(57)【要約】細胞外マトリックス材料が記載されている。この材料は、フィブリンまたはフィブリノゲン、および増量剤を含む架橋された足場を有する。このような足場には、リン酸カルシウム鉱物相が堆積される。また、このような材料を形成するための方法が記載される。このようなリン酸カルシウム鉱物相は、上記足場を、Ｃａ２＋およびＨＰＯ４２を含み、任意選択で各種イオンをさらに含む流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フィブリンまたはフィブリノゲン、および増量剤を含む架橋された足場、ならびに
前記足場上に堆積しているセラミック
を含む、細胞外マトリックス材料。
【請求項２】
前記セラミックが、リン酸カルシウム鉱物相であるか、またはリン酸カルシウム鉱物相を含む、請求項１に記載の細胞外マトリックス。
【請求項３】
前記増量剤が、アルギン酸塩、例えばアルギン酸ナトリウムまたは誘導体化アルギン酸塩、例えばプロピルグリコアルギン酸ナトリウムである、請求項１または請求項２に記載の細胞外マトリックス材料。
【請求項４】
前記増量剤が、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ；例えばコンドロイチン６−硫酸、コンドロイチン４−硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、キチン、キトサン、デキストラン硫酸またはヒアルロナン）である、請求項１または請求項２に記載の細胞外マトリックス材料。
【請求項５】
前記増量剤が、ヒドロキシエチルデンプン、エチルセルロース、キサンタンガムおよびアガロースから選択される、請求項１または請求項２に記載の細胞外マトリックス材料。
【請求項６】
細胞外マトリックス材料を調製するための方法であって、セラミックを、フィブリンまたはフィブリノゲン、および増量剤を含む架橋された足場上に堆積させるステップを含む、方法。
【請求項７】
前記セラミックが、リン酸カルシウム鉱物相である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、生物模倣堆積によって前記足場上に堆積させられる、請求項６または請求項７に記載の方法。
【請求項９】
リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、Ｃａ２＋およびＨＰＯ４２を含み、任意選択でｉ）Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ−、ＨＣＯ３−，ＨＰＯ４２−およびＳＯ４２−、ｉｉ）Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ−、ＨＣＯ３−およびＨＰＯ４２−、またはｉｉｉ）Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋をさらに含む流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項６から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、１〜３０ｍＭのＣａ２＋、好ましくは１〜２０ｍＭのＣａ２を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、０．５〜１０ｍＭのＨＰＯ４２−を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、１００〜８００ｍＭのＮａ＋を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、１〜５０ｍＭのＫ＋を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、０．５〜２０ｍＭのＭｇ２＋を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、１００〜８００ｍＭのＣｌ−を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、１〜１００ｍＭのＨＣＯ３−を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、１〜１０ｍＭのＳＯ４２−を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、１〜５ｍＭのＣａ２＋、好ましくは２〜３ｍＭのＣａ２＋、最も好ましくは約２．５ｍＭのＣａ２＋を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、０．５〜３ｍＭのＨＰＯ４２−、好ましくは０．５〜２ｍＭのＨＰＯ４２−、最も好ましくは約１ｍＭのＨＰＯ４２−を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、１００〜２００ｍＭのＮａ＋、好ましくは１２０〜１６０ｍＭのＮａ＋、さらにより好ましくは１４０〜１５０ｍＭのＮａ＋、最も好ましくは約１４２ｍＭのＮａ＋を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、１〜１０ｍＭのＫ＋、好ましくは３〜７ｍＭのＫ＋、最も好ましくは約５ｍＭのＫ＋を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、０．５〜３ｍＭのＭｇ２＋、好ましくは１〜２ｍＭのＭｇ２＋、最も好ましくは約１．５ｍＭのＭｇ２＋を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、１００〜２００ｍＭのＣｌ−、好ましくは１２０〜１６０ｍＭのＣｌ−、より好ましくは１４０〜１５０ｍＭのＣｌ−、最も好ましくは約１４８．８ｍＭのＣｌ−を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、１〜１０ｍＭのＨＣＯ３−、好ましくは２〜８ｍＭのＨＣＯ３−、より好ましくは４〜５ｍＭのＨＣＯ３−、最も好ましくは約４．２ｍＭのＨＣＯ３−を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、１〜５ｍＭのＣａ２＋、０．５〜３ｍＭのＨＰＯ４２、１００〜２００ｍＭのＮａ＋、１〜１０ｍＭのＫ＋、０．５〜３ｍＭのＭｇ２＋、１００〜２００ｍＭのＣｌ−および１〜１０ｍＭのＨＣＯ３−を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項１１から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、２〜３ｍＭのＣａ２＋、０．５〜２ｍＭのＨＰＯ４２−、１２０〜１６０ｍＭのＮａ＋、３〜７ｍＭのＫ＋、１〜２ｍＭのＭｇ２＋、１２０〜１６０ｍＭのＣｌ−および２〜８ｍＭのＨＣＯ３−を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項１１から２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、１０〜３０ｍＭのＣａ２＋を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、５〜１０ｍＭのＨＰＯ４２−を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から１７または２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、５００〜８００ｍＭのＮａ＋を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から１７または２７から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、１０〜４０ｍＭのＫ＋を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から１７または２７から２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、５〜１５ｍＭのＭｇ２＋を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から１７または２７から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、５００〜８００ｍＭのＣｌ−を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から１７または２７から３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、１０〜１００ｍＭのＨＣＯ３−を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から１７または２７から３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、前記足場を、１〜１０ｍＭのＳＯ４２−を含む流体と接触させるか、または前記足場を前記流体に浸漬させることによって、前記足場上に堆積させられる、請求項７から１７または２７から３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記足場が、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも２日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、または少なくとも９日間、前記流体と接触させられるか、または前記流体に浸漬させられる、請求項９から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記足場が、２０日間まで、好ましくは１０日間まで、最も好ましくは９日間まで、前記流体と接触させられるか、または前記流体に浸漬させられる、請求項９から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記足場が、
（ａ）フィブリノゲンの水溶液を、凝固剤および増量剤と混合するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた混合物を、架橋剤と共にインキュベートするステップと、
（ｃ）前記架橋剤を除去するために、ステップ（ｂ）で得られた架橋された組成物を洗浄するステップと
を含む方法によって得られた、形成された、または入手可能である、請求項７から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）フィブリノゲンの水溶液を、凝固剤および増量剤と混合するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた混合物を、架橋剤と共にインキュベートするステップと、
（ｃ）前記架橋剤を除去するために、ステップ（ｂ）で得られた架橋された組成物を洗浄するステップと
を含む方法によって、前記足場を形成することを含む、請求項７から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
フィブリノゲンが、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の１つを超える純度レベルで存在する、請求項３７または請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
フィブリノゲンが、切断型のフィブリノゲン、例えばフィブリンＡ、フィブリンＢ、フィブリンＣ、フィブリンＤ、フィブリンＸおよびフィブリンＹとして存在する、請求項３７から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記切断型のフィブリノゲンが、フィブリンＥである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
フィブリノゲンが、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはＨＥＰＥＳ緩衝食塩水でｐＨ４〜１０の間に緩衝化された水溶液として存在する、請求項３７から４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記凝固剤が、酵素または非酵素凝固剤を含む、請求項３７から４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記凝固剤が、トロンビン、例えばヒトトロンビンである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ステップ（ａ）が、発泡剤と混合することを含む、請求項３７から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記発泡剤が、非イオン性洗浄剤、温度感受性ゲル化界面活性剤（例えばプルロニック１２７）、ジホスファチジルグリセロールタイプのリン脂質または不混和性相とフィブリノゲン水溶液相の混合物を含み、好ましくは前記発泡剤が、プルロニック界面活性剤、例えばプルロニックＦ６８および／またはプルロニックＦ１２７、より好ましくはプルロニックＦ６８を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記発泡剤が、糖界面活性剤のクラスの１種または複数の界面活性剤からなるか、またはそれを含む、請求項４５または請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記発泡剤が、糖アシル界面活性剤のクラスの１種または複数の界面活性剤からなるか、またはそれを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記発泡剤が、Ｃ８〜Ｃ１２のアシル鎖長を有する糖アシル界面活性剤のクラスの発泡剤である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記発泡剤が、少なくとも２種、好ましくは３種の糖界面活性剤を含むか、またはそれからなる、請求項４７から４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記発泡剤の糖アシル界面活性剤が、ピラノシド（特に、グルコピラノシド）、マルトシド、およびアシルスクロース界面活性剤のクラスから選択される、請求項４８から５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記糖アシル界面活性剤が、ＯＧＰ、ＯＤＭ、ＤＧＰおよびＤｄＧＰ、ＴＧＰ、ＨＧＰ、ＤＭＰ、デシルスクロース（ｎＤＳ）、ドデシルスクロース（ｎＤｄＳ）、好ましくはＯＧＭ、ＤＭＰおよびＤｄＧＰからなる群から選択される、請求項４８から５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
ステップ（ｂ）で使用される前記架橋剤が、カルボジイミドカップリング剤、例えばＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイニド（ethylcarbodiiniide）（ＥＤＣ）；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、アジドカップリング剤；ジイソシアネート架橋剤、例えばヘキサメチレンジイソシアネート；エポキシド架橋剤、例えばエピクロロヒドリン、グリシジルエーテルおよびグリシジルアミン；ならびにアルデヒド架橋剤、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールから選択される、請求項３７から５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
