(57)【要約】本発明は、脳（例えばヒト）の大部分の特性をインビトロで再現する神経オルガノイドと、疾患を研究しかつ神経疾患および障害の治療のための治療薬を同定するためにこの神経オルガノイドを使用する方法とを特徴とする。2019502407.tif 000016
2019502407.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト誘導多能性幹細胞（hIPSC）に由来する、インビトロで生成された三次元神経オルガノイドであって、網膜マーカーまたは皮質マーカーを発現する第一領域と、脳幹、小脳、および/または脊髄のマーカーを各々発現する1つまたは複数のさらなる神経領域とを含む前記オルガノイド。
【請求項２】
1つまたは複数の神経マーカーを発現する細胞と、星状細胞マーカー、乏突起膠細胞マーカー、ミクログリアマーカー、および/または血管マーカーからなる群より選択されるマーカーを発現する細胞とを含む、請求項1に記載のオルガノイド。
【請求項３】
hIPSCが、神経学的異常に関連する遺伝子変異を含む、請求項1に記載のオルガノイド。
【請求項４】
遺伝子変異が、TSC1、TSC2、PSEN1、またはAPPに存在する、請求項1に記載のオルガノイド。
【請求項５】
ヒト誘導多能性幹細胞に由来する、インビトロで生成された三次元神経オルガノイドであって、神経マーカーを発現する第一細胞型と、星状細胞マーカー、乏突起膠細胞マーカー、ミクログリアマーカー、または血管マーカーを発現する第二細胞型とを含む前記オルガノイド。
【請求項６】
神経マーカーが、網膜特異的グアニル酸シクラーゼ（GUY2D、GUY2F）、網膜および前神経ひだホメオボックス（Retina And Anterior Neural Fold Homeobox）（RAX）、ならびに網膜特異的銅含有アミンオキシダーゼ2（RAX）からなる群より選択される網膜マーカーである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の神経オルガノイド。
【請求項７】
神経マーカーが、ダブルコルチン、NeuN、FOXP2、CNTN4、およびTBR1からなる群より選択される皮質マーカーである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の神経オルガノイド。
【請求項８】
神経マーカーが、チロシンヒドロキシラーゼ、小胞モノアミントランスポーター2（VMAT2）、ドーパミンアクティブトランスポーター（DAT）、およびドーパミン受容体D2(D2R)からなる群より選択されるドーパミン作動性ニューロンのマーカーである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の神経オルガノイド。
【請求項９】
神経マーカーが、ATOH1、PAX6、SOX2、LHX2、GRID2、または別の小脳マーカーである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の神経オルガノイド。
【請求項１０】
神経マーカーが、SOX2、NeuroD1、DCX、EMX2、FOXG1、PROX1、または別の顆粒ニューロンマーカーである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の神経オルガノイド。
【請求項１１】
神経マーカーが、FGF8、INSM1、GATA2、ASCL1、GATA3、または別の脳幹マーカーである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の神経オルガノイド。
【請求項１２】
神経マーカーが、HOXA1、A2、A3、B4、A5、C8、またはD13からなる群より選択されるホメオボックス遺伝子である、請求項2〜5のいずれか一項に記載の神経オルガノイド。
【請求項１３】
神経マーカーが、NKCC1、KCC2、または別のGABA作動性マーカーである、請求項2〜5のいずれか一項に記載の神経オルガノイド。
【請求項１４】
星状細胞マーカーがGFAPであり、乏突起膠細胞マーカーがOLIG2またはMBPであり、ミクログリアマーカーがAIF1またはCD4であり、かつ血管マーカーがNOS3である、請求項2〜5のいずれか一項に記載の神経オルガノイド。
【請求項１５】
（a）ヒト誘導多能性幹細胞（hIPSC）とガンマ線照射マウス胚線維芽細胞フィーダー細胞（MEF）との混合培養物から最小限に接着性であるhIPSCを選択し、かつ、胚様体（EB）を得るためにスフェア形成を促進する条件下でIPSCを培養する工程;
（b）EBをプレートに移し、かつ、神経外胚葉分化を誘導する条件下で培養する工程;
（c）静的条件下で約3〜5日間、成長因子を含む三次元マトリックス中でEBを培養する工程;
（d）増殖培地の層流を促進する条件下、三次元マトリックス中でEBを培養し、それによって神経オルガノイドを得る工程
を含む、神経オルガノイドを得るための方法。
【請求項１６】
（a）iPSCを単独でまたは照射したMEFの存在下で培養する工程;
（b）胚葉分化を促進する条件下、ROCK阻害剤およびbFGFの存在下で約4日間、低接着性U底プレート中で、工程（a）からのiPSCを培養し、次いで形成のためにROCK阻害剤またはbFGFを欠く培地中でiPSCを培養する工程;
（c）神経誘導を促進する条件下で低接着性プレートに（b）からのiPSCを播種し、かつ、胚様体からの神経外胚葉形成を示す胚様体を選択する工程;
（d）選択した胚様体を三次元培養マトリックス中に包埋し、かつ、神経オルガノイド発生を促進する条件下で、1日2〜3回、培養物を穏やかに振動させながら培養する工程;ならびに
（e）神経オルガノイドを静置培養する工程
を含む、神経オルガノイドを得るための方法。
【請求項１７】
酸化を最小限に抑える条件下で保存したβ-メルカプトエタノールが、工程（a）〜（e）の各々において培地に添加される、請求項15または16に記載の方法。
【請求項１８】
培養物において培地の緩やかな層流を誘導するために、1日2回、培養物を約2分間穏やかに振動させる、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
三次元培養マトリックスの量が、栄養素およびガスの交換を可能にしつつモルフォゲンおよび成長因子を捕捉するように最適化される、請求項15または16に記載の方法。
【請求項２０】
胚様体が、約10、20、または30μlの三次元培養マトリックス中に包埋される、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
hIPSCが、MEFを培養基に接着させ、次いで非接着性hIPSCを除去することによって選択される、請求項15に記載の方法。
【請求項２２】
三次元マトリックスが、エンゲルブレス-ホルム-スワーム（Engelbreth-Holm-Swarm）（EHS）肉腫細胞から抽出された可溶化基底膜調製物である、請求項15または16に記載の方法。
【請求項２３】
網膜マーカーまたは皮質マーカーを発現する第一領域と、中脳、脳幹、小脳、および/または脊髄のマーカーを発現する1つまたは複数のさらなる領域とを含む、請求項15または16に記載の方法に従って生成されたインビトロ由来の神経オルガノイド。
【請求項２４】
アルツハイマー病または結節性硬化症に関連する突然変異を含む、請求項23に記載のオルガノイド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2016年1月14日に出願された米国仮特許出願第62/278,857号および2016年2月23日に出願された同第62/298,872号の利益を主張するものであり、これらの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
成人のほぼ3分の1が、人生で少なくとも一度は神経発達疾患、神経精神疾患または神経疾患（例えば自閉症、不安、気分障害、神経変性疾患）に罹患する。米国および欧州経済への脳疾患のコストは、年間数千億ドルと推定される。神経科学は、典型的には生体脳または生体組織試料の実験的操作に頼ってきたが、科学の進歩は多くの要因によって制限されてきた。倫理的および技術的理由から、ほとんどの侵襲的技術はヒトで使用することが不可能である。動物における実験は費用がかかり、動物で得られた結果は、長くて費用のかかるヒトでの臨床試験で検証されなければならない。疾患の機構を理解し、潜在的な治療法を試験するためにヒト脳の改善された実験モデルが緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
以下に記載するように、本発明は、脳（例えばヒト）の大部分の特性をインビトロで再現する神経オルガノイドと、疾患を研究しかつ神経疾患および障害の治療のための治療薬を同定するためにこの神経オルガノイドを使用する方法とを特徴とする。
【０００４】
１つの局面では、本発明は、ヒト誘導多能性幹細胞(hIPSC)に由来する、インビトロで生成された三次元神経オルガノイドを特徴とし、このオルガノイドは、網膜マーカーまたは皮質マーカーを発現する第一領域と、脳幹、小脳、および/または脊髄のマーカーを各々発現する1つまたは複数のさらなる神経領域とを含む。1つの態様では、オルガノイドは、1つまたは複数の神経マーカーを発現する細胞と、星状細胞マーカー、乏突起膠細胞マーカー、ミクログリアマーカー、および/または血管マーカーを発現する細胞とを含む。別の態様では、hIPSCは、神経学的異常に関連する遺伝子変異を含む。別の態様では、遺伝子変異は、TSC1、TSC2、PSEN1、またはAPPに存在する。
【０００５】
