(57)【要約】  サンプル中のフラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体の検出方法であって、以下のステップ：（ａ）サンプルを、固定されたＩｇＭ結合分子を備えた固体支持体と接触させること、（ｂ）サンプル中のＩｇＭ抗体を、該ＩｇＭ抗体も固体支持体上に固定されるように、固体支持体上のＩｇＭ結合分子に結合させること、ならびに（ｃ）以下の：（ｉ）可溶性フラビウイルスタンパク質Ｅ（ｓＥ）の逆平行二量体、および（ｉｉ）マーカー、を含む複合体を結合させ、そして、該マーカーを検出することによって特異的なフラビウイルスＩｇＭ抗体への該複合体の結合を同定することによって、フラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体を検出すること、を含む方法；ならびに該方法をおこなうのに好適なキットを開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のフラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体の検出方法であって、以下のステップ：
（ａ）サンプルを、固定されたＩｇＭ結合分子を備えた固体支持体と接触させること、
（ｂ）サンプル中のＩｇＭ抗体を、該ＩｇＭ抗体も固体支持体上に固定されるように、固体支持体上のＩｇＭ結合分子に結合させること、ならびに
（ｃ）以下の：
（ｉ）可溶性フラビウイルスタンパク質Ｅ（ｓＥ）の逆平行二量体、および
（ｉｉ）マーカー、
を含む複合体を結合させ、そして、該マーカーを検出することによって特異的なフラビウイルスＩｇＭ抗体への該複合体の結合を同定することによって、フラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体を検出すること、
を含む方法。
【請求項２】
サンプル中のフラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体の検出方法であって、以下のステップ：
（ａ）サンプルを、固定されたＩｇＭ結合分子を備えた固体支持体と接触させること、
（ｂ）サンプル中のＩｇＭ抗体を、該ＩｇＭ抗体も固体支持体上に固定されるように、固体支持体上のＩｇＭ結合分子に結合させること、ならびに
（ｃ）可溶性フラビウイルスタンパク質Ｅ（ｓＥ）の逆平行二量体とマーカーを、該ｓＥ二量体およびマーカーを含む複合体の形成のためにあらかじめ混合すること、ならびに
（ｄ）あらかじめ形成しておいた複合体を結合させ、そして、該マーカーを検出することにより特異的フラビウイルスＩｇＭ抗体への該複合体の結合を同定することによって、フラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体を検出すること、
を含む方法。
【請求項３】
前記ＩｇＭ結合分子が、抗ＩｇＭ抗体またはそのＩｇＭ結合断片である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記フラビウイルスが、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、特にＤＥＮＶ血清型１（ＤＥＮ１）、ＤＥＮＶ血清型２（ＤＥＮ２）、ＤＥＮＶ血清型３（ＤＥＮ３）、およびＤＥＮＶ血清型４（ＤＥＮ４）、ならびにジカウイルス（ＺＶ）の群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが、血清もしくは血漿サンプル、または脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ｓＥの逆平行二量体がタグを含み、ここで、該タグがｓＥの逆平行二量体にマーカーを連結し、ここで、該タグが、好ましくはＳｔｒｅｐ−タグまたはＨｉｓ−タグから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記マーカーが、親和性マーカー、蛍光マーカー、放射性マーカー、核酸マーカー、発色性マーカー、発光マーカー、磁気マーカー、またはその組み合わせから選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記複合体が、標識抗体、特にｓＥの逆平行二量体のタグに特異的である抗体；Ｓｔｒｅｐ−タグ結合タンパク質、特に請求項７に記載のマーカーを含むＳｔｒｅｐ−タグ結合タンパク質を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記固体支持体が、マイクロタイタープレートまたは他のプラスチックコンテナもしくは平面、生物学的マイクロチップ、ビーズ、ディスク、磁性粒子、ファイバー光学センサ、ガラススライド、あるいは膜、好ましくはニトロセルロース膜、ポリテトラフルオロエチレン膜、セルロースアセテート膜またはセルロースニトラート膜である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記マーカーの検出が、更なる物質の添加を含み、それによって、シグナルを生じることとなるか、またはマーカーを活性化してシグナルを誘発し、そしてそのシグナルを計測することとなる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
対照として、重要なヒト病原性フラビウイルスの遠縁にあたるフラビウイルスのｓＥ、好ましくはリオブラボー（Rio Bravo）、モドック（Modoc）、ヨコセ（Yokose）、エンテベコウモリ（Entebbe bat）、バルケドジ（Barkedji）、またはランミ（Lammi）ウイルスのｓＥ、特にリオブラボーウイルスのｓＥが適用される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が自動化システムで行われる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法をおこなうためのキットであって：
−固定されたＩｇＭ結合分子を含む固体支持体、および
−以下の
（ｉ）可溶性フラビウイルスタンパク質Ｅ（ｓＥ）の逆平行二量体、および
（ｉｉ）マーカー、
を含む複合体、
を含むキット。
【請求項１４】
マーカーを検出する手段、好ましくは親和性マーカー、蛍光マーカー、放射性マーカー、発色性マーカー、発光マーカー、または磁気マーカーを検出する手段を更に含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記キットが、自動検出システムを更に含み、好ましくは、サンプル輸送デバイス、検出デバイス、コンピューター処理ユニットおよび／またはコンピューター処理ユニットで実行されたコンピューターソフトウェアプログラムによって処理された、検出ユニットからのシグナルを表示するためのディスプレイを含む、請求項１３または１４に記載のキット。
【請求項１６】
少なくとも前記の固体支持体および／または複合体および／またはｓＥおよびマーカーが、無菌のラップの中、好ましくは無菌の透明プラスチックラップの中に包装される、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サンプル中のフラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
フラビウイルス感染は、ヒトの健康にとって世界的に重要なものであり、−ジカウイルス、デング熱ウイルスおよび西ナイルウイルスの蔓延が例証するように−高まる脅威をもたらす。最近のフラビウイルス感染の血清学的診断法は、高感度を有する特異的ＩｇＭ抗体を検出する免疫学的アッセイを必要とする。異なった方法で設計された様々なアッセイ形式、例えば：ａ）間接ＥＬＩＳＡ、ここで、固相（例えば、マイクロタイタープレート）に直接取り付けられたフラビウイルス抗原が、患者の血清と共にインキュベートされ、かつ、ここで、固定された抗原に結合するＩｇＭ抗体が、抗ヒトＩｇＭ抗体を使用することによって検出される；ｂ）Ｍ−抗体捕捉（ＭＡＣ）ＥＬＩＳＡ、ここで、固相が抗ヒトＩｇＭ抗体でコートされ、かつ、患者の血清と共にインキュベートされ、およびここで、特異的ＩｇＭの検出が、それぞれのフラビウイルス抗原を使用することによって行われる（ＷＯ２０１１／００４３２４Ａｌ、ＷＯ２０１６／０２２０７１Ａｌ）、がこの目的のために使用されている。
【０００３】
フラビウイルス免疫化後のＩｇＧ抗体の検出のための間接ＥＬＩＳＡは、例えば、ＷＯ９９／０６０６８Ａ２に記載されている。そこに記載されたアッセイは、フラビウイルスに対するＩｇＧ抗体の検出のための固定抗原として短縮型デング熱エンベロープタンパク質の二量体型を使用する。
【０００４】
間接ＥＬＩＳＡと比較したＭＡＣ ＥＬＩＳＡの利点は、リウマチ因子および他の非特異的反応との起こり得る干渉、ならびに同じ試験形式の中の抗原の互換性の最小限化である。
【０００５】
これは、Van Loonら（J. Clin. Microbiol. 13(1981): 416-422）およびVan Loonら（J. Clin. Microbiol. 17(1983): 997-1004）で明らかにされ、ここで、トキソプラズマ感染またはサイトメガロウイルス感染それぞれの診断のための直接ＭＡＣ ＥＬＩＳＡの性能が間接ＥＬＩＳＡと比較された。斯かる比較はまた、Heinzら（J. Clin. Microbiol. 14 (1981): 141-146）で開示され、そして彼は、血清および脳脊髄液中のダニ媒介性脳炎ウイルスに対するＩｇＭ抗体の検出のためのＭＡＣ ＥＬＩＳＡが間接ＥＬＩＳＡに比べてより感受性が高いことを確認した。
【０００６】
そのため、この試験形式は、デング熱感染症（Shamala 2015）の血清学的診断の標準的な方法になっており、診断研究室に最小限必要なものとしてＷＨＯによって推奨される（参照：WHO 2009）。ＭＡＣ ＥＬＩＳＡの品質に最も重要な要素は、抗原とその検出方法である。
【０００７】
ヒト患者のフラビウイルス感染の検出のための試験システムは、Revetzら（Clin. Biochem. 42 (2009), 180-184）、ＷＯ９９／０９４１４Ａ１、ＷＯ２００８／１５２５２８Ａ２、およびＥＰ２９８００９９Ａ１で更に開示される。
【０００８】
