(57)【要約】  核酸分析のための、データ処理および計算アノテーションシステムおよびデバイス、ならびに対応する方法が本明細書に開示されている。特に、核酸試料のリピート領域をサイズ分類するための方法が本明細書に開示されている。例えば、本明細書に開示された方法は、増幅産物のラダーを用いて核酸サイズを決定する。
2019502367.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ．リピート領域を増幅すること；
ｉｉ．高分解能断片分析を実施すること；
ｉｉｉ．増幅産物のラダーを得ること；および
ｉｖ．内部標準として増幅産物のラダーを用いて、リピート領域長を決定し、それによりリピート領域をサイズ分類すること
を含む、核酸試料のリピート領域をサイズ分類する方法。
【請求項２】
ａ）リピート領域を含む核酸の領域を増幅すること；
ｂ）高分解能断片分析を実施すること；
ｃ）増幅産物のラダーを得ること；および
ｄ）内部標準として増幅産物のラダーを参照して、核酸をサイズ分類すること
を含む、核酸のサイズ分類において内部標準として増幅産物のラダーを用いる方法。
【請求項３】
ａ）リピート領域を含む核酸の領域を増幅すること；
ｂ）ｉ．高分解能断片分析を実施すること；
ｉｉ．増幅産物のラダーを得ること；および
ｉｉｉ．内部標準としてラダーを用いて、リピート領域長を決定すること
によりリピート領域の全長を測定すること
を含む、患者由来の核酸のリピート領域の全長を測定する方法。
【請求項４】
増幅産物のラダーのリピートプロファイルを決定することをさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
ａ）リピート領域を含む核酸の領域を増幅すること；
ｂ）増幅産物のラダーを得ること；
ｃ）増幅産物のラダーのリピートプロファイルを決定し、それによりリピート領域をサイズ分類すること
を含む、リピート領域サイズ分類の方法。
【請求項６】
ｉ．核酸試料のリピート領域を増幅すること；
ｉｉ．高分解能断片分析を実施すること；
ｉｉｉ．増幅産物のラダーを得ること；
ｉｖ．少なくとも１つの遺伝子特異的ピークを同定すること；ならびに
ｖ．増幅産物のラダーを用いて、リピート領域の少なくとも１つ、および少なくとも１つの遺伝子特異的ピークをサイズ分類すること
を含む、ジェノタイプピークサイズ分類の方法。
【請求項７】
内部サイズ分類標準を作成する方法であって、
チャネルにおいて増幅産物のラダーに対応するリピートプロファイルを同定すること；
繰り返しが、
前のピーク位置および区間値を用いて、リピートプロファイルにおいて予想されるピーク位置を決定すること、
予想されるピーク位置を含む第１のウィンドウ内にピーク位置を同定すること、および
同定されたピーク位置におけるシグナル強度が振幅基準を満たす場合、同定されたピーク位置をリピートピーク位置のセットに加えること
を含む、リピートピーク位置のセットを繰り返し、作成すること；ならびに
リピートピーク位置のセットおよび対応する断片サイズのセットを用いて、リピートピーク位置とリピート断片サイズとの間の線形関係を推定すること
を含む、方法。
【請求項８】
外部サイズ分類標準を作成する方法であって、
チャネルにおいて公知の断片サイズを有する産物のラダーに対応するピークを同定することであって、ピークが局所的ノイズ閾値を超える、同定すること；
断片サイズの第１セットおよび対応するピーク位置の第１のセットを用いるピーク位置と断片サイズとの間の線形関係を、チャネルの第１の領域における同定されたピークを用いて、繰り返し、再推定することであって、繰り返す再推定が、
漸減する断片サイズを断片サイズの第１のセットへ含めること、および
漸減する断片サイズに対応するピーク位置を、対応するピーク位置の第１のセットへ含めること
を含む、繰り返し、再推定すること；
断片サイズの第２のセットおよび対応するピーク位置の第２のセットを用いる、チャネルの第２の領域についてのピーク位置と断片サイズとの間の非線形関係を、チャネルの第２の領域における同定されたピークを用いて、推定すること；
線形関係と非線形関係を組み合わせることにより、核酸試料のリピート領域をサイズ分類するための外部サイズ分類標準を作成すること
を含む、方法。
【請求項９】
バックグラウンドモデルを区分的にスケーリングして、動的閾値を得ることを含む、バックグラウンドモデルから動的閾値を作成すること；
動的閾値を用いて、遺伝子特異的産物ピーク位置を決定すること；
サイズ標準を用いて、リピートサイズを遺伝子特異的産物ピーク位置に関連づけること；および
遺伝子特異的産物サイズの表示をアウトプットすること
を含む、ジェノタイプピークサイズ分類のための方法。
【請求項１０】
サイズ分類標準を作成するための方法であって、
データファイルのチャネルにおいてピークを同定すること；
予想されるサイズ分類標準を受け取ること；
予想されるサイズ分類標準に依存する費用関数を最小にするサイズ分類標準を決定することであり、
同定されたピークのサブセットを選択すること；
同定されたピークのサブセットについてサイズ分類標準を計算すること；
同定されたピークのサブセットについてのサイズ分類標準を用いて費用関数を計算すること；
費用関数を最小にする同定されたピークのサブセットについてのサイズ分類モデルの１つを同定すること
を含む、決定すること；および
費用関数を最小にする同定されたピークのサブセットについてのサイズ分類モデルの１つを、少なくとも１つの遺伝子特異的ピークをサイズ分類するためのサイズ分類標準として割り当てること
を含む、方法。
【請求項１１】
チャネルが増幅産物のラダーに対応し、かつ少なくとも１つの遺伝子特異的ピークをサイズ分類するためのサイズ分類標準が内部標準を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
チャネルが、公知の断片サイズを有する産物のラダーに対応し、かつ少なくとも１つの遺伝子特異的ピークをサイズ分類するためのサイズ分類標準が外部標準を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
リピートプロファイルが、リピートシグナル開始およびリピート数を含む、請求項４または９のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
リピートプロファイルが増幅産物位置を含む、請求項４または９のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
リピート領域がＣ／Ｇリッチな領域である、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
リピート領域が、リピート性Ａ／Ｔリッチなセグメントである、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
リピート領域がホモポリマーセグメントである、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
増幅がポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項１から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
リピート領域の増幅のための少なくとも第１のプライマーおよび第２の異なるプライマーをさらに含む、請求項１から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
第１のプライマーがリピート領域の一部を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
第２のプライマーがリピート領域の外側の位置にアニールする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
増幅産物のラダーを用いて、核酸試料の第２の領域をサイズ分類することをさらに含む、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ラダーが、リピート領域の外側の核酸領域をサイズ分類するために用いられる、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
第３のプライマーおよび任意の第４のプライマーをさらに含む、請求項１９から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
第２の核酸領域が増幅される、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
第２および第３の核酸領域が増幅される、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
第２の核酸、および適宜、第３の核酸がリピート領域である、請求項２４または２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
高分解能断片分析が、３塩基対またはそれ未満長さが異なる増幅産物を識別する、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
高分解能断片分析が、１塩基対長さが異なる増幅産物を識別する、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
増幅産物のラダーが、リピートエレメント周期性、第１の増幅産物、増幅産物のカウント数、および一定のエレメント長を含む、請求項１から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
リピートエレメント周期性、第１の増幅産物、および増幅産物のカウント数からリピート領域のサイズを決定することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
一定のエレメント長からリピート領域のサイズを決定することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ピーク形状、ピーク大きさ、および局所的領域内のピークの周期性の少なくとも１つに基づいて、サイズ分類標準を作成するためのリピート領域のピークを選択することをさらに含む、請求項３１から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
周波数に基づいた分析を用いて、リピートエレメントサイズを決定することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
増幅産物のラダーにおいて各増幅産物のサイズを決定することをさらに含む、請求項１から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
リピート領域において公知の配列割り込みを無効にすることをさらに含む、請求項１から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
シグナルアーチファクトを補正することをさらに含む、請求項１から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
ラダーが、割り込みエレメントを通り過ぎて核酸領域をサイズ分類するために用いられる、請求項１から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
標準サイズ曲線を決定することをさらに含む、請求項１から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
増幅産物のラダーが内部標準である、請求項１から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
リピート領域高分解能断片分析移動度が、増幅産物のラダーに対して正規化されて、リピート領域の内または外側の増幅産物をサイズ分類する、請求項１から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
リピート領域を含む核酸を含有する患者試料を提供することをさらに含む、請求項１から４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
再構築されたジェノタイプを作製することをさらに含む、請求項１から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
領域における任意の割り込み配列への順方向での距離または少なくとも１つのリピート領域における任意の割り込み配列への逆方向での距離、および領域の全長を決定して、領域における割り込み配列の全ての可能な配置を含む可能性のあるジェノタイプのセットを作製すること、ならびに可能性のあるジェノタイプのセットを評価して、全てのパラメータ情報を満たす解答ジェノタイプを決定することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
リピート領域が、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＳＣＡ７、ＳＣＡ８、Ｘ２５、ＣＳＴＢ、Ｃ９ＯＲＦ７２、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＨＴＴ、ＡＲ、ＡＴＮ１、ＡＴＸＮ１−３、ＡＴＸＮ７、ＡＴＸＮ１０、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＳＣＡ８、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、ＣＮＢＰ、ＴＢＰ、およびＴＯＭＭ４０遺伝子座またはそれらの断片に含まれる、請求項１から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
リピート領域が、ＦＭＲ１またはＦＭＲ２遺伝子座またはその断片に含まれる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
患者におけるＦＭＲ１もしくはＦＭＲ２障害に関連づけられるジェノタイプを検出すること、または患者の子孫におけるＦＭＲ１もしくはＦＭＲ２障害のリスクを検出することをさらに含む、請求項１から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
ＦＭＲ１またはＦＭＲ２障害が、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、脆弱Ｘ症候群Ｅ（ＦＲＡＸＥ）、脆弱Ｘ随伴振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能低下症（ＦＸＰＯＩ）、またはドーパミン応答性パーキンソニズムである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
患者において障害を診断し、または患者の子孫において障害のリスクを診断する方法であって、
ａ）リピート領域を含む患者試料由来の核酸の領域を増幅すること；
ｂ）高分解能断片分析を実施すること；
ｃ）増幅産物のラダーを得ること；および
ｄ）内部標準として増幅産物のラダーを用いて、リピート領域長を決定すること
を含み、
伸長したリピート領域が検出された場合には、障害が診断される、方法。
【請求項５０】
障害が、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）、脆弱Ｘ（ＦＲＡＸＥ）精神遅滞、脆弱Ｘ随伴振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能低下症（ＦＸＰＯＩ）、脊髄小脳変性症１型、脊髄小脳変性症２型、脊髄小脳変性症３型、脊髄小脳変性症６型、脊髄小脳変性症７型、脊髄小脳変性症８型、フリードライヒ運動失調症、進行性ミオクローヌスてんかん、筋緊張性ジストロフィーＩ、筋緊張性ジストロフィーＩＩ、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、およびアルツハイマー病である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
障害が、脆弱Ｘ症候群もしくは脆弱Ｘ（ＦＲＡＸＥ）精神遅滞、脆弱Ｘ随伴振戦／運動失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、脆弱Ｘ関連原発性卵巣機能低下症（ＦＸＰＯＩ）、ドーパミン応答性パーキンソニズム、またはアルツハイマー病である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
伸長したリピート領域に関連した障害を有する患者を処置する方法であって、
ａ）患者において伸長したリピート領域を有するジェノタイプを検出することであり、
ｉ．少なくとも１つのリピート領域を含む核酸の領域を増幅すること；
ｉｉ．高分解能断片分析を実施すること；
ｉｉｉ．増幅産物のラダーを得ること；および
ｉｖ．増幅産物のラダーを用いて、リピート領域をサイズ分類し、それにより伸長したリピート領域を検出すること
を含む、検出すること；ならびに
ｂ）障害についての処置を患者に施すこと
を含む、方法。
【請求項５３】
チャネルにおいてリピートプロファイルを同定することが、チャネルの第２のウィンドウ内のシグナル強度を周波数ドメインへ変換すること、周波数基準を満たす第２ウィンドウ内のシグナル強度の優位周波数を決定すること、および第２ウィンドウ内の位置をリピートプロファイルのおよその開始位置として同定することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項５４】
リピートピーク位置のセットを繰り返し、作成すると同時に、リピートピーク位置のセットの１つまたは複数のシグナル強度を用いて、振幅基準を反復して、アップデートすることをさらに含む、請求項７および５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
リピートピーク位置のセットを繰り返し、作成すると同時に、リピートピーク位置のセットの１つまたは複数のピーク位置を用いて、区間値を反復して、アップデートすることをさらに含む、請求項７および５３から５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
リピートピーク位置のセットを繰り返し、作成する前に、リピートプロファイルの第１の部分の統計的尺度を用いて振幅基準を初期化することをさらに含む、請求項７および５３から５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
リピートピーク位置のセットを繰り返し、作成する前に、リピートプロファイルの第２の部分の周期性を用いて区間値を初期化することをさらに含む、請求項７および５３から５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
繰り返し再推定の繰り返しが、
漸減する断片サイズの１つ、およびピーク位置と断片サイズとの間の再推定された線形関係を用いて、予想されるピーク位置を決定すること；
予想されるピーク位置を含むウィンドウ内にチャネルにおける実際のピーク位置を決定すること、ならびに
実際のピーク位置を、対応するピーク位置の第１のセットへ含めること
をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項５９】
チャネルにおいて増幅産物のラダーに対応するピークを同定することが、
スライドウィンドウを用いて計算された振幅閾値を超える、可能性のあるピークをチャネルにおいて決定すること；
可能性のあるピークの第２のピークを含む区間における可能性のあるピークの第１のピークが、可能性のあるピークの第２のピークより大きいことを決定すること；および
少なくとも可能性のあるピークの第２のピークを排除して、可能性のあるピークをチャネルにおけるピークとして同定すること
をさらに含む、請求項８および５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
増幅産物のラダーを用いてリピート領域の少なくとも１つおよび少なくとも１つの遺伝子特異的産物ピークをサイズ分類することが、サイズ分類標準を用いてリピート領域の少なくとも１つおよび少なくとも１つの遺伝子特異的ピークをサイズ分類することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項６１】
リピートプロファイルにおいてピークをコールするための閾値を動的に決定することをさらに含む、請求項６または６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
リピートプロファイルにおいてピークをコールするためにスライドウィンドウを用いることをさらに含む、請求項６および６０から６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
リピートプロファイルにおいて振幅閾値より下にピークを内挿することをさらに含む、請求項６および６０から６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
リピートプロファイルにおいて推定上のピーク位置を用いてサンプリング単位から塩基対単位へマッピングする較正曲線を作成することをさらに含む、請求項６および６０から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
動的閾値を得るためにバックグラウンドモデルを区分的にスケーリングすることが、
第１の断片サイズより上で、かつ第２の断片サイズより下のサイズを有する増幅産物に対応するバックグラウンドモデルの第１の領域を決定すること；
第２の断片サイズより上のサイズを有する増幅産物に対応するバックグラウンドモデルの第２の領域を決定すること；
最初のスケーリング因子から、最初のスケーリング因子より小さい第２のスケーリング因子まで変動する第１のスケーリング因子を、バックグラウンドモデルの第１の領域に掛けること、および
第２のスケーリング因子をバックグラウンドモデルの第２の領域に掛けること
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項６６】
動的閾値を得るためにバックグラウンドモデルを区分的にスケーリングすることが、
第１の断片サイズより小さいサイズを有する増幅産物に対応するバックグラウンドモデルの第３の領域を決定すること；および
最初のスケーリング因子をバックグラウンドモデルの第３領域に掛けること
をさらに含む、請求項９または６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
動的閾値を用いてリピートプロファイルにおいて遺伝子特異的産物ピーク位置を決定することが、
リピートプロファイルにおいて第１の位置に第１のピークを同定すること、および
第１の位置におけるリピートプロファイルの第１の値が、第１の位置における動的閾値の第１の値を超えることを決定すること
を含む、請求項９、６５、および６６のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
動的閾値を用いてリピートプロファイルにおいて遺伝子特異的産物ピーク位置を決定することが、
リピートプロファイルにおいて第２の位置に第２のピークを同定することであって、第２ピークが第１のピークに隣接している、同定すること；
第２の位置におけるリピートプロファイルの第２の値が振幅基準を満たすことを決定することであって、振幅基準が第１の値に基づいている、決定すること；および
第２の位置におけるリピートプロファイルの第２の値が、第２の位置における動的閾値の第２の値を超えることを決定すること
をさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
リピートプロファイルからバックグラウンドモデルを作成することをさらに含み、作成が、インプットデータのスライドウィンドウの少なくとも１つの統計的尺度に基づいて値をアウトプットするように構成されたフィルタを用いて、リピートプロファイルにフィルタをかけることを含む、請求項９および６５から６８のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
リピートプロファイルからバックグラウンドモデルを作成することをさらに含み、作成が、バックグラウンドモデルの高周波成分を減衰させるように構成されたフィルタを用いてリピートプロファイルにフィルタをかけることを含む、請求項９および６５から６９のいずれかに記載の方法。
【請求項７１】
請求項７および５３から５７のいずれかに記載の方法により内部サイズ分類標準を作成することをさらに含み、サイズ分類標準が内部サイズ分類標準に基づいている、請求項９および６０から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
請求項７および５３から５７のいずれかに記載の方法により内部サイズ分類標準を作成すること；
請求項８および５８から５９の一項に記載の方法により外部サイズ分類標準を作成すること；ならびに
内部サイズ分類標準および外部サイズ分類標準を用いて移動度補正済みサイズ分類標準を作成すること
をさらに含み、サイズ分類標準が移動度補正済みサイズ分類標準に基づいている、請求項９および６０から７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
移動度補正済みサイズ分類標準を作成することが、
内部サイズ分類標準および外部サイズ分類標準を用いてアフィン変換を作成すること、および
アフィン変換を外部サイズ分類標準に適用して、移動度補正済みサイズ分類標準を得ること
を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
請求項８および５８から５９の一項に記載の方法により外部サイズ分類標準を作成することをさらに含み、サイズ分類標準が外部サイズ分類標準に基づいている、請求項９および６０から７１のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
データファイルをシグナルアーチファクトについて補正することをさらに含む、請求項６から８および７２から７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
シグナルアーチファクトについて補正することが、
データファイルにおいて、可能性のある気泡位置を含むウィンドウを同定すること；
ウィンドウ内で、チャネルについてのシグナル強度間の相関を決定すること；および
決定された相関に基づいて、ウィンドウ内のチャネルについてのシグナル強度を、シミュレートされたノイズに置き換えること
を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
シグナルアーチファクトについて補正することが、
第１の電磁的に検出可能な部分を検出するように構成された、データファイルにおけるチャネルの動的範囲を拡張すること；
データファイルにおいてチャネルの飽和領域を含むウィンドウを同定すること；
ウィンドウ内のチャネルについてのシグナル強度、およびウィンドウ内の別の電磁的に検出可能な部分を検出するように構成された、データファイルにおける別のチャネルについてのシグナル強度を用いて、組み合わされたシグナル強度を決定すること、および
ウィンドウ内のチャネルについてのシグナル強度を、組み合わされたシグナル強度に置き換えること
を含む、請求項７５および７６のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
組み合わされたシグナル強度を決定することが、第１のチャネルにおける計算されたピークの形状を外挿することを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
シグナルアーチファクトについて補正することが、
データファイルにおいてチャネルについてのシグナル強度に基づいて漏出位置を同定すること；
データファイルにおける別のチャネルについてのシグナル強度に基づいて、漏出位置を含むウィンドウを決定すること；および
ウィンドウ内の他のチャネルについてのシグナル強度を、シミュレートされたノイズに置き換えること
を含む、請求項７５、７６、および７７のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
品質管理基準の達成を決定することをさらに含み、品質管理基準が、サイズ分類標準基準、リピートプロファイルシグナル・ノイズ比基準、リピートプロファイル混入基準、およびマイナーアレル感度基準の少なくとも１つを含む、請求項６から８および７１から７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
サイズ分類標準基準が、内部サイズ分類標準適合度基準、外部サイズ分類標準適合度基準、および内部サイズ分類標準を外部サイズ分類標準と比較する一貫性基準の少なくとも１つを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
遺伝子特異的産物ピーク位置に関連づけられたリピートサイズがゼロ未満である時、リピートプロファイル混入基準に不合格である、請求項８０および８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
遺伝子特異的産物ピーク位置におけるリピートプロファイルの値の最大値に対するリピートプロファイルのノイズ値の比率が閾値を超える時、マイナーアレル感度基準が満たされている、請求項８０、８１、および８２のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
リピート領域の増幅のための１つまたは複数のプライマー；
バッファー；ならびに
請求項１〜８３のいずれかに記載のデータ処理および計算方法を実施する分析ソフトウェアについての少なくとも１つのソフトウェアキーならびに／または分析ソフトウェアを記憶する少なくとも１つの非一過性媒体
を含む、試料においてリピート領域をジェノタイピングするためのキット。
【請求項８５】
リピート領域の増幅のための１つまたは複数のプライマー；
バッファー；ならびに
請求項１から８３のいずれかに記載のデータ処理および計算方法を実施する分析ソフトウェアについての少なくとも１つのソフトウェアキーおよび／または分析ソフトウェアを記憶する少なくとも１つの非一過性媒体
を含む、試料においてリピート領域をジェノタイプピークサイズ分類するためのキット。
【請求項８６】
プライマーが遺伝子座のリピート領域の一部と同一または相補的である、請求項８４または８５に記載のキット。
【請求項８７】
リピート領域の増幅のための第２のプライマーをさらに含む、請求項８４から８６のいずれかに記載のキット。
【請求項８８】
外部サイズ分類ラダーをさらに含む、請求項８４から８７のいずれかに記載のキット。
【請求項８９】
ＦＭＲ１またはＦＭＲ２のリピート領域をジェノタイプピークサイズ分類するためのキットであって、
リピート領域の増幅のためのフォワードプライマーおよびリバースプライマーの混合物；
ＧＣリッチなバッファー；
耐熱性ポリメラーゼ；ならびに
請求項１から８３のいずれかに記載のデータ処理および計算方法を実施する分析ソフトウェアについての少なくとも１つのソフトウェアキーならびに／または分析ソフトウェアを記憶する少なくとも１つの非一過性媒体
を含む、キット。
【請求項９０】
データ処理または計算方法が
リピートプロファイルにおいてピークをコールするための閾値を動的に決定する工程；
リピートプロファイルにおいて振幅閾値より下にピークを内挿する工程；および
リピートプロファイルにおける推定上のピーク位置を用いて、サンプリング単位から塩基対単位へマッピングする較正曲線を作成する工程
を含む、請求項８９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、参照により全体として本明細書に組み入れられている、２０１５年１１月３日に出願された米国仮出願第６２／２５０，４７６号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、核酸分析のための、データ処理および計算アノテーションシステムおよびデバイス、ならびに対応する方法に関する。特に、本開示は、核酸のリピート（ｒｅｐｅａｔ）領域をサイズ分類する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ヌクレオチドリピート（例えば、ホモポリマー領域、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、ヘキサヌクレオチドリピートなど）の領域を含む遺伝子座は、ヒトまたは動物ゲノムにおいてよく見られる。豊富なＧＣ（グアニン−シトシン）含有量を有する遺伝子座もまたよく見られ、一方、ＡＴ（アデニン−チミン）リッチな含有量を有する座が報告および研究されている。いくつかの状況において、ＧＣもしくはＡ／Ｔリッチな領域の伸長（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、またはヌクレオチドリピートの伸長は、様々な疾患状態と関連づけることができる。例えば、Ｘ染色体上に位置する脆弱Ｘ精神遅滞−１遺伝子（ＦＭＲ１）の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）におけるＣＧＧリピートの伸長は、脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）ならびに様々な障害および表現型に関連している。たいていの人々において、トリヌクレオチドＣＧＧは、ＦＭＲ１遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）（「ＣＧＧリピート領域」）においておよそ５〜４４回、リピートしている。この領域における約４５個より多いＣＧＧリピート、特に約２００個より多いＣＧＧリピートへの伸長は、ＦＸＳと関連づけられている。ＦＸＳ表現型は、精神遅滞、自閉症、不安、および他の認知または行動状態が挙げられ得る（J. Mol. Diag. 10(6): 496-501 (2008)）。同様に、ＦＭＲ２遺伝子の５’ＵＴＲにおけるＣＣＧトリヌクレオチドリピート領域（「ＣＣＧリピート領域」）の伸長は、Ｘ連鎖性知的障害、特に脆弱Ｘ症候群Ｅ（ＦＲＡＸＥ）に関連している。ＦＲＡＸＥは、Ｘ連鎖性精神遅滞の一般的な型である。他の例では、リピート長多型が、疾患状態と関連づけられている。例えば、ＴＯＭＭ４０遺伝子のイントロン６は、ポリＴリピート領域を含有し、集団においてリピート長多型を示すことが報告されている（rs 10524523）。ＴＯＭＭ４０ポリＴサイズは、遅発型アルツハイマー病、および高齢者における認知能力と関連していると報告されている（The Pharmacogenetics Journal 10:375-3840 (2010);および Alzheimer's and Dementia 9:132-136 (2013)参照）。さらに、Ｃ９ＯＲＦ７２遺伝子におけるイントロンの（Ｇ４Ｃ２）ｎヘキサヌクレオチドリピート伸長は、一般的な集団においておよそ１／６００の頻度で観察されており、全ての筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および前頭側頭葉型認知症（ＦＴＤ）症例のおよそ１０％において存在する。３０個より少ないリピートは正常とみなされ、一方、病原性Ｃ９ＯＲＦ７２伸長は、数百〜数千個のリピートを含み得る。したがって、患者ジェノタイプ（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）を正確に測定し、サイズ分類し、再構築するための方法は、これらを始めとする疾患の診断および処置にとって有益であり得る。
【０００４】
ＦＭＲ１およびＦＭＲ２におけるＣＧＧおよびＣＣＧリピートなどのヌクレオチドリピートを含む配列を評価するための方法には、制限酵素消化およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ストラテジーが挙げられる。制限消化分析は、リピート領域のサイズの粗い測定を提供することができる。しかしながら、制限消化分析は、分解能が限定され得、短い割り込み配列（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ）（例えば、ＣＧＧリピート領域内のＡＧＧ割り込み配列）を容易には検出せず、かつメチル化状態を決定することができない。
【０００５】
ＰＣＲストラテジーは、リピート領域をサイズ分類すること、および様々なジェノタイプを再構築することにおいて、より高い精度を提供し得る。しかしながら、長いリピート配列を含む遺伝子座、またはこれらの座についてジェノタイプを再構築する能力を邪魔するＧＣもしくはＡ／Ｔリッチな配列を含有する遺伝子座の増幅およびシーケンシングにおいて制限が存在する。例えば、ＦＭＲ１におけるＣＧＧリピートの分析のためにＰＣＲ手順を最適化するための努力が試みられており、それには、従来のＰＣＲアッセイへの改変が挙げられる（Genome Res. 6(7): 633-8, (1996); J. Mol. Diag. 8: 544-550, (2006);および Am. J. Med. Genet. 51(4): 527-34, (1994)参照）。最近になって、２００個を超えるＣＧＧまたはＣＣＧリピートを有するゲノム座のより信頼性の高い増幅を可能にするＰＣＲ技術が開発されている。