1つの局面では、本発明は、ヒト誘導多能性幹細胞に由来する、インビトロで生成された三次元神経オルガノイドを特徴とし、このオルガノイドは、神経マーカーを発現する第一細胞型と、星状細胞マーカー、乏突起膠細胞マーカー、ミクログリアマーカー、または血管マーカーを発現する第二細胞型とを含む。１つの態様では、網膜マーカーは、網膜特異的グアニル酸シクラーゼ(GUY2D、GUY2F)、網膜および前神経ひだホメオボックス（Retina And Anterior Neural Fold Homeobox）(RAX)、ならびに網膜特異的銅含有アミンオキシダーゼ2(RAX)である。別の態様では、神経マーカーは、ダブルコルチン、NeuN、FOXP2、CNTN4、およびTBR1である皮質マーカーである。別の態様では、神経マーカーは、チロシンヒドロキシラーゼ、小胞モノアミントランスポーター2(VMAT2)、ドーパミンアクティブトランスポーター(DAT)、およびドーパミン受容体D2(D2R)からなる群より選択されるドーパミン作動性ニューロンのマーカーである。別の態様では、神経マーカーは、ATOH1、PAX6、SOX2、LHX2、GRID2、または別の小脳マーカーである。別の態様では、神経マーカーは、SOX2、NeuroD1、DCX、EMX2、FOXG1、PROX1、または別の顆粒ニューロンマーカーである。別の態様では、神経マーカーは、FGF8、INSM1、GATA2、ASCL1、GATA3、または別の脳幹マーカーである。別の態様では、神経マーカーは、HOXA1、A2、A3、B4、A5、C8、またはD13であるホメオボックス遺伝子である。別の態様では、神経マーカーは、NKCC1、KCC2、または別のGABA作動性マーカーである。別の態様では、星状細胞マーカーはGFAPであり、乏突起膠細胞マーカーはOLIG2またはMBPであり、ミクログリアマーカーはAIF1またはCD4であり、血管マーカーはNOS3である。
【０００６】
別の局面では、本発明は、ヒト誘導多能性幹細胞（hIPSc）とガンマ線照射マウス胚線維芽細胞フィーダー細胞（MEF）との混合培養物から最小限に接着性であるhIPScを選択し、かつ、胚様体（EB）を得るためにスフェア形成を促進する条件下でIPSCを培養する工程;EBをプレートに移し、かつ、神経外胚葉分化を誘導する条件下で培養する工程;静的条件下で約3〜5日間、成長因子を含む三次元マトリックス中でEBを培養する工程;増殖培地の層流を促進する条件下、三次元マトリックス中でEBを培養し、それによって神経オルガノイドを得る工程を含む、神経オルガノイドを得るための方法を特徴とする。
【０００７】
別の局面では、本発明は、iPSCを単独でまたは照射したMEFの存在下で培養する工程;胚葉分化を促進する条件下、ROCK阻害剤およびbFGFの存在下で約4日間、低接着性U底プレート中で、前の工程からのiPSCを培養し、次いで形成のためにROCK阻害剤またはbFGFを欠く培地中でiPSCを培養する工程;神経誘導を促進する条件下で低接着性プレートに前の工程からのiPSCを播種し、かつ、胚様体からの神経外胚葉形成を示す胚様体を選択する工程;選択した胚様体を三次元培養マトリックス中に包埋し、かつ、神経オルガノイド発生を促進する条件下で、1日2〜3回、培養物を穏やかに振動させながら培養する工程;ならびに神経オルガノイドを静置培養する工程を含む、神経オルガノイドを得るための方法を特徴とする。
【０００８】
上記局面の様々な態様では、β-メルカプトエタノールは、酸化を最小限に抑える条件下で保存され、この方法の各工程で培地に添加される。他の態様では、培養物において培地の緩やかな層流を誘導するために、1日2回、培養物を約1〜5（例えば1、2、3、4、5）分間穏やかに振動させる。他の態様では、三次元培養マトリックスの量は、栄養素およびガスの交換を可能にしつつモルフォゲンおよび成長因子を捕捉するように最適化される。別の態様では、胚様体は約10、20、または30μlの三次元培養マトリックス中に包埋される。他の態様では、hIPSCは、MEFを培養基に接着させ、次いで非接着hIPSCを除去することによって選択される。他の態様では、三次元マトリックスは、エンゲルブレス-ホルム-スワーム（Engelbreth-Holm-Swarm）（EHS）肉腫細胞から抽出された可溶化基底膜調製物である。
【０００９】
別の局面では、本発明は、上記のいずれかの局面に従って生成されたインビトロ由来の神経オルガノイドを特徴とし、このオルガノイドは、網膜マーカーまたは皮質マーカーを発現する第一領域と、中脳、脳幹、小脳、および/または脊髄のマーカーを発現する1つまたは複数のさらなる領域とを含む。
【００１０】
本発明によって定義される組成物および製品は、単離されたかまたはさもなければ製造されたものである。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１１】
定義
別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される用語の多くについての一般的な定義を当業者に提供する:Singleton et al,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988);The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag(1991);およびHale & Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。本明細書において使用される場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、下記でこれらに与えられる意味を有する。
【００１２】
「アミロイド前駆体タンパク質」とは、アルツハイマー病に関連する、NCBI Ref Seq.NP_001129488またはそのフラグメントと少なくとも約85％の同一性を有するタンパク質を意味する。1つの態様では、アルツハイマー病ではAPP配列が重複する。例示的なAPP配列を以下に示す。
2019502407.tif 000003
【００１３】
「APPポリヌクレオチド」とは、APPタンパク質をコードする核酸分子を意味する。
【００１４】
「オルガノイド」とは、天然に存在する臓器の構造、マーカー発現または機能を少なくともある程度まで正確に反映する、インビトロで生成された細胞型の組織化された塊を意味する。
【００１５】
「神経マーカー」とは、その発現が神経細胞運命に関連する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。例示的な神経マーカーには、皮質、網膜、小脳、脳幹、顆粒ニューロン、ドーパミン作動性およびGABA作動性ニューロンに関連するマーカーが含まれる。例示的な小脳マーカーには、ATOH1、PAX6、SOX2、LHX2、およびGRID2が含まれるが、これらに限定されるわけではない。ドーパミン作動性ニューロンの例示的なマーカーには、チロシンヒドロキシラーゼ、小胞モノアミントランスポーター2（VMAT2）、ドーパミンアクティブトランスポーター（DAT）、およびドーパミン受容体D2（D2R）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。例示的な皮質マーカーには、ダブルコルチン、NeuN、FOXP2、CNTN4、およびTBR1が含まれるが、これらに限定されるわけではない。例示的な網膜マーカーには、網膜特異的グアニル酸シクラーゼ（GUY2D、GUY2F）、網膜および前神経ひだホメオボックス(RAX)、ならびに網膜特異的銅含有アミンオキシダーゼ2(RAX)が含まれるが、これらに限定されるわけではない。例示的な顆粒ニューロンマーカーには、SOX2、NeuroD1、DCX、EMX2、FOXG1、およびPROX1が含まれるが、これらに限定されるわけではない。例示的な脳幹マーカーには、FGF8、INSM1、GATA2、ASCL1、GATA3が含まれるが、これらに限定されるわけではない。例示的な脊髄マーカーには、HOXA1、A2、A3、B4、A5、C8、またはD13を含むがこれらに限定されるわけではないホメオボックス遺伝子が含まれるが、これらに限定されるわけではない。例示的なGABA作動性マーカーには、NKCC1またはKCC2が含まれるが、これらに限定されるわけではない。例示的な星状細胞マーカーには、GFAPが含まれるが、これに限定されるわけではない。例示的な乏突起膠細胞マーカーには、OLIG2またはMBPが含まれるが、これらに限定されるわけではない。例示的なミクログリアマーカーには、AIF1またはCD4が含まれるが、これらに限定されるわけではない。例示的な血管マーカーには、NOS3が含まれるが、これに限定されるわけではない。
【００１６】
「TSC1ポリペプチド」とは、脳発生において機能する、NCBI Ref:NP_000359.1で提供される配列と少なくとも85％のアミノ酸同一性を有するタンパク質またはそのフラグメントを意味する。例示的なヒトアミノ酸配列を以下に示す。
2019502407.tif 000004
【００１７】
「TSC1ポリヌクレオチド」とは、TSC1ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする任意の核酸配列を意味する。例示的なヒトTSC1核酸配列は、NCBI Ref NM_000368で提供される。
2019502407.tif 000005
2019502407.tif 000006
2019502407.tif 000007
【００１８】
「TSC2ポリペプチド」とは、脳発生において機能する、NCBI Ref:NP_000539.2で提供される配列と少なくとも85％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはそのフラグメントを意味する。例示的なヒトアミノ酸配列を以下に示す。
2019502407.tif 000008
1つの態様では、TSC2ポリペプチドは、脳発生に影響を及ぼす突然変異を含む。別の態様では、TSC2ポリペプチドは、N末端から1743番目の位置のアルギニンがグルタミンで置換されたARG1743GLNを含む。ARG1743GLNは、R1743Qとも称され得る。
【００１９】
「TSC2ポリヌクレオチド」とは、TSC2ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする任意の核酸配列を意味する。例示的なヒトTSC2核酸配列は、NCBI Ref NM_000548で提供される。
2019502407.tif 000009
2019502407.tif 000010
2019502407.tif 000011
【００２０】