前記架橋剤が、アルデヒド架橋剤、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記アルデヒド架橋剤が、グルタルアルデヒドである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
還元剤または毒性低減剤、例えば水素化ホウ素ナトリウムまたはリシンを添加するステップをさらに含む、請求項３７から５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
前記混合ステップ（ａ）が、例えば曝気により混合して発泡させることによって達成される、請求項３７から５６のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
ステップ（ａ）で得られた前記混合物が、前記インキュベーションステップ（ｂ）の前にキャスティングされ、凍結され、任意選択で凍結乾燥される、請求項３７から５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
二価または多価金属イオン、例えばカルシウム、例えば塩化カルシウムを添加するステップをさらに含む、請求項３７から５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
混合ステップ（ａ）のための前記混合物が、タンパク質安定剤として糖をさらに含み、前記糖が、小さいポリオールまたは炭水化物、例えばグリセロール、ソルビトール、スクロースまたはトレハロースである、請求項３７から５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
前記糖が、ステップ（ａ）の前記混合物中、フィブリノゲンに対して好ましくは１０〜１１ｗｔ％の量、好ましくは４〜７．５ｗｔ％の量のトレハロースである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
（ｉ）ステップ（ａ）の前記混合物が、前記インキュベーションステップ（ｃ）の前に、所定の形状の型でキャスティングされ、凍結され、任意選択で凍結乾燥されるか、または（ｉｉ）ステップ（ｄ）の生成物が、所定の形状の型で生成され、次に前記生成物が凍結され、任意選択で凍結乾燥されるかのいずれかである、所定の形状を有する細胞外マトリックス組成物を調製するための、請求項３７から６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
前記増量剤が、アルギン酸塩、例えばアルギン酸ナトリウムまたは誘導体化アルギン酸塩、例えばプロピルグリコアルギン酸ナトリウムである、請求項３７から６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記増量剤が、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ；例えばコンドロイチン６−硫酸、コンドロイチン４−硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、キチン、キトサン、デキストラン硫酸またはヒアルロナン）である、請求項３７から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記増量剤が、ヒドロキシエチルデンプン、エチルセルロース、キサンタンガムおよびアガロースから選択される、請求項３７から６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
請求項６から６５のいずれかに記載の方法によって得られた、または入手可能である、細胞外マトリックス材料。
【請求項６７】
リン酸カルシウム鉱物相が、前記細胞外マトリックス材料の重量の少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％である、請求項１から５または６６のいずれかに記載の細胞外マトリックス材料。
【請求項６８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏでの骨再生のため、または骨欠損の処置のための医薬品の製造において使用するための、請求項１から５または６６に記載の細胞外マトリックス組成物の使用。
【請求項６９】
請求項１から５または６６に記載の細胞外マトリックス材料を、骨欠損、例えば創傷または骨折に適用するステップを含む、骨再生の方法。
【請求項７０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏでの骨再生において使用するため、または骨欠損を処置するための、請求項１から５または６６のいずれかに記載の細胞外マトリックス材料。
【請求項７１】
リン酸カルシウム鉱物相が、オルトリン酸カルシウム化合物、好ましくはヒドロキシアパタイトを含む、請求項１から５または６６のいずれかに記載の細胞外マトリックス材料。
【請求項７２】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、オルトリン酸カルシウム化合物、好ましくはヒドロキシアパタイトを含む、請求項７から６５のいずれかに記載の方法。
【請求項７３】
リン酸カルシウム鉱物相が、リン酸八カルシウムを含む、請求項１から５または６６のいずれかに記載の細胞外マトリックス材料。
【請求項７４】
リン酸カルシウム鉱物相が、非晶質および／または結晶性リン酸カルシウム鉱物相を含む、請求項１から５、６６または７３のいずれかに記載の細胞外マトリックス材料。
【請求項７５】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、リン酸八カルシウムを含む、請求項７から６５のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
前記リン酸カルシウム鉱物相が、非晶質および／または結晶性リン酸カルシウム鉱物相を含む、請求項７から６５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外マトリックス材料、およびこのような材料を作るための方法に関する。この材料は、骨再生を促進するために使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
外傷、感染、腫瘍または固有の遺伝的障害によって引き起こされた骨欠損の再生は、臨床的課題である。また骨欠損の再生は、外科手技、例えば脊椎固定術、または股関節および膝の再建手術に必要とされる。骨欠損を処置するための現在の外科手術法は、しばしば、自家または同種いずれかの骨の移植を伴う。自家骨移植片は、骨の修復および再生のための「至適基準」であるとみなされる。しかしこれらの方法は、自家骨移植片の場合には、骨供給の制限およびドナー部位の罹患（donor  site  morbidity）、または同種骨移植の場合には疾患伝播および骨折および偽関節などの制限を受ける。これらの不利益は、有効な骨移植片代替品として作用し得る新しい生体材料の開発の推進力となっている（Garcia-Garetaら、２０１５年）。
【０００３】
自然骨は、骨移植片代替品の開発のためのモデルとして働く。骨移植片代替品を開発するために使用される異なる材料は、１）自然および合成生分解性ポリマー、２）リン酸カルシウム（ＣａＰ）材料およびバイオガラスを含むセラミック、３）金属、４）炭素ベースの材料、例えばカーボンナノチューブおよびグラフェン、ならびに５）２種またはそれよりも多い材料の組合せである複合材料である。
【０００４】
骨に存在する生体鉱物は、高度に置換されているヒドロキシアパタイトである（WopenkaおよびPasteris  ２００５年；LeGeros  ２００８年）。生体鉱物から製作されたインプラントは、周辺骨組織と相互反応することができる（Garcia-Garetaら、２０１５年）。ＣａＰを組み込む生体材料は、骨伝導性であってよく（このことは、その材料が、生体材料表面上の骨組織との直接結合を促進することを意味する）、骨誘導性であってよい（このことは、その材料が、局所幹細胞を誘導して骨細胞に分化することを意味する）（Garcia-Garetaら、２０１５年）。
【０００５】
フィブリンは、骨、軟骨、皮膚、腱、靱帯、肝臓または心臓組織などの組織の再生に使用されている。しかし、このような用途では、フィブリンは、典型的にはゲルの形態である。例えば、骨再生の文脈では、フィブリン糊およびセメントの組合せを使用して、注射可能な材料を作製することができる（Cuiら、２０１０年；Dongら、２０１３年；Lopez-Herediaら、２０１３年；Xiuら、２０１４年）。またフィブリンは、複合骨移植片代替品を作製するために、合成ポリマー、例えばポリ（プロピレンフマレート）またはポリ−ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グルコリドと組み合わされてきた（Mishraら、２０１６年；Ignjatovicら、２００５年）。
【０００６】
フィブリンは、優れた生体適合性を示す自然に存在する生分解性ポリマーであるが、フィブリンの血管新生促進特性および生理活性特性、機械特性、ならびに生分解特性は、非常に低く、したがってその使用が制限される（Ahmedら、２００８年）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Garcia-Gareta  E,  Coathup  MJ,  Blunn  GW.  (2015)  Osteoinduction  of  bone  grafting  materials  for  bone  repair  and  regeneration.  Bone  81,  112-121
【非特許文献２】Wopenka  B,  Pasteris  JD.  (2005)  A  mineralogical  perspective  on  the  apatite  in  bone.  Mater  Sci  Eng  C25,  131-143
【非特許文献３】LeGeros  RZ.  (2008)  Calcium  phosphate-based  osteoinductive  materials.  Chem  Rev  108,  4742-4753
【非特許文献４】Cui  G,  Li  J,  Lei  W,  Bi  L,  Tang  P,  Liang  Y,  Tao  S,  Wang  Y.  (2010)  The  mechanical  and  biological  properties  of  an  injectable  calcium  phosphate  cement-fibrin  glue  composite  for  bone  regeneration.  J  Biomed  Mater  Res  B  Appl  Biomater  92(2),  377-85
【非特許文献５】Dong  J,  Cui  G,  Bi  L,  Li  J,  Lei  W.  (2013)  The  mechanical  and  biological  studies  of  calcium  phosphate  cement-fibrin  glue  for  bone  reconstruction  of  rabbit  femoral  defects.  Int  J  Nanomedicine  8,  1317-24
【非特許文献６】Lopez-Heredia  MA,  Pattipeilohy  J,  Hsu  S,  Grykien  M,  van  der  Weijden  B,  Leeuwenburgh  SC,  Salmon  P,  Wolke  JG,  Jansen  JA.  (2013)  Bulk  physicochemical,  interconnectivity,  and  mechanical  properties  of  calcium  phosphate  cements-fibrin  glue  composites  for  bone  substitute  applications.  J  Biomed  Mater  Res  A  101(2),  478-90
【非特許文献７】Xiu  J,  Fan  J,  Li  J,  Cui  G,  Lei  W.  (2014)  Different  angiogenic  abilities  of  self-setting  calcium  phosphate  cement  scaffolds  consisting  of  different  proportions  of  fibrin  glue.  Biomed  Res  Int  2014:785146
【非特許文献８】Mishra  R,  Roux  BM,  Posukonis  M,  Bodamer  E,  Brey  EM,  Fisher  JP,  Dean  D.  (2016)  Effect  of  prevascularization  on  in  vivo  vascularization  of  poly(propylene  fumarate)/fibrin  scaffolds.  Biomaterials  77,  255-66
【非特許文献９】Ignjatovic  N,  Ajdukovic  Z,  Uskokovic  D.  (2005)  New  biocomposite  [biphasic  calcium  phosphate  /  poly-DL-lactide-co-glycolide/biostimulative  agent]  filler  for  reconstruction  of  bone  tissue  changed  by  osteoporosis.  J  Biomed  Sci  Mater  Med  16(7),  621-6
【非特許文献１０】Ahmed  TAE,  Dare  EV,  Hincke  M.  (2008)  Fibrin:  A  versatile  scaffold  for  tissue  engineering  applications.  Tissue  Eng  Part  B  14(2),  199-215
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、前述の欠点の少なくとも一部を克服する、改善された骨再生組成物を提供することが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、フィブリンまたはフィブリノゲン、およびセラミックを含む細胞外マトリックス材料が提供される。
【００１０】
本発明によれば、フィブリンまたはフィブリノゲン、増量剤、およびセラミックを含む細胞外マトリックス材料が提供される。
【００１１】
フィブリンまたはフィブリノゲン、および任意選択で増量剤は、架橋され得る。架橋は、本明細書に記載される方法を使用して達成することができる。
【００１２】