【０００６】
現行のワークフローストラテジーは、ＰＣＲをサイズ分解能技術、例えば、キャピラリー電気泳動と共に用いる場合が多い。キャピラリー電気泳動は、ＰＣＲに基づいたアッセイの定量的能力を向上させて、ＤＮＡ産物の単一塩基分解能に至るまでの正確な分解能を可能にする。ＤＮＡ産物のサイズ分類を容易にするために、典型的には、例えば、特定のキャピラリー電気泳動適用のための目的のサイズ範囲に渡る、公知のサイズの、プールされた色素標識ＤＮＡ断片を用いる、外部標準キャリブレータが用いられる。それでも、これらの標準を適用することにより達成される実現可能な能力にも関わらず、このアプローチは、いくつかの欠点を有し、それらには、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ｉ．市販されている色素標識ＤＮＡラダーの高い費用；ｉｉ．標準ラダーについての専用色素チャネルの使用により引き起こされる、キャピラリー電気泳動多重化バンド幅の低減；ｉｉｉ．ＰＣＲ増幅分析物と標準ＤＮＡとの間の塩基組成または配列の違いによる歪んだ電気泳動移動度に起因するサイズ分類の不正確さがあり、特別注文のＤＮＡラダーの使用を必要とし、それは、特にリピート障害ＰＣＲ産物について、サイズ分類するのに用いるのに面倒または非効率的であり得ること。さらに、ＦＭＲ１  ＰＣＲおよびＣＥ産物の断片サイズ分析は、訓練されたオペレータにより手作業で行われ、それは、大きな試料セットについては面倒であり、かつ他の点では合理化されたワークフローへ曖昧さと主観性の両方を導入し得る。
【発明の概要】
【０００７】
したがって、ＧＣまたはＡ／Ｔリッチでもあり得る、リピート領域をサイズ分類し、それらのリピート領域と関連したジェノタイプを再構築する向上した方法の必要性が当技術分野において存在する。本明細書に開示された方法は、１つまたは複数のヌクレオチドリピート領域をサイズ分類し、それらからジェノタイプを再構築するための増幅に基づいた方法における、単独での、または外部標準と組み合わせた、内部標準の作成および使用に関する。
【０００８】
図面は、必ずしも一定の縮尺、または網羅的であるとは限らない。それより、一般的に、本明細書に記載された発明の原理を図示することに重きを置かれる。この明細書に組み入れられ、かつそれの一部を構成する添付の図面は、本開示と一致したいくつかの実施形態を例証し、かつその説明と一緒に、本開示の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ジェノタイプピークサイズ分類のためのシステムの例示的な高レベル表示を描く。
【図２】図２は、ゲノムリピート領域を自動的に分析するための例示的な過程を示す。
【図３】図３Ａは、外部サイズ分類標準を作成するのに用いられる例示的な外部サイズ分類ラダーを描く。図３Ｂは、例示的な外部サイズ分類標準を描く。
【図４】図４Ａは、増幅産物のラダーの例示的なチャネルを描く。図４Ｂは、リピートプロファイル（ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｆｉｌｅ）を用いた、内部サイズ分類標準の作成を描く。
【図５】図５は、バックグラウンドモデルおよび動的閾値を用いてアノテートされた、例示的なリピートプロファイルを描く。
【図６】図６Ａは、（ｎ，ｎ＋１）ジェノタイプを示すヘテロ接合体女性についての例示的なリピート領域を描く。図６Ｂは、例示的な伸長したリピート領域を描く。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、異なる品質管理問題を有する試料を描く。図７Ａは、不十分なＲＯＸラダーを有する試料を描く。図７Ｂは、不十分なＰＣＲ増幅を有する試料を描く。図７Ｃは、混入ピークを有する試料を描く。
【図８】図８は、ジェノタイプピークサイズ分類のための例示的なコンピュータシステムを描く。
【図９】図９は、実施例１に記載されたある特定の実施形態による実験設計の概略図を描く。
【図１０】図１０は、リピートピーク局在化が遺伝子特異的産物のサイズ分類に利用される過程のグラフ表示を描く。各リピートの期待される位置は、独立型サイズ分類ラダーとしてか、または外部サイズ分類標準の断片移動度補正としてかのいずれかで、サイズ分類のための較正曲線を作成するのに用いられ得る。
【図１１】図１１は、濃い灰色での１１０６試料確証データセットにおけるジェノタイプの分布と比較した、薄い灰色での一般的な集団におけるＦＭＲ１ジェノタイプの分布を描く。
【図１２】図１２は、内部由来のサイズ分類ラダーを用いて決定されたリピート領域長と、ＲＯＸラダー（ＲＯＸ  １００サイズラダー、Ａｓｕｒａｇｅｎ  Ｐ／Ｎ：１４５１９４）と呼ばれる外部サイズ分類標準から導かれたサイズ分類ラダーとの間の一致を描く。
【図１３】図１３は、臨床セットにおいて評価されたメジャーアレルの手作業でのサイズ分類と自動サイズ分類との比較を描く。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、遺伝子特異的産物に対するアルゴリズムの分析感度を詳述する図を描く。矢印は、自動サイズ分類により生じたコールを示す。図１４Ａは、追加の遺伝子特異的産物の検出を描く。図１４Ｂは、低量の伸長したアレルの検出を描く。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、ＦＭＲ１ジェノタイプ範囲に渡るアッセイの分析感度を詳述する図を描く。矢印は、自動サイズ分類により生じたコールを示す。図１５Ａは、正常な試料を描く。図１５Ｂは、マイナーアレルを有する前突然変異試料を描く。
【図１６】図１６は、例示的なアッセイおよびソフトウェアコンポーネントの図を示す、
【図１７】図１７は、ある特定のアッセイを描く外部ラダーのＲＯＸプロファイルを描く。
【図１８】図１８Ａおよび１８Ｂは、臨床試料の大きな（ｎ＝１１０６）セットの自動サイズ分類分析を試験した結果を描く。
【図１９】図１９Ａおよび１９Ｂは、複数機器のＲＵＳＨインプット量試験の結果を描く。
【図２０】図２０Ａおよび２０Ｂは、人工マイナーアレルインプット滴定試験の結果を描く。
【図２１】図２１Ａおよび２１Ｂは、ＲＵＳＨ試料滴定試験の結果を描く。
【図２２】図２２Ａおよび２２Ｂは、正常なジェノタイプを有する試料についての自動サイズ分類分析の例示的な結果を描く。図２２Ｃおよび２２Ｄは、前突然変異ジェノタイプを有する試料についての自動サイズ分類分析の例示的な結果を描く。
【図２３】図２３Ａおよび２３Ｂは、伸長型試料についての自動サイズ分類分析の例示的な結果を描く。図２３Ｃおよび２３Ｄは、低レベルのマイナーアレル同定およびサイズ分類の例示的な結果を描く。
【図２４】図２４は、正常、前突然変異、および伸長型のジェノタイプ範囲を通してのジェノタイプの混合物を有する対照試料についての自動サイズ分類分析の例示的な結果を描く。
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂは、９５％前突然変異試料のバックグラウンドにおける５％完全突然変異試料の混合物を含む対照試料についての自動サイズ分類分析の例示的な結果を描く。図２５Ａは、全てのコールされたジェノタイプを含む完全な試料を描き、一方、図２５Ｂは、完全突然変異コールを示すズームインバージョンを描く。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
今、本開示によるある特定の例示的実施形態が詳細に参照され、それらのある特定の例は、添付の図面において図示されている。
【００１１】
本明細書で用いられたセクション見出しは、系統化することをのみ目的とし、記載された主題を限定するものとして解釈されるべきではない。非限定的に、特許、特許出願、論説、書籍、および論文を含む、この出願に引用された全ての文書、または文書の部分は、任意の目的のために、全体として参照により本明細書に明確に組み入れられている。参照により組み入れられた刊行物および特許または特許出願が、本明細書に含有された本発明と矛盾する限りにおいては、本明細書が、いかなる矛盾した材料にも優先する。
【００１２】
本発明を理解するのを助けるために、ある特定の用語がまず、定義される。追加の定義は、本出願を通して提供される。
【００１３】
特許請求の範囲および／または本明細書において用語「を含む」と共に用いられる場合の語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、または「その（ｔｈｅ）」の使用は、「１つ（ｏｎｅ）」を意味し得るが、それはまた、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」、および「１つまたは１つより大きい」という意味とも一致する。
【００１４】
この出願において、単数形の使用は、具体的に他に指定がない限り、複数形を含む。また、この出願において、「または」の使用は、他に指定がない限り、「および／または」を意味する。さらに、用語「を含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、加えて、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「を含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の語形の使用は、限定的ではない。本明細書に記載されたいかなる範囲も、その端点、およびその端点間の全ての値を含むものと理解される。
【００１５】
本明細書で用いられる場合、用語「Ａ／Ｔリッチな」、「Ａ／Ｔリッチさ」、および「リピート性Ａ／Ｔリッチセグメント」は、下記で定義されたホモポリマーセグメント、または（ＴｎＡ）ｍ、（ＡＴｎ）ｍ、（ＴＡｎ）ｍ、または（ＡｎＴ）ｍ（ｎは２以上であり、ｍは、リピート性Ａ／Ｔリッチなセグメントの長さが１０残基以上である）を含むセグメントを指す。ｎの値は、そのセグメントを通して一定である必要はない。したがって、リピート性Ａ／Ｔリッチセグメントの例には、ＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴ、ＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴ、ＡＡＴＡＡＡＡＡＡＴなどが挙げられる。（ＴｎＡ）ｍ、（ＡＴｎ）ｍ、（ＴＡｎ）ｍ、または（ＡｎＴ）ｍを含むセグメントに関して、いくつかの実施形態において、ｎは２から１０までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｎは３から１０までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｎは４から１０までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｎは２から８までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｎは３から８までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｎは４から８までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｎは２から６までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｎは３から６までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｍは２から２０までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｍは３から２０までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｍは４から２０までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｍは２から１５までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｍは３から１５までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｍは４から１５までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｍは２から１０までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｍは３から１０までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｍは４から１０までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｍは２から８までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｍは３から８までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、ｍは４から８までの範囲の値である。いくつかの実施形態において、リピート性Ａ／Ｔリッチセグメントの長さは、約１０残基から約６０残基までの範囲内にある。いくつかの実施形態において、リピート性Ａ／Ｔリッチセグメントの長さは、約１０個の連続した（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ）残基から約４０個の連続した残基までの範囲内にある。いくつかの実施形態において、リピート性Ａ／Ｔリッチセグメントの長さは、約１５個の連続した残基から約４０個の連続した残基までの範囲内にある。いくつかの実施形態において、リピート性Ａ／Ｔリッチセグメントの長さは、約２０個の連続した残基から約４０個の連続した残基までの範囲内にある。いくつかの実施形態において、リピート性Ａ／Ｔリッチセグメントの長さは、約５個の連続した残基から約５０個の連続した残基までの範囲内にある。いくつかの実施形態において、リピート性Ａ／Ｔリッチセグメントの長さは、約１０個の連続した残基から約５０個の連続した残基までの範囲内にある。いくつかの実施形態において、リピート性Ａ／Ｔリッチセグメントの長さは、約１５個の連続した残基から約５０個の連続した残基までの範囲内にある。いくつかの実施形態において、リピート性Ａ／Ｔリッチセグメントの長さは、約２０個の連続した残基から約５０個の連続した残基までの範囲内にある。いくつかの実施形態において、リピート性Ａ／Ｔリッチセグメントの長さは、約５個の連続した残基から約６０個の連続した残基までの範囲内にある。いくつかの実施形態において、リピート性Ａ／Ｔリッチセグメントの長さは、約１０個の連続した残基から約６０個の連続した残基までの範囲内にある。いくつかの実施形態において、リピート性Ａ／Ｔリッチセグメントの長さは、約１５個の連続した残基から約６０個の連続した残基までの範囲内にある。いくつかの実施形態において、リピート性Ａ／Ｔリッチセグメントの長さは、約２０個の連続した残基から約６０個の連続した残基までの範囲内にある。他に指示がない限り、リピート性Ａ／Ｔリッチセグメントは、以下の段落で説明されているような割り込み配列を含み得る。いくつかの実施形態において、リピート性Ａ／Ｔリッチセグメントは、割り込み配列を含まない。
【００１６】
本明細書で用いられる場合、「漏出（ｂｌｅｅｄ−ｏｖｅｒ）」は、蛍光標識ＰＣＲ産物が十分な強度で蛍光を発し、異なって標識されたＰＣＲ産物へ論理的に割り当てられた重複蛍光周波数放出帯域に有意なシグナルを生じる時に起こる。この漏出は、異なるチャネルについての蛍光検出器が重複スペクトル感度を有する場合に生じ得る。この漏出は、多重反応において特定のチャネルに固有の産物を検出する過程をコンボリューションし（ｃｏｎｖｏｌｕｔｅ）得る。例えば、ＨＥＸチャネルにおけるＰＣＲ産物は、十分な強度で蛍光を発して、ＲＯＸチャネルにおける記録されたシグナル強度に影響し得る。
【００１７】
本明細書で用いられる場合、「ＧＣリッチな」、「ＧＣリッチさ」、および「リピート性ＧＣリッチセグメント」は、ＧヌクレオチドもしくはＣヌクレオチドを含む下記で定義されたホモポリマーセグメント、またはＧヌクレオチドおよびＣヌクレオチドのリピート性パターンを含むセグメントを指す。ＣＧＧリピート、ＣＣＧリピート、ＧＧＧＧＣＣリピート、および任意の散在ＡＧＧ割り込み配列が含まれる。グアニン残基、シトシン残基、またはそれらの類似体である、核酸またはその核酸の断片における総核酸塩基残基に占める割合またはパーセンテージは、リッチさを定義する。例えば、正確に３０個のシトシン、正確に３０個のグアニン、正確に１個のシトシン類似体、および正確に１個のグアニン類似体を含有する１００個のヌクレオチド配列は、６２％のＧＣリッチさを有する。いくつかの実施形態において、「ＧＣリッチな」核酸または核酸の領域は、約５０％より多いグアニン残基、シトシン残基、またはそれらの類似体を含有するものである（例えば、約５０％、５１％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％より多いグアニン残基、シトシン残基、もしくはそれらの類似体、または中間の任意のパーセンテージ）。
【００１８】
本明細書で用いられる場合、用語「ホモポリマーセグメント」は、連続してリピートされたＧ、Ｃ、Ａ、Ｔ、またはＵなどのヌクレオチドを含む核酸のセグメントを指す。
【００１９】
他に指示がない限り、ホモポリマーセグメント、ＧＣリッチなリピート、またはＡ／Ｔリッチなリピートは、さもなければ連続した、またはリピートした、一連のヌクレオチドにおいて割り込み配列を含み得る。割り込み配列は、一連を構成する他のヌクレオチドとは異なる任意の数のヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、割り込み配列は、単一ヌクレオチドである。割り込み配列を含むホモポリマーセグメントの例は、第１の数のＴ残基、その後、１個のＣ残基、その後、第２の数のＴ残基である。
【００２０】
割り込み配列を含むホモポリマーセグメントの例は、第１の数のＵ残基、その後、１個のＣ残基、その後、第２の数のＵ残基である。割り込み配列を含むホモポリマーセグメントの別の例は、第１の数のＡ残基、その後、１個のＧ残基、その後、第２の数のＡ残基である。前述の例におけるＡ、Ｔ、またはＵ残基の第１および第２の数は、例えば、５〜１０の範囲内であり得る。いくつかの実施形態において、前述の例におけるＡ、Ｔ、またはＵ残基の第１および第２の数は、６〜１０の範囲内である。いくつかの実施形態において、前述の例におけるＡ、Ｔ、またはＵ残基の第１および第２の数は、７〜１０の範囲内である。いくつかの実施形態において、前述の例におけるＡ、Ｔ、またはＵ残基の第１および第２の数は、８〜１０の範囲内である。いくつかの実施形態において、前述の例におけるＡ、Ｔ、またはＵ残基の第１および第２の数は、９〜１０の範囲内である。あるいは、ホモポリマーセグメントは、連続した一連のヌクレオチド（割り込まれていない）を含む。
【００２１】
本明細書で用いられる場合、「核酸」は、対象から単離されている、および／またはリピート領域のサイズ分類が求められている、任意の連続する（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）ヌクレオチド残基または類似体である。核酸は、対象から単離された遺伝子、遺伝子断片、またはゲノム領域を含み得る。本明細書で用いられる場合、「ジェノタイプ」は、核酸の核酸塩基配列であり、またはそれを含む。
【００２２】
本明細書で用いられる場合、「ピーク位置」は、勾配がｓｉｇｎをプラスからマイナスへ変化させるシグナルのインデックスであり得る。ピーク位置の他の定義は、構想されたシステムおよび方法から逸脱することなく用いられ得る。例えば、以下の通りである：
ｆ（ｘ，ｃ）＝Δ１  ｓｇｎ（Δ１  ｓ（ｘ，ｃ））
【００２３】
【数１】
2019502367.tif 000003
【００２４】
式中、ｓ（ｘ，ｃ）は、機器チャネルｃについてのインデックスｘにおけるシグナル強度を表し、ｆ（ｘ，ｃ）は、そのシグナル強度の一階微分係数のｓｉｇｎの微分係数であり、Ｐ（ｃ）は、ｆ（ｘ，ｃ）が−２に等しい、チャネルｃにおける全てのインデックスのセットを表す。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、「ピークショルダー」は、シグナル強度が振幅閾値を超えるピーク位置に最も近いポイントであり得る。この振幅閾値は、平均値より２標準偏差だけ上であり得る。いくつかの実施形態において、標準偏差および平均値は、ピークショルダーを含むシグナルの区間に対して計算され得る。左ピークショルダーは、ピーク位置より低いインデックスを有するピークショルダーであり得、右ピークショルダーは、ピーク位置より高いインデックスを有するピークショルダーであり得る。他の実施形態において、ピークショルダーは、統計的分布をピークにフィッティングさせることにより同定することができ、ショルダーは、分布の末端（パーセンタイルカットオフにより定義される）における位置に割り当てられる。さらに他の実施形態において、ピークショルダーは、ピーク領域の一階微分係数を用いて同定することができ、ショルダーは、一階微分係数の絶対値が閾値より下である位置に割り当てられる。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、「リピート領域」または「ヌクレオチドリピート領域」は、１〜２０核酸塩基残基長のリピート性配列（例えば、ホモポリマー、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド、テトラヌクレオチド、ペンタヌクレオチド、ヘキサヌクレオチド配列など）を含む核酸または核酸の領域を指し、その短い配列は、２回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、１０回、１５回、２０回、５０回、１００回、２００回、５００回、またはそれ以上のリピート）、リピートされる。例えば、ヌクレオチドリピートは、ＣＧＧ、ＣＣＧ、ＧＧＧＧＣＣなどの短い配列が２回以上、リピートされている核酸の領域を包含する。リピート領域は、ホモポリマー、例えば、一連のＡまたはＴヌクレオチドであり得、リピート領域は、割り込み配列またはリピート変異体を含んでもよい。核酸または核酸の領域は、リピートとＧＣリッチな領域の両方、またはリピートとＡＴリッチな領域の両方であり得る（しかし、そうである必要はない）。例えば、核酸または核酸の領域は、グアニン残基、シトシン残基、またはそれらの類似体のジ−、トリ−、テトラ−、ペンタ−、またはヘキサ−ヌクレオチドリピートを含み得る。
【００２７】
核酸は、１つまたは複数の割り込み配列を含有する１個または複数のヌクレオチドリピート領域、Ａ／Ｔリッチな領域、またはＧＣリッチな領域を含み得る。本明細書で用いられる場合、核酸内の「割り込み配列」は、リピートパターンと一致しない、核酸内の１個もしくは複数の核酸塩基残基もしくは類似体の存在を指し、またはＧＣリッチな領域において、ＧもしくはＣ（またはその類似体）以外の核酸塩基を含む。例えば、ＧＣリッチなヌクレオチドリピート領域は、４０個のＣＧＧリピート内に散在した２個のＡＧＧ配列を有する、４０個のＣＧＧトリヌクレオチドリピートを含む配列を包含し得る。
【００２８】
本明細書で用いられる場合、「シグナル強度」は、「相対蛍光単位」またはＲＦＵによって本明細書では表されるが、蛍光の他の測定単位が、構想されたシステムおよび方法から逸脱することなく、用いられ得る。
【００２９】
本明細書で用いられる場合、用語「鋳型」は、核酸合成反応における延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）のためにプライマーと相互作用する核酸を指す。
【００３０】
Ｉ．リピート領域のサイズ分類およびジェノタイプの再構築
図１は、ジェノタイプピークサイズ分類のためのシステム１００の例示的な高レベルな表示を描く。システム１００は、ＰＣＲデバイス１１０、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）デバイス１２０、アノテーションデバイス１３０、および実験室情報管理システム１４０を含み得る。ＰＣＲデバイス１１０は、当業者によく知られたＰＣＲ機器を含み得る。例えば、ＰＣＲデバイスは、サーマルサイクルを含み得る。非限定的例として、ＡＢＩモデル９７００サーマルサイクラーが用いられ得る。ＰＣＲデバイス１１０は、核酸試料のリピート領域を増幅するように構成され得る。
【００３１】
ＣＥデバイス１２０は、当業者によく知られたＣＥ機器を含み得る。例えば、ＡＢＩモデル３１００、３１３０、３７３０、または３５００  ＣＥデバイスが用いられ得る。ＣＥデバイス１２０は、高分解能断片分析を実施するように構成され得る。いくつかの実施形態において、ＣＥデバイスは、増幅断片をサイズによって分離するために用いられ得る。いくつかの実施形態において、ＣＥデバイスは、増幅産物のラダーを生成するために用いられ得る。他の実施形態において、ＣＥデバイスは、増幅断片をサイズによって分離することにより増幅産物のラダーを生成するように用いられ得る。ある特定の実施形態において、ＣＥデバイスは、リピート領域サイズ分類情報を得るために用いられる。ＣＥデバイス１２０は、増幅産物のこのラダーを示すアウトプットを提供するように構成され得る。いくつかの実施形態において、このアウトプットは、ファイルに１つまたは複数のチャネルを含み得る。ファイルは、．ＦＳＡファイル、または当業者に知られた類似したファイルであり得る。
【００３２】
アノテーションデバイス１３０は、専用コンピュータデバイス、デスクトップ、ワークステーション、オールインワンシステム、コンピュータクラスター、端末、メインフレーム、モバイルコンピュータデバイス、または他のコンピュータデバイスを含み得る。アノテーションデバイス１３０は、スタンドアロンであり得、またはより大きいシステムの部分であり得る、サブシステムの部分であり得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、遠隔設置され、かつパブリックネットワークまたは専用プライベートネットワークを通して通信する分散サーバーを含み得る。いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、少なくとも一部、クラウドコンピューティングインフラストラクチャ上のバーチャルシステムとして、実行され得る。開示された実施形態と一致して、アノテーションデバイス１３０は、データおよび／またはソフトウェア命令を記憶するように構成された１つまたは複数の記憶デバイスを含み得、またはそれらと通信し得る。記憶されたデータおよび／またはソフトウェア命令は、１つまたは複数のソフトウェアプログラムを含み得る。例えば、記憶されたデータおよび／またはソフトウェア命令は、分析ソフトウェアを含み得る。アノテーションデバイス１３０は、開示された実施形態と一致した１つまたは複数の方法を実施するようにこの分析ソフトウェアを実行し得る。ある特定の態様において、アノテーションデバイス１３０は、アノテーションデバイス１３０から遠隔操作で、この分析ソフトウェアを実行し得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、１つまたは複数の遠隔デバイスにアクセスして、記憶された分析ソフトウェアを実行し得る。ある特定の実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、分析ソフトウェアの記憶、実行、および／または実装に基づいた特定の装置またはシステムとして構成され得る。アノテーションデバイス１３０は、ＣＥデバイス１２０および実験室情報管理システム１４０などのシステム１００の他のコンポーネントと通信するように構成され得る。アノテーションデバイス１３０は、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ、ＦｉｒｅＷｉｒｅ、ＵＳＢ、ＲＳ−２３２、ＳＣＳＩ、ＷＬＡＮ、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ、または類似したインターフェイスを用いてシステム１００のこれらのコンポーネントと通信し得る。
【００３３】
アノテーションデバイス１３０は、リピート性ゲノム領域をサイズ分類するように構成され得る。このサイズ分類は、自動的に実施され得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、ＦＭＲ１サイズ分類結果を作成するように構成され得る。アノテーションデバイス１３０は、リピート性ゲノム領域をサイズ分類し、および／または遺伝子産物位置を同定するように、シグナル処理技術、統計的技術、および機械学習技術の組合せを用い得る。アノテーションデバイス１３０は、この分析の結果をアウトプットし、および／またはこの分析の工程を仲介するように構成され得る。アノテーションデバイス１３０は、これらの指示を、実験室情報管理システム１４０へ、またはディスプレイ、プリンター、記憶デバイス、もしくは別のシステムへアウトプットするように構成され得る。
【００３４】
実験室情報管理システム１４０は、専用コンピュータデバイス、デスクトップ、ワークステーション、オールインワンシステム、コンピュータクラスター、端末、メインフレーム、モバイルコンピュータデバイス、または他のコンピュータデバイスを含み得る。実験室情報管理システム１４０は、スタンドアロンであり得、またはより大きいシステムの部分であり得る、サブシステムの部分であり得る。例えば、実験室情報管理システム１４０は、遠隔設置され、かつパブリックネットワークまたは専用プライベートネットワークを通して通信する分散サーバーを含み得る。いくつかの実施形態において、実験室情報管理システム１４０は、少なくとも一部、クラウドコンピューティングインフラストラクチャ上のバーチャルシステムとして、実行され得る。開示された実施形態と一致して、実験室情報管理システム１４０は、データおよび／またはソフトウェア命令を記憶するように構成された１つまたは複数の記憶デバイスを含み得、またはそれらと通信し得る。記憶されたデータおよび／またはソフトウェア命令は、１つまたは複数のソフトウェアプログラムを含み得る。実験室情報管理システム１４０は、開示された実施形態と一致した１つまたは複数の方法を実施するように、記憶された１つまたは複数のソフトウェアプログラムを実行し得る。ある特定の態様において、実験室情報管理システム１４０は、実験室情報管理システム１４０から遠隔操作で、記憶された１つまたは複数のソフトウェアプログラムを実行し得る。例えば、実験室情報管理システム１４０は、１つまたは複数の遠隔デバイスにアクセスして、記憶された１つまたは複数のソフトウェアプログラムを実行し得る。ある特定の実施形態において、実験室情報管理システム１４０は、ソフトウェア命令の記憶、実行、および／または実装に基づいた特定の装置またはシステムとして構成され得る。実験室情報管理システム１４０は、ＣＥデバイス１２０およびアノテーションデバイス１３０などのシステム１００の他のコンポーネントと通信するように構成され得る。実験室情報管理システム１４０は、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ、ＦｉｒｅＷｉｒｅ、ＵＳＢ、ＲＳ−２３２、ＳＣＳＩ、ＷＬＡＮ、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ、または類似したインターフェイスを用いてシステム１００のこれらのコンポーネントと通信し得る。
【００３５】
実験室情報管理システム１４０は、試料および対応するデータを管理するように構成され得る。他の態様において、実験室情報管理システム１４０は、ワークフローを自動化するために用いられ得る。いくつかの実施形態において、実験室情報管理システム１４０は、試料管理実験室情報管理システム（Ｓａｍｐｌｅ  Ｍａｎａｇｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）、ワトソン実験室情報管理システム（Ｗａｔｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）、ノーチラス実験室情報管理システム（Ｎａｕｔｉｌｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）、または臨床実験室情報管理システム（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）を実行するように構成され得る。当業者は、適切な実験室情報管理システムについて容易にわかるだろう。実験室情報管理システム１４０は、ゲノム試料に関する情報を受け取るように構成され得る。実験室情報管理システム１４０は、アノテーションデバイス１３０、記憶デバイス、または別のシステムからのこの情報を受け取り得る。実験室情報管理システム１４０は、この情報を記憶のために整え、かつ関連臨床医に見せるように構成され得る。
【００３６】
当業者により認識されているように、図１に描かれたデバイスの特定の配置は、限定することを意図するものではない。例えば、システム１００は、追加のデバイス、またはより少ないデバイスを含む場合がある。同様に、システム１００の個々のデバイスの機能が、複数のデバイスに渡って分散され得、システム１００の異なるデバイスにより実施される複数の機能が、単一のデバイスによって実施され得る。
【００３７】
システム１００は、リピート領域をサイズ分類し、適宜、ジェノタイプを再構築する以下の方法を実施するように構成され得る。いくつかの実施形態において、リピート領域のサイズ分析は、リピート領域を増幅すること、および増幅された産物を用いて、リピート領域サイズを決定することを含み得る。ある特定の実施形態において、核酸のリピート領域が増幅されて、増幅産物のラダーが得られる。増幅産物のラダーは、リピート領域をサイズ分類することにおける内部標準として用いられ得る。いくつかの実施形態において、内部標準は、任意の外部標準なしに用いられる。他の実施形態において、内部標準は、外部標準と組み合わせて用いられる。いくつかの実施形態において、外部標準は、蛍光標識ＤＮＡラダー、例えば、ＲＯＸサイズ標準であり得る。より具体的な実施形態において、ＲＯＸサイズ標準は、ＲＯＸ  １０００サイズラダー（Ａｓｕｒａｇｅｎ  Ｐ／Ｎ：１４５１９４）であり得る。リピート領域の増幅パターンは、リピート領域をサイズ分類するために用いられ得る。当業者は、増幅産物のラダーが、リピートプロファイル、リピートエレメント周期性、第１の増幅産物、増幅産物カウント数、および／または一定のエレメント長などの、リピート領域をサイズ分類することにおいて有用なある特定の特徴を有することを理解するであろう。ある特定の実施形態において、サイズ分類情報は、再構築されるジェノタイプを作製するために、患者において障害を診断するために、もしくは患者の子孫の障害のリスクを診断するために、または伸長したリピート領域に関連した障害を有する患者を処置することにおいて、用いられ得る。
【００３８】
様々な実施形態において、リピート領域をサイズ分類する方法は、リピート領域を含む核酸または部分を増幅して、一連の増幅断片を生成することを含む。増幅断片は、特定の断片において増幅されたリピート単位の数に対応する、異なる長さのものであり得る。他の実施形態において、リピート領域を含む核酸または部分が増幅されず、さらなる分析のために直接的に単離され、断片化される。いくつかの実施形態において、増幅断片（または増幅されていない断片）は、例えば、高分解能断片分析、例えば、遺伝子アナライザ、マイクロチップアナライザ（例えば、バイオアナライザ）、キャピラリー電気泳動、またはラダーの増幅断片を分析するための別の高分解能方法を用いる分析などのサイズ分解能技術を用いて、サイズによって分離される。例えば、キャピラリー電気泳動が用いられ得る。ある特定の実施形態において、バイオアナライザなどのマイクロチップ電気泳動が用いられ得る。様々な実施形態において、高分解能断片分析は、例えば、キャピラリー電気泳動電気泳動図において異なるリピート数の増幅産物に対応するピークを評価することにより、増幅産物のラダーを生成するために用いられる。いくつかの実施形態において、個々のリピート単位の公知の長さは、リピート単位のラダーを、ヌクレオチド塩基対（ｂｐ）長を示すラダーへ変換するために用いることができる。例えば、リピート単位を含む核酸領域の増幅およびキャピラリー電気泳動は、３ヌクレオチドの単位によって長さが異なる増幅断片のラダーを生じ、増幅産物のラダーについてのパラメータ情報を用いて、ラダーをヌクレオチド長の測定単位への変換を可能にする。いくつかの実施形態において、ラダーは、目的の核酸においてリピート領域のサイズを決定するために用いられる。いくつかの実施形態において、ラダーは、リピート領域を含む核酸の他の部分のサイズ、またはラダーを生成する同じ反応において増幅された目的の他の核酸のサイズを決定するために用いられる。いくつかの実施形態において、リピート領域サイズは、ジェノタイプを再構築するために用いられる。ある特定の実施形態において、リピート領域における任意の割り込み配列への順方向および逆方向での距離などの追加のパラメータもまた同定され（例えば、キャピラリー電気泳動電気泳動図から）、ジェノタイプを再構築するためにリピート領域サイズと共に用いられる。ある特定の実施形態において、リピート配列における割り込み配列は、増幅産物のラダーにおいて検出される。
