(57)【要約】  アルミニウムに吸着する、補助脂質を伴うＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニストを含むアジュバントの安定な水性製剤を提供する。免疫応答を刺激する製剤を用いる組成物及び方法もまた提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＴＬＲアゴニストと、
（ｂ）補助脂質とを含む、ＴＬＲ水性製剤。
【請求項２】
前記ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ５アゴニスト、ＴＬＲ６アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ７／８アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストを含む、請求項１記載の水性製剤。
【請求項３】
アルミニウム塩をさらに含む、請求項１又は２に記載の水性製剤。
【請求項４】
（ａ）ＴＬＲ７／８アゴニストと、
（ｂ）補助脂質とを含む、ＴＬＲ７／８水性製剤。
【請求項５】
水性製剤は、４００ｎｍ以下の粒子サイズを有する安定なナノ懸濁液剤である、請求項４記載の水性製剤。
【請求項６】
（ａ）ＴＬＲ７／８アゴニストと、
（ｂ）補助脂質と、
（ｃ）アルミニウム塩とを含む、組成物。
【請求項７】
前記ＴＬＲ７／８アゴニストは、前記アルミニウム塩に吸着する、請求項６記載の組成物。
【請求項８】
前記ＴＬＲ７／８アゴニストは、前記アルミニウム塩の２５パーセントで、前記アルミニウム塩に吸着する、請求項６記載の組成物。
【請求項９】
前記アルミニウム塩は、水酸化アルミニウム、アルミニウム三水和物（aluminum trihydrate）、オキシ水酸化アルミニウム（aluminum oxyhydroxide）、リン酸アルミニウム（aluminum phosphate）、水酸化リン酸アルミニウム（aluminum hydroxyphosphate）、水酸化リン酸アルミニウム硫酸塩（aluminum hydroxyphosphate sulfate）及び硫酸アルミニウムカリウム（potassium aluminum sulfate）からなる群から選択される、請求項６から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アルミニウム塩は、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）を含む、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
前記アルミニウム塩は、ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）を含む、請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＴＬＲ７／８アゴニストは、３Ｍ−０５２を含む、請求項４から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記補助脂質は、リン脂質又は第四級アンモニウム塩脂質（quaternary ammonium salt lipid）である、請求項４から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記補助脂質は、炭素数１０〜２０のアルキル鎖を含む、請求項４から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記補助脂質は、ＤＯＰＣ、ＤＳＰＧ、ＤＳＴＡＰ及びポリソルベート８０から選択される、請求項４から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記補助脂質は、ＤＳＰＧ及びＤＳＴＡＰから選択される、請求項４から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
３Ｍ−０５２、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）及びＤＳＰＧを含む、請求項６記載の組成物。
【請求項１８】
３Ｍ−０５２、ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）及びＤＳＴＡＰを含む、請求項６記載の組成物。
【請求項１９】
抗原をさらに含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記抗原は、結核関連抗原、インフルエンザ関連抗原、赤血球凝集素関連抗原、癌関連抗原、ウイルス関連抗原及びアメーバ症関連抗原から選択される、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
前記結核関連抗原は、ＩＤ９３、ＩＤ９１及びＢＣＧからなる群から選択される、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
前記インフルエンザ関連抗原は、Ｈ５Ｎ１、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ及びインフルエンザＣからなる群から選択される、請求項２０記載の組成物。
【請求項２３】
アメーバ症関連抗原は、ＬｅｃＡである、請求項２０記載の組成物。
【請求項２４】
前記ウイルス関連抗原は、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎からなる群から選択される、請求項２０記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物は安定である、請求項４から２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物は、少なくとも約６ヶ月間安定である、請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物は、少なくとも約１年間安定である、請求項２５記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物は、２〜８℃で、少なくとも６ヶ月間安定である、請求項２５記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物は、２〜８℃で、少なくとも１年間安定である、請求項２５記載の組成物。
【請求項３０】
（ａ）ＴＬＲ４アゴニストと、
（ｂ）ＤＰＴＡＰである補助脂質とを含む、ＴＬＲ４水性製剤。
【請求項３１】
水性製剤は、４００ｎｍ以下の粒子サイズを有する安定なナノ懸濁液剤である、請求項３０記載の水性製剤。
【請求項３２】
（ａ）ＴＬＲ４アゴニストと、
（ｂ）ＤＰＴＡＰである補助脂質と、
（ｃ）ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）であるアルミニウム塩とを含む、組成物。
【請求項３３】
前記ＴＬＲ４アゴニストは、前記アルミニウム塩に吸着する、請求項３２記載の組成物。
【請求項３４】
ＴＬＲ７／８アゴニストは、前記アルミニウム塩の２５パーセントで、アルミニウム塩に吸着する、請求項３２又は３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ＴＬＲ４アゴニストは、リン酸アルミニウム（aluminum phosphate）に吸着する、請求項３０から３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ＴＬＲ４アゴニストは、３Ｄ−モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）を含む、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ＴＬＲ４アゴニストは、ＧＬＡを含む、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ＴＬＲ４アゴニストは、一般式（ＩＶ）の合成ＧＬＡ、
【化１】
2019519504.tif 000027
（ＩＶ）
又は薬剤的に許容できるその塩を含むものであって、式中、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６は、同一であるか又は異なるものであり、独立に−Ｏ−、−ＮＨ−又は−（ＣＨ２）−であり、
Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９及びＬ１０は、同一であるか又は異なるものであり、独立に、存在しないか又は−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｙ１は、酸官能基であり、
Ｙ２及びＹ３は、同一であるか又は異なるものであり、独立に−ＯＨ、−ＳＨ又は酸官能基であり、
Ｙ４は、−ＯＨ又は−ＳＨであり、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、同一であるか又は異なるものであり、独立に、炭素数８〜１３のアルキルであり、
Ｒ２及びＲ４は、同一であるか又は異なるものであり、独立に、炭素数６〜１１のアルキルである、請求項３７記載の組成物。
【請求項３９】
前記ＴＬＲ４アゴニストは、一般式（Ｖ）の合成ＧＬＡ、
【化２】
2019519504.tif 000028
（Ｖ）
又は薬剤的に許容できるその塩を含むものであって、式中、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、炭素数１１〜２０のアルキルであり、Ｒ２及びＲ４は、炭素数１２〜２０のアルキルである、請求項３７記載の組成物。
【請求項４０】
前記ＴＬＲ４アゴニストは、以下の一般式の合成ＧＬＡ：
【化３】
2019519504.tif 000029
又は薬剤的に許容できるその塩を含む、請求項３７記載の組成物。
【請求項４１】
抗原をさらに含む、請求項３０から４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記抗原は、結核関連抗原、インフルエンザ関連抗原、赤血球凝集素関連抗原、癌関連抗原、ウイルス関連抗原及びアメーバ症関連抗原から選択される、請求項４１記載の組成物。
【請求項４３】
前記結核関連抗原は、ＩＤ９３、ＩＤ９１及びＢＣＧからなる群から選択される、請求項４１記載の組成物。
【請求項４４】
前記インフルエンザ関連抗原は、Ｈ５Ｎ１、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ及びインフルエンザＣからなる群から選択される、請求項４１記載の組成物。
【請求項４５】
前記アメーバ症関連抗原は、ＬｅｃＡである、請求項４１記載の組成物。
【請求項４６】
前記ウイルス関連抗原は、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎からなる群から選択される、請求項４１記載の組成物。
【請求項４７】
前記組成物は安定である、請求項３０から４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記組成物は、少なくとも約６ヶ月間安定である、請求項４７記載の組成物。
【請求項４９】
前記組成物は、少なくとも約１年間安定である、請求項４７記載の組成物。
【請求項５０】
前記組成物は、２〜８℃で、少なくとも６ヶ月間安定である、請求項４７記載の組成物。
【請求項５１】
前記組成物は、２〜８℃で、少なくとも１年間安定である、請求項４７記載の組成物。
【請求項５２】
請求項１から５１のいずれか一項に記載の製剤又は組成物を含む、医薬組成物。
【請求項５３】
前記医薬組成物はワクチンである、請求項５２記載の医薬組成物。
【請求項５４】
抗原をさらに含む、請求項５２又は５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記抗原は、結核関連抗原、インフルエンザ関連抗原、赤血球凝集素関連抗原、癌関連抗原、ウイルス関連抗原及びアメーバ症関連抗原から選択される、請求項５４記載の組成物。
【請求項５６】
前記結核関連抗原は、ＩＤ９３、ＩＤ９１及びＢＣＧからなる群から選択される、請求項５５記載の組成物。
【請求項５７】
前記インフルエンザ関連抗原は、Ｈ５Ｎ１、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ及びインフルエンザＣからなる群から選択される、請求項５５記載の組成物。
【請求項５８】
前記アメーバ症関連抗原は、ＬｅｃＡである、請求項５５記載の組成物。
【請求項５９】
前記ウイルス関連抗原は、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎からなる群から選択される、請求項５５記載の組成物。
【請求項６０】
前記組成物は安定である、請求項５２から５９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
組成物は、少なくとも約６ヶ月間安定である、請求項６０記載の医薬組成物。
【請求項６２】
組成物は、少なくとも約１年間安定である、請求項６０記載の医薬組成物。
【請求項６３】
組成物は、２〜８℃で、少なくとも６ヶ月間安定である、請求項６０記載の医薬組成物。
【請求項６４】
組成物は、２〜８℃で、少なくとも１年間安定である、請求項６０記載の医薬組成物。
【請求項６５】
対象において免疫応答を刺激する方法であって、該方法が、前記対象に請求項１から６４のいずれか一項に記載の製剤又は組成物を投与することによって、前記対象において免疫応答を刺激することを含む、方法。
【請求項６６】
前記免疫応答は、非特異的免疫応答である、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
前記免疫応答は、抗原特異的免疫応答である、請求項６５記載の方法。
【請求項６８】
前記免疫応答は、Ｂ細胞の活性化、Ｔ細胞の活性化、抗体の産生又はサイトカインの放出に関与する、請求項６５記載の方法。
【請求項６９】
前記組成物は、単剤療法に用いられる、請求項６５記載の方法。
【請求項７０】
前記組成物は、アレルギー、中毒、癌又は自己免疫の治療に用いられる、請求項６５記載の方法。
【請求項７１】
前記組成物は、ワクチンに用いられる、請求項６５記載の方法。 
【請求項７２】
前記組成物の投与経路は、経口、静脈、皮内、経皮、経鼻、皮下又は経肛門である、請求項６５から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記対象は、ヒトである、請求項６５から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記対象は、非ヒト哺乳動物である、請求項６５から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記非ヒト哺乳動物は、イヌ、ウシ又はウマである、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニスト及び補助脂質を含む水性製剤を調製する方法であって、前記ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニスト及び前記補助脂質を含む組成物が、１ｎｍから約４５０ｎｍの範囲にある粒子を含み、前記方法が、
（ａ）ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニスト及び補助脂質を溶媒中で混合して溶液を作製することと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記溶液から溶媒を除去して膜組成物を作製することと、
（ｃ）ステップ（ｃ）の前記膜組成物を再水和して再水和組成物を作製することと、
（ｄ）前記再水和組成物を高エネルギー源に晒してナノ懸濁液剤組成物を作製することとを含む、方法。
【請求項７７】
前記高エネルギー源は、マイクロフルイダイザー、エクストルーダー、超音波処理器、シルバーソンミキサー（silverson mixer）又はホモジナイザーより発生する、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
抗原を前記ナノ懸濁液剤組成物と混合することをさらに含む、請求項７６記載の方法。
【請求項７９】
アルミニウム塩を前記ナノ懸濁液剤組成物と混合することをさらに含む、請求項７６記載の方法。
【請求項８０】
アルミニウム塩及び抗原を前記ナノ懸濁液剤組成物と混合することをさらに含む、請求項７６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年５月１６日出願の米国仮出願第６２／３３７，３２２号の利益を主張し、その全体を参照することによりここに組み入れられたものとする。
連邦政府委託研究又は開発に関する記載
【０００２】
この発明は、米国保健福祉省（U.S. Department of Health and Human Services）の事前準備・対応担当次官補局（ＡＳＰＲ（Office of the Assistant Secretary for Preparedness and Response））内にある米国生物医学先端研究開発局（ＢＡＲＤＡ（Biomedical Advanced Research and Development Authority））により授与された契約番号ＨＨＳＯ１００２０１００００３９Ｃで政府により援助がなされた。政府は、この発明において確かな権利を有する。
【０００３】
本発明は、医薬品製剤及びワクチン製剤の分野に関する。より詳細には、本明細書に記載の実施形態は、任意にアルミニウム塩に吸着することが可能である、ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニスト及び補助脂質（helper lipid）を含むアジュバントの安定な水性製剤に関する。
【背景技術】
【０００４】
２０世紀初頭のＧｌｅｎｎｙの先駆的な功績以来、アルミニウム塩がヒトワクチン中で最も広く用いられるアジュバントとなり、様々なワクチン抗原と共に安全かつ好適な無類の歴史を生んできた（１）。アルミニウム塩は概して、大きい表面積及び高電荷密度を伴う半晶質のナノ粒子及びマイクロ粒子を含む。それらは、ワクチン抗原がアルミニウム塩粒子（２）の表面に最適に吸着するときに、アジュバントとして最も有効となり得る。アルミニウム塩は、ワクチン抗原に対する抗体応答を増強するのに有効であるが、それらがワクチン抗原に対する細胞免疫を実質的に増大させるということをほとんど示さない。効果的な細胞免疫の誘導は、結核、ＨＩＶ及びマラリアを含むいくつかの疾患にとっての有効なワクチンの開発に恐らく不可欠である。したがって、追加的な免疫増強剤をアルミニウム塩に吸着させることもまた、ワクチン製剤開発における最優先の検討事項であるはずである。そのため、米国ＦＤＡが２００９年にヒト用にグラクソスミスクライン社のヒトパイローマウイルスワクチン、サーバリックス（Ｃｅｒｖａｒｉｘ（（登録商標））を認可したときに、アジュバントの臨床用途が２００９年に進歩したが、サーバリックス（Ｃｅｒｖａｒｉｘ（（登録商標）））はＡＳ０４、オキシ水酸化アルミニウム（aluminum oxyhydroxide）に吸着したＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）リガンドのモノホスホリルリピドＡ（monophosphoryl lipid A）（ＭＰＬ（登録商標））よりなるアジュバント系を含有する（３）。ＴＬＲ４アゴニストに加えて、前臨床及び臨床開発において他のパターン認識受容体（ＰＲＲ）リガンドは、アルミニウム塩への吸着の恩恵を受け得る（４）。ＴＬＲ４リガンドＭＰＬ（登録商標）等の一部のＰＲＲリガンドは、物理化学的構造の互換性に起因して、一部のアルミニウム塩に吸着する。このように、オキシ水酸化アルミニウムは、リン酸塩リガンド交換及び／又は静電的相互作用に起因して、こうした分子を吸着する（２）。しかしながら、ＴＬＲ７／８アゴニストイミダゾキノリン等の他の関心のＰＲＲリガンドは、オキシ水酸化アルミニウムへの吸着を容易にすることとなるような構造的部分を含有していない。
【０００５】
本明細書に記載する、特許出願及び特許公開公報を含む全ての参考文献は、あたかも独立の各文献が特別にかつ個別に示されて参照によって組み入れられるかのように、それらの全体を参照によりここに組み入れるものとする。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、（ａ）ＴＬＲアゴニストと、（ｂ）補助脂質（helper lipid）とを含む、ＴＬＲ水性製剤を提供する。或る実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ５アゴニスト、ＴＬＲ６アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ７／８アゴニスト、又はＴＬＲ９アゴニストを含む。或る実施形態では、該水性製剤はアルミニウム塩をさらに含む。
【０００７】
本開示は、（ａ）ＴＬＲ７／８アゴニストと、（ｂ）補助脂質とを含む、ＴＬＲ７／８水性製剤を提供する。或る実施形態では、該水性製剤は、４００ｎｍ以下の粒子サイズを有する安定なナノ懸濁液剤である。
【０００８】
本開示は、（ａ）ＴＬＲ７／８アゴニストと、（ｂ）補助脂質と、（ｃ）アルミニウム塩とを含む、組成物を提供する。或る実施形態では、該ＴＬＲ７／８アゴニストは、アルミニウム塩に吸着する。或る実施形態では、該ＴＬＲ７／８アゴニストは、アルミニウム塩の２５パーセントで、アルミニウム塩に吸着する。或る実施形態では、アルミニウム塩は、水酸化アルミニウム、アルミニウム三水和物（aluminum trihydrate）、オキシ水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム（aluminum phosphate）、水酸化リン酸アルミニウム（aluminum hydroxyphosphate）、水酸化リン酸アルミニウム硫酸塩（aluminum hydroxyphosphate sulfate）及び硫酸アルミニウムカリウム（potassium aluminum sulfate）からなる群から選択される。或る実施形態では、アルミニウム塩はＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）を含む。或る実施形態では、アルミニウム塩はＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）を含む。或る実施形態では、ＴＬＲ７／８アゴニストは３Ｍ−０５２を含む。或る実施形態では、補助脂質は、リン脂質又は第四級アンモニウム塩脂質（（quaternary ammonium salt lipid））である。或る実施形態では、補助脂質は、炭素数１０〜２０のアルキル鎖を含む。或る実施形態では、補助脂質は、ＤＯＰＣ、ＤＳＰＧ、ＤＳＴＡＰ及びポリソルベート８０から選択される。或る実施形態では、補助脂質は、ＤＳＰＧ及びＤＳＴＡＰから選択される。或る実施形態では、組成物は、３Ｍ−０５２、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）及びＤＳＰＧを含む。或る実施形態では、組成物は、３Ｍ−０５２、ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）及びＤＳＴＡＰを含む。或る実施形態では、組成物は抗原をさらに含む。或る実施形態では、抗原は、結核関連抗原、インフルエンザ関連抗原、赤血球凝集素関連抗原、癌関連抗原、ウイルス関連抗原及びアメーバ症関連抗原から選択される。或る実施形態では、結核関連抗原は、ＩＤ９３、ＩＤ９１及びＢＣＧからなる群から選択される。或る実施形態では、インフルエンザ関連抗原は、Ｈ５Ｎ１、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ及びインフルエンザＣからなる群から選択される。或る実施形態では、アメーバ症関連抗原はＬｅｃＡである。或る実施形態では、ウイルス抗原はＢ型肝炎及びＣ型肝炎からなる群から選択される。或る実施形態では、組成物は安定である。或る実施形態では、組成物は、少なくとも約６ヶ月間安定である。或る実施形態では、組成物は、少なくとも約１年間安定である。或る実施形態では、組成物は、２〜８℃で、少なくとも６ヶ月間安定である。或る実施形態では、組成物は、２〜８℃で、少なくとも１年間安定である。
【０００９】
本開示は、（ａ）ＴＬＲ４アゴニストと、（ｂ）ＤＰＴＡＰである補助脂質とを含む、ＴＬＲ４水性製剤を提供する。或る実施形態では、該水性製剤は、４００ｎｍ以下の粒子サイズを有する安定なナノ懸濁液剤である。
【００１０】
本開示は、（ａ）ＴＬＲ４アゴニストと、（ｂ）ＤＰＴＡＰである補助脂質と、（ｃ）ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）であるアルミニウム塩とを含む、組成物を提供する。或る実施形態では、該ＴＬＲ４アゴニストは、アルミニウム塩に吸着する。或る実施形態では、ＴＬＲ７／８アゴニストは、アルミニウム塩の２５パーセントで、アルミニウム塩に吸着する。或る実施形態では、該ＴＬＲ４アゴニストは、リン酸アルミニウムに吸着する。或る実施形態では、該ＴＬＲ４アゴニストは、３Ｄ−モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）を含む。或る実施形態では、該ＴＬＲ４アゴニストは、ＧＬＡを含む。或る実施形態では、該ＴＬＲ４アゴニストは、一般式（ＩＶ）の合成ＧＬＡ、
【００１１】
【化１】
2019519504.tif 000002
（ＩＶ）
又は薬剤的に許容できるその塩を含むものであって、式中、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６は、同一であるか又は異なるものであり、独立に−Ｏ−、−ＮＨ−又は−（ＣＨ２）−であり、
Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９及びＬ１０は、同一であるか又は異なるものであり、独立に、存在しないか又は−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｙ１は、酸官能基であり、
Ｙ２及びＹ３は、同一であるか又は異なるものであり、独立に−ＯＨ、−ＳＨ又は酸官能基であり、
Ｙ４は、−ＯＨ又は−ＳＨであり、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、同一であるか又は異なるものであり、独立に炭素数８〜１３のアルキルであり、
Ｒ２及びＲ４は、同一であるか又は異なるものであり、独立に炭素数６〜１１のアルキルである。
【００１２】
或る実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、一般式（Ｖ）の合成ＧＬＡ、
【００１３】
【化２】
2019519504.tif 000003
（Ｖ）
又は薬剤的に許容できるその塩を含むものであって、式中、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、炭素数１１〜２０のアルキルであり、Ｒ２及びＲ４は、炭素数１２〜２０のアルキルである。
【００１４】
或る実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の一般式の合成ＧＬＡ、
【００１５】
【化３】
2019519504.tif 000004
又は薬剤的に許容できるその塩を含むものである。
【００１６】
或る実施形態では、組成物は抗原をさらに含む。或る実施形態では、抗原は、結核関連抗原、インフルエンザ関連抗原、赤血球凝集素関連抗原、癌関連抗原、ウイルス関連抗原及びアメーバ症関連抗原から選択される。或る実施形態では、結核関連抗原は、ＩＤ９３、ＩＤ９１及びＢＣＧからなる群から選択される。或る実施形態では、インフルエンザ関連抗原は、Ｈ５Ｎ１、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ及びインフルエンザＣからなる群から選択される。或る実施形態では、アメーバ症関連抗原はＬｅｃＡである。或る実施形態では、ウイルス関連抗原はＢ型肝炎及びＣ型肝炎からなる群から選択される。或る実施形態では、組成物は安定である。或る実施形態では、組成物は、少なくとも約６ヶ月間安定である。或る実施形態では、組成物は、少なくとも約１年間安定である。或る実施形態では、組成物は、２〜８℃で、少なくとも６ヶ月間安定である。或る実施形態では、組成物は、２〜８℃で、少なくとも１年間安定である。
【００１７】
本開示は、本明細書で開示する製剤又は組成物を含む医薬組成物を提供する。或る実施形態では、医薬組成物はワクチンである。或る実施形態では、医薬組成物は抗原をさらに含む。或る実施形態では、抗原は、結核関連抗原、インフルエンザ関連抗原、赤血球凝集素関連抗原、癌関連抗原、ウイルス関連抗原及びアメーバ症関連抗原から選択される。或る実施形態では、結核関連抗原は、ＩＤ９３、ＩＤ９１及びＢＣＧからなる群から選択される。或る実施形態では、インフルエンザ関連抗原は、Ｈ５Ｎ１、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ及びインフルエンザＣからなる群から選択される。或る実施形態では、アメーバ症関連抗原はＬｅｃＡである。或る実施形態では、ウイルス関連抗原はＢ型肝炎及びＣ型肝炎からなる群から選択される。或る実施形態では、医薬組成物の組成物は安定である。或る実施形態では、組成物は、少なくとも約６ヶ月間安定である。或る実施形態では、組成物は、少なくとも約１年間安定である。或る実施形態では、組成物は、２〜８℃で、少なくとも６ヶ月間安定である。或る実施形態では、組成物は、２〜８℃で、少なくとも１年間安定である。