「PSEN1ポリペプチド」とは、酵素活性を有するまたはβアミロイドレベルの調節において機能する、NCBI Ref:NP_000012.1で提供される配列と少なくとも85％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質またはそのフラグメントを意味する。例示的なヒトアミノ酸配列を以下に示す。
2019502407.tif 000012
1つの態様では、PSEN1ポリペプチドは突然変異（例えばALA246GLU）を包含する。1つの態様では、PSEN1ポリペプチドは、グルタミン酸によって置換された、例示的なPSEN1ポリペプチドのN末端から246番目の位置のアラニンに対応する、アラニンを含む。ALA246GLUは、A246Eとも称され得る。
【００２１】
「PSEN1ポリヌクレオチド」とは、PSEN1ポリペプチドまたはそのフラグメントをコードする任意の核酸配列を意味する。例示的なヒトPSEN1核酸配列は、NCBI Ref NM_000021で提供される。
2019502407.tif 000013
2019502407.tif 000014
2019502407.tif 000015
【００２２】
「作用物質」とは、任意の小分子化学化合物、抗体、核酸分子、またはポリペプチドもしくはそのフラグメントを意味する。
【００２３】
「改変」とは、本明細書に記載されるもののような標準的な技術分野で公知の方法によって検出される遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性の変化（増加または減少）を意味する。本明細書において使用される場合、改変は、発現レベルの10％の変化、25％の変化、40％の変化またはさらに50％またはそれ以上の発現レベルの変化を含む。
【００２４】
本開示において、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含有する」および「有する」等は、米国特許法でこれらに与えられる意味を有することができ、「包含する（includes）」、「包含する（including）」等を意味することができる;「から本質的になる」または「本質的に構成される」は、同様に米国特許法で与えられる意味を有し、この用語は制限がなく、列挙されるものの本質的または新規な特徴が、列挙されるものより多くの存在によって変化しない限り、列挙されるものより多くの存在を許容するが、先行技術の態様は除外する。
【００２５】
「検出する」は、検出すべき分析物の存在、不存在または量を同定することを指す。
【００２６】
「疾患」とは、細胞、組織または器官の正常な機能を損なうまたは妨げる任意の状態または障害を意味する。疾患の例には、結節性硬化症またはアルツハイマー病を含む神経学的状態が含まれる。
【００２７】
「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」という用語は、天然の状態で認められるような通常それに付随する成分を様々な程度まで含まない物質を指す。「単離する」は、元の供給源または周囲からの分離の程度を示す。「精製する」は、単離よりも高い分離の程度を示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、不純物がタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を及ぼさないまたは他の有害な結果を引き起こさないように十分に、他の物質を含まない。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えDNA技術によって作製されるときは、細胞材料、ウイルス物質もしくは培養培地を実質的に含まない、または化学合成されるときは、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない場合、精製されている。純度および均質性は、典型的には、分析化学技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィを用いて決定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じることを示し得る。修飾、例えばリン酸化またはグリコシル化に供され得るタンパク質の場合、異なる修飾は、別々に精製することができる異なる単離されたタンパク質を生じ得る。
【００２８】
「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が由来する生物の天然のゲノムにおいて、遺伝子に隣接する遺伝子を含まない核酸（例えばDNA）を意味する。この用語は、したがって、例えば、ベクターに、自律複製するプラスミドもしくはウイルスに、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAに組み込まれた組換えDNA、または他の配列とは独立した別個の分子（例えばPCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって作製されたcDNAまたはゲノムもしくはcDNAフラグメント）として存在する組換えDNAを含む。さらに、この用語は、DNA分子から転写されるRNA分子、およびさらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。
【００２９】
「単離されたポリペプチド」とは、それに天然に付随する成分から分離された本発明のポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、それが天然に結合しているタンパク質および天然に存在する有機分子を少なくとも60重量％含まない場合、単離されている。1つの態様では、調製物は少なくとも75％である。他の態様では、本発明のポリペプチドは、少なくとも約90〜99重量％である。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば天然源からの抽出によって、そのようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって、またはタンパク質を化学合成することによって入手し得る。純度は、任意の適切な方法、例えばカラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはHPLC分析によって測定することができる。
【００３０】
「マーカー」とは、特定の細胞型に関連する発現レベルまたは活性を有する任意のタンパク質またはポリヌクレオチド分析物を意味する。1つの態様では、トランスクリプトミクスを用いて、細胞運命、細胞分化および細胞特異的な構造または機能に関連するマーカーのレベルを測定する。
【００３１】
本明細書において使用される場合、「作用物質を得る」におけるような「得る」は、作用物質を合成する、購入する、またはさもなければ取得することを含む。
【００３２】
「参照」とは、標準または対照条件を意味する。
【００３３】
「対象」とは、ヒトまたは、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジもしくはネコなどの非ヒト哺乳動物を含むが、これに限定されるわけではない哺乳動物を意味する。
【００３４】
本明細書において提供される範囲は、その範囲内のすべての値の省略表現であると理解される。例えば、1〜50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50からなる群からの任意の数、数の組み合わせまたは部分的な範囲を含むと理解される。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「治療する（treat）」、「治療する（treating）」、「治療（treatment）」等の用語は、それに関連する障害および/または症状を軽減するまたは改善することを指す。除外するものではないが、障害または状態を治療することは、それに関連する障害、状態または症状が完全に排除されることを必要としないことが認識されるであろう。
【００３６】
特に明記されているまたは文脈から明らかである場合を除いて、本明細書において使用される場合、「または」という用語は包括的であると理解される。特に明記されているまたは文脈から明らかである場合を除いて、本明細書において使用される場合、「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」という用語は、単数または複数であると理解される。
【００３７】
特に明記されているまたは文脈から明らかである場合を除いて、本明細書において使用される場合、「約」という用語は、当技術分野における通常の許容範囲内、例えば平均の2標準偏差以内と理解される。約は、記述された値の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％または0.01％以内と理解することができる。文脈から特に明白でない限り、本明細書において提供されるすべての数値は、約という用語によって修飾される。
【００３８】
本明細書中の変動要素の任意の定義における化学基のリストの記述は、任意の単一の基または列挙される基の組み合わせとしてのその変動要素の定義を含む。本明細書における変動要素または局面の態様の記述は、任意の単一の態様としての、または任意の他の態様もしくはその一部との組み合わせでのその態様を含む。
【００３９】
本明細書において提供される任意の組成物または方法は、本明細書において提供される他の組成物および方法のいずれかの1つまたは複数と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図1Aは、インビトロで12週間で達成された約5週のインユーテロ発生に典型的な脳オルガノイド構造体の4倍の暗視野像を示す顕微鏡写真である。平均サイズ:2〜3mmの長さ。図1Bは、約12週間の培養後のiPSC由来ヒト脳オルガノイドの切片の免疫蛍光画像を示す。40倍のレンズを備えたレーザー共焦点イメージングを用いて得られた、厚さ0.3ミクロンの33個の光学切片のZスタック。上のパネルは、βIIIチューブリン（緑色:軸索）;MAP2（赤色:樹状突起）;Hoechst（青色:核）で染色した;下のパネルは、ダブルコルチン（赤色）で染色した。