【００３９】
様々な実施形態において、リピート領域、例えば、ＧＣリッチもしくはＡ／Ｔリッチな領域をサイズ分類し、および／もしくは特徴づけるための方法、ならびに／またはリピート領域を含むジェノタイプを再構築するための方法が本明細書で開示される。例えば、本明細書で開示される方法は、ＣＧＧリピートまたはＣＣＧリピートを含む核酸またはその断片からリピート領域をサイズ分類するために用いることができる。本明細書で開示された方法は、ホモポリマーセグメントなどのＡ／Ｔリッチセグメントを含む核酸またはその断片からリピート領域をサイズ分類するために用いることができる。サイズ分類の方法は、リピート領域において割り込み配列を決定するための方法、加えて、サイズ分類に基づいてジェノタイプを再構築する方法（単独で、またはリピート領域における任意の割り込み配列への順方向および逆方向での距離などの追加のパラメータと組み合わせて）と共に用いることができる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、方法は、対象から単離された、ＦＭＲ１もしくはＦＭＲ２遺伝子、もしくはその断片、またはＦＭＲ１もしくはＦＭＲ２の５’ＵＴＲ、もしくはその断片のリピート領域をサイズ分類するために用いることができる。ある特定の実施形態において、本明細書で開示された方法は、ＣＧＧリピートパターンおよび位置、ならびにＡＧＧ割り込み配列の組織化ならびに／またはＦＭＲ１の５’ＵＴＲ内のメチル化を含む、対象由来の試料においてＦＭＲ１遺伝子についてのジェノタイプを再構築するのを助けるために用いられる。他の実施形態において、本明細書で開示された方法は、ＦＭＲ１についてのように、ＣＣＧリピートパターンを含む、ＦＭＲ２についてのジェノタイプを再構築するのを助けるために用いられる。さらに他の実施形態において、本明細書で開示された方法は、ＴＯＭＭ４０のリピート領域をサイズ分類するのを助けるために用いられる。他の実施形態において、方法は、Ｃ９ＯＲＦ７２のリピート領域をサイズ分類するのを助けるために用いられる。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示された方法は、患者試料由来の核酸またはその断片のリピート領域のサイズを決定するために用いられ、核酸が、少なくとも１つのリピートまたはＧＣリッチもしくはＡ／Ｔリッチな領域を有し、かつ前記患者の両親の少なくとも１人由来の関連ジェノタイプが知られていない。いくつかの実施形態において、リピート領域を含む、目的の核酸または部分が患者試料から単離される。様々な単離および精製方法が知られており、用いることができる。ある特定の実施形態において、本明細書で開示された方法は、患者試料由来の例えばＦＭＲ１またはＦＭＲ２の、ＣＧＧまたはＣＣＧリピート領域のサイズを決定するために用いられる。ある特定の実施形態において、本明細書で開示された方法は、患者試料由来のヘキサマーリピート、例えば、Ｃ９ＯＲＦ７２のＧＧＧＧＣＣリピートのサイズを決定するために用いられる。ある特定の実施形態において、本明細書で開示された方法は、患者試料由来のホモポリマーリピート、例えば、ＴＯＭＭ４０のポリＴリピート領域のサイズを決定するために用いられる。いくつかの実施形態において、患者の両親の少なくとも１人由来の、ＦＭＲ１、ＦＭＲ２、Ｃ９ＯＲＦ７２、またはＴＯＭＭ４０ジェノタイプなどの関連ジェノタイプが知られていない。
【００４２】
ある特定の実施形態において、核酸試料のリピート領域のサイズ分類のための方法は、患者由来の試料を提供することを含み、試料が、１つまたは複数のリピート領域またはＧＣリッチもしくはＡＴリッチな領域を有する核酸またはその断片を含有する。いくつかの実施形態において、核酸を特徴づける情報（すなわち、「パラメータ情報」）が収集される。いくつかの実施形態において、パラメータ情報は、リピートプロファイル、リピートエレメント周期性、第１の増幅産物、増幅産物カウント数、および／または一定のエレメント長を含む、増幅産物のラダーから得られる特徴を含む。いくつかの実施形態において、リピートプロファイルは、電気泳動図において観察されるピークのパターンである。いくつかの実施形態において、増幅産物は、リピート領域を、選択されたプライマーを用いて増幅することにより産生される断片の蔓延（ｓｐｒｅａｄ）である。いくつかの実施形態において、リピート領域の全長は、パラメータ情報から計算される。いくつかの実施形態において、追加のパラメータ情報、例えば、目的の領域のＧＣリッチさもしくはＡ／Ｔリッチさのパーセント、ならびに／またはリピートもしくはＧＣリッチもしくはＡ／Ｔリッチな領域における任意の割り込み配列への順方向および逆方向での距離に関する情報が作成される。いくつかの実施形態において、収集された情報は、自動分析を行うようにプログラミングされたプロセッサを含む装置を用いて自動的に分析される。ある特定の実施形態において、サイズ分類解答（ｓｏｌｕｔｉｏｎ）または解答ジェノタイプの精度は、それがパラメータ情報と適合することを確認するようにジェノタイプを手作業で分析することにより、または任意の他の確認アッセイ（例えば、制限酵素消化、サンガーシーケンシング、またはハイスループットシーケンシングの他の形式）を行うことにより評価することができる。いくつかの実施形態において、サイズ分類解答または解答ジェノタイプは、コンピュータ上に電子的にディスプレイもしくは記憶することができ、またはその後の診断および治療目的のために印刷することができる。
【００４３】
ある特定の実施形態において、リピート領域のサイズ分類は、リピート領域において、突然変異もしくはジェノタイプを検出するために、またはリピート領域における突然変異に関連した障害もしくは障害のリスクを診断し、もしくは診断するのを助けるために用いることができ、例えば、ＦＭＲ１、ＦＭＲ２、Ｃ９ＯＲＦ７２、またはＴＯＭＭ４０関連の突然変異、ジェノタイプ、または障害が挙げられる。
【００４４】
様々な実施形態において、核酸のリピート領域を特徴づけるサイズ分類情報は、増幅および高分解能断片分析などの任意の適切な方法を用いて得ることができる。ある特定の実施形態において、サイズ分類情報（例えば、パラメータ情報のサブセット、核酸を特徴づける情報）は、増幅産物のラダーに関するリピートプロファイル、リピートエレメント周期性、第１の増幅産物、増幅産物カウント数、および／または一定のエレメント長を含む。いくつかの実施形態において、リピート領域の全長、加えてリピート領域の開始点から最初の、またはそれに続く割り込み配列までの順方向および逆方向での距離が、パラメータ情報に含まれる。いくつかの実施形態において、パラメータ情報を分析するように、およびリピート領域をサイズ分類するように、適宜、その情報からジェノタイプを再構築するようにプログラミングされたプロセッサを含む装置が提供される。ある特定の実施形態において、装置は、核酸を特徴づける情報から核酸のジェノタイプを再構築するために用いられる。いくつかの実施形態において、装置は、増幅産物のラダーにおいて各産物のサイズを評価する。いくつかの実施形態において、リピート領域の長さならびに順方向および逆方向での割り込み配列に基づいた全ての可能なジェノタイプ再構築が作製されて、全てのパラメータ情報を満たす再構築が選択される（例えば、順方向と逆方向の両方において正しい位置に割り込み配列を配置するジェノタイプ）。ある特定の実施形態において、装置は、スクリーン上にディスプレイされ、将来の使用のためにデジタル的に保存され、または記録された紙として印刷され得る、再構築されたジェノタイプの報告書を提供する。
【００４５】
様々な実施形態において、核酸に関するパラメータ情報は、核酸をサイズ分類するのに適した増幅産物のラダーに関する情報を含む限り、当技術分野において公知の任意の方法を用いて得ることができる。いくつかの実施形態において、パラメータ情報は、増幅産物のラダーに関する、リピートプロファイル、リピートエレメント周期性、第１の増幅産物、増幅産物カウント数、および／または一定のエレメント長を含む。核酸部位を特異的に切断する制限酵素が、リピート領域を分析し、それにより、パラメータ情報を作成するために用いることができる。例えば、ＦＭＲ１のＣＧＧリピート区画内のＡＧＧ割り込み配列の存在は、制限酵素ＥｃｉＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて核酸を消化することにより検出することができる。制限酵素は、消化された産物のラダーを生成するために用いられ得、そのラダーをサイズ分類に用いることができる。他の実施形態において、必要な情報を作成するために増幅方法を用いることができる。例えば、制限消化および／またはＰＣＲ方法を、１つまたは複数のＣＧＧまたはＣＣＧリピート領域を決定することにおいて、患者から単離されたＦＭＲ１もしくはＦＭＲ２遺伝子またはその断片と共に用いることができる。
【００４６】
国際公開番号ＷＯ／２０１４／０１５２７３に開示された方法は、全体として参照により本明細書に組み入れられており、それは、リピート領域を分析し、リピートサイズ、およびリピート領域における任意の割り込み配列までの順方向および逆方向での距離を含むパラメータ情報を得るための、その刊行物に開示された、ＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動方法を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態において、リピート領域を増幅して増幅産物を生成するための適切な方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応、多重ライゲーション依存性プローブ増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｌｉｇａｔａｂｌｅ  ｐｒｏｂｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、インベーダーテクノロジー（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ）、ローリングサークル増幅、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転写、鎖置換増幅、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、ＲＮＡ（例えば、Ｅｂｅｒｗｉｎｅ）増幅、ループ媒介性等温増幅、または当業者に知られている任意の他の方法が挙げられる。例えば、ＦＭＲ１リピート領域増幅は、ＣＧＧリンカープライマーおよびヒトＦＭＲ１  ＰＣＲキット（Ａｓｕｒａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）を用いた２段階ＰＣＲアプローチを用いて、生じさせることができる。Tassone et al., J Mol Diagn. 10(1):43-49 (2008); Chen et al., J Mol Diagn. 12(5): 589-600 (2010); Yrigollen et al., PLoS One 6(7): e21728 (2011)を参照されたい。例えば、少なくとも１つのＧＣリッチな領域を含む核酸が、（ａ）ＣＧＧ、ＣＣＧ、ＧＣＧ、ＣＧＣ、ＧＣＣ、またはＧＧＣリピートを含む第１のプライマーおよびＧＣリッチな領域の外側の位置にアニールする第２のプライマーを含む、少なくとも２つのＰＣＲプライマーを提供すること；（ｂ）少なくとも２つの異なるプライマーを用いて核酸にＰＣＲを実施することであって、ここで、ＰＣＲが、ＰＣＲ産物のセットを生じる、実施すること；（ｃ）ＰＣＲ産物のセットを高分解能技術（キャピラリー電気泳動など）を用いて分解して、ＰＣＲ産物のサイズおよび存在量の表示を生成させること；ならびに（ｄ）ＰＣＲ産物のサイズおよび存在量情報からＧＣリッチな領域の長さ、およびＧＣリッチな領域内に割り込み配列が位置しているかどうか、またはどこに位置しているかを導くことにより、分析することができる。
【００４８】
様々な実施形態において、ＰＣＲ増幅された核酸は、例えば、当業者によく知られたキャピラリー電気泳動（ＣＥ）機器などの高分解能断片アナライザ、例えば、ＡＢＩモデル３１００、３１３０、３７３０、または３５００  ＣＥ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、リピート領域サイズ分類情報を得るように分析される。増幅された核酸を電気泳動的に、または別の方法で、サイズ分類し、および／またはシーケンシングする能力がある任意の機器を含む他の道具もまた用いることができる。サイズ分類および他のパラメータ情報を収集する任意の他の方法（例えば、サンガーシーケンシングまたはハイスループットシーケンシングの他の形式）もまた用いることができる。米国特許出願公開第２０１０／０２０９９７０号、第２０１０／０２４３４５１号、および第２０１２／０１０７８２４号に記載されたＰＣＲ方法などの、ＦＭＲ１遺伝子またはその断片を分析するための様々な技術は、リピートスペーシングにより長さが分割された増幅産物のラダーを生じる場合が多い。例えば、ＦＭＲ１およびＦＭＲ２の５’ＵＴＲまたはそれらの断片においてＣＧＧおよびＣＣＧリピート座を特徴づけるためのリピート領域サイズ分類およびジェノタイプ再構築は、米国特許出願公開第２０１０／０２４３４５１号（参照により本明細書に組み入れられている）に記載された、段落［００４０］〜［００５１］、［００５６］〜［００６０］、［００６５］〜［００６７］、［００８９］、［００９４］、および［０１０４］において開示されたプライマー、ポリメラーゼ、試薬、および反応条件を含む、方法を用いて、作製することができる。追加として、米国特許出願公開第２０１０／０２０９９７０号、第２０１０／０２４３４５１号、および第２０１２／０１０７８２４号（全体として参照により本明細書に組み入れられている）は、ＧＣリッチな領域を分析するためのＰＣＲ方法および試薬を記載する。
【００４９】
例えば、いくつかの実施形態において、ＦＭＲ１およびＦＭＲ２パラメータ情報は、リピート領域の外側にアニールするプライマー、およびリピート配列、並べ換え配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）、または配列（ＧＣＧ、ＣＣＧ、ＣＧＣ、ＧＣＣ、またはＧＧＣ）の逆相補体にアニールするプライマーを用いて作成することができる。リピート領域の外側（上流または下流）にアニールすることができるプライマーは、フォワードプライマーまたはリバースプライマーであり得る。プライマーは、リピート領域を挟む配列にアニールしてもよい。フォワードプライマーの例には、CGG TGG AGG GCC GCC TCT GAG C（配列番号１）、CAG GCG CTC AGC TCC GTT TCG GTT T（配列番号２）、CAG TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC G（配列番号３）、TCC GGT GGA GGG CCG CCT CTG AGC（配列番号４）、GGT TCG GCC TCA GTC AGG CGC TCA GCT CCG TTT CG（配列番号５）、GGG TTC GGC CTC AGT CAG GCG CTC AGC TCC GTT TCG（配列番号６）、GCG GGC CGG GGG TTC GGC CTC AGT CA（配列番号７）、CAG CGG GCC GGG GGT TCG GCC TCA G（配列番号８）、GCA GCG GGC CGG GGG TTC GGC CTC A（配列番号９）、GGG CCG GGG GTT CGG CCT CAG TCA G（配列番号１０）、GGG GTT CGG CCT CAG TCA GGC GCT CA（配列番号１１）、GGG GTT CGG CCT CAG TCA GGC GCT CAG（配列番号１２）、GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC ACT TCC（配列番号１３）、TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC A（配列番号１４）、CAC TTC CGG TGG AGG GCC GCC TCT GA（配列番号１５）、TTC CGG TGG AGG GCC GCC TCT GAG C（配列番号１６）、およびTCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC ACG GCG GCG GCG GCG GA（配列番号４４）が挙げられる。リバースプライマーの例には、CGC ACT TCC ACC ACC AGC TCC TCC A（配列番号１７）、GGA GCC CGC CCC CGA GAG GTG（配列番号１８）、GGG AGC CCG CCC CCG AGA GGT（配列番号１９）、CGC ACT TCC ACC ACC AGC TCC TCC AT（配列番号２０）、CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG TG（配列番号２１）、CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GT（配列番号２２）、CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GTG（配列番号２３）、CGC CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG TG（配列番号２４）、GCG CCG GGA GCC CGC CCC CGA GAG GT（配列番号２５）、CGC CGG GAG CCC GCC CCC GAG AGG T（配列番号２６）、GCG CCA TTG GAG CCC CGC ACT TCC ACC A（配列番号２７）、GCG CCA TTG GAG CCC CGC ACT TCC A（配列番号２８）、AGC GCC ATT GGA GCC CCG CAC TTC C（配列番号２９）、CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCA C（配列番号３０）、TTG GAG CCC CGC ACT TCC ACC ACC A（配列番号３１）、AGC CCC GCA CTT CCA CCA CCA GCT CCT C（配列番号３２）、GAG CCC CGC ACT TCC ACC ACC AGC TCC T（配列番号３３）、CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCA CCA CCA G（配列番号３４）、CCC GCA CTT CCA CCA CCA GCT CCT CCA TCT（配列番号３５）、TAG AAA GCG CCA TTG GAG CCC CGC ACT TCC（配列番号３６）、AAG CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CC（配列番号３７）、AAG CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCC CGC CGC CGC CGC CG（配列番号４３）、およびAAG CGC CAT TGG AGC CCC GCA CTT CCC CGC CGC CGC CGC CT（配列番号４５）が挙げられる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、ＦＭＲ１およびＦＭＲ２アッセイは、プライマーTCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCACTTCCGGT（配列番号３８）、AGCGTCTACTGTCTCGGCACTTGCCCGCCGCCGCCG（配列番号３９）、TCA GGC GCT CAG CTC CGT TTC GGT TTC A（配列番号４０）、およびTCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA CGGCGGCGGCGGCGG（配列番号４１）を用いることができる。方法は追加として、配列番号１〜３８または４０のいずれかの配列を含むプライマー、ならびに３’末端に付加されたＣＧＧまたはその並べ換え型および逆相補体（例えば、ＧＣＧ、ＣＣＧ、ＣＧＣ、ＧＣＣ、またはＧＧＣ）の追加のリピートを含むプライマーを用いることを含む。いくつかの実施形態において、プライマーにおけるＣＧＧリピートまたは並べ換え型の数は、４個または５個である。いくつかの実施形態において、プライマーは、１２〜１５ヌクレオチドまたはそれ以上に及ぶＣＧＧリピート（またはその並べ換え型）の配列を含有する。いくつかの実施形態において、プライマーは、３リピートから１０リピートまでの範囲であるＣＧＧリピート（またはその並べ換え型）の配列を含有する。プライマーは、３、４、５、６、７、８、９、または１０リピート、ならびに適宜、１個または２個のＣおよび／またはＧ残基の追加の部分的リピートを含有し得る。
【００５１】
いくつかの実施形態において、リピート領域またはＧＣリッチな領域にアニールするプライマーは、割り込みエレメントを含む領域における部位に対する優先的な結合活性を有する。割り込みエレメントの部位との優先的な結合は、例えば、ＰＣＲ反応において、リピート領域またはＧＣリッチな領域の外側に結合する逆方向の第２のプライマーと共にそのプライマーを用いることにより、割り込みエレメントを含む少なくとも１個の産物の選択的増幅を生じ得る。優先的な結合活性は、例えば、ＣＧＧおよびＡＧＧエレメント、またはそれらの並べ換え型および／もしくは逆相補体を含む部位、例えば、（１）１個のＡＧＧエレメント、またはＡを含むＡＧＧエレメントの一部、および（２）３個、４個、５個、または６個のＣＧＧエレメント、および適宜、追加の部分的ＣＧＧエレメントを含む部位に特異的であり得る。
【００５２】
いくつかの実施形態において、リピート領域またはＧＣリッチな領域にアニールし、かつ割り込みエレメントを含む部位と優先的に結合するプライマーは、リピートまたはＧＣリッチな配列にアニールするプライマーの部分内に、またはその末端にＡ、Ｔ、またはＵ残基を含み得る。例えば、プライマーは、ＣＧＧ、ＣＣＧ、ＧＣＧ、ＣＧＣ、ＧＣＣ、またはＧＧＣリピートのひと続きの中に、または末端にＡ、Ｔ、またはＵを有し得、例えば、上記の配列番号４４および４５を参照されたい。Ａ、Ｔ、またはＵ残基は、プライマーの３’末端に存在し得る。Ａ、Ｔ、またはＵ残基がＣＧＧ、ＣＣＧ、ＧＣＧ、ＣＧＣ、またはＧＣＣ、ＧＧＣリピートの末端に存在する場合、Ａ、Ｔ、またはＵ残基と最後の完全なＣＧＧ、ＣＣＧ、ＧＣＧ、ＣＧＣ、ＧＧＣ、またはＧＧＣリピートとの間に部分的ＣＧＧ、ＣＣＧ、ＧＣＧ、ＣＧＣ、ＧＣＣ、またはＧＧＣリピートがあってもよいし、なくてもよい。Ａ、Ｔ、またはＵ残基の代わりに、他の天然ヌクレオチド残基と比べてＴ／ＵまたはＡ残基と優先的に塩基対形成する非天然ヌクレオチド残基を用いることは可能である。同様に、ＣＧＧ、ＣＣＧ、ＧＣＧ、ＣＧＣ、ＧＣＣ、またはＧＧＣリピートを構成する１個または複数のＧおよび／またはＣ残基の代わりに、他の天然ヌクレオチド残基と比べてＣまたはＧ残基と優先的に塩基対形成する１個または複数の非天然ヌクレオチド残基を用いることも可能である。さもなければＣＧＧ、ＣＣＧ、ＧＣＧ、ＣＧＣ、ＧＣＣ、またはＧＧＣリピートを構成する配列（適宜、Ａ、Ｔ、Ｕ残基、または上記で論じられているような対応する非天然残基と共に）内の１個または複数のそのような非天然ヌクレオチド残基の存在は、ＣＧＧ、ＣＣＧ、ＧＣＧ、ＣＧＣ、ＧＣＣ、またはＧＧＣリピートの配列としての本開示の脈絡内での前記配列のアイデンティティを無効にすることはない。非天然ヌクレオチド残基は、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、およびウラシル（それぞれ、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、およびＵ）以外の核酸塩基を含むヌクレオチド残基である。ＡまたはＴ／Ｕ残基と優先的に塩基対形成する非天然ヌクレオチド残基の例には、非限定的に、他の天然残基と比べてＡまたはＴ／Ｕ残基と優先的に塩基対形成するＴ、Ｕ、またはＡ残基の付加体（例えば、５−置換ウラシル類似体）、ならびに、例えば、プソイドウラシルおよびジアミノプリンなどの核酸塩基を含む残基が挙げられる。
【００５３】
いくつかの実施形態において、Ｃ９ＯＲＦ７２パラメータ情報は、リピート領域の外側にアニールするプライマー、およびリピート配列、並べ換え配列、またはその配列の逆相補体にアニールするプライマーを用いて作成することができる。リピート領域の外側（上流または下流）にアニールすることができるプライマーは、必要に応じてフォワードプライマーまたはリバースプライマーであり得る。これらの配列は、リピート領域を挟む配列にアニールし得る。フォワードプライマーの例には、ＴＧＣ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＧＣＧ  ＧＧＣ  ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＧＣＡ  ＡＣＣ  ＧＣＡ（配列番号４６）が挙げられる。リバースプライマーの例には、ＣＧＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＴＡＧ  ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＡＧＧ  ＡＧＴ  ＣＧ（配列番号４７）、ＴＧＣ  ＧＣＣ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＧＣＧ  ＧＧＣ  ＧＣＡ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＧＣＡ  ＡＣＣ  ＧＣＡ  ＣＣＣ  ＣＧＧ  ＣＣＣ  ＣＧＧ  ＣＣＣ  ＣＧＧ（配列番号４８）、ＣＧＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＴＡＧ  ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＡＧＧ  ＡＧＴ  ＣＧＣ  ＣＧＧ  ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＧＧＣ  ＣＧＧ  ＧＧ（配列番号４９）が挙げられる。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ＴＯＭＭ４０パラメータ情報は、リピート領域の外側にアニールするプライマー、およびリピート配列、並べ換え配列、またはその配列の逆相補体にアニールするプライマーを用いて作成することができる。リピート領域の外側（上流または下流）にアニールすることができるプライマーは、フォワードプライマーまたはリバースプライマーであり得る。これらの配列は、リピート領域を挟む配列にアニールし得る。フォワードプライマーの例には、ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＣＡＴ  ＴＧＧ  ＧＡＴ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  Ｃ（配列番号５０）が挙げられる。リバースプライマーの例には、ＧＡＴ  ＴＧＣ  ＴＴＧ  ＡＧＣ  ＣＴＡ  ＧＧＣ  ＡＴＴ  Ｃ（配列番号５１）が挙げられる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、第１のプライマーは、増幅産物のラダーを作製する場合に用いられ、割り込みエレメントを含まないリピートまたはＧＣリッチな領域における部位に対する優先的な結合活性を有する。割り込みエレメントの存在は、この方法の結果において、合成が割り込みエレメントを含む部位と結合した第１のプライマーの延長を含んだであろう、相対的に低レベルの産物により、シグナルを発生し得る。これらの低レベルは、電気泳動図において、より高いピークにより囲まれた、ギャップまたは低いピークのセットとして現れ得る。いくつかの実施形態において、割り込みエレメントを含むリピートまたはＧＣリッチな領域における部位に対する優先的な結合活性を有する第１のプライマーが提供される。割り込みエレメントの存在は、アンカード（ａｎｃｈｏｒｅｄ）アッセイにおいて、合成が割り込みエレメントを含む部位と結合した第１のプライマーの延長を含んだ、相対的に高レベルの産物により、シグナルを発生する。その高レベルは、電気泳動図において、より低いピークおよび／またはベースラインシグナルにより囲まれたスパイクとして現れ得る。
【００５６】
パラメータ情報を作成する方法は、少なくとも２つまたは少なくとも３つの異なるプライマーを提供することを含む増幅反応に関わり得る。いくつかの実施形態において、少なくとも３つの異なるプライマーが提供され、そのプライマーの１つが、リピートまたはＧＣリッチな領域の外側で優先的に結合するプライマーであり、第２のプライマーは、リピートまたはＧＣリッチな領域内で優先的に結合し、第３のプライマーは、第１のプライマーまたは第２のプライマーのいずれかの部分列である。いくつかの実施形態において、１つのプライマーは、ＣＧＧリピートおよび５’フラップ配列を含むキメラプライマーであり、別のプライマーは、そのキメラプライマーの５’フラップ配列の配列を有する。キメラプライマーの５’フラップ配列の配列を有するプライマーは、キメラプライマーの非リピート配列全体を有し得るが、必ずしもそうとは限らないことは留意されるべきである。言い換えれば、１つのプライマーの一部または全部の配列が、別のプライマーの配列により含まれ得、例えば、キメラプライマーは５’フラップ配列を含み、別のプライマーは、５’フラップの一部または全部の配列を含み得る。いくつかの実施形態において、プライマーは、ＣＧＧリピート配列の１２〜１５ヌクレオチドを含有する。５’フラップ配列は、ＣＧＧリピート領域に隣接した、もしくはその近くの配列に対応し得、またはそれは、ＣＧＧリピート領域内とその周辺の配列とは無関係であり得る。いくつかの実施形態において、キメラプライマーの長さは、およそ３５、４０、４５、５０、または５５ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態において、プライマーの１つまたは複数は、６０℃から７５℃までの範囲、例えば、およそ６０℃、６５℃、７０℃、または７５℃の融解温度を有する。
【００５７】
いくつかの実施形態において、少なくとも３つの異なるプライマーが提供され、１つのプライマーが、別のプライマーの濃度より低い濃度で提供される。例えば、キメラプライマーは適宜、キメラプライマーの５’フラップ配列の配列を有するプライマーより低い濃度で提供される。倍数の差として表される濃度の比は、２から１０，０００までの範囲、またはそれ以上、例えば、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、または１０，０００（またはその間の任意の値）であり得る。そのような実施形態において、より低い濃度で存在するプライマーは、増幅反応の初期ラウンドで枯渇し得、その結果、延長は、一般的に、完全に、またはほとんど完全に、まだ存在するプライマー（最初、相対的により高い濃度で存在していた）からである。
【００５８】
いくつかの実施形態において、パラメータ情報を作成する方法は、１より高いＧＣ／ＡＴ比で、かつリピートまたはＧＣリッチな鋳型を含むＤＮＡの合成を誘導する総ｄＮＴＰ濃度で、ｄＮＴＰを提供することを含む。米国特許出願公開第２０１０−０２０９９７０号を参照。ＧＣ／ＡＴ比は、約１．１、１．２、１．４、１．６、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、またはそれより高くあり得る。ＧＣ／ＡＴ比は、１．１から２０の間、１．１から１５の間、１．１から１０の間、１．１から８の間、１から１５の間、１．１から７の間、１．１から６の間、１．１から５の間、１．２から２５の間、１．４から２５の間、１．６から２５の間、２から２５の間、３から２５の間、４から２５の間、５から２５の間、２から１５の間、２．５から１０の間、または４から１０の間であり得る。総ｄＮＴＰ濃度は、約０．４ｍＭ、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、または３ｍＭであり得る。ｄＮＴＰ濃度は、０．４ｍＭから３ｍＭの間、０．５ｍＭから３ｍＭの間、０．６ｍＭから３ｍＭの間、０．７ｍＭから３ｍＭの間、０．８ｍＭから３ｍＭの間、０．９ｍＭから３ｍＭの間、１ｍＭから３ｍＭの間、０．４ｍＭから２ｍＭの間、０．４ｍＭから１．５ｍＭの間、０．４ｍＭから１．２ｍＭの間、０．４ｍＭから１ｍＭの間、０．４ｍＭから０．９ｍＭの間、０．４ｍＭから０．８ｍＭの間、０．４ｍＭから０．７ｍＭの間、０．５ｍＭから２ｍＭの間、０．５ｍＭから１ｍＭの間、または０．６ｍＭから０．９ｍＭの間であり得る。「ＧＣ／ＡＴ比」とは、所定の溶液または混合物における、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびそれらの全てのヌクレオチド類似体の合計の濃度の、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、およびそれらの全てのヌクレオチド類似体の合計の濃度に対する比を意味する。「ｄＮＴＰ」は、デオキシヌクレオチド三リン酸を表し、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、およびそれらの類似体を指す。「ヌクレオチド類似体」は、天然の塩基アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、またはウラシル（Ｕ）以外の塩基部分、デオキシリボースと同一または類似した糖部分、および少なくとも１個のリン酸または複数のリン酸（二リン酸または三リン酸）部分を含む分子またはイオンである。ヌクレオチド類似体は、ｄＴＴＰの類似体が一般的にｄＵＴＰの類似体でもあり、その逆もまた同様であることを別として、それが、三リン酸および糖部分（その両方の構造と立体配置がポリメラーゼによる核酸二重らせんへの取り込みに適している）、ならびに塩基（それの、核酸二重らせんにおける塩基対形成性および核酸二重らせんにおけるＤＮＡポリメラーゼにより取り込みの座位が、前に列挙された５個のヌクレオチドの１個と最も類似している）を含む場合、特定のヌクレオチド、特にｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、またはｄＵＴＰの類似体である。非限定的に「ヌクレオシド」、「塩基」、「核酸塩基」、または「残基」を含む用語と共に用いられる用語「類似体」は、あたかもそれが「ヌクレオチド」と共に用いられたかのように、同じように解釈されるべきである。
【００５９】
いくつかの実施形態において、パラメータ情報を作成する方法は、ＰＣＲ増幅反応についてのバッファーを提供することをさらに含み得る。バッファーは、例として、かつ非限定的に、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ビストリスプロパン、重炭酸塩、リン酸塩、グリシン、ヒスチジン、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ならびにそれらの様々なコンジュゲート塩基／酸および塩を含み得る。
【００６０】