フラビウイルス中和抗体の主な対象は、フラビウイルスエンベロープタンパク質Ｅであり、そしてそれは、３つのドメイン（ＤＩ（Ｄ１）、ＤＩＩ、ＤＩＩＩ）から成る。フラビウイルス中和活性が、Ｅタンパク質のドメインのＤＩおよびＤＩＩ、またはＥ二量体構造を対象とした抗体によって主に駆動されることがわかった（Jarmer et al., J. Virol. 88 (2014): 13845-13857）。別の試験では、ビリオン表面に提示されたＥタンパク質の複合四級エピトープを対象とした抗体に対する黄熱（ＹＦ）ワクチン接種によりフラビウイルス中和活性が付与された（Vratskikh et al., Plos Pathogens 9 (2013): e1003458）。
【０００９】
Vogtら（J. Virol. 83(2009): 6494-6507）は、２つの西ナイルウイルス（ＷＮＶ）特異的ヒトモノクローナル抗体を特徴づけし、そして、それらの中和活性が、Ｅタンパク質のＤＩＩの二量体界面、ならびにＤＩとＤＩＩとの間のヒンジにおける突然変異によって変更される場合があることが開示された。
【００１０】
結果として、Ｅタンパク質の異なった組換え型で構成された多くの免疫組成物が、フラビウイルスワクチンのために開発された（例えば、ＷＯ２００４／０５２２９３Ａ２、ＷＯ２００６／１１５５４８Ａ２、ＷＯ２０１６／０１２８００Ａ１）。
【００１１】
これらの試験がフラビウイルスＥタンパク質に対するヒトＩｇＧ応答を規定するために重要なものである一方、それらは、感染症ですぐに産生されるＩｇＭ抗体の検出によるフラビウイルス感染の血清学的診断法に関係しない。
【発明の概要】
【００１２】
そのため、本発明の目的は、特に、最近のフラビウイルス感染の検出用のフラビウイルス特異的ＩｇＭ抗体の検出のための改良されたＭＡＣ ＥＬＩＳＡを提供するために、患者サンプル中のフラビウイルス特異的ＩｇＭの検出に有利な方法を提供することである。
【００１３】
そのため、本発明は、サンプル中のフラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体の検出方法であって、以下のステップ：
（ａ）サンプルを、固定されたＩｇＭ結合分子を備えた固体支持体と接触させること、
（ｂ）サンプル中のＩｇＭ抗体を、該ＩｇＭ抗体も固体支持体上に固定されるように、固体支持体上のＩｇＭ結合分子に結合させること、ならびに
（ｃ）以下の：
（ｉ）可溶性フラビウイルスタンパク質Ｅ（ｓＥ）の逆平行二量体、および
（ｉｉ）マーカー、
を含む複合体を結合させ、そして、該マーカーを検出することによって特異的なフラビウイルスＩｇＭ抗体への該複合体の結合を同定することによって、フラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体を検出すること、
を含む方法を開示する。
【００１４】
本発明は更に、サンプル中のフラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体の検出方法であって、以下のステップ：
（ａ）サンプルを、固定されたＩｇＭ結合分子を備えた固体支持体と接触させること、
（ｂ）サンプル中のＩｇＭ抗体を、該ＩｇＭ抗体も固体支持体上に固定されるように、固体支持体上のＩｇＭ結合分子に結合させること、ならびに
（ｃ）可溶性フラビウイルスタンパク質Ｅ（ｓＥ）の逆平行二量体とマーカーを、該ｓＥ二量体およびマーカーを含む複合体の形成のためにあらかじめ混合すること、ならびに
（ｄ）あらかじめ形成しておいた複合体を結合させ、そして、該マーカーを検出することにより特異的フラビウイルスＩｇＭ抗体への該複合体の結合を同定することによって、フラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体を検出すること、
を含む方法を開示する。
【００１５】
そのため、本発明は、特にＭＡＣ ＥＬＩＳＡ試験形式に好適な新しい検出システムを提供する。フラビウイルスＭＡＣ ＥＬＩＳＡに限り使用される抗原としては、酵素反応を介したウイルス特異抗体による更なるステップにおいて検出される、ウイルス調製物または組換えにより作製されたウイルス様粒子が挙げられる。一方で、ウイルス調製物の製造は、高度な感染性物質−多くの場合、生物学的安全性レベル３のもの−の取り扱い、および商業用途のためのそれらの不活性化を必要とし；その一方で、ウイルス様粒子は、比較的高価であり、精製、製造および標準化するのが難しい。
【００１６】
ＭＡＣ ＥＬＩＳＡ形式は、本発明による方法および試験システムの特に好ましい形式である。ＩｇＭ試験は、フラビウイルス感染の診断にとって一般的に重要なものである、なぜなら、（例えば、ＰＣＲによる）ウイルスの直接検出は、感染症後の短い時間域だけで可能であり、多くの場合、臨床症状の存在にもかかわらず、それまでに陰性になる。渡航医学との関連において、ウイルスは、フラビウイルス風土病地域への旅行から戻ったときに稀にしか検出可能にならない。従って、血清学、特にＩｇＭ検出は、フラビウイルス診断のために非常に重要である。
【００１７】
最も重要なヒト病原性フラビウイルスの一つは、熱帯および亜熱帯地域で同時に広がるデングウイルス（血清型１〜４）および急速に蔓延するジカウイルスである。これらの地域は人気がある観光客の目的地であるので、これらの感染症を識別する確実な検査は、風土病地域において非常に重要であるだけではなく、旅行者の自国においても非常に重要である。
【００１８】
フラビウイルスＩｇＭを検出するためのＭＡＣ ＥＬＩＳＡ形式の存在との比較において、本発明による診断検査システムは、いくつかの利点を有する：本発明によるアッセイには、フラビウイルスＩｇＭ抗体、特にデングウイルス、ジカウイルス、ダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、の高度に特異的な検出に関して優れた適合性がある。一連の本発明で得られるデータもまた、この試験がジカウイルスの感染症とデングウイルスの感染症との間を完全に識別し得るだけでなく、デングウイルス感染（血清型１〜４）の血清型特異的診断にも好適であることも示す。加えて、本発明による方法はまた、例えば、デング熱ウイルスおよびジカウイルスの、重複感染の検出も可能であった。
【００１９】
そのうえ、当該試験システムの安定性およびその要素（特にｓＥ二量体とマーカーを含む複合体）の信頼できる規定のため、本発明による試験システムは、効果的および確実に標準化できる。特に、ウイルス特異抗原（可溶性Ｅタンパク質）は、大量に、かつ、高度に精製された形態で、組換えにより作製できる。ｓＥの製造のために、（例えば、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、ショウジョウバエ（Drosophila）細胞またはバキュロウイルスベースの発現系における）ｓＥの天然の折り畳みを可能にする任意の組換えシステムが好適である。また、他の要素が商業的に購入されてもよい。
【００２０】
それとは対照的に、現在市販の同等の試験システムは、非活化ウイルス、感染細胞溶解物または組換えにより作製されたウイルス様粒子を使用する。非活化ウイルスまたは細胞溶解物の主な不都合は、それらが、ヒトにとって高病原性であるウイルスの取り扱いを必要とする点である。ウイルス様粒子（ＶＬＰ、ＲＳＰ、組換えｐｒＭ−Ｅ抗原）の主な不都合は、（１）（組換え製造は可能であるが）抗原精製のための比較的簡単なアプローチがないことであるが；しかしながら、これらの抗原は未精製の細胞培養上清として使用され、そしてそれには、追加試薬および追加試験ステップ（すなわち、ウイルス特異抗体および対応する抗体検出試薬）を必要とする、および各ウイルス検査（デング熱、ジカ、ＴＢＥなど）のために、特異的抗体が必要であるという不都合があり；（２）ウイルス様粒子は、脂質膜を含有し、そのため、本来、不安定性の傾向があり、そのため、（本発明による試験における非常に安定した可溶抗原とは対照的に）保管問題があり；（３）Ｅタンパク質が脂質膜にアンカーされている粒子が、ｐＨ感応性であり；実際には、酸性ｐＨ値では、粒子表面のＥタンパク質は、完全に別の形状へと折り畳み直され、そしてそれが、粒子の凝集につながり；従って、ＶＬＰなどの抗原の粒子形態は、非常に繊細な診断抗原である。
【００２１】
フラビウイルスに感染したか、またはワクチン接種した患者の血清中の抗体集団が、フラビウイルスＥタンパク質のドメインＤＩおよび／またはＤＩＩの複合エピトープを対象としたＩｇＧ抗体から主に構成されているという知見（Jarmer et al., J. Virol. 88 (2014): 13845-13857; Vratskikh et al., Plos Pathogens 9 (2013): e1003458; Vogt et al. J. Virol. 83(2009): 6494-6507）は、改良された免疫化プロトコールおよび抗体検出アッセイの開発の発端となる。
【００２２】
従って、ＷＯ９９／０６０６８Ａ２では、組換え短縮型二量体Ｅタンパク質でマウスを免疫化し、そして、最後の注射の１０日後に血清を分析し、間接ＥＬＩＳＡにおいて抗原として短縮型組換え二量体Ｅタンパク質を使用してＩｇＧ抗体の存在を示し、ならびに抗体（ＰＲＮＴｓ）を中和することから成るプロセスを記載している。対照的に、当該試験システムは、急性フラビウイルス感染の診断のためのＭＡＣ−ＥＬＩＳＡシステムにおけるあらかじめ形成しておいたｓＥ二量体マーカー複合体を提供する。本発明のアッセイの利点は、様々なフラビウイルス感染症の同時鑑別診断のための、ヒト血清中のフラビウイルスＩｇＭ抗体の高度に特異的な検出に現れる。ＭＡＣ−ＥＬＩＳＡアッセイが間接ＥＬＩＳＡより感度が高いことは、従来技術から予想されたが（Van Loon et al. J. Clin. Microbiol. 13(1981): 416-422; Van Loon et al. J. Clin. Microbiol. 17(1983): 997-1004 and Heinz et al. J. Clin. Microbiol. 14 (1981): 141-146）、ｓＥ単独よりむしろ、本発明によるあらかじめ形成しておいたｓＥ二量体マーカー複合体の使用により観察された技術的効果は、驚くべきものであり、疑わしいフラビウイルス感染がある患者により迅速、かつ、確実な試験を提供する（図３および９）。
【００２３】
