ｌｕｂｂｅｒｔｓ，２００１＆２００４
【非特許文献９】Ｎａｋａｅ，２００３
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆに結合することができ、特にヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメイン並びにヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインを含む、多重特異性抗体分子であって、抗体分子が、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆの生物活性を中和することができる多重特異性抗体分子を提供する。一実施形態では、多重特異性抗体分子は三特異性であり、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインをさらに含む。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書で用いられる「抗原結合部位」又は「結合部位」とは、標的抗原と特異的に相互作用する１つ以上の可変ドメインの一部又は全部（例えば、一対の可変ドメインの一部又は全部）を含む分子の一部分を指す。
【００１４】
本明細書で用いられる「結合ドメイン」とは、標的抗原及び場合によっては１つ以上の定常ドメイン（例えば、κ又はλのいずれかであるＣＨ１ドメイン及び／又はＣＬドメイン）と特異的に相互作用する、１つ以上の可変ドメイン（例えば、可変ドメインＶＨ及びＶＬの対など）を含む分子の一部分を指す。結合ドメインは、単一ドメイン抗体を含み得る。一実施形態では、各結合ドメインは一価である。好ましくは、各結合ドメインは、１個以下のＶＨ及び１個のＶＬを含む。
【００１５】
本明細書中で使用される「特異的に」は、それが特異的である抗原、又は、非特異的である抗原に対する親和性と比較して、特異的である抗原に対して有意に高い結合親和性（例えば、５、６、７、８、９、１０倍高い結合親和性）を有する結合部位又は結合ドメインのみを認識する、結合部位又は結合ドメインを指すことを意図する。
【００１６】
本明細書で用いられる「多重特異性抗体」は、２つ以上の結合ドメイン、例えば２つ又は３つの結合ドメインを有する本明細書に記載の抗体分子を指す。
【００１７】
一実施形態では、構築物は二重特異性抗体である。
【００１８】
本明細書で用いられる「二重特異性抗体」は、一方の結合部位がヒトＴＮＦ−αに結合し、他方の結合部位がヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに結合する、２つの抗原結合部位を有する抗体分子を指す。
【００１９】
一実施形態において、抗体構築物は三重特異性抗体である。
【００２０】
本明細書で用いられる「三重特異性抗体」は、３つの抗原結合部位を有する抗体分子を指す。
【００２１】
本発明の一実施形態では、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに結合することができる多重特異性抗体分子が提供され、ここで抗体分子は、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆの生物活性を中和することができる。
【００２２】
一実施形態では、多重特異性抗体分子は、ヒトＴＮＦ−αに特異的な第１の結合ドメインと、ヒトＩＬ−１７Ａに特異的な第２の結合ドメインと、ヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な第３の結合ドメインとを含む。
【００２３】
代替の実施形態では、多重特異性抗体分子は、ヒトＴＮＦ−αに特異的な第１の結合ドメインと、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆの両方に特異的な第２の結合ドメインとを含む。
【００２４】
一実施形態では、抗体分子は、３つの結合ドメインを含み、２つの結合ドメインは同じ抗原に結合し（同じ抗原の同じエピトープ又は異なるエピトープと結合することを含む）、第３の結合ドメインは異なる（別個の）抗原と結合する。一例において、多重特異性抗体分子は、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆの抗原に結合し、２つの結合ドメインがヒトＴＮＦ−αに結合し、第３の結合ドメインがヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに結合する。別の例において、多重特異性抗体分子は、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆの抗原に結合し、２つの結合ドメインがヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに各々結合することができ、第３の結合ドメインがヒトＴＮＦ−αに結合する。
【００２５】
一実施形態では、本発明による抗体分子は、ヒトＴＮＦ−αに特異的な１つ以下の結合ドメインと、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な１つ以下の結合ドメインとを含む。したがって、この実施形態では、抗体分子はヒトＴＮＦ−αに結合するために一価であり、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに結合するために一価である。
【００２６】
一実施形態では、本発明の多重特異性抗体分子は、３つの異なる抗原に独立して結合する３つの結合ドメインを含む。一実施形態では、多重特異性抗体分子は、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆの抗原に結合し、第１の結合ドメインはヒトＴＮＦ−αに結合し、第２の結合ドメインはヒトＩＬ−１７Ａに結合し、第３の結合ドメインはヒトＩＬ−１７Ｆに結合する。
【００２７】
別の実施形態では、多重特異性抗体分子は、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＩＬ−１７Ａ、ヒトＩＬ−１７Ｆ及びヒト血清アルブミンの抗原に結合し、第１の結合ドメインはヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに結合し、第２の結合ドメインはヒトＴＮＦ−αに結合し、第３の結合ドメインは抗体分子の半減期を延長することができる抗原に結合する。抗体分子の半減期を延長することができる抗原に結合する第３の結合ドメインは、ヒト血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子、又はＣＤ３５／ＣＲ１に結合し得る。
【００２８】
本明細書で使用する「血清担体タンパク質」は、チロキシン結合タンパク質、トランスサイレチン、α１酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン及びアルブミン、又はそれらのいずれかの断片を含む。
【００２９】
本明細書で使用される「循環免疫グロブリン分子」は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ｓＩｇＡ、ＩｇＭ及びＩｇＤ、又はそれらのいずれかの断片を含む。
【００３０】
ＣＤ３５／ＣＲ１は、３６日の半減期（正常範囲は２８〜４７日、Ｌａｎａｒｏ．ｅｔ  ａｌ．、１９７１、Ｃａｎｃｅｒ、２８（３）：６５８−６６１）を有する赤血球上に存在するタンパク質である。
【００３１】
特定の実施形態では、多重特異性抗体分子は３つの結合ドメインを含むか又はそれらから構成され、第１の結合ドメインはヒトＴＮＦ−αに特異的であり、第２の結合ドメインはヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的であり、第３の結合ドメインはヒト血清アルブミンに特異的である。
【００３２】
一実施形態では、本発明による抗体分子は、ヒトＴＮＦ−αに特異的な１つ以下の結合ドメインと、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な１つ以下の結合ドメインと、ヒト血清担体タンパク質、例えばヒト血清アルブミンに特異的な１つ以下の結合ドメインとを含む。したがって、この実施形態では、抗体分子はヒトＴＮＦ−αに結合するために一価であり、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに結合するために一価であり、ヒト血清担体タンパク質、例えばヒト血清アルブミンに結合するために一価である。
【００３３】
標的抗原がホモマルチマー、例えばヒトＴＮＦ−α三量体又はヒトＩＬ−１７二量体である、同じ標的抗原に対する複数の結合ドメインを含む抗体分子は、インビボで大きな抗体及び抗原複合体を形成する可能性がより高い。抗体分子が各標的抗原に対して１つ以下の結合ドメインを含む本発明の実施形態において、抗体は、同じ標的抗原に対する複数の結合ドメインを含む抗体分子と比較して、インビボで大きな抗体及び抗原複合体を形成する傾向が有利に低い。
【００３４】
本発明は、高親和性でＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの両方に結合することができる改良された多重特異性抗体を提供する。特に、本発明の多重特異性抗体は、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの両方に特異的に結合することができる。特異的に結合するとは、抗体が他のポリペプチドよりもＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆポリペプチド（ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆヘテロ二量体を含む）に対してより大きな親和性を有し、一実施形態では抗体はＩＬ−１７の他のアイソフォームには結合しない。本発明の多重特異性抗体は、ＩＬ−１７Ａホモ二量体及びＩＬ−１７Ｆホモ二量体に特異的に結合することができる。好ましくは、本発明の多重特異性抗体はまた、ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆヘテロ二量体に結合する。
【００３５】
好ましくは、本発明の多重特異性抗体は、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの両方の活性を中和する。一実施形態では、本発明の多重特異性抗体は、ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆヘテロ二量体の活性も中和する。したがって、本発明の多重特異性抗体は、それらがＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの両方の生物活性を阻害し得るという有利な特性を有する。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、「中和抗体」という用語は、例えば、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆがそれらの１種以上の受容体に結合することをブロックすることによって、及びＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆヘテロ二量体がその１種以上の受容体に結合することをブロックすることによって、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの両方の生物シグナル伝達活性を中和できる抗体を表す。本明細書中で使用される場合、「中和」という用語が、生物シグナル伝達活性の部分的又は完全な減少を指すことは理解されるであろう。さらに、抗体によるＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの活性の中和の程度は、同じであっても異なっていてもよいことは理解されるであろう。一実施形態において、ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆヘテロ二量体の活性の中和の程度は、ＩＬ−１７Ａ又はＩＬ−１７Ｆの活性の中和の程度と同じであっても異なっていてもよい。中和を決定するための好適なアッセイは、当該分野で公知であり、そのようなアッセイのいくつかは、本明細書の実施例に提供される。
【００３７】
好ましくは、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆポリペプチドはヒトである。一実施形態において、この抗体はカニクイザルのＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆにも結合する。
【００３８】
多重特異性抗体はまた、好都合には、高親和性でＴＮＦ−αに結合することができる。特に、本発明の多重特異性抗体は、ＴＮＦ−αに特異的に結合することができる。
【００３９】
好ましくは、本発明の多重特異性抗体は、例えば、ＴＮＦ−αの１種以上の受容体に対するＴＮＦ−αの結合をブロックすることによって、ＴＮＦ−αの活性を中和する。本明細書中で使用される場合、「中和」という用語が、生物シグナル伝達活性の部分的又は完全な減少を指すことは理解されるであろう。好ましくは、ＴＮＦ−αポリペプチドはヒトである。一実施形態において、抗体はカニクイザルのＴＮＦ−αにも結合する。中和を決定するための好適なアッセイは、当該分野で公知であり、そのようなアッセイのいくつかは、本明細書の実施例に提供される。
【００４０】
したがって、本発明はまた、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆによって媒介される疾患、例えば自己免疫又は炎症性疾患又はがんの治療及び／又は予防におけるこのような抗体の使用を提供する。
【００４１】
結合親和性（ＫＤ）は、標準アッセイ、例えばＢＩＡｃｏｒｅなどの表面プラズモン共鳴によって測定することができる。
【００４２】
一実施形態では、多重特異性抗体分子は、ヒトＴＮＦ−αに対して２００ｐＭ以下、例えば１００ｐＭ以上、５０ｐＭ以上、２０ｐＭ以上、１５ｐＭ以上又は１２ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態では、多重特異性抗体分子は、ヒトＴＮＦ−αに対して５０ｐＭ〜１ｐＭ、２０ｐＭ〜１ｐＭ、１５ｐＭ〜１ｐＭ又は１２ｐＭ〜１ｐＭの範囲の結合親和性を有する。一実施形態では、多重特異性抗体分子は、ヒトＴＮＦ−αに対して１５ｐＭ〜５ｐＭ又は１２ｐＭ〜１１ｐＭの範囲の結合親和性を有する。
【００４３】
一実施形態では、多重特異性抗体分子は、ヒトＩＬ−１７Ａに対して２００ｐＭ以下、例えば１００ｐＭ以上、５０ｐＭ以上、２０ｐＭ以上、１０ｐＭ以上、８ｐＭ以上、５ｐＭ以上又は２ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態では、多重特異性抗体分子は、ヒトＩＬ−１７Ａに対して５０ｐＭ〜１ｐＭ、２０ｐＭ〜１ｐＭ、１０ｐＭ〜１ｐＭ、８ｐＭ〜１ｐＭ、５ｐＭ〜１ｐＭ又は２ｐＭ〜１ｐＭの範囲の結合親和性を有する。
【００４４】
一実施形態では、多重特異性抗体分子は、ヒトＩＬ−１７Ｆに対して２００ｐＭ以下、例えば１００ｐＭ以上、５０ｐＭ以上、２０ｐＭ以上、１５ｐＭ以上又は１０ｐＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態では、多重特異性抗体分子は、ヒトＩＬ−１７Ｆに対して５０ｐＭ〜１ｐＭ、２０ｐＭ〜１ｐＭ、１５ｐＭ〜１ｐＭ又は１０ｐＭ〜１ｐＭの範囲の結合親和性を有する。一実施形態では、多重特異性抗体分子は、ヒトＩＬ−１７Ｆに対して１０ｐＭ〜５ｐＭ又は８ｐＭ〜７ｐＭの範囲の結合親和性を有する。
【００４５】
一実施形態では、多重特異性抗体分子は、ヒト血清アルブミンに対して３ｎＭ以上、２ｎＭ以上、１．９ｎＭ以上又は１．８ｎＭ以上の結合親和性を有する。一実施形態では、多重特異性抗体分子は、ヒト血清アルブミンに対して３ｎＭ〜１ｐＭ、２ｎＭ〜１ｎＭ、２ｎＭ〜１．５ｎＭ又は１．８ｎＭ〜１．７ｎＭの範囲の結合親和性を有する。
【００４６】
本発明の一態様では、各結合ドメインは２つの抗体可変ドメイン、好ましくはＶＨ／ＶＬ対を含む。一態様では、各結合ドメインは、２つ以下の抗体可変ドメインを含む。
【００４７】
本発明の多重特異性抗体分子は、上記のように２つ以上の抗原、例えば３つの抗原に結合することができる任意の好適な抗体フォーマットを有することができる。
【００４８】
一態様では、抗体分子のフォーマットは、ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、タンデムｓｃＦｖ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ’Ｆｖ、ＦａｂｄｓＦｖ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ、Ｆａｂ−（ｄｓｓｃＦｖ）２、ＦａｂＦｖＦｖ、ＦａｂＦｖＦｃ、ｄｉＦａｂ、ｄｉＦａｂ’、ｔｒｉｂｏｄｙ、タンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ、ｓｃｄｉａｂｏｄｙ−Ｆｃ、ｓｃｄｉａｂｏｄｙ−ＣＨ３、Ｉｇ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｉｇ、Ｖ−Ｉｇ、Ｉｇ−Ｖ、Ｄｕｏｂｏｄｙ及びＤＶＤ−Ｉｇから選択される。一例では、抗体分子は、図８に２ｘｄｓｓｃＦｖとして示され、国際公開第２０１５／１９７７７２号明細書に記載されているフォーマットを有する。
【００４９】
一実施形態では、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメイン及びＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ及びｄｓｓｃＦｖから独立して選択される。
【００５０】
本発明の一実施形態では、抗体分子は、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインを含まない。Ｆｃドメインとも呼ばれるＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインを欠く抗体分子は、補体結合などのＦｃドメインに起因する機能的特性が必要でない場合に有利である。
【００５１】
抗体治療薬中のＦｃドメイン、特にＩｇＧ１アイソタイプＦｃなどの活性Ｆｃドメインの存在は、インビボでＦｃＧＲ及び補体などの炎症誘発性タンパク質との相互作用をもたらし得る。したがって、本発明の抗体分子がＦｃドメインを含まない実施形態では、抗体は、Ｆｃドメインを含む抗体分子と比較して、インビボでＦｃＧＲ及び補体などの炎症誘発性タンパク質との相互作用がより少ない場合がある。
【００５２】
標的抗原がホモマルチマーである同じ標的抗原に対する複数の結合ドメインとＦｃドメインの両方を含む抗体は、大きな抗体すなわち抗原複合体を形成する傾向を複数の活性Ｆｃドメインと組み合わせて、大きな免疫複合体を形成し得る。大きな免疫複合体は、インビボで不適切に沈着して免疫系の活性化を招くことがある。抗体が各標的抗原に対して１つ以下の結合ドメインを含み、Ｆｃドメインを含まない本発明の実施形態では、大きな免疫複合体を形成する抗体の能力が低下し、したがってインビボでの不適切な沈着及び免疫活性化の可能性が低くなる。
【００５３】
本発明の一態様において、多重特異性抗体分子は、
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ１−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖と、
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ１−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖と
を含むか又はそれらから構成される二量体として提供され、
式中、
ＶＨ１は重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ１は重鎖定常領域のドメイン、例えばそのドメイン１を表し、
Ｘは結合又はリンカーを表し、
Ｙは結合又はリンカーを表し、
Ｖ１はｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表し、
ＶＬ１は軽鎖可変ドメインを表し、
ＣＬは軽鎖定常領域由来のドメイン、例えばＣκを表し、
Ｖ２はｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表す。
【００５４】
一実施形態では、ＶＨ１及びＶＬ１は共に、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆから選択される第１の抗原に特異的な結合ドメインを形成する。一実施形態では、ＶＨ１及びＶＬ１は共に、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインを形成する。
【００５５】
一実施形態では、Ｖ１は、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆから選択される第２抗原に特異的な結合ドメインを含む。一実施形態では、Ｖ１は、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインを含む。
【００５６】
一実施形態では、Ｖ２は、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆから選択される第２又は第３の抗原に特異的な結合ドメインを含む。一実施形態では、Ｖ２は、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインを含む。
【００５７】
一実施形態では、ＶＨ１及びＶＬ１は、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインを含み、Ｖ１及び／又はＶ２は、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインを含む。Ｖ１及びＶ２がヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインを含む実施形態において、Ｖ１及びＶ２は、ヒトＴＮＦ−αの同一又は異なるエピトープに結合し得る。
【００５８】
一実施形態では、ＶＨ１及びＶＬ１はヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインを含み、Ｖ１及び／又はＶ２はヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインを含む。Ｖ１及びＶ２がヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインを含む実施形態において、Ｖ１及びＶ２は、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆの同一又は異なるエピトープに結合し得る。
【００５９】
一実施形態では、抗体分子は、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で定義されるポリペプチド鎖を含むか又はそれらから構成され、ヒトＴＮＦ−αに特異的な１つ以下の結合ドメイン及びヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な１つ以下の結合ドメインを含む。
【００６０】
本発明の一態様において、多重特異性抗体分子は、さらなる抗原に結合することができ、血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子又はＣＤ３５／ＣＲ１に特異的な結合ドメインを含み、例えば、抗体分子に対する半減期を延長する。
【００６１】
一実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１が特異性を有する目的の抗原は、血清担体タンパク質、例えばヒト血清アルブミンなどのヒト血清担体である。
【００６２】
一実施形態では、Ｖ１が特異性を有する目的の抗原は、血清担体タンパク質、例えばヒト血清アルブミンなどのヒト血清担体である。
【００６３】
一実施形態では、Ｖ２が特異性を有する目的の抗原は、血清担体タンパク質、例えばヒト血清アルブミンなどのヒト血清担体である。
【００６４】
一実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１、Ｖ１又はＶ２のうちの１つのみが、血清担体タンパク質、例えばヒト血清アルブミンなどのヒト血清担体に対する特異性を有する。
【００６５】
したがって、一実施形態では、抗体分子は、上記の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で定義されるポリペプチド鎖を含むか又はそれらから構成され、
式中、
ａ．ＶＨ１及びＶＬ１は、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインを含み、
ｂ．Ｖ１はヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインを含み、Ｖ２は血清担体タンパク質、例えばヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインを含み、又はＶ２はヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインを含み、Ｖ１は血清担体タンパク質、例えばヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインを含む。
【００６６】
一実施形態では、抗体分子は、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で定義されるポリペプチド鎖を含むか又はそれらから構成され、ヒトＴＮＦ−αに特異的な１つ以下の結合ドメイン、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な１つ以下の結合ドメイン、及び血清担体タンパク質、例えばヒト血清アルブミンに特異的な１つ以下の結合ドメインを含む。
【００６７】
ＶＨ１−ＣＨ１部分はＶＬ−ＣＬ部分と共に機能性Ｆａｂ又はＦａｂ’断片を形成する。
【００６８】
ＶＨ１は可変ドメイン、例えば重鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、ＶＨ１は重鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、ＶＨ１はキメラ可変ドメインであり、すなわち少なくとも２つの種に由来する成分、例えばヒトフレームワーク及び非ヒトＣＤＲを含む。一実施形態では、ＶＨ１はヒト化されている。一実施形態では、ＶＨ１はヒトである。
【００６９】
ＶＬ１は可変ドメイン、例えば軽鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、ＶＬ１は軽鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、ＶＬ１はキメラ可変ドメインであり、すなわち少なくとも２つの種に由来する成分、例えばヒトフレームワーク及び非ヒトＣＤＲを含む。一実施形態では、ＶＬ１はヒト化されている。一実施形態では、ＶＬ１はヒト化されている。一実施形態では、ＶＬはヒトである。
【００７０】
一般に、ＶＨ１及びＶＬ１は共に抗原結合ドメインを形成する。一実施形態では、ＶＨ１及びＶＬ１は同族対を形成する。
【００７１】
本明細書中で使用される「同族対」は、インビボで生成された単一抗体由来の一対の可変ドメイン、すなわち宿主から単離された可変ドメインの自然発生対形成を指す。したがって、同種対はＶＨ及びＶＬ対である。一例では、同族対は抗原を協同的に結合する。
【００７２】
本明細書で用いられる「可変領域」は、ＣＤＲ及びフレームワーク、特に好適なフレームワークを含む抗体鎖中の領域を指す。
【００７３】
本開示における使用のための可変領域は、一般に、当該分野で公知の任意の方法によって生成され得る抗体に由来するであろう。
【００７４】
本明細書で用いられる「由来する」とは、使用される配列又は使用される配列と高度に類似する配列が、抗体の軽鎖又は重鎖などの元の遺伝物質から得られたという事実を指す。
【００７５】
本明細書中で使用される「非常に類似する」とは、その全長に渡って９５％以上、例えば９６、９７、９８又は９９％類似しているアミノ酸配列を指すことを意図する。
【００７６】
ＶＨ１及びＶＬ１について上に記載した本発明で使用するための可変領域は、任意の好適な供給源由来であってもよく、例えば、完全ヒト又はヒト化であってもよい。
【００７７】
一実施形態では、ＣＨ１ドメインは、抗体重鎖又はその誘導体由来の天然に存在するドメイン１である。
【００７８】
一実施形態では、軽鎖中のＣＬ断片は、定常κ配列又は定常λ配列又はその誘導体である。
【００７９】
本明細書中で使用される天然に存在するドメインの誘導体は、天然に存在する配列中の１、２、３、４又は５個のアミノ酸が置換又は欠失されている場合を指すことを意図しており、これは、例えば、望ましくない特性を排除するが、ドメインの特徴付け機能は保持されることによって、ドメインの特性を最適化する。
【００８０】
一実施形態では、機能的Ｆａｂ又はＦａｂ’断片には、１つ以上の天然又は人工の鎖間（すなわち、軽鎖及び重鎖間）ジスルフィド結合が存在する。
【００８１】
一実施形態では、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖のＣＨ１とＣＬとの間に「天然の」ジスルフィド結合が存在する。
【００８２】
ＣＬドメインがκ又はλのいずれかに由来する場合、システインを形成する結合の天然の位置は、ヒトｃκ及びｃλにおいて２１４である（Ｋａｂａｔ付番第４版１９８７）。
【００８３】
ＣＨ１中のジスルフィド結合形成システインの正確な位置は、実際に用いられる特定のドメインに依存する。したがって、例えばヒトγ−１において、ジスルフィド結合の天然の位置は位置２３３に位置する（Ｋａｂａｔ付番第４版１９８７）。γ２、γ３、γ４、ＩｇＭ及びＩｇＤのような他のヒトアイソタイプの結合形成システインの位置は公知であり、例えば、ヒトＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４は位置１２７であり、ヒトＩｇＤ及びＩｇＡ２Ｂの重鎖は１２８である。
【００８４】
場合により、式Ｉ及び式ＩＩのポリペプチドのＶＨとＶＬとの間にジスルフィド結合が存在することがある。
【００８５】
一実施形態では、本開示による多重特異性抗体は、ＣＨ１とＣＬとの間に天然に存在する位置と同等又は対応する位置にジスルフィド結合を有する。
【００８６】
一実施形態では、ＣＨ１を含む定常領域及びＣＬなどの定常領域は、天然に存在しない位置にあるジスルフィド結合を有する。これは、必要な１つ又は複数の位置でアミノ酸鎖にシステインを導入することによって分子内に操作され得る。この非天然ジスルフィド結合は、ＣＨ１とＣＬとの間に存在する天然のジスルフィド結合に加えて、又はこれに代わるものである。天然の位置にあるシステインは、ジスルフィド架橋を形成することができないセリンのようなアミノ酸で置換することができる。
【００８７】
操作されたシステインの導入は、当該分野で公知の任意の方法を用いて実施することができる。これらの方法には、ＰＣＲ伸長重複突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発又はカセット突然変異誘発が含まれるが、これらに限定されない（概してＳａｍｂｒｏｏｋ．ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹ、１９８９；Ａｕｓｂｅｌ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ＆Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ、１９９３を参照されたい）。部位特異的突然変異誘発キットは市販されており、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）が挙げられる。カセット変異誘発は、Ｗｅｌｌｓ．ｅｔ  ａｌ．、１９８５、Ｇｅｎｅ、３４：３１５−３２３に基づいて行うことができる。或いは、突然変異体は、アニーリング、ライゲーション及びＰＣＲ増幅並びに重複オリゴヌクレオチドのクローニングによる全遺伝子合成によって作製することができる。
【００８８】
一実施形態では、ＣＨ１とＣＬとの間のジスルフィド結合は完全に存在せず、例えば鎖間システインはセリンなどの別のアミノ酸で置換されていてもよい。したがって、一実施形態では、分子の機能的Ｆａｂ断片に鎖間ジスルフィド結合は存在しない。参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００５／００３１７０号明細書などの開示には、鎖間ジスルフィド結合を有さないＦａｂ断片を提供する方法が記載されている。
【００８９】
一実施形態において、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）で定義されるポリペプチド鎖を含むか又はそれらから構成される、上記で定義した抗体分子は、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインを含まない。