いくつかの実施形態において、パラメータ情報を作成する方法は、鋳型依存性様式でｄＮＴＰからＤＮＡを合成する少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼを提供することを含み得る。ＤＮＡポリメラーゼは、野生型、改変型、好熱性、キメラ、遺伝子組換え型、および／または２つ以上のポリメラーゼの混合物を含み得る。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅｘａｃｔ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（５  ＰＲＩＭＥ  ＧｍｂＨ）、ＡｃｃｕＳｕｒｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）Ｐｆｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ高フィデリティ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｈｉｒｅ（商標）ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ホットスタート高フィデリティＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）ＲＥＤＴａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰｆｕＴｕｒｂｏ（登録商標）ＣｘホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（商標）ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）、Ｅｘｔｅｎｓｏｒ  Ｈｉ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ酵素（ＡＢｇｅｎｅ）、ＡＣＣＵＺＹＭＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、ＳＡＨＡＲＡ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、ＶＥＬＯＣＩＴＹ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、ＧｅｎｅＣｈｏｉｃｅ（登録商標）ＡｃｃｕＰＯＬ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＧｅｎｅＣｈｏｉｃｅ，Ｉｎｃ．）、ＧｅｎｅＣｈｏｉｃｅ（登録商標）ＵｎｉＰＯＬ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＧｅｎｅＣｈｏｉｃｅ，  Ｉｎｃ．）、エロンガーゼ酵素ミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｆｘ５０（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＫＯＤ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ＫＯＤ  ＸＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、Ｅｘｐａｎｄ  ２０ｋｂ  ＰＬＵＳ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｅｘｐａｎｄ高フィデリティＰＬＵＳ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｅｘｐａｎｄ高フィデリティ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｅｘｐａｎｄ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｅａｓｙ−Ａ（商標）高フィデリティＰＣＲクローニング酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＸＬ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）増強型ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｋａｐａ  ＬｏｎｇＲａｎｇｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅ���ｓ）、Ｋａｐａ  ＨｉＦｉ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｋａｐａ２Ｇ（商標）ロバストＤＮＡポリメラーゼ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｋａｐａ２Ｇ（商標）ロバストホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｋａｐａ２Ｇ（商標）Ｆａｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｋａｐａ２Ｇ（商標）ＦａｓｔホットスタートＤＮＡポリメラーゼ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＬＡ  ＴＡＱ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）、Ｏｐｔｉｍａｓｅ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ、Ｉｎｃ．）、Ｅｘｏ−Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＨｏｔＭａｓｔｅｒ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５  ＰＲＩＭＥ  ＧｍｂＨ）、ＨｏｔＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｂｎｏｖａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼＬｇ  Ｆｒａｇ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＭａｓｔｅｒＡｍｐ（商標）Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｒｅｄ  Ｈｏｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＡＢｇｅｎｅ）、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｉｍｅ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＡＢｇｅｎｅ）、Ｔａｑ−ｒｅｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ  ＧｍｂＨ）、ＢＩＯ−Ｘ−ＡＣＴ（商標）Ｌｏｎｇ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、ＢＩＯ−Ｘ−ＡＣＴ（商標）Ｓｈｏｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、Ｂｉｏｌｉｎｅ  ＨｙｂｒｉＰｏｌ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）、ＢｉｏＴｈｅｒｍ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ｅＥｎｚｙｍｅ  ＬＬＣ）、ＥＵ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ｅＥｎｚｙｍｅ  ＬＬＣ）、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ｅＥｎｚｙｍｅ  ＬＬＣ）、ＧｅｎｅＣｈｏｉｃｅ（登録商標）ＲｅｄＰＯＬ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（ＧｅｎｅＣｈｏｉｃｅ，  Ｉｎｃ．）、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（商標）ＧＣ−Ｒｉｃｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）３１７３  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｅｘｏ  Ｍｉｎｕｓ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）、９  Ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｎｏｒｔｈ（改変型）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｐｗｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｐａｑ５０００（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＹｉｅｌｄＡｃｅ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｅ２ＴＡＫ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ株式会社）、またはＰ．コダカラエンシス（Ｐ．  ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）、Ｐ．フリオサス（Ｐ．  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、Ｔ．ゴルゴナリウス（Ｔ．  ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）、Ｔ．ジリジイ（Ｔ．  ｚｉｌｌｉｇｉｉ）、Ｔ．リトラリス（Ｔ．  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）「Ｖｅｎｔ（商標）」、Ｐ．ＧＢ−Ｄ「Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ」、Ｔ．９Ｎ−７、���．アグレガンス（Ｔ．  ａｇｇｒｅｇａｎｓ）、Ｔ．バロシイ（Ｔ．  ｂａｒｏｓｓｉｉ）、Ｔ．フミコーランス（Ｔ．  ｆｕｍｉｃｏｌａｎｓ）、Ｔ．セラー（Ｔ．  ｃｅｌｅｒ）、パイロコッカス種（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＳＴ７００株、Ｔ．パシフィカス（Ｔ．  ｐａｃｉｆｉｃｕｓ）、Ｐ．アビシー（Ｐ．  ａｂｙｓｉｉ）、Ｔ．プロファンダス（Ｔ．  ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ）、Ｔ．サイクリ（Ｔ．  ｓｉｃｕｌｉ）、Ｔ．ヒドロサーマリス（Ｔ．  ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓ）、サーモコッカス種（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）ＧＥ８株、Ｔ．チオレデュセンス（Ｔ．  ｔｈｉｏｒｅｄｕｃｅｎｓ）、Ｐ．ホリコシイ（Ｐ．  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）もしくはＴ．オンヌリネウス（Ｔ．  ｏｎｎｕｒｉｎｅｕｓ）ＮＡ１、サーモコッカス種９°Ｎ−７、サーモコッカス種ＧＩ−Ｊ、サーモコッカス種ＭＡＲ−１３、サーモコッカス種ＧＢ−Ｃ、サーモコッカス種ＧＩ−Ｈ、サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・カルドフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、もしくはバチルス・カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）由来の天然に存在するＤＮＡポリメラーゼを含み得る。
【００６１】
いくつかの実施形態において、プライマーの少なくとも１つは、放射線学的または電磁気的に検出可能な部分を含む。放射線学的に検出可能な部分には、ベータまたはガンマ粒子などの検出可能な粒子を放射する放射性同位元素、例えば、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、および１２５Ｉが挙げられる。電磁気的に検出可能な部分には、検出可能な様式で電磁放射と相互作用する（光吸収、発光、または両方を含む）化学的実体、例えば、発色団およびフルオロフォア、例えば、フルオレセイン、ＦＡＭ、シアニン色素、ローダミン色素などが挙げられる。例示的なフルオロフォアには、ＦＡＭ（商標）（フルオレセイン）、ＨＥＸ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＪＯＥ（商標）、ＶＩＣ（登録商標）、ＮＥＤ（商標）、ＰＥＴ（登録商標）、ＲＯＸ（商標）、ＴＡＭＲＡ（商標）、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）が挙げられる。
【００６２】
別の例において、ＴＯＭＭ４０またはその断片のＡ／Ｔリッチセグメント座を特徴づけるためのリピート領域サイズ分類およびジェノタイプ再構築は、参照により組み入れられている、米国仮特許出願第６２／１９６，２３９号に記載された、プライマー、ポリメラーゼ、試薬、および反応条件を含む方法を用いて作製され得る。
【００６３】
ＩＩ．増幅産物のラダー
様々な実施形態において、目的の核酸（またはリピート領域を含むその核酸の部分）の増幅から生成された増幅産物（本明細書において増幅断片とも呼ばれる）は、電気泳動、好ましくはキャピラリー電気泳動に供され、リピート領域のサイズは、電気泳動により生じた増幅産物のラダーを用いて決定される。いくつかの実施形態において、増幅産物のラダーは、それ自体、リピート領域の長さを決定するための内部標準として用いられる。内部標準は、例えば、内部サイズ分類ラダー較正を用いて、増幅産物のラダーから計算され得る。他の実施形態において、増幅産物のラダーは、核酸のサイズを決定するための内部標準として、かつ外部標準と組み合わせて、用いられる。ある特定の実施形態において、外部標準は、外部サイズ分類ラダー較正を用いて計算され得る。追加の実施形態において、内部サイズ分類ラダー較正（増幅産物のラダー）は、外部サイズ分類ラダー較正（外部標準）と組み合わせて用いられ得る。下記で詳細に記載されているように、内部標準の適合度、外部標準の適合度、および内部標準と外部標準との間の一貫性はまた、試料品質管理に用いられ得る。
【００６４】
本明細書に提供された方法において、増幅産物のラダーは、リピート領域を含む核酸の領域を増幅し、かつキャピラリー電気泳動などの高分解能断片分析方法を実施することにより、得ることができる。いくつかの実施形態において、電気泳動（例えば、キャピラリー電気泳動）は、たった１個のリピート単位だけ異なる増幅産物を識別することができる（例えば、ＣＧＧリピート領域において、たった３ヌクレオチドだけ異なる増幅産物を識別することができる）。いくつかの実施形態において、リピート単位は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチド長、またはそれ以上である。いくつかの実施形態において、リピート単位は、２ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、リピート単位は、３ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、リピート単位は、６ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、電気泳動は、３ヌクレオチドまたはそれ未満の増幅産物を識別することができる。いくつかの実施形態において、電気泳動は、１ｂｐの増幅産物を識別することができる。いくつかの実施形態において、リピート領域は、ホモポリマーセグメントであり、電気泳動は、１ヌクレオチド長異なる増幅産物を識別する。
【００６５】
様々な実施形態において、リピートプロファイルは、電気泳動により生じた増幅産物のラダーから作成される。いくつかの実施形態において、リピートプロファイルは、サイズ分類すること、例えば、リピート領域、または患者試料において評価されている核酸における目的の任意の他の領域をサイズ分類することに用いられる。一部の場合では、リピートプロファイルは、リピートシグナルの始まりを検出することを含む。さらに他の実施形態において、リピートプロファイルは、電気泳動図における開始の長さを含む。追加の実施形態において、リピートプロファイルはリピート数を含む。
【００６６】
様々な実施形態において、リピートピーク同定についてのアルゴリズムは、いくつかの段階で働く。ある特定の実施形態において、リピートシグナルの始まりは、まず、機器のサンプリング周波数に基づいてリピートシグナルが開始するウィンドウについての情報を用いて、検出される。他の実施形態において、その後、分位に基づいた分析を用いて、リピートシグナルが開始し、そして終了する範囲が決定される。いくつかの実施形態において、周波数に基づいた分析を用いて、サンプリング単位におけるリピート周期性が決定される。ある特定の実施形態において、リピート周期性を用いて、リピートピークがコールされるであろうウィンドウサイズが通知される。他の実施形態において、分位に基づいたアプローチを用いて、リピートピークがコールされるべきである閾値が導かれる。いくつかの実施形態において、スライドウィンドウが、単一のリピートピークをコールするために用いられ、各ウィンドウについてのそのコールされたピークが、その範囲内で最大の大きさをもつマイナスの二階微分係数を有すると定義される。ある特定の実施形態において、リピート周期性を用いて、リピートピークがコールされるであろうウィンドウサイズが通知される場合、ピークが見出されず、またはシグナルが閾値を下回るならば、ウィンドウの中心におけるリピートピークの位置が外挿され得る。ある特定の実施形態において、ピークがコールされる時、サンプリング単位でのリピートピーク間の差に基づいたウィンドウのサイズが調整され得る。
【００６７】
様々な実施形態において、リピートピーク同定のためのアルゴリズムは、第１に、機器のサンプリング周波数に基づいてリピートシグナルが開始するウィンドウについての情報を用いて、リピートシグナルの始まりを検出することにより、働く。ある特定の実施形態において、ピーク同定のためのアルゴリズムは、第１に、機器のサンプリング周波数に基づいてリピートシグナルが開始するウィンドウについての情報を用いてリピートシグナルの始まりを検出し、第２に、分位に基づいた分析を用いて、リピートシグナルが開始し、そして停止する範囲を決定することにより、働く。他の実施形態において、ピーク同定のためのアルゴリズムは、第１に、リピートシグナルが機器のサンプリング周波数に基づいて開始するウィンドウについての情報を用いてリピートシグナルの始まりを検出し、第２に、分位に基づいた分析を用いて、リピートシグナルが開始し、そして停止する範囲を決定し、第３に、周波数に基づいた分析を用いて、サンプリング単位でのリピート周期性を決定することにより、働く。いくつかの実施形態において、ピーク同定のためのアルゴリズムは、第１に、機器のサンプリング周波数に基づいてリピートシグナルが開始するウィンドウについての情報を用いてリピートシグナルの始まりを検出し、第２に、分位に基づいた分析を用いて、リピートシグナルが開始し、そして停止する範囲を決定し、第３に、周波数に基づいた分析を用いて、サンプリング単位でのリピート周期性を決定し、第４に、リピート周期性を用いて、リピートピークがコールされるであろうウィンドウサイズを通知することにより、働く。ある特定の実施形態において、ピーク同定のためのアルゴリズムは、第１に、機器のサンプリング周波数に基づいてリピートシグナルが開始するウィンドウについての情報を用いてリピートシグナルの始まりを検出し、第２に、分位に基づいた分析を用いて、リピートシグナルが開始し、そして停止する範囲を決定し、第３に、周波数に基づいた分析を用いて、サンプリング単位でのリピート周期性を決定し、第４に、リピート周期性を用いて、リピートピークがコールされるであろうウィンドウサイズを通知し、第５に、分位に基づいたアプローチを用いて、リピートピークがコールされるであろう閾値を導くことにより、働く。ある特定の実施形態において、ピーク同定のためのアルゴリズムは、第１に、機器のサンプリング周波数に基づいてリピートシグナルが開始するウィンドウについての情報を用いてリピートシグナルの始まりを検出し、第２に、分位に基づいた分析を用いて、リピートシグナルが開始し、そして停止する範囲を決定し、第３に、周波数に基づいた分析を用いて、サンプリング単位でのリピート周期性を決定し、第４に、リピート周期性を用いて、リピートピークがコールされるであろうウィンドウサイズを通知し、第５に、分位に基づいたアプローチを用いて、リピートピークがコールされるであろう閾値を導き、第６に、スライドウィンドウを用いて、各ウィンドウについてのコールされるピークが、その範囲内で最大の大きさをもつマイナスの二階微分係数を有するとして定義される単一のリピートピークをコールすることにより、働く。いくつかの実施形態において、ピークが見出されず、またはシグナルが、第４段階において決定された閾値を下回るならば、ウィンドウの中心としてのリピートピークの位置が外挿され得る。他の実施形態において、ピークがコールされる時、サンプリング単位でのリピートピーク間の差に基づいたウィンドウのサイズが調整され得る。
【００６８】
ある特定の実施形態において、リピートエレメント周期性が決定される。他の実施形態において、リピートエレメントサイズが、フーリエ変換分析などの周波数に基づいた分析を用いて決定される。いくつかの実施形態において、方法は、機器サンプリングドメインから塩基対リピートドメインへ変換することを含む。他の実施形態において、その情報は、増幅産物のラダーにおいて各増幅産物のサイズを決定するために用いられる。いくつかの実施形態において、ラダーにおけるリピートエレメントのヌクレオチド長を決定することから導かれる情報は、リピート領域のサイズを決定するための較正曲線を作成するために用いられる。より具体的な実施形態において、リピート領域キャピラリー電気泳動は、リピート領域をサイズ分類するために増幅産物のラダーに対して正規化される。ある特定の実施形態において、リピートプロファイル全体が、較正曲線を作成するために用いられる。他の実施形態において、ピークは、例えば、ピーク高さおよび／またはピーク形状に基づいて、較正曲線用に選択される。さらに他の実施形態において、ピークは、リピートプロファイル周期性の一貫性の品質に基づいて選択される。追加の実施形態において、リピートプロファイル周期性の一貫性は、例えば、エントロピーフィルタまたは周波数フィルタとして、リピートピーク位置シグナルの変換バージョンに閾値を適用することにより、決定される。
【００６９】
ある特定の実施形態において、アノテーティングデバイス１３０は、リピートプロファイル全体を用いて、サイズ分類標準を作成するように構成され得る。様々な実施形態において、アノテーティングデバイス１３０は、ピーク特性に基づいてサイズ分類標準を作成するためにピークを選択し得る。ピーク特性は、ピーク高さおよび／またはピーク形状であり得る。様々な実施形態において、アノテーティングデバイス１３０は、リピートプロファイル周期性の一貫性などのリピートプロファイル周期性特徴に基づいてサイズ分類標準を作成するためにピークを選択し得る。例えば、リピートプロファイル周期性の一貫性は、アノテーティングデバイス１３０により、ピーク間の差におけるエントロピーフィルタとして、または周波数フィルタとしてのいずれかで、リピートピーク位置シグナルの変換バージョンに閾値を適用することにより決定され得る。
【００７０】
ある特定の実施形態において、リピートエレメント周期性は、リピート性モチーフまたはリピート性配列の周波数を反映し、例えば、リピートエレメント周期性は、ＦＭＲ１遺伝子座についての３塩基対である。リピートエレメント周期性は、遺伝子座におけるリピート長に依存して１、２、３、４、５、もしくは６、またはそれ以上であり得る。ある特定の実施形態において、第１の増幅産物は、ラダー内の増幅産物のセットにおける最短の増幅産物の長さである。ある特定の実施形態において、増幅産物カウント数は、異なる長さの産物の数である。ある特定の実施形態において、増幅数のカウントは、期待される周期性に従って訂正することができる。ある特定の実施形態において、各鋳型についての一定のエレメント長は、プライマーおよび鋳型により決定される固定化断片である。
【００７１】
さらなる実施形態において、方法は、シグナルアーチファクトについて補正することを含む。そのようなシグナルアーチファクトには、混入ピーク、欠測ピーク、気泡、閃光シグナル（ｆｌａｒｅ  ｕｐ  ｓｉｇｎａｌ）、または他の蛍光チャネルからのシグナルの漏出を挙げることができる。
【００７２】
リピート領域のサイズ分類が、様々な実施形態において、サイズ分類のために、外部標準の代わりの増幅産物のラダーの使用を含むことを、当業者は容易に認識するだろう。
【００７３】
様々な実施形態において、追加のパラメータ情報は、リピート領域における任意の割り込み配列への順方向および逆方向での距離など、電気泳動の電気泳動図から得られる。いくつかの実施形態において、追加のパラメータ情報と組み合わされたリピート領域サイズは、ジェノタイプを再構築するために用いられる。いくつかの実施形態において、パラメータ情報の一部を満たす全ての可能なジェノタイプを評価して、全てのパラメータ情報を満たす解答ジェノタイプを同定する機械可読媒体を実行する装置上で再構築が行われる。いくつかの実施形態において、このジェノタイプの自動再構築のための装置、方法、および機械可読媒体は、全体として参照により組み入れられている、国際公開特許番号ＷＯ／第２０１４／０１５２７３に記載されたものである。
【００７４】
ＩＩＩ．自動サイズ分類分析
様々な実施形態において、リピート領域の自動サイズ分類のための方法が提供される。いくつかの実施形態において、リピート領域の自動サイズ分類は、まず、試料においてリピートプライマーピークおよび遺伝子特異的プライマーピークを同定および定義する。ある特定の実施形態において、局所的ウィンドウにおけるピーク形状、ピーク規模、またはピーク間の距離が考慮される。他の実施形態において、標準曲線は、リピートプライマーピークの少なくとも３つを用いて作成され得る。より具体的な実施形態において、標準曲線は、リピートプライマーピークの全部を用いて作成され得る。ある特定の実施形態において、標準曲線は、全てのリピートプライマーピークを用いて、１セットの変数についての値を決定することにより、作成される。いくつかの実施形態において、変数には、例えば、リピートエレメントサイズ、最初のピークに先行する塩基対、リピートエレメントサイズを掛けた、リピートプライマーにおけるリピートエレメントの数マイナス１、ピークカウント数、および相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）プライミングに用いられる一定のエレメント長が挙げられ得るが、それらに限定されない。ある特定の実施形態において、標準曲線は、以下の変数についての値を決定することにより作成される：−  Ｚ＝リピートエレメントサイズ（ｂｐ）、−  Ｘ＝最初のピークに先行する塩基対（Ｘ＝［ＲＰプライマーにおけるリピートエレメントの数−１］＊Ｚ）、−  Ｎ＝ピークカウント数（１からＮまでの合計ピーク）、およびＡｎｃ＝相補的プライミングに用いられる一定のエレメント長（ｂｐで）。より具体的な実施形態において、標準曲線は、３０のＣＧＧリピートの正常な男性を用いて作成される。いくつかの実施形態において、３０のＣＧＧリピートの男性を用いて、以下の変数が計算される：−  Ｚ＝リピートエレメントサイズ（ｂｐで）（ＡｍｐｌｉｄｅＸ  ＦＭＲ１について：３ｂｐリピート）、−  Ｘ＝最初のピークに先行する塩基対、Ｘ＝［ＲＰプライマーにおけるリピートエレメントの数−１］（ＡｍｐｌｉｄｅＸ  ＦＭＲ１について：Ｘ＝［５×ＣＧＧ−１］＊３＝１２ｂｐ）、−  Ｎ＝ピークカウント数（１からＮまでの合計ピーク）（３０ＣＧＧの正常なＦＸＳ男性試料における最後のピークについて、Ｎ＝２６（２６個のスタッターピークが存在する））、−  Ａｎｃ＝相補的プライミングに用いられる一定のエレメント長（ｂｐで）（ＡｍｐｌｉｄｅＸ  ＦＭＲ１例について、一定のエレメント長は１２７ｂｐである）。いくつかの実施形態において、標準曲線がいったん作成されたならば、自動化過程は、スタッターパターンにおける各ｎピークの正確なサイズを計算する：例えば、Ｎピークについてのサイズ（ｂｐ）＝［Ｘ＋ＺＮ＋Ａｎｃ］。ある特定の実施形態において、自動化過程は、ギャップ（ｂｐで）＋Ｘを全体のサイズに外挿することにより、リピートプロファイルへの配列割り込みを無効にする。例えば、ＦＭＲ１およびＡＧＧ割り込み配列について：＝３ｂｐ＋１２ｂｐ＝１５ｂｐ。ある特定の実施形態において、自動化過程は、計算されたサイズ（上記のような）に対して、ピーク（またはそれらのタイムスタンプ）についての観察されたＣＥサイズを��ロットすることにより、リピートプライマーピークから較正曲線を作成し、遺伝子特異的サイズ計算のために、その導かれた線形回帰関数を用いた。
【００７５】
ある特定の実施形態において、サイズ分類標準は、リピートプロファイル内の断片についてのサイズを示すために用いられ得る。他の実施形態において、サイズ分類曲線は、外挿により、リピート領域の外側の断片のサイズを示すために用いられ得る。
【００７６】
ある特定の実施形態において、リピートプライミング化ＰＣＲ（Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｉｍｅｄ−ＰＣＲ）（ＲＰ−ＰＣＲ）が、リピート領域アセスメントに用いられ得る。ＲＰ−ＰＣＲは、縮重プライマーを用いて、ジェノタイプに一致した複数のリピート断片を作製し得る。ＲＰ−ＰＣＲを用いるいくつかの実施形態は、リピートアセスメントのための方法として、サイズ分類を回避して、スタッターピークの直接的カウントを用いる。この直接的カウントは、式：ｒ（リピート領域カウント数）ａ＝Ｎ＋Ｘ／Ｚを使用し得る。例えば、ＦＭＲ１について、２６＋１２／３＝３０ＣＧＧ。
【００７７】
様々な実施形態において、方法は、サイズ分類分析を行うようにプログラミングされたプロセッサを含む装置（例えば、コンピュータ）を用いて行うことができる。いくつかの実施形態において、プロセッサは、核酸に関する情報（パラメータ情報）を受け取り、その後、その核酸について解答ジェノタイプを再構築するようにプログラミングされる。いくつかの実施形態において、パラメータ情報は、リピート領域サイズ情報である。いくつかの実施形態において、パラメータ情報は、リピート領域における任意の割り込み配列への順方向および逆方向での距離をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、リピート領域サイズ、および適宜、任意の割り込み配列への順方向および逆方向での距離が、ジェノタイプの自動再構築のために装置により用いられる。いくつかの実施形態において、装置はまた、インプット情報および／または解答ジェノタイプを表示するためのモニターを含む。いくつかの実施形態において、解答ジェノタイプは、装置に電子的に記憶され、および／またはさらなる診断的もしくは治療的使用のために印刷することができる。
【００７８】
下記の実施例においてより詳細に記載されているように、方法は、いくつかの実施形態において、ＦＭＲ１遺伝子においてＣＧＧリピート領域のジェノタイプをサイズ分類するために用いることができる。ＦＭＲ１の５’ＵＴＲは、１つまたは複数のＣＧＧリピート領域を含み得、そのリピート領域のそれぞれが、その領域内に１個または複数のＡＧＧ割り込み配列を含有し得る。２個以上のＡＧＧ割り込み配列が存在する場合、これらは、一般的に、連続して存在しない（すなわち、（ＡＧＧ）ｎ（ｎは２以上である）を含むＣＧＧリピート領域を見出すことはまれである）。
【００７９】
ＩＶ．試料
目的の核酸を含有する様々な試料が、リピート領域または核酸をサイズ分類する、開示された方法において用いることができる。様々な実施形態において、試料は、ヒトまたは非ヒト動物から得られる。例えば、試料は、患者試料であり得る。「患者試料」は、患者由来の任意の生物学的検体である。試料という用語には、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、涙、唾液、リンパ液、透析液、洗浄液、精液、および／または他の液体試料などの
生体液、ならびに生物学的起源の細胞および組織を含むが、それらに限定されない。細胞および組織には、口腔細胞、口内洗浄収集物、または毛包を含む皮膚細胞が挙げられ得る。その用語はまた、ヒトから単離された細胞、または培養細胞、細胞上清、および細胞可溶化物を含む、それら由来の細胞を含む。それはさらに、器官または組織の培養から引き出された液体、組織生検試料、腫瘍生検試料、糞便試料、および生理学的組織から抽出された液体、ならびに固形組織、組織切片、および細胞可溶化物から分離された細胞を含む。それはまた、脳由来のものなど、死後固形組織試料も含み得る。試料という用語はまた、目的の核酸を含む、ヒトまたは非ヒト動物から得られる任意の他の細胞または非細胞の検体を含む。いくつかの実施形態において、試料は、少なくとも約８０ｎｇ未満、１００ｎｇ未満、１５０ｎｇ未満、２００ｎｇ未満、５００ｎｇ未満、１，０００ｎｇ未満、１，５００ｎｇ未満、２，０００ｎｇ未満、２，５００ｎｇ未満、３，０００ｎｇ未満、４，０００ｎｇ未満、または５，０００ｎｇ未満の、目的の核酸を含有する。
【００８０】
場合によっては、試料は、１つまたは複数の目的の核酸を含む。目的の核酸は、ゲノムＤＮＡであり得る。目的のゲノムＤＮＡまたは他の核酸は、本発明の方法に供される前に、試料の他のＤＮＡおよび非ＤＮＡ成分から分離され得る。ＤＮＡ精製および分離の多くの方法が当技術分野で知られており、開示された方法と共に用いられ得る。いくつかの実施形態において、目的の核酸は、インビトロで合成された核酸を含み得る。インビトロでの核酸合成の例には、ＰＣＲなどの増幅反応、インビトロでの転写、インビトロでの逆転写、インビトロでのプライマー延長、シーケンシング反応、ホスホラミダイトに基づいた核酸合成、およびそれらの組合せが挙げられる。
【００８１】
いくつかの実施形態において、試料中の目的の核酸は、リピート領域、例えば、１つまたは複数のリピート性ＧＣリッチセグメントを含み得る。ある特定の実施形態において、試料中の目的の核酸は、ＦＭＲ１および／もしくはＦＭＲ２遺伝子、もしくはその断片、またはＦＭＲ１および／もしくはＦＭＲ２の５’ＵＴＲの少なくとも部分（例えば、ＦＭＲ１の５’ＵＴＲのＣＧＧリピートまたはＦＭＲ２の５’ＵＴＲにおけるＣＣＧリピートを含む部分）を含み得る。ある特定の実施形態において、核酸のサイズは、約５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、５００ｂｐ、もしくは７００ｂｐ、または１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７ｋｂ、もしくは１０ｋｂ、またはその間の任意の値であり得る。いくつかの実施形態において、核酸のサイズは、５０ｂｐから１０ｋｂの間、１００ｂｐから１０ｋｂの間、２００ｂｐから１０ｋｂの間、３００ｂｐから１０ｋｂの間、５００ｂｐから１０ｋｂの間、７００ｂｐから１０ｋｂの間、１ｋｂから１０ｋｂの間、１．５ｂｐから１０ｋｂの間、２ｂｐから１０ｋｂの間、３ｂｐから１０ｋｂの間、５０ｂｐから７ｋｂの間、５０ｂｐから５ｋｂの間、５０ｂｐから４ｋｂの間、５０ｂｐから３ｋｂの間、５０ｂｐから２ｋｂの間、５０ｂｐから１．５ｋｂの間、１００ｂｐから７ｋｂの間、２００ｂｐから５ｋｂの間、または３００ｂｐから４ｋｂの間であり得る。
【００８２】
様々な実施形態において、試料中の目的の核酸は、ホモポリマーセグメントなどの１つまたは複数のリピート性Ａ／Ｔリッチセグメントを含み得る。ある特定の実施形態において、Ａ／Ｔリッチセグメントは、（ｉ）少なくとも１０個のＡ残基、少なくとも１０個のＴ残基、もしくは少なくとも１０個のＵ残基を含むホモポリマーセグメントであって、少なくとも１０個のＡ、Ｔ、もしくはＵ残基が、連続し、もしくは１〜３個の他のヌクレオチドによって１回、中断されている、ホモポリマーセグメント、または（ｉｉ）（ＴｎＡ）ｍ、（ＡＴｎ）ｍ、（ＴＡｎ）ｍ、または（ＡｎＴ）ｍを含むセグメントであって、ｎが２以上であり、ｍが、リピート性Ａ／Ｔリッチセグメントの長さが１０残基以上であるような、セグメントである。いくつかの実施形態において、核酸鋳型は、ホモポリマーセグメントなどの１つまたは複数のリピート性Ａ／Ｔリッチセグメントを含むことが知られ得る。核酸鋳型は、ホモポリマーセグメントなどの１つまたは複数のリピート性Ａ／Ｔリッチセグメントを含むのではないかと疑われ得る。ある特定の実施形態において、核酸のサイズは、約５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、５００ｂｐ、もしくは７００ｂｐ、または１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、７ｋｂ、もしくは１０ｋｂ、またはその間の任意の値であり得る。いくつかの実施形態において、核酸のサイズは、５０ｂｐから１０ｋｂの間、１００ｂｐから１０ｋｂの間、２００ｂｐから１０ｋｂの間、３００ｂｐから１０ｋｂの間、５００ｂｐから１０ｋｂの間、７００ｂｐから１０ｋｂの間、１ｋｂから１０ｋｂの間、１．５ｂｐから１０ｋｂの間、２ｂｐから１０ｋｂの間、３ｂｐから１０ｋｂの間、５０ｂｐから７ｋｂの間、５０ｂｐから５ｋｂの間、５０ｂｐから４ｋｂの間、５０ｂｐから３ｋｂの間、５０ｂｐから２ｋｂの間、５０ｂｐから１．５ｋｂの間、１００ｂｐから７ｋｂの間、２００ｂｐから５ｋｂの間、または３００ｂｐから４ｋｂの間であり得る。
【００８３】