【００１８】
本開示は、対象において免疫応答を刺激する方法を提供するものであって、該方法は、該対象に本明細書に開示の製剤又は組成物を投与することによって、対象において免疫応答を刺激することを含む。或る実施形態では、免疫応答は非特異的免疫応答である。或る実施形態では、免疫応答は抗原特異的免疫応答である。或る実施形態では、免疫応答は、Ｂ細胞の活性化、Ｔ細胞の活性化、抗体の産生又はサイトカインの放出に関与する。或る実施形態では、組成物は単剤療法に用いられる。或る実施形態では、組成物はアレルギー、中毒、癌又は自己免疫の治療に用いられる。或る実施形態では、組成物はワクチンに用いられる。或る実施形態では、組成物の投与経路は、経口、静脈、皮内、経皮、経鼻、皮下又は経肛門である。或る実施形態では、対象はヒトである。或る実施形態では、対象は非ヒト哺乳動物である。或る実施形態では、非ヒト哺乳動物は、イヌ、ウシ又はウマである。
【００１９】
本開示では、ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニスト及び補助脂質を含む水性製剤を調製する方法を提供するものであって、ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニスト及び補助脂質を含む組成物が、１ｎｍ〜約４５０ｎｍの範囲内である粒子を含み、該方法は、（ａ）ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニスト及び補助脂質を溶媒中で混合して溶液を作製することと、（ｂ）ステップ（ａ）の溶液から溶媒を除去して膜組成物を作製することと、（ｃ）ステップ（ｃ）の膜組成物を再水和して再水和組成物を作製することと、（ｄ）再水和組成物を高エネルギー源に晒してナノ懸濁液剤組成物を作製することとを含む。或る実施形態では、該高エネルギー源は、マイクロフルイダイザー、エクストルーダー、超音波処理器、シルバーソンミキサー（silverson mixer）又はホモジナイザーより発生する。或る実施形態では、方法は、抗原をナノ懸濁液剤組成物と混合することをさらに含む。或る実施形態では、方法は、アルミニウム塩をナノ懸濁液剤組成物と混合することをさらに含む。或る実施形態では、方法は、アルミニウム塩と抗原とをナノ懸濁液剤組成物と混合することをさらに含む。
【００２０】
本発明のこれらの態様及び他の態様について、以下の発明を実施するための形態及び添付の図面を参照することにより明らかになることとなる。さらに、本発明の特定の態様をより詳細に説明する、様々な参考文献を本明細書において記載するが、それらの全体が参照によって組み込まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、３Ｍ−０５２の構造と種々のリン脂質とを示している。
【００２２】
【図２−１】図２Ａ〜２Ｄは、３Ｍ−０５２水性懸濁液剤の物理的性質と、アルミニウム塩に対する吸着性を示している。図２Ａは、製造時の３Ｍ−０５２水性懸濁液剤の粒子サイズと多分散指数とを示している（同一サンプルからの３測定値の平均±標準偏差を示している）。図２Ｂは、選択した３Ｍ−０５２懸濁液剤の２週間にわたる粒子サイズ安定性を示している（同一サンプルからの３測定値の平均±標準偏差を示している）。図２Ｃは、選択した３Ｍ−０５２懸濁液剤のゼータ電位を示している（ゼータ電位に関して同一サンプルからの９測定値の平均±標準偏差を示している）。図２Ｄは、３Ｍ−０５２水性懸濁液剤のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）又はＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）に対する吸着性を示しており、アルミニウム塩含有サンプルの遠心分離後の上清中の３Ｍ−０５２濃度を、アルミニウム塩を含有しないサンプルと比較して、モニタリングすることによって評価した。サンプルは、２０００×ｇで２〜３分間遠心分離を行った。エラーバーは、異なるバッチの３Ｍ−０５２を用いた２つの別個の実験からの標準偏差を表すものであり、各実験からの各サンプルは、デュプリケートで実行した。
【図２−２】同上。
【００２３】
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、単独又はオキシ水酸化アルミニウム存在中での３Ｍ−０５２−ＡＦの粒子サイズ特性を示している。図３Ａは、強度基準光散乱サイズ分布を示している。図３Ｂは、体積基準光散乱サイズ分布を示している。
【００２４】
【図４】図４は、上清のＵＶ吸光度によって測定した、３Ｍ−０５２−ＡＦのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）に対する吸着等温線を示している。エラーバーは、異なるバッチでの３Ｍ−０５２を用いた２つの別個の実験からの標準偏差を表すものであり、各実験からの各サンプルは、デュプリケートで実行した。
【００２５】
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、アルミニウム（ａｌｕｍ）と３Ｍ０５２とが、協同的な抗原特異的免疫原性を誘導することを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＩＤ９３（０．５μｇ）を単独で、又は、３Ｍ−０５２−ＡＦ（０．５μｇ）で、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）で、もしくはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）に結合した３Ｍ−０５２−ＡＦ（０．５μｇ）でのアジュバントを含むＩＤ９３（０．５μｇ）での筋肉内注射により、３週空けて３回免疫した。図５Ａでは、初回免疫後３週目の、ＩＤ９３−特異的なＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｃ及び全ＩｇＧ（ＩｇＧＴ）の血清エンドポイント力価をＥＬＩＳＡで決定した。Ｎ＝４〜５マウス／群。図５Ｂでは、最終免疫後４週目の、脾細胞をブレフェルジンＡの存在中で培地又はＩＤ９３で８時間再刺激して、サイトカイン産生ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度をＩＤ９３特異反応から培地の反応を減算することによって決定した。データは、１群当たり４〜５動物で同様の結果であった２つの実験のものを表している。平均±標準誤差（s.e.m.）を示している。＊ｐ＜０．０５対ＩＤ９３、＃ｐ＜０．０５対ＩＤ９３＋３Ｍ−０５２−ＡＦ、†ｐ＜０．０５対ＩＤ９３＋３Ｍ−０５２−Ａｌｕｍである。
【００２６】
【図６−１】図６Ａ〜６Ｄは、３Ｍ−０５２の用量漸増法を示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＩＤ９３（０．５ｕｇ）を単独で、又は、３Ｍ−０５２−ＡＦ（０．１、０．５、１又は１０μｇ）で、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）で、もしくはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）に結合した３Ｍ−０５２−ＡＦ（０．１、０．５、１又は１０μｇ）でのアジュバントを含むＩＤ９３（０．５μｇ）での筋肉内注射により、３週空けて２回免疫した。図６Ａ及び６Ｂでは、初回免疫後３週目の、ＩＤ９３−特異的なＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｃ及び全ＩｇＧの血清エンドポイント力価をＥＬＩＳＡで決定した。Ｎ＝５マウス／群。図６Ｃ及び６Ｄでは、最終免疫後１週目の、脾細胞をブレフェルジンＡの存在中で培地又はＩＤ９３で８時間再刺激して、サイトカイン産生ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度をＩＤ９３特異反応から培地の反応を減算することによって決定した。データは、１群当たり５動物で同様の結果であった２つの実験のものを表している。平均±標準誤差（s.e.m.）を示している。
【図６−２】同上。
【００２７】
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、ＴＬＲ７が３Ｍ−０５２のアジュバント活性を誘導するＴＨ１に用いられることを示している。野生型Ｃ５７ＢＬ／６又はＢ６．１２９Ｓ１−ＴＬＲ７ｔｍ１Ｆｌｖ（ＴＬＲ７−／−）マウスを、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）で、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）と結合した３Ｍ−０５２−ＡＦ（１μｇ）で、又はＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）と結合したＧＬＡ-ＡＦ（５μｇ）でのアジュバントを含むＩＤ９３（０．５μｇ）を、３週空けて筋肉内注射することで２回免疫した。図７Ａでは、初回免疫後３週目に、ＩＤ９３−特異的なＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｃの血清抗体力価を決定した。図７Ｂは、第２回免疫後１週目に、次いでＩＤ９３で脾細胞の生体外刺激することで定量化したＩＤ９３−特異的なＣＤ４  Ｔ細胞を示している。Ｎ＝５マウス／群。データは、１群当たり５動物で同様の結果であった２つの実験のものを表している。バーが平均±標準誤差（s.e.m.）を示している。＊ｐ＜０．０５である。
【００２８】
【図８−１】図８Ａ〜８Ｄは、３Ｍ−０５２−Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌと共に製剤されたＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原が、３Ｍ−０５２−ＡｄｊｕＰｈｏｓ、３Ｍ−０５２単独、又はいずれかのタイプのＡｌｕｍ単独と共に製剤されたＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原と比較して、抗体のＴＨ１−型細胞応答の増強を誘導することを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原（１０μｇ）を単独で、又は３Ｍ−０５２−ＡＦ（１μｇ）で、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）で、ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）で、３Ｍ−０５２−Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）で、もしくは３Ｍ−０５２−ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）でのアジュバントを含むＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原（１０μｇ）での筋肉内注射により、３週空けて３回免疫した。図８Ａは、実験のプロトコルを示している。図８Ｂは、初回免疫後３週目の、ＥＬＩＳＡで決定した、ＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原特異的なＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｃ及び全ＩｇＧ（ＩｇＧ）の血清エンドポイント力価の結果を示している。Ｎ＝５マウス／群であり、バーが平均±標準偏差を示している。図８Ｃでは、第２回免疫後１週目の、脾細胞をＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原で再刺激して、サイトカイン産生ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリーによって決定した。Ｎ＝５マウス／群であり、バーが平均±標準偏差を示している。図８Ｄでは、第２回及び第３回免疫後３週目の、ＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原特異的な骨髄抗体分泌細胞をＥＬＩＳＰＯＴによって決定した。Ｎ＝５マウス／群であり、バーが平均±標準誤差（s.e.m.）を示している。＊ｐ＜０．０５対ＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原、＃ｐ＜０．０５対３Ｍ−０５２−ＡＦ、†ｐ＜０．０５対対応するＡｌｕｍ（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）又はＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標））、‡ｐ＜０．０５対３Ｍ−０５２-ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）である。
【図８−２】同上。
【００２９】
【図９】図９Ａ〜９Ｄは、３Ｍ−０５２及びアルミニウムが協同して、免疫化に対する先天応答を増大させることを示している。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、３Ｍ−０５２−ＡＦ（１μｇ）で、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）で、ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）で、３Ｍ−０５２−Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）で、又は３Ｍ−０５２−ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）で筋肉内に免疫した。１８時間後、鼠径部の流入領域リンパ節を取得し、ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋炎症系単核細胞の流入（図９Ａ）、Ｂ細胞におけるコスティミュラトリー分子ＣＤ８６、炎症系単核細胞又はＤＣの発現（図９Ｂ）、リンパ細胞におけるＣＤ６９の発現（図９Ｃ）、及び、それぞれＮＫ細胞ならびに好中球によるＩＦＮ−γ又はＩＬ−１ｂの発現（図９Ｄ）を分析した。Ｎ＝５マウス／群。データは、１群当たり５動物で同様の結果であった２つの実験のものを表している。バーが平均＋標準誤差（s.e.m.）を示している。＊ｐ＜０．０５対なし、＃ｐ＜０．０５対３Ｍ−０５２−ＡＦ、†ｐ＜０．０５対対応するＡｌｕｍ（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）又はＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標））、‡ｐ＜０．０５対３Ｍ−０５２-ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）である。
【００３０】
【図１０】図１０は、６ヶ月にわたる３Ｍ−０５２−ＤＳＰＧのナノ懸濁液剤の粒子サイズ及びサイズの多分散を示している（ｎ＝６バッチ、平均±標準偏差を示している）。
【００３１】
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｃは、３Ｍ−０５２−Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌと共に製剤したＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原が、腟のＴＨ１−型細胞応答の増強を誘導することを示している。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原（１０μｇ）を単独で、又は、３Ｍ−０５２−ＡＦ（１μｇ）、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）で、ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）で、３Ｍ−０５２−Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）で、もしくは３Ｍ−０５２−ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）でのアジュバントを含むＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原（１０μｇ）での筋肉内注射により、３週空けて３回免疫した。図１１Ａは、実験のプロトコルを示している。図１１Ｂでは、第３回免疫後３週目の、ＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原特異的なＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｃ及び全ＩｇＧの膣洗浄エンドポイント力価をＥＬＩＳＡで決定した。Ｎ９〜１０マウス／群であり、バーが平均±標準偏差を示している。図１１Ｃでは、各免疫後１週目の、脾細胞をＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原で再刺激して、サイトカイン産生ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリーによって決定した。Ｎ＝５マウス／群であり、バーが平均±標準誤差（s.e.m.）を示している。＊ｐ＜０．０５対ＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原、＃ｐ＜０．０５対３Ｍ−０５２−ＡＦ、†ｐ＜０．０５対対応するＡｌｕｍ（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）又はＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標））、‡ｐ＜０．０５対３Ｍ−０５２-ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）である。
【図１１−２】同上。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本開示は、ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニストと、補助脂質（helper lipid）とを含む組成物であって、水溶液中でアルミニウム塩と結合するのに好適である該組成物に関する。本開示は、ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニストと、補助脂質とを含む、水性製剤を提供する。本開示はまた、アルミニウム塩に吸着する補助脂質と共に、ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニストを含むアジュバントの安定な水性組成物を提供する。
【００３３】
ＴＬＲリガンドのアルミニウム塩に対する吸着が、より局所的な輸送をもたらし、増強したアジュバント活性を促進し得る。しかしながら、特定のＴＬＲアゴニストの構造は、アルミニウムへの有効な吸着を可能にするものではないことがある。本開示は、補助脂質を介してアルミニウム塩への吸着を促進するＴＬＲアゴニストを含む脂質系組成物の組成物に関する。
【００３４】
本開示は、安定な水性製剤を生じる、補助脂質を伴うＴＬＲアゴニスト製剤を介して、ＴＬＲアゴニストのアルミニウム及び／又は抗原との生理化学の構造的な互換性の強化を提供する。安定な水性製剤又はナノ懸濁液剤の調製は、それを経てＴＬＲアゴニスト及び補助脂質の粒子が約４５０ｎｍ以下の大きさになるようなエネルギー入力（超音波処理又は微少溶液操作（microfluidization））によって容易になる。水性製剤又はナノ懸濁液剤は、約２〜８℃で、少なくとも約１週間、２週間、４週間、３ヶ月、６ヶ月、９ヶ月又は１年間、安定である。水性製剤又はナノ懸濁液剤は、ＴＬＲアゴニスト及び補助脂質の組成物であって、該組成物は、本明細書に開示するように所定の期間にわたって安定であるようなＴＬＲアゴニストと補助脂質との分散物である。
【００３５】
本明細書に記載の水性製剤を含む組成物（ワクチン組成物、医薬組成物等）もまた提供される。一部の実施形態では、組成物は、対象における免疫応答を刺激するのに有用である。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、１つ又は複数の抗原をさらに含む。
【００３６】
本記載では、「約」及び「実質的に〜からなる」という語は、別に示されていない限り、記載された範囲、値又は構造の±２０%を意味する。本明細書で用いる“ａ”及び“ａｎ”という語は、列挙された要素のうちの「１つ又は複数」を指すということを理解されたい。択一（例えば、「又は（or）」）の使用は、二者択一の選択肢のうちの１つ、両方又は任意のそれらの組み合わせのうちのいずれかを意味するということを理解されたい。本明細書で用いる場合「含む（include）、「有する（have）」及び「含む・備える（comprise）」という語は、同義で用いるものであって、いずれの語もその変化形も、非限定的なものとして解釈されることを意図している。
【００３７】
以下の語は、別に示されていない限り、以下の意味を有する。規定されていないあらゆる語は、その技術分野で認識されている意味を有するものとする。
【００３８】
「アルキル」は、１〜２０個の炭素原子を含み、或る好ましい実施形態では１１〜２０個の炭素原子を含む、直鎖又は分枝の、非環式又は環式の、不飽和又は飽和の脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルには、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル等を含む、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル等が含まれ、一方、飽和分枝アルキルには、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル等が含まれる。代表的な飽和環式アルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等が含まれ、一方不飽和環式アルキルには、シクロペンテニル及びシクロヘキセニル等が含まれる。環式アルキルは、本明細書では、単素環（homocycle）又は単素環式（homocyclic ring）とも称する。不飽和アルキルは、隣接する炭素原子間に少なくとも１つの二重結合又は三重結合（それぞれ「アルケニル」又は「アルキニル」と称する）を含有する。代表的な直鎖及び分枝アルケニルには、エチレニル（ethylenyl）、プロピレニル（propylenyl,）、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル（isobutylenyl）、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル等が含まれ、一方代表的な直鎖及び分枝アルキニルには、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニル等が含まれる。
【００３９】
「ハロ」又は「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを指す。
【００４０】
「ヒドロキシ」又は「ヒドロキシル」は、−ＯＨ基を指す。
【００４１】
「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキル基を指し、アルキルは本明細書で規定されている。アルコキシには、例として、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ等が含まれる。
【００４２】
「アシルアミノ」は、−ＮＲ２０Ｃ（Ｏ）Ｒ２１基を指し、Ｒ２０及びＲ２１は、水素、アルキル及びアリールから独立に選択される。
【００４３】
「酸官能基（acid functional group）」は、水性溶媒中でプロトンを供与することが可能である官能基を意味する（すなわち、ブレンステッド・ローリーの酸）。プロトン供与後、酸官能基は、負電荷をもつ種になる（すなわち、酸官能基の共役塩基）。酸官能基の例としては、−ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）２（リン酸塩）、−ＯＳ（＝Ｏ）（ＯＨ）２（硫酸塩）、−ＯＳ（ＯＨ）２（亜硫酸塩）、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（カルボン酸塩）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（アスパラギン酸塩）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ（コハク酸塩）及び−ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＨ）２（カルボキシメチルリン酸塩）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
組成物
【００４４】
本開示は、ＴＬＲアゴニストと、補助脂質とを含む、水性製剤を提供する。或る実施形態では、ＴＬＲアゴニスト及び補助脂質を含む水性製剤又はナノ懸濁液剤を、アルミニウム塩と混合させる。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、１つ又は複数の薬剤又は抗原をさらに含むことが可能である。
【００４５】
本開示は、（１）ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニストと、（２）補助脂質とを含む、水性製剤を提供する。或る実施形態では、ＴＬＲ７／８アゴニスト及び補助脂質を含む組成物は、高エネルギー源に晒されて、水性製剤又はナノ懸濁液剤組成物を生成する。或る実施形態では、ＴＬＲ４アゴニスト及び補助脂質を含む組成物は、高エネルギー源に晒されて、水性製剤又はナノ懸濁液剤組成物を生成する。或る実施形態では、水性製剤又はナノ懸濁液剤組成物は、サイズが約１ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲、例えば約４００ｎｍ未満又は約２００ｎｍ未満等の粒子を含む。
【００４６】
或る実施形態では、ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニスト及び補助脂質を含む水性製剤又はナノ懸濁液剤を、アルミニウム塩と混合させる。本開示は、（１）ＴＬＲ７／８アゴニストと、（２）補助脂質と、（３）アルミニウム塩とを含む、組成物を提供する。本開示は、（１）ＴＬＲ４アゴニストと、（２）補助脂質と、（３）アルミニウム塩とを含む、組成物を提供する。
【００４７】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、１つ又は複数の薬剤又は抗原をさらに含むことが可能である。本開示は、（１）ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニストと、（２）補助脂質とを含み、１つ又は複数の薬剤又は抗原をさらに含む、水性製剤を提供する。本開示は、（１）ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニストと、（２）補助脂質と、（３）アルミニウム塩とを含み、１つ又は複数の薬剤又は抗原をさらに含む、水性組成物を提供する。本開示は、（１）ＴＬＲ７／８アゴニストと、（２）補助脂質と、（３）アルミニウム塩とを含み、１つ又は複数の薬剤又は抗原をさらに含む、水性組成物を提供する。本開示は、（１）ＴＬＲ４アゴニストと、（２）補助脂質と、（３）アルミニウム塩とを含み、１つ又は複数の薬剤又は抗原をさらに含む、水性組成物を提供する。
【００４８】
水性組成物である組成物の説明を、以下に提供する。
ＴＬＲアゴニスト 
【００４９】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＴＬＲアゴニストは、疎水性又は比較的疎水性であり、補助脂質の不在下であると、高エネルギー源の入力の有無にかかわらず、水と混合したときに本開示の安定な水性ナノ懸濁液剤を実質的に形成しない。一部の実施形態では、本開示のＴＬＲアゴニストは、炭化水素鎖等のナノ極性部分を含有する。一部の実施形態では、本開示のＴＬＲアゴニストは、有機溶媒に可溶であるが、水に不溶であるか又は水への溶解度が乏しく、本開示の補助脂質の不在下であると、水溶液中で大きい凝集体ばかりになる傾向を有する。ＴＬＲアゴニストの物理化学的性質が、Membrane Structural Biology: With Biochemical and Biophysical Foundations by Mary Luckey, Cambridge University Press, New York, 2014に説明されているが、その全体を参照によって本明細書に組み込むものとする。