【００９０】
Ｖ１はｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、又はｄｓｓｃＦｖ、例えばｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表す。
【００９１】
Ｖ２はｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、又はｄｓｓｃＦｖ、例えばｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表す。
【００９２】
本明細書で用いられる「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むか又はそれらから構成される一本鎖可変断片を指し、ＶＨ及びＶＬ可変ドメイン間のペプチドリンカーによって安定化されている。ＶＨ及びＶＬ可変ドメインは、任意の好適な向きであり得、例えば、ＶＨのＣ末端は、ＶＬのＮ末端に連結され得るか、又はＶＬのＣ末端は、ＶＨのＮ末端に連結され得る。
【００９３】
本明細書で用いられる「ジスルフィド安定化単鎖可変断片」又は「ｄｓｓｃＦｖ」は、ＶＨ及びＶＬ可変ドメイン間のペプチドリンカーによって安定化され、ＶＨとＶＬとの間のドメイン間ジスルフィド結合も含む一本鎖可変断片を指す。
【００９４】
本明細書で用いられる「ジスルフィド安定化可変断片」又は「ｄｓＦｖ」は、ＶＨ及びＶＬ可変ドメイン間にペプチドリンカーを含まない一本鎖可変断片を指し、代わりにＶＨ及びＶＬ間のドメイン間ジスルフィド結合によって安定化される。
【００９５】
本明細書で用いられる「単一ドメイン抗体」又は「ｓｄＡｂ」は、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨなどの単一の単量体可変抗体ドメインから構成される抗体断片を指す。
【００９６】
一実施形態では、Ｖ１及びＶ２は両方ともｄｓＦｖである。Ｖ１及びＶ２の両方がｄｓＦｖである場合、ＶＨ又はＶＬ可変ドメインのいずれかがＶ１及びＶ２について同一である。一実施形態では、Ｖ１及びＶ２は同じＶＨ可変ドメインを有する。別の実施形態では、Ｖ１及びＶ２は同じＶＬ可変ドメインを有する。一実施形態では、ＶＨ及びＶＬ可変ドメインはＶ１及びＶ２について同じである。後者は、いくつかの標的にとって望ましい可能性がある架橋結合を可能にする。
【００９７】
一実施形態では、Ｖ１はｄｓＦｖであり、Ｖ２はｓｃＦｖである。一実施形態では、Ｖ１はｓｃＦｖであり、Ｖ２はｄｓＦｖである。一実施形態では、Ｖ１はｄｓｓｃＦｖであり、Ｖ２はｄｓＦｖである。一実施形態では、Ｖ１はｄｓＦｖであり、Ｖ２はｄｓｓｃＦｖである。一実施形態では、Ｖ１はｄｓｓｃＦｖであり、Ｖ２はｓｃＦｖである。一実施形態では、Ｖ１はｓｃＦｖであり、Ｖ２はｄｓｓｃＦｖである。一実施形態では、Ｖ１はｓｃＦｖではない。一実施形態では、Ｖ２はｓｃＦｖではない。一実施形態では、Ｖ１及びＶ２の両方がｓｃＦｖではない。
【００９８】
Ｖ１及び／又はＶ２がｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである実施形態において、Ｖ１の軽鎖及び重鎖可変ドメイン及び／又はＶ２の軽鎖可変ドメイン及び／又は重鎖可変ドメインは、２つの操作されたシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結される。Ｖ１及び／又はＶ２の可変ドメインＶＨ及びＶＬ間のジスルフィド結合は、下記の２つの残基の間にある（文脈上別途明記しない限り、以下のリストではＫａｂａｔ付番を使用する）。Ｋａｂａｔ付番に言及する場合、関連する参照は、Ｋａｂａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡである。
【００９９】
一実施形態において、ジスルフィド結合は、
・ＶＨ３７＋ＶＬ９５、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６、７８１−７８８、Ｚｈｕｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）参照、
・ＶＨ４４＋ＶＬ１００、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３、５４５１−５４５９、Ｒｅｉｔｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、又はＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．２６９、Ｎｏ．２８、ｐｐ．１８３２７−１８３３１、Ｒｅｉｔｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、又はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ｖｏｌ．１０、ｎｏ．１２、ｐｐ．１４５３−１４５９、Ｒａｊａｇｏｐａｌｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）参照、
・ＶＨ４４＋ＶＬ１０５、例えば、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８、８２５−８３１、Ｌｕｏｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）参照、
・ＶＨ４５＋ＶＬ８７、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６、７８１−７８８、Ｚｈｕｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）参照、
・ＶＨ５５＋ＶＬ１０１、例えば、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３７７、１３５−１３９、Ｙｏｕｎｇｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）参照、
・ＶＨ１００＋ＶＬ５０、例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、１３６２−１３６７、Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）参照、
・ＶＨ１００ｂ＋ＶＬ４９、
・ＶＨ９８＋ＶＬ４６、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６、７８１−７８８、Ｚｈｕｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）参照、
・ＶＨ１０１＋ＶＬ４６、
・ＶＨ１０５＋ＶＬ４３、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、Ｖｏｌ．９０、ｐｐ．７５３８−７５４２、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）、又はＰｒｏｔｅｉｎｓ  １９、３５−４７、Ｊｕｎｇｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）参照、
・ＶＨ１０６＋ＶＬ５７、例えばＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３７７、１３５−１３９、Ｙｏｕｎｇｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）参照
を含む群から選択される位置にあり、
ＶＨ値及びＶＬ値は、所与のＶ１又はＶ２内で独立して選択される。
【０１００】
上記のアミノ酸対は、ジスルフィド結合が形成され得るようにシステインによる置換に寄与する位置にある。システインは、既知の技術によってこれらの所望の位置に操作することができる。したがって、一実施形態では、本開示による改変システインは、所定のアミノ酸位置の天然に存在する残基がシステイン残基で置換されている場合を指す。
【０１０１】
操作されたシステインの導入は、当該分野で公知の任意の方法を用いて実施することができる。これらの方法には、ＰＣＲ伸長重複突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発又はカセット突然変異誘発が含まれるが、これらに限定されない（概してＳａｍｂｒｏｏｋ．ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹ、１９８９；Ａｕｓｂｅｌ．ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ＆Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ、１９９３を参照されたい）。部位特異的突然変異誘発キットは市販されており、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）が挙げられる。カセット変異誘発は、Ｗｅｌｌｓ．ｅｔ  ａｌ．、１９８５、Ｇｅｎｅ、３４：３１５−３２３に基づいて行うことができる。或いは、突然変異体は、アニーリング、ライゲーション及びＰＣＲ増幅並びに重複オリゴヌクレオチドのクローニングによる全遺伝子合成によって作製することができる。
【０１０２】
したがって、一実施形態においてＶ１及び／又はＶ２がｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨ及びＶＬ及び／又はＶ２の可変ドメインＶＨ及びＶＬは、２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合によって連結されていてもよく、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１００、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ１００ｂとＶＬ４９、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０１とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３、ＶＨ１０６とＶＬ５７を含む群から選択される。
【０１０３】
一実施形態においてＶ１及び／又はＶ２がｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨ及びＶＬ及び／又はＶ２の可変ドメインＶＨ及びＶＬは、１つがＶＨで１つがＶＬの２つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結されていてもよく、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７とＶＬ９５、ＶＨ４４とＶＬ１００、ＶＨ４４とＶＬ１０５、ＶＨ４５とＶＬ８７、ＶＨ１００とＶＬ５０、ＶＨ９８とＶＬ４６、ＶＨ１０５とＶＬ４３、ＶＨ１０６とＶＬ５７を含む群から選択される。
【０１０４】
一実施形態では、Ｖ１がｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨ及びＶＬは、一方がＶＨ４４で他方がＶＬ１００の位置の２つの操作されたシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結される。
【０１０５】
一実施形態では、Ｖ２がｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ２の可変ドメインＶＨ及びＶＬは、一方がＶＨ４４で他方がＶＬ１００の２つの操作されたシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結される。
【０１０６】
一実施形態では、Ｖ１及びＶ２がｄｓＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１及びＶ２の可変ドメインＶＨ及びＶＬは、一方がＶＨ４４で他方がＶＬ１００の位置の２つの操作されたシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結される。
【０１０７】
一実施形態では、Ｖ１及びＶ２が両方ともｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１及びＶ２の可変ドメインＶＨ及びＶＬは、一方がＶＨ４４で他方がＶＬ１００の位置の２つの操作されたシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結される。
【０１０８】
一実施形態では、Ｖ１がｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｓｃＦｖである場合、Ｖ１のＶＨドメインは、例えばペプチド結合を介してＸに結合する。
【０１０９】
一実施形態では、Ｖ１がｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｓｃＦｖである場合、Ｖ１のＶＬドメインは、例えばペプチド結合を介してＸに結合する。
【０１１０】
一実施形態では、Ｖ２がｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｓｃＦｖである場合、Ｖ２のＶＨドメインは、例えばペプチド結合を介してＹに結合する。
【０１１１】
一実施形態では、Ｖ２がｄｓＦｖ、ｄｓｓｃＦｖ又はｓｃＦｖである場合、Ｖ２のＶＬドメインは、例えばペプチド結合を介してＹに結合する。
【０１１２】
当業者は、Ｖ１及び／又はＶ２がｄｓＦｖを表す場合、多重特異性抗体は、Ｘ又はＹに結合していない対応する遊離ＶＨ又はＶＬドメインをコードする第３のポリペプチドを含むことを認識するであろう。Ｖ１及びＶ２が両方ともｄｓＦｖである場合には、「遊離可変ドメイン」（すなわち、ジスルフィド結合を介してポリペプチドの残部に連結されたドメイン）は両方の鎖に共通である。したがって、ポリペプチドにＸ又はＹを介して融合又は連結された実際の可変ドメインは、各ポリペプチド鎖において異なっていてもよいが、それと対になる遊離可変ドメインは一般に互いに同一である。
【０１１３】
一実施形態では、Ｘは結合である。
【０１１４】
一実施形態では、Ｙは結合である。
【０１１５】
一実施形態では、Ｘ及びＹの両方が結合である。
【０１１６】
一実施形態では、Ｘはリンカー、好ましくはペプチドリンカー、例えば部分ＣＨ１及び部分Ｖ１を結合するための好適なペプチドである。
【０１１７】
一実施形態では、Ｙはリンカー、好ましくはペプチドリンカー、例えば部分ＣＬ及び部分Ｖ２を連結するための好適なペプチドである。
【０１１８】
一実施形態では、Ｘ及びＹの両方がリンカーである。一実施形態では、Ｘ及びＹの両方がペプチドリンカーである。
【０１１９】
本明細書で使用する「ペプチドリンカー」という用語は、アミノ酸から構成されるペプチドを指す。ある範囲の好適なペプチドリンカーが当業者には公知であろう。
【０１２０】
一実施形態では、Ｘ及び／又はＹペプチドリンカーは、長さが５０アミノ酸以下、例えば２０アミノ酸以下、例えば約１５アミノ酸以下、例えば長さが９、１０、１１、１２、１３又は１４アミノ酸である。
【０１２１】
一実施形態では、Ｘ及び／又はＹリンカーは、配列１〜６７で示される配列から選択される。
【０１２２】
一実施形態では、Ｘ及び／又はＹリンカーは、配列番号１又は配列番号２で示される配列から選択される。
【０１２３】
一実施形態では、Ｘは配列ＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号１）を有する。
【０１２４】
一実施形態では、Ｙは配列ＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号１）を有する。
【０１２５】
一実施形態では、Ｘは配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２）を有する。
【０１２６】
一実施形態では、Ｙは配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２）を有する。
【０１２７】
一実施形態では、Ｘは配列番号１で示される配列を有し、Ｙは配列番号２で示される配列を有する。
【０１２８】
一実施形態では、Ｘは配列番号２で示される配列を有し、Ｙは配列番号１で示される配列を有する。
【０１２９】
一実施形態では、Ｘは配列番号２で示される配列を有し、Ｙは配列番号２で示される配列を有する。
【０１３０】
一実施形態では、Ｘは配列番号６９又は７０で示される配列を有する。一実施形態では、Ｙは配列番号６９又は７０で示される配列を有する。一実施形態では、Ｘは配列番号６９で示される配列を有し、Ｙは配列番号７０で示される配列を有する。
【０１３１】
Ｘ及び／又はＹについての好適なリンカー配列も以下の表１及び２に提供されている。
【０１３２】
【表１】
2019502380.tif 000002
【０１３３】
【表２】
2019502380.tif 000003
【０１３４】
剛性リンカーの例には、ペプチド配列ＧＡＰＡＰＡＡＰＡＰＡ（配列番号５２）、ＰＰＰＰ（配列番号５３）及びＰＰＰが含まれる。
【０１３５】
一実施形態では、ペプチドリンカーはアルブミン結合ペプチドである。
【０１３６】
アルブミン結合ペプチドの例は、国際公開第２００７／１０６１２０号明細書に提供されており、表３を含む。
【０１３７】
【表３】
2019502380.tif 000004
【０１３８】
アルブミン結合ペプチドをリンカーとして使用することは、多重特異性抗体分子の半減期を増加させることができるという利点がある。
【０１３９】
一実施形態では、Ｖ１及びＶ２の少なくとも１つはｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである。例えば、Ｖ１はｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖであり、Ｖ２はｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである。
【０１４０】
一実施形態では、Ｖ１はｄｓｓｃＦｖであり、Ｖ２はｄｓｓｃＦｖである。
【０１４１】
Ｖ１がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである実施形態では、Ｖ１は、
ａ．式（ＩＩＩ）：ＶＨ２−Ｚ１−ＶＬ２、及びＶＨ２が例えばペプチド結合を介してＸに結合する、又は
ｂ．式（ＩＶ）：ＶＬ２−Ｚ１−ＶＨ２、及びＶＬ２が例えばペプチド結合を介してＸに結合する、
ポリペプチド鎖を含むか又はそれから構成され、
式中、ＶＨ２は重鎖可変ドメインを表し、Ｚ１はリンカー、例えばペプチドリンカーを表し、ＶＬ２は軽鎖可変ドメインを表す。
【０１４２】
Ｖ２がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである実施形態では、Ｖ２は、
ａ．式（Ｖ）：ＶＨ３−Ｚ２−ＶＬ３、及びＶＨ３が例えばペプチド結合を介してＹに結合する、又は
ｂ．式（ＶＩ）：ＶＬ３−Ｚ２−ＶＨ３、及びＶＬ３が例えばペプチド結合を介してＹに結合する
ポリペプチド鎖を含むか又はそれから構成され、
式中、ＶＨ３は重鎖可変ドメインを表し、Ｚ２はリンカー、例えばペプチドリンカーを表し、ＶＬ３は軽鎖可変ドメインを表す。
【０１４３】
一実施形態では、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖ中のペプチドリンカーＺ１及び／又はＺ２は、長さが約１２〜２５アミノ酸の範囲、例えば１５〜２０アミノ酸である。
【０１４４】
一実施形態では、Ｖ１がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨ及びＶＬを連結するリンカーＺ１は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６８）を有する。
【０１４５】
一実施形態では、Ｖ２がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ２の可変ドメインＶＨ及びＶＬを連結するリンカーＺ２は、配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６８）を有する。
【０１４６】
一実施形態では、Ｖ１がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨ及びＶＬを連結するリンカーＺ１は、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６９）を有する。
【０１４７】
一実施形態では、Ｖ２がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ２の可変ドメインＶＨ及びＶＬを連結するリンカーＺ２は、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６９）を有する。
【０１４８】
一実施形態では、Ｖ１がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ１の可変ドメインＶＨ及びＶＬを連結するリンカーＺ１は、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号７０）を有する。
【０１４９】
一実施形態では、Ｖ２がｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖである場合、Ｖ２の可変ドメインＶＨ及びＶＬを連結するリンカーＺ２は、配列ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ（配列番号７０）を有する。
【０１５０】
したがって、一態様では、
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ１−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖と、
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ１−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖と
を含むか又はそれらから構成される多重特異性抗体分子が提供され、
式中、
ＶＨ１は重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ１は重鎖定常領域のドメイン、例えばそのドメイン１を表し、
Ｘは、配列番号２で示される配列を有するリンカーを表し、
Ｙは、配列番号２で示される配列を有するリンカーを表し、
Ｖ１は、式（ＩＩＩ）：ＶＨ２−Ｚ１−ＶＬ２のポリペプチド鎖を含むか又はそれから構成されるｄｓｓｃＦｖを表し、式中、ＶＨ２は重鎖可変ドメインを表し、Ｚ１は配列番号６８で示される配列を有するリンカーを表し、ＶＬ２は軽鎖可変ドメインを表し、ＶＨ２は例えばペプチド結合を介してＸに結合し、Ｖ１の可変ドメインＶＨ２及びＶＬ２は、一方はＶＨ４４、他方はＶＬ１００の位置で２つの操作されたシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結され、
ＶＬ１は軽鎖可変ドメインを表し、
ＣＬは軽鎖定常領域由来のドメイン、例えばＣκを表し、
Ｖ２は、式（Ｖ）：ＶＨ３−Ｚ２−ＶＬ３のポリペプチド鎖を含むか又はそれから構成されるｄｓｓｃＦｖを表し、式中、ＶＨ３は重鎖可変ドメインを表し、Ｚ２は配列番号６８で示される配列を有するリンカーを表し、ＶＬ３は軽鎖可変ドメインを表し、ＶＨ３は例えばペプチド結合を介してＹに結合し、Ｖ２の可変ドメインＶＨ３及びＶＬ３は、一方はＶＨ４４、他方はＶＬ１００の位置で２つの操作されたシステイン残基間のジスルフィド結合により結合され、
式中、ＶＨ１及びＶＬ１は、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインを含み、Ｖ１はヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインを含み、Ｖ２はヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインを含み、又はＶ２はヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインを含み、Ｖ１はヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインを含む。
【０１５１】
本発明は、上記定義の多重特異性抗体分子であって、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＨ１については配列番号８５で示される配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲＨ２については配列番号８６で示される配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲＨ３については配列番号８７で示される配列を有するＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む、多重特異性抗体分子を提供する。一実施形態では、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインは、ＣＤＲＨ１については配列番号８５、ＣＤＲＨ２については配列番号８６、ＣＤＲＨ３については配列番号８７に示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲを含む。一実施形態では、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインは３つの重鎖ＣＤＲを含み、ＣＤＲＨ１の配列は配列番号８５で示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＨ２の配列は配列番号８６で示される配列と少なくとも６０％同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＨ３の配列は配列番号８７で示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する。
【０１５２】
本発明は、上記定義の多重特異性抗体分子であって、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＬ１については配列番号８８又は配列番号１３６で示される配列を有するＣＤＲ、ＣＤＲＬ２については配列番号８９、配列番号１３７、配列番号１３８又は配列番号１３９で示される配列を有するＣＤＲ、及びＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有するＣＤＲの少なくとも１つを含む、多重特異性抗体分子を提供する。一実施形態では、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインは、ＣＤＲＬ１については配列番号８８及び配列番号１３６、ＣＤＲＬ２については配列番号８９、配列番号１３７、配列番号１３８又は配列番号１３９、ＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含む。一実施形態では、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインは、３つの軽鎖ＣＤＲを含み、ＣＤＲＬ１の配列は、配列番号８８又は配列番号１３６で示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＬ２の配列は、配列番号８９、配列番号１３７、配列番号１３８又は配列番号１３９で示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＬ３の配列は、配列番号９０で示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する。
【０１５３】
本発明は、上記定義の多重特異性抗体分子であって、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＨ１については配列番号８５、ＣＤＲＨ２については配列番号８６、及びＣＤＲＨ３については配列番号８７で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号８８、ＣＤＲＬ２については配列番号８９、及びＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含む、多重特異性抗体分子を提供する。
【０１５４】
本発明は、上記定義の多重特異性抗体分子であって、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＨ１については配列番号８５、ＣＤＲＨ２については配列番号８６、及びＣＤＲＨ３については配列番号８７で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号１３６、ＣＤＲＬ２については配列番号８９、配列番号１３７、配列番号１３８又は配列番号１３９、及びＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含む、多重特異性抗体分子を提供する。
【０１５５】
本発明は、上記定義の多重特異性抗体分子であって、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインが、配列番号９２又は配列番号９６で示される配列、配列番号９２又は配列番号９６で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号９２又は配列番号９６で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ２が、ＣＤＲＨ１については配列番号８５、ＣＤＲＨ２については配列番号８６、ＣＤＲＨ３については配列番号８７で示される配列を有する配列を含む重鎖可変ドメインを含む、多重特異性抗体分子を提供する。
【０１５６】
一例では、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインがヒト化される。本発明のヒト化抗体において、アクセプター重鎖及び軽鎖は、必ずしも同じ抗体に由来する必要はなく、所望であれば、異なる鎖由来のフレームワーク領域を有する複合鎖を含んでいてもよい。
【０１５７】
一例では、本発明のＴＮＦ−α結合ドメインの重鎖のためのこのような好適なフレームワーク領域の１つは、ヒトＶＨ３  １−３  ３−２１  ＪＨ４アクセプターフレームワークに由来する。
【０１５８】
したがって、一例において、ＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインは、ＣＤＲ−Ｈ１については配列番号８５で示される配列、ＣＤＲ−Ｈ２については配列番号８６で示される配列、及びＣＤＲＨ３については配列番号８７で示される配列から選択される１つ以上のＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを含み、重鎖フレームワーク領域はヒトアクセプターフレームワークＶＨ３  １−３  ３−２１  ＪＨ４に由来する。
【０１５９】
本発明のヒト化抗体において、フレームワーク領域は、アクセプター抗体のものと全く同じ配列を有する必要はない。例えば、異常な残基は、そのアクセプター鎖クラス又はタイプのより頻繁に生じる残基に変更されてもよい。或いは、アクセプターフレームワーク領域の選択された残基は、それらがドナー抗体の同じ位置で見出される残基に対応するように変更されてもよい（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ．ｅｔ  ａｌ．、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２，３２３−３２４を参照されたい）。そのような変更は、ドナー抗体の親和性を回復するのに必要な最小限に留めるべきである。変更する必要があり得るアクセプターフレームワーク領域の残基を選択するためのプロトコルは、国際公開第９１／０９９６７号明細書に記載されている。
【０１６０】
このように、一実施形態では、重鎖及び／又は軽鎖のフレームワーク中の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０残基が別のアミノ酸残基で置換される。
【０１６１】
したがって、一例において、ＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインは、重鎖可変ドメインを含み、ここで、重鎖可変ドメインの位置２４、４８、４９、７１、７３、７８及び９３（Ｋａｂａｔ付番）の残基の少なくとも１つはドナー残基であり、例えば配列番号９２又は配列番号９６で示される配列を参照されたい。
【０１６２】
一実施形態では、重鎖可変ドメインの残基２４は、別のアミノ酸、例えばスレオニンで置換される。
【０１６３】
一実施形態では、重鎖可変ドメインの残基４８は、別のアミノ酸、例えばイソロイシンで置換される。
【０１６４】
一実施形態では、重鎖可変ドメインの残基４９は、別のアミノ酸、例えばグリシンで置換される。
【０１６５】
一実施形態では、重鎖可変ドメインの残基７１は、別のアミノ酸、例えばバリンで置換される。
【０１６６】
一実施形態では、重鎖可変ドメインの残基７３は、別のアミノ酸、例えばリジンで置換される。