【図２】図2は、中脳マーカーであるチロシンヒドロキシラーゼによる脳オルガノイド切片の免疫組織化学染色を示す顕微鏡写真である。8週齢の脳オルガノイドのパラホルムアルデヒド固定切片をチロシンヒドロキシラーゼに対する抗体で染色し、Alexa488結合二次抗体で検出し（緑色）、細胞核を示すためにHoechstで対比染色した（青色）;チロシンヒドロキシラーゼおよびHoechstに結合する抗体で染色した切片のスピニングディスク共焦点画像（40倍レンズ）（スケールバー:10μm）。
【図３】切片のスピニングディスク共焦点画像（40倍レンズ）。GFAPで染色した星状細胞（赤色）およびNeuNで染色した成熟ニューロン（緑色）。
【図４】図4は、概ね公知のプロファイル（下のパネル）と比較した、オルガノイド培養物の1、4および12週目のNKCC1およびKCC2発現のヒートマップとしての転写物の発生発現プロファイルを上のパネルに示す模式図である。NKCC1:Na(+)-K(+)-Cl(-)コトランスポーターアイソフォーム1。KCC2:K(+)-Cl(-)コトランスポーターアイソフォーム2。
【図５Ａ】図5Aは、NKCC1およびKCC2によるGABA作動性塩化物勾配の調節を示す模式図である。
【図５Ｂ】図5Bは、AmpliSeqとして市販されているトランスクリプトーム配列決定アプローチを用いて測定した、約12週間の培養下の脳オルガノイドの全トランスクリプトームプロファイルの代表的部分を示す表を提供する。この技術は、Clontechから購入した成人ヒト脳参照（HBR）およびまたAllen Instituteデータベースの公的に入手可能な胚ヒト脳（BRAINSCAN）アトラスにおいて発現されるものと比較できる、ニューロンおよび他の細胞型の多様な集団のニューロンマーカーの発現を際立たせた。
【図５Ｃ】図5Cは、インビトロでの約12週間の培養後のオルガノイド（縦列2）とヒト脳参照（縦列3）における遺伝子発現を比較するAmpliseq遺伝子発現データを示す表を提供する。98％を超える一致が観察された。
【図５Ｄ】図5Dは、約12週間の培養後の2つの独立した実験の間に生成されたオルガノイド（縦列2および3）を比較するAmpliseq遺伝子発現データを示す表を提供する。2つのオルガノイド間での遺伝子発現の再現性は99％を上回った。表において、値はRPKM（リード・パー・キロベース・パー・ミリオン・リード（Reads Per Kilo Base per Million reads））であり、<1はバックグラウンドであることに留意されたい。
【図６Ａ】図6Aは、発生トランスクリプトミクスの結果を示す模式図である。インビトロでの脳オルガノイド発生は、脳の発生プログラムの開始中の転写因子の発現パターンに関する公知のブール論理に従う。時点:1週間、4週間、12週間。PITX3およびNURR1（NR4A）は、中脳の発生を開始させる（早期;1週目）転写因子であり、DLK1、KLHL1、PTPRUおよびADH2は、これら2つの転写因子に応答して中脳発生をさらに促進し（中期;4週目および12週目）、TH、VMAT2、DATおよびD2Rは、インビボ発生発現パターンを模倣するドーパミンニューロンの機能を規定する。オルガノイドは、ドーパミン作動性ニューロンの発生に関与することがこれまでに公知の遺伝子を発現する（Blaess S,Ang SL.Genetic control of midbrain dopaminergic neuron development.Wiley Interdiscip Rev Dev Biol.2015 Jan 6.doi:10.1002/wdev.l69）。
【図６Ｂ】図6Bは、オルガノイド（縦列2）およびヒト脳参照（縦列3）において発現されない遺伝子についてのAmpliseq遺伝子発現データを示す表である。このデータは、生成されたオルガノイドが非神経組織の特徴である遺伝子を発現しないことを示す。この遺伝子発現の一致度は、非神経組織で高度に濃縮されるまたは特異的に発現されると考えられる約800の遺伝子について5％未満である。示されている嗅上皮で発現される嗅覚受容体遺伝子は代表的な例である。表中のほとんどの遺伝子について、遺伝子発現はゼロである。
【図７】図7は、小脳発生において発現される転写因子（TF）および特異的マーカーGRID2の発生ヒートマップを示す模式図を含む。
【図８】図8は、海馬歯状回で発現される転写因子の模式図および発生ヒートマップを提供する。
【図９】図9は、GABA作動性介在ニューロン発生において発現される転写因子の模式図および発生ヒートマップを提供する。GABA作動性介在ニューロンは、インビトロでは遅れて発生する。
【図１０】図10は、橋のセロトニン縫線核マーカー（Serotonergic Raphe Nucleus Markers of the Pons）で発現される転写因子の模式図および発生ヒートマップを提供する。
【図１１】図11は、転写因子トランスクリプトミクスの模式図および発生ヒートマップを提供する。脊髄頸部、胸部および腰部領域の分節化に関与するHox遺伝子は、インユーテロで別々の時点に発現される。インビトロ発生時間（1週間、4週間、12週間）の関数としての、オルガノイドにおけるこれらのHox遺伝子の発現パターン。
【図１２】図12は、2つの独立した実験からの脳オルガノイド発生の複製可能性を示すグラフである。トランスクリプトームの結果は、正常な12週齢の脳オルガノイドのAmpliseq分析によって得られた。
【図１３】図13は、星状細胞、乏突起膠細胞、ミクログリアおよび血管系細胞のマーカーの模式図および遺伝子発現定量化を提供する。
【図１４】図14は、正常（WT）、結節性硬化症（TSC2）およびTSC2対WTの培養約1週目の技術的複製物からのAmpliseq全ゲノムトランスクリプトミクスデータの散布図を含む。各複製物においておよそ13,000の遺伝子転写物が示されている。
【図１５】図15は、網膜発生および他の特異的マーカーにおいて発現される転写因子（TF）の発生ヒートマップを示す。網膜マーカーは、例えばFarkas et al.BMC Genomics 2013,14:486に記載されている。
【図１６】図16は、発達中の皮質の放射状グリア細胞およびニューロンにおいて発現される転写因子（TF）およびマーカーの発生ヒートマップを示す。
【図１７】図17は、インビトロでの脳オルガノイド発生を示す模式図である。iPSCは誘導多能性幹細胞を表す。NPCは神経前駆細胞を表す。
【図１８】図18は、2つの独立した実験からの脳オルガノイド発生の複製可能性を示すグラフである。
【図１９】図19は、TSC2（ARG1743GLN）オルガノイドにおける特定の遺伝子の発現レベルの変化を示す表である。約13,000の遺伝子を分析し、そのうち995の遺伝子は自閉症関連であり、121の遺伝子は癌関連である。
【図２０】図20は、TSC2（ARG1743GLN）オルガノイドにおける遺伝子発現の分析を示す模式図である。
【図２１】図21Aおよび21Bは、APP遺伝子重複（ALA246GLU）オルガノイドにおける特定の遺伝子の発現レベルの変化を示す2つの表である。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト障害に関連する遺伝的、分子的および細胞性異常を研究するためのインビトロモデルとして有用な、誘導多能性幹細胞（iPSC）由来のオルガノイドを特徴とする。このオルガノイドは、脳（例えばヒト、げっ歯動物）の発生、生理学および他の特徴をインビトロで再現する。本発明はさらに、疾患を研究しかつ神経疾患および障害の治療のための治療薬を同定するためにこの神経オルガノイドを使用する方法を提供する。
【００４２】
本発明は、少なくとも一部には、インビトロでの約12週間の培養後に、インユーテロで約5週間後のヒト胎児脳に匹敵する発生レベルを示すヒト脳オルガノイドを構築するために有用な方法に基づく。これらのオルガノイドは、多種多様なニューロンに特徴的なマーカーを発現する。オルガノイドは、星状細胞、乏突起膠細胞、ミクログリアおよび血管細胞のマーカーも含む。これらのオルガノイドは、ヒトの脳内で発現されることが公知の遺伝子の>98％を発現する単一の脳構造体中に、網膜、皮質、中脳、脳幹および脊髄を含む脳の主要領域すべてを形成する。このオルガノイドは、ヒトにおけるインビボでの使用に先立って、有効性、安全性および毒性に関して治療薬をスクリーニングすることを可能にするプラットフォームとして有用である。
【００４３】
特定の態様では、オルガノイドは線維芽細胞起源のiPSCに由来する。これらのオルガノイドでは、12週間以内に脳の主要部分:網膜、皮質、中脳、後脳および脊髄の完全な発生を観察することができる。これらのオルガノイドは、96ウェルプレート上で形成され得る。脳回路の双方向環境がこれらのオルガノイドに存在する。これらのオルガノイドでは、ニューロンおよびグリア細胞におけるエキソソームによるmiRNAとタンパク質の交換などの神経ニッチ作用が維持される。2つの独立した実験からの結果は、遺伝子発現パターンの99％を超える再現性を示す。これらはヒト脳参照と一致している。3つの独立したiPSC系統からの技術的複製物は、99％を超える遺伝子発現パターンを示す。3つの独立した脳オルガノイド（そのうちの1つが女性に由来する）からの結果は、特定の疾患病理を除いて、99％を超える遺伝子パターン類似性を示す。オルガノイドモデルは、臨床診断用途および薬剤開発のFDA測定基準に達するべく開発中である。
【００４４】
スクリーニングアッセイ