【００５０】
本明細書で用いる場合「水に不溶」は、化合物を水と混合したときに、例えば、室温、例えば約２５℃〜５０℃で水と混合したときに、溶解しない化合物を指す。本明細書で用いる場合「水への溶解度が低い」は、例えば、室温、例えば約２５℃〜５０℃等で水と混合したときに、水中で約３０ｍｇ／ｍＬ以下の溶解度を有する化合物を指す。本明細書で用いる場合「水への溶解度が乏しい」は、水に不溶又は低い水溶性である化合物、例えば非極性化合物を指すために用いることが可能である。
ＴＬＲ７／８アゴニスト
【００５１】
本明細書では、本明細書に記載の組成物に用いることが可能であるＴＬＲ７／８アゴニストが提供される。本明細書で用いる場合「ＴＬＲ７／８アゴニスト」は、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８又は両方とのその相互作用を介してその生物活性に影響を及ぼすアゴニストを指す。そうした生物活性には、先天免疫系を介した免疫応答を増強する、ＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８媒介シグナル伝達の誘導が含まれるが、これに限定されない。一部の実施形態では、ＴＬＲは、イミダゾキノリンアミン誘導体（例えば米国特許第４，６８９，３３８号（Ｇｅｒｓｔｅｒ）を参照）であるが、他の化合物のクラスも同様に公知である（例えば米国特許第５，４４６，１５３号（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，１９４，４２５号（Ｇｅｒｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）及び米国特許第６，１１０，９２９号（Ｇｅｒｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、及び国際公開第２００５／０７９１９５号（Ｈａｙｓ  ｅｔ  ａｌ．）を参照）。
【００５２】
或る実施形態では、ＴＬＲ７／８アゴニストは、以下の一般式（Ｉ）の構造の化合物、：
【００５３】
【化４】
2019519504.tif 000005
（Ｉ）
又は薬剤的に許容できるその塩であって、式中、
Ｒ１０は、水素及び炭素数１〜６のアルキルからなる群から選択され、
Ｒ１１ｂは、ハロ、ヒドロキシル、炭素数１〜６のアルキル及びアシルアミノからなる群から選択される１つ又は複数の群で置換されていてもよい炭素数１〜６のアルキルである。
【００５４】
一般式（Ｉ）の一部の実施形態では、Ｒ１０は水素である。一部の実施形態では、Ｒ１０は炭素数１〜６のアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１０はメチル、エチル、ｎ−プロピル又はｎ−ブチルである。一部の実施形態では、Ｒ１０はｎ−ブチルである。
【００５５】
一般式（Ｉ）の一部の実施形態では、Ｒ１１ｂはアシルアミノで置換されている炭素数２〜４のアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１１ｂは−（ＣＨ２）４−アシルアミノである。一部の実施形態では、Ｒ１１ｂは−（ＣＨ２）４−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−炭素数１〜２５のアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１１ｂは−（ＣＨ２）４−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−炭素数１５〜２５のアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１１ｂは−（ＣＨ２）４−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−炭素数１５〜２０のアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ１１ｂは−（ＣＨ２）４−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−炭素数１７のアルキルである。
【００５６】
或る実施形態では、ＴＬＲ７／８アゴニストは、以下の構造の化合物又は薬剤的に許容できるその塩の化合物である：
【００５７】
【化５】
2019519504.tif 000006
（３Ｍ−０５２）
或る好ましい実施形態では、本明細書の組成物において用いられるＴＬＲ７／８アゴニストは、米国特許第９，２４２，９８０号に記載されるＮ−（４−｛［４−アミノ−２−ブチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］オキシ｝ブチル）オクタデカンアミド）、３Ｍ−０５２を含む。
ＴＬＲ４アゴニスト
【００５８】
或る好ましい実施形態では、本明細書の組成物において用いられるＴＬＲ４アゴニストは、グルコピラノシルリピドアジュバント（ＧＬＡ（glucopyranosyl lipid adjuvant））、例えば米国特許出願公開第２００７／０２１０１７号、第２００９／０４５０３３号、第２０１０／０３７４６６号及び第２０１０／０３１０６０２号に記載のもの等を含み、その内容は、それら全体を参照によって本明細書に組み込むものとする。
【００５９】
例えば、或る実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の一般式（ＩＩ）の構造を有する合成ＧＬＡアジュバント、：
【００６０】
【化６】
2019519504.tif 000007
（ＩＩ）
又は薬剤的に許容できるその塩であって、式中、
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５及びＬ６は、同一であるか又は異なるものであり、独立に−Ｏ−、−ＮＨ−又は−（ＣＨ２）−であり、
Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９及びＬ１０は、同一であるか又は異なるものであり、独立に、存在しないか又は−Ｃ（＝Ｏ）−であり、
Ｙ１は、酸官能基であり、
Ｙ２及びＹ３は、同一であるか又は異なるものであり、独立に−ＯＨ、−ＳＨ又は酸官能基であり、
Ｙ４は、−ＯＨ又は−ＳＨであり、
Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、同一であるか又は異なるものであり、独立に炭素数８〜１３のアルキルであり、
Ｒ２及びＲ４は、同一であるか又は異なるものであり、独立に炭素数６〜１１のアルキルである。
【００６１】
合成ＧＬＡ構造の一部の実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、炭素数１０のアルキルであり、Ｒ２及びＲ４は炭素数８のアルキルである。或る実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、炭素数１１のアルキルであり、Ｒ２及びＲ４は炭素数９のアルキルである。
【００６２】
例えば、或る実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の一般式（ＩＩＩ）の構造を有する合成ＧＬＡアジュバント又は薬剤的に許容できるその塩である：
【００６３】
【化７】
2019519504.tif 000008
（ＩＩＩ）。
【００６４】
上記合成ＧＬＡ構造の或る実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、炭素数１１〜２０のアルキルであり、Ｒ２及びＲ４は炭素数１２〜２０のアルキルである。他の或る実施形態では、ＧＬＡは上記に記載した一般式を有し、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、炭素数１１のアルキルであり、Ｒ２及びＲ４は炭素数１３のアルキルである。他の或る実施形態では、ＧＬＡは上記に記載した一般式を有し、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、炭素数１０のアルキルであり、Ｒ２及びＲ４は炭素数８のアルキルである。
【００６５】
他の或る実施形態では、ＧＬＡは上記に記載した一般式を有し、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、炭素数１１〜２０のアルキルであり、Ｒ２及びＲ４は炭素数９〜２０のアルキルである。或る実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、炭素数１１のアルキルであり、Ｒ２及びＲ４は炭素数９のアルキルである。
【００６６】
或る実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の一般式（ＩＶ）の構造を有する合成ＧＬＡアジュバント又は薬剤的に許容できるその塩である：
【００６７】
【化８】
2019519504.tif 000009
（ＩＶ）。
【００６８】
上記ＧＬＡ構造の或る実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、炭素数１１〜２０のアルキルであり、Ｒ２及びＲ４は炭素数９〜２０のアルキルである。或る実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、炭素数１１のアルキルであり、Ｒ２及びＲ４は炭素数９のアルキルである。
【００６９】
或る実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の一般式（Ｖ）の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントである：
【００７０】
【化９】
2019519504.tif 000010
（Ｖ）。
【００７１】
上記ＧＬＡ構造の或る実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、炭素数１１〜２０のアルキルであり、Ｒ２及びＲ４は炭素数９〜２０のアルキルである。或る実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、炭素数１１のアルキルであり、Ｒ２及びＲ４は炭素数９のアルキルである。
【００７２】
或る実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の一般式（ＶＩ）の構造を有する合成ＧＬＡアジュバント又は薬剤的に許容できるその塩である：
【００７３】
【化１０】
2019519504.tif 000011
（ＶＩ）。
【００７４】
上記ＧＬＡ構造の或る実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、炭素数１１〜２０のアルキルであり、Ｒ２及びＲ４は炭素数９〜２０のアルキルである。或る実施形態では、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、炭素数１１のアルキルであり、Ｒ２及びＲ４は炭素数９のアルキルである。
【００７５】
或る実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバント又は薬剤的に許容できるその塩である：
【００７６】
【化１１】
2019519504.tif 000012
【００７７】
或る実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバント又は薬剤的に許容できるその塩である：
【００７８】
【化１２】
2019519504.tif 000013
【００７９】
或る実施形態では、ＴＬＲ４アゴニストは、以下の構造を有する合成ＧＬＡアジュバント又は薬剤的に許容できるその塩である：
【００８０】
【化１３】
2019519504.tif 000014
【００８１】
別の実施形態では、弱毒化リピドＡ誘導体（ＡＬＤ（attenuated lipid A derivative））が、本明細書で記載の組成物に組み込まれる。ＡＬＤは、分子がリピドＡの有害作用を減じる又は変えることを示すように変更又は構成されたリピドＡ様分子である。これら有害作用には、発熱性、局所的シュワルツマン反応性（local Shwarzman reactivity）、及び、ニワトリ胚５０％致死量アッセイ（ＣＥＬＤ５０）で評価されるような毒性が含まれる。本開示に係る有用なＡＬＤには、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ又はＭＰＬ）及び３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ（3-deacylated monophosphoryl lipid A）（３Ｄ−ＭＬＡ又は３Ｄ−ＭＰＬ）が含まれる。ＭＬＡ（ＭＰＬ）及び３Ｄ−ＭＬＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）は公知であり、本明細書において必ずしも詳細に説明しない。例えば、Ribi ImmunoChem Research社に付与された、１９８４年３月１３日発行の米国特許第４，４３６，７２７号を参照されたいものであり、これはモノホスホリルリピドＡ及びその製造について開示している。Ｍｙｅｒｓらの米国特許第４，９１２，０９４号及び再審査証明書（reexamination certificate）、特許公報第４，９１２，０９４号もまた、Ribi ImmunoChem Research社に付与され、３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡ及びその製造方法を例示している。例えば、英国特許第２２２０２１１号及び国際公開第９２／１１６５５６号もまた参照されたい。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（3 De-O-acylated monophosphoryl lipid A）が、英国特許第２２２０２１１号（Ｒｉｂｉ）より公知である。これは、化学的に、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと、４、５又は６アシル化鎖との混合物であり、Ribi Immunochem Montana社により製造されている。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの特定の形態が、国際特許出願国際公開第９２／１１６５５６号に開示されている。ＭＬＡ及び３Ｄ−ＭＬＡに関するこれら特許のそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８２】
上記ＴＬＲ４アゴニスト化合物においては、分子内の官能基に応じて全体的な電荷が決定できる。例えば、リン酸基は、リン酸基の電離状態に応じて、負電荷をもつか又は中性となることが可能である。
【００８３】
本明細書に提供された実施形態のいずれかにおいて、ＴＬＲ４アゴニストは一般式（ＩＩＩ）の構造を有する合成ＧＬＡアジュバントか又は薬剤的に許容できるその塩であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は、炭素数１１のアルキルであり、Ｒ２及びＲ４は炭素数１３のアルキルである。
補助脂質
【００８４】
本明細書では、本明細書に記載の組成物に用いることが可能である補助脂質が提供される。
【００８５】
或る実施形態では、補助脂質は、リン脂質又は第四級アンモニウム塩脂質である。或る実施形態では、補助脂質は、ホスファチジルコリン又はホスホグリセリドであるリン脂質である。或る実施形態では、補助脂質は、以下の部分のうちのいずれかを含み：
【００８６】
【化１４】
2019519504.tif 000015
【００８７】
【化１５】
2019519504.tif 000016
【００８８】
【化１６】
2019519504.tif 000017
式中、Ｘ−はアルカリ金属対イオンであり、Ｙ＋はハロゲン化物対イオンである。
【００８９】
或る実施形態では、補助脂質は、炭素数１０〜２０のアルキル鎖を含む。或る実施形態では、補助脂質は、炭素数１２〜１８のアルキル鎖を含む。
【００９０】
或る実施形態では、補助脂質は、陰イオン性である。或る実施形態では、補助脂質は、陽イオン性である。或る実施形態では、補助脂質は、全体的に中性の電荷をもつ。或る実施形態では、補助脂質は、両性イオンである。
【００９１】
或る実施形態では、好適な補助脂質は、以下に示すものである。
【００９２】
【表１−１】
2019519504.tif 000018
【００９３】
【表１−２】
2019519504.tif 000019
【００９４】
【表１−３】
2019519504.tif 000020
【００９５】
或る実施形態では、補助脂質は、ＤＬＰＧ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＤＯＰＧ、ＤＳＴＡＰ及びＤＰＴＡＰから選択される。或る実施形態では、補助脂質は、ＤＬＰＧ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ及びＤＯＰＧから選択される。或る実施形態では、補助脂質は、ＤＳＴＡＰ及びＤＰＴＡＰから選択される。
【００９６】
或る実施形態では、補助脂質は、ＤＳＰＧである。或る実施形態では、補助脂質は、ＤＳＴＡＰである。或る実施形態では、補助脂質は、ＤＰＴＡＰである。
【００９７】
或る実施形態では、補助脂質は、ＤＳＰＧ及びＤＳＴＡＰから選択される。或る実施形態では、補助脂質は、ＤＳＰＧ及びＤＳＴＡＰから選択される。或る実施形態では、補助脂質は、ＤＳＰＧである。或る実施形態では、補助脂質は、ＤＳＴＡＰである。
【００９８】
或る実施形態では、補助脂質は、ＤＬＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＳＰＣ、ＤＯＰＣ及びＰＯＰＣから選択される。或る実施形態では、補助脂質は、ＤＬＰＣ、ＤＳＰＣ及びＤＯＰＣから選択される。
【００９９】
或る実施形態では、補助脂質は、ＤＰＰＣ及びＤＰＴＡＰから選択される。或る実施形態では、補助脂質は、ＤＰＰＣである。或る実施形態では、補助脂質は、ＤＰＴＡＰである。
【０１００】
或る実施形態では、補助脂質は、ＤＯＰＣ、ＤＳＰＧ、ＤＳＴＡＰ及びポリソルベート８０から選択される。
【０１０１】
本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいては、補助脂質は、ＤＬＰＥとすることが可能である。
【０１０２】
本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいては、補助脂質は、ＤＭＴＡＰとすることが可能である。
【０１０３】
本明細書に記載の実施形態のいずれかにおいては、補助脂質は、ＤＴＡＰとすることが可能である。
アルミニウム塩
【０１０４】
上記に示すように、本明細書に記載の組成物は、アルミニウム塩を含むことが可能であり、それは本明細書においてａｌｕｍと称し得る。好適なアルミニウム塩には、水酸化アルミニウム（aluminum hydroxide）、アルミニウム三水和物（aluminum trihydrate）、オキシ水酸化アルミニウム（aluminum oxyhydroxide）、リン酸アルミニウム（aluminum phosphate）、水酸化リン酸アルミニウム（aluminum hydroxyphosphate）、水酸化リン酸アルミニウム硫酸塩（aluminum hydroxyphosphate sulfate）及び硫酸アルミニウムカリウム（potassium aluminum sulfate）が含まれる。アルミニウム塩はまた、以下の一般式：Ａｌ（ＯＨ）３、ＡｌＨ３Ｏ３、ＡｌＨ６Ｏ３、ＡｌＯ（ＯＨ）、Ａｌ（ＯＨ）（ＰＯ４）及びＫＡｌ（ＳＯ４）２で表すこともある。良好な安全性の記録を有し、抗体応答を増強し、抗原を安定化させ、かつ、大規模製造が比較的単純であることを理由に、共アジュバント（co-adjuvant）として用いられるアルミニウム塩は有利である（Edelman 2002 Mol. Biotechnol. 21:129-148; Edelman, R. 1980 Rev. Infect.Dis. 2:370-383.）。
【０１０５】
或る実施形態では、アルミニウム塩は、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、水酸化アルミニウム又はオキシ水酸化アルミニウムである。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）は、全体的に正電荷をもち、負電荷をもつ部分を容易に吸着させることが可能である。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）はまた、Ａｍｐｈｏｊｅｌ、水酸化アルミニウムゲル、アルミナ三水化物（Hydrated alumina）、アルミニウムトリヒドロキシド（Aluminum trihydroxide）又はＡｌｕｇｅｌｉｂｙｅとも称することが可能である。
【０１０６】
或る実施形態では、アルミニウム塩はＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）、リン酸アルミニウムである。ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）は、全体的に負電荷をもち、正電荷をもつ部分を容易に吸着させることが可能である。
ＴＬＲアゴニスト及び補助脂質の水性製剤
【０１０７】
上記に示すように、本開示は、（１）ＴＬＲアゴニストと、（２）補助脂質とを含む、水性製剤を提供する。本開示は、（１）ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニストと、（２）補助脂質とを含む、水性製剤を提供する。
【０１０８】
或る実施形態では、本開示は、（１）ＴＬＲ７／８アゴニストと、（２）補助脂質とを含む、水性製剤を提供する。或る実施形態では、水性製剤は、ＴＬＲ７／８アゴニストと、ＤＯＰＣ、ＤＳＰＧ、ＤＳＴＡＰ及びポリソルベート８０からなる群から選択される補助脂質とを含む。或る実施形態では、水性製剤は、ＴＬＲ７／８アゴニストと、ＤＳＰＧ及びＤＳＴＡＰからなる群から選択される補助脂質とを含む。
【０１０９】
或る実施形態では、本開示は、（１）ＴＬＲ４アゴニストと、（２）補助脂質とを含む、水性製剤を提供する。或る実施形態では、本開示は、（１）ＴＬＲ４アゴニストと、（２）ＤＰＴＡＰである補助脂質とを含む、水性製剤を提供する。
【０１１０】
或る実施形態では、ＴＬＲアゴニスト及び補助脂質を含む組成物は、高エネルギー源に晒されて、水性製剤又はナノ懸濁液剤組成物を生成する。或る実施形態では、ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニスト及び補助脂質を含む組成物は、高エネルギー源に晒されて、水性製剤又はナノ懸濁液剤組成物を生成する。或る実施形態では、水性製剤は、サイズが約１ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲、例えば約４００ｎｍ未満又は約２００ｎｍ未満等である、ＴＬＲアゴニスト及び補助脂質のナノ懸濁液剤粒子を含む。
サイズ
【０１１１】
一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約５０ｎｍ〜７５ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約５０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約５０ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約５０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約２０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約２０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約１０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約１ｎｍ、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１５５ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１６５ｎｍ、約１７０ｎｍ、約１７５ｎｍ、約１８０ｎｍ、約１８５ｎｍ、約１９０ｎｍ、約１９５ｎｍ、又は約２００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約１ｎｍ以下、約５ｎｍ以下、約１０ｎｍ以下、約１５ｎｍ以下、約２０ｎｍ以下、約２５ｎｍ以下、約３０ｎｍ以下、約３５ｎｍ以下、約４０ｎｍ以下、約４５ｎｍ以下、約５０ｎｍ以下、約５５ｎｍ以下、約６０ｎｍ以下、約６５ｎｍ以下、約７０ｎｍ以下、約７５ｎｍ以下、約８０ｎｍ以下、約８５ｎｍ以下、約９０ｎｍ以下、約９５ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、約１０５ｎｍ以下、約１１０ｎｍ以下、約１１５ｎｍ以下、約１２０ｎｍ以下、約１２５ｎｍ以下、約１３０ｎｍ以下、約１３５ｎｍ以下、約１４０ｎｍ以下、約１４５ｎｍ以下、約１５０ｎｍ以下、約１５５ｎｍ以下、約１６０ｎｍ以下、約１６５ｎｍ以下、約１７０ｎｍ以下、約１７５ｎｍ以下、約１８０ｎｍ以下、約１８５ｎｍ以下、約１９０ｎｍ以下、約１９５ｎｍ以下、又は約１９９ｎｍ以下である。
【０１１２】
一部の実施形態では、ＴＬＲアゴニスト及び補助脂質のナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約２００ｎｍ以下、約２０５ｎｍ以下、約１０ｎｍ以下、約２１５ｎｍ以下、約２２０ｎｍ以下、約２２５ｎｍ以下、約２３０ｎｍ以下、約２３５ｎｍ以下、約２４０ｎｍ以下、約２４５ｎｍ以下、約２５０ｎｍ以下、約２５５ｎｍ以下、約２６０ｎｍ以下、約２６５ｎｍ以下、約２７０ｎｍ以下、約２７５ｎｍ以下、約２８０ｎｍ以下、約２８５ｎｍ以下、約９０ｎｍ以下、約２９５ｎｍ以下、約３００ｎｍ以下、約３０５ｎｍ以下、約３１０ｎｍ以下、約３１５ｎｍ以下、約３２０ｎｍ以下、約３２５ｎｍ以下、約１３０ｎｍ以下、約３３５ｎｍ以下、約１４０ｎｍ以下、約１４５ｎｍ以下、約１５０ｎｍ以下、約３５５ｎｍ以下、約３６０ｎｍ以下、約３６５ｎｍ以下、約３７０ｎｍ以下、約３７５ｎｍ以下、約３８０ｎｍ以下、約３８５ｎｍ以下、約３９０ｎｍ以下、約３９５ｎｍ以下、又は、約３９９ｎｍ以下、約４００ｎｍ以下、約４０５ｎｍ以下、約４１０ｎｍ以下、約４１５ｎｍ以下、約４２０ｎｍ以下、約４２５ｎｍ以下、約４３０ｎｍ以下、約４３５ｎｍ以下、約４４０ｎｍ以下、約４４０ｎｍ以下、約４４５ｎｍ以下、又は約４５０ｎｍ以下である。
【０１１３】
一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子は、少なくとも０．４５ミクロンのフィルターを通って濾過可能である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子は、０．４５ミクロン以下のポアサイズのフィルターを通って濾過可能である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子は、０．４５ミクロンのフィルターを通って濾過可能である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子は、０．２０ミクロンのフィルターを通って濾過可能である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子は、０．２２ミクロンのフィルターを通って濾過可能である。
安定性
【０１１４】
本明細書で提供する一部の実施形態では、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニスト）及び補助脂質を含む１〜４５０ｎｍのサイズの水性ナノ懸濁液剤粒子が安定であり、そこではナノ懸濁液剤粒子のサイズを４５０ｎｍ未満で維持され、またそこでは本開示の補助脂質が不在であるＴＬＲアゴニストと比較して、粒子の凝集が少ないか又は凝集がない。
【０１１５】
一部の実施形態では、「安定」は、製剤又は組成物が、凝集がほとんどないか凝集が全くみられない、又は、初期粒子サイズと比べて時間の経過による製剤の平均粒子サイズ又は多分散性の増加がほとんどないか全体的に全くみられない、ナノ懸濁液剤粒子より構成されることを指す。
【０１１６】
ナノ懸濁液剤粒子の安定性は、当業者によく知られた技術で測定することが可能である。一部の実施形態では、安定性は視覚的に観察される。視覚による検査には、粒子性、線状性（flocculence）又は凝集の検査が含まれ得る。一部の実施形態では、安定性は、ナノ懸濁液剤粒子のサイズによって決定される。例えば、該サイズは、Ｘ線及びレーザー回折、動的光散乱（ＤＬＳ）、ＣｒｙｏＥＭ又はＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅを含むがこれらに限定されない、この技術分野で公知の技術によって評価することが可能である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズはＺ平均径（Z-average diameter）を指す。一部の実施形態では、安定性は、特定のサイズのフィルター、例えば０．２０、０．２２又は０．４５ミクロンのフィルターを透過するナノ懸濁液剤粒子の能力で評価する。一部の実施形態では、安定性はｐＨで決定される。一部の実施形態では、安定性は、例えば動的光散乱（ＤＬＳ）技術を使用することによる多分散指数（ＰｄＩ）の測定によって決定される。