様々な実施形態において、多重アッセイは、２つ以上の核酸領域の並行分析に用いることができる。いくつかの実施形態において、多重ＰＣＲ反応は、核酸の少なくとも１つのリピート領域をサイズ分類するために用いることができる。ある特定の実施形態において、第１および第２の核酸領域が増幅される。特定の実施形態において、第２の核酸領域が増幅される。他の実施形態において、第１、第２、および第３の核酸領域が増幅される。他の実施形態において、第２および第３の核酸領域が増幅される。さらに他の実施形態において、第２の核酸、および適宜、第３の核酸領域が増幅される。ある特定の実施形態において、核酸領域は、ラダー増幅産物についての鋳型と異なる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの核酸領域、少なくとも２つの核酸領域、少なくとも３つの核酸領域、少なくとも４つの核酸領域、または少なくとも５つの核酸領域が増幅される。いくつかの実施形態において、多重アッセイは、２つ以上の遺伝子座をサイズ分類するために用いることができる。いくつかの実施形態において、多重アッセイは、３つ以上の遺伝子座をサイズ分類するために用いることができる。いくつかの実施形態において、多重アッセイは、ＦＭＲ１およびＦＭＲ２の少なくとも１つのリピート領域をサイズ分類するために用いることができる。他の実施形態において、多重アッセイは、ＦＭＲ１およびＣ９ＯＲＦ７２の少なくとも１つのリピート領域をサイズ分類するために用いることができる。いくつかの実施形態において、多重アッセイは、ＦＭＲ２およびＣ９ＯＲＦ７２の少なくとも１つのリピート領域をサイズ分類するために用いることができる。ある特定の実施形態において、多重アッセイは、ＦＭＲ２およびＣ９ＯＲＦ７２の少なくとも１つのリピート領域をサイズ分類するために用いることができる。他の実施形態において、多重アッセイは、伸長したリピート領域に関連した障害、例えば、脊髄小脳変性症、筋緊張性ジストロフィー、またはハンチントン病について用いることができる。ある特定の実施形態において、多重アッセイは、２つ以上の蛍光標識と共に用いることができる。
【００８４】
Ｖ．リピート領域サイズ分類の装置および機械可読媒体
様々な実施形態において、１つまたは複数のリピート領域のサイズ分類に用いられ、および適宜、リピート領域を含有する核酸についてのジェノタイプの再構築に用いられる装置が開示される。いくつかの実施形態において、核酸リピート領域のサイズまたは特徴に関する情報が、ジェノタイプを再構築するのに用いられる装置に提供される。いくつかの実施形態において、リピート領域はまた、割り込み配列、例えば、ＣＧＧリピート領域におけるＡＧＧ割り込み配列を含む。いくつかの実施形態において、リピート領域サイズ、ならびに任意の割り込み配列への順方向および逆方向での距離を含むパラメータ情報が、ジェノタイプを再構築するのに用いられる装置に提供される。
【００８５】
様々な実施形態において、核酸試料のリピート領域をサイズ分類し、適宜、例えば、再構築されるジェノタイプを作製するための装置が開示される。いくつかの実施形態において、装置は、メモリデバイスへ通信可能に連結されたプロセッサを含む。いくつかの実施形態において、プロセッサにより実行される場合、リピート領域のサイズ分類およびジェノタイプ再構築分析をプロセッサに行わせる機械実行可能な命令が、メモリデバイスに記憶される。ある特定の実施形態において、機械実行可能な命令は、（ａ）リピート領域を増幅すること、（ｂ）高分解能断片分析を実施すること、（ｃ）増幅産物のラダーを得ること、および（ｄ）増幅産物のラダーを内部標準として用いて、リピート領域の長さを決定することをプロセッサにさせる。ある特定の実施形態において、装置はさらに、プロセッサおよびメモリデバイスへ通信可能に連結されたモニターを含み、メモリデバイスに記憶された機械実行可能な命令が、解答ジェノタイプをモニター上に表示するようにプロセッサに命令する。いくつかの実施形態において、装置はさらに、プロセッサおよびメモリデバイスへ通信可能に連結されたプリンターを含み、メモリデバイスに記憶された機械実行可能な命令が、解答ジェノタイプをプリンターで印刷するようにプロセッサに命令する。
【００８６】
様々な実施形態において、リピート領域をサイズ分類するために用いられる装置は、核酸に関するパラメータ情報（例えば、増幅産物のラダーに関する、リピートプロファイル、リピートエレメント周期性、第１の増幅産物、増幅産物カウント数、および／または一定のエレメント長）のインプットを受け入れることができる。いくつかの実施形態において、装置は、パラメータ情報を用いて、増幅産物のラダーにおける各増幅産物のサイズ、および／または核酸の全体のサイズを決定するようにプログラミングされる。装置は、その結果を表示し、および／またはアーカイブに入れるようにプログラミングされ得る。いくつかの実施形態において、装置は、その結果を表示し、および／またはアーカイブに入れるための手段を含む。
【００８７】
様々な実施形態において、本明細書に開示された装置は、プロセッサおよびメモリデバイスを含み、メモリデバイスが、核酸に関するパラメータ情報のインプットを受け入れて、サイズ分類分析を行うようにプロセッサに命令する機械可読な命令を含有し、そのサイズ分類分析が、標準曲線を作成するために、以下の式によって表され得る：−  Ｚ＝リピートエレメントサイズ（ｂｐで）、−  Ｘ＝最初のピークに先行する塩基対、Ｘ＝［リピートプライマーにおけるリピートエレメントの数−１］＊Ｚ、−  Ｎ＝ピークカウント数（１からＮまでの合計ピーク）、−  Ａｎｃ＝相補的プライミングに用いられる一定のエレメント長（ｂｐで）。いくつかの実施形態において、スタッター（ｓｈｕｔｔｅｒ）パターンにおける各ｎピークの正確なサイズを決定するために、以下の式が用いられ得る：Ｎピークについてのサイズ（塩基対）＝［Ｘ＋ＺＮ＋Ａｎｃ］。結果として、この式は、リピート領域のサイズを提供する。
【００８８】
いくつかの実施形態において、装置はさらに、解答ジェノタイプを表示するための手段（例えば、ジェノタイプを視覚的に表示するモニター、ジェノタイプをデジタル形式で保存するデータ記憶媒体、および／または解答ジェノタイプをプリンター、もしくは他の電子的記憶もしくはディスプレイデバイスへ送信するための接続）を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、装置はコンピュータであり、コンピュータは、プロセッサ、およびそれに記憶されたコンピュータコードを有するメモリデバイスを含み、コンピュータコードは、核酸に関するパラメータ情報のインプットを受け入れ、その後、増幅産物のラダーのリピートプロファイルを決定し、それにより、リピート領域をサイズ分類するようにプロセッサに命令する。いくつかの実施形態において、コンピュータはまた、インプット情報および／または再構築されたジェノタイプを表示するためのモニターを含む。いくつかの実施形態において、再構築されたジェノタイプは、コンピュータに電子的に記憶され、および／またはさらなる診断的もしくは治療的使用のために印刷することができる。様々な実施形態において、コンピュータは、ユーザーとの対話を可能にするためのデバイスを含む。例えば、コンピュータは、ユーザー（患者、医者、または他のヘルスケアワーカー）がパラメータ情報を入力すること、および／または再構築されたジェノタイプにアクセスし、操作することを可能にするキーボードおよび／またはポインティングデバイス（例えば、マウスまたはトラックボール）を含み得る。
【００９０】
様々な実施形態において、リピート領域のサイズ分類、および適宜、ジェノタイプの再構築を行えという命令は、装置に機械可読媒体（例えば、機械実行可能な命令、ソフトウェア、コンピュータコード、コンピュータプログラムなど）において記憶され得る。例えば、機械可読媒体は、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｊａｖａ、Ｐｅｒｌ、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｊｕｌｉａ、Ｒ、Ｇｏ、Ｒｕｂｙ、Ｓｃａｌａ、Ｊａｖａｓｃｒｉｐｔ、または任意の他のコンピュータコードに適切なフォーマットで記憶されたコンピュータコードを含み得る。機械可読媒体は、核酸に関するパラメータ情報を用いてリピート領域のサイズ分類を行うために装置へ命令を与えることができる。様々な実施形態において、機械可読媒体上の命令は、（ａ）リピート領域を増幅すること、（ｂ）高分解能断片分析を実施すること、（ｃ）増幅産物のラダーを得ること、および（ｄ）増幅産物のラダーを内部標準として用いて、リピート領域の長さを決定することを装置に命令することができる。
【００９１】
いくつかの実施形態において、機械可読媒体上の命令は、サイズ結果をモニター上に表示するように装置に命令する。いくつかの実施形態において、機械可読媒体上の命令は、サイズ結果をプリンターで印刷するように装置に命令する。
【００９２】
機械可読媒体に記憶された命令は、装置によって（例えば、コンピュータ内のプロセッサによって）用いられ得る、命令、情報、および／またはデータを提供する任意のコード、記号、または他のシグナルであり得る。いくつかの実施形態において、機械可読媒体に記憶された命令は、核酸に関するパラメータ情報を受け取り、リピート領域をサイズ分類するための分析を行い、核酸のサイズを記憶または送信するように装置に命令するプログラムをコードする。
【００９３】
いくつかの実施形態において、機械可読媒体に記憶された命令は、リピート領域サイズ分類分析プログラムを実行するように装置に命令する。いくつかの実施形態において、プログラムは、核酸のサイズを表示し、および／またはアーカイブに入れるように（例えば、サイズをモニター上に表示するように、サイズをデータ記憶媒体に保存するように、および／またはサイズをプリンターもしくは他の電子的記憶もしくはディスプレイデバイスへ送信するように）との命令を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態において、機械可読媒体に記憶された命令は、モニター上にグラフィカルディスプレイを提供するユーザーインターフェイスをさらにコードする。いくつかの実施形態において、インターフェイスは、ユーザーが核酸に関するパラメータ情報を入力するのを（例えば、ユーザーがデータファイルをアップロードするのを可能にすることにより、またはユーザーがユーザーインターフェイス上に示されたディスプレイフィールドへ情報を入力するのを可能にすることにより）可能にする。いくつかの実施形態において、ユーザーインターフェイスは、インプットデータおよび／またはサイズ結果を表示し、および／または保存するための様々な方法（例えば、データをユーザーのモニター上に表示すること、データを特定化された電子デバイスまたは電子アドレスへ送ること、データを特定の場所へ印刷し、および／または保存することによる）など、パラメータ情報を分析するための選択肢をユーザーに提供する。
【００９５】
様々な実施形態において、核酸サイズは、装置へ物理的に接続された記憶媒体に（例えば、コンピュータ上のハードドライブなどの内部メモリデバイスに）データとして記憶され得、および／または装置へ通信可能に接続されている（例えば、有線またはワイヤレスイントラネットまたはインターネット接続などによる）リモート記憶デバイスに記憶され得る。いくつかの実施形態において、ユーザーインターフェイスは、自動的に、サイズを特定の場所に記憶させ、サイズを印刷し、および／またはサイズを特定化された電子デバイスもしくは電子アドレスへ（例えば、核酸サイズを要請していた医療専門家のＥメールアドレスへ）送るための選択肢をユーザーに提供する。
【００９６】
ＶＩ．使用方法
様々な実施形態において、上記で開示された方法は、伸長したリピート領域、例えば、ＧＣリッチな領域もしくはＡ／Ｔリッチなリピート領域を検出するために、および／または患者において障害を診断するために、もしくは患者の子孫において障害のリスクを診断するために、用いることができる。いくつかの実施形態において、方法は、例えば、（１）患者から試料を得ること、（２）ＣＧＧもしくはＣＣＧリピートを含む領域またはリピート性Ａ／Ｔリッチセグメントなどの１つまたは複数のリピート領域を有する核酸を試料から単離すること、（３）１つまたは複数のリピート領域を有する核酸の領域を増幅すること、（４）キャピラリー電気泳動を実施すること、（５）増幅産物のラダーを得ること、（６）増幅産物のラダーを内部標準として用いて、リピート領域の長さを決定することを含む、リピート領域に関連した遺伝的障害を診断し、リスクを診断し、または処置するために用いることができる。いくつかの実施形態において、方法は、リピート領域において任意の割り込み配列を検出すること、および割り込み配列への順方向および逆方向での距離を決定することをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、リピート領域サイズ、および適宜、任意の割り込み配列への順方向および逆方向での距離は、ジェノタイプを再構築するために用いられる。いくつかの実施形態において、リピート領域サイズ、および適宜、再構築されたジェノタイプは、伸長したリピート領域を検出するために、または伸長したリピート領域、例えば、ＧＣリッチな領域、もしくはホモポリマーセグメントなどのＡ／Ｔリッチな領域に関連した遺伝的障害を診断するために用いられる。いくつかの実施形態において、リピート領域の長さおよび／または再構築されたジェノタイプは、患者または患者の子孫において遺伝的障害のリスクを予測するために用いられる。いくつかの実施形態において、リピート領域の長さおよび／または再構築されたジェノタイプは、患者において遺伝的障害を検出するために用いられる。いくつかの実施形態において、リピート領域の長さおよび／または再構築されたジェノタイプは、患者の子孫において遺伝的障害のリスクを検出するために用いられる。ある特定の実施形態において、方法は、リピート領域の長さおよび／または再構築されたジェノタイプに基づいて適切な処置決定（例えば、妊娠カウンセリングおよび／または不妊治療を提供すること）を行うことを含む。いくつかの実施形態において、方法は、リピート領域の長さおよび／または再構築されたジェノタイプに基づいて遺伝的障害を有すると同定された患者に適切な処置を施すことを含む。
【００９７】
例えば、方法は、伸長したＦＭＲ１またはＦＭＲ２アレルに関連した障害を診断し、および／またはそれのリスクを予測し、および／またはそれに関する処置決定を行うために、ＦＭＲ１またはＦＭＲ２核酸またはその断片を患者試料から単離すること、ＣＧＧまたはＣＣＧリッチなリピート領域を増幅すること、キャピラリー電気泳動を実施して、増幅産物のラダーを得ること、および増幅産物のラダーを用いて、ＣＧＧまたはＣＣＧリッチなリピート領域サイズを決定することを含み得る。例えば、２００より多いＣＧＧもしくはＣＣＧリピートのサイズが、患者において脆弱Ｘ症候群もしくは脆弱Ｘ（ＦＲＡＸＥ）精神遅滞を検出するために用いることができ、または３５〜４５より多いＣＧＧもしくはＣＣＧリピートのサイズの範囲が、患者の子孫において脆弱Ｘ症候群もしくは脆弱Ｘ（ＦＲＡＸＥ）精神遅滞のリスクを検出するために用いることができる。いくつかの実施形態において、方法はまた、ＣＧＧまたはＣＣＧリッチなリピート領域において任意の割り込み配列への順方向および逆方向での距離を検出すること、リピートサイズおよび割り込み情報を用いてＦＭＲ１またはＦＭＲ２アレルについてのジェノタイプを再構築すること、および再構築されたジェノタイプを用いて、伸長したＦＭＲ１またはＦＭＲ２アレルに関連した障害を検出することを含む。
【００９８】
多数の遺伝子およびゲノム領域は、ＧＣリッチなまたはＡ／Ｔリッチな領域を含む、リピート領域を含み、そのリピート領域は遺伝的障害に関連しており、そのことは、それらを有望な診断的および治療的標的にさせている。したがって、様々な実施形態において、本明細書に開示されたリピート領域をサイズ分類する方法は、これらの遺伝子座について用いることができ、関連した遺伝的障害について、診断し、予知し、処置し、および／または処置決定を導くために用いることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示されたリピート領域をサイズ分類する方法は、ＦＭＲ１またはＦＭＲ２遺伝子を分析するために用いることができる。いくつかの実施形態において、これらの方法は、ＦＭＲ１の５’ＵＴＲにおけるＣＧＧリピート領域およびＦＭＲ２の５’ＵＴＲにおけるＣＣＧリピート領域の長さに関連している、ＦＸＳ、ＦＲＡＸＥ、ＦＸＴＡＳ、ＦＸＰＯＩ、およびドーパミン応答性パーキンソニズムの診断を助けることができる。例えば、５’ＵＴＲにおける約４５より多いＣＧＧリピートを有する再構築されたＦＭＲ１ジェノタイプ、および特に、約２００より多いＣＧＧリピートを有するジェノタイプは、ＦＸＳおよび関連した障害を診断するために、加えて、患者の子孫においてその障害のリスクを診断するために用いることができる。
【００９９】
さらなる実施形態において、リピート領域をサイズ分類する方法は、伸長したリピート領域の、他の障害に関連したジェノタイプを検出するために用いられ得、例えば、脊髄小脳変性症１型、脊髄小脳変性症２型、脊髄小脳変性症３型、脊髄小脳変性症６型、脊髄小脳変性症７型、脊髄小脳変性症８型、フリードライヒ運動失調症、進行性ミオクローヌスてんかん、筋緊張性ジストロフィーＩ、筋緊張性ジストロフィーＩＩ、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、脊髄小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、およびアルツハイマー病である。これらの状態に関連した遺伝子座は当技術分野において公知であり、それらには、非限定的に、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＳＣＡ７、ＳＣＡ８、Ｘ２５、ＣＳＴＢ、Ｃ９ＯＲＦ７２、ＤＭＰＫ、ＺＮＦ９、ＨＴＴ、ＡＲ、ＡＴＮ１、ＡＴＸＮ１−３、ＡＴＸＮ７、ＡＴＸＮ１０、ＣＡＣＮＡ１Ａ、ＳＣＡ８、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ、ＣＮＢＰ、ＴＢＰ、およびＴＯＭＭ４０が挙げられる。例えば、Nat Genet. 1996 May;13(1):105-8; Nat Genet. 1996 May;13(1):109-13を参照。これらの座におけるＧＣリッチな領域および／またはリピート領域の過伸長および／または過剰メチル化は疾患に関連しており、本明細書に開示された方法を用いたこれらの突然変異および伸長の検出は、検出された状態について、処置の一部として、または処置を導くために用いることができる。表１は、本明細書に開示された方法と共に用いることができる遺伝子座の例、およびそれらの座におけるリピート領域と疾患ジェノタイプまたは表現型との間の関係を示す。ある特定の実施形態において、方法は、リピート領域アレル内の２０より多い、３０より多い、３５より多い、４０より多い、５０より多い、１００より多い、１１０より多い、または２００より多いリピートのリピート長を検出する。
【０１００】
【表１】
2019502367.tif 000004
【０１０１】
例えば、リピート領域をサイズ分類し、および／またはジェノタイプを再構築することは、脊髄小脳変性症１型および２型などのＳＣＡ１またはＳＣＡ２の障害に関連したジェノタイプを検出するために用いることができ、その障害は、それらのＣＡＧリピート領域の伸長に関連している。例えば、リピート領域をサイズ分類することは、ＳＣＡ１またはＳＣＡ２遺伝子における１個または複数のＣＡＧリピートの全長、加えて、ＣＡＧリピートにおけるＣＡＴまたはＣＡＡ割り込み配列への順方向および逆方向での距離に関する情報を提供することができる。１個または複数のＣＡＧリピートの全長、および任意の割り込み配列への順方向かまたは逆方向かのいずれかでの距離を用いてリピート領域をサイズ分類することは、ＳＣＡ１またはＳＣＡ２遺伝子について１セットの可能性のあるジェノタイプを生じさせるために適用することができる。リピート領域をサイズ分類することは、突然変異もしくはジェノタイプを検出するために、またはＳＣＡ１もしくはＳＣＡ２関連突然変異、ジェノタイプ、もしくは障害を診断し、もしくは診断するのを助けるために、加えて、その障害を処置し、および処置決定を導くために用いることができる。
【０１０２】
他の実施形態において、リピート領域をサイズ分類し、および／またはジェノタイプを再構築する方法は、リピート性Ａ／Ｔリッチセグメントに関連した障害などの伸長したリピート領域に関連した他の障害を検出するために用いられ得る。いくつかの実施形態において、その障害は、神経変性疾患である。いくつかの実施形態において、神経変性疾患はアルツハイマー病である。アルツハイマー病は、遅発型アルツハイマー病であり得る。リピート性Ａ／Ｔリッチセグメントに関連した他の遺伝子座は当技術分野において公知であり、例えば、遺伝子ＴＯＭＭ４０である。いくつかの実施形態において、アセスメントされているリピート座位はＴＯＭＭ４０のイントロン６の全部または一部である。いくつかの実施形態において、アセスメントされているＴＯＭＭ４０遺伝子のイントロン６の部分は、ポリＴリピート多型（ｒｅ  １０５２４５２３）を含有する。
【０１０３】
自動サイズ分類分析
図２は、ゲノムリピート領域を自動的に分析するための例示的な過程を示す。この過程は、シグナル前処理工程２０１、サイズ分類標準を作成する工程２０３、および遺伝子産物のサイズ分類工程２０５を含み得る。当業者に認識されているように、構想された実施形態から逸脱することなく、追加の工程が実施され得、工程が除去され得、工程の順序が変わり得る。アノテーションデバイス１３０は、開示された実施形態と一致して、これらの工程を実施するように構成され得る。
【０１０４】
工程２０１において、アノテーションデバイス１３０は、生データを受け取って、前処理するように構成され得る。生データは、ＣＥデバイス１２０から、または別のデバイスから受け取られ得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、生データを記憶デバイスから引き出すように構成され得る。生データは、ＣＥ実験の各チャネルについてのシグナル強度を記憶するデータファイルに受け入れられ得る。これらのデータファイルは、シグナル強度をＪＳＯＮに基づいたフォーマットで記憶し得る。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、ＰＣＲアッセイは、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ機器（３１３０／３５００／３７００）のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓファミリーと共に実行され得、その機器の全ては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより維持される独自仕様のフォーマットでデータをエクスポートする。このフォーマットは、Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＦＳＡ）フォーマットと呼ばれ、一連の独自仕様に従ってコード化された、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）実験からの蛍光データを含有する。アノテーションデバイス１３０は、このファイルフォーマットに直接的にアクセスするように構成され得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、プログラムアクセスおよび操作のために、そのファイルにおける情報をデコードして、ｊｓｏｎに基づいたフォーマットへ編成するように設計されたパーサーを用い得る。このパーサーは、Ｂｉｏ：：Ｔｒａｃｅ：：ＡＢＩＦ（フリーソフトウェアとして認可されている）と呼ばれるｐｅｒｌプログラミング言語についてのオープンソースモジュールを用い得る。このパーサーは、異なるＧｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ機器（３１３０／３５００／３７００）に渡って実行された１０００個より多い試料に関して確証されており、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（ＦＳＡフォーマットにアクセスするための現行標準）を通して見られる未処理の蛍光データと正確に一致していることが示されている。パーサーのアウトプットは、ＣＥ実験の複数チャネルについてのシグナル強度を記憶し得るデータファイルを含み得る。これらのデータファイルは、シグナル強度をＪＳＯＮに基づいたフォーマットで記憶し得る。
【０１０６】
データファイルの少なくとも１つのチャネルは、増幅産物のラダーに対応し得る。このチャネルは、リピートプロファイルを含み得る。いくつかの実施形態において、データファイルの別のチャネルは、公知のサイズを有する産物のラダーに対応し得る。例えば、データファイルのこの他のチャネルは、ＲＯＸラダーなどの外部ラダーに対応し得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、リピートプロファイルが存在するデータファイルにおいて、目的の領域を検出するように構成され得る。アノテーションデバイス１３０は、周波数に基づいた分析を用いてリピートプロファイルの周期性を動的に決定し得る。アノテーションデバイス１３０は、リピートプロファイルにおけるリピートピークをコールするための閾値を動的に決定し得る。閾値は、振幅閾値であり得る。アノテーションデバイス１３０は、スライドウィンドウを用いて、リピートプロファイルにおけるリピートピークをコールし得る。アノテーションデバイス１３０は、閾値より下のリピートプロファイルにおけるリピートピークを内挿し得る。この内挿は、アノテーションデバイス１３０により作成されたサイズ分類標準の精度を向上させ得る。アノテーションデバイス１３０は、リピートプロファイルにおける推定上の開始ピーク位置およびその後のピーク位置を用いて、サンプリング単位から塩基対単位へマッピングするサイズ分類標準を作成し得る。
【０１０８】
前処理は、パースされたデータを正規化して、異なる構成で実行された試料に渡る差を調整し得る。例えば、ＰＣＲアッセイは、データ解釈のためにＣＥに基づいた読み取りを用い、ＣＥ機器に体系的に存在するシグナルアーチファクトによるコンボリューションを受けやすくなり得る。パースされたデータの各チャネルは、下流データ処理を単純化し、かつそのロバスト性を増加させるために、アノテーションデバイス１３０によりフィルタにかけられ得る。いくつかの態様において、ローパスフィルタまたはバンドパスフィルタが、データを平滑化するためにチャネルの１つまたは複数に適用され得る。ローパスフィルタは、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙ、移動平均、または他の類似したフィルタであり得る。ＣＥデバイスにおける各チャネルについてのベースライン蛍光値が、デバイスの耐用年限を通して継続的に較正されなければならないため、各チャネルは、実験室に渡る不適切な機器較正および／または機器構成の変動性を無効にするために、アノテーションデバイス１３０により正規化され得る。アノテーションデバイス１３０は、チャネルからの値を減算することによりチャネルを再較正するように構成され得る。この値は、チャネルのシグナル強度の統計値であり得る。例えば、その値は、チャネルのシグナル強度の１０パーセンタイルであり得る。１０パーセンタイルは、シグナル強度において一般的に遭遇されるシャープなマイナスのゆらぎによって影響されることなく、シグナルにおけるより低い値をロバストに表し得る。下記の方程式において、ｓ（ｘ，ｃ）は、機器チャネルｃについての位置ｘにおけるシグナル強度を表すものとする：
ｂ（ｃ）＝Ｑ１０（ｓ（ｘ，ｃ））
ｓｎｏｒｍ（ｘ，ｃ）＝ｓ（ｘ，ｃ）−ｂ（ｃ）
【０１０９】
アノテーションデバイス１３０は、シグナル前処理中の気泡または混入物質などのアーチファクトから生じるアーチファクトを除去するように構成され得る。ＣＥ実験中のキャピラリー管に存在する気泡は、シグナル強度に大きなスパイクを生じ得る。これらのスパイクは、遺伝子特異的産物またはＲＯＸチャネルサイズ分類ピークとして誤って解釈されて、間違った結果を生じ得る。しかしながら、気泡からの蛍光は、チャネルの全部に、同じような程度の大きさで影響し、アノテーションデバイス１３０が気泡アーチファクトを同定し、かつ除去することを可能にする。
【０１１０】
第１の工程において、アノテーションデバイス１３０は、パースされたデータにおいて全チャネルに渡る５０  ＲＦＵを超える全てのピークの位置を見出すように構成され得る。アノテーションデバイス１３０は、ピークインデックスの交差が複数チャネルに渡って起こる時、候補気泡アーチファクト位置を決定するように構成され得る。例えば、チャネル（｛ＦＡＭ，ＨＥＸ，ＮＥＤ，ＲＯＸ｝）におけるピークインデックスの交差は以下：
Ｃ＝Ｐ（ＦＡＭ）∩Ｐ（ＨＥＸ）∩Ｐ（ＮＥＤ）∩Ｐ（ＲＯＸ）
のように表され得る。
【０１１１】
アノテーションデバイス１３０は、気泡アーチファクトが各候補位置に存在するかどうかを決定するように構成され得る。第１の工程として、アノテーションデバイス１３０は、チャネルにおいて、可能性のある気泡位置を含むウィンドウを同定するように構成され得る。いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、候補位置におけるシグナル強度ピークの左ショルダーおよび右ショルダー［ｈｉｌ，ｈｉｒ］を決定するように構成され得る。以下の方程式において、Ｓ（ｉ，ｃ）は、チャネルｃについての左ショルダーと右ショルダーとの間のシグナル強度の関数であり得、ｉは、候補ピーク位置を表し得る。
Ｓ（ｉ，ｃ）＝ｓ（［ｈｉｌ，ｈｉｒ］，ｃ）
【０１１２】
第２の工程として、アノテーションデバイス１３０は、ウィンドウ内の複数チャネルに渡るシグナル強度間の相関を決定するように構成され得る。この相関は、チャネルに渡ってシグナル強度を比較する、ペアワイズ順位相関有意検定または任意の他の類似性尺度であり得る：
【０１１３】
【数２】
2019502367.tif 000005
【０１１４】
ここで、検定される機器チャネルのセットはＣＨであり、ＰＣ（ｉ）は、候補ピーク位置ｉについてのペアワイズ順位相関値のセットである。
【０１１５】
アノテーションデバイス１３０は、順位相関有意検定が、全てのペアワイズ比較に渡って有意閾値より低い有意値を生じる場合、気泡アーチファクトが候補位置に存在すると決定するように構成され得る。
【０１１６】
【数３】
2019502367.tif 000006
【０１１７】
ここで、Ｂは、気泡アーチファクトを有する候補位置を示し、Ｔは、有意閾値である。Ｔは０．０００１から０．０１の間であり得、例えば、０．００５の有意閾値は、独立した訓練データセットを用いて実験的に検証されている。
【０１１８】
アノテーションデバイス１３０は、気泡アーチファクトを置き換えるように構成され得る。いくつかの態様において、ウィンドウ内のチャネルについてのシグナル強度は、アノテーションデバイス１３０によって、シミュレートされたノイズに置き換えられ得る。シミュレートされたノイズは、気泡を囲む領域についてのシグナル強度を用いてアノテーションデバイス１３０によって決定される平均および標準偏差を有する、ガウスノイズであり得る：
ｂｋｇ（ｉ，ｃ）＝ｓ（［ｈｉｌ−ｄ，ｈｉｌ］，ｃ）∪ｓ（［ｈｉｒ，ｈｉｒ＋ｄ］，ｃ）
μ（ｉ，ｃ）＝平均ｂｋｇ（ｉ，ｃ）
σ（ｉ，ｃ）＝標準偏差ｂｋｇ（ｉ，ｃ）
ｓ（［ｈｉｌ，ｈｉｒ］，ｃ）〜Ｎ（μ（ｉ，ｃ），σ（ｉ，ｃ））
【０１１９】
ここで、ｂｋｇ（ｉ，ｃ）は、気泡を囲む領域についての値のセットである。この例において、領域は、左ピークショルダーおよび右ピークショルダーからｄ位置単位、延長する。非限定的例として、ｄは５から５０の間であり得る。
【０１２０】
アノテーションデバイス１３０は、データファイルにおいてチャネルのダイナミックレンジを延長するように構成され得る。いくつかの実施形態において、チャネルは、最初の電磁的に検出可能な部分を検出するように構成され得る。例えば、チャネルは、ＦＡＭチャネルであり得る。アノテーションデバイス１３０は、シグナル飽和の領域に渡ってピーク形状を外挿することによりチャネルのダイナミックレンジを延長し得る。飽和は、電磁的に検出可能な部分が機器ＲＦＵセンサーの収集限界より高い発光で蛍光を発する場合に起こり得、その結果として、ピーク形状に関する情報の損失を生じる。しかしながら、収集についての波長スペクトルは、チャネルに渡っての漏出を許容するため、飽和した領域についてのピーク形状は、同様の波長での蛍光を捕獲するチャネルから外挿することができる。
【０１２１】
第１の工程において、アノテーションデバイス１３０は、チャネルにおいてウィンドウを同定するように構成され得る。ウィンドウは、チャネルの飽和した領域を含み得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、シグナル強度が振幅閾値を超えるチャネルの領域を決定し得る。この振幅閾値は、実験的に導かれ得、機器特異的であり得る。下記の方程式において、ｓ（ｘ，ｃ）は、機器チャネルｃについてのインデックスｘにおけるシグナル強度を表すものとし、Ｌは、飽和判定基準を満たす全ての位置インデックスのセットを表すものとし、Ｔは、ある機器特異的閾値であるとする：
【０１２２】
【数４】
2019502367.tif 000007
【０１２３】
いくつかの態様において、ｃは、ＦＡＭチャネルを含み得る。様々な態様において、Ｔは、１０００  ＲＦＵから４００００  ＲＦＵの間であり得、Ｔは、飽和が起こっているＲＦＵレベルを記載する。アノテーションデバイス１３０は、Ｌにおけるインデックスでのシグナル強度を改変するように構成され得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、データファイルにおける、チャネルについてのウィンドウ内のシグナル強度、および１つまたは複数の他のチャネルについてのウィンドウ内のシグナル強度を用いた、組み合わされたシグナル強度を決定し得る。これらの他のチャネルは、他の電磁的に検出可能な部分を検出するように構成され得る。例えば、これらの他のチャネルは、ＮＥＤチャネルまたはＨＥＸチャネルであり得る。シグナル強度は、線形的に、または非線形的に結合され得る。いくつかの実施形態において、組み合わされたシグナル強度を決定することは、第１のチャネルにおける計算されたピークの形状を外挿することを含む。例えば、組み合わされたシグナル強度は、チャネルについてのウィンドウ内のシグナル強度の線形結合を含み得る。組み合わされたシグナル強度は、オフセットをさらに含み得る。非限定的例として、アノテーションデバイス１３０は、ＮＥＤチャネルからのＲＦＵ値をＦＡＭチャネルへ結合するように構成され得る：
【０１２４】
【数５】
2019502367.tif 000008
【０１２５】
前述の例に示されているように、アノテーションデバイス１３０は、ウィンドウ内のチャネルについてのシグナル強度を、組み合わされたシグナル強度に置き換えるように構成され得る。
【０１２６】
アノテーションデバイス１３０は、開示された実施形態と一致して、工程２０３においてサイズ分類標準を作成するように構成され得る。アノテーションデバイス１３０は、このサイズ分類標準を用いて、シグナルにおける位置単位（ＰＯＰ７ゲルにおいて移動した距離と相似）から塩基対サイズへ変換するように構成され得る。サイズ分類標準は、非一過性メモリに記憶されたデータまたは命令を含み得る。下で記載されているように、アノテーションデバイス１３０は、内部サイズ分類標準および外部サイズ分類標準の少なくとも１つを用いて、この全部のサイズ分類標準を作成するように構成され得る。いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、サイズ分類標準をディスプレイ、プリンター、システム１００の別のコンポーネント（例えば、実験室情報管理システム１４０）、または別のシステムにアウトプットするように構成され得る。
【０１２７】
アノテーションデバイス１３０は、開示された実施形態と一致して、工程２０５においてジェノタイプピークを同定し、かつサイズ分類するように構成され得る。この工程において、アノテーションデバイス１３０は、アッセイにおける様々なプライマーセットの、測定されたシグナルへの異なる効果を補正するバックグラウンドモデルを作成し得る。このバックグラウンドモデルは、測定されたシグナルにおいて少なくとも１つの遺伝子特異的産物ピークを同定するために、アノテーションデバイス１３０によって用いられ得る。
【０１２８】
アノテーションデバイス１３０は、サイズ分類標準を用いて、リピート領域の少なくとも１つおよび少なくとも１つの遺伝子特異的産物ピークをサイズ分類するように構成され得る。アノテーションデバイス１３０は、工程２０３において作成されたサイズ分類標準を用い得る。このサイズ分類標準は、内部サイズ分類標準、外部サイズ分類、または内部サイズ分類標準と、内部サイズ分類標準または別のサイズ分類標準との両方から作成された組合せ型サイズ分類標準であり得る。例えば、アノテーションデバイス１３０はまた、記憶デバイスから引き出された、システム１００の別のコンポーネントから受け入れられた、または別のシステムから受け入れられたサイズ分類標準を用いるように構成され得る。いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、少なくとも１つの遺伝子特異的産物ピークの指示、および／またはリピート領域のサイズを、ディスプレイ、プリンター、システム１００の別のコンポーネント（例えば、実験室情報管理システム１４０）、または別のシステムにアウトプットするように構成され得る。このアウトプットは、最初のゲノム試料を提供する患者のジェノタイプの指示を含み得る。
【０１２９】