神経オルガノイドは、神経学的状態の発症を治療または予防する剤の毒性および有効性スクリーニングに使用することができる。1つの態様では、本明細書に記載の方法に従って生成されたオルガノイドを候補の剤と接触させる。オルガノイド（またはオルガノイド内の様々な細胞）の生存率を未処理対照オルガノイドの生存率と比較して、候補化合物の毒性を特徴付ける。細胞生存率を測定するためのアッセイは当技術分野において公知であり、例えばCrouch et al.(J.Immunol.Meth.160,81-8);Kangas et al.(Med.Biol.62,338-43,1984);Lundin et al.,(Meth.Enzymol.133,27-42,1986);Petty et al.(Comparison of J.Biolum.Chemilum 10,29-34,1995);およびCree et al.(Anticancer Drugs 6:398-404,1995)によって記述されている。細胞生存率は、MTT(3-(4,5-ジメチルチアゾリル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド)（Barltrop,Bioorg.＆Med.Chem.Lett.1:611,1991;Cory et al.,Cancer Comm.3,207-12,1991;Paull J.Heterocyclic Chem.25,911,1988）を含む様々な方法を用いて検定することができる。細胞生存率アッセイは市販もされている。これらのアッセイには、ルシフェラーゼ技術を使用してATPを検出し、培養中の細胞の健康状態または数を定量化するCELLTITER-GLO（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Promega）、および乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）細胞毒性アッセイであるCellTiter-Glo（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Promega）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００４５】
別の態様では、オルガノイドは、神経発生、活性または機能に影響を与える遺伝子突然変異を含む。オルガノイド内の細胞のポリペプチドまたはポリヌクレオチド発現は、ウェスタンブロット法、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、インサイチューハイブリダイゼーション、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）、ELISA、マイクロアレイ分析、RT-PCR、ノーザンブロット法または比色アッセイ、例えばブラッドフォードアッセイおよびローリーアッセイなどの、当技術分野において周知の手順によって比較することができる。
【００４６】
1つの実施例では、1つまたは複数の候補の剤を、様々な濃度で、オルガノイドを含有する培地に添加する。細胞内で発現される関心対象のポリペプチドの発現を促進する剤は、本発明において有用と見なされる;このような剤は、例えば神経発生または神経機能の異常によって特徴付けられる損傷、疾患または障害を予防する、遅延させる、改善する、安定化するまたは治療するための治療薬として使用し得る。ひとたび同定されると、本発明の剤は、神経学的状態を治療または予防するために使用し得る。
【００４７】
別の態様では、オルガノイドの細胞の活性または機能を候補化合物の存在下と不在下で比較する。望ましくは細胞の活性または機能を変化させる化合物を、本発明の方法において有用であるとして選択する。
【００４８】
試験化合物および抽出物
一般に、本発明において有用な剤は、当技術分野で公知の方法に従って、天然産物もしくは合成（もしくは半合成）抽出物の大きなライブラリから、または化学物質ライブラリから、またはポリペプチドもしくは核酸ライブラリから同定される。創薬および開発の分野の当業者は、試験抽出物または化合物の正確な供給源が本発明のスクリーニング手順に重要ではないことを理解するであろう。スクリーニングに使用される剤は、神経学的状態の治療のための治療薬として公知のものを含み得る。あるいは、実質的にあらゆる未知の化学抽出物または化合物が、本明細書に記載の方法を用いてスクリーニングできる。そのような抽出物または化合物の例には、植物、真菌、原核生物または動物ベースの抽出物、発酵ブロスおよび合成化合物、ならびに既存のポリペプチドの修飾物が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００４９】
細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態の天然ポリペプチドのライブラリは、Biotics(Sussex,UK)、Xenova(Slough,UK)、Harbor Branch Oceangraphics Institute(Ft.Pierce,Fla.)およびPharmaMar,U.S.A.(Cambridge,Mass.)を含む多くの供給源から市販されている。そのようなポリペプチドは、当技術分野で公知の、本明細書に記載の方法を用いてタンパク質形質導入ドメインを含むように修飾することができる。さらに、天然および合成で生成されるライブラリは、所望する場合は、当技術分野で公知の方法に従って、例えば標準的な抽出および分画法によって作製される。分子ライブラリの合成のための方法の例は、当技術分野において、例えばDeWitt et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909,1993;Erb et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422,1994;Zuckermann et al.,J.Med.Chem.37:2678,1994;Cho et al.,Science 261:1303,1993;Carrell et al.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059,1994;Carell et al.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061,1994;およびGallop et al.,J.Med.Chem.37:1233,1994において見出すことができる。さらに、所望する場合は、任意のライブラリまたは化合物が、標準的な化学的、物理的または生化学的方法を用いて容易に修飾される。
【００５０】
多くのポリペプチド、サッカリド、脂質、ペプチドおよび核酸ベースの化合物を含むがこれらに限定されるわけではない化学化合物のランダムなまたは指向性合成（例えば半合成もしくは全合成）を生じさせるための数多くの方法も利用可能である。合成化合物ライブラリは、Brandon Associates（Merrimack,N.H.）およびAldrich Chemical（Milwaukee,Wis.）から市販されている。あるいは、候補化合物として使用される化学化合物は、当業者に公知の標準的な合成技術および方法を使用して、容易に入手可能な出発物質から合成することができる。本明細書に記載の方法によって同定された化合物を合成するのに有用な合成化学変換および保護基の方法（保護および脱保護）は、当技術分野において公知であり、例えばR.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers(1989);T.W.Greene and P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,2nd ed.,John Wiley and Sons(1991);L.Fieser and M.Fieser,Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1994);L.Paquette,ed.,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis,John Wiley and Sons(1995)およびそれに続く版に記載されているようなものを含む。
【００５１】
化合物のライブラリは、溶液中（例えばHoughten,Biotechniques 13:412-421,1992）、またはビーズ（Lam,Nature 354:82-84,1991）、チップ(Fodor,Nature 364:555-556,1993)、細菌(Ladner、米国特許第5,223,409号)、胞子(Ladner、米国特許第5,223,409号)、プラスミド(Cull et al.,Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869,1992)もしくはファージ上(Scott and Smith,Science 249:386-390,1990;Devlin,Science 249:404-406,1990;Cwirla et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.87:6378-6382,1990;Felici,J.Mol.Biol.222:301-310,1991;Ladner、前記)に提示され得る。
【００５２】
さらに、創薬および開発の分野の当業者は、脱複製（例えば分類学的脱複製、生物学的脱複製および化学的脱複製もしくはそれらの任意の組み合わせ）または活性が既知の物質の複製物もしくは反復物の除去のための方法を、可能な場合は常に使用すべきであることを容易に理解する。
【００５３】
粗抽出物が所望の活性を有することが判明した場合、認められた作用の原因となる分子成分を単離するために、正のリード抽出物のさらなる分画が必要である。したがって、抽出、分画および精製工程の目標は、神経学的異常を治療または予防する粗抽出物中の化学的実体の注意深い特性決定および同定である。そのような不均一な抽出物の分画および精製の方法は当技術分野において公知である。所望する場合は、治療薬として有用であることが示された化合物を、当技術分野で公知の方法に従って化学的に修飾する。
【００５４】
キット
1つの態様では、本発明は、本発明のオルガノイドを含むキットを提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載のオルガノイドを得るための試薬を、単独でまたはそのような試薬の使用のための指示と組み合わせて提供する。そのようなキットは、生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態の通知を伴うことがあり、この通知は、ヒトでの投与のための製造、使用または販売の前記機関による承認を反映する。
【００５５】