そのため、本発明は、以下の構成物：逆平行二量体（図１Ｂ）として提供される組換え可溶性フラビウイルスＥタンパク質（ｓＥ；フラビウイルス表面の主成分；図１Ａを参照）、を含む、新規検出システムを提供する。Ｅタンパク質を、別の形態（例えば、ｓＥの単量体形もしくは天然に存在する未成熟または成熟型（例えば、ウイルス粒子全体またはＶＬＰｓ）など）として提供するのではなく、逆平行ｓＥ二量体として提供するのが、本発明のアッセイにとって重要である。好ましくは、ｓＥの逆平行二量体は、（好ましくはカルボキシ末端に）タグを含む。このタグによって、または他の複合体形成部分を用いて、マーカーとの複合体（例えば、酵素標識タンパク質）を形成でき、このあらかじめ形成しておいた複合体は、ＭＡＣ−ＥＬＩＳＡでディテクターとして使用される（図２）。この設定を用いて、フラビウイルスＩｇＭ抗体の検出のための高感度、かつ、特異的な試験が提供される。ａ）Ｅタンパク質の逆平行二量体構造が使用されること（図１Ｂ）、およびｂ）個々の要素の連続した形態ではなく、あらかじめ形成しておいた複合体（図２）が使用されること（図３）は、試験の品質にとって決定的である。そのうえ、固定されたＩｇＭ結合分子によって捕捉されるサンプルのＩｇＭ抗体に加えられるべき複合体をあらかじめ形成しておくために、複数の結合部位を伴ったタンパク質を認識するタグを使用することは、非常に有利である。
【００２４】
一連の本発明でおこなわれる実験（以下の実施例の項を参照；図３および４）は、ａ）組換えＥタンパク質が逆平行二量体としてではなく、単量体として使用された場合（図４Ａ、Ｂ）、およびｂ）抗原が、マーカー（例えば、酵素標識多価タンパク質）を伴ったあらかじめ形成しておいた複合体として提供されずに、連続して使用された場合（図３の破線）、本発明の技術的効果（すなわち、高感度かつ特異的な試験；図３）が達成できなかったことを示した。その一方、本発明の方法およびアッセイシステムの驚くべき有利な性能は、例えば、ＴＢＥに関して、本発明のアッセイシステムが確立された試験システムと比較された図５、ならびに、ＴＢＥウイルス（図５Ａ）、ジカウイルス（図５Ｂ）、およびデングウイルス（図５Ｃ）による最近の感染症の診断における性能が図示されている図６、において示されている。観察された本発明の技術的効果はまた、ｓＥの二量体型を使用した従来のＭＡＣ ＥＬＩＳＡとの比較試験においても示された（図９）。可溶性ｓＥ二量体やマーカーの連続添加（図９、黒色の点線）が、従来のＭＡＣ ＥＬＩＳＡと比較して、より弱い感度をもたらしたのに反して（図９、灰色の実線および破線）、本発明による可溶性ｓＥ二量体およびマーカーを含むあらかじめ形成しておいた複合体の添加は、感度の劇的な増強につながり、そしてそれは、他のすべての形式を著しく上回った（図９、黒色の実線）。
【００２５】
従って、本発明による方法には、固定されたＩｇＭ抗体に、複合体の要素を別々に加えるのではなく、ｓＥの逆平行二量体およびマーカーを含む複合体を加えることが不可欠である。
【００２６】
当該試験システムにおけるｓＥの逆平行二量体に関する条件は、本発明の性能に特に関連するものである。フラビウイルスＥタンパク質は、十分に特徴づけされており、脂質二重膜中のタンパク質をアンカーする膜アンカーにエクトドメインを連結するステムが後に続く、エクトドメインから成る。エクトドメインは、３つのドメイン、ドメインＩ（該ドメイン内に覆われたＮ末端を有する）、ドメインＩＩおよびドメインＩＩＩを含有し、それぞれが、通常オーバーラップしない抗原決定基を含む。膜アンカーには、膜のステム／エクトドメイン側にＣ末端が存在する２つの膜貫通セグメントがある（例えば、２１（ＴＢＥ）、２２（デング）、２３（ジカ）を参照）。多数のフラビウイルスタンパク質Ｅ配列が知られており、かつ、配列データベースで入手可能であって、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）の代表的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ．Ｕ２７４９５で入手可能であり；デングウイルス（ＤＥＮＶ）、特にＤＥＮＶ血清型１（ＤＥＮ１）の代表的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ．ＡＦ２２６６８７で入手可能であり；ＤＥＮＶ血清型２（ＤＥＮ２）の代表的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ．Ｕ８７４１１で入手可能であり；ＤＥＮＶ血清型３（ＤＥＮ３）の代表的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ．ＤＱ８６３６３８で入手可能であり；およびＤＥＮＶ血清型４（ＤＥＮ４）の代表的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ．ＮＣ＿００２６４０で入手可能であり；ならびにジカウイルス（ＺＶ）の代表的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ ｎｏ．ＫＪ７７６７９１で入手可能である（本願で言及したすべての配列データベースエントリ：２０１６年５月２０日による）。
【００２７】
ｓＥは、任意選択でステムドメインの一部または全部を含めたフラビウイルスタンパク質Ｅの完全なエクトドメインを含み、かつ、アンカードメインを欠くことによって規定される。本発明によるｓＥ二量体は、該二量体が、他のサブユニット形状を有する二量体とは対照的に、「頭−尾」凝集（例えば、図１Ｂを参照）でなければならないことを意味する「逆平行」であると規定される。
【００２８】
本発明に使用されるｓＥは、−定義上−「可溶性」タンパク質である。これは、ｓＥが任意の膜アンカーを欠いていることを意味する。従って、ｓＥは、膜貫通セグメントを構成するアミノ酸を欠いている（例えば、ＴＢＥでは、アミノ酸４５４、４５５または４５６で始まり、ＤＥＮ１、２および４では、アミノ酸４５３、４５４または４５５で始まり、ＤＥＮ３では、アミノ酸４５１、４５２または４５３で始まり、およびＺＶでは、アミノ酸４６２、４６３または４６４で始まる）。
【００２９】
本発明のｓＥは、ステム領域の一部、あるいはステム領域全体、例えば、ＴＢＥでは、アミノ酸４００〜４１０からアミノ酸４５４、４５５または４５６の間のアミノ酸、ＤＥＮ１、２および４では、アミノ酸３９９〜４０９からアミノ酸４５３、４５４または４５５の間のアミノ酸、ＤＥＮ３では、アミノ酸３９７〜４０７からアミノ酸４５１、４５２または４５３の間のアミノ酸、ならびにＺＶでは、アミノ酸４０８〜４１８からアミノ酸４６２、４６３または４６４の間のアミノ酸、を含んでもよい。
【００３０】
好ましい実施形態によると、本発明によるｓＥもまた、任意のステム領域配列を欠いている。
【００３１】
本発明によるｓＥタンパク質は、実用的な理由から組換え技術によって提供される。従って、それは、天然のフラビウイルスタンパク質Ｅ配列またはその組み合わせに主にまたは排他的に含まれ（例えば、２以上のフラビウイルスのタンパク質Ｅ配列を含有するキメラＥタンパク質（もちろん、逆平行ｓＥ二量体を依然として形成している））、任意選択で非天然配列が補足されたまたはその中に埋め込まれた（すなわち、天然フラビウイルス中に生じない配列）。そのため、更なる配列を含むことが可能であり、そしてその配列はフラビウイルス起源のものである必要はない。例えば、好ましくはＣ末端にて、ｓＥに尾部を提供することは、特に好ましく、そして、その尾部は、タグとしての機能を果たしてもよい。
【００３２】
タグは、ｓＥの精製に使用されても、ならびに本発明による複合体の形成およびＩｇＭ抗体に結合した後のｓＥ（および全体としての複合体）の検出に使用されてもよい。
【００３３】
ｓＥ配列はまた、例えば、それを製造、精製、取り扱いするのを容易にする、それをより抗原性にする、より反応性にする、その抗原特性を変更する、免疫グロブリンに対するその結合特性を変更するなどのｓＥの特性を改善するために、特異的変更に晒されることもある。また、斯かるｓＥ変異体は、本発明で適用され得るが、もちろん、バリエーションが、本発明に必要とされるかまたは特異的ＩｇＭ結合特性を悪化させる（またはエクトドメイン構造を破壊する）、逆平行二量体構造を形成することができない。
【００３４】
ＩｇＭ結合分子は、それらがサンプル中のＩｇＭ分子を効果的に結合するのに十分に特異的である限り、本発明には重要でない。好ましくは、ＩｇＭ結合分子は、抗ＩｇＭ抗体またはそのＩｇＭ結合断片であり；これらのＩｇＭ結合分子は、フラビウイルスＩｇＭに関する従来技術ＭＡＣ ＥＬＩＳＡにおいて既に首尾よく適用された。また、ＩｇＭへの他の親和性結合剤は、当該技術分野で広く知られており；あるものは、抗体由来または抗体ベースであり、あるものはそうでない。
【００３５】
斯かる商業的に使用されるまたは提案されるＩｇＭ結合分子の例は、抗ＩｇＭ Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子（ａｂｃａｍ製、例えば、ａｂ３６０８８）、Ｃｌｑ（ＵＳ５，０７７，３９１Ａ）、マンナン結合タンパク質（ＵＳ５，１１２，９５２Ａ、例えば、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（登録商標））、マンノース結合タンパク質（２６）、非特異的ＩｇＭ結合ペプチド（ＷＯ９８／２６７９４Ａ１、ＥＰ０７５２４２５Ａ２）、特異的ＩｇＭ結合ペプチド（例えば、ＴｅｃｈｎｏｇｅｎによるＫＡＰＴＩＮ−Ｍ（商標）またはＷＯ２００１／００２００１Ａ１によるペプチド）である。好適なＩｇＭ結合分子の別の例は、ＩｇＭ特異的Ｆｃ受容体、例えば、ＩｇＭ重鎖のためのＦｃ受容体（ＦｃμΙ）、特にＦａｉｍ３／Ｔｏｓｏであり、およびＣＤ３５１（Ｆｃμ／αＲ）でもあり、またはその機能的な断片であり、そしてそれは、好ましくは（ＷＯ２０１６／０５９０１８Ａ１で開示される）Ｆａｉｍ３／ＴｏｓｏのＩｇ様ドメインを含む。アッセイで使用されるべき特異的ＩｇＭ分子は、通常、試験される（単数もしくは複数の）特異的ウイルスの性質、サンプル、およびＩｇＭ結合分子の特異性に基づいて選択されてもよい（例えば、それがＩｇＭとＩｇＧの間の特異的な識別を可能にすること；そのため、好ましいＩｇＭ結合分子が、ＩｇＧよりＩｇＭにより高い親和性を示す分子である、すなわち、ＩｇＧ／ＩｇＭ含有のサンプルからのＩｇＭの選択的結合を可能にする）。抗体由来の足場の技術および抗体由来の結合配列のシャッフルに基づいて特異的ＩｇＭ結合分子を作成するために、様々な技術が利用可能である。
【００３６】