【０１６７】
一実施形態では、重鎖可変ドメインの残基７８は、別のアミノ酸、例えばアラニンで置換される。
【０１６８】
一実施形態では、重鎖可変ドメインの残基９３は、別のアミノ酸、例えばスレオニンで置換される。
【０１６９】
一実施形態では、本開示によるヒト化抗ＴＮＦ−α重鎖可変ドメイン中の残基４８はイソロイシンであり、残基４９はグリシンであり、７１はバリンであり、７３はリジンであり、７８はアラニンであり、残基９３はスレオニンである。
【０１７０】
したがって、一例では、ヒト化ＴＮＦ−α結合ドメインが提供され、ここで、少なくとも重鎖可変ドメインの４８、４９、７１、７３、７８及び９３（Ｋａｂａｔ付番）の各位置の残基はドナー残基であり、例えば、配列番号９２又は配列番号９６で示される配列を参照されたい。
【０１７１】
一例では、ヒト化ＴＮＦ−α結合ドメインが提供され、ここで、少なくとも重鎖可変ドメインの２４、４８、４９、７１、７３、７８及び９３（Ｋａｂａｔ付番）の各位置の残基はドナー残基である。
【０１７２】
一例では、本発明のヒト化ＴＮＦ−α結合ドメインの軽鎖に適したフレームワーク領域は、ヒトアクセプターフレームワークＶＫ１  ２−１（Ｕ）Ａ２０  ＪＫ２に由来する。
【０１７３】
したがって、一例において、ＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインは、ＣＤＲ−Ｌ１については配列番号８８又は１３６で示される配列、ＣＤＲ−Ｌ２については配列番号８９、１３７、１３８又は１３９、ＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を含む軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖フレームワーク領域は、ヒトアクセプターフレームワークＶＫ１  ２−１（Ｕ）Ａ２０  ＪＫ２に由来する。
【０１７４】
一例において、ＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインは、ヒト化軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖の可変ドメインの位置６５、７１及び８７（Ｋａｂａｔ付番）の残基の１つ以上がドナー残基であり、例えば、配列番号９１又は配列番号９５で示される配列を参照されたい。
【０１７５】
一例では、ヒト化ＴＮＦ−α結合ドメインが提供され、ここで、少なくとも軽鎖可変ドメインの６５、７１及び８７（Ｋａｂａｔ付番）の各位置にある残基は、ドナー残基であり、例えば、配列番号９１又は配列番号９５で示される配列を参照されたい。
【０１７６】
一実施形態では、軽鎖可変ドメインの残基６５は、別のアミノ酸、例えばスレオニンで置換される。
【０１７７】
一実施形態では、軽鎖可変ドメインの残基７１は、別のアミノ酸、例えばチロシンで置換される。
【０１７８】
一実施形態では、軽鎖可変ドメインの残基８７は、別のアミノ酸、例えばフェニルアラニンで置換される。
【０１７９】
一実施形態では、本開示によるヒト化抗ＴＮＦ−α軽鎖可変領域において、残基６５はトレオニンであり、残基７１はチロシンであり、残基８７はフェニルアラニンである。
【０１８０】
本発明は、上記定義の多重特異性抗体分子であって、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインが、配列番号９１又は配列番号９５で示される配列、配列番号９１又は配列番号９５で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号９１又は配列番号９５で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、ＣＤＲＬ１については配列番号８８、ＣＤＲＬ２については配列番号８９、ＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有する配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、多重特異性抗体分子を提供する。
【０１８１】
本発明は、上記で定義した多重特異性抗体分子であって、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインが、配列番号９１で示される配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号９２で示される配列を含む重鎖可変ドメインを含む、多重特異性抗体分子を提供する。
【０１８２】
本発明は、上記で定義した多重特異性抗体分子であって、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインが、配列番号１４７で示される配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号９２で示される配列を含む重鎖可変ドメインを含む、多重特異性抗体分子を提供する。
【０１８３】
本発明は、上記で定義した多重特異性抗体分子であって、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインが、配列番号９５で示される配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号９６で示される配列を含む重鎖可変ドメインを含む、多重特異性抗体分子を提供する。
【０１８４】
本発明は、上記で定義した多重特異性抗体分子であって、抗体が、ヒトＴＮＦ−αに特異的なｄｓｓｃＦｖを含み、ｄｓｓｃＦｖは、配列番号１０１で示される配列、配列番号１０１で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号１０１で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、ＣＤＲＨ１については配列番号８５、ＣＤＲＨ２については配列番号８６、ＣＤＲＨ３については配列番号８７で示される配列を有し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、ＣＤＲＬ１については配列番号８８、ＣＤＲＬ２については配列番号８９、ＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有する配列を含む、多重特異性抗体分子を提供する。
【０１８５】
本発明は、上記で定義した多重特異性抗体分子であって、抗体が、ヒトＴＮＦ−αに特異的なｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖは、配列番号９９で示される配列、配列番号９９で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号９９で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、ＣＤＲＨ１については配列番号８５、ＣＤＲＨ２については配列番号８６、ＣＤＲＨ３については配列番号８７で示される配列を有し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、ＣＤＲＬ１については配列番号８８、ＣＤＲＬ２については配列番号８９、ＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有する配列を含む、多重特異性抗体分子を提供する。
【０１８６】
抗体分子が上記で定義した式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖を含むか又はそれらから構成される本発明の態様において、抗体分子は、ＣＤＲＨ１については配列番号８５、ＣＤＲＨ２については配列番号８６及びＣＤＲＨ３については配列番号８７の配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号８８又は配列番号１３６、ＣＤＲＬ２については配列番号８９又は１３７又は１３８又は１３９、ＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでもよく、これらは抗体分子中のＶＨ１／ＶＬ１の位置にある。一実施形態では、ＣＤＲＨ１については配列番号８５、ＣＤＲＨ２については配列番号８６及びＣＤＲＨ３については配列番号８７で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号８８又は配列番号１３６、ＣＤＲＬ２については配列番号８９又は配列番号１３７又は配列番号１３８又は配列番号１３９、及びＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲは、本開示の構築物においてＶ１の位置にある。一実施形態では、ＣＤＲＨ１については配列番号８５、ＣＤＲＨ２については配列番号８６及びＣＤＲＨ３については配列番号８７で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号８８又は配列番号１３６、ＣＤＲＬ２については配列番号８９又は配列番号１３７又は配列番号１３８又は配列番号１３９、及びＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲは、本開示の構築物においてＶ２の位置にある。一実施形態では、ＣＤＲＨ１については配列番号８５、ＣＤＲＨ２については配列番号８６及びＣＤＲＨ３については配列番号８７で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号８８又は配列番号１３６、ＣＤＲＬ２については配列番号８９又は配列番号１３７又は配列番号１３８又は配列番号１３９、及びＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲは、本開示の構築物においてＶ１及びＶ２の位置にある。一実施形態では、ＣＤＲＨ１については配列番号８５、ＣＤＲＨ２については配列番号８６及びＣＤＲＨ３については配列番号８７で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号８８又は配列番号１３６、ＣＤＲＬ２については配列番号８９又は配列番号１３７又は配列番号１３８又は配列番号１３９、及びＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲは、本開示の構築物においてＶＨ１／ＶＬ１及びＶ１の位置にある。一実施形態では、ＣＤＲＨ１については配列番号８５、ＣＤＲＨ２については配列番号８６及びＣＤＲＨ３については配列番号８７で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号８８又は配列番号１３６、ＣＤＲＬ２については配列番号８９又は配列番号１３７又は配列番号１３８又は配列番号１３９、及びＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲは、本開示の構築物においてＶＨ１／ＶＬ１及びＶ２の位置にある。
【０１８７】
一実施形態では、本開示の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖を含む抗体分子中のＴＮＦ−α結合部位は、配列番号９２及び配列番号９６から選択される重鎖可変ドメイン、及び配列番号９１及び配列番号９５から選択される軽鎖可変ドメイン、特にそれぞれ重鎖と軽鎖の配列番号９２と配列番号９１、又は配列番号９６と配列番号９５を含む。一実施形態では、これらのドメインは、本開示の構築物においてＶＨ１／ＶＬ１の位置にある。一実施形態では、これらの可変ドメインは、Ｖ１の位置にある。一実施形態において、これらの可変ドメインは、Ｖ２の位置にある。一実施形態では、これらの可変ドメインはＶ１及びＶ２の位置にある。一実施形態では、これらの可変ドメインは、本開示の構築物においてＶＨ１／ＶＬ１及びＶ１の位置にある。一実施形態では、これらの可変ドメインは、本開示の構築物においてＶＨ１／ＶＬ１及びＶ２の位置にある。可変ドメインが本開示の構築物の２つの位置にある場合、同じ対の可変ドメインが各位置に存在してもよく、又は２つの異なる対の可変ドメインが使用されてもよい。
【０１８８】
一実施形態では、本開示の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖を含む抗体分子中のＴＮＦ−α結合部位は、ヒトＴＮＦ−αに特異的なｄｓｓｃＦｖを含み、ｄｓｓｃＦｖは、配列番号１０１で示される配列を含む。一実施形態では、配列番号１０１で示される配列を含むｄｓｓｃＦｖは、Ｖ１及び／又はＶ２の位置にある。一実施形態では、配列番号１０１で示される配列を含むｄｓｓｃＦｖは、Ｖ１の位置にある。一実施形態では、配列番号１０１で示される配列を含むｄｓｓｃＦｖは、Ｖ２の位置にある。
【０１８９】
本発明は、上記定義の多重特異性抗体分子であって、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＨ１については配列番号７１、ＣＤＲＨ２については配列番号７２、ＣＤＲＨ３については配列番号７３で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲを含む、多重特異性抗体分子を提供する。一実施形態では、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインは３つの重鎖ＣＤＲを含み、ＣＤＲＨ１の配列は配列番号７１で示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＨ２の配列は配列番号７２で示される配列と少なくとも６０％同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＨ３の配列は配列番号７３で示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する。
【０１９０】
本発明は、上記定義の多重特異性抗体分子であって、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＬ１については配列番号７４、ＣＤＲＬ２については配列番号７５、ＣＤＲＬ３については配列番号７６で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含む、多重特異性抗体分子を提供する。一実施形態では、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインは３つの軽鎖ＣＤＲをさらに含み、ＣＤＲＬ１の配列は、配列番号７４で示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＬ２の配列は、配列番号７５で示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＬ３の配列は、配列番号７６で示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する。
【０１９１】
本発明は、上記定義の多重特異性抗体分子であって、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインが、ＣＤＲＨ１については配列番号７１、ＣＤＲＨ２については配列番号７２及びＣＤＲＨ３については配列番号７３で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号７４、ＣＤＲＬ２については配列番号７５及びＣＤＲＬ３については配列番号７６で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含む、多重特異性抗体分子を提供する。
【０１９２】
本発明は、上記定義の多重特異性抗体分子であって、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインが、配列番号７８で示される配列、配列番号７８で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号７８で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、ＣＤＲＨ１については配列番号７１、ＣＤＲＨ２については配列番号７２及びＣＤＲＨ３については配列番号７３で示される配列を有する配列を含む重鎖可変ドメインを含む、多重特異性抗体分子を提供する。
【０１９３】
本発明は、上記定義の多重特異性抗体分子であって、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインが、配列番号７７で示される配列、配列番号７７で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号７７で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、ＣＤＲＬ１については配列番号７４、ＣＤＲＬ２については配列番号７５及びＣＤＲＬ３については配列番号７６で示される配列を有する配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、多重特異性抗体分子を提供する。
【０１９４】
本発明は、上記で定義した多重特異性抗体分子であって、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインが、配列番号７８で示される配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号７７で示される配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、多重特異性抗体分子を提供する。
【０１９５】
本発明は、上記定義の多重特異性抗体分子であって、ヒトＩｌ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインが、配列番号８２で示される配列、配列番号８２で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号８２で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、ＣＤＲＨ１については配列番号７１、ＣＤＲＨ２については配列番号７２及びＣＤＲＨ３については配列番号７３で示される配列を有する配列を含む重鎖可変ドメイン及び重鎖定常ドメインを含む重鎖を含む、多重特異性抗体分子を提供する。
【０１９６】
本発明は、上記定義の多重特異性抗体分子であって、ヒトＩｌ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインが、配列番号８１で示される配列、配列番号８１で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号８１で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、ＣＤＲＬ１については配列番号７４、ＣＤＲＬ２については配列番号７５及びＣＤＲＬ３については配列番号７６で示される配列を有する配列を含む軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含む軽鎖を含む、多重特異性抗体分子を提供する。
【０１９７】
本発明は、上記で定義した多重特異性抗体分子であって、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインが、配列番号８２で示される配列を有する重鎖と、配列番号８１で示される配列を有する軽鎖とを含む、多重特異性抗体分子を提供する。
【０１９８】
抗体分子が上記で定義した式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖を含むか又はそれらから構成される本発明の態様において、抗体分子は、ＣＤＲＨ１については配列番号７１、ＣＤＲＨ２については配列番号７２及びＣＤＲＨ３については配列番号７３の配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号７４、ＣＤＲＬ２については配列番号７５及びＣＤＲＬ３については配列番号７６で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでもよく、これらは抗体分子中のＶＨ１／ＶＬ１の位置にある。一実施形態では、ＣＤＲＨ１については配列番号７１、ＣＤＲＨ２については配列番号７２及びＣＤＲＨ３については配列番号７３で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号７４、ＣＤＲＬ２については配列番号７５及びＣＤＲＬ３については配列番号７６で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲは、本開示の構築物においてＶ１の位置にある。一実施形態では、ＣＤＲＨ１については配列番号７１、ＣＤＲＨ２については配列番号７２及びＣＤＲＨ３については配列番号７３で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号７４、ＣＤＲＬ２については配列番号７５及びＣＤＲＬ３については配列番号７６で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲは、本開示の構築物においてＶ２の位置にある。一実施形態では、ＣＤＲＨ１については配列番号７１、ＣＤＲＨ２については配列番号７２及びＣＤＲＨ３については配列番号７３で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号７４、ＣＤＲＬ２については配列番号７５及びＣＤＲＬ３については配列番号７６で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲは、本開示の構築物においてＶ１及びＶ２の位置にある。一実施形態では、ＣＤＲＨ１については配列番号７１、ＣＤＲＨ２については配列番号７２及びＣＤＲＨ３については配列番号７３で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号７４、ＣＤＲＬ２については配列番号７５及びＣＤＲＬ３については配列番号７６で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲは、本開示の構築物においてＶＨ１／ＶＬ１及びＶ１の位置にある。一実施形態では、ＣＤＲＨ１については配列番号７１、ＣＤＲＨ２については配列番号７２及びＣＤＲＨ３については配列番号７３で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号７４、ＣＤＲＬ２については配列番号７５及びＣＤＲＬ３については配列番号７６で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲは、本開示の構築物においてＶＨ１／ＶＬ１及びＶ２の位置にある。
【０１９９】
一実施形態では、本開示の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖を含む抗体分子中のＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆ結合部位は、配列番号７８で示される重鎖可変ドメインと、軽鎖配列番号７７で示される軽鎖可変ドメインとを含む。一実施形態では、これらのドメインは、本開示の構築物においてＶＨ１／ＶＬ１の位置にある。一実施形態では、これらの可変ドメインは、Ｖ１の位置にある。一実施形態において、これらの可変ドメインは、Ｖ２の位置にある。一実施形態では、これらの可変ドメインはＶ１及びＶ２の位置にある。一実施形態では、これらの可変ドメインは、本開示の構築物においてＶＨ１／ＶＬ１及びＶ１の位置にある。一実施形態では、これらの可変ドメインは、本開示の構築物においてＶＨ１／ＶＬ１及びＶ２の位置にある。
【０２００】
一実施形態では、本開示の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖を含む抗体分子中のＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆ結合部位は、ＶＨ１の位置に配列番号８２で示される配列を有する重鎖と、ＶＬ１の位置に配列番号８１で示される配列を有する軽鎖とを含む。
【０２０１】
本発明は、上記定義の多重特異性抗体分子であって、抗体分子が、ＣＤＲＨ１については配列番号１０３、ＣＤＲＨ２については配列番号１０４、ＣＤＲＨ３については配列番号１０５で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲを含むヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインを含む、多重特異性抗体分子を提供する。一実施形態では、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインは３つの重鎖ＣＤＲを含み、ＣＤＲＨ１の配列は配列番号１０３で示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＨ２の配列は配列番号１０４で示される配列と少なくとも６０％同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＨ３の配列は配列番号１０５で示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する。
【０２０２】
本発明は、上記定義の多重特異性抗体分子であって、抗体分子が、ＣＤＲＬ１については配列番号１０６、ＣＤＲＬ２については配列番号１０７、ＣＤＲＬ３については配列番号１０８で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含むヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインを含む、多重特異性抗体分子を提供する。一実施形態では、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインは３つの軽鎖ＣＤＲをさらに含み、ＣＤＲＬ１の配列は、配列番号１０６で示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＬ２の配列は、配列番号１０７で示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有し、ＣＤＲＬ３の配列は、配列番号１０８で示される配列と少なくとも６０％の同一性又は類似性を有する。
【０２０３】
本発明は、上記定義の多重特異性抗体分子であって、抗体分子が、ＣＤＲＨ１については配列番号１０３、ＣＤＲＨ２については配列番号１０４及びＣＤＲＨ３については配列番号１０５で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号１０６、ＣＤＲＬ２については配列番号１０７及びＣＤＲＬ３については配列番号１０８で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含むヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインを含む、多重特異性抗体分子を提供する。
【０２０４】
本発明はまた、上記定義の多重特異性抗体結合分子であって、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインが、配列番号１１０又は配列番号１１４で示される配列、配列番号１１０又は配列番号１１４で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号１１０又は配列番号１１４で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、ＣＤＲＨ１については配列番号１０３、ＣＤＲＨ２については配列番号１０４、ＣＤＲＨ３については配列番号１０５で示される配列を有する配列を含む重鎖可変ドメインを含む、多重特異性抗体結合分子を提供する。
【０２０５】
本発明は、上記定義の多重特異性抗体分子であって、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインが、配列番号１０９又は配列番号１１３で示される配列、配列番号１０９又は配列番号１１３で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号１０９又は配列番号１１３で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、ＣＤＲＬ１については配列番号１０６、ＣＤＲＬ２については配列番号１０７、ＣＤＲＬ３については配列番号１０８で示される配列を有する配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、多重特異性抗体分子を提供する。
【０２０６】
本発明はまた、上記で定義した多重特異性抗体結合分子であって、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインが、配列番号１１０で示される配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１０９で示される配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、多重特異性抗体結合分子を提供する。
【０２０７】
本発明はまた、上記で定義した多重特異性抗体結合分子であって、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインが、配列番号１１４で示される配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１１３で示される配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む、多重特異性抗体結合分子を提供する。
【０２０８】
本発明はまた、上記で定義した多重特異性抗体結合分子であって、抗体が、ヒト血清アルブミンに特異的なｄｓｓｃＦｖを含み、ｄｓｓｃＦｖは、配列番号１１９で示される配列、配列番号１１９で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号１１９で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、ＣＤＲＨ１については配列番号１０３、ＣＤＲＨ２については配列番号１０４、ＣＤＲＨ３については配列番号１０５で示される配列を有し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、ＣＤＲＬ１については配列番号１０６、ＣＤＲＬ２については配列番号１０７、ＣＤＲＬ３については配列番号１０８で示される配列を有する配列を含む、多重特異性抗体結合分子を提供する。
【０２０９】
本発明はまた、上記で定義した多重特異性抗体結合分子であって、抗体が、ヒト血清アルブミンに特異的なｓｃＦｖを含み、ｓｃＦｖは、配列番号１１７で示される配列、配列番号１１７で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは配列番号１１７で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３が、ＣＤＲＨ１については配列番号１０３、ＣＤＲＨ２については配列番号１０４、ＣＤＲＨ３については配列番号１０５で示される配列を有し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３が、ＣＤＲＬ１については配列番号１０６、ＣＤＲＬ２については配列番号１０７、ＣＤＲＬ３については配列番号１０８で示される配列を有する配列を含む、多重特異性抗体結合分子を提供する。
【０２１０】