【０１１７】
一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のＺ平均径は、評価期間中の時間の経過により５０％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１２％未満、１０％未満、７％未満、５％未満、３％未満、１％未満増加する。
【０１１８】
一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子は０〜８℃で、例えば２〜８℃等で安定である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子は０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃又は８℃で、少なくとも１分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、少なくとも２５分間、少なくとも３０分間、少なくとも３５分間、少なくとも４０分間、少なくとも４５分間、少なくとも５０分間、少なくとも５５分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、又は、少なくとも５年間安定である。
【０１１９】
一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子は２０〜３０℃で安定である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子は２５℃で、少なくとも１分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、少なくとも２５分間、少なくとも３０分間、少なくとも３５分間、少なくとも４０分間、少なくとも４５分間、少なくとも５０分間、少なくとも５５分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、又は、少なくとも５年間安定である。
【０１２０】
一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子は３５〜４０℃で安定である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子は３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃又は４０℃で、少なくとも１分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、少なくとも２５分間、少なくとも３０分間、少なくとも３５分間、少なくとも４０分間、少なくとも４５分間、少なくとも５０分間、少なくとも５５分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、又は、少なくとも５年間安定である。
【０１２１】
一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子は５７〜６２℃で安定である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子は５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃又は６２℃で、少なくとも１分間、少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、少なくとも２５分間、少なくとも３０分間、少なくとも３５分間、少なくとも４０分間、少なくとも４５分間、少なくとも５０分間、少なくとも５５分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月間安定である。
【０１２２】
例示的な一実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子は２〜８℃で、少なくとも２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、又は１年間安定である。
【０１２３】
一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子は１〜４凍結融解後安定である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子は１凍結融解後、２凍結融解後、３凍結融解後又は４凍結融解後安定である。
ＴＬＲアゴニスト、補助脂質及びアルミニウム塩の組み合わせ
【０１２４】
上記に示すように、アルミニウム塩に吸着する、補助脂質と共にＴＬＲアゴニストを含むアジュバントの安定な水性製剤を提供する。本開示では、アルミニウム塩に吸着する、補助脂質と共にＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニストを含むアジュバントの安定な水性製剤を提供する。
【０１２５】
或る実施形態では、本開示は、（１）ＴＬＲ７／８アゴニストと、（２）補助脂質と、（３）アルミニウム塩とを含む、水性組成物を提供する。或る実施形態では、水性製剤は、（１）ＴＬＲ７／８アゴニストと、（２）ＤＯＰＣ、ＤＳＰＧ、ＤＳＴＡＰ及びポリソルベート８０からなる群から選択される補助脂質と、（３）アルミニウム塩とを含む。或る実施形態では、水性製剤は、（１）ＴＬＲ７／８アゴニストと、（２）ＤＳＰＧ及びＤＳＴＡＰからなる群から選択される補助脂質と、（３）アルミニウム塩とを含む。
【０１２６】
或る実施形態では、本開示は、（１）ＴＬＲ４アゴニストと、（２）補助脂質と、（３）アルミニウム塩とを含む、水性組成物を提供する。或る実施形態では、本開示は、（１）ＴＬＲ４アゴニストと、（２）ＤＰＴＡＰである補助脂質と、（３）アルミニウム塩とを含む、水性組成物を提供する。或る実施形態では、本開示は、（１）ＴＬＲ４アゴニストと、（２）補助脂質と、（３）リン酸アルミニウム（例えば、ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標））であるアルミニウム塩とを含む、水性組成物を提供する。或る実施形態では、本開示は、（１）ＴＬＲ４アゴニストと、（２）ＤＰＴＡＰである補助脂質と、（３）リン酸アルミニウム（例えば、ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標））であるアルミニウム塩とを含む、水性組成物を提供する。
【０１２７】
各成分の選択に関連する因子には、成分の電荷及び交換可能なリガンドの存在が含まれるが、これらに限定されない。適切な成分が選択されれば、ＴＬＲアゴニスト及び補助脂質は、アルミニウム塩に吸着するのに好適となる。或る実施形態では、吸着は、試験管内での条件で生じる。
【０１２８】
結合又は吸着は、生化学的相互作用、生理学的相互作用及び／もしくは化学的相互作用を含むがこれらに限定されない特異的もしくは非特異的な結合又は相互作用に典型的に起因する、相互に親和性を示す又は結合能を示す、分子間又はそれらの部分間における相互作用を指す。或る実施形態では、アルミニウム塩との結合は、ＵＶ分光法、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は遠心分離実験によって決定することが可能である。
【０１２９】
一部の実施形態では、組成物に存在する補助脂質を伴うＴＬＲアゴニストの少なくとも２５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％が、アルミニウム粒子と会合する。会合の百分率を決定する例示的な１つの方法を、実施例１に示している。
【０１３０】
アルミニウム塩への吸着は、概して、静電相互作用及びリガンド交換のメカニズムに従って行われ得るが、これらに限定されない。静電相互作用では、特定の溶液条件下で成分における反対の電荷の存在が利用される。リガンド交換では、成分のうちの１つにおけるリン酸基を利用して、他の成分のヒドロキシル基と交換される。リガンド交換では、成分内の利用可能なリン酸基及びヒドロキシル基が利用される。ＴＬＲアゴニスト、補助脂質及びアルミニウム塩を含むアジュバント組成物と組み合わせた、抗原を伴うワクチン組成物を調製するためには、電荷と抗原におけるリン酸基及びヒドロキシル基の存在とを検討する。
リガンド交換
【０１３１】
或る実施形態では、リガンド交換のメカニズムに関して、抗原と、ＴＬＲアゴニスト、補助脂質及びアルミニウム塩を含むアジュバント組成物との間にリガンド交換が存在し得る。
【０１３２】
或る実施形態では、アジュバント組成物（例えば、ＴＬＲアゴニスト、補助脂質及びアルミニウム塩）の成分間にリガンド交換が存在し得る。上記に示すように、アジュバント組成物内の特定の成分はリン酸基を含む一方で、他の特定の成分は、ヒドロキシル基を含み、それによってリガンド交換が可能となる。例えば、特定のＴＬＲ４アゴニストはリン酸基を含む。また特定の補助脂質もリン酸基を含む。またＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）もリン酸基を含む。ヒドロキシル基は、以下の成分：抗原、ＴＬＲアゴニスト、補助脂質及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）中に存在する。
静電相互作用
【０１３３】
或る実施形態では、静電相互作用のメカニズムに関して、ワクチン組成物は実質的におよそ生理的なｐＨで中性の電荷をもつ。
【０１３４】
ワクチン組成物の抗原が電荷をもつ場合、アジュバント組成物（例えば、ＴＬＲアゴニスト、補助脂質及びアルミニウム塩）に関する成分は、抗原の電荷を中和して実質的に中性の電荷をもつワクチン組成物をもたらすように選択することが可能である。ワクチン組成物の抗原が実質的に中性の電荷をもつ場合、アジュバント組成物（例えば、ＴＬＲアゴニスト、補助脂質及びアルミニウム塩）に関する成分は、抗原の電荷を実質的に中性に維持して、実質的に中性の電荷をもつワクチン組成物をもたらすように選択することが可能である。上記に示すように、アジュバント組成物における各成分は、負電荷とする、正電荷とする、又は中性の電荷とすることによって特徴付けることが可能である。
【０１３５】
或る実施形態では、製剤組成物は、ＴＬＲアゴニスト、補助脂質及びアルミニウム塩を含むものであって、この成分は、以下の表からの性質により選択される。
【０１３６】
【表２】
2019519504.tif 000021
【０１３７】
或る実施形態では、製剤組成物は、ＴＬＲアゴニスト、補助脂質及びアルミニウム塩を含むものであって、この成分は、以下の表から選択される。
【０１３８】
【表３】
2019519504.tif 000022
組成物の製造方法 
【０１３９】
本開示では、ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニスト）及び補助脂質を含む水性製剤を調製する方法を提供するものであって、該方法は、
（ａ）ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニスト）及び補助脂質を溶媒中で混合して溶液を作製することと、
（ｂ）ステップ（ａ）の溶液から溶媒を除去して膜組成物を作製することと、
（ｃ）ステップ（ｃ）の膜組成物を再水和して再水和組成物を作製することと、
（ｄ）再水和組成物を高エネルギー源に晒してナノ懸濁液剤組成物を作製することとを含む。
【０１４０】
一部の実施形態では、溶媒は低沸点を有する。この方法に好適な溶媒には、クロロホルム、ジクロロメタン、メタノール及び水が含まれるが、これらに限定されない。或る実施形態では、溶媒はクロロホルムである。或る実施形態では、溶媒はクロロホルム、メタノール及び水を含む。
【０１４１】
或る実施形態では、ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニスト及び補助脂質の混合では、ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニストの補助脂質に対する比を約１：２とすることが可能である。
【０１４２】
ステップ（ａ）での成分の混合は、室温で、又は軽く加熱しながら実行することが可能である。軽く加熱する場合は、最大３０、３５又は４０℃に加熱することが可能である。
【０１４３】
方法のステップ（ｂ）では、軽く加熱しながら又は減圧しながら、溶媒を除去する。一部の実施形態では、溶媒は減圧しながら除去する。減圧する場合は、大気圧よりも低い圧力とする。
【０１４４】
ステップ（ｃ）では、膜組成物を再水和する。再水和に好適な溶媒は水である。或る実施形態では、この水は超純水である。
【０１４５】
ステップ（ｄ）では、再水和組成物が高エネルギー源に晒されてナノ懸濁液剤組成物を作製する。或る実施形態では、再水和組成物は攪拌される。攪拌の方法は、超音波処理である。超音波処理は、最大数時間行うことが可能である。或る実施形態では、攪拌は、組成物が半透明になるまで継続する。或る実施形態では、攪拌は、組成物が実質的に視認できない粒子となるまで継続する。一部の実施形態では、溶液は、ＵＶ分光法、濁度計又は動的光散乱によって読むことで明らかとなるように透明である。
【０１４６】
ステップ（ｄ）では、再水和組成物を加工又は粉砕することが可能である。加工又は粉砕は、超音波処理、シルバーソンミックス（silverson mixing）及び微少溶液操作を含む、この技術分野で公知の標準技術を用いて行われる。
【０１４７】
一部の実施形態では、高エネルギー源は、少なくとも２，０００ＰＳＩ、少なくとも３，０００、５，０００ＰＳＩ、少なくとも１０，０００ＰＳＩ、少なくとも１５，０００ＰＳＩ、少なくとも２０，０００ＰＳＩ、少なくとも２５，０００ＰＳＩ、少なくとも３０，０００ＰＳＩ、少なくとも３５，０００ＰＳＩ、少なくとも４０，０００ＰＳＩ、少なくとも４５，０００ＰＳＩ又は少なくとも５０，０００ＰＳＩを与える。一部の実施形態では、高エネルギー源は、約５，０００〜５０，０００、５，０００〜１０，０００、５，０００〜１５，０００、５，０００〜２０，０００、５，０００〜２５，０００、５，０００〜３０，０００、５，０００〜３５，０００、５，０００〜４０，０００、５，０００〜４５，０００、又は５，０００〜５００００ＰＳＩを与える。一部の実施形態では、高エネルギー源は、約４５，０００〜５０，０００、４０，０００〜５０，０００、３５，０００〜５０，０００、３０，０００〜５０，０００、２５，０００〜５０，０００、２０，０００〜５０，０００、１５，０００〜５０，０００、１０，０００〜５０，０００、又は５，０００〜５０，０００ＰＳＩを与える。一部の実施形態では、高エネルギー源は、約２５，０００〜３５，０００、２５，０００〜３０，０００、又は３０，０００〜３５，０００ＰＳＩを与える。一部の実施形態では、高エネルギー源は、約３０，０００ＰＳＩを与える。
【０１４８】
一部の実施形態では、高エネルギー源は、高せん断源（high shear source）である。
【０１４９】
一部の実施形態では、高エネルギー源は、マイクロフルダイザー（microfluidizer）である。微少溶液操作（microfluidization）は、組成物を高せん断力に晒す加工を説明するために用いる。一部の実施形態では、組成物は、マイクロフルダイザー（MICROFLUIDIZER（登録商標））として公知の機器又は装置によって加工される。
【０１５０】
一部の実施形態では、高エネルギー源は、エクストルーダーである。
【０１５１】
一部の実施形態では、高エネルギー源は、超音波処理器である。
【０１５２】
一部の実施形態では、高エネルギー源は、ホモジナイザーである。
【０１５３】
一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、５０又は１００パスの高せん断力を受ける。一部の実施形態では、組成物は、１〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０又は９１〜１００パスの高せん断力を受ける。一部の実施形態では、組成物は、３、６又は１０パスの高せん断力を受けた。
【０１５４】
或る実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約１ｎｍ〜４５０ｎｍの範囲、例えば約４００ｎｍ未満又は約２００ｎｍ未満等のサイズの範囲である。
【０１５５】
一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約５０ｎｍ〜７５ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約５０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約５０ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約５０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約２０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約２０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約１０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約１０ｎｍ〜１００ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約１０ｎｍ〜５０ｎｍの範囲である。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約１ｎｍ、約５ｎｍ、約１０ｎｍ、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、約４０ｎｍ、約４５ｎｍ、約５０ｎｍ、約５５ｎｍ、約６０ｎｍ、約６５ｎｍ、約７０ｎｍ、約７５ｎｍ、約８０ｎｍ、約８５ｎｍ、約９０ｎｍ、約９５ｎｍ、約１００ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１４５ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１５５ｎｍ、約１６０ｎｍ、約１６５ｎｍ、約１７０ｎｍ、約１７５ｎｍ、約１８０ｎｍ、約１８５ｎｍ、約１９０ｎｍ、約１９５ｎｍ、又は約２００ｎｍである。一部の実施形態では、ナノ懸濁液剤粒子のサイズは、約１ｎｍ以下、約５ｎｍ以下、約１０ｎｍ以下、約１５ｎｍ以下、約２０ｎｍ以下、約２５ｎｍ以下、約３０ｎｍ以下、約３５ｎｍ以下、約４０ｎｍ以下、約４５ｎｍ以下、約５０ｎｍ以下、約５５ｎｍ以下、約６０ｎｍ以下、約６５ｎｍ以下、約７０ｎｍ以下、約７５ｎｍ以下、約８０ｎｍ以下、約８５ｎｍ以下、約９０ｎｍ以下、約９５ｎｍ以下、約１００ｎｍ以下、約１０５ｎｍ以下、約１１０ｎｍ以下、約１１５ｎｍ以下、約１２０ｎｍ以下、約１２５ｎｍ以下、約１３０ｎｍ以下、約１３５ｎｍ以下、約１４０ｎｍ以下、約１４５ｎｍ以下、約１５０ｎｍ以下、約１５５ｎｍ以下、約１６０ｎｍ以下、約１６５ｎｍ以下、約１７０ｎｍ以下、約１７５ｎｍ以下、約１８０ｎｍ以下、約１８５ｎｍ以下、約１９０ｎｍ以下、約１９５ｎｍ以下、又は約１９９ｎｍ以下である。
【０１５６】
水性製剤は、本明細書に記載するように、アルミニウム塩とさらに混合することが可能である。
【０１５７】
水性製剤は、本明細書に記載するように、抗原とさらに混合することが可能である。
【０１５８】
水性製剤は、本明細書に記載するように、アルミニウム塩及び抗原とさらに混合することが可能である。
【０１５９】
本開示では、上記の方法のいずれかによって作製される産物を提供する。
【０１６０】
本開示では、
（ａ）ＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニスト）及び補助脂質を溶媒中で混合して溶液を作製することと、
（ｂ）ステップ（ａ）の溶液から溶媒を除去して膜組成物を作製することと、
（ｃ）ステップ（ｃ）の膜組成物を再水和して再水和組成物を作製することと、
（ｄ）再水和組成物を高エネルギー源に晒してナノ懸濁液剤組成物を作製することと、によって作製されたナノ懸濁液剤組成物を提供する。
【０１６１】
本開示は、上記ステップ（ａ）〜（ｄ）によって作製されたナノ懸濁液剤組成物を提供するものであって、ナノ懸濁液剤組成物をアルミニウム塩と混合することと、ナノ懸濁液剤組成物を抗原と混合することと、又は、ナノ懸濁液剤組成物をアルミニウム塩及び抗原と混合することとをさらに含む。
薬剤
【０１６２】
本明細書で提供される水性製剤は、１つ又は複数の薬剤をさらに含み得るものであって、該薬剤は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗原、アジュバント、診断薬、治療薬、有機体、ゲノム又はウイルスとすることが可能である。一部の実施形態では、水性製剤は２つ以上の薬剤を含む。一部の実施形態では、該薬剤は水性製剤と会合する。一部の実施形態では、薬剤はリガンド交換及び／又は静電（電荷に基づく）相互作用によって水性製剤と会合する。
ポリペプチド
【０１６３】
一部の実施形態では、薬剤はポリペプチドである。一部の実施形態では、ポリペプチドは、完全長のタンパク質又はその断片である。一部の実施形態では、ポリペプチドはペプチドである。一部の実施形態では、ポリペプチドは融合タンパク質である。一部の実施形態では、融合タンパク質は、個体に投与すると、免疫応答を誘発することが可能である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、以下にさらに記載する抗原である。
抗原
【０１６４】
一部の実施形態では、薬剤は抗原である。
【０１６５】
一部の実施形態では、ポリペプチド抗原は、アレルギー、癌もしくは感染症に関与する、又はアレルギー、癌もしくは感染症由来である。
【０１６６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、ワクチン接種目的に有用であり、ワクチン製剤（ワクチン組成物）として提供される。
【０１６７】
抗原は、任意の標的のエピトープ、分子（生体分子を含む）、分子複合体（生体分子を含有する分子複合体を含む）、細胞内集合体（subcellular assembly）、対象における免疫反応性の誘導又は増強が望まれる細胞又は組織とすることができる。しばしば、抗原という語は、関心のポリペプチド抗原を指すこととする。しかしながら、本明細書で用いる場合、抗原はまた、関心のポリペプチド抗原をコードする組換えコンストラクト（例えば、発現コンストラクト）を指すこともある。或る実施形態では、抗原は、感染性の病原体及び／もしくはエピトープ、生体分子、感染症、癌、自己免疫疾患、アレルギー、喘息もしくは、抗原特異的免疫応答の刺激が望まれるもしくは有益となるような任意の他の状態と関連する細胞又は組織であり得るか、又は、それらに由来し得るか、又はそれらと免疫学的に交差反応し得る。
【０１６８】
或る実施形態では、結核菌（M. tuberculosis）もしくは癩菌（M. leprae）もしくは他のマイコバクテリウム等の放線菌属（Actinobacterium）；サルモネラ属（Salmonella）、ナイセリア属（Neisseria）、ボレリア属（Borrelia）、クラミジア属（Chlamydia）もしくはボルデテラ属（Bordetella）のうちの１つの細菌；単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、サイトメガロウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス（Epstein Barr Virus）（ＥＢＶ）、ＲＳウイルス（respiratory syncytial virus）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）及びサイトメガロウイルス等のウイルス；ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２等のＨＩＶ；アスペルギルス属（Aspergillus）、ブラストミセス属（Blastomyces）、コクシジオイデス属（Coccidioides）及びニューモシスチス属（Pneumocysti）等の真菌、もしくは、カンジダ・アルビカンス（C. albicans）、カンジダ・グラブラタ（C. glabrata）、カンジダ・クルセイ（C. krusei）、カンジダ・ルシタニエ（C.lusitaniae）、カンジダ・トロピカリス（C. tropicalis）及びカンジダ・パラシローシス（C. parapsilosis）等のカンジダ種を含む酵母菌；例えば、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）、二日熱マラリア原虫（P. vivax）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）及び卵形マラリア原虫（P. ovale）を含むマラリア原虫種である原生動物等の寄生生物；又は、アカントアメーバ属（Acanthamoeba）、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、アンギオストロンギルス属（Angiostrongylus）、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansonii）、ビルハルツ住血吸虫（Schistosoma haematobium）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）、ズビニ鉤虫（Ancylostoma）、赤痢アメーバ、大腸アメーバ（Entamoeba coli）、エントアメーバ・ディスパー（Entamoeba dispar）、エントアメーバ・ハルトマン（Entamoeba hartmanni）、エントアメーバ・ポレック（Entamoeba polecki）、バンクロフト糸状虫（Wuchereria bancrofti）、ジアルジア（Giardia）及びリーシュマニア（Leishmania）のうちの１つもしくは複数等である他の寄生生物を含む、バクテリア、ウイルス又は真菌等である少なくとも１つの感染性病原体に由来する抗原を考察する。或る実施形態では、抗原は、結核、インフルエンザ、アメーバ症、ＨＩＶ、肝炎又はリーシュマニア症に関与する抗原からのものであり得る又は該抗原に関連し得る。
【０１６９】
一部の実施形態では、抗原はアメーバ症関連抗原である。一部の実施形態では、抗原はアメーバ症を引き起こす抗原からのものである。一部の実施形態では、抗原はアメーバ症を引き起こす有機体からのものである。一部の実施形態では、抗原は赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）からのものである。一実施形態では、抗原はＬｅｃＡを含む。一実施形態では、抗原はＬｅｃＡである。
【０１７０】
一部の実施形態では、抗原はインフルエンザ関連抗原である。一部の実施形態では、抗原はインフルエンザ原因抗原である。一部の実施形態では、抗原はインフルエンザ原因ウイルスからのものである。一実施形態では、抗原はＨ５Ｎ１を含む。一実施形態では、抗原はＨ５Ｎ１を含む。
【０１７１】
例えば、或る実施形態では、抗原はボレリア種（Borrelia sp.）由来であり、抗原は、核酸、病原体由来の抗原又は抗原製剤、組換えで産生されたタンパク質又はペプチド、及び、キメラ融合タンパク質を含み得る。こうした抗原の１つはＯｓｐＡである。ＯｓｐＡは、宿主細胞（Ｌｉｐｏ−ＯｓｐＡ）におけるその生合成による脂質付加形態の完全成熟タンパク質であり得、又は、あるいは非脂質付加誘導体であり得る。こうした非脂質付加誘導体は、インフルエンザウイルスの非構造タンパク質（ＮＳ１）のうちのはじめの８１個のＮ−末端アミノ酸を有する非脂質付加のＮＳ１−ＯｓｐＡ融合タンパク質と完全ＯｓｐＡタンパク質とを含み、他のＭＤＰ−ＯｓｐＡは、ＯｓｐＡを担持するさらなる３個のＮ−末端アミノ酸の非脂質付加形態である。
【０１７２】
或る実施形態では、抗原は、ＨＩＶ−１（例えばｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０又はｇｐ１６０等）、ｇＤもしくはその誘導体等のヒトヘルペスウイルス、又は、ＨＳＶ１もしくはＨＳＶ２からのＩＣＰ２７、サイトメガロウイルス（特に、ヒト）（ｇＢ又はその誘導体等）、ロタウイルス（弱毒化生ウイルスを含む）、エプスタイン・バーウイルス（ｇｐ３５０又はその誘導体等）、水痘・帯状疱疹ウイルス（ｇｐｌ、ＩＩ及びＩＥ６３等）等の最初期タンパク質から、又は、Ｂ型肝炎ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎表面抗原又はその誘導体）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス及びＥ型肝炎ウイルス等の肝炎ウイルスから、又は、パラミクソウイルス属等：ＲＳウイルス（Ｆ及びＧタンパク質又はその誘導体等）、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ６、１１、１６、１８等）、フラビウイルス（黄熱病ウイルス、デングウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）もしくはインフルエンザウイルス（全生ウイルスもしくは不活化ウイルス、卵もしくはＭＤＣＫ細胞で増殖したインフルエンザウイルス成分、又は、全インフルエンザビロソーム（Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920に記載されるとおり）もしくはＨＡ、ＮＰ、ＮＡもしくはＭタンパク質等のその精製されたタンパク質もしくは組換えタンパク質もしくはそれらの組み合わせ）である他のウイルス性の病原菌から等のウイルス由来である。