本発明によれば、フィブリンまたはフィブリノゲン、および増量剤を含む架橋された足場、ならびに足場上に堆積されているセラミックを含む細胞外マトリックス材料が提供される。
【００１３】
本発明によれば、複合足場を含む細胞外マトリックス材料であって、複合足場が、フィブリンおよび／またはフィブリノゲン、ならびに増量剤を含み、架橋されているか、または架橋によって確立されたものであり、セラミックが、複合足場上に堆積されている、細胞外マトリックス材料が提供される。
【００１４】
好ましくは、セラミックは、リン酸カルシウム鉱物相である。
【００１５】
本発明によれば、フィブリンまたはフィブリノゲン、および増量剤を含む架橋された足場、ならびに足場上に堆積されているリン酸カルシウム鉱物相を含む細胞外マトリックス材料が提供される。
【００１６】
本発明によれば、細胞外マトリックス材料を調製する方法またはプロセスであって、セラミックを、フィブリンまたはフィブリノゲン、および増量剤を含む架橋された足場上に堆積するステップを含む、方法またはプロセスが提供される。
【００１７】
本発明によれば、細胞外マトリックス材料を調製する方法またはプロセスであって、リン酸カルシウム鉱物相を足場に堆積するステップを含み、足場が、フィブリンまたはフィブリノゲン、および増量剤を含むか、またはそれから形成される、方法またはプロセスが提供される。
【００１８】
好ましい一実施形態では、足場は、フィブリンを含む。
【００１９】
一部の実施形態では、足場は、別個の層に配置された線維を含まない。
【００２０】
本発明によれば、足場は、（ａ）フィブリノゲンの水溶液を、凝固剤および増量剤と混合することと、（ｂ）ステップ（ａ）で得られた混合物を、架橋剤と共にインキュベートすることと、（ｃ）架橋剤を除去するために、ステップ（ｂ）で得られた架橋された組成物を洗浄することとを含む方法によって得ることができ、または入手可能である。
【００２１】
本発明の方法は、（ａ）フィブリノゲンの水溶液を、凝固剤および増量剤と混合するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で得られた混合物を、架橋剤と共にインキュベートするステップと、（ｃ）架橋剤を除去するために、ステップ（ｂ）で得られた架橋された組成物を洗浄するステップとを含むことができる。
【００２２】
本発明の細胞外マトリックスを形成するために使用される組成物（例えば、本発明の方法のステップ（ａ）において使用するための組成物、例えばフィブリノゲンを含む組成物）において、凝固剤および増量剤（ならびに任意選択で発泡剤および／または安定化剤）、フィブリノゲンは、０．５〜１０重量％の量で存在し得る。フィブリノゲンは、ｐＨ４〜１０の間に緩衝化された水溶液として存在し得る。フィブリノゲンは、ｐＨ７〜８の間（例えば７．４）に緩衝化され得る。フィブリノゲンは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはＨＥＰＥＳ緩衝食塩水で緩衝化され得る。
【００２３】
多孔質の架橋されたフィブリン足場は、全層皮膚創傷の処置のために開発されてきた。このような足場は、ＷＯ２００７／１４４６４４Ａ１およびＷＯ２０１３／１６４６３５Ａ１に記載されており、その具体例は、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）である。Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）は、グルタルアルデヒド架橋によって安定化されている、フィブリンとアルギン酸塩の複合体である内因的に血管新生を促進する生体材料である。Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）を作るための基本的配合は、フィブリノゲンとトロンビンの酵素反応を伴い、アルギン酸塩が、足場を増量し、支えるために使用されている。
【００２４】
驚くべきことに、本発明の出願人は、本発明の細胞外マトリックス材料は、堆積したセラミックを含まないこのような足場と比較して、分解速度が低下し得ることを見出した。このことは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの新しい骨形成が４カ月間までかかり得ることが示唆されている骨再生分野において、特に有利である（HadjidakisおよびAndroulakis  ２００６年）。Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）は、ブタモデルの全層皮膚創傷への埋め込み後約５〜６週間まで、組織学的切片において観測されている。
【００２５】
さらに、セラミック、例えばリン酸カルシウム鉱物相を足場上に堆積するにもかかわらず、本発明の材料は、驚くべきことにその多孔性を維持して、細胞、例えば線維芽細胞（例えば皮膚線維芽細胞）および骨前駆細胞を生体材料に遊走させ、定植させることができる。この材料は、良好な生体適合性を有することができ、したがって細胞は、材料上で有効に成長し、増殖し、分化することができ、フィブリンまたはフィブリノゲンの血管新生促進特性および生理活性特性も維持され得る。したがって、本発明の材料は、フィブリンまたはフィブリノゲンによって提供される有益な特性の一部を維持することができると同時に、フィブリンおよびフィブリノゲンの有利でない特性、例えばその機械特性および生分解特性の一部を克服する。
【００２６】
「リン酸カルシウム鉱物相」という用語は、カルシウムイオンを、オルトリン酸、メタリン酸またはピロリン酸、および場合により水素イオンまたは水酸化物イオンと一緒に含む鉱物相を包含する。例えば、リン酸カルシウム鉱物相は、リン酸一カルシウム、リン酸二カルシウムおよび／またはリン酸三カルシウムを含むことができる。一例では、リン酸カルシウム鉱物相は、アパタイト、例えばヒドロキシアパタイトを含む。セラミックは、リン酸八カルシウム（ＯＣＰ）および／または非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）を含むことができる。セラミックは、結晶性リン酸カルシウム鉱物相を含むことができる。
【００２７】
セラミックは、本明細書に記載される通り、複数のまたは組合せの異なる鉱物相を含むことができる。
【００２８】
リン酸カルシウム鉱物相は、他の１種または複数の元素、例えばマグネシウムを含むことができる。
【００２９】
一部の実施形態では、リン酸カルシウム鉱物相は、ヒドロキシアパタイトを含まない。一部の実施形態では、リン酸カルシウム鉱物相は、リン酸三カルシウム、例えばβ−リン酸三カルシウムを含むことができない。
【００３０】
リン酸カルシウム鉱物相は、生物模倣堆積を使用して足場に堆積され得る。例えば、足場は、流体もしくは溶液と接触させることができ、または流体もしくは溶液に浸漬させることができる。一実施形態では、流体は、疑似体液（ＳＢＦ）溶液であってよい（Kokuboら、１９９０年）。流体または溶液は、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）およびリン酸イオン、例えばリン酸水素イオン（ＨＰＯ４２−）を含むことができる。流体または溶液は、好ましくは、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）、カリウムイオン（Ｋ＋）、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）、塩化物イオン（Ｃｌ−）、炭酸水素イオン（ＨＣＯ３−）および／または硫酸イオン（ｍＭ  ＳＯ４２−）をさらに含む。流体または溶液は、Ｎａ＋、Ｃａ２＋、ＨＰＯ４２−、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃｌ−、ＨＣＯ３−およびＳＯ４２−を含むことができる。流体または溶液は、Ｎａ＋、Ｃａ２＋、ＨＰＯ４２−、Ｋ＋、Ｍｇ２＋、Ｃｌ−およびＨＣＯ３−を含むことができる。流体または溶液は、Ｎａ＋、Ｃａ２＋、ＨＰＯ４２−、Ｋ＋、およびＣｌ−を含むことができる。
【００３１】
流体は、１〜３０ｍＭのＣａ２＋を含むことができる。流体は、１〜２０ｍＭのＣａ２＋を含むことができる。一部の実施形態では、流体は、１〜５ｍＭのＣａ２＋、例えば２〜３ｍＭのＣａ２＋、例えば約２．５ｍＭのＣａ２＋を含むことができる。あるいは、流体は、１０〜３０ｍＭのＣａ２＋、例えば１０〜２０ｍＭのＣａ２＋、例えば１５〜１９ｍＭのＣａ２＋を含むことができる。
【００３２】
流体は、０．５〜１０ｍＭのＨＰＯ４２−を含むことができる。一部の実施形態では、流体は、０．５〜３ｍＭのＨＰＯ４２−、例えば０．５〜２ｍＭのＨＰＯ４２−、例えば約１ｍＭのＨＰＯ４２−を含むことができる。あるいは、流体は、５〜１０ｍＭのＨＰＯ４２−、例えば６〜８ｍＭのＨＰＯ４２−を含むことができる。
【００３３】
流体は、１００〜８００ｍＭのＮａ＋を含むことができる。一部の実施形態では、流体は、１００〜２００ｍＭのＮａ＋、例えば１２０〜１６０ｍＭのＮａ＋または１４０〜１５０ｍＭのＮａ＋、例えば約１４２ｍＭのＮａ＋を含むことができる。あるいは、流体は、５００〜８００ｍＭのＮａ＋、例えば６００〜８００ｍＭのＮａ＋を含むことができる。
【００３４】
流体は、１〜５０ｍＭのＫ＋を含むことができる。一部の実施形態では、流体は、１〜１０ｍＭのＫ＋、例えば３〜７ｍＭのＫ＋、例えば約５ｍＭのＫ＋を含むことができる。あるいは、流体は、１０〜４０ｍＭのＫ＋を含むことができる。
【００３５】
流体は、０．５〜２０ｍＭのＭｇ２＋を含むことができる。一部の実施形態では、流体は、０．５〜３ｍＭのＭｇ２＋、例えば１〜２ｍＭのＭｇ２＋、例えば約１．５ｍＭのＭｇ２＋を含むことができる。あるいは、流体は、５〜１５ｍＭのＭｇ２＋、例えば９〜１２ｍＭのＭｇ２＋を含むことができる。
【００３６】
流体は、１００〜８００ｍＭのＣｌ−を含むことができる。一部の実施形態では、流体は、１００〜２００ｍＭのＣｌ−、例えば１２０〜１６０ｍＭのＣｌ−を含むことができる。好ましくは、流体は、約１４０〜１５０ｍＭのＣｌ−、例えば約１４８．８ｍＭのＣｌ−を含む。あるいは、流体は、５００〜８００ｍＭのＣｌ−、例えば６００〜８００ｍＭのＣｌ−を含むことができる。
【００３７】
流体は、１〜１００ｍＭのＨＣＯ３−を含むことができる。一部の実施形態では、流体は、１〜１０ｍＭのＨＣＯ３−、例えば２〜８ｍＭのＨＣＯ３−を含むことができる。好ましくは、流体は、４〜５ｍＭのＨＣＯ３−、例えば約４．２ｍＭのＨＣＯ３−を含む。あるいは、流体は、１０〜１００ｍＭのＨＣＯ３−、例えば２０〜８０ｍＭのＨＣＯ３−を含むことができる。
【００３８】
流体は、１〜１０ｍＭのＳＯ４２−を含むことができる。
【００３９】
一例では、流体は、１〜３０ｍＭのＣａ２＋、０．５〜１０ｍＭのＨＰＯ４２−、１００〜８００ｍＭのＮａ＋、１〜５０ｍＭのＫ＋、０．５〜２０ｍＭのＭｇ２＋、１００〜８００ｍＭのＣｌ−、１〜１００ｍＭのＨＣＯ３−、および１〜１０ｍＭのＳＯ４２−を含むことができる。
【００４０】
一例では、流体は、１〜３０ｍＭのＣａ２＋  ０．５〜１０ｍＭのＨＰＯ４２−、１００〜８００ｍＭのＮａ＋、１〜５０ｍＭのＫ＋、０．５〜２０ｍＭのＭｇ２＋、１００〜８００ｍＭのＣｌ−および１〜１００ｍＭのＨＣＯ３−を含むことができる。
【００４１】
一例では、流体は、１〜３０ｍＭのＣａ２＋  ０．５〜１０ｍＭのＨＰＯ４２−、１００〜８００ｍＭのＮａ＋、１〜５０ｍＭのＫ＋および１００〜８００ｍＭのＣｌ−を含むことができる。
【００４２】
一例では、流体は、１〜５ｍＭのＣａ２＋および０．５〜３ｍＭのＨＰＯ４２を含むことができ、任意選択で１００〜２００ｍＭのＮａ＋、１〜１０ｍＭのＫ＋、０．５〜３ｍＭのＭｇ２＋、１００〜２００ｍＭのＣｌ−および１〜１０ｍＭのＨＣＯ３−も含むことができる。
【００４３】
別の例では、流体は、２〜３ｍＭのＣａ２＋および０．５〜２ｍＭのＨＰＯ４２−を含むことができ、任意選択で１２０〜１６０ｍＭのＮａ＋、３〜７ｍＭのＫ＋、１〜２ｍＭのＭｇ２＋、１２０〜１６０ｍＭのＣｌ−および２〜８ｍＭのＨＣＯ３−も含むことができる。
【００４４】
さらに別の例では、流体は、約２．５ｍＭのＣａ２＋および約１ｍＭのＨＰＯ４２を含むことができ、任意選択で約１４２ｍＭのＮａ＋、約５ｍＭのＫ＋、約１．５ｍＭのＭｇ２＋、約１４９ｍＭのＮａ＋および約４ｍＭのＨＣＯ３−も含むことができる。
【００４５】
一例では、流体は、１０〜３０ｍＭのＣａ２＋、５〜１０ｍＭのＨＰＯ４２−、５００〜８００ｍＭのＮａ＋、１０〜４０ｍＭのＫ＋、５〜１５ｍＭのＭｇ２＋、５００〜８００ｍＭのＣｌ−、１０〜１００ｍＭのＨＣＯ３−および１〜１０ｍＭのＳＯ４２−を含むことができる。
【００４６】
一例では、流体は、１０〜３０ｍＭのＣａ２＋、５〜１０ｍＭのＨＰＯ４２−、５００〜８００ｍＭのＮａ＋、１０〜４０ｍＭのＫ＋、５〜１５ｍＭのＭｇ２＋、５００〜８００ｍＭのＣｌ−および１０〜１００ｍＭのＨＣＯ３−を含むことができる。
【００４７】
一例では、流体は、１０〜３０ｍＭのＣａ２＋、５〜１０ｍＭのＨＰＯ４２−、５００〜８００ｍＭのＮａ＋、１０〜４０ｍＭのＫ＋および５００〜８００ｍＭのＣｌ−を含むことができる。
【００４８】
足場は、流体に浸漬させるか、または流体と接触させることができる。好ましくは、足場は、流体に浸漬させられる。足場は、少なくとも１２時間、少なくとも１日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間または少なくとも９日間、流体に浸漬させるか、または流体と接触させることができる。足場は、１０日間まで、好ましくは９日間まで、流体に浸漬させるか、または流体と接触させることができる。例えば、足場は、１日〜１０日間、浸漬させることができる。あるいは、足場は、４８時間（２日間）まで、流体に浸漬させるか、または流体と接触させることができる。例えば、足場は、１２時間〜４８時間、流体に浸漬させることができる。
【００４９】
流体への浸漬または流体との接触は、２０℃および５０℃、好ましくは３０〜４０℃、より好ましくは約３７℃で行うことができる。
【００５０】
好ましくは、セラミック、例えばリン酸カルシウム鉱物相は、足場全体に堆積させられる。好ましくは、セラミックは、足場上または足場全体に実質的に均質または均一に堆積される。均質または均一な分布は、本明細書に記載される通り生物模倣法によって、例えば足場をＳＢＦ流体または溶液に浸漬させることによって助長され得る。
【００５１】
リン酸カルシウム鉱物相、例えばヒドロキシアパタイトを合成する他の方法は、当業者に公知である。例えば、ヒドロキシアパタイトは、湿式化学堆積によって合成され得る。例えば、ヒドロキシアパタイトナノ結晶懸濁液は、以下の反応によって調製することができる。
１０Ｃａ（ＯＨ）２＋６Ｈ３ＰＯ４→Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２＋１８Ｈ２Ｏ
【００５２】
あるいは、ヒドロキシアパタイトは、ゾルゲル法または電解結晶化によって合成することができる。
【００５３】
リン酸カルシウム鉱物相は、足場上に堆積している球状鉱物結晶および／またはプレート様の結晶の形態であってよい。これらは、球状またはプレート様の形態と呼ぶことができる。球状およびプレート様の形態の例は、図１０に示されている。一部の例では、結晶は、０．０２５〜１μｍ、好ましくは０．０５〜０．８μｍのアベレージ（平均、最頻または中央）最大線寸法を有することができる。
【００５４】