本発明の実施には、別段の指示がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を使用し、これらは十分に当業者の技術範囲内である。そのような技術は、文献において、例えば“Molecular Cloning:A Laboratory Manual",second edition(Sambrook,1989);“Oligonucleotide Synthesis"(Gait,1984);“Animal Cell Culture"(Freshney,1987);“Methods in Enzymology"“Handbook of Experimental Immunology"(Weir,1996);“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells"(Miller and Calos,1987);“Current Protocols in Molecular Biology"(Ausubel,1987);“PCR:The Polymerase Chain Reaction",(Mullis,1994);“Current Protocols in Immunology"(Coligan,1991)において詳細に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生成に適用可能であり、したがって、それら自体、本発明を作製および実施する際に考慮され得る。特定の態様のための特に有用な技術を以下の項で論じる。
【００５６】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニングおよび治療方法を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されるものであり、本発明者らが自らの発明と見なすものの範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００５７】
実施例1:ヒト誘導多能性幹細胞由来の神経オルガノイドの生成
ヒト誘導多能性幹細胞由来の神経オルガノイドを以下のように生成した。
【００５８】
MEFの調製
・MEF培地中のゼラチン被覆した培養基上に、ウェル当たり2×105細胞の密度で、照射したマウス胚線維芽細胞（MEF）を播種する。プレートを37℃のインキュベータ中に一晩置く。
【００５９】
誘導多能性幹細胞（iPSC）の継代:
・予め温めたPBSでMEFを洗浄する。培地を1ウェルあたり1mlのiPSC培地/ROCK阻害剤と交換する。
・インキュベータからiPSCプレートを取り出す。iPSC細胞にiPSC培地を供給する。滅菌StemPro EZPassageツールを使用して、iPSCコロニーを切り出し、再懸濁する。細胞を穏やかに再懸濁し、分割して、MEF含有ウェルに移す（1:1）。
【００６０】
1.胚様体（EB）の作製:
・100mm培養皿を0.1％ゼラチンで被覆する。37℃のインキュベータに20分間入れる。
ゼラチンを取り除き、BSC中ですぐに使える状態まで皿を空気乾燥させる。
・6ウェルプレートの2つのウェルは、96ウェルプレートに十分な細胞を提供するはずである。iPSCとMEFを含むウェルを、Ca2+/Mg2+を欠く予め温めたPBSで洗浄する。PBS溶液を除去し、タンパク質分解酵素およびコラーゲン分解酵素の予め温めた細胞剥離溶液、ACCUTASE（商標）1ml/ウェルと置き換える。すべての細胞が剥離されるまで37℃のインキュベータで20分間プレートをインキュベートする。
・予め温めたiPSC培地を各ウェルに添加し、穏やかに粉砕して可視のコロニーを分割する。
・予め温めたさらなる培地を添加して15mlにし、ゼラチン被覆した培養プレート上に細胞を移して、37℃のインキュベータで60分間、MEFを被覆表面に接着させる。細胞懸濁液中に存在するiPSCを計数する。
・室温で5分間、300xgで懸濁液を遠心分離する。上清を廃棄し、ROCK阻害剤（最終濃度50μM）を含むEB培地中に、9,000細胞/150μLの体積になるように細胞を再懸濁する。
・LIPIDURE（登録商標）低接着性U底96ウェルプレートに150μlを播種し、37℃でインキュベートする。LIPIDUREコーティングは、ホスホリルコリンによって構成される生体適合性ポリマーであるMPCポリマーを含有する。
【００６１】
2.胚葉分化の開始:
・ウェルの底部でのEB形成を妨げることなく、EB培地の3/4を静かに交換することによって1日おきにEBに供給する。EB内のiPSC細胞間の相互作用がピペット操作中のせん断応力によってかき乱されないことが重要である。最初の4日間、EB培地は50μM ROCK阻害剤および4ng/mLのbFGFを含む。残りの2〜3日間は、ROCK阻害剤もbFGFもEBに添加しない。
【００６２】
3.原始神経上皮の誘導:
・LIPIDURE（登録商標）96ウェルプレート中のEBを、6日目または7日目に、500μl/ウェルの神経誘導培地を含む2つの24ウェルプレートに移す。2つのEBを各ウェルに静かに播種する。
・2日後、培地を交換する。EBは、神経外胚葉分化を示す「ハロー」をそれらの外周に帯びるはずである。「ハロー」を有するEBだけを、マトリゲルに包埋するために選択する。他のEBは廃棄する。
【００６３】
4.マトリゲル包埋:
・長方形[5cmx7cm]のプラスチックパラフィンフィルム（PARAFILM）を、3％過酸化水素を用いて滅菌し、長方形の中に一連のくぼみを作る。これは、例えば、長方形を空の滅菌200ulチップボックスプレスの中心に置き、長方形を静かに押してくぼみを作り、ボックス内に穴の跡をつけることによって達成され得る。ボックスにエタノールを噴霧し、BSC中に置いて乾燥させる。
・4℃で平衡に達するまで、冷蔵庫内で氷上にて2〜3時間、凍結マトリゲルマトリックスアリコート（500μl）を解凍する。
・工程3からの単一EBをフィルムの各々のくぼみに移す。7cm×5cmの長方形は20のEBを保持するはずである。余分な培地をピペットで除去した後、マトリゲルの20μlアリコートをEB上に移す。37℃で30分間インキュベートしてマトリゲルを重合させる。粘性マトリゲルの20μlの小滴は、必須の栄養素およびガスの交換を可能にしつつ、初期にEB内の細胞によって分泌されたモルフォゲンおよび成長因子の勾配を捕捉することによって、EBからの脳オルガノイドの適切な成長を支持する最適な3D環境を形成することが認められた。組織培養インキュベータ（37℃/5％CO2）内で1日2回数分間、手で穏やかに振動させることによって、包埋されたEBへのガスおよび栄養素の最適な交換がさらに可能になる。
・100mm組織培養皿に分化培地1を添加する。マトリゲル中のEBを含むフィルムを培地上に裏返して置き、37℃で16時間インキュベートする。
・16時間後、EB/マトリゲル小滴を、フィルムから培地を含む培養皿に移す。37℃での静置培養を4日間継続し、安定な神経オルガノイドを形成させる。
【００６４】
5.オルガノイド発生:
オルガノイドを、分化培地2を含む培養皿に静かに移す。フラスコを、37℃/5％インキュベータ内の40rpmで回転するオービタルシェーカー上に置く。理論に拘束されることを望むものではないが、網膜、皮質、中脳、後脳および脊髄を含む、より複雑で完全な構造体への脳オルガノイドの発生中のパターン形成に影響を及ぼし得る種々の系統のニューロンの初期前駆体間の拡散勾配の乱れを最小限に抑えるため;オルガノイドの生存のためのマトリックス内のガスの最適な交換を提供し、アポトーシスを防止するため;栄養素を提供してマトリックス内に最適に拡散させるため;ならびに脳脊髄液の機能を有効に模倣する廃棄物の流出を可能にするために、これらの条件を選択した。モルフォゲンおよび成長因子勾配が、脳の関連構造体を形成するレシピエント細胞内の標的に作用するのに十分な時間を与えるために、培地をフラスコ中で3〜4日ごとに交換する。培地の交換は、構造体がより大きなオルガノイドに成長するにつれて、オルガノイドの最外周に配置されるモルフォゲン/分泌された成長因子の勾配に対する不必要なかく乱を避けるために注意して行う。
【００６５】
図16は、インビトロでの脳オルガノイド発生を示す。トランスクリプトーム解析に基づき、iPSC細胞は、3D培養後の細胞の本体を形成し、これが、神経分化培地処理後に神経前駆細胞（NPC）になる。ニューロンは、約1週間で細胞培養物において認めることができる。約4週間で、複数の系統のニューロンが出現する。約12週間で、オルガノイドは、ミクログリア、乏突起膠細胞、星状細胞、神経前駆細胞、ニューロンおよび介在ニューロンを含む種々の種類の細胞を有する段階へと発達する。
【００６６】
実施例2:ヒト誘導多能性幹細胞由来の神経オルガノイドは、ヒトの脳発生の特徴を発現する
インビトロでの約12週間の培養後、トランスクリプトームおよび免疫組織化学分析は、実施例1で記述した方法に従って生成されたオルガノイドが、ニューロン、星状細胞、乏突起膠細胞、ミクログリアおよび血管系に特徴的なマーカーを発現する細胞（図1〜図14）ならびに神経外胚葉起源のすべての主要な脳構造体を含むことを示す。形態学的には、明視野イメージングにより、オルガノイドは、大脳皮質、頭屈および眼茎を含む容易に識別可能な神経構造体（グレイ解剖学テキスト）を含む。それらの遺伝子発現パターンは、成人のヒト脳参照（Clontech）のものと>98％一致する。それらはまた、以前に記述された発生学的に組織された方法で遺伝子を発現する（例えば中脳の中脳ドーパミン作動性ニューロンについては、Blaese et al.,2015）。それらはまた、複数の神経特異的マーカー（樹状突起、軸索、核）、皮質ニューロン（ダブルコルチン）、中脳ドーパミンニューロン（チロシンヒドロキシラーゼ）および星状細胞（免疫組織学によるGFAP）を染色する。
【００６７】
すべてのヒトオルガノイドは、線維芽細胞起源のiPSC（System Biosciences,Inc）由来であった。様々な脳構造体の発生をオルガノイドにおいて特徴付けた。網膜マーカーを図15に示す。皮質発生の間に発現される微小管関連タンパク質であるダブルコルチン（DCX）が認められた（図1Aおよび図1B、図16）。中脳発生は、チロシンヒドロキシラーゼのマーカーを用いて特徴付けた（図2）。トランスクリプトミクスを用いて、中脳マーカーDLK1、KLHL1およびPTPRUの発現を検出した（図6A）。オルガノイド中の星状細胞の存在を同定するために、GFAPでの染色を用いた（図3）。成熟ニューロンの存在を、NeuNに対する染色で特徴付けた（図3）。ニューロン特異的膜タンパク質であるNKCC1およびKCC2の存在が認められた（図4）。NKCC1およびKCC2の役割の模式図を図5Aに示す。図5Bは、ヒトの脳発生の間に発現される様々なマーカーが、実施例1に記載したように生成したオルガノイドにおいても発現されることを示す。