本発明による方法は、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、特にＤＥＮＶ血清型１（ＤＥＮ１）、ＤＥＮＶ血清型２（ＤＥＮ２）、ＤＥＮＶ血清型３（ＤＥＮ３）、およびＤＥＮＶ血清型４（ＤＥＮ４）、ならびにジカウイルス（ＺＶ）に特異的なＩｇＭを検出するのに特に好適である。
【００３７】
本発明による方法は、好ましくは、フラビウイルス特異的ＩｇＭを潜在的に含有することが知られているサンプルに対して行われる。従って、好ましいサンプルは、血液（ヒト血液由来のサンプル）、特に血清または血漿サンプル、ならびに脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプル由来のすべての可能性のあるサンプルである。
【００３８】
本発明の特に好ましい実施形態は、マーカーに結合するタグを備えたｓＥ分子を使用する。従って、ｓＥの逆平行二量体は、好ましくはタグを含み、そしてここで、該タグは、ｓＥの逆平行二量体にマーカーを連結する。好適なタグの例は、例えば、参照文献２４または２５で概説され、そして、ポリーＨｉｓ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、カルモジュリン結合ペプチド、インテイン−キチン結合ドメイン、ストレプトアビジン／ビオチンベースのタグ、Ｈｉｓ−Ｐａｔｃｈ ＴｈｉｏＦｕｓｉｏｎ、タンデムアフィニティータグ、ペプチド／エピトープタグ、レポータータグ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ユビキチン修飾因子、ＨａｌｏＴａｇｓ（登録商標）、Ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ ｅＸａｃｔ（商標）、ＰＤＺドメインベースタグ、ＦＬＡＧ、ｃ−Ｍｙｃ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｔｗｉｎ ＳｔｒｅｐＩＩ、ＭＢＰ、ＧＳＴ、デンプン、フルオロアパタイト、ダイアトマイト、β−ＧＲＰ、ＥＬＰ、ＲＴＸ、ＥＬＫ１６、Ｆｈ８、４ＡａＣｔｅｒ、ＰａｇＰ、ｅＧＦＰ、ヘム、ＰＹＰ、ＮｕｓＡ、ＳＵＭＯ、Ｔｒｘ、ＸＴＥＮ、ＦＡＴＴなど（ｓ.２４、２５）を含む。好ましい実施形態では、タグは、Ｓｔｒｅｐ−タグまたはＨｉｓ−タグである。
【００３９】
当該方法において、ｓＥの逆平行二量体と共に複合体で提供されることができるすべての好適なマーカーが適用できる。好ましくは、ＭＡＣ ＥＬＩＳＡにおいて確立されたすべてのマーカー、特にフラビウイルスＭＡＣ ＥＬＩＳＡで既に適用されたものが好適である。従って、好ましいマーカーは、親和性マーカー、蛍光マーカー、放射性マーカー、核酸マーカー、発色性マーカー、発光マーカー、磁気マーカー、またはその組み合わせから成る群から選択される。例えば、マーカーは、発色体、酵素、触媒、フルオロフォア、金コロイドおよび直接観察するラベルから選択されてもよい。直接観察するラベルの場合、コロイド金属もしくは非金属粒子、発色性粒子、酵素もしくは基質、有機重合体、またはラテックス粒子を使用してもよい。標識としての使用に好適な多数の酵素が、例えば、ＵＳ４,３６６,２４１Ａ；４,８４３,０００Ａおよび４,８４９,３３８Ａに開示されている。本発明における好適な酵素標識としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられ、好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼである。酵素標識は、単独または第二の酵素と組み合わせて使用されてもよく、そしてそれは、溶液である。本発明では、二次抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼに取り付けられ、そして次に、その基質ＤＡＢと反応させ、そして、目視により検出可能な色変化を生じ、好ましくは複合体の検出を実現する。ビオチン化のような他の標識化方法、または例えばＦＩＴＣ、ＰＥもしくは蛍光タンパク質などの蛍光部分を用いた標識もまた使用され得る。その後、二次、標識抗体、好ましくはモノクローナルもまた、免疫複合体を検出および定量化するために使用され得る。標識がビオチンであれば、検出は、更なるステップでアビジンまたはストレプトアビジン標識酵素を加えることによって行われ得る。最先端で知られているとおり、酵素の基質の添加は、標識の定量化、そしてその結果として、免疫複合体化形態の抗体の定量化を可能にする。
【００４０】
好ましい実施形態では、本発明による方法で使用される複合体は、標識抗体、特にｓＥの逆平行二量体のタグに特異的である抗体；Ｓｔｒｅｐ−タグ結合タンパク質、特に先に触れたマーカーを含むＳｔｒｅｐ−タグ結合タンパク質、を含む。
【００４１】
当該方法で使用される固体支持体は、（１）ＩｇＭ結合分子の結合および（２）固体表面に結合したＩｇＭ結合分子へのサンプル中のＩｇＭの結合、を可能にする任意の好適な固体支持体であり得る。固体支持体はまた、複合体への結合の際に固定されたサンプルＩｇＭの適切な取り扱い、および固定されたＩｇＭへの複合体の結合事象の検出を可能にすべきである。そのため、固体支持体は、好ましくはＥＬＩＳＡ、特にＭＡＣ ＥＬＩＳＡで既に使用される材料である。そのため、好ましい固体支持体は、マイクロタイタープレート、生物学的マイクロチップ、ビーズ、ディスク、磁性粒子、または他のプラスチックコンテナもしくは平面、ファイバー光学センサ、ガラススライド、あるいは膜、好ましくはニトロセルロース膜、ポリテトラフルオロエチレン膜、セルロースアセテート膜またはセルロースニトラート膜である。好ましくは、本発明による方法は、自動化システムで行われる。従って、自動検出システムについて確立されたまたは好適なすべての固体支持体が、本発明による方法に適用され得る。例えば、本発明により設定された方法および試験は、既に存在している、市販の自動化システム、例えばＡｒｃｈｉｔｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Abbott）；Ｖｉｄａｓ Ｉｍｍｕｎｏａｎａｌｙｚｅｒ（Biomerieux）；Ｃｏｂａｓ ａｎｄ Ｅｌｅｃｓｙｓ ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ−Ａｎａｌｙｚｅｒｓ（Roche Diagnostics）；Ｌｉａｉｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Diasorin）；Ｅｕｒｏｉｍｍｕｎ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ（Euroimmun）などを容易に適合させ得る。
【００４２】
マーカーの性質によって、当該方法において、最終的にマーカーを検出するために更なる物質を加える必要があってもよい。更なる物質の添加は、それによって、シグナルを生じることとなるか、またはマーカーを活性化し、それによって、検出可能なシグナルを生じる（または次にシグナルの作成を受ける別のマーカーを作り出す）。次に、このシグナルは、最終的に検出されても、および計測されて、検出されてもよく、そして、結局、固体表面上のＩｇＭ結合分子に結合したフラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体の量を定量化されてもよい。次に、これは、フラビウイルス特異的ＩｇＭがサンプル中に含有されているか否か（そして、含有されている場合には、その量）の結論を可能にする。次に、これは、このサンプルが採取されたヒトがフラビウイルス感染に罹患しているか否か示唆している。
【００４３】
当該アッセイ設定を用いることで、異なるフラビウイルス感染を識別すること、ならびにデング熱血清型を識別すること、および異なるフラビウイルスの多重感染を検出することさえも可能である。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態によると、方法は、幅広いフラビウイルス交差反応性抗体を測定するための対照として、重要なヒト病原性フラビウイルスの遠縁にあたるフラビウイルス（例えばリオブラボー（Rio Bravo）、モドック（Modoc）、ヨコセ（Yokose）、エンテベコウモリ（Entebbe bat）、バルケドジ（Barkedji）、ランミ（Lammi）ウイルスなど）のｓＥを適用する。斯かる対照ｓＥの特に好ましい例は、リオブラボーウイルスのｓＥである。斯かるｓＥを使用することは、幅広い交差反応性抗体の特異的バックグラウンドを制御するために本発明による方法を最適化するのに有利である。「幅広い」（フラビウイルス）交差反応性抗体という用語は、全てのまたは大部分のフラビウイルスに対して交差反応性であり、例えばデング熱血清型の間で、交差反応性である抗体などの「血清型群交差反応性抗体」とは区別される。リオブラボーウイルスｓＥを用いることで、非特異的バックグラウンドが測定できる（そして、全体の結果から差引かれる）だけではなく、幅広いフラビウイルス交差反応性抗体の特異的なバックグラウンドもまた測定できる。
【００４５】
別の態様によると、本発明は、本発明による方法をおこなうのに好適なキットに関する。本発明によるこのキットは：
−固定されたＩｇＭ結合分子を含む固体支持体、および
−以下の
（ｉ）可溶性フラビウイルスタンパク質Ｅ（ｓＥ）の逆平行二量体、および
（ｉｉ）マーカー、
を含む複合体、
を含む。
【００４６】
本発明によるキットは、好ましくは、マーカーを検出する手段、好ましくは親和性マーカー、蛍光マーカー、放射性マーカー、発色性マーカー、発光マーカー、または磁気マーカーを検出する手段を更に含んでもよい。
【００４７】
好ましくは、本発明のキットは、サンプルまたはサンプルを含有するコンテナ、および／またはフラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体を含む標準を更に含む。
【００４８】
すでに前述したとおり、幅広いフラビウイルス交差反応性抗体の特異的なバックグラウンドを測定するための重要なヒト病原性フラビウイルスにわずかに関係するリオブラボーウイルスまたは別のフラビウイルスからのｓＥを用いた当該方法をおこなうことは有利である。従って、本発明によるキットは、好ましくは、斯かるｓＥまたは斯かるｓＥを含む複合体を含む。
【００４９】