セラミック、例えばリン酸カルシウム鉱物相は、本発明の細胞外マトリックス材料の重量の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％であり得る。好ましくは、セラミックは、細胞外マトリックスの重量の少なくとも４０％である。より好ましくは、セラミックは、細胞外マトリックスの重量の少なくとも５０％である。
【００５５】
本発明の細胞外マトリックス材料は、好ましくは予め形成されるか、または予め製作され、したがって、マトリックス材料は、それが形成された後に対象に適用または投与される。
【００５６】
本発明の細胞外マトリックス材料は、好ましくは無菌である。
【００５７】
本発明の細胞外マトリックス材料は、使用前の保存のために、パッケージ、好ましくは無菌パッケージに含有され得る。
【００５８】
本発明の細胞外マトリックス材料は、特定のレオロジー特性または粘弾特性を有することができる。例えば、材料は、２０℃で、５０〜１００ｋＰａ、例えば５０〜７５０ｋＰａ、例えば５０〜６００ｋＰａのせん断または貯蔵弾性率（Ｇ’）を有することができる。Ｇ’は、少なくとも５０ｋＰａであってよい。Ｇ’は、１０００ｋＰａまでであってよい。Ｇ’は、少なくとも２００ｋＰａ、または少なくとも４００ｋＰａであってよい。
【００５９】
本明細書におけるフィブリノゲンへの言及は、ヒトフィブリノゲンを含み得る。あるいは、フィブリノゲンは、ウシフィブリノゲンであってよい。フィブリノゲンは、血漿から精製されていてもよい。精製フィブリノゲンへの言及は、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％または９９％の１つを超える純度レベルのフィブリノゲンを含む。好ましくは、純度は、８０％超、より好ましくは９０％超である。フィブリノゲンは、組換えにより合成されていてもよい。
【００６０】
天然のまたは自然に存在するフィブリノゲンに加えて、本明細書におけるフィブリノゲンへの言及は、フィブリノゲンの誘導体、例えばフィブリノゲンの断片またはフィブリノゲンの類似体も含み得る。フィブリノゲンの任意の断片または類似体は、天然のまたは自然に存在するフィブリノゲンの血管新生機能を保持するべきであることを理解されよう。フィブリノゲンの断片の例として、切断型のフィブリノゲン、例えばフィブリンＡ、フィブリンＢ、フィブリンＣ、フィブリンＤ、フィブリンＸおよびフィブリンＹが挙げられる。さらなる実施形態では、切断型のフィブリノゲンは、フィブリンＥである。フィブリノゲンの類似体の例として、ペプチドの１つもしくは複数のアミノ酸残基が、他の自然に存在するもしくは合成のアミノ酸残基によって置換されており、かつ／または１つもしくは複数のアミノ酸残基が、ペプチドから欠失されており、かつ／または１つもしくは複数のアミノ酸残基が、ペプチドに付加されている、フィブリノゲンの修飾誘導体が挙げられる。フィブリノゲン類似体は、天然のまたは自然に存在するフィブリノゲン、例えばヒトフィブリノゲンの少なくとも７０％、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を有することができる。フィブリノゲンへの言及は、電気処理された（electroprocessed）フィブリノゲンまたはその誘導体、例えば米国特許出願第２００４／０２２９３３３号に記載されているものまでは拡大できないことを理解されよう。
【００６１】
好ましい例では、本発明の細胞外マトリックスは、トロンビンによってフィブリノゲンが開裂した後に形成されたフィブリンを含む。トロンビンによるフィブリノゲンの開裂によって、フィブリンモノマーが形成され、そのフィブリンモノマーは、重合して線維を形成することができる。したがって、本発明において、例えば本発明の方法において使用することができるフィブリノゲンの任意の誘導体は、好ましくは、トロンビンによって開裂されて、重合して線維を形成することができるフィブリンモノマー誘導体を形成する能力を保持している。したがって、本明細書におけるフィブリンへの言及は、フィブリンモノマーの誘導体、例えば重合してフィブリンを形成することができるフィブリンモノマーの類似体から形成されたフィブリンも含み得る。フィブリノゲンモノマー類似体は、天然のまたは自然に存在するフィブリンモノマー、例えばヒトフィブリンモノマーの少なくとも７０％、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列相同性を有することができる。
【００６２】
例えば、フィブリノゲンおよびフィブリンモノマーの類似体は、好ましくは、各末端における２つの球状小結節（Ｄドメイン）および中間における１つの球状小結節（Ｅドメイン）からなる球状構造を保持している。フィブリンモノマーの類似体は、好ましくは、フィブリンモノマーのγおよびβ鎖に存在する空洞であるγおよびβホールと、トロンビンによるフィブリノゲンからフィブリノペプチドＡおよびＢの切除によって曝露されるそれらの相補的結合ペプチド（ノブ）とのノブ−ホール相互反応を介して相互反応する能力を保持している。ノブは、中心のＥドメインから伸びており、γおよびβホールは、Ｄドメインに存在する。結果的に、１つのモノマーのＥドメインは、隣接しているモノマーのＤドメインと相互反応することができる。
【００６３】
本発明の方法において使用される凝固剤は、酵素凝固剤または非酵素凝固剤を含むことができる。好ましい例では、酵素凝固剤は、トロンビン（ＩＵＢＭＢ酵素命名法ＥＣ３．４．２１．５）またはトロンビン模倣物である。細胞外マトリックスにおけるトロンビンまたはトロンビン模倣物の存在は、ゲル形態の安定な組成物の形成を助ける。
【００６４】
一例では、酵素凝固剤は、トロンビン、例えばヒトトロンビンである。トロンビンは、トリプシン様の基質特異性を有するキモトリプシンファミリーのエンドペプチダーゼである。トロンビンは、フィブリノゲンのＡｒｇ−Ｇｌｙ結合を選択的に開裂してフィブリノペプチドＡおよびＢを放出することによって、フィブリノゲンをフィブリンに変換する。
【００６５】
またトロンビンは、フィブリノゲナーゼ、トロンバーゼ、トロンボフォート（thrombofort）、局所用トロンビン−Ｃ、トロポスタシン（tropostasin）、活性化血液凝固因子ＩＩ、血液凝固因子Ｈａ、因子Ｈａ、Ｅトロンビン、β−トロンビン、およびγ−トロンビンと説明される。したがって、トロンビン模倣物への言及は、これらの特性を示す任意の構造的および機能的に関係する薬剤、類似体、およびそれらのあらゆる誘導体を含む。このようなトロンビン模倣物の例として、Ｂａｔｒｏｘｏｂｉｎ（同義語：デフィブラーゼ、レプチラーゼ；ＩＵＢＭＢ命名法ＳＯｌ．１７６）、Ｃｒｏｔａｌａｓｅ（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ａｄａｍａｎｔｅｕｓ毒液に由来するもの；同義語：デフィブリンザイム（defibrinzyme）；ＩＵＢＭＢ命名法ＳＯｌ．１７７）、Ｂｏｔｈｒｏｍｂｉｎ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ｊａｒａｒａｃａ毒液に由来するもの；ＩＵＢＭＢ命名法ＳＯｌ．１７９）、Ａｔｒｏｘｉｎ（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ  ａｔｒｏｘに由来するもの；ＩＵＢＭＢ命名法Ｕ９Ｇ．０５）、Ａｎｃｒｏｄ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｔｉｘ毒素に由来するもの；同義語Ａｒｖｉｎ、Ｐｒｏｔａｃ、タンパク質Ｃアクチベーター；ＩＵＢＭＢ命名法ＳＯｌ．１７８）、およびＧａｂｏｎａｓｅ（Ｂｉｔｉｓ  ｇａｂｏｎｉｃａに由来するもの；ＩＵＢＭＢ命名法Ｓ０１．４３０）が挙げられる。
【００６６】
非酵素凝固剤には、プロタミンまたはヒアルロナンが含まれ得る。
【００６７】
本発明の細胞外マトリックス材料の形成における増量剤の存在は、細胞外マトリックスの形成を開始するという利点をもたらすことができ、得られた混合物のミクロ構造を相乗的に調節することができる。
【００６８】
増量剤の例として、アルギン酸塩；キサンタンガムおよびスクレログルカンを含めたバイオポリマー；カルボキシメチルセルロース；カラゲニン（例えばガラクトース硫酸）；ガラクトマンナン、すなわちローカストビーンガムおよびグアーガムの花（flower）；ヘタスターチ；特異的可溶性の不活性なミクロビーズ；グリコサミノグリカン（ＧＡＧ；例えばコンドロイチン６−硫酸、コンドロイチン４−硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸（bulphate）、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、キチン、キトサン、デキストラン硫酸またはヒアルロナン）、ならびにローカストビーンガム精製エキス、例えばレシチンおよびペクチンが挙げられる。
【００６９】
増量剤は、好ましくはアルギン酸塩または誘導体化アルギン酸塩である。例えば、増量剤は、アルギン酸ナトリウムまたはプロピルグリコアルギン酸（propylglycoalginate）ナトリウムであり得る。細胞外マトリックス組成物におけるアルギン酸塩の存在は、ゲル形態の安定な組成物の形成を助けるという利点をもたらす、カルシウムに依存しない共沈殿反応を誘導する。
【００７０】
アルギン酸塩は、２つのヘキスロン酸残基：β−Ｄ−マンヌロン酸（またはＭ−残基）およびα−Ｌ−グルロン酸（またはＧ−残基）の配列から構成されたポリウロニドである、アルギン酸の塩である。α−Ｌ−グルロン酸は、β−Ｄ−マンヌロン酸の酵素エピマー化から形成される。これらのモノマーは、連続Ｇ−残基（Ｇ−ブロック）、連続Ｍ−残基（Ｍ−ブロック）のホモポリマーブロック、交互ＭおよびＧ−残基（ＭＧ−ブロック）、または無作為組織化ブロックに見ることができる。各ブロックタイプの相対量は、共に、アルギン酸塩の起源と共に変わる。交互ブロックは、最も可撓性の鎖を形成し、より低いｐＨで、その他のブロックよりも可溶性が高い。Ｇ−ブロックは、二価のカチオン、例えばＣａ２＋、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｃｕ２＋等を添加すると、Ｍ−が豊富な鎖よりも強力なゲルを形成するので、より適している。これは、６つよりも多い残基の２つのＧ−ブロックが、二価のカチオンと安定な架橋接合点を形成して、三次元ゲル網目構造をもたらすことができるからである（Simpson-NEら、Biomaterials  ２５巻（２００４年）２６０３〜２６１０頁）。
【００７１】
あるいは、増量剤は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ；例えばコンドロイチン６−硫酸、コンドロイチン４−硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、キチン、キトサン、デキストラン硫酸またはヒアルロナン）であり得る。組成物内のＧＡＧの存在は、フィブリノゲンの架橋中に共有結合によってフィブリノゲンに架橋され得るアミノ酸残基を有するという点で、安定性の増強という利点をもたらすことができる。
【００７２】
増量剤は、ヒドロキシエチルデンプン、エチルセルロース、キサンタンガムおよびアガロースから選択することができる。
【００７３】
本発明の細胞外マトリックス材料は、架橋された増量剤を含むことができる。架橋された増量剤は、フィブリンまたはフィブリノゲンに架橋され得る。
【００７４】
足場を形成するための方法は、フィブリノゲンの水溶液を、発泡剤と混合するステップを含むことができる。したがって、この方法は、フィブリノゲンの水溶液を、凝固剤、増量剤および発泡剤（および任意選択で安定化剤）と混合するステップを含むことができる。
【００７５】
発泡剤の例として、界面活性剤、ブロックコポリマー界面活性剤、例えばプルロニック界面活性剤、洗浄剤等が挙げられる。発泡剤の存在は、有効な発泡構造を作製すると同時に、例えば、界面活性剤の場合にはエタノールに溶解させることによって、またはミクロビーズの場合にはカルシウムイオン濃度を低減してカルシウム依存性ビーズゲルを溶出することによって、組成物から容易に除去できるという利益をもたらす。さらなる実施形態では、発泡剤は、界面活性剤、非イオン性洗浄剤、感熱性ゲル化界面活性剤、ポロキサマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）、特にＦ６８またはＦ１２７）またはポロキサミン（例えば、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標）１３０７）、ジホスファチジルグリセロールタイプのリン脂質、または不混和相（例えばイソペンタン）と水性フィブリノゲン溶液相の混合物を含む。好ましい一実施形態では、発泡剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、例えば、好ましくはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８およびＦ１２７から選択されるプルロニック界面活性剤を含む。特に好ましい一実施形態では、発泡剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を含む。
【００７６】
発泡剤は、糖界面活性剤のクラス、より好ましくは糖アシル界面活性剤のクラスの１種または複数の界面活性薬剤からなり得るか、またはそれを含み得る。発泡剤は、それが糖アシル界面活性剤のクラスの発泡剤である場合、Ｃ８〜Ｃ１２のアシル鎖長を有することができる。糖アシル界面活性剤は、ピラノシド（特に、グルコピラノシド）、マルトシド、およびアシルスクロース界面活性剤のクラスから選択することができる。糖アシル界面活性剤は、ＯＧＰ、ＯＤＭ、ＤＧＰおよびＤｄＧＰ、ＴＧＰ、ＨＧＰ、ＤＭＰ、デシルスクロース（ｎＤＳ）、ドデシルスクロース（ｎＤｄＳ）からなる群から選択することができる。好ましくは、糖アシル界面活性剤は、ＤＭＰ、ＤｄＧＰおよび／またはＯＤＭを含むか、またはそれからなる。
【００７７】
発泡剤は、少なくとも２種、または少なくとも３種の糖界面活性剤を含み得るか、またはそれからなり得る。
【００７８】
発泡剤は、複数種の糖界面活性剤および少なくとも１種のプルロニック界面活性剤を含むことができる。特に好ましい一実施形態では、発泡剤は、ＤＭＰ、ＤｄＧＰ、ＯＤＭおよびＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８を含む。
【００７９】
足場を形成するための方法は、フィブリノゲンの水溶液を、安定化剤、例えばタンパク質安定化剤と混合するステップをさらに含むことができる。したがって、本発明の方法は、フィブリノゲンの水溶液を、凝固剤、増量剤、安定化剤、および任意選択で発泡剤と混合するステップを含むことができる。適切な安定化剤は、トレハロースである。他の適切な安定化剤には、小さい炭水化物、ポリオール、例えばグリセロール、ソルビトール、グルコースおよびスクロース  トレハロース、ならびにラフィノースが含まれ得る。好ましい安定剤は、トレハロースである。好ましくは、トレハロースは、フィブリノゲン、凝固剤、増量剤（ならびに任意選択で発泡剤および／または安定化剤）を含む混合物中、フィブリノゲンに対して１０〜１１ｗｔ％の量、好ましくは４〜７．５ｗｔ％の量で存在する。
【００８０】
あるいは、またはさらには、フィブリノゲンの水溶液を凝固剤および増量剤（ならびに任意選択で発泡剤および／または安定化剤）と混合する方法ステップは、キャスティング、相分離キャスティング、発泡、凍結乾燥、押出、織物化（textiling）、フェルト化（felting）、スプレーコーティングまたは急速製造ステップを含むことができる。一実施形態では、混合物は、インキュベーションステップの前に、キャスティングされ、凍結され、任意選択で凍結乾燥される。