図３Ａは、外部サイズ分類標準を作成するのに用いられる例示的な外部サイズ分類ラダーを描く。上で記載されているように、アノテーションデバイス１３０は、工程２０３においてサイズ分類標準を作成するように形成され得る。ＣＥ実験における断片サイズ分類のための現行のゴールドスタンダードは、外部から加えられた公知のサイズの色素標識分子の使用を必要とし、その分子は、ＰＣＲアッセイに用いられる他の電磁的に検出可能な部分により生じた周波数スペクトルの外側のバンドに蛍光ピークを生じる（例えば、ＡｍｐｌｉｄｅＸ（登録商標）ＦＭＲ１  ＰＣＲ産物）。これらの蛍光ピークは、アッセイにより生成された標的産物とは無関係に同定され得る。いくつかの態様において、これらのピークは、ＦＳＡシグナルにおける位置（サンプリング単位での）を断片サイズ（塩基対での）に関係づける外部サイズ分類標準を作成するために、アノテーションデバイス１３０によって用いられ得る。アノテーションデバイス１３０は、ＲＯＸ蛍光ピークを自動的に同定し、かつ標識し、同時に、さもなければ結果として誤標識されたピークを生じるだろう（例えば、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒに基づいたワークフローまたは同様のソフトウェアを用いる場合）アーチファクトを検出するように構成され得る。アノテーションデバイス１３０により用いられるラベリングシステムおよび方法は、将来的なアッセイに用いられるように構想される任意のサイズ分類ラダー（例えば、ＲＯＸ  １０００またはＲＯＸ  ２００）へ延長され得る。
【０１３０】
第１の工程において、アノテーションデバイス１３０は、データファイルにおいてチャネルで生じたアーチファクトを同定するように構成され得る。このチャネルは、外部から加えられた、公知のサイズの色素標識サイズ分類ラダー分子に関連づけられ得る。アーチファクトは「漏出」アーチファクトであり得る。
【０１３１】
ＰＣＲ産物に対応するチャネルにおけるシグナル強度が振幅閾値を超える場合、そのＰＣＲ産物は、他のチャネルに影響するのに十分な強度で蛍光を発している可能性がある。したがって、アノテーションデバイス１３０は、ＰＣＲ産物に対応するチャネルにおけるシグナル強度に基づいて可能性のある漏出位置をまず、同定するように構成され得る。これらの位置は、機器特異的閾値を超えるシグナル強度を有し得る。この機器特異的閾値は、実験的に決定され得る。それは、他の方法で推定され得る。下記の方程式において、ｓ（ｘ，ｃ）は、機器チャネルｃについてのインデックスｘにおけるシグナルを表すものとし、Ｔ（機器）は、機器特異的閾値であるとし、Ｂはｃにおける漏出位置インデックスのセットを表すものとする：
ｆ（ｘ，ｃ）＝Δ１  ｓｇｎ（Δ１  ｓ（ｘ，ｃ））
【０１３２】
【数６】
2019502367.tif 000009
【０１３３】
【数７】
2019502367.tif 000010
【０１３４】
いくつかの態様において、ｃはＦＡＭチャネルであり得る。上記で列挙されたＲＦＵ値および機器は例示であり、限定することを意図されない。類似した値が同じ機器について用いられ得、追加の値が、類似した機器について決定され得る。
【０１３５】
第２の工程において、アノテーションデバイス１３０は、第１のチャネルから第２のチャネルへの漏出の程度を決定するように構成され得る。いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、漏出位置を含むウィンドウを決定し得る。これらのウィンドウは、第１のチャネルにおけるシグナル強度に基づいてアノテーションデバイス１３０により決定され得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、漏出位置を囲む左のピークショルダー位置と右のピークショルダー位置との間の領域としてウィンドウを定義し得る。左のピークショルダー位置および右のピークショルダー位置は、ピークの左側の領域および右側の領域においてノイズプロファイルをアセスメントし、その後、そのノイズプロファイルからのパラメータを用いて、ピークシグナルがノイズから有意に偏向する閾値を決定することにより、アノテーションデバイス１３０によって決定され得る。いくつかの実施形態において、ノイズプロファイルは、ガウス分布に従うと仮定され、ピークショルダーは、シグナルが平均値より上へ２標準偏差分、偏向する点として標識される。当業者により認識されているように、他の振幅閾値またはノイズ分布モデルが用いられ得る。いくつかの態様において、左のノイズプロファイルおよび右のノイズプロファイルは、独立してパラメータ化され得る。下記の方程式は、漏出位置ｉについてのこの過程の非限定的例を記載する：
ｂｋｇｌ（ｉ）＝ｓ（［ｉ−６０，ｉ−３０］，ｃ）
ｂｋｇｒ（ｉ）＝ｓ（［ｉ＋３０，ｉ＋６０］，ｃ）
μｌ（ｉ）＝平均ｂｋｇｌ（ｉ），μｒ（ｉ）＝平均ｂｋｇｒ（ｉ）
σｌ（ｉ）＝標準偏差ｂｋｇｌ（ｉ），σｒ（ｉ）＝標準偏差ｂｋｇｒ（ｉ）
【０１３６】
【数８】
2019502367.tif 000011
【０１３７】
【数９】
2019502367.tif 000012
【０１３８】
ここで、ｃは第１のチャネルであり、ＦＡＭチャネルまたは別のチャネルであり得、ｄは３０〜１００サンプリング単位の間であり得る。
【０１３９】
第３の工程において、アノテーションデバイス１３０は、左のピークショルダーと右のピークショルダーとの間の領域に渡ってノイズをシミュレートするように構成され得る。このシミュレートされたノイズは、第２のチャネルにおけるシグナルバックグラウンドを模倣するようにアノテーションデバイス１３０により選択されたパラメータを有するガウスであり得る。下記の方程式は、漏出位置ｉについてのこの過程の非限定的例を記載する：
ｂｋｇ（ｉ）＝ｓ（［ｈｉｌ−ｄ２，ｈｉｌ］，ＲＯＸ）∪ｓ（［ｈｉｒ，ｈｉｒ＋ｄ２］，ｃ２）
μ（ｉ）＝平均ｂｋｇ（ｉ）
σ（ｉ）＝標準偏差ｂｋｇ（ｉ）
ｓ（［ｈｉｌ，ｈｉｒ］，ｃ２）〜Ｎ（μ（ｉ），σ（ｉ））
【０１４０】
ここで、ｃ２は、第２のチャネルであり、ＲＯＸチャネルまたは別のチャネルであり得、ｄ２は、５〜５０サンプリング単位の間であり得る。第４の工程において、アノテーションデバイス１３０は、他のチャネルについてのウィンドウ内のシグナル強度を、シミュレートされたノイズに置き換えるように構成され得る。
【０１４１】
図３Ａは、サンプリング単位の範囲に渡ってシグナル強度３０１（ＲＦＵでの）を含み得る、漏れ込み位置除去のアウトプットである、チャネル３００を描く。チャネル３００は、ＲＯＸ  ＰＣＲ産物に対応し得る。示されているように、シグナル強度３０１は、実際のピークおよびアーチファクト（例えば、アーチファクト３１５および３１７）を含み得る。アノテーションデバイス１３０は、チャネル３００において、ピークが局所的ノイズ閾値を超える時、ピークを同定するように構成され得る。この同定は、偽陽性ピークのコールである可能性が高いピークアーチファクトを除去することを含み得る。
【０１４２】
第１の工程において、アノテーションデバイス１３０は、チャネルにおいて、スライドウィンドウを用いて計算された振幅閾値を超える、可能性のあるピークを決定するように構成され得る。このスライドウィンドウは、アノテーションデバイス１３０により、シグナル強度３０１に渡って実行され得、２５０〜７５０サンプリング単位の幅の間のであり得る。例えば、スライドウィンドウは、５００サンプリング単位幅であり得る。アノテーションデバイス１３０は、ウィンドウ内のシグナル強度３０１の、平均および標準偏差などの統計値を決定し得る。アノテーションデバイス１３０は、その決定された統計値に基づいて、可能性のあるピークを、振幅閾値を超えるものとして決定し得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、平均ノイズレベルより上へ３標準偏差分を超えるピークを同定し得る。
【０１４３】
第２の工程において、アノテーションデバイス１３０は、「ショルダー」アーチファクトによって引き起こされる偽陽性ピークを同定するように構成され得る。偽陽性ピークを同定するために、アノテーションデバイス１３０は、近くのピークのうちの最大のもののみを選択し得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、可能性のあるピークを含む区間内でピーク高さを比較し得る。アノテーションデバイス１３０は、その可能性のあるピークが、その区間における別の可能性のあるピークより小さいと決定し得る。したがって、アノテーションデバイス１３０は、その可能性のあるピークが偽陽性ピークであると決定し得、この可能性のあるピークを、次の分析のために、そのチャネルにおけるピークから排除し得る。その区間は、２５〜７５サンプリング単位幅の間であり得る。
【０１４４】
アノテーションデバイス１３０は、開示された実施形態と一致して、外部サイズ分類標準を作成するために、チャネルにおけるピークを断片サイズに関連づけるように構成され得る。いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、断片サイズとの関連づけのために、チャネルにおいて最も可能性が高いピークを選ぶ繰り返しアプローチを用い得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、断片サイズの第１のセットおよび対応するピーク位置の第１のセットを用いたピーク位置と断片サイズとの間の線形関係を、チャネルの第１の領域における同定されたピークを用いて、繰り返し、再推定し得る。このアプローチは、最初の条件を選択するために、より大きい断片サイズと関連づけられた低ノイズプロファイルを利用する。当業者により認識されているように、アノテーションデバイス１３０は、代替として、データに適用されるモデルに従って、残差を最小化する最適化ルーチンを用いて、ピークを断片サイズに関連づけるように構成され得る。この最適化ルーチンは、モデルに対する適合度を定量化する判定基準に基づいて、モデルにおいて検討されるピークを繰り返し、含め、および除去することができる。
【０１４５】
第１の工程において、アノテーションデバイス１３０は、チャネルにおいて、所定の塩基対長より大きい期待断片サイズを、最も遠い（キャピラリーにおける距離で）ピークに自動的に関連づけるように構成され得る。例えば、最後のピーク位置（例えば、ピーク位置３２１）は、最大の期待断片サイズ（例えば、断片サイズ３２３）と自動的に関連づけられ得る。次に最も大きいピークは、次に最も大きい期待断片サイズに関連づけられ得る。所定の塩基対長は、およそ５００塩基対であり得る。
【０１４６】
第２の工程において、アノテーションデバイス１３０は、塩基対の所定の範囲内の標識されたピークにモデルをフィッティングする（ｆｉｔ）ように構成され得る。当業者により認識されているように、塩基対によって表された値はまた、リピート数によっても表され得、塩基対による値の表現は、限定的であることを意図されない。例えば、線形サイズ分類ラダーは、１次最小二乗回帰を、所定の範囲内での標識されたピークにフィッティングすることにより、アノテーションデバイス１３０により作成され得る。所定の範囲は、３５０〜５５０塩基対の間から始まり得、６５０〜７５０塩基対の間で終わり得る。モデルは、アノテーションデバイス１３０が、サンプリング単位を塩基対長および／またはリピート数へ変換するのを可能にし得る。
【０１４７】
第３の工程において、アノテーションデバイス１３０は、チャネル３００の第１の領域３１０における同定されたピークを用いて、このモデルを繰り返し、再推定するように構成され得る。いくつかの実施形態において、サンプリング単位と塩基対との間の関係は、第１の領域３１０に渡って線形であり得る。チャネルのこの領域は、塩基対の所定の数より少ないものに対応するピークを含み得る。アノテーションデバイス１３０は、断片サイズの第１のセットおよび対応するピーク位置の第１のセットを用いた、ピーク位置と断片サイズとの間の線形関係を繰り返し、再推定するように構成され得る。アノテーションデバイス１３０は、より大きい断片サイズからより小さい断片サイズへ進み、線形関係を再推定するために用いられる断片サイズのセットおよび対応するピーク位置のセットへ、漸減する断片サイズを含め得る。例えば、断片サイズ３１３が次に最も大きい断片サイズである時、アノテーションデバイス１３０は、断片サイズ３１３および対応するピーク位置３１１を断片サイズの第１のセットおよび対応するピーク位置の第１のセットへ加えるように構成され得る。その後、アノテーションデバイス１３０は、第１の領域３１０における、断片サイズ３１３とより大きい断片サイズ、および第１の領域３１０における、ピーク位置３１１とより大きいピーク位置を用いて、ピーク位置と断片サイズとの間の線形関係を再推定し得る。
【０１４８】
各繰り返しにおいて、いくつかの実施形態では、アノテーションデバイス１３０は、最新の線形関係を用いて、次の断片サイズに対応するピーク位置を決定するように構成され得る。いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、次の断片サイズおよび最新の線形関係を用いて、予想されるピーク位置を決定し得る。この次の断片サイズは、漸減する断片サイズのうちの１つであり得、最新の線形関係は、上記で論じられた再推定された線形関係の１つであり得る。その後、アノテーションデバイス１３０は、その予想されるピーク位置を含むウィンドウを決定し得る。このウィンドウは、予想されるピーク位置の両側に５〜５０サンプリング単位の間を含み得る。アノテーションデバイス１３０は、予想されるピーク位置を含むウィンドウ内にチャネルにおける実際のピーク位置を決定し得る。この実際のピーク位置は、シグナル強度３０１の微分係数のｓｉｇｎの微分係数を用いて、上記のように決定され得る。アノテーションデバイス１３０は、その実際のピーク位置を、対応するピーク位置の第１のセットへ含むように構成され得る。このように、実際のピーク位置が変化するため、最新の線形関係が適切にアップデートされ得る。さらに、この方法は、データにおいてアーチファクトを同定するための追加の方法を提供し得る。例えば、アーチファクト３１７は、ウィンドウ（例えば、ウィンドウ３１９）内になく、そのため、アノテーションデバイス１３０が、線形関係を再推定する時、このアーチファクト３１７をスキップし得る。したがって、線形関係の推定は向上し得る。
【０１４９】
このように、アノテーションデバイス１３０は、ゲルのよりノイズが多い領域においてピーク関連づけの精度を増加させるように、新しいデータ点との線形関係を継続してアップデートし得る。この繰り返しアプローチは、不適切なサイズ分類ラダーパラメータ化に寄与し得るＲＯＸチャネルにおけるシグナルアーチファクトを無視することにおいて、現行の方法（ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ、ＧｅｎｅＭａｒｋｅｒ）より特異的であることが示されており、プライマーダイマーピークをＲＯＸ断片ピークとして取り違えることに対してロバストでもある。
【０１５０】
アノテーションデバイス１３０は、第２の領域３２０について、ピーク位置と断片サイズとの間の非線形関係を決定するように構成され得る。いくつかの実施形態において、この非線形関係は、１次、２次、もしくは３次スプラインモデルなどのスプラインモデル、または２次もしくは３次多項式モデルを含み得る。アノテーションデバイス１３０は、断片サイズ３２３およびピーク位置３２１などの、第２の領域３２０における断片サイズのセットおよび対応する同定されたピーク位置のセットを用いて、非線形関係を決定し得る。いくつかの態様において、図３Ａに示されているように、第１の領域３１０および第２の領域３２０は重複し得ない。例えば、第２の領域３２０のより低い境界は、第１の領域３１０のより高い境界に等しくあり得る。第２の領域３２０は、６５０〜７５０塩基対より大きい断片を含み得る。
【０１５１】
図３Ｂに示されているように、アノテーションデバイス１３０は、第１の領域３３０についての線形関係３３１と第２の領域３４０についての非線形関係３４１を組み合わせることにより、外部サイズ分類標準３５０を作成するように構成され得る。外部サイズ分類標準３５０を作成するために、アノテーションデバイス１３０は、線形関係３３１および非線形関係３４１を再サンプリングすることにより追加の点を生じさせ得る。外部サイズ分類標準３５０を作成するために、一変量スプラインモデルが、これらの追加の点にフィッティングされる。いくつかの実施形態において、追加の点は、外部サイズ分類標準に沿って均一な間隔で、例えば、一定数の塩基対だけ異なって、置かれ得る。追加の点の数は、断片サイズの最初の数より実質的に大きくあり得る。例えば、断片サイズの最初の数より２〜１０倍多い追加の点が作成され得る。例えば、４０〜２００個の間の追加の点が用いられ得る。
【０１５２】
いくつかの代替の実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、最適性基準を満たすサイズ分類標準を推定するように構成され得る。いくつかの態様において、アノテーションデバイス１３０は、データに適用されるモデルに従って、残差を最小化する最適化ルーチンを用いて、ピークを断片サイズに関連づけ得る。この最適化ルーチンは、モデルに対する適合度を定量化する判定基準に基づいて、モデルにおいて検討されるピークを繰り返し、含め、および除去することができる。
【０１５３】
例えば、アノテーションデバイス１３０は、チャネルにおいて、可能性のあるピークの２つ以上のサブセットを作成するように構成され得る。この作成は、決定論的であり得、または少なくとも部分的にランダムであり得る。非限定的例として、各サブセットは、第１のピークを含み得る。アノテーションデバイス１３０は、各サブセットについてサイズ分類標準を決定するように構成され得る。これらのサイズ分類標準は、線形関係、あるいはスプラインモデルまたは２次もしくは３次多項式モデルなどの非線形関係を含み得る。いくつかの態様において、アノテーションデバイス１３０は、比較点を作成するために、サイズ分類標準を再サンプリングするように構成され得る。アノテーションデバイス１３０は、再サンプリングされたサイズ分類標準と参照モデルとの間の比較に基づいて、再サンプリングされたサイズ分類標準の少なくとも一部について費用関数を計算するように構成され得る。参照モデルは、期待されるサイズ分類標準を含み得る。当業者により認識されているように、アーチファクトを含むサブセットを用いて作成されたサイズ分類標準は、参照モデルと大いに異なり得る。これらのモデルについての費用関数の値は、ほとんどまたは全くアーチファクトを含まない対象についての費用関数の値より大きい可能性が高い。費用関数は、Ｌ１ノルム、Ｌ２ノルム、または当業者に公知の他の費用関数を含み得る。したがって、アノテーションデバイス１３０は、リピート領域の少なくとも１つおよび少なくとも１つの遺伝子特異的ピークをサイズ分類する場合、費用関数を最小化するサイズ分類標準を用いるように構成され得る。この方法は、有利には、可能性のあるピークにおいてアーチファクトの同定を必要とせず、そのようなアーチファクトが、より高い費用をもたらし得るからである。当業者により認識されているように、この方法は、内部サイズ分類標準または外部サイズ分類標準を推定するために用いられ得る。
【０１５４】
図４Ａは、開示された実施形態と一致した、データファイルの例示的なチャネルを描く。場合によっては、上記の外部サイズ分類標準は、外部から加えられた公知のサイズの色素標識ＰＣＲ産物とゲノム領域のＰＣＲ断片との間の組成の違いのために、不正確である可能性がある。例えば、キャピラリー電気泳動におけるＲＯＸ断片移動度は、ＦＭＲ１断片移動度と異なり、ＲＯＸ断片のヌクレオチドのバランスがとれた性質と比較して、ＦＭＲ１断片のＧＣリッチな性質による。これらの不正確のために、アノテーションデバイス１３０は、内部サイズ分類標準を作成するように構成され得る。いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、内部サイズ分類標準および外部サイズ分類標準を用いて移動度が補正されたサイズ分類標準を作成するように構成され得る。外部サイズ分類標準は、図３Ａおよび３Ｂに関して上で記載されているように、ＲＯＸチャネルから導かれ得る。アノテーションデバイス１３０による内部サイズ分類標準の作成は、データファイルのチャネルにおいてリピートプロファイルを同定し、リピートピーク位置とリピート断片サイズとの間の線形関係を推定することを含み得る。
【０１５５】
図４Ａに示されているように、データファイルのチャネルは、リピートプロファイル４１０を含み得る。リピートプロファイルは、最小の検出されたＰＣＲ断片ピークから始まり、最大の検出されたＰＣＲ断片ピークまたは遺伝子産物ピークで終わるチャネルの部分を含み得る。例えば、リピートプロファイル４１０は、２０００サンプリング単位後から始まり得、４５００〜５０００サンプリング単位の間で終わり得る。図４Ａに描かれているように、リピートプロファイル４１０は、漸増的に大きくなる断片に対応するピークのリピート的連続を表示し得る。ゲノム試料に依存して、リピートプロファイル４１０はまた、４５００サンプリング単位あたりのピークなど、１つまたは複数の遺伝子産物ピークを表示し得る。
【０１５６】
アノテーションデバイス１３０は、データファイルのチャネルにおいてリピートプロファイル４１０を同定するように構成され得る。いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、ＲＯＸラダーなどの外部サイズ分類標準を用いて、リピートプロファイル４１０の始まりの位置を予想し、近似し得る。アノテーションデバイス１３０が、品質管理基準（下記）を満たす外部サイズ分類標準を作成することができない場合、または内部モデルのみを用いる場合、アノテーションデバイス１３０は、以下の過程を用いて、リピートプロファイル４１０の始まりを決定し得る。
【０１５７】
第１の工程において、アノテーションデバイス１３０は、リピートプロファイルのおよその開始位置を決定するように構成され得る。アノテーションデバイス１３０は、第１のウィンドウサイズＷを用いてチャネルの総和変換（ｓｕｍｍａｔｉｏｎ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を実施し得る：
【０１５８】
【数１０】
2019502367.tif 000013
【０１５９】
このように、変換されたデータ、ｔ（ｉ）は、重複していない第１ウィンドウとして、チャネルについての第１のウィンドウ内のシグナル強度の和を含み得る。当業者により認識されているように、アノテーションデバイス１３０は、追加として、または代替として、チャネルをローパスフィルタにかけ得る。チャネルｃは、ＦＡＭチャネルであり得、第１のウィンドウサイズＷは５０〜１０００サンプリング単位の間であり得る。変換されたシグナルにおける最大のピーク（プライマーダイマー増幅事象により引き起こされる可能性がある）について、アノテーションデバイス１３０は、上記で提供されたピークショルダーの議論に従って、少なくとも最右のピークショルダーを見出し得る。
【０１６０】
ｔ（ｉ）を用いて、最右のピークショルダーの位置を決定した後、アノテーションデバイス１３０は、チャネルの第２のウィンドウ内のシグナル強度を周波数ドメインへ変換し、第２ウィンドウ内のシグナル強度の優位周波数が周波数基準を満たす時を決定するように構成され得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、この位置から始まる、第２のウィンドウ内のチャネルの優位周波数を計算し得る。第２のウィンドウは、１００〜２００サンプリング単位の幅の間であり得る。アノテーションデバイス１３０は、シグナルの優位周波数と所定の周波数との間の差が、実験的に導かれた差の基準を満たす、最初の第２のウィンドウとしてリピートプロファイルのおよその始まりを決定し得る。
【０１６１】
第２の工程において、アノテーションデバイス１３０は、リピートプロファイルの厳密な開始位置を決定するように構成され得る。アノテーションデバイス１３０は、第３のウィンドウ内のシグナル強度の統計的尺度を用いて、この厳密な開始位置を決定し得る。例えば、正確なリピート開始部位は、第３のウィンドウ内のシグナル強度の所定のパーセンタイルより大きい最初の位置として、アノテーションデバイス１３０により決定され得る。いくつかの実施形態において、第３のウィンドウは、およその開始位置で始まり得る。下記の方程式において、ａはシグナル開始部位のおよその位置を表すものとし、ｃはチャネルとする：
ｗ＝［ａ，ａ＋１０００］
【０１６２】
【数１１】
2019502367.tif 000014
【０１６３】
この例において、統計的尺度は、８５パーセンタイルであるが、そのパーセンタイルは、例えば、７０〜９９パーセンタイルの間であり得る。同様に、第３のウィンドウの幅は１０００サンプリング単位であるが、第３のウィンドウは５０〜５０００サンプリング単位幅の間であり得る。平均および標準偏差などの他の統計的尺度から導かれた振幅閾値もまた用いられ得る。チャネルｃはＦＡＭチャネルであり得る。
【０１６４】
第２の工程において、アノテーションデバイス１３０は、リピートプロファイルの終了位置を決定するように構成され得る。いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、リピートプロファイルの終了位置の終点（ｅｎｄ）を決定するためにチャネルをフィルタにかけ得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、第４のウィンドウを用いてチャネルに渡ってパーセンタイルフィルタを適用し得る。その変換が適用された後、シグナル終了位置は、振幅閾値を超える最後の変換された領域として、アノテーションデバイス１３０により選択され得る：
ｔ（ｉ）＝Ｑ９０（ｓ（［ｉｘ，ｉｘ＋１００］，ｃ）），ｉｘ＝（１００ｘ｜ｘ＝１，２，３…）
【０１６５】
【数１２】
2019502367.tif 000015
【０１６６】
このように、変換されたデータ、ｔ（ｉ）は、第４のウィンドウに渡る、チャネルｃのパーセンタイルフィルタにかけられた値を含み得る。この例において、パーセンタイルは、９０パーセンタイルであるが、パーセンタイル値は、７０パーセンタイルから９９パーセンタイルまでの範囲であり得る。同様に、第４のウィンドウの幅は１００サンプリング単位であるが、第３のウィンドウは５０〜５０００サンプリング単位幅の間であり得る。平均および標準偏差などの他の統計的尺度から導かれた振幅閾値もまた用いられ得る。チャネルｃはＦＡＭチャネルであり得る。ここで、終点は、リピートプロファイル４１０における最終値のインデックスであり得る。振幅閾値は、機器特異的であり得、実験的に導かれ得る。ここで、その値は１００ＲＦＵであるが、この値は、限定的であることを意図されない。
【０１６７】
図４Ｂは、開示された実施形態と一致した、リピートプロファイルを用いた内部サイズ分類標準の作成を描く。アノテーションデバイス１３０は、リピートプライマーに起因する、チャネルにおける振幅ピークを同定するように構成され得る。アノテーションデバイス１３０は、これらのピークを、期待される断片サイズに関連づけて、内部サイズ分類標準を作成し得る。いくつかの態様において、下記でより詳細に論じられているように、アノテーションデバイス１３０は、リピートプロファイルの周期性から導かれたウィンドウを用いてリピートピークを繰り返し、コールし得る。アノテーションデバイス１３０は、周期性がリピートプロファイルにおいてシフトするにつれて、このウィンドウを調整し得、リピートピークが抑圧されている所に（例えば、ＡＧＧ割り込み部位において）ピーク位置を内挿し得る。
【０１６８】
第１の工程において、シグナルの開始位置および終了位置が同定された後、アノテーションデバイス１３０は、最初の区間値および最初の振幅閾値を決定するように構成され得る。上で記載されているように、アノテーションデバイス１３０は、周波数に基づいた分析を用いてリピートプロファイルの周期性を動的に決定し得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、リピートプロファイルの最初の部分にフーリエ変換を実施して、リピートプロファイルの優位周波数を同定し得る。最初の部分は、開始位置で始まり得る。アノテーションデバイス１３０は、優位周波数の逆数を用いて、予想されるピーク位置を決定するための最初の区間値を計算し得る：
【０１６９】
【数１３】
2019502367.tif 000016
【０１７０】
【数１４】
2019502367.tif 000017
【０１７１】
ここで、ｆｒｐは、最初の部分に渡るチャネルｃの優位周波数である。この例において、最初の部分は、１０００サンプリング単位幅であるが、最初の部分は、５００〜５０００サンプリング単位幅の間であり得る。チャネルｃはＦＡＭチャネルであり得る。
【０１７２】
アノテーションデバイス１３０は、リピートプロファイルにおいて、リピートピークをコールするための閾値を動的に決定し得る。その閾値は、振幅閾値であり得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、リピートプロファイルの最初の部分に渡って計算された統計的尺度を用いて、リピート位置を同定するための最初の振幅閾値を決定するように構成され得る。最初の部分は開始位置で始まり得、統計的尺度はパーセンタイルであり得る：
ｔｒｐ＝Ｑ２５（ｓ（［開始点，開始点＋２０００］），ｃ）
【０１７３】
ここで、ｔｒｐは、最初の振幅閾値である。この例において、２５パーセンタイルが統計的尺度であるが、パーセンタイルは５パーセンタイル〜５０パーセンタイルの間の範囲であり得る。同様に、最初の部分は、２０００サンプリング単位幅であるが、１００〜５０００単位幅であり得る。チャネルｃはＦＡＭチャネルであり得る。アノテーションデバイス１３０は、平均および標準偏差などの他の統計的尺度を用いて、最初の振幅閾値を決定し得る。
【０１７４】
第３の工程において、アノテーションデバイス１３０は、リピートピーク位置のセットを繰り返し、作成するように構成され得る。様々な態様において、アノテーションデバイス１３０は、繰り返しのごとに、リピートプロファイル４１０において、予想されるピーク位置４２５を決定し得る。予想されるピーク位置４２５は、前のピーク位置４２１および区間値４２３に依存し得る。いくつかの態様において、アノテーションデバイス１３０は、スライドウィンドウを用いて、リピートプロファイルにおいてリピートピークをコールし得る。いくつかの実施形態において、区間値４２３は、最初の区間値から導かれ得る。アノテーションデバイス１３０は、予想されるピーク位置４２５を含むウィンドウ４２７内でリピートピーク位置を同定し得る。いくつかの実施形態において、ピークを選択するためのウィンドウは、区間値４２３の２５〜１００％であり得る。ある特定の実施形態において、ウィンドウは、区間値４２３の５０〜１００％の間、または８０〜１００％の間である。アノテーションデバイス１３０は、ウィンドウ４２７内の最大ピークの位置を決定するように構成され得る。この同定されたピーク位置におけるシグナル強度が振幅閾値４２９を超える場合、この実際のピーク４３１が、リピートピーク位置のセットに加えられ得る。いくつかの実施形態において、振幅閾値４２９は、最初の振幅閾値から導かれ得る。次の繰り返しにおいて、前のピーク位置が、この繰り返し中に同定された実際のピーク４３１であり得る。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、振幅閾値４２９および区間値４２３の１つまたは複数をアップデートするように構成され得る。例えば、振幅閾値４２９は、２つ以上の前の繰り返しについての実際のピークにおけるシグナル強度の平均であり得る。同様に、区間値４２３は、２つ以上の前の繰り返しについての、実際のピークと前のピークとの間の位置との差の平均であり得る。いくつかの実施形態において、これらの平均は、３〜５０個の以前の繰り返しに関するものであり得る。このように、アノテーティングデバイス１３０は、リピートプロファイルの経過に渡ってのリピートピークの周期性および振幅におけるシフトに適応し得る。
【０１７６】
【数１５】
2019502367.tif 000018
【０１７７】
【数１６】
2019502367.tif 000019
【０１７８】
ここで、ｘｎｅｘｔは、そのウィンドウ内の最大のピークの位置であり、このピークは、チャネルｃ（ＦＡＭチャネルであり得る）についてのシグナル強度が振幅閾値を超える場合、リピートピーク位置のセットに加えられる。いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、閾値より下のリピートプロファイルにおけるリピートピークを内挿し得る。例えば、シグナル強度が振幅閾値を超えない時、予想されるピーク位置がリピートピーク位置のセットに加えられる。このように、アノテーティングデバイス１３０は、リピートピーク振幅が縮小する領域においてピークを内挿し得る。この内挿は、アノテーションデバイス１３０により作成されるサイズ分類標準の精度を向上させ得る。
【０１７９】
第４の工程において、アノテーションデバイス１３０は、リピートピーク位置とリピート断片サイズとの間の関係を記載する内部サイズ分類標準を作成するように構成され得る。いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、リピートプロファイルにおける推定される開始ピーク位置および次のピーク位置を用いて、サンプリング単位から塩基対単位へマッピングする較正曲線（すなわち、サイズ分類標準）を作成し得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、リピートピーク位置のセットおよび対応する断片サイズのセットを用いて内部サイズ分類標準を作成し得る。アノテーションデバイス１３０は、最初のリピートピーク位置を最小の断片サイズと関連づけ、２番目のリピートピーク位置を次に最も小さい断片サイズと関連づけるなどにより、リピートピーク位置と断片サイズとの間の対応を確立し得る。いくつかの実施形態において、各追加のリピートピーク位置は、前の断片サイズより大きい１つの追加のリピートである断片サイズと関連づけられ得る。アノテーションデバイス１３０は、対応する断片サイズのセットをリピートピーク位置のセットに対して回帰推定をすることにより関係を作成し得る。
【０１８０】
図２に関して上で記載されているように、アノテーションデバイスは、内部サイズ分類標準、外部サイズ分類モード、または組み合わされたサイズ分類標準を用いるように構成され得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、内部サイズ分類標準および外部サイズ分類標準を用いて、移動度補正済みサイズ分類標準（ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｓｉｚｉｎｇ  ｓｔａｎｄａｒｄ）を作成するように構成され得る。アノテーションデバイス１３０は、内部サイズ分類標準および外部サイズ分類標準を用いるアフィン変換を作成することにより、移動度補正済みサイズ分類標準を作成し得る。このアフィン変換は、外部サイズ分類ラダーの線形成分と非線形成分の両方が移動度補正済みサイズ分類標準に寄与することを保証し得る。アフィン変換は、以下の方程式により記載され得る：Ｌｒｐ（ｘ）は内部サイズ分類標準を表すものとし、ＬＲＯＸ（ｘ）は外部モデルを表すものとし、ＬＮＬ（ｘ）は、外部モデルの非線形領域についての一変量スプラインモデルを表すものとする：
Ｌｒｐ（ｘ）＝ｍｒｐｘ＋ｂｒｐ
【０１８１】
【数１７】
2019502367.tif 000020
【０１８２】
【数１８】
2019502367.tif 000021
【０１８３】
この例において、移動度補正済みサイズ分類標準の感度は、外部サイズ分類標準ＬＲＯＸ（ｘ）の感度と内部サイズ分類標準Ｌｒｐ（ｘ）の感度の比に依存し、一方、移動度補正済みサイズ分類標準のオフセットは、内部サイズ分類標準のオフセットおよび外部サイズ分類標準のオフセット、ならびに外部サイズ分類標準の感度と内部サイズ分類標準の感度の比に依存する。アノテーションデバイス１３０は、アフィン変換を外部サイズ分類標準に適用して、移動度補正済みサイズ分類標準を得るように構成され得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、上記の方程式を用いて、移動度補正済みサイズ分類標準を計算し得る。
【０１８４】
図１１に関して上で記載されているように、アノテーションデバイス１３０は、ジェノタイプピークを同定し、かつサイズ分類するように構成され得る。チャネルは、リピートセグメントと遺伝子特異的増幅の両方を呈示し得、それゆえに、アノテーションデバイス１３０は、ジェノタイプピークを同定する前に、シグナル強度のこれらの２つの成分を分離し得る。追加として、アノテーションデバイス１３０はまた、下でより詳細に記載されているように、異常なジェノタイプピークを同定するように構成され得る。
【０１８５】
第１の工程において、アノテーションデバイス１３０は、リピート増幅事象のシグナル寄与を遺伝子特異的増幅事象のシグナル寄与から分離するための、バックグラウンドモデルを作成するように構成され得る。バックグラウンドモデルの生成は、ＦＭＲ１リピート領域におけるＡＧＧ割り込み配列から生じるギャップなどの、リピート領域における割り込みにより生じるリピートプロファイルにおけるギャップに対処し得る。バックグラウンドモデルの生成はまた、リピートプロファイルのリピートピーク成分から偏向するが、デコンボルーションするための周波数に基づいたフィルタリングアプローチを可能にするだろう特性をもたない、遺伝子特異的産物ピークに対処し得る。