【０１７３】
他の或る実施形態では、抗原は、淋菌（N. gonorrhea）及び髄膜炎菌（N. meningitidis）（例えば、莢膜多糖及びその複合体、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、ＰｉｌＣ、アドヘシン）を含むナイセリア種（Neisseria spp）；化膿レンサ球菌（S. pyogenes）（例えば、Ｍタンパク質又はその断片、Ｃ５Ａプロテアーゼ、リポテイコ酸）、Ｂ群溶血性レンサ球菌（S. agalactiae）、ミュータンスレンサ球菌（S. mutans）：軟性下疳菌（H. ducreyi）；カタル球菌（Branhamella catarrhalis）としても知られるモラクセラ・カタラーリス（M. catarrhalis）を含むモラクセラ種（例えば、高分子量又は低分子量のアドヘシン及びインベイシン）；百日咳菌（B. pertussis）（例えば、パータクチン、百日咳毒素又はそれらの誘導体、糸状赤血球凝集素（filamenteous hemagglutinin）、アデニル酸シクラーゼ、フィムブリエ（fimbriae））、パラ百日咳菌（B. parapertussis）及び気管支敗血症菌（B. bronchiseptica）を含むボルデテラ種；結核菌（M. tuberculosis）（例えば、ＥＳＡＴ６、抗原８５Ａ、−Ｂ又は−Ｃ）、ウシ型結核菌（M. bovis）、癩菌（M. leprae）、鳥型結核菌（M. avium）、ヨーネ菌（M. paratuberculosis）、マイコバクテリウム・スメグマチス（M. smegmatis）を含む、マイコバクテリウム種；レジオネラニューモフィラ（L. pneumophila）を含むレジオネラ種；腸管中毒性大腸菌（enterotoxic E. coli）（例えば、定着因子、易熱性毒素又はその誘導体、耐熱性毒素又はその誘導体）、腸管出血性大腸菌（enterohemorragic E. coli）、腸管病原性大腸菌（enteropathogenic E. coli）（例えば、志賀毒素様毒素又はその誘導体）を含む大腸菌種；コレラ菌（V. cholera）（例えば、コレラ毒素又はその誘導体）を含むビブリオ種；ソンネ菌（S. sonnei）、志賀赤痢菌（S. dysenteriae）、シゲラ・フレックスネリ（S. flexnerii）を含む赤痢菌種；エンテロコリチカ菌（Y. enterocolitica）（例えば、Ｙｏｐタンパク質）、ペスト菌（Y. pestis）、偽結核菌感染症（Y. pseudotuberculosi）を含むエルシニア種；ジェジュニ菌（C. jejuni）（例えば、毒素、アドヘンシン及びインベイシン）及びカンピロバクター・コリ（C. coli）を含むカンピロバクター種；チフス菌（S. typhi）、パラチフス菌（S. paratyphi）、豚コレラ菌（S. choleraesuis）、腸炎菌（S. Enteritidis）を含むサルモネラ菌種；リステリア菌（L. monocytogenes）を含むリステリア種；ヘリコバクターピロリ（H. pylori）（例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）を含むヘリコバクター種；緑膿菌（P. aeruginosa）を含むシュードモナス種；黄色ブドウ球菌（S. aureus）、表皮ブドウ球菌（S. epidermidis）を含むブドウ球菌種；フェカリス菌（E. faecalis）、フェシウム菌（E. faecium）を含むエンテロコッカス種；破傷風菌（C. tetani）（例えば、破傷風毒素及びその誘導体）、ボツリヌス菌（C. botulinum）（例えばボツリヌス毒素及びその誘導体）、クロストリジウム・ディフィシレ（C. Difficile）（例えば、クロストリジウム毒素Ａ又はＢ及びその誘導体）を含むクロストリジウム種；炭疽菌（B. anthracis）（例えば、ボツリヌス毒素及びその誘導体）を含むバチルス種；ジフテリア菌（C. diphtheriae）（例えば、ジフテリア毒素及びその誘導体）を含むコリネバクテリウム種；ライム病菌（B. burgdorferi）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、ボレリア・ガリニ（B. garinii）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、ボレリア・アフゼリ（B. afzelii）（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、Ｂ．  ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、回帰熱ボレリア（B. hermsii）を含むボレリア種；エーリキア・エクイ（E. equi）及びヒト顆粒球エーリキア症の因子を含むエーリキア種；斑点熱リケッチア（R. rickettsii）を含むリケッチア種；トラコーマ病原体（C. trachomatis）（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、肺炎クラミジア（C. pneumoniae）（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、オウム病クラミジア（C. psittaci）を含むクラミジア種；レプトスピラ・インターロガンス（L. interrogans）を含むレプトスピラ種；梅毒トレポネーマ（T. pallidum）（例えば、レア外膜タンパク質）、トレポネーマ・デンティコラ（T. denticola）、Ｔ．  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅを含むトレポネーマ種；又は、他の病原性微生物等である、１つ又は複数の病原性微生物由来である。
【０１７４】
他の或る実施形態では、抗原は、熱帯熱マラリア原虫（P. falciparum）を含むマラリア原虫種；トキソプラズマ原虫（例えば、ＳＡＧ２、ＳＡＧ３、Ｔｇ３４）を含むトキソプラズマ種；赤痢アメーバ（E. histolytica）を含む赤痢アメーバ種；バベシア・ミクロティ（B. microti）を含むバベシア種；クルーズトリパノソーマ（T. cruzi）を含むトリパノソーマ種；ランブル鞭毛虫（G. lamblia）を含むジアルジア種；森林型熱帯リーシュマニア（L. major）を含むリーシュマニア（Leshmania）種；カリニ肺炎菌（P. carinii）を含むニューモシスチス種；腟トリコモナス（T. vaginalis）を含むトリコモナス種等の、１つもしくは複数の寄生生物（例えば、John, D.T. and Petri, W.A., Markell and Voge’s Medical Parasitology-9th Ed., 2006, WB Saunders, Philadelphia; Bowman, D.D., Georgis’ Parasitology for Veterinarians-8th Ed., 2002, WB Saunders, Philadelphiaを参照のこと）に由来、又は、（ｉ）線虫感染症（蟯虫、回虫、ヒト鞭虫、アメリカ鉤虫、ズビニ鉤虫、バンクロフト糸状虫、マレー糸状虫、回旋糸状虫、メジナ虫、旋毛虫及び糞線虫を含むがこれらに限定されない）；（ｉｉ）吸虫感染症（マンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫、日本住血吸虫、メコン住血吸虫、肝吸虫（Opisthorchis sinensis）、肺吸虫種、肝蛭、ファスキオラマグナ（Fasciola magna）、巨大肝蛭を含むがこれらに限定されない）；及び（ｉｉｉ）条虫感染症（無鉤条虫及び有鉤条虫を含むがこれらに限定されない）等の哺乳動物に感染可能である寄生虫に由来する。或る実施形態では、抗原は、住血吸虫（Schisostoma）種である、マンソン住血吸虫、ビルハルツ住血吸虫及び／もしくは日本住血吸虫に由来、又は、カンジダ・アルビカンス（C. albicans）を含むカンジダ種；クリプトコッカス・ネオフォルマンス（C. neoformans）を含むクリプトコッカス種等である酵母菌に由来する。
【０１７５】
他の特異的な抗原は、例えばＴｈ  Ｒａ１２、Ｔｂ  Ｈ９、Ｔｂ  Ｒａ３５、Ｔｂ３８−１、Ｅｒｄ  １４、ＤＰＶ、ＭＴＩ、ＭＳＬ、ｍＴＴＣ２及びｈＴＣＣ１である結核菌（M. tuberculosis）に由来する（国際公開第９９／５１７４８号）。結核菌（M. tuberculosis）のタンパク質はまた、少なくとも２、３又は４以上の結核菌（M. tuberculosis）のポリペプチドがより大きいタンパク質と融合しているものである、融合タンパク質及びその変異体を含む。特定の融合体としては、Ｒａ１２−ＴｂＨ９−Ｒａ３５、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ、ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ、Ｅｒｄ１４ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ｍＴＣＣ２、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ、ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ｍＴＣＣ２、ＴｂＨ９−ＤＰＶ−ＭＴＩが挙げられる（国際公開第９９１５１７４８号）。用いられ得る他の抗原としては、米国特許出願公開第２０１０／０１２９３９１号及び国際公開第２００８／１２４６４７号に記載の抗原、抗原の組み合わせならびに融合タンパク質が挙げられる。例示的な一実施形態では、融合タンパク質はＩＤ９３である。例示的な一実施形態では、融合タンパク質はＩＤ９１である。
【０１７６】
他の特定の抗原は、クラミジア（Chlamydia）に由来するものであり、例えば、高分子量タンパク質（ＨＷＭＰ）（国際公開第９９／１７７４１号）、ＯＲＦ３（欧州特許第３６６４１２号）及び推定膜タンパク質（putative membrane proteins）（Ｐｍｐｓ）が挙げられる。他のクラミジア抗原は、国際公開第９９１２８４７５号に記載の群から選択することが可能である。特定の抗原は、肺炎球菌（S. pneumoniae）（例えば、莢膜多糖及びその複合体、ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ストレプトリシン、コリン結合タンパク質）を含むレンサ球菌（Streptococcus）種、及びタンパク抗原ニューモリシン（Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342）、及びそれらの変異解毒誘導体（国際公開第９０／０６９５１号、国際公開第９９／０３８８４号）に由来し得る。他の細菌ワクチンは、ヘモフィルスインフルエンザＢ菌（例えば、ＰＲＰ及びその複合体）、例えばＯＭＰ２６である分類不能型インフルエンザ菌（non typeable H. influenza）を含むヘモフィルス（Haemophilus）種、高分子量アドヘシン、Ｐ５、Ｐ６、タンパク質Ｄ及びリポタンパク質Ｄ、ならびに、フィンブリン及びフィンブリン由来ペプチド（米国特許第５，８４３，４６４号）又は複数の複製変異体もしくはその融合タンパク質に由来する抗原を含む。
【０１７７】
他の特定の抗原はＢ型肝炎由来である。Ｂ型肝炎表面抗原の誘導体は、この技術分野で周知であり、とりわけ、欧州特許出願第ＥＰ−Ａ４１４３７４号、第ＥＰ−Ａ−０３０４５７８号及び第ＥＰ１９８４７４号に記載されているそれらのＰｒｅＳ１、Ｐａｒｓ２Ｓ抗原を含む。一態様では、特にＣＨＯ細胞で発現する場合、抗原はＨＩＶ−１  ｇｐ１２０である。さらなる実施形態では、抗原はｇＤ２ｔである。
【０１７８】
他の実施形態では、抗原は、性器疣贅（genital wart）の原因と考えられるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）（ＨＰＶ６又はＨＰＶ１１及びその他の）及び子宮頚癌の原因のＨＰＶウイルス（ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びその他の）に由来する。特定の抗原には、ＨＰＶ６及びＨＰＶ１１タンパク質、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１及びＬ２から選択される１つ又は複数の抗原を含む、Ｌ１粒子又はキャプソメア及び融合タンパク質が含まれる。融合タンパク質の特定の形態には、国際公開第９６／２６２７７号に開示されるＬ２Ｅ７、及び英国特許出願公開第９７１７９５３．５号（国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９８／０５２８５号）に開示されるタンパク質Ｄ（１／３）−Ｅ７が含まれる。可能性のあるさらなる抗原には、ＨＰＶ１６又は１８抗原が含まれる。例えば、Ｌ１もしくはＬ２抗原モノマー、又は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）として共に存在するＬ１もしくはＬ２抗原、又は、ＶＬＰもしくはキャプソメア構造中に単独で存在するＬ１単独タンパク質である。こうした抗原、ウイルス様粒子及びキャプソメアは、それ自体は公知である。例えば、国際公開第９４／００１５２号、国際公開第９４／２０１３７号、国際公開第９４／０５７９２号及び国際公開第９３／０２１８４号を参照されたい。
【０１７９】
他の実施形態では、抗原は融合タンパク質である。融合タンパク質は、単独で又はＥ７、Ｅ２もしくはＦ５等である融合タンパク質として含まれ得、例えば、特定の実施形態には、Ｌ１Ｅ７融合タンパク質を含むＶＬＰが含まれる（国際公開第９６／１１２７２号）。特にＨＰＶ１６抗原には、タンパク質Ｄ担体と融合した初期タンパク質Ｅ６又はＦ７が含まれ、ＨＰＶ１６からのタンパク質Ｄ−Ｅ６もしくはＥ７融合体もしくはその組み合わせ、又は、Ｅ６もしくはＥ７のＬ２との組み合わせを形成する（国際公開第９６／２６２７７号）。あるいは、ＨＰＶ１６又は１８の初期タンパク質Ｅ６及びＥ７は、例えばタンパク質Ｄ−Ｅ６／Ｅ７融合体である、単一分子で存在し得る。組成物は、ＨＰＶ１８の前にＥ６及びＥ７タンパク質のいずれか又は両方を、例えばタンパク質Ｄ−Ｅ６もしくはタンパク質Ｄ−Ｅ７融合タンパク質又はタンパク質ＤのＥ６／Ｅ７融合タンパク質の形態で、含有してもよいものであり得る。組成物は、他のＨＰＶ株から、例えばＨＰＶ３１又は３３株からの抗原をさらに含んでもよい。
【０１８０】
抗原はまた、マラリアを引き起こす寄生生物に由来するものであり得る。例えば、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodia falciparum）の抗原には、ＲＴＳ，Ｓ及びＴＲＡＰが含まれる。ＲＴＳは、Ｂ型肝炎ウイルスの表面（Ｓ）抗原とＢ型肝炎表面抗原のｐｒｅＳ２部分の４アミノ酸を介して連結している、熱帯熱マラリア原虫（P.falciparum）のスポロゾイド周囲（ＣＳ）蛋白のＣ末端部分の実質的に全てを含む、ハイブリッドタンパク質である。その完全な構造は、英国特許出願第９１２４３９０．７号の優先権を主張する、国際公開第９３／１０１５２号として公開された、国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ９２／０２５９1号に開示されている。酵母菌において発現する場合には、ＲＴＳはリポタンパク粒子として産生され、ＨＢＶからＳ抗原と共発現する場合には、ＲＴＳ，Ｓとして知られる混合粒子を産生する。
【０１８１】
ＴＲＡＰ抗原は、国際公開第９０／０１４９６号として公開されている、国際特許出願第ＰＣＴ／ＧＢ８９／００８９５号に記載されている。本発明のある実施形態はマラリアワクチンであって、抗原製剤には、ＲＴＳ，Ｓ及びＴＲＡＰ抗原の組み合わせが含まれる。多段階のマラリアワクチンの成分となる候補の可能性がある他のマラリア原虫抗原は、マラリア原虫種における、熱帯熱マラリア原虫（P. faciparum）の、ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、Ｓｅｑｕｅｓｔｒｉｎ、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７１２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０、及びそれらの類似体である。
【０１８２】
一実施形態では、抗原は、免疫療法による癌治療に有用となり得るように、癌細胞に由来するものである。例えば、該抗原は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵癌、腎癌又はメラノーマ糖に対する腫瘍拒絶抗原であり得る。例示的な癌又は癌細胞由来抗原には、ＭＡＧＥ１、３及びＭＡＧＥ４もしくは国際公開第９９／４０１８８号に開示されるもの等の他のＭＡＧＥ抗原、ＰＲＡＭＥ、ＢＡＧＥ、Ｌａｇｅ（ＮＹ  Ｅｏｓ  １としても知られる）、ＳＡＧＥ及びＨＡＧＥ（国際公開第９９／５３０６１号）、又はＧＡＧＥ（Robbins and Kawakami, 1996 Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997 & 1998); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p. 293が含まれる。これら非限定的な例の癌抗原は、メラノーマ、肺癌、肉腫及び膀胱癌等の広範な種類の腫瘍で発現される。例えば、米国特許第６，５４４，５１８号を参照されたい。
【０１８３】
他の腫瘍特異的抗原には、担持タンパク質に対する、ＧＭ２及びＧＭ３等の腫瘍特異的もしくは腫瘍関連のガングリオシドもしくはその複合体、又は、完全長性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ、国際公開第９５／２０６００号）等の自己ペプチドホルモン、多数のがん治療で有用な短い１０アミノ酸長ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態では、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＰＳＣＡ（例えば、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95(4) 1735-1740 1998）、ＰＳＭＡ等の前立腺抗原が用いられ、又は、一実施形態では、Ｐｒｏｓｔａｓｅ（プロスターゼ）として知られる抗原が用いられる。（例えば、Nelson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96: 3114-3119; Ferguson, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999.96, 3114-3119、国際公開第９８／１２３０２号、米国特許第５，９５５，３０６号、国際公開第９８／２０１１７号、米国特許第５，８４０，８７１号及び第５，７８６，１４８号、国際公開第００／０４１４９号）。他の前立腺特異的抗原は、国際公開第９８／１３７４１８号及び国際公開第００４１４９号より公知である。その他のものにはＳＴＥＡＰがある（PNAS 96 14523 14528 7-12 1999）。
【０１８４】
本発明の文脈において有用な他の腫瘍関連抗原には、Ｐｌｕ−１（J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999）、ＨＡＳＨ−１、ＨａｓＨ−２、Ｃｒｉｐｔｏ（Salomon et al Bioessays 199, 21:61-70, U.S. Pat. No. 5,654,140）及びＣｒｉｐｔｉｎ（米国特許第５，９８１，２１５号が含まれる。また、癌治療の際のワクチンに特に関連する抗原には、チロシナーゼ及びサバイビンも含まれる。
【０１８５】
或る実施形態では、本開示の組成物は、高齢者、ならびに／又は、腎臓透析における対象を含む、化学療法及び／もしくは放射線療法により免疫抑制性された対象、移植患者等に特に利用可能であることとなる。こうした個体は概して、ワクチンに対する免疫応答が低下しているため、本開示の組成物の使用により、これら対象において達成される免疫応答を向上させることが可能である。
【０１８６】
他の実施形態では、この発明の組成物に用いられる薬剤には、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）等の状態を予防及び治療するために、細菌感染症（例えば、肺炎球菌）によって引き起こされた又は悪化したもの等である呼吸器疾患に関連する抗原が含まれる。ＣＯＰＤは、慢性気管支炎及び／又は肺気腫を患う患者の不可逆的もしくは一部可逆的な気道閉塞が存在することで、生理学的に規定される（Am J Respir Crit Care Med. 1995 Nov;152(5 Pt 2):S77-121）。ＣＯＰＤの悪化はしばしば、細菌（例えば、肺炎球菌）の感染が原因である（Clin Microbiol Rev. 2001 Apr;14(2):336-63）。
ポリヌクレオチド
【０１８７】
一部の実施形態では、薬剤はポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー及びオリゴヌクレオチドが含まれるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。一部の実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡは一本鎖又は二本鎖である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは非コードＲＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはコードＲＮＡである。一部の実施形態では、ＲＮＡは、レプリコンＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ及びミクロＲＮＡからなる群から選択される。
【０１８８】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドが、抗原である又は抗原を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは融合タンパク質である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはＬｅｃＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはＨ５Ｎ１である。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドはＩＤ９３である。
【０１８９】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはレプリコンである。一部の実施形態では、レプリコンは、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージ又はウイルスであり、それはその自身の制御下で大部分を複製することが可能である。一部の実施形態では、レプリコンはＲＮＡ又はＤＮＡである。一部の実施形態では、レプリコンは一本鎖又は二本鎖である。一部の実施形態では、レプリコンはＲＮＡウイルス由来である。
アジュバント
【０１９０】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、ＴＬＲアゴニスト以外のアジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、アジュバントは、ＡＳ−２、モノホスホリルリピドＡ、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（3-de-O-acylated monophosphoryl lipid A）、ＩＦＡ、ＱＳ２１、ＣＷＳ、ＴＯＭ、ＡＧＰ、ＣｐＧ-含有オリゴヌクレオチド、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、Ｌｅｉｆ、サポニン、サポニン模倣体、生物リピドＡ及び合成リピドＡ、イミキモド、ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ、レシキモド（resiquimod）、ｐｏｌｙＩ：Ｃ、フラゲリン、ＧＬＡ、ＳＬＡ、Ｓｔｉｎｇｉｎならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
有機体
【０１９１】
一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物には有機体が含まれる。例えば、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、インフルエンザ原因ウイルス、又は結核（ＴＢ）の原因となる細菌結核菌（Mycobacterium tuberculosis）である。現在のところ、結核菌に対する防御免疫を誘導する最も効率的な方法は、生細菌でのワクチン接種である。この目的のために用いられる最もよくみられるマイコバクテリウム属は、マイコバクテリウム・ボビスの非病原性株である、カルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）である。そのため、一部の実施形態では、組成物が、マイコバクテリウムを含む。
【０１９２】
一部の実施形態では、薬剤はウイルス又はウイルスゲノムである。そのため、これらの実施形態では、組成物が、ウイルス又はウイルスゲノムを含む。
ＴＬＲアゴニスト
【０１９３】
本明細書に記載するように、本開示の或る実施形態では、１つ又は複数のＴｏｌｌ様受容体アゴニスト（ＴＬＲアゴニスト）を含む医薬組成物を含めた、組成物及び免疫アジュバント組成物を考察する。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）には、大量の感染性病原体中に又は大量の感染性病原体において存在し得る等の種々の保存微生物分子構造の宿主細胞に対して早期認識能力を授けるものである、自然免疫系の細胞表面膜貫通受容体が含まれる。（例えば、Armant et al., 2002 Genome Biol. 3(8):reviews3011.1-3011.6; Fearon et al., 1996 Science 272:50; Medzhitov et al., 1997 Curr. Opin. Immunol. 9:4; Luster 2002 Curr. Opin. Immunol. 14:129; Lien et al. 2003 Nat. Immunol. 4:1162; Medzhitov, 2001 Nat. Rev. Immunol. 1:135; Takeda et al., 2003 Ann Rev Immunol. 21:335; Takeda et al. 2005 Int. Immunol. 17:1; Kaisho et al., 2004 Microbes Infect.6:1388; Datta et al., 2003 J. Immunol. 170:4102）。
【０１９４】
先天免疫系を介する免疫応答の開始を増強するＴＬＲ媒介シグナル伝達の誘導を、細胞表面ＴＬＲを結合しているＴＬＲアゴニストが生じさせ得る。例えば、リポ多糖（ＬＰＳ）はＴＬＲ２又はＴＬＲ４を介するＴＬＲアゴニストであり得（Tsan et al., 2004 J. Leuk. Biol. 76:514; Tsan et al., 2004 Am. J. Physiol. Cell Phsiol. 286:C739; Lin et al., 2005 Shock 24:206）、ポリ（イノシン−シチジン）（ｐｏｌｙｌ：Ｃ）はＴＬＲ３を介するＴＬＲアゴニストであり得（Salem et al., 2006 Vaccine 24:5119）、ペプチドグリカンはＴＬＲ２及び／又はＴＬＲ６アゴニストであり得（Soboll et al., 2006 Biol. Reprod. 75:131; Nakao et al., 2005 J. Immunol. 174:1566）、３Ｍ００３（3M Pharmaceuticals社（ミネソタ州セントポール）の４−アミノ−２−（エトキシメチル）−α，α−ジメチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール水和物、分子量３１８Ｄａ、関連化合物３Ｍ００１及び３Ｍ００２の原料でもある。Gorden et al., 2005 J. Immunol. 174:1259）が、ＴＬＲ７アゴニスト（Johansen 2005 Clin. Exp. Allerg. 35:1591）及び／又はＴＬＲ８アゴニスト（Johansen 2005）であり得、フラゲリンがＴＬＲ５アゴニストであり得（Feuillet et al., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:12487）、またＣ型肝炎抗原がＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ９を介するＴＬＲアゴニストとして機能し得る（Lee et al., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1828; Horsmans et al., 2005 Hepatol. 42:724）。他のＴＬＲアゴニストが公知であり（例えば、Schirmbeck et al., 2003 J. Immunol. 171:5198）、現在記載の特定の実施形態に応じて利用してもよい。