【００８１】
キャスティングステップは、典型的には、細胞外マトリックス組成物を調製する当業者に公知の手順を含むことを理解されよう。典型的には、キャスティングステップは、ステップ（ａ）で得られた混合物を、３７℃で１５分間インキュベーションすることを含む。あるいは、インキュベーションは、少なくとも３０分間、または少なくとも１時間、行うことができる。例えば、インキュベーションは、３７℃で１時間、行うことができる。
【００８２】
凍結ステップは、典型的には、ステップ（ａ）で得られた、キャスティングされた混合物を、０℃未満（例えば−２００℃〜−７０℃）で数時間から一晩、保存することを含む。一実施形態では、ステップ（ａ）で得られた、キャスティングされた混合物は、−２０℃で１時間凍結させられた後、−７０℃で一晩凍結させられる。
【００８３】
凍結乾燥ステップは、典型的には、凍結乾燥の当業者に公知の手順を含むことを理解されよう。例えば、ステップ（ａ）で得られた、キャスティングされ、凍結された混合物の凍結乾燥は、典型的には、一晩から数日間（例えば２４時間）、適切な圧力（例えば１０−２ｍＢａｒ）および適切な温度（例えば−６００℃）で凍結乾燥することを含む。
【００８４】
本発明による細胞外マトリックスを調製するための方法は、フィブリノゲンの水溶液、凝固剤、増量剤（および任意選択で発泡剤および／または安定化剤）の混合物を、発泡させ、凝固させるステップを含むことができる。発泡は、曝気により混合することによって達成することができる。さらなる実施形態では、発泡は、曝気装置を使用して（例えば３０秒間）達成される。発泡は、泡立てるか、またはブレンドすることによって達成することができる。
【００８５】
本発明の細胞外マトリックス材料を形成するために、本発明の方法において使用される架橋剤は、当業者に一般に公知のいくつかの架橋剤または架橋技術のいずれか１つ、例えば化学的、放射的および熱脱水（dehydrothermal）法であってよい。
【００８６】
本明細書における「架橋」への言及は、共有結合による架橋に関する。したがって、架橋は、フィブリンモノマーを、トロンビンを使用してフィブリノゲンからフィブリノペプチドＡおよびＢを開裂した後に会合させ、重合する方法は包含しない。好ましくは、架橋は、化学的架橋剤を使用して酵素によらず達成される。
【００８７】
適切な化学的架橋剤の例として、カルボジイミドカップリング剤、例えばＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、アジドカップリング剤；ジイソシアネート架橋剤、例えばヘキサメチレン（hexam  ethylene）ジイソシアネート；エポキシド架橋剤、例えばエピクロロヒドリン（epi-chlorhydrin）、グリシジルエーテルおよびグリシジルアミン；ならびにアルデヒド架橋剤、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールが挙げられる。
【００８８】
化学的架橋剤は、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）および／またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含むことができる。
【００８９】
化学的架橋剤は、アルデヒド架橋剤、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールを含むことができる。アルデヒド架橋剤は、生体適合性が改善された細胞外マトリックス組成物を提供するという利点を有する。例えば、本発明者らは、アルデヒド架橋剤の存在によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの伝播（例えばマトリックス上へのヒト内皮細胞または線維芽細胞の播種）が増強されることを本明細書で示している。さらなる実施形態では、アルデヒド架橋剤は、グルタルアルデヒドである。グルタルアルデヒドを架橋剤として使用することによって、他のアルデヒドよりも急速に最適な架橋密度をもたらすという驚くべき利点がもたらされ、相対的に高密度の架橋を達成することもできる。好ましい例では、化学的架橋剤は、グルタルアルデヒドである。
【００９０】
架橋剤が、グルタルアルデヒドまたはＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）および／またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を含む場合、本発明による方法は、毒性低減剤（例えばリシンまたは水素化ホウ素ナトリウム）を添加するステップをさらに含むことができる。
【００９１】
一例では、増量剤がアルギン酸塩を含む場合、本発明の方法は、アルギン酸塩をフィブリノゲンまたはフィブリンに架橋する追加の架橋ステップを含むことができる。さらなる例では、架橋剤は、過ヨウ素酸を含む。このような追加の架橋ステップは、得られた組成物の安定性を増強する可能性が高い。
【００９２】
架橋剤を用いるインキュベーションは、典型的には、適切な温度（例えば２０〜５０℃または室温）で１分間〜２４時間の間（例えば４時間）、実施することができる。
【００９３】
架橋剤がアルデヒド架橋剤を含む場合、その方法は、還元剤を添加するステップをさらに含むことができる。還元剤は、インキュベーションの後、架橋剤を除去するための洗浄の前に添加することができる。
【００９４】
還元剤の存在は、架橋プロセスを安定化すると考えられ、驚くべきことに、生物学的有効性が増強された細胞外マトリックス組成物をもたらす。さらに、還元剤の存在は、組成物から非還元架橋剤が浸出することによって引き起こされた細胞傷害効果を低減する可能性が高い。
【００９５】
適切な還元剤の例として、水素化ホウ素ナトリウムまたは類似のカルボニル基反応性を有する薬剤が挙げられる。還元剤は、典型的には、０．１％ｗ／ｗ〜１０％ｗ／ｗ（例えば約１％ｗ／ｗ）の量で添加することができる。還元剤は、０．１％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖ（例えば約１％ｗ／ｖ）の量で添加することができる。
【００９６】
本発明による方法は、二価または多価金属イオン、例えばカルシウム（例えば塩化カルシウム）を添加するステップを含むことができる。カルシウムの存在によって、以下の有益な特性の１つまたは複数がもたらされる。（ｉ）トロンビンの活性化ステップ、（ｉｉ）増量剤、例えばアルギン酸塩のゲル化ステップ、（ｉｉｉ）フィブリノゲン凝固反応の調節、（ｉｖ）タンパク分解に対する、架橋されたフィブリノゲン、フィブリンまたは誘導された断片の安定性。カルシウムの濃度は、アルギン酸塩をゲル化させ、かつ／またはトロンビンを活性化するのに十分に高いが、組成物から浸出する可能性が高く、細胞傷害効果を有する量を超えないように選択されることを理解されよう。一実施形態では、カルシウムは、１〜５０ｍＭの間の最終濃度で添加される。さらなる実施形態では、カルシウムは、およそ５０ｍＭの最終濃度で添加される。
【００９７】
本発明の方法の洗浄ステップは、数時間または数日間にわたって浸出するおそれがある、残留している化学的架橋剤（および存在する場合には還元剤）を除去する。洗浄ステップはまた、架橋後に得られた細胞外マトリックス組成物の生体適合性を増大する。
【００９８】
ステップにおける洗浄は、適切な緩衝液、例えばＰＢＳ、または溶媒、例えば水、エタノール、メタノール、プロパノール、イソプロパノールもしくはその混合物中、適切な洗浄レジメ（regime）（例えば５×５分間の洗浄）を使用して達成することができる。洗浄ステップは、超音波処理を伴うことができる。超音波の形態の超音波処理（例えば５×３０秒間のバースト）の存在は、架橋剤（および存在する場合には還元剤）の除去をさらに増強する。洗浄ステップは、エタノール／水の混合物（例えば９５％ｖ／ｖのエタノールおよび５％ｖ／ｖの水）で５×５分間、洗浄することを含むことができる。
【００９９】
本発明の細胞外マトリックス材料は、使用前に凍結され、任意選択で凍結乾燥され得る。
【０１００】
本発明の細胞外マトリックス材料は、好ましくは、４００μｍまでの孔径分布を有する。例えば、細胞外マトリックス材料は、大部分が２０〜２７０μｍの範囲のサイズの細孔を有することができる。
【０１０１】
本発明の細胞外マトリックス材料は、好ましくは、５０％よりも高い、好ましくは６０％よりも高い、より好ましくは７５％よりも高い、例えば８０％よりも高いバルク多孔性を有する。
【０１０２】
本発明のさらなる態様によれば、骨欠損、例えば創傷もしくは骨折の処置において使用するため、または骨再生を促進するための、本明細書で定義される細胞外マトリックス材料が提供される。
【０１０３】
本発明のさらなる態様によれば、骨欠損、例えば創傷もしくは骨折を処置するため、または骨再生を促進するための医薬品の製造において使用するための、本明細書で定義される細胞外マトリックス材料の使用が提供される。
【０１０４】
本発明のまたさらなる態様によれば、骨欠損、例えば創傷または骨折を処置する方法であって、本明細書で定義される細胞外マトリックス材料を骨欠損部位に適用するステップを含む、方法が提供される。
【０１０５】
本明細書で前述した細胞外マトリックス材料は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの骨再生のために使用することができる。
【０１０６】
ここで、本発明の例を、添付の図を参照しながら例として記載する。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】図１は、１５０倍および４０，０００倍の拡大率におけるＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）の、相互接続した開口多孔性および線維性質、ならびにそのミクロ多孔性（左）およびナノ多孔性（右）を示すＳＥＭ写真を示しており、線維は、ｉｎ  ｖｉｖｏシナリオを模倣するナノサイズであり、細胞は、ナノサイズの細胞外マトリックスと接触している。
【０１０８】
【図２】図２は、模擬体液（ＳＢＦ）に浸漬させた後の経時的な鉱物堆積を示す、４０，０００倍におけるリン酸カルシウム−Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）（ＣａＰ−ＳＭ）のＳＥＭ写真を示す。左上は、ＳＢＦ中２日間、右上は、ＳＢＦ中４日間、左下は、ＳＢＦ中６日間、および右下は、ＳＢＦ中９日間浸漬させたものである。
【０１０９】
【図３】図３は、ＳＢＦに浸漬させた後のミクロ多孔性の低減を示す、１５０倍におけるＣａＰ−ＳＭのＳＥＭ写真を示す。左上は、ＳＢＦ中２日間、右上は、ＳＢＦ中４日間、左下は、ＳＢＦ中６日間、および右下は、ＳＢＦ中９日間浸漬させたものである。
【０１１０】
【図４】図４は、ＳＢＦに６日間浸漬させた後のＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）（スペクトル１）およびＣａＰ−ＳＭ（スペクトル２）のＥＤＸ分析を示しており、ＣａおよびＰが、Ｍｇも含有するＣａＰ堆積物の主な元素であることを示している。
【０１１１】
【図５】図５は、この研究で使用したＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）足場のエオシン染色を示す（４倍の拡大率）（左）。エオシン対比染色によるＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色（１０倍の拡大率）（右）。
【０１１２】
【図６−１】図６は、ＳＢＦに浸漬させて２日目、６日目および９日目の、対照試料（Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標））についてのＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色結果を示す。左の写真は、２０倍の拡大率であり、右の写真は、４０倍の拡大率である。
【図６−２】図６は、ＳＢＦに浸漬させて２日目、６日目および９日目の、対照試料（Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標））についてのＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色結果を示す。左の写真は、２０倍の拡大率であり、右の写真は、４０倍の拡大率である。
【０１１３】
【図７】図７は、異なる期間にわたってＳＢＦに浸漬させた、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）（ＣａＰ−ＳＭ０）およびＣａＰ−ＳＭのｉｎ  ｖｉｔｒｏ分解を示す。上は、７日間（１６８時間）までの結果であり、下のクローズアップは、最初の６時間におけるＣａＰ−ＳＭ足場の分解速度が、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）と比較して激減することを示す結果である。結果は、アベレージ±標準偏差を示す。
【０１１４】
【図８】図８は、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイの結果を示している（＊ｐ＜０．０５）。結果は、アベレージ±標準偏差を示す。
【０１１５】
【図９】図９は、１０日間培養した後のヒト皮膚線維芽細胞を播種したＣａＰ−ＳＭ足場の横断面のＨ＆Ｅ染色を示す。左上は、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）であり（２０倍の拡大率）、右上は、ＳＢＦに２日間浸漬させた後のＣａＰ−ＳＭであり（４０倍の拡大率）、左下は、ＳＢＦに６日間浸漬させた後のＣａＰ−ＳＭであり（４０倍の拡大率）、右下は、ＳＢＦに９日間浸漬させた後のＣａＰ−ＳＭである（４０倍の拡大率）。この図では白黒バージョンで目に見えないが、足場は、鮮やかなピンク色に染色されており、細胞は、紫色に染色されているように見える。
【０１１６】
【図１０】図１０は、ＣａＰ−ＳＭ１、ＣａＰ−ＳＭ２、ＳＭ１およびＳＭ２のＳＥＭ写真を示す。
【０１１７】
【図１１】図１１は、ＣａＰ−ＳＭ１、ＣａＰ−ＳＭ２、ＳＭ１およびＳＭ２の鉱物堆積物における主な元素のＥＤＸ元素分析を示す。
【０１１８】
【図１２】図１２は、ＣａＰ−ＳＭ、ＳＭ１およびＳＭ２足場についてのＦＴＩＲの代表的スペクトルを示す。
【０１１９】
【図１３】図１３は、ＳＭ１、ＳＭ２、ＣａＰ−ＳＭ１およびＣａＰ−ＳＭ２の足場のＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色を示す。
【０１２０】
【図１４】図１４は、１％トリプシンを使用した、ＣａＰ−ＳＭ１およびＣａＰ−ＳＭ２足場のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生分解の写真を示す。
【０１２１】
【図１５】図１５は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨前駆細胞で行った生存／死滅アッセイから、１日目および２８日目に得られた結果を示す。＋ＯＭは、骨形成培地を示し、−ＯＭは、標準培地を示す（骨形成補充物を含まない）。
【０１２２】