抗体分子が上記で定義した式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖を含むか又はそれらから構成される本発明の態様において、抗体分子は、ＣＤＲＨ１については配列番号１０３、ＣＤＲＨ２については配列番号１０４及びＣＤＲＨ３については配列番号１０５の配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号１０６、ＣＤＲＬ２については配列番号１０７及びＣＤＲＬ３については配列番号１０８で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含んでもよく、これらは抗体分子中のＶＨ１／ＶＬ１の位置にある。一実施形態では、ＣＤＲＨ１については配列番号１０３、ＣＤＲＨ２については配列番号１０４及びＣＤＲＨ３については配列番号１０５で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号１０６、ＣＤＲＬ２については配列番号１０７及びＣＤＲＬ３については配列番号１０８で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲは、本開示の構築物においてＶ１の位置にある。一実施形態では、ＣＤＲＨ１については配列番号１０３、ＣＤＲＨ２については配列番号１０４及びＣＤＲＨ３については配列番号１０５で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号１０６、ＣＤＲＬ２については配列番号１０７及びＣＤＲＬ３については配列番号１０８で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲは、本開示の構築物においてＶ２の位置にある。一実施形態では、ＣＤＲＨ１については配列番号１０３、ＣＤＲＨ２については配列番号１０４及びＣＤＲＨ３については配列番号１０５で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号１０６、ＣＤＲＬ２については配列番号１０７及びＣＤＲＬ３については配列番号１０８で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲは、本開示の構築物においてＶ１及びＶ２の位置にある。一実施形態では、ＣＤＲＨ１については配列番号１０３、ＣＤＲＨ２については配列番号１０４及びＣＤＲＨ３については配列番号１０５で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号１０６、ＣＤＲＬ２については配列番号１０７及びＣＤＲＬ３については配列番号１０８で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲは、本開示の構築物においてＶＨ１／ＶＬ１及びＶ１の位置にある。一実施形態では、ＣＤＲＨ１については配列番号１０３、ＣＤＲＨ２については配列番号１０４及びＣＤＲＨ３については配列番号１０５で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号１０６、ＣＤＲＬ２については配列番号１０７及びＣＤＲＬ３については配列番号１０８で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲは、本開示の構築物においてＶＨ１／ＶＬ１及びＶ２の位置にある。
【０２１１】
一実施形態では、本開示の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖を含む抗体分子中のヒト血清アルブミン結合部位は、配列番号１１０及び配列番号１１４から選択される重鎖可変ドメイン、及び配列番号１０９及び配列番号１１３から選択される軽鎖可変ドメイン、特にそれぞれ重鎖と軽鎖の配列番号１１０と配列番号１０９、又は配列番号１１４と配列番号１１３を含む。一実施形態では、これらのドメインは、本開示の構築物においてＶＨ１／ＶＬ１の位置にある。一実施形態では、これらの可変ドメインは、Ｖ１の位置にある。一実施形態において、これらの可変ドメインは、Ｖ２の位置にある。一実施形態では、これらの可変ドメインはＶ１及びＶ２の位置にある。一実施形態では、これらの可変ドメインは、本開示の構築物においてＶＨ１／ＶＬ１及びＶ１の位置にある。一実施形態では、これらの可変ドメインは、本開示の構築物においてＶＨ１／ＶＬ１及びＶ２の位置にある。可変ドメインが本開示の構築物の２つの位置にある場合、同じ対の可変ドメインが各位置に存在してもよく、又は２つの異なる対の可変ドメインが使用されてもよい。
【０２１２】
一実施形態では、本開示の式（Ｉ）及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖を含む抗体分子中のヒト血清アルブミン結合部位は、ヒト血清アルブミンに特異的なｄｓｓｃＦｖを含み、ｄｓｓｃＦｖは、配列番号１１９で示される配列を含む。一実施形態では、配列番号１１９で示される配列を含むｄｓｓｃＦｖはＶ１及び／又はＶ２の位置にある。一実施形態では、配列番号１１９で示される配列を含むｄｓｓｃＦｖは、位置Ｖ１の位置にある。一実施形態では、配列番号１１９で示される配列を含むｄｓｓｃＦｖは、Ｖ２の位置にある。
【０２１３】
本発明の一態様において、上記で定義した多重特異性抗体分子は、
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ１−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖と、
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ１−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖と
を含むか又はそれらから構成される二量体として提供され、
式中、
ＶＨ１は、ＣＤＲＨ１については配列番号７１、ＣＤＲＨ２については配列番号７２及びＣＤＲＨ３については配列番号７３で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ１は重鎖定常領域ドメイン、例えばそのドメイン１を表し、
Ｘは結合又は例えば配列番号２で示される配列を有するリンカーを表し、
Ｙは結合又は例えば配列番号２で示される配列を有するリンカーを表し、
Ｖ１は、ＣＤＲＨ１については配列番号８５、ＣＤＲＨ２については配列番号８６及びＣＤＲＨ３については配列番号８７で示される配列を有する３つの重鎖と、ＣＤＲＬ１については配列番号８８、ＣＤＲＬ２については配列番号８９及びＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含むｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表し、
ＶＬ１は、ＣＤＲＬ１については配列番号７４、ＣＤＲＬ２については配列番号７５及びＣＤＲＬ３については配列番号７６に示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを表し、
ＣＬは軽鎖定常領域由来のドメイン、例えばＣκを表し、
Ｖ２は、ＣＤＲＨ１については配列番号１０３、ＣＤＲＨ２については配列番号１０４及びＣＤＲＨ３については配列番号１０５で示される配列を有する３つの重鎖と、ＣＤＲＬ１については配列番号１０６、ＣＤＲＬ２については配列番号１０７及びＣＤＲＬ３については配列番号１０８で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含むｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表す。
【０２１４】
本発明の一態様において、上記で定義した多重特異性抗体分子は、
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ１−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖と、
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ１−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖と
を含むか又はそれらから構成される二量体として提供され、
式中、
ＶＨ１は、ＣＤＲＨ１については配列番号７１、ＣＤＲＨ２については配列番号７２及びＣＤＲＨ３については配列番号７３で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲを含む重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ１は重鎖定常領域ドメイン、例えばそのドメイン１を表し、
Ｘは結合又は例えば配列番号２で示される配列を有するリンカーを表し、
Ｙは結合又は例えば配列番号２で示される配列を有するリンカーを表し、
Ｖ１は、ＣＤＲＨ１については配列番号１０３、ＣＤＲＨ２については配列番号１０４及びＣＤＲＨ３については配列番号１０５で示される配列を有する３つの重鎖と、ＣＤＲＬ１については配列番号１０６、ＣＤＲＬ２については配列番号１０７及びＣＤＲＬ３については配列番号１０８で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含むｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表し、
ＶＬ１は、ＣＤＲＬ１については配列番号７４、ＣＤＲＬ２については配列番号７５及びＣＤＲＬ３については配列番号７６に示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインを表し、
ＣＬは軽鎖定常領域由来のドメイン、例えばＣκを表し、
Ｖ２は、ＣＤＲＨ１については配列番号８５、ＣＤＲＨ２については配列番号８６及びＣＤＲＨ３については配列番号８７で示される配列を有する３つの重鎖と、ＣＤＲＬ１については配列番号８８、ＣＤＲＬ２については配列番号８９及びＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含むｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表す。
【０２１５】
一態様では、
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ１−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖と、
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ１−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖と
を含むか又はそれらから構成される多重特異性抗体分子が提供され、
式中、
ＶＨ１は、配列番号７８で示される配列を有する重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ１は重鎖定常領域のドメイン、例えばそのドメイン１を表し、
Ｘは、例えば配列番号２で示される配列を有するリンカーを表し、
Ｙは、例えば配列番号２で示される配列を有するリンカーを表し、
Ｖ１は、配列番号９６で示される配列を有する重鎖可変ドメインと配列番号９５で示される配列を有する軽鎖可変ドメインとを含むｄｓｓｃＦｖを表し、
ＶＬ１は、配列番号７７で示される配列を有する軽鎖可変ドメインを表し、
ＣＬは軽鎖定常領域由来のドメイン、例えばＣκを表し、
Ｖ２は、配列番号１１４で示される配列を有する重鎖可変ドメインと配列番号１１３で示される配列を有する軽鎖可変ドメインとを含むｄｓｓｃＦｖを表す。
【０２１６】
一態様では、
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ１−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖と、
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ１−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖と
を含むか又はそれらから構成される多重特異性抗体分子が提供され、
式中、
ＶＨ１は、配列番号７８で示される配列を有する重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ１は重鎖定常領域のドメイン、例えばそのドメイン１を表し、
Ｘは、例えば配列番号２で示される配列を有するリンカーを表し、
Ｙは、例えば配列番号２で示される配列を有するリンカーを表し、
Ｖ１は、配列番号１１４で示される配列を有する重鎖可変ドメインと配列番号１１３で示される配列を有する軽鎖可変ドメインとを含むｄｓｓｃＦｖを表し、
ＶＬ１は、配列番号７７で示される配列を有する軽鎖可変ドメインを表し、
ＣＬは軽鎖定常領域由来のドメイン、例えばＣκを表し、
Ｖ２は、配列番号９６で示される配列を有する重鎖可変ドメインと配列番号９５で示される配列を有する軽鎖可変ドメインとを含むｄｓｓｃＦｖを表す。
【０２１７】
一態様では、
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ１−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖と、
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ１−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖と
を含むか又はそれらから構成される多重特異性抗体分子が提供され、
式中、
ＶＨ１及びＣＨ１は、配列番号８２で示される配列を有する重鎖可変ドメイン及び重鎖定常ドメインを表し、
Ｘは、例えば配列番号２で示される配列を有するリンカーを表し、
Ｙは、例えば配列番号２で示される配列を有するリンカーを表し、
Ｖ１は、配列番号９６で示される配列を有する重鎖可変ドメインと配列番号９５で示される配列を有する軽鎖可変ドメインとを含むｄｓｓｃＦｖを表し、
ＶＬ１及びＣＬは、配列番号８１で示される配列を有する軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを表し、
Ｖ２は、配列番号１１４で示される配列を有する重鎖可変ドメインと配列番号１１３で示される配列を有する軽鎖可変ドメインとを含むｄｓｓｃＦｖを表す。
【０２１８】
一態様では、
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ１−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖と、
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ１−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖と
を含むか又はそれらから構成される多重特異性抗体分子が提供され、
式中、
ＶＨ１及びＣＨ１は、配列番号８２で示される配列を有する重鎖可変ドメイン及び重鎖定常ドメインを表し、
Ｘは、例えば配列番号２で示される配列を有するリンカーを表し、
Ｙは、例えば配列番号２で示される配列を有するリンカーを表し、
Ｖ１は、配列番号１１４で示される配列を有する重鎖可変ドメインと配列番号１１３で示される配列を有する軽鎖可変ドメインとを含むｄｓｓｃＦｖを表し、
ＶＬ１及びＣＬは、配列番号８１で示される配列を有する軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを表し、
Ｖ２は、配列番号９６で示される配列を有する重鎖可変ドメインと配列番号９５で示される配列を有する軽鎖可変ドメインとを含むｄｓｓｃＦｖを表す。
【０２１９】
一態様では、
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ１−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖と、
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ１−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖と
を含むか又はそれらから構成される多重特異性抗体分子が提供され、
式中、
ＶＨ１及びＣＨ１は、配列番号８２で示される配列を有する重鎖可変ドメイン及び重鎖定常ドメインを表し、
Ｘは、例えば配列番号２で示される配列を有するリンカーを表し、
Ｙは、例えば配列番号２で示される配列を有するリンカーを表し、
Ｖ１は、配列番号１０１で示される配列を含むｄｓｓｃＦｖを表し、
ＶＬ１及びＣＬは、配列番号８１で示される配列を有する軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ド  メインを表し、
Ｖ２は、配列番号１１９で示される配列を含むｄｓｓｃＦｖを表す。
【０２２０】
一態様では、
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ１−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖と、
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ１−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖と
を含むか又はそれらから構成される多重特異性抗体分子が提供され、
式中、
ＶＨ１及びＣＨ１は、配列番号８２で示される配列を有する重鎖可変ドメイン及び重鎖定常ドメインを表し、
Ｘは、例えば配列番号２で示される配列を有するリンカーを表し、
Ｙは、例えば配列番号２で示される配列を有するリンカーを表し、
Ｖ１は、配列番号１１９で示される配列を含むｄｓｓｃＦｖを表し、
ＶＬ１及びＣＬは、配列番号８１で示される配列を有する軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを表し、
Ｖ２は、配列番号１０１で示される配列を含むｄｓｓｃＦｖを表す。
【０２２１】
本発明は、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインと、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインと、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインとを含む三重特異性抗体分子を提供し、抗体分子は、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ．配列番号１２５で示される配列、
ｉｉ．配列番号１２５で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは
ｉｉｉ．配列番号１２５で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＨ１については配列番号７１、ＣＤＲＨ２については配列番号７２、ＣＤＲＨ３については配列番号７３で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＨ１については配列番号８５、ＣＤＲＨ２については配列番号８６、ＣＤＲＨ３については配列番号８７で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号８８、ＣＤＲＬ２については配列番号８９、ＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含む配列
を含むか又はそれから構成される第１のポリペプチド、及び
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ．配列番号１３１で示される配列、
ｉｉ．配列番号１３１で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは
ｉｉｉ．配列番号１３１で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＬ１については配列番号７４、ＣＤＲＬ２については配列番号７５、ＣＤＲＬ３については配列番号７６で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＨ１については配列番号１０３、ＣＤＲＨ２については配列番号１０４、ＣＤＲＨ３については配列番号１０５で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号１０６、ＣＤＲＬ２については配列番号１０７、ＣＤＲＬ３については配列番号１０８で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含む配列
を含むか又はそれから構成される第２のポリペプチド
を含むか又はそれから構成される。
【０２２２】
一実施形態において、抗体分子は、配列番号１２５で示される配列を有する第１のポリペプチドと、配列番号１３１で示される配列を有する第２のポリペプチドとを含むか又はそれらから構成される。
【０２２３】
本発明はまた、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインと、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインと、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインとを含む三重特異性抗体分子であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ．配列番号１２７で示される配列、
ｉｉ．配列番号１２７で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは
ｉｉｉ．配列番号１２７で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＨ１については配列番号７１、ＣＤＲＨ２については配列番号７２、ＣＤＲＨ３については配列番号７３で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＨ１については配列番号８５、ＣＤＲＨ２については配列番号８６、ＣＤＲＨ３については配列番号８７で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号８８、ＣＤＲＬ２については配列番号８９、ＣＤＲＬ３については配列番号９０で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含む配列
を含むか又はそれから構成される第１のポリペプチド、及び
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ．配列番号１３１で示される配列、
ｉｉ．配列番号１３１で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列、或いは
ｉｉｉ．配列番号１３１で示される配列と少なくとも８０％の同一性又は類似性を有する配列であって、ＣＤＲＬ１については配列番号７４、ＣＤＲＬ２については配列番号７５、ＣＤＲＬ３については配列番号７６で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＨ１については配列番号１０３、ＣＤＲＨ２については配列番号１０４、ＣＤＲＨ３については配列番号１０５で示される配列を有する３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１については配列番号１０６、ＣＤＲＬ２については配列番号１０７、ＣＤＲＬ３については配列番号１０８で示される配列を有する３つの軽鎖ＣＤＲとを含む配列
を含むか又はそれから構成される第２のポリペプチド
を含むか又はそれらから構成される三重特異性抗体分子を提供する。
【０２２４】
一実施形態では、抗体分子は、配列番号１２７で示される配列を有する第１のポリペプチドと、配列番号１３１で示される配列を有する第２のポリペプチドとを含むか又はそれらから構成される。
【０２２５】
本発明はまた、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインと、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインと、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインとを含む三重特異性抗体分子であって、配列番号１２１で示される配列を有する第１のポリペプチドと、配列番号１２９で示される配列を有する第２のポリペプチドとを含むか又はそれらから構成される三重特異性抗体分子を提供する。
【０２２６】
本発明はまた、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインと、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインと、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインとを含む三重特異性抗体分子であって、配列番号１２３で示される配列を有する第１のポリペプチドと、配列番号１２９で示される配列を有する第２のポリペプチドとを含むか又はそれらから構成される三重特異性抗体分子を提供する。
【０２２７】
本発明はまた、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインと、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインと、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインとを含む三重特異性抗体分子であって、配列番号１２６で示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる第１のポリペプチドと、配列番号１３２で示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる第２のポリペプチドとを含むか又はそれらから構成される三重特異性抗体分子を提供する。
【０２２８】
本発明はまた、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインと、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインと、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインとを含む三重特異性抗体分子であって、配列番号１４４で示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる第１のポリペプチドと、配列番号１４６で示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる第２のポリペプチドとを含むか又はそれらから構成される三重特異性抗体分子を提供する。
【０２２９】
本発明はまた、ヒトＴＮＦ−αに特異的な結合ドメインと、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに特異的な結合ドメインと、ヒト血清アルブミンに特異的な結合ドメインとを含む三重特異性抗体分子であって、配列番号１４３で示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる第１のポリペプチドと、配列番号１４５で示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる第２のポリペプチドとを含むか又はそれらから構成される三重特異性抗体分子を提供する。
【０２３０】
一実施形態では、本発明による三重特異性抗体分子は、配列番号１３２、配列番号１４６又は配列番号１４５から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる第１ポリペプチドと、配列番号１２６、配列番号１４４又は配列番号１４３から選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる第２のポリペプチドとを含むか又はそれらから構成される。上記に定義した三重特異性抗体分子は、好ましくはヒトＴＮＦ−α、ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆの生物活性を中和することができる。
【０２３１】
本開示はまた、本明細書中に開示される配列と８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％類似する配列を提供する。
【０２３２】
本明細書で用いられる「同一性」は、整列した配列中の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。
【０２３３】
本明細書で使用される「類似性」は、整列した配列中の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で類似の型であることを示す。例えば、イソロイシン又はバリンの代わりにロイシンを用いてもよい。相互にしばしば置換され得る他のアミノ酸としては、
−フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）、
−リシン、アルギニン及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）、
−アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）、
−アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）、
−システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）
が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３４】
同一性及び類似性の程度は容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１、ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．＆Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２．Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．、１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．、１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６））。
【０２３５】
本発明の多重特異性構築物において使用するための抗体は、当該分野で公知の任意の好適な方法によって生成することができる。
【０２３６】
抗原ポリペプチドに対して生成される抗体は、周知の日常的なプロトコルを用いて動物、好ましくは非ヒト動物にポリペプチドを投与することにより、動物の免疫化が必要な場合に得ることができる（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（編）、Ｖｏｌ  ４、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６を参照されたい）。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ又はブタのような多くの温血動物が免疫処置され得る。しかしながら、マウス、ウサギ、ブタ及びラットが一般的に最も適している。
【０２３７】
モノクローナル抗体は、当分野で公知の任意の方法、例えば、ハイブリドーマ手法（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−４９７）、トリオーマ手法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法（Ｋｏｚｂｏｒ．ｅｔ  ａｌ．、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２）及びＥＢＶハイブリドーマ手法（Ｃｏｌｅ．ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ｐｐ７７−９６、Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８５）によって調製され得る。
【０２３８】
また、抗体は、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ、Ｊ．ｅｔ  ａｌ．、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３（１５）：７８４３−７８４８ｌ、国際公開第９２／０２５５１号明細書、国際公開第２００４／０５１２６８号明細書及び国際公開第２００４／１０６３７７号明細書に記載の方法により、特異性抗体の産生のために選択した単独のリンパ球から生成させた免疫グロブリン可変領域ｃＤＮＡをクローニングして発現させることによる、単独リンパ球抗体法を用いて生成してもよい。
【０２３９】
また、本開示における使用のための抗体は、当該分野で公知の種々のファージディスプレイ法を用いて生成することもでき、Ｂｒｉｎｋｍａｎ．ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５，１８２：４１−５０）、Ａｍｅｓ．ｅｔ  ａｌ．．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９５、１８４：１７７−１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ．ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，２４：９５２−９５８）、Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ、１９９７  １８７  ９−１８）、Ｂｕｒｔｏｎ．ｅｔ  ａｌ．（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４，５７：１９１−２８０）及び国際公開第９０／０２８０９号明細書、国際公開第９１／１０７３７号明細書、国際公開第９２／０１０４７号明細書、国際公開第９２／１８６１９号明細書、国際公開第９３／１１２３６号明細書、国際公開第９５／１５９８２号明細書、国際公開第９５／２０４０１号明細書、及び米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号、同第５，９６９，１０８号、及び国際公開第２００１１／３０３０５号明細書によって開示されている方法を含む。