【０１９５】
種々の実施形態では、ＴＬＲアゴニストは、ＴＬＲ２アゴニスト、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ５アゴニスト、ＴＬＲ６アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、ＴＬＲ７／８アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、それらの組み合わせであり得る。
組換え発現コンストラクト
【０１９６】
本明細書で開示される或る実施形態によれば、本明細書で記載される組成物は、抗原をコードする核酸配列と操作可能に結合されたプロモーターを含む少なくとも１つの組換え発現コンストラクトを含有し得る。さらなる或る実施形態では、組換え発現コンストラクトは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス又はレトロウイルスベクター等であるウイルスベクター中に存在する。こうした発現コンストラクト及びベクターを作製及び使用する組成物ならびに方法は、本明細書で提供するようなポリペプチド抗原の発現に関して、例えばAusubel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 2006 John Wiley & Sons, NYにより、この技術分野において公知である。組換え発現コンストラクトの非限定的な例は、概して、例えば米国特許第６，８４４，１９２号、第７，０３７，７１２号、第７，０５２，９０４号、第７，００１，７７０号、第６，１０６，８２４号、第５，６９３，５３１号、第６，６１３，８９２号、第６，８７５，６１０号、第７，０６７，３１０号、第６，２１８，１８６号、第６，７８３，９８１号、第７，０５２，９０４号、第６，７８３，９８１号、第６，７３４，１７２号、第６，７１３，０６８号、第５，７９５，５７７号及び第６，７７０，４４５号及びその他において、現在開示する或る実施形態で利用する、本明細書で提供されるようなポリペプチド抗原の発現に適応することが可能であるような教示と共に、見ることが可能である。
免疫応答
【０１９７】
このように、本開示では、免疫応答を開始することが可能である宿主内で、免疫応答を変更（すなわち、例えば当業者が精通しているものであるような適切な制御と比べて、統計的に有意な方式で増加又は減少）させる組成物を提供する。当業者にとって公知であるように、免疫応答は、宿主の免疫状態の何らかの活性の変更であり得、それは、宿主の免疫状態の維持及び／又は規制に関与する、１つもしくは複数の組織、器官、細胞もしくは分子の構造又は機能において何らかの変更を含み得る。典型的に、免疫応答は、可溶性の免疫グロブリンもしくは抗体；サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、ホルモン、増殖因子等の可溶性のメディエータのみならず他の可溶性の小ペプチド、炭水化物、ヌクレオチド及び／もしくは脂質のメディエータ；例えば細胞増殖、変更された運動性、特異的遺伝子発現もしくは細胞溶解性挙動等の特殊活性の誘導である免疫系細胞の変更された機能的もしくは構造的な性質によって判定されるような、細胞活性状態の変化；変更された表面抗原発現プロファイルもしくはアポトーシス（プログラムされた細胞死）の開始を含む免疫系細胞による細胞分化；又は、免疫応答の存在が検出され得るようなその他の基準の、生体内又は試験管内での測定を含むがこれらに限定されない種々の周知のパラメータのいずれかによって検出できる。
【０１９８】
免疫応答はしばしば、例えば分子及び細胞レベルでの宿主の免疫系の細胞及び組織による、自己構造体と非自己構造体との区別として認識され得るが、本開示はそれらに限定されるものではない。例えば免疫応答はまた、自己の分子、細胞又は組織の免疫認識に起因する免疫系の状態の変化も含み得、これは免疫系の成分の典型的な制御等である、任意の数の正常の状態を伴うこともあり、又は、自己免疫疾患及び変性疾患において観察される不適当な自己疫応答等である病状において存在することもある。他の例としては、特定の免疫系の活性の上方制御（抗体及び／もしくはサイトカインの産生、又は、細胞性免疫の活性等）による誘導に加えて、免疫応答はまた検出可能な免疫の抑制、弱毒化もしくはその他の下方制御を含み得、それは、選択された抗原、抗原投与経路、特異的耐性誘導又は他の因子の結果であり得る。
【０１９９】
本開示のワクチンによる、免疫応答の誘導の判定は、当業者が容易になじむこととなるような複数の周知の免疫学的アッセイのいずれかによって確立され得る。こうしたアッセイには、可溶性の抗体；サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、ホルモン、増殖因子等の可溶性のメディエータのみならず他の可溶性の小ペプチド、炭水化物、ヌクレオチド及び／もしくは脂質のメディエータ；例えば細胞増殖、変更された運動性、特異的遺伝子発現もしくは細胞溶解性挙動等の特殊活性の誘導である免疫系細胞の変更された機能的もしくは構造的な性質によって判定されるような、細胞活性状態の変化；変更された表面抗原発現プロファイルもしくはアポトーシス（プログラムされた細胞死）の開始を含む免疫系細胞による細胞分化の、生体内又は試験管内での測定を含むが必ずしもこれらに限定されない。これら及び同様のアッセイを実行する手順は広く知られており、例えばＬｅｆｋｏｖｉｔｓ（Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998、またCurrent Protocols in Immunologyも参照、例えばWeir, Handbook of Experimental Immunology, 1986 Blackwell Scientific, Boston, MA; Mishell and Shigii (eds.)Selected Methods in Cellular Immunology, 1979 Freeman Publishing, San Francisco, CA; Green and Reed, 1998 Science 281:1309も参照、またそれらで引用される参考文献）において見られる。
【０２００】
抗原反応性Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によって達成できる。例えばＴ細胞の増殖は、ＤＮＡ合成速度を測定することによって検出することが可能であり、抗原特異性は、候補抗原反応性Ｔ細胞が曝露する刺激（例えば、特定の所望の抗原パルス抗原提示細胞又はコントロール抗原パルス抗原提示細胞）を制御することによって決定することが可能である。刺激されて増殖したＴ細胞は、ＤＮＡ合成速度の上昇をみせる。ＤＮＡ合成速度を測定する典型的な方法は、例えば、新規に合成されるＤＮＡに組み込まれるヌクレオシド前駆体、トリチウムチミジンによるＴ細胞のパルスラベル培養によるものがある。取り込まれたトリチウムチミジンの量を、液体シンチレーションスペクトロメータで決定することが可能である。Ｔ細胞の増殖を検出する他の方法には、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の産生、Ｃａ２＋フラックス、又は３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウム等の色素取り込みについて増加を測定することが含まれる。あるいは、リンホカインの合成（インターフェロンガンマ等）を測定することが可能であり、又は、特定の抗原に応答することが可能であるＴ細胞の相対数を定量化してもよい。
【０２０１】
抗原特異性抗体の産生の検出は、例えば、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、平衡透析、又はウエスタンブロット法を含む固相免疫ブロット法等の試験管内の方法論を用いて、本開示に係るワクチンで処理した宿主からのサンプル（例えば、血清、血漿又は血液等のサンプルを含有する免疫グロブリン）をアッセイすることによって達成することができる。好ましい実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイは、抗原に特異的な固相モノクローナル抗体による、標的抗原の抗原捕捉固定をさらに含み、例えばアッセイの感度を向上させ得る。可溶性のメディエータ（例えば、サイトカイン、ケモカイン、リンホカイン、プロスタグランジン等）の生成（elaboration）は、例えば市販の販売元（例えば、シグマ社（ミズーリ州セントルイス）、R & D Systems社（ミネソタ州ミネアポリス）のR & D Systems 2006 Catalogも参照のこと）より容易に利用可能である方法、装置及び試薬を用いて、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって容易に判断され得る。
【０２０２】
この技術分野で周知の通例のアッセイを用いて、任意の数の他の免疫学的パラメータを監視してもよい。これらには、例えば、論拠のあるマーカー抗原系、免疫組織化学もしくは他の関連のアッセイを用いた、種々の末梢血もしくはリンパ球系単核細胞の亜集団についての、抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、二次的な試験管内抗体応答、フロー免疫細胞蛍光分析（flow immunocytofluorimetric analysis）が含まれ得る。これらアッセイ及び他のアッセイは、例えば、Rose et al. (Eds.), Manual of Clinical Laboratory Immunolog, 5th Ed., 1997 American Society of Microbiology, Washington, DCに見ることができる。
【０２０３】
したがって、本明細書で提供されるワクチン及びアジュバント組成物は、ＴＨ１−型Ｔリンパ球応答、ＴＨ２−型Ｔリンパ球応答、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答、抗体応答、サイトカイン応答、リンホカイン応答、ケモカイン応答及び炎症反応から選択される少なくとも１つの免疫応答を、宿主において誘発する又は向上させることが可能となるということが考察される。或る実施形態では、免疫応答は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）から選択される１つ又は複数のサイトカインの産生、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８及びＩＬ−２３から選択される１つ又は複数のインターロイキンの産生、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ４及びＣＣＬ５から選択される１つ又は複数のケモカインの産生、ならびに、メモリーＴ細胞応答、メモリーＢ細胞応答、エフェクターＴ細胞応答、細胞傷害性Ｔ細胞応答及びエフェクターＢ細胞応答から選択されるリンパ球応答、のうちの少なくとも１つを含み得る。例えば、国際公開第９４／００１５３号、国際公開第９５／１７２０９号、国際公開第９６／０２５５５号、米国特許第６，６９２，７５２号、米国特許第７，０８４，２５６号、米国特許第６，９７７，０７３号、米国特許第６，７４９，８５６号、米国特許第６，７３３，７６３号、米国特許第６，７９７，２７６号、米国特許第６，７５２，９９５号、米国特許第６，０５７，４２７号、米国特許第６，４７２，５１５号、米国特許第６，３０９，８４７号、米国特許第６，９６９，７０４号、米国特許第６，１２０，７６９号、米国特許第５，９９３，８００号、米国特許第５，５９５，８８８号、Smith et al., 1987 J Biol Chem. 262:6951; Kriegler et al., 1988 Cell 53:45 53; Beutler et al., 1986 Nature 320:584、米国特許第６，９９１，７９１号、米国特許第６，６５４，４６２号、米国特許第６，３７５，９４４号を参照されたい。
医薬組成物
【０２０４】
本明細書では、本明細書に記載の組成物を含む医薬組成物（医薬組成物を含む）を提供する。一部の実施形態では、組成物は、薬剤的に許容できる担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含む。一部の実施形態では、医薬組成物はワクチン組成物である。本明細書に記載の組成物は、対象において免疫応答を刺激するために、該対象に投与することが可能である（非特異的応答及び抗原特異的応答を含む）。一部の実施形態では、対象は哺乳動物（例えば、家畜（ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ等）及び愛玩動物（ネコ、イヌ等）又はヒトを含む動物）である。一実施形態では、対象はヒトである。他の実施形態では、対象は非ヒト哺乳動物である。他の実施形態では、非ヒト哺乳動物は、イヌ、ウシ又はウマである。一部の実施形態では、対象は温血動物である。
【０２０５】
医薬組成物は概して、本明細書に記載の組成物を含み、薬剤的に許容できる担体、賦形剤もしくは希釈剤と組み合わせた抗原、追加的なＴＬＲアゴニスト又は組換え発現コンストラクトから選択される本明細書で提供される１つ又は複数の組成物をさらに含み得る。
【０２０６】
したがって、或る態様では、本開示はＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニストの「単独療法」に関するものであって、本明細書に記載の該ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニストは、実質的に他の抗原を欠いている組成物に製剤されて、そして有機体による感染等である疾患もしくは他の状態を治療又は予防する目的で、免疫応答、例えば非特異的免疫応答を刺激するために対象に投与される。他の態様では、本開示は実質的に他の抗原を欠いている組成物におけるＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニストに関し、有機体による感染等である疾患もしくは他の状態を治療又は予防する目的で、免疫応答、例えば非特異的免疫応答を刺激するために対象に投与される。一実施形態では、例えば、対象において免疫応答を刺激するために、本開示の組成物及び方法が採用される。別の実施形態では、ＧＬＡは、キット中に提供されていてもよいスプレー形態である。
【０２０７】
他の或る実施形態では、医薬組成物は本明細書に記載の組成物と抗原との両方を含むワクチン組成物であり、本明細書で提供するように、薬剤的に許容できる担体、賦形剤もしくは希釈剤と組み合わせた他のＴＬＲアゴニスト等及び／又は組換え発現コンストラクトから選択される１つ又は複数の成分をさらに含んでもよい。例示的な担体は、採用される投与量及び濃度では、投与される者にとって無毒である。
【０２０８】
例示的な担体は、採用される投与量及び濃度では、投与される者にとって無毒である。ＴＬＲ７／８アゴニスト又はＴＬＲ４アゴニストと抗原とを含むワクチンは、典型的には皮内、皮下、筋肉内、静脈内の経路又は他の経路で、体重１キログラム当たり約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇが投与されることとなる。
【０２０９】
好ましい投与量は、約１μｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇであり、約５μｇ／ｋｇ〜約２００μｇ／ｋｇが特に好ましい。当業者にとっては、投与の回数及び頻度は、宿主の応答に依存することとなることが明白であろう。治療上の使用に関する「薬剤的に許容できる担体」は、薬剤分野において周知であり、例えばRemingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.（A.R. Gennaro edit.1985）に記載されている。例えば、生理学的なｐＨで無菌食塩水及びリン酸緩衝食塩水が用いられ得る。医薬組成物には、防腐剤、安定剤、色素及び香味剤が与えられてもよい。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルを防腐剤として添加できる。Ｉｄ.１４４９。さらに、抗酸化剤及び懸濁剤を用いてもよい。Ｉｄ．。
【０２１０】
「薬剤的に許容できる塩」は、前記化合物、有機酸もしくは無機酸（酸付加塩）又は、有機塩基もしくは無機塩基（塩基付加塩）の組み合わせに由来する、本実施形態の化合物の塩を指す。本実施形態の組成物は、自由塩基又は塩形態の何れかで使用され得、両形態は、本実施形態の範囲内であるものとみなされる。
【０２１１】
医薬組成物は、組成物の患者への投与を可能にするような任意の形態であってよい。例えば、組成物は固体、液体又は気体（エアロゾル）の形態であり得る。典型的な投与経路は、限定するものではないが、経口、局所、非経口（例えば、舌下の又は頬側の）、舌下、直腸、膣又は鼻腔内（例えばスプレーとして）を含む。本明細書で用いる場合、非経口という語は、イオン導入（例えば、米国特許第７，０３３，５９８号、第７，０１８，３４５号、第６，９７０，７３９）、超音波導入（sonophoretic）（例えば、米国特許第４，７８０，２１２号、第４，７６７，４０２号、第４，９４８，５８７号、第５，６１８，２７５号、第５，６５６，０１６号、第５，７２２，３９７号、第６，３２２，５３２号、第６，０１８，６７８号）、温熱的（thermal）（例えば、米国特許第５，８８５，２１１号、第６，６８５，６９９号）、受動経皮的（passive transdermal）（例えば、米国特許第３，５９８，１２２号、第３，５９８，１２３号、第４，２８６，５９２号、第４，３１４，５５７号、第４，３７９，４５４号、第４，５６８，３４３号、第５，４６４，３８７、英国特許出願公開第２２３２８９２号明細書、米国特許第６，８７１，４７７号、第６，９７４，５８８号、第６，６７６，９６１）、顕微針（例えば、米国特許第６，９０８，４５３号、第５，４５７，０４１号、第５，５９１，１３９号、第６，０３３，９２８号）投与と、また皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内、静脈内、くも膜下腔内、道内（intrameatal）、尿道内の注射又は点滴技術を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載する組成物（ワクチン及び医薬の組成物を含む）が、イオン泳動、マイクロキャビテーション（microcavitation）、超音波導入（sonophoresis）又は顕微針から選択される技術によって皮内投与される。
【０２１２】
医薬組成物は、組成物を患者に投与したときに、そこに含有される活性成分を生物が利用可能にできるように製剤される。患者に投与することとなる組成物は１以上の投与単位の形態をとるものであって、例えば錠剤を単一の投与単位とすることができ、エアロゾル形態での１つ又は複数の本開示の組成物の容器が、複数の投与単位を保持してもよい。
【０２１３】
経口投与用には、賦形剤及び／又は結合剤が存在してもよい。例としては、ショ糖、カオリン、グリセリン、デンプンデキストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース及びエチルセルロースが挙げられる。着色料及び／又は香味剤が存在してもよい。被覆殻を採用してもよい。
【０２１４】
組成物は、液体、例えばエリキシル剤、シロップ、液剤、エマルジョン又は懸濁液の形態であってもよい。該液体は、２つの例として、経口投与用であり得るか、注射による輸送用であり得る。経口投与用を意図する場合、好ましい組成物は、甘味剤、防腐剤、色素／着色剤、及び調味料のうちの１つ又は複数を含有する。注射投与を意図する組成物では、界面活性剤、防腐剤、浸潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定剤及び等張剤のうちの１つ又は複数を含み得る。
【０２１５】
本明細書で用いる場合、液剤、懸濁液剤又は他の類似の形態である液体医薬組成物は、以下の担体又は賦形剤：例えば注射用蒸留水、食塩水、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張食塩水、例えばスクアレン、スクアラン、鉱油、ｍａｎｎｉｄｅ  ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ、コレステロール及び／又は溶媒もしくは懸濁溶媒として機能し得る合成モノグリセリドもしくはジグリセリド、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の溶媒である不揮発性油等である無菌希釈液；例えばベンジルアルコール又はメチルパラベンである抗菌剤；例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムである抗酸化剤；例えばエチレンジアミン四酢酸であるキレート化剤；例えば酢酸塩、クエン酸塩もしくはリン酸塩である緩衝剤、ならびに、例えば塩化ナトリウムもしくはブドウ糖等の張性を調節するための試薬、のうちの１つ又は複数を含み得る。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器又はガラスもしくはプラスチック製の多用量バイアルに封入することが可能である。注射可能な医薬組成物は、無菌とすることが好ましい。
【０２１６】
他の実施形態では、本開示の組成物は、エアロゾル化可能である方式に製剤される。
【０２１７】
ワクチン又は医薬組成物中に輸送担体等の他の成分を含むことも望ましいものであり得、限定されるものではないが、アルミニウム塩、油中水型エマルジョン、生分解性油担体、水中油型エマルジョン、生分解性マイクロカプセル及びリポソームが含まれる。こうした担体中で用いられる追加的な免疫賦活性物質（共アジュバント）の例もまた上記に記載されており、Ｎ-アセチルムラミル−Ｌ−アラニン−Ｄ−イソグルタミン（ＭＤＰ）、グルカン、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマインターフェロン、及びＩＬ−１２が含まれ得る。
【０２１８】
当業者にとって公知であるあらゆる好適な担体を、本開示の医薬組成物中で用いることができるが、担体の種類は、投与形態及び徐放を所望するか否かに依存して変更されることとなる。皮下注射等の非経口投与用では、担体が、水、食塩水、アルコール、脂肪、ロウ又は緩衝剤を含むことが好ましい。経口投与用では、上記した担体のいずれか、又はマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム（sodium saccharine）、タルク、セルロース、ブドウ糖、ショ糖及び炭酸マグネシウム等である固体担体を採用することができる。生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクチド（polylactic galactide））を、本実施形態の医薬組成物用の担体として採用してもよい。好適な生分解性ミクロスフェアは、例えば米国特許第４，８９７，２６８号及び第５，０７５，１０９号に開示されている。これに関しては、ミクロスフェアは約２５ミクロンより大きいものとすることが好ましい。
【０２１９】
医薬組成物はまた、緩衝剤等の希釈剤、アスコルビン酸等の抗酸化剤、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、ブドウ糖、ショ糖又はデキストリンを含む炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート化剤、グルタチオン及び他の安定剤ならびに賦形剤を含んでもよい。中性緩衝食塩水、又は、非特異的血清アルブミンと混合した食塩水が、例示的な適切な希釈剤である。産物は、希釈剤として適切な賦形剤溶液（例えばショ糖）を用いた凍結乾燥物として調製され得ることが好ましい。
【０２２０】
上記に記載するように、或る実施形態では、本開示は所望の抗原をコードする核酸分子を輸送することが可能である組成物を含む。こうした組成物には、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス（国際公開第９０／０７９３６号、国際公開第９１／０２８０５号、国際公開第９３／２５２３４号、国際公開第９３／２５６９８号及び国際公開第９４／０３６２２号を参照のこと）、アデノウイルス（Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988；Li et al., Hum.Gene Ther.4:403-409, 1993；Vincent et al., Nat. Genet.5:130--134, 1993；及び、Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994を参照のこと）、ポックスウイルス（米国特許第４，７６９，３３０号、米国特許第５，０１７，４８７号及び国際公開第８９／０１９７３号を参照のこと））、ポリカチオン分子と複合化する組換え発現コンストラクト核酸分子（国際公開第９３／０３７０９号を参照のこと）、及び、リポソームと関連する核酸（Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851, 1987を参照のこと）が含まれる。或る実施形態では、ＤＮＡは死滅又は不活化させたアデノウイルスと結合し得る（Curiel et al., Hum.Gene Ther.3:147-154, 1992; Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6094, 1992を参照のこと）。他の好適な組成物には、ＤＮＡリガンド（Wu et al., J. Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989を参照のこと）及び脂質−ＤＮＡ複合体（Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989を参照のこと）が含まれる。
【０２２１】
直接の生体内手順に加えて、宿主から細胞を取り出し、改変し、同様の又は他の宿主動物内に入れる、生体外手順を用いてもよい。当業者は、生体外の文脈において、抗原をコードする核酸分子の組織細胞への導入に関して上記に示した組成物のいずれかを利用することが可能であることが明らかであろう。ウイルスの物理的及び化学的取り込み方法のプロトコルは、この技術分野において周知である。
【０２２２】
したがって、本実施形態は、宿主、患者もしくは細胞培養において、免疫応答を向上させる又は誘発させるのに有用である。本明細書で用いる場合「患者」という語は、任意の温血動物を指し、好ましくはヒトを指す。ある患者は、感染症、乳癌等の癌、又は、自己免疫疾患を患うか、又は、正常（すなわち、検出可能な疾患及び／又は感染がない）であり得る。「細胞の培養」は、免疫適格細胞又は免疫系の単離細胞（Ｔ細胞、マクロファージ、単核細胞、Ｂ細胞及び樹状細胞を含むがこれらに限定されない）を含有する任意の調製である。こうした細胞は、当業者に周知である種々の技術のいずれか（例えば、フィコール−ハイパーク密度遠心分離（Ficoll-hypaque density centrifugation））によって単離することができる。細胞は、癌罹患患者から単離することができ（必ずしもそうではないが）、また治療後の患者に再導入することができる。
【０２２３】
或る実施形態では、非経口投与又は経口投与のいずれかを意図する液体組成物は、好適な用量が得られることとなるように、ある量のワクチン組成物を含有するべきである。典型的には、この量は、組成物中で、抗原を少なくとも０．０１重量％とする。経口投与を意図する場合、この量は、組成物の０．１〜約７０重量％とするように変化させてよい。好ましい経口組成物としては、抗原を約４％〜約５０％含有する。好ましい組成物及び製剤は、非経口の投与単位が、活性成分を０．０１〜１重量％含有するように調製される。
【０２２４】