本発明による方法は、自動化システムとして好ましくは実施される。従って、本発明によるキットはまた、好ましくは、斯かる自動検出をおこなう際に必要であるか、または役立つ要素も含む。好ましい実施形態によると、当該キットは、自動検出システムを更に含み、好ましくは、サンプル輸送デバイス、検出デバイス、コンピューター処理ユニットおよび／またはコンピューター処理ユニットで実行されたコンピューターソフトウェアプログラムによって処理された、検出ユニットからのシグナルを表示するためのディスプレイを含む。
【００５０】
斯かる自動化システムの特に好ましい要素は、例えば、先に言及したＡｒｃｈｉｔｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Abbott）；Ｖｉｄａｓ Ｉｍｍｕｎｏａｎａｌｙｚｅｒ（Biomerieux）；Ｃｏｂａｓ ａｎｄ Ｅｌｅｃｓｙｓ ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ−Ａｎａｌｙｚｅｒｓ（Roche Diagnostics）；Ｌｉａｉｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Diasorin）；Ｅｕｒｏｉｍｍｕｎ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ（Euroimmun）などの市販の自動化システムの一部に既に存在するものである。
【００５１】
キットは、すぐに使用できるキットとしての商業的設定で提供されてもよい。好ましくは、キットの要素は、無菌のラップの中、好ましくは無菌の透明プラスチックラップの中に梱包される。要素は、あらかじめ滅菌されていても、無菌製造手段によって提供されても、または生産工程の最後に、すなわち、最終的な包装のためにキットの要素を包んだ後でさえ、滅菌されてもよい。キットは、取扱説明書を伴った好適な製品リーフレットが添付されていてもよく、最終的に販売用の製品ボックス（例えば、密閉製品ボックス）で提供される。キットが自動化システムとして販売される場合、通常、システム全体が無菌包装される要求はない。従って、無菌のラップの中、好ましくは無菌の透明プラスチックラップの中に包装された、少なくとも固体支持体および／または複合体および／またはｓＥおよびマーカーを提供することが好ましい。
【００５２】
本発明は、それに限定されるものではないが、以下の実施例および図面によって更に開示される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明に使用される抗原の例示；Ａ：未成熟（左）形態および成熟（右）形態のフラビウイルス粒子の略図。ウイルスタンパク質：Ｅ−エンベロープ；ｐｒＭ−膜タンパク質の前駆体；Ｍ−膜タンパク質；Ｃ−カプシドタンパク質；ｓＥ−いわゆる「ステム」および膜貫通アンカーを欠くＥのＣ末端が短縮された可溶型。Ｂ：ダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ）ウイルスｓＥの結晶構造のリボンダイヤグラム。上のパネル：上面図（このタンパク質の逆平行二量体構造を示す）；下のパネル：側面図。３つのｓＥドメインの色分け：ドメインＩ（ＤＩ）−赤色；ドメインＩＩ（ＤＩＩ）−黄色；ドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）−青色。３つのｓＥドメインの色分け：ドメインＩ（ＤＩ）−灰色；ドメインＩＩ（ＤＩＩ）−明灰色；ドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）−暗灰色。Ｃ：それらの側面図における、Ｅの単量体の可溶型のリボンダイヤグラム（第１パネル：ｓＥ単量体（ＴＢＥ）；第２パネル：ｓＥΔＦＰ（アミノ酸９８〜１１１がＧＧＧＧ−リンカーによって置換されたＴＢＥ ｓＥ単量体）；第３パネル：ＤＩ＋ＤＩＩ単量体（ＴＢＥ）；第４パネル：ｐｒ＋ｓＥ単量体（ＤＥＮ２）、ＦＰ−融合ペプチド）。
【図２】本発明における試験原理の略図；本発明に使用したＭＡＣ（ＩｇＭ抗体捕捉）ＥＬＩＳＡ形式；ＨＲＰ−西洋ワサビペルオキシダーゼ。
【図３】３つの別々のＭＡＣ ＥＬＩＳＡにおける最近のヒトＴＢＥウイルス感染の血清プールの滴定曲線。黒色の実線：本発明によるアッセイ。灰色の実線：参照文献（４）、（１７）による従来のアッセイ。黒色の点線：本発明によるが、ディテクター成分の連続添加を用いたアッセイ。
【図４】ディテクター複合体に単量体および二量体Ｅ抗原を使用するＭＡＣ ＥＬＩＳＡ。Ａ：最近のヒトＴＢＥウイルス感染の血清プールの１：１００希釈物を、ディテクター複合体の抗原としてＴＢＥ ｓＥ二量体（黒色の棒）、ＴＢＥ ｓＥΔＦＰ、ＴＢＥ ＤＩ＋ＩＩおよびＴＢＥ ｐｒ−ｓＥ（灰色網掛けの棒）を使用した本発明のアッセイで分析した。Ｂ：最近のヒトＷＮウイルス感染からの４つの血清サンプルを、抗原（灰色の棒）として精製された全ＷＮウイルス粒子を使用したＭＡＣ ＥＬＩＳＡと比較して、ディテクター複合体に単量体ＷＮ ｓＥ（黒色の棒）を使用する本発明のアッセイ形式において１：１００の希釈にて分析した。ＨＲＰ−西洋ワサビペルオキシダーゼ；ｍａｂ−モノクローナル抗体。
【図５】任意の単位で表した、精製された感染ＴＢＥウイルス（白抜き四角形）を使用した従来のＭＡＣ ＥＬＩＳＡと比較した、本発明のアッセイ（黒色の点）における、最近のＴＢＥウイルス感染からの３１個のヒト血清サンプルのＴＢＥ ＩｇＭ測定の結果。Ｎｓ−有意ではない。バーは、平均＋／−９５％信頼区間を示す。血清希釈−１：１０００。
【図６】ＴＢＥ、ジカ、ＷＮ、およびＤＥＮ４ウイルスからの組換えｓＥタンパク質のオリゴマー構造の実証。ＤＭＳを用いた化学的架橋（＋）後の、およびそれなし（−）の組換えｓＥタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。クマシーブルーでの染色。
【図７】Ｘ軸に示したフラビウイルスｓＥ抗原のパネルを用いた、本発明のアッセイを使用した最近のフラビウイルス感染の血清サンプルの分析の結果。Ａ：ＴＢＥウイルス感染；Ｂ：ジカウイルス感染；Ｃ：デング２型ウイルス感染；Ｄ：デング熱３型ウイルス感染；Ｅ：ジカおよびデング２型ウイルス二重感染；Ｆ：デング熱３型ウイルス感染。血清希釈−１：１００。
【図８】Ｘ軸に示したデング熱血清型１〜４ｓＥ抗原を用いた、本発明のアッセイを使用した最近のデング熱感染の血清サンプルの分析の結果。Ａ：デング１型ウイルス感染；Ｂ：デング２型ウイルス感染；Ｃ：デング３型ウイルス感染；Ｄ：デング熱４型ウイルス感染。血清希釈−１：１００。
【図９】４つ別々のＭＡＣ ＥＬＩＳＡにおける最近のヒトＴＢＥウイルス感染の血清プールの滴定曲線。黒色の実線：本発明によるアッセイ。黒色の点線：本発明によるが、ディテクター成分の連続添加を用いたアッセイ。灰色の実線：本発明の複合体中と同じ組換えｓｔｒｅｐ−タグｓＥを使用しているが、検出のためにビオチン標識Ｅタンパク質特異的モノクローナル抗体（ｍａｂ）およびストレプトアビジン−ＨＲＰを使用した、従来のＴＢＥ ＭＡＣ ＥＬＩＳＡ。灰色の破線：検出のために、タグ無しｓＥ二量体（精製したＴＢＥウイルスから単離した、Heinz et al. 1991, J Virol 65 (10):5579-5583）、ならびにビオチン標識Ｅタンパク質特異的モノクローナル抗体（ｍａｂ）およびストレプトアビジン−ＨＲＰを使用した従来のＴＢＥ ＭＡＣ ＥＬＩＳＡ。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
略語：
ＤＩ、ＩＩ、ＩＩＩ      ドメインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ
ＤＥＮ                  デング熱
ＤＭＳ                  スベルイミノ酸ジメチル
ＥＬＩＳＡ              酵素結合免疫吸着測定法
ＦＰ                    融合ペプチド
ＨＲＰ                  西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＪＥ                    日本脳炎
ＭＡＣ ＥＬＩＳＡ      ＩｇＭ抗体捕捉ＥＬＩＳＡ
ＰＢＳ                  リン酸緩衝生理食塩水
ＲＢ                    リオブラボー
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ        ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ｓＥ                    可溶性Ｅ
ＴＢＥ                  ダニ媒介性脳炎
ＷＮ                    西ナイル熱
【実施例】
【００５５】
材料と方法
ヒト血清サンプル
患者の血清サンプルを、ウィーン医科大学ウイルス学部に送り、−２０℃にて保存した。
【００５６】
ウイルス製造と不活性化
ウイルス製造を、実質的に、参照文献（３、１９）に記載のとおり実施した。要するに、ニワトリ初期胚細胞に、ＴＢＥウイルス、菌株Ｎｅｕｄｏｒｆｌ（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｕ２７４９５）またはＷＮウイルス、菌株ＮＹ９９（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＦ１９６８３５）を感染させた。２４〜４８時間のｐ.ｉ.、細胞上清を採取し、遠心分離によって浄化した。ＷＮウイルスを、ホルマリン（１：２０００）を用いて３７℃にて２４時間不活性した。ウイルス含有懸濁液を、超遠心分離によって濃縮し、そして、レートゾーナルとそれに続く、平衡スクロース密度勾配遠心分離法によって精製した。
【００５７】
組換えＥタンパク質の製造
組換え抗原を、参照文献（５、１８〜２０）に記載の二重ｓｔｒｅｐ−タグを用いたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）により製造した。発現ベクターｐＴ３８９は、エクスポートシグナル配列Ｂｉｐ、エンテロキナーゼ切断部位および二重ｓｔｒｅｐ−タグをコードする。ドロソフィラ・シュナイダー２細胞を、選択用のブラストサイジンを使用して安定的に形質移入した。ＣｕＳＯ4の添加によってタンパク質発現を誘導し、そして、上清を、誘導の７〜１０日後に採収した。抗原を、製造業者の取扱説明書に従ってストレプトアクチンカラム（ＩＢＡ）を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【００５８】