【０２４０】
一実施形態では、本開示による多重特異性分子がヒト化される。
【０２４１】
本明細書で用いられるヒト化（ＣＤＲグラフト抗体を含む）とは、ヒト免疫グロブリン分子由来の非ヒト種及びフレームワーク領域由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する分子を指す（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、国際公開第９１／０９９６７号明細書を参照されたい）。ＣＤＲ全体ではなくＣＤＲの特異性決定残基を移すことが必要であるにすぎないことが理解されるであろう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ．ｅｔ  ａｌ．、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６，２５−３４を参照されたい）。ヒト化抗体は、場合により、ＣＤＲが由来する非ヒト種に由来する１つ以上のフレームワーク残基をさらに含んでいてもよい。
【０２４２】
本明細書中で使用される場合、用語「ヒト化抗体分子」は、重鎖及び／又は軽鎖が、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖及び／又は軽鎖可変領域フレームワークにグラフトしたドナー抗体（例えば、ネズミモノクローナル抗体）由来の１つ以上のＣＤＲ（必要に応じて１つ以上の改変ＣＤＲを含む）を含む抗体分子を指す。総説については、Ｖａｕｇｈａｎ．ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６、５３５−５３９、１９９８を参照されたい。一実施形態では、全ＣＤＲが移されるのではなく、上記のいずれか１つのＣＤＲから１つ以上の特異性決定残基のみがヒト抗体フレームワークに移される（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ．ｅｔ  ａｌ．、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６，２５−３４を参照されたい）。一実施形態では、上記の１つ以上のＣＤＲから特異性決定残基のみがヒト抗体フレームワークに移される。別の実施形態では、上記の各ＣＤＲから特異性決定残基のみがヒト抗体フレームワークに移される。
【０２４３】
ＣＤＲ又は特異性決定残基が移植される場合、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／タイプ（マウス、霊長類及びヒトフレームワーク領域を含む）に関して、任意の適切なアクセプター可変領域フレームワーク配列を用いることができる。好適には、本発明によるヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域並びに本明細書で提供される１つ以上のＣＤＲを含む可変ドメインを有する。
【０２４４】
本開示において使用され得るヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭである（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ、前記）。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは重鎖に、ＲＥＩは軽鎖に、ＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは重鎖及び軽鎖の両方に使用することができる。或いは、ヒト生殖系列配列を使用してもよく、これらはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／又はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｍｒｃ−ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ／ｌｉｓｔ２．ｐｈｐから入手可能である。
【０２４５】
本開示のヒト化抗体分子において、アクセプター重鎖及び軽鎖は、必ずしも同じ抗体に由来する必要はなく、所望であれば、異なる鎖由来のフレームワーク領域を有する複合鎖を含んでいてもよい。
【０２４６】
フレームワーク領域は、アクセプター抗体のものと全く同じ配列を有する必要はない。例えば、異常な残基は、そのアクセプター鎖クラス又はタイプのより頻繁に生じる残基に変更されてもよい。或いは、アクセプターフレームワーク領域中の選択された残基は、それらがドナー抗体中の同じ位置で見出される残基に対応するように変更することができる（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２，３２３−３２４を参照されたい）。そのような変更は、ドナー抗体の親和性を回復するのに必要な最小限に留めるべきである。変更する必要があり得るアクセプターフレームワーク領域の残基を選択するためのプロトコルは、国際公開第９１／０９９６７号明細書に記載されている。
【０２４７】
フレームワークの誘導体は、１、２、３又は４個のアミノ酸が、例えばドナー残基を有する別のアミノ酸で置換されていてもよい。
【０２４８】
ドナー残基は、ドナー抗体由来の残基、すなわちＣＤＲが最初に由来する抗体である。ドナー残基は、ヒト受容体フレームワーク（アクセプター残基）に由来する好適な残基によって置換されてもよい。
【０２４９】
一実施形態では、本開示の多重特異性抗体は完全ヒトであり、特に可変ドメインの１つ以上は完全ヒトである。
【０２５０】
完全ヒト分子は、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が全てヒト起源であるか、又はヒト起源の配列と実質的に同一であり、必ずしも同じ抗体由来ではないものである。完全ヒト抗体の例は、例えば、上記のファージディスプレイ法によって産生された抗体、及びネズミ免疫グロブリン可変部及び場合により定常領域遺伝子がそれらのヒト対応物によって置換されたマウスによって産生された抗体を含み得、例えば、欧州特許第０５４６０７３号、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，７７０，４２９号、欧州特許第０４３８４７４号及び欧州特許第０４６３１５１号の一般的な用語に記載されている。
【０２５１】
一実施形態では、本開示の多重特異性抗体分子は、標的抗原（１又は複数）に対する改善された親和性を提供するように処理される。このような変異体は、ＣＤＲの変異（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５４，３９２−４０３，１９９５）、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９−７８３、１９９２）、大腸菌の変異誘発物株の使用（Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５０，３５９−３６８、１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、８，７２４〜７３３，１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５６，７７〜８８，１９９６）及び性ＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９１，２８８〜２９１，１９９８）を含む多数の親和性成熟プロトコルによって得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（前出）は、これらの親和性成熟方法を論じている。
【０２５２】
この文脈において本明細書で用いられるような改善された親和性は、出発分子に対する改善を指す。
【０２５３】
必要に応じて、本開示において使用するための多重特異性抗体構築物は、１つ以上のエフェクター分子にコンジュゲートされ得る。エフェクター分子は、単一のエフェクター分子又は本発明の抗体に結合することができる単一の部分を形成するように連結された２つ以上のそのような分子を含み得ることが理解される。エフェクター分子に連結された抗体断片を得ることが望ましい場合、これは、抗体断片が直接又はカップリング剤を介してエフェクター分子に連結される標準的な化学的又は組換えＤＮＡ手順によって調製され得る。このようなエフェクター分子を抗体にコンジュゲートさせる技術は、当該分野で周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、２ｎｄ  Ｅｄ．、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ編、１９８７，ｐｐ．６２３−５３；Ｔｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ  １９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋ  ｅｔ  ａｌ  １９９９，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８３，６７−１２３を参照されたい）。特定の化学的手順には、例えば、国際公開第９３／０６２３１号明細書、国際公開第９２／２２５８３号明細書、国際公開第８９／００１９５号明細書、国際公開第８９／０１４７６号明細書及び国際公開第０３０３１５８１号明細書に記載されているものが含まれる。或いは、エフェクター分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、例えば国際公開第８６／０１５３３号明細書及び欧州特許第０３９２７４５号に記載されているような組換えＤＮＡ手順を用いて結合を達成してもよい。
【０２５４】
本明細書中で使用される「エフェクター分子」という用語は、例えば、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、他の抗体又は抗体断片、合成又は天然に存在するポリマー、核酸及びそれらの断片、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらの断片、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、キレート化金属、ナノ粒子、並びに蛍光化合物又はＮＭＲもしくはＥＳＲ分光法によって検出できる化合物などのレポーター基を含む。
【０２５５】
他のエフェクター分子には、１１１  Ｉｎ及び９０  Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリフォルニウム２５２、イリジウム１９２及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート化放射性核種、又は、限定されるものではないがアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンなどの薬剤が挙げられる。
【０２５６】
他のエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド及び酵素が含まれる。対象となる酵素としては、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。対象となるタンパク質、ポリペプチド及びペプチドには、免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素又はジフテリア毒素などの毒素、インスリン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子又は組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質、血栓剤（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）もしくは抗血管新生剤、例えば、アンジオスタチン又はエンドスタチン、又はリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、又は他の成長因子などの生物反応修飾因子、及び免疫グロブリンを含むがこれらに限定されない。
【０２５７】
他のエフェクター分子は、例えば診断に有用な検出可能な物質を含み得る。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性核種、陽電子放出金属（陽電子放出断層撮影に使用するため）、及び非放射性常磁性金属イオンが含まれる。診断剤として使用するために抗体にコンジュゲートされ得る金属イオンについては、一般的に米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。好適な酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含み、好適な補欠分子族は、ストレプトアビジン、アビジン及びビオチンを含み、好適な蛍光物質は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル及びフィコエリトリンを含み、好適な発光物質はルミノールを含み、好適な生物発光物質は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンを含み、好適な放射性核種は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ及び９９Ｔｃを含む。
【０２５８】
別の実施形態では、エフェクター分子は、インビボでの抗体の半減期を延長し、及び／又は抗体の免疫原性を低下させ、及び／又は上皮バリアを超えた免疫系への抗体の送達を増強し得る。このタイプの好適なエフェクター分子の例には、国際公開第０５／１１７９８４号明細書に記載されているようなポリマー、アルブミン、アルブミン結合タンパク質又はアルブミン結合化合物が含まれる。
【０２５９】
エフェクター分子がポリマーである場合、一般的に、合成又は天然に存在するポリマー、例えば適宜置換された直鎖もしくは分岐鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレンポリマー、又は分岐型もしくは非分岐型の多糖類、例えばホモ又はヘテロの多糖類であり得る。
【０２６０】
上記の合成ポリマーに存在し得る特定の任意選択の置換基には、１種以上のヒドロキシ基、メチル基又はメトキシ基が含まれる。
【０２６１】
合成ポリマーの具体的な例には、場合によって置換された直鎖又は分岐鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）又はその誘導体、特に、場合によって置換されたポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はその誘導体が含まれる。
【０２６２】
具体的な天然に存在するポリマーとしては、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン又はその誘導体が挙げられる。
【０２６３】
本明細書で使用される「誘導体」は、反応性誘導体、例えば、マレイミドなどのようなチオール選択的反応基を含むことが意図される。反応基は、直接又はリンカーセグメントを介してポリマーに連結できる。このような基の残基が、抗体断片とポリマーとの間の連結基として、時には生成物の一部を形成することが理解されるであろう。
【０２６４】
ポリマーのサイズは、所望に応じて変更できるが、一般的には平均分子量が５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば５０００〜４００００Ｄａ、例えば２００００〜４００００Ｄａの範囲となろう。ポリマーサイズは、具体的には、生成物の使用目的、例えば腫瘍などの特定の組織に局在する能力、又は循環半減期を延長する能力に基づいて選択できる（例えば、Ｃｈａｐｍａｎ、２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４、５３１−５４５を参照されたい）。したがって、例えば、例えば腫瘍の治療に使用するために、生成物を循環から離れて組織に浸透させることを意図する場合、分子量の小さいポリマー、例えばおよそ５０００Ｄａの分子量のポリマーの使用が有利であり得る。生成物が循環中に残存する用途では、分子量の大きいポリマー、例えば２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリマーの使用が有利であり得る。
【０２６５】
好適なポリマーには、例えばポリ（エチレングリコール）、又は特にメトキシポリ（エチレングリコール）もしくはその誘導体など、特に約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲の分子量を有するポリアルキレンポリマーが含まれる。
【０２６６】
一実施形態では、本開示において使用するための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合する。特定の一例において、抗体は抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、任意の利用可能なアミノ酸側鎖又は抗体断片に位置する末端アミノ酸官能基、例えば任意の遊離アミノ、イミノ、チオール、ヒドロキシル又はカルボキシル基を介して結合できる。このようなアミノ酸は、抗体断片中に天然に存在してもよく、又は組換えＤＮＡ法を用いて断片中に操作・導入してもよい（例えば、米国特許第５，２１９，９９６号、米国特許第５，６６７，４２５号、国際公開第９８／２５９７１号明細書、国際公開第２００８／０３８０２４号明細書を参照されたい）。一実施形態では、本発明の抗体分子は、修飾Ｆａｂ断片であり、修飾は抗体分子の重鎖のＣ末端に１つ以上のアミノ酸を付加して、エフェクター分子の結合を可能にする。好適には、付加アミノ酸は、エフェクター分子が結合できる１つ以上のシステイン残基を含む修飾ヒンジ領域を形成する。複数の部位を用いて、２つ以上のＰＥＧ分子を結合させることができる。
【０２６７】
好適には、ＰＥＧ分子は、抗体断片中に位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して共有結合される。修飾された抗体断片に結合した各ポリマー分子は、断片に位置するシステイン残基のイオウ原子に共有結合できる。共有結合は、一般的にジスルフィド結合、又は特にイオウ−炭素の結合であろう。チオール基が、活性化エフェクター分子と適切に結合する場所として使用される場合、例えばマレイミドなどのチオール選択的誘導体及びシステイン誘導体を使用できる。活性化ポリマーは、上記のポリマー‐修飾抗体断片の調製において出発物質として使用できる。活性化ポリマーは、α−ハロカルボン酸又はエステル、例えばヨードアセトアミド、イミド、例えばマレイミド、ビニルスルホン又はジスルフィドなどのチオール反応基を含む任意のポリマーであってもよい。このような出発物質は、市販で（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡから）得られる、又は市販の出発物質から従来の化学的手順を用いて調製できる。特定のＰＥＧ分子には、２０Ｋメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）が含まれる。
【０２６８】
一実施形態では、例えば、欧州特許第０９４８５４４号又は欧州特許第１０９００３７号に開示されている方法に従って、分子内にＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ又はＦａｂ’がＰＥＧ化されており、すなわち共有結合したＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール）を有する［「ポリ（エチレングリコール）の化学及び生物学的応用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、１９９２、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９７、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ及び「生物医科学のための生物学的結合タンパク質カップリング技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１９９８、Ｍ．Ａｓｌａｍ及びＡ．Ｄｅｎｔ、Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ、Ａ．２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００２，５４：５３１−５４５も参照されたい］。一実施形態では、ＰＥＧは、ヒンジ領域内のシステインに結合される。一例では、ＰＥＧ修飾Ｆａｂ断片は、修飾ヒンジ領域内の単一のチオール基に共有結合したマレイミド基を有する。リジン残基は、マレイミド基に共有結合していてもよく、リシン残基上の各アミン基には、約２０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが結合していてもよい。したがって、Ｆａｂ断片に結合したＰＥＧの全分子量は、約４０，０００Ｄａであり得る。
【０２６９】
特定のＰＥＧ分子には、Ｎ、Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール）分子量２０，０００）修飾リジンの２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミドが含まれ、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋとしても知られている（Ｎｅｋｔａｒ、以前はＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）。
【０２７０】
ＰＥＧリンカーの代替供給源には、ＧＬ２−４００ＭＡ２（以下の構造中のｍは５である）及びＧＬ２−４００ＭＡ（ｍは２である）を供給するＮＯＦが含まれ、ｎは約４５０である。
【化１】
2019502380.tif 000005
【０２７１】
すなわち、各ＰＥＧは約２０，０００Ｄａである。
【０２７２】
次のタイプのさらなる代替ＰＥＧエフェクター分子は、Ｄｒ  Ｒｅｄｄｙ、ＮＯＦ及びＪｅｎｋｅｍから入手可能である。
【化２】
2019502380.tif 000006
【０２７３】
一実施形態では、例えば、重鎖のアミノ酸２２６（連続付番による）など、鎖中のアミノ酸２２６又はその付近のシステインアミノ酸残基を介して結合した、ＰＥＧ化された（例えば、本明細書に記載のＰＥＧを有する）抗体分子が提供される。
【０２７４】
一実施形態では、本開示の分子をコードするポリヌクレオチド配列、例えばＤＮＡ配列が提供される。
【０２７５】
一実施形態では、本開示の分子の１つ以上、例えば２つ以上、又は３つ以上のポリペプチド成分、例えば、
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ１−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖、及び
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ１−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖
であって、
式中、
ＶＨ１は重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ１は重鎖定常領域のドメイン、例えばそのドメイン１を表し、
Ｘは結合又はリンカーを表し、
Ｙは結合又はリンカーを表し、
Ｖ１はｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表し、
ＶＬ１は軽鎖可変ドメインを表し、
ＣＬは軽鎖定常領域由来のドメイン、例えばＣκを表し、
Ｖ２はｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表す
ポリペプチド成分をコードするポリヌクレオチド配列が提供される。
【０２７６】
一実施形態では、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドはベクターに含まれる。
【０２７７】
当業者であれば、Ｖ１及び／又はＶ２がｄｓＦｖを表す場合、多重特異性抗体は、Ｘ又はＹに結合していない対応する遊離ＶＨ又はＶＬドメインをコードする第３のポリペプチドを含むであろうことを理解するであろう。したがって、本発明の多重特異性タンパク質は、１つ以上、２つ以上、又は３つ以上のポリヌクレオチドによってコードされてもよく、これらは１つ以上のベクターに組み込まれてもよい。
【０２７８】
ベクターを構築する一般的な方法、形質移入法及び培養方法は、当業者に周知である。この点に関しては、「分子生物学における最新プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９９、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇにより作成された「Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｍａｎｕａｌ」を参照されたい。
【０２７９】
また、本発明の多重特異性タンパク質をコードする１つ以上のＤＮＡ配列を含む１つ以上のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞が提供される。任意の好適な宿主細胞／ベクター系を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列の発現のために使用することができる。細菌、例えば大腸菌、及び他の微生物系を使用してもよく、又は真核生物、例えば哺乳動物宿主細胞発現系を使用してもよい。好適な哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、骨髄腫、ＮＳＯ骨髄腫細胞及びＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞又はハイブリドーマ細胞が挙げられる。
【０２８０】
本発明はまた、本開示の多重特異性タンパク質を産生するプロセスを提供し、このプロセスは、本発明の多重特異性タンパク質をコードするＤＮＡからタンパク質を発現させるのに適した条件下で、本発明のベクターを含む宿主細胞を培養する工程と、多重特異性タンパク質を単離する工程とを含む。
【０２８１】
重鎖及び軽鎖の両方を含む生成物を産生するために、細胞株に２つのベクターで形質移入することができ、第１のベクターは軽鎖ポリペプチドをコードし、第２のベクターは重鎖ポリペプチドをコードする。或いは、単一のベクターを使用してもよく、このベクターは、軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む。一例では、細胞株に、本発明の抗体分子のポリペプチド鎖を各々コードする２つのベクターを形質移入してもよい。Ｖ１及び／又はＶ２がｄｓＦｖである場合、細胞株に、本発明の多重特異性タンパク質のポリペプチド鎖を各々コードする３つのベクターを形質移入してもよい。
【０２８２】
一実施形態において、
ａ）式（Ｉ）：ＶＨ１−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１のポリペプチド鎖と、
ｂ）式（ＩＩ）：ＶＬ１−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２のポリペプチド鎖と
から選択される異なるポリペプチドを各々コードする２つのベクターを細胞株に形質移入し、
式中、
ＶＨ１は重鎖可変ドメインを表し、
ＣＨ１は重鎖定常領域のドメイン、例えばそのドメイン１を表し、
Ｘは結合又はリンカーを表し、
Ｙは結合又はリンカーを表し、
Ｖ１はｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを表し、
ＶＬ１は軽鎖可変ドメインを表し、
ＣＬは軽鎖定常領域由来のドメイン、例えばＣκを表し、
Ｖ２はｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦＶ又はｄｓｓｃＦｖを表す。
【０２８３】
一実施形態では、Ｖ１がｄｓＦｖであり、Ｖ１のＶＨドメインがＸに結合している場合、Ｖ１のＶＬドメインをコードする第３のベクターを細胞株に形質移入してもよい。
【０２８４】
一実施形態では、Ｖ１がｄｓＦｖであり、Ｖ１のＶＬドメインがＸに結合している場合、Ｖ１のＶＨドメインをコードする第３のベクターを細胞株に形質移入してもよい。
【０２８５】
一実施形態では、Ｖ２がｄｓＦｖであり、Ｖ２のＶＨドメインがＹに結合している場合、Ｖ２のＶＬドメインをコードする第３のベクターを細胞株に形質移入してもよい。
【０２８６】
一実施形態では、Ｖ２がｄｓＦｖであり、Ｖ２のＶＬドメインがＹに結合している場合、細胞株に、Ｖ２のＶＨドメインをコードする第３のベクターを形質移入してもよい。
【０２８７】
一実施形態では、Ｖ１及びＶ２の両方がｄｓＦｖであり、Ｖ２のＶＬドメインがＹに結合し、Ｖ１のＶＬドメインがＸに結合している場合、Ｖ１及びＶ２の両方に共通のＶＨドメインをコードする第３のベクターを細胞株に形質移入してもよい。
【０２８８】
一実施形態では、Ｖ１及びＶ２の両方がｄｓＦｖであり、Ｖ２のＶＨドメインがＹに結合し、Ｖ１のＶＨドメインがＸに結合している場合、Ｖ１及びＶ２の両方に共通のＶＬドメインをコードする第３のベクターを細胞株に形質移入してもよい。
【０２８９】
多重特異性抗体生成物の発現を最適化するために、宿主細胞に形質移入する各ベクターの比を変えることができることは理解されよう。２つのベクトルを使用する一実施形態では、ベクトルの比は１：１であってもよい。３つのベクトルを使用する一実施形態では、ベクトルの比は１：１：１であってもよい。当業者は、形質移入後のタンパク質発現レベルの日常的な試験によって最適な比を見出すことができることが理解されよう。代替的に又は加えて、各ベクター由来の多重特異性構築物の各ポリペプチド鎖の発現レベルは、同じ又は異なるプロモーターを使用することによって制御され得る。
【０２９０】
２つ以上、又は存在する場合３つのポリペプチド成分が単一のベクター中のポリヌクレオチドによってコードされてもよいことが理解されるであろう。２つ以上、特に３つ以上のポリペプチド成分が単一のベクター中のポリヌクレオチドによってコードされる場合、各ポリペプチド成分の相対的発現は、本開示のポリペプチド成分をコードする各ポリヌクレオチドに対して異なるプロモーターを利用することによって変えることができる。
【０２９１】
一実施形態では、ベクターは、単一のプロモーターの制御下で、本発明の多重特異性抗体分子の２つ、又は存在する場合３つのポリペプチド鎖をコードする単一のポリヌクレオチド配列を含む。
【０２９２】
一実施形態では、ベクターは、本発明の多重特異性抗体分子の２つ、又は存在する場合３つのポリペプチド鎖をコードする単一のポリヌクレオチド配列を含み、各ポリペプチド鎖をコードする各ポリヌクレオチド配列は、異なるプロモーターの制御下にある。
【０２９３】
本開示による多重特異性タンパク質は、宿主細胞から良好なレベルで発現する。したがって、抗体及び／又は断片の特性は最適化され、商業的処理に役立つようである。
【０２９４】
有利には、本開示の多重特異性抗体分子は、精製後にみられる凝集の量を最小にし、医薬濃度で構築物の製剤中の単量体の量を最大にし、例えば、単量体は総タンパク質の５０％、６０％、７０％もしくは７５％又はそれ以上、例えば８０もしくは９０％又はそれ以上、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８もしくは９９％又はそれ以上であり得る。一例では、本開示の多重特異性抗体分子の精製サンプルは、４℃で２８日間保存した後、９８％又は９９％を超える単量体のままである。一例では、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に５ｍｇ／ｍｌの本開示の多重特異性抗体分子の精製サンプルは、４℃で２８日間保存した後、９８％を超える単量体のままである。
【０２９５】
本開示の抗体分子及びそれを含む組成物は、治療、例えば病理学的状態の治療及び／又は予防において有用である。
【０２９６】
本開示は、１種以上の製薬上許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて本開示の抗体分子を含む、医薬組成物又は診断用組成物も提供する。したがって、特に本明細書に開示された適応症に対して、治療で使用するため及び医薬製造のための本開示の抗体の使用が提供される。
【０２９７】
この組成物は、薬学的に許容される担体を普通は含むであろう無菌医薬組成物の一部として通常供給されるであろう。本開示の医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバントをさらに含み得る。
【０２９８】
本開示はまた、本開示の抗体分子を、１種以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と一緒に添加及び混合する工程を含む、医薬組成物又は診断用組成物の調製方法を提供する。
【０２９９】