【０１８６】
図５は、バックグラウンドモデル５２０および動的閾値５３０を用いてアノテートされた例示的なリピートプロファイル５１０を描く。いくつかの実施形態において、バックグラウンドモデルは、所定のウィンドウ内のリピートプロファイルの大きさに依存し得る。リピートプロファイルにおけるギャップがリピート領域における配列割り込み５７０から生じる場合、バックグラウンドモデルは、その割り込み配列に近位の局所的リピートピークの大きさに依存し得る。遺伝子特異的産物ピーク５４０、伸長ピーク５５０、およびモザイク事象（ｍｏｓｉａｃｉｓｍ）ピーク５６０の間のバックグラウンドモデルもまた、割り込み配列に近位の局所的リピートピークの大きさに依存し得る。
【０１８７】
第１の工程において、アノテーションデバイス１３０は、リピートプロファイル５１０をフィルタにかけることによりバックグラウンドモデル５２０を作成するように構成され得る。いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、インプットデータのスライドウィンドウの少なくとも１つの統計的尺度に基づいて値をアウトプットするように構成されたフィルタを用いて、リピートプロファイル５１０をフィルタにかけ得る。例えば、フィルタは、ウィンドウ内のリピートプロファイル５１０の中央値の和および四分位範囲をアウトプットし得る。ウィンドウは、３〜３０リピートの幅の間、例えば、１１リピートの幅であり得る。このデザインは、アノテーションデバイス１３０が、ＡＧＧ割り込み配列および遺伝子特異的産物により引き起こされるリピートシグナルにおける大きなゆらぎを拒否すると同時に、ウィンドウにおいてリピートピークの高さを捕捉することを可能にし得る。当業者により認識されているように、中央値平滑化フィルタおよび線形フィルタ（例えば、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈフィルタ）などの他のフィルタ型が代わりに用いられ得る。
【０１８８】
第２の工程において、アノテーションデバイス１３０は、バックグラウンドモデルの高周波成分を軽減するように構成されたフィルタを用いて、バックグラウンドモデル５２０をさらにフィルタにかけるように構成され得る。いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタを用いて、バックグラウンドモデル５２０の高周波成分を軽減し得る。Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタは、３〜３０の幅の間、例えば、７リピートの幅であり得る。Ｓａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタは、リピートプロファイル動力学と調和するように整えられ、他のフィルタデザインのアウトプットで目に見えるピークおよびトラフを妨げ得る。
【０１８９】
第３の工程において、アノテーションデバイス１３０は、上記の方法に従って、生じたバックグラウンドモデル５２０においてピークショルダーを決定するように構成され得る。いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、ピークショルダー内のシグナル強度を、ピークショルダー値の間に線形的に内挿された値に置き換え得る。
【０１９０】
アノテーションデバイス１３０は、バックグラウンドモデルから動的閾値を生じるように構成され得る。動的閾値は、遺伝子特異的産物ピークを同定するためにアノテーションデバイス１３０により用いられ得る。動的閾値を生じるようにバックグラウンドモデルを動的にスケーリングすることにより、アノテーションデバイス１３０は、より低い断片サイズ範囲において特異性を増加させ得、一方、より高い断片サイズ範囲において感度を増加させ得る。いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、１番目の断片サイズより上で、かつ２番目の断片サイズより下のサイズを有する、増幅産物に対応するバックグラウンドモデルの第１の領域を決定するように構成され得る。アノテーションデバイス１３０はまた、２番目の断片サイズより上のサイズを有する、増幅産物に対応するバックグラウンドモデルの第２の領域を決定し得る。アノテーションデバイス１３０は、最初のスケーリング因子からその最初のスケーリング因子より低い第２のスケーリング因子までを変動する第１のスケーリング因子を、バックグラウンドモデルの第１の領域に掛け得る。例えば、第１のスケーリング因子は、最初のスケーリング因子から第２のスケーリング因子までを線形的に変動し得る。アノテーションデバイス１３０はまた、バックグラウンドモデルの第２の領域に第２のスケーリング因子を掛け得る。
【０１９１】
下記の方程式において、ＭＢＧはバックグラウンドモデル５２０を表すものとし、ＭＧは動的閾値を表すものとし、ｒ１は第１の断片サイズに対応するインデックスを表すものとし、ｒ２は第２の断片サイズに対応するインデックスを表すものとする：
【０１９２】
【数１９】
2019502367.tif 000022
【０１９３】
この例において、第１のスケーリング因子は３であり、第２のスケーリング因子は１．５であるが、これらの値は限定的であることを意図されない。第１のスケーリング因子は、１．２５〜１０の間を変動し得、第２のスケーリング因子は１．２５〜１０の間を変動し得る。いくつかの態様において、第１の断片サイズは、０リピート、または多くも２０リピートに対応し得る。様々な態様において、第１の断片サイズは、７０〜１９０リピートの間、例えば、１２０リピートに対応し得る。この例において、アノテーションデバイス１３０は、０〜１２０リピートの間の領域において、３から１．５へ減少する区分的スケーリング因子をバックグラウンドモデル５２０に適用し得、その後、１２０リピート後、１．５での一定のままにして、動的閾値５３０を得る。
【０１９４】
アノテーションデバイス１３０は、動的閾値５３０を用いてジェノタイプピークセットを決定するように構成され得る。アノテーションデバイス１３０は、上記のような、シグナル強度の微分係数のｓｉｇｎの微分係数に基づいて、リピートプロファイルにおいて、可能性のある位置を同定し得る。可能性のあるピーク位置におけるリピートプロファイルの値がその可能性のあるピーク位置における動的閾値の値を超える時、アノテーションデバイス１３０は、ジェノタイプピークセットにその可能性のあるピーク位置を含み得る。
【０１９５】
アノテーションデバイス１３０は、サイズ分類ラダーおよび遺伝子特異的産物ピーク位置を用いて、リピートサイズを遺伝子特異的産物ピークに関連づけるように構成され得る。アノテーションデバイス１３０により用いられるサイズ分類標準は、内部サイズ分類標準、外部サイズ分類標準、および移動度補正済みサイズ分類標準のうちの１つを含み得る。いくつかの態様において、アノテーションデバイス１３０は、以下の方程式：
【０１９６】
【数２０】
2019502367.tif 000023
を用いて、リピートサイズを産物ピーク位置に関連づけ得る。
【０１９７】
この例において、Ｌサイズ分類（ｘ）はサイズ分類標準であるとし、Ｓｐは遺伝子特異的産物プライマーの塩基対でのサイズであるとし、Ｓｒはリピートの塩基対でのサイズであるとし、Ｇを、動的閾値を用いて同定されたジェノタイプピークセットであるとする。非限定的例として、Ｓｐは２０〜１０００塩基対の間の範囲、例えば、２４０塩基対であり得るが、他の値も可能である。同様に、Ｓｒは３塩基対であり得るが、他の値も可能である。これらのおよび他のパラメータにおける遺伝子特異的またはリピート特異的変動は、記載された構成の範囲内である。
【０１９８】
アノテーションデバイス１３０は、ジェノタイプピークセットを決定した後、正常な遺伝子特異的産物ピークとして存在しない遺伝子特異的産物ピーク（すなわち、ホモ接合体女性（ｆｅｍａｌｅ）試料、ｎ／ｎ＋１ジェノタイプ、伸長型試料）を解明するように構成され得る。ホモ接合体女性ピークは、提供された性情報を用いて解明し得る。例えば、単独でコールされる遺伝子特異的産物ピークは、女性試料についてのホモ接合体ジェノタイプへと解明され得る。
【０１９９】
図６Ａに示されているように、アノテーションデバイス１３０は、近位ジェノタイプ（ｎ／ｎ＋１）を有するゲノム試料について遺伝子特異的産物ピーク位置を決定するように構成され得る。そのような試料を同定することは、困難な問題であり得、そのような試料は、女性試料の１０％を構成する。アノテーションデバイス１３０は、第１のピーク６３１の側の第２のピーク６３３を同定することによりそのような試料を同定し得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、リピートプロファイル６１０ａにおける第２のピーク６３３を第１のピーク６３１に隣接した第２の位置で同定し得る。第２のピーク６３３は、第１のピーク６３１と大きさが類似し得る。例えば、アノテーションデバイス１３０は、第２の位置におけるリピートプロファイルの第２の値が、第１の値に基づいた振幅基準を満たすこと決定し得る。例えば、第２の位置におけるリピートプロファイルの第２の値は、第１の値の７０％〜９０％の間である振幅閾値を超え得る。いくつかの実施形態において、第１のピーク６３１と第２のピーク６３３の両方が、動的閾値６２０を超え得る。
【０２００】
図６Ｂに示されているように、アノテーションデバイス１３０は、ジェノタイプピークが同定されないが、リピートプロファイル６１０ｂが伸長を示す時、試料を、伸長型試料と標識するように構成され得る。当業者により認識されているように、リピート領域がＦＭＲ１である場合、そのような試料は、２００リピートを通り過ぎて遠くへ伸長するリピートプロファイルを有する試料として存在し得る。
【０２０１】
任意の複雑なＰＣＲに基づいたワークフローのように、産物は、オペレータのエラーかまたは機器のエラーのいずれかの結果として増幅できないことが時々あり得る。これは試料を解釈不可能にし得るため、アノテーションデバイス１３０は、再分析のために試料にフラグを付けるように構成され得る。アノテーションデバイス１３０は、ユーザーが結果を間違って解釈することを防ぐために複数の品質管理測定を実施し得る。いくつかの実施形態において、アノテーションデバイス１３０は、以下のこれらの品質管理基準の２つのカテゴリーを含み得る：３つの基準（サイズ分類標準基準、リピートプロファイルシグナル・ノイズ比基準、およびリピートプロファイル混入基準）が明確に試料を不合格にして、ジェノタイプコールを生じないこと、および１つの基準（マイナーアレル感度基準）が、より大きな疑念をもってユーザーにより解釈されるはずであるジェノタイプコールを生じること。この「リスクがある」ＱＣカテゴリーは、それらのデータが信頼性をもって生じ得るレベルより下にジェノタイプコールについての閾値を設定することからユーザーを保護するために設計される。
【０２０２】
図７Ａ〜７Ｃは、異なる品質管理基準を有する試料を描く。図７Ａは、不十分なＲＯＸラダーを有する試料を描く。この試料は、サイズ分類標準基準に不合格であり得る。サイズ分類標準基準は、サイズ分類標準が正しく導かれていること、およびそれが、内部キャリブレータに関する期待にマッチすることを保証する。アノテーションデバイス１３０は、これを保証するために３つの異なる基準を用い得、試料が合格するために少なくとも１つの基準の達成を必要とし得る。例えば、全ての３つの基準の達成が必要とされ得る。基準の１つ目は、外部ラダーピークに対する外部モデル適合度についての決定係数（Ｒ２）が、０．９８より大きいことであり得る。２つ目の基準は、内部ラダーピークに対する内部モデル適合度についての決定係数が、０．９８より大きいことであり得る。最後の基準は、内部サイズ分類標準を外部サイズ分類標準と比較する一貫性基準であり得る。適合を通して、等間隔での点についての内部モデル適合度に対する外部モデル適合度が０．９８より大きい時、この一貫性基準が満たされ得る。上記の決定係数閾値を、間違ったサイズ分類を生じた試料と、正しいサイズ分類を生じた試料との間を正確に識別するレベルを選択することにより、独立した訓練セットから実験的に決定した。他の実施形態において、周波数に基づいた分析は、リピートプロファイルが、サイズ分類に用いるのに十分な周期性のものであるかどうかを決定し得る。
【０２０３】
図７Ｂは、十分にＰＣＲ増幅されていない試料を描く。この試料はリピートプロファイルシグナル・ノイズ比基準に不合格であり得る。この基準は、ユーザーが、十分に増幅されていない試料についての結果を解釈することを防ぐ。十分に増幅されていない試料は、処理中のアルゴリズムの仮定を乱し得、間違ったまたは偽陰性のジェノタイプが報告され／見逃されることを生じる可能性があり得る。高レベルで、アルゴリズムは、リピートプロファイルの開始に近位の機器のノイズレベルに対して、リピートプロファイルの開始についての十分なシグナル・ノイズ比が存在することを検証し得る。このＱＣについてのＳＮＲ閾値は、間違ったサイズ分類を生じた試料と、正しいサイズ分類を生じた試料との間を正確に識別するレベルを選択することにより、独立した訓練セットから実験的に決定され得る。
Ｌｎ＝Ｑ７５（ｓ（［Ｉｒｐ（１）−２００，Ｉｒｐ（１）−５０］，ｃ））
【０２０４】
【数２１】
2019502367.tif 000024
【０２０５】
【数２２】
2019502367.tif 000025
【０２０６】
これらの例示的な方程式において、チャネルｃはＦＡＭチャネルであり得る。この例において、７５パーセンタイルが、リピートプロファイルのウィンドウ表示の部分に関して、アノテーションデバイス１３０により計算され得る。他のパーセンタイル、例えば、６０〜９５パーセンタイル、または平均および標準偏差などの他の統計的尺度が用いられ得ることを当業者は認識しているだろう。同様に、この限定的例において、リピートプロファイルのウィンドウ表示の部分は、開始位置の２００サンプリング単位前から、開始位置の５０単位前まで伸長する。しかし、チャネルの他のウィンドウもまた用いられ得る。
【０２０７】
図７Ｃは、混入ピークを有する試料を示す。この試料は、リピートプロファイル混入基準に不合格であり得る。リピートプロファイル混入基準は、不適切なジェノタイプが報告されることに寄与する可能性がある、不適切な試料調製に関係した、オフターゲット増幅または増幅アーチファクトの事例を同定するために用いられ得る。このＱＣについての不合格基準は、遺伝子特異的産物ピークが、遺伝子特異的プライマーにより生じる可能性があり得ない範囲において同定されることとして定義され得る。例えば、遺伝子特異的産物ピークについて導かれたリピート数が、０個未満のリピート（すなわち、場合によっては、２４０ｂｐ未満）であるならば、試料は、混入を有するとフラグを付けられ得る。
【０２０８】
【数２３】
2019502367.tif 000026
【０２０９】
マイナーアレル感度基準は、機器のバックグラウンドノイズと試料における最大のジェノタイプピークとの間の比に関して、アッセイについて可能であるレベルより下にマイナーアレルコーリング閾値を設定しないようにユーザーに警告し得る。ノイズレベル（上記で説明されているような）と最大ジェノタイプピークとの間の比率がマイナーアレル頻度を超えるならば、そのレベルでのマイナーアレルは正確に同定することができず、その試料は、ユーザーがより厳格に解釈するべきである「リスクがある」ＱＣとフラグを付けられる。下記の方程式において、Ｇはジェノタイプピーク位置のセットを表すものとし、ｃはチャネルを表すものとし、Ｔｍａはユーザーによって特定化されたマイナーアレル閾値を表すものとし、Ｌｎはマイナーアレル感度基準のために計算されたシグナルのバックグラウンドノイズレベルを表すものとする：
【０２１０】
【数２４】
2019502367.tif 000027
【０２１１】
【数２５】
2019502367.tif 000028
【０２１２】
図８は、ジェノタイプピークサイズ分類のための例示的なコンピュータシステムを描く。いくつかの実施形態において、コンピューティングシステム８００は、プロセッサ８０１、メモリ８０３、ディスプレイ８０５、Ｉ／Ｏインターフェイス８０７、およびネットワークアダプタ８０９を含む。これらのユニットは、バス８１１により、またはワイヤレスでそれぞれの他のものと通信し得る。図８に示されたコンポーネントは、単一のデバイスまたは複数のデバイスにおいて存在し得る。
【０２１３】
開示された実施形態と一致して、プロセッサ８０１は、マイクロプロセッサ、中央処理装置（ＣＰＵ）、図形処理装置（ＧＰＵ）、または類似したデバイスであり得る。メモリ８０３は、コンピュータハードディスク、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、リムーバブル記憶装置、またはリモートコンピュータ記憶装置などの非一過性機器を含有する非一過性メモリを含み得る。いくつかの態様において、メモリ８０３は、ソフトウェアプログラムを記憶するように構成され得る。いくつかの態様において、プロセッサ８０１は、開示されたシステムおよび方法の運用を実施するようにコンピューティングシステム８００を構成し得る、メモリ８０３に記憶された非一過性命令および／またはプログラムを実行するように構成され得る。様々な態様において、当業者により認識されているように、プロセッサ８０１は、開示されたシステムおよび方法の運用を実施するように、リモートメモリに記憶された非一過性命令および／またはプログラムを実行するように構成され得る。ディスプレイ８０５は、視覚的アウトプットを提供する任意のデバイスであり得、例えば、コンピュータモニター、ＬＣＤスクリーンなどである。Ｉ／Ｏインターフェイス８０７は、キーボード、マウス、トラックボール、オーディオインプットデバイス、タッチスクリーン、赤外線インプットインターフェイス、または類似したデバイスなどの、コンピューティングシステム８００のユーザーからコンピュータシステム８００へ情報を伝達するための手段を含み得る。ネットワークアダプタ８０９は、コンピューティングシステム８００が外部ネットワークと情報を交換することを可能にするための手段を含み得る。例えば、ネットワークアダプタ８０９は、ワイヤレスワイドエリアネットワーク（ＷＷＡＮ）アダプタ、ブルートゥースモジュール、近距離無線通信モジュール、またはローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）アダプタを含み得る。
【０２１４】
本明細書に開示されたアッセイを行うための試薬、分析ソフトウェア、および高分子のキットもまた本明細書に提供される。ある特定の実施形態において、試料においてリピート領域をジェノタイピングするためのキットは、本明細書に記載されているような、リピート領域の増幅のための１つまたは複数のプライマー、バッファー、および分析ソフトウェアまたはソフトウェアキーを含む。他の実施形態において、ジェノタイプピークサイズ分類のためのキットは、リピート領域の増幅のための１つまたは複数のプライマー、バッファー、ならびに分析ソフトウェアを記憶する非一過性媒体および／またはソフトウェアキーを含む。ある特定の態様において、キットは、本明細書に記載されているような遺伝子座のリピート領域の一部に同一または相補的であるプライマーを含む。他の態様において、キットは、増幅プライマーセットまたは複数の増幅プライマーセットをさらに含み、そのプライマーの少なくとも１つが、上に記載されているような遺伝子座のリピート領域の一部に同一または相補的である配列を含む。本明細書に記載されているような分析ソフトウェアは、ＣＤ−ＲＯＭまたは他のデータ記憶デバイスなどの非一過性コンピュータ可読媒体に記憶されたデータおよび／または命令を含み得る。用語「ソフトウェアキー」は、本明細書に記載された分析ソフトウェアのダウンロードもしくはそれへのアクセスを可能にするように構成された、ソフトウェアライセンスキー、暗号化キー、ＵＲＬ、ＵＲＬ、および／またはパスワードを指す。この「ソフトウェアキー」は、紙、カード用紙、ステッカー、または類似した媒体などの非一過性媒体上に表示され得る；またはＣＤ−ＲＯＭもしくは他のデータ記憶デバイスなどの非一過性コンピュータ可読媒体に記憶され得る（例えば、「ｒｅａｄｍｅ」ファイルに位置する）。キットは、具体的には、例えば、この明細書の特許請求の範囲１〜８３のいずれか一項に記載のデータ処理および計算方法を実施する分析ソフトウェアを含むことを企図する。
【０２１５】
キットはさらに、本明細書に記載されたアッセイを行うための酵素を含んでもよく、その酵素には、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などのポリメラーゼが挙げられるが、それらに限定されない。ある特定の態様において、キットは、外部サイズ分類ラダーを含む。サイズ分類ラダーは、ＲＯＸラダー、または本明細書に記載されているようなサイズ分類ラダーであり得る。ある特定の態様において、キットは、陽性対照試料、例えば、鋳型対照試料またはプールされた細胞株対照試料を含む。
【０２１６】
キットはまた、プライマー、ｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、および／またはバッファーを含む、リピート領域を増幅するための試薬を含み得る。そのようなキットは、反応バッファー、増幅バッファー、および／またはポリメラーゼバッファーなどの１つもしくは複数のバッファー、ＤＮＡ試料を調製するための化合物、ならびに、例えば、プローブまたは標識などの増幅産物を単離および／または検出するためのコンポーネントを含み得る。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、本発明のキットは、以下（上記で論じられている方法、試薬、および組成物と一貫した）の１つまたは複数を含む：試料精製のためのコンポーネント、カオトロピック剤を有する溶解バッファーを含む；ガラス繊維フィルタまたはカラム；溶出バッファー；洗浄バッファー、アルコール溶液；およびヌクレアーゼ阻害剤。キットのコンポーネントは、例えば、水性媒体中か、または凍結乾燥の形態かのいずれかでパッケージングされ得、適切な容器において提供される。キットのコンポーネントは、乾燥粉末として提供され得る。試薬および／またはコンポーネントが乾燥粉末として提供される場合、その粉末は、適切な溶媒の添加によって再構成することができる。その溶媒もまた別の容器において提供されることが構想される。容器には、一般的に、溶媒が入れられ、適宜、等分されている、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、および／または他の容器もしくは等価物が挙げられる。キットのコンポーネントが１つおよび／または複数の溶液中で提供される場合、その溶液は、水溶液であり、無菌水溶液が特に好ましい。キットはまた、無菌の薬学的に許容されるバッファーおよび／または他の溶媒を含有するための第２の容器または等価物を含み得る。
【０２１８】
そのようなキットはまた、核酸分解から保護する試薬などの、ＤＮＡまたはＲＮＡを保存または維持するコンポーネントも含み得る。そのようなコンポーネントは、ヌクレアーゼフリーもしくはＲＮアーゼフリーであり得、または例えばＲＮアーゼから、保護し得る。本明細書に記載された組成物または試薬のいずれかが、キット内のコンポーネントであり得る。追加の材料には、反応に用いられ得る、適切な反応容器、バリア組成物、増幅および／もしくはＰＣＲのための反応混合物（バッファー、およびｄＮＴＰなどの試薬を含む）、ヌクレアーゼフリーもしくはＲＮアーゼフリーの水、ＲＮアーゼ阻害剤、ならびに／または任意の追加のバッファー、化合物、補助因子、イオン性成分、タンパク質、酵素、ポリマーなどが挙げられ得る。
【実施例】
【０２１９】
以下の実施例は、例証する役割を果たし、決して、本開示を限定するものではない。
【実施例１】
【０２２０】
リピート領域の増幅
ＣＧＧリピート領域のサイズ分析についてのＰＣＲに基づいたワークフローは、ＡｍｐｌｉｄｅＸ（商標）ＦＭＲ１  ＰＣＲアッセイ（Ａｓｕｒａｇｅｎカタログ番号４９４０２；米国特許出願公開第２０１０／０２０９９７０号）を用いて達成され得る。図９および１６参照。
【実施例２】
【０２２１】
内部標準を用いて核酸のリピート領域をサイズ分類するためのワークフロー
ＦＭＲ１遺伝子内のＣＧＧリッチな領域に沿ってのプライミング事象に関連したリピートプロファイルを利用するサイズ分類方法を、開発した。キャピラリー電気泳動プロット「リピートピーク」における各ピークが、隣接したプライミング事象、すなわち、長さが１個余分のリピートの増幅産物に対応するため、ピークのヌクレオチドでの長さは、最初のリピートピークのサイズ（塩基対での）（プライマー配列長を考慮に入れる）を仮定し、その後、最初のピーク後の各リピートピークがその前のピークより３塩基対長いと仮定することにより推定することができる。この情報は、ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ＦＳＡ）シグナル（サンプリング単位での）での位置を断片サイズ（塩基対での）に関係づける較正曲線を作成するために用いられる。
【０２２２】
詳細には、リピートピーク同定のためのアルゴリズムが、いくつかの段階で働く。第１に、リピートシグナルの始まりは、リピートシグナルが機器のサンプリング周波数に基づいて開始するウィンドウについての情報を用いて検出される。第２に、分位に基づいた分析を用いて、リピートシグナルが開始し、そして終了する範囲を決定する。第３に、周波数に基づいた分析を用いて、サンプリング単位におけるリピート周期性を決定する。第４に、リピート周期性を用いて、リピートピークがコールされるウィンドウサイズを通知する。第５に、分位に基づいたアプローチを用いて、リピートピークがコールされるはずである閾値を導く。第６に、スライドウィンドウを用いて、単一リピートピークをコールし、各ウィンドウについてのコールされたピークが、その範囲における最大の大きさをもつ、マイナスの二階微分係数を有すると定義される。ピークが見出されず、またはシグナルが、第４の段階において決定された閾値より下にある場合には、ウィンドウの中央としてのリピートピークの位置が外挿され得る。ピークがコールされる時、サンプリング単位でのリピートピーク間の差に基づいたウィンドウのサイズが調整され得る。図１０は、遺伝子特異的産物をサイズ分類するためにピーク位置が利用される過程のグラフを描く。各リピートピークの期待される位置を用いて、サイズ分類のための較正曲線を作成する。図１０は、カスタムプライマーのＦＭＲ２セット（ｐ／ｎ  ４９５４１）と組み合わせたＡｍｐｌｉｄｅＸ試薬を用いて作成された。
【０２２３】
リピートピークが同定された後、ソフトウェアは、リピートピークについての期待される断片長（ヌクレオチドでの）に対する全てのピークインデックス（サンプリング単位での）の３次スプライン補間を用いて、サイズ分類のためのモデルを作成し得る。いくつかの実施形態において、サイズ分類標準は、区分的であり得、１次多項式フィットをゲルの線形領域に、および一変量スプラインフィットをゲルの非線形領域に適用し得る。
【実施例３】
【０２２４】
メジャーアレルの自動的遺伝子特異的産物同定
このアッセイについてＦＭＲ１ジェノタイプを自動的に作製するために開発されたアルゴリズムは、サイズ分類方法と共に用いることができる。そのアルゴリズムは、遺伝子特異的産物を同定するのに大きさに基づいたアプローチを採用し、特定化された閾値に至るまで全てのアレルピークを標識する。このアルゴリズムについてのワークフローは、０の一階微分係数およびマイナスの二階微分係数を有する、ピーク様の形状をもつ領域を同定し、相対蛍光単位（ＲＦＵ）の大きさによって領域をランク付けすることを含む。任意の工程として、性をインプットとして提供し、各性に必要とされるピークの数を戻し、アレルの数（すなわち、ホモ接合体女性試料について）を自動的に決定することを含み得る。完全突然変異分析について、コールされるリピートに合格した存在するリピートピークをアセスメントするために、伸長についてのリピートプロファイルが、分位に基づいたアプローチを用いて分析される。伸長が発生する場合には、伸長したアレルが報告される。遺伝子特異的リピートジェノタイプは、ＡｍｐｌｉｄｅＸソフトウェアにおいて、内部的に導かれたラダーを用いて決定される。
【実施例４】
【０２２５】
マイナーアレルの自動的遺伝子特異的産物同定
メジャーアレルジェノタイピングに加えて、マイナーアレルカットオフの研究室特異的定義を可能にするマイナーアレル検出のための過程を確立した。マイナーアレルおよびモザイク現象は、典型的には、その現象が臨床関連カテゴリーで起こる場合のみ臨床関連であるため、アルゴリズムを、前突然変異から完全突然変異の範囲においてマイナーアレルを探索するように特異的に設計した。具体的には、マイナーアレル検出のためのアルゴリズムは、以下の工程をとり得る：（１）アルゴリズムのメジャーアレルジェノタイピング相で検出されたピークのランク付けリストから、任意の過剰なピークが５４ＣＧＧリピート長より長いかどうかを決定する、および（２）それらのピークについて、シグナルにおいて同定された最大の遺伝子特異的産物のユーザー定義の閾値パーセンテージより高いＲＦＵ大きさをどれが有するか（もしあれば）を決定する。閾値は、現在、１０％をデフォルトにしているが、アルゴリズムへのインプットとして特定化することができる。
【実施例５】
【０２２６】
リピート領域をサイズ分類するためのワークフローを用いることの応用
上記で論じられたアルゴリズムの性能を、ＦＭＲ１ジェノタイプ全範囲に及ぶ、５００個のランダムに選択され、かつ以前にアノテートされた臨床試料の包括的セットに対して評価した。ＱＣ基準を合格した試料を、前のセクションで記載された方法を用いてジェノタイピングし、期待されたピークサイズと観察されたピークサイズとの差（リピート単位での）として精度を測定した。加えて、ＲＯＸラダー、例えば、ＲＯＸ  １０００サイズラダー、Ｐ／Ｎ：１４５１９４（外部参照標準）と内部サイズ分類方法との間の一致を、試料コホートに渡る相関分析を用いて評価した。マイナーアレル検出能もまた、オペレータが同定したモザイク現象を有する７つの試料の選択されたコホートを用いて試験した。これについて、アルゴリズムを、５％マイナーアレル感度まで下げてコールするようにパラメータ化し、結果を、手作業でサイズ分類されたマイナーアレルと比較した。最後に、アルゴリズムを、分析感度および伸長にフラグと付けるためのリピートプロファイルの利用を評価するために、５％感度対照（Ａｓｕｒａｇｅｎ、Ｐ／Ｎ  １４５３０３）を用いて試験した。この感度対照は、９５％の短い女性正常および前突然変異アレル（ＣＧＧ＝３０、５６）および５％の伸長アレル（＞２００  ＣＧＧ）で構成された。
【０２２７】
図１１は、一般的な集団におけるＦＭＲ１ジェノタイプの発表された分布（Tassone et al., 2012）と共に、本研究で試験された患者ＦＭＲ１ジェノタイプの分布を示す。その試験セットにおける患者の分布は、臨床的関連性がより高いジェノタイプについてのアルゴリズムの感度をアセスメントするために、より大きいサイズ範囲においてより高密度であった。全体的に見て、５００個の試料のうちの４７２個がシグナル強度についてのＱＣ閾値を合格し、前のセクションに記載された方法論を用いて、ジェノタイピングされた。埋め込まれたＱＣ工程が２８個の不合格試料（５．６％）を正確に同定し、それらは、目視検査で、完全なシグナルドロップアウト（９個の試料）かまたはリピートピーク高さの有意な欠損（１９個の試料）のいずれかを有することが確認された。
【０２２８】
加えて、リピートピークサイズ分類方法が、前に用いられた方法論（ＲＯＸラダーを用いる）と、Ｒ２＞０．９５で相関することが見出され、ＡｍｐｌｉｄｅＸ  ＦＭＲ１ワークフローの一部としての外部較正コンポーネント（ＲＯＸラダーおよび対照試料）の必要性を最小限にすることを示唆した。図１２は、ＲＯＸサイズ分類方法と内部サイズ分類方法との間の一致の例を描く。
【０２２９】
埋め込まれたＱＣを合格する４７２個の試料について、アルゴリズムは、成功裏に、全てのメジャー（非モザイク）アレル（８５５個）を同定し、２００リピートより多いアレルを完全突然変異としてフラグを付けた。２００リピートより多くを有するアレルは、内部サイズ分類方法を用いて、それらの以前に報告されたサイズ（手分析を用いて独立して決定された）の±１  ＣＧＧ内で正確に位置づけされた。表２は、臨床的突然変異カテゴリーに関するジェノタイピング精度を詳述する。全体的に見て、２個を除いて全ての試料が、それらの期待されたカテゴリーに正しく同定され、２個の、間違って標識された試料が、それらの以前報告されたサイズの±１  ＣＧＧを有するとジェノタイピングされた。図１３は、ジェノタイピング精度をより詳細に示し、コホートにおける全ての非モザイクピークについての期待されたＦＭＲ１ジェノタイプ対観察されたＦＭＲ１ジェノタイプを描く。図１３は、実現可能性研究における全てのメジャーアレル（８５５個）の手作業サイズ分類と自動サイズ分類との間の相関を描く。図１３は、自動ＦＭＲ１ジェノタイピングワークフローが、手作業割当に基づいたワークフローとの一致した結果を生じたことを示す。
【０２３０】
【表２】
2019502367.tif 000029
【０２３１】
加えて、マイナーアレル同定のための過程により、７個の手作業でアノテートされたマイナーアレルのセットから全てのマイナーアレルが、それらの手作業で導かれたサイズの±１  ＣＧＧ内に正しく同定された。図１４Ａは、マイナーアレル検出能を詳述する図を示す。その図における全てのマイナーアレルは、ＦＭＲ１ソフトウェアにより自動的に検出され、手分析と一致して標識された。その図はまた、ユーザー特異的マイナーアレル検出のために機能的に開発された感度調整を描く。
【０２３２】
最後に、感度対照試料は、正確にジェノタイピングされ、伸長したアレルとしてフラグを付けられた。図１４Ｂは、遺伝子特異的産物のアルゴリズムのラベリングを描く。
【０２３３】
図１５Ａおよび１５Ｂは、ＦＭＲ１ジェノタイプ範囲に渡るアルゴリズムの分析感度を詳述する図を示す。矢印は、自動サイズ分類により作製されたコールを示す。図８は、ＡｍｐｌｉｄｅＸ  ＰＣＲ／ＣＥ  ＦＭＲ１レポーターを描き、例えば、ＦＭＲ１遺伝子のＣＧＧリピート領域を標的にするキャピラリー電気泳動に基づいたアッセイの効率および一貫性を向上させる、高度に正確な自動ＦＭＲ１分析エンジンおよびソフトウェアインターフェイスが設計された。このソフトウェアは、ＡｍｐｌｉｄｅＸ（登録商標）ＦＭＲ１  ＰＣＲ試薬を用いて処理された１０００個より多い臨床試料に関して試験され、手作業でのジェノタイピングとの１００％一致を実証した。そのソフトウェアはまた、少量の遺伝子特異的産物を検出する高い感度を実証した。このソフトウェアは、ＦＭＲ１アッセイワークフローについての分析時間を１００倍より高く、向上させる可能性が高く、ＣＥプロファイル曖昧性を解決することにおいてオペレータ間の一貫性を向上させる可能性をもつ。
【実施例６】
【０２３４】
不合格の試料の検出
シグナルの始まりに向けて起こり得るシグナルアーチファクト（例えば、小さい最初のピーク、ＡＧＧ割り込み配列）に対してロバストであるように、分位に基づいた分析を用いることによりシグナルドロップアウトを検出する、再分析のために試料にフラグを付ける自動化ストラテジーを開発した。そのアルゴリズムは、ＲＦＵ大きさの９５分位（シグナル）およびＲＦＵ大きさの５分位（バックグラウンド）を計算することにより働き、それらの値の間の差が２００ＲＦＵより下にある試料を不合格にする。試料を不合格にするための２００ＲＦＵ閾値は、正常なインプット量から１２．４ｐｇゲノムＤＮＡインプット量まで下がって滴定された１セットの対照試料を用いて実験的に決定された。その閾値は、正しいジェノタイプコールをもたらす最後のインプット量を考慮することにより決定され、それらの試料についてシグナルとノイズの間の平均分離点として計算された。シグナルドロップアウトを同定することに加えて、より高いサイズ範囲においてＲＯＸラダーピークの欠如を認識することにより、時期尚早に停止された実行を同定するためのアルゴリズムを開発した。同定されたＲＯＸピークの数が期待より低い場合には、アルゴリズムは、不完全なデータを有するとして試料にフラグを付ける。これは、臨床的関連に関して間違ってジェノタイピングされた試料を生じ得るエラーから潜在的に守ることができる。
【実施例７】
【０２３５】
誤標識されたＲＯＸピークの同定
シグナル完全性についての自動チェックと共に、少数のサイズ分類エラーに寄与する可能性があり得るＲＯＸチャネルにおける誤標識問題を同定するためのアルゴリズムを開発した。どのようにして誤標識問題が間違ったサイズ分類に寄与し得るかの描写について図１７を参照されたい。その図におけるドットは、シグナルにおける期待されるＲＯＸラダーピークの位置を示し、黒い線は、２次多項式を用いたサイズ内挿を示す。これらの実際の点と内挿された点との間の相関は、ゲル完全性の良好な指標としての役割を果たし、誤標識問題を同定するために用いることができる。これらの小さい誤標識問題は、ＲＯＸラダーによる内挿サイズ分類に影響し得るが、それらは、リピートプロファイルによるサイズ分類にそれほど大きい影響を有さず、リピートプロファイルによりサイズ分類ラダーを内挿するために用い得るさらに多くの点があるからである。Ｒ２値は、２次多項式適合度により予測されるサイズを実際のサイズに対するデータへ相関させることにより計算された。偏差≧０．９８Ｒ２は、間違ったサイズ分類に寄与し得る誤標識問題があった可能性があることを示す。