医薬組成物は、局所投与を意図してもよいものであり、その場合には、担体は、液剤、エマルジョン、軟膏又はゲル基剤を好適に含むことができる。この基剤は例えば、以下のうちの１つ又は複数：ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、ミツロウ、鉱油、例えば水及びアルコールである希釈剤、ならびに乳化剤ならびに安定剤、を含むことができる。局所投与用の医薬組成物中には、増粘剤が存在していてもよい。経皮投与を意図する場合には、組成物は、経皮貼布又はイオン導入デバイスを含むことができる。局所製剤には、抗原（例えば、ＧＬＡ−抗原ワクチン組成物）又はＧＬＡ（例えば、免疫アジュバント組成物であって、ＧＬＡはAvanti Polar Lipids社（アラバマ州アラバスター）より市販される。例えば製品番号６９９８００）を、約０．１〜約１０％ｗ／ｖ（単位体積重量）の濃度で含有し得る。
【０２２５】
組成物は、例えば、直腸内で融解して薬剤を放出することとなるような座剤の形態で、直腸投与用とすることができる。直腸投与用組成物は、好適な非刺激性賦形剤として、油脂性基剤を含有し得る。こうした基剤には、限定するものではないが、ラノリン、カカオバター及びポリエチレングリコールが含まれる。本開示の方法では、ワクチン組成物／アジュバントは、インサート、ビーズ、徐放製剤、貼布又は高速放出製剤（fast-release formulation）の使用を介して投与してもよい。
【０２２６】
また或る実施形態では、本明細書で開示されるワクチン組成物及び／又は免疫アジュバント組成物を含むキットであって、１つ又は複数の容器で提供され得るキットが考察される。一実施形態では、ワクチン組成物及び／又は免疫アジュバント組成物の全ての成分が、単一の容器内に共に存在するが、該実施形態はそれに限定することを意図するものではなく、例えば免疫アジュバント組成物が抗原成分とは分離されて接触しないものである２つ以上の容器についてもまた考察される。非限定的な理論として、免疫アジュバント組成物のみの投与が有益に機能し得る場合もある一方で、こうした投与が、抗原の投与とは時間的及び／又は空間的（例えば、異なる解剖学的位置で）に有益に間をとり得るような他の場合もあり、また一方で、本明細書に記載されるような、抗原及びアジュバント組成物の両方及び随意に本明細書に記載の他の成分も同様に含有するワクチン組成物の対象への投与が有益に行われるようなさらに他の場合もあるということが考えられる。
【０２２７】
こうしたキットの実施形態に係る容器は、任意の好適な器（vessel）、バイアル、アンプル、チューブ、カップ、箱、瓶、フラスコ、ジャー、ディッシュ、単一ウェル又は複数ウェル装置のウェル、貯留部（reservoir）、タンク等、又は、本明細書で開示する組成物を配置し、保存し、及び／又は輸送し、内容物を取り出すために出し入れすることができる他のデバイスであり得る。典型的にはこうした容器は、意図する使用との互換性があり、収納された内容物の回収を容易に行うことが可能である材料で製造することができる。こうした容器の好ましい例には、ガラス及び／もしくはプラスチックで封止される又は再封止可能なチューブならびにアンプルが含まれ、それらは、針及び注射器を用いて内容物を引き出すことと互換性がある、ゴムセプタム又は他の封止手段を有することを含む。こうした容器は、例えば、容器から材料を効率よく取り出すことを許容し、かつ、例えば紫外線もしくは極端な温度等の分解性条件もしくは微生物汚染を含む望まない汚染の導入から材料を保護するような物質により製造もしくは該物質で被覆できるガラス又は化学的に互換性のあるプラスチックもしくは樹脂により製造してもよい。この容器は、無菌又は滅菌可能であること、ならびに、例えば本明細書に記載のワクチン組成物及び／もしくは免疫アジュバント組成物及び／もしくは抗原及び／もしくは組換え発現コンストラクト等を懸濁又は溶解させるために用いることができる等、任意のキャリヤ、賦形剤、溶媒、担体等と互換性があるような物質より製造されることが好ましい。
【０２２８】
以下の実施例は、例示のために提供するものであって、限定するためのものではない。
【実施例】
【０２２９】
実施例１  アジュバント活性を向上させるための、合成ＴＬＲ７／８リガンドのオキシ水酸化アルミニウムへの吸着
概要
【０２３０】
１世紀近くの間、最も広く用いられているワクチンアジュバント製剤はアルミニウム塩であり、そのため安全性と効能の歴史が確立されている。それにもかかわらず、大きな課題である疾患の標的、例えば結核又はＨＩＶに関しては、アルミニウム塩のアジュバント活性は、予防効果を達成するのに十分有力でないことがある。ＴＬＲリガンドのアルミニウム塩への吸着は、ヒトパピローマウイルスワクチンＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）等において、アジュバント活性の向上を促進する。しかしながら、ＴＬＲ７／８アゴニストイミダゾキノリン等の一部のＴＬＲリガンドは、アルミニウム塩に対して効果的に吸着しない。本開示では、用いる補助脂質の構造的性質によりアルミニウム塩への吸着を促進するような合成ＴＬＲ７／８リガンド（例えば、３Ｍ−０５２）の脂質系ナノ懸濁液剤を開発することによって、課題を解決する製剤アプローチについて記載する。免疫したマウスにおいて、オキシ水酸化アルミニウム吸着製剤である３Ｍ−０５２が、結核及びＨＩＶに対するワクチン抗原への抗体及びＴＨ１型の細胞免疫応答を向上させた。
【０２３１】
本開示では、はじめにＰＲＲリガンドを水性ナノ懸濁液剤の形態で補助脂質と共に調製した場合に、ＰＲＲリガンドの化学的構造を変化させることなく、補助脂質の構造的性質がＰＲＲリガンドのアルミニウム塩への吸着を促進し得る、ということを提供する。さらに、このアプローチの万能性は、それと複合化している補助脂質の構造に応じて、同一のＰＲＲリガンドが異なる種類のアルミニウム塩と吸着することを可能にし得る。本開示では、共吸着される組換えの結核又はＨＩＶのワクチン抗原に対する抗体及び細胞の免疫原性を向上させるワクチンアジュバント製剤を形成するために、合成ＴＬＲ７／８リガンド３Ｍ−０５２（５）とアルミニウム塩との間の吸着性の相互作用を改変するナノ懸濁液剤の開発に関与する製剤アプローチを提供する。
材料及び方法
【０２３２】
アジュバント製剤の材料
合成の１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ｐｈｏｓｐｈｃｏｃｈｏｌｉｎｅ（ＤＬＰＣ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（phosphocholine）（ＤＭＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＬＰＧ）、１，２−ｄｉｍｙｒｓｉｔｏｙｌ−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＭＰＧ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＰＰＧ），１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＳＰＧ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ＤＯＰＧ）、１，２−ジステアロイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＳＴＡＰ）、１，２−ジパルミトイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＰＴＡＰ）、及びグルコピラノシルリピドアジュバント（ＧＬＡ、ＰＨＡＤ（登録商標）としても知られる）を、Avanti Polar Lipids社（アラバマ州アラバスター）より購入した。ポリソルベート８０は、J.T. Baker社（カリフォルニア州サンフランシスコ）より購入した。ポロクサマー１８８は、Spectrum Chemical社（カリフォルニア州ガーデナ）より購入した。食塩水（０．９％ｗ／ｖ）は、Teknova社（カリフォルニア州ホリスター）より購入した。ＴＬＲ９  ＣｐＧコントロールは、Avecia社（マサチューセッツ州ミルフォード）より得た。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）‘８５’及びＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）は、E.M. Sergeant Pulp & Chemical社（ニュージャージー州クリフトン）より購入した。ＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原は、Fouts et al.（Expression and Characterization of a Single-Chain Polypeptide Analogue of the Human Immunodeficiency Virus Type 1 gp120-CD4 Receptor Complex”  Virol. vol. 74, no. 24, December 2000, 11427-11436）に参照される。実施例で用いたＧＬＡは一般式（ＩＩＩ）の構造を有し、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６は炭素数１１のアルキルであり、Ｒ２及びＲ４は炭素数１３のアルキルである。
【０２３３】
アジュバント製剤の製造
水性ナノ懸濁液剤は、３Ｍ−０５２又はＧＬＡを脂質賦形剤と共にモル比１：２（アジュバント：脂質）で、クロロホルム中にもしくは、クロロホルム、メタノール及び水の混合液中に分散させることで製造した。その後溶媒を、Ｇｅｎｅｖａｃ ＥＺ−２遠心エバポレーター（ニューヨーク州ストーンリッジ（Stone Ridge）)を用いて蒸発させた。乾燥させた膜を超純水で再水和して、その後最大数時間又は調製物が視認できる粒子のない半透明になるまで、超音波処理の水浴を約６０℃にしてＣｒｅｓｔ  ｐｏｗｅｒｓｏｎｉｃ  ＣＰ２３０Ｄ（ニュージャージー州トレントン）で超音波処理した。アルミニウム含有組成物を調製するために、水性ナノ懸濁液剤をＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）又はＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）と混合した。免疫原性試験のために、組換えワクチン抗原（ＩＤ９３又はＨＩＶ  ｇｐ１２０の抗原）を、ナノ懸濁液、アルミニウム及び上記した希釈剤と共に混合した。
【０２３４】
アジュバント製剤の特性決定及び安定性
水性ナノ懸濁液剤は、Malvern Instruments社（英国ウスターシャー）のゼータサイザーナノ（Zetasizer Nano）−Ｓ又は−ＺＳを用いて動的光散乱（ＤＬＳ）によって粒子サイズについて特性決定した。水性ナノ懸濁液剤は、Ｚ−平均（Z-ave）として報告される、分散強度バイアスの平均直径値が得られる３回の測定からなる分析の前に、ポリスチレンキュベット中で１：１０又は１：１００倍に水で希釈した。ゼータサイザーナノ−ＺＳにより、水での１：１０希釈で調製した各サンプルから回収した９回の連続測定で、使い捨てキャピラリーセルを用いてゼータ電位を測定した。通常、３Ｍ−０５２濃度は、調製物をエタノール：ＨＣｌ（９８：２ｖ：ｖ）で１：２０に希釈した後３２２．５ｎｍのＵＶ吸光度より測定し、検量線と比較した。有機溶媒での希釈により、ナノ懸濁液剤粒子の光分散から干渉可能性が除去される。しかしながら、３Ｍ−０５２の結合等温線については、最大感度が望まれる場合には、サンプル又は標準に対して希釈を行わなかった。あるいは、３Ｍ−０５２の濃度は、荷電化粒子検出器を備えた逆相ＨＰＬＣで決定した。ＴＬＲ９  ＣｐＧコントロールの濃度は、エタノール：ＨＣｌで１：２０に希釈後、２６０ｎｍのＵＶ吸光度より測定した。ＧＬＡ濃度は、Ｃ１８カラム（Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３又はＡｇｉｌｅｎｔ  ＸＢｒｉｄｇｅ）及び荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）を備えた逆相ＨＰＬＣを用いて、先に記載したように、メタノール：クロロホルム：水の移動相のグラジエントで測定した（６）。非結合ＴＬＲリガンドを検出するために、アルミニウム含有製剤を上記に示すように短時間遠心分離し、上清をＵＶ吸光度又はＨＰＬＣ−ＣＡＤでアッセイした。遠心分離時間は、実験に応じて、２，０００〜１６，０００×ｇで２〜５分とした。一部の実験では（図２Ｄ及び表４）、アルミニウム塩製剤中のＴＬＲアゴニストの沈降作用における食塩水又はバッファーの塩の影響を除去するために、はじめにアルミニウム塩を遠心分離して、上清を取り出し、水で置き換えたが、この処理は、結合試験においてアルミニウム塩を用いる前の別の洗浄で繰り返した。
【０２３５】
クライオＴＥＭ画像
サンプルを、４００メッシュの銅製グリッドに載せた穴開き炭素フィルムで支持したガラス状の氷中に保持した。３μＬ滴のサンプル懸濁液を、洗浄したグリッドに塗布し、ろ紙で汚れを除去して直ぐに液体エタン中でガラス化を行うことによって、サンプルを調製した。グリッドは、イメージングのために電子顕微鏡に移動するまで、液体窒素下で保存した。電子顕微鏡解析は、ＦＥＩ社のＴｅｃｎａｉ  Ｔ１２電子顕微鏡を用いて実行し、ＦＥＩ  Ｅａｇｌｅ４Ｋ×４ＫＣＣＤカメラを設置して１２０ｋｅＶで操作した。ガラス状の氷のグリッドは、−１７０℃以下の温度でグリッドを維持するクライオステージを用いて、電子顕微鏡に移動させた。各グリッドの画像を、試料の分布全体を評価するために多重スケールで取得した。イメージングに好適でありそうな標的箇所を低倍率で特定したら、高倍率画像を１１０，０００×（０．１０ｎｍ／ピクセル）、５２，０００×（０．２１ｎｍ／ピクセル）及び２１，０００×（０．５０ｎｍ／ピクセル）の公称倍率で取得した。この画像は、−２μｍ（１１０，０００×）、−３μｍ〜−２μｍ（５２，０００×）及び−５μｍ（２１，０００×）の公称アンダーフォーカス及び電子照射量約９〜４２ｅ／Å２で取得した。
【０２３６】
アルミニウム塩への抗原の吸着性
３Ｍ−０５２及びＩＤ９３又はＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）及びＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）への結合効率を、ＵＶ−Ｖｉｓ分光法と、銀染色のＳＤＳ−ＰＡＧＥとにより決定した。１ｍＬの製剤を、食塩希釈液、抗原、３Ｍ−０５２−ＡＦ及び／又はアルミニウム塩を混合することによって調製した。ＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原の吸着性を決定するために、３０μｌのサンプル上清を１０μｌのＬＤＳサンプルバッファー，ｒｅｄｕｃｉｎｇ（４Ｘ）又はＬＤＳサンプルバッファー，ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ（４Ｘ）と混合し、次いでその２０〜２５μｌを１５μｌのＳｅｅＢｌｕｅ２  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄと共に１０レーンのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに加えた。ＩＤ９３の吸着性を決定するために、４５μｌのサンプル上清を１５μｌのＬＤＳサンプルバッファー，ｒｅｄｕｃｉｎｇ（４Ｘ）と混合し、次いでその２５μｌを１５μｌのＳｅｅＢｌｕｅ２  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄと共に１０レーンのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに加えた。該ゲルを１９０Ｖで５５分間走査し、その後固定液、５０：４０：１０のＥｔＯＨ：ＣＨ３ＣＯＯＨ：Ｈ２Ｏ中に一晩置いた。その後、Sigma-Aldrich社（ミズーリ州セントルイス）のＰｒｏｔｅｏＳｉｌｖｅｒ  Ｐｌｕｓ  Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎキットの指示に従って、ゲルを染色した。
【０２３７】
動物及び免疫化
Ｃ５７Ｂｌ／６及びＢ６．１２９Ｓ１−ＴＬＲ７ｔｍ１Ｆｌｖ／Ｊ（ＴＬＲ７−／−）を、Jackson Laboratories社（メーン州バー・ハーバー）より購入した。ＡｄｊｕＰｈｏｓ、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）で、３Ｍ−０５２＋Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）で、３Ｍ−０５２＋ＡｄｊｕＰｈｏｓもしくはＧＬＡ＋Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）でのアジュバントを含む、組換え型ＴＢワクチン抗原ＩＤ９３（０．５μｇ／用量）又はＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原（１０μｇ／用量）での筋肉内注射により、マウスを免疫した。最終的なアジュバント投与量は、１００μＬ中２００μｇのＡｄｊｕＰｈｏｓ又はＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）と共に、５μｇのＧＬＡ又は０．１〜１０μｇの３Ｍ−０５２とした。マウスは初回免疫後３週目に追加免疫した。全てのマウスを、特定病原体未感染条件下で維持した。全ての手順が、ＩＤＲＩ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅで承認された。
【０２３８】
抗体力価
マウスの血清（Ｎ＝５／群）は、免疫後２１日目に、眼窩後方血液を、ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ血清回収チューブ（ＶＷＲインターナショナル社（VWR International）、ペンシルベニア州ウェストチェスター）に回収して、次いで遠心分離することによって調製した。その後各血清サンプルを、抗体捕捉ＥＬＩＳＡによって分析した。簡潔には、ＥＬＩＳＡプレート（Nunc社、ニューヨーク州ロチェスター）を、０．１Ｍ重炭酸塩緩衝液中２μｇ／ｍｌの免疫抗原でコーティングし、１％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした。その後、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後に、連続希釈した血清サンプル、抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２ｃ−ＨＲＰ（Southern Biotech社、アラバマ州バーミンガム）、及び、ＡＢＴＳ−Ｈ２Ｏ２（Kirkegaard and Perry Laboratories社、メリーランド州ゲイザースバーグ）をこの順序通りにプレートに加えた。プレートを、４０５ｎｍ（ＥＬＸ８０８、Bio-Tek Instruments社、バーモント州ウィヌースキー）で分析した。エンドポイント力価は、Ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン６（ＧｒａｐｈＰａｄ（グラフパッド））を用いて計算した。あるいは、膣洗浄液をＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原での第３回免疫後３週目に回収し、同じ方法で抗体力価を分析した。
【０２３９】
細胞内サイトカイン染色
最終免疫後１週目に、脾細胞を単離した。赤血球を、Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓバッファー（eBioscience社）を用いて溶解し、ＲＰＭＩ  １６４０及び１０％ＦＢＳ中で再懸濁した。細胞を２×１０６細胞／ウェルで９６ウェルプレートに入れて、免疫抗原（１０μｇ／ｍＬ）で２時間刺激するか、又は３７℃で無刺激とした。ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（BD Biosciences社）を添加し、細胞を３７℃でさらに８時間インキュベートした。細胞を洗浄し、抗ＣＤ１６／３２（クローン２．４Ｇ２）の存在中で２０分間、ＣＤ４（クローンＧＫ１．５）、ＣＤ４４（クローンＩＭ７）及びＣＤ８（クローン５３−６．７）（BioLegend社及びeBioscience社）に対する蛍光色素標識した抗体で表面染色した。細胞を洗浄して、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（BD Biosciences社）で２０分間透過処理した。細胞をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（BD Biosciences社）で２回洗浄して、２０分間室温で、ＣＤ１５４（クローンＭＲ１）、ＩＦＮ−γ（クローンＸＭＧ−１．２）、ＩＬ−２（クローンＪＥＳ６−５Ｈ４）、ＴＮＦ（クローンＭＰ６−ＸＴ２２）、ＧＭ−ＣＳＦ（クローンＭＰ１−２２Ｅ９、ＩＬ−５（クローンＴＲＦＫ５）及びＩＬ−１７Ａ（クローンＴＣ１１−１８Ｈ１０．１）（BioLegend社及びeBioscience社）に対する蛍光色素標識した抗体で細胞内染色した。細胞を洗浄して、ＰＢＳ中で再懸濁した。最大１０６の事象を、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（BD Biosciences社）で収集した。データはＦｌｏｗＪｏ（TreeStar社）で分析した。細胞を、シングレット＞リンパ球＞ＣＤ４＋ＣＤ８−＞サイトカイン陽性又はＣＤ４４ｈｉ＞サイトカイン陽性としてゲートした。抗原特異的応答頻度は、応答陽性の非刺激細胞の頻度を抗原刺激細胞から減算することによって決定した。
【０２４０】
抗体分泌細胞ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
骨髄中に存在する抗原特異的抗体の分泌細胞を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより定量した。アッセイ開始の１日前に、マルチスクリーンＥＬＩＳＰＯＴプレート（Millipore社）を１ｕｇの抗原／ウェルでコーティングし、一晩インキュベートした。ブロッキングしたプレートを、洗浄用緩衝液（ＰＢＳ＋０．５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、回収用培地で２時間ブロッキングし、３回洗浄した。免疫後２１日目に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＲＰＭＩ培地に骨髄を回収して、Ｇｕａｖａ自動細胞計数器（Millipore社）を用いて定量し、そして１×１０６細胞／ｍＬに再懸濁した。細胞は３倍に連続希釈し、プレートに加えて、３７℃で５時間インキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と複合化したヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Southern Biotech社）の１：１００希釈の添加によって、分泌抗体を検出した。ＡＥＣペルオキシダーゼ基質キット（Vector Labs社）により製造元の指示に従って、スポットを可視化した。スポットはＣＴＬバイオアナライザーで定量した。
【０２４１】
先天免疫応答
腓腹筋への筋肉内免疫１８時間後に、膝窩の流入領域リンパ節を回収して、プロテアーゼ阻害剤を含有するＰＢＳ（Thermo Fisher Scientific社）中で分離した。細胞は、CＤ８、ＣＤ９０．２（クローン５３−２．１）、ＣＤ１９（クローン１Ｄ３）、ＮＫ１．１（クローンＰＫ１３６）、ＣＤ１１ｃ（クローンＮ４１８）、ＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０）、Ｌｙ６Ｇ（クローン１Ａ８）、Ｌｙ６Ｃ（ＨＫ１．４）、ＣＤ６９（クローンＨ１．２Ｆ３）及びＣＤ８６（クローンＧＬ１）に関して、２０分間氷上で表面染色した。細胞を洗浄して、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（BD Biosciences社）で２０分間透過処理した。細胞をＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ（BD Biosciences社）で２回洗浄して、２０分間室温で、ＩＦＮ−γ及びｐｒｏＩＬ−１β（クローンＮＪＴＥＮ３）（BioLegend及びeBioscience社）に対する蛍光色素標識した抗体で細胞内染色した。細胞を洗浄して、ＰＢＳ中で再懸濁した。最大１０６の事象を、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（BD Biosciences社）で収集した。データはＦｌｏｗＪｏ（TreeStar社）で分析した。細胞を、シングレット＞細胞＞ＣＤ１９＋ＣＤ９０．２−（Ｂ細胞）、ＣＤ８＋ＣＤ９０．２＋（ＣＤ８  Ｔ細胞）、ＣＤ８−ＣＤ９０．２＋（ＣＤ４  Ｔ細胞）、ＣＤ８−ＣＤ１９−ＮＫ１．１＋（ＮＫ細胞）、ＣＤ８−ＣＤ１９−ＣＤ１１ｃ＋（ＤＣｓ）、ＣＤ８−ＣＤ１９−ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋（炎症系単核細胞）又はＣＤ１９−ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｇ＋（ＰＭＮ）としてゲートした。
【０２４２】
統計的分析
抗体及びＴ細胞の応答を、Ｐｒｉｓｍバージョン５又はそれ以降（ＧｒａｐｈＰａｄ（グラフパッド））を用いて、チューキーの多重比較修正で２元配置分散分析（two-way ANOVA）によって分析した。ｐ値＜０．０５を与えた比較が重要であると考えた。有意義な比較のみを図面に示している（アジュバントを含む群対抗原単独；３Ｍ−０５２−Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、対Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）、３Ｍ−０５２−ＡＦ又は３Ｍ−０５２−ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）；３Ｍ−０５２−ＡｄｊｕＰｈｏｓ、対ＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）又は３Ｍ−０５２−ＡＦ）。
結果
製剤開発及び物理化学的特性決定
【０２４３】
ＴＬＲリガンドの水性ナノ懸濁液剤は、安定な補助脂質を添加して、エネルギーを入力（例えば、超音波処理）し、脂質複合体の粒子サイズを破壊することによって調製する（７）。３Ｍ−０５２とナノサイズの粒子を形成する安定な補助脂質を決定するために、ある範囲のリン脂質（図１）をスクリーニングした。はじめにこれら補助脂質を、ＴＬＲ４リガンドでの研究に基づいて、有機溶媒中でモル比１：２（３Ｍ−０５２：補助脂質）で３Ｍ−０５２と混合した（８）。溶媒を蒸発させた後、調製物を水和及び超音波処理して、粒子サイズを約＜２００ｎｍまで減少させて最終的な無菌ろ過の可能性を許容するようにした。動的光散乱によって決定したとおり、いくつかの製剤の許容される製造後の粒子サイズ（約＜２００ｎｍ）を提示している（図２Ａ）。補助脂質の性質が、製剤の粒子サイズと物理的な安定性を表していた。５℃で２週間保存したことにより、一部の製剤では、サイズが有意に大きくなり（ＤＬＰＣ、ＤＯＰＣ、ポリソルベート８０）、製剤が物理的に不安定性であることを示した一方で、他の製剤では、変化がほぼなかった（ＤＳＰＧ、ＤＳＴＡＰ）（図２Ｂ）。
【０２４４】
予想した通り、３Ｍ−０５２等のイミダゾキノリンの化学構造に起因して、ほとんどの製剤で正電荷となり（図２Ｃ）、ｐＫａが約７であった（９）。しかしながら、ＤＳＰＧでは、ＤＳＰＧ内の負電荷のリン酸基に起因して陰イオン性粒子の形成を生じる。陰イオン性の水性懸濁液は、オキシ水酸化アルミニウムに対する吸着の可能性を理由に、ワクチンアジュバント開発で特に関心のあるものである。そのため、３Ｍ−０５２の安定の水性懸濁液剤のオキシ水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムに対する吸着性を試験した。３Ｍ−０５２を１００μｇ／ｍｌの濃度で、ＤＳＰＧ系懸濁液剤のオキシ水酸化アルミニウムへの効率的な結合が観察されたが、しかし３Ｍ−０５２のＤＳＴＡＰ系懸濁液剤のオキシ水酸化アルミニウムへの検出可能な吸着は発生しなかった（図２Ｄ、推定ＬＯＤ約５μｇ／ｍＬ）。対照的に、ＤＳＴＡＰ系懸濁液は、リン酸アルミニウムに効率的に吸着したが、オキシ水酸化アルミニウムへの吸着はなかった。そのため、補助脂質を適切に選択することによって、異なる種類のアルミニウム塩との３Ｍ−０５２の水性ナノ懸濁液剤の吸着が促進される。ＤＳＰＧと同一又は類似の主鎖であるが異なるアシル鎖長又は飽和をもつリン脂質もまた、ナノ懸濁液剤の形成と３Ｍ−０５２のオキシ水酸化アルミニウムに対する吸着性とを向上させた（表１）。
表１  ＰＧ系ナノ懸濁液剤のサイズ及び吸着性における、アシル鎖及び飽和による影響
値は、粒子サイズとサイズの多分散性とに関しては同一サンプル、又は、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）に対する吸着実験に関してはデュプリケートサンプルでの、３回測定の平均±標準偏差を表している。