以下の組換えタンパク質を発現させ、本発明のＭＡＣ−ＥＬＩＳＡの抗原として使用した：
【００５９】
ＴＢＥウイルス：ｓＥ−アミノ酸Ｅ１〜４００；ＴＢＥウイルスＤＩ＋ＩＩ−アミノ酸Ｅ１〜３０２；ＴＢＥウイルスｓＥΔＦＰ−アミノ酸１〜４００（アミノ酸９８〜１１１をＧＧＧＧ−リンカーにより置換した）；ＴＢＥウイルスｐｒ＋ｓＥ［アミノ酸ｓＥ１〜４００；参照文献（２）に記載のフューリン切断部位における突然変異を伴ったｐｒＭ１〜１２９；ｐｒＭおよびｓＥを、参照文献（７）に記載のタバコエッチウイルスプロテアーゼ切断部位によって接続した］。
【００６０】
ＷＮウイルス：ｓＥ−アミノ酸Ｅ１〜４００；ＤＥＮウイルス：ＤＥＮＶ１、２および４のｓＥ−アミノ酸Ｅ１〜３９９；ＤＥＮＶ３の１〜３９７；ジカウイルス：ｓＥ−アミノ酸Ｅ１〜４０８；リオブラボー：ｓＥ−アミノ酸Ｅ１〜３９５。
ＴＢＥ（Ｎｅｕｄｏｒｆｌ）；ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｕ２７４９５
ＷＮ（ＮＹ９９）；ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＦ１９６８３５
デング１（ＦＧＡ／８９）；ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＦ２２６６８７
デング２（１６６８１）；ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｕ８７４１１
デング３（ＣＨ５３４８９）；ＧｅｎＢａｎｋ＃ＤＱ８６３６３８
デング４（１１０７０）；ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＣ＿００２６４０
ジカ（Ｈ／ＰＦ／２０１３）；ＧｅｎＢａｎｋ＃ＫＪ７７６７９１
Ｒｉｏ Ｂｒａｖｏ（ＲｉＭＡＲ）；ＧｅｎＢａｎｋ＃ＡＦ１４４６９２
【００６１】
ウイルスとｍａｂの標識
精製した感染性ＴＢＥウイルスおよびＷＮ特異的モノクローナル抗体を、製造業者の取扱説明書に従って「ライトニング結合ＨＲＰ標識キット」（Innova Biosciences）を使用して、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した。
【００６２】
化学的架橋とＳＤＳ−ＰＡＧＥ
組換えタンパク質の化学的架橋を、先に記載したとおり実質的におこなった（１）。簡単に言えば、１０ｍＭのスベルイミノ酸ジメチル（ＤＭＳ；Pierce）を、トリエタノールアミンバッファーｐＨ８.０中の組換えタンパク質に加え、そして、室温にて３０分間インキュベートした。架橋を、１０ｍＭの終濃度までのエタノールアミンの添加によって停止させた。タンパク質を、トリクロロ酢酸で沈殿させ、参照文献（９）に記載のように、非還元条件下で５％のポリアクリルアミドゲルを使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そして、クマシーブルーＲ−２５０で染色した。
【００６３】
ＭＡＣ ＥＬＩＳＡ
すべてのＭＡＣ ＥＬＩＳＡ形式に関して、Ｎｕｎｃ ＭａｘｉＳｏｒｐプレートを、カルボナートバッファー（ｐＨ９.６；０.１５９％のＮａ2ＣＯ3および０.２９３％のＮａＨＣＯ3）で１：１,０００に希釈したヒトμ鎖（ＤＡＫＯ）に対するウサギ免疫グロブリン５０μｌ／ウェルを用いて、４℃にて一晩コートした。コーティング溶液の除去後に、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）バッファーｐＨ７.４（２％のＴｗｅｅｎ２０および２％のヒツジ血清含有）中の血清サンプルを加え、３７℃にて４５分間インキュベートした。
【００６４】
次に、血清サンプルを取り出し、そして、ＰＢＳ ｐＨ７.４を用いた３回の洗浄ステップ後に、様々な検出システムを、以下のとおり適用した：
【００６５】
ａ）従来のＴＢＥ ＭＡＣ ＥＬＩＳＡ（４、１７）：ペルオキシダーゼ標識した感染性ＴＢＥウイルスを、３７℃にて３０分間インキュベートした。
【００６６】
ｂ）従来のＷＮ ＭＡＣ ＥＬＩＳＡ：ホルマリン不活性化ＷＮウイルスを、３７℃にて３０分間インキュベートし、続いて、ＷＮウイルス特異的ペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体と共に３０分間インキュベートした。
【００６７】
ｃ）あらかじめ形成しておいた本発明の複合体：ｓＥタンパク質およびストレプトアクチン−ＨＲＰ（ＩＢＡ）を、所定の至適濃度で混合し、５００ｒｐｍ、室温にて３０分間インキュベートし、そして、−８０℃にて保存したか、またはそのまま使用した。複合体を、３７℃にて３０分間インキュベートした。
【００６８】
ｄ）複合体に使用されるのと同じ濃度での、本発明の複合体要素の連続添加：ｓＥを３７℃にて３０分間インキュベートし、続いて、ストレプトアクチン−ＨＲＰと共に３０分間インキュベートした。
【００６９】
ｅ）本発明の複合体中のものと同じ組換え、ｓｔｒｅｐ−タグｓＥを使用したが、検出のためにビオチン標識Ｅタンパク質特異的モノクローナル抗体（ｍａｂ）およびストレプトアビジン−ＨＲＰを使用した、従来のＴＢＥ ＭＡＣ ＥＬＩＳＡ：ｓＥを３７℃にて３０分間インキュベートし、続いて、ｍａｂと共に３０分間インキュベートし、そして、ストレプトアビジン−ＨＲＰと共に３０分間インキュベートした。
【００７０】
ｆ）タグ無しｓＥ二量体（単離型精製ＴＢＥウイルス、Heinz 1991）を使用し、かつ、検出のために、ビオチン標識Ｅタンパク質特異的モノクローナル抗体（ｍａｂ）およびストレプトアビジン−ＨＲＰを使用した、従来のＴＢＥ ＭＡＣ ＥＬＩＳＡ：ｓＥを３７℃にて３０分間インキュベートし、続いて、ｍａｂと共に３０分間インキュベートし、そして、ストレプトアビジン−ＨＲＰと共に３０分間インキュベートした。
【００７１】
次に、プレートを３回洗浄し、そして、５０μｌの基質（ｏ−フェニレンジアミン；Sigma）を添加した。暗所内、室温にて３０分間、酵素を反応させ、そして、１００μｌの２Ｎ Ｈ2ＳＯ4の添加によって停止させた。
【００７２】
結果
１.）本発明によるＭＡＣ ＥＬＩＳＡが、検出のためにＨＲＰ−標識感染性ＴＢＥウイルスを使用するＭＡＣ ＥＬＩＳＡと同等であること、および２.）この性能が、ディテクター要素があらかじめ形成しておいた複合体として添加されたときにのみ達成され、個々の要素が連続して添加されたときには達成されないことの実証。
【００７３】
本発明によるアッセイの品質を評価するために、我々は、その性能を、ａ）ディテクターとして精製された感染性ＨＲＰ標識ダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ）ウイルスを使用する確立されたＭＡＣ ＥＬＩＳＡの性能（４、１７）およびｂ）本発明のディテクター複合体の個々の要素が連続して添加されるアッセイ形式と比較した。図３で見られるように、最近のＴＢＥウイルス感染からの血清サンプルのプールにおける本発明のアッセイを用いたＩｇＭ検出の感度は、従来のアッセイと同等であった。対照的に、個々のディテクター要素（ｓＥ二量体およびＨＲＰ−ストレプトアクチン）を連続して添加したとき、はるかに低いシグナルを得た（図３）。
【００７４】
図３は、３つの別々のＭＡＣ ＥＬＩＳＡにおける最近のヒトＴＢＥウイルス感染の血清プールの滴定曲線を示す（黒色の実線：本発明によるアッセイ；灰色の実線：参照文献（４、１７）による従来のアッセイ；黒色の点線：本発明によるが、ディテクター要素の連続添加を使用するアッセイ）。
【００７５】
本発明によるＭＡＣ ＥＬＩＳＡの優れた性能が、ディテクター複合体に使用したｓＥの逆平行二量体構造に依存していることの実証。
【００７６】
ディテクター複合体に使用する抗原の構造要求性を分析するために、我々は、ＴＢＥウイルスｓＥ二量体を、このタンパク質の異なる単量体形と比較した。これには、１.）ドメインＩＩの二量体化（アミノ酸９８〜１１１、融合ペプチドＦＰ）に必要である配列エレメントを取り除いたｓＥ（ｓＥΔＦＰ）、２.）ドメインＩ＋ＩＩだけから成る構築物（ＤＩ＋ＩＩ）、および３.）ｐｒとの複合体の単量体ｓＥ（ｐｒ＋ｓＥ）、が挙げられた。
【００７７】
図４Ａの結果は、単量体形を用いたアッセイ（灰色網掛けの棒、図４Ａ）の性能が、
二量体ｓＥ（黒色の棒、図４Ａ）を使用した本発明のアッセイと比較して、劇的に低下することを示す。
【００７８】
加えて、我々は、−ＴＢＥおよび他のフラビウイルス（５、８、１０、１１、１５）とは対照的に−日本脳炎（ＪＥ）ウイルス様の別のフラビウイルスシステム［西ナイル（ＷＮ）ウイルス］における本発明のアッセイ形式が、組換えタンパク質（６、８、１３）としての製造のときに、ｓＥの単量体形をもたらすことを分析した。単量体のＴＢＥ ｓＥ形態で得られた結果と一致して（図４Ａ）、精製したウイルス粒子全体を使用したＭＡＣ ＥＬＩＳＡと比較して、非常に低いシグナルが、単量体のＷＮウイルスｓＥで観察された（図４Ｂ）。
【００７９】
これらの結果は、本発明のアッセイの品質が、ディテクター複合体のフラビウイルスＥ抗原の天然の逆平行構造に依存していることを実証する。
【００８０】
図４は、ディテクター複合体に単量体および二量体Ｅ抗原を使用したＭＡＣ ＥＬＩＳＡを示す（Ａ：最近のヒトＴＢＥウイルス感染の血清プールの１：１００希釈物を、ディテクター複合体の抗原としてＴＢＥ ｓＥ二量体（黒色の棒）、ＴＢＥ ｓＥΔＦＰ、ＴＢＥ ＤＩ＋ＩＩおよびＴＢＥ ｐｒ−ｓＥ（灰色網掛けの棒）を使用した本発明のアッセイで分析した。Ｂ：最近のヒトＷＮウイルス感染からの４つの血清サンプルを、抗原として精製したＷＮウイルス粒子全体を使用したＭＡＣ ＥＬＩＳＡと比較して（灰色の棒）、ディテクター複合体中に単量体ＷＮ ｓＥを使用した本発明のアッセイ形式（黒色の棒）において、１：１００の希釈にて分析した；ＨＲＰ−西洋ワサビペルオキシダーゼ；ｍａｂ−モノクローナル抗体）。
【００８１】
最近のＴＢＥウイルス感染からの３１個のヒト血清サンプルのパネルを使用した、本発明によるＭＡＣ ＥＬＩＳＡが従来の形式と同等であることの実証。
【００８２】