【図１６】図１６は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨前駆細胞を用いて行った、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）、ＣａＰ−ＳＭ１およびＣａＰ−ＳＭ２を播種した足場についての、骨形成培地中２８日間の培養期間にわたるａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイの結果を示す。結果は、アベレージ±標準偏差を示す。
【０１２３】
【図１７】図１７は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨前駆細胞を用いて行った、標準（−ＯＭ）または骨形成（＋ＯＭ）条件下のいずれかで２８日間培養した後の、播種した足場のＨ＆Ｅ染色を示す。この図では白黒バージョンで目に見えないが、細胞核は、周辺にピンク色の細胞質を伴って濃い紫色に見えており、足場は、ピンク色／濃いピンク色に染色されている。
【０１２４】
【図１８】図１８は、標準（−ＯＭ）または骨形成（＋ＯＭ）条件下のいずれかで２８日間培養した後の、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を播種したＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）、ＣａＰ−ＳＭ１およびＣａＰ−ＳＭ２足場のＤＡＰＩ染色切片を示す。この図では白黒バージョンで目に見えないが、細胞核は、青色蛍光に見えている。スケールバーは５００μｍである。
【０１２５】
【図１９】図１９は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨前駆細胞を用いて行った、標準（−ＯＭ）または骨形成（＋ＯＭ）条件下のいずれかで２８日間培養した後の、播種した足場の代表的ＳＥＭ画像を示す。
【０１２６】
【図２０】図２０は、標準（−ＯＭ）または骨形成（＋ＯＭ）条件下のいずれかで２８日間培養した後の、ＭＣ３Ｔ３を播種した足場におけるオステオポンチンの免疫染色を示す。この図では白黒バージョンで容易には目に見えないが、赤色蛍光は、オステオポンチンの存在を示し、青色蛍光は、細胞核を示す。
【０１２７】
【図２１】図２１は、標準（−ＯＭ）または骨形成（＋ＯＭ）条件下のいずれかで２８日間培養した後の、ＭＣ３Ｔ３を播種した足場におけるＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色を示す。この図では白黒バージョンで容易には目に見えないが、黒色／暗褐色は、ＣａＰ堆積物を示し、ピンク色は、フィブリン線維を示す。
【０１２８】
【図２２】図２２は、（上）異なる足場および対照の代表的な巨視的画像、ならびに（下）足場および対照についての血管領域の百分率（平均±平均の標準誤差）を示す。３種の足場の間に、統計的有意性は見出されなかった。
【実施例】
【０１２９】
（実施例１）
材料および方法
・Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）の調製
Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘの製造方法は、３つの別個の段階で行われる。
１）予め加温した（３７℃）試薬を激しく混合して（４０００ｒｐｍ）、白色の発泡物を形成し、それを、型にキャスティングし、３７℃で１時間インキュベートして凝固させる。
２）８０％無水エタノール／２０％ＭＥＳ緩衝液中、０．２％ｖｏｌ／ｖｏｌのグルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）を用いて室温で４時間、化学的に架橋した後、ｄｉＨ２Ｏで１回洗浄し（１０分）、ｄｉＨ２Ｏ中０．１％ｗｔ／ｖｏｌのＮａＢＨ４（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）で１回洗浄し（一晩）、ｄｉＨ２Ｏ中０．１％ｗｔ／ｖｏｌのＮａＢＨ４で５回洗浄し（１０分）、ｄｉＨ２Ｏで５回洗浄して（１０分）、残留している可能性がある任意のグルタルアルデヒドおよびその還元剤ＮａＢＨ４を排除する。
３）−４０℃で３６時間、足場を凍結乾燥させる（Ｖｉｒｔｉｓ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｅｒ、Ｂｉｏｐｈａｒｍａ、ＵＫ）。
【０１３０】
第１の段階で混合した試薬は、以下のものである。
・ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ＝７．４中、２％ｗｔ／ｖｏｌのアルギン酸塩（Ｎｏｖａｍａｔｒｉｘ、Ｎｏｒｗａｙ）３ｍｌ
・ｄｉＨ２Ｏ中１Ｍ  ＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）２５μｌ
・ＭＥＳ／ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ＝７．４中、２％ｗｔ／ｖｏｌの透析ヒトフィブリノゲン（ＲｉａＳＴＡＰ（登録商標）、ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）（Sharmaら、２０１５年）またはウシフィブリノゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）６ｍｌ
・界面活性剤ミックス［ｄｉＨ２Ｏ中２０％ｗｔ／ｖｏｌのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）、ｄｉＨ２Ｏ中２０％ｗｔ／ｖｏｌのデシル−β−ｄ−マルトピラノシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）、ｄｉＨ２Ｏ中２０％ｗｔ／ｖｏｌのドデシル−β−ｄ−グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）、およびｄｉＨ２Ｏ中２０％ｗｔ／ｖｏｌのオクチル−β−ｄ−マルトピラノシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）］（ＷＯ２０１３１６４６３５Ａ１）７５０μｌ
・ＨＥＰＥＳ／ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４中、１０Ｉ．Ｕ．／ｍｌのヒトトロンビン（ＴＩＳＳＥＥＬ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．、ＵＳ）または透析ウシトロンビン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）１．２ｍｌ
・ｄｉＨ２Ｏ中６６％ｗｔ／ｖｏｌのトレハロース（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫ）１．５ｍｌ
【０１３１】
・模擬体液（ＳＢＦ）に浸漬させることによるリン酸カルシウム−Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）（ＣａＰ−ＳＭ）の調製
ＳＢＦ溶液を、Kokuboら、１９９０年によって記載されているプロトコールに従って調製した。ＳＢＦ溶液は、定義された濃度の関連するイオンを含有していた（表１）。
【表１】
2019529022.tif 000002
【０１３２】
ＳＢＦ溶液を調製するために、以下の量および試薬を、０．４ＬのｄＨ２Ｏに添加した。０．１５２ｇのＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ、０．１７６ｇのＮａＨＣＯ３、０．１１４ｇのＫ２ＨＰＯ４−３Ｈ２Ｏ、０．１３９ｇのＣａＣｌ２、０．１１２ｇのＫＣｌおよび４．０２７ｇのＮａＣｌ。溶液を、１０分間激しく撹拌した。ｐＨを、（ＣＨ２ＯＨ）３ＣＮＨ２５０ｍＭ／ＨＣｌ４５ｍＭの緩衝液で７．２５に調整した。最後に、体積をｄＨ２Ｏで０．５Ｌまで増大し、溶液を、１０分間激しく撹拌した。
【０１３３】
１ｃｍ×１ｃｍのＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）足場を、３７℃で９日間までＳＢＦに浸漬させた。ＳＢＦ溶液は、２〜３日ごとに変更した。浸漬時間が経過した後、足場をＳＢＦ溶液から除去し、ｄＨ２Ｏで洗浄し、−８０℃で凍結し、凍結乾燥させた。
【０１３４】
・走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）およびエネルギー分散Ｘ線分光法（ＥＤＸ）
ＳＥＭおよびＥＤＸ分析を、ロンドン大学クイーンメアリーのＮａｎｏｖｉｓｉｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅで実施した。
【０１３５】
ＳＢＦに浸漬してから０、２、４、６および９日後の凍結乾燥させたＣａＰ−ＳＭ試料に、金をスパッタリングコーティングした後、ＳＥＭおよびＥＤＸ分析で観測した。
【０１３６】
ＳＥＭ顕微鏡写真を、１５０倍、５００倍、２，０００倍、１０，０００倍、２０，０００倍および４０，０００倍の拡大率で撮影し、５ｋＶで得た。足場の形態、定性的な孔径、ＣａＰ結晶堆積物の形態およびサイズを、ＳＥＭ画像から研究した。
【０１３７】
ＣａＰ−ＳＭ足場の元素分析およびＣａ／Ｐ比を、１０ｋＶで得られたＥＤＸスペクトルから研究した。
・横断面のＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色
【０１３８】
ＣａＰ−ＳＭ足場をパラフィンに包埋し、横断面を、ミクロトームを使用して厚さ４μｍにカットした。
【０１３９】
Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色の原理は、銀イオンが酸性条件下でリン酸と反応する沈殿反応である。次に、照明光の下で、リン酸銀から銀への光化学的分解が生じる。ＡｇＮＯ３１．５ｇをｄＨ２Ｏ１００ｍｌに添加することによって、１．５％硝酸銀溶液を調製した。同様に、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３２．５ｇをｄＨ２Ｏ１００ｍｌに添加することによって、２．５％チオ硫酸ナトリウム溶液を調製した。
【０１４０】
スライドを、１．５％硝酸銀溶液でカバーし、明光に１時間曝露した後（ランプの下）、ｄＨ２Ｏで洗浄した。次に、スライドを２．５％チオ硫酸ナトリウムで５分間カバーし、流水に浸した後、エオシン対比染料に５分間浸漬させた。スライドを７０％ＩＭＳに浸し、次に９０％ＩＭＳに浸し、１００％ＩＭＳに１分間浸漬させた。最後に、キシレンに２分間浸漬させ、キシレンに２回浸し、乾燥させておき、光学顕微鏡下で観測するためにカバースリップを乗せた。ＣａＰ堆積物は、黒色／暗褐色に染色されており、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）は、ピンク色／赤色に染色されていた。
【０１４１】
・ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生分解性（トリプシン消化）
１ｃｍ×１ｃｍのＣａＰ−ＳＭ足場（ＳＢＦへの浸漬時間当たりｎ＝３）を、１２ウェルプレートに入れた。足場ディスクを入れた各ウェルに、ベルセン溶液中０．２５％トリプシン２．５ｍｌを添加し、プレートを、５％ＣＯ２を用いて３７℃でインキュベートした。０、２、４、６、２４、４８、および１６８時間（７日）目に、各ウェルから得られた一定分量１００μｌを、エッペンドルフチューブに移し、−８０℃で保存した。各ウェルに、ベルセン溶液中、新しい０．２５％トリプシン１００μｌで補充した。
【０１４２】
総タンパク質比色アッセイを、一定分量１００μｌで実施した。０．１〜１．５ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ中ウシ血清アルブミンの標準曲線を調製した。一定分量を解凍した後、一定分量から得られた５０μＬおよび標準を、キュベット中、ＢｒａｄｆｏｒｄＵｌｔｒａ（商標）溶液７５０μｌと混合した。製造者の指示に従って、５９５ｎｍにおける吸光度を、Ｍ５５０複光束ＵＶ／可視分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｃａｍｓｐｅｃ  Ｌｔｄ．、ＵＫ）で空気に対して測定した。０時点について５９５ｎｍにおける吸光度を、その他の試料から減算した。標準曲線をプロットし、それを使用して、完全に分解された場合には１×１ｃｍの足場小片が溶液中４ｍｇ／ｍｌのタンパク質を有するはずであることを考慮して、溶液中のマトリックスタンパク質の百分率を算出した。
【０１４３】
・ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイによる細胞生存度
３人の異なるドナーから得られた正常なヒトの初代皮膚線維芽細胞を使用した。細胞を単離し、既に記載されている通り培養した（Sharmaら、２０１５年）。
【０１４４】
ＳＥＭによって、ＳＢＦに浸漬して２日後に、ＣａＰ堆積物が０．２μｍまでのサイズになり、６日目および９日目には０．０５〜０．８μｍの大きさの凝集体になることが示される通り、この研究では、ＳＢＦ中ＣａＰ−ＳＭを０、２、６および９日間使用した。さらに、ＳＢＦにおいて６日間経過した後よりも９日間経過した後に、多くのＣａＰが観測される。したがってこの研究では、細胞生存度に対するＣａＰ堆積物サイズおよびＣａＰ濃度の効果が観測された。
【０１４５】
１ｃｍ×１ｃｍのＣａＰ−ＳＭ足場を、プラスチックカバースリップ（単層対照）と共に２４ウェルプレートに移し、ＩＭＳで１回洗浄した後、ＰＢＳで４回洗浄した。細胞集団１つ当たり３つの足場を使用し、したがってｎ＝９であった。
【０１４６】
足場１つ当たり０．５×１０６個の細胞を、５回継代して播種し、５％ＣＯ２を用いて３７℃で３時間インキュベートした後、細胞を足場に接着させ、ウェルごとに培地２ｍＬを添加した。
【０１４７】
培養の１、２、４、７および１０日目に、ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイを実施した。ウェルごとにａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）作用溶液（フェノールを含まないＤＭＥＭで原液を１０倍希釈した）１ｍｌを添加し、試料を、５％ＣＯ２を用いて３７℃で４時間インキュベートした後、各ウェルの内容物をキュベットに移し、吸光度を、ｕｖ／ｖｉｓ分光光度計で５７０ｎｍにおいて測定した。
【０１４８】
結果を、一元ＡＮＯＶＡによってＳｉｇｍａ  Ｓｔａｔ  ３．５ソフトウェアを使用して統計的に分析した。ｐ＜０．０５を有意な結果とみなした。
【０１４９】
・ＣａＰ−ＳＭを介する細胞遊走
播種したＣａＰ−ＳＭ足場を、１０日間培養した後、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン組織学的検査のために処理した。横断面を、ミクロトームを使用して厚さ４μｍにカットした。
【０１５０】
切片を、典型的なヘマトキシリンおよびエオシン染色で染色し、それによって、細胞は紫色／黒色に染色され、バックグラウンドは、鮮やかなピンク色に見える。
【０１５１】
染色された切片を乾燥させ、光学顕微鏡法で観測するためにカバースリップを乗せた。
【０１５２】
（実施例２）
結果
・ＳＥＭおよびＥＤＸ分析
図１のＳＥＭ画像は、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）が、線維から構成された均一で均質な材料であることを示している。この材料は、ミクロ多孔性（３０〜３５０μｍ）ならびにナノ多孔性（０．０６〜０．６μｍ）を有している。細孔は、相互接続しているように見える。