【０２４５】
【表４】
2019519504.tif 000023
【０２４６】
ＤＳＰＧ系ナノ懸濁液剤（以後、３Ｍ−０５２−ＡＦと示す）に対するその後の努力は、本開示で用いたもの等の陰イオン性組換えタンパク質抗原に関して概して好ましいアルミニウム塩であるオキシ水酸化アルミニウムに吸着するナノ懸濁液を形成するその能力に向けられた。３Ｍ−０５２−ＡＦは、少なくとも６ヶ月間、４℃で物理的に安定であり、平均粒子サイズ又は粒子サイズの多分散性での変化はほとんど見られなかった（図１０）。
【０２４７】
クライオ透過型電子顕微鏡（ｃｒｙｏＴＥＭ）で特性決定された３Ｍ−０５２−ＡＦの形態は、直径約５〜１５ｎｍのミセル構造のかなり均一な懸濁を示したが、大きい不規則な形状の粒子もまた存在していた（データは図示せず）。これらサイズの特性決定は、Ｚ平均値は概して１００ｎｍを超えているという上記で示した動的光散乱と矛盾するように思われ得る。しかしながら、動的光散乱で得られた動的光散乱強度基準Ｚ平均値は、大きい粒子が少ない割合であることによる影響を受けているが、それは図３Ａで明らかなようにそれらが小さい粒子よりも光を多く散乱する(光散乱が１０６の粒径に比例している）からである。強度基準サイズ分布を体積基準サイズ分布に数学的に変換すると、約２０ｎｍの範囲の粒子が多いことを示すが、体積基準サイズ分布さえも１０３に比例して大きい粒子により歪んでいる。それにもかかわらず、３Ｍ−０５２−ＡＦの体積基準サイズ分布は、クライオＴＥＭ結果とより一致している（図３ｂ）。３Ｍ−０５２−ＡＦの小さい粒子サイズに起因して、ナノ懸濁液剤粒子は、オキシ水酸化アルミニウムを含有するクライオＴＥＭで明らかにならなかった（データは図示せず）。実際には、３Ｍ−０５２−ＡＦが存在するか否かにかかわらず、オキシ水酸化アルミニウム粒子の形態は大差ないことが明らかになったが、注目すべき例外としては、オキシ水酸化アルミニウムコントロールと比較して、サイズが大きい結晶性の凝集が３Ｍ−０５２−ＡＦ含有サンプル中で見られたことである。
【０２４８】
３Ｍ−０５２−ＡＦに対するＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）の吸着性能を決定するため、種々の濃度のナノ懸濁液剤をオキシ水酸化アルミニウムと混合して、断続的に攪拌しながら約３０分間静置させて、次いでアルミニウム粒子がペレット状になるように遠心分離した。その後上清を、３Ｍ−０５２についてアッセイし、非結合物質を検出した（図４）。ナノ懸濁液剤の吸着性能は、アルミニウム１ｍｇ当たり約０．１６ｍｇであった。本開示で記載する続くマウス免疫原性実験で用いる３Ｍ−０５２の投与量は、この濃度より下とした。時間経過による３Ｍ−０５２−ＡＦのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）への吸着安定性は、５℃で１６週間保存した前後の非結合３Ｍ−０５２についてサンプルをアッセイすることによって評価した。コントロールの上清中の３Ｍ−０５２が一部欠如していることが見られたが（プラスチック製の微小遠心管に付着していることを示唆しているかもしれない）、アルミニウム含有サンプルの上清中にある検出可能な３Ｍ−０５２は増加せず、１６週間にわたって脱離していないことを示唆した（表２）。さらに、３Ｍ−０５２のオキシ水酸化アルミニウムに対する吸着を妨害する他のＴＬＲリガンドの存在は見られず、多様な吸着ＰＲＲリガンドを含有するアルミニウム系製剤が使用可能であろうことを示唆した（表２）。
表２  共吸着ＴＬＲリガンドの存在中での時間経過による３Ｍ−０５２−ＡＦの吸着の安定性
３Ｍ−０５２−ＡＦはＤＳＰＧを含有し、一方ＧＬＡ−ＡＦはＤＰＰＧを含有する。ＴＬＲ９  ＣｐＧコントロールは可溶性であり、ゆえに補助脂質を含有しない。非結合ＴＬＲリガンドを、ＵＶ吸光度（３Ｍ−０５２、ＴＬＲ９  ＣｐＧコントロール）で又は荷電化粒子検出器を備えたＨＰＬＣ（ＧＬＡ）でアッセイした。値は、デュプリケートサンプルの平均±標準偏差を表している。
【０２４９】
【表５】
2019519504.tif 000024
ＮＭ：測定せず
【０２５０】
３Ｍ−０５２は、リガンド交換又は静電的なメカニズムのいずれを経てオキシ水酸化アルミニウムと吸着するかを決定するために、静電結合（１０）を中和させる、吸着におけるイオン強度の効果を評価した。塩化ナトリウム濃度が増加するとコントロールサンプルの上清中の３Ｍ−０５２の内容量が減少するという傾向は、食塩水に晒されたときに３Ｍ−０５２−ＡＦの粒子が急速に増加し、アルミニウムが存在していない場合であってさえも結果的にナノ懸濁液剤がペレット化することに起因する（表３）。それにもかかわらず、塩化ナトリウム濃度の増加により、オキシ水酸化アルミニウムに対する３Ｍ−０５２−ＡＦの結合の減少をみせなかった。
表３  ３Ｍ−０５２−ＡＦのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）に対する吸着性における食塩水濃度の影響
サンプルは、２０００×ｇで１０秒間遠心分離した。値は、デュプリケートサンプルの平均±標準偏差を表している。
【０２５１】
【表６】
2019519504.tif 000025
アジュバントの生物活性
【０２５２】
３Ｍ−０５２のオキシ水酸化アルミニウムに対する結合が、オキシ水酸化アルミニウム又は３Ｍ−０５２−ＡＦのいずれが生体内のアジュバント活性を変化させるかを決定するために、３Ｍ−０５２−ＡＦ、オキシ水酸化アルミニウム、又はオキシ水酸化アルミニウムと結合した３Ｍ−０５２−ＡＦのいずれかでのアジュバントを含む結核ワクチン抗原ＩＤ９３（１１）でＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫した。初回免疫後３週目、ＩＤ９３＋３Ｍ−０５２−Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）を受けたマウスが、ＩＤ９３特異的な全ＩｇＧのみならずＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｃのサブタイプの最大上清力価を呈し、このことが、３Ｍ−０５２−ＡＦ又はＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）単独のいずれかと比較して、３Ｍ−０５２−Ａｌｈｙｒｏｇｅｌが固有のアジュバント性を有することを示唆した（図５Ａ）。第３回免疫の１ヶ月後、ＩＤ９３で脾細胞を刺激して、ブレフェルジンＡ存在中でのサイトカイン産生をフローサイトメトリーにより測定することによって、ＣＤ４  Ｔ細胞応答を評価した。ＩＤ９３単独で免疫したマウスと比較して、ＩＤ９３＋３Ｍ−０５２−ＡＦ及びＩＤ９３＋３Ｍ−０５２−Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）で免疫した両マウスでは、ＣＤ１５４を発現するＩＤ９３特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の頻度がより高かった。ＩＤ９３＋３Ｍ−０５２-Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）で免疫したマウスは、ＩＤ９３刺激によりＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、ＩＬ−２及びＧＭ−ＣＳＦを生成するＴＨ１細胞を呈した（図５Ｂ）。いくつかの追跡実験で、これらの発見が確認されたが、３Ｍ−０５２−ＡＦの一部のバッチでは、３Ｍ−０５２−Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）と同程度のＴＨ１  Ｔ細胞のアジュバント活性の誘導を見せた。この矛盾に対するひとつの可能性のある説明としては、リン脂質（ＤＳＰＧ）の３Ｍ−０５２に対する比率が考えられる。ＴＬＲ４リガンドを用いた実験では、リン脂質：ＴＬＲ４リガンドの比を体系的に変化させることで、物理化学的のみならず試験管内の生物活性のアッセイにおける二相反応が明らかになったことが示されている（１２）。そのため、本開示で採用するリン脂質：３Ｍ−０５２の比がそうした変曲点に近いものであったならば、調製におけるわずかな変化又は製剤の物理的性質が、その生物活性での変化を見かけ上もたらすだろう。
【０２５３】
３Ｍ−０５２−ＡＦのオキシ水酸化アルミニウムとの結合が、そのアジュバント活性を本質的に変化させるのか、又は、単にその生物学的利用性を変化させるのかを決定するために、単独での３Ｍ−０５２−ＡＦ又はオキシ水酸化アルミニウムと結合した３Ｍ−０５２−ＡＦのアジュバント活性を、２つのｌｏｇ１０用量範囲にわたって調べた。アジュバントを含むＩＤ９３での初回免疫後３週目、３Ｍ−０５２−ＡＦのアルミニウム吸着製剤は、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）単独又は同一用量範囲の３Ｍ−０５２−ＡＦのいずれかと比較して、用量範囲全体にわたってより高い血清抗体力価を一貫して誘発した（図６Ａ及び６Ｂ）。同様に、３Ｍ−０５２−Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）は、１μｇの試験用量のピーク応答を伴うＩＤ９３特異的ＣＤ４  Ｔ細胞を増大させる釣鐘状の用量反応をみせた。これらＣＤ１５４及びＩＦＮ−γの応答は、０．１、１もしくは１０μｇでオキシ水酸化アルミニウム又は３Ｍ−０５２−ＡＦでのアジュバントを含むＩＤ９３により誘発された応答よりも、実質的に高かった（図６Ｃ及び６Ｄ）。同様の用量反応が、ＴＮＦ及びＩＬ−２を産生するＣＤ４  Ｔ細胞でも観察された。これに基づいて、３Ｍ−０５２−ＡＦのオキシ水酸化アルミニウムとの結合は、いずれかの方向における１つのｌｏｇ１０範囲にわたって生物学的利用性のみを変化させる以外の何らかの手段によって、そのアジュバント活性を変化させると結論付けることができる。
【０２５４】
試験管内では、３Ｍ−０５２が、ヒトＴＬＲ７及びＴＬＲ８を活性化する（５）。これら先天免疫受容体が、３Ｍ−０５２−Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）の生体内のアジュバント活性に関する因子であるか否かを決定するために、ワクチン接種した野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスと、ＴＬＲ７欠乏マウス（Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、機能低下（hypofunctional）ＴＬＲ８を発現する）とについて免疫応答を比較した。コントロールとして、Ｃ５７ＢＬ／６及びＴＬＲ７−／−のマウスを、ＴＬＲ４アゴニストのアジュバントＧＬＡ−Ａｌｕｍでのアジュバントを含むＩＤ９３で免疫した。免疫した群の全てが、アジュバント又は遺伝子型によらず、高力価のＩＤ９３特異的ＩｇＧ１抗体を産生した（図７Ａ）。３Ｍ−０５２−Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）及びＧＬＡ−Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）の両方もまた、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）単独と比較して、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて高力価のＩｇＧ２ｃを誘発した。ＴＬＲ７−／−マウスでは、ＩｇＧ２ｃの誘導が、ＩＤ９３＋３Ｍ−０５２−Ａｌｕｍで免疫した動物において劇的に減少し、一方、ＩＤ９３＋ＧＬＡ−Ａｌｈｄｙｒｏｇｅｌに対するＩｇＧ２ｃ応答は、ＴＬＲ７欠乏による影響を受けなかったことが、ＴＬＲ７は、３Ｍ−０５２を認識するために利用されるのであって、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）又はＧＬＡを認識するために利用されるのではないということを示した。ＩＤ９３＋３Ｍ−０５２−Ａｌｈｄｙｒｏｇｅｌ（登録商標）もまた、ごくわずかなＩＬ−５又はＩＬ−１７Ａの産生（それぞれＴＨ２とＴＨ１７の免疫性のマーカーである）を伴ってＩＦＮ−γ及びＴＮＦを産生することができるＣＤ４  Ｔ細胞によって特性決定されたＷＴマウスにおいて、頑健な細胞応答を誘発した。しかしながら、ＴＬＲ７−／−マウスにおいては、ＩＤ９３＋３Ｍ−０５２−Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）は、ＩＤ９３に対してわずかなＣＤ４  Ｔ細胞応答のみを誘発したが、それはＷＴマウスにおいてＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）単独でのアジュバントを含むＩＤ９３によって誘発された応答と、規模の面では実質的に相違ないものであった（図７Ｂ）。ＩＤ９３＋ＧＬＡ−Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）でのＷＴマウス及びＴＬＲ７−／−マウスの免疫化が、同様のＴＨ１応答を誘発したが、これはＴＬＲ７−／−マウスでは、アルミニウムで調製されたアジュバントを含有する他のＴＬＲアゴニストを伴うワクチンに対して、それらのＣＤ４  Ｔ細胞応答は弱まらないことを示唆する。したがって、試験管内での発見と同様に、３Ｍ−０５２−Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）は、特に高頻度のＴＨ１ＣＤ４  Ｔ細胞とＩｇＧ２ｃのスイッチした抗体応答（IgG2c switched antibody response）とを誘発することにおいて、その生体内のアジュバント活性のためにＴＬＲ７を利用すると結論付けることができる。
【０２５５】
３Ｍ−０５２の様々なワクチン抗原との生体内のアジュバント活性のみならず様々なアルミニウム塩の効果を試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、３Ｍ−０５２−ＡＦ、オキシ水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、又は、オキシ水酸化アルミニウムと組み合わせた３Ｍ−０５２−ＡＦ、又はリン酸アルミニウムと組み合わせた３Ｍ−０５２−ＡＦのいずれかでのアジュバントを含むＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原で免疫した（１３）。初回免疫後３週目に、最も増加した血清ＩｇＧ及びＩｇＧ２ｃ抗体応答は、３Ｍ−０５２−オキシ水酸化アルミニウムでのアジュバントを含むＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原によって誘発された（図８Ｂ）。興味深いことに、３Ｍ−０５２−オキシ水酸化アルミニウムはまた、粘膜ＩｇＧ２ｃと抗体分泌長命形質細胞とを最も高いレベルで産生した（図８Ｄ及び１１）。さらに、３Ｍ−０５２及びオキシ水酸化アルミニウムを含有する製剤は、ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＦＮγ及びＴＮＦについての最も強力な誘発剤（図８Ｃ）であり、初回免疫後１週では特にそうであった（図１１）。全体として、３Ｍ−０５２−オキシ水酸化アルミニウムは、このモデルでは３Ｍ−０５２-リン酸アルミニウムよりもより強力なアジュバント活性を有することを示したが、ＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原は、オキシ水酸化アルミニウムには吸着するが、リン酸アルミニウムには実質的に吸着しないため（データは図示せず）、免疫原性応答が減少したのは、リン酸アルミニウムに対して抗原及び／又は３Ｍ−０５２両方の最適な吸着性が乏しいことに起因するであろう。
【０２５６】
ワクチン抗原に対する頑健な適応免疫応答の誘導には、先天免疫系の適切な活性化を利用して、共刺激のサイトカイン環境がもたらされる。そのため、３Ｍ−０５２＋／−リン酸アルミニウム又はオキシ水酸化アルミニウムでの免疫化によって変化する、流入領域リンパ節における先天免疫応答を分析した。３Ｍ−０５２は、オキシ水酸化アルミニウムと、それより少ないリン酸アルミニウムと協同して、筋肉内注射（i.m. injection）の１８時間後、流入領域リンパ節における炎症系単核細胞（ＣＤ１１ｂ＋Ｌｙ６Ｃ＋）数の頑健な増加を誘発した（図９Ａ）。同様に、３Ｍ−０５２及び両アルミニウムの製剤が、Ｂ細胞、単核細胞及び樹状細胞を含むＡＰＣ上の共刺激分子ＣＤ８６の発現と、ＣＤ６９発現で示したように、ＣＤ４  Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞のみならずＢ細胞の一時的な活性化とを増大した（図９Ｂ及びＣ）。３Ｍ−０５２はオキシ水酸化アルミニウムと固有に協同して、ＩＦＮ−γを発現するＮＫ細胞と、ＩＬ−１を産生する好中球との数を増大させたが（図９Ｄ）、両分子はワクチンアジュバントとの頑健なＴＨ１応答の誘発に重要である（１４）。３Ｍ−０５２及びアルミニウム間の相乗作用に対するこの先天応答が、ワクチン抗原に対する適応免疫応答を頑健に生成するために適切な環境を形成する可能性がある。ＩＦＮ−γ産生ＮＫ細胞及びＩＬ−１産生好中球の増殖が、３Ｍ−０５２＋リン酸アルミニウムが誘発する弱い応答と比較して３Ｍ−０５２＋オキシ水酸化アルミニウムが誘発するより強力なアジュバント活性には関連する。
議論
【０２５７】
適切なＴＬＲ７／８アゴニスト製剤は、製造可能性、有力なＴＨ１応答の誘導、及び、ＦＤＡ承認済み製品での先使用を含むいくつかの理由のために、興味深いアジュバント開発アプローチである。マウスにおけるＩｇＧ２抗体を含む、向上したＴＨ１型先天免疫応答を生成するためにＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ８に向けられるイミダゾキノリンの能力について、文献において文書化されている（１５〜１７）。イミダゾキノリンは、合成小分子として、高い費用対効果及び高純度で製造可能である。ＴＬＲ７リガンド、イミキモドは、塗り薬Ａｌｄａｒａ（登録商標）中の活性成分であり、皮膚癌及び性器疣贅の治療に用いるヒト免疫療法用に承認されている。しかしながら、ワクチンアジュバントとして注射されるイミダゾキノリンは、臨床試験初期段階を突破していない。それらが小さいサイズであることから、Ｒ８４８等の可溶性をもつ製剤化されていないイミダゾキノリンは、注射部位から急速に拡散して、局所刺激というよりは全身性免疫活性を引き起こすという仮説がある。この理由から、ワクチン抗原と共有結合的に結合させる又は粒状製剤に封入する等、イミダゾキノリンの拡散を「遅らせる」ための戦略が、前臨床試験で可能性を示した（５、１８〜２１）。Ｓｍｉｒｎｏｖらは、Ｒ８４８等の脂質付加しない構造をもつことが明らかな、局所的なアジュバント活性は維持するが全身性の応答にはならない、イミダゾキノリン構造への１８炭素鎖の付加をもたらすような化学合成アプローチを記載している（５）。このように、３Ｍ−０５２と称する分子（図１）は、ナノ懸濁液剤、リポソーム又はエマルジョン等の脂質系製剤への組込みに、より従順である。
【０２５８】
Ｗｕらによる研究では、オキシ水酸化アルミニウムに対する吸着を容易にする、ホスホン酸基をもつ新規ＴＬＲ７リガンドの化学合成を示しており、全身性の活性を低減しながら一時的な局所的アジュバント活性が改善したと結論付けている（２１）。アルミニウム吸着ＴＬＲ７製剤は、アルミニウム単独又はＴＬＲ７リガンド単独での抗原と比較して、問題に対する保護を向上させることを含めて、種々のワクチン抗原に対する抗体の規模と品質を有効に押し上げた（２１）。これに対して、本明細書に記載の製剤アプローチは実質的に、ＰＲＲリガンド上のホスホン酸基を用いずに、ＰＲＲリガンドのアルミニウム塩への吸着を容易にし、これにより幅広い適用性を有することができるものである。アルミニウム吸着ＰＲＲリガンド製剤は、既にＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）等の承認ワクチンに含有されているため、ＰＲＲリガンドがもつアルミニウム塩への吸着を容易にする能力は、規制の観点から開発上の利点をもたらすことができる。製剤ベースのアプローチでは、既存のアゴニスト構造を化学的に改変する必要性を回避することができる代わりに、アルミニウム塩への吸着を促進することが製剤の性質に左右される。さらに、脂質製剤を変更することで、ワクチン抗原とＰＲＲリガンドとが同種のアルミニウム塩に吸着されるように、ＰＲＲリガンドの吸着性を特定のアルミニウム塩に対して好ましく誂えることができる。こうした賦形剤の性質には、アシル鎖の長さ及び飽和ならびに主鎖の構造／電荷が含まれる。我々は、後者が、ナノ懸濁液剤のアルミニウム塩に吸着する能力における主要な決定要因であることを発見したが、アシル鎖構造もまた、ＰＲＲリガンド及び補助脂質間における安定な懸濁液剤形態を確実にするために考慮に入れるべきである。
【０２５９】
ナノ懸濁液剤系製剤アプローチは万能であるが、アジュバントを含んだワクチン製剤を最適化するために、緩衝剤／塩の選択、アルミニウム塩の種類、混合順序、希釈剤及びワクチン抗原の性質による影響を、よく特徴付けるべきであるということに留意されたい。例えば、ＨＩＶ  ｇｐ１２０抗原及び３Ｍ−０５２−ＡＦは、オキシ水酸化アルミニウムと比較して、リン酸アルミニウムに対しては最適に吸着しにくいため、抗原吸着性とは独立に、３Ｍ−０５２−ＡＦの吸着性の重要性を完全に区別することは不可能であった。
【０２６０】
補助脂質のアプローチを用いて、ＴＬＲ４リガンドをオキシ水酸化アルミニウムに吸着させた。別の不溶性ＴＬＲ４リガンドＧＬＡは、その後吸着を可能にさせるオキシ水酸化アルミニウムと混合させることができる、補助脂質を用いた水性懸濁液剤として調製することができる。しかしながらＧＬＡの場合、リガンド交換を経て吸着を容易にさせるリン酸基を、アゴニスト自体が含有している。３Ｍ−０５２の場合、アゴニストがリン酸基を含有しないため、リガンド交換による吸着は、補助脂質に起因し得る。しかしながら、本開示においては、ＩＤ９３＋３Ｍ−０５２−Ａｌｕｍが、ＩＤ９３＋ＧＬＡ−Ａｌｕｍよりも強力なＴＨ１応答を誘導することが明らかとなった。ＴＬＲ７／８及びＴＬＲ４の細胞位置ならびに分布は有意に異なり、種の間で変動する（１７）。例えば、ＴＬＲ８は、マウスでは抵抗性であると考えられているため、３Ｍ−０５２等のアゴニストが、ヒト又は機能的なＴＬＲ８をもつ他の種では応答の変化又は向上を誘発し得る。かかる考察は、本明細書で提示したデータと合わせると、アルミニウム系ＴＬＲ７／８アジュバント製剤が、ヒトにおけるＴＨ１応答に関して強力なアジュバント製剤を提供することとなることを示唆している。
【０２６１】
３Ｍ−０５２とアルミニウムとは協同して、流入領域ＬＮにおいてＡＰＣ上で共刺激分子ＣＤ８６の発現を増加させ、抗原とは独立した方式で流入領域リンパ節に残るようにリンパ球を一時的に活性化する。ＡＰＣを活性化し、同じ流入領域ＬＮ中にリンパ球を留めることによって、この相乗作用は、リンパ球のプライミングと増殖とにとって最適な環境を形成する。興味深いことに、ＧＬＡ−ＳＥのアジュバント性に利用できることを我々が発見した、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１β（１４）の早期産生を含む先天応答もまた、３Ｍ−０５２をオキシ水酸化アルミニウムと調製したことで明らかになった。このことは、これらパラメータが有効なアジュバント活性の有用で万能な証拠となるであろうことを示唆し得る。こうした証拠の特定は、新規のワクチン候補の合理的な開発の助けとなるはずである。
【０２６２】
結論として、補助脂質の性質に基づいてアルミニウム塩に吸着させるようにすることができる、脂質系ＰＲＲリガンドを水性ナノ懸濁液剤に調製する方法を開発した。こうした製剤は、Ｃｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）で用いられるＴＬＲ４リガンドとアルミニウムの組み合わせの類似体であり、またアルミニウム塩は、ヒトワクチンのアジュバントの分野で最も広く用いられており、論拠のある安全性と免疫原性の記録が確立しているため、新規ＰＲＲリガンドのアルミニウムと互換性のある製剤に発展できることが、臨床へのより速い移行を可能にし得る。
実施例２  アルミニウムに対する合成ＴＬＲ４リガンドの吸着
【０２６３】
ＴＬＲ４リガンドＧＬＡの安定な水性懸濁液剤のオキシ水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムへの吸着を試験し、結果を表４に示した。これらのデータは、補助脂質を適切に選択することによって、オキシ水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウムに対するＴＬＲ４リガンドの吸着性を誂えることが可能であるということを示唆している。
表４  ＧＬＡの水性ナノ懸濁液剤のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）又はＡｄｊｕＰｈｏｓ（登録商標）に対する吸着性
【０２６４】
【表７】
2019519504.tif 000026
【０２６５】
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１６．Schwenk R, DeBot M, Porter M, Nikki J, Rein L, Spaccapelo R, Crisanti A, Wightman PD, Ockenhouse CF, Dutta S. IgG2 Antibodies against a Clinical Grade <italic>Plasmodium falciparum</italic> CSP Vaccine Antigen Associate with Protection against Transgenic Sporozoite Challenge in Mice.PLoS ONE.2014;9(10):e111020.
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１９．Kasturi SP, Skountzou I, Albrecht RA, Koutsonanos D, Hua T, Nakaya HI, Ravindran R, Stewart S, Alam M, Kwissa M, Villinger F, Murthy N, Steel J, Jacob J, Hogan RJ, Garcia-Sastre A, Compans R, Pulendran B. Programming the magnitude and persistence of antibody responses with innate immunity.Nature.2011;470:543-7.
２０．Wille-Reece U, Wu C-y, Flynn BJ, Kedl RM, Seder RA.Immunization with HIV-1 Gag Protein Conjugated to a TLR7/8 Agonist Results in the Generation of HIV-1 Gag-Specific Th1 and CD8+ T Cell Responses.The Journal of Immunology.2005;174(12):7676-83.
２１．Wu TY-H, Singh M, Miller AT, De Gregorio E, Doro F, D’Oro U, Skibinski DAG, Mbow ML, Bufali S, Herman AE, Cortez A, Li Y, Nayak BP, Tritto E, Filippi CM, Otten GR, Brito LA, Monaci E, Li C, Aprea S, Valentini S, Calabro S, Laera D, Brunelli B, Caproni E, Malyala P, Panchal RG, Warren TK, Bavari S, O’Hagan DT, Cooke MP, Valiante NM.Rational design of small molecules as vaccine adjuvants.Science Translational Medicine.2014;6(263):263ra160
【０２６６】
本明細書で引用ならびに／又は出願データシートに列記した、上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許文献は全て、参照によってその全体が本明細書に組み込まれているものである。
【０２６７】
この発明の特定の実施形態を説明の目的で本明細書に記載したが、この発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、種々の変形をなすことができるものであるということが、先の記載より理解されるであろう。したがって、この発明は、添付の請求項による場合を除いて限定されない。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
2019519504.tif 000036
【図６−２】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【国際調査報告】
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