本発明のアッセイ形式の感度を、精製した感染性ＴＢＥウイルスを使用した従来のＭＡＣ ＥＬＩＳＡのものと比較するために、我々は、記載した（１７）ように任意のＴＢＥＩｇＭ単位を測定するための陽性標準血清を使用して、両方のアッセイで最近のヒトＴＢＥウイルス感染からの３１個の血清サンプルのパネルを分析した。結果の評価は、両アッセイに統計学上の有意差がなく、完全な同等性を明らかにした（図５）。
【００８３】
図５は、任意の単位で表現された、精製した感染性ＴＢＥウイルス（白抜きの四角形）を使用した従来のＭＡＣ ＥＬＩＳＡと比較した、本発明のアッセイ（黒色の点）における最近のＴＢＥウイルス感染からの３１個のヒト血清サンプルのＴＢＥ ＩｇＭ測定の結果を示す（Ｎｓ−有意ではない。バーは、平均＋／−９５％の信頼区間を示す。血清希釈−１：１０００）。
【００８４】
本発明によるＭＡＣ ＥＬＩＳＡはまた、二量体組換えｓＥタンパク質を生じ、かつ、高い特異性で最近のヒトＴＢＥ、デング熱、およびジカウイルス感染の血清学的診断法を可能にする、他の重要なヒト病原性フラビウイルスに関しても機能することの実証。
【００８５】
本発明は、ｓＥの天然逆平行構造の使用に依存している。組換えタンパク質発現による斯かる二量体の形成は、フラビウイルス間で異なる、具体的には、ＪＥとＷＮの組換えｓＥタンパク質は単量体である（６、８、１３）；比較図１）。しかしながら、他の重要なヒト病原性フラビウイルスのｓＥタンパク質は、潜在的に二量体を形成することができ（図６）、よって、本発明のアッセイ形式にそのまま使用できた（図７）。
【００８６】
このために、我々は、デング熱（ＤＥＮ）およびジカウイルスの組換えｓＥタンパク質を発現および精製し、そして、ＴＢＥ（主に二量体）およびＷＮ（主に単量体）ウイルスのｓＥタンパク質との比較の際のＤＭＳとの架橋によって、それらのオリゴマー構造を分析した。図６で見られるように、ＤＥＮ４およびジカｓＥタンパク質の両方が、二量体構造と一致し、ＴＢＥウイルスに類似した架橋パターンをもたらした。ＤＥＮ血清型１、２および３のｓＥタンパク質を用いて得られた結果は、ＤＥＮ４のものに類似していた。
【００８７】
図６は、ＴＢＥ、ジカ、ＷＮ、およびＤＥＮ４ウイルスからの組換えｓＥタンパク質のオリゴマー構造を実証する（ＤＭＳを用いた化学的架橋なし（−）および化学的架橋後（＋）の組換えｓＥタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。クマシーブルーで染色）。
【００８８】
本発明のアッセイに関するＤＥＮおよびジカウイルスｓＥ抗原の適合性を実証するために、我々は、ＴＢＥ、ＤＥＮ血清型１〜４、ジカ、およびリオブラボーウイルスのｓＥと平行して、これらのウイルスへの最近の感染症からのヒト血清サンプルを分析した。後者のｓＥを、すべての関連ヒト病原性フラビウイルスと遠縁にあり（１６）、アッセイシグナルに対する幅広いフラビウイルス交差反応性抗体の貢献の測定を可能にする交差反応性対照抗原として使用する。抗原としてデング血清型１、２、３、４；ジカ；リオブラボーおよびＴＢＥ ｓＥを使用した本発明のＭＡＣ ＥＬＩＳＡにおいて斯かる血清サンプルを用いて得られた結果の例を図７に示す。データは、ヒトの重要なフラビウイルス感染の型特異的な血清学的診断を可能にする、アッセイの優れた性能を明らかにする。パネルＥは、デング熱およびジカウイルスへの最近の重複感染でさえ解消できることを示す。
【００８９】
異なるＤＥＮ血清型への連続した感染は、特に、斯かる感染症の血清学的診断法で問題を引き起こす可能性がある、幅広いフラビウイルス交差反応性抗体を発生させる傾向がある（１２、１４）。ヒト病原体（リオブラボーウイルスからのｓＥ）としての役割を果たさない独立したフラビウイルス抗原を含めることは、バックグラウンド交差反応性画分の検出を可能にし、これにより、４つの血清型すべてを用いたアッセイにおけるシグナルの程度を比較することによって、最近感染したＤＥＮウイルスを同定するのに役立つ可能性がある（図７Ｆ）。
【００９０】
図７は、Ｘ軸で示したフラビウイルスｓＥ抗原のパネルを用いた本発明のアッセイを使用した、最近のフラビウイルス感染の血清サンプルの分析の結果を示す（Ａ：ＴＢＥウイルス感染；Ｂ：ジカウイルス感染；Ｃ：デング２型ウイルス感染；Ｄ：デング３型ウイルス感染；Ｅ：ジカおよびデング２型ウイルス感染；Ｆ：デング３型ウイルス感染；血清希釈−１：１００）。
【００９１】
本発明のアッセイを使用したデングウイルス感染の血清型特異的診断に関する更なる例を、図８に示す。
【００９２】
図８は、Ｘ軸で示したデング血清型１〜４ｓＥ抗原を用いた本発明のアッセイを使用した、最近のデング熱感染の血清サンプルの分析の結果を示す（Ａ：デング１型ウイルス感染；Ｂ：デング２型ウイルス感染；Ｃ：デング３型ウイルス感染；Ｄ：デング４型ウイルス感染；血清希釈−１：１００）。
【００９３】
本発明によるＭＡＣ ＥＬＩＳＡが、同様にｓＥの二量体型を使用する従来のＭＡＣ ＥＬＩＳＡ形式と比較して、優れていることの実証。
【００９４】
本発明のアッセイの改良された技術的効果を実証するために、我々は、その性能を、ａ）本発明によるが、ディテクター要素の連続添加を使用したアッセイの性質、ｂ）本発明の複合体中のものと同じ組換え、ｓｔｒｅｐ−タグｓＥを使用したが、検出のために、ビオチン標識Ｅタンパク質特異的モノクローナル抗体（ｍａｂ）およびストレプトアビジン−ＨＲＰを使用した従来のＴＢＥ ＭＡＣ ＥＬＩＳＡ、ならびにｃ）検出のためにタグ無しｓＥ二量体（単離型精製ＴＢＥウイルス、Heinz 1991）、ビオチン標識Ｅタンパク質特異的モノクローナル抗体（ｍａｂ）およびストレプトアビジン−ＨＲＰを使用した従来のＴＢＥ ＭＡＣ ＥＬＩＳＡ、と比較した。図９に見られるように、最近のヒトＴＢＥウイルス感染からの血清サンプルのプールにおける本発明のアッセイを用いたＩｇＭ検出の感度は、当該技術分野に記載の類似の方法を用いた検出に比べて、驚いたことに感度が高い。
【００９５】
図９の結果は、本発明によるあらかじめ形成しておいた複合体としてのディテクター要素の添加（図９の黒色の実線）が、ディテクター要素の連続添加（図９の黒色の点線）と比較して性能を大幅に増強することを示す。加えて、結果は、同じ組換えｓＥ抗原を使用した従来のＭＡＣ ＥＬＩＳＡを用いて（図９の灰色の実線）、ＩｇＭ検出の性能が、本発明によるアッセイと比較して、はるかに低かったことを実証する。同じ結果を、ＴＢＥウイルスから単離したタグ無しｓＥ二量体を使用した従来のＭＡＣ ＥＬＩＳＡを用いて得た（図９の灰色の破線）。
【００９６】
よって、データは、本発明は、その性能がｓＥ二量体を使用した既存の従来のＭＡＣ ＥＬＩＳＡに関して劇的に改善し得る、高感度なＩｇＭ検出アッセイを提供することを明らかにする。
【００９７】
この開示を考慮して、本発明は、以下の好ましい実施形態を提供する：
【００９８】
１．
サンプル中のフラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体の検出方法であって、以下のステップ：
（ａ）サンプルを、固定されたＩｇＭ結合分子を備えた固体支持体と接触させること、
（ｂ）サンプル中のＩｇＭ抗体を、該ＩｇＭ抗体も固体支持体上に固定されるように、固体支持体上のＩｇＭ結合分子に結合させること、ならびに
（ｃ）以下の：
（ｉ）可溶性フラビウイルスタンパク質Ｅ（ｓＥ）の逆平行二量体、および
（ｉｉ）マーカー、
を含む複合体を結合させ、そして、該マーカーを検出することによって特異的なフラビウイルスＩｇＭ抗体への該複合体の結合を同定することによって、フラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体を検出すること、
を含む方法。
【００９９】
２．
前記ＩｇＭ結合分子が、抗ＩｇＭ抗体またはそのＩｇＭ結合断片である、実施形態１に記載の方法。
【０１００】
３．
前記フラビウイルスが、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、特にＤＥＮＶ血清型１（ＤＥＮ１）、ＤＥＮＶ血清型２（ＤＥＮ２）、ＤＥＮＶ血清型３（ＤＥＮ３）、およびＤＥＮＶ血清型４（ＤＥＮ４）、ならびにジカウイルス（ＺＶ）の群から選択される、実施形態１または２に記載の方法。
【０１０１】
４．
前記サンプルが、血清もしくは血漿サンプル、または脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルである、実施形態１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【０１０２】
５．
前記ｓＥの逆平行二量体が、タグを含み、そしてここで、該タグが、ｓＥの逆平行二量体にマーカーを連結し、そのタグが、好ましくはＳｔｒｅｐ−タグまたはＨｉｓ−タグから選択される、実施形態１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【０１０３】
６．
前記マーカーが、親和性マーカー、蛍光マーカー、放射性マーカー、核酸マーカー、発色性マーカー、発光マーカー、磁気マーカー、またはその組み合わせから選択される、実施形態１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【０１０４】
７．
前記複合体が、標識抗体、特にｓＥの逆平行二量体のタグに特異的である抗体；Ｓｔｒｅｐ−タグ結合タンパク質、特に実施形態６に記載のマーカーを含むＳｔｒｅｐ−タグ結合タンパク質を含む、実施形態１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【０１０５】
８．
前記固体支持体が、マイクロタイタープレートまたは他のプラスチックコンテナもしくは平面、生物学的マイクロチップ、ビーズ、ディスク、磁性粒子、ファイバー光学センサ、ガラススライド、あるいは膜、好ましくはニトロセルロース膜、ポリテトラフルオロエチレン膜、セルロースアセテート膜またはセルロースニトラート膜である、実施形態１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【０１０６】
９．
前記マーカーの検出が、更なる物質の添加を含み、それによって、シグナルを生じることとなるか、またはマーカーを活性化してシグナルを誘発し、そしてそのシグナルを計測することとなる、実施形態１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【０１０７】
１０.