抗体分子は、医薬組成物又は診断用組成物中の唯一の活性成分であってもよく、又は他の抗体成分、例えば抗ＩＬ−１β、抗Ｔ細胞、抗ＩＦＮγ又は抗ＬＰＳ抗体を含む他の活性成分、又はキサンチンなどの非抗体成分を含む活性成分を伴ってもよい。他の好適な活性成分には、耐性を誘導することができる抗体、例えば、抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ４抗体が含まれる。
【０３００】
さらなる実施形態では、本開示による抗体、断片又は組成物は、さらなる薬学的に活性な薬剤と組み合わせて使用される。
【０３０１】
医薬組成物は、治療有効量の本発明の抗体分子を好適に含む。本明細書で使用する「治療有効量」という用語は、標的とされる疾患又は状態を治療、改善又は予防するため、又は検出可能な治療効果もしくは予防効果を発揮するために必要な治療剤の量を指す。任意の抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイ又は動物モデル（通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類）のいずれかで最初に推定することができる。動物モデルは、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも使用できる。このような情報は、その後、ヒトにおける有用な投与量及び投与経路を決定するために使用できる。
【０３０２】
ヒト対象の正確な治療有効量は、病態の重篤度、対象の全体的な健康状態、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与の回数及び頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性及び治療に対する耐性／応答に依存するであろう。この量は、日常的な実験によって決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであろう。或いは、用量は１日当たり１〜５００ｍｇ、例えば１０〜１００、２００、３００又は４００ｍｇであり得る。医薬組成物は、本発明の活性薬剤の所定量を含有する単位用量形態で都合よく提供することができる。
【０３０３】
組成物は、患者に単独で投与してもよく、又は他の薬剤、薬物又はホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、連続して又は別々に）投与してもよい。
【０３０４】
本開示の抗体分子を投与する用量は、治療する状態の性質、存在する炎症の程度、及び抗体分子が予防的に使用されているか、又は既存の状態を治療するために使用されているかに依存する。
【０３０５】
投与の頻度は、抗体分子の半減期及びその効果の持続時間に依存するであろう。抗体分子が短い半減期（例えば、２〜１０時間）を有する場合、１日に１回以上の投与が必要な場合がある。或いは、抗体分子が長い半減期（例えば、２〜１５日）を有する場合、１日１回、１週間に１回、又はさらに１もしくは２ヶ月に１回の投与のみ必要であり得る。
【０３０６】
薬学的に許容される担体は、それ自体は組成物を摂取する個体にとって有害な抗体の産生を誘発すべきではなく、有毒であってはならない。好適な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子などの、大型でゆっくりと代謝される巨大分子であってもよい。
【０３０７】
薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩などの有機酸の塩を使用することができる。
【０３０８】
治療用組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体をさらに含み得る。さらに、補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝物質がこのような組成物中に存在してもよい。このような担体は、患者による摂取のために、医薬組成物を錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁液として処方することを可能にする。
【０３０９】
投与に適した形態には、例えば注射又は注入による、例えばボーラス注射又は連続注入による非経口投与に適した形態が含まれる。生成物が注射又は注入用である場合、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又は乳濁液の形態を取ってもよく、懸濁剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤助剤を含み得る。或いは、抗体分子は、使用前に適切な滅菌液体で再構成するために、乾燥形態であってもよい。
【０３１０】
処方されると、本発明の組成物は、被験体に直接投与することができる。治療される対象は動物であってもよい。しかしながら、１つ以上の実施形態において、組成物はヒト対象に投与するために適合される。
【０３１１】
一実施形態では、本開示による製剤において、最終製剤のｐＨは、抗体又は断片の等電点の値と類似していないため、製剤のｐＨが７である場合、８−９以上のｐＩが適切である可能性がある。理論に縛られることは望まないが、これにより最終的に安定性が改善された最終製剤が提供されると考えられ、例えば、抗体又は断片が溶液中に残る。
【０３１２】
本開示の医薬組成物は、限定するものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経皮的（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮的（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（例えば国際公開第９８／２０７３４号明細書を参照）、皮下的、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、経膣又は直腸経路を含む任意の数の経路によって投与することができる。皮下噴射器もまた本発明の医薬組成物を投与するために使用され得る。典型的には、治療用組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかの注射剤として調製され得る。注射前の液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液に適した固体形態もまた調製することができる。好ましくは、本発明の抗体分子は、皮下、吸入又は局所投与される。
【０３１３】
組成物の直接送達は、一般的に、注射、皮下、腹腔内、静脈内又は筋肉内注射によって達成されるか、又は組織の間質腔に送達されるであろう。組成物はまた、対象の特定の組織に投与することができる。投薬治療は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールであり得る。
【０３１４】
組成物中の活性成分は抗体分子であることが理解されよう。そのため、胃腸管の分解を受けやすいであろう。したがって、組成物を消化管を使用する経路によって投与する場合、組成物には、抗体を分解から保護するが、消化管から吸収された後に抗体を放出する薬剤を含有する必要がある。
【０３１５】
薬学的に許容される担体の徹底的な考察は、レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．１９９１）で利用できる。
【０３１６】
一実施形態では、製剤は、吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。
【０３１７】
好適な吸入可能な調製物には、吸入可能な粉末、噴射剤ガスを含有する計量エアロゾル又は噴射剤ガスを含まない吸入可能な溶液（噴霧可能な溶液又は懸濁液など）が含まれる。活性物質を含有する本開示による吸入可能な粉末は、上記の活性物質単独又は上記の活性物質と生理学的に許容される賦形剤との混合物から構成することができる。
【０３１８】
これらの吸入可能な粉末は、単糖類（例えばグルコース又はアラビノース）、二糖類（例えばラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖類及び多糖類（例えばデキストラン）、ポリアルコール（例えばソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩類（例えば塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）又はこれらの互いの混合物を含み得る。単糖類又は二糖類が好適に使用され、乳糖又はグルコースが特に、排他的ではないが水和物の形態で使用される。
【０３１９】
肺に沈着させるための粒子には、１０ミクロン未満、例えば１〜９ミクロン、例えば０．１〜５ミクロン、特に１〜５ミクロンの粒径が必要である。活性剤（抗体又は抗体断片など）の粒径が主に重要である。
【０３２０】
吸入可能なエアロゾルを調製するために使用できる推進ガスは、当技術分野で公知である。好適な推進ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン又はイソブタンなどの炭化水素、及びメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン又はシクロブタンの塩素化及び／又はフッ素化誘導体などのハロ炭化水素から選択される。上記の推進ガスは、単独で又はそれらの混合物として使用することができる。
【０３２１】
特に好適な推進ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ及びＴＧ２２７から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）及びそれらの混合物が特に適している。
【０３２２】
また、噴霧ガス含有吸入可能エアロゾルは、共溶媒、安定剤、表面活性剤（界面活性剤）、抗酸化剤、潤滑剤及びｐＨ調整手段など、他の成分を含有してもよい。これらの成分は全て当業界で公知である。
【０３２３】
本発明による噴射剤ガス含有吸入可能エアロゾルは、５重量％までの活性物質を含有することができる。本発明によるエアロゾルは、例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％、又は０．５〜１重量％の活性を含有する。
【０３２４】
或いは、肺への局所投与は、例えば噴霧器のような装置、例えば圧縮機に接続されたネブライザーである（例えば、バージニア州リッチモンドのＰａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｉｎｃ．によって製造されたＰａｒｉ  Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）圧縮機に接続されたＰａｒｉ  ＬＣ−Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（登録商標）ネブライザー）。
【０３２５】
一実施形態では、製剤は、噴霧によって送達される単位用量を含有する個別のアンプルとして提供される。
【０３２６】
一実施形態では、抗体は、再構成のために凍結乾燥形態で、又は懸濁液製剤として供給される。
【０３２７】
本開示の抗体は、例えば溶液又は懸濁液の形態で、溶媒中に分散させて送達することができる。適切な生理学的溶液、例えば生理食塩水、薬理学的に許容される溶媒又は緩衝溶液に懸濁させることができる。当技術分野で公知の緩衝溶液は、水１ｍｌ当たりエデト酸二ナトリウム０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇ、塩酸８．０ｍｇ〜９．０ｍｇ、ポリソルベート０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇ、無水クエン酸０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇ、及びクエン酸ナトリウム０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇを含んで約４．０〜５．０のｐＨを達成することができる。上記のように、懸濁液は、例えば、凍結乾燥された抗体から作製することができる。
【０３２８】
治療用懸濁液又は溶液製剤はまた、１種以上の賦形剤を含むことができる。賦形剤は、当技術分野で周知であり、バッファー（例えば、クエン酸バッファー、リン酸バッファー、酢酸バッファー及び重炭酸バッファー）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール及びグリセロールを含む。溶液又は懸濁液は、リポソーム又は生分解性ミクロスフェアに封入することができる。製剤は、一般的に、滅菌製造プロセスを用いて実質的に滅菌された形態で提供されるであろう。
【０３２９】
これは、製剤に使用される緩衝溶媒溶液の濾過、滅菌緩衝溶媒溶液中の抗体の無菌懸濁液、及び当業者によく知られた方法による滅菌容器への製剤の分配による産生及び滅菌を含み得る。
【０３３０】
本開示による噴霧可能な製剤は、例えば、ホイルエンベロープに包装された単回投与単位（例えば、密封されたプラスチック容器又はバイアル）として提供され得る。各バイアルは、溶媒／溶液バッファーの体積、例えば２ｍｌ中に単位用量を含有する。
【０３３１】
本開示の抗体は、噴霧による送達に適していると考えられる。
【０３３２】
また、本発明の抗体は、遺伝子治療を用いて投与することもできると考えられる。これを達成するために、適切なＤＮＡ成分の制御下で抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列を患者に導入して、抗体鎖をＤＮＡ配列から発現させ、ｉｎ  ｓｉｔｕで組み立てる。
【０３３３】
本発明はまた、治療において使用するための上記で定義した多重特異性抗体分子を提供する。
【０３３４】
本発明はまた、炎症性疾患の制御のための上記で定義した多重特異性抗体分子を提供する。好ましくは、多重特異性抗体分子は、炎症過程を減少させるために、又は炎症過程を予防するために使用され得る。
【０３３５】
本発明はまた、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆによって媒介されるか、又はＴＮＦ−α及びＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆのレベル増大に関連する病理学的障害の治療又は予防に使用するための本発明の多重特異性抗体分子を提供する。好ましくは、病理学的状態は、感染症（ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫）、感染と関連している内毒素性ショック、関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎、全身型若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、喘息、慢性閉塞性気道疾患（ＣＯＡＤ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性肺傷害、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、クローン病、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、潰瘍性大腸炎、キャッスルマン病、強直性脊椎炎及び他の脊椎関節症、皮膚筋炎、心筋炎、ブドウ膜炎、眼球突出症、自己免疫性甲状腺炎、ペーロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣病、腹膜炎、乾癬、アトピー性皮膚炎、脈管炎、手術による癒着、卒中、自己免疫性糖尿病、Ｉ型糖尿病、ライム関節炎、髄膜脳炎、中枢及び末梢神経系の免疫媒介性炎症性障害、例えば、多発性硬化症及びギラン・バレー症候群、他の自己免疫障害、膵炎、外傷（手術）、対宿主性移植片病、移植片拒絶、線維形成性障害、例えば、肺線維症、肝線維症、腎線維症、強皮症又は全身性硬化症、がん（充実性腫瘍（黒色腫、胚芽腫、肉腫、扁平上皮がん、移行上皮がん、卵巣がんなど）と血液悪性腫瘍、特に、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病の両方、胃がん及び結腸がん）、心臓疾患、例えば、虚血性疾患、例えば、心筋梗塞並びにアテローム性動脈硬化、血管内凝固、骨吸収、骨粗鬆症、歯周炎及び低塩酸症（ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｈｙｄｉａ）を含む群から選択される。
【０３３６】
一実施形態において、本発明の抗体は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、全身型若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、喘息、慢性閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、アトピー性皮膚炎、強皮症、全身性硬化症、肺線維症、炎症性腸疾患、強直性脊椎炎及び他の脊椎関節症及びがんを含む群から選択される病理学的障害の治療又は予防において使用される。
【０３３７】
一実施形態において、本発明の抗体は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、全身型若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、喘息、慢性閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、アトピー性皮膚炎、強皮症、全身性硬化症、肺線維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎及び他の脊椎関節症及びがんを含む群から選択される病理学的障害の治療又は予防において使用される。
【０３３８】
一実施形態において、本発明の抗体は、関節炎、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、全身型若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、喘息、慢性閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、アトピー性皮膚炎、強皮症、全身性硬化症、肺線維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎及び他の脊椎関節症を含む群から選択される病理学的障害の治療又は予防において使用される。
【０３３９】
一実施形態において、本発明の抗体は、関節炎、乾癬性関節炎、全身型若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎及び他の脊椎関節症、乾癬、化膿性汗腺炎、ベーチェット病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、喘息、心筋炎、ブドウ膜炎、アトピー性皮膚炎、血管炎、中枢及び末梢神経系の免疫媒介性炎症性障害、例えば、多発性硬化症及びギラン・バレー症候群、他の自己免疫障害、骨粗鬆症、骨吸収、痛風、サルコイドーシス、シェーグレン症候群及び壊疽性膿皮症を含む群から選択される病理学的障害の治療又は予防において使用される。
【０３４０】
一実施形態では、病理学的障害は関節リウマチである。
【０３４１】
一実施形態では、病理学的障害はクローン病である。
【０３４２】
一実施形態では、病理学的障害は潰瘍性大腸炎である。
【０３４３】
一実施形態では、病理学的障害はブドウ膜炎である。
【０３４４】
一例では、本発明の抗体は、炎症性又は免疫関連疾患の治療に使用される。一例では、炎症性又は免疫関連疾患は、関節リウマチ、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む群から選択される。
【０３４５】
本発明はまた、疼痛、特に炎症に関連する疼痛の治療又は予防における使用のための本発明の抗体分子を提供する。
【０３４６】
本発明はさらに、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆによって媒介されるか、又はＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆのレベル増大に関連する病理学的障害の治療又は予防のための医薬製造における、本発明の抗体分子の使用を提供する。好ましくは、病理学的障害は、本明細書において上に記載した医学的適応症の１つである。本発明はさらに、疼痛、特に炎症に関連する疼痛の治療又は予防のための医薬製造における、本発明の抗体分子の使用を提供する。
【０３４７】
本発明の抗体分子は、ヒト又は動物の体内においてＴＮＦ−α及びＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆの効果を低下させることが望ましい任意の治療法に利用され得る。ＴＮＦ−α及びＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆは体内を循環してもよく、又は体内の特定の部位、例えば炎症部位に望ましくない高レベルで局在して存在してもよい。
【０３４８】
本発明による抗体分子は、好ましくは、炎症性疾患、自己免疫疾患又はがんの制御に使用される。
【０３４９】
本発明はまた、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆによって媒介される障害に罹患しているか、又はそのリスクがあるヒト又は動物の対象を治療する方法を提供し、方法は、本発明の抗体分子を有効量で対象に投与することを含む。
【０３５０】
本発明による抗体分子は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１７Ａ及び／又はＩＬ−１７Ｆが関与する病態の診断、例えばインビボ診断及び画像化に使用することもできる。
【０３５１】
したがって、治療における使用、及びそれを用いた治療方法のための、本開示による多重特異性抗体が提供される。
【０３５２】
一実施形態では、多重特異性抗体（特に、本発明による抗体又は断片）を精製するプロセスが提供される。
【０３５３】
一実施形態では、多重特異性抗体（特に本発明による抗体又は断片）を精製するプロセスであって、不純物がカラムに保持され、抗体が非結合画分に維持されるように、非結合モードで陰イオン交換クロマトグラフィーを実施する工程を含むプロセスが提供される。この工程は、例えば、約６〜８のｐＨで行うことができる。
【０３５４】
この方法は、例えば約４〜５のｐＨで実施される陽イオン交換クロマトグラフィーを用いる初期捕捉工程をさらに含んでもよい。
【０３５５】
この方法は、生成物及びプロセスに関連する不純物が生成物流れから適切に分解されることを確実にするために、追加のクロマトグラフィー工程（１又は複数）をさらに含んでもよい。
【０３５６】
精製プロセスは、濃縮及びダイアフィルトレーション工程などの１つ以上の限外濾過工程を含んでもよい。
【０３５７】
上記で使用されるような精製形態は、少なくとも９０％の純度、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ｗ／ｗ以上の純度を意味することを意図する。
【０３５８】
内毒素を実質的に含まないとは、一般的に、内毒素含量が抗体生成物１ｍｇ当たり１ＥＵ以下、例えば、生成物１ｍｇ当たり０．５ＥＵ又は０．１ＥＵであることを指す。
【０３５９】
宿主細胞タンパク質又はＤＮＡを実質的に含まないとは、一般に、抗体生成物１ｍｇ当たり４００μｇ以下、又は１００μｇ／ｍｇ以下、特に２０μｇ／ｍｇ以下の宿主細胞タンパク質及び／又はＤＮＡ含量を適宜意味する。
【０３６０】
本発明の抗体分子は、病態の診断、例えばインビボ診断及び画像化に使用することもできる。
【０３６１】
一実施形態では、本発明による多重特異性タンパク質構築物を選択する方法であって、
ａ）Ｖ１又はＶ２のいずれかが所与の可変領域対についてｄｓｓｃＦｖである場合に、単量体多重特異性タンパク質の収率を決定する工程と、
ｂ）（ａ）において試験されたＶ１又はＶ２のいずれかが同じ可変領域対についてのｄｓＦｖである場合に、単量体多重特異性タンパク質の収率を決定する工程と、
ｃ）（ａ）及び（ｂ）で得られた単量体の収率を比較し、最も高い単量体収率を有する多重特異的タンパク質を選択する工程と
を含む方法が提供される。
【０３６２】
典型的には、本方法の工程（ａ）及び（ｂ）における「可変領域対」はＶＨ及びＶＬ対である。一般的には、ＶＨ及びＶＬは共に抗原結合ドメインＶ１又はＶ２を形成する。したがって、本方法は、本発明の構築物においてＶＨ及びＶＬ対をｄｓｓｃＦｖ及びｄｓＦｖの両方として試験することを可能にし、最も単量体の構築物を工程（ｃ）で選択する。
【０３６３】
典型的には、本方法の工程（ａ）及び（ｂ）において、収率は、アフィニティークロマトグラフィーの後などの精製後に決定される。単量体収率は、サイズ排除クロマトグラフィーなどの任意の好適な方法を用いて決定することができる。
【０３６４】
本明細書の文脈における「含む」は、包含することを意味することを意図している。技術的に適切な場合、本発明の実施形態は組み合わせることができる。実施形態は、特定の特徴／要素を含むものとして本明細書に記載される。本開示は、これらの特徴／要素で構成されるか又は本質的にこれらの特徴／要素で構成される別個の実施形態にも及ぶ。
【０３６５】
特許及び出願などの技術的参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３６６】
本明細書に具体的且つ明示的に列挙された実施形態は、単独で、又は１つ以上のさらなる実施形態と組み合わせて、免責事項の基礎を形成することができる。
【０３６７】
本開示は、添付図面を参照する以下の実施例においてのみ例示としてさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【０３６８】
【図１】本発明による抗体分子のアミノ酸配列及び核酸配列を示す。
【図２】本発明による抗体分子のアミノ酸配列及び核酸配列を示す。
【図３】本発明による抗体分子のアミノ酸配列及び核酸配列を示す。
【図４】本発明による抗体分子のアミノ酸配列及び核酸配列を示す。
【図５】本発明による抗体分子のアミノ酸配列及び核酸配列を示す。
【図６】本発明による抗体分子のアミノ酸配列及び核酸配列を示す。
【図７】本発明による抗体分子のアミノ酸配列及び核酸配列を示す。
【図８】Ｆａｂ−２ｘｄｓｓｃＦｖ及びＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ−ｄｓＦｖフォーマットを示す図である。
【図９】ＣＡ２１０９マウスＦａｂ（ｆｗｋ１８  ＦＡＢ）ＩｇＧ１（ｆｗｋ１８  ＩｇＧ）の滴定曲線を示す図である。
【図１０ａ】アクチノマイシンＤ／及びヒトＴＮＦ−α及びＴｒＹｂｅ１８Ｂ又は対照化合物エンブレルで処理したＬ９２９細胞の代表的な細胞生存曲線を示す図である。
【図１０ｂ】アクチノマイシンＤ／及びカニクイザルＴＮＦ−α及びＴｒＹｂｅ１８Ｂ又は対照化合物エンブレルで処理したＬ９２９細胞の代表的な細胞生存曲線を示す図である。
【図１１】ＴｒＹｂｅ１８Ｂが、マウスにおけるヒトＴＮＦ−α誘導性好中球を阻害することを示す図である。
【図１２】ＴｒＹｂｅ１８Ｂが、マウスにおける組み合わせヒトＴＮＦ−α及びヒトＩＬ−１７Ａ誘導性好中球を阻害することを示す図である。
【図１３】ＴｒＹｂｅ１８Ｂの異なるバッチのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す図である。
【図１４】ＴｒＹｂｅ１８Ｂがインビトロでの好中球遊走を阻害することを示す図である。
【図１５】カニクイザルに対するＴｒＹｂｅ１８ＢのＩＶボーラス投与後のＴｒＹｂｅ１８Ｂの血清濃度を示す図である。
【実施例】
【０３６９】
例１：中和抗ヒトＴＮＦ−α可変領域の単離
Ｂ細胞培養及び抗体スクリーニングのための材料を生成するために、以下の免疫化を行った。
【０３７０】
５匹のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、小分子ベンズイミダゾール化合物、化合物１（国際公開第２０１３／１８６２２９号明細書及びＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０７４５２７に記載されている）とプレ複合体化したヒトＴＮＦ−αの３ショットで免疫化した。血清を生成し、ＥＬＩＳＡでヒトＴＮＦ−αへの結合について試験した。力価は１００，０００希釈を超えて測定可能であり、したがってＢ細胞培養に許容可能であると考えられた。
【０３７１】
Ｚｕｂｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）及びＬｉｇｈｔｗｏｏｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）によって記載された方法と同様の方法を用いて、Ｂ細胞培養物を調製した。簡潔には、ウェル当たり約５０００細胞の密度でＢ細胞を含む脾細胞を、１０％ＦＣＳ（ＰＡＡ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ）、２％ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、０．１％β−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、２−５％活性化脾細胞培養上清及びマウスγ照射したネズミ胸腺腫細胞（５×１０４／ウェル）を補充した２００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を有するバーコード化９６ウェル組織培養プレートで培養し、５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で７日間免疫した。このプロジェクト中に７，０００万を超えるＢ細胞をスクリーニングした。
【０３７２】
Ｂ細胞培養上清中のヒトＴＮＦ特異性抗体の存在を、標的抗原の供給源としてビオチン化ヒトＴＮＦでコーティングされた１０ミクロンのスーパーアビジンポリマービーズ（Ｂａｎｇｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用する均一蛍光ベースの結合アッセイを用いて測定した。１０μｌの上清を、バーコード化９６ウェル組織培養プレートから、Ｍａｔｒｉｘ  Ｐｌａｔｅｍａｔｅ液体ハンドラーを使用して５０００個のコーティングされたビーズを含有するバーコード化３８４ウェルブラックウォールアッセイプレートに移した。結合は、ヤギ抗ラット又はマウスＩｇＧ  Ｆｃγ特異的Ｃｙ−５コンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いて明らかにした。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００細胞検出システムでプレートを読み取った。
【０３７３】
或いは、陽性ウェルを同定するためにＥＬＩＳＡアッセイを使用した。３８４ウェルＥＬＩＳＡプレートを２ｕｇ／ｍｌのＴＮＦでコーティングした後、１０ｕｌのＢ細胞培養上清をブロックプレートに添加した。１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ヤギ抗ラットＦｃ特異的ＨＲＰコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）で結合を明らかにした。
【０３７４】
一次スクリーニングの後、Ａｖｉｓｏ  Ｏｎｙｘヒットピッキングロボット及び−８０℃で凍結した細胞培養プレート中のＢ細胞を用いて、陽性上清を９６ウェルバーコード化マスタープレート上に集めた。次に、高親和性の抗体を含むウェルを同定するために、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイでマスタープレートをスクリーニングした。
【０３７５】
ＴＮＦ−αの生物活性を中和することができる抗体を同定するために、本発明者らは、マスタープレート中のＢ細胞培養上清を用いて細胞ベースのＴＮＦ−αレポーターアッセイを行った。アッセイには、ヒトＴＮＦ−αを含むＮＦκＢ経路を介して作用する多くの刺激に応答してアルカリホスファターゼを分泌するように操作されたＨＥＫ−２９３−ＣＤ４０−ＢＬＵＥ細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を利用した。抗体含有上清をこのアッセイで１：２．５の単一希釈で直接使用した。高親和性ブロッキング抗体（Ｂｉａｃｏｒｅで１００ｐＭ未満、レポーターアッセイで＞９０％阻害を示す）を含むウェルを、さらなる進行のために選択した。
【０３７６】
対象のウェルの選択から抗体可変領域遺伝子を回収できるように、Ｂ細胞の異種集団を含む所与のウェル中の抗原特異的Ｂ細胞の同定を可能にするためにデコンボリューション工程を実施しなければならなかった。これは、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｆｏｃｉ法を用いて達成された。簡潔には、陽性ウェルからの免疫グロブリン分泌Ｂ細胞を、ビオチン化ヒトＴＮＦ及びヤギ抗ラットＦｃγ断片特異的ＦＩＴＣコンジュゲート（Ｊａｃｋｓｏｎ）の１：１２００最終希釈で被覆したストレプトアビジンビーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）と混合した。３７℃で１時間静的インキュベーションした後、抗原特異的Ｂ細胞は、そのＢ細胞を取り囲む蛍光ハロの存在により同定することができた。オリンパス顕微鏡を用いて同定されたこれらの個々のＢ細胞を、次にエッペンドルフマイクロマニピュレーターで採取し、ＰＣＲチューブに入れた。