【０１５３】
図２に示されているＳＥＭ画像は、経時的な鉱物堆積を示している。ＳＢＦに２日間浸漬させた後、０．２μｍまでのサイズの球状鉱物堆積物が観測される。ＳＢＦに４日間浸漬させた後、フィブリン／アルギン酸塩マトリックスの表面上に球状鉱物結晶が観測され、この結晶は、浸漬時間の延長に伴って成長する。ＳＢＦに６日間浸漬させた後、生体材料の表面全体に、球状鉱物結晶（０．０５〜０．８μｍの大きさの凝集体）が観測される。
【０１５４】
ＳＢＦ溶液における浸漬時間の延長に伴って、結晶の大きさの増大が見られるが、図２の右下から分かる通り、ＳＢＦに９日間浸漬させた後、フィブリン線維がまだ目に見えている。このことは、フィブリンの有益な血管新生促進特性および生理活性特性が、結晶の存在によって覆い隠されないはずであることを示唆している。
【０１５５】
図３の画像は、経時的なＣａＰ堆積物の低拡大率の写真を示しており、これは、ＳＢＦにわずか２日間浸漬させた後に、多孔性の低減が顕著である通り、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）に見出される元のミクロ多孔性が、ＳＢＦに浸漬させると低減することを示唆している（図３、左上）。
【０１５６】
ＳＢＦに６日間浸漬させた後のＣａＰ−ＳＭのＥＤＸ分析（図４）は、ＣａおよびＰが、９日目でも球状結晶の主な元素であることを示している。６日目までは、ＥＤＡＸスペクトルにおいてＣａおよびＰは検出されない。Ｃａ／Ｐ算出値は、１．７±０．６であった（アベレージ±標準偏差；ヒドロキシアパタイトのＣａ／Ｐは、１．６７である）。Ｍｇも存在しており、ＳＢＦはＭｇ２＋を含有しており、Ｍｇ２＋は、骨鉱物中に存在することが報告されている代替イオンの１つである（WopenkaおよびPasteris  ２００５年；LeGeros  ２００８年）。
【０１５７】
・横断面のＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色
図５は、使用したＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）足場のエオシン染色（左）およびエオシンを用いた対比染色によるＶｏｎ  Ｋｏｓｓａで染色された足場（右）を示す。図から分かる通り、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）は、Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色の後、より暗色に見える。ＳＥＭ写真で既に観測された通り、足場の均質な開口細孔構造を見ることもできる。
【０１５８】
図６は、模擬体液（ＳＢＦ）に９日間まで浸漬させた後の、ＣａＰ−ＳＭ足場のＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色結果を示す。試料を、エオシンで対比染色した。ＣａＰ堆積物は、黒色／暗褐色に染色されており、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）は、ピンク色／赤色に染色されている。
【０１５９】
写真から観測される通り、足場線維は、ＳＢＦへの浸漬によって暗色に見える。黒色／褐色の染色は、ＳＢＦへの浸漬期間が長いほど、増大するように見える。足場構造全体にＣａＰ堆積物が見出され、均質に染色されているように見えることが示されていることも興味深い。これらの結果は、足場をＳＢＦに浸漬させる生物模倣手順によって、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）全体にＣａＰ堆積物の均質な堆積が達成され得ることを示唆している。
【０１６０】
・ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生分解性（トリプシン消化）
図７は、ＳＢＦへの浸漬時間が延長すると、足場のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分解速度が低下することを示している。分解速度は、特に、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）と比較して、最初の６時間で低下する。これらの結果は、ＣａＰ−ＳＭが、ブタモデルの全層皮膚創傷への埋め込み後５〜６週間まで、組織学的切片に観測されたＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）よりも、ｉｎ  ｖｉｖｏで分解するのにより長時間かかり得ることを示唆している。ｉｎ  ｖｉｖｏでの新しい骨形成は、４カ月間までかかり（HadjidakisおよびAndroulakis  ２００６年）、したがって、骨の修復にとって、ＣａＰ−ＳＭの分解がより緩慢であることが有益であると予測されることを示唆している。
【０１６１】
・ａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイによる細胞生存度
図８に示されている結果は、細胞がＣａＰ−ＳＭ足場上で成長し、増殖できることを示しており、このことは、生物模倣法によって堆積したＣａＰが、細胞にとって毒性ではないことを示唆している。
【０１６２】
単層対照と足場上の細胞の間に、４日目までに有意な差異があり（ｐ＜０．０５）、７日目にはＣａＰ−ＳＭ２および６だけにあり、次に１０日目には有意な差異はない。このことは、播種効率が１００％であるフラット対照と比較して、３Ｄ足場上への非効率的な細胞の播種に起因し得る。培養期間が進むと、３Ｄ足場の細胞は、フラット対照上よりも増殖する。最後に、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）とＣａＰ−ＳＭ足場の間に統計的有意差はなく、このことは、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）の有益な細胞特性が、ＣａＰ−ＳＭ足場に依然として存在することを示唆している。
【０１６３】
・ＣａＰ−ＳＭを介する細胞遊走
図９の写真は、正常なヒトの初代皮膚線維芽細胞が、ＣａＰ−ＳＭ足場を介して遊走することができ、１０日間培養した後、足場全体に定植したことを示している。
【０１６４】
（実施例３）
代替足場を形成するための材料および方法
代替足場を、前述した通り、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）をＳＢＦ溶液に浸漬させることによって配合した。
【０１６５】
表２は、ＳＢＦ溶液中に存在する関連するイオンの濃度を記載している。
【表２】
2019529022.tif 000003
【０１６６】
ＳＢＦ−１溶液を調製するために、以下の量および試薬を、０．７ＬのｄＨ２Ｏに添加した。１．４６５ｇのＣａＣｌ２、１．５５５ｇのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、２．５２０ｇのＮａＨＣＯ３および１．１５０ｇのＫ２ＨＰＯ４．３Ｈ２Ｏ。この後、溶液のｐＨを、１ＭのＨＣｌを使用して６．０に調整した後、その溶液に０．３６０ｇのＮａ２ＳＯ４、１．１２５ｇのＫＣｌ、２７．０１５ｇのＮａＣｌおよび２．１３０ｇのＮａ２ＣＯ３を添加した。最後に、溶液のｐＨを、１ＭのＨＣｌを使用して６．５に調整した。
【０１６７】
ＳＢＦ−２溶液を調製するために、以下の量および試薬を、０．４ＬのｄＨ２Ｏに添加した。０．６９５ｇのＣａＣｌ２、０．７６０ｇのＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ、０．８８０ｇのＮａＨＣＯ３および０．５７０ｇのＫ２ＨＰＯ４．３Ｈ２Ｏ。この後、溶液のｐＨを、１ＭのＨＣｌを使用して６．０に調整した後、その溶液に０．５６０ｇのＫＣｌおよび２０．１３５ｇのＮａＣｌを添加した。最後に、溶液のｐＨを、１ＭのＮａＯＨを使用して６．５に調整した。
【０１６８】
ＳＢＦ−３溶液を調製するために、以下の量および試薬を、０．４ＬのｄＨ２Ｏに添加した。２０．１３５ｇのＮａＣｌ、０．６９５ｇのＣａＣｌ２および０．５７０ｇのＫ２ＨＰＯ４．３Ｈ２Ｏ。この溶液のｐＨを、１ＭのＨＣｌを使用して６．０に調整した。
【０１６９】
すべての溶液を、使用前に０．２２μｍのＰＥＳ膜で濾過した。
【０１７０】
１ｃｍ×１ｃｍのＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）足場を、ＳＢＦ−１またはＳＢＦ−２溶液のいずれかに、オービタルシェーカーにより１６０ｒｐｍで常に撹拌しながら、３７℃で２４時間浸漬させた。浸漬時間が経過した後、足場をＳＢＦ溶液から除去し、超音波水クリーナー中、ｄＨ２Ｏで６０秒間洗浄し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。
【０１７１】
凍結乾燥させた足場を、ＳＢＦ−３に、オービタルシェーカーにより８０ｒｐｍで常に撹拌しながら、３７℃で４８時間、さらに浸漬させることができる。浸漬時間が経過した後、足場をＳＢＦ−３溶液から除去し、超音波水クリーナー中、ｄＨ２Ｏで６０秒間洗浄し、−８０℃で凍結させ、凍結乾燥させた。
【０１７２】
凡例：
ＳＭ１：ｄＨ２Ｏに２４時間浸漬させたＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）足場（ＣａＰ−ＳＭ１の対照）。
ＳＭ２：ｄＨ２Ｏに４８時間浸漬させた、凍結乾燥させたＳＭ１足場（ＣａＰ−ＳＭ２の対照）。
ＣａＰ−ＳＭ１：ＳＢＦ−１に２４時間浸漬させたＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）足場。ＣａＰ鉱物堆積物は、球状形態を示す。
ＣａＰ−ＳＭ２：ＳＢＦ−３にさらに４８時間浸漬させた、凍結乾燥させたＳｍａｒｔＣａＰ１足場。ＣａＰ鉱物堆積物は、プレート様の形態を示す。
【０１７３】
（実施例４）
代替足場を試験するための方法および結果
ａ）走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）およびエネルギー分散Ｘ線分光法（ＥＤＸ）
【０１７４】
図１０に示されている結果は、ＣａＰ−ＳＭ１のフィブリンマトリックス全体に均一に分布した、球状形態のＣａＰ鉱物堆積物を示している。ＣａＰ−ＳＭ２には、プレート様の形態が観測される。ＳＭ１およびＳＭ２は、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）に見られる典型的な線維を示している。
【０１７５】
ＥＤＸ元素分析（図１１）は、ＣａＰ−ＳＭ１およびＣａＰ−ＳＭ２の鉱物堆積物の主な元素がＣａおよびＰであることを示した。Ｃａ／Ｐ算出値は、ＣａＰ−ＳＭ１およびＣａＰ−ＳＭ２について、それぞれ１．２９±０．２８および１．０２±０．３７であった（アベレージ±標準偏差）。Ｍｇも、ＣａＰ−ＳＭ１スペクトルに存在していた。
【０１７６】
ｂ）フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）およびＸ線回折（ＸＲＤ）
ＣａＰ堆積物における官能基の分析を、ＦＴＩＲによって行った。足場を、減衰全反射アクセサリー（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ  ＡＴＲ、Ｓｐｅｃａｃ、ＵＫ）と接触させて置くことによって、スペクトルを得た。スペクトルソフトウェアｖ５．０．１（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、ＵＫ）によって、各化学基のピーク強度を同定した（波数は、５００〜４０００ｃｍ−１の間で固定し、分解は４ｃｍ−１とした）。
【０１７７】
ＣａＰ堆積物の相の組成および結晶化度を、ＸＲＤによって、グラファイトフィルターを通したＣｕ  Ｋα放射線を用いてＲＩＧＡＫＵ  Ｄ／ｍａｘ  ２５００回折計を４０ｋＶおよび８０ｍＡで操作して使用して研究した。データを、２θ＝５°〜８０°からステップサイズ０．０３°で収集した。
【０１７８】
図１２に示されているＦＴＩＲスペクトルは、対照（ＳＭ１およびＳＭ２）とＣａＰ−ＳＭ足場の間に差異が存在することを示している。ＣａＰ−ＳＭ試料では、ＰＯ４バーストピークを、およそ１０５０ｃｍ−１において見ることができ、その後およそ８５０ｃｍ−１において小さいショルダーピークを見ることができるが、それらは、ＨＰＯ４基またはＣＯ３基またはその両方に起因し得る。特にＣａＰ−ＳＭ２で目に見えるおよそ６００ｃｍ−１におけるピークは、ＰＯ４基に起因し得る。ＣａＰ−ＳＭ１でおよそ１４５０ｃｍ−１において見られる小さいピークは、ＣＯ３基に起因し得る。さらに、スペクトルは、ＣａＰ−ＳＭ１と比較してＣａＰ−ＳＭ２においてＰＯ４ピークの強度が大きくなることを示しており、このことは、ＣａＰ−ＳＭ１足場よりもＣａＰ−ＳＭ２において、より多量のリン酸鉱物相が堆積したことを示唆している。ＦＴＩＲの結果は、ＣａＰ堆積物中ＰＯ４が存在し、特にＣａＰ−ＳＭ１において、場合によりＨＰＯ４およびＣＯ３基の両方が存在することを示唆している。
【０１７９】
ＣａＰ−ＳＭ１足場におけるＣａＰ堆積物が非常に非晶質であり、ＸＲＤが、非常に非晶質の鉱物相を検出しない通り、ＣａＰ−ＳＭ１のＸＲＤスペクトルは、ピークを示さなかった。ＣａＰ−ＳＭ２では、ＸＲＤスペクトルによって、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）および／またはリン酸八カルシウム（ＯＣＰ）に対応し得るピークが明らかになった。しかし、これらのピークはブロードであり、このことは、ＣａＰ−ＳＭ２中に存在するＣａＰ鉱物相が、あまり結晶性でなかったことを示している。ＥＤＸによって算出されたＣａ／Ｐ比が、およそ１であることを考慮すると、ＣａＰ−ＳＭ２は、ＣａＰ相、例えばＯＣＰと非晶質リン酸カルシウム（ＡＣＰ）の組合せから構成され得る。ＯＣＰおよびＡＣＰについて、それぞれＣａ／Ｐ＝１．３３およびＣａ／Ｐ＝０．６７〜１．５（Habrakenら、２０１６年）。
【０１８０】
ｃ）横断面のＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色
図１３は、エオシンを用いた対比染色によるＶｏｎ  Ｋｏｓｓａで染色された足場を示している。図１３では容易には目に見えないが、ＣａＰ鉱物堆積物は、黒色／暗褐色に染色されており、フィブリン線維は、ピンク色／赤色に染色されている。図１３から観測される通り、ＣａＰ鉱物堆積物は、足場構造全体に見出され、このことは、足場全体にＣａＰが均質に堆積したことを示唆している。ＳＭ１およびＳＭ２対照試料にはＣａＰ鉱物堆積物は観測されなかった。
【０１８１】
ｄ）レオロジー
レオロジーは、材料ならびに生体組織の粘弾特性（固体および流体の両方）を研究する工学部門である（Holtら、２００８年；Saitohら、２０１０年）。Ｋｉｎｅｘｕｓレオメータ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を振動モードで使用した。各足場から、２ｃｍ×２ｃｍの試料を調製し、２つの直径２０ｍｍの並行プレートの間に置いた（プレート間の間隔＝０．３ｍｍ）。試料を水和させ、統合温度調節器を使用して、試料ステージの温度を２０℃に維持した。「振幅掃引」および「周波数掃引」を含めた測定の組合せを、各試料に対して行った。「振幅掃引」は、０．０５から５％に線形増加する調節応力を適用することによって実施した。応力に対応する歪みを記録した。発振周波数は、１Ｈｚに維持した。線形粘弾性領域（ＬＶＥＲ）内の最大の歪みは、「振幅掃引」から選択された。せん断または貯蔵弾性率Ｇ’を、異なる試料について算出した。Ｇ’は、弾性に関するものであり、材料が、どのようにして弾性変形の形態で再使用することができるエネルギーを貯蔵するかの指標となる。したがって、Ｇ’は、材料の固体の特徴に関する。