【００６８】
オルガノイド内で発現されるマーカーは、興奮性、抑制性、コリン作動性、ドーパミン作動性、セロトニン作動性、星状細胞、乏突起膠細胞、ミクログリア、血管系の細胞型の存在と一致する。これらのマーカーは、Clontech（図5C）からのヒト脳参照（HBR）によって同定されたものと一致し、独立した実験で再現可能であった（図5D）。脳の外側の組織に特徴的なマーカーは認められなかった（図6B）。
【００６９】
ドーパミンの合成に使用される酵素であるチロシンヒドロキシラーゼは、免疫細胞化学（図5B）およびトランスクリプトミクス（図6A）を用いてオルガノイドにおいて認められた。小胞モノアミントランスポーター2（VMAT2）、ドーパミンアクティブトランスポーター（DAT）、およびドーパミン受容体D2（D2R）を含む他のドーパミン作動性マーカーの発現は、トランスクリプトーム解析を用いて認められた。図7は、小脳発生に特徴的なマーカーの発現を描写する。図8は、海馬歯状回に存在するニューロンに特徴的な、トランスクリプトミクスを用いて同定されたマーカーのリストを提供し、脊髄は12週間のインビトロ培養後に認められた。図9は、GABA作動性介在ニューロン発生に特徴的な、トランスクリプトミクスを用いて同定されたマーカーのリストを提供する。図10は、脳幹に特徴的な、トランスクリプトミクスを用いて同定されたマーカー、特に橋のセロトニン作動性縫線核に関連するマーカーのリストを提供する。図11は、脊髄の頸部、胸部および腰部領域の発生の間に発現される様々なHox遺伝子の発現を列挙する。
【００７０】
図12は、結果が実験間で再現可能であることを示す。トランスクリプトミクスを用いて検出されたマーカーの発現を図13に要約する。
【００７１】
要するに、本明細書において報告される結果は、本発明が、サイズおよび特定の形態学的特徴に基づき、約5週齢のヒト胎児脳に類似するインビトロ培養されたオルガノイドを提供し、培養皿で成長させることができる約2〜3mmのオルガノイドにおいて、眼茎、大脳半球および頭屈に非常によく似ていることを裏付ける。ニューロン、軸索、樹状突起の存在、皮質の層発生および中脳マーカーの存在を確認するために、切片に関する免疫組織学的方法およびオルガノイドの共焦点イメージングを用いて、高分解能の形態学的分析を実施した。
【００７２】
このオルガノイドは、図Xの皮質構造の層状組織化によって表される脳回路の双方向環境を含み、したがって、エキソソームによるmiRNAとタンパク質の交換が異なる細胞型間で起こり得る自然な神経ニッチの形成を支持する。
【００７３】
脳オルガノイドを、トランスクリプトミクスによって1週目、4週目および12週目に評価した。オルガノイドは再現可能および複製可能である（図5C、図5D、図12および図18）。2つの独立した実験で生成され、トランスクリプトーム解析に供された脳オルガノイドは、発現パターンの>99％の複製可能性およびほとんどの遺伝子の同等の発現レベルを示し、そのうちの一部では<2倍の分散であった。
【００７４】
全ゲノムトランスクリプトミクスを用いて培養時間の関数として遺伝子発現パターンを分析した。本明細書に報告される結果は、インビボでの遺伝子発現の公知の発生順序が起こるが、いくぶんより緩やかな時系列で起こることを示す。例として、中脳での中脳ニューロンの発生においてユニークに発現される転写因子NURR1およびPITX3を用いて、本発明者らは、インビトロでのそれらの一時的な発現パターンが公知のインビボ遺伝子発現パターンを再現することを示す（図6A）。同様に、GABAが媒介する興奮から抑制への移行は、細胞内の塩化物イオンを増加させるNa(+)-K(+)-2Cl(--))コトランスポーターNKCC1（SLC12A2）の、細胞内の塩化物イオンを減少させるK(+)-Cl(-)コトランスポーターKCC2（SLC12A5）（Owens and Kriegstein,2002）への発現の切り替え後に起こる（Blaesse et al.,2009）。本発明者らは、NKCC1およびKCC2の発現プロファイルが、興奮性であるGABAから抑制性へと移行する胎児脳と一致する方法で変化し（図4および図5）、発生トランスクリプトミクスによって観測することができる、培養中の脳オルガノイドの発生に関するデータを有している。
【００７５】
上述したオルガノイドは、以下の方法および材料を用いて得られた。
【００７６】
細胞:
・ヒトiPSC、フィーダー依存性（System Bioscience. WT SC600A-W）
・CF-1マウス胚線維芽細胞フィーダー細胞、γ線照射（Applied StemCell,Inc. No.ASF-1217）
【００７７】
増殖培地および添加物
・DMEM非必須アミノ酸（MEM-NEAA,Invitrogen No.11140-050）
・リン酸緩衝生理食塩水、滅菌（Invitrogen No.14040-091）
・リン酸緩衝生理食塩水、Ca++およびMg++不含（Invitrogen No.14190-094）
・ゲンタマイシン試薬溶液（Invitrogen No.15750-060）
・抗生物質-抗真菌剤（Invitrogen No.15240-062）
・2-メルカプトエタノール（EmbryoMAX、EMBMillipore No.ES-007-E）
・塩基性線維芽細胞成長因子（FGF、PeproTech No.051408-1）
・ヘパリン（Sigma、No.H3149-25KU）
・インスリン溶液（Sigma No.I9278-5ml）
・ジメチルスルホキシド（No.D9170-5VL）
・ROCK阻害剤Y27632（Millipore No.SCM075）
・ゼラチン溶液、B型（Sigma No.G1393-100ml）
・マトリゲルマトリックス（BD Bioscience No.354234）、成長因子非減少型マトリゲル
・（Sigma No.A6964）
・過酸化水素（Fisher No.H325-500）
・エタノール
・無菌H2O
【００７８】
培地組成物:
MEF培地:以下を添加したDMEM培地:
・10％ウシ胎仔血清
・100単位/mlペニシリン
・100μg/mlストレプトマイシン
・0.25μg/ml Fungizone
・IPSC培地:以下を添加したDMEM/F12培地:
・20％ノックアウト置換血清
・3％ウシ胎仔血清 o 2mM Glutamax
・1X最小必須培地非必須アミノ酸
・20ng/ml塩基性線維芽細胞成長因子
【００７９】
EB培地:以下を添加した、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(DMEM)/ハムF-12培地（Invitrogenから市販されている）:
・20％ノックアウト置換血清
・3％ウシ胎仔血清 o 2mM Glutamax
・1X最小必須培地非必須アミノ酸
・55μMのβ-メルカプトエタノール
・4ng/ml塩基性線維芽細胞成長因子
・神経誘導培地:以下を添加したDMEM/F12培地:
・1:50希釈のN2添加物
・1:50希釈のGlutaMax
・1:50希釈のMEM-NEAA
・10μg/mlヘパリン
【００８０】
分化培地1:以下を添加した、DMEM/F12培地:神経細胞培養用基礎培地（1:1）（それぞれInvitrogenから市販されている）
・1:200希釈のN2添加物
・1:100希釈のB27-ビタミンA
・2.5μg/mlインスリン
・窒素マスク下に保持し、-20℃で凍結させた55μMのβ-メルカプトエタノール
・100単位/mlペニシリン
・100μg/mlストレプトマイシン
・0.25μg/ml Fungizone
【００８１】
分化培地2:以下を添加した、DMEM/F12培地:神経細胞培養用基礎培地（1:1）:
・1:200希釈のN2添加物
・1:100希釈のB27+ビタミンA
・2.5μg/mlインスリン
・窒素マスク下に保持し、-20℃で凍結させた55μMのβ-メルカプトエタノール。理論に拘束されることを望むものではないが、β-メルカプトエタノールは、インキュベータ内の、毒性の反応性酸素種の産生を促進する可能性が高い20％酸素環境において、適切なiPSCの健康およびEBへの成長のための酸化還元条件を提供する。不適切な保存条件に起因するその酸化還元能力の喪失は、iPSC由来のEBからのオルガノイドの適切な発生を損ない得る。
・100単位/mlペニシリン
・100μg/mlストレプトマイシン
・0.25μg/ml Fungizone
【００８２】
分化培地3:以下を添加した、DMEM/F12培地:神経細胞培養用基礎培地（1:1）:
・1:200希釈のN2添加物 1:100希釈のB27+ビタミンA
・2.5μg/mlインスリン
・窒素マスク下に保持し、-20℃で凍結させた55μMのβ-メルカプトエタノール。理論に拘束されることを意図しないが、β-メルカプトエタノールは、EB由来の脳オルガノイドにおける中脳構造体の発生に寄与し得る。
・100単位/mlペニシリン
・100μg/mlストレプトマイシン
・0.25μg/ml Fungizone
・メラトニン
・TSH
【００８３】
装置:
・StemPro EZPassage（Invitrogen No.23181-010）理論に拘束されることを望むものではないが、EZPassageツールは、サブクローニングのためのより均一なiPScコロニーをもたらす、iPSCの均一な正方形を切り出す。均一性は、EBを作製する際に下流の均一性を高める。
・組織培養フラスコ、再密閉可能な115cm2（TPP No.TP90652）
・組織培養フラスコ、再密閉可能な150cm2（TPP No.TP90552）
・Lipidure被覆プレート、96ウェル、U底（LCU96）
・Lipidure被覆マルチディッシュ、24ウェル（510101619）
・Parafilm（Sigma No.P7793）150ml/250ml溶液用の滅菌ろ過ユニット（TPP99150、TPP99250）