【０３７７】
重鎖及び軽鎖可変領域特異的プライマーを用いた逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによって、２１０２、２１０１、２１０９及び２１１１として知られる４つの異なる抗体の抗体可変領域遺伝子を単細胞から回収した。ラットの可変領域をマウスγ１  ＩｇＧ又はＦａｂ（ＶＨ）又はマウスκ（ＶＬ）哺乳類発現ベクターにクローニングすることを可能にする、３’末端及び５’末端に制限部位を組み込んだネステッド２°ＰＣＲを用いて、Ａｖｉｓｏ  Ｏｎｙｘ液体ハンドリングロボットで２回のＰＣＲを行った。重鎖及び軽鎖構築物を、フェクチン２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び４８ウェルプレートで発現された組換え抗体を１ｍｌの容量で用いて、ＨＥＫ−２９３細胞に共形質移入した。５〜７日の発現後、上清を採取し、抗体をさらなるスクリーニングに供した。
【０３７８】
組換えラット／マウスキメラＩｇＧ及びＦａｂ分子を、ＨＥＫ−２９３−ＣＤ４０−ＢＬＵＥレポーターアッセイにおいていくつかの濃度でスクリーニングして、ＥＣ５０値の計算を可能にし、最大パーセンテージ阻害を決定した。Ｆａｂ断片を、抗体が一価の場合に活性であることを確実にするために試験した。ＩｇＧをＢｉａｃｏｒｅ実験で分析して、ヒトＴＮＦに対する結合親和性を決定した。Ｂｉａｃｏｒｅ実験のアッセイフォーマットは、固定された抗マウスＩｇＧ−ＦｃによるマウスＩｇＧの捕捉、次に、捕捉された表面上のヒトＴＮＦの滴定であった。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＢＩＡ（Ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片（ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、アミンカップリング化学反応によってＣＭ５センサーチップ上に約５０００応答単位（ＲＵ）のレベルまで固定化した。泳動バッファーとして、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を流速１０μＬ／分で使用した。固定化抗マウスＩｇＧ−Ｆｃによる捕捉のために、０．５μｇ／ｍＬでマウスＩｇＧの１０μＬ注入液を使用した。ヒトＴＮＦを捕捉したマウスＩｇＧの上に３０μＬ／分の流速で２０ｎＭで２回注入した。表面を、４０ｍＭ  ＨＣｌの２×１０μＬ注入により再生し、１０μＬ／分の流速で５ｍＭ  ＮａＯＨを５μＬ注入して散在させた。標準的な手順に従って、Ｔ２００ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１．０）を用いてバックグラウンド差引きした結合曲線を分析した。
【０３７９】
【表４】
2019502380.tif 000007
【０３８０】
中和は、ＨＥＫ−２９３−ＣＤ４０−ＢＬＵＥレポーターアッセイ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を用いて測定した。ＥＣ５０及び％中和が示されている。結合動力学を決定するためにＢｉａｃｏｒｅ分析を行った。オンレート（ｋａ）、オフレート（ｋｄ）及びアフィニティー定数（ＫＤ）が示されている。
【０３８１】
図９は、ＣＡ２１０９ラット／マウスＦａｂ（ｆｗｋ１８ＦＡＢ）ＩｇＧ１（ｆｗｋ１８  ＩｇＧ）の滴定曲線を示す。上記のように、ＨＥＫ−２９３−ＣＤ４０−ＢＬＵＥレポーターアッセイ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を用いてデータを決定した。
【０３８２】
上記のようにして単離した４つの抗体（２１０１、２１０９、２１１１及び２１０２）の全てを、以下の表４ａに示すように、ヒトＴＮＦ（ｈＴＮＦ）及びカニクイザルＴＮＦ（ｃＴＮＦ）に対するカニクイザル及びヒトＴＮＦ交差反応についてラット／ヒトキメラＦａｂとしてスクリーニングした。
【０３８３】
Ｂｉａｃｏｒｅ実験のアッセイフォーマットは、固定化した抗ヒトＦ（ａｂ’）によるラット／ヒトキメラＦａｂの捕捉、次に、捕捉した表面上のヒト又はカニクイザルＴＮＦの滴定であった。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＢＩＡ（Ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片（ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２断片特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、アミンカップリング化学反応によってＣＭ５センサーチップ上に約５０００応答単位（ＲＵ）のレベルまで固定化した。泳動バッファーとして、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を流速１０μＬ／分で使用した。固定化したヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２による捕捉のために０．５μｇ／ｍＬのラット／ヒトキメラの１０μＬ注入液を用いた。ヒト又はカニクイザルＴＮＦを、３０μＬ／分の流速で、捕捉したラット／ヒトキメラＦａｂに（それぞれ５ｎＭ又は３．１２５ｎＭで）注入した。表面を、５０ｍＭ  ＨＣｌの２×１０μＬ注入により再生し、１０μＬ／分の流速で５ｍＭ  ＮａＯＨを５μＬ注入して散在させた。標準的な手順に従って、Ｔ２００ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１．０）を用いてバックグラウンド差引きした結合曲線を分析した。
【０３８４】
【表５】
2019502380.tif 000008
【０３８５】
【表６】
2019502380.tif 000009
【０３８６】
抗体２１０２は、カニクイザルＴＮＦに対してはるかに低い親和性を有することが見出された。この抗体はまた、ヒト化の間に親和性を失ったため、それ以上進行しなかった。
【０３８７】
この研究に基づいて、ＣＡ２１０９を、そのカニクイザル／ヒト交差反応性、高親和性（表４）及び強力な中和活性（図９及び表４）のためにリード候補として選択した。この抗体を、これらの特性に基づいてヒト化のために選択した。
【０３８８】
類似の親和性及び中和特性を有する２つの他の抗体を、ＣＡ２１０９と並行してヒト化のために選択し、これらは２１０１及び２１１１であった。しかしながら、２１０１はヒト化に際してＴＮＦに対する親和性を保持できなかったため、この抗体はこれ以上進行しなかった。抗体２１０９及び抗体２１１１の両方を首尾よくヒト化し、次にｓｃＦｖフォーマットに変換し、中和活性を確認するためにＬ９２９ＴＮＦ阻害アッセイ（以下の例６に記載のアッセイ）でスクリーニングした（表４ｂ）。
【０３８９】
【表７】
2019502380.tif 000010
【０３９０】
表４ｂにみられるように、抗体２１１１はｓｃＦｖとしてこのアッセイで活性を保持しなかったため、多重特異性ＴｒＹｂｅ抗体分子での使用には適していなかった。抗体２１０９のみが、ヒト化ｓｃＦｖとして、カニクイザル−ヒト交差反応性、高親和性、中和能及び熱安定性を保持した。抗体ＣＡ２１０９のヒト化について以下にさらに詳細に説明する。
【０３９１】
例２：抗ＴＮＦ−α抗体ＣＡ２１０９のヒト化
抗体ＣＡ２１０９を、ヒト生殖系列フレームワーク上に相補性決定領域（ＣＤＲ）をグラフトすることによってヒト化した。ラット抗体（ドナー）配列とヒト生殖系列（アクセプター）フレームワークとのアラインメントを、設計したヒト化配列と共に図６及び７に示す。
【０３９２】
選ばれた軽鎖生殖系列アクセプター配列は、ヒトＶＫ１  ２−１（Ｕ）Ａ２０  Ｖ領域＋ＪＫ２  Ｊ領域（Ｖ  ＢＡＳＥ、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）であった。選ばれた重鎖生殖系列アクセプター配列は、ヒトＶＨ３  １−３  ３−２１  Ｖ領域＋ＪＨ４  Ｊ領域（Ｖ  ＢＡＳＥ、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）であった。ドナーからアクセプター配列にグラフトしたＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔを組み合わせた定義が使用されるＣＤＲ−Ｈ１を除いて、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ．ｅｔ  ａｌ．、１９８７）によって定義される通りである。
【０３９３】
初期Ｖ領域配列をコードする遺伝子を、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ  ＧｍｂＨによる自動合成アプローチによって設計及び構築し、オリゴヌクレオチド指向性突然変異誘発によってグラフトバージョンｇＬ１、ｇＬ１８、ｇＨ１及びｇＨ２を生成するように改変した。ｇＬ１８遺伝子配列を、ヒトＣ−κ定常領域（Ｋｍ３アロタイプ）をコードするＤＮＡを含むＵＣＢ  Ｃｅｌｌｔｅｃｈヒト軽鎖発現ベクターｐＭｈＣＫデルタにサブクローニングした。ｇＨ２配列を、ヒト重鎖γ−１  ＣＨ１定常領域をコードするＤＮＡを含むＵＣＢ  Ｃｅｌｌｔｅｃｈ発現ベクターｐＭｈｇ１Ｆａｂにサブクローニングした。
【０３９４】
完全活性を維持し、高い熱安定性を維持するために、ヒト化重鎖の４８（イソロイシン）、４９（グリシン）、７１（バリン）、７３（リジン）、７８（アラニン）及び９３（トレオニン）（Ｋａｂａｔ付番）を保持した。同様に、ヒト化軽鎖の位置６５（スレオニン）、７１（チロシン）及び８７（フェニルアラニン）（Ｋａｂａｔ付番）のドナー残基を保持した。さらに、３１、５０及び５２のアスパラギン残基をそれぞれセリン、アスパラギン酸及びセリンに変異させることにより、軽鎖中の３つの脱アミノ化部位を除去した。最後に選択した可変グラフト配列ｇＬ１８及びｇＨ２を図６及び図７並びに配列番号９１及び配列番号９２に示す。以下の例において、抗体２１０９への言及はいずれも、元のラットの親配列ではなくこれらのヒト化配列を指す。
【０３９５】
例３：哺乳動物細胞におけるＦａｂ４９６．ｇ３−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）２１０９及びＦａｂ４９６．ｇ３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）６４５プラスミドの構築及び発現
ヒトＩＬ−１７Ａ及びヒトＩＬ−１７Ｆに対する抗体ＣＡ０２８＿００４９６．ｇ３（本明細書では抗体４９６．ｇ３とも呼ばれる）の産生は、国際公開第２００８／０４７１３４号明細書及び国際公開第２０１２／０９５６６２号明細書に以前に記載されている。抗体は、ｐＭ親和性を有するヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ及びＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体に結合する。抗体４９６．ｇ３のＦａｂフォーマットのＣＤＲ、重及び軽可変領域並びに軽鎖及び重鎖をコードするアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を図１に示す。４９６．ｇ３（ＩＬ−１７Ａ／Ｆ結合）Ｆａｂ定常領域は、ヒトＣ−κ定常領域（Ｋ１ｍ３アロタイプ）及びヒトγ−１  ＣＨ１定常領域及びヒンジ（Ｇ１ｍ１７アロタイプ）を含んでいた。
【０３９６】
抗ヒトアルブミン抗体６４５の産生は、国際公開第２０１３／０６８５７１号明細書に以前に記載されている。ＣＤＲ、重及び軽可変領域、抗体６４５のｓｃＦｖ及びｄｓｓｃＦＶフォーマットをコードするアミノ酸配列及びＤＮＡ配列を図３に示す。
【０３９７】
抗ＴＮＦ抗体２１０９の産生は上記に記載されており、ＣＤＲ、重及び軽可変領域、抗体２１０９のｓｃＦｖ及びｄｓｓｃＦＶフォーマットをコードするアミノ酸及びＤＮＡ配列を図２に示す。
【０３９８】
抗体２１０９と抗体６４５のｄｓｓｃＦｖは各々Ｋａｂａｔ付番システムを用いて残基４４（重鎖）と１００（軽鎖）との間に安定化ジスルフィド結合を含んでいた。
【０３９９】
抗体６４５ＨＬのｄｓｓｃＦｖを１１アミノ酸軽鎖リンカー（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）により抗体４９６．ｇ３のＦａｂｃκ断片に連結し、抗体ＣＡ２１０９ＨＬのｄｓｓｃＦｖを１１アミノ酸重鎖リンカーＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ［本明細書ではＳ、２×Ｇ４Ｓとも呼ばれる］（配列番号２）又はＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ［本明細書ではＳ、Ｇ４Ｔ、Ｇ４Ｓとも呼ばれる］（配列番号１）により抗体４９６．ｇ３のＦａｂＣＨ１断片に連結した。生成された抗体フォーマットを図８に２ｘｄｓｓｃＦｖとして示し、本明細書ではＴｒＹｂｅとして知られている。
【０４００】
一過性発現を使用して、Ｆａｂ４９６．ｇ３−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）２１０９（配列番号１２７）（ＦａｂＨＣ及びｄｓｓｃＦｖ２１０９を連結するリンカーＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳを有する）及びＦａｂ４９６．ｇ３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）６４５（配列番号１３１）（ＦａｂＬＣ及びｄｓｓｃＦｖ６４５を連結するリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する）を発現させた。軽鎖全体及び重鎖Ｆａｂ断片をコードする遺伝子を、大腸菌での発現のために以前にコドンレベルで最適化されたプラスミドから制限クローニングした。６４５ｄｓＨＬ  ｓｃＦｖをコードするＡｇｅＩ−ＥｃｏＲＩ遺伝子断片をｐＴｒＹｂｅ  ＨＣ＃１から切り出し、ｐＥＤ４８９にクローニングして、ＵＣＢ社内発現ベクターｐＮＡＦＬ（Ｄｈａｍｉ、２０１２）中に「軽鎖単一遺伝子ベクター」４９６．ｇ３  ＬＣ−６４５  ｄｓＨＬ  ｓｃＦｖを生成した。２１０９ｄｓＨＬ  ｓｃＦｖ（ＢｓｐＥＩ−ＥｃｏＲＩ断片）をコードするＤＮＡをＤＮＡ２．０により合成し、ｐＴｒＹｂｅ  ＨＣ＃１（Ｄｈａｍｉ、２０１２）にクローニングして、ＵＣＢ社内発現ベクターｐＮＡＦＨ（Ｄｈａｍｉ、２０１２）中に「重鎖単一遺伝子ベクター」４９６．ｇ３  Ｆａｂ−２１０９  ｄｓＨＬ  ｓｃＦｖを生成した。ＨＥＫ２９３細胞中の両方の単一遺伝子ベクターの一過性共発現後に、重鎖リンカーＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳ及びＦａｂ４９６．ｇ３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）６４５を有するＦａｂ４９６．ｇ３−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）２１０９を含むＴｒＹｂｅタンパク質を、細胞培養上清から精製した。精製したＴｒＹｂｅは高レベルの単量体（８９％）と高い熱安定性（Ｔｍ７１℃）を示したため、安定した細胞株生成を進めた。
【０４０１】
安定な発現を使用して、Ｆａｂ４９６．ｇ３−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）２１０９（配列番号１２５）（ＦａｂＨＣをｄｓｓｃＦｖ２１０９に連結するリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する）及びＦａｂ４９６．ｇ３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）６４５（配列番号１３１）（ＦａｂＬＣをｄｓｓｃＦｖ６４５に連結するリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する）を発現させ、これは本明細書において抗体分子Ｔｒｙｂｅ１８Ｂとも呼ばれ、約１ｇ／Ｌの産生レベル及び約７０％単量体を有する哺乳類ＣＨＯ細胞株に由来する。精製されたＴｒＹｂｅ１８Ｂを生成するために、下流精製プロセスを実施した。
【０４０２】
例４：Ｆａｂ４９６．ｇ３−（ＨＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ２１０９（ＬＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ６４５（Ｔｒｙｂｅ１８Ｂ）の抗原標的のＢｉａｃｏｒｅ親和性及び同時結合
Ｆａｂ４９６．ｇ３−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）２１０９（配列番号１２５）（ＦａｂＨＣをｄｓｓｃＦｖ２１０９に連結するリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する）と、Ｆａｂ４９６．ｇ３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）６４５（配列番号１３１）（ＦａｂＬＣをｄｓｓｃＦｖ６４５に連結するリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する）とを含む抗体分子（例３の方法に従って産生された場合、本明細書では抗体分子Ｔｒｙｂｅ１８Ｂとも呼ばれる）を、以下に記載の方法に従って、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＩＬ−１７Ａ、ヒトＩＬ−１７Ｆ及びヒト血清アルブミンに対する親和性について試験した。
【０４０３】
アッセイフォーマットは、固定化した抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２によるＴｒＹｂｅ１８Ｂの捕捉、次に、捕捉した表面上のヒトＴＮＦ、ヒトＩＬ−１７Ａ、ヒトＩＬ−１７Ｆ及びヒト血清アルブミンの滴定であった。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＢＩＡ（Ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆ（ａｂ’）２断片特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をアミンカップリング化学反応によってＣＭ５  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ上に約５０００反応単位（ＲＵ）の捕捉レベルまで固定化した。泳動バッファーとしてＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を流速１０μＬ／分で使用した。固定化した抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２による捕捉のために０．５μｇ／ｍＬのＴｒＹｂｅ１８Ｂの１０μＬ注入液を用いた。ヒトＴＮＦ、ヒトＩＬ−１７Ａ、ヒトＩＬ−１７Ｆ及びＨＳＡを、様々な濃度（それぞれ５ｎＭ〜０．１５６２５ｎＭ、５ｎＭ〜０．１５６２５ｎＭ、１０ｎＭ〜０．３１２５ｎＭ及び１００ｎＭ〜３．１２５ｎＭ）で、３０μＬ／分の流速で、捕捉したＴｒＹｂｅ１８Ｂ上で滴定した。５０ｍＭ  ＨＣｌの２×１０μＬの注入液により表面を再生させ、１０μＬ／分の流速で５ｍＭ  ＮａＯＨを５μＬ注入して散在させた。バックグラウンド差引き結合曲線は、Ｔ２００ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１．０）を用いて標準的な手順に従って分析した。動態パラメータはフィッティングアルゴリズムから決定した。結果を表５に示す。
【０４０４】
【表８】
2019502380.tif 000011
【０４０５】
さらなるアッセイを行って、カニクイザルＴＮＦ、カニクイザルＩＬ−１７Ａ、カニクイザルＩＬ−１７Ｆ及びカニクイザルアルブミンに対する抗体分子ＴｒＹｂｅ１８Ｂの結合を測定した。アッセイフォーマットは、固定化した抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２によるＴｒＹｂｅ１８Ｂの捕捉、次に、捕捉した表面上のカニクイザルＴＮＦ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ及びアルブミンの滴定であった。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＢＩＡ（Ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆ（ａｂ’）２断片特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をアミンカップリング化学反応によってＣＭ５  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ上に約５０００反応単位（ＲＵ）の捕捉レベルまで固定化した。泳動バッファーとして、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を流速１０μＬ／分で使用した。固定化した抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２による捕捉のために０．５μｇ／ｍＬのＴｒＹｂｅ１８Ｂの１０μＬ注入液を使用した。カニクイザルＴＮＦ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、及びアルブミンを、様々な濃度（それぞれ５ｎＭ〜０．１５６２５ｎＭ、１０ｎＭ〜０．３１２５ｎＭ、４０ｎＭ〜１．２５ｎＭ及び１００ｎＭ〜３．１２５ｎＭ）で、３０μＬ／分の流速で、捕捉したＴｒＹｂｅ１８Ｂ上で滴定した。５０ｍＭ  ＨＣｌの２×１０μＬの注入液により表面を再生させ、１０μＬ／分の流速で５ｍＭ  ＮａＯＨを５μＬ注入して散在させた。バックグラウンド差引き結合曲線は、Ｔ２００ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン１．０）を用いて標準的な手順に従って分析した。動態パラメータはフィッティングアルゴリズムから決定した。結果を表６に示す。
【０４０６】
【表９】
2019502380.tif 000012
【０４０７】
ヒトＩＬ−１７Ａ、ヒトＴＮＦ及びヒト血清アルブミンのＴｒＹｂｅ１８Ｂへの同時結合を評価した。固定化した抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２によってＴｒＹｂｅ１８Ｂ構築物をセンサーチップに捕捉し、次に、捕捉したＴｒＹｂｅ１８Ｂ上でｈＩＬ−１７Ａのみ、ｈＴＮＦのみ、ＨＳＡのみ、又はｈＩＬ−１７Ａ、ｈＴＮＦ及びＨＳＡの混合溶液を別々に滴定した。
【０４０８】
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＢＩＡ（Ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。ＴｒＹｂｅ１８Ｂ結合ヒトＴＮＦ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ及びＨＳＡのＢｉａｃｏｒｅ動態について上記の方法で述べたように、ＴｒＹｂｅ１８Ｂ構築物をセンサーチップ表面に捕捉した。１００ｎＭ  ＨＳＡ、２０ｎＭ  ｈＩＬ−１７Ａ、２０ｎＭ  ｈＴＮＦ又は１００ｎＭ  ＨＳＡ、２０ｎＭ  ｈＩＬ−１７Ａ、２０ｎＭ  ｈＴＮＦの最終濃度の混合溶液を、捕捉したＴｒＹｂｅ１８Ｂ上で別々に滴定した。
【０４０９】
ｈＩＬ−１７Ａ／ｈＴＮＦ／ＨＳＡ複合溶液の結合反応は、表７に示すように、個々の注入液の反応の和と同等であった。これにより、ＴｒＹｂｅ１８ＢがヒトＩＬ−１７Ａ、ヒトＴＮＦ及びＨＳＡに同時に結合することができることが確認される。
【０４１０】
【表１０】
2019502380.tif 000013
【０４１１】
さらなるアッセイを行って、カニクイザルＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦ及びアルブミンのＴｒＹｂｅ１８Ｂへの同時結合を測定した。固定化した抗ヒトＩｇＧ−Ｆ（ａｂ’）２によってＴｒＹｂｅ１８Ｂ構築物をセンサーチップに捕捉し、次に、捕捉したＴｒＹｂｅ１８Ｂ上で、カニクイザルＩＬ−１７Ａのみ、カニクイザルＴＮＦのみ、カニクイザルＨＳＡのみ、又はカニクイザルＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦ及びアルブミンの混合溶液を別々に滴定した。
【０４１２】
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＢＩＡ（Ｂｉａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。ＴｒＹｂｅ１８Ｂ結合カニクイザルＴＮＦ、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦのＢｉａｃｏｒｅ動態について上記の方法で述べたように、ＴｒＹｂｅ１８Ｂ構築物をセンサーチップ表面に捕捉した。１００ｎＭのＣＳＡ、２０ｎＭのカニクイザル１７Ａ、２０ｎＭのカニクイザルＴＮＦ、又は１００ｎＭのＨＳＡ、２０ｎＭのカニクイザルＩＬ−１７Ａ、２０ｎＭのカニクイザルＴＮＦの最終濃度の混合溶液を、捕捉したＴｒＹｂｅ１８Ｂ上で別々に滴定した。
【０４１３】
表８に示すように、カニクイザルＩＬ−１７Ａ／カニクイザルＴＮＦ／ＣＳＡ複合溶液の結合反応は、個々の注入液の反応の和と同等であった。これにより、ＴｒＹｂｅ１８ＢがカニクイザルＩＬ−１７Ａ、カニクイザルＴＮＦ及びＣＳＡに同時に結合することができることが確認される。
【０４１４】
【表１１】
2019502380.tif 000014
【０４１５】
例６：ＴＮＦ（ヒト及びカニクイザル）に対するＦａｂ４９６．ｇ３−（ＨＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ２１０９（ＬＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ６４５（Ｔｒｙｂｅ１８Ｂ）のインビトロ細胞に基づく活性
Ｆａｂ４９６．ｇ３−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）２１０９（配列番号１２５）（ＦａｂＨＣをｄｓｓｃＦｖ２１０９に連結するリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する）と、Ｆａｂ４９６．ｇ３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）６４５（配列番号１３１）（ＦａｂＬＣをｄｓｓｃＦｖ６４５に連結するリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する）とを含む抗体分子（例３の方法に従って産生された場合、本明細書では抗体分子Ｔｒｙｂｅ１８Ｂとも呼ばれる）を、ヒトＴＮＦ−αに対する活性についてインビトロ細胞アッセイで試験した。Ｌ９２９細胞株は、ＴＮＦ−αの細胞傷害性作用に感受性であるネズミの線維肉腫細胞株である。ＴＮＦは、ヒト、カニクイザル又はネズミのＴＮＦ−αに結合するＴＮＦ受容体を介して、アポトーシスを誘導するように刺激する。細胞をアクチノマイシンＤと共処理すると、ＴＮＦ−αによる死滅に対する感受性が増加する。アクチノマイシンＤ／ＴＮＦ−α及びＴｒＹｂｅ１８Ｂによる処理後のＬ９２９細胞の生存率は、ルシフェラーゼ反応（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を介したＡＴＰレベル（生存率の低下と共に減少する）を検出することによって決定した。
【０４１６】
Ｌ９２９細胞を、１時間のプレインキュベーションの後、ＴｒＹｂｅ１８Ｂ（濃度範囲８．１２Ｅ−９Ｍ〜１．２３Ｅ−１３Ｍ）又は対照化合物エンブレル（濃度範囲１．３Ｅ−９Ｍ〜２Ｅ−１４Ｍ）の存在下で２．３５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ及び１００ｐｇ／ｍｌのヒトＴＮＦ−αで、３８４ウェル平底プレート中で３０μｌの最終容量で処理した。３７℃で２４時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｌｔｄ）により５％ＣＯ２細胞生存率を測定した。[図１０ａ]アクチノマイシンＤ／及びヒトＴＮＦ−α及びＴｒＹｂｅ１８Ｂ又は
対照化合物エンブレルで処理したＬ９２９細胞の代表的な細胞生存曲線を示す図である。
【０４１７】
また、Ｌ９２９細胞を、１時間のプレインキュベーションの後、ＴｒＹｂｅ１８Ｂ（濃度範囲８．１２Ｅ−９Ｍ〜１．２３Ｅ−１３Ｍ）又は対照化合物エンブレル（濃度範囲１．３Ｅ−９Ｍ〜２Ｅ−１４Ｍ）の存在下で２．３５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤ及び２０ｐｇ／ｍｌのカニクイザルＴＮＦ−αで、３８４ウェル平底プレート中で３０μｌの最終容量で処理した。３７℃で２４時間後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｌｔｄ）により５％ＣＯ２細胞生存率を測定した。[図１０ｂ]アクチノマイシンＤ／及びカニクイザルＴＮＦ−α及び
ＴｒＹｂｅ１８Ｂ又は対照化合物エンブレルで処理したＬ９２９細胞の代表的な細胞生存曲線を示す図である。
【０４１８】
ヒト又はカニクイザルＴＮＦ−αによって刺激された場合、ＴｒＹｂｅ１８Ｂは用量依存的にＴＮＦ−αの死滅効果を完全に阻害することができた（平均ＥＣ５０  ５．８７ｐＭ（ヒト、Ｎ＝３）及び平均ＥＣ５０  ４．９７ｐＭ（カニクイザル、Ｎ＝２））。ＴｒＹｂｅ１８ＢはマウスＴＮＦと交差反応せず、したがってネズミＴＮＦ−α（Ｎ＝３）の死滅効果を阻害しなかった。
【０４１９】
例７：ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆに対するＦａｂ４９６．ｇ３−（ＨＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ２１０９（ＬＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ６４５（Ｔｒｙｂｅ１８Ｂ）のインビトロ細胞に基づく活性
Ｆａｂ４９６．ｇ３−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）２１０９（配列番号１２５）（ＦａｂＨＣをｄｓｓｃＦｖ２１０９に連結するリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する）と、Ｆａｂ４９６．ｇ３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）６４５（配列番号１３１）（ＦａｂＬＣをｄｓｓｃＦｖ６４５に連結するリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する）とを含む抗体分子（例３の方法に従って産生された場合、本明細書では抗体分子Ｔｒｙｂｅ１８Ｂとも呼ばれる）を、ヒト及びカニクイザルＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆに対する活性についてインビトロ細胞アッセイで試験した。
【０４２０】
ＩＬ−１βと組み合わせたＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆは、ネズミ線維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３によるＩＬ−６放出を誘導する。これは、抗ＩＬ−１７Ａ及び抗ＩＬ−１７Ｆ分子の中和能力を試験するアッセイ系の基礎を形成する。
【０４２１】
国際公開第２０１２／０９５６６２号明細書に記載されているＴｒＹｂｅ１８Ｂ又は抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体ＣＡ０２８＿００４９６．ｇ３（濃度範囲５０００ｎｇ／ｍＬ〜１９．５ｎｇ／ｍＬ）を、組換えヒトＩＬ−１７Ａ（３０ｎｇ／ｍＬ）及び組換えヒトＩＬ−１β（５０ｐｇ／ｍＬ）と共に３７℃で４時間プレインキュベートした。次に、ＴｒＹｂｅ／抗体タンパク質複合体を、９６ウェル平底プレート中のＮＩＨ−３Ｔ３細胞に移した。３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度で３日間インキュベートした後、細胞を含まない上清を回収し、ＩＬ−６のレベルをＭＳＤによって決定した。
【０４２２】
ＴｒＹｂｅ１８Ｂ又は抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体ＣＡ０２８＿００４９６．ｇ３（濃度範囲５０００ｎｇ／ｍＬ〜１９．５ｎｇ／ｍＬ）を、組換えヒトＩＬ−１７Ｆ（３００ｎｇ／ｍＬ）及び組換えヒトＩＬ−１β（５０ｐｇ／ｍＬ）と共に３７℃で４時間プレインキュベートした。次に、ＴｒＹｂｅ／抗体タンパク質複合体を、９６ウェル平底プレート中のＮＩＨ−３Ｔ３細胞に移した。３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度で３日間インキュベートした後、細胞を含まない上清を回収し、ＩＬ−６のレベルをＭＳＤによって決定した。