対照として、重要なヒト病原性フラビウイルスの遠縁にあたるフラビウイルスのｓＥ、好ましくはリオブラボー（Rio Bravo）、モドック（Modoc）、ヨコセ（Yokose）、エンテベコウモリ（Entebbe bat）、バルケドジ（Barkedji）、またはランミ（Lammi）ウイルスのｓＥ、特にリオブラボーウイルスのｓＥが適用される、実施形態１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【０１０８】
１１.
前記方法が自動化システムで行われる、実施形態１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【０１０９】
１２.
前記自動化システムが、市販の自動化システムでおこなわれること、好ましくはＡｒｃｈｉｔｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Abbott）；Ｖｉｄａｓ Ｉｍｍｕｎｏａｎａｌｙｚｅｒ（Biomerieux）；Ｃｏｂａｓ ａｎｄ Ｅｌｅｃｓｙｓ ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ−Ａｎａｌｙｚｅｒｓ（Roche Diagnostics）；Ｌｉａｉｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Diasorin）；またはＥｕｒｏｉｍｍｕｎ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ（Euroimmun）でおこなわれることを特徴とする、実施形態１０に記載の方法。
【０１１０】
１３.
実施形態１〜１２のいずれか１項に記載の方法をおこなうためのキットであって：
−固定されたＩｇＭ結合分子を含む固体支持体、および
−以下の
（ｉ）可溶性フラビウイルスタンパク質Ｅ（ｓＥ）の逆平行二量体、および
（ｉｉ）マーカー、
を含む複合体、
を含むキット。
【０１１１】
１４.
マーカーを検出する手段、好ましくは親和性マーカー、蛍光マーカー、放射性マーカー、発色性マーカー、発光マーカー、または磁気マーカーを検出する手段を更に含む、実施形態１３に記載のキット。
【０１１２】
１５.
サンプルまたはサンプルを含有するコンテナを更に含む、実施形態１３または１４に記載のキット。
【０１１３】
１６.
フラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体を含む標準を更に含む、実施形態１３〜１５のいずれか１項に記載のキット。
【０１１４】
１７.
前記キットが、重要なヒト病原性フラビウイルスの遠縁にあたるフラビウイルスのｓＥ、好ましくはリオブラボー（Rio Bravo）、モドック（Modoc）、ヨコセ（Yokose）、エンテベコウモリ（Entebbe bat）、バルケドジ（Barkedji）、またはランミ（Lammi）ウイルスのｓＥ、特にリオブラボーウイルスのｓＥを更に含む、実施形態１３〜１６のいずれか１項に記載のキット。
【０１１５】
１８.
前記キットが、自動検出システムを更に含み、好ましくは、サンプル輸送デバイス、検出デバイス、コンピューター処理ユニットおよび／またはコンピューター処理ユニットで実行されたコンピューターソフトウェアプログラムによって処理された、検出ユニットからのシグナルを表示するためのディスプレイを含む、実施形態１３〜１７のいずれか１項に記載のキット。
【０１１６】
１９.
前記キットが、市販の自動化システムと組み合わせられる、好ましくはＡｒｃｈｉｔｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Abbott）；Ｖｉｄａｓ Ｉｍｍｕｎｏａｎａｌｙｚｅｒ（Biomerieux）；Ｃｏｂａｓ ａｎｄ Ｅｌｅｃｓｙｓ ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ−Ａｎａｌｙｚｅｒｓ（Roche Diagnostics）；Ｌｉａｉｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Diasorin）；Ｅｕｒｏｉｍｍｕｎ Ａｎａｌｙｚｅｒｓ（Euroimmun）と組み合わせられる、実施形態１３〜１８のいずれか１項に記載のキット。
【０１１７】
２０.
前記少なくとも固体支持体および／または複合体および／またはｓＥおよびマーカーが、無菌のラップの中、好ましくは無菌の透明プラスチックラップの中に包装される、実施形態１３〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【０１１８】
参照文献
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【図１】
2019527837.tif 000002
【図２】
2019527837.tif 000003
【図３】
2019527837.tif 000004
【図４】
2019527837.tif 000005
【図５】
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【図６】
2019527837.tif 000007
【図７】
2019527837.tif 000008
【図８】
2019527837.tif 000009
【図９】
2019527837.tif 000010
【手続補正書】
【提出日】平成31年2月6日(2019.2.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のフラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体の検出方法であって、以下のステップ：
（ａ）サンプルを、固定されたＩｇＭ結合分子を備えた固体支持体と接触させること、
（ｂ）サンプル中のＩｇＭ抗体を、該ＩｇＭ抗体も固体支持体上に固定されるように、固体支持体上のＩｇＭ結合分子に結合させること、ならびに
（ｃ）可溶性フラビウイルスタンパク質Ｅ（ｓＥ）の逆平行二量体とマーカーを、該ｓＥ二量体およびマーカーを含む複合体の形成のためにあらかじめ混合すること、ここで、前記ｓＥの逆平行二量体がタグを含み、該タグがｓＥの逆平行二量体にマーカーを連結する、ならびに
（ｄ）あらかじめ形成しておいた複合体を結合させ、そして、該マーカーを検出することにより特異的フラビウイルスＩｇＭ抗体への該複合体の結合を同定することによって、フラビウイルスに特異的なＩｇＭ抗体を検出すること、
を含む方法。
【請求項２】
前記ＩｇＭ結合分子が、抗ＩｇＭ抗体またはそのＩｇＭ結合断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フラビウイルスが、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）、デングウイルス（ＤＥＮＶ）、特にＤＥＮＶ血清型１（ＤＥＮ１）、ＤＥＮＶ血清型２（ＤＥＮ２）、ＤＥＮＶ血清型３（ＤＥＮ３）、およびＤＥＮＶ血清型４（ＤＥＮ４）、ならびにジカウイルス（ＺＶ）の群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルが、血清もしくは血漿サンプル、または脳脊髄液（ＣＳＦ）サンプルである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記タグが、Ｓｔｒｅｐ−タグまたはＨｉｓ−タグから選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記マーカーが、親和性マーカー、蛍光マーカー、放射性マーカー、核酸マーカー、発色性マーカー、発光マーカー、磁気マーカー、またはその組み合わせから選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記複合体が、標識抗体、特にｓＥの逆平行二量体のタグに特異的である抗体；Ｓｔｒｅｐ−タグ結合タンパク質、特に請求項５に記載のマーカーを含むＳｔｒｅｐ−タグ結合タンパク質を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記固体支持体が、マイクロタイタープレートまたは他のプラスチックコンテナもしくは平面、生物学的マイクロチップ、ビーズ、ディスク、磁性粒子、ファイバー光学センサ、ガラススライド、あるいは膜、好ましくはニトロセルロース膜、ポリテトラフルオロエチレン膜、セルロースアセテート膜またはセルロースニトラート膜である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記マーカーの検出が、更なる物質の添加を含み、それによって、シグナルを生じることとなるか、またはマーカーを活性化してシグナルを誘発し、そしてそのシグナルを計測することとなる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
対照として、重要なヒト病原性フラビウイルスの遠縁にあたるフラビウイルスのｓＥ、好ましくはリオブラボー（Rio Bravo）、モドック（Modoc）、ヨコセ（Yokose）、エンテベコウモリ（Entebbe bat）、バルケドジ（Barkedji）、またはランミ（Lammi）ウイルスのｓＥ、特にリオブラボーウイルスのｓＥが適用される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が自動化システムで行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法をおこなうための、
−固定されたＩｇＭ結合分子を含む固体支持体、および
−以下の
（ｉ）可溶性フラビウイルスタンパク質Ｅ（ｓＥ）の逆平行二量体、および
（ｉｉ）マーカー、
を含む複合体、
を含むキットの使用。
【請求項１３】
前記キットが、マーカーを検出する手段、好ましくは親和性マーカー、蛍光マーカー、放射性マーカー、発色性マーカー、発光マーカー、または磁気マーカーを検出する手段を更に含む、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記キットが、自動検出システムを更に含み、好ましくは、サンプル輸送デバイス、検出デバイス、コンピューター処理ユニットおよび／またはコンピューター処理ユニットで実行されたコンピューターソフトウェアプログラムによって処理された、検出ユニットからのシグナルを表示するためのディスプレイを含む、請求項１２または１３に記載の使用。
【請求項１５】
少なくとも前記の固体支持体および／または複合体および／またはｓＥおよびマーカーが、無菌のラップの中、好ましくは無菌の透明プラスチックラップの中に包装される、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の使用。
【国際調査報告】
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