【０１８２】
異なる足場のＧ’算出値（平均±標準誤差平均として）は、ＳＭ１では１１．２４±２．５４ｋＰａ、ＳＭ２では１１．０４±２．３３ｋＰａ、ＣａＰ−ＳＭ１では７５．２２±５５．４０ｋＰａ、ＣａＰ−ＳＭ２では５６１．３３±１０９．７９ｋＰａであった。したがって、ＣａＰ鉱物相をフィブリンベースのマトリックスに添加すると、材料が強化される。プレート様の形態は、球状形態よりも足場を強力にする。
【０１８３】
ｅ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生分解性（トリプシン消化）
足場（Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）、脱塩骨マトリックスまたはＤＢＭ、ＣａＰ−ＳＭ１およびＣａＰ−ＳＭ２）を、５ｍｍ×５ｍｍの正方形の小片にカットした後、ｐＨ７．２の１％トリプシンで３７℃において４８時間まで処理した。足場を、対照としてのＰＢＳ単独に浸漬させた。試料を、０時間、１８時間、２４時間および４８時間目に、キャノンのカメラを使用して巨視的に画像化し、立体顕微鏡を使用して微視的に画像化した。
【０１８４】
図１４の画像は、４８時間後にＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）およびＤＢＭの両方が完全に分解するが、ＣａＰ−ＳＭ１およびＣａＰ−ＳＭ２の小片はまだ目に見えていることを示している。ＣａＰ−ＳＭ１は、１％トリプシン中で４８時間経過した後、ＣａＰ−ＳＭ２よりも分解の程度が大きかった。これらの結果は、ＣａＰ−ＳＭ足場が、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）またはＤＢＭよりもｉｎ  ｖｉｖｏで分解するのに長時間かかり得ることを示唆している。
【０１８５】
ｆ）生存／死滅およびａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）アッセイによる細胞生存度および増殖
足場（対照として使用したＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）、ＣａＰ−ＳＭ１およびＣａＰ−ＳＭ２）を、５ｍｍ×５ｍｍの正方形の小片にカットし、７０％ＩＭＳで滅菌し、ＰＢＳで３回洗浄し、平底２４ウェル超低接着プレートに入れた。足場に、培地２０μｌ中、１×１０５個のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１サブクローンマウス前骨芽細胞（骨前駆細胞）を播種した。播種した後、プレートを、３７℃において５％ＣＯ２を用いて３時間インキュベートして、細胞を足場に接着させた。接着のためのインキュベーション時間が経過した後、骨形成補充物（５０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸、１０ｍＭのβ−グリセロリン酸塩および１００ｎＭのデキサメタゾン）を含む（＋ＯＭ）または含まない（−ＯＭ）、αＭＥＭ（１％抗生物質および１０％ウシ胎仔血清を含むイーグル最小必須培地アルファ改変型）１ｍｌを、ウェルごとに添加し、３７℃において５％ＣＯ２を用いて２８日間にわたって培養した。
【０１８６】
播種した足場を、細胞の組込みおよび生存度について、生存／死滅細胞染色を使用して製造者の指針（Ｓｉｇｍａ）に従って評価した。ここで、生存細胞は、緑色蛍光を発し、死滅細胞は、赤色蛍光を発する。簡潔には、足場をＰＢＳで洗浄した後、生存／死滅染色溶液で染色し、次に暗室中、３７℃および５％ＣＯ２で３０分間、染色手順を実施した。生存細胞および死滅細胞を、蛍光画像化および共焦点顕微鏡によって可視化した。
【０１８７】
播種した足場を、新しい２４ウェルプレートに移し、ウェルごとにａｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）作用溶液（１０％ＦＣＳおよび１％抗生物質を補充した、フェノールを含まないダルベッコ改変イーグル培地で原液を１０倍希釈した）１ｍｌを添加し、試料を、３７℃で５％ＣＯ２を用いて３時間インキュベートした後、各ウェルの内容物をキュベットに移し、吸光度を、ｕｖ／ｖｉｓ分光光度計で５７０ｎｍにおいて測定した。
【０１８８】
結果は、細胞が培養期間にわたって生存可能なままであり、増殖できることを示した。生存／死滅アッセイは、標準条件および骨形成条件下の両方で、あらゆる足場上に緑色蛍光性の細胞（生存可能）を示した（図１５）。また画像は、細胞が、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）と比較してＣａＰ−ＳＭ足場において集団で成長することを示している。細胞は、最初、１４日目にプラトーに達するまで、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）対照およびＣａＰ−ＳＭ１足場でより急速に増殖するように見えたが、ＣａＰ−ＳＭ２では、細胞は、培養期間にわたって成長のプラトーに達しなかった（図１６）。これらの結果は、ＣａＰ−ＳＭ１およびＣａＰ−ＳＭ２が、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）の有益な細胞特性を保っていることを示唆している。
【０１８９】
ｇ）ＣａＰ−ＳＭを介する細胞遊走
播種したＣａＰ−ＳＭ足場を、２８日間培養した後、実施例１と同様に４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン組織学的検査のために処理し、標準ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０１９０】
図１７の画像は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞が、ＣａＰ−ＳＭ足場を介して遊走することができ、２８日培養した後、足場全体に定植したことを示している。Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で細胞の流入および遊走を促進することが示されており（Garcia-Garetaら、２０１３年；Sharmaら、２０１６年）、これらの結果は、ＣａＰ−ＳＭ足場がこの特性を保持していることを示している。
【０１９１】
さらに、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）、ＣａＰ−ＳＭ１およびＣａＰ−ＳＭ２足場におけるＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の分布を、標準（−ＯＭ）および骨形成（＋ＯＭ）条件下で２８日間培養した後、核のＤＡＰＩ染色を使用して調査した。組織学的スライドを脱パラフィン処理し、再水和させ、蒸留水で洗浄した後、ＤＡＰＩマウント培地を含むＦｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄ（商標）（Ｆ６０５７  Ｓｉｇｍａ）を、製造者の指示に従って適用した。簡潔には、バイアルを室温にし、マウント培地１〜２滴を試料の上に直接適用し、室温でおよそ５分間静置した。次に、切片に、気泡が入らないように注意深くカバースリップを乗せ、端部をマニキュア液で封止した。次に、切片を、共焦点走査型レーザー顕微鏡を使用し、ＤＡＰＩのために４０５ｎｍ波長のレーザーを使用して画像化した（励起３７２、発光４５６）。切片を、足場のＸＹ面全体についてタイル走査し、次に、共焦点顕微鏡の５％オーバーラップ自動化機能を使用して重ね合わせた。
【０１９２】
図１８の画像は、細胞が、足場全体に定植し、足場の深さにわたって均質に分布していることを示している。
【０１９３】
ｈ）細胞の取込み
標準条件または骨形成条件下のいずれかで２８日間培養した後、播種した足場を、２．５％グルタルアルデヒドで固定した。１時間の１％四酸化オスミウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）による固定の前後に、試料を０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液で洗浄した。この後、等級シリーズのＩＭＳ（２０％〜６０％）およびエタノール（７０％〜１００％）によって試料を脱水させた。試料を、１００％エタノール中に残し、エタノールを一晩で蒸発させた。乾燥させた細胞化試料および無細胞試料をスタブにマウントし、炭素コーティングし（Ａｇａｒ  Ａｕｔｏ  Ｓｐｕｔｔｅｒ  Ｃｏａｔｅｒ、Ａｇａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＳＥＭ顕微鏡（ＦＥＩ  Ｉｎｓｐｅｃｔ  Ｆ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）で観察した。
【０１９４】
結果は、標準培養条件および骨形成培養条件の両方において、細胞がＣａＰ−ＳＭ足場に取り込まれたことを示した（図１９）。細胞は、相互接続した細胞の層を形成し、その一部の領域が、足場内に埋め込まれていることが分かる。すべての試料で、一部の細胞質突起が見られる。これらの結果は、ＣａＰ−ＳＭ足場の良好な細胞特性を実証している。
【０１９５】
ｉ）骨形成分化
足場（対照として使用したＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）、ＣａＰ−ＳＭ１およびＣａＰ−ＳＭ２）を、既に説明した通り、５ｍｍ×５ｍｍの正方形の小片にカットし、滅菌し、１×１０５個のＭＣ３Ｔ３−Ｅ１を播種し、標準培地および骨形成培地の両方で培養した。
【０１９６】
非コラーゲン性マトリックスの堆積を、パラフィン包埋切片のオステオポンチン免疫染色によって評価した。簡潔には、抗原回復を、熱媒介性抗原回復によって、ｐＨ６のクエン酸ナトリウム緩衝液を使用して実施した。抗原が回復した後、切片を、５％ウシ血清アルブミンを使用して３５℃で１時間ブロックし、一次抗オステオポンチン抗体（１：５０、ａｂｃａｍ  ａｂ８４４８）で４℃において一晩染色した。この後、切片を、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５４６二次抗体を使用して室温で２時間染色した。次に、切片を洗浄し、ＤＡＰＩをベースとするマウンティング培地でマウントし、カバースリップを乗せ、Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＲＥ２共焦点顕微鏡を使用して可視化した。
【０１９７】
鉱物化を、既に説明した通りＶｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色によって評価した。
【０１９８】
骨の細胞外マトリックス中に存在するタンパク質であるオステオポンチンの免疫染色は、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１が、ＣａＰ−ＳＭ１およびＣａＰ−ＳＭ２足場において骨形成経路に分化したことを示した（図２０、ここで赤色蛍光はオステオポンチンの存在を示しているが、これは、白黒バージョンの図では容易に観測することができない）。予想通り、骨形成条件下で培養した試料では、より多くの分化が観測された。Ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色は、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）対照と比較して、播種したＣａＰ−ＳＭ足場において鉱物が広範に堆積したことを示した（図２１）。
【０１９９】
これらの結果は、ＣａＰ−ＳＭ足場中に存在するＣａＰ鉱物堆積物が、骨形成経路への骨前駆細胞の分化を促進することを示している。
【０２００】
ｊ）血管新生
足場の潜在的な血管新生促進可能性を、ｅｘ  ｏｖｏ絨毛性尿膜（ＣＡＭ）アッセイを使用して評価した。足場（対照として使用したＳｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）、ＣａＰ−ＳＭ１およびＣａＰ−ＳＭ２）を、５ｍｍ×５ｍｍの正方形の小片にカットし、７０％ＩＭＳで滅菌し、ＰＢＳで３回洗浄した。陰性および陽性対照を、足場と平行に実施した。濾紙に、ＰＢＳ（陰性）または１０ｎｇ／ｍｌの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）溶液（陽性）のいずれかを浸み込ませた。ニワトリの有精卵を、３７．５℃、３％ＣＯ２でインキュベートし、湿度を３５％〜４５％の間に維持した。インキュベーション後３日目に、胚を、湿度７５〜８０％およびインキュベーション温度３７．５℃で、卵殻を含まない培養系に移した。卵殻なしの培養時間が経過して６日目に、足場を、成長しているＣＡＭ上に適用した。すべての足場の血管新生を、立体顕微鏡を使用して写真を撮影することによって巨視的に調査した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、巨視的写真を分析し、足場ごとの血管面積の百分率を算出した。
【０２０１】
ＣＡＭアッセイから得られた結果（図２２）は、ＣａＰ−ＳＭ１およびＣａＰ−ＳＭ２足場が、Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）足場と非常に類似した、潜在的な血管新生促進可能性を有していることを示した。Ｓｍａｒｔ  Ｍａｔｒｉｘ（登録商標）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで血管新生を促進することが示されており、したがって結果は、ＣａＰ−ＳＭ１およびＣａＰ−ＳＭ２足場が、ＣａＰ鉱物相を添加した後、この潜在的な血管新生促進可能性を保持するはずであることを示唆している。
【０２０２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
2019529022.tif 000010
【図７】
2019529022.tif 000011
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2019529022.tif 000016
【図１３】
2019529022.tif 000017
【図１４】
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【図１５】
2019529022.tif 000019
【図１６】
2019529022.tif 000020
【図１７】
2019529022.tif 000021
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2019529022.tif 000024
【図２１】
2019529022.tif 000025
【図２２】
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【国際調査報告】
2019529022.tif 000027
2019529022.tif 000028
2019529022.tif 000029