【０４２３】
ＴｒＹｂｅ１８Ｂ又は抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体ＣＡ０２８＿００４９６．ｇ３（濃度範囲５０００ｎｇ／ｍＬ〜１９．５ｎｇ／ｍＬ）を、組換えカニクイザルＩＬ−１７Ａ（３０ｎｇ／ｍＬ）及び組換えヒトＩＬ−１β（５０ｐｇ／ｍＬ）と共に３７℃で４時間プレインキュベートした。次に、ＴｒＹｂｅ／抗体タンパク質複合体を、９６ウェル平底プレート中のＮＩＨ−３Ｔ３細胞に移した。３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度で３日間インキュベートした後、細胞を含まない上清を回収し、ＩＬ−６のレベルをＭＳＤによって決定した。
【０４２４】
ＴｒＹｂｅ１８Ｂ又は抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体ＣＡ０２８＿００４９６．ｇ３（濃度範囲５０００ｎｇ／ｍＬ〜１９．５ｎｇ／ｍＬ）を、組換えカニクイザルＩＬ−１７Ｆ（３００ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１β（５０ｐｇ／ｍＬ）と共に３７℃で４時間プレインキュベートした。次に、トライボディ／抗体タンパク質複合体を、９６ウェル平底プレート中のＮＩＨ−３Ｔ３細胞に移した。３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度で３日間インキュベートした後、細胞を含まない上清を回収し、ＩＬ−６のレベルをＭＳＤによって決定した。
【０４２５】
ＴｒＹｂｅ１８Ｂ又は抗ＩＬ１７Ａ／Ｆ抗体ＣＡ０２８＿００４９６．ｇ３（濃度範囲５０００ｎｇ／ｍＬ〜１９．５ｎｇ／ｍＬ）を、組換えカニクイザルＩＬ−１７Ｆ（３００ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−１β（５０ｐｇ／ｍＬ）と共に３７℃で４時間プレインキュベートした。次に、トライボディ／抗体タンパク質複合体を、９６ウェル平底プレート中のＮＩＨ−３Ｔ３細胞に移した。３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度で３日間インキュベートした後、細胞を含まない上清を回収し、ＩＬ−６のレベルをＭＳＤによって決定した。
【０４２６】
ＮＩＨ  ３Ｔ３バイオアッセイにおいて、ＴｒＹｂｅ１８Ｂは、ヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆ
の両方に誘導されたＩＬ−６放出を、濃度依存的に阻害した（データは示さず）。ＴｒＹｂｅ１８Ｂは対照抗体ＣＡ０２８＿００４９６．ｇ３と同等の効力を有していた（データは示さず）。
【０４２７】
例８：ＴＮＦ−αに対するＦａｂ４９６．ｇ３−（ＨＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ２１０９（ＬＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ６４５（Ｔｒｙｂｅ１８Ｂ）のインビボ活性
Ｆａｂ４９６．ｇ３−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）２１０９（配列番号１２５）（ＦａｂＨＣをｄｓｓｃＦｖ２１０９に連結するリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する）と、Ｆａｂ４９６．ｇ３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）６４５（配列番号１３１）（ＦａｂＬＣをｄｓｓｃＦｖ６４５に連結するリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する）とを含む抗体分子（例３の方法に従って産生された場合、本明細書では抗体分子Ｔｒｙｂｅ１８Ｂとも呼ばれる）を、ヒトＴＮＦ−α阻害についてインビボアッセイで試験した。
【０４２８】
マウスにおける外因性ヒトＴＮＦ−αの腹腔内投与は、好中球に関連する局所炎症反応を誘発する。この反応は、マウスＴＮＦ受容体Ｉ（ＴＮＦＲＩ）の活性化及びその後のＮＦ−κＢ媒介性転写後の好中球ケモカインの放出によって大いに引き出される。ヒトＴＮＦ−α誘導性好中球のこのモデルは、ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆとは独立した生理学的系におけるヒトＴＮＦ−αに対するＴｒＹｂｅ１８Ｂのインビボ有効性及び効力を決定するために使用することができる。ヒトＴＮＦ−αがこのモデルにおける唯一の炎症刺激であるため、ＴｒＹｂｅ１８Ｂによる予防的治療は、ヒトＴＮＦ−α誘導性腹腔好中球増加症を阻害すると仮定した。
【０４２９】
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＰＢＳ又はＴｒＹｂｅ１８Ｂ漸増濃度（０．１、１又は１０ｍｇ／ｋｇ）で静脈内処理した。ＰＢＳ又はＴｒＹｂｅ１８Ｂ処理の１時間後、マウスにＰＢＳ又はヒトＴＮＦ−α（０．３μｇ／ｋｇ）を腹腔内投与した。４時間後、マウスを屠殺し、フローサイトメトリーによる好中球の評価のために腹膜灌流を採取した。結果はｎ＝８／群の平均（＋／−ＳＥＭ）である。統計的比較は、Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定（＊＊＊＊＝ｐ≦０．０００１）を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算した。
【０４３０】
図１１は、ＴｒＹｂｅ１８Ｂが、１及び１０ｍｇ／ｋｇ（それぞれ９６％及び１００％阻害）での応答のほぼ完全な除去で、ヒトＴＮＦ−α誘導性好中球を用量依存的に阻害することができることを示す。この系にはヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆが存在しないため、ＴｒＹｂｅ１８Ｂの抗ヒトＴＮＦ−αｄｓｓｃＦｖがインビボで有効且つ強力であることを示唆している。
【０４３１】
例９：ＴＮＦ−α及びＩＬ−１７Ａに対するＦａｂ４９６．ｇ３−（ＨＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ２１０９（ＬＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ６４５（Ｔｒｙｂｅ１８Ｂ）のインビボ活性
Ｆａｂ４９６．ｇ３−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）２１０９（配列番号１２５）（ＦａｂＨＣをｄｓｓｃＦｖ２１０９に連結するリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する）と、Ｆａｂ４９６．ｇ３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）６４５（配列番号１３１）（ＦａｂＬＣをｄｓｓｃＦｖ６４５に連結するリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する）とを含む抗体分子（例３の方法に従って産生された場合、本明細書では抗体分子Ｔｒｙｂｅ１８Ｂとも呼ばれる）を、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１７Ａの阻害についてインビボアッセイで試験した。
【０４３２】
ＴｒＹｂｅ１８Ｂ抗体が、両方のサイトカインが同時に存在することから生じる生物学的応答を阻害することができることを示すことは重要である。以前の研究は、インビボでのヒトＴＮＦ−αとＩＬ−１７Ａとの組み合わせが、いずれかの刺激単独の合計よりも大きい相乗的好中球応答を生じることを示した。したがって、ＴｒＹｂｅ１８Ｂのインビボ有効性及び効力を、ヒトＩＬ−１７Ａと組み合わせたヒトＴＮＦ−αに対して試験した。このモデルにおけるヒトＴＮＦ−αとヒトＩＬ−１７Ａの相乗的寄与をさらに区別するために、ヒトＴＮＦ−α（１０１．４）及びヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆ（抗体ＣＡ０２８＿００４９６．ｇ３）に対する単一特異性抗体を用いた。
【０４３３】
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＰＢＳ、抗体ＣＡ０２８＿００４９６．ｇ３（３０ｍｇ／ｋｇ）、１０１．４（３０ｍｇ／ｋｇ）又はＴｒＹｂｅ１８Ｂの濃度を増加させて（０．１、１又は１０ｍｇ／ｋｇ）静脈内投与した。抗体投与の１時間後、マウスに、ＰＢＳ、ヒトＩＬ−１７Ａ（１０μｇ／ｋｇ）、ヒトＴＮＦ−α（０．３μｇ／ｋｇ）、又はヒトＩＬ−１７Ａ（１０μｇ／ｋｇ）とヒトＴＮＦ−α（０．３μｇ／ｋｇ）との組み合わせを腹腔内投与した。４時間後、マウスを屠殺し、フローサイトメトリーによる好中球の評価のために腹膜灌流を採取した。結果はｎ＝８／群の平均（＋／−ＳＥＭ）である。統計的比較は、Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定（＊＝ｐ≦０．０５、＊＊＝ｐ≦０．０１＝＊＊＊＝ｐ≦０．００１＝＊＊＊＊＝ｐ≦０．０００１）を用いた一元配置ＡＮＯＶＡを用いて計算した。
【０４３４】
図１２は、ヒトＴＮＦ−αと組み合わせたヒトＩＬ−１７Ａの腹腔内投与が、単独で投与されたいずれかの刺激の合計よりもはるかに大きい局所好中球応答を誘導することを示す。さらに、このモデルにおけるヒトＴＮＦ−α（過剰の抗ＴＮＦ−α抗体１０１．４を用いる）の阻害は、組み合わされたＩＬ−１７Ａ／ＴＮＦ−α誘導性反応を、ＩＬ−１７Ａ単独投与後に観察されたものと同様のレベルまで低下させた。同様に、ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆ（過剰の抗体ＣＡ０２８＿００４９６．ｇ３を用いる）の阻害は、組み合わされたＩＬ−１７Ａ／ＴＮＦ−α誘導性反応を、ＴＮＦ−α単独投与後に観察されたものと同じレベルまで阻害することができたのみであった。対照的に、ＴｒＹｂｅ１８Ｂは、ＩＬ−１７Ａ／ＴＮＦ−α誘導性好中球増加を、抗体ＣＡ０２８＿００４９６．ｇ３又は１０１．４のいずれかで達成されたレベル（それぞれ１０ｍｇ／ｋｇのＴｒＹｂｅ１８Ｂで９６％の阻害に対して、３０ｍｇ／ｋｇの１０１．４及び抗体ＣＡ０２８＿００４９６．ｇ３で８１％及び６７％の阻害）を超えて、用量依存的に阻害することができた。また、このデータは、ＴｒＹｂｅ１８ＢがインビボモデルにおいてヒトＴＮＦ−α及びヒトＩＬ−１７Ａの両方を同時に阻害できることを示す。
【０４３５】
例１０：Ｆａｂ４９６．ｇ３−（ＨＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ２１０９（ＬＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ６４５（Ｔｒｙｂｅ１８Ｂ）の生物物理学的特徴付け
Ｆａｂ４９６．ｇ３−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）２１０９（配列番号１２５）（ＦａｂＨＣをｄｓｓｃＦｖ２１０９に連結するリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する）及びＦａｂ４９６．ｇ３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）６４５（配列番号１３１）（ＦａｂＬＣをｄｓｓｃＦｖ６４５に連結するリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する）を含む抗体分子（例３の方法に従って産生された場合、本明細書では抗体分子Ｔｒｙｂｅ１８Ｂとも呼ばれる）と、Ｆａｂ４９６．ｇ３−（ＨＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）２１０９（配列番号１２７）（ＦａｂＨＣ及びｄｓｓｃＦｖ２１０９を連結するリンカーＳＧＧＧＧＴＧＧＧＧＳを有する）及びＦａｂ４９６．ｇ３−（ＬＣ）ｄｓｓｃＦｖ（ＨＬ）６４５（配列番号１３１）（ＦａｂＬＣ及びｄｓｓｃＦｖ６４５を連結するリンカーＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを有する）を含む抗体分子（例３の方法に従って産生された場合、本明細書では抗体分子Ｔｒｙｂｅ１８Ｔとも呼ばれる）とを、生物物理学的特性実験で試験した。
【０４３６】
３つのバッチの抗体分子を分析した（表９参照）。この研究は、ＴｒＹｂｅ１８Ｂ分子の全体的な生化学的及び生物物理学的特徴の決定をもたらした。
【０４３７】
さらに、親ＴｒＹｂｅ１８Ｂ分子とは異なって溶出する安定なバッチ２の精製からの画分（Ａ３）を分析して、同一性を確認し、したがってＴｒＹｂｅ１８Ｂ分子の予想外の不純度及び／又は生物物理学的特徴を説明することができた。
【０４３８】
【表１２】
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【０４３９】
バッチの純度は、サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥＣ  ＨＰＬＣ）（データは示さず）及びＳＤＳ  ＰＡＧＥ（非還元及び還元条件下）（図１３）によって決定した。
【０４４０】
ＳＥＣ  ＨＰＬＣで判断すると、２．２％未満の高分子量種（一過性バッチ：０．５６％、安定バッチ１：０．５９％、安定バッチ２：２．２％）で、全てのサンプルが同じ保持時間で溶出した。一過性サンプルは、主要なピークよりも遅く溶出する広いピークによって示されるように、低分子量の混入物を含んでいた。
【０４４１】
図１３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ４−２０％Ｎｏｖｅｘ  Ｔｒｉｓ／Ｇｌｙｃｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたＴｒＹｂｅ１８Ｂの異なるバッチのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。（Ａ）非還元（＋Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）及び（Ｂ）還元条件下での分析。レーン１＝Ｂｌｕｅ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｍａｒｋｅｒを参照、レーン２＝Ａ３（安定バッチ２の精製からの画分）、レーン３＝一過性バッチ、レーン４＝安定バッチ１、レーン５＝安定バッチ２。全ての３つのバッチは、完全に組み立てられたジスルフィド対の抗体分子に起因する約１３０ｋＤａ（非還元条件下）のバンドを有するＳＤＳ  ＰＡＧＥによって同様のレベルの純度を示し、それぞれの還元重鎖及び軽鎖に一致する約５０ｋＤａのダブレット（還元条件下）を示した。非還元条件下では、約５０ｋＤａのバンドがあり、これはＡ３（レーン２）で観察されたものと同等であった。Ａ３は、インタクトマススペクトル分析（５０．８ｋＤａ）及びＮ末端シークエンシング（優勢軽鎖）により、システインでキャップされた軽鎖であることが確認された。マススペクトル分析は重鎖を認識しなかったため、対象サンプルの５０ｋＤａのバンド（非還元ゲル）は軽鎖であると考えられた。これは後でＰｏｎｓｅａｕ  Ｓ染色したブロットから切り取ったバンドのＮ末端配列分析により確認し、軽鎖Ｎ末端（ＡＩＱＬＴＱＳＰＳＳ．）のみが識別された。
【０４４２】
ｐＩ測定：
方法１：１ｍｇ／ｍｌのタンパク質サンプル３０μｌ、メチルセルロース０．３５％、ｐＨ３−１０両性電解質（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ）４％、各合成ｐＩマーカー（４．６５及び９．７７）１μｌ、及びＨＰＬＣグレードの水で最終容量を１００μｌとする。次に、混合物をｉＣＥ３  ＩＥＦ分析装置（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）を用いて分析し、１５００Ｖで１分間プレフォーカシングした後、３０００Ｖで５分間焦点を合わせた。次に、較正されたエレクトロフェログラムをＥｍｐｏｗｅｒソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ製）を用いて統合した。
【０４４３】
方法２：２ｍｇ／ｍｌのタンパク質サンプル３０μｌ、１％メチルセルロース１０５ｕｌ、ｐＨ３−８両性電解質（Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ）１２ｕｌ、各合成ｐＩマーカー（４．６５及び９．７７）１．５μｌ、及びＨＰＬＣグレードの水で最終容量を３００μｌにする。次に、混合物を方法１と同様にｉＣＥ３を用いて分析した。
【０４４４】
ＴｒＹｂｅＴ及びＴｒＹｂｅ１８Ｂの全てのバッチについての実験ｐＩは高く（範囲９．２〜９．４）、予想される処方ｐＨ（約ｐＨ５）において（凝集の危険性が増加する場合）全体的な分子電荷が約０になる可能性は低い。
【０４４５】
画分Ａ３のｐＩは、優勢に８．３１（４８．６％）であることが判明した。
【０４４６】
分子安定性：
分子の安定性は、融解温度（Ｔｍ）（アンフォールディングの尺度）及び攪拌の効果（物理的ストレスによるアンフォールディング後の凝集）によって測定した。
【０４４７】
ＴｒＹｂｅＴ及びＴｒＹｂｅ１８Ｂの全てのバッチの示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によるＴｍ分析では、２つの主なドメインを区別することができた。より低いアンフォールディング事象は、２１０９ｓｃＦｖに起因していた。バッファー種及びｐＨは融解温度に影響しないようであった。
【０４４８】
サーモフルオル（ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ）アッセイは、異なるドメイン間を区別するのが容易ではないが、ＤＳＣ分析から得られたものと同様のＴｍ値（観察されたところ）をもたらした。安定バッチ１及び安定バッチ２では、より高いアンフォールディングドメインのみが明らかであった。一過性バッチについては、早期アンフォールディング遷移（４８〜５０℃）を識別することが可能であり、これは過度の軽鎖の存在に起因する可能性があった。
【０４４９】
【表１３】
2019502380.tif 000016
【０４５０】
要約すると、上記の分析から、ＴｒＹｂｅＴ及びＴｒＹｂｅ１８Ｂの３つのバッチ間に有意差がないことが明らかであった。
【０４５１】
ＴｒＹｂｅ１８Ｂは高いｐＩを有したが、分子の２１０９ｓｃＦｖ成分のＣＤＲによって支配されると思われる従来のフォーマット（ＩｇＧ及びＦａｂ’分子）と比較して、中程度に低いＴｍを示した。全てのバッチにはおそらく異種性／不安定性に寄与する過剰な軽鎖が含まれていたが、精製によって除去することができた。
【０４５２】
例１１：ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆに対するＦａｂ４９６．ｇ３−（ＨＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ２１０９（ＬＣ）ｄｓＨＬｓｃＦｖ６４５（Ｔｒｙｂｅ１８Ｂ）のインビトロ細胞に基づく活性
ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆアイソフォームに加えてＴＮＦ−αは、Ｔｈ１７細胞によって産生される重要なサイトカインであり、関節の滑膜細胞などの非血液組織の活性化を介して間接的に好中球の動員を誘導することが知られている。この研究では、好中球遊走の複雑なインビトロモデルにおけるＴｒＹｂｅ１８Ｂの有効性を、ＩＬ−１７ＡＦを標的とする個々の抗体とＴＮＦ−αを標的とするエンブレルとの組み合わせと比較した。
【０４５３】
ＲＡ滑膜細胞の活性化：１日目：培養したＲＡ滑膜細胞（継代６）を、２４ウェルのトランスウェルプレートの下部チャンバーに１ウェル当たり１０４細胞で播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。２日目：翌日、ＩＬ−１７Ａ（国際公開第２００８／００１０６３号明細書に記載の抗体４９７）で予めブロックした（室温で１時間）Ｔｈ１７細胞（ＥＷＢＥ−０３７３８８）、又は追加の抗ＴＮＦ−α中和エンブレルを含むか含まないＩＬ−１７ＦもしくはＩＬ−１７ＡＦ（抗体ＣＡ０２８＿００４９６．ｇ３）特異性抗体に由来する上清（１：１０希釈）で滑膜細胞を活性化させた。Ｔｈ１７も陰性対照Ａ３３  ＩｇＧ又はＴｒＹｂｅ１８Ｂと予めインキュベートして、ＩＬ−１７Ａ＋Ｆ及びＴＮＦ−αを中和した。培養は、対照培地又は刺激培地のいずれかにおいて０．５ｍｌの全容量で行った。Ｔｈ１７上清に存在する標的サイトカインを完全に中和するために、試験した全抗体を過剰量（１０μｇ／ｍｌ）で使用した。次に、刺激された線維芽細胞を、移動アッセイの前にさらに２４時間インキュベートした。
【０４５４】
好中球移動アッセイ：３日目：ヒト全血からヒト白血球（Ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ）を単離するために、４０ｍｌのＡＣＫ溶解バッファーを１０ｍｌのヒト血液と室温で１０分間混合してＲＢＣを効率的に溶解した。次に、白血球を４００ｇで１０分間回転させ、さらに２０ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した後、プレーンＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で１０６細胞／ｍｌで再懸濁して計数した。５×１０５個の白血球（０．５ｍｌ）をトランスウェルの上部チャンバーに播種し、３７℃で６時間インキュベートした。３．０μＭの透過性膜を通過して下部チャンバーに移動した白血球を単離し、抗ヒトＣＤ１８特異性抗体（Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で３０分間（氷上で２ｕｌ／試験）標識して好中球を同定した。次に、抗体染色したサンプルをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で１回洗浄した後、ＢＤ  ＬＳＲＩＩ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ２０サイトメトリー分析装置でＦＡＣＳ取得した。全サンプルを、Ｓｉｇｍａ参照ビーズをスパイクした２００μＬのＰＢＳに再懸濁した。比較分析として、ＩｇＧ（−抗ＴＮＦ−α）を使用するＤｕｎｎｅｔポスト試験を用いた一元配置Ａｎｏｖａを用いて統計解析を行った。
【０４５５】
ＴｒＹｂｅ１８Ｂ又はＩＬ−１７アイソフォーム特異性抗体及びＴＮＦ−α遮断抗体のいずれかを使用して、複雑な前臨床インビトロアッセイでヒト好中球の移動を調節する際のＩＬ−１７及びＴＮＦ−αの個々の及び集団的影響を決定することが可能であった。Ｔｈ１７細胞からの上清を用いて活性化したＲＡ滑膜細胞は、好中球の走化性反応を有意に増加させた（図１４）。好中球の移動は、アイソタイプが一致した陰性対照と比較して、特異性ＩＬ−１７Ａ遮断によって有意に抑制された。ＲＡ滑膜細胞活性化前のＴｈ１７上清中のＩＬ−１７Ｆのみの中和は、好中球移動能を変化させなかった。対照的に、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−１７Ｆの二重阻害は、ＩＬ−１７Ａ阻害のみよりも好中球移動を大幅に抑制した。エンブレルを用いたＴＮＦ−αの前遮断も、追加のＩＬ−１７アイソフォーム特異性中和抗体によってさらに抑制された好中球走化性に顕著な影響を及ぼした。重要なことに、ＴｒＹｂｅ１８Ｂを用いたＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ及びＴＮＦの三重特異性遮断は、これらのサイトカインを中和する別々の抗体を使用した場合と同様の好中球移動の阻害を示した。
【０４５６】
この研究において、独立したブロッキング（抗ＩＬ−１７ＡＦ＋エンブレル）を利用するか又はＴｒＹｂｅ１８Ｂを用いた三重特異性遮断を介するいずれにおいても、ＩＬ−１７ＡＦ及びＴＮＦ−αの中和によって好中球移動の最適な阻害が達成されることが示された。
【０４５７】
例１２：インビボでのＴｒＹｂｅ１８Ｂの薬物動態（ＰＫ）分析
４匹の雄性カニクイザルにＴｒＹｂｅ１８Ｂの静脈内（ＩＶ）ボーラス投与量１０ｍｇ／ｋｇを投与し、選択した間隔で２８日間血清サンプルを採取した。ＩＬ１７Ａ／Ｆ及びＴＮＦ結合領域の両方の存在を確認するイムノアッセイを使用して、ＴｒＹｂｅ１８Ｂの濃度についてサンプルを分析した。２つの区画のＰＫ分析を行った。
【０４５８】
ＴｒＹｂｅ１８Ｂの血清濃度は、ＦｃＲｎに結合し、ＦｃＲｎによってリサイクルされる能力を有する大きな分子量のタンパク質と一致した（図１５）。この性質は、そのアルブミン結合ドメインによってＴｒＹｂｅ１８Ｂに付与される。ＴｒＹｂｅ１８ＢのＩＶ投与後の初期濃度は、血漿容量と同様の中央区画容量を有する分子と一致した。濃度は、約５．６日の終末（β）半減期で二重指数関数的に低下した（表１１）。遅い終末半減期は、ＴｒＹｂｅ１８Ｂの比較的遅いクリアランスと一致し、ＦｃＲｎとの結合及びＦｃＲｎによるリサイクルと整合している。ゆっくりとしたクリアランスはまた、分子の結合成分のいずれかの実質的な切断が、見掛けクリアランスの増加として現れるため、インビボでのＴｒＹｂｅの安定性を実証する。
【０４５９】
【表１４】
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【配列表フリーテキスト】
【０４６０】
配列表１〜２  ＜２２３＞ペプチドリンカー
配列表３〜１１  ＜２２３＞ヒンジリンカー
配列表１２〜１９  ＜２２３＞フレキシブルリンカー
配列表２０
＜２２３＞フレキシブルリンカー
＜２２３＞Ｘａａは天然アミン酸であり得る
配列表２１
＜２２３＞フレキシブルリンカー
＜２２３＞Ｘａａは天然アミン酸であり得る
＜２２３＞Ｘａａは天然アミン酸であり得る
配列表２２
＜２２３＞フレキシブルリンカー
＜２２３＞Ｘａａは天然アミン酸であり得る
＜２２３＞Ｘａａは天然アミン酸であり得る
＜２２３＞Ｘａａは天然アミン酸であり得る
配列表２３
＜２２３＞フレキシブルリンカー
＜２２３＞Ｘａａは天然アミン酸であり得る
＜２２３＞Ｘａａは天然アミン酸であり得る
＜２２３＞Ｘａａは天然アミン酸であり得る
＜２２３＞Ｘａａは天然アミン酸であり得る
配列表２４
＜２２３＞フレキシブルリンカー
＜２２３＞Ｘａａは天然アミン酸であり得る
配列表２５〜５１  ＜２２３＞フレキシブルリンカー
配列表５２〜５３  ＜２２３＞剛性リンカー
配列表５４〜６８  ＜２２３＞アルブミン結合ペプチド
配列表６９〜７０  ＜２２３＞フレキシブルリンカー
配列表７１  ＜２２３＞抗体４９６ｇ３のＣＤＲ配列‐ＣＤＲＨ１
配列表７２  ＜２２３＞抗体４９６ｇ３のＣＤＲ配列‐ＣＤＲＨ２
配列表７３  ＜２２３＞抗体４９６ｇ３のＣＤＲ配列‐ＣＤＲＨ３
配列表７４  ＜２２３＞抗体４９６ｇ３のＣＤＲ配列‐ＣＤＲＬ１
配列表７５  ＜２２３＞抗体４９６ｇ３のＣＤＲ配列‐ＣＤＲＬ２
配列表７６  ＜２２３＞抗体４９６ｇ３のＣＤＲ配列‐ＣＤＲＬ３
配列表７７  ＜２２３＞抗体４９６ｇ３の軽鎖可変領域
配列表７８  ＜２２３＞抗体４９６ｇ３の重鎖可変領域
配列表７９  ＜２２３＞抗体４９６ｇ３の軽鎖可変領域をコードしているＤＮＡ
配列表８０  ＜２２３＞抗体４９６ｇ３の重鎖可変領域をコードしているＤＮＡ
配列表８１  ＜２２３＞抗体４９６ｇ３の軽鎖（ＶＬ‐ＣＬ）
配列表８２  ＜２２３＞抗体４９６ｇ３の重鎖（ＶＨ‐ＣＨ１）
配列表８３  ＜２２３＞抗体４９６ｇ３の軽鎖をコードしているＤＮＡ（シグナル配列なし）
配列表８４  ＜２２３＞抗体４９６ｇ３の重鎖をコードしているＤＮＡ（シグナル配列なし）
配列表８５  ＜２２３＞抗体２１０９のＣＤＲ配列ＣＤＲＨ１
配列表８６  ＜２２３＞抗体２１０９のＣＤＲ配列ＣＤＲＨ２
配列表８７  ＜２２３＞抗体２１０９のＣＤＲ配列ＣＤＲＨ３
配列表８８  ＜２２３＞抗体２１０９のＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１
配列表８９  ＜２２３＞抗体２１０９のＣＤＲ配列ＣＤＲＬ２
配列表９０  ＜２２３＞抗体２１０９のＣＤＲ配列ＣＤＲＬ３
配列表９１  ＜２２３＞抗体２１０９ｇＬ１８の軽鎖可変領域
配列表９２  ＜２２３＞抗体２１０９ｇＨ２の重鎖可変領域
配列表９３  ＜２２３＞抗体２１０９ｇＬ１８の軽鎖可変領域をコードしているＤＮＡ
配列表９４  ＜２２３＞抗体２１０９ｇＨ２の重鎖可変領域をコードしているＤＮＡ
配列表９５  ＜２２３＞抗体２１０９ｇＬ１８の軽鎖可変領域
配列表９６  ＜２２３＞抗体２１０９ｇＨ２の重鎖可変領域
配列表９７  ＜２２３＞抗体２１０９ｇＬ１８の軽鎖可変領域をコードしているＤＮＡ
配列表９８  ＜２２３＞抗体２１０９ｇＨ２の重鎖可変領域をコードしているＤＮＡ
配列表９９  ＜２２３＞抗体２１０９ｇＨ２ｇＬ１８のｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）
配列表１００  ＜２２３＞抗体２１０９ｇＨ２ｇＬ１８のｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）をコードしているＤＮＡ
配列表１０１  ＜２２３＞抗体２１０９ｇＨ２ｇＬ１８のｄｓｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）
配列表１０２  ＜２２３＞抗体２１０９ｇＨ２ｇＬ１８のｄｓｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）をコードしているＤＮＡ
配列表１０３  ＜２２３＞抗体６４５のＣＤＲ配列ＣＤＲＨ１
配列表１０４  ＜２２３＞抗体６４５のＣＤＲ配列ＣＤＲＨ２
配列表１０５  ＜２２３＞抗体６４５のＣＤＲ配列ＣＤＲＨ３
配列表１０６  ＜２２３＞抗体６４５のＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１
配列表１０７  ＜２２３＞抗体６４５のＣＤＲ配列ＣＤＲＬ２
配列表１０８  ＜２２３＞抗体６４５のＣＤＲ配列ＣＤＲＬ３
配列表１０９  ＜２２３＞抗体６４５の軽鎖可変領域
配列表１１０  ＜２２３＞抗体６４５の重鎖可変領域
配列表１１１  ＜２２３＞抗体６４５の軽鎖可変領域をコードしているＤＮＡ
配列表１１２  ＜２２３＞抗体６４５の重鎖可変領域をコードしているＤＮＡ
配列表１１３  ＜２２３＞抗体６４５の軽鎖可変領域
配列表１１４  ＜２２３＞抗体６４５の重鎖可変領域
配列表１１５  ＜２２３＞抗体６４５の軽鎖可変領域をコードしているＤＮＡ
配列表１１６  ＜２２３＞抗体６４５の重鎖可変領域をコードしているＤＮＡ
配列表１１７  ＜２２３＞抗体６４５のｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）
配列表１１８  ＜２２３＞抗体６４５のｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）をコードしているＤＮＡ
配列表１１９  ＜２２３＞抗体６４５のｄｓｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）
配列表１２０  ＜２２３＞抗体６４５のｄｓｓｃＦｖ（ＶＨ−ＶＬ）をコードしているＤＮＡ
配列表１２１  ＜２２３＞４９６．ｇ３ＨＣ−２１０９ＶＨＶＬ
配列表１２２  ＜２２３＞４９６．ｇ３ＨＣ−２１０９ＶＨＶＬをコードしているＤＮＡ
配列表１２３  ＜２２３＞４９６．ｇ３ＨＣ−２１０９ＶＨＶＬ
配列表１２４  ＜２２３＞４９６．ｇ３ＨＣ−２１０９ＶＨＶＬをコードしているＤＮＡ
配列表１２５  ＜２２３＞４９６．ｇ３ＨＣ−２１０９ｄｓＶＨＶＬ
配列表１２６  ＜２２３＞４９６．ｇ３ＨＣ−２１０９ｄｓＶＨＶＬをコードしているＤＮＡ
配列表１２７  ＜２２３＞４９６．ｇ３ＨＣ−２１０９ｄｓＶＨＶＬ
配列表１２８  ＜２２３＞４９６．ｇ３ＨＣ−２１０９ｄｓＶＨＶＬをコードしているＤＮＡ
配列表１２９  ＜２２３＞４９６．ｇ３ＬＣ−６４５ＶＨＶＬ
配列表１３０  ＜２２３＞４９６．ｇ３ＬＣ−６４５ＶＨＶＬをコードしているＤＮＡ
配列表１３１  ＜２２３＞４９６．ｇ３ＬＣ−６４５ｄｓＶＨＶＬ
配列表１３２  ＜２２３＞４９６．ｇ３ＬＣ−６４５ｄｓＶＨＶＬをコードしているＤＮＡ
配列表１３３  ＜２２３＞抗体２１０９のラット可変重鎖配列
配列表１３４  ＜２２３＞ＪＨ４を含むヒト生殖系列アクセプターフレームワークＶＨ３配列１−３  ３−２１
配列表１３５  ＜２２３＞抗体２１０９の重鎖可変領域ｇＨ１
配列表１３６  ＜２２３＞抗体２１０９のＣＤＲ配列ＣＤＲＬ１
配列表１３７〜１３９  ＜２２３＞抗体２１０９のＣＤＲ配列ＣＤＲＬ２
配列表１４０  ＜２２３＞ラット抗体２１０９の軽鎖可変領域
配列表１４１  ＜２２３＞ヒトＶＫ１  ２−１（Ｕ）Ａ２０  ＪＫ２アクセプターフレームワーク
配列表１４２  ＜２２３＞抗体２１０９の軽鎖可変領域ｇＬ１
配列表１４３〜１４４  ＜２２３＞４９６．ｇ３ＨＣ−２１０９ｄｓＶＨＶＬをコードしているＤＮＡ
配列表１４５〜１４６  ＜２２３＞４９６．ｇ３ＬＣ−６４５ｄｓＶＨＶＬをコードしているＤＮＡ
配列表１４７  ＜２２３＞抗体ＣＡ２１０９の軽鎖可変領域ｇＬ１８
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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