【実施例８】
【０２３６】
ＦＭＲ１サイズ分類分析
８．１．  ワークフロー概観
ＦＭＲ１  ＣＧＧ分析についての現ワークフローは、ジェノタイプがキャピラリー電気泳動データから解釈されている点を通して合理化されている。手作業での解釈は、大量試験にとってかなりのボトルネックであり、自動アルゴリズムは、全過程を大幅に向上させる可能性がある。この研究において、高度に正確なＦＭＲ１サイズ分類結果を生じるＦＭＲ１分析の自動解決法を開発した。そのアルゴリズムの構成要素の概観は、このセクション内で詳細に記載されている。高レベルにおいて、アルゴリズムはいくつかの段階で働く。アルゴリズムの第１の段階は、ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓファイルから生データを抽出し、異なる構成で実行された試料に渡る差を正規化するために前処理を実施する。第２の段階は、各試料の内部のコンポーネントを用いて、シグナルにおける位置単位（ＰＯＰ７ゲルにおいて移動した距離に相似）から塩基対サイズへ変換するためにサイズ分類ラダーをパラメータ化することを含む。アルゴリズムの最終段階は、アッセイにおいて異なるプライマーセットからの増幅をデコンボルーションするためのモデルをパラメータ化すること、およびそのモデルを用いて、ジェノタイプピークを同定することを含む。
【０２３７】
８．１．１．  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＦＳＡ）ファイルパース
ＡｍｐｌｉｄｅＸ（登録商標）ＦＭＲ１  ＰＣＲアッセイは、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ機器（３１３０／３５００／３７００）のＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓファミリーと共に実行されるように設計され、その機器の全ては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより維持される独自仕様のフォーマットでデータをエクスポートする。このフォーマットは、Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓフォーマットと呼ばれ、「Applied Biosystems Genetic Analysis Data File Format, 2009」に記載され、かつ全体として参照により本明細書に組み入れられた、一連の独自仕様に従ってコード化された、キャピラリー電気泳動実験からの蛍光データを含有する。このファイルフォーマットに直接的にアクセスするために、情報をデコードして、プログラムでアクセスし、かつ操作することが容易であるＪＳＯＮに基づいたフォーマットへ編成するための、特定化されたパーサーを設計した。このパーサーは、Ｂｉｏ：：Ｔｒａｃｅ：：ＡＢＩＦと呼ばれるｐｅｒｌプログラミング言語についてのオープンソースモジュールを大量に利用する。パースソフトウェアは、異なるＧｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ機器（３１３０／３５００／３７００）に渡って実行された１０００個より多い試料に関して確証されており、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓフォーマットにアクセスするための現行標準）を通して見られる未処理の蛍光データと正確に一致していることが示されている。
【０２３８】
８．１．２．  ＦＭＲ１サイズ分類分析内の前処理
８．１．２．１．  シグナル平滑化
ＡｍｐｌｉｄｅＸ（登録商標）ＦＭＲ１  ＰＣＲアッセイは、データ解釈のためにキャピラリー電気泳動に基づいた読み取りに頼るため、そのアッセイは、ＣＥ機器に体系的に存在するシグナルアーチファクトによるコンボリューションを受けやすかった。処理における第１の工程として、データを平滑化するために、チャネルのそれぞれにＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタを適用した。これは、下流処理におけるアルゴリズムにより作成される仮定が単純化されるのを可能にし、また処理後の運用においてロバスト性を増加させた。
【０２３９】
８．１．２．２．  ベースライン正規化
平滑化後、次に、不適切な機器較正を無効にするために各チャネルを正規化した。各チャネルを正規化するために、シグナルから、シグナルにおけるＲＦＵ値の１０パーセンタイルを引き算した。１０パーセンタイルは、実験的に選択され、それが、一般的に遭遇されるシャープなマイナスのゆらぎによって影響されることなく、シグナルにおけるより低い値をロバストに表したからである。代替の適切な値も同様に、シャープなマイナスのゆらぎによって影響されることなく、シグナルにおけるより低い値を表すだろう。
【０２４０】
８．１．２．３．  気泡混入除去
ＡｍｐｌｉｄｅＸ（登録商標）ＦＭＲ１アルゴリズムへの前処理工程として、気泡アーチファクトを同定し、除去した。そのような気泡は、間違った結果を生じる形で遺伝子特異的産物またはＲＯＸチャネルサイズ分類ピークとして解釈され得る、シグナル強度において大きなスパイクを生じ得る。しかし、ＣＥ実行中の気泡キャピラリーチューブの存在は、同じような程度の大きさでチャネルの全部に影響する蛍光をもたらした。このノイズピークが複数チャネルで存在することを利用することにより、気泡アーチファクトを同定し、かつ除去した。
【０２４１】
気泡が見出された部位のそれぞれについて、ピークショルダー間にガウスノイズをシミュレートすることにより、気泡を除去した。そのノイズについての平均および標準偏差を、気泡を囲む領域から決定した。
【０２４２】
８．１．２．４．  シグナル飽和解決
別の前処理工程は、シグナル飽和がＦＡＭチャネルにおいて起こった領域に関してピーク形状を外挿することを含んだ。産物が、機器ＲＦＵセンサーの収集限界より大きい発光で蛍光を発した時に飽和が起こり、ピーク形状に関する情報の損失をもたらす。しかしながら、収集についての波長スペクトルは、チャネルに渡る漏出を許容するため、飽和領域についてのピーク形状は、同様の波長での蛍光を捕獲するチャネルから外挿することができる。同定された飽和領域において、ＮＥＤチャネルからのＲＦＵ値を、ＨＥＸチャネルへ加えた。
【０２４３】
８．１．３．  自動サイズ分類ラダー較正
キャピラリー電気泳動実験における断片サイズ分類のための現在のゴールドスタンダードは、外部から加えられる、公知のサイズの色素標識ＰＣＲ産物の使用を必要とし、その産物は、ＡｍｐｌｉｄｅＸ（登録商標）ＦＭＲ１  ＰＣＲ産物により生じた周波数スペクトルの外側のバンドに蛍光ピークを生じる。これらの蛍光ピークは、アッセイにより生成された標的産物とは無関係に同定することができ、ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓシグナルにおける位置（サンプリング単位での）を断片サイズ（塩基対サイズでの）に関係づける較正曲線を作成するために用いられる。これらの蛍光ピークを同定する過程は、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアにおいて自動的に操縦されるが、それは、誤標識されたピークを訂正するために手作業での検査を必要とする場合が多く、そのことは、ＡｍｐｌｉｄｅＸ（登録商標）分析を実施するのに必要とされる時間を有意に増加させ得る。これを改善するために、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒに基づいたワークフローを妨げる誤標識現象に対してロバストであるようなやり方で、ＲＯＸ蛍光ピークを自動的に同定し、かつ標識するアルゴリズムを開発した。加えて、そのアルゴリズムは、将来的なアッセイ開発に用いられる任意のサイズ分類ラダー（ＲＯＸ  １０００、ＲＯＸ  ２００）へ容易に延長するように開発された。
【０２４４】
８．１．３．１．  漏出アーチファクト除去
分析に関わる第１の段階は、期待されたサイズの、ＲＯＸ断片ピークへの割当をコンボリューションし得る、ＨＥＸチャネルからの漏出アーチファクトを除去することを含んだ。これらの漏出アーチファクトを検出するために、アルゴリズムは、ＨＥＸチャネルにおいて、実験的に導かれた機器特異的閾値より上の位置を同定し、その後、その領域に渡って、シグナルバックグラウンドを模倣するガウスノイズをシミュレートした。
【０２４５】
８．１．３．２．  ＲＯＸ断片ピークコーリング
分析に関わる第２の段階は、１セットの候補ＲＯＸ断片ピークをコールし、偽陽性ピークコールである可能性が高いピークアーチファクトを除去することを含んだ。ＲＯＸ断片ピークの候補セットを同定するために、幅が５００位置単位である、データに渡るスライドフィルタを実行した。各ウィンドウについて：（ａ）その範囲内でのシグナルの平均および標準偏差が採用され、（ｂ）平均ノイズレベル（ＣＥ機器についてのノイズプロファイルは、ガウス分布に従うと仮定される）より上へ３標準偏差分を超えるピークがコールされた。これらの候補ピークを検出した後、「ショルダー」アーチファクトにより引き起こされる近位の偽陽性ピークは、選択されたピークの周囲のウィンドウにおいて最大ピークを選択することにより、解決された。
【０２４６】
８．１．３．３．  ＲＯＸ断片ピーク関連づけ
分析の第３の段階は、標識される断片ピークに関連づけられる最も可能性が高いピークを選ぶ繰り返しアプローチを用いることを含んだ。このアプローチは、最初の条件を選択するために、より大きい断片サイズに関連づけられた低ノイズプロファイルを利用した。要するに、５００ｂｐより大きい全ての期待されるＲＯＸ断片サイズが、候補ピークの最も遠い（キャピラリーにおける距離による）セットと自動的に関連づけられた。その後、５００ｂｐ〜７００ｂｐの間の全ての標識されるＲＯＸピークのための線形サイズ分類ラダーが、１次最小二乗回帰を用いて、フィッティングされ、次（５００ｂｐ未満）の断片ピークの位置を予想するために用いられた。その後、その予想された位置に最も近い候補ピークが、その断片サイズで標識され、線形サイズ分類ラダーは、そのデータ点を含むように、再びフィッティングされた。アルゴリズムは、繰り返し、この形式で、候補ピークをＲＯＸピーク断片サイズで標識し、ゲルのノイズがより高い領域においてピーク関連づけの精度を増加させるやり方で、新しいデータ点に関して、継続して訓練する。この繰り返しアプローチは、不適切なサイズ分類ラダーのパラメータ化に寄与し得るＲＯＸチャネルにおけるシグナルアーチファクトを無視することにおいて、現行方法（ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ、ＧｅｎｅＭａｒｋｅｒ）より特異的であることが示されており、プライマーダイマーピークをＲＯＸ断片ピークと誤解することに対してもロバストである。
【０２４７】
８．１．３．４．  サイズ分類ラダーのパラメータ化
その後、区分的サイズ分類標準が、最終のサイズ分類ラダーを用いて作成された。区分的モデルは、６５０ｂｐより下のラダーピークについて線形モデルを用い、６５０ｂｐより上のラダーピークについて一変量スプラインモデル（局所的サザン方法に類似（Analytical Biochemistry 100(2):319-323 (1979)参照））を用いた。最終の平滑化サイズ分類ラダーをパラメータ化するために、区分的モデルを用いて、位置単位の、断片サイズへの関連づけと共に、１００個の等間隔での点を再サンプリングした。これらの再サンプリングされた点は、ラダーの平滑化最終バージョンを作成するために、一変量スプラインモデルを用いてこれらのデータにフィッティングされた。
【０２４８】
８．１．４．  サイズ分類ラダー移動度補整
キャピラリー電気泳動におけるＲＯＸ断片移動度は、ＦＭＲ１断片移動度とは異なり、ＲＯＸ断片のヌクレオチドバランスのとれた性質に対してＦＭＲ１断片のＧＣリッチな性質のためである。これらの違いを無効にするために、移動度補正因子を、ＦＭＲ１リピートシグナルからパラメータ化し、ＲＯＸチャネルから導かれたサイズ分類ラダーに適用した。この過程に関与する以下のいくつかの工程があった：１）リピートシグナルの開始位置および終了位置の同定、２）全てのリピート断片ピークのラベリング、３）移動度補正の適用。
【０２４９】
８．１．４．１．  ＦＭＲ１シグナルウィンドウのパラメータ化
リピートピークを標識することに先行することとして、シグナルの目的の領域が決定された。ＲＯＸラダーを用いて、リピートプロファイルの始まりについてのおよその位置を予想した。ＲＯＸラダーのパラメータ化が失敗するか、または生じた適合度が、ＲＯＸ  ＱＣ基準（セクション８．１．６参照）に合わなかったならば、以下の工程が用いられた。
【０２５０】
２００位置単位のウィンドウサイズでのデータへの総和変換が用いられた。その変換されたシグナルにおける最大ピーク（プライマーダイマー増幅事象により引き起こされる）について、ピークショルダーが同定された。最も右側のショルダーから、１００位置単位ウィンドウ内のシグナルの優位周波数を計算する変換が適用された。シグナルの優位周波数が実験的に導かれた許容範囲内にある、最初のウィンドウの位置が、リピートプロファイルのおよその始まりとして用いられた。
【０２５１】
いったんリピート領域のおよその位置が同定されたならば、そのおよそのリピート開始部位から１０００位置単位ウィンドウ内のシグナルの８５パーセンタイルより大きい最初の位置を同定することにより、正確なリピート開始部位が決定された。
【０２５２】
リピート領域の終了位置は、１００位置単位のウィンドウサイズで、シグナルに渡って９０パーセンタイルフィルタを適用する変換を用いて同定された。その変換が適用された後、シグナル終了位置は、実験的に導かれた機器特異的閾値より上に入る最後の変換された領域として選択された。
【０２５３】
８．１．４．２．  リピートプライマーピークのコーリング
シグナルの開始位置および終了位置が同定された後、リピートプライマーセットにより生じたシグナルにおいて全ての増幅ピークを決定することにより分析が進行した。その後、これらのピークは、予想されるプライミング事象がもたらすサイズに関連づけられ、線形ラダー適合度が生成された。高レベルにおいて、リピートピークは、リピートピークを繰り返しコールするシグナルの周期性から導かれたウィンドウを用いてコールされ、シグナルにおいて周期性がシフトするにつれてウィンドウが調整され、リピート性ピークが抑圧されている所（すなわち、ＡＧＧ割り込み部位）にピーク位置が内挿された。
【０２５４】
開始部位から１０００位置単位ウィンドウにおけるフーリエ変換を用いて、リピートプロファイルの周期性を同定した。ピーク間の期待される開始距離は、周期性の逆数を用いて計算された。開始部位から２０００位置単位ウィンドウの２５パーセンタイルを用いて、ピーク位置を内挿するための閾値を導いた。
【０２５５】
リピートプロファイルの長さ（上記で決定された開始位置と終了位置の間）を決定するために、およそのピーク位置を含有するウィンドウを予想し、その範囲において最大ピークを選択することにより、リピート閾値より上にある次のピークコールのピークが繰り返し、選ばれた。ピークを選択するためのウィンドウは、ピーク間の距離のサイズ（シグナルの周期性により決定された場合）の１／２として計算された。
【０２５６】
８．１．４．３．  サイズ分類ラダー移動度補整
リピートプロファイルについての全てのピークが同定された後、それらは、期待される断片サイズで標識され、線形サイズ分類ラダーを作成するために用いられた。この線形サイズ分類ラダーは、ＲＯＸラダーがアフィン変換を用いてマッピングされ得る、サイズ補正ラダーとしての役割を果たした。アフィン変換によるマッピングは、サイズ分類ラダーの線形成分と非線形成分の両方が移動度補正を適用されることを保証した。
【０２５７】
８．１．５．  ジェノタイプピーク同定およびサイズ分類
サイズ分類分析の重要な部分は、ジェノタイプピーク同定およびサイズ分類であった。シグナルは、リピートセグメント増幅と遺伝子特異的増幅の両方を呈示すため、ジェノタイプピークの同定は、簡単ではなく、シグナルのこれらの２つの成分をデコンボルーションするための工程を含む。追加として、正常なジェノタイプピークとして存在しない困難なジェノタイプは、その過程を通して同定された。
【０２５８】
８．１．５．１．  リピートプロファイルバックグラウンド推定
遺伝子特異的増幅事象を同定することにおける第１の工程は、遺伝子特異的増幅事象のシグナル寄与からリピート増幅事象のシグナル寄与をデコンボルーションするためのバックグラウンドモデルをパラメータ化することを含んだ。この過程を困難にさせるシグナルアーチファクトの中で、最も有意なものは以下であった：（１）リピートプロファイルの大きさを有意に縮小させるＦＭＲ１リピート領域におけるＡＧＧ割り込みであり、それは、バックグラウンドモデルを作成する間、無視されなければならないプロファイルにおける「ギャップ」を生じる；および（２）シグナルのリピート成分から有意に偏向するが、デコンボルーションへの周波数に基づいたフィルタリングアプローチを可能にするだろう特性を欠く遺伝子特異的産物ピーク。
【０２５９】
デコンボルーション過程は、所定のウィンドウ内のリピートシグナルの高さとして、リピートプロファイルの「バックグラウンド」をモデル化した。ＡＧＧ割り込みについて、「バックグラウンド」は、ＡＧＧ割り込みに近位の局所的リピートピークのレベルであった。遺伝子特異的産物ピークについて、「バックグラウンド」は同様に、シグナルにおける遺伝子特異的偏向に近位の局所的リピートピークのレベルであった。
【０２６０】
分析は、バックグラウンドモデルを作成するために以下の工程を含んだ。リピートシグナルにおける全てのピークについて、１１リピートのウィンドウサイズに渡ってデータの中央値および四分位範囲をフィルタが加えた。このフィルタは、ウィンドウにおいてリピートピークの高さを捕獲するように設計されが、ＡＧＧ割り込みおよび遺伝子特異的産物により引き起こされるリピートシグナルにおける大きなゆらぎに対してロバストであった。生じたシグナルについて、データを平滑化するために７リピートのウィンドウサイズをもつＳａｖｉｔｚｋｙ−Ｇｏｌａｙフィルタが用いられた。生じたシグナルにおける任意の「ピーク」が、ピークショルダーを通して線形的に内挿された。
【０２６１】
８．１．５．２．  動的閾値を用いるジェノタイプピーク同定
より低いサイズ範囲におけるコーリングをより特異的にし、より高いサイズ範囲におけるコーリングをより高感度にする動的スケーリングアプローチを適用することにより、上記のデコンボルーションモデルから動的閾値が導かれた。高レベルにおいて、スケーリングアプローチは、０〜１２０リピートの間の領域において３から１．５へ減少させ、その後、１２０リピート後においては１．５の一定のままである区分的スケール因子をデコンボルーションモデルに適用した。ピーク様形状を有する領域を同定するための上記の方法に従い、この閾値を用いてジェノタイプピークセットが決定された。遺伝子特異的産物ピークは、前のセクションにおいて導かれたサイズ分類ラダーを用いて、リピートサイズへ変換され、遺伝子特異的増幅産物からの非リピート成分の公知の断片サイズ（この場合、２４０ｂｐで）を用いてリピート数へ変換された。
【０２６２】
８．１．５．３．  困難なジェノタイプの解明
ジェノタイプピークセットＧを決定することにおける最初の合格後、正常な遺伝子特異的産物ピークとして存在しない困難なジェノタイプ（すなわち、ホモ接合体女性試料、ｎ／ｎ＋１ジェノタイプ、伸長型試料）が解明された。ホモ接合体女性ピークは、提供された性情報を用いて解明され、単独でコールされたピークが、女性試料についてのホモ接合体ジェノタイプへと解明された。正常範囲内の近位のジェノタイプ（ｎ／ｎ＋１）を有する試料は、ジェノタイプピークの次のリピートピークを用いることにより解明された。リピートピークがジェノタイプピークに隣接して存在し、かつそのリピートピークのシグナル強度が、隣接したジェノタイプピークの高さの９０％以内であった場合、そのリピートピークもまた、ジェノタイプピークとして標識された。最後に、試料についてジェノタイプピークが同定されなかったが、リピートプロファイルが伸長を示した場合、その試料は伸長型試料として標識された。これは通常、遺伝子特異的産物ピークを欠き、リピートプロファイルが２００リピートを超えて十分伸長した男性（ｍａｌｅ）試料について起こった。
【０２６３】
８．１．６．  自動の埋め込まれた品質管理
結果の誤解釈を防ぐためにいくつかの品質管理尺度が用いられた。品質管理尺度の２つのカテゴリーがあった。品質管理尺度の第１のカテゴリー（サイズ分類ラダーＱＣ、シグナル大きさＱＣ、および混入ＱＣ）に不合格となる試料について、ジェノタイプコールは生じなかった。品質管理尺度の第２のカテゴリー（マイナーアレル感度ＱＣ）に不合格となる試料についてのジェノタイプコールは、より大きい懐疑を以て解釈された。この第２のカテゴリーは、ユーザーが、ジェノタイプコールを、それらのデータにより信頼性をもって支持されるものではないと判断することから守るはずである。
【０２６４】
８．１．６．１．  サイズ分類ラダーＱＣ
サイズ分類ラダーＱＣは、サイズ分類ラダーが、内部キャリブレータに対して、正しく導かれ、期待値とマッチすることを検証した。この尺度は、３つの異なる基準を組み合わせており、その基準のそれぞれが、試料が合格するために満たされなければならない。第１に、ＲＯＸラダーピークに対するＲＯＸラダー適合度についての決定係数（Ｒ２）が０．９８より高くなければならない。第２に、内部ラダーピークに対する内部ラダー適合度についての決定係数が０．９８より高くなければならない。第３に、適合を通して等間隔での点について、内部ラダー適合度に対するＲＯＸラダー適合度についての決定係数が０．９８より高くなければならない。これらの決定係数閾値は、間違ったサイズ分類を生じた試料と正しいサイズ分類を生じた試料との間を正確に識別するレベルを選択することにより、独立した訓練セットから実験的に決定された。
【０２６５】
８．１．６．２．  シグナル大きさＱＣ
シグナル大きさＱＣは、試料が十分な増幅を受けたことを検証した。十分に増幅されていない試料は、処理中アルゴリズムの仮定を乱し、間違ったまたは偽陰性のジェノタイプが報告され／見逃されることをもたらす可能性があり得る。高レベルにおいて、アルゴリズムは、リピートプロファイルの開始に近位の装置のノイズレベルに対して、リピートプロファイルの開始についての十分なシグナル−ノイズ比が存在することを検証する。このＱＣについてのＳＮＲ閾値は、間違ったサイズ分類を生じた試料と、正しいサイズ分類を生じた試料との間を正確に識別するレベルを選択することにより、独立した訓練セットから実験的に決定された。
【０２６６】
８．１．６．３．  混入ＱＣ
混入ＱＣは、試料がオフターゲット増幅を受けず、または間違ったジェノタイプ報告に寄与し得る不適切な試料調製に関係した増幅アーチファクトを含まないことを検証した。遺伝子特異的プライマーを用いて生じ得ない範囲において遺伝子特異的産物ピークが同定された時、試料はこのＱＣに不合格であった。例えば、遺伝子特異的産物ピークについて導かれたリピート数が０未満のリピート（または等価的に２４０ｂｐ未満）であった時、試料は混入を有するとフラグを付けられた。
【０２６７】
８．１．６．４．  マイナーアレル感度ＱＣ
混入ＱＣは、試料が、選ばれたマイナーアレルコーリング閾値について十分低いバックグラウンドノイズを有することを検証した。このＱＣは、機器のバックグラウンドノイズと試料における最大のジェノタイプピークとの比率に依存する。シグナルにおけるノイズレベルと最大のジェノタイプピークとの比率がマイナーアレル頻度を超える時、その頻度におけるマイナーアレルは正確に同定することができず、その試料は、ユーザーがより厳格に解釈するべきである「リスクがある」ＱＣというフラグを付けられる。
【０２６８】
８．２．  ＦＭＲ１サイズ分類性能
ＦＭＲ１サイズ分類分析についての性能を、複数の機器に渡っていくつかの大きなコホートについて試験した。これらの研究のそれぞれについて、アルゴリズムは、アッセイガイドラインに従って、正しく、期待されたＱＣ不合格にフラグを付け、ＱＣ合格試料の１００％をサイズ分類した。サイズ分類についてのアッセイガイドラインは、ジェノタイプ＜７０リピートについて＋／−１リピート、ジェノタイプ＜１２０リピートについて＋／−３リピート、およびジェノタイプ≧１２０リピートについてそのリピート数の＋／−５％として定義された。加えて、モザイクピークを有するとオペレータにより同定された、いくつかの試料について、低レベルのモザイクピークが検出された。ＱＣを不合格となった試料は、訓練された手作業でのオペレータにより不合格状態に値するとして独立して検証された。この研究における真のデータは、ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒソフトウェアによる手作業でのサイズ分類により、訓練されたオペレータによって作成された。さらに、本研究で試験されたジェノタイプの分布は、正常な集団において期待されるジェノタイプとはほんのわずか異なった。この研究におけるジェノタイプの分布は、ジェノタイピング精度がより大きな臨床的影響を生じる症例についてアルゴリズムをストレス試験するために、中間、前突然変異、および完全突然変異範囲において臨床的に関連するアレルを意図的に強化させた。
【０２６９】
８．２．１．  Ｓａｌｌｙ  Ｎｏｌａｎ性能研究
Ｓａｌｌｙ  Ｎｏｌａｎ試料セットを、３５００  ＣＥ機器において、通常のインプットおよび条件を用いて作製した。これは、アルゴリズムを外部実験室で試験するために設計され、インプット量は、アッセイの通常の使用法に従う。合計１０４０個の試料がこの研究において評価され、ＱＣを合格した試料についてジェノタイプの１００％がアッセイガイドラインに従って正確にサイズ分類された。図１８Ａは、本研究における試料のジェノタイプ分布を示す。図１８Ｂは、アッセイ結果について生じた自動でのジェノタイプと手作業でのジェノタイプの比較を示し、表３は、手作業でのカテゴリー別コールと自動でのカテゴリー別コールの比較を詳述する。
【０２７０】
【表３】
2019502367.tif 000030
【０２７１】
８．２．２．  複数機器のＲＵＳＨインプット量研究
この性能研究について、アッセイのオペレータエラーに対するロバスト性を試験するために、試料のＲＵＳＨセット（ジェノタイプおよび試料特徴の多様な分布についてアッセイを試験することに一般的に用いられる）を、異なるインプット量で流した。加えて、各インプットレベルを、３つの異なる機器において流し、アッセイの複数機器能力を試験した。インプットレベルは、１００ｎｇ／μｌ、２０ｎｇ／μｌ、４ｎｇ／μｌ、および０．８ｎｇ／μｌであり、それらは、上限および下限においてアッセイについての通常のインプット量（２０ｎｇ／μｌ）に及ぶ。合計３１個の試料をこの研究において評価し、ＱＣを合格した試料についてのジェノタイプの１００％が、アッセイガイドラインに従って正確にサイズ分類された。図１９Ａは、本研究における試料のジェノタイプ分布を示す。図１９Ｂは、アッセイ結果について生じた自動でのジェノタイプと手作業でのジェノタイプの比較を示し、表４は、手作業でのカテゴリー別コールと自動でのカテゴリー別コールの比較を詳述する。
【０２７２】
【表４】
2019502367.tif 000031
【０２７３】
８．２．３．  人工マイナーアレルインプット滴定研究
この分析は、ジェノタイプの全スペクトルに渡って低レベルのマイナーアレルにフラグを付けることができる。この能力を実証するために、研究は、前突然変異試料のバックグラウンドにおいて低レベルのマイナーアレル（３０リピートおよび５６リピート）の存在をシミュレートした。７６、９６、および１１９におけるマイナーアレルを、異なるインプットレベルで非依存的に、前突然変異バックグラウンド（２０ｎｇ／μｌ）へ混合した。この実験におけるマイナーアレルについてのインプットレベルのスペクトルは、２０ｎｇ／μｌ、１０ｎｇ／μｌ、５ｎｇ／μｌ、２．５ｎｇ／μｌ、および１ｎｇ／μｌを含んだ。試料において前突然変異ピークをサイズ分類すること、および混合されたモザイクピークをサイズ分類することにおける分析能をアセスメントした。合計４０個の試料をこの研究において評価し、ＱＣを合格した試料についてのジェノタイプ（マイナーアレルを含む）の１００％が、アッセイガイドラインに従って正確にサイズ分類された。図２０Ａは、本研究における試料のジェノタイプ分布を示す。図２０Ｂは、アッセイ結果について生じた自動でのジェノタイプと手作業でのジェノタイプとの間の比較を示し、表５は、手作業でのカテゴリー別コールと自動でのカテゴリー別コールとの間の比較を詳述する。
【０２７４】
【表５】
2019502367.tif 000032
【０２７５】
８．２．４．  ＲＵＳＨ試料滴定研究
この性能研究について、試料のＲＵＳＨセットは、低い試料インプットレベルにおけるアルゴリズムのロバスト性をストレス試験するために、通常のインプット量から５回の２倍段階希釈を受けた。この実験において試験されたインプットレベルは、１００％（２０ｎｇ／μｌ）、５０％（１０ｎｇ／μｌ）、２５％（５ｎｇ／μｌ）、１２．５％（２．５ｎｇ／μｌ）、６．２％（１．２５ｎｇ／μｌ）、および３．１％（０．７５ｎｇ／μｌ）を含む。合計６６個の試料をこの研究において評価し、ＱＣを合格した試料についてのジェノタイプの１００％が、アッセイガイドラインに従って正確にサイズ分類された。図２１Ａは、本研究における試料のジェノタイプ分布を示す。図２１Ｂは、アッセイ結果について生じた自動でのジェノタイプと手作業でのジェノタイプとの間の比較を示し、表６は、手作業でのカテゴリー別コールと自動でのカテゴリー別コールとの間の比較を詳述する。
【０２７６】
【表６】
2019502367.tif 000033
【０２７７】
８．２．５．  ＱＣ不合格モードシミュレーション研究
本研究においてＲＯＸ  ＱＣ不合格モードを試験するために、試料ジェノタイプの範囲に渡ってＲＯＸ不合格の２つの異なる型を有する試料セットを作製した。第１の不合格モードは、標識されたＲＯＸ断片を含まないＲＵＳＨ試料セットのＣＥ分析を含んだ。第２の不合格モードは、ＲＯＸ  ４００ラダーを含む（ＲＯＸ  １０００はこのアッセイに必要とされる）ＲＵＳＴ試料セットのＣＥ分析を含んだ。合計で、ＲＯＸを含まない１３個の試料およびＲＯＸ  ４００を含む１２個の試料を分析し、サイズ分類ラダーＱＣ状態に関するアルゴリズムにより適切に不合格にされた。
【０２７８】
８．２．６．  結果応答時間の改善
アノテーションデバイス１３０は、ＦＭＲ１結果を生じるための応答時間を大幅に改善する。１０００個の試料のコホートについて、手作業でのオペレータは、１試料あたり１分間、必要とすると仮定されて、コホート全体を処理するのに所要１６．６時間となった。対照的に、アノテーションデバイス１３０は、コホート全体についての結果を１分２４秒間で生じ（２つのコアを使用する機械で）、結果を得るまでの時間を７００分の１未満への増加を示した。
【０２７９】
８．２．７．  分析能
アッセイの分析感度をさらに例証するために、図２２Ａ〜２５Ｂは、アルゴリズムが正しく無効にし、手作業でのオペレータに従ったサイズ分類を生じることができる、様々な異なるジェノタイプおよびまれな場合の範囲を描く。例えば、図２２Ａおよび２２Ｂは、正常なジェノタイプを有する試料についての自動サイズ分類分析の結果を描く。図２２Ｃおよび２２Ｄは、並べ換えジェノタイプを有する試料についての自動サイズ分類分析の結果を描く。図２３Ａおよび２３Ｂは、伸長型試料についての自動サイズ分類分析の結果を描く。図２３Ｃおよび２３Ｄは、低レベルのマイナーアレル同定およびサイズ分類を描く。図２４は、正常、並べ換え、および伸長型のジェノタイプ範囲に渡るジェノタイプの混合物を有する対照試料についての自動サイズ分類分析の結果を描く。図２５Ａおよび２５Ｂは、９５％並べ換え試料のバックグラウンドにおける５％完全突然変異試料の混合物を含む対照試料についての自動サイズ分類分析の結果を描く。図２５Ａは、全てのコールされたジェノタイプを含む完全な試料を描き、一方、図２５Ｂは、完全突然変異コールを示すズームインバージョンを描く。
【０２８０】
８．３．  考察
ＡｍｐｌｉｄｅＸ（登録商標）ＦＭＲ１  ＰＣＲインシリコＣＧＧ断片サイズ分析ツールを開発した。この新規なツールは、臨床的に関連したＦＭＲ１ジェノタイプの全範囲の迅速かつ正確な同定およびサイズ分類を可能にし、大量試料処理および自動データ分析を支援する。
【０２８１】
上記の実施例において要約された研究は、いくつかの重要な特徴をもつ、ＦＭＲ１  ＰＣＲ断片サイズ分析のための高性能アノテーションデバイスを実証している。これらの中には、（１）ＦＭＲ１  ＣＧＧリピートサイズの全部の臨床的に関連したスペクトルについての正確なジェノタイピング；（２）低レベルのモザイク現象（１％まで下がった）を正確に同定し、かつサイズ分類する能力；（３）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（３１３０、３５００、３７３０）のＡＢＩファミリーに関する複数機器の適合性；（４）キャピラリー電気泳動機器により生じるシグナルアーチファクト（気泡、不適切な較正、漏出アーチファクト、シグナル飽和、および収集ノイズ）に対するロバスト性；（５）試料の手作業での処理と比較した場合の有意に低減した分析時間（５００分の１未満）、ならびに／または（６）不十分な増幅、混入アーチファクト、低品質のＲＯＸラダー、もしくは期待されたアレル検出能対試料から推測されるアレル検出能における不一致からユーザーを守るための自動ＱＣ分析および試料フラグ付けがある。
【０２８２】
上記の実施例は、本開示を例証することを意図され、決して限定することを意図するものではない。開示されたデバイスおよび方法の他の実施形態は、本明細書を考慮すること、ならびに本明細書に開示されたデバイスおよび方法の実施から当業者に明らかであろう。
【０２８３】
前述の開示された実施形態は、例証のみを目的として提示されている。本開示は、網羅的ではなく、主張された主題を、開示された正味の実施形態に限定しない。改変およびバリエーションが上記の教示に照らせば可能であり、または本発明を実施することから獲得され得ることを当業者は前述の記載から理解しているだろう。いくつかの態様において、開示された実施形態と一致した方法は、開示された方法工程を除外し得、または方法工程の開示された順序もしくは方法工程間の開示された分離度合を変更し得る。例えば、方法工程は、同じまたは類似した目的を達成するために、必要に応じて、省かれ、繰り返され、または組み合わせられ得る。様々な態様において、非一過性コンピュータ可読媒体は、開示された実施形態と一致した方法を実施するための命令を記憶し得る。これらの命令は、開示された方法工程を除外し得、または方法工程の開示された順序もしくは方法工程間の開示された分離度合を変更し得る。例えば、非一過性コンピュータ可読媒体は、同じまたは類似した目的を達成するために、方法工程を、必要に応じて、省き、繰り返し、または組み合わせる、開示された実施形態と一致した方法を実施するための命令を記憶し得る。ある特定の態様において、システムは必ずしも、あらゆる開示された部分を含むことを必要とせず、他の開示されていない部分を含み得る。例えば、システムは、同じまたは類似した目的を達成するために、部分を、必要に応じて、省き、繰り返し、または組み合わせ得る。したがって、主張される主題は、開示された実施形態に限定されず、代わりに、添付された特許請求の範囲によって、それらの等価物の完全な範囲を鑑みて、定義される。
【図１】
2019502367.tif 000034
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
2019502367.tif 000041
【図６Ｂ】
2019502367.tif 000042
【図７Ａ】
2019502367.tif 000043
【図７Ｂ】
2019502367.tif 000044
【図７Ｃ】
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【図８】
2019502367.tif 000046
【図９】
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【図１０】
2019502367.tif 000048
【図１１】
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【図１２】
2019502367.tif 000050
【図１３】
2019502367.tif 000051
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
2019502367.tif 000058
【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
2019502367.tif 000060
【図１９Ｂ】
2019502367.tif 000061
【図２０Ａ】
2019502367.tif 000062
【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2019502367.tif 000077
2019502367.tif 000078
2019502367.tif 000079