・37℃および5％CO2で維持した、ベンチトップ組織培養遠心分離機CO2インキュベータ
【００８４】
実施例3:結節性硬化症複合体モデル
結節性硬化症複合体（TSC）は、脳を含む多くの異なる器官において非悪性腫瘍を形成させる遺伝的障害である。TSCは、患者が発作、発達遅延、知的障害および自閉症を有するため、生活の質に強い影響を及ぼす。結節性硬化症複合体を引き起こし得る2つの遺伝子が同定されている。TSC1遺伝子は9番染色体上に位置し、ハマルチン遺伝子と呼ばれる。他方の遺伝子、TSC2は16番染色体上に位置し、ツベリン遺伝子と呼ばれる。
【００８５】
本発明者らは、iPSCからのTSC2遺伝子の遺伝子変異体（ARG1743GLN）（カタログNo.GM25318 Coriell Institute Repository,NJ）を有する患者に由来するiPSC細胞からヒト脳オルガノイドを誘導した。このオルガノイドは、結節性硬化症TSC2突然変異体の遺伝的モデルとして役立つ。正常およびTSC2突然変異体モデルの両方を、遺伝子発現の変化およびそれらがTSC患者に関連する公知の臨床病理とどの程度相関しているかを評価するために、Ampliseq分析を用いてゲノムワイドトランスクリプトーム解析に供した（図14）。
【００８６】
全ゲノムトランスクリプトームデータは、発現されたすべての遺伝子（約13,000）のうちで、12未満が、WTおよびTSC2の両方の複製物において>2倍の分散を示すことを明らかにする。これは、培養1週目の本発明者らの脳オルガノイド誘導工程の堅固さおよび複製可能性についてのさらなる裏付け証拠である。TS患者は、臨床的に、典型的には脳、肺、心臓、腎臓および皮膚を含む複数の器官に腫瘍（過誤腫（Harmatoma））を有する。WT対TSC2の比較において、>2倍から300倍の差を示す遺伝子には、全ゲノムおよびエクソーム配列決定法（SFARIサイトデータベース）を用いてマッピングされた、1）腫瘍形成および2）自閉症と相関するものが含まれる（図19および図20）。
【００８７】
図19は、TSC2（Arg1743Gln）モデル（縦列2および3）ならびにWT（正常）モデル（縦列3および4）由来のオルガノイドの複製物間で比較したSimon Foundation（SFARI）データベース中の遺伝子のAmpliseq遺伝子発現データを示す。自閉症遺伝子および倍数変化（縦列5）を有する他の臨床症状に関連する遺伝子ならびにSFARIデータベースの状態または公知の腫瘍形成状態が強調されている。
【００８８】
したがって、トランスクリプトームデータは、結節性硬化症患者における腫瘍、自閉症および他の臨床症状の公知の臨床表現型と良好に相関し、ヒト脳オルガノイド発生モデルの有用性を実証する。
【００８９】
実施例4:アルツハイマー病APP1遺伝子重複ヒト脳オルガノイド
モデル
アルツハイマー病は、記憶障害および日常生活を妨げる他の知的能力に関連する、認知症の一般的な形態である。アルツハイマー病は認知症症例の60〜80％を占める。プラークおよびもつれと呼ばれる2つの異常な構造体が神経細胞を損傷し、死滅させると考えられている。プラークは、神経細胞間の間隙に蓄積するβ-アミロイドと呼ばれるタンパク質断片の沈着物である。もつれは、細胞の内部に蓄積するタウと呼ばれる別のタンパク質のねじれた線維である。
【００９０】
ヒト脳オルガノイドは、アミロイド前駆体タンパク質（APP）遺伝子の変異体を有する患者由来のiPSC細胞から生成されたものであり、この遺伝子は、ADの早期発症の60歳の女性から複製されている。iPSCは、ニュージャージー州のCoriell Instituteから入手した。
【００９１】
PSEN1遺伝子は、プレセニリン1と呼ばれるタンパク質をコードする。このタンパク質は、ガンマ-（γ-）セクレターゼと呼ばれる複合体の1つの部分（サブユニット）である。プレセニリン1は、タンパク質分解によって他のタンパク質をより小さなペプチドに切断する、複合体の主要な機能を果たし、プレセニリン1はγ-セクレターゼのタンパク質分解サブユニットと表現される。
【００９２】
γ-セクレターゼ複合体は、細胞を取り巻く膜内に位置し、細胞膜を横切る多くの異なるタンパク質（膜貫通タンパク質）を切断する。この切断は、細胞の外側から核内にシグナルを伝達するいくつかの化学的シグナル伝達経路における重要な工程である。Notchシグナル伝達として知られるこれらの経路の1つは、毛包細胞および他の種類の皮膚細胞の正常な成熟および分裂に必須である。Notchシグナル伝達は、正常な免疫系機能にも関与する。
【００９３】
γ-セクレターゼ複合体は、脳および他の組織で作られるアミロイド前駆体タンパク質（APP）を処理するうえでのその役割が最もよく知られていると考えられる。γ-セクレターゼは、APPを、可溶性アミロイド前駆体タンパク質（sAPP）およびいくつかの型のアミロイド-ベータ（β）ペプチドを含むより小さなペプチドに切断する。sAPPが成長促進特性を有し、出生前および出生後の両方の脳において神経細胞（ニューロン）の形成に役割を果たし得ることを示唆する証拠がある。sAPPおよびアミロイドβペプチドの他の機能は現在検討中である。
【００９４】
脳オルガノイドモデル系の有用性を、APP突然変異を有するアルツハイマー病患者の遺伝的脳オルガノイドモデルを構築することによって試験した。正常およびAPP突然変異モデルの両方を、培養4週目の遺伝子発現の変化およびそれらがAD患者に関連する公知の臨床病理とどの程度相関しているかを評価するために全ゲノムトランスクリプトーム解析に供した。
【００９５】
図21Aおよび21Bは、AD（APP）モデル（縦列2および3）ならびに倍数変化（縦列6）を有するWT（正常）モデル（縦列4および5）からのオルガノイドの複製物間でのSFARIデータベース中の遺伝子のAmpliseq遺伝子発現比較を示す。これらは、その発現がアルツハイマー病モデルにおいて調節不全である遺伝子の代表的な例である。
【００９６】
全ゲノムトランスクリプトームデータは、発現されたすべての遺伝子（培養4週目に約13,000）のうちで、WTおよびAPPの両方の複製物において約1800だけが>2倍の分散を示すことを明らかにする。これは、脳オルガノイド誘導工程の堅固さおよび複製可能性についてのさらなる裏付け証拠である。
【００９７】
要するに、約1800の調節不全遺伝子がアルツハイマー病専用のデータベースにマッピングされているため、APP突然変異によってかき乱された新しい遺伝子調節ネットワークが「アルツハイマー病ネットワーク」として同定された。その意味は、ゲノミクスによって同定された自閉症と相関する何百もの遺伝子変異体がごくわずかなアルツハイマー病ネットワークしか表していない可能性があるということであり、これらのネットワークにおける節点を同定することは、ADの治療標的の同定を大きく簡略化するであろうことを示唆する。
【００９８】
他の態様
前記の説明から、様々な用途および条件に適合させるために、本明細書に記載された本発明に変更および修正を加え得ることは明らかであろう。そのような態様もまた、添付の特許請求の範囲内である。
【００９９】
本明細書中の変動要素の任意の定義における要素のリストの記述は、列挙される要素の任意の単一の要素または組み合わせ（もしくは部分的組み合わせ）としてのその変動要素の定義を含む。本明細書における態様の記述は、任意の単一の態様としての、または任意の他の態様もしくはその部分との組み合わせでのその態様を含む。
【０１００】
本明細書で言及したすべての特許および刊行物は、各々の独立した特許および刊行物が具体的におよび個別に参照により組み込まれることが示されているのと同じように、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2019502407.tif 000017
【図２】
2019502407.tif 000018
【図３】
2019502407.tif 000019
【図４】
2019502407.tif 000020
【図５Ａ】
2019502407.tif 000021
【図５Ｂ】
2019502407.tif 000022
【図５Ｃ】
2019502407.tif 000023
【図５Ｄ】
2019502407.tif 000024
【図６Ａ】
2019502407.tif 000025
【図６Ｂ−１】
2019502407.tif 000026
【図６Ｂ−２】
2019502407.tif 000027
【図６Ｂ−３】
2019502407.tif 000028
【図７】
2019502407.tif 000029
【図８】
2019502407.tif 000030
【図９】
2019502407.tif 000031
【図１０】
2019502407.tif 000032
【図１１−１】
2019502407.tif 000033
【図１１−２】
2019502407.tif 000034
【図１１−３】
2019502407.tif 000035
【図１２】
2019502407.tif 000036
【図１３】
2019502407.tif 000037
【図１４】
2019502407.tif 000038
【図１５】
2019502407.tif 000039
【図１６】
2019502407.tif 000040
【図１７】
2019502407.tif 000041
【図１８】
2019502407.tif 000042
【図１９Ａ】
2019502407.tif 000043
【図１９Ｂ】
2019502407.tif 000044
【図１９Ｃ】
2019502407.tif 000045
【図２０】
2019502407.tif 000046
【図２１Ａ】
2019502407.tif 000047
【図２１Ｂ】
2019502407.tif 000048
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月14日(2018.9.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2019502407000001.app
【国際調査報告】
2019502407.tif 000049
2019502407.tif 000050
2019502407.